SK285664B6 - Purifikovaná a izolovaná transkripčná regulačná DNA škrečacieho EF-1alfa, hostiteľské bunky, vektory, chimerické polynukleotidy a plazmidy - Google Patents

Purifikovaná a izolovaná transkripčná regulačná DNA škrečacieho EF-1alfa, hostiteľské bunky, vektory, chimerické polynukleotidy a plazmidy Download PDF

Info

Publication number
SK285664B6
SK285664B6 SK118-99A SK11899A SK285664B6 SK 285664 B6 SK285664 B6 SK 285664B6 SK 11899 A SK11899 A SK 11899A SK 285664 B6 SK285664 B6 SK 285664B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
dna
seq
plasmid
fragment
nucleic acid
Prior art date
Application number
SK118-99A
Other languages
English (en)
Other versions
SK11899A3 (en
Inventor
Daniel S. Allison
Original Assignee
Icos Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Icos Corporation filed Critical Icos Corporation
Publication of SK11899A3 publication Critical patent/SK11899A3/sk
Publication of SK285664B6 publication Critical patent/SK285664B6/sk

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702Regulators; Modulating activity
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67General methods for enhancing the expression
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01KANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00Genetically modified animals
    • A01K2217/05Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Purifikovaná a izolovaná transkripčná regulačná DNA škrečacieho EF-1alfa zvolená z a) DNA obsahujúcej sekvenciu nukleovej kyseliny uvedenú v SEQ ID NO: 1, b) DNA obsahujúcej časť sekvencie nukleovej kyseliny uvedenej v SEQ ID NO: 1, ktorá je schopnápodporovať transkripciu génu operatívne pripojeného k regulačnej DNA, c) DNA obsahujúcej oblasť od nukleotidu 2114 do nukleotidu 3656 uvedenej v SEQ ID NO: 1, d) 11,7 kb regulačnej DNA sekvencie škrečacieho EF-1alfa v plazmide pDEF14, ktorý je uložený v zbierke ATCC pod prírastkovým číslom 98 398, e) DNA obsahujúcej sekvencie nukleovej kyseliny uvedenej v SEQ ID NO: 28, f) škrečacej regulačnej DNA sekvencie, ktorá hybridizuje s DNA opísanou v SEQ ID NO: 1 za podmienok zahŕňajúcich konečné premytie v tlmivom roztoku obsahujúcom 2X SSC a 0,1 % SDS pri 65 °C, g) DNA obsahujúcej 1,56 kb od 5' do iniciačného ATG kodónu v SEQ ID NO: 1. Hostiteľskébunky, vektory, chimerické polynukleotidy a plazmidy.

Description

Vynález sa týka regulačných sekvencií DNA pochádzajúcich z škrcčacicho EF-Ια. Ďalej sa vynález týka expresných konštruktov obsahujúcich uvedenú regulačnú DNA, hostiteľských buniek transformovaných alebo transfekovaných touto regulačnou DNA a spôsobov zvyšovania transkripcie génu pri použití tejto regulačnej DNA. Vynález sa takisto týka expresných konštruktov obsahujúcich uvedenú regulačnú DNA operatívne pripojenú k špecifickým génovým sekvenciám.
Doterajší stav techniky
Transkripcia akéhokoľvek daného eukaryotického génu sa uskutočňuje pomocou jedného z troch enzýmov, RNA polymeráz, z ktorých každý účinkuje na konkrétny podsúbor génov. Zatiaľ čo transkripcia veľkých ribozómových RNA prebieha pomocou RNA polymerázy I a malá ribozómová RNA a tRNA sa prepisujú RNA polymerázou III, DNA sekvencie kódujúce proteíny a väčšina malých jadrových RNA sú transkribované RNA polymerázou II. Pre každý typ génu transkripcia vyžaduje interakciu príslušnej polymerázy s promótorovými sekvenciami génu a vznik stabilného transkripčhého iniciačného komplexu. Všeobecne je možné uviesť, že transkripcia od ktoréhokoľvek z troch polymeráz tiež vyžaduje interakciu určitého väzbového faktora s promótorovou sekvenciou a rozoznanie väzbového faktora pomocou druhého faktora, ktorý tak umožní interakciu polymerázy so sekvenciou génu. Zatiaľ čo tento mechanizmus je minimálnou požiadavkou transkripcie katalyzovanej RNA polymerázami I a III, proces vedúci k transkripcii katalyzovanej RNA polymerázou II je zložitejší.
Vzhľadom na rozsiahle množstvo génových sekvencií transkribovaných RNA polymerázou II a vzhľadom na skutočnosť, že regulačné schémy pre tieto gény sú vysoko premenlivé v rovnakej bunke a odlišujú sa tiež pre každú jednotlivú bunku, je transkripcia katalyzovaná RNA polymerázou II okrem iných interakcií iných väzbových proteínov k regulačným sekvenciám DNA, iným ako je promótor, ovplyvnená väzbou mnohých transkripčných faktorov v iniciačnom komplexe. Tieto iné väzbové proteíny môžu slúžiť na aktiváciu transkripcie nad bazálnu hladinu alebo úplne potláčajú transkripciu. Pripojenie represora je možné takisto považovať za prostriedok ako zabrániť aktivácii, vzhľadom na to, že bazálna transkripčná hladina v prípade vyšších cukaryotov jc normálne veľmi nízka. Na druhej strane, aktivácia je obvyklou konečnou odpoveďou na určitý fyziologický signál a vyžaduje buď odstránenie represorového väzbového proteínu alebo aiteráciu v chromatínovej štruktúre, aby sa umožnil vznik aktívneho transkripčného iniciačného komplexu.
Jadrom vzniku transkripčného komplexu a nevyhnutnou podmienkou pre bazálnu hladinu expresie génu je promótorová sekvencia, ktorá je označovaná ako „TATA box“ a ktorá je umiestená pred transkripčným štartovacím miestom polymerázy II TATA box je väzbovým miestom pre všadeprítomný transkripčný faktor označovaný ako TFIID, ale ako už bolo uvedené, transkripcia od promótorovej sekvencie je v prípade väčšiny génov silne ovplyvnená ďalšími regulačnými oblasťami DNA, ktoré môžu zosilňovať alebo potláčať transkripciu génu. Elementy DNA tohto typu sú v rôznych polohách vzhľadom na kódujúcu sekvenciu v géne a vzhľadom na TATA box. Tieto ďalšie transkripčná regu lačné elementy často pracujú tkanivovo alebo bunkovo špecificky.
Pri expresii rekombinantných proteínov je veľmi dôležité zvoliť regulačnú DNA, ktorá obsahuje sekvenciu promótora TATA a ďalšie regulačné elementy kompatibilné s transkripčným aparátom hostiteľskej bunky. Z tohto dôvodu sa obvykle dáva prednosť regulačným DNA, ktoré sú endogénne vzhľadom na zvolenú hostiteľskú bunku. Značný úspech bol tiež dosiahnutý pri použití regulačnej DNA odvodenej od sekvencií vírusového genómu, vzhľadom na to, že rozmedzie hostiteľov je v prípade vírusov široké a že bola dokázaná aktivita vírusových regulačných DNA v rôznych typoch bunky. Ako príklad vírusových regulačných DNA, ktoré sa bežne používajú na expresiu rekombinantného proteínu, je možné uviesť promótor/zosilňovač raného génu SV40 [Dijkema et al., EMBO J. 4: 761 (1985)], koncovú dlhú repetíciu DNA vírusu Rousovho sarkómu [Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 6777 (1982b)], fragmenty hovädzieho papilómavírusu [Sarver et al., Mol. Celí. Biol. 1: 486 (1981)] a elementy promótora/zosilňovača ľudského cytomegalovírusu [Boshart et al., Celí. 41: 521 (1985)]. Napriek širokému rozmedziu bunkových typov, na ktorých bola demonštrovaná funkčnosť vírusových regulačných DNA, Je možné, že existujú nevírusové DNA elementy promótora/zosilňovača, ktoré umožňujú zvýšiť transkripciu rekombinantného proteínu v špecifických bunkových líniách prostredníctvom účinnejšieho využitia transkripčného aparátu hostiteľskej bunky.
V tomto odbore teda existuje potreba identifikovať sekvencie regulačnej DNA promótora/zosilňovača, ktoré fungujú v homológnych a hetcrológnych typoch buniek, pričom účelom je zvýšenie expresie rekombinantného proteínu a vysoký výťažok požadovaného proteínového produktu. Mimoriadne dôležitou potrebou je identifikovať takc regulačné DNA promótora/zosilňovača, ktoré môžu byť s vysokou účinnosťou využité v cicavčích bunkách, s cieľom zvýšiť produkciu rekombinantných proteínov in vitro, ktoré sú glykolyzované podobným spôsobom, ako je to v prípade gíykozylačných profilov, ktoré sú výsledkom expresie in vivo. V prípade takto exprimovaných proteínov pri terapeutickom alebo profylaktickom podávaní existuje menšia pravdepodobnosť, že budú antigénne a väčšia pravdepodobnosť, že budú fyziologicky účinné. Regulačné oblasti DNA tohto typu sú tiež ľahko inzertovateľné do hostiteľských buniek s cieľom zvýšiť expresiu génov, ktoré sú endogénne vzhľadom na hostiteľské bunky alebo gény predtým zavedené do genómu hostiteľskej bunky, spôsobmi, ktoré sú v tomto odbore dobre známe a rutinne využívané.
Podstata vynálezu
Predmetom vynálezu je v základnom rozpracovaní purifikovaná a izolovaná transkripčná regulačná DNA škrečacieho EF-1 a zvolená z:
a) DNA obsahujúcej sekvenciu nukleovej kyseliny uvedenú v SEQ ID NO: 1,
b) DNA obsahujúcej časť sekvencie nukleovej kyseliny uvedenej v SEQ ID NO: 1, ktorá je schopná podporovať transkripciu génu operatívne pripojeného k regulačnej DNA,
c) DNA obsahujúcej oblasť od nukleotidu 2114 do nukleotidu 3656 sekvencie uvedenej v SEQ ID NO: 1,
d) 11,7 kb regulačnej DNA sekvencie škrečacieho EF-l<x v plazmide pDEF14, ktorý je uložený v zbierke ATCC pod prírastkovým číslom 98 398,
e) DNA obsahujúcej sekvencie nukleovej kyseliny uvedenú v SEQ ID NO: 28,
f) škrečacej regulačnej DNA sekvencie, ktorá hybridizuje s DNA opísanou v SEQ ID NO: 1 za podmienok zahŕňajúcich konečné premytie v tlmivom roztoku obsahujúcom 2X SSC a 0,1% SDS pri 65°C,
g) DNA obsahujúcej 1,56 kb od 5' do iniciačného ATG kodónu v SEQ ID NO: 1.
Purifikované a izolované polynukleotidy odvodené z buniek škrečka podľa vynálezu regulujú transkripciu génu. Tieto polynukleotidy zahrnujú regulačné DNA sekvencie od 5' konca do translátovanej oblasti gén EF-lct vaječníka čínskeho chrčka. Prednostná DNA podľa vynálezu je označovaná ako CHEF1 regulačná DNA a obsahuje približne 3,7 kb DNA, ktorá siaha od reštrikčného miesta Spel do iniciačného metionínového kodénu (ATG) proteínu EF-la. Predmetom vynálezu sú takisto polynukleotidy s menej ako 3,7 kb, ak sú tieto menšie fragmenty polynukleotidov schopné zvyšovať transkripciu operatívne pripojeného génu. Aktívne fragmenty DNA podľa vynálezu, definované schopnosťou regulovať (to znamená zosilňovať) transkripciu génu, sú ľahko identifikovateľné delečnými štúdiami, ktoré sú v tomto odbore dobre známe a bežne využívané. Regulačná DNA podľa tohto vynálezu zahrnuje polynukleotidy izolované z prírodných zdrojov, ako bunkových kultúr, ako aj polynukleotidy produkované enzymatickými alebo čisto chemickými syntetickými postupmi. Podľa jednej realizácie teda vynález poskytuje spôsob prípravy CHEF1 DNA z genémovej knižnice. Alternatívne môže byť DNA pripravená cnzymatickou syntézou, ktorá napríklad využíva polymerázové reťazcové reakcie (PCR), alebo čisto chemickou syntézou, pri ktorej sa postupne pridávajú jednotlivé nukleotidy alebo sa hybridizujú a ligujú prekrývajúce sa oligonukleotidy. Najvýhodnejšia DNA sekvencia je opísaná v SEQ ID NO: 1. Predmetom vynálezu sú ďalej DNA sekvencie, ktoré pri stringentných podmienkach hybridizujú s DNA opísanou v SEQ ID NO: 1. Stringentné podmienky zahrnujú premytie v pufri obsahujúcom asi 2X SSC a asi 0,1% SDS pri asi 65 °C alebo podmienky ekvivalentné.
Predmetom vynálezu je ďalej DNA plazmid obsahujúci regulačné polynukleotidy CHEF1. Plazmidy podľa vynálezu takisto môžu obsahovať DNA sekvencie kódujúce proteín, ktorý je predmetom záujmu, alebo RNA produkt, ktorý je predmetom záujmu, operatívne pripojené k polynukleotidovej sekvencií CHEF1. Ďalej je predmetom vynálezu hostiteľská bunka transformovaná, transfekovaná a/alebo elektroporovaná polynukleotidom alebo plazmidom podľa vynálezu. Plazmidová DNA podľa vynálezu môže byť zavedená do genómu hostiteľskej bunky alebo sa v bunke môže vyskytovať vo forme uzatvoreného kružnicového plazmidu. Ako prednostné plazmidy podľa vynálezu, ktoré sú mimoriadne prístupné na zavedenie požadovanej DNA sekvencie, je možné uviesť plazmidy pDEF14 a pDEF2. Bakteriálna hostiteľská bunka transformovaná pDEF14 bola uložená v zbierke Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 9.apríla 1997 pod prírastkovým číslom 98398 a bakteriálna hostiteľská bunka transformovaná pDEF2 bola uložená v zbierke Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 4. marca 1997 pod prírastkovým číslom 98343.
Predmetom vynálezu je tiež lineárny DNA vektor obsahujúci polynukleotid CHEF1. Vektor podľa vynálezu je možné získať z vírusového zdroja alebo ho je možné syntetizovať in vitro. Predmetom vynálezu jc ďalej hostiteľská bunka transfekovaná alebo elektroporovaná do sekvencií lineárneho vektora. DNA tohto typu je mimoriadne užitočná na expresiu sekvencie heterológneho génu operatívne pripojenej k DNA sekvencií CHEF1 alebo na miestne cielenú homológnu rekombináciu, pri ktorej sekvencia CHEF1 môže byť zavedená do genómu hostiteľskej bunky s cieľom modulácie expresie operatívne pripojenej sekvencie.
Ďalej je predmetom vynálezu molekula chimerickej rekombinantnej DNA, kde je CHEF1 DNA operatívne pripojená (to znamená podnecuje transkripciu) k sekvencií génu kódujúcej požadovaný proteínový produkt. Chimerické molekuly sú všeobecne molekulami, ktoré obsahujú domény, ktoré sa normálne nevyskytujú v spojení s prostredím divokého typu. Chimerická DNA podľa vynálezu môže zahrnovať časť alebo celú regulačnú DNA CHEF1 v asociácii s DNA sekvenciou, ktorá je odlišná od génu pre škrečací proteín EF-la. Ako proteínové štruktúry kódované chimerickými molekulami je možné uviesť fyziologicky aktívne proteíny, časti alebo podjednotky aktívnych proteínov, ako aj markerové alebo reportérové proteíny. Polynukleotidová sekvencia kódujúca proteínový produkt môže byť odvodená od komplementárnej DNA (cDNA), genómovej DNA, syntetickej DNA alebo DNA odvodenej kombináciami molekúl týchto typov. Proteínové produkty môžu byť endogénne (to znamená normálne sa nachádzajú v genóme CHO bez transformačného, transfekčného alebo podobného zavedenia DNA) vzhľadom na bunky vaječníka čínskeho chrčka (CHO). Okrem toho proteínové produkty môžu byť kódované exogénnymi zdrojmi, pričom exogénnym zdrojom je zdroj odlišný od genómu bunky CHO, ako je napríklad syntetická DNA. Ako prednostné chimcrickc molekuly podľa vynálezu je možné uviesť molekuly, v ktorých je DNA CHEFI operatívne pripojená k DNA kódujúcej: (i) ťažký reťazec anti-ICAM3 protilátky ICM3, (ii) ľahký reťazec ICM3, (iii) ťažký reťazec anti-CDl 1/CD18 protilátky hu23F2G, (iv) ľahký reťazec hu23F2G, (v) chitinázu, (vi) acetylhydrolázu faktora aktivujúceho doštičky (PAF-AH) a (vii) chemokín odvodený od makrofágu (MDC). Bakteriálne hostiteľské bunky transformované plazmidovou DNA, ktoré obsahujú chimerické molekuly (i) až (vii), boli uložené v zbierke Američan Type Culture Collection 1. apríla 1997 pod prírastkovými číslami: (i) 98381, (ii) 98382, (iii) 98383, (iv) 98384, (v) 98385, (vi) 98386 a (vii) 98387.
Predmetom vynálezu je ďalej hostiteľská bunka transformovaná alebo transfekovaná DNA CHEFI podľa vynálezu. Prednostná hostiteľská bunka podľa vynálezu je odvodená od bunky čínskeho chrčka (Circetulus griseus), o ktorej regulačnej DNA CHEFI by sa predpokladalo, že poskytne vyššiu úroveň expresie proteínu. Predmetom vynálezu sú však tiež ďalšie typy buniek odvodených od iných druhov ako napríklad od buniek arménskeho chrčka (Cricetulus migratoris) alebo sýrskeho (zlatého) chrčka (Mesocricetus auratus), ako aj typy buniek odvodené od buniek iných živočíšnych rodov. Bunky môžu byť získané z pľúc, vaječníka, peritonea, svalov, sleziny, obličiek, melanómu alebo somatického zdroja, ako aj z celého zárodku alebo celého embrya. Hostiteľské bunky podľa vynálezu uvedené skôr, ako aj ďalšie typy buniek, napríklad myelomatické bunkové línie, o ktorých regulačnej DNA CHEFI by sa predpokladalo, že poskytne vysokú úroveň transkripcie, je možné získať zo zbierky Američan Type Culture Collection alebo je možné ich napestovať priamo z živočíšneho zdroja. Rekombinantné molekuly podľa vynálezu, ktoré obsahujú regulačnú DNA CHEFI, umožnia zvýšenú úroveň expresie mRNA operatívne pripojených heterológnych polynukleotidov (to znamená tých, ktoré sa bez transfekčného, transformačného alebo podobného zavedenia v hostiteľskom genóme normálne nenachádzajú). V závislosti od povahy
SK 285664 Β6 polynukleotidy pripojeného k sekvenciám polynukleotidov CHEF1, by zvýšená transkripcia viedla k zvýšeným úrovniam polypeptidov alebo zvýšeným úrovniam rôznych druhov RNA v prípadoch, keď pripojený polynukleotid kóduje napríklad transferovú RNA, ribozomálnu RNA, malú jadrovú RNA a pod. Takýmto druhom RNA tiež môže byť kódujúca RNA komplementárna k mRNA získanej transkripciou endogénnej alebo exogénnej génovej sekvencie. Zvýšená translácia polypeptidu bude nevyhnutne závisieť od prítomnosti vhodných translačných signálov prítomných v mRNA.
Predmetom vynálezu je ďalej spôsob zavádzania DMA CHEF1 do špecifických miest genómovej DNA hostiteľských buniek s cieľom zvýšiť úroveň transkripcie endogénnej génovej sekvencie. Na zavedenie celej alebo časti DNA CHEF1 je možné použiť homológnu rekombináciu. V hostiteľských bunkách, ktoré sú modifikované týmto spôsobom, je DNA CHEF1 operatívne pripojená ku kódujúcim sekvenciám DNA (pozri napríklad medzinárodné prihlášky PCT WO/94/12650, WO 92/20808 a WO 91/09955. Predmetom vynálezu sú teda nevyhnutne tiež sekvencie alterovanej genómovej DNA so zavedenou regulačnou DNA CHEF1.
Alternatívne je predmetom vynálezu hostiteľská bunka, v ktorej je exogénna DNA inzertovaná v susedstve a v operatívnej polohe: vzhľadom na DNA CHEF1 prítomnej v genóme. Hostiteľské bunky tohto typu zahrnujú CHO buky a inzertovaná sekvencia buď nahrádza DNA kódujúcu EF-la, alebo je táto sekvencia vložená medzi regulačnú DNA CHEF1 a DNA kódujúcu EF-Ια. Do rozsahu vynálezu tiež patria aj iné hostiteľské bunky než CHO, do ktorých genómu bola predtým inzertovaná DNA CHEF1 a potom do operatívne pripojenej polohy inzertovaná ďalšia DNA.
Predmetom vynálezu je ďalej spôsob zvyšovania transkripcie požadovaného génu, ktorého podstata spočíva v tom, že sa do hostiteľskej bunky zavedie polynukleotid zahrnujúci škrečaciu regulačnú sekvenciu EF-Ια. tak, že sa táto regulačná sekvencia začlení do genómovej DNA hostiteľa v operatívne pripojenej polohe vzhľadom na požadovaný gén. Ďalej do rozsahu vynálezu patrí spôsob zvyšovania transkripcie požadovaného génu, ktorého podstata spočíva v tom, že sa do hostiteľskej bunky zavedie polynukleotid zahrnujúci škrečaciu regulačnú oblasť EF-Ια. a zameriavaciu oblasť, pričom táto zameriavacia oblasť je zostavená tak, že umožňuje integrovať regulačnú oblasť v mieste operatívne pripojenom k požadovanému génu kódujúcemu proteín odlišnému od EF-Ια. Do rozsahu vynálezu tiež patri spôsob zvyšovania transkripcie génov, ktoré sú endogénne vzhľadom na CHO bunky, ako aj spôsob zvyšovania transkripcie génov, ktoré sú exogénne vzhľadom na CHO bunky.
Rekombinantné molekuly podľa vynálezu je možné využívať na produkciu transgénnych živočíchov, pri ktorej sa do vyvíjajúceho sa zárodku alebo somatickej bunky živočícha zavedie chimerická rekomibinantná DNA obsahujúca DNA CHEF1 operatívne pripojenú k sekvencií DNA, ktorá je predmetom záujmu. Chimerické rekombinantné molekuly je možné zavádzať napríklad mikroinjekciami a ak sa použijú zárodočné bunky, môžu všetky bunky výsledného živočícha obsahovať rekombinantnú DNA podľa vynálezu. Alternatívne je možné chimerickú DNA podľa vynálezu zavádzať do buniek embrya a v tomto prípade DNA podľa vynálezu môže byť obsiahnutá vo veľkom počte buniek výsledného živočícha.
DNA CHEF1 je takisto užitočná pri identifikácii blízko príbuzných regulačných oblasti DNA, ktoré môžu poskytovať expresiu génu vyššiu a dlhodobejšiu, ako akú umožňuje
CHEF1. Podobne, znalosť sekvencií DNA CHEF1 umožní zostrojiť syntetické DNA buď syntézou de novo alebo jednoduchou alebo niekoľkonásobnou modifikáciou sekvencií CHEF1, pričom výsledné syntetické DNA budú mať sekvencie podobné sekvencií CHEF1, ale budú schopné poskytnúť vyššie úrovne transkripcie génu.
Nasleduje podrobnejší opis vynálezu.
Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcich príkladoch realizácie. V príklade 1 je opísané klonovanie škrečacieho génu EF-Ια. a príbuznej regulačnej DNA CHEF1. Príklad 2 sa týka subklonovania a sekvenčnej analýzy regulačnej oblasti CHEF1. V príklade 3 jc charakterizovaný polynukleotid promótora CHEF1 a v príklade 4 je opísaný spôsob zostrojenia rôznych expresných vektorov obsahujúcich DNA CHEF1. V príklade 5 je opísané transfekčné stanovenie na zistenie účinnosti regulačnej DNA CHEF1. V príklade 6 je podrobne popísané porovnanie úrovní expresie rekombinantného proteínu pri použití buď regulačnej DNA CHEF1 alebo promótora cytomegalovírusu (CMV). V príklade 7 sú skúmané rozdiely v regulačnej kapacite DNA CHEF1 s rôznymi dĺžkami.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Klonovanie CHEF1
Pri pokuse izoloval škrečaci homológ ľudského génu EF-Ια sa DNA genómová knižnica buniek vaječníka čínskeho chrčka (CHO-K1) (Stratagene, la Jolla, CA, USA), podrobí sereeningu s cDNA pre ľudský EF-la.
Knižnica CHO-K1, čiastočne štiepená Sau3A v klonovacom vektore Eambda F1X(R)II, bola získaná od firmy Stratagene (La Jolla, CA, USA) v hostiteľskej bunke kmeňov XL-l-Blue MRA a XLl-Blue MRA (P2). Hostiteľské bunky sa pripravia podľa protokolu odporučeného výrobcom s modifikáciami, ktoré sú stručne opísané ďalej.
Bunky z glycerolového zásobného roztoku sa v prúžkoch nanesú na LB misky, ktoré neobsahujú žiadne antibiotikum. Pre inokulačné kvapalné LB médium sa vyberú jednotlivé kolónie a nechajú sa rásť do neskorej logaritmickej fázy a optickej hustoty OD600 asi 0,9. Potom sa bunky skladujú podľa protokolu navrhnutého výrobcom a/alebo bezprostredne použijú spôsobom opísaným ďalej.
Pri príprave kultúr na ďalšiu kultiváciu sa jednotlivé kolónie zoberú z misiek pripravených opísaným spôsobom a použijú sa na inokuláciu. Bunky sa pestujú v 50 ml LB média doplneného 0,5 ml IM síranu horečnatého a 1 ml 10 % maltózy v deionizovanej vode. Bunky sa pestujú cez noc pri 30 °C a zozbierajú centrifugáciou v stolnej centrifúge (2000 min.'1 počas 5 minút pri teplote miestnosti) a resuspendujú v 10 mM sírane horečnatom pri OD60o 0,5.
Fág lambda dodaný výrobcom sa zriedi v SM pufri (1 liter zásobného roztoku obsahuje 5,8 g chloridu sodného, 2,0 g hydrátu síranu horečnatého, 50 ml IM Tris HC1, pH 7,5 a 5 ml 2 % (hmotnosť/objem) želatíny) na 10- až 105násobné zriedenie 2 μΐ roztoku s každou koncentráciou sa pridajú k 400 μΐ hostiteľských buniek v 10 mM síranu horečnatom (OD600 asi 0,5). Výsledná zmes sa inkubuje 15 minút pri 37 °C, aby sa umožnilo pripojenie fágu k bunkám a pridá sa k nej vrchný agar (0,75% LBM agaróza s teplotou 48 °C). Každá zmes sa dvojmo nanesie na LBM agarózové misky. Z výsledkov je zrejmý titer 3 x 106 jednotiek tvoriacich plak (pfuj/μΐ fágového zásobného roztoku.
Pripravia sa čerstvo hostiteľské bunky pri použití opísaného postupu pred prehľadávaním knižnice. Približne 50
000 fágových pfu sa pridá k 600 μΐ hostiteľských buniek (s
OD50fJ približne 0,5) s 6,5 ml 0,75% LBM agarózy s teplotou 48 °C. Zmes sa rozprestrie na agarózové misky, ktoré sa potom inkubujú približne 8 hodín pri 37 °C. Misky sa potom 5 hodín chladia pri 4 °C, aby sa zabránilo prilepeniu vrchnej agarózy ku krycej vrstve nitrocelulózy. Na misky sa umiestia membrány BA-85 s veľkosťou pórov 0,45 μτη (S+S, Keene, NH) a v prenose sa pokračuje počas 2 minút. Membrány sa z misiek odstránia a prenesená DNA sa denaturuje 2 minúty v 1,5M chloride sodnom/0,5M hydroxide sodnom. Filtre sa neutralizujú 5 minút v 1,5M chloride sodnom/Ι,ΟΜ Tris-HCl (pH 8,0) a blotujú na papier Whatman 3 MM a zahrievajú sa pri zníženom tlaku pri 80 °C počas asi 1,5 až 2 hodín.
Ako sonda na prehľadávanie knižnice sa použije sekvencia cDNA ľudského EF-Ια [Uetsuki et al., J. Biol. Chem. 264: 5791 až 5798 (1989)], v prípade ktorej sa dokázalo, že vykazuje 95 % zhodu s kódujúcou oblasťou EFla. [Hayashi et al., J. Biochem. 106: 506 až 563, 1989), ktorá sa pripraví nasledujúcim postupom. 1,4 kb sonda ľudského EF-Ια sa získa z plazmidu MO107, pRc/CMV (Invitrogen, San Dlego, CA, OSA) vektora obsahujúceho cDNA ľudského EF-Ια inzertovaného v mieste EcoRI. S cieľom prvého potvrdenia, že plazmid MO 107 obsahuje predpokladanú ľudskú cDNA, sa inzert DNA sekvencuje s 3' a 5' vektorovými primármi.
94-17 AGGCACAGTCGAGGCTGATC (SEQ ID NO: 2) 94-18 TTCCAGGGTCAAGGAAGGCA (SEQ ID NO: 3)
Prvých 263 párov báz inzertu má viac ako 90 % zhodu s publikovanou sekvenciou kódujúcou ľudský EF-Ια a zatiaľ čo pri 3' konci je presné stanovenie namáhavé, malé úseky by mohli byť zhodné s predpokladanou sekvenciou. Súhrne táto zhoda ukazuje, že plazmid kóduje požadovanú sekvenciu.
Celý humánny inzert sa odstráni z plazmidu štiepením EcoRI a pás cDNA s 1,4 kb sa dvakrát podrobí gélovej purifikácii pri použití súpravy QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit podľa pokynov výrobcu. DNA sa cluuje 50 μΐ TE, výsledný roztok sa skoncentruje v zariadení Microcon-10 (Amicon, Beverly, MA, USA) na 25 μΐ, alikvót sa označí 32P-a-dTTP a 32P-a-dCTP pri použití súpravy na značenie Boehringer Mannheim Random Primcd DNA podľa pokynov výrobcu. Značená sonda s purifíkuje pri použití rotujúcej kolóny G50, aby sa odstránili nezačlenené nukleotidy. Pri porovnaní purifikovaná sonda vzhľadom na nepurifíkovaný alikvót vykazuje 46 % zavedenie rádioaktívnej značky a 5 x 103 cpm/min./μΐ (cpm = počet impulzov za minútu).
Nitrocelulózovú membrány pripravené opísaným spôsobom sa skúšajú nasledujúcim postupom. Pripraví sa zásobný roztok prehybridizačného/hybridizačného pufra, ktorý obsahuje 22,5 ml 20X SSC, 30,0 ml 50X Denhardbovho roztoku, 3,0 ml IM fosfátového pufra (pH 6,8) (69 ml IM dihydrogenrosforečnanu sodného, 31 ml IM hydrogenfosforečnanu sodného), 0,75 ml 20 % SDS a 70,75 ml destilovanej vody. S cieľom prehybridizácie sa 1,4 ml 10 mg/ml DNA lososej spermy (Stratagene) varí 5 minút s 0,6 ml destilovanej vody a potom pridá k 7 ml destilovanej vody a 72 ml zásobného roztoku pufra. Filtre sa inkubujú v prehybridizačnom pufri minimálne 2 hodiny pri 65 °C.
S cieľom prehybridizácie sa spoja 30 μΐ sondy, 200 μΐ 10 mg/lnl DNA z lososej spermy a 770 μΐ destilovanej vody. Vzniknutá zmes sa 5 minút varí a pridá sa k 36 ml zásobného pufra s 3 ml destilovanej vody. Z filtrov sa odstráni prehybridizačný roztok a nahradí sa hybridizačným pufrom. Filtre sa inkubujú cez noc pri 65 °C po hybridizácii sa filtre 3 hodiny premývajú pri 65 °C s tromi výmenami puf ra obsahujúceho 2X SSC a 0,1 % SDS a potom na 40 hodín podrobia autorádiografii.
kolónii identifikovaných ako pozitívne sa zachytia do 1 ml SM pufra obsahujúceho 20 μΐ chloroformu. S cieľom vyradiť možné pseudogény, ktorým chýba jeden alebo viac intrónov, sa vytvoria páry PCR primérov tak, aby lemovali vždy dva intróny: priméry 95-136 (SEQ ID NO: 4) a 95-137 (SEQ ID NO: 5) lemujúce intróny 2 a 3; priméry 95-138 (SEQ ID NO: 6) a 95-139 (SEQ ID NO: 7) lemujúce intróny 3 a 4; priméry 95-140 (SEQ ID NO: 8) a 95-141 (SEO ID NO: 9) lemujúce intróny 4 a 5; a priméry 95-142 (SEQ ID NO: 10) a 95-143 (SEO ID NO: 11) lemujúce intróny 6 a 7.
95-136 (SEQ ID NO: 4) GCCACCTGATCTACAAATGT
95-137 (SEQ ID NO: 5) GAGATACCAGCCTCAAATTC
95-138 (SEQ ID NO: 6) ATGTGACCATCATTGATGCC
95-140 (SEQ ID NO: 8) GTTGGAATGGTGACAACATG 95-141 (SEQ ID NO: 9) CAGGTTTTAAAACACCAGTC 95-142 (SEQIDNO: 10) AATGACCCACCAATGGAAGC 95-143 (SEQ ID NO: 11) ACAGCAACTGTCTGCCTCAT
Predpokladaná veľkosť PCR produktov pri použití CHO EF-Ια. DNA templátu je založená na veľkosti a umiestnení intrónov v publikovanej sekvencií ľudského EF-la. Každá PCR reakcia zahrnuje 2 μΐ fágu, 2,5 μΐ každého vhodného páru primérov (100 μ§/ητ1), 2 μΐ 2 mM zmesi dNTP, 2,5 μΐ 10X PCR pufra (Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ, USA), 1,5 μΐ 25mM chloridu horečnatého, 0,125 μΐ Taq polymerázy (5 jednotiek/μΐ) (Perkin Elmer) a 11,8 μΐ destilovanej vody. Ampliftkácia sa uskutočňuje 4 minúty pri 94 °C a potom nasleduje 30 cyklov zahrnujúcich 1 minútu pri 90 °C, 2 minúty pri 50 “C a 4 minúty pri 72 °C. Amplifikačné produkty sa rozdelia na 1,2 % agarózovom géli pri použití IX TAE. V prípade troch zo 47 pozitívnych plakov bolo zistené, že kódujú pravé gény (č. 2, 7 a 40) obsahujúce všetky intróny. Tieto tri pozitívne vzorky sa podrobia tretiemu prehľadávaniu pri použití nasledujúceho postupu. Opísaným postupom sa pripravia miskové kultúry a pre každý z troch pozitívnych plakov sa pripravia zásobné roztoky v zriedeniach 10 až 105.20 až 50 izolovaných plakov z každého zásobného roztoku sa podrobí prehľadávaniu pomocou PCR s nasledujúcimi výsledkami. Kloň č. 2 vykazuje 2 pozitívne plaky (označené ako 2.12 a 2.17) z celkovo 22 plakov podrobených skriningu, kloň č. 7 vykazuje 1 pozitívny plak (označený ako 7.44) z 50 prehľadávaných plakov a kloň 40 vykazuje jeden pozitívny plak (označený ako 40.24) zo 40 plakov podrobených skriningu. Z každej z týchto štyroch vzoriek sa ďalej opísaným spôsobom izoluje fágová DNA.
Hostiteľské bunky XL-1 Blue MRA (P2) sa v prúžkoch navzorkujú na LB agarózové misky a nechajú sa rásť cez noc pri 47 °C. Vyberie sa jediná kolónia, ktorou sa zaočkuje 50 ml LB média (obsahujúceho 0,2 % maltózu a 10 mM síran horečnatý). Kultúra sa nechá rásť cez noc pri 30 °C. Bunky a zozbierajú päťminútovou centrifiigáciou pri teplote miestnosti pri 2000 min.’1 na stolnej centrifúge a resuspendujú sa v 50 ml 10 mM síranu horečnatého. Resuspendované hostiteľské bunky (50 μΐ) sa zmiešajú so 100 μΐ zásobného roztoku každého z pozitívnych fágov a vzniknutá zmes sa inkubuje 15 minút pri 37 °C, aby sa umožnilo pripojenie fágu k bunkám. K zmesi trepanej 2 hodiny pri 37 °C sa pridá asi 500 μΐ LBM média a potom ďalších 200 μΐ hostiteľských buniek. Vzniknutá zmes sa inkubuje ďalších 15 minút pri 37 °C. Pridá sa vrchný agar (8 ml 0,75 %
LBM agarózy s 48 °C) a potom sa zmes nanesie na misky a nechá rásť ccz noc pri 37 °C.
Potom sa ku každej miske pridá 12 ml zried’ovacieho roztoku lambda (10 mM Tris-HCl. pH 7,5, 10 mM síran horečnatý) a miskami sa mierne kýva počas 2 hodín. Zried’ovací roztok sa odstráni a 10 minút centrifuguje pri 400 x g v stolnej centrifúge. K supematantu sa pridá vždy 1 gl RNázy A s koncentráciou 1 mg/ml a DNázy 1 s koncentráciou 1 mg/ml. Vzniknutá zmes sa inkubuje 15 minút pri 37 °C a pridá sa k nej rovnaký objem zrážacieho pufŕa (20 % polyetylénglykol 8000, 2M chlorid sodný, 20 mM TrisHCl, 10 mM síran horečnatý) a výsledná zmes sa 1 hodinu inkubuje na ľade a potom 20 minút centrifuguje pri 8000 x g. Supematant sa odstráni, peleta sa 10 minút suší na vzduchu pri teplote miestnosti, resuspenduje v 500 gl TE, krátko centrifuguje, aby sa odstránili častice a supematant sa prevedie do čistej 1,65 ml skúmavky apitube. Do skúmavky sa pridá asi 2,5 μ 20 % SDS (zmes sa 5 minút inkubuje pri 65 °C) a pridá sa k nej 2,5 gl proteinázy K s koncentráciou 10 mg/ml (inkubácia 1 hodinu pri 65 °C) a 10 gl 5M chloridu sodného. Zmes sa extrahuje raz rovnakým objemom zmesi fenolu a chloroformu a raz rovnakým objemom chloroformu. Po prídavku rovnakého objemu izopropylalkoholu a následnej trojhodinovej inkubácii pri -70 °C sa zmes 15 minút centrifuguje v epifúge pri najvyššej rýchlosti. Získaná peleta sa premyje 70 % etanolom, vysuší na vzduchu a resuspenduje v 100 gl TE.
Príklad 2
Subklonovanie regulačného úseku EF- la
S cieľom stanoviť veľkosť inzertu DNA EF-Ια fágová DNA pripravená spôsobom opísaným v príklade 1 štiepi Nôti a výsledné reštrikčné fragmenty sa rozdelia na 0,6% IX TAF agarózovom géli. Okrem predpokladaných lemujúcich fragmentov lambda s dĺžkou 19 kb a 10 kb, klony 2.12 a 2.17 majú identické profily štiepenia s pásmi s 11 kb a 4,5 kb. Takisto klony 7.44 a 40.24 majú profily štiepenia zhodné s pásmi inzertu s 12 kb a 7 kb, čo spolu s údajmi o štiepení klonov 2.12 a 2.17 dokazuje prítomnosť vnútorného reštrikčného miesta Nôti v DNA EF-Ια. Fragmenty inzertu z klonov 2.12 a 7.44 sa subklonujú nasledujúcim postupom.
Fágová DNA (60 gl) pripravená spôsobom opísaným v príklade 1 sa štiepi Nôti a štiepená DNA sa vyzráža prídavkom 20 gl 3M octanu sodného a 400 gl 100 % etanolu. Vyzrážaná DNA sa zhromaždí centrifugáciou, premyje sa 200 gl 70 % etanolu, suší 15 minút na vzduchu a resuspenduje v 20 gl TE. Suspenzia sa 10 minút zahrieva na 65 °C a pridajú sa k nej 2 gl pufra pre elektroforézu. DNA sa rozdelí elektroforézou na agarózovom géli a pásy s 4,5 kb, 7 kb, 11 kb a 12 kb sa odrežú vo forme agarózových rezov. Z každého agarózového rezu sa pri použití súpravy na extrakciu QTAGEN QIAquick podľa pokynov výrobcu extrahuje DNA. Čistota pásov a koncentrácia sa overí oddelením 5 gl alikvótu z každého izolovaného fragmentu na 0,6 % IX TEA agarózovom géli.
Jednotlivé fragmenty sa oddelene ligujú k pBluescriptSW' štiepenemu Nôti. Pri ligáciách 11 a 12 kb fragmentov sa pred zavedením inzertu fragmentu linearizovaný vektor ošetrí teľacou alkalickou fosfatázou. 2 gl každého ligátu sa použijú pre elektroporáciu 40 gl elektrokompetentných buniek XL-1 Blue. Transformované bunky a nanesú na misky s LBM/carb agarózou so 40 gl 5 % X-gal v dimetylformamide (DMF) a 20 gl 0,lM 1PTG na misku. Bunky sa inkubujú cez noc pri 37 °C a ráno ochladla na 4 °C, aby sa zvýšila intenzita modrej farby.
Pri druhom výbere sa biele kolónie naprúžkujú na misky s agarózou LBM/carb s obsahom X-gal a IPTG opísaným spôsobom a kolónie, ktoré sú nasledujúci deň biele, sa nechajú rásť v 3 ml LBM/carb cez noc pri 37 °C. Plazmidová DNA z bielych kolónii pestovaných cez noc sa pripraví pri použití WIZARD Plus Minipreps DNA Purification Systém (Promega, Madison, WI, USA) podľa protokolu navrhnutého výrobcom.
Reštrikčná analýza izolovanej plazmidovej DNA ukáže, že 4,5 kb, 7 kb a 12 kb fragment sa úspešne ligoval k vektoru pBluteseript SW a výsledné plazmidy sa označia ako pSK/EF. 1.4.5., PSK/EF1.7 apSK/EF1.12.
Každý z plazmidov sa pripraví pri použití súpravy Q1AGEN midi prep kit podľa protokolu navrhnutého výrobcom. PCR sa podrobí každý z nových vektorov, vytitruje sa templátová DNA a použijú sa primáry kódujúce oblasti (SEO ID NO: 4 až 11, ktoré sa používajú v pároch spôsobom opísaným pre selekciu pseudogénov, ktorým chýba jeden alebo väčší počet rôznych intrónov), Titrácia sa uskutočňuje po tom, ako sa pri vysokých koncentráciách zisti, že všetky tri fragmenty obsahujú úplnú oblasť pre EFΊα, čo naznačuje možnú krížovú kontamináciu troch plazmidových prípravkov. Pri titrácii sa PCR uskutočňuje v reakčnej zmesi obsahujúcej 2,5 gl templátovej DNA s koncentráciou 0,001, 0,01, 0,1, 1 alebo 10 ng/gl a zahrnujúcej 2,5 gl 10X PCR pufra (Perkin Elmer), 2,0 gl 2mM zmesi dNTP, 1,5 gl 25 mM chloridu horečnatého, 0,125 gl Tag polymerázy (Perkin Elmer) a 11,4 gl destilovanej vody. Amplifikácia sa uskutočňuje pri nasledujúcich podmienkach; 4 minúty pr 94 °C a potom 30 cyklov, z ktorých každý zahrnuje 1 minútu pri 90 °C, 2 minúty pri 50 °C a 4 minúty pri 72 °C. Výsledky ukazujú, že úplná oblasť pre EFΊα je umiestená v 4,5 kb a 7 kb fragmente.
Pre každý inzert sa pri použití súpravy Stratagene FLASH Nonradioactive Gene Mapping Kit určenej na použitie s vektorom Lambda FIX I1!R) zostrojí reštrikčná mapa. Namiesto fágovej DNA sa však použije plazmidová DNA vyštiepená Nôti z vektorov pSK opísaným spôsobom. Na zostrojenie mapy sa v podstate použije protokol navrhnutý výrobcom. Tento postup je možné stručne opísať takto: plazmidy sa sckvencujú pri použití primáru Ml3 (SEQ ID NO: 12) a reverzného priméru M13 (SEQ ID NO: 13) (komplementárneho k oblastiam v mnohočetnej klonovacej oblasti pBluescript SW4), aby sa lokalizovali sekvencie primérov T3 (SEQ ID NO: 14) a T7 (SEQ ID NO: 15) vnútorných vzhľadom na miesto Nôti pre každý inzert.
M13 GTAAAACGACGGCCAGT (SEQ ID NO: 12)
M13rcv GGAAACAGCTATGACCATG (SEQ1D NO: 13)
T3 AATTAACCCTCACTAAAGGG (SEQIDNO: 14)
T7 GTTAATACGACTCACTATAGGGC (SEQ ID NO: 15)
Priméry 17 a 13 sa použijú ako sondy na protokol zostavenia génovej mapy. Keďže sa ukázalo, že inzert ET-la obsahuje vnútorné miesto Nôti, predpokladá sa, že páry fragmentov (4,5 kb/11 kb a 7 kb/12 kb) zahrnujú jednu alebo druhú sekvenciu primérov a teda sa stanovilo, že 4,5 a 12 kb inzert obsahuje sekvenciu priméru 17, zatiaľ čo 7kb inzert má sekvenciu 13.
4,5 a 7 kb inzerty obsahujúce oblasť pre EF-Ια sa vyštiepia z vektora štiepením Nôti. Štiepená DNA sa oddelí na agarózovom géli a oddelené fragmenty sa z gélu odrežú.
každého agarózováho rezu sa pri použití súpravy na extrakciu QIAGEN QIAguick podľa pokynov výrobcu izoluje
DNA. Mapovanie sa uskutočňuje pri použití siedmich rôzSK 285664 Β6 nych enzýmov pri čiastočnom reštrikčnom štiepení. Reakčné produkty sa rozdelia na agarózovom géli, DNA sa prevedie na nylonovú membránu Duralon-UV a skúša sa pri použití oligonukleotidov 13 a 17 ako sondy. Stanoví sa veľkosť pásov a zostroja sa reštrikčné mapy.
Plazmid pSK/EF1.7 sa sekvencuje s vnútornými parametrami pôvodne skonštruovanými pre PCR prehľadávanie (SEQ ID NO: 4 až 11 (predtým opísané priméry 95-136 až 95-143)), čím sa overí, že sekvenciou génu je sekvencia predtým identifikovaného proteínu. Stanoví sa orientácia kódujúcej oblasti a zostroja sa ďalšie priméry, ktoré umožňujú sekvencovanie k vnútornému miestu Notl. Stanovi sa sekvencia celej kódujúcej oblasti, ktorá sa potom porovnáva s predpokladanou sekvenciou cDNA opísanou v Hayashi et al.;(pozri skôr). .Analýza sekvencie potvrdí, že izolovaná DNA skutočne kóduje rovnakú sekvenciu EF-Ια, ako DNA opísaná Hayashim (pozri skôr). Okrem toho je oblasť prvého exónu identická s predtým publikovanou oblasťou sekvencie škrečacieho c DNA EF-Ια pri 5' konci (Hayashi, pozri skôr) a bolo identifikovaných sedem intrónov, z čoho je zrejmé, že štruktúra sa podobá štruktúre známej pre ľudské homológ.
Sekvencia a reštrikčná mapa získaná zo 7 kb fragmentu ukazuje, že časť 5' lemujúceho intrónu a promótor sú umiestené v 12 kb fragmente od 5’ do vnútorného miesta Notl. Z 12 kb inzertu sa vyštiepi Spel/NotI 3 kb fragment od 5' do vnútorného miesta Notl a subklonuje do pBluescriptSK* dopredu štiepeného rovnakými enzýmami. Výsledný plazmid sa označí ako pSK/EF1.3. 3 kb fragment sa mapuje opísaným spôsobom pri použití KpnI a Clal, čím sa potvrdia reštrikčné miesta a sekvencuje sa pri použití súpravy Erase a Base (Promega, Madison, SI, USA) pri použití Clal a KpnI miest na vytvorenie predĺženie 5’ a 3’. Sekvenčná analýza ukáže oblasti obsahujúce promótor, TATA box a 0,9 kb intrón v 5' netranslátovanej lemujúcej oblasti s rovnakou dĺžkou, ako má prvý intrón v ľudskom géne [Uetsuki, 1989, pozri skôr]. Sekvencia CHEF1 promótora a 5' intrónu je uvedená v SEQ ID NO: 1, pričom intrón zahrnuje nukleotidy 2699 až 3641.
Príklad 3
Charakterizácia regulačnej DNA CHEF
Sekvencia pred ATG štart kodónom (vrátane) škrečacieho génu EF-Ια je opísaná v SEQ ID NO: 1. Väčšina identifikovateľných väzbových miest transkripčného faktora sa pravdepodobne vyskytuje od 3' do (protismerovo) Sací miesta umiesteného 1,56 kb do 5' do iniciačného ATG kodónu génu EF-Ια. Každý z expresných vektorov obsahuje sekvencie CHEF1 opísané ďalej, ale obsahuje tiež 2 kb CHEF1 sekvencie od 5' k miestu Sací.
Sekvencovanie ukáže prítomnosť dokonale konsenzuálneho TAT boxu umiesteného asi 1 kb od 5' smerom k iniciačnému ATG štart kodónu a oblasť medzi protismerovo umiesteným miestom Sací a TATA boxom obsahuje vždy mnoho možných väzbových miest pre transkripčný faktor [Boulikas, Crit. Rev. Euk. Gene Exp. 4: 117 až 321 (1994)], ako sú miesta Spi (SEQ ID NO: 16 alebo 17), miesta ATF (SEQ ID NO: 18) a miesta NF-1 (SEQ ID NO: 19).
GGCGGG SĽU ID NO« 1$
GGGľ.’GG SEIJ ID NO: 17
TGACGY<C/A)R SECJ ID NO: 18
rľGGCNs_ÄCT/G>CCR SEQ ID NO: 19
Podobne ako v prípade ľudského génu EF-Ια [Uetsuki et al., pozri skôr] sa tu vyskytuje 943bp intrón v 5' netran slátovanej oblasti (UTR) škrečacieho génu EF-Ια., čo je zrejmé z umiestenia zostrihov donorovej a akceptorovej sekvencie. Ale pri použití analytického programu Geneworks DNA bolo zistené, že sekvencia intrónu v 5' UTR je len zo 62 % identická so sekvenciou v ľudskom géne. Intrón 5' zahrnuje mnoho možných väzbových miest pre transkripčné faktory, čo zhruba zodpovedá počtu väzbových miest medzi miestom Sací a TATA boxom, čo ukazuje, že intrón 5' by mohol byť dôležitý pre optimálnu transkripciu riadenú promótorom EF-la.
Pri použití analytického programu Geneworks DNA bolo zistené, že sekvencia CHEF1 od reštrikčného miesta Seal (v protismere) až do (ale nie vrátane) intrónu 5' (v smere) je zo 64 % zhodná so sekvenciou ľudského EF-la. Porovnanie umiestení väzbových miest transkripčného faktora Spi ľudskej a škrečacej regulačnej sekvencie je uvedené v tabuľke 1. Úplná sekvencia ľudského génu EF-la [Uetsski et al., pozri skôr] je uvedená v SEQ ID NO: 29.
Tabuľka 1
Vzdialenosť miest Spi od TATA boxu
Chrtiek
Políihŕt nuklecitlcki
-A'2A
-304 •<w:i -172.
-151 ••26
Člnvek f‘ol.c»ha nukleotidu
-335
-220 •21.18
432
476
f.7'3
690
7
261
425
495
594
Príklad 4
Konštrukcia expresných plazmidov
Mnohé plazmidy, ktoré sa používajú v nasledujúcich príkladoch, boli získané ďalej opísanými postupmi.
Plazmid pSV2 dhfr (prírastkové číslo ATCC 37146) sa rozštiepi Sphl/BamHI a 1,8 kb fragment kódujúci dihydrofolát reduktázu (DHFR) sa prečistí (fragment 1). Fragment kódujúci DHFR tiež obsahuje sekvenciu promótora/operátora SV40 umiestenú smerom k 5' a polyadenylačnú sekvenciu umiestenú smerom 3' vzhľadom na dhfr gén. Plazmid pSLl 190 (Pharmacia) sa rozštiepi HindlII, posunuté konce sa doplnia Klenowom a tupo zakončená DNA sa opäť liguje, aby sa eliminovalo miesto HindlII, za vzniku plazmidu pSL119OH, ktorý sa potom štiepi Spthl/BamHl a 3,4 kb fragment sa prečistí (fragment 2). 1,8 kb fragment pSV2dhfr (fragment 1) sa liguje k 3,4 kb fragmentu pSLl 19OH (fragmentu 2), čím sa získa plazmid pSLl 190H-dhfr.
Plazmid pStll9OH-dhfr sa modifikuje nasledujúcim postupom, aby sa z neho odstránilo niekoľko reštrikčných miest. Plazmid sa najprv štiepi Xbal/NheI (čím sa získajú komplementárne posunuté konce) a lineárny plazmid sa opäť liguje, čim sa odstránia obidve miesta Xbal a Nhel. Pri druhom postupe sa pSL119OH-dhfr štiepi HindlII, posunuté konce sa doplnia Klenovovým fragmentom a lineárny plazmid sa opäť liguje, čím sa eliminuje HindlII miesto. Pri treťom postupe sa pSLl 19OH-dhfr štiepi BglII, posunuté konce sa doplnia Klenowom a lineárny plazmid sa opäť liguje, čím sa odstráni miesto BglII. Výsledkom týchto troch stupňov je plazmid pSLl 190H-dhfr/NXHB, z ktorého boli odstránené miesta Xbal, NheI, HindlII a BglII. Plazmid pSLl 19OH-dhfr/NXHB sa štiepi EcoRI/BamHI, inzertuje sa do neho linkér NPB1/NPB2 (získaný anotáciou oligonukleotidov NPB1 a NPB2 [SEQ ID NO; 20 a 21] za vzniku plazmidu pSL/dhfr/Notl, ktorý má jedinečné reštrikčné miesto Notl.
NEBI GATCGCGGCCGCGTTTAAACGGATCC (SEQ ID NO: 20)
NPB2 AATTGGATCCGITTAAACGCGGCCGC (SEQ ID NO: 21)
Tento plazmid pSL/dhfr/Notl sa štiepi Asp718/BamHI a 1,8kb fragment kódujúci DHFR sa prečistí (fragment 3). Plazmid pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA, OSA) sa štiepi Asp718/BglII, čím dôjde k odstráneniu promótora CMV a polyadenylačnej DNA hovädzieho rastového hormónu (BOH) a 3,7 kb fragment sa prečistí (fragment 4). 1,8 kb fragment pSL/dhfr/Notl kódujúci DHFE s obsahom sekvencie promótora/operátora SV40 a polyadenylačnej sekvencie (fragment 3) sa liguje k 3,7 kb fragmentu pRc/CMV (fragmentu 4) za vzniku plazmidu pRc/DHFR/Notl.
Plazmid pRc/CMV sa štiepi Asp718/Xbal a 0,8 kb fragment kódujúci polyadenylačnú DNA BGH sa prečistí (fragment 5). Plazmid pRc/DHFR/Notl sa rozštiepi BamHI/Asp718 a 4 kb fragment obsahujúci sekvencie DHFR, promótora/operátora SV40 a polyadenylačnú sekvenciu sa prečistí (fragment 6). Plazmid pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA, USA) sa štiepi BglII/SacI a 0,71 kb fragment kódujúci promótor CMV sa prečistí (fragment 7). 0,8 kb fragment pRc/CMV (fragment 5), 4 kb fragment pRc/DHFR/Notl (fragment 6). 0,7 kb fragment pCEP4 (fragment 7) a fragment syntetického adaptéru Sacl/Xbal sa spoja štvorcestnou ligáciou, čím sa získa plazmid pDCl. Adaptor sa vytvorí aneláciou oligonukleotidov SXP1 a SXP2.
SXPl (SEQ ID NO: 22) J'-CGTTTAGTGAACCGTCAGATCTACATAACAACATTCCTC CTCTAAAGAAGCCCCAAGCTrGATATCIGCAGAATrCT-3'
SXP (SEQIDNO:23) 5'-CTAGAGAATTCTGCAGATATCAAGCTrGGGGCTrCTTTAGAG GAGGAATGTTGTTATGTAGATCTGACGGTTCACrAAACGAGCT-3'
Plazmid pDCl teda obsahuje promótor CMV, oblasť polylinkóra, polyadenylačné miesto z BGH a gén DHFR riadený promótorom SV40 a sekvenciu SV40 zostrihu/polyadenylačnóho miesta.
Plazmid pDCl sa štiepi Xhol a izoluje sa 4,5 kb fragment, ktorý neobsahuje promótor CMV a polyadenylačnú DNA BGH, ktorý sa liguje k plazmidu pDCil. Plazmid pDCil sa potom štiepi BamHI/XhoI a 4,5kb fragment sa prečistí (fragment 8). 4,5 kb fragment pDCil (fragment 8) a liguje k PCR fragmentu štiepenému BamHI/SalI kódujúcemu čiastočnú sekvenciu promótora CMV získanú pri použití primerov 96-13 a 96-14 (plazmid pDCl ako templát), čim sa získa plazmid pDCi2.
Printér 96-13 (SEQ ID NO: 24)
5'-AGTTCAGTCGACGGCGCGCCAACCCGGGAATCC GGACGGGATCTATACATTGAATCAATATTGGCA-3'
Primdr96-14 (SEQIDNO125)
ATGTCAGGATCCACGCGGAACTCCATATATGGGCTATGAACT
Plazmid pDCi2 sa štiepi Asp718/Spel a 4,2 kb fragment kódujúci DHFR s obsahom sekvencie promóto ra/operátora SV40 a polyadenylačnej sekvencie sa purifikuje (fragment 9) a pDCl sa štiepi Asp718/Spel a 1,5 kb fragment obsahujúci čiastočnú DNA promótora CMV s BGH polyadenylačnými signálmi sa purifikuje (fragment 10). 4,2 kb fragment pDCi2 (fragment 9) sa liguje k 1,5 kb fragmentu pDCl (fragmentu 10), čim sa získa plazmid pDC31. Plazmid pDC31 sa od pDCl odlišuje tým, že obsahuje niekoľko nových reštrikčných miest, ako Smal a Ascl pri 5' konci promótor CMV, ktoré boli vytvorené. Plazmid pDC31 sa štiepi Notl, posunutá DNA sa otupí pri použití polymerázy T4 a plazmid sa opäť liguje, aby sa vylúčilo miesto Notl, čím sa získa plazmid pDC36. Plazmid pDC36 je rovnaký ako pDC31 s výnimkou miesta Notl, ktoré bolo zničené.
Plazmid pDC36 sa štiepi Apal/BamHI, posunuté konce sa doplnia a plazmid sa opäť liguje za vzniku pDC38. pDC38 je rovnaký ako pDC36, až na fragment Apal/BamHI obsahujúci polyadenylačnú sekvenciu hovädzieho rastového hormónu, ktorá z neho bola odstránená. Plazmid pDC38 sa štiepi Smal/HindlII a 4,6kb fragment, ktorý neobsahuje DNA promótora CMV, sa purifikuje (fragment 11).
Plazmid pSK/EF1.3 sa štiepi EcoRV/Notl'Pvul a 2,9kb fragment kódujúci sekvenciu promótora CHEF1 a protismerovú sekvenciu DNA sa purifikuje (fragment 12). Blueseript SW^II (pSK+) sa štiepi Notl a 2,9kb fragment sa purifikuje (fragment 13). 7kb Notl fragment z fágu lambda 7,4 sa liguje k 2,9 pSK+ fragmentu (fragmentu 13), čim sa získa plazmid pSK/EFl .7.
Plazmid pSK1 sa štiepi HindlII/NotI a 2,9kb fragment sa purifikuje (Fragment 14). Plazmid pSK/EF1.7 sa štiepi Notl/Ncol a 620bp fragment kódujúci časť 5' netranslátovaného intrónu CHEFil sa purifikuje (fragment 15). 123bp PCR fragment štiepený HindlII/Ncol kódujúci zvyšný 5' intrón vytvorený pri použití primárov 96-36 a 96-45 a pSK/EF1.12 ako templátu sa prečistí (fragment 16).
Prime'r 96-36 (SEQ ED NO; 26)
GGCTTAGCTCCGAGGAGGG
Primár 96-45 (SEQ ID NO: 27)
CGTGACAAGCTTGGTTTrCACAACAC
2,9 kb fragment pSK+ (fragment 14), 620 bp fragment pSK/EFl (fragment 15) a 123bp fragment HindlII/Ncol (fragment 16) sa ligujú, čím sa získa plazmid pSK/5’EF-l obsahujúci úplnú sekvenciu 5' inbrónu CHEF1.
Plazmid pSK/5'EF-l sa štiepi HindlII/NotI a 0,7kb fragment kódujúci 5' intrón sa purifikuje (fragment 17). 4,6kb fragment PDC38 neobsahujúci promótor CMV (fragment 11), 2,9 kb fragment pSK/EF1.3 obsahujúci sekvenciu promótora CHEF1 a protismerevú sekvenciu (fragment 12) a 0,7 kb pSK/5'EF-l fragment kódujúci úplný 5' intrón (fragment 17) sa spoja pri trojcestnej ligácii, čím sa získa plazmid pDEFl, ktorý teda obsahuje kompletnú 5' regulačnú DNA CHEF1, gén dhfr a začiatok replikácie SV40, ktorý umožní replikáciu za vzniku veľmi vysokého počtu kópií v bunkách transformovaných antigénom SV40 T.
Plazmid pDEFl sa štiepi HindlII, posunuté konce sa doplnia a plazmid sa štiepi Notl. 2,6 kb fragment obsahujúci okrem čiastočnej sekvencie 5’ intrónu sekvenciu promótora CHEF1 a protismerovú sekvenciu DNA sa purifikuje (fragment 18). Plazmid pDEFl sa štiepi Notl/Asp718 a 1,3 kb fragment kódujúci zvyšok t” intrónu sa purifikuje (fragment 19). Plazmid pDC38 sa štiepi Smal/Asp718 a
4kb fragment kódujúci DHFR s obsahom sekvencie promótora/operátora SV40 a polyadenylačnej DNA sa purifikuje (fragment 20). 2,6 kb fragment pDEFl (fragment 18), 1,3 kb fragment pDEFl (fragment 19) a 4kb fragment pDC38 (fragment 20) sa spoja trojcestnou ligáciou, čím sa získa plazmid pDEF2. Plazmid pDEF2 v E. coli kmeňa XL-1 Blue bol uložený 4. marca 1997 v zbierke Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA pod prírastkovým číslom 98343. Plazmid pDEF2 sa od pDEFl líši v tom, že z neho bol odstránený 0,3 kb fragment HindlII/Spel umiestený 2,3 kb proti smeru do TATA boxu CHEF1 a že obsahuje len jedno miesto HindlII umiestnené v oblasti polylinkéra. pDEF2 sa použije v prípadoch, keď gén, ktorý má byť exprimovaný, obsahuje vlastné polyadenylačné miesto.
S cieľom linearizácie sa plazmid pDEF2 štiepi Asp718/Xbal, pričom sa však tiež odstráni začiatok replikačných sekvencií a 7,4 kb fragment sa purifikuje (fragment 21). Plazmid pDCl sa štiepi Asp718/Xbal a 0,8 kb fragment, ktorý okrem polyadenylačných sekvencií BGH sa vyznačuje tým, že má obsah zámeny začiatku alebo replikačnej DNA, sa puriftkuje (fragment 22). 7,4 kb fragment pDEF2 (fragment 21) a 0,8 kb fragment pDC21 (Fragment 22) sa spoja za vzniku plazmidu pDEFlO, ktorý sa líši od pDEFl rovnakým spôsobom ako pDEF2. Plazmid pDEFlO sa od pDEF2 odlišuje v tom, že v pDEFlO pri 3' konci oblasti polylinkéra je polyadenylačné miesto z génu hovädzieho rastového hormónu.
Plazmid pDEFlO sa štiepi HindlII/Xbal s cieľom linearizácie a 8,2 kb fragment sa purifíkuje (fragment 23). Plazmid pDCl/MDC, plazmid kódujúci chemokín odvodené od chemokínu ľudského makrofágu (MDC) sa štiepi HindlII/Xbal a 0,4 kb fragment kódujúci MDC sa puriftkuje (fragment 24). Ligáciou 8,2 kb fragmentu pDEFlO (fragment 23) s 0,4 kb fragmentom pDCl/MDC (fragmentom 24) sa vyrobí plazmid pDEFlO/MDC.l.
Plazmid pRc/CMV sa štiepi BamHI, posunuté konce sa doplnia Klenowom, plazmid sa štiepi Asp718 a 1,5 kb fragment sa purifíkuje (fragment 15). Plazmid pDCl sa štiepi Notl, posunuté konce sa doplnia Klenowom, plazmid sa štiepi Asp718 a 3,9 kb fragment sa purifíkuje (fragment 26). 1,5 kb fragment pRc/CMV (fragment 25) sa liguje s 3,9kb fragmentom pDCl (fragmentom 26), čím sa získa plazmid pNCX.
Plazmid pNCX sa podobá pDCl s tou výnimkou, že dhfŕ gén je nahradený génom rezistencie proti neomycínu (NeoR). Plazmid pNCX sa štiepi Asp718/Pvul a 2,1 kb fragment sa purifíkuje (fragment 27). Plazmid pDEFl sa štiepi Asp718zPvuI a 5,9 kb fragment sa puriftkuje (fragment 28). 2,1 kb fragment pNCX (fragment 27) sa liguje do 5,9 kb fragmentu pDEFl (fragmentu 28) za vzniku plazmidu pNEFl. pNEFl sa líši od pDEFl tým, že nesie bakteriálny gén rezistencie proti neomycínu (NeoR), ktorý kóduje rezistenciu proti neomycínu alebo G418. Gény, ktoré majú byť inzertované do pNEFl, sú všeobecne fragmenty HindlII/Xbal, ktoré sa inzertujú po začiatočnom štiepení HindlII alebo trojcestnej ligácii, keďže plazmid obsahuje dve miesta HindlII.
Príklad 5
Transfekcia buniek DG44 a skúška produktivity
S cieľom transfekcie hostiteľských buniek DG44 jediným plazmidom sa obvykle linearizuje 50 až 100 pg plazmidu štiepením reštrikčným enzýmom Pvul alebo AscI. Pri transfekcii, keď sa majú do buniek CHO zavádzal dva plazmidy, sa plazmidy nechajú neštiepené. Pred transformáciou sa plazmidy vyzrážajú etanolom a premyjú dvakrát 70 % etanolom. DNA pelety sa krátko sušia a resuspendujú v 400 pl sterilnej destilovanej vody. K «suspendovanej DNA sa pridá 400 pl sterilného 2X HeBS (40 mM HEPES hydroxid sodný, pH 7,0; 274 mM chlorid sodný; 10 mM chlorid draselný; 1,4 mM hydrogenfosforečnan sodný; 12 mM dextróza).
Netransfekované bunky DG44 sa kultivujú v médiu DMEM/F-12 doplnenom hypoxantínom (na konečnú koncentráciu 0,01 mM) a tymidínom (na konečnú koncentráciu 0,0016 mM), tiež označovaným ako HT. S cieľom pestovania netransfekovaných aj transfekovaných buniek DG44 sa k médiu pridá dialyzované FBS do konečnej koncentrácie 5 až 10 % objemových. Bunky DG44 sa pripravia na transfekciu tak, že sa kultúry nechajú rásť do asi 50 % alebo nižšej konfluencie v 150 cm2 ošetrených polystyrénových nádobách na tkanivovú kultiváciu (Coming). Bunky sa z plastu odstránia tak, že sa najprv odsaje médium a prilipnuté bunky sa premyjú raz soľným fosfátovým pufrovacim roztokom bez vápnika a horčíka (CMF-PBS: 2,7 mM chlorid draselný; 1,5 mM dihydrogenfosforečnan draselný; 137 mM chlorid sodný a 8,1 mM hydrogenfosforečnan sodný), pridajú sa k nim 4 ml roztoku obsahujúceho 0,0125 % ožiarený trypsín (Worthington Biochemical Corporation) v CMF-PBS a inkubujú sa niekoľko minút pri 37 °C. K bunkám sa pridá médium (4 ml) obsahujúce hovädzie fetálne sérum (FBS), stanoví sa koncentrácia buniek a alikvóty 2 x 107 buniek sa peletizujú centrifugáciou. Každá bunková peleta sa premyje raz v CMF-PBS a «suspenduje v 0,8 ml roztoku obsahujúceho HeBS s požadovanou plazmidovou DNA. Resuspendované bunky sa pri teplote miestnosti prevedú do 0,4 cm kyvety Cene Pulser (Bio-Rad) a umiestnia sa do elektroporačného zariadenia Bio-Rad GenePulzer. Bunky sa elektroporujú pri teplote miestnosti s vybíjaním kondenzátora 290 V a 960 pF (pulz 9 až 11,5 ms). Bunky sa asi 10 minút ponechajú v kyvete a potom pridajú do 10 ml DMEM/F-12 doplneného 5 až 10 % dialyzovaným FBS a HT. Potom sa stanoví úmrtnosť (vylúčenie trypánovej modrej), ktorá je obvykle asi 50 %. Bunky sa peletizujú centrifugáciou, pelety sa resuspendujú v 2 ml DMEM/F-12 doplnenom 5 až 10 % dialyzovaným FBS a HT („neselektívne médium“) a zaočkujú sa na 10 cm polystyrénové misky na tkanivovú kultiváciu. Po dvojdennom raste sa bunky, ten čas obvykle konfluentné, z misiek odstránia pri použití trypsínu, ako je opísané a v rôznych zriedeniach v DMEM/F-lľ doplnenom 5 až 10 % dialyzovaným FBS a bez HT („selektívne médium“) zaočkujú na 10 cm2 misky. Päť a deväť dní potom sa k bunkám pridá selektívne médium. Po asi 2 týždňoch sa kolónie transfektatnu (obvykle viac ako 1000 na každú transfekciu) z misiek odstránia pri použití trypsínu, opísaným spôsobom a po prídavku selektívneho média sa stanoví koncentrácia buniek. Aspoň dva alikvóty 2 x 106 buniek na každú transfekciu sa pridajú k 10 cm miskám obsahujúcim 10 ml selektívneho média. Bunky sa nechajú rásť až do zániku, keď je väčšina buniek odpojená od dosky vplyvom preplnenia. Supematant zo zaniknutých kultúr sa skúša metódou ELISA, čím sa stanoví priemerný titer produktu.
Príklad 6
Produkcia rekombinantného proteínu pri použití CHEF1
Bunky DG44 opísané v príklade 5 sa transfekujú plazmidy nesúcimi gény uvedenými v tabuľke 3 operatívne pripojenými k regulačnej DNA CHEF1. Bakteriálne kmene transformované plazmidmi kódujúcimi každý z génov, ktoré boli použité pri skúške, boli uložené v zbierke Američan
Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,
Maryland 20852, USA, 1. apríla 1997 pod prírastkovými číslami uvedenými v tabuľke 2.
Tabuľka 2
Prírastkové čísla plazmidov
Krtdnwariý yŕn Označenie plazmidu Prírastkom é čísi.
Tažkétio reťazca Protilátky ICľ13 pl)EFl./ICM3H.2 96381
Ľahkého reťazca protilátky runj pNr.n/rcri3L.3 90392
Ťažkého reťazca protilátky 23F2G PDEF1/F2GH.I 98383
ľahkého reťazca protilátky 23F2U PIMFF1/F2GL. .1 98384
Chltlriázy pOĽFl/CTN.l 98385
Acetylhydr olázy iiktlvaCnéhci faktora doštičiek ÍPAF-AH) PDEF2/HPH.4 98386
(.‘hemolŕ f nu c.id'jadf-riélio ud mck'._>fá-.ju <MDC> pDfcFlO/MUC.l 98387
Po selekcii na transfektanty sa spojené kolónie (viac ako 200) z každej transfekcie odstránia z misiek pri použití trypsínu a rovnaký počet buniek z každej transfekcie sa nanesie na misky a nechá sa rásť do uhynutia. Supematanty sa odstránia a expresia proteínu sa stanovuje pri použití metódy EL1SA alebo enzýmového stanovenia. Výsledky sú uvedené v tabuľke 3.
Tabuľka 3
Expresia proteínu pri použití regulačných sekvencií CHEF1 aCMV
T i Lur· pr oheíriu
T.CM3 ll+l.
1XM3 ΜΊ.
Hu23l'2ťi 11+1. n»:
1062
1848
2:1.0í J
337
3(50
3200
8900
231)1 J
12H5C1
S výnimkou prvej skúšky na expresiu chitinázy (v tabuľke 3 označená ako chitináza-1) sa pri použití regulačnej DNA CHEF1 dosiahnu významne vyššie úrovne produkcie proteínu, ktoré sú trikrát až jedenásťkrát vyššie ako pri expresii s promótorom CM V.
S cieľom stanoviť, či v prípade zníženej expresie, ktorá bola zistená v prípade skúšky na chitinázu, ide o abnormálny alebo opakovateľný výsledok, ktorý by bol charakteristický a/alebo jedinečný na chitinázu, sa skúška zopakuje, ale pri použití dvoch oddelených transfekcií, na rozdiel od jedinej transfekcie použitej pri prvej skúške, kde výsledkom bol neobvykle nízky počet získaných transfektantov. Okrem toho sa použije iná skúška na aktivitu chitiázy, v prípade ktorej sa ukázalo, že je presnejšia ako postupy použité pri prvej skúške.
Výsledkom transfekcií pri druhej skúške je počet transfektantov, ktorý je konzistentnejší s predchádzajúcimi výsledkami dosiahnutými pri použití plazmidu pDEF2, ktorý pri ďalších skúškach produkuje viac ako 150 X počtu trans fektantov dosiahnutého s plazmidom CMV. Výsledky z druhého pokusu (označeného v tabuľke 3 ako chitináza 2) sú vnútorne konzistentné, čo zvyšuje dôveryhodnosť výsledkov, napriek tomu, že zistené zvýšenie expresie proteinu (asi 1,4x), v porovnaní s expresiou pri použití promótora CMV, je nižšie ako zvýšenia zistené v prípade ostatných proteínov skúšaných skôr.
Príklad 7
Produkcia rekombinantného proteínu pri použití regulačnej DNA CHEF1 s rôznymi dĺžkami
Skonštruuje sa expresný vektor obsahujúci ďalších 8 kb 5’ lemujúcej DNA z génu EF-Ια a označí sa ako pDEF14. Plazmid PDEF14 sa od pDEF2 odlišuje v tom, že pDEF14 obsahuje približne 11,7 kb DNA lemujúcej 5' škrečacieho EF-Ια., zatiaľ čo pDEF2 obsahuje len 3,3 kb tejto sekvencie. Plazmid pDEF14 tiež obsahuje 4 kb škrečacej 3' lemujúcej DNA priliehajúcej k 3’ koncu DHFR expresnej kazety. Väčší plazmid pDEF14 sa skonštruuje spôsobom, ktorý je stručne opísaný ďalej.
Z pDEF2 sa odstráni 2,6 kb AscI/NotI fragment CHEF1 a na jeho miesto sa inzertuje 11 kb AscI/NotI fragment CHEF1. Inzercia dlhšej sekvencie najprv vyžaduje modifikáciu Xbal miesta umiesteného 11,7 kb od 5' smerom k iniciačnému ATG EF-Ια. na miesto AscI. Okrem toho sa inzertuje 4kb Nsil/Sall fragment s tupými koncami, ktorý je tvorený lemujúcou sekvenciou CHEF1 začínajúcou pri Nsil mieste 118 párov báz od 3' konca k stop kodónu EF-Ια., do Pmel/Sall miesta 3' k DHFR expresnej kazete umiestenej na 3’ konci oblasti polylinkéra, do ktorej sú inzertované gény, ktoré majú byť exprimované. Úplná 3’ DNA sekvencia so začiatkom pri stop kodóne génu EF-la. je uvedená v SEQ ID NO: 28. Baktéria transformovaná týmto plazmidom bola uložená v zbierke Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, RockvíIIe, Maryland 20852, USA, 9. apríla 1997 pod prírastkovým číslom 98398. Výsledný plazmid pDEF14 obsahuje jedinečné Xbal a Nôti miesta spolu s mnohočetnými HindlII miestami a inzercia génu do tohoto plazmidu s cieľom expresie teda vyžaduje trojcestnú ligáciu. Tak napríklad gén môže byť inzertovaný do plazmidu ligáciou HindlII/Xbal fragmentu obsahujúceho požadovaný gén so 737bp Notl/HindlII fragmentom z PDEF14 a 19,7 kb Xbal/NotI fragmentom z pDEF14.
Expresia proteínu pri použití tohto vektora sa porovná s expresiou pri použití vektora pDEF2, ktorý obsahuje menšiu časť 5' lemujúcej oblasti EF-Ια. Pri predchádzajúcich skúškach bola DNA kódujúca ťažký aj ľahký reťazec protilátky 23F2G subklonovaná do vektorov pDEF2 a pDEF14 a úrovne expresie stanovené po transfekcií do buniek DG44 sú opísané v príklade 5. GOny kódujúce obidva reťazce protilátky sa vo vektoroch umiestnia lineárne a expresia obidvoch génov sa poháňa sekvenciou CHEF1 v jednotlivých plazmidoch. Kódujúce oblasti pre dva reťazce v každom plazmide sa rozdelia identickou 4,3 bk DNA odvodenou od 3' netranslátovanej oblasti ľudského IgG4.
Výsledky ukazujú, že expresia 23F2G z väčšej CHEF1 sekvencie je v pDEF14 štvornásobne väčšia ako expresia protilátky z menšej sekvencie pDEF2. Tento výsledok je prekvapujúci vzhľadom na to, že väčšina identifikovateľných väzbových miest transkripčného faktora pDEF14 je tiež v sekvencií DNA v pDEF2. Je teda možné, že v DNA CHEF1 v plazmide pDEF14 jc umiestené jedno alebo viac ďalších a neidentifikovaných väzbových miest transkripčného faktora alebo sekvencií zosilňovačov. Inak povedané, väčšia DNA CHEF1 môže poskytovať výhodu zvýšenej transkripcie vďaka určitej vlastnosti 3' DNA sekvencie.
Odborníkom v tomto odbore určite zrejmé mnohé modifikácie vynálezu, ako je opísaný a ilustrovaný v predchádzajúcom texte.
Takéto modifikácie a zmeny nepredstavujú únik z rozsahu vynálezu, ktorý je daný len patentovým nárokmi.
SEKVENČNÝ PROTOKOL
Cl) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE.
(i) PRIHLASOVATEĽ. Allison. Daniel S.
(1.1) NÁZOV VYNÁLEZU. Transkrlpčná regulačná DNA ôkreCacieho
EF-1”
Ctil) POČET SEKVENCIÍ. 29 (iv) ADRESA PRE KOREŠPONDENCIU.
(A) ADRESÁT. Marshall, O'Tonie, Geratein, ňurray Ä
Borun (B) ULICA. 233 South Wacker Drlve. 6300 Sears Touer
ÍC> MESTO. C.hlcagn <D> ŠTÁT, llllnols (E) KRAJINA. USA (F) ZIP. 60606 (u) POČÍTAČOVO ČITATEĽNÁ FORMA.
(A) TYP MÉDIA. Floppy disk (B) POČÍTAČ. IBM PC compatlble (C.) OPERAČNÍ SYSTÉM. PC-00S/MS-D0S (D) SiFTldARE. Patentln Release «1.0. Version «1.30 (ui) ÚDAJE O SÚČASNEJ PRIHLÁŠKE.
(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY.
(B) DÁTUM PODANIA.
(C) ZATRIEDENIE.
(vl.il) INFORMÁCIE U ZÁSTUPCOVI.
(A) MENO. KAREL ČERMÁK, AKP ČERMÁK-HílfiEJŠ-VRBA,
NÁRODNÍ 32, 11.0 01 PRAHA 1 (C) ČÍSLO SPISU. 01-11-99-ČE (Ix) 1 ľt EKl IMUN1KAČNÉ SPOJENIE.
(A) TELEFÓN. 312-474-6300 (B) TELEFAX. 312-474-0448 <2) ÚDAJE O SEX) ID Níl.l.
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
(A) DĹŽKA. 3673 párov báž (B) TYP. nukleová kyselina (C) DRUH RE-ŤAZCA. Jednoretazccvá (0) TOPDLÓGTA. lineárna (ii.) DRUH MOLEKULY. DNA (xi) PIFIS SEKVENCIE. SED .ID NCh.l.
AGTTCCTTTG
CAGATCCCAC
AGGTTGGTTC
AATAATATCA
GATCTCTTGA
GCCCATAATC TTAGTGATAA
GAGTGCTTGC
TATTCCATTA
CAAAATACCT
GTTTTTCTTT
CTTCTGAGAT AAAAAAAAAA
AAAAGAAAAA
GCCTTTAATC
CCAGCACGCA
GCCTGGTCTA
CCTAGTGAGT AACAGCCACA
CAATCAGAAC
I5ACAAGCATT
TAAATAATAG
GGGATGGGCT
CTGGGCGAGT TTGATTAGAT
TCTT1TCATG
AĽACACACAC
ACACACACAA
AGAATCAGAA
GTAAAGCTAA
CGTGAAGCGt:
GCTTCAGGCT
GCĽAGCAĽAG
GGGCAGATCC
GGCTGGGAAG
GGTCCCTAGG
GGGCTGACGT
1140
ATGTGGACAĽ 1200
ATTGTTTGTT
1260
AGGTTATTAG
1'120
CTGGTGTGCT 1380 ľ ľ IĽACCGTC 1440
CCTGCCCGGA 1500
AAAGAAAAGA
1560
GGAGGCAGAG 1620
TTCAGGGCAC 1680
CACAGCAAAA 1740
GACGAGCCAT 1800
AAGATTGCTA
1860
TTCCTCGTGC 1920
TGCGCGCACA
1980
CTGTGGGACT
2040
TCCAGAGAAG 2100
GTCGAGCTCT 2160
ATTGTGCACC
2220
CGGAĽAGTAG ACTAGGCAGT GAATAAATAC GAGACCCTCG RCTAGCATTA GAGGCATTTA AAAĽAGGCTA GCAGGGCGGA CCAGGGCTAA CGCAGTTATG TTTTGAGAAG ATGCTGGCCT TCTATCAAAT CACAAAATCC TAAGVATTAT CAGCTGGĽGC GGGCCACCGA TCTCCCGCGG
GTCĽTCAAAT gatgttgtac TCTAAGGCTA GTTCCATCTC AGAAACAAAA AAACTGGCCA GGGCCGGCAT TCTCTGTGAG AGAGACTGTC ATCCTTGGAA CTĽTGATTTĽ CTAAATGAGA AACTGTACCC TTTTTTAGCT TCTGAACGGA TGGATGGAAT GCTGAGCÍXT GGGACAAGCA
GCTCCTTATT ATCTGGAGGA AAAATGTAGC CACAACCĽĽA CAACAAAGAA GGGCCAAAAA GGTGGCGCAC TTTGAGGTCA TCAAAAACAA CTGTAGGAAT ACAAGTGTCA CCAĽGTGGAG AAATACACAC TAAGAAGCCC ACTCC.CAGGG GAACCAAGAG TAGGTTCTGG GGGGAT GGCG
ACTAGTTCCA AAGCACAGAG
ATTAGÍICTA TTGTTAĽAAA
TAGGCAUrAG AAATCTCTGT
GAAAAAGGtiA GGCTT TTGTG
TGCCTTÍiCAT CAGAAAAAGC
IÍĽIGTĽGAT ICTGGAHCT ľTGGTTACAA TAAATGACAA aacctgct Ití AAGAAACCTG
IGTGGTtíGGíi 1TAGAAATCA
AAGGCCAGCĽ AGGTIĽ1GIC tcct ricm G ľΤ Ϊ TGGAGC
CTATCCTGGC AGlXAírlCCTC íGCIGGGAIľ AAACAAAAAT
AACATCAGGA
AGCCTGACTC
YGAGTTGÍÚAT GGAAGGTGTC ctí iggi ccí: AAIAATGCTA
T rΓI1ΛΑΑΑΑ IAGATAALAG
ClAAGAATCA T I ΠΑΤΑ) Π
GAG Γ ( T ΤΤΊ T
AAGATGAATT nGCTAGIGT
12.0
GGTAICAAGA
180
I I TGTGAAAT
240
GCATAÍiACCL
3(1(1
AGAAAATGAT
360
TTAACAGAAI
420
TAGAAGGITG
480
CACGľĽIGTA
640
TCAGCAACAC
600
ΠΤΤΤΤΤΤΤΤ
660
AC1AGCTCTG
720
AAAGG1ATGC
780
GGTGGTGAGA
840
CCTTIAGAGC
900
CACACATAGC
960
ΛΛΤTAAAAAC
1.U2Í1
AGTATCATGT
1080
CC’TCCIAGC
ACTAACCAGT TTCATTTTCCš TAATTTTAAC
TGTGIÍTGAI TAGTTATATA TAAGTGCAAA TAAGGCTCTG ATCCCAGCAT AGTGAGTTTG TTTCTTTTCT AAGAGCAGGC ACCACCAACG GGGCTCAGTG TACATGĽTTG TATACACAGC AACAACAGTf ΛΛΛΤΠ GCTT ITGACTGTGG
GTTTCCAAGG TATATTTCTT GACIGGCTGA AATGTGGCCA C I L! H AAĽAC TACTTTTAGG CAAAGCCAGA TAATATAGGA TGGGAAGTAG AGGCCACCCT TTTTTTGGTT TGGCCTCGAA CCCCAGOm GTCACAGGCA AGGQAAGAGA ATP.TGCATTC TGGGTTGTGA TCAACTCATC AGTCTTGrĽC
AAATAAATGA ACftATHCTC GAACCCTAGA TTATAGAAAA cc i cc i tgaí:: GAAACGľAGT AACĽTCCTGA ATTAGGAGAA aggtagaaga gaactacatc: TCTCTGTGTA CTCAGAGATC TGTCTCAAAC TTC1CTGCAA ACTĽACTCCT ACACACACTA AAACTAGAAC CCAAAATTTG GGAAGCAAAT
CGGGAGGTGG
GCAGTGGAGT
GAGGAAGGGT
CCCACCCCCG
ATGGAGCĽGA GAATCCCAGG
GACCGTCGCT
CCCAGCGCGG
ĽĽGGAGGAGC
GCCCACAGTC
CCCGGCGGTG
GGGCAAACTG
GGAAAGTGGT AAĽGGTATAA
AAGTGCGGTA GAACGCAGGT
GAGTGGCGGG TCGGACCGCC
CCTCĽACGGG 2280
AGGACAGATT 2340
GAGTAATTCA 2400
AAATTCTGGC 2460
CTGCGCCTAG 2520
GGGGAGGGGC
2500
GTCGTGTGCT
2640
GTCGCGTTGG 2700
TGIGGĽCTCC 2760
AAGGGACACC
CTGGACGCCC TACAAAAGGA CGGCCTCCCA GGCGGATCGC GCGCTGAGCG GGCTCCGCCC ACGTTCTTTT GCGGGĽCCGG
CGGATCTCGA
TCTTGGCCAG
GGGATCGCCT
SCCCGGAACC
GGGTCGGCGG
6GGGCCCGGG
TCTTCCCGAG
TCGCAACGGG
GCTCCCTCCT
CACAGCCTTG TCCTCACCGC TCGCCCCTGG GCTGTGCCCG GAGAGCACAA agccagcgcg GGTGGGGGAG TTTGCCGTCA TTGAGCGGGG
GTGCGGGTGT CGTCGGCĽGG GCTTCTCTGC GAGCGTTCCC GCCCTGGATG
GCGGGCTGTG 2820
CGGGAGGGCG AGGGGGGGAG GCCTGGC.GGC GGCCCCGGAG CCTCGCCTCG TGTCGGGCGT 2ÔSO
GAGGCCTAGC GTGGCTTCCG CCCCGCCGCG TGCCACCGCG GCCGCGCTTT
GCTGTCTGCC 2940
CGGCTGCCCT CGATTGCCTG CCCGCGGCCC GGGCCAACAA AGGGAGĽGCtí TGGAGC-TGGC 3000
TGGTAGGGAG CGGGGGGGGG
ACCGGGCCCG
GCGGCCTGTG
TĽCTGATAAG CCCGGGTCCC
GGCCCGGTCT CCCGCCCGCC
CGGCACCAGT AGGAGCTCAA
CCCCGTAGTC 3060
CCCGTCCCGC 3120
GCGGCCGGGC 3180
GGCCAGTACC 3240
TGCGTGCGCG
3300
CGCATGTCGG
AGCACATGTC
GGTGGGTTTT
CCGTAGT6GC
GAAAGATGGC
GCAGGGAGAG
CGACGCCGCC AGATGCCGGG TTAGCTCCGA CGCTCCCGGG
CGGCAGCAGT
TGGACGGGTA TTCAGGTGGC GGAGGGCGAG
CCCTGTAGCA
AATGGAGGAC GCGGĽAGCCĽ GGCGGAGCGG GGCGGGTGAG TCACĽĽACAĽ
AAAĽGAAGĎG:1360
GGCCTTGCCC CTCGCCGCCC GCTGCTTCCT GTGACCCCGT GGTGTACCGG
CCGCACTTCA3420
GTCACCCC'GG CCCCTCTTTC GGAGCACCGC TGGC.CTCCGC TGGRGGAGGG GATCTGTCTA3460
ATGGCGTTGG AGTTTGCTCA CATTTGGTGG GTGGAGACTG TAGCCAGGCC
AGCCTGGCCA3540
TGGAAGTAAT TCTTGGAATT TGCCCATTTT GAGTTTGGAG CGAAGCTGAT TGACAAAGCT3600
GCTTAGUCOT TCAAAGGTAT TCTTCGAACT TTTTTTTTAA GGTGTTRTGA
AAACCACCGC3660
TAATTCAAAT CCAACATG
3678 (2) ÚDAJE (I SEQ TD Níl«2i <11 CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE» (A) DÍŽKA. 20 párov báz (fi) TYP. nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA· jednoreťazcová (D) TílPOlÓGIAi lineárna (li) DRUH MOLEKULY. DNA
Cxl) POPIS SEKVENCIE: SECJ ID NO. 2.
AGGC.'ACAGTC GAGGCTRATC
C2) ÚDAJE U SECJ TD NU.3· (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE· (A) DĹŽKA· 20 párov báz (R) TYP· nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA· .jednoreť.azcová (D) IIPULÚGIA. lineárna (11) DRUH Míl EKIH.Y. DMA (XI) POPIS SEKVENCIE· SEC) 10 Ν0·3.
I TCEAGriGTC AAGGAAGGCA (2) ÚOAJF O Sf-LJ TD Ntb4· (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
(A) DĹŽKA. 20 párciu báz <0) TYP, nukleová kyselina ť C) DRUH REŤAZCA· JednoreLazccruá (D) HJPllí ÚG'l A , 1 i rieárna
2U (D) TOPOLÓGIA. lineárnu (ii) DRUH MOLEKULY. DNA (xi) POPIS SEKVENCIE· SED ID NCkS.
GTTGGAATGG TGACAACAIG (2) ÚDAJE O SEQ ID NC).9.
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
(A) DĹŽKA. 20 párov báz (B) TYP. nukleová kyselina (Ľ) DRUH REŤAZCA. Jednoretazcová (0) IHPOLĽIGTA. lineárna (ii) DRUH MOLEKULY. DNA (xi) POPIS SEKVENCIE. SECJ ID NO.9:
CAGGTTTTAA AACACCAGTC (2) ÚDAJE 0 SEQ ID NO.10.
<i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
(A) DĹŽKA. 20 párov báz (B) TYP. nukleová kyselina
CO CJRUÚ REŤAZCA, jednoreťazcovd (D) TOPOLÓGIA. lineárna (1.1) DRUH MOLEKULY· DNA (xi.) POPIS SEKVENCIE. SECJ ID NO. 10.
AATGACCCAC CAATGSAAGC (2) ÚDAJE O SECJ ID NO.ll.
Cl) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
(A) DĹŽKA. 20 Párov báz (R) TYP. nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA. Jednoreťazcouá (D) TOPOLÓGIA. lineárna
CÍD DRUH MOL.EKUl.Yr DNA
Cxl) POPIS SEKVENCIE. CLU 10 NO.ll.
ACAGCAACTG TCTGCCTCAT (2) ÚDAJE (I SEÍJ ID NO.12.
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
CA) DĹŽKA. 17 párov báz
CO) TYP. nukleová kyselina (K) DRUH MCU.FKULY. DNA (xi) POPIS SEKVENCIE. SEC) ID NO.4.
GCĽACC1GA7 C ľACAAATGT (2) ÚDAJE O SECJ ID NLI.S.
C i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE· (A) DĹŽKA· 20 párov báz (B) TYP. nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA, jednoreťazcouá (0) TOPOLÓGIA. lineárna
C 1 -i) DRUH MOLEKULY. DNA (xl) POPIS SEKVENCIE, STU ID ΝΠ.5.
GAGATACCAG CCTCAAACTC (2) ÚDAJE O SŕlJ ID NO.6.
(i) ĽHARAKTERI.STIKA SEKVENCIE· (A) DĹŽKA; 20 párnu báz (D) TYP· nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA· jednoreťazu-ová (D) ΤΟΡΟΙ.άίΤΛ. lineárna (ii) DRUH MOLEKULY. DNA (xi) POPIS SEKVENCIE, SEO ID NO.6.
A1GTGACCAT CATlGATGCC (2) ÚDAJE 0 SED ID NO.7.
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
(A) DĹŽKA· 20 párov báz (A) TYP, nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA, jednor eť.azoová
CD) JOPDLLlGIA. lineárna (11) DRUH MOLEKÚL. Y. DMA (xi) POPIS SEKVENCIE. SE(J ID NU·?·
GTGACTTTCC ATCCCTTGAA (2) ÚDAJE I) SEQ ID NO.8.
(L) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE· (A) DĹŽKA. 20 párw báz (S) TYP· nukleová kyselina
C Ij) DRUH REŤAZCA, iednur eĽazcová (C) DRUH REŤAZCA· Jodncireťazcová (D) TOPOLÓGIA. lineárna (ii) DRUH MOLEKULY. DNA (xi) POPIS SEKVENCIE. SEU ID NO.12.
GTAAAACGAC GGCCAGT (2) (JDAJt 0 SED ID NÍJ.13.
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
CA) DĹŽKA. 19 párov báz
CD) TYP. nukleová kyselina
CC) DRUH REľŤAZĽA: jednoretazcnuA (D) TOPOLÓGIA. lineárna < 11.) DRIJH MOLEKULY. DNA (Xl) POPIS SEKVENCIE. SEQ TO NOciS.
GGAAACAGCT ATGACCATG <2) ÚDAJE í.l SEC) TD NÍ1.14, (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE· (A) DĹŽKA. 20 párov báz
CR) TYP. nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA, jednuretazcovd
CD) TOPOLÓGIA. lineárna (ii) DRUH M0LEKL1I Y. DNA (xi.) POPIS SEKVENCIE. SEQ ID NO.14.
AATTAACCCT CACTAAA3GC (2) ÚDAJE U SEQ IU NLH15.
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
CA) DĹŽKA. 23 párov báz
CCD TYP. nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA. Jprir.oreťaznnuá (U) I (JPIJLÓGIA · Lineárna (11) DRUH MOLEKULY. DNA (xi) POPTS SEKVENCIE. SECJ TD NIL1.5.
GTTAATACGA CTCACTATAG GCC (2) ÚDAJE U SEIJ 10 NÍI.16· (i) CUARAKTERLSIIKA SEKVENCIE·
CA) DĹŽKA. 6 párov báz <B) TYP. nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA· jednoretazcová (D) TOPOLÓGIA« lineárna (li) DRUH MOLEKULY DNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEČI ID Nlhlb.
GGCGGG 6 (2) ÚDAJE 0 SEIJ ΙΓ) Níl.17.
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE· (A) DĹŽKA: 15 párov báz <0> TYP: nukleová kyselina (Ľ) DRUH REŤAZCA: iednoreťazcová (D) TIFOLÓGIA. lineárna (ii) DRUH MOLEKULY. DNA
Cxi) PíPľS SEKVENCIE. SEQ ID NO.17.
GGGCGG 6 (2) ÚDAJE O SED ID NU.18.
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
(A) DĹŽKA. 8 párov báz
C R) TYP· nukleová kyselina (Ľ) DRUH REŤAZCA, jednoretazcová
CO) HFLVÚGLAt lineárna
C i L) DRUH MOLEKULY . DNA (xi) PIPTS SEKVENCIE. SEQ ID N0.18.
TGACGYMR 8 (2) ÚDAJE O SEIJ ID NlJtlH.
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE· (A) DĹŽKA: 13 párov báz (B) TYP. nukleová kyselina (CO DRUH REŤAZCA. Jednoreťazcová (D) TOPOLÓGIA. lineárnu (11) DRUH MIBEKDLY: DNA (xi) PTFTS SEKVENCIE: SED 10 NU>19.
rGGCNNNNNKCCR13 (2) ÚI1A.IC 11 SLO 10 Ν0·20.
Cl) CHARAKTERISTCKA SEKVENCIE·
TTGTTATGTA60
GATCTGACGG TTCACTAAAC GAGCT65 <2) ÚDAJE O SEQ ID NO.24.
(!) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
(A) DĹŽKA. t»S párov báz
C B) TYP. nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA. Jedrioreťazcová
CD) TOPOLÓGIA. lineárna (ii) DRUH MOLEKULY. DNA (xi) POPIS SEKVENCIE. SEO TO NO.24.
AGTTCAGTCG ACGGCGCGCC AACCCGGGAA TCCGGACGF.G ATCTATACAT
TGAATCAATA 60
TTGGCA 66 (2) ÚDAJE O SEQ ID NO.25· (1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
(A) DĹŽKA. 42 Párov báz (Θ) TYP. nukleová kyselina
CC) DRUH RtÍAZCA. iednoretlazcová (D) TOPCLÓGIA. lineárna (li) DRUH MOLEKULY. ONA (xi) POPIS SEKVENCIE. SEQ ID N0.25.
ATGTCAGGAT CCACGCGGAA CTCCATATAT GGGCTATGAA CT 42 (2) ÚDAJE O SĽO 10 NO.26.
(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
(A) DĹŽKA. 19 párov báz (B) TYP. nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA. Jednoretazccvá (D) TOPOLÓGIA. lineárna (ii) DRUH HCX.EKLILY: DNA (xi) POPIS SEKVENCIE. SEQ ID NO.26»
GGCTTAGCTC CGAGGAGGG 19 (2) ÚDAJE O SLU ID NO·27.
(1) CHARAKTERISIIKA SEKVENCIE.
CA) DĹŽKA. 26 párov báz (0) TYP. nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA. Jednoreťazcová (A) DĹŽKA. 2ti párov báz
CB) TYP: nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA: iednoretazcová (D) HFllÓGIA. lineárna (11) DRUH Híí EKUL Y. DNA
Cxl.) PlPľS SEKVENEIF: SED 10 Ν0.2Π.
GATĽGCGGCC GCGTT1AAAĽ ISGATCĽ 26 (2) ÚDAJE O SED ID Níl.21:
ít) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE* (A) DĹŽKA. 2G pírou báv (3) TYP: nukleová kyselina <í:> druh Rl TAZCAi jednoreCazccivá (D) TOPOLÓGIA: lineárna (li) DRUH MOLEKULY* ONA (xi) POPIS SEKVENCIE. SFw U) NO.21.
AAlIGGATDi: 151 ľ IAAACGU GGCCGĽ 26 (2) ÚDAJI-, t) SED LD NU.22.
íl) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
(A) DĹŽKA. 77 párov báz (R) TYP. nukleová kyselina (C) DRUH Fíl ŤAZCA. Jednoretazcová (D) TOPOLÓGIA. lineárnu (ii) DRUH MOLEKULY. DNA (xi) PÍPIS SEKVINC1E. SĽU ID NU.22.
CGTTTAGIGA accgtcagat CTACATAACA acattcctcc TCTAAAGAAG CCCCAAGCTT 60
GATATĽTGĽA GAAIICÍ 77 (2) ÚDAJI LI StlJ ID Níl.23.
íl) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE· (A) DĹŽKA. IT5 párov báz <EJ> TYP: nukleová kyselina í C) DRUH REŤAZCA, jednoreťazcová
CD) TOPOLÓGIA. lineárnu
Í1i) DRUH Mll.FKlH Y* DNA (xi) POPIS SEKVENCIE. SEQ ID NO.23:
CTAGAGAATT CTGCAGATA1 CAAGCTTGGG GCTTCTTTAG AGGAGGAATG (D) TOPOLÓGIA. lineárna (li) DRUH MOLEKULY. DNA (xi) POPIS SEKVENCIE. SEO ID NIJ.27.
ĽGTGACAAGC TTCGTTTTCA CAACAC (2) ÚDAJE U SEQ 10 N0»2G>
(i) CHARAK1ERISTIKA SEKVENCIE.
(A) DĹŽKA: 4263 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina
CC) DRUH REŤAZCA, jednoreťazcová (0) TIFOLÓGIA. lineárna
Clá) DRUH MOLEKULY. DNA
Cxl) POPIS SEKVENCIE: SEQ TO NO.26.
TGAATATTAC CCCTAACAC.C TGCCACCCĽA GTCTTAATCA GTGGTGGAAG
AACGGTCTCA60
GAACTGTTTG TCTCAATTGG CCATTTAAGT TTAATAGTGA AAGACTGGTT AATGATAACA120
ATGLATCGGA AAACCTTCAG GAGGAAAGGA GAATGTTTTG TGGAACATTT
TTGTGTGTRT180
GGCAGTTTTA AGTTATTAGT TTTCAAAATC AGTACTTTTT AATGGAAACA
ACTTGACCAA240
AAATCISTCA CAGAATTTTG AGACCCAT1A AAATACAAGT TTAATGAGAA
GTCTGTCTCT300
GTTAATGĽTG AAGTCAITAC TAAG1GCTTA GĽľTAGCAAG GTATGTGGAT
GCCCATTTGT360
GTTCCAAGGG ATJGGAĽTGT TCATCAGGAC CCAGAGCTGA GTTTCAAGGG
CTCAAGAGAT420
GGCTTATTAC CTGTGGGTGT CTTGAAGGTT CTGGTTGGGA CAAA'ITAGGA
ATGT1TITGG480
CAGACATGGT GACTACCTTC ATCTG6GTGA GTTCAGTTGA TT7GTCT1GA GCCTTTGGGG540
TTTACACAAG TAAATGACAT CATAĽAGTTA GTGTAT1GTT AGTGAATATT AATATATGAG600
GCARRr.TTTG CTCTAGCAAT TTTAGAACTA GTTTTCAGGA AAGGGTTCAT crTGTGCAI T 6BĽI
GGATGiriGA TTCTATĽACT TAGAGTTTAA ACTGAAAGTG ĽTCAAGAGGT
721)
CTGGGATATA ΛΑΙ AAGiXTT
AAAGGCCATC 700
TCTGTAGCtľ CTAATGGTAT
CAGGAATTTA
GGZIGAAAAAT
OCICCCAACC GUTÍ3AAGCCC
GAGATAAGGA 1020
CftAAAAGTTA GGIGGTCTTA
AATTGGGTTA GGAGľCACTl
1TTTCACOTT 1140
AľlTAAAUCGG TGACTAAAGG AGAĽGtiíGAG 1260
ĽľCAGAACGl
TCAACTTAGT
GAAAAGG1AG AňGGTGAGAT
TTGGTAArCT
GCTCGGATGG GA1 CCAGGGC TACCAAATTA I hl u J
ATlTACCGAíX TAATi'XcCíTG CAAAACGAAG 1740
GAATTTAĽAG GAAHAGGAA ílT TAAAAAA .1000
AGGTTTGAĽA ACCAGGCTGG
GĽTGAAATCT
CAACATTC.TG
CTTCCATGTA TGGTTGTGAG
CĽACCATGTG CTCTTAACXT iTTGAGCCATr: CAAACCCCĽT
AGGCCTTCTG AGGTTATTCG
GAGCTGCAGG
ATGCAGTGAA
GGCAAGCTGA
TGC1GAGCCT
GATGACĽAAG TAAAAGCATG
ĽGTCATTTTT
ĽCbCAGCGIG
ITTAAATTAA TAGTGĽCTTG
GCAGGTATAC TTTCAGTCAG
GCTCAGGCAG ľGAGCCTATT
AGTATACCGA TGCCTCCGAA
ATACTGGGAC TCTACATTTT
ACTGCCAGAT
GCAGGGTGT T TATTTAĽCAtl
TCiAAATAlXr GGGCCATAAG CAAAGTGGCA
TATClIAľrCT ATAGTGCATG CTTGTTCAAT
T'ľTGTUAGTA TAAATGGATG GGTTGIAUGC
UACTTTAAAA GCTTAGCATA liAGGAGCATG
UWAAGGH 1
GCA TGTAAAr AAAAGCCCľT
TGrriwwiA caisaaggijaa
AGACACGTAA AATGGAATTT GGÍ5ATTCACA
TACCAGGĽAC AAAGGTGTCT
AlAAäCTACA ggiattctta aľattaaaac aitatgggca
GGATTTCTTT
1.060
TGTCTGCCTG 1920
TATCTGCACA 1980
GTTGCrGSGA 2040
TCCARCCCCA 2100
TCAGTAATGA 2100
IC.TGCĽ I CAG 2220
GGTATATTTT 2280
ĽTGGGACACA 2340
AATGCTCTTG
2400
ACTAGTTTGG 2400
TAĽTGAACTC 2520
CC-CTTAAACT 2580
TCAATATGTG 2640
TAAAGGCTGC
2700
GTCATGGCTG CCTGGCTTGG TTAGAAGACG ΑΤΓΟΑΑΟΓΟΑ GCTTGGGCAC AGGGCTTTTG TGĽAGGľTTG GTTTAAAAAA AGTAGAAGAA AGAAGGCTAT
T CC TGGACCr
ACACTT1TTT GCACCAGATC GGACCTCTGG
ATTTTTAATG GCTACCGAGA GGAGľCCAGC AAAATAAGTG CATAGGCCAA GCCTACACTA
AGTTGTGTAG ATTATGTATA rGCTAATGGA AAGAGCAGTG GCTGGGAAAT
GTAGGATTTA ATCÍTAGAAA GGTAAAGTGC TGCTCTATAT CTCTCAGCCA
ΑΑΑΤΤΓΓΓΤΤ TCCTCCTCAT TGTGATTAAG AATTTTTFTG AGĽACCACAA
TGGGGGTAAG rccTTTrTGT CCTGAGAACA GGATGGGGGT CCTGGCTCTT
CTATTTAACC TTTTTAAGAA GTTACGATTA CAGGCCTCCC GAAATACTTT
TTGGGGGGCA TGGG1GGGAG AGCAGGGTTT CTCTGTATTA GCCCTGGOTU TCCTGGAACT 2760
CTGTAGACCA GGCTATTCTT GAGCTĽAGAT TAGCCTGTCT CTGCCTCCTA AATICTGGGA 2R20
TTAAAGGTGT GTGCTACTGC TGCCTGGC.TA CAAAGAĽATT T'fT! TTTTTC TTAAATTTAA 2Θ80
AAAĽAAAAGT AGCACTCAGG GGTTĽTTTTA 2940 GAAGGGTGGT TGGTGTTGGC ACATACTCCA
TTITGAGTTT GTAAGGGCTA GTCCCAGGAA 3000 TGAAGACTGC ATTACTGCCG CCCCTCCCTG
CACAGAGAAA AGGCTGGCCT TCCTATTTGG 30G0 AGCCTATCCT GGTAAC-TCGC TOIGTAGACC
CGAACTCAAG CCACCAACAC AGAACCACCT 3120 GCCTCTGAAI GCTGGTATTA AGGGCAGGCA
CCAGCCTAAA GAATAAACAT AAATGTCTTT 3180 TTTTTAAAGA TTTTTTTTTT TTTTTTTAGA
TCTGTTTACA AIXCGATCTC ATATTCTGCT 3240 TCTATGTATA TCTGCACACT AGAAUAGGGC
ATAATGGATG AUCTCTGĽAA GTTGTGAGCC 3300 ACCAAGTGGT TGGTGGGAAT TGAACTCAGA
GAGCAGTCAG 0GC1CTTGAG TGCTCTTAAC 3360 CTCTCAGCCA TCTĽ.TCCAGC CCĽTAAAAA1
ATARGGTCTC CACATAGCAC AAGTAGTTTG 3420 AGACTGAGTT GGCTATATAA ACAAGGCTGG
CA1GTACAGC RRAGGATCAT TGGGTTTAGT 3480 TTACATGGGG TGTTTTTGTC TCTGGAGGCA
TTGAGCATAG TTGAGAACTA GGAGľ-AATA 3540 GTGAGGTCAT GTTTTATCTA C.TCTTCTGAA
AGCTGATGCA GGTGGAAACT AAGCAAGTTT 3600 GACTGAAGAA GTCCAGTTTA TGAGAACAAG
AATGTGTCAA TGGGAATTAG AGATGGCCTT 3660 GCATGTGTTT TAGATGATGA CCCAGTCACT
TGGATGTGTA CCTATATGAA AGACCTATAl 37211 CTTGAC.AGGA li Γ GAACAG r 6 TCTTAIAGGT
AGAAATGAGA CCTGGTTCAT CATAĽCCATT 3780 TTGTTTCCCC TAA3AATTCA CTTTTCĽTAA
GCTATTTAGG TTGCTTATGT TTATTTTACT 3840 TGCAAATCCT AGGTGCTCCC TTACCCAGTA
GGCACCAAAG TGACAAiXTA TCACTCAĽTC 3900 CCATGATTTG CAAGTCTCTG GGAACTTCCA
CAATAGCAAC TI1TGCAAAA TCAAATACAT 3960 TTTCTCAGTA CCAATTTTGA AGAAAAAATA
l AGC 1 LilATG GATGGGTACT AAATAGTGAC GTTATCTCCA GAAGGCCTAT
GAAGAATTAA 4020 liGTl'GAGTTC AGTTGAGľTC AGCAGĽAAGT TTAAGGTTCA TCCATTTTTG
TACAGTGTTT 4080
TCCTATTACG GľAAGTGrrr 1'GCCTGCAGG AATATCTGTA CCACAT6C7T GC.CTCGTACC 4140
IATATCGGCC AGAAGAĽGGC TTIGGATUCT CTGGACTTGA ATTACAGATG GGTATTAGCC 4200
AĽCATTTAĽG TGCTGGGAAT TGAAACCAAĽ TCCTĽTGGAA GAACAGCAAG
TGATOGAGTC 4260
GAC 4263 ¢2) ÚDAJE U SEQ 11) N0.29:
<i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE.
IM DĹŽKA. 4695 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH REŤAZCA: jednorctazcová (OJ TOPOLÓGIA. lineárna ¢11) DRUH MCMEKIHY. ONA <xi) POPIS SEKVENCIE: SE.ÍJ ID Ν0.29»
CCCGGGCTGG GCTGAGACCC GCAGAGGAAG ACGCTCTAGG GAT11UlCCC GGACTAGCGA60
2ATGGCAAGG CTGAGGACGG GAGGCTGATT GAĽftGGCGAA GGIAĽAĽĽĽT AATC1CAATA120
CAACCTTTGG AGCTAAGCCA GCAAIGGTAG AGGGAAGATT ĽTGĽAĽGTCC CTTCĽAGGCG180
GCCTCCCCGT CACCACCCCC CCCAACCCGC CCCGACCGGA GCTCAGAGTA ATTCATAIIAA240
AAGGACTCGC CCCTGCCTTG RGGAATCCCA GGGACCGTCG TTAAACTCCC ACTAACGTAG30CJ
AACC.CAGAGA TCGr.TGCGTT CCCGCCCCC.T CACC.CGC.CCG CTC1CGTCAT CACTGAGGTG360
GARAAGAGCA TGCr.TGAGGC. TCCGGTGCCC GTCAGTGGGC AGAGCGCACA TCGCCCACAG420 ľCí ť:CGAGAA GTlGGGGUĽA GGĽGÍĽGCĽA AT I GAAQCGG TGIXTAGAGA ACGTGGCGCG480
GGGTAAACTS GGAAAGTQAT GTCGTGTACT GGCTCCGCCT TľTTCCCGAG GGTGGGGGAG54CI
AACCGTATAT AAGTGCAGTA GTCGCCGTGA ACGTTCTTTT TCGCAACGGG TTTGCCGCCA 600
GAACACAGGT AAGTGCCGTG TGTGGTTCCC GCGGGCCTGG CCTCTTTACG
GGTTAIGGCC660
CTTGCGTGCĽ TTGAATTACT TCCACGCCCC TGGCTGCAGT ACGIGATTCT
TGATCCCGAG720
CTTCGGGTTG GAAGTGGG1G GGAGAGTTCG AGGCGTTGCG CTTAAGGAGC ĽCCTTCGCCT780
CGTGCTTGAG TTGAGGCCTG GCCTGGGCGC TGGGGCCGCC GCGTGCGAAT
CTGGTGGCAC840
CTTCGCGCCT GTCTCGCTGC TTTCGATAAG TCTCTAGCCA TTTAAAATTT
TTGATGACCT900
GCTGCGACGC TTTTTTTCTG GCAAGATAGT CTTGTAAATG CGGGCCAAGA
TCTGCACACT960
BGTATTTCGG TTTTTGGGGC CGCGGGCGGC GACGGGGCCĽ GTGCGTCCCA GCGCACATGT1020
TCGGCGAGGC GGGGĽCTGCG AGCGCGGCCA CCGAGAATCG GACGGGGGTA
GTCTCAAGCT1080
GGCCGGCCTG CTCTGGTGCC TGGCGTCGCG CCGCCGTGTA TCGCCCCGCC
CTGGGCGGCA1140
AGGGTGGCCC GGTCGGCACC AGTTGCGTGA GCGGAAAGAT GGCCGCTTCC
CGGCCCTGCI1200
GCAGGGAGCT CAAAATGGAG GACGCGGCGC TCGGGAGAGC GGGCGGGTGA
GTCACCĽAUA1260
CAAAGGAAAA GGGCCTTTCC GTCCTCAGCC GTCGCTTCAT GTGACTCCAC
GGAGTACCGG1320
GCGCCGTCCA GGCACCTCGA TTAGTTĽTCG AGCTTTTGGA GTACGTCGTC TTTAGGTTGG13Θ0
TTTCAGATGC 2760
CTTGGTTCAA GGGATGGAAA GTCACCCGTA AGGATGGCAA TGCĽAGTGGA
ACCACGCTGC 2820
TTGAGGCTCT GGACTGCATC CTACCACCAA CTCRTCCAAC TGACAAGCCC TTGCGCCTGC 2ΘΒ0
CTCTCCAGGA TGTCTACAAA ATTGGTGGTA AGTTGGCTGT AAACAAAGTT GAAT1TGAGT 2940
TGATAGAGTA CTGTCTGCCT TCATAGGTAT TTAQTATGCT GTAAATATTT TTAGGTAITG 3000
GTACTGTTCC TGTTGGCCGA GTGGAGACTG GTGTTCTĽAA ACCCGGTATG GTGGTCACCT 3060
TTGCTCCAGT CAAĽGTTACA ACGGAAGTAA AATCTGTCGA AA1GCACCAT GAAGCTTTGA 3120
GTGAAGCTCf TCCTGGGGAC AATGTGGGCT TGAATGTCAA GAATGTGľCT GTC.AAGGATG 3180
TÍCGTCGTGG CAACGTTGCT GGTGAOAGOA AAAATGACCC ACCAATGGAA GCAGCTGGCT 3240
TCACTGCTCA GGTAACAATT TAAAGTAACA TTAACTTATT GCAGAGGCTA AAGTCATTTG3300
AGACTTTGGA TTTGCAOTGA ATGCAAATCT TTTTTCĽAAG CTGATIATCC TGAACCATCC3360
AGGCCAAATA AGCGCCGGCT ATGCCCCTGT ATTGGATTGC CACACGGCTC
ACATTGCATG 3420
CAAGTTTGCT GAGCTGAAGG AAAAGATTGA TCGCCGTTCT GGTAAAAAGĽ
TGGAAGATGG3480
CCCTAAATTC TTGAAGTĽTC GTGATGCTGC ĽATTGTTGAT ATGG7TCCTG
GCAAGCCCAT3540
GTGTGTTGAG AGOTTCTCAG ACTATCCACC TTTGGGTAAG GATGACTACT
TAAATGTAAA 3600
GGGGAGGGGT TTTATGCGAT GGAGTTTC.CC CACACTGAGT GGGTGGAGAC AAAGTTGTGI TAAAGATGAA AAATACAACT GAACAGTACT TTGGGIAATA
TGAAGTTAGG 1440 ATTAACTTTT3660
CCAGCTTGGC ACTIGATGTA ATTCTCCTTG GAATTTGCCC TTTTTGAGTT TTTTTAATAG GTCGCTTTGĽ TGTTCGTGAT ATGAGACAGA ĽAGITGCGGT
TGGATCTTGG 1500 GGGTGTCATC3720
TTCATTCTCA AGCCTCAGAC AGTGGTTCAA AGTTTTTTTC TTCCATTTCA AAAGCAGIGG ACAAGAAGGĽ TGĽTGGAGCT GGCAAGGTCA CCAAGTCTGC
GGTGTCGTGA 15G0 CCAGAAAGCT3780
AAACTAĽĽCU 1AAAAGCCAA AATGGGAAAG GAAAAGACTC ATATCAACAT ĽAGAAGGĽ1A AATGAATATT ATCCCTAATA CCTGCCACCC CACTCITAAT
TGTCGTCATT 1620 CAGTGGTGGA3Θ40
GGACACGTAG ATTCGGGCAA ATGCGGTGGC 1680 GTCCAIXACT AĽTGGCCATĽ TGATCTATAA
ATCGACAAAA GAftCCATÉGA TTTAATACCA 1740 AAAATTTGAG AAGGAGGCTG CTGAGGTATG
GAAAGGGAAA GATCAAC.TAA ATTTCCCCAG 1800 AATGAGTTTT ACCAGCAGAA TCATTAGGTG
AACTAGTGAG TGGTTTAGAT GAAATAATTT 1060 CTGAATGCTA ATAGTTAAGA CC.TTACTTAT
rar.TTTTGGT gacttctgta TAATAGTTAA 1920 ATCGTATTGC TAGTGAGTAG ATTTGGATGT
GATCCTACTT ATAAAAGTTT ACCAAAATĽA 1980 GATTTTTGGT TGCTTCTGTA AĽĽCAAAGTG
CTTTGGACTT GGAGTTGTAA AAGGAAATTG 2040 AGTGGAAACT GCCAATTAAG GGCTGGGGAC
AAGCTGGAGT TTGTGTTTTA GATGGGAAAG 2100 GTAACCAAGT AACGACTCTT AATCCTTACA
GGĽlCCíl 1 L1A AGTATGCCTG ACGTGGTATC 2160 GGTCTTGGAT AAACTGAAAG CTGAGCGTGA
ACCATTGATA TCTCCTTGTG TATCATTGAT 2220 GAAATTTGAG ACCAGCAAGT ACTATGTGAC
GCCCCAGGAC ACAGAGACTT GGTTGGGATT 2280 TATCAAAAAC ATGATTACAG GGACATCTCA
AATAATTC1TA GGTľTCTTTA TGTCATTTGG 2340 TCCCAAAAGG CTTGCTTTGT ACACTGGTTT
AGAGTTGACA GGGATATGTC CCTGATTGTT 2400 TTTGCTTTCT TTAAAGGOTG ACTGTGCTGT
GCTGĽTGGTG TTGGľtíAATT CCGAGAGCAT 2460 TGAAGLTGGT ATCTCCAAGA AIGGGCAGAC
GCĽCTTCTGG CTTACACACT OAAAATGGAT 2520 GGGTGTGAAA CAACTAATTG TCGGTGTTAA
TCCACTGAGC CACCCTACAG AGTCAGCACT 2580 CCAGAAGAGA TATGAGGAAA TTGTTAAGGA
AGAACGGTCT CAGAACTGTT TGTTTCAATT GCCCATTTAA GTTTAGTACT AAAAGACTGG 3900
TTAATGATAA CAATGCATCG TAAftACCTTC AGAAGGAAAG GAGAATGITT
TGTGGAIXAC3960
TTTGGTTTTC TTTTTTGCGT GTGGCAGTTT TAAGTTATTA GTTTTTAAAA
TCAGTACTTT4020
TTAATGGAAA CAACTTRACC AAAAATTTGT CACAGAATTT TGAGACCCAT
ΤΑΑΑΑΑΑΙΠΤ4880
AAATGAGAAA (XTGTGTGTT CCTTTGGTCA ACACCGAGAC ATTTAGGTGA
AAGACATCTA4140
ATTCTGGTTT TACGAATCTG GAAACTTCTT GAAAATGTAA TTCTTGAGTT
AACACTTCTG4200
GGTGGAGAAT AGGGTTGTTT TCCCCCCACA TAATTGGAAG GGGAAGGAAT ATCATTTAAA4260
GC-TATGGGAG GGTTTCTTTG ATTACAACAC TGGAGAGAAA TGP.AGCAIGT
TGCTGATTGC4320
CTGTCACTAA AACAGGCCAA AAACTGAGTC CTTGGGTTGC ATAGAAAGCT
TCATGTTGCT4380
AAACCAATGT TAAGTGAATC TTTGGAAACA AAATGTTTCC. AAATTACTGG GATGTGCATG4440
TTGAAAĽGTG GG1TAAAATG ACTGGGCAGT GAAAGTTGAC TATTTGCCAT GACATAAGAA4500
ATAAOTGTAG
AGTCA6TGGA
GTAAGCTTTA
CAGAATAGGA
TGGCTAGTCT 4560
TGCCATTTTG 4620
ACACCCTATG AGTGGAAĽlili
ATGGTTTCAC
AAGTTCTATT i ľľafu i ga
GAGTGCTATT
ACAAGGTTC1 AATAGAAAAA GATGGCAATT TGAAGTARCT ATAAAATTAG ACTAATTAC.A 4600
TTGC.TTTTCT CCGAC

Claims (29)

1. Purifikovaná a izolovaná transkripčná regulačná DNA škrečacieho EF-Ια, zvolená z a) DNA obsahujúcej sekvenciu nukleovej kyseliny uvedenú v SEQ ID NO: 1, b) DNA obsahujúcej časť sekvencie nukleovej kyseliny uvedenej v SEQ ID NO: 1, ktorá je schopná zvýšiť transkripciu génu operatívne pripojeného k regulačnej DNA, c) DNA obsahujúcej oblasť od nukleotidu 2114 do nukleotidu 3656 sekvencie uvedenej v SEQ ID NO: 1, d) 11,7 kb regulačnej DNA sekvencie škrečacieho EF-Ια v plazmide pDEF14, ktorý je uložený v zbierke ATCC pod prírastkovým číslom 98 398, e) DNA obsahujúcej sekvencie nukleovej kyseliny uvedenej v SEQ ID NO: 28, f) škrečacej regulačnej DNA sekvencie, ktorá hybridizujc s DNA opísanou v SEQ ID NO: I za podmienok zahŕňajúcich konečné premytie v tlmivom roztoku obsahujúcom 2X SSC a 0,1% SDS pri 65 °C, g) DNA obsahujúcej 1,56 kb od 5' do iniciačného ATG kodónuvSEQ IDNO: 1.
2. DNA podľa nároku 1, kde uvedená regulačná DNA obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny uvedenú v SEQ ID NO: 1.
3. DNA podľa nároku 1, kde regulačná DNA obsahuje časť sekvencie nukleovej kyseliny uvedenej v SEQ ID NO: 1, ktorá je schopná zvýšiť transkripciu génu operatívne pripojeného k regulačnej DNA.
4. DNA podľa nároku 3, kde regulačná DNA obsahuje oblasť od nukleotidu 2114 do nukleotidu 3656 sekvencie polynukleotidu uvedeného v SEQ ID NO: 1.
5. Hostiteľská bunka obsahujúca DNA podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, kde DNA nie je operatívne pripojená k EF-Ια kódujúcim sekvenciám.
6. Vektor obsahujúci DNA podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, kde DNA nie je operatívne pripojená k EF-la kódujúcim sekvenciám.
7. Hostiteľská bunka transformovaná alebo transfekovaná vektorom podľa nároku 6.
8. Chimerický polynukleotid zahŕňajúci regulačnú DNA škrečacieho EF-Ια, podľa nároku 1 operatívne pripojenú k DNA sekvencii kódujúcej proteín, táto sekvencia DNA kóduje proteín odlišný od škrečacieho EF-la.
9. Chimerický polynukleotid podľa nároku 8, kde regulačná DNA obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny uvedenú v SEQ IDNO: 1.
10. Chimerický polynukleotid podľa nároku 8, kde regulačná DNA obsahuje časť sekvencie nukleovej kyseliny uvedenej v SEQ ID NO: 1, táto časť je schopná zvýšiť transkripciu génu operatívne pripojeného k regulačnej DNA.
11. Chimerický polynukleotid podľa nároku 10, kde regulačná DNA obsahuje oblasť od nukleotidu 2114 do nukleotidu 3656 v polynukleotide uvedenom v SEQ ID NO: 1.
12. Chimerický polynukleotid podľa nároku 8, kde sekvencia DNA kódujúca proteín kóduje proteín endogénny vzhľadom na škrečacie bunky, ktorý je odlišný od EF-la.
13. Chimerický polynukleotid podľa nároku 8, kde sekvencia DNA kóduje proteín heterológny vzhľadom na škrečacie bunky.
14. Hostiteľská bunka transformovaná alebo transfekovaná chimerickým polynukleotidom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 13.
15. Expresný plazmid obsahujúci chimerický polynukleotid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 13.
16. Expresný plazmid podľa nároku 15, ktorý ďalej obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny uvedenú v SEQ ID NO: 28.
17. Expresný plazmid podľa nároku 16, kde sekvencia nukleovej kyseliny uvedená v SEQ ID NO: 28 je umiestnená 3' vzhľadom na chimerický polynukleotid.
18. Hostiteľská bunka transformovaná alebo transfekovaná expresným plazmidom podľa nároku 15.
19. Hostiteľská bunka transformovaná alebo transfekovaná expresným plazmidom podľa nároku 16 alebo 17.
20. Plazmid pDEF2 uložený v zbierke ATCC pod prírastkovým číslom 98343.
21. Plazmid pDEF14 uložený v zbierke ATCC pod prírastkovým číslom 98398-
22. Plazmid pDEFl/ICM3H.2 uložený v zbierke ATCC pod prírastkovým číslom 98381.
23. Plazmid pNEFl/ICM3L.3 uložený v zbierke ATCC pod prírastkovým číslom 98382.
24. Plazmid pDEFl/F2GH.l uložený v zbierke ATCC pod prírastkovým číslom 98383.
25. Plazmid pNEFl/F2GL.l uložený v zbierke ATCC pod prírastkovým číslom 98384.
26. Plazmid pDEFl/CTN.l uložený v zbierke ATCC pod prírastkovým číslom 98385.
27. Plazmid pDEF2/HPH.4 uložený v zbierke ATCC pod prírastkovým číslom 98386.
28. Plazmid pDEFlO/MDC. 1 uložený v zbierke ATCC pod prírastkovým číslom 98387.
29. Hostiteľská bunka transformovaná alebo transfekovaná expresným plazmidom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 20 až 28.
SK118-99A 1997-05-01 1998-05-01 Purifikovaná a izolovaná transkripčná regulačná DNA škrečacieho EF-1alfa, hostiteľské bunky, vektory, chimerické polynukleotidy a plazmidy SK285664B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/847,218 US5888809A (en) 1997-05-01 1997-05-01 Hamster EF-1α transcriptional regulatory DNA
PCT/US1998/008906 WO1998049289A1 (en) 1997-05-01 1998-05-01 HAMSTER EF-1α TRANSCRIPTIONAL REGULATORY DNA

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK11899A3 SK11899A3 (en) 2000-05-16
SK285664B6 true SK285664B6 (sk) 2007-05-03

Family

ID=25300098

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK118-99A SK285664B6 (sk) 1997-05-01 1998-05-01 Purifikovaná a izolovaná transkripčná regulačná DNA škrečacieho EF-1alfa, hostiteľské bunky, vektory, chimerické polynukleotidy a plazmidy

Country Status (20)

Country Link
US (1) US5888809A (sk)
EP (2) EP1676916A1 (sk)
JP (1) JP2000513948A (sk)
CN (2) CN100430477C (sk)
AT (1) ATE318900T1 (sk)
AU (1) AU742561B2 (sk)
BR (1) BR9804896B1 (sk)
CZ (1) CZ296544B6 (sk)
DE (1) DE69833649T2 (sk)
DK (1) DK0920498T3 (sk)
ES (1) ES2263206T3 (sk)
HK (1) HK1022719A1 (sk)
HU (1) HU225764B1 (sk)
IL (1) IL127897A (sk)
NO (1) NO323853B1 (sk)
PL (1) PL195604B1 (sk)
PT (1) PT920498E (sk)
RU (2) RU2249617C2 (sk)
SK (1) SK285664B6 (sk)
WO (1) WO1998049289A1 (sk)

Families Citing this family (120)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8183344B2 (en) * 1996-04-24 2012-05-22 University Of Michigan Inactivation resistant factor VIII
US6479256B1 (en) 1998-03-04 2002-11-12 Icos Corporation Lectomedin materials and methods
KR20000046969A (ko) * 1998-12-31 2000-07-25 이선경 이종 유전자 유래의 유전자 발현 조절요소를 포함하는 강력한전사 활성을 가진 진핵세포 발현벡더
AU2002213196A1 (en) * 2000-10-12 2002-04-22 Icos Corporation Modulation of ligand binding/enzymatic activity of alpha beta proteins
AU2002230773A1 (en) * 2000-12-18 2002-07-01 Wyeth Promoters and recombinant expression constructs
ES2344070T3 (es) * 2001-07-04 2010-08-17 Chromagenics B.V. Secuencias de adn con actividad anti-represora.
EP1513936A2 (en) * 2002-06-14 2005-03-16 Chromagenics B.V. Use of repression blocking sequences in methods for enhancing gene expression
ES2362273T3 (es) * 2002-06-14 2011-06-30 Chromagenics B.V. Método para la producción simultánea de múltiples proteínas; vectores y células para su uso en el mismo.
WO2004055215A1 (en) * 2002-12-18 2004-07-01 Chromagenics B.V. A method for improving protein production
EP1572994B1 (en) * 2002-12-20 2007-02-21 Chromagenics B.V. Means and methods for producing a protein through chromatin openers that are capable of rendering chromatin more accessible to transcription factors
DE602004025157D1 (de) 2003-09-23 2010-03-04 Univ North Carolina Zellen, die Vitamin-K-Reduktase und Vitamin-K-abhängiges Protein coexprimieren und deren Anwendung zur Verbesserung der Produktivität von diesem Vitamin-K-abhängigen Protein
US20060195935A1 (en) 2004-11-08 2006-08-31 Chromagenics B.V. Selection of host cells expressing protein at high levels
SI1809750T1 (sl) 2004-11-08 2012-08-31 Chromagenics Bv Izbira gostiteljskih celic, ki imajo visok nivo izraĹľanja proteina
US8039230B2 (en) * 2004-11-08 2011-10-18 Chromagenics B.V. Selection of host cells expressing protein at high levels
JP5291341B2 (ja) * 2004-11-08 2013-09-18 クロマジェニックス ベー ヴェー タンパク質を高レベルで発現する宿主細胞の選定
US8999667B2 (en) * 2004-11-08 2015-04-07 Chromagenics B.V. Selection of host cells expressing protein at high levels
CA2590284A1 (en) * 2004-12-08 2006-06-15 Icos Corporation Recombinant method for making multimeric proteins
US20090325226A1 (en) * 2005-03-15 2009-12-31 Stafford Darrel W Methods and Compositions for Producing Active Vitamin K-Dependent Proteins
WO2007008848A2 (en) 2005-07-07 2007-01-18 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the c-terminus
CA2614436C (en) 2005-07-07 2016-05-17 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine side-chain modifications at the c-terminus
WO2007045465A1 (en) 2005-10-21 2007-04-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the recombinant expression of a polypeptide
JP5666776B2 (ja) 2005-10-28 2015-02-12 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft 齧歯動物細胞におけるタンパク質発現
WO2007075976A2 (en) * 2005-12-21 2007-07-05 Inspiration Biopharmaceuticals, Inc. Method of producing biologically active vitamin k dependent proteins by recombinant methods
WO2007081336A1 (en) * 2006-01-13 2007-07-19 Five Prime Therapeutics, Inc. Mammalian vectors for high-level expression of recombinant proteins
CA2651478C (en) 2006-05-17 2015-02-03 Josef Endl Polypeptide producing cells
CA2656558A1 (en) * 2006-06-30 2008-01-10 The Regents Of The University Of Michigan Method of producing factor viii proteins by recombinant methods
US20090203077A1 (en) * 2006-06-30 2009-08-13 The Regents Of The University Of Michigan Method of producing factor viii proteins by recombinant methods
US20090143288A1 (en) 2007-03-13 2009-06-04 Roche Palo Alto Llc Peptide-complement conjugates
EP1975228A1 (en) 2007-03-28 2008-10-01 Fachhochschule Mannheim Polynucleotides for enhancing expression of a polynucleotide of interest
AU2008245524A1 (en) 2007-04-26 2008-11-06 Cnj Holdings, Inc. Recombinant vitamin K dependent proteins with high sialic acid content and methods of preparing same
KR101163295B1 (ko) * 2007-06-29 2012-07-05 에프. 호프만-라 로슈 아게 향상된 면역글로불린을 생산하는 중쇄 돌연변이체
EP2207881A1 (en) 2007-10-12 2010-07-21 F. Hoffmann-Roche AG Protein expression from multiple nucleic acids
WO2009067546A2 (en) 2007-11-19 2009-05-28 Celera Corpration Lung cancer markers and uses thereof
UA101497C2 (ru) 2008-04-24 2013-04-10 Селтик Фарма Пег Лтд. Конъюгаты фактора ix с увеличенным временем полужизни
CA2975228C (en) 2008-05-02 2020-07-21 Seattle Genetics, Inc. Methods and compositions for making antibodies and antibody derivatives with reduced core fucosylation
CA2771410C (en) 2009-08-06 2020-10-06 Cmc Icos Biologics, Inc. Methods for improving recombinant protein expression comprising reduction in translation efficiency of a selectable marker protein
WO2011033005A2 (en) 2009-09-15 2011-03-24 Medimmune Limited Cells for transient expression and uses thereof
WO2011053738A1 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Inspiration Biopharmaceuticals, Inc. Method of producing recombinant vitamin k dependent proteins
EP2339009A1 (en) 2009-12-22 2011-06-29 Sandoz Ag Cold inducible promoter sequences
HUE038788T2 (hu) 2010-03-31 2018-11-28 Boehringer Ingelheim Int Anti-CD40 antitestek
UA112062C2 (uk) 2010-10-04 2016-07-25 Бьорінгер Інгельхайм Інтернаціональ Гмбх Cd33-зв'язувальний агент
JP6126532B2 (ja) 2010-11-04 2017-05-10 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 抗il−23抗体
EP2655607A4 (en) 2010-12-21 2014-05-14 Univ North Carolina METHOD AND COMPOSITIONS FOR PRODUCING ACTIVE VITAMIN K-DEPENDENT PROTEINS
US20150158934A1 (en) 2011-09-09 2015-06-11 Ucl Business Plc Broadly neutralizing vhh against hiv-1
PL2771031T3 (pl) 2011-10-28 2018-09-28 Prothena Biosciences Limited Co. Humanizowane przeciwciała rozpoznające alfa-synukleinę
EA031948B1 (ru) 2011-11-16 2019-03-29 Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх Антитело к il-36r или его антигенсвязывающий фрагмент, выделенный полинуклеотид, клетка-хозяин и способ получения этого антитела или его фрагмента, содержащая их фармацевтическая композиция и применение антитела или его фрагмента и композиции
JP2015503907A (ja) 2011-12-22 2015-02-05 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft 真核細胞のための全長抗体提示システムおよびその使用
EP3816284A1 (en) 2011-12-22 2021-05-05 F. Hoffmann-La Roche AG Expression vector for antibody production in eukaryotic cells
CN113896787A (zh) 2011-12-22 2022-01-07 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 表达载体元件组合、新的生产用细胞产生方法及其在重组产生多肽中的用途
WO2013112945A1 (en) 2012-01-27 2013-08-01 Neotope Biosciences Limited Humanized antibodies that recognize alpha-synuclein
EP2812702B1 (en) 2012-02-10 2019-04-17 Seattle Genetics, Inc. Diagnosis and management of CD30-expressing cancers
US20130230901A1 (en) * 2012-02-14 2013-09-05 Portola Pharmaceuticals, Inc. Process for making recombinant antidote to factor xa inhibitor
CN109206516A (zh) 2012-05-03 2019-01-15 勃林格殷格翰国际有限公司 抗IL-23p19抗体
UA118441C2 (uk) 2012-10-08 2019-01-25 Протена Біосаєнсиз Лімітед Антитіло, що розпізнає альфа-синуклеїн
US20150307863A1 (en) 2012-11-20 2015-10-29 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for modified factor ix proteins
NZ711654A (en) 2013-03-12 2021-07-30 Cmc Icos Biologics Inc Improved recombinant protein expression using a hybrid chef1 promoter
EP2970453B1 (en) 2013-03-13 2019-12-04 Prothena Biosciences Limited Tau immunotherapy
US10513555B2 (en) 2013-07-04 2019-12-24 Prothena Biosciences Limited Antibody formulations and methods
RU2535871C1 (ru) * 2013-07-10 2014-12-20 Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ") Плазмида для экспрессии в клетке китайского хомячка, клетка китайского хомячка - продуцент белка с Gla-доменом и способ получения белка с Gla-доменом
WO2015004633A1 (en) 2013-07-12 2015-01-15 Neotope Biosciences Limited Antibodies that recognize islet-amyloid polypeptide (iapp)
WO2015004632A1 (en) 2013-07-12 2015-01-15 Neotope Biosciences Limited Antibodies that recognize iapp
JP2017501848A (ja) 2013-11-19 2017-01-19 プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド 便秘症状からのレビー小体病の免疫療法のモニター
EA033604B1 (ru) 2014-01-31 2019-11-08 Boehringer Ingelheim Int Молекула анти-baff антитела, фармацевтическая композиция, содержащая эту молекулу, способы ее применения и кодирующий ее изолированный полинуклеотид
EP3116911B8 (en) 2014-03-12 2019-10-23 Prothena Biosciences Limited Anti-mcam antibodies and associated methods of use
TW201623331A (zh) 2014-03-12 2016-07-01 普羅帝納生物科學公司 抗黑色素瘤細胞黏著分子(mcam)抗體類及使用彼等之相關方法
CA2938931A1 (en) 2014-03-12 2015-09-17 Prothena Biosciences Limited Anti-laminin4 antibodies specific for lg1-3
US10059761B2 (en) 2014-03-12 2018-08-28 Prothena Biosciences Limited Anti-Laminin4 antibodies specific for LG4-5
CA2944402A1 (en) 2014-04-08 2015-10-15 Prothena Biosciences Limited Blood-brain barrier shuttles containing antibodies recognizing alpha-synuclein
US10507241B2 (en) 2014-07-24 2019-12-17 Boehringer Ingelheim International Gmbh Biomarkers useful in the treatment of IL-23A related diseases
TWI781507B (zh) 2015-01-28 2022-10-21 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 抗甲狀腺素運送蛋白抗體
TWI769570B (zh) 2015-01-28 2022-07-01 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 抗甲狀腺素運送蛋白抗體
TWI718122B (zh) 2015-01-28 2021-02-11 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 抗甲狀腺素運送蛋白抗體
KR102554850B1 (ko) 2015-02-06 2023-07-13 더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐 최적화된 인간 응고 인자 viii 유전자 발현 카세트 및 그의 용도
EP3685856A1 (en) 2015-04-14 2020-07-29 Boehringer Ingelheim International GmbH Treatment of asthma with anti-il-23a antibodies
JP6936217B2 (ja) 2015-05-12 2021-09-15 シンティミューン,インコーポレイティド ヒト化型親和性成熟抗FcRn抗体
CA2998716A1 (en) 2015-09-16 2017-03-23 Prothena Biosciences Limited Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of giant cell arteritis, polymyalgia rheumatica or takayasu's arteritis
WO2017046774A2 (en) 2015-09-16 2017-03-23 Prothena Biosciences Limited Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of giant cell arteritis, polymyalgia rheumatica or takayasu's arteritis
TWI733695B (zh) 2015-09-18 2021-07-21 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 治療發炎性疾病之方法
WO2017070167A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for modified factor ix fusion proteins
WO2017149513A1 (en) 2016-03-03 2017-09-08 Prothena Biosciences Limited Anti-mcam antibodies and associated methods of use
WO2017153953A1 (en) 2016-03-09 2017-09-14 Prothena Biosciences Limited Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of granulomatous lung diseases
WO2017153955A1 (en) 2016-03-09 2017-09-14 Prothena Biosciences Limited Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of granulomatous lung diseases
EP4410997A2 (en) 2016-04-15 2024-08-07 Boehringer Ingelheim International GmbH Methods of treating inflammatory diseases
US10822417B2 (en) 2016-04-25 2020-11-03 Syntimmune, Inc. Humanized affinity matured anti-FcRn antibodies
WO2017191559A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Prothena Biosciences Limited Tau immunotherapy
CU24538B1 (es) 2016-05-02 2021-08-06 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos monoclonales que compiten por unirse a tau humano con el anticuerpo 16g7
CU24537B1 (es) 2016-05-02 2021-07-02 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos monoclonales que compiten por unirse a tau humano con el anticuerpo 3d6
WO2017208210A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Prothena Biosciences Limited Anti-mcam antibodies and associated methods of use
WO2018007922A2 (en) 2016-07-02 2018-01-11 Prothena Biosciences Limited Anti-transthyretin antibodies
JP7017013B2 (ja) 2016-07-02 2022-02-08 プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド 抗トランスサイレチン抗体
JP7016470B2 (ja) 2016-07-02 2022-02-07 プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド 抗トランスサイレチン抗体
JP6818134B2 (ja) 2016-09-29 2021-01-20 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft ポリペプチド産生細胞を選択するための改善された方法
EP3677597A1 (en) 2016-10-14 2020-07-08 Boehringer Ingelheim International GmbH Methods of treating diseases
JP2020512344A (ja) 2017-03-27 2020-04-23 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 抗il−36r抗体併用治療
IL270375B1 (en) 2017-05-02 2024-08-01 Prothena Biosciences Ltd Antibodies that recognize tau
US10793634B2 (en) 2017-06-09 2020-10-06 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-TrkB antibodies
AU2017434556A1 (en) 2017-09-28 2020-04-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Dosing regimes for treatment of synucleinopathies
CN111801424A (zh) 2018-01-10 2020-10-20 Agc生技制品公司 双向chef1载体
CN112004826B (zh) 2018-02-05 2024-06-14 自由大学基金会 反向激动性抗us28抗体
WO2019156566A1 (en) 2018-02-12 2019-08-15 Umc Utrecht Holding B.V. Bispecific molecules comprising gamma-delta tcr and t-cell or nk cell binding domain
WO2019226050A2 (en) 2018-05-24 2019-11-28 Wageningen Universiteit Novel viral anti-infective reagents
WO2019235923A1 (en) 2018-06-04 2019-12-12 Erasmus University Medical Center Rotterdam Role for low density lipoprotein receptor-related protein 10 in progressive brain diseases
AU2019291890A1 (en) 2018-06-29 2020-12-17 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-CD40 antibodies for use in treating autoimmune disease
CN110904127B (zh) 2018-09-18 2024-09-20 瓦赫宁恩研究基金会 非洲猪瘟病毒疫苗
WO2020080941A1 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Umc Utrecht Holding B.V. Anti- low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6 antibodies
CR20210272A (es) 2018-11-26 2021-07-14 Forty Seven Inc Anticuerpos humanizados contra c-kit
WO2020130838A2 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Qvq Holding B.V. Antibodies for preventing or treating candidiasis
CU20210073A7 (es) 2019-03-03 2022-04-07 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos que se unen dentro de la región de unión a microtúbulos de tau definida por cdrs
CA3132917A1 (en) 2019-03-08 2020-09-17 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-il-36r antibody formulations
KR20220019660A (ko) 2019-04-02 2022-02-17 이뮨튠 비.브이. 면역-자극성 조성물 및 이의 용도
EP3966239A1 (en) 2019-05-09 2022-03-16 Boehringer Ingelheim International GmbH Anti-sema3a antibodies and their uses for treating eye or ocular diseases
TW202115112A (zh) 2019-06-27 2021-04-16 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 抗-angpt2抗體
CN114423788A (zh) 2019-09-24 2022-04-29 勃林格殷格翰国际有限公司 抗nrp1a抗体及其用于治疗眼或眼部疾病的用途
BR112022023989A2 (pt) 2020-05-26 2023-02-07 Boehringer Ingelheim Int Anticorpos anti-pd-1
JP2023533458A (ja) 2020-06-24 2023-08-03 プロシーナ バイオサイエンシーズ リミテッド ソルチリンを認識する抗体
CN117062836A (zh) 2021-02-05 2023-11-14 勃林格殷格翰国际有限公司 抗il1rap抗体
CA3239286A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Cdr-Life Ag Anti-c3 antibodies and antigen-binding fragments thereof and their uses for treating eye or ocular diseases
CN114540352A (zh) * 2022-02-16 2022-05-27 艾瑞生命科学技术(常州)有限公司 一种多核苷酸、载体元件及表达载体和宿主细胞及应用
WO2024096735A1 (en) 2022-10-31 2024-05-10 Stichting Amsterdam UMC Single domain anti-cd169 antibodies
WO2024101989A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Stichting Amsterdam UMC Activation inducible antigen receptors for adoptive immunotherapy

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5266491A (en) * 1989-03-14 1993-11-30 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. DNA fragment and expression plasmid containing the DNA fragment
JP3051411B2 (ja) * 1989-03-14 2000-06-12 持田製薬株式会社 新規dnaならびにそれを含有する発現プラスミド
ES2151463T5 (es) * 1989-12-22 2012-10-29 Merck Serono Sa Constructos de ADN para la activación y la modificación de la expresión de genes endógenos
US5650294A (en) * 1990-06-25 1997-07-22 Basf Aktiengesellschaft Isolated promoter and terminator of elongation factor 1-α
AU664847B2 (en) * 1991-05-15 1995-12-07 Cell Genesys, Inc. Genomic modifications with homologous DNA targeting
CA2051085C (en) * 1991-09-10 2001-08-21 Shigekazu Nagata Expression plasmids
TW402639B (en) * 1992-12-03 2000-08-21 Transkaryotic Therapies Inc Protein production and protein delivery

Also Published As

Publication number Publication date
CZ296544B6 (cs) 2006-04-12
RU2004136574A (ru) 2006-05-27
EP0920498A1 (en) 1999-06-09
EP0920498B1 (en) 2006-03-01
WO1998049289A1 (en) 1998-11-05
ATE318900T1 (de) 2006-03-15
CN1230991A (zh) 1999-10-06
NO323853B1 (no) 2007-07-16
HUP0004137A3 (en) 2003-08-28
AU742561B2 (en) 2002-01-03
DE69833649D1 (de) 2006-04-27
JP2000513948A (ja) 2000-10-24
HK1022719A1 (en) 2000-08-18
PT920498E (pt) 2006-08-31
RU2249617C2 (ru) 2005-04-10
ES2263206T3 (es) 2006-12-01
DE69833649T2 (de) 2006-12-28
PL331005A1 (en) 1999-06-21
CZ28099A3 (cs) 2000-02-16
BR9804896A (pt) 1999-08-31
EP1676916A1 (en) 2006-07-05
AU7277098A (en) 1998-11-24
IL127897A (en) 2005-12-18
NO990025D0 (no) 1999-01-04
HU225764B1 (en) 2007-08-28
IL127897A0 (en) 1999-11-30
DK0920498T3 (da) 2006-07-10
PL195604B1 (pl) 2007-10-31
HUP0004137A2 (en) 2001-03-28
US5888809A (en) 1999-03-30
SK11899A3 (en) 2000-05-16
CN100430477C (zh) 2008-11-05
NO990025L (no) 1999-03-01
CN101570753A (zh) 2009-11-04
BR9804896B1 (pt) 2013-11-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK285664B6 (sk) Purifikovaná a izolovaná transkripčná regulačná DNA škrečacieho EF-1alfa, hostiteľské bunky, vektory, chimerické polynukleotidy a plazmidy
JP6577969B2 (ja) 部位特異的セリンリコンビナーゼ及びそれらの使用方法
JP4999293B2 (ja) 人工染色体、該染色体の使用および人工染色体の製造方法
CS267192A3 (en) Expression systems
US6482937B1 (en) Porcine Oct-4 promoter
CA2445011A1 (en) Transformed silkworm producing human collagen
CA2405768A1 (en) Self-extinguishing recombinases, nucleic acids encoding them and methods of using the same
JP2010522549A (ja) 目的のポリヌクレオチドの発現を増強するためのポリヌクレオチド
JP2006262875A (ja) 鳥類の卵管内でタンパク質を発現させるための遺伝子構築物、およびこれを用いたタンパク質の生産方法
US5759805A (en) CD69 transcriptional regulatory elements
WO1998046756A9 (en) Secreted protein ssp-1 compositions and therapeutic and diagnostic uses therefor
CA2259145C (en) Hamster ef-1.alpha. transcriptional regulatory dna
CA2203613C (en) Secreted .alpha.-amylase as a reporter gene
KR100607527B1 (ko) 인간이 아닌 형질전이된 동물로부터의 고 전사 복합체의 정제방법
EP0753579B1 (en) Novel promoter and method of gene expression using the same
EP0881288B1 (en) Purification of higher order transcription complexes from transgenic non-human animals
Gunaratne et al. An evolutionarily conserved palindrome in the Drosophila Gld promoter directs tissue-specific expression.
JPH05115283A (ja) プロテインホスフアターゼ阻害物質−1の遺伝子及びその発現
AU655815B2 (en) Gene expression cassette containing non-coding sequence of growth hormone gene
WO1998014218A1 (en) MAMMALS AND CELLS WITH A HOMOZYGOUS DISRUPTION IN THE RNase L GENE AND METHODS THEREFOR
Han Molecular cloning and functional testing of tissue-specific regulatory elements in human neutrophil elastase gene

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Assignment and transfer of rights

Owner name: CMC ICOS BIOLOGICS, INC., S.E. BOTHELL, WA, US

Free format text: FORMER OWNER: ICOS CORPORATION, S. E. BOTHELL, WA, US

Effective date: 20141010

MK4A Expiry of patent

Expiry date: 20180501