JPH0746995A - プラスミド及び組替え体 デスルファトヒルヂン ｈｖ−１ ペプチドの製法 - Google Patents

プラスミド及び組替え体 デスルファトヒルヂン ｈｖ−１ ペプチドの製法

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JPH0746995A
JPH0746995A JP5105996A JP10599693A JPH0746995A JP H0746995 A JPH0746995 A JP H0746995A JP 5105996 A JP5105996 A JP 5105996A JP 10599693 A JP10599693 A JP 10599693A JP H0746995 A JPH0746995 A JP H0746995A
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plasmid
dna
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ncaim
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Istvan Otto
オット イシュトヴァーン
Tibor Dr Klupp
クルップ ティボル
Istvan Molnar
モルナール イシュトヴァーン
Patthy Andras
パッツィー アンドラーシュ
Istvan Balta
バルタ イシュトヴァーン
Barko Nee Toots Zsuzsa
バルコー ネーエ トーツ ジュジャ
Gabor Ambrus
アムブルシュ ガーボル
Saraato Janos
サラートゥ ヤーノシュ
Tegdes Aniko
テグデシュ アニコー
Imre Moravcsik
モラヴチック イムレ
Ejudo Cecilia
エヂュド ツェツィリア
Albrecht Karoly
アルブレシュト カーロリィ
Koenczoel Kalman
コェンツォェル カールマーン
Winze Attila
ヴィンツェ アッティラ
Barabas Eva
バラバーシュ エーヴァ
Mate Gyoergy
マーテー ヂョェルヂィ
Botond Kiss Gyoergy
ボトンド キッシュ ヂョェルヂィ
Peter Kiss
キッシュ ペーテル
Poorya Kalman
ポーリャ カールマーン
Janos Erdei
エルデイ ヤーノシュ
Gulyaas Eva
グルヤーシュ エーヴァ
Zuirahi Erika
ズィラヒ エリカ
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  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ２つのヒルヂン型：即ち、変異型ＨＶ−１
３３ＡＳＰ及びＨＶ−１３３ＡＳＮを、組替え体技術に
より生産する新規な方法を提供することを目的にある。 【構成】微生物のコドン使用において、合成ヌクレアー
ゼ配列は、単離したプロモーター及び信号配列を有する
読み取りフレームの下流及びその中で結合され、そし
て、前記の要素を有する形質発現／分泌カセットをプラ
スミドＤＮＡ中に挿入し、選択滴培養条件で細胞を培養
する。大腸菌、サッカロマイセス及びストレプトマイセ
ス種が、前記の組替え体プラスミドで形質転換され、血
栓症抑制剤のデスルファトヒルヂン ＨＶ−１を生合成
し、それを、単離し、同定するものである。このように
して製造されたデスルファトヒルヂンは、血液凝固を抑
制するために使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規なプラスミド及び
組替え体デスルファトヒルヂン ＨＶ−１ペプチドを生
産する方法に関する。特に、本発明は、 −デスルファトヒルヂン ＨＶ−１ ３３（ＡＳＰ）及
びＨＶ−１ ３３（ＡＳＮ）変異型（３３部位のアスパ
ラギン或いはアスパラギン酸で）を決めるヌクレオチド
配列を生成するための−前記のＤＮＡ配列を、形質発現
／分泌ベクターＤＮＡ中にクローン化するための、 −前記ベクターＤＮＡを微生物中に変換するための、 −所望のＤＮＡ配列を有する細胞を選択するための、そ
して、 −前記の細胞を培養し、単離するための方法に関する。
【０００２】そして、本発明は、ヌクレオチド配列コー
ドヒルヂンＨＶ−１、ヒルヂン及び前記の配列を含む新
規なプラスミドＤＮＡを形質発現するに必要な調節ヌク
レオチドに関する。
【０００３】
【従来の技術】ヒルヂンは、リ−チ（ヒルド メヂシナ
リス[Hirudo medicinalis])の唾液腺中で作られる。６
５のアミノ酸根のポリペプチドであり、３つのヂスルフ
ィド架橋を有する。ヒルヂンは、現在まで知られる凝血
阻止剤として最も能力のあるものであり、その機能は、
血液凝固カスケ−ドのタンパク質分解酵素の１つである
トロンビンの特定の阻止を通して活性される。リ−チで
製造されるヒルヂン類（文献上ではＨＶ−１、ＨＶ−２
及びＰＡ）の機能と構造は、長期間にわたりよく知られ
ている。ヒルヂン類は、リ−チ体から製造された、そし
て、組替え体技術によっても製造された。組替え体ヒル
ヂンは、天然ヒルヂン類のデスルファト変異型であり、
それは、微生物は、６３−位でチロシンを硫酸化できな
いからである。デスルファトヒルヂンの血液凝固阻止効
果及び血栓−ヒルヂン複合体中の分解定数は、硫酸化ヒ
ルヂンのものとほぼ同じである。
【０００４】単純化のために、組替え体技術で製造され
たデスルファトヒルヂンを、ここで、ヒルヂンと称す
る。血栓を選択的に阻止する剤としてのヒルヂンは、血
栓症のみならず、Ｖ、ＶIII及びＸIII凝血因子の活性化
また血小板反応をも遮断するものである。その適用は、
特に、血栓塞栓症に、動脈血栓症の遮断及び静脈血栓症
の予防のために、特に好適にあり、また、伝染された脈
管内凝固に、体腔外の循環に、抗血栓III欠乏の条件
に、血栓症の間の再閉鎖の予防に、線維素溶解剤によ
り、加熱手術において、そして血液透析において、特に
好適である。
【０００５】基礎的及び応用的な研究室において、組替
えＤＮＡ技術で作られる製薬学的に良いペプチド及びタ
ンパク質は、常に多くなっている。ヒルヂンを作るため
に、ヒルド メヂナリスの抗凝固剤−組替え技術によ
り、１９８４年以来実験が行なわれている。ヒルヂン
は、他のペプチドと同様に、既知の遺伝子を持つ微生物
を使用して、所望の構造の遺伝子で、目的の化合物を生
体合成する転写及び翻訳の調節ヌクレオチド配列を与え
て、組替え技術で効率的に製造できる。一般的に、形質
発現／分泌のシステムは、プラスミドのような担体ＤＮ
Ａ分子等の中で、細胞中に導入できる。
【０００６】ヒルヂンは、先ず、大腸菌細胞中で微生物
学的に製造された。ヨーロッパ特許明細書第１５８,５
６４号によると、形質転換体ヒルヂンは、大腸菌によ
り、ｐＢＲ３２２プラスミドから形質発現へと構成され
るｐＴＧベクターを用いて、生体合成される。ランブダ
ファージのＰＬプロモーターは、プロモーターとして
用いた。この方法で作られた培養物ブロスは、ヒルヂン
１０〜１５単位／ｍｌ（１ｍｇのヒルヂンは、１３,０
００〜１５,０００単位に相当する）を含有した。細胞
中に溜まったは、分離するために、細胞は溶菌されなけ
ればならない。培養物中のヒルヂンの抗血栓活性は、正
確に同定されなかった。公開されたドイツ特許出願第
３、４４５、５１７号は、組替え体ヒルヂンを作るラク
ト、β−ラクタマ−ゼ、トリプトファン及びリポプロテ
イン プロモーターを有する形質発現システムを用い
た。ＥＭＢＬ８プラスミドに基づいた、その形質発現シ
ステムにより作られた生体合成ヒルヂンは、細胞内空間
に残り、従って、細胞は溶菌されなければならなかっ
た。ヒルヂン活性１〜２単位／ｌを持つ培養物は、この
方法により得られる。然し乍ら、ヒルヂン成分は、その
生成物が同定されなかったので、活性に機能するか否か
が疑問である。
【０００７】ヨーロッパ特許明細書第２５８,１１８号
は、大腸菌による、ヨーロッパ特許明細書第１５８,５
６４号で得られた形質発現システムを用いて、ある差
で、γ−インターフェロン、抗トリプシン及びヒルヂン
を得た。その差は、プラスミドが、ＤＡＰ（ジアミノピ
メリン酸）遺伝子を挿入するにより安定化されることで
ある。得られた培養物ブロスの血栓遮断活性１０〜２０
単位／ｍｌは同定されなかった。ヨーロッパ特許明細書
第３５６,３３５号によると、信号配列を用いる大腸菌
を培養することにより、１３〜４５単位／ｍｌの濃度で
ヒルヂンＨＶ−２を製造した。この信号配列は、ペリプ
ラスマチック空間へ生成物を分泌するに適すが、浸透衝
撃により単離できた。ヒルヂン類似活性に役立つ活性化
剤は、信頼性データにより同定されなかった。ヨーロッ
パ特許明細書第４４８,０９３号の発明者は、α−シク
ロデキシトリングリコシル トランスフェラ−ゼ信号配
列を用いたトリプシン−ラック融合プロモーターのコン
トロールの下で、ヒルヂン類の製造を開示している。培
養中、ヒルヂン生合成は、イソプロピル−β−チオガラ
クトシド（ＩＰＴＧ）により導入された。ヒルヂン活性
は、培養物ブロス中に見られ、生物学的方法で測定され
た。生成物の単離と構造決定は、報告されていなかっ
た。
【０００８】ヨーロッパ特許明細書第１６８,３４２号
（ハンガリー特許明細書第２０２,２８８号に相当す
る）に従うと、ヒルヂンＨＶ−１は、既知のｐＢＲ３２
２プラスミドＤＮＡの誘導体を用いて、トリプトファン
（ｔｒｐ）オペロンのコントロール下で製造された。こ
こで、目的化合物は大腸菌細胞中に残り、従って、細胞
は、培養物から生合成したヒルヂン３〜６単位／ｍｌを
単離するために、溶菌しなければならなかった。生成物
は、Ｎ−及びＣ−末端アミノ酸分析でのみ特徴付けわれ
た。ヒルヂンは、また融合タンパク質の形で生成でき
た。この場合、ヒルヂンは、他のタンパク質と共に生成
され、融合タンパク質は、所謂包含体の形で、細胞質中
に集積する。この方法の利点は、高い量で沈殿物の形で
最適に形成される異質のタンパク質は、細胞を毒さな
く、そして、溶菌された細胞から容易に調製できる。ヒ
ルヂンは、酵素的或いは化学的な方法により融合生成物
から注出できる。ヨーロッパ特許明細書第１７１,０２
４号は、既知の大腸菌プラスミド(pUC12,pKK177.3,pAT1
53)を用いて、合成されたヌクレオチド配列によりヒル
ヂンを形質発現した。ＩＰＴＧでの導入した後ラックＵ
Ｖ５プロモーターの調節の下で、ヒルヂン活性に役立つ
活性剤は、細胞を溶菌し、融合生成物を臭化シアンによ
り切断することにより、調製された。略説からは、得ら
れた生成物が、ヒルヂン配列を有するか否かが、明らか
にならなく、とにかく、合成された量についても明らか
にならない。
【０００９】ドイツ特許明細書第３,５２６,９９５号に
よると、ｔａｃプロモーターの転写コントロールの下
に、ＩＰＴＧ導入と大腸菌により、融合タンパク質は、
トリプトファン構造遺伝子の領域と、ベクターＤＮＡ中
にあるヒルヂン或いはプロインシュリン ヌクレオチド
配列を用いることにより、製造できた。生成物の単離及
び同定についてのデータは記載されていない。ドイツ特
許明細書第３,５４１,８５６号において、インタ−ロイ
キン−２とヒルヂン類を含有する融合タンパク質が、ラ
ック抑制遺伝子を用いて、製造されることを開示してい
る。方法の再現性と効率は、この特許から暗示できな
く、それは、生成物の単離と同定についてデータがない
からである。ドイツ特許明細書第３,６３６,９０３号
は、大腸菌による、ｌａｃ及びｔａｃプロモーターの調
節の下で、インタ−ロイキン−２、コロニ−刺激因子及
びヒルヂン融合タンパク質の製造を開示した。生成物の
存在は、適当な抗体を用いて、ウエスタ−ン−ブロッチ
ングで確認された。データが欠乏しているために、この
方法の効率及び適用性は説明されできない。
【００１０】ヨーロッパ特許明細書第２８６,９５６号
の発明者は、β−ガラクトシダ−ゼ、プロインシュリ
ン、インタ−ロイキン、カルシトニン及びヒルヂン ペ
プチドから、大腸菌細胞、ｐＵＣ、ｐＢＲ及びｐＷタイ
プ プラスミド及びｌａｃプロモーターを用いて、融合
タンパク質を製造する目的であった。処理方法の詳細或
いは製造の実施例をいずれも説明していない。公開され
たＰＴＣ出願Ｎｏ．ＷＯ／１３５６０は、例えば、組織
活性化ペプチド及びヒルヂン或いはアルミニンＢ１を有
する融合タンパク質の製造に関する。この方法では、大
腸菌及びｐＮＰ6プラスミドを用いる。公開されたＰＴ
Ｃ出願Ｎｏ．ＷＯ／１３５６０に従うと、前記の大腸菌
及びｐＮＰ6プラスミド、Ｅ１コルシン プロモーター
及びｌｅｘ ａ オペライタ−は、大腸菌によりヒルヂ
ン含有の他の融合タンパク質の間で製造するために用い
られる。ＨＰＬＣ分析に従って、既知の方法を用いて、
ヒルヂン純度は、９５％であったが、製造の効率データ
も培養物中のヒルヂンの定量も開示されていない。
【００１１】ドイツ特許明細書第３,９４２,５８０号で
は、タンパク質Ａ−ヒルヂン融合タンパク質の製造は、
大腸菌Ｎ．４８３０−１株で、既知のｐＲＩＴ及びｐＰ
ＲＩＴプラスミドを用いて行なう。ヨーロッパ特許明細
書第４１２,５２６号の発明者は、ポルシン アデニレ
イト キナ−ゼ−ヒルヂン融合タンパク質を大腸菌を用
いて製造する。形質発現ベクターを構成するため、トリ
プシン プロモーター構築をそのベクター中にする。遺
伝子工学の好適な対象物の１つは、サッカロマイセスで
ある。イ−ストの遺伝子学と生化学は、比較的知られ、
その形質発現／分泌システムは、早くに発達した。ヒル
ヂン製造は、サッカロマイセス細胞によりなされ得る。
ヨーロッパ特許明細書第１６８,３４２号（これは、ハ
ンガリ−特許明細書第２０２,２８８号に相当する）で
は、ヒルヂン製造方法が開示され、ＨＶ−１同類は、Ｐ
Ｈ０５プロモーターのコントロール下でサッカロマイセ
ス セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)により生
合成される。形質発現生成物は、培養物ブロス中に分泌
されなく、従って、、細胞は、生成物を調製するため
に、溶析されなければならない。生成されたヒルヂンの
量は、説明から分からなく、その推定される構造は、十
分に証明されていない。
【００１２】ＰＣＴ出願Ｎｏ．ＷＯ８６／０１２２４で
は、１０〜１５単位／ｍｌのヒルヂン活性を有する培養
物が、サッカロマイセス セレビシアエにより、ｐＴＧ
プラスミド類（フェロモン プロモーター）を用いて、
えられたが、一方、生成物は同定されなかった。フラン
ス特許明細書第２,６０７,５１７号（ハンガリ−特許明
細書第２０２,９１９号に相当する）の発明者は、多数
のｐＴＧプラスミド類を用いて、ヒルヂンＨＶ−２変異
型を製造した。形質発現の二官能性プラスミドにおい
て、ヒルヂン遺伝子が、フェロモン プロモーター及び
ＰＧＫターミナイター領域により形質発現された。α−
セックス フェロモンの単一配列は、生成物を細胞内空
間に分泌するのみ用いた。プラスミドは、ｐＢＲ３２２
及びロイシン２−ｄ遺伝子の大腸菌配列を有する。この
方法において、２０単位／ｍｌのヒルヂン活性は、培養
物中で製造された。そして、活性剤は、ポリアクリルア
ミド ゲル 電気泳動法により測定された。
【００１３】ヨーロッパ特許明細書第２２５,６３３号
は、サッカロマイセス セレビシアエ細胞を培養するこ
とによりヒルヂン変異型の製造を開示している。ＧＡＰ
ＤＨ及びＰＨ０５遺伝子のプロモーター配列及びそのハ
イブリッド及びトリプトファン配列が用いられた。生成
物の分泌は、ＰＨ０５或いは逆転信号ペプチド配列によ
り細胞内空間に向けられた。ＰＨ０５遺伝子のターミナ
イター領域は、転写ターミナイターとして用いたが、一
方、ＬＥＵ（ロイシン）２遺伝子が選択マーカーとして
用いられた。生成物の全アミノ酸配列が決められた。ヨ
ーロッパ特許明細書第２５２,８５４号の発明者は、更
にフランス特許明細書第２,６０７,５１７号から知られ
るｐＴＧ形質発現 プラスミドを製造した。この方法に
従って、４〜９単位／ｍｌのヒルヂン活性が、サッカロ
マイセス セレビシアエ株の培養物中で得られた。活性
化合物は同定されなかった、そして、その構造は分析さ
れていなかった。ヨーロッパ特許明細書第３４０,１７
０号の発明者は、全ての２ミクロンの配列を有するプラ
スミドを用いて、サッカロマイセス セレビシアエ細胞
を培養した。単一配列のためのＰＨ０５配列及びプロモ
ーターのためのＧＡＰＤＨ或いはＰＨ０５配列を用い
た。培養物ブロスから単離されたヒルヂンの１つは、Ｈ
Ｖ−１と同じであったが、他のものは、そのＣ−末端上
を損傷されていた。
【００１４】ヨーロッパ特許明細書第３４１,２１５号
によると、ヒルヂンが、カルボキシペプチド活性のない
サッカロマイセス セレビシアエ株により製造された。
この方法の本質は、前記のヨーロッパ特許明細書第３４
０,１７０号中に開示されたＤＮＡ構造が、ｙｓｃペプ
タ−ゼ製造のないサッカロマイセス株中で発現される。
発明者は、Ｃ−末端の損傷されたヒルヂンの形成が抑制
できる逆転相ＨＰＬＣにより証明した。生成物の単離及
び同定については情報はない。ヨーロッパ特許明細書第
３９０,６７６号の発明者は、その方法により低減でき
たタンパク質加水分解機能で損傷したサッカロマイセス
セレビシアエ株を選択を行なった。この株により、ヒ
ルヂンＨＶ−２が、この方法により低減できたタンパク
質加水分解劣化により製造された。
【００１５】ＰＣＴ出願ＮＯ．ＷＯ９０／１３６４６に
従うと、信号ペプチドをコード化するＤＮＡ配列が、上
記に開示されたプラスミド中に挿入された。そのプラス
ミドを有するサッカロマイセス セレビシアエ細胞培養
物は、４０〜１３０単位／ｍｌのヒルヂン活性を製造し
た。ヒルヂンＨＶ−２は、ＨＰＬＣ分析及びＮ−末端ア
ミノ酸分析により同定された。公開されたＰＣＴ出願Ｎ
ｏ．ＷＯ９１／０９１３５は、他に、サッカロマイセス
セレビシアエ細胞によりヒルヂン製造及びヒルヂン含
有融合タンパク質を開示している。この方法で用いたｐ
ＳＷ６形質発現ベクターは、ロイシン−２遺伝子、α−
因子プレプロ−ペプチド遺伝子、ｇａｌ及びＰＧＫプロ
モーター、及びＰＧＫターミナイター領域を有する。こ
の方法を用いて、１００〜１５０単位／ｍｌのヒルヂン
活性を示す培養物が得られた。
【００１６】ヨーロッパ特許明細書第４３５,７７６号
によると、ヒルヂンＨＶ−２が、人工的に構築されたＧ
ＡＬ７及びＡＤＨ２プロモーターを用いて、サッカロマ
イセス セレビシアエ細胞中に形質発現された。生成さ
れたが同定されていないヒルヂンの量は、５単位／ｍｌ
であった。ヨーロッパ特許明細書第３９６,４３６号
は、更に、サッカロマイセス セレビシアエ細胞によ
り、ｙｓｃＦプロテア−ゼのコード化遺伝子をイ−スト
のゲノム及び形質発現プラスミド中に挿入することによ
り、ヒルヂンＨＶ−２の形質発現を実現した。単位／Ａ
６００（６００ｎｍでの培養物の吸光度）でのヒルヂン
ＨＶ−２の濃度は、２３〜７４であった。生成物は同定
されていなかった。ヨーロッパ特許明細書第２７３,８
００号の発明者は、ＨＶ−２変異型の構成のために従来
説明されたサッカロマイセス プラスミド ベクターを
使用した。同じ目的が、ヨーロッパ特許明細書第３２
４,７１２号及び第３３２,５２３号にあった。ヒルヂン
形質発現の実験は、大腸菌及びサッカロマイセス細胞で
のみならず、バチルス ズブチリス(Bacillus subtili
s)(ヨーロッパ特許明細書第４０２,１５９号）及びバチ
ルス アミロリキュファシエンス(Bacillus amylolique
faciens)(ヨーロッパ特許明細書第４０２,１５９号）、
昆虫[L.Benatti等の,Gene 101,255〜260(1991)]及び哺
乳動物細胞[フランス特許明細書第2,611,723号]により
行なわれる。アミノ酸配列を変異したＨＶ−１は、バチ
ルス細胞により、合成分泌配列の助けにより、そして、
天然プロテア−ゼ プロモーターの転写調節の下で、製
造された。
【００１７】ヒルヂン形質発現は、ストレプトマイセス
細胞[E.Bender等のAppl.Microbiol.Biotechnol.34,203
〜207(1990)]中で達成されたたった１つの例があった。
テンダミスタット アミラ−ゼ 抑制剤並びに融合プロ
モーターの信号配列を用いて、発明者は、大腸菌コロン
用途上に基づいた合成ヒルヂン構造遺伝子の形質発現を
行なった。その培養物中で、ヒルヂン様の分子は、免疫
学的なブロッテイングにより検出されたが、そのヒルヂ
ン活性は、標準ヒルヂンの２０倍のみであった。この発
見に基づいて、合成され、分泌された剤は、最終的に劣
化されたヒルヂン様のペプチドであったと結論された。
現在の技術の概要から、多くの者が、ヒルヂンＨＶ−１
及びＨＶ−２及びその変異型を製造しようとしている。
ターゲット化合物の形質発現及び分泌に関して、ＤＮＡ
ベクター及び調節配列を用いる。
【００１８】形質発現レベルは、ほとんどの場合、実験
的に開発された方法のほとんどの場合、低いと結論でき
る。更に、すべてにわたり、発明者は、ターゲット化合
物のみならず、そのＮ−或いはＣ−末端（前記のもの
も、血栓症を遮断できる）で損傷された分子を測定し
て、ヒルヂン量を決める方法を用いる。ほとんどの特許
で、形質発現化合物は、純粋形に単離されていなく、収
率に関するデータは公開されていなく、生成物のアミノ
酸配列が分析されていなく、純粋の生成物は各々特徴ず
けられていなく、従って、形質発現及び形質発現システ
ムの効果性である培養物中のヒルヂン濃度を実際にのべ
ることができない。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の問題
点を解決するためになされたものである。最も知られる
処理方法の効率を、入手できたデータに基づいて、新規
な方法とは各々比較できなく、これらの方法での偶然の
再現性は、ある場合では、説明が機械的であり、出発株
やＤＮＡの評価性を説明しないので、困難になり得る。
本発明は、２つのヒルヂン型：即ち、変異型ＨＶ−１
３３ＡＳＰ及びＨＶ−１ ３３ＡＳＮを、組替え体技術
により生産する新規な方法を提供することを目的にあ
る。
【００２０】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記の技術的
な課題の解決のために、成されたもので、デスルファト
ヒルヂン ＨＶ−１ ３３ ＡＳＰ及びデスルファトヒ
ルヂン ＨＶ−１ ３３ ＡＳＮ ペプチドを製造する
方法において、ａ）バチルス サーキュランス(Bacillu
s circulans)α−アミラ−ゼ及び大腸菌中の信号配列か
ら誘導されたプロモーターのヌクレオチド配列のコント
ロール下で、或いは、ｂ）λ−ファージの右腕上にあ
り、２つのアミノ酸配列を順次そして独立に単一メッセ
ンジャ−ＲＮＡから翻訳するＰＲプロモーターのコント
ロール下で、或いは、大腸菌細胞中の融合蛋白質とし
て、或いは、ｃ）合成ヌクレオチド配列：・・・5’-TC
A TTCGTT CAA GGT GTA TCT TTG GAT AAG AGA-3’(この
配列はエンドペプチダ−ゼのための分泌及び切断の部位
を確保するための信号ペプチド及びアミノ酸配列のため
の解読するものである）を用いて、プラスミド ベクタ
ーＤＮＡの形質発現及び安定性のレベルを決めるために
ＵＲＡ３及びロイシン２−ｄ遺伝子を使用し、前記のプ
ラスミド中の形質発現／分泌のカセットを、サッカロマ
イセス バヤヌス(Saccharomyces bayanus)及びサッカ
ロマイセス セレビシアエ(Saccharomycescerevisiae)
により、適用して、ｐＸプロモーター、ＵＡＳ転写活性
化配列、開始 及び終了コドンのコントロール下で、
ｄ）バチルス サーキュランス(Bacillus circulans)α
−アミラ−ゼのプロモーター、信号及び調節のヌクレオ
チド配列のコントロールの下で、或いは、ストレプトマ
イセスから誘導されたネオマイシンＲ遺伝子のプロモー
ターのコントロール下で、ストレプトマイセス細胞中
で、複製するに適する形質発現／分泌のＤＮＡベクター
中で、生体内の合成の信号配列のコントロール下で、微
生物のコドン用途に基づいて、生体内で合成された前記
ヒルヂンＨＶ−１ペプチドのためのヌクレオチド配列コ
ードを発現することにより、適正な培養条件下で、前記
の要素を有するプラスミドの変換した後に、前記微生物
を培養し、次に、細胞外で集積され、或いは融合蛋白質
の形で生成されたヒルヂンを分離することにより、前記
ヒルヂンＨＶ−１ペプチドを生体合成することを特徴と
する前記製法を提供する。
【００２１】そして、大腸菌及びサッカロマイセス細胞
中で用いるデスルファトヒルヂンＨＶ−１変異型のヌク
レオチド配列コードは、次の式； GTT GTT TAC ACC GAC TGT ACC GAA TCT GGT CAA AAC TTG TGT TTA TGT GAA GGT TCT AAC GTC TGC GGT CAG GGT AAC AAG TGT ATC TTG GGT TCT RAC GGT GAA AAA AAT CAA TGT GTC ACT GGC GAA GGT TTA CCA AAG CCA CAA TCC CAC AAC GAT GGT GAC TTC GAG GAA ATT CCT GAA GAA TAC CTA CAA を有するものが好適である。また、工程１ｄにおいて、 GTT GTT TAC ACC GAC TGT ACC GAA AGC GGT CAG AAC CTC TGC CTG TGC GAG GGC TCG AAC GTC TGC GGA CAG GGG AAT AAG TGC ATC CTT GGA TCG GAC GGA GAG AAG AAT CAG TGC GTA ACC GGC GAG GGG ACA CCA AAG CCC CAA TCC CAC AAC GAC GGC GAT TTC GAG GAG ATA CCC GAG GAA TAC CTG CAA の式を有するデスルファヒルヂン ＨＶ−１変異型が作
られ、使用するヌクレオチド配列コード化分泌信号配列
は、次式： ATG ATC CTC AAG ACC TTC CCG AAG TTC CTG GCT GCG GTC CTT GCT CTC TCA CTG ACG GCG GCA CTC CCC CCA CTG TTC CCG GCC を有することが好適である。ベクターＤＮＡのｐＵＣ１
９：Ｈ１６、ｐＵＮ１２１：Ｈ１６及び大腸菌細胞の誘
導体を変換のために用い得る。デスルファトヒルヂン
ＨＶ−１変異型の形質発現は、プラスミドを用いて、シ
ングルｍＲＮＡが、λ−ファージ左腕の熱誘導プロモー
ターの制御下で転写され、ヒルヂン変異型が、欠失β−
ガラクトシダ−ゼ配列、即ち、前記の配列で読み取るフ
レ−ムでの２つの停止コドン、バチルス サーキュラン
ス(Bacillus circulans)α−アミラ−ゼ遺伝子、リボゾ
−ム結合部位、α−アミラ−ゼ信号配列及びヒルヂン構
造遺伝子を有するヌクレオチド配列により規定されたｍ
ＲＮＡから翻訳され、或いは、デスルファトヒルヂン
ＨＶ−１変異型及びβ−ガラクトシダ−ゼの完全或いは
欠失配列は、アミノ酸配列がメチオニンにより結合され
るような方法で、翻訳され、ＰＲプロモーターの転写コ
ントロール下で行なわれるとよい。次のプラスミド：即
ち、ｐＥＸ１：：Ｈ１６ デルタＥｃｏＲＶ、ｐＥＸ
１：：ＢＨＡｓｐｆｐ或いはｐＥＸ１：：ＢＨ２２１Ａ
ｓｎデルタＥｃｏＲＶ−ＳｍａＩ及びその誘導体を、ベ
クターＤＮＡとして用いるとよい。サッカロマイセス
ベクターＤＮＡは、ｅｂ１、ｅｂ２或いはｅｂ６形質発
現の分泌カセットを有するとよい。また、前記株は、サ
ッカロマイセス セレビシアエ(Saccharomyces cerevis
iae)GYOK1(M)[NCAIM (P)Y 1156]及び(M)5[NCAIM (P)Y 1
157]或いはサッカロマイセス バヤヌス(Saccharomyces
bayanus)BO-74[NCAIM (P)Y1158]であるのが好適であ
る。更に、次のプラスミド：即ち、ｐＭＩＡＭＨＩＲ
３／Ａ、ｐＭデルタネオ、ｐＭＩ−Ｋ２デルタネオ或い
はｐＧＹＯＫＩ１：：ＮＳＨ１６をベクターＤＮＡとし
て用いるのが好適である。
【００２２】デスルファトヒルヂン ＨＶ−１変異型を
発現する該サッカロマイセス株を、ロイシン含有媒体中
に維持し、主培養物ブロスをウラシルで抑制しながら、
予備培養するとよい。ｐＵＣ１９：Ｈ１６プラスミド及
びその大腸菌形質転換体、ｐＵＮ１２１：Ｈ１６プラス
ミド及びその大腸菌形質転換体、ｐＥＸ１：Ｈ１６デル
タＥcoＲＶプラスミド及びその大腸菌形質転換体、ｐＥ
Ｘ１：ＢＨＡａｐｆｐプラスミド及びその大腸菌形質転
換体、ｐＥＸ１：ＢＨ２２１アスプデルタＥｃｏＲＶ−
ＳｍａＩプラスミド及びその大腸菌形質転換体、ｅｂ
１、ｅｂ２或いはｅｂ６の形質発現／分泌カセットのヌ
クレオチド配列を有し、サッカロマイセス細胞がこれら
のプラスミドで変換されるプラスミドがよい。また、ｐ
ＭＩＡＭＨＩＲ３／Ａプラスミド及びそのストレプトマ
イセス形質転換体、ｐＭＩデルタネオプラスミド及びそ
のストレプトマイセス形質転換体、ｐＭＩ−Ｋ２デルタ
ネオプラスミド及びそのストレプトマイセス形質転換
体、ｐＧＹＯＫＩ１：ＮＳＨ１６プラスミド及びそのス
トレプトマイセス形質転換体が有用である。
【００２３】
【作用】本発明は、α−アミラ−ゼ プロモーター及び
バチルス サーキュランス(Bacillus circulans)のクロ
モソマルＤＮＡから分離された信号配列（その配列は決
められた）のコントロール下で、安定なヒルヂン生産
が、大腸菌細胞により成され得ることを認識したことに
基づいている。同様に、多量のヒルヂンが、２つのペプ
チドの翻訳を決める信号メッセンジャ−ＲＮＡ上に試験
管中で作った本発明の人造のオペロンを用いて、大腸菌
中で、得ることができる。
【００２４】ヒルヂン−欠失β−ガラクトシダーゼ融合
タンパク質を、λ−ファージＰＲプロモーターの転写調
節の下で、製造することに成功した。本発明により同定
された新規なｐＸプロモーターの翻訳調節の下に、サッ
カロマイセス細胞の培養物ブロス中でヒルヂンＨＶ−１
を製造するに成功した。そして、ＵＡＳ転写活性配列の
コントロール下で、開始及び終端のコドンを適用し、エ
ンドペプチダ−ゼのための切断位を確保する信号ペプチ
ド及びアミノ酸配列を用いて、ｒｅｇ１及びゴ−ル(gal
l)変異型を有する株での安定性を決めるＵＲＡ３及びロ
イシン２−ｄ遺伝子を有するＤＮＡプラスミドでの形質
発現レベルを決める形質発現／分泌カセットを用いて、
ヒルヂンＨＶ−１の製造に成功した。
【００２５】ＵＲＡ３及びロイシン２−ｄ遺伝子を利用
して、コピ−数を調節するに成功した。これに基づい
て、各々ヒルヂン並びにプラスミド安定性の再現に成功
した。特に、良好な培養技術は、ｒｅｇ１突然変異を有
する株中のガラクト−ス誘導ＵＡＳ領域により、−この
突然変異の存在下で達成できる。ＵＡＳ領域は、抑制的
でなく、−そして、ゴ−ル(gall)突然変異が、培養物ブ
ロスからのガラクト−スインジュ−サの消費を遮断して
いる。本発明者は、スケ−ルアップ方法で、そして、サ
ッカロマイセス バヤヌス中でのプラスミドの安定性
で、生じる困難点を克服できた。安定なヒルヂンＨＶ−
１形質発現及び分泌は、最初に、工業的培養に知られる
ストレプトマイセス細胞により、ストレプトマイセス
コドン用途に基づいて設計した合成ヌクレオチド配列を
持つ新規な形質発現／分泌ＤＮＡベクターを用いて、達
成された。
【００２６】本発明の製法により、スケ−ルアップに適
するヒルヂンＨＶ−１の再現性ある製造は、大腸菌、サ
ッカロマイセス及びストレプトマイセス株により達成さ
れ、最も高いヒルヂンＨＶ−１製造レベルは、約１４０
〜１８０ｍｇ／ｌ培養物にある。ヒルヂンＨＶ−１ペプ
チドは、純粋形に単離されて、全アミノ酸配列が決めら
れた。
【００２７】上記に基づいて、本発明は、デスルファト
ヒルヂン ＨＶ−１ ３３ＡＳＰ及びデスルファトヒル
ヂン ＨＶ−１ ３３ＡＳＮペプチドを製造する方法に
関し、その方法は、微生物のコドン使用に基づいて試験
管内で合成したヒルヂンＨＶ−１ペプチドを解読するヌ
クレオチド配列を発現することにより、前記のヒルヂン
ＨＶ−１ペプチドを合成する工程よりなる；次の条件で
行なう：即ち； ａ）バチルス サーキュランス(Bacillus circulans)α
−アミラ−ゼ遺伝子及び大腸菌中の信号配列から引き出
されたプロモーターのヌクレオチド配列のコントロール
下で、或いは、 ｂ）λ−ファージの右腕上にあり、１つのオペロンか
ら、２つのアミノ酸配列を順次そして独立に単一メッセ
ンジャ−ＲＮＡから翻訳するＰＲプロモーターのコント
ロール下で、或いは、大腸菌細胞中の融合蛋白質とし
て、或いは、 ｃ）合成ヌクレオチド配列：・・・5’-TCA TTC GTT CA
A GGT GTA TCT TTG GAT AAG AGA-3’(この配列はエンド
ペプチダ−ゼのための分泌及び切断の部位を確保するた
めの信号ペプチド及びアミノ酸配列を解読するものであ
る）を用いて、プラスミド ベクターＤＮＡの形質発現
及び安定性のレベルを決めるためにＵＲＡ３及びロイシ
ン２−ｄ遺伝子を使用し、前記のプラスミド中の形質発
現／分泌のカセットを、サッカロマイセス バヤヌス(S
accharomyces bayanus)及びサッカ ロマイセス セレビ
シアエ(Saccharomyces cerevisiae)により、適用して、
ｐＸプロモーター、ＵＡＳ転写活性化配列、開始及び終
了コドンのコントロール下で、 ｄ）バチルス サーキュランス(Bacillus circulans)α
−アミラ−ゼのプロモーター、信号及び調節のヌクレオ
チド配列のコントロールの下で、或いは、ストレプトマ
イセスから誘導されたネオマイシンＲ遺伝子のプロモー
ターのコントロール下で、ストレプトマイセス細胞中
で、複製するに適する形質発現／分泌のＤＮＡベクター
中で、生体内の合成の信号配列のコントロール下で、そ
して、上記の微生物を、前記の要素を有するプラスミド
の転換した後に、適当な培養条件下で、培養し、次い
で、ヒルヂンを細胞外に蓄積した或いは融合蛋白質の形
で製造したヒルヂンを分離することによるなる。
【００２８】実施例内で、大腸菌、サッカロマイセス及
びストレプトマイセス微生物により２つの形の製造を説
明する。用いた形質発現／分泌システム及び前記微生物
のコドン用途に基づいて設計された構造遺伝子を解読す
るヌクレオチド配列は、新規である。
【００２９】用途微生物と競合し、そして、ヒルヂンＨ
Ｖ−１のアミノ酸配列を決めるヌクレオチド配列の部分
は、必要な限定位置及び停止コドンを解読しており、実
施例１に説明する方法により、合成された。
【００３０】図１及び図２は、ヒルヂンＨＶ−１のアミ
ノ酸及びヌクレオチド配列を示す。そして、アスパルチ
ン酸及びアスパラギン酸は、３３位で、Ａｓｘによりマ
ーカーされ、Ｒは、アデニン或いはグアニンを意味し、
Ｚは、シトシン或いはチミンを意味する。
【００３１】図３は、ｐＵＣ１９プラスミド（ニュ−イ
ングランド ビオラブ．インク．カナダ）にヌクレオチ
ド配列分析により評価された構造遺伝子の挿入を示す。
評価数は、大腸菌JM 109(pUC19::H207 Asp)[NCAIM (P)B
1171]及び(pUC19::H221 Asn) [NCAIM (P)B 1175]であ
る。
【００３２】従って、、ヒルヂンを発現するために、前
記の配列は、大腸菌、サッカロマイセス及びストレプト
マイセスが操作的に調節配列に欠失する形質発現／分泌
ＤＮＡベクター中に配位子結合された。
【００３３】大腸菌コドン用途に基づいて設計された構
造遺伝子を発現するために、全ＤＮＡを、バチルス サ
ーキュランス(Bacillus circulans)［ＧＹＯＫｂ−２４
３、受託番号/NCAIM (P)B 1159]から,実施例２の方法に
より、製造した。従って、ＤＮＡ遺伝子バンクが、ｐＧ
Ｙ９７プラスミド［大腸菌 ｐＧＹ９７,NCAIM (P)B358
/]を用いて製造された（ハンガリ−特許明細書第２０
４,８９２号参照）。図４は、ｐＧＹ９７プラスミド
ベクターの図式的な表示である。バチルスサーキュラン
ス(Bacillus circulans)のプロモーターのインビトロフ
ァージ充填を行ない、α−アミラーゼ構造遺伝子及びそ
の信号配列が、ｐＧＹＯＫＩプラスミド上で同定され
た。図５は、大腸菌細胞中でα−アミラーゼ遺伝子を運
ぶファージ プラグの出現を示している。
【００３４】図６及び７は、ヒルヂンを再クローン化し
変換するために用いる処理法を図式的に示すものであ
る。図８は、Ｈ１６と示されるべき形質発現／分泌カセ
ットのヌクレオチド配列を示す。図９、１０及び１１
は、各々大腸菌GY 1095(pUN121)/NCAIM (P)B 1163/及び
大腸菌1095 /NCAIM (P)B 1162/]のpUC19或いはpUN121中
のヒルヂンの合成配列に対する読み取りフレ−ム中に結
合するα−アミラーゼ プロモーター及び信号配列の位
置を示す。大腸菌細胞は、アミラーゼ−ヒルヂン（Ｈ１
６）形質発現／分泌カセットを有するプラスミドで形質
転換された。ヒルヂン製造は、実施例で詳細される方法
により決められ、安定した高いヒルヂン活性を有する株
を実験室培養で選択した。［株は、大腸菌ＪＭ１０９
（pUC19::H16及びpUN121::H16)/NCAIM (P)B 1170及びNC
AIM (P)B 1176/]を寄託した]。ヒルヂン活性ペプチドを
調製し、精製し、ＨＰＬＣ及びアミノ酸配列を、デスル
ファトヒルヂン ＨＶ−１と同定する。
【００３５】人工的オペロンは、大腸菌中でヒルヂンを
製造するために構成された。ヒルヂンをコード化する構
造遺伝子を、Ｍ１３ｍｐ１８ファージ（New England Bi
olobs. Inc. カナダ）中に実施例４により、挿入し、そ
して、ｐＥＸ１プラスミド(Boehringer Mannheim Bioch
emica GmbH.)中に挿入し、β−ガラクトシダーゼ構造遺
伝子のＣ−末端にした（図１１参照）。この構成におい
て、β−ガラクトシダーゼを、λ−ファージのＰＲプロ
モーターから転写され、一方、ヒルヂンは、α−アミラ
ーゼ遺伝子のプロモーターから転写される。フラグメン
トは、β−ガラクトシダーゼのヌクレオチド配列から、
ＥｃｏＲＶ消化により切断された。このフラグメント
は、β−ガラクトシダーゼ配列のＣ−末端エンド及びア
ミラーゼプロモーターを有する。残りの配列は、β−ガ
ラクトシダーゼのＮ−末端エンド、バチルス サーキュ
ランスα−アミラーゼの非翻訳配列（ＮＴ）、ヒルヂン
構造遺伝子（Ｈｉｒ）、Ｈｉｒの上流にあるリゾボ−ム
結合位置（ＳＤ）及びλ−ファージの熱誘導のプロモー
ターによる人工的オペロンを有する。このオペロンは、
１つのｍＲＮＡのみを転写し、翻訳中では、ヒルヂン及
び欠失β−ガラクトシダーゼが生合成される。ヒルヂン
ＨＶ−１は、単離され、実施例での方法を用いて、前記
の構成により形質転換された熱誘導大腸菌培養物から単
離された。更に、ヒルヂンは、ＨＰＣＬ分析及び／或い
はアミノ酸配列分析により同定された。前記の大腸菌 p
op 2136(pEX1::H16デルタEcoRV)株を寄託した[寄託番号;N
CAIM (P)B 1165]。
【００３６】β−ガラクトシダーゼ−ヒルヂン融合タン
パク質を構成するために、実施例５に説明される方法に
より、ヒルヂン構造遺伝子を単離した。次に、Ｍ１３ｍ
ｐ１８及びブル−スクリプト（ストラタジ−ン;Stratag
ene)ベクター中にサブクローン化され（図１２）そし
て、β−ガラクトシダーゼ（図１３）のＣ−末端をコー
ドするヌクレオチド配列した後すぐにの位置に、フレ−
ム読み取りでのｐＥＸ１プラスミド中に挿入した。この
ように得られた融合タンパク質は、λ−ファージの熱誘
導で、強いＰＲプロモーターの転写コントロール下で、
生合成された。大腸菌pop 2136[NCAIM (P)B 1161]細胞
中でcI ts 温度敏感抑制剤のコントロール下で製造され
るヒルヂンの量を上げるために、β−ガラクトシダーゼ
のヌクレオチド配列をＰｖｕII,SmaI及びEcoRV制限酵素
により欠失された。前記の構成は、大腸菌pop 2136株中
で形質転換され、細胞を熱誘導され、生成物は、ポリア
ルリルアミド ゲル電気泳動により分析された。この分
析法によると、前記融合タンパク質は、期待のように長
い。臭化シアンにより切断された後、ヒルヂンＨＶ−１
をＨＰＬＣ及びアミノ配列分析により開放し、分析され
た。
【００３７】大腸菌pop2136(pEX1::BH 207 Aspfp)及び
大腸菌pop 2136(pEX1::BH221 AsnデルタEcoRV-SmaI)株の
寄託番号は、各々、[NCAIM (P)B 1169]及び[NCAIM (P)B
1177]である。
【００３８】上記の簡単な観察から、また、実施例か
ら、使用構造遺伝子、コントロール配列及び形質発現／
分泌システムに関して、大腸菌中で組替え体デスルファ
トヒルヂン ＨＶ−１変異型を製造する本方法は、新規
であることが明らかにした。及びバチルス サーキュラ
ンスα−アミラーゼ遺伝子のプロモーター及び信号配列
及び、ｐＥＸ１プラスミド中に形成されるべき人工的オ
ペロン及び融合タンパク質の解読のヌクレオチド配列を
用いて、本発明者は、単離し、精製し、そしてアミノ酸
配列分析した後に、ヒルヂンＨＶ−１と証明された生成
物を多量に得た。
【００３９】実施例６に詳細に説明される実験を行なっ
て、サッカロマイセス細胞中に組替え体デスルファトヒ
ルヂン ＨＶ−１変異型を作成した。サッカロマイセス
コロン用途に設計され、必要な粘着性末端を有する構
造遺伝子が、ＹｐＧＹＯＫ１及びＹｐＧＹＯＫ２の形質
発現及び分泌プラスミドＤＮＡ中に挿入された［大腸菌
MC1061(YpGYOK1)/NCAIM (P)B 1166/及び大腸菌MC1061
(YpGYOK2)/NCAIM (P)B1167/]。
【００４０】上記のプラスミドは、プラスミドＤＮＡ
ｐＪＤＢ（ベッグス、Melec. Genetics in Yeast, Alfr
ed Benzon Symposium,18巻,383〜390,1981,寄託番号[NC
AIM(P)B 1184/],G2[Guarente, Methods in Enzymology,
101,181〜191,1983,寄託番号/NCAIM (P)B 1182/]及び
ブル−スクリプト（ストラタジ−ン:Stratagene)から構
成された。ＹｇＧＹＯＫ１プラスミドは、ＵＡＳ（アッ
プストリ−ム 活性化配列）を有し、それは、ガラクト
−スにより誘導でき、グルコ−スにより抑制され、更
に、新規なｐＸプロモーターを単離し、本発明により配
列され、２ミクロンの内因性イースト プラスミド（Ｆ
ＬＰ遺伝子の終端領域を持つ）の一部である。また、こ
のプラスミドは、大腸菌複製オリジン、アンピシリン耐
性をコード化する遺伝子及びヘルパ−ファージの感染と
ともに前記プラスミドの単一ストランド形成に必要なバ
クテリオファージｆ1オリジンを含有している。更に、Y
pGYOK1のコピー数をコントロールするＵＲＡ３及びロイ
シン２−ｄ遺伝子を含有している。最終的に、それは、
イースト クリベロマイセス ラクチス(Kluyveromyces
lactis)のキラ−毒素遺伝子の信号配列をコード化する
フラグメントを含有する。
【００４１】図１４は、４８−ｍｅｒの合成ヌクレオチ
ド フラグメント（図１５）を用いて、インビトロの位
置特定のオリゴヌクレオチド媒介突然変異原した後に、
形質発現／分泌カセットの調節配列と読み取りフレ−ム
中の構造遺伝子を融合することにより、更に、イースト
エンドペプチドのための切断位置を作成することによ
り、合成ヒルヂン遺伝子を前記のプラスミド中に挿入し
たことを示す。そして、それにより、YEpGYOK1H形質発
現／分泌のプラスミドが最終的に得られた。
【００４２】異なる形質発現／分泌プラスミド システ
ムは、前記のプラスミドを用いて、実施例に説明の方法
により構成された。そして、図１６、１７、１９及び２
０に示される。合成ヒルヂン構造遺伝子は、YpGYOK2プ
ラスミド/NCAIM (P)B 1167/中に挿入された(図１９参
照）。このプラスミドは、２ミクロンのプラスミドの全
配列、大腸菌複製オリジン、アンピシリン耐性を解読す
る遺伝子、更に、前記プラスミドのコピー数の選択と調
節を確保するために、ＵＲＡ３及びロイシン２−ｄ遺伝
子を有する。YEpGYOK1eb1からのヒルヂン形質発現/分泌
カセットを、大腸菌MC1061(pGAPT)/NCAIM (P)B 1164か
らのGAPDH遺伝子をコード化するFLPターミナイター領域
及びターミナイター領域がなくて、前記のプラスミド中
に挿入された。この方法では、YEpGYOK2eb2形質発現/分
泌プラスミド(図２０参照）を得た。
【００４３】ヒルヂンをコード化する構造遺伝子を、Yp
GYOK1及びYpGYOK2プラスミド中に挿入し、プロモーター
とバチルス サーキュランスα−アミラーゼ（図１８、
１９）のコントロール下でヒルヂンを形質発現した。前
記の形質発現／分泌ベクター−理論的にサッカロマイセ
ス細胞中でヒルヂンＨＶ−１と仮定した−は、サッカロ
マイセス株中に形質転換された。
【００４４】サッカロマイセス セレビシアエ GYOKI
1、ｌｅｕ、ｕｒａ、ａｄｅ株は、ｃｉｒ+[GYOKI (M)1/
NCAIM (P)Y 1156],サッカロマイセス セレビシアエGYO
KI-5;leu,ura,gall,regl株は,cir+[GYOKI(M)5/NCAIM
(P)Y 1157/]であり、一方、サッカロマイセス バヤヌ
スGYOKI-1139;leu株は,ciro[GYOKI BO-74/NCAIM (P)Y 1
158/]である。ｃｉｒ+株は、内因性プラスミドを含有す
るが、一方、ｃｉｒoはそうでない。ＧＹＯＫＩ−５株
のゲノムにおいて、炭素源として、ガラクト−ス利用に
役立つｇａｌｌ遺伝子は、損傷され、従って、その細胞
は、ガラクト−スを代謝することが不可能である。
【００４５】ヒルヂン製造をスクリーンした後、次の株
を寄託した；サッカロマイセス セレビシアエ(Sacchar
omyces cerevisiae)K25/2 (YEpGYOK1eb2)[NCAIM (P)Y 1
172],サッカロマイセス バヤヌス(Saccharomyces baya
nus)K9(YEpGYOK2eb2)[NCAIM(P)Y 1173],サッカロマイセ
ス セレビシアエ K25/4 (YEpGYOK2eb2)[NCAIM (P)Y117
4]及びサッカロマイセス セレビシアエ K/34 (YEpGYOK
1eb1)[NCAIM (P)Y 1187]。
【００４６】上記の簡単な概略から、そして、詳細な実
施例から、サッカロマイセス細胞により、組替え体デス
ルファトヒルヂン ＨＶ−１を製造する本方法は、新規
であり、構造遺伝子、調節配列、全体的に、形質発現／
分泌システムそして、株について、新規であることが明
らかにされる。
【００４７】構成システム中の前記のヌクレオチド配列
を用いて、高い量で、そして、１００μｇ／ｍｌ以上濃
度で、培養物を得ることができる。単離し、精製した
後、生成物は、適当なＨＶ−１アミノ酸配列を有すると
証明された。
【００４８】ストレプトマイセス細胞によりデスルファ
トヒルヂン ＨＶ−１を製造するために、大腸菌及びサ
ッカロマイセス形質発現／分泌ベクターを作成するに使
用するバチルス サーキュランスα−アミラーゼ プロ
モーター及び信号細胞のコントロールの下で、作用する
カセットを、ストレプトマイセス−大腸菌の二官能性ベ
クター中に、実施例７に説明される方法によりクローン
化された。次いで、ストレプトマイセス リビダンス細
胞[NCAIM (P)B 257]中に形質転換した。これらの構成に
おいて、合成ヒルヂンＨＶ−１遺伝子は、α−アミラー
ゼ プロモーター或いはネオマイシン トランスフェラ
−ゼ遺伝子及び転写ターミナイターの調節下で行なわれ
る。ストレプトマイセス細胞中のα−アミラーゼ信号配
列の適当な作用は、ストレプトマイセス プラスミド中
のバチルス サ−キュランスから誘導されたα−アミラ
ーゼ 形質発現 分泌カセットを担持するストレプトマ
イセス リビダンス細胞の上澄液のα−アミラーゼ活性
を測定することによりチェックした。ｐＭＩ １．３、
ｐＭＩＡＭＨＩＲ３／Ａ、ｐネオＡＭＨＩＲ、ｐデルタ
ＡＭＨＩＲ、ｐＭＩデルタネオ、ｐＫＫデルタネオ及び
ｐＭＩ−Ｋ２デルタネオ組替え体プラスミドの制限及び
作用マップは、図２１〜２６に示される。その構成は、
実施例７に詳細に説明される。
【００４９】ストレプトマイセス リビダンス(Streptom
yces lividans)細胞は、前記の組替え体プラスミドで形
質転換された。その組替え体を培養し、次いで、培養物
のヒルヂン活性を測定した。培養物ブロスのヒルヂン活
性は、乏しいので、新規なデスルファトヒルヂン ＨＶ
−１構造遺伝子は、良好と考えるストレプトマイセスの
コドン用途に基づいて合成された。ヒルヂン活性を持つ
培養物が、この構成により製造された（実施例７）。新
規な遺伝子（図２参照）は、大腸菌JM109(pUC19::SH16)
[NCAIM (P)B 1182]の名で寄託された。前記の遺伝子
を、ストレプトマイセス細胞[NCAIM (P)B 1008及びNCAI
M (P)B 1009;ハンガリー特許明細書第１９７,０４５号
参照］をも複製することができるpGYOKI1及びpGYOKI1/2
ベクターＤＮＡ中に挿入した。挿入された遺伝子を含有
するpGYOKI::NSH16プラスミドは、大腸菌(pGYOKI::NSH1
6)[NCAIM(P)B 1186]として寄託した。
【００５０】このヒルヂンを生成する大腸菌−ストレプ
トマイセス シャットル プラスミド ベクター及び株
は、新規である。次の株を寄託した。即ち；大腸菌[pMI
AMHIR3/A /NCAIM (P)B 1181/],大腸菌MC1061 [pMIデルタネ
オ/NCAIM (P)B 1180/]及び大腸菌MC1061[pMI-Keデルタネオ/N
CAIM (P)B 1178/]である。前記プラスミドを有する大腸
菌、サッカロマイセス及びストレプトマイセス形質転換
体によりヒルヂン製造を、異なる培養環境下で、調査し
た（実施例８を詳細には参照）。ここで、多数の株及び
培養条件の差異のために、培地の詳細な説明は省略し
た。株の保持及び培養に対しては、培養物の単位量中で
できるだけ多くの生細胞の伝搬を確保する必要があり、
また、細胞中の所定のプラスミドを保持する必要があ
る。培地は、炭素及び窒素源の外に、無機塩、微量元
素、ビタミン及びインデユ−サ−を、使用株に各々依存
して、含有し得る。実施例８に定めた培地は、保護範囲
を限定するものでなく、炭素源は、グルコ−スのみなら
ず、例えば、サッカロ−ズ、澱粉、マルト−スも含み、
イ−スト抽出物の代わりに例えば、加水分解されるカゼ
イン或いはアミノ酸を用いることができるは、当業者に
容易に明らかであるからである。培養のためには、ガラ
クト−ス誘導ＵＡＳ配列を有するプラスミドを持つサッ
カロマイセス セレビシアエＧＹＯＫＩ（Ｍ）5株を使
用するのが有利である。それは、ｐＸプロモーターは、
ＵＡＳ配列のコントロール下であり、ＵＡＳは、グルコ
ースにより抑制されないので、前記の株のｒｅｇｌ突然
変異がある。他方、ｇａｌｌ（胆嚢）突然変異のあるた
めに、誘導因子として用いる強力なガラクト−スは、培
地の外に行かない。
【００５１】上記の認識は、株を保持し、転移するた
め、また、培養工程を設計するために、有利に適用でき
る。ＵＲＡ３及びロイシン２−ｄ遺伝子は、本発明の形
質発現／分泌プラスミドでの選択マーカーとして使用さ
れる。転換体が、ウラシル含有最小培地中で成長される
とき、１０〜１４日展開し、プラスミドのコピ−数は、
この細胞中で６０〜１００に達する。他方、ロイシン存
在下で選択を行なうと、コピ−数は、一般的に、１０〜
２０であり、形質転換体の展開は、非常に迅速で（５〜
６日）ある。同時に、細胞を、ロイシン存在下での液体
培地中で培養すると、元のプラスミドを含有し、ウラシ
ル存在下で、コピー数が大きいものとなる。ヒルヂン製
造は、変動し、そして、本発明の実験により、少なくと
も４つの異種のプラスミド誘導体が、細胞から単離でき
る。これは、ウラシル含有の培養物ブロスが、ヒルヂン
量を高くするのに有利に用いられることを意味する。そ
して、この理由は、プラスミドのコピー数が高くなるた
めであり、一方、ロイシン含有培地は、安定したプラス
ミド維持を確保し、培養物の第１段で適当であるもので
ある。
【００５２】実施例９の方法で調製された培養物の血液
凝固活性は、２種の血液試験、或いは、合成血栓症クロ
モジン サブストレ−トを用いて、測定された。これら
の方法は、予備スクリーンした後に、目的化合物、即
ち、ヒルヂン ＨＶ−１のみならず、Ｎ−或いはＣ−端
末損傷誘導体の活性を測定するので、選択された培養物
のヒルヂンＨＶ−１製造も、ＨＰＬＣ分析により測定さ
れた。ヒルヂンは、製造され、培養物培地から精製され
（実施例１０）、次いで、Ｎ−及びＣ−端末基分析によ
り、或いは、全アミノ酸配列の決定（実施例１１）によ
り同定された。
【００５３】本発明の製法により作られたデスルファト
ヒルヂン ＨＶ−１化合物は、生物学的活性に関して天
然ヒルヂンと等価である。従って、血栓症、血栓塞栓症
等の処置及び予防に、同様に適用できる。製剤学的製品
は、実施例１２に示すような方法を用いて、製造され、
単離されたデスルファトヒルヂン ＨＶ−１から調製で
きる。
【００５４】次の株は、本発明の方法に用いられ、ブタ
ペスト条約に従って、国立コレクション オブ アグリ
カルチャル エンド インダトリアル マイクロオルガ
ニズム（ＮＣＡＩＭ）に預けられている。 大腸菌pop2136(pEX1::H16 デルタEcoRV)NCAIM (P)B 001
165 大腸菌MC1061 (pGAOT) NCAIM (P)B 001164 大腸菌GY1095 (pUN121) NCAIM (P)B 001163 大腸菌GY1095 NCAIM (P)B 001162 大腸菌pop2136 NCAIM (P)B 001161 バチルス サーキュランス(Bacillus circulans) GYOKb
-243 NCAIM(P)B 001159 サッカロマイセス バヤヌス(Saccharomyces bayanus)l
eu GYOKI BO-74 NCAIM(P)B 001158 サッカロマイセス セレビシアエ(Saccharomyces cerev
isiae) gall, regl, ura3, leu GYOKI (M)Y NCAIM (P)
B 001157 サッカロマイセス セレビシアエ(Saccharomyces cerev
isiae) ade, leu, uraGYOKI (M)1 NCAIM (P)Y 001156 大腸菌 MC1061 (YpGYOK2) NCAIM (P)B 001167 大腸菌 MC1061 (YpGYOK1) NCAIM (P)B 001166 大腸菌pop2136(pEX1::BH207 Aspfp) NCAIM (P)B 001169 大腸菌 JM109 (pUC19::H16) NCAIM (P)B 001170 大腸菌 JM109 (pUC19::H207 Asp) NCAIM (P)B 001171 サッカロマイセス セレビシアエ(Saccharomyces cerev
isiae) K25/2 (YEpGYOKleb2) NCAIM (P)B 001172 サッカロマイセス セレビシアエ(Saccharomyces cerev
isiae) K25/4 (YEpGYOK2eb2) NCAIM (P)B 001174 サッカロマイセス バヤヌス(Saccharomyces bayanus)
K9 (YEpGYOK 2eb2) NCAIM (P)B 001173 大腸菌 JM109 (pUC19::H221 Asn) NCAIM (P)B 001175 大腸菌 JM109 (pUC121::H16) NCAIM (P)B 001176 大腸菌pop2136(pEX1::H221 AsnデルタEcoRV-SmaI)NCAIM
(P)B 001177 大腸菌 MC1061 (GYOKI-pG2) NCAIM (P)B 001183 大腸菌 MC1061 (pJDB207) NCAIM (P)B 001184 大腸菌 JM109 (pUC19::SH16) NCAIM (P)B 001182 大腸菌 MC1061 (GYOKI::NSH16) NCAIM (P)B 001179 ストレプトマイセス リビダンス(Streptomyces lividan
s) (pGYOKI1::NSH16)NCAIM (P)B 001186 大腸菌 (pMIAMHIR 3/A) NCAIM (P)B 001181 大腸菌 MC1061 (pMIK2 デルタNeo) NCAIM (P)B 001180 大腸菌 MC1061 (pMIK2 デルタNeo) NCAIM (P)B 001178 ストレプトマイセス リビダンス(Streptomyces lividan
s) pIJ 702 NCAIM (P)B001185 ストレプトマイセス リビダンス(Streptomyces lividan
s) NCAIM (P)B 000257大腸菌 K1400 pGY97 NCAIM
(P)B 000358 大腸菌 pGYOKI1 NCAIM (P)B 001008 大腸菌 pGYOKI1/2 NCAIM (P)B 001009 大腸菌 NM526 NCAIM (P)B 001006 大腸菌 K1400 NCAIM (P)B 000357 ストレプトマイセス テネブラリウス(Streptomyces ten
ebrarius) NCAIM (P)B000169 サッカロマイセス セレビシアエ(Saccharomyces cerev
isiae) K/34 (YEpGYOKlebl) NCAIM (P)B 00118
7
【００５５】ハンガリー特許第１９７,０４５号は、二
官能性ＤＮＡクローン化ベクターを作るためのそして、
その形質転換体を作るための方法を開示し、また、ハン
ガリー特許第２０４,８９２号は、ＤＮＡクローン化ベ
クターを作る方法を開示し、それ等及びジーンバンク
は、ここで参照とされるものである。
【００５６】次に、本発明の製法を具体的に実施例によ
り説明するが、本発明はそれらによって限定されるもの
ではない。％は、特に記しない限り、重量パ−セントに
よる。
【００５７】
【実施例１】 遺伝子コード化ヒルヂンの製造とクローン化 １．Ａ．ヒルヂン遺伝子のインビトロ合成 ヒルヂンＨＶ−１のイソ形は、大腸菌及びサッカロマイ
セス セレビシアエ結合コドン用途に基づいて設計され
た。設計されたヌクレオチド順序は、図１に示される。
遺伝子は、オリゴヌクレオチドから互いに結合され（図
２の矢印参照）、必要なオ−バラップの塩基対（１４−
２０ｂｐ）が設計された。オリゴヌクレオチドは、製造
者の指示に従うと、アプライド バイオシステム サイ
クロンＤＮＡ−合成機で、β−シアノエチル−ジイソプ
ロピル−フォフォルアミダイトモノマ−から化学的に合
成された。３３番目のアミノ酸混合マッチをコード化す
るトリプレットは、コドンの第１の塩基を結合する(III
において、フラグメントＡ＋Ｇ及びIVにおいて、フラグ
メントＴ＋Ｃ）に適用される。
【００５８】合成の最後において、得られた溶液の光学
密度は、２６０ｎｍで測定され、濃度は、次の式の助け
により計算された。ＯＤ２６０／計イプシロン−濃度
（モル／ｌ）。計イプシロンは、オリゴヌクレオチドで
見られるヌクレオチドのモル消光度の合計である。この
値は、個々のヌクレオチドには、次の通りである。Ａ：
１５．４×１０３ｌ／Ｍ；Ｃ；７．３×１０３ ｌ／
Ｍ；Ｇ：１１．７×１０３ｌ／Ｍ；Ｔ：８．８×１０３
ｌ／Ｍ。合成後、得られたデトリレイトされたオリゴ
ヌクレオチドを、垂直用意変質ポリアクリルアミド ゲ
ル電気泳動により、１０％のウレア中に精製した。ゲル
８４ｇのウレアを製造するために、１５むるの１０倍Ｔ
ＥＢバッファと５０ｍｌの４０％アクリルアミドとビス
アクリルアミド（１９：１の比率）を、蒸留水により２
００ｍｌに調節した。ウレアをその中に溶解し、次い
で、６００μｌの１０％アンモニウム パ−スルフェ−
ト（ＡＰＳ）と１４０μｌのＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テト
ラメチル−エチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ、シグマ、Ｕ
ＳＡ）を添加し、ゲルを、互いに２ｍｍの位置にある２
つのガラス板の間に注いだ。１０倍ＴＥＢバッファの組
成は、次の通りである：水中の、０．８９Ｍトリス塩
基、０．８９ ホウ酸と０．０２Ｍエチレンジアミンテ
トラ酢酸（ＥＤＴＡ）。３０分間の重合の後、ゲルを、
電気泳動装置中に置いた。１０μＭのオリゴヌクレオチ
ドを同量のフォルムアミド（バッファを入った：９５％
のフォルムアミド、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％の
ブロモフェノ−ル ブル−と０．０５％のキシレンシア
ノ−ル）と混合した。５分間沸騰させた後、ゲルのスラ
ブ中に入れた。ゲルは、ブロモフェノ−ル ブル−が、
その終端に達するまで、一定の出力で操作された。ガラ
ス板を除き、ゲルは、プラスチック ラップ上に置き、
関心のある最も高い密度帯を、背景として白色シ−トを
用いて、紫外線（ＵＶ、２６０ｎｍ）中で励起した。激
しく粉砕した後、ゲルを、１６時間、５ｍｌの０．１Ｍ
塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液中で回転させた。ゲル
フラグメントを遠心分離した（Janeczsky K23 スウィ
ンギング バケット ロ−タ、ガラス遠心分離管（１０
ｍｌ）、４２００ｒｐｍで、４℃、１０分間］。上澄液
を回収し、予備活性化ＤＥ５２カラム上に入れて、４ｍ
ｌの蒸留水で３回洗浄した。そして、ＤＮＡは、１ｍｌ
の１ＭＮａＣｌで３回溶出した。
【００５９】活性化ＤＥ５２カラムは、次のようにして
作った：５ｇのＤＥセルロ−ス(Whatman)を、エーレン
マイヤー フラスコ中で７５ｍｌの１ＭＮａＣｌ溶液中
で、０．５時間懸濁した。残査を固定し、上澄液は、ア
スピレイションにより除去した。この処理法は、３回繰
り返した。最後に、上澄液を取った。綿−ウ−ルを、ギ
ルソン−ピペット滴定の円錐形端中に入れた。水で脱塩
した後、オリゴヌクレオチド試料を入れた。溶出したオ
リゴヌクレオチドを、３倍の量の液体窒素中の酢酸アン
モニウムとエタノ−ルにより沈殿させた。酢酸アンモニ
ウムとエタノ−ル混合物は、３０ｍｌの７．５Ｍ酢酸ア
ンモニウムと１８０ｍｌの９６％エタノ−ルを混合する
ことにより形成された。オリゴヌクレオチドを回収する
ために、ＤＮＡを、溶解し、遠心分離（１２,０００ｒ
ｐｍ、１０分間、室温）し、真空中で、乾燥させ、滅菌
蒸留水中で再溶解した。
【００６０】合成フラグメントの終端は、フォスフォリ
ル化して、全て、ＩとＶＩとした。フォスフォリル化の
ために、１５０ｐＭのデオキシ−５’−アデノシン−ト
リフォスフェイト（１．５μｌの水中）、５μＣｉγ−
３２−ｄＡＴＰ、３μｌの５−倍キナ−ゼ バッファ
［２５０ｍＭのトリス・Ｃｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ
の塩化マグネシウム、１０ｍＭのジチオツレイト−ル］
と、１μｌ（１０単位）のＴ４ポリヌクレオチド キナ
−ゼ（ＢＲＬ、ＵＳＡ）を、１０μｌの１０ｐＭオリゴ
ヌクレオチド溶液中に添加した。そして、４５分間、３
７℃で培養し、次いで、３分間、１００℃で、沸騰さ
せ、次に、前記の変成ゲルで、オリゴヌクレオチド帯
を、オ−トラヂオグラフィで検出した。ゲルは、プラス
チック ラップ中にラップし、試料を暗所でＸ線フィル
ム（ＭＥＤＩＦＯＲＴ ＲＴ、Forte,Vac)上に置いて、
そして、５分間露光し、次に、フィルムを製造者の指示
に従って、現像し、次に、顕にして、ゲル上に再載置し
た。ゲル片を、暗スポットに相当して、フィルム上で励
起し、抽出し、クロマトグラフィし、上記のように沈殿
させた。オリゴヌクレオチドを、上記の方法で、ウレア
を略して、混合し（１０−１０μｌ）、アニ−ルし（６
５℃、１時間）、沈殿させ、ゲル上で精製した。再沈殿
した後、溶解させた。得られたヂュプリス(duplice)
は、次のように結合された。６μ（４０ｐＭ）のＩ＋Ｉ
Ｉのヂュプリス＋６μ（４０ｐＭ）のＩＩＩ＋ＩＶのヂ
ュプリス＋６μ（４０ｐＭ）のＶ＋ＶＩのヂュプリスと
６μの５倍リガ−ゼバッファ［２５０ｍＭトリス・Ｃｌ
（ｐＨ７．５）及び５０ｍＭの塩化マグネシウム］、３
μｌの１０ｍＭアデノシン５’−トリフォスフェイト
（ＡＴＰ）、及び３μｌの１００ｍＭジチオツレイト−
ト（ＤＤＴ）及び０．５μｌ（０．５単位）のＴ４リガ
−ゼ(Boehringer Mannheim GmbH,ドイツ）を混合した。
そして、反応混合物を、１６℃で、１６時間培養し、最
終的に、リゲイション生成物を、中和ゲル上に、前記の
方法により再精製した。
【００６１】１．Ｂ．合成遺伝子のクローン化 クローン化は、ｐＵＣ１９プラスミド ベクターを用い
て行なった。大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＣ１９）（New En
gland Biolabs.,USA)株をLBa培地に保持した。ＬＢａを
作成するために、１０ｇのトリプトン(Bacto)、５ｇの
イースト抽出物(Bacto)と１０ｇのＮａＣｌを、０．８
ｌの蒸留水に溶解せしめ、ｐＨ７．５に、０．０１Ｍ水
酸化ナトリウムで調整した。０．０１Ｍの塩化水素酸及
び１７ｇのＢａｒｃｏアガーを添加した。次に、溶液の
量を、１ｌに調節し、溶液を３０分間、３７℃で滅菌し
た。
【００６２】プラスミドＤＮＡを、マキシプレプ法によ
り単離した。微生物を、ＬＢ培地中で培養した。ＬＢ培
地は、ＬＢａと同じ組成であるが、アガーを含有しな
い。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌培地
は、０．１ｍｌの前記の培養物で接種された。培養物
を、ロタリー撹拌器（２００ｒｐｍ）で１６時間、３７
℃で、撹拌した。これで製造された細胞は、ソルバル(S
orvall)RC3B遠心分離器で、4℃30分間で回収した。細胞
は、67mlのTGE中に懸濁液した。TGE溶液は、2.3mlの40%
グルコース水溶液、２．５ｍｌの１Ｍのトリス・Ｃｌ溶
液（ｐＨ８．０）、４ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ(Rea
nal,Butapest)溶液及び91.2mlの脱イオン水を含有す
る。TGE中懸濁した細胞は、134mlのNSEで処理した。NSE
溶液を製造するために、次の成分を138.7mlの蒸留水に
添加した:13.3mlの3M水酸化ナトリウム水溶液、8mlの25
%のラウリル硫酸ナトリウム及び45mlの0.25M EDTA水溶
液である。切断溶菌液は、１時間２℃で培養した、次
に、１００ｍｌの３／５Ｍ 酢酸カリウム溶液を添加し
た。そして、０℃に２０分間放置した。酢酸カリウム溶
液は、２３０ｍｌの氷酢酸、５７ｍｌの蒸留水を、５８
８．９ｇの１２００ｍｌ蒸留水に溶解させた酢酸カリウ
ムに添加することにより製造した。前記の懸濁液は、ソ
ルバル(Sorvall)RC3B遠心分離器で、８０００ｒｐｍ、
ＧＳ−３ロ−ターで、０℃、２０分間で遠心分離され
た。上澄液は、１８ｍｌの−２０℃のイソプロパノ−ル
で沈殿せしめ、１時間、−２０℃で培養した。ＤＮＡ沈
殿物は、０℃の遠心分離で回収された。そして、１０ｍ
ｌのエタノールで洗浄され、最終的に、真空デシケイタ
−中で乾燥された。生成物は、２５０ｍｌの０．０１Ｍ
トリス・Ｃｌ（ｐＨ７．５）バッファと１ｍｌの水中
の０．２５Ｍ ＥＤＴＡを含有するＴＥ溶液７ｍｌ中に
溶解した。
【００６３】塩化セシウム(Serva)及び１０μｇ臭化エ
チジウムを７ｍｌの前記の溶液に溶解した。次に得られ
た溶液を、ソルバル(Sorvall)ＯＴＤ−５０Ｂウルトラ
遠心分離器のＴ８６５．１ロ−タ−中で４８時間、１５
℃で３９０００ｒｐｍで遠心分離した。低い帯域は、紫
外線で検出され、注射器で除去され、臭化エチジウム
は、二倍量のブタノ−ルで３回抽出された。プラスミド
含有溶液は、ＴＥ溶液の１０００倍量で透析され、純粋
なpUC19プラスミドＤＮＡが得られた。ＤＮＡの濃度
は、２６０ｎｍでの光学密度に基づいて、計算された。
１ＯＤ２６０は、５０μｇ／ｍｌのＤＮＡに相当する。
pUC19 ＤＮＡは、KpnI及びSphI制限エンドヌクレアー
ゼを使用して、製造者の指示に従って、消化される。そ
の後、50μｌの消化されたpUC19ＤＮＡと5pMの二重スト
ランド ヒルヂン遺伝子を混合し、T4ＤＮＡリガーゼ(B
oehringer Mannheim GmbH,ドイツ)で、製造者の指示に従
って、配位結合された。配位結合されたＤＮＡは、大腸
菌JM109競合細胞(Pharmacia)中に形質転換された。競合
細胞は、次の方法により製造された。
【００６４】大腸菌JM109株は、−７０℃で保存され
た。この保存のために、大腸菌JM109株は、M9培地で、4
8時間、37℃激しく撹拌して培養された。M9培地の作成
のために、6gの水素燐酸2ナトリウム、3gの2水素燐酸カ
リウム、1gの塩化アンモニウム及び0.5gの塩化ナトリウ
ムを、1lの蒸留水に溶解した、そして、30分間、121℃
で滅菌した。滅菌、冷却後、次の滅菌溶液を添加した:1
mlの1M硫酸マグネシウム、1mlの0.1M塩化カルシウム、1
mlの1.0Mチアミン塩酸塩及び5mlの20％グルコース。3ml
の成長培養物に、225μｌのジメチル−スルフォキシド
(DMSO)を、添加した。混合後、−７０℃に保存した。
０．１ｍｌのこのように保存した培養物を、５ｍｌの２
ＴＹ培養中で培養し、３７℃で１６時間激しく撹拌し、
細胞を伝搬せしめた。２ＴＹ培地を作成するために、１
６ｇのトリプトン(Bacto)、１０ｇのイースト抽出物(Ba
cto)と、５ｇのＮａＣｌを、１ｌの蒸留水中に溶解し
た。０．１Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ７．３に調節し
た。次に、３０分間、１２１℃で滅菌した。次に、細胞
を、予備加熱したエーレンマイヤー フラスコ（３７
℃）で、１ｍｌの該細胞で接種された１００ｍｌの２Ｔ
Ｙ培地で培養した。次に、培養物を、フラスコを、氷に
上に置くことにより冷却し、ジャネツキイ(Janetzky)K2
3遠心分離器で、揺動バケット ローターを使用して、
４０００ｒｐｍで、１０分間、０℃で回収した。上澄液
を除去し、ペレットを、５０ｍｌの５０ｍＭ滅菌冷却塩
化カルシウム溶液中に懸濁した。前記のように遠心分離
したまま、０℃で、２０分間放置するため、上澄液を、
除去し、沈殿物を、９ｍｌの滅菌冷却された５０ｍＭ塩
化カルシウム溶液中に懸濁した。次に、水性の、滅菌、
冷却された８７％グリシン1.5mlを添加し、激しく撹拌
した後、300μｌの懸濁液部分を、エッペンドルフ管(1.
5ml,Greiner,ドイツ)に分割した。液体窒素中に凍結した
後、−７０℃に保存した。
【００６５】競合する細胞を形質転換するために、粉砕
溶解し、５μｌのリゲイトを添加した。次に、２０分
間、３０℃で３分間、氷浴中で培養し、更に２分間氷浴
中で行なった。１０００μｌの２ＴＹ培地中で、３７℃
で１時間培養した後、次の物質を添加した：２５μｌの
０．１Ｍ IPTG、25μｌの２％５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Ｘ−ｇ
ａｌ）。このようにして得られた混合物を、５０μｇ／
ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢａプレイト（平板）
上で、１：１０、１：１００と１：１２００の希釈度で
プレイト（（平板にぬる）した。このようにして得た白
色コロニーを、接種し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含有するＬＢ培地３ｍｌ中で、１６時間、３７℃で撹
拌培養器中で培養した。
【００６６】ミニプレプ法によるプラスミドＤＮＡの単
離は、次のようにして行なわれた。１．５ｍｌの３７℃
で１６時間成長された細胞培養物を、エッペンドルフ管
（１．５ｍｌ）で２分間、１２００ｒｐｍで遠心分離し
た。上澄液を除去し、ペレットを、１００μｌのＴＧＥ
中に懸濁し、次に、２００μｌのＮＳＥ（前記参照）を
添加した。強く撹拌した後、氷浴中で、５分間培養し
た。次に、１５０μｌの３／５Ｍの酢酸カリウム溶液を
添加し、５分間、氷浴上で培養した。遠心分離（５分
間、１２、０００）した後、上澄液を回収し、−２０℃
無水エタノール７００μｌ中に沈殿せしめた。ＤＮＡ沈
殿物を、遠心分離（５分間、１２、０００ｒｐｍ）で回
収した。デシケイションの後に、１００μｇ／ｍｌのリ
ボヌクレアーゼ(Reanal,Butapest)を含有するＴＥ中に
溶解し、１時間、３７℃で培養した。次に、ＤＮＡ試料
をフェノールで処理し、次に、沈殿せしめ、５０μｌＴ
Ｅ中に溶解した。ＴＧＥ、ＮＳＥ及び３／５Ｍ酢酸カリ
ウム溶液を、マキシプレプ法により製造した。フェノー
ル処理の場合、試料を、渦上に、２５：２４：１のフェ
ロモン、クロロフォルム、イソアミルアルコ−ルの混合
物の当量で混合した。懸濁液の遠心分離の後に、１ｌの
液化フェノールと１ｌの０．１Ｍトリス・Ｃｌ（ｐＨ
８）を撹拌し、分離器中で、水性相を、撹拌しながら、
ｐＨ８に、１Ｍ水酸化ナトリウム溶液で調節した。次
に、低い相は、１ｌの０．１トリス塩基で再び平衡化さ
れ、次に、０．２％のβ−メルカプトエタノールと、
０．１％の８−ヒドロキシ−キノリンを添加した。この
ように作ったフェノールを、クロロフォルムと混合し、
上記の比率のイソアミル−アルコ−ルと混合した。
【００６７】次のＤＮＡをPvuII制限エンドヌクレアー
ゼ(New England Biolabs.,USA)で、製造者の指示に従っ
て、消化せしめた。ヌクレオチド順序は、配列により決
定された。これは、セーキュエナーゼ バ−ジョン２．
０ＤＮＡ配列ｋｉｔ(United States Biochemical,USA)
により製造者の指示に従って、達成された。所望のクロ
ーンは、配列分析に基づいて選択された。その２つは、
大腸菌JM109(pUC19::H207 Asp)及び大腸菌JM109(pUC1
9::H221 Asn)と称された。図３は、これらの物理的及び
作用のマップを示す。
【００６８】１つのコロニ−を、５０μｇ／ｍｌのアン
ピシリン含有のＬＢａ上の元の数でストリ−ク作成する
ことにより選択し、そして、５０μｇ／ｍｌのアンピシ
リン含有の５ｍｌＬＢ上に培養した。培養を１６時間行
なった後、３ｍｌの得られた培養物と２２５μｌＤＭＳ
Ｏを混合し、−７０℃で保存した。株は、次の寄託番号
で寄託した。 大腸菌JM109(pUC19::H207 Asp)[NCAIM (P)B 1171]及び 大腸菌JM109(pUC19::H221 Asp)[NCAIM (P)B 1175]
【００６９】
【実施例２】 バチルス サーキュランス(Bacillus circulans)のα−
アミラーゼ遺伝子のクローン化及び表現化 ２．Ａ．バチルス サーキュランス細胞の培養 バチルス サーキュランス(Bacillus circulans)ＧＹＯ
Ｋｂ−２４３ [NCAIM (P)B 1159]微生物をＬＢ（実施
例１参照）中で１日、３７℃で培養した。１００ｍｌの
ＬＢ培地を、全容量５００ｍｌのエーレンマイヤー フ
ラスコ中の固体培養物から得た細胞で接種した。培養物
の細胞数は、４〜６×１０8 ／ｍｌであった。
【００７０】２．Ｂ．バチルス サーキュランス(Bacil
lus circulans)全ＤＮＡの分離と精製 バチルス サーキュランスGYOKb-243[NCAIM (P)B 1159]
微生物をＬＢ（実施例１参照）中で、１日、３７℃で培
養した。１００ｍｌのＬＢ培地は、５００ｍｌの全容量
のエーレンマイヤー フラスコ中の固体培養物から誘導
された細胞で接種され、１２時間、３７℃で培養され
た。培養物の細胞数は、４〜６×１０8／ｍｌであっ
た。
【００７１】２．Ｃ．ｐＧＹ９７プラスミド ベクター
の構成 ハンガリ−特許明細書第２０４,８９２号は、ｐＧＹ９
７プラスミド ベクター（その物理的及び作用的マップ
は、図３に示される）のクローン化のための作成、精製
及び用途を開示している。本発明は、これらの詳細な方
法に基づいており、従って、その簡単な説明をここで行
なう。大腸菌K1400(pGY97)[寄託番号NCAIM (P)B 358]株
を、−７０℃に保存した。細胞を、５０μｇ／ｍｌアン
ピシリン含有のＴＡ培地中で、２８℃で安定相になるま
で、培養した。従って、３ｍｌの培養物ブロス及び０．
２２５ｍｌのＤＭＳＯ（シグマ）を混合し、−７０℃で
保存した。ＴＡ培地を形成するために、１０ｇのトリプ
トン（Ｂａｃｔｏ）、１ｇのイースト抽出物（Ｄｉｆｃ
ｏ）と５ｇのＮａＣｌを、１ｌの蒸留水中に溶解した。
次に、１ｍｌの０．１Ｍ塩化マグネシウムと１ｍｌの１
Ｍ塩化カルシウム溶液を添加した。培地を、３０分間、
１２１℃で滅菌した。固体ＴＡｇ培地を作成するため
に、ＴＡｇを、２０ｇ／ｌのアガーで補充して、同じ処
理法を行った。
【００７２】２．Ｄ．大腸菌K1400(pGYY97)[NCAIM (P)B
358]細胞からのファージ形のpGYY97組替え体プラスミ
ドの製造 大腸菌K1400(pGY97)[NCAIM (P)B 358]株を保持し、実施
例２Ｃにより培養した。大腸菌K1400の寄託番号はNCAIM
(P)B 357である。ファージ形中のpGY97プラスミドを精
製するために、大腸菌NM526株を、３７℃で転移させ、
ファージ定滴を測定した。この温度でpGY97プラスミド
をファージ形に伝搬させた。ファージストックは、クロ
ロフォルム含有の懸濁液中に４℃で貯蔵された。大腸菌
NM526[NCAIM (P)B 1006]によりTA培地と０．０１ｍｌの
クロロフォルム中に製造された４ｍｌのファージ懸濁液
を、はげしく混合し、希釈した。次に、大腸菌NM526株
を転移させた。単一プラクを採取し、１ｍｌのＳＭ中に
懸濁し、その後、４〜６時間、０℃で撹拌した。ＳＭ溶
液を製造するために、２０ｍｌの１Ｍトリス・Ｃｌ（ｐ
Ｈ７．５）バッファ、５．８ｇのＮａＣｌ、２．０ｇの
硫酸マグネシウムと２０ｇのゼラチンを、１ｌの蒸留水
中に溶液させた。溶液は、２０分間、１２１℃で滅菌し
た。０．１ｍｌｎｏファージ懸濁液から、プレイト 溶
菌液を、ＴＡｇ培地中に製造した。
【００７３】プレイトを、８〜１０時間、３７℃で培養
した。６ｍｌのＳＭバッファを、全清浄化プレイト 溶
菌液上に注ぎ、０℃で緩やかに撹拌した。５ｍｌの前記
のプレイト溶菌液を、５００ｍｌのバクテリア細胞培養
物に添加し、ＴＡ培地中で指数関数的成長相になった
（ＯＤ６００＝０．３）。そして、転移された培養物
を、３７℃で撹拌培養器中で培養した。培養物の値ＯＤ
６００は、３０分毎に測定した。最小に達すると、溶菌
液を室温に冷却し、５ｍｌのクロロフォルムを添加し
た。強い撹拌の後に、ＲＮア−ゼ（Sigma)で１μｇ／ｍ
ｌ最終濃度で処理し、３０分間培養した。５００ｍｌの
溶菌液に、２９．２ｇの結晶ＮａＣｌを添加し、塩を、
１時間混合した。細胞の残滓を、４℃で１０分間遠心分
離で分離した（１１００ｒｐｍ）。上澄液を回収し、結
晶ポリエチレン グリコ−ル６０００（ＰＥＧ６００
０、FLUKA)を添加(最終濃度10％)した。ＰＥＧを溶解
し、１時間、０℃で培養した、そして、形成された沈殿
物は、遠心分離（１１、０００ｒｐｍ）により回収し
た。上澄液を捨て、ペレットを注意深く同量のクロロフ
ォルムで抽出した。２つの相を、遠心分離で選択し、
０．５ｇ／ｍｌの塩化セシウム(Serva)を水性相に添加
した。ＣｓＣｌの溶解後、懸濁相を、ＣｓＣｌ段階勾配
の上に重ねた。ＣｓＣｌ勾配は、ＳＭ中に、次の溶液を
用いて形成した。
【００７４】 溶液 密度 ＣｓＣｌ ＳＭ 屈折率 (g/ml) (g) (ml) (n) ａ １．４５ ６０ ８５ 1.3768 ｂ １．５０ ６７ ８２ 1.3815 ｃ １．７０ ９５ ７５ 1.3990
【００７５】３ｍｌの溶液ｃを、ＳＭ２８のきれいなポ
リプロピレン遠心分離管(Sorvall)中にピペットで入れ
た。その後、３ｍｌの溶液ｂ、そして、ファージ懸濁液
４ｍｌは、互いに注意深く重ねられた。２０ｍｌのファ
ージ懸濁液を、この勾配に重ねた。遠心分離は、ソルバ
ル(Sorvall)OTD-50Bウルトラ遠心分離器で、２時間、４
℃でＳＷ２８ロ−ター（２２、０００）で行なわれた。
ファージ帯域は、皮下注射針で(aとb層の間の蛋白色帯
域)回収した、そして、その量は、1.5g/mlのCsCl溶解(S
M中)により、10mlに調節された。この懸濁液を、プラス
チック遠心分離管中に注がれ、SW50.1ロ−ターで、３
８、０００ｒｐｍで２４時間、４℃で上記遠心分離器で
遠心分離された。ファージ帯域は、皮下注射針で回収さ
れ、１０００倍量のＮＴＭバッファ[10mlの1.0M NaCl、
20mlの1.0Mのトリス・Ｃｌ(pH7.5)、10mlの1.0M塩化マ
グネシウム及び960mlの脱イオン水］に対して、透析さ
れた。
【００７６】２．Ｅ．ｐＧＹ９７ファージＤＮＡの単離 透析した後、次の成分を、１．０ｍｌのファージ懸濁液
を添加した：最終濃度２０ｍＭでの０．５ＭのＥＤＴＡ
（ｐＨ８．０）、５０μｇ／ｍｌのプロテイナ−セＫ及
び最終濃度０．５％の２０％ラウリル硫酸ナトリウム。
混合物を、１時間、３７℃で培養した。消化の後に、
１：１のフェノ−ルとクロロフォルムの当量の混合物を
撹拌することによりフェノ−ル処理した。次に、２つの
相を、遠心分離により分離した（１０分間、１０,００
０ｒｐｍ)。水性相は、１０００倍容量のＴＥで透析し
た。ＤＮＡの濃度を、２６０ｎｍで（１ ＯＤ２６０単
位は、５０μ／ｍｌ ＤＮＡ）測定した光学濃度に基づ
いて計算した。
【００７７】２．Ｆ．ベクター及び挿入ＤＮＡの製造と
連結（ライゲイション） １２．５μｌのＢ−バッファを、実施例２Ｅに従って精
製したプラスミドＤＮＡ１２．５μｌに添加した。Ｈｈ
ｏＩ制限エンドヌクレア−ゼ(BRL,メリ−サンド州）の
プラスミドＤＮＡ５単位を、反応混合物に添加して、１
時間、３７℃で培養した。３ＭＮａＣｌのＢ−バッファ
１０００μｌ、１２０μｌの１Ｍトリス・Ｃｌ（ｐＨ
７．５）及び１２０μｌの１Ｍの塩化マグネシウムと
８．４μｌのβ−メルカプトエタノ−ルと８６５０μｌ
の蒸留水を混合した。消化の効率は、ゲル電気泳動法で
制御した。消化の量は、ライゲイションとＸｈｏＩでの
再消化により制御した。第１の消化が正しい場合、第１
の消化パターン帯は、ライゲイション及び再消化の後に
現れる。１μｌの消化試料に対して、１０μｌのバッフ
ァを添加して、得られたフラグメントを既知の方法によ
りアガロ−ス ゲル 電気泳動法で分離した。Ｄ−バッ
ファを製造するために、５ｍｌの８０％サカロ−ス、
０．０１ｇのブロモフェノ−ル ブル−、０．４ｍｌの
１Ｍトリス・Ｃｌ（ｐＨ７．５）と４．０ｍｌの蒸留水
を添加した。アガロ−ス ゲルを、１ｇのアガロ−ス(S
igma,セントルイス,USA)を、８０ｍｌのＴＥＡバッファ
に添加することにより製造した。６０℃に冷却した後、
水平モ−ルドに注いだ。ＴＥＡバッファを作るために、
４８．５ｇのトリス塩基、３．７ｇのジナトリウム−Ｅ
ＤＴＡ及び１６．４ｇの酢酸ナトリウムを、８００ｍｌ
の蒸留水に溶解した。上記の場合、ＴＥＡには、０．０
５ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ臭化エチヂウム溶液を補充し
た。ＴＥＡバッファは、濃縮酢酸によりｐＨ８．５に調
節され、蒸留水をとんし、最終量１０００ｍｌにした。
【００７８】前記のフラグメントをチェックした後、フ
ォスファターゼで処理した。フォスファターゼ処理は、
次のように成された。XhoI酵素で処理されたＤＮＡに対
して、２０単位のフォスファターゼ(Calf Intestinal,B
oehringer Mannheim GmbH,ドイツ)を添加し、先ず、15分
間、37℃で培養し、次に、15分間56℃で培養した。それ
に次に、試料を20単位のバクテリア アルカリ フォス
ファターゼ(BRL,メリ-ランド,USA)で同じバッファ中で、60
分間、68℃で処理した。これらの処理の後、試料を当量
のフェノールとクロロフォルム１：１の比率で抽出し
た。注意深く混合した後、２つの相を、遠心分離（１０
分間、１０、０００ｒｐｍ）で分離した。水性相を、エ
ーテルで３回抽出した、そして、２・１／２量の９６％
エタノールを添加することにより沈殿せしめた。沈殿Ｄ
ＮＡは、遠心分離（１０、０００ｒｐｍ）で回収した。
上澄液を除去し、ＤＮＡをデシケイトし、２０μｌのＴ
Ｅ溶液中に溶解した。フォスファターゼ処理の効率は、
配位結合により（コントロールとして、未処理のXhoIフ
ラグメントを使用して）チェックした。処理が適する場
合、配位結合の後、出発フラグメントが受け取られる。
フォスファターゼ処理ベクター フラグメントは、それ
自体配位結合できない（ハンガリー特許明細書第２０
４、８９２号参照）。
【００７９】１２．５μｌのこのように製造したｐＧＹ
９７プラスミドＤＮＡ及び１２．５μｌのＢバッファを
混合し、５単位のＢａｍＨＩ制限エンドヌクレア−ゼ(B
RL,メリ−ランド,USA)により、１時間３７℃で培養する
ことにより、消化せしめた。１２５μｌの実施例２Ｂに
よる方法で精製したバチルス サーキュランス全ＤＮＡ
溶液を、１単位のＳａｕ３ＡＩ制限エンドヌクレア−ゼ
(BRL)により、１２５μｌのＢバッファ中で、１０分
間、３７℃で培養することにより消化せしめた。部分消
化のＤＮＡは、フェノ−ルで処理し、エタノ−ルで沈殿
せしめた。
【００８０】ＤＮＡを、５００μｌのＴＥ中に再溶解さ
せた。Sau3AIは、ＤＮＡを消化し、異なる長さのフラグ
メントとなる。ベクターにクローン化すべきフラグメン
トの最適長さは、9〜15kbの範囲であるので、それらの
フラグメントを分離するために、部分消化が、サクロー
ス勾配上に載せられた。勾配遠心分離の間に、フラグメ
ントは、そのサイズにより、分離する。このように、好
適なフラグメントを単離するに都合が良い。サクロース
勾配遠心分離は、次のように成される。SW41遠心分離管
中に連続的なサクロース勾配（１０〜４０％の範囲 を
形成する。10〜40％サクロース溶液を、１Ｍの塩化ナト
リウムを含有するＴＥバッファ中に作った。これらの溶
液の各６ｍｌを、勾配混合器装置で混合し、遠心分離管
中に充填した。５００μｌのＤＮＡ試料を、勾配の頂部
に載せて、ソルバル(Sorvall)OTD-50Bウルトラ遠心分離
機中で、４℃で１６時間３２、０００ｒｐｍで遠心分離
した。遠心分離終了後、２００μｌ部分を集め、ＤＮＡ
のサイズを、アガロースゲル電気泳動法で測定した。１
０μｌの各ＤＮＡ部分を、１０μｌの各Ｄバッファと混
合した。次に、溶液を、ゲルのスラブ中に載せて、試料
を、電気泳動法（４０Ｖ、４０ｍＡ）で、ＴＥＡバッフ
ァ中で分析した。
【００８１】ＤＮＡ帯は、ＤＮＡフラグメントの異なる
サイズに相当し、紫外線での螢光に基づいて観察した。
その写真を取り、同定した。適当な部分を合わせて、エ
タノ−ルで沈殿させ、１０ｍｌＴＥ中に再溶解した。Ｂ
ａｍＨＩ制限エンドヌクレア−ゼは、ＤＮＡを、ＧＧＡ
ＴＣＣ配列で切断し、ＧＡＴＣ配列でのＳａｕ３ＡＩと
なる。切断した後、”付着末端”と称するものは、４塩
基を有するように形成された。それは、互いに結合でき
た。１０μｌのｐＧＹ９７ ＤＮＡは、ＢａｍＨＩで消
化し、１０μｌの部分消化の（Ｓａｕ３ＡＩ）バチルス
サーキュランスＤＮＡは、５μｌのＬバッファと５単
位のＴ４ＤＮＡリガ−ゼ（BRL,メリ−ランド、USA)を添
加することにより溶菌され、反応培養物となり、それ
を、１６時間、１５℃で培養した。
【００８２】Ｌバッファは、１．２５ｍｌの１Ｍトリス
・Ｃｌ（ｐＨ８．０）、０．２５ｍｌの１Ｍ塩化マグネ
シウム、０．５ｍｌの１Ｍジチオツレイト−ル、３０．
３ｍｇのＡＴＰ及び３ｍｌの脱イオン水を含有する。
【００８３】２．Ｇ．ファージＤＮＡのインビトロ充填 反応混合物中に、これらのＤＮＡ分子は、２つの適当に
配位したベクター−ア−ム分子の間に、バチルス サー
キュランスＤＮＡの適当なフラグメントを含有するリゲ
イション間に出現する。これらの分子は、インビトロ充
填混合物によりファージ粒子中に、充填された。
【００８４】インビトロ充填は、感染ファージ粒子は、
ファージＤＮＡを、適当なバッファ中での適する大腸菌
細胞リゼイト（溶菌液）（ＳＥとＦＴＬ）へ添加するこ
とにより形成できる。
【００８５】充填は、市販のインビトロキット(kit)(Am
ersham,England)で製造者の指示に従って、成された。
簡単には、充填は、次のように成された。キットからの2μ
ｌSEと5μｌのFTL溶菌液は、氷浴上で粉砕溶解した。次
に、8μｌのＤＮＡ充填バッファと10μｌの配位結合液
(前記参照)に添加した。直ぐに混合した後、混合物を、
先ず、0℃で10分間接種し、次に、25℃で60℃培養し
た。宿主バクテリアの培養とファージ数の測定は、イン
ビトロ充填キットの指示により成された。TAK培地は、T
Aと同じだが、前者は、2.2％のアガー(Bacto)と１％の
デンプン(BDH)を含有する。12時間の培養の後、1300プ
ラクが見出された。コントロール配位結合（バチルス
サーキュランスＤＮＡなしで）では、プラクが現れな
い。1300のプラクの間に、１つのAmy+(消化デンプンと
アミラ−ゼ活性を有する）組替え体ファージ（図５）が
ある。Amy+ファージプラクを検出するため、形質転換さ
れた培養物を含有するプレイトは、臭素蒸気中に置かれ
た。臭素は、デンプンを青く染める。従って、生合成さ
れたアミラーゼ消化デンプンを含有しているプラクは、
白色である（図５）。Amy+ファージ プラクは、実施例
２Ｄ、２Ｅの方法に従って、増殖された。次に、ファー
ジＤＮＡを、単離し、BamHI、BglII,EcoRI,HindIII,Pst
I(New England Biolabs.,USA)制限酵素を用いて、製造
者の指示に従って、消化された。消化物は、ゲル電気泳
動法（実施例２Ｆに従って）で分析され、そして、図６
に示される、その制限マップが構成された。組替え体フ
ァージクローンは、pGYOKI-30と呼ぶ。
【００８６】２．Ｈ．α−アミラーゼ遺伝子のサブクロ
ーン化 実施例２ＧのＤＮＡを、EcoRI(New England Biolabs.,U
SA)制限エンドヌクレアーゼで消化する。消化は、実施
例２Ｆに説明されるゲル電気泳動法によりコントロール
され；消化は部分的である。その後、混合物は、フェノ
ールにより抽出され、エタノールにより沈殿せしめら
れ、実施例２Ｇの方法により再配位結合された。大腸菌
GY1095[NCAIM (P)B 1162]競合細胞は、10μｌのリガー
ゼにより形質転換された。競合細胞は、実施例１Ｂによ
り、大腸菌GY1095[NCAIM (P)B 1162]株を適用すること
により形質転換された。培養物は、12時間37℃で培養さ
れた。アンピシリン耐性(ApR)コロニー(形質転換頻度:1
0,000形質転換体/1μｇＤＮＡ)は、Amy表現型のための
臭素蒸気中にチェックされた。１つのAmy+コロニーは、
伝搬され、得られた株は、GY1095(pGYOKI-34)と呼ばれ
た。図６は、その物理的及び作用のマップを示す。
【００８７】２．Ｉ．ｐＧＹＯＫＩ−３１プラスミドＤ
ＮＡの製造と精製 ＧＹＯ１０９５(pGYOKI-31)株を−２０℃に保持した。
プラスミドＤＮＡをそこから実施例１Ｂの説明の予備混
合し、培地を、GY1095(pGYOKI-31)株により培養するこ
とにより、単離した。プラスミドの部分限定マップが、
実施例３Ｃの方法で、ＡｖａＩ、ＢｃII、ＣｌａＩ、Ｋ
ｐｎＩ、Ｐｖｕｌ酵素でも測定された。
【００８８】２．Ｊ．ｐＧＹＯＫＩ−３３及びｐＧＹＯ
Ｋ−３４プラスミドの製造 プラスミドＤＮＡを大腸菌JM109(pUC19)及びGY1095(pGY
OKI-31)株から実施例１Ｂに説明したマキシプレプ法に
より単離した。ｐＵＣ１９ベクターＤＮＡは、ＳｐｈＩ
で消化された。その後、ｐＧＹＯＫＩ−３１からフラグ
メントを線形形成し、欠失させるために、ＳｐｈＩ及び
ＮｒｕＩ(New England Biolabs.,USA)制限エンドヌクレ
ア−ゼにより、製造者に与えられた環境を用いて、消化
した。混合物は、フェノ−ルにより実施例１Ｂに説明さ
れるように、抽出された。次に、沈殿せしめ（実施例２
Ｆ）、再溶解の後、ライゲイション バッファ中で、Ｔ
４ＤＮＡリガ−ゼ(Boehringer Mannheim GmbH,ドイツ）
で、製造者の方法により、１６時間、１６℃で連結し
た。連結後、大腸菌ＧＹ１０９５細胞中の形質転換し、
５０μｇ／ｍｌのアンピシリン含有のＴＡＫ培地上に、
実施例２Ｈにより、プレイトした。
【００８９】得られたＡｍｙ+コロニ−を、展開し、そ
して、プラスミドＤＮＡを、実施例１Ｂに説明されるミ
ニプレップ法により単離した。その後、プラスミドを、
ＰｓｔＩ制限エンドヌクレア−ゼ(New England Biolab
s.,USA)により、製造者の方法を用いて、消化せしめ
た。更に、ｐＵＣ１９プラスミドからの２つの異なる配
位でのＡｍｙ+のＤＮＡフラグメントを、実施例２Ｆに
説明のゲル電気泳動法により製造した。得られたクロー
ンを、ＧＹ１０９５(GYOKI-33)とＧＹ１０９５(GYOKI-3
4)と称した。図６は、その物理的及び作用的なマップを
示す。
【００９０】
【実施例３】アミラーゼ−ヒルヂンの形質発現／分泌カセットの製造 プラスミドＤＮＡを、大腸菌JM109(pUC19::H207 Asp)
(実施例１Ｂ）及び大腸菌GY1095(pGYOKI-34)(実施例２
Ｊ）株から、マキシプレップ法（実施例１Ｂ）により単
離した。ｐＵＣ１９：：Ｈ２０７ Ａｓｐプラスミド
は、ＫｐｎＩを使用することにより消化した。pGYOKI-3
4プラスミドは、KpnI、EcoRIとBclI制限エンドヌクレア
ーゼ(New England Biolabs.,USA)により消化された。フ
ェノ−ル（実施例１Ｂ）により抽出した後、Ｔ４ ＤＮ
Ａリガーゼ(New England Biolabs.,USA)で、製造者の指
示に従って、配位結合された。その後、配位結合は、大
腸菌競合細胞（実施例１Ｂ）中に形質転換された。ミニ
プレプ法は、ＡｍｐRコロニーから、成された（実施例
１Ｂ）。
【００９１】バチルス サーキュランス及び合成ヒルヂ
ン遺伝子から誘導されるＤＮＡを含有するクローンは、
適当な配位で一緒に、ＰｓｔＩ制限酵素分析（実施例２
Ｊ）により確認された。
【００９２】所望の構成物は、大腸菌GY1095細胞(実施
例1B)中に形質転換され、プラスミドＤＮＡを、これら
の細胞からも単離した(実施例1B)。株は、大腸菌GY1095
(pUC19-AH)と称する。GY1095(pUC19-deltaAH)欠失プラ
スミドを構成するために、前記の構成物は、部分的に、
ClaIと全部でAccIで消化された。配位結合し、形質転換
し、ミニプレプ法によるプラスミド単離、制限分析の後
に、ClaI切断位置のみを有する所望の構成物は、選択さ
れた。ＤＮＡは、このクローンからマキシプレプ法によ
り(実施例1B)単離された。ＤＮＡは、ClaI(New England
Biolabs.,USA)で、製造者の指示に従って、消化され
た。次に、それを、Bal31エキソヌクレア−ゼ(BRLUSA)
で製造者の指示に従って、処理され、長さ１０〜１００
のヌクレオチドの欠失領域に達した。その後、ムング
ビ−ン ヌクレア−ゼ(Pharmacia,スウエ-デン)により製造
者の指示に従って、処理された。最終的に、配位結合さ
れた(実施例3)。pUC19::H16(図８）は、ヒルヂンの形質
発現し、分泌しているが、この配位結合混合物中に見出
すことができる。
【００９３】
【実施例４】：大腸菌中のヒルヂンの形質発現 ４．Ａ．大腸菌 JM109 (pUC19::H16)株（図８）による
ヒルヂン形質発現 大腸菌JM109競合細胞は、実施例３の最終配位結合混合
物で形質転換された。形質転換されたバクテリアは、５
０μｇ／ｍｌのアンピシリン含有のLBa培地上にプレイ
トされた。展開されたコロニーを、５ｍｌの５０μｇ／
ｍｌのアンピシリン含有のＬＢ液体培地中で培養し、１
６時間、３７℃で撹拌した。培養物のヒルヂン活性は、
血液試験とクロモジム方法（実施例９参照）により測定
された。ヒルヂン様活性を示す培養物の１つは、大腸菌
JM109(pUC19::H16)と称する。株は、寄託番号NCAIM (P)
B 1170として寄託された。pUC19::H16配列は、セ−キエ
ナ−ゼバ−ジョン２．０ｋｉｔ(United States Biochem
ical,USA)により製造者の指示に従って、分析された。
配列のコンピュ−タ分析は、信号配列と構造遺伝子の適
する結合点を予想した。これは、ヒルヂンタンパク質の
配列（実施例１１）により支持された。
【００９４】図８は、Ｈ１６のヌクレオチド配列であ
る。
【００９５】４．Ｂ．大腸菌JM109 (pUN121::H16)株中
でのヒルヂン形質発現 プラスミドＤＮＡは、大腸菌JM109(pUC19::H16)とGY109
5(pUC121I[寄託番号[NCAIM (P)B 1163]株から、実施例1
Bのマキシプレプ法により、単離された。その両方を、H
indIII(New England Biolabs.,USA)で,製造者の指示に
従って、消化された。単離されたＤＮＡは、混合され、
沈殿され、配位結合され、大腸菌JM109競合細胞(実施例
1B)中に形質転換された。形質転換された細胞は、15μ
ｇ／ｍｌのテトラサイクリン含有のLBa培地上にプレイ
トされ、２０時間、２８℃で培養された。プラスミドＤ
ＮＡは、ミニプレプ法により、TcR誘導体から単離され
た、その後、H16挿入を含有するpUC121構成物は、PstI
消化物を使用して、実施例1Bの方法に従って、選択され
た。ヒルヂン様の活性は、コントロールされた(実施例
9)。製造株は、大腸菌JM109(pUN121::H16)と称され、そ
れは、寄託番号[NCAIM (P)B 1176]の下で寄託された。
図１０は、その物理的及び作用のマップを示す。
【００９６】４．Ｃ．人工的オペロンによるヒルヂン形
質発現 容易にクローン化される形でのＨ１６形質発現／分泌カ
セットを得るために、異なる種のサブクローン化を行な
った。プラスミドＤＮＡは、実施例４Ａに説明されるＪ
Ｍ１０９（ｐＵＣ：：Ｈ１６）株から、実施例１Ｂに説
明されるマキシプレップ法を用いて、単離された。大腸
菌ＪＭ１０９ Ｍ１３ｍｐ１８株(New England Biolab
s.,USA)を、実施例２Ｃに説明される方法により、株
は、２ＴＹ培地上で３７℃でアンピシリンなし、成長さ
せることにより、維持した。
【００９７】二重ストランド ファージＤＮＡは、実施
例１Ｂのマキシプレプ法により、大腸菌JM109(M13mp19)
株を、1l LB液体培地に接種することにより、大腸菌JM1
09(M13mp19)株から単離された。pUC19::H16プラスミド
ＤＮＡ及びM13mp19二重ストランド ファージＤＮＡ
を、HindIII(New England Biolabs.,USA)制限エンドヌ
クレアーゼで製造者の指示に従って、消化した。２つの
消化ＤＮＡ試料は混合され、エタノールで沈殿させ、沈
殿物を配位結合混合物中に再溶解した。配位結合した
後、大腸菌JM109競合細胞中に、実施例１Ｂの方法を使
用して、形質転換した。形質転換後、ファージを、固体
培地中の接種した。この方法に対して、４８時間、ｍ９
培地中（上記の組成を参照）で成長したJM109培養物100
μｌ、0.1M IPTG25μｌ、2%X-gal25μｌを、42℃で溶融
したトップ層アガーＨ2.5mlに添加した。トップアガー
Ｈを製造するために、１０ｇのトリプトン(Bacto)及び
８ｇのＮａＣｌを、１ｌの蒸留水中に溶解した。８ｇの
アガー(Bacto)を添加し、２０分間、１２１℃で滅菌し
た。１００μｌの形質転換混合物を、このように得られ
た溶融アガーに添加した。そして、混合した直後、Ｈ培
地上に注ぎ、均一に伸ばした。Ｈ培地は、８ｇでなく、
１８ｇのアガーを含有することにより、Ｈトップアガー
と同様に、製造された。
【００９８】トップ アガーを５分間室温で固化せし
め、その後、１６時間、３７℃で培養した。培養後、白
色及び青色のプラクがプレイト上に見出された。白色プ
ラクを、ツ−スピックを使用して採取して、１００倍希
釈した大腸菌JM109細胞を含有する新鮮な2TY液体培地2m
l中で培養した。ファージは、6時間、37℃で激しく撹拌
して伝搬せしめた。組替え体M13mp19ファージ中のH16カ
セットの存在をチェックするために、二重ストランドフ
ァージＤＮＡを培養物から、実施例1Bの方法を用いて単
離した。培養物は、実施例9に説明する血液試験により
スクリーンした。単離したＤＮＡは、EcoRIとHindIII(N
ew England Biolabs.,USA)で、製造者の指示に従って、
消化せしめた。実施例1Bのマキシプレプ法により、M13m
p19-H16を、採取されたプラクを含有する２ＴＹ培地で
成長されたJM109培養物の１０ｍｌで16時間、37℃で接
種された新鮮な液体LB培地１０ｍｌ中に伝搬することに
より、二重ストランドファージＤＮＡは、前記の組替え
体M13mp19-H16から単離され、プラスミドＤＮＡは、大
腸菌pop2136(pEX1)(Boehringer Mannheim Biochemical)
株から単離された。pop2136(pEX1)株は、最大２８℃で
培養した。
【００９９】pop2136(pEX1)株を実施例２Ｃの方法で維
持した。単離したＤＮＡをHindIII(New England Biolab
s.,USA)で、製造者の指示に従って、消化せしめた。２
つの消化物を混合し、沈殿せしめ、配位結合し、pop213
6競合細胞に、実施例1Bを適用して、pop2136(pEX1)株を
28℃で培養することにより、形質転換させた。形質転換
された細胞を、LBa培地上にプレイトし、２０時間２８
℃で培養した。
【０１００】β−ガラクトシダーゼに相当する配位にあ
るｐＥＸ１のHindIIIポリリンカ−中にクローン化され
たＨ１６誘導体を、ＡｍｐＲ誘導体から、ＰｓｔＩ酵素
消化(New England Biolabs.,USA)により選択された。得
られた株は、大腸菌pop2136(pEX1-H16)とした。図１０
は、プラスミドの物理的及び作用的マップを示す。プラ
スミドＤＮＡは、前記の株から、実施例１Ｂに説明され
るマキシプレップ法により単離された。次に、製造者の
処理法に従って、ＥｃｏＲＶエンドヌクレア−ゼ(New E
ngland Biolabs.,USA)で消化された。その後、沈殿し、
リゲイトし、形質転換し、ｐｏｐ２１３６[NCAIM (P)B
1161]競合細胞にした。次に、形質転換体を、実施例１
Ｂに説明される方法により、プレ−ト化し、処理した。
人工的オペロンを担持する得られた株は、ｐｏｐ２１３
６（ｐＥＸ１：：Ｈ１６デルタＥｃｏＲＶ）と称した、
そして、[NCAIM (P)B 1165]との寄託番号で寄託した。
【０１０１】
【実施例５】：β−ガラクトシダーゼ−ヒルヂン融合タ
ンパク質の製造 異なるサブクローン化を行ない、合成ヒルヂン遺伝子の
好適なクローン化を確保した。プラスミドＤＮＡを、実
施例１で説明した大腸菌JM109(pUC::H207 Asp)株から、
マキシプレップ（実施例１Ｂ）により単離した。二重ス
トランド ファージＤＮＡを、大腸菌M13mp18株からマ
キシプレプ法により分離した(実施例1B)。分離した二重
−ストランド ファージＤＮＡを、EcoRI及びHindIII酵
素(New England Biolabs.,USA)により消化し、H207 Asp
カセットを、Ｍ１３ｍｐ１８ベクターにより実施例４Ｃ
の方法で、サブクローン化した。クローンは、M13mp1
8::H207 Aspと称した。これらのサブクローン化実験処
理は、繰り返し、ドナー構成は、M13mp19::H207 Aspと
して、受容細胞はpBLUESCRIPT KS+(Stratagene)で行な
った。形質転換した後、細胞を、５０μｇ。ｍｌのアン
ピシリンを含有し、JM109細胞をないＬＢ培地上に塗っ
た。青色及び白色のコロニーから、白色のものを、５０
μｇ／ｍｌのアンピシリン含有の３ｍｌのＬＢ培地中に
培養した。１６時間、３７℃で強く撹拌した後、プラス
ミドＤＮＡを、ミニプレプ法により単離した。EcoRI-Hi
ndIII二重消化により、H207 Asp遺伝子の存在でチェッ
クした。
【０１０２】所望のクローンは、大腸菌JM109(pBUESCRI
PT KS+::H207 Asp)と称した。図１２は、その物理的と
作用的なマップを示す。同じサブクローン工程を、繰り
返すが、この場合、ドナー構成は、JM109(pBLUESCRIPT
KS+::H207 Asp)であり、一方、受容細胞は、M13mp18で
あり、切断酵素は、BamHIとSalIである。形質転換した
後、細胞を、Ｍ培地上に、大腸菌JM109細胞と一緒に塗
った。白色プラクを、展開した白色と青色のプラクかる
接種した。１６時間、３７℃ではげしく撹拌した後、二
重ストランド ファージＤＮＡを、ミニプレプ法により
単離して、H207 Asp遺伝子の存在下でEcoRI-HindIII消
化によりチェックした。クローンは、pop2136(pEX1::BH
207 Asp)と称した。図１３は、その物理的、作用的なも
ののマップを示す。
【０１０３】プラスミドＤＮＡを、実施例１Ｂのマキシ
プレプ法により、このクローンから単離した。その後、
SmaI酵素(New England Biolabs.,USA)により製造者の指
示に従って、消化した。次に、沈殿させ、溶菌し、ｐｏ
ｐ２１３６細胞中に形質転換した。プラスミドＤＮＡ
は、展開したコロニーの培養物から単離した。ＤＮＡ
は、ＢａｍＨＩで消化させた（全工程は実施例１Ｂに従
って行なわれた）。ＢａｍＩで消化できない構成は、大
腸菌pop2136(pEX1::BH207 Aspfp)と称した。株は、寄託
番号[NCAIM (P)B 1169]として寄託された。
【０１０４】構成の正確さは、配列によりコントロール
された。この処理のために、コントロールプラスミドＤ
ＮＡを、pop2136(PEXi::BH207 Asp)株からマキシプレプ
法により(実施例1B)単離された。BH207 Asp構成は、M13
mp19ファージ ベクター(NewEngland Biolabs.,USA)
に、HindIII酵素を用いてサブクローン化された。
【０１０５】構成は、前記のベクター中での配列バ−ジ
ョン２．０ｋｉｔ(United States Biochemical,USA)に
より製造者の指示に従って、配列された。受け取った配
列の分析から、ヒルヂンは、β−ガラクトシダーゼのフ
レ−ムと結合した、そして、従って、融合タンパク質の
製造が可能であることが明らかにされた。融合タンパク
質中のヒルヂンの比率を上げるために、PvuII-SmaI及び
EcoRI-SamI欠失は、pop2136 (pEX1::BH207 Aspfp)の場
合と同様に構成され、SmaI、PvII消化(New England Bio
labs.,USA)及びEcoRV消化は、各々製造者の指示に従っ
て適用された。このように得られた株は、大腸菌pop213
6(pEX1::BH207 AsnデルタEcoRV-SmaI)と称され、寄託番号
[NCAIM (P)B 1177]として寄託された。
【０１０６】
【実施例６】：サッカロマイセス細胞中でのヒルヂン形
質発現 ６．Ａ．サッカロマイセス形質発現／分泌カセットの構
成 ６．Ａ．ａ）YpGYOK1及びYpGYOK2ベクターの製造 大腸菌−サッカロマイセス二作用のベクターによりヒル
ヂンを形質発現し、分泌するために、これらのヌクレオ
チド配列を配慮した：即ち、 −ＵＲＡ３及びロイシン２−ｄ遺伝子 −大腸菌及びサッカロマイセスの複製オリジン −単一ストランドＤＮＡの形成に対するインビトロ オ
リゴヌクレオチド介在突然変異原にためのバクテリオフ
ァージｆ1オリジン −サッカロマイセス中の操作する転写及び翻訳調節因子
（例えば、促進因子、プロモーター、分泌信号、転写終
了因子）
【０１０７】出発プラスミドは、3.2kbの大腸菌pBS(+/
-)(Stratagene)及びサッカロマイセスpJDB207[大腸菌MC
1061(pJDB207)[NCAIM (P)B 1184]プラスミドである。pB
S(+/-)プラスミドは、f1複製オリジンと遺伝子授与アン
ピシリン耐性を有する。pJDB207は、３．２２ｋｂ長の
ヌクレオチド フラグメント上のorigene遺伝子と２ミ
クロン イースト プラスミドのFLP遺伝子の転写ター
ミナイターを有する。ｇ２プラスミド[大腸菌MC1061(GY
OKI-pG-2)[NCAIM (P)B 1183]からの1.6kb長のフラグメ
ントは、URA3遺伝子とGAL1-GAL10の属間領域を有する。
【０１０８】YpGYOK1プラスミドの設計で、サッカロマ
イセスからのプロモーター−プル−ブのプラスミドによ
り単離されたｐＸプロモーターを配慮した。信号配列を
設計するために、クルイベロマイセス ラクチスのリ−
ダ− ペプチドをコード化する遺伝子フラグメントを、
出発物質として考えた。そして、それを、アプライドバ
イオシステム サイクロンＤＮＡ合成器上で、製造者の
指示に従って、実施例１の方法を用いて、インビトロ合
成した。次にヌクレオチド配列が合成された：ATG AAT
ATA TTT TAC ATA TTT TTG TTT TTG CTG TCA TTC GTT CA
A GGT ACCCGG GGA
【０１０９】M13mp19ファージ ベクターの前記遺伝子フ
ラグメント及びポリリンカ−配列も、挿入した。後者
は、次の制限切断位置を含有する：XhoI、SacI、SmaI、
BamHI、SalI、HindIIIである。製造者の指示を用いて制
限消化を行なった後、フラグメントを、電気溶出により
単離し、配位結合し、次に、大腸菌−サッカロマイセス
プラスミドを単離し、YpGYOK1と称した。前記のプラ
スミドを含有する大腸菌株は、寄託番号[NCAIM (P)B 11
66]の下で寄託した。図１９は、YpGYOK1の部分制限及び
作用のマップを示す。YpGYOK2プラスミドは、YpGYOK1ベ
クターに対して、全部で２ミクロンの配列をなす。図１
９は、その部分制限及び作用マップである。大腸菌株
は、YpGYOK2プラスミドを有し、[NCAIM (P)B 1167]の寄
託番号として寄託した。
【０１１０】６．Ａ．ｂ）YpGYOK1HN及びYpHYOK1HPの製
造 大腸菌JM109[pUC19::H207 Asp (NCAIM (P)B 1171)]及び
大腸菌JM109[pUC19::H221 Asn (NCAIM (P)B 1175)]株
（前記の方法で製造された）は、Kpn-SphI制限位置の間
にクローン化された合成ヒルヂン構造遺伝子を含有す
る。ヒルヂン遺伝子を有する約１．２ｋｂ長さのフラグ
メントは、単離されたプラスミドＤＮＡ（前記の方法）
から、ＳａｃＩ及びＨｉｎｄIII制限エンドヌクレア−
ゼ(Amersham)により、製造者の指示に従って、切断され
た。その後、ゲル電気泳動により、１．８％のアガロ−
ス中で分離された。次に、所望のフラグメントを切断
し、透析バッグ中で電気溶出した。クロロホルムでの抽
出後、ＤＮＡをエタノ−ルで沈殿させ、１０μｇの蒸留
水に再溶解させた。
【０１１１】YpGYOK1プラスミドを、大腸菌（前記の実
施例６Ａａ参照）から単離した。そして、ＤＮＡを、Ｂ
ａｍＨＩ及びHindIII酵素(Amersham)で製造者の方法を
用いて、消化させた。ゲル電気泳動と精製法（前記参
照）により分離した後、８．９ｋｂ長さのフラグメント
を蒸留水中に再溶解した。
【０１１２】３μｌの０．２ｋｂ長のSacI-HindIIIフラ
グメントと3μｌの8.9kb長のBamHI-HindIIIフラグメン
トを混合し、製造者の指示に従って、BamHIとSacIの付
着エンドと実施例１で製造された合成アダプターと結合
することにより、配位結合(T4ＤＮＡ リガーゼ、Boehri
nger Mannheim GmbH,ドイツ）した。前記のアダプター
のヌクレオチド配列は、 5’-GATCCGGGCCCTGTTAGAGCT-3’ 3’-GCCCGGGACAATC-5’である。
【０１１３】配位結合した後、大腸菌MC1061細胞(Pharm
acia LKB)を、上記の方法を用いて形質転換した。ヒル
ヂン構造の導入した後、得られたYpGYOK1HN及びYpGYOK1
HPベクターのＤＮＡ中で、次のヌクレオチド配列は、信
号配列をコード化する領域と結合することにより形成さ
れる。 Met Asn Ile Phe Thr Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe ATG AAT ATA TTT TAC ATA TTT TTG TTT TTG CTG TCA TTC Val Gln Gly thr arg gly ser gly pro cys STOP GTT CAA GGT ACC CGG GGA TCC GGG CCC TGT TAG AGC TCG KpnI BamHI ApaI SacI GTA CGG GGC CAT GGT-HIRUDIN-TA GTA AGC ATG CAA GCT T SphI HindIII
【０１１４】アダプター配列は、下線されており、不利
な遺伝子部分のアミノ酸配列は、小文字で示される。３
３位置でのアスパルチン酸或いはアスパアラギンをコー
ド化するヒルヂン遺伝子を含有するサッカロマイセス
ベクターは、制限マッピングにより制御され、各々、Yp
GYOK1HN及びYpGYOK1HPとして称される。図１４と１５
は、前記のプラスミドを製造するに使用される処理法を
図式的に示すものである。
【０１１５】６．Ａ．ｃ）ＹＥｐＧＹＯＫ１Ｈ及びＹＥ
ｐＧＹＯＫ１ＨＰの構成 ヒルヂン遺伝子は、信号ペプチドをコード化するヌクレ
オチド配列のフレ−ムにはなく、更に、ヒルヂンの正確
な切断位置は、予知できない。インビトロ オリゴヌク
レオチド−媒介の突然変異原は、適当な読み取りフレ−
ムを調節し、そして、ヒルヂンＮ−末端の信号ペプチダ
−ゼ上流の切断位置を形成するために、使用できる。突
然変異原に対して、バイオ−ラッド(Bio-Rad:Richmond,
CA,USA)MUTA-GENE kitを製造者の指示に従って、適用し
た。
【０１１６】６．Ａ．ｃａ）チミンの代わりにウラシル
を有するＹＥｐＧＹＯＫ１Ｈの単一標準ＤＮＡの製造 大腸菌CJ236 細胞(kit参照)は、上記の方法に従って、Y
pGYOK1HN及びYpGYOK1HPベクターＤＮＡ(実施例6Ab)によ
り形質転換された。前記の株の突然変異細胞は、大きな
頻度で、チミンの代わりにウラシルをＤＮＡ中に含有し
ている。チミンの代わりにウラシルを有する単一ストラ
ンドのＤＮＡは、大腸菌CJ236(YpGYOK1H)株から次の方
法を用いて単離された。
【０１１７】大腸菌K12 CJ236(YpGYOK1H)培養物一夜成
長物は、３０μｇ／ｍｌのクロルアムフェニコ−ル及び
１００μｇ／ｍｌのアンピリンを含有するＬＢ培地２０
ｍｌ中で培養し。６時間で３７℃の撹拌器で培養した
後、Ｍ１３Ｒ４０８ヘルパ−ファージの１〜３×１０6p
fuで感染させた。最終的に、撹拌器中で３７℃で一夜培
養した。培養物の上澄液中で、ファージ粒子は、Ｍ１３
ファージのゲノムの代わりに単一−ストランドＹｐＧＹ
ＯＫ１Ｈ ＤＮＡを含有する。
【０１１８】遠心分離により培養物ブロスから細胞を除
去した後、ファージは、酢酸アンモニウム（０．８Ｍの
最終濃度）とポリエチレン グリコ−ル８０００（最終
濃度４％）を用いて、上澄液から沈殿された。ファージ
沈殿は、ＴＥバッファ中に懸濁され、フェノ−ルで抽出
された。エチレンジアミン−テトラ酢酸の存在下で、フ
ァージのタンパク質皮膜を開くことができ、従って、フ
ェノ−ル抽出により除去するに適するものである。チミ
ンの代わりにウラシルを含みYpGYOK1Hの単一ストランド
ＤＮＡを、エタノ−ル（２．５倍量）で沈殿し、ＴＥバ
ッファ中で再溶解した。
【０１１９】６．Ａ．ｃｂ）突然変異原オリゴヌクレオ
チド 次の４８マ−の合成オリゴヌクレオチドを、インビトロ
突然変異原に用いた。オリゴヌクレオチドを、上記の方
法を用いて、製造できた。
【０１２０】5’-GCC GGT GTA AAC AAC TCT CTT ATC CA
A AGA TAC ACC TTG AAC GAA TGA-3’ 下線したセグメントは、YpGYOK1Hベクター中のヒルヂン
の第１の５−アミノ酸残査に、そして、クルイベロマイ
セス ラクチス(Kluyveromyces lactis)配列信号ペプチ
ドの最後の５−アミノ酸残査（図１５参照）に相当して
いる。
【０１２１】オリゴヌクレオチド介在突然変異原により
再構成されたベクターＤＮＡにおいて、次の要素が順次
に見出され得る。 クルイベロマイセス ラクチスの信号
ペプチドのコード化するセグメント、α−マットイング
型イースト中のα−因子プレプロ−リ−ダ−の最後の４
アミノ酸をコード化するＤＮＡ配列とリシンとアルギニ
ンのコード化するＫＥＸ２エンドペプチダ−ゼの切断位
置のヌクレオチド配列。突然変異原オリゴヌクレオチド
は、ヒルヂン遺伝子と信号ペプチド配列の間の翻訳フレ
−ムを調節し、ヒルヂンのＮ−末端部分での信号ペプチ
ド切断位置を形成するの両方に適するものである。
【０１２２】６．Ａ．ｃｃ）ＹｐＧＹＯＫ１Ｈベクター
の２重ストランド形を形成し、そのコピー ストランド
には、ウラシル基が欠いており、チミジンの代わりにウ
ラシルを含有する前記ベクターＤＮＡの形の単一ストラ
ンド形から、突然変異原オリゴヌクレオチドを用いて、
形成した ２００ｐＭの突然変異原オリゴヌクレオチド（実施例６
Ａｃｂ参照）、３μｌの１Ｍトリス・Ｃｌ（ｐＨ８．
０）、１．５μｌの０．２Ｍ ＡＴＰの混合物を、蒸留
水で、３０μｌに調整した。混合した後、４．５単位の
Ｔ４ポリヌクレオチド キナ−ゼ酵素（上記参照）を添
加し、反応混合物を、４５分間、３７℃で培養した。反
応は、６５℃で１０分間の熱不活性化により遮断され
た。
【０１２３】０．１ｐＭの前記の燐酸化突然変異原オリ
ゴヌクレオチド、チミンの代わりにウラシルを含有する
１００ｎｇの単一ストランドYpGYOK1HベクターＤＮＡ、
２０ｍＭの塩化マグネシウム及び５０ｍＭのＮａＣｌ
を、９μｌの混合物に添加した。混合した後、６５℃で
５分間培養した。混合物は、次に、約４０分間で室温に
連続的に冷却した。
【０１２４】YpGYOK1HベクターＤＮＡの補償ストランド
は、前記のベクターの単一ストランド形上のプライマ−
として、アニ−ルされた突然変異原オリゴヌクレオチド
を用いて、インビトロ合成された。ウラシルを、伸長反
応（チミンのみ）に添加していないので、インビトロ合
成された補償ストランドは、ウラシル残査を含有できな
かった。アニ−ルされたオリゴヌクレオチドを含有する
単一ストランド ベクター９μｌ；４つのｄＮＴＰを含
有し、２．５ｍの濃度の溶液３μｌ、０．５μｌの１０
ｍＭ ＡＴＰ含有溶液、０．１Ｍトリス・Ｃｌ（ｐＨ
７．４）、０．０５Ｍ塩化マグネシウム及び０．０２Ｍ
ＤＤＴ、２単位のＴ４ ＤＮＡリガ−ゼ（前記参照）
及び１．５μｌ（２単位）のＴ４ ＤＮＡポリメラ−ゼ
を添加した。この反応混合物を、先ず、５分間、氷浴で
培養し、次に、１２０分間、３７℃で培養した。４０μ
ｌのＴＥバッファを添加した後、混合物を凍結した。得
られた反応混合物中で、雑種（ハイブリッド）二重スト
ランドＤＮＡがあり、その中には、１ストランドが、チ
ミンの代わりにウラシル残査を含有し、配列信号配列と
ヒルヂンとの結合部分は、実施例６Ａｃｂの説明に相当
し、一方、他のストランドでは、配列信号とヒルヂンと
の間を結合するセグメントの配列は、突然変異原オリゴ
ヌクレオチドの配列に相当している。
【０１２５】６．Ａ．ｃｄ）ヒルヂンの形質発現及び分
泌に適するYEpGYOK1HN及びYEpGYOK1HPＤＮＡベクターの
作成のための最終工程 実施例６Ａｃｃの方法により、作成された、ハイブリッ
ド、二重ストランドＤＮＡベクターを、大腸菌Ｋ１２
ＭＶ１１９０（キット参照）競合細胞（上記参照）中に
形質転換した。この株の中で、ウラシル残査を含有する
ＤＮＡの複製頻度は低く、従って、形質転換体は、オリ
ゴヌクレオチドにより５０％の確率で、コードされた突
然変異を行なう。AmpR形質転換体から誘導されるプラス
ミドの制限的分析により決定され、２〜５が所望の突然
変異となるとされ、即ち、YEpGYOK1HNプラスミドとな
り、一方、４〜６は、他の反応混合物中でYEpGYOK1HPプ
ラスミドを含有していた。図１５は、上記のプラスミド
を製造するに用いるインビトロ突然変異原を図式的に示
すものである。
【０１２６】６．Ａ．ｃｅ）ヒルヂンの形質発現と分泌
のために適するYEpGYOK1HＤＮＡベクターのヌクレオチ
ド配列の分析。 配列信号及びヒルヂン配列の結合領域を、インビトロ
オリゴヌクレオチド−媒介−突然変異原により得られた
YEpGYOK1HベクターＤＮＡをコントロールするために、
測定した。YEpGYOK1Hベクターは、ＳａｃＩ及びヒンド
(Hind)III制限エンドヌクレオチドによる消化され、２
８０ｋｂの長いフラグメントコード化ヒルヂンを、ゲル
電気泳動により分離し、次いで、上記の方法によりゲル
から単離した。
【０１２７】YEpGYOK1Hベクターは、SacIとHindIII制限
エンドヌクレアーゼ(上記参照)により消化され、そし
て、280kb長のヒルヂンをコードするフラグメントは、
ゲル電気泳動により分離され、そして、上記の方法に従
って、ゲルから単離された。
【０１２８】M13mp19ファージ ベクター(Stratagene)
は、SacIとHindIII酵素により消化された。次に、前記
の遺伝子フラグメントと配位結合された。配位結合混合
物は、競合的大腸菌細胞中に形質転換された。組替え体
ファージを形質転換体から選択した。M13mp19中の分泌
信号-ヒルヂン遺伝子構成を有する株は、LB培地中で培
養された。単一ストランド ファージＤＮＡは、実施例6
Acaと同じ方法を用いて、培養物の上澄液から製造され
た。
【０１２９】このようにして得られた単一ストランドＤ
ＮＡのヌクレオチド配列は、サンガ−(Sanger)ジデオキ
シ−介在の鎖化方法により測定された。配列決定実験に
従って、ＡチャンネルとＣとＤチャンネルの読み取れる
部分は、期待通りである。
【０１３０】６．Ａ．ｄ）YEpGYOK1eb1の形成 YEpGYOK1HN及びYEpGYOK1HPプラスミド(実施例６参照）
を、HindIII制限酵素により消化した。更に、ムング
ビ−ン(Mung Bean)エンドヌクレアーゼ(Pharmacia)で処
理した。次に、次のXhoI制限切断位置は、次のアダプタ
ー((New EnglandBiolabs.の製品)を用いることにより形
成された: 5’-CCGCTCGAGCGG-3’ XhoI切断位置を形成するために、ブラント末端ＤＮＡと
アダプターを含有する反応混合物は、Ｔ４ＤＮＡリガ−
ゼ(Boehringer Mannheim GmbH.,ドイツ)により、製造者
の指示に従って、配位結合された。
【０１３１】６．Ａ．ｅ）YEpGYOK1eb2の形成 ２０μｌのYEpGYOK2eb2プラスミドＤＮＡ(実施例6Aiの
方法で製造した)、１０μｌのＥ１バッファと６８μｌ
の蒸留水を混合した。Ｅ１バッファを製造するために、
５００μｌの２Ｍトリス・Ｃｌ（ｐＨ７．４）、１６６
０μｌの３ＭＮａＣｌ、１０００μｌの１Ｍ塩化マグネ
シウム、５０μｌのメルカプトエタノ−ル、６７９０μ
ｌの蒸留水を混合した。プラスミドＤＮＡ含有の反応混
合物に、２０単位のSacI及び20単位のBamHI制限エンド
ヌクレアーゼ(Amersham,England)を添加した。信号配
列、ヒルヂン構造遺伝子及びGAPDHターミナイターを含
有するSacI-BamHIＤＮＡフラグメントを上記のゲル電気
泳動及び電気溶出法を用いて、製造された。
【０１３２】１０μｌのＥ３バッファと６１μｌの蒸留
水を、２５μｌのYpGYOK1プラスミドＤＮＡ（実施例６
Ａａ）に添加した。２０単位のSacIと20単位のBamHI制
限酵素(Amersham,England)を添加した後、反応混合物
を、１６時間、３７℃で培養した。得られた線形ＤＮＡ
分子は、フェノ−ルで抽出し、タンパク質を除去し、沈
殿せしめた。ＤＮＡ分子を真空中で解離した後、沈殿物
は、１０μｌの蒸留水中に再溶解せしめた。
【０１３３】３μｌのＬ配位結合バッファ、１μｌのＤ
ＴＴ溶液、１μｌのＡＴＰ溶液及び１μｌの蒸留水は、
４μｌの各、前記の方法で製造された線形ＤＮＡ試料に
添加された。線形ＤＮＡ分子を結合するために、反応混
合物は、１μｌ（２．５単位）のＴ４ ＤＮＡリガ−ゼ
(Amersham,England)を補充され、１６時間１５℃で培養
された。
【０１３４】YEpGYOK1eb2環状分子は、反応混合物中に
現れ、上記の方法により単離される。図１６は、処理方
法とプラスミドを図式的に示す。
【０１３５】６．Ａ．ｆ）YEpGYOK1(eb2)2(図１６参
照）の構成 ６．Ａ．ｆａ）pUC19eb2プラスミドの製造 実施例６Ａｅに従って、製造された２０μｌのYEpGYOK1
eb2プラスミドＤＮＡと10μｌのE4バッファと66μｌの
蒸留水を混合した。20単位のXhoI及び20単位のSalI制限
エンドヌクレアーゼをプラスミドＤＮＡ含有混合物中に
添加した。次に、１６時間３７℃で培養した。eb2形質
発現カセットを含有するＤＮＡフラグメントを、上記の
方法を用いて、アガロース ゲル電気泳動と電気溶出に
より単離した。
【０１３６】pUC19環状プラスミドは、SalI制限酵素に
より線形化し、次に、ゲル電気泳動及び電気溶出法によ
り単離された。eb2形質発現カセットを含有する線形pUC
19プラスミドＤＮＡ及びＤＮＡフラグメントは、T4リガ
ーゼ(前記参照)により配位結合された。pUC19eb2環状Ｄ
ＮＡ分子は、反応混合物中に見られ、上記の方法を用い
て単離された。
【０１３７】６．Ａ．ｆｂ）YEpGYOK1(eb2)2の製造 YEpGYOK 1eb2プラスミドは、BamHI制限酵素により前記
の環境下で線形化された。eb2形質発現カセットを含有
するＤＮＡフラグメントは、pUC19eb2プラスミドから
(実施例6Afa参照)、BamHI制限酵素により上記の方法を
用いて単離された。線形フラグメントは、配位結合(上
記参照)により結合された。YEpGYOK1(eb2)2環状ＤＮＡ
分子は、YEpGYOK1eb2ＤＮＡの線形フラグメント及びeb2
形質発現カセットを有するフラグメントを含有する反応
混合物中に現れた(図17参照)。
【０１３８】６．Ａ．ｇ）YEpGYOK1eb6の形成 ６．Ａ．ｇａ）pUC19eb6プラスミドの形成 pUC19::H16プラスミドＤＮＡ(実施例4A)を形成方法を用
いてBamHIとSphI制限酵素により消化せしめた後、プロ
モーターとバチルス サーキュランスα-アミラーゼと
ヒルヂン構造の信号配列を、前記のプラスミドから単離
した。eb2カセットを含まないフラグメントを、pUC19eb
2プラスミドＤＮＡ(実施例6Afa)からBamHIとSphI酵素を
用いて単離され、消化された。最終的に、GAPDHターミ
ナイターを含有するＤＮＡフラグメントが製造され、pU
C19eb2プラスミドＤＮＡから、SphI制限エンドヌクレア
ーゼにより単離された。製造されたＤＮＡフラグメント
は、前記の方法を用いて、配位結合された。pUC19eb6環
状プラスミドは、3つのフラグメントを含有する反応混
合物中にあった。
【０１３９】６．Ａ．ｇｂ）YEpGYOK1eb6の形成 YpGYOK1プラスミドは、BamHI制限酵素により所望方法を
用いて線形化された。その後、eb6形質発現カセットを
含有するＤＮＡフラグメントは、pUC19eb6プラスミドか
らBamHI消化酵素(上記参照)を用いて単離した。線形Ｄ
ＮＡフラグメントは、上記の方法を用いて配位結合され
た。eb6形質発現カセットを含有するYEpGYOK1eb6環状Ｄ
ＮＡ分子は、反応混合物(図１８、１９参照）中に現れ
た。
【０１４０】６．Ａ．ｈ）YpGYOK2T(図２０参照）の形
成 20μｌのYpGYOK2プラスミドＤＮＡ(実施例6A)、20μｌ
のE4バッファと156μｌの蒸留水を混合した。2Mトリス
・Ｃｌ（ｐＨ７．９）のバッファ５００μ、５０００μ
ｌの３ＭＮａＣｌ、１０００μｌの１Ｍ塩化マグネシウ
ム、５０μｌのメルカプトエタノ−ル及び３４５０μｌ
の蒸留水を混合した。２０単位のSalIと20単位のBamHI
制限エンドヌクレアーゼ(Amersham,England)を、プラス
ミドＤＮＡを含有する反応混合物に添加した、次に、１
６時間、３７℃で培養した。
【０１４１】制限エンドヌクレアーゼを使用することに
より製造したYpGYOK2ＤＮＡのフラグメントを、アガロ
ース ゲル 電気泳動により分離し、次に、精製した。
この方法で、13.2kb長のSalI-BamHI線形旋回ＤＮＡ分子
を得た。25μｌのpGAPTプラスミドＤＮＡ[NCAIM (P)B 1
164]、10μｌのE4バッファと61μｌの蒸留水を混合し
た。20単位のSalIと20単位のBamHI制限エンドヌクレア
ーゼ(Amersham,England)をプラスミドＤＮＡ含有の反応
混合物中に添加した。次に、16時間37℃で培養した。GA
PDHターミナイター領域を含有する線形ＤＮＡフラグメ
ントは、SalIとBamHIの付着性末端を有し、エンドヌク
レアーゼで処理したpGAPTプラスミドのフラグメントか
ら製造された。線形ＤＮＡ分子の配位結合に対して、次
の溶液を利用した：Ｌ溶液 ：2.5mLの1Mトリス・Ｃｌ（ｐＨ７．６）、２．
５ｍｌの２．５Ｍ塩化マグネシウム及び５ｍｌの５０％
ポリエチレン グリコ−ル６０００(Fluka A.G.)を混合
し、2.5mgのウシ血清アルンミン(Sigma,USA)をそこに溶
解させた。DDT溶液 :3.09gジチオツレイト−ルを、２０ｍｌの０．
０１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）溶液中に溶解させ
た。ATP溶液 :60mgのアデノシン３燐酸塩を、８００μｌの水
に溶解させた。ｐＨを０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液で
７．０に調節し、蒸留水で１０００μｌにした。溶液
は、４℃で製造した。
【０１４２】次の溶液を、各々４μｌのＤＮＡフラグメ
ント含有溶液に添加した：３μｌのＬ溶液、１μｌのDD
T溶液、1μｌのATP溶液と1μｌの蒸留水。線形ＤＮＡ分
子を結合するために、反応混合物には、２．５単位のＴ
４ＤＮＡリガーゼ(Amersham,England)含有溶液１μｌを
補充し、次に、１６時間、１５℃で培養された。この処
理の後に、GAPDHターミナイター含有のYpGYOK2T ＤＮＡ
分子が、反応混合物中に現れた。
【０１４３】６．Ａ．ｉ）YEpGYOK2eb2(図２０参照）の
製造 20μｌのYpGYOK2Tプラスミド、10μｌのE4バッファと69
μｌの蒸留水を混合した。20単位のSalI制限エンドヌク
レアーゼ(Amersham,England)を反応混合物中に添加し、
16時間、37℃で培養した。タンパク質抽出(前記参照)の
後に、線形ＤＮＡ分子を沈殿せしめ、10μｌのTE(実施
例1B参照)中に再溶解させた。
【０１４４】20μｌのYEpGYOK1eb1プラスミドＤＮＡ(実
施例6Ad)、10μｌのE3バッファと68μｌの蒸留水を混合
した。E3バッファを製造するために、5000μｌの2Mトリ
ス・Ｃｌ（ｐＨ７．５）、3300μｌの3M NaCl、1000μ
ｌの1M 塩化マグネシウム、50μｌのメルカプトエタノ
−ル及び650μｌの蒸留水を混合した。20単位のXhoI制
限酵素(Amersham,England)を、プラスミドＤＮＡ含有の
反応混合物中に添加した。そして、16時間、37℃で培養
した。YEpGYOK1eb1 ＤＮＡのフラグメントは、その制限
酵素により消化され、電気泳動法により分離され、単離
された。XhoI付着性末端は、pXプロモーター、信号配列
及びヒルヂン構造遺伝子を含有する製造された小さいフ
ラグメントの末端に見出された。
【０１４５】SalI付着性末端及びYEpGYOK1eb1プラスミ
ドＤＮＡから誘導されたフラグメント(pXプロモータ
ー、信号配列、ヒルヂン構造遺伝子及びXhoI付着性末端
を含有する)を有するYpGYOK2Tプラスミドの製造された
線形ＤＮＡ分子は、配位結合できる。これは、XhoIとSa
lI-BamHI切断位置の単一標準部分が補償するために、達
成できる。配位結合の後に、形成された二重ストランド
ＤＮＡは、SalIでもXhoIでも切断されない。
【０１４６】3μｌの各線形フラグメントは、3μｌのL
溶液、1μｌのDTT溶液、1μｌのATP溶液(上記参照)及び
3μｌの蒸留水に添加された。線形ＤＮＡ分子を結合す
るために、2.5μｌのT4 ＤＮＡリガーゼ(Amersham,Engl
and)を含有する1μｌの溶液を、反応混合物に添加し
た。次に、16時間、15℃で培養した。環状YEpGYOK2eb2
ＤＮＡ分子は、上記の方法により単離された。図２０
は、前記のプラスミドの製造を図式的に湿し、その部分
制限と作用のマップを示す。
【０１４７】６．Ａ．ｊ）YEpGYOK2(eb2)2(図１７参
照）の形成 実施例６Ａｆｂの方法を、上記のYEpGYOK2eb2プラスミ
ドをYEpGYOK1eb2の代わりに用いて、行なった。
【０１４８】６．Ａ．ｋ）YEpGYOK2eb6(図１９参照）の
形成 実施例６Ａｆｂの方法を、YpGYOK1の代わりにYpGYOK2プ
ラスミドＤＮＡを利用して、行なった。この方法で、YE
pGYOK2eb6プラスミドＤＮＡが得られた。形質発現と分
泌カセットを含有する形質転換体により製造されたヒル
ヂンHV-1は、実施例6に説明された。単離され(実施例10
での方法を用いて)、同定され(実施例11で説明される方
法で)た生成物は、デスルファトヒルヂン ＨＶ−１で
あると証明された。 次の株が寄託された:サッカロマイセス セレビシアエ
(Saccharomyces cerevisiae) K25/2(YEpGYOK1eb2)[寄託
番号:[NCAIM (P)B 1172]、サッカロマイセスセレビシア
エ K25/4(YEpGYOK2eb2)[寄託番号:[NCAIM (P)B 1174]、
サッカロマイセス バヤヌス(Saccharomyces bayanus)
K9 (YEpGYOK2eb2)[寄託番号:[NCAIM (P)B 1174]。
【０１４９】６．Ｂ．発現／分泌ベクターＤＮＡをサッ
カロマイセス種への形質転換 プラスミドを、サッカロマイセス セレビシアエとサッ
カロマイセス バヤヌス株へと、次の処理法を用いて、
導入した。株を、次の成分を含有するYPDa培地上に保持
した:1％のイースト抽出物(Difco)、2％のペプトン(Dif
co)、２％のグルコ−ス及び２％のアガー(Bacto)。培地
をpH7.0に10％水酸化ナトリウム溶液で調節した。100ml
の滅菌YPD培養物(500ml全量エーレンマイヤー フラス
コ中)を、スラント培養物から細胞懸濁液により培養し
た。YPD培地の組成は、YPDaと同じで、前者はアガーな
しであった。培養物は、１６〜１８時間、２８℃で回転
撹拌器で培養した。１〜１．５×１０8の細胞／ｍｌを
含有する培養物ブロスを遠心分離した（5000rpm、10分
間)、次に、細胞を一度水で洗浄した。ペレットを１．
２Ｍのソルビト−ル、２５ｍＭのＥＤＴＡ及び５ｍＭの
ジチオツレト−ル（ｐＨ８．０）を含有する溶液中に懸
濁し、１０分間、２８℃でゆっくりと撹拌した。
【０１５０】予備処理した細胞を、遠心分離(3000rpm,1
0分間)により収穫した。1.2Mソルビト−ルで２回洗浄し
た後、次の成分を含有する混合物中に再懸濁した：pH5.
8(1Mのソルビト−ル、１０ｍＭのＥＤＴＡと１００ｍＭ
のクエン酸）のECS溶液中に溶解したノバジム(Novozym)
234(Calbiochem)の０．５％。細胞は、スフェロプラス
ト(Sheroplast)を形成し、注意深く撹拌し、28℃で培養
した。一方、１０〜１５分毎に顕微鏡で処理をコントロ
ールした。適するスフェロプラスト形成には、２５〜４
５分間が必要であり、それは、適用株に依存している。
スフェロプラストは、遠心分離され、０．８Ｍソルビト
ール溶液で２回洗浄した。次に、ペレットは、0.8Mのソ
ルビトール、10mMのトリス・Cl及び10mM塩化カルシウムを含
有するSTC混合物中で再び洗浄された。
【０１５１】スフェロプラストを形質転換するために、
所望のＤＮＡを、当量の２Ｍソルビトール溶液と混合
し、上記の方法に従って、製造されたSTC混合物0.5mlに
添加した。形質転換混合物は、注意深く撹拌され、28℃
で10分間培養された。次に、pH7.4のPEG-TC溶液の0.9ml
(次の成分:22％のポリエチレン グリコ−ル4000、10mM
の塩化カルシウム及び10mMのトリス・Clを含有する)を添加
した。25分間28℃で注意深く撹拌した後、形質転換体混
合物を遠心分離(12,000rpm、2秒)した。そして、ペレッ
トを、０．３ｍｌのソルビトール-YPD培地(YPD培地は、
2Mの1:1の比率のソルビトールと混合した))中に懸濁し
た。細胞壁を再生するために、細胞を、次の成分を含有
するMMWS-YNBアガー上にプレイトされた：０．６７％の
イースト窒素塩基（アミノ酸なし）、２．０％のグルコ
−ス、１８．２２％のソルビトール、２．０％アガー(B
acto)、そして、必要なアミノ酸或いはヌクレアーゼ塩
基（５０μｇ／ｍｌ）で補充された。０．１ｍｌの形質
転換混合物を、２０ｍｌの再生アガー上にプレイトし、
2%の代わりに3%アガーを含有して、７ｍｌの、MMWS-YNB
として同じ組成のトップ アガーで重ねた。培養物は、
２８℃でコロニーが現れるまで培養した。
【０１５２】次の株を、形質発現。分泌プラスミドＤＮ
Ａと実施例6Aの方法により形質転換した。 サッカロマイセス セレビシアエ GYOKI (M)1 [NCAIM
(P)B 1156] サッカロマイセス セレビシアエ GYOKI (M)5 [NCAIM
(P)B 1157] サッカロマイセス バヤヌス BO-74 [NCAIM (P)B
1158]
【０１５３】先ず、実施例８で説明した選択的培養条件
下で成長した形質転換体のヒルヂン製造は、監視され、
次に、培養物のヒルヂン濃度は、実施例９の説明の方法
を用いて、測定した。最終的に、ヒルヂンは、実施例１
０で説明するように、製造され、実施例１１に従って、
同定された。
【０１５４】
【実施例７】：ストレプトマイセス細胞のヒルヂンの形
質発現 ７．Ａ．形質発現／分泌ベクターＤＮＡの製造 ７．Ａ．ａ）ｐＭＩ１．３プラスミドの形成 全ＤＮＡを、ストレプトマイセス テネラリウス[NCAIM
(P)B 169]株から、実施例２Ｂを用いて単離したが、溶
析処理の間は、１．５時間でなく、１５分間であった。
形成した全ＤＮＡは、MboI制限エンドヌクレアーゼ(BR
L)で製造者の指示に従って、部分的に消化された。２〜
１０ｋｂの領域のＤＮＡフラグメントは、アガロース
ゲル 電気泳動法及び電気溶出法により単離された。そ
して、MboIフラグメント(BglII切断位置に挿入するに適
する）は、BglIIエンドヌクレアーゼで線形されたpIJ70
2ベクターＤＮＡストレプトマイセス リビダンス(Strep
tomyceslividans)pIJ702[NCAIM (P)B 1185]中に配位結
合された。ストレプトマイセスリビダンス[NCAIM (P)B
257]細胞は、配位結合した後pMIlプラスミド数により実
施例7Cに従って、形質転換された。形質転換体は、アプ
ラマイシンとトブラマイシンを含有する培地上に選択さ
れた。耐性ストレプトマイセス リビダンス形質転換体
の１つは、pMI1.3と証される。図２１は、このプラスミ
ドの部分制限及び作用マップを示す。
【０１５５】７．Ａ．ｂ）pMIMHHIR3/Aプラスミドの形
成 前に説明した方法で製造されたpUC19::H16プラスミドＤ
ＮＡのKpnIフラグメントは、KpnI制限酵素により切断さ
れるpMI1.3プラスミドＤＮＡ中に配位結合された。配位
結合混合物は、ストレプトマイセス リビダンス[NCAIM
(P)B 257]細胞中に次の方法を用いて、形質転換され
た。形質転換体は、５０μｇ／ｍｌのアプラマイシン及
び／或いはトブラマイシン(BIOGAL)を含有するR2YE培地
（以下参照）上に選択された。形質転換体のヒルヂン製
造は、実施例８、９に説明される方法を用いて、スクリ
ーンされた。耐性とヒルヂン製造株の１つは、ストレプ
トマイセス リビダンスpMIAMHIR3/Aと称される。このプ
ラスミドは、[NCAIM (P)B 1181]の寄託番号で寄託され
た。図２２は、その部分制限と作用のマップを示す。
【０１５６】７．Ａ．ｃ）pMI-K2デルタネオプラスミドの形
成 pGYOKI1/2プラスミド[ハンガリー特許明細書第197,045
参照、寄託番号[NCAIM(P)B 1009]のネオマイシン フォ
スフォトランスフェラ−ゼ遺伝子を含有するpネオAMHIR
プラスミドを製造するために、前記の遺伝子は、EcoRV-
XbaIフラグメント上に単離され、それは、pUC19::H16[N
CAIM (P)B 1170]プラスミド(バチルスサーキュランスα
−アミラーゼ及びヒルヂン構造遺伝子のプロモーター及
び信号配列を含有する形質発現カセットを有する）中に
挿入された。消化及び配位結合は、製造者に従って、得
られた。形質転換された細胞の形質転換及び選択は、上
記のように成された。製造されたプラスミドは、ｐＮｅ
ｏＡＭＨＩＲと称する。図２３は、その部分作用と制限
のマップを示す。ミニプレプ法によりｐＮｅｏＡＭＨＩ
Ｒを単離した後、ＤＮＡをＮｃｏＩ制限酵素により切断
し、付着性末端は、ムング ビ−ン ヌクレアーゼ(Ame
rsham)により処理された。ＥｃｏＲＶでの処理後、４．
６ｋｂ長のＥｃｏＲＶ−ＮｅｏＩフラグメントを、配位
結合により再環状化にした。制限消化及び配位結合は、
製造者の指示に従って、行なわれた。
【０１５７】配位結合混合物は、ストレプトマイセス
リビダンス細胞中に形質転換された。そして、形質転換
体の形質転換と選択は、上記の方法を用いて成された。
バチルスとネオマイシン フォスフォトランスフェラ−
ゼの構造遺伝子から誘導されるプロモーターは、得られ
たｐｄｅｌｔａＮｅｏＡＭＨＩＲプラスミドから失って
いるが、一方、ネオマイシン フォスフォトランスフェ
ラ−ゼのプロモーターは、バチルス サーキュランスα
−アミラーゼの配列信号の上流側に見られる。図２４
は、そのプラスミドの部分作用と制限のマップである。
【０１５８】ｐＭＩ−ｄｅｌｔａＮｅｏ（図２５参照）
大腸菌ストレプトマイセスの２作用のプラスミドを製造
するために、pdeltaNeoAMHIRプラスミドの3.6kg長のPst
-KpnIフラグメントを、pmI1.3プラスミドのPstI-KpnIフ
ラグメントに配位結合した。制限消化及び配位結合は、
製造者の指示に従って、行なわれた。プラスミドは、他
に大腸菌及びストレプトマイセス複製オリジン、ネブラ
マイシン抗生物質に対する遺伝子授受耐性、ストレプト
マイセスから誘導されたプロモーター、信号配列及びヒ
ルヂン構造遺伝子を含有する。前記のプラスミドを含有
する株は、寄託番号[NCAIM (P)B 1180]として、[大腸菌
MC1061 (pMI-deltaNeo)]寄託された。pMI-deltaNeoプラ
スミドは、ストレプトマイセス リビダンス中に形質転
換された。形質転換体の形質転換及び選択は、製造者の
指示に従って、行なわれた。
【０１５９】前記のプラスミドの形質発現カセットに対
して、転写ターミナイターは、その読み取り方向に相当
して、結合された。形質発現カセットを含有するEcoRI-
HindIIIフラグメントは、pdeltaNeoAMHIRプラスミドか
ら切り出され、pKK233-2プラスミド(Pharmacia)のEcoRI
とHindIII位置中に挿入された。制限消化と配位結合
は、製造者の指示に従って、行なわれた。この方法で、
pKK233-2ベクターのPtrcプロモーターは、転写ターミナ
イターの上流側の形質発現カセットにより置換された。
図２６は、前記のpKK-deltaNeoプラスミドの部分制限と
作用のマップを示す。
【０１６０】pKK-デルタネオプラスミドの５．１kbのKpnI-P
stIフラグメントを、pMI1.3ストレプトマイセス リビダ
ンスのKpnI及びPstI位置中に挿入し、ヒルヂン形質発現
と分泌の適する大腸菌-ストレプトマイセス二官能性Ｄ
ＮＡベクターを製造する。制限消化と配位結合は、製造
者の指示に従って、行なった。図２７は、得られたpMI-
K2デルタネオプラスミドの制限と作用マップを示す。このプ
ラスミドは、大腸菌のた め、そして、ストレプトマイ
セスのために、複製オリジン、微生物とヒルヂン製造の
ためのpKK-デルタネオプラスミドの形質発現/分泌カセット
の両方の選択的な培養を確保するマーカー遺伝子を含有
する。形質発現/分泌カセットは、ストレプトマイセス
から誘導されるネオ プロモーター、バチルス サーキ
ュランスα−アミラーゼ遺伝子の形質発現信号領域、合
成ヒルヂン遺伝子及び大腸菌rrnBT1T2の転写ターミナイ
ターを有する。前記のプラスミドを含有する大腸菌MC10
61 (pMI-K2デルタネオ)株は、寄託番号[NCAIM (P)B 1178]で
寄託された。
【０１６１】７．Ａ．ｄ．ストレプトマイセス コドン
用途に基づいて設計された新規な遺伝子の合成 新規な信号配列と構造の遺伝子は、ストレプトマイセス
種のコドン用途を配慮して設計された。図２は、その結
合点を示すオリゴマ−のヌクレオチド配列である。オリ
ゴマ−は、実施例１Ａの方法を用いて、受容細胞ベクタ
ーをM13mp18とM13mp19ファージ(New England Biolabs.,
USA)として、合成された。信号配列(ssで示す)は、Hind
IIIとPstIの間にクローン化された(実施例4C参照)。所
望のクローンは、製造者の指示に従って、受けるファー
ジを配列した後、選択された(配列バ−ジョン2.0kit,Un
ited States Biochemical,USA)。二重ストランド ファ
ージＤＮＡは、M13mp18::ss及びM13mp19::sg組替え体フ
ァージからマキシプレプ法により(実施例１Ｂ）、単離
された。両試料は、PstI及びBamHI酵素(New England Bi
olabs.,USA)により、製造者の指示に従って、消化さ
れ、更に、M13mp19::sgは、ClaI酵素で消化された。２
つの反応混合物を混合し、沈殿せしめ、配位結合され、
そして、形質転換した後、形質転換された細胞は、実施
例４Ｃの方法で、Ｘ−ゲルとIPTGを省略してプレイトさ
れた。実施例４Ｃの方法を用いて、EcoRIとHindIIIでの
消化の後に、ssとsgのオリゴヌクレオチドは、ゲル電気
泳動を用いて測定された。二重ストランド ファージＤ
ＮＡは、M13mp19::ss-sgファージから実施例１Ｂの方法
により単離された。製造者の指示に従って、PstI酵素(N
ewEngland Biolabs. USA)により消化した後、製造者の
指示に従って、ムング ビ−ン エキソヌクレア−ゼ(P
harmacia)により処理された。その後、沈殿させ、配位
結合され、形質転換され、実施例４Ｃに従って、Ｘ−ga
lとIPTGは使用しないで、プレイトされた。所望のクロ
ーンは、得られたファージ（セ−クエナ−ゼバ−ジョ
ン、2.0kit;United States Biochemical,USA)を製造者
の指示に従って、配列化した後、選択された。上記のク
ローンは、M13mp19::SH16と称された。SH16カセット
は、pUC19プラスミドに実施例１Ｂの方法を使用して、
サブクローン化された。株は、[NCAIM (P)B 1182]とし
て寄託された。
【０１６２】７．Ａ．ｅ．”SH16”を担持する大腸菌−
ストレプトマイセスの二官能性ベクター の
形成 ７．Ａ．ｅａ）二重ストランド ファージＤＮＡを、M1
3mp18::SH16組替え体ファージから実施例１Ｂの方法を
用いて、製造した。次いで、BamHIとClaIとHindIII酵素
(New England Biolabs.,USA)で製造者の指示に従って、
消化された。ファージスクリプト二重ストランドＤＮＡ
(Stratagene)をM13mp18二重ストランドＤＮＡ(実施例7A
c)を使用して、製造した後、ＤＮＡを、BamHIとClaIとH
indIII酵素(New England Biolabs.,USA)で製造者の指示
に従って、消化した。ファージスクリプト ファージ含
有の株を、ストラタジ−ン(Stratagene;USA)から得た、
そして、M13mp18の場合で使用した方法で保持し、伝搬
した。２つのＤＮＡ試料は、混合し、沈殿させ、配位結
合し、形質転換し、そして、その形質転換体は、実施例
４Ｃの方法を用いて、プレイトされた。所望の構成は、
白色プラクから誘導されたＤＮＡ（配列バ−ジョン２．
０ｋｉｔ；United States Biochemical;USA;その製造者
の指示に従って）の配列決定の後に、選択した。そし
て、ファージスクリプト::SH16と称した。GYO1095(pGYO
KI1/2)[NCAIM (P)B 1009]株を、実施例１ Ｂの方法によ
り保持した。伝搬の後、細胞の伝搬の間には、培地は、
３０μｇ／ｍｌクロルアンフェニコ−ルを含有すること
により、プラスミドＤＮＡをそこからマキシプレプ法に
より単離した。
【０１６３】pGYOKI1/2プラスミドＤＮＡは、BglIIとXb
aI酵素(New England Biolabs.,USA)により、製造者の指
示に従って、消化された。pUC18プラスミド(Pharmacia,
LKB;この株は、pUC19プラスミド含有の株と同様に維持
され,培養された)を含有する株を培養した後に、ＤＮＡ
をBamHIとXbaI酵素(New England Biolabs.,USA)によ
り、製造者の指示に従って、消化された。2つのＤＮＡ
試料は混合され、沈殿され、配位結合され、形質転換さ
れ、そして、実施例1Bによって、プレイトされた。得ら
れた白色のコロニ−から１２の試料は、培養され、プラ
スミドＤＮＡは、ミニプレプ法により単離された。そし
て、pUC18プラスミド中のpGYOKI1/2プラスミドの2.6kb
長の、BglII-XbaIフラグメントを含有する誘導体は、製
造されたＤＮＡは、EcoRIとHindIIIで消化することによ
り、そして、ゲル電気泳動法を適用することにより選択
された。それは、JM109(pUC18BamHI/XbaI::pGYOKI1/2 B
glIII/XbaI)と称した、そして、ＤＮＡはそこからマキ
シプレプ法により(実施例1B)により単離された。ＤＮＡ
は、NcoIとXbaI酵素(New England Biolabs.,USA)によ
り、製造者の指示に従って、消化された。二重ストラン
ドＤＮＡは、ファージスクリプト：：SH16からマキシプ
レプ法により(実施例1B)、単離された。それは、BamHI
とXbaI酵素(New England Biolabs.,USA)により、製造者
の指示に従って、消化された。２つの消化されたＤＮＡ
は、混合され、配位結合され、形質転換後、細胞は、５
０μｇ／ｍｌのアンピシリン（実施例１Ｂ参照）含有の
ＬＢプレイト上に塗られた。１２の形質転換体は、培養
され、プラスミドＤＮＡは、そこから、ミニプレプ法に
より単離され、850kb長のPstIフラグメントの存在を確
認した。消化されたＤＮＡフラグメントを、ゲル電気泳
動法により分離した。このプラスミド誘導体を含有する
大腸菌株は、JM(pUC18::NSH16)と称した。
【０１６４】前記のプラスミドの構成の間、ＮｃｏＩ消
化は、pGYOKI1/2プラスミドのネオマイシン配列のＡＴ
Ｇコドンの直前になされた。一方、ストレプトマイセス
コドン用途に基づいて設計されたＳＨ１６遺伝子は、
ＡＴＧコドンの直前のＢｓｐＨＩエンドヌクレア−ゼで
消化された。その消化のために、配位結合の後に、ネオ
マイシンのプロモーターは、ネオマイシン遺伝子に置い
たＳＨ１６に正確に結合する。
【０１６５】７．Ａ．ｅｂ）プラスミドＤＮＡを、JM10
9(pUC18::NSH16)から、ミクスプレプ法（実施例１Ｂ参
照）により単離した。そして、製造の指示に従って、Ps
tI及びXbaI酵素(New England Biolabs.,USA)で消化せし
めた。ＤＮＡの消化に対して、同じ方法を、ｐＧＹＯＫ
Ｉ1/2の場合に用いた。２つの消化物を混合し、溶析し
た。溶析物を、ＪＭ１０９競合細胞（実施例１Ｂ参照）
に形質転換し、形質転換された細胞を、３０μｇ／ｍｌ
のクロロアムフェニコ−ル含有のＬＢａ培地上にプレイ
トした。
【０１６６】展開されたコロニ−を、実施例１Ｂに説明
された方法を用いて、増殖させた。そして、プラスミド
ＤＮＡをそこから単離した。そのＤＮＡは、ＰｓｔＩ及
びＸｂａＩ酵素で消化した。そして、そのフラグメント
を、ゲル電気泳動法を用いて、分離した。蒸発した後、
ｐＧＹＯＫＩ1/2プラスミド中にＳＨ１６含有のクロー
ンの１つを、選択して、ＭＣ１０６１(pGYOKI::NSH16)
と称した。その株は、寄託番号[NCAIM (P)B 1199]の下
で寄託した。プラスミドＤＮＡを、マキシプレプ法によ
りこの株から単離した。
【０１６７】７．ｅｃ）ＧＹ１０９５(pGYOKI-1)株を実
施例１Ｂに説明された方法を用いて、保持した。そし
て、増殖後、プラスミドＤＮＡをマキシプレプ法により
製造された。培地中で、３０μｇのクロルアムフェニコ
−ルを使用することによった。pGYOKI-1プラスミドＤＮ
Ａを、ＰｓｔＩにより消化した、そして、ＸｂａＩ酵素
(New England Biolobs.,USA)により部分的に製造指示に
従って、消化せしめた。
【０１６８】二重ストランドＤＮＡは、pUC18::NSH16か
らマキシプレプ法により(実施例１Ｂ）、単離された。
そして、ＤＮＡは、ＰｓｔＩ及びＸｂａＩ酵素(New Eng
landBiolabs.,USA)で、製造者の指示に従って、消化さ
れた。２つの試料の混合の後、これらを、配位結合し、
形質転換し、実施例１Ｂを使用して、３０μｇ／ｍｌの
クロルアンフェニコ−ルを含有するＬＢａ培地中にぬっ
た。１２の形質転換体を培養し、プラスミドＤＮＡを、
それから、ミニプレプ法により、単離し、８５０ｋｂの
長さのＰｓｔＩ ＸｂａＩフラグメントの存在を確認し
た。ＤＮＡは、ＰｓｔＩ ＸｂａＩ酵素で消化され、消
化されたＤＮＡフラグメントは、ゲル電気泳動法により
分離した。所望の株は、JM109(pGYOKI-1::XNSH16)と証
した。プラスミドＤＮＡを、前記の株から、マキシプレ
プ法により（実施例１Ｂ）、単離した。
【０１６９】７．Ａ、ｅｄ）実施例１Ｂに説明された方
法を用いて、ＧＹＯＫ１０９５（ｐＧＹＯＫＩ−１）株
を維持した。培養の後、プラスミドＤＮＡを、Ｐｓｔ酵
素(NewEngland Biolabs.,USA)で、製造者の指示に従っ
て、消化した。二重ストランドＤＮＡを、pUC18::NSH16
から単離し、そして、ＤＮＡを、PstI酵素(New England
Biolabs.,USA)で、製造者の指示に従って、消化した。
２つの試料を混合し、配位結合し、形質転換し、そして
形質転換体を、３０μｇ／ｍｌのクロルアンフェニコ−
ル含有のＬＢａ培地上に、実施例１Ｂの方法を適用し
て、ぬった。１２の形質転換体を、培養し、プラスミド
ＤＮＡをそれから単離した。ＰｓｔＩ消化の後、８５０
ｋｂの長さのフラグメントを含有する所望の構成を、ゲ
ル電気泳動法により選択した。この場合、挿入したもの
は、互いに、HindIII消化により分離できる２つの方向
に配位できる。この方法で得られた構成は、JM109(pGYO
KI-1::PNSH16A)とJM109(pGYOKI-1::PNSH16B)とされた。
プラスミドＤＮＡは、これらの株から、マキシプレプ法
により（実施例１Ｂ）、単離された。
【０１７０】７Ｂ．ストレプトマイセス リビダンス(S
treptomyces lividans)細胞の変換 ストレプトマイセス リビダンス(Streptomyces lividan
s)株の胞子懸濁液を、次の成分を含有するＲ２ＹＥ培地
の斜面上に線状接種した。 サクロ−ス １０．３％ 硫酸カリウム ０．０２５％ 塩化マグネシウム６水和物 １．０１２％ グルコ−ス １．０％ カゼイン加水分解物（酸）（Difco) ０．０１ ％ 微量元素溶液 ０．１％ ＴＥＳバッファ（ｐＨ７．２） ０．５７３％ 水酸化ナトリウム ０．０７５％ アガー（Ｂａｃｔｏ） ２．２％ 微量元素溶液の組成は、次の通りである。 塩化亜鉛 ４０ｍｇ 塩化第１銅１０水和物 １０ｍｇ モリブデン酸アンモニウム４水和物 １０ｍｇ 塩化第１鉄６水和物 １０ｍｇ 塩化化合物４水和物 ２００ｍｇ 塩化マンガン４水和物 １０ｍｇ 蒸留水 １０００ｍｌ ＴＥＳバッファは、１０ｍＭのトリス・Ｃｌ（ｐＨ８．
０）、１ｍＭのＥＤＴＡ及び５０ｍＭのＮａＣｌを含有
している。
【０１７１】培地は、１２１℃で２０分間に滅菌した。
次に、１％ｖ／ｖの滅菌０．５％２水素燐酸カリウム、
８．０％ｖ／ｖの滅菌３．７％の塩化カルシウム溶液及
び１．５％ｖ／ｖの滅菌２０％のプロリン溶液を添加し
た（ｐＨ７．２）。２８℃で４日培養した後、培養物
は、蒸留水で洗浄し、スポアを回収した。スポア懸濁液
は、１００ｍｌのＢＩＢＢ１０培地中に接種した。培地
は、５００ｍｌのエーレンマイヤー フラスコ中で滅菌
された。ＢＩＢＢ１０培地の組成は、次の通りである。 サクロ−ス １０．０％ イースト抽出物 ０．３％ ペプトン ０．５％ マルト抽出物 ０．３％ 塩化マグネシウム６水和物 ０．１％ グルコ−ス １．０％
【０１７２】滅菌の前に、ＢＩＢＢ培地を、ｐＨ７．０
に、１０％水酸化ナトリウムで調節した。培養培地を回
転撹拌器上で、２６０ｒｐｍで２４時間２８℃で撹拌し
た。次に、３ｍｌの同じものを、１００ｍｌの新鮮な、
接種の前に０．５％のグリシンで補充されたＢＩＢＢ１
０培地中に接種した。これらの培養物は、１８時間、上
記の培養条件で、培養され、チェックの後に、細胞を、
遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０分間）で回収した。１
００ｍｌの培養ブロスから誘導された菌糸体を、次の組
成分を含むＰＨ混合物（ｐＨ７．０）中に懸濁した。 サクロ−ス １１．３％ 硫酸カルシウム ０．０２５％ 塩化マグネシウム６水和物 ０．２％ 微量元素溶液（上記参照） ０．２ｖ／ｖ％ ２水素燐酸カリウム ０．００５％ 塩化カルシウム２水和物 ０．３７％ ＴＥＳバッファ（ｐＨ７．２参照） １０．０ｖ／ｖ％
【０１７３】１ｍｇ／ｍｌのリソチ−ムを、上記の懸濁
液に添加し、２８℃で培養し、一方、プロトプラスト形
成を１５分毎にチェックした。３０〜６０分が、完全な
プロトプラスト形成に必要である。５ｍｌのＰＨバッフ
ァを、プロトプラスト懸濁液に混合した。次に、１０分
間で固定された。固定されない懸濁液部分を、２ｍの高
さで綿−ウ−ルを含有するカラムで、濾過した。濾過し
たプロトプラストを遠心分離（上記参照）した。そし
て、ペレットを２回洗浄し、形質転換のために用いた。
【０１７４】プラスミドＤＮＡ（一般的に１０μｌＤＮ
Ａ〜１０9プロトプラスト）を、プロトプラストのの緩
んだペレットに添加した。そして、ＰＨバッファ中に溶
解した４０％のポリエチレン グリコ−ル０．５ｍｌで
補充した。１時間ゆっくりと混合した後、上記の懸濁液
を含有するチュ−ブを、１０分間、３５００ｒｐｍで遠
心分離した。プロトプラスト混合物を、Ｒ２ＹＥアガー
プレ−ト（組成は上記で説明）の表面に注入した。２
８℃、２４時間、プレ−トに接種した後、必要な抗生物
質を含むトップ アガーをその上に重ねた。トップ ア
ガーの組成は、次のものである。 ラブ レムコ(Lab Lemco)粉末(肉抽出物) ０．０６％ イースト 抽出物 ０．１２％ ペプチド（Difco) ０．３％ アガー(Bacto) ０．６％ ＳＮＡ（ｐＨ７．２）で示される。培養物は、２８℃
で、転換されたコロニ−が出現するまで、培養した。α
−アミラーゼ或いはネオマイシン プロモーターの転写
コントロールに下で、ヒルヂンＨＶ−１の２つの変異型
を形質転換する能力を有するストレプトマイセス株を作
成するために、また、ヒルヂンを、α−アミラーゼ遺伝
子のヌクレオチド或いは分泌信号ペプチドをコード化す
る合成ヌクレオチド配列を用いて、培養物ブロス中に、
分泌するために、大腸菌−ストレプトマイセス二官能性
プラスミド（実施例７Ａ）を、ストレプトマイセス細胞
中に、実施例７Ｂで説明した方法を使用して、転写し
た。ストレプトマイセス リビダンス(NCAIM (P)B 257)
株の場合に、形質転換効率は、１×１０6細胞を用い
て、１０００−５０００転換され、コロニ−／１μｇの
ＤＮＡに転換した。選択滴な培養条件を用いて、形質転
換体をスクリーンし、製造されたヒルヂンの濃度を、実
施例９の方法で測定した。次に、生成物を、実施例１０
により単離した。そして、実施例１１で説明したよう
に、最終的に同定した。結果は、実施例８に完全に説明
される。
【０１７５】次の株を次の寄託番号で寄託された：大腸
菌 JM109(pUC19::SH16)[NCAIM (P)B 1182]、大腸菌 MC1
061(pGYOKI::NSH16)[NCAIM (P)B 1179]、ストレプトマ
イセス リビダンスpIJ702[NCAIM (P)B 1158]及びストレ
プトマイセス リビダンスpGYOKI1::NSH16)[NCAIM (P)B
1186]
【０１７６】
【実施例８】撹拌フラスコ及び実験室規模培養器中でのヒルヂン含有
培養ブロスの生成 ８．Ａ．ヒルヂン含有の大腸菌培養物の生成 ヒルヂンの生合成を決める形質発現／分泌のカセットを
含む細胞を、固体ＴＡｇ媒体（バクト アガ−の２％
で）上に維持した。
【０１７７】媒体は、抗生物質（詳細は後記する）で補
充された。熱感応性ｃＩ遺伝子生成物を含む株は、２８
℃の温度で培養した。[NCAIM (P)B 1165]及び[NCAIM
(P)B 1170]の培養物ブロスは、５０μｇ／アンピシリン
１ｍｌで補充された。一方、[NCAIM (P)B 1176]株の場
合、３０μｇ／オキシテトラサイクリンを用いた。５０
０ｍｌエ−レンマイヤ− フラスコに用意した１００ｍ
ｌの滅菌培地を、展開された培養物で接種した。培地の
滅菌は、１２１℃で１０分間行なった。接種されたフラ
スコは、２６０回転／分で回転撹拌器で撹拌された。２
４時間毎に、試料をとって、実施例９で説明する方法を
用いて、細胞数と培養物のヒルヂン活性を測定した。
【０１７８】表１：撹拌フラスコでの最小５つの実験の
平均値に基づいた結果を示す。 株 培養時間 細胞数 pH ヒルヂンＨＶ−１ (時間) ml当り μｇ／ｍｌ NCAIM (P)B 1165 ２４ 6×108 ７．５ ４３ ４８ 8×108 ７．９ ３５ NCAIM (P)B 1170 ２４ 7×108 ７．７ ３５ ４８ 7×108 ７．９ ３９ NCAIM (P)B 1176 ２４ 5×108 ７．６ ３８ ４８ 2×109 ８．１ ４２ ヒルヂンを、実施例１０で説明した方法を用いて培養物
から分離した。そして、その生成物を実施例１１により
同定した。
【０１７９】８．Ｂ．大腸菌による融合蛋白質の生成 大腸菌pop2136(pEX1:BH207 Aspfp)[NCAIM (P)B 1169],
大腸菌pop2136(pEX1::BH221 AsnデルタＥｃｏＲＶ−Ｓ
ｍａＩ）[NCAIM (P)B 1177]及びコントロール株pop2136
及びpop2136 pEX1を、ＴＡｇ培地（上記）上に保持し
た。培養を２８℃で行なった。５００ｍｌエーレンマイ
ヤー フラスコ中に用意した１００ｍｌ培地を、スラン
ト アガー 培養物で接種した。培養の滅菌は、１２１
℃で２０分間行なった。滅菌後、それに６０μｇ／ｍｌ
の濾過滅菌アンピシリン溶液を添加した。フラスコを回
転撹拌機上で２６０ｒｐｍで１６時間撹拌した。次に、
同じ成分を含有する新鮮な培地を、前記の培養物で１：
１００に比率で接種すた。細胞は、ＯＤ５５０の０．５
〜０．６に成長した。この領域に達して、接種温度は、
４２℃に調節して、細胞が更に２時間成長するようにし
た。２℃に冷却した後、細胞を遠心分離で分離し、音波
処理により粉砕した。β−ガラクトシダーゼ−ヒルヂン
タンパク質を、遠心分離で分離し、ヒルヂンを、ギ酸
で、メチオニン残査で融合タンパク質から切断した。
【０１８０】細胞を音波処理した後、５ｌの培養物から
分離し、遠心分離生成物の湿重量は、主な融合タンパク
質を含有して、大腸菌 pop2136(pEX1::BH207 Aspfp)[NC
AIM(P)B 1169]株及び大腸菌 pop2136(pEX1::BH221 Asnd
eltaEcoRV-SmaI)[NCAIM (P)B 1177]株から各々誘導され
た各々２．６ｇと１．７ｇであった。
【０１８１】図２８は、ポリアクリルアミド（６％）ゲ
ル 電気泳動の図を示し、培養物と単離処理を示す。試
料は、６０ｍＭのトリス・Ｃｌ（ｐＨ６．８）、１００
ｍＭのヂチオツレイト−ル、４％のＳＤＳ、０．２％の
ブロモフェノ−ル ブル−及び２０％のグリセロ−ルを
含有する混合物中で、ゲルへ入れた、次に、６時間、電
気泳動（５００Ｖ、４００ｍＡ）処理した。図２８にお
いて、レ−ン８は、β−ガラクトシダーゼ−ヒルヂン完
全融合タンパク質［大腸菌pop2136(pEX1::BH207 Aspfp)
[NCAIM (P)B 1169]を示す。レ−ン２、３、２ａ及び３
ａは、各々欠失誘導体［大腸菌pop2136(pEX1::BH221 As
n deltaEcoRV-SmaI)[NCAIM (P)B 1177]に相当する。レ
−ン８は、プラスミドを含有しないコントロールpop213
6を示す。
【０１８２】８．Ｃ、サッカロマイセス(Saccaromyses)
細胞によるヒルヂンの生成 サッカロマイセス セレビシアエ(Saccharomyces cerev
isiae)及びサッカロマイセス バヤヌス(Saccharomyces
bayanus)を、次の成分を含有するＭＭＷＳ−Ａ培地中
に接種した。 硫酸アンモニウム ０．５％ 燐酸２水素カリウム ０．１％ 硫酸７水和マグネシウム ０．０５％ グルコ−ス（別に滅菌された） ２．０％ ソルビト−ル ３．０％ ウッカハム ビタミン 溶液* ０．１％ アガ−（バクト(Bacto)) １．５％ *濾過により滅菌した ウッカハム溶液の組成は、次の通りである。 葉酸 ０．２ｍｇ ビオチン ０．２ｍｇ パントテン酸カルシウム ４０．０ｍｇ イノシト−ル ２００．０ｍｇ ニコチン酸 ４０．０ｍｇ ｐ−アミノ安息香酸 ２０．０ｍｇ ピリドキシン塩酸塩 ４０．０ｍｇ チアミン塩酸塩 ４０．０ｍｇ リボフラビン ２０．０ｍｇ 蒸留水 １００．０ｍｇ
【０１８３】ＭＭＷＳ−Ａ培地のｐＨを、１０％水酸化
ナトリウム溶液により、滅菌前に調節した。培地を１２
１℃で２５分間滅菌した。サッカロマイセス セレビシ
アエ(Saccharomyces cerevisiae)Ｋ２５／２[NCAIM (P)
B 1172]とサッカロマイセス バヤヌス(Saccharomyces
bayanus)K9[NCAIM (P)B 1173]株の培地は、補足されな
いが、サッカロマイセス セレビシアエ(Saccharomyces
cerevisiae)K25/4[NCAIM (P)B 1174]の培地は、５０μ
ｇ／Ｌ−ロイシン１ｍｌで補足された。
【０１８４】接種予備培養物ブロスは、次の組成のＭＭ
ＷＳ−Ｇａｌであった。 硫酸アンモニウム ０．５％ 燐酸２水素カリウム ０．１％ 硫酸７水和マグネシウム ０．０５％ ガラクト−ス* ２．０％ ウッカハム ビタミン溶液** ０．１％ 硫酸アンモニウム ０．５％* は別に滅菌した。** は濾過により滅菌した。
【０１８５】培地のｐＨを、１０％水酸化ナトリウム溶
液で７．２に調整した。滅菌は、１２１℃の温度で３０
分間行なった。接種予備培養物ブロスは、５０μｇ／ウ
ラシル或いはロイシン１ｍｌで補足した。サッカロマイ
セス セレビシアエ[NCAIM (P)B 1172]株を培養するた
めにMMWS-Glu-Gal培地を用いた。この培地はMMWS-Galと
して用いたと同じ成分を有したが、３．０％のグルコ−
スと０．５％のガラクト−スを含有した。同じ組成の培
地を、生成（主培養物）のために用いた。１００ｍｌの
MMWS-Gal(或いはMMWS-Glu-Gal；用いた株に依存する）
培地は５００ｍｌエ−レンマイヤ−フラスコ中に用意
し、アガ− スラント（ＭＭＷＳ−Ａ）の全細胞マスに
接種された。そして、２６０ｒｐｍで撹拌され、３．５
ｃｍ直径の軌道サイズで２８℃の温度での軌道撹拌器上
で培養された。２０〜２２時間後、培養物ブロスは、接
種すると適正な６〜９×１０7 個の細胞を含有する。
【０１８６】５００ｍｌのエ−レンマイヤ−フラスコ中
に用意された滅菌ＭＭＷＳ培地各々１００ｍｌに、前記
の培養物を各々１ｍｌで接種した。培地は、同じ撹拌機
（上記参照）上で１４４時間、２８℃で培養した。滅菌
水中に溶解させた１ｇ（１％）のガラクト−スを、サッ
カロマイセス バヤヌス(NCAIM (P)B 1173)の培養物中
に、培養の７２時間目に添加した。培養物の細胞数とｐ
Ｈ、更に、生成されたヒルヂンの量は、新鮮な試料から
毎日測定さられた。表２は、サッカロマイセス セレビ
シアエ[NCAIM (P)B 1172]ほとんど同じ値になるサッカ
ロマイセス バヤヌス[NCAIM (P)B 1173]株で行なった
培養の結果を示す。生細胞の細胞数は、細胞を固体ＭＭ
ＷＳ−Ａ及び完全な培地（ＭＭＷＳ−Ａが０．５％のペ
プトンと０．５％のイースト抽出物で補充されたもの）
上にプレ−トすることにより測定された。一方、ヒルヂ
ン活性は、実施例９に説明の方法により測定された。
【０１８７】 表２ 培養時間 生きている細胞 ｐＨ ヒルヂンＨＶ−１ （時間） 数／ｍｌ μｇ／ｍｌ ０ ２．１×１０6 ７．２ ０ ２４ ２．１×１０6 ７．１ ９ ４８ ２．１×１０7 ６．３ ５６ ７２ ２．１×１０8 ５．１ ８６ ９６ ２．１×１０8 ４．３ ９５ １２０ ２．１×１０8 ３．１ １１０
【０１８８】用いた株に依存して、５ｌのＭＭＷＳ−Ｇ
ａｌ或いはＭＭＷＳ−Ｇｌｕ−Ｇａｌ培地を、３０分間
１２１℃で、平らなブレ−ド形インペラ−を備える実験
室規模培養機の１０ｌの容器中で滅菌した。滅菌培養
は、滅菌培地を、上記のように製造され、チェックされ
た１００ｍｌの植菌物で接種した。必要の場合、パ−ム
油を抗泡剤として添加した。培養は、温度２８℃で、５
ｌ／分の空気吹き込み量で行なった。撹拌速度は、２４
ｒｍｐにされ、１００ｍｌの水に溶解させた４５ｇの滅
菌ガラクト−スをサッカロマイセス バヤヌス[NCAIM
(P)B 1173]株の培養物に、培養の７２時間目に添加し
た。培養間に、次のデータが測定された：最小及び完全
な培地中での細胞数、ＯＤ６００の値、培養物のｐＨ、
ヒルヂンの活性（たまに、炭素源の消費、オ−バ−フロ
−の溶解酸素及び二酸化炭素濃度も）。
【０１８９】表３は、サッカロマイセス セレビシアエ
[NCAIM (P)B 1174]及びサッカロマイセス バヤヌス[NC
AIM (P)B 1173]株で行なった特性培養の結果を示す。 表３ 株 細胞数 ＯＤ ｐＨ ヒルヂンHV-1 培養 最小 完全 600nm μg/ml時間 培地 培地 でNCAIM (P)B 1173 0 2×106 2×106 140 7.1 0 24 8×106 7×106 1040 6.5 8 48 4×107 5×107 1760 5.7 31 72 9×107 1×108 3150 4.3 57 93 3×108 3×108 3150 3.6 96 120 6×108 7×108 4240 2.8 132NCAIM (P)B 1174 0 1×106 2×106 140 7.1 0 24 4×106 4×106 1140 6.7 5 48 1×107 2×107 1840 5.9 32 72 5×107 4×108 2900 4.6 66 93 1×108 3×108 3380 3.8 92 120 6×108 6×108 4240 2.9 125
【０１９０】株保持及び接種工程（上記参照）を、ロオ
シン含有の培地中で行ない、培養の第２段は、５０μｇ
／ｍｌのウラシルを補充した培地中で行なった。次に、
上記の値を３０〜３５％超えるヒルヂン活性、或いは特
別の場合６０％超える活性が、培養物ブロス中に集積さ
れる。
【０１９１】８．Ｄ．ストレプトマイセス リビダンス
(Streptomyces lividans)を培養することによるヒルヂ
ン含有培養物ブロスの製造 ストレプトマイセス リビダンス株は、次のプラスミド
を含有する：pMIAMHIR3/A,pMIdeltaNeo,pMI-K2deltaNeo
及びpGYOKI1::NSH16を含有し、４０μｇ／ｍｌのチオス
トレプトン（シグマ）で、２８℃で１２０時間で補充し
たR2YE培地(実施例７Ｂ参照）上で、培養した。培養さ
れた株から誘導されたスポア懸濁液を、５００ｍｌのエ
ーレンマイヤー フラスコ中に準備された１００ｍｌの
滅菌（３０分、１２０℃）Ｒ２ＹＥ培地中で、接種さ
れ、次いで、２６０ｒｐｍ、２８℃の温度で、１２０時
間回転撹拌器上で成長せしめた。培養物のヒルヂン含有
量は、２４時間毎に、実施例９の方法を用いて、試料を
採取して、測定した。１２０時間での培養物のヒルヂン
活性は、次の通りである。 ストレプトマイセス リビダンス pMIAMHIR 3/4 14μg/ml pMIdeltaNeo 12μg/ml pMI-K2deltaNeo 18μg/ml pGYOKI1 27μg/ml
【０１９２】
【実施例９】 ヒルヂン含有量の測定 ９．Ａ．迅速血液凝固試験 １ｍｌの３．３％クエン酸ナトリウム溶液を、９ｍｌの
ヒト動脈血液に混合した。１００μｌの保存した血液
を、１００μｌのバクテリア培養物と混合し、次に、１
０μｌの１６０ｍＭ塩化カルシウム溶液を添加して、ス
トップ ウオッチは、同じ時間で開始した。継続的な撹
拌の下で、先ず検出したフィブリン糸が出現する時間を
測定した。血液クロット時間を増加したときのみに、少
なくとも、コントロールに関して２倍に増加した（形質
発現／分泌プラスミドＤＮＡを含まない培養物）ときの
み、培養物は、ヒルヂン様の物質のプロヂュ−サと見做
される。
【０１９３】９．Ｂ．クロモジム方法 必要な成分は、次の通りである。クロモジムＴＨ（Boeh
ringer Mannheim GmbH),トリス・Ｃｌ、ＮａＣｌ、ＨＣ
ｌ、ヒルヂン、トリエタノ−ルアミン及びヒトトロンビ
ン（シグマ）である。
【０１９４】方法の原理：プロテア−ゼであるトロンビ
ンは、合成基体クロモジム（トシル−グリシル−プロリ
ル−アルギニン−４−ニトラニリド酢酸）からＧｌｙ−
Ｐｒｏ−Ａｒｇのトリペプチドを切断し、黄色の４−ニ
トラリンとなり、溶液の色を黄色に変える。にるは、ト
ロンビンと安定な錯体を形成し、その活性を遮断し、従
って、前記の反応を抑制する。反応混合物の製造に必要
な溶液は： １．バッファ（ｐＨ８．０、ＨＣｌで調整）は、０．０
５Ｍのトリス・Ｃｌと０．１５４ＭのＮａＣｌを含有す
る。 ２．１．５ｍＭのクロモジム溶液 この溶液は、５００μｌの蒸留水と５０μｌのトリエタ
ノ−ルアミンを混合することにより製造される。基体の
溶解は、４０〜４５℃温度により促進される。基体とそ
の溶液を、４℃に保持する。 ３．１０単位／ｍｌ含有するヒルヂン溶液とその希釈液 この溶液は、バッファ溶液（１）を用いて製造される。
０〜４℃の温度に保存される。濃縮溶液は、−２０℃に
保存される。 ４．２単位／ｍｌを含有するトロンビン溶液とその希釈
液 この溶液は、バッファ（１）を用いて製造される。長期
間、−２０℃に保存され、１週間４℃に保持される。ト
ロンビン溶液とヒルヂン希釈液は、マイクロプレ−トの
井戸に添加され、標準曲線を決める。１００μｌのトロ
ンビン溶液と５０μｌのヒルヂン希釈液更に未知の活性
の溶液５０μｌを、マイクロプレ−トの井戸に入れら
れ、５０μｌのクロモジン溶液を補充する。反応は、３
７℃でのクロモジン溶液の添加で開始する。反応は、６
０分培養した後、可視光で観察される。適当な量のヒル
ヂンの存在下で、反応混合物は、白くなり、或いは、黄
色になる。読み取り後、適当なヒルヂン濃度を計算す
る。ヒルヂン濃度（μｇ／ｍｌ）＝ヒルヂン活性（単
位）：１２。
【０１９５】９．Ｃ．血液凝塊の防止に基づいた方法 この方法の原理は、ヒルヂン活性は、既知の凝塊活性を
有するトロンビン標準に対する抑制活性で、定量的に測
定できるという事実に基づいたものである。従って、未
知の溶液のヒルヂン活性は、抗トロンビン単位（ＡＴ−
Ｕ）で表現できる。ヒト 血漿の凝塊時間は、ヒルヂン
濃度に直接に依存している。
【０１９６】測定性能：血液凝固を始めるために、２０
０μｌのクエン酸血漿を、１００μｌの異なるヒルヂン
含有量の液量に混合した。そして、それを、０．１５Ｍ
トリス・Ｃｌ（ｐＨ７．４）バッファ中に溶解させた１
００μｌの標準化トロンビン溶液（１ＮＩＨ単位に相当
する）と混合した。凝塊時間は、凝固測定器（Schnitge
r-Gross)中で測定した。ヒルヂン溶液の濃度は、凝塊時
間で、ヒルヂンなしのコントロールと比較して、３−５
−倍増加となるような方法に選択した。
【０１９７】測定の評価 補正曲線は、ヒルヂン試料の活性を計算するものであ
る。０．１〜１．０単位トロンビン／１００μｌを含有
するトロンビン溶液を用いて、トロンビンの補正曲線を
得るのに用いる。そして、相当するプロット時間を記録
する。トロンビン量（Ｘ）は、ヒルヂンで遮断されな
く、相当する４倍の凝塊時間（測定され、そして、コン
トロールの血液−凝塊時間の量）は、上記の曲線から読
み取れる。
【０１９８】４倍クローン化時間に相当するヒルヂン量
（Ｙ）は、凝固時間に対するヒルヂン濃度をプロットす
ることによりヒルヂン補正曲線から読み取る。４倍比較
的凝固時間（Ｙ）に相当するヒルヂン量をこの曲線から
読み取る。２つの補正曲線（血栓症１Ｕ／１００μｌが
反応混合物中で永久に使用されると考える）から読み取
る値に基づいて、特定のヒルヂン活性をｍｇ量で、次の
式から計算できる。 [1000(1-X)]/Y=AT-U/mg
【０１９９】９．Ｄ．ＨＰＬＣ（半定量的方法）による
培養物ブロスの分析 ５０ｍｌの培養物ブロスを濾過し、そのｐＨをＮａＯＨ
で７．５に調整する。５０ｍｌの冷却アセトン（１５
℃）を、上記の溶液と混合する。１時間混合した後、培
養物ブロスを濾過する。ロ液を全容量１０ｍｌのＤＥＡ
Ｅ３２(Servacel)アニオン交換カラムに入れ、次に、次
に、２０ｍｌの５０％水性アセトンで洗浄する。次に、
カラムを先ず５ｍｌのバッファ（２０ｍＭの酢酸アンモ
ニウム、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０）で溶離し、次い
で、３０ｍｌのバッファで溶離する。約３０ｍｌの容量
の溶離液を、真空中で５ｍｌ容量に蒸発せしめる。この
濃縮液を、逆転−相ＨＰＬＣシステムを用いて、分析す
る。ＨＰＬＣシステムの特性は次の通りである。 カラム型：ＶＹＤＡＣ Ｃ−１８、３００Å、１０μ
ｍ、４ｍｍ×２５０ｍｍ（Bio Szeparacios Tarsasag,
ブタペスト）； 検出：２２０ｎｍと２８０ｎｍで； 検出限界：−０．０５〜１．００ＡＵＦ／１０ｍＶ最終
デフレクション； 注入：ＬＫＢオ−トサンプラ−２１５７ 溶媒；溶媒Ａ：蒸留水中の０．１％のトリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ） 溶離：次の傾斜プロフィルを溶離に用いる：
【０２００】 時間 流量 溶質Ａ 溶質Ｂ (分) (ml/分) (％) (％) ０〜５ １．０ １００ ０ ５〜６ １．０ ８５ １５ ６〜３６ １．０ ６５ ３５ ３６〜３８ １．０ ４０ ６０ １００μｌの濃縮試料を、カラムに注入した。２１分３
０秒に現れたピークが、真正のデスルファトヒルヂン
ＨＶ−１のピークと比較された。
【０２０１】
【実施例１０】 組替え体ヒルヂンの単離 １０．Ａ．大腸菌培養物からの組替え体ヒルヂンの単離 ３ｌの大腸菌JM109(pUC19::H16)株の培養物ブロスは、
４５μｇ／ｍｌのデスルファトヒルヂン ＨＶ−１を含
有し、セイズ(Seitz)濾過器で濾過され、次に、培養物
ブロスを、１時間混合した。そして、１ＮのＮａＯＨ溶
液でｐＨ７．５に調整した。次に、３ｌの１５℃アセト
ンを溶液と混合した。培養物ブロスを１時間混合し、セ
イズ(Seitz)濾過器で濾過した。ロ液をＤＥＡＥ３２カ
ラム(Servacel,250ml)に、３５０〜５００ｍｌ／時間の
流量で入れた。次に、カラムを２５０ｍｌの５０％水性
アセトンで洗浄し、２５０ｍｌのＡバッファ（２０ｍＭ
の酢酸アンモニウム、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．
５）で洗浄した。次いで、カラムを線形塩勾配（ストッ
ク溶液：７５０ｍｌのＡバッファと７５ｍｌのＢ−バッ
ファ、後者は、２０ｍＭの酢酸アンモニウムと４ＭのＮ
ａＣｌ、ｐＨ５．０）で、流量１２０〜２５０ｍｌ／時
間で溶出した。溶出液を、４０ｍｌに集め、その活性
を、実施例９Ｃにより血液凝塊の抑制に基づいて検出し
た。活性部分（約１５０ｍｌ）をプ−ルし、得られた溶
液のｐＨを、１ＮのＮａＣｌ溶液で７．５にし、次に、
真空中で循環蒸発器で、３６〜３８℃の水浴上で１５ｍ
ｌの最終量に濃縮した。濃縮溶液を、セファックス(Sep
hax)G-50(Pharmacia,500ml)カラムに（カラム直径と床
高さの比は、１：２５）担持した。カラムを、脱イオン
水で１６０ｍｌ／時間の流量で溶出した。そして、５０
ｍｌ部分を取った。部分の血液凝塊活性を測定した後、
活性部分を集め（約２５０ｍｌ）、ロタバップ中に濃縮
し、最終的に冷凍乾燥した。この方法を用いて、ヒルヂ
ン含有の４２０ｍｇの粗生成物を得た。粗抽出物を、３
ｍｌの脱イオン水に溶解し、溶液のｐＨを、０．２Ｎの
ＮａＯＨ溶液で、７．５に調整した。得られた溶液を、
１４ｍｌのＱ−セファロ−ス ファ−スト フロ− ア
ニオン交換カラム(Pharmacia;カラム直径と床高さの比
は、１：２５）上に担持させた。カラムを２８ｍｌの脱
イオン水で洗浄し、次に、４２ｍｌの０．１Ｍのギ酸ア
ンモニウム溶液（ｐＨ３．９）で溶出した。溶出中、
１．５ｍｌの部分を、採取し、その部分のヒルヂン活性
を、血液凝固に基づいた方法を用いて、チェックした。
活性部分をプ−ルし（約５ｍｌ）、調整した後、ｐＨ
を、１ＮのＮａＯＨ溶液で調節した。溶液をロタバップ
中で３６〜３８℃で濃縮した。濃縮溶液を、セファック
ス(Sephax)G-50(Pharmacia,500ml)カラムに（カラム直
径と床高さの比は、１：２５）担持した。カラムを、脱
イオン水で溶出し、５０ｍｌの部分を採取した。部分の
血液凝塊活性を測定し、活性部分を集め（約３０ｍ
ｌ）、上記のように濃縮し、最終的に冷凍乾燥した。こ
の方法で、２１０ｍｇの粗生成物を得た。粗抽出物を、
ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。精製のために、ＬＫＢ装置
を、次の特性で用いた。 カラム型：デルタ パックＣ−１８（３００Å）、１９
ｍｍ×３００ｍｍ（水） 検出：２２０ｎｍと２８０ｎｍで； 検出限界：−０．０１〜２．０ ＡＵＦＳ／１０ｍＶ； 注入：Rheodyne 7125,サンプル ル−プ2000μl; 部分回収；マニュアル．
【０２０２】傾斜溶出を、クロマトグラフィで使用し
た。次の溶液を、溶出液を製造するために使用した：溶
液Ａ（０．１％の蒸留水中のトリフロオロ酢酸）及び溶
液Ｂ（０．１％のアセトニトリル中のトリフロオロ酢
酸）。３０〜６０ｍｇの粗の生成物を、１ｍｌの溶液Ａ
中で遠心分離機で溶解した。溶液は、４０００ｒｐｍで
５分間遠心分離をかけた。上澄液を、ハミルトン注射器
で、溶液Ａと平衡させたカラムに注射した。溶出は、次
の組成成分を用いて行なった。
【０２０３】 時間 流量 溶質Ａ 溶質Ｂ （分） (ml/分) ％ ％ ０〜２ ８．０ １００ ０ ２〜３ ８．０ ８５ １５ ３〜３３ ８．０ ６５ ３５ ３３〜３８ ８．０ ４０ ６０
【０２０４】デスルファトヒルヂン ＨＶ−１を保持ス
ケ−ルＨＰＬＣシステム中で、３０分及び３０分３０秒
での間でのカラムから溶出せしめた。デスルファトヒル
ヂンＨＶ−１を含有する部分は、プ−ルし、冷凍乾燥さ
せた。この方法で、４２ｍｇのクロマトグラフィ的に均
一のデスルファトヒルヂン ＨＶ−１（３３Ａｓｐ）が
得られた。
【０２０５】１０．Ｂ．大腸菌により生体合成された融
合蛋白質からデスルファトヒルヂンＨＶ−１変異型を製
造する １０ｌの大腸菌pop2136(pEX11::BM207 Aspfp)株培養物
ブロスを０℃に冷却し、細胞を３０００ｒｐｍで１５分
間、４℃で遠心分離した。得られた湿ったペレット（１
４ｇ）を、６０ｍＭのトリス・Ｃｌ（ｐＨ８．０）、５
０ｍＭのＮａＣｌ、及び１ｍＭのＥＤＴＡを含有する溶
液に溶解させた。次に、バクテリア細胞を音波処理（Ｍ
ＳＥ；５μ高さ、３分間）で氷浴中で、溶解した。β−
ガラクトシダーゼ−ヒルヂン融合タンパク質を含有する
５ｇの湿ったペレットが、前記の懸濁液の遠心分離（１
５分、１０、０００ｇ；４℃）で得られた。
【０２０６】融合タンパク質を、１８０ｍｌの７０％ギ
酸に、継続的に３０分間撹拌して、溶解し、次に、溶液
を、１４ｍｌの７０％ギ酸に溶解させた０．４ｇの臭化
シアンと混合した（１ｍｇの乾燥タンパク質／０．５ｍ
ｇＢｒＣＮ）。反応混合物は、室温で光なしで窒素雰囲
気に保持し、次に、脱イオン水で１０倍に希釈された。
水溶液は、真空で濃縮され、凍結乾燥された。得られた
生成物（約１ｇ）を、１０ｍｌの６Ｍグアニジン塩酸塩
に再溶解し、溶液を、β−メルカプトエタノ−ルで調節
し、０．１Ｍの最終濃度とした。溶液のｐＨは、トリス
塩で８．２にされ、溶液は、３時間、室温に培養され
た。溶液を、６Ｍグアニジン塩酸塩、５０ｍＭのトリス
塩と１ｍＭのＥＤＴＡを含有する溶液で希釈した。次
に、１０倍の量の５０ｍＭトリス塩基に対して、１８時
間透析した。遠心分離した後、真空で濃縮され、最終的
に凍結乾燥された。純粋なデスルファトヒルヂン ＨＶ
−１（３３Ａｓｐ）を得るために、凍結乾燥物は、実施
例１０Ａの方法を用いて、予備的規模のＲＰ−ＨＰＬＣ
上で精製された。
【０２０７】１０．Ｃ．サッカロマイセス セレビシア
エ(Saccharomyces cerevisiae)培養物からのヒルヂンの
単離 実施例８で、サッカロマイセス セレビシアエK25/2(YE
pGYOK1eb2)株により製造され、１００μｇ／ｍｌのデス
ルファトヒルヂン ＨＶ−１を含有する５ｌの培養物ブ
ロスを、サイツ・フィルターで濾過し、培養物ブロスの
ｐＨを、１ＮＮａＯＨで７．５に調節した。５ｌのアセ
トンをブロスに混合した。１時間撹拌した後、培養物ブ
ロスをサイツ・フィルターで濾過した。ロ液を、ＤＥＡ
Ｅ３２(Servacel;420ml)アニオン交換カラム中に流量６
００〜８００ｍｌ／時間（カラムの直径と床高さの比率
は、１：６）に入れた。次に、４５０ｍｌの５０％水性
アセトンで洗浄し、２０ｍＭ酢酸アンモニウムと１００
ｍＭのＮａＣｌを含有するｐＨ７．５のＡバッファ４５
０ｍｌで洗浄した。次に、溶出を、線形塩勾配（保存溶
液：１２６０ｍｌのＡバッファと１２６０ｍｌのＢバッ
ファは、２０ｍＭ酢酸アンモニウムと４ＭのＮａＣｌを
含有し、ｐＨ５．０）を用いて、流量２００〜４００ｍ
ｌ／時間で行なった。溶出液は、７０ｍｌ部分に採集し
た。その血液凝塊活性は、実施例９Ｃの方法により測定
した。活性部分は、プ−ルし（約２５０ｍｌ）、得られ
た溶液のｐＨを１ＮＮａＯＨで７．５に調節下。最終的
に、真空中で、３６〜３８℃で２５ｍｌに濃縮された。
濃縮溶液を、セファデックスG-50カラム(Pharmacia;800
ml;カラムの直径と床高さの比率は、１:25)に入れた。
カラムを脱イオン水で流量２６０ｍｌ／時間で溶出し
た。部分は、回収した。血液凝塊活性を示す部分は、プ
−ルされ（約４００ｍｌ）、濃縮後、得られた溶液は、
凍結乾燥された。この方法の適用で、デスルファトヒル
ヂン含有の１．２ｇの粗生成物が得られた。粗抽出物
は、実施例１０Ａで説明されたＲＰ−ＨＰＬＣ法を用い
て精製された。この精製法を用いて、１５５ｍｇのデス
ルファトヒルヂン ＨＶ−１（３３Ａｓｐ）が得られ
た。図２９は、生成物の逆転−相ＨＰＬＣ精製図を示
す。
【０２０８】１０．Ｄ．サッカロマイセス バヤヌス培
養物から組替え体ヒルヂンを単離する サッカロマイセス バヤヌスK9 (YEpGYOK2eb2)株で形成
した培養物ブロス５ｌを、実施例１０Ｃで説明した方法
を用いて、精製し、クロマトグラフィ的に純粋なデスル
ファトヒルヂン ＨＶ−１（３３Ａｓｐ）を製造した。
【０２０９】１０．Ｅ．ストレプトマイセス リビダン
スの培養物から組替え体ヒルヂンを単 離する。 ストレプトマイセス リビダンス(pGYOKI1::NSH16)によ
り製造された５ｌの培養物ブロスを、実施例１０Ａの方
法を用いて、製造し、クロマトグラフィ的に純粋なデス
ルファトヒルヂン ＨＶ−１（３３Ａｓｐ）変異型が得
られた。
【０２１０】
【実施例１１】：デスルファトヒルヂン ＨＶ−１（３
３Ａｓｐ）及びＨＶ−１（３３Ａｓｐ）成分の構造の確
認 実施例８と１０により製造したヒルヂン成分の構造の変
異方法が、次の方法を用いて、行なわれた。
【０２１１】１１．Ａ．アミノ酸分析 アミノ酸組成物を、水ピコタグ（ＰｉｃｏＴａｇ）方法
を用いて決定した。ヒルヂンを、６ＭのＨＣｌ溶液でガ
ス相で１１６℃で２４時間で加水分解した。形成したア
ミノ酸残査は、中和され、フェニルチオカルバモイル誘
導体に変換された。それらは、逆転−相ＨＰＬＣで分離
された。検出は、２５４ｎｍで行なわれた。生成物のア
ミノ酸組成は、期待されたヒルヂンＨＶ−１組成に相当
している。（理論的組成は、次の通りで；３Ｌｙｓ、１
Ｈｉｓ、６Ｃｙｓ、９Ａｓｘ、４Ｔｈｒ、４Ｓｅｒ、１
３Ｌｇｘ、３Ｐｒｏ、９Ｇｌｙ、４Ｖａｌ、２Ｉｌｅ、
４Ｌｅｕ、２Ｔｙｒ、１Ｐｈｅである）。Ａｓｘは、ア
スパルチン酸及びアスパラギンの全数を示し、Ｇｌｘ
は、グルタミン酸とグルタミンの全数を示す。
【０２１２】１１．Ｂ．Ｎ−及びＣ−終端アミノ酸配列
の決定 Ｎ−末端分析分析 クロマトグラフィ的に均質なデスルファトヒルヂン Ｈ
Ｖ−１成分の測定は、タンパク質／ペプチド 配列器４
７１／Ａ（Applied Biosystems)中で行なわれた。調査
した生成物のＮ−末端アミノ酸配列は、Val-Tyr-Tyr適
合性である。
【０２１３】Ｃ−末端分析 カルボキシペプチダ−ゼＹを、Ｃ−末端アミノ酸残査の
測定に用いた。消化は、１０ｍＭの燐酸バッファ（ｐＨ
５．５）中で３７℃の温度で行なった。アミノ酸組成
は、異なる時間に採取した消化試料の部分から測定し
た。試料を、クエン酸バッファ（ｐＨ２．２）中のアミ
ノ酸分析器に注入した。一連の測定の結果は、ヒルヂン
生成物のアミノ酸残査は、グルタミンであると示す。
【０２１４】１１．Ｃ、デスルファトヒルヂン ＨＶ−
１成分の全配列分析 ６５のアミノ酸残査を含有するヒルヂンは、３ジスルフ
ィド架橋とシステインのフェニルチオヒダントイン誘導
体を含有するヒルヂンは、不安定である。従って、シス
テインを安定した誘導体に変換する必要がある。これ
は、次のように達成された：１ｎＭのヒルヂンを、５０
μｌのバッファ（６Ｍのグアニジン塩酸塩、０．２５Ｍ
のトリス・Ｃｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ；ｐＨ７．５）に溶
解し、次に、２μｌの新鮮な１０％β−メルカプトエタ
ノ−ルに添加した、次に、混合物をアルゴン雰囲気中で
１０分間、暗所で、室温で、培養した。その後、２μｌ
の新鮮な１：６の４−ビニルピリミジンとエタノ−ルの
混合物を、混合物に添加して、上記のように培養した。
試料を、２ｍｌの水で調節し、セッパック(Seppak)C-18
予備精製カラム（ミリポア）上に入れた。カラムを、３
ｍｌで洗浄し、最終的に２ｍｌの４０％のアセトニトリ
ルで溶出した。このように形成したピリジルエチレ−ト
ヒルヂンを、逆転−相ＨＰＬＣ［Vydac C-18 10μ;4.
6mm×250mm;1ml/分.;Ａ溶液（０．１トリフルオロ酢酸
／ＴＦＡ／水中）；Ｂ溶液（０．１％ＴＦＡアセトニト
リル中）；０％Ｂから６０％Ｂで、３０分間］を精製し
た。ピリジルエチレ−ト誘導体を、ほとんど同じ停留時
間で、溶出して、ヒルヂンとした。
【０２１５】ヒルヂンは、１工程でＣ−末端に配列する
には、長過ぎる。従って、そのフラグメントにすること
は、実際的のようである。分子は、位置２７、３６と４
７に３リシン残査がある。そのため、トリプシン消化の
後に、４フラグメントは、得られた。然し乍ら、位置４
７でのリシンは、プロリンに次いでおり、従って、約３
フラグメントが出現できる。トリプシンによる消化は、
次の環境で行なわれた。アルキレ−ト化ヒルヂンを、５
０μｌの０．１Ｍ重炭酸アンモニウム溶液（ｐＨ８．
５）に溶解させた。トリプシンを、比率１：２０で溶液
に添加し、溶液を次に３時間室温で培養した。生成され
たフラグメントは、ＲＰ−ＨＰＬＣにより分離された。
得られた４つのフラグメントは、ヒルヂン１−１７、２
８−３６、３７−６５及び２８−６５のグラグメント
と、アプライド ビオシステム(Applied Biosystems)４
７１／Ａオ−トマテック 配列器を用いて、立証され
た。最後のフラグメントの出現は、位置３６−３７での
Ｌｙｓ−Ａｓｎ結合は、完全に切断された事実により説
明され得る。仮定すると、デスルファトヒルヂン ＨＶ
−１（３３Ａｓｐ）成分の２８−３６と２８−６５フラ
グメントは、位置３３にアスパルチン酸を含有し、デス
ルファトヒルヂン ＨＶ−１（３３Ａｓｎ）の場合、ア
スパラギンは、この位置にあった。
【０２１６】１１．Ｄ．リ−チ（水蛭）からのデスルフ
ァトヒルヂン ＨＶ−１（３３Ａｓｐ）の製造と、微生
物的に製造されたデスルファトヒルヂン ＨＶ−１（３
３Ａｓｐ）成分との比較 １１．Ｄ．ａ．ヒルヂンＨＶ−１（３３Ａｓｐ）成分の
単離 １週間保持された水蛭（Hirudo medicinalis)１３０ｇ
を、石硬度に凍結された。次の日に、室温で氷解した。
そして、２６０ｍｌの０．５ＭのＮａＣｌ注にブレ−ド
プロペラ−混合機で粉砕した。次に、ウルトラツルラ
ックス(Ultraturrax)装置で均質化した。６０分間撹拌
した後、混合物のｐＨを、２０％塩酸で２に調節した。
酸性抽出物を、７０℃に、永続的な撹拌で１５分間で暖
めた。０−４℃に冷却した後、遠心分離した。上澄液
を、無水エタノ−ルの１．５容量で沈殿させた。沈殿物
を、遠心分離で回収した。得られた上澄液を、２０％塩
酸でｐＨ２に調節した。２倍容量の水で希釈した後、２
０ｇのフ−ラ−(fuller’s)土を添加した。９０分間撹
拌した後、懸濁液を濾過した。ヒルヂンをフ−ラ−(ful
ler’s)土から、アンモニウムでｐＨ８．５の５０％水
性エタノ−ルに溶解した。中和した後、溶出液を、真空
中で濃縮した。次に、透析により脱塩した。透析液は、
０．２Ｍのアンモニウム−酢酸バッファ（ｐＨ５．０；
Ａ溶液）で平衡にされたエクテオラ(Ecteola)セルロ−
ス カラム（床高さ２３ｃｍ；直径１．ｃｍ ）上での
勾配溶出により精製した。０．５Ｍの溶液Ａに溶解させ
たＮａＣｌを、溶媒Ｂとして用い、勾配を形成した。溶
出した後、濃縮し、凍結乾燥した粗生成物は、ヒルヂン
の典型的な生物学的活性を示す。
【０２１７】粗の抽出物を少量、０．１水性ＴＦＡ溶液
（Ａ溶液）で平衡化されたＲＰ−ＨＰＬＣカラム（ＫＬ
Ｂ Ultrapac TSK ODS-120T,5μm,4.6×25mm)上の担持
させた。次に、ヒルヂンを、溶液Ｂ（アセトニトリル中
の０．１％ＴＦＡ）で線形勾配で溶出した。活性と証明
された部分は、プ−ルされ、勾配溶出を用いて、モノＱ
(Pharmacia)アニオン交換カラム上で精製された。（カ
ラムの特性：５．０×５ ．０ｍｍ；Ａ−バッファ：２
０ｍＭのトリス・Ｃｌ（ｐＨ７．５）；Ｂ−バッファ：
１ＭのＮａＣｌを含有する２０ｍＭのトリス・Ｃｌ（ｐ
Ｈ７．５）：０％Ｂから７０％Ｂ）。活性剤を含有する
部分を精製し、脱塩するために、ＬＫＢＵｌｔｒａカラ
ム上に担持させ、一方、ヒルヂンの溶出を、Ｂ−溶液の
２３％でイソクラテック法で、行なった。この方法で、
ヒルヂンＨＶ−１（３３Ａｓｐ）成分は、高い純度で生
成された。
【０２１８】１１．Ｄ．ｂ．トリフロロ酢酸によるヒル
ヂンＨＶ−１（３３Ａｓｐ）の加水分解 ０．５μｇの分離ヒルヂン（実施例１１Ｄａ参照）を、
７０μｇの蒸留水中に溶解した。０．５μｇの単離ヒル
ヂン（実施例１１Ｄａ参照）を、７０μｌの蒸留水中に
溶解させた。３０μｌのＴＦＡを添加した後、２５分
間、５７℃で培養した。反応混合物は、１００μｌの蒸
留水で希釈し、ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（ＬＫＢ ウルト
ラパック ＴＳＫ ＯＤＳ−１２０Ｔ）上に担持させ、
実施例１１Ｄａに説明した方法で、０〜６０％のＢ−溶
液の線形勾配で３０分間溶出させた。後のピークの停留
時間は、微生物学的に製造した組替え体デスルファトヒ
ルヂン ＨＶ−１（Ａｓｐ）の停留時間に相当する。
【０２１９】
【実施例１２】 ヒルヂン含有の製薬学的製品の製造 高い価値の製薬学的製品は、本発明による製法で生成さ
れたヒルヂン ペプチドから製造された。製薬学的に利
用できる担体は、該製品に添加された。ヒルヂンは、適
当な担体中に溶解されるか或いは懸濁されることができ
る。静脈或いは非経口的な投与のものを製造するため
に、１００ｍｌの発熱因子のない水の中に、３０ｍｇの
ヒルヂンＨＶ−１及び０．９ｇの分析学的に純粋なＮａ
Ｃｌを溶解させた。溶液を、ミリポア メンブランを通
す濾過により滅菌した。そして、アンプル中に充填し
た。このように得た製薬学的な組成物は、動脈血栓症の
遮断のために、また、静脈血栓症の防止のために、血栓
塞栓症に有利に利用できる。
【０２２０】
【発明の効果】以上説明したように、本発明の製法によ
り、前記のような効果が得られた。
【０２２１】２つのヒルヂン型：即ち、変異型ＨＶ−１
３３ＡＳＰ及びＨＶ−１ ３３ＡＳＮを、組替え体技
術により生産する新規な方法を提供した。更に、本発明
による製法で生成されたヒルヂン ペプチドから製造さ
れた。製薬学的に利用できる担体は、該製品に添加され
た。ヒルヂンは、適当な担体中に溶解されるか或いは懸
濁されることができる。静脈或いは非経口的な投与のも
のを製造するために、１００ｍｌの発熱因子のない水の
中に、３０ｍｇのヒルヂンＨＶ−１及び０．９ｇの分析
学的に純粋なＮａＣｌを溶解させた。溶液を、ミリポア
メンブランを通す濾過により滅菌した。そして、アン
プル中に充填した。このように得た製薬学的な組成物
は、動脈血栓症の遮断のために、また、静脈血栓症の防
止のために、血栓塞栓症に有利に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による大腸菌−サッカロマイセス コド
ンの使用に基づいて設計したヒルヂンＨＶ−１構造の配
列を示し、
【図２】本発明による相当するアミノ酸配列を有するス
トレプトマイセス コドンに基づいての単一ペプチド及
びデスルファヒルヂンのヌクレオチド配列を示す。
【図３】pUC19::H207 Asp及びpUC19::H221 Asnベクター
ＤＮＡを生産する方法を図式的に示す。
【図４】pGY97ベクターの部分的限定及び機能地図を示
す。
【図５】ファージでトランスフェクションされ、沃素で
染色されたプレイト（平板）で生物の形態を示す写真で
あり、矢印はpGYOKI 30ベクター含有のファージ プラ
クの１つを示す。
【図６】pGYOKI30及びpGYOKI31ベクターＤＮＡを生産す
るに用いる方法を図式的示す。
【図７】pGYOKI33及びpGYOKI34ベクターＤＮＡを生産す
るに用いる方法を図式的示す。
【図８】次の調節要素：プロモーター（ＰＲ）（−３
５、−１０及び転写開始部位で）；非翻訳領域(5’NT);
シャイン−ダルガルノ配列(SD:Shine-Dalgarno):信号ペ
プチドを解読する遺伝子:ヒルヂン構造遺伝子（ＨＩ
Ｒ）を含有するＨ１６のヌクレオチド配列である。
【図９】pGYOKI1-H16プラスミドの一部を図式的に示
し、H16配列はpUC19::H16からクローン化されて,図の略
号は図８と同じであり、SPCはエンドペプチドのための
支持された切断部位を示す。
【図１０】pUN121::H16ベクターの図式的地図である。
【図１１】pEX1::H16ベクターの図式的地図である。
【図１２】ヒルヂンＨＶ−１配列をpブル−スクリプトK
S+ベクターＤＮＡ中にクローン化する方法を図式的に示
す。
【図１３】α-ガラクトシダ−ゼ−ヒルヂン融合蛋白質
を発現するためのベクターＤＮＡを生産する方法を図式
的に示す。
【図１４】YpGYOK1HベクターＤＮＡを生産するために用
いる方法を図式的に示す。
【図１５】オリゴヌクレオチド−仲介の突然変異誘発に
使用する方法を図式的に示す。
【図１６】YEpGYOK1eb2及びpUC19eb2ベクターＤＮＡを
生産するに使用する方法を示す。
【図１７】YEpGYOK1(eb2)2及びYEpGYOK2(eb2)2ベクター
ＤＮＡを生産するに使用する方法を示す。
【図１８】pUC19eb6ベクターＤＮＡを生産するに使用す
る方法を示す。
【図１９】YEpGYOK1eb6及びYEpGYOK2eb6ベクターＤＮＡ
を生産するに使用する方法を示す。
【図２０】YpGYOK2T及びYEpGYOK2eb2ベクターＤＮＡを
生産するに使用する方法を示す。
【図２１】pMI1.3ベクターＤＮＡの部分制限地図を示
す。
【図２２】pMIAMHIRベクターＤＮＡの部分制限地図を示
す。
【図２３】pNeoAMHIRベクターＤＮＡの部分制限地図を
示す。
【図２４】pデルタネオAMHIRベクターＤＮＡの部分制限
地図を示す。
【図２５】pMI-デルタネオ ベクターＤＮＡの部分制限
地図を示す。
【図２６】pKK-デルタネオ ベクターＤＮＡの部分制限
地図を示す。
【図２７】pMI-K2デルタネオ ベクターＤＮＡの部分制
限地図を示す。
【図２８】β−ガラクトシダ−ゼ−ヒルヂン融合蛋白質
の分析を示すSDS-PAGEゲルで，生物の形態を示す写真で
ある。
【図２９】ＨＰＬＣにより作られたデスルファトヒルヂ
ン ＨＶ−１のクロマトグラフプロフィルを示し、デス
ルファトヒルヂン ＨＶ−１は、２１分３０秒に見られ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/79 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 イシュトヴァーン モルナール ハンガリー国 1121 ブダペスト コッシ ュツ エル ウッツァ 32 (72)発明者 アンドラーシュ パッツィー ハンガリー国 1016 ブダペスト フェン ヨェー ウッツァ 10 (72)発明者 イシュトヴァーン バルタ ハンガリー国 1142 ブダペスト カッシ ャイ ウッツァ 10 (72)発明者 ジュジャ バルコー ネーエ トーツ ハンガリー国 1046 ブダペスト オーツ ェアーナーロク ウッツァ 11 (72)発明者 ガーボル アムブルシュ ハンガリー国 1025 ブダペスト チャラ ーン ウッツァ 45／ベー (72)発明者 ヤーノシュ サラートゥ ハンガリー国 1151 ブダペスト ヴェレ シェヂィハーズィ ウッツァ 21 (72)発明者 アニコー テグデシュ ハンガリー国 1031 ブダペスト ヴィズ ィモルナール ウッツァ ６ (72)発明者 イムレ モラヴチック ハンガリー国 1095 ブダペスト メシュ テル ウッツァ 38 (72)発明者 ツェツィリア エヂュド ハンガリー国 1072 ブダペスト ラーコ ーツィ ウート 32 (72)発明者 カーロリィ アルブレシュト ハンガリー国 1145 ブダペスト メキシ コーイ ウート 44 (72)発明者 カールマーン コェンツォェル ハンガリー国 1134 ブダペスト ドゥニ ョヴ イ ウッツァ 16 (72)発明者 アッティラ ヴィンツェ ハンガリー国 1142 ブダペスト チャー クトルニャ パルク ４ (72)発明者 エーヴァ バラバーシュ ハンガリー国 1025 ブダペスト プスタ セリ ウート ６ (72)発明者 ヂョェルヂィ マーテー ハンガリー国 1046 ブダペスト エオェ トゥヴォェシュ イェー ウッツァ 15 (72)発明者 ヂョェルヂィ ボトンド キッシュ ハンガリー国 6720 セゲド カーラース ウッツァ 16 (72)発明者 ペーテル キッシュ ハンガリー国 6723 セゲド エーピート ェー ウッツァ 13／ア (72)発明者 カールマーン ポーリャ ハンガリー国 4028 デブレツェン ペー シィ ウッツァ ９ (72)発明者 ヤーノシュ エルデイ ハンガリー国 4027 デブレツェン ハー マーン カー ウッツァ 32 (72)発明者 エーヴァ グルヤーシュ ハンガリー国 4031 デブレツェン キシ ェヂェシ ウッツァ 50 (72)発明者 エリカ ズィラヒ ハンガリー国 4032 デブレツェン ウー ルレートゥイェ ウッツァ １

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 デスルファトヒルヂン ＨＶ−１ ３３
    ＡＳＰ及びデスルファトヒルヂン ＨＶ−１ ３３
    ＡＳＮ ペプチドの製法において、 ａ）バチルス サーキュランス(Bacillus circulans)α
    −アミラ−ゼ及び大腸菌中の信号配列から誘導されたプ
    ロモーターのヌクレオチド配列のコントロール下で、或
    いは、 ｂ）λ−ファージの右腕上にあり、２つのアミノ酸配列
    を順次そして独立に単一メッセンジャ−ＲＮＡから翻訳
    するＰＲプロモーターのコントロール下で、或いは、大
    腸菌細胞中の融合蛋白質として、或いは、 ｃ）合成ヌクレオチド配列：・・・5’-TCA TTC GTT CA
    A GGT GTA TCT TTG GAT AAG AGA-3’(この配列はエンド
    ペプチダ−ゼのための分泌及び切断の部位を確保するた
    めの信号ペプチド及びアミノ酸配列のため解読するもの
    である）を用いて、プラスミド ベクターＤＮＡの形質
    発現及び安定性のレベルを決めるためにＵＲＡ３及びロ
    イシン２−ｄ遺伝子を使用し、前記のプラスミド中の形
    質発現／分泌のカセットを、サッカロマイセス バヤヌ
    ス(Saccharomyces bayanus)及びサ ッカロマイセス セ
    レビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)により、適用し
    て、ｐＸプロモーター、ＵＡＳ転写活性化配列、開始及
    び終了コドンのコントロール下で、 ｄ）バチルス サーキュランス(Bacillus circulans)α
    −アミラ−ゼのプロモーター、信号の及び調節のヌクレ
    オチド配列のコントロールの下で、或いは、ストレプト
    マイセスから誘導されたネオマイシンＲ遺伝子のプロモ
    ーターのコントロール下で、ストレプトマイセス細胞中
    で、複製するに適する形質発現／分泌のＤＮＡベクター
    中で、生体内の合成の信号配列のコントロール下で、 微生物のコドン用途に基づいて、生体内で合成された前
    記ヒルヂンＨＶ−１ペプチドのためのヌクレオチド配列
    コードを発現することにより、 適正な培養条件下で、前記の要素を有するプラスミドの
    変換した後に、前記微生物を培養し、次に、細胞外で集
    積され、或いは融合蛋白質の形で生成されたヒルヂンを
    分離することにより、前記ヒルヂンＨＶ−１ペプチドを
    生体合成することを特徴とする前記製法。
  2. 【請求項２】請求項１の工程ａ、ｂ、ｃにおいて、 大腸菌及びサッカロマイセス細胞中で用いるデスルファ
    トヒルヂン ＨＶ−１変異型のヌクレオチド配列コード
    は、次の式； GTT GTT TAC ACC GAC TGT ACC GAA TCT GGT CAA AAC TTG TGT TTA TGT GAA GGT TCT AAC GTC TGC GGT CAG GGT AAC AAG TGT ATC TTG GGT TCT RAC GGT GAA AAA AAT CAA TGT GTC ACT GGC GAA GGT TTA CCA AAG CCA CAA TCC CAC AAC GAT GGT GAC TTC GAG GAA ATT CCT GAA GAA TAC CTA CAA を有することを特徴とする請求項１に記載の製法。
  3. 【請求項３】請求項１の工程ｄにおいて、 GTT GTT TAC ACC GAC TGT ACC GAA AGC GGT CAG AAC CTC TGC CTG TGC GAG GGC TCG AAC GTC TGC GGA CAG GGG AAT AAG TGC ATC CTT GGA TCG GAC GGA GAG AAG AAT CAG TGC GTA ACC GGC GAG GGG ACA CCA AAG CCC CAA TCC CAC AAC GAC GGC GAT TTC GAG GAG ATA CCC GAG GAA TAC CTG CAA の式を有するデスルファヒルヂン ＨＶ−１変異型が作
    られ、使用するヌクレオチド配列コード化分泌信号配列
    は、次式： ATG ATC CTC AAG ACC TTC CCG AAG TTC CTG GCT GCG GTC CTT GCT CTC TCA CTG ACG GCG GCA CTC CCC CCA CTG TTC CCG GCC を有することを特徴とする請求項１に記載の製法
  4. 【請求項４】ベクターＤＮＡのｐＵＣ１９：Ｈ１６、ｐ
    ＵＮ１２１：Ｈ１６及び大腸菌細胞の誘導体を変換のた
    めに用いることを特徴とする請求項２に記載の製法。
  5. 【請求項５】デスルファトヒルヂン ＨＶ−１変異型の
    形質発現は、プラスミドを用いて、シングルｍＲＮＡ
    が、λ−ファージ左腕の熱誘導プロモーターの制御下で
    転写され、ヒルヂン変異型が、欠失β−ガラクトシダ−
    ゼ配列、即ち、前記の配列で読み取るフレ−ムでの２つ
    の停止コドン、バチルス サーキュランス(Bacillus ci
    rculans)α−アミラ−ゼ遺伝子、リボゾ−ム結合部位、
    α−アミラ−ゼ信号配列及びヒルヂン構造遺伝子を有す
    るヌクレオチド配列により規定されたｍＲＮＡから翻訳
    され、或いは、 デスルファトヒルヂン ＨＶ−１変異型及びβ−ガラク
    トシダ−ゼの完全或いは欠失配列は、アミノ酸配列がメ
    チオニンにより結合されるような方法で、翻訳され、Ｐ
    Ｒプロモーターの転写コントロール下で行なわれること
    を特徴とする請求項２に記載の製法。
  6. 【請求項６】次のプラスミド：即ち、ｐＥＸ１：：Ｈ１
    ６ デルタＥｃｏＲＶ、ｐＥＸ１：：ＢＨＡｓｐｆｐ或
    いはｐＥＸ１：：ＢＨ２２１ＡｓｎデルタＥｃｏＲＶ−
    ＳｍａＩ及びその誘導体を、ベクターＤＮＡとして用い
    ることを特徴とする請求項２或いは５に記載の製法。
  7. 【請求項７】サッカロマイセス ベクターＤＮＡは、ｅ
    ｂ１、ｅｂ２或いはｅｂ６形質発現の分泌カセットを有
    することを特徴とする請求項２に記載の製法。
  8. 【請求項８】前記株は、サッカロマイセス セレビシア
    エ(Saccharomyces cerevisiae)GYOK1(M)[NCAIM (P)Y 11
    56]及び(M)5[NCAIM (P)Y 1157]或いはサッカロマイセス
    バヤヌス(Saccharomyces bayanus)BO-74[NCAIM (P)Y1
    158]である請求項７に記載の製法。
  9. 【請求項９】次のプラスミド：即ち、ｐＭＩＡＭＨＩＲ
    ３／Ａ、ｐＭデルタネオ、ｐＭＩ−Ｋ２デルタネオ或
    いはｐＧＹＯＫＩ１：：ＮＳＨ１６をベクターＤＮＡと
    して用いることを特徴とする請求項３に記載の製法。
  10. 【請求項１０】デスルファトヒルヂン ＨＶ−１変異型
    を発現する該サッカロマイセス株を、ロイシン含有媒体
    中に維持し、主培養物ブロスをウラシルで抑制しなが
    ら、予備培養することを特徴とする請求項１、２或いは
    ７に記載の製法。
  11. 【請求項１１】ｐＵＣ１９：Ｈ１６プラスミド及びその
    大腸菌形質転換体。
  12. 【請求項１２】ｐＵＮ１２１：Ｈ１６プラスミド及びそ
    の大腸菌形質転換体。
  13. 【請求項１３】ｐＥＸ１：Ｈ１６デルタＥcoＲＶプラス
    ミド及びその大腸菌形質転換体。
  14. 【請求項１４】ｐＥＸ１：ＢＨＡａｐｆｐプラスミド及
    びその大腸菌形質転換体。
  15. 【請求項１５】ｐＥＸ１：ＢＨ２２１アスプデルタＥｃ
    ｏＲＶ−ＳｍａＩプラスミド及びその大腸菌形質転換
    体。
  16. 【請求項１６】ｅｂ１、ｅｂ２或いはｅｂ６の形質発現
    ／分泌カセットのヌクレオチド配列を有し、サッカロマ
    イセス細胞がこれらのプラスミドで変換されるプラスミ
    ド。
  17. 【請求項１７】ｐＭＩＡＭＨＩＲ３／Ａプラスミド及び
    そのストレプトマイセス形質転換体。
  18. 【請求項１８】ｐＭＩデルタネオプラスミド及びそのス
    トレプトマイセス形質転換体。
  19. 【請求項１９】ｐＭＩ−Ｋ２デルタネオプラスミド及び
    そのストレプトマイセス形質転換体。
  20. 【請求項２０】ｐＧＹＯＫＩ１：ＮＳＨ１６プラスミド
    及びそのストレプトマイセス形質転換体。
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