ES2222454T3

ES2222454T3 - Enzimas mejoradas para la produccion de acido 2-ceto-l-gluconico.

Info

Publication number: ES2222454T3
Application number: ES93920493T
Authority: ES
Inventors: Robert A. Lazarus; Mark Hurle; Stephen Anderson; David B. Powers
Original assignee: Rutgers State University of New Jersey
Current assignee: Rutgers State University of New Jersey
Priority date: 1992-09-08
Filing date: 1993-09-07
Publication date: 2005-02-01
Anticipated expiration: 2013-09-07
Also published as: KR100318225B1; FI951046A; EP0662122A4; NZ255940A; DK0662122T3; PT662122E; CA2144053A1; EP0662122A1; US5376544A; DE69333546D1; US5912161A; FI951046A0; KR950703638A; WO1994005772A1; US5583025A; ATE268814T1; JPH08500978A; JP3500148B2; DE69333546T2; CA2144053C

Abstract

MUTANTES DE LA REDUCTASA A DE ACIDO 2,5-DICETO-D-GLUCONICO, ENZIMA UTILIZADA PARA PRODUCIR ACIDO 2-QUETO-L-GULONICO Y PRECURSOR DE ACIDO ASCORBICO (VITAMINA C) SE PREPARAN POR MUTAGENESIS DEPENDIENTE DEL LUGAR. ESTOS MUTANTES TIENEN INCREMENTADA ACTIVIDAD CATALITICA, AUMENTADOS NIVELES DE EXPRESION Y/O MAYOR ESTABILIDAD DE TEMPERATURA.

Description

Enzimas mejoradas para la producción de ácido 2-ceto-L-glucónico.

Campo de la invención

La invención se refiere a formas mutadas de la ácido 2,5-diceto-D-glucónico (2,5-DKG) reductasa A, una variante de la DKG reductasa que existe en la naturaleza. Las formas mutadas pueden mostrar una actividad catalítica mejorada para convertir estereoselectivamente el 2,5-DKG en ácido 2-ceto-L-glucónico (2-KLG), un precursor del ácido ascórbico (vitamina C). Además, las formas mutadas pueden tener niveles de expresión in vivo incrementados y/o una estabilidad térmica mejorada.

Antecedentes de la invención

Debido al aumento de la concienciación de la gente por la salud en todo el mundo, hay una demanda creciente de vitamina C. También contribuye a la demanda de ácido ascórbico su uso extendido como antioxidante para conservar alimentos. Una propuesta para satisfacer esta demanda es conseguir una producción incrementada de 2-KLG, un producto intermedio de la producción de ácido ascórbico. El producto intermedio, 2-KLG, puede ser convertido fácilmente en ácido ascórbico mediante ciclización catalizada por un ácido o por una base. Tiene también mayor estabilidad y mayor duración de conservación que el ácido ascórbico. Por tanto, en lugar de producir ácido ascórbico directamente, es más práctico almacenar grandes cantidades de 2-KLG para su conversión posterior en ácido ascórbico.

Varias especies de un primer grupo de microorganismos, Erwinia, Acetobacter y Gluconobacter, pueden producir 2,5-DKG a partir de glucosa. Un segundo grupo de microorganismos del grupo de bacterias corineformes (Corynebacterium, Brevibacterium y Arthrobacter), así como especies de Micrococcus, Staphylococcus, Pseudomonas, Bacillus y Citrobacter, son capaces de convertir 2,5-DKG, producido por un microorganismo del primer grupo, en 2-KLG. Esta cofermentación de los microorganismos apropiados para producir 2-KLG fue simplificada combinando los rasgos relevantes de especies de Erwinia y de especies de Corynebacterium en un único microorganismo (Anderson y col., Science 230: 144 (1985)). Esto se llevó a cabo identificando la 2,5-DKG reductasa en la especie de Corynebacterium que convierte 2,5-DKG en 2-KLG. El gen que codifica esta reductasa fue posteriormente clonado y expresado en Erwinia herbicola, una bacteria de la familia Enterobacteriaceae que convierte la D-glucosa en 2,5-DKG en una única fermentación. La cepa bacteriana recombinante resultante, con 2,5-DKG reductasa como enzima fundamental, fue capaz de convertir la D-glucosa en 2-KLG en un único proceso de fermentación (Lazarus y col., Fourth ASM Conf. Genet. Molec. Biol. Indust. Microorg., 187-193 (1989)).

La mejora de la eficacia catalítica de la 2,5-DKG reductasa, en el proceso de una sola fermentación, es una forma significativa de incrementar la producción de 2-KLG. Además, una 2,5-DKG reductasa A purificada con actividad catalítica incrementada podría ser utilizada en un proceso in vitro para la conversión de 2,5-DKG en 2-KLG. Por ejemplo, tal proceso permitiría la producción continua de 2-KLG mediante la inmovilización del enzima purificado en un soporte sólido.

De acuerdo con el esquema de Michaelis-Menten mostrado a continuación,

Km kcat

E + S \leftrightarrow ES \rightarrow E + P

la eficacia de una reacción enzimática puede ser medida por dos parámetros cinéticos, kcat y Km. La constante de velocidad catalítica, kcat, conocida también como número de renovación, es una medida de la descomposición del complejo enzima-sustrato (ES). Representa también el número máximo de moléculas de sustrato (S) que es convertido en producto (P) a través de un complejo ES por sitio activo del enzima (E) por unidad de tiempo. La Vmáx es la velocidad o tasa máxima de la reacción catalizada por el enzima cuando el enzima está saturado con sustrato. Por tanto, Vmáx es constante a una concentración de sustrato saturante y permanece inalterada con cualquier incremento de la concentración del sustrato. La kcat a concentraciones saturantes de sustrato está relacionada con la Vmáx y con la concentración total del enzima, [E_{T}], por la ecuación siguiente: Vmáx = kcat [E_{T}]. La constante de Michaelis, Km, es igual a la constante de disociación del complejo ES. Por tanto, Km es una medida de la potencia del complejo ES. En una comparación de Kms, una Km más baja representa un complejo con una unión más potente, más favorable, mientras que una Km mayor representa un complejo con una unión más débil, menos favorable. La relación kcat/Km, denominada constante de especificidad, representa la especificidad de un enzima por un sustrato, esto es la eficacia catalítica por molécula de enzima para un sustrato. Cuanto mayor sea la constante de especificidad más preferido será el sustrato por el enzima.

Se han conseguido rendimientos impresionantes de 2-KLG con una 2,5-DKG reductasa de Corynebacterium (2,5-DKG reductasa A, conocida también como 2,5-DKG reductasa II) (Anderson y col., Science 230: 144 (1985); Miller y col., J. Biol. Chem. 262: 9016 (1987)) expresada en cepas huésped apropiadas (productoras de 2,5-DKG) tales como especies de Erwinia. Estos resultados se han conseguido a pesar de que la 2,5-DKG reductasa A tiene una baja constante de especificidad para 2,5-DKG. Como Corynebacterium no se encuentra de manera natural con 2,5-DKG, no es sorprendente que este compuesto sea un mal sustrato para la 2,5-DKG reductasa A.

Esta baja constante de especificidad para la 2,5-DKG reductasa A contrasta con una segunda 2,5-DKG reductasa homóloga de Corynebacterium (2,5-DKG reductasa B, conocida también como 2,5-DKG reductasa I) que tiene una constante de especificidad mayor para 2,5-DKG (Sonoyama y Kobayashi, J. Ferment. Technol. 65: 311 (1987)). Además, ambas 2,5-DKG reductasas son homólogas a varias aldosa y cetorreductasas conocidas que tienen mayores constantes de especificidad hacia sus sustratos conocidos. Tales hallazgos indican que el sitio activo de la 2,5-DKG reductasa A no está configurado óptimamente para la conversión catalítica del 2,5-DKG en 2-KLG. Por tanto, parece que con el fin de optimizar la actividad específica de la 2,5-DKG reductasa A en el proceso de una única fermentación, deben realizarse sustituciones de aminoácidos mediante mutagénesis dirigida a un sitio en el sitio activo del enzima.

Además de mejorar los parámetros cinéticos del enzima, la mutagénesis dirigida a un sitio puede incrementar la estabilidad estructural mediante sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos. Los siguientes son ejemplos de mutaciones estructuralmente estabilizantes. La introducción de nuevos enlaces disulfuro para crear enlaces cruzados covalentes entre diferentes partes de una proteína ha sido utilizada para mejorar la estabilidad térmica del lisozima del bacteriófago T4 (Matsumura y col., Nature 342: 291-293 (1989)), del represor del bacteriófago \lambda (Sauer y col., Biochem. 25: 5992-5998 (1986)), de la dihidrofolato reductasa de E. coli (Villafranca y col., Biochem. 26: 2182 (1987)) y de subtilisina BPN' (Pantoliano y col., Biochem. 26: 2077-2082 (1987)). Existe un programa de ordenador (Pabo y col., Biochem. 25: 5987-5991 (1986)) que permite un barrido eficaz de la estructura tridimensional de una proteína determinada cristalográficamente para sugerir aquellos sitios en los que la inserción de dos cisteínas podría dar lugar a enlaces disulfuro. Tales enlaces no alterarían la conformación a escala mayor, mientras que estabilizarían la conformación local.

Se ha demostrado que sustituciones de aminoácidos tales como glicina por alanina en la hélice \alpha incrementan la estabilidad térmica del represor del bacteriófago \lambda (Hecht y col., Proteins: Struct. Funct. Genet. 1:43-46 (1986)) y de la proteasa neutra de Bacillus stearothermophilus (Imanaka y col., Nature 324: 695-697 (1986)). Se consiguió un incremento de la temperatura de fusión, T_{m}, del lisozima del bacteriófago T4 por las dos sustituciones de aminoácidos de alanina por prolina y glicina por alanina (Matthews y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6663-6667 (1987)). Se ha demostrado que la sustitución de aminoácidos en el núcleo central hidrofóbico de una proteína por residuos aromáticos tales como tirosina, especialmente en posiciones próximas a las agrupaciones preexistentes de cadenas laterales aromáticas, estimula la estabilidad térmica de la kanamicina nucleotidil transferasa (Liao y col., Biochem. 83: 576-580 (1986)) y del represor del bacteriófago \lambda (Hecht y col., Biochem. 81: 5685-5689 (1984)).

Las secuencias para el control de la transcripción y de la traducción en vectores de expresión son elementos clave requeridos para la producción a alto nivel de proteínas en bacterias. Los promotores Trp de E. coli, P_{L} del bacteriófago \lambda, lac UV5 de E. coli y la fusión Trp-lacUV5 (Tac) están entre los promotores procarióticos utilizados más frecuentemente (de Boer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25 (1983); Sambrook y col., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press (1989); Remaut y col., Gene 15: 81-93 (1981)). No hay manera de determinar si una proteína particular se expresará en un nivel elevado después de la inducción de la transcripción a partir de estos promotores. La eficacia traduccional del mensaje, la estabilidad del ARNm, y la estabilidad intrínseca de la proteína son factores fundamentales en la expresión a alto nivel. Por tanto, cuando una proteína experimenta mutagénesis es siempre posible que se vea afectado su nivel de expresión.

La mutagénesis dirigida a un sitio, utilizando oligonucleótidos de ADN sintéticos que tienen la secuencia deseada, permite la sustitución, la deleción o la inserción de nucleótidos seleccionados en una secuencia de ADN que codifique una proteína de interés. Se utilizan procedimientos de ADN recombinante para introducir la mutación deseada mediante la sustitución de la secuencia diana por la secuencia sintética. El desarrollo de plásmidos conteniendo un origen de replicación derivado de un bacteriófago filamentoso (Vieira y Messing, Methods in Enzymology 153: 3 (1987)) permite el clonaje de fragmentos en formas de plásmidos de hebra sencilla capaces de replicación autónoma. La utilización de tales plásmidos elimina la ardua tarea del subclonaje de fragmentos de ADN de plásmidos en vectores bacteriófagos filamentosos. Existen kits comercialmente disponibles para llevar a cabo la mutagénesis dirigida a un sitio.

Mutantes de la 2,5-DKG reductasa A con características que varíen del enzima nativo serían muy útiles. En particular, mutantes con actividad catalítica mejorada, estabilidad térmica incrementada y niveles de expresión incrementados, serían útiles para ampliar la utilidad comercial del enzima.

Desgraciadamente, a no ser que las proteínas compartan regiones de homología de secuencias o de homología estructural sustancial, no es posible generalizar entre las proteínas para predecir con precisión, sobre la base de una mutación beneficiosa de una proteína, si la secuencia que codifica otra proteína debería ser cambiada para mejorar el funcionamiento de esa proteína. Por tanto, es necesario emprender un análisis de las características estructurales y funcionales precisas de la proteína particular que va a ser alterada. Esto determina qué aminoácidos alterar para producir un resultado deseado, tal como una actividad catalítica, una estabilidad térmica o una expresión incrementadas.

La presente invención proporciona formas mutadas de la 2,5-DKG reductasa A procariótica. Se llevó a cabo el análisis de la estructura de la 2,5-DKG reductasa A con el fin de seleccionar alteraciones que codifican el enzima para alterar la estabilidad, la expresión y/o la actividad de los mutantes resultantes. Se diseñó una mutagénesis dirigida a un sitio de la secuencia que codifica el enzima para producir los mutantes.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona mutantes que contienen modificaciones específicas de la 2,5-DKG reductasa A, y materiales y métodos útiles para producir estas proteínas, así como microorganismos modificados y líneas celulares útiles para su producción. Otros aspectos de la invención incluyen construcciones de expresión y productos de las mismas para las 2,5-DKG reductasas modificadas así como vectores de clonaje que contienen el ADN que codifica las 2,5-DKG reductasas modificadas.

El ADN que codifica la 2,5-DKG reductasa A de tipo salvaje es modificado utilizando mutagénesis dirigida a un sitio, empleando una forma de hebra sencilla del plásmido que permite la generación de un cambio en un lugar seleccionado dentro de la región codificadora de la 2,5-DKG reductasa A. Mediante este método, se introduce un cambio en el ADN aislado que codifica la 2,5-DKG reductasa A que, después de la expresión del ADN, tiene como resultado la sustitución de al menos un aminoácido en un lugar predeterminado de la 2,5-DKG reductasa A. También, utilizando este método, se introduce un cambio en el ADN aislado que codifica la 2,5-DKG reductasa A que, después de la transcripción del ADN, tiene como resultado una sustitución de al menos un nucleótido en un lugar predeterminado del ARNm de la 2,5-DKG reductasa A que permite una expresión incrementada.

Las 2,5-DKG reductasa modificadas y las secuencias codificadoras de la invención pueden presentar una estabilidad, una expresión y/o una actividad catalítica mejoradas, y pueden tener una Km y una Vmáx variadas.

Por consiguiente, la presente invención proporciona una forma mutante de la 2,5-DKG reductasa A que contiene una o más de:

(a) una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos en los residuos 165-168, 187-198, 224-234 ó 262-278 de la 2,5-DKG reductasa A, definida como en la Figura 3, que dan lugar a una actividad que es diferente de la de la 2,5-DKG reductasa A de tipo salvaje,

(b) la sustitución de glicina por alanina en una hélice \alpha que da lugar a una estabilidad incrementada con respecto a la 2,5-DKG reductasa A de tipo salvaje,

(c) la sustitución de un aminoácido aromático próximo a una agrupación aromática que da lugar a una estabilidad incrementada con relación a la 2,5-DKG reductasa A de tipo salvaje, o

(d) la sustitución de asparragina en el residuo 2 y de treonina en el residuo 5 y de serina en el residuo 7, definida como en la Figura 3, que da lugar a una expresión de la proteína incrementada en el huésped.

La invención proporciona también una construcción de ADN que comprende un gen estructural conteniendo al menos un codón mutado, en la que este gen codifica un mutante de la invención.

La invención proporciona también una célula huésped transformada con un vector de expresión que incluye una construcción de ADN de la invención. Esta célula huésped puede ser una bacteria y el vector de expresión puede ser un plásmido.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 muestra un vector de expresión para el gen de la 2,5-DKG reductasa A;

la Fig. 2 muestra un vector de expresión para producir formas mutantes de la 2,5-DKG reductasa A; y

la Fig. 3 muestra esquemáticamente un modelo propuesto para la 2,5-DKG reductasa A.

Descripción detallada de la invención Definiciones

Según se utiliza en la presente, el término 2,5-DKG reductasa A de "tipo salvaje" se refiere a una proteína que es capaz de catalizar la conversión de 2,5-DKG en 2-KLG estereoselectivamente. El enzima de tipo salvaje es el enzima antes de las modificaciones descritas en la presente. El enzima es obtenido de especies de Corynebacterium derivadas de la cepa ATCC Nº 31090 según está descrito en la Patente de EE.UU. Nº 5.008.193.

"Mutante", en relación con la 2,5-DKG reductasa A de "tipo salvaje", se refiere a una proteína que contiene una o más sustituciones, deleciones o inserciones de residuos de aminoácidos. Estos residuos han sido seleccionados utilizando ciertos planteamientos para predecir aquellas regiones de la proteína que es más probable que contengan residuos del sitio activo. Un planteamiento implica la utilización de predicciones de la estructura secundaria para asignar la 2,5-DKG reductasa A a una estructura de barril \alpha/\beta de ocho hebras. Se llevan a cabo varias modificaciones con el fin de modificar el gen que codifica mutantes del enzima con características diferentes, en comparación con el enzima de tipo salvaje, para convertir 2,5-DKG en 2-KLG estereoselectivamente.

Es muy conocido en la técnica que muchos de los compuestos discutidos en la presente especificación, tales como proteínas y los derivados ácidos de sacáridos, pueden existir en una variedad de estados de ionización dependiendo de su medio circundante, si están en solución, o fuera de las soluciones a partir de las cuales han sido preparados si están en forma sólida. La utilización de un término tal como, por ejemplo, ácido glucónico, para designar tales moléculas tiene la intención de incluir todos los estados de ionización de la molécula orgánica referida. Así, por ejemplo, "ácido D-glucónico" y "D-gluconato" se refieren ambos al mismo resto orgánico, y no tienen la intención de especificar estados de ionización particulares. Es bien conocido que el ácido D-glucónico puede existir en forma no ionizada, o puede estar disponible, por ejemplo, como la sal de sodio, potasio u otra sal. La forma ionizada o no ionizada en la que el compuesto es pertinente a la descripción, será obvia a partir del contexto para una persona experta en la técnica, o será irrelevante. De este modo, la propia proteína 2,5-DKG reductasa A y sus diferentes mutantes pueden existir en una variedad de estados de ionización dependiendo del pH. Todos estos estados de ionización están abarcados por los términos "2,5-DKG reductasa A" y "forma mutante de la 2,5-DKG reductasa A".

El término "vector de expresión" incluye vectores que son capaces de expresar secuencias de ADN en ellos contenidas si tales secuencias están unidas operativamente a otras secuencias capaces de efectuar su expresión. Está implícito, aunque no manifestado explícitamente, el que los vectores de expresión deben ser replicables en los organismos huésped ya sea como episomas o como una parte integral de un ADN cromosómico. Claramente, una falta de replicación los convertiría en efectivamente inoperables. En suma, al término "vector de expresión" se le da también una definición funcional. Generalmente, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de "plásmidos". El término plásmido se refiere a moléculas de ADN de doble hebra circulares o a moléculas de ADN de hebra sencilla circulares que contienen un origen de replicación derivado de un bacteriófago filamentoso. Estas moléculas de ADN, en su forma de vector, no está unidas a los cromosomas. Otros vectores eficaces comúnmente utilizados son ADN de fagos y ADN no circular. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" son utilizados a menudo indistintamente. Sin embargo, la invención tiene la intención de incluir otras formas de vectores de expresión que cumplan funciones equivalentes y que sean, o que resultarán más adelante, conocidas.

"Células huésped recombinantes", "célula huésped", "células", "cultivos celulares", etc., son utilizados indistintamente para designar células individuales, líneas celulares, cultivos celulares y células recogidas que hayan sido o que estén destinadas a ser transformadas con los vectores recombinantes de la invención. Los términos incluyen también la progenie de las células que recibieron originalmente el vector.

"Transformación" se refiere a cualquier proceso para alterar el contenido de ADN del huésped. Esto incluye procedimientos de transformación in vitro tales como transfección mediada por fosfato de calcio o DEAE-dextrano, electroporación, inyección nuclear, infección con fagos u otros medios similares para llevar a cabo la captación controlada de ADN según se conoce en la técnica.

Los términos "aminoácido" y "aminoácidos" se refieren a todos los L-\alpha-aminoácidos que existen de forma natural. Esta definición tiene la intención de incluir norleucina, ornitina y homocisteína. Los aminoácidos son identificados por las denominaciones de una sola letra o de tres letras:

Asp	D	ácido aspártico	Ile	I	isoleucina
Thr	T	treonina	Leu	L	leucina
Ser	S	serina	Tyr	Y	tirosina
Glu	E	ácido glutámico	Phe	F	fenilalanina
Pro	P	prolina	His	H	histidina
Gly	G	glicina	Lys	K	lisina
Ala	A	alanina	Arg	R	arginina
Cys	C	cisteína	Trp	W	triptófano
Val	V	valina	Gln	Q	glutamina
Met	M	metionina	Asn	N	asparragina

Estos aminoácidos pueden ser clasificados de acuerdo con la composición química y las propiedades de sus cadenas laterales. Son clasificados de manera general en dos grupos, cargados y no cargados. Cada uno de estos grupos está dividido en subgrupos con el fin de clasificar los aminoácidos con más precisión:

I. Aminoácidos Cargados

Residuos Ácidos: ácido aspártico, ácido glutámico

Residuos Básicos: lisina, arginina, histidina

II. Aminoácidos No Cargados

Residuos Hidrofílicos: serina, treonina, asparragina, glutamina

Residuos Alifáticos: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina

Residuos No Polares: cisteína, metionina, prolina

Residuos Aromáticos: fenilanalina, tirosina, triptófano

TABLA 1

Residuo Original	Sustituciones Conservadoras
Ala	ser
Arg	lys
Asn	gln; his
Asp	glu
Cys	ser; ala
Gln	asn
Glu	asp
Gly	pro
His	asn; gln
Ile	leu; val
Leu	ile; val
Lys	arg; gln; glu
Met	leu; ile
Phe	met; leu; tyr
Ser	thr
Thr	ser
Trp	tyr
Tyr	trp; phe
Val	ile; leu

Los cambios sustanciales en la función o en la estabilización se realizan seleccionando sustituciones que sean menos conservadoras que las mostradas en la Tabla 1, esto es, seleccionando residuos que difieran más significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto polipeptídico en el área de la sustitución, por ejemplo como una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana o (c) el volumen de la cadena lateral. Las sustituciones que se espera en general que produzcan los mayores cambios serán aquéllas en las que (a) un residuo hidrofílico, por ejemplo serilo o treonilo, es sustituido por un residuo hidrofóbico, por ejemplo leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo (o viceversa); (b) un cisteinilo o un prolilo es sustituido por cualquier otro residuo (o viceversa); (c) un residuo con una cadena lateral electropositiva, por ejemplo lisilo, arginilo o histidilo, es sustituido por un residuo electronegativo, por ejemplo glutamilo o aspartilo (o viceversa); o (d) un residuo con una cadena lateral voluminosa, por ejemplo fenilalanilo, es sustituido por uno que no tenga cadena lateral, por ejemplo glicilo (o viceversa).

Métodos generales

La mayoría de las técnicas que son utilizadas para transformar células, construir vectores, llevar a cabo una hibridación con una sonda, realizar una mutagénesis dirigida a un sitio y similares, así como la selección de mutantes, son ampliamente practicadas en el oficio. La mayoría de los técnicos son familiares con los recursos materiales estándar que describen condiciones y procedimientos específicos (ver por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989)). Sin embargo, se presentan los párrafos siguientes como una orientación adicional.

Expresión de la 2,5-DKG reductasa A

El gen funcional completo es ligado a un vector de expresión adecuado que contenga un promotor y un sitio de unión de ribosomas operativos en la célula huésped en la cual se transformará la secuencia codificadora. En el estado actual de la técnica, hay varios sistemas de promotor/control y varios huéspedes procarióticos adecuados disponibles que son apropiados para la presente invención. Pueden utilizarse huéspedes similares para el clonaje y para la expresión, ya que los procariotas son, en general, preferidos para el clonaje de secuencias de ADN. El método de producción de 2-KLG está asociado muy convenientemente con tales sistemas microbianos. E. coli K12 cepa 294 (ATCC Nº 31446) es particularmente útil como huésped para clonaje. Otras cepas microbianas que pueden ser utilizadas incluyen cepas de E. coli tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC Nº 31537) y E. coli DH-1 (ATCC Nº 33489). Para la expresión, pueden utilizarse las cepas anteriormente mencionadas así como E. coli W3110 (F-, \lambda-, prototrófica, ATCC Nº 27325), bacilos tales como Bacillus subtilis y otras enterobacteriáceas tales como Salmonella typhimurium o Serratia marcesans y varias especies de Pseudomonas. Un grupo de huéspedes particularmente preferido incluye aquellos cultivos que son capaces de convertir la glucosa u otros metabolitos comúnmente disponibles en 2,5-DKG. Ejemplos de tales huéspedes se encuentran generalmente entre los géneros Acetobacter, Gluconobacter, Acetomonas y Erwinia. La taxonomía y la nomenclatura de estos géneros son tales que la misma cepa o cepas similares tienen a veces nombres diferentes. Por ejemplo, Acetobacter cerinus utilizado en el ejemplo siguiente es referido también como Gluconobacter cerinus. Ejemplos de huéspedes particulares incluyen, pero no se limitan a, Erwinia herbicola ATCC Nº 21998 (considerada también como Acetomonas albosesamae en la Patente de EE.UU. Nº 3.998.697); Acetobacter (Gluconobacter) oxydans subespecie melanozenes, IFO 3292, 3293, ATCC Nº 9937; Acetobacter (Gluconobacter) cerinus, IFO 3263, IFO 3266; Gluconobacter rubiginous, IFO 3244; Acetobacter fragum ATCC Nº 21409; Acetobacter (Acetomonas) suboxydans subespecie industrious, ATCC Nº 23776.

En general, se utilizan en relación con estos huéspedes vectores de expresión o de clonaje plasmídicos o plásmidos de conjugación que contienen secuencias de replicación y control que derivan de especies compatibles con la célula huésped. El vector lleva normalmente un origen de replicación así como genes marcadores que son capaces de proporcionar una selección fenotípica en las células transformadas. Por ejemplo, E. coli es transformada típicamente utilizando pBR322, un plásmido derivado de una cepa de E. coli (Bolivar y col., Gene 2: 95 (1977)). El pBR322 contiene genes de resistencia a ampicilina y tetraciclina y proporciona de este modo un medio fácil para identificar las células transformadas. Para ser utilizado en expresión, el plásmido pBR322, u otro plásmido microbiano, debe contener también, o debe ser modificado para que contenga, promotores que puedan ser utilizados por el organismo microbiano para la expresión de sus propias proteínas. Esos promotores, muy comúnmente utilizados en la construcción de ADN recombinante, incluyen los sistemas de promotores de la \beta-lactamasa (penicilinasa) y de la lactosa (Chang y col., Nature 273: 615 (1978); Itakura y col., Science 198: 1056 (1977); Goeddel y col., Nature 281: 544 (1979)) y un sistema promotor del triptófano (trp) (Goeddel y col., Nucleic Acids Res. 8: 4057 (1980); Solicitud de EPO Nº 0036776). Aunque éstos son los más comúnmente utilizados, se han descubierto y utilizado otros promotores microbianos. Se han publicado detalles referentes a sus secuencias de nucleótidos, permitiendo a un trabajador experto ligar los mismos funcionalmente en una relación operativa a genes de vectores de transformación. (Siebenlist y col., Cell 20: 269 (1980)).

Mediante el corte y la ligadura adecuados, pueden incluirse secuencias de ADN que codifiquen la 2,5-DKG reductasa A en los vectores anteriormente mencionados preparados según se explicó anteriormente. Cualquier secuencia innecesaria o inhibidora puede ser eliminada y el enzima procariótico puede ser luego purificado; o las células intactas o rotas pueden ser utilizadas directamente como catalizadores. Alternativamente, puede elegirse el huésped de tal manera que una vez transformado sea capaz de llevar a cabo la conversión completa de la glucosa o de otro metabolito adecuado en el producto 2-KLG deseado.

El ADN plasmídico de tipo salvaje y el ADN plasmídico mutante para la 2,5-DKG reductasa A son transfectados en un huésped para la expresión del enzima. Las células huésped recombinantes son cultivadas bajo condiciones que favorezcan la expresión del enzima. Normalmente se proporciona una presión de selección mediante la presencia de un antibiótico. La resistencia al antibiótico está codificada por el vector. El cultivo bajo estas condiciones tiene como resultado rendimientos del enzima mayores que los de la síntesis del enzima de tipo salvaje del organismo parental. Este es el caso incluso si es el organismo parental el que es transformado.

Construcción de vectores para mutagénesis

Anderson y col. han descrito la construcción del plásmido ptrp1-35 en la Patente de EE.UU. Nº 5.008.193, el cual contiene el gen de la DKG reductasa A clonado bajo el control del promotor trp de E. coli (Figura 1). Se construye un derivado de este plásmido, con unas cuantas modificaciones secundarias, para facilitar la construcción y la caracterización de las formas mutantes de la 2,5-DKG reductasa A. Estas modificaciones se describen a continuación. La construcción plasmídica final es denominada pSStac.DKGR.AAA y está mostrada en la Fig.
2.

A) El gen estructural de la 2,5-DKG reductasa A es mutado para que incluya tres nuevos sitios de enzimas de restricción con el fin de facilitar estudios de mutagénesis posteriores. Estos tres sitios son "silentes", esto es, la secuencia de aminoácidos de la proteína DKGR A resultante permanece inalterada.

B) El promotor en pSStac.DKGR.AAA es el promotor tac II descrito por de Boer y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25 (1983)) en lugar del promotor trp encontrado en ptrp1-35. Ésta es una versión modificada del promotor trp que contiene el sitio de unión para el represor lac, permitiendo que la expresión del gen sea regulada en células que expresen el represor lac.

C) El plásmido es modificado posteriormente para que incluya el origen de replicación del fago f1 filamentoso de hebra sencilla. La utilización de esta secuencia de ADN en plásmidos es bien conocida en la técnica para producir una forma del plásmido de hebra sencilla para secuenciación y mutagénesis.

Mutagénesis dirigida a un sitio

Una vez que se han seleccionado las modificaciones deseadas, la secuencia de ADN que codifica la 2,5-DKG reductasa A es sometida a mutagénesis dirigida a un sitio con el fin de sustituir nucleótidos que codifican aminoácidos seleccionados en posiciones predeterminadas de la secuencia.

El procedimiento preferido para la mutagénesis dirigida a un sitio se lleva a cabo clonando la secuencia de ADN que codifica el enzima de tipo salvaje en un plásmido recombinante que contiene un origen de replicación derivado de un bacteriófago de hebra sencilla. Posteriormente se utiliza un cebador apropiado para convertir un residuo en una posición identificada, por ejemplo, para una sustitución de aminoácidos conservadora. Se utiliza un cebador oligonucleotídico sintético, complementario a la secuencia deseada, excepto en áreas de desacoplamiento limitado, como cebador en la síntesis de una hebra complementaria a la secuencia de la 2,5-DKG reductasa A de tipo salvaje de hebra sencilla en el vector plasmídico. El ADN de doble hebra resultante es transformado en una bacteria huésped. Los cultivos de la bacteria transformada son sembrados en placas de agar, permitiendo la formación de colonias a partir de las células individuales que albergan el plásmido. Teóricamente, el 50% de las colonias constarán de plásmido conteniendo la forma mutante; el 50% tendrán la secuencia original. Las colonias son hibridadas con un cebador sintético radiomarcado bajo condiciones rigurosas que permitan la hibridación solamente con el plásmido mutante que formará un apareamiento perfecto con la sonda. Las colonias que hibridan son posteriormente recogidas y cultivas y se recupera el ADN plasmídico mutante.

Selección de sitios para mutagénesis de mutantes para el gen de la 2,5-DKG reductasa A de tipo salvaje

Es crucial para la selección de los sitios de mutagénesis la predicción de una estructura secundaria y terciaria del enzima de tipo salvaje. Las predicciones de la estructura secundaria se llevan a cabo de la forma siguiente. Primero, las secuencias de las 2,5-DKG reductasas A y B, y de otros cinco enzimas homólogos (sintasa de prostaglandina F, aldosa reductasa de cristalino bovino y de cristalino de rata, aldehído reductasa de hígado humano y \rho-cristalina del cristalino de ojo de rana) son alineadas para revelar varios residuos conservados. Segundo, las secuencias son sometidas a diferentes algoritmos de predicción de la estructura (Chou y Fasman, Adv. Enzymol. 47: 45-148 (1978); Garnier y col., J. Mol. Biol. 120: 97-120 (1978); Wilmot y Thornton, J. Mol. Biol. 203: 221-232 (1988); Karplus y Schulz, Naturwissenschaften 72: 212-214 (1985); Eisenberg y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 140-144 (1984); Rose y Roy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4643-4647 (1980)) bien conocidos en la técnica. Estas predicciones son confrontadas y comparadas para derivar un modelo aproximado de la estructura secundaria del enzima como un barril \alpha/\beta de ocho hebras. Esta predicción de la estructura secundaria es consistente con las estructuras secundarias recientemente resueltas de enzimas homólogos que tienen el plegamiento de un barril \alpha/\beta de ocho hebras (Rondeau y col., Nature 355: 469-472 (1992); Wilson y col., Science 257: 81-84 (1992)).

La estructura de barril está constituida por dos componentes. El primer componente es un núcleo central de ocho hebras beta paralelas enrolladas dispuestas muy juntas, como duelas, en un barril. Rodeando esta estructura de barril hay un segundo componente de ocho hélices alfa que están unidas a las hebras beta mediante bucles de varias longitudes. Esta estructura de barril \alpha/\beta de ocho hebras es denominada el barril de la triosafosfato isomerasa (TIM), por el enzima para el cual se observó esta estructura por vez primera. El patrón de plegamiento del barril \alpha/\beta se encuentra en 17 enzimas cuyas estructuras cristalinas se conocen. De hecho, el 10% aproximadamente de las estructuras enzimáticas conocidas son barriles \alpha/\beta (Farber y Petsko, TIBS 15 (Junio de 1990)). Los 17 enzimas de barril \alpha/\beta conocidos tienen un núcleo central de barril \alpha/\beta común; la especificidad de sustrato y de cofactor procede de los bucles variables que unen las hebras beta y las hélices alfa.

En la Fig. 3 se muestra esquemáticamente el modelo de estructura secundaria propuesto para la 2,5-DKG reductasa A basado en un consenso de predicciones de la estructura secundaria en miembros de la familia de las aldosa reductasas (ver anteriormente), en el que las hebras beta están representadas por flechas y las hélices alfa están mostradas como cilindros. Las regiones de cadena polipéptida que conectan los elementos pronosticados de la estructura secundaria están indicadas como de estructura no definida. Hay extensiones N y C-terminales de 34 y 17 aminoácidos, respectivamente. Tales extensiones de los enzimas de barril TIM forman a menudo hélices alfa que se pliegan sobre la parte superior o la parte inferior del barril. Se cree que algún subgrupo de los ocho bucles en el extremo C de la lámina beta (hacia la parte superior de la Fig. 3), así como la "cola" C-terminal (posiciones 262 a 278) contienen el sitio activo del enzima, igual que en los demás enzimas de barril TIM. Aunque es sólo un modelo aproximado, esta estructura facilita enormemente el diseño racional del enzima, permitiendo centrarse en esos residuos encontrados en los bucles del sitio activo propuestos. Será obvio que residuos adicionales cerca de los que están en los bucles propuestos y en la "cola" pueden constituir también parte del sitio activo.

Tal información referente a qué aminoácidos comprende el sitio activo de un enzima puede ser conseguida a partir del conocimiento de la forma tridimensional real del enzima en cuestión, según se obtiene a partir de estudios cristalográficos de rayos x o de estudios de RMN. En el caso de la 2,5-DKG reductasa no existe todavía en la literatura publicada tal información estructural. Por tanto, una estrategia alternativa en tal caso sería utilizar el modelo para la 2,5-DKG reductasa A como un barril \alpha/\beta según se discutió anteriormente, para limitar las posibles sustituciones de aminoácidos individuales a aquellos residuos que se encuentran en los bucles del sitio activo propuestos.

Mediante tal planteamiento, se identifican los tres bucles superficiales que constituyen el sitio de unión del sustrato de la 2,5-DKG reductasa A. Estos bucles están en las posiciones 165-168, 187-198 y 224-234. Se produce un grupo de doce mutantes de la 2,5-DKG reductasa A en estos bucles. Este grupo comprende casi todas las sustituciones puntuales posibles de la secuencia de la 2,5-DKG reductasa B. Muchos de estos mutantes muestran reducciones importantes de su actividad para convertir 2,5-DKG en 2-KLG, incluso cuando se realizan solamente cambios secundarios o conservadores en los aminoácidos. Uno de los mutantes, con una sustitución de glutamina por arginina en posición 192 de la secuencia de la 2,5-DKG reductasa A, tiene una capacidad mejorada para convertir 2,5-DKG en 2-KLG. La construcción de este mutante, denominado "Q192R" está descrita en el Ejemplo 2.

Los doce mutantes son expresados en Acetobacter cerinus y analizados para determinar la conversión de 2,5-DKG en 2-KLG en la etapa de lisado bruto. La Tabla 2 siguiente incluye una comparación de las actividades de los doce mutantes de la 2,5-DKG reductasa A frente a la 2,5-DKG reductasa A y la 2,5-DKG reductasa B de tipo salvaje. Los ensayos de la Tabla 2 se llevaron a cabo según está descrito en la Tabla 3 posterior. La actividad incrementada de Q192R en la etapa de lisado bruto, aunque en cierto modo oscurecida por los niveles elevados de actividad reductasa de fondo según se observa en los lisados del control pBR322, es sin embargo significativa y reproducible. Los datos de pBR322, del enzima de tipo salvaje, y del mutante Q192R de la Tabla 2 son la media de tres ensayos separados de los lisados. Asumiendo una contribución aditiva simple de la actividad reductasa de fondo en estos lisados, estos datos muestran que el mutante Q192R es dos veces más activo que el enzima de tipo salvaje frente a 2,5-DKG. La caracterización de las constantes cinéticas de Q192R purificado proporciona una Km y una Vmáx mejoradas para este enzima con relación a la 2,5-DKG reductasa A de tipo salvaje. Ver el Ejemplo 5. Así, Q192R presenta una mejora sobre el enzima natural en especificidad (Km) y en la tasa de renovación (Vmáx).

De una manera similar a la descrita anteriormente, la "cola" C-terminal es también identificada como parte del sitio activo. Se diseña un mutante truncado que tiene como resultado la terminación del polipéptido antes de los últimos ocho residuos de aminoácido de la 2,5-DKG reductasa A. Se encontró que este mutante se expresaba bien y que se conservaba el sitio de unión del cofactor, pero, según se muestra en la Tabla 2 siguiente, es absolutamente inactivo utilizando 2,5-DKG como sustrato. Por este criterio se deduce que la "cola" C-terminal comprende parte del bolsillo de unión del 2,5-DKG.

TABLA 2

Identidad del Lisado		% del Tipo Salvaje sobre 2,5-DKG
pBR322 (control)		0%
2,5-DKG Reductasa A		100%
2,5-DKG Reductasa B		\may{3}600%
(glicina por alanina
\hskip0.5cm en posición 191)	mutante G191A	1%
(glutamina por arginina
\hskip0.5cm en posición 192)	mutante Q192R	200%
(glicina eliminada en
\hskip0.5cm posición 193)	mutante por deleción G193	0%
(lisina por arginina
\hskip0.5cm en posición 194)	mutante K194R	8%
(tirosina por serina
\hskip0.5cm en posición 195)	mutante Y195S	6%
(alanina por tirosina
\hskip0.5cm en posición 167)	mutante A167Y	0%
(tirosina por fenilalanina
\hskip0.5cm en posición 168)	mutante Y168F	2%
(glutamina por prolina
\hskip0.5cm en posición 169)	mutante Q169P	15%
(lisina por leucina
\hskip0.5cm en posición 225)	mutante K225L	5%
(fenilalanina por serina
\hskip0.5cm en posición 227)	mutante F227S	12%
(valina por treonina
\hskip0.5cm en posición 228)	mutante V228T	23%
(valina por prolina
\hskip0.5cm en posición 229)	mutante V229P	22%
(codón de parada en
\hskip0.5cm posición 271)	mutante truncado	0%
	(carece de los últimos
	ocho aminoácidos)

Sin utilizar el modelo de barril \alpha/\beta como orientación, es necesaria una búsqueda aleatoria de todas las sustituciones posibles de aminoácidos individuales. Esto requiere la construcción y el ensayo de 170 de tales enzimas, reflejando las diferencias entre los enzimas para el posible reclutamiento de la actividad similar a la de la 2,5-DKG reductasa B hacia el marco de la 2,5-DKG reductasa A.

Los residuos de glicina en las hélices alfa que pueden aceptar el volumen incrementado del grupo metilo sustituido, son sustituidos por residuos de alanina para introducir la estabilización. La introducción de residuos de aminoácidos aromáticos tales como tirosina, fenilalanina y triptófano próximos a agrupaciones aromáticas dentro del enzima, está también dentro del ámbito de la invención. Estos residuos aromáticos adicionales estabilizan el enzima en lugares en los que la introducción de tales grupos aromáticos no deformará la conformación global.

Mutaciones en sitios particulares de una proteína pueden dar lugar a la expresión incrementada de esa proteína en bacterias. Actualmente no hay forma de predecir qué mutaciones darán lugar a una expresión incrementada. Sin embargo, se sabe que los factores de eficacia traduccional, estabilidad del ARNm y estabilidad incrementada de la proteína, tienen un papel clave en la expresión a un nivel elevado.

Muchos de los demás mutantes puntuales posibles son generados en grupos de una a cuatro sustituciones de aminoácidos muy espaciadas. De los mutantes que se pliegan de manera estable, solamente aquéllos que caen en el bucle 165-168, en el bucle 187-198, en el bucle 224-234 y en la "cola" C-terminal (262-278) presentan una actividad significativamente diferente de la del enzima de tipo salvaje. Ésta es una confirmación adicional de que estas regiones de los bucles y de la cola contienen el sitio activo del enzima.

Cualquier número de las mutaciones aquí propuestas puede ser combinado en un único mutante. Obviamente, una sustitución particular en una posición excluye la sustitución con otro aminoácido en esa misma posición en ese mutante particular.

Los ejemplos siguientes se presentan para ilustrar la presente invención y para ayudar a una persona con experiencia habitual a realizar y utilizar la misma. Los ejemplos no tienen intención alguna de limitar de otro modo el ámbito de la invención.

Ejemplo 1 Construcción del plásmido pSStac.DKGR.AAA para mutagénesis

Una alícuota del plásmido ptrp1-35 fue digerida con los enzimas de restricción EcoRI y HindIII y el fragmento de 1690 pares de bases resultante fue purificado mediante electroforesis en gel de agarosa. Este fragmento fue luego ligado en el vector M13mp19 digerido con EcoRI y HindIII. El fago recombinante resultante (denominado M13mp19.DKGRA) fue utilizado para aislar una forma molde de hebra sencilla del fago para la mutagénesis posterior. El molde fue mutagenizado con tres oligonucleótidos con el fin de introducir tres nuevos sitios de corte de enzimas de restricción en el gen de la 2,5-DKG reductasa A. Estos sitios son todos "silentes" en cuanto a que aunque introducen un nuevo sitio de corte de restricción en la secuencia de ADN, la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada permanece inalterada debido a la degeneración del código genético. Los tres oligonucleótidos mutagénicos y los cambios introducidos son según sigue: 1) el oligonucleótido XbaA tiene la secuencia 5' CGCGAAGCTGGCTCTA
GATCAGGTCGAC 3' e introduce un nuevo sitio de XbaI en el aminoácido en posición 98; 2) el oligonucleótido ApaA tiene la secuencia 5' ATCGTGGGGGCCCCTCGGTCAGGGC 3' e introduce un nuevo sitio de ApaI en el aminoácido en posición 188; y 3) el oligonucleótido KpnA tiene la secuencia 5' GAGGTCGACTGAGGTACCCGAACACCCG 3' e introduce un nuevo sitio de KpnI inmediatamente después del codón de parada (TGA) después del último aminoácido. La reacción y las condiciones de la mutagénesis fueron esencialmente las mismas que las descritas en el Ejemplo 2 para la construcción del mutante Q192R. Después de la reacción de mutagénesis, las placas positivas fueron identificadas por hibridación con el oligonucleótido mutagénico bajo condiciones rigurosas, y la región codificadora completa del fragmento de la 2,5-DKG reductasa A fue secuenciada para confirmar las mutaciones.

El plásmido pSStac.DKGR.AAA fue construido como una ligadura de tres vías de los fragmentos siguientes: 1) EcoRI a HindIII del fago mutagenizado M13mp19.DKGRA según se describió anteriormente; éste contiene el gen que codifica la 2,5-DKG reductasa A; 2) el fragmento PstI a EcoRI (850 pares de bases) del plásmido ptac6 (el ptac6 es equivalente al plásmido ptrp1-35, pero contiene el promotor tac según está descrito en de Boer y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25 (1983) en lugar del promotor trp encontrado en ptrp1-35) y 3) el fragmento del vector de \sim4.000 pares de bases desde HindIII hasta PstI del plásmido p690. El plásmido p690 es un derivado del plásmido pBR322 con el fragmento de restricción RsaI/DraI del genoma del bacteriófago f1 (nucleótidos 5489-5946), que contiene el origen de replicación de ADN de hebra sencilla, insertado en el sitio de PvuII.

Los tres fragmentos anteriormente descritos fueron aislados mediante electroforesis en gel de agarosa, purificados y ligados en proporciones aproximadamente equimolares, y utilizados para transformar células de E. coli competentes. Las colonias resultantes fueron analizadas mediante mapeo de restricción con el fin de identificar la construcción correcta, denominada pSStac.DKGR.AAA (Fig. 2).

Ejemplo 2 Mutagénesis dirigida a un sitio del gen de la 2,5-DKG reductasa A A. Preparación del ADN molde para la mutagénesis

Células de E. coli (cepa XL1-Blue, Stratagene Corporation) portadoras del plásmido pSStac.DKGR.AAA fueron cultivadas en medio LB (Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, A.1 (1989)) hasta la fase log temprana e infectadas con el fago cooperador VCS-M13 (Stratagene). La infección con el fago cooperador proporciona los factores necesarios para el empaquetamiento y la secreción de la forma de hebra sencilla del plásmido pSStac.DKGR.AAA. Las células infectadas fueron cultivadas durante una noche con agitación a 37ºC, y al día siguiente las células fueron eliminadas por centrifugación a 10.000 rpm durante 10 minutos en un rotor Sorvall SM24. Se retuvo el sobrenadante que contenía el plásmido empaquetado y se desechó el aglutinado celular. El plásmido empaquetado fue precipitado mediante la adición de 1/4 de volumen de NaCl 2,5 M, PEG (polietilén glicol) 20%. Después de la adición la mezcla fue almacenada a temperatura ambiente durante 20 minutos y posteriormente se recuperó el precipitado mediante centrifugación.

El precipitado fue disuelto en 0,4 ml de tampón TE (Tris 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM) y purificado posteriormente mediante varias extracciones secuenciales con un volumen igual de cloroformo:fenol 50:50. Después de cada extracción se conservó la fase acuosa (superior). El plásmido puro fue precipitado con 2 volúmenes de etanol enfriado en hielo. El precipitado fue recuperado por centrifugación y disuelto en tampón TE. Se calculó la concentración del plásmido midiendo la absorbancia óptica a 260 nm utilizando la conversión de 1 DO_{260} = 40 \mug de ADN de hebra sencilla por mililitro. La concentración del plásmido fue ajustada a 1 \mug por ml con TE.

B. Fosforilación del cebador oligonucleotídico

Se sintetizó un oligonucleótido sintético con la secuencia 5' GCCCCTCGGTCGCGGCAAGTACG 3' y se fosforiló según sigue: el oligonucleótido fue diluido hasta una concentración de 5,0 unidades de DO_{260} por ml. Posteriormente se combinaron 2,5 \mul de oligonucleótido con 3 \mul de tampón de quinasa 10x (Tris 1 M, pH 8,0, MgCl_{2} 100 mM, ditiotreitol 70 mM, ATP 10 mM), 25 \mul de agua y 2 unidades de polinucleótido quinasa de T4 (New England Biolabs). La mezcla fue incubada a 37ºC durante 15 minutos, posteriormente el enzima quinasa fue inactivado mediante calentamiento a 70ºC durante 10 minutos.

C. Reacción de mutagénesis

Se combinaron 6 \mul de cebador sometido a la reacción con quinasa con 1 \mug de ADN molde y 2,5 \mul de tampón RB 10x (Tris 70 mM, pH 7,5, mercaptoetanol 50 mM, NaCl 550 mM y EDTA 1 mM) en un volumen total de 10,5 \mul. El cebador fue hibridado al molde mediante calentamiento de la mezcla a 65ºC durante 5 minutos, enfriando luego lentamente hasta temperatura ambiente durante un periodo de 30 minutos.

A la mezcla de hibridación se añadieron 1,5 \mul de tampón RB 10x, 1 \mul de ATP 10 mM, 1 \mul de DTT 10 mM (ditiotreitol) y 1 \mul de ADN ligasa de T4 (New England Biolabs). Después de 10 minutos, se añadieron 1 \mul de MgCl_{2} 1 M, 1 \mul de dNTPs 5 mM (una mezcla equimolar de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) y 0,5 \mul de Klenow (fragmento grande de la ADN polimerasa I, New England Biolabs) y la mezcla se incubó a 15ºC durante una noche.

Al día siguiente, células de E. coli MutL competentes congeladas fueron transformadas con una alícuota de la mezcla de reacción y sembradas sobre de placas de agar que contenían una selección de antibióticos (12,5 \mug/ml de tetraciclina, 50 \mug/ml de ampicilina). Las colonias portadoras de plásmidos mutantes fueron identificadas inicialmente mediante hibridación con el oligonucleótido mutagénico original bajo condiciones rigurosas (Wood y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1585-1588 (1988)). Se prepararon posteriormente los plásmidos mutantes en una forma de hebra sencilla igual que en la Sección A y se confirmaron mediante secuenciación directa del ADN del plásmido (kit de secuenciación "Sequenase Sequencing Kit", United States Biochemical Corporation). El mutante resultante de la 2,5 DKG reductasa A, Q192R, según se muestra en el Ejemplo 5, tenía una actividad catalítica mejorada en comparación con la 2,5-DKG reductasa A de tipo salvaje.

Ejemplo 3 Expresión de la 2,5-DKG reductasa A de tipo salvaje en Acetobacter cerinus

El ADN plasmídico fue introducido en Acetobacter cerinus (ATCC Nº 39140) mediante electroporación, según está descrito (Wirth y col., Mol. Gen. Genet. 216(1): 175-177 (Marzo de 1989)) utilizando un aparato Genepulser (Biorad Corporation). Las células fueron cultivadas hasta la mitad de la fase logarítmica (DO_{550} \sim0,2-0,8) en 100 ml de medio LB y recuperadas por centrifugación a 5.000 rpm en un rotor Sorvall SS-34 durante 5 minutos a 4ºC. Las células fueron resuspendidas en medio volumen de tampón para electroporación enfriado en hielo (sacarosa 300 mM, tampón fosfato de sodio 7 mM, pH 7,0 y MgCl_{2} 1 mM), aglutinadas de nuevo por centrifugación y resuspendidas finalmente en 1/20º de volumen de tampón para electroporación, y almacenadas en hielo hasta su utilización.

El ADN plasmídico (0,1 a 1,0 \mug) fue añadido a una cubeta de electroporación de 0,4 cm (Biorad Corporation) que contenía 0,8 ml de las células de Acetobacter preparadas. Se mezclaron las células y el ADN en la cubeta y se enfriaron sobre hielo durante 10 minutos antes de la electroporación. Se aplicó a las células y al ADN un único pulso a 2500 mV utilizando un ajuste de capacidad de 25 \muF, y se diluyeron inmediatamente hasta 3,0 ml con medio LB nuevo. Las células diluidas se dejaron luego recuperar con agitación a 30ºC durante 2 horas. Alícuotas (10-100 \mul) de las células transformadas fueron sembradas en medio selectivo (placas de agar LB conteniendo 50 \mug/ml de ampicilina y 12,5 \mug/ml de tetraciclina) y las placas se cultivaron durante una noche a 30ºC.

Ejemplo 4 Purificación del mutante Q192R y de la 2,5-DKG reductasa A de tipo salvaje

Se cultivaron colonias individuales de células de Acetobacter cerinus transformadas en 200 ml de medio YT 2x (Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, A.3 (1989)) conteniendo antibióticos (12,5 \mug/ml de tetraciclina y 50 \mug/ml de ampicilina) a 30ºC durante una noche. Las células fueron recuperadas por centrifugación (15 minutos a 8000 rpm en un rotor Sorvall GS3) y se almacenaron congeladas. Las células fueron luego descongeladas en 1/5 de volumen de tampón de lisis (Tris 50 mM, pH 8,0, EDTA 50 mM, Tween 0,1%, 2 mg/ml de lisozima) y lisadas durante dos horas sobre hielo. Las células lisadas fueron centrifugadas de nuevo igual que anteriormente y se conservó el sobrenadante que contenía el extracto celular bruto.

La proteína 2,5-DKG reductasa A fue purificada del extracto celular bruto mediante cromatografía en DEAE celulosa. La DEAE celulosa (marca Whatman DE-52) fue pre-equilibrada con Tris 25 mM, pH 7,0. Un total de 5,0 ml del gel fue vertido en una columna de cromatografía de plástico desechable, a la cual se aplicó el extracto celular bruto. Una vez que se hubo unido todo el extracto a la columna, la columna fue lavada con dos volúmenes de columna de Tris 25 mM pH 7,0, posteriormente con un volumen de Tris 25 mM pH 7,0 conteniendo NaCl 0,3 M y, finalmente, la proteína 2,5-DKG reductasa A fue eluida con Tris 25 mM pH 7,0 conteniendo NaCl 0,6 M. Las preparaciones fueron analizadas para determinar la concentración de proteínas mediante el método del ácido bicinconínico (Methods in Enzymology 182: 60-62 (1990)) y analizadas para determinar su pureza mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida.

Ejemplo 5 Caracterización cinética de la 2,5-DKG reductasa A de tipo salvaje y del mutante Q192R

Las preparaciones de los enzimas 2,5-DKG reductasa A de tipo salvaje y mutante Q192R fueron caracterizadas cinéticamente en cuanto a su capacidad para reducir el sustrato 2,5-DKG a 2-KLG. Los ensayos fueron realizados en un volumen total de 1 ml de Tris 50 mM, pH 7,0, conteniendo NADPH 0,2 mM, una cantidad constante de enzima (15-20 mg) y cantidades de sustrato que variaban desde 2 a 14 mM. Los ensayos se llevaron a cabo a 25ºC y la velocidad de reducción del sustrato fue medida espectrofotométricamente midiendo la pérdida de absorbancia a una longitud de onda de 340 nm (que es indicativa de la oxidación del cofactor NADPH a NADP^{+}).

Los datos fueron analizados de acuerdo con la bien conocida ecuación de Michaelis para determinar los parámetros cinéticos Vmáx y Km utilizando el paquete de programas de ordenador Enzfit (Biosoft, Cambridge, R.U.) en un ordenador de sobremesa Epson. La 2,5-DKG reductasa A de tipo salvaje tenía una Vmáx para el sustrato 2,5-DKG de 7,8 \mumoles por minuto por miligramo de proteína, mientras que el mutante Q192R tenía una Vmáx de 14,0, una mejora de 1,8 veces. La Km o constante de Michaelis del enzima de tipo salvaje era de 28 mM, mientras que la Km del mutante Q192R era de 21 mM para este sustrato. Esto daba lugar a una constante de especificidad (kcat/Km) de 140 M^{-1} s^{-1} para el enzima de tipo salvaje y una constante de especificidad de 335 M^{-1} s^{-1} para el mutante Q192R, una mejora de 2,4 veces.

Ejemplo 6 Un mutante de la 2,5-DKG reductasa A con expresión in vivo incrementada

Se descubrió una forma mutante de la 2,5-DKG reductasa A que, aunque tenía una actividad equivalente a la del enzima de tipo salvaje, tenía cantidades incrementadas de la proteína que se acumulaban en el huésped de expresión Acetobacter. Este mutante, denominado "HS1", contiene tres cambios de aminoácidos: asparragina sustituye a treonina en posición dos, treonina sustituye a serina en posición cinco y serina sustituye a valina en posición siete. La síntesis de este mutante fue dirigida por un oligonucleótido de 37 bases con la secuencia 5' AATTCTATGAACGTTCCCAC
CATCAGCCTCAACGAC 3'. Las etapas de la reacción de mutagénesis fueron esencialmente las mismas que las descritas para la construcción del mutante Q192R.

La Tabla 3 siguiente muestra resultados de ensayos de lisados celulares brutos de Acetobacter cerinus llevando: el plásmido pBR322, un plásmido control que no contiene la secuencia de la 2,5-DKG reductasa A, pSStac.DKGR.AAA, el plásmido que expresa el gen de tipo salvaje o pSStac.DKGR.AAA.HS1, que contiene las mutaciones de HS1. Se prepararon extractos celulares brutos según se describió en la sección sobre la purificación de la 2,5-DKG reductasa A y de la proteína mutante Q192R. Se muestran resultados de cultivos celulares triplicados.

TABLA 3

	valores del ensayo*	media	% respecto al tipo salvaje
pBR322	-0,031	-0,030	-0,041	-0,034	0%
pSStac.DKGR.AAA	-0,158	-0,192	-0,186	-0,178	100%
pSStac.DKGR.AAA.HS1	-0,207	-0,214	-0,217	-0,213	124%
*los valores son los cambios de la absorbancia a 340 nm por minuto, por 50 \mul de extracto celular bruto, a una
concentración de sustrato de 2,5-DKG 10 mM y NADPH 0,2 mM en Tris 50 mM, pH 7,0, 25ºC.

En estos ensayos de los lisados celulares brutos, es necesario tener en cuenta la reductasa de fondo procedente de las propias células de Acetobacter cerinus. Esta cantidad de actividad está representada en los cultivos de pBR322 y es restada de los demás valores con el fin de calcular un "% de actividad respecto al tipo salvaje".

Los ensayos fueron realizados igual que anteriormente, en un volumen total de 1,0 ml de Tris 50 mM, pH 7,0, conteniendo NADPH 0,2 mM, una única cantidad fija de 2,5-DKG (10 mM) y 50 \mul de lisado celular bruto.

Los cultivos celulares que llevaban pSStac.DKGR.AAA.HS1 mostraban consistentemente un incremento del 20-30% de los niveles de expresión sobre los cultivos celulares que contenían el plásmido de tipo salvaje pSStac.DKGR.A
AA. Este incremento de la expresión puede ser debido a cambios en la estabilidad del ARNm, en el nivel de traducción del mensaje, en la estabilidad de la proteína, o a alguna combinación de estos efectos.

Ejemplo 7 Un mutante de la 2,5-DKG reductasa A con estabilidad térmica incrementada

Se descubrió una forma mutante de la 2,5-DKG reductasa A que tenía una estabilidad térmica incrementada en el huésped de expresión Acetobacter. Este mutante contiene dos cambios de aminoácidos: alanina sustituye a glicina en posición 55 y alanina sustituye a glicina en posición 57. La síntesis de este mutante está dirigida por un oligonucleótido de bases con la secuencia 5' GAAACGAAGAAGCGGTCGCGGCCGCGATCGCG 3'. Las etapas de la reacción de mutagénesis son esencialmente las mismas que las descritas para la construcción del mutante Q192R.

Ejemplo 8 Mutantes de la 2,5-DKG reductasa A con actividad reducida

Se descubrieron formas mutantes de la 2,5-DKG reductasa A que mostraban reducciones importantes de la actividad para convertir 2,5-DKG en 2-KLG. Las etapas de las reacciones de mutagénesis fueron esencialmente las mismas que las descritas para la construcción del mutante Q192R. Los siguientes oligonucleótidos de bases dirigieron la síntesis de tales mutantes que mostraban una actividad reducida en el huésped de expresión Acetobacter:

con una sustitución de glicina por alanina en posición 191 para construir el mutante G191A, 5' GGGGCCGCTCGC
CCAGGGCAAGT 3';

con una deleción de glicina en posición 193 para construir el mutante G193 con una deleción, 5' CCGCTCGGT
CAGAAGTACGACCT 3';

con una sustitución de lisina por arginina en posición 194 para construir el mutante K194R, 5' CGGTCAGGGCCG
CTACGACCTCT 3';

con una sustitución de tirosina por serina en posición 195 para construir el mutante Y195S, 5' TCAGGGCAAGTC
GGACCTCTTCG 3';

con una sustitución de alanina por tirosina en posición 167 para construir el mutante A167Y, 5' GCTGCACCCC
TACTACCAGCAGC 3';

con una sustitución de tirosina por fenilalanina en posición 168 para construir el mutante Y168F, 5' GCACCCCGC
CTTCCAGCAGCGCG 3';

con una sustitución de glutamina por prolina en posición 169 para construir el mutante Q169P, 5' CCCCGCC
TACCCGCAGCGCGAGA 3';

con una sustitución de lisina por leucina en posición 225 para construir el mutante K225L, 5' GCACCTGC
AGCTCGGTTTCGTGG 3';

con una sustitución de fenilalanina por serina en posición 227 para construir el mutante F227S, 5' GCAGAAGGGT
TCGGTGGTCTTCC 3';

con una sustitución de valina por treonina en posición 228 para construir el mutante V228T, 5' GAAGGGTTT
CACCGTCTTCCCGA 3';

con una sustitución de valina por prolina en posición 229 para construir el mutante V229P, 5' GGGTTTCGTGCCC
TTCCCGAAGT 3' y con un codón de parada en posición 271 para construir el mutante truncado, 5' GGGTCGCGTGT
GAGCACACCCCG 3'.

Claims

1. Una forma mutante de la 2,5-DKG reductasa A que comprende una o más de:

(a): una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos en los residuos 165-168, 187-198, 224-234 ó 262-278 de la 2,5-DKG reductasa A, definida como en la Figura 3, que dan lugar a una actividad que es diferente de la de la 2,5-DKG reductasa A de tipo salvaje,

(b): la sustitución de glicina por alanina en una hélice \alpha que da lugar a una estabilidad incrementada con relación a la 2,5-DKG reductasa A de tipo salvaje,

(c): la sustitución de un aminoácido aromático próximo a una agrupación aromática que da lugar a una estabilidad incrementada con relación a la 2,5-DKG reductasa A de tipo salvaje, o

(d): la sustitución de asparragina en el residuo 2 y de treonina en el residuo 5 y de serina en el residuo 7, definidas como en la Figura 3, que da lugar a una expresión incrementada de la proteína en el huésped.

2. Una forma mutante de la 2,5-DKG reductasa A de acuerdo con la reivindicación 1 parte (a), que presenta una constante de especificidad incrementada con relación a la 2,5-DKG reductasa A de tipo salvaje y que comprende la sustitución del aminoácido glutamina por arginina en el residuo 192, definida como en la Figura 3.

3. Una forma mutante de la 2,5-DKG reductasa A de acuerdo con la reivindicación 1 parte (a), que presenta una actividad reducida con relación a la 2,5-DKG reductasa A de tipo salvaje y que contiene alanina en el residuo 191, una deleción en el residuo 193, arginina en el residuo 194, serina en el 195, tirosina en el residuo 167, fenilalanina en el residuo 168, prolina en el residuo 169, leucina en el residuo 225, serina en el residuo 227, treonina en el residuo 228 o prolina en el residuo 229, definida como en la Figura 3.

4. Una forma mutante de la 2,5-DKG reductasa A de acuerdo con la reivindicación 1 parte (b), que presenta una estabilidad térmica incrementada con relación a la 2,5-DKG reductasa A de tipo salvaje y contiene alanina en el residuo 55 y alanina en el residuo 57, definida como en la Figura 3.

5. Una forma mutante de la 2,5-DKG reductasa A de acuerdo con la reivindicación 1 parte (a), que es inactiva utilizando 2,5-DKG como sustrato y contiene un codón de parada en el residuo 271, definida como en la Figura 3.

6. Una construcción de ADN que comprende un gen estructural conteniendo al menos un codón mutado, codificando dicho gen una forma mutante de la 2,5-DKG reductasa A de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

7. Una célula huésped transformada con un vector de expresión que incluye una construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 6.

8. La célula huésped de la reivindicación 7 que es una bacteria.

9. La célula huésped de la reivindicación 8, en la que la bacteria es del género Erwinia.

10. La célula huésped de la reivindicación 8, en la que la bacteria es del género Gluconobacter.

11. La célula huésped de la reivindicación 8, en la que la bacteria es del género Acetobacter.

12. La célula huésped de la reivindicación 8, en la que la bacteria es Acetobacter cerinus (IFO 3263).

13. Una célula huésped de acuerdo cualquiera de las reivindicaciones 7-12, en la que el vector de expresión es un plásmido.

14. La célula huésped de la reivindicación 13, en la que el plásmido es pSStac.DKGR.AAA, definido como en la Figura 2, en la que el gen de la 2,5-DKG reductasa A en ella contenido comprende los cambios de aminoácidos siguientes:

(i): N sustituye a T en posición 2,

(ii): T sustituye a S en posición 5, y

(iii): S sustituye a V en posición 7.

siendo definidas dichas posiciones como en la Figura 3.