DE602004009931T2

DE602004009931T2 - An der wachstumsfördernden funktion des essigsäurebakteriums beteiligtes gen und verwendungen davon

Info

Publication number: DE602004009931T2
Application number: DE602004009931T
Authority: DE
Inventors: Shigeru Chita-gun NAKANO
Original assignee: Mitsukan Group Corp Handa; Mizkan Group Corp
Current assignee: Mitsukan Group Corp Handa; Mizkan Group Corp
Priority date: 2003-06-26
Filing date: 2004-06-16
Publication date: 2008-08-28
Anticipated expiration: 2024-06-17
Also published as: JP4551870B2; EP1642977B1; EP1642977A4; CN1842595A; JPWO2005001095A1; US20060228445A1; EP1642977A1; DE602004009931D1; US7541491B2; WO2005001095A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft einen essigsäureresistenten Mikroorganismus und noch spezifischer ein Gen, das für ein Protein mit einer wachstumsfördernden Funktion kodiert, das von einem Mikroorganismus stammt, einen Mikroorganismus, bei dem die Anzahl der Kopien dieses Gens amplifiziert ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung von Essig unter Verwendung solcher Mikroorganismen.
Hintergrund nach dem Stand der Technik
Essigsäurebakterien sind Mikroorganismen, die auf breiter Ebene für die Herstellung von Essig verwendet werden. Insbesondere werden Essigsäurebakterien, die zum Genus Acetobacter gehören, und dieselben, die zum Genus Gluconacetobacter gehören, für die industrielle Essigsäure-Fermentation verwendet.
Bei der Essigsäure-Fermentation wird Ethanol, das im Medium enthalten ist, oxidiert und durch Essigsäurebakterien zu Essigsäure umgewandelt. Als Resultat wird Essigsäure in dem Medium akkumuliert. Essigsäure wirkt auch inhibierend auf Essigsäurebakterien. Mit der zunehmenden Menge akkumulierter Essigsäure und der Zunahme der Essigsäurekonzentration in dem Medium kommt es zu einer allmählichen Verringerung der Wachstumsfähigkeit und der Fermentationsfähigkeit von Essigsäurebakterien.
Insbesondere scheint die Wachstumsinduktionsperiode, d. h. die Periode, bis die Essigsäurebakterien tatsächlich zu wachsen anfangen, wonach es möglich wird, die Akkumulierung von Essigsäure zu bestätigen, länger zu sein, je höher die Essigsäurekonzentration wird.
Daher ist es bei der Essigsäure-Fermentation erwünscht, die Wachstumsinduktionsperiode weiter zu verkürzen, sogar im Fall einer höheren Essigsäurekonzentration. Als ein Mittel für diesen Zweck wurde ein Verfahren offenbart, das die Addition von PQQ (4,5-Dihydro-4,5-dioxo-1H-pyrrolo-[2,3-f]-chinolin-2,7,9-tricarbonsäure) zu einer Fermentationsflüssigkeit zur Förderung des Wachstums umfasst, um die so genannte Wachstumsinduktionsperiode zu verkürzen (z. B. siehe JP-Patent-Veröffentlichung (Kokai) Nr. 61-58584 A (1986)).
Es ist jedoch schwierig, PQQ in großen Mengen zu erhalten, und PQQ erweist sich als teuer. Die Implementierung solch eines Verfahrens in industriellem Maßstab wurde daher als unökonomisch angesehen. Dementsprechend wurden Anstrengungen unternommen, Essigsäurebakterien zu züchten und zu verbessern, indem das Wachstum (Resistenz gegen Essigsäure) von Essigsäurebakterien in Gegenwart einer hohen Essigsäurekonzentration gefördert wird sowie durch Klonen von Genen, die für Proteine mit einer Funktion kodieren, die in der Lage ist, die so genannte Wachstumsinduktionsperiode zu verkürzen (Gene, die in die Wachstumsförderung involviert sind), und durch Verwendung der in die Wachstumsförderung involvierten Gene.
Es wurden jedoch bis jetzt keine Gene isoliert, die in die Wachstumsförderung von Essigsäurebakterien involviert sind. Unter solchen Umständen entstand der Wunsch nach Isolierung eines neuen Gens mit einer wachstumsfördernden Funktion sowie kodierend für ein Protein, das Funktionen besitzt, um auf praktischer Ebene das Wachstum (Resistenz gegen Essigsäure) von Essigsäurebakterien in Gegenwart einer hohen Essigsäurekonzentration zu fördern und die Wachstumsinduktionsperiode zu verkürzen, sowie Erzeugung von Essigsäurebakterien, die unter Verwendung des in die Wachstumsförderung involvierten Gens eine stärkere Wachstumsfunktion besitzen.
Offenbarung der Erfindung
Die Ziele der vorliegenden Erfindung bestehen in der Isolation eines neuen Gens mit einer wachstumsfördernden Funktion sowie kodierend für ein Protein, das auf praktischer Ebene in der Lage ist, eine Wachstumsfunktion (Resistenz gegen Essigsäure) in Gegenwart einer hohen Essigsäurekonzentration zu verbessern und eine so genannte Wachstumsinduktionsperiode zu verkürzen, in der Zucht eines Essigsäurebakteriums mit einer besseren wachstumsfördernden Funktion unter Verwendung des Gens mit solch wachstumsfördernder Funktion sowie in der Bereitstellung eines Verfahrens zur wirksamen Erzeugung von Essig mit einer hohen Essigsäurekonzentration unter Verwendung des Essigsäurebakteriums.
Die Erfinder erschufen eine Hypothese, der zufolge ein spezifisches Gen, das für ein Protein mit einer wachstumsfördernden Funktion kodiert, die anderen Mikroorganismen fehlt, in Essigsäurebakterien vorhanden sein könnte, die sogar in Gegenwart von Essigsäure zu Wachstum und Fermentation in der Lage sind. Die Erfinder versuchten anschließend, dieses Gen zu isolieren, und waren bei der Isolation dieses neuen Gens erfolgreich. Weiters erhielten die Erfinder Resultate dahingehend, dass die Verwendung eines solchen Gens, das für ein Protein mit einer wachstumsfördernden Funktion kodiert, die Verbesserung der wachstumsfördernden Funktion sowie die Resistenz von Mikroorganismen gegenüber Essigsäure ermöglicht, sowie eine wirksame Herstellung von neuem Essig, der Essigsäure in hoher Konzentration enthält. Daher haben die Erfinder die vorliegende Erfindung fertiggestellt.
Die vorliegende Erfindung lautet wie in den Ansprüchen definiert.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein schematisches Diagramm der Restriktionsenzym-Karte eines Gen-Fragments (enthaltend pS10 und ompA), das von Gluconacetobacter entanii abstammt.
2 zeigt das Verfahren des Züchtens einer Transformante in einem Medium, das Essigsäure enthält, die eine amplifizierte Anzahl an Kopien eines Gens besitzt, das von Gluconacetobacter entanii abstammt, und eine wachstumsfördernde Funktion besitzt.
3 zeigt die Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) eines Proteins, das von einem Gen kodiert wird, das von Gluconacetobacter entanii abstammt, und in eine wachstumsfördernde Funktion involviert ist.
4 zeigt das Konstruktionsschema sowie die Restriktionsenzym-Karte für pGI18.
Bester Modus zur Durchführung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden ausführlich beschrieben. Diese Anmeldung beansprucht eine Priorität von der Japanischen Patentanmeldung Nr. 2003-183047 , eingereicht am 26. Juni 2003, wobei der Inhalt derselben, der in der Beschreibung und/oder den Zeichnungen beschrieben ist, hierin inkludiert ist.
1. Isolation eines Gens, das für ein Protein mit einer wachstumsfördernden Funktion kodiert
Die Erfinder haben ein Verfahren zur Isolation eines Gens mit einer wachstumsfördernden Funktion aus Essigsäurebakterien entwickelt und haben versucht, ein Gen mit solch einer Funktion zu isolieren. Gemäß diesem Isolationsverfahren wird ein Gen mit einer wachstumsfördernden Funktion durch Konstruktion einer chromosomalen DNA-Bibliothek von Essigsäurebakterien aus Essigsäurebakterien, Transformieren der Essigsäurebakterien mit der chromosomalen DNA-Bibliothek und anschließendes Screning auf einen bakteriellen Essigsäurestamm, der in der Lage ist, innerhalb von 3 Tagen auf Agarmedium in Gegenwart von 1% Essigsäure zu wachsen, isoliert, wohingegen Essigsäurebakterien normalerweise 4 Tage benötigen, um auf demselben Medium zu wachsen.
Durch die Anwendung dieses Verfahrens auf Essigsäurebakterien, die zum Genus Gluconacetobacter gehören, die tatsächlich für die Herstellung von Essig verwendet werden, ist es den Erfindern erstmals gelungen, ein neues Gen mit einer wachstumsfördernden Funktion zu klonieren. Das neue Gen kann die wachstumsfördernde Funktion verbessern, durch die eine Wachstumsfunktion (Resistenz gegen Essigsäure) auf praktischer Ebene in Gegenwart einer hohen Essigsäurekonzentration verstärkt wird und die Wachstumsinduktionsperiode verkürzt wird.
Das so erhaltene Essigsäure-Resistenz-Gen besitzt als Resultat einer Homologiesuche von DDBJ/EMBL/Genbank und SWISS-PROT/PIR in gewissem Ausmaß eine Homologie mit einer Gruppe von Proteinen, die von einem ompA-Gen, das in Escherichia coli gefunden wurde, einem ompA-Gen von Caulobacter crescentus sowie anderen produziert werden. Es wurde angenommen, dass es sich bei dem Gen um das ompA-Gen von Essigsäurebakterien handelt.
Weiters besitzt das ompA-Gen der vorliegenden Erfindung eine Homologie auf Ebene der Aminosäuresequenz von 36% mit dem ompA-Gen von Escherichia coli sowie eine Homologie auf der Ebene der Aminosäuresequenz von 30% mit dem ompA-Gen von Caulobacter crescentus. Aufgrund dieser extrem geringen Ausmaße der Homologie wurde bestätigt, dass das ompA-Gen der vorliegenden Erfindung eine geringfügige Analogie zu ompA-Genen von anderen Mikroorganismen aufweist, jedoch ein neues Gen ist (hierin im Folgenden auch als das ompA-Gen bezeichnet), das für ein neues Protein kodiert (hierin im Folgenden auch als das OMPA-Protein bezeichnet), das spezifisch für Essigsäurebakterien ist.
In der vorliegenden Erfindung wurde eine Transformante mit einer amplifizierten Anzahl an Kopien des ompA-Gens durch Ligieren des ompA-Gens an einen Plasmidvektor sowie durch anschließendes Transformieren eines Essigsäurebakteriums mit dem Vektor erzeugt. In dieser Transformante war die Resistenz gegen Essigsäure signifikant verbessert (siehe Beispiel 3). Weiters wurde bei Züchtung der Transformante unter Belüftung in Gegenwart von Ethanol ihre Fähigkeit, Essigsäure zu fermentieren, und insbesondere ihre wachstumsfördernde Funktion, signifikant ver stärkt. Die wachstumsfördernde Funktion (Resistenz gegen Essigsäure) in Gegenwart einer hohen Essigsäurekonzentration wurde ebenfalls verstärkt. Daher wurden eine verkürzte Wachstumsinduktionsperiode, eine verstärkte Wachstumsrate, die Fähigkeit, bei erhöhten Essigsäurekonzentrationen zu wachsen, und dergleichen bestätigt (siehe Beispiele 2 bis 4). Dementsprechend konnte bestätigt werden, dass das ompA-Gen mit Sicherheit für ein Protein mit einer wachstumsfördernden Funktion kodiert und dass das Gen so exprimiert wird, dass die Funktion des Proteins ausgeübt werden kann. Daher haben die Erfinder erwartet, dass Essig mit einer hohen Essigsäurekonzentration wirksam unter Verwendung eines Mikroorganismus produziert werden kann, worin die Anzahl an Kopien des ompA-Gens amplifiziert ist.
2. DNA und Protein der vorliegenden Erfindung
Die DNA der vorliegenden Erfindung kodiert für das ompA-Gen, das von einem Essigsäurebakterium abstammt, und kodiert für eine Regulationssequenz des Gens. Weiters wird angenommen, dass die DNA für ein Protein mit einer Funktion zur Verbesserung der Resistenz gegen Essigsäure und einer wachstumsfördernden Funktion kodiert (Seq.-ID Nr. 2).
Die DNA der vorliegenden Erfindung kann aus der chromosomalen DNA von Gluconacetobacter entanii erhalten werden, wie unten stehend beschrieben.
Zuerst wird eine chromosomale DNA-Bibliothek aus Gluconacetobacter entanii hergestellt, wie z. B. der Acetobacter-altoacetigenes-MH-24-Stamm (unter der Zugriffsnr. FERM BP-491 am 23. Februar 1984 (ursprüngliche Hinterlegung) beim International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi Tsukuba, Ibaraki, Japan), dem National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), hinterlegt). Die chromosomale DNA kann durch ein herkömmliches Verfahren erhalten werden (z. B. siehe JP-Patent-Veröffentlichung (Kokai) Nr. 60-9489 A (1985)).
Um das ompA-Gen zu isolieren, wird als Nächstes eine chromosomale DNA-Bibliothek aus der oben erhaltenen chromosomalen DNA konstruiert. Zuerst wird die chromosomale DNA partiell mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, um ein Gemisch verschiedener Fragmente zu erhalten. Durch die Regulierung der Zeit für die Spaltungsreaktion und dergleichen, um die verschiedenen Ausmaße der Spaltung zu regulieren, kann eine große Bandbreite verschiedener Arten von Restriktionsenzymen verwendet werden. Die chromosomale DNA kann z. B. durch das Aufbringen von Sau3A I auf die DNA bei einer Temperatur von 30°C oder mehr, vorzugsweise bei 37°C, bei einer Enzymkonzentration, die von 1 bis 10 Einheiten/ml reicht, für verschiedene Reaktionszeiten (1 Minute bis 2 Stunden) verdaut werden.
Als Nächstes werden die so gespaltenen chromosomalen DNA-Fragmente an eine Vektor-DNA ligiert, die autonom innerhalb von Essigsäurebakterien replizierbar ist, wodurch rekombinante Vektoren konstruiert werden. Spezifisch wird die Vektor-DNA mit einem Restriktionsenzym umgesetzt (z. B. BamH I, das die Erzeugung einer terminalen Nucleotidsequenz hervorruft, die komplementär zu dem Restriktionsenzym Sau3A I ist, das für die Spaltung der chromosomalen DNA verwendet wird), und zwar unter Bedingungen einer Temperatur von 30°C und einer Enzymkonzentration von 1 bis 100 Einheiten/ml für eine Zeitspanne von 1 Stunde oder länger, wodurch die Vektor-DNA vollständig verdaut und gespalten wird.
Als Nächstes wird das Gemisch chromosomaler DNA-Fragmente, das wie oben stehend beschrieben erhalten wurde, mit der gespaltenen Vektor-DNA gemischt, und anschließend wird T₄-DNA-Ligase hinzugefügt und unter Bedingungen, bei denen die Temperatur von 4°C bis 16°C reicht und die Enzymkonzentration von 1 bis 100 Einheiten/ml reicht, für eine Zeitspanne von 1 Stunde oder länger (vorzugsweise 6 bis 24 Stunden) umgesetzt, wodurch ein rekombinanter Vektor erhalten wird.
Verfahren zur Konstruktion einer chromosomalen DNA-Bibliothek aus chromosomaler DNA sind nach dem Stand der Technik bekannt (z. B. das Shot-Gun-Verfahren) und sind nicht auf das oben beschriebene Verfahren beschränkt.
Ein Essigsäurebakterium, das allgemein 4 Tage benötigt, um in Gegenwart von 1% Essigsäurekonzentration auf einem Agarmedium zu wachsen, wie z. B. der Acetobacter-aceti-Stamm Nr. 1023 (unter der Zugriffsnr. FERM BP-2287 am 27. Juni 1983 (ursprüngliche Hinterlegung) beim International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi Tsukuba, Ibaraki, Japan), dem National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, hinterlegt), wird unter Verwendung des so erhaltenen rekombinanten Vektors transformiert. Anschließend werden die Stämme auf einem 1% Essigsäure-hältigen Agarmedium ausgebreitet, gefolgt von 3 Tagen Kultur. Die erzeugten Kolonien werden beimpft und in einem Flüssigmedium gezüchtet. Es werden Plasmide von den so erhaltenen Bakterien gesammelt, so dass DNA-Fragmente, die das ompA-Gen enthalten, erhalten werden können.
Ein spezifisches Beispiel der DNA der vorliegenden Erfindung ist eine DNA mit der in Seq.-ID Nr. 1 dargestellten Nucleotidsequenz. In dieser DNA ist die Nucleotidsequenz der Nucleotid-Nr. 180 bis 1376 in Seq.-ID Nr. 1 eine kodierende Region, die für das in Seq.-ID Nr. 2 dargestellte Protein kodiert.
Die in Seq.-ID Nr. 1 dargestellte Nucleotidsequenz oder die in Seq.-ID Nr. 2 dargestellte Aminosäuresequenz (entsprechend den Nucleotid-Nr. 180 bis 1376 aus Seq.-ID Nr. 1 in 3) zeigte eine Homologie auf Aminosäuresequenzebene von 36% mit dem ompA-Gen von Escherichia coli und eine Homologie auf Aminosäuresequenzebene von 30% mit dem ompA-Gen von Caulobacter crescentus, und zwar als Resultat einer Homologiesuche von DDBJ/EMBL/Genbank und SWISS-PROT/PIR. Es wurde daher angenommen, dass das relevante Gen für ein OMPA-Protein kodiert. Da jedoch beide Homologien geringe Werte von 40% oder weniger aufwiesen, war klar, dass es sich bei dem Gen um ein neues Gen handelt, das sich von diesen Genen unterscheidet.
Hinsichtlich der DNA der vorliegenden Erfindung wurde die Nucleotidsequenz des ompA-Gens, das von der DNA kodiert wurde, hier aufgeklärt. Daher kann z. B. die DNA mittels Polymerasekettenreaktion (PCR-Reaktion) unter Verwendung genomischer DNA eines Essigsäurebakteriums, Gluconacetobacter entanii, als Matrize so wie Oligonucleotiden, die basierend auf der Nucleotidsequenz synthetisiert werden, als Primer oder durch Hybridisierung unter Verwendung eines Oligonucleotids, das basierend auf der Nucleotidsequenz synthetisiert wird, als Sonde erhalten werden. Diese DNA mit Funktionen als ein Primer oder eine Sonde sowie hergestellt aus einer partiellen Sequenz des ompA-Gens ist auch in der DNA der vorliegenden Erfindung enthalten. Spezifisch kann DNA, die aus der in Seq.-ID Nr. 3 oder 4 dargestellten Sequenz besteht, als Primer in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, die DNA der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht darauf beschränkt. Hier bedeutet „mit Funktionen als ein Primer oder eine Sonde" den Besitz der Länge und der Nucleotidzusammensetzung einer Nucleotidsequenz, die die Verwendung als Primer oder Sonde ermöglichen. Das Design solcher DNA, die in der Lage ist, als Primer oder als Sonde zu fungieren, ist Fachmännern wohlbekannt.
DNA (Oligonucleotid) kann z. B. gemäß einem herkömmlichen Verfahren unter Verwendung verschiedener im Handel erhältlicher DNA-Synthesegeräte synthetisiert werden. Weiters kann eine PCR-Reaktion gemäß einem herkömmlichen Verfahren unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase (hergestellt von TAKARA BIO INC.), KOD-Plus-(hergestellt von TOYOBO CO., LTD.) und dergleichen unter Verwendung des Thermal-Cycler-Gene-Amp-PCR-System 9700, das von Applied Biosystems hergestellt wird, durchgeführt werden.
Weiters wird das OMPA-Protein der vorliegenden Erfindung von der oben stehenden DNA kodiert und enthält spezifisch die in Seq.-ID Nr. 2 dargestellte Aminosäuresequenz.
Das Protein der vorliegenden Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, umfasst auch ein Protein, das eine Aminosäuresequenz enthält, die von der in Seq.-ID Nr. 2 gezeigten Aminosäuresequenz durch Deletion von 1 bis 10 und vorzugsweise 1 bis 5 Aminosäuren, Addition von 1 bis 10 und vorzugsweise 1 bis 5 Aminosäuren oder Substitution von 1 bis 10 und vorzugsweise 1 bis 5 Aminosäuren mit anderen Aminosäuren abstammt. DNA, die für dieses Protein kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die wie oben stehend beschrieben mutiert ist, und mit einer wachstumsför dernden Funktion, kann ebenfalls durch ein ortsspezifisches Mutageneseverfahren erhalten werden, spezifisch durch das Verändern der Nucleotidsequenz, etwa zur Deletion, Substitution, Insertion, Addition oder Inversion von Aminosäuren an spezifischen Stellen. Weiters kann die wie oben stehend beschriebene DNA auch durch eine herkömmlicherweise bekannte Behandlung erhalten werden, um eine Mutation hervorzurufen.
Weiters kann eine Variante der DNA der vorliegenden Erfindung, die für ein Protein mit einer wachstumsfördernden Funktion kodiert, auch durch das Verfahren der ortsspezifischen Mutagenese oder dergleichen synthetisiert werden. Zusätzlich dazu kann zur Einführung einer Mutation in die DNA, bei der es sich um ein Gen handelt, ein bekanntes Verfahren, wie z. B. das Kunkel-Verfahren und das Gapped-Duplex-Verfahren oder dementsprechend modifizierte Verfahren, verwendet werden. Die Mutation wird z. B. unter Verwendung eines Sets zur Einführung von Mutationen eingeführt, welches das Verfahren der ortsspezifischen Mutagenese (z. B. Mutan-K (produziert von TAKARA BIO INC.) oder Mutan-G (produziert von TAKARA BIO INC.)) oder dergleichen verwendet. Weiters kann die Mutation in ein Gen eingeführt werden, oder ein chimäres Gen kann auch durch Verfahren, wie z. B. fehleranfällige PCR, DNA-Shuffling oder dergleichen, konstruiert werden. Das Verfahren der fehleranfälligen PCR und die Verfahren des DNA-Shuffling sind nach dem Stand der Technik bekannt. Hinsichtlich der fehleranfälligen PCR siehe z. B. K. Chen und F. H. Arnold, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5618–5622 (1993), und bezüglich des DNA-Shuffling-Verfahrens siehe W. P. Stemmer, Nature 370, 389–391 (1994), sowie W. P. Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10747–10751 (1994).
Hier gibt eine „wachstumsfördernde Funktion" in der vorliegenden Erfindung eine Funktion zur Förderung des Wachstums von Mikroorganismen in der Gegenwart von Essigsäure an. Genauer gesagt bedeutet der Ausdruck eine schnelle Wachstumsrate oder eine großes Ausmaß an Wachstum von Bakterien in Gegenwart von Essigsäure. Weiters zeigt der Ausdruck auch einen hohen oberen Grenzwert der Essigsäurekonzentration, bei dem Wachstum oder Essigsäure-Fermentation möglich ist. Solch eine „wachstumsfördernde Funktion" kann auch eine Funktion zur Verstärkung der Resistenz gegen Essigsäure bedeuten. Ob ein Gen, in dem wie oben stehend beschrieben eine Mutation eingeführt ist, für ein Protein mit solch einer wachstumsfördernden Funktion kodiert oder nicht, kann durch Bestimmung der Gegenwart oder der Abwesenheit in einem essigsäurehältigen Medium bestätigt werden, wie in den Beispielen gezeigt wird.
Weiters ist allgemein bekannt, dass die Aminosäuresequenz eines Proteins und die Nucleotidsequenz, die für das Protein kodiert, unter verschiedenen Spezies, Stämmen, Varianten und Arten leicht variiert. DNAs, die für im Wesentlichen identische Proteine kodieren, können von allen Essigsäurebakterien erhalten werden, insbesondere jenen von Spezies oder Stämmen, die dem Genus Acetobacter oder dem Genus Gluconacetobacter angehören, sowie Varianten und Arten davon.
Genauer gesagt kann z. B. in der in Seq.-ID Nr. 1 dargestellten Nucleotidsequenz eine DNA, die unter stringenten Bedingungen an eine DNA hybridisiert, die aus einem Teil einer Nucleotidsequenz besteht, die komplementär zu der aus Nucleotid-Nr. 180 bis 1376 bestehenden Nucleotidsequenz ist, oder an eine DNA, die aus einer Nucleotidsequenz besteht, die eine Sonde sein kann, die aus einem Teil der DNA von Nucleotid-Nr. 180 bis 1376 hergestellt ist, und die für ein Protein mit einer wachstumsfördernden Funktion kodiert, aus Essigsäurebakterien, die dem Genus Acetobacter oder dem Genus Gluconacetobacter angehören, mutierten Essigsäurebakterien, die dem Genus Acetobacter oder dem Genus Gluconacetobacter angehören, oder natürlich mutierten Stämmen oder Varianten davon isoliert werden. Auf diese Art und Weise kann auch eine DNA erhalten werden, die für ein Protein kodiert, das im Wesentlichen mit dem zuvor genannten Protein identisch ist, d. h. ein Protein, das eine wachstumsfördernde Funktion beibehält. Der Ausdruck „stringente Bedingungen" bedeutet bei Verwendung hierin Bedingungen, durch die so genannte spezifische Hybride gebildet werden und nichtspezifische Hybride nicht gebildet werden. Es ist schwierig, diese Bedingungen genau in numerischen Werten darzustellen. Diese Bedingungen sind z. B. Bedingungen, bei denen Nucleinsäuren, die eine hohe Homologie gemeinsam haben, wie z. B. eine Homologie von 70% oder mehr, aneinander hybridisieren und Nucleinsäuren, die eine geringere Homologie als dieses Ausmaß gemeinsam haben, nicht aneinander hybridisieren. Andere solche Beispiele umfassen allgemeine Waschbedingungen zur Hybridisierung, wie z. B. Bedingungen, worin das Waschen bei 60°C ausgeführt wird, und zwar mit einer Salzkonzentration, die 0,1% SDS im Fall von 1 × SSC entspricht.
3. Essigsäureresistenter Mikroorganismus (Mikroorganismus mit verstärkter wachstumsfördernder Funktion) der vorliegenden Erfindung
Die DNA der vorliegenden Erfindung kodiert für ein OMPA-Protein mit einer wachstumsfördernden Funktion. Durch die Verwendung der DNA der vorliegenden Erfindung kann ein Mikroorganismus mit einer verstärkten wachstumsfördernden Funktion in Gegenwart von Essigsäure, d. h. ein Mikroorganismus mit verstärkter Resistenz gegen Essigsäure, produziert werden.
Die wachstumsfördernde Funktion eines Mikroorganismus kann z. B. durch Ligieren des ompA-Gens an einen rekombinanten Vektor und Transformieren eines Mikroorganismus mit dem Vektor, um die intrazelluläre Anzahl an Kopien des Gens zu amplifizieren, oder durch Ligieren eines strukturellen Genabschnitts des Gens und einer Promotorsequenz, die in einem Mikroorganismus wirksam funktioniert, an einen rekombinanten Vektor und Transformieren des Mikroorganismus mit dem Vektor verstärkt werden, um die Anzahl der Kopien des Gens zu amplifizieren und um die Genexpression zu verstärken.
Der rekombinante Vektor der vorliegenden Erfindung kann durch Ligieren der DNA, die für das OMPA-Protein kodiert, wie im oben stehenden Abschnitt „2. DNA und Protein der vorliegenden Erfindung" beschrieben wird, an einen geeigneten Vektor erhalten werden. Eine Transformante kann durch Transformieren eines Wirts unter Verwendung dieses rekombinanten Vektors der vorliegenden Erfindung erhalten werden, so dass das ompA-Gen exprimiert werden kann.
Als ein rekombinanter Vektor kann ein Phage oder ein Plasmid verwendet werden, der/das innerhalb von Wirten autonom replizierbar ist. Beispiele von Plasmid-DNA umfassen Plasmide, die von Escherichia coli abstammen (z. B. pBR322, pBR325, pUC118, pET16b u. s. w.), Plasmide, die von Bacillus subtilis abstammen (z. B. pUB110, pTP5 u. s. w.), sowie Plasmide, die von Hefe abstammen (z. B. YEp13, YCp50 u. s. w.). Beispiele von Phagen-DNA umfassen λ-Phagen (z. B. λgt10, λZAP u. s. w.). Weiters kann eine Transformante auch unter Verwendung eines Tier-Virus-Vektors, wie z. B. eines Retrovirus oder Vakzinia-Virus, eines Insekten-Virus-Vektors, wie z. B. eines Baculovirus, eines künstlichen bakteriellen Chromosoms (BAC), eines künstlichen Hefe-Chromosoms (YAC) oder dergleichen hergestellt werden.
Weiters kann Target-DNA auch unter Verwendung eines Multi-Kopien-Vektors, eines Transposons oder dergleichen in einen Wirt eingeführt werden. In der vorliegenden Erfindung wird so ein Multi-Kopien-Vektor oder Transposon ebenfalls in den rekombinanten Vektor der vorliegenden Erfindung inkludiert. Solche Multi-Kopien-Vektoren umfassen pUF106 (siehe z. B. M. Fujiwara et al., Cellulose, 153–158 (1989)), pMV24 (siehe z. B. M. Fukaya et al., Appl. Environ. Microbiol. 55, 171–176 (1989)), pGI18 (siehe z. B. die Beschreibung der JP-Patentanmeldung 2003-350265 , Beispiel 3), pTA 5001 (A) sowie pTA 5001 (B) (siehe z. B. die Veröffentlichung des JP-Patents (Kokai) Nr. 60–9488 A (1985)). Es kann auch ein Vektor vom Chromosomen-Integrations-Typ pMVL1 verwendet werden (siehe z. B. H. Okumura et al., Agric. Biol. Chem. 52, 3125–3129 (1988)). Weiters umfassen Beispiele solcher Transposons Mu und IS1452.
Um die DNA der vorliegenden Erfindung in einen Vektor zu insertieren, wird z. B. ein Verfahren verwendet, das die Spaltung gereinigter DNA mit einem geeigneten Restriktionsenzym sowie anschließendes Insertieren des Produkts in eine Restriktionsenzymstelle oder eine Mehrfachklonierungsstelle geeigneter Vektor-DNA umfasst, um sie an den Vektor zu ligieren.
Die DNA der vorliegenden Erfindung sollte in einen Vektor inkorporiert werden, so dass die Funktionen eines Gens, das von der DNA kodiert wird, ausgeführt werden. Daher kann zusätzlich zu einem Promotor und der DNA der vorliegenden Erfindung falls gewünscht ein cis-Element, wie z. B. ein Enhancer, ein Spleißsignal, ein PolyA- Additionssignal, ein Selektionsmarker, eine Ribosomenbindungssequenz (SD-Sequenz) oder dergleichen, an einen rekombinanten Vektor der vorliegenden Erfindung ligiert werden. Weiters umfassen Beispiele solcher Selektionsmarker ein Dihydrofolatreduktase-Gen, ein Kanamycin-Resistenz-Gen, ein Tetrazyklin-Resistenz-Gen, ein Ampicillin-Resistenz-Gen und ein Neomycin-Resistenz-Gen oder dergleichen.
Weiters wird zur Substitution einer Promotorsequenz des ompA-Gens auf der chromosomalen DNA mit einer anderen Promotorsequenz, die in der Lage ist, wirksam in Essigsäurebakterien zu funktionieren, die dem Genus Acetobacter oder Gluconacetobacter angehören, ein Vektor zur homologen Rekombination konstruiert, und anschließend kommt es unter Verwendung des Vektors zur homologen Rekombination im Chromosom eines Mikroorganismus. Beispiele dieser Promotorsequenz umfassen jene, die von anderen Mikroorganismen als Essigsäurebakterien abstammen, wie z. B. eine Promotorsequenz eines Ampicillin-Resistenz-Gens des Escherichia-coli-Plasmids pBR322 (hergestellt von TAKARA BIO INC.), jene eines Kanamycin-Resistenz-Gens eines Plasmids pHSG298 (hergestellt von TAKARA BIO INC.), jene eines Chloramphenicol-Resistenz-Gens eines Plasmids pHSG396 (hergestellt von TAKARA BIO INC.) und jene eines β-Galactosidase-Gens oder dergleichen. Die Konstruktion eines Vektors zur homologen Rekombination ist Fachmännern bekannt. Wie oben stehend beschrieben, wird durch die Anordnung des endogenen ompA-Gens in einem Mikroorganismus unter Kontrolle eines starken Promotors die Anzahl an Kopien des ompA-Gens amplifiziert und daher die Expression verstärkt.
Mikroorganismen, die zur Transformation zu verwenden sind, sind nicht spezifisch eingeschränkt, solange sie eingeführte DNA exprimieren können. Beispiele solcher Mikroorganismen umfassen Bakterien (z. B. Escherichia coli, Bacillus subtilis und Milchsäurebakterien), Hefe und Pilze, sowie jene, die dem Genus Aspergillus angehören. In der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung von Essigsäurebakterien als die hierin verwendeten Mikroorganismen aufgrund des Zwecks der Verstärkung der wachstumsfördernden Funktion dieser bevorzugt. Unter den Essigsäurebakterien werden Bakterien, die zum Genus Acetobacter gehören, sowie jene, die zum Genus Gluconacetobacter gehören, bevorzugt.
Ein Beispiel für Bakterien, die zum Genus Acetobacter gehören, ist Acetobacter aceti. Genauer gesagt kann z. B. der Acetobacter-acti-Stamm Nr. 1023 (FERM BP-2287), der Acetobacter-aceti-Stamm der Subspezies xylinum IFO3288 und der Acetobacteraceti-Stamm IFO3283 verwendet werden.
Weiters umfassen Beispiele von Bakterien, die zum Genus Gluconacetobacter gehören, den Gluconacetobacter-europaeus-Stamm DSM6160 und Gluconacetobacter entanii. Genauer gesagt kann der Acetobacter-altoacetigenes-Stamm MH-24 (FERM BP-491) verwendet werden.
Verfahren zur Einführung eines rekombinanten Vektors in Bakterien umfassend Essigsäurebakterien sind nicht spezifisch eingeschränkt, solange sie zur Einführung von DNA in Bakterien geeignet sind. Beispiele eines solchen Verfahrens umfassen ein Verfahren, das ein Calciumion verwendet (siehe z. B. M. Fukaya et al., Agric. Biol. Chem. 49, 2091–2097 (1985)), sowie ein Elektroporationsverfahren (siehe z. B. H. Wong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8130–8134 (1990)) oder dergleichen.
Wird Hefe als ein Wirt verwendet, so werden z. B. Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombe verwendet. Verfahren zur Einführung eines rekombinanten Vektors in Hefe sind nicht spezifisch eingeschränkt, solange sie zur Einführung von DNA in Hefe geeignet sind. Beispiele eines solchen Verfahrens umfassen ein Elektroporationsverfahren, ein Sphäroplastenverfahren und ein Lithiumacetatverfahren.
Transformanten können unter Verwendung der Eigenschaften eines Marker-Gens auf einem einzuführenden Vektor ausgewählt werden. Wird z. B. ein Neomycin-Resistenz-Gen verwendet, so werden Mikroorganismen, die eine Resistenz gegen ein G418-Arzneimittel zeigen, ausgewählt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann eine Transformante durch Transferieren eines rekombinanten Vektors, der Nucleinsäuren enthält, die zumindest die in Seq.-ID Nr. 1 dargestellte Nucleotidsequenz aufweisen, z. B. eines rekombinanten Vektors pOMPA1, worin die Nucleinsäuren in einen Essigsäurebakterium-Escherichia-coli-Shuttle-Vektor (Multi-Kopien-Vektor) pUF106 insertiert wurden, in den Acetobacter-aceti-Stamm Nr. 1023 (FERM BP-2287) oder durch Einführen eines rekombinanten Vektors pOMPA2, worin die Nucleinsäuren in einen Essigsäurebakterium-Escherichia-coli-Shuttle-Vektor (Multi-Kopien-Vektor) pGI18 insertiert wurden, in den Acetobacter-aceti-Stamm IFO3288 der Subspezies xylinum erhalten werden.
Wird eine wachstumsfördernde Funktion, wie oben stehend beschrieben, in Essigsäurebakterien verstärkt, die zum Genus Acetobacter oder zum Genus Gluconacetobacter gehören, die die Fähigkeit besitzen, Alkohol zu oxidieren, so kann die Produktionsmenge und die Produktionswirksamkeit von Essigsäure erhöht werden.
4. Verfahren zur Produktion von Essig
Mikroorganismen (Essigsäurebakterien) mit einer selektiv verstärkten wachstumsfördernden Funktion (als ein Resultat der Amplifikation der Anzahl an Kopien eines Gens mit solch einer wachstumsfördernden Funktion) und mit der Fähigkeit, Alkohol zu oxidieren, werden wie im oben stehenden Abschnitt „3. Essigsäureresistenter Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung" beschrieben hergestellt. Solche Mikroorganismen können zur Herstellung von Essig verwendet werden, da sie in Gegenwart von Essigsäure wachsen können und Essigsäure produzieren. Daher werden Mikroorganismen mit amplifizierter Kopienanzahl des ompA-Gens in einem Medium gezüchtet, das Alkohol enthält, und anschließend dazu gebracht, Essigsäure zu produzieren und im Medium zu akkumulieren, so dass Essig, der Essigsäure in einer hohen Konzentration enthält, wirksam produziert werden kann.
Die Essigsäure-Fermentation im Produktionsverfahren der vorliegenden Erfindung kann auf eine ähnliche Art und Weise durchgeführt werden wie bei einem Verfahren der Essigproduktion, das ein herkömmliches Fermentationsverfahren unter Verwendung von Essigsäurebakterien umfasst, ein Fermentationsverfahren ist jedoch nicht spezifisch darauf beschränkt. Ein für die Essigsäure-Fermentation zu verwendendes Medium kann entweder ein synthetisches oder ein natürliches Medium sein, solange es eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, eine anorganische Substanz und Ethanol enthält und, falls notwendig, geeignete Mengen an Nahrungsquellen, die für das Wachstum des verwendeten Mikrobenstamms erforderlich sind, umfasst.
Beispiele einer Kohlenstoffquelle umfassen verschiedene Kohlenhydrate, wie z. B. Glucose und Saccharose, und verschiedene organische Säuren. Als eine Stickstoffquelle kann eine natürliche Stickstoffquelle wie z. B. Pepton oder Lysat der Fermentationsmikroorganismen verwendet werden.
Weiters erfolgt die Kultur unter aeroben Bedingungen, wie z. B. jenen des Verfahrens einer feststehenden Kultur, des Verfahrens einer Schüttelkultur oder des Verfahrens einer Belüftungs- und Agitationskultur. Die Kultur erfolgt allgemein bei 30°C. Der pH für ein Medium beträgt im Allgemeinen von 2,5 bis 7 und vorzugsweise von 2,7 bis 6,5. Der pH kann auch unter Verwendung verschiedener Säuren, verschiedener Basen, Puffer und dergleichen angepasst werden. Die Kultur erfolgt im Allgemeinen für eine Zeitspanne von 1 bis 21 Tagen.
Durch die Kultur von Mikroorganismen mit einer amplifizierten Anzahl an Kopien des ompA-Gens wird Essigsäure in einer hohen Konzentration in einem Medium akkumuliert. Weiters wird die Wachstumsrate von solchen Mikroorganismen verbessert, so dass die Produktionsrate von Essigsäure verbessert wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann Mikroorganismen eine wachstumsfördernde Funktion verliehen werden, um ihr Wachstum zu verstärken. Weiters wird bei Mikroorganismen mit der Fähigkeit, Alkohol zu oxidieren, und insbesondere bei Essigsäurebakterien die Wachstumsfunktion (Resistenz gegen Essigsäure) in Gegenwart einer hohen Essigsäurekonzentration verstärkt und die Wachstumsinduktionsperiode signifikant verkürzt. Daher kann solchen Mikroorganismen und solchen Bakterien die Fähigkeit verliehen werden, Essigsäure in einer hohen Konzentration in einem Medium wirksam zu akkumulieren. Die so erzeugten Mikroorganismen (Essigsäurebakte rien) sind für die Herstellung von Essig, enthaltend Essigsäure in einer hohen Konzentration, von Nutzen.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird durch die Beispiele weiter ausführlicher beschrieben. Der technische Umfang der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt.
[Beispiel 1] Klonieren eines Gens, das von Gluconacetobacter entanii abstammt und eine wachstumsfördernde Funktion aufweist, sowie Bestimmung von dessen Nucleotidsequenz und Aminosäuresequenz
(1) Konstruktion einer chromosomalen DNA-Bibliothek
Der Acetobacter-altoacetigenes-Stamm MH-24 (FERM BP-491), der ein Stamm von Gluconacetobacter entanii ist, wurde in einer Schüttelkultur bei 30°C in einem YPG-Medium gezüchtet (3% Glucose, 0,5% Hefeextrakt und 0,2% Polypepton), das mit 6% Essigsäure und 4% Ethanol ergänzt war. Nach dem Züchten wurde das Kulturmedium zentrifugiert (7.500 × g für eine Zeitspanne von 10 Minuten), wodurch Bakterienzellen erhalten wurden. Von den so erhaltenen Bakterienzellen wurden chromosomale DNAs gemäß einem Präzipitationsverfahren der chromosomalen DNA hergestellt (siehe z. B. JP-Patent-Veröffentlichung (Kokai) Nr. 60-9489 A (1985)).
Die chromosomalen DNAs, die auf die oben stehende Art und Weise erhalten wurden, wurden partiell mit einem Restriktionsenzym Sau3A I verdaut (von TAKARA BIO INC.). Der Escherichia-coli-Essigsäurebakterium-Shuttle-Vektor pUF106 wurde vollständig verdaut und mit einem Restriktionsenzym BamH I gespalten. Geeignete Mengen dieser DNAs wurden hineingemischt und anschließend unter Verwendung eines Ligationssets ligiert (TaKaRa DNA Ligation Kit Ver. 2, von TAKARA BIO INC.), wodurch eine chromosomale DNA-Bibliothek aus Gluconacetobacter entanii konstruiert wird.
(2) Klonieren eines Gens mit einer wachstumsfördernden Funktion
Die chromosomale DNA-Bibliothek von Gluconacetobacter entanii, wie oben stehend beschrieben erhalten, wurde in den Acetobacter-aceti-Stamm Nr. 1023 transformiert (FERM BP-2287), von dem bekannt ist, dass er im Allgemeinen 4 Tage benötigt, um auf einem Agarmedium, das 1% Essigsäure enthält, zu wachsen. Die Bakterienzellen wurden anschließend auf einem YPG-Agarmedium, das 1% Essigsäure und 100 μg/ml Ampicillin enthielt, bei 30°C 3 Tage lang gezüchtet. Kolonien, die innerhalb von 3 Tagen erzeugt wurden, wurden beimpft und auf einem YPG-Medium, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, gezüchtet, und anschließend wurden Plasmide der erhaltenen Bakterienzellen gesammelt. Ein Sau3A-I-Fragment mit etwa 2,3 kbp wurde kloniert, wie in 1 dargestellt, und das Plasmid wurde pS10 genannt.
Wie oben stehend beschrieben, wurde ein Gen-Fragment erhalten, das eine wachstumsfördernde Funktion besitzt, die es dem Acetobacter-aceti-Stamm Nr. 1023 ermöglicht, innerhalb von 3 Tagen auf einem Agarmedium zu wachsen, das 1% Essigsäure enthält, obwohl der Stamm im Allgemeinen 4 Tage benötigt, um auf solch einem Agarmedium, das 1% Essigsäure enthält, zu wachsen.
(3) Bestimmung der Nucleotidsequenz des klonierten DNA-Fragments
Das oben stehend klonierte Sau3A-I-Fragment wurde in die BamH-I-Stelle von pUC19 insertiert, und die Nucleotidsequenz des Fragments wurde anschließend durch das Didesoxy-Kettenterminations-Verfahren nach Sanger bestimmt. Als ein Resultat wurde die in Seq.-ID Nr. 1 dargestellte Nucleotidsequenz bestimmt. Die Sequenzierung wurde für die gesamte Region beider DNA-Stränge durchgeführt, wobei beide Spaltungspunkte einander überlappen. Das so erhaltene Gen wurde ompA genannt.
In der in Seq.-ID Nr. 1 dargestellten Nucleotidsequenz wurde die Gegenwart eines offenen Leserasters, der für 399 Aminosäuren kodiert, die in Seq.-ID Nr. 2 (3) dargestellt werden, die von Nucleotid-Nr. 180 bis 1376 reichen, bestätigt.
[Beispiel 2] Wirkung der Verkürzung der Wachstumsinduktionsperiode in einer Transformante mit einem Gen, das eine wachstumsfördernde Funktion besitzt, aus Gluconacetobacter entanii
(1) Transformation in Acetobacter aceti
Das oben genannte ompA-Gen, das gemäß Beispiel 1 aus dem Acetobacteraltoacetigenes-Stamm MH-24 kloniert wurde (FERM BP-491), wurde durch das PCR-Verfahren unter Verwendung von KOD-Plus-(von TOYOBO CO., LTD.) amplifiziert. Das so amplifizierte DNA-Fragment wurde in die Restriktionsenzym-Sma-I-Spaltstelle des Essigsäurebakterium-Escherichia-coli-Shuttle-Vektors pUF106 insertiert (siehe z. B. M. Fujiwara et al., Cellulose, 153–158 (1989)), um ein Plasmid pOMPA1 herzustellen. Das amplifizierte Fragment, das in pOMPA1 insertiert ist, ist schematisch in 1 dargestellt. 1 zeigt die Restriktionsenzym-Karte des von Gluconacetobacter entanii abstammenden Gen-Fragments (pS10), das unter Verwendung von Sau3A I kloniert wurde, die Position des Gens mit der wachstumsfördernden Funktion sowie das in pOMPA1 insertierte Fragment.
Das PCR-Verfahren wurde durchgeführt, wie unten stehend ausführlich beschrieben. Genauer gesagt wurde die PCR unter den folgenden PCR-Bedingungen unter Verwendung einer genomischen DNA des Acetobacter-altoacetigenes-Stamms MH-24 als Matrize, Primer 1 (5'-GTTTCCCGGAATTCCCGTTTCAGCTCCTTC-3'; Seq.-ID Nr. 3), Primer 2 (5'-ATATCTTTCAGGGCATTTGGAGGTATTCCG-3'; Seq.-ID Nr. 4) sowie KOD-Plus-(von TOYOBO CO., LTD.) durchgeführt.
Genauer gesagt wurde das PCR-Verfahren 30 Zyklen lang durchgeführt, wobei jeder eine Temperatur von 94°C für eine Zeitspanne von 15 Sekunden, 60°C für eine Zeitspanne von 30 Sekunden und 68°C für eine Zeitspanne von 1 Minute umfasste.
Das pOMPA1 wurde in den Acetobacter-aceti-Stamm Nr. 1023 mittels eines Elektroporationsverfahrens transformiert (siehe z. B. H. C. Wong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8130–8134 (1990)). Die Transformante wurde unter Verwendung eines YPG-Agarmediums, das mit 100 μg/ml Ampicillin und 1% Essigsäure ergänzt war, selektiert.
Plasmide wurden aus der ampicillinresistenten Transformante extrahiert, die auf dem Selektionsmedium innerhalb von 3 Tagen herangewachsen war, und anschließend gemäß einem herkömmlichen Verfahren analysiert. Daher wurde bestätigt, dass der Stamm Plasmide mit dem Gen mit der wachstumsfördernden Funktion behielt.
(2) Essigsäure-Fermentationstest unter Verwendung der Transformante
Die ampicillinresistente Transformante, die wie oben stehend beschrieben erhalten wurde, mit dem Plasmid pOMPA1 sowie der ursprüngliche Acetobacter-aceti-Stamm Nr. 1023 mit nur dem Shuttle-Vektor pUF106 wurden hinsichtlich der Fähigkeit der Essigsäure-Fermentation verglichen.
Genauer gesagt wurde die Belüftungs- und Agitationskultur in 2,5 l YPG-Medium, das 1% Essigsäure, 4% Ethanol und 100 μg/ml Ampicillin enthielt, bei 30°C, 400 U/min und 0,20 vvm unter Verwendung eines 5-l-Mini-Jar-Fermenters (von Mitsuwa Scientific Corp., KMJ-5A) durchgeführt. Es wurde den Stämmen ermöglicht, bis zu einer Essigsäurekonzentration von 3% zu fermentieren. Anschließend wurde ein Teil des Kulturmediums entfernt, wobei 700 ml des Kulturmediums im Mini-Jar-Fermenter zurückblieben. 1,8 l YPG-Medium, das Essigsäure, Ethanol und 100 μg/ml Ampicillin enthielt, wurden zu den verbleibenden 700 ml des Kulturmediums bis zu einer Essigsäurekonzentration von 3% und einer Ethanolkonzentration von 4% hinzugefügt.

Die Essigsäure-Fermentation wurde erneut initiiert. Die Belüftungs- und Agitationskultur wurde fortgesetzt, während Ethanol hinzugefügt wurde, um die Ethanolkonzentration von 1% im Medium beizubehalten. Die Transformante wurde mit dem ursprünglichen Stamm bezüglich der Fähigkeit zur Essigsäure-Fermentation verglichen. Die Resultate sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1

	Finale erreichte Essigsäurekonzentration (%)	Spezifische Wachstumsrate (OD660/h)	Produktionsrate (%/h)	Wachstumsinduktionsperiode (h)
Ursprünglicher Stamm	9,9	0,0162	0,071	54,4
Transformante	9,8	0,0213	0,072	5,0

Basierend auf den Resultaten in Tabelle 1 kann bestätigt werden, dass im Fall der Transformante die spezifische Wachstumsrate signifikant höher war, die Wachstumsinduktionsperiode signifikant verkürzt wurde und dass die Transformante in der Lage war, eine wirksame Essigsäure-Fermentation durchzuführen.
[Beispiel 3] Verstärkung der Essigsäure-Resistenz der Transformante mit einem Gen mit einer wachstumsfördernden Funktion aus Gluconacetobacter entanii
(1) Konstruktion eines Essigsäurebakterium-Escherichia-coli-Shuttle-Vektors pGI18
pGI18 wurde unter Verwendung eines Plasmids pGI1 mit ungefähr 3,1 kb konstruiert, das vom Acetobacter-altoacetigenes-Stamm MH-24 (FERM BP-491) und pUC18 abstammte.
Genauer gesagt wurden Bakterienzellen aus dem Kulturmedium des Acetobacteraltoacetigenes-Stamm MH-24 (FERM BP-491) gesammelt, unter Verwendung von Natriumhydroxid oder Natriumdodecylsulfat lysiert, mit Phenol behandelt und anschließend mit Ethanol behandelt, wodurch die Plasmid-DNA gereinigt wurde.
Das so erhaltene Plasmid war ein zirkuläres doppelsträngiges DNA-Plasmid mit 3 Erkennungsstellen für Hinc II und 1 Erkennungsstelle für Sfi I. Die vollständige Länge des Plasmids war etwa 3100 Basenpaare (bp). Weiters besaß das Plasmid keine Erkennungsstellen für EcoR I, Sac I, Kpn I, Sma I, BamH I, Xba I, Sal I, Pst I, Sph I oder Hind III. Das Plasmid wurde pGI1 genannt und für die Konstruktion des Vektors pGI18 verwendet.
Das oben erhaltene Plasmid pGI1 wurde durch das PCR-Verfahren unter Verwendung von KOD-Plus-(von TOYOBO CO., LTD.) amplifiziert. Die Amplifikationsprodukte wurden mit Aat II gespalten. Das Fragment wurde in die Restriktionsenzym-Aat-II-Spaltstelle von pUC18 insertiert, wodurch ein Plasmid pGI18 erzeugt wurde (4).
Das PCR-Verfahren wurde durchgeführt, wie unten stehend ausführlich beschrieben. Genauer gesagt wurde die PCR unter den folgenden PCR-Bedingungen unter Verwendung eines Plasmids pGI1 als Matrize und von Primer A (Seq.-ID Nr. 6) und Primer B (Seq.-ID Nr. 7), welche die Restriktionsenzym-Aat-II-Erkennungsstellen aufweisen, als Primer durchgeführt.
Genauer gesagt wurde das PCR-Verfahren 30 Zyklen lang durchgeführt, wobei jeder eine Temperatur von 94°C für eine Zeitspanne von 30 Sekunden, 60°C für eine Zeitspanne von 30 Sekunden und 68°C für eine Zeitspanne von 3 Minuten umfasste.
Wie in 4 dargestellt enthielt das so erhaltene Plasmid pGI18 sowohl pUC18 als auch pGI1, und seine gesamte Länge lag bei etwa 5800 Basenpaaren (5,8 kbp).
Die Nucleotidsequenz des Plasmids pGI18 ist in Seq.-ID Nr. 5 dargestellt.
(2) Transformation in Acetobacter aceti der Subspezies xylinum
Das vom Acetobacter-altoacetigenes-Stamm MH-24 (FERM BP-491) abstammende Gen mit der wachstumsfördernden Funktion, das in Beispiel 1 erhalten wurde, wurde durch das PCR-Verfahren unter Verwendung von KOD-Plus-(von TOYOBO CO., LTD.) amplifiziert. Der Essigsäurebakterium-Escherichia-coli-Shuttle-Vektor pGI18, der in (1) konstruiert wurde, wurde mit einem Restriktionsenzym Sma I gespalten. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde anschließend in die Restriktionsenzym-Sma-I-Spaltstelle des Shuttle-Vektors insertiert, um ein Plasmid pOMPA2 herzustellen. Das in pOMPA2 insertierte, amplifizierte Fragment ist schematisch in 1 dargestellt. 1 zeigt die Restriktionsenzym-Karte des von Gluconacetobacter entanii abstammenden Gen-Fragments (pS10), das unter Verwendung von Sau3A I kloniert wird, die Position des Gens mit der wachstumsfördernden Funktion und das in pOMPA2 insertierte Fragment.
Das PCR-Verfahren wurde durchgeführt, wie unten stehend ausführlich beschrieben. Genauer gesagt, wurde die PCR unter den folgenden PCR-Bedingungen unter Verwendung einer genomischen DNA des Acetobacter-altoacetigenes-Stamms MH-24 als eine Matrize, von Primer 1 (5'-GTTTCCCGGAATTCCCGTTTCAGCTCCTTC-3': Seq.-ID Nr. 3), Primer 2 (5'-ATATCTTTCAGGGCATTTGGAGGTATTCCG-3': Seq.-ID Nr. 4) sowie unter Verwendung von KOD-Plus-(von TOYOBO CO., LTD.) durchgeführt.
Genauer gesagt wurde das PCR-Verfahren 30 Zyklen lang durchgeführt, wobei jeder eine Temperatur von 94°C für eine Zeitspanne von 15 Sekunden, 60°C für eine Zeitspanne von 30 Sekunden und 68°C für eine Zeitspanne von 1 Minute umfasste.
Das pOMPA2 wurde in den Acetobacter-aceti-Stamm IFO3288 der Subspezies xylinum transformiert, wobei es sich um einen Acetobacter-aceti-Stamm der Subspezies Xylinum handelt, und zwar mittels des Elektroporationsverfahrens (siehe z. B. H. C. Wong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8130–8134 (1990)). Die Transformante wurde unter Verwendung eines YPG-Agarmediums, das mit 100 μg/ml Ampicillin und 1% Essigsäure ergänzt war, selektiert.
Plasmide wurden aus der ampicillinresistenten Transformante extrahiert, die auf dem Selektionsmedium herangewachsen war, und anschließend gemäß einem herkömmlichen Verfahren analysiert. Daher wurde die Retention von Plasmiden mit dem Essigsäure-Resistenz-Gen bestätigt.
(3) Resistenz der Transformante gegen Essigsäure
Die ampicillinresistente Transformante mit dem Plasmid pOMPA2, die in (2) oben stehend erhalten wurde, wurde mit dem ursprünglichen Acetobacter-aceti-Stamm IFO3288 der Subspezies xylinum mit nur dem darin eingeführten Shuttle-Vektor pGI18 hinsichtlich des Wachstums in einem YPG-Medium, das mit Essigsäure ergänzt ist, verglichen.
Genauer gesagt wurde die Schüttelkultur (150 U/min) bei 30°C in 100 ml eines YPG-Mediums durchgeführt, das 3% Essigsäure und 100 μg/ml Ampicillin enthielt. Das Wachstum der Transformante und jenes des ursprünglichen Stamms im Medium, das mit Essigsäure ergänzt war, wurde durch das Messen von Bakterienkonzentrationen bei 660 nm verglichen.
Als ein Resultat, wie in 2 dargestellt, konnte bestätigt werden, dass in dem mit 3% Essigsäure ergänzten Medium die Transformante (durch weiße Kreise dargestellt) wachsen konnte, wo hingegen der ursprüngliche Acetobacter-aceti-Stamm IFO3288 der Subspezies xylinum (durch ausgemalte Kreise dargestellt) nicht in der Lage war, zu wachsen. Daher konnte die Funktion der Verstärkung der Resistenz des Gens mit der wachstumsfördernden Funktion gegen Essigsäure bestätigt werden.
[Beispiel 4] Essigsäure-Fermentationstest der Transformante mit einem Gen mit einer wachstumsfördernden Funktion aus Gluconacetobacter entanii
Die ampicillinresistente Transformante mit dem Plasmid pOMPA2, das in Beispiel 3 erhalten wurde, wurde mit dem ursprünglichen Acetobacter-aceti-Stamm IFO3288 der Subspezies xylinum mit nur dem darin eingeführten Shuttle-Vektor pGI18 hinsichtlich der Fähigkeit der Essigsäure-Fermentation verglichen.
Genauer gesagt wurde ein 5-I-Mini-Jan-Fermenten (von Mitsuwa Scientific Corp., KMJ-5A) mit einem YPG-Medium mit einer Essigsäurekonzentration von 1% und einer Alkoholkonzentration von 4% befüllt. Die Transformante oder der ursprüngliche Stamm wurde bei 0,4% auf das Medium geimpft. Anschließend wurde die Belüftungs- und Agitationskultur bei einer Fermentationstemperatur von 32°C, 500 U/min und 0,20 vvm initiiert. Stieg die Essigsäurekonzentration im Verlauf der Fermentation auf 4% an, so wurde die Hinzufügung eines Rohmaterial-Mediums initiiert (Alkoholkonzentration von 7,8% und Essigsäurekonzentration von 0,26%), das durch das Mischen einer Lösung von 17,9% verzuckertem Reis, einer Essigsäure-Fermentationslösung von 3,2%, 7,8% Alkohol und 71,1% Wasser hergestellt wurde. Die Fermentation wurde weiter fortgeführt, bis die Essigsäurekonzentration auf 7,2% angestiegen war.
War die Essigsäurekonzentration auf 7,2% angestiegen, so wurde eine kontinuierliche Fermentation durchgeführt, während die Hinzufügungsgeschwindigkeit des Rohmaterial-Mediums angepasst wurde, um die Essigsäurekonzentration beibehalten zu können.
Die Transformante und der ursprüngliche Stamm wurden hinsichtlich der Hinzufügungsgeschwindigkeit des Rohmaterial-Mediums, d. h. der Hinzufügungsgeschwindigkeit (proportional zur Produktionsgeschwindigkeit), verglichen. Die Resultate sind in Tabelle 2 angeführt.
Weiters wurden die Transformante und der ursprüngliche Stamm auch hinsichtlich der Fähigkeit der Essigsäure-Fermentation verglichen, als die Hinzufügungsgeschwindigkeit im Fall der Transformante auf beinahe das Äquivalent jener des ursprünglichen Stamms zum Zeitpunkt der kontinuierlichen Fermentation mit einer Essigsäurekonzentration von 7,2% angepasst wurde. Die Resultate sind in Tabelle 3 angeführt. Tabelle 2

Essigsäure Bakterien Hinzufügungs

konzentration konzentration geschwindigkeit

(%) (OD660) (g/h)

Ursprünglicher Stamm 7,17 0,675 87,2

Transformante 7,23 0,675 98,5

Tabelle 3

Essigsäure Bakterien Hinzufügungs

konzentration konzentration geschwindigkeit

(%) (OD660) (g/h)

Ursprünglicher Stamm 7,24 0,712 87,1

Transformante 7,64 0,695 91,1
Basierend auf den Resultaten in Tabelle 2 wurde gezeigt, dass auch im Fall kontinuierlicher Essigsäure-Fermentation die Produktivität (Hinzufügungsgeschwindigkeit des Rohmaterial-Mediums) im Fall der Transformante im Vergleich mit dem ursprünglichen Stamm höher und besser war.
Weiters wurde basierend auf den Resultaten in Tabelle 3 gezeigt, dass bei der Durchführung einer kontinuierlichen Essigsäure-Fermentation bei konstanter Produktivität (Hinzufügungsgeschwindigkeit des Rohmaterial-Mediums) die Transformante die kontinuierliche Essigsäure-Fermentation im Vergleich zum ursprünglichen Stamm mit höherer Essigsäurekonzentration durchführen konnte und eine bessere Resistenz gegen Essigsäure aufwies.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Gen mit einer wachstumsfördernden Funktion bereit. Ein Stamm, der durch die Verwendung des Gens erhalten werden kann, besitzt eine verbesserte Wachstumsfunktion (Resistenz gegen Essigsäure) in Gegenwart einer hohen Essigsäurekonzentration, eine verkürzte Wachstumsinduktions-Periode und eine verbesserte Resistenz gegen Essigsäure. Solch ein Stamm kann zur hochgradig effizienten Produktion von Essig mit einer hohen Essigsäurekonzentration verwendet werden. Daher ist die vorliegende Erfindung für die hochgradig effiziente Produktion von Essig mit einer hohen Essigsäurekonzentration von Nutzen.
Sequenzfreier Text
Seq.-ID Nr. 3, 4, 6 und 7: synthetische Oligonucleotide
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Protein der folgenden (A) oder (B): (A) Protein, das die Aminosäuresequenz umfasst, die in Seq.-ID Nr. 2 dargestellt ist, oder (B) Protein, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die von der Aminosäuresequenz, die in Seq.-ID Nr. 2 dargestellt ist, durch Deletion von 1 bis 10 Aminosäuren, Addition von 1 bis 10 Aminosäuren oder Substitution von 1 bis 10 Aminosäuren abgeleitet ist, und das über eine wachstumsfördernde Funktion verfügt.
DNA, die für das folgende Protein (A) oder (B) kodiert: (A) Protein, das die Aminosäuresequenz umfasst, die in Seq.-ID Nr. 2 dargestellt ist, oder (B) Protein, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die von der Aminosäuresequenz, die in Seq.-ID Nr. 2 dargestellt ist, durch Deletion von 1 bis 10 Aminosäuren, Addition von 1 bis 10 Aminosäuren oder Substitution von 1 bis 10 Aminosäuren abgeleitet ist, und das über eine wachstumsfördernde Funktion verfügt.
DNA der folgenden (A) oder (B): (A) DNA, welche die Nucleotidsequenz von Nucleotid Nr. 180 bis 1376 in der in Seq.-ID Nr. 1 dargestellten Nucleotidsequenz umfasst, oder (B) DNA, die in der Lage ist, sich unter stringenten Bedingungen an eine DNA zu hybridisieren, die aus einer Sequenz besteht, die zur Nucleotidsequenz von Nucleotid Nr. 180 bis 1376 in der in Seq.-ID Nr. 1 dargestellten Nucleotidsequenz komplementär ist, und für ein Protein kodiert, das über eine wachstumsfördernde Funktion verfügt.
Rekombinanter Vektor, der DNA nach Anspruch 2 oder 3 umfasst.
Transformante, die mit dem rekombinanten Vektor nach Anspruch 4 transformiert ist.
Mikroorganismus, der über eine verstärkte wachstumsfördernde Funktion verfügt, worin die Zahl der Kopien der DNA nach Anspruch 2 oder 3 innerhalb einer Zelle amplifiziert wird.
Mikroorganismus nach Anspruch 6, der ein Essigsäurebakterium ist, das zum Genus Acetobacter oder zum Genus Gluconacetobacter gehört.
Verfahren zur Produktion von Essig, welches das Kultivieren des Mikroorganismus nach Anspruch 6 oder 7 in einem Medium umfasst, das Alkohol enthält, und den Mikroorganismus dazu bringt, im Medium Essigsäure zu erzeugen und zu akkumulieren.