KR20180073586A - Il-12를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 방법 - Google Patents

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Abstract

본 특허 출원은 일반적으로는 암의 치료, 및 보다 상세하게는 암의 치료를 위한 IL-12를 발현하는 슈도타입화 렌티바이러스의 용도에 관한 것이다.

Description

IL-12를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 방법
본 특허 출원은 일반적으로는 암의 치료, 및 보다 상세하게는 암의 치료를 위한 IL-12를 발현하는 슈도타입화 렌티바이러스의 용도에 관한 것이다.
암세포는 항원을 발현한다. 이러한 항원이 존재함에도 불구하고, 종양은 일반적으로 숙주에 의해 쉽게 인식 및 제거되지 않는다는 것이 질병의 진행과정에서 증명되어 있다. 면역 시스템이 종양을 예방할 수 없다는 것은 회피 기전, 활성 억제(active suppression), 또는 차선의 활성화 반응 때문이다.
사이토카인은 선천적 및 후천적 면역 체계 모두에서 필수적이다. 그들은 세포 및 체액 반응의 균형을 바꿀 수 있고, B 림프구의 클래스 전환을 바꿀 수 있고, 선천적 반응을 변형시킬 수 있다.
인터루킨-12는 면역 시스템에서 다양한 생물학적 효과를 갖는 이종이량체 (heterodimeric) 사이토카인이다. 그것은 p35 및 p40의 2 개의 서브유닛으로 구성되어 있는데, 둘다 p70, 활성 형태의 IL-12의 분비를 위해 필요하다. 인터루킨-12는 수지상 세포 (DC)에 작용하여, 성숙 및 항원 제시를 증가하게 하여 종양 특이적 항원에 대한 T 세포 반응의 개시를 가능하게 한다. 그것은 또한 DC에 의한 IL-12의 분비를 유도하여, 반응을 증폭시키는 양성 피드백 메커니즘을 만든다. 일단 반응이 개시되면, IL-12는 CD4 + T 세포가 인터페론-감마 (IFN-감마)를 분비하게 유도하고, CD8+ 세포독성 T 세포 반응을 일으키면서, Th1 사이토카인 프로파일을 향한 면역 시스템을 지시하는데 기본적인 역할을 한다 (예를 들어, Cancer Immunol Immunother (2014) 63:419-435 참조). 그러나, IL-12는 또한 IFN-γ와 결합된 종양 괴사 인자 -알파 (TNF-알파)를 포함하는 다른 사이토카인의 분비를 일으키고, CD4+ 세포독성 T 림프구 (CTL)의 개발을 위한 전제조건인 강력한 염증촉진성 사이토카인이다 (Sasiain, MC, et al (1998) Clinical and experimental immunology 114 : 196-203). 게다가, IL-12는 IFNγ 및 다른 사이토카인의 유도를 통해 대식세포 및 호산구와 같은 선천성 면역 세포의 활성화를 촉진시킬 수 있다. 상기 활성화는 이들 세포에 의한 IL-12 분비, 및 추가로 선천적 및 후천적 반응 모두의 증폭을 일으킨다 (Portielje, J. E., et al, (2003) Cancer Immunol Immunother 52 : 133-144). 그러나, 높은 수준의 IL-12, 및 결과적으로 IFNγ는 또한 IL-10과 같은 길항 분자의 유도 및 STAT4와 같은 IL-12의 하류 신호 분자의 감소와 관련이 있다 (Portielje, J. E., et al. (2003) Clin Cancer Res 9: 76-83; Sacco, S., et al. (1997) Blood 90: 4473-4479; Leonard, J. P., et al. (1997) Blood 90: 2541-2548.).
재조합 IL-12의 직접 주사는 백혈병의 일부 마우스 모델에서 나타내왔다. (Masztalerz, A., et al., (2003) Cancer Immunol Immunother 52: 235-242; Zagozdzon, R., et al. (1998) Int J Cancer 77: 720-727; Tatsumi, T., et al. (2001) Cancer research 61: 7563-7567; Nastala, C. L., et al. (1994) J Immunol 153: 1697-1706; Dunussi-Joannopoulos, K., et al., (1999) Blood 94: 4263-4273.). 이 접근법을 쓰는 초기 인간 임상시험은 덜 유망하지만 (Atkins, M. B., et al. (1997) Clin Cancer Res 3: 409-417; Kang, W. K., et al. (2001) Human gene therapy 12: 671-684; Mazzolini, G., et al. (2005) J Clin Oncol 23: 999-1010; Dohnal, A. M., et al., (2007) Cytotherapy 9: 755-770.), 혁신적인 유전자 치료 전략은 암에 대항하는 예방적 면역요법의 개발을 가속화할 수 있다.
본 발명의 일 양상은 다음 렌티바이러스 벡터 입자를 제공한다: a) 160X가 없거나 글루탐산 이외의 아미노산인 서열번호 1의 신드비스 (Sindbis)바이러스 E2 당단백질, 또는 서열번호 1과 80% 이상의 동일성을 갖고 160X가 없거나, 글루탐산 이외의 아미노산이고, 수지상 세포를 감염시킬 수 있는 서열번호 1의 변이체를 포함하는 외피로서; 상기 E2는 신드비스 바이러스 E3과의 융합 단백질의 일부가 아닌 것인 외피; 및 b) IL-12를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 게놈. 본 명세서에 기재된 렌티바이러스 벡터 입자의 임의의 구체예에서, 상기 IL-12는 단일 사슬 IL-12 (scIL-12)이다. 본 명세서에 기재된 렌티바이러스 벡터의 임의의 구체예에서, sclL-12는 p35-L-p40을 포함한다. 본 명세서에 기재된 렌티바이러스 벡터 입자의 임의의 구체예에서, 상기 sclL-12는 p40-L-p35를 포함한다. 본 명세서에 기재된 상기 렌티바이러스 벡터 입자의 다른 구체예에서, 상기 렌티바이러스 벡터 게놈은 항원을 코딩하는 서열을 더 포함한다. 이에 대하여, 상기 항원은 종양 관련 항원, 바이러스성 항원, 박테리아성 항원, 또는 진균성 항원이다. 임의의 구체예에서, 상기 종양 관련 항원은 전립선 산 포스파타제 (prostatic acid phosphatase), 전립선 특이적 항원 (prostate specific antigen), NKX3.1, 전립선 특이적 막 항원 (prostate specific membrane antigen), PRAME, BAGE, RAGE, NY-ESO-1, SAGE, HAGE, GAGE, Plu-1, HASH -1, HasH-2, Cripto, Criptin, MART-1/Melan-A, gp100, gp75, mda-7, 티로시나제, 티로시나제-관련 단백질, p53, Ras, c-Myc, A-Raf, B-Raf, and C-Raf, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, MART-1, BAGE, DAM-6, -10, GAGE-1, GAGE -2, GAGE -8, GAGE-3, GAGE -4, GAGE -5, GAGE -6, GAGE -7B, NA88-A, MART-1, MC1R, Gp100, PSM, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC2, PRAME, P15, RU1, RU2, SART-1, SART-3, 빌롬 종양 항원 (Wilms' tumor antigen: WT1), AFP, β-카테닌/m, 카스파제-8/m, CEA, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, Mum-1, Mum-2, Mum-3, 미오신/m, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, 아넥신 II, CDC27/m, TPI/mbcr-abl, BCR-ABL, 인터페론 조절 인자 4 (IRF4), ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RAR, 종양-관련 칼슘 신호 트랜스듀서 1 (TACSTD1) TACSTD2, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR 및 EGFRvIII), 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (PDGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR), 인테그린-연결 키나제 (ILK), STAT3, STAT5, STAT6, HIF-1, HIF-2, 핵 인자-카파 B (NF-κB), Notch1-4, c-Met, 포유류 라파마이신 표적(mTOR: mammalian targets of rapamycin), WNT, PMSA, PR-3, MDM2, 메소텔린(Mesothelin), 신장 세포 암종(renal cell carcinoma)-5T4, SM22-알파, 카르본산염 안히드라제 I (CAI) 및 IX (CAIX) (G250로도 알려짐), STEAD, TEL/AML1, GD2, 프로테나제3, hTERT, 육종 전좌 절단점(sarcoma translocation breakpoints), EphA2, ML-IAP, EpCAM, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, ALK, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, 폴리시알 산, MYCN, RhoC, GD3, 푸코실 GM1(fucosyl GM1), 메소텔리안(mesothelian), PSCA, sLe, PLAC1, GM3, BORIS, Tn, GLoboH, NY-BR-1, RGs5, SART3, STn, PAX5, OY-TES1, 정자 단백질 17 (sperm protein 17), LCK, HMWMAA, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, 레구메인(legumain), TIE2, Page4, MAD-CT-1, FAP, MAD-CT-2, 및 포스 관련 단백질 1(fos related antigen 1)로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다.
본 발명의 다른 양상은, 다음을 포함하는 렌티 바이러스 벡터 입자와 같은, 본 명세서에 기재된 렌티바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다: a) 160X가 없거나 글루탐산 이외의 아미노산인 서열번호 1의 신드비스 바이러스 E2 당단백질, 또는 서열번호 1과 80% 이상의 동일성을 갖고 160X가 없거나, 글루탐산 이외의 아미노산이고, 수지상 세포를 감염시킬 수 있는 서열번호 1의 변이체를 포함하는 외피로서; 상기 E2는 신드비스 바이러스 E3과의 융합 단백질의 일부가 아닌 것인 외피; 및 b) IL-12를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 게놈. 임의의 구체예에서, 상기 방법은 종양 항원을 코딩하는 제 2 렌티바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 더 포함한다. 임의의 구체예에서, IL-12를 발현하는 상기 렌티바이러스 벡터 입자 및 제 2 렌티바이러스 벡터는 동시에 투여된다. 다른 구체예에서, IL-12를 발현하는 상기 렌티바이러스 벡터 입자 및 제 2 렌티바이러스 벡터는 상이한 시간에 순차적으로 투여된다. 다른 구체예에서, 본 명세서에 기재된 IL-12를 발현하는 상기 렌티바이러스 벡터 입자 및 제 2 렌티바이러스 벡터는 상이한 경로로 투여된다. 다른 구체예에서, 본 명세서에 기재된 IL-12를 발현하는 상기 렌티바이러스 벡터 입자 및 제 2 렌티바이러스 벡터는 상이한 부위에 투여된다. 다른 구체예에서, 본 명세서에 기재된 IL-12를 발현하는 상기 렌티바이러스 벡터 입자 및 제 2 렌티바이러스 벡터는 동일한 경로로, 상이한 부위에 투여된다. 다른 구체예에서, 본 명세서에 기재된 IL-12를 발현하는 상기 렌티바이러스 벡터 입자는 종양내로 투여된다. 일 구체예에서, TLR4 작용제 (agonist)는 본 명세서에 기재된 상기 렌티바이러스 벡터 입자와 함께 종양내로 투여된다. 임의의 구체예에서, 상기 TLR4 작용제는 IL-12를 발현하는 상기 렌티바이러스 벡터 입자와 같은 조성물로 종양내로 투여된다. 다른 구체예에서, 상기 TLR4 작용제는 IL-12를 발현하는 상기 렌티바이러스 벡터 입자와 동시에 종양내로 투여되지만, 별도의 조성물로 투여된다. TLR4 작용제가 투여되는 이러한 구체예에서, TLR4 작용제는 수성 또는 수중유 에멀젼 제형 중의 글루코피라노실지질 A (GLA)일 수 있다. 임의의 구체예에서, 본 명세서에 기재된 IL-12를 발현하는 상기 렌티바이러스 벡터 입자는 종앵내로 투여되고, 제 2 렌티바이러스 벡터는 상이한 경로로 상이한 부위에 동시에 투여된다.
본 발명의 다른 양상은 상기 렌티바이러스 벡터 게놈은 항원을 코딩하는 서열을 더 포함하고, IL-12를 발현하는 본 명세서에 기재된 렌티바이러스 벡터 입자를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 상기 렌티바이러스 벡터 입자는 종양내로 투여된다. 임의의 구체예에서, 상기 렌티바이러스 벡터 입자는 단일 용량으로 투여된다. 다른 구체예에서, 상기 렌티바이러스 벡터 입자는 낮은-수준의 IL-12를 생산한다. 이에 대하여, 상기 낮은-수준의 IL-12는 시험관 내 형질도입 분석에서 측정된 것으로, 처음 48시간 동안 생성된 약 0.1 ㎍ 내지 1㎍/1E10 벡터 게놈이다.
본 발명의 다른 양상은 인간 또는 동물 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 IL-12를 발현하는 렌티바이러스 벡터 입자를 포함한다.
본 발명의 다른 양상은 다음을 포함하는 조성물을 제공한다: a) 160X가 없거나 글루탐산 이외의 아미노산인 서열번호 1의 신드비스 바이러스 E2 당단백질, 또는 서열번호 1과 80% 이상의 동일성을 갖고 160X가 없거나, 글루탐산 이외의 아미노산이고, 수지상 세포를 감염시킬 수 있는 서열번호 1의 변이체를 포함하는 외피로서; 상기 E2는 신드비스 바이러스 E3과의 융합 단백질의 일부가 아닌 것인 외피; 및 b) 종양 항원을 코딩하는 제 2 렌티바이러스 벡터 입자와 조합하는; IL-12를 코딩하는 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 게놈.
본 발명의 다른 양상은 다음을 포함하는 산물을 제공한다: a) 렌티바이러스 벡터를 포함하는 제 1 조성물로서, 특히 다음 입자를 포함한다: 1) 160X가 없거나 글루탐산 이외의 아미노산인 서열번호 1의 신드비스 바이러스 E2 당단백질, 또는 서열번호 1과 80% 이상의 동일성을 갖고 160X가 없거나, 글루탐산 이외의 아미노산이고, 수지상 세포를 감염시킬 수 있는 서열번호 1의 변이체를 포함하는 외피로서; 상기 E2는 신드비스 바이러스 E3과의 융합 단백질의 일부가 아닌 것인 외피; 및 2) IL-12를 코딩하는 서열을 포함하는 렌티바이러스 게놈; 및 b) 종양 항원을 코딩하는 제 2 렌티바이러스 벡터 입자를 포함하는 제 2 조성물; 상기 제 1 조성물이 종양내로 투여되고 제 2 조성물이 상이한 경로에 의해 투여되는, 개체에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 산물. 일 구체예에서, 상기 제 2 조성물은 피내, 피하, 또는 근육내 투여된다. 다른 구체예에서, 상기 제 1 조성물 및 제 2 조성물은 동시에 투여된다. 추가 구체예에서, 상기 제 1 조성물 및 제 2 조성물은 순차적으로 투여된다.
본 발명의 다른 양상은 약제학적으로 허용가능한 부형제 및 다음을 포함하는 렌티바이러스 벡터 입자를 포함하는 치료용 또는 예방용 백신을 제공한다: a) 160X가 없거나 글루탐산 이외의 아미노산인 서열번호 1의 신드비스 바이러스 E2 당단백질, 또는 서열번호 1과 80% 이상의 동일성을 갖고 160X가 없거나, 글루탐산 이외의 아미노산이고, 수지상 세포를 감염시킬 수 있는 서열번호 1의 변이체를 포함하는 외피로서; 상기 E2는 신드비스 바이러스 E3과의 융합 단백질의 일부가 아닌 것인 외피; 및 b) IL-12를 코딩하는 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 게놈으로, 항원을 코딩하는 서열을 더 포함하는 렌티바이러스 벡터 게놈.
본 발명의 다른 양상은 IL-12를 코딩하는 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 게놈을 포함하는 렌티바이러스 벡터 입자를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법으로서; 상기 렌티바이러스 벡터 입자를 포함하는 상기 조성물은 종양내로 투여되고, 상기 렌티바이러스 벡터 입자는 시험관 내 형질도입 분석에서 측정된 경우; 처음 48시간 동안 생성된 약 0.1 ㎍ 내지 1㎍/1E10 벡터 게놈인 낮은 수준의 IL-12를 생산하는 것인 방법을 제공한다. 임의의 구체예에서, 상기 치료는 조절 T 세포의 감소 (depletion)를 더 포함한다. 이에 대하여, 조절 T 세포의 감소는 시클로포스파미드의 전신 투여 또는 조절 T 세포를 감소시키는 항체와 같은 작용제의 처리를 포함할 수 있다. 예시적으로 그러한 항체는 항-CD25 항체이다. 임의의 구체예에서, 상기 시클로포스파미드 또는 항-CD25 항체의 전신 투여는 상기 렌티바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 종양내 주사 이전이다.
본 명세서에 기재된 암의 치료 방법은 시클로포스파미드 또는 조절 T 세포를 감소시키는 작용제, 예를 들어 항체 (예를 들어, 항-CD25 항체)의 전신 투여와 같은 조절 T 세포의 감소와 병용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 렌티바이러스 벡터 입자를 포함한다: a) 160X가 없거나 글루탐산 이외의 아미노산인 서열번호 1의 신드비스 바이러스 E2 당단백질, 또는 서열번호 1과 80% 이상의 동일성을 갖고 160X가 없거나, 글루탐산 이외의 아미노산이고, 수지상 세포를 감염시킬 수 있는 서열번호 1의 변이체를 포함하는 외피로서; 상기 E2는 신드비스 바이러스 E3과의 융합 단백질의 일부가 아닌 것인 외피; 및 b) IL-23를 코딩하는 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 게놈.
도 1a 및 도 1b는 VP02/NY-ESO-1와 함께 VP02/IL-12의 공동-전달 (co-delivery)이 항-NY-ESO-1 CD8 T 세포 반응을 향상시킨다는 것을 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 VP02/hCAIX와 함께 VP02/IL-12의 공동-전달이 항-hCAIX CD8 T 세포 반응을 향상시킨다는 것을 나타낸다.
도 3a 및 도 3b는 VP02/IL-12의 공동-전달이 렌티바이러스 벡터 VP02/NY-ESO-1에 의해 유도된 NY-ESO-1에 대한 항원-특이적 CD8 T 세포 반응을 유의하게 향상시킨다는 것을 나타낸다.
도 4a 및 도 4b는 VP02/IL-12의 공동-전달이 렌티바이러스 벡터 VP02/NY-ESO-1에 의해 유도된 NY-ESO-1에 대한 항원-특이적 CD4 T 세포 반응을 유의하게 향상시켰다는 것을 나타낸다.
도 5a, 도 5b, 도 5c 및 도 5d는 경계 면역원성 용량 (1E9 vg)에서 LV305와 함께 VP02/IL-12 (1E9 vg 용량)의 더 낮은 용량의 병용-투여가 CD8 및 CD5 반응을 향상시켰다는 것을 나타낸다.
도 6은 VP02/IL-12의 병용-투여가 높은 용량의 VP02/hCAIX의 치료적 활성을 향상시켰지만 그 차이는 유의하지 않았음을 나타낸다.
도 7a 및 도 7b는 낮은 용량의 LV305에 의해 매개되는 항종양 효능이 VP02/IL-12의 추가-혼합(ad-mixing)에 의해 향상되었고 항종양 효능이 NY-ESO-1-특이적 CD8 T 세포의 크기와 상관 관계가 있었다는 것을 나타낸다 (도 7b).
도 8a 및 도 8b는 VP02/IL-23이 프라이밍 면역 후에 PBMC에서 LV305-유도된 CD8 T 세포 반응을 유의하게 향상시킬 수 있었다는 것을 나타낸다 (도 8b).
도 9a 및 도 9b는 B16F10 발바닥 마우스 종양 모델에서 LV/IL-12의 종양내 주사의 항종양 효능을 나타낸다. 도 9a는 종양 성장 곡선을 나타내고, 도 9b는 통합(LV703) 및 통합 결핍(LV704, VP02로도 기재됨) 렌티바이러스 벡터 모두의 생존 곡선을 나타낸다.
도 10a 및 도 10b는 B16F10 옆구리 마우스 종양 모델에서 LV/IL-12의 종양내 주사의 항종양 효능을 나타낸다. 도 10a는 종양 성장 곡선을 나타내고, 도 10b는 통합(LV703) 및 통합 결핍(LV704, VP02로도 기재됨) 렌티바이러스 벡터 모두의 생존 곡선을 나타낸다.
도 11a 및 도 11b는 P815 마우스 종양 모델에서 LV/IL-12의 종양내 주사의 항종양 효능을 나타낸다. 도 11a는 종양 성장 곡선을 나타내고, 도 11b는 통합(LV703) 및 통합 결핍(LV704, VP02로도 기재됨) 렌티바이러스 벡터 모두의 생존 곡선을 나타낸다.
도 12a 및 도 12b는 CT26 옆구리 마우스 종양 모델에서 LV/IL-12의 종양내 주사의 항종양 효능을 나타낸다. 도 12a는 종양 성장 곡선을 나타내고, 도 12b는 통합(LV703) 및 통합 결핍(LV704, VP02로도 기재됨) 렌티바이러스 벡터 모두의 생존 곡선을 나타낸다.
도 13a 및 도 13b는 4T1 마우스 종양 모델에서 LV/IL-12의 종양내 주사의 항종양 효능을 나타낸다. 도 13a는 종양 성장 곡선을 나타내고, 도 13b는 통합(LV703) 및 통합 결핍(LV704, VP02로도 기재됨) 렌티바이러스 벡터 모두의 생존 곡선을 나타낸다.
도 14a 및 도 14b는 A20 마우스 종양 모델에서 LV/IL-12의 종양내 주사의 항종양 효능을 나타낸다. 도 14a는 종양 성장 곡선을 나타내고, 도 14b는 통합(LV703) 및 통합 결핍(LV704, VP02로도 기재됨) 렌티바이러스 벡터 모두의 생존 곡선을 나타낸다.
도 15a 및 도 15b는 함께 환합된 rNY-ESO-1 + GLA-SE로 병용-투여되고, 꼬리의 끝에 피하주사(s.c.)로 투여되었을 때, VP02/IL-12의 추가는 NY-ESO-1 항원-특이적 CD4 T 세포 반응을 유의하게 증가시켰다는 것을 나타낸다. 도 15a는 사이토카인 양성 CD4 T 세포의 백분율을 나타내고, 도 15b는 IFNγ CD4 양성 T 세포의 전체 백분율을 나타낸다.
도 16a, 도 16b, 도 16c, 및 도 16d는 GLA-SE와 병용한 재조합 B형 간염 표면 항원(rHBsAg)을 사용한 실험에서 VP02/IL-12의 추가가 CD8 T 세포 반응을 유의하게 촉진 (boost) (도 16a 및 도 16b)시킨 반면, CD4 T 세포 반응은 감소(도 16c 및 도 16d)시킨 것을 나타낸다.
도 17a, 17b, 17c: C57BL/6 암컷 마우스 (수(n) = 8/군)에게 우측 발바닥에 1 × 106 B16F10 흑색종(melanoma) 세포로 접종하였다. 7 일째, 종양-보유 마우스에게 좌측 발바닥에 1 × 106 흑색종 세포를 접종하였다. 그러고는 마우스를 LV/IL-12 (LV703) 또는 LV703/IL-12/RTmut 또는 대조군 벡터, IT ± 200 ㎍ 항-CTLA-4 항체 또는 아이소타입(isotype) 대조군, IP로 면역화시켰다. 항체는 연구가 끝날때까지, 주 1회 투여하였다. 17a, 개별 종양 성장; 17b 개별 압스코팔(abscopal) 종양 성장; 17c, 생존 비율.
도 18a, 18b, 18c: C57BL/6 암컷 마우스 (수 = 8/군)에게 우측 옆구리에 1 × 105 B16F10 흑색종 세포로 접종하였다. 7 일째, 종양-보유 마우스에게 좌측 옆구리에 1 × 105 흑색종 세포를 접종하였다. 그 후 마우스를 LV/IL-12 (LV703) 또는 LV703/IL-12/RTmut 또는 대조군 벡터, IT ± 200 ㎍ 항-CTLA-4 항체 또는 동형 대조군, IP로 면역화시켰다. 항체는 연구가 끝날때까지, 주 1회 투여하였다. 18a, 개별 종양 성장; 18b 개별 압스코팔 종양 성장; 18c, 생존율.
도 19a, 19b, 19c, 19d: BALB/c 암컷 마우스 (수 = 10/군)에게 오른쪽 4번째 유방 지방 패드 안에 1 × 105 4T1 유방암 세포를 동소로(orthotopically) 접종하였다. 7 일째, 종양-보유 마우스에게 동소로 1 × 105 4T1 유방 암 세포를 오른쪽 4번째 유방 지방 패드 안에 접종하였다. 그 후 마우스를 LV 703/IL-12 또는 대조군 벡터, IT ± GLA, IT ± 200 ㎍ 항-CTLA-4 항체 또는 동형 대조군, IP로 면역화시켰다. GLA의 첫번째 용량은 종양-내 투여 전에 LV 703/IL-12와 혼합된 5 ㎍ GLA-AF였다. 이후의 종양-내 GLA 용량은 5 ㎍ 였고, 매주 투여되었다. 19A, 최초의 개별 종양 성장; 19b, 추가 압스코팔 종양과 함께 동물에서 최초의 개별 종양 성장; 19c, 개별 압스코팔 종양 성장; 19d, 생존율.
도 20a 및 20b는 종양내 LV703/IL-12로 처리된 마우스에서 IL-12 및 IFNγ의 혈장 수준을 나타내는 그래프이다.
도 21은 LV703/IL-12로 척수강내 (i.t.) 처리된 마우스의 개별 종양 크기(B16F10 옆구리 모델) 및 다른 세포 타입의 감소를 나타내는 그래프이다: (21a): CD8 T 세포 감소; (21b): CD4 T 세포 감소; (21c): NK 세포 감소; (21d): CD8 + CD4 감소 및 CD8, CD4 + NK 감소; (21e): CD8 + NK 및 CD4 + NK 감소.
본원은 IL-12를 코딩하는 렌티바이러스 벡터를 투여함으로써 암을 치료하는 조성물 및 방법을 개시한다. 임의의 구체예에서, 렌티바이러스 벡터는 IL-12를 발현하는 수지상 세포 (DC) 표적화 렌티바이러스 벡터이다. 특정 구체예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 신드비스 바이러스 E2로부터 유래된 외피 당단백질 변이체, IL-12를 코딩하는 서열을 포함하는 게놈, 및 선택적으로 기타 성분을 포함한다. 당단백질 변이체는 참조 신드비스 바이러스 균주인 HR과 비교하여 헤파란 술페이트에 대한 결합의 감소를 나타낸다. 외피 당단백질은 렌티바이러스 벡터 입자에 의한 수지상 세포의 감염을 용이하게 한다. 본 명세서에서 사용된 "용이하게 하다(Facilitates)" 감염은 형질도입을 용이하게 하는 것과 동일하며, 표적 세포 안으로 슈도타입화 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 입자의 수용체-매개 진입을 촉진 또는 향상시키는, 단독 또는 다른 분자와 함께 작용하는, 외피 당단백질의 역할을 의미한다.
일반적으로, 렌티바이러스 벡터 입자는 기능적 벡터 입자를 생성하기 위해 필요한 성분을 함께 코딩하는 하나 이상의 플라스미드 벡터 및/또는 통합된 요소를 함유하는 세포주에 의해 생산된다. 이들 렌티바이러스 벡터 입자는 전형적으로 복제-능력이 없으며, 단일 회차의 감염만이 가능하다. 가장 많게는, 렌티바이러스 벡터 입자를 생성하는 다양한 유전적 성분을 분리하는데 생산 세포 염색체에 안정적으로 통합된 다중 플라스미드 벡터 또는 개별 발현 카세트(cassette)를 사용하지만, 렌티바이러스 성분 모두를 가지는 단일 플라스미드 벡터를 사용할 수도 있다. 하나의 실례로, 패키징 세포주는 바이러스 벡터 게놈을 함유하는 하나 이상의 플라스미드, LTR, 시스-작용 패키징 서열 및 대상 서열(들), 바이러스의 효소적 및 구조적 성분을 코딩하는 하나 이상의 플라스미드(예를 들어, gag 및 pol), 및 외피 당단백질을 코딩하는 하나 이상의 플라스미드를 포함한다. 임의의 구체예에서, 외피 단백질은 아르보바이러스 외피 당단백질이다. 다른 구체예에서, 외피 단백질은 게놈을 위해 사용된 바이러스에 대한 이종 바이러스로부터 유래된다(예를 들어, 외피 당단백질은 렌티바이러스 벡터 이외의 바이러스로부터 유도된다). 바이러스 입자는 세포막을 관통하고, 수지상 세포를 표적으로 하는 아르보바이러스 외피와 같은 대상 서열 및 외피 당단백질을 함유하는, 전형적으로 2 개의 RNA 게놈을 포함하는 코어를 포함한다. 아르보바이러스 당단백질이 신드비스 바이러스 E2 당단백질일 때, 당단백질은 참조 균주 HR과 비교하여 헤파란 술페이트에 대한 결합이 감소되도록 조작된다. 이것은 보통 HR E2 당단백질 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 변화를 수반한다.
이론에 구애되지 않고, 바이러스 입자가 세포 표면에 결합하는 것은 엔도사이토시스를 유도하고, 바이러스를 엔도솜안으로 있게하고, 막 융합을 유발하고, 바이러스 코어가 세포질로 들어가게 하는 것으로 여겨진다. 렌티바이러스 벡터 입자의 통합을 이용하는 임의의 구체예에서, 물질의 핵으로의 이동 및 역전사 후에, 바이러스의 게놈은 대상 서열을 표적 세포의 게놈에 통합시킨 표적 세포 게놈에 포함된다. 그러나, 삽입 돌연변이 유발(insertional mutagenesis)의 가능성을 줄이고 지정된 항원(들)의 일시적인 발현을 촉진시키기 위해, 다른 구체예는 표적 세포 게놈으로 통합되지 않고, 대신에 에피솜으로부터의 대상 서열(들)을 발현하는 결핍된 렌티바이러스 벡터 입자를 사용한다. 어느 쪽이든, 감염된 세포는 대상 서열(들), 예를 들어, IL-12 및 임의의 항원 및/또는 자극 분자를 발현한다. 포함될 때, 항원은 수지상 세포에 의해 가공되고, 항원-특이적 면역 반응을 생성하는 T 및 B 세포에 제시될 수 있다. 수지상 세포가 항원-특이적 면역 반응을 자극할 수 있는 한 상술한 특이적 경로가 요구되는 것은 아니다.
바이러스 입자는 예방적 또는 치료적 효과를 제공하기 위해 개체에게 투여될 수 있다. 대상 서열의 물질은 전형적으로 단일 사슬 IL-12 (scIL-12) 또는 IL-12의 다른 형태이고, 또한 질병-유발 인자 또는 질병 세포 (예를 들어, 종양 세포)의 항원, 및 또는 사이토카인과 같은 추가의 면역조절 분자를 포함할 수 있다. 수지상 세포의 감염 및 물질의 발현 후, IL-12에 추가하여 벡터로부터 항원이 발현되는 실시예구체예에서, IL-12가 발현되고, 면역반응은 항원에 의해 생성되고, IL-12 물질이 발현된 것에 의해 촉진된다. 상기 면역 반응은 체액성 또는 세포성 또는 둘 다 일 수 있다.
A. 바이러스 벡터 외피
본 명세서에 기재된 바이러스 벡터는 일반적으로 이종 바이러스로부터의 외피 단백질로 슈도타입화된다. 임의의 구체예에서, 바이러스 벡터는 VSVg 외피 당단백질로 슈도타입화된다. 다른 구체예에서, 바이러스 벡터는 이종 HIV (예를 들어, HIV-2) 또는 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV: feline immunodeficiency virus), 말 감염성 빈혈 바이러스(equine infectious anemia virus), 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV: simian immunodeficiency virus), 또는 메디/비스나 바이러스와 같은 다른 이종 레트로바이러스로부터 유래된 외피 당단백질로 슈도타입화 될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터는 아르보바이러스로부터 유래된 외피 당단백질로 슈도타입화된다. 절지동물-매개성 바이러스(Arthropod-borne viruses, Arboviruses)는 모기와 같은 감염된 절지동물에 의해 사람, 말, 또는 새와 같은 숙주에게 전염되는 바이러스다. 아르보바이러스는 알파바이러스 및 플라비바이러스를 포함하는 바이러스의 하위-속으로 더 나뉘며, 양극성의 단일-가닥 RNA 게놈 및 당단백질-함유 외피를 가진다. 예를 들어, 뎅기열 바이러스, 황열병 바이러스 및 웨스트 나일 바이러스는 플라비 바이러스 계열에 속하며, 신드비스 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스 및 베네수엘라 말 뇌염 바이러스는 알파 바이러스 속의 일원이다 (Wang et al. J. Virol. 66, 4992 (1992)). 신드비스 바이러스의 외피는 2 개의 막전위 당단백질 (Mukhopadhyay et al. Nature Rev. Microbio. 3, 13 (2005)): E1이 융합을 담당한다고 여겨지며, E2가 세포 결합을 담당한다고 여겨진다. 신드비스 바이러스 외피 당단백질은 온코레트로바이러스 및 렌티바이러스를 포함하는, 기타 레트로바이러스를 슈도타입화 하는 것으로 알려져 있다.
상술된 바와 같이, 아르보바이러스 외피 당단백질은 렌티바이러스-기반의 벡터 게놈을 슈도타입화하는데 사용될 수 있다. "슈도타입화된(pseudotyped)" 렌티바이러스는 렌티바이러스 게놈과는 다른 바이러스에 의해 코딩되는 하나 이상의 외피 당단백질을 가지는 렌티바이러스 입자이다. 상기 외피 당단백질은 본 명세서에 기재된 바와 같이, 변형, 돌연변이 또는 가공될 수 있다.
신드비스 바이러스 및 다른 알파 바이러스의 외피는 바이러스 입자 막의 지질 이중층으로 포함되며, 전형적으로 여러카피의 두 당단백질, E1 및 E2를 포함한다. 각 당단백질은 막-통과(spanning) 영역을 가지고 있다; E2는 약 33 잔기의 세포질 도메인을 갖는 반면, E1의 세포질 꼬리는 매우 짧다 (약 2 잔기). E1과 E2는 둘 막-통과 영역에 또는 그 근처에 부착된 팔미트산을 갖는다. E2는 처음에, 퓨린 또는 다른 Ca2+-의존성 세린 프로테이나제에 의해 E2와 E3으로 불리는 작은 당단백질로 절단되는 전구체 단백질로 합성된다. E2 및 E1을 코딩하는 서열 사이에 위치한 것은 6K라 불리는 단백질을 코딩하는 서열이다. E3 및 6K는, 각각, E2 및 E1 당단백질을 막으로 전위시키는 역할을 하는 신호 서열이다. 신드비스 바이러스 게놈에서, 신드비스 외피 단백질의 코딩 영역은 E3, E2, 6K 및 E1을 코딩하는 서열을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 아르보바이러스 바이러스의 "외피(envelope)"는 적어도 E2를 포함하고, 또한 E1, 6K 및 E3을 포함할 수 있다. HR 균주, 신드비스 바이러스의 외피 당단백질의 예시적인 서열은 WO 2011/011584의 서열번호 17로 제시된다. 다른 아르보바이러스에 대한 외피 당단백질의 서열은 예를 들어, GenBank에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 뎅기 바이러스 당단백질을 코딩하는 서열은 Accession GQ252677 에서 (GenBank의 다른 것들 중에서) 및 NCBI의 바이러스 변이 데이터베이스에서 (GenBank 자료 및 바이러스 변이 데이터베이스는 외피 당단백질 서열에 대한 인용으로 포함되어 있다) 및 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 외피 당백질의 서열은 Accession NP 040824에서 (외피 당단백질의 서열에 대한 인용으로 포함됨) 찾을 수 있다.
알파바이러스 및 특히, 신드비스 바이러스에 대한 수지상 세포의 세포 수용체(들)의 지금까지 명확하게 확인되지 않았지만, 일 수용체는 DC-SIGN인 것으로 보인다 (Klimstra et al., J Virol 77: 12022, 2003). "부착(attachment)", "결합(binding)", "표적화(targeting)" 등 용어의 사용은 상호교환 가능하게 사용되며, 신드비스 바이러스 외피 당단백질 및 세포 성분 사이의 상호작용의 메커니즘을 나타내는 것을 의미하지 않는다. DC-SIGN (Dendritic Cell Specific ICAM-3 (Intracellular Adhesion Molecules 3)-Grabbing Nonintegrin; also known as CD209)은 물질의 엔도사이토시스 및 신속한 결합이 가능한 C 형 렉틴-유사 수용체이다 (Geijtenbeek, TB, et al. Annu.Rev.Immunol.22 : 33-54, 2004). E2는 DC-SIGN을 통해 수지상 세포에 바이러스를 표적으로 하는 것으로 보인다. 본 명세서에 나타낸 바와 같이, DC-SIGN을 발현하는 세포는 신드비스 바이러스 E2로 슈도타입화된 바이러스 벡터 입자에 의해서 DC-SIGN을 발현하지 않는 동일유전자(isogenic) 세포보다 더 형질도입된다(2 배 이상, 3 배 이상, 4 배 이상, 5 배 이상, 6 배 이상, 7배 이상, 8 배 이상, 9 배 이상, 또는 10 배 이상). E2 당단백질이 바이러스 감염을 촉진하는 메커니즘은 아마도 DC-SIGN에 직접적인 결합을 통하거나 입체구조 또는 다른 메커니즘을 변화시키면서 일어나는 것으로 DC-SIGN과 관련된 것으로 보인다. 실제 메커니즘에 관계 없이, E2에 의한 표적화는 DC-SIGN을 발현하는 세포, 즉 수지상 세포에 유리하다.
신드비스 바이러스는 또한 헤파란 술페이트을 통해 세포에 결합하는 것으로 보인다(Klimstra et al., J Virol 72: 7357, 1998; Burmes and Griffin, J Virol 72: 7349, 1998). 헤파란 술페이트 및 기타 세포 표면 글리코사미노글리칸은 대부분의 세포 유형의 표면에서 발견되기 때문에, 신드비스 외피 당단백질 및 헤파란 술페이트 사이의 상호작용을 감소시키는 것이 바람직하다. 이는 신드비스 바이러스 외피의 헤파란 술페이트으로의 결합을 감소 또는 예를 들어, 신드비스 바이러스 외피의 수지상 세포에 대한 결합을 증가시키거나 결합활성(avidity)을 증가시키거나 두가지 모두로 결합을 증가시킴으로써 수행된다. 그 결과, 다른 세포 유형에 의해 발현될 수 있고, 외피가 DC-SIGN에 특이적인 경우에도 발생할 수 있는 다른 분자에 대한 비특이적 결합은 감소되고, 개선된 특이성은 원하는 면역 반응을 감소시키거나 다른 세포 유형의 표적 형질 도입을 벗어난 것과 관련되어 있는 부작용과 같은 바람직하지 않은 부작용을 피하는데 기여할 수 있다. DC-SIGN을 발현하는 세포의 상대적으로 특이적인 형질 도입의 이점에 추가하거나 대안적으로, 신드비스 바이러스 외피 E2 당단백질로 슈도타입화된 바이러스 입자는 VSVG와 같은 당단백질로 슈도타입화된 바이러스 입자에 비해 다른 장점을 제공할 수있다. 이러한 이점의 예로는 VSV-G 슈도타입화된 바이러스 입자의 투여와 관련이 있다고 생각되는 보체-매개 용해 및/또는 신경 세포 표적화 감소를 포함한다.
다양한 실례로, 렌티바이러스 벡터 입자는 DC-SIGN을 발현하는 세포에 특이 적으로 결합하고 헤파란 술페이트에 대한 결합을 감소시키거나 금지시킨다. 즉, 신드비스 바이러스 외피 E2 당단백질은 다른 세포 유형에 비해 DC-SIGN을 발현하는 수지상 세포에 대한 바이러스로 우선적으로 직접 변형될 수 있다. 다른 연구들 가운데 구조 연구 및 분자 모델링으로부터 얻은 정보에 기초하여, 외피 단백질, 특히, E2 및 E1 당단백질의 변이체 서열은 당단백질이 외피 단백질로서의 기능을 유지하게 설계되고 생성되지만 바람직한 결합 특이성, 결합활성(avidity) 또는 결합 수준을 갖는다. 후보 변이체 서열은 각 당단백질에 대해 생성될 수 있으며, 가장 바람직한 특성을 갖는 외피 당단백질을 동정하기 위해 하기 기재된 방법, 또는 당업계에 공지 된 다른 방법을 사용하여 분석될 수 있다.
신드비스 E2의 임의의 변이체 서열은 서열 번호 1과 비교하여 160 번째 잔기에서 하나 이상의 아미노산 변경을 갖는다. 160 번째 잔기는 결실되거나 글루탐산 이외의 아미노산으로 변경된다. 변경은 가장 일반적으로 하나 이상의 아미노산의 치환이지만, 대안적으로 하나 이상의 아미노산의 첨가 또는 결실일 수 있다. 바람직하게는, 임의의 부가적인 아미노산은 소수이며, 안전성을 손상시킬 수 있는 항원성 에피토프 (예를 들어, 헤마글루티닌 태그 서열)을 포함하지 않는다. 2 개 이상의 변경이 있는 경우, 둘 다 동일한 유형 (예를 들어, 치환) 또는 다른 유형 (예를 들어, 치환 및 결실)일 수 있다. 다중 변경은 단백질 서열에서 인접하여 흩어지거나 위치할 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 E2 당단백질의 예시적인 변이체는 WO2011011584에 기재되어 있으며, 본 명세서에 제공된 서열 목록의 서열 번호 3 내지 15 중 어느 하나 및 본 명세서에 기재된 이의 변이체를 포함한다.
제 1예에서, 변이체 서열은 약 50 번째 잔기 내지 약 180 번째 잔기의 영역에서 하나 이상의 아미노산 변경을 포함한다. 상기 영역 내에 헤파란 술페이트에 결합하는 것과 관련이 있는 아미노산이 있다. E2의 순(net) 양성 전하를 줄임으로써, 헤파린 술페이트과의 정전기 상호작용을 감소시킬 수 있어, 결과적으로 헤파린 술페이트에 대한 결합을 감소를 시킬 수 있다. 이 영역에서 후보 양성 전하를 띠는 아미노산은 63, 70, 76, 84, 97, 104, 129, 131, 133, 139, 148, 149, 159 번째 잔기의 리신(lysine)이며, 65, 92, 128, 137, 157, 170, 172 번째 잔기의 아르기닌이다 (Bear et al., Virology 347: 183-190, 2006). 이러한 아미노산 중 몇 개 이상은 헤파란 술페이트에 결합하는 E2와 직접적으로 연관되어 있다. 순 양성 전하는 리신 또는 아르기닌의 결실 또는 리신 또는 아르기닌의 중성 또는 음성 전하를 띠는 아미노산으로의 치환에 의해 감소될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 이러한 리신 및 아르기닌은 글루탐산 또는 아스파르트산으로 대체될 수 있다. 임의의 구체예는 70, 76 또는 159 리신의 하나 이상의 치환을 갖는다. E2가 E3를 갖는 폴리단백질로 발현되는 경우, 본래 E3/E2 절단 부위에 인접하여 위치하는 리신은 유지된다 - 즉, 인식 서열 및 절단 부위는 변경되지 않는다. 대안적으로, 본래 엔도펩티다아제 절단 부위 서열은 다른 엔도펩티다아제에 대한 인식 서열로 대체된다.
E2의 임의의 변이체는 또한 수지상 세포에 대한 결합에 긍정적인 영향을 주는 방식으로 변형된다. 인용 HR 서열의 160 번째 잔기에서 발견된 글루탐산의 변경은 수지상 세포에 대한 결합을 개선시킬 수 있다(Gardner et al., J Virol 74, 11849, 2000 참조). 임의의 변이체에서 160 번째 잔기의 결실 또는 160 번째 잔기의 치환과 같은 변경이 발견된다. 특정 변이체에서, 비-전하 아미노산은 Glu로 치환되고, 다른 변이체에서는 비-산성 아미노산은 Glu로 치환된다. 전형적으로, Glu160은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 또는 이소 루신을 포함하는 작거나 지방족인 아미노산 중 하나로 대체된다.
기타 변이체는 2 개 이상의 아미노산 변경을 포함한된다. 전형적으로 이러한 변이체에서 변경 중 하나는 Glu160이고, 나머지 변경(들)은 약 50 번째 내지 약 180 번째 잔기에 걸친 영역에서 하나 이상의 리신 및 아르기닌의 변경이다. 임의의 상기 변이체는 Glu160의 결실 또는 비-산성 잔기로의 변경 및 리신 70, 리신 76, 또는 리신 159의 비-염기성 아미노산으로의 하나 이상의 변경을 포함한다. 일부 특이적 변이체는 Glu160을 Gly로, Lys70을 Glu로, 및 Lys159를 Glu로; Glu160을 Gly, Lys 70, 76 및 159를 Glu로; Glu160의 결실 및 Lys70 및 159를 Glu로; 및 Glu160의 결실 및 Lys70, 76, 및 159를 Glu의 변경을 포함한다.
임의의 경우, E2 단백질은 적어도 E3과 융합되거나 또는 리더 서열과 융합된 폴리단백질로 먼저 발현된다. 리더 서열은 E3 또는 다른 서열인지 여부에 관계 없이, 바이러스 외피의 E2는 E3 또는 다른 리더 서열이 없어야 한다. 다시 말해서, E2는 바람직하게는 E3/E2 융합 단백질 (예를 들어, SVGmu라 불리는 E3/E2 융합 단백질)이 아니다. 임의의 구체예에서, E2는 E3-E2-6K-E1 폴리단백질의 일부로서 발현된다. 신드비스 바이러스는 본래 폴리단백질의 일부로서 E2를 발현하고, E3/E2, E2/6K, 및 6K/E1의 접합(junction) 영역은 엔도펩티다아제에 의해 인식되고 절단되는 서열을 갖는다. 일반적으로, E3/E2 접합은 퓨린(furin) 또는 65 번째 및 66 번째 잔기 사이의 퓨린-유사 세린 엔도펩티다아제에 의해 절단된다. 퓨린은 2 개의 아미노산이 떨어진 한 쌍의 아르기닌 잔기에 대한 특이성을 갖는다. 퓨린에 의한 E3/E2 절단을 유지하기 위해, 62 내지 66 잔기 (RSKRS; 서열 번호 26)는 2 개의 아미노산이 떨어진 2 개의 아르기닌 잔기 및 세린 잔기를 유지해야 한다. 대안적으로, 상이한 절단 서열이 E3/E2 퓨린 절단 서열 또는 임의의 다른 절단 서열 대신에 사용될 수 있다. 인식 및 절단 부위는, 제한없이, 아스파르틱 엔도펩티다아제 (예를 들어, 카텝신 D, 키모신, HIV 프로테아제), 시스테인 엔도펩티다아제 (브로멜라인, 파파인, 칼파인), 메탈로엔도펩티다아제 (예를 들어, 콜라게나아제, 서모라이신(thermolysin)), 세린 엔도펩티다아제(예를 들어, 키모트립신, IXa 인자, X 인자, 트롬빈, 트립신), 스트렙토키나아제를 포함하는 엔도펩티다아제에 대하여 통합될 수 있다. 이러한 효소에 대한 인식 및 절단 부위 서열은 잘 알려져 있다.
이미 언급된 것 이외의 E2의 아미노산도 또한 변경될 수 있다. 일반적으로, 변이체 E2 서열은 인용 E2 서열과 80% 이상의 아미노산 서열의 동일성을 갖거나, 82% 이상, 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 98% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다. 당단백질 변이체는 E2를 구성하는 외피를 갖는 바이러스 입자에 의한 수지상 세포의 감염을 촉진시키는 능력과 같은 생물학적 기능을 드러내야 한다. 실험에서 바이러스 조립, 세포 표면에의 부착 및 감염의 다양한 양상에서 중요한 역할을 갖는 것으로 보이는 외피 당단백질 영역을 확인하였다. 변이체를 만들 때, 하기 정보가 가이드라인으로 사용될 수 있다. E2의 세포질 꼬리 - 대략 408 번째 내지 415 번째 잔기 - 가 바이러스 조립에 중요하다 (West et al. J Virol 80: 4458-4468, 2006; 8). 다른 영역은 2 차 구조의 형성에 관련되고 (대략 33 번째 내지 53 번째 잔기); 그리고 수송 및 단백질 안정성에 관련된다 (대략 86 번째 내지 119 번째 잔기) (Navaratmarajah et al., J Virol 363: 124-147, 2007;). 변이체는 약 370 번째 내지 380 번째 잔기, 세포막을 통과하는 영역의 소수성 특징을 보유할 수 있다. 상기 변이체는 N-연결된 글리코실화 부위 NIT 잔기 (196 번째 내지 198 번째 잔기) 및 NFT (318 번째 내지 320 번째 잔기) 중 하나 또는 모두를 보유할 수 있고, 팔미토일화된 부위 (C-396, C416 및 C417) 중 하나 이상을 보유할 수 있다 (Strauss and Strauss Microbiol Rev 58, 491-562, 1994; pp. 499-509). 반면에, E2의 많은 영역은 유해한 사건없이 변경될 수 있다. 예를 들어, E2의 많은 상이한 위치에서 트랜스포손의 삽입은 여전히 자립가능한(viable) 바이러스 (Navaratmarajah, ibid)를 초래하였다.
임의의 구체예에서, 태그 펩티드는 E3, 6K 또는 E1 단백질에 포함될 수 있다. 일부 목적을 위해, 태그는 E2에 포함될 수 있지만, 태그는 인간 환자에게 투여하기 위한 제품에서의 사용에 바람직하지 않다. 짧은 서열 (예를 들어, 5 내지 30의 아미노산)인 태그 펩티드는 외피 발현 및 바이러스 입자 내 존재의 검출을 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 검출 목적을 위해, 태그 서열은 전형적으로 항체 또는 화학 물질에 의해 검출가능할 것이다. 태그에 대한 또다른 용도는 바이러스 입자의 정제를 촉진하는 것이다. 태그의 결합 파트너를 함유하는 기질이 바이러스를 흡수하기 위해 사용될 수 있다. 바이러스의 용출은 태그를 결합 파트너로부터 옮기는 부분으로 처리하면서 수행될 수 있거나 태그 서열이 절단가능한 서열과 연결되어 있을 때, 적절한 엔도펩티다아제로 처리하면 편리하게 바이러스의 방출을 허용할 수 있다. (예를 들어, Qiagen 카탈로그, Factor Xa Protease System 참조). 태그 펩티드의 제거는 일반적으로 동물 개체에서의 바이러스 입자 사용의 안전성 목적을 위해 바람직하다. 태그가 제거되지 않으면, 태그에 대한 면역 반응이 발생할 수 있다.
적절한 태그는, 상업적으로 이용가능한 항체인, FLAG (DYKDDDDK) (서열번호 28) (미국 특허 제 4,703,004 호), 키틴 결합 단백질, 말토스 결합 단백질, 글루타티온-S-전이효소, 폴리(히스티딘, His) (미국 특허 제 4,569,794 호), 티오레독신 (thioredoxiin), HA (헤마글루티닌)-태그 등이 있지만, 이에 한정되지 않는다. 폴리(His)는 결합된 금속 이온, 예를 들어, 니켈 또는 코발트를 함유하는 친화성 매질에 흡착될 수 있고, 낮은 pH 매질로 용리될 수 있다.
바이러스 입자는 수지상 세포를 표적으로 하는 바이러스에 포함된 외피 당단백질의 특이성을 결정하기 위해 평가될 수 있다. 예를 들어, 골수 세포의 혼합 집단을 개체로부터 수득하고 시험관 내에서 배양할 수 있다. 대안적으로, DC-SIGN을 발현하거나 발현하지 않는 동일유전자 세포주를 수득하여 사용할 수 있다. 재조합 바이러스는 골수 세포 또는 동일유전자 세포주의 혼합 집단에 투여될 수 있고, 바이러스에 포함된 리포터 유전자의 발현은 배양된 세포에서 분석될 수 있다. 임의의 구체예는 제한된 희석 분석을 이용할 수 있는데, 상기 세포의 혼합 집단은 별도의 부분으로 분할되고, 그 후 별도로 바이러스의 감소량을 가지고 배양된다(예를 들어, 각각 2 배, 5 배, 10 배 적은 바이러스). 일부 구체예에서, 혼합 세포 집단에서 감염된 세포의 약 50% 이상, 보다 바람직하게는 약 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 95% 이상이 DC-SIGN을 발현하는 수지상 세포이다. 임의의 구체예에서, 감염된 수지상 세포와 감염된 비-수지상 세포 (또는 비 DC-SIGN 발현 세포)의 비는 약 2:1 이상, 약 3:1 이상, 약 4:1 이상, 약 5:1 이상, 약 6:1 이상, 약 7:1 이상, 약 8:1 이상, 약 9:1 이상, 약 10:1 이상, 약 20:1 이상, 약 30:1 이상, 약 40:1 이상, 약 50:1 이상, 약 100:1 이상, 약 200:1 이상, 약 500:1 이상, 약 1000:1 이상, 약 5000:1 이상, 약 10,000:1 이상, 또는 그 이상이다. 한정적인 희석을 위하여, 더 높은 선택성은 전형적으로 투입 바이러스의 더 높은 희석(즉, 적은 양)에서 나타난다.
슈도타입화된 바이러스 입자의 활성은 임의의 다양한 기술에 의해 결정될 수있다. 예를 들어, 감염 효율 (IU, 감염 단위)을 측정하기 위한 바람직한 방법은 바이러스 입자를 세포에 투여하고 벡터 게놈에 코딩된 물질의 발현을 측정하는 것이다. 분석될 수 있는 모든 산물이 사용될 수 있다. 하나의 편리한 유형의 물질은 녹색 형광 단백질 (GFP)과 같은 형광 단백질이다. GFP 및 분석은 실시예에 예시되어 있다. 사용될 수있는 다른 물질은 세포 표면에 발현된 단백질 (예를 들어, 항체 결합에 의한 검출), 효소 등을 포함한다. IL-12의 검출을 위해, IL-12 검출 분석 (예를 들어, ELISA) 또는 생물학적 기능 분석 (예를 들어, 실시예 1 참조)이 사용될 수 있다. 상기 물질이 항원을 포함하고 세포가 수지상 세포인 경우, 항원 특이적 면역 반응을 알아냄으로써 감염성/활성을 평가할 수 있다. 게다가, 포유류에서의 부작용을 확인할 수 있다. 수지상 세포를 특이적으로 표적화하는 능력은 예를 들어, 하기 기재된 바와 같은 세포 배양에서 직접 시험될 수 있다.
바이러스 입자는 또한 그 선택성 및/또는 표적 세포막의 침투를 촉진시키는 능력을 위하여 준비 및 시험될 수 있다. 변형되지 않은 당단백질을 갖는 외피를 갖는 바이러스 입자는 비교를 위한 대조군으로 사용될 수 있다. 간략하게, 외피 당단백질에 대한 수용체를 발현하는 세포는 표준 감염 분석을 사용하여 바이러스에 의해 감염된다. 특정 시간 후, 예를 들어 감염-후 48 시간에, 세포를 수집할 수 있고, 바이러스에 감염된 세포의 백분율은, 예를 들어 유동 세포 계측법에 의해 결정될 수 있다. 선택성은 바이러스에 감염된 세포의 비율을 계산하여 점수를 매길 수 있다. 유사하게, 바이러스 역가에 대한 변이체 외피 당단백질의 영향은 변이체 외피를 포함하는 바이러스에 감염된 세포의 백분율을 대응하는 야생형 (수정되지 않은) 외피 당단백질을 포함하는 바이러스에 감염된 세포의 백분율로 나누어 정량화할 수 있다. 특히 적합한 변이체는 선택성 및 감염성 역가에서 최상의 조합을 가질 것이다. 일단 변이체가 선택되면, 바이러스 농도 분석을 수행하여 이러한 바이러스가 활동을 상실하지 않고, 농축될 수 있음을 확인한다. 바이러스 상등액을 수집하고 초원심분리에 의해 농축시킨다. 바이러스의 역가는 바이러스 원액(stock solution)의 한정된 희석, 및 상술한 대로 바이러스에 의해 발현된 산물의 발현을 측정하는 외피 당단백질에 대한 수용체를 발현하는 세포의 감염에 의하여 결정될 수 있다.
렌티바이러스 벡터 입자의 표적 세포로의 진입은 활동의 다른 유형의 평가이다. BlaM-Vpr (베타-락타마제 Vpr) 융합 단백질은 HIV-1 바이러스 침투를 평가하기 위해 사용되었고; BlaM 및 신드비스 바이러스 외피 당단백질의 융합은, 예를 들어, E1 또는 E2/E1 융합 단백질은 표적 세포로의 융합 및 침투를 촉진시키는 외피 단백질의 효능을 평가하는데 사용될 수 있다. 바이러스 입자는, 예를 들어, 바이러스 요소, BlaM-Vpr 및 관심있는 변이체 외피 (및 적절한 경우의 친화성 분자)를 포함하는 하나 이상의 벡터로 패키징 세포를 일시적으로 형질감염시킴으로써 준비될 수 있다. 생성된 바이러스는 표적 분자 (또는 친화성 분자)가 결합의 유리 억제제(free inhibitor) (예 : 항체)의 부재 또는 존재에서 특이적으로 결합하는 분자를 발현하는 세포를 감염시키는데 사용될 수 있다. 세포는 그 후 CO2-독립적인 배지로 세척되고 CCF2 염료 (Aurora Bioscience)로 채울 수 있다. 절단 반응이 완료되도록 실온에서 배양한 후, 세포를 파라포름알데히드로 고정시키고, 유동 세포계측법 및 현미경 관찰로 분석할 수 있다. 청색 세포의 존재는 바이러스의 세포질로의 침투를 나타내고; 차단(blocking) 항체를 추가할 때 더 적은 청색 세포가 예상될 수 있다 (Cavrois et al. Nat Biotechnol 20: 1151-1154, 2002;).
침투가 낮은 pH에 의존하는지를 조사하고, 바람직한 pH 의존성을 갖는 외피 당단백질을 확인하기 위하여, NH4Cl 또는 pH를 변경시키는 다른 화합물을 감염 단계에서 첨가할 수 있다(NH4Cl은 엔도좀의 산성 구획을 중화시킬 것이다). NH4Cl의 경우, 청색 세포의 사라짐은 바이러스 침투가 pH-의존성이 낮음을 나타내는 것이다. 게다가, 활성이 pH-의존적인지 확인하기 위해, 암모늄 클로라이드, 클로로퀸(chloroquine), 콘카나마이신(concanamycin), 바필로마이신 AI(bafilomycin Al), 모넨신(monensin), 니게리신(nigericin), 등의 리소조모트로픽 제제(lysosomotropic agents)를 배양 완충액에 첨가할 수 있다. 이러한 제제는 엔도솜 구획 내에서 pH를 상승시킨다 (예, Drose and Altendorf, J. Exp. Biol. 200, 1-8, 1997). 이러한 제제의 억제 효과는 바이러스 융합 및 침입에 대한 pH의 역할을 드러낼 것이다. 상이한 융해성(fusogenic) 분자를 나타내는 바이러스 사이의 상이한 진입 속도가 비교될 수 있으며, 특정한 적용을 위해 가장 적합하게 선택될 수 있다.
PCR-기반 진입 분석은 역전사를 모니터하고 바이러스 진입의 속도의 지표로서 바이러스성 DNA 합성의 속도를 측정하는데 활용할 수 있다. 예를 들어, 특정한 외피 단백질 분자를 포함하는 바이러스 입자는 293T 세포, DC 또는 외피 단백질 분자에 대한 적절한 결합 파트너 (수용체)를 자연적으로 발현하거나, 발현되도록 조작된 임의의 다른 세포와 같은 표적 세포와 함께 배양된다. 즉시 또는 시간이 지난 후 (감염이 일어나게 하기 위해), 결합되지 않은 바이러스는 제거되고 세포의 부분 표본(aliquot)은 바이러스성 핵산을 위해 분석된다. 이러한 분액(aliquots)에서 DNA를 추출하고 일반적으로 LTR-특이적 프라이머로 프라임된, 반-정량적 분석에서 증폭 분석을 실시한다. LTR-특이적 DNA 산물의 출현은 바이러스 진입의 성공을 의미한다.
B. 렌티바이러스 벡터 게놈
바이러스 벡터 입자는 scIL-12와 같은 IL-12를 코딩하는 서열 및 선택적으로 하나 이상의 대상 서열을 포함하는, 게놈을 포함한다. 게놈이 바이러스 입자 내로 패키징되게 하는 서열 및 표적 세포의 형질 도입 후 대상 서열(들)의 발현을 촉진시키는 서열과 같은 다른 서열이 포함될 수 있다. 게놈은 Pfeifer 및 Verma (Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177-211, 2001;)에 기재된 것과 같은 인간 유전자 치료 응용에 대해 확인된 것을 포함하는, 다수의 적합하고, 이용가능한 렌티바이러스 게놈 기초 벡터 중 임의의 것에서 유래될 수 있다. 단순화를 위해 상기 게놈은 또한 "바이러스 벡터 게놈" 또는 "벡터 게놈"으로 기재된다.
1. 백본
적합한 렌티바이러스 벡터 게놈은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV-1), HIV-2, 고양이 면역 결핍 바이러스 (FIV), 말 전염성 빈혈 바이러스, 원숭이 면역 결핍 바이러스 (SIV) 및 메디/비스나 바이러스에 기초한 것을 포함한다. 렌티바이러스의 바람직한 특징은 그들이 분열 및 비-분열 세포 모두를 감염시킬 수 있다는 것, 표적 세포가 분열 (또는 분열하기 위해 표적 세포를 자극)할 필요가 없다는 것이다. 일반적으로, 상기 게놈 및 외피 당단백질은 생성된 바이러스 벡터 입자가 슈도타입화된 것과 같은 상이한 바이러스에 기초할 것이다. 벡터 게놈의 안전성 특징이 바람직하게 포함된다. 안전성 특징에는 자가-불활성화 LTR 및 통합 결핍(deficient) 게놈/입자가 포함된다. 예시적인 벡터는 WO 2011/011584에 기재되어 있으며, IL-12, 다른 면역자극 분자, 사이토카인 및 관심 항원을 포함하는 대상 서열의 발현을 위해 본 발명의 구체예에서 이와 같은 벡터가 사용될 수 있다.
일부 예시적인 구체예에서, 바이러스 벡터 게놈은 HIV-1 게놈 또는 SIV 게놈과 같은 렌티바이러스 게놈으로부터의 서열을 포함한다. 상기 바이러스 게놈 구조는 렌티바이러스의 5' 및 3' LTR로부터의 서열을 포함할 수 있으며, 특히 렌티바이러스의 5' LTR로부터의 R 및 U5 서열 및 렌티바이러스의 자가-불활성화 또는 불활성화 3' LTR을 포함할 수 있다. LTR 서열은 임의의 종의 임의의 렌티바이러스로부터의 LTR 서열일 수 있다. 예를 들어, HIV, SIV, FIV 또는 BIV의 LTR 서열일 수 있다. 전형적으로, LTR 서열은 HIV LTR 서열이다.
벡터 게놈은 불활성화된 또는 자가-불활성화 3' LTR을 포함할 수 있다 (Zufferey et al. J Virol 72: 9873, 1998; Miyoshi et al., J Virol 72:8150, 1998;). 자가-불활성화 벡터는 일반적으로 벡터 통합(integraion) 동안 5' LTR로 복제되는 3' 긴 말단 반복 (LTR: long terminal repeat)으로부터의 인핸서 및 프로모터 서열의 결실을 갖는다. 일 예에서, 3' LTR의 U3 요소는 그의 인핸서 서열, TATA 박스(box), Sp1 및 NF-카파 B 부위의 결실을 함유한다. 자가-불활성화 3' LTR의 결과로서, 진입 및 역전사 후에 생성 된 프로바이러스는 불활성화된 5' LTR을 포함할 것이다. 이는 벡터 게놈의 동원 위험과 인접한 세포 프로모터에 대한 LTR의 영향을 줄임으로써 안전성을 향상시키기 위함이다. 자가-불활성화 3' LTR은 당업계에 공지된 임의의 방법으로 구축될 수 있다.
선택적으로, 렌티바이러스 5' LTR로부터의 U3 서열은 이종 프로모터 서열과 같은 바이러스 구조 내의 프로모터 서열로 대체될 수 있다. 이는 패키징 세포주로부터 회수된 바이러스의 역가를 증가시킬 수 있다. 인핸서 서열이 또한 포함될 수 있다. 패키징 세포주에서 바이러스 RNA 게놈의 발현을 증가시키는 임의의 인핸서/프로모터 조합이 사용될 수 있다. 일 예에서, CMV 인핸서/프로모터 서열이 사용된다 (US 5385839 및 US 5168062).
임의의 구체예에서, 삽입 돌연변이 유발의 위험은 렌티바이러스 벡터 게놈을 결핍이 있는 통합(integration defective)으로 구축함으로써 최소화된다. 비-통합/통합 결핍 벡터 게놈을 생산하기 위해 다양한 접근법을 추구할 수 있다. 이러한 접근법은 pol 유전자의 인테그라제 효소 성분에 돌연변이(들)의 조작을 수반하여, 비활성 인테그라제를 갖는 단백질을 코딩하도록 한다. 벡터 게놈 그 자체는, 예를 들어, 부착 부위 중 하나 또는 둘 다를 변이 또는 결실하거나 결실 또는 변경을 통해 3' LTR-근위 폴리퓨린 트랙 (PPT: proximal polypurine tract)을 비-기능적으로 만들어서, 통합을 방지하도록 수정할 수 있다. 추가로, 비-유전적 접근법이 가능하고; 이들은 인테그라제의 하나 이상의 기능을 억제하는 약리학적 제제를 포함한다. 접근법은 상호 배타적인 것이 아니어서, 즉, 한번에 둘 이상을 사용할 수 있다. 예를 들어, 인테그라제 및 부착 부위가 둘 다 비-기능적일 수 있거나 인테그라제 및 PPT 부위가 비-기능적일 수 있거나 부착 부위 및 PPT 부위가 비-기능적일 수 있거나 상기 모두가 비-기능적일 수 있다.
상술한 바와 같이, 하나의 접근법은 비-기능적 인테그라제를 만들고 사용하는 것이다. 인테그라제는 바이러스 이중-가닥 두가닥-말단(blunt-ended) DNA의 절단과 염색체 표적 부위의 두 가닥에서 5'-인산염에 상기 말단의 연결에 관여한다. 인테그라제는 세가지 기능적 도메인을 가지고 있다: 아연-결합 모티프 (HHCC)를 함유하는 N-말단 도메인, 촉매성 코어 및 보존된 DD35E 모티프 (HIV-1에서 D64, D116, E152)를 함유하는 중심 도메인 코어, 및 DNA 결합 성질을 갖는 C-말단 도메인. 인테그라제에 도입된 점 돌연변이는 정상 기능을 방해하기에 충분하다. 많은 인테그라제 돌연변이가 구축되고 특성화되었다 (Philpott and Thrasher, Human Gene Therapy 18:483, 2007; Apolonia, Thesis submitted 내지 University College London, April 2009, pp, 82-97; Engelman et al. J Virol 69: 2729, 1995; Nightingale et al. Mol Therapy, 13: 1121, 2006, 참조). 인테그라제 단백질을 코딩하는 서열은, 바람직하게는 역전사 효소 활성 또는 핵 표적화를 유의하게 손상시키지 않고, 단백질을 불활성화 시키도록 결실되거나 변이될 수 있어서, 프로바이러스의 표적 세포 게놈으로의 통합을 방지하기만 한다. 용인되는 돌연변이는 인테그라제 촉매 작용, 가닥 전달, att 부위에의 결합, 숙주 염색체 DNA에의 결합, 및 다른 기능을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, HIV 또는 SIV 인테그라제의 35 잔기에서 단일 아스파르트산에서 아스파라긴으로의 치환은 바이러스 DNA 통합을 완전히 없앤다. 인테그라제의 결실은 일반적으로 C-말단 도메인에 국한된다. 235 번째 내지 288 번째 잔기에 대한 코딩 서열의 결실은 유용한 비-기능적 인테그라제를 초래한다 (Engelman et al. J Virol 69:2729, 1995). 추가적인 예로서, 돌연변이, 예를 들어, Asp64 (잔기 수는 다른 렌티바이러스 또는 레트로바이러스로부터 인테그라제를 위한 잔기 수에 상응하여 HIV-1에 대해 주어지며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다) (예를 들어, D64E, D64V), Asp116 (예를 들어, D116N), Asn120 (예를 들어, N120K), Glu152, Gln148 (예를 들어, Q148A), Lys156, Lys159, Trp235 (예를 들어, W235E), Lys264 (예를 들어, K264R), Lys266 (예를 들어, K266R), Lys273 (예를 들어, K273R)에 대해 생성될 수 있다. 다른 돌연변이가 구축될 수 있고, 통합, 이식 유전자(transgene) 발현, 및 다른 바람직한 파라미터에 대하여 시험될 수 있다. 이러한 기능에 대한 분석은 잘 알려져 있다. 돌연변이는 부위 특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis) 및 핵산 서열의 화학적 합성을 포함하는 임의의 다양한 기술에 의해 생성될 수 있다. 하나의 돌연변이가 만들어지거나 이러한 돌연변이 중 하나 이상이 인테그라제에 존재할 수 있다. 예를 들어, 인테그라제는 2 개의 아미노산, 3 개의 아미노산, 4 개의 아미노산 등에서 돌연변이를 가질 수 있다.
대안적으로 또는 인테그라제 돌연변이체(들)의 사용과 병용하여, U3 및 U5의 부착 부위 (att)가 돌연변이화될 수 있다. 인테그라제는 이러한 부위에 결합하고 3'-말단 디뉴클레오티드는 벡터 게놈의 양 말단에서 절단된다. CA 디뉴클레오티드는 오목한(recessed) 3' 말단에 위치하고; CA는 가공에 필요하며, 뉴클레오티드의 돌연변이는 숙주 염색체 내로의 통합을 차단한다. 상기 CA 디뉴클레오티드의 A는 통합을 위한 가장 중요한 뉴클레오티드이며, 상기 게놈의 양 말단의 돌연변이가 최상의 결과를 제공할 것이다 (Brown et al J Virol 73: 9011 (1999)). 일 구체예에서, 각 말단의 CA는 TG로 변경된다. 다른 예시에서, 각 말단의 CA는 일 말단은 TG, 다른 말단은 GT로 변경된다. 다른 예시에서, 각 말단의 CA는 결실되고; 다른 예시에서, CA의 A는 각 말단에서 결실된다.
통합은 또한 3' LTR 근위에 위치한 폴리퓨린 트랙 (polypurine tract: PPT)의 변이 또는 결실에 의해 저해될 수 있다 (WO 2009/076524). 상기 PPT는 플러스-가닥 DNA 합성을 위한 프라이머 결합 부위로서 역할을 할 수 있는 약 15 뉴클레오티드의 폴리퓨린 서열이다. 이 경우, PPT의 돌연변이 또는 결실은 역전사 과정을 표적으로 한다. 메커니즘에 구애됨 없이 PPT의 변이 또는 결실에 의해서, 선형 DNA의 생성이 급격히 감소되고 본질적으로 단지 1-LTR DNA 원(circle)만이 생성된다. 통합에는 선형 이중-가닥 DNA 벡터 게놈이 요구되며, 통합은 본질적으로 그것 없이 제거된다. 상술한 바와 같이, PPT는 돌연변이 또는 결실에 의해 비-기능적으로 만들어질 수 있다. 전형적으로, 상기 전체 15 nt PPT가 결실될 수 있고, 일부 실시예에서는, 더 짧은 14 nt, 13, nt, 12 nt, 11 nt, 10 nt, 9 nt, 8 nt, 7 nt, 6 nt, 5 nt, 4 nt, 3 nt 및 2 nt가 결실될 수 있다. 돌연변이가 되면, 첫번째 4 염기의 단일 및 이중 돌연변이가 여전히 전사를 감소 시키지만, 전형적으로 특히, PPT의 5' 반에서 다수의 돌연변이가 일어난다 (McWilliams et al., J Virol 77:11150, 2003). PPT의 3' 말단에서 만들어진 돌연변이는 일반적으로 더 극적인 효과를 가진다 (Powell and Levin J Virol 70:5288, 1996).
벡터 게놈을 비-통합으로 만드는 이러한 상이한 접근법은 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 하나 이상의 접근법이 여분의 메커니즘을 통해 페일-세이프 벡터를 구축하는데 사용될 수 있다. 따라서, PPT 돌연변이 또는 결실은 att 부위 돌연변이 또는 결실 및 인테그라제 돌연변이와 둘 다 조합되거나 PPT 돌연변이 또는 결실은 att 부위 돌연변이 또는 결실, 또는 인테그랄 돌연변이와 조합될 수 있다. 유사하게, att 부위 돌연변이 또는 결실 및 인테그라제 돌연변이는 서로 또는 PPT 돌연변이 또는 결실과 조합될 수있다.
2. 규제 요소
본 명세서에서 논의된 바와 같이, 바이러스 벡터 게놈은 표적 세포에 발현되기를 원하는, 선택적으로 하나 이상의 다른 관심 핵산 및 IL-12를 코딩하는 서열을 포함한다. 단순화를 위해, "대상 서열" (SOI: sequence of interest) 이라는 용어는 IL-12, 및 임의의 실시예에서 하나 이상의 다른 대상 서열 (하나 이상의 다른 면역자극 분자, 사이토카인 또는 하나 이상의 항원과 같다)의 의미로 사용된다. 전형적으로, 대상 서열은 5' LTR 및 3' LTR 서열 사이에 위치한다. 추가로, IL-12 및 임의의 다른 대상 서열을 코딩하는 서열은 바람직하게는, 다른 유전 요소, 대상 서열의 발현을 특정 방식으로 조절하기 위해, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서를 포함하는 전사 조절 서열과 기능적인 관계에 있다. 특정 예에서, 유용한 전사 조절 서열은 시간적 및 공간적으로 모두 활성에 대해 고도로 조절되는 서열이다. 성분의 발현을 조절하기 위해 사용될 수있는 발현 조절 요소는 당업계에 공지되어 있으며, 유도성 프로모터, 구성적(constitutive) 프로모터, 분비 신호, 인핸서 및 기타 조절 요소를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
대상 서열 및 임의의 다른 발현가능한 서열은 전형적으로 내부 프로모터/인핸서 조절 서열과 기능적인 관계에 있다. "내부" 프로모터/인핸서는 바이러스 벡터 구조에서 5' LTR 및 3' LTR 서열 사이에 위치하며 대상 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 내부 프로모터/인핸서는 그것이 기능적인 관계에 있는 유전자의 발현을 증가시키는 것으로 공지된 임의의 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서 조합일 수 있다. "기능적인 관계(functional relationship)"및 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 프로모터 및/또는 인핸서가 적절한 분자와 접촉한 때, 발현될 대상 서열이 상기 프로모터 및/또는 인핸서에 대해 정확한 위치 및 방향에 있음을 의미하지만, 이에 한정되지 않는다..
내부 프로모터/인핸서의 선택은 대상 서열의 바람직한 발현 패턴 및 공지된 프로모터/인핸서의 특이적인 성질에 기초한다. 따라서, 내부 프로모터는 구성적으로 활성일 수 있다. 사용될 수 있는 구성형 프로모터의 비-제한적인 예는 유비퀴틴 (US 5510474; WO 98/32869,), CMV (Thomsen et al., PNAS 81:659, 1984; US 5168062,), 베타-악틴 (Gunning et al. 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4831-4835,) 및 pgk (예를 들어, Adra et al. 1987 Gene 60:65-74; Singer-Sam et al. 1984 Gene 32:409-417; and Dobson et al. 1982 Nucleic Acids Res. 10:2635-2637, 참조)을 위한 프로모터를 포함한다.
대안적으로, 프로모터는 조직 특이적 프로모터일 수 있다. 일부 바람직한 실시*구체예에서, 프로모터는 표적 세포-특이적 프로모터이다. 예를 들어, 프로모터는 CD11c, CD103, TLRs, DC-SIGN, BDCA-3, DEC-205, DCIR2, 만노오스 수용체, 덱틴-1, Clec9A, MHC Class II를 포함하는 수지상 세포에 의해 발현되는 임의의 산물로부터일 수 있다. 추가로, 프로모터는 대상 서열의 유도가능한 발현을 허용하도록 선택될 수 있다. 테트라사이클린 반응성 시스템, lac 오퍼레이터-리프레서 시스템뿐만 아니라 열 충격, 금속 이온, 예를 들어 메탈로티오네인 프로모터, 인터페론, 저산소증(hypoxia), 스테로이드, 예를 들어 프로게스테론 또는 글루코코르티코이드 수용체 프로모터, 방사선, 예를 들어 VEGF 프로모터를 포함하는, 다양한 환경적 또는 생리적 변화에 반응하는 프로모터를 포함하는 유도성 발현을 위한 다수의 시스템이 당업계에 공지되어 있다. 또한, 대상 유전자의 바람직한 발현을 수득하기 위해 프로모터의 조합이 사용될 수 있다. 통상의 기술자는 유기체 또는 관심 표적 세포에서 유전자의 바람직한 발현 패턴에 기초하여 프로모터를 선택할 수 있을 것이다.
바이러스 게놈은 적어도 하나의 RNA 중합효소 II 또는 III 반응성 프로모터를 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 대상 서열에 작동가능하게 연결될 수 있고 또한 종결 서열에 연결될 수 있다. 추가로, 하나 이상의 RNA 중합효소 II 또는 III 프로모터가 포함될 수 있다. RNA 중합효소 II 및 III 프로모터는 당업자에게 잘 알려져 있다. RNA 중합효소 III 프로모터의 적절한 범위는, 예를 들어, Paule 및 White, Nucleic Acids Research., Vol. 28, pp 1283-1298 (2000)에서 찾을 수 있다. RNA 중합효소 II 또는 III 프로모터는 또한 하류 RNA 코딩 서열을 전사하기 위해 RNA 중합효소 II 또는 III를 지시할 수 있는 임의의 합성 또는 조작된 DNA 단편을 포함한다. 게다가, RNA 중합효소 II 또는 III (Pol II 또는 III) 프로모터 또는 바이러스 벡터 게놈의 일부로서 사용되는 프로모터는 유도성일 수 있다. 특히 적합한 유도가능한 Pol II 또는 III 프로모터가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 특히 적합한 Pol II 또는 III 프로모터는 Ohkawa 및 Taira, Human Gene Therapy, Vol. 11, pp 577-585 (2000) 및 Meissner et al. Nucleic Acids Research, Vol. 29, pp 1672-1682 (2001)에서 제공되는 테트라사이클린 반응 프로모터를 포함한다. 내부 인핸서는 관심 유전자의 발현을 증가시키기 위해 바이러스 구조 내에 존재할 수도 있다. 예를 들어, CMV 인핸서 (Boshart 등, Cell, 41: 521, 1985;)가 사용될 수 있다. HIV, CMV 및 포유류 게놈과 같은 바이러스 게놈 중 많은 인핸서가 동정되고 특성화되었다 (GenBank 참조). 인핸서는 이종 프로모터와 조합하여 사용될 수 있다. 당업자는 바람직한 발현 패턴에 기초하여 적절한 인핸서를 선택할 수 있을 것이다.
바이러스 벡터 게놈은 본 명세서에서 논의된 다른 서열, 바이러스 성분, 및 대상 서열에 작동가능하게 연결되고 보통 표적 세포에 의해 인식되는 프로모터를 함유 할 것이다. 프로모터는 RNA 중합효소의 결합 및 발생하는 전사를 가능하게 하는 핵산 서열에 의해 형성된 발현 조절 요소이다. 프로모터는 유도성, 구성형, 일시적으로 활성 또는 조직 특이적일 수 있다. 유도성 프로모터의 활성은 생물학적 또는 비생물학적 인자의 존재 또는 부재에 의해 유도된다. 유도성 프로모터는 작동가능하게 연결된 유전자의 발현으로 유기체, 그의 제조물의 임의의 발달 단계 또는 특정 조직에서 켜지거나(on) 꺼질(off) 수 있기 때문에, 유전자 조작에서 유용한 도구가 될 수 있다. 유도성 프로모터는 화학적으로-조절되는 프로모터, 및 물리적으로-조절되는 프로모터로 분류될 수 있다. 전형적인 화학적으로-조절되는 프로모터는 알코올-조절 프로모터 (예를 들어, 알코올 디히드로게나제 I (alcA) 유전자 프로모터), 테트라사이클린-조절 프로모터 (예를 들어, 테트라사이클린-반응성 프로모터), 스테로이드-조절 프로모터 (예를 들어, 래트 글루코코르티코이드 수용체 (GR)-기반 프로모터, 인간 에스트로겐 수용체 (ER)-기반 프로모터, 모스(moth) 엑디손 수용체-기반 프로모터, 및 스테로이드/레티노이드/갑상선 수용체 수퍼패밀리에 기반한 프로모터), 금속-조절 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오네인 유전자-기반 프로모터), 및 발병-관련 프로모터 (예를 들어, 아라비돕시스 및 옥수수 병원체-관련 (pathogen-related: PR) 단백질-기반 프로모터)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 전형적인 물리적-조절 프로모터는 온도-조절 프로모터 (예를 들어, 열 충격 프로모터), 및 광-조절 프로모터 (예를 들어, 대두 SSU 프로모터)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 기타 예시적인 프로모터는 다른 곳, 예를 들어, 2009 년 5 월 18 일에 접속된 Patent Lens 웹 사이트의 "유전자 발현을 조절하는데 사용되는 프로모터(Promoters used to regulate gene expression)"에 기재되어 있다.
당업자는 특정 상황에 기초하여 적절한 프로모터를 선택할 수 있을 것이다. 발현되는 유전자에 프로모터를 작동가능하게 연결시키는 방법과 같이 많은 다른 프로모터가 당업계에 잘 알려져 있다. 자연 프로모터 서열 및 많은 이종 프로모터는 둘다 패키징 세포 및 표적 세포에서 발현을 지시하는데 사용될 수 있다. 그러나, 이종 프로모터가, 일반적으로 자연 프로모터와 비교하여 바람직한 단백질에 대하여 많은 전사 및 높은 수율을 가능하게 하므로, 바람직하다.
프로모터는 폴리오마 바이러스, 계두(fowlpox) 바이러스, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스(bovine papilloma virus), 조류 육종 바이러스(avian sarcoma virus), 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 시미안 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 수득될 수 있다. 프로모터는, 프로모터가 표적 세포와 양립할 수 있는 경우, 또한, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터, 열-충격 프로모터, 또는 자연적인 서열과 정상적으로 결합된 프로모터와 같은 이종 포유동물 프로모터일 수있다. 일 구체예에서, 상기 프로모터는 바이러스 발현 시스템에서 자연적으로 발생하는 바이러스 프로모터이다. 일부 구체예에서, 상기 프로모터는 수지상 세포-특이적 프로모터이다. 수지상 세포-특이적 프로모터는, 예를 들어, CD11c 프로모터일 수 있다.
벡터(들)에 인핸서 서열을 삽입하여 전사를 증가시킬 수 있다. 인핸서는 전형적으로 길이가 약 10 내지 300 bp이고, 시스-활성 (cis-acting) DNA 요소이며, 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 작용한다. 포유류 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-페토단백질(alpha-fetoprotein) 및 인슐린) 및 진핵 세포 바이러스로부터 많은 인핸서 서열이 알려져 있다. 예를 들어, 복제 개시점(replication origin)의 후단부(bp 100-270)에 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제개시점의 말기의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 인핸서는 항원-특이적 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터로 접합될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.
발현 벡터는 또한 전사의 종결 및 mRNA 안정화를 위하여 필요한 서열을 함유할 수 있다. 이러한 서열은 진핵세포 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 비해독 부위(untranslated regions), 5', 및 선택적으로 3'에서 종종 발견되며 당업계에 잘 알려져있다.
바이러스 벡터 게놈은 추가적인 유전 요소를 함유할 수도 있다. 구조에 포함될 수 있는 요소의 유형은 어떤 식으로든 제한되지 않으며 특정 결과를 얻기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 표적 세포에서 바이러스 게놈의 핵 진입을 용이하게 하는 신호가 포함될 수 있다. 그러한 신호의 예는 HIV-1 cPPT/CTS 신호 (DNA 플랩)이다. 또한, 표적 세포에서 프로바이러스 통합 부위의 특성화를 용이하게하는 요소가 포함될 수 있다. 예를 들어, tRNA 호박코돈 억제자(amber suppressor) 서열이 구조에 포함될 수 있다. 예를 들어, 닭 베타-글로빈으로부터의 절연체(insulator) 서열 또한 바이러스 게놈 구조에 포함될 수 있다. 상기 요소는 메틸화 및 이질염색질형성(heterochromatinization) 효과로 인해 표적 세포에서 통합 프로바이러스를 침묵시키는 기회를 줄인다. 추가로, 절연체는 염색체상의 통합 부위에서 주변 DNA로부터의 양성 또는 음성 위치의 효과로부터 내부 인핸서, 프로모터 및 외인성 유전자를 보호할 수 있다. 추가로, 벡터 게놈은 관심 유전자의 발현을 향상시키도록 고안된 하나 이상의 유전적 요소를 함유할 수 있다. 예를 들어, 우드척(woodchuck) 간염 바이러스 반응성 요소 (woodchuck hepatitis virus responsive element: WRE)가 상기 구조에 놓여질 수 있다 (Zufferey et al. 1999. J. Virol. 74:3668-3681; Deglon et al. 2000. Hum. Gene Ther. 11:179-190,).
바이러스 벡터 게놈은 전형적으로 패키징 또는 생산자 세포주에 형질전환될 수 있는 플라스미드 형태로 구축된다. 플라스미드는 일반적으로 박테리아에서 플라스미드의 복제에 유용한 서열을 포함한다. 이와 같은 플라스미드는 당업계에 잘 알려져 있다. 추가로, 원핵생물의 복제 개시점을 포함하는 벡터는 유전자의 발현이 약물 내성과 같은 검출가능하거나 선별가능한 마커를 부여하는 유전자를 또한 포함할 수 있다. 전형적인 박테리아 내성 약물은 암피실린이나 테트라사이클린에 내성을 부여하는 물질이다.
본 명세서에 기재된 하나 이상의 성분을 함유하는 플라스미드는 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 용이하게 구축된다. 구축된 플라스미드에서 정확한 서열을 확인하기 위한 분석을 위해, 플라스미드는 대장균에서 복제되고, 정제되고, 제한 효소 분해 또는 종래의 방법에 의해 결정된 그의 DNA 서열에 의해 분석될 수 있다.
포유류 세포에서 일시적인 발현을 위해 구축된 벡터도 사용될 수 있다. 일시적인 발현은 숙주 세포가 발현 벡터의 많은 복제본을 축적하고, 이어서, 발현 벡터에서 항원-특이적 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드의 높은 수준을 합성하도록 숙주 세포에서 효율적으로 복제 할 수 있는 발현 벡터의 사용과 관련이 있다. 폴리뉴클레오티드. See Sambrook et al., supra, pp. 16.17-16.22 참조. 폴리펩티드의 발현에 적응하기 위한 적합한 다른 벡터 및 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 특정 상황에 용이하게 적용될 수 있다.
본 명세서에 제공된 기술을 사용하여, 당업자는 리포터 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 패키징 세포를 형질감염시키고 적합한 기술, 예를 들어, 녹색 형광 단백질 접합체로부터 형광을 측하는 것을 사용하여 발현을 측정함으로써 특정 발현 시스템의 효율을 시험할 수 있음을 인식 할 것이다. 적합한 리포터 유전자는 당업계에 잘 알려져 있다.
3. 대상 서열의 유형
본 명세서에 기재된 레트로바이러스 벡터는 IL-12 및 선택적으로, 면역자극 분자, 사이토카인, 케모카인, 관심 항원, 체크포인트 억제제, 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 대상 서열을 코딩한다.
IL-12를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 당업계에 공지되어 있으며 공개된 데이터베이스에서 이용가능하다. 당업자가 쉽게 이해할 수 있는 바와 같이, IL-12는 면역 시스템에 다수의 생물학적 효과를 갖는 이종이량체 사이토카인이다. 그것은 p35 및 p40의 2 개의 서브유닛으로 이루어져 있는데, 둘다 p70, 활성 형태의 IL-12의 분비를 위해 필요하다. 일 구체예에서, IL-12 서열 (발현 카세트)는 IL-12 폴리펩티드의 발현을 지시하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 변이체 및 유도체가 IL-12 활성을 보유하는 경우, 공지된 IL-12 분자의 변이체 및 유도체를 포함하는 임의의 IL-12 폴리펩티드가 사용될 수 있다. IL-12 활성은 당업계에 공지된 분석법을 사용하여 측정될 수 있다 (예를 들어, 실시예 1에 기재된 바와 같음). 일 구체예에서, 상기 IL-12는 인간 IL-12이다. 다른 구체예에서, 상기 IL-12는 쥐 IL-12이다. 일 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 단일 전사물로부터 다중 이식 유전자의 발현을 가능하게 하는 IRES 서열에 의해 분리된 IL-12 서브유닛, p35 및 p40의 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 기재된 벡터는 단일 사슬 IL-12 (scIL-12)를 코딩한다. 이와 관련하여, 단일 사슬 융합 단백질은 어느 한 방향으로 IL-12 서브유닛을 코딩할 수 있고, 특정 구체예에서는 p35-L-p40 또는 p40-L-p35와 같은 2 개의 서브유닛 사이에 링커를 포함할 수 있다. "링커(linker)"는 약 2 내지 약 150 개의 아미노산의 링커와 같은 다른 펩티드 또는 폴리펩티드를 연결하거나 연결시키는 펩티드이다. 다양한 링커 중 임의의 것이 당업계에 공지되어 있고, 본 명세서에서 사용될 수 있다 (예를 들어, Adv Drug Deliv Rev. 2013 Oct;65(10):1357-69 참조). 특정 구체예에서, 링커는 엘라스틴 링커이다.
다른 대상 서열이 또한 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터에 포함될 수있다. 따라서, 이와 관련하여, 대상 서열은 어떤 방식으로도 한정되지 않고, 당업자가 표적 세포에 전사되고 발현되도록 바라는 임의의 핵산을 포함한다. 상기 산물은 단백질 또는 핵산일 수 있다. 대상 서열은 siRNA, 마이크로 RNA, 상보적 영역이 길이가 약 20 리보뉴클레오티드보다 긴 자가-상보적 이중 가닥 RNA 또는 메시지 RNA와 상보적인 RNA를 포함하는 단백질 또는 핵산 분자를 코딩할 수 있다. 메시지 RNA에 대한 상기 상보적인 (안티-센스) RNA의 결합은 단백질로 번역될 수 있는 가능성을 차단한다. 일부 예에서, 대상 서열은 면역 반응이 요구되는 항원을 코딩할 수 있다. 특히, HIV, HSV, HCV, HPV, 말라리아, 또는 결핵과 같은 제제유래의 종양 항원 및 감염성 질병 항원이 바람직하다.
임의의 경우에, 대상 서열은 분자의 발현을 하향-조절하는 관심의 작은 억제 RNA (siRNA) 또는 마이크로RNA (miRNA)를 코딩하는 유전자일 수 있다. 예를 들어, siRNA 또는 마이크로RNA를 코딩하는 유전자는 수지상 세포의 활성화 또는 성숙을 저해하는 것을 포함하여, 세포에서 음성 조절 인자의 발현을 하향-조절하는데 사용될 수 있다. siRNA 및 마이크로RNA는 당업계에 잘 알려져 있다 (Fire et al., Nature 391:806, 1998; "The RNA Interference Resource" of Applied Biosystems, Trang et al., Oncogene Suppl 2:S52, 2008; Taganov, K., et al. 2007. Immunity 26:133-137; Dahlberg, J. E. and E. Lund. 2007. Sci. STKE 387:pe25; Tiemann and Rossi, EMBO Mol Med 1: 142, 2009 참조). 대안적으로, 대상 서열은 상보적 영역의 길이가 약 20 리보뉴클레오티드보다 긴 자가-상보성 이중 가닥 RNA 또는 길이가 약 20 리보뉴클레오티드보다 긴 안티-센스 RNA를 코딩할 수 있다. 당업자는 RNA 중합효소 Ⅲ프로모터로부터, 대안적으로는, RNA 중합효소 II 프로모터로부터 전사되는 비-코딩 RNA의 성분으로부터 siRNA, miRNA, dsRNA 및 안티-센스 RNA 분자를 발현할 수 있다.
추가적으로, 대상 서열은 IL-12를 코딩하는 서열을 포함하고, 둘 이상의 물질을 코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 형태에서, 전달될 상기 서열은 하나 이상의 단백질, 하나 이상의 siRNA, 하나 이상의 마이크로 RNA, 하나 이상의 dsRNA 또는 하나 이상의 안티-센스 RNA 분자 또는 이들의 조합을 코딩하는 다수의 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 전달될 상기 서열은 IL-12 및 면역 반응이 요구되는 하나 이상의 항원을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 상기 하나 이상의 항원은 단일 질병 또는 장애와 관련될 수 있거나, 다수의 질병 및/또는 장애와 관련될 수 있다. 일부 경우에, 면역 조절 단백질을 코딩하는 유전자가 면역 반응이 요구되는 항원을 코딩하는 유전자와 함께 포함될 수 있으며, 상기 조합은 바람직한 방향 및 규모의 면역 반응을 유도 및 조절할 수 있다. 따라서, 임의의 구체예에서, 상기 벡터는 IL-12를 코딩하는 서열, 항원을 코딩하는 서열 및 면역 조절 단백질을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 산물은 코딩된 서열이 하나의 프로모터와 기능적 관계에 있는 초기 융합 산물로서 생산될 수 있다. 대안적으로, 산물은 별도로 코딩될 수 있으며, 각 코딩 서열은 프로모터와 기능적 관계가 있다. 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다.
다른 곳에서 언급된 바와 같이, 임의의 구체예에서, 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터는 IL-12를 코딩하는 서열 및 질병 또는 장애와 관련된 하나 이상의 항원을 코딩하는 대상 서열을 포함한다. 질병 또는 장애와 관련된 임의의 항원은 본 명세서에 기재된 바와 같은 바이러스 입자를 사용하여 수지상 세포에 전달될 수 있다. 질병 또는 장애와 관련된 항원이 동정된다. 많은 질병 및 장애와 관련된 항원은 당업계에 잘 알려져 있다. 항원은 질병 또는 장애와 관련이 있음이 이미 공지되어 있거나, 또는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 확인될 수 있다. 예를 들어, 종양-관련 항원과 같이 환자가 고통 받고있는 유형의 암의 유형에 대한 항원이 공지될 수 있거나 당업계에 공지된 임의의 다양한 방법에 의해 종양 자체로부터 확인될 수 있다. 종양-관련 항원은, 예를 들어, 신장 세포 암, 전립선 암, 흑색종, 및 유방암을 포함하는 다양한 암으로 알려져 있다. 예를 들어, 일부 유방암에서는 Her-2 수용체가 암세포 표면에서 과다발현된다. 예시적인 종양 항원은 전립선 산 포스파타제, 전립선 특이적 항원, NKX3.1, 전립선 특이적 막 항원, PRAME; BAGE; RAGE, NY-ESO-1, SAGE, HAGE, GAGE, Plu-1, HASH -1, HasH-2, Cripto, Criptin, MART-1/Melan-A, gp100, gp75, mda-7, 티로시나제, 티로시나제-관련 단백질, p53, Ras, c-Myc, A-Raf, B-Raf, and C-Raf, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, MART-1, BAGE, DAM-6, -10, GAGE-1, GAGE -2, GAGE -8, GAGE-3, GAGE -4, GAGE -5, GAGE -6, GAGE -7B, NA88-A, MART-1, MC1R, Gp100, PSM, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC2, PRAME, P15, RU1, RU2, SART-1, SART-3, 빌롬 종양 항원, AFP, β-카테닌/m, 카스파제-8/m, CEA, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, Mum-1, Mum-2, Mum-3, 미오신/m, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, 아넥신 II, CDC27/m, TPI/mbcr-abl, BCR-ABL, 인터페론 조절 인자 4 (IRF4), ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RAR, 종양-관련 칼슘 신호 트랜스듀서 1 (TACSTD1) TACSTD2, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR 및 EGFRvIII), 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (PDGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR), 인테그린-연결 키나제 (ILK), STAT3, STAT5, STAT6, HIF-1, HIF-2, 핵 인자-카파 B (NF-κB), Notch1-4, c-Met, 포유류 라파마이신 표적(mTOR), WNT, PMSA, PR-3, MDM2, 메소텔린, 신장 세포 암종-5T4, SM22-알파, 카르본산염 안히드라제 I (CAI) 및 IX (CAIX) (G250로도 알려짐), STEAD, TEL/AML1, GD2, 프로테나제3, hTERT, 육종 전좌 절단점, EphA2, ML-IAP, EpCAM, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, ALK, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, 폴리시알 산, MYCN, RhoC, GD3, 푸코실 GM1, 메소텔리안, PSCA, sLe, PLAC1, GM3, BORIS, Tn, GLoboH, NY-BR-1, RGs5, SART3, STn, PAX5, OY-TES1, 정자 단백질 17, LCK, HMWMAA, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, 레구메인, TIE2, Page4, MAD-CT-1, FAP, MAD-CT-2, 및 포스 관련 항원 1을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 다수의 종양 관련 항원이 검토되었다 (예를 들어, "Tumor-Antigens Recognized By T-Lymphocytes," Boon T, Cerottini J C, Vandeneynde B, Vanderbruggen P, Vanpel A, Annual Review Of Immunology 12: 337-365, 1994; "A listing of human tumor antigens recognized by T cells," Renkvist N, Castelli C, Robbins P F, Parmiani G. Cancer Immunology Immunotherapy 50: (1) 3-15 MAR 2001, 참조).
항원은 또한, 예를 들어, HIV/AIDS와 같은 감염성 질병과 관련된 항원일 수 있다. 상기 항원은, 예를 들어, gp120 일 수 있다 (Klimstra, W. B., et al. 2003. J Virol 77:12022-12032; Bernard, K. A., et al. 2000. Virology 276:93-103; Byrnes, A. P., et al. 1998. J Virol 72: 7349-7356,). 다른 예시적인 항원은 gag, pol, env, tat, nef 및 rev를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다 (Lieberman, J. et al. 1997. AIDS Res Hum Retroviruses 13(5): 383-392; Menendez-Arias, L. et al. 1998. Viral Immunol 11(4): 167-181,).
바이러스 항원의 예는 아데노바이러스 폴리펩티드, 알파바이러스 폴리펩티드, 칼리시바이러스 폴리펩티드, 예를 들어, 칼리시바이러스 캡시드 항원, 코로나 바이러스 폴리펩티드, 디스템퍼(distemper) 바이러스 폴리펩티드, 에볼라 바이러스 폴리펩티드, 엔테로바이러스 폴리펩티드, 플라비바이러스(flavivirus) 폴리펩티드, 간염 바이러스(AE) 폴리펩티드, 예를 들어, B형 간염 코어 또는 표면 항원, 또는 C형 간염 바이러스 E1 또는 E2 당댄백질, 코어, 또는 비-구조적 단백질, 또는 헤르페스바이러스 폴리펩티드, 예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스 또는 수두 대상포진 바이러스(varicella zoster virus) 당단백질, 면역결핍 바이러스 폴리펩티드, 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스 외피 또는 프로테아제, 감염성 복막염 바이러스 폴리펩티드, 인플루엔자 바이러스 폴리펩티드, 예를 들어, 인플루엔자 A 헤마글루티닌, 뉴라미니다제, 또는 뉴클로단백질, 백혈병 바이러스 폴리펩티드, 마르부르그(Marburg) 바이러스 폴리펩티드, 오르토믹소바이러스 폴리펩티드, 파필로마 바이러스 폴리펩티드, 파라인플루엔자 바이러스 폴리펩티드, 예를 들어, 헤마글루티닌/뉴라미니다제, 파라믹소 바이러스 폴리펩티드, 파르보바이러스 폴리펩티드, 페스티바이러스(pestivirus) 폴리펩티드, 피코르나(picorna) 바이러스 폴리펩티드, 예를 들어, 폴리오바이러스 캡시드 폴리펩티드, 폭스 바이러스 폴리펩티드, 예를 들어, 천연두 바이러스(vaccinia virus) 폴리펩티드, 광견병 바이러스(rabies virus) 폴리펩티드, 예를 들어, 광견병 바이러스 당단백질 G, 레오바이러스 폴리펩티드, 레트로바이러스 폴리펩티드, 및 로타바이러스 폴리펩티드를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
박테리아 항원의 예는, 악티노미세스 폴리펩티드, 바실루스 폴리펩티드, 박테로이데스(Bacteroides) 폴리펩티드, 보르데텔라 폴리펩티드, 바르토넬라 폴리펩티드, 보렐리아 폴리펩티드, 예를 들어, B.(보렐리아) 부르그도페리 OspA, 브루셀라 폴리펩티드, 캄필로박터 폴리펩티드, 카프노사이토파가(Capnocytophaga) 폴리펩티드, 클라미디아 폴리펩티드, 클로스트리듐 폴리펩티드, 코네리박테리움 폴리펩티드, 콕시엘라 폴리펩티드, 더마토필러스 폴리펩티드, 엔테로코커스 폴리펩티드, 에를키아(Ehrlichia) 폴리펩티드, 에세리키아 폴리펩티드, 프란시셀라 폴리펩티드, 푸소박테륨(Fusobacterium) 폴리펩티드, 헤모바르토넬라(Haemobartonella) 폴리펩티드, 헤모필루스 폴리펩티드, 예를 들어, H. 인플루엔자 타입 b 외막 단백질, 헬리코박터 폴리펩티드, 클렙시엘라 폴리펩티드, L-형 박태리아 폴리펩티드, 렙토스피라 폴리펩티드, 리스테리아 폴리펩티드, 마이코박테리아 폴리펩티드, 마이코플라스마 폴리펩티드, 나이세리아(Neisseria) 폴리펩티드, 네오리케차(Neorickettsia) 폴리펩티드, 노카르디아 폴리펩티드, 파스퇴렐라(Pasteurella) 폴리펩티드, 펩토코커스 폴리펩티드, 펩토스트렙토코쿠스 폴리펩티드, 뉴모코쿠스(Pneumococcus) 폴리펩티드, 프로테우스 폴리펩티드, 슈도모나스 폴리펩티드, 리케차(Rickettsia) 폴리펩티드, 로칼리메아(Rochalimaea) 폴리펩티드, 살모넬라 폴리펩티드, 쉬겔라 폴리펩티드, 스타필로코쿠스 폴리펩티드, 스트렙토코쿠스 폴리펩티드, 예를 들어, S. 화농성 M 단백질, 트레포네마(Treponema) 폴리펩티드, 그리고 여시니아(Yersinia) 폴리펩티드, 예를 들어, Y. 페스트 F1 및 V 항원을 포함하지만, 이에 한정되진 않는다.
진균 항원의 예는, 아브시다이아(Absidia) 폴리펩티드, 아크레모늄 폴리펩티드, 알터나리아 폴리펩티드, 아스페르길루스 폴리펩티드, 바시디오볼루스 폴리펩티드, 비폴라리스 폴리펩티드, 블라스토마이세스 폴리펩티드, 칸디다 폴리펩티드, 콕시디오이데스 폴리펩티드, 코니디오볼루스 폴리펩티드, 크립토코쿠스 폴리펩티드, 쿠르발라리아 폴리펩티드, 에피더모피톤(Epidermophyton) 폴리펩티드, 엑소피알라 폴리펩티드, 게오트리큠(Geotrichum) 폴리펩티드, 히스토플라스마 폴리펩티드, 마두렐라 폴리펩티드, 말라세지아 폴리펩티드, 마이크로스포럼 폴리펩티드, 모니리엘라 폴리펩티드, 모르티에렐라 폴리펩티드, 무코르 폴리펩티드, 패실로마이세스 폴리펩티드, 페니실륨 폴리펩티드, 피알레모니움 폴리펩티드, 피알로포라 폴리펩티드, 프로토테카 폴리펩티드, 슈도알레쉐리아(Pseudallescheria) 폴리펩티드, 슈도미크로도치움(Pseudomicrodochium) 폴리펩티드, 피시움(Pythium) 폴리펩티드, 리노스포리듐 폴리펩티드, 리조푸스 폴리펩티드, 스콜레코바시디움 폴리펩티드, 스포로트릭스(Sporothrix) 폴리펩티드, 스템필리움 폴리펩티드, 트리코피톤(Trichophyton) 폴리펩티드, 트리콜스포론 폴리펩티드, 및 자일로하이파(Xylohypha) 폴리펩티드를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
원충류(protozoan) 기생충 항원의 예는, 바베시아 폴리펩티드, 바란티디움 폴리펩티드, 베스노이티아 폴리펩티드, 크립토스포리듐 폴리펩티드, 에이메리아(Eimeria) 폴리펩티드, 엔세팔리토준 폴리펩티드, 엔트아메바 폴리펩티드, 지아르디아 폴리펩티드, 함몬디아 폴리펩티드, 헤파토준 폴리펩티드, 아이소스포라 폴리펩티드, 리슈마니아(Leishmania) 폴리펩티드, 마이크로스포리디아 폴리펩티드, 네오스포라 폴리펩티드, 노세마 폴리펩티드, 펜타트리코모나스 폴리펩티드, 플라스모디움 폴리펩티드, 예를 들어 P. 팔시파룸(falciparum) 포자소체단백질 (circumsporozoite) (PfCSP), 스포로조이테 표면 단백질 2 (sporozoite surface protein 2: PfSSP2), 간 조직 항원 1의 카복실기 말단 (PfLSA1 c-말단), 및 방출 단백질 1 (PfExp-1), 뉴모시스티스 폴리펩티드, 사르코시스티스 폴리펩티드, 스키스토소마(Schistosoma) 폴리펩티드, 타일레리아(Theileria) 폴리펩티드, 톡소플라스마 폴리펩티드, 및 트리파노소마 폴리펩티드를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
연충류 (helminth) 기생충 항원의 예는, 아칸토케일로네마 폴리펩티드, 아엘루로스트롱질루스(Aelurostrongylus) 폴리펩티드, 안실로스토마 폴리펩티드, 안지오스트롱일루스(Angiostrongylus) 폴리펩티드, 아스카리스 폴리펩티드, 브루기아 폴리펩티드, 부노스토뭄 폴리펩티드, 카필라리아 폴리펩티드, 차베르티아 폴리펩티드, 쿠페리아 폴리펩티드, 크레노소마 폴리펩티드, 딕티오카울루스 폴리펩티드, 딕티오피메 폴리펩티드, 디페탈로네마 폴리펩티드, 디필로보스리움 폴리펩티드, 디필리디움 폴리펩티드, 디로필라리아 폴리펩티드, 드라쿤롤루스 폴리펩티드, 엔테로비우스 폴리펩티드, 필라로이데스 폴리펩티드, 하에몬쿠스 폴리펩티드, 라고킬라스카리스 폴리펩티드, 로아 폴리펩티드, 만소넬라 폴리펩티드, 뮤엘레리우스(Muellerius) 폴리펩티드, 나노피에투스(Nanophyetus) 폴리펩티드, 네카토르 폴리펩티드, 네마토디루스 폴리펩티드, 외소파고스토뭄 폴리펩티드, 온코세르카 폴리펩티드, 오피스토르키스 폴리펩티드, 오스테르타기아 폴리펩티드, 파라필라리아 폴리펩티드, 파라고니무스 폴리펩티드, 파라스카리스 폴리펩티드, 피살롭테라 폴리펩티드, 프로토스트롱질루스 폴리펩티드, 세타리아 폴리펩티드, 스피로세르카 폴리펩티드, 스피로메트라 폴리펩티드, 스테파노필라리아 폴리펩티드, 스트롱길로이드 폴리펩티드, 스트롱질루스 폴리펩티드, 텔라지아 폴리펩티드, 톡사스카리스 폴리펩티드, 톡소카라 폴리펩티드, 트리키넬라 폴리펩티드, 트리코스트론길루스 폴리펩티드, 트리쿠리스 폴리펩티드, 운시나리아(Uncinaria) 폴리펩티드, 및 우체레리아(Wuchereria) 폴리펩티드를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
체외기생충 (ectoparasite) 항원의 예는, 벼룩 (flea)으로부터의 폴리펩티드 (방어성 항원뿐만 아니라 알레르기 항원을 포함); 연진드기 (soft tick) 및 참진드기 (hard tick)를 포함한, 진드기; 깔따구 (midge), 집모기 (mosqui내지e), 나방파리 (sand fly), 먹파리 (black fly), 등에 (horse fly), 뿔파리과 (horn fly), 사슴 파리 (deer fly), 체체 파리 (tsetse flly), 침파리 (stable fly), 구더기증 (myiasis)-발생 파리 및 무는 각다귀(gnat)와 같은 파리; 개미; 거미, 이; 진드기;및 빈대(bed bug) 및 침노린재(kissing bug)와 같은 노린재(true bug)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일단 항원이 동정되고 선택되면, 상기 바람직한 항원을 코딩하는 서열이 동정된다. 바람직하게는, 상기 서열은 cDNA를 포함한다. 그런 다음 상기 서열은 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 바이러스 벡터 게놈에 복제된다.
임의의 형태에서, 벡터는 면역조절 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다. 예시적인 면역조절 분자는 임의의 다양한 사이토카인을 포함한다. 본 명세서에 사용된 "사이토카인"은 세포간 매개체로서 다른 세포에 작용하는 한 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반적인 용어를 의미한다. 그러한 사이토카인의 예는 림포카인, 모노카인 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이 있다. 사이토카인 중에는 인간 성장 호르몬, N- 메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬과 같은 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴랙신(relaxin); 프로릴랙신; 여포 자극 호르몬 (follicle stimulating hormone: FSH), 갑상선 자극 호르몬 (thyroid stimulating hormone: TSH) 및 황체 형성 호르몬 (luteinizing hormone: LH)과 같은 당단백 호르몬; 간 성장 인자; 섬유아세포(fibroblast) 성장 인자; 프로락틴; 태반성 락토겐; 종양 괴사 인자-알파 및 베타; 뮐러(mullerian)-억제 물질; 마우스 성선자극호르몬(gonadotropin)-관련 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); NGF-베타와 같은 신경 성장 인자; 혈소판-성장 인자; TGF-알파 및 TGF-베타와 같은 형질전환 성장 인자 (TGFs); 인슐린-유사 성장 인자-I 및 II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도성 인자; 인터페론-알파, 베타, 및 -감마와 같은 인터페론; 대식세포-CSF (M-CSF)와 같은 콜로니 자극 인자 (CSFs); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 과립구-CSF (G-CSF); IL-1, IL-1알파, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11과 같은 인터류킨(ILs); IL-15, TNF-알파 또는 TNF-베타와 같은 종양 괴사 인자; 및 LIF 및 키트 리간드 (kit ligand: KL)를 포함하는 다른 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본 명세서에서 사용하기 위해 고려되는 다른 면역조절 분자는 B7.1, B7.2, 4-1BB, CD40 리간드 (CD40L), 약물-유도성 CD40 (iCD40), 등을 포함한다. 임의의 구체예에서, 이러한 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 수지상 세포에서 코딩 서열의 발현을 지시하는 하나 이상의 조절 요소의 제어하에 있다.
임의의 구체예에서, 본 명세서에 기재된 IL-12를 발현하는 벡터에 의해 코딩되는 면역조절 분자는 체크포인트 억제제 분자이다. 면역 체크포인트는 면역 반응의 지속 및 진폭을 조절하고 자가-내성을 유지하는데 중요한 면역 시스템의 다양한 억제 경로를 나타낸다. 종양은 임의의 면역-체크포인트 경로를 특히 종양 항원에 특이적인 T 세포에 대한 면역 저항의 주요 메커니즘으로 사용한다 (예를 들어, Pardoll, 2012 Nature 12:252; Chen and Mellman 2013 Immunity 39:1 참조). 본원은 면역 체크포인트 억제제를 코딩하는 벡터를 제공한다. 면역 체크포인트 억제제는 통계적으로 유의한 방식으로 면역계의 억제 경로를 차단하거나 억제하는 모든 제제를 포함한다. 그러한 억제제는 면역 체크포인트 수용체를 차단하거나 억제하는데 결합하거나, 면역 체크포인트 수용체 리간드를 차단하거나 억제하는데 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 실례인 면역 체크포인트 분자는 CTLA-4, 4-1BB (CD137), 4-1BBL (CD137L), PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, TIM3, B7H3, B7H4, VISTA, KIR, 2B4 (CD2 패밀리 분자에 속하며 모든 NK, γδ, 및 기억 CD8+ (αβ) T 세포에서 발현됨), CD160 (BY55로도 인용됨) 및 CGEN-15049를 차단 또는 억제하기 위해 표적화되나, 이에 한정되지는 않는다. 면역 체크포인트 억제제는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, TIM3, B7H3, B7H4, VISTA, KIR, 2B4, CD160 및 CGEN-15049의 하나 이상의 활성을 차단하거나 억제하는데 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 다른 결합 단백질을 포함한다. 실례인 면역 체크포인트 억제제는 임의의 하기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다: 트레멜리무맙 (CTLA-4 차단 항체), 항-OX40, PD-L1 단일클론 항체 (항-B7-H1; MEDI4736), MK-3475 (펨브롤리주맙; PD1 차단제), 니볼루맙 (항-PD1 항체), CT-011 (항-PD1 항체), BY55 단일클론 항체, AMP224 (항-PDL1 항체), BMS-936559 (항-PDL1 항체), MPDL3280A (아테졸리주맙; 항-PDL1 항체), MSB0010718C (항-PDL1 항체) 및 예르보이/이필리무맙 (항-CTLA-4 체크포인트 억제제).
검출 가능한 산물, 일반적으로 단백질을 코딩하는 서열은 바람직한 산물을 발현하는 세포의 동정이 가능하도록 포함될 수 있다. 예를 들어, 녹색 형광 단백질 (GFP)과 같은, 형광 마커 단백질은 대상 서열 (예를 들어, 항원을 코딩하는)과 함께 구조에 포함된다. 다른 경우, 단백질은 항체에 의해 검출 될 수 있거나, 단백질은 검출 가능한 산물 또는 예를 들어, 하그로마이신 내성과 같은, 약물 내성을 부여하는, 형질감염 또는 형질도입된 표적 세포의 선택을 허용하는 산물을 생성하기 위해 기질에 작용하는 효소일 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 진핵 세포에의 사용에 적합한 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 네오마이신, 메토트렉세이트, 블라스티시딘, 당업계에 공지된 다른 것들에 내성을 부여하는 단백질, 또는 영양 결핍의 보충, 또는 배지로부터 지체되는 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 코딩한다. 선택가능한 마커는 선택적으로 별도의 플라스미드에 존재할 수 있고, 공동-형질감염에 의해 도입될 수 있다.
패키징 세포에서 바람직한 바이러스의 생산에 필요한 보조 단백질의 발현 또는 표적 세포에서 다수의 대상 서열의 발현에 필요한 2 개 이상의 요소 (예를 들어, 대상 서열, 외피 분자, DC 성숙 인자)를 포함하는 하나 이상의 멀티시스트론(multicistronic) 발현 단위가 활용될 수있다. 멀티시스트론 벡터의 사용은 요구되는 핵산 분자의 총 수를 감소시키고, 따라서 다중 벡터 게놈으로부터의 발현을 조정하는 것과 관련된 있을 수 있는 어려움을 막는다. 멀티시스트론 벡터에서 발현되는 다양한 요소는 하나 이상의 프로모터 (및 필요에 따라 다른 발현 조절 요소)에 작동가능하게 연결된다. 일부 형태에서, 멀티시스트론 벡터는 대상 서열, 리포터 산물을 코딩하는 서열, 및 바이러스 요소를 포함한다. 대상 서열은 IL-12를 포함하고 또한 선택적으로 항원을 코딩하고, 임의의 구체예에서는 추가적인 면역자극 분자, 체크포인트 억제제, 또는 다른 사이토카인을 또한 포함할 수 있다. 때때로, 멀티시스트론 벡터는 IL-12를 코딩하는 유전자, 항원, 다른 면역자극 분자 및 바이러스 요소를 코딩하는 유전자를 포함한다.
멀티시스트론 발현 벡터에서 발현되는 각 성분은 동일한 프로모터로부터 다양한 단백질의 분리 발현을 위해, 예를 들어, 내부 리보솜 삽입 부위 (IRES) 요소 또는 바이러스 2A 요소에 의해 분리될 수 있다. IRES 요소 및 2A 요소는 당업계에 공지되어 있다 (U.S. Pat. No. 4,937,190; de Felipe et al. 2004. Traffic 5: 616-626,). 일 구체예에서, 구제역(foot-and-mouth diseases) 바이러스 (FMDV), 말 비염(equine rhinitis) A 바이러스, 및 토세아 아시그나(thosea asigna) 바이러스 (TaV)로부터의 2A-유사 서열 (Szymczak et al. 2004. Nat. Biotechnol. 22: 589-594,)과 연결된 퓨린 클리비지 부위 서열 (RAKR) (Fang et al. 2005. Nat. Biotech 23: 584-590,)을 코딩하는 올리고뉴클레오티드는 멀티시스트론 벡터에서 유전적 요소를 분리하는데 사용된다. 특정 멀티시스트론 벡터의 효능은 표준 프로토콜을 사용하여 각 유전자의 발현을 검출함으로써 용이하게 시험할 수 있다.
임의의 구체예에서, 다중 관심서열이 (예를 들어, IL-12 및 하나 이상의 관심 항원, 및/또는 하나 이상의 추가적인 면역자극 분자, 및/또는 체크포인트 억제제, 등) 표적 세포에서의 발현을 위해 고려되고, 다중 벡터는 각 벡터가 하나 이상의 대상 서열을 발현하는 곳에서 사용될 수 있다. 일 특정 구체예에서, 하나의 레트로바이러스 벡터는 IL-12를 발현하고 본질적으로 임의의 하나 이상의 다른 벡터와 조합하여 보조 벡터로 사용될 수 있다. 이에 대하여, 하나의 레트로바이러스 벡터는 IL-12를 발현하고 별도의 레트로바이러스 벡터는 면역 반응이 요구되는 하나 이상의 관심 항원을 발현할 수 있다. 다른 구체예에서, IL-12를 발현하는 하나의 레트로바이러스 벡터는 하나 이상의 항원 및/또는 하나 이상의 추가 면역자극 분자 및/또는 체크포인트 억제제를 발현하는 별도의 레트로 바이러스 벡터와 함께 사용하기 위해 생성될 수 있다. 따라서, 다수의 대상 서열이 고려되는 경우, 이들은 동일하거나 별도의 벡터에 제공될 수 있다.
구체적인 예시에서, 바이러스 벡터 게놈은: 사이토메갈로바이러스 (CMV) 인핸서/프로모터 서열; HIV 5' LTR의 R 및 U5 서열; 패키징 서열 (ψ); HIV-1 플랩 신호; 내부 인핸서; 내부 프로모터; 대상 유전자; 우드척 간염 바이러스 반응 요소; tRNA 호박 억제자 서열; 그것의 인핸서 서열의 결실을 갖는 U3 요소; 닭 베타-글로빈 절연체; 및 3' HIV LTR의 R 및 U5 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 벡터 게놈은 손상되지 않은 렌티바이러스 5' LTR 및 자가-불활성화 3' LTR을 포함한다 (Iwakuma et al. Virology 15:120, 1999,).
벡터 게놈의 구축은 제한효소 (endonuclease) 절단, 라이게이션 (ligation), 형질전환, 플라스미드 정제, 및 DNA 시퀀싱의 표준 기술을 포함하지만, 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 적합한 유전 공학 기술을 사용하여 수행될 수 있고, 예를 들어, Sambrook et al (1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.), Coffin et al. (Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1997)) and "RNA Viruses: A Practical Approach" (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000),에 기재되어 있다.
C. 바이러스 입자의 생산
당업계에 이미 공지된 다양한 방법 중 임의의 방법은 감염성 렌티바이러스 벡터 입자의 게놈이 바이러스 벡터 게놈의 RNA 카피를 포함한 것을 생산하는데 사용될 수 있다. 일 방법으로, 바이러스 벡터 게놈은 바이러스 벡터 게놈으로부터 전사된, 바이러스 게놈 RNA를 바이러스 입자로 패키징하는데 필요한 모든 성분을 함유하는 패키징 세포주에 도입된다. 대안적으로, 바이러스 벡터 게놈은 하나 이상의 대상 서열 이외에 바이러스 성분을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 그러나, 표적 세포에서 상기 게놈의 복제를 방지하기 위해, 복제에 요구되는 내인성 바이러스 유전자는 일반적으로 제거되고 패키징 세포주에 별도로 제공된다.
일반적으로, 렌티바이러스 벡터 입자는, 입자를 생성시키는데 필요한 성분을 함유하는 하나 이상의 플라스미드 벡터로 형질감염된 세포주에 의해 생산된다. 이러한 렌티바이러스 벡터 입자는 전형적으로 복제-능력이 없으며, 단일 회차의 감염만이 가능하다. 가장 흔히, 렌티바이러스 벡터 입자를 생성하는 다양한 유전 성분을 분리하기 위해 다중 플라스미드 벡터가 활용된다. 그렇지 않으면, 복제 능력이 있는 바이러스를 생성할 수 있는 재조합의 기회가 감소한다. 그러나 바람직하다면, 렌티바이러스 성분 모두를 갖는 단일 플라스미드 벡터가 사용될 수 있다. 다중 플라스미드 벡터를 사용하는 시스템의 일 예로써, 세포주는 LTR, 시스-작용 패키징 서열, 및 이종 프로모터에 작동 가능하게 연결된 대상 서열(들)을 포함하는 바이러스 벡터 게놈 (즉, 벡터 게놈 플라스미드)을 함유하는 하나 이상의 플라스미드, 바이러스의 효소적 및 구조적 성분을 코딩하는 하나 이상의 플라스미드 (즉, Gag 및 Pol과 같은 성분을 코딩하는 패키징 플라스미드), 및 아르보바이러스 외피 당단백질을 코딩하는 하나 이상의 외피 플라스미드로 형질감염된다. 본 명세서에 기재되고 당업계에 공지된 바와 같이, 추가적인 플라스미드, 예를 들어, Rev-발현 플라스미드는 레트로바이러스 입자 생산을 향상시키는데 사용될 수 있다. 바이러스 입자는 세포막을 관통하고 대상 서열을 함유하는 게놈 및 수지상 세포를 표적으로 하는 아르보바이러스 외피 당단백질을 포함하는 코어를 포함한다. 아르보바이러스 당단백질이 신드비스 바이러스 E2 당단백질인 경우, 당단백질은 참조 균주 HR과 비교하여 헤파란 술페이트에 대한 결합이 감소되도록 조작된다.
본 발명의 플라스미드 벡터를 갖는 패키징 세포의 형질감염은 공지된 방법에 의해 수행될 수 있고, 사용되는 방법은 어떠한 방식으로든 제한되지 않는다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 리포좀을 포함하는 지질-기반 전달 시스템, "벗겨진(naked)" DNA의 전달, 및 Schatzlein AG. (2001. Non-Viral Vectors in Cancer Gene Therapy: Principles and Progresses. Anticancer Drugs,)에 기재된 것과 같은 폴리사이클로덱스트린 화합물을 이용한 전달을 포함하는 수많은 비-바이러스성 전달 시스템이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Graham et al. (1973. Virol. 52:456; Wigler et al. (1979. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1373-76), 참조와 같은 양이온성 지질 또는 염 처리 방법이 전형적으로 사용된다. 인산 칼슘 침전법이 가장 자주 사용된다. 그러나, 핵 미세주입(microinjection) 및 박테리아 원형질체 융합을 포함하는, 벡터를 세포로 도입하는 다른 방법 또한 사용될 수 있다.
패키징 세포주는 바이러스 게놈 RNA를 렌티바이러스 벡터 입자로 패키징하기 위해 트랜스에서 요구되는 바이러스성 조절 및 구조 단백질을 포함하는 성분을 제공한다. 패키징 세포주는 렌티바이러스 단백질을 발현하고 기능적 렌티바이러스 벡터 입자를 생산할 수 있는 임의의 세포주일 수 있다. 일부 적합한 패키징 세포주는 293 (ATCC CCL X), 293T, HeLa (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) 및 Cf2Th (ATCC CRL 1430) 세포를 포함한다. 상기 패키징 세포주는 필요한 바이러스 단백질을 안정하게 발현할 수 있다. 그러한 패키징 세포주는, 예를 들어, 미국 특허 제 6,218,181 호에 기재되어 있다. 대안적으로, 패키징 세포주는 바이러스 벡터 게놈과 함께 하나 이상의 필요한 바이러스 단백질을 코딩하는 핵산 분자로 일시적으로 형질 주입될 수 있다. 상기 결과의 바이러스 입자를 수집하고 표적 세포를 감염시키는데 사용한다. 외피 당단백질(들)을 코딩하는 유전자(들)는 보통 pcDNA3 (Invitrogen, CA USA)와 같은 발현 벡터 내로 복제된다. 진핵 세포 발현 벡터는 당업계에 잘 알려져 있고 다수의 상업적인 공급원으로부터 이용가능하다. 293T 세포와 같은 패키징 세포는 대상 서열 (예를 들어, IL-12, 선택적으로 하나 이상의 항원, 추가적인 사이토카인)을 코딩하는 바이러스 벡터 게놈, 바이러스 패킹 성분을 코딩하는 적어도 하나의 플라스미드, 및 표적화 분자의 발현을 위한 벡터와 그때 공동-형질감염된다. 외피는 패키징 세포의 막에 발현되고 바이러스 벡터에 통합된다.
일 시나리오에서, 하나 이상의 벡터는 본 명세서에 기재된 바와 같은 E2와 같은 신드비스 바이러스 외피 당단백질로 슈도타입화된 렌티바이러스 벡터 입자를 준비하기 위한 패키징 세포주에 폴리뉴클레오티드 서열을 도입하는데 사용된다. 상기 벡터는 신드비스 바이러스 외피, 대상 서열(들) (예를 들어, IL-12 및 선택적으로 하나 이상의 항원 또는 다른 대상 서열), 및 패키징 세포에 의해 제공되지 않는 바이러스의 생산에 필요한 임의의 성분을 포함하는 바이러스의 다양한 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다.
그러나 다른 시나리오에서, 패키징 세포는 IL-12 및 하나 이상의 추가 벡터를 코딩하는 바이러스 벡터 게놈과 공동-형질감염된다. 예를 들어, IL-12(및 선택적으로 하나 이상의 추가적인 대상 서열)를 코딩하는 바이러스 벡터에 추가하여, 제 2 벡터는 바람직하게는 변형된 (변이체로도 불리는) 신드비스 바이러스 외피를 코딩하는 유전자를 지닌다. 일부 상황에서, IL-12를 코딩하는 바이러스 벡터 게놈은 또한 케모카인, 사이토카인, DC 성숙 인자, 또는 면역 체크포인트 메카니즘을 조절하는 인자의 비-제한적인 예를 포함하는, 추가적으로 선택된 면역조절 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 상황에서, 선택된 면역조절 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 IL-12를 코딩하는 바이러스 벡터 및 하나 이상의 추가적인 벡터를 패키징 세포 내로 공동-형질감염되는 제 3 벡터에 함유된다.
일부 또는 임의의 실시예에서, 본 명세서에 기재된 렌티바이러스 벡터 입자는 SAMHD1 억제제를 포함한다. 임의의 실시예에서, SAMHD1 억제제는 Vpx 단백질 또는 Vpr 단백질이다. 임의의 실시예에서, 본 명세서에 기재된 렌티바이러스 벡터 입자는 Vpx 단백질 또는 이의 변이체를 포함한다 (예를 들어, WO2013/149167 참조). 일부 또는 임의의 실시예에서, 상기 변이체는 SAMHD1을 억제하는 능력을 보유한다.
신드비스 바이러스 외피 단백질은 4 개의 E2 단백질 2 개 및 E1 단백질 2 개인, N-연결된 글리칸을 함유한다. 만노시다제 I 억제제가 없는 포유류 세포에서 생산된 바이러스의 2 개의 N-글리칸은 높은-만노스 구조 (하나의 E2 N-연결된 글리칸 및 하나의 E1 N-연결된 글리칸)를 가지는 반면, 나머지 2 개는 복잡한 구조를 가진다. 2 개의 복잡한 구조인 N-글리칸은 외피 단백질의 표면에 노출되어 있는 반면, 2 개의 높은-만노스 구조인 N-글리칸은 외피 단백질의 삼량체 중심에 묻혀있다. 복잡한 N-연결된 글리칸을 가진 신드비스 바이러스 입자는 덜 복잡하고, 고도로 만노실화된 당단백질을 가진 입자처럼 효율적으로 DC-SIGN에 결합하지 않는다.
임의의 구체예에서, 바이러스 입자는 키푸넨신(kifunensine) (예를 들어, WO2013/149167 참조)와 같은 만노시다제 I 억제제의 존재 중 포유류 세포에서 생산된다. 따라서, 일부 또는 임의의 구체예에서, 바이러스 패키징 세포는 만노시다제 I 억제제의 존재 중 배양된다. 일부 또는 임의의 구체예에서, 만노시다제 I 억제제는 키푸넨신이다. 일부 구체예에서, 키푸넨신은 본 배지에서 약 0.01 ㎍/ml 내지 약 1 mg/ml, 약 0.1 ㎍/ml 내지 약 10 ㎍/ml, 약 0.1 ㎍/ml 내지 약 9 ㎍/ml, 약 0.1 ㎍/ml 내지 약 8 ㎍/ml, 약 0.1 ㎍/ml 내지 약 7 ㎍/ml, 약 0.1 ㎍/ml 내지 약 6 ㎍/ml, 약 0.1 ㎍/ml 내지 약 5 ㎍/ml, 약 0.1 ㎍/ml 내지 약 4 ㎍/ml, 약 0.1 ㎍/ml 내지 약 3 ㎍/ml, 약 0.1 ㎍/ml 내지 약 2 ㎍/ml, 약 0.1 ㎍/ml 내지 약 1 ㎍/ml, 약 0.25 ㎍/ml 내지 약 10 ㎍/ml, 약 0.25 ㎍/ml 내지 약 9 ㎍/ml, 약 0.25 ㎍/ml 내지 약 8 ㎍/ml, 약 0.25 ㎍/ml 내지 약 7 ㎍/ml, 약 0.25 ㎍/ml 내지 약 6 ㎍/ml, 약 0.25 ㎍/ml 내지 약 5 ㎍/ml, 약 0.25 ㎍/ml 내지 약 4 ㎍/ml, 약 0.25 ㎍/ml 내지 약 3 ㎍/ml, 약 0.25 ㎍/ml 내지 약 2 ㎍/ml, or 약 0.25 ㎍/ml 내지 약 1 ㎍/ml의 농도이다.
일부 또는 임의의 구체예에서, 슈도타입화된 렌티바이러스 벡터 입자는 신드비스 바이러스 E2 당단백질 및 Vpx 단백질을 포함하고 상기 렌티바이러스 입자는 만노시다제 I 억제제의 존재하에서 생성된다. 일부 구체예에서, 만노시다제 억제제는 데옥시만노지리마이신 (DMNJ)이다. 바람직한 구체예에서, 만노시다제 억제제는 키푸넨신이다. 일부 구체예에서, DMNJ는 본 배지에서 약 1.0 ㎍/ml 내지 약 1.0 mg/ml, 약 1.0 ㎍/ml 내지 약 900 ㎍/ml, 약 1.0 ㎍/ml 내지 약 800 ㎍/ml, 약 1.0 ㎍/ml 내지 약 700 ㎍/ml, 약 1.0 ㎍/ml 내지 약 600 ㎍/ml, 약 1.0 ㎍/ml 내지 약 500 ㎍/ml, 약 1.0 ㎍/ml 내지 약 400 ㎍/ml, 약 1.0 ㎍/ml 내지 약 300 ㎍/ml, 약 1.0 ㎍/ml 내지 약 200 ㎍/ml, 약 1.0 ㎍/ml 내지 약 100 ㎍/ml, 약 50 ㎍/ml 내지 약 500 ㎍/ml, 약 50 ㎍/ml 내지 약 400 ㎍/ml, 약 50 ㎍/ml 내지 약 300 ㎍/ml, 약 50 ㎍/ml 내지 약 200 ㎍/ml, 약 50 ㎍/ml 내지 약 100 ㎍/ml, 약 100 ㎍/ml 내지 약 500 ㎍/ml, 약 100 ㎍/ml 내지 약 400 ㎍/ml, 약 100 ㎍/ml 내지 약 300 ㎍/ml, 약 100 ㎍/ml 내지 약 200 ㎍/ml, 약 200 ㎍/ml 내지 약 500 ㎍/ml, or 약 200 ㎍/ml 내지 약 400 ㎍/ml의 농도이다.
일부 또는 임의의 구체예에서, 만노시다제 I 억제제 (예, 키푸넨신)의 존재 중 생산된 슈도타입화된 렌티바이러스 벡터 입자는 적어도 60%의 N-연결된 글리칸이 만노스5(Man5), Man6, Man7, Man8, 및/또는 Man9 구조를 포함하는 외피 당단백질 (예를 들어, 신드비스 바이러스 E2)을 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 약 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 N-연결 글리칸은 Man5, Man6, Man7, Man8 , 및/또는 Man9+ 구조를 포함한다.
일 시나리오에서, 하나 이상의 벡터는 본 명세서에 기재된 바와 같은 E2와 같은 신드비스 바이러스 외피 당단백질로 슈도타입화된 렌티바이러스 벡터 입자를 준비하기 위한 패키징 세포주에 폴리뉴클레오티드 서열을 도입하는데 사용된다. 일부 구체예에서, 상기 렌티바이러스 벡터 입자는 고도로 만노실화된다. 일부 구체예에서, 상기 렌티바이러스 벡터 입자는 또한 Vpx 단백질 또는 이의 변이체를 포함한다. 그러나 다른 구체예에서, 렌티바이러스 벡터 입자는 고도로 만노실화되고 Vpx 단백질 또는 이의 변이체를 포함한다. 상기 벡터는 신드비스 바이러스 외피, 대상 서열(들) (전형적으로 항원을 코딩함), 및 패키징 세포에 의해 제공되지 않는 바이러스의 생산에 필요한 임의의 성분을 포함하는 바이러스의 다양한 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다.
바이러스 외피 단백질의 글리코실화 프로파일은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 글리코시다제 (예를 들어, EndoH 또는 PNGaseF)로 처리되거나 처리되지 않고 방치된 바이러스 당단백질에 대한 겔 이동 분석을 비교할 수 있다. 다른 방법은 바이러스 당단백질로부터 글리칸을 절단하고 HPLC 및 질량 분광법을 통해 성분을 분리 및 동정하는 것을 포함한다.
바이러스의 생산은 본 명세서에 기재된 바와 같이 측정되고 부피당 IU로 발현된다. IU는 감염성 단위 또는 대안적으로 형질도입 단위 (transduction units: TU)이고; IU 및 TU는 바이러스 벡터 입자 준비의 역가를 정량적으로 측정할 때 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 게놈이 용이하게 측정 가능한 산물을 발현할 수 있는 바이러스가 생성된다. 형광 단백질, 녹색 형광 단백질이 바람직하다. 렌티바이러스 벡터는 전형적으로 비-통합성이다. 그 후, 상기 바이러스는 표적 세포에 투여되고, GFP를 발현하는 표적 세포의 수가 유동 세포 계측법에 의해 결정된다. 그 후, 역가가 계산된다. 역가는 바람직하게는 가능한 높지만, 세포 상등액(임의의 농축 전)의 적어도 1 x 105 IU / mL, 적어도 3 x 105 IU / mL, 적어도 1 x 106 IU / mL, 적어도 3 x 106 IU / mL, 또는 적어도 1 x 107 IU / mL 이다. 대안적으로, VSV-G 포락선을 갖는 동일한 세포에서 슈도타입화된 동일한 렌티바이러스 벡터의 역가는 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%이다.
D. 바이러스 전달
바이러스는 IL-12 및 임의의 다른 관심 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전달이 요구되는 표적 수지상 세포 (DCs)에 바이러스가 접촉하는 것이 가능하게 하는 임의의 방식으로 표적 세포에 전달될 수 있다. 때때로, 바이러스의 적합한 양이 인간 또는 다른 동물에게 직접적으로 (생체 내), 예를 들어, 체내로의 주입를 통해, 도입될 것이다. 적절한 동물로는, 말, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 토끼, 닭 또는 기타 새가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에 개시된 바이러스 입자 및 다른 치료제는 정맥내, 피부-내, 피하(subcutaneous), 결절내, 복막강-내 또는 점막과 같은 다수의 경로로 주입될 수 있다. 상기 바이러스는 미국 특허 제 7,241,275, 7,115,108, 7,108,679, 7,083,599, 7,083,592, 7,047,070, 6,971,999, 6,808,506, 6,780,171, 6,776,776, 6,689,118, 6,670,349, 6,569,143, 6,494,865, 5,997,501, 5,848,991, 5,328,483, 5,279,552, 4,886,499 호에 개시된 장치와 같은 피내(subdermal) 주입 장치를 사용하여 전달될 수 있다. 일 특정 구체예에서, 상기 바이러스는 종양내로 전달된다. 표적 세포를 포함하는 기관 내로 직접과 같이 다른 주입 위치도 적합하다. 예를 들어, 림프절, 비장 및 골수에 바이러스를 전달하기 위해 림프절-내 주사, 비장-내 주사 또는 골수-내 주사가 각각 사용될 수 있다. 표적 세포의 특정 상황 및 특성에 따라, 예를 들어 눈, 입 또는 피부 안의 상피 조직과의 직접적인 접촉, 또는 흡입과 같은 것을 포함하는 다른 수단을 통해 도입하는 것이 수행될 수 있다.
본원의 다른 곳에서 언급된 바와 같이, 특정 구체예에서, 다수의 대상 서열이 표적 세포에서의 발현을 위해 고려된다. 상기 대상 서열은 동일한 벡터로부터 발현되거나 별개의 벡터에 제공될 수 있다. 이에 대하여, 다중 벡터의 투여가 고려된다. 임의의 실시예에서, 각 벡터는 동일한 경로에 의해 투여된다. 다른 실시예에서, 각 벡터는 상이한 경로에 의해 및 상이한 시간에서 투여될 수 있다. 일 실시예구체예에서, 각 벡터는 동일한 경로에 의해 투여되지만 상이한 용량 및 상이한 시간에 투여된다. 추가의 실시예에서, 각 벡터는 동일한 경로 및 동시에, 동일 또는 상이한 부위에서, 및 동일한 용량 또는 상이한 투여량으로 투여된다. 다른 실시예에서, 각 벡터는 동일한 경로 및 동시에 투여되지만, 각 벡터는 상이한 용량으로 투여된다.
일 예로, IL-12를 발현하는 벡터는 관심 항원을 발현하는 별도의 벡터와 동시에 종양내로 투여될 수 있다. 추가적인 예에서, IL-12를 발현하는 벡터는 하나 이상의 관심 항원 및 선택적으로 하나 이상의 추가 대상 서열을 발현하는 별도의 벡터와 동시에 종양내로 투여될 수 있다. 추가의 구체예에서, IL-12 및 하나 이상의 관심 항원을 발현하는 벡터는 종양내로 투여된다. 추가의 구체예에서, IL-12를 발현하는 벡터를 종양내로 투여하고, 하나 이상의 관심 항원을 발현하는 별도의 벡터를 상이한 종양에서, 종양내로, 또는 상이한 부위에서 및 상이한 경로(예를 들어, 피하로, 피내로 또는 근육내로)를 통해 별도의 부위에서 동시에 투여할 수 있다. 다른 구체예에서, IL-12를 발현하는 벡터는 종양내로 투여될 수 있고, 하나 이상의 관심 항원을 발현하는 별도의 벡터는 IL-12를 발현하는 벡터의 전 또는 후에 동일한 부위 또는 상이한 부위에서 투여될 수 있다. 이에 대하여, 상기 두 벡터는 상이한 부위 및 상이한 용량을 사용하여 투여될 수 있다. IL-12를 발현하는 벡터 및 하나 이상의 항원을 발현 및/또는 다른 대상 서열을 포함하는 별도의 벡터가 동시에 투여되는 경우, 별도의 벡터를 포함하는 조성물을 단일 투여 용량으로 혼합하는 것이 유리할 수 있다.
대안적으로, 표적 세포를 제공하고 배양 플레이트와 같이 시험관 내에서 바이러스와 접촉시킨다. 표적 세포는 전형적으로 건강한 개체 또는 치료를 필요로 하는 개체 또는 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 것이 바람직한 개체로부터 수득된 수지상 세포를 포함하는 세포 집단이다. 개체로부터 세포를 수득하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 정맥절개, 외과적 절제, 및 생검을 포함한다. 인간 DC는 CD34α+ 인간 조혈 전구 세포를 수득하고 다른 곳에서 기재된 시험관 내 배양 방법을 사용하여 생성될 수 있다 (예를 들어, Banchereau et al. Cell 106, 271-274 (2001)).
바이러스는 배지에 현탁되고 배양 플레이트, 튜브 또는 다른 용기의 웰에 첨가될 수 있다. 바이러스를 함유하는 배지는 세포의 도말(plated) 전에 또는 세포를 도말한 후에 첨가될 수 있다. 세포는 전형적으로 생존력을 제공하고 숙주 세포의 형질도입이 일어나도록 배지에서 적합한 농도의 바이러스를 허용하는 적절한 양의 배지에서 배양된다. 상기 세포는 바람직하게는 바이러스가 세포를 감염시키는데 충분한 시간 동안 바이러스와 함께 배양된다. 바람직하게는 상기 세포는 적어도 1 시간, 적어도 5 시간 또는 적어도 10 시간 동안 바이러스와 함께 배양된다.
생체 내 및 시험관 내 전달 둘 다에서, 상기 바람직한 표적 세포를 감염시키기에 충분한 수를 함유하는 바이러스 입자의 부분 표본이 사용될 수 있다. 상기 표적 세포가 배양될 때, 바이러스 입자의 농도는 일반적으로 적어도 1 IU/㎕, 보다 바람직하게는 적어도 10 IU/㎕, 더욱 바람직하게는 적어도 300 IU/㎕, 더욱 더 바람직하게는 적어도 1X104 IU/㎕, 더욱 더 바람직하게는 적어도 1X105 IU/㎕, 더욱 더 바람직하게는 적어도 1X106 IU/㎕ 더욱 더 바람직하게는 적어도 1X107 IU/㎕이다.
시험관 내에서 바이러스에 감염된 후, 표적 세포는 인간 또는 다른 동물에게 도입 (또는 재-도입)될 수 있다. 상기 세포는 진피, 진피 아래, 또는 말초 혈류로 도입될 수 있다. 동물에게 도입된 세포는 바람직하게는 부정적인 면역 반응을 막기 위해 그 동물로부터 유래된 세포이다. 유사한 면역 배경을 갖는 공여자로부터 유래된 세포가 또한 사용될 수 있다. 또한 사용될 수 있는 다른 세포는 면역학적으로 부정적인 반응을 막기 위해 고안된 세포를 포함한다.
표적 세포는 예를 들어, 대상 서열 또는 유전자(들)의 통합, 전사 및/또는 발현, 통합된 유전자의 복제 수, 및 통합의 위치를 분석할 수 있다. 그러한 분석은 언제든지 수행될 수 있고 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다.
바이러스 또는 바이러스-감염된 수지상 세포가 투여되는 개체는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 감염된 세포의 위치, 바이러스-전달된 폴리뉴클레오티드 또는 관심 유전자의 발현, 면역 반응의 자극에 대하여 분석될 수 있고, 질병 또는 장애와 관련된 증상에 대해 모니터링될 수 있다.
상기 개시된 세포를 감염시키는 방법은 세포의 개별-특이적 특성에 의존하지 않는다. 결과적으로, 다양한 동물 종으로 용이하게 확장될 수 있다. 일부 예에서, 바이러스 입자는 인간 또는 인간의 수지상 세포에 전달되고, 다른 경우에는 마우스, 말, 개, 고양이, 또는 기타 조류, 마우스와 같은 동물에 전달된다. 본 명세서에서 논의된 바와 같이, 바이러스 벡터 게놈은 넓은 숙주 범위 뿐만 아니라 표적 세포 특이성을 부여받기 위해 슈도타입화된다. 당업자는 또한 특정 동물 종에서의 대상 서열의 바람직한 발현을 달성하기 위해 적절한 내부 프로모터 및 다른 요소를 알아낼 것이다. 따라서, 당업자는 임의의 종으로부터 수지상 세포를 감염시키는 방법을 변형시킬 수 있을 것이다.
E. 치료 및 예방 행정
표적 세포는 질병 또는 장애의 치료 또는 예방을 위해 본 명세서에 기재된 바와 같은 렌티바이러스 벡터 입자로 감염될 수 있다. 특히, 환자 중 IL-12에 의해 영향을 받는 면역 반응이 유도되는 자에게 유익할 수 있다. 특정 실시예에서, 수지상 세포는, 특히 환자 중 면역 반응의 활성화가 유익한 자를 위하여, 질병 또는 장애의 예방 또는 치료를 위한 본 명세서에 기재된 렌티바이러스 벡터 입자로 감염될 수 있다. 많은 그러한 질병이 잘 알려져 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 의한 치료 또는 예방이 가능한 질병 또는 장애는, 바이러스성, 박테리아성, 진균성, 및 기생충성 감염을 포함하는 감염질병, 암, 자가 면역 질병을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일 방법에서, 질병은 수지상 세포에 대상 서열을 전달하기 위해 본 명세서에 기재된 바이러스 입자로서, 상기 대상 서열의 발현은 IL-12 및 선택적으로 질병-특이적 항원을 생성하고, 세포 면역 반응 및 체액 면역 반응을 자극하게 되는 것에 의해 치료된다. 임의의 구체예에서, IL-12는 면역 반응이 요구되는 하나 이상의 항원을 코딩하는 대상 서열과 함께 발현되지만, 수지상 세포에서 정상적으로 발현되지 않는다. 항원(들)은 수지상 세포에 의해 발현되고 제시된다. 상기 바이러스 벡터 게놈은 추가적인 면역자극 분자 또는 체크포인트 억제제와 같은 다른 면역조절 분자를 더 코딩할 수 있다.
전형적인 사용으로, 바이러스 입자는 IL-12, 및 특정 실시예에서, 동일한 벡터 또는 별도의 벡터에 의해 발현되는 하나 이상의 항원과 병용하는 IL-12를 코딩하는 표적 세포 서열에 전달한다. 상기 전달은 시험관 내에서 수지상 세포를 바이러스와 접촉시킴으로써 달성될 수 있으며, 이 때 감염된 수지상 세포가 환자에게 제공된다. 다른 경우에는, 전달은 생체 내에서 수지상 세포를 감염시키기 위해 바이러스를 개체에게 전달함으로써 달성될 수 있다. 그런 다음 상기 수지상 세포는 IL-12를 생산하여 IL-12에 의해 유도된 다른 생물학적 활성 중에서 CD8 T 세포의 유도, B 세포 및 CD4 T 세포의 증가, TH1 반응의 유도를 포함하는 IL-12에 대한 세포 반응을 유발한다. 임의의 실시예에서, IL-12를 발현하는 DC 표적화 렌티바이러스 벡터는 종양내로 투여되고, 이에 의해 다른 생물학적 활성 중, Th1 반응의 유도를 유발하고 치료적 항-종양 활성을 제공한다. 임의의 실시예에서, 하나 이상의 항원을 발현하는 벡터와 함께 IL-12를 발현하는 DC 표적화 렌티바이러스 벡터의 종양내 투여는 환자에게 항원이 발현된 세포 및 체액 면역 반응을 유도하기 위해 T 세포 또는 B 세포를 자극한다. 그러한 방법으로, 질병 또는 장애를 겪는 환자는 바람직한 특이성을 갖는 면역 세포가 생성됨에 의하여 치료된다.
임의의 구체예에서, IL-12를 발현하는 벡터는 종양내로 투여될 수 있다. 본 명세서에 개시된 내용은 예상외로 낮은 수준의 IL-12를 발현하는 렌티바이러스 벡터의 종양내 주사가 시험된 다수의 모델에서 치료적으로 효과가 있다는 것을 나타낸다. 특히, 상기 실험은 본 명세서에 기재된 바와 같이 낮은 수준의 IL-12를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 표적으로 하는 DC의 단일 종양내 주사 조차도 치료적으로 효과가 있다는 것을 나타내었다. 당업계의 다른 연구에서는 전기천공법으로의 IL-12의 다중 주사가 요구되고 보다 높은 수준의 IL-12가 요구된다. 예를 들어, 한 연구에서 전기천공법을 이용한 IL-12 플라스미드의 종양내 주사는 1, 5 및 8 일에 3 회의 주사로, 그리고 가능하면 7 주에 2 번째 치료 과정으로 수행된다 (예를 들어, 임상 시험 NCT01440816 참조). 다른 연구에서, 피험자는 28-일 주기로 1 일과 8 일째, 2 일의 치료일로 구성된 6 회의 치료 주기로 받을 수 있다. 이러한 연구에서, 환자는 pIL-12의 종양내 주입을 받고 즉시 종양 부위 주변의 전기 방전에 의해 플라스미드 DNA를 종양 세포로 전기천공시켰다 (예를 들어, NCT01579318 참조).
본 발명은 예상외로 본 명세서에 기재된 렌티바이러스 벡터의 주입으로 인하여 종양에서 국소적으로 매우 낮은 수준의 IL-12 발현이 치료적으로 효과가 있다는 것을 나타낸다. 이에 대하여, IL-12 발현 수준은 최적 배양 조건 하에서 시험관 내 연구에 기초하여, 처음 48 시간 동안 약 0.5 마이크로그람/1E10 벡터 게놈 미만으로 생성되었다. IL-12 수준은 실시예 1 및 실시예 6에서 기재된 바와 같은 시험관 내 형질도입 분석을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 적절한 표적 세포의 1E6 (렌티바이러스 벡터 입자가 변형된 신드비스 E2 당단백질과 슈도타입화된 293-DC-SIGN 세포와 같음)를 1일째에 적절한 배양 배지 2 mL 중 6 웰 플레이트에 도말한다. 1 일째에, 상기 세포는 8.5E9 벡터 게놈으로 형질도입된다. 형질도입은 일반적으로 600 ㎕의 배지에서 수행한 다음, 6 시간 후에 0.9 mL의 배지를 첨가하였다. 3 일째 (형질 도입 후 48 시간), 상등액을 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과하고 표준 ELISA (예를 들어, R&D 키트 M1270과 같은 상업적으로 이용가능한 키트를 사용)를 사용하여 IL-12를 측정한다.
따라서, 본 발명의 일 특정 구체예에서, 본 명세서에 기재된 IL-12를 발현하는 바이러스 벡터는 종양내 투여되고, 임의의 구체예에서는 암의 치료를 위해 단일 주사로 종양내 투여된다. 임의의 구체예에서, IL-12를 발현하는 본 명세서에 기재된 렌티바이러스 벡터의 종양내 주사는 낮은 수준의 IL-12를 생산한다. 임의의 구체예에서, 본 명세서에 기재된 IL-12를 발현하는 상기 렌티바이러스 벡터의 단일 종양내 주사가 사용되고, 낮은-수준의 IL-12를 생산한다. 본 명세서에 기재된 상기 렌티바이러스 벡터의, 특정 구체예에서 단일 주사, 종양내 주사에 의해 생산된 IL-12의 수준은 일반적으로 처음 48 시간 동안 생산된 약 0.05 마이크로그람에서 처음 48 시간 동안 생성된 약 5 마이크로그람까지의 범위이며, 상기 기재된 시험관 내 분석에 의해 측정된다. 임의의 구체예에서, 본 명세서에 기재된 상기 렌티바이러스 벡터의 단일 종양내 주사에 의해 생산된 IL-12의 수준은 처음 48 시간 동안 생성된 약 0.1 마이크로그람에서 처음 48 시간 동안 생산된 약 1 마이크로그람의 범위이다. 임의의 구체예에서, 상기 기재된 시험관 내 분석에 의해 측정된 처음 48시간 동안 렌티바이러스 벡터의 단일 종양내 주사에 의해 생산된 IL-12의 수준은 약 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9 또는 약 5.0 ㎍이다. 본 명세서에 기재된 렌티바이러스 벡터의 특정 용량에 의해 생산된 IL-12의 양은 최적 배양 조건 하에서 시험관 내 연구를 이용하여 측정될 수 있다.
특정 구체예에서, 단일 종양내 주사에 사용되는 IL-12를 발현하는 DC 표적화 렌티바이러스 벡터는 통합 벡터이다. 다른 구체예에서, 단일 종양내 주사에 사용되는 IL-12를 발현하는 DC 표적화 렌티바이러스 벡터는 비-통합 벡터이다.
일 구체예에서, IL-12를 발현하는 DC 표적화 렌티바이러스 벡터는 시클로포스파미드와 같은 조절 T 세포 감소제, 항-CTLA4 또는 조절 T 세포 마커에 특이적으로 결합하는 항체 (예를 들어, 항-CD25 항체; 다클리주맙을 포함)와 함께 종양내로 투여된다. 이에 대하여, 상기 조절 T 세포 결핍 제제는 본 명세서에 기재된 바와 같은 LV-IL12의 종양내 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 임의의 실시*구체예에서, IL-12를 발현하는 DC 표적화 렌티바이러스 벡터는 시클로포스파미드, 항-CTLA4 또는 조절 T 세포 결핍 항체 또는 제제와 같은 조절 T 세포를 감소시키는 제제의 전신 투여와 동시에 종양내 투여된다. 임의의 구체예에서, 낮은 용량의 시클로포스파미드는 메트로놈 처방을 이용하여 투여된다. 임의의 구체예에서, 시클로포스파미드는 경구 투여된다.
인간의 조절 T 세포를 감소시키기 위한 다양한 방법이 존재하거나 평가되고 있으며, 본 명세서에 기재된 LV/IL12 벡터 및 방법은 이러한 방법 중 임의의 방법과 함께 사용될 수 있다. 당업자라면 알 수 있는 바와 같이, 그러한 하나의 방법은 CD44+CD137+ 조절 T 세포의 감소이다 (예를 들어, Immunotherapy. 2012 May; 4(5): 483-485 참조).
다른 구체예에서, IL-12를 발현하는 본원의 바이러스 벡터는 관심 항원을 발현하는 제 2 벡터와 동시에 투여된다. 추가적인 예에서, IL-12를 발현하는 벡터는 하나 이상의 관심 항원 및 선택적으로 하나 이상의 추가 대상 서열을 발현하는 별도의 벡터와 동시에 종양내로 투여될 수 있다. 추가의 구체예에서, IL-12 및 하나 이상의 관심 항원을 발현하는 벡터는 종양내로 투여된다. 추가의 구체예에서, IL-12를 발현하는 벡터를 종양내로 투여하고, 하나 이상의 관심 항원을 발현하는 별도의 벡터를 상이한 종양에서, 종양내로, 또는 상이한 부위에서 및 상이한 경로(예를 들어, 피하로, 피내로 또는 근육내로)를 통해 별도의 부위에서 동시에 투여한다. 다른 구체예에서, IL-12를 발현하는 벡터는 종양내로 투여될 수 있고, 하나 이상의 관심 항원을 발현하는 별도의 벡터는 IL-12를 발현하는 벡터의 전 또는 후에 동일한 부위 또는 상이한 부위에서 투여될 수 있다. 이에 대하여, 상기 두 벡터는 상이한 부위 및 상이한 용량을 사용하여 투여될 수 있다. IL-12를 발현하는 벡터 및 하나 이상의 항원을 발현 및/또는 다른 대상 서열을 포함하는 별도의 벡터가 동시에 투여되는 경우, 별도의 벡터를 포함하는 조성물을 단일 투여 용량으로 혼합하는 것이 유리할 수 있다.
바이러스 감염 후, 대상 서열 (예를 들어, IL-12를 코딩하고 선택적으로 하나 이상의 항원을 코딩함)이 표적 수지상 세포에 의해 발현된다. 예를 들어, 시험관 밖인 경우, 주사에 의해, 표적 수지상 세포를 환자에게 다시 이동시키고 상기 바람직한 항원에 대한 면역 반응을 생성할 수 있는 면역 세포와 상호 작용시킨다. 바람직한 구체예에서, 재조합 바이러스는 환자에게 주사되어, 표적 수지상 세포를 제자리에서(in situ) 형질도입시킨다. 상기 수지상 세포는 IL-12 및 선택적으로 치료될 질병 또는 장애와 관련된 특정 항원을 발현하며, 환자는 질병 또는 장애에 대한 효과적인 면역 반응을 나타낼 수 있다.
상기 바이러스 벡터 게놈은 하나 이상의 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있으며, 표적 수지상 세포의 형질도입시 세포에 전달된 다수의 항원에 대한 면역 반응을 생성한다. 일부 구체예에서, 항원은 단일 질병 또는 장애와 관련이 있다. 다른 구체예에서, 항원은 다수의 질병 또는 장애와 관련이 있다.
일부 바이러스에서, DC의 성숙을 활성화 및/또는 자극하는 DC 성숙 인자는 대상 서열과 함께 전달된다. 대안적으로, 상기 DC는 바이러스 전달 이전, 동시, 또는 이후에 DC 성숙 인자의 전달에 의해 활성화된다. DC 성숙 인자는 바이러스 투여와 별도로 제공될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 하나 이상의 면역조절 분자 및/또는 DC 성숙 인자는 바이러스 게놈에 함유되고 바이러스가 수지상 세포를 감염시킨 후에 발현되는 하나 이상의 서열에 의해 코딩될 수 있다. 면역조절 분자를 코딩하는 서열은 또한 패키징 세포주에서 IL-12 및 선택적으로 하나 이상의 항원을 코딩하는 바이러스 벡터와 함께 공동-형질감염된 별도의 벡터로 제공될 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법은 환자에서 차용 면역 요법(adoptive immunotherapy)을 위해 사용될 수 있다. IL-12를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 특정 구체예에서 바람직한 항원을 수득하고 재조합 바이러스에 패키징한다. 표적 수지상 세포를 환자로부터 수득하고 IL-12 및 선택적으로 바람직한 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 바이러스로 형질도입한다. 그런 다음, 수지상 세포를 다시 환자에게 이동시킨다.
바이러스 입자는 생체 내에서 주사되어 DC를 감염시키고 IL-12 및 선택적으로 항원 또는 다른 면역자극 분자를 코딩하는 서열을 전달할 수 있다. 바이러스 입자의 양은 적어도 3X106 IU 이고, 적어도 1X107 IU, 적어도 3X107IU, 적어도 1X108 IU, 적어도 3X108 IU, 적어도 1X109 -- IU, 또는 적어도 3X109 IU일 수 있다. 선택된 간격으로 수여자의 림프 기관의 DC는 예를 들어, GFP 또는 루시퍼라제와 같은 마커 발현을 관찰하여 발현을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 핵산 모니터링 기술 및 역전사 효소 (RT) 활성의 측정은 또한 바이러스 입자의 생체분포를 분석하는데 사용될 수 있다. 말초 혈액 단핵 세포, 림프절, 비장, 또는 렌티바이러스 벡터 입자-처리된 수여자의 악성 또는 표적 병원체-감염 조직으로부터의 T 세포는 항원 자극에 대한 반응의 규모 및 지속성(durability)으로부터 측정될 수있다. 상피 세포 및 림프 세포와 같은 DC 이외의 조직 세포는 생체 내 유전자 전달의 특이성을 위해 분석될 수 있다.
백신에는 종종 보조제가 포함된다. 임의의 실시예에서, IL-12를 발현하는 렌티바이러스 벡터는 다른 백신과 함께 보조제로서 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 렌티바이러스 벡터 입자는 또한 보조제와 함께 투여될 수 있다. 상기 보조제는 재조합 바이러스 입자와 함께, 재조합 바이러스 입자 전에 또는 재조합 바이러스 입자 후에 투여될 수 있다. 바이러스 입자와 함께 투여되는 경우, 바람직한 보조제는 외피 당단백질을 함유하는 바이러스 막을 파괴하는 것과 같이, 바이러스 입자의 완전한 상태를 현저하게 파괴하지 않는다.
유도된 면역 반응을 더 증가시키기 위해 다양한 보조제를 바이러스와 병용하여 사용할 수 있다. 임의의 예시적인 보조제는 명반(alum), 3 데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A (MPL)를 포함한다 (GB 2220211 참조). QS21은 남아메리카에서 발견되는 퀼라야 사포나리아 몰리나 나무의 껍질로 부터 분리된 사포닌 또는 트리테르펜 글리코시드(triterpene glycoside)이다 (Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell and Newman, Plenum Press, NY, 1995); 미국 특허 제 5,057,540 호 참조). 다른 보조제는 선택적으로, 모노포스포릴지질 A (Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997) 참조)와 같은 면역 자극제와 병용하는 수중유 에멀젼 (스쿠알렌 또는 땅콩 오일과 같음)이다. 다른 보조제는 CpG이다 (Bioworld Today, Nov. 15, 1998). 대안적으로, Aβ를 보조제와 커플링할 수 있다. 예를 들어, Aβ의 리포펩티드 버전은 B형 간염 항원 백신에 대해 기재된 바와 같이 팔미틴산 또는 다른 지질을 Aβ의 N-말단에 직접 커플링함으로써 준비될 수 있다 (Livingston, J. Immunol. 159, 1383-1392 (1997)). 그러나, 그러한 커플링은 Aβ의 면역 반응의 성질에 영향을 미치면서 Aβ의 형태를 실질적으로 변형시키지 않아야 한다. 보조제는 활성제와 함께 치료적 조성물의 성분으로서 투여될 수 있거나 치료제의 투여 전, 투여 후 또는 동시에 별도로 투여될 수 있다.
보조제의 한 부류는 알루미늄 히드록시드, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 술페이트와 같은 알루미늄 염(명반)이다. 그러한 보조제는 MPL 또는 3-DMP, QS21, 폴리글루타민 산 또는 폴리라이신과 같은 중합체 또는 단량체 아미노산과 같은 다른 특이적 면역자극 제제와 함께 또는 따로 사용될 수있다. 보조제의 다른 부류는 수중유 에멀젼 제형이다. 그러한 보조제는 무라밀 펩티드 (예를 들어, N-아세틸무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP), N-아세틸-노르무라밀-L-알라닐-D- 이소글루타민 (nor-MDP), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타밀-L-알라닌-2-(1'-2'디팔미토일-sn- -글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸라민 (MTP-PE), N-아세틸글루코사미닐-N-아세틸무라밀-L-Al-D-이소글루-L-Ala-디팔미톡시 프로필아미드 (DTP-DPP) 테라미드(theramide).TM.), 또는 다른 박테리아 세포벽 성분과 같은 다른 특이적 면역자극 제제와 함께 또는 따로 사용될 수 있다. 수중유 에멀젼은 (a) 미세유동화기(microfluidizer) 110Y 모델 (Microfluidics, Newton Mass.)과 같은 미세유동화기를 사용하여 서브마이크론 입자로 제형화되는, 5% 스쿠알렌, 0.5% 트윈 80, 및 0.5% 스판 85 (선택적으로 다양한 양의 MTP-PE를 함유)를 함유하는, MF59 (WO 90/14837) (b) 큰 입자 사이즈 에멀젼으로 생성되는 볼텍스드 또는 서브마이크론 에멀젼으로 미세유동화되는, 10% 스쿠알렌, 0.4% 트윈 80, 5% 플루로닉-차단 폴리머 L121, 및 thr-MDP를 함유하는, SAF (c) 2% 스쿠알렌, 0.2% 트윈 80, 및 모노포스포릴리피드A (MPL), 트레할로스 디미콜라테 (TDM), 및 세포벽 구조 (cell wall skeleton: CWS), 바람직하게는 MPL+CWS (Detox™)로 구성되는 군으로부터의 하나 이상의 박테리아 세포벽 성분을 함유하는 리비 보조제 시스템 (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, Mont.)를 포함한다. 바람직한 보조제의 다른 부류는 스티뮬론.TM (QS21, Aquila, Worcester, Mass.)과 같은 사포닌 보조제, 또는 ISCOMs(면역자극 복합체) 및 ISCOMATRIX과 같은 것으로부터 생성된 입자이다. 다른 보조제는 완전 프로인트 보조제 (CFA: Complete Freund's Adjuvant)와 불완전 프로인트 보조제 (IFA: Incomplete Freund's Adjuvant)가 포함된다. 다른 보조제는 인터루킨 (IL-1, IL-2 및 IL-12), 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 종양 괴사 인자 (TNF)와 같은 사이토카인을 포함한다.
본원의 조성물과 함께 사용될 수 있는 다른 보조제는 화학식 (I)에 의해서 확인된다:
Figure pct00001
(I)
여기서 상기 A1 및 A2 부분(moiety)은 히드로겐, 포스페이트 및 포스페이트 염의 군으로부터 독립적으로 선택된다. 소듐 및 포타슘은 포스페이트 염에 대한 예시적인 반대 이온(counterion)이다. 상기 R1, R2, R3, R4, R5, 및 R6 부분은 C3 내지 C23로 대표되는 3 내지 23 개의 탄소를 갖는 히드로카르빌 군으로부터 독립적으로 선택된다. 추가적인 명확성을 위해, 부분이 다수의 구성을 갖는 특이적인 군으로부터 "독립적으로 선택되는"경우, 제 1 부분으로 선택된 구성은 어떠한 방식으로도 제 2 부분으로 선택된 구성원의 선택에 제한을 주거나 영향을 주지 않는다는 것을 알아야 한다. R1, R3, R5 및 R6이 결합 된 탄소 원자는 비대칭이며, 따라서 R 또는 S 입체화학으로 존재할 수 있다. 일 실시예에서, 이들 탄소 원자 모두는 R 입체화학에 존재하고, 다른 실시예에서, 이들 탄소 원자 모두는 S 입체 화학에 존재한다.
"히드로카르빌(Hydrocarbyl)"은 탄소 원자의 배열이 직쇄 또는 분지쇄, 비고리형 또는 고리형일 수 있고, 인접한 탄소 원자 사이의 결합이 전적으로 단일 결합일 수 있는 수소 및 탄소로부터 완전히 형성된 화학적 부분을 말한다. 즉, 임의의 2 개의 인접한 탄소 원자 사이에 존재하는 2 중 또는 3 중 결합이있을 수 있으며, 즉, 불포화된 히드로카르빌을 제공하고, 히드로카르빌기의 탄소 원자의 수는 3 내지 24 개의 탄소 원자이다. 상기 히드로카르빌은 알킬, 여기서 대표적인 직쇄 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실, 및 운데실, 도데실, 트리데실, 테트라데실, 펜타데실, 헥사데실, 헵타데실, 옥타데실을 포함하는 것과 같은 종류의 것을 포함한다.; 반면, 분지쇄 알킬은 이소프로필, 이차-부틸, 이소부틸, 삼차-부틸, 이소펜틸, 및 같은 종류의 것을 포함한다. 대표적인 포화 환형 히드로카르빌은 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 등을 포함하고; 반면 불포화 고리형 히드로카르빌은 시클로펜테닐 및 시클로헥세닐 등을 포함한다. 불포화 히드로카르빌은 인접한 탄소 원자 사이에 적어도 하나의 이중 결합 또는 삼중 결합을 포함한다 (히드로카르빌이 비-고리형인 경우 각각 "알케닐"또는 "알키닐", 히드로카르빌이 적어도 부분적으로 고리형인 경우 시클로알케닐 및 시클로알키닐이라고 각각 지칭 됨). 대표적인 직쇄 및 분지쇄 알케닐은 에틸레닐, 프로필레닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 이소부틸레닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-메틸-1-부테닐, 2-메틸-2-부테닐, 2-메틸-2-부테닐, 2,3-디메틸-2-부테닐, 등을 포함하고; 반면 대표적인 직쇄 및 분지쇄 알키닐은 아세틸레닐, 프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐, 3-메틸-1-부티닐 등을 포함한다.
식 (I)의 보조제는 당업계에 공지된 합성 방법, 예를 들어, PCT 국제 공개 번호 WO 2009/035528에 개시된 합성 방법뿐만 아니라 WO 2009/035528에서 확인된 출판물에 의해 수득될 수 있다. 임의의 상기 보조제는 또한 상업적으로 수득할 수 있다. 바람직한 보조제는 Avanti Polar Lipids, Alabaster AL의 카탈로그에서 확인된 제품 번호 699800이며, 하기 E10과 병용하여 E1이 참조된다.
본 발명의 다양한 실시예에서, 보조제는 식 (I)의 화학 구조를 가지나, A1, A2, R1, R2, R3, R4, R5 및 R6 부분은 이들 부분에 대해 이전에 제공된 옵션의 부분 집합으로부터 선택되며, 여기서 이들 부분 집합은 하기 E1, E2, 등으로 확인된다.
E1: A1 은 포스페이트 또는 포스페이트 염이고 A2는 히드로겐이다.
E2: R1, R3, R5 및 R6 은 C3-C21 알킬이고; R2 및 R4은 C5-C23 히드로카르빌이다.
E3: R1, R3, R5 및 R6 은 C5-C17 알킬이고; R2 및 R4은 C7-C19 히드로카르빌이다.
E4: R1, R3, R5 및 R6 은 C7-C15 알킬이고; 및 R2 및 R4은 C9-C17 히드로카르빌이다.
E5: R1, R3, R5 및 R6 은 C9-C13 알킬이고; R2 및 R4은 C11-C15 히드로카르빌이다.
E6: R1, R3, R5 및 R6 은 C9-C15 알킬이고; R2 및 R4은 C11-C17 히드로카르빌이다.
E7: R1, R3, R5 및 R6 은 C7-C13 알킬이고; R2 및 R4은 C9-C15 히드로카르빌이다.
E8: R1, R3, R5 및 R6 은 C11-C20 알킬이고; R2 및 R4은 C12-C20 히드로카르빌이다.
E9: R1, R3, R5 및 R6 은 C11 알킬이고; R2 및 R4은 C13 히드로카르빌이다.
E10: R1, R3, R5 및 R6 은 운데실이고 R2 및 R4은 트리데실이다.
임의의 선택에서, E2 내지 E10은 각 구체예 E1과 결합되고, 및/또는 E2 내지 E9의 히드로카르빌 군은 알킬 군, 바람직하게는 직쇄 알킬 군이다.
식 (I)의 보조제는 약학적 조성물로, 선택적으로 공동-보조제와 함께 제형화될 수 있으며, 이는 하기에 각 논의된다. 이에 대한 인용은 GLA 보조제에 대한 수성 제형 (AF) 및 안정한 에멀젼 제형 (SE)과 같은 제형을 제공하는 미국 특허 공개 번호 제 2008/0131466 호에 있고, 이들 제형은 식 (I)의 임의의 보조제로 활용될 수 있다.
보조제는 단일 조성물로서 본 발명의 바이러스와 투여될 수 있거나, 또는 본 발명의 재조합 바이러스의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 임의의 실시예에서, 면역원은 보조제와 포함된다. 면역원 및 보조제는 동일한 바이알에 패키징되어 공급되거나 별도의 바이알에 패키징되여 사용 전에 혼합될 수 있다. 면역원 및 보조제는 전형적으로 치료적 적용을 대상으로 나타내는 라벨과 패키된다. 면역원 및 보조제가 별도로 패키징되는 경우, 상기 패키징은 전형적으로 사용 전에 혼합하기 위한 지침을 포함한다. 보조제 및/또는 담체의 선택은 보조제를 함유하는 백신의 안정성, 투여 경로, 투여 계획, 백신이 접종되는 종에 대한 보조제의 효능에 달려 있으며, 인간에 약학적으로 허용가능한 보조제는 관련 규제 기관에 의해 인간에 대한 투여가 승인되거나 승인가능한 것이다. 예를 들어, 완전 프로인트 보조제는 인간에의 투여에 적합하지 않다. 명반, MPL 및 QS21이 바람직하다. 선택적으로, MPL과 명반, QS21과 명반, QS21과 MPL, 및 명반, QS21 및 MPL을 함께와 같은 둘 이상의 상이한 보조제가 동시에 사용될 수 있다. 또한, 선택적으로 불완전 프로인트 보조제는 명반, QS21, 및 MPL 및 이들의 모든 조합 중 임의의 것과 병용하여 사용될 수 있다(Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)).
본 명세서에 기재된 레트로바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 또한 하나 이상의 다른 치료제의 투여와 동시에, 전에, 또는 후에 투여될 수 있다.
그러한 병용 요법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터 및 하나 이상의 추가 활성제를 함유하는 단일 약학적 투여 제형의 투여뿐만 아니라 본 발명의 바이러스 벡터 및 각 활성제가 자체의 분리된 약학적 투여 제형을 포함하는 조성물의 투여를 포함할 수 있다 예를 들어, 바이러스 벡터 및 다른 활성제를 포함하는 조성물은 정제 또는 캡슐과 같은 단일 장내 (예를 들어, 경구) 투여 조성물로 함께 환자에게 투여될 수 있거나, 또는 각 제제는 별도의 장내 (예를 들어, 경구) 투여 제형으로 투여될 수 있다. 유사하게, 바이러스 벡터 및 다른 활성제를 포함하는 조성물은 생리 식염수 또는 다른 생리 학적으로 허용되는 용액과 같은 단일 비경구 (예를 들어, 피하, 피내, 결절내, 종양내 또는 근육내와 같은 본 명세서에 공지되고 기재된 임의의 비경구 경로)투여 조성물로 함께 환자에게 투여될 수 있거나 각 약제는 별도의 비경구 투여 제형으로 투여될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 병용 요법은 동일한 경로로 투여될 수 있거나 상이한 경로를 사용하여 투여될 수 있다. 별도의 투여 제형이 사용되는 경우, 바이러스 벡터 및 하나 이상의 추가의 활성제를 포함하는 조성물은 본질적으로 동시에, 즉, 동시에 또는 개별적으로 시차를 두고, 즉, 순차적으로 및 임의의 순서로 투여될 수 있다. 병용 요법은 모든 이러한 요법을 포함하는 것으로 여겨진다.
따라서, 임의의 실시예에서, 하나 이상의 다른 치료제 (예를 들어, 다른 항암제, 또는 기타 완화제 또는 보조 요법)과 병용하여 상기 개시된 바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 투여도 고려된다. 임의의 실시예에서, 그러한 상기 치료제는 본 명세서에 기재된 바와 같은 특정 암에 대한 표준 치료로 당업계에 받아들여질 수 있다. 고려되는 예시적인 치료제는 사이토카인, 성장 인자, 스테로이드, NSAID, DMARD, 항-염증제, 면역 체크포인트 억제제, 화학치료제, 방사선치료제 또는 다른 활성 및 부수적인 제제가 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 하나 이상의 화학치료제를 포함하는, 하나 이상의 암 치료제와 병용하여 투여된다. 암 치료제의 예는 티오테파(thiotepa) 및 시클로포스파미드 (CYTOXANTM)와 같은 알킬화제; 부술판, 임프로술판 및 피포술판과 같은 알킬 술포네이트; 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파와 같은 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스파오라미드 및 트리메틸올로메라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로리드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 무스타르드와 같은 니트로겐 무스타르드; 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴과 같은 니트로수레아; 아클라키노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 플레오마이신, 카크티노마이신, 칼리체아미신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 클로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥쏘-L-노르레우신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르켈로마이신, 미토마이신, 미코페놀 산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투버르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신과 같은 항생제; 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU)과 같은 항-대사물질; 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트와 같은 엽산 유사체; 프루다라빈, 6-머르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘, 5-FU와 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론, 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤과 같은 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄과 같은 항-아드레날; 프롤린 산과 같은 엽산 보충제(replenisher); 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레풀린 산; 암사크린; 페스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티니움 아세테이트; 에토글루시드; 갈리움 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린 산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK®; 라족산; 시조피란; 스피로게르마니움; 테누아존 산; 트리아지쿠온; 2, 2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 (“Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀 (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) 및 독세탁셀 (TAXOTERE®, Rhne-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로르암부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 메르카토푸린; 메토트렉세이트; 시스플라틴 및 카르보플라틴과 같은 백금 유사체; 빈플라스틴; 트라스트주맙, 도세탁셀, 플라티늄; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노바트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소메라제 저해제 RFS 2000; 디플루오로메틸로미틴(DMFO); 타르그레틴™ (Targretin™) (벡사로텐), 판레틴™ (Panretin™) (알리트레티노인)과 같은 레티노산 유도체; 온탁™ (ONTAK™) (데닐레우킨 디프티톡스); 에스페라미신; 카페시타빈; 및 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 상기 중의 파생물을 포함한다. 또한 이러한 정의에 포함되는 것으로 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 저해제 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜 (파레스톤)과 같은 항-에스트로겐; 및 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 레우프롤리드, 및 고세렐린과 같은 항-안드로겐; 및 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 상기 중의 파생물과 같은 종양에 호르몬 활성을 조절하거나 저해하는 항-호르몬 제제가 있다. 추가로 암 치료제는 소라페닙, 및 아프타닙, 악시티닙, 베바시주맙, 세툭시맙, 크리조티닙, 다사티닙, 에를로티닙, 포스타마티닙, 게피티닙, 이마티닙, 라파티닙, 렌바티닙, 무브리티닙, 닐로티닙, 파니투무맙, 파조파닙, 페가타닙, 라니비주맙, 룩솔리티닙, 트라스트주맙, 반데타닙, 베무라페닙, 및 수니티닙과 같은 다른 단백질인산화효소; 시롤리무스(라파마이신), 에베롤리무스 및 다른 mTOR 저해제를 포함한다.
다른 구체예에서, 본원의 바이러스 벡터 조성물은 다른 면역 자극제와 병용하여 투여된다. 그러한 면역 자극제는 N-아세틸뮤라밀-L-알라닌-D-이소글루타민 (MDP), 글루칸, IL-12, GM-CSF, 인터페론-γ 및 항-CD40 항체 또는 결합하는 다른 항체를 포함하지만 이에 한정되지 않고 공동-자극 경로 (예를 들어, CD28, ICOS, OX40, CD27 등)를 활성화시킨다.
일 구체예에서, 본원의 바이러스 벡터 조성물은 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제와 병용하여 투여된다. 면역 체크포인트는 면역 반응의 지속 및 진폭을 조절하고 자가-내성을 유지하는데 중요한 면역 시스템의 다양한 억제 경로를 나타낸다. 종양은 임의의 면역-체크포인트 경로를 특히 종양 항원에 특이적인 T 세포에 대한 면역 저항의 주요 메커니즘으로 사용한다 (예를 들어, Pardoll, 2012 Nature 12:252; Chen and Mellman 2013 Immunity 39:1, 참조). 본원의 개시는 항원이 없는 GLA 조성물과 병용하여 투여될 수있는 면역 체크포인트 억제제를 제공한다. 그러한 병용 요법은 항암 면역 반응을 향상시키기 위해 협력한다. 임의의 바이러스는 면역 체크포인트 경로를 끌어들이기 위한 메커니즘을 개발해왔다. 그러므로, 임의의 구체예에서, 그러한 병용 요법은 항-바이러스 성 면역 반응을 향상시키는데 사용될 수 있다.
면역 체크포인트 억제제는 통계적으로 유의한 방식으로 면역계의 억제 경로를 차단하거나 억제하는 모든 제제를 포함한다. 그러한 억제제는 면역 체크포인트 수용체를 차단하거나 억제하는데 결합하거나, 면역 체크포인트 수용체 리간드를 차단하거나 억제하는데 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 실례인 면역 체크포인트 분자는 CTLA-4, 4-1BB (CD137), 4-1BBL (CD137L), PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, TIM3, B7H3, B7H4, VISTA, KIR, 2B4 (CD2 패밀리 분자에 속하며 모든 NK, γδ, 및 기억 CD8+ (αβT 세포에서 발현됨), CD160 (BY55로도 기재됨) 및 CGEN-15049를 차단 또는 억제하기 위해 표적화되나, 이에 한정되지는 않는다. 면역 체크포인트 억제제는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, TIM3, B7H3, B7H4, VISTA, KIR, 2B4, CD160 및 CGEN-15049의 하나 이상의 활성을 차단하거나 억제하는데 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 다른 결합 단백질을 포함한다. 실례인 면역 체크포인트 억제제는 임의의 하기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다: 트레멜리무맙 (CTLA-4 차단 항체), 항-OX40, PD-L1 단일클론 항체 (항-B7-H1; MEDI4736), MK-3475 (PD1 차단제), 니볼루맙 (항-PD1 항체), CT-011 (항-PD1 항체), BY55 단일클론 항체, AMP224 (항-PDL1 항체), BMS-936559 (항-PDL1 항체), MPLDL3280A (항-PDL1 항체), MSB0010718C (항-PDL1 항체) 및 예르보이/이필리무맙 (항-CTLA-4 체크포인트 억제제).
추가의 구체예에서, 본원의 바이러스 벡터 조성물은 다른 TLR4 작용제, 또는 TLR8 작용제 또는 TLR9 작용제와 병용하여 투여된다. 그러한 작용제는 펩티도글리칸, 폴리I:C, CpG, 3M003, 플라젤린, 및 진핵생물의 리보솜 신장 및 개시 인자 4a (LeIF)의 라슈마니아 동족체로부터 선택될 수 있다.
추가적인 구체예에서, 본원의 바이러스 벡터 조성물은 사이토카인과 병용하여 투여된다. "사이토 카인"은 세포간 매개체로서 다른 세포에서 작용하는 일 세포 집단에 의해 방출된 단백질에 대한 일반적인 용어이다. 그러한 사이토카인의 예는 림포카인, 모노카인 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이 있다. 사이토카인 중에는 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬과 같은 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴랙신(relaxin); 프로릴랙신; 여포 자극 호르몬 (FSH: follicle stimulating hormone), 갑상선 자극 호르몬 (TSH: thyroid stimulating hormone) 및 황체 형성 호르몬 (LH: luteinizing hormone)과 같은 당단백질 호르몬; 간 성장 인자; 섬유아세포(fibroblast) 성장 인자; 프로락틴; 태반성 락토겐; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 뮐러(mullerian)-억제 물질; 마우스 성선자극호르몬(gonadotropin)-관련 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); NGF-베타와 같은 신경 성장 인자; 혈소판-성장 인자; TGF-알파 및 TGF-베타와 같은 형질전환 성장 인자 (TGFs); 인슐린-유사 성장 인자-I 및 II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도(osteoinductive) 인자; 인터페론-알파, 베타 및 감마와 같은 인터페론; 대식세포-CSF (M-CSF)와 같은 콜로니 자극 인자 (CSFs); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 과립구-CSF (G-CSF); IL-1, IL-1알파 IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-27, TNF를 포함하나, 이에 한정되지 않는 IL-1 내지 IL-36과 같은 인터류킨(ILs); 및 LIF 및 키트 리간드 (KL)를 포함하는 다른 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 사이토 카인은 자연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 자연 서열 사이토카인의 생물학적 활성 등가물을 포함한다.
임의의 구체예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 엔도솜 산성화를 방지하고 종양 세포에 의해 유도된 자가소화작용(autophagy)을 억제하여 세포 성장 및 영양 결핍의 촉진을 견디는 리소조모트로픽 제제인 클로로퀸과 병용하여 투여될 수 있다. 보다 일반적으로는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 자외선 억제제, 방사선증강제(radiosensitizers), 또는 클로로퀸, 미소니다졸, 메트로니다졸과 같은 화학증강제(chemosensitizers), 및 티라파자민과 같은 저산소 세포 독소(hypoxic cytotoxin)로서 작용하는 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 이에 대하여, 바이러스 벡터와 클로로퀸 또는 기타 방사선 또는 화학 증강제 또는 자가소화작용 억제제와의 상기 병용은 다른 암 치료제 또는 방사선 요법과의 더 병용하여 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 시클로포스파미드, 독소루비신, 옥살리플라틴 및 미톡산트론과 같은 "면역원성 세포 사멸 (immunogenic cell death)"이라고 명명된 면역 반응의 수반되는 활성화로 종양 세포를 죽이는 것으로 알려진 작은 분자 약물과 병용하여 투여될 수 있다. 게다가 파투필론 (에포틸론 B), 표피-성장 인자 수용체 (EGFR), 표적 단일클론 항체 7A7.27, 히스톤 디아세틸라제 억제제 (예를 들어, 보리노스타트, 로미뎁신, 파노비노스타트, 벨리노스타트, 및 엔티노스타트), n3-다중불포화 지방산 도코사헥사엔산, 또한 프로테아좀 억제제(예를 들어, 보르테조밉), 쉬코닌 (리토스페르뭄 에리트로르히존의 뿌리의 주요 성분) 및 TVec (탈리모젠 라헤르파렙벡)과 같은 온콜리틱 바이러스와 같은 종양 세포의 면역원성을 향상시키기 위한 공지된 약물과 병용하여 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 국소 또는 전신적으로 투여될 수 있는 DNA 메틸전이효소 (예를 들어, 데시타빈, 5-아자-2'-데옥시시티딘)와 같은 후성유전학적(epigenetic) 요법과 병용하여 투여될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 DC에 의한 종양의 ADCC 흡수를 증가시키는 하나 이상의 항체와 병용하여 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 항원 제시 세포에 의한 종양 세포 또는 그의 단편의 섭취하고 이어서 면역 시스템에 종양 항원을 제시하는 것을 유도하거나 향상시키는 임의의 분자와 바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 병용하는 것을 고려한다. 이러한 분자는 수용체 결합 (Fc 또는 만노스 수용체와 같음)을 유도하고 항체, 항체-유사 분자, 다중-특이적 다가 분자 및 중합체와 같은 항원 제시 세포로 수송하는 제제를 포함한다. 그러한 분자는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물로 종양내 투여되거나 상이한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 리툭시맙, 세툭시맙, 트라스투주맙, 캠파스, 파나투무맙, 오파투무맙, 브렌툭시맙, 페르투주맙, 아도-트르스투주맙, 엠탄신, 오비누투주맙, 항-HER1, -HER2, -HER3 항체 (예를 들어, MEHD7945A; MM-111; MM-151; MM-121; AMG888), 항-EGFR 항체 (예를 들어, 니모투주맙, ABT-806) 또는 다른 유사 항체의 종양내 주사와 병용하여 종양내로 투여될 수 있다. 내재화를 유도할 수 있는 Fc 수용체 및 다른 수용체와 맞물릴 수 있는 임의의 다가 스캐폴드(scaffold)-예를 들어, 수용체와 맞물릴 수 있는 Fc 단편 또는 중합체에 연결된 표적에 결합 할 수 있는 펩티드 및/또는 단백질은 본 명세서에 기재된 병용 요법에서 사용될 수 있다.
임의의 구체예에서, 바이러스 벡터와 그러한 항체의 병용은 항-CTLA-4와 같은 공동-자극 신호(예를 들어, 억제 경로를 차단함으로써)를 촉진시키거나 항-CD40, 항-CD28, 항-ICOS, 항-OX40, 항-CD27 항체, 등과 같은 공동-자극 경로를 활성화시키는 항체와 더 병용할 수 있다.
바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 단독으로 또는 방사선 요법, 면역 체크포인트 억제제, 화학요법 또는 다른 암 치료제, 이식, 면역요법, 호르몬 요법, 광에너지 요법, 등과 같은 다른 공지된 암 치료법과 병용 투여될 수 있다. 상기 조성물은 항생제와 병용 투여될 수 있다.
본원은 선택적으로 항원을 발현하는 다른 렌티바이러스 벡터와 병용하여, 또는 다른 치료제와 병용하여, IL12를 발현하는 DC 표적화 렌티바이러스 벡터를 투여함으로써 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특이적 암의 예는 폐암, 결장암, 유방암, 고환암, 위암, 췌장암, 난소암, 간암, 방광암, 직장암 및 전립선 암을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가적인 암은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 백혈병, 림프종, 자궁경부암, 신경교종 종양, 선암, 육종, 연조직 육종 및 피부암을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 암은 방광 종양, 유방 종양, 전립선 종양, 기저 세포 암종, 담도암, 방광암, 골암, 뇌 및 CNS 암 (예를 들어 신경교종 종양), 자궁경부암, 융모암종, 결장암 및 직장암, 결합 조직암, 소화기 계통의 암; 자궁내막암, 식도암; 안구암; 두경부암; 위암; 상피내종양; 신장암; 후두암; 백혈병; 간암; 폐암 (예를 들어, 소세포 및 비-소세포); 호지킨 림프종 및 비-호지킨 림프종을 비롯한 림프종; 흑색종; 골수종, 신경모세포종, 구강암 (예를 들어, 입술, 혀, 구강 및 인두); 난소암; 췌장암, 망막아세포종; 횡문근육종; 직장암, 신장암, 호흡기 계통의 암; 육종, 피부암; 위암, 고환암, 갑상선암; 자궁암, 비뇨기 계통의 암뿐만 아니라 다른 암종 및 육종을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 암은 또한 당업계에 공지된 포유류에서 신종양형성(neoplasia) 및 악성 장애를 포함한다. 일 실시예에서, 본원은 IL12를 발현하는 DC 표적화 렌티바이러스 벡터의 종양내 주사에 의해 암을 치료하는 방법을 제공하고, 일부 실시예에서는 단일 종양내 주사를 사용한다. 주사가능한 종양을 갖는 임의의 암은 본 명세서에서 IL12 발현하는 DC 표적화 렌티바이러스 벡터의 종양내 주입이 고려된다.
F. 약학적 조성물 및 키트
또한 본 명세서에서 고려되는 바이러스 및 하나 이상의 성분을 함유하는 약학적 조성물 및 키트가 고려된다. 약학적 조성물은 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터 입자 및 약학적 담체를 포함할 수 있다. 키트는 본 명세서에서 제공되는 약학적 조성물 및/또는 조합물, 및 사용 설명서와 같은 하나 이상의 요소, 화합물을 개체에 투여하기 위한 장치를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 바이러스 입자 및 적합한 약제적 담체를 함유하는 약학적 조성물이 본 명세서에 제공된다. 본 명세서에서 제공되는 약학적 조성물은 다양한 형태, 예를 들어, 고체, 액체, 분말, 수성, 또는 동결건조된 형태일 수 있다. 적합한 약학적 담체의 예는 당업계에 공지되어 있다. 그러한 담체 및/또는 첨가제는 통상적인 방법으로 제제화 될 수 있으며, 적합한 용량으로 대상에게 투여될 수 있다. 지질, 뉴클레아제 억제제, 중합체 및 킬레이트화제와 같은 안정화 제제는 신체 내의 분해로부터 조성물을 보존할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 상기 바이러스 벡터 입자는 키트로서 패키징될 수 있다. 키트는 사용 설명서, 장치, 및 추가 시약과 같은 요소 및 튜브, 용기, 및 주사기와 같은 방법의 수행을 위한 요소를 하나 이상 선택적으로 포함할 수 있다. 예시적인 키트는 본 명세서에서 제공된 바이러스를 포함할 수 있고, 사용 설명서, 개체에서 바이러스를 검출하기 위한 장치, 개체에 바이러스를 투여하기 위한 장치 및 개체에 화합물을 투여하기 위한 장치를 선택적으로 포함할 수 있다.
관심 유전자 (전형적으로 항원)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키트도 본 명세서에서 고려된다. 키트는 바이러스 패키징 성분을 코딩하는 적어도 하나의 플라스미드 및 신드비스 바이러스 E2 당단백질 변이체를 코딩하는 벡터를 포함할 수 있다. 일부 키트는 바이러스 패키징 성분을 코딩하는 적어도 하나의 플라스미드, 신드비스 바이러스 E2 당단백질 변이체를 코딩하는 벡터 및 적어도 하나의 DC 성숙 인자를 코딩하는 벡터를 포함할 것이다.
대상 서열 (일반적으로 항원)을 코딩하는 바이러스 벡터 및 선택적으로 DC 성숙 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 키트도 또한 본 명세서에서 고려된다. 일부 키트에서, 키트는 바이러스 패키징 성분을 코딩하는 적어도 하나의 플라스미드와 신드비스 바이러스 E2 당단백질 변이체를 코딩하는 벡터를 포함한다.
키트는 또한 설명서를 함유할 수 있다. 설명서는 전형적으로 바이러스를 서술하는 실재적인 표현및, 선택적으로 키트에서 포함되는 다른 요소, 및 바이러스를 투여하기 위한, 개체의 적절한 상태를 결정하는 방법, 적절한 투여량, 및 적절한 투여 방법을 포함하는 투여 방법을 포함한다. 설명서는 치료 시간의 기간 동안 개체를 모니터링하기 위한 지침도 포함할 수 있다.
본 명세서에서 제공된 키트는 또한 개체에게 바이러스를 투여하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 약물 또는 백신을 투여하기 위해 당업계에 공지된 임의의 다양한 장치가 본 명세서에 제공된 키트에 포함될 수 있다. 예시적인 장치는 피하주사 바늘, 정맥주사 바늘, 카테터, 바늘없는(needle-less) 주사 장치, 흡입기 및 점안기와 같은 액체 디스펜서를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 전형적으로 키트의 바이러스를 투여하는 장치는 키트의 바이러스와 양립할 수 있다. 예를 들어, 고압 주입 장치와 같은 바늘없는 주입 장치가 고압 주입에 의해 손상되지 않은 바이러스와 함께 키트에 포함될 수 있지만, 전형적으로 고압 주입에 의해 손상된 바이러스가 있는 키트에는 포함되지 않는다.
본 명세서에서 제공된 키트는 또한 DC 활성제 또는 자극제와 같은 화합물을 개체에게 투여하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 약물 또는 백신을 투여하기 위해 당업계에 공지된 임의의 다양한 장치가 본 명세서에 제공된 키트에 포함될 수 있다. 예시적인 장치는 피하주사 바늘, 정맥주사 바늘, 카테터, 바늘없는(needle-less) 주사 장치, 흡입기 및 점안기와 같은 액체 디스펜서를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 전형적으로, 키트의 화합물을 투여하기 위한 장치는 화합물의 바람직한 투여 방법과 양립할 수 있다.
다음은 본 명세서에서 고려되는 렌티바이러스 벡터 및 사용 방법의 일부 구체예이다.
구체예 1은 수지상 세포-표적으로 하는 렌티바이러스 벡터 입자(lentiviral vector particle)를 포함하는 조성물로서, 상기 입자는 IL-12를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 게놈을 포함하며, 상기 조성물은 종양내로 투여되어 암의 치료에 사용하기 위한 조성물이다.
구체예 2는 구체예 1에 있어서, 상기 IL-12는 단일 사슬 IL-12 (scIL-12)인 것인 조성물이다.
구체예 3은 구체예 2에 있어서, 상기 scIL-12는 p35-L-p40을 포함하는 것인 조성물이다.
구체예 4는 구체예 2에 있어서, 상기 scIL-12는 p40-L-p35를 포함하는 것인 조성물이다.
구체예 5는 이전 구체예 중 어느 하나에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터 입자는 DC-SIGN을 발현하는 수지상 세포에 선택적으로 결합하는 변형된 알파바이러스 E2 당단백질을 포함하는 것인 조성물이다.
구체예 6은 이전 구체예 중 어느 하나에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터 입자는 160X가 없거나 글루탐산 이외의 아미노산인 서열번호 1의 신드비스 바이러스 (Sindbis virus) E2 당단백질, 또는 서열번호 1과 80% 이상의 동일성을 갖고 160X가 없거나, 글루탐산 이외의 아미노산이고, 수지상 세포를 감염시킬 수 있는 서열번호 1의 변이체를 포함하는 외피를 포함하며, 상기 E2는 신드비스 바이러스 E3과의 융합 단백질의 부분이 아닌 것인 조성물이다.
구체예 7은 이전 구체예 중 어느 하나에 있어서, 상기 치료는 종양내로 보조제 (adjuvant)를 투여하는 것을 더 포함하는 것인 조성물이다.
구체예 8은 이전 구체예 중 어느 하나에 있어서, 상기 보조제는 글루코피라노실 지질 A (GLA)의 수성(aqueous) 또는 수중 (oil in water) 에멀젼 제형인 것인 조성물이다.
구체예 9는 이전 구체예 중 어느 하나에 있어서, 상기 렌티바이러스 입자를 포함하는 상기 조성물은 글루코피라노실 지질 A (GLA)의 수성 제형를 더 포함하는 것인 조성물이다.
구체예 10은 이전 구체예 중 어느 하나에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터 입자는 단일 용량으로 투여되는 것인 조성물이다.
구체예 11은 이전 구체예 중 어느 하나에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터 입자는 시험관 내 형질도입 분석에서 측정된 바, 처음 48 시간 동안 생성된 약 0.1 ㎍ 내지 1㎍/1E10 벡터 게놈의 IL-12 수준을 생산하는 것인 조성물이다.
구체예 12는 이전 구체예 중 어느 하나에 있어서, 상기 치료는 조절 T 세포의 감소 (depletion)를 더 포함하는 것인 조성물이다.
구체예 13은 이전 구체예 중 어느 하나에 있어서, 상기 조절 T 세포 감소는 시클로포스파미드 또는 항-CD25 항체의 전신 투여를 포함하는 것인 조성물이다.
구체예 14는 이전 구체예 중 어느 하나에 있어서, 상기 시클로포스파미드 또는 항-CD25 항체의 전신 투여는 상기 렌티바이러스 벡터를 포함하는 상기 조성물의 종양내 주사 이전인 것인 조성물이다.
구체예 15는 이전 구체예 중 어느 하나에 있어서, 상기 치료는 종양 항원을 코딩하는 제 2 렌티바이러스 벡터 입자를 투여하는 것을 더 포함하는 것인 조성물이다.
구체예 16은 (a) IL-12를 코딩하는 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 게놈을 포함하는 수지상 세포-표적으로 하는 렌티바이러스 벡터 입자를 포함하는 제 1 조성물; 및 (b) 종양 항원을 코딩하는 제 2 렌티바이러스 벡터 입자를 포함하는 제 2 조성물;을 포함하며, 상기 제 1 조성물이 종양내로 투여되고 제 2 조성물이 상이한 경로에 의해 투여되는, 개체에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 산물이다.
구체예 17은 구체예 16에 있어서, 상기 제 2 조성물은 피내, 피하, 또는 근육내 투여되는 것인 산물이다.
구체예 18은 구체예 16 내지 17중 어느 하나에 있어서, 상기 제 1 조성물 및 제 2 조성물은 동시에 투여되는 것인 산물이다.
구체예 19는 구체예 16 내지 18중 어느 하나에 있어서, 상기 제 1 조성물 및 제 2 조성물이 순차적으로 투여되는 것인 산물이다.
구체예 20은 160X가 없거나 글루탐산 이외의 아미노산인 서열번호 1의 신드비스 바이러스 E2 당단백질, 또는 1서열번호 1과 80% 이상의 동일성을 갖고 160X가 없거나, 글루탐산 이외의 아미노산이고, 수지상 세포를 감염시킬 수 있는 서열번호 1의 변이체를 포함하는 외피로서, 상기 E2는 신드비스 바이러스 E3과의 융합 단백질의 부분이 아닌 것인 외피; 및 IL-23을 코딩하는 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 게놈을 포함하는 렌티바이러스 입자이다.
구체예 21은 a.) 160X가 없거나 글루탐산 이외의 아미노산인 서열번호 1의 신드비스 바이러스 E2 당단백질, 또는 서열번호 1과 80% 이상의 동일성을 갖고 160X가 없거나, 글루탐산 이외의 아미노산이고, 수지상 세포를 감염시킬 수 있는 서열번호 1의 변이체를 포함하는 외피로서; 상기 E2는 신드비스 바이러스 E3과의 융합 단백질의 일부가 아닌 것인 외피; 및 b.) IL-12를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 게놈;을 포함하는 렌티바이러스 벡터 입자이다.
구체예 22는 구체예 21에 있어서, 상기 IL-12는 단일 사슬 IL-12 (scIL-12)인 것인 렌티바이러스 벡터 입자이다.
구체예 23은 구체예 21 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 scIL-12는 p35-L-p40을 포함하는 것인 렌티바이러스 벡터 입자이다.
구체예 24는 구체예 21 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 scIL-12는 p40-L-p35를 포함하는 것인 렌티바이러스 벡터 입자이다.
구체예 25는 구체예 21 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터 게놈은 항원을 코딩하는 서열을 더 포함하는 것인 렌티바이러스 벡터 입자이다.
구체예 26은 구체예 21 내지 25중 어느 하나에 있어서, 상기 항원은 종양 관련 항원, 바이러스성 항원, 박테리아성 항원, 또는 진균성 항원인 것인 렌티바이러스 벡터 입자이다.
구체예 27은 구체예 26의 렌티바이러스 벡터 입자로서, 상기 종양 관련 항원은 전립선산 포스파타제, 전립선 특이적 항원, NKX3.1, 전립선 특이적 막 항원, PRAME, BAGE, RAGE, NY-ESO-1, SAGE, HAGE, GAGE, Plu-1, HASH -1, HasH-2, Cripto, Criptin, MART-1/Melan-A, gp100, gp75, mda-7, 티로시나제, 티로시나제-관련 단백질, p53, Ras, c-Myc, A-Raf, B-Raf, 및 C-Raf, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, MART-1, BAGE, DAM-6, -10, GAGE-1, GAGE -2, GAGE -8, GAGE-3, GAGE -4, GAGE -5, GAGE -6, GAGE -7B, NA88-A, MART-1, MC1R, Gp100, PSM, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC2, PRAME, P15, RU1, RU2, SART-1, SART-3, 빌롬 종양 항원, AFP, β-카테닌/m, 카스파제-8/m, CEA, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, Mum-1, Mum-2, Mum-3, 미오신/m, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, 아넥신 II, CDC27/m, TPI/mbcr-abl, BCR-ABL, 인터페론 조절 인자 4 (IRF4), ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RAR, 종양-관련 칼슘 신호 트랜스듀서 1 (TACSTD1) TACSTD2, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR 및 EGFRvIII), 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (PDGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR), 인테그린-연결 키나제 (ILK), STAT3, STAT5, STAT6, HIF-1, HIF-2, 핵 인자-카파 B (NF-κB), Notch1-4, c-Met, 포유류 라파마이신 표적(mTOR), WNT, PMSA, PR-3, MDM2, 메소텔린, 신장 세포 암종-5T4, SM22-알파, 카르본산염 안히드라제 I (CAI) 및 IX (CAIX) (G250로도 알려짐), STEAD, TEL/AML1, GD2, 프로테나제3, hTERT, 육종 전좌 절단점, EphA2, ML-IAP, EpCAM, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, ALK, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, 폴리시알 산, MYCN, RhoC, GD3, 푸코실 GM1, 메소텔리안, PSCA, sLe, PLAC1, GM3, BORIS, Tn, GLoboH, NY-BR-1, RGs5, SART3, STn, PAX5, OY-TES1, 정자 단백질 17, LCK, HMWMAA, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, 레구메인, TIE2, Page4, MAD-CT-1, FAP, MAD-CT-2, 및 포스 관련 단백질 1로 구성된 군으로부터 선택된 것이다.
구체예 28은 임의의 렌티바이러스 벡터 입자를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법이다.
구체예 29는 구체예 28에 있어서, 종양 항원을 코딩하는 제 2 렌티바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 더 포함하는 것인 방법이다.
구체예 30은 구체예 28 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 구체예 21의 상기 렌티바이러스 벡터 입자 및 제 2 렌티바이러스 벡터를 동시에 투여하는 것인 방법이다.
구체예 31은 구체예 28 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 구체예 21의 상기 렌티바이러스 벡터 입자 및 제 2 렌티바이러스 벡터를 상이한 시간에 순차적으로 투여하는 것인 방법이다.
구체예 32는 구체예 29에 있어서, 구체예 21의 상기 렌티바이러스 벡터 입자 및 제 2 렌티바이러스 벡터를 상이한 경로로 투여하는 것인 방법이다.
구체예 33은 구체예 29에 있어서, 구체예 21의 상기 렌티바이러스 벡터 입자 및 제 2 렌티바이러스 벡터를 상이한 부위에 투여하는 것인 방법이다.
구체예 34는 구체예 29에 있어서, 구체예 21의 상기 렌티바이러스 벡터 입자 및 제 2 렌티바이러스 벡터를 동일한 경로로, 상이한 부위에 투여하는 것인 방법이다.
구체예 35는 구체예 28에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터 입자는 종양내로 투여되는 것인 방법이다.
구체예 36은 구체예 29에 있어서, 구체예 21의 상기 렌티바이러스 벡터 입자를 종양내로 투여하고, 상기 제 2 렌티바이러스 벡터를 상이한 부위에서, 상이한 경로로 동시에 투여하는 것인 방법이다.
구체예 37은 구체예 25의 렌티바이러스 벡터 입자를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법이다.
구체예 38은 구체예 28에 있어서, 상기 방법은 종양내로 TLR4 작용제 (agonist)를 투여하는 단계를 더 포함하는 것인 방법이다.
구체예 39는 구체예 38에 있어서, 상기 TLR4 작용제는 글루코피라노지질 A (GLA)의 수성 또는 수중유 에멀젼 제형인 것인 방법이다.
구체예 40은 구체예 35에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터 입자를 포함하는 조성물이 글루코피라노지질 A (GLA)의 수성 제형을 더 포함하는 것인 방법이다.
구체예 41은 상기 방법 중 어느 하나에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터 입자는 단일 용량으로 투여되는 것인 방법이다.
구체예 42는 상기 방법 중 어느 하나에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터 입자는 낮은-수준의 IL-12를 생산하는 것인 방법이다.
구체예 43은 상기 방법 중 어느 하나 에 있어서, 상기 낮은 수준의 IL-12는 시험관 내 형질도입 분석에서 측정된 바, 처음 48시간 동안 생성된 약 0.1 ㎍ 내지 1㎍/1E10 벡터 게놈인 것인 방법이다.
구체예 44는 상기 방법 중 어느 하나에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터 입자는 종양내로 투여되는 것인 방법이다.
구체예 45는 인간 또는 동물 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 구체예 21 내지 구체예 27 중 어느 하나에 따른 렌티바이러스 벡터 입자이다.
구체예 46은 구체예 21에 따른 렌티바이러스 벡터 입자 및 종양 항원을 코딩하는 제 2 렌티바이러스 벡터 입자를 포함하는 조성물이다.
구체예 47은 구체예 25의 렌티바이러스 벡터 입자 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 치료용 또는 예방용 백신이다.
하기의 실시예는 예시의 방법으로써 제공되는 것이지, 제한하려는 것은 아니다.
실시예
실시예 1
IL-12를 발현하는 렌티바이러스 벡터의 조작
마우스의 IL-12 (본 명세서에서 VP02/IL-12로 인용함)를 발현하기 위하여, DC-SIGN (예, 미국 특허 제 8,187,872호 및 제 8,323,662호 참조)을 발현하는 수지상 세포에 렌티바이러스 벡터를 표적으로 하는 변형된 신드비스 E2 외피 당단백질로 슈도타입화된 렌티바이러스 벡터를 조작하였다. IL-12는 p35 및 p40 서브유닛에 연결된 2개의 디설피드로 구성되어 있다. 2개의 다른 구조는 다른 방향이지만 모두 엘라스틴 링커를 통하여 연결된 서브유닛으로 준비하였다: p35-엘라스틴-p40 및 p40-엘라스틴-p35 (p35-L-p40; p40-L-p35). 초기 실험은 p40-L-p35 벡터가 IL-12를 훨씬 더 많이 생성한다는 것을 보여 주었다. 기능성 생물분석에서, 293-DC-SIGN 세포를 VP02/IL-12 후보 물질로 형질도입하고, 배양 상등액을 수득하였다. 마우스의 비장세포(splenocyte)를 상등액과 함께 배양하였다. 1 내지 48 시간의 실험 과정에서, 비장 배양 상등액을 수득하고, 분비된 IFNγ를 분석하였다. 그 결과, VP02/IL-12 후보 물질 모두 기능성 IL-12를 생성하였다. 그러나 p40-L-p35 후보물질은 후속 연구대상으로 선택되었다.
벡터에 의해 생성된 IL-12의 양을 정량화하기 위해 추가 실험을 수행하였다. 실험은 하기와 같다:
* 0 일째: 2.5ml 배지를 갖는 6웰(well)에서 well 당 1e6개의 293T-DCSIGN 세포를 접종하였다.
* 1 일째: 다음 날, VP02-mIL12(p35-p40) 및 VP02-mIL12(p40-p35)를 형질감염시켰다: (Invitrogen의 리포펙타민2000 사용) 양성 형질감염 대조군을 위해 VP02-GFP 플라스미드를 포함하였다.
- 250㎕ OptiMEM 배지에 1.5㎍의 플라스미드를 첨가하였다.
- 4.5㎕ 리포펙타민2000 시약을 첨가, 혼합하고, 실온(RT: Room temperature)에서 30분간 배양하였다.
- 접종된 세포에 직접 추가하였다.
* 1 일째: well 당 10㎕ 농도, 벡터를 형질도입하였다.
- VP02-mIL12(p35-엘라스틴-p40)-non-integrating, ml 당3.1e11 게놈
- VP02-mIL12 (p40-엘라스틴-p35)-non-integrating, ml 당 5.9e11 게놈
- VP02-GFP-non-integratin, ml 당 1.9e11 게놈
* 2 일째: 신선한 10% FBS DMEM으로 배지를 교체하고, 1x PBS로 세척하였다.
* 4 일째: 상층액을 수득하고, .45μM의 필터로 여과한 후, ELISA 전까지 -80℃에서 보관하였다.
모든 상층액에서 IL-12가 검출되었다. 플라스미드 형질감염은 예상대로, 벡터 형질도입보다 훨씬 높은 수준이었다. p40-L-p35 벡터는 역방향보다 많은 IL-12를 생성하였다. 그 결과는 하기 표에 나타내었다.
Figure pct00002
실시예 2
종양 항원을 발현하는 렌티바이러스 벡터와 VP02/IL-12의 병용-투여는 항원-특이적 CD8 T 세포를 향상시켰다.
이 실험은 종양 항원을 발현하는 VP02을 갖는 VP02/IL-12의 공동-전달이 항종양 항원 CD8 T 세포 반응을 향상시킨다는 것을 나타낸다.
VP02 렌티바이러스 벡터로부터 발현된 종양 관련 항원의 발현과 병용하여, VP02/IL-12 렌티바이러스 벡터로부터 생성된 IL-12의 존재가 마우스에서 항원-특이적 CD8 T 세포 반응을 향상시킬 수 있는지를 평가하기 위해 두 가지 실험을 수행하였다
암컷 C57/BL/6 또는 B6D2/F1 마우스를 표 1에 따라 VP02/IL-12 및 VP02/종양 항원(NY-ESO-1 또는 CAIX)으로 말단 꼬리에 피하 주사하였다. CD8 반응성 펩타이드로 생체 외에서 재-자극한 후에 세포내 사이토카인 염색에 의해 면역화한 후, 13일 후에 비장 T 세포 반응을 측정하였다.
Figure pct00003
도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, NY-ESO-1(도 1) 또는 hCAIX(도 2)를 발현하는 VP02와 함께 공동-전달되는 VP02/IL-12는 항원 특이적 CD8 반응을 향상시켰다.
추가 실험은 VP02/IL-12에 의해 제공되는 향상을 평가하기 위해 수행되었다. 도 3에 나타낸 바와같이, LV305(NY-ESO-1를 발현하는 VP02)와 VP02/IL-12의 병용-투여는 비교적 높은 벡터 게놈 용량 (1E10 벡터 게놈)에서 투여될 때 항원 특이적 CD8 T 세포 반응을 향상시켰다. 그러나 높은 벡터 게놈(v.g.) 용량에서도 IL-12의 발현은 대체로 꽤 낮았다(예를 들어, 최적 배양 조건 하에서 인 비트로 연구에 기초하여, 처음 48 시간 동안 생성된 것이 0.5 마이크로그람 미만이었다.)는 것에 주목하여야 한다. 특히, 이 실험에서 1E9vg에서 생성된 항-YN-ESO-1 항원-특이적 면역 반응은 본질적으로 검출 불가능하고, 기본적으로 검출할 수 없는 면역 반응은 VP02/IL-12의 공동-전달에 의해 예상밖으로 유의하게 향상된 점에 주목해야 한다(도 3b). VP02/IL-12 공동-전달은 또한 CD4 반응을 향상시킨다(도 4a 및 도 4b 참조).
면역원성을 나타내는 최소 용량 (1E9 vg)의 LV305과 함께, 보다 낮은 용량(1E9 vg 투여량)의 VP02/IL-12를 병용-투여하면 CD8 및 CD4 반응이 향상되었다(도 5a-5d 참조).
실시예 3
VP02/IL12의 병용-투여는 높은 용량의 VP02/HCAIX의 치료 활성을 향상시켰다.
이 실시예는 종양 클론을 발현하는 BC.12hCAIX 으로 챌린지된 마우스에서 VP02/IL-12로 VP02/hCAIX의 치료상 이익를 시험하기 위해 수행된 실험을 기재한다.
마우스에 hCAIX를 발현하는 BC.12 종양 세포를 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 치료는 8 일째에 투여되었다. 종양 크기는 2 내지 3일마다 기록하였다. 기본적인 실험 프로토콜은 아래 표 2 및 표 3에 나타내었다.
Figure pct00004
Figure pct00005
도 6에 나타낸 바와 같이, VP02/IL12의 병용-투여는 높은 투여량의 VP02/hCAIX의 치료 활성을 향상 시켰지만, 그 차이는 유의하지 않았다. 유사하게, VP02/IL-12의 병용-투여는 중간-투여량의 VP02/hCAIX의 치료 활성을 향상시켰지만, 그 차이는 유의하지 않았다.
실시예 4
VP02/IL-12의 병용-투여는 낮은 투여량의 VP02/NY-ESO-1 (LV305)의 치료 활성을 향상시켰다.
이 실험은 VP02/IL-12의 병용-투여가 NY02-ESO-1 (LV305)을 발현하는 VP02의 서브 면역원성 용량의 치료 활성을 향상시킨다는 것을 나타낸다.
이 실험에서, 방법은 다음과 같다: 0 일째: BALB/c 마우스의 꼬리 정맥에 정맥주사(i.v.)로, 1.5 x 105 CIN.23 세포를 챌린지한다. 3 일째: VP02/NYESO1 ± VP02/mIL12, 꼬리베이스에 면역화한다. 18 일째: 종양으로부터 림프구를 분리하고, 유동 세포 계측법을 통해 비장을 분석하였다.
도 7a에 나타낸 바와 같이, 저용량 LV305에 의해 매개되는 항종양 효능은 VP02/IL12와의 추가-혼합에 의해 유의하게 향상되었고, 항종양 효능은 NYESO1-특이적 CD8 T 세포의 크기와 관련이 있었다 (도 7b).
실시예 1 내지 4에 대한 요약 및 결론: VP02/IL12는 향상된 항-종양 효능을 포함하는 VP02-기초 면역요법에 대한 CD8 및 CD4 반응을 향상시키는데 사용될 수 있다. CD8 반응에 대한 효과는 전형적으로 3 내지 5 배 LV305의 용량 증가와 동일하며, CD4 반응의 향상에 대한 10 배 이상의 용량과 동일하다. VP02/IL12는 전형적으로 VP02 면역요법 (예를 들어, LV305)이 더 약한 반응 수준을 유도할 때 가장 효과적이다. LV305의 경우, 본 명세서에 기재된 마우스 모델에서, 그러한 반응은 전형적으로 1E9-1E10 vg 용량 범위에서 유도된다. VP02/IL12는 저용량으로 사용될 때 효과가 더 적다. 특히, 때때로 IL-12의 1E10 vg 보다 낮은 용량만으로도 CD8 반응에 대한 면역-증강 효과가 나타났다. VP02/IL12는 VPO2/Ag와 동등한 또는 그 이상의 용량으로 사용될 때 전형적으로 효과적이며, 이는 면역 반응이 요구되는 종양 항원과 동일한 벡터로부터 효과적으로 발현될 수 있음을 암시한다.
실시예 5
다른 사이토카인을 발현하는 VP02의 투여
VP02로부터 발현된 일련의 7 개의 상이한 사이토카인을 종양-특이적 항원 특이적 면역 반응을 향상시키는 능력에 대해 시험하였다.
시험된 사이토카인은 VP02/IL-15, VP02/IL-18, VP02/IL-21, VP02/IL-23, VP02/IL-1β, VP02/IL-TNF, VP02/IL-IFNγ이었다. BALB/c 마우스를 일정한 용량의 VP02/IL-X (hi)와 함께 LV305 (hi, med, lo)의 3 가지 투여 수준에서 3 주 간격으로 2 회 면역화시켰다. 14 일째, T-세포 반응은 말초 혈액 포스트-프라임 (중간 용량만)에서 측정되었다. 주사 후 33 일째, ICS 및 유동세포계측법으로 분석하기 위해 림프구를 비장으로부터 분리하였다.
시험된 사이토카인 중에서, VP02/IL-23은 PBMC에서 LV305 -유도 된 CD8 T 세포 반응을 프라임 후에 유의하게 증강시킬 수 있었다 (도 8 참조).
실시예 6
IL-12를 발현하는 렌티바이러스 벡터의 단일 종양-내 투여는 시험된 6 종의 마우스 종양 모델 중 6 종에서 유의한 항-종양 효능을 야기하였다.
이 실시예는 IL-12를 발현하는 렌티바이러스 벡터의 종양-내 주사가 시험된 6 종의 마우스 종양 모델 중 6 종에서 유의하게 효과적이었음을 나타낸다.
종양-내 LV/IL-12 투여는 하기에 요약된 방법을 사용하여 6 종의 상이한 마우스 종양 모델에서 시험하였다.
방법
0 일째 : 마우스에 종양 세포를 접종한다. 7 일째 : IL-12 (LV703 - 통합형, 704 - 통합형 버전; 704 - 통합형 결핍 버전, 또한 VP02로 인용됨)를 발현하는 변형된 신드비스 외피로 수도타입화된 LV 또는 변형된 신드비스 외피 대신에 VSVG로 슈도타입화된 LV/IL-12 (통합 결핍)로 마우스를 면역화하였다. 종양이 > 100 mm2 (발바닥) 또는 200 mm2 (옆구리)에 도달하면 마우스를 안락사시켰다.
종양 성장 및 생존을 위해 6 주 이상 동안 마우스를 모니터링하였다.
도 9 내지 도 14에 나타낸 바와 같이, LV/IL-12는 시험된 6 종의 종양 모델로 처리된 동물 모두에서 종양 성장을 감소시키고 생존을 증가시키는데 매우 효과적이었다. 변형된 신드비스 E2 당단백질로 슈도타입화된 통합 렌티바이러스 벡터 인 703/mIL-12 렌티바이러스 벡터는 모든 종양 모델에서 최고의 항종양 효능을 달성하였다. 703 벡터만큼 효과적이지는 않지만 통합 결핍 벡터 (704/mIL-12 (VP02/IL-12로도 인용됨) 및 VSVG/mIL-12)도 종양 성장을 지연시키고 생존을 증가시키는데 효과적이었다.
상기 기재된 종양내 주사 실험에서 사용된 벡터로 형질도입된 293-DC-SIGN 세포로부터 수득된 상등액에서 IL-12 수준을 결정하기 위해 추가적인 실험을 수행하였다. 네비라핀의 존재 또는 부재 하에 형질도입 후 48 시간 동안 IL-12의 생산에 대하여 벡터의 통합 및 비-통합 버전을 시험하였다. 특히, 0 일째에, 1E6 293-DC-SIGN 세포를 2 mL의 완전한 DMEM 중 6 웰 플레이트에 도말하였다. 1 일째에, 상기 세포는 네비라핀의 부재 및 존재하에 8.5E9 벡터 게놈으로 형질도입되었다. 형질도입은 600 ㎕의 완전한 DMEM ± 네비라핀에서 수행되었고, 그 후 0.9 mL 의 완전한 DMEM ± 네비라핀을 6 시간 후에 첨가하였다. 3 일째에 (형질도입 후 48 시간), 상등액을 0.45 ㎛ 필터로 여과하였다. 시판중인 키트 R&D kit M1270을 사용하여 표준 ELISA를 수행하였다. 결과는 하기 표에 나타내었다. 괄호 안의 숫자는 네비라핀 존재 하에서 측정된 IL-12를 나타낸다.
Figure pct00006
비록 비교 연구가 수행되지는 않았지만, 보다 짧은 기간에 더 높은 수준의 IL-12를 발현하는 급성 바이러스 패밀리에 기초한 벡터와 비교할 때 더 긴 시간 동안 퍼진 상대적으로 낮은 발현은 상기 실험에서 보여준 놀라운 효능에 기여할 수 있고, 안전성 프로파일에 유리할 수도 있다. 추가로, 수지상 세포에서 IL12의 발현을 특이적으로 표적으로 하는, IL-12를 생리학적으로 가장 잘 생산하는 세포는 전기천공법이나 다른 암포트로픽 바이러스를 통해 임의의 종양 세포에 무작위로 주사하는 것과는 대조적으로 예상치않게 유효한 항-종양 반응에 기여할 수 있다.
실시예 7
항-CTLA-4 항체 및/또한 GLA-AF와 병용한 IL-12를 발현하는 렌티바이러스 벡터의 단일 종양-내 투여는 시험된 3 종의 마우스 종양 모델 중 3 종에서 유의한 항-종양 효능을 야기하였다.
이 실시예는 항-CTLA-4 항체 및/또한 GLA-AF와 병용한 IL-12를 발현하는 렌티바이러스 벡터의 종양-내 주사가 시험된 3 종의 마우스 종양 모델 중 6 종에서 유의하게 효과적이었음을 나타낸다.
항-CTLA-4 항체 및/또한 GLA-AF와 병용한 종양-내 LV/IL-12 투여는 하기에 요약된 방법을 사용하여 3 종의 상이한 마우스 종양 모델에서 시험하였다.
방법
0 일째 : 마우스에 종양 세포를 접종한다(우측). 7 일째 : 마우스에 종양 세포를 접종한다(좌측). 마우스는 LV703/IL-12 (703 - 통합형 버전; 1.3E10 게놈; 마우스 당 prep에서 5.4 ng rIL12) 또는 LV703/IL-12/RTmut (703 - 통합형 버전; 역전사효소는 그 활성을 제거하기 위하여 돌연변이됨; 9.8E9 게놈; 마우스 당 prep에서 5.4 ng rIL12)로 면역화되었고, 항-CTLA-4 또는 GLA. 항-CTLA-4와 함께 또는 단독으로 연구의 종료까지 매주 한 번 투여되었다. GLA를 투여받은 마우스에서, 제 1 GLA 용량 (7 일째에 주어짐)은 GLA-AF이고, 벡터와 혼합된 후 종양내 투여되었다. GLA의 다음 용량은 연구 종료까지 매주 한 번 투여된 GLA-SE였다. 종양이 > 100 mm2 (발바닥) 또는 200 mm2 (옆구리)에 도달하면 마우스를 안락사시켰다.
종양 성장 및 생존을 위해 6 주 이상 동안 마우스를 모니터링하였다.
도 17 내지 도 19에 나타낸 바와 같이, 703/IL-12는 시험된 3 종의 종양 모델로 처리된 동물 모두에서 종양 성장을 감소시키고 생존을 증가시키는데 매우 효과적이었고, 실시예 6에 나타난 결과를 확인하였다. LV703/IL-12/RTmut으로 처리 된 마우스의 종양 성장은 처리되지-않은 종양-보유 마우스와 유사하기 때문에, 손상되지 않은 역전사 효소를 갖는 벡터 입자의 존재에 의해 치료적 이익이 유도되었다. 시험된 각 종양 모델에서의 추가적인 관찰은 하기와 같이 상세히 설명한다.
B16 발바닥 모델 (도 17)에서, 최초 종양 (우측)에서의 종양-내 LV703/IL-12 투여는 비-처리 말초 부위 (좌측)에서의 종양 성장을 유의하게 지연시켰고, 이는 압스코팔 효과로 알려진 현상이다. 항-CTLA-4 항체의 추가는 최초 종양의 성장을 더 지연 시켰으나, 말초 종양에서는 그렇지 않았다.
B16 옆구리 모델 (도 18)에서, 최초 종양의 종양내 LV703/IL-12 투여는 비-처리 말초 부위에서의 종양 성장을 유의하게 지연 시켰다. 항-CTLA-4 항체의 추가는 최초 종양에서의 성장을 더 지연시키지 못했지만 (아마도 LV703/IL-12 단독으로 거의 모든 종양 성장을 억제하는데 성공했기 때문이다), 말초 종양의 성장을 더 지연시켰다 (도 18b 참조). 이 모델에서, LV703/IL-12의 단일 종양내 주사은 최초 종양의 퇴행 및 치료되지 않은 이차 종양의 성장을 지연시켰다. 퇴행성 종양을 가진 마우스는 면역 기억의 차선적인 생성을 제안하는 두 번째 종양 챌린지를 거부하지 못했다.
위에서 언급한 바와 같이, 4T1 유방 종양 모델 (도 19)에서 최초 종양의 종양-내 LV703/IL-12 투여는 최초 종양 성장을 유의하게 지연시켰다. GLA-SE의 추가적인 종양-내 투여는 최초 종양의 성장을 추가로 지연시켰다 (도 19a). 최초 종양에서의 종양내 LV703/IL-12 + GLA-SE 투여는 또한 치료되지 않은 말초 부위에서 종양 성장을 지연시켰다 (도 19c). LV703/IL-12 + GLA-SE에 대한 항-CTLA-4 항체의 추가는 최초 종양 또는 말초 종양의 성장을 더 지연시키지 않았다 (아마도 4T1은 폐에 퍼지는 종양으로 인한 질식으로 죽어가는 동물로, 공격적이고 급격한 종양 모델이기 때문일 것이고; 도 19b 및 19c 참조). 동물의 생존은 표 4에 기재되어 있다.
Figure pct00007
따라서, 상기 실시예는 면역요법으로부터 이익을 얻는 암 및 다른 질병의 치료를 위해 LV/IL-12 단독으로 또는 체크포인트 저해제 및/또는 TLR4 작용제와 병용하여 사용하는 것을 지지한다.
실시예 8
재조합 단백질 및 GLA/SE와의 병용투여시 VP02/IL-12는 항원 특이적 CD4 T 세포 반응을 유의하게 증가시켰다.
이 실시예의 실험은 합성 지질 A TLR4 작용제 보조제인, 재조합 단백질 + GLA/SE와 함께 VP02/IL-12 병용-투여의 면역원성을 평가하기 위해 수행되었다.
피하주사로 꼬리 기저에서 주사하여, VP02/IL-12 및 재조합 NY-ESO-1 (rNY-ESO-1)과, GLA/SE를 함께 또는 단독으로, 암컷 B6D2/F1 마우스에 면역화시켰다(표 5 참조). CD4 및 CD8 반응성 펩타이드로 생체 외 재-자극 후 ICS에 의한 면역화 7 일 후에 비장 T 세포 반응을 측정하였다.
Figure pct00008
그 결과를 도 15에 나타내었다. 예상대로, GLA-SE를 갖는 재조합 단백질은 TH1 CD4 T 세포 반응을 유도하였다. 도 15a는 사이토카인 양성 CD4 T 세포 백분율을 나타내고, 도 15b는 전체 IFNγ CD4 양성 T 세포 백분율을 나타낸다. 그 결과, VP02/IL-12의 첨가는 rNY-ESO-1 + GLA-SE과 함께 혼합하여 병용-투여하고 피하주사로 꼬리 기저에 주사하였을 때 NY-ESO-1 항원-특이적 CD4 T 세포 반응을 유의하게 증가시켰다.
GLA-SE와 병용하여 재조합 B 형 간염 표면 항원 (rHBsAg)을 사용하는 별도의 실험에서, VP02/IL-12의 첨가는 CD8 T 세포 반응을 유의하게 증가시켰으나 (도 16a 및 16b), CD4 T 세포 반응을 감소시켰다 (도 16c 및 16d).
CD4 반응 수준의 감소 또는 적어도 증가의 감소는 항원을 발현하는 VP02에 대한 반응의 VP02/IL12 향상 효과와 비교하여 두드러진다. 가능한 설명은 항원-발현 VP02가 높은 CD4 반응만을 유도하는 반면, 재조합 단백질 항원을 갖는 GLA는 유의한 CD4 수준을 유도한다는 것이다. 그러므로, IL12의 추가는 CD4 유도에 추가적인 자극을 제공하지 않을 수 있다.
실시예 9
종양내 LV/IL-12로 처리된 마우스의 혈액에서 검출된 IL-12 및 IFNγ
이 실시예의 실험은 LV/IL-12의 종양내 주사 후 IL-12 및 IFNγ의 혈장 수준 및 속도을 평가하기 위해 수행되었다.
마우스 (6 마리 암컷/군)에게 1 x 105 B16 종양 세포를 접종하였다. 종양을 감지할 수 있었을 때 (7 일째), 마우스를 LV703/mIL12, IT로 면역화시켰다. 0(피를 뽑기 전), 1, 3, 6, 8, 12, 15, 17 및 20 일째에 혈액을 채취하여 혈장에 존재하는 IL-12 및 IFNγ의 양을 측정하였다. 종양의 성장은 매주 2 내지 3 회 모니터링되었다. 종양 면적이 200 mm2 (옆구리)를 초과하여 마우스를 안락사시켰다. 도 20에 나타낸 바와 같이, 종양내 LV703/mIL12를 주사한 마우스의 혈액에서 증가된 IL12 및 IFNγ가 검출되었다.
실시예 10
종양내 LV/IL-12로 치료된 마우스의 세포 감소 연구
이 실시예에서 실험은 종양내 LV/IL-12로 처리된 마우스에서 항-종양 효과의 원인이되는 세포를 조사하기 위해 수행되었다.
방법
마우스 (10 내지 20 마리의 암컷/군)에게 1 x 105 B16 종양 세포를 접종하였다. 항체 (200 ㎍)로 특이적 면역 세포 부분 집합이 감소되면 4 일째에 시작하여 매주 두 번 계속된다. 종양이 감지 가능할 때 (7 일째), 마우스를 LV703/mIL12, IT로 면역화시켰다. 종양의 성장은 일주일에 2 내지 3 회 모니터링하였다. 종양 면적이 200 mm2 (옆구리)를 초과하면 마우스를 안락사시켰다.
도 21에서 나타나고 이전 실험에서 확인된 바와 같이, LV703/IL12의 단일 종양내 주사는 종양의 퇴행을 초래하였다. 단일 면역 세포 부분 집합의 감소는 척수강내 LV/IL12에 의해 유발된 항-종양 효능을 배제하지 않은 것이다. 특히 도 21a 및 21b 참조. 추가적으로, CD4 및 NK 세포의 감소는 척수강내 LV/IL-12에 의해 유도된 항-종양 효능을 배제하지 않았다. CD8 T 세포의 감소는 이들 세포가 LV703/IL-12 척수강내 주사된 마우스에서 항-종양 조절을 중재하기 위해 요구되지만, 충분하지는 않다는 것을 나타내었다. (예를 들어, CD8 세포만의 감소는 항-종양 효과를 배제하지 않지만, CD4 세포, NK 세포 또는 둘 다의 감소와 조합할 때, 종양 조절은 배제되는 도 21 참조.).
총 41 종의 마우스 중 상기 실험의 98 일째에, 8 종의 마우스에 종양이 있었다. 33 종의 마우스에는 종양이 없었으며, LV/IL12의 종양내 치료의 예상치 못한 효과를 추가로 확인하였다.
흥미롭게도, 심한 백반증(vitiligo)이 종양내 LV/IL12를 주사한 마우스에서 관찰되었고, CD4 T 세포가 감소되었다 (도 21b 및 21e 참조). 상기 효과는 CD8 T 세포가 존재할 때만 관찰되었으며, 이는 척수강내 LV703/IL-12는 적어도 모낭세포를 표적으로 하는 이펙터(effector) CD8 T 세포의 부분 집합을 생성하여, 모피 색의 색소 탈실(백반증)을 유도했다. 백반증은 흑색종-특이적 항-종양 효능의 강한 유도의 결과로 흔히 관찰되는 자가면역 질병의 발병입니다. 게다가, 백반증은 CD4 T 세포가 감소된 LV703/IL-12 처리된 마우스의 척수강내에서만 관찰되었기 때문에, 조절 T 세포의 감소은 척수강내 LV703/IL-12 치료를 더 향상시킨다.
요약하면, LV/mIL12의 국소 (종양내) 투여는 전신 CD8 T 세포-매개 항-종양 반응 (콜드 종양을 핫 종양으로 전환시킴)을 촉진시킨다. 이론에 얽매이지 않고, 면역 기억의 최적 발달을 위해서는, 조절 T 세포가 감소되는 것이 필요할 수 있다.
실시예 11
종양내 LV/IL-12로 처리된 마우스에서 조절 T 세포의 감소 연구
실험은 조절 T 세포 감소와 종양내 IL-12 투여의 병용의 치료 효능을 조사하기 위해 수행된다.
방법
마우스 (10 내지 20 마리의 암컷/군)에게 1 x 105 B16 종양 세포를 접종하였다. 조절 T 세포 감소를 낮은 용량의 시클로포스파미드, 항-CD25 또는 항-CTLA4 항체 (200 ㎍) 또는 디프테리아 독소(하기 참조)로 4 일째에 시작하여 매주 두 번 계속하였다. 종양이 감지 가능할 때 (7 일째), 마우스를 LV703/mIL12로 종양내로 면역화시켰다. 종양의 성장은 일주일에 2 내지 3 회 모니터링하였다. 종양 면적이 200 mm2 (옆구리)를 초과하면 마우스를 안락사시켰다.
조절 T 세포는 형질전환 마우스 (예를 들어, DEREG 또는 Foxp3.LuciDTR 마우스)를 사용하여 감소된다. 이 마우스는 Foxp3 프로모터의 제어하에 디프테리아 독소 수용체 (DTR) 이식 유전자를 지니고 있어 어느 시점에서나 디프테리아 독소를 투여하여 조절 T 세포를 특이적으로 감소하게 한다 (예를 들어, Li et al., Eur J Immunol 2010, 40:3325-3335 참조).
이론에 구애되지 않고, 조절 T 세포의 감소는 척수강내 LV703/IL-12 치료을 더 향상시킨다. 기억 세포는 조절 T 세포 감소 치료를 받지 않는 군과 비교하여 기억 표현형 세포의 증가를 알아하기 위해 측정될 수 있다. 치료가 재-챌린지 후에 종양 성장을 억제하기에 충분한지를 결정하기 위해 종양이 퇴행된 마우스를 다시 재-챌린지하기 위한 추가 실험을 수행하였다.
서열 목록에 개시된 서열은 또한 WO2011011584에서 제공된다:
Figure pct00009
본원 및 청구 범위에서 사용된, 단수 형태 "일(하나의)", "및(그리고)"및 "상기"는 문맥상 명확하게 다르게 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "항원"에 대한 인용은 다수의 그러한 항원을 포함하고, "세포"또는 "상기 세포"에 대한 인용은 당업자에게 알려진 하나 이상의 세포 및 이의 동등물 (예를 들어, 다수의 세포), 등이 포함된다. 유사하게, "화합물"또는 "조성물"에 대한 인용은 다수의 그러한 화합물 또는 조성물을 포함하며, 문맥에 달리 명시되지 않는 한, 각각 하나 이상의 화합물 또는 조성물을 말한다. 방법의 단계들이 기재되거나 청구 범위에 기재되고, 단계들이 특정 순서로 발생하는 것으로 기재되는 경우, 제 2 단계 "이전"에 (즉, 전에) 발생하는 (또는 수행되는) 제 1 단계의 기재는 다시 쓰면 제 2 단계가 제 1 단계의 "후속"으로 발생하는 (또는 수행되는)것으로 다시 쓰인 것과 동일한 의미를 갖는다. 수치 또는 수치 범위를 말할 때 "약"이라는 용어는 수치 또는 수치 범위가 실험적 변동 내에서의 근사치 (또는 통계적 실험 오차 이내)를 의미하므로, 숫자 또는 수치 범위는 명시된 숫자 또는 숫자 범위의 1% 내지 15% 사이에서 달라질 수 있다. 용어 "포함하는"(및 "포함하다(복수명사뒤)"또는 "포함하다(단수명사뒤)"또는 "가지다"또는 "함유하다"와 같은 관련된 용어)는 다른 임의의 실시예를 배제하는 것이 아니다. 예를 들어, 본 명세서에서 기재된 임의의 물질의 구성, 조성물, 방법 또는 과정, 등의 실시예는 상기 기재된 특징으로 "이루어지다" 또는 "본질적으로 이루어지다"일 수 있다.
상술한 다양한 실시예는 조합되어 추가적인 실시예를 제공할 수 있다. 본 명세서에서 언급 및/또는 출원 데이터 시트(Application Data Sheet)에 열거된 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원, 비-특허 공보 및 번호로 언급된 모든 서열은 본 명세서에 인용으로, 전체적으로, 포함된다. 추가의 실시예를 제공하기 위해 다양한 특허, 출원 및 공보의 개념이 필요하다면 실시예의 양상이 수정될 수 있다.
상술한-상세한 설명에 비추어 본 실시예에 대한 상기 및 다른 변경이 이루어질 수있다. 일반적으로, 다음의 청구 범위에서, 사용된 용어는 청구 범위를 명세서 및 청구 범위에 개시된 특정 실시예로 제한하는 것으로 해석되어서는 안되며, 가능한 모든 실시예 및 그러한 청구 범위의 전체를 동등물의 전체 범위에서 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구 범위는 그 개시에 의해 한정되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Immune Design Corporation <120> COMPOSITIONS COMPRISING LENTIVIRAL VECTORS EXPRESSING IL-12 AND METHODS OF USE THEREOF <130> 31943/50189A/PC <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 423 <212> PRT <213> Sindbis virus <220> <221> misc_feature <222> (160)..(160) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 1 Ser Val Ile Asp Asp Phe Thr Leu Thr Ser Pro Tyr Leu Gly Thr Cys 1 5 10 15 Ser Tyr Cys His His Thr Val Pro Cys Phe Ser Pro Val Lys Ile Glu 20 25 30 Gln Val Trp Asp Glu Ala Asp Asp Asn Thr Ile Arg Ile Gln Thr Ser 35 40 45 Ala Gln Phe Gly Tyr Asp Gln Ser Gly Ala Ala Ser Ala Asn Lys Tyr 50 55 60 Arg Tyr Met Ser Leu Lys Gln Asp His Thr Val Lys Glu Gly Thr Met 65 70 75 80 Asp Asp Ile Lys Ile Ser Thr Ser Gly Pro Cys Arg Arg Leu Ser Tyr 85 90 95 Lys Gly Tyr Phe Leu Leu Ala Lys Cys Pro Pro Gly Asp Ser Val Thr 100 105 110 Val Ser Ile Val Ser Ser Asn Ser Ala Thr Ser Cys Thr Leu Ala Arg 115 120 125 Lys Ile Lys Pro Lys Phe Val Gly Arg Glu Lys Tyr Asp Leu Pro Pro 130 135 140 Val His Gly Lys Lys Ile Pro Cys Thr Val Tyr Asp Arg Leu Lys Xaa 145 150 155 160 Thr Thr Ala Gly Tyr Ile Thr Met His Arg Pro Arg Pro His Ala Tyr 165 170 175 Thr Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Ser Gly Lys Val Tyr Ala Lys Pro Pro 180 185 190 Ser Gly Lys Asn Ile Thr Tyr Glu Cys Lys Cys Gly Asp Tyr Lys Thr 195 200 205 Gly Thr Val Ser Thr Arg Thr Glu Ile Thr Gly Cys Thr Ala Ile Lys 210 215 220 Gln Cys Val Ala Tyr Lys Ser Asp Gln Thr Lys Trp Val Phe Asn Ser 225 230 235 240 Pro Asp Leu Ile Arg His Asp Asp His Thr Ala Gln Gly Lys Leu His 245 250 255 Leu Pro Phe Lys Leu Ile Pro Ser Thr Cys Met Val Pro Val Ala His 260 265 270 Ala Pro Asn Val Ile His Gly Phe Lys His Ile Ser Leu Gln Leu Asp 275 280 285 Thr Asp His Leu Thr Leu Leu Thr Thr Arg Arg Leu Gly Ala Asn Pro 290 295 300 Glu Pro Thr Thr Glu Trp Ile Val Gly Lys Thr Val Arg Asn Phe Thr 305 310 315 320 Val Asp Arg Asp Gly Leu Glu Tyr Ile Trp Gly Asn His Glu Pro Val 325 330 335 Arg Val Tyr Ala Gln Glu Ser Ala Pro Gly Asp Pro His 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tggtaactag agatccctca gaccctttta 660 gtcagtgtgg aaaatctcta gca 683 <210> 22 <211> 416 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 22 cctagaaaaa catggagcaa tcacaagtag caatacagca gctaccaatg ctgattgtgc 60 ctggctagaa gcacaagagg aggaggaggt gggttttcca gtcacacctc aggtaccttt 120 aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg 180 actggaaggg ctaattcact cccaacgaag acaagatctg ctttttgcct gtactgggtc 240 tctctggtta gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct 300 taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga 360 ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagca 416 <210> 23 <211> 401 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 23 cctagaaaaa catggagcaa tcacaagtag caatacagca gctaccaatg ctgattgtgc 60 ctggctagaa gcacaagagg aggaggaggt gggttttcca gtcacacctc aggtaccttt 120 aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac tttttactgg aagggctaat 180 tcactcccaa cgaagacaag atctgctttt tgcctgtact gggtctctct ggttagacca 240 gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag 300 cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag 360 atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc a 401 <210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 24 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25 Ser Pro Ser Tyr Ala Tyr His Gln Phe 1 5 <210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> Sindbis virus <400> 26 Arg Ser Lys Arg Ser 1 5 <210> 27 <211> 4 <212> PRT <213> Sindbis virus <400> 27 Arg Ser Lys Arg 1 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 28 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5

Claims (47)

  1. 수지상 세포-표적으로 하는 렌티바이러스 벡터 입자(lentiviral vector particle)를 포함하는 조성물로서, 상기 입자는 IL-12를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 게놈을 포함하며, 상기 조성물은 종양내로 투여되어 암의 치료에 사용하기 위한 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 IL-12는 단일 사슬 IL-12 (scIL-12)인 것인 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 scIL-12는 p35-L-p40을 포함하는 것인 조성물.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 scIL-12는 p40-L-p35를 포함하는 것인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터 입자는 DC-SIGN을 발현하는 수지상 세포에 선택적으로 결합하는 변형된 알파바이러스 E2 당단백질을 포함하는 것인 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터 입자는 160X가 없거나 글루탐산 이외의 아미노산인 서열번호 1의 신드비스 바이러스 (Sindbis virus) E2 당단백질, 또는 서열번호 1과 80% 이상의 동일성을 갖고 160X가 없거나, 글루탐산 이외의 아미노산이고, 수지상 세포를 감염시킬 수 있는 서열번호 1의 변이체를 포함하는 외피를 포함하며, 상기 E2는 신드비스 바이러스 E3과의 융합 단백질의 부분이 아닌 것인 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 치료는 종양내로 보조제 (adjuvant)를 투여하는 것을 더 포함하는 것인 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 보조제는 글루코피라노실 지질 A (GLA)의 수성(aqueous) 또는 수중 (oil in water) 에멀젼 제형인 것인 조성물.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 렌티바이러스 입자를 포함하는 상기 조성물은 글루코피라노실 지질 A (GLA)의 수성 제형를 더 포함하는 것인 조성물.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터 입자는 단일 용량으로 투여되는 것인 조성물.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터 입자는 시험관 내 형질도입 분석에서 측정된 바, 처음 48 시간 동안 생성된 약 0.1 ㎍ 내지 1㎍/1E10 벡터 게놈의 IL-12 수준을 생산하는 것인 조성물.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 치료는 조절 T 세포의 감소 (depletion)를 더 포함하는 것인 조성물.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 조절 T 세포 감소는 시클로포스파미드 또는 항-CD25 항체의 전신 투여를 포함하는 것인 조성물.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 시클로포스파미드 또는 항-CD25 항체의 전신 투여는 상기 렌티바이러스 벡터를 포함하는 상기 조성물의 종양내 주사 이전인 것인 조성물.
  15. 청구항 1에 있어서, 상기 치료는 종양 항원을 코딩하는 제 2 렌티바이러스 벡터 입자를 투여하는 것을 더 포함하는 것인 조성물.
  16. (a) IL-12를 코딩하는 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 게놈을 포함하는 수지상 세포-표적으로 하는 렌티바이러스 벡터 입자를 포함하는 제 1 조성물; 및 (b) 종양 항원을 코딩하는 제 2 렌티바이러스 벡터 입자를 포함하는 제 2 조성물;을 포함하며, 상기 제 1 조성물이 종양내로 투여되고 제 2 조성물이 상이한 경로에 의해 투여되는, 개체에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 산물.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 제 2 조성물은 피내, 피하, 또는 근육내 투여되는 것인 산물.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 제 1 조성물 및 제 2 조성물은 동시에 투여되는 것인 산물.
  19. 청구항 16에 있어서, 상기 제 1 조성물 및 제 2 조성물이 순차적으로 투여되는 것인 산물.
  20. 160X가 없거나 글루탐산 이외의 아미노산인 서열번호 1의 신드비스 바이러스 E2 당단백질, 또는 서열번호 1과 80% 이상의 동일성을 갖고 160X가 없거나, 글루탐산 이외의 아미노산이고, 수지상 세포를 감염시킬 수 있는 서열번호 1의 변이체를 포함하는 외피로서, 상기 E2는 신드비스 바이러스 E3과의 융합 단백질의 부분이 아닌 것인 외피; 및 IL-23을 코딩하는 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 게놈을 포함하는 렌티바이러스 입자.
  21. a. 160X가 없거나 글루탐산 이외의 아미노산인 서열번호 1의 신드비스 바이러스 E2 당단백질, 또는 서열번호 1과 80% 이상의 동일성을 갖고 160X가 없거나, 글루탐산 이외의 아미노산이고, 수지상 세포를 감염시킬 수 있는 서열번호 1의 변이체를 포함하는 외피로서; 상기 E2는 신드비스 바이러스 E3과의 융합 단백질의 일부가 아닌 것인 외피; 및
    b. IL-12를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 게놈;을 포함하는 렌티바이러스 벡터 입자.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 IL-12는 단일 사슬 IL-12 (scIL-12)인 것인 렌티바이러스 벡터 입자.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 scIL-12는 p35-L-p40을 포함하는 것인 렌티바이러스 벡터 입자.
  24. 청구항 22에 있어서, 상기 scIL-12는 p40-L-p35를 포함하는 것인 렌티바이러스 벡터 입자.
  25. 청구항 21에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터 게놈은 항원을 코딩하는 서열을 더 포함하는 것인 렌티바이러스 벡터 입자.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 항원은 종양 관련 항원, 바이러스성 항원, 박테리아성 항원, 또는 진균성 항원인 것인 렌티바이러스 벡터 입자.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 종양 관련 항원은 전립선산 포스파타제 (prostatic acid phosphatase), 전립선 특이적 항원 (prostate specific antigen), NKX3.1, 전립선 특이적 막 항원 (prostate specific membrane antigen), PRAME, BAGE, RAGE, NY-ESO-1, SAGE, HAGE, GAGE, Plu-1, HASH -1, HasH-2, Cripto, Criptin, MART-1/Melan-A, gp100, gp75, mda-7, 티로시나제, 티로시나제-관련 단백질, p53, Ras, c-Myc, A-Raf, B-Raf, 및 C-Raf, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, MART-1, BAGE, DAM-6, -10, GAGE-1, GAGE -2, GAGE -8, GAGE-3, GAGE -4, GAGE -5, GAGE -6, GAGE -7B, NA88-A, MART-1, MC1R, Gp100, PSM, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC2, PRAME, P15, RU1, RU2, SART-1, SART-3, 빌롬 종양 항원(Wilms' tumor antigen: WT1), AFP, β-카테닌/m, 카스파제-8/m, CEA, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, Mum-1, Mum-2, Mum-3, 미오신/m, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, 아넥신 II, CDC27/m, TPI/mbcr-abl, BCR-ABL, 인터페론 조절 인자 4 (IRF4), ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RAR, 종양-관련 칼슘 신호 트랜스듀서 1 (TACSTD1) TACSTD2, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR 및 EGFRvIII), 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (PDGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR), 인테그린-연결 키나제 (ILK), STAT3, STAT5, STAT6, HIF-1, HIF-2, 핵 인자-카파 B (NF-κB), Notch1-4, c-Met, 포유류 라파마이신 표적(mTOR: mammalian targets of rapamycin), WNT, PMSA, PR-3, MDM2, 메소텔린(Mesothelin), 신장 세포 암종(renal cell carcinoma)-5T4, SM22-알파, 카르본산염 안히드라제 I (CAI) 및 IX (CAIX) (G250로도 알려짐), STEAD, TEL/AML1, GD2, 프로테나제3, hTERT, 육종 전좌 절단점(sarcoma translocation breakpoints), EphA2, ML-IAP, EpCAM, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, ALK, 안드로겐 수용체, 시클린 B1, 폴리시알 산, MYCN, RhoC, GD3, 푸코실 GM1(fucosyl GM1), 메소텔리안(mesothelian), PSCA, sLe, PLAC1, GM3, BORIS, Tn, GLoboH, NY-BR-1, RGs5, SART3, STn, PAX5, OY-TES1, 정자 단백질 17 (sperm protein 17), LCK, HMWMAA, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, 레구메인(legumain), TIE2, Page4, MAD-CT-1, FAP, MAD-CT-2, 및 포스 관련 항원 1(fos related antigen 1)로 구성된 군으로부터 선택된 것인 렌티바이러스 벡터 입자.
  28. 청구항 21의 렌티바이러스 벡터 입자를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법.
  29. 청구항 28에 있어서, 종양 항원을 코딩하는 제 2 렌티바이러스 벡터를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  30. 청구항 29에 있어서, 청구항 21의 상기 렌티바이러스 벡터 입자 및 제 2 렌티바이러스 벡터를 동시에 투여하는 것인 방법.
  31. 청구항 29에 있어서, 청구항 21의 상기 렌티바이러스 벡터 입자 및 제 2 렌티바이러스 벡터를 상이한 시간에 순차적으로 투여하는 것인 방법.
  32. 청구항 29에 있어서, 청구항 21의 상기 렌티바이러스 벡터 입자 및 제 2 렌티바이러스 벡터를 상이한 경로로 투여하는 것인 방법.
  33. 청구항 29에 있어서, 청구항 21의 상기 렌티바이러스 벡터 입자 및 제 2 렌티바이러스 벡터를 상이한 부위에 투여하는 것인 방법.
  34. 청구항 29에 있어서, 청구항 21의 상기 렌티바이러스 벡터 입자 및 제 2 렌티바이러스 벡터를 동일한 경로로, 상이한 부위에 투여하는 것인 방법.
  35. 청구항 28에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터 입자는 종양내로 투여되는 것인 방법.
  36. 청구항 29에 있어서, 청구항 21의 상기 렌티바이러스 벡터 입자를 종양내로 투여하고, 상기 제 2 렌티바이러스 벡터를 상이한 부위에서, 상이한 경로로 동시에 투여하는 것인 방법.
  37. 청구항 25의 렌티바이러스 벡터 입자를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법.
  38. 청구항 28에 있어서, 상기 방법은 종양내로 TLR4 작용제 (agonist)를 투여하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  39. 청구항 38에 있어서, 상기 TLR4 작용제는 글루코피라노지질 A (GLA)의 수성 또는 수중유 에멀젼 제형인 것인 방법.
  40. 청구항 35에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터 입자를 포함하는 조성물이 글루코피라노지질 A (GLA)의 수성 제형을 더 포함하는 것인 방법.
  41. 청구항 35에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터 입자는 단일 용량으로 투여되는 것인 방법.
  42. 청구항 35에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터 입자는 낮은-수준의 IL-12를 생산하는 것인 방법.
  43. 청구항 42에 있어서, 상기 낮은 수준의 IL-12는 시험관 내 형질도입 분석에서 측정된 바, 처음 48시간 동안 생성된 약 0.1 ㎍ 내지 1 ㎍/1E10 벡터 게놈인 것인 방법.
  44. 청구항 37에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터 입자는 종양내로 투여되는 것인 방법.
  45. 인간 또는 동물 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 청구항 21 내지 청구항 27 중 어느 한 항에 따른 렌티바이러스 벡터 입자.
  46. 청구항 21에 따른 렌티바이러스 벡터 입자 및 종양 항원을 코딩하는 제 2 렌티바이러스 벡터 입자를 포함하는 조성물.
  47. 청구항 25의 렌티바이러스 벡터 입자 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 치료용 또는 예방용 백신.

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