CN115677850B - 具备较强抗凝血活性的医蛭基因突变水蛭素及其制备方法 - Google Patents
具备较强抗凝血活性的医蛭基因突变水蛭素及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
在分子动力学（MD）蛋白质结合力分析、分子生物学以及药理学筛选基础上，本专利制备了医蛭（Hirudo medicinalis）基因突变水蛭素（HV1）HV1‑E62D‑Y63D‑L64D以及HV1‑E62D‑L64D。药效分析实验表明，HV1‑E62D‑Y63D‑L64D以及HV1‑E62D‑L64D具备优于野生型基因重组HV1的抗凝血活性。本发明专利说明书详细介绍了以上医蛭基因突变水蛭素HV1‑E62D‑Y63D‑L64D以及HV1‑E62D‑L64D以及它们的制备方法和药理学作用。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质工程制药领域，具体涉及一组一级结构改造的医蛭基因重组水蛭素，及其制备和分离纯化方法。
背景技术
天然水蛭素是从吸血水蛭的唾液腺中提取的一种单链多肽，是目前已知的最有效的凝血酶抑制剂，其中HV1是由医蛭(Hirudo medicinalis)分泌。 HV1由65个氨基酸残基组成，相对分子质量为7.8kD，C末端富含酸性氨基酸，包括第63位可以发生硫酸化修饰的酪氨酸。在凝血途经中，水蛭素以凝血级联反应中的核心酶--凝血酶作为靶标，通过离子键和疏水作用力与凝血酶紧密且不可逆转地结合，使其失去裂解可溶性纤维蛋白原的能力，从而阻止不溶性纤维蛋白的形成。多种动物模型和临床药理研究表明，水蛭素能有效防治血栓性疾病，尤其是凝血酶起关键作用的疾病。同时，水蛭素具有不需要任何内源性辅助因子(如抗凝血酶(AT))，出血少，免疫原性低等优点。
目前，天然水蛭素只能以很低的产量分离出来，且药用水蛭的数量有限，无法制备足够的水蛭素用于治疗目的。近年来，也有研究者利用微生物表达基因重组水蛭素，但是与天然水蛭素相比，微生物表达的水蛭素C末端缺乏酪氨酸O-硫酸化修饰，缺少与“外部位点I”相互作用的带有负电荷的基团，因此抗凝血活性低于野生型水蛭素。为了解决这一问题，我们利用基因工程技术将C 末端的多个氨基酸残基突变为天冬氨基酸，以增加水蛭素C末端所带的负电荷，获得较高抗凝血活性的基因重组药用水蛭水蛭素。
发明内容
1.发明的目的
利用大肠杆菌工程菌种表达并纯化具有较强抗凝血活性的医蛭基因重组水蛭素突变体，及其制备方法。
2.发明的技术方案
一、提高抗凝血活性的重组水蛭素HV1突变体的设计
利用GROMACS分子动力学(MD)分析系统的WHAM模块，我们分析了野生型以及多种突变型HV1的C末端与凝血酶的结合力。分析结果表明，通过氨基酸残基突变为天冬氨酸(Asp或D)增加C末端的负电荷(图1)，可以提高水蛭素与凝血酶的亲和力(图2)。MD分析可以提供一定的理论依据，实际作用需要通过实验来验证。在MD分析基础上，我们设计了多种用于提高水蛭素HV1抗凝血活性的突变体，并进行筛选，本专利设计所描述的是其中的的HV1的突变体HV1-E62D-L64D和HV1-E62D-Y63D-L64D(图3)。
二、基因重组水蛭素HV1及其突变体的表达质粒构建
模板的准备：从NCBI获得HV1的CDS序列。根据原核表达系统中密码子的偏好性，进行碱基序列优化(核苷酸或氨基酸序列表中第2条序列)，并合成。
序列的准备：设计PCR引物，利用上游引物引入His亲和纯化标签，利用下游引物序列引入氨基酸突变位点的碱基序列。
PCR扩增：将HV1的第62位谷氨酸(E)和第64位亮氨酸(L)同时突变为天冬氨酸(D)(核苷酸或氨基酸序列表中第3、4条序列)，将第62位谷氨酸(E)、第63位酪氨酸(Y)和第64位亮氨酸(L)同时突变为天冬氨酸 (D)(核苷酸或氨基酸序列表中第5、6条序列)，扩增得到两端带有限制性内切酶位点(NdeI和HindIII)的cDNA片段，分别为NdeI-HisTag-HV1-HindIII、 NdeI-HisTag-HV1-E62D-L64D-HindIII、以及NdeI-HisTag-HV1-E62D-Y63D-L64D-HindIII。
限制性内切酶酶切：双酶切DNA片段NdeI-HisTag-HV1-HindIII、 NdeI-HisTag-HV1-E62D-L64D-HindIII、和NdeI-HisTag-HV1-E62D-Y63D-L64D– HindIII、以及载体pET21a(+)，产生粘性末端。
T4连接酶连接：用T4连接酶分别将切出粘性末端的 NdeI-HisTag-HV1-HindIII、NdeI-HisTag-HV1-E62D-L64D-HindIII、NdeI-HisTag -HV1-E62D-Y63D-L64D-HindIII与切开的表达载体pET21a(+)连接，构建带有His亲和纯化标签的HV1 pET21a(+)、HV1-E62D-L64D pET21a(+)、HV1-E62D-Y63D-L64D pET21a(+)原核表达重组质粒。
重组质粒的鉴定：将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α，阳性克隆子进行双酶切鉴定和DNA测序。
三、基因重组水蛭素蛋白HV1、HV1-E62D-L64D、HV1-E62D -Y63D-L64D的原核表达
将构建成功的重组质粒通过热激法转化到大肠杆菌表达菌株(BL21 衍生株E.coli str.B F-ompT hsdSB(rB -mB -)gal dcm lacY1 ahpC gor522 trxB(DE3))，加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白小量表达；筛选高表达菌株，进行大量表达。
利用超声法破碎表达HV1、HV1-E62D-L64D、HV1-E62D-Y63D-L64D 的菌体，考马斯亮蓝染色法确定目标蛋白表达情况。
利用镍离子亲和层析方法，采用梯度浓度洗脱的方式分离、纯化带有 His标签的HV1、HV1-E62D-L64D、HV1-E62D-Y63D-L64D蛋白。透析后，4℃抽真空冻干，低温保存。
利用BCA法定量样品蛋白浓度。定量后的蛋白样品经SDS-PAGE分离(Bis-Tris胶)，Western blot鉴定纯化后的蛋白样品HV1、HV1-E62D-L64D、 HV1-E62D-Y63D-L64D。
四、基因重组水蛭素HV1、HV1-E62D-L64D、HV1-E62D -Y63D-L64D的抗凝血活性分析
利用发色底物S-2238(H-D-Phe-Pip-Arg-pNA.2HCl)测定体系中存在基因重组水蛭素的条件下，人α-凝血酶的表观米氏常数，了解它们对α-凝血酶的的抑制作用。
通过测定基因重组水蛭素对人α-凝血酶的竞争性抑制常数Ki，分析水蛭素对凝血酶的结合能力。实验采用发色底物法，动态测定酶促反应Ki。发色底物为S-2238(H-D-Phe-Pip-Arg-pNA.2HCl)。
将重组水蛭素在体外与健康人血浆孵育，通过测定血浆凝血指标，包括测定活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)和凝血酶时间(TT)，进一步分析重组水蛭素的体外抗凝血活性。实验结果表明， HV1-E62D-Y63D-L64D的体外抗凝作用强于未突变株HV1(图13)。
3.发明的有益效果
本发明可以获得一种具有较高抗凝血活性的基因重组药用水蛭素突变蛋白，优于基因重组水蛭素，具有生产周期短、成本低等优点。
附图说明
图1.医蛭水蛭素HV1的C末端与凝血酶的结合方式以及各种HV1 水蛭素C末端负电荷分布。A.医蛭水蛭素HV1的C末端与凝血酶结合正视图，其中较大的以静电分布图表示的是人凝血酶，结合在凝血酶表面以条带和结构式表示的是HV1的C末端片段。B.医蛭水蛭素HV1的C末端与凝血酶结合侧式图，表示方法同上。C.野生型医蛭水蛭素HV1的C末端负电荷分布。D.基因重组HV1-E62D-L64D的C末端负电荷分布图，灰度代表负电荷的量。E.基因重组HV1-E62D-Y63D-L64D的C末端负电荷分布，灰度代表负电荷的量。
图2.野生型以及突变型水蛭素HV1的C末端与凝血酶结合力的分子动力学“拉开分析”(Pulling assay)结果。结果显示在凝血酶的近距离范围内使两条多肽链分开所需拉力(Pullf)，上升相反映蛋白质之间的结合能。A.野生型HV1的C末端与凝血酶分离的Pullf变化。B.与图A相同时间段内野生型 HV1的C末端与凝血酶分离的距离。C.基因重组HV1-E62D-L64D的C末端与凝血酶分离的Pullf变化。D.与图C相同时间段内HV1-E62D-L64D的C末端与凝血酶分离的距离。E.基因重组HV1-E62D-Y63D-L64D的C末端与凝血酶分离的Pullf变化。F.与图E相同时间段内HV1-E62D-Y63D-L64D的C末端与凝血酶分离的距离。
图3.野生型医蛭水蛭素HV1与本专利制备的医蛭基因突变水蛭素的氨基酸序列比对。A.氨基酸保守性用深浅不同的灰色显示。B.氨基酸的化学性质分类以深浅不同的灰色表示。
图4.HisTag-HV1 pET21a(+)重组表达质粒图谱。
图5.HisTag-HV1-E62D-L64D pET21a(+)重组表达质粒图谱。
图6.HisTag-HV1-E62D-Y63D-L64D pET21a(+)重组表达质粒图谱。
表1.PCR一般引物序列。酶切位点NdeI(AAGCTT)和HindIII (CATATG)用带下划线的黑体字表示。
图7.HisTag-HV1 pET21a(+)重组质粒的测序结果峰图。展示的碱基序列是从目的基因起始密码子ATG开始，包括5’端编码6xHisTag的核苷酸序列，至三个重复的TAA终止密码子，测序结果正确。
图8.HisTag-HV1-E62D-L64D pET21a(+)重组质粒的测序结果峰图。
展示的碱基序列是从目的基因起始密码子ATG开始，包括5’端编码6xHisTag 的核苷酸序列，至三个重复的TAA终止密码子，测序结果正确。
图9.HisTag-E62D-Y63D-L64D pET21a(+)重组质粒的测序结果峰图。展示的碱基序列是从目的基因起始密码子ATG开始，包括5’端编码6xHisTag 的核苷酸序列，至三个重复的TAA终止密码子，测序结果正确。
图10.纯化后蛋白HV1、HV1-E62D-L64D、HV1-E62D-Y63D-L64D 的Western blot检测结果图。HV1、HV1-E62D-L64D、HV1-E62D-Y63D-L64D蛋白用SDS-PAGE(Bis-tris胶)分离后，转印到低荧光背景NC膜检测，一抗为抗6x HisTag鼠抗单克隆抗体，二抗为羊抗鼠IgG-Alexa Fluor 488，最后用 Typhoon FLA 9500(GE Healthcare)检测荧光条带。其中，M为蛋白质分子量标记；泳道1-3分别为纯化蛋白HV1、HV1-E62D-L64D、HV1-E62D-Y63D-L64D。箭头指示目的条带。
图11.基因重组蛋白野生型HV1、突变型HV1-E62D-L64D以及 HV1-E62D-Y63D-L64D对人α-凝血酶表观Km的测定结果。结果表明：基因重组野生型HV1水蛭素比较，HV1-E62D-L64D以及HV1-E62D-Y63D-L64D对凝血酶的亲和力提高。Con：空白对照组，HV1：基因重组野生型医蛭水蛭素， HV1-E62D-L64D：62位谷氨酸与64位亮氨酸突变为天冬氨酸的基因重组HV1 水蛭素，HV1-E62D-Y63D-L64D：62位谷氨酸、63位酪氨酸和64位亮氨酸突变为天冬氨酸的基因重组HV1水蛭素。
图12.重组蛋白HV1、HV1-E62D-L64D、HV1-E62D-Y63D-L64D 对人α-凝血酶竞争性抑制常数Ki的测定结果。其中，图A-C分别对应基因重组 HV1水蛭素(HV1)、62位谷氨酸与64位亮氨酸突变为天冬氨酸的基因重组 HV1水蛭素(HV1-E62D-L64D)，62位谷氨酸、63位酪氨酸和64位亮氨酸(HV1-E62D-Y63D-L64D)。结果显示，HV1-E62D-L64D的Ki值略低于HV1 的Ki值，而HV1-E62D-Y63D-L64D的Ki值低于HV1的Ki值2倍多。
图13.重组蛋白HV1、HV1-E62D-L64D、HV1-E62D-Y63D-L64D对人血浆凝血指标APTT、PT和TT影响。图A、B、C分别对应凝血指标APTT、 PT、TT测定结果。柱形图数据为平均值±SD，*P<0.05或**P<0.01，与天然野生型HV1水蛭素(WT)比较；#P<0.05或##P<0.01,与基因重组野生型HV1水蛭素比较；n＝4。结果均显示，与WT组比较，HV1组的凝血指标显著降低；HV1-E62D-Y63D-L64D组的凝血指标显著高于HV1组，且与WT组无显著性差别。
具体实施方案
以下内容为野生型以及突变型基因重组HV1的制备和药效验证方法。
具体实施方式一：本实施方式原核表达并分离纯化重组药用水蛭素蛋白HV1、HV1-E62D-L64D和HV1-E62D-Y63D-L64D，按以下步骤进行：
一、基因重组水蛭素HV1及其突变体的表达质粒构建
根据原核表达体系中的密码子偏好性优化设计HV1的CDS序列，以适于在大肠杆菌表达菌株中高效表达。设计PCR引物引入氨基酸突变位点，并以NdeI和HindIII作为重组蛋白CDS序列的上下游两端的酶切位点，构建带有His标签的原核表达序列NdeI-HisTag-HV1HindIII、NdeI-HisTag-HV1-E62D -L64D-HindIII、NdeI-HisTag-HV1-E62D-Y63D-L64D-HindIII。具体步骤如下：
引物设计：设计扩增HisTag-HV1的上游引物F：NdeI-HisTag-HV1-F (核苷酸或氨基酸序列表中第7条序列)，下游引物R：HV1-HindIII-R(核苷酸或氨基酸序列表中第8条序列)；设计扩增HisTag-HV1-E62D-L64D的上游引物F：NdeI-HisTag-HV1-F,下游引物R：E62D-L64D-HindIII-R(核苷酸或氨基酸序列表中第9条序列)；设计扩增HisTag-HV1-E62D-Y63D-L64D的上游引物F：NdeI-HisTag-HV1-F，下游引物R：E62D-Y63D-L64D(核苷酸或氨基酸序列表中第10条序列)(表1)。
目的基因扩增：用普通PCR法，以人工合成的HV1序列为模板，用引物F和R分别扩增出目的条带NdeI-HisTag-HV1-HindIII、NdeI-HisTag-HV1 -E62D-L64D-HindIII、NdeI-HisTag-HV1-E62D-Y63D-L64D-HindIII。
限制性内切酶双酶切：用NdeI和HindIII分别双酶切片段NdeI-HisTag -HV1-HindIII、NdeI-HisTag-HV1-E62D-L64D-HindIII、NdeI-HisTag-HV1-E62D-Y63D-L64D-HindIII和空载体pET21a(+)。
T4 DNA连接酶连接：用T4 DNA连接酶分别连接目的片段和载体，构建表达质粒HisTag-HV1 pET21a(+)、HisTag-HV1-E62D-L64D pET21a(+)、 HisTag-HV1-E62D-Y63D-L64D pET21a(+)(图4～6)。
重组质粒鉴定：将构建好的重组质粒转入大肠杆菌，扩增后提取质粒，测序结果正确(图7～9)。
二、基因重组水蛭素蛋白HV1、HV1-E62D-L64D、HV1-E62D -Y63D-L64D的原核表达，具体步骤如下：
诱导表达：42℃，45s将表达质粒HisTag-HV1 pET21a(+)、 HisTag-HV1-E62D-L64DpET21a(+)、HisTag-HV1-E62D-Y63D-L64D pET21a(+)转入大肠杆菌表达菌株中，37℃恢复菌体1小时，取50μL涂布于含有氨苄抗生素的LB固体培养板，37℃倒置培养12h。挑取单菌落至10ml含有氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃、180rpm振摇12h，将菌液按1:50转接培养至 OD600nm＝0.6，然后加入终浓度为1.0mM的IPTG于180rpm，25℃诱导表达 9h。
亲和纯化：将上述表达菌体收集在离心管中，以6,000rpm，在4℃条件下，离心15min，弃掉上清。加入非变性裂解液(50mM Tris-HCl，300mM NaCl，10mM咪唑，pH 8.0)柔和洗涤菌体，12,000rpm，4℃离心15min，收集沉淀，洗涤3次，每次15min。每克湿重加入8mL非变性裂解液，用旋转混合仪分散菌体。将菌液置于冰上，用超声波破碎仪破碎菌体，破碎功率为400 W，破碎3s,停5s共破碎200次。12,000rpm，4℃离心20min，收集上清，利用镍柱进行重组水蛭素蛋白的纯化。具体步骤如下：
平衡：用5倍柱体积的10mM咪唑缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mM咪唑)平衡镍柱。上样：将超声破碎离心后的上清液加到镍柱里，重复3次。漂洗：依次利用3倍柱体积的30mM咪唑缓冲液(50mM NaH2PO4、 300mM NaCl、30mM咪唑)和3倍柱体积的50mM咪唑缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、50mM咪唑)漂洗镍柱，洗脱掉结合不牢固的杂蛋白。洗脱：利用250mM咪唑缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、250mM咪唑)洗脱目的蛋白，收集洗脱组分，每1mL洗脱目的蛋白的流出液储存在一个 EP管内。
蛋白鉴定：用BCA法测定样品蛋白浓度。经SDS-PAGE(Bis-Tris胶) 分离定量后的样品蛋白，利用Western blot鉴定纯化后目标蛋白。其中，Western blot采用半干转印将目的蛋白转印(条件：80mA,12V,18min)到硝酸纤维素 (NC)膜，一抗为抗HisTag鼠抗单克隆抗体，二抗为山羊抗小鼠IgG H&L(Alexa 488)，最后用Typhoon FLA9500(GEHealthcare,USA)检测荧光条带(图 10)。
三、基因重组水蛭素蛋白HV1、HV1-E62D-L64D、HV1-E62D -Y63D-L64D的药理学实验，包括重组蛋白与人凝血酶竞争性抑制常数Ki的测定、人血浆凝血指标APTT、PT和TT的测定。具体步骤如下：
Ki测定的方法是发色底物法，凝血酶特异性底物为S-2238(H-D-Phe- Pip-Arg-pNA·2HCl)。具体步骤是：设置对照孔和样本孔，对照孔加入样本稀释液40μL或样本稀释液20μL与人α-凝血酶20μL，待测样本孔加入待测样本20 μL和人α-凝血酶20μL。用锡箔纸封住反应孔，室温孵育10min。随后，用排枪加入发色底物S-2238 160μL并小心混匀，立即使用酶标仪测定10min内每10 s间隔动态检测405nm波长处各孔的吸光度值，根据吸光值变化计算拟合曲线，曲线反映表观Km变化(图11)以及竞争性抑制常数Ki(图12)。
人血浆凝血参数测定的具体方法：将新鲜冰冻的人血浆(海南省人民医院血液科)在37℃水浴锅中迅速融化，在室温条件下分别将重组蛋白HV1、 HV1-E62D-L64D、HV1-E62D-Y63D-L64D 5μg/ml与融化后血浆孵育10min，野生型水蛭素(WT)作为阳性对照组、生理盐水(NS)作为空白对照组，使用全自动血凝仪(CA-6500，Sysmex)测定凝血指标活化部分凝血酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)和凝血酶时间(TT)(图13)。
序列表
<110> 王大勇
<120> 具备较强抗凝血活性的医蛭基因突变水蛭素及其制备方法
<140> 2021108400695
<141> 2021-07-24
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 65
<212> PRT
<213> 医蛭(Hirudo medicinalis)
<400> 1
Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys
1 5 10 15
Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser
20 25 30
Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro
35 40 45
Gln Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu
50 55 60
Gln
65
<210> 2
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgcatcacc atcatcacca cgttgtttac accgactgca ccgaatctgg tcagaacctg 60
tgcctgtgcg agggctctaa cgtgtgcggg cagggtaaca aatgcatcct gggttctgac 120
ggtgaaaaaa accagtgcgt taccggtgaa ggtaccccga aaccgcagtc tcacaacgac 180
ggtgacttcg aagaaatccc ggaagaatac ctgcagtaat aataa 225
<210> 3
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys
1 5 10 15
Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser
20 25 30
Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro
35 40 45
Gln Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Asp Tyr Asp
50 55 60
Gln
65
<210> 4
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgcatcacc atcatcacca cgttgtttac accgactgca ccgaatctgg tcagaacctg 60
tgcctgtgcg agggctctaa cgtgtgcggg cagggtaaca aatgcatcct gggttctgac 120
ggtgaaaaaa accagtgcgt taccggtgaa ggtaccccga aaccgcagtc tcacaacgac 180
ggtgacttcg aagaaatccc ggaagactac gaccagtaat aataa 225
<210> 6
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys
1 5 10 15
Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser
20 25 30
Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro
35 40 45
Gln Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Asp Asp Asp
50 55 60
Gln
65
<210> 5
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgcatcacc atcatcacca cgttgtttac accgactgca ccgaatctgg tcagaacctg 60
tgcctgtgcg agggctctaa cgtgtgcggg cagggtaaca aatgcatcct gggttctgac 120
ggtgaaaaaa accagtgcgt taccggtgaa ggtaccccga aaccgcagtc tcacaacgac 180
ggtgacttcg aagaaatccc ggaagacgac gaccagtaat aataa 225
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
attccatatg catcaccatc atcaccacgt tgttacac 38
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cccaagcttt tattattact gcaggtattc ttcc 34
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cccaagcttt tattattact ggtcgtagtc ttccgggatt tc 42
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cccaagcttt tattattact ggtcgtcgtc ttccgggatt tc 42
Claims (3)
1.医蛭HV1基因重组突变蛋白HV1-E62D-Y63D-L64D，其特征在于，该基因重组突变蛋白以HV1的氨基酸序列为母本，将其第62位谷氨酸、第63位酪氨酸和第64位亮氨酸同时突变为天冬氨酸；
所述HV1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.HV1基因重组突变蛋白HV1-E62D-L64D，其特征在于，所述基因重组突变蛋白以HV1的氨基酸序列为母本，将其第62位谷氨酸和第64位亮氨酸同时突变为天冬氨酸；
所述HV1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1或2所述的基因重组突变蛋白的体外表达方法，其特征在于，利用可诱导表达质粒在大肠杆菌中表达上述基因重组突变蛋白。
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| 重组水蛭素的原核表达及分离纯化;黄孔威等;中国畜牧兽医;第45卷(第1期);1-13 * |
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