DE2822568C2 - - Google Patents

Description

Die Anmeldung betrifft den im Anspruch 1 angegebenen DNS-Transfer-Vektor. Die Ansprüche 2 und 3 betreffen Ausgestaltungen dieses Vektors. Ansprüche 4 und 5 betreffen einen veränderten Mikroorganismus, enthaltend den Vektor gemäß den Ansprüchen 1 oder 2. Anspruch 6 betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines DNS-Transfer-Vektors mit einer menschliches Insulin codierenden Nucleotidsequenz. Die Ansprüche 7 bis 14 betriffen Ausgestaltungen dieses Verfahrens.

Die Konstruktion von biologisch funktionellen bakteriellen Plasmiden bzw. die Replikation und Expression eines Staphylococcus Plasmid-Gens in einem Escherichia coli-Stamm werden in Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol. 70, Nr. 11, November 1973, S. 3240-3244 sowie in Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol. 71, Nr. 4, April 1974, S. 1030-1034 beschrieben.

Folgende Symbole und Abkürzungen werden in vorliegender Beschreibung verwendet:

DNS
= Desoxyribonukleinsäure
RNS	= Ribonukleinsäure
cDNS	= komplementäres DNS (enzymatisch synthetisiert aus einer mRNS-Sequenz)
mRNS	= messenger-RNS
tRNS	= transfer-RNS
dATP	= Deoxyadenosintriphosphat
dGTP	= Deoxyguanosintriphosphat
dCTP	= Deoxycytidintriphosphat
A	= Adenin
T	= Thymin
G	= Guanin
C	= Cytosin
Tris	= 2-Amino-2-hydroxy-ethyl-1,3-propandiol
EDTA	= Ethylendiamin-tetraessigsäure
ATP	= Adenosintriphosphat
TTP	= Thymidintriphosphat

Die biologische Bedeutung der Basensequenz der DNS ist die eines Speichers der genetischen Information. Es ist bekannt, daß die Basensequenz der DNS als Code verwendet wird, der die Aminosäuresequenz sämtlicher von der Zelle erzeugter Proteine bestimmt. Außerdem dienen Teile der Sequenz regulatorischen Zwecken, zur Steuerung von Herstellungszeitpunkt und Menge jedes Proteins. Die Arbeitsweise dieser steuernden Elemente ist erst zum Teil erkannt. Schließlich dient die Basensequenz in jedem Strang als Matrize bei der Replikation der DNS, die die Zellteilung begleitet.

Die Art und Weise, in welcher die Information der Basensequenz der DNS auf die Aminosäuresequenz von Proteinen übertragen wird, ist ein fundamentaler Vorgang, der universell für alle lebenden Organismen ist.

Es konnte bewiesen werden, daß jede üblicherweise in Proteinen vorhandene Aminosäure durch die Sequenz eines oder mehrerer Trinucleotide oder Tripletts bestimmt wird. Jedem Protein entspricht somit ein Segment der DNS mit einer Triplett-Sequenz, die der Aminosäuresequenz des Proteins entspricht. Den genetischen Code veranschaulicht folgende Tabelle.

Genetischer Code

Phenylalanin (Phe)
TTK
Leucin (Leu)	XTY
Isoleucin (Ile)	ATM
Methionin (Met)	ATG
Valin (Val)	GTL
Serin (Ser)	ORS
Prolin (Pro)	CCL
Threonin (Thr)	ACL
Alanin (Ala)	GCL
Tyrosin (Tyr)	TAK
Terminationssignal	TAJ
Terminationssignal	TGA
Histidin (His)	CAK
Glutamin (Gln)	CAJ
Asparagin (Gln)	AAK
Lysin (Lys)	AAJ
Asparaginsäure (Asp)	GAK
Glutaminsäure (Glu)	GAJ
Cystein (Cys)	TGK
Tryptophan (Try)	TGG
Arginin (Arg)	WGZ
Glycin (Gly)	GGL

Schlüssel: Jedes Triplett aus drei Buchstaben stellt ein Trinucleotid der DNS dar, mit einem 5′-Ende links und einem 3′-Ende rechts. Die Buchstaben stehen für die Purin- oder Pyrimidinbasen, die die Nucleotidsequenz bilden:

A = Adenin
G = Guanin
C = Cytosin
T = Thymin
X = T oder C, falls Y = A oder G
X = C, falls Y = C oder T
Y = A, G, C oder T, falls X = C
Y = A oder G, falls X = T
W = C oder A, falls Z = A oder G
W = C, falls Z = C oder T
Z = A, G, C oder T, falls W = C
Z = A oder G, falls W = A
QR = TC, falls S = A, G, C oder T
QR = AG, falls S = T oder C
S = A, G, C oder T, falls QR = TC
S = T oder C, falls QR = AG
J = A oder G
K = T oder C
L = A, T, C oder G
M = A, C oder T

Im biologischen Vorgang der Übersetzung der Nucleotidsequenz in eine Aminosäuresequenz erfolgt als erste Stufe die sogenannte Transcription. In dieser Stufe wird ein Segment der DNS mit der für das herzustellende Protein zuständigen Sequenz auf eine RNS übertragen. Die RNS ist ein der DNS ähnliches Polynucleotid, in dem jedoch Ribose anstelle der Desoxyribose und Uracil anstelle von Thymin stehen. Die Basen der RNS sind zur gleichen Art von Basenpaarung befähigt wie die Basen der DNS. Die durch Transcription einer DNS-Nucleotidsequenz entstehende RNS ist daher zu dieser kopierten Sequenz komplementär. Diese RNS wird als messenger-RNS (mRNS) bezeichnet wegen ihrer Zwischenstellung zwischen dem genetischen Apparat und dem Apparat der Proteinsynthese der Zelle.

In der Zelle dient die mRNS als Matrize in einem komplexen Vorgang, an dem zahlreiche Enzyme und Organellen innerhalb der Zelle beteiligt sind und der zur Synthese spezifischer Aminosäuresequenzen führt. Dieser Vorgang wird als Translation bezeichnet.

Häufig gibt es weitere Stufen, die dazu dienen, aus der bei der Translation entstandenen Aminosäuresequenz ein funktionales Protein zu erzeugen. Ein Beispiel ist die Herstellung des Insulins.

Der direkte Vorläufer des Insulins ist ein Polypeptid, das Proinsulin, das die beiden Insulinketten A und B über ein weiteres Peptid C gebunden enthält, vergleiche Steiner, D. F. Cunningham, D., Spigelman, L. und Aten, B., Science 157, 697 (1967). Kürzlich wurde berichtet, daß das erste Translationsprodukt von Insulin-mRNS nicht Proinsulin selbst, sondern ein Pre-proinsulin ist, das mehr als 20 weitere Aminosäuren am Amino-Ende des Proinsulins enthält, vergleiche Cahn, S. J., Keim, P. und Steiner, D. F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 1964 (1976), und Lomedico, P. T. und Saunders, G. F., Nucl. Acids Res. 3, 381 (1976). Die Struktur des Pre-proinsulinmoleküls kann schematisch wie folgt wiedergegeben werden. NH₂-(Pre-peptid)- B-Kette-(C-Peptid)-A-Kette-COOH.

Zahlreiche Proteine von Bedeutung für Medizin oder Forschung werden in den Zellen höherer Organismen wie der Wirbeltiere gefunden oder hergestellt. Hierzu gehören zum Beispiel das Hormon Insulin, andere Peptidhormone wie das Wachstumshormon, an der Regulierung des Blutdrucks beteiligte Proteine und zahlreiche Enzyme mit Bedeutung für technische, medizinische oder Forschungszwecke. Häufig ist es schwierig, diese Proteine in brauchbaren Mengen durch Extraktion aus dem Organismus zu gewinnen, insbesondere bei Proteinen menschlichen Ursprungs. Es besteht daher ein Bedarf an Techniken, durch die derartige Proteine von Zellen außerhalb des Organismus in vernünftigen Mengen erzeugt werden. In manchen Fällen ist es möglich, geeignete Zellstämme durch die Techniken der Gewebekultur zu erhalten. Das Wachstum von Zellen in Gewebekulturen ist jedoch langsam, das Medium ist teuer, die Bedingungen müssen genau kontrolliert werden und die Ausbeuten sind niedrig. Häufig ist es auch schwierig, einen gezüchteten Zellstamm mit den gewünschten differenzierten Eigenschaften zu erhalten.

Im Gegensatz dazu können Mikroorganismen wie Bakterien relativ leicht in chemisch definierten Medien gezüchtet werden. Die Fermentationstechnologie ist bereits hochentwickelt und gut steuerbar. Das Wachstum der Organismen erfolgt rasch, und hohe Ausbeuten sind möglich. Außerdem wurden bestimmte Mikroorganismen bereits genetisch genau charakterisiert und gehören in der Tat zu den am besten charakterisierten und erkannten Organismen.

Es wäre daher sehr erwünscht, den Transfer eines Gen-Codes für ein Protein medizinischer Bedeutung aus einem Organismus, der normalerweise das Protein produziert, in einen geeigneten Mikroorganismus zu erzielen. Auf diese Weise könnte das Protein unter gesteuerten Wachstumsbedingungen vom Mikroorganismus hergestellt und in gewünschten Mengen erhalten werden. Es ist auch möglich, daß die Gesamtkosten der Herstellung des gewünschten Proteins durch ein derartiges Verfahren erheblich vermindert werden könnten. Die Fähigkeit zur Isolierung und zum Transfer der Gensequenz, die die Produktion eines speziellen Proteins bestimmt, in einen Mikroorganismus genau bekannter genetischer Struktur eröffnet außerdem der Forschung die wertvolle Möglichkeit zu untersuchen, wie die Synthese eines solchen Proteins gesteuert und wie das Protein nach der Synthese verarbeitet wird. Ferner können isolierte Gene verändert werden, so daß sie Proteinvarianten mit anderen therapeutischen oder funktionellen Eigenschaften codieren.

Die vorliegende Erfindung betrifft Maßnahmen, um die genannten Ziele zu erreichen. Ein Verfahren wird offenbart, das mehrere Stufen, einschließlich Enzym-katalysierter Reaktionen umfaßt. Nachstehend werden die bisherigen Kenntnisse über die Natur dieser Enzymreaktionen skizziert.

Reverse Transcriptase katalysiert die Synthese der einen RNS-Matrize komplementären DNS in Gegenwart der RNS-Matrize, eines Oligo-deoxynucleotid-Primers und der vier Deoxynucleosid-triphosphate dATP, dGTP, dCTP und TTP. Die Reaktion wird eingeleitet durch die nicht-covalente Bindung des Oligodeoxynucleotid-Primers an das 3′-Ende der mRNS, darauf folgt die stufenweise Addition der geeigneten Deoxynucleotide, entsprechend der Basenpaarungsregel, an das 3′-Ende der wachsenden Kette. Das als Produkt erhaltene Molekül kann als haarnadelförmig beschrieben werden, es enthält die Ausgangs-RNS und einen komplementären DNS-Einzelstrang. Die Reverse Transcriptase kann ferner eine ähnliche Reaktion katalysieren, bei der ein DNS-Einzelstrang als Matrize dient, in welchem Fall man als Produkt einen haarnadelförmigen DNS-Doppelstrang erhält mit einer Schleife DNS-Einzelstrang, durch die ein Paar Enden verbunden werden; vergleiche Aviv, H. und Lederer, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408 (1972) und Efstratiadis, A., Kafatos, F. C., Maxam, A. F. und Maniatis, T., Cell. 7, 279 (1976).

Restrictions-endonucleasen sind Enzyme, die zur Hydrolyse von Phosphodiesterbindungen in doppelsträngiger DNS befähigt sind, wobei die Sequenz des DNS-Strangs gespalten wird. Liegt die DNS in Form einer geschlossenen Schleife vor, so wird diese in lineare Form überführt. Das Hauptmerkmal eines Enzyms dieser Art besteht darin, daß die hydrolytische Wirkung nur dort eintritt, wo eine spezifische Nucleotidsequenz vorliegt. Diese Sequenz wird als Erkennungsstelle (Spaltstelle) der Restrictions-endonuclease bezeichnet. Restrictions-endonucleasen wurden aus verschiedenen Quellen isoliert und ihre Nucleotidsequenz und die Erkennungsstellen wurden ermittelt. Einige Restrictions-endonucleasen hydrolysieren die Phosphodiesterbindungen in beiden Strängen an der gleichen Stelle, so daß stumpfe Enden entstehen. Andere katalysieren die Hydrolyse von Bindungen, die um einige Nucleotide voneinander entfernt sind, wodurch einsträngige Bereiche an jedem Ende des gespaltenen Moleküls entstehen. Diese einsträngigen Enden sind selbst-komplementär, daher kohäsiv, und sie können verwendet werden, um die hydrolysierte DNS erneut zu binden. Da jede für eine Spaltung durch ein derartiges Enzym anfällige DNS die gleiche Erkennungsstelle enthalten muß, werden die gleichen kohäsiven Enden produziert, so daß es möglich wird, heterologe DNS-Sequenzen mit anderen, ähnlich erhaltenen Sequenzen zu verknüpfen; vergleiche Roberts, R. J., Crit. Rev. Biochem. 4, 123 (1976). Die Erkennungsstellen sind relativ rar, jedoch wurde die allgemeine Verwendbarkeit der Restrictions-endonucleasen stark erweitert durch die chemische Synthese doppelsträngiger Oligo-nucleotide mit den Sequenzen der Erkennungsstellen. Somit kann praktisch jedes DNS-Segment an ein anderes Segment gekoppelt werden, indem man einfach das entsprechende Restrictions-oligo-nucleotid an die Molekülenden anhängt und das Produkt der hydrolytischen Wirkung der entsprechenden Restrictions-endonuclease unterwirft, wobei man die erforderlichen kohäsiven Enden erhält; vergleiche Heynecker, H. L., Shine, J., Goodman, H. M., Boyer, H. W., Rosenberg, J., Dickerson, R. E., Narang, S. A., Itakura, K., Lin, S. und Riggs, A. D., Nature 263, 748 (1976), und Scheller, R. H., Dickerson, R. E., Boyer, H. W., Riggs, A. D. und Itakura, K., Science 196, 177 (1977).

Sl-Endonuclease ist ein Enzym, das zur Hydrolyse der Phosphodiesterbindungen einsträngiger DNS oder einsträngiger Zwischenstücke in sonst doppelsträngiger DNS befähigt ist; vergleiche Vogt, V. M., Eur. J. Biochem. 33, 192 (1973).

DNS-Ligase ist ein Enzym, das die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen zwei DNS-Segmenten mit einem 5′-Phosphat bzw. einem 3′-Hydroxyl bewirkt, die zum Beispiel von zwei DNS-Fragmenten gebildet werden, die durch kohäsive Enden zusammengehalten werden. Die normale Funktion des Enzyms besteht vermutlich darin, einsträngige Zwischenstücke in einem sonst doppelsträngigen DNS-Molekül zu verbinden. Unter geeigneten Bedingungen kann jedoch DNS-Ligase die Verbindung stumpfer Enden katalysieren, wo zwei Moleküle mit stumpfen Enden kovalent gebunden sind; vergleiche Sgaramella, V., Van de Sande, J. H., und Khorana, H. G., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 67, 1468 (1970).

Alkalische Phosphatase ist ein Enzym, das Phosphatesterbindungen, einschließlich der 5′-terminalen Phosphatgruppen in DNS hydrolysiert.

Eine weitere Stufe im zu beschreibenden Gesamtverfahren ist die Insertion eines spezifischen DNS-Fragments in einen DNS-Vektor, zum Beispiel ein Plasmid. Als Plasmid bezeichnet man jede autonom DNS-replizierende Einheit, die in einer Mikrobenzelle neben dem Genom der Wirtszelle vorliegen kann. Ein Plasmid ist mit den Chromosomen der Wirtszelle nicht genetisch verbunden. Plasmid-Desoxyribonukleinsäuren sind doppeltsträngige Ringmoleküle, im allgemeinen mit Molekulargewichten von der Größenordnung einiger Millionen, obgleich bei einigen das Molekulargewicht größer als 10⁸ ist. Sie stellen gewöhnlich nur einen kleinen prozentualen Anteil der gesamten DNS der Zelle dar. Die Plasmid-DNS läßt sich im allgemeinen von der DNS der Wirtszelle aufgrund des großen Größenunterschiedes abtrennen. Die Plasmide können unabhängig von der Geschwindigkeit der Teilung der Wirtszelle replizieren, und in einigen Fällen kann ihre Replikationsgeschwindigkeit durch Veränderung der Wachstumsbedingungen vom Experimentator beeinflußt werden. Obgleich das Plasmid als geschlossener Ring vorliegt, kann man auf künstlichem Weg ein DNS-Fragment in das Plasmid einführen, wobei ein rekombiniertes Plasmid mit vergrößerter Molekülgröße entsteht, ohne daß seine Fähigkeit zur Replikation oder Expression beliebiger Gene des Plasmids wesentlich beeinträchtigt würde. Das Plasmid dient daher als nützlicher Vektor zur Übertragung eines DNS-Segments in eine neue Wirtszelle. Zur Neukombination von DNS geeignete Plasmide enthalten typischerweise Gene, die aus Selektionsgründen brauchbar sein können, zum Beispiel Gene der Arzneimittelresistenz.

Zur Illustrierung der Ausführung der Erfindung werden die Isolierung und der Transfer von Ratteninsulin-Gen sowie menschliches Insulin-Gen im einzelnen beschrieben.

Insulin wurde 1922 zum ersten Mal isoliert. Bekanntlich wird dieses Hormon heute zur Behandlung von Diabetes verwendet. Zwar liefern die Schlachthäuser Bauchspeicheldrüsen von Rindern und Schweinen als Insulinquelle, doch entwickelt sich eine Verknappung des Hormons, da die Zahl der Diabetiker weltweit ansteigt. Außerdem entwickeln einige Diabetiker eine allergische Reaktion gegen Rinder- und Schweineinsulin. Die Möglichkeit, menschliches Insulin in den weltweiten Bedarf deckenden Mengen zu erzeugen, wäre daher äußerst erwünscht. Die Herstellung von menschlichem Insulin in Bakterien stellt eine Technik dar, mit der dieses angestrebte Ziel erreicht werden könnte. Ein Fortschritt in dieser Richtung wurde jedoch bisher dadurch vereitelt, daß keine Technik zur Einführung des Insulin-Gens in Bakterien vorlag. Die vorliegende Erfindung stellt eine derartige Technik bereit.

Die Möglichkeit zur Herstellung einer DNS mit einer spezifischen Sequenz, die den genetischen Code für ein spezifisches Protein abgibt, erlaubt die Modifizierung der Nucleotidsequenz durch chemische oder biologische Mittel derart, daß auch das schließlich erzeugte Protein modifiziert wird. Auf diese Weise könnte man zum Beispiel ein modifiziertes Insulin herstellen, das auf spezielle medizinische Bedürfnisse ausgerichtet ist. Die genetische Fähigkeit zur Herstellung einer insulinähnlichen Aminosäuresequenz mit den wesentlichen funktionellen Eigenschaften des Insulins kann daher auf einen Mikroorganismus übertragen werden.

Die Befähigung zum Transfer des genetischen Codes für ein bestimmtes Protein, das im normalen Stoffwechsel eines höheren Organismus benötigt wird, in einen Mikroorganismus wie zum Beispiel ein Bakterium, eröffnet neue Möglichkeiten zur Herstellung derartiger Proteine. Damit entsteht auch die Möglichkeit zur Vermehrung oder dem Ersatz solcher Proteine durch Proteine, welche von erfindungsgemäß veränderten Mikroorganismen erzeugt wurden dort, wo die Fähigkeit des höheren Organismus zur normalen Produktion dieser Proteine geschädigt wurde.

Die Erfindung wird dargestellt am Beispiel spezifischer DNS-Sequenzen, die in ein Escherichia coli-Bakterium transferiert werden, nämlich des Strukturgens für Ratten Pre-proinsulin, und des Gens für menschliches Insulin.

Im vorliegenden Verfahren wird eine ausgewählte Zellpopulation zunächst nach einer neuen Methode isoliert. Aus den Zellen wird intakte mRNS nach einem Verfahren extrahiert, bei dem praktisch sämtliche RNase-Aktivität unterdrückt wird. Die intakte messenger-RNS aus dem Extrakt wird durch Säulenchromatographie gereinigt und dann der Einwirkung von reverser Transcriptase unterworfen, wobei diese Einwirkung in Gegenwart der zur Synthese eines komplementären (cDNS)-Stranges erforderlichen vier Deoxynucleosid-triphosphate erfolgt. Das Produkt dieser ersten Reaktion mit reverser Transcriptase wird in einem Verfahren weiterbehandelt, das die Ribonucleotidsequenz selektiv entfernt. Die zurückbleibende Deoxynucleotidsequenz, die zur Ausgangs-mRNS komplementär ist, wird in einer zweiten Reaktion mit reverser Transcriptase oder DNS-Polymerase in Gegenwart der vier Deoxynucleosid-triphosphate inkubiert. Das resultierende Produkt ist eine doppelte cDNS-Struktur, deren komplementäre Stränge an einem Ende durch eine einsträngige Schleife miteinander verbunden sind. Dieses Produkt wird dann mit für den Einzelstrang spezifischer Nuclease behandelt, die die einsträngige Schleife abspaltet. Die resultierende doppelsträngige cDNS wird sodann verlängert, indem man an beiden Enden eine spezifische DNS addiert, die die Sequenz einer Erkennungs- bzw. Spaltstelle eines Restriktionsenzyms aufweist. Die Addition wird durch eine DNS-Ligase katalysiert. Die verlängerte cDNS wird dann mit einer Restriktions-endonuclease behandelt, wobei an den 5′-Enden jedes Stranges der Doppelhelix selbst-komplementäre einsträngige Enden entstehen.

Eine Plasmid-DNS mit einer Erkennungsstelle für die gleiche Restriktions-endonuclease wird mit diesem Enzym behandelt, um den Polynucleotidstrang zu spalten und selbst-komplementäre einsträngige Nucleotidsequenzen an den 5′-Enden zu erzeugen. Die 5′-terminalen Phosphatgruppen an den einsträngigen Enden werden entfernt, um zu verhindern, daß das Plasmid eine zur Transformierung einer Wirtszelle fähige Ringstruktur bildet. Die wie vorstehend beschrieben vorbereitete cDNS und die Plasmid-DNS werden dann in Gegenwart von DNS-Ligase zusammen inkubiert. Unter den beschriebenen Reaktionsbedingungen kann die Bildung eines lebensfähigen, geschlossenen Rings aus Plasmid-DNS nur erfolgen, falls ein Segment der cDNS eingefügt wird. Das die cDNS-Sequenz enthaltende Plasmid wird dann in eine geeignete Wirtszelle verbracht. Zellen, die ein lebensgefährliches Plasmid aufgenommen haben, erkennt man am Auftreten von Kolonien mit einem vom Plasmid beigesteuerten Merkmal wie zum Beispiel Arzneimittel-Resistenz. Reine Bakterienstämme, die das rekombinierte Plasmid mit der eingebauten cDNS-Sequenz enthalten, werden dann gezüchtet und das neukombinierte Plasmid wird anschließend reisoliert. Auf diese Weise können große Mengen an rekombinierter Plasmid-DNS hergestellt werden, woraus man die spezifische cDNS-Sequenz durch endonucleolytische Spaltung mit dem entsprechenden Restriktionsenzym wieder isolieren kann.

Die vorliegende Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Isolierung eines DNS-Moleküls mit spezifischer Nucleotidsequenz und deren Transfer in einen Mikroorganismus, wobei man die ursprüngliche Nucleotidsequenz der DNS nach der Vermehrung im Mikroorganismus wiederfindet.

Die das erfindungsgemäße Verfahren ausmachenden Stufen können in vier allgemeine Kategorien unterteilt werden:

1. Die Isolierung einer gewünschten Zellpopulation aus einem höheren Organismus

Es gibt zwei Quellen für die genetische Sequenz, die ein spezielles Protein codiert: die DNS des zugrunde liegenden Organismus selbst, und eine RNS-Übersetzung der DNS. Nach den heutigen Sicherheitsbestimmungen der National Institutes of Health wird für die USA vorgeschrieben, daß menschliche Gene jeder Art nur dann in neukombinierte DNS und anschließend in Bakterien eingebracht werden können, nachdem sie sehr sorgfältig gereinigt wurden, oder wenn man in besonders ausgestatteten (P4) Einrichtungen arbeitet, vergleiche US-Federal Register, Bd. 41, Nr. 131, 7. 7. 1967, S. 27 902-27 943. Jedes Verfahren mit tatsächlicher Brauchbarkeit zur Herstellung von menschlichem Protein, wie zum Beispiel das vorliegende Verfahren, arbeitet daher vorzugsweise mit der Isolierung der spezifischen mRNS, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die das gewünschte Protein codiert. Auf diese Weise genießt man den weiteren Vorteil, daß die mRNS leichter als aus Zellen extrahierte DNS gereinigt werden kann. Insbesondere kann man auch Vorteil ziehen aus der Tatsache, daß in hochdifferenzierten Organismen wie den Wirbeltieren, die Identifizierung einer spezifischen Zellpopulation von spezifischer Lokalisierung im Organismus möglich ist, deren Funktion hauptsächlich in der Produktion des betreffenden Proteins besteht. Eine solche Population kann auch während einer vorübergehenden Entwicklungsstufe des Organismus vorliegen. In derartigen Zellpopulationen besitzt ein großer Anteil der aus den Zellen isolierten mRNS die gewünschte Nucleotidsequenz. Die Wahl der zu isolierenden Zellpopulation und das bei der Isolierung angewandte Verfahren können im Hinblick auf die Ausgangsreinheit der mRNS von wesentlicher Bedeutung sein.

In den meisten Geweben, Drüsen und Organen werden die Zellen von einem im allgemeinen faserigen Netzwerk aus Bindegewebe zusammengehalten, das hauptsächlich aus Kollagen besteht, das jedoch je nachdem auch andere Strukturproteine, Polysaccharide und mineralische Ablagerungen enthalten kann. Die Isolierung von Zellen eines bestimmten Gewebes erfordert zwangsläufig Verfahren zur Freisetzung der Zellen aus der Bindegewebs-Matrix. Die Isolierung und Reinigung eines speziellen differenzierten Zelltyps umfaßt daher zwei Hauptstufen: die Absonderung der Zellen vom Bindegewebe, und die Abtrennung der gewünschten Zellen von allen anderen im Gewebe vorliegenden Zellarten. Die erfindungsgemäß vorgesehenen Arbeitsweisen sind auf die Isolierung zahlreicher Zelltypen aus verschiedenen Geweben anwendbar. So wird zum Beispiel die Isolierung von Langerhans'schen Inseln aus Bauchspeicheldrüsen, die zur Isolierung von Insulin codierender mRNS geeignet sind, beschrieben.

Insulin produzierende Zellen können auch aus anderen Quellen stammen, zum Beispiel aus der Bauchspeicheldrüse von Kälberföten und aus gezüchteten Insel-Tumorzellen. Die Isolierung reiner Inselzellen ist in diesen Fällen wesentlich einfacher, insbesondere bei Verwendung reiner Zellkulturen. In diesen Fällen ist das vorstehend beschriebene Verfahren zur Isolierung der Inselzellen nicht erforderlich, doch bleibt das genannte Verfahren wegen seiner allgemeinen Anwendbarkeit von Vorteil.

Häufig kann der Anteil an gewünschter mRNS erhöht werden, wenn man die Zellreaktionen auf Stimuli aus der Umgebung richtig einsetzt. So kann zum Beispiel die Behandlung mit einem Hormon zu gesteigerter Produktion der gewünschten mRNS führen. Weitere Verfahren sind das Züchten bei einer bestimmten Temperatur oder in Gegenwart eines spezifischen Nährmediums oder einer sonstigen chemischen Substanz.

2. Extraktion der mRNS

Ein wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die praktisch vollständige Entfernung der RNase-Aktivität im Zellextrakt. Die zu extrahierende mRNS ist ein einsträngiges Polynucleotid, ungepaart mit einem komplementären Strang. Die hydrolytische Aufspaltung einer einzigen Phosphodiesterbindung in der Sequenz würde daher das gesamte Molekül für den Zweck der Transferierung einer intakten genetischen Sequenz in einen Mikroorganismus unbrauchbar machen. Wie bereits erwähnt, ist das Enzym RNase weit verbreitet, aktiv und außerordentlich stabil. Es findet sich auf der Haut, übersteht die üblichen Spülverfahren für Glasapparaturen und verunreinigt gelegentlich Lagerbestände organischer Chemikalien. Die Schwierigkeiten sind besonders akut beim Arbeiten mit Extrakten von Pankreaszellen, da die Schilddrüse eine Quelle für Verdauungsenzyme darstellt und daher an RNase reich ist. Das Problem der Verunreinigung durch RNase stellt sich jedoch bei sämtlichen Geweben, und das vorliegend offenbarte Verfahren zur Entfernung der RNase-Aktivität ist auf sämtliche Gewebe anwendbar. Die überraschende Wirksamkeit der Methode wird am Beispiel der erfolgreichen Isolierung intakter mRNS aus isolierten Inselzellen der Bauchspeicheldrüse beschrieben.

Beim Aufreißen der Zellen und bei sämtlichen Vorgängen, die zur Isolierung der von Protein praktisch freien RNS angewandt werden, setzt man erfindungsgemäß eine Kombination aus einem chaotropen Anion, einem chaotropen Kation und einem Disulfidbindungen spaltenden Mittel ein. Die gemeinsame Wirkung dieser Mittel wird am Beispiel ihrer Verwendung bei der Isolierung von praktisch unverletzter mRNS aus isolierten Langerhans'schen Inseln aus Ratten-Pankreas beschrieben.

Die Wahl der geeigneten chaotropen Ionen basiert auf deren Löslichkeit in wäßrigen Medien und ihrer Verfügbarkeit. Geeignete chaotrope Kationen sind zum Beispiel das Guanidinium-, Carbamoylguanidinium-, Guanylguanidinium-, Lithiumion und dergleichen. Geeignete chaotrope Anionen sind zum Beispiel das Jodid, Perchlorat, Thiocyanat-, Diiodsalicylation und dergleichen. Die Wirksamkeit von Salzen, die durch Kombination derartiger Kationen und Anionen gebildet sind, hängt zum Teil von deren Löslichkeit ab. So ist zum Beispiel Lithium-diiodsalicylat ein stärkeres Denaturierungsmittel als Guanidiniumthiocyanat, jedoch besitzt es eine Löslichkeit von nur etwa 0,1 M, außerdem ist es relativ teuer. Die bevorzugte Kombination aus Kation und Anion liegt im Guanidiniumthiocyanat vor, da dieses Salz leicht zugänglich und in wäßrigen Medien gut löslich ist, bis zu etwa 5-molaren Lösungen.

Thiolverbindungen wie das β-Merkaptoethanol spalten bekanntlich intramolekulare Disulfidbindungen in Proteinen mittels einer Thiol-Disulfid-Austauschreaktion. Zahlreiche Thiolverbindungen sind in dieser Richtung wirksam, zum Beispiel β-Merkaptoethanol, Dithiothreit, Cystein, Propanoldimerkaptan und dergleichen. Eine wesentliche Eigenschaft ist die Löslichkeit in Wasser, da die Thiolverbindung in großem Überschuß über die intramolekularen Disulfide vorliegen muß, um die Austauschreaktion zu Ende zu führen. β-Merkaptoethanol wird wegen seiner Verfügbarkeit und seines günstigen Preises bevorzugt.

Bei der Inhibierung der RNase während der RNS-Extraktion aus Zellen oder Geweben ist die Wirkung eines chaotropen Salzes direkt von seiner Konzentration abhängig. Die bevorzugte Konzentration ist daher die höchstmögliche Konzentration. Der Erfolg des erfindungsgemäßen Verfahrens hinsichtlich der Konservierung intakter mRNS während der Extraktion beruht vermutlich auf der raschen Denaturierung der RNase und dem Ausmaß der Denaturierung. Dies erklärt möglicherweise die Überlegenheit des Guanidiniumthioncyanats gegenüber dem Hydrochlorid, trotz der Tatsache, daß das Hydrochlorid als Denaturierungsmittel nur wenig schwächer ist. Die Wirksamkeit eines Denaturierungsmittels wird definiert als die Schwellenkonzentration, die zur vollständigen Denaturierung eines Proteins benötigt wird. Andererseits hängt die Geschwindigkeit der Denaturierung zahlreicher Proteine ab von der Konzentration des Denaturierungsmittels in bezug auf die Schwellenkonzentration, erhöht von der fünften zur zehnten Potenz; vergleiche Tanford, C. A., Adv. Prot. Chem. 23, 121 (1968). Diese Beziehung ergibt qualtitativ, daß ein nur schwach stärkeres Denaturierungsmittel als Guanidiniumhydrochlorid ein Protein bei gleicher Konzentration um ein Vielfaches schneller denaturieren kann. Die kinetischen Beziehungen zwischen RNase-Denaturierung und mRNS-Konservierung während deren Extraktion aus den Zellen war zum Zeitpunkt der Erfindung offenbar noch nicht erkannt. Die obigen Erwägungen führen dahin, daß das bevorzugte Denaturierungsmittel ein solches wäre, das eine niedrige Schwellenkonzentration in Kombination mit hoher Wasserlöslichkeit besitzt. Aus diesem Grund wird Guanidiniumthiocyanat gegenüber Lithiumdiiodsalylat bevorzugt, obgleich letztere Verbindung ein stärkeres Denaturierungsmittel ist, da die Löslichkeit des Guanidiniumthiocyanats wesentlich höher ist und man es daher in einer Konzentration anwenden kann, die eine raschere RNase-Inaktivierung erlaubt. Obige Erwägungen erklären auch die Bevorzugung von Guanidiniumthiocyanat vor dem vergleichsweise löslichen Hydrochlorid, da ersteres ein etwas stärkeres Denaturierungsmittel ist.

Die Verwendung eines Disulfidbindungen spaltenden Mittels in Kombination mit einem Denaturierungsmittel verstärkt und erhöht die Wirkung des letzteren, indem auf diese Weise das RNase-Molekül vollständig entfaltet wird. Die Thiolverbindung beschleunigt den Fortgang des Denaturierungsprozesses, indem sie eine schnelle Renaturierung verhindert, die eintreten kann, falls die intramolekularen Disulfidbindungen intakt bleiben. Ferner wird jede, im mRNS-Präparat zurückbleibende und dieses verunreinigende RNase praktisch inaktiv, auch in Abwesenheit von Denaturierungsmittel und Thiol. Disulfidbindungen spaltende Mittel mit Thiolgruppen sind bei jeder Konzentration in gewissem Ausmaß wirksam, doch wird im allgemeinen ein großer Überschuß an Thiolgruppen gegenüber den intramolekularen Disulfidbindungen bevorzugt, damit die Gleichgewichtsreaktion in Richtung der Disulfidspaltung abläuft. Andererseits sind zahlreiche Thiolverbindungen übelriechend und unangenehm bei hohen Konzentrationen zu verarbeiten, so daß für die Praxis eine obere Konzentrationsgrenze entsteht. Beim β-Merkaptoethanol erwiesen sich Konzentrationen im Bereich von 0,05 M bis 1,0 M als wirksam, und Konzentrationen von 0,2 M werden bei der Isolierung von nicht abgebauter RNS aus Rattenpankreas als optimal betrachtet.

Der pH-Wert des Mediums während der mRNS-Extraktion aus den Zellen kann im Bereich von pH 5,0 bis 8,0 liegen.

Nach dem Aufbrechen der Zellen wird die RNS aus der Masse aus Zellprotein und DNS abgesondert. Zu diesem Zweck sind mehrere Verfahren bekannt, die sämtlich geeignet sind. Eine übliche Praxis ist ein Ausfällverfahren mit Ethanol, bei dem die RNS selektiv ausfällt. Bevorzugt wird erfindungsgemäß die Ausfällstufe umgangen und das Homogenisat direkt auf eine 5,7-molare Cäsiumchloridlösung, die sich in einem Zentrifugenröhrchen befindet, aufgeschichtet, worauf Zentrifugierung erfolgt; vergleiche die Beschreibung von Glisin, V., Crkvenjakov, R., und Byus, C., Biochemistry 13, 2633 (1974). Diese Methode wird bevorzugt, da sie stetig eine für RNase ungünstige Umgebung aufrechterhält, so daß man die RNS in hoher Ausbeute und frei von DNS und Protein gewinnt.

Die obigen Verfahren führen zur Reinigung der gesamten RNS aus dem Zellhomogenisat. Nur ein Teil dieser RNS ist jedoch die erwünschte mRNS. Um diese mRNS weiter zu reinigen, benutzt man die Tatsache, daß in den Zellen höherer Organismen mRNS nach der Transcription in der Zelle weiterverarbeitet wird unter Bindung mit Polyadenylsäure. Derartige mRNS mit daran gebundenen Poly-A-Sequenzen kann selektiv isoliert werden durch Chromatographieren an Säulen mit Cellulose, an die Oligo-thymidylat gebunden ist, siehe Aviv, H. und Leder, P., loc. cit. Die vorstehenden Verfahren liefern im wesentlichen reine, intakte mRNS aus Ausgangsmaterialien, die an RNase reich sind. Die Reinigung der mRNS und die folgenden in vitro durchgeführten Stufen können mit jeder mRNS, unabhängig ihres Herkunftsorganismus, in praktisch gleicher Weise ausgeführt werden.

Unter bestimmten Bedingungen, zum Beispiel bei der Verwendung von Zellen aus Gewebekulturen als Quelle der mRNS, kann die Verunreinigung mit RNase so niedrig sein, daß obige Stufe der RNase-Inhibierung nicht erforderlich ist. In diesen Fällen können die Methoden des Standes der Technik zur Verminderung der RNase-Aktivität ausreichen.

3. Bildung der cDNS

Fig. 1 ist eine schematische Wiedergabe der restlichen Stufen des Verfahrens. Die erste Stufe besteht in der Bildung einer DNS-Sequenz, die zur gereinigten mRNS komplementär ist. Als Enzym wählt man für diese Reaktion reverse Transcriptase, obgleich im Prinzip jedes Enzym verwendet werden könnte, das zur Bildung eines komplementären DNS-Strangs aufgrund der als Matrize verwendeten mRNS fähig ist. Die Reaktion kann unter den bekannten Bedingungen ausgeführt werden, wobei man die mRNS als Matrize und ein Gemisch der vier Deoxynucleosidtriphosphate als Vorläufer des DNS-Strangs einsetzt. Zweckmäßig wird eines der Deoxynucleosid-triphosphate in α-Stellung mit 32 _P markiert, um den Reaktionsverlauf verfolgen und die Aufarbeitung und Abtrennung, zum Beispiel durch Chromatographieren und Elektrophorese, kontrollieren und quantitative Ausbeuteangaben machen zu können; vergleiche Efstratiadis, A. et al., loc. cit. Wie aus der Zeichnung ersichtlich, erhält man als Produkt der Reaktion mit der reversen Transcriptase eine doppelsträngige Haarnadelform mit nicht-covalenter Bindung zwischen dem RNS-Strang und dem DNS-Strang.

Das Produkt der Reaktion mit der reversen Transcriptase wird nach Standardverfahren aus dem Reaktionsgemisch gewonnen. Zweckmäßig verwendet man eine Kombination aus Phenolextraktion, Chromatographieren an "Sephadex G-LOO" und Ausfällung mit Ethanol.

Sobald die cDNS enzymatisch synthetisiert ist, kann die RNS-Matrize entfernt werden. Zahlreiche Verfahren zum selektiven Abbau von RNS in Gegenwart von DNS sind bekannt. Das bevorzugte Verfahren ist eine alkalische Hydrolyse, die hochselektiv ist und durch pH-Einstellung leicht gesteuert werden kann.

Nach der alkalischen Hydrolyse und anschließender Neutralisierung kann die lmit 32 _P markierte cDNS durch Ausfällung mit Ethanol konzentriert werden, falls dies erwünscht ist.

Die Synthese einer doppelsträngigen haarnadelförmigen cDNS erfolgt unter Verwendung des entsprechenden Enzyms, zum Beispiel mit DNS-Polymerase oder reverser Transcriptase. Die Reaktionsbedingungen sind ähnlich wie vorstehend beschrieben, einschließlich der Verwendung eines in α-Stellung mit 32 _P markierten Nucleosid-triphosphats. Die reverse Transcriptase ist aus verschiedenen Quellen erhältlich, zum Beispiel aus Vogel-Myeloblastosisvirus (das Virus ist erhältlich von der Life Sciences Incorporated, St. Petersburg, Florida, die es gemäß einem Vertrag mit den National Institutes of Health produziert).

Nach der Bildung der cDNS-Haarnadel kann es empfehlenswert sein, die DNS aus dem Reaktionsgemisch rein zu gewinnen. Auch hier kann man zweckmäßig Phenolextraktion, Chromatographieren an "Sephatex G-l00" und Ausfällung mit Ethanol zur Reinigung des DNS-Produkts und Befreiung von verunreinigendem Protein verwenden.

Die Haarnadelstruktur kann in eine übliche doppelsträngige DNS überführt werden, indem man die einsträngige Schleife, die die Enden komplementärer Stränge verbindet, entfernt. Zu diesem Zweck stehen verschiedene Enzyme zur Verfügung, die eine spezifische hydrolytische Spaltung einsträngiger DNS-Bereiche bewirken. Ein für diesen Zweck geeignetes Enzym ist die Sl-Nuclease aus Aspergillus oryzae. Die Behandlung der haarnadelförmigen DNS mit Sl-Nuclease führt in hohen Ausbeuten zu cDNS-Molekülen mit basengepaarten Enden. Extraktion, Chromatographieren und Ausfällung mit Ethanol erfolgen wie vorstehend beschrieben. Die Verwendung von reverser Transcriptase und Sl-Nuclease bei Synthesen doppelsträngiger cDNS-Übertragungen von mRNS wurde von Efstratiadis, et. al., loc. cit., beschrieben. Gegebenenfalls kann man den Anteil an cDNS-Molekülen mit stumpfen Enden erhöhen durch eine Behandlung mit E. coli-DNS-Polymerase I in Gegenwart der vier Deoxynucleosid-triphosphate. Die Kombination von Exonuclease- und Polymerase-Aktivität des Enzyms führt zur Entfernung sämtlicher hervorstehender 3′-Enden und zum Auffüllen sämtlicher hervorstehender 5′-Enden. Auf diese Weise wird die Teilnahme der Hauptmenge der cDNS-Moleküle an den folgenden Verknüpfungsreaktionen sichergestellt.

Die nächste Verfahrensstufe besteht in der Behandlung der Enden des cDNS-Produkts derart, daß geeignete Sequenzen an jedem Ende stehen, die eine Erkennungsstelle für eine Restriktions-endonuclease aufweisen. Die Wahl des an die Enden zu addierenden DNS-Fragments bestimmt sich durch Zweckmäßigkeitsgründe in der Handhabung. Die an die Enden zu addierende Sequenz wird entsprechend der gewählten Restriktions-endonuclease ausgewählt, und diese Wahl basiert wiederum auf der Wahl des DNS-Vektors, mit dem die cDNS zu rekombinieren ist. Das gewählte Plasmid sollte mindestens eine Stelle besitzen, die auf die Spaltung durch Restriktions-endonuclease anspricht. Das Plasmid pMB9 besitzt zum Beispiel eine Erkennungsstelle für das Enzym Hind III. Hind III wird aus Hemophilus influenza isoliert und nach dem Verfahren von Smith, H. O. und Wilcox, K. W., J. Mol. Biol. 51, 379 (1970) gereinigt. Das Enzym Hae III aus Hemophilus aegyptious wird nach dem Verfahren von Middleton, J. H., Edgell, M. H. und Hutchinson III, C. A., J. Virol. 10, 42 (1972) gereinigt. Ein Enzym aus Hemophilus suis, das als Hsu I bezeichnet wird, katalysiert die Hydrolyse an den gleichen Erkennungsstellen wie Hind III. Diese beiden Enzyme werden daher als funktional austauschbar betrachtet. Zweckmäßig verwendet man ein chemisch synthetisiertes doppelsträngiges Decanucleotid mit der Erkennungssequenz für Hind III zur Bindung an die Enden des cDNS-Doppelstrangs. Das doppelsträngige Decanucleotid besitzt die in Fig. 1 dargestellte Sequenz, vergleiche Heyneker, H. L., et al. und Scheller, R. H., et al., loc. cit. Verschiedene solcher synthetischen Sequenzen mit Erkennungsstellen stehen heute zur Verfügung, so daß man die Enden der doppelten DNS so präparieren kann, daß sie auf die Einwirkung einer der zahlreichen Restriktions-Endonucleasen ansprechen.

Die Bindung der Erkennungsstellensequenz an die Enden der cDNS kann auf bekanntem Weg erfolgen. Das Verfahren der Wahl ist eine Reaktion, die als "Verknüpfung stumpfer Enden" bezeichnet und von einer DNS-Ligase katalysiert wird, die nach der Methode von Panet, A., et al., Biochemistry 12, 5045 (1973) gereinigt worden war. Die Reaktion der Verknüpfung stumpfer Enden wurde von Sgaramella, V., et al., loc. cit. beschrieben. Das Produkt der Verknüpfung einer cDNS mit stumpfen Enden mit einem großen molaren Überschuß eines doppelsträngigen Decanucleotids mit einer Hind III-Endonuclease-Erkennungsstelle ist eine cDNS mit dieser Hind III-Erkennungssequenz an jedem Ende. Die Behandlung des Reaktionsprodukts mit Hind III-Endonuclease führt zur Spaltung an der Erkennungsstelle und Bildung einsträngiger selbst-komplementärer 5′-Enden, siehe Fig. 1.

4. Bildung eines rekombinierten DNS-Transfer-Vektors

Im Prinzip können eine Vielzahl Viren- und Plasmid-DNS zur Neukombination mit der auf vorstehend beschriebene Weise hergestellten cDNS verwendet werden. Die Grundvoraussetzungen bestehen bestehen darin, daß der DNS-Transfer-Vektor zum Eintritt in eine Wirtszelle befähigt sein muß, seine Replikation in der Wirtszelle erfolgt und daß er außerdem eine genetische Bestimmungsgröße besitzt, die es ermöglicht, diejenigen Wirtszellen, die den Vektor aufgenommen haben, auszusondern. Aus Gründen der öffentlichen Sicherheit sollte der Auswahlbereich eingeschränkt werden auf solche Transfer-Vektorarten, die für die jeweiligen Versuche geeignet erscheinen, entsprechend den vorstehend erwähnten Richtlinien der National Institutes of Health. Die Liste genehmigter DNS-Transfer-Vektoren wird ständig erweitert, da neue Vektoren entwickelt und vom entsprechenden Komitee der National Institutes of Health anerkannt wurden. Erfindungsgemäß ist selbstverständlich die Verwendung jeglicher Viren- und Plasmid-DNS vorgesehen, die die beschriebenen Fähigkeiten besitzen, einschließlich solcher, deren Genehmigung noch bevorsteht. Geeignete Transfer-Vektoren, deren Verwendung heute genehmigt ist, sind verschiedene Derivate von Bakteriophagen λ (vgl. zum Beispiel Blattner, F. R., Williams, B. G., Blechl, A. E., Denniston-Thompson, K., Faber, H. E., Furlong, L. A., Grundwald, D. J., Kiefer, D. O., Moore, D. D., Schumm, J. W., Sheldon, E. L. und Smithies, O., Science 196, 161 1977) ) und Derivate des Plasmids col El (vgl. zum Beispiel Rodriguez, R. L., Bolivar, S., Goodman, H. M., Boyer, H. W. und Betlach, M. N., ICN-UCLA Symposium on Molecular Mechanisms In The Control of Gene Expression, D. P. Nierlich, W. J., Rutter, C. F., Fox. Eds. (Accademic Press, NY, 1976) S. 471-477). Plasmide aus col El sind relativ klein, sie besitzen Molekulargewichte in der Größenordnung weniger Millionen und haben die Eigenschaft, daß die Anzahl der Kopien von Plasmid-DNS pro Wirtszelle von 20 bis 40 unter Normalbedingungen auf 1000 oder mehr erhöht werden kann, wenn man die Wirtszelle mit Chloramphenicol behandelt. Die Fähigkeit zur Erhöhung der Genmenge in der Wirtszelle erlaubt es unter bestimmten Umständen, unter der Kontrolle des Experimentators die Wirtszelle zu veranlassen, daß sie hauptsächlich Proteine erzeugt, die von den Genen auf dem Plasmid codiert werden. Derartige Derivate von col El sind daher bevorzugte Transfer-Vektoren gemäß der Erfindung. Zu den geeigneten Derivaten von col El gehören die Plasmide pMB-9, die das Gen für Tetracyclinresistenz tragen, und pBR-313, pBR-315, pBR-316, pBR-317 und pBR-322, die außer dem Tetracyclin-Resistenzgen ein Gen für Ampicillinresistenz besitzen. Die Anwesenheit von Arzneimittelresistenz-Genen stellt eine zweckmäßige Möglichkeit zur Auswahl der Zellen dar, die mit Erfolg vom Plasmid befallen wurden, da Kolonien dieser Zellen in Gegenwart der Wirkstoffe wachsen, während Zellen ohne das Plasmid nicht wachsen bzw. keine Kolonien bilden. In den Beispielen dieser Beschreibung wurde stets ein Plasmid aus col El verwendet, das zusätzlich zum Arzneimittelresistenz-Gen eine Hind III-Erkennungsstelle besaß.

Wie beim Plasmid, kann auch die Wahl des geeigneten Wirtes aus einem sehr breiten Spektrum erfolgen, wobei der Bereich aus Gründen der öffentlichen Sicherheit jedoch eng begrenzt wurde. Ein E. coli-Stamm mit der Bezeichnung X-1776 wurde entwickelt und von den National Institutes of Health für Verfahren der beschriebenen Art genehmigt, wobei P2-Einrichtungen vorgeschrieben sind; vergleiche Curtiss, III, R., Ann. Rev. Microbiol., 30, 507 (1976). E. coli RR-1 kann verwendet werden, wenn P3-Einrichtungen vorhanden sind. Wie im Fall der Plasmide, sieht die Erfindung selbstverständlich die Verwendung von Stämmen jeglicher Wirtszellen vor, die zur Beherbergung des gewählten Vektors dienen können, einschließlich Protisten und anderer Bakterien, zum Beispiel Hefen.

Rekombinierte Plasmide werden erhalten, indem man mit Restriktions-Endonuclease behandelte Plasmid-DNS mit cDNS vermischt, wobei beide analog behandelte Endgruppen enthalten. Um die Möglichkeit, daß cDNS-Segmente Kombinationen miteinander eingehen, minimal zu halten, wird die Plasmid-DNS in molarem Überschuß über die cDNS eingesetzt. Diese Arbeitsweise hat bisher dazu geführt, daß die Hauptmenge der Plasmide ohne ein inseriertes cDNS-Fragment zirkuliert. Die anschließend transformierten Zellen enthalten dann hauptsächlich Plasmid und keine mit cDNS neukombinierten Plasmide. Das Ergebnis ist ein sehr langwieriger und zeitraubender Selektionsvorgang. Gemäß dem Stand der Technik wurde dieses Problem gelöst, indem man versuchte, DNS-Vektoren herzustellen mit einer Erkennungsstelle für die Restriktions-Endonuclease in der Mitte eines geeigneten Markierungsgens derart, daß die Insertion der cDNS das Gen teilt, wodurch Verlust der vom Gen codierten Funktion eintritt.

Vorzugsweise wird eine Methode zur Herabsetzung der Kolonienzahl, die auf neukombinierte Plasmide zu untersuchen sind, angewandt. Hierbei behandelt man Plasmid-DNS, die mit der Restriktions-Endonuclease abgeschnitten wurde, mit alkalischer Phosphatase (handelsübliches Enzym). Durch die Behandlung mit alkalischer Phosphatase werden die 5′-terminalen Phosphatgruppen von den mit der Endonuclease erzeugten Enden des Plasmids entfernt, und die Selbstverknüpfung der Plasmid-DNS wird verhindert. Die Ringbildung und Transformation hängen somit von der Insertion eines DNS-Fragments ab, das 5′-phosphorylierte Enden aufweist. Dieses Verfahren setzt die relative Häufigkeit von Transformationen ohne Neukombination auf weniger als 1 bis 10⁺⁴ herab.

Das erfindungsgemäße Verfahren basiert auf der Tatsache, daß die durch DNS-Ligase katalysierte Reaktion stattfindet zwischen einer 5′-Phosphat-DNS-Endgruppe und einer 3′-Hydroxyl-DNS-Endgruppe. Wird die terminale 5′-Phosphatgruppe entfernt, so tritt keine Bindungsreaktion ein. Ist doppelsträngige DNS zu verbinden, so sind zwei Situationen möglich, wie in Tabelle 1 gezeigt:

Tabelle 1

In Tabelle 1 wird die doppelsträngige DNS schematisch durch zwei parallele Linien wiedergegeben, wobei die 5′- und 3′-Endgruppen je nachdem Hydroxyl- oder Phosphatgruppen aufweisen. Im Fall I liegen 5′-Phosphatgruppen an beiden reaktionsfähigen Endgruppen vor, mit dem Ergebnis, daß beide Stränge kovalent gebunden werden. Im Fall II besitzt nur einer der zu verbindenden Stränge eine terminale 5′-Phosphatgruppe mit dem Ergebnis, daß eine einsträngige kovalente Bindung erfolgt, während im anderen Strang eine Diskontinuität vorliegt. Der nicht-kovalent verbundene Strang bleibt mit dem Molekül aufgrund von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basenpaaren an den gegenüberliegenden Strängen in bekannter Weise verbunden. Im Fall II besitzt keines der Enden der Reaktionsteilnehmer eine 5′-Phosphatgruppe, so daß keine Bindungsreaktion eintreten kann.

Unerwünschte Bindungsreaktionen können daher verhindert werden, indem man entsprechende Enden der Reaktionsteilnehmer, deren Verbindung zu verhüten ist, behandelt unter Entfernung der 5′-Phosphatgruppen. Man kann jede Methode zur Entfernung von 5′-Phosphatgruppen anwenden, die die DNS nicht anderweitig beschädigt. Bevorzugt wird die durch das Enzym alkalische Phosphatase katalysierte Hydrolyse.

Das vorstehend beschriebene Verfahren ist auch dann brauchbar, wenn ein lineares DNS-Molekül in zwei Unterfragmente, typischerweise mit einer Restriktions-Endonuclease, zu spalten und dann in der originalen Sequenz zu rekonstruieren ist. Die Unterfragmente können gesondert gereinigt und die gewünschte Sequenz kann durch erneute Verbindung der Unterfragmente rekonstruiert werden. Das Enzym DNS-Ligase, das die End-an-Ende-Verknüpfung von DNS-Fragmenten katalysiert, kann zu diesem Zweck verwendet werden, vergleiche Sgaramella, V., Van de Sande, J. H. und Khorana, H. G., Proc. Natl., Sci USA 67, 1468 (1970). Sind die zu verbindenden Sequenzen nicht stumpf, so kann man die aus E. coli erhaltene Ligase verwenden, vergleiche Modrich, P. und Lehman, I. R., J. Biol. Chem. 245, 3626 (1970).

Die Rekonstituierung der Originalsequenz aus durch Restriktions-Endonuclease erhaltenen Unterfragmente wird stark verbessert, wenn man eine Methode anwendet, die die Rekonstitution in falscher Sequenz verhütet. Dies geschieht durch Behandlung des cDNS-Fragments homogener Länge der gewünschten Sequenz mit einem Mittel, das die 5′-terminalen Phosphatgruppen der cDNS entfernt vor der Spaltung der homogenen cDNS mit einer Restriktions-Endonuclease. Man verwendet wieder bevorzugt alkalische Phosphatase. Die 5′-terminalen Phosphatgruppen sind eine strukturelle Vorbedingung für die spätere verbindende Wirkung der DNS-Ligase, die zur Rekonstituierung der gespaltenen Unterfragmente verwendet wird. Enden ohne 5′-terminale Phosphatgruppe können daher nicht kovalent gebunden werden. Die DNS-Unterfragmente können nur an solchen Enden gebunden werden, die eine 5′-Phosphatgruppe besitzen.

Dieses Verfahren verhindert die wichtigste unerwünschte Bindungsreaktion, nämlich die Verbindung von zwei Fragmenten mit umgekehrter Sequenz, das heißt hinten-an-vorn, statt vorn-an-hinten. Andere mögliche Nebenreaktionen wie Dimerisierung und Cyclisierung werden nicht verhindert, da diese in einer Reaktion vom Typ II gemäß Tabelle 1 erfolgen. Diese Nebenreaktionen sind weniger nachteilig, da sie zu physikalisch abtrennbaren und identifizierbaren Produkten führen, was bei der Neukombination in falscher Richtung nicht der Fall ist.

Zur Illustrierung des vorstehend beschriebenen Verfahrens wurde Ratteninsulin und menschliches Insulin codierende cDNS isoliert und mit einem Plasmid rekombiniert. Die DNS-Moleküle wurden zur Transformation von E. coli X-1776 verwendet. Die Selektion der zu transformierenden Zellen erfolgte durch Wachstum auf einem tetracyclinhaltigen Medium. Eine aus transformierten Zellen gewonnene neukombinierte Plasmid-DNS enthielt ein inseriertes DNS-Fragment von etwa 410 Nucleotiden Länge. Weitere Neukombinationen, die auf gleiche Weise isoliert worden waren, wurden ebenfalls analysiert. Die inserierten Fragmente wurden mit Hind III- oder HSU I-Endonuclease aus dem Plasmid freigesetzt und die DNS-Sequenz wurde nach der Methode von Maxam, A. M. und Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 74, 560 (1977) ermittelt. Die Nucleotidsequenzen der inserierten DNS-Fragmente waren überlappt und enthielten die gesamte Codierungsreaktion für Ratten-Proinsulin I und 13 von 23 Aminosäuren der Prepeptid-Sequenz. Eine Zusammenstellung der Nucleotidsequenz dieser Region wird nachstehend dargestellt.

Das beschriebene Verfahren ist allgemein anwendbar auf die Isolierung und Reinigung eines Gens aus einem höheren Organismus, einschließlich menschlicher Gene, dessen Transfer in einen Mikroorganismus und Replikation im Mikroorganismus. Auch neue rekombinierte Plasmide, die das gesamte, oder einen Teil des isolierten Gens enthalten, werden beschrieben. Ferner werden bisher unbekannte neue Mikroorganismen beschrieben, die als Teil ihrer genetischen Ausstattung ein Gen eines höheren Organismus enthalten. Die folgenden Beispiele beschreiben im einzelnen das Verfahren in der Anwendung auf die Isolierung, Reinigung und den Transfer von Ratten-Insulin-Gen in E. coli. In den Beispielen werden ferner rekombinante Plasmide charakterisiert, die Teile von Ratten-Insulin-Gen und menschlichem Insulin-Gen enthalten, sowie die die genannten Gene enthaltenden neuen Mikroorganismen.

Beispiel 1

Zur Herstellung von gereinigten Ratten-Insulinzellen wird die Bauchspeicheldrüse einer anästhetisierten Ratte mit Hank'scher Salzlösung infundiert durch rückläufige Infusion in den Pankreasgang. Die Hank'sche Salzlösung ist eine bekannte und handelsübliche Standardlösung. Dann wird die Bauchspeicheldrüse entfernt, in Hank'scher Lösung von 0°C zerkleinert und mit Kollagenase und Trypsin-Inhibitor verdaut. Sämtliche Verfahren erfolgen bei 0 bis 4°C, falls nichts anderes angegeben. Die Bedingungen bei der Verdauung sind äußerst kritisch. Zwei zerkleinerte Bauchspeicheldrüsen in 8 ml Gesamtvolumen Hank'scher Lösung werden in ein 30 ml-Glasrohr gefüllt. Alle Glasteile waren mit Silikon behandelt worden. Das Inkubationsgemisch enthielt 12 mg Kollagenase, ein aus Clostridium histolyticum erhaltenes Enzym (hergestellt im wesentlichen nach dem Verfahren von Mandl, I., Mackeman, J. D. und Howes, E. L., J. Clin. Invest. 32, 1323 (1943) - Typ CLS IV) und 1 mg Sojabohnentrypsin-Inhibitor. Die Inkubation erfolgte bei 37°C während 25 Min. unter Schütteln mit 90 Bewegungen pro Minute. Ständige Beobachtung war erforderlich, um sicherzustellen, daß die Kollagenase-Verdauung in optimalem Ausmaß verlief. Bei zu kurzer Inkubation waren die Inselzellen unvollständig freigesetzt, bei zu langer Inkubation beginnt ihre Zersetzung. Nach der Inkubation wurde das Glasrohr 1 Min. bei 200 × G zentrifugiert. Die überstehende Fllüssigkeit wurde abdekantiert und der Kuchen wurde mit Hank'scher Lösung gewaschen, dieser Vorgang wurde fünfmal wiederholt. Nach dem letzten Zentrifugieren wurde der Kuchen in 15 ml des Handelsprodukts Ficoll mit der Dichte 1,085 suspendiert. Eine Schicht von 8 ml Ficoll der Dichte 1,080 wurde zugegeben und eine Schicht aus 5 ml Ficoll der Dichte 1,060, dann wurde das Glasrohr in einem schwingenden Becherrotor 5 Min. bei 500 × G und dann 5 Min. bei 2000 × G zentrifugiert. Die Acinar-Zellen blieben am Boden, die Inselzellen stiegen im Gradienten auf und bildeten eine Schicht zwischen den beiden Oberschichten. Die Inselzellschicht enthielt verunreinigende Ganglionzellen, Lymphknoten und Bindegewebe. Große Verunreinigungsfragmente wurden vom Schichtmaterial entfernt. Der Rest des Präparates wurde unter dem Mikroskop von Hand von sichtbaren Verunreinigungen mittels einer Mikropipette befreit. Das Zellpräparat wurde dann in Hank'scher Lösung verdünnt und zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert und der Zellkuchen wurde in flüssigem Stickstoff gefroren gelagert.

Die von 200 Ratten zusammengefaßten Inselzellen wurden in 4-molarer Guanidiniumthiocyanatlösung (Handelsbezeichnung Tridom), die 1-molar an b-Merkaptoethanol und auf pH 5,0 gepuffert war, bei 4°C homogenisiert. Das Homogenisat wurde über 1,2 ml 5,7-molare Cäsiumchloridlösung, die 100 mMol Ethylendiamintetraessigsäure enthielt, überschichtet und 18 Std. bei 37 Umdrehungen/Minute im Rotor SW 50,1 einer Ultrazentrifuge bei 15°C zentrifugiert. Dabei wandert die RNS zum Boden des Zentrifugierröhrchens.

Polyadenylierte RNS wurde durch Chromatographieren des RNS-Gesamtpräparates an Oligo(dT)-Zellulose nach dem Verfahren von Aviv, H., und Leder, P., loc. cit., isoliert.

Zur Transcription der gesamten polyadenylierten RNS aus den Langerhans'schen Inseln von Ratten in cDNS wurde reverse Transcriptase aus Vogel-Myeloblastosis-Virus verwendet. Die Reaktionen wurden in 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, mit 9 mM MgCl₂, 30 mM NaCl, 20 mM β-Mercaptoethanol, 1 mM von jeweils 3 nicht-radioaktiven Deoxyribonucleosid-triphosphaten, 250 µM des vierten, in α-Stellung mit 32 _P markiertem Deoxynucleosid-triphosphat, spezifische Aktivität 50-200 Curie/Mol, 20 µg/ml Oligo-dT_12-18, 100 µg/ml polyadenylierter RNS und 200 Einheiten/ml reverser Transcriptase ausgeführt. Das Gemisch wurde 15 Min. bei 45°C inkubiert. Nach Zusatz von EDTA-Na₂ bis 25 mM wurde die Lösung mit einem gleichen Volumen mit Wasser gesättigtem Phenol extrahiert, dann wurde die wäßrige Phase an einer mit Sephadex G-100 gefüllten Säule von 0,3 cm Durchmesser und 10 cm Höhe in 10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 100 mM NaCl, 2 mM EDTA chromatographiert. Die eluierte Nukleinsäure wurde nach Zusatz von Ammoniumacetat (pH 6,0 bis 0,25 M) mit Ethanol ausgefällt. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert, der Kuchen wurde in 50 µl frisch zubereiteter 0,1-molarer Natriumhydroxidlösung gelöst und 20 Min. bei 70°C inkubiert, um die RNS zu hydrolysieren. Das Gemisch wurde mit 1-molarer Natriumacetatlösung, pH 4,5, neutralisiert und das 32 _P -cDNS-Produkt wurde mit Ethanol ausgefällt und erneut in Wasser gelöst. Proben einsträngiger cDNS wurden auf nativem Polyacrylamid-Gel nach der Methode von Dingman, C. W., und Peacock, A. C., Biochemistry 7, 659 (1968) analysiert. Die Gele wurden getrocknet und die 32 _P -DNS wurde durch Autoradiographie unter Verwendung eines Kodak No-Screen NS-2T-Films ermittelt. Die cDNS war heterodispers, wie aus der Elektrophorese ersichtlich. Sie enthielt mindestens eine Haupt-cDNS von etwa 450 Nucleotiden (Vergleich mit bekannten Standards).

Beispiel 2

Die gemäß Beispiel 1 erhaltene einsträngige cDNS wurde mit reverser Transcriptase behandelt, um den komplementären Strang herzustellen. Das Reaktionsgemisch enthielt 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 9 mM MgCL₂, 10 mM Dithiothreit, 50 mM von jeweils drei nicht-markierten Deoxyribonucleosid-triphosphaten, 1 mM eines in α-Stellung mit 32 _P markierten Nucleosid-triphosphats mit der spezifischen Wirkung 1-10 Curie/Millimol, 50 µg/ml cDNS und 220 Einheiten/ml reverse Transcriptase. Das Reaktionsgemisch wurde 120 Min. bei 45°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusatz von EDTA-Na₂ bis 25 mM abgestoppt, dann wurde mit Phenol extrahiert, an Sephadex G-100 chromatographiert und mit Ethanol ausgefällt. Eine Probe des Reaktionsprodukts von 500 bis 1000 cpm wurde durch Gel-Elektrophorese, wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert. Es wurde eine heterodisperse Bande mit Zentrum um 450 Nucleotide Länge beobachtet, beim Vergleich mit Standardproben. Proben der DNS-Reaktionsprodukte der Beispiele 1 und 2 wurden gesondert mit überschüssiger Restriktions-Endonuclease Hae III behandelt und durch Gel-Elektrophorese analysiert. Beide Produkte wurden durch die Endonuclease gespalten, so daß zwei Banden der Radioaktivität bei der Gel-Elektrophorese beobachtet wurden. Die aus der Spaltung der doppelsträngigen cDNS resultierenden Banden repräsentieren Spaltungsprodukte von im wesentlichen gleicher Kettenlänge wie bei der Spaltung der einsträngigen cDNS.

Beispiel 3

Das doppelsträngige Reaktionsprodukt von Beispiel 2 wurde in einer Konzentration von 2-5 µg/ml mit 30 Einheiten Sl-Nuclease mit einer Aktivität von 1200 Einheiten/ml in 0,03 M Natriumacetat, pH 4,6, 0,3 M Natriumchlorid, 4,5 mM ZnCl₂ 30 Min. bei 22°C inkubiert und weitere 15 Min. bei 10°C. Mit dem Zusatz von Tris-base bis 0,1 M Endkonzentration, EDTA bis 25 mM und coli-tRNS (hergestellt nach der Methode von Ehrenstein, G., Methods in Enzymology, Herausg. S. P. Colowick und N. O. Kaplan, Bd. 12A, S. 588 (1967) ) bis 40 µg/ml wurde die Verdauung gestoppt. Nach der Extraktion des Reaktionsgemisches mit Phenol und Chromatographieren an Sephadex G-100 wurde die eluierte 32 _P -cDNS mit Ethanol ausgefällt. Diese Behandlung führte zu einer hohen Ausbeute an cDNS-Molekülen mit basengepaarten Enden, die zur Verknüpfung der stumpfen Enden an chemisch synthetisierte Decanucleotide erforderlich waren. Hind III-Decamere wurden nach dem Verfahren von Scheller, R. H., Dickerson, R. E., Boyer, H. W., Riggs, A. D. und Itakura, K., Science 196, 177 (1977) hergestellt. Die Verknüpfung der Hind III-Decamere mit der cDNS erfolgte durch Inkubieren bei 14°C in 66 mM Tris-HCl, pH 7,6, 6,6 mM MgCl₂, 1 mM ATP, 10 mM Dithiothreit, mit 3 mM Hind III-Decamere mit 10⁵ cpm/pMol und T4 DNS-Ligase, etwa 500 Einheiten/Milliliter, während 1 Stunde. Das Reaktionsgemisch wurde dann 5 Min. auf 65°C erwärmt, um die Ligase zu inaktivieren. Dann wurden KCl bis 50 mM Endkonzentration, β-Mercaptoethanol bis 1 mM Endkonzentration und EDTA bis 0,1 mM Endkonzentration vor der Verdauung mit 150 Einheiten/ml zugegeben, die während 2 Std. bei 37°C zugegeben wurde. Hind III- und Hae III-Endonuclease sind handelsübliche Präparate. Das Reaktionsprodukt wurde durch Gel-Elektrophorese, wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert. Dabei wurde ein Peak beobachtet, der einer Sequenz von etwa 450 Nucleotiden entsprach, außerdem wurden Fragmente der abgespaltenen Hind III-Decamere beobachtet.

Beispiel 4

Plasmid pMB-9-DNS (Herstellung: Rodrigues, R. L., Boliver, F., Goodman, H. M., Boyer, H. W. und Betlach, M., ICN-UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology, D. P. Wierlich, W. J. Rutter und C. F. Fox, Eds., (Academic Press, New York 1976) S. 471-477) wurde an der Hind III-Erkennungsstelle mit Hsu I-Endonuclease gespalten, dann mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das Enzym war im Reaktionsgemisch in einer Menge von 0,1 Einheit/Mikrogramm DNS vorhanden, das Reaktionsgemisch wurde in 25 mM Tris-HCl für pH 8 30 Min. bei 25°C inkubiert, dann erfolgte Phenol-Extraktion zur Entfernung der Phosphatase. Nach der Ausfällung mit Ethanol wurde die mit Phosphatase behandelte Plasmid-DNS zu cDNS zugegeben, die zu Hind III kohäsive Enden besaß, und zwar in einem Molverhältnis von 3 Mol Plasmid zu 1 Mol cDNS. Das Gemisch wurde in 66 mM Tris, pH 7,6, 6,6 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreit und 1 mM ATP 1 Std. bei 14°C in Gegenwart von 50 Einheiten/ml T4 DNS-Ligase inkubiert.

Dann wurde das Reaktionsgemisch direkt zu einer Suspension von E. coli X-1776-Zellen zugegeben, die wie folgt zur Transformation vorbereitet waren: die Zellen wurden bis zu einer Zelldichte von etwa 2 × 10⁸ Zellen/ml in 50 ml Medium gezüchtet, das 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Natriumchlorid, 2 mM NaOH, 100 µg/ml Diaminopimelinsäure und 40 µg/ml Thymin enthielt und 37°C zeigte. Die Zellen wurden durch fünfminütiges Zentrifugieren unter 5000 × G bei 5°C gesammelt, in 20 ml kalter 10-millimolarer Natriumchloridlösung suspendiert, erneut zentrifugiert und wieder in 20 ml Transformationspuffer suspendiert, der 75 mM CaCl₂, 140 mM NaCl und 10 mM Tris, pH 7,5, enthielt, und 5 Min. in Eis stehengelassen. Dann wurden die Zellen zentrifugiert und erneut in 0,5 ml Transformationspuffer suspendiert. Die Transformation erfolgte durch Vermischen von 100 µl der Zellsuspension mit 50 µl rekombinierter DNS (1 µg/ml). Das Gemisch wurde 15 Min. bei 0°C inkubiert, dann 4 Min. bei 25°C und 30 Min. bei 0°C behandelt. Sodann wurden die Zellen zum Wachstum unter ausgewählten Bedingungen auf Agar-Platten übertragen.

Das Aussuchen der rekombinierten Plasmide erfolgte mit 5 Mikrogramm/ml Tetracyclin bei Transformation mit dem Hind III-Produkt. Es wurde eine als pAU-1 bezeichnete Neukombination isoliert. Rohe Plasmid-Präparate mit 2 µg-5 µg DNS (isoliert aus pAU-1) wurden mit überschüssiger Hsu I-Endonuclease behandelt. Dann wurden 10 mM EDTA-Na₂ und 10% (Gewicht/Volumen) Rohrzucker zugesetzt und das Gemisch wurde an 8% Polyacrylamid-Gel zerlegt. Die DNS wurde in einer Stellung entsprechend etwa 410 Basenpaare Länge gefunden. In einem ähnlichen Versuch wurde als Transfer-Vektor das Plasmid pBR-322 verwendet. Sämtliche Bedingungen blieben wie beschrieben, lediglich die letzte Selektion der rekombinierten Klone erfolgte auf 20 µg/ml Ampicillin enthaltenden Platten.

Beispiel 5

Eine menschliches Insulin codierende Nucleotidsequenz wird nach der Vorschrift der Beispiele 1 bis 4 isoliert, gereinigt und in ein Plasmid inseriert, wobei man von menschlichem Pankreasgewebe ausgeht, das einer geeigneten Quelle entstammt, zum Beispiel einem gespendeten Pankreas oder einem frischem Leichnam oder einem menschlichen Insulinoma. Ein Mikroorganismus wird im wesentlichen nach der Vorschrift von Beispiel 4 erzeugt, mit einer die A- und B-Kette von menschlichem Insulin codierenden Nucleotidsequenz. Die bekannte Aminosäuresequenz der A-Kette lautet:

Die Aminosäuresequenz der Kette B lautet:

Die Aminosäuresequenzen werden ausgehend vom Ende mit freier Aminogruppe beziffert, vergleiche Smith, L. F., Diabetes 21, (Erg. 2), 458 (1972).

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird es erstmalig möglich, eine für ein spezifisches regulatorisches Protein eines höheren Organismus, wie zum Beispiel eines Wirbeltiers, codierende Nucleotidsequenz zu isolieren, ferner kann der Transfer der darin enthaltenen genetischen Informationen in einem Mikroorganismus durchgeführt werden, in welchem die unbegrenzte Replikation möglich ist. Das offenbarte Verfahren wird erfindungsgemäß auf die Isolierung und Reinigung des menschlichen Insulin-Gens und seinen Transfer in einen Mikroorganismus angewandt.

Offenbart werden einige neue rekombinierte Plasmide, die in ihrer Nucleotidsequenz eine Struktur aufweisen, die durch Transcription aus einem Gen eines höheren Organismus erhalten wurde. Offenbar werden neue Mikroorganismen, die abgewandelt sind, so daß sie eine Nucleotidsequenz enthalten, die durch Transcription aus einem Gen eines höheren Organismus entstanden ist. Die Beispiele illustrieren die Erfindung am Transfer von Ratten-Gen für Proinsolin I in einen Stamm von Escherichia coli.

Die Sequenz des Hauptstücks des transferierten Gens wurde in jedem Fall ermittelt, wobei festgestellt wurde, daß sie die gesamte Aminosäuresequenz von Ratten-Proinsulin I codiert.

Claims (15)

1. DNS-Transfer-Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er in seiner Nucleotidsequenz eine Untersequenz enthält, die

• a) die A-Kette des menschlichen Insulins codiert und besteht aus und ggf.
• b) die B-Kette von menschlichem Insulin codiert und besteht aus: worin
  A = Deoxyadenyl,
  G = Deoxyguanyl,
  C = Deoxycytosyl,
  T = Thymidyl,
  J = A oder G,
  K = T oder C,
  L = A, TC oder G,
  M = A, C oder T,
  X _n = T oder C, falls Y _n = A oder G und C, falls Y _n = C oder T,
  Y _n = A, G, C oder T, falls X _n = C und A oder G, falls X _n = T,
  W _n = C oder A, falls Z _n = G oder A, und C, falls Z _n = C oder T,
  Z _n = A, G, C oder T, falls W _n = C, und A oder G, falls W _n = A,
  QR _n = TC, falls S _n = A, G, C oder T, und AG, falls S _n = T oder C,
  S _n = A, G, C oder T, falls QR _n = TC, und T oder C, falls QR _n = AG

bedeuten,
und die tiefgestellten Ziffern n die Aminosäurestellung im menschlichen Insulin, dem die Nucleotidsequenz nach dem genetischen Code entspricht, bezeichnen, wobei die Aminosäurestellungen vom Amino-Ende beziffert werden.

2. DNS-Transfer-Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die für die A- und B-Ketten codierenden Untersequenzen durch eine Nucleotidsequenz (N _a N _b N _c ) _j innerhalb der Teilsequenz 5′---ACL₃₀ (N _a N _b N _c ) _j GCL₁---3′ verknüpft sind, wobei N _a , N _b und N _c A, T, G oder C bedeuten können und j eine beliebige Zahl von 0 bis 100 darstellt, vorausgesetzt, daß N _a N _b N _c weder TAJ noch TGA bedeutet.

3. DNS-Vektor nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß er aus Plasmid pMB-9 oder pBR-322 abgeleitet ist.

4. Veränderter Mikroorganismus, enthaltend den Vektor nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der DNS-Transfer-Vektor aus Plasmid pMB-9 oder pBR-322 abgeleitet und in Escherichia coli transferiert ist.

5. Veränderter Mikroorganismus nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Escherichia coli Escherichia coli X 1776 oder Escherichia coli RR-1 ist.

6. Verfahren zur Herstellung eines DNS-Transfer-Vektors mit einer menschliches Insulin codierenden Nucleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, daß man

• (a) aus einer Bauchspeicheldrüse eines Menschen Inselzellen isoliert, welche Insulin codierende mRNS enthalten,
• (b) aus den Inselzellen die mRNS in Gegenwart einer RNase-Inhibitior-Zusammensetzung, die ein chaotropes Kation, ein chaotropes Anion und ein Disulfidbindungen spaltendes Mittel enthält, extrahiert, so daß der RNase-Abbau der mRNS verhindert wird,
• (c) die von Protein, DNS und anderer RNS im wesentlichen freie mRNS isoliert,
• (d) eine doppelsträngige cDNS synthetisiert, deren einer Strang eine der mRNS komplementäre Nucleotidsequenz aufweist, wobei man eine cDNS mit Insulin codierender Nucleotidsequenz erhält,
• (e) einen DNS-Transfer-Vektor mit reaktionsfähigen Enden, die miteinander oder mit doppelsträngiger cDNS verbunden werden können, bereitstellt, und
• (f) den DNS-Transfer-Vektor und die doppelsträngigen cDNS mit der Insulin codierenden Nucleotidsequenz miteinander verbindet.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Inselzellen isoliert, indem man Inselzellen und andere Zellen enthaltendes Bauchspeicheldrüsengewebe mit einem hydrolytischen Enzym und einem Trypsin-Inhibitor behandelt zur Freisetzung der Inselzellen von den anderen Zellen, das so behandelte Gewebe fraktioniert, um von anderen Zellen und Zellrückständen im wesentlichen freie Inselzellen zu gewinnen, und die mRNS, die an Insulin codierender Nucleotidsequenz angereichert ist, aus den Zellen isoliert.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als hydrolytisches Enzym ein empirisch ausgewähltes Kollagenase-Präparat verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlung mit dem hydrolytischen Enzym in Silikon-beschichteter Glasapparatur ausführt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man einen bestimmten Teil der reaktionsfähigen Enden mit einem Reagens vorbehandelt, das zur Entfernung der 5′-terminalen Phosphatgruppen befähigt ist, und DNS-Moleküle mit vorbehandelten und unbehandelten reaktionsfähigen Enden zusammen mit einer DNS-Ligase inkubiert, die eine, eine Verbindung zwischen den reaktionsfähigen Enden herstellende Reaktion katalysiert unter Ausnahme der vorbehandelten reaktionsfähigen Enden, die in der Ligase-katalysierten Reaktion nicht miteinander verbunden werden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die zu verbindenden DNS-Moleküle aus einem Gemisch aus mit Restriktions-Endonuclease behandelter Plasmid-DNS und nicht-plasmider linearer DNS bestehen und der zur Vorbehandlung bestimmte Teil die Plasmid-DNS enthält, so daß die End-an-Ende-Verknüpfung der Plasmid-DNS ohne Rekombination mit der nicht-plasmiden DNS verhindert wird.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Vorbehandlung der reaktionsfähigen Enden alkalische Phosphatase verwendet.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als chaotropes Kation Guanidiniumion und als chaotropes Anion Thiocyanation verwendet.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man eine RNase-Inhibitor-Zusammensetzung verwendet, die 4 M Guanidiniumthiocyanat und 0,2 M β-Mercaptoethanol enthält.