PL195604B1 - Oczyszczony i wyizolowany DNA, komórka gospodarza, wektor, chimeryczny polinukleotyd, plazmidy orazsposób zwiększania transkrypcji - Google Patents
Oczyszczony i wyizolowany DNA, komórka gospodarza, wektor, chimeryczny polinukleotyd, plazmidy orazsposób zwiększania transkrypcjiInfo
- Publication number
- PL195604B1 PL195604B1 PL98331005A PL33100598A PL195604B1 PL 195604 B1 PL195604 B1 PL 195604B1 PL 98331005 A PL98331005 A PL 98331005A PL 33100598 A PL33100598 A PL 33100598A PL 195604 B1 PL195604 B1 PL 195604B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- dna
- seq
- plasmid
- sequence
- fragment
- Prior art date
Links
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims abstract description 60
- 238000013518 transcription Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 230000035897 transcription Effects 0.000 title claims abstract description 41
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 title claims abstract description 30
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 195
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 129
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 91
- 101001009070 Homo sapiens HBS1-like protein Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 45
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 102100027377 HBS1-like protein Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 37
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 25
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 25
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 12
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 104
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 28
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 15
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 145
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 30
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 29
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 29
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 23
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 15
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 14
- 101100028920 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cfp gene Proteins 0.000 description 13
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 13
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 13
- 102000006433 Chemokine CCL22 Human genes 0.000 description 12
- 108010083701 Chemokine CCL22 Proteins 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 10
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 9
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 9
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 8
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 8
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 7
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 7
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 6
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 5
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 5
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 5
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 5
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 3
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101710151413 Chitinase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101710151415 Chitinase 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100037328 Chitotriosidase-1 Human genes 0.000 description 2
- 101710132290 Chitotriosidase-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 101710107327 Endochitinase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101710107425 Endochitinase 2 Proteins 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 2
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 108091029842 small nuclear ribonucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 101710126783 Acetyl-hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 102100036958 Cytosolic Fe-S cluster assembly factor NUBP1 Human genes 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 101100517598 Dictyostelium discoideum nubp2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100118093 Drosophila melanogaster eEF1alpha2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100039990 Hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 101000713083 Homo sapiens C-C motif chemokine 22 Proteins 0.000 description 1
- 101000598198 Homo sapiens Cytosolic Fe-S cluster assembly factor NUBP1 Proteins 0.000 description 1
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000617808 Homo sapiens Synphilin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000807961 Homo sapiens V-type proton ATPase subunit H Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 1
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 101100170590 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) DMA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100293632 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) NBP2 gene Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010053551 Sp1 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 102100021997 Synphilin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000006290 Transcription Factor TFIID Human genes 0.000 description 1
- 108010083268 Transcription Factor TFIID Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 102100030246 Transcription factor Sp1 Human genes 0.000 description 1
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 229920004482 WACKER® Polymers 0.000 description 1
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000280 densification Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 101150061866 hey2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000043802 human CCL22 Human genes 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- -1 rRNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- ZNJHFNUEQDVFCJ-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+].OCCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 ZNJHFNUEQDVFCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
1. Oczyszczony i wyizolowany DNA regulujacy transkrypcje EF-1a chomika wybrany z: a) DNA obejmujacego sekwencje nukleotydowa pokazana na Id. Sekw. nr 1, b) DNA obejmujacego czesc sekwencji kwasu nukleinowego pokazanej na Id. Sekw. nr 1, która jest zdolna do zapoczatkowywania transkrypcji genu polaczonego funkcjonalnie z regulatorowym DNA, c) DNA obejmujacego od okolo nukleotydu 2114 do okolo nukleotydu 3656 sekwencji polinu- kleotydowej pokazanej na Id. Sekw. nr 1, d) 11,7 kb DNA regulatorowej sekwencji EF-1a chomika w plazmidzie pDEF14 (Nr dostepu ATCC 98398), e) DNA obejmujacego w przyblizeniu 1,56 kb w kierunku 5' od poczatkowego kodonu ATG w Id. Sekw. nr 1, f) DNA obejmujacego sekwencje kwasu nukleinowego pokazana na Id. Sekw. nr 28, i g) sekwencji DNA hybrydyzujacej z DNA przedstawionym w Id. Sekw. nr 1 w warunkach, w któ- rych ostatnie plukanie przeprowadzane jest w 65°C w buforze zawierajacym okolo 2xSSC i okolo 0,1% SDS. PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest oczyszczony i wyizolowany DNA, komórka gospodarza, wektor, chimeryczny polinukleotyd, plazmidy oraz sposób zwiększania transkrypcji.
Transkrypcja dowolnego genu eukariotycznego prowadzona jest przez jeden z trzech enzymów, polimeraz RNA, z których każdy działa na określonym zestawie genów. Transkrypcja wielkich rybosomalnych RNA prowadzona jest przez polimerazę IRNA, a małe rybosomalne RNA i tRNA ulegają transkrypcji pod wpływem polimerazy III RNA natomiast transkrypcja sekwencji DNA kodujących białka i większość małych jądrowych RNA prowadzona jest przez polimerazy II RNA. Dla każdego rodzaju genu transkrypcja wymaga oddziaływania odpowiedniej polimerazy z sekwencjami promotorowymi genu i wytworzenia stabilnego kompleksu inicjującego transkrypcję. Ogólnie, transkrypcja z dowolnej z trzech polimeraz również wymaga oddziaływania pewnych czynników wiążących z sekwencją promotora i rozpoznania czynnika wiążącego przez drugi czynnik, który w ten sposób umożliwia oddziaływanie polimerazy z sekwencją genu. O ile mechanizm ten stanowi minimalny wymóg do transkrypcji z polimeraz RNA Ii III, proces prowadzący do transkrypcji z polimerazy RNA II jest bardziej złożony.
Prawdopodobnie z powodu znacznej ilości sekwencji genowych ulegających transkrypcji przez polimerazę RNA II oraz fakt, że wzorce regulacji dla tych genów są silnie zmienne w samej komórce oraz między komórkami, transkrypcja z udziałem polimerazy RNA II znajduje się pod wpływem wielu czynników transkrypcyjnych obecnych w kompleksie inicjującym, oprócz oddziaływania z innymi białkami wiążącymi się z regulatorowymi sekwencjami DNA innymi niż promotor. Te inne białka wiążące mogą służyć do równoczesnej aktywacji transkrypcji poza poziom podstawowy albo hamować transkrypcję. Wiązanie represorów można również rozpatrywać jako środek zapobiegający aktywacji transkrypacji w świetle przeprowadzonych obserwacji, które wskazują, że podstawowa transkrypcja u wyższych eukariontów jest zwykle bardzo niska. Z drugiej strony, aktywacja jest zwykle końcową reakcją na pewien sygnał fizjologiczny i wymaga usunięcia represorowych białek wiążących albo zmiany struktury chromatyny w celu umożliwienia wytworzenia aktywnego kompleksu inicjującego transkrypcję.
Ośrodkiem tworzenia kompleksu transkrypcyjnego oraz warunkiem koniecznym do podstawowej ekspresji genu, jest sekwencja promotora zwana sekwencją „TATA” (TATA box), która położona jest powyżej miejsca początku transkrypcji dla polimerazy RNA II. Sekwencja TATA jest miejscem wiązania rozpowszechnionego czynnika transkrypcyjnego określanego jako TFIID, ale jak wspomniano, transkrypcja z sekwencji promotora w większości genów znajduje się pod silnym wpływem dodatkowych regulatorowych sekwencji DNA, które mogą wzmocnić albo zahamować transkrypcję genu. Elementy DNA tego typu znajdują się w różnych położeniach względem sekwencji kodujących genu oraz względem sekwencji TATA. Te dodatkowe regulatorowe elementy transkrypcyjne często działają w sposób swoisty dla tkanki albo dla komórki.
Podczas ekspresji białek rekombinowanych szczególnie istotny jest dobór regulatorowego DNA, który obejmuje sekwencje promotora TATA i dodatkowe elementy regulatorowe, zgodne z mechanizmami transkrypcyjnymi komórki gospodarza. Z tego względu, korzystny jest endogenny regulatorowy DNA wybranej komórki gospodarza. Alternatywnie, znaczne powodzenie osiągnięto przy użyciu regulatorowych DNA pochodzących z sekwencji genomowych wirusów, w związku z szerokim zakresem gospodarzy dla wirusów oraz wykazanej aktywności wirusowych regulatorowych DNA w różnych rodzajach komórek. Dobrze znane i rutynowo stosowane wirusowe regulatorowe DNA do ekspresji białek rekombinowanych obejmują, przykładowo: promotor/wzmacniacz genu wczesnego SV40 (Dijkema i in., EMBO J 4:761 (1985)), DNA długich końcowych powtórzeń wirusa mięsaka Rousa (Gorman i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6777 (1982b)), fragmenty bydlęcego wirusa brodawczaków (Sarver i in., Mol. Cell. Biol. 1:486 (1981)) i elementy promotora/wzmacniacza ludzkiego wirusa cytomegalii (Boshart i in., Cell 41: 521 (1985)). Mimo, że wirusowe DNA działają w szerokim zakresie rodzajów komórek, być może istnieją niewirusowe elementy DNA promotora/wzmacniacza, które umożliwiają podwyższoną transkrypcję rekombinowanych białek w konkretnych liniach komórkowych, dzięki skuteczniejszemu zastosowaniu mechanizmów transkrypcyjnych komórki gospodarza.
Stąd, w stanie techniki istnieje potrzeba identyfikacji regulatorowych sekwencji DNA promotora/wzmacniacza, które działają w homologicznych i heterologicznych rodzajach komórek, w celu zwiększenia ekspresji białek rekombinowanych i zapewnienia wyższego uzysku pożądanego produktu białkowego. Szczególnie istotna jest konieczność identyfikacji takich regulatorowych DNA promotora/wzmacniacza, które można zastosować skuteczniej w komórkach ssaków w celu zwiększenia wyPL 195 604 B1 twarzania białek rekombinowanych in vitro, które są glikozylowane w sposób identyczny z wzorcem glikozylacji zachodzącym na skutek ekspresji białka in vivo. Białka wyrażane w ten sposób i podawane w celach terapeutycznych albo profilaktycznych będą prawdopodobnie mniej antygenowe i prawdopodobnie bardziej fizjologicznie czynne. Sekwencje regulatorowe DNA tego rodzaju można również wprowadzać do komórek gospodarza w celu zwiększenia ekspresji endogennych genów komórki gospodarza albo uprzednio wprowadzonych do genomu komórki gospodarza znanymi i rutynowo praktykowanymi technikami.
Wynalazek dotyczy oczyszczonego i wyizolowanego DNA regulującego transkrypcję EF-1a chomika wybranego z:
a) DNA obejmującego sekwencję nukleotydową pokazaną na Id. Sekw. nr 1,
b) DNA obejmującego część sekwencji kwasu nukleinowego pokazanej na Id. Sekw. nr 1, która jest zdolna do zapoczątkowywania transkrypcji genu połączonego funkcjonalnie z regulatorowym DNA,
c) DNA obejmującego od około nukleotydu 2114 do około nukleotydu 3656 sekwencji polinukleotydowej pokazanej na Id. Sekw. nr 1,
d) 11,7 kb DNA regulatorowej sekwencji EF-1a chomika w plazmidzie pDEF14 (Nr dostępu ATCC 98398),
e) DNA obejmującego w przybliżeniu 1,56 kb w kierunku 5' od początkowego kodonu ATG w Id. Sekw. nr 1,
f) DNA obejmującego sekwencję kwasu nukleinowego pokazaną na Id. Sekw. nr 28, i
g) sekwencji DNA hybrydyzującej z DNA przedstawionym w Id. Sekw. nr 1 w warunkach, w których ostatnie płukanie przeprowadzane jest w 65°C w buforze zawierającym około 2xSSC i około 0,1% SDS.
W korzystnym wykonaniu wynalazku DNA obejmuje sekwencję nukleotydową pokazaną na Id. Sekw. nr 1.
W innym korzystnym wykonaniu wynalazku regulatorowy DNA obejmuje część sekwencji kwasu nukleinowego pokazanej na Id. Sekw. nr 1, która jest zdolna do zapoczątkowywania transkrypcji genu połączonego funkcjonalnie z regulatorowym DNA, a korzystnie obejmuje od około nukleotydu 2114 do około nukleotydu 3656 sekwencji polinukleotydowej pokazanej jako Id. Sekw. nr 1.
Ponadto wynalazek dotyczy komórki gospodarza obejmującej DNA według wynalazku, który nie jest połączony funkcjonalnie z sekwencjami kodującymi EF-1a.
W zakres wynalazku wchodzi też wektor obejmujący DNA według wynalazku, który nie jest połączony funkcjonalnie z sekwencjami kodującymi EF-1a.
Wynalazek dotyczy także komórki gospodarza transformowanej albo transfekowanej wektorem według wynalazku.
Ponadto w zakres wynalazku wchodzi chimeryczny polinukleotyd obejmujący regulatorowy DNA EF-1a chomika według wynalazku, połączony funkcjonalnie z sekwencją DNA kodującą białko, inne niż EF-1a chomika, przy czym korzystnie regulatorowy DNA obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego pokazaną na Id. Sekw. nr 1, korzystniej obejmuje część sekwencji kwasu nukleinowego pokazanej na Id. Sekw. nr 1, która jest zdolna do zapoczątkowania transkrypcji genu połączonego funkcjonalnie z regulatorowym DNA, jeszcze korzystniej obejmuje od około nukleotydu 2114 do około nukleotydu 3656 sekwencji polinukleotydowej pokazanej jako Id. Sekw. nr 1.
W korzystnym wykonaniu wynalazku chimerycznego polinukleotydu według wynalazku, sekwencja DNA kodująca białko koduje białko endogenne dla komórki chomika inne niż EF-1a, albo białko heterologiczne dla komórki chomika.
W zakres wynalazku wchodzi komórka gospodarza transformowana albo transfekowana chimerycznym polinukleotydem według wynalazku.
W zakres wynalazku wchodzi również plazmid ekspresyjny obejmujący chimeryczny polinukleotyd według wynalazku, a korzystnie obejmuje ponadto sekwencję kwasu nukleinowego podaną w Id. Sekw. nr 28, korzystniej sekwencję kwasu nukleinowego przedstawioną w Id. Sekw. nr 28, która położona jest w kierunku 3' względem chimerycznego polinukleotydu.
Wynalazek również obejmuje komórkę gospodarza transformowaną albo transfekowaną plazmidem ekspresyjnym według wynalazku.
W zakres wynalazku wchodzi również plazmid pDEF2 (Nr. dostępu ATCC 98343), plazmid pDEF14 (Nr. dostępu ATCC.98398), plazmid pDEF1./ICM3H.2 (Nr. dostępu ATCC.98381), plazmid pNEF1/ICM3L.3 (Nr. dostępu ATCC.98382), plazmid pDEF1/F2GH.1 (Nr. dostępu ATCC.98383), plazmid pNEF1/F2GL.1 (Nr. dostępu ATCC.98384), plazmid pDEF1/CTN.1 (Nr. dostępu
PL 195 604 B1
ATCC.98385), plazmid pDEF2/HPH.4 (Nr. dostępu ATCC.98386) oraz plazmid pDEF10/MDC.1 (Nr. dostępu ATCC.98387).
Wynalazek dotyczy również komórki gospodarza transformowanej albo transfekowanej plazmidem ekspresyjnym według wynalazku.
Ponadto wynalazek dotyczy sposobu zwiększania transkrypcji genu będącego przedmiotem zainteresowania w komórce gospodarza, który obejmuje etap integrowania DNA obejmującego regulatorowy DNA EF-1a chomika według wynalazku do genomowego DNA komórki gospodarza w pozycji połączonej funkcjonalnie z interesującym genem, przy czym korzystnie integrowany DNA ponadto obejmuje sekwencję docelową, a komórką gospodarza korzystnie jest komórka jajnika chomika chińskiego, i wówczas korzystnie interesujący gen jest endogenny dla komórki jajnika chomika chińskiego, albo jest heterologiczny dla komórki jajnika chomika chińskiego i jest stabilnie zintegrowany z genomowym DNA komórki jajnika chomika chińskiego.
Oczyszczone i wyizolowane polinukleotydy pochodzące z komórek chomika, które regulują transkrypcję genu, obejmują sekwencje regulatorowe DNA 5' do regionów ulegających translacji genu EF-1a komórek jajnika chomika chińskiego. Taki korzystny DNA został oznaczony jako regulatorowy DNA CHEF1 i obejmuje około 3,7 kb DNA ciągnący się od miejsca restrykcyjnego Spel do kodonu początkowej metioniny (ATG) białka EF-1a. Polinukleotydy poniżej 3,7 kb są również istotne, o ile mniejsze fragmenty polinukleotydowe są zdolne do zwiększenia transkrypcji połączonego z nim funkcjonalnie genu. Fragmenty czynne DNA określone są zdolnością do regulowania (tj. zwiększania) transkrypcji genu i można je łatwo zidentyfikować przez badania delecyjne, które są znane i rutynowo praktykowane w tej dziedzinie techniki. Takie regulatorowe DNA obejmują polinukleotydy wyizolowane ze źródeł naturalnych, takich jak komórki hodowane, jak również polinukleotydy wytworzone przez syntezę enzymatyczną albo całkowicie chemiczną. Tak więc, korzystając z wynalazku możliwe jest wyizolowanie DNA CHEF1 z biblioteki genomowej. Alternatywnie, DNA można skonstruować przez syntezę enzymatyczną, wykorzystując, przykładowo, reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), albo przez syntezę całkowicie chemiczną, w której kolejno dodaje się poszczególne nukleotydy albo nakładające się nukleotydy hybrydyzuje i poddaje ligacji. Korzystna sekwencja DNA podana jest w Id. Sekw. nr 1. Wynalazek obejmuje też sekwencje DNA, które hybrydyzują w surowych warunkach z DNA podanym na Id. Sekw. nr 1. Surowe warunki obejmują płukanie w około 65°C w buforze zawierającym około 2XSSC i około 0,1% SDS albo równoważne warunki.
Plazmidowe DNA według wynalazku zawierają polinukleotydy regulatorowe CHEF1. Plazmidy takie mogą obejmować sekwencje DNA kodujące interesujące białko albo interesujący produkt RNA połączony funkcjonalnie z sekwencją polinukleotydu CHEF1. Stosując transfekcję albo elektroporację z opisanymi polinukleotydami albo plazmidami można uzyskać komórkę gospodarza, która również wchodzi w zakres wynalazku. Plazmidowy DNA poddaje się integracji z genomem komórki gospodarza albo może on istnieć w komórce w postaci zamkniętego kolistego plazmidu. Plazmidy szczególnie przydatne do wprowadzania pożądanych sekwencji DNA to opisane plazmidy pDEF14 i pDEF2. Komórki gospodarza bakteryjnego transformowane pDEF14 i pDEF2 zdeponowano, odpowiednio, 9 kwietnia, 1997 i 4 marca, 1997 w American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA i nadano im numery, odpowiednio, 98398 i 98343.
Liniowe wektory DNA według wynalazku obejmujące polinukleotyd CHEF1 otrzymuje się ze źródeł wirusowych albo można je syntetyzować in vitro. DNA tego rodzaju jest szczególnie przydatny do ekspresji sekwencji genów heterologicznych połączonych funkcjonalnie z sekwencjami DNA CHEF1, albo do ukierunkowanej homologicznej rekombinacji, w której sekwencje CHEF1 można wprowadzić do genomu komórki gospodarza w celu modulowania ekspresji sekwencji połączonych funkcjonalnie.
W chimerycznych rekombinowanych cząsteczkach DNA według wynalazku, DNA CHEF1 jest połączony funkcjonalnie z (tj. zapoczątkowuje transkrypcję) sekwencją genu kodującego pożądany produkt białkowy. Chimeryczne cząsteczki są takimi cząsteczkami, które zawierają domeny nie spotykane normalnie w połączeniu w środowisku naturalnym. Przykładowo, chimeryczny DNA może obejmować część albo całość regulatorowego DNA CHEF1 w połączeniu z sekwencją DNA inną niż gen kodujący białko EF-1a chomika. Produkty białkowe kodowane przez cząsteczki chimeryczne obejmują białka aktywne fizjologicznie, części albo podjednostki aktywnych białek, jak również białka znacznikowe albo reporterowe. Sekwencja polinukleotydowa kodująca produkt białkowy może pochodzić z komplementarnego DNA (cDNA), genomowego DNA, syntetycznego DNA, albo DNA wybranego z kombinacji cząsteczek tego rodzaju. Produkty białkowe mogą być endogenne (tj. normalnie spotyPL 195 604 B1 kane w genomie CHO, bez wprowadzania DNA przez transformację, transfekcję itp.) dla komórek jajnika chomika chińskiego (CHO). Oprócz tego produkt białkowy może być kodowany przez źródła egzogenne, przy czym jest to źródło inne niż genom komórki CHO, w tym, przykładowo, syntetyczny DNA. Przykładowe cząsteczki chimeryczne według wynalazku obejmują DNA CHEF1, które są połączone funkcjonalnie z DNA kodującym: (i) łańcuch ciężki przeciwciała ICM3 przeciwko ICAM-3, (ii) łańcuch lekki ICM3, (iii) łańcuch ciężki przeciwciała hu23F2G, przeciwko CD11/CD18, (iv) łańcuch lekki hu23F2G, (v) chitynazę, (vi) hydrolazę acetylową-czynnik aktywujący płytki (PAF-AH) i (vii) chemokinę pochodzącą z makrofagów (MDC). Komórki gospodarza bakteryjnego transformowane plazmidowym DNA obejmującym cząsteczki chimeryczne zdeponowano 1 kwietnia, 1997, w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA pod numerami dostępu, odpowiednio, (i) 98381, (ii) 98382, (iii) 98383, (iv) 98384, (v) 98385, (vi) 98386 i (vii) 98387.
Komórkami gospodarza, które mogą być transformowane albo transfekowane opisanym DNA CHEF1 według wynalazku są komórki pochodzące z chomików chińskich (Cricetalus griseus), w których regulatorowy DNA CHEF1 zapewnia wysoki poziom ekspresji białka. Możliwe jest również wykorzystanie innych rodzajów komórek pochodzących z alternatywnych gatunków, przykładowo, chomika armeńskiego (Cricetalus migratoris) albo syryjskiego (złotego, Mesocricetus auratus), jak również inne rodzaje komórek pochodzące ze zwierząt innych gatunków. Komórki można otrzymać z płuc, jajnika, otrzewnej, mięśni, trzustki, nerki, czerniaka albo źródeł somatycznych, jak również z całych zarodków albo płodów. Komórki gospodarza wymienione powyżej, jak również inne rodzaje, przykładowo, linie komórkowe szpiczaka, w których, jak się oczekuje, sekwencje regulatorowe DNA CHEF1 zapewnią wysoki poziom transkrypcji, można otrzymać z American Type Culture Collection, albo hodować bezpośrednio ze źródeł zwierzęcych.
Cząsteczki rekombinowane, które obejmują regulatorowe DNA CHEF1 zapewnią zwiększony poziom ekspresji funkcjonalnie połączonych heterologicznych polinukleotydów mRNA (tj. normalnie nie występujących w genomie gospodarza, bez wprowadzenia ich przez transfekcję, transformację itp.). Zależnie od natury polinukleotydu połączonego z sekwencją polinukleotydową CHEF1, zwiększona transkrypcja powinna doprowadzić do podwyższonego poziomu polipeptydów albo zwiększonego poziomu różnych rodzajów RNA w takich warunkach, w których połączony polinukleotyd koduje, przykładowo tRNA, rRNA, małe jądrowe RNA itp. Rodzaje RNA mogą obejmować również antysensowny RNA komplementarny do mRNA ulegający transkrypcji z sekwencji endogennej albo egzogennej. Zwiększona translacja polipeptydu powinna zależeć od obecności odpowiedniego sygnału translacji obecnego w mRNA.
DNA CHEF1 wprowadza siędo konkretnych miejsc w genomowym DNA komórek gospodarza w celu zwiększenia poziomu transkrypcji sekwencji genów endogennych. Rekombinacja homologiczna może być wykorzystana do wprowadzenia całości albo części DNA CHEF1. W komórkach gospodarza zmodyfikowanych w ten sposób, DNA CHEF1 połączony jest funkcjonalnie z kodującymi sekwencjami DNA. Patrz, przykładowo, międzynarodowa publikacja PCT WO 94/12650, międzynarodowa publikacja PCT WO 92/20808 i międzynarodowa publikacja PCT WO 91/09955. Komórki gospodarza, w których egzogenny DNA wprowadzono w sąsiedztwie i w funkcjonalnym położeniu względem DNA CHEF1 obecnego w genomie obejmują komórki CHO a wprowadzone sekwencje albo zastępują DNA kodujący EF-1a albo są wprowadzone pomiędzy regulatorowy DNA CHEF1 i DNA kodujący EF1a. Wykorzystane mogą być również komórki gospodarza inne niż komórki CHO, w których DNA CHF1 został uprzednio wprowadzony do genomu, zaś dodatkowy DNA został wprowadzony później w położeniu połączonym funkcjonalnie.
Sposób zwiększania transkrypcji pożądanego genu według wynalazku, które obejmuje etap wprowadzania do komórki gospodarza polinukleotydu obejmującego sekwencję regulatorową EF-1a chomika, w wyniku czego sekwencja regulatorowa integruje do genomowego DNA gospodarza w położeniu połączonym funkcjonalnie względem pożądanego genu sposób według wynalazku pozwala na zwiększanie transkrypcji genów endogennych dla komórek CHO, jak również zwiększanie transkrypcji genów egzogennych dla komórek CHO.
Cząsteczki rekombinowane według wynalazku można zastosować do wytwarzania zwierząt transgenicznych, w których chimeryczny rekombinowany DNA obejmujący DNA CHEF1 połączony funkcjonalnie z interesującą sekwencją DNA wprowadza się do komórek rozwijającego się zarodka albo komórek somatycznych zwierzęcia. Chimeryczne rekombinowane cząsteczki można wprowadzać, przykładowo, przez mikroiniekcję, a gdy wprowadzi się je do komórek zarodkowych wszystkie komórki powstałego zwierzęcia mogą zawierać rekombinowany DNA. Ewentualnie, chimeryczny re6
PL 195 604 B1 kombinowany DNA według wynalazku można wprowadzać do komórek płodu, i wówczas wiele z komórek powstającego zwierzęcia może zawierać taki rekombinowany DNA.
DNA CHEF1 jest również przydatny do identyfikacji blisko spokrewnionych regulatorowych sekwencji DNA, które mogą wpływać na ekspresję genu silniej albo słabiej niż to umożliwia CHEF1. Podobnie, znajomość sekwencji DNA CHEF1 umożliwia konstruowanie syntetycznych DNA, syntezą de novo albo przez pojedyncze albo liczne modyfikacje sekwencji CHEF1, przy czym powstające syntetyczne DNA mają sekwencje przypominające CHEF1 ale są zdolne do wywoływania wyższych poziomów transkrypcji genu.
Wynalazek zilustrowany jest poniższymi Przykładami. W przykładzie 1 opisano klonowanie genu EF-1a chomika i towarzyszącego regulatorowego DNA CHEF1. Przykład 2 dotyczy klonowania i analizy sekwencji regulatorowej CHEF1. W przykładzie 3 przedstawiono charakterystykę polinukleotydu promotorowego CHEF1, zaś w przykładzie 4 opisano w jaki sposób konstruowano różne wektory ekspresyjne zawierające DNA CHEF1. W przykładzie 5 opisano testy transfekcji wykorzystane do określenia wydajności regulatorowego DNA CHEF1. W przykładzie 6 szczegółowo opisano porównanie poziomów ekspresji białka rekombinowanego uzyskanych przy użyciu regulatorowego DNA CHEF1 i promotora wirusa cytomegalii (CMV). W przykładzie 7 badano różnice w zdolności regulacyjnej DNA CHEF1 o różnych długościach.
Przykład 1
Klonowanie CHEF1
Bibliotekę genomowego DNA komórek jajnika chomika chińskiego (CHO-K1) (Stratagene, La Jolla, CA) badano przesiewowo przy użyciu cDNA ludzkiego EF-1a w celu wyizolowania chomiczego homologa ludzkiego genu EF-1a.
®
Bibliotekę CHO-K1częściowe trawienie SauSA w wektorze klonującym Lambda FIX®II otrzymano ze Stratagene (La Jolla, CA) w komórkach XL-1-Blue MRAi XL1-Blue MRA (P2). Komórki gospodarza przygotowano według instrukcji producenta z następującymi modyfikacjami.
Komórki z puli przechowywanej w glicerolu pobrano na płytki LB bez antybiotyku. Pojedyncze kolonie wyselekcjonowano do zaszczepienia płynnej pożywki LB i hodowano do późnej fazy wzrostu wykładniczego i OD600 rzędu około 0,9. W tym momencie komórki przechowywano według instrukcji producenta albo zastosowano natychmiast jak to opisano niżej.
Podczas przygotowania hodowli do wysiania, pojedyncze kolonie pobrane z płytek wytworzonych w opisany wyżej sposób zastosowano do zaszczepienia i hodowano komórki w 50 ml pożywki LB z dodatkiem 0,5 ml 1M MgSO4 i 1ml 10% maltozy w wodzie dejonizowanej. Po całonocnym wzroście w 30°C, komórki zebrano przez odwirowanie na wirówce stołowej (2000 obrotów na minutę przez 5 minut w temperaturze pokojowej) i zawieszono w 10 mM MgSO4 w OD600 równej 0,5.
Faga lambda dostarczonego przez producenta, rozcieńczono w buforze SM (przygotowanym jako 1 litr roztworu wyjściowego zawierającego 5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO<H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl, pH
7,5 i 5 ml 2% żelatyny (wag./obj.)) w zakresie od 10- do 105-krotnie i 2 ml każdego z rozcieńczeń dodano do 400 mlkomórek gospodarza w 10 mM MgSO4 (OD600=0,5). Powstałą mieszaninę inkubowano przez 15 minut w 37°C w celu umożliwienia fagom związanie się z komórkami, dodano górnego agaru (0,75% agarozy LBM w temperaturze 48°C) i każdą z mieszanin wysiano w powtórzeniu na płytki z agarozą LBM. Wyniki wskazywały na miano 3x106 jednostek tworzących łysinki (pfu)/ml roztworu faga.
Świeże komórki gospodarza przygotowano w opisany wyżej sposób w celu przeszukiwania biblioteki. Około 50000 pfu faga dodano do 600 ml komórek gospodarza (OD600=0,5) w 6,5 ml 0,75% agarozy LBM w temperaturze 48°C. Mieszaninę rozprowadzono na płytkach agarozowych, które następnie inkubowano przez około 8 godzin w 37°C. Następnie, płytki schłodzono przez 5 godzin w 4°C w celu zapobieżenia przyleganiu górnej agarozy do nakładek z nitrocelulozy. Membrany, BA-85, średnicaporów 0,45 mm (S+S, Keene, NH) umieszczono na powierzchni płytek i prowadzono przeniesienie przez dwie minuty. Membrany pobrano z płytek i przeniesiony DNA denaturowano w 1,5 M NaCl/0,5 M NaOH/1,0 Tris-HCl (pH 8,0), osuszano na papierze Whatman-3MM i zapiekano pod próżnią w 80°C przez 1,5-2 godziny.
Sekwencję cDNA ludzkiego genu EF-1 a (Uetsuki i in., J. Biol. Chem. 264: 5791-5798 (1989)), która jak wcześniej wykazano jest w 95% identyczna z regionem kodującym EF-1 a CHO (Hayashi i in., J. Biochem. 1 06: 560-563 (1989)) zastosowano jako sondę do przeszukiwania biblioteki i przygotowano jak opisano niżej. Sonda ludzkiego EF-1a wielkości 1,4 kb pochodziła z plazmidu M0107, wektora pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA) zawierającego cDNA ludzkiego EF-1 a wprowadzony
PL 195 604 B1 w miejsce EcoRI. W celu potwierdzenia, że plazmid M0107 zawiera oczekiwany ludzki cDNA, wstawkę cDNA sekwencjonowano starterami 5' i 3'.
94-17 AGGCACAGTCGAGGCTGATC (Id. Sekw. nr 2)
94-18 TTCCAGGGTCAAGGAAGGCA (Id. Sekw. nr 3)
Pierwsze 263 bp wstawki wykazywały 90% identyczności z opublikowaną sekwencją kodującą ludzkiego EF-1a i, o ile sekwencję końca 3' trudno było określić dokładnie, można było dopasować niewielkie ciągi oczekiwanej sekwencji. Podsumowując, przyrównania te wskazywały, że plazmid kodował pożądaną sekwencję.
Całą ludzką wstawkę pobrano z plazmidu przez trawienie EcoRI i oczyszczono dwukrotnie z żelu prążek zawierający DNA o wielkości 1,4 kb przy użyciu zestawu do ekstrakcji DNA QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit według instrukcji producenta. DNA eluowano w 50 mlTE, powstały roztwór zatę32 żano do 25 ml w Microcon-10 (Amicon, Beverly, MA) i znakowano porcje przy użyciu 32P-a-dTTP 32 i 32P- a-dCTP stosując zestaw do losowego znakowania DNA Random Primed DNA Labelling Kit, Boehringer Mannheim według instrukcji producenta. Znakowaną sondę oczyszczano stosując kolumnę do wirowania G50 w celu usunięcia niewłączonych nukleotydów, zaś porównanie aktywności oczyszczonej sondy z aktywnością porcji z przed wirowania wykazało 46% wbudowywanie znacznika 5 radioaktywnego o aktywności 5x105 cpm/min/ml.
Membrany nitrocelulozowe wytworzone jak opisano wyżej sondowano w następujący sposób. Przygotowano roztwór prehybrydyzacyjny/hybrydyzacyjny, który obejmował 22,5 ml 20XSSC, 30,0 ml 50X roztwór Denhardta, 3,0 ml 1 M buforu fosforanowego (pH 6,8) (69 ml 1 M NaH2PO4, 31 ml 1 M Na2HPO4), 0,75 ml 20% SDS i 78,75 ml dH2O. Do prehybrydyzacji, 1,4 ml w stężeniu 10 mg/ml DNA spermy łososia (Stratagene) gotowano przez 5 minut w 0,6 ml H2O, a następnie dodano 7 ml dH2O i 72 ml roztworu bufora. Filtry inkubowano w 65°C przez minimum 2 godziny w buforze prehybrydyzacyjnym.
Do hybrydyzacji połączono 30 ml sondy, 200 ml 10 mg/ml DNA spermy łososia i 770 ml dH2O, gotowano przez 5 minut i dodano 36 ml roztworu bufora z 3 ml dH2O. Roztwór prehybrydyzacyjny pobrano z filtrów, dodano roztworu hybrydyzacyjnego i inkubowano filtry w 65°C przez noc. Po hybrydyzacji, filtry płukano przez trzy godziny w 65°C z trzema zmianami bufora zawierającego 2XSSC i 0,1% SDS, a następnie poddano autoradiografii przez 48 godzin.
Zidentyfikowano 47 kolonii pozytywnych, które pobrano do 1 ml bufora SM zawierającego 20 ml chloroformu. W celu wykluczenia ewentualnych pseudogenów, pozbawionych jednego albo więcej intronów, zaprojektowano pary starterów flankujące po dwa introny: startery 95-136 (Id. Sekw. nr 4) i 95-137 (Id. Sekw. nr 5) obejmujące introny 2 i 3; startery 95-138 (Id. Sekw. nr 6) i 95-139 (Id. Sekw. nr 7) obejmujące introny 3 i 4; startery 95-140 (Id. Sekw. nr 8)i 95-141 (Id. Sekw. nr9) obejmujące introny 4 i 5 oraz startery 95-142 (Id. Sekw. nr 10) i 95-143 (Id. Sekw. nr 11) obejmujące introny 6 i 7.
95-136 (Id. Sekw. nr 4) GCCACCTGAT CTACAAATGT CCTCAAATTC CATTGATGCC TGACAACATG AACACCAGTC CAATGGAAGC TCTGCCTCAT
Przewidywana wielkość produktów PCR z użyciem matrycy CHO EF-1a oparta była na wielkości i położeniu intronów w opublikowanej sekwencji ludzkiego EF-1a. Każda reakcja PCR obejmowała 2 m l faga, 2,5 m l każdego ze starterów odpowiedniej pary (100 m g/ml), 2 ml 2mM mieszaniny dNTP,
2,5 ml 10X bufora PCR (Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ), 1,5 ml 2,5 mM MgCl2, 0,125 ml polimerazy Taq (5 jedn./ml) (Perkin-Elmer) i 11,8 ml H2O. Amplifikację przeprowadzono przez 4 minuty w 94°C, a następnie 30 cykli po 1 minutę w 90°C, 2 minuty w 50°C, i 4 minuty w 72°C. Produkty amplifikacji rozdzielono na 1,2% żelach agarozowych w 1XTAE. Trzy spośród 47 pozytywnych łysinek kodowało prawdziwe geny (#2, 7i 40) zawierające wszystkie introny i te trzy próbki poddano kolejnemu badaniu w następujący sposób. Przygotowano wysiane hodowle w opisany wyżej sposób przy użyciu od 10- do 105-krotnych roztworów wytworzonych z każdej z trzech pozytywnych łysinek. 20 do 50 wyizolowanych łysinek z każdej partii przeszukiwano przy użyciu PCR z następującymi wynikami. Klon #2 dał dwa klony pozytywne (oznaczone 2.12 i 2.17) spośród 20 przeszukanych, klon #7 dał jeden (oznaczony 7.44) spośród 50 przeszukanych, zaś klon 340 dał 1 pozytywny (oznaczony 40.24) spośród 40 przeszukanych. Fagowy DNA wyizolowano z każdej z 4 próbek w następujący sposób.
95-137 (Id. 95-138 (Id. 95-140 (Id. 95-141 (Id. 95-142 (Id. 95-143 (Id.
Sekw.
Sekw.
Sekw.
Sekw.
Sekw.
Sekw.
nr5) nr6) nr8) nr9)
GAGATACCAG ATGTGACCAT GTTGGAATGG CAGGTTTTAA nr 10) AATGACCCAC nr 11) ACAGCAACTG
PL 195 604 B1
Komórki XL-1-Blue MRA (P2) wysiano na płytki z agarozy LB i hodowano przez noc w 37°C. Selekcjonowano pojedynczą kolonię w celu zakażenia 50 ml pożywki LB (zawierającej 0,2% maltozę i 10 mM MgSO4) i hodowano przez noc w 30°C. Komórki zebrano przez wirowanie i przez 5 minut przy 2000 obrotów na minutę na wirówce stołowej i zawieszono komórki w 50 ml 10 mM MgSO4. Zawieszone komórki gospodarza (50 ml) zmieszano z 100 ml roztworu poszczególnych fagów pozytywnych i inkubowano przez 15 minut w 37°C w celu umożliwienia fagom połączenie się z komórkami. Dodano około 500 ml pożywki LB i wytrząsano mieszaninę przez 2 godziny w 37°C. Dodano dodatkowe 200 ml komórek gospodarza i prowadzono inkubację przez dodatkowe 15 minut w 37°C. Dodano górny agar (8 ml 0,75% agarozy LBM w temperaturze 48°C) po czym mieszaninę wylano i hodowano na płytkach prze noc w 37°C.
Po hodowli przez noc, do każdej płytki dodano 12 ml rozcieńczalnika lambda (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgSO4) i wytrząsano płytki delikatnie przez 2 godziny. Rozcieńczalnik usunięto i odwirowano przez 10 minut, przy 4000 x g w wirówce stołowej. Do nadsączu dodano po 1 m 1 mg/ml RNAzy A i 1 mg/ml DNAzy Ii prowadzono inkubację przez 15 minut w 37°C. Dodano równą objętość buforu do precypitacji (20% PEG 8000, 2 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgSO4), a następnie inkubowano na lodzie przez godzinę, po czym mieszaninę odwirowano przy 8000 x g przez 20 minut, nadsącz usunięto i wysuszono osad na powietrzu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Osad rozpuszczono w 500 ml TE, krótko odwirowano w celu usunięcia cząstek stałych i przeniesiono nadsącz do czystej probówki 1,65 ml. Dodano około 2,5 ml20% SDS (inkubowano przez 5 minut w 65°C), a następnie dodano 2,5 ml 10 mg/ml proteinazy K (i inkubowano przez godzinę w 65°C) i 10 ml 5M NaCl. Mieszaninę ekstrahowano równą objętością mieszaniny fenol : chloroform i raz równą objętością chloroformu. Następnie dodano równą objętość izopropanolu, a następnie inkubowano w -70°C przez 3 godziny, po czym mieszaninę odwirowano przez 15 minut na najwyższej prędkości w wirówce stołowej. Powstały osad płukano 70% etanolem, suszono na powietrzu i zawieszono w 100 mlTE.
Przykład 2
Klonowanie sekwencji regulatorowej EF-1a
W celu określenia wielkości wstawki DNA EF-1a, fagowy DNA wytworzony jak to opisano w Przykładzie 1 trawiono Notl powstałe fragmenty restrykcyjne rozdzielano na 0,6% żelu agarozowym w 1XTAE. Klony 2.12 i 2.17 wykazywały identyczny wzorzec trawienia z prążkami 11 kb i 4,5 kb oprócz oczekiwanych fragmentów faga lambda 19 kb i 10 kb. Klony 7.44 i 40.24 również wykazywały identyczne wzorce trawienia z prążkami wstawki 12 kb i 7 kb, co wraz z informacją pochodzącą z trawienia klonów 2.12 i 2.17 wskazywało na obecność miejsca Notl w DNA EF-1a. Fragmenty wstawki z klonów 2.12 i 7.44 klonowano w następujący sposób.
Fagowy DNA (60 ml) wytworzony jak to opisano w Przykładzie 1 trawiono Notl, po czym trawiony DNA precypitowano przez dodanie 20 ml 3 M octanu sodu i 400 ml 100% etanolu. Precypitowany DNA zebrano przez odwirowanie, płukano w 200 ml70% etanolu, suszono na powietrzu i zawieszano w 20 m lTE i podgrzewano do 65°C przez 10 minut, przed dodaniem 2 m l buforu do elektroforezy. DNA rozdzielano stosując elektroforezę na żelu agarozowym i wycięto z agarozy prążki 4,5 kb, 7 kb, 11 kb i 12 kb. Z każdego skrawka agarozy ekstrahowano DNA stosując zestaw do ekstrakcji DNA QIAquick według instrukcji producenta. Czystość prążków i stężenie oceniono przez rozdzielenie porcji 5 ml każdego z izolowanych fragmentów na 0,6% żelu agarozowym w 1XTAE.
Poszczególne fragmenty poddano ligacji z pBluescript SW+ trawionym Notl. W przypadku ligacji fragmentów 11 kb i 12 kb, linearyzowany wektor traktowano fosfatazą alkaliczną przed wprowadzeniem wstawki. 2 ml każdej z mieszanin ligacyjnych zastosowano do elektroporacji 40 ml elektrokompetentnych komórek XL-1-Blue. Transformowane komórki wysiano na płytki agarozową LBM z karbenicyliną i 40 ml 5% X-gal w dimetyloformamidzie (DMF) i 20 ml 0,1 MIPTG na płytkę. Komórki inkubowano przez noc w 37°C, po czym rano przeniesiono płytki do 4°C w celu zwiększenia intensywności niebieskiego zabarwienia.
We wtórnym badaniu, białe kolonie rozprowadzono po płytkach LBM z karbenicyliną zawierających X-gal i IPTG, jak to opisano wyżej, i kolonie które pozostały białe następnego dnia hodowano w 3 ml LBM z karbenicyliną przez noc w 37°C. Plazmidowy DNA z białych kolonii hodowanych przez noc wyizolowano stosując zestaw do izolacji DNA Wizard Plus Minipreps DNA Purification System (Promega, Madison, WI) według instrukcji producenta.
Analiza restrykcyjna wyizolowanych plazmidowych DNA wskazywała, że fragmenty 4,5 kb, 7 kb i 12 kb pomyślnie poddane zostały ligacji do wektora pBluescript SW+ i oznaczono je, odpowiednio, pSK/EF1.4.5, pSK/EF1.7 i pSK/EF1.12.
PL 195 604 B1
Każdy z plazmidów wyizolowano stosując zestaw QIAGEN według instrukcji producenta. PCR przeprowadzono na każdym z nowych wektorów, miareczkując matrycowy DNA i stosując startery dla regionu kodującego (Id. Sekw. nr od 4 do 11, zastosowane w parach jak to opisano wyżej, w celu badania przesiewowego pseudogenów pozbawionych jednego albo wielu intronów). Miareczkowanie prowadzono po stwierdzeniu, że w wysokim stężeniu, wszystkie trzy fragmenty zawierają kompletny region kodujący EF-1a, co sugerowało ewentualne zanieczyszczenie krzyżowe pomiędzy trzema preparatami plazmidowymi. Podczas miareczkowania, przeprowadzono PCR w reakcjach zawierających
2,5 ml każdej z matryc DNA w stężeniu 0,001, 0,01, 0,1, 1 albo 10 ng/ml, 2,5 ml 10X buforu PCR (Perkin Elmer), 2,0 ml 2 mM mieszaniny dNTP, 1,5 ml 25 mM MgCl2, 0,125 ml polimerazy DNA Taq (Perkin Elmer) i 11,4 ml H2O. Amplifikację przeprowadzono w następujących warunkach: 4 minuty w 94°C, a następnie 30 cykli po 1 minutę w 90°C, 2 minuty w 50°C i 4 minuty w 72°C. Wyniki wskazują, że kompletny region kodujący EF-1a położony był we fragmentach 4,5 kb i 7 kb.
Sporządzono mapę restrykcyjną dla każdej wstawki, stosując zestaw Stratagene FLASH Non® radioactive Gene Mapping Kit, przeznaczony do stosowania z wektorem Lambda FIX®II. Jednakże, zamiast stosować fagowy DNA, wycięto plazmidowy DNA przez trawienie NotI z wektorów pSK jak to opisano wyżej. Protokół mapowania był zasadniczo jak sugerowany przez wytwórcę. Pokrótce, Plazmidy sekwencjonowano starterami M13 (Id. Sekw. nr 12) i odwrotnym M13 (Id. Sekw. nr 13) komplementarnymi do regionów w miejscu klonowania wektora pBluescript SW+) wykrywających miejsca T3 (Id. Sekw. nr 14) i T7 (Id. Sekw. nr 15) wewnątrz miejsca NotI w każdej ze wstawek.
M13 GTAAAACGAC GGCCAGT (Id. Sekw. nr12)
M13rev GGAAACAGCT ATGACCATG (Id. Sekw. nr13)
T3 AATTAACCCT CACTAAAGGG (Id. Sekw. nr14)
T7 GTTAATACGA CTCACTATAG GGC (Id. Sekw. nr15)
Startery T7 i T3 zastosowano jako sondy w protokole mapowania genu. Ponieważ wstawka EF-1a obejmowała wewnętrzne miejsce Notl, para fragmentów (4,5 kb/11 kb i 7 kb/11 kb) zawierała, jak przewidywano, jedną albo więcej sekwencji startera, stąd stwierdzono, że wstawki 4,5 kb i 12 kb obejmują sekwencję startera T7, zaś wstawka 7 kb zawiera sekwencję T3.
Wstawki 4,5 kb i 7 kb zawierające region kodujący EF-1a wycięto z wektora przez trawienie Notl. Trawiony DNA rozdzielono na żelu agarozowym, rozdzielone fragmenty wycięto z żelu i wyizolowano DNA z każdego skrawka żelu stosując zestaw QIAquick firmy QIAGEN według instrukcji producenta. Mapowanie przeprowadzono stosując 7 różnych enzymów w częściowych trawieniach restrykcyjnych. Produkty reakcji rozdzielono na żelu agarozowym, DNA przeniesiono na membranę nylonową Duralon-UV i sondowano stosując oligonukleotydy T3 i T7 jako sondy. Wielkości prążków zmierzono i sporządzono mapę restrykcyjną.
Plazmid pSK/EF1.7 sekwencjonowano wewnętrznymi starterami przeznaczonymi oryginalnie do przeszukiwania przez PCR (Id. Sekw. nr 4 do 11) (uprzednio opisane startery 95-136 do 95-143) w celu upewnienia się, że sekwencja genu była sekwencją uprzednio określonego białka. Określono orientację regionu kodującego i zaprojektowano dodatkowe startery, które umożliwiały sekwencjonowanie do wewnętrznego miejsca Notl. Określono sekwencję całego regionu kodującego, po czym porównano ją z oczekiwaną sekwencją cDNA opisana w Hayashi i in. (wyżej). Analiza sekwencji potwierdziła, że wyizolowany DNA w rzeczywistości kodował tą samą sekwencję EF-1a co opisana przez Hayashi i in. Oprócz tego, sekwencja pierwszego egzonu była identyczna z uprzednio opisaną sekwencją cDNA EF-1a chomika na końcu 5' (Hayashi, wyżej) oraz zidentyfikowano siedem intronów w oparciu o strukturę podobną do znanej z ludzkiego homologa.
Sekwencja i mapa restrykcyjna otrzymana z fragmentu 7 kb wskazywała, że część intronu flankującego 5' i promotor położone były we fragmencie 12 kb w kierunku 5' od wewnętrznego miejsca Notl. Fragment Spel/NotI wielkości 3 kb położony 5' względem wewnętrznego miejsca NotI wycięto ze wstawki 12 kb i klonowano do pBluescript SK+ uprzednio trawionego tymi samymi enzymami, zaś powstały fragment oznaczono pSK/EF1.3. Fragment 3 kb mapowano jak to opisano wyżej, stosując Kpnl i Clal w celu potwierdzenia miejsc restrykcyjnych i sekwencjonowano stosując zestaw Erase-A-Base (Promega, Madison, WI) korzystając z miejsc Clal i Kpnl do wydłużania w kierunku, odpowiednio, 5'i 3'. Analiza sekwencji wskazywała regiony zawierające promotor, ramkę TATA i intron wielkości 0,9 kb w nie ulegającym translacji regionie flankującym 5', który miał tę samą wielkość co pierwszy intron genu ludzkiego (Uetsuki, 1989, wyżej). Sekwencja promotora CHEF1 i intronu 5' podana jest na Id. Sekw. nr 1, przy czym intron obejmuje nukleotydy od 2699 do 3641.
PL 195 604 B1
P r z y k ł a d 3
Charakterystyka regulatorowego DNA CHEF
Sekwencję obejmującą kodon startowy ATG i powyżej genu EF-1a chomika pokazano na Id. Sekw. nr 1. Większość z możliwych do zidentyfikowania miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych występuje w kierunku 3' od górnego miejsca SacI położonego 1,56 kb w kierunku 5' od początkowego kodony ATG genu EF-1a. Każdy z wektorów ekspresyjnych obejmujących sekwencję CHEF1 również zawiera 2 kb sekwencji CHEF1 5' od miejsca SaCI.
Sekwencjonowanie wskazuje na obecność doskonałej zgodności ramki TATA, położonej około 1 kb w kierunku 5' od początkowego kodonu ATG, zaś region pomiędzy górnym miejscem SacI i ramką TATA zawiera liczne miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych (Boulikas, Crit. Rev. Euk. Gene Exp. 4: 117-321 (1994)), w tym miejsca Spl (Id. Sekw. nr 16 albo 17), miejsca ATF (Id. Sekw. nr 18) i miejsca NF-1 (Id. Sekw. nr 19).
GGCGGG Id. Sekw. nr 16
GGGCGG Id. Sekw. nr 17
TGACGY(C/A)R Id. Sekw. nr 18
TTGGCN5-6(T/G)CCR Id. Sekw. nr 19
Podobnie do ludzkiego genu EF-1a (Uetsuki i in., wyżej) występuje intron wielkości 943 bp w nie ulegającym translacji regionie 5' (UTR) genu EF-1 a chomika, który wywnioskowano na podstawie istnienia sekwencji donora i akceptora składania transkryptu. Jednakże, stosując program do analizy DNA Geneworks, stwierdzono, że sekwencja intronu w 5'UTR jest jedynie w 62% identyczna z genem ludzkim. Intron 5' obejmuje liczne potencjalne miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych, z grubsza w ilości równej z liczbą miejsc wiązania pomiędzy miejscem SacI i ramką TATA, co wskazuje,że region 5' może być istotny dla optymalnej transkrypcji z promotora EF-1a.
Stosując program do analizy DNA Geneworks, stwierdzono, że sekwencja CHEF1 od górnego miejsca SacI do, choć z wyłączeniem, sekwencji intronu 5' jest w 64% identyczna z sekwencją ludzkiego genu EF-1a. Porównanie położenia miejsc wiązania czynnika transkrypcyjnego Sp1 w sekwencjach regulatorowych chomika i człowieka pokazano na Tabeli 1. Kompletną sekwencję ludzkiego genu EF-1a (Uetsuki i in., wyżej) podano na Id. Sekw. nr 29.
Odległość miejsc Sp1 od ramki TATA chomik człowiek pozycja nukleotydowa
-424
-304
-183
-171
-151
-135
156
168
257
261
425
495
589
594
688 pozycja nukleotydowa
-335
-220
-208
432
476
573
581
690
P r z y k ł a d 4
Konstruowanie plazmidów ekspresyjnych
Liczne plazmidy wykorzystane w kolejnych Przykładach skonstruowano według następującej procedury.
Plazmid pSV2-dhfr (numer dostępu ATCC 37146) trawiono Sphl/BamHI i oczyszczono fragment wielkości 1,8 kb kodujący reduktazę dihydrofolianu (DHFR) (Fragment 1). Fragment kodujący DHFR
PL 195 604 B1 obejmował również promotor/operator SV40 i sekwencje poliadenylacji, położone odpowiednio 5' i 3' od genu dhfr. Plazmid pSL1190 (Pharmacia) trawiono HindIII, końce wypełniono stosując fragment Klenowa i tempo zakończone fragmenty DNA poddano ponownej ligacji w celu zniszczenia miejsca Hindlll otrzymując plazmid pSL1190H, który trawiono Sphl/BamHI i oczyszczono fragment wielkości 3,4 kb (Fragment 2). Fragment pSV2-dhfr 1,8 kb (Fragment 1) poddano ligacji z fragmentem pSL1190H wielkości 3,4 kb (Fragment 2) otrzymując plazmid pSL1190H-dhfr.
Plazmid pSL 1190H-dhfr zmodyfikowano w sposób eliminujący kilka miejsc restrykcyjnych w następujący sposób. Plazmid trawiono najpierw XbaI/NheI (otrzymując końce komplementarne) i ponownie poddano ligacji plazmid eliminując oba miejsca XbaI i Nhel. Podczas drugiej procedury, pSL1190H-dhfr trawiono Hindlll, końce wypełniano stosując fragment Klenowa i liniowy plazmid ponownie poddawano ligacji eliminując miejsce Hindlll. W trzecim procesie, pSL1190H-dhfr trawiono BgllI, końce wypełniano fragmentem Klenowa i liniowy plazmid ponownie poddawano ligacji eliminując miejsce BglII. Efektem końcowym tych procedur był plazmid pSL1190H-dhfr/NXHB, w którym zniszczono miejsca Xbal, Nhel, HindIII i Bglll. Plazmid pSL1190H-dhfr/NXHB trawiono EcoRL/BamHI i wprowadzono łącznik NPB1/NPB2 (skonstruowany przez połączenie oligonukleotydów NPB1 i NPB2 (Id. Sekw. nr20 i 21) otrzymując plazmid pSL/dhfr/Hotl posiadający unikalne miejsce restrykcyjne Notl.
NBP1 GATCGGGCC GCGTTTAAAC GGATCC (Id. Sekw. nr 20)
NBP2 AATTGGATCC GTTTAAACGC GGCCGC (Id. Sekw. nr 21)
Powstały plazmid pSL/dhfr/NotI trawiono Asp718/BamHI i oczyszczono fragment wielkości 1,8 kb kodujący DHFR (Fragment 3). Plazmid pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA) trawiono Asp718/BglII w celu usunięcia promotora CMV i miejsca poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu (BGH) i oczyszczono fragment wielkości 3,7 kb (Fragment 4). fragment pSL/dhfr/NotI wielkości 1,8 kb, kodujący DHFR z sekwencją promotora/operatora SV40 i sekwencją poliadenylacji (Fragment 3) poddano ligacji z fragmentem pRc/CMV wielkości 3,7 kb (Fragment 4) otrzymując plazmid pRc/DHFR/Notl.
Plazmid pRc/CMV trawiono Asp718/XbaI i oczyszczono fragment wielkości 0,8 kb kodujący sygnał poliadenylacji BGH (Fragment 5). Plazmid pRc/DHFR/Notl trawiono BamHI/Asp718 i oczyszczono fragment wielkości 4 kb z sekwencjami DHFR, promotorem/operatorem SV40 i sygnałem poliadenylacji (Fragment 6). Plazmid pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA) trawiono BgllI/SacI i oczyszczono fragment kodujący promotor CMV wielkości 0,7 kb (Fragment 7). Fragment pRc/CMV 0,8 kb (Fragment 5), fragment 4 kb pRc/DHFR/Notl (Fragment 6), fragment pCEP4 0,7 kb (Fragment 7) i fragment syntetycznego adaptera SacI/XbaI połączono w poczwórnej ligacji otrzymując plazmid pDC1. Adaptor skonstruowano łącząc oligonukleotydy SXP1 i SXP2.
SXP1 (Id. Sekw. nr 22)
5'CGTTTAGTGAACCGTCAGATCTACATAACAACATTCCTCCTCTAAAGAAGCCCC
AAGCTTGATATCTGCAGAATTCT-3'
SXP (Id. Sekw. nr 23)
5'CTAGAGAATTCTGCAGATATCAAGCTTGGGGCTTCTTTAGAGGAGGAATGTTGT TATGTAGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCT-3 '
Plazmid pDC1 obejmował więc promotor CMV, region łącznikowy, miejsce poliadenylacji z BGH i gen dhfr pod kontrolą promotora SV40 i sekwencję składania/poliadenylacji SV40.
Plazmid pDC1 trawiono Xhol, wyizolowano fragment wielkości 4,5 kb pozbawiony promotora CMV i sygnału poliadenylacji BGH i poddano ligacji otrzymując plazmid pDCi1. Plazmid pDCi1 trawiono BamHI/XhoI i oczyszczono fragment wielkości 4,5 kb (Fragment 8). Fragment pDCi1 (Fragment 8) poddano ligacji z fragmentem PCR trawionym BamHI/SalI kodującym częściową sekwencję promotora CMV wytworzonego przy użyciu dwóch starterów 96-13 i 96-14 (z plazmidem pDC1 jako matrycą) otrzymując plazmid pDCi2.
Starter 96-13 (Id. Sekw. nr24)
5'AGTTCAGTCGACGGCGCGCCAACCCGGGAATCCGGACGGGATCTATACATTGAA
TCAATATTGGCA-3'
Starter 96-14 (Id. Sekw. nr25)
ATGTCAGGATCCACGCGGAACTCCATATATGGGCTATGAACT
Plazmid pDCi2 trawiono Asp718/SpeI i oczyszczono fragment kodujący DHFR z sekwencjami promotora/operatora SV40 i sygnałem poliadenylacji, wielkości 4,2 kb (Fragment 9), oraz trawiono pDC1 Asp718/SpeI i oczyszczono fragment 1,5 kb obejmujący częściową sekwencję promotora CMV z sygnałem poliadenylacji BGH (Fragment 10). Fragment 4,2 kb pDCi2 (Fragment 9) poddano ligacji
PL 195 604 B1 z 1,5 kb pDC1 (Fragment 10) otrzymując plazmid pDC31. Plazmid pDC31 różnił się od pDC1 kilkoma nowymi miejscami restrykcyjnymi, w tym SmaI i AscI na końcu 5' promotora CMV. Plazmid pDC31 trawiono NotI, końce stępiono stosując polimerazę DNA T4 i ponownie poddano ligacji plazmid w celu wyeliminowania miejsca NotI otrzymując plazmid pDC36. Plazmid pDC36 był identyczny co pDC31, z takim wyjątkiem, że miał zniszczone miejsce NotI.
Plazmid pDC36 trawiono ApaI/BamHI, końce wypełniano i ponownie poddano plazmid ligacji otrzymując pDC38. Plazmid pDC38 był taki sam jak pDC36 z takim wyjątkiem, że usunięto fragment ApaI/BamHI zawierający sekwencję poliadenylacji genu bydlęcego hormonu wzrostu. Plazmid pDC38 trawiono SmaI/HindIII i oczyszczono fragment wielkości 4,6 kb pozbawiony promotora CMV (Fragment 11).
Plazmid pSK/EF1.3 trawiono EcoRV/NotI/PvuI i oczyszczono fragment wielkości 2,9 kb kodujący promotor CHEF1 i sekwencje znajdujące się powyżej (Fragment 12). Bluescript SW+II (pSK+) trawiono NotI i oczyszczono fragment 2,9 kb (Fragment 13). Fragment NotI wielkości 7 kb z faga Lambda 7.4 poddano ligacji z fragmentem pSK+ 2,9 (Fragment 13) otrzymując plazmid pSK/EF1.7.
Plazmid pSK+ trawiono HindIII/NotI i oczyszczono fragment wielkości 2,9 kb (Fragment 14). Plazmid pSK/EF1.7 trawiono NotI/NcoI i oczyszczono fragment 620 bp kodujący część intronu nie ulegającego translacji 5' CHEF1 (Fragment 15). Fragment PCR trawiony HindIII/NcoI wielkości 123 bp, kodujący pozostałą część intronu 5' wytworzono ze starterów 96-36 i 96-45 oraz pSK/EF1.12 jako matrycy i oczyszczono (Fragment 16).
Starter 96-36 (Id. Sekw. nr 26)
GGCTTAGCTC CGAGGAGGG
Starter 96-45 (Id. Sekw. nr 27)
CGTGACAAGC TTGGTTTTCA CAACAC
Fragment pSK+ wielkości 2,9 kb (Fragment 14), fragment 620 bp pSK/EF1.7 (Fragment 15) i fragment Hindlll/NcoI 123 bp (Fragment 16) poddano ligacji otrzymując plazmid pSK/5'EF-1 o kompletnej sekwencji intronu 5' Ef-1a.
Plazmid pSK/5'EF-1 trawiono HindIII/NotI i oczyszczono fragment kodujący intron 5' (Fragment 17). Fragment pDC38 wielkości 4,6 kb, pozbawiony promotora CMV (Fragment 11), fragment pSK/EF1.3 wielkości 2,9 kb z promotorem CHEF1 i sekwencjami powyżej (Fragment 12) oraz fragment pSK/5'EF-1 wielkości 0,7 kb kodujący kompletny intron 5' (Fragment 17) połączono w potrójnej ligacji otrzymując plazmid pDEF1, który zawierał kompletny regulatorowy DNA 5'CHEF1, gen dhfri początek replikacji SV40 pozwalający na replikację w znacznej liczbie kopii w liniach komórkowych transformowanych antygenem T SV40.
Plazmid pDEF1 trawiono Hindlll, końce wypełniano i trawiono plazmid Notl, po czym oczyszczano fragment wielkości 2,6 kb zawierający promotor CHEF1 i sekwencje DNA powyżej, oprócz częściowej sekwencji intronu 5' (Fragment 18). Plazmid pDEF1 trawiono NotI/Asp718 i oczyszczano fragment 1,3 kb kodujący pozostałość intronu 5' (Fragment 19). Plazmid pDC38 trawiono SmaI/Asp718 i oczyszczano fragment wielkości 4 kb kodujący DHFR z promotorem/operatorem SV40 i sygnałem poliadenylacji (Fragment 20). Fragment 2,6 kb pDEF1 (Fragment 18), fragment pDEF1 1,3 kb (Fragment 19) 9 fragment pDC38 wielkości 4 kb (Fragment 20) połączono w potrójnej ligacji otrzymując plazmid pDEF2. Plazmid pDEF2 w E. coli XL-1 Blue zdeponowano 4 marca, 1997 w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA pod numerem dostępu 98343. Plazmid pDEF2 różnił się od pDEF1 tym, że miał usunięty fragment 0,3 kb Hindlll/Spel o 2,3 kb powyżej sekwencji TATA CHEF1 i zawierał pojedyncze miejsce Hindlll położone w regionie łącznika. pDEF2 stosowano w przypadkach gdy wyrażany gen zawierał własne miejsce poliadenylacji.
Plazmid pDEF2 trawiono Asp718/XbaI w celu linearyzacji plazmidu, co również eliminowało sekwencje początku replikacji i oczyszczano fragment wielkości 7,4 kb (Fragment 21). Plazmid pDC1 trawiono Asp718/Xbal i oczyszczano fragment wielkości 0,8 kb obejmujący zastępczy fragment początku replikacji oraz sekwencje poliadenylacji BGH (Fragment 22). Fragment pDEF2 wielkości 7,4 kb (Fragment 21) oraz fragment pDC21 0,8 kb (fragment 22) połączono tworząc plazmid pDEF10, który różnił się od pDEF1 w taki sam sposób co pDEF2. Plazmid pDEF10 różnił się od pDEF2 tym, że na końcu 3' łącznika pDEF10 znajdowało się miejsce poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu.
Plazmid pDEF10 trawiono HindIII/XbaI w celu linearyzacji plazmidu i oczyszczano fragment wielkości 8,2kb (Fragment 23). Plazmid pDC1/MDC kodujący ludzką chemokinę pochodzącą z makrofagów (MDC), trawiono HindIII/XbaI i oczyszczano fragment kodujący MDC wielkości 0,4 kb (Fragment 24). Ligacja fragmentu 8,2 kb pDEF10 (Fragment 23) z fragmentem pDC1/MDC wielkości 0,4 kb (Fragment 24) dała plazmid pDEF10/MDC.
PL 195 604 B1
Plazmid pRc/CMV trawiono BamHI, końce wypełniano fragmentem Klenowa, plazmid trawiono Asp718i oczyszczano fragment wielkości 1,5kb (Fragment 25). Plazmid pDC1 trawiono Notl, końce wypełniano fragmentem Klenowa, trawiono Asp718 i oczyszczano fragment wielkości 3,9 kb (Fragment 26). Fragment pRc/CMV wielkości 1,5 kb (Fragment 25) poddano ligacji z fragmentem pDC1 wielkości3,9kb(Fragment26)otrzymując plazmidpNCX.
PlazmidpNCXjest podobny do pDC1 z takim wyjątkiem, że gen dhfr zastąpiono genem oporności na neomycynę (NeoR). Plazmid pNCX trawiono Asp718/PvuI i oczyszczano fragment wielkości 2,1kb (Fragment 27). Plazmid pDEfl trawiono Asp718/PvuI i oczyszczano fragment wielkości 5,9kb (Fragment 28). Fragment pNCX wielkości 2,1 kb (Fragment 27) poddano ligacji z fragmentem pDEF1 wielkości5,9kb(Fragment28)otrzymując plazmid pNEF1. pNEF1 różnił się od pDEF1 tym, że niósł bakteryjny gen oporności na neomycynę (NeoR) kodujący oporność na neomycynę albo G418. Geny wprowadzane do pNEF1 są ogólnie fragmentami HindIII/XbaI wprowadzonymi po częściowym trawieniu HindllI albo potrójnej ligacji, ponieważ plazmid posiada dwamiejscaHindlll.
Przykład 5
Transfekcja komórek DG44 i test produktywności
Do transfekcji komórek DG44 pojedynczym plazmidem, zwykle 50-100 mg plazmidu linearyzowano przez trawienie enzymem Pvul albo AscI. Do transfekcji dwoma plazmidami komórek CHO, plazmidy pozostawiano nietrawione. Przed transformacją plazmidy precypitowano etanolem i dwukrotnie płukano 70% etanolem. Osad DNA krótko suszono i zawieszano w 400 ml sterylnej destylowanej wody. Do rozpuszczonego DNA dodawano 400 ml sterylnego HeBS (40 mM HEPES-NaOH, pH 7,0, 274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,4 mM Na2HPO4, 1,2 mM dekstroza). Nietransfekowane komórki DG44 hodowano w pożywce DMEM/F-12 z dodatkiem hipoksantyny (stężenie końcowe 0,01 mM) i tymidyny (0,0016 mM) określanychjako „HT”. Do hodowania transfekowanych i nietransfekowanych komórek DG44 dodawano do pożywki dializowaną FBS w stężeniu końcowym 5-10% obj. Komórki DG44 przygotowano do transfekcji przez hodowanie do około 50% albo niższej zlewności w polistyrenowych butelkach hodowlanych 150 cm3 (Corning). Komórki pobierano z butelek przez aspirację pożywki, płukanie przylegających komórek roztworem soli buforowanym fosforanem bez wapnia i magnezu (CMF-PBS: 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4), dodanie 4 ml roztworu zawierającego 0,0125% napromieniowaną trypsynę (worthington Biochemical Corporation) w CMF-PBS i inkubowanie w 37°C przez kilka minut. Pożywkę (4 ml) zawierającą surowicę płodową bydlęcą (FBS) dodawano, po czym oznaczano liczbę komóreki porcje po 2x107 komórek wirowano w postaci osadu. Każdyz osadów płukano CMF-PBS i zawieszano w 0,8 ml roztworu zawierającego HeBSi pożądany plazmidowy DNA. Zawieszone komórki przeniesiono do kuwety 0,4 cm urządzenia Gene Pulser (Bio-Rad) w temperaturze pokojowej i umieszczano w urządzeniu do elektroporacji Gene Pulser. Komórki poddano elektroporacji w temperaturze pokojowej przy użyciu wyładowania 290 wolt i960 mF (puls od 9 do 1 1 ,5 ms). Komórki trzymano w kuwecie przez około 10 minut po czym dodawano je do 10 ml pożywki DMEM/F-12 z dodatkiem 5-10% dializowanej FBS i HT. W tym momencie mierzono odsetek martwych komórek (test z błękitem trypanu) i wynosił on zwykle około 50%. Następnie komórki wirowano, zawieszano w 2 ml DMEM/F-12 z dodatkiem 5-10% dializowanej FBS i HT (pożywka nieselektywna) i wysiewano na 10 cm polistyrenowe szalki hodowlane. Po dwóch dniach hodowli,wzrost komórek zwykle osiągał zlewność, komórki pobierano z szalekstosując trypsynęjak 2 toopisano,i wysiewano na szalki 10 cm2 w różnych rozcieńczeniach w pożywce DMEM/F-12 z dodatkiem5-10% dializowanejFBSibezHT(pożywkaselektywna).W5i9dni później komórki odżywiano pożywką selektywną. Po około 2 tygodniach transfekowane kolonie (zwykle ponad 1000 na transfekcję) pobierano z szalek stosując trypsynę, jak to opisano wyżej, i po dodaniu pożywki selektywnej oznaczano liczbę komórek. Z każdej transfekcji przynajmniej dwie porcje po 2x106 komórek umieszczano w 10 cm szalkach zawierających po 10 ml pożywki selektywnej. Komórki hodowano do zaniku, do momentu w którym większość komórek odczepiła się od podłoża z powodu nadmiernego zagęszczenia. Nadsącz z takich hodowli badano testem ELISA w celu określenia średniego miana produktu.
Przykład 6
Wytwarzanie białka rekombinowanego przy użyciu CHEF1
Komórki DG44 opisane w Przykładzie 5 transfekowano plazmidami niosącymi geny podane w Tabeli 3, połączone funkcjonalnie z regulatorowym DNA CHEF1. Szczepy bakteryjne transformowane tymi plazmidami kodującymi geny wykorzystane w testach zdeponowano 1 kwietnia, 1997, w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA pod numerami dostępu podanymi wTabeli2.
PL 195 604 B1
Tab e l a 2
| kodowany gen | Oznaczenie plazmidu | Nr dostępu |
| łańcuch ciężki przeciwciała ICM3 | pDEF1/ICM3H.2 | 98381 |
| łańcuch lekki przeciwciała ICM3 | pNEF1/ICM3L.3 | 98382 |
| łańcuch ciężki przeciwciała 23F2G | pDEF1/F2GH.1 | 98383 |
| łańcuch lekki przeciwciała 23F2G | pNEF1/F2GL.1 | 98384 |
| chitynaza | pDEF1/CTN.1 | 98385 |
| czynnik aktywujący | pDEF2/HPH.4 | 98386 |
| płytki-hydrolaza acetylowi (PAF-AH) | ||
| chemokina pochodząca z makrofagów (MDC) | pDEF10/MDC.1 | 98387 |
Po selekcji w kierunku transfektantów, pule kolonii (ponad 200) z każdej transfekcji pobrano z każdej z szalek stosując trypsynę i identyczną liczbę komórek z każdej transfekcji ponownie wysiano i hodowano do zaniku. Nadsącze pobrano i badano ekspresję białka stosując ELISA albo test enzymatyczny. Wyniki podano w Tabeli 3.
Tab e l a 3
Ekspresja białka wykorzystująca sekwencje regulatorowe CHEF1 i CMV
Transfekowany gen Miano białka
CMV CHEF1
| ICM3 H+L | 554 | 1862 |
| ICM3 H+L | 288 | 2153 |
| Hu23F2G H+L | 337 | 1848 |
| MDC | 360 | 2100 |
| PAF-AH | 590 | 6574 |
| chitynaza-1 | 3200 | 2300 |
| chitynaza-2 | 8900 | 12850 |
Z wyjątkiem pierwszych doświadczeń badających ekspresję chitynazy (oznaczonej chitynaza-1 w Tabeli 3), zastosowanie regulatorowego DNA CHEF1prowadziło do wytworzenia istotnie wyższych poziomów białka ze wzrostem w zakresie od 3-krotnego do 11-krotnego w porównaniu z promotorem CMV.
W celuokreśleniaczy zmniejszona ekspresja obserwowana wteściez chitynazą była anomalią czy unikalną charakterystyką chitynazy, doświadczenie przeprowadzono drugi raz ale stosując dwie osobne transfekcje, w przeciwieństwie do pojedynczej transfekcji zastosowanej w pierwszym doświadczeniu, co spowodowało niezwykle niską liczbę otrzymanych transfektantów. Oprócz tego, zastosowano różne testy na aktywność chitynazy precyzyjniejszą techniką niż zastosowana w pierwszymdoświadczeniu.
Transfekcje w drugiej próbie dały wieletransfektantóww sposób bardziej spójnyniżpoprzednie wyniki, które spowodowały ponad 150% wzrost liczby transfektantów z plazmidem CMV. Wyniki drugiego doświadczenia (oznaczonego na Tabeli 3 jako chitynaza-2) były wewnętrznie spójne, co doprowadziło do poprawy wyników (1,4-krotnym) w porównaniu z wynikami z promotorem CMV.
Przykład 7
Wytwarzanie białka rekombinowanego przy użyciu regulatorowych DNA CHEF1 o różnych długościach
Skonstruowano również wektor ekspresyjny obejmujący dodatkowe 8 kb flankującego regiony
DNA 5' z genu EF-1a i oznaczono go pDEF14. PlazmidpDEF14różniłsię od pDEF2tym,że pDEF14 zawierał około 11,7 kb flankującego DNA 5' EF-1a chomika, podczas gdy pDEF2 zawierał jedynie 3,3 kb tej samej sekwencji. Plazmid pDEF14 obejmował również 4 kb flankującego DNA 3' chomika stycznego do końca 3' kasety ekspresji DHFR. Większy plazmid pDEF14 skonstruowano w następujący sposób.
Pokrótce, fragment AscI/Notl CHEF1 wielkości 2,6 kb usunięto z pDEF2i w to miejsce wprowadzono fragment AscI/NotI CHEF1 wielkości 11 kb. Wprowadzenie większej sekwencji wymagało moPL 195 604 B1 dyfikacji miejsca XbaI położonego 11,7 kb w kierunku 5' od początkowego kodonu ATG EF-1a w miejsce AscI. Oprócz tego, fragment Nsil/Sall wielkości 4 kb, obejmujący sekwencje flankujące CHEF1 począwszy od miejsca Nsil 118 bp w kierunku 3' od kodonu stop EF-1a, wprowadzono w miejsce Pmel/SalI w kierunku 3' od kasety ekspresji DHFR położonej na końcu 3' regionu łącznika, do którego wprowadzane są wyrażane geny. Kompletna sekwencja 3', począwszy od kodonu stop genu EF-1a podana jest jako Id. Sekw. nr 28. Bakterie transformowane plazmidem zdeponowano 9 kwietnia, 1997 w American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USAi nadano im numer 98398. Powstały plazmid pDEF14 obejmował unikalne miejsca Xbal i Notl wraz z wieloma miejscami HindllI co spowodowało konieczność potrójnej ligacji w celu wprowadzenia genu do plazmidu w celu ekspresji. Przykładowo, gen można wprowadzić do plazmidu przez poddanie ligacji fragmentu HindIII/XbaI obejmującego pożądany gen z fragmentem NotI/HindllI wielkości 737 bp z pDEF14 i fragmentem XbaI/Notl z pDEF14.
Ekspresję białka przy użyciu tego wektora porównywano z ekspresją przy użyciu wektora pDEF2 obejmującego mniejszą część regionu flankującego 5' EF-1a. We wstępnych doświadczeniach DNA kodujący łańcuchy lekkie i ciężkie przeciwciała 23F2G klonowano do pDEF2 i pDEF14 i określano poziom ekspresji po transfekcji do komórek DG44 jak to opisano wyżej w Przykładzie 5. Geny kodujące oba łańcuchy przeciwciała uporządkowano liniowo w wektorach i napędzano ekspresję obu genów sekwencją CHEF1 w poszczególnych plazmidach. Regiony kodujące dla obu łańcuchów w każdym z plazmidów oddzielone były DNA wielkości 4,3 kb pochodzącym z nie ulegającego translacji regionu ludzkiej IgG4.
Wyniki wskazują, że ekspresja 23F2G z większej sekwencji w pDEF14 była 4-krotnie większa niż ekspresja przeciwciała z mniejszej sekwencji pDEF2. Wynik ten był nieoczekiwany, ponieważ większość możliwych do zidentyfikowania miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych w pDEF14 znajduje się również w sekwencji DNA pDEF2. Stąd możliwe jest, że jedna albo więcej dodatkowych i niezidentyfikowanych miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych albo sekwencji wzmacniających znajduje się w DNA CHEF1 w plazmidzie pDEF14. Alternatywnie, większy DNA CHEF1 może zapewniać korzyści zwiększonej transkrypcji w wyniku pewnych właściwości sekwencji DNA 3'.
Oczekuje się, że liczne modyfikacje i odmiany wynalazku, jak podane w powyższych ilustrujących przykładach są oczywiste dla specjalisty w tej dziedzinie. Wynalazek ograniczony jest więc jedynie ograniczeniami podanymi w zastrzeżeniach patentowych.
PL 195 604 B1
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:
(i) ZGŁASZAJĄCY: Allison, Daniel S.
(ii) TYTUŁ WYNALAZKU: ' (iii) LICZBA SEKWENCJI: 29 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:
(A) ADRESAT: Marshall, 0'Toole, Gerstein, Murray&Borun (B) ULICA: 6300 Sears Tower, 233 South Wacker Drive (C) MIASTO: Chicago (D) STAN: Illinois (E) KRAJ: Stany Zjednoczone Ameryki (F) KOD: 60606 (v) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:
(A) TYP NOŚNIKA: Floppy disk (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE:PatentIn Release #1,0, Version #1.30 (vi) DANE DOTYCZĄCE OBECNEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA:
(B) DATA ZGŁOSZENIA:
(C) KLASYFIKACJA:
(viii) INFORMACJA O RZECZNIKU:
(A) NAZWA: Wiliams Jr., Joseph A (B) NUMER REJESTRACYJNY: 38,659 (C) NUMER SPRAWY: 27866/33537 (ix) INFORMACJE TELEKOMUNIKACYJNE:
(A) TELEFON: 312/474-6300 (B) TELEFAX: 312/474-0448 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 3678 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 1:
actagttcca aagatgaatt actaaccagt gtttccaagg aaataaatga aagcagagag
PL 195 604 B1 attagttcta taggcactag gaaaaaggga
TGCCTTGCAT
TTCTGTGGAT
TTGGTTACAA
AACCTGCTTG
TGTGGTGGGG
AAGGCCAGCC tcctctcttt
CTATCCTGGC
TGCTGGGATT
AACATCAGGA
TGAGTTGGAT
CTCTGGTCCC
TTTTTAAAAĄ gtaagaatca cagttttttt
CAGATCCCAC
AATAATATCA
GCCCATAATC
GAGTGCTTGC
CAAAATACCT
CTTCTGAGAT
AAAAGAAAAA
CCAGCACGCA
CCTAGTGAGT
TTGCTAGTGT
GGTATCAAGA
TTTGTGAAAT
GCATAGACCC
AGAAAATGAT ttaacagaat
TAGAAGGTTG
CACGTCTGTA
TCAGCAACAC
ΤΤΤΓΓΤΤΙΤΤ
ACTAGCTCTG
AAAGGTATGC
GGTGGTGAGA
CCTJTAGAGC
CACACATAGC aattaaaaac agtatcatgt
CCTTCCTAGC
ATGTGGACAC
ATTGTTTGTT
AGGTTATTAG
CTGGTGTGCT
TTTCACCGTC
CCTGCCCGGA
AAAGAAAAGA
GGAGGCAGAG
TTCAGGGCAC
TTCATTTTCG
TAATTTTAAC
GAGAGAGGGT
TGTGTTTGAT tagttatata
TAAGTGCAAA
TAAGGCTCTG
ATCCCAGCAT
AGTGAGTTTG
TTTCTTTTCT
AAGAGCAGGC
ACCACCAACG
GGGCTCAGTG
TACATGGTTG tatacacagc
AACAACAGTT aaatttgctt
TTGACTGTGG
CGGACAGTAG
ACTAGGCAGT
GAATAAATAC
GAGACCCTCG
CCTAGCATTA
GAGGCATTTA
AAACAGGCTA
GCAGGGCGGA
CGAGGGCTAA tatatttctt
GACTGGCTGA
AATGTGGCCA
CTCTTAACAC
TACTJTTAGG
CAAAGCCAGA
TAATATAGGA
TGGGAAGTAG
AGGCCACCCT ttttttggtt
TGGCCTCGAA
CCCCAGGTTT
GTCACAGGCA
AGGGAAGAGA
ATGTGCATTC
TGGGTTGTGA
TCAACTCATC agtcttgtcc
GTCCTCAAAT
GATGTTGTAC
TCTAAGGCTA
GTTCCATCTC
AGAAACAAAA
AAACTGGCCA
GGGCCGGCAT
TCTCTGTGAG
AGAGACTGTC
ACAATTTCTC
GAACCCTAGA
TTATAGAAAA
CCTCCTTGAC
GAAACGTaGT
AACCTCCTGA
ATTAGGAGAA
AGCTAGAAGA gaactacatc
TCTCTGTGTA
CTCAGAGATC
TGTCTCAAAC
TTCTCTGCAA
ACTGACTCCT
ACACACACTA
AAACTAGAAC
CCAAAATTTG
GGAAGCAAAT
GCTCCTTATT
ATCTGGAGGA
AAAATGTAGC
CAGAACCCCA
CAACAAAGAA
GGGCCAAAAA
GGTGGCGGAG
TTTGAGCTCA
TCAAAAACAA
| TTGTTACAAA | 120 |
| AAATCTCTGT | 180 |
| GGCTTTTGTG | 240 |
| CAGAAAAAGC | 300 |
| TCTGGATTCT | 360 |
| taaatgagaa | 420 |
| AAGAAACCTG | 460 |
| TTAGAAATCA | 540 |
| AGGTTCTGTC | 600 |
| GTTTTGGAGC | 660 |
| AGCCAGCCTC | 720 |
| AAACAAAAAT | 760 |
| AGCCTGACTC | 640 |
| GGAAGGTGTC | 900 |
| AATAATGCTA | 960 |
| TAGATAATAG | 1020 |
| TTTTATATTT | 1080 |
| AGTTCCTTTG | 1140 |
| AGGTTGGTTC | 1200 |
| GATCTCTTGA | 1260 |
| ttagtgataa | 1320 |
| tattccatta | 1380 |
| GTTTTTCTTr | 1440 |
| aaaaaaaaaa | 1500 |
| GCCTTTAATC | 1560 |
| GCCTGGTCTA | 1620 |
| aacagccaca | 1680 |
PL 195 604 B1
| CAATCAGAAC CACAGCAAAA CGCAGTTATG ATCC7TGGAA CTGTAGGAAT GACAAGCATT | 1740 |
| taaataatag gacgagccat ttttgagaag ctctgatttc acaagtgtca gggatgggct | 1600 |
| CTGGGCGAGT AAGATTGCTA ATGCTGGCCT CTAAATGAGA CCACGTGGAG TTGATTAGAT | 1660 |
| TCTTTTCATG TTCCTCGTGC TCTATGAAAT AACTGTACCC AAATACACAC ACACACACAC | 1920 1960 |
| acacacacaa tgcgcgcaca cacaaaatcc ttttttagct taagaagccc agaatcagaa | |
| gtaaagctaa ctgtgggact taagtattat tctgaacgga actcccaggg CGTGAAGCGC | 2040 |
| gcttcaggct tccagagaag cagctggcgc tggatggaat gaaccaagag gccagcacag | 2100 |
| GGGCASATCC GTCGAGCTCT CGGCCACCGA GCTGAGCCCT TAGGTTCTGG GGCTGGGAAG | 2160 |
| GGTCCCTAGG ATTGTGCACC TCTCCCGCGG GGGACAAGCA GGGGATGGCG GGGCTGACGT | 2220 |
| CGGGAGGTGG CCTCCACGGG AAGGGACACC CGGATCTCGA CACAGCCTTG GCAGTGGAGT | 2280 |
| CAGGAAGGGT AGGACAGATT CTGGACGCCC TCTTGaCCAG TCCTCACCGC CCCACCCCCG | 2340 |
| atggagccga gagtaattca tacaaaagga gggatcgcct tcgcccctgg gaatcccagg | 2400 |
| GACCGTCGCT AAATTCTGGC CGGCCTCCCA GCCCGGAACC GCTGTGCCCG CCCAGCGCGG | 2460 |
| cgggaggagc ctgcgcctag ggcggatcgc gggtcggcgg gagagcacaa gcccacagtc | 2S20 |
| CCCGGCGGTG GGGGAGGGGC GCGCTGAGCG GGGGCCCGGG AGCCAGCGCG GGGCAAACTG | 25Θ0 |
| GGAAAGTGGT GTCGTGTGCT GGCTCCGCCC TCTTCCCGAG GGTGGGGGAG AACGGTATAA | 2640 |
| AAGTGCGGTA GTCGCGTTGG ACGTTCTTTT TCGCAACGGG TTTGCCGTCA GAACGCAGGT | 2700 |
| GAGTGGCGGG TGTGGCCTCC GCGGGCCCGG GCTCCCTCCT TTGAGCGGGG TCGGACCGCC | 2760 |
| gtgcgggtgt cgtcggccgg gcttctctgc gagcgttccc gccctggatg gcgggctgtg | 2620 |
| CGGGAGGGCG AGGGGGGGAG GCCTGGCGGC GGCCCCGGAG CCTCGCCTCG TGTCGGGCGT | 2660 |
| GAGGCCTAGC GTGGCTTCCG CCCCGCCGCG TGCCACCGCG GCCGCGCTTT GCTGTCTGCC | 2940 |
| CGGCTGCCCT CGATTGCCTG CCCGCGGCCC GGGCCAACAA AGGGAGGGCG TGGAGCTGGC | 3000 |
| TGGTAGGGAG CCCCGTAGTC CGCATGTCGG GCAGGGAOAG CGGCAGCAGT cGGGGGGGGG | 3060 |
| ACCGGGCCCG CCCGTCCCGC AGCACATGTC CGACGCCGCC TGGACGGGTA GCGGCCTGTG | 3120 |
| TCCTGATAAG GCGGCCGGGC GGTGGGTTTT AGATGCCGGG TTCAGGTGGC CCCGGGTCCC | 3180 |
| GGCCCGOTCT GGCCAGTACC CCCTAGTGGC TTAGCTCCGA GGAGGGCGAG CCCGCCCGCC | 3240 |
| CGGCACCAGT TGCGTGCGCG GAAAGATGGC CGCTCCCGGG CCCTGTAGCA AGGAGCTCAA | 3300 |
PL 195 604 B1
| AATGGAGGAC | GCGGCAGCCC | GGCGGAGCGG | GGCGGGTGAG | TCACCCACAC | AAAGGAAGAG | 3360 |
| GGCCTTGCCC | CTCGCCGGCC | GCTGCTTCCT | GTGACCCCGT | GGTGTACCGG | CCGCACTTCA | 3420 |
| GTCACCCCGG | GCGCTCTTTC | GGAGCACCGC | TGGCCTCCGC | TGGGGGAGGG | GATCTGTCTA | 3460 |
| ATGGCGTTGG | AGTTTGCTCA | CATTTGGTGG | GTGGAGACTG | TAGCCAGGCC | AGCCTGGCCA | 3540 |
| TGGAAGTAAT | TCTTGGAATT | TGCCCATTTT | GAGTTTGGAG | CGAAGCTGAT | TGACAAAGCT | 3600 |
| GCTTAGCCGT | TCAAAGGTAT | TCTTCGAACT | TTTTTTTTAA | GGTGTTGTGA | AAACCACCGC | 3660 |
| TAATTCAAAT | CCAACATG | 3676 |
(2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:2 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 2:
AGGCACAGTC GAGGCTGATC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:3 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 3:
TTCCAGGGTC AAGGAAGGCA
PL 195 604 B1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:4 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 4
GCCACCTGAT CTACAAATGT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:5 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 5:
GAGATACCAG CCTCAAATTC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:6 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 6
ATGTGACCAT CATTGATGCC
PL 195 604 B1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:7 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 7:
GTGACTTTCC ATCCCTTGAA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:8 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 8:
GTTGGAATGG TGACAACATG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:9 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B, TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 9:
CAGGTTTTAA AACACCAGTC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:10
PL 195 604 B1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:10:
AATGACCCAC CAATGGAAGC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:11 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:11:
ACAGCAACTG TCTGCCTCAT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:12:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:12:
GTAAAACGAC GGCCAGT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:13 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad
PL 195 604 B1 (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:13:
GGAAACAGCT ATGACCATG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:14 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:14:
AATTAACCCT CACTAAAGGG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:15:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 23 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:15:
GTTAATACGA CTCACTATAG GGC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:16 (i) CHARAKTERYSTYKĄ SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 6 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza
PL 195 604 B1 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:16:
GGCGGG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:17 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 6 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:17:
GGGCGG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:18 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 8 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:18:
TGACGYMR (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:19 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 13 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa
PL 195 604 B1 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:19:
TGGCNNNNNKCCR (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:20:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:20:
GATCGGGCC GCGTTTAAAC GGATCC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:21:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:21:
AATTGGATCC GTTTAAACGC GGCCGC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:22:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 77 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA
PL 195 604 B1 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:22:
CGTTTAGTGA ACCGTCAGAT CTACATAACA ACATTCCTCC TCTAAAGAAG CCCCAAGCTT
GATATCTGCA GAATTCT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:23:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 85 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 23:
CTAGAGAATT CTGCAGATAT CAAGCTTGGG GCTTCTTTAG AGGAGGAATG TTGTTATGTA
GATCTGACGG TTCACTAAAC GAGCT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:24:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 66 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:24:
AGTTCAGTCG ACGGCGCGCC AACCCGGGAA TCCGGACGGG ATCTATACAT TGAATCAATA
TTGGCA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:25:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 42 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza
PL 195 604 B1 (D).TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:25:
ATGTCAGGAT CCACGCGGAA CTCCATATAT GGGCTATGAA CT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:26:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 26:
GGCTTAGCTC CGAGGAGGG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:27:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR:27:
CGTGACAAGC TTGGTTTTCA CAACAC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:28
PL 195 604 B1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 4263 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 28:
| TGAATATTAC | CCCTAACACC | TGCCACCCCA | GTCTTAATCA | GTGGTGGAAG | AACGGTCTCA | 60 |
| GAACTGTTTG | TCTCAATTGG | CCATTTAAGT | ttaatagtga | AAGACTGGTT | AATGATAACA | 120 |
| ATGCATCGGA | AAACCTTCAG | GAGGAAAGGA | gaatgttttg | TGGAACATTT | TTGTGTGTGT | 160 |
| GGCAGTTTTA | AGTTATTAGT | TTTCAAAATC | AGTACTTTTT | AATGGAAACA | ACTTGACCAA | 240 |
| AAATCTGTCA | CAGAATTTTG | AGACCCATTA | AAATACAAGT | TTAATGAGAA | GTCTGTCTCT | 300 |
| GTTAATGCTG | AAGTCATTAC | TAAGTGCTTA | GCTTAGCAAG | GTATGTGGAT | GCCCATTTGT | 360 |
| GTTCCAAGGG | ATTGGACTGT | TCATCAGGAC | CCAGAGCTGA | GTTTCAAGGG | CTCAAGAGAT | 420 |
| GGCTTATTAC | CTGTGGGTGT | CTTGAAGGTT | CTGGTTGGGA | CAAATTAGGA | ATGTTTTTGG | 460 |
| CAGACATGGT | GACTACCTTC | ATCTGGGTGA | GTTCAGTTGA | TTTGTCTTGA | GCCTTTGGGG | 540 |
| TTTACACAAG | TAAATGACAT | CATACAGTTA | GTGTATTGTT | AGTGAATATT | AATATATGAG | 600 |
| GCAGGCTTTG | CTCTAGCAAT | TTTAGAACTA | GTTTTCAGGA | aagggttcat | CTTGTGCATT | 660 |
| GGATGTTTGA | TTCTATCACT | TAGAGTTTAA | ACTGAAAGTG | CTCAAGAGGT | TTTATTTAGG | 720 |
| CTGGGATATA | AATAAGCCTT | tctgtagctt | GTAATGGTAT | CAGGAATTTA | aaaggccatc | 760 |
| TGGGGCACAA | AGATTAAGCA | GAAAAGGTAG | AAGGTGAGAT | TGGGGGACTT | TGAGTACTTC | 840 |
| ACACACTTTA | ATGTGTGAGT | GCTTTAGTGC | atatagtaca | ACTGCCAGAT | aagggcatcc | 900 |
| ACATCTGATT | GTTTGGAAGG | CACCTTGTGG | tttctgggaa | TTCAGAATTG | ggagaaaaat | 960 |
| GCTCCCAACC | GCTGAAGCCC | TTGGTAATCT | GCAGGGTGTT | TATTTAGCAfl | gagataagga | 1020 |
| CAAAAAGTTA | TAGTGTGGAG | TTGGTTGAGT | TGGTAGATGT | CATTACAACA | ggtggtctta | 1080 |
PL 195 604 B1
| AATTGGGTTA | GGAGTCACTT | TGAAATACCT | GGGCCATAAG | caaagtggca | TTTTCACCTT | 1140 |
| TCAGGAGAAA | CTGGTACACT | tatccattct | ATAGTGGATG | cttgttcaat | TGGGCTGATG | 1200 |
| ACTAAACCGG | TGACTAAAGG | TTTGTCAGTA | TAAATGGATG | ggttgtaggc | AGACOGTGAG | 1260 |
| GAA1TACTAT | ACCTGCAAGG | AGTCATTGCC | TGATCTGCCT | ggaaaggggc | AGGATTGAGT | 1320 |
| CTCAGAACGT | GTACACCATA | GGATATGGAA | AAATTTGTCA | cgcctagcat | TCAACTTAGT | 1380 |
| GGTGTAGCGC | CACCTACTGG | CACTTTAAAA | GCTTAGCATA | gaggagcatg | TGTGTTAGGA | 1440 |
| GCTCGGATGG | GATCCAGGGC | CTCAAGGTTT | GCATGTAAAT | aaaagccctt | TACCAAA1TA | 1500 |
| ACTACATACC | AGCATACATC | AGTCCTTTAG | tgttgaaaaa | CAGAAGGGAA | AGCTAATATA | 1560 |
| TATAGTGCTT | GCTTTATTTA | AGTCTAGCTG | ATTACGTGTT | TGGTTGCCAG | TGTGACTAGT | 1620 |
| CTGGAGTTGA | ATTTGTCCTC | agacacgtaa | AATGGAATTT | GGGATTCACA | ACACTCTAGT | 1680 |
| ATGAGGGACC | TAATGGCCTG | TACCAGGCAC | AAACGTGTCT | ATAAACTACA | CAAAACGAAG | 1740 |
| GAATTTACAG | gaattaggaa | GGTATTCTTA | ACATTAAAAC | attatgggca | ΤΪΤΤΑΑΑΑΑΑ | 1800 |
| AGCTTTGACA | GGATTTCTTT | gtcatggctg | TCCTGGAGCT | AGTTGTOTAG | ACCAGGCTGG | 1860 |
| GCTGAAATCT | tgtctgcctg | cctggcttgg | ACACTTTlTr | ATTATGTATA | CAACATTCTG | 1920 |
| CTTCCATGTA | tatctgcaca | TTAGAAGACG | GCACCAGATC | TCCTAATGGA | TGGTTGTGAG | 1980 |
| CCACCATGTG | GTTGCTGGGA | attgaactca | GGACCTCTGG | AAGAGCAGTG | CTCTTAACCT | 2040 |
| CTGAGCCATC | TCCAGCCCCA | GCTTGGGCAC | ATTTTTAATG | GCTGGGAAAT | CAAACCCCCT | 2100 |
| AGGCCTTCTG | TCAGTAATGA | AGGGCTTTTG | GCTACCGAGA | GTAGGATTTA | AGGTTATTCG | 2160 |
| GAOCTGCAOG | TCTGCCTCAG | TGCAGGTTTG | GGAGTCCAGC | ATCTTAGAAA | ATGCAGtGAA | 2220 |
| GCCAAGCTGA | gctatatttt | GTTTAAAAAA AAAATAAGTC | GGTAAAGTGC | TGCTGAGCCT | 2260 | |
| GATGACCAAG | CTGGGACACA | AGTAGAAGAA | CATAGGCCAA | TGCTCTATAT | taaaagcatg | 2340 |
| GGTCATTTTT | AATGCTCTTG | AGAAGGCTAT | GCCTACACTA | CTCTCAGCCA | CCGCAGCGTG | 2400 |
| TTTAAATTAA | ACTAGTTTGG | aaattttctt | TGGGGGTAAG | CTATTTAACC | TAGTGCCTTG | 2460 |
| GCAGGTATAC | TACTGAACTC | TCCTCCTCAT | tcctttttgt | TTTTTAAGAA | TTTCAGTCAG | 2520 |
| GCTCAGGCAG | CCCTTAAACT | TGTGATTAAG | CCTGAGAACA | GTTACGATTA | TGAGCCTATT | 2580 |
| AGTATACCGA | tcaatatgtg | AATTTTTTTG | ggatgggggt | CAGGCCTCCC | TGCCTCCCAA | 2640 |
| ATACTGGGAC TAAAGGCTGC | ACCACCACAA | CCTGGCTCTT | GAAATAClTr | TCTACATJTT | 2700 |
PL 195 604 B1
| TTGGGGGGCA | tgggtgggag | AGCAGGGTTT | CTCTGTATTA | GCCCTGGCTC | TCCTGGAACT | 2760 |
| CTGTAGACCA | GGCTATTCTT | GAGCTCAGAT | TAGCCTGTCT | CTGCCTCCTA | AATTCTGGGA | 2620 |
| “AAAGGTGT | GTGCTACTGC | TGCCTGGCTA | CAAAGACATT | tittotitc | ΤΤΑΑΑΊΤΓΑΑ | 2880 |
| AAACAAAAGT | GGTTCTTTTA | GAAGGGTGGT | tggtgttggc | ACATACTCCA | AGCACTCAGG | 2940 |
| TTTTGAGTTT | GTCCCAGGAA | TGAAGACTGC | attactgccg | CCCCTCCCTG | GTAAGGGCTA | 3000 |
| CACAGAGAAA | TCCTATTTGG | AGCCTATCCT | GGTAACTCGC | TCTGTAGACC | aggctggcct | 3060 |
| CGAACTCAAG | AGAACCACCT | GCCTCTGAAT | GCTGGTATTA | agggcaggca | CCACCAACAC | 3120 |
| CCAGCCTAAA | AAATGTCTIT | TTTTTAAAGA | ττττίτττττ | tttttttaca | GAATAAACAT | 3160 |
| TCTGTTTACA | atattctgct | TCTATGTATA | TCTGCACACT | AGAAGAGGGC | ACCCGATCTC | 3240 |
| ATAATGGATG | GTTGTGAGCC | accaagtggt | TGCTGGGAAT | TGAACTCAGA | ACCTCTGGAA | 3300 |
| GAGCAGTCAG | TGCTCTTAAC | CTCTGAGCCA | TCTCTCCAGC | CCCTAAAAAT | GGCTCTTGAG | 3360 |
| ATAGGGTCTC | AAGTAGTTTG | AGACTGAGTT | GGCTATATAA | ACAAGGCTGG | cacatagcac | 3420 |
| CATGTACAGC | TGGGTTTAGT | 1TACATGGGG | TGTTTTTGTC | TCTGGAGGCA | GGAGGATCAT | 3460 |
| TTGAGCATAG | GGAGTTAATA | gtgaggtcat | GTTTTATCTA | CTCTTCTGAA | TTGAGAACTA | 3540 |
| agctgatgca | AAGCAAGTTT | GACTGAAGAA | GTCCAGTTTA | TGAGAACAAG | GGTGGAAACT | 3600 |
| AATGTGTCAA | AGATGGCCTT | GCATGTGCTT | TAGATGATGA | CCCAGTCACT | TGGGAATTAC | 3660 |
| TGGATGTGTA | agacctatat | cttgacagga | GTGAACAGTG | TCTTATAGGT | CCTATATGAA | 3720 |
| AGAAATGAGA | catacccatt | ttgtttcccc | TAAGAATTCA | CCTTTCCTAA | CCTGGTTCAT | 3*760 |
| GCTATTTAGG | TTATTTTACT | TGCAAATCCT | AGGTGCTCCC | TTACCCAGTA | TTGCTTATGT | 3640 |
| GGCACCAAAG | TCACTCACTC | CCATGATITG | CAAGTCTCTG | GGAACTTCCA | TGACAACCTA | 3900 |
| GAATAGCAAC | TCAAATACAT | tttctcagta | CCAATTTTGA | agaaaaaata | TTTTGCAAAA | 3960 |
| TAGCTGTATG | GATGGGTACT | aaatagtgag | GTTATCTCCA | GAAGGCCTAT | GAAGAATTAA | 4020 |
| GGTTGAGTTC | AGTTGAGTTC | AGCAGCAAGT | ttaaggttca | TCCATTTrTG | TACAGTGTTT | 4060 |
| TCCTATTACG | gtaagtgttt | TGCCTGCAGG | aatatctgta | CCACATGCTT | GCCTGGTACC | 4140 |
| TATATCGGCC | agaagagggc | tttggatcct | ctggacttga | ATTACAGATG | GGTATTAGCC | 4200 |
| ACCATTTAGG | TGCTGGGAAT | TGAAACCAAG | TCCTCTGGAA | GAACAGCAAG | TGATCOAGTC | 4260 |
| GAC | 4263 |
PL 195 604 B1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR:29 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
(A) DŁUGOŚĆ: 4695 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (Xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 29
| CCCGGGCTGG | GCTGAGACCC | GCAGAGGAAG | ACGCTCTAGG | GATTTGTCCC | GGACTAGCGA | €0 |
| gatggcaagg | CTGAGGACGG | GAGGCTGATT | GAGAGGCOAA | GGTACACCCT | AATCTCAATA | 120 |
| CAACCTTTGG | AGCTAAGCCA | GCAATGGTAG | agggaagatt | CTGCACGTCC | CTTCCAGGCG | 180 |
| GOCTCCCCGT | CACCACCCCC | CCCAACCCGC | CCCGACCGGA | GCTGAGAGTA | ATTCATACAA | 240 |
| aaggaćtcgc | CCCTGCCTTG | GGGAATCCCA | GGGACCGTCG | TTAAACTCCC | actaacgtag | 300 |
| AACCCAGAGA | TCGCTGCGTT | CCCGCCCCCT | CACCCGCCCG | CTCTCGTCAT | CACTGAGGTG | 360 |
| GAGAAGAGCA | TGCGTGAGGC | TCCGGTGCCC | GTCAGTGGGC | AGAGCGCACA | TCGCCCACAG | 420 |
| TCCCCGAGAA | GTTGGGGGGA | GGGGTCGGCA | ATTGAACCGG | TGCCTAGAGA | AGGTGGCGCG | 460 |
| GGGTAAACTG | GGAAAGTGAT | GTCGTGTACT | GGCTCCGCCT | TTTTCCCGAG | GGTGGGGGAG | S40 |
| AACCGTATAT | aagtgcagta | GTCGCCGTGA | ACGTTCTTTT | TCGCAACGGG | TTTGCCGCCA | 600 |
| GAACACAGGT | aagtgccgtg | TGTGGTTCCC | GCGGGCCTGG | CCTCTTTACG | GGTTATGGCC | 660 |
| CTTGCGTGCC | ttgaattact | TCCACGCCCC | TGGCTGCAGT | ACGTGATTCT | TGATCCCGAG | 720 |
| CTTCGGGTTG | GAAGTGGGTG | GGAGAGITCG | AGGCCTTGCG | CTTAAGGAGC | CCCTTCGCCT | 7B0 |
| cgtgcttgag | TTGAGGCCTG | GCCTGGGCGC | TGGGGCCGCC | gcgtgcgaat | CTGGTGGCAC | 840 |
| CTTCGCGCCT | GTCTCGCTGC | TTTCGATAAG | TCTCTAGCCA | ΤΊΤΑΑΑΑΤΤΓ | ttgatgacct | 900 |
| GCTGCGACGC | •nrrrrrcTG | GCAAGATAGT | CTTGTAAATG | cgggccaaga | TCTGCACACT | |
| GGTATTTCGG | TTTTTGGGGC | CGCGGGCGGC | GACGGGGCCC | GTGCGTCCCA | GCGCACATGT | 1020 |
| tcggcgaggc | GGGGCCTGCG | AGCGCGGCCA | CCGAGAATCG | GACGGGGGTA | gtctcaagct | 1060 |
| GGCCGGCCTG | CTCTGGTGCC | TGGCCTCGCG | CCGCCGTGTA | TCGCCCCGCC | ctgggcggca | 1140 |
| aggctggccc | GGTCGGCACC | AGTTGCGTGA | GCGGAAAGAT | GGCCGCTTCC | CGGCCCTGCT | 1200 |
| gcagggagct | CAAAATGGAG | GACGCGGCGC | TCGGGAGAGC | GGGCGGGTGA | gtcacccaca | 1260 |
PL 195 604 B1
| CAAAGGAAAA | . GGGCCTTTCC | GTCCTCAGCC | gtcgcttcat | GTGACTCCAC | GGAGTACCGG | 1320 |
| GCGCCGTCCA | GGCACCTCGA | TTAGTTCTCG | agcttttgga | GTACGTCGTC | titaggttgg | 1360 |
| GGGGAGGGGT | TTTATGCGAT | GGAGTTTCCC | CACACTGAGT | GGGTGGAGAC | tgaagttagg | 1440 |
| CCAGCTTGGC | AOTGATGTA | ATTCTCCTTG | gaatttgccc | TOTTGAGTT | TGGATCITGG | 1500 |
| ttcattctca | AGCCTCAGAC | AGTGGTTCAA | ΑΟτπϋΙΤΙΟ | TTCCATTTCA | GGTGTCGTGA | 1560 |
| AAACTACCCC | taaaagccaa | AATGGGAAAG | GAAAAGACTC | ATATCAACAT | tgtcgtcatt | 1620 |
| GGACACGTAG | ATTCGGGCAA | GTCCACCACT | actggccatc | TOATCTATAA | ATGCGGTGGC | 1660 |
| ATCGACAAAA | GAACCATTGA | aaaatttgag | AAGGAGGCTG | CTGAGGTATG | tttaatacca | 1740 |
| GAAAGGGAAA | GATCAACTAA AATGAGTTTT | ACCAGCAGAA | TCATTAGGTG | ATTTCCCCAG | 1800 | |
| AĄCTAGTGAG | TGGTTTAGAT | CTGAATGCTA | ATAGTTAAGA | CCTTACTTAT | GAAATAATTT | 1660 |
| TGCTTTTGGT | gacttctgta | atcgtattgc | TAGTGAGTAG | ATTTGGATGT | TAATAGTTAA | 1920 |
| gatcctactt | ATAAAĄGTTT | GATnTTGGT | TGCTTCTGTA | ACCCAAAGTG | ACCAAAATCA | 1980 |
| CTTTGGACTT | GGAGTTGTAA | AGTGGAAACT | GCCAATTAAG | GGCTGGGGAC | AAGGAAATTG | 2040 |
| AAGCTGGAGT | TTGTGTTTTA | GTAACCAAGT | AACGACTCTT | AATCCTTACA | GATGGGAAAG | 2100 |
| GGCTCCTTCA | AGTATGCCTG | GGTCTTGGAT | AAACTGAAAG | ctgagcgtga | ACGTGGTATC | 2160 |
| accattgata | TCTCCTTGTG | GAAATTTGAG | ACCAGCAAGT | actatgtgac | tatcattgat | 2220 |
| GCCCCAGGAC | ACAGAGACTT | TATCAAAAAC | ATGATTACAG | ggacatctca | ggttgggatt | 2260 |
| AATAATTCTA | GGTTTCTTTA | TCCCAAAAGG | OTGCTTTGT | ACACTGGTTT | tgtcatttgg | 2340 |
| AGAGTTGACA | GGGATATGTC | titgctttct | TTAAAGGCTG | ACTGTGCTGT | CCTGATTGTT | 2400 |
| gctgctggtg | TTGGTGAATT | TGAAGCTGGT | ATCTCCAAGA | ATGGGCAGAC | CCGAGAGCAT | 2460 |
| GCCCTTCTGG | CTTACACACT | GGGTGTGAAA | CAACTAATTG | TCGGTGTTAA | CAAAATGGAT | 2520 |
| TCCACTGAGC | CACCCTACAG | ccaoaagaga | TATGAGGAAA | TTGTTAAGGA | AGTCAGCACT | 2560 |
| TACATTAAGA | AAATTGGCTA | caaccccgac | ACAGTAGCAT | TTGTGCCAAT | TTCTGGTTGG | 2640 |
| AATGGTGACA | ACATGCTGGA | GCCAAGTGCT | AACGTAAGTG | GCTTTCAAGA | CCAITGTTAA | 2700 |
| AAAGCTCTGG | GAATGGCGAT | TTCATGCTTA | CAGAAATTGG | CATGCTTGTG | tttcagatgc | 2760 |
| CTTGGTTCAA | GGGATGGAAA | GTCACCCGTA | AGGATGGCAA | TGCCAGTGGA ACCACGCTGC | 2B20 | |
| TTGAGGCTCT | GGACTGCATC | CTACCACCAA | CTCGTCCAAC | TGACAAGCCC TTGCGCCTGC | 2680 |
PL 195 604 B1
| CTCTCCAGGA | . TGTCTAGAAA | . ATTGGTGGTA | AGTTGGCTGT | AAACAAAGTT | GAATTTGAGT | 2940 |
| tgatagagta | . CTGTCTGCCT | TCATAGGTAT | ITAGTATGCT | GTAAATATTT | TTAGGTATTG | 3000 |
| GTACTGTTCC | TGTTGGCCGA | gtggagactg | GTGTTCTCAA | ACCCGGTATG | GTGGTCACCT | 3060 |
| TTGCTCCAGT | CAACGTTACA | ACGGAAGTAA | AATCTGTCGA | AATGCACCAT | GAAGCTTTGA | 3120 |
| GTGAAGCTCT | TCCTGGGGAC | AATGTGGGCT | TCAATGTCAA | GAATGTGTCT | GTCAAGGATG | 3180 |
| TTCGTCGTGG | CAACGTTGCT | GGTGAGAGCA | AAAATGACCC | ACCAATGGAA | GCAGCTGGCT | 3240 |
| TCACTGCTCA | GGTAACAATT | TAAAGTAACA | TTAACTTATT | GCAGAGGCTA | AAGTGATTTO | 3300 |
| AGACTTTGGA | tttgcactga | ATGCAAATCT | TTTTTCCAAG | GTGATTATCC | TGAACCATCC | 3360 |
| AGGCCAAATA | AGCGCCGGCT | ATGCCCCTGT | ATTGGATTGC | CACACGGCTC | ACŁTTGCATG | 3420 |
| CAAGTTTGCT | GAGCTGAAGG | AĄAAGATTGA | TCGCCGTTCT | GGTAAAAAGC | TGGAAGATGG | 3480 |
| CCCTAAATTC | ttgaagtctg | GTGATGCTGC | CATTGTTGAT | ATGGTTCCTG | GCAAGCCCAT | 3540 |
| GTGTGTTGAG | AGCTTCTCAG | AGTATCCACC | TTTGGGTAAG | GATGACTACT | TAAATGTAAA | 3600 |
| aaagttgtgt | taaagatgaa | AAATACAACT | GAACAGTACT | TTGGGTAATA | ATTAACTITT | 3660 |
| TTTTTAATAG | gtcgctttgc | tgttcgtgat | ATGAGACAGA | CAGTTGCGGT | GGGTGTCATC | 3720 |
| AAAGCAGTGG | ACAAGAAGGC | tgctggagct | GGCAAGGTCA | CCAAGTCTGG | CCAGAAAGCT | 3780 |
| CAGAAGGCTA | AATGAATATT | atccctaata | CCTGCCACCC | CACTCTTAAT | CAGTGGTGGA | 3840 |
| AGAACGGTCT | cagaactgtt | tgtttcaatt | GGCCATTTAA | GTTTAGTAGT | AAAAGACTGG | 3900 |
| TTAATGATAA | CAATGCATCG | taaaaccttc | AGAAGGAAAG | GAGAATGTTT | TGTGGACCAC | 3960 |
| TTTGGTlTrC | TTTTTTGCGT | GTGGCAGTTT | TAAGTTATTA | GTTTTTAAAA | TCAGTACCTT | 4020 |
| TTAATGGAAA | CAACTTGACC | AAAAATTTGT | CACAGAATTT | TGAGACCCAT | TAAAAAAGTT | 4080 |
| AAATGAGAAA | CCTGTGTGTT | CCTTTGGTCA | ACACCGAGAC | ATTTAGGTGA | aagacatcta | 4140 |
| ATTCTGGTTT | TACGAATCTG | GAAACTTCTT | GAAAATGTAA | TTCTTGAGTT | AACACTTCTG | 4200 |
| GGTGGAGAAT | AGGGTTGTTT | TCCCCCCACA | TAATTGGAAG | GGGAAGGAAT | atcatttaaa | 4260 |
| GCTATGGGAG | GGTTTCTTTG | aitacaacac | TGGAGAGAAA | TGCAGCATG7 | TGCTGATTGC | 4320 |
| CTGTCACTAA | AACAGGCCAA | AAACTGAGTC | CTTGGGTTGC | ATAGAAAGCT | TCATGTTGCT | 4380 |
| AAACCAATGT | TAAGTGAATC | tttggaaaca | AAATGTTTCC | AAATTACTGG | GATGTGCATG | 4440 |
| TTGAAACGTG | GGTTAAAATG | actgggcagt | GAAAGTTGAC | tatttgccat | GACATAAGAA | 4500 |
| ATAAGTGTAG | TGGCTAGTGT | ACACCCTATG | AGTGGAAGGG | I tccattttga agtcagtgga | 4560 | |
| GTAAGCTTTA | TGCCAT1TTG | atggtttcac | AAGTTCTATT | gagtgctatt | CAGAATAGGA | 4620 |
| ACAAGGTTCT | AATAGAAAAA | gatggcaatt | TGAAGTAGCT | ataaaattag | ACTAATTACA | 4680 |
| TTGCTTTTCT | CCGAC | 4695 |
PL 195 604 B1
Claims (34)
1. Oczyszczony i wyizolowany DNA regulujący transkrypcję EF-1 a chomikawybranyz:
a) DNA obejmującego sekwencję nukleotydową pokazaną na Id. Sekw. nr 1 ,
b) DNA obejmującego część sekwencji kwasu nukleinowego pokazanej na Id. Sekw. nr1,która jest zdolna do zapoczątkowywania transkrypcji genu połączonego funkcjonalnie z regulatorowym DNA,
c) DNA obejmującego od około nukleotydu 2114 do około nukleotydu 3656 sekwencji polinukleotydowej pokazanej na Id. Sekw. nr 1 ,
d) 11,7 kb DNA regulatorowej sekwencji EF-1 a chomika w plazmidzie pDEF14 (Nr dostępu ATCC 98398),
e) DNA obejmującego w przybliżeniu 1,56 kb w kierunku 5' od początkowego kodonu ATG wId.Sekw.nr1,
f) DNA obejmującego sekwencję kwasu nukleinowego pokazaną na Id. Sekw. nr 28, i
g) sekwencji DNA hybrydyzującej z DNA przedstawionym w Id. Sekw. nr 1 w warunkach, w których ostatnie płukanie przeprowadzane jest w 65°C w buforze zawierającym około 2xSSC i około 0,1%SDS.
2. DNA według zastrz. 1 , znamienny tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową pokazanąna Id. Sekw. nr 1.
3. DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że regulatorowy DNA obejmuje część sekwencji kwasu nukleinowego pokazanej na Id. Sekw. nr 1 , która jest zdolna do zapoczątkowywania transkrypcji genu połączonego funkcjonalnie z regulatorowym DNA.
4. DNA według zastrz. 3, znamienny tym, że obejmuje od około nukleotydu 2114 do około nukleotydu 3656 sekwencji polinukleotydowej pokazanej jako Id. Sekw. nr 1.
5. Komórka gospodarza obejmująca DNA określony w zastrz. 1 , przy czym DNA nie jest połączony funkcjonalnie z sekwencjami kodującymi EF-1 a.
6. Wektor obejmujący DNA określony w zastrz. 1 , przy czym DNA nie jest połączony funkcjonalnie z sekwencjami kodującymi EF-1 a.
7. Komórka gospodarza transformowana albo transfekowana wektorem określonym w zastrz. 6.
8. Chimeryczny polinukleotyd obejmujący regulatorowy DNA EF-1 a chomika określony w zastrz. 1 , połączony funkcjonalnie z sekwencją DNA kodującą białko inne niż EF-1a chomika.
9. Chimeryczny polinukleotyd według zastrz. 8, znamienny tym, że regulatorowy DNA obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego pokazaną na Id. Sekw. nr 1.
10. Chimeryczny polinukleotyd według zastrz. 8, znamienny tym, że regulatorowy DNA obejmujeczęść sekwencji kwasu nukleinowego pokazanej na Id. Sekw. nr 1, która jest zdolna do zapoczątkowania transkrypcji genu połączonego funkcjonalnie z regulatorowym DNA.
1 1. Chimeryczny polinukleotyd według zastrz. 10, znamienny tym, że regulatorowy DNA obejmuje od około nukleotydu 2114 do około nukleotydu 3656 sekwencji polinukleotydowej pokazanej jako Id. Sekw. nr 1.
12. Chimeryczny polinukleotyd według zastrz. 8, znamienny tym, że sekwencja DNA kodująca białko koduje białko endogenne dla komórki chomika inne niż EF-1 a.
13. Chimeryczny polinukleotyd według zastrz. 8, znamienny tym, że sekwencja DNA koduje białko heterologiczne dla komórki chomika.
14. Komórka gospodarza transformowana albo transfekowana chimerycznym polinukleotydem określonym w zastrz. 8.
15. Plazmid ekspresyjny obejmujący chimeryczny polinukleotyd określony w zastrz. 8.
16. Plazmid ekspresyjny według zastrz. 15, znamienny tym, że ponadto obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego podaną w Id. Sekw. nr 28.
17. Plazmid ekspresyjny według zastrz. 16, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego przedstawiona w Id. Sekw. nr 28 położona jest w kierunku 3' względem chimerycznego polinukleotydu.
18. Komórka gospodarza transformowana albo transfekowana plazmidem ekspresyjnym określonymwzastrz.15.
19. Komórka gospodarza transformowana albo transfekowana plazmidem ekspresyjnym określonymwzastrz.16albo17.
20. Plazmid pDEF2 (Nr. dostępu ATCC 98343).
21. Plazmid pDEF14 (Nr. dostępu ATCC.98398).
PL 195 604 B1
22. Plazmid pDEF1./ICM3H.2 (Nr. dostępu ATCC.98381).
23. Plazmid pNEF1/ICM3L.3 (Nr. dostępu ATCC.98382).
24. Plazmid pDEF1/F2GH.1 (Nr. dostępu ATCC.98383).
25. Plazmid pNEF1/F2GL.1 (Nr. dostępu ATCC.98384).
26. Plazmid pDEF1/CTN.1 (Nr. dostępu ATCC.98385).
27. Plazmid pDEF2/HPH.4 (Nr. dostępu ATCC.98386).
28. Plazmid pDEF10/MDC.1 (Nr. dostępu ATCC.98387).
29. Komórka gospodarza transformowana albo transfekowana plazmidem ekspresyjnym określonym w zastrz. 20 - 28.
30. Sposób zwiększania transkrypcji genu będącego przedmiotem zainteresowania w komórce gospodarza, znamienny tym, że obejmuje etap integrowania DNA obejmującego regulatorowy DNA EF-1a chomika określony w zastrz. 1 do genomowego DNA komórki gospodarza w pozycji połączonej funkcjonalnie z interesującym genem.
31. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że integrowany DNA ponadto obejmuje sekwencję docelową.
32. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że komórką gospodarza jest komórka jajnika chomika chińskiego.
33. Sposób według zastrz. 32, znamienny tym, że interesujący gen jest endogenny dla komórki jajnika chomika chińskiego.
34. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że gen będący przedmiotem zainteresowania jest heterologiczny dla komórki jajnika chomika chińskiego i jest stabilnie zintegrowany z genomowym DNA komórki jajnika chomika chińskiego.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/847,218 US5888809A (en) | 1997-05-01 | 1997-05-01 | Hamster EF-1α transcriptional regulatory DNA |
| PCT/US1998/008906 WO1998049289A1 (en) | 1997-05-01 | 1998-05-01 | HAMSTER EF-1α TRANSCRIPTIONAL REGULATORY DNA |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL331005A1 PL331005A1 (en) | 1999-06-21 |
| PL195604B1 true PL195604B1 (pl) | 2007-10-31 |
Family
ID=25300098
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL98331005A PL195604B1 (pl) | 1997-05-01 | 1998-05-01 | Oczyszczony i wyizolowany DNA, komórka gospodarza, wektor, chimeryczny polinukleotyd, plazmidy orazsposób zwiększania transkrypcji |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5888809A (pl) |
| EP (2) | EP0920498B1 (pl) |
| JP (1) | JP2000513948A (pl) |
| CN (2) | CN100430477C (pl) |
| AT (1) | ATE318900T1 (pl) |
| AU (1) | AU742561B2 (pl) |
| BR (1) | BR9804896B1 (pl) |
| CZ (1) | CZ296544B6 (pl) |
| DE (1) | DE69833649T2 (pl) |
| DK (1) | DK0920498T3 (pl) |
| ES (1) | ES2263206T3 (pl) |
| HK (1) | HK1022719A1 (pl) |
| HU (1) | HU225764B1 (pl) |
| IL (1) | IL127897A (pl) |
| NO (1) | NO323853B1 (pl) |
| PL (1) | PL195604B1 (pl) |
| PT (1) | PT920498E (pl) |
| RU (2) | RU2249617C2 (pl) |
| SK (1) | SK285664B6 (pl) |
| WO (1) | WO1998049289A1 (pl) |
Families Citing this family (119)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8183344B2 (en) * | 1996-04-24 | 2012-05-22 | University Of Michigan | Inactivation resistant factor VIII |
| US6479256B1 (en) | 1998-03-04 | 2002-11-12 | Icos Corporation | Lectomedin materials and methods |
| KR20000046969A (ko) * | 1998-12-31 | 2000-07-25 | 이선경 | 이종 유전자 유래의 유전자 발현 조절요소를 포함하는 강력한전사 활성을 가진 진핵세포 발현벡더 |
| EP1325341A2 (en) * | 2000-10-12 | 2003-07-09 | Icos Corporation | Modulation of ligand binding/enzymatic activity of alpha beta proteins |
| WO2002050264A2 (en) * | 2000-12-18 | 2002-06-27 | Wyeth | Promoters and recombinant expression constructs |
| ATE466941T1 (de) * | 2001-07-04 | 2010-05-15 | Chromagenics Bv | Dns-sequenzen mit anti-repressor-aktivität |
| ATE500331T1 (de) * | 2002-06-14 | 2011-03-15 | Chromagenics Bv | Verfahren zur gleichzeitigen herstellung von multiplen proteinen; vektoren und zellen, die hierfür verwendung finden |
| WO2003106674A2 (en) * | 2002-06-14 | 2003-12-24 | Chromagenics B.V. | Means and methods for regulating gene expression |
| DK1573058T3 (da) * | 2002-12-18 | 2012-01-16 | Chromagenics Bv | Fremgangsmåde til forbedring af proteinproduktion |
| WO2004056986A2 (en) * | 2002-12-20 | 2004-07-08 | Chromagenics B.V. | Means and methods for producing a protein through chromatin openers that are capable of rendering chromatin more accessible to transcription factors |
| EP2380985B1 (en) | 2003-09-23 | 2014-01-01 | University of North Carolina at Chapel Hill | Cells expressing vitamin K epoxide reductase and use thereof |
| US8999667B2 (en) * | 2004-11-08 | 2015-04-07 | Chromagenics B.V. | Selection of host cells expressing protein at high levels |
| US8039230B2 (en) * | 2004-11-08 | 2011-10-18 | Chromagenics B.V. | Selection of host cells expressing protein at high levels |
| US20060195935A1 (en) | 2004-11-08 | 2006-08-31 | Chromagenics B.V. | Selection of host cells expressing protein at high levels |
| MX2007004595A (es) * | 2004-11-08 | 2007-08-15 | Chromagenics Bv | Seleccion de celulas hospederas que expresan proteinas en altas concentraciones. |
| US20060172382A1 (en) | 2004-11-08 | 2006-08-03 | Chromagenics B.V. | Selection of host cells expressing protein at high levels |
| CA2590284A1 (en) * | 2004-12-08 | 2006-06-15 | Icos Corporation | Recombinant method for making multimeric proteins |
| AU2005329450A1 (en) | 2005-03-15 | 2006-09-28 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for producing active Vitamin K-dependent proteins |
| WO2007008848A2 (en) | 2005-07-07 | 2007-01-18 | Seattle Genetics, Inc. | Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the c-terminus |
| JP5171621B2 (ja) | 2005-07-07 | 2013-03-27 | シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド | フェニルアラニン側鎖修飾をｃ末端に有するモノメチルバリン化合物 |
| US7807409B2 (en) * | 2005-10-21 | 2010-10-05 | Roche Palo Alto Llc | Method for the recombinant expression of a polypeptide |
| CA2624685C (en) | 2005-10-28 | 2014-06-03 | Ulrich Goepfert | Protein expression in rodent cells |
| EP1969127B8 (en) * | 2005-12-21 | 2017-12-13 | Aptevo BioTherapeutics LLC | Method of producing biologically active vitamin k dependent proteins by recombinant methods |
| WO2007081336A1 (en) * | 2006-01-13 | 2007-07-19 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Mammalian vectors for high-level expression of recombinant proteins |
| EP2208792B1 (en) | 2006-05-17 | 2015-05-06 | Hoffmann-La Roche AG | Polypeptide producing cells |
| US20090203077A1 (en) * | 2006-06-30 | 2009-08-13 | The Regents Of The University Of Michigan | Method of producing factor viii proteins by recombinant methods |
| AU2007269233B2 (en) * | 2006-06-30 | 2011-06-09 | Cnj Holdings, Inc. | Method of producing Factor VIII proteins by recombinant methods |
| TW200902544A (en) | 2007-03-13 | 2009-01-16 | Hoffmann La Roche | Peptide-complement conjugates |
| EP1975228A1 (en) | 2007-03-28 | 2008-10-01 | Fachhochschule Mannheim | Polynucleotides for enhancing expression of a polynucleotide of interest |
| US20100081187A1 (en) | 2007-04-26 | 2010-04-01 | Griffith Michael J | Recombinant vitamin k dependent proteins with high sialic acid content and methods of preparing same |
| US8314225B2 (en) * | 2007-06-29 | 2012-11-20 | Hoffman-La Roche Inc. | Heavy chain mutant leading to improved immunoglobulin production |
| US8771988B2 (en) | 2007-10-12 | 2014-07-08 | Hoffmann-La Roche Inc. | Protein expression from multiple nucleic acids |
| CA2705486C (en) | 2007-11-19 | 2019-04-02 | Celera Corporation | Lung cancer markers and uses thereof |
| CN102046205A (zh) | 2008-04-24 | 2011-05-04 | 凯尔特药物Peg有限公司 | 具有延长的半衰期的因子ix缀合物 |
| US8163551B2 (en) | 2008-05-02 | 2012-04-24 | Seattle Genetics, Inc. | Methods and compositions for making antibodies and antibody derivatives with reduced core fucosylation |
| EP2462237B1 (en) | 2009-08-06 | 2015-12-23 | Cmc Icos Biologics, Inc. | Methods for improving recombinant protein expression |
| DK2478107T3 (da) | 2009-09-15 | 2019-01-02 | Medimmune Ltd | Celler til transient ekspression og anvendelser deraf |
| JP5851410B2 (ja) | 2009-10-30 | 2016-02-03 | シーエヌジェイ ホールディングス、インク． | 組換えビタミンｋ依存性タンパク質の生成法 |
| EP2339009A1 (en) | 2009-12-22 | 2011-06-29 | Sandoz Ag | Cold inducible promoter sequences |
| MA34091B1 (fr) | 2010-03-31 | 2013-03-05 | Boehringer Ingelheim Int | Anticorps anti-cd40 |
| UA112062C2 (uk) | 2010-10-04 | 2016-07-25 | Бьорінгер Інгельхайм Інтернаціональ Гмбх | Cd33-зв'язувальний агент |
| PT2635601T (pt) | 2010-11-04 | 2016-09-27 | Boehringer Ingelheim Int | Anticorpos anti-il-23 |
| EP2655607A4 (en) | 2010-12-21 | 2014-05-14 | Univ North Carolina | METHOD AND COMPOSITIONS FOR PRODUCING ACTIVE VITAMIN K-DEPENDENT PROTEINS |
| EP2753644A1 (en) | 2011-09-09 | 2014-07-16 | Universiteit Utrecht Holding B.V. | Broadly neutralizing vhh against hiv-1 |
| EP3378535B1 (en) | 2011-10-28 | 2023-01-04 | Prothena Biosciences Limited | Humanized antibodies that recognize alpha-synuclein |
| CA2852994C (en) | 2011-11-16 | 2023-02-14 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Anti il-36r antibodies |
| MX2014007262A (es) | 2011-12-22 | 2014-08-01 | Hoffmann La Roche | Sistema de exhibicion de anticuerpos de longitud completa para celulas eucarioticas y su uso. |
| SI2794878T1 (sl) | 2011-12-22 | 2020-07-31 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Organizacija ekspresijskega vektorja, postopki izdelave nove proizvodne celice in njihova uporaba za rekombinantno proizvodnjo polipeptidov |
| SG11201403443WA (en) | 2011-12-22 | 2014-07-30 | Hoffmann La Roche | Expression vector element combinations, novel production cell generation methods and their use for the recombinant production of polypeptides |
| CA2863953A1 (en) | 2012-01-27 | 2013-08-01 | Neotope Biosciences Limited | Humanized antibodies that recognize alpha-synuclein |
| CN104254778A (zh) | 2012-02-10 | 2014-12-31 | 西雅图遗传学公司 | Cd30+癌症的检测和治疗 |
| US20130230901A1 (en) * | 2012-02-14 | 2013-09-05 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Process for making recombinant antidote to factor xa inhibitor |
| EP4039275A1 (en) | 2012-05-03 | 2022-08-10 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Anti-il-23p19 antibodies |
| UA118441C2 (uk) | 2012-10-08 | 2019-01-25 | Протена Біосаєнсиз Лімітед | Антитіло, що розпізнає альфа-синуклеїн |
| CA2892038C (en) | 2012-11-20 | 2021-12-28 | Darrel W. Stafford | Methods and compositions for modified factor ix proteins |
| CN105209625B (zh) | 2013-03-12 | 2019-03-29 | Cmc依科斯生技制品公司 | 使用杂合chef1启动子的改善重组蛋白表达 |
| EP2970453B1 (en) | 2013-03-13 | 2019-12-04 | Prothena Biosciences Limited | Tau immunotherapy |
| US10513555B2 (en) | 2013-07-04 | 2019-12-24 | Prothena Biosciences Limited | Antibody formulations and methods |
| RU2535871C1 (ru) * | 2013-07-10 | 2014-12-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ") | Плазмида для экспрессии в клетке китайского хомячка, клетка китайского хомячка - продуцент белка с Gla-доменом и способ получения белка с Gla-доменом |
| WO2015004633A1 (en) | 2013-07-12 | 2015-01-15 | Neotope Biosciences Limited | Antibodies that recognize islet-amyloid polypeptide (iapp) |
| WO2015004632A1 (en) | 2013-07-12 | 2015-01-15 | Neotope Biosciences Limited | Antibodies that recognize iapp |
| JP2017501848A (ja) | 2013-11-19 | 2017-01-19 | プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド | 便秘症状からのレビー小体病の免疫療法のモニター |
| EA033604B1 (ru) | 2014-01-31 | 2019-11-08 | Boehringer Ingelheim Int | Молекула анти-baff антитела, фармацевтическая композиция, содержащая эту молекулу, способы ее применения и кодирующий ее изолированный полинуклеотид |
| JP2017512772A (ja) | 2014-03-12 | 2017-05-25 | プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド | Ｌｇ１〜３に特異的な抗ラミニン４抗体 |
| TW201623331A (zh) | 2014-03-12 | 2016-07-01 | 普羅帝納生物科學公司 | 抗黑色素瘤細胞黏著分子（ｍｃａｍ）抗體類及使用彼等之相關方法 |
| JP6728053B2 (ja) | 2014-03-12 | 2020-07-22 | プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド | 抗ｍｃａｍ抗体及び関連する使用方法 |
| EP3116907A1 (en) | 2014-03-12 | 2017-01-18 | Prothena Biosciences Limited | Anti-laminin4 antibodies specific for lg4-5 |
| US10562973B2 (en) | 2014-04-08 | 2020-02-18 | Prothena Bioscience Limited | Blood-brain barrier shuttles containing antibodies recognizing alpha-synuclein |
| EP3172339A1 (en) | 2014-07-24 | 2017-05-31 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Biomarkers useful in the treatment of il-23a related diseases |
| TWI781507B (zh) | 2015-01-28 | 2022-10-21 | 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 | 抗甲狀腺素運送蛋白抗體 |
| TWI711631B (zh) | 2015-01-28 | 2020-12-01 | 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 | 抗甲狀腺素運送蛋白抗體 |
| TWI786505B (zh) | 2015-01-28 | 2022-12-11 | 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 | 抗甲狀腺素運送蛋白抗體 |
| EP3253786A4 (en) | 2015-02-06 | 2018-10-17 | The University of North Carolina at Chapel Hill | Optimized human clotting factor viii gene expression cassettes and their use |
| AU2016247921A1 (en) | 2015-04-14 | 2017-08-31 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Methods of treating diseases |
| KR20180023900A (ko) | 2015-05-12 | 2018-03-07 | 신티뮨, 인크. | 인간화된 친화성 성숙 항-FcRn 항체 |
| JP2018530540A (ja) | 2015-09-16 | 2018-10-18 | プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド | 巨細胞動脈炎、リウマチ性多発筋痛症又は高安動脈炎の処置又は予防のための抗ｍｃａｍ抗体の使用 |
| WO2017046774A2 (en) | 2015-09-16 | 2017-03-23 | Prothena Biosciences Limited | Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of giant cell arteritis, polymyalgia rheumatica or takayasu's arteritis |
| TWI733695B (zh) | 2015-09-18 | 2021-07-21 | 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 | 治療發炎性疾病之方法 |
| WO2017070167A1 (en) | 2015-10-20 | 2017-04-27 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for modified factor ix fusion proteins |
| WO2017149513A1 (en) | 2016-03-03 | 2017-09-08 | Prothena Biosciences Limited | Anti-mcam antibodies and associated methods of use |
| WO2017153955A1 (en) | 2016-03-09 | 2017-09-14 | Prothena Biosciences Limited | Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of granulomatous lung diseases |
| WO2017153953A1 (en) | 2016-03-09 | 2017-09-14 | Prothena Biosciences Limited | Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of granulomatous lung diseases |
| MX2018012410A (es) | 2016-04-15 | 2019-02-21 | Boehringer Ingelheim Int | Metodos para tratar enfermedades inflamatorias. |
| KR20190015704A (ko) | 2016-04-25 | 2019-02-14 | 신티뮨, 인크. | 인간화된 친화성 성숙 항-fcrn 항체 |
| KR20230070336A (ko) | 2016-05-02 | 2023-05-22 | 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 | 타우 인식 항체 |
| WO2017191559A1 (en) | 2016-05-02 | 2017-11-09 | Prothena Biosciences Limited | Tau immunotherapy |
| UA124148C2 (uk) | 2016-05-02 | 2021-07-28 | Протена Біосайенсіс Лімітед | Антитіла, що розпізнають тау |
| WO2017208210A1 (en) | 2016-06-03 | 2017-12-07 | Prothena Biosciences Limited | Anti-mcam antibodies and associated methods of use |
| EP3478714A2 (en) | 2016-07-02 | 2019-05-08 | Prothena Biosciences Limited | Anti-transthyretin antibodies |
| EP3478716A2 (en) | 2016-07-02 | 2019-05-08 | Prothena Biosciences Limited | Anti-transthyretin antibodies |
| EP3478715A2 (en) | 2016-07-02 | 2019-05-08 | Prothena Biosciences Limited | Anti-transthyretin antibodies |
| JP6818134B2 (ja) | 2016-09-29 | 2021-01-20 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | ポリペプチド産生細胞を選択するための改善された方法 |
| US20180105588A1 (en) | 2016-10-14 | 2018-04-19 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Methods of treating diseases |
| EP3601350A1 (en) | 2017-03-27 | 2020-02-05 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Anti il-36r antibodies combination therapy |
| BR112019022906A2 (pt) | 2017-05-02 | 2020-05-26 | Prothena Biosciences Limited | Anticorpos que reconhecem tau |
| US10793634B2 (en) | 2017-06-09 | 2020-10-06 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Anti-TrkB antibodies |
| AU2017434556A1 (en) | 2017-09-28 | 2020-04-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Dosing regimes for treatment of synucleinopathies |
| CN111801424A (zh) | 2018-01-10 | 2020-10-20 | Agc生技制品公司 | 双向chef1载体 |
| WO2019151865A1 (en) | 2018-02-05 | 2019-08-08 | Stichting Vu | Inverse agonistic anti-us28 antibodies |
| WO2019156566A1 (en) | 2018-02-12 | 2019-08-15 | Umc Utrecht Holding B.V. | Bispecific molecules comprising gamma-delta tcr and t-cell or nk cell binding domain |
| WO2019226050A2 (en) | 2018-05-24 | 2019-11-28 | Wageningen Universiteit | Novel viral anti-infective reagents |
| WO2019235923A1 (en) | 2018-06-04 | 2019-12-12 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Role for low density lipoprotein receptor-related protein 10 in progressive brain diseases |
| JP2021529754A (ja) | 2018-06-29 | 2021-11-04 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 自己免疫疾患の処置における使用のための抗ｃｄ４０抗体 |
| CN110904127A (zh) | 2018-09-18 | 2020-03-24 | 瓦赫宁恩研究基金会 | 非洲猪瘟病毒疫苗 |
| WO2020080941A1 (en) | 2018-10-16 | 2020-04-23 | Umc Utrecht Holding B.V. | Anti- low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6 antibodies |
| KR20210094610A (ko) | 2018-11-26 | 2021-07-29 | 포티 세븐, 인코포레이티드 | c-Kit에 대한 인간화 항체 |
| WO2020130838A2 (en) | 2018-12-21 | 2020-06-25 | Qvq Holding B.V. | Antibodies for preventing or treating candidiasis |
| SG11202108414UA (en) | 2019-03-03 | 2021-08-30 | Prothena Biosciences Ltd | Antibodies recognizing tau |
| WO2020185479A1 (en) | 2019-03-08 | 2020-09-17 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Anti-il-36r antibody formulations |
| KR20220019660A (ko) | 2019-04-02 | 2022-02-17 | 이뮨튠 비.브이. | 면역-자극성 조성물 및 이의 용도 |
| US11267880B2 (en) | 2019-05-09 | 2022-03-08 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Anti-Sema3A antibodies and their uses for treating eye or ocular diseases |
| TW202115112A (zh) | 2019-06-27 | 2021-04-16 | 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 | 抗-angpt2抗體 |
| TW202126685A (zh) | 2019-09-24 | 2021-07-16 | 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 | 抗nrp1a抗體及其用於治療眼或眼部疾病之用途 |
| IL298431A (en) | 2020-05-26 | 2023-01-01 | Boehringer Ingelheim Int | Anti-pd-1 antibodies |
| JP2024505674A (ja) | 2021-02-05 | 2024-02-07 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 抗ｉｌ１ｒａｐ抗体 |
| WO2023118312A1 (en) | 2021-12-22 | 2023-06-29 | Cdr-Life Ag | Anti-c3 antibodies and antigen-binding fragments thereof and their uses for treating eye or ocular diseases |
| CN114540352A (zh) * | 2022-02-16 | 2022-05-27 | 艾瑞生命科学技术(常州)有限公司 | 一种多核苷酸、载体元件及表达载体和宿主细胞及应用 |
| WO2024096735A1 (en) | 2022-10-31 | 2024-05-10 | Stichting Amsterdam UMC | Single domain anti-cd169 antibodies |
| WO2024101989A1 (en) | 2022-11-08 | 2024-05-16 | Stichting Amsterdam UMC | Activation inducible antigen receptors for adoptive immunotherapy |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3051411B2 (ja) * | 1989-03-14 | 2000-06-12 | 持田製薬株式会社 | 新規ｄｎａならびにそれを含有する発現プラスミド |
| US5266491A (en) * | 1989-03-14 | 1993-11-30 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | DNA fragment and expression plasmid containing the DNA fragment |
| DE69031172T2 (de) * | 1989-12-22 | 1998-03-12 | Applied Research Systems | Modifikation der endogenen genexpression mit hilfe eines regulatorischen elements mittels homologe rekombination |
| US5650294A (en) * | 1990-06-25 | 1997-07-22 | Basf Aktiengesellschaft | Isolated promoter and terminator of elongation factor 1-α |
| AU664847B2 (en) * | 1991-05-15 | 1995-12-07 | Cell Genesys, Inc. | Genomic modifications with homologous DNA targeting |
| CA2051085C (en) * | 1991-09-10 | 2001-08-21 | Shigekazu Nagata | Expression plasmids |
| TW402639B (en) * | 1992-12-03 | 2000-08-21 | Transkaryotic Therapies Inc | Protein production and protein delivery |
-
1997
- 1997-05-01 US US08/847,218 patent/US5888809A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-05-01 EP EP98920128A patent/EP0920498B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 SK SK118-99A patent/SK285664B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-05-01 EP EP06003954A patent/EP1676916A1/en not_active Withdrawn
- 1998-05-01 IL IL12789798A patent/IL127897A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-05-01 AT AT98920128T patent/ATE318900T1/de active
- 1998-05-01 DK DK98920128T patent/DK0920498T3/da active
- 1998-05-01 BR BRPI9804896-1B1A patent/BR9804896B1/pt active IP Right Grant
- 1998-05-01 ES ES98920128T patent/ES2263206T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 PT PT98920128T patent/PT920498E/pt unknown
- 1998-05-01 WO PCT/US1998/008906 patent/WO1998049289A1/en active Application Filing
- 1998-05-01 RU RU99101788/13A patent/RU2249617C2/ru active
- 1998-05-01 HU HU0004137A patent/HU225764B1/hu unknown
- 1998-05-01 PL PL98331005A patent/PL195604B1/pl unknown
- 1998-05-01 AU AU72770/98A patent/AU742561B2/en not_active Expired
- 1998-05-01 DE DE69833649T patent/DE69833649T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 CZ CZ0028099A patent/CZ296544B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-05-01 CN CNB988009137A patent/CN100430477C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 CN CNA2008101103936A patent/CN101570753A/zh active Pending
- 1998-05-01 JP JP10547444A patent/JP2000513948A/ja active Pending
-
1999
- 1999-01-04 NO NO19990025A patent/NO323853B1/no not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-03-15 HK HK00101582A patent/HK1022719A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-12-10 RU RU2004136574/13A patent/RU2004136574A/ru not_active Application Discontinuation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL195604B1 (pl) | Oczyszczony i wyizolowany DNA, komórka gospodarza, wektor, chimeryczny polinukleotyd, plazmidy orazsposób zwiększania transkrypcji | |
| CA2234071C (en) | Intensive homologous promoter obtained from hamsters | |
| JP2009102331A (ja) | 遍在性クロマチンオープニングエレメント（ｕｃｏｅ）を含むポリヌクレオチド | |
| JP2002525067A (ja) | レプチン誘導遺伝子 | |
| CS267192A3 (en) | Expression systems | |
| US6482937B1 (en) | Porcine Oct-4 promoter | |
| US20020199214A1 (en) | Avian lysozyme promoter | |
| AU705640B2 (en) | Compositions and methods for mediating cell cycle progression | |
| US7153685B2 (en) | Tamoxifen and 4-hydroxytamoxifen-activated system for regulated production of proteins in eukaryotic cells | |
| US5759805A (en) | CD69 transcriptional regulatory elements | |
| WO1998046756A9 (en) | Secreted protein ssp-1 compositions and therapeutic and diagnostic uses therefor | |
| CA2203613C (en) | Secreted .alpha.-amylase as a reporter gene | |
| JP2003235575A (ja) | 哺乳動物において機能的なトランスポゾン | |
| CA2259145C (en) | Hamster ef-1.alpha. transcriptional regulatory dna | |
| KR100607527B1 (ko) | 인간이 아닌 형질전이된 동물로부터의 고 전사 복합체의 정제방법 | |
| CN115322993B (zh) | 一种用于猪基因组定点整合外源基因的安全位点及用其构建猪育种群方法 | |
| US6410723B1 (en) | VDUP1 promoter and methods of use thereof | |
| US20060288437A1 (en) | Zinc finger-based drug-dependent gene regulation system | |
| CA2242382C (en) | Compositions and methods for mediating cell cycle progression | |
| MXPA98004115A (en) | Purification of more elevated order transcription compositions from transgenic animals no huma |