KR20220019660A - 면역-자극성 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법에 사용하기 위한, 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는, 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 셔플된 p10과 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제 및 약리학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 면역 자극 조성물, 및 개체를 치료하는 방법에서 이의 사용에 관한 것이다.

Description

면역-자극성 조성물 및 이의 용도
본 발명은 일반적으로 교환된(swapped) p10 및 p20 도메인을 포함하는, 구성적으로 활성인 전-염증성(pro-inflammatory) 카스파제와 같은 파이롭토시스성 (pyroptotic) 세포 사멸 유도인자를 포함하는 면역 자극성 조성물에 관한 것이다.
1. 서론
암과 병원체에 대한 효과적인 면역 반응은 악성 형질전환 또는 감염된 세포에 의해 선택적으로 발현되는 단백질 단편 (항원)에 대한 특이적인 T 세포의 활성화를 필요로 한다. 배액 (draining) 림프절에서 활성화될 때, 이러한 활성화된 T 세포가 순환계에 재진입하고, 영향을 받은 조직을 침범하여 비정상적이나 건강하지 않은 세포가 제거된다. 항원과의 이러한 첫 만남 이후, 이들 T 세포의 확장된 하위집단이 지속되며 더 손쉽게 활성화된다. 따라서, 이들 기억 T 세포는 동일하거나 유사한 병원체에 대한 재-감염에 대한 민감성을 감소시키며 유사하게 암 재발 위험을 감소시킬 수 있다. 항원 특이성과 기억은 모두 적응 면역계의 특징이다.
감염 예방을 위해, 개체는 감염성 병원체 자체로부터 유래하거나 또는 펩티드, 단백질, mRNA, 또는 DNA의 형태로 합성적으로 생성되는, 항원 제제의 투여에 의해 면역화될 수 있다. 다르게는 백신접종으로 알려진, 이러한 과정은 암의 예방 및 치료에 또한 적용될 수 있다. 선천적 면역계 활성화는 적응 면역 반응의 유도를 위한 절대적인 필수요소이다. 그러므로, 특히 합성 백신의 경우에, 백신의 효능에 중요한 것은 선천적 면역계 세포를 활성화시키는 보조제를 포함시키는 것이다 (McKee and Marrack, 2017. Curr Opin Immunol 47: 44-51).
가장 일반적으로 사용되는 보조제는 알루미늄 염으로 구성된, 알룸 (alum)이다. 보다 최근에 개발된 보조제는 병원체-관련 분자 패턴 (PAMPS)을 모방하여 선척적 면역 세포 상에 패턴 인식 수용체 (PRR)를 표적하는 경향이 있다 (Kanzler et al., 2007. Nat Med 13: 552-9; Wu, 2016. Immunology 148: 315-25; Vasou et al., 2017. Viruses 9: pii: E186). 이러한 보조제는 일반적으로 단백질 및 펩티드 백신과 잘 작동하지만, RNA 또는 DNA로 구성된 유전자 백신과는 작동하지 않는다 (Li and Petrovsky, 2016. Expert Rev Vaccines 15: 313-29).
감염성 병원체에서 유래한 최초의 백신은 18세기에 만들어졌지만, 유전자 백신은 훨씬 최근의 것이다. 최초의 DNA 백신은 20세기 말경에 개발되었고, mRNA 백신에 대한 첫 보고서는 2004년으로 기록된다 (Carralot et al., 2004. Cell Mol Life Sci 61: 2418-24). 많은 유전자 백신이 현재 임상 시험 중이지만, 인간에 사용이 승인된 것은 아직 없다. 이 분야의 주요 과제는 효과적인 보조제의 발견이다. 이러한 보조제는 통상적으로 mRNA 또는 DNA와 결합되고 사이토카인, 케모카인과 같은 면역 자극성 단백질, 및 보다 최근에는 PRR 신호전달 경로의 구성성분을 인코딩한다. 이들 보조제 중 지금까지 인간 임상 시험에서 가능성을 보인 것은 단지 두가지이다: 사이토카인 IL-12 및 GM-CSF (CSF2) (Li et al., 2017. Clin Vaccine Immunol 24: e00263-17; Richie et al., 2012. Hum Vaccin Immunother 8: 1564-84).
따라서, 유전자 백신, 즉 핵산-기반 백신에 대한 보조제로서 사용할 수 있는 선척성 면역 반응의 효과적인 유도인자를 제공할 필요가 있다.
2. 발명의 요약
본 발명은 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응, 바람직하게는 T-세포 매개 면역 반응을 자극하는 방법에 사용하기 위한 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제를 제공한다.
감염되거나 형질전환된 세포는 그들이 사멸하는 방식으로 면역계에 경고할 수 있다. 세포자멸사(apoptosis)는 면역학적으로 침묵하는 경향이 있는데, 이는 세포자멸사 세포가 염증 신호를 방출하지 않고 대식세포에 의해 신속하게 제거되기 때문이다. 대조적으로, 염증성 세포 사멸을 겪는 세포는 면역 활성화를 유도한다. 파이롭토시스(pyroptosis) 및 네크롭토시스(necroptosis)는 손상 관련 분자 패턴 (DAMPS; Wallach et al., 2016. Science 352: 51-58)의 방출을 초래하는 프로그램된 괴사의 형태로 최근에 발견되었다. 이러한 DAMPS에는 살아있는 세포에서 비-염증성 기능을 수행하는 세포내 분자 (예: ATP, 고-이동성군 박스 1 (HMGB1; high-mobility group box 1)), 및 IL-1β, IL-18 및 IL-33과 같은 사이토카인이 포함된다. 파이롭토시스성 및 네크롭토시스성 DAMPS는 세포외 환경으로 방출되는 막 파괴가 필요하고, 여기서 패턴 인식 수용체 (PRRs) 및/또는 사이토카인 수용체에 결합하여 선천적 면역 세포를 활성화시킬 수 있다.
네크롭토시스를 겪는 세포는 항-종양 면역을 유발하는 것으로 알려져 있다. 네크롭토시스성 세포를 마우스에 주입하면 이들 세포내 함유된 종양 항원에 대해 특이적인 IFNγ-, TNF- 및 IL-2-생성 T 세포가 활성화된다. 이들 T 세포는 세포독성이 있고 종양 세포를 효과적으로 제거할 수 있다 (Yatim et al., 2015. Science 350: 328-334; Aaes et al., 2016. Cell Rep 15: 274-278). 더욱이, 종양 세포에서 네크롭토시스성 작용인자 분자인, 혼합 계통 키나제 도메인-유사 (MLKL; mixed lineage kinase domain-like)의 강제 발현은 해당 종양을 제거하는데 도움이 되는 종양-특이적 T 세포를 활성화시킨다 (van Hoecke et al., 2018. Nat Commun 9: 3417). 항-종양 면역에서 네크롭토시스의 중요성은 MLKL의 바로 상류에서 이 기전의 중요 역할을 하는 수용체 상호작용 단백질 키나제 3 (RIPK3; receptor interacting protein kinase 3)의 발현이 종양 세포에서 자주 감소한다는 사실에 의해 또한 강조된다. 활성 MLKL은 세포막에 기공을 형성하고, 이때 삼투현상으로 인해 세포가 '폭발'하여 풍부한 DAMP 방출이 유도된다. 따라서, 네크롭토시스는 항-바이러스 면역에 전형적으로 적용되는 면역 반응의 한 유형인, 전-염증성 사이토카인 IFNγ 및 TNF를 특징으로 하는 세포독성 반응을 촉발함으로써 항-종양 면역을 자극할 수 있다.
반면, 파이롭토시스는 주로 살모넬라균, 진균 및 일부 바이러스와 같은 박테리아에 노출된 대식세포에서 발생한다. 파이롭토시스에 특이적인 것은 전-염증성 사이토카인 IL18 및 IL1β의 방출과 세포막에 가스더민 D (GSDMD; gasdermin D) 기공의 형성이다 (Amarante-Mendes et al., 2018. Front Immunol 9: 2379-97). GSDMD는 삼투현상으로 유도된 세포 팽윤 및 파열이 없는 파이롭토시스 구성체 (pyroptotic body)의 형성을 특징으로 하는 형태학적으로 독특한 유형의 세포 사멸을 유도한다 (Chen et al., 2016. Cell Res 26:1007-20). 사이토카인 생성과 세포 사멸은 둘 다 전-염증성 카스파제, 가장 중요하게는 카스파제-1의 활성화에 의존한다. 이 기전은 카스파제-1이 결여된 마우스가 인플루엔자 감염에 덜 민감하고 (Ren et al., 2017. Sci Rep 7: 7625), 카스파제-1의 억제가 광견병 바이러스 감염 후 마우스의 생존을 연장하기 때문에(Koraka et al., 2018. Vaccine 10.1016/j.vaccine.2018.04.002), 바이러스 감염 퇴치에 해로울 수 있다. 따라서, 네크롭토시스와 달리 파이롭토시스는 상이한 시그니처 사이토카인 프로필 (IL18, IL1β)과 형태를 가진, 제한된 세포 하위 집합 (대식세포)에서 항균 반응으로 나타난다. 그러므로, 바이러스 또는 암에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 이 기전을 표적하는 것은 명백하지 않다.
US 2014/037685, US 2018/311343, WO 2018/049014 및 WO 2018/106753을 포함하는 여러 문헌이 파이롭토시스 유도인자가 면역 반응을 자극할 수 있다는 점을 제안했다. 이러한 파이롭토시스 유도인자는 바람직하게는 CARD (ASC), 카스파제-1과 같은 염증성 카스파제, 가스더민-D 또는 가스더민 E와 같은 가스더민, 및/또는 이들 단백질 중 어느 하나의 변이체를 함유하는 세포자멸사-관련 반점(speck) 단백질이거나 또는 이로부터 선택된 단백질을 인코딩한다. 그렇지만, 이들 문헌 중 어느 것도 도메인 교환에 의해 생성된 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제를 개시하거나 제시하지 않는다.
본 발명에 따른 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제, 바람직하게는 인간의 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제는 선택적으로 단백질분해효소에 의해 절단 가능한 부위에 의해 연결된, 교환된 p20 및 p10 도메인을 포함한다. 본 발명에 따른 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제는 바람직하게는 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제-1이다. 본 발명에 따른 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제는 바람직하게는 카스파제-모집 도메인 (CARD; caspase-recruitment domain)이 결여되어 있다.
본 발명에 따른 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제, 바람직하게는 인간 카스파제-1은 바람직하게는 C135 (서열번호: 1)에 상응하는 시스테인으로부터 40개 이하의 아미노산 잔기의 거리, 바람직하게는 10개 미만의 아미노산 잔기, 예컨대 0-2개의 아미노산 잔기의 거리에 위치하는, G401 (서열번호: 1)에 상응하는 글리신을 포함한다. 본 발명에 따른 바람직한 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제는 바람직하게는 C136 (서열번호: 52)에 상응하는 시스테인으로부터 0 내지 40개 이하의 아미노산 잔기의 거리, 바람직하게는 0-10개의 아미노산 잔기, 예컨대 0-2개의 아미노산 잔기의 거리에 위치하는, G403 (서열번호: 52)에 상응하는 글리신을 포함한다. 이는 p20 도메인의 최대 16개의 N-말단 아미노산과 p10 도메인의 최대 1개의 C-말단 아미노산을 효과적으로 제거하거나 대체한다.
본 발명에 따른 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제는 바람직하게는 단백질의 N-말단 부분에 p20-p10 도메인간 링커 (IDL)가 결여되어 있다. 따라서, IDL의 남은 부분인, 카스파제 p10 도메인의 N-말단 영역이 바람직하게는 15개 아미노산, 바람직하게는 7개 아미노산, 보다 바람직하게는 2개 아미노산 보다 짧거나, 가장 바람직하게는 결여된다.
바람직한 면역 반응은 개체에 존재하는 종양 또는 감염에 대해 지시되거나 개체에서 종양 또는 감염의 발생 또는 재발을 방지하도록 유도된다. 따라서, 상기 파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제의 투여는 예방 및/또는 치료 투여를 위한 것이다.
일 구현예에서, 상기 파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제는 바람직하게는 종양내 주사에 의해 개체의 종양 내로 투여된다.
일 구현예에서, 상기 파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제는 백신의 보조제로서 국소 및/또는 전신 투여된다.
상기 파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제는, 바람직하게는 하나 이상의 면역 관문 억제제와 같은 보조 분자 및/또는 케모카인 또는 사이토카인과 같은 추가의 면역 자극 분자, 바람직하게는 표 3에 예시된 바와 같은 하나 이상의 보조 분자와 조합하여 투여된다. 바람직한 보조 분자는 면역 관문 억제제, 예를 들어 PD1 또는 이의 리간드에 대한 항체, CTLA-4에 대한 항체, 및/또는 인터루킨-12(IL12)와 같은 사이토카인 및/또는 과립구-대식세포 집락-자극 인자 (CSF2)이다.
일 구현예에서, 상기 파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제는, 바람직하게는 표 1-2 중 어느 하나에 개시된 파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제를 발현하는 발현 분자로서 제공된다.
본 발명은 또한 파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 면역-자극 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 면역 자극성 조성물은 바람직하게는 적어도 하나의 항원 또는 항원-인코딩 핵산 분자를 추가로 포함한다. 상기 면역-자극 조성물은 면역 관문 억제제와 같은 보조 면역 자극 분자 및/또는 사이토카인 및/또는 케모카인과 같은 추가의 면역 자극 분자를 더 포함할 수 있다. 바람직한 보조 분자는 표 3에 제공된 분자 중 하나 이상이거나 이를 포함한다.
본 발명에 따른 면역-자극 조성물에서, 상기 파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제는 바람직하게는 표 1-2 중 어느 하나에 나타낸 분자로부터 선택된다.
본 발명은 또한 종양 또는 감염을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 면역-자극 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 조성물을 제공하고 개체에게 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응, 바람직하게는 T-세포 매개 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다.
3. 도면 설명
도 1. 카스파제-1 작제물. CASP1_WT (서열번호: 1)은 Mus musculus Casp1의 전체 야생형 서열을 코딩하는 반면, CASP1_C285G (서열번호: 2)에서는 Casp1의 활성 부위의 시스테인 (284번 위치)이 글리신으로 대체되어, 이 부위를 효소적으로 비활성화시킨다. CASP1_RV (서열번호: 3) 및 CASP1_RV2 (서열번호: 4)에서, C-말단 p10 도메인 (서열번호: 5)은 N-말단으로 이동되어 Il1b의 카스파제-1 절단 부위 (서열번호: 7)에 의해 CARD-p20 링커 서열 (서열번호: 6)로부터 분리되며, 이는 하향 화살표로 표시되어 있다. CASP1_RV는 CASP1_RV2에서 제거된, N-말단에 p20 (5 C-말단 아미노산)의 작은 부분을 유지한다. 마지막으로 iCASP1 (서열 번호: 8)에서 CARD가 결여된 (CARD-less) 버전의 카스파제-1은 작은 SGGGS 링커 (서열 번호: 9)에 의해 FKBP (F36V-FKBP, 서열 번호: 10)으로부터의 AP1903-유도성 이량체화 도메인에 연결된다. dCASP1 (서열번호: 12)에서 F36M-FKBP (서열번호: 11)는 자발적 이량체화를 유도한다.
도 2. CASP1_RV 및 CASP1_RV2는 세포 사멸을 유도한다. B16F10 세포를 25 ng의 GFP-플라스미드 (서열 번호 13, 표지 p53)와 혼합된 25 ng의 표시된 플라스미드 (서열 번호: 14-20)로 형질감염시켰다. 형질감염 2일 후, 세포를 수확하고 사멸 세포 마커인, 7-AAD로 염색했다. (A) 카스파제-1 작제물. (B) 대조군 작제물. 관련이 없는 작은 펩티드 Reps1 (서열 번호: 20)을 코딩하는 발현 벡터는 음성 대조군으로, GSDMD_NTER (서열 번호: 14)는 양성 대조군으로 작용했다. DExD/H-Box Helicase 58 (Ddx58; FLAG_RIGI_NTER, 서열번호: 19)의 N-말단을 나타내는 작제물 또한 세포 사멸을 유도하는 것을 알 수 있다.
도 3. CASP1_RV2는 프로-IL-1β 처리 및 IL-1β 분비를 유도한다. B16F10 세포를 10 ng 빈(empty) 벡터, 프로-IL1β (서열 번호: 21, IL1B_FL, 카스파제-1 의존적), 또는 성숙 IL-1β (서열 번호: 22, IL1B_WT, 카스파제-1 독립적)와 혼합된 0.6 ng의 표시된 플라스미드로 형질감염시켰다. 표시되는 경우, 형질감염 1일 후, 세포를 10 nM AP1903으로 처리하였다. 형질감염 2일 후, IL-1β ELISA 및 LDH 방출 측정을 위해 상청액을 수집하였다. 이러한 실험 조건에서는, 유의미한 LDH 방출이 일어나지 않았기 때문에, 형질감염 중 어느 것도 세포 사멸을 초래하지 않았다는 것을 알 수 있다 (데이터 미도시).
도 4. CASP1_RV2는 T 세포 반응과 항-종양 면역을 개선시킨다. C57BL/6 마우스에 0일 째에 빈 벡터 대조군, CASP1_RV2 (서열 번호: 4) 또는 참조 보조제 CSF2 (서열 번호: 24, 10 μg)와 함께 폴리에피토프 백신 (서열 번호: 23, 10 μg)을 피내 백신접종시켰다. 백신 접종 후 (A) 6일, (B) 9일, (C) 13일 및 (D) 44일에 OVA-특이적 CD8 T-세포 반응을 사량체 염색으로 평가하였다. 마우스는 29일째에 B16-OVA 세포로 챌린지시킨 다음, 종양 성장을 추가 3개월 동안 추적하였다. E. 무-종양 생존.
도 5. 활성 형태의 Ddx58 (RIG-I)과 Gsdmdc1 (GSDMD)은 CD8 T 세포 면역을 개선시키지 않는다. C57BL/6 마우스에 10 μg 빈 벡터 대조군 (-) 또는 활성 형태의 Ddx58 (서열 번호: 19, FLAG_RIGI_NTER), 카스파제-1 (서열번호: 4, CASP1_RV2), Gsdmdc1 (서열번호: 14, GSDMD_NTER), 또는 Csf2 (서열번호: 24, CSF2)를 인코딩하는 플라스미드와 함께, 10 μg 폴리에피토프 백신 (닫힌 부호) 또는 빈 벡터 (열린 부호)로 피내 백신접종시켰다. 백신접종 후 8일째에, OVA-특이적 CD8 T 세포 반응을 사량체 염색으로 평가하였다.
도 6. 구성적으로 활성인 마우스 카스파제-1의 진행성 N-말단 절단은 최적 CASP1_RV 활성을 위해 N-말단에서 p20-p10 도메인간 링커 (IDL)의 일부를 유지하는데 필요한 요소를 드러낸다. (A) CASP1_RV의 N-말단 변이체의 도식적 표현. p10 도메인의 N-말단 서열 상류는 MVLLKDSVRDSEEDFLTDAIFEDD (CASP1_RV, 서열번호: 3), MSEEDFLTDAIFEDD (CASP1_RV2, 서열번호: 4) 및 M (CASP1_RV2_NTR, 서열번호: 38)이다. B16-F10 세포를 0.5 또는 10 ng/웰 (100 ㎕)의 표시된 카스파제-1 (또는 GSDMD N-말단, 서열 번호: 14) 및 10 ng/웰 IL-1β DNA 플라스미드로 공동 형질감염시키고, (B) IL-1β (0.5 ng/웰 카스파제-1) 및 (C) LDH 활성 (0.5 및 10 ng/웰 카스파제-1)을 2일 후 상청액에서 측정하였다.
도 7. 구성적으로 활성인 마우스 카스파제-1 (CASP1_RV2)은 야생형 카스파제-1 (CASP1_WT)보다 약 30배 더 강력하다. B16-F10 세포는 100 ㎕당 10 ng 프로-IL1β 플라스미드와 함께 표시된 양의 카스파제-1 플라스미드 (분석에서 플라스미드의 일정한 총량을 유지하기 위해 삽입물이 없는 플라스미드로 연속적으로 희석됨)로 공동-형질감염시키고, 상청액에서 (A) IL-1β 및 (B) LDH 활성을 2일 후에 평가하였다. CASP1_RV2 [서열번호: 4] 및 CASP1_WT [서열번호: 1]의 활성 부위 돌연변이는 각각 CASP1_RV2_C305G [서열번호: 39] 및 CASP1_C285G [서열번호: 2]였다.
도 8 293개의 세포를 (A) 프로-IL1β [서열번호: 37] 또는 (B) 인간 GSDMD [서열번호: 53]를 인코딩하는 10 ng/웰 플라스미드와 함께, 총 DNA 농도를 일정하게 유지하기 위해 빈 벡터 플라스미드에서 연속적으로 희석된, 표시된 농도의 인간 카스파제-1 (hCASP1) 변이체 [서열 번호: 35, 44, 49-52]로 공동-형질감염시켰다. 2일 후 상청액을 수집하여 (A) IL1β 농도 또는 (B) LDH 활성을 측정하였다.
도 9. (A) 인간 카스파제-1의 결정 구조. p10 도메인 (아미노산 317-404)의 C-말단에 위치한 Gly403과 p20 도메인 (아미노산 135-297)의 N-말단 Leu135의 근접성을 알 수 있다. Yang et al. (2018) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 115: 6792-6797로부터 변경됨. (B) 인간 및 마우스 전-염증성 카스파제의 서열 정렬. mCasp1-C135/hCASP1-C136 (hCASP1-L135 옆) 및 mCasp1-G401/hCASP1-G403 아미노산 잔기의 보존을 알 수 있다.
4.1 정의
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "세포 사멸"은 생물학적 세포가 기능을 수행하는 것을 중단하는 사건이다. 이는 자연적 과정의 결과일 수 있거나, 질병, 국소적 손상, 또는 세포를 포함하는 유기체의 사멸과 같은 요인의 결과일 수 있다. 세포자멸사 및 파이롭토시스를 포함한, 다양한 유형의 세포 사멸은 종종 형태학적 기준에 의해 정의된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "프로그램된 세포 사멸"은 활성 예정된 분자 기전에 의해 관여된 임의의 유형의 세포 사멸을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "세포자멸사 (apoptosis)"는 세포의 라운딩-업 (rounding-up), 위족 (pseudopode)의 수축, 세포 부피의 감소 (pyknosis), 염색질 응축, 핵 단편화 (karyorrhexis) 및 원형질막 수포화를 수반하는 세포 사멸을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "괴사 (necrosis)"는 세포 손상 또는 병원체에 의한 침윤에 의한 프로그램되지 않은 세포 사멸을 의미한다. 괴사는 세포 부피의 증가, 세포 소기관의 팽창, 원형질막의 파열 및 이에 따른 세포내 내용물의 손실을 특징으로 한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 “네크롭토시스 (necroptosis)"는 유사 키나제 (MLKL)와 같은 혼합 계통 키나제 도메인의 활성화 및 원형질막의 급성 투과화를 수반하는, 카스파제-독립적 방식에 의한 프로그램된 형태의 세포 사멸을 의미한다. 네크롭토시스는 항-바이러스 방어 기전으로 작용하여 바이러스 카스파제 억제제의 존재하에 세포가 "세포 자살"을 겪도록 하여, 바이러스 복제를 제한할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "파이롭토시스 (pyroptosis)"는 염증성 카스파제의 활성화가 가스더민의 절단 및 세포막의 투과를 유도하는 프로그램된 형태의 세포 사멸을 의미한다. 또한, 활성화된 카스파제는 프로-인터루킨 1 베타 (proIL1β) 및 프로-IL18 (pro-IL18)과 같은 프로-사이토카인을 생물학적 활성 형태로 절단할 수 있으며, 이후 이는 세포 투과화의 결과로 방출된다. 파이롭토시스는 세포내 병원체에 감염되면 발생한다. 파이롭토시스는 세포내 복제 니쉬 (niches)를 제거하고 숙주의 방어 반응을 향상시켜 다양한 박테리아 및 바이러스 감염의 신속한 제거를 촉진한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "T-세포 매개 면역 반응"은 세포내 병원체, 예를 들어 바이러스 또는 박테리아에 감염된 세포를 검출하고 파괴하는 역할을 하는 보호 기전을 의미한다. T-세포 매개 면역 반응은 또한 종양 세포의 파괴에 기여할 수 있다. 주요 플레이어는 인터페론 감마 (IFN-γ) 및 종양 괴사 인자 (TNF)와 같은 염증성 사이토카인을 생성하는, CD4+ 및 CD8+ T 세포이다. 또한, CD8+ T 세포는 감염 및/또는 형질전환된 세포의 세포자멸사를 유도하는 능력이 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "CARD를 함유하는 세포자멸사-관련 스펙형 단백질 (ASC)"은 두 개의 단백질-단백질 상호작용 도메인: N-말단 PYRIN-PAAD-DAPIN 도메인 (PYD) 및 C-말단 카스파제-모집 도메인 (CARD)으로 구성된 어댑터 단백질 (인간 단백질 UniProt: Q9ULZ3)을 의미한다. ASC를 인코딩는 인간 유전자는 PYCARD (HGNC: 16608; Entrez Gene: 29108; Ensembl: ENSG00000103490)로 명명된다. 활성화된 ASC는 파이롭토시스의 핵심 매개체이며 카스파제-1과 같은 염증성 카스파제의 활성화를 위한 스캐폴드 역할을 한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "카스파제-1"은 시스테인-아스파르트산 단백질분해효소 (카스파제) 패밀리의 일원인 단백질 (인간 단백질 UniProt: P29466)을 의미한다. 카스파제는 활성 효소를 형성하기 위해 이량체화되는 크고 작은 2개의 하부단위를 생성하기 위해 보존된 아스파트르산 잔기에서 단백질분해 처리를 거치는 비활성 전구효소로서 존재한다. 카스파제-1을 인코딩하는 인간 유전자는 CASP1 (HGNC: 1499; Entrez Gene: 834; Ensembl: ENSG00000137752)로 명명된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "가스더민 D"는 염증성 카스파제에 의해 N-말단 및 C-말단 부분으로 절단되는 단백질을 의미한다. 절단 후, N-말단 부분은 원형질막으로 이동하고 기공을 형성하여, 이에따라 성숙 인터루킨 (IL) 1B 및 IL18의 방출을 촉진하고 파이롭토시스를 유발한다. 전장 가스더민 D는 484개의 아미노산 (인간 단백질 UniProt: P57764)을 포함하며, 이 중 아미노산 잔기 1-275는 N-말단 부분을 구성하고, 아미노산 잔기 276-484는 C-말단 부분을 구성한다. 가스더민 D를 인코딩하는 인간 유전자는 GSDMD (HGNC: 25697; Entrez Gene: 79792; Ensembl: ENSG00000104518)로 명명된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "염증성 카스파제"는 파이롭토시스를 유도할 수 있는 카스파제를 의미한다. 상기 염증성 카스파제는 바람직하게는 하나 이상의 카스파제-1, 카스파제-4, 카스파제-5 및 카스파제-12로부터 선택된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "단백질 변이체"는 내인성 단백질과 유사한 활성을 갖는 단백질을 의미한다. 단백질 변이체는 단백질의 활성 부분, 또는 상동이지만 동일하지 않은 단백질 또는 이의 부분일 수 있다. 상기 상동성 단백질 또는 이의 부분은 활성이고, 바람직하게는 상응하는 인간 단백질과 70% 이상 동일, 보다 바람직하게는 상응하는 인간 단백질과 적어도 80% 동일, 예컨대 90% 이상 동일, 95% 이상 동일 또는 99% 이상 동일하다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 용어 "동일성 %"는 단백질 변이체가 단백질의 활성 부분을 의미하는 경우를 제외하고, 단백질의 전장에 걸쳐 결정된 바와 같은 동일성 %를 의미한다.
바람직한 단백질 변이체는 활성 또는 유도성 단백질이다. ASC, 카스파제-1 및 가스더민 D의 바람직한 단백질 변이체는 표 1 및 2에 제시된다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "활성 또는 유도성 단백질"은 활성화 필요없이 우세하게 활성인 단백질을 의미하거나, 또는 이의 활성이 예를 들어 과발현, 전사 활성화 또는 이량체화에 의해 유도될 수 있는 단백질을 의미한다. 유도성 전사 활성화의 예는 테트라사이클린-제어 유전자 발현 시스템에 의해 제공된다 (Yamada et al., 2018. Cell Rep 25: 487-500.e6). 유도성 이량체화의 예는 박테리아와 식물의 피토크롬과 크립토크롬의 상호작용 도메인을 기반으로 하는 광학 이량체 시스템(optical dimerizer system)에 의해 제공된다. 이러한 상호작용 도메인의 예는 애기장대 크립토크롬 2(CRY2; Arabidopsis thaliana cryptochrome 2) 및 CRY2-상호작용 염기성 헬릭스-루프-헬릭스(Helix-Loop-Helix) (CIB1; Taslimi et al., 2016. Nature Chem Biol 12: 425-430), 및 FK506-결합 단백질 (FKBP) 및 라파마이신에 의해 이량체화되도록 유도될 수 있는, mTOR의 FKBP-라파마이신 결합 (Frb) 도메인 (Kohler and Bertozzi, 2003. Chem Biol 10:1303-11), 및 Shield 1 (Banaszynski et al., 2006. Cell 126: 995-1004)과 같은 이의 변이체이다. 상업적으로 이용가능한 시스템은 iDimerize Inducible Homodimer System (Takara, Kusatsu, Japan)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항원"은 적응 면역계, 즉 B 세포 및/또는 T 세포에 의해 특이적으로 인식될 수 있는 분자를 의미한다. 항체 또는 T-세포 수용체에 의해 결합되는 항원 내의 서열을 에피토프라고 지칭한다. 바람직한 항원은 네오-에피토프, 박테리아 및 바이러스와 같은 병원체로부터의 에피토프, 및/또는 자연에서 발생하지 않는 합성 에피토프를 포함하는, 암에서 고도로 발현되거나 이에 특이적인 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "네오-에피토프"는 아미노산 코딩 서열을 변경하는 비-상동성 체세포 DNA 돌연변이를 통해 발생하는 에피토프를 의미한다. 바람직한 T-세포 에피토프는 8-20개의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 8-13개의 아미노산 잔기를 포함한다. 바람직한 항원은 2-50개, 바람직하게는 5-25개 개별 에피토프, 바람직하게는 각각이 8-40개 아미노산 잔기의 서열 내에 포함되는, 폴리에피토프이거나 이를 포함한다. 폴리에피토프의 개별 에피토프는 바람직하게는 1-10개 아미노산 잔기의 스페이서 (spacer) 서열에 의해 대체될 수 있다.
상기 항원은 또한 바람직하게는 GGVADLIKKFESISKEE (Riedl et al 2008, Nat Methods. 5:605)와 같은 G-액틴 또는 F-액틴 결합 서열을 포함한다. 액틴은 사멸하는 세포에 의해 유리되고 교차 프라이밍 (cross-priming) CD8 T 세포 반응 (Schulz et al. 2018, Cell Reports 24:419-428)에 중요한, 통상적인 유형 1 DC (cDC1s; Ahrens et al. 2012, Immunity 36: 635-645; Zhang et al. 2012. Immunity 36: 646-657) 상의 수지상 세포 자연 살해자 렉틴 그룹 수용체 1 (DNGR-1; Dendritic cell Natural killer lectin Group Receptor 1)에 결합한다. 그러므로 액틴 또는 액틴 결합 서열의 포함은 cDC1에 의한 CD8 T 세포의 더 효율적인 교차 프라이밍을 초래할 수 있고, 따라서 면역 반응을 더 효과적으로 자극할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "보조 분자 (accessory molecule)"는 면역 관문 (checkpoint) 억제제, 및 케모카인 및/또는 사이토카인과 같은 추가 면역 자극 분자를 포함하는, T-세포 매개 면역 반응을 촉진할 수 있는 분자를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "면역 관문 억제제"는 면역 세포와 다른 세포 또는 사이토카인 간의 억제 상호작용을 차단하여 암 세포의 사멸을 증가시킬 수 있는 분자를 의미한다. 관문 상호작용 분자의 예는 PD-1/PD-L1 및 CTLA-4/B7-1/B7-2이다. 바람직한 면역 관문 억제제는 PD-1과 PD-L1 간의 상호작용을 차단하는 분자이다. PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용을 차단하는 상기 분자는 바람직하게는 PD1에 대한 항체 및/또는 PDL1에 대한 항체이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "추가 면역 자극 분자"는 세포독성 T-림프구 유도와 같은 T-세포 매개 면역 반응을 촉진하는 분자를 의미한다. 이러한 분자는 전-염증성 사이토카인, 예를 들어 표 3에 개시된 바와 같은, IL-1β, IL-6, IL-12와 같은 인터루킨 (IL-), 과립구-대식세포 집락 자극 인자 (CSF2; granulocyte-macrophage colony stimulating factor) 및 종양 괴사 인자 (TNF), 단핵구 화학유인 단백질 또는 MCP-1과 같은 케모카인을 포함한다. 바람직한 다른 면역 자극 분자는 IL-12, IL-23, IL-27 및/또는 IL-35와 같은 IL-12 패밀리 (계열) 일원 및/또는 CSF2이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "유전자적 (genetic) 백신" 또는 유전자 (gene) 백신은 면역 반응에 대해 지시되는 항원을 인코딩하는 하나 이상의 RNA 또는 DNA 핵산 서열을 포함하는 백신을 의미한다. 세포 면역 반응을 유도하는 유전자 백신은 예를 들어 약독화된 병원성 박테리아 또는 바이러스와 관련된 위험을 회피하면서 특정 세포 반응을 생성하는 수단을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "백신"은 면역 자극 분자, 바람직하게는 상기 분자에 대한 면역 반응을 자극하는 항원을 의미한다. 상기 면역 반응은 바람직하게는 면역 시스템이 작용제를 공격하도록 자극함으로써 상기 면역 자극 분자를 포함 및/또는 발현하는 작용제에 대해 능동 면역을 부여한다. 백신이라는 용어는 면역-자극 분자 및 보조제를 포함하는 조성물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "전신 투여"는 예를 들어 정맥내, 복강내, 비강내, 피내, 경피 또는 근육내 투여와 같은 비경구 투여를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "국소 투여"는 예를 들어 피부, 눈, 점막, 또는 흡입을 통한 투여와 같은 신체 표면에 대한 국소 투여를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, "교환된 (swapped)"이라고도 하는 용어 "셔플된 (shuffled)"은 보존된 도메인의 순서가 변경된 재조합 단백질을 의미한다. 셔플되거나 교환된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 카스파제는 p10 도메인이 p20 도메인에 대한 N-말단인 재조합 카스파제이다.
4.2 파이롭토시스 유도인자로서의 단백질
일 구현예에서, 파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 단백질분해효소 절단가능 부위에 의해 선택적으로 연결된, 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는, 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제가 숙주 세포에서 발현되는 단백질로서 제공된다. 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제는 바람직하게는 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제-1이다.
인간 카스파제-1 서열 (UniProt accession code P29466)을 기반으로, 카스파제-1은 프로펩티드 (propeptide)로서 생성된다. 인간 카스파제-1 (서열번호: 52)은 아미노산 잔기 1에서 아미노산 잔기 92까지 카스파제 모집 도메인 (CARD; 서열번호: 54)을 함유한다. 잔기 93-119는 CARD-도메인 링커 (CDL; 서열번호: 55)로 또한 알려진 CARD와 p20 도메인 사이의 링커를 구성한다. p20 하위집단 도메인 (서열번호: 56)은 아미노산 잔기 120에서 아미노산 잔기 297까지 뻗어 있고 Cys285 주위에 효소 활성 부위를 함유한다. p20 도메인은 아미노산 잔기 298에서 아미노산 잔기 316까지의 작은 p20-p10 도메인간 링커 (IDL; 서열번호: 57), 및 아미노산 잔기 317부터 아미노산 잔기 404까지의 p10 하위집단 (서열번호: 58)으로 이어진다.
N-말단 CARD 도메인을 보유하는 활성 카스파제에는 CARD 도메인이 필요하다는 점이 제시되었다 (Boucher et al., 2018. J Exp Med 215: 827-840). 놀랍게도, 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 본 발명에 따른 바람직한 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제는 바람직하게는 카스파제-모집 도메인 (CARD)이 결여되어 있다.
상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제는, 인간 세포자멸사-유도 집행자 카스파제-3 및 -6의 구성적으로 활성인 형태를 기반으로 하였다 (Srinivasula et al., 1998. J Biol Chem 273: 10107-11). 이 문헌에 설명된 바와 같이, 예를 들어 활성 카스파제-3의 설계에서, N-말단 p20 및 C-말단 p10 도메인은 교환되고 짧은 (8AA) 카스파제-3 절단 부위에 의해 분리된다. 몇 개의 p20 아미노산을 포함하는, p10의 상류 서열 일부 또한 이 교환에 의해 이동되었다. 따라서, 생성된 활성 카스파제의 N-말단은 4개의 p20 아미노산으로 시작하여 작은 p20-p10 도메인간 링커 (IDL)와 p10으로 이어졌다 (Srinivasula et al., 1998. J Biol Chem 273: 10107-11).
주목할 점은 효소적으로 비활성인 프로-카스파제-3이 이미 도메인간 링커 (IDL)의 절단 시 형태를 변경하는 안정적인 이량체이며, 이는 IDL을 절단하는 스프링-로딩된 (spring-loaded) 기전이 스트레인 (strain)을 방출시켜 효소가 활성 형태로 재배열되는 것을 가능하게 한다는 점을 나타낸다. 대조적으로, 카스파제-1은 활성화를 위해 IDL의 절단과 이량체화를 필요로 한다. 따라서, 구성적으로 활성인 카스파제-1이 p10 및 p20 도메인의 셔플링에 의해 생성될 수 있는지 여부를 조사하였다.
구성적으로 활성인 마우스 염증성 카스파제-1 (CASP1_RV, 서열번호: 3)을 Srinivasula et al., 1998 (Srinivasula et al., 1998. J Biol Chem 273: 10107-11)에 기술된 바와 같이 생성하였다. 따라서 마우스 CASP1_RV의 N-말단은 5개의 p20 아미노산과 IDL로 시작되었다. 그렇지만, 이 N-말단이 더 점진적으로 결여된 3개의 CASP1_RV 변이체를 시험한 결과, CASP1_RV2 [서열번호: 4]에서 N-말단 p20 잔여물의 제거가 증가했지만, CASP1_RV2_NTR [서열번호: 38]에서 IDL의 추가 제거가 CASP1_RV의 활성을 감소시키는 것으로 나타났다. 다시 말해, 가장 활성인 CASP1_RV2 변이체는 N-말단에서 대부분의 고도로 음으로 하전된 IDL 서열 SEEDFLTDAIFEDD를 유지했다. 야생형 마우스 카스파제-1 (CASP1_WT)과 비교하여 CASP1_RV2는 시험관 내 분석에서 약 30배 더 강력했다. 따라서, 카스파제-1의 CARD 도메인의 존재와 활성화 기전의 차이와 같은 인간 카스파제-3과 마우스 카스파제-1의 차이에도 불구하고, Srinivasula 접근 방식은 실제로 구성적으로 활성인 마우스 카스파제-1을 생성했다.
구성적으로 활성인 인간 카스파제-1 변이체 (hCASP1_RV2, 서열번호: 35)의 설계는 마우스 CASP1_RV2를 기반으로 했으며, 따라서 도메인간 링커 GNLSLPTTEEFEDD의 14개 아미노산으로 또한 시작되었다. 놀랍게도, 마우스 CASP1_RV2와 현저하게 대조적으로, p10 (hCASP1_RV2_NTR, 서열번호: 49)의 상류에 있는 모든 N-말단 잔기를 제거하는 것은 이의 활성을 크게 증가시켰다.
따라서, 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 바람직한 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제는 p10 도메인 앞에 IDL 서열에서 하나 이상의 음으로 하전된 아미노산 잔기 D 및 E가 결여된, 바람직하게는 도메인간 링커 SVGVSGNLSLPTTEEFEDD, 바람직하게는 완전한 도메인간 링커 SVGVSGNLSLPTTEEFEDD가 결여된, 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 구성적으로 활성인 전염증성 카스파제-1이다.
셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 바람직한 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제에서, 개시 코돈인 ATG는, 바람직하게는 p10 서열 앞에, 바람직하게는 p10 서열 바로 앞에 위치한다.
셔플된 p10과 p20 도메인 사이의 개재 서열 (intervening sequence)은 유동적인 것으로 나타난다. 활성 형태의 카스파제-1의 결정 구조 (Yang et al., 2018. Proc Natl Acad Sci USA 115: 6792-6797)는 p10 도메인의 C-말단과 p20 도메인의 N-말단 사이의 간격이 작음을 제안하는 것으로 보인다. 셔플된 p10과 p20 도메인 [서열 번호: 40-43, 45-47]을 포함하는 마우스 및 인간 카스파제-1의 이 영역에서 아스파르트산 단백질분해효소 부위를 제거하는 것은, 프로-IL1β를 처리하는 능력에 영향을 미치지 않으며, 이는 자가단백질분해가 이의 활성에 기여하지 않음을 나타낸다 (데이터 표시되지 않음). 오히려, 이 영역은 단지 유동적인 링커 역할을 하는 것으로 나타났다. 사실상, 링커의 크기를 9개의 아미노산으로 줄이는 것은, 예상대로, 중립적인 사건이 아니었지만, 놀랍게도 더 작은 링커에서 자가단백질분해 표적 부위의 존재와 상관없이, hCASP1_NTR의 활성이 증가되었다. 야생형 인간 카스파제-1과 비교하여, 생성된 hCASP1_NTR_GSL [서열 번호: 50]은 시험관내 분석에서 약 30배 더 강력했다. 따라서, 다시한번 마우스 카스파제-1과 대조적으로, p10 및 p20 도메인을 교환하는 것은 인간 카스파제-1의 활성을 유의미하게 증가시키지 않았다. 그렇지만, N-말단에서 IDL-잔여물을 제거하고 교환된 p10 및 p20 도메인 사이의 링커 크기를 줄이면, 예상밖으로 구성적으로 활성인 인간 카스파제-1이 생성되었다.
셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 바람직한 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제는 C135 (서열번호 :1)에 상응하는 시스테인으로부터 0 내지 40개의 아미노산 잔기 거리에, 바람직하게는 1-10개의 아미노산 잔기 거리에 위치하는 G401 (서열번호: 1)에 상응하는 글리신을 포함한다. 본 발명에 따른 가장 바람직한 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제는 G401과 C135 잔기 사이에 감소된 거리를 가지며 따라서 p10과 p20 사이에 링커가 결여되어 있다.
서열번호: 1은 마우스 카스파제-1 서열에 상응한다. 당업자는 상기 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "상응하는"이 상이한 카스파제-1 서열의 등가 아미노산 잔기가 상이한 카스파제의 동일한 위치의 아미노산 잔기가 아닐 수 있다는 점을 나타낸다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 마우스 C135는 인간 C136에 상응한다. 유사하게, 마우스의 G401은 인간 G403에 상응한다. 따라서, 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 바람직한 구성적 인간 활성 전-염증성 카스파제-1은 C136에 상응하는 시스테인으로부터 0 내지 40개의 아미노산 잔기의 거리, 바람직하게는 0-10개의 아미노산 잔기 거리에 위치하는 G403에 상응하는 글리신을 포함한다. 본 발명에 따른 가장 바람직한 구성적으로 활성인 인간 전-염증성 카스파제-1은 G403과 C136 잔기 사이에 감소된 거리를 가지며 따라서 셔플된 p10 및 p20 도메인 사이에 링커가 결여되어 있다.
상기 링커는 약 1개 아미노산 잔기 내지 약 40개 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 약 35개 아미노산 잔기, 예컨대 30개 아미노산 잔기, 20개 아미노산 잔기, 15개 아미노산 잔기, 10개 아미노산 잔기, 예컨대 2개 아미노산 잔기를 포함하는 링커 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 링커 폴리펩티드 서열의 일부 바람직한 예는 Gly-Ser 링커, 예를 들어 WO 99/42077에 기재된 바와 같은, 예를 들어 (Gly4 Ser)3, (Gly4 Ser)7 또는 (Gly3 Ser2)3, 및 예를 들어 WO 06/040153 및 WO 06/122825에 기재된 GS30, GS15, GS9 및 GS7 링커를 포함한다.
이종 단백질 생산을 위해 일반적으로 사용되는 발현 시스템은 대장균(E. coli), 바큘로바이러스 (baculovirus), 효모, 중국 햄스터 난소 세포 (CHO), 인간 배아 신장 (HEK) 세포 및 HEK293T, HEK293E, HEK-293F 및 HEK-293FT를 포함한 HEK293 세포 (Creative Biolabs, NY, USA)를 포함하는 이들의 유도체, 및 PER.C6® 세포 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)를 포함한다. 이종 시스템에서 재조합 단백질의 발현 효율은 전사 수준과 형질번역 수준 둘 모두를 포함하는 많은 요인에 의존한다.
상기 파이롭토시스 유도인자, 예를 들어 ASC, 카스파제-1 및/또는 가스더민 D, 또는 이들의 변이체, 바람직하게는 활성 또는 유도성 변이체, 더욱 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제로부터 선택되는 단백질은 원핵세포, 바람직하게는 대장균, 진균, 가장 바람직하게는 사상 진균 또는 효모, 예컨대 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 또는 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 예컨대 HEK 세포 및 이의 유도체를 이용하여 생성될 수 있다. 포유동물 세포에서의 발현을 위한 상업적 시스템, 예를 들어 Expi293 포유동물 일시적 단백질 발현 시스템 (Thermo Fisher Scientific, Waltham (MA) USA)이 상업적으로 이용 가능하다.
사상 진균에서 파이롭토시스 유도인자의 생성은 바람직하게는 본원에 참조로 포함된, Joosten et al., 2005. J Biotechnol 120:347-359에 설명된 바와 같이 수행된다.
피치아 파스토리스에서 파이롭토시스 유도인자의 생성은 바람직하게는 본원에 참조로 포함된, Rahbarizadeh et al., 2006. J Mol Immunol 43:426-435에 설명된 바와 같이 수행된다.
HEK 세포 및/또는 이의 유도체에서 파이롭토시스 유도인자의 생성은 바람직하게는 Thomas and Smart, 2005. J Pharmacol Toxicol Methods 51: 187-200, 및/또는 Lin et al., 2015. PLOS ONE 10: e0123562에 설명된 바와 같이 수행된다.
상기 파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제는 바람직하게는 관심 세포에 상기 파이롭토시스 유도인자를 인코딩하는 핵산을 제공함으로써 생성된다. 상기 핵산, 바람직하게는 DNA는 바람직하게는 당업자에게 공지된 바와 같이, 폴리머라제, 제한 효소 및 리가제의 사용을 포함하는, 재조합 기술에 의해 생성된다. 대안적으로, 상기 핵산은, 당업자에게 공지된 바와 같은, 인공 유전자 합성에 의해, 예를 들어 부분적으로 또는 완전히 중첩되는 올리고뉴클레오티드의 합성에 의해, 또는 유기 화학 및 재조합 기술의 조합에 의해 제공된다. 상기 핵산은 바람직하게는 선택된 세포 또는 세포주에서 파이롭토시스 유도인자의 발현을 향상시키기 위해 코돈 최적화된다. 추가 최적화는 바람직하게는 잠복 스플라이스 (cryptic splice) 부위의 제거, 잠복 폴리A 꼬리의 제거 및/또는 mRNA의 바람직하지 않은 폴딩 (folding)을 초래하는 서열의 제거를 포함한다. 스플라이스 부위가 측면에 있는 인트론의 존재는 진핵 세포의 핵으로부터의 방출을 촉진할 수 있다. 또한, 핵산은 바람직하게는 파이롭토시스 유도인자가 세포 밖으로 원핵생물의 주변세포질 또는 성장 배지로 분비되기 위한 단백질 방출 신호를 인코딩하여, 파이롭토시스 유도인자가 효율적으로 정제되도록 한다.
파이롭토시스 유도인자의 정제 방법은 당업계에 공지되어 있으며 일반적으로 이온 교환과 같은 크로마토그래피를 기반으로 하여 오염물질을 제거한다. 오염물질 외에도, 분해 산물 및 응집체와 같은 생성물 자체의 원치않는 파생물을 또한 제거할 필요가 있을 수 있다. 적합한 정제 공정 단계는 Berthold and Walter, 1994 (Berthold and Walter, 1994. Biologicals 22: 135-150)에 제공된다.
대안으로서 또는 추가로, 파이롭토시스 재조합 유도인자는 유전공학적으로 특정 태그로 표지되어, 단백질이 태그에 특이적인 컬럼에 부착되도록 하여 불순물로부터 분리되도록 할 수 있다. 그후, 정제된 단백질을 친화성 컬럼에서 디커플링 시약으로 교환한다. 이 방법은 재조합 단백질을 정제하기 위해 점점 더 많이 적용되고 있다. 히스티딘 태그와 같은 통상의 단백질 태그는 태그를 특이적으로 캡처하는 친화성 컬럼 (예: 히스티딘 태그용 Ni-IDA 컬럼)과 함께 사용되어 다른 불순물로부터 단백질을 분리한다. 이후, 특정 태그 (예: 히스티딘 태그의 경우 이미다졸)에 따른 디커플링 시약을 사용하여 컬럼에서 단백질을 교환한다. 전통적인 정제 방법과 비교할 때 이 방법은 더 특이적이다. 적합한 추가적인 태그는 Chatterjee, 2006. (Cur Opin Biotech 17, 353-358)에 개시된 바와 같은, c-myc 도메인, 혈구응집소 태그 및 말토스-결합 단백질, 글루타티온-S-트랜스퍼라제, 말토스-결합 단백질, FLAG 태그 펩티드, 비오틴 수용체 펩티드, 스트렙타비딘-결합 펩티드 및 칼모듈린-결합 펩티드를 포함한다. 이들 태그를 사용하는 방법은 당업계에 공지되어 있고 파이롭토시스 유도인자를 정제하는데 사용될 수 있다.
4.3 파이롭토시스 유도인자로서의 발현 작제물
파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 본 발명에 따른 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제를 인코딩하는 발현 작제물이 추가로 제공된다. 상기 발현 작제물은 바람직하게는 강한 프로모터, 예를 들어 바이러스 기원 (예: 인간 사이토메갈로바이러스) 또는 포유동물 세포와 같은 세포에서 고도로 발현되는 유전자로부터 유래된 프로모터와 같은 높은 발현 수준을 위한 수단을 포함한다 (Running Deer and Allison, 2004 Biotechnol Prog 20: 880-889, 미국 특허 제5888809호). 작제물은 바람직하게는 당업자에게 공지된 바와 같은, 예를 들어 글루타민 합성효소의 발현 또는 적합한 수용 세포에서 벡터의 증폭을 위한 디히드로폴레이트 환원효소의 발현과 같은 선택 시스템을 포함한다.
상기 작제물은 바이러스 벡터, 바람직하게는 분열 및 비-분열 암 세포를 형질도입할 수 있는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 바람직하게는 재조합 아데노-연관 바이러스 벡터, 단순 포진 바이러스-기반 벡터, WO2011128704에 기술된 바와 같은 변형된 백시니아 앙카라-기반 벡터와 같은 수두 바이러스-기반 벡터, 또는 인간 면역결핍 바이러스-기반 벡터와 같은 렌티바이러스-기반 벡터이다. 상기 바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스-기반 벡터와 같은 렌티바이러스 기반 벡터, 또는 말로니 마우스 백혈병 바이러스 (MoMLV; Moloney Murine Leukemia Virus) 기반 벡터, 비장 중심 형성 바이러스 (SFFV; Spleen-Focus Forming Virus), 골수 증식성 육종 바이러스 (MPSV; Myeloproliferative Sarcoma Virus) 또는 마우스 줄기 세포 바이러스 (MSCV)와 같은 감마-레트로바이러스-기반 벡터와 같은 레트로바이러스-기반 벡터이다. 바람직한 레트로바이러스 벡터는 SFG 감마 레트로바이러스 벡터이다 (Rivi
Figure pct00001
re et al., 1995. PNAS 92: 6733-6737).
감마-레트로바이러스-기반 벡터를 포함하는 레트로바이러스는, 그룹 항원 폴리프로틴 (Gag)-폴리머라제 (Pol) 및/또는 엔벨롭 (Env) 단백질을 제공하는 적합한 보완 세포에 패키징될 수 있다. 적합한 패키징 세포는 인간 배아 신장 유래 293T 세포, 피닉스 (Phoenix) 세포 (Swift et al., 2001. Curr Protoc Immunol, Chapter 10: Unit 10 17C), PG13 세포 (Loew et al., 2010. Gene Therapy 17: 272-280) 및 Flp293A 세포 (Schucht et al., 2006. Mol Ther 14: 285-92)이다.
바람직한 발현 작제물은 파이롭토시스 유도인자의 생체내 발현을 위한 비-바이러스 발현 작제물, 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제이다. 비-바이러스 벡터에는 원형 또는 선형 DNA 분자 및 메신저 RNA와 같은 RNA 분자를 포함한다. 비-바이러스 발현 작제물은 리포솜, 리포플렉스 또는 폴리플렉스에 패키징될 수 있고/있거나 분자 접합체 (molecular conjugate)로서 제공될 수 있다. 플라스미드 박테리아 DNA 서열이 없는 미니서클 DNA 분자 또는 선형 DNA 분자는 시험관내에서 생성될 수 있고 생체내에서 높은 수준으로 파이롭토시스 유도인자를 발현할 수 있다.
상기 발현 작제물은 사이토카인과 같은 다른 면역 자극 분자를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함할 수 있다.
대안으로서 또는 추가로서, 상기 발현 작제물은 다른 면역 자극 분자를 코딩하는 발현 작제물과 조합될 수 있다.
4.4 유도된 파이롭토시스 적용
본 발명은 개체에 상기 파이롭토시스 유도인자를 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 면역 반응, 바람직하게는 T-세포 매개 면역 반응을 자극하는 방법에 사용하기 위한 파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제를 제공한다. 상기 파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제는, 바람직하게는 질병을 앓고 있거나 질병에 걸릴 위험이 있는 인간에서 예방 또는 치료 투여에 사용된다. 상기 질병에는 홍역, 풍진, 콜레라, 수막구균병, 인플루엔자, 디프테리아, 볼거리, 파상풍, A형 간염, B형 간염, E형 간염, 백일해, 결핵, 폐렴구균병, 장티푸스, 소아마비, 진드기 매개 뇌염, B형 헤모필루스 인플루엔자, 광견병, 수두 및 대상포진 (shingles), 인유두종바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 호흡기세포융합 바이러스, 거대세포 바이러스, 로타바이러스 위장염, 황열병, 일본뇌염, 말라리아, 뎅기열, 지카바이러스-관련 소두증, 탄저병, 흑사병, Q열병, 천연두 또는 암과 같은 비-감염성 질병이 포함되지만, 이로 제한되지는 않는다.
일 구현예에서, 상기 질환은 암이다. 상기 개체는 암종, 선종, 흑색종, 육종, 백혈병, 생식 세포암, 모세포종 및/또는 림프종을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 암의 재발을 방지하도록 치료받거나 이를 앓고 있을 수 있다.
상기 암종은 선암, 편평 세포 암종, 샘편평 세포 암종, 역형성 암종, 대세포 암종 및 소세포 암종을 포함하고, 방광암, 유방암, 신장암, 췌장암, 난소암, 폐암, 간암, 두경부암, 편평세포암, 결장직장암, 자궁경부암, 신세포암, 위암, 전립선암, 흑색종, 뇌암, 갑상선암, 자궁암, 식도암을 포함한다.
상기 육종은 아스킨 (Askin's) 종양, 연골육종, 유잉 (Ewing's) 육종, 악성 신경초종, 골육종, 및 섬유육종, 평활근육종, 지방육종 및 횡문근육종을 포함하는 연조직 육종을 포함한다.
상기 백혈병은 버킷 (Burkitt's) 백혈병과 같은 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 (AML) 및 만성 골수성 백혈병 (CML)과 같은 골수성 백혈병, 모발 세포 백혈병 (HCL), T-세포 전림프구성 백혈병, 거대과립 립프구성 백혈병, 성인 T-세포 백혈병 및 클론성 호산구증가증 (clonal eosinophilia)을 포함하는 급성 및 만성 백혈병을 포함한다.
상기 생식 세포암은 생식세포종, 이상배아종 및 정액종과 같은 생식세포종 또는 정상세포종양, 및 기형종 및 다배아종과 같은 비배아종성 또는 비수모세포 종양을 포함한다.
상기 모세포종은 간모세포종, 수모세포종, 신모세포종, 신경모세포종, 췌장모세포종, 흉막폐모세포종, 망막모세포종, 다형성 교모세포종 및 생식섬모세포종을 포함한다.
상기 림프종은 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 버킷 림프종, 여포성 림프종, 외투 세포 림프종, 소림프구성 림프종 및 림프형질구성 림프종을 포함한다.
4.5 종양내 투여
본 발명의 구현예에서 바람직한 암은 육종, 생식 세포암 및 암종과 같은 체질량을 형성하는 암이다. 파이롭토시스 유도인자, 예를 들어 ASC, 카스파제-1 및/또는 가스더민 D로부터 선택된 활성 또는 유도성 단백질, 보다 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제는 암을 앓고 있는 개체에게 국소적으로, 바람직하게는 종양내로 투여될 수 있다. 암 세포의 결과적인 파이롭토시스는 암-특이적 항원, 바람직하게는 암 네오에피토프와 함께 손상-관련 분자 패턴을 방출시키며, 이는 종양 특이적 T 세포를 활성화시켜 잔여 암세포를 공격하기 시작하고 결국 암을 제거할 수도 있을 것이다.
상기 파이롭토시스 유도인자, 예를 들어 ASC, 카스파제-1, 및/또는 가스더민 D로부터 선택된 활성 또는 유도성 단백질, 보다 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제는 단백질로서, 바람직하게는 암 세포에서 상기 파이롭토시스 유도인자를 발현하는 발현 작제물로서, 종양내 투여될 수 있다. 상기 종양내로의 파이롭토시스 유도인자의 투여는 바람직하게는 당업자에게 공지된 바와 같이 종양내 주사, 바람직하게는 주사 또는 전기천공에 의한 것이다. 상기 전기천공은 시험관내 분리된 세포 상에 또는 바람직하게는 생체내에 적용될 수 있다. 종양내 투여되는 단백질로서, 파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제의 유효량은 암의 증상이 개선되거나 무효화되기도 하는 원하는 효과를 생성하기에 충분히 많은 투여량이다. 치료학적 유효량은 바람직하게는 부작용을 유발하지 않는다. 일반적으로, 치료학적 유효량은 개체의 연령, 상태, 성별 뿐만 아니라 질병의 정도에 따라 달라질 수 있고, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 복용량은 임의의 합병증의 경우 개별 내과의가 조정할 수 있다. 치료학적 유효량은 1일 이상 동안 1회 또는 반복 용량 투여에서, 약 1 마이크로그램 내지 약 100 밀리그램, 바람직하게는 약 10 마이크로그램 내지 약 10 밀리그램, 가장 바람직하게는 약 0.1 밀리그램 내지 약 1 밀리그램으로 달라질 수 있다.
암세포와 같은 세포를 단백질로 형질도입하기에 적합한 형질감염 시약은 Saint-PROTEIN® 형질감염 시약 (Synvolux, Leiden, the Netherlands)을 포함한다.
바람직하게는 단백질로서, 상기 유효량의 파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제는 바람직하게는 pH 값이 5 내지 9, 바람직하게는 6 내지 8인 완충 용액으로서 제공된다. 상기 완충 용액은 예를 들어 포스페이트-, 히스티딘- 또는 숙시네이트-기반 완충제, 폴리소르베이트, 트레할로스 이수화물 및/또는 메티오닌을 포함할 수 있다.
파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제를 발현하는 비-바이러스 발현 작제물과 같은 발현 작제물은, 이를 필요로 하는 개체에게 유효량으로 투여될 수 있다. 암을 치료하기 위해 암에 대한 면역 반응을 효과적으로 유도하기 위해서는 2일 내지 5일 이상의 연속일 동안의 반복 투여와 같은 반복 투여가 바람직하다.
파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제를 발현하는 비-바이러스 발현 작제물과 같은 발현 작제물은, 바람직하게는 종양내로 주사 또는 전기천공에 의해 투여된다. 종양내 투여를 위한 제제는 멸균 수성 또는 비-수성 용액 현탁액, 및 에멀젼을 포함할 수 있다. 비-수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일 및 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르가 있다. 종양내 투여를 위한 제제는 바람직하게는 임의로 완충제 및 염을 포함하는 물, 염화나트륨 용액과 같은 염수, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 또는 젖산 링거와 같은 수성 담체를 포함한다. 예를 들어, 항균제, 항-산화제, 킬레이트제, 및 불활성 기체 등과 같은 방부제 및 다른 첨가제가 또한 존재할 수 있다.
비-바이러스 발현 작제물과 같은 파이롭토시스 유도인자를 발현하는 발현 작제물의 치료학적 유효량은 약 0.001 mg 내지 약 100 mg, 바람직하게는 약 0.01 mg 내지 약 10 mg, 가장 바람직하게는 약 0.1 mg 내지 1 mg으로 달라질 수 있다.
본 발명은 암 네오에피토프에 대해 개체의 면역반응을 자극하여 상기 개체를 개선 및/또는 치료하기 위하여, 개체에게 파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 암을 앓고 있는 개체를 개선 및/또는 치료하는 방법, 및/또는 암의 재발을 방지하는 방법을 또한 제공한다.
세포, 특히 암세포를 비-바이러스 발현 작제물과 같은 발현 작제물로 형질감염시키거나 형질도입시키기 위한 적합한 형질감염 시약은 폴리에틸렌이민과 같은 양이온성 폴리플렉스, DOTAP와 같은 양이온성 지질 또는 Saint-DNA 및 Saint-mRNA 형질감염 시약 (Synvolux, Leiden, the Netherlands)과 같은 피리디늄-기반 지질을 포함하는 리포좀 또는 리포플렉스를 포함한다.
4.6 전신 투여
본 발명은 개체에게 파이롭토시스 유도인자를 투여하는 단계를 포함하는 개체의 면역 반응, 바람직하게는 T-세포 매개 면역 반응을 자극하는 방법에 사용하기 위한 파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전염증성 카스파제를 제공하며, 여기서 상기 파이롭토시스 유도인자는 백신, 바람직하게는 유전자 백신의 보조제로서 전신 투여된다.
치료학적 적용을 위해, 파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같은, 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제는, 암 또는 감염과 같은 질병을 앓고 있는 개체에게, 질병을 최소한 부분적으로 중단시키고, 바람직하게는 질병을 치료하고/하거나 질병-관련 합병증을 감소 또는 중단시키기에 충분한 양으로 투여된다. 이를 달성하기에 적절한 양을 "치료학적 유효량"으로 정의한다. 이러한 사용에 효과적인 양은 질병의 중증도와 개인의 전반적인 건강 상태 및 투여 방법에 따라 결정될 것이다. 파이롭토시스 유도인자의 단일 또는 다중 투여는 환자가 필요로 하고 용인되는 용량 및 빈도에 따라 투여될 수 있다.
예방적 적용을 위해, 파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같은, 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제를 개체에게 투여하여 질병의 확립 또는 재발로부터 보호하는 데 도움을 줄 수 있는 면역 반응을 유도한다.
파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제를 발현하는 비-바이러스 발현 작제물과 같은 발현 작제물은, 완충제, 염화나트륨 용액과 같은 염수, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 또는 젖산 링거 또는 고정유를 포함하는 수성 용액으로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 항균제, 항-산화제, 킬레이트제, 및 불활성 기체 등과 같은 방부제 및 다른 첨가제가 또한 존재할 수 있다.
파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제를 발현하는 발현 작제물, 예컨대 비바이러스성 발현 작제물의 치료학적 유효량은 약 0.001 mg 내지 약 100 mg, 바람직하게는 약 0.01 mg 내지 약 10 mg, 가장 바람직하게는 약 0.1 mg 내지 약 1 mg으로 달라질 수 있다.
상기 백신, 바람직하게는 유전자 백신은, 원하는 보호 또는 치료 면역 반응에 대해 하나 이상의 항원, 즉, 특정 단백질 또는 이의 일부를 인코딩한다. 상기 하나 이상의 항원은 병원체, 예를 들어 홍역, 풍진, 콜레라, 수막구균 질환, 인플루엔자, 디프테리아, 볼거리, 파상풍, A형 간염, B형 간염, E형 간염, 백일해, 결핵, 폐렴구균병, 장티푸스, 소아마비, 진드기 매개 뇌염, B형 헤모필루스 인플루엔자, 광견병, 수두 및 대상포진 (shingles), 인유두종바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 호흡기세포융합바이러스, 거대세포바이러스, 로타바이러스 위장염, 황열병, 일본뇌염, 말라리아, 뎅기열, 지카바이러스 관련-소두증, 탄저병, 흑사병, Q열병, 천연두로부터 선택되는 질병을 유발하는 병원체로부터 유래되거나 또는 암에 의해 발현된다.
유전자 백신에 의해 선택적으로 인코딩되는 항원의 예는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 외피 단백질 (gp160), HIV-Nef, 홍역 혈구응집소 당단백질, 홍역 융합 당단백질, 홍역 뉴클레오캡시드 단백질, 풍진 E1 단백질, 풍진 E2 단백질, 풍진 캡시드 단백질, 콜레라 독소, 콜레라 B 하부단위 단백질, 수막구균 NadA D, NHBA D, FHBP D, PorA VR1 D, PorA VR2 D 및/또는 이들의 아변이체 (Brehony et al., 2015. Euro Surveill 20: 10.2807/1560-7917. .2015.20.49.30084), 인플루엔자 바이러스 혈구응집소, 인플루엔자 바이러스 핵단백질, 디프테리아 톡소이드, 볼거리 바이러스 외피 당단백질, 볼거리 바이러스 혈구응집소-뉴라미니다제, 볼거리 바이러스 용혈 세포 융합 (F) 당단백질, 볼거리 바이러스 기질 외피 단백질, 파상풍 톡소이드, A형 간염 바이러스 표면 항원, B형 간염 바이러스 표면 항원, E형 간염 바이러스 표면 항원, 백일해 독소, 백일해 사상 혈구응집소, 백일해 퍼탁틴 (pertactin), 결핵 ESAT-6, 결핵 CFP10 (van Pin xteren et al., 2000. Clin Diagn Lab Immunol 7: 155-160), 폐렴구균 캡슐 항원, 장티푸스균 O 항원 (Salmonella Typhi O antigen), 장티푸스균 H 항원, 장티푸스균 50kDa 외막 단백질, 폴리오바이러스 D 항원, 폴리오바이러스 C 항원, 진드기-매개 뇌염 바이러스 도메인 III, 헤모필루스 인플루엔자 타입 a 항원, 헤모필루스 인플루엔자 타입 b 항원, 광견병 바이러스 당단백질, 수두-대상포진 바이러스 당단백질 E, 인유두종 바이러스 L1 캡시드 단백질, 로타바이러스 E1A 당단백질, 황열병 외피 (E) 당단백질, 일본뇌염 외피 단백질 도메인 III, 열원충 글루타메이트 탈수소효소, 히스티딘 풍부 단백질 II, 젖산 탈수소효소, 및/또는 과당-비스포스페이트 알돌레이스 단백질, 뎅기열 바이러스 항원 (DEN-1 내지 DEN-4), 지카 바이러스 비구조 단백질 1, 탄저 독소, 여르시니아 페스트 분획 (Yersinia pestis fraction) 1 캡슐 항원, 여르시니아 페스트 분획 V 단백질, Q 열병 바이러스 27-kDa 외막 단백질 (Com1), 백시니아 바이러스 A30, B7 및 F8 항원 (Sakhatskyy et al., 2008. Virology 371: 98-107), 및 이들의 임의의 단편 또는 조합을 포함한다.
유전자 백신에 의해 인코딩될 수 있는 항원의 바람직한 예는 암 네오에피토프 또는 다른 종양-관련 항원이다. 상기 암 네오에피토프는 암 세포에서 상기 네오에피토프를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)에서 비-상동 돌연변이, 삽입 또는 결실로부터 초래되어, 건강한 세포의 에피토프와 비교하여 변경된 아미노산을 생성한다. 상기 암 네오에피토프는 상이한 암 및 개별 환자마다 차이가 있을 수 있다. 따라서, 상기 암 항원은 바람직하게는 맞춤형 암 백신으로서 개발된다. 이를 위해 암 세포와 상응하는 건강한 세포를 환자로부터 분리한 후, 게놈 DNA 및/또는 전사된 mRNA의 서열을 분석한다. 암세포와 상응하는 건강한 세포로부터 얻은 서열을 비교하면 상응하는 건강한 세포와 비교할 때, 암세포에서 변경된 서열을 동정할 수 있을 것이다.
맞춤형 암 백신을 개발하기 위해, 암 체세포 돌연변이를 감지하고 잠재적인 종양-특이적 네오에피토프를 예측하는 소프트웨어 툴(tool)이 개발되었다. 상기 소프트웨어 툴에는 TSNAD: 암 체세포 돌연변이 및 종양-특이적 네오에피토프 검출을 위한 통합 소프트웨어 (Zhou et al., 2017. R Soc Open Sci 4: 170050); CloudNeo: 환자-특이적 종양 네오에피토프를 동정하기 위한 클라우드 파이프라인 (Bais et al., 2017. Bioinformatics, 33: 3110-3112); pVAC-Seq: 종양 네오에피토프를 동정하기 위한 게놈-유도 인실리코 접근 방식 (Hundal et al., 2016. Genome Medicine 8:11) 및 pVACtools: 맞춤형 암 백신 설계를 위한 컴퓨터를 이용한 선택 및 네오에피토프 시각화 (Kiwala et al., 2018. Cancer Genetics 226-227: 45-46)이 포함되지만, 이로 제한되지 않는다.
상기 암 네오에피토프는 펩티드/단백질로 제형화되거나 RNA 또는 DNA 분자로 인코딩될 수 있다. RNA 및 DNA 백신은 단일 분자 상에 여러 에피토프를 인코딩할 수 있다. 바람직한 유전자 백신은 암 네오에피토프를 코딩하는 DNA를 이들이 발현되는 숙주 세포에 도입하고, 궁극적으로 T 세포에 대한 에피토프의 제시를 유도한다.
세포 면역 반응을 자극하기 위해, 예를 들어 암 네오에피토프를 포함하는 항원은 바람직하게는 8 내지 20-잔기 펩티드로 처리되고 CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포에 의해 인식되기 위해 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자 상으로 각각 로딩된다. 상기 8 내지 20개 아미노산 잔기 펩티드는 바람직하게는 단백질분해효소에 의해 하나 이상의 암 네오에피토프로 처리되는, 폴리에피토프라고도 하는, 예비단백질을 인코딩하는 DNA 발현 작제물로서 제공된다.
상기 예비단백질은 바람직하게는 2-50개의 개별 암 네오에피토프, 보다 바람직하게는 2-40개, 더욱 바람직하게는 3-30개, 더욱 바람직하게는 5-25개의 개별 암 네오에피토프를 포함한다. 상기 개별 암 네오에피토프, 또는 상기 네오에피토프를 포함하는 서열은 추가적인 아미노산이 측면에 있을 수 있고, 바람직하게는 1-10개 아미노산 잔기, 바람직하게는 1-5개 아미노산 잔기, 예컨대 2개 아미노산 잔기, 3개 아미노산 잔기 또는 4개의 아미노산 잔기인 작은 스페이서 서열에 의해 분리될 수 있다.
유전자 백신은 RNA 또는 DNA 발현 작제물로부터 상기 하나 이상의 항원의 발현을 지시한다. DNA 발현 작제물로부터의 항원 발현은 바이러스 프로모터와 같은 전사적으로 활성인 프로모터에 의해 구동된다. 상기 프로모터는 당업자에게 공지된 바와 같이, 바람직하게는 SV40 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터 및 가장 바람직하게는 사이토메갈로바이러스 (CMV) 조기(immediate early) 프로모터로부터 선택된다. 발현 속도를 개선하기 위한 추가 변형은 진핵 세포에서 발현을 위한 코돈 사용 최적화; 프로모터 인핸서 서열의 삽입; 합성 인트론의 삽입; 5' UTR 및/또는 3' UTR 서열, 예컨대 아데노바이러스 삼자 리더 (TPL) 서열 또는 우드척 전사후 조절 요소 (WPRE; Woodchuck Posttranscriptional Regulatory Element)의 존재; 및 소 성장 호르몬 또는 토끼 베타-글로빈 폴리아데닐화 서열과 같은 강한 폴리아데닐화/전사 종결 신호를 포함하기 위한 폴리아데닐화 및 전사 종결 서열에 대한 변형을 포함한다.
상기 유전자 백신은 사이토카인과 같은 다른 면역 자극 분자를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 비제한적 예가 표 1-2에 제공되어 있는, 파이롭토시스 유도인자, 예를 들어 ASC, 카스파제-1, 및/또는 가스더민 D로부터 선택되는 활성 또는 유도성 단백질, 더욱 바람직하게는 상기 4.3의 본원에 상세한 바와 같은 발현 작제물은, 본원에 기재된 바와 같은 백신, 바람직하게는 유전자 백신과 조합하여 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법에 사용하기 위한 것일 수 있으며, 이에따라 상기 파이롭토시스 유도인자는 길항 항체 및/또는 가용성 리간드를 포함하나 이에 제한되지 않는 사이토카인, 케모카인, 작용 항체 및/또는 면역 억제 분자의 억제제와 같은 다른 면역 자극 분자와 같은 하나 이상의 보조 분자와 조합하여 투여된다. 상기 보조 분자는 작은 분자, 단백질로서, 또는 발현 작제물로서, 파이롭토시스 유도인자 및 백신, 바람직하게는 유전자 백신의 투여와 동시에, 별개로 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
바람직한 보조 분자는 표 3에 개시된 또 다른 면역 자극 분자, 바람직하게는 IL-12, IL-2, IL-4, CSF2, 인터페론, IL-18, TNF, 및/또는 Ox-40, 가장 바람직하게는 IL-12 및/또는 CSF2, 작용성 Flt3-항체 및/또는 PD1 또는 PD-L1 차단제와 같은 면역 관문 억제제, 예컨대 펨브로리주맙 (pembrolizumab) (Merck), 니볼루맙 (nivolumab) (Bristol-Myers Squibb), 피딜리주맙 (pidilizumab) (Medivation/Pfizer), MEDI0680 (AMP-514; AstraZeneca) 및 PDR001 (Novartis); PD-L2 Fc 융합 단백질 (AMP-224; GlaxoSmithKline)과 같은 융합 단백질; 아테졸리주맙 (atezolizumab) (Roche/Genentech), 아벨루맙 (avelumab) (Merck/Serono 및 Pfizer), 더발루맙 (durvalumab) (AstraZeneca), BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb); 및 작은 분자 억제제 예컨대 PD-1/PD-L1 억제제 1 (WO2015034820; (2S)-1-[[2,6-디메톡시-4-[(2-메틸-3-페닐페닐)메톡시]페닐]메틸]피페리딘-2-카르복실산), BMS202 (PD-1/PD-L1 억제제 2; WO2015034820; N-[2-[[[2-메톡시-6-[(2-메틸[1,1'-비페닐]-3-일)메톡시]-3-피리디닐]메틸]아미노]에틸]-아세트아미드), 및 PD-1/PD-L1 억제제 3 (WO/2014/151634; (3S,6S,12S,15S,18S,21S,24S,27S,30R,39S,42S,47aS)-3-((1H-이미다졸-5-일)메틸)-12,18-비스((1H-인돌-3-일)메틸)-N,42-비스(2-아미노-2-옥소에틸)-36-벤질-21,24-디부틸-27-(3-구아니디노프로필)-15-(히드록시메틸)-6-이소부틸-8,20,23,38,39-펜타메틸-1,4,7,10,13,)로부터 선택된다. 추가 항-PD1 분자에는 라디라투주맙 베도틴 (ladiratuzumab vedotin) (Seattle Genetics)이 포함된다.
바람직하게는 발현 작제물, 바람직하게는 비-바이러스 발현 작제물로서 투여되는, 상기 파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 상기 본원에 기재된 바와 같은, 교환된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제의 전신투여, 및 상기 본원에 기재된 바와 같은 유전자 백신의 동시, 개별 또는 순차적 투여는, 바람직하게는 예를 들어 정맥내, 복강내, 비강내, 근육내 또는 가장 바람직하게는 피내와 같이 비경구 투여된다.
4.7 면역 자극 조성물
본 발명은 파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 면역 자극 조성물을 추가로 제공한다. 상기 파이롭토시스 유도인자는 바람직하게는 표 1-2에 나타낸 분자로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제이다.
상기 약학적으로 허용가능한 부형제는 활성 성분의 생물학적 활성유효성을 저해하지 않는 무독성 물질이다. "생리학적으로 허용가능한"이라는 용어는 세포, 세포 배양, 조직 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템과 양립할 수 있는 무독성 물질을 의미한다. 담체의 특성은 투여 경로에 의존할 것이다. 생리학적으로 및 약학적으로 허용가능한 부형제는 희석제, 충진제, 염 완충제, 안정화제, 가용화제, 및 당업계에 널리 공지된 다른 물질을 포함한다.
본 발명에 따른 바람직한 면역-자극 조성물은 유전자 백신, 바람직하게는 상기 본원에 기재된 바와 같은 1-50개의 암 네오에피토프를 인코딩하는 유전자 백신을 추가로 포함한다.
상기 파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제, 및 본 발명의 면역-자극 조성물 내의 상기 유전자 백신은, 바람직하게는 비-바이러스 발현 작제물로부터 발현된다. 비-바이러스 발현 작제물은 mRNA 또는 플라스미드 DNA와 같은 네이키드 DNA 및 시험관내 증폭된 DNA를 포함한다. 비-바이러스 발현 작제물은 리포솜에 패키징될 수 있고/있거나 분자 접합체로서 제공될 수 있다. 플라스미드 박테리아 DNA 서열이 없는 미니서클 DNA 벡터는 박테리아에서 생성될 수 있고 생체내에서 높은 수준으로 파이롭토시스 유도인자를 인코딩하는 핵산을 발현할 수 있다.
본 발명은 암 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 면역 자극 조성물을 추가로 제공한다.
본 발명은 파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제, 및 본 발명에 따른 유전자 백신을 포함하는 면역 자극 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 제공하여 개체를 치료하는 단계를 포함하는 암을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 암을 앓고 있는 개체를 치료하기 위한 치료제의 제조에 있어서의, 파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전염증성 카스파제, 및 본 발명에 따른 유전자 백신을 포함하는 면역 자극 조성물의 용도를 추가로 제공한다.
상기 파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제는, 바람직하게는 IL-12 및 CSF2와 같은 사이토카인과 같은 다른 면역 자극 분자와 조합하여 투여된다.
본 발명은 파이롭토시스 유도인자, 바람직하게는 셔플된 p10 및 p20 도메인을 포함하는 상기 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제를 제공하는 단계, 및 개체에게 상기 파이롭토시스 유도인자를 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역반응, 바람직하게는 T-세포 매개 변역 반응을 자극하는 방법을 추가로 제공한다.
명료함 및 간결한 기재 목적을 위해, 특징들은 동일 또는 별도의 구현예의 일부로서 본원에 기재되었지만, 본 발명의 범위는 기재된 특징들의 전부 또는 일부의 조합을 갖는 구현예를 포함할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
5. 실시예
실시예 1
재료 및 방법
DNA 작제물
파이롭토시스의 매개체에 대한 DNA 코딩을 함유하는 발현 작제물 (표 1)은 Gibson 어셈블리에 의해 생성하였다. 간략히 설명하면, (단편) Pycard, Casp1, Gsdmdc1, Il1b, Il18, Ripk3, Mlkl (Mus musculus), CASP1, IL1B (Homo sapiens)를 D1 (C57BL/6 기원의 수지상 세포주, Winzler et al., 1997. J Exp Med 185: 317-328 참조) cDNA, 또는 합성된 코돈-최적화 DNA (Pycard, Csf2, hCASP1_RV2; Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA)에서 증폭시키고, Gibson 어셈블리 클로닝 키트 (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)를 사용하여 벡터 pD2610-v10 (ATUM, Newark, CA, USA) 내로 클로닝시켰다. dasher GFP (서열 번호: 13), 작고 관련 없는 펩티드 서열 (서열 번호: 20)인 Reps1을 코딩하거나, 또는 삽입물이 모두 결여된 작제물을 대조군으로 사용하였다.
백신접종 실험에서, 보조제 또는 대조군 플라스미드를 C57BL/6 MC38 결장암 세포주 뿐만 아니라, 3개의 알라닌으로 구성된 '스페이서 서열'(서열번호: 30 참조)에 의해 분리된, 닭 난백알부민으로부터의 2개의 모델 항원 (OT-II, OT-I; 서열 번호 28 및 29 참조)으로부터 유래된, 3개의 종양-특이적 항원 (Dpagt1, Reps1, Adpgk; 서열 번호: 25-27 참조)을 코딩하는 폴리에피토프 DNA 백신 (서열 번호: 23)과 조합시켰다.
모든 플라스미드는 대장균 균주 DH5α를 사용하여 성장시키고 Macherey-Nagel (Dueren, Germany) 엔도톡신-무함유 (Endotoxin-Free; EF) 플라스미드 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 백신접종을 위해, 플라스미드는 Nucleobond 필터에서 추가 정제 단계를 거친 후 원심분리 (30분, 10,000g, 4℃)를 통해 임의의 잔여 절편을 제거하였다.
마우스 및 세포주
C57BL/6 (Jico) 마우스는 Jackson 실험실 (Bar Harbour, ME, USA)에서 구입하여 LUMC 동물 시설에서 FELASA-인증 조건 하에 수용하였다. C57BL/6 기원의 흑색종 세포주인 B16-F10은, 가습된 CO2 배양기 (37℃, 5% CO2)에서 L-글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신 (모두 ThermoFisher-Gibco 공급) 존재 하에, 8% 태아 송아지 혈청 (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, the Netherlands)이 보충된 IMDM (ThermoFisher-Gibco, Waltham, MA, USA)으로 구성된 배양 배지에서 유지시켰다. B16-OVA는 난백알부민으로 안정적으로 형질감염된 B16-F10 세포주로서 동일한 조건에서 배양시켰다.
형질감염
B16-F10 세포를 100 ㎕ 배양 배지의 96-웰 평평한 바닥 플레이트에 2,000 세포/웰로 플레이팅하였다. 하루 후, 양이온성 지질-기반 형질감염 시약인 Saint-DNA (Synvolux products Leiden, the Netherlands)와 복합화된 10 ㎕ DNA를 첨가하여 형질감염시켰다. 형질감염 2일 후, 세포 사멸 및/또는 DAMPS의 방출을 유세포 분석, ELISA 또는 LDH 분석에 의해 분석하였다.
유세포 분석
세포 상청액을 제거하고 PBS로 웰을 휑군 후 잔여 부착 세포를 트립신 (ThermoFisher-Gibco)으로 처리하여 비부착 및 부착 세포를 수득하였다. 96-웰 V-바닥 플레이트에서 상청액과 트립신 처리된 세포를 혼합하고 원심분리한 후, 생성된 세포를 FACS 완충액 (PBS, 1% BSA, 0.02% 아지드)으로 세척하고 FACS 완충액에 15분 동안 희석시킨, 막 무결성을 상실한, 사멸 세포에 진입하는 염료인, 7-아미노액티노마이신 D(7-AAD) (Biolegend, San Diego, CA, USA)에 노출시켰다. 그후 세포는 488 nm 레이저 (Merck MilliPore, Burlington, MA, USA)가 장착된 Guava EasyCyte HT 유세포 분석기에서 즉시 분석하였다.
IL-1β ELISA
IL-1β를 측정하기 위해, 세포 상청액을 원심분리하여 세포 파편을 제거하고 공급자 (Biolegend, San Diego, CA)가 제공한 프로토콜을 이용하여, 샌드위치 ELISA로 분석했다. 간략히 설명하면, 96-웰 플레이트를 밤새 포획 항체로 코팅시켰다. 결합되지 않은 항체를 세척 (4회 세척 단계)한 후, 50-1000배 희석된 상청액 (참고로, 적정된 재조합 IL-1β)을 첨가하고 진탕하면서 실온에서 2시간 동안 배양시켰다. 4회 세척 단계 후, 바이오틴화된 검출 항체를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양시킨 다음, 추가 4회의 세척 단계를 거쳐 스트렙타비딘-HRP와 함께 30분 동안 배양시켰다. 스트렙-HRP를 세척한 후, TMB 기질 용액을 첨가하였다. 450 nm 및 570 nm에서의 흡광도를 Tecan Infinite F50 (Tecan Group Ltd, M
Figure pct00002
nnedorf, Switzerland)에서 판독하였다.
LDH 분석
배양 배지로 방출된 젖산 탈수소효소 (LDH)를 정량적으로 측정하기 위한 비색 분석(LDH Cytotoxicity Assay Kit, ThermoFisher-Pierce, Waltham, MA, USA)을 이용하여 세포 사멸을 정량화하였다. 이 분석은 결합된 효소 반응을 기반으로 한다. 첫째, LDH는 NAD+에서 NADH로의 환원을 통해 젖산에서 피루브산으로의 전환을 촉매한다. 둘째, 디아포라아제는 NADH를 사용하여 테트라졸륨염 (INT)을 적색 포르마잔 생성물로 환원시킨다. 따라서, 포르마잔 형성 수준은 배지에 방출된 LDH의 양에 정비례한다. 간략히 설명하면, 50 ㎕의 반응 혼합물을 50 ㎕의 2배 희석된 배양 상청액과 혼합하였다. 암실의 실온에서 30분 동안 배양시킨 후, 정지 용액을 첨가한 다음 450 nm 및 620 nm에서 흡광도를 판독하였다. 세포독성 백분율은 다음과 같이 계산하였다: ((OD450-OD620)샘플-(OD450-OD620)배지 대조군)/((OD450-OD620)양성 대조군-(OD450-OD620)배지 대조군)x100%.
마우스 백신접종 및 종양 챌린지 (challenge)
0일째 수컷 C57BL/6 마우스에 10 μg 폴리에피토프 백신 (서열번호: 23 참조) (또는 빈 벡터 대조군), 10 μg 보조제 (또는 빈 벡터) 및 10 μg 보조제 2 (또는 빈 벡터)로 구성된, 30 μg의 엔도톡신-무함유 플라스미드 DNA를 함유하는 30 ㎕ 0.9% NaCl 용액을 피내 주사하였다. 백신접종 며칠 후 채혈한 혈액을 적혈구 용해 완충액으로 처리하고 0.1% 소 혈청 알부민 및 0.02% 아지드화 나트륨 (PBS/BSA)이 보충된 PBS에서 PE-접합된 H2-Kb/SIINFEKL 사량체 (LUMC tetramer facility, Leiden, the Netherlands)로 염색시켰다. 암실의 실온에서 30분 동안 배양시킨 후, CD3, CD4, CD8에 대한 형광색소-결합 항체 (Biolegend, San Diego, CA, USA)를 첨가하여 T 세포 하위집합을 식별한 다음, 추가 30분 동안 얼음으로 처리하고 PBS/BSA로 2회 세척 단계를 거쳐 결합되지 않은 사량체 및 항체를 제거하였다. 샘플은 BD LSRII (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)에서 수집하고 FlowJo (FlowJo LLC)를 사용하여 분석하였다.
백신접종 후 29일째에, 마우스에 오브알부민으로 안정적으로 형질감염된 B16-F10 흑색종 세포인, 50,000개의 B16-OVA 세포를 피하 주사하였다. 종양 성장을 3 내지 4일마다 모니터링하고, 종양 크기를 (길이 x 너비 x 너비)/2로 계산하였다. 1000 mm3 을 초과하는 종양을 갖고 있거나 출혈성 궤양이 있는 마우스는 CO2로 질식시켜 안락사시켰다.
결과
구성적으로 활성인 카스파제-1 변이체의 설계
ASC (서열 번호: 31), 카스파제-1 (서열 번호: 1-4, 8, 12), 가스더민 D (서열 번호: 14-15), 파이롭토시스의 시그니처 신호 분자, cDNA 서열을 기반으로 하는 일련의 작제물을 설계하였다 (도 1, 표 1, 2, 4). 비-염증성 카스파제를 이용한 연구 (Srinivasula et al., 1998. J Biol Chem 273: 10107-11; Park et al., 2006. Biochem Biophys Res Commun 347: 941-8)는 야생형 카스파제-1과 비교해 역순으로 ('재셔플된') IL-1β 카스파제-1 절단 부위에 의해 연결된, 카스파제-1 p10 및 p20 도메인으로 구성된 단백질이 구성적으로(constitutively) 활성일 것임을 제안하였다. 그러나, 최근 연구에 따르면, 활성 형태의 카스파제-1이 N-말단 CARD 도메인의 존재를 또한 필요로 하며 (Boucher et al., 2018. J Exp Med 215: 827-840), 이러한 작제물 (CASP1_RV 및 CASP1_RV2, 도 1, 각각 서열번호: 3 및 4)은 활성화되지 않을 것임을 제시한다. 추가 작제물에서, 유도성 (iCASP1, 서열번호: 8)이거나 구성적인 (dCASP1, 서열번호: 12), 이량체화 도메인은 보통 카스파제-1을 상류 활성화 신호전달 캐스케이드에 연결하는 N-말단 CARD 도메인을 대체했다. 최종적으로, 돌연변이된 활성 부위 (CASP1_C285G, 서열번호: 2) 뿐만 아니라 야생형 대조군 (CASP1_WT, 서열번호: 1)을 갖는 대조군 작제물을 생성하였다.
구성적으로 활성인 카스파제-1 변이체 CASP1_RV 및 CASP1_RV2는 세포 사멸을 유도한다.
활성화될 때, 카스파제-1은 가스더민 D를 절단함으로써 파이롭토시스성 세포 사멸을 유도한다 (Aglietti and Dueber, 2017. Trends Immunol 38: 261-271). 이것은 가스더민 D N-말단 도메인을 방출시켜, 세포의 원형질막에 세포독성 기공 형성을 유발시킨다. 본 발명의 카스파제-1 변이체 (도 1)가 세포 사멸을 유도하는지 시험하기 위해, B16F10 세포를 GFP-인코딩 플라스미드 (서열 번호: 13)와 함께 해당 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 2일 후, 야생형 카스파제-1 (CASP1_WT) 및 활성 부위 돌연변이체 (CASP1_C285G)는 음성 대조군 (서열 번호: 20)과 비교하여 세포 사멸이 거의 내지 전혀 유도되지 않은 반면 (<20% 7-AAD+ 세포), GSDMD의 N-말단 도메인 (서열번호: 14-15)은 사실상 모든 세포를 사멸시켰다 (>90%) (도 2). 야생형 및 점 돌연변이된 카스파제-1과 달리, '재셔플된' 카스파제-1 (CASP1_RV 및 CASP1_RV2) 변이체는 대다수의 B16F10 세포를 사멸시켰다. 또한, 대부분의 사멸된 세포가 GFP를 발현하였으며, 이는 유전자 백신에 활성 카스파제-1을 포함시키는 것이 DNA 백신에 의해 인코딩된 항원의 발현을 저해하지 않는 다는 것을 제안하였다. 따라서, 활성 카스파제-1이 CARD 도메인을 필요로 한다는 이전 보고서 (Boucher et al., 2018. J Exp Med 215: 827-840)와 달리, 본 발명의 새로운 CARD가 없는 ‘재셔플된’ 카스파제-1 작제물은 구성적으로 활성인 것으로 나타났다.
구성적으로 활성인 카스파제-1 변이체 CASP1_RV 및 CASP1_RV2는 IL-1β 분비를 유도한다.
파이롭토시스의 특징 중 하나는 발열성 사이토카인인 IL-1β의 분비이다. 이 사이토카인은 세포질 전구체 (프로-IL-1β)로서 생성되고 이의 방출은 카스파제-1에 의한 프로-IL-1β와 가스더민 D 둘 모두의 절단을 필요로 한다 (Evavold et al., 2018. Immunity 48: 35-44; Heilig et al., 2018. Eur J Immunol 48: 584-592, Monteleone et al., 2018. Cell Rep 24: 1425-1433). 실제로, CASP1_WT 및 CASP1_C285G가 아닌, 활성 카스파제-1 변이체, CASP1_RV 및 CASP1_RV2가 프로-IL-1β (서열 번호: 21, 도 3)로 공동-형질감염시킨 B16-F10 세포로부터 IL-1β 방출을 유도하였다. 유사하게, AP1903 (iCASP1) 또는 구성적 (dCASP1)에 의해 유도된, 카스파제-1 이량체 또한 이 분석에서 IL-1β 분비를 야기하였다.
CASP1_RV2는 T 세포 반응 및 항종양 면역을 향상시킨다.
구성적으로 활성인 형태의 카스파제-1 (CASP1_RV 및 CASP1_RV2)이 세포 사멸을 유도하고 IL-1β의 처리 및 분비를 유도할 수 있었기 때문에, 다음으로 본 발명자들은 유전적 보조제로서의 이의 가능성을 시험하였다. 이를 위해, 마우스를 폴리에피토프 백신 (서열번호: 23)을 코딩하는 플라스미드와 유전적 보조제를 인코딩하는 플라스미드의 1:1 혼합물로 백신접종시켰다. 폴리에피토프 백신은 오브알부민-유래 CD8+ T 세포 에피토프 SIINFEKL을 포함하고, 이는 H-2Kb MHC 클래스 I 분자에 결합할 때 특정 T 세포에 의해 인식된다. CASP1_RV2가 CASP1_RV보다 약간 더 활성화되었기 때문에 (도 2-3), 전자를 사용하였다. 백신접종 직후, 참조 보조제 CSF2가 아닌, CASP1_RV2가 혈액에서 발견되는 SIINFEKL 특이적 T 세포의 빈도를 유의미하게 증가시켰고 (도 4A), 이후의 시점에서 CASP1_RV2와 CSF2의 보조제 효과는 유사하였다 (도 4B, C).
흥미롭게도, B16-OVA로 마우스를 챌린지시키는 것은, CSF2 (서열 번호: 24, 도 4D) 경우 보다 훨씬 더 강력하게, 보조제를 받지못한 마우스와 비교할 때 CASP1_RV2-보조제 첨가 그룹에서 특이적 T 세포 면역의 엄청난 증가를 초래했다. 이것은 이 보조제가 이종 프라임-부스트 요법 (heterologous prime-boost regimen)에서 특히 잘 작동함을 시사할 수 있다 (Kardani et al., 2016, Vaccine 34: 413-423).
모의 백신을 접종한 마우스에서, B16-OVA 종양은 주사 후 3주 이내에 변함없이 성장하였다 (도 4E). 폴리에피토프 백신이 종양 성장을 상당히 지연시켰지만, 대부분의 마우스는 결국 종양이 발생하였다. 대조적으로, 대부분의 CASP1_RV2-보조제 첨가된 마우스는 종양이 없는 상태로 유지되었다. 따라서, 신규의 구성적으로 활성인 형태의 카스파제-1은 T 세포 면역과 종양 보호를 유의미하게 개선시켰다.
구성적으로 활성인 형태의 RIG-I 및 GSDMD는 T 세포 면역을 개선시키지 않는다.
카스파제-1은 염증소체 기전의 중심부분이다. 따라서, 본 발명자들은 이 기전의 다른 구성 요소 또한 유전적 보조제로 작용할 수 있어야 한다고 추론하였다. 이 아이디어를 시험하기 위해, 본 발명자들은 C-말단 억제 도메인을 제거하여, RIG-I (서열번호: 19)로도 알려진 Ddx58, 및 GSDMD (서열번호: 14)로도 알려진 Gsdmdc1의 구성적으로 활성인 버전을 생성시켰다. RIG-I는 카스파제-1의 상류에서 작용하여 IL-1β 처리 및 방출을 촉진할 수 있으며 (Poeck et al. 2010, Nature Immunology 11: 63-69), GSDMD는 막 파괴를 담당하는 카스파제-1의 하류 표적이다. 이들 작제물은 둘다 세포 사멸을 유도하였다 (도 2). 또한, 시험된 다른 모든 작제물과 대조적으로, B16F10 세포를 RIG-1 작제물로 형질감염시키면, IFNβ와 IL-6이 생성되었다 (데이터 미도시). 그러나, 놀랍게도, 폴리에피토프 백신과 조합하여 이의 보조제 활성을 시험한 경우, 활성 카스파제-1 작제물만이 T 세포 반응을 개선시켰다 (도 5).
실시예 2.
재료 및 방법
DNA 작제물
파이롭토시스의 매개체에 대한 DNA 코딩을 함유하는 발현 작제물 (표 1 및 표 4)은 Gibson 어셈블리에 의해 생성하였다. 간략히 설명하면, Casp1, Gsdmdc1, Il1b, (Mus musculus), IL1B, GSDMD (Homo sapiens)(의 단편)는 D1 (C57BL/6 기원의 수지상 세포주, Winzler et al., 1997. J Exp Med 185: 317-328 참조) 또는 293 cDNA, 또는 합성 코돈-최적화 DNA (CASP1; Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA) 로부터 증폭시키고 Gibson 어셈블리 클로닝 키트 (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)를 이용하여 벡터 pD2610-v10 (ATUM, Newark, CA, USA) 내로 클로닝시켰다. 이러한 작제물의 작은 변경 (예: N-말단 또는 링커 서열의 변형, 단일 아미노산 치환)은 전용 프라이머 및 Gibson 어셈블리를 이용하여 도입시켰다. 모든 플라스미드는 대장균 균주 DH5α를 사용하여 성장시켰고 Macherey-Nagel (Dueren, Germany) 엔도톡신-무함유 (EF) 플라스미드 정제 키트를 사용하여 정제하였다.
세포주
C57BL/6 기원의 흑색종 세포주인 B16-F10은, 가습된 CO2 배양기 (37℃, 5% CO2)에서 L-글루타민, 페니실린 및 스트렙토마이신 (모두 ThermoFisher-Gibco 공급) 존재 하에, 8% 송아지 태아 혈청 (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, the Netherlands)이 보충된 IMDM (ThermoFisher-Gibco, Waltham, MA, USA)으로 구성된 배양 배지에서 유지시켰다. 인간 배아 신장 세포 (ATCC CRL-1573)에서 유래한 상피 세포주인 293을 동일한 조건에서 배양시켰다.
형질감염
B16-F10 세포 (2,000개 세포/웰) 또는 293 세포 (20,000개 세포/웰)를 100㎕ 배양 배지의 96-웰 평평한 바닥 플레이트에 플레이팅하였다. 하루 후, 양이온성 지질-기반 형질감염 시약인 Saint-DNA (Synvolux products, Leiden, the Netherlands)와 복합화된 10㎕ (20-40ng) DNA를 첨가하여 이들을 형질감염시켰다. 형질감염 2일 후, 세포 사멸 및/또는 DAMPS의 방출을 LDH 분석 또는 ELISA로 분석하였다.
IL-1β ELISA
IL-1β를 측정하기 위해, 세포 상청액을 원심분리하여 세포 파편을 제거하고 공급자 (Biolegend, San Diego, CA)가 제공한 프로토콜을 이용하여, 샌드위치 ELISA로 분석했다. 간략히 설명하면, 96-웰 플레이트를 밤새 포획 항체로 코팅하였다. 결합되지 않은 항체를 세척 (4회 세척 단계)한 후, 50-1000배 희석된 상청액 (참고로, 적정된 재조합 IL-1β)을 첨가하고 진탕하면서 실온에서 2시간 동안 배양시켰다. 4회 세척 단계 후, 바이오틴화된 검출 항체를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양시킨 다음, 추가 4회의 세척 단계를 거쳐 스트렙타비딘-HRP와 함께 30분 동안 배양시켰다. 스트렙-HRP를 세척한 후, TMB 기질 용액을 첨가하였다. 450 nm 및 570 nm에서의 흡광도를 Tecan Infinite F50 (Tecan Group Ltd, M
Figure pct00003
nnedorf, Switzerland)에서 판독하였다.
LDH 분석
LDH-Glo 세포독성 분석 (Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 배양 상청액에서 LDH 활성을 측정하였다. 이 분석에서, 손상된 세포에서 방출된 LDH는 NAD+의 NADH로의 동시 환원과 함께 젖산의 산화를 촉매한다. 환원효소는 NADH와 환원효소 기질을 사용하여 루시페린을 생성하고, 이 루시페린은 Ultra-Glo™ rLuciferase에 의해 생물발광 신호로 변환된다. 생성된 발광 신호는 존재하는 LDH의 양에 비례한다. 간략히 설명하면, 10 ㎕ 배양 상청액을 90 ㎕ LDH 저장 완충액 (200 mM Tris-HCl (pH 7.3), 10% 글리세롤, 1% BSA)으로 희석시켰다. LDH 저장 완충액에서 추가 10배 희석 후, 50 ㎕의 100배 희석된 상청액을 50 ㎕의 LDH 검출 시약과 혼합하고 암실의 실온에서 배양한 다음, Tecan Infinite F50 (Tecan Group Ltd, M
Figure pct00004
nnedorf, Switzerland)에서 30분 및 60분에 발광을 판독하였다. 데이터는 RLU (Relative Light Unit)으로 표시하였다.
결과
마우스 CASP1_RV2 기능은 N-말단 IDL 서열의 존재에 따라 결정된다.
본 발명자들의 구성적으로 활성인 마우스 염증성 카스파제-1 (CASP1_RV, 서열번호: 3)의 초기 설계는 인간 세포자멸사-유도성 인간 집행자 (executioner) 카스파제-3 및 -6의 구성적으로 활성인 버전의 설계에 의해 주도되었다 (Srinivasula et al., 1998 J Biol Chem 273: 10107-11). 활성 카스파제-3의 설계에 있어서, 예를 들어, N-말단 p20 및 C-말단 p10 도메인을 교환시키고, 짧은 (8AA) 카스파제-3 절단 부위에 의해 분리시켰다. 여러 p20 아미노산을 포함하는 p10의 상류 서열 일부 또한 이 교환에 의해 이동시켰고, 생성된 활성 카스파제의 N-말단은 4개의 p20 아미노산으로 시작한 다음, 작은 (6 AA) p20-p10 도메인간 링커 및 p10로 이어졌다 (Srinivasula et al., 1998. J Biol Chem 273: 10107-11). 따라서 마우스 CASP1_RV의 N-말단은 5개의 p20 아미노산과 IDL로 시작되었다. CASP1_RV2 (서열번호: 4)에서 p20 잔여물을 제거하면, CASP1_RV (서열번호: 3, 도 2-3)에 비해 활성이 증가하는 것으로 나타났기 때문에, 본 발명자들은 IDL을 모두 결여하는 추가 변이체 CASP1_RV2_NTR (서열번호: 38)를 시험하였다. 이러한 N-말단이 점진적으로 결여된 이들 세개의 CASP1_RV 변이체를 시험한 결과 CASP1_RV2에서 N-말단 p20 잔여물의 제거는 증가되었으나, CASP1_RV2_NTR에서 IDL의 추가적인 제거가 CASP1_RV의 활성을 감소시키는 것으로 나타났다 (도 6). 다시 말해서, 가장 활성인 CASP1_RV2 변이체는 N-말단에서 대부분의, 고도로 음으로 하전된 IDL 서열 SEEDFLTDAIFEDD를 유지하였다. 야생형 마우스 카스파제-1 (CASP1_WT)과 비교하여, CASP1_RV2는 시험관 내 분석에서 약 30배 더 강력했다 (도 7). 따라서, 카스파제-1의 CARD 도메인의 존재와 같은 인간 카스파제-3과 마우스 카스파제-1 사이의 중요한 차이와, 활성화 기전의 차이에도 불구하고, Srinivasula의 접근 방식은 실제로 구성적으로 활성인 마우스 카스파제-1을 생성시켰다.
인간 CASP1_RV2 기능은 N-말단 IDL 서열의 부재 (absence)에 의존한다.
구성적으로 활성인 인간 카스파제-1 변이체 (hCASP1_RV2, 서열번호: 35)의 설계는 마우스 CASP1_RV2를 기반으로 했고, 따라서 도메인간 링커 (IDL): GNLSLPTTEEFEDD의 14개 아미노산으로 또한 시작되었다. 그러나, hCASP1_RV2는 야생형 인간 카스파제-1 (hCASP1_WT, 도 8)보다 유의미하게 더 활성적이지 않았다. 따라서, 마우스 카스파제-1과 대조적으로, Srinivasula 접근 방식을 따르는 것은 인간 카스파제-1의 활성을 유의미하게 증가시키지 않았다. 놀랍게도, 마우스 CASP1_RV2 (도 6)와 현저하게 대조적이며, 효소 활성 부위로부터의 거리에도 불구하고 (Yang et al., 2018. Proc Natl Acad Sci USA 115: 6792-6797), p10 상류의 모든 N-말단 잔기 (hCASP1_RV2_NTR, 서열번호: 49)를 제거하는 것은 이의 활성을 크게 증가시켰다 (도 8).
p10-p20 링커 크기의 감소는 구성적으로 활성인 인간 카스파제-1 효능을 추가로 증가시킨다.
다음으로, 본 발명자들은 p10과 p20 사이의 개재 서열에 주목했다. 마우스 및 인간 CASP1_RV2 [서열 번호: 40-43, 45-47]의 이 영역에서 아스파르트산 단백질분해효소 부위를 제거해도 프로-IL1β를 처리하는 능력에 유의미한 영향을 미치지 않았으며, 이는 자가 단백질분해가 활성에 기여하지 않았다는 것을 시사하였다 (데이터 미도시). 오히려, 이 영역은 단지 유동적인 링커 역할을 하는 것으로 나타났다. 활성 형태의 카스파제-1의 결정 구조 (Yang et al., 2018. Proc Natl Acad Sci USA 115: 6792-6797)는 p10 도메인의 C-말단과 p20의 N-말단 사이의 거리가 다소 작은 것으로 나타났다 (도 9). 사실상, 본 발명자들은 링커의 크기를 9개 아미노산으로 줄이는 것이, 본 발명자들의 예상과 같이, 중립적인 사건이 아니라, 놀랍게도 hCASP1_NTR의 활성을 증가시킨다는 것을 발견하였다 (도 8B). 이것은 이 더 작은 링커에서 자가단백질분해 표적 부위의 존재 (hCASP1_NTR_CCS의 AYVHDAPVR, 서열번호: 51) 또는 부재 (hCASP1_NTR_GSL의 GSGSGSGSG, 서열번호: 50)와 독립적이었다 (도 8B). 야생형 인간 카스파제-1과 비교하여, hCASP1_NTR_GSL (서열 번호: 50)은 시험관내 분석에서 약 30배 더 강력했다 (도 8). 따라서, Srinivasula 접근 방식은 인간 카스파제-1의 활성을 유의미하게 증가시키지 않았지만, N-말단 잔기를 제거하고, 어느 정도 링커 크기를 감소시켜, 예기치 않게 구성적으로 활성인 인간 카스파제-1이 생성되었다.
표 1. 파이롭토시스-관련 작제물. 카스파제-1 작제물의 상세한 설명은 도 1 참조
Figure pct00005
표 2. 아미노산 서열
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
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Figure pct00016
표 3. 공동-자극성 분자의 개요
Figure pct00017
Figure pct00018
표 4. 카스파제-1 작제물. 카프파제-1 작제물의 상세한 설명은 도 6 참조
Figure pct00019
SEQUENCE LISTING <110> Immunetune B.V. <120> Immune-stimulatory compositions and use thereof <130> P122264PC00 <140> PCT/NL2020/050225 <141> 2020-04-02 <150> EP 19166877.1 <151> 2019-04-02 <160> 79 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 402 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met Ala Asp Lys Ile Leu Arg Ala Lys Arg Lys Gln Phe Ile Asn Ser 1 5 10 15 Val Ser Ile Gly Thr Ile Asn Gly Leu Leu Asp Glu Leu Leu Glu Lys 20 25 30 Arg Val Leu Asn Gln Glu Glu Met Asp Lys Ile Lys Leu Ala Asn Ile 35 40 45 Thr Ala Met Asp Lys Ala Arg Asp Leu Cys Asp His Val Ser Lys Lys 50 55 60 Gly Pro Gln Ala Ser Gln Ile Phe Ile Thr Tyr Ile Cys Asn Glu Asp 65 70 75 80 Cys Tyr Leu Ala Gly Ile Leu Glu Leu Gln Ser Ala Pro Ser Ala Glu 85 90 95 Thr Phe Val Ala Thr Glu Asp Ser Lys Gly Gly His Pro Ser Ser Ser 100 105 110 Glu Thr Lys Glu Glu Gln Asn Lys Glu Asp Gly Thr Phe Pro Gly Leu 115 120 125 Thr Gly Thr Leu Lys Phe Cys Pro Leu Glu Lys Ala Gln Lys Leu Trp 130 135 140 Lys Glu Asn Pro Ser Glu Ile Tyr Pro Ile Met Asn 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Lys Asp Phe Ile Ala Phe Cys 1 5 10 15 Ser Ser Thr Pro Asp Asn Val Ser Trp Arg His Pro Thr Met Gly Ser 20 25 30 Val Phe Ile Gly Arg Leu Ile Glu His Met Gln Glu Tyr Ala Cys Ser 35 40 45 Cys Asp Val Glu Glu Ile Phe Arg Lys Val Arg Phe Ser Phe Glu Gln 50 55 60 Pro Asp Gly Arg Ala Gln Met Pro Thr Thr Glu Arg Val Thr Leu Thr 65 70 75 80 Arg Cys Phe Tyr Leu Phe Pro Gly His Ala Tyr Val His Asp Ala Pro 85 90 95 Val Arg Asn Pro Ala Met Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Gly Asn Val 100 105 110 Lys Leu Cys Ser Leu Glu Glu Ala Gln Arg Ile Trp Lys Gln Lys Ser 115 120 125 Ala Glu Ile Tyr Pro Ile Met Asp Lys Ser Ser Arg Thr Arg Leu Ala 130 135 140 Leu Ile Ile Cys Asn Glu Glu Phe Asp Ser Ile Pro Arg Arg Thr Gly 145 150 155 160 Ala Glu Val Asp Ile Thr Gly Met Thr Met Leu Leu Gln Asn Leu Gly 165 170 175 Tyr Ser Val Asp Val Lys Lys Asn Leu Thr Ala Ser Asp Met Thr Thr 180 185 190 Glu Leu Glu Ala Phe Ala His Arg Pro Glu His Lys Thr Ser Asp Ser 195 200 205 Thr Phe Leu Val Phe Met Ser His Gly Ile Arg Glu Gly Ile 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17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> binding sequence <400> 59 Gly Gly Val Ala Asp Leu Ile Lys Lys Phe Glu Ser Ile Ser Lys Glu 1 5 10 15 Glu <210> 60 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IDL sequence <400> 60 Ser Glu Glu Asp Phe Leu Thr Asp Ala Ile Phe Glu Asp Asp 1 5 10 <210> 61 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> inter-domain linker <400> 61 Gly Asn Leu Ser Leu Pro Thr Thr Glu Glu Phe Glu Asp Asp 1 5 10 <210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 62 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 63 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 63 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser 35 <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 64 Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser 1 5 10 15 <210> 65 <211> 8 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 65 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> aa <400> 66 Ala Tyr Val His Asp Ala Pro Val Arg 1 5 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 67 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 68 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Phe Pro Ala Pro Gln Ala Val Gln Asp Asn Pro Ala Met Pro Thr Ser 1 5 10 15 Ser Gly Ser Glu Gly Asn Val Lys Leu Cys Ser Leu Glu Glu Ala Gln 20 25 30 Arg Ile Trp Lys Gln Lys Ser Ala Glu Ile Tyr Pro Ile Met Asp Lys 35 40 45 Ser Ser Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn 50 55 60 <210> 69 <211> 59 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 69 Ser Ser Glu Thr Lys Glu Glu Gln Asn Lys Glu Asp Gly Thr Phe Pro 1 5 10 15 Gly Leu Thr Gly Thr Leu Lys Phe Cys Pro Leu Glu Lys Ala Gln Lys 20 25 30 Leu Trp Lys Glu Asn Pro Ser Glu Ile Tyr Pro Ile Met Asn Thr Thr 35 40 45 Thr Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn 50 55 <210> 70 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Pro Asn Lys Lys Ala His Pro Asn Met Glu Ala Gly Pro Pro Glu Ser 1 5 10 15 Gly Glu Ser Thr Asp Ala Leu Lys Leu Cys Pro His Glu Glu Phe Leu 20 25 30 Arg Leu Cys Lys Glu Arg Ala Glu Glu Ile Tyr Pro Ile Lys Glu Arg 35 40 45 Asn Asn Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn 50 55 60 <210> 71 <211> 56 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 71 His His Gly Glu Ala Asn Leu Glu Met Glu Glu Pro Glu Glu Ser Leu 1 5 10 15 Asn Thr Leu Lys Leu Cys Ser Pro Glu Glu Phe Thr Arg Leu Cys Arg 20 25 30 Glu Lys Thr Gln Glu Ile Tyr Pro Ile Lys Glu Ala Asn Gly Arg Thr 35 40 45 Arg Lys Ala Leu Ile Ile Cys Asn 50 55 <210> 72 <211> 60 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Thr Ser Val Lys Pro Leu Leu Gln Ile Glu Ala Gly Pro Pro Glu Ser 1 5 10 15 Ala Glu Ser Thr Asn Ile Leu Lys Leu Cys Pro Arg Glu Glu Phe Leu 20 25 30 Arg Leu Cys Lys Lys Asn His Asp Glu Ile Tyr Pro Ile Lys Lys Arg 35 40 45 Glu Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn 50 55 60 <210> 73 <211> 60 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 73 Ala His Glu Ser His Leu Met Leu Thr Ala Pro His Gly Leu Gln Ser 1 5 10 15 Ser Glu Val Gln Asp Thr Leu Lys Leu Cys Pro Arg Asp Gln Phe Cys 20 25 30 Lys Ile Lys Thr Glu Arg Ala Lys Glu Ile Tyr Pro Val Met Glu Lys 35 40 45 Glu Gly Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn 50 55 60 <210> 74 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Val Phe Ile Gly Arg Leu Ile Glu His Met Gln Glu Tyr Ala Cys Ser 1 5 10 15 Cys Asp Val Glu Glu Ile Phe Arg Lys Val Arg Phe Ser Phe Glu Gln 20 25 30 Pro Asp Gly Arg Ala Gln Met Pro Thr Thr Glu Arg Val Thr Leu Thr 35 40 45 Arg Cys Phe Tyr Leu Phe Pro Gly His 50 55 <210> 75 <211> 57 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 75 Leu Phe Ile Glu Ser Leu Ile Lys His Met Lys Glu Tyr Ala Trp Ser 1 5 10 15 Cys Asp Leu Glu Asp Ile Phe Arg Lys Val Arg Phe Ser Phe Glu Gln 20 25 30 Pro Glu Phe Arg Leu Gln Met Pro Thr Ala Asp Arg Val Thr Leu Thr 35 40 45 Lys Arg Phe Tyr Leu Phe Pro Gly His 50 55 <210> 76 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Ile Phe Ile Thr Gln Leu Ile Thr Cys Phe Gln Lys Tyr Ser Trp Cys 1 5 10 15 Cys His Leu Glu Glu Val Phe Arg Lys Val Gln Gln Ser Phe Glu Thr 20 25 30 Pro Arg Ala Lys Ala Gln Met Pro Thr Ile Glu Arg Leu Ser Met Thr 35 40 45 Arg Tyr Phe Tyr Leu Phe Pro Gly Asn 50 55 <210> 77 <211> 57 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 77 Tyr Phe Ile Thr Arg Leu Ile Ser Cys Phe Arg Lys His Ala Cys Ser 1 5 10 15 Cys His Leu Phe Asp Ile Phe Leu Lys Val Gln Gln Ser Phe Glu Lys 20 25 30 Ala Ser Ile His Ser Gln Met Pro Thr Ile Asp Arg Ala Thr Leu Thr 35 40 45 Arg Tyr Phe Tyr Leu Phe Pro Gly Asn 50 55 <210> 78 <211> 57 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Ile Phe Ile Thr Glu Leu Ile Thr Cys Phe Gln Lys Tyr Ser Cys Cys 1 5 10 15 Cys His Leu Met Glu Ile Phe Arg Lys Val Gln Lys Ser Phe Glu Val 20 25 30 Pro Gln Ala Lys Ala Gln Met Pro Thr Ile Glu Arg Ala Thr Leu Thr 35 40 45 Arg Asp Phe Tyr Leu Phe Pro Gly Asn 50 55 <210> 79 <211> 57 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 79 Leu Phe Ile Ser Lys Leu Ile Asp Cys Phe Lys Lys Tyr Cys Trp Cys 1 5 10 15 Tyr His Leu Glu Glu Ile Phe Arg Lys Val Gln His Ser Phe Glu Val 20 25 30 Pro Gly Glu Leu Thr Gln Met Pro Thr Ile Glu Arg Val Ser Met Thr 35 40 45 Arg Tyr Phe Tyr Leu Phe Pro Gly Asn 50 55

Claims (17)

  1. 단백질분해효소 절단 가능 부위에 선택적으로 연결된, 교환된 p10 및 p20 도메인을 포함하는, 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제, 바람직하게는 인간 카스파제.
  2. 제1항에 있어서, 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제-1, 바람직하게는 인간 카스파제 1인, 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제.
  3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 카스파제 모집-도메인(CARD: caspase-recruitment domain)이 결여된, 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, G403 (서열번호: 52)에 상응하는 글리신이 C136 (서열번호: 52)에 상응하는 시스테인으로부터 0 내지 40개의 아미노산 잔기의 거리에, 바람직하게는 0 내지 10개의 아미노산 잔기 거리에 위치하는 것인, 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, p20-p10 도메인간 링커(IDL)가 결여된, 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 구성적으로 활성인 전염증성 카스파제를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응, 바람직하게는 T-세포 매개 면역 반응을 자극하는 방법에 사용하기 위한, 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제.
  7. 제6항에 있어서, 상기 면역 반응이 개체에 존재하는 종양 또는 감염에 대해 지시되는 것인, 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제.
  8. 제6항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카스파제가 개체의 종양 내로, 바람직하게는 종양내 주사에 의해 투여되는 것인, 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제.
  9. 제6항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카스파제가 백신의 보조제로서 전신 투여되는 것인, 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카스파제가 면역 관문 억제제와 같은 하나 이상의 보조 분자 및/또는 사이토카인 또는 케모카인과 같은 추가의 면역 자극 분자와 조합하여 투여되는 것인, 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제.
  11. 제10항에 있어서, 상기 보조 분자가 표 3으로부터 선택되는 것인, 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 보조 분자가 IL-12 및/또는 CSF2로부터 선택되는 것인, 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제.
  13. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 구성적으로 활성인 전-염증성 카스파제 및 약리학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 면역 자극 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 적어도 하나의 항원 또는 항원-인코딩 핵산 분자를 추가로 포함하는, 면역 자극 조성물.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 면역 관문 억제제와 같은 보조 면역 자극 분자 및/또는 사이토카인 또는 케모카인과 같은 추가의 면역 자극 분자를 추가로 포함하는, 면역 자극 조성물.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 또는 감염을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 면역 자극 조성물.
  17. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 제공하는 단계, 및 상기 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 면역 반응, 바람직하게는 T-세포 매개 면역 반응을 자극하는 방법.
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