CN111705032A

CN111705032A - 一种原核表达细胞及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111705032A
Application number: CN202010659296.3A
Authority: CN
Inventors: 高乐; 王壹; 张昊; 栗慧超; 于源华; 宋禹
Original assignee: Kehe Biological Technology Beijing Co ltd
Current assignee: Kehe Biological Technology Beijing Co ltd
Priority date: 2020-07-09
Filing date: 2020-07-09
Publication date: 2020-09-25
Anticipated expiration: 2040-07-09
Also published as: CN111705032B

Abstract

本发明实施例涉及一种原核表达细胞及其制备方法和应用，该原核表达细胞能共表达肝素酶I HepA’和分子伴侣素CpkA。肝素酶I HepA’的氨基酸序列中，关键是用带净正电荷的信号标签肽取代HepA中前导肽氨基酸序列。改造后的含有一段带净正电荷的信号标签肽的肝素酶I HepA’在原核表达细胞中的表达量大大提高，尤其是存在于上清液中的蛋白量大大提高；同时由于CpkA的羧基端带净负电荷，其与带净正电荷的信号标签肽产生静电相互作用，使得CpkA和HepA’结合力更强，因此CpkA可以更有效地帮助HepA’折叠成正确的构象，从而提高其可溶性表达。

Description

一种原核表达细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种原核表达细胞及其制备方法和应用。

背景技术

低分子量肝素(low molecular weight heparin，LMWH)是近几年出现的一种新型的肝素类抗血栓药物，是由普通肝素经物理化学反应解聚制备而成的一类分子量较小的组分，分子量约为3000-7000，作用机理主要是通过与抗凝血酶结合使凝血因子Xa和IIa失活，从而达到抗凝作用。与普通肝素相比，低分子量肝素具有更多的优点，如抗血栓作用更显著，且体内半衰期长，生物利用率高，口服易吸收，出血等副作用小等等。

目前制备低分子量肝素最常用的方法仍然是利用肝素酶裂解获得。肝素酶是指一大类特异性裂解肝素或者硫酸乙酰肝素等肝素结构类似物的多糖裂解酶。肝素酶I(HepA，EC 4.2.2.7)最初从Favobacterium heparinum中分离出来，肝素酶I的基因序列全长是1155bp，同时编码384个氨基酸，其中第1-21个氨基酸是前导肽部分，具有常见的Ala-X-Ala结构。肝素酶I能以位点依赖的方式特异性地切割肝素/硫酸肝素，从而在生产低分子量肝素的领域有巨大潜力。但重组HepA在原核表达系统，如大肠杆菌中，表达难度较大，存在蛋白表达量小、蛋白纯度低、蛋白溶解性差等问题。1992年，Sasisekharan等人首次从肝素黄杆菌中克隆并成功获得不含前21个氨基酸的肝素酶I基因，将其转至大肠杆菌DE3中重组表达，发现DE3可以表达获得HepI蛋白，但主要以包涵体形式存在，经复性变性后，获得的肝素酶I酶活也很低。为了提高HepI在大肠杆菌中的可溶性表达量并分离纯化出所需蛋白，科学家们一直在努力，Ernst等人将肝素酶I基因尝试克隆在不同的表达载体上表达，发现在pET-12a和pET-28a载体上，肝素酶I均以无活性的包涵体形式存在。而在载体pET-15b上也仅可以产生少量目的蛋白，且活性极低，对包涵体进行复性操作后，也没有得到酶活。Huang等(Jing Huang,et al.Enhanced soluble expression of recombinant Flavobacteriumheparinum heparinase I in Escherichia coli by fusing it with various solublepartners.Protein Expression and Purification 83(2012)169–176，本发明中称为文献1)通过将HepA基因C端克隆和融合5种可溶性伴侣，尝试提高重组HepA在大肠杆菌中表达系统中的溶解度，但该技术容易使得大肠杆菌表达菌株在进行表达时，因为要合成单个巨大的融合蛋白质而产生代谢负担，影响表达以及活性。因此有必要改进现有技术。

分子伴侣是一大类能够识别并结合到不完整折叠或装配的多肽或蛋白质，并帮助其折叠成正确的空间结构的蛋白。分子伴侣主要被分为以下几类：Hsp70家族、Hsp90家族、Hsp60即分子伴侣素等。其中分子伴侣素的主要功能是帮助胞内新生肽链正确折叠。从嗜热菌Thermococcus kodakarensis中提取发现了两个分子伴侣素，即冷诱导型CpkA和热诱导型CpkB，CpkA由548个氨基酸组成，适应低温；CpkB由546个氨基酸组成，编码一分子量为59.14kDa的蛋白质，适应高温。这两个分子伴侣素具有高度序列同一性(77％)。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

发明目的

本发明的目的在于提供一种能共表达肝素酶I HepA’和分子伴侣素CpkA的原核表达细胞及其制备方法和应用。肝素酶I HepA’的氨基酸序列中，用带净正电荷的信号标签肽取代HepA中前导肽氨基酸序列，改造后的含有一段带净正电荷的信号标签肽的肝素酶IHepA’在原核表达细胞中的表达量大大提高，尤其是存在于上清液中的蛋白量大大提高；同时由于CpkA的羧基端带净负电荷，其与带净正电荷的信号标签肽产生静电相互作用，使得相比于CpkA和细胞内其他蛋白质的结合力而言，CpkA和HepA’结合力更强，因此CpkA可以更有效地帮助HepA’在原核表达细胞内折叠成正确的构象，从而提高其可溶性表达。

解决方案

为实现本发明目的，本发明实施例提供了以下技术方案：

一种原核表达细胞，所述原核表达细胞内包括：含有编码肝素酶I HepA’的DNA序列的第一重组表达载体和含有编码分子伴侣素CpkA的DNA序列的第二重组表达载体；

所述肝素酶I HepA’的氨基酸序列中包括：HepA前导肽被带净正电荷的信号标签肽取代后的HepA的氨基酸序列；

且第一重组表达载体和第二重组表达载体的骨架载体为能在原核表达细胞内共同表达的载体。

肝素酶I HepA’是一种经过改造的HepA，如上所述，肝素酶I HepA’的氨基酸序列中包括：HepA前导肽被带净正电荷的信号标签肽取代后的HepA的氨基酸序列，即肝素酶IHepA’的氨基酸序列中包括：带净正电荷的信号标签肽，以及HepA中除去前导肽的部分，其中HepA中除去前导肽的部分既可以是其本身的氨基酸序列，也可以是HepA中除去前导肽的部分经过突变、缺失、增加后仍能保持HepA功能的氨基酸序列。

在一种可能的实现方式中，被取代的HepA前导肽的氨基酸序列为MKKQILYLIVLQQLFLCSAYA(SEQ ID NO:1)；

取代HepA前导肽的且带净正电荷的信号标签肽的氨基酸序列选自下表的任意一条：

在一种可能的实现方式中，第一重组表达载体中，编码带净正电荷的信号标签肽的DNA序列的5’端还连接有编码MGSSHHHHHH氨基酸序列的DNA序列。组氨酸的加入为了方便纯化。

在一种可能的实现方式中，第一重组表达载体和第二重组表达载体的骨架载体为能共同表达的任意两种质粒；可选地，含有编码肝素酶I HepA’的DNA序列的表达载体为pET28a，含有编码分子伴侣素CpkA的DNA序列的表达载体为pACYC-Duet。

在一种可能的实现方式中，所述原核细胞为大肠杆菌。

在一种可能的实现方式中，所述分子伴侣素CpkA为来自Thermococcuskodakarensis的CpkA。

本发明实施例还提供了上述原核表达细胞的制备方法，包括以下步骤：

将编码肝素酶I HepA’的DNA序列连接至第一表达载体中构建第一重组表达载体；

将编码分子伴侣素CpkA的DNA序列连接至第二表达载体中构建第二重组表达载体，所述第二表达载体能与第一表达载体在原核表达细胞中共表达；

将第一重组表达载体和第二重组表达载体共转化至原核表达细胞中。

本发明实施例还提供了一种在原核表达细胞中表达可溶性肝素酶I的方法，包括使用上述原核表达细胞进行共表达的步骤。

本发明实施例还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有编码肝素酶IHepA’的DNA序列，所述肝素酶I HepA’的氨基酸序列中包括：HepA前导肽被带净正电荷的信号标签肽取代后的HepA的氨基酸序列。

本发明实施例还提供了一种DNA序列，其特征在于，所述DNA序列包括编码肝素酶IHepA’的DNA序列，所述肝素酶I HepA’的氨基酸序列中包括：HepA前导肽被带净正电荷的信号标签肽取代后的HepA的氨基酸序列。

本发明实施例还提供了一种肝素酶I HepA’，其特征在于，所述肝素酶I HepA’的氨基酸序列中包括：HepA前导肽被带净正电荷的信号标签肽取代后的HepA的氨基酸序列。

在一种可能的实现方式中，被取代的HepA前导肽的氨基酸序列为MKKQILYLIVLQQLFLCSAYA；

本发明实施例还提供了一种上述肝素酶I HepA’在制备低分子量肝素中的应用。

有益效果

(1)本发明实施例的原核表达细胞中，肝素酶I HepA’的氨基酸序列中用带净正电荷的信号标签肽取代HepA中前导肽氨基酸序列，改造后的含有一段带净正电荷的信号标签肽的肝素酶I HepA’在原核表达细胞中的表达量大大提高，尤其是存在于上清液中的蛋白量大大提高；同时由于CpkA的羧基端带净负电荷，其与带净正电荷的信号标签肽产生静电相互作用，使得相比于CpkA和细胞内其他蛋白质的结合力而言，CpkA和HepA’结合力更强，因此CpkA可以更有效地帮助HepA’在原核表达细胞内折叠成正确的构象，从而提高其可溶性表达。

(2)本发明实施例的原核表达细胞中，同现有技术中通过将HepA基因C端克隆和融合5种可溶性伴侣的方法相比，本发明实施例中表达的蛋白为小肽融合蛋白，而不是像文献1中那样是蛋白质融合蛋白，蛋白质融合蛋白分子量十分巨大，表达宿主在发酵表达时的代谢负担加大，蛋白质翻译也容易出错。此外，本发明实施例中无需在纯化后切除掉IF2、GST这些融合蛋白，减少了额外的步骤。本发明实施例中的肝素酶I的产量至少提高了三分之一，在比活相当的情况下，总活力单位也提高了至少三分之一。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

图1A是本发明实施例1中实验设计的示意图，即“信号标签肽融合蛋白-分子伴侣素体系共表达肝素酶I的方法”的设计思路；图1B是本发明实施例1中编码天然HepA的DNA序列；图1C是本发明实施例1中被删除的编码天然HepA的基因中负责编码前导肽(Leadsequence)的核苷酸序列的示意图(如方框中所示)；图1D是编码信号标签肽(Signal-tag)S1的核苷酸序列的示意图(粗体)。

图2是本发明实施例1、对比例1、对比例2、对比例3中总菌破碎液、破碎液上清、破碎液沉淀三种样品的SDS-PAGE蛋白质电泳图；泳道1-3是HepA在大肠杆菌中单表达的结果：其中泳道1是总菌破碎液，泳道2是破碎液上清，泳道3是破碎液沉淀；泳道4-6是HepA’在大肠杆菌中单表达的结果，其中泳道4是总菌破碎液，泳道5是破碎液上清，泳道6是破碎液沉淀；泳道7-9是HepA和CpkA在大肠杆菌中共表达的结果，其中：泳道7是总菌破碎液，泳道8是破碎液上清，泳道9是破碎液沉淀；泳道10-12是HepA’和CpkA在大肠杆菌中共表达结果，其中：泳道10是总菌破碎液，泳道11是破碎液上清，泳道12是破碎液沉淀。

图3A和图3B是本发明实施例1中HepA’和CpkA在大肠杆菌中共表达后，HepA’纯化结果的SDS-PAGE图，图3A中表示镍柱纯化后的HepA’：泳道1为上柱前样品，泳道2-5为反复上柱后的流出液，泳道6为1mM咪唑洗杂蛋白流出液，泳道7为100mM咪唑洗脱液，泳道8为200mM咪唑洗脱液，泳道9为第二次200mM咪唑洗脱液，M为蛋白质分子量Marker；图3B中表示阳离子交换柱纯化后的HepA’：泳道1为上柱前样品，泳道2为上柱后流出液，M为蛋白质分子量Marker，泳道3-10为不同管数的洗脱液(Na₂HPO₄-柠檬酸(pH6.0)缓冲液)。箭头为目的蛋白HepA’所在条带。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

如无特殊说明，以下材料均为现有技术中可获得的或者可商购的。

实施例1 pET28a-HepA’和pACYC-CpkA

图1A给出了本发明信号标签肽融合蛋白-分子伴侣素体系共表达肝素酶I法的设计思路，图1B给出了编码天然HepA的DNA序列：

1.将编码天然HepA的基因中负责编码前导肽(Lead sequence)的核苷酸序列删除(如图1C所示)，并用编码信号标签肽(Signal-tag)S1的核苷酸序列取代(如图1D所示)，取代后的核苷酸序列编码的是经过改造的肝素酶I，该经过改造的肝素酶I被命名为HepA’；其中：删除的前导肽的氨基酸序列为：MKKQILYLIVLQQLFLCSAYA，S1的氨基酸序列为RGRRGG。

2.将编码HepA’的核苷酸序列连接至大肠杆菌表达质粒中(以pET28a为例)，所得质粒命名为pET28a-HepA’。

3.将编码来自Thermococcus kodakarensis的分子伴侣素CpkA的核苷酸序列连接至另一个大肠杆菌表达质粒中(以pACYC-Duet为例)，命名为pACYC-CpkA。

4.将构建好的pET28a-HepA’和pACYC-CpkA共转化至大肠杆菌工程菌中(以Escherichia coli(DE3)为例)，HepA和CpkA在大肠杆菌中共表达，纯化所得蛋白。

具体步骤包括：

(1)去除信号肽的肝素酶I(HepI’-28a)的构建

以HepI-28a质粒(即将编码天然HepA的核苷酸序列(含编码前导肽的核苷酸序列)连接至大肠杆菌表达质粒pET28a中所得质粒)作为模板，利用设计的去除信号肽的PCR引物(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)根据表1体系进行全质粒PCR，产物为6373bp，PCR反应体系、PCR引物和反应条件如下所示；

表1 PCR反应体系

去除信号肽的PCR引物

经过上一步操作得到的产物为模板DNA和PCR扩增产物的混合物。模板DNA是从菌中提取出来的，含有甲基化位点；PCR扩增出的产物为简单的碱基连接，没有经过甲基化等的修饰。FastDigest DpnI能够特异性的消化带有甲基位点的基因片段，可以将模板DNA消化掉，从而保证转化成功的菌为含有突变质粒，反应体系如下表：

DpnI反应体系

将产物转化入DH5α中，将含有Kan抗性的固体培养基在37℃下过夜培养至有单菌落长出，将提取的质粒用BamH I和Xho I处理进行双酶切验证，最后确定突变成功的质粒，确定将编码天然HepA的基因中负责编码前导肽(Lead sequence)的核苷酸序列删除，并用编码信号标签肽(Signal-tag)S1的核苷酸序列取代。

(2)分子伴侣素CpkA保存在pET-21a上，其与pET-28a使用同一套复制系统，不能同时存在于一个宿主菌中，因此筛选更换为pACYCDuet-1作为分子伴侣素的新载体。利用NEBcutter V2.0对CpkA碱基序列进行分析，与pACYCDuet-1质粒图谱进行比对确定酶切位点，利用Oligo7设计引物分别在5’和3’端分别加上酶切位点Nde I(CATATG)和EcoR V(GATATC)，送由库美公司进行合成。PCR反应体系、PCR引物(即SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5)和反应条件如下所示：

CpkA的PCR引物

斜体加粗部分为酶切位位

CpkA的PCR体系

质粒pACYCDuet-1和CpkA的PCR产物双酶切，将双酶切电泳胶通过胶回收的方式获得所需的基因片段，具体步骤依照天根柱式胶回收试剂盒提供的说明书进行胶回收操作。为了防止载体发生自身连接和环化的情况，需要将双酶切过的载体经去磷酸化酶(rSAP)处理，去除其5’末端的磷酸基团。

去磷酸化反应体系

将各组分混匀后，在37℃下温浴60min使其反应完全，然后将体系在65℃温浴5min，以失活去磷酸化酶rSAP。将EP管12000rpm离心2min，取上清利用乙醇沉淀法进一步纯化载体。向上一步得到的载体中加入1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)混匀，再加入1mL 95％乙醇(冰)，混匀各组分，将EP管置于-20℃静置1h。12000rpm下离心10min，弃上清，加入500μL70％乙醇清洗两次，离心弃上清，将EP管开口置于通风处至乙醇完全挥发，加入20μL无菌水溶解核酸。把经过乙醇沉淀获得的载体和经过胶回收得到的目的片段进行电泳，利用ImageJ比较两者浓度，调节浓度比载体:目的基因≥1:10，利用T4连接酶进行连接操作。将产物转化入DH5α中，将含有Kan抗性的固体培养基在37℃下过夜培养至有单菌落长出，将提取的质粒进行双酶切验证和测序验证。

(3)将构建好的pET28a-HepA’和pACYC-CpkA共转化至大肠杆菌工程菌中(以Escherichia coli(DE3)为例)，HepA’和CpkA在大肠杆菌中共表达，如图2中10、11、12泳道所示，表达后的HepA’通过镍柱纯化、除盐柱除盐、阳离子交换柱层析的方式，获得纯度达到90％以上的HepA’蛋白，如图3A中的泳道7和图3B所示。

对比例1 pET28a-HepA单表达

将编码天然HepA的核苷酸序列(含编码前导肽的核苷酸序列)连接至大肠杆菌表达质粒pET28a中，所得质粒命名为pET28a-HepA，将构建好的pET28a-HepA转化至大肠杆菌工程菌Escherichia coli(DE3)中进行单表达。

对比例2 pET28a-HepA’单表达

将编码HepA’的核苷酸序列连接至大肠杆菌表达质粒中(以pET28a为例)，所得质粒命名为pET28a-HepA’，将构建好的pET28a-HepA’转化至大肠杆菌工程菌Escherichiacoli(DE3)中进行单表达。

对比例3 pET28a-HepA和pACYC-CpkA共表达

将编码HepA的核苷酸序列连接至大肠杆菌表达质粒pET28a中，所得质粒命名为pET28a-HepA；

将编码来自Thermococcus kodakarensis的分子伴侣素CpkA的核苷酸序列连接至另一个大肠杆菌表达质粒pACYC-Duet中，命名为pACYC-CpkA；

将构建好的pET28a-HepA和pACYC-CpkA共转化至大肠杆菌工程菌Escherichiacoli(DE3)为例中，HepA和CpkA在大肠杆菌中共表达。

收获实施例1、对比例1-3中表达后的菌液，每个实施例或对比例中的菌液均取总菌破碎液、破碎液上清、破碎液沉淀三种样品，进行SDS-PAGE蛋白质电泳检测，结果如图2所示，结果显示：

相对于HepA单独表达时的HepA表达量，HepA’单独表达时的HepA’表达量增加约10％，占总蛋白的百分之四十左右，更重要的是HepA’在上清中的表达量显著增加，占整个上清蛋白质的95％(如图2中4、5、6泳道所示)。

HepA’和CpkA共表达时，HepA’总表达量增加，上清中HepA’表达量增加(95％)，而且几乎没有包涵体。即相对于Hep A’单独表达而言，不可溶表达量大大减少，几乎所有的HepA’在CpkA的帮助下都折叠正确(如图2中10、11、12泳道所示)。

但通过HepA和CpkA共表达时可以看出：CpkA并不能很好的增加HepA的可溶性表达(如图2中7、8、9泳道所示)。说明在本方法中，提高HepA的可溶性表达有两个关键因素，一是HepA必须融合极性标签肽形成HepA’肽融合蛋白，二是共表达的CpkA帮助HepA’在胞内正确折叠。

实施例2

将实施例1中HepA’和CpkA共表达所得HepA’经过镍柱纯化、再经过阳离子交换柱纯化，所得纯化后的HepA’的产量和比活详见表1。同时发明人还参照背景技术中文献1的方法将HepA基因C端克隆和融合4种可溶性伴侣(IF2、GST、MBP、SUMO)并在大肠杆菌中进行表达，将表达产物切除掉融合蛋白之后所得的肝素酶I进行测定，相应产量和比活相见表1，将文献1中的表达产物切除掉融合蛋白是为了更好的反应肝素酶I的产量。

表1各种来源的肝素酶I的产量(1L发酵液中的产量)和比活。

肝素酶I比活定义为30℃，pH7.0缓冲液中，一分钟内生成1μmol糖醛酸的酶活力定义为1IU。

酶活测定方法采用的是2010年Banga等人采用的方法：肝素被肝素酶I裂解后，会产生大量糖醛酸不饱和键，糖醛酸在232nm处有明显的吸收峰，根据232nm处紫外吸收的增加量可以计算出肝素酶I的酶活。配制2mg/mL肝素底物缓冲液(100mM Mops，5mM CaAc₂，pH7.0)，向3mL底物缓冲液在30℃水浴锅中预热10min，向体系中加入100μL纯化出的肝素酶I蛋白，检测232nm处的吸收值变化，根据时间进程曲线计算肝素酶I活力。糖醛酸中不饱和键C4-C5摩尔吸光系数为3800cm^-1·M^-1。

与文献1中通过将HepA基因C端克隆和融合4种可溶性伴侣的方法相比，本发明实施例中表达的蛋白为小肽融合蛋白，而不是像文献1中那样是蛋白质融合蛋白，蛋白质融合蛋白分子量十分巨大，表达宿主在发酵表达时的代谢负担加大，蛋白质翻译也容易出错。此外，本发明实施例中无需在纯化后切除掉IF2、GST这些融合蛋白，减少了额外的步骤。从表1中可以看出，与文献1中的几种情况相比，本发明实施例中的肝素酶I的产量至少提高了三分之一，在比活相当的情况下，总活力单位也提高了至少三分之一。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 科赫生物科技（北京）有限公司

<120> 一种原核表达细胞及其制备方法和应用

<130> 1092-190476F

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> Favobacterium heparinum

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(21)

<223> 被取代的HepA中前导肽

<400> 1

Met Lys Lys Gln Ile Leu Tyr Leu Ile Val Leu Gln Gln Leu Phe Leu

1 5 10 15

Cys Ser Ala Tyr Ala

20

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL SEQUENCE

<400> 2

caccgtggtc gtcgtggtgg tcagcaaaaa aaatccggta acat 44

<210> 3

<211> 44

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL SEQUENCE

<400> 3

ttgctgacca ccacgaggac cacggtgatg atgatgatga tggc 44

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL SEQUENCE

<400> 4

cgccatatgg cacagcttag tgga 24

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> ARTIFICIAL SEQUENCE

<400> 5

ttgatatcac atgcccatgt ccattccg 28

Claims

1.一种原核表达细胞，其特征在于，所述原核表达细胞内包括：

含有编码肝素酶I HepA’的DNA序列的第一重组表达载体和含有编码分子伴侣素CpkA的DNA序列的第二重组表达载体；

所述肝素酶I HepA’的氨基酸序列包括：HepA前导肽被带净正电荷的信号标签肽取代后的HepA的氨基酸序列；

且第一重组表达载体和第二重组表达载体的骨架载体为能在原核表达细胞内共同表达的载体；

可选地，被取代的HepA前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

2.根据权利要求1所述的原核表达细胞，其特征在于，第一重组表达载体中，编码带净正电荷的信号标签肽的DNA序列的5’端还连接有编码MGSSHHHHHH氨基酸序列的DNA序列。

3.根据权利要求1所述的原核表达细胞，其特征在于，第一重组表达载体和第二重组表达载体的骨架载体为能共同表达的任意两种质粒；可选地，含有编码肝素酶I HepA’的DNA序列的表达载体为pET28a，含有编码分子伴侣素CpkA的DNA序列的表达载体为pACYC-Duet。

4.根据权利要求1所述的原核表达细胞，其特征在于，所述原核细胞为大肠杆菌；

和/或，所述分子伴侣素CpkA为来自Thermococcus kodakarensis的CpkA。

5.一种权利要求1-4之一所述的原核表达细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.一种在原核表达细胞中表达可溶性肝素酶I的方法，其特征在于，包括使用权利要求1-4之一所述的原核表达细胞进行共表达的步骤。

7.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有编码肝素酶I HepA’的DNA序列，所述肝素酶I HepA’的氨基酸序列中包括：HepA前导肽被带净正电荷的信号标签肽取代后的HepA的氨基酸序列。

8.一种DNA序列，其特征在于，所述DNA序列包括编码肝素酶I HepA’的DNA序列，所述肝素酶I HepA’的氨基酸序列中包括：HepA前导肽被带净正电荷的信号标签肽取代后的HepA的氨基酸序列。

9.一种肝素酶I HepA’，其特征在于，所述肝素酶I HepA’的氨基酸序列中包括：HepA前导肽被带净正电荷的信号标签肽取代后的HepA的氨基酸序列。

10.权利要求9所述的肝素酶I HepA’在制备低分子量肝素中的应用。