DE69333546T2

DE69333546T2 - Verbesserte enzyme zur herstellung von 2-keto-l-gulonsäure

Info

Publication number: DE69333546T2
Application number: DE69333546T
Authority: DE
Inventors: A. Robert LAZARUS; Mark Hurle; Stephen Anderson; B. David POWERS
Original assignee: Rutgers State University of New Jersey
Current assignee: Rutgers State University of New Jersey
Priority date: 1992-09-08
Filing date: 1993-09-07
Publication date: 2005-08-25
Anticipated expiration: 2013-09-08
Also published as: DE69333546D1; DK0662122T3; JPH08500978A; CA2144053A1; US5376544A; EP0662122B1; EP0662122A1; JP3500148B2; KR950703638A; US5583025A; EP0662122A4; CA2144053C; AU683623B2; AU5102193A; FI951046A; KR100318225B1; ATE268814T1; WO1994005772A1; NZ255940A; PT662122E

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf mutierte Formen der 2,5-Diketo-D-Gluconsäure-(2,5-DKG)-Reduktase a, eine natürlich vorkommende Variante der DKG-Reduktase. Die mutierten Formen können eine verbesserte katalytische Aktivität für die stereoselektive Umwandlung von 2,5-DKG in 2-Keto-L-Gluconsäure (2-KLG), einem Vorläufer der Ascorbinsäure (Vitamin C), zeigen. Zusätzlich können die mutierten Formen erhöhte Expressionslevel in vivo und/oder eine verbesserte Temperaturstabilität haben.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Wegen einem sich erweiternden Gesundheitsbewusstsein von Menschen überall in der Welt bestand ein gesteigerter Bedarf für Vitamin C. Zu dem Bedarf für Ascorbinsäure trägt auch seine weit verbreitete Verwendung als ein Antioxidationsmittel für die Konservierung von Nahrungsmitteln bei. Ein Ansatz zur Befriedigung dieser Nachfrage ist, eine erhöhte Produktion von 2-KLG zu erreichen, einem Zwischenprodukt bei der Herstellung von Ascorbinsäure. Das Zwischenprodukt 2-KLG kann leicht durch eine säure- oder basenkatalysierte Cyclisierung in Ascorbinsäure umgewandelt werden. Es hat auch eine höhere Stabilität und Lagerstabilität als Ascorbinsäure. Deswegen ist es praktischer, anstatt Ascorbinsäure direkt zu produzieren, 2-KLG für die nachfolgende Umwandlung in Ascorbinsäure zu lagern.
Eine Reihe an Arten einer ersten Gruppe an Mikroorganismen, Erwinia, Acetobacter und Gluconobacter, können 2,5-DKG aus D-Glucose erzeugen. Eine zweite Gruppe an Mikroorganismen aus der coryneformen Gruppe an Bakterien (Corynebacterium, Brevibacterium und Arthrobacter), ebenso wie Arten von Micrococcus, Staphylococcus, Pseudomonas, Bacillus und Citrobacter, sind in der Lage, 2,5-DKG, erzeugt durch einen Mikroorganismus der ersten Gruppe, zu 2-KLG umzuwandeln. Diese Cofermentation geeigneter Mikroorganismen, um 2-KLG herzustellen, wurde vereinfacht durch die Kombination der relevanten Eigenschaften von sowohl der Erwinia sp. als auch der von Corynebacterium sp. in einem einzigen Mikroorganismus (Anderson et al., Science, 23: 144–149 (1985)). Dieses wurde bewerkstelligt durch die Identifikation der 2,5-DKG-Reduktase in dem Corynebacterium sp., welches 2,5-DKG in 2-KLG umwandelt. Das Gen für diese Reduktase wurde dann kloniert und in Erwinia herbicola, einem Bakterium der Familie der Enterobacteriaceae, welches D-Glucose in 2,5-DKG in einer einzigen Fermentation umwandelt, exprimiert. Der resultierende rekombinante Bakterienstamm, mit 2,5-DKG-Reduktase als dem zentralen Enzym, war in der Lage, die D-Glucose in 2-KLG in einem Einzelfermentationsvorgang umzuwandeln (Lazarus et al., Fourth ASM Conf. Genet. Molec. Biol. Indust. Microorg., 187–193 (1989)).
Die Verbesserung der katalytischen Wirksamkeit der 2,5-DKG-Reduktase in dem Einzelfermentationsvorgang ist ein wichtiger Weg, um die Produktion von 2-KLG zu steigern. Auch könnte eine gereinigte 2,5-DKG-Reduktase A mit erhöhter katalytischer Aktivität in einem in vitro-Vorgang für die Umwandlung von 2,5-DKG zu 2-KLG verwendet werden. Zum Beispiel würde solch ein Vorgang die kontinuierliche Produktion von 2-KLG durch Immobilisierung des gereinigten Enzyms auf einem festen Trägermaterial erlauben.
Gemäß dem unten ausgeführten Michaelis-Menten-Schema
kann die Effizienz einer enzymatischen Reaktion durch zwei kinetische Parameter, kcat und Km, gemessen werden. Die Katalyseratekonstante, kcat, auch bekannt als die Umsetzungszahl, ist ein Maß für das Zusammenbrechen des Enzymsubstrat-(ES)-Komplexes. Sie steht auch für die maximale Anzahl an Substratmolekülen (S), die zum Produkt (P) über einen ES-Komplex pro aktives Zentrum des Enzyms (E) pro Zeiteinheit umgewandelt werden. Vmax ist die Maximalgeschwindigkeit oder -rate der enzymkatalysierten Reaktion, wenn das Enzym mit Substrat gesättigt ist. Deswegen ist Vmax bei gesättigter Substratkonzentration konstant und bleibt mit jedem Anstieg in der Substratkonzentration unverändert. Bei gesättigten Substratkonzentrationen steht kcat in Beziehung mit Vmax und der Gesamtenzymkonzentration, [E_T], durch die folgende Gleichung: Vmax = kcat [E_T]. Die Michaelis-Konstante, Km, ist der Dissoziationskonstante des ES-Komplexes gleich. Folglich ist Km ein Maß für die Stärke des ES-Komplexes. In einem Vergleich von Km-Werten repräsentiert ein niedrigerer Km einen Komplex mit einer stärkeren, günstigeren Bindung, wohingegen ein höherer Km einen Komplex mit einer schwächeren, weniger günstigen Bindung repräsentiert. Das Verhältnis kcat/Km, als Spezifitätskonstante bezeichnet, repräsentiert die Spezifität eines Enzyms für ein Substrat, das heißt die katalytische Effizienz pro Enzymmolekül für ein Substrat. Je größer die Spezifitätskonstante ist desto mehr wird das Substrat durch das Enzym bevorzugt.
Beeindruckende Mengen von 2-KLG wurden mit einer 2,5-DKG-Reduktase aus Corynebacterium (2,5-DKG-Reduktase A, auch bekannt als 2,5-DKG-Reduktase II) erzielt (Anderson et al., Science, 230: 144–149 (1985); Miller et al., J. Biol. Chem., 262: 9016–9020 (1987)), die in geeigneten Wirtsstämmen (2,5-DKG-Hersteller) wie z. B. Erwinia sp.exprimiert worden war. Diese Ergebnisse wurden trotzdem erreicht, dass 2,5-DKG-Reduktase A eine niedrige Spezifitätskonstante für 2,5-DKG hat.
Diese niedrige Spezifitätskonstante für 2,5-DKG-Reduktase A steht im Widerspruch zu einer zweiten, homologen 2,5-DKG-Reduktase aus Corynebacterium (2,5-DKG-Reduktase B, auch bekannt als 2,5-DKG-Reduktase I), von der eine höhere Spezifitätskonstante für 2,5-DKG berichtet wurde (Sonoyama und Kobayashi, J. Ferment. Technol., 65: 311–317 (1987)). Zusätzlich sind beide 2,5-DKG-Reduktasen homolog zu etlichen bekannten Aldose- und Keto-Reduktasen, die höhere Spezifitätskonstanten für ihre bekannten Substrate haben. Solche Erkenntnisse zeigen an, dass das aktive Zentrum der 2,5-DKG-Reduktase A nicht optimal für die katalytische Umsetzung von 2,5-DKG zu 2-KLG konfiguriert ist. Deswegen scheint es, dass, um die spezifische Aktivität der 2,5-DKG-Reduktase A in dem Einzelfermentationsvorgang zu optimieren, Aminosäuresubstitutionen durch ortsgerichtete Mutagenese an dem aktiven Zentrum des Enzyms getätigt werden müssen.
Zusätzlich zur Verbesserung der kinetischen Parameter eines Enzyms kann ortsgerichtete Mutagenese die strukturelle Stabilität durch Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -insertionen erhöhen. Die Folgenden sind Beispiele strukturell stabilisierender Mutationen. Das Einführen neuer Disulfidbindungen, um kovalente Quervernetzungen zwischen unterschiedlichen Teilen eines Proteins zu schaffen, wurde verwendet, um die thermische Stabilität des Lysozyms des Bakteriophagen T4 (Matsumura et al., Nature, 342: 291–293 (1989)), des Bakteriophagen-λ-Repressors (Sauer et al., Biochem., 25: 5992–5998 (1986)), der Dihydrofolatreduktase von E. coli (Villafranca et al., Biochem., 26: 2182–2189 (1987)) und von Subtilisin BPN' (Pantoliano et al., Biochem., 26: 2077–2082 (1987)) zu verbessern. Es gibt ein Computerprogramm (Pabo et al., Biochem., 25: 5987–5991 (1986)), das ein wirksames Durchsuchen der kristallographisch bestimmten dreidimensionalen Struktur eines Proteins erlaubt, um jene Stellen vorzuschlagen, wo das Einfügen von zwei Cysteinen zu Disulfidbrücken führen könnte. Solche Bindungen würden die Konformation in großem Maßstab nicht stören, während sie die örtliche Konformation stabilisieren würden.
Von den Aminosäuresubstitutionen von Alanin für Glycin in der α-Helix wurde gezeigt, dass sie die thermische Stabilität des Bakteriophagen-λ-Repressors (Hecht et al., Struct. Funct. Genet., 1: 43–46 (1986)) und der neutralen Protease aus Bacillus stearothermophilus (Imanaka et al., Nature, 324: 695–697 (1986)) erhöhen. Eine Erhöhung der Schmelztemperatur, T_m, für das Bakteriophagen-T4-Lysozym wurde durch zwei Aminosäuresubstitutionen von Prolin für Alanin und Alanin für Glycin bewerkstelligt (Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 6663–6667 (1987)). Von dem Ersetzen von Aminosäuren in dem hydrophoben Kern eines Proteins durch aromatische Reste, wie z. B. Tyrosin, insbesondere in Positionen in der Nähe von bereits bestehenden Clustern aromatischer Nebenketten, wurde gezeigt, dass es die thermische Stabilität in der Kanamycin-Nucleotidyltransferase (Liao et al., Biochem., 83: 576–580 (1986)) und in dem Bakteriophagen-λ-Repressor (Hecht et al., Biochem., 81: 5685–5689 (1984)) fördert.
Transkriptions- und Translationskontrollsequenzen in Expressionsvektoren sind Schlüsselelemente, die für die Produktion von Proteinen in Bakterien in hohem Maße benötigt werden. Die E. coli Trp-, Bakteriophagen λP_L-, E. coli lac UV5- und die Trp-lacUV5-Fusions- (Tac-) Promotoren befinden sich unter den am häufigsten verwendeten prokaryotischen Promotoren (de Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21–25 (1983); Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press (1989); Remaut et al., Gene, 15: 81–93 (1981)). Es gibt keinen Weg zu bestimmen, ob ein bestimmtes Protein nach der Induktion durch diese Promotoren hoch exprimiert wird. Die Translationseffizienz der Botschaft, die mRNS-Stabilität, und die intrinsische Proteinstabilität sind die Hauptfaktoren bei der Hochexpression. Deswegen ist es immer möglich, wenn ein Protein der Mutagenese unterzogen wird, dass seine Expressionsspiegel beeinträchtigt werden.
Ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung von synthetischen DNS-Oligonucleotiden mit der gewünschten Sequenz erlaubt die Substitution, Deletion oder Insertion ausgewählter Nucleotide innerhalb einer DNS-Sequenz, die ein Protein von Interesse kodiert. Rekombinante DNS-Verfahren werden verwendet, um die gewünschte Mutation durch Substitution der synthetischen Sequenz für die Zielsequenz einzuführen. Die Entwicklung von Plasmiden, die einen Replikationsstartpunkt enthalten, abgeleitet von einem filamentösen Bakteriophagen (Vieira und Messing, Methods in Enzymology, 153: 3–11 (1987)), erlaubt das Klonieren von Fragmenten in einzelsträngigen Formen von Plasmiden, die zu autonomer Replikation fähig sind. Die Verwendung solcher Plasmide eliminiert das mühsame Geschäft des Subklonierens von DNS-Fragmenten von Plasmiden zu filamentösen Bakteriophagenvektoren. Kits zum Durchführen von ortsgerichteter Mutagenese sind im Handel erhältlich.
Mutanten der 2,5-DKG-Reduktase A mit Eigenschaften, die zu denen des nativen Enzyms variieren, wären nützlich. Besonders Mutanten mit einer verbesserten katalytischen Aktivität, einer verstärkten Temperaturstabilität und erhöhten Expressionsspiegeln würden nützlich sein, um die kommerzielle Nützlichkeit des Enzyms auszudehnen.
Unglücklicherweise ist es nicht möglich, solange Proteine nicht Bereiche von wesentlicher Sequenz oder struktureller Homologie teilen, unter Proteinen zu verallgemeinern, um, basierend auf einer günstigen Mutation eines Proteins, präzise vorherzusagen, wo die Sequenz, die ein anderes Protein kodiert, verändert werden sollte, um das Erscheinungsbild jenes Proteins zu verbessern. Deshalb ist es notwendig, eine Analyse der präzisen strukturellen und funktionellen Eigenschaften des bestimmten zu ändernden Proteins vorzunehmen. Dies bestimmt, welche Aminosäuren zu ändern sind, um ein gewünschtes Ergebnis zu erzeugen, wie z. B. gesteigerte katalytische Effizienz, thermische Stabilität oder Expression.
Die vorliegende Erfindung stellt mutierte Formen der prokaryotischen 2,5-DKG-Reduktase A bereit. Es wurde eine Analyse der Struktur der 2,5-DKG-Reduktase A unternommen, um Änderungen auszuwählen, die das Enzym kodieren, um die Stabilität, Expression und/oder Aktivität der resultierenden Mutanten zu ändern. Ortsgerichtete Mutagenese der Sequenz, die das Enzym kodiert, wurde gestaltet, um die Mutanten zu erzeugen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Mutanten bereit, die spezifische Modifikationen der 2,5-DKG-Reduktase A enthalten, und sie stellt Materialien und Verfahren bereit, die bei der Herstellung dieser Proteine nützlich sind, ebenso wie modifizierte Mikroorganismen und Zelllinien, die bei deren Produktion nützlich sind. Andere Aspekte der Erfindung schließen die Expressionskonstrukte und Produkte davon für die modifizierten 2,5-DKG-Reduktasen ebenso wie Klonierungsvektoren ein, die die DNS enthalten, die die modifizierten 2,5-DKG-Reduktasen kodieren.
Es wird die DNS, die die Wildtyp-2,5-DKG-Reduktase A kodiert, unter Verwendung von ortsgerichteter Mutagenese modifiziert, wobei eine einzelsträngige Form des Plasmids verwendet wird, das die Erzeugung einer Änderung an einer ausgewählten Stelle innerhalb des kodierenden Bereichs der 2,5-DKG-Reduktase A ermöglicht. Durch dieses Verfahren wird eine Änderung in isolierter DNS, die 2,5-DKG-Reduktase A kodiert, eingeführt, welche nach der Expression der DNS in der Substitution von wenigstens einer Aminosäure an einer vorherbestimmten Stelle in der 2,5-DKG-Reduktase A resultiert. Ebenfalls wird unter Verwendung dieses Verfahrens eine Änderung in isolierter DNS, die 2,5-DKG-Reduktase A kodiert, eingeführt, welche nach der Transkription der DNS in der Substitution von wenigstens einem Nucleotid an einer vorbestimmten Stelle in der mRNS der 2,5-DKG-Reduktase A resultiert, was eine erhöhte Expression erlaubt.
Die modifizierten 2,5-DKG-Reduktasen und kodierenden Sequenzen der Erfindung können eine verbesserte Stabilität, Expression und/oder katalytische Aktivität ausüben und können variierte Km- und Vmax-Werte haben.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung eine mutierte Form der 2,5-DKG-Reduktase A bereit, die eines oder mehrere der folgenden umfasst:

(a) eine oder mehrere Aminosäure-Substitutionen, -Insertionen oder -Deletionen an den Resten 165–168, 187–198, 224–234 oder 262–278 der 2,5-DKG-Reduktase A, wie in 3 definiert, was zu einer Aktivität führt, welche unterschiedlich ist von jener der Wildtyp-2,5-DKG-Reduktase A,
(b) Substitution von Alanin für Glycin in einer α-Helix, was zu einer erhöhten Stabilität im Vergleich zu der Wildtyp-2,5-DKG-Reduktase A führt,
(c) Substitution einer aromatischen Aminosäure in der Nähe eines aromatischen Clusters, was zu einer erhöhten Stabilität im Vergleich zu der Wildtyp-2,5-DKG-Reduktase A führt, oder
(d) Substitution von Asparagin am Rest 2 und von Threonin am Rest 5 und von Serin am Rest 7, wie in 3 definiert, was zu einer erhöhten Proteinexpression im Wirt führt.

Die Erfindung stellt auch ein DNS-Konstrukt bereit, das ein Strukturgen umfasst, das wenigstens ein mutiertes Codon enthält, worin dieses Gen eine Mutante der Erfindung kodiert.
Die Erfindung stellt auch eine Wirtszelle bereit, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der ein DNS-Konstrukt der Erfindung einschließt. Diese Wirtszelle kann ein Bakterium sein und der Expressionsvektor kann ein Plasmid sein.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt einen Expressionsvektor für das 2,5-DKG-Reduktase-A-Gen;
2 zeigt einen Expressionsvektor für die Erzeugung mutierter Formen der 2,5-DKG-Reduktase A; und
3 zeigt schematisch ein vorgeschlagenes Modell für die 2,5-DKG-Reduktase A.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Definitionen
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Wildtyp"-2,5-DKG-Reduktase A auf ein Protein, das in der Lage ist, stereoselektiv die Umsetzung von 2,5-DKG zu 2-KLG zu katalysieren. Das Wildtypenzym ist das Enzym vor den Modifikationen, wie sie hierin beschrieben sind. Das Enzym wird gewonnen aus Corynebacterium sp., abgeleitet vom ATCC-Stamm Nr. 31090, wie beschrieben im US-Patent Nr. 5,008,193.
"Mutante" im Zusammenhang mit der "Wildtyp"-2,5-DKG-Reduktase A bezieht sich auf ein Protein, das eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, Deletionen oder Insertionen von Aminosäureresten enthält. Diese Reste wurden ausgewählt unter Verwendung gewisser Ansätze, um jene Bereiche des Proteins vorherzusagen, die am wahrscheinlichsten Reste des aktiven Zentrums enthalten. Ein Ansatz schließt die Verwendung von Vorhersagen der Sekundärstruktur ein, um 2,5-DKG-Reduktase A einer achtsträngigen α/β-Tonnenstruktur zuzuordnen. Eine Reihe an Modifikationen wird unternommen, um das Gen zu modifizieren, um Mutanten des Enzyms zu kodieren mit im Vergleich zu dem Wildtypenzym unterschiedlichen Eigenschaften für die stereoselektive Umsetzung von 2,5-DKG zu 2-KLG.
Es ist im Stand der Technik wohl verstanden, dass viele der Verbindungen, die in der gegenwärtigen Beschreibung diskutiert werden, wie z. B. Proteine und die sauren Derivate von Zuckern, in einer Reihe an Ionisierungszuständen existieren können in Abhängigkeit von ihren um gebenden Medien, falls sie in Lösung sind oder außerhalb der Lösungen, aus denen sie zubereitet worden sind, falls sie in fester Form vorlagen. Bei der Verwendung eines Begriffes wie beispielsweise Gluconsäure, um solche Moleküle zu bezeichnen, ist beabsichtigt, alle Ionisierungszustände des organischen Moleküls, auf das er sich bezieht, einzuschließen. Folglich beziehen sich z. B. sowohl "D-Gluconsäure" und "D-Gluconat" auf dieselbe organische Einheit und sind nicht darauf gerichtet, besondere Ionisierungszustände zu bestimmen. Es ist wohl bekannt, dass D-Gluconsäure in unionisierter Form existieren kann oder erhältlich sein kann z. B. als das Natrium-, Kalium- oder ein anderes Salz. Die ionisierte oder unionisierte Form, in welcher die Verbindung für die Offenbarung angemessen ist, wird entweder für den Fachmann aus dem Zusammenhang offensichtlich oder bedeutungslos sein. Folglich können das 2,5-DKG-Reduktase-A-Protein selber und seine verschiedenen Mutanten in einer Reihe an Ionisierungszuständen in Abhängigkeit von dem pH-Wert existieren. Alle diese Ionisierungszustände sind umfasst durch die Begriffe "2,5-DKG-Reduktase A" und "mutierte Form der 2,5-DKG-Reduktase A".
"Expressionsvektor" schließt Vektoren ein, die in der Lage sind, darin enthaltene DNS-Sequenzen zu exprimieren, wo solche Sequenzen operabel mit anderen Sequenzen gekoppelt sind, die in der Lage sind, ihre Expression zu bewirken. Es ist impliziert, obwohl nicht ausdrücklich festgestellt, dass Expressionsvektoren in den Wirtsorganismen entweder als Episomen oder als ein integraler Teil einer chromosomalen DNS replizierbar sein müssen. Klar würde ein Fehlen der Replikation sie tatsächlich inoperabel machen. Im Ergebnis wird "Expressionsvektor" auch eine funktionelle Definition gegeben. Allgemein werden Expressionsvektoren, die bei rekombinanten DNS-Techniken von Nutzen sind, oftmals in der Form von "Plasmiden" vorliegen. Plasmide beziehen sich entweder auf zirkuläre doppelsträngige DNS-Moleküle oder zirkuläre einzelsträngige DNS-Moleküle, die einen Replikationsstartpunkt enthalten, der von einem filamentösen Bakteriophagen abgeleitet ist. Diese DNS-Moleküle, in ihrer Vektorform, sind nicht an die Chromosomen gekoppelt. Andere effektive Vektoren, die gewöhnlich verwendet werden, sind Phagen und azirkuläre DNS. In der vorliegenden Beschreibung werden "Plasmid" und "Vektor" oftmals austauschbar verwendet. Die Erfindung ist jedoch beabsichtigt, andere solche Formen von Expressionsvektoren einzuschließen, die äquivalenten Funktionen dienen und welche bekannt sind oder nachfolgend bekannt werden.
"Rekombinante Wirtszellen", "Wirtszelle", "Zellen", "Zellkulturen" usw. werden austauschbar verwendet, um individuelle Zellen, Zelllinien, Zellkulturen und geerntete Zellen zu bezeichnen, die mit den rekombinanten Vektoren der Erfindung transformiert wurden oder von denen beabsichtigt wird, sie damit zu transformieren. Die Begriffe schließen auch die Vorläufer der Zellen ein, die ursprünglich den Vektor erhielten.
"Transformation" bezieht sich auf jeden Vorgang, um den DNS-Gehalt des Wirtes zu ändern. Dies schließt in vitro-Transformationsvorgänge wie z. B. durch Calciumphosphat oder DEAE-Dextran vermittelte Transfektion, Elektroporation, Kerninjektion, Phageninfektion oder solche anderen Mittel ein, um kontrollierte DNS-Aufnahme zu bewirken, wie sie im Stand der Technik bekannt sind.
Die Begriffe "Aminosäure" und "Aminosäuren" beziehen sich auf sämtliche natürlich vorkommenden L-α-Aminosäuren. Von dieser Definition wird gedacht, dass sie Norleucin, Ornithin und Homocystein einschließt. Die Aminosäuren werden durch entweder ihre Einzel-Buchstaben- oder Drei-Buchstaben-Bezeichnungen identifiziert:
Diese Aminosäuren können gemäß der chemischen Zusammensetzung und den Eigenschaften ihrer Seitenketten klassifiziert werden. Sie werden grob in zwei Gruppen klassifiziert, geladene und ungeladene. Jede dieser Gruppen wird in Untergruppen aufgeteilt, um die Aminosäuren genauer zu klassifizieren:

I. Geladene Aminosäuren saure Reste: Asparaginsäure, Glutaminsäure basische Reste: Lysin, Arginin, Histidin
II. Ungeladene Aminosäuren hydrophile Reste: Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin aliphatische Reste: Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin apolare Reste: Cystein, Methionin, Prolin aromatische Reste: Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan

Ursprünglicher Rest	Konservative Substitutionen
Ala	ser
Arg	lys
Asn	gln; his
Asp	glu
Cys	ser, ala
Gln	asn
Glu	asp
Gly	pro
His	asn; gln
Ile	leu; val
Leu	ile; val
Lys	arg; gln; glu
Met	leu; ile
Phe	met; leu; tyr
Ser	thr
Thr	ser
Trp	tyr
Tyr	trp; phe
Val	ile; leu

Wesentliche Änderungen in der Funktion oder Stabilisierung werden durch das Auswählen von Substitutionen erzeugt, die weniger konservativ sind als jene in Tabelle 1, das heißt durch Auswählen von Resten, die sich signifikanter in ihrer Wirkung auf die Aufrechterhaltung von (a) der Struktur des Polypeptidgerüstes in dem Bereich der Substitution, wie z. B. als eine Blatt- oder helikale Konformation, (b) der Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Zielstelle oder (c) der Masse der Seitenkette unterscheiden. Die Substitutionen, von denen im Allgemeinen erwartet wird, dass sie die stärksten Änderungen erzeugen, werden jene sein, in denen (a) ein hydrophiler Rest, z. B. Serin oder Threonin, substituiert wird für (oder durch) einen hydrophoben Rest, z. B.
Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl; (b) ein Cysteinyl oder Prolyl substituiert wird für (oder durch) irgendeinen anderen Rest; (c) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z. B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl, substituiert wird für (oder durch) einen elektronegativen Rest, z. B. Glutamyl oder Aspartyl; oder (d) ein Rest mit einer großen Seitenkette, z. B. Phenylalanyl, ersetzt wird für (oder durch) einen, der keine Seitenkette hat, z. B. Glycyl.
Allgemeine Methoden
Die meisten der Techniken, die verwendet werden, um Zellen zu transformieren, Vektoren zu konstruieren, Hybridisierung mit einer Sonde zu bewirken, ortsgerichtete Mutagenese durchzuführen und Ähnliche, ebenso wie die Selektion von Mutanten, werden im Stand der Technik weit praktiziert. Die meisten Praktiker sind mit den Standardquellmaterialien, die spezifische Bedingungen und Vorgänge beschreiben, vertraut (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989)). Für die zusätzliche Führung werden jedoch die folgenden Absätze dargestellt.
Expression von 2,5-DKG-Reduktase A
Das vollständige funktionelle Gen wird in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert, der einen Promotor und eine Ribosomenbindungsstelle enthält, die in der Wirtszelle operabel ist, in welche die kodierende Sequenz transformiert werden wird. Im gegenwärtigen Stand der Technik sind eine Anzahl an Förder-/Kontrollsystemen und geeigneten prokaryotischen Wirten erhältlich, die für die vorliegende Erfindung angemessen sind. Ähnliche Wirte können sowohl für das Klonieren als auch für die Expression verwendet werden, da Prokaryonten im Allgemeinen für das Klonieren von DNS-Sequenzen bevorzugt werden. Das Verfahren der 2-KLG-Produktion ist am üblichsten mit solchen mikrobiellen Systemen verbunden. Der E. coli-K12-Stamm 294 (ATCC Nr. 31446) ist als ein Klonierungswirt besonders nützlich. Andere mikrobielle Stämme, die verwendet werden, schließen E. coli-Stämme, wie z. B. E. coli B, E. coli X1776 (ATCC Nr. 31537) und E. coli DH-1 (ATCC Nr. 33489) ein. Für die Expression können die zuvor genannten Stämme ebenso wie E. coli W3110 (F-, λ-, prototrophisch ATCC Nr. 27325), Bazillen wie z. B. Bacillus subtilus und andere Enterobacteriaceae wie z. B. Salmonella typhimurium oder Serratia marcesans und zahlreiche Pseudomonas-Spezies verwendet werden. Eine besonders bevorzugte Gruppe an Wirten schließt jene Kulturen ein, die in der Lage sind, Glucose oder andere allgemein erhältliche Metaboliten von 2,5-DKG umzuwandeln. Beispiele solcher Wirte werden allgemein innerhalb der Gattungen Acetobacter, Gluconobacter, Acetomonas und Erwinia gefunden. Die Taxonomie und Nomenklatur dieser Gattungen sind dergestalt, dass denselben oder ähnlichen Stämmen manchmal verschiedene Namen gegeben werden. Zum Beispiel wird auf Acetobacter cerinus, in dem Beispiel unten verwendet, auch Bezug genommen als Gluconobacter cerinus. Beispiele bestimmter Wirte schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Erwinia herbicola ATCC Nr. 21998 (auch in Betracht gezogen als Acetomonas albosesamae im US-Patent Nr. 3,998,697); Acetobacter (Gluconobacter) oxydans Unterart melanozenes, IFO 3292, 3293 ATCC Nr. 9937; Acetobacter (Gluconobacter) cerinus IFO 3263 IFO 3266; Gluconobacter rubiginous, IFO 3244; Acetobacter fragum ATCC Nr. 21409; Acetobacter (Acetomonas) suboxydans Unterart industrious ATCC Nr. 23776.
Im Allgemeinen werden Plasmidexpressions- oder Klonierungsvektoren oder konjugierende Plasmide, die Replikations- und Kontrollsequenzen enthalten, welche abgeleitet werden aus Spezies, die mit der Wirtszelle verträglich sind, in Verbindung mit diesen Wirten verwendet.
Der Vektor trägt gewöhnlich einen Replikationsstartpunkt ebenso wie Markergene, die in der Lage sind, eine phänotypische Selektion in transformierten Zellen bereitzustellen. Zum Beispiel wird E. coli typischerweise unter Verwendung von pBR322 transformiert, einem Plasmid, das abgeleitet ist aus einem E. coli-Stamm (Bolivar et al., Gene, 2: 95–113 (1977)). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und stellt folglich einfache Mittel für die Identifikation transformierter Zellen bereit. Für die Verwendung bei der Expression muss das pBR322-Plasmid oder ein anderes mikrobielles Plasmid auch Promotoren enthalten, oder es muss modifiziert worden sein, um Promotoren zu enthalten, welche durch den mikrobiellen Organismus für die Expression seiner eigenen Proteine verwendet werden können. Jene Promotoren, die am gewöhnlichsten bei der rekombinanten DNS-Konstruktion verwendet werden, schließen das β-Lactamase-(Penicillinase)-System und Lactose-Promotor-Systeme (Chang et al., Nature, 275: 617–624 (1978); Itakura et al., Science, 198: 1056–1063 (1977); Goeddel et al., Nature, 281: 544–548 (1979)) und ein Tryptophan-(trp)-Promotor-System (Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057–4074 (1980); EP-Anmeldung Nr. 0 036 776) ein. Während diese die am üblichsten verwendeten sind, wurden auch andere mikrobielle Promotoren entdeckt und verwendet. Details betreffend ihre Nucleotidsequenzen wurden veröffentlicht, was den Fachmann in die Lage versetzt, jene funktionell in operabler Beziehung zu Genen in Transformationsvektoren zu ligieren (Siebenlist et al., Cell, 20: 269–281 (1980)).
Durch geeignetes Spalten und Ligieren können DNS-Sequenzen, die 2,5-DKG-Reduktase A kodieren, in den zuvor genannten Vektoren eingeschlossen werden, die, wie oben umrissen, zubereitet wurden. Jegliche unnötigen oder hemmenden Sequenzen können zerstört werden und das prokaryotische Enzym kann dann aufgereinigt werden; oder die intakten oder gebrochenen Zellen werden direkt als Katalysatoren verwendet. Alternativ kann der Wirt gewählt werden, so dass er, wenn er einmal transformiert ist, in der Lage ist, die gesamte Umsetzung von Glucose oder einem anderen geeigneten Metaboliten zu dem gewünschten 2-KLG-Produkt zu bewirken.
Sowohl die Wildtyp-Plasmid-DNS als auch die mutierte Plasmid-DNS für 2,5-DKG-Reduktase A werden in einen Wirt für die Enzymexpression transfiziert. Die rekombinanten Wirtszellen werden unter Bedingungen kultiviert, welche die Enzymexpression begünstigen. Gewöhnlich wird Selektionsdruck durch die Anwesenheit eines Antibiotikums ausgeübt. Die Resistenz gegen das Antibiotikum wird durch den Vektor kodiert. Die Kultur unter diesen Bedingungen resultiert in Enzymausbeuten, die größer sind als die Wildtyp-Enzym-Synthese des elterlichen Organismus. Dies ist sogar der Fall, wenn es der elterliche Organismus ist, der transformiert worden ist.
Vektorkonstruktion für die Mutagenese
Anderson et al. beschrieben die Konstruktion des Plasmids ptrpl-35 im US-Patent 5,008,193, welches das klonierte 2,5-DKG-Reduktase-A-Gen unter der Kontrolle des E. coli-trp-Promotors enthält (1). Ein Derivat dieses Plasmids wird mit einigen geringeren Modifikationen konstruiert, um die Konstruktion und Charakterisierung mutierter Formen der 2,5-DKG-Reduktase A zu erleichtern. Diese Modifikationen werden unten beschrieben. Das endgültige Plasmidkonstrukt wird pSStac.DKGR.AAA genannt und ist in 2 gezeigt.

A) Das Strukturgen für die 2,5-DKG-Reduktase A wird mutiert, um drei neue Restriktionsenzymstellen einzuschließen, um weitere Mutagenesestudien zu erleichtern. Diese drei Stellen sind "stumm", das heißt die Aminosäuresequenz des resultierenden DKGR-A-Proteins bleibt unverändert.
B) Der Promotor in pSStac.DKGR.AAA ist der tac-II-Promotor, beschrieben durch de Boer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21–25 (1983)) anstelle des trp-Promotors, der in ptrpl-35 gefunden wird. Dies ist eine modifizierte Version des trp-Promotors, der die Bindungsstelle für den lac-Repressor enthält, was die Expression des Gens ermöglicht, das in Zellen zu regulieren ist, die den lac-Repressor exprimieren.
C) Das Plasmid wird weiter modifiziert, um den Replikationsstartpunkt des einzelsträngigen filamentösen Phagen f1 zu enthalten. Die Verwendung dieser DNS-Sequenz in Plasmiden ist im Stand der Technik wohl bekannt, um eine einzelsträngige Form des Plasmids für das Sequenzieren und die Mutagenese zu erzeugen.

Ortsgerichtete Mutagenese
Nachdem die gewünschten Modifikationen ausgewählt worden sind, wird die DNS-Sequenz, welche die 2,5-DKG-Reduktase A kodiert, ortsgerichteter Mutagenese unterzogen, um Nucleotide zu ersetzen, die ausgewählte Aminosäuren an den vorbestimmten Positionen in der Sequenz kodieren.
Das bevorzugte Vorgehen für ortsgerichtete Mutagenese wird durch Klonieren der DNS-Sequenz, die das Wildtypenzym kodiert, in ein rekombinantes Plasmid durchgeführt, das einen Replikationsstartpunkt enthält, der von einem einzelsträngigen Bakteriophagen abgeleitet ist. Dann wird ein geeigneter Primer verwendet, um ein Rest an einer identifizierten Position umzuwandeln, z. B. eine konservative Aminosäureersetzung. Ein synthetischer Oligonucleotidprimer, der, mit Ausnahme in Gebieten von begrenzten fehlenden Übereinstimmungen, komplementär ist zu der gewünschten Sequenz, wird als ein Primer bei der Synthese eines Strangs verwendet, der komplementär ist zu der einzelsträngigen Sequenz der Wildtyp-2,5-DKG-Reduktase A in dem Plas midvektor. Die resultierende doppelsträngige DNS wird in ein Wirtsbakterium transformiert. Konturen der transformierten Bakterien werden auf Agarplatten ausplattiert, wodurch Koloniebildung aus einzelnen Zellen ermöglicht wird, die das Plasmid beherbergen. Theoretisch werden 50% der Kolonien aus Plasmid bestehen, das die mutierte Form enthält; 50% werden die Ausgangssequenz haben. Die Kolonien werden mit radiomarkiertem synthetischen Primer unter stringenten Bedingungen hybridisiert, die eine Hybridisierung nur mit dem mutierten Plasmid erlauben, das eine perfekte Übereinstimmung mit der Sonde bilden wird. Hybridisierende Kolonien werden dann gepickt und kultiviert und die mutierte Plasmid-DNS wird wiedergewonnen.
Auswahl von Stellen für die Mutagenese von Mutanten für das Wildtyp-2,5-DKG-Reduktase-A-Gen
Entscheidend bei der Auswahl von Mutagenesestellen ist die Vorhersage einer Sekundär- und Tertiärstruktur des Wildtypenzyms. Die Vorhersagen der Sekundärstruktur werden auf einem der folgenden Wege durchgeführt. Zuerst werden die Sequenzen der 2,5-DKG-Reduktasen A und B und die von fünf anderen homologen Enzymen (Prostaglandin-F-Synthase, Rinderlinsen- und Rattenlinsen-Aldosereduktase, menschliche Leberaldehydreduktase und p-Kristallin aus Froschaugenlinsen) angeordnet, um eine Anzahl konservierter Reste aufzudecken. Als zweites werden die Sequenzen einer Reihe an Strukturvorhersagealgorithmen unterzogen (Chou und Fasman, Adv. Enzymol., 47: 45–148 (1978); Garnier et al., J. Mol. Biol., 120: 97–120 (1978); Wilmot und Thornton, J. Mol. Biol., 203: 221–232 (1988); Karphus und Schulz, Naturwissenschaften, 72: 212–214 (1985); Eisenberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 140–144 (1984); Rose und Roy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4643–4647 (1980)), die im Stand der Technik wohl bekannt sind. Diese Vorhersagen werden gesammelt und miteinander verglichen, um ein grobes Modell der Sekundärstruktur des Enzyms als eine achtsträngige α/β-Tonne abzuleiten. Diese Sekundärstrukturvorhersage steht in Übereinstimmung mit den kürzlich gelösten Sekundärstrukturen von homologen Enzymen, die die Faltung einer achtsträngigen α/β-Tonne haben (Rondeau et al., Nature, 355: 469–472 81992); Wilson et al., Science, 257: 81–84 (1992)).
Die Tonnenstruktur ist aus zwei Bestandteilen zusammengesetzt. Der erste Bestandteil ist ein Kern aus acht verdrehten parallelen Beta-Strängen, die eng aneinander, ähnlich Fassdauben, zu einer Tonne angeordnet sind. Diese Tonnenstruktur umgibt ein zweiter Bestandteil von acht Alpha-Helices, die mit den Beta-Strängen durch Schleifen unterschiedlicher Längen verbunden sind. Diese achtsträngige α/β-Tonnenstruktur wird die Triosephosphatisomerase-(TIM)-Tonne genannt nach dem Enzym, für welches diese Struktur zuerst beobachtet worden war. Das Faltmuster der α/β-Tonne wird in 17 Enzymen gefunden, deren Kristallstrukturen bekannt sind. In der Tat sind ungefähr 10% der bekannten Enzymstrukturen α/β-Tonnen (Faber und Petsko, TIBS, 15: 228– 234 81990)). Die 17 bekannten α/β-Tonnenenzyme haben einen gemeinsamen α/β–Tonnenkern; die Substrat- und Cofaktorspezifität kommt von den variablen Schleifen, die die Beta-Stränge und Alpha-Helices verbindet.
Das vorgeschlagene Sekundärstrukturmodell für die 2,5-DKG-Reduktase A, basierend auf dem Konsensus der Sekundärstrukturvorhersagen von Mitgliedern der Aldosereduktase-Familie (siehe oben), wird schematisch in 3 gezeigt, wo Beta-Stränge durch Pfeile dargestellt werden und die Alpha-Helices als Zylinder gezeigt sind. Bereiche der Polypeptidkette, die die vorhergesagten Elemente der Sekundärstruktur verknüpfen, sind gekennzeichnet als von undefinierter Struktur seiend. Es gibt N- und C-terminale Verlängerungen von 34 bzw. 17 Aminosäuren. Solche Verlängerungen in den TIM-Tonnenenzymen bilden oftmals Alpha-Helices, die sich über das obere Ende oder den Boden der Tonne zurückfalten. Von einigen Untergruppen der acht Schleifen an dem C-Terminus des Beta-Faltblatts (in Richtung der Oberseite von 3), ebenso wie von dem C-terminalen "Schwanz" (Positionen 262 bis 278) wird angenommen, dass sie das aktive Zentrum des Enzyms umfassen, wie in anderen TIM-Tonnenenzymen. Obwohl es nur ein grobes Modell ist, erleichtert diese Struktur stark das rationale Bearbeiten des Enzyms, indem es ermöglicht, den Fokus auf jene Reste zu richten, die in vorhergesagten Schleifen des aktiven Zentrums gefunden werden. Es wird offensichtlich sein, dass zusätzliche Reste, die sich in der Nähe zu jenen in den vorhergesagten Schleifen und im "Schwanz" befinden, ebenso einen Teil des aktiven Zentrums umfassen können.
Solche Information, wie welche Aminosäuren das aktive Zentrum eines Enzyms umfassen, kann aus dem Wissen der tatsächlichen dreidimensionalen Form des fraglichen Enzyms gewonnen werden, wie erhalten aus röntgenkristallographischen oder NMR-Untersuchungen. In dem Fall der 2,5-DKG-Reduktase gibt es bis jetzt keine solche strukturelle Information in der veröffentlichten Literatur. Deswegen würde eine alternative Strategie in solch einem Fall die Verwendung des Modells für die 2,5-DKG-Reduktase A als eine α/β-Tonne sein, wie oben diskutiert, um die möglichen einzelnen Aminosäureersetzungen auf jene Reste zu begrenzen, die in den vorgeschlagenen Schleifen des aktiven Zentrums gefunden werden.
Durch solch einen Ansatz werden die drei Oberflächenschleifen, die die Substratbindungsstelle der 2,5-DKG-Reduktase A sind, identifiziert. Diese Schleifen befinden sich an den Positionen 165–168, 187–198 und 224–234. Ein Satz aus zwölf 2,5-DKG-Reduktase-A-Mutanten wird in diesen Schleifen gemacht. Dieser Satz umfasst annähernd sämtliche möglichen Punkt-Substitutionen der 2,5-DKG-Reduktase-B-Sequenz. Viele dieser Mutanten zeigen große Reduktionen in der Aktivität, um 2,5-DKG-Reduktase zu 2-KLG umzuwandeln, sogar wenn nur geringe oder konservative Änderungen in den Aminosäuren durchgeführt werden. Eine der Mutanten, mit einer Substitution von Arginin für Glutamin an der Position 192 in der 2,5-DKG-Reduktase-A-Sequenz, hat eine verbesserte Fähigkeit, 2,5-DKG in 2-KLG umzusetzen. Die Konstruktion dieser Mutante, bezeichnet als "Q192R", wird in Beispiel 2 beschrieben.
Die zwölf Mutanten werden in Acetobacter cerinus exprimiert und für die Umsetzung von 2,5-DKG zu 2-KLG im Rohlysatstadium untersucht. Tabelle 2 unten schließt einen Vergleich der Aktivitäten der zwölf 2,5-DKG-Reduktase-A-Mutanten mit denen der Wildtyp-2,5-DKG-Reduktase A und -2,5-DKG-Reduktase B ein. Die Untersuchungen in Tabelle 2 werden wie in Tabelle 3 unten beschrieben durchgeführt. Die gesteigerte Aktivität von Q192R im Rohlysatstadium, obwohl sie etwas durch die hohen Spiegel an Hintergrundreduktaseaktivität, wie sie in den pBR322-Kontrollysaten gesehen werden kann, verschleiert wird, ist nichtsdestotrotz signifikant und reproduzierbar. Die Daten für pBR322, das Wildtypenzym und die Q192R-Mutante in Tabelle 2 sind der Durchschnitt von drei getrennten Lysatuntersuchungen. Durch die Annahme einer einfachen additiven Beteiligung der Hintergrundreduktaseaktivität in diesen Lysaten zeigen diese Daten, dass die Q192R-Mutante doppelt so aktiv ist wie das Wildtypenzym gegen 2,5-DKG. Die Charakterisierung der kinetischen Konstanten aus gereinigtem Q192R ergibt für dieses Enzym im Vergleich zur Wildtyp-2,5-DKG-Reduktase A einen verbesserten Km- und Vmax-Wert. Siehe Beispiel 5. Folglich zeigt Q192R eine Verbesserung gegenüber dem natürlichen Enzym, sowohl hinsichtlich der Spezifität (Km) als auch der Umsetzungsrate (Vmax).
Auf eine Weise, die ähnlich mit jener ist, die oben beschrieben wurde, wird der C-terminale "Schwanz" auch als Teil des aktiven Zentrums identifiziert. Es wird eine Kürzungsmutante geschaffen, die in einer Polypeptidtermination vor den letzten acht Aminosäureresten der 2,5-DKG-Reduktase A resultiert. Von dieser Mutante wird gefunden, dass sie gut exprimiert wird und dass die Cofaktor-Bindungsstelle gewahrt worden ist, sie ist jedoch, wie in Tabelle 2 unten gezeigt, absolut inaktiv bei der Verwendung von 2,5-DKG als ein Substrat. Durch dieses Kriterium wird geschlossen, dass der C-terminale "Schwanz" einen Teil der Bindungstasche für 2,5-DKG umfasst.
Tabelle 2
Ohne Verwendung des α/β-Tonnenmodells als Führung ist eine zufällige Suche aller möglicher einzelner Aminosäureersetzungen notwendig. Dies erfordert die Konstruktion und die Untersuchung von 170 solcher Enzyme, was die Unterschiede zwischen den Enzymen für eine mögliche Rekrutierung der 2,5-DKG-Reduktase-B-ähnlichen Aktivität auf das 2,5-DKG-Reduktase-A-Gerüst widerspiegelt.
Es werden Glycinreste in α-Helizes, die die erhöhte Masse der substituierten Methylgruppe annehmen können, mit Alaninresten substituiert, um eine Stabilisierung einzuführen. Die Einführung von aromatischen Aminosäureresten wie Tyrosin, Phenylalanin und Tryptophan in der Nähe von aromatischen Clustern innerhalb des Enzyms liegen ebenfalls innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung. Diese zusätzlichen aromatischen Reste stabilisieren das Enzym an Stellen, wo die Einführung solcher aromatischer Gruppen die Gesamtkonfirmation nicht stören wird.
Mutationen an bestimmten Stellen in einem Protein können zu einer erhöhten Expression jenes Proteins in Bakterien führen. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt gibt es keinen Weg, vorherzusagen, welche Mutationen zu einer verstärkten Expression führen werden. Es ist jedoch bekannt, dass die Faktoren translationale Effizienz, mRNS-Stabilität und erhöhte Proteinstabilität eine Schlüsselrolle bei der Hochexpression spielen.
Viele der anderen möglichen Punktmutationen werden in Clustern von einer bis vier eng beabstandeten Aminosäuresubstitutionen erzeugt. Von den Mutanten, die stabil gefaltet sind, üben nur jene, die in die 164–168-Schleife, die 187–198-Schleife, die 224–234-Schleife und den C-terminalen "Schwanz" (262–278) fallen, eine Aktivität aus, die signifikant von dem Wildtyp-Enzym unterschiedlich ist. Dies ist eine zusätzliche Bestätigung, dass diese Schleifen- und Schwanzregionen das aktive Zentrum des Enzyms umfassen.
Jede Anzahl an hierin vorgeschlagenen Mutationen kann in einer einzelnen Mutante kombiniert werden. Offensichtlich schließt eine bestimmte Substitution an einer Stelle die Ersetzung mit einer anderen Aminosäure an derselben Stelle in jener bestimmten Mutante aus.
Die folgenden Beispiele werden präsentiert, um die vorliegende Erfindung zu erläutern und um einem Durchschnittsfachmann bei der Durchführung und Verwendung derselben zu assistieren. Es ist nicht beabsichtigt, dass die Beispiele in irgendeinem Wege oder andersartig den Schutzumfang der Erfindung beschränken.
BEISPIEL 1
Konstruktion des Plasmids pSStac.DKGR.AAA für die Mutagenese
Eine Aliquote des Plasmids ptrpl-35 wurde mit EcoRI- und HindIII-Restriktionsenzymen verdaut und das resultierende 1.690 Basenpaar-Fragment wurde durch Agarosegelelektrophorese aufgereinigt. Dieses Fragment wurde dann in den mit EcoRI und HindIII verdauten Vektor M13 mp19 ligiert. Der resultierende rekombinante Phage (bezeichnet als M13 mp19.DKGRA) wurde verwendet, um eine einzelsträngige Matrizenform des Phagen für die anschließende Mutagenese zu isolieren. An der Matrize wurde eine Mutation mit drei Oligonucleotiden ausgelöst, um drei neue Restriktionsenzymspaltstellen in dem 2,5-DKG-Reduktase-A-Gen einzuführen. Diese Stellen sind in dahingehend alle "stumm", dass, obwohl sie eine neue Restriktionsspaltstelle in die DNS-Sequenz einführen, die Aminosäuresequenz des Proteins, für das kodiert wird, wegen der Degeneriertheit des genetischen Codes unverändert bleibt. Die drei mutagenen Oligonucleotide und die eingeführten Änderungen sind wie folgt: 1) das Oligonucleotid XbaA hat die Sequenz 5' CGCGAAGCTGGCTCTAGATCAGGTCGAC 3' und führt eine neue XbaI-Stelle an der Aminosäureposition 98 ein; 2) das Oligonucleotid ApaA hat die Sequenz 5' ATCGTGGGGGCCCCTCGGTCAGGGC 3' und führt eine neue ApaI-Stelle an der Aminosäureposition 188 ein; und 3) das Oligonucleotid KpnA hat die Sequenz 5' GAGGTCGACTGAGGTACCCGAACACCCG 3' und führt eine neue KpnI-Stelle unmittelbar folgend auf das Stoppcodon (TGA) nach der letzten Aminosäure ein. Die Mutagenesereaktion und -bedingungen waren im Wesentlichen dieselben wie in Beispiel 2 für die Konstruktion der Mutante Q192R beschrieben. Nach der Mutagenesereaktion wurden positive Plaques durch Hybridisierung mit den mutagenen Oligonucleotiden unter stringenten Bedingungen identifiziert und der gesamte kodierende Bereich des 2,5-DKG-Reduktase-A-Fragmentes wurde sequenziert, um die Mutationen zu bestätigen.
Das Plasmid pSStac.DKGR.AAA wurde als eine Drei-Wege-Ligation der folgenden Fragmente konstruiert: 1) EcoRI bis HindIII von dem mutagenierten Phagen M13 mp19.DKGRA, wie oben beschrieben, wobei dieses Fragment das kodierende Gen für 2,5-DKG-Reduktase A enthält; 2) das PstI- bis EcoRI-Fragment (850 Basenpaare) von dem Plasmid ptac6 (ptac6 ist äquivalent zu dem Plasmid ptrpl-35, enthält jedoch den tac-Promotor, wie beschrieben in de Boer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21–25 (1983), anstelle des trp-Promotors, der in ptrpl-35 gefunden wird), und 3) das 4.000 Basenpaar große Vektorfragment von HindIII bis PstI aus dem Plasmid p690. Das p690-Plasmid ist ein Derivat des Plasmids pBR322 mit dem RsaI/DraI-Restriktionsfragment aus dem Genom des Bakteriophagen f1 (Nucleotide 5489–5946), enthaltend den einzelsträngigen DNS-Replikationsstartpunkt, eingefügt in die PvuII-Stelle.
Die drei oben beschriebenen Fragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese isoliert, aufgereinigt und in annähernd äquimolaren Verhältnissen ligiert und verwendet, um kompetente E. coli-Zellen zu transformieren. Die resultierenden Kolonien wurden durch Restriktionskartierung analysiert, um das korrekte Konstrukt zu identifizieren, genannt pSStac.DKGR.AAA (2).
BEISPIEL 2
Ortsgerichtete Mutagenese des 2,5-DKG-Reduktase-A-Gens
A. Zubereitung der Matrizen-DNS für die Mutagenese
E. coli-Zellen (Stamm XL1-Blue, Stratagene Corporation), die das Plasmid pSStac.DKGR.AAA tragen, wurden in LB-Medien (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press A.1 (1989)) wachsen gelassen bis zur frühen logarithmischen Phase und mit dem Helferphagen VCS-M13 (Stratagene) infiziert. Die Infektion mit einem Helferphagen stellt die benötigen Faktoren für das Verpacken und die Sekretion der einzelsträngigen Form des Plasmids pSStac.DKGR.AAA bereit. Die infizierten Zellen wurden über Nacht unter Schütteln bei 37°C wachsen gelassen und am nächsten Tag wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 10.000 rpm für 10 Minuten in einem Sorvall-SM24-Rotor entfernt. Der Überstand, der das verpackte Plasmid enthält, wurde aufbewahrt und das Zellpellet verworfen. Das verpackte Plasmid wurde durch die Zugabe von 1/4 Volumen 2,5 M NaCl, 20% PEG (Polyethylenglykol) gefällt. Nach der Zugabe wurde die Mischung bei 25°C für 20 Minuten gelagert und dann wurde das Präzipitat durch Zentrifugation wieder gewonnen.
Das Präzipitat wurde in 0,4 ml TE-Puffer (10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA) gelöst und weiter durch etliche aufeinander folgende Extraktionen mit einem gleichen Volumen an 50 : 50 Chloroform : Phenol aufgereinigt. Nach jeder Extraktion wurde die wässrige (obere) Phase zurückbehalten. Die DNS wurde mit 2 Volumen an eiskaltem Ethanol gefällt. Das Präzipitat wurde wieder gewonnen durch Zentrifugation und in TE-Puffer gelöst. Die Konzentration des Plasmids wurde durch Messen der optischen Absorption bei 260 nm unter Verwendung der Umwandlung von 1 OD₂₆₀ = 40 μg einzelsträngige DNS pro Milliliter geschätzt. Die Konzentration des Plasmids wurde auf 1 μg pro ml mit TE angeglichen.
B. Phosphorylierung des Oligonucleotidprimers
Ein synthetisches Oligonucleotid mit der Sequenz 5' GCCCCTCGGTCGCGGCAAGTACG 3' wurde synthetisiert und wie folgt phosphoryliert: Das Oligonucleotid wurde auf eine Konzentration von 5,0 OD₂₆₀-Einheiten pro ml verdünnt. Dann wurden 2,5 μl Oligonucleotid mit 3 μl 10 × Kinasepuffer (1 M Tris, pH 8,0, 100 mM MgCl₂, 70 mM Dithiothreitol, 10 mM ATP), 25 μl Wasser und 2 Einheiten T4-Polynucleotidkinase (New England Biolabs) kombiniert. Die Mischung wurde bei 37°C für 15 Minuten inkubiert, dann wurde das Kinaseenzym durch Erhitzen auf 70°C für 10 Minuten inaktiviert.
C. Mutagenesereaktion
6 μl von mit Kinase behandeltem Primer wurden mit 1 μg Matrizen-DNS und 2,5 μl 10 × RB-Puffer (70 mM Tris, pH 7,5, 50 mM Mercaptoethanol, 550 mM NaCl und 1 mM EDTA) in einem Gesamtvolumen von 10,5 μl kombiniert. Der Primer wurde mit der Matrize zum Doppelstrang gebildet durch Erhitzen der Mischung auf 65°C für 5 Minuten, und dann langsam auf 25°C über einen Zeitraum von 30 Minuten abgekühlt.
Zu der Annealing-Mischung wurden 1,5 μl 10 × RB-Puffer, 1 μl 10 mM ATP, 1 μl 10 mM DTT (Dithiothreitol) und 1 μl T4-DNS-Ligase (New England Biolabs) hinzugefügt. Nach 10 Minuten wurden 1 μl 1 M MgCl₂, 1 μl 5 mM dNTPs (eine äquimolare Mischung aus dATP, dCTP, dGTP und dTTP) und 0,5 μl Klenow (großes Fragment der DNS-Polymerase I, New England Biolabs) hinzugefügt und die Mischung wurde bei 15°C über Nacht inkubiert.
Am folgenden Tag wurden die gefroren kompetenten E. coli-MutL-Zellen mit einer Aliquote der Reaktionsmischung transformiert und auf Agarplatten ausplattiert, die Antibiotikaselektion enthielten (12,5 μg/ml Tetracyclin, 50 μg/ml Ampicillin). Kolonien, die mutierte Plasmide tragen, wurden anfänglich durch Hybridisierung mit dem mutagenen Ausgangsoligonucleotid unter stringenten Bedingungen identifiziert (Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 1585–1588 (1988)). Mutierte Plasmide wurden dann in einer einzelsträngigen Form wie in Abschnitt A zubereitet und durch direktes DNS-Sequenzieren des Plasmids bestätigt (United States Biochemical Corporation, Sequenase-Sequenzierkit). Die resultierende mutierte Q192R-2,5-DKG-Reduktase A, wie in Beispiel 5 gezeigt, hatte eine verbesserte katalytische Aktivität im Vergleich zu der Wildtyp-2,5-DKG-Reduktase A.
BEISPIEL 3
Expression der Wildtyp-2,5-DKG-Reduktase A in Acetobacter cerinus
Plasmid-DNS wurde in Acetobacter cerinus (ATCC Nr. 39140) durch Elektroporation eingeführt, wie beschrieben (Wirth et al., Mol. Gen. Genet., 216(1): 175–177 (1989)) unter Verwendung eines Genepulser-Apparates (Biorad Corporation). Die Zellen wurden bis zur mittleren logarithmischen Phase (OD₅₅₀ ~0,2–0,8) in 100 ml LB-Medium wachsen gelassen und durch Zentrifugation bei 5.000 rpm in einem Sorvall-SS-34-Rotor für 5 Minuten bei 4°C wieder gewonnen. Die Zellen wurden in einem halben Volumen eiskaltem Elektroporationspuffer (300 mM Sucrose, 7 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0 und 1 mM MgCl₂) resuspendiert, wiederum durch Zentrifugation pelletiert und anschließend in 1/20 Volumen Elektroporationspuffer resuspendiert und bis zur Verwendung auf Eis gelagert.
Plasmid-DNS (0,1 bis 1,0 μg) wurde zu einer 0,4 cm Elektroporationsküvette (Biorad Corporation) hinzugefügt, welche 0,8 ml der zubereiteten Acetobacter-Zellen enthielt. Die Zellen und die DNS wurden in der Küvette vermischt und auf Eis für 10 Minuten vor der Elektroporation gekühlt. Den Zellen und der DNS wurde ein einzelner Puls von 2500 mV unter Verwendung einer 25 μF-Kondensatoreinstellung gegeben und sofort auf 3,0 ml mit frischen LB-Medien verdünnt. Den verdünnten Zellen wurde dann ermöglicht, sich unter Schütteln bei 30°C für 2 Stunden zu erholen. Aliquoten (10–100 μl) der transformierten Zellen wurden auf Selektionsmedien (LB-Agarplatten, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin und 12,5 μg/ml Tetracyclin) ausplattiert und die Platten wurden über Nacht bei 30°C wachsen gelassen.
BEISPIEL 4
Aufreinigung der Mutante Q192R und der Wildtyp-2,5-DKG-Reduktase A
Einzelkolonien transformierter Acetobacter cerinus-Zellen wurden in 200 ml 2 × YT-Medien (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989)), enthaltend Antibiotika (12,5 μg/ml Tetracyclin und 50 μg/ml Ampicillin) bei 30°C über Nacht wachsen gelassen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation wieder gewonnen (15 Minuten bei 8.000 rpm in einem Sorvall-GS3-Rotor) und gefroren gelagert. Die Zellen wurden dann in 1/5 Volumen Lysepuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 50 mM EDTA, 0,1% Tween, 2 mg/ml Lysozym) aufgetaut und für 2 Stunden auf Eis lysiert. Die lysierten Zellen wurden wiederum wie zuvor zentrifugiert und der Überstand, der den rohen Zellextrakt enthielt, wurde aufbewahrt.
Das 2,5-DKG-Reduktase-A-Protein wurde von dem Rohzellextrakt durch Chromatographie auf DEAE-Zellulose aufgereinigt. DEAE-Zellulose (Whatman DE-52, Marke) wurde mit 25 mM Tris, pH 7,0, voräquilibriert. Ein Gesamtvolumen von 5,0 ml des Gels wurde in eine wegwerfbare Plastik-Chromatographiesäule gegossen, auf welche der Rohzellextrakt aufgetragen wurde. Nachdem der gesamte Extrakt an die Säule gebunden hatte, wurde die Säule mit zwei Säulenvolumen 25 mM Tris, pH 7,0, gewaschen, dann mit einem Volumen 25 mM Tris, pH 7,0, enthal tend 0,3 M NaCl, gewaschen und schließlich wurde das 2,5-DKG-Reduktase-A-Protein mit 25 mM Tris, pH 7,0, enthaltend 0,6 M NaCl, eluiert. Die Zubereitungen wurden auf die Proteinkonzentration durch das Dicinchonsäureverfahren (Methods in Enzymology, 182: 60–62 (1990)) untersucht und auf ihre Reinheit durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese überprüft.
BEISPIEL 5
Kinetische Charakterisierung der Wildtyp- und der mutierten Q192R-2,5-DKG-Reduktase A
Die Zubereitungen der Wildtyp- und mutierten Q192R-2,5-DKG-Reduktase-A-Enzyme wurden kinetisch charakterisiert hinsichtlich ihrer Fähigkeit, das Substrat 2,5-DKG zu 2-KLG zu reduzieren. Die Untersuchungen wurden in 1 ml Gesamtvolumen aus 50 mM Tris, pH 7,0, enthaltend 0,2 mM NADPH, eine konstante Enzymmenge (15–20 mg) und Substratmengen, die von 2 bis 14 mM variierten, durchgeführt. Die Untersuchungen wurden bei 25°C durchgeführt und die Rate der Substratreduktion wurde spektrophotometrisch durch Messen des Verlustes an Absorption bei 340 nm Wellenlänge (welche kennzeichnend ist für die Oxidation des Cofaktors NADPH zu NADP+) gemessen.
Die Daten wurden gemäß der wohl bekannten Michaelis-Gleichung analysiert, um die kinetischen Parameter Vmax und Km unter Verwendung des Enzfit-Softwarepaketes (Biosoft, Cambridge, UK) auf einem Epson-Tischrechner zu bestimmen. Die Wildtyp-2,5-DKG-Reduktase A hatte einen Vmax-Wert für das Substrat 2,5-DKG von 7,8 μmol pro Minute pro Milligramm Protein, während die Q192R-Mutante einen Vmax-Wert von 14,0 hatte, eine 1,8-fache Steigerung. Der Km-Wert oder die Michaelis-Konstante des Wildtypenzyms war anscheinend 28 mM, wohingegen der Km-Wert der Q192R-Mutante für dieses Substrat 21 mM war. Dies führte zu einer offensichtlichen Spezifitätskonstante (kcat/Km) von 140 M^–1 s^–1 für das Wildtypenzym und einer Spezifitätskonstante von 335 M^–1 s^–1 für die Q192R-Mutante, eine 2,4-fache Steigerung.
BEISPIEL 6
Eine Mutante der 2,5-DKG-Reduktase A mit erhöhter in vivo-Expression
Eine mutierte Form der 2,5-DKG-Reduktase A wurde entdeckt, welche, obwohl sie eine Aktivität hatte, die zu dem Wildtyp-Enzym äquivalent war, erhöhte Menge des Proteins hatte, die in dem Acetobacter-Expressionswirt akkumulierte. Diese Mutante, genannt "HS1", enthält drei Aminosäureänderungen: Asparagin ersetzt Threonin an Position zwei, Threonin ersetzt Serin an Position fünf und Serin ersetzt Valin an Position sieben. Die Synthese dieser Mutante wurde durch ein 37 Basen aufweisendes Oligonucleotid mit der Sequenz 5' AATTCTATGAACGTTCCCACCATCAGCCTCAACGAC 3' gelenkt. Die Schritte in der Mutagenesereaktion waren im Wesentlichen dieselben, wie für die Konstruktion der Q192R-Mutante umrissen.
Tabelle 3 unten zeigt die Ergebnisse von Untersuchungen von Rohzelllysaten von Acetobacter cerinus, die entweder das Plasmid pBR322, ein Kontrollplasmid, das keine 2,5-DKG-Reduktase-A-Sequenz enthält, pSStac.DKGR.AAA, das Plasmid, welches das Wildtyp-Gen exprimiert, oder pSStac.DKGR.AAA.HS1, welches die HS1-Mutationen enthält, tragen. Rohzellextrakte wurden wie in dem Abschnitt über die Aufreinigung des 2,5-DKG-Reduktase-A- und Q192R-Mutanten-Proteins beschrieben zubereitet. Die Ergebnisse sind für dreifache Zellkulturen gezeigt.
Tabelle 3
Bei diesen Untersuchungen an Rohzelllysaten ist es notwendig, die Hintergrund-Reduktase der Acetobacter cerinus-Zellen selber zur Rechenschaft zu ziehen. Diese Menge an Aktivität wird von den pBR322-Kulturen repräsentiert und wird von den anderen Werten abgezogen, um eine "% Wildtyp-Aktivität" zu berechnen.
Die Untersuchungen wurden wie zuvor in 1,0 ml Gesamtvolumen aus 50 mM Tris, pH 7,0, durchgeführt, die 0,2 mM NADPH, eine einzelne festgelegte Menge an 2,5-DKG (10 mM) und 50 μl Rohzelllysat enthielt.
Zellkulturen, die pSStac.DKGR.AAA.HS1 tragen, zeigen übereinstimmend eine 20- bis 30%ige Zunahme in den Expressionsspiegeln gegenüber Zellkulturen, die das Wildtyp-Plasmid pSStac.DKGR.AAA enthalten. Diese Steigerung der Expression kann wegen Änderungen der mRNS-Stabilität, dem Maß der Translation des Boten, der Proteinstabilität oder einer gewissen Kombination dieser Effekte geschehen.
BEISPIEL 7
Eine Mutante der 2,5-DKG-Reduktase A mit erhöhter Temperaturstabilität
Es wird eine mutierte Form der 2,5-DKG-Reduktase A entdeckt, welche eine erhöhte Temperaturstabilität in dem Acetobacter-Expressionswirt hat. Diese Mutante enthält zwei Aminosäureänderungen: Alanin ersetzt Glycin an Position 55 und Alanin ersetzt Glycin an Position 57. Die Synthese dieser Mutante wird Basen-Oligonucleotid mit der Sequenz 5' GAAACGAAGAAGCGGTCGCGGCCGCGATCGCG 3' gelenkt. Die Schritte in der Mutagenesereaktion sind im Wesentlichen dieselben, wie für die Konstruktion der Q192R-Mutante umrissen.
BEISPIEL 8
2,5-DKG-Reduktase-A-Mutanten mit reduzierter Aktivität
Es wurden mutierte Formen der 2,5-DKG-Reduktase A entdeckt, welche beträchtliche Reduktionen in der Aktivität für die Umsetzung von 2,5-DKG zu 2-KLG zeigten. Die Schritte in den Mutagenesereaktionen waren im Wesentlichen dieselben, wie für die Konstruktion der Q192R-Mutante umrissen. Die folgenden Basen-Oligonucleotide lenkten die Synthese solcher Mutanten, die eine reduzierte Aktivität in dem Acetobacter-Expressionswert zeigten:
mit einer Substitution von Alanin für Glycin an Position 191, um die G191A-Mutante, 5' GGGGCCGCTCGCCCAGGGCAAGT 3', zu konstruieren;
mit einer Deletion von Glycin an Position 193, um die G193-Deletionsmutante, 5' CCGCTCGGTCAGAAGTACGACCT 3', zu konstruieren;
mit einer Substitution von Arginin für Lysin an Position 194, um die K194R-Mutante, 5' CGGTCAGGGCCGCTACGACCTCT 3', zu konstruieren;
mit einer Substitution von Serin für Tyrosin an Position 195, um die Y195S-Mutante, 5' TCAGGGCAAGTCGGACCTCTTCG 3', zu konstruieren;
mit einer Substitution von Tyrosin für Alanin an Position 167, um die A167Y-Mutante, 5' GCTGCACCCCTACTACCAGCAGC 3', zu konstruieren;
mit einer Substitution von Phenylalanin für Tyrosin an der Position 168, um die Y168F-Mutante, 5' GCACCCCGCCTTCCAGCAGCGCG 3', zu konstruieren;
mit einer Substitution von Prolin für Glutamin an Position 169, um die Q169P-Mutante 5' CCCCGCCTACCCGCAGCGCGAGA 3', zu konstruieren;
mit einer Substitution von Leucin für Lysin an Position 225, um die K225L-Mutante, 5' GCACCTGCAGCTCGGTTTCGTGG 3', zu konstruieren;
mit einer Substitution von Serin für Phenylalanin an Position 227, um die F227S-Mutante, 5' GCAGAAGGGTTCGGTGGTCTTCC 3', zu konstruieren;
mit einer Substitution von Threonin für Valin an Position 228, um die V228T-Mutante, 5' GAAGGGTTTCACCGTCTTCCCGA 3', zu konstruieren;
mit einer Substitution von Prolin für Valin an Position 229, um die V229P-Mutante, 5' GGGTTTCGTGCCCTTCCCGAAGT 3', zu konstruieren;
und mit einem Stopp-Codon an Position 271, um die Kürzungsmutante, 5' GGGTCGCGTGTGAGCACACCCCG 3', zu konstruieren.

Claims

Mutante Form der 2,5-DKG-Reduktase A (2,5-Diketo-D-glukonsäure-Reduktase A), die eines oder mehrere umfasst von: (a) einer oder mehreren Aminosäuresubstitutionen, -insertionen oder -deletionen an den Resten 165–168, 187–198, 224–234 oder 262–278 der 2,5-DKG-Reduktase A, wie in 3 definiert, die zu einer Aktivität führen, die sich von derjenigen der wildtyp 2,5-DKG-Reduktase A unterscheidet, (b) einer Substitution von Alanin für Glycin in einer α-Helix, die zu einer erhöhten Stabilität verglichen mit der wildtyp 2,5-DKG-Reduktase A führt, (c) die Substitution einer aromatischen Aminosäure in der Nähe eines aromatischen Clusters, was zu einer erhöhten Stabilität im Vergleich zur wildtyp 2,5-DKG-Reduktase A führt, oder (d) die Substitution von Asparagin im Rest 2 und Threonin im Rest 5 und Serin im Rest 7, definiert wie in 3, was zu einer erhöhten Proteinexpression im Wirt führt.
Mutante Form der 2,5-DKG-Reduktase A gemäß Anspruch 1 Teil (a), die eine erhöhte spezifische Konstante im Vergleich zur wildtyp 2,5-DKG-Reduktase A aufweist und welche die Aminosäuresubstitution Glutamin zu Arginin im Rest 192 umfasst, wie in 3 definiert.
Mutante Form der 2,5-DKG-Reduktase A gemäß Anspruch 1 Teil (a), die eine verringerte Aktivität im Vergleich zur wildtyp 2,5-DKG-Reduktase A aufweist und welche Alanin im Rest 191, eine Deletion im Rest 193, Arginin im Rest 194, Serin bei 195, Tyrosin im Rest 167, Phenylalanin im Rest 168, Prolin im Rest 169, Leucin im Rest 225, Serin im Rest 227, Threonin im Rest 228 oder Prolin im Rest 229 enthält, wie in 3 definiert.
Mutante Form der 2,5-DKG-Reduktase A gemäß Anspruch 1 Teil (b), die eine erhöhte Temperaturstabilität im Vergleich zur wildtyp 2,5-DKG-Reduktase A aufweist und welche Alanin im Rest 55 und Alanin im Rest 57 umfasst, definiert wie in 3.
Mutante Form der 2,5-DKG-Reduktase A gemäß Anspruch 1, Teil (a), die bei Verwendung von 2,5-DKG als ein Substrat inaktiv ist und ein Stopcodon im Rest 271, wie in 3 definiert, umfasst.
DNS-Konstrukt, umfassend ein Strukturgen, enthaltend mindestens ein mutiertes Codon, wobei das Gen für eine mutante Form der 2,5-DKG-Reduktase A nach einem der vorstehenden Ansprüche kodiert.
Wirtszelle, transformiert mit einem Expressionsvektor, der ein DNS-Konstrukt gemäß Anspruch 6 umfasst.
Wirtszelle nach Anspruch 7, bei der es sich um ein Bakterium handelt.
Wirtszelle nach Anspruch 8, worin das Bakterium aus der Gattung Erwinia ist.
Wirtszelle nach Anspruch 8, worin das Bakterium aus der Gattung Gluconobacter ist.
Wirtszelle nach Anspruch 8, worin das Bakterium aus der Gattung Acetobacter ist.
Wirtszelle nach Anspruch 8, worin das Bakterium Acetobacter cerinus (IFO 3263) ist.
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 7–12, worin der Expressionsvektor ein Plasmid ist.
Wirtszelle nach Anspruch 13, worin das Plasmid pSStac.DKGR.AAA ist, wie in 2 definiert, worin das 2,5-DKG-Reduktase A-Gen, das darin enthalten ist, die folgenden Aminosäureänderungen enthält: (i) N ersetzt T in Position 2, (ii) T ersetzt S in Position 5, und (iii) S ersetzt V in Position 7, worin die Positionen wie in 3 definiert sind.