SK285664B6 - Purifikovaná a izolovaná transkripčná regulačná DNA škrečacieho EF-1alfa, hostiteľské bunky, vektory, chimerické polynukleotidy a plazmidy - Google Patents
Purifikovaná a izolovaná transkripčná regulačná DNA škrečacieho EF-1alfa, hostiteľské bunky, vektory, chimerické polynukleotidy a plazmidy Download PDFInfo
- Publication number
- SK285664B6 SK285664B6 SK118-99A SK11899A SK285664B6 SK 285664 B6 SK285664 B6 SK 285664B6 SK 11899 A SK11899 A SK 11899A SK 285664 B6 SK285664 B6 SK 285664B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- dna
- seq
- plasmid
- fragment
- nucleic acid
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 124
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims abstract description 67
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims abstract description 31
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 31
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 title claims abstract description 26
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 title claims abstract description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 188
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 86
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 46
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims abstract description 34
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims abstract description 34
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 14
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 24
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 claims description 18
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 claims description 15
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 146
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 90
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 29
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 29
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 26
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 description 20
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 15
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 13
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 12
- 101150003085 Pdcl gene Proteins 0.000 description 12
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 12
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 12
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 102000006433 Chemokine CCL22 Human genes 0.000 description 8
- 108010083701 Chemokine CCL22 Proteins 0.000 description 8
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 8
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 8
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 8
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 8
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 8
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 7
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 5
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 4
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 4
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 4
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 4
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 108010024976 Asparaginase Proteins 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100031538 Phosphatidylcholine-sterol acyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 102000017143 RNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010013845 RNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 2
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 108010052418 (N-(2-((4-((2-((4-(9-acridinylamino)phenyl)amino)-2-oxoethyl)amino)-4-oxobutyl)amino)-1-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-1-oxoethyl)-6-(((-2-aminoethyl)amino)methyl)-2-pyridinecarboxamidato) iron(1+) Proteins 0.000 description 1
- BOFUZZAQNVYZFF-UHFFFAOYSA-N 2-(3-chlorophenyl)-3-methylmorpholine Chemical compound CC1NCCOC1C1=CC=CC(Cl)=C1 BOFUZZAQNVYZFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710151413 Chitinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710151415 Chitinase 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100037328 Chitotriosidase-1 Human genes 0.000 description 1
- 101710132290 Chitotriosidase-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 235000008733 Citrus aurantifolia Nutrition 0.000 description 1
- 241000699798 Cricetulus Species 0.000 description 1
- 241000699679 Cricetulus migratorius Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 101710107327 Endochitinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710107425 Endochitinase 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100040004 Gamma-glutamylcyclotransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100027377 HBS1-like protein Human genes 0.000 description 1
- 101000886680 Homo sapiens Gamma-glutamylcyclotransferase Proteins 0.000 description 1
- 101001009070 Homo sapiens HBS1-like protein Proteins 0.000 description 1
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 1
- 101100460719 Mus musculus Noto gene Proteins 0.000 description 1
- PKFBJSDMCRJYDC-GEZSXCAASA-N N-acetyl-s-geranylgeranyl-l-cysteine Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CSC[C@@H](C(O)=O)NC(C)=O PKFBJSDMCRJYDC-GEZSXCAASA-N 0.000 description 1
- 101100028920 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cfp gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L Phosphate ion(2-) Chemical compound OP([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004353 Polyethylene glycol 8000 Substances 0.000 description 1
- 102000057361 Pseudogenes Human genes 0.000 description 1
- 108091008109 Pseudogenes Proteins 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- 102100039832 Ribonuclease pancreatic Human genes 0.000 description 1
- 101710123428 Ribonuclease pancreatic Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710136739 Teichoic acid poly(glycerol phosphate) polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 235000011941 Tilia x europaea Nutrition 0.000 description 1
- 102000006290 Transcription Factor TFIID Human genes 0.000 description 1
- 108010083268 Transcription Factor TFIID Proteins 0.000 description 1
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 229920004482 WACKER® Polymers 0.000 description 1
- 101100187345 Xenopus laevis noto gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000003990 capacitor Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000004922 lacquer Substances 0.000 description 1
- 239000004571 lime Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 235000019446 polyethylene glycol 8000 Nutrition 0.000 description 1
- 229940085678 polyethylene glycol 8000 Drugs 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 108091029842 small nuclear ribonucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- ZNJHFNUEQDVFCJ-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+].OCCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 ZNJHFNUEQDVFCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Purifikovaná a izolovaná transkripčná regulačná DNA škrečacieho EF-1alfa zvolená z a) DNA obsahujúcej sekvenciu nukleovej kyseliny uvedenú v SEQ ID NO: 1, b) DNA obsahujúcej časť sekvencie nukleovej kyseliny uvedenej v SEQ ID NO: 1, ktorá je schopnápodporovať transkripciu génu operatívne pripojeného k regulačnej DNA, c) DNA obsahujúcej oblasť od nukleotidu 2114 do nukleotidu 3656 uvedenej v SEQ ID NO: 1, d) 11,7 kb regulačnej DNA sekvencie škrečacieho EF-1alfa v plazmide pDEF14, ktorý je uložený v zbierke ATCC pod prírastkovým číslom 98 398, e) DNA obsahujúcej sekvencie nukleovej kyseliny uvedenej v SEQ ID NO: 28, f) škrečacej regulačnej DNA sekvencie, ktorá hybridizuje s DNA opísanou v SEQ ID NO: 1 za podmienok zahŕňajúcich konečné premytie v tlmivom roztoku obsahujúcom 2X SSC a 0,1 % SDS pri 65 °C, g) DNA obsahujúcej 1,56 kb od 5' do iniciačného ATG kodónu v SEQ ID NO: 1. Hostiteľskébunky, vektory, chimerické polynukleotidy a plazmidy.
Description
Vynález sa týka regulačných sekvencií DNA pochádzajúcich z škrcčacicho EF-Ια. Ďalej sa vynález týka expresných konštruktov obsahujúcich uvedenú regulačnú DNA, hostiteľských buniek transformovaných alebo transfekovaných touto regulačnou DNA a spôsobov zvyšovania transkripcie génu pri použití tejto regulačnej DNA. Vynález sa takisto týka expresných konštruktov obsahujúcich uvedenú regulačnú DNA operatívne pripojenú k špecifickým génovým sekvenciám.
Doterajší stav techniky
Transkripcia akéhokoľvek daného eukaryotického génu sa uskutočňuje pomocou jedného z troch enzýmov, RNA polymeráz, z ktorých každý účinkuje na konkrétny podsúbor génov. Zatiaľ čo transkripcia veľkých ribozómových RNA prebieha pomocou RNA polymerázy I a malá ribozómová RNA a tRNA sa prepisujú RNA polymerázou III, DNA sekvencie kódujúce proteíny a väčšina malých jadrových RNA sú transkribované RNA polymerázou II. Pre každý typ génu transkripcia vyžaduje interakciu príslušnej polymerázy s promótorovými sekvenciami génu a vznik stabilného transkripčhého iniciačného komplexu. Všeobecne je možné uviesť, že transkripcia od ktoréhokoľvek z troch polymeráz tiež vyžaduje interakciu určitého väzbového faktora s promótorovou sekvenciou a rozoznanie väzbového faktora pomocou druhého faktora, ktorý tak umožní interakciu polymerázy so sekvenciou génu. Zatiaľ čo tento mechanizmus je minimálnou požiadavkou transkripcie katalyzovanej RNA polymerázami I a III, proces vedúci k transkripcii katalyzovanej RNA polymerázou II je zložitejší.
Vzhľadom na rozsiahle množstvo génových sekvencií transkribovaných RNA polymerázou II a vzhľadom na skutočnosť, že regulačné schémy pre tieto gény sú vysoko premenlivé v rovnakej bunke a odlišujú sa tiež pre každú jednotlivú bunku, je transkripcia katalyzovaná RNA polymerázou II okrem iných interakcií iných väzbových proteínov k regulačným sekvenciám DNA, iným ako je promótor, ovplyvnená väzbou mnohých transkripčných faktorov v iniciačnom komplexe. Tieto iné väzbové proteíny môžu slúžiť na aktiváciu transkripcie nad bazálnu hladinu alebo úplne potláčajú transkripciu. Pripojenie represora je možné takisto považovať za prostriedok ako zabrániť aktivácii, vzhľadom na to, že bazálna transkripčná hladina v prípade vyšších cukaryotov jc normálne veľmi nízka. Na druhej strane, aktivácia je obvyklou konečnou odpoveďou na určitý fyziologický signál a vyžaduje buď odstránenie represorového väzbového proteínu alebo aiteráciu v chromatínovej štruktúre, aby sa umožnil vznik aktívneho transkripčného iniciačného komplexu.
Jadrom vzniku transkripčného komplexu a nevyhnutnou podmienkou pre bazálnu hladinu expresie génu je promótorová sekvencia, ktorá je označovaná ako „TATA box“ a ktorá je umiestená pred transkripčným štartovacím miestom polymerázy II TATA box je väzbovým miestom pre všadeprítomný transkripčný faktor označovaný ako TFIID, ale ako už bolo uvedené, transkripcia od promótorovej sekvencie je v prípade väčšiny génov silne ovplyvnená ďalšími regulačnými oblasťami DNA, ktoré môžu zosilňovať alebo potláčať transkripciu génu. Elementy DNA tohto typu sú v rôznych polohách vzhľadom na kódujúcu sekvenciu v géne a vzhľadom na TATA box. Tieto ďalšie transkripčná regu lačné elementy často pracujú tkanivovo alebo bunkovo špecificky.
Pri expresii rekombinantných proteínov je veľmi dôležité zvoliť regulačnú DNA, ktorá obsahuje sekvenciu promótora TATA a ďalšie regulačné elementy kompatibilné s transkripčným aparátom hostiteľskej bunky. Z tohto dôvodu sa obvykle dáva prednosť regulačným DNA, ktoré sú endogénne vzhľadom na zvolenú hostiteľskú bunku. Značný úspech bol tiež dosiahnutý pri použití regulačnej DNA odvodenej od sekvencií vírusového genómu, vzhľadom na to, že rozmedzie hostiteľov je v prípade vírusov široké a že bola dokázaná aktivita vírusových regulačných DNA v rôznych typoch bunky. Ako príklad vírusových regulačných DNA, ktoré sa bežne používajú na expresiu rekombinantného proteínu, je možné uviesť promótor/zosilňovač raného génu SV40 [Dijkema et al., EMBO J. 4: 761 (1985)], koncovú dlhú repetíciu DNA vírusu Rousovho sarkómu [Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 6777 (1982b)], fragmenty hovädzieho papilómavírusu [Sarver et al., Mol. Celí. Biol. 1: 486 (1981)] a elementy promótora/zosilňovača ľudského cytomegalovírusu [Boshart et al., Celí. 41: 521 (1985)]. Napriek širokému rozmedziu bunkových typov, na ktorých bola demonštrovaná funkčnosť vírusových regulačných DNA, Je možné, že existujú nevírusové DNA elementy promótora/zosilňovača, ktoré umožňujú zvýšiť transkripciu rekombinantného proteínu v špecifických bunkových líniách prostredníctvom účinnejšieho využitia transkripčného aparátu hostiteľskej bunky.
V tomto odbore teda existuje potreba identifikovať sekvencie regulačnej DNA promótora/zosilňovača, ktoré fungujú v homológnych a hetcrológnych typoch buniek, pričom účelom je zvýšenie expresie rekombinantného proteínu a vysoký výťažok požadovaného proteínového produktu. Mimoriadne dôležitou potrebou je identifikovať takc regulačné DNA promótora/zosilňovača, ktoré môžu byť s vysokou účinnosťou využité v cicavčích bunkách, s cieľom zvýšiť produkciu rekombinantných proteínov in vitro, ktoré sú glykolyzované podobným spôsobom, ako je to v prípade gíykozylačných profilov, ktoré sú výsledkom expresie in vivo. V prípade takto exprimovaných proteínov pri terapeutickom alebo profylaktickom podávaní existuje menšia pravdepodobnosť, že budú antigénne a väčšia pravdepodobnosť, že budú fyziologicky účinné. Regulačné oblasti DNA tohto typu sú tiež ľahko inzertovateľné do hostiteľských buniek s cieľom zvýšiť expresiu génov, ktoré sú endogénne vzhľadom na hostiteľské bunky alebo gény predtým zavedené do genómu hostiteľskej bunky, spôsobmi, ktoré sú v tomto odbore dobre známe a rutinne využívané.
Podstata vynálezu
Predmetom vynálezu je v základnom rozpracovaní purifikovaná a izolovaná transkripčná regulačná DNA škrečacieho EF-1 a zvolená z:
a) DNA obsahujúcej sekvenciu nukleovej kyseliny uvedenú v SEQ ID NO: 1,
b) DNA obsahujúcej časť sekvencie nukleovej kyseliny uvedenej v SEQ ID NO: 1, ktorá je schopná podporovať transkripciu génu operatívne pripojeného k regulačnej DNA,
c) DNA obsahujúcej oblasť od nukleotidu 2114 do nukleotidu 3656 sekvencie uvedenej v SEQ ID NO: 1,
d) 11,7 kb regulačnej DNA sekvencie škrečacieho EF-l<x v plazmide pDEF14, ktorý je uložený v zbierke ATCC pod prírastkovým číslom 98 398,
e) DNA obsahujúcej sekvencie nukleovej kyseliny uvedenú v SEQ ID NO: 28,
f) škrečacej regulačnej DNA sekvencie, ktorá hybridizuje s DNA opísanou v SEQ ID NO: 1 za podmienok zahŕňajúcich konečné premytie v tlmivom roztoku obsahujúcom 2X SSC a 0,1% SDS pri 65°C,
g) DNA obsahujúcej 1,56 kb od 5' do iniciačného ATG kodónu v SEQ ID NO: 1.
Purifikované a izolované polynukleotidy odvodené z buniek škrečka podľa vynálezu regulujú transkripciu génu. Tieto polynukleotidy zahrnujú regulačné DNA sekvencie od 5' konca do translátovanej oblasti gén EF-lct vaječníka čínskeho chrčka. Prednostná DNA podľa vynálezu je označovaná ako CHEF1 regulačná DNA a obsahuje približne 3,7 kb DNA, ktorá siaha od reštrikčného miesta Spel do iniciačného metionínového kodénu (ATG) proteínu EF-la. Predmetom vynálezu sú takisto polynukleotidy s menej ako 3,7 kb, ak sú tieto menšie fragmenty polynukleotidov schopné zvyšovať transkripciu operatívne pripojeného génu. Aktívne fragmenty DNA podľa vynálezu, definované schopnosťou regulovať (to znamená zosilňovať) transkripciu génu, sú ľahko identifikovateľné delečnými štúdiami, ktoré sú v tomto odbore dobre známe a bežne využívané. Regulačná DNA podľa tohto vynálezu zahrnuje polynukleotidy izolované z prírodných zdrojov, ako bunkových kultúr, ako aj polynukleotidy produkované enzymatickými alebo čisto chemickými syntetickými postupmi. Podľa jednej realizácie teda vynález poskytuje spôsob prípravy CHEF1 DNA z genémovej knižnice. Alternatívne môže byť DNA pripravená cnzymatickou syntézou, ktorá napríklad využíva polymerázové reťazcové reakcie (PCR), alebo čisto chemickou syntézou, pri ktorej sa postupne pridávajú jednotlivé nukleotidy alebo sa hybridizujú a ligujú prekrývajúce sa oligonukleotidy. Najvýhodnejšia DNA sekvencia je opísaná v SEQ ID NO: 1. Predmetom vynálezu sú ďalej DNA sekvencie, ktoré pri stringentných podmienkach hybridizujú s DNA opísanou v SEQ ID NO: 1. Stringentné podmienky zahrnujú premytie v pufri obsahujúcom asi 2X SSC a asi 0,1% SDS pri asi 65 °C alebo podmienky ekvivalentné.
Predmetom vynálezu je ďalej DNA plazmid obsahujúci regulačné polynukleotidy CHEF1. Plazmidy podľa vynálezu takisto môžu obsahovať DNA sekvencie kódujúce proteín, ktorý je predmetom záujmu, alebo RNA produkt, ktorý je predmetom záujmu, operatívne pripojené k polynukleotidovej sekvencií CHEF1. Ďalej je predmetom vynálezu hostiteľská bunka transformovaná, transfekovaná a/alebo elektroporovaná polynukleotidom alebo plazmidom podľa vynálezu. Plazmidová DNA podľa vynálezu môže byť zavedená do genómu hostiteľskej bunky alebo sa v bunke môže vyskytovať vo forme uzatvoreného kružnicového plazmidu. Ako prednostné plazmidy podľa vynálezu, ktoré sú mimoriadne prístupné na zavedenie požadovanej DNA sekvencie, je možné uviesť plazmidy pDEF14 a pDEF2. Bakteriálna hostiteľská bunka transformovaná pDEF14 bola uložená v zbierke Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 9.apríla 1997 pod prírastkovým číslom 98398 a bakteriálna hostiteľská bunka transformovaná pDEF2 bola uložená v zbierke Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 4. marca 1997 pod prírastkovým číslom 98343.
Predmetom vynálezu je tiež lineárny DNA vektor obsahujúci polynukleotid CHEF1. Vektor podľa vynálezu je možné získať z vírusového zdroja alebo ho je možné syntetizovať in vitro. Predmetom vynálezu jc ďalej hostiteľská bunka transfekovaná alebo elektroporovaná do sekvencií lineárneho vektora. DNA tohto typu je mimoriadne užitočná na expresiu sekvencie heterológneho génu operatívne pripojenej k DNA sekvencií CHEF1 alebo na miestne cielenú homológnu rekombináciu, pri ktorej sekvencia CHEF1 môže byť zavedená do genómu hostiteľskej bunky s cieľom modulácie expresie operatívne pripojenej sekvencie.
Ďalej je predmetom vynálezu molekula chimerickej rekombinantnej DNA, kde je CHEF1 DNA operatívne pripojená (to znamená podnecuje transkripciu) k sekvencií génu kódujúcej požadovaný proteínový produkt. Chimerické molekuly sú všeobecne molekulami, ktoré obsahujú domény, ktoré sa normálne nevyskytujú v spojení s prostredím divokého typu. Chimerická DNA podľa vynálezu môže zahrnovať časť alebo celú regulačnú DNA CHEF1 v asociácii s DNA sekvenciou, ktorá je odlišná od génu pre škrečací proteín EF-la. Ako proteínové štruktúry kódované chimerickými molekulami je možné uviesť fyziologicky aktívne proteíny, časti alebo podjednotky aktívnych proteínov, ako aj markerové alebo reportérové proteíny. Polynukleotidová sekvencia kódujúca proteínový produkt môže byť odvodená od komplementárnej DNA (cDNA), genómovej DNA, syntetickej DNA alebo DNA odvodenej kombináciami molekúl týchto typov. Proteínové produkty môžu byť endogénne (to znamená normálne sa nachádzajú v genóme CHO bez transformačného, transfekčného alebo podobného zavedenia DNA) vzhľadom na bunky vaječníka čínskeho chrčka (CHO). Okrem toho proteínové produkty môžu byť kódované exogénnymi zdrojmi, pričom exogénnym zdrojom je zdroj odlišný od genómu bunky CHO, ako je napríklad syntetická DNA. Ako prednostné chimcrickc molekuly podľa vynálezu je možné uviesť molekuly, v ktorých je DNA CHEFI operatívne pripojená k DNA kódujúcej: (i) ťažký reťazec anti-ICAM3 protilátky ICM3, (ii) ľahký reťazec ICM3, (iii) ťažký reťazec anti-CDl 1/CD18 protilátky hu23F2G, (iv) ľahký reťazec hu23F2G, (v) chitinázu, (vi) acetylhydrolázu faktora aktivujúceho doštičky (PAF-AH) a (vii) chemokín odvodený od makrofágu (MDC). Bakteriálne hostiteľské bunky transformované plazmidovou DNA, ktoré obsahujú chimerické molekuly (i) až (vii), boli uložené v zbierke Američan Type Culture Collection 1. apríla 1997 pod prírastkovými číslami: (i) 98381, (ii) 98382, (iii) 98383, (iv) 98384, (v) 98385, (vi) 98386 a (vii) 98387.
Predmetom vynálezu je ďalej hostiteľská bunka transformovaná alebo transfekovaná DNA CHEFI podľa vynálezu. Prednostná hostiteľská bunka podľa vynálezu je odvodená od bunky čínskeho chrčka (Circetulus griseus), o ktorej regulačnej DNA CHEFI by sa predpokladalo, že poskytne vyššiu úroveň expresie proteínu. Predmetom vynálezu sú však tiež ďalšie typy buniek odvodených od iných druhov ako napríklad od buniek arménskeho chrčka (Cricetulus migratoris) alebo sýrskeho (zlatého) chrčka (Mesocricetus auratus), ako aj typy buniek odvodené od buniek iných živočíšnych rodov. Bunky môžu byť získané z pľúc, vaječníka, peritonea, svalov, sleziny, obličiek, melanómu alebo somatického zdroja, ako aj z celého zárodku alebo celého embrya. Hostiteľské bunky podľa vynálezu uvedené skôr, ako aj ďalšie typy buniek, napríklad myelomatické bunkové línie, o ktorých regulačnej DNA CHEFI by sa predpokladalo, že poskytne vysokú úroveň transkripcie, je možné získať zo zbierky Američan Type Culture Collection alebo je možné ich napestovať priamo z živočíšneho zdroja. Rekombinantné molekuly podľa vynálezu, ktoré obsahujú regulačnú DNA CHEFI, umožnia zvýšenú úroveň expresie mRNA operatívne pripojených heterológnych polynukleotidov (to znamená tých, ktoré sa bez transfekčného, transformačného alebo podobného zavedenia v hostiteľskom genóme normálne nenachádzajú). V závislosti od povahy
SK 285664 Β6 polynukleotidy pripojeného k sekvenciám polynukleotidov CHEF1, by zvýšená transkripcia viedla k zvýšeným úrovniam polypeptidov alebo zvýšeným úrovniam rôznych druhov RNA v prípadoch, keď pripojený polynukleotid kóduje napríklad transferovú RNA, ribozomálnu RNA, malú jadrovú RNA a pod. Takýmto druhom RNA tiež môže byť kódujúca RNA komplementárna k mRNA získanej transkripciou endogénnej alebo exogénnej génovej sekvencie. Zvýšená translácia polypeptidu bude nevyhnutne závisieť od prítomnosti vhodných translačných signálov prítomných v mRNA.
Predmetom vynálezu je ďalej spôsob zavádzania DMA CHEF1 do špecifických miest genómovej DNA hostiteľských buniek s cieľom zvýšiť úroveň transkripcie endogénnej génovej sekvencie. Na zavedenie celej alebo časti DNA CHEF1 je možné použiť homológnu rekombináciu. V hostiteľských bunkách, ktoré sú modifikované týmto spôsobom, je DNA CHEF1 operatívne pripojená ku kódujúcim sekvenciám DNA (pozri napríklad medzinárodné prihlášky PCT WO/94/12650, WO 92/20808 a WO 91/09955. Predmetom vynálezu sú teda nevyhnutne tiež sekvencie alterovanej genómovej DNA so zavedenou regulačnou DNA CHEF1.
Alternatívne je predmetom vynálezu hostiteľská bunka, v ktorej je exogénna DNA inzertovaná v susedstve a v operatívnej polohe: vzhľadom na DNA CHEF1 prítomnej v genóme. Hostiteľské bunky tohto typu zahrnujú CHO buky a inzertovaná sekvencia buď nahrádza DNA kódujúcu EF-la, alebo je táto sekvencia vložená medzi regulačnú DNA CHEF1 a DNA kódujúcu EF-Ια. Do rozsahu vynálezu tiež patria aj iné hostiteľské bunky než CHO, do ktorých genómu bola predtým inzertovaná DNA CHEF1 a potom do operatívne pripojenej polohy inzertovaná ďalšia DNA.
Predmetom vynálezu je ďalej spôsob zvyšovania transkripcie požadovaného génu, ktorého podstata spočíva v tom, že sa do hostiteľskej bunky zavedie polynukleotid zahrnujúci škrečaciu regulačnú sekvenciu EF-Ια. tak, že sa táto regulačná sekvencia začlení do genómovej DNA hostiteľa v operatívne pripojenej polohe vzhľadom na požadovaný gén. Ďalej do rozsahu vynálezu patrí spôsob zvyšovania transkripcie požadovaného génu, ktorého podstata spočíva v tom, že sa do hostiteľskej bunky zavedie polynukleotid zahrnujúci škrečaciu regulačnú oblasť EF-Ια. a zameriavaciu oblasť, pričom táto zameriavacia oblasť je zostavená tak, že umožňuje integrovať regulačnú oblasť v mieste operatívne pripojenom k požadovanému génu kódujúcemu proteín odlišnému od EF-Ια. Do rozsahu vynálezu tiež patri spôsob zvyšovania transkripcie génov, ktoré sú endogénne vzhľadom na CHO bunky, ako aj spôsob zvyšovania transkripcie génov, ktoré sú exogénne vzhľadom na CHO bunky.
Rekombinantné molekuly podľa vynálezu je možné využívať na produkciu transgénnych živočíchov, pri ktorej sa do vyvíjajúceho sa zárodku alebo somatickej bunky živočícha zavedie chimerická rekomibinantná DNA obsahujúca DNA CHEF1 operatívne pripojenú k sekvencií DNA, ktorá je predmetom záujmu. Chimerické rekombinantné molekuly je možné zavádzať napríklad mikroinjekciami a ak sa použijú zárodočné bunky, môžu všetky bunky výsledného živočícha obsahovať rekombinantnú DNA podľa vynálezu. Alternatívne je možné chimerickú DNA podľa vynálezu zavádzať do buniek embrya a v tomto prípade DNA podľa vynálezu môže byť obsiahnutá vo veľkom počte buniek výsledného živočícha.
DNA CHEF1 je takisto užitočná pri identifikácii blízko príbuzných regulačných oblasti DNA, ktoré môžu poskytovať expresiu génu vyššiu a dlhodobejšiu, ako akú umožňuje
CHEF1. Podobne, znalosť sekvencií DNA CHEF1 umožní zostrojiť syntetické DNA buď syntézou de novo alebo jednoduchou alebo niekoľkonásobnou modifikáciou sekvencií CHEF1, pričom výsledné syntetické DNA budú mať sekvencie podobné sekvencií CHEF1, ale budú schopné poskytnúť vyššie úrovne transkripcie génu.
Nasleduje podrobnejší opis vynálezu.
Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcich príkladoch realizácie. V príklade 1 je opísané klonovanie škrečacieho génu EF-Ια. a príbuznej regulačnej DNA CHEF1. Príklad 2 sa týka subklonovania a sekvenčnej analýzy regulačnej oblasti CHEF1. V príklade 3 jc charakterizovaný polynukleotid promótora CHEF1 a v príklade 4 je opísaný spôsob zostrojenia rôznych expresných vektorov obsahujúcich DNA CHEF1. V príklade 5 je opísané transfekčné stanovenie na zistenie účinnosti regulačnej DNA CHEF1. V príklade 6 je podrobne popísané porovnanie úrovní expresie rekombinantného proteínu pri použití buď regulačnej DNA CHEF1 alebo promótora cytomegalovírusu (CMV). V príklade 7 sú skúmané rozdiely v regulačnej kapacite DNA CHEF1 s rôznymi dĺžkami.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Klonovanie CHEF1
Pri pokuse izoloval škrečaci homológ ľudského génu EF-Ια sa DNA genómová knižnica buniek vaječníka čínskeho chrčka (CHO-K1) (Stratagene, la Jolla, CA, USA), podrobí sereeningu s cDNA pre ľudský EF-la.
Knižnica CHO-K1, čiastočne štiepená Sau3A v klonovacom vektore Eambda F1X(R)II, bola získaná od firmy Stratagene (La Jolla, CA, USA) v hostiteľskej bunke kmeňov XL-l-Blue MRA a XLl-Blue MRA (P2). Hostiteľské bunky sa pripravia podľa protokolu odporučeného výrobcom s modifikáciami, ktoré sú stručne opísané ďalej.
Bunky z glycerolového zásobného roztoku sa v prúžkoch nanesú na LB misky, ktoré neobsahujú žiadne antibiotikum. Pre inokulačné kvapalné LB médium sa vyberú jednotlivé kolónie a nechajú sa rásť do neskorej logaritmickej fázy a optickej hustoty OD600 asi 0,9. Potom sa bunky skladujú podľa protokolu navrhnutého výrobcom a/alebo bezprostredne použijú spôsobom opísaným ďalej.
Pri príprave kultúr na ďalšiu kultiváciu sa jednotlivé kolónie zoberú z misiek pripravených opísaným spôsobom a použijú sa na inokuláciu. Bunky sa pestujú v 50 ml LB média doplneného 0,5 ml IM síranu horečnatého a 1 ml 10 % maltózy v deionizovanej vode. Bunky sa pestujú cez noc pri 30 °C a zozbierajú centrifugáciou v stolnej centrifúge (2000 min.'1 počas 5 minút pri teplote miestnosti) a resuspendujú v 10 mM sírane horečnatom pri OD60o 0,5.
Fág lambda dodaný výrobcom sa zriedi v SM pufri (1 liter zásobného roztoku obsahuje 5,8 g chloridu sodného, 2,0 g hydrátu síranu horečnatého, 50 ml IM Tris HC1, pH 7,5 a 5 ml 2 % (hmotnosť/objem) želatíny) na 10- až 105násobné zriedenie 2 μΐ roztoku s každou koncentráciou sa pridajú k 400 μΐ hostiteľských buniek v 10 mM síranu horečnatom (OD600 asi 0,5). Výsledná zmes sa inkubuje 15 minút pri 37 °C, aby sa umožnilo pripojenie fágu k bunkám a pridá sa k nej vrchný agar (0,75% LBM agaróza s teplotou 48 °C). Každá zmes sa dvojmo nanesie na LBM agarózové misky. Z výsledkov je zrejmý titer 3 x 106 jednotiek tvoriacich plak (pfuj/μΐ fágového zásobného roztoku.
Pripravia sa čerstvo hostiteľské bunky pri použití opísaného postupu pred prehľadávaním knižnice. Približne 50
000 fágových pfu sa pridá k 600 μΐ hostiteľských buniek (s
OD50fJ približne 0,5) s 6,5 ml 0,75% LBM agarózy s teplotou 48 °C. Zmes sa rozprestrie na agarózové misky, ktoré sa potom inkubujú približne 8 hodín pri 37 °C. Misky sa potom 5 hodín chladia pri 4 °C, aby sa zabránilo prilepeniu vrchnej agarózy ku krycej vrstve nitrocelulózy. Na misky sa umiestia membrány BA-85 s veľkosťou pórov 0,45 μτη (S+S, Keene, NH) a v prenose sa pokračuje počas 2 minút. Membrány sa z misiek odstránia a prenesená DNA sa denaturuje 2 minúty v 1,5M chloride sodnom/0,5M hydroxide sodnom. Filtre sa neutralizujú 5 minút v 1,5M chloride sodnom/Ι,ΟΜ Tris-HCl (pH 8,0) a blotujú na papier Whatman 3 MM a zahrievajú sa pri zníženom tlaku pri 80 °C počas asi 1,5 až 2 hodín.
Ako sonda na prehľadávanie knižnice sa použije sekvencia cDNA ľudského EF-Ια [Uetsuki et al., J. Biol. Chem. 264: 5791 až 5798 (1989)], v prípade ktorej sa dokázalo, že vykazuje 95 % zhodu s kódujúcou oblasťou EFla. [Hayashi et al., J. Biochem. 106: 506 až 563, 1989), ktorá sa pripraví nasledujúcim postupom. 1,4 kb sonda ľudského EF-Ια sa získa z plazmidu MO107, pRc/CMV (Invitrogen, San Dlego, CA, OSA) vektora obsahujúceho cDNA ľudského EF-Ια inzertovaného v mieste EcoRI. S cieľom prvého potvrdenia, že plazmid MO 107 obsahuje predpokladanú ľudskú cDNA, sa inzert DNA sekvencuje s 3' a 5' vektorovými primármi.
94-17 AGGCACAGTCGAGGCTGATC (SEQ ID NO: 2) 94-18 TTCCAGGGTCAAGGAAGGCA (SEQ ID NO: 3)
Prvých 263 párov báz inzertu má viac ako 90 % zhodu s publikovanou sekvenciou kódujúcou ľudský EF-Ια a zatiaľ čo pri 3' konci je presné stanovenie namáhavé, malé úseky by mohli byť zhodné s predpokladanou sekvenciou. Súhrne táto zhoda ukazuje, že plazmid kóduje požadovanú sekvenciu.
Celý humánny inzert sa odstráni z plazmidu štiepením EcoRI a pás cDNA s 1,4 kb sa dvakrát podrobí gélovej purifikácii pri použití súpravy QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit podľa pokynov výrobcu. DNA sa cluuje 50 μΐ TE, výsledný roztok sa skoncentruje v zariadení Microcon-10 (Amicon, Beverly, MA, USA) na 25 μΐ, alikvót sa označí 32P-a-dTTP a 32P-a-dCTP pri použití súpravy na značenie Boehringer Mannheim Random Primcd DNA podľa pokynov výrobcu. Značená sonda s purifíkuje pri použití rotujúcej kolóny G50, aby sa odstránili nezačlenené nukleotidy. Pri porovnaní purifikovaná sonda vzhľadom na nepurifíkovaný alikvót vykazuje 46 % zavedenie rádioaktívnej značky a 5 x 103 cpm/min./μΐ (cpm = počet impulzov za minútu).
Nitrocelulózovú membrány pripravené opísaným spôsobom sa skúšajú nasledujúcim postupom. Pripraví sa zásobný roztok prehybridizačného/hybridizačného pufra, ktorý obsahuje 22,5 ml 20X SSC, 30,0 ml 50X Denhardbovho roztoku, 3,0 ml IM fosfátového pufra (pH 6,8) (69 ml IM dihydrogenrosforečnanu sodného, 31 ml IM hydrogenfosforečnanu sodného), 0,75 ml 20 % SDS a 70,75 ml destilovanej vody. S cieľom prehybridizácie sa 1,4 ml 10 mg/ml DNA lososej spermy (Stratagene) varí 5 minút s 0,6 ml destilovanej vody a potom pridá k 7 ml destilovanej vody a 72 ml zásobného roztoku pufra. Filtre sa inkubujú v prehybridizačnom pufri minimálne 2 hodiny pri 65 °C.
S cieľom prehybridizácie sa spoja 30 μΐ sondy, 200 μΐ 10 mg/lnl DNA z lososej spermy a 770 μΐ destilovanej vody. Vzniknutá zmes sa 5 minút varí a pridá sa k 36 ml zásobného pufra s 3 ml destilovanej vody. Z filtrov sa odstráni prehybridizačný roztok a nahradí sa hybridizačným pufrom. Filtre sa inkubujú cez noc pri 65 °C po hybridizácii sa filtre 3 hodiny premývajú pri 65 °C s tromi výmenami puf ra obsahujúceho 2X SSC a 0,1 % SDS a potom na 40 hodín podrobia autorádiografii.
kolónii identifikovaných ako pozitívne sa zachytia do 1 ml SM pufra obsahujúceho 20 μΐ chloroformu. S cieľom vyradiť možné pseudogény, ktorým chýba jeden alebo viac intrónov, sa vytvoria páry PCR primérov tak, aby lemovali vždy dva intróny: priméry 95-136 (SEQ ID NO: 4) a 95-137 (SEQ ID NO: 5) lemujúce intróny 2 a 3; priméry 95-138 (SEQ ID NO: 6) a 95-139 (SEQ ID NO: 7) lemujúce intróny 3 a 4; priméry 95-140 (SEQ ID NO: 8) a 95-141 (SEO ID NO: 9) lemujúce intróny 4 a 5; a priméry 95-142 (SEQ ID NO: 10) a 95-143 (SEO ID NO: 11) lemujúce intróny 6 a 7.
95-136 (SEQ ID NO: 4) GCCACCTGATCTACAAATGT
95-137 (SEQ ID NO: 5) GAGATACCAGCCTCAAATTC
95-138 (SEQ ID NO: 6) ATGTGACCATCATTGATGCC
95-140 (SEQ ID NO: 8) GTTGGAATGGTGACAACATG 95-141 (SEQ ID NO: 9) CAGGTTTTAAAACACCAGTC 95-142 (SEQIDNO: 10) AATGACCCACCAATGGAAGC 95-143 (SEQ ID NO: 11) ACAGCAACTGTCTGCCTCAT
Predpokladaná veľkosť PCR produktov pri použití CHO EF-Ια. DNA templátu je založená na veľkosti a umiestnení intrónov v publikovanej sekvencií ľudského EF-la. Každá PCR reakcia zahrnuje 2 μΐ fágu, 2,5 μΐ každého vhodného páru primérov (100 μ§/ητ1), 2 μΐ 2 mM zmesi dNTP, 2,5 μΐ 10X PCR pufra (Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ, USA), 1,5 μΐ 25mM chloridu horečnatého, 0,125 μΐ Taq polymerázy (5 jednotiek/μΐ) (Perkin Elmer) a 11,8 μΐ destilovanej vody. Ampliftkácia sa uskutočňuje 4 minúty pri 94 °C a potom nasleduje 30 cyklov zahrnujúcich 1 minútu pri 90 °C, 2 minúty pri 50 “C a 4 minúty pri 72 °C. Amplifikačné produkty sa rozdelia na 1,2 % agarózovom géli pri použití IX TAE. V prípade troch zo 47 pozitívnych plakov bolo zistené, že kódujú pravé gény (č. 2, 7 a 40) obsahujúce všetky intróny. Tieto tri pozitívne vzorky sa podrobia tretiemu prehľadávaniu pri použití nasledujúceho postupu. Opísaným postupom sa pripravia miskové kultúry a pre každý z troch pozitívnych plakov sa pripravia zásobné roztoky v zriedeniach 10 až 105.20 až 50 izolovaných plakov z každého zásobného roztoku sa podrobí prehľadávaniu pomocou PCR s nasledujúcimi výsledkami. Kloň č. 2 vykazuje 2 pozitívne plaky (označené ako 2.12 a 2.17) z celkovo 22 plakov podrobených skriningu, kloň č. 7 vykazuje 1 pozitívny plak (označený ako 7.44) z 50 prehľadávaných plakov a kloň 40 vykazuje jeden pozitívny plak (označený ako 40.24) zo 40 plakov podrobených skriningu. Z každej z týchto štyroch vzoriek sa ďalej opísaným spôsobom izoluje fágová DNA.
Hostiteľské bunky XL-1 Blue MRA (P2) sa v prúžkoch navzorkujú na LB agarózové misky a nechajú sa rásť cez noc pri 47 °C. Vyberie sa jediná kolónia, ktorou sa zaočkuje 50 ml LB média (obsahujúceho 0,2 % maltózu a 10 mM síran horečnatý). Kultúra sa nechá rásť cez noc pri 30 °C. Bunky a zozbierajú päťminútovou centrifiigáciou pri teplote miestnosti pri 2000 min.’1 na stolnej centrifúge a resuspendujú sa v 50 ml 10 mM síranu horečnatého. Resuspendované hostiteľské bunky (50 μΐ) sa zmiešajú so 100 μΐ zásobného roztoku každého z pozitívnych fágov a vzniknutá zmes sa inkubuje 15 minút pri 37 °C, aby sa umožnilo pripojenie fágu k bunkám. K zmesi trepanej 2 hodiny pri 37 °C sa pridá asi 500 μΐ LBM média a potom ďalších 200 μΐ hostiteľských buniek. Vzniknutá zmes sa inkubuje ďalších 15 minút pri 37 °C. Pridá sa vrchný agar (8 ml 0,75 %
LBM agarózy s 48 °C) a potom sa zmes nanesie na misky a nechá rásť ccz noc pri 37 °C.
Potom sa ku každej miske pridá 12 ml zried’ovacieho roztoku lambda (10 mM Tris-HCl. pH 7,5, 10 mM síran horečnatý) a miskami sa mierne kýva počas 2 hodín. Zried’ovací roztok sa odstráni a 10 minút centrifuguje pri 400 x g v stolnej centrifúge. K supematantu sa pridá vždy 1 gl RNázy A s koncentráciou 1 mg/ml a DNázy 1 s koncentráciou 1 mg/ml. Vzniknutá zmes sa inkubuje 15 minút pri 37 °C a pridá sa k nej rovnaký objem zrážacieho pufŕa (20 % polyetylénglykol 8000, 2M chlorid sodný, 20 mM TrisHCl, 10 mM síran horečnatý) a výsledná zmes sa 1 hodinu inkubuje na ľade a potom 20 minút centrifuguje pri 8000 x g. Supematant sa odstráni, peleta sa 10 minút suší na vzduchu pri teplote miestnosti, resuspenduje v 500 gl TE, krátko centrifuguje, aby sa odstránili častice a supematant sa prevedie do čistej 1,65 ml skúmavky apitube. Do skúmavky sa pridá asi 2,5 μ 20 % SDS (zmes sa 5 minút inkubuje pri 65 °C) a pridá sa k nej 2,5 gl proteinázy K s koncentráciou 10 mg/ml (inkubácia 1 hodinu pri 65 °C) a 10 gl 5M chloridu sodného. Zmes sa extrahuje raz rovnakým objemom zmesi fenolu a chloroformu a raz rovnakým objemom chloroformu. Po prídavku rovnakého objemu izopropylalkoholu a následnej trojhodinovej inkubácii pri -70 °C sa zmes 15 minút centrifuguje v epifúge pri najvyššej rýchlosti. Získaná peleta sa premyje 70 % etanolom, vysuší na vzduchu a resuspenduje v 100 gl TE.
Príklad 2
Subklonovanie regulačného úseku EF- la
S cieľom stanoviť veľkosť inzertu DNA EF-Ια fágová DNA pripravená spôsobom opísaným v príklade 1 štiepi Nôti a výsledné reštrikčné fragmenty sa rozdelia na 0,6% IX TAF agarózovom géli. Okrem predpokladaných lemujúcich fragmentov lambda s dĺžkou 19 kb a 10 kb, klony 2.12 a 2.17 majú identické profily štiepenia s pásmi s 11 kb a 4,5 kb. Takisto klony 7.44 a 40.24 majú profily štiepenia zhodné s pásmi inzertu s 12 kb a 7 kb, čo spolu s údajmi o štiepení klonov 2.12 a 2.17 dokazuje prítomnosť vnútorného reštrikčného miesta Nôti v DNA EF-Ια. Fragmenty inzertu z klonov 2.12 a 7.44 sa subklonujú nasledujúcim postupom.
Fágová DNA (60 gl) pripravená spôsobom opísaným v príklade 1 sa štiepi Nôti a štiepená DNA sa vyzráža prídavkom 20 gl 3M octanu sodného a 400 gl 100 % etanolu. Vyzrážaná DNA sa zhromaždí centrifugáciou, premyje sa 200 gl 70 % etanolu, suší 15 minút na vzduchu a resuspenduje v 20 gl TE. Suspenzia sa 10 minút zahrieva na 65 °C a pridajú sa k nej 2 gl pufra pre elektroforézu. DNA sa rozdelí elektroforézou na agarózovom géli a pásy s 4,5 kb, 7 kb, 11 kb a 12 kb sa odrežú vo forme agarózových rezov. Z každého agarózového rezu sa pri použití súpravy na extrakciu QTAGEN QIAquick podľa pokynov výrobcu extrahuje DNA. Čistota pásov a koncentrácia sa overí oddelením 5 gl alikvótu z každého izolovaného fragmentu na 0,6 % IX TEA agarózovom géli.
Jednotlivé fragmenty sa oddelene ligujú k pBluescriptSW' štiepenemu Nôti. Pri ligáciách 11 a 12 kb fragmentov sa pred zavedením inzertu fragmentu linearizovaný vektor ošetrí teľacou alkalickou fosfatázou. 2 gl každého ligátu sa použijú pre elektroporáciu 40 gl elektrokompetentných buniek XL-1 Blue. Transformované bunky a nanesú na misky s LBM/carb agarózou so 40 gl 5 % X-gal v dimetylformamide (DMF) a 20 gl 0,lM 1PTG na misku. Bunky sa inkubujú cez noc pri 37 °C a ráno ochladla na 4 °C, aby sa zvýšila intenzita modrej farby.
Pri druhom výbere sa biele kolónie naprúžkujú na misky s agarózou LBM/carb s obsahom X-gal a IPTG opísaným spôsobom a kolónie, ktoré sú nasledujúci deň biele, sa nechajú rásť v 3 ml LBM/carb cez noc pri 37 °C. Plazmidová DNA z bielych kolónii pestovaných cez noc sa pripraví pri použití WIZARD Plus Minipreps DNA Purification Systém (Promega, Madison, WI, USA) podľa protokolu navrhnutého výrobcom.
Reštrikčná analýza izolovanej plazmidovej DNA ukáže, že 4,5 kb, 7 kb a 12 kb fragment sa úspešne ligoval k vektoru pBluteseript SW a výsledné plazmidy sa označia ako pSK/EF. 1.4.5., PSK/EF1.7 apSK/EF1.12.
Každý z plazmidov sa pripraví pri použití súpravy Q1AGEN midi prep kit podľa protokolu navrhnutého výrobcom. PCR sa podrobí každý z nových vektorov, vytitruje sa templátová DNA a použijú sa primáry kódujúce oblasti (SEO ID NO: 4 až 11, ktoré sa používajú v pároch spôsobom opísaným pre selekciu pseudogénov, ktorým chýba jeden alebo väčší počet rôznych intrónov), Titrácia sa uskutočňuje po tom, ako sa pri vysokých koncentráciách zisti, že všetky tri fragmenty obsahujú úplnú oblasť pre EFΊα, čo naznačuje možnú krížovú kontamináciu troch plazmidových prípravkov. Pri titrácii sa PCR uskutočňuje v reakčnej zmesi obsahujúcej 2,5 gl templátovej DNA s koncentráciou 0,001, 0,01, 0,1, 1 alebo 10 ng/gl a zahrnujúcej 2,5 gl 10X PCR pufra (Perkin Elmer), 2,0 gl 2mM zmesi dNTP, 1,5 gl 25 mM chloridu horečnatého, 0,125 gl Tag polymerázy (Perkin Elmer) a 11,4 gl destilovanej vody. Amplifikácia sa uskutočňuje pri nasledujúcich podmienkach; 4 minúty pr 94 °C a potom 30 cyklov, z ktorých každý zahrnuje 1 minútu pri 90 °C, 2 minúty pri 50 °C a 4 minúty pri 72 °C. Výsledky ukazujú, že úplná oblasť pre EFΊα je umiestená v 4,5 kb a 7 kb fragmente.
Pre každý inzert sa pri použití súpravy Stratagene FLASH Nonradioactive Gene Mapping Kit určenej na použitie s vektorom Lambda FIX I1!R) zostrojí reštrikčná mapa. Namiesto fágovej DNA sa však použije plazmidová DNA vyštiepená Nôti z vektorov pSK opísaným spôsobom. Na zostrojenie mapy sa v podstate použije protokol navrhnutý výrobcom. Tento postup je možné stručne opísať takto: plazmidy sa sckvencujú pri použití primáru Ml3 (SEQ ID NO: 12) a reverzného priméru M13 (SEQ ID NO: 13) (komplementárneho k oblastiam v mnohočetnej klonovacej oblasti pBluescript SW4), aby sa lokalizovali sekvencie primérov T3 (SEQ ID NO: 14) a T7 (SEQ ID NO: 15) vnútorných vzhľadom na miesto Nôti pre každý inzert.
| M13 | GTAAAACGACGGCCAGT | (SEQ ID NO: 12) |
| M13rcv | GGAAACAGCTATGACCATG | (SEQ1D NO: 13) |
| T3 | AATTAACCCTCACTAAAGGG | (SEQIDNO: 14) |
| T7 | GTTAATACGACTCACTATAGGGC | (SEQ ID NO: 15) |
Priméry 17 a 13 sa použijú ako sondy na protokol zostavenia génovej mapy. Keďže sa ukázalo, že inzert ET-la obsahuje vnútorné miesto Nôti, predpokladá sa, že páry fragmentov (4,5 kb/11 kb a 7 kb/12 kb) zahrnujú jednu alebo druhú sekvenciu primérov a teda sa stanovilo, že 4,5 a 12 kb inzert obsahuje sekvenciu priméru 17, zatiaľ čo 7kb inzert má sekvenciu 13.
4,5 a 7 kb inzerty obsahujúce oblasť pre EF-Ια sa vyštiepia z vektora štiepením Nôti. Štiepená DNA sa oddelí na agarózovom géli a oddelené fragmenty sa z gélu odrežú.
každého agarózováho rezu sa pri použití súpravy na extrakciu QIAGEN QIAguick podľa pokynov výrobcu izoluje
DNA. Mapovanie sa uskutočňuje pri použití siedmich rôzSK 285664 Β6 nych enzýmov pri čiastočnom reštrikčnom štiepení. Reakčné produkty sa rozdelia na agarózovom géli, DNA sa prevedie na nylonovú membránu Duralon-UV a skúša sa pri použití oligonukleotidov 13 a 17 ako sondy. Stanoví sa veľkosť pásov a zostroja sa reštrikčné mapy.
Plazmid pSK/EF1.7 sa sekvencuje s vnútornými parametrami pôvodne skonštruovanými pre PCR prehľadávanie (SEQ ID NO: 4 až 11 (predtým opísané priméry 95-136 až 95-143)), čím sa overí, že sekvenciou génu je sekvencia predtým identifikovaného proteínu. Stanoví sa orientácia kódujúcej oblasti a zostroja sa ďalšie priméry, ktoré umožňujú sekvencovanie k vnútornému miestu Notl. Stanovi sa sekvencia celej kódujúcej oblasti, ktorá sa potom porovnáva s predpokladanou sekvenciou cDNA opísanou v Hayashi et al.;(pozri skôr). .Analýza sekvencie potvrdí, že izolovaná DNA skutočne kóduje rovnakú sekvenciu EF-Ια, ako DNA opísaná Hayashim (pozri skôr). Okrem toho je oblasť prvého exónu identická s predtým publikovanou oblasťou sekvencie škrečacieho c DNA EF-Ια pri 5' konci (Hayashi, pozri skôr) a bolo identifikovaných sedem intrónov, z čoho je zrejmé, že štruktúra sa podobá štruktúre známej pre ľudské homológ.
Sekvencia a reštrikčná mapa získaná zo 7 kb fragmentu ukazuje, že časť 5' lemujúceho intrónu a promótor sú umiestené v 12 kb fragmente od 5’ do vnútorného miesta Notl. Z 12 kb inzertu sa vyštiepi Spel/NotI 3 kb fragment od 5' do vnútorného miesta Notl a subklonuje do pBluescriptSK* dopredu štiepeného rovnakými enzýmami. Výsledný plazmid sa označí ako pSK/EF1.3. 3 kb fragment sa mapuje opísaným spôsobom pri použití KpnI a Clal, čím sa potvrdia reštrikčné miesta a sekvencuje sa pri použití súpravy Erase a Base (Promega, Madison, SI, USA) pri použití Clal a KpnI miest na vytvorenie predĺženie 5’ a 3’. Sekvenčná analýza ukáže oblasti obsahujúce promótor, TATA box a 0,9 kb intrón v 5' netranslátovanej lemujúcej oblasti s rovnakou dĺžkou, ako má prvý intrón v ľudskom géne [Uetsuki, 1989, pozri skôr]. Sekvencia CHEF1 promótora a 5' intrónu je uvedená v SEQ ID NO: 1, pričom intrón zahrnuje nukleotidy 2699 až 3641.
Príklad 3
Charakterizácia regulačnej DNA CHEF
Sekvencia pred ATG štart kodónom (vrátane) škrečacieho génu EF-Ια je opísaná v SEQ ID NO: 1. Väčšina identifikovateľných väzbových miest transkripčného faktora sa pravdepodobne vyskytuje od 3' do (protismerovo) Sací miesta umiesteného 1,56 kb do 5' do iniciačného ATG kodónu génu EF-Ια. Každý z expresných vektorov obsahuje sekvencie CHEF1 opísané ďalej, ale obsahuje tiež 2 kb CHEF1 sekvencie od 5' k miestu Sací.
Sekvencovanie ukáže prítomnosť dokonale konsenzuálneho TAT boxu umiesteného asi 1 kb od 5' smerom k iniciačnému ATG štart kodónu a oblasť medzi protismerovo umiesteným miestom Sací a TATA boxom obsahuje vždy mnoho možných väzbových miest pre transkripčný faktor [Boulikas, Crit. Rev. Euk. Gene Exp. 4: 117 až 321 (1994)], ako sú miesta Spi (SEQ ID NO: 16 alebo 17), miesta ATF (SEQ ID NO: 18) a miesta NF-1 (SEQ ID NO: 19).
| GGCGGG | SĽU | ID | NO« | 1$ |
| GGGľ.’GG | SEIJ | ID | NO: | 17 |
| TGACGY<C/A)R | SECJ | ID | NO: | 18 |
| rľGGCNs_ÄCT/G>CCR | SEQ | ID | NO: | 19 |
Podobne ako v prípade ľudského génu EF-Ια [Uetsuki et al., pozri skôr] sa tu vyskytuje 943bp intrón v 5' netran slátovanej oblasti (UTR) škrečacieho génu EF-Ια., čo je zrejmé z umiestenia zostrihov donorovej a akceptorovej sekvencie. Ale pri použití analytického programu Geneworks DNA bolo zistené, že sekvencia intrónu v 5' UTR je len zo 62 % identická so sekvenciou v ľudskom géne. Intrón 5' zahrnuje mnoho možných väzbových miest pre transkripčné faktory, čo zhruba zodpovedá počtu väzbových miest medzi miestom Sací a TATA boxom, čo ukazuje, že intrón 5' by mohol byť dôležitý pre optimálnu transkripciu riadenú promótorom EF-la.
Pri použití analytického programu Geneworks DNA bolo zistené, že sekvencia CHEF1 od reštrikčného miesta Seal (v protismere) až do (ale nie vrátane) intrónu 5' (v smere) je zo 64 % zhodná so sekvenciou ľudského EF-la. Porovnanie umiestení väzbových miest transkripčného faktora Spi ľudskej a škrečacej regulačnej sekvencie je uvedené v tabuľke 1. Úplná sekvencia ľudského génu EF-la [Uetsski et al., pozri skôr] je uvedená v SEQ ID NO: 29.
Tabuľka 1
Vzdialenosť miest Spi od TATA boxu
Chrtiek
Políihŕt nuklecitlcki
-A'2A
-304 •<w:i -172.
-151 ••26
Člnvek f‘ol.c»ha nukleotidu
-335
-220 •21.18
432
476
f.7'3
690
7
261
425
495
594
Príklad 4
Konštrukcia expresných plazmidov
Mnohé plazmidy, ktoré sa používajú v nasledujúcich príkladoch, boli získané ďalej opísanými postupmi.
Plazmid pSV2 dhfr (prírastkové číslo ATCC 37146) sa rozštiepi Sphl/BamHI a 1,8 kb fragment kódujúci dihydrofolát reduktázu (DHFR) sa prečistí (fragment 1). Fragment kódujúci DHFR tiež obsahuje sekvenciu promótora/operátora SV40 umiestenú smerom k 5' a polyadenylačnú sekvenciu umiestenú smerom 3' vzhľadom na dhfr gén. Plazmid pSLl 190 (Pharmacia) sa rozštiepi HindlII, posunuté konce sa doplnia Klenowom a tupo zakončená DNA sa opäť liguje, aby sa eliminovalo miesto HindlII, za vzniku plazmidu pSL119OH, ktorý sa potom štiepi Spthl/BamHl a 3,4 kb fragment sa prečistí (fragment 2). 1,8 kb fragment pSV2dhfr (fragment 1) sa liguje k 3,4 kb fragmentu pSLl 19OH (fragmentu 2), čím sa získa plazmid pSLl 190H-dhfr.
Plazmid pStll9OH-dhfr sa modifikuje nasledujúcim postupom, aby sa z neho odstránilo niekoľko reštrikčných miest. Plazmid sa najprv štiepi Xbal/NheI (čím sa získajú komplementárne posunuté konce) a lineárny plazmid sa opäť liguje, čim sa odstránia obidve miesta Xbal a Nhel. Pri druhom postupe sa pSL119OH-dhfr štiepi HindlII, posunuté konce sa doplnia Klenovovým fragmentom a lineárny plazmid sa opäť liguje, čím sa eliminuje HindlII miesto. Pri treťom postupe sa pSLl 19OH-dhfr štiepi BglII, posunuté konce sa doplnia Klenowom a lineárny plazmid sa opäť liguje, čím sa odstráni miesto BglII. Výsledkom týchto troch stupňov je plazmid pSLl 190H-dhfr/NXHB, z ktorého boli odstránené miesta Xbal, NheI, HindlII a BglII. Plazmid pSLl 19OH-dhfr/NXHB sa štiepi EcoRI/BamHI, inzertuje sa do neho linkér NPB1/NPB2 (získaný anotáciou oligonukleotidov NPB1 a NPB2 [SEQ ID NO; 20 a 21] za vzniku plazmidu pSL/dhfr/Notl, ktorý má jedinečné reštrikčné miesto Notl.
NEBI GATCGCGGCCGCGTTTAAACGGATCC (SEQ ID NO: 20)
NPB2 AATTGGATCCGITTAAACGCGGCCGC (SEQ ID NO: 21)
Tento plazmid pSL/dhfr/Notl sa štiepi Asp718/BamHI a 1,8kb fragment kódujúci DHFR sa prečistí (fragment 3). Plazmid pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA, OSA) sa štiepi Asp718/BglII, čím dôjde k odstráneniu promótora CMV a polyadenylačnej DNA hovädzieho rastového hormónu (BOH) a 3,7 kb fragment sa prečistí (fragment 4). 1,8 kb fragment pSL/dhfr/Notl kódujúci DHFE s obsahom sekvencie promótora/operátora SV40 a polyadenylačnej sekvencie (fragment 3) sa liguje k 3,7 kb fragmentu pRc/CMV (fragmentu 4) za vzniku plazmidu pRc/DHFR/Notl.
Plazmid pRc/CMV sa štiepi Asp718/Xbal a 0,8 kb fragment kódujúci polyadenylačnú DNA BGH sa prečistí (fragment 5). Plazmid pRc/DHFR/Notl sa rozštiepi BamHI/Asp718 a 4 kb fragment obsahujúci sekvencie DHFR, promótora/operátora SV40 a polyadenylačnú sekvenciu sa prečistí (fragment 6). Plazmid pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA, USA) sa štiepi BglII/SacI a 0,71 kb fragment kódujúci promótor CMV sa prečistí (fragment 7). 0,8 kb fragment pRc/CMV (fragment 5), 4 kb fragment pRc/DHFR/Notl (fragment 6). 0,7 kb fragment pCEP4 (fragment 7) a fragment syntetického adaptéru Sacl/Xbal sa spoja štvorcestnou ligáciou, čím sa získa plazmid pDCl. Adaptor sa vytvorí aneláciou oligonukleotidov SXP1 a SXP2.
SXPl (SEQ ID NO: 22) J'-CGTTTAGTGAACCGTCAGATCTACATAACAACATTCCTC CTCTAAAGAAGCCCCAAGCTrGATATCIGCAGAATrCT-3'
SXP (SEQIDNO:23) 5'-CTAGAGAATTCTGCAGATATCAAGCTrGGGGCTrCTTTAGAG GAGGAATGTTGTTATGTAGATCTGACGGTTCACrAAACGAGCT-3'
Plazmid pDCl teda obsahuje promótor CMV, oblasť polylinkóra, polyadenylačné miesto z BGH a gén DHFR riadený promótorom SV40 a sekvenciu SV40 zostrihu/polyadenylačnóho miesta.
Plazmid pDCl sa štiepi Xhol a izoluje sa 4,5 kb fragment, ktorý neobsahuje promótor CMV a polyadenylačnú DNA BGH, ktorý sa liguje k plazmidu pDCil. Plazmid pDCil sa potom štiepi BamHI/XhoI a 4,5kb fragment sa prečistí (fragment 8). 4,5 kb fragment pDCil (fragment 8) a liguje k PCR fragmentu štiepenému BamHI/SalI kódujúcemu čiastočnú sekvenciu promótora CMV získanú pri použití primerov 96-13 a 96-14 (plazmid pDCl ako templát), čim sa získa plazmid pDCi2.
Printér 96-13 (SEQ ID NO: 24)
5'-AGTTCAGTCGACGGCGCGCCAACCCGGGAATCC GGACGGGATCTATACATTGAATCAATATTGGCA-3'
Primdr96-14 (SEQIDNO125)
ATGTCAGGATCCACGCGGAACTCCATATATGGGCTATGAACT
Plazmid pDCi2 sa štiepi Asp718/Spel a 4,2 kb fragment kódujúci DHFR s obsahom sekvencie promóto ra/operátora SV40 a polyadenylačnej sekvencie sa purifikuje (fragment 9) a pDCl sa štiepi Asp718/Spel a 1,5 kb fragment obsahujúci čiastočnú DNA promótora CMV s BGH polyadenylačnými signálmi sa purifikuje (fragment 10). 4,2 kb fragment pDCi2 (fragment 9) sa liguje k 1,5 kb fragmentu pDCl (fragmentu 10), čim sa získa plazmid pDC31. Plazmid pDC31 sa od pDCl odlišuje tým, že obsahuje niekoľko nových reštrikčných miest, ako Smal a Ascl pri 5' konci promótor CMV, ktoré boli vytvorené. Plazmid pDC31 sa štiepi Notl, posunutá DNA sa otupí pri použití polymerázy T4 a plazmid sa opäť liguje, aby sa vylúčilo miesto Notl, čím sa získa plazmid pDC36. Plazmid pDC36 je rovnaký ako pDC31 s výnimkou miesta Notl, ktoré bolo zničené.
Plazmid pDC36 sa štiepi Apal/BamHI, posunuté konce sa doplnia a plazmid sa opäť liguje za vzniku pDC38. pDC38 je rovnaký ako pDC36, až na fragment Apal/BamHI obsahujúci polyadenylačnú sekvenciu hovädzieho rastového hormónu, ktorá z neho bola odstránená. Plazmid pDC38 sa štiepi Smal/HindlII a 4,6kb fragment, ktorý neobsahuje DNA promótora CMV, sa purifikuje (fragment 11).
Plazmid pSK/EF1.3 sa štiepi EcoRV/Notl'Pvul a 2,9kb fragment kódujúci sekvenciu promótora CHEF1 a protismerovú sekvenciu DNA sa purifikuje (fragment 12). Blueseript SW^II (pSK+) sa štiepi Notl a 2,9kb fragment sa purifikuje (fragment 13). 7kb Notl fragment z fágu lambda 7,4 sa liguje k 2,9 pSK+ fragmentu (fragmentu 13), čim sa získa plazmid pSK/EFl .7.
Plazmid pSK1 sa štiepi HindlII/NotI a 2,9kb fragment sa purifikuje (Fragment 14). Plazmid pSK/EF1.7 sa štiepi Notl/Ncol a 620bp fragment kódujúci časť 5' netranslátovaného intrónu CHEFil sa purifikuje (fragment 15). 123bp PCR fragment štiepený HindlII/Ncol kódujúci zvyšný 5' intrón vytvorený pri použití primárov 96-36 a 96-45 a pSK/EF1.12 ako templátu sa prečistí (fragment 16).
Prime'r 96-36 (SEQ ED NO; 26)
GGCTTAGCTCCGAGGAGGG
Primár 96-45 (SEQ ID NO: 27)
CGTGACAAGCTTGGTTTrCACAACAC
2,9 kb fragment pSK+ (fragment 14), 620 bp fragment pSK/EFl (fragment 15) a 123bp fragment HindlII/Ncol (fragment 16) sa ligujú, čím sa získa plazmid pSK/5’EF-l obsahujúci úplnú sekvenciu 5' inbrónu CHEF1.
Plazmid pSK/5'EF-l sa štiepi HindlII/NotI a 0,7kb fragment kódujúci 5' intrón sa purifikuje (fragment 17). 4,6kb fragment PDC38 neobsahujúci promótor CMV (fragment 11), 2,9 kb fragment pSK/EF1.3 obsahujúci sekvenciu promótora CHEF1 a protismerevú sekvenciu (fragment 12) a 0,7 kb pSK/5'EF-l fragment kódujúci úplný 5' intrón (fragment 17) sa spoja pri trojcestnej ligácii, čím sa získa plazmid pDEFl, ktorý teda obsahuje kompletnú 5' regulačnú DNA CHEF1, gén dhfr a začiatok replikácie SV40, ktorý umožní replikáciu za vzniku veľmi vysokého počtu kópií v bunkách transformovaných antigénom SV40 T.
Plazmid pDEFl sa štiepi HindlII, posunuté konce sa doplnia a plazmid sa štiepi Notl. 2,6 kb fragment obsahujúci okrem čiastočnej sekvencie 5’ intrónu sekvenciu promótora CHEF1 a protismerovú sekvenciu DNA sa purifikuje (fragment 18). Plazmid pDEFl sa štiepi Notl/Asp718 a 1,3 kb fragment kódujúci zvyšok t” intrónu sa purifikuje (fragment 19). Plazmid pDC38 sa štiepi Smal/Asp718 a
4kb fragment kódujúci DHFR s obsahom sekvencie promótora/operátora SV40 a polyadenylačnej DNA sa purifikuje (fragment 20). 2,6 kb fragment pDEFl (fragment 18), 1,3 kb fragment pDEFl (fragment 19) a 4kb fragment pDC38 (fragment 20) sa spoja trojcestnou ligáciou, čím sa získa plazmid pDEF2. Plazmid pDEF2 v E. coli kmeňa XL-1 Blue bol uložený 4. marca 1997 v zbierke Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA pod prírastkovým číslom 98343. Plazmid pDEF2 sa od pDEFl líši v tom, že z neho bol odstránený 0,3 kb fragment HindlII/Spel umiestený 2,3 kb proti smeru do TATA boxu CHEF1 a že obsahuje len jedno miesto HindlII umiestnené v oblasti polylinkéra. pDEF2 sa použije v prípadoch, keď gén, ktorý má byť exprimovaný, obsahuje vlastné polyadenylačné miesto.
S cieľom linearizácie sa plazmid pDEF2 štiepi Asp718/Xbal, pričom sa však tiež odstráni začiatok replikačných sekvencií a 7,4 kb fragment sa purifikuje (fragment 21). Plazmid pDCl sa štiepi Asp718/Xbal a 0,8 kb fragment, ktorý okrem polyadenylačných sekvencií BGH sa vyznačuje tým, že má obsah zámeny začiatku alebo replikačnej DNA, sa puriftkuje (fragment 22). 7,4 kb fragment pDEF2 (fragment 21) a 0,8 kb fragment pDC21 (Fragment 22) sa spoja za vzniku plazmidu pDEFlO, ktorý sa líši od pDEFl rovnakým spôsobom ako pDEF2. Plazmid pDEFlO sa od pDEF2 odlišuje v tom, že v pDEFlO pri 3' konci oblasti polylinkéra je polyadenylačné miesto z génu hovädzieho rastového hormónu.
Plazmid pDEFlO sa štiepi HindlII/Xbal s cieľom linearizácie a 8,2 kb fragment sa purifíkuje (fragment 23). Plazmid pDCl/MDC, plazmid kódujúci chemokín odvodené od chemokínu ľudského makrofágu (MDC) sa štiepi HindlII/Xbal a 0,4 kb fragment kódujúci MDC sa puriftkuje (fragment 24). Ligáciou 8,2 kb fragmentu pDEFlO (fragment 23) s 0,4 kb fragmentom pDCl/MDC (fragmentom 24) sa vyrobí plazmid pDEFlO/MDC.l.
Plazmid pRc/CMV sa štiepi BamHI, posunuté konce sa doplnia Klenowom, plazmid sa štiepi Asp718 a 1,5 kb fragment sa purifíkuje (fragment 15). Plazmid pDCl sa štiepi Notl, posunuté konce sa doplnia Klenowom, plazmid sa štiepi Asp718 a 3,9 kb fragment sa purifíkuje (fragment 26). 1,5 kb fragment pRc/CMV (fragment 25) sa liguje s 3,9kb fragmentom pDCl (fragmentom 26), čím sa získa plazmid pNCX.
Plazmid pNCX sa podobá pDCl s tou výnimkou, že dhfŕ gén je nahradený génom rezistencie proti neomycínu (NeoR). Plazmid pNCX sa štiepi Asp718/Pvul a 2,1 kb fragment sa purifíkuje (fragment 27). Plazmid pDEFl sa štiepi Asp718zPvuI a 5,9 kb fragment sa puriftkuje (fragment 28). 2,1 kb fragment pNCX (fragment 27) sa liguje do 5,9 kb fragmentu pDEFl (fragmentu 28) za vzniku plazmidu pNEFl. pNEFl sa líši od pDEFl tým, že nesie bakteriálny gén rezistencie proti neomycínu (NeoR), ktorý kóduje rezistenciu proti neomycínu alebo G418. Gény, ktoré majú byť inzertované do pNEFl, sú všeobecne fragmenty HindlII/Xbal, ktoré sa inzertujú po začiatočnom štiepení HindlII alebo trojcestnej ligácii, keďže plazmid obsahuje dve miesta HindlII.
Príklad 5
Transfekcia buniek DG44 a skúška produktivity
S cieľom transfekcie hostiteľských buniek DG44 jediným plazmidom sa obvykle linearizuje 50 až 100 pg plazmidu štiepením reštrikčným enzýmom Pvul alebo AscI. Pri transfekcii, keď sa majú do buniek CHO zavádzal dva plazmidy, sa plazmidy nechajú neštiepené. Pred transformáciou sa plazmidy vyzrážajú etanolom a premyjú dvakrát 70 % etanolom. DNA pelety sa krátko sušia a resuspendujú v 400 pl sterilnej destilovanej vody. K «suspendovanej DNA sa pridá 400 pl sterilného 2X HeBS (40 mM HEPES hydroxid sodný, pH 7,0; 274 mM chlorid sodný; 10 mM chlorid draselný; 1,4 mM hydrogenfosforečnan sodný; 12 mM dextróza).
Netransfekované bunky DG44 sa kultivujú v médiu DMEM/F-12 doplnenom hypoxantínom (na konečnú koncentráciu 0,01 mM) a tymidínom (na konečnú koncentráciu 0,0016 mM), tiež označovaným ako HT. S cieľom pestovania netransfekovaných aj transfekovaných buniek DG44 sa k médiu pridá dialyzované FBS do konečnej koncentrácie 5 až 10 % objemových. Bunky DG44 sa pripravia na transfekciu tak, že sa kultúry nechajú rásť do asi 50 % alebo nižšej konfluencie v 150 cm2 ošetrených polystyrénových nádobách na tkanivovú kultiváciu (Coming). Bunky sa z plastu odstránia tak, že sa najprv odsaje médium a prilipnuté bunky sa premyjú raz soľným fosfátovým pufrovacim roztokom bez vápnika a horčíka (CMF-PBS: 2,7 mM chlorid draselný; 1,5 mM dihydrogenfosforečnan draselný; 137 mM chlorid sodný a 8,1 mM hydrogenfosforečnan sodný), pridajú sa k nim 4 ml roztoku obsahujúceho 0,0125 % ožiarený trypsín (Worthington Biochemical Corporation) v CMF-PBS a inkubujú sa niekoľko minút pri 37 °C. K bunkám sa pridá médium (4 ml) obsahujúce hovädzie fetálne sérum (FBS), stanoví sa koncentrácia buniek a alikvóty 2 x 107 buniek sa peletizujú centrifugáciou. Každá bunková peleta sa premyje raz v CMF-PBS a «suspenduje v 0,8 ml roztoku obsahujúceho HeBS s požadovanou plazmidovou DNA. Resuspendované bunky sa pri teplote miestnosti prevedú do 0,4 cm kyvety Cene Pulser (Bio-Rad) a umiestnia sa do elektroporačného zariadenia Bio-Rad GenePulzer. Bunky sa elektroporujú pri teplote miestnosti s vybíjaním kondenzátora 290 V a 960 pF (pulz 9 až 11,5 ms). Bunky sa asi 10 minút ponechajú v kyvete a potom pridajú do 10 ml DMEM/F-12 doplneného 5 až 10 % dialyzovaným FBS a HT. Potom sa stanoví úmrtnosť (vylúčenie trypánovej modrej), ktorá je obvykle asi 50 %. Bunky sa peletizujú centrifugáciou, pelety sa resuspendujú v 2 ml DMEM/F-12 doplnenom 5 až 10 % dialyzovaným FBS a HT („neselektívne médium“) a zaočkujú sa na 10 cm polystyrénové misky na tkanivovú kultiváciu. Po dvojdennom raste sa bunky, ten čas obvykle konfluentné, z misiek odstránia pri použití trypsínu, ako je opísané a v rôznych zriedeniach v DMEM/F-lľ doplnenom 5 až 10 % dialyzovaným FBS a bez HT („selektívne médium“) zaočkujú na 10 cm2 misky. Päť a deväť dní potom sa k bunkám pridá selektívne médium. Po asi 2 týždňoch sa kolónie transfektatnu (obvykle viac ako 1000 na každú transfekciu) z misiek odstránia pri použití trypsínu, opísaným spôsobom a po prídavku selektívneho média sa stanoví koncentrácia buniek. Aspoň dva alikvóty 2 x 106 buniek na každú transfekciu sa pridajú k 10 cm miskám obsahujúcim 10 ml selektívneho média. Bunky sa nechajú rásť až do zániku, keď je väčšina buniek odpojená od dosky vplyvom preplnenia. Supematant zo zaniknutých kultúr sa skúša metódou ELISA, čím sa stanoví priemerný titer produktu.
Príklad 6
Produkcia rekombinantného proteínu pri použití CHEF1
Bunky DG44 opísané v príklade 5 sa transfekujú plazmidy nesúcimi gény uvedenými v tabuľke 3 operatívne pripojenými k regulačnej DNA CHEF1. Bakteriálne kmene transformované plazmidmi kódujúcimi každý z génov, ktoré boli použité pri skúške, boli uložené v zbierke Američan
Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,
Maryland 20852, USA, 1. apríla 1997 pod prírastkovými číslami uvedenými v tabuľke 2.
Tabuľka 2
Prírastkové čísla plazmidov
| Krtdnwariý yŕn | Označenie plazmidu | Prírastkom | é čísi. |
| Tažkétio reťazca Protilátky ICľ13 | pl)EFl./ICM3H.2 | 96381 | |
| Ľahkého reťazca protilátky runj | pNr.n/rcri3L.3 | 90392 | |
| Ťažkého reťazca protilátky 23F2G | PDEF1/F2GH.I | 98383 | |
| ľahkého reťazca protilátky 23F2U | PIMFF1/F2GL. .1 | 98384 | |
| Chltlriázy | pOĽFl/CTN.l | 98385 | |
| Acetylhydr olázy iiktlvaCnéhci faktora doštičiek ÍPAF-AH) | PDEF2/HPH.4 | 98386 | |
| (.‘hemolŕ f nu c.id'jadf-riélio ud mck'._>fá-.ju <MDC> | pDfcFlO/MUC.l | 98387 |
Po selekcii na transfektanty sa spojené kolónie (viac ako 200) z každej transfekcie odstránia z misiek pri použití trypsínu a rovnaký počet buniek z každej transfekcie sa nanesie na misky a nechá sa rásť do uhynutia. Supematanty sa odstránia a expresia proteínu sa stanovuje pri použití metódy EL1SA alebo enzýmového stanovenia. Výsledky sú uvedené v tabuľke 3.
Tabuľka 3
Expresia proteínu pri použití regulačných sekvencií CHEF1 aCMV
T i Lur· pr oheíriu
T.CM3 ll+l.
1XM3 ΜΊ.
Hu23l'2ťi 11+1. n»:
1062
1848
2:1.0í J
337
3(50
3200
8900
231)1 J
12H5C1
S výnimkou prvej skúšky na expresiu chitinázy (v tabuľke 3 označená ako chitináza-1) sa pri použití regulačnej DNA CHEF1 dosiahnu významne vyššie úrovne produkcie proteínu, ktoré sú trikrát až jedenásťkrát vyššie ako pri expresii s promótorom CM V.
S cieľom stanoviť, či v prípade zníženej expresie, ktorá bola zistená v prípade skúšky na chitinázu, ide o abnormálny alebo opakovateľný výsledok, ktorý by bol charakteristický a/alebo jedinečný na chitinázu, sa skúška zopakuje, ale pri použití dvoch oddelených transfekcií, na rozdiel od jedinej transfekcie použitej pri prvej skúške, kde výsledkom bol neobvykle nízky počet získaných transfektantov. Okrem toho sa použije iná skúška na aktivitu chitiázy, v prípade ktorej sa ukázalo, že je presnejšia ako postupy použité pri prvej skúške.
Výsledkom transfekcií pri druhej skúške je počet transfektantov, ktorý je konzistentnejší s predchádzajúcimi výsledkami dosiahnutými pri použití plazmidu pDEF2, ktorý pri ďalších skúškach produkuje viac ako 150 X počtu trans fektantov dosiahnutého s plazmidom CMV. Výsledky z druhého pokusu (označeného v tabuľke 3 ako chitináza 2) sú vnútorne konzistentné, čo zvyšuje dôveryhodnosť výsledkov, napriek tomu, že zistené zvýšenie expresie proteinu (asi 1,4x), v porovnaní s expresiou pri použití promótora CMV, je nižšie ako zvýšenia zistené v prípade ostatných proteínov skúšaných skôr.
Príklad 7
Produkcia rekombinantného proteínu pri použití regulačnej DNA CHEF1 s rôznymi dĺžkami
Skonštruuje sa expresný vektor obsahujúci ďalších 8 kb 5’ lemujúcej DNA z génu EF-Ια a označí sa ako pDEF14. Plazmid PDEF14 sa od pDEF2 odlišuje v tom, že pDEF14 obsahuje približne 11,7 kb DNA lemujúcej 5' škrečacieho EF-Ια., zatiaľ čo pDEF2 obsahuje len 3,3 kb tejto sekvencie. Plazmid pDEF14 tiež obsahuje 4 kb škrečacej 3' lemujúcej DNA priliehajúcej k 3’ koncu DHFR expresnej kazety. Väčší plazmid pDEF14 sa skonštruuje spôsobom, ktorý je stručne opísaný ďalej.
Z pDEF2 sa odstráni 2,6 kb AscI/NotI fragment CHEF1 a na jeho miesto sa inzertuje 11 kb AscI/NotI fragment CHEF1. Inzercia dlhšej sekvencie najprv vyžaduje modifikáciu Xbal miesta umiesteného 11,7 kb od 5' smerom k iniciačnému ATG EF-Ια. na miesto AscI. Okrem toho sa inzertuje 4kb Nsil/Sall fragment s tupými koncami, ktorý je tvorený lemujúcou sekvenciou CHEF1 začínajúcou pri Nsil mieste 118 párov báz od 3' konca k stop kodónu EF-Ια., do Pmel/Sall miesta 3' k DHFR expresnej kazete umiestenej na 3’ konci oblasti polylinkéra, do ktorej sú inzertované gény, ktoré majú byť exprimované. Úplná 3’ DNA sekvencia so začiatkom pri stop kodóne génu EF-la. je uvedená v SEQ ID NO: 28. Baktéria transformovaná týmto plazmidom bola uložená v zbierke Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, RockvíIIe, Maryland 20852, USA, 9. apríla 1997 pod prírastkovým číslom 98398. Výsledný plazmid pDEF14 obsahuje jedinečné Xbal a Nôti miesta spolu s mnohočetnými HindlII miestami a inzercia génu do tohoto plazmidu s cieľom expresie teda vyžaduje trojcestnú ligáciu. Tak napríklad gén môže byť inzertovaný do plazmidu ligáciou HindlII/Xbal fragmentu obsahujúceho požadovaný gén so 737bp Notl/HindlII fragmentom z PDEF14 a 19,7 kb Xbal/NotI fragmentom z pDEF14.
Expresia proteínu pri použití tohto vektora sa porovná s expresiou pri použití vektora pDEF2, ktorý obsahuje menšiu časť 5' lemujúcej oblasti EF-Ια. Pri predchádzajúcich skúškach bola DNA kódujúca ťažký aj ľahký reťazec protilátky 23F2G subklonovaná do vektorov pDEF2 a pDEF14 a úrovne expresie stanovené po transfekcií do buniek DG44 sú opísané v príklade 5. GOny kódujúce obidva reťazce protilátky sa vo vektoroch umiestnia lineárne a expresia obidvoch génov sa poháňa sekvenciou CHEF1 v jednotlivých plazmidoch. Kódujúce oblasti pre dva reťazce v každom plazmide sa rozdelia identickou 4,3 bk DNA odvodenou od 3' netranslátovanej oblasti ľudského IgG4.
Výsledky ukazujú, že expresia 23F2G z väčšej CHEF1 sekvencie je v pDEF14 štvornásobne väčšia ako expresia protilátky z menšej sekvencie pDEF2. Tento výsledok je prekvapujúci vzhľadom na to, že väčšina identifikovateľných väzbových miest transkripčného faktora pDEF14 je tiež v sekvencií DNA v pDEF2. Je teda možné, že v DNA CHEF1 v plazmide pDEF14 jc umiestené jedno alebo viac ďalších a neidentifikovaných väzbových miest transkripčného faktora alebo sekvencií zosilňovačov. Inak povedané, väčšia DNA CHEF1 môže poskytovať výhodu zvýšenej transkripcie vďaka určitej vlastnosti 3' DNA sekvencie.
Odborníkom v tomto odbore určite zrejmé mnohé modifikácie vynálezu, ako je opísaný a ilustrovaný v predchádzajúcom texte.
Takéto modifikácie a zmeny nepredstavujú únik z rozsahu vynálezu, ktorý je daný len patentovým nárokmi.
SEKVENČNÝ PROTOKOL
Cl) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE.
(i) PRIHLASOVATEĽ. Allison. Daniel S.
(1.1) NÁZOV VYNÁLEZU. Transkrlpčná regulačná DNA ôkreCacieho
EF-1”
Ctil) POČET SEKVENCIÍ. 29 (iv) ADRESA PRE KOREŠPONDENCIU.
(A) ADRESÁT. Marshall, O'Tonie, Geratein, ňurray Ä
Borun (B) ULICA. 233 South Wacker Drlve. 6300 Sears Touer
ÍC> MESTO. C.hlcagn <D> ŠTÁT, llllnols (E) KRAJINA. USA (F) ZIP. 60606 (u) POČÍTAČOVO ČITATEĽNÁ FORMA.
(A) TYP MÉDIA. Floppy disk (B) POČÍTAČ. IBM PC compatlble (C.) OPERAČNÍ SYSTÉM. PC-00S/MS-D0S (D) SiFTldARE. Patentln Release «1.0. Version «1.30 (ui) ÚDAJE O SÚČASNEJ PRIHLÁŠKE.
(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY.
(B) DÁTUM PODANIA.
(C) ZATRIEDENIE.
(vl.il) INFORMÁCIE U ZÁSTUPCOVI.
(A) MENO. KAREL ČERMÁK, AKP ČERMÁK-HílfiEJŠ-VRBA,
NÁRODNÍ 32, 11.0 01 PRAHA 1 (C) ČÍSLO SPISU. 01-11-99-ČE (Ix) 1 ľt EKl IMUN1KAČNÉ SPOJENIE.
(A) TELEFÓN. 312-474-6300 (B) TELEFAX. 312-474-0448 <2) ÚDAJE O SEX) ID Níl.l.
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
(A) DĹŽKA. 3673 párov báž (B) TYP. nukleová kyselina (C) DRUH RE-ŤAZCA. Jednoretazccvá (0) TOPDLÓGTA. lineárna (ii.) DRUH MOLEKULY. DNA (xi) PIFIS SEKVENCIE. SED .ID NCh.l.
AGTTCCTTTG
CAGATCCCAC
AGGTTGGTTC
AATAATATCA
GATCTCTTGA
GCCCATAATC TTAGTGATAA
GAGTGCTTGC
TATTCCATTA
CAAAATACCT
GTTTTTCTTT
CTTCTGAGAT AAAAAAAAAA
AAAAGAAAAA
GCCTTTAATC
CCAGCACGCA
GCCTGGTCTA
CCTAGTGAGT AACAGCCACA
CAATCAGAAC
I5ACAAGCATT
TAAATAATAG
GGGATGGGCT
CTGGGCGAGT TTGATTAGAT
TCTT1TCATG
AĽACACACAC
ACACACACAA
AGAATCAGAA
GTAAAGCTAA
CGTGAAGCGt:
GCTTCAGGCT
GCĽAGCAĽAG
GGGCAGATCC
GGCTGGGAAG
GGTCCCTAGG
GGGCTGACGT
1140
ATGTGGACAĽ 1200
ATTGTTTGTT
1260
AGGTTATTAG
1'120
CTGGTGTGCT 1380 ľ ľ IĽACCGTC 1440
CCTGCCCGGA 1500
AAAGAAAAGA
1560
GGAGGCAGAG 1620
TTCAGGGCAC 1680
CACAGCAAAA 1740
GACGAGCCAT 1800
AAGATTGCTA
1860
TTCCTCGTGC 1920
TGCGCGCACA
1980
CTGTGGGACT
2040
TCCAGAGAAG 2100
GTCGAGCTCT 2160
ATTGTGCACC
2220
CGGAĽAGTAG ACTAGGCAGT GAATAAATAC GAGACCCTCG RCTAGCATTA GAGGCATTTA AAAĽAGGCTA GCAGGGCGGA CCAGGGCTAA CGCAGTTATG TTTTGAGAAG ATGCTGGCCT TCTATCAAAT CACAAAATCC TAAGVATTAT CAGCTGGĽGC GGGCCACCGA TCTCCCGCGG
GTCĽTCAAAT gatgttgtac TCTAAGGCTA GTTCCATCTC AGAAACAAAA AAACTGGCCA GGGCCGGCAT TCTCTGTGAG AGAGACTGTC ATCCTTGGAA CTĽTGATTTĽ CTAAATGAGA AACTGTACCC TTTTTTAGCT TCTGAACGGA TGGATGGAAT GCTGAGCÍXT GGGACAAGCA
GCTCCTTATT ATCTGGAGGA AAAATGTAGC CACAACCĽĽA CAACAAAGAA GGGCCAAAAA GGTGGCGCAC TTTGAGGTCA TCAAAAACAA CTGTAGGAAT ACAAGTGTCA CCAĽGTGGAG AAATACACAC TAAGAAGCCC ACTCC.CAGGG GAACCAAGAG TAGGTTCTGG GGGGAT GGCG
ACTAGTTCCA AAGCACAGAG
ATTAGÍICTA TTGTTAĽAAA
TAGGCAUrAG AAATCTCTGT
GAAAAAGGtiA GGCTT TTGTG
TGCCTTÍiCAT CAGAAAAAGC
IÍĽIGTĽGAT ICTGGAHCT ľTGGTTACAA TAAATGACAA aacctgct Ití AAGAAACCTG
IGTGGTtíGGíi 1TAGAAATCA
AAGGCCAGCĽ AGGTIĽ1GIC tcct ricm G ľΤ Ϊ TGGAGC
CTATCCTGGC AGlXAírlCCTC íGCIGGGAIľ AAACAAAAAT
AACATCAGGA
AGCCTGACTC
YGAGTTGÍÚAT GGAAGGTGTC ctí iggi ccí: AAIAATGCTA
T rΓI1ΛΑΑΑΑ IAGATAALAG
ClAAGAATCA T I ΠΑΤΑ) Π
GAG Γ ( T ΤΤΊ T
AAGATGAATT nGCTAGIGT
12.0
GGTAICAAGA
180
I I TGTGAAAT
240
GCATAÍiACCL
3(1(1
AGAAAATGAT
360
TTAACAGAAI
420
TAGAAGGITG
480
CACGľĽIGTA
640
TCAGCAACAC
600
ΠΤΤΤΤΤΤΤΤ
660
AC1AGCTCTG
720
AAAGG1ATGC
780
GGTGGTGAGA
840
CCTTIAGAGC
900
CACACATAGC
960
ΛΛΤTAAAAAC
1.U2Í1
AGTATCATGT
1080
CC’TCCIAGC
ACTAACCAGT TTCATTTTCCš TAATTTTAAC
TGTGIÍTGAI TAGTTATATA TAAGTGCAAA TAAGGCTCTG ATCCCAGCAT AGTGAGTTTG TTTCTTTTCT AAGAGCAGGC ACCACCAACG GGGCTCAGTG TACATGĽTTG TATACACAGC AACAACAGTf ΛΛΛΤΠ GCTT ITGACTGTGG
GTTTCCAAGG TATATTTCTT GACIGGCTGA AATGTGGCCA C I L! H AAĽAC TACTTTTAGG CAAAGCCAGA TAATATAGGA TGGGAAGTAG AGGCCACCCT TTTTTTGGTT TGGCCTCGAA CCCCAGOm GTCACAGGCA AGGQAAGAGA ATP.TGCATTC TGGGTTGTGA TCAACTCATC AGTCTTGrĽC
AAATAAATGA ACftATHCTC GAACCCTAGA TTATAGAAAA cc i cc i tgaí:: GAAACGľAGT AACĽTCCTGA ATTAGGAGAA aggtagaaga gaactacatc: TCTCTGTGTA CTCAGAGATC TGTCTCAAAC TTC1CTGCAA ACTĽACTCCT ACACACACTA AAACTAGAAC CCAAAATTTG GGAAGCAAAT
CGGGAGGTGG
GCAGTGGAGT
GAGGAAGGGT
CCCACCCCCG
ATGGAGCĽGA GAATCCCAGG
GACCGTCGCT
CCCAGCGCGG
ĽĽGGAGGAGC
GCCCACAGTC
CCCGGCGGTG
GGGCAAACTG
GGAAAGTGGT AAĽGGTATAA
AAGTGCGGTA GAACGCAGGT
GAGTGGCGGG TCGGACCGCC
CCTCĽACGGG 2280
AGGACAGATT 2340
GAGTAATTCA 2400
AAATTCTGGC 2460
CTGCGCCTAG 2520
GGGGAGGGGC
2500
GTCGTGTGCT
2640
GTCGCGTTGG 2700
TGIGGĽCTCC 2760
AAGGGACACC
CTGGACGCCC TACAAAAGGA CGGCCTCCCA GGCGGATCGC GCGCTGAGCG GGCTCCGCCC ACGTTCTTTT GCGGGĽCCGG
CGGATCTCGA
TCTTGGCCAG
GGGATCGCCT
SCCCGGAACC
GGGTCGGCGG
6GGGCCCGGG
TCTTCCCGAG
TCGCAACGGG
GCTCCCTCCT
CACAGCCTTG TCCTCACCGC TCGCCCCTGG GCTGTGCCCG GAGAGCACAA agccagcgcg GGTGGGGGAG TTTGCCGTCA TTGAGCGGGG
GTGCGGGTGT CGTCGGCĽGG GCTTCTCTGC GAGCGTTCCC GCCCTGGATG
GCGGGCTGTG 2820
CGGGAGGGCG AGGGGGGGAG GCCTGGC.GGC GGCCCCGGAG CCTCGCCTCG TGTCGGGCGT 2ÔSO
GAGGCCTAGC GTGGCTTCCG CCCCGCCGCG TGCCACCGCG GCCGCGCTTT
GCTGTCTGCC 2940
CGGCTGCCCT CGATTGCCTG CCCGCGGCCC GGGCCAACAA AGGGAGĽGCtí TGGAGC-TGGC 3000
TGGTAGGGAG CGGGGGGGGG
ACCGGGCCCG
GCGGCCTGTG
TĽCTGATAAG CCCGGGTCCC
GGCCCGGTCT CCCGCCCGCC
CGGCACCAGT AGGAGCTCAA
CCCCGTAGTC 3060
CCCGTCCCGC 3120
GCGGCCGGGC 3180
GGCCAGTACC 3240
TGCGTGCGCG
3300
CGCATGTCGG
AGCACATGTC
GGTGGGTTTT
CCGTAGT6GC
GAAAGATGGC
GCAGGGAGAG
CGACGCCGCC AGATGCCGGG TTAGCTCCGA CGCTCCCGGG
CGGCAGCAGT
TGGACGGGTA TTCAGGTGGC GGAGGGCGAG
CCCTGTAGCA
AATGGAGGAC GCGGĽAGCCĽ GGCGGAGCGG GGCGGGTGAG TCACĽĽACAĽ
AAAĽGAAGĎG:1360
GGCCTTGCCC CTCGCCGCCC GCTGCTTCCT GTGACCCCGT GGTGTACCGG
CCGCACTTCA3420
GTCACCCC'GG CCCCTCTTTC GGAGCACCGC TGGC.CTCCGC TGGRGGAGGG GATCTGTCTA3460
ATGGCGTTGG AGTTTGCTCA CATTTGGTGG GTGGAGACTG TAGCCAGGCC
AGCCTGGCCA3540
TGGAAGTAAT TCTTGGAATT TGCCCATTTT GAGTTTGGAG CGAAGCTGAT TGACAAAGCT3600
GCTTAGUCOT TCAAAGGTAT TCTTCGAACT TTTTTTTTAA GGTGTTRTGA
AAACCACCGC3660
TAATTCAAAT CCAACATG
3678 (2) ÚDAJE (I SEQ TD Níl«2i <11 CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE» (A) DÍŽKA. 20 párov báz (fi) TYP. nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA· jednoreťazcová (D) TílPOlÓGIAi lineárna (li) DRUH MOLEKULY. DNA
Cxl) POPIS SEKVENCIE: SECJ ID NO. 2.
AGGC.'ACAGTC GAGGCTRATC
C2) ÚDAJE U SECJ TD NU.3· (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE· (A) DĹŽKA· 20 párov báz (R) TYP· nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA· .jednoreť.azcová (D) IIPULÚGIA. lineárna (11) DRUH Míl EKIH.Y. DMA (XI) POPIS SEKVENCIE· SEC) 10 Ν0·3.
I TCEAGriGTC AAGGAAGGCA (2) ÚOAJF O Sf-LJ TD Ntb4· (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
(A) DĹŽKA. 20 párciu báz <0) TYP, nukleová kyselina ť C) DRUH REŤAZCA· JednoreLazccruá (D) HJPllí ÚG'l A , 1 i rieárna
2U (D) TOPOLÓGIA. lineárnu (ii) DRUH MOLEKULY. DNA (xi) POPIS SEKVENCIE· SED ID NCkS.
GTTGGAATGG TGACAACAIG (2) ÚDAJE O SEQ ID NC).9.
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
(A) DĹŽKA. 20 párov báz (B) TYP. nukleová kyselina (Ľ) DRUH REŤAZCA. Jednoretazcová (0) IHPOLĽIGTA. lineárna (ii) DRUH MOLEKULY. DNA (xi) POPIS SEKVENCIE. SECJ ID NO.9:
CAGGTTTTAA AACACCAGTC (2) ÚDAJE 0 SEQ ID NO.10.
<i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
(A) DĹŽKA. 20 párov báz (B) TYP. nukleová kyselina
CO CJRUÚ REŤAZCA, jednoreťazcovd (D) TOPOLÓGIA. lineárna (1.1) DRUH MOLEKULY· DNA (xi.) POPIS SEKVENCIE. SECJ ID NO. 10.
AATGACCCAC CAATGSAAGC (2) ÚDAJE O SECJ ID NO.ll.
Cl) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
(A) DĹŽKA. 20 Párov báz (R) TYP. nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA. Jednoreťazcouá (D) TOPOLÓGIA. lineárna
CÍD DRUH MOL.EKUl.Yr DNA
Cxl) POPIS SEKVENCIE. CLU 10 NO.ll.
ACAGCAACTG TCTGCCTCAT (2) ÚDAJE (I SEÍJ ID NO.12.
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
CA) DĹŽKA. 17 párov báz
CO) TYP. nukleová kyselina (K) DRUH MCU.FKULY. DNA (xi) POPIS SEKVENCIE. SEC) ID NO.4.
GCĽACC1GA7 C ľACAAATGT (2) ÚDAJE O SECJ ID NLI.S.
C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE· (A) DĹŽKA· 20 párov báz (B) TYP. nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA, jednoreťazcouá (0) TOPOLÓGIA. lineárna
C 1 -i) DRUH MOLEKULY. DNA (xl) POPIS SEKVENCIE, STU ID ΝΠ.5.
GAGATACCAG CCTCAAACTC (2) ÚDAJE O SŕlJ ID NO.6.
(i) ĽHARAKTERI.STIKA SEKVENCIE· (A) DĹŽKA; 20 párnu báz (D) TYP· nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA· jednoreťazu-ová (D) ΤΟΡΟΙ.άίΤΛ. lineárna (ii) DRUH MOLEKULY. DNA (xi) POPIS SEKVENCIE, SEO ID NO.6.
A1GTGACCAT CATlGATGCC (2) ÚDAJE 0 SED ID NO.7.
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
(A) DĹŽKA· 20 párov báz (A) TYP, nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA, jednor eť.azoová
CD) JOPDLLlGIA. lineárna (11) DRUH MOLEKÚL. Y. DMA (xi) POPIS SEKVENCIE. SE(J ID NU·?·
GTGACTTTCC ATCCCTTGAA (2) ÚDAJE I) SEQ ID NO.8.
(L) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE· (A) DĹŽKA. 20 párw báz (S) TYP· nukleová kyselina
C Ij) DRUH REŤAZCA, iednur eĽazcová (C) DRUH REŤAZCA· Jodncireťazcová (D) TOPOLÓGIA. lineárna (ii) DRUH MOLEKULY. DNA (xi) POPIS SEKVENCIE. SEU ID NO.12.
GTAAAACGAC GGCCAGT (2) (JDAJt 0 SED ID NÍJ.13.
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
CA) DĹŽKA. 19 párov báz
CD) TYP. nukleová kyselina
CC) DRUH REľŤAZĽA: jednoretazcnuA (D) TOPOLÓGIA. lineárna < 11.) DRIJH MOLEKULY. DNA (Xl) POPIS SEKVENCIE. SEQ TO NOciS.
GGAAACAGCT ATGACCATG <2) ÚDAJE í.l SEC) TD NÍ1.14, (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE· (A) DĹŽKA. 20 párov báz
CR) TYP. nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA, jednuretazcovd
CD) TOPOLÓGIA. lineárna (ii) DRUH M0LEKL1I Y. DNA (xi.) POPIS SEKVENCIE. SEQ ID NO.14.
AATTAACCCT CACTAAA3GC (2) ÚDAJE U SEQ IU NLH15.
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
CA) DĹŽKA. 23 párov báz
CCD TYP. nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA. Jprir.oreťaznnuá (U) I (JPIJLÓGIA · Lineárna (11) DRUH MOLEKULY. DNA (xi) POPTS SEKVENCIE. SECJ TD NIL1.5.
GTTAATACGA CTCACTATAG GCC (2) ÚDAJE U SEIJ 10 NÍI.16· (i) CUARAKTERLSIIKA SEKVENCIE·
CA) DĹŽKA. 6 párov báz <B) TYP. nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA· jednoretazcová (D) TOPOLÓGIA« lineárna (li) DRUH MOLEKULY DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEČI ID Nlhlb.
GGCGGG 6 (2) ÚDAJE 0 SEIJ ΙΓ) Níl.17.
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE· (A) DĹŽKA: 15 párov báz <0> TYP: nukleová kyselina (Ľ) DRUH REŤAZCA: iednoreťazcová (D) TIFOLÓGIA. lineárna (ii) DRUH MOLEKULY. DNA
Cxi) PíPľS SEKVENCIE. SEQ ID NO.17.
GGGCGG 6 (2) ÚDAJE O SED ID NU.18.
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
(A) DĹŽKA. 8 párov báz
C R) TYP· nukleová kyselina (Ľ) DRUH REŤAZCA, jednoretazcová
CO) HFLVÚGLAt lineárna
C i L) DRUH MOLEKULY . DNA (xi) PIPTS SEKVENCIE. SEQ ID N0.18.
TGACGYMR 8 (2) ÚDAJE O SEIJ ID NlJtlH.
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE· (A) DĹŽKA: 13 párov báz (B) TYP. nukleová kyselina (CO DRUH REŤAZCA. Jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA. lineárnu (11) DRUH MIBEKDLY: DNA (xi) PTFTS SEKVENCIE: SED 10 NU>19.
rGGCNNNNNKCCR13 (2) ÚI1A.IC 11 SLO 10 Ν0·20.
Cl) CHARAKTERISTCKA SEKVENCIE·
TTGTTATGTA60
GATCTGACGG TTCACTAAAC GAGCT65 <2) ÚDAJE O SEQ ID NO.24.
(!) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
(A) DĹŽKA. t»S párov báz
C B) TYP. nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA. Jedrioreťazcová
CD) TOPOLÓGIA. lineárna (ii) DRUH MOLEKULY. DNA (xi) POPIS SEKVENCIE. SEO TO NO.24.
AGTTCAGTCG ACGGCGCGCC AACCCGGGAA TCCGGACGF.G ATCTATACAT
TGAATCAATA 60
TTGGCA 66 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO.25· (1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
(A) DĹŽKA. 42 Párov báz (Θ) TYP. nukleová kyselina
CC) DRUH RtÍAZCA. iednoretlazcová (D) TOPCLÓGIA. lineárna (li) DRUH MOLEKULY. ONA (xi) POPIS SEKVENCIE. SEQ ID N0.25.
ATGTCAGGAT CCACGCGGAA CTCCATATAT GGGCTATGAA CT 42 (2) ÚDAJE O SĽO 10 NO.26.
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
(A) DĹŽKA. 19 párov báz (B) TYP. nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA. Jednoretazccvá (D) TOPOLÓGIA. lineárna (ii) DRUH HCX.EKLILY: DNA (xi) POPIS SEKVENCIE. SEQ ID NO.26»
GGCTTAGCTC CGAGGAGGG 19 (2) ÚDAJE O SLU ID NO·27.
(1) CHARAKTERISIIKA SEKVENCIE.
CA) DĹŽKA. 26 párov báz (0) TYP. nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA. Jednoreťazcová (A) DĹŽKA. 2ti párov báz
CB) TYP: nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA: iednoretazcová (D) HFllÓGIA. lineárna (11) DRUH Híí EKUL Y. DNA
Cxl.) PlPľS SEKVENEIF: SED 10 Ν0.2Π.
GATĽGCGGCC GCGTT1AAAĽ ISGATCĽ 26 (2) ÚDAJE O SED ID Níl.21:
ít) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE* (A) DĹŽKA. 2G pírou báv (3) TYP: nukleová kyselina <í:> druh Rl TAZCAi jednoreCazccivá (D) TOPOLÓGIA: lineárna (li) DRUH MOLEKULY* ONA (xi) POPIS SEKVENCIE. SFw U) NO.21.
AAlIGGATDi: 151 ľ IAAACGU GGCCGĽ 26 (2) ÚDAJI-, t) SED LD NU.22.
íl) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
(A) DĹŽKA. 77 párov báz (R) TYP. nukleová kyselina (C) DRUH Fíl ŤAZCA. Jednoretazcová (D) TOPOLÓGIA. lineárnu (ii) DRUH MOLEKULY. DNA (xi) PÍPIS SEKVINC1E. SĽU ID NU.22.
CGTTTAGIGA accgtcagat CTACATAACA acattcctcc TCTAAAGAAG CCCCAAGCTT 60
GATATĽTGĽA GAAIICÍ 77 (2) ÚDAJI LI StlJ ID Níl.23.
íl) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE· (A) DĹŽKA. IT5 párov báz <EJ> TYP: nukleová kyselina í C) DRUH REŤAZCA, jednoreťazcová
CD) TOPOLÓGIA. lineárnu
Í1i) DRUH Mll.FKlH Y* DNA (xi) POPIS SEKVENCIE. SEQ ID NO.23:
CTAGAGAATT CTGCAGATA1 CAAGCTTGGG GCTTCTTTAG AGGAGGAATG (D) TOPOLÓGIA. lineárna (li) DRUH MOLEKULY. DNA (xi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NIJ.27.
ĽGTGACAAGC TTCGTTTTCA CAACAC (2) ÚDAJE U SEQ 10 N0»2G>
(i) CHARAK1ERISTIKA SEKVENCIE.
(A) DĹŽKA: 4263 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA, jednoreťazcová (0) TIFOLÓGIA. lineárna
Clá) DRUH MOLEKULY. DNA
Cxl) POPIS SEKVENCIE: SEQ TO NO.26.
TGAATATTAC CCCTAACAC.C TGCCACCCĽA GTCTTAATCA GTGGTGGAAG
AACGGTCTCA60
GAACTGTTTG TCTCAATTGG CCATTTAAGT TTAATAGTGA AAGACTGGTT AATGATAACA120
ATGLATCGGA AAACCTTCAG GAGGAAAGGA GAATGTTTTG TGGAACATTT
TTGTGTGTRT180
GGCAGTTTTA AGTTATTAGT TTTCAAAATC AGTACTTTTT AATGGAAACA
ACTTGACCAA240
AAATCISTCA CAGAATTTTG AGACCCAT1A AAATACAAGT TTAATGAGAA
GTCTGTCTCT300
GTTAATGĽTG AAGTCAITAC TAAG1GCTTA GĽľTAGCAAG GTATGTGGAT
GCCCATTTGT360
GTTCCAAGGG ATJGGAĽTGT TCATCAGGAC CCAGAGCTGA GTTTCAAGGG
CTCAAGAGAT420
GGCTTATTAC CTGTGGGTGT CTTGAAGGTT CTGGTTGGGA CAAA'ITAGGA
ATGT1TITGG480
CAGACATGGT GACTACCTTC ATCTG6GTGA GTTCAGTTGA TT7GTCT1GA GCCTTTGGGG540
TTTACACAAG TAAATGACAT CATAĽAGTTA GTGTAT1GTT AGTGAATATT AATATATGAG600
GCARRr.TTTG CTCTAGCAAT TTTAGAACTA GTTTTCAGGA AAGGGTTCAT crTGTGCAI T 6BĽI
GGATGiriGA TTCTATĽACT TAGAGTTTAA ACTGAAAGTG ĽTCAAGAGGT
721)
CTGGGATATA ΛΑΙ AAGiXTT
AAAGGCCATC 700
TCTGTAGCtľ CTAATGGTAT
CAGGAATTTA
GGZIGAAAAAT
OCICCCAACC GUTÍ3AAGCCC
GAGATAAGGA 1020
CftAAAAGTTA GGIGGTCTTA
AATTGGGTTA GGAGľCACTl
1TTTCACOTT 1140
AľlTAAAUCGG TGACTAAAGG AGAĽGtiíGAG 1260
ĽľCAGAACGl
TCAACTTAGT
GAAAAGG1AG AňGGTGAGAT
TTGGTAArCT
GCTCGGATGG GA1 CCAGGGC TACCAAATTA I hl u J
ATlTACCGAíX TAATi'XcCíTG CAAAACGAAG 1740
GAATTTAĽAG GAAHAGGAA ílT TAAAAAA .1000
AGGTTTGAĽA ACCAGGCTGG
GĽTGAAATCT
CAACATTC.TG
CTTCCATGTA TGGTTGTGAG
CĽACCATGTG CTCTTAACXT iTTGAGCCATr: CAAACCCCĽT
AGGCCTTCTG AGGTTATTCG
GAGCTGCAGG
ATGCAGTGAA
GGCAAGCTGA
TGC1GAGCCT
GATGACĽAAG TAAAAGCATG
ĽGTCATTTTT
ĽCbCAGCGIG
ITTAAATTAA TAGTGĽCTTG
GCAGGTATAC TTTCAGTCAG
GCTCAGGCAG ľGAGCCTATT
AGTATACCGA TGCCTCCGAA
ATACTGGGAC TCTACATTTT
ACTGCCAGAT
GCAGGGTGT T TATTTAĽCAtl
TCiAAATAlXr GGGCCATAAG CAAAGTGGCA
TATClIAľrCT ATAGTGCATG CTTGTTCAAT
T'ľTGTUAGTA TAAATGGATG GGTTGIAUGC
UACTTTAAAA GCTTAGCATA liAGGAGCATG
UWAAGGH 1
GCA TGTAAAr AAAAGCCCľT
TGrriwwiA caisaaggijaa
AGACACGTAA AATGGAATTT GGÍ5ATTCACA
TACCAGGĽAC AAAGGTGTCT
AlAAäCTACA ggiattctta aľattaaaac aitatgggca
GGATTTCTTT
1.060
TGTCTGCCTG 1920
TATCTGCACA 1980
GTTGCrGSGA 2040
TCCARCCCCA 2100
TCAGTAATGA 2100
IC.TGCĽ I CAG 2220
GGTATATTTT 2280
ĽTGGGACACA 2340
AATGCTCTTG
2400
ACTAGTTTGG 2400
TAĽTGAACTC 2520
CC-CTTAAACT 2580
TCAATATGTG 2640
TAAAGGCTGC
2700
GTCATGGCTG CCTGGCTTGG TTAGAAGACG ΑΤΓΟΑΑΟΓΟΑ GCTTGGGCAC AGGGCTTTTG TGĽAGGľTTG GTTTAAAAAA AGTAGAAGAA AGAAGGCTAT
T CC TGGACCr
ACACTT1TTT GCACCAGATC GGACCTCTGG
ATTTTTAATG GCTACCGAGA GGAGľCCAGC AAAATAAGTG CATAGGCCAA GCCTACACTA
AGTTGTGTAG ATTATGTATA rGCTAATGGA AAGAGCAGTG GCTGGGAAAT
GTAGGATTTA ATCÍTAGAAA GGTAAAGTGC TGCTCTATAT CTCTCAGCCA
ΑΑΑΤΤΓΓΓΤΤ TCCTCCTCAT TGTGATTAAG AATTTTTFTG AGĽACCACAA
TGGGGGTAAG rccTTTrTGT CCTGAGAACA GGATGGGGGT CCTGGCTCTT
CTATTTAACC TTTTTAAGAA GTTACGATTA CAGGCCTCCC GAAATACTTT
TTGGGGGGCA TGGG1GGGAG AGCAGGGTTT CTCTGTATTA GCCCTGGOTU TCCTGGAACT 2760
CTGTAGACCA GGCTATTCTT GAGCTĽAGAT TAGCCTGTCT CTGCCTCCTA AATICTGGGA 2R20
TTAAAGGTGT GTGCTACTGC TGCCTGGC.TA CAAAGAĽATT T'fT! TTTTTC TTAAATTTAA 2Θ80
| AAAĽAAAAGT AGCACTCAGG | GGTTĽTTTTA 2940 | GAAGGGTGGT | TGGTGTTGGC | ACATACTCCA |
| TTITGAGTTT GTAAGGGCTA | GTCCCAGGAA 3000 | TGAAGACTGC | ATTACTGCCG | CCCCTCCCTG |
| CACAGAGAAA AGGCTGGCCT | TCCTATTTGG 30G0 | AGCCTATCCT | GGTAAC-TCGC | TOIGTAGACC |
| CGAACTCAAG CCACCAACAC | AGAACCACCT 3120 | GCCTCTGAAI | GCTGGTATTA | AGGGCAGGCA |
| CCAGCCTAAA GAATAAACAT | AAATGTCTTT 3180 | TTTTTAAAGA | TTTTTTTTTT | TTTTTTTAGA |
| TCTGTTTACA AIXCGATCTC | ATATTCTGCT 3240 | TCTATGTATA | TCTGCACACT | AGAAUAGGGC |
| ATAATGGATG AUCTCTGĽAA | GTTGTGAGCC 3300 | ACCAAGTGGT | TGGTGGGAAT | TGAACTCAGA |
| GAGCAGTCAG 0GC1CTTGAG | TGCTCTTAAC 3360 | CTCTCAGCCA | TCTĽ.TCCAGC | CCĽTAAAAA1 |
| ATARGGTCTC CACATAGCAC | AAGTAGTTTG 3420 | AGACTGAGTT | GGCTATATAA | ACAAGGCTGG |
| CA1GTACAGC RRAGGATCAT | TGGGTTTAGT 3480 | TTACATGGGG | TGTTTTTGTC | TCTGGAGGCA |
| TTGAGCATAG TTGAGAACTA | GGAGľ-AATA 3540 | GTGAGGTCAT | GTTTTATCTA | C.TCTTCTGAA |
| AGCTGATGCA GGTGGAAACT | AAGCAAGTTT 3600 | GACTGAAGAA | GTCCAGTTTA | TGAGAACAAG |
| AATGTGTCAA TGGGAATTAG | AGATGGCCTT 3660 | GCATGTGTTT | TAGATGATGA | CCCAGTCACT |
| TGGATGTGTA CCTATATGAA | AGACCTATAl 37211 | CTTGAC.AGGA | li Γ GAACAG r 6 | TCTTAIAGGT |
| AGAAATGAGA CCTGGTTCAT | CATAĽCCATT 3780 | TTGTTTCCCC | TAA3AATTCA | CTTTTCĽTAA |
| GCTATTTAGG TTGCTTATGT | TTATTTTACT 3840 | TGCAAATCCT | AGGTGCTCCC | TTACCCAGTA |
| GGCACCAAAG TGACAAiXTA | TCACTCAĽTC 3900 | CCATGATTTG | CAAGTCTCTG | GGAACTTCCA |
| CAATAGCAAC TI1TGCAAAA | TCAAATACAT 3960 | TTTCTCAGTA | CCAATTTTGA | AGAAAAAATA |
| l AGC 1 LilATG | GATGGGTACT | AAATAGTGAC | GTTATCTCCA | GAAGGCCTAT |
GAAGAATTAA 4020 liGTl'GAGTTC AGTTGAGľTC AGCAGĽAAGT TTAAGGTTCA TCCATTTTTG
TACAGTGTTT 4080
TCCTATTACG GľAAGTGrrr 1'GCCTGCAGG AATATCTGTA CCACAT6C7T GC.CTCGTACC 4140
IATATCGGCC AGAAGAĽGGC TTIGGATUCT CTGGACTTGA ATTACAGATG GGTATTAGCC 4200
AĽCATTTAĽG TGCTGGGAAT TGAAACCAAĽ TCCTĽTGGAA GAACAGCAAG
TGATOGAGTC 4260
GAC 4263 ¢2) ÚDAJE U SEQ 11) N0.29:
<i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
IM DĹŽKA. 4695 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednorctazcová (OJ TOPOLÓGIA. lineárna ¢11) DRUH MCMEKIHY. ONA <xi) POPIS SEKVENCIE: SE.ÍJ ID Ν0.29»
CCCGGGCTGG GCTGAGACCC GCAGAGGAAG ACGCTCTAGG GAT11UlCCC GGACTAGCGA60
2ATGGCAAGG CTGAGGACGG GAGGCTGATT GAĽftGGCGAA GGIAĽAĽĽĽT AATC1CAATA120
CAACCTTTGG AGCTAAGCCA GCAAIGGTAG AGGGAAGATT ĽTGĽAĽGTCC CTTCĽAGGCG180
GCCTCCCCGT CACCACCCCC CCCAACCCGC CCCGACCGGA GCTCAGAGTA ATTCATAIIAA240
AAGGACTCGC CCCTGCCTTG RGGAATCCCA GGGACCGTCG TTAAACTCCC ACTAACGTAG30CJ
AACC.CAGAGA TCGr.TGCGTT CCCGCCCCC.T CACC.CGC.CCG CTC1CGTCAT CACTGAGGTG360
GARAAGAGCA TGCr.TGAGGC. TCCGGTGCCC GTCAGTGGGC AGAGCGCACA TCGCCCACAG420 ľCí ť:CGAGAA GTlGGGGUĽA GGĽGÍĽGCĽA AT I GAAQCGG TGIXTAGAGA ACGTGGCGCG480
GGGTAAACTS GGAAAGTQAT GTCGTGTACT GGCTCCGCCT TľTTCCCGAG GGTGGGGGAG54CI
AACCGTATAT AAGTGCAGTA GTCGCCGTGA ACGTTCTTTT TCGCAACGGG TTTGCCGCCA 600
GAACACAGGT AAGTGCCGTG TGTGGTTCCC GCGGGCCTGG CCTCTTTACG
GGTTAIGGCC660
CTTGCGTGCĽ TTGAATTACT TCCACGCCCC TGGCTGCAGT ACGIGATTCT
TGATCCCGAG720
CTTCGGGTTG GAAGTGGG1G GGAGAGTTCG AGGCGTTGCG CTTAAGGAGC ĽCCTTCGCCT780
CGTGCTTGAG TTGAGGCCTG GCCTGGGCGC TGGGGCCGCC GCGTGCGAAT
CTGGTGGCAC840
CTTCGCGCCT GTCTCGCTGC TTTCGATAAG TCTCTAGCCA TTTAAAATTT
TTGATGACCT900
GCTGCGACGC TTTTTTTCTG GCAAGATAGT CTTGTAAATG CGGGCCAAGA
TCTGCACACT960
BGTATTTCGG TTTTTGGGGC CGCGGGCGGC GACGGGGCCĽ GTGCGTCCCA GCGCACATGT1020
TCGGCGAGGC GGGGĽCTGCG AGCGCGGCCA CCGAGAATCG GACGGGGGTA
GTCTCAAGCT1080
GGCCGGCCTG CTCTGGTGCC TGGCGTCGCG CCGCCGTGTA TCGCCCCGCC
CTGGGCGGCA1140
AGGGTGGCCC GGTCGGCACC AGTTGCGTGA GCGGAAAGAT GGCCGCTTCC
CGGCCCTGCI1200
GCAGGGAGCT CAAAATGGAG GACGCGGCGC TCGGGAGAGC GGGCGGGTGA
GTCACCĽAUA1260
CAAAGGAAAA GGGCCTTTCC GTCCTCAGCC GTCGCTTCAT GTGACTCCAC
GGAGTACCGG1320
GCGCCGTCCA GGCACCTCGA TTAGTTĽTCG AGCTTTTGGA GTACGTCGTC TTTAGGTTGG13Θ0
TTTCAGATGC 2760
CTTGGTTCAA GGGATGGAAA GTCACCCGTA AGGATGGCAA TGCĽAGTGGA
ACCACGCTGC 2820
TTGAGGCTCT GGACTGCATC CTACCACCAA CTCRTCCAAC TGACAAGCCC TTGCGCCTGC 2ΘΒ0
CTCTCCAGGA TGTCTACAAA ATTGGTGGTA AGTTGGCTGT AAACAAAGTT GAAT1TGAGT 2940
TGATAGAGTA CTGTCTGCCT TCATAGGTAT TTAQTATGCT GTAAATATTT TTAGGTAITG 3000
GTACTGTTCC TGTTGGCCGA GTGGAGACTG GTGTTCTĽAA ACCCGGTATG GTGGTCACCT 3060
TTGCTCCAGT CAAĽGTTACA ACGGAAGTAA AATCTGTCGA AA1GCACCAT GAAGCTTTGA 3120
GTGAAGCTCf TCCTGGGGAC AATGTGGGCT TGAATGTCAA GAATGTGľCT GTC.AAGGATG 3180
TÍCGTCGTGG CAACGTTGCT GGTGAOAGOA AAAATGACCC ACCAATGGAA GCAGCTGGCT 3240
TCACTGCTCA GGTAACAATT TAAAGTAACA TTAACTTATT GCAGAGGCTA AAGTCATTTG3300
AGACTTTGGA TTTGCAOTGA ATGCAAATCT TTTTTCĽAAG CTGATIATCC TGAACCATCC3360
AGGCCAAATA AGCGCCGGCT ATGCCCCTGT ATTGGATTGC CACACGGCTC
ACATTGCATG 3420
CAAGTTTGCT GAGCTGAAGG AAAAGATTGA TCGCCGTTCT GGTAAAAAGĽ
TGGAAGATGG3480
CCCTAAATTC TTGAAGTĽTC GTGATGCTGC ĽATTGTTGAT ATGG7TCCTG
GCAAGCCCAT3540
GTGTGTTGAG AGOTTCTCAG ACTATCCACC TTTGGGTAAG GATGACTACT
TAAATGTAAA 3600
GGGGAGGGGT TTTATGCGAT GGAGTTTC.CC CACACTGAGT GGGTGGAGAC AAAGTTGTGI TAAAGATGAA AAATACAACT GAACAGTACT TTGGGIAATA
TGAAGTTAGG 1440 ATTAACTTTT3660
CCAGCTTGGC ACTIGATGTA ATTCTCCTTG GAATTTGCCC TTTTTGAGTT TTTTTAATAG GTCGCTTTGĽ TGTTCGTGAT ATGAGACAGA ĽAGITGCGGT
TGGATCTTGG 1500 GGGTGTCATC3720
TTCATTCTCA AGCCTCAGAC AGTGGTTCAA AGTTTTTTTC TTCCATTTCA AAAGCAGIGG ACAAGAAGGĽ TGĽTGGAGCT GGCAAGGTCA CCAAGTCTGC
GGTGTCGTGA 15G0 CCAGAAAGCT3780
AAACTAĽĽCU 1AAAAGCCAA AATGGGAAAG GAAAAGACTC ATATCAACAT ĽAGAAGGĽ1A AATGAATATT ATCCCTAATA CCTGCCACCC CACTCITAAT
TGTCGTCATT 1620 CAGTGGTGGA3Θ40
| GGACACGTAG ATTCGGGCAA ATGCGGTGGC 1680 | GTCCAIXACT | AĽTGGCCATĽ | TGATCTATAA |
| ATCGACAAAA GAftCCATÉGA TTTAATACCA 1740 | AAAATTTGAG | AAGGAGGCTG | CTGAGGTATG |
| GAAAGGGAAA GATCAAC.TAA ATTTCCCCAG 1800 | AATGAGTTTT | ACCAGCAGAA | TCATTAGGTG |
| AACTAGTGAG TGGTTTAGAT GAAATAATTT 1060 | CTGAATGCTA | ATAGTTAAGA | CC.TTACTTAT |
| rar.TTTTGGT gacttctgta TAATAGTTAA 1920 | ATCGTATTGC | TAGTGAGTAG | ATTTGGATGT |
| GATCCTACTT ATAAAAGTTT ACCAAAATĽA 1980 | GATTTTTGGT | TGCTTCTGTA | AĽĽCAAAGTG |
| CTTTGGACTT GGAGTTGTAA AAGGAAATTG 2040 | AGTGGAAACT | GCCAATTAAG | GGCTGGGGAC |
| AAGCTGGAGT TTGTGTTTTA GATGGGAAAG 2100 | GTAACCAAGT | AACGACTCTT | AATCCTTACA |
| GGĽlCCíl 1 L1A AGTATGCCTG ACGTGGTATC 2160 | GGTCTTGGAT | AAACTGAAAG | CTGAGCGTGA |
| ACCATTGATA TCTCCTTGTG TATCATTGAT 2220 | GAAATTTGAG | ACCAGCAAGT | ACTATGTGAC |
| GCCCCAGGAC ACAGAGACTT GGTTGGGATT 2280 | TATCAAAAAC | ATGATTACAG | GGACATCTCA |
| AATAATTC1TA GGTľTCTTTA TGTCATTTGG 2340 | TCCCAAAAGG | CTTGCTTTGT | ACACTGGTTT |
| AGAGTTGACA GGGATATGTC CCTGATTGTT 2400 | TTTGCTTTCT | TTAAAGGOTG | ACTGTGCTGT |
| GCTGĽTGGTG TTGGľtíAATT CCGAGAGCAT 2460 | TGAAGLTGGT | ATCTCCAAGA | AIGGGCAGAC |
| GCĽCTTCTGG CTTACACACT OAAAATGGAT 2520 | GGGTGTGAAA | CAACTAATTG | TCGGTGTTAA |
| TCCACTGAGC CACCCTACAG AGTCAGCACT 2580 | CCAGAAGAGA | TATGAGGAAA | TTGTTAAGGA |
AGAACGGTCT CAGAACTGTT TGTTTCAATT GCCCATTTAA GTTTAGTACT AAAAGACTGG 3900
TTAATGATAA CAATGCATCG TAAftACCTTC AGAAGGAAAG GAGAATGITT
TGTGGAIXAC3960
TTTGGTTTTC TTTTTTGCGT GTGGCAGTTT TAAGTTATTA GTTTTTAAAA
TCAGTACTTT4020
TTAATGGAAA CAACTTRACC AAAAATTTGT CACAGAATTT TGAGACCCAT
ΤΑΑΑΑΑΑΙΠΤ4880
AAATGAGAAA (XTGTGTGTT CCTTTGGTCA ACACCGAGAC ATTTAGGTGA
AAGACATCTA4140
ATTCTGGTTT TACGAATCTG GAAACTTCTT GAAAATGTAA TTCTTGAGTT
AACACTTCTG4200
GGTGGAGAAT AGGGTTGTTT TCCCCCCACA TAATTGGAAG GGGAAGGAAT ATCATTTAAA4260
GC-TATGGGAG GGTTTCTTTG ATTACAACAC TGGAGAGAAA TGP.AGCAIGT
TGCTGATTGC4320
CTGTCACTAA AACAGGCCAA AAACTGAGTC CTTGGGTTGC ATAGAAAGCT
TCATGTTGCT4380
AAACCAATGT TAAGTGAATC TTTGGAAACA AAATGTTTCC. AAATTACTGG GATGTGCATG4440
TTGAAAĽGTG GG1TAAAATG ACTGGGCAGT GAAAGTTGAC TATTTGCCAT GACATAAGAA4500
ATAAOTGTAG
AGTCA6TGGA
GTAAGCTTTA
CAGAATAGGA
TGGCTAGTCT 4560
TGCCATTTTG 4620
ACACCCTATG AGTGGAAĽlili
ATGGTTTCAC
AAGTTCTATT i ľľafu i ga
GAGTGCTATT
ACAAGGTTC1 AATAGAAAAA GATGGCAATT TGAAGTARCT ATAAAATTAG ACTAATTAC.A 4600
TTGC.TTTTCT CCGAC
Claims (29)
1. Purifikovaná a izolovaná transkripčná regulačná DNA škrečacieho EF-Ια, zvolená z a) DNA obsahujúcej sekvenciu nukleovej kyseliny uvedenú v SEQ ID NO: 1, b) DNA obsahujúcej časť sekvencie nukleovej kyseliny uvedenej v SEQ ID NO: 1, ktorá je schopná zvýšiť transkripciu génu operatívne pripojeného k regulačnej DNA, c) DNA obsahujúcej oblasť od nukleotidu 2114 do nukleotidu 3656 sekvencie uvedenej v SEQ ID NO: 1, d) 11,7 kb regulačnej DNA sekvencie škrečacieho EF-Ια v plazmide pDEF14, ktorý je uložený v zbierke ATCC pod prírastkovým číslom 98 398, e) DNA obsahujúcej sekvencie nukleovej kyseliny uvedenej v SEQ ID NO: 28, f) škrečacej regulačnej DNA sekvencie, ktorá hybridizujc s DNA opísanou v SEQ ID NO: I za podmienok zahŕňajúcich konečné premytie v tlmivom roztoku obsahujúcom 2X SSC a 0,1% SDS pri 65 °C, g) DNA obsahujúcej 1,56 kb od 5' do iniciačného ATG kodónuvSEQ IDNO: 1.
2. DNA podľa nároku 1, kde uvedená regulačná DNA obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny uvedenú v SEQ ID NO: 1.
3. DNA podľa nároku 1, kde regulačná DNA obsahuje časť sekvencie nukleovej kyseliny uvedenej v SEQ ID NO: 1, ktorá je schopná zvýšiť transkripciu génu operatívne pripojeného k regulačnej DNA.
4. DNA podľa nároku 3, kde regulačná DNA obsahuje oblasť od nukleotidu 2114 do nukleotidu 3656 sekvencie polynukleotidu uvedeného v SEQ ID NO: 1.
5. Hostiteľská bunka obsahujúca DNA podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, kde DNA nie je operatívne pripojená k EF-Ια kódujúcim sekvenciám.
6. Vektor obsahujúci DNA podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, kde DNA nie je operatívne pripojená k EF-la kódujúcim sekvenciám.
7. Hostiteľská bunka transformovaná alebo transfekovaná vektorom podľa nároku 6.
8. Chimerický polynukleotid zahŕňajúci regulačnú DNA škrečacieho EF-Ια, podľa nároku 1 operatívne pripojenú k DNA sekvencii kódujúcej proteín, táto sekvencia DNA kóduje proteín odlišný od škrečacieho EF-la.
9. Chimerický polynukleotid podľa nároku 8, kde regulačná DNA obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny uvedenú v SEQ IDNO: 1.
10. Chimerický polynukleotid podľa nároku 8, kde regulačná DNA obsahuje časť sekvencie nukleovej kyseliny uvedenej v SEQ ID NO: 1, táto časť je schopná zvýšiť transkripciu génu operatívne pripojeného k regulačnej DNA.
11. Chimerický polynukleotid podľa nároku 10, kde regulačná DNA obsahuje oblasť od nukleotidu 2114 do nukleotidu 3656 v polynukleotide uvedenom v SEQ ID NO: 1.
12. Chimerický polynukleotid podľa nároku 8, kde sekvencia DNA kódujúca proteín kóduje proteín endogénny vzhľadom na škrečacie bunky, ktorý je odlišný od EF-la.
13. Chimerický polynukleotid podľa nároku 8, kde sekvencia DNA kóduje proteín heterológny vzhľadom na škrečacie bunky.
14. Hostiteľská bunka transformovaná alebo transfekovaná chimerickým polynukleotidom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 13.
15. Expresný plazmid obsahujúci chimerický polynukleotid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 13.
16. Expresný plazmid podľa nároku 15, ktorý ďalej obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny uvedenú v SEQ ID NO: 28.
17. Expresný plazmid podľa nároku 16, kde sekvencia nukleovej kyseliny uvedená v SEQ ID NO: 28 je umiestnená 3' vzhľadom na chimerický polynukleotid.
18. Hostiteľská bunka transformovaná alebo transfekovaná expresným plazmidom podľa nároku 15.
19. Hostiteľská bunka transformovaná alebo transfekovaná expresným plazmidom podľa nároku 16 alebo 17.
20. Plazmid pDEF2 uložený v zbierke ATCC pod prírastkovým číslom 98343.
21. Plazmid pDEF14 uložený v zbierke ATCC pod prírastkovým číslom 98398-
22. Plazmid pDEFl/ICM3H.2 uložený v zbierke ATCC pod prírastkovým číslom 98381.
23. Plazmid pNEFl/ICM3L.3 uložený v zbierke ATCC pod prírastkovým číslom 98382.
24. Plazmid pDEFl/F2GH.l uložený v zbierke ATCC pod prírastkovým číslom 98383.
25. Plazmid pNEFl/F2GL.l uložený v zbierke ATCC pod prírastkovým číslom 98384.
26. Plazmid pDEFl/CTN.l uložený v zbierke ATCC pod prírastkovým číslom 98385.
27. Plazmid pDEF2/HPH.4 uložený v zbierke ATCC pod prírastkovým číslom 98386.
28. Plazmid pDEFlO/MDC. 1 uložený v zbierke ATCC pod prírastkovým číslom 98387.
29. Hostiteľská bunka transformovaná alebo transfekovaná expresným plazmidom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 20 až 28.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/847,218 US5888809A (en) | 1997-05-01 | 1997-05-01 | Hamster EF-1α transcriptional regulatory DNA |
| PCT/US1998/008906 WO1998049289A1 (en) | 1997-05-01 | 1998-05-01 | HAMSTER EF-1α TRANSCRIPTIONAL REGULATORY DNA |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK11899A3 SK11899A3 (en) | 2000-05-16 |
| SK285664B6 true SK285664B6 (sk) | 2007-05-03 |
Family
ID=25300098
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK118-99A SK285664B6 (sk) | 1997-05-01 | 1998-05-01 | Purifikovaná a izolovaná transkripčná regulačná DNA škrečacieho EF-1alfa, hostiteľské bunky, vektory, chimerické polynukleotidy a plazmidy |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5888809A (sk) |
| EP (2) | EP1676916A1 (sk) |
| JP (1) | JP2000513948A (sk) |
| CN (2) | CN101570753A (sk) |
| AT (1) | ATE318900T1 (sk) |
| AU (1) | AU742561B2 (sk) |
| BR (1) | BR9804896B1 (sk) |
| CZ (1) | CZ296544B6 (sk) |
| DE (1) | DE69833649T2 (sk) |
| DK (1) | DK0920498T3 (sk) |
| ES (1) | ES2263206T3 (sk) |
| HK (1) | HK1022719A1 (sk) |
| HU (1) | HU225764B1 (sk) |
| IL (1) | IL127897A (sk) |
| NO (1) | NO323853B1 (sk) |
| PL (1) | PL195604B1 (sk) |
| PT (1) | PT920498E (sk) |
| RU (2) | RU2249617C2 (sk) |
| SK (1) | SK285664B6 (sk) |
| WO (1) | WO1998049289A1 (sk) |
Families Citing this family (119)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8183344B2 (en) * | 1996-04-24 | 2012-05-22 | University Of Michigan | Inactivation resistant factor VIII |
| US6479256B1 (en) | 1998-03-04 | 2002-11-12 | Icos Corporation | Lectomedin materials and methods |
| KR20000046969A (ko) * | 1998-12-31 | 2000-07-25 | 이선경 | 이종 유전자 유래의 유전자 발현 조절요소를 포함하는 강력한전사 활성을 가진 진핵세포 발현벡더 |
| US20030088061A1 (en) * | 2000-10-12 | 2003-05-08 | Staunton Donald E. | Materials and methods to modulate ligand binding/enzymatic activity of alpha/beta proteins containing an allosteric regulatory site |
| AU2002230773A1 (en) * | 2000-12-18 | 2002-07-01 | Wyeth | Promoters and recombinant expression constructs |
| SG143066A1 (en) * | 2001-07-04 | 2008-06-27 | Chromagenics Bv | Dna sequences comprising gene transcription regulatory qualities and methods for detecting and using such dna sequences |
| AU2003243059A1 (en) * | 2002-06-14 | 2003-12-31 | Chromagenics B.V. | Use of repression blocking sequences in methods for enhancing gene expression |
| WO2003106684A2 (en) * | 2002-06-14 | 2003-12-24 | Chromagenics B.V. | A method for simultaneous production of multiple proteins; vectors and cells for use therein |
| ATE524559T1 (de) * | 2002-12-18 | 2011-09-15 | Chromagenics Bv | Methode zur verbesserung der proteinproduktion |
| WO2004056986A2 (en) * | 2002-12-20 | 2004-07-08 | Chromagenics B.V. | Means and methods for producing a protein through chromatin openers that are capable of rendering chromatin more accessible to transcription factors |
| EP1842920B2 (en) | 2003-09-23 | 2017-06-21 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Cells coexpressing vitamin K reductase and vitamin K dependent protein and use thereof to improve the productivity of said vitamin K dependent protein |
| WO2006101474A1 (en) * | 2005-03-15 | 2006-09-28 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for producing active vitamin k-dependent proteins |
| US8039230B2 (en) * | 2004-11-08 | 2011-10-18 | Chromagenics B.V. | Selection of host cells expressing protein at high levels |
| EP1809750B1 (en) * | 2004-11-08 | 2012-03-21 | ChromaGenics B.V. | Selection of host cells expressing protein at high levels |
| US8999667B2 (en) * | 2004-11-08 | 2015-04-07 | Chromagenics B.V. | Selection of host cells expressing protein at high levels |
| ATE550432T1 (de) | 2004-11-08 | 2012-04-15 | Chromagenics Bv | Selektion von wirtszellen mit proteinexpression auf hohem niveau |
| US20060195935A1 (en) | 2004-11-08 | 2006-08-31 | Chromagenics B.V. | Selection of host cells expressing protein at high levels |
| US20060121574A1 (en) * | 2004-12-08 | 2006-06-08 | Icos Corporation | Recombinant method for making multimeric proteins |
| CA2614436C (en) | 2005-07-07 | 2016-05-17 | Seattle Genetics, Inc. | Monomethylvaline compounds having phenylalanine side-chain modifications at the c-terminus |
| US8871720B2 (en) * | 2005-07-07 | 2014-10-28 | Seattle Genetics, Inc. | Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the C-terminus |
| DE602006021335D1 (de) | 2005-10-21 | 2011-05-26 | Hoffmann La Roche | Methode zur rekombinanten expression eines polyeptids |
| US7892790B2 (en) | 2005-10-28 | 2011-02-22 | Hoffmann-La Roche Inc. | Protein expression in rodent cells |
| SI1969127T2 (sl) * | 2005-12-21 | 2017-10-30 | Cnj Holdings, Inc | Metoda pridobivanja biološko aktivnih proteinov, odvisnih od vitamina K, z rekombinantnimi metodami |
| WO2007081336A1 (en) * | 2006-01-13 | 2007-07-19 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Mammalian vectors for high-level expression of recombinant proteins |
| KR101202498B1 (ko) | 2006-05-17 | 2012-11-16 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 폴리펩티드 생성 세포 |
| US20090203077A1 (en) * | 2006-06-30 | 2009-08-13 | The Regents Of The University Of Michigan | Method of producing factor viii proteins by recombinant methods |
| JP2009542225A (ja) * | 2006-06-30 | 2009-12-03 | ザ・リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ミシガン | 組換え法によりｆｖｉｉｉタンパク質を生産する方法 |
| CL2008000707A1 (es) | 2007-03-13 | 2008-09-22 | Hoffmann La Roche | Conjugado de polipeptidos antifusogenicos y polipeptidos derivados de la cabeza globular del factor del complemento c1q; composicion farmaceutica que lo comprende; su uso para tratar infecciones viricas; y metodo de produccion. |
| EP1975228A1 (en) | 2007-03-28 | 2008-10-01 | Fachhochschule Mannheim | Polynucleotides for enhancing expression of a polynucleotide of interest |
| JP6050927B2 (ja) | 2007-04-26 | 2016-12-21 | シーエヌジェイ ホールディングス，インコーポレイテッド | 高シアル酸含量を有する組換えビタミンｋ依存性タンパク質およびその調製方法 |
| ES2665920T3 (es) * | 2007-06-29 | 2018-04-30 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Mutante de cadena pesada para mejorar la producción de inmunoglobulina |
| US8771988B2 (en) | 2007-10-12 | 2014-07-08 | Hoffmann-La Roche Inc. | Protein expression from multiple nucleic acids |
| EP3115469B1 (en) | 2007-11-19 | 2020-04-29 | Celera Corporation | Lung cancer markers and uses thereof |
| UA101497C2 (ru) | 2008-04-24 | 2013-04-10 | Селтик Фарма Пег Лтд. | Конъюгаты фактора ix с увеличенным временем полужизни |
| CA2723197C (en) | 2008-05-02 | 2017-09-19 | Seattle Genetics, Inc. | Methods and compositions for making antibodies and antibody derivatives with reduced core fucosylation |
| ES2563073T3 (es) | 2009-08-06 | 2016-03-10 | Cmc Icos Biologics, Inc. | Métodos para mejorar la expresión de proteínas recombinantes |
| DK2478107T3 (da) | 2009-09-15 | 2019-01-02 | Medimmune Ltd | Celler til transient ekspression og anvendelser deraf |
| WO2011053738A1 (en) | 2009-10-30 | 2011-05-05 | Inspiration Biopharmaceuticals, Inc. | Method of producing recombinant vitamin k dependent proteins |
| EP2339009A1 (en) | 2009-12-22 | 2011-06-29 | Sandoz Ag | Cold inducible promoter sequences |
| EP2552965A2 (en) | 2010-03-31 | 2013-02-06 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Anti-cd40 antibodies |
| UA112062C2 (uk) | 2010-10-04 | 2016-07-25 | Бьорінгер Інгельхайм Інтернаціональ Гмбх | Cd33-зв'язувальний агент |
| EP3456740A1 (en) | 2010-11-04 | 2019-03-20 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Anti-il-23 antibodies |
| WO2012088222A2 (en) | 2010-12-21 | 2012-06-28 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for producing active vitamin k-dependent proteins |
| US20150158934A1 (en) | 2011-09-09 | 2015-06-11 | Ucl Business Plc | Broadly neutralizing vhh against hiv-1 |
| PT2771031T (pt) | 2011-10-28 | 2018-05-24 | Prothena Biosciences Ltd | Anticorpos humanizados que reconhecem a alfa-sinucleína |
| EP3536710A1 (en) | 2011-11-16 | 2019-09-11 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Anti il-36r antibodies |
| KR102285184B1 (ko) | 2011-12-22 | 2021-08-03 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 발현 벡터 구성원 조합, 신규한 제조 세포 생성 방법 및 폴리펩티드의 재조합적 제조를 위한 그의 용도 |
| KR20140107295A (ko) | 2011-12-22 | 2014-09-04 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 진핵 세포용 전장 항체 표시 시스템 및 그것의 용도 |
| PL2794878T3 (pl) | 2011-12-22 | 2020-07-27 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Organizacja wektora ekspresyjnego, nowe sposoby generowania komórek produkcyjnych i ich zastosowanie do rekombinowanej produkcji polipeptydów |
| BR112014018561A8 (pt) | 2012-01-27 | 2017-07-11 | Neotope Biosciences Ltd | Anticorpo; ácido nucleico; célula hospedeira; composição farmacêutica; uso de um anticorpo; método para produção de um anticorpo; e método para produção de uma linhagem celular que produz um anticorpo |
| ES2725569T3 (es) | 2012-02-10 | 2019-09-24 | Seattle Genetics Inc | Diagnóstico y tratamiento de cánceres que expresan CD30 |
| CN104254603A (zh) * | 2012-02-14 | 2014-12-31 | 博尔托拉制药公司 | 用于制备xa因子抑制剂的重组解毒剂的方法 |
| EA201401204A1 (ru) | 2012-05-03 | 2015-05-29 | Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх | Антитела к il-23p19 |
| UA118441C2 (uk) | 2012-10-08 | 2019-01-25 | Протена Біосаєнсиз Лімітед | Антитіло, що розпізнає альфа-синуклеїн |
| US20150307863A1 (en) | 2012-11-20 | 2015-10-29 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for modified factor ix proteins |
| WO2014164869A1 (en) | 2013-03-12 | 2014-10-09 | Cmc Icos Biologics, Inc. | Improved recombinant protein expression using a hybrid chef1 promoter |
| CU24446B1 (es) | 2013-03-13 | 2019-10-04 | Prothena Biosciences Ltd | Un anticuerpo monoclonal humanizado que se une a tau |
| US10513555B2 (en) | 2013-07-04 | 2019-12-24 | Prothena Biosciences Limited | Antibody formulations and methods |
| RU2535871C1 (ru) * | 2013-07-10 | 2014-12-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ") | Плазмида для экспрессии в клетке китайского хомячка, клетка китайского хомячка - продуцент белка с Gla-доменом и способ получения белка с Gla-доменом |
| US9951131B2 (en) | 2013-07-12 | 2018-04-24 | Prothena Biosciences Limited | Antibodies that recognize IAPP |
| US9850302B2 (en) | 2013-07-12 | 2017-12-26 | Prothena Biosciences Limited | Antibodies that recognize IAPP |
| JP2017501848A (ja) | 2013-11-19 | 2017-01-19 | プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド | 便秘症状からのレビー小体病の免疫療法のモニター |
| CA2934965A1 (en) | 2014-01-31 | 2016-03-17 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Novel anti-baff antibodies |
| TW201623331A (zh) | 2014-03-12 | 2016-07-01 | 普羅帝納生物科學公司 | 抗黑色素瘤細胞黏著分子（ｍｃａｍ）抗體類及使用彼等之相關方法 |
| CA2938946A1 (en) | 2014-03-12 | 2015-09-17 | Prothena Biosciences Limited | Anti-mcam antibodies and associated methods of use |
| JP2017514458A (ja) | 2014-03-12 | 2017-06-08 | プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド | Ｌｇ４−５に対して特異的な抗−ラミニン４抗体 |
| JP2017512772A (ja) | 2014-03-12 | 2017-05-25 | プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド | Ｌｇ１〜３に特異的な抗ラミニン４抗体 |
| EP3129051A1 (en) | 2014-04-08 | 2017-02-15 | Prothena Biosciences Limited | Blood-brain barrier shuttles containing antibodies recognizing alpha-synuclein |
| EP3708679A1 (en) | 2014-07-24 | 2020-09-16 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Biomarkers useful in the treatment of il-23a related diseases |
| TWI769570B (zh) | 2015-01-28 | 2022-07-01 | 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 | 抗甲狀腺素運送蛋白抗體 |
| TWI781507B (zh) | 2015-01-28 | 2022-10-21 | 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 | 抗甲狀腺素運送蛋白抗體 |
| TWI786505B (zh) | 2015-01-28 | 2022-12-11 | 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 | 抗甲狀腺素運送蛋白抗體 |
| KR102554850B1 (ko) | 2015-02-06 | 2023-07-13 | 더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐 | 최적화된 인간 응고 인자 viii 유전자 발현 카세트 및 그의 용도 |
| EP3685856A1 (en) | 2015-04-14 | 2020-07-29 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Treatment of asthma with anti-il-23a antibodies |
| KR20180023900A (ko) | 2015-05-12 | 2018-03-07 | 신티뮨, 인크. | 인간화된 친화성 성숙 항-FcRn 항체 |
| CA2998716A1 (en) | 2015-09-16 | 2017-03-23 | Prothena Biosciences Limited | Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of giant cell arteritis, polymyalgia rheumatica or takayasu's arteritis |
| WO2017046774A2 (en) | 2015-09-16 | 2017-03-23 | Prothena Biosciences Limited | Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of giant cell arteritis, polymyalgia rheumatica or takayasu's arteritis |
| TWI733695B (zh) | 2015-09-18 | 2021-07-21 | 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 | 治療發炎性疾病之方法 |
| WO2017070167A1 (en) | 2015-10-20 | 2017-04-27 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for modified factor ix fusion proteins |
| WO2017149513A1 (en) | 2016-03-03 | 2017-09-08 | Prothena Biosciences Limited | Anti-mcam antibodies and associated methods of use |
| WO2017153953A1 (en) | 2016-03-09 | 2017-09-14 | Prothena Biosciences Limited | Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of granulomatous lung diseases |
| WO2017153955A1 (en) | 2016-03-09 | 2017-09-14 | Prothena Biosciences Limited | Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of granulomatous lung diseases |
| MX2018012410A (es) | 2016-04-15 | 2019-02-21 | Boehringer Ingelheim Int | Metodos para tratar enfermedades inflamatorias. |
| EA201892427A1 (ru) | 2016-04-25 | 2019-10-31 | ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИ-FcRn АНТИТЕЛА С СОЗРЕВШЕЙ АФФИННОСТЬЮ | |
| CU24538B1 (es) | 2016-05-02 | 2021-08-06 | Prothena Biosciences Ltd | Anticuerpos monoclonales que compiten por unirse a tau humano con el anticuerpo 16g7 |
| JP7170316B2 (ja) | 2016-05-02 | 2022-11-14 | プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド | タウ免疫療法 |
| EP3452508A1 (en) | 2016-05-02 | 2019-03-13 | Prothena Biosciences Limited | Antibodies recognizing tau |
| WO2017208210A1 (en) | 2016-06-03 | 2017-12-07 | Prothena Biosciences Limited | Anti-mcam antibodies and associated methods of use |
| JP7016470B2 (ja) | 2016-07-02 | 2022-02-07 | プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド | 抗トランスサイレチン抗体 |
| JP7017013B2 (ja) | 2016-07-02 | 2022-02-08 | プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド | 抗トランスサイレチン抗体 |
| JP7076711B2 (ja) | 2016-07-02 | 2022-05-30 | プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド | 抗トランスサイレチン抗体 |
| EP3472198B1 (en) | 2016-09-29 | 2020-03-04 | H. Hoffnabb-La Roche Ag | Improved method for selecting polypeptide producing cells |
| EP4032906A1 (en) | 2016-10-14 | 2022-07-27 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Methods of treating diseases |
| CN110461877A (zh) | 2017-03-27 | 2019-11-15 | 勃林格殷格翰国际有限公司 | 抗il-36r抗体联合治疗 |
| SG11201910066QA (en) | 2017-05-02 | 2019-11-28 | Prothena Biosciences Ltd | Antibodies recognizing tau |
| US10793634B2 (en) | 2017-06-09 | 2020-10-06 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Anti-TrkB antibodies |
| AU2017434556A1 (en) | 2017-09-28 | 2020-04-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Dosing regimes for treatment of synucleinopathies |
| US20210062217A1 (en) | 2018-01-10 | 2021-03-04 | Agc Biologics, Inc. | Bidirectional chef1 vectors |
| CN112004826A (zh) | 2018-02-05 | 2020-11-27 | 自由大学基金会 | 反向激动性抗us28抗体 |
| WO2019156566A1 (en) | 2018-02-12 | 2019-08-15 | Umc Utrecht Holding B.V. | Bispecific molecules comprising gamma-delta tcr and t-cell or nk cell binding domain |
| WO2019226050A2 (en) | 2018-05-24 | 2019-11-28 | Wageningen Universiteit | Novel viral anti-infective reagents |
| WO2019235923A1 (en) | 2018-06-04 | 2019-12-12 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Role for low density lipoprotein receptor-related protein 10 in progressive brain diseases |
| EP3813950A1 (en) | 2018-06-29 | 2021-05-05 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Anti-cd40 antibodies for use in treating autoimmune disease |
| CN110904127A (zh) | 2018-09-18 | 2020-03-24 | 瓦赫宁恩研究基金会 | 非洲猪瘟病毒疫苗 |
| WO2020080941A1 (en) | 2018-10-16 | 2020-04-23 | Umc Utrecht Holding B.V. | Anti- low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6 antibodies |
| WO2020112687A2 (en) | 2018-11-26 | 2020-06-04 | Forty Seven, Inc. | Humanized antibodies against c-kit |
| WO2020130838A2 (en) | 2018-12-21 | 2020-06-25 | Qvq Holding B.V. | Antibodies for preventing or treating candidiasis |
| WO2020180819A1 (en) | 2019-03-03 | 2020-09-10 | Prothena Biosciences Limited | Antibodies recognizing tau |
| JP7420827B2 (ja) | 2019-03-08 | 2024-01-23 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 抗ｉｌ－３６ｒ抗体製剤 |
| JP2022529139A (ja) | 2019-04-02 | 2022-06-17 | イミュネチューン・ベー・フェー | 免疫刺激組成物及びその使用 |
| AR122266A1 (es) | 2019-05-09 | 2022-08-31 | Boehringer Ingelheim Int | Anticuerpos anti-sema3a y sus usos para tratar enfermedades oculares |
| TW202115112A (zh) | 2019-06-27 | 2021-04-16 | 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 | 抗-angpt2抗體 |
| TW202126685A (zh) | 2019-09-24 | 2021-07-16 | 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 | 抗nrp1a抗體及其用於治療眼或眼部疾病之用途 |
| EP4157876A1 (en) | 2020-05-26 | 2023-04-05 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Anti-pd-1 antibodies |
| JP2024505674A (ja) | 2021-02-05 | 2024-02-07 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 抗ｉｌ１ｒａｐ抗体 |
| AR128065A1 (es) | 2021-12-22 | 2024-03-20 | Cdr Life Ag | Anticuerpos anti-c3 y fragmentos de unión al antígeno de estos y sus usos para tratar enfermedades oftálmicas u oculares |
| CN114540352A (zh) * | 2022-02-16 | 2022-05-27 | 艾瑞生命科学技术(常州)有限公司 | 一种多核苷酸、载体元件及表达载体和宿主细胞及应用 |
| WO2024096735A1 (en) | 2022-10-31 | 2024-05-10 | Stichting Amsterdam UMC | Single domain anti-cd169 antibodies |
| WO2024101989A1 (en) | 2022-11-08 | 2024-05-16 | Stichting Amsterdam UMC | Activation inducible antigen receptors for adoptive immunotherapy |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5266491A (en) * | 1989-03-14 | 1993-11-30 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | DNA fragment and expression plasmid containing the DNA fragment |
| JP3051411B2 (ja) * | 1989-03-14 | 2000-06-12 | 持田製薬株式会社 | 新規ｄｎａならびにそれを含有する発現プラスミド |
| UA42675C2 (uk) * | 1989-12-22 | 2001-11-15 | Апплайд Рєзєч Сістемз, Арс Холдінг Н.В. (Антільські Острови) | Спосіб активації гена, що в нормі транскрипційно мовчить, з геному еукаріотичної клітинної лінії, спосіб модифікації характеристик експресії гена з геному еукаріотичної клітинної лінії, диференційована еукаріотична клітинна лінія (варіанти), днк-конструкт |
| US5650294A (en) * | 1990-06-25 | 1997-07-22 | Basf Aktiengesellschaft | Isolated promoter and terminator of elongation factor 1-α |
| AU664847B2 (en) * | 1991-05-15 | 1995-12-07 | Cell Genesys, Inc. | Genomic modifications with homologous DNA targeting |
| CA2051085C (en) * | 1991-09-10 | 2001-08-21 | Shigekazu Nagata | Expression plasmids |
| TW402639B (en) * | 1992-12-03 | 2000-08-21 | Transkaryotic Therapies Inc | Protein production and protein delivery |
-
1997
- 1997-05-01 US US08/847,218 patent/US5888809A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-05-01 EP EP06003954A patent/EP1676916A1/en not_active Withdrawn
- 1998-05-01 IL IL12789798A patent/IL127897A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-05-01 CN CNA2008101103936A patent/CN101570753A/zh active Pending
- 1998-05-01 CZ CZ0028099A patent/CZ296544B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-05-01 PT PT98920128T patent/PT920498E/pt unknown
- 1998-05-01 ES ES98920128T patent/ES2263206T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 PL PL98331005A patent/PL195604B1/pl unknown
- 1998-05-01 HU HU0004137A patent/HU225764B1/hu unknown
- 1998-05-01 WO PCT/US1998/008906 patent/WO1998049289A1/en active Application Filing
- 1998-05-01 JP JP10547444A patent/JP2000513948A/ja active Pending
- 1998-05-01 EP EP98920128A patent/EP0920498B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 RU RU99101788/13A patent/RU2249617C2/ru active
- 1998-05-01 BR BRPI9804896-1B1A patent/BR9804896B1/pt active IP Right Grant
- 1998-05-01 DE DE69833649T patent/DE69833649T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 SK SK118-99A patent/SK285664B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-05-01 AT AT98920128T patent/ATE318900T1/de active
- 1998-05-01 CN CNB988009137A patent/CN100430477C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 AU AU72770/98A patent/AU742561B2/en not_active Expired
- 1998-05-01 DK DK98920128T patent/DK0920498T3/da active
-
1999
- 1999-01-04 NO NO19990025A patent/NO323853B1/no not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-03-15 HK HK00101582A patent/HK1022719A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-12-10 RU RU2004136574/13A patent/RU2004136574A/ru not_active Application Discontinuation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK285664B6 (sk) | Purifikovaná a izolovaná transkripčná regulačná DNA škrečacieho EF-1alfa, hostiteľské bunky, vektory, chimerické polynukleotidy a plazmidy | |
| JP6577969B2 (ja) | 部位特異的セリンリコンビナーゼ及びそれらの使用方法 | |
| JP4999293B2 (ja) | 人工染色体、該染色体の使用および人工染色体の製造方法 | |
| CS267192A3 (en) | Expression systems | |
| US6482937B1 (en) | Porcine Oct-4 promoter | |
| CA2445011A1 (en) | Transformed silkworm producing human collagen | |
| CA2405768A1 (en) | Self-extinguishing recombinases, nucleic acids encoding them and methods of using the same | |
| JP2006262875A (ja) | 鳥類の卵管内でタンパク質を発現させるための遺伝子構築物、およびこれを用いたタンパク質の生産方法 | |
| JP2010522549A (ja) | 目的のポリヌクレオチドの発現を増強するためのポリヌクレオチド | |
| US5759805A (en) | CD69 transcriptional regulatory elements | |
| WO1998046756A9 (en) | Secreted protein ssp-1 compositions and therapeutic and diagnostic uses therefor | |
| CA2259145C (en) | Hamster ef-1.alpha. transcriptional regulatory dna | |
| CA2203613C (en) | Secreted .alpha.-amylase as a reporter gene | |
| KR100607527B1 (ko) | 인간이 아닌 형질전이된 동물로부터의 고 전사 복합체의 정제방법 | |
| EP0753579B1 (en) | Novel promoter and method of gene expression using the same | |
| EP0881288B1 (en) | Purification of higher order transcription complexes from transgenic non-human animals | |
| Gunaratne et al. | An evolutionarily conserved palindrome in the Drosophila Gld promoter directs tissue-specific expression. | |
| JPH05115283A (ja) | プロテインホスフアターゼ阻害物質−１の遺伝子及びその発現 | |
| AU655815B2 (en) | Gene expression cassette containing non-coding sequence of growth hormone gene | |
| WO1998014218A1 (en) | MAMMALS AND CELLS WITH A HOMOZYGOUS DISRUPTION IN THE RNase L GENE AND METHODS THEREFOR |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC4A | Assignment and transfer of rights |
Owner name: CMC ICOS BIOLOGICS, INC., S.E. BOTHELL, WA, US Free format text: FORMER OWNER: ICOS CORPORATION, S. E. BOTHELL, WA, US Effective date: 20141010 |
|
| MK4A | Expiry of patent |
Expiry date: 20180501 |