ES2218659T3 - Mutantes mejorados de (2,5 dkg) reductasa a. - Google Patents
Mutantes mejorados de (2,5 dkg) reductasa a.Info
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Abstract
SE DESCRIBEN MUTANTES DE ACIDO 2,5 - DICETO - D - GLUCONICO REDUCTASA A Y B, ENZIMAS QUE SE UTILIZAN PARA PRODUCIR EL ACIDO 2 - CETO - L - GULONICO, UN PRECURSOR DE ACIDO ASCORBICO (VITAMINA C), QUE SE PREPARAN MEDIANTE MUTAGENESIS DIRIGIDA ESPECIFICA DE SITIO. ESTOS MUTANTES PUEDEN MOSTRAR UNA O MAS DE LAS SIGUIENTES CARACTERISTICAS: MEJOR ESTABILIDAD FRENTE A LA TEMPERATURA, MAYOR RESISTENCIA A LA INHIBICION DEL SUSTRATO, MAYOR RECAMBIO DEL SUSTRATO POR LA ENZIMA Y MAYOR AFINIDAD POR EL SUSTRATO.
Description
Mutantes mejorados de (2,5 DKG) reductasa A.
La presente invención se refiere a formas
mutantes mejoradas de un enzima industrialmente valioso. Más
específicamente, la invención se refiere a formas mutadas de la
reductasa A del ácido
2,5-diceto-D-glucónico
(2,5-DKG), variante de la 2,5-DKG
reductasa que existe de manera natural. Las formas mutadas muestran
una actividad catalítica mejorada para convertir
2,5-DKG estereoselectivamente en ácido
2-ceto-L-glucónico
(2-KLG), un precursor del ácido ascórbico (vitamina
C). Las formas mutadas pueden presentar una o más de las
características siguientes: estabilidad térmica mejorada,
resistencia incrementada a la inhibición por el sustrato,
renovación del sustrato por el enzima incrementada y una afinidad
por el sustrato incrementada.
Debido al aumento de la concienciación de la
gente por la salud en todo el mundo, hay una demanda creciente de
vitamina C. También contribuye a la demanda de ácido ascórbico su
uso extendido como antioxidante para conservar alimentos. Una
propuesta para satisfacer esta demanda es conseguir una producción
incrementada de 2-KLG, un producto intermedio de la
producción de ácido ascórbico. El producto intermedio,
2-KLG, puede ser convertido fácilmente en ácido
ascórbico mediante ciclización catalizada por un ácido o por una
base. Tiene también mayor estabilidad y duración de conservación que
el ácido ascórbico. Por tanto, en lugar de producir ácido ascórbico
directamente, es más práctico almacenar grandes cantidades de
2-KLG para su conversión posterior en ácido
ascórbico.
Varias especies de un primer grupo de
microorganismos, Erwinia, Acetobacter y
Gluconobacter, pueden producir 2,5-DKG a
partir de glucosa. Un segundo grupo de microorganismos del grupo de
bacterias corineformes (Corynebacterium, Brevibacterium y
Arthrobacter), así como especies de Micrococcus,
Staphylococcus, Pseudomonas, Bacillus y Citrobacter, son
capaces de convertir 2,5-DKG, producido por un
microorganismo del primer grupo, en 2-KLG. Una
fermentación en tándem o una cofermentación de los microorganismos
apropiados para producir 2-KLG fue simplificada
combinando los rasgos relevantes de especies de Erwinia y de
especies de Corynebacterium en un único microorganismo
(Anderson y col., Science 230: 144-149
(1985)). Esto se llevó a cabo identificando la
2,5-DKG reductasa en la especie de
Corynebacterium que convierte 2,5-DKG en
2-KLG. El gen que codifica esta reductasa fue
posteriormente clonado y expresado en Erwinia herbicola, una
bacteria de la familia Enterobacteriaceae que convierte la
D-glucosa en 2,5-DKG en una única
fermentación. La cepa bacteriana recombinante resultante, con
2,5-DKG reductasa como enzima fundamental, fue
capaz de convertir la D-glucosa en
2-KLG en un único proceso de fermentación (Lazarus
y col., Fourth ASM Conf. Genet. Molec. Biol. Indust.
Microorg., 187-193 (1989)).
La mejora de la eficacia catalítica de la
2,5-DKG reductasa, en el proceso de una sola
fermentación, es una forma significativa de incrementar la
producción de 2-KLG. Además, una
2,5-DKG reductasa A purificada con actividad
catalítica incrementada podría ser utilizada en un proceso in
vitro para la conversión de 2,5-DKG en
2-KLG. Por ejemplo, tal proceso permitiría la
producción continua de 2-KLG mediante la
inmovilización del enzima purificado en un soporte sólido.
De acuerdo con el esquema de
Michaelis-Menten mostrado a continuación,
Km
\hskip0,5cmkcat
E + S \leftarrow \rightarrow ES \rightarrow
E +
P
la eficacia de una reacción enzimática puede ser
medida por dos parámetros cinéticos, kcat y Km. La constante de
velocidad catalítica, kcat, conocida también como número de
renovación, es una medida de la descomposición del complejo
enzima-sustrato (ES). Representa también el número
máximo de moléculas de sustrato (S) que es convertido en producto
(P) a través de un complejo ES por sitio activo del enzima (E) por
unidad de tiempo. La Vmáx es la velocidad o tasa máxima de la
reacción catalizada por el enzima cuando el enzima está saturado
con sustrato. Por tanto, Vmáx es constante a una concentración de
sustrato saturante y permanece inalterada con cualquier incremento
de la concentración del sustrato. La kcat a concentraciones
saturantes de sustrato está relacionada con la Vmáx y con la
concentración total del enzima, [E_{\tau}], por la ecuación
siguiente: Vmáx = kcat [E_{\tau}]. La constante de Michaelis, Km,
es la concentración de sustrato a la cual la velocidad es igual a
Vmáx/2. Por tanto, Km es una medida de la potencia del complejo ES.
En una comparación de Kms, una Km más baja representa un complejo
con una unión más potente, más favorable, mientras que una Km mayor
representa un complejo con una unión más débil, menos favorable. La
relación kcat/Km, denominada constante de especificidad, representa
la especificidad de un enzima por un sustrato, esto es la eficacia
catalítica por molécula de enzima para un sustrato. Cuanto mayor
sea la constante de especificidad más preferido será el sustrato
por el
enzima.
Se han conseguido rendimientos impresionantes de
2-KLG con una 2,5-DKG reductasa de
Corynebacterium (2,5-DKG reductasa A,
conocida también como 2,5-DKG reductasa II)
(Anderson y col., Science 230: 144-149
(1985); Miller y col., J. Biol. Chem. 262:
9016-9020 (1987)) expresada en cepas huésped
apropiadas (productoras de 2,5-DKG) tales como
especies de Erwinia. Estos resultados se han conseguido a
pesar de que la 2,5-DKG reductasa A tiene una baja
constante de especificidad descrita para
2,5-DKG.
Esta baja constante de especificidad descrita
para la 2,5-DKG reductasa A contrasta con una
segunda 2,5-DKG reductasa homóloga de
Corynebacterium (2,5-DKG reductasa B,
conocida también como 2,5-DKG reductasa I) que
tiene una constante de especificidad mayor descrita para
2,5-DKG (Sonoyama y Kobayashi, J. Ferment.
Technol. 65: 311-317 (1987)). Además, ambas
2,5-DKG reductasas son homólogas a varias aldosa y
cetorreductasas conocidas que tienen mayores constantes de
especificidad hacia sus sustratos conocidos. Como
Corynebacterium no se encuentra de manera natural con
2,5-DKG, no es sorprendente que este compuesto sea
un mal sustrato para la 2,5-DKG reductasa A. Tales
hallazgos indican que el sitio activo de la 2,5-DKG
reductasa A no está configurado óptimamente para la conversión
catalítica del 2,5-DKG en 2-KLG. Por
tanto, parece que con el fin de optimizar la actividad específica
de la 2,5-DKG reductasa A en el proceso de una única
fermentación, deben realizarse sustituciones de aminoácidos
mediante mutagénesis dirigida a un sitio en el sitio activo del
enzima.
Además de mejorar los parámetros cinéticos del
enzima, la mutagénesis dirigida a un sitio puede incrementar la
estabilidad estructural mediante sustituciones, deleciones o
inserciones de aminoácidos. Los siguientes son ejemplos de
mutaciones estructuralmente estabilizantes. La introducción de
nuevos enlaces disulfuro para crear enlaces cruzados covalentes
entre diferentes partes de una proteína ha sido utilizada para
mejorar la estabilidad térmica del lisozima del bacteriófago T4
(Matsumura y col., Nature 342: 291-293
(1989)), del represor del bacteriófago \lambda (Sauer y col.,
Biochem. 25: 5992-5998 (1986)), de la
dihidrofolato reductasa de E. coli (Villafranca y col.,
Biochem. 26: 2182-2189 (1987)) y de
subtilisina BPN' (Pantoliano y col., Biochem. 26:
2077-2082 (1987)). Existe un programa de ordenador
(Pabo y col., Biochem. 25: 5987-5991 (1986))
que permite un barrido eficaz de la estructura tridimensional de
una proteína determinada cristalográficamente para sugerir aquellos
sitios en los que la inserción de dos cisteínas podría conducir a
enlaces disulfuro. Tales enlaces no alterarían la conformación a
escala mayor, aunque estabilizarían la conformación local.
Se ha demostrado que sustituciones de aminoácidos
tales como glicina por alanina en la hélice \alpha incrementan la
estabilidad térmica del represor del bacteriófago \lambda (Hecht
y col., Proteins: Struc. Funct. Genet.
1:43-46 (1986)) y de la proteasa neutra de
Bacillus stearothermophilus (Imanaka y col., Nature
324: 695-697 (1986)). Se consiguió un
incremento de la temperatura de fusión, T_{m}, del lisozima del
bacteriófago T4 por las dos sustituciones de aminoácidos de alanina
por prolina y glicina por alanina (Matthews y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84: 6663-6667 (1987)). Se ha
demostrado que la sustitución de aminoácidos en el núcleo central
hidrofóbico de una proteína por residuos aromáticos tales como
tirosina, especialmente en posiciones próximas a las agrupaciones
preexistentes de cadenas laterales aromáticas, estimula la
estabilidad térmica de la kanamicina nucleotidil transferasa (Liao
y col., Biochem. 83: 576-580 (1986)) y del
represor del bacteriófago \lambda (Hecht y col., Biochem.
81: 5685-5689 (1984)).
Las secuencias para el control de la
transcripción y de la traducción en vectores de expresión son
elementos clave requeridos para la producción a alto nivel de
proteínas en bacterias. Los promotores Trp de E. coli,
P_{L} del bacteriófago \lambda, lac UV5 de E. coli y la
fusión Trp-lacUV5 (Tac) están entre los promotores
procarióticos utilizados más frecuentemente (de Boer y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25 (1983);
Sambrook y col., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press
(1989); Remaut y col., Gene 15: 81-93
(1981)). La eficacia traduccional del mensaje, estabilidad del
ARNm, y la estabilidad intrínseca de la proteína son factores
fundamentales en la expresión a alto nivel.
La mutagénesis dirigida a un sitio, utilizando
oligonucleótidos de ADN sintéticos que tienen la secuencia deseada,
permite la sustitución, la deleción o la inserción de nucleótidos
seleccionados en una secuencia de ADN que codifique una proteína de
interés. Se utilizan procedimientos de ADN recombinante para
introducir la mutación deseada mediante la sustitución de la
secuencia diana por la secuencia sintética. El desarrollo de
plásmidos conteniendo un origen de replicación derivado de un
bacteriófago filamentoso (Vieira y Messing, Methods in Enzymology
153: 3-11 (1987)) permite el clonaje de
fragmentos en forma de plásmidos de hebra sencilla capaces de
replicación autónoma. La utilización de tales plásmidos elimina la
ardua tarea del subclonaje de fragmentos de ADN de plásmidos en
vectores bacteriófagos filamentosos. Existen kits comercialmente
disponibles para llevar a cabo la mutagénesis dirigida a un
sitio.
Mutantes de la 2,5-DKG reductasa
A con características que varíen del enzima nativo serían muy
útiles. En particular, una o más de las características siguientes:
estabilidad térmica mejorada, resistencia incrementada a la
inhibición por el sustrato, renovación incrementada del sustrato
por el enzima y una afinidad incrementada por el sustrato, serían
útiles para ampliar la utilidad comercial del enzima.
Desgraciadamente, a no ser que las proteínas
compartan regiones de homología sustancial de secuencias o de
homología estructural, no es posible generalizar entre las
proteínas para predecir con precisión, sobre la base de una
mutación beneficiosa de una proteína, si la secuencia que codifica
otra proteína debería ser cambiada para mejorar el funcionamiento
de esa proteína. Por tanto, es necesario emprender un análisis de
las características estructurales y funcionales precisas de la
proteína particular que va a ser alterada. Esto sugiere qué
aminoácidos alterar para producir un resultado deseado, tal como
una eficacia catalítica incrementada o una estabilidad térmica
incrementada.
Cada vez más frecuentemente se realiza la
correlación entre las estructuras de proteínas conocidas y la
secuencia de una proteína diana utilizando simulaciones por
ordenador (van Gunsteren, V.F., Prot. Engin. 2:
5-13 (1988); Yang, M.M. y col., En: Reaction
Centers of Photosynthetic Bacteria,
(Michel-Beyerle, Ed.),
Springer-Verlag, Alemania (1990), pp.
209-218), bases de datos (Moult, J. y col.,
Proteins 1: 146-163 (1987); Klein, P. y
col., Biopolymers 25: 1659-1672 (1986);
Nakashima, H. y col., J. Biochem. 99:
153-162 (1986); Deleage, G. y col., Prot. Engin.
1: 289-294 (1987)); redes neurales (Qian, N. y
col., J. Molec. Biol. 202: 865- 884 (1988); Holley, L.H. y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 152-156
(1989); Bohr, H. y col., FEBS Lett. 241:
223-228 (1988)); o sistemas expertos (Robson, B. y
col., J. Molec. Graphics 5: 8-17 (1987)).
Ver, de manera general, Fasman, G.R., TIBS 14:
295-299 (1989)).
La utilización de ordenadores o de métodos
asistidos por ordenador para analizar la estructura de proteínas se
discute, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. 4.704.692 (Ladner);
4.760.025 (Estell y col.); 4.853.871 (Pantoliano y col.) y 4.908.773
(Pantoliano y col.).
Las comparaciones de secuencias llevadas a cabo
utilizando la secuencia de la 2,5-DKG reductasa
mostraron que era un miembro de una superfamilia más grande de
carbonilo reductasas monoméricas, procarióticas y eucarióticas,
dependientes de NADPH, conocidas como las aldo-ceto
reductasas (Carper y col., Exp. Eye Res. 49:
377-388 (1989); Bohren y col., J. Biol. Chem.
264: 9547-9551 (1989)). Los miembros de esta
familia de enzimas incluyen: enzimas biosintéticos tales como la
sintasa de prostaglandina F bovina; enzimas destoxificantes tales
como la clordecona reductasa y la aflatoxina b1 reductasa; y
proteínas estructurales sin actividad enzimática identificada tales
como la cristalina rho del cristalino de rana.
El enzima aldosa reductasa humano ha sido
caracterizado y estudiado extensamente. La aldosa reductasa ha sido
implicada en complicaciones diabéticas; se cree que causa la
reducción de glucosa a sorbitol en pacientes diabéticos, teniendo
como resultado las cataratas diabéticas y la neuropatología
asociada con la diabetes de larga duración. Se han realizado
esfuerzos significativos para encontrar inhibidores específicos de
la aldosa reductasa con el fin de prevenir las complicaciones
diabéticas en humanos (Frank, Opthamology 98:
586-593 (1991); Zenon y col., Clinical Pharmacy
9: 446-456 (1990)). Debido a su potencial
importancia en la salud humana, la estructura cristalina de la
aldosa reductasa humana ha sido resuelta por varios grupos, bien
como el holoenzima (Wilson y col., Science 257:
81-84 (1992)), en complejo con el cofactor NADPH o
con el análogo del cofactor ATP-ribosa (Rondeau y
col., Nature 355: 469-472 (1992); Borhani y
col., J. Biol. Chem. 267: 24841-24847
(1992)), o en complejo con el inhibidor zopolrestat (Wilson y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 9847-9851
(1993)). Recientemente se ha resuelto también la estructura de otro
miembro de la familia de las aldo-ceto reductasas,
alfa HSD (Hoog y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:
2517-2521 (1994)). Estas estructuras muestran que
las aldo-ceto reductasas son barriles con ocho
pliegues alfa/beta paralelos conocidos también como motivos
"barril TIM", por la triosa fosfato isomerasa, en la que se
describió por vez primera. Éste es un plegamiento proteico
extremadamente común, con \sim17 ejemplos conocidos; alrededor
del 10% de todos los enzimas cuyas estructuras son conocidas son
"barriles TIM" (Farber y Petsko, TIBS 1990:
228-235 (1990)).
La estructura de la aldosa reductasa humana
revela varias características. El barril \alpha/\beta de la
aldosa reductasa está compuesto por ocho hebras beta que forman el
"núcleo central" del barril, rodeadas por ocho hélices alfa
que están unidas a las hebras beta por bucles de longitudes
variables. Igual que en todos los enzimas con estructura de barril
TIM conocidos, los bucles encontrados en los extremos C terminales
de las hebras beta contienen el sitio activo del enzima, en el cual
se unen el sustrato y el cofactor y tiene lugar la catálisis. El
NADPH se une a la parte superior del barril en una conformación
extendida, con el anillo de nicotinamida a partir del cual tiene
lugar la transferencia del hidruro ocupando casi el centro exacto
del barril. La orientación del anillo de nicotinamina del cofactor
es como se esperaría para una reductasa de clase A, con el hidrógeno
pro-R sobresaliendo hacia el bolsillo de unión del
sustrato. Hay dos características estructurales secundarias extra
en el barril de la aldosa reductasa: dos hélices alfa adicionales
(denominadas H1 y H2), que se encuentran en los bucles de
aminoácidos que unen la hebra beta siete y la hélice alfa siete, y
en la "cola" C terminal después de la hélice alfa ocho. La
estructura de la aldosa reductasa muestra esta cola
C-terminal pasando por encima de la parte superior
del barril para formar parte del sitio activo.
WO 94/05772 proporciona mutantes que contienen
modificaciones específicas de la 2,5-DKG reductasa
A, que pueden exhibir una estabilidad, una expresión y/o una
actividad catalítica mejoradas, y que pueden tener Km y Vmáx
variadas.
La presente invención proporciona formas mutadas
de la 2,5-DKG reductasa A procariótica
enzimáticamente activa.
La presente invención proporciona mutantes que
contienen modificaciones específicas de la 2,5-DKG
reductasa A, y materiales y métodos útiles para producir estas
proteínas, así como microorganismos modificados y líneas celulares
útiles para su producción. En particular, la invención proporciona
una forma mutante de la 2,5-DKG reductasa A que
tiene una capacidad mejorada para convertir 2,5-DKG
en 2-KLG y que tiene una sustitución de aminoácidos
en la posición 22 definida como en la SEC ID Nº: 1. Otros aspectos
de la invención incluyen construcciones de expresión y productos de
las mismas para las 2,5-DKG reductasas modificadas
así como vectores de clonaje que contienen el ADN que codifica las
2,5-DKG reductasas modificadas. En particular, la
invención proporciona una construcción de ADN que comprende un gen
estructural conteniendo al menos un codón mutado, codificando dicho
gen un mutante de la invención. Se proporciona también una célula
huésped transformada con un vector de expresión que incluye una
construcción de ADN de la invención.
El ADN que codifica la 2,5-DKG
reductasa A de tipo salvaje es modificado utilizando mutagénesis
dirigida a un sitio, empleando la forma de hebra sencilla del gen
que permite la generación de un cambio en un lugar seleccionado
dentro de la región codificadora de la 2,5-DKG
reductasa A. Mediante este método, se introduce un cambio en el ADN
aislado que codifica la 2,5-DKG reductasa A que,
después de la expresión del ADN, tiene como resultado la
sustitución de al menos un aminoácido en un lugar predeterminado de
la 2,5-DKG reductasa A.
Las 2,5-DKG reductasas
modificadas y las secuencias codificadoras de la invención pueden
presentar una o más de las características siguientes: estabilidad
térmica mejorada, resistencia incrementada a la inhibición por el
sustrato, renovación incrementada del sustrato por el enzima y
afinidad por el sustrato incrementada. Las 2,5-DKG
reductasas modificadas pueden tener Km y Vmáx variadas.
La Figura 1 muestra un vector de expresión para
el gen de la 2,5-DKG reductasa A;
la Figura 2 muestra un vector de expresión para
producir formas mutantes de la 2,5-DKG reductasa A;
y
la Figura 3 muestra los plásmidos
ptrp1-35.A y ptrp1-35.B.
La Figura 4 muestra esquemáticamente un modelo
algorítmico para la 2,5-DKG reductasa A (SEC ID Nº:
1).
La Figura 5 muestra una comparación de los
elementos secundarios pronosticados en la 2,5-DKG
reductasa A sobre la base del modelo algorítmico y del modelo de
homología.
La Figura 6 muestra una alineación de las
secuencias de proteínas de las 2,5-DKG reductasas A
y B con la aldosa reductasa humana. Los recuadros representan
elementos estructurales secundarios en la aldosa reductasa (SEC ID
Nº: 2) (SEC ID Nº: 3).
La Figura 7 muestra la cinética del sustrato del
mutante F22Y de la 2,5-DKG reductasa A y del
mutante Y23F de la 2,5-DKG reductasa B en
comparación con las 2,5-DKG reductasas A y B de
tipo salvaje.
La Figura 8 muestra la cinética del sustrato del
mutante N50A de la 2,5-DKG reductasa B comparada
con las 2,5-DKG reductasas A y B de tipo
salvaje.
La Figura 9 muestra la cinética del sustrato del
mutante A272G de la 2,5-DKG reductasa A en
comparación con las 2,5-DKG reductasas A y B de tipo
salvaje.
La Figura 10 muestra la cinética del sustrato del
mutante F22Y/Q192R de la 2,5-DKG reductasa A, del
mutante F22Y/A272G de la 2,5-DKG reductasa A y del
mutante Q192R/A272G de la 2,5-DKG reductasa A en
comparación con las 2,5-DKG reductasas A y B de
tipo salvaje.
La Figura 11 muestra la Km del cofactor de los
mutantes F22Y, Q192R, A272G y F22Y/A272G de la
2,5-DKG reductasa A en comparación con las
2,5-DKG reductasas A y B.
La Figura 12 muestra el análisis de
desnaturalización térmica de mutantes seleccionados en comparación
con las 2,5-DKG reductasas A y B de tipo
salvaje.
Según se utiliza en la presente, el término
2,5-DKG reductasa A de "tipo salvaje" se
refiere a una proteína que es capaz de catalizar la conversión de
2,5-DKG en 2-KLG
estereoselectivamente. El enzima de tipo salvaje es el enzima
obtenido de especies de Corynebacterium derivadas de la cepa
ATCC Nº 31090 según está descrito en la Patente de EE.UU. Nº
5.008.193.
El término 2,5-DKG reductasa B de
"tipo salvaje" se refiere a una proteína que es capaz de
catalizar la conversión de 2,5-DKG en
2-KLG estereoselectivamente. El enzima de tipo
salvaje es el enzima obtenido de especies de Corynebacterium
shs752001 según está descrito por Hardy y col. en la Patente de
EE.UU. Nº 4.945.052.
Según se utiliza en la presente, el término
"mutante" en relación con una proteína tal como la
2,5-DKG reductasa A de "tipo salvaje" o la
2,5-DKG reductasa B de "tipo salvaje", se
refiere a una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos
relacionada. Sin embargo, contiene una o más sustituciones,
deleciones o inserciones de residuos de aminoácidos. Estos residuos
han sido seleccionados utilizando ciertos planteamientos. Un
planteamiento implica la utilización de predicciones de la
estructura secundaria para asignar la 2,5-DKG
reductasa A a una estructura de barril \alpha/\beta de ocho
hebras. Pueden llevarse a cabo varias modificaciones con el fin de
modificar el gen que codifica mutantes del enzima con
características mejoradas, en comparación con el enzima de tipo
salvaje, para convertir 2,5-DKG en
2-KLG estereoselectivamente.
Es muy conocido en la técnica que muchos de los
compuestos discutidos en la presente especificación, tales como
proteínas y los derivados ácidos de sacáridos, pueden existir en
una variedad de estados de ionización dependiendo de su medio
circundante, si están en solución, o fuera de las soluciones a
partir de las cuales han sido preparados si están en forma sólida.
La utilización de un término tal como, por ejemplo, ácido glucónico,
para designar tales moléculas tiene la intención de incluir todos
los estados de ionización de la molécula orgánica referida. Así,
por ejemplo, "ácido D-glucónico" y
"D-gluconato" se refieren ambos al mismo resto
orgánico, y no tienen la intención de especificar estados de
ionización particulares. Es bien conocido que el ácido
D-glucónico puede existir en forma no ionizada, o
puede estar disponible, por ejemplo, como la sal de sodio, potasio
u otra sal. La forma ionizada o no ionizada en la que el compuesto
es pertinente a la descripción, será obvia a partir del contexto
para una persona experta en la técnica, o será irrelevante. De este
modo, la propia proteína 2,5-DKG reductasa A y sus
diferentes mutantes pueden existir en una variedad de estados de
ionización dependiendo del pH. Todos estos estados de ionización
están abarcados por los términos "2,5-DKG
reductasa A" y "forma mutante de la 2,5-DKG
reductasa A".
El término "vector de expresión" incluye
vectores que son capaces de expresar secuencias de ADN en ellos
contenidas si tales secuencias están unidas operativamente a otras
secuencias capaces de efectuar su expresión. Está implícito, aunque
no manifestado explícitamente, el que los vectores de expresión
deben ser replicables en los organismos huésped ya sea como episomas
o como una parte integral de un ADN cromosómico. Claramente, una
falta de replicación los convertiría en efectivamente inoperables.
En suma, al término "vector de expresión" se le da también una
definición funcional. Generalmente, los vectores de expresión de
utilidad en las técnicas de ADN recombinante están a menudo en
forma de "plásmidos". El término plásmido se refiere a
moléculas de ADN de doble hebra circulares o a moléculas de ADN de
hebra sencilla circulares que contienen un origen de replicación.
Estas moléculas de ADN, en su forma de vector, no está unidas a los
cromosomas. Otros vectores eficaces comúnmente utilizados son ADN
de fagos y ADN no circular. En la presente especificación,
"plásmido" y "vector" son utilizados a menudo
indistintamente. Sin embargo, la invención tiene la intención de
incluir otras formas de vectores de expresión que cumplan funciones
equivalentes y que sean, o que serán posteriormente, conocidas.
El término "construcción" tiene la intención
de incluir de manera general plásmidos, vectores, etc. y fragmentos
de los mismos (tales como casetes y secuencias génicas).
"Células huésped recombinantes", "célula
huésped", "células", "cultivos celulares", etc., son
utilizados indistintamente para designar células individuales,
líneas celulares, cultivos celulares y células recogidas que hayan
sido o que vayan a ser transformadas con los vectores recombinantes
de la invención. Los términos incluyen también la progenie de las
células que recibieron originalmente el vector.
"Transformación" se refiere a cualquier
proceso para alterar el contenido de ADN del huésped. Esto incluye
procedimientos de transformación in vitro tales como
transfección mediada por cloruro de calcio, fosfato de calcio o
DEAE-dextrano, conjugación, electroporación,
inyección nuclear, infección con fagos u otros medios tales para
llevar a cabo la captación controlada de ADN según se conoce en la
técnica.
Los términos "aminoácido" y
"aminoácidos" se refieren a todos los
L-\alpha-aminoácidos que existen
de forma natural. Esta definición tiene la intención de incluir
norleucina, ornitina y homocisteína. Los aminoácidos son
identificados por las denominaciones de una sola letra o de tres
letras:
| Asp | D | ácido aspártico | Ile | I | isoleucina |
| Thr | T | treonina | Leu | L | leucina |
| Ser | S | serina | Tyr | Y | tirosina |
| Glu | E | ácido glutámico | Phe | F | fenilalanina |
| Pro | P | prolina | His | H | histidina |
| Gly | G | glicina | Lys | K | lisina |
| Ala | A | alanina | Arg | R | arginina |
| Cys | C | cisteína | Trp | W | triptófano |
| Val | V | valina | Gln | Q | glutamina |
| Met | M | metionina | Asn | N | asparragina |
Estos aminoácidos pueden ser clasificados de
acuerdo con la composición química y las propiedades de sus cadenas
laterales. Son clasificados de manera general en dos grupos,
cargados y no cargados. Cada uno de estos grupos está dividido en
subgrupos con el fin de clasificar los aminoácidos con más
precisión:
\;
\;Aminoácidos cargados
Residuos Ácidos: ácido aspártico, ácido
glutámico
Residuos Básicos: lisina, arginina,
histidina
\;Aminoácidos no cargados
Residuos Hidrofílicos: serina, treonina,
asparragina, glutamina
Residuos Alifáticos: glicina, alanina,
valina, leucina, isoleucina
Residuos No Polares: cisteína, metionina,
prolina
Residuos Aromáticos: fenilanalina,
tirosina, triptófano
| Residuo Original | Sustituciones Conservadoras | |
| Ala | ser | |
| Arg | lys | |
| Asn | gln; his | |
| Asp | glu | |
| Cys | ser; ala | |
| Gln | asn | |
| Glu | asp | |
| Gly | pro | |
| His | asn; gln | |
| Ile | leu; val | |
| Leu | ile; val | |
| Lys | arg; gln; glu | |
| Met | leu; ile | |
| Phe | met; leu; tyr | |
| Ser | thr | |
| Thr | ser | |
| Trp | tyr | |
| Tyr | trp; phe | |
| Val | ile; leu |
Los cambios fundamentales en la función o en la
estabilización se realizan seleccionando sustituciones que sean
menos conservadoras que las mostradas en la Tabla 1, esto es,
seleccionando residuos que difieran más significativamente en su
efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto
polipeptídico en el área de la sustitución, por ejemplo como una
conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o la
hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana o (c) el volumen de
la cadena lateral. Las sustituciones que se espera en general que
produzcan los mayores cambios serán aquéllas en las que (a) un
residuo hidrofílico, por ejemplo serina o treonina, es sustituido
por un residuo hidrofóbico, por ejemplo leucina, isoleucina,
fenilalanina, valina o alanina; (b) una cisteína o una prolina es
sustituida por cualquier otro residuo; (c) un residuo con una
cadena lateral electropositiva, por ejemplo lisina, arginina o
histidina, es sustituido por un residuo electronegativo, por ejemplo
ácido glutámico o ácido aspártico; o (d) un residuo con una cadena
lateral voluminosa, por ejemplo fenilalanina, es sustituido por uno
que no tenga cadena lateral, por ejemplo glicina.
La mayoría de las técnicas que son utilizadas
para transformar células, construir vectores, llevar a cabo una
hibridación con una sonda, realizar una mutagénesis dirigida a un
sitio y similares, son ampliamente practicadas en el oficio. La
mayoría de los trabajadores son familiares con los recursos
materiales estándar que describen condiciones y procedimientos
específicos (ver por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989),
incorporado a la presente por referencia). Sin embargo, se
presentan los párrafos siguientes como una guía adicional.
El gen funcional completo es ligado a un vector
de expresión adecuado que contenga un promotor y un sitio de unión
de ribosomas operativos en la célula huésped en la cual se
transformará la secuencia codificadora. En el estado actual de la
técnica, hay varios sistemas de estimulación/control y varios
huéspedes procarióticos adecuados disponibles que son apropiados
para la presente invención. Pueden utilizarse huéspedes similares
para el clonaje y para la expresión, ya que los procariotas son, en
general, preferidos para el clonaje de secuencias de ADN. El método
de producción de 2-KLG está asociado muy
convenientemente con tales sistemas microbianos. E. coli K12
cepa 294 (ATCC Nº 31446) es particularmente útil como huésped para
clonaje. Otras cepas microbianas que pueden ser utilizadas incluyen
cepas de E. coli tales como E. coli B, E. coli
X1776 (ATCC Nº 31537) y E. coli DH-1 (ATCC
Nº 33489). Para la expresión, pueden utilizarse las cepas
anteriormente mencionadas así como E. coli W3110 (F-,
\lambda-, prototrófica, ATCC Nº 27325), bacilos tales como
Bacillus subtilis y otras enterobacteriáceas tales como
Salmonella typhimurium o Serratia marcesans y varias
especies de Pseudomonas. Un grupo de huéspedes
particularmente preferido incluye aquellos cultivos que son capaces
de convertir la glucosa u otros metabolitos comúnmente disponibles
en 2,5-DKG. Ejemplos de tales huéspedes se
encuentran generalmente entre los géneros Acetobacter,
Gluconobacter, Acetomonas y Erwinia. La taxonomía y la nomenclatura
de estos géneros son tales que la misma cepa o cepas similares
tienen a veces nombres diferentes. Por ejemplo, Acetobacter
cerinus utilizado en el ejemplo siguiente es referido también
como Gluconobacter cerinus. Ejemplos de huéspedes
particulares incluyen, pero no se limitan a, Erwinia
herbicola ATCC Nº 21998 (considerada también como Acetomonas
albosesamae en la Patente de EE.UU. Nº 3.998.697);
Acetobacter (Gluconobacter) oxydans subespecie
melanozenes, IFO 3292, 3293, ATCC Nº 9937; Acetobacter
(Gluconobacter) cerinus, IFO 3263, IFO 3266; Gluconobacter
rubiginous, IFO 3244; Acetobacter fragum ATCC Nº 21409;
Acetobacter (Acetomonas) suboxydans subespecie
industrious, ATCC Nº 23776.
En general, se utilizan en relación con estos
huéspedes vectores de expresión o de clonaje plasmídicos o
plásmidos de conjugación que contienen secuencias de replicación y
control que derivan de especies compatibles con la célula huésped.
El vector lleva normalmente un origen de replicación así como genes
marcadores que son capaces de proporcionar una selección fenotípica
en las células transformadas. Por ejemplo, E. coli es
transformada típicamente utilizando pBR322, un plásmido derivado de
una cepa de E. coli (Bolivar y col., Gene 2:
95-113 (1977)). El pBR322 contiene genes de
resistencia a ampicilina y tetraciclina y proporciona de este modo
un medio fácil para identificar las células transformadas. Para ser
utilizado en expresión, el plásmido pBR322, u otro plásmido
microbiano, debe contener también, o debe ser modificado para que
contenga, promotores que puedan ser utilizados por el organismo
microbiano para la expresión de sus propias proteínas. Esos
promotores, muy comúnmente utilizados en la construcción de ADN
recombinante, incluyen los sistemas de promotores de la
\beta-lactamasa (penicilinasa) y de la lactosa
(Chang y col., Nature 275: 617-624 (1978);
Itakura y col., Science 198: 1056-1063
(1977); Goeddel y col., Nature 281: 544-548
(1979)) y un sistema promotor del triptófano (trp) (Goeddel y col.,
Nucleic Acids Res. 8: 4057-4074 (1980);
Solicitud de EPO Nº 0036776). Aunque éstos son los más comúnmente
utilizados, se han descubierto y utilizado otros promotores
microbianos. Se han publicado detalles referentes a sus secuencias
de nucleótidos, permitiendo a un trabajador experto ligar los
mismos funcionalmente en una relación operativa a genes de vectores
de transformación. (Siebenlist y col., Cell 20:
269-281 (1980)).
Mediante el corte y la ligadura adecuados, pueden
incluirse secuencias de ADN que codifiquen la
2,5-DKG reductasa A y B en los vectores
anteriormente mencionados preparados según se esquematizó
anteriormente. Cualquier secuencia innecesaria o inhibidora puede
ser eliminada y el enzima procariótico puede ser luego purificado;
o las células intactas o rotas pueden ser utilizadas directamente
como catalizadores. Alternativamente, puede elegirse el huésped de
tal manera que una vez transformado sea capaz de llevar a cabo la
conversión completa de la glucosa o de otro metabolito adecuado en
el producto 2-KLG deseado.
Los ADNs plasmídicos de tipo salvaje, el ADN
plasmídico mutante para la 2,5-DKG reductasa A y el
ADN plasmídico mutante para la 2,5-DKG reductasa B
son transfectados en un huésped para la expresión del enzima. Las
células huésped recombinantes son cultivadas bajo condiciones que
favorezcan la expresión del enzima. Normalmente se proporciona una
presión de selección mediante la presencia de un antibiótico. La
resistencia al antibiótico está codificada por el vector.
Anderson y col. han descrito la construcción del
plásmido ptrp1-35 en la Patente de EE.UU. Nº
5.008.193, incorporada a la presente por referencia, el cual
contiene el gen de la DKG reductasa A clonado bajo el control del
promotor trp de E. coli (Figura 1). Se construye un
derivado de este plásmido, con unas cuantas modificaciones
secundarias, para facilitar la construcción y la caracterización de
las formas mutantes de la 2,5-DKG reductasa A. Estas
modificaciones se describen a continuación. La construcción
plasmídica final es denominada pSStac.DKGR.AAA y está mostrada en la
Figura 2.
A) El gen estructural de la
2,5-DKG reductasa A es mutado para que incluya tres
nuevos sitios de enzimas de restricción con el fin de facilitar
estudios de mutagénesis posteriores. Estos tres sitios son
"silentes", esto es, la secuencia de aminoácidos de la
proteína DKGR A resultante permanece inalterada.
B) El promotor en pSStac.DKGR.AAA es el promotor
tac II descrito por de Boer y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA
80: 21-25 (1983)) en lugar del promotor
trp encontrado en ptrp1-35. Ésta es una
versión modificada del promotor trp que contiene el sitio de
unión para el represor lac, permitiendo que la expresión del gen
sea regulada en células que expresen el represor lac.
C) El plásmido es modificado posteriormente para
que incluya el origen de replicación del fago f1 filamentoso de
hebra sencilla. La utilización de esta secuencia de ADN en
plásmidos es bien conocida en la técnica para producir una forma
del plásmido de hebra sencilla para secuenciación y mutagénesis.
Con el fin de producir 2,5-DKG
reductasas y mutantes, se construyeron dos plásmidos adicionales:
ptrp1-35.A y ptrp1-35.B (Figura 3),
que expresan los genes estructurales para las variantes A y B de la
2,5-DKG reductasa, respectivamente, detrás del
promotor trp de E. coli en un vector derivado de
pBR322. El punto de partida para estas construcciones plasmídicas
era ptrp1-35 descrito en la Patente de EE.UU. Nº
5.008.193.
En la preparación de los genes de la DKG
reductasa A y B para la expresión, se realizaron varias
modificaciones a las secuencias codificadoras de tipo salvaje de
estos genes. El plásmido con el gen de la DKG reductasa A de tipo
salvaje en ptrp1-35 tiene un sitio de EcoRI
inmediatamente corriente arriba de la metionina de inicio; se
introdujo un sitio de KpnI inmediatamente después del codón
de terminación para permitir que el gen estructural completo sea
escindido en una digestión con EcoRI-KpnI. De manera
similar, se introdujeron sitios de EcoRI y KpnI
inmediatamente corriente arriba y corriente abajo del gen de la DKG
reductasa B de tipo salvaje para permitir que el gen B fuera
colocado en el mismo vector que el gen A.
El gen de la DKG reductasa A de tipo salvaje fue
modificado para introducir nuevos sitios de XbaI y
ApaI que, junto con los sitios de EcoRI y KpnI
flanqueantes, subdividen el gen en tres segmentos, siendo cada uno
\sim1/3 de la longitud. Los sitios de XbaI y ApaI en
el gen A son "silentes", esto es, no alteran la secuencia de
aminoácidos de la proteína codificada. Los mismos dos sitios de
XbaI y ApaI fueron introducidos en las posiciones
análogas del gen de la DKG reductasa B. El primero de estos dos
sitios, XbaI, es silente en el gen B y no altera la secuencia
de aminoácidos del gen B. Sin embargo, no fue posible introducir el
segundo de los dos sitios (ApaI) en la secuencia B sin
alterar la secuencia de aminoácidos. Se introdujo por tanto una
variación en la secuencia para acomodar el sitio de ApaI: la
serina 189 de la DKG reductasa B fue mutada a glicina (el
aminoácido encontrado en la posición análoga del gen A) durante la
creación del sitio de ApaI.
El plásmido ptrp1-35 fue digerido
con EcoRI y HindIII para generar un fragmento de
\sim1690 pb que contenía el gen estructural de la DKG reductasa A
y una secuencia corriente abajo, el cual fue purificado mediante
electroforesis en gel de acrilamida y ligado en el ADN del vector
M13mp19 digerido con EcoRI y HindIII. Las reacciones
de ligadura fueron transformadas en células de E. coli cepa
JM101; y los recombinantes apropiados fueron identificados mediante
mapeo de restricción de preparaciones del fago recombinante RF. El
fago recombinante (M19mp19.EcoRI/HindIII.DKGRA) fue
preparado como una preparación molde a gran escala (forma de hebra
sencilla) para las reacciones de mutagénesis.
El punto de partida para los plásmidos que
contenían el gen de la DKGR B de tipo salvaje es el plásmido pCBR13
según está descrito (Grindley y col., Applied and Environmental
Microbiology 54: 1770-1775 (1988)) incorporada
a la presente por referencia. El plásmido pCBR13 fue digerido con
EcoRI y BamHI para generar un fragmento de \sim2000
pb, que fue purificado mediante electroforesis en gel de acrilamida
y ligado en M13mp19 digerido con EcoRI y BamHI para
generar el fago recombinante M13mp19.RI/BamHI.DKGRB. El fago
recombinante (M13mp19.RI/BamHI.DKGRB) fue preparado como una
preparación molde a gran escala (forma de hebra sencilla) para las
reacciones de mutagénesis.
Las reacciones de mutagénesis fueron según sigue.
Se diseñaron cebadores oligonucleotídicos para introducir nuevos
sitios de restricción en los genes de la DKGR A y B de tipo
salvaje: para DKGR A: se introdujeron sitios de XbaI,
ApaI y KpnI; para DKGR B: se introdujeron sitios de
EcoRI, ApaI, XbaI y KpnI. Los
oligonucleótidos utilizados para introducir estos sitios de
restricción fueron los siguientes:
XbaI.A = 5'-C GCG AAG CTG
GCT CTA GAT CAG GTC GAC-3' (SEC ID Nº: 4),
ApaI.A = 5'-A TCG TGG GGG CCC CTC GGT CAG
GGC-3' (SEC ID Nº: 5), KpnI.A =
5'-GAG GTC GAC TGA GGT ACC CGA ACA CCC
G-3' (SEC ID Nº: 6), EcoRI.B =
5'-GGG TAT CTA GAA TTC TAT GCC
GAA-3' (SEC ID Nº: 7), XbaI.B =
5'-C GAC CGG CTG GGT CTA GAC GTG ATC
GAC-3' (SEC ID Nº: 8), ApaI.B =
5'-ACC GAG AGC TGG GGG CCC CTC GCC CGG
CGC-3' (SEC ID Nº: 9), KpnI.B =
5'-GAA GAG ATG TAG GGT ACC GAT GCC GCG
CA-3' (SEC ID Nº: 10).
Las reacciones de mutagénesis se realizaron
mediante el método de "dos cebadores" según está descrito por
Carter, Methods Enzymol. 154: 382 (1987), que se incorpora a
la presente por referencia. Los oligonucleótidos mutagénicos fueron
diluidos hasta 10 unidades de DO_{260} por ml. Se llevó a cabo una
reacción con quinasa según sigue: 2 \mul de cebador, 2 \mul de
tampón de quinasa 10x, 1 \mul de DTT 100 mM, 13,5 \mul de
H_{2}O doble destilada y desionizada y 0,5 \mul de quinasa (4
unidades/\mul, New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)
durante 30 minutos a 37ºC. La quinasa fue posteriormente inactivada
por calor mediante incubación a 70ºC durante 15 minutos, y la
reacción se ajustó a una concentración de cebador de 5 \muM. Se
prepararon reacciones de hibridación que contenían 5 \mul de cada
cebador apropiado a 5 \muM, 5 \mul de un cebador sometido
similarmente a quinasa y "corriente arriba" (un
18-mero para secuenciación que es complementario a
la secuencia inmediatamente corriente arriba del sitio de clonaje
del poliadaptador M13 (5'-TTC CCA GTC ACG ACG
TTG-3' (SEC ID Nº: 11)), 3 \mug de molde, 2,5
\mul de tampón RB 10x en un volumen final de 25 \mul y se llevó
a cabo la hibridación mediante calentamiento a 75 grados
centígrados en un bloque de calentamiento durante 3 minutos,
dejándose luego enfriar hasta 25ºC en la poyata de trabajo. Se
realizaron extensiones mediante la adición de 2 \mul de dATP,
dCTP, dGTP y dTTP 2,0 mM; más 1 \mul de ligasa (6 unidades
Weiss/\mul, New England Biolabs, Beverly, Massachusetts), 1 \mul
de fragmento Klenow de la ADN polimerasa de E. coli (5
unidades/\mul, fragmento grande de la ADN polimerasa I, New
England Biolabs, Beverly, Massachusetts), 5 \mul de tampón de
ligasa 5x, 2 \mul de rATP 10 mM y H_{2}O hasta un total de 50
\mul. La extensión se realizó a 25ºC durante 4 horas. Cinco
\mul de la reacción de extensión fueron transformados en células
de E. coli MutL CaCl_{2} competentes. Las placas
individuales fueron dispuestas en una placa de microvaloración de
96 pocillos, cultivadas a 37ºC, estampadas sobre un tapiz de
células de E. coli cepa JM101 y cultivadas de nuevo a 37ºC.
Se realizaron múltiples réplicas de cada placa en filtros de
nitrocelulosa y se sondaron con los oligonucleótidos mutagénicos
radiomarcados con ^{32}P. Las condiciones fueron según sigue:
hibridación durante una hora a 37ºC, lavado con SSC 6x a 37ºC,
posteriormente con la solución de lavado TMACl (cloruro de
tetrametilamonio 3 M, Tris 50 mM pH 8,0, EDTA 2 mM y SDS al 0,1% a
65 y 68ºC). Los supuestos recombinantes individuales que hibribadan
con todos los oligonucleótidos apropiados fueron preparados en
forma de hebra sencilla y secuenciados para confirmar que estaban
presentes todos los sitios correctos y que no se habían introducido
mutaciones secundarias. Los fagos mutantes así identificados fueron
denominados:
"M13mp19 . RI / HindIII . DKGR .
AAA"
y
"M13mp19 . RI / BamHI . DKGR .
BBB".
Los genes mutados fueron subclonados desde el
fago de nuevo en el vector ptrp1-35 para su
expresión. El molde de M13mp19.RI/HindIII.DKGR.AAA fue
"rellenado" con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa de
E. coli (5 unidades/\mul, fragmento grande la ADN
polimerasa I, New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)
utilizando los cuatro dNTPs para generar una forma de doble hebra
en la reacción siguiente: 25 \mul de molde, 5 \mul de tampón de
traducción con muescas 10x, 3 \mul de dATP, dCTP, dGTP, dTTP 10
mM, 10 \mul del cebador "corriente arriba" complementario de
M13 (5'-TTC CCA GTC ACG ACG
TTG-3'), en un volumen total de 52 \mul. Las
reacciones fueron hibridadas lentamente en un bloque de
calentamiento igual que anteriormente, e iniciadas mediante la
adición de 1 \mul de fragmento Klenow de la ADN polimerasa de
E. coli (5 unidades/\mul, fragmento grande la ADN
polimerasa I, New England Biolabs, Beverly, Massachusetts) y
extendidas durante 30 minutos a 25ºC. La mezcla de reacción fue
luego digerida con EcoRI y HindIII y el fragmento de
1690 pb resultante fue purificado y subclonado en
ptrp1-35 digerido con EcoRI y HindIII
para generar el plásmido ptrp1-35.DKGR.A. Para la
construcción de DKGR B, el molde M13mp19.
EcoRI/BamHI.DKGR.BBB fue rellenado de forma similar,
digerido con EcoRI y KpnI, y este fragmento de
\sim843 pb purificado mediante electroforesis en gel de
acrilamida. Este fragmento fue clonado posteriormente en
ptrp1-35.A digerido con EcoRI/KpnI
(sustituyendo el gen de la DKGR A mutagenizado, pero reteniendo las
secuencias corriente abajo de DKGR A desde KpnI hasta
HindIII). Este plásmido es denominado
ptrp1-35.DKGR.B:S189G.
ptrp1-35.DKGR.B:S189G.
La construcción
ptrp1-35.DKGR.B:S189G que expresaba DKGR B fue
utilizada como punto de partida para construir un plásmido que
expresara DKGR B de tipo salvaje, con el codón de serina apropiado
en la posición 189. Esto fue realizado según sigue:
ptrp1-35.B:S189G fue digerido con NcoI y
XhoI para eliminar los \sim2/3 (\sim700 pb) internos de
la secuencia codificadora; esta región incluye los sitios de
XbaI y ApaI introducidos así como la mutación de
serina a glicina en el aminoácido 189. Esta región fue sustituida
por la secuencia del gen de tipo salvaje procedente de pCBR13 desde
NcoI hasta XhoI. La construcción final es denominada
ptrp1-35.DKGR.B.
Con el fin de producir la proteína
2,5-DKG reductasa A y B para su caracterización,
los plásmidos ptrp1-35.A y
ptrp1-35.B, junto con el plásmido control pBR322,
fueron introducidos en E. coli cepa HB101 mediante el método
del CaCl_{2} y seleccionados en placas de agar LB que contenían
ampicilina y tetraciclina. Cultivos de 5,0 ml fueron cultivados
hasta la saturación durante una noche en LB más ampicilina y
tetraciclina a 37ºC con agitación. Las células fueron recuperadas
por centrifugación y se analizaron alícuotas mediante
electroforesis en gel SDS-PAGE. No se observaron
nuevas bandas en el rango de peso molecular \sim30.000 esperado
para la 2,5-DKG reductasa en estos lisados
celulares, ni en experimentos similares con E. coli cepa
MM294. Los lisados celulares fueron analizados para determinar
actividad 2,5-DKG reductasa, y no se observó
actividad en estos lisados por encima del fondo del lisado de
pBR322.
Cuando estos plásmidos fueron introducidos
similarmente en una cepa de Acetobacter cerinus (IFO 3263)
que fue cultivada a 28ºC y analizada para determinar la expresión
mediante electroforesis SDS-PAGE, se observaron
nuevas bandas destacadas en el rango de \sim30.000 daltons en los
lisados de ptrp1-35.A y ptrp1-35.B.
Los ensayos con los lisados celulares de Acetobacter cerinus
para determinar la actividad reductora de 2,5-DKG
mostraron también una actividad incrementada sobre el fondo de
pBR322.
La secuencia de ADN que codifica la
2,5-DKG reductasa A o la 2,5-DKG
reductasa B es sometida a mutagénesis dirigida a un sitio con el fin
de sustituir nucleótidos que codifican aminoácidos seleccionados en
posiciones predeterminadas de la secuencia.
El procedimiento preferido para la mutagénesis
dirigida a un sitio, en la que se va a alterar solamente un único
par de bases, se lleva a cabo clonando la secuencia de ADN que
codifica el enzima de tipo salvaje en un plásmido recombinante que
contiene un origen de replicación derivado de un bacteriófago de
hebra sencilla. Posteriormente se utiliza un cebador apropiado para
transformar un nucleótido en una posición identificada. Se utiliza
un cebador oligonucleotídico sintético, complementario a la
secuencia deseada, excepto en áreas de desacoplamiento limitado,
como cebador en la síntesis de una hebra complementaria a la
secuencia de la 2,5-DKG reductasa A o de la
2,5-DKG reductasa B de tipo salvaje, de hebra
sencilla, en el vector plasmídico. El ADN de doble hebra resultante
es transformado en una bacteria huésped. Los cultivos de la
bacteria transformada son sembrados en placas de agar, permitiendo
la formación de colonias a partir de las células individuales que
albergan el plásmido. Teóricamente, el 50% de las colonias constarán
de plásmido conteniendo la forma mutante; el 50% tendrán la
secuencia original. Las colonias son hibridadas con un cebador
sintético radiomarcado bajo condiciones rigurosas que permitan la
hibridación solamente con el plásmido mutante que formará un
apareamiento perfecto con la sonda. Las colonias que hibridan son
posteriormente recogidas y cultivas y se recupera el ADN plasmídico
mutante.
Una mutagénesis dirigida a un sitio posterior
puede ser utilizada para alterar nucleótidos adicionales en
cualquier mutante. Alternativamente, pueden construirse mutantes
con más de un nucleótido alterado utilizando técnicas que son
familiares para los técnicos tales como el aislamiento de
fragmentos de restricción y la ligadura de tales fragmentos en un
vector de expresión. (Ver, por ejemplo, Sambrook y col.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Press (1989)).
Es crucial para la selección de los sitios de
mutagénesis la predicción de una estructura secundaria y terciaria
del enzima de tipo salvaje. Las predicciones de la estructura
secundaria se llevan a cabo de una de las formas siguientes.
Primero, las secuencias de las 2,5-DKG reductasas A
y B, y de otros cinco enzimas homólogos (sintasa de prostaglandina
F, aldosa reductasa de cristalino bovino y de cristalino de rata,
aldehído reductasa de hígado humano y
\rho-cristalina del cristalino de ojo de rana) son
alineadas para revelar varios residuos conservados. Segundo, las
secuencias son sometidas a diferentes algoritmos de predicción de
la estructura (Chou y Fasman, Adv. Enzymol. 47:
45-148 (1978); Garnier y col., J. Mol. Biol.
120: 97-120 (1978); Wilmot y Thornton, J.
Mol. Biol. 203: 221-232 (1988); Karplus y
Schulz, Naturwissenschaften 72: 212-214
(1985); Eisenberg y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:
140-144 (1984); Rose y Roy, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 77: 4643-4647 (1980)) bien conocidos
en la técnica. Estas predicciones son confrontadas y comparadas para
derivar un modelo aproximado de la estructura secundaria del enzima
como un barril \alpha/\beta de ocho hebras ("modelo
algorítmico"). Esta predicción de la estructura secundaria es
consistente con las estructuras secundarias recientemente resueltas
de enzimas homólogos que tienen el plegamiento de un barril
\alpha/\beta de ocho hebras (Rondeau y col., Nature 355:
469-472 (1992); Wilson y col., Science 257:
81-84 (1992)).
La estructura de barril está constituida por dos
componentes. El primer componente es un núcleo central de ocho
hebras beta paralelas enrolladas dispuestas muy juntas, como
duelas, en un barril. Rodeando esta estructura de barril hay un
segundo componente de ocho hélices alfa que están unidas a las
hebras beta mediante bucles de varias longitudes. Esta estructura de
barril \alpha/\beta de ocho hebras es denominada el barril de
la triosafosfato isomerasa (TIM), por el enzima para el cual se
observó esta estructura por vez primera. El patrón de plegamiento
del barril \alpha/\beta se encuentra en 17 enzimas cuyas
estructuras cristalinas se conocen. De hecho, el 10%
aproximadamente de las estructuras enzimáticas conocidas son
barriles \alpha/\beta (Farber y Petsko, TIBS 15:
228-234 (1990)). Los 17 enzimas de barril
\alpha/\beta conocidos tienen un núcleo central de barril
\alpha/\beta común; la especificidad de sustrato y de cofactor
procede de los bucles variables que unen las hebras \beta y las
hélices \alpha.
En la Figura 4 se muestra esquemáticamente (SEC
ID Nº: 1) un modelo de estructura secundaria propuesto para la
2,5-DKG reductasa A basado en el modelo algorítmico
(ver anteriormente), en el que las hebras beta están representadas
por flechas y las hélices alfa están mostradas como cilindros. Las
regiones de cadena polipéptida que conectan los elementos
pronosticados de la estructura secundaria están indicadas como de
estructura no definida. Hay extensiones N y
C-terminales de 34 y 17 aminoácidos,
respectivamente. Se cree que algún subgrupo de los ocho bucles en el
extremo C de la lámina beta (hacia la izquierda de la Figura 4),
así como la "cola" C-terminal (posiciones 262
a 278) contienen el sitio activo del enzima, igual que en los demás
enzimas de barril TIM. Aunque es sólo un modelo aproximado, esta
estructura facilita enormemente el diseño racional del enzima,
permitiendo centrarse en esos residuos encontrados en los bucles
del sitio activo propuestos. Es obvio que residuos adicionales
cerca de los que están en los bucles propuestos y en la "cola"
pueden comprender también parte del sitio activo.
La selección de los sitios para mutagénesis es
potenciada por un análisis estructural comparativo adicional. El
análisis de la secuencia de la 2,5-DKG reductasa
reveló que era un miembro de una superfamilia mayor de carbonilo
reductasas monoméricas, procarióticas y eucarióticas, dependientes
de NADPH, conocidas como aldo-ceto reductadas
(Carper y col., Exp. Eye Res. 49: 377-388
(1985); Bohren y col., J. Biol. Chem. 264:
9547-9551 (1989)). Los miembros de este grupo
incluyen enzimas bioasintéticas tales como la sintasa de
protaglandina F bovina, enzimas destoxificantes tales como la
clordecona reductasa y la aflatoxina b1 reductasa, así como
proteínas estructurales sin actividad enzimática identificada tales
como la rho-cristalina del cristalino de rana.
La estructura de la aldosa reductasa humana
revela varias características clave importantes en el modelado
mediante homología. El barril \alpha/\beta de la aldosa
reductasa está compuesto por ocho hebras beta que forman el
"núcleo central" del barril, rodeadas por ocho hélices alfa que
está unidas a las hebras beta mediante bucles de longitudes
variables. Igual que en otros enzimas de barril TIM conocidos, los
bucles encontrados en los extremos C-terminales de
las hebras beta comprenden el sitio activo del enzima, en el cual
se unen el sustrato y el cofactor y tiene lugar la catálisis. El
NADPH se une a la parte superior del barril en una conformación
extendida, ocupando el anillo de nicotinamida desde el cual tiene
lugar la transferencia del hidruro casi el centro exacto del
barril. La orientación del anillo de nicotinamida del cofactor es
como se esperaría para una reductasa de clase A, con el hidrógeno
pro-R sobresaliendo hacia el bolsillo de unión del
sustrato. Hay dos características extra de la estructura secundaria
en el barril de la aldosa reductasa: dos hélices alfa adicionales
(denominadas H1 y H2), que se encuentran en los bucles de
aminoácidos que unen la hebra beta siete y la hélice alfa siete, y
en la "cola" C-terminal después de la hélice
alfa ocho. La estructura de la aldosa reductasa muestra esta cola
C-terminal pasando por encima de la parte superior
del barril para formar parte del sitio activo.
Se construyó un modelo de la
2,5-DKG reductasa variante A sobre la base de las
coordenadas del complejo aldosa reductasa:NADPH (Wilson y col.,
Science 257: 81-84 (1992)), aplicando métodos
de modelado (Greer, Methods in Enzymology 202:
239-252 (1991); Bajorath y col., Protein Science
2: 1798-1810 (1993); incorporadas ambas a la
presente por referencia). La Figura 5 muestra los elementos
secundarios pronosticados por este modelo.
Tal información referente a qué aminoácidos
comprende el sitio activo de un enzima puede ser conseguida a
partir del conocimiento de la forma tridimensional real del enzima
en cuestión, según se obtiene a partir de estudios cristalográficos
de rayos x o de estudios de RMN. En el caso de la
2,5-DKG reductasa no existe todavía en la literatura
publicada tal información equivalente. Por tanto, una estrategia
alternativa en tal caso sería utilizar los modelos para la
2,5-DKG reductasa A, según se discutió
anteriormente, para limitar las posibles sustituciones de
aminoácidos individuales, o combinaciones de sustituciones de
aminoácidos individuales, a aquellos residuos que se encuentran
asociados con áreas del sitio activo.
Mutaciones en sitios particulares de una proteína
pueden conducir a una expresión incrementada de esa proteína en
bacterias. Muchos de los demás mutantes puntuales posibles son
generados en grupos de una a cuatro sustituciones de aminoácidos
muy separadas. De los mutantes que están plegados de manera estable,
solamente aquéllos que se encuentran en la región
21-25, en la región 46-52, en el
bucle 164-170, en el bucle 188-200,
en el bucle 230-235 y en la "cola"
C-terminal (262-278) presentan una
actividad significativamente diferente de la del enzima de tipo
salvaje. Esto es una confirmación adicional de que estas regiones
de los bucles y la cola comprenden el sitio activo del enzima.
Cualquier número de las mutaciones aquí
propuestas puede ser combinado en un único mutante. Obviamente, una
sustitución particular en una posición excluye la sustitución con
otro aminoácido en el mismo lugar en ese mutante particular.
Los ejemplos siguientes se presentan para
ilustrar la presente invención y para ayudar a una persona con
experiencia habitual a realizar y utilizar la misma. Los ejemplos
no tienen intención alguna de limitar de otro modo el ámbito de la
invención.
Una alícuota del plásmido
ptrp1-35 fue digerida con los enzimas de
restricción EcoRI y HindIII y el fragmento de 1690
pares de bases resultante fue purificado mediante electroforesis en
gel de agarosa. Este fragmento fue luego ligado en el vector
M13mp19 digerido con EcoRI y HindIII. El fago
recombinante resultante (denominado M13mp19.DKGRA) fue utilizado
para aislar una forma molde de hebra sencilla del fago para la
mutagénesis posterior. El molde fue mutagenizado con tres
oligonucleótidos con el fin de introducir tres nuevos sitios de
corte de enzimas de restricción en el gen de la
2,5-DKG reductasa A. Estos sitios son todos
"silentes" en cuanto a que aunque introducen un nuevo sitio de
corte de restricción en la secuencia de ADN, la secuencia de
aminoácidos de la proteína codificada permanece inalterada debido a
la degeneración del código genético. Los tres oligonucleótidos
mutagénicos y los cambios introducidos son según sigue: 1) el
oligonucleótido XbaA tiene la secuencia
5'-CGCGAAGCTGGCTCTAGATCAGGTCGAC-3'
(SEC ID Nº: 12) e introduce un nuevo sitio de XbaI en el
aminoácido en posición 98; 2) el oligonucleótido ApaA tiene
la secuencia 5'- ATCGTGGGGGCCCCTCGGTCAGGGC-3' (SEC
ID Nº: 13) e introduce un nuevo sitio de ApaI en el
aminoácido en posición 188; y 3) el oligonucleótido KpnA
tiene la secuencia
5'-GAGGTCGACTGAGGTACCCGAACACCCG-3'
(SEC ID Nº: 14) e introduce un nuevo sitio de KpnI
inmediatamente después del codón de parada (TGA) después del
aminoácido final. La reacción y las condiciones de la mutagénesis
fueron esencialmente las mismas que las descritas en el Ejemplo 2
para la construcción del mutante Q192R. Después de la reacción de
mutagénesis, las placas positivas fueron identificadas por
hibridación con el oligonucleótido mutagénico bajo condiciones
rigurosas, y la región codificadora completa del fragmento de la
2,5-DKG reductasa A fue secuenciada para confirmar
las mutaciones.
El plásmido pSStac.DKGR.AAA fue construido como
una ligadura de tres vías de los fragmentos siguientes: 1)
EcoRI a HindIII del fago mutagenizado M13mp19.DKGRA
según se describió anteriormente; éste contiene el gen que codifica
la 2,5-DKG reductasa A; 2) el fragmento PstI
a EcoRI (850 pares de bases) del plásmido ptac6 (el ptac6 es
equivalente al plásmido ptrp1-35, pero contiene el
promotor tac según está descrito en de Boer y col. (Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 80: 21-25 (1983) en lugar del
promotor trp encontrado en ptrp1-35) y 3) el
fragmento del vector de \sim4.000 pares de bases desde
HindIII hasta PstI del plásmido p690. El plásmido
p690 es un derivado del plásmido pBR322 con el fragmento de
restricción RsaI/DraI del genoma del bacteriófago f1
(nucleótidos 5489-5946), que contiene el origen de
replicación de ADN de hebra sencilla, insertado en el sitio de
PvuII.
Los tres fragmentos anteriormente descritos
fueron aislados mediante electroforesis en gel de agarosa,
purificados y ligados en proporciones aproximadamente equimolares,
y utilizados para transformar células de E. coli
competentes. Las colonias resultantes fueron analizadas mediante
mapeo de restricción con el fin de identificar la construcción
correcta, denominada pSStac.DKGR.AAA (Figura 2).
Células de E. coli (cepa
XL1-Blue, Stratagene Corporation) portadoras del
plásmido pSStac.DKGR.AAA fueron cultivadas en medio LB (Sambrook y
col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Press, A.1 (1989)) hasta la fase log temprana e infectadas
con el fago cooperador VCS-M13 (Stratagene). La
infección con el fago cooperador proporciona los factores
necesarios para el empaquetamiento y la secreción de la forma de
hebra sencilla del plásmido pSStac.DKGR.AAA. Las células infectadas
fueron cultivadas durante una noche con agitación a 37ºC, y al día
siguiente las células fueron eliminadas por centrifugación a 10.000
rpm durante 10 minutos en un rotor Sorvall SM24. Se retuvo el
sobrenadante que contenía el plásmido empaquetado y se desechó el
aglutinado celular. El plásmido empaquetado fue precipitado
mediante la adición de 1/4 de volumen de NaCl 2,5 M, PEG (polietilén
glicol) 20%. Después de la adición la mezcla fue almacenada a 25ºC
durante 20 minutos y posteriormente se recuperó el precipitado
mediante centrifugación.
El precipitado fue disuelto en 0,4 ml de tampón
TE (Tris 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM) y purificado posteriormente
mediante varias extracciones secuenciales con un volumen igual de
cloroformo:fenol 50:50. Después de cada extracción se conservó la
fase acuosa (superior). El ADN fue precipitado con 2 volúmenes de
etanol enfriado en hielo. El precipitado fue recuperado por
centrifugación y disuelto en tampón TE. Se calculó la concentración
del plásmido midiendo la absorbancia óptica a 260 nm utilizando la
conversión de 1 DO_{260} = 40 \mug de ADN de hebra sencilla por
mililitro. La concentración del plásmido fue ajustada a 1 \mug por
ml con TE.
Se sintetizó un oligonucleótido sintético con la
secuencia
5'-GCCCCTCGGTCGCGGCAAGTACG-3' (SEC
ID Nº: 15) y se fosforiló según sigue: el oligonucleótido fue
diluido hasta una concentración de 5,0 unidades de DO_{260} por
ml. Posteriormente se combinaron 2,5 \mul de oligonucleótido con
3 \mul de tampón de quinasa 10x (Tris 1 M, pH 8,0, MgCl_{2} 100
mM, ditiotreitol 70 mM, ATP 10 mM), 25 \mul de agua y 2 unidades
de polinucleótido quinasa de T4 (4 unidades/\mul, New England
Biolabs, Beverly, Massachusetts). La mezcla fue incubada a 37ºC
durante 15 minutos, posteriormente el enzima quinasa fue inactivado
mediante calentamiento a 70ºC durante 10 minutos.
Se combinaron 6 \mul de cebador sometido a la
reacción con quinasa con 1 \mug de ADN molde y 2,5 \mul de
tampón RB 10x (Tris 70 mM, pH 7,5, mercaptoetanol 50 mM, NaCl 550
mM y EDTA 1 mM) en un volumen total de 10,5 \mul. El cebador fue
hibridado al molde mediante calentamiento de la mezcla a 65ºC
durante 5 minutos, enfriando luego lentamente hasta 25ºC durante un
periodo de 30 minutos.
A la mezcla de hibridación se añadieron 1,5
\mul de tampón RB 10x, 1 \mul de ATP 10 mM, 1 \mul de DTT 10
mM (ditiotreitol) y 1 \mul de ADN ligasa de T4 (6 unidades
Weiss/\mul, New England Biolabs, Beverly, Massachusetts). Después
de 10 minutos, se añadieron 1 \mul de MgCl_{2} 1 M, 1 \mul de
dNTPs 5 mM (una mezcla equimolar de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) y 0,5
\mul de Klenow (5 unidades/\mul, fragmento grande de la ADN
polimerasa I, New England Biolabs, Beverly, Massachusetts) y la
mezcla se incubó a 15ºC durante una noche.
Al día siguiente, células de E. coli MutL
competentes congeladas fueron transformadas con una alícuota de la
mezcla de reacción y sembradas sobre de placas de agar que
contenían una selección de antibióticos (12,5 \mug/ml de
tetraciclina, 50 \mug/ml de ampicilina). Las colonias portadoras
de plásmidos mutantes fueron identificadas inicialmente mediante
hibridación con el oligonucleótido mutagénico original bajo
condiciones rigurosas (Wood y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82: 1585-1588 (1988)). Se prepararon
posteriormente los plásmidos mutantes en una forma de hebra sencilla
igual que en la Sección A y se confirmaron mediante secuenciación
directa del ADN del plásmido (kit de secuenciación "Sequenase
Sequencing Kit", United States Biochemical Corporation). El
mutante resultante de la 2,5 DKG reductasa A, Q192R, según se
muestra en el Ejemplo 5, tiene una actividad catalítica mejorada en
comparación con la 2,5-DKG reductasa A de tipo
salvaje.
El ADN plasmídico fue introducido en
Acetobacter cerinus (ATCC Nº 39140) mediante
electroporación, según está descrito (Wirth y col., Mol. Gen.
Genet. 216(1): 175-177 (1989)) utilizando
un aparato Genepulser (Biorad Corporation). Las células fueron
cultivadas hasta la mitad de la fase logarítmica (DO_{550}
\sim0,2-0,8) en 100 ml de medio LB y recuperadas
por centrifugación a 5.000 rpm en un rotor Sorvall
SS-34 durante 5 minutos a 4ºC. Las células fueron
resuspendidas en medio volumen de tampón para electroporación
enfriado en hielo (sacarosa 300 mM, tampón fosfato de sodio 7 mM, pH
7,0 y MgCl_{2} 1 mM), aglutinadas de nuevo por centrifugación y
resuspendidas finalmente en 1/20º de volumen de tampón para
electroporación, y almacenadas en hielo hasta su utilización.
El ADN plasmídico (0,1 a 1,0 \mug) fue añadido
a una cubeta de electroporación de 0,4 cm (Biorad Corporation) que
contenía 0,8 ml de las células de Acetobacter preparadas. Se
mezclaron las células y el ADN en la cubeta y se enfriaron sobre
hielo durante 10 minutos antes de la electroporación. Se aplicó a
las células y al ADN un único pulso a 2500 mV utilizando un ajuste
de capacidad de 25 \muF, y se diluyeron inmediatamente hasta 3,0
ml con medio LB nuevo. Las células diluidas se dejaron luego
recuperar con agitación a 30ºC durante 2 horas. Alícuotas
(10-100 \mul) de las células transformadas fueron
sembradas en medio selectivo (placas de agar LB conteniendo 50
\mug/ml de ampicilina y 12,5 \mug/ml de tetraciclina) y las
placas se dejaron crecer durante una noche a 30ºC.
Se cultivaron colonias individuales de las
células de Acetobacter cerinus transformadas en 200 ml de
medio YT 2x (Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Press, A.3 (1989)) conteniendo
antibióticos (12,5 \mug/ml de tetraciclina y 50 \mug/ml de
ampicilina) a 30ºC durante una noche. Las células fueron recuperadas
por centrifugación (15 minutos a 8000 rpm en un rotor Sorvall GS3)
y se almacenaron congeladas. Las células fueron luego descongeladas
en 1/5 de volumen de tampón de lisis (Tris 50 mM, pH 8,0, EDTA 50
mM, Tween 0,1%, 2 mg/ml de lisozima) y lisadas durante dos horas
sobre hielo. Las células lisadas fueron centrifugadas de nuevo
igual que anteriormente y se conservó el sobrenadante que contenía
el extracto celular bruto.
La proteína 2,5-DKG reductasa A
fue purificada del extracto celular bruto mediante cromatografía en
DEAE celulosa. La DEAE celulosa (marca Whatman
DE-52) fue pre-equilibrada con Tris
25 mM, pH 7,0. Un total de 5,0 ml del gel fue vertido en una
columna de cromatografía de plástico desechable, a la cual se
aplicó el extracto celular bruto. Una vez que se hubo unido todo el
extracto a la columna, la columna fue lavada con dos volúmenes de
columna de Tris 25 mM pH 7,0, posteriormente con un volumen de Tris
25 mM pH 7,0 conteniendo NaCl 0,3 M y, finalmente, la proteína
2,5-DKG reductasa A fue eluida con Tris 25 mM pH
7,0 conteniendo NaCl 0,6 M. Las preparaciones fueron analizadas para
determinar la concentración de proteínas mediante el método del
ácido bicinconínico (Methods in Enzymology 182:
60-62 (1990)) y analizadas para determinar su
pureza mediante electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida.
Las preparaciones de los enzimas
2,5-DKG reductasa A de tipo salvaje y mutante Q192R
fueron caracterizadas cinéticamente en cuanto a su capacidad para
reducir el sustrato 2,5-DKG a 2-KLG.
Los ensayos fueron realizados en un volumen total de 1 ml de Tris
50 mM, pH 7,0, conteniendo NADPH 0,2 mM, una cantidad constante de
enzima (15-20 \mug) y cantidades de sustrato que
variaban desde 2 a 14 mM. Los ensayos se llevaron a cabo a 25ºC y la
velocidad de reducción del sustrato fue medida
espectrofotométricamente midiendo la pérdida de absorbancia a una
longitud de onda de 340 nm (que es indicativa de la oxidación del
cofactor NADPH a NADP^{+}).
Los datos fueron analizados de acuerdo con la
bien conocida ecuación de Michaelis para determinar los parámetros
cinéticos Vmáx y Km utilizando el paquete de programas de ordenador
Enzfit (Biosoft, Cambridge, R.U.) en un ordenador de sobremesa
Epson. La 2,5-DKG reductasa A de tipo salvaje tenía
una Vmáx aparente para el sustrato 2,5-DKG de 7,8
\mumoles por minuto por miligramo de proteína, mientras que el
mutante Q192R tenía una Vmáx aparente de 14,0, una mejora de 1,8
veces. La Km o constante de Michaelis del enzima de tipo salvaje era
aparentemente de 28 mM, mientras que la Km del mutante Q192R era
aparentemente de 21 mM para este sustrato. Esto daba lugar a una
constante de especificidad aparente (kcat/Km) de 140 M^{-1}
s^{-1} para el enzima de tipo salvaje y una constante de
especificidad de 335 M^{-1} s^{-1} para el mutante Q192R, una
mejora de 2,4 veces.
Se construyó un modelo de la
2,5-DKG reductasa variante A sobre la base de las
coordenadas del complejo aldosa reductasa:NADPH (Wilson y col.,
Science 257: 81-84 (1992)), aplicando métodos
de modelado (Greer, Methods in Enzymology 202:
239-252 (1991), incorporada a la presente por
referencia; Bajorath y col., Protein Science 2:
1798-1810 (1993) incorporada a la presente por
referencia), en el cual se definen y se mantienen constantes
"regiones conservadas estructuralmente" (generalmente regiones
de características de estructura secundaria como la hélice alfa y
la lámina beta, o regiones con una extensa identidad de secuencias),
a las cuales se añaden posteriormente "bucles" de aminoácidos
variables. La conformación de estos bucles es modelada mediante
búsquedas conformacionales a través de bases de datos de
estructuras cristalinas, o mediante algoritmos para la generación de
conformaciones aleatorias.
La Figura 6 muestra la alineación de las
secuencias de proteínas de las 2,5-DKG reductasas A
y B con la aldosa reductasa humana; los residuos en un recuadro
muestran características de la estructura secundaria procedentes de
la estructura cristalina de la aldosa reductasa (Bruce y col.,
Biochem. J. 299: 805-811 (1994)). En este
modelado, los cambios principales fueron: sustitución del bucle
largo que une la hebra beta cuatro y la hélice alfa cuatro y la
hebra beta siete y la hélice H1 con bucles más cortos, y el modelado
de una nueva conformación de la cola para tener en cuenta la cola
más corta de la 2,5-DKG reductasa A. La estructura
restante se mantuvo constante. Se eligieron estructuras de
apariencia similar para estos bucles a partir de varias
posibilidades generadas por un programa de generación de
conformaciones aleatorias. El modelo fue utilizado con el fin de
convertir en diana para mutagénesis varios residuos del sitio
activo pronosticado de la 2,5-DKG reductasa A, y es
también utilizado en las secciones siguientes para ilustrar las
localizaciones aproximadas de estos mutantes en la estructura de
barril de la 2,5-DKG reductasa A.
El modelo de homología fue utilizado para
determinar diferencias estructurales alrededor del bolsillo de
unión al sustrato que podrían ser la base de las diferencias
observadas entre la renovación del sustrato de la
2,5-DKG reductasa A y de la DKG reductasa B. En
particular, el modelo de homología fue utilizado para localizar
aminoácidos para sustitución asociados con el bolsillo de unión al
sustrato en la 2,5-DKG reductasa A que fueran menos
hidrofílicos que el aminoácido correspondiente en la
2,5-DKG reductasa B.
El aminoácido 22 parece formar parte del bolsillo
de especificidad de sustrato en el sitio activo tanto en la
estructura de la aldosa reductasa como en el modelo de homología de
la 2,5-DKG reductasa A. Se encuentra una
fenilalanina en el enzima 2,5-DKG reductasa A,
mientras que una tirosina ocupa esta posición en la secuencia de la
2,5-DKG reductasa B. El resto hidroxilo extra de la
tirosina en comparación con la fenilalanina puede contribuir a la
capacidad para unir H de la región del sitio activo del enzima
2,5-DKG reductasa B.
La construcción de estos dos mutantes, F22Y e
Y23F es según sigue: se diseñaron cuatro oligonucleótidos, dos para
la mutagénesis y dos para el sondaje, según sigue: A:F22Y.m =
5'-C GGG TAC GGC GTC TAC AAG GTG CCG CCG
G-3' (SEC ID Nº: 16), A:F22Y.p =
5'-C GGC GTC TAC AAG GTG C-3' (SEC
ID Nº: 17), B:Y23F.m = 5'-T GGG CTC GGC ACG TTC AAC
CTG CGC GGC G-3' (SEC ID Nº: 18), y B:Y23F.p =
5'-C GGC ACG TTC AAC CTG C-3' (SEC
ID Nº: 19). Los oligonucleótidos con el sufijo ".m" fueron
sometidos a la acción de la quinasa y utilizados para mutar moldes
para los genes de la 2,5-DKG reductasa A y B de tipo
salvaje con el kit de Amersham (los moldes son fragmentos de
EcoRI-KpnI de los genes para las DKG reductasas A y B
en M13mp19). Las etapas de las reacciones de mutagénesis, el
aislamiento y caracterización de los mutantes fueron esencialmente
los mismos que los esquematizados para la construcción del mutante
Q192R, excepto en que se utilizaron los oligonucleótidos con el
sufijo ".p" para aislar los mutantes. El mutante F22Y
resultante de la 2,5-DKG reductasa A tiene una
tirosina en posición 22, y el mutante Y23F resultante de la
2,5-DKG reductasa B tiene una fenilalanina en
posición 23.
La caracterización cinética del mutante F22Y de
la 2,5-DKG reductasa A y del mutante Y23F de la
2,5-DKG reductasa B se llevó a cabo esencialmente de
la misma manera que en el Ejemplo 5, excepto en que para determinar
los parámetros cinéticos de la reducción dependiente de NADPH del
2,5-DKG por las 2,5-DKG reductasas,
se realizaron una serie de reacciones con una concentración
saturante constante de NAPDH (200 \muM) y concentraciones
variables de sustrato desde 0 a 30 mM. El mutante F22Y de la
2,5-DKG reductasa A muestra una actividad
incrementada significativa y reproducible en comparación con la
2,5-DKG reductasa A de tipo salvaje (Figura 7). La
actividad del mutante Y23F de la 2,5-DKG reductasa
B es menor que la de la 2,5-DKG reductasa B de tipo
salvaje (Figura 7). El mutante F22Y de la 2,5-DKG
reductasa A puede mostrar también una resistencia incrementada a la
inhibición por el sustrato en comparación con el enzima
2,5-DKG reductasa B de tipo salvaje.
La posición 49 fue seleccionada para mutagénesis
sobre la base de la proximidad de este sitio al sitio de unión del
sustrato en el modelo de homología, y de una diferencia
pronunciada de la hidrofobicidad en esa posición en los enzimas
2,5-DKG reductasa A y B: la 2,5-DKG
reductasa A tiene una isoleucina en posición 49, mientras que la
2,5-DKG reductasa B tiene una asparragina en
posición 50. La posición 49 se encuentra en un bucle de aminoácidos
que une la hebra beta 2 y la hélice alfa 2. Se construyeron dos
mutantes para analizar el efecto de mutaciones en la cadena lateral
en este sitio: I49N, mutante de la 2,5-DKG
reductasa A y N50A, mutante de la 2,5-DKG reductasa
B. La construcción de estos mutantes fue según sigue: las secuencias
oligonucleotídicas fueron las siguientes: A:I49N.m =
5'-C GAC ACC GCG GCG AAC TAC GGA AAC GAA
G-3' (SEC ID Nº: 20), A:I49N.p =
5'-C GCG GCG AAC TAC GGA A-3' (SEC
ID Nº: 21), B:N50A.m = 5'-TC GAC ACG GCG GTG GCG TAC
GAG AAC GAG AG-3' (SEC ID Nº: 22) y B:N50A.p =
5'-G GCG GTG GCG TAC GAG A-3'(SEC ID
Nº: 23). Las etapas de las reacciones de mutagénesis, el
aislamiento y la caracterización de los mutantes fueron
esencialmente los mismos que los esquematizados para la
construcción del mutante F22Y. El mutante I49N resultante de la
2,5-DKG reductasa A tiene una asparragina en
posición 49 y el mutante N50A resultante de la
2,5-DKG reductasa B tiene una alanina en posición
50.
La caracterización cinética del mutante I49N de
la 2,5-DKG reductasa A y del mutante N50A de la
2,5-DKG reductasa B se llevó a cabo esencialmente de
la misma manera que en el Ejemplo 5, excepto en que para determinar
los parámetros cinéticos de la reducción dependiente de NADPH del
2,5-DKG por las 2,5-DKG reductasas,
se realizaron una serie de reacciones con una concentración
saturante constante de NADPH (200 \muM) y concentraciones
variables de sustrato desde 0 a 30 mM. El mutante I49N de la
2,5-DKG reductasa A no produjo niveles detectables
de proteína recombinante en la célula huésped, debido probablemente
a inestabilidad estructural. El mutante N50A de la
2,5-DKG reductasa B se expresaba normalmente. Los
resultados cinéticos para el mutante N50A de la
2,5-DKG reductasa B están mostrados en la Figura 8.
El mutante N50A de la 2,5-DKG reductasa B no
presenta inhibición por el sustrato hasta concentraciones de
sustrato mayores de 15 mM. La actividad del enzima
2,5-DKG reductasa B de tipo salvaje disminuye
después de la adición de solamente 2,5-DKG 5 mM
(Figura 8).
Se utilizó el método Ala-Scan
para localizar residuos en el extremo C-terminal de
la 2,5-DKG reductasa A (Cunningham y Wells,
Science 204: 1081 (1989), que se incorpora a la presente por
referencia). Se construyeron un total de 11 mutantes con el método
Ala-Scan: D278A, V277A, E276A, D275A, P274A, H273A,
S271A, V270A, R269A, S267A y D265A sobre la base de la predicción de
que la región cubierta por estos mutantes era parte del sitio
activo del enzima. Además, se generó el mutante siguiente no
derivado del empleo de la técnica Ala-Scan: el
mutante A272G de la 2,5-DKG reductasa A fue
producido sustituyendo la alanina en posición 272 por una glicina
en esa posición. Los mutantes de la 2,5-DKG
reductasa fueron construidos utilizando los oligonucleótidos
siguientes: A:D278A = 5'-GAT GAG GTC GCG TGA GGT ACC
C-3' (SEC ID Nº: 24); A:V277A =
5'-CCC GAT GAG GCG GAC TGA GGT A-3'
(SEC ID Nº: 25); A:E276A = 5'-CAC CCC GAT GCC GTC
GAC TGA G-3' (SEC ID Nº: 26); A:D275A =
5'-GCA CAC CCC GCG GAG GTC GAC T-3'
(SEC ID Nº: 27); A:P274A = 5'-G AGC GCA CAC GCG GAT
GAG GTC G-3' (SEC ID Nº: 28); A:H273A =
5'-C GTG AGC GCA GCG CCC GAT GAG
G-3' (SEC ID Nº: 29); A:A272G =
5'-CGC GTG AGC GGG CAC CCC GAT G-3'
(SEC ID Nº: 30); A:S271A = 5'-G GGT CGC GTG GCG GCA
CAC CCC G-3' (SEC ID Nº: 31); A:V270A =
5'-TCG GGT CGC GCG AGC GCA CAC C-3'
(SEC ID Nº: 32); A:R269A = 5'-C GGT TCG GGT GCG GTG
AGC GCA C-3' (SEC ID Nº: 34); A:S267A =
5'-G GGC GAC GGT GCC GGT CGC GTG
A-3' (SEC ID Nº: 35); A:D265A =
5'-GAT CCG GGC GCG GGT TCG GGT C-3'
(SEC ID Nº: 36). Las etapas de las reacciones de mutagénesis, el
aislamiento y la caracterización de los mutantes fueron
esencialmente los mismos que los esquematizados para la
construcción del mutante Q192R.
Se llevó a cabo una caracterización cinética
bruta de los mutantes D278A, V277A, E276A, D275A, P274A, H273A,
A272G, S271A, V270A, R269A, S267A y D265A de la
2,5-DKG reductasa A. Uno de estos mutantes, A272G,
tuvo como resultado una actividad incrementada. El mutante A272G de
la 2,5-DKG reductasa A fue caracterizado
esencialmente de la misma manera que en el Ejemplo 5, excepto en
que con el fin de determinar los parámetros cinéticos de la
reducción dependiente de NADPH del 2,5-DKG por las
2,5-DKG reductasas, se llevaron a cabo una serie de
reacciones con una concentración saturante constante de NADPH (200
\muM) y concentraciones variables de sustrato desde 0 a 30 mM. El
mutante A272G de la 2,5-DKG reductasa A mostraba una
actividad significativa y reproducible sobre el enzima de tipo
salvaje A a todas las concentraciones de sustrato, solamente con
una ligera indicación de inhibición por el sustrato en el rango
examinado (ver la Figura 9). El mutante presentaba una Vmáx aparente
de 21,44 +/- 4,10 segundos^{-1} y una Km aparente de 42,61 +/-
12,13 mM.
Se construyeron tres mutantes dobles de la
2,5-DKG reductasa A: F22Y/Q192R, Q192R/A272G y
F22Y/A272G. Las construcciones fueron según sigue:
Para el mutante doble Q192R/A272G, el plásmido
ptrp1-35.A:Q192R fue digerido con EcoRI y
BamHI para generar un fragmento de 787 pb que contenía la
mutación Q192R. El plásmido ptrp1-35.A:A272G fue
digerido con BamHI y ClaI para generar un fragmento
de 708 pb que contenía la mutación A272G. Los dos mutantes fueron
combinados en una ligadura de tres vías con el vector
ptrp1-35.A digerido con EcoRI y ClaI
para generar el mutante doble
ptrp1-35.A:Q192R/A272G. Los mutantes fueron
verificados mediante digestiones de restricción para asegurar que
los dos fragmentos esperados estaban en su sitio. El mutante
Q192R/A272G resultante de la 2,5-DKG reductasa A
tiene una arginina en posición 192 y una glicina en posición
272.
Para el mutante doble F22Y/A272G de la
2,5-DKG reductasa, se preparó un fragmento que
contenía F22Y de \sim600 pares de bases mediante digestión con
EcoRI y ApaI del plásmido
ptrp1-35.A:F22Y. Se preparó un fragmento (\sim300
pb) que llevaba la mutación A272G mediante la digestión con
ApaI y KpnI del plásmido
ptrp1-35.A:A272G. El mutante fue combinado
posteriormente en una ligadura de tres vías con
ptrp1-35.A digerido con EcoRI-KpnI
para dar el plásmido ptrp1-35.A:F22Y/A272G. El
mutante F22Y/A272G resultante de la 2,5-DKG
reductasa A tiene una tirosina en posición 22 y una glicina en
posición 272.
El mutante F22Y/Q192R de la
2,5-DKG reductasa A fue preparado mediante una
estrategia similar, sin embargo el oligonucleótido que dirigió la
mutación Q192R eliminó el sitio de ApaI, de tal manera que la
construcción se produjo a través del sitio de XhoI del gen
de la 2,5-DKG reductasa A. El plásmido
ptrp1-35.A:F22Y fue digerido con EcoRI y
XhoI, dando un fragmento de 435 pb que contenía la mutación
F22Y. En una segunda digestión, ptrp1-35.A:Q192R
fue digerido con XhoI y KpnI para dar un fragmento de
400 pb que contenía la mutación Q192R. Estos dos fragmentos fueron
combinados en una ligadura de tres vías con
ptrp1-35.A digerido con EcoRI y KpnI
para dar el plásmido ptrp1-35.A:F22Y/Q192R. El
mutante F22Y/Q192R resultante de la 2,5-DKG
reductasa A tiene una tirosina en posición 22 y una arginina en
posición 192.
Los tres mutantes dobles fueron confirmados
mediante mapeo de restricción y secuenciación directa para asegurar
que las dos mutaciones correctas estaban en su lugar.
La caracterización cinética de los mutantes
dobles F22Y/Q192R, Q192R/A272G y F22Y/A272G de la
2,5-DKG reductasa A se llevó a cabo esencialmente
de la misma manera que en el Ejemplo 5, excepto en que para
determinar los parámetros cinéticos de la reducción dependiente de
NADPH del 2,5-DKG por las 2,5-DKG
reductasas, se llevó a cabo una serie de reacciones con una
concentración saturante constante de NADPH (200 \muM) y
concentraciones variables de sustrato desde 0 hasta 30 mM. La
cinética del sustrato de los mutantes dobles se muestra en la
Figura 10. Los mutantes dobles que contienen Q192R no conducen a una
actividad incrementada. La actividad catalítica del mutante
F22Y/Q192R de la 2,5-DKG reductasa A es similar a la
de los dos mutantes parentales. La actividad catalítica del mutante
Q192R/A272G de la 2,5-DKG reductasa A es menor que
la de la DKG reductasa A de tipo salvaje. El mutante doble
F22Y/A272G de la 2,5-DKG reductasa A tiene una clara
aditividad o incluso sinergia sobre sus dos enzimas parentales, y
supera la actividad de la DKG reductasa B a concentraciones de
sustrato mayores de 17,5 mM. Este mutante doble muestra también un
efecto de inhibición por el sustrato.
La afinidad por el cofactor de la DKG reductasa A
F22Y, Q192R, A272G y F22Y/A272G fue determinada mediante el
análisis de una serie de reacciones con una concentración constante
de sustrato y concentraciones variables de NADPH. Cada serie de
reacciones constaba de bis-Tris 50 mM pH 6,8,
2,5-DKG 10 mM, NADPH desde 2,5 hasta 200 \muM y
enzima en un volumen total de 1,0 ml. Los datos iniciales de la
velocidad de las reacciones fueron ajustados a la ecuación de
Michaelis-Menten mediante análisis de regresión no
lineal según se describió previamente para determinar
K_{M,NADPH}. Los resultados están mostrados en la Figura 11. Las
alteraciones de la constante de Michaelis para NADPH en los
mutantes no son significativas; los valores están todos dentro del
+/- 30% de la K_{M,NADPH} del enzima de tipo salvaje y varían
desde uno elevado de 8,19 \muM para la 2,5-DKG
reductasa A F22Y/A272G y uno bajo de 4,92 \muM para la
2,5-DKG reductasa A A272G.
La inestabilidad térmica puede ser una
característica crítica de un enzima que puede limitar su utilidad
en un proceso industrial. Los mutantes F22Y, Q192R, A272G y
F22Y/A272G de la 2,5-DKG reductasa A con actividad
catalítica incrementada fueron sometidos a análisis de dicroismo
circular con el fin de determinar qué efectos podrían haber tenido
las mutaciones sobre la estabilidad térmica. Muestras de proteína
de la 2,5-DKG reductasa A y B y de los mutantes
F22Y, Q192R, A272G y F22Y/A272G de la 2,5-DKG
reductasa A fueron concentradas en membranas Amicon
YM-10, desaladas en tampón fosfato 10 mM, pH 7,0,
utilizando una columna G25 preempaquetada (PD-10 de
Pharmacia) y ajustadas a 200 \mug/ml de concentración final para
el análisis de dicroismo circular. Las muestras fueron medidas en
un espectrofotómetro de dicroismo circular Aviv modelo 60DS, en una
cubeta de 1,0 mm. Las medidas fueron corregidas por el fondo del
tampón. Los datos primarios de elipticidad (grados) fueron
convertidos en valores de elipticidad molar (grados M^{-1}
cm^{-1}) mediante la relación:
elipticidad molar = (100)(elipticidad)/(C)(l) en
la cual C es la concentración molar de la muestra y l es la longitud
de la trayectoria en centímetros. Las proteínas muestran un mínimo
a \sim220 nm, lo cual es indicativo del contenido de hélices
alfa. La desnaturalización térmica fue determinada monitorizando la
pérdida de elipticidad a 220 nm como función de la temperatura. Las
Tms del punto medio de las curvas de desnaturalización térmica
están mostradas en la Figura 12.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: POWERS, DAVID B. ANDERSON, STEPHEN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MÉTODOS MEJORADOS PARA LA PRODUCCIÓN DE VITAMINA C
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 35
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: HOWREY & SIMON
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1299 PENNSYLVANIA AVENUE, N.W.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: WASHINGTON
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: DC
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 20004
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/585.595
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO: 16-ENERO-1996
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/584.019
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO: 11-ENERO-1996
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL REPRESENTANTE/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: AUERBACH, JEFFREY I.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 32680
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 6137-0014 CIP
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (202) 383-7451
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (202) 383-6610
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 278 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: 2,5-DKG REDUCTASA A
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLADO INDIVIDUAL: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 277 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: DKGR B
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 316 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ALDOSA REDUCTASA
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA: HOMO SAPIENS
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGAAGCTG GCTCTAGATC AGGTCGAC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCGTGGGGG CCCCTCGGTC AGGGC
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGGTCGACT GAGGTACCCG AACACCCG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGTATCTAG AATTCTATGC CGAA
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGACCGGCTG GGTCTAGACG TGATCGAC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCGAGAGCT GGGGGCCCCT CGCCCGGCGC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAGAGATGT AGGGTACCGA TGCCGCGCAC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTCCCAGTCA CGACGTTG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGAAGCTG GCTCTAGATC AGGTCGAC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCGTGGGGG CCCCTCGGTC AGGGC
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGGTCGACT GAGGTACCCG AACACCCG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCCCTCGGT CGCGGCAAGT ACG
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGGTACGGC GTCTACAAGG TGCCGCCGG
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGCGTCTAC AAGGTGC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGGCTCGGC ACGTTCAACC TGCGCGGCG
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGCACGTTC AACCTGC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGACACCGCG GCGAACTACG GAAACGAAG
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGGCGAAC TACGGAA
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGACACGGC GGTGGCGTAC GAGAACGAGA G
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCGGTGGCG TACGAGA
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATGAGGTCG CGTGAGGTAC CC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCGATGAGG CGGACTGAGG TA
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACCCCGATG CCGTCGACTG AG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCACACCCCG CGGAGGTCGA CT
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGCGCACAC GCGGATGAGG TCG
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTGAGCGCA GCGCCCGATG AGG
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGTGAGCG GGCACCCCGA TG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGTCGCGTG GCGGCACACC CCG
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGGGTCGCG CGAGCGCACA CC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGTTCGGGT GCGGTGAGCG CAC
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGCGACGGT GCCGGTCGCG TGA
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCCGGGCG CGGGTTCGGG TC
\hfill22
Claims (15)
1. Una forma mutante de la
2,5-DKG reductasa A que tiene mejorada la capacidad
para convertir 2,5-DKG en 2-KLG y
que tiene una sustitución de aminoácido en la posición 22, definida
como en la SEC ID Nº 1.
2. El mutante de acuerdo con la reivindicación 1,
que tiene una tirosina en dicha posición 22.
3. El mutante de acuerdo con la reivindicación 1,
que tiene una serina, treonina, histidina, glutamina, asparragina o
triptófano en dicha posición 22.
4. El mutante de acuerdo con la reivindicación 1
ó 2 que tiene una sustitución de aminoácido en la posición 272,
definido como en la SEC ID Nº 1.
5. El mutante de acuerdo con la reivindicación 4,
que tiene una glicina en dicha posición 272.
6. Una forma mutante de la
2,5-DKG reductasa A de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2, 4 y 5, que tiene disminuida la inhibición
por el sustrato.
7. Una forma mutante de la
2,5-DKG reductasa A de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2, 4 y 5, que tiene mejorada la estabilidad
térmica.
8. Una forma mutante de la
2,5-DKG reductasa A de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2, 4 y 5, que tiene incrementada la renovación
del sustrato por el enzima o una afinidad por el sustrato
incrementada.
9. Una construcción de ADN que comprende un gen
estructural que contiene al menos un codón mutado, codificando
dicho gen un mutante de acuerdo con cualquier reivindicación
precedente.
10. Una célula huésped transformada con un vector
de expresión que incluye una construcción de ADN de acuerdo con la
reivindicación 9.
11. La célula huésped de la reivindicación 10,
que es una bacteria.
12. La célula huésped de la reivindicación 11, en
la que la bacteria es del género Erwinia, Gluconobacter o
Acetobacter.
13. La célula huésped de la reivindicación 12, en
la que la bacteria es Acetobacter cerinus (IFO 3263).
14. La célula huésped de la reivindicación 10, en
la que el vector de expresión es un plásmido.
15. La célula huésped de la reivindicación 10, en
la que el vector de expresión es ptrp1-35.A como en
la Figura 3 que tiene las mutaciones F22Y/A272G o F22Y/Q192R.
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