JP2020072689A

JP2020072689A - Ｄｃ−ｓｉｇｎを発現する細胞に対して改善された形質導入の有効性を有するレンチウイルスベクター粒子

Info

Publication number: JP2020072689A
Application number: JP2019234349A
Authority: JP
Inventors: ジェイムズニコライクリストファー; James Nicolai Christopher; ユー．タリーンセミー; U Tareen Semih
Original assignee: Immune Design Corp
Current assignee: Immune Design Corp
Priority date: 2012-03-30
Filing date: 2019-12-25
Publication date: 2020-05-14
Also published as: PT2831095T; EP2831095A1; SG11201406162UA; MX2014011823A; CA2868838C; JP2015512263A; ES2707288T3; DK2831095T3; KR102070472B1; EP2831095B1; EP3480316A1; EA201491813A1; NZ700340A; WO2013149167A1; AU2013237900A1; IL234838B; US10993999B2; AU2013237900B2; BR112014024449A2; EA038702B1

Abstract

【課題】改善された偽型レンチウイルスベクター粒子を生成するために有用な材料および方法を提供する。【解決手段】本開示の一態様は、偽型レンチウイルスベクター粒子を生成する方法を提供する。本開示の別の態様は、（ａ）ＳＡＭＨＤ１阻害剤と、（ｂ）抗原をコードする外因性ポリヌクレオチドと、（ｃ）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に優先的に結合するエンベロープ糖タンパク質とを含む偽型レンチウイルスベクター粒子を含む組成物を提供し、該組成物中のＮ連結グリカンの少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％は、Ｍａｎ５〜Ｍａｎ９構造、好ましくはＭａｎ９を含む。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年３月３０日に出願された米国特許出願第１３／４３６，４７２号、２０１２年１２月４日に発行された米国特許第８，３２３，６６２号、２０１２年６月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／６６６，１０３号、２０１２年１２月３日に出願された同第６１／７３２，７５６号、および２０１３年３月１５日に出願された同第６１／７８９，５７５号に優先権を主張し、これらのすべては、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
電子的に提出された材料の参照による援用

本明細書と同時に提出され、２０１３年３月２９日に作成された、「４６４１７Ａ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称の１２４６，１７３バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイルとして特定されるコンピュータ可読のアミノ酸／ヌクレオチド配列表が、参照によりその全体が組み込まれる。

本開示は、改善された偽型レンチウイルスベクター粒子を生成するために有用な材料および方法に関する。

樹状細胞（ＤＣ）は、免疫応答の開始および制御に必須な抗原提示細胞である。ＤＣは、抗原を捕捉および処理し、末梢からリンパ器官に移動して、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）に制限される様式で、抗原を静止Ｔ細胞に提示することができる。これらの細胞は、骨髄（ＢＭ）に由来し、樹状形態および高い可動性を示す。特化した抗原提示細胞（ＡＰＣ）としてのＤＣの発見は、特異的抗原の表示のためにＤＣを標的とすることを含む、ＤＣに基づく免疫化／ワクチン接種の戦略における試みを加速させた。組み換えウイルス系ベクターは、指定された抗原（複数を含む）をコードする遺伝子を宿主細胞に対して直接送達する機構として開発されている。所望の適応免疫応答の誘導を通して、発現された遺伝子産物が、治療的利益を提供する。

安全かつ有効なシステムの達成における課題には、所望の一連の宿主細胞を効率的に標的とするベクターを設計すること、適切な送達システムを提供すること、および指定されたヒト被検体集団にわたって広く利用され得るように、有効な免疫応答を引き起こすように所望の抗原を発現させることが含まれる。
本明細書に開示されるシンドビスウイルスおよび他のアルファウイルスのエンベロープ糖タンパク質は、ウイルス粒子膜の脂質二重層に組み込まれる。通常、ウイルス膜（エンベロープ）は、単一の前駆体タンパク質の切断から産生される、２つの糖タンパク質ヘテロ二量体Ｅ１およびＥ２の三量体の複数のコピーを含む。前駆体タンパク質は、そのＮ末端からＣ末端に、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、およびＥ１タンパク質を含む。小Ｅ３糖タンパク質は、膜へのＥ２タンパク質の転座のためのシグナル配列として機能し、フリンまたはいくつかの他のＣａ^２＋依存セリンプロテイナーゼによって、Ｅ２から切断する。６Ｋタンパク質は、膜へのＥ１タンパク質の転座のためのシグナル配列として機能し、次いで、前駆体タンパク質から切断する。国際公開第ＷＯ２００８／０１１６３６号および米国特許第２０１１／００６４７６３号は、レンチウイルスパッケージングシステムを開示する。

国際公開第２００８／０１１６３６号米国特許出願公開第２０１１／００６４７６３号

本発明者らは、（ａ）高度にマンノシル化されているアルファウイルス糖タンパク質により偽型化される、そして、（ｂ）Ｖｐｘタンパク質を含むという２つの特徴を示すレンチウイルスベクター粒子が、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞に対して予想外に改善された形質導入の有効性を有することを発見した。これらの粒子を、これらの２つの特徴のうちの１つのみを有するレンチウイルスベクター粒子よりもさらに効率的に、ＤＣ−ＳＩＧＮ、特に、樹状細胞を発現する細胞に感染させる。具体的な例では、Ｖｐｘタンパク質と、対象となる配列（例えば、抗原をコードするポリヌクレオチド）を含むレンチウイルスゲノムとを含む高度にマンノシル化されている偽型レンチウイルスベクター粒子が提供される。
偽型レンチウイルスベクター粒子を生成する方法

本開示の一態様は、偽型レンチウイルスベクター粒子を生成する方法を提供し、本方法は、（ａ）マンノシダーゼ阻害剤、好ましくはマンノシダーゼＩ阻害剤を含む培養培地中で、（１）外因性抗原をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターゲノムと、（２）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞に優先的に結合するアルファウイルス糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、（３）ＳＡＭＨＤ１阻害剤をコードするポリヌクレオチドとを含むウイルスパッケージング細胞を培養することと、（ｂ）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞に優先的に結合する偽型レンチウイルスベクター粒子を単離することと、を含む。

本開示の別の態様は、偽型レンチウイルスベクター粒子を生成する方法を提供し、本方法は、（ａ）キフネンシンを含む培養培地中で、（１）外因性抗原をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターゲノムと、（２）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に優先的に結合するシンドビスＥ２糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、（３）ＳＡＭＨＤ１阻害活性を保持するＶｐｘタンパク質またはＶｐｒタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含むウイルスパッケージング細胞を培養することと、（ｂ）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に優先的に結合する偽型レンチウイルスベクター粒子を単離することと、を含む。いくつかの実施形態において、Ｅ２糖タンパク質は、配列番号３０［ＳＩＮ−Ｖａｒ１］と９０％同一である。いくつかの実施形態において、（ｉ）Ｅ２糖タンパク質の残基１６０は、不在であるか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸であり、（ｉｉ）Ｅ２糖タンパク質変異体の残基７０、７６、もしくは１５９のうちの１つ以上は、非塩基性残基であり、（ｉｉｉ）Ｅ２糖タンパク質変異体は、シンドビスウイルスＥ３糖タンパク質との融合タンパク質の一部ではない。いくつかの実施形態において、Ｅ２糖タンパク質は、配列番号３０［ＳＩＮ−Ｖａｒ１］である。

本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、Ｖｐｘタンパク質は、ＳＩＶｍａｃＶｐｘ（配列番号４４）と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。

本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、Ｖｐｘタンパク質は、ＳＩＶｍａｃＶｐｘ（配列番号４４）、ＳＩＶｓｍＶｐｘ（配列番号４５）、ＳＩＶｒｃｍＶｐｘ（配列番号４６）、またはＨＩＶ−２Ｖｐｘ（配列番号４７）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。

本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、Ｖｐｒタンパク質は、ＳＩＶｄｅｂＶｐｒ（配列番号４８）またはＳＩＶｍｕｓＶｐｒ（配列番号４９）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。

本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、抗原は、腫瘍特異的抗原またはウイルス特異的抗原である。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、腫瘍特異的抗原は、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ、例えば、ＭＡＧＥ−Ａ３およびＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ−７、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質、例えば、ＴＲＰ２、腎細胞癌抗原、５Ｔ４、ＳＭ２２−アルファ、炭酸脱水酵素Ｉ、炭酸脱水酵素ＩＸ（Ｇ２５０としても知られる）、ＨＩＦ−１アルファ、ＨＩＦ−２アルファ、ＶＥＧＦ、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性リン酸塩、前立腺の６−膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、ＮＫＸ３．１、テロメラーゼ酵素、スルビビン、メソテリン、変異型ｒａｓ、ｂｃｒ／ａｂｌ再構成、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、変異型ｐ５３、野生型ｐ５３、サイトクロームＰ４５０１Ｂ１、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ７、癌胎児性抗原、メルケル細胞ウイルスＴ抗原癌タンパク質、およびアルファ−フェトタンパク質から成る群から選択される。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、ウイルス特異的抗原は、ＨＩＶ抗原、ＳＩＶ抗原、アデノウイルス抗原、エンテロウイルス抗原、コロナウイルス抗原、カリシウイルス抗原、ジステンパーウイルス抗原、エボラウイルス抗原、フラビウイルス抗原、肺炎ウイルス抗原、ヘルペスウイルス抗原、感染性腹膜炎ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、白血病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、オルトミクソウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、パラインフルエンザウイルス抗原、パラミクソウイルス抗原、パラボウイルス抗原、ペスチウイルス抗原、ピコルナウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ポックスウイルス抗原、ポリオーマウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、レオウイルス抗原、レトロウイルス抗原、またはロタウイルス抗原である。

本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、レンチウイルスベクターゲノムは、第２の抗原をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、第１および第２の抗原は、２つの抗原の間に自己切断型Ａ２ペプチドを含む融合タンパク質として発現される。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、自己切断型Ａ２ペプチドは、配列番号５６または配列番号５７のアミノ酸配列を含む。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、第１の抗原は、ＭＡＧＥ−Ａ３であり、第２の抗原は、ＮＹ−ＥＳＯ−１である。

本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、キフネンシンは、約０．０１μｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの濃度で、培養培地中に存在する。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、キフネンシンは、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌの濃度で、培養培地中に存在する。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、キフネンシンは、約０．２５μｇ／ｍｌ〜約２μｇ／ｍｌの濃度で、培養培地中に存在する。

本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、ウイルスパッケージング細胞は、（ｉ）ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含むポリヌクレオチドと、（ｉｉ）ｒｅｖタンパク質をコードするポリヌクレオチドとをさらに含む。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子は、ヒトのコドンに最適化され、配列番号５４の１２２８〜１５０９位周辺に最適化されないウインドウを含む。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含むポリヌクレオチドは、機能的ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）を欠いている。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含むポリヌクレオチドは、機能的ＲＲＥが欠失しているため、このＲＲＥを欠いている。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、ｐｏｌ遺伝子は、不活性インテグラーゼ酵素をコードする。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、インテグラーゼ酵素は、Ｄ６４Ｖ突然変異体を有する。

本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、Ｖｐｘタンパク質またはＶｐｒタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ｒｅｖタンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含むポリヌクレオチドと同じまたは異なるプラスミド上にある。

本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、レンチウイルスベクターゲノムは、ＨＩＶ−１に由来する。

本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、レンチウイルスベクターゲノムは、不活性化された３’側の長い末端反復（ＬＴＲ）または自己不活性化された３’側の長い末端反復（ＬＴＲ）を有する。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、レンチウイルスベクターゲノムは、エンハンサー配列、ＴＡＴＡボックス、Ｓｐ１部位、ＮＫ−カッパＢ部位、またはポリプリン区画（ＰＰＴ）のうちの少なくとも１つを欠いているＵ３要素を含む。

本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、レンチウイルスベクターゲノムは、配列番号２１［ＳＩＮベクター］、２２［７０３ベクター］、または２３［７０４ベクター］のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。

本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、レンチウイルスベクターゲノムは、樹状細胞成熟／刺激因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、樹状細胞成熟／刺激因子は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＴＮＦα、Ｂ７．１、Ｂ７．２、４−１ＢＢ、ＣＤ４０リガンド、および薬物誘導ＣＤ４０から成る群から選択される。

本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、抗原をコードするヌクレオチド配列は、ヒトユビキチンＣプロモ−ター（ＵｂｉＣ）、サイトメガロウイルス前初期プロモ−ター（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルスプロモ−ター（ＲＳＶ）、およびテトラサイクリン応答プロモ−ターから成る群から選択されるプロモ−ターに作動可能に連結している。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、プロモ−ターは、イントロン欠損プロモーターである。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、イントロン欠損プロモーターは、ＵｂｉＣである。

本開示の関連態様は、上記で挙げた方法のうちのいずれかによって産生されるレンチウイルスベクター粒子を提供する。
偽型レンチウイルスベクター粒子を含む組成物

本開示の別の態様は、（ａ）ＳＡＭＨＤ１阻害剤と、（ｂ）抗原をコードする外因性ポリヌクレオチドと、（ｃ）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に優先的に結合するエンベロープ糖タンパク質とを含む偽型レンチウイルスベクター粒子を含む組成物を提供し、該組成物中のＮ連結グリカンの少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％は、Ｍａｎ_５〜Ｍａｎ_９構造、好ましくはＭａｎ_９を含む。

本開示の別の態様は、（ａ）Ｖｐｘタンパク質と、（ｂ）抗原をコードする外因性ポリヌクレオチドと、（ｃ）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に優先的に結合するエンベロープ糖タンパク質とを含む偽型レンチウイルスベクター粒子を含む組成物を提供し、該組成物中のＮ連結グルカンの少なくとも８０％は、Ｍａｎ_９構造を含む。

本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、Ｖｐｘタンパク質は、ＳＩＶｍａｃＶｐｘタンパク質（配列番号４４）と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。

本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、偽型レンチウイルスベクター粒子を、少なくとも１％、または少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも２０％のインビトロ形質導入の有効性によりＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に感染させる。例えば、実施例８の手順を参照されたい。

本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、糖タンパク質は、シンドビスウイルスＥ２糖タンパク質である。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、Ｅ２糖タンパク質は、配列番号３０［ＳＩＮ−Ｖａｒ１］に対して少なくとも９０％同一性を有する。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、（ｉ）Ｅ２糖タンパク質の残基１６０は、不在であるか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸であり、（ｉｉ）Ｅ２糖タンパク質変異体の残基７０、７６、または１５９のうちの１つ以上が、非塩基性残基であり、（ｉｉｉ）Ｅ２糖タンパク質変異体は、シンドビスウイルスＥ３糖タンパク質との融合タンパク質の一部ではない。

本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、抗原は、腫瘍特異的抗原またはウイルス特異的抗原である。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、腫瘍特異的抗原は、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ、例えば、ＭＡＧＥ−Ａ３およびＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ−７、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質、例えば、ＴＲＰ２、腎細胞癌抗原、５Ｔ４、ＳＭ２２−アルファ、炭酸脱水酵素Ｉ、炭酸脱水酵素ＩＸ（Ｇ２５０としても知られる）、ＨＩＦ−１アルファ、ＨＩＦ−２アルファ、ＶＥＧＦ、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性リン酸塩、前立腺の６−膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、ＮＫＸ３．１、テロメラーゼ酵素、スルビビン、メソテリン、変異型ｒａｓ、ｂｃｒ／ａｂｌ再構成、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、変異型ｐ５３、野生型ｐ５３、サイトクロームＰ４５０１Ｂ１、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ７、癌胎児性抗原、メルケル細胞ウイルスＴ抗原癌タンパク質、およびアルファ−フェトタンパク質から成る群から選択される。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、ウイルス特異的抗原は、ＨＩＶ抗原、ＳＩＶ抗原、アデノウイルス抗原、エンテロウイルス抗原、コロナウイルス抗原、カリシウイルス抗原、ジステンパーウイルス抗原、エボラウイルス抗原、フラビウイルス抗原、肺炎ウイルス抗原、ヘルペスウイルス抗原、感染性腹膜炎ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、白血病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、オルトミクソウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、パラインフルエンザウイルス抗原、パラミクソウイルス抗原、パラボウイルス抗原、ペスチウイルス抗原、ピコルナウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ポックスウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、レオウイルス抗原、レトロウイルス抗原、またはロタウイルス抗原である。

本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、レンチウイルスベクターゲノムは、第２の抗原をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、第１および第２の抗原は、２つの抗原の間に自己切断型Ａ２ペプチドを含む融合タンパク質として発現される。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、自己切断型Ａ２ペプチドは、配列番号５６または配列番号５７のアミノ酸配列を含む。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、第１の抗原は、ＮＹ−ＥＳＯ−１であり、第２の抗原は、ＭＡＧＥ−Ａ３である。

本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、レンチウイルスベクターゲノムは、不活性化された３’側の長い末端反復（ＬＴＲ）または自己不活性化された３’側の長い末端反復（ＬＴＲ）を有する。いくつかの態様において、レンチウイルスベクターゲノムは、エンハンサー配列、ＴＡＴＡボックス、Ｓｐ１部位、ＮＫ−カッパＢ部位、またはポリプリン区画（ＰＰＴ）のうちの少なくとも１つを欠いているＵ３要素を含む。

本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、抗原をコードするヌクレオチド配列は、ヒトユビキチンＣプロモ−ター（ＵｂｉＣ）、サイトメガロウイルス前初期プロモ−ター（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルスプロモ−ター（ＲＳＶ）、およびテトラサイクリン応答プロモ−ターから成る群から選択されるプロモ−ターに作動可能に連結している。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、プロモ−ターは、イントロン欠損プロモーターである。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、イントロン欠損プロモーターは、ヒトユビキチンＣ（ＵｂｉＣ）プロモ−ターである。

本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、偽型レンチウイルスベクター粒子は、少なくとも１０^５／ｍＬのＩＵを有する。

本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、組成物は、免疫刺激剤をさらに含む。

本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、組成物は、アジュバントをさらに含む。例えば、本明細書に開示されるような、アジュバントは、ミョウバン、または３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）を含む。本明細書に開示されるアジュバントの種類には、（ａ）アルミニウム塩、（ｂ）任意に他の特定の免疫刺激剤、例えば、ムラミルペプチド、または他の細菌細胞壁成分を含む、または含まない、水中油型エマルション製剤、（ｃ）ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸを含むサポニンアジュバント、（ｄ）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、（ｅ）サイトカイン、ならびに（ｆ）式（Ｉ）のアジュバントが含まれる。

式中、部分Ａ１およびＡ２は、水素、リン酸塩、およびリン酸塩から成る群から独立して選択される。ナトリウムおよびカリウムは、リン酸塩の例示的な対イオンである。部分Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、およびＲ^６は、独立して、Ｃ_３−Ｃ_２３によって表される、３〜２３個の炭素を有するヒドロカルビルから成る群から選択される。さらなる明瞭さのために、部分が複数のメンバーを有する特定された基「から独立して選択される」とき、第１の部分のために選択されたメンバーは、第２の部分のために選択されたメンバーの選択に決して影響を及ぼさない、または限定しないことを理解すべきである。Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５、およびＲ^６が結合される炭素原子は非対称であり、このため、ＲまたはＳの立体化学のいずれかで存在し得る。一実施形態において、これらの炭素原子のすべてはＲ立体化学であり、一方で、別の実施形態において、これらの炭素原子のすべてはＳ立体化学である。

本開示の様々な実施形態において、アジュバントは、式（Ｉ）の化学構造を有するが、部分Ａ１、Ａ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、これらの部分のために前に提供される選択肢のうちのサブセットから選択され、これらのサブセットは、Ｅ１、Ｅ２等によって以下に特定される。
Ｅ１：Ａ_１は、リン酸またはリン酸塩であり、Ａ_２は水素である。
Ｅ２：Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５、およびＲ^６は、Ｃ_３−Ｃ_２１アルキルであり、Ｒ^２およびＲ^４は、Ｃ_５−Ｃ_２３ヒドロカルビルである。
Ｅ３：Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５、およびＲ^６は、Ｃ_５−Ｃ_１７アルキルであり、Ｒ^２およびＲ^４は、Ｃ_７−Ｃ_１９ヒドロカルビルである。
Ｅ４：Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５、およびＲ^６は、Ｃ_７−Ｃ_１５アルキルであり、Ｒ^２およびＲ^４は、Ｃ_９−Ｃ_１７ヒドロカルビルである。
Ｅ５：Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５、およびＲ^６は、Ｃ_９−Ｃ_１３アルキルであり、Ｒ^２およびＲ^４は、Ｃ_１１−Ｃ_１５ヒドロカルビルである。
Ｅ６：Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５、およびＲ^６は、Ｃ_９−Ｃ_１５アルキルであり、Ｒ^２およびＲ^４は、Ｃ_１１−Ｃ_１７ヒドロカルビルである。
Ｅ７：Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５、およびＲ^６は、Ｃ_７−Ｃ_１３アルキルであり、Ｒ^２およびＲ^４は、Ｃ_９−Ｃ_１５ヒドロカルビルである。
Ｅ８：Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５、およびＲ^６は、Ｃ_１１−Ｃ_２０アルキルであり、Ｒ^２およびＲ^４は、Ｃ_１２−Ｃ_２０ヒドロカルビルである。
Ｅ９：Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５、およびＲ^６は、Ｃ_１１アルキルであり、Ｒ^２およびＲ^４は、Ｃ_１３ヒドロカルビルである。
Ｅ１０：Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５、およびＲ^６は、ウンデシルであり、Ｒ^２およびＲ^４は、トリデシルである。

ある選択肢において、Ｅ２〜Ｅ１０のそれぞれは、実施形態Ｅ１と組み合わせられるか、および／またはＥ２〜Ｅ９のヒドロカルビル基は、アルキル基、好ましくは直鎖アルキル基である。好ましいアジュバントは、Ｅ１０と組み合わせたＥ１であり、（ｉ）Ａ_１は、リン酸またはリン酸塩であり、Ａ_２は水素であり、（ｉｉ）Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５、およびＲ^６は、ウンデシルであり、Ｒ^２およびＲ^４は、トリデシルである。

本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、エンベロープ糖タンパク質はまた、マウスＳＩＧＮＲ１を発現する細胞に結合する。

本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、偽型レンチウイルスベクター粒子はまた、マウスＳＩＧＮＲ１を発現しない細胞と比較して、マウスＳＩＧＮＲ１を発現する細胞をより効率的に形質導入する。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
（ａ）ＳＡＭＨＤ１阻害活性を保持するＶｐｘタンパク質またはＶｐｒタンパク質と、（ｂ）抗原をコードする外因性ポリヌクレオチドと、（ｃ）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞に優先的に結合する複数のエンベロープ糖タンパク質とを含む偽型レンチウイルスベクター粒子を含む組成物であって、マンノシダーゼ阻害剤の不在下で調製された同じ偽型レンチウイルスベクター粒子の対照組成物と比較して、より高度にマンノシル化されている、組成物。
（項目２）
前記エンベロープ糖タンパク質が、アルファウイルス糖タンパク質である、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記エンベロープ糖タンパク質が、シンドビス糖タンパク質である、項目２に記載の組成物。
（項目４）
高マンノシル化が、マンノシダーゼ阻害剤の不在下で調製された対照組成物よりもさらにＥｎｄｏＨ感受性であることを特徴とする、項目１〜３のいずれかに記載の組成物。
（項目５）
ＥｎｄｏＨ感受性が、ＥｎｄｏＨ処理後、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって、前記エンベロープ糖タンパク質の分子量を評価することによって判定される、項目１〜３のいずれかに記載の組成物。
（項目６）
ＥｎｄｏＨによる処理後の前記エンベロープ糖タンパク質の分子量が、（ａ）エンドグリコシダーゼにより処理されないエンベロープ糖タンパク質と、（ｂ）ＰＮＧａｓｅＦにより処理されたエンベロープ糖タンパク質との間の距離の約４５％以上シフトしている、項目１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７）
ＥｎｄｏＨによる処理後の前記エンベロープ糖タンパク質の分子量が、（ａ）エンドグリコシダーゼにより処理されないエンベロープ糖タンパク質と、（ｂ）ＰＮＧａｓｅＦにより処理されたエンベロープ糖タンパク質との間の距離の約７０％以上シフトしている、項目６に記載の組成物。
（項目８）
ＥｎｄｏＨによる処理後の前記エンベロープ糖タンパク質の分子量が、（ａ）エンドグリコシダーゼにより処理されないエンベロープ糖タンパク質と、（ｂ）ＰＮＧａｓｅＦにより処理されたエンベロープ糖タンパク質との間の距離の約９０％以上シフトしている、項目６に記載の組成物。
（項目９）
前記組成物中の前記エンベロープ糖タンパク質のうちの少なくとも３０％が、マンノシダーゼ阻害剤の不在下で調製された偽型レンチウイルスベクター粒子の対照組成物中の同じアミノ酸配列（複数を含む）を有する対照糖タンパク質と比較して、増加した量のＥｎｄｏＨ感受性グリカンを有する、項目１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０）
前記エンベロープ糖タンパク質の大部分が、高度にマンノシル化されている、項目１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１）
前記偽型レンチウイルスベクター粒子が、組み込み不能である、項目１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２）
前記組成物が、シンドビスＥ２糖タンパク質を含む、項目１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３）
前記Ｅ２糖タンパク質が、配列番号３０［ＳＩＮ−Ｖａｒ１］と９０％同一である、項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
（ｉ）前記Ｅ２糖タンパク質の残基１６０が、不在であるか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸であり、（ｉｉ）前記Ｅ２糖タンパク質変異体の残基７０、７６、もしくは１５９のうちの１つ以上が、非塩基性残基であり、（ｉｉｉ）前記Ｅ２糖タンパク質変異体が、シンドビスウイルスＥ３糖タンパク質との融合タンパク質の一部ではない、項目１２または１３に記載の組成物。
（項目１５）
前記Ｅ２糖タンパク質が、配列番号３０［ＳＩＮ−Ｖａｒ１］である、項目１４に記載の組成物。
（項目１６）
前記Ｖｐｘタンパク質が、ＳＩＶｍａｃＶｐｘ［配列番号４４］と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１７）
前記Ｖｐｘタンパク質が、ＳＩＶｍａｃＶｐｘ（配列番号４４）、ＳＩＶｓｍＶｐｘ（配列番号４５）、ＳＩＶｒｃｍＶｐｘ（配列番号４６）、またはＨＩＶ−２Ｖｐｘ（配列番号４７）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１８）
前記Ｖｐｘタンパク質が、ＳＩＶｄｅｂＶｐｒ（配列番号４８）またはＳＩＶｍｕｓ
Ｖｐｒ（配列番号４９）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１９）
前記抗原が、腫瘍特異的抗原またはウイルス特異的抗原である、項目１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２０）
前記腫瘍特異的抗原が、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ−７、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質、腎細胞癌抗原、５Ｔ４、ＳＭ２２−アルファ、炭酸脱水酵素Ｉ、炭酸脱水酵素ＩＸ（Ｇ２５０としても知られる）、ＨＩＦ−１アルファ、ＨＩＦ−２アルファ、ＶＥＧＦ、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性リン酸塩、前立腺の６−膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、ＮＫＸ３．１、テロメラーゼ酵素、スルビビン、メソテリン、変異型ｒａｓ、ｂｃｒ／ａｂｌ再構成、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、変異型ｐ５３、野生型ｐ５３、サイトクロームＰ４５０１Ｂ１、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ７、癌胎児性抗原、およびアルファ−フェトタンパク質から成る群から選択される、項目１９に記載の組成物。
（項目２１）
前記ウイルス特異的抗原が、ＨＩＶ抗原、ＳＩＶ抗原、アデノウイルス抗原、エンテロウイルス抗原、コロナウイルス抗原、カリシウイルス抗原、ジステンパーウイルス抗原、エボラウイルス抗原、フラビウイルス抗原、肺炎ウイルス抗原、ヘルペスウイルス抗原、感染性腹膜炎ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、白血病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、オルトミクソウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、パラインフルエンザウイルス抗原、パラミクソウイルス抗原、パラボウイルス抗原、ペスチウイルス抗原、ピコルナウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ポックスウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、レオウイルス抗原、レトロウイルス抗原、またはロタウイルス抗原である、項目１９に記載の組成物。
（項目２２）
前記レンチウイルスベクターゲノムが、第２の抗原をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２３）
前記第１および第２の抗原が、前記２つの抗原の間に自己切断型Ａ２ペプチドを含む融合タンパク質として発現される、項目２２に記載の組成物。
（項目２４）
自己切断型Ａ２ペプチドが、配列番号５６または配列番号５７のアミノ酸配列を含む、項目２３に記載の組成物。
（項目２５）
前記第１の抗原が、ＮＹ−ＥＳＯ−１であり、前記第２の抗原が、ＭＡＧＥ−Ａ３である、項目２２〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２６）
前記第１および第２の抗原が、二方向性プロモーターから発現される、項目２２に記載の組成物。
（項目２７）
前記エンベロープ糖タンパク質が、マウスＳＩＧＮＲ１を発現する細胞に結合する、項目１に記載の組成物。
（項目２８）
前記偽型レンチウイルスベクター粒子が、マウスＳＩＧＮＲ１を発現しない細胞と比較して、マウスＳＩＧＮＲ１を発現する細胞をより効率的に形質導入する、項目１に記載の組成物。
（項目２９）
偽型レンチウイルスベクター粒子を生成する方法であって、
（ａ）キフネンシンを含む培養培地中で、
（１）外因性抗原をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターゲノムと、
（２）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に優先的に結合するシンドビスＥ２糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
（３）ＳＡＭＨＤ１阻害活性を保持するＶｐｘタンパク質またはＶｐｒタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、を含むウイルスパッケージング細胞を培養することと、
（ｂ）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に優先的に結合する偽型レンチウイルスベクター粒子を単離することと、を含む、方法。
（項目３０）
前記Ｅ２糖タンパク質が、配列番号３０［ＳＩＮ−Ｖａｒ１］と９０％同一である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
（ｉ）前記Ｅ２糖タンパク質の残基１６０が、不在であるか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸であり、（ｉｉ）前記Ｅ２糖タンパク質変異体の残基７０、７６、または１５９のうちの１つ以上が、非塩基性残基であり、（ｉｉｉ）前記Ｅ２糖タンパク質変異体が、シンドビスウイルスＥ３糖タンパク質との融合タンパク質の一部ではない、項目２９または３０に記載の方法。
（項目３２）
前記Ｅ２糖タンパク質が、配列番号３０［ＳＩＮ−Ｖａｒ１］である、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記Ｖｐｘタンパク質が、ＳＩＶｍａｃＶｐｘ［配列番号４４］と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記Ｖｐｘタンパク質が、ＳＩＶｍａｃＶｐｘ（配列番号４４）、ＳＩＶｓｍＶｐｘ（配列番号４５）、ＳＩＶｒｃｍＶｐｘ（配列番号４６）、またはＨＩＶ−２Ｖｐｘ（配列番号４７）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記Ｖｐｘタンパク質が、ＳＩＶｄｅｂＶｐｒ（配列番号４８）またはＳＩＶｍｕｓ
Ｖｐｒ（配列番号４９）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、項目２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記抗原が、腫瘍特異的抗原またはウイルス特異的抗原である、項目２９〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記腫瘍特異的抗原が、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ−７、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質、腎細胞癌抗原、５Ｔ４、ＳＭ２２−アルファ、炭酸脱水酵素Ｉ、炭酸脱水酵素ＩＸ（Ｇ２５０としても知られる）、ＨＩＦ−１アルファ、ＨＩＦ−２アルファ、ＶＥＧＦ、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性リン酸塩、前立腺の６−膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、ＮＫＸ３．１、テロメラーゼ酵素、スルビビン、メソテリン、変異型ｒａｓ、ｂｃｒ／ａｂｌ再構成、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、変異型ｐ５３、野生型ｐ５３、サイトクロームＰ４５０１Ｂ１、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ７、癌胎児性抗原、およびアルファ−フェトタンパク質から成る群から選択される、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記ウイルス特異的抗原が、ＨＩＶ抗原、ＳＩＶ抗原、アデノウイルス抗原、エンテロウイルス抗原、コロナウイルス抗原、カリシウイルス抗原、ジステンパーウイルス抗原、エボラウイルス抗原、フラビウイルス抗原、肺炎ウイルス抗原、ヘルペスウイルス抗原、感染性腹膜炎ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、白血病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、オルトミクソウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、パラインフルエンザウイルス抗原、パラミクソウイルス抗原、パラボウイルス抗原、ペスチウイルス抗原、ピコルナウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ポックスウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、レオウイルス抗原、レトロウイルス抗原、またはロタウイルス抗原である、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記レンチウイルスベクターゲノムが、第２の抗原をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目２９〜３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記第１および第２の抗原が、前記２つの抗原の間に自己切断型Ａ２ペプチドを含む融合タンパク質として発現される、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
自己切断型Ａ２ペプチドが、配列番号５６または配列番号５７のアミノ酸配列を含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記第１の抗原が、ＮＹ−ＥＳＯ−１であり、前記第２の抗原が、ＭＡＧＥ−Ａ３である、項目３９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記第１および第２の抗原が、二方向性プロモーターから発現される、項目３９に記載の方法。
（項目４４）
前記キフネンシンが、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌの濃度で、前記培養培地中に存在する、項目２９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記キフネンシンが、約０．２５μｇ／ｍｌ〜約２μｇ／ｍｌの濃度で、前記培養培地中に存在する、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記ウイルスパッケージング細胞が、
（ｉ）ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含むポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）ｒｅｖタンパク質をコードするポリヌクレオチドとをさらに含む、項目２９〜４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子が、ヒトのコドンに最適化され、配列番号５４の１２２８〜１５０９位周辺に最適化されないウインドウを含む、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含むポリヌクレオチドが、機能的ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）を欠いている、項目４６または４７に記載の方法。
（項目４９）
前記ｐｏｌ遺伝子が、不活性インテグラーゼ酵素をコードする、項目４６〜４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記インテグラーゼ酵素が、Ｄ６４Ｖ突然変異体を有する、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記Ｖｐｘタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、前記ｒｅｖタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または前記ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含むポリヌクレオチドと同じまたは異なるプラスミド上にある、項目４６〜５０のいずれか一項に記載の方法。（項目５２）
前記レンチウイルスベクターゲノムが、ＨＩＶ−１に由来する、項目２９〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記レンチウイルスベクターゲノムが、不活性化された３’側の長い末端反復（ＬＴＲ）または自己不活性化された３’側の長い末端反復（ＬＴＲ）を有する、項目２９〜５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記レンチウイルスベクターゲノムが、エンハンサー配列、ＴＡＴＡボックス、Ｓｐ１部位、ＮＫ−カッパＢ部位、またはポリプリン区画（ＰＰＴ）のうちの少なくとも１つを欠いているＵ３要素を含む、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記レンチウイルスベクターゲノムが、配列番号２１、２２、または２３のうちのいずれか１つの前記ヌクレオチド配列を含む、項目２９〜５４のいずれか一項に記載の方法。（項目５６）
前記レンチウイルスベクターゲノムが、樹状細胞成熟／刺激因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目２９〜５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記樹状細胞成熟／刺激因子が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＴＮＦα、Ｂ７．１、Ｂ７．２、４−１ＢＢ、ＣＤ４０リガンド、および薬物誘導ＣＤ４０から成る群から選択される、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
抗原をコードする前記ヌクレオチド配列が、ヒトユビキチンＣプロモ−ター（ＵｂｉＣ）、サイトメガロウイルス前初期プロモ−ター（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルスプロモ−ター（ＲＳＶ）、およびテトラサイクリン応答プロモ−ターから成る群から選択されるプロモ−ターに作動可能に連結している、項目２９〜５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記プロモ−ターが、イントロン欠損プロモーターである、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記イントロン欠損プロモーターが、ＵｂｉＣプロモーターである、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
項目２９〜４５に記載の方法によって産生される、レンチウイルスベクター粒子。
（項目６２）
項目４６〜６０に記載の方法によって産生される、レンチウイルスベクター粒子。
（項目６３）
偽型レンチウイルスベクター粒子を生成する方法であって、
（ａ）キフネンシンを含む培養培地中で、
（１）ＭＡＧＥ−Ａ３およびＮＹ−ＥＳＯ−１をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターゲノムであって、自己切断型ＴＡ２ペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ＭＡＧＥ−Ａ３およびＮＹ−ＥＳＯ−１をコードするポリヌクレオチドとの間に配置され、前記レンチウイルスゲノムがポリプリン区画（ＰＰＴ）を欠いており、ＭＡＧＥ−Ａ３およびＮＹ−ＥＳＯ−１の発現が、イントロンを欠いているＵｂｉＣプロモーターによって制御される、レンチウイルスベクターゲノムと、
（２）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に優先的に結合するシンドビスＥ２糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
（３）ヒトのコドンに最適化されるｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが機能的ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）を欠いており、前記ｐｏｌ遺伝子が不活性インテグラーゼ酵素をコードする、ポリヌクレオチドと、
（４）ＳＡＭＨＤ１阻害活性を保持するＶｐｘタンパク質またはＶｐｒタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含むウイルスパッケージング細胞を培養することと、
（ｂ）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に優先的に結合する偽型レンチウイルスベクター粒子を単離することと、を含む、方法。

本開示の他の特性および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、この詳細な説明から、本開示の精神および範囲内の種々の変化および変更は当業者に明らかになり得るので、詳細な説明および特定の実施例は、本開示の特定の実施形態を示すが、例示のためだけに与えられると理解されるべきである。

ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体を安定的に発現するＨＴ１０８０細胞（１Ａ）、またはＤＣ−ＳＩＧＮを欠いているＨＴ１０８０細胞（１Ｂ）に感染させるための、様々なマンノシダーゼ阻害剤（例えば、キフネンシン、ＤＭＮＪ、およびスワインソニン）の存在下で産生される偽型レンチウイルスベクター粒子の能力を示す。感染効率は、レンチウイルスベクターからのＧＦＰの発現を判定することによって評価された。ｙ軸は、ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージである。

ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体を安定的に発現するＨＴ１０８０細胞（２Ａ）またはＤＣ−ＳＩＧＮを欠いているＨＴ１０８０細胞（２Ｂ）に感染させるための、４００μｇ／ｍｌのＤＭＮＪまたは様々な濃度のキフネンシンの存在下で産生される偽型レンチウイルスベクター粒子の能力を示す。感染効率は、図１と同様に、評価された。

（図３Ａ）ＰＮＧａｓｅＦおよびＥｎｄｏＨに対する基質特異性を示す略図である。ＰＮＧａｓｅＦは、グリコシル化プロファイルにかかわらず、すべてのＮ連結グリコシル化を切断する一般的なエンドグリコシダーゼである。ＥｎｄｏＨは、高マンノースＮ連結グリコシル化のみを切断する特殊化したエンドグリコシダーゼである。ＥｎｄｏＨは、高マンノースＮ連結グリコシル化のみを切断する（すなわち、ＥｎｄｏＨは、キフネンシンの不在下で、ＳＩＮＶａｒ１上において４つのうちの２つの部位、そして、キフネンシンの存在下で、ＳＩＮＶａｒ１上において４つのうちの４つの部位を標的とする）。（図３Ｂ）ゲルシフトを使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動し、シンドビスウイルスエンベロープに対する抗体を用いた免疫ブロット法によって、キフネンシンまたはＤＭＮＪの存在下で産生される偽型レンチウイルスベクター粒子における糖タンパク質のグリコシル化状態を判定するための実験の結果を示す。

ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体を安定的に発現するＨＴ１０８０細胞に感染させるための、４００μｇ／ｍｌのＤＭＮＪまたは様々な濃度のキフネンシンの存在下で産生される偽型レンチウイルスベクター粒子の能力を示す。感染効率は、図１と同様に、評価された。

図４Ａにおいて産生された偽型レンチウイルスベクター粒子におけるＥ２糖タンパク質のグリコシル化状態を判定するための実験の結果を示す。

２９３Ｔ細胞中で発現するＨＡタグＳＩＶｍａｃＶｐｘのウェスタンブロット（抗ＨＡ）である。ＣＭＶプロモーター（ｐＥＮＶ−ＳＩＶｍａｃＶｐｘと命名された構築物）によって駆動された哺乳動物発現ベクターにクローン化された。ＨＡタグＳＩＶｍａｃＶｐｘを含むウイルス粒子から抽出するウイルスタンパク質のウェスタンブロット（抗ＨＡ）である。抗ＨＡ抗体を用いた免疫ブロット法のために、ゲル上にウェルあたり１００ｎｇのｐ２４を充填した。抗ｐ２４抗体は、負荷対照として使用された。

ＣＤ１１ｃが陽性である樹状細胞にゲートをかけ、ｙ軸にＤＣ−ＳＩＧＮをとり、ＧＦＰが陽性である細胞のパーセンテージ（ｘ軸；Ｖｐｘを含む、または含まないＶＳＶ−Ｇにより偽型化した組み込み不良なレンチウイルスによる感染の結果として）を評価することによって測定された形質導入事象の散布図である。

ＣＤ１１ｃが陽性である樹状細胞にゲートをかけ、ｙ軸にＤＣ−ＳＩＧＮをとり、ＧＦＰが陽性である細胞のパーセンテージ（ｘ軸；Ｖｐｘを含む、または含まないＶＳＶ−Ｇにより偽型化した組み込み可能なレンチウイルスによる感染の結果として）を評価することによって測定された形質導入事象の散布図である。

Ｖｐｘを含む、または含まないＳＩＮｖａｒ１により偽型化した組み込み不良なレンチウイルスにより感染し、キフネンシンの不在の存在下で産生される樹状細胞にゲートをかけることによって測定された形質導入事象の散布図である。ｙ軸はＣＤ１１ｃまたはＤＣ−ＳＩＧＮが陽性であった細胞を測定し、ｘ軸はＧＦＰが陽性であった細胞のパーセンテージを測定する。

未処理（レーン１〜３）、４００μｇ／ｍｌのＤＭＮＪ（レーン４〜６）、または１μｇ／ｍｌのキフネンシン（レーン７〜９）を用いて、実施例１に従って調製されたシンドビスウイルス糖タンパク質のウェスタンブロットである。粒子は、エンドグリコシダーゼにより処理されなかったか（レーン１、４、７）、ＥｎｄｏＨで１時間インキュベートされたか（レーン２、５、８）、またはＰＮＧａｓｅＦで１時間インキュベートされた（レーン３、６、９）。次いで、試料は、ゲルシフトアッセイ、およびシンドビスウイルスエンベロープに対する抗体を用いた免疫ブロット法を使用して分析された。

（マンノシダーゼ阻害剤なし）レーン１〜３からのそれぞれの帯およびレーン上の位置の強度プロファイルである。

（ＤＭＮＪで処理された）レーン４〜６からのそれぞれの帯およびレーン上の位置の強度プロファイルである。

（キフネンシンで処理された）レーン７〜９からのそれぞれの帯およびレーン上の位置の強度プロファイルである。

２９３ＴｈｕＤＣ−ＳＩＧＮ細胞を、野生型（ＷＴ）または欠損インテグラーゼ（Ｄ６４Ｖ）でパッケージ化されたベクターと、延長された３’ＰＰＴ（７０３）または３’ＰＰＴ欠失（７０４）を含むベクターゲノムとで形質導入した。４８時間の形質導入後、形質導入細胞から抽出されたゲノムＤＮＡにおいて、ネスト化したＡｌｕ−ＰＣＲ分析が行われた。エラーバーは、三連で行われた形質導入からの平均の標準誤差を示す。図１０Ｂおよび１０Ｃは、２つの独立した方法を使用して、ＧＦＰ−Ｔ２Ａ−ＮｅｏＲをコードするＷＴ／７０３およびＤ６４Ｖ／７０４ベクターの組み込み率を示す。

示されたベクターを段階希釈して、ＨＴ１０８０ｈｕＤＣ−ＳＩＧＮ細胞を形質導入した。Ｇ４１８選択下で、形質導入した細胞を成長させ、個々の組み込み事象を表すネオマイシン耐性コロニーを計数した。実施例１０に記載されるように、組み込み事象を計算した。

ＨＴ１０８０ｈｕＤＣ−ＳＩＧＮ細胞を、示されたベクターで形質導入した。フローサイトメトリーを形質導入後の複数の時点で行って、ＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージを決定した。エラーバーは、三連で行われたフローサイトメトリーの平均の標準誤差を示す。

ヒトＰＢＭＣを、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で３日間処理し、次いで、２０ｎｇのｐ２４のＧＦＰをコードするＩＤ−ＶＰ０２でインキュベートした。ベクター添加時に、培養は、主として、ＤＣ、Ｂ細胞、およびＴ細胞から成った。形質導入から３日後、表面マーカーについて、細胞が分析され、ＤＣ（ＣＤ１１ｃ^＋）６％、Ｂ細胞（ＣＤ１１ｃ⁻、ＣＤ１９^＋）１０％、またはＴ細胞（ＣＤ１１ｃ⁻、ＣＤ３ε^＋）８０％のいずれかとして分類された。形質導入事象は、それぞれの細胞集団内でＧＦＰ陽性である細胞のパーセントを評価することによって測定された。プロット中の数字は、ＧＦＰ^＋ゲート内の細胞のパーセンテージである。

ベクターゲノム部分（上）は、それぞれの端で長い末端反復（ＬＴＲ）を含むことが表される。スプライスドナー（ＳＤ）およびスプライス受容体（ＳＡ）部位は、プシーパッケージングシグナル（Ψ）、部分ｇａｇ配列、およびＲｅｖ応答要素（ＲＲＥ）の側面に位置する。抗原プロモーター（プロモーター）と３’ＬＴＲとの間の要素は、強調表示されず、そのため、フォワードスラッシュマーク（／／）が使用される。ＷＴｇａｇ／ｐｏｌ部分（中央）は、ｇａｇ（黒色ボックス）およびｐｏｌ（灰色ボックス）遺伝子、それに続いて、ＲＲＥを示すことが表される。ＷＴｇａｇ／ｐｏｌとベクターゲノム（ＲＲＥおよびｇａｇの初めの３５４ｂｐ）との間で相同である２つの要素が、括弧で表される（尺度は表示せず）。ベクターゲノムとＷＴｇａｇ／ｐｏｌとの間の組み換えの仮説領域が接続線で示される。ＲＩｇａｇ／ｐｏｌ部分（下）は、コドンに最適化されたｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子（野生型と区別するための白いボックス）を示すことが表される。ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子との間のコドンに最適化されないフレームシフトは、その天然コドン配列（黒色および灰色ボックスを重複する）で表される。プシーｇａｇ組み換えアッセイに使用されるプライマーは、構築物上の適切な位置で示される。第一ラウンドのＰＣＲプライマーは、閉じた矢印で表し、（プシーｇａｇの組み換えを検出するための）対７０９および７１０または（組み込まれたベクターゲノムを検出するための）７０９および３７８である。プライマー対７０９および３７８を用いて組み込まれたベクターに対して予測された増幅は、１６９７ｂｐである。ネスト化したＰＣＲプライマーは、開いた矢印で表され、（ＷＴｇａｇ／ｐｏｌによるプシーｇａｇ組み換えを検出するための）対８６３および８３５または（ＲＩｇａｇ／ｐｏｌによるプシーｇａｇ組み換えを検出するための）８６３および８６４である。プシーｇａｇ組み換えプライマー対のいずれかによる予測された増幅は、９３７ｂｐである。

２９３Ｔ細胞は、Ｒｅｖプラスミド（＋）または空の骨格プラスミド（−）のいずれかの存在下で、ＷＴｇａｇ／ｐｏｌまたはＲＩｇａｇ／ｐｏｌプラスミドのいずれかでトランスフェクトした。２４時間後、細胞を溶解し、抗ｐ２４抗体を使用して、Ｇａｇタンパク質の発現について分析した。未処理のＧａｇタンパク質（ｐ５５）およびｐ２４を、矢印で示す。非形質転換細胞からの溶解物を、対照として含んだ。ウェルの同等負荷は、抗アクチン抗体を用いて確認した。

ＧＦＰをコードするベクターは、ＷＴｇａｇ／ｐｏｌまたはＲＩｇａｇ／ｐｏｌのいずれかの２つのプラスミド量（６μｇまたは３μｇ）で産生された。ベクター上清中の得られたｐ２４レベルを表に示す。２９３Ｔ細胞を、１４Ａ中で産生された２倍希釈のベクターで形質導入し、２日後のＧＦＰの発現について分析した。ＧＦＵ／ｍＬを計算し、ｙ軸上にプロットした。ベクターを作製するために使用されたｇａｇ／ｐｏｌプラスミドのμｇ量（６μｇまたは３μｇ）を、ｘ軸上にプロットする。ＷＴｇａｇ／ｐｏｌおよびＲＩｇａｇ／ｐｏｌをそれぞれ、黒色または白色カラムで示す。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、完全長ＯＶＡまたはＨＢＳＳビヒクルのみをコードするＬＶの指示された用量（２×１０^７、１×１０^８、または５×１０^８ＴＵ）で免疫化された。示されるように、ＬＶは、組み込み可能な（ＩＮＴ＋）または組み込み不能（ＩＮＴ−）のいずれかであり、ＷＴまたはＲＩｇａｇ／ｐｏｌのいずれかで生成された。免疫化から１２日後、ＯＶＡ_２５７特異的膵臓ＣＤ８Ｔ細胞の割合を、エクスビボでのペプチド再刺激後、ＩＦＮ−γに対するＩＣＳによって測定した。

Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたり５匹）に、Ｈ−２^ｂに制限されたＯＶＡ_２５７ＣＤ８Ｔ細胞エピトープを含有するポリエピトープ抗原（ＬＶ１ｂ）をコードするＷＴまたはＲＩｇａｇ／ｐｏｌのいずれかで生成された５×１０^８ＴＵの組み込み不能（ＩＮＴ−）ＬＶで免疫化し、１×１０^７ＴＣＩＤ_５０野生型ＷＲ株ワクチンウイルス（ＶＶ−ＷＴ）、ＷＲ株組み換えＯＶＡワクチンウイルス（ｒＶＶ−ＯＶＡ）で免疫化後２８日目にチャレンジしたか、またはチャレンジしないままにした。３３日目（チャレンジ後５日目）に、それぞれの動物の卵巣のウイルス負荷を、ＴＣＩＤ_５０アッセイによって測定した。

２９３Ｔ細胞を、ＷＴｇａｇ／ｐｏｌまたはＲＩｇａｇ／ｐｏｌベクターのいずれかで形質導入した。２日後、ゲノムＤＮＡを単離し、図１２中に図式化されるような、ベクターゲノム内で結合するプライマー対７０９および３７８を使用して、ＰＣＲによって、組み込みプロウイルスＤＮＡについて分析した。ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル上に視覚化した。ベクターゲノムの単位複製配列サイズを、矢印で示す。テンプレート対照は、ＰＣＲおよびゲルに含まれなかった。

図１７ＡからのゲノムＤＮＡを、第一ラウンドのＰＣＲ、それに続いて、ネスト化したＰＣＲでプロウイルスプシーｇａｇ組み換えについて分析した。第一ラウンドのＰＣＲは、それぞれ、ｇａｇ／ｐｏｌ内でベクターゲノムおよびフレームシフトに結合するプライマー対７０９および７１０を使用した。１μＬの第一ラウンドのＰＣＲ産物を、ネスト化したＰＣＲにおいて、未希釈（１：１）、または１：１００、または１：１０００の希釈のいずれかの鋳型として使用した。ネスト化したＰＣＲにおけるプライマー対は、８６３および８３５、または８６３および８６４のいずれかであった。前者の対（８６３、８３５）は、それぞれ、ベクターゲノムおよびＷＴｇａｇ／ｐｏｌに結合する。後者の対（８６３、８６４）は、ベクターゲノムおよびＲＩｇａｇ／ｐｏｌに結合する。すべてのプライマーおよびそれらの結合部位を、図１２中に図式化される。鋳型のみの対照が含まれた。得られたネスト化したＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル上に視覚化した。プシーｇａｇ組み換えの単位複製配列サイズを、矢印で示す。

ＷＴｇａｇ／ｐｏｌのネスト化したＰＣＲからの帯（１ｋｂ未満の鮮やかな帯）を、ＴＯＰＯ−ＴＡベクターにクローン化し、配列決定した。ＷＴｇａｇ／ｐｏｌプシーｇａｇ組み換え帯の配列を、ベクターゲノム、部分ｇａｇ、またはＷＴｇａｇ／ｐｏｌを用いて配列するために印を付けた領域とともに示す。ダブルスラッシュ（／／）および点は、簡潔さのために示されない配列を示す。配列上の数字は、単位複製配列上のヌクレオチド配列部位を示す。プシーｇａｇ組み換えの塩基対１−４１４は、ベクターゲノムを用いて配列するが、ｂｐ１２０−９３７は、ＷＴｇａｇ／ｐｏｌを用いて配列する。参考までに、部分ｇａｇ配列は、組み換えのｂｐ７６−４３９である。

ＲＩｇａｇ／ｐｏｌのネスト化したＰＣＲからの帯（１ｋｂ〜３ｋｂの弱い帯）を、ＴＯＰＯ−ＴＡベクターにクローン化し、配列決定した。ＲＩｇａｇ／ｐｏｌ組み換えバンドの配列を、ベクターゲノムまたはＲＩｇａｇ／ｐｏｌを用いて配列するために印を付けた領域とともに示す。点は、簡潔さのために示されない配列を示す。配列上の数字は、単位複製配列上のヌクレオチド配列部位を示す。ＲＩ組み換えの塩基対１−１２５３は、ベクターゲノムを用いて配列するが、ｂｐ１２５４−１３２９は、ＲＩｇａｇ／ｐｏｌを用いて配列する。参考までに、部分ｇａｇ配列は、組み換えのｂｐ７６−４３９である。完全配列およびアラインメントを、（補足図Ｓ１Ｂ）に示す。

（Ａ）ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ（ＨＴ１０８０ｈｕＤＣ−ＳＩＧＮ）、（Ｂ）マウスＳＩＧＮＲ１（ＨＴ１０８０ｍＳＩＧＮＲ１）、（Ｃ）マウスＳＩＧＮＲ３（ＨＴ１０８０ｍＳＩＧＮＲ３）、または（Ｄ）マウスＳＩＧＮＲ５（ＨＴ１０８０ｍＳＩＧＮＲ５）を安定的に発現するＨＴ１０８０細胞およびＨＴ１０８０細胞を、キフネンシン（ｋｉｆｕ）の不在または存在下のいずれかで産生された、濃縮した（１，０００倍）ＧＦＰをコードする組み込み不能のＶＳＶ−Ｇにより偽型化したベクター、またはＧＦＰをコードするＩＤ−ＶＰ０２により偽型化したベクターでインキュベートした。

膵臓およびリンパ細胞におけるＳＩＧＮＲ１およびＳＩＧＮＲ５の発現を、生存している単細胞事象において分析した。ＳＩＧＮＲ１またはＳＩＧＮＲ５に特異的な抗体を欠いているパターンを染色する対照を示す。膵臓およびリンパ節からの生存している単細胞事象を、Ｂ細胞（Ｂ２２０＋ＴＣＲβ−、Ｒ４で表示）、Ｔ細胞（ＴＣＲβ^＋、Ｂ２２０⁻、Ｒ５で表示）、およびＤＣ（Ｂ２２０⁻ ＴＣＲβ⁻ ＭＨＣ−ＩＩ^＋ＣＤ１１ｃ^ｈｉ、Ｒ７で表示）に細分類し、続いて、ＳＩＧＮＲ５およびＳＩＧＮＲ１の発現について分析した。すべてのサブセットについては、ＳＩＧＮＲ１およびＳＩＧＮＲ５に特異的な抗体を欠失している陰性対照株における陽性事象の頻度は、０．００以下であった。

ＧＦＰをコードするＩＤ−ＶＰ０２を用いた皮下注射後の流入領域リンパ節におけるＧＦＰを発現する細胞の表現型を、フローサイトメトリーによって測定した。雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたり１５匹）に、３×１０^１０ゲノムのＧＦＰをコードするＩＤ−ＶＰ０２、非蛍光性タンパク質をコードする対照ＩＤ−ＶＰ０２を足蹠に皮下注射したか、または処置しないままにした。４日後、膝窩および頸部リンパ節を、別々に、５匹のマウスからプール（処置群あたり３つのプール）し、ＧＦＰを発現する細胞の存在について分析した。（Ａ）膝窩（流入領域）または頸部（非流入領域）リンパ節からの生存するシングレット事象を、ＧＦＰの発現について分析した。ナイーブまたは陰性対照ＩＤ−ＶＰ０２からの膝窩リンパ節細胞は、陰性対照としての役割を果たした。（Ｂ）ＧＦＰをコードするＩＤ−ＶＰ０２を注射されたマウスの膝窩リンパ節からのＧＦＰ^＋事象におけるＣＤ１１ｃおよびＭＨＣ−ＩＩの頻度を、対照として、灰色で示された全Ｂ２２０−ＴＣＲβ−事象上に重ね合わせて黒色点として示す。（Ｃ）ＧＦＰ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＭＨＣ−ＩＩ^＋事象におけるＳＩＧＮＲ１の発現は、ＳＩＧＮＲ１に特異的な抗体を含む（左パネル）および含まない（右パネル）ことを示す。ゲート統計は、３つの生物学的複製の平均値である。パネル（Ａ）の値は、１×１０^６細胞あたり陽性事象の数である一方、すべての他のゲート値は、パーセンテージである。ＧＦＰをコードするＩＤ−ＶＰ０２を用いた皮下注射後の流入領域リンパ節におけるＧＦＰを発現する細胞の表現型を、フローサイトメトリーによって測定した。雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたり１５匹）に、３×１０^１０ゲノムのＧＦＰをコードするＩＤ−ＶＰ０２、非蛍光性タンパク質をコードする対照ＩＤ−ＶＰ０２を足蹠に皮下注射したか、または処置しないままにした。４日後、膝窩および頸部リンパ節を、別々に、５匹のマウスからプール（処置群あたり３つのプール）し、ＧＦＰを発現する細胞の存在について分析した。（Ａ）膝窩（流入領域）または頸部（非流入領域）リンパ節からの生存するシングレット事象を、ＧＦＰの発現について分析した。ナイーブまたは陰性対照ＩＤ−ＶＰ０２からの膝窩リンパ節細胞は、陰性対照としての役割を果たした。（Ｂ）ＧＦＰをコードするＩＤ−ＶＰ０２を注射されたマウスの膝窩リンパ節からのＧＦＰ^＋事象におけるＣＤ１１ｃおよびＭＨＣ−ＩＩの頻度を、対照として、灰色で示された全Ｂ２２０−ＴＣＲβ−事象上に重ね合わせて黒色点として示す。（Ｃ）ＧＦＰ^＋ＣＤ１１ｃ^＋ＭＨＣ−ＩＩ^＋事象におけるＳＩＧＮＲ１の発現は、ＳＩＧＮＲ１に特異的な抗体を含む（左パネル）および含まない（右パネル）ことを示す。ゲート統計は、３つの生物学的複製の平均値である。パネル（Ａ）の値は、１×１０^６細胞あたり陽性事象の数である一方、すべての他のゲート値は、パーセンテージである。

Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたり３匹）は、尾基底部に、３×１０^１０ゲノムのＩＤ−ＶＰ０２の単回の皮下注射を受けた。逆転写ベクターＤＮＡの存在によって判定されるように、示された組織中のＩＤ−ＶＰ０２の生体内分布は、注射してから１、４、８、２１、または４２日後に、定量的ＰＣＲによって評価された。鼠径および頸部リンパ節は、それぞれ、流入領域および非流入領域として示される。入力ＤＮＡを、２００ｎｇに正規化した。反応あたり１０コピーの定量下限（ＬＯＱ）は、標準曲線上の最も低いコピー数によって定義された。４０ｑＰＣＲサイクル内の増幅されなかった試料は、検出されず（ＮＤ）として表記された。

（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、指示された用量（ベクターゲノム）の完全長ＯＶＡをコードするＩＤ−ＶＰ０２またはＨＢＳＳビヒクルのみで免疫化した。免疫化から１２日後、ＯＶＡ_２５７に特異的な膵臓ＣＤ８Ｔ細胞のパーセンテージを、ＩＣＳによって測定した。（Ｂ）ＯＶＡをコードするＩＤ−ＶＰ０２に対する一次および二次ＣＤ８Ｔ細胞応答の動態が、プライム−ブーストレジメンにおいて、３５日間隔で１×１０^１０ゲノムのＩＤ−ＶＰ０２を用いてマウス（群あたり５匹）を免疫化し、指示された時点で膵臓ＣＤ８Ｔ細胞応答を分析することによって決定された。免疫化は、すべての群が同日にＩＣＳによって分析されるように調整された。（Ｃ）ペプチド再刺激後に生存能力のあるＣＤ８Ｔ細胞上の代表的な細胞内ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２、および表面ＣＤ１０７ａ染色。（Ｄ）一次および二次応答のほぼピークおよび構築後の、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、およびＣＤ１０７ａの組み合わせを発現するＣＤ８Ｔ細胞の頻度。ＩＦＮ−γ陰性であった少数のＣＤ８Ｔ細胞が、任意の他のエフェクター分子を発現した。（Ｅ）ＣＤ４４^ｈｉＨ−２Ｋ^ｂ−ＯＶＡ_２５７五量体^＋ＣＤ８Ｔ細胞のエフェクター／メモリ表現型は、指示された時点でＣＤ１２７およびＫＬＲＧ１で染色することによって評価された。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、指示された用量（ベクターゲノム）の完全長ＯＶＡをコードするＩＤ−ＶＰ０２またはＨＢＳＳビヒクルのみで免疫化した。免疫化から１２日後、ＯＶＡ_２５７に特異的な膵臓ＣＤ８Ｔ細胞のパーセンテージを、ＩＣＳによって測定した。（Ｂ）ＯＶＡをコードするＩＤ−ＶＰ０２に対する一次および二次ＣＤ８Ｔ細胞応答の動態が、プライム−ブーストレジメンにおいて、３５日間隔で１×１０^１０ゲノムのＩＤ−ＶＰ０２を用いてマウス（群あたり５匹）を免疫化し、指示された時点で膵臓ＣＤ８Ｔ細胞応答を分析することによって決定された。免疫化は、すべての群が同日にＩＣＳによって分析されるように調整された。（Ｃ）ペプチド再刺激後に生存能力のあるＣＤ８Ｔ細胞上の代表的な細胞内ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２、および表面ＣＤ１０７ａ染色。（Ｄ）一次および二次応答のほぼピークおよび構築後の、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、およびＣＤ１０７ａの組み合わせを発現するＣＤ８Ｔ細胞の頻度。ＩＦＮ−γ陰性であった少数のＣＤ８Ｔ細胞が、任意の他のエフェクター分子を発現した。（Ｅ）ＣＤ４４^ｈｉＨ−２Ｋ^ｂ−ＯＶＡ_２５７五量体^＋ＣＤ８Ｔ細胞のエフェクター／メモリ表現型は、指示された時点でＣＤ１２７およびＫＬＲＧ１で染色することによって評価された。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、指示された用量（ベクターゲノム）の完全長ＯＶＡをコードするＩＤ−ＶＰ０２またはＨＢＳＳビヒクルのみで免疫化した。免疫化から１２日後、ＯＶＡ_２５７に特異的な膵臓ＣＤ８Ｔ細胞のパーセンテージを、ＩＣＳによって測定した。（Ｂ）ＯＶＡをコードするＩＤ−ＶＰ０２に対する一次および二次ＣＤ８Ｔ細胞応答の動態が、プライム−ブーストレジメンにおいて、３５日間隔で１×１０^１０ゲノムのＩＤ−ＶＰ０２を用いてマウス（群あたり５匹）を免疫化し、指示された時点で膵臓ＣＤ８Ｔ細胞応答を分析することによって決定された。免疫化は、すべての群が同日にＩＣＳによって分析されるように調整された。（Ｃ）ペプチド再刺激後に生存能力のあるＣＤ８Ｔ細胞上の代表的な細胞内ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２、および表面ＣＤ１０７ａ染色。（Ｄ）一次および二次応答のほぼピークおよび構築後の、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、およびＣＤ１０７ａの組み合わせを発現するＣＤ８Ｔ細胞の頻度。ＩＦＮ−γ陰性であった少数のＣＤ８Ｔ細胞が、任意の他のエフェクター分子を発現した。（Ｅ）ＣＤ４４^ｈｉＨ−２Ｋ^ｂ−ＯＶＡ_２５７五量体^＋ＣＤ８Ｔ細胞のエフェクター／メモリ表現型は、指示された時点でＣＤ１２７およびＫＬＲＧ１で染色することによって評価された。

（Ａ）実験スケジュール：Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたり５匹）を、５×１０^１０、１×１０^１０、または２×１０^９ベクターゲノムのＨ−２^ｂに制限されたＯＶＡ_２５７およびＬＣＭＶＧＰ_３３ＣＤ８Ｔ細胞エピトープを含有するポリエピトープ抗原をコードするＩＤ−ＶＰ０２（ＬＶ１ｂ）で免疫化し、１×１０^７ＴＣＩＤ５０野生型ＷＲ株ワクチンウイルス（ＶＶ−ＷＴ）、ＷＲ株組み換えＯＶＡワクチンウイルス（ｒＶＶ−ＯＶＡ）で免疫化してから３５日目にチャレンジしたか、またはチャレンジしないままにした。４０日目（チャレンジから５日後）に、膵臓ＣＤ８Ｔ細胞応答および卵巣におけるウイルス負荷を測定した。（Ｂ）ＯＶＡ_２５７およびＬＣＭＶＧＰ_３３に特異的なＣＤ８Ｔ細胞応答は、エクスビボでの再刺激後、細胞内ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αに対して染色することによって測定された。ＣＤ８Ｔ細胞サイトカインプロファイルの代表的な点プロットを示す。（Ｃ）それぞれの動物に対するＯＶＡ_２５７に特異的なＩＦＮ−γ＋ＣＤ８Ｔ細胞の頻度。（Ｄ）それぞれの動物の卵巣内の（ＴＣＩＤ_５０アッセイによって測定された）ウイルス負荷。（Ａ）実験スケジュール：Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたり５匹）を、５×１０^１０、１×１０^１０、または２×１０^９ベクターゲノムのＨ−２^ｂに制限されたＯＶＡ_２５７およびＬＣＭＶＧＰ_３３ＣＤ８Ｔ細胞エピトープを含有するポリエピトープ抗原をコードするＩＤ−ＶＰ０２（ＬＶ１ｂ）で免疫化し、１×１０^７ＴＣＩＤ５０野生型ＷＲ株ワクチンウイルス（ＶＶ−ＷＴ）、ＷＲ株組み換えＯＶＡワクチンウイルス（ｒＶＶ−ＯＶＡ）で免疫化してから３５日目にチャレンジしたか、またはチャレンジしないままにした。４０日目（チャレンジから５日後）に、膵臓ＣＤ８Ｔ細胞応答および卵巣におけるウイルス負荷を測定した。（Ｂ）ＯＶＡ_２５７およびＬＣＭＶＧＰ_３３に特異的なＣＤ８Ｔ細胞応答は、エクスビボでの再刺激後、細胞内ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αに対して染色することによって測定された。ＣＤ８Ｔ細胞サイトカインプロファイルの代表的な点プロットを示す。（Ｃ）それぞれの動物に対するＯＶＡ_２５７に特異的なＩＦＮ−γ＋ＣＤ８Ｔ細胞の頻度。（Ｄ）それぞれの動物の卵巣内の（ＴＣＩＤ_５０アッセイによって測定された）ウイルス負荷。

（Ａ）ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたり５匹）を、ＡＨ１Ａ５をコードするＩＤ−ＶＰ０２、ＯＶＡに連結された内因性ＣＴ２６腫瘍拒絶反応エピトープＡＨ１のヘテロクリット性（ｈｅｔｅｒｏｃｌｉｔｉｃ）突然変異体（ＯＶＡ−ＡＨ１Ａ５）、またはＨＢＳＳビヒクルのみのベクターゲノムにおいて、指示された用量で免疫化した。免疫化から１２日後、ＡＨ１Ａ５またはＡＨ１に特異的な膵臓ＣＤ８Ｔ細胞のパーセンテージは、ＩＣＳによって測定された。（Ｂ）免疫化から１２日後、１：１：１でＡＨ１、ＡＨ１Ａ５、または対照ペプチドによりそれぞれパルスした色素標識した標的細胞の混合物は、免疫化およびナイーブマウス（群あたり３匹）に静脈内移入した。翌日、膵臓を採取し、それぞれの集団の相対的回復を、ナイーブマウスと免疫化したマウスを比較して、特異的な致死を計算した。（Ｃ）ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたり１０匹）を、４×１０^９ベクターゲノムのＯＶＡ−ＡＨ１Ａ５をコードするＩＤ−ＶＰ０２で免疫化した。４週間後、マウスに、右脇腹に８×１０^４ＣＴ２６腫瘍細胞を皮下注射し、腫瘍が１００ｍｍ^２を超えたときに、マウスを殺処分した。（Ｄ）治療的免疫化：ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたり１０匹）に、８×１０^４ＣＴ２６腫瘍細胞を皮下注射した。４日後、マウスを、４×１０^９ベクターゲノムのＯＶＡ−ＡＨ１Ａ５をコードするＩＤ−ＶＰ０２で免疫化するか、または処置しないままにし、腫瘍が１００ｍｍ^２を超えたときに、マウスを殺処分した。

本開示は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞（例えば、樹状細胞）に効率的に結合し、生産的に感染させる偽型レンチウイルスベクター粒子を生成するために有用な方法および材料に関する。本開示における方法および材料は、レンチウイルスベクター粒子中のＶｐｘタンパク質と、エンベロープ内において、高度にマンノシル化されている（例えば、キフレンシンの存在下で、ウイルスパッケージング細胞を培養することによって）アルファウイルス糖タンパク質（例えば、シンドビスウイルス糖タンパク質）との組み合わせが、エンベロープ内において、Ｖｐｘタンパク質または高マンノシル化糖タンパク質のいずれかを欠いているレンチウイルスベクター粒子よりもさらに効率的に、ＤＣ−ＳＩＧＮ（例えば、樹状細胞）を発現する非分裂細胞に感染させるレンチウイルスベクター粒子をもたらす予想外の発見に関する。本開示の１つの有利な態様は、シンドビスウイルスＥ２糖タンパク質により偽型化され、キフネンシンの存在下で産生されるレンチウイルスベクター粒子が、ビリオン中にＶｐｘタンパク質を含む場合、さらにより効率的に、樹状細胞に感染し、そのため、樹状細胞への対象となる配列（例えば、抗原をコードするポリヌクレオチド）の送達および発現を可能にすることである。

定義

ポリペプチドに関連して使用される場合、「機能的断片」という用語は、切断されている、つまり、Ｎ末端またはＣ末端から１つ以上のアミノ酸を欠失している、そして、所望の活性を保持する、ポリペプチドを意味する。Ｖｐｘタンパク質に関連して使用される場合、「機能的断片」とは、ＳＡＭＨＤ１の活性を阻害する能力を保持する断片を意味する。この用語は、切断されているポリヌクレオチドに同様に適用され得る。

ポリペプチドに関連して使用される場合、「変異体」という用語は、親ポリペプチドに対して１つ以上の置換、欠失、または挿入を有するポリペプチドを意味する。いくつかの文脈において、変異体は、所望の活性を保持するものである。Ｖｐｘタンパク質に関連して使用される場合、「機能的変異体」とは、ＳＡＭＨＤ１の活性を阻害する能力を保持する変異体を意味する。この用語は、親ポリヌクレオチドに対して１つ以上の置換、欠失、または挿入を有するポリヌクレオチドに同様に適用され得る。

本明細書で使用される、「保存的アミノ酸置換」という用語は、同様の特性、例えば、大きさ、電荷、疎水性、親水性、および／または芳香性を有する別のアミノ酸とのあるアミノ酸の置換であり、以下に示されるような、交換が含まれる。

一般的な側鎖特性を共有するアミノ酸残基は、しばしば、以下の通りに分類される。
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、
（２）中性の親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ、
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ、
（５）鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ、および
（６）芳香性：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。

本明細書で使用される、「組み込み不能」および「組み込み不良」という用語は、互換的に使用される。組み込み不能ウイルスベクターは、組み込むときに、組み込み可能ウイルスベクターよりも効率が少なくとも１０倍（好ましくは、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍、少なくとも２００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも３００倍、少なくとも３５０倍、少なくとも４００倍、少なくとも４５０倍、少なくとも５００倍、少なくとも５５０倍、少なくとも６００倍、少なくとも６５０倍、少なくとも７００倍、少なくとも７５０倍、少なくとも８００倍、少なくとも８５０倍、少なくとも９００倍、少なくとも９５０倍、または少なくとも１０００倍）少ないベクターである。例えば、組み込み不能とは、組み込むときに、組み込み不良であるように修飾されていないウイルスベクターよりも効率が少なくとも約２０倍〜約１００倍少ないことを意味し得る。組み込みは、当該技術分野で知られているあらゆる方法、例えば、Ａｌｕ要素に近い組み込み事象のＰＣＲ検出によって測定することができる。

「偽型」レンチウイルスは、レンチウイルスゲノムとは異なるウイルスによってコードされる１つ以上のエンベロープ糖タンパク質を有するレンチウイルス粒子である。エンベロープ糖タンパク質は、本明細書に記載されるように、修飾、突然変異、または操作され得る。

本明細書で使用される、「外因性抗原」という用語は、本明細書に開示されるレンチウイルスベクターに発現されるように遺伝子を操作する抗原を指す。したがって、用語は、本明細書に開示されるレンチウイルスベクターに発現されるように遺伝子を操作するＨＩＶ由来の抗原を明確に含む。

本明細書で使用される、「ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に優先的に結合する」シンドビスＥ２糖タンパク質は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現しない細胞よりも効率的にＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に結合する糖タンパク質である。

シンドビスウイルスエンベロープタンパク質は、４つのＮ連結グルカン（Ｅ２タンパク質に２つ、そして、Ｅ１タンパク質に２つ）を含む。哺乳動物細胞において、マンノシダーゼＩ阻害剤の不在下で産生されるウイルスの２つのＮ−グルカンは、高マンノース構造を有し（１つは、Ｅ２Ｎ連結グルカンであり、１つは、Ｅ１Ｎ連結グルカン）、一方、残りの２つは、複合体構造を有する。２つの複合体構造のＮ−グルカンは、エンベロープタンパク質の表面上に露出しており、一方、２つの高マンノース構造のＮ−グルカンは、エンベロープタンパク質の三量体の中心に埋没している。参照により組み込まれる、Ｍｏｒｉｚｏｎｏｅｔａｌ．，ＪＶｉｒｏｌ，８４：１４，６９２３−３４（２０１０）を参照されたい。したがって、通常、哺乳動物細胞内に産生されるシンドビスウイルス糖タンパク質を有するウイルス粒子におけるＮ連結グルカンの５０％は、高マンノース構造を有する。「高度にマンノシル化されている」ウイルス粒子は、例えば、質量分析法（Ｃｒｉｓｐｉｎｅｔａｌ．，ＪＢＣ２００９を参照されたい）によって測定される、ウイルスエンベロープ糖タンパク質においてＮ連結グルカンの少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％が、少なくともＭａｎ_５構造、好ましくはＭａｎ_９を含む、粒子である。
ＳＡＭＨＤ１阻害剤
ＶｐｘおよびＶｐｒ

いくつかのまたは任意の実施形態において、ＳＡＭＨＤ１阻害剤は、Ｖｐｘタンパク質またはＶｐｒタンパク質である。Ｖｐｘは、とりわけ、ＨＩＶ−２、ＳＩＶスーティマンガベイ（ＳＩＶｓｍ）、ＳＩＶシロエリマンガベイ（ＳＩＶｒｃｍ）、およびＳＩＶマカク（ＳＩＶｍａｃ）のウイルスによってコードされる。ＨＩＶ−２およびＳＩＶのＶｐｘは、１１２−アミノ酸（ａａ）、１８ｋＤａタンパク質であり、ｐ５５^ｇａｇ前駆体のｐ６領域との相互作用を通してかなりの量のビリオン中にパッケージ化されている。Ｖｐｘは、最近、ヒト樹状および骨髄細胞に発現される制限因子、ＳＡＭＨＤ１の活性を阻害することが示された。Ｌａｇｕｅｔｔｅｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７４，６５４−６５７（２０１１）。ＳＡＭＨＤ１は、概して、ＨＩＶ−１感染に効果がないヒト樹状および骨髄細胞を示す制限因子として特定された。

ＳＩＶおよびＨＩＶ−２からのＶｐｘは、アミノ酸レベルで８３％同一である。Ｇｏｕｊｏｎｅｔａｌ．，ＪＶｉｒｏｌ，８２：２４，１２３３５−１２３４５（２００８）を参照されたい。したがって、ＳＩＶとＨＩＶ−２で異なる残基は、Ｖｐｘ機能には、重要でないと仮定され得る。さらに、ＳＩＶおよびＨＩＶ−２からのＶｐｘの突然変異分析は、その他によって行われ、本開示の材料および方法で使用するＶｐｘ変異体を生成する際に指針として使用され得る。Ｇｏｕｊｏｎらを参照されたい。Ａｓｎ２６Ａｌａ、Ｓｅｒ５２Ａｌａ、およびＳｅｒ６３Ａｌａ／Ｓｅｒ６５Ａｌａ突然変異体は、Ｖｐｘ機能に影響を及ぼさない。プロリンに富むＣ末端１１残基、Ｓｅｒ１３Ａｌａ、Ｌｙｓ８４Ａｌａ／Ｌｙｓ８５Ａｌａ、Ｔｈｒ１７Ａｌａ、Ｔｈｒ２８Ａｌａ、Ｇｌｙ８６Ａｌａ／Ｃｙｓ８７Ａｌａ、Ｓｅｒ１３Ａｌａ／Ｔｈｒ１７Ａｌａ／Ｔｈｒ２８Ａｌａ、Ｈｉｓ３９Ａｌａ、およびＴｙｒ６６Ａｌａ／Ｔｙｒ６８Ａｌａ／Ｔｙｒ７１Ａｌａ、Ｔｒｐ４９Ａｌａ／Ｔｒｐ５３Ａｌａ／Ｔｒｐ５６Ａｌａ、およびＬｙｓ６８Ａｌａ／Ｌｙｓ７７Ａｌａ突然変異体の欠失は、Ｖｐｘ活性を抑止する。

いくつかのまたは任意の実施形態において、本明細書に記載されるレンチウイルスベクター粒子は、Ｖｐｘタンパク質またはその変異体を含む。いくつかのまたは任意の実施形態において、変異体は、ＳＡＭＨＤ１を阻害する能力を保持する。いくつかのまたは任意の実施形態において、変異体は、配列番号４５（ＳＩＶｓｍＶｐｘ）と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかのまたは任意の実施形態において、変異体は、配列番号４６（ＳＩＶｒｃｍＶｐｘ）と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかのまたは任意の実施形態において、変異体は、配列番号４４（ＳＩＶｍａｃＶｐｘ）と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかのまたは任意の実施形態において、変異体は、配列番号４７（ＨＩＶ−２）と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

Ｖｐｘの抗ＳＡＭＨＤ１活性は、ＶｐｘのＮ末端の８６残基に局在化されている。Ｇｒａｍｂｅｒｇｅｔａｌ．，ＪＶｉｒｏｌ，８４：３，１３８７−１３９６。したがって、いくつかのまたは任意の実施形態において、機能的断片は、ＶｐｘのＳＡＭＨＤ１阻害領域、すなわち、配列番号４４のアミノ酸残基１〜８６を含む。

Ｖｐｘは、いくつかのレンチウイルスのみに存在するが、すべての霊長類のレンチウイルスは、Ｖｐｒと称されるＶｐｘに密接に関係する遺伝子をコードする。Ｖｐｒは、細胞周期停止させることで知られている。しかしながら、最近、ＳＩＶｄｅｂおよびＳＩＶｍｕｓから単離されたＶｐｒタンパク質は、ヒトＳＡＭＨＤ１を阻害することが示された。Ｌｉｍｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＨｏｓｔ＆Ｍｉｃｒｏｂｅ，１１，１９４−２０４（２０１２）。したがって、いくつかのまたは任意の実施形態において、本明細書に記載されるレンチウイルスベクター粒子は、ＳＡＭＨＤ１を阻害するＶｐｒタンパク質、またはＳＡＭＨＤ１を阻害する能力を保持するその変異体を含む。いくつかのまたは任意の実施形態において、変異体は、配列番号４８（ＳＩＶｄｅｂＶｐｒ）と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかのまたは任意の実施形態において、変異体は、配列番号４９（ＳＩＶｍｕｓＶｐｒ）と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

タンパク質の配列アラインメントからの情報を使用して、上で定義されるような、機能的変異体およびＶｐｘの機能的断片変異体を生成することができる。アミノ酸を欠失するおよび突然変異するための手技は、当該技術分野でよく知られている。Ａｕｓｕｂｅｌ，
Ｆ．Ｍ．ｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，（１９９８）（２０１１年までのすべての付録を含む）を参照されたい。概して、機能的変異体を構築するために、非保存的または保存的置換または欠失は、これらの位置が、機能を保持しながら、非保存的置換を可能にする傾向があるため、Ｖｐｘタンパク質をコードするウイルスとは異なる位置で導入することができる。ウイルスにわたって保存されたアミノ酸残基を有する位置に関しては、残基が保持されるか、または保存的置換が導入される。Ｖｐｘ、Ｖｐｒ、およびその変異体は、本明細書に開示されるまたは当該技術分野で知られている方法に従って、ＳＡＭＨＤ１の活性を阻害する能力について試験される。参照によりそれらの全体が組み込まれる、Ｌｉｍｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＨｏｓｔ＆Ｍｉｃｒｏｂｅ，１１，１９４−２０４（２０１２）およびＬａｈｏｕａｓｓａｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＩｍｍｕｎｏｌ，１３：３，２２３−２２９（２０１２）を参照されたい。

ＳＩＶｍａｃＶｐｘのＨＩＶ−１ビリオンへのパッケージ化が、ＳＩＶｍａｃｐ６に類似しているＧａｇタンパク質のｐ６領域の修飾を必要とすることを示す前の報告にもかかわらず（Ｓｕｎｓｅｒｉｅｔａｌ．，ＪＶｉｒｏｌ，８６：６（２０１２））、本発明者は、ｐ６を修飾する、またはＶｐｘをＨＩＶ−１Ｖｐｒに融合させる必要なく、本明細書に開示されるＨＩＶ−１系偽型レンチウイルスベクターに効率的にパッケージ化されることを予想外に発見している。したがって、いくつかのまたは任意の実施形態において、Ｖｐｘタンパク質は、Ｖｐｒタンパク質に融合されない。同様に、いくつかのまたは任意の実施形態において、パッケージング細胞内のｇａｇタンパク質は、その天然配列からは修飾されない。

いくつかのまたは任意の実施形態において、Ｖｐｘタンパク質は、ＨＩＶ−１Ｖｐｒタンパク質に融合されない。

通常、Ｖｐｘタンパク質は、ウイルス粒子内にパッケージ化される。しかしながら、いくつかのまたは任意の実施形態において、Ｖｐｘタンパク質をコードする遺伝子は、レンチウイルスゲノム内に含まれ、ウイルス粒子を標的細胞に感染する場合に、発現される。ウイルスベクターエンベロープ

節足動物媒介性ウイルス（アルボウイルス）は、蚊等の感染した節足動物ベクターによって、ヒト、ウマ、またはトリ等の宿主に伝播するウイルスである。アルボウイルスは、正極性の一本鎖ＲＮＡゲノムと、糖タンパク質含有エンベロープとを有する、アルファウイルスおよびフラビウイルスを含む、ウイルスの亜科にさらに分割される。例えば、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、およびウエストナイルウイルスは、フラビウイルス科に属し、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルスは、アルファウイルス科の成員である（Ｗａｎｇｅｔａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６，４９９２（１９９２））。シンドビスウイルスのエンベロープは、２つの膜貫通糖タンパク質を含み（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙｅｔａｌ．ＮａｔｕｒｅＲｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．３，１３（２００５））、Ｅ１は、融合に関与すると考えられ、Ｅ２は、細胞結合に関与すると考えられる。シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質は、オンコレトロウイルスおよびレンチウイルスを含む、他のレトロウイルスを偽型化することが知られている。

シンドビスウイルスおよび他のアルファウイルスのエンベロープは、ウイルス粒子膜の脂質二重層に組み込み、通常、２つの糖タンパク質、Ｅ１およびＥ２の複数の複製を含む。それぞれの糖タンパク質は、膜貫通領域を有し、Ｅ２は、約３３残基細胞質ドメインを有するが、Ｅ１の細胞質尾部は、非常に短い（約２残基）。Ｅ１およびＥ２はいずれも、膜貫通領域内または付近に付着したパルミチン酸を有する。Ｅ２は、最初に、フリンまたは他のＣａ２＋依存セリンプロテイナーゼによって、Ｅ２および小糖タンパク質であるＥ３に切断される、前駆体タンパク質として合成される。Ｅ２およびＥ１をコードする配列の間に、タンパク質をコードする配列である６Ｋが位置する。Ｅ３および６Ｋは、Ｅ２およびＥ１糖タンパク質をそれぞれ膜に移行させる働きをする、シグナル配列である。シンドビスウイルスゲノムにおいて、シンドビスエンベロープタンパク質のコード領域は、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、およびＥ１をコードする配列を含む。本明細書で使用される、アルボウイルスの「エンベロープ」は、少なくともＥ２を含み、またＥ１、６Ｋ、およびＥ３を含んでもよい。シンドビスウイルス、ＨＲ株のエンベロープ糖タンパク質の例示的な配列は、配列番号１７（Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、およびＥ１ポリタンパク質）として示される。他のアルボウイルスのエンベロープ糖タンパク質の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにおいて認めることができる。例えば、デングウイルス糖タンパク質をコードする配列は、受託番号ＧＱ２５２６７７（特にＧｅｎＢａｎｋにおいて）およびＮＣＢＩにおけるウイルス変異データベース（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号およびウイルス変異データベースは、エンベロープ糖タンパク質配列を参照することにより組み込まれる）において認めることができ、ベネズエラウマ脳炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする配列は、受託番号ＮＰ０４０８２４（エンベロープ糖タンパク質の配列を参照することによって組み込まれる）において認めることができる。

「Ｅ２糖タンパク質の残基番号」への参照（残基１６０、７０、７６、または１５９等）は、シンドビス株ＨＲのＥ２糖タンパク質（すなわち、「シンドビスＨＲ参照株」）である、配列番号１８のタンパク質のアミノ酸配列を参照することにより定義される。例えば、残基７０が配列番号１８から欠失しているシンドビスＥ２糖タンパク質の変異体が産生される場合、「残基１６０」は、そのような変異体の実際の残基１５９を指す。他のアルファウイルスにおいて類似した位置は、相同性を最大にするアラインメントを通して決定され得る。

「付着」、「結合」、「標的」等の用語の使用は、同義的に用いられ、シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質と細胞成分との間の相互作用の機構を示すことを意味しない。ＤＣ−ＳＩＧＮ（樹状細胞特異的なＩＣＡＭ−３（ＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＡｄｈｅｓｉｏｎＭｏｌｅｃｕｌｅｓ３）−ＧｒａｂｂｉｎｇＮｏｎｉｎｔｅｇｒｉｎ、ＣＤ２０９としても知られる）は、物質の急速結合およびエンドサイトーシスが可能なＣ型レクチン様受容体である（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ，Ｔ．Ｂ．，ｅｔａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：３３−５４，２００４）。Ｅ２は、ＤＣ−ＳＩＧＮを通して樹状細胞に対してウイルスを標的とすると考えられる。本明細書に示されるように、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現しない同質遺伝子細胞よりも優れた（少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍優れた）シンドビスウイルスＥ２により偽型化したウイルスベクター粒子によって形質導入される。Ｅ２糖タンパク質がウイルス感染を促進する機構は、場合によって、ＤＣ−ＳＩＧＮに直接結合するか、または構造もしくは一部の他の機構を変更することによって、ＤＣ−ＳＩＧＮに関与すると考えられる。実際の機構に関わらず、Ｅ２による標的化は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞、つまり樹状細胞に優先的である。

シンドビスウイルスはまた、ヘパラン硫酸を介して細胞に結合する（Ｋｌｉｍｓｔｒａ
ｅｔａｌ．，ＪＶｉｒｏｌ７２：７３５７，１９９８、ＢｕｒｍｅｓａｎｄＧｒｉｆｆｉｎ，ＪＶｉｒｏｌ７２：７３４９，１９９８）。ヘパラン硫酸および他の細胞表面グリコサミノグリカンは、大部分の細胞型の表面に見られるため、ヘパラン硫酸とシンドビスエンベロープ糖タンパク質との間の相互作用を減少させることが望ましい。これは、シンドビスウイルスエンベロープのヘパラン硫酸への結合を減少させるか、またはシンドビスウイルスエンベロープの樹状細胞への結合を増加させる、例えば、親和性を増加させるか、またはそれら両方によって達成することができる。結果として、他の細胞型によって発現され得、かつエンベロープがＤＣ−ＳＩＧＮに特異的である場合でさえも起こり得る、他の分子への非特異的結合が減少し、向上した特異性が、望ましくない副作用、例えば、望ましい免疫反応を低減し得る副作用または他の細胞型の的外れな形質導入と関連付けられる副作用を回避する役割を果たし得る。ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞の比較的特異的な形質導入の利点の代替として、またはそれらに加えて、シンドビスウイルスエンベロープＥ２糖タンパク質により偽型化したウイルス粒子は、ＶＳＶＧ等の糖タンパク質により偽型化したウイルス粒子を超える他の利点を提供し得る。そのような利点の例には、補体媒介性溶解の減少および／または神経細胞標的の減少が挙げられ、これらのいずれもＶＳＶ−Ｇにより偽型化したウイルス粒子の投与と関連すると考えられる。

様々な実施形態において、本明細書に開示されるレンチウイルスベクター粒子は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞に特異的に結合し、ヘパラン硫酸への結合を減少または抑止した。つまり、シンドビスウイルスエンベロープＥ２糖タンパク質は、他の細胞型に対してＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞にウイルスを優先的に配向するように修飾されてもよい。他の研究中の構造研究および分子モデリングから得られる情報に基づいて、エンベロープタンパク質の変異体配列、特にＥ２およびＥ１糖タンパク質は、糖タンパク質がエンベロープタンパク質としてのそれらの機能を維持するが、望ましい結合特異性、親和性、または結合レベルを有するように設計および生成される。それぞれの糖タンパク質に対する変異体配列の候補を作製し、下記の方法または当該技術分野で知られている他の方法を使用して分析して、最も望ましい特性を有するエンベロープ糖タンパク質を特定してもよい。

シンドビスＥ２のある変異体配列は、配列番号１または配列番号１８（Ｅ２シンドビスＨＲ参照配列）と比較して、残基１６０において少なくとも１つのアミノ酸の変更を有する。残基１６０は、欠失しているか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸に変更する。変更は、最も一般的に、少なくとも１つのアミノ酸の置換であるが、代替的に、変更は、１つ以上のアミノ酸の付加または欠失であり得る。好ましくは、あらゆる追加アミノ酸は、少数であり、安全性を損なう恐れがある抗原エピトープ（例えば、血球凝集素タグ配列）を含まない。２つ以上の変更がある場合、それらはいずれも同一型（例えば、置換）または異なる型（例えば、置換および欠失）であり得る。複数の変更は、タンパク質配列において分散するか、または隣接して位置付けることができる。

いくつかの実施形態において、変異体配列は、シンドビスウイルスＥ２（配列番号１８）の約残基５０〜約残基１８０の領域に少なくとも１つのアミノ酸変更を含む。この領域内に、ヘパラン硫酸への結合に関与するアミノ酸が存在する。Ｅ２の正味正電荷を減少させることによって、ヘパラン硫酸との静電相互作用を減少させることができ、ヘパラン硫酸への結合を減少させる。この領域内の正電荷アミノ酸の候補には、配列番号１８の残基６３、７０、７６、８４、９７、１０４、１２９、１３１、１３３、１３９、１４８、１４９、１５９におけるリシン、および残基６５、９２、１２８、１３７、１５７、１７０、１７２におけるアルギニンが挙げられる（Ｂｅａｒｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
３４７：１８３−１９０，２００６）。これらのアミノ酸の少なくともいくつかは、ヘパラン硫酸へのＥ２結合において直接関与する。正味正電荷は、リシンもしくはアルギニンの欠失、またはリシンもしくはアルギニンの中性もしくは負電荷アミノ酸による置換によって減少させることができる。例えば、これらのリシンおよびアルギニンの１つ以上は、グルタミン酸またはアスパラギン酸と置換されてもよい。ある実施形態は、リシン７０、７６、または１５９の少なくとも１つの置換を有する。Ｅ２が、Ｅ３を有するポリタンパク質として発現される場合、天然Ｅ３／Ｅ２切断部位に隣接して位置するリシンが維持される。つまり、認識配列および切断部位は未変更である。あるいは、天然エンドペプチダーゼ切断部位配列は、異なるエンドペプチダーゼの認識配列と置換される。

シンドビスウイルスＥ２のある変異体はまた、樹状細胞への結合に良い影響を与える方法で修飾される。参照ＨＲ配列（配列番号１８）の残基１６０において認められるグルタミン酸の変更は、樹状細胞への結合を向上させることができる（Ｇａｒｄｎｅｒｅｔａｌ．，ＪＶｉｒｏｌ７４，１１８４９，２０００を参照されたく、その全体が組み込まれる）。残基１６０の欠失または残基１６０の置換等の変更は、ある変異体において認められる。特定の変異体において、非電荷アミノ酸は、Ｇｌｕに置換され、他の変異体において、非酸性アミノ酸は、Ｇｌｕに置換される。通常、Ｇｌｕ１６０は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンを含む、小アミノ酸または脂肪族アミノ酸の１つと置換される。

他の変異体は、２つ以上（例えば、３、４、または５つ）のアミノ酸変更を含む。通常、これらの変異体において、変更の１つはＧｌｕ１６０であり、残りの変更（複数を含む）は、残基約５０〜約１８０にわたる領域内のリシンおよびアルギニンの１つ以上の変更である。ある変異体は、非酸性残基へのＧｌｕ１６０の変更または欠失、および非塩基性アミノ酸へのリシン７０、リシン７６、またはリシン１５９の１つ以上の変更を含む。いくつかの特定の変異体は、Ｇｌｙに対してＧｌｕ１６０、Ｇｌｕに対してＬｙｓ７０、およびＧｌｕに対してＬｙｓ１５９；Ｇｌｙに対してＧｌｕ１６０、Ｇｌｕに対してＬｙｓ７０、７６、および１５９；Ｇｌｕに対してＧｌｕ１６０およびＬｙｓ７０および１５９の欠失；ならびにＧｌｕ１６０およびＧｌｕに対してＬｙｓ７０、７６、および１５９の欠失を含む。いくつかの実施形態において、Ｅ２変異体は、配列番号３０〜４３［ＳＩＮｖａｒ１−１４Ｅ２］のいずれか１つと８０〜１００％（例えば、８２％、８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％）同一である。

ある例において、Ｅ２タンパク質は、最初に、少なくともＥ３との融合またはリーダー配列との融合において、ポリタンパク質として発現される。リーダー配列がＥ３であるか、または別の配列であるかに関わらず、ウイルスエンベロープのＥ２は、Ｅ３または別のリーダー配列を含んではならない。言い換えれば、Ｅ２は、好ましくは、Ｅ３／Ｅ２融合タンパク質ではない。ある実施形態において、Ｅ２は、Ｅ３−Ｅ２−６Ｋ−Ｅ１ポリタンパク質の一部として発現される。これらの実施形態において、ポリタンパク質は、配列番号３〜１６［ＳＩＮｖａｒ１−１４ポリタンパク質］のいずれか１つと８０〜１００％（例えば、８２％、８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、９７％、または９９％）同一である。シンドビスウイルスは、ポリタンパク質の一部として、Ｅ２を自然に発現し、Ｅ３／Ｅ２、Ｅ２／６Ｋ、および６Ｋ／Ｅ１の接合領域は、エンドペプチダーゼによって認識および切断される配列を有する。通常、Ｅ３／Ｅ２接合は、残基６５〜６６の間でフリンまたはフリン様セリンエンドペプチダーゼによって切断される。フリンは、２つのアミノ酸によって分離される、対アルギニン残基に対して特異性を有する。フリンによるＥ３／Ｅ２切断を維持するために、残基６２〜６６（ＲＳＫＲＳ、配列番号２６）は、２つのアミノ酸分離を有する２つのアルギニン残基、およびセリン残基を維持しなければならない。あるいは、Ｅ３／Ｅ２フリン切断配列または他の切断配列のいずれかの代わりに、異なる切断配列を使用することができる。認識部位および切断部位は、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ（例えば、カテプシンＤ、キモシン、ＨＩＶプロテアーゼ）、システインエンドペプチダーゼ（ブロメライン、パパイン、カルパイン）、メタロエンドペプチダーゼ（例えば、コラーゲナーゼ、サーモリシン）、セリンエンドペプチダーゼ（例えば、キモトリプシン、ＩＸａ因子、Ｘ因子、トロンビン、トリプシン）、ストレプトキナーゼを含むが、これらに限定されない、エンドペプチダーゼのために組み込むことができる。これらの酵素の認識および切断部位は、よく知られている。

既述されるもの以外に、シンドビスウイルスＥ２内のアミノ酸が変更されてもよい。一般に、変異体Ｅ２配列は、参照Ｅ２配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するか、または少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有してもよい。いくつかの実施形態において、変異体Ｅ２配列は、配列番号３０［ＳＩＮｖａｒ１］に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するか、または少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有してもよい。いくつかの実施形態において、変異体Ｅ２配列は、配列番号３１［ＳＩＮｖａｒ２］に対して、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するか、または少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有してもよい。いくつかの実施形態において、変異体Ｅ２配列は、配列番号３２［ＳＩＮｖａｒ３］に対して、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するか、または少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有してもよい。

変異体糖タンパク質は、Ｅ２を含むエンベロープを有するウイルス粒子による樹状細胞の感染を促進する能力等の生物学的機能を呈しなければならない。実験は、ウイルス会合、細胞表面への付着、および感染の種々の態様において、重要な役割を有すると考えられる、エンベロープ糖タンパク質の領域が識別した。変異体を作製する場合、以下の情報をガイドラインとして使用することができる。Ｅ２の細胞質尾部−約残基４０８〜４１５は、ウイルス会合に重要である（Ｗｅｓｔｅｔａｌ．ＪＶｉｒｏｌ８０：４４５８−４４６８，２００６、その全体が組み込まれる）。他の領域は、二次構造の形成に関与し（約残基３３〜５３）、ならびに輸送およびタンパク質安定性に関与する（約残基８６〜１１９）（Ｎａｖａｒａｔｍａｒａｊａｈｅｔａｌ．，ＪＶｉｒｏｌ３６３：１２４−１４７，２００７、その全体が組み込まれる）。変異体は、膜に広がる領域、約残基３７０〜３８０の疎水性を維持してもよい。変異体は、Ｎ連結した糖鎖付加部位残基ＮＩＴ（残基１９６〜１９８）およびＮＦＴ（残基３１８〜３２０）の１つまたは両方を維持してもよく、パルミトイル化される部位の１つ以上を維持（Ｃ−３９６、Ｃ４１６、およびＣ４１７）（ＳｔｒａｕｓｓａｎｄＳｔｒａｕｓｓＭｉｃｒｏｂｉｏｌＲｅｖ５８，４９１−５６２，１９９４；ｐｐ．４９９−５０９が組み込まれる）。一方、Ｅ２の多くの領域は、有害な事象なしに変更されてもよい。例えば、Ｅ２の多くの異なる位置におけるトランスポゾンの挿入は、依然として生存ウイルスをもたらす（Ｎａｖａｒａｔｍａｒａｊａｈ、同書）。

ある実施形態において、タグペプチドは、Ｅ３、６Ｋ、またはＥ１タンパク質に組み込まれてもよい。いくつかの目的で、タグは、Ｅ２に組み込まれてもよいが、タグは、ヒト患者に投与するための産物での使用には望ましくない。短配列である（例えば、５〜３０アミノ酸）タグペプチドは、ウイルス粒子内のエンベロープ発現の欠失およびその存在の検出を促進するために使用することができる。検出目的のために、タグ配列は、通常、抗体または化学物質によって検出可能である。タグの別の用途は、ウイルス粒子の精製を促進することである。タグの結合パートナーを含有する基質は、ウイルスを吸収するために使用することができる。ウイルスの溶出は、結合パートナーからタグを移動させる部分による処理によって達成することができるか、またはタグ配列が切断可能な配列と結合している場合には適切なエンドペプチダーゼによる処理は、便宜的にウイルスの放出を可能にする。（例えば、Ｑｉａｇｅｎｃａｔａｌｏｇ，ＦａｃｔｏｒＸａＰｒｏｔｅａｓｅＳｙｓｔｅｍを参照されたい）。タグペプチドの除去は、一般に、動物被検体におけるウイルス粒子使用の安全目的で望ましい。タグが除去されない場合、タグに対する免疫反応が起こり得る。

適切なタグとしては、特に、これらの抗体が商業的に入手可能であるＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号２８）（米国特許第４，７０３，００４号、その全体が組み込まれる）、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ポリ（Ｈｉｓ）（米国特許第４，５６９，７９４号、その全体が組み込まれる）、チオレドキシン、ＨＡ（ヘマグルチニン）−タグが挙げられるが、これらに限定されない。ポリ（Ｈｉｓ）は、例えば、ニッケルまたはコバルト等の結合性金属イオンを含有する親和性媒体上に吸着し、低ｐＨ媒体で溶出することができる。

ウイルス粒子は、樹状細胞を標的とするウイルスに組み込まれるエンベロープ糖タンパク質の特異性を決定するように評価されてもよい。例えば、骨髄細胞の混合群を被検体から取得し、インビトロで培養することができる。あるいは、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現するか、または発現しない同質遺伝子細胞株を取得して使用することができる。組み換えウイルスを、骨髄細胞の混合群または同質遺伝子細胞株に投与することができ、ウイルスに組み込まれるレポーター遺伝子の発現は、培養細胞において分析することができる。ある実施形態は、限界希釈分析を用いてもよく、細胞の混合群は、別々の部分に分けられ、次に、漸減量のウイルス（例えば、それぞれの部分において、２倍、５倍、１０倍少ないウイルス）で別々にインキュベートされる。いくつかの実施形態において、混合細胞群中の感染細胞の少なくとも約５０％、より好ましくは、少なくとも約６０％、７０％、８０％、または９０％、さらにより好ましくは、少なくとも約９５％が、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞である。ある実施形態において、感染した樹状細胞対感染した非樹状細胞（または非ＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞）の比は、少なくとも約２：１、少なくとも約３：１、少なくとも約４：１、少なくとも約５：１、少なくとも約６：１、少なくとも約７：１、少なくとも約８：１、少なくとも約９：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約２０：１、少なくとも約３０：１、少なくとも約４０：１、少なくとも約５０：１、少なくとも約１００：１、少なくとも約２００：１、少なくとも約５００：１、少なくとも約１０００：１、少なくとも約５０００：１、少なくとも約１０，０００：１、またはそれ以上である。限界希釈については、通常、より優れた選択性が、より高い希釈（すなわち、より低量）のウイルス投入で見られる。

偽型ウイルス粒子の活性は、多様な手技のいずれかによって決定することができる。例えば、感染効率（ＩＵ、感染単位）を測定するための好適な方法は、ウイルス粒子を細胞に投与し、ベクターゲノム内でコードされる産物の発現を測定することによるものである。分析することができるあらゆる産物を使用してもよい。便宜的な種類の産物の１つは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光タンパク質である。使用することができる他の産物には、細胞表面上で発現されるタンパク質（例えば、抗体結合による検出）、酵素等が含まれる。産物が抗原であり、細胞が樹状細胞である場合、感染性／活性は、免疫応答を決定することによって評価することができる。さらに、哺乳動物における副作用を確認することが可能である。樹状細胞を特異的に標的とする能力は、例えば、以下に記載されるような細胞培養において直接試験することもできる。

ウイルス粒子を調製して、それらの選択性および／または標的細胞膜の貫通を促進するそれらの能力に関して試験することもできる。未修飾糖タンパク質を有するエンベロープを有するウイルス粒子は、比較のための対照として使用することができる。つまり、エンベロープ糖タンパク質の受容体を発現する細胞を、標準感染分析を使用して、ウイルスに感染させる。規定の時間後、例えば、感染から４８時間後に、細胞を採取することができ、例えば、フローサイトメトリーによって、ウイルスに感染した細胞の割合を決定することができる。選択性は、ウイルスに感染した細胞の割合を計算することによって、スコア化することができる。同様に、変異体エンベロープ糖タンパク質のウイルス力価への影響は、変異体エンベロープを含むウイルスに感染した細胞の割合を、対応する野生型（未修飾）エンベロープ糖タンパク質を含むウイルスに感染した細胞の割合で割ることによって定量化することができる。特に適切な変異体は、選択性と感染力価との最良の組み合わせを有する。変異体が選択されると、ウイルス濃度分析を行って、これらのウイルスが活性を低下させることなく濃縮され得ることを確認してもよい。ウイルスの上澄みを採取し、超遠心分離法によって濃縮する。ウイルスの力価は、ウイルス原液の限界希釈およびエンベロープ糖タンパク質の受容体を発現する細胞の感染によって決定することができ、上述されるように、ウイルスによって発現される産物の発現を測定する。

レンチウイルスベクター粒子の標的細胞への侵入は、別の種類の活性評価である。ＢｌａＭ−Ｖｐｒ（ベータラクタマーゼＶｐｒ）融合タンパク質を利用して、ＨＩＶ−１ウイルスの貫通、ＢｌａＭおよびシンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質、例えば、Ｅ１の融合を評価するか、またはＥ２／Ｅ１融合タンパク質を使用して、標的細胞への融合および貫通を促進することにおける、エンベロープタンパク質の有効性を評価することができる。ウイルス粒子は、例えば、ウイルス要素ＢｌａＭ−Ｖｐｒ、および対象となる変異体エンベロープ（ならびに適切な場合、親和性分子）を含む１つ以上のベクターによる、パッケージング細胞の一時的トランスフェクションによって調製されてもよい。得られたウイルスを使用して、標的分子（または親和性分子）が、結合の遊離阻害剤（抗体等）の不在または存在下で、特異的に結合する、分子を発現する細胞に感染させることができる。次いで、細胞は、ＣＯ_２非依存性培地で洗浄し、ＣＣＦ２染料（ＡｕｒｏｒａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を充填することができる。室温でインキュベートして、切断反応を完了させた後、パラホルムアルデヒドによって細胞を固定し、フローサイトメトリーおよび顕微鏡で分析することができる。青色細胞の存在は、細胞質へのウイルスの貫通を示し、遮断抗体が添加される場合は、青色細胞が少なくなることが予想される（Ｃａｖｒｏｉｓ
ｅｔａｌ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２０：１１５１−１１５４，２００２；その全体が組み込まれる）。

貫通が低ｐＨに依存するかどうかを調査し、所望のｐＨ依存を有するエンベロープ糖タンパク質を識別するために、ＮＨ_４ＣｌまたはｐＨを変更する他の化合物を、感染ステップにおいて添加することができる（ＮＨ_４Ｃｌは、エンドソームの酸性コンパートメントを中和する）。ＮＨ_４Ｃｌの場合において、青色細胞の消失は、ウイルスの貫通が低ｐＨ依存であることを示す。さらに、活性がｐＨ依存であることを確認するために、リソソーム作用剤、例えば、塩化アンモニウム、クロロキン、コンカナマイシン、バフィロマイシンＡｌ、モネンシン、ニゲリシン等を、インキュベーション緩衝液に添加してもよい。これらの薬剤は、エンドソームコンパートメント内のｐＨを上昇させる（例えば、ＤｒｏｓｅａｎｄＡｌｔｅｎｄｏｒｆ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．２００，１−８，１９９７）。これらの薬剤の阻害作用は、ウイルス融合および侵入に対するｐＨの役割を明らかにする。異なる融合分子を示すウイルス間の異なる侵入動態を比較し、特定の適用に対して最も適切なものが選択されてもよい。

ＰＣＲ系侵入分析を利用して、逆転写をモニタリングし、ウイルス侵入の動態を示すようなウイルスＤＮＡ合成の動態を測定することができる。例えば、特定のエンベロープタンパク質分子を含むウイルス粒子は、２９３Ｔ細胞等の標的細胞、ＤＣ、またはエンベロープタンパク質分子の適切な結合パートナー（受容体）を発現するように操作されたか、または自然に発現する、あらゆる他の細胞と共にインキュベートされる。即時または（感染を起こすための）時間増分後のいずれかで、未結合ウイルスを除去し、細胞のアリコートをウイルス核酸に関して分析する。これらのアリコートからＤＮＡを抽出して、一般に、半定量分析において、ＬＴＲ特異的プライマーでプライムする増幅分析にかける。ＬＴＲ特異的ＤＮＡ産物の出現は、ウイルス侵入の成功を示す。
レンチウイルスベクターゲノム

ウイルスベクター粒子は、対象となる少なくとも１つの配列（例えば、１、２、３、４、または５）を含むゲノムを含む。他の配列は、ゲノムがウイルス粒子にパッケージ化されるのを可能にする配列、および標的細胞の形質導入に続いて対象となる配列（複数を含む）の発現を促進する配列等を含んでもよい。ゲノムは、多量の適切な入手できるレンチウイルスゲノム系ベクターのいずれかに由来し得、ヒト遺伝子治療適用に対して識別されるもの、例えば、ＰｆｅｉｆｅｒおよびＶｅｒｍａによって説明されるものを含む（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．ＧｅｎｏｍｉｃｓＨｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２：１７７−２１１，２００１；参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。簡潔さの目的で、ゲノムは、「ウイルスベクターゲノム」または「ベクターゲノム」とも称される。
骨格

適切なレンチウイルスベクターゲノムは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）、ＨＩＶ−２、フェリン免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、およびマエディ／ビスナウイルスに基づくものを含む。レンチウイルスの望ましい特性は、それらが分裂および非分裂細胞の両方に感染することができることであり、標的細胞が分裂している（または標的細胞を刺激して分裂させる）必要はない。一般に、ゲノムおよびエンベロープ糖タンパク質は、得られたウイルスベクター粒子が偽型化されるように、異なるウイルスに基づく。望ましくは、ベクターゲノムの安全機能が組み込まれる。安全機能には、自己不活性化ＬＴＲおよび非組み込みゲノムが含まれる。

いくつかの例示的な実施形態において、ウイルスベクターゲノムは、レンチウイルスゲノム、例えば、ＨＩＶ−１ゲノムまたはＳＩＶゲノムからの配列を含む。ウイルスゲノム構成は、レンチウイウルスの５’および３’ＬＴＲからの配列を含み、特に、レンチウイルスの５’ＬＴＲ、およびレンチウイウルスからの不活性化または自己不活性化３’ＬＴＲからのＲおよびＵ５配列を含んでもよい。ＬＴＲ配列は、あらゆる種からのあらゆるレンチウイルスからのＬＴＲ配列であってもよい。例えば、それらは、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、またはＢＩＶからのＬＴＲ配列であってもよい。通常、ＬＴＲ配列は、ＨＩＶＬＴＲ配列である。

ベクターゲノムは、不活性化または自己不活性化３’ＬＴＲを含んでもよい（Ｚｕｆｆｅｒｅｙｅｔａｌ．ＪＶｉｒｏｌ７２：９８７３，１９９８、Ｍｉｙｏｓｈｉｅｔａｌ．，ＪＶｉｒｏｌ７２：８１５０，１９９８、米国公開第２０１０／０３２３４０３号、それらの全体がすべて組み込まれる）。自己不活性化ベクターは、一般に、３’側の長い末端反復（ＬＴＲ）からのエンハンサーおよびプロモーター配列の欠失を有し、ベクター組み込み中に５’ＬＴＲに複製される。一例において、３’ＬＴＲのＵ３要素は、そのエンハンサー配列、ポリプリン区画（ＰＰＴ）、ＴＡＴＡボックス、Ｓｐ１、およびＮＦ−カッパＢ部位の欠失を含有する。自己不活性化３’ＬＴＲの結果として、侵入および逆転写に続いて生成されるプロウイルスは、不活性化５’ＬＴＲを含む。その論理的根拠は、ベクターゲノムの移動のリスク、およびＬＴＲの付近の細胞プロモーターへの影響を減少させることによって、安全性を向上させることである。自己不活性化３’ＬＴＲは、当該技術分野で知られているあらゆる方法によって構成されてもよい。様々な実施形態において、偽型レンチウイルスベクターは、配列番号２３の配列を含むレンチウイルスベクターゲノムを含む。このベクターは、３’ＰＰＴおよびＴＡＴＡボックスの欠失を含む。したがって、ベクターは、（ａ）感染した標的細胞中で転写されたｄｓＤＮＡベクターからの完全長ベクターゲノムの転写が防止される、（ｂ）組み込み後の３’ＬＴＲが、プロモーターとして機能を果たし得る場合に生じ得る挿入による活性化のリスクを最小限に抑える、（ｃ）延長したＵ３欠失がさらなる、重複する安全機構（例えば、インテグラーゼの突然変異）によって捕捉され得るように、自己不活性化される。

任意に、レンチウイルス５’ＬＴＲからのＵ３配列は、ウイルス構成のプロモーター配列、例えば、異種プロモーター配列と置換されてもよい。これは、パッケージング細胞株から回収されたウイルスの力価を増加させることができる。また、エンハンサー配列が含まれてもよい。パッケージング細胞株においてウイルスＲＮＡゲノムの発現を増加させる、あらゆるエンハンサー／プロモーターの組み合わせが使用されてもよい。一実施例において、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター配列が使用される（米国特許第５，３８５，８３９号および米国特許第５，１６８，０６２号、これらのそれぞれはその全体が組み込まれる）。

ある実施形態において、挿入突然変異のリスクは、レンチウイルスベクターゲノムを組み込み不良となるように構成することによって最小化される。多様なアプローチを遂行して、非組み込みベクターゲノムを産生することができる。これらのアプローチは、不活性インテグラーゼを有するタンパク質をコードするように、ｐｏｌ遺伝子のインテグラーゼ酵素成分への突然変異（複数を含む）を操作することを含む。ベクターゲノム自体を修飾して、例えば、付着部位の一方または両方を突然変異もしくは欠失すること、または欠失もしくは修飾を通して３’ＬＴＲ−近位ポリプリン区画（ＰＰＴ）を非機能的にすることによって、組み込みを回避することができる。さらに、非遺伝的アプローチが使用可能であり、これらは、インテグラーゼの１つ以上の機能を阻害する薬理作用のある薬物を含む。アプローチは、相互排他的ではなく、つまり、それらの１つより多くを一度に使用することができる。例えば、インテグラーゼおよび付着部位の両方が非機能的であり得るか、またはインテグラーゼおよびＰＰＴ部位が非機能的であり得るか、または付着部位およびＰＰＴ部位が非機能的であり得るか、またはそれらのすべてが非機能的であり得る。

上記のように、１つのアプローチは、非機能的インテグラーゼを作製および使用することである。インテグラーゼは、ウイルス二重鎖平滑末端ＤＮＡの切断と、染色体標的部位の２つの鎖において、末端を５’リン酸塩に結合することに関与する。インテグラーゼは、亜鉛結合モチーフ（ＨＨＣＣ）を含有するＮ末端ドメイン、触媒コアおよび保存ＤＤ３５Ｅモチーフ（ＨＩＶ−１におけるＤ６４、Ｄ１１６、Ｅ１５２）を含有する中央ドメインコア、およびＤＮＡ結合特性を有するＣ末端ドメインの３つの機能ドメインを有する。インテグラーゼに導入される点突然変異は、正常機能を崩壊させるのに十分である。多くのインテグラーゼ突然変異が構成および特性化された（ＰｈｉｌｐｏｔｔａｎｄＴｈｒａｓｈｅｒ，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１８：４８３，２００７、Ａｐｏｌｏｎｉａ，ＴｈｅｓｉｓｓｕｂｍｉｔｔｅｄｔｏＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＣｏｌｌｅｇｅＬｏｎｄｏｎ，Ａｐｒｉｌ２００９，ｐｐ，８２−９７、Ｅｎｇｅｌｍａｎｅｔａｌ．ＪＶｉｒｏｌ６９：２７２９，１９９５、Ｎｉｇｈｔｉｎｇａｌｅ
ｅｔａｌ．ＭｏｌＴｈｅｒａｐｙ，１３：１１２１，２００６を参照されたく、これらのすべてはそれらの全体が組み込まれる）。インテグラーゼタンパク質をコードする配列を欠失または突然変異させて、好ましくは、逆転写酵素活性または核標的を著しく損なうことなく、タンパク質を不活性化することができ、それによって、プロウイルスの標的細胞ゲノムへの組み込みのみを回避する。許容される突然変異は、インテグラーゼ触媒、鎖移転、ａｔｔ部位への結合、宿主染色体ＤＮＡへの結合、および他の機能を低下させることができる。例えば、ＨＩＶまたはＳＩＶインテグラーゼの残基３５における、単一アスパラギン酸からアスパラギンへの置換は、ウイルスＤＮＡの組み込みを完全に抑止する。インテグラーゼの欠失は、一般に、Ｃ末端ドメインに限定される。残基２３５〜２８８のコード配列の欠失は、有用な非機能的インテグラーゼをもたらす（Ｅｎｇｅｌｍａｎ
ｅｔａｌ．ＪＶｉｒｏｌ６９：２７２９，１９９５）。さらなる実施例として、突然変異、例えば、Ａｓｐ６４（残基数は、ＨＩＶ−１に対して指定され、他のレンチウイルスまたはレトロウイルスからのインテグラーゼの対応する残基数は、当業者によって容易に決定され得る）（例えば、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ）、Ａｓｐ１１６（例えば、Ｄ１１６Ｎ）、Ａｓｎ１２０（例えば、Ｎ１２０Ｋ）、Ｇｌｕ１５２、Ｇｌｎ１４８（例えば、Ｑ１４８Ａ）、Ｌｙｓ１５６、Ｌｙｓ１５９、Ｔｒｐ２３５（例えばＷ２３５Ｅ）、Ｌｙｓ２６４（例えば、Ｋ２６４Ｒ）、Ｌｙｓ２６６（例えば、Ｋ２６６Ｒ）、Ｌｙｓ２７３（例えば、Ｋ２７３Ｒ）を生成することができる。他の突然変異を構成し、組み込み、導入遺伝子の発現、および任意の他の望ましいパラメーターに関して試験することができる。これらの機能に関する分析は、よく知られている。突然変異は、部位特異的突然変異誘発および核酸配列の化学合成を含む、多様な手技のいずれかによって生成することができる。１つの突然変異を作製してもよいか、または１つを超えるこれらの突然変異がインテグラーゼ内に存在することができる。例えば、インテグラーゼは、２つのアミノ酸、３つのアミノ酸、４つのアミノ酸等において、突然変異を有してもよい。

あるいは、またはインテグラーゼ変異体（複数を含む）の使用と組み合わせて、Ｕ３およびＵ５内の付着部位（ａｔｔ）を突然変異させることもできる。インテグラーゼは、これらの部位に結合し、３’末端ジヌクレオチドは、ベクターゲノムの両端で切断する。ＣＡジヌクレオチドは、陥没した３’末端に位置付けられ、ＣＡは、宿主染色体へのヌクレオチドブロック組み込みの突然変異を処理するために必要とされる。ＣＡジヌクレオチドのＡは、組み込みに最も重要なヌクレオチドであり、ゲノムの両端における突然変異は、最良の結果をもたらす（ＢｒｏｗｎｅｔａｌＪＶｉｒｏｌ７３：９０１１（１９９９）。一例示において、それぞれの末端のＣＡは、ＴＧに変更される。他の例示において、それぞれの末端のＣＡは、一端においてＴＧに変更され、他端においてＧＴに変更される。他の例示において、それぞれの末端のＣＡは欠失し、他の例示において、ＣＡのＡはそれぞれの末端で欠失する。

組み込みは、ポリプリン区画（ＰＰＴ）の突然変異または欠失によって阻害することもできる（国際公開第ＷＯ２００９／０７６５２４号、その全体が組み込まれる）、３’ＬＴＲ近位に位置付けられる。ＰＰＴは、プラス鎖ＤＮＡ合成のプライマー結合部位として機能することができる、約１５ヌクレオチドのポリプリン配列である。この例において、ＰＰＴの突然変異または欠失は、逆転写プロセスを標的とする。機構にとらわれることを望むものではないが、ＰＰＴを変異または欠失させることによって、線状ＤＮＡの産生は、根本的に減少し、本質的に１−ＬＴＲＤＮＡ環のみが産生される。組み込みは、線状二本鎖ＤＮＡベクターゲノムを必要とし、組み込みは、本質的にそれなしで排除される。上記のように、ＰＰＴは、変異または欠失によって非機能的にすることができる。通常、約１５ｎｔＰＰＴ全体が欠失されるが、一部の実施形態において、より短い１４ｎｔ、１３ｎｔ、１２ｎｔ、１１ｎｔ、１０ｎｔ、９ｎｔ、８ｎｔ、７ｎｔ、６ｎｔ、５ｎｔ、４ｎｔ、３ｎｔ、および２ｎｔの欠失が作製されてもよい。突然変異が作製される場合、通常、複数の突然変異が、特にＰＰＴの５’半分で作製されるが（ＭｃＷｉｌｌｉａｍｓ
ｅｔａｌ．，ＪＶｉｒｏｌ７７：１１１５０，２００３）、最初の４つの塩基における単一および二重突然変異は、依然として転写を減少させる。ＰＰＴの３’末端で作製される突然変異は、一般に、より劇的な効果を有する（ＰｏｗｅｌｌａｎｄＬｅｖｉｎＪＶｉｒｏｌ７０：５２８８，１９９６）。

ベクターゲノム非組み込みを作製するためのこれらの異なるアプローチは、個別または組み合わせて使用することができる。１つを超えるアプローチの使用は、重複機構によって二重安全ベクターを構築するために使用されてもよい。したがって、ＰＰＴ突然変異または欠失は、ａｔｔ部位突然変異もしくは欠失、またはインテグラーゼ突然変異と組み合わせることができるか、またはＰＰＴ突然変異もしくは欠失は、ａｔｔ部位突然変異もしくは欠失およびインテグラーゼ突然変異の両方と組み合わせることができる。同様に、ａｔｔ部位突然変異または欠失およびインテグラーゼ突然変異は、相互に組み合わされるか、またはＰＰＴ突然変異もしくは欠失と組み合わされてもよい。

偽型レンチウイルス粒子の安全性を強化するためのさらなる手技は、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を含むプラスミドを修飾して、レンチウイルスベクターとの潜在的な組み換え部位を排除することを含む。この手技は、単独で、または本明細書に記載される手技のいずれかと組み合わせて使用することができる。例えば、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子は、哺乳動物またはヒトの「コドンに最適化され」得る、すなわち、ｇａｇおよび／またはｐｏｌ遺伝子の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％のコドンが、同じアミノ酸をコードするが、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞には好まれる、コドンと置き換えられ、そのため、哺乳動物、例えば、ヒトの細胞中の発現を向上または最適化させる。ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子のコドンに最適化するために、「野生型」コドンをヒトゲノムにおいてさらに頻繁に利用されるコドンに変更するポリヌクレオチドが、生成される。しかしながら、ＨＩＶでは、ある部分のゲノムは、そのｍＲＮＡの同じ開始コドンから出発するＧａｇおよびＰｏｌを合成するために必要とされるフレームシフトを可能にするために、実質的には、元のコドン（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の元のコドン）を保持しなければならない。Ｇａｇ−Ｐｏｌの翻訳は、ｍＲＮＡのコドン４３２周辺のｐ７／ｐ１接合部の５’方向（−１シフト）において、リーディングフレームのシフトを必要とする。次いで、Ｇａｇ−Ｐｏｌの翻訳は、終止コドンが後で約３，０００ヌクレオチドに達するまで、この新しいリーディングフレームで進める。リボソーム−１のフレームシフトは、特定の滑りやすいコンセンサス配列とリボソームに中断をもたらす下流の二次ＲＮＡ構造の両方を必要とする非常に制御された事象である。したがって、本開示によれば、ｇａｇおよびｐｏｌをコードする核酸は、「最適化されないウインドウ」、つまり、配列番号５４のほぼ１２２８位から開始する（またはほぼ１２１８〜１２９８、もしくは１２１８〜１２３８、もしくは１２２８〜１２３８、もしくは１２１８〜１２２８、もしくは１２２８〜１２９８、もしくは１２３８〜１２４８、もしくは１２４８〜１２５８、もしくは１２５８〜１２６８、もしくは１２６８〜１２７８、もしくは１２７８〜１２８８、もしくは１２８８〜１２９８位で開始する）（ｇａｇ−ｐｏｌオープンリーディングフレーム）、実質的には、野生型ｇａｇ−ｐｏｌ配列から変化しない配列番号５４の１５０９位で終止する（または１３７３〜１５５８、もしくは１３７３〜１５０９、もしくは１３７３〜１５００、もしくは１３７３〜１４７０、もしくは１３７３〜１４４０、もしくは１３７３〜１４１０、もしくは１３７３〜１４０１、もしくは１３７３〜１３９２、もしくは１３７３〜１３８３、もしくは１４０１〜１５０９、もしくは１４４０〜１５０９、もしくは１４９９〜１５１９、もしくは１４９９〜１５０９、もしくは１５０９〜１５１９位で終止する）領域を含む。すなわち、最適化されないウインドウは、実質的には、元のコドン（例えば、少なくとも９０％、９５％、または１００％の元のコドン）を保持する。配列番号５４のヌクレオチド１２２８〜１５０９に相当する最適化されないウインドウは、配列番号５４が突然変異するか、またはより大きなヌクレオチド配列の一部であるとき、異なる実際のヌクレオチド番号付けを有し得る、例えば、プラスミドが配列番号５４に対して１００ヌクレオチド５’を含む場合、最適化されないウインドウは、プラスミド中のヌクレオチド１３２８〜１６０９に相当するであろうことが理解される。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド１２２９〜１２９８の領域は、実質的には、元のコドンを保持する、および／またはヌクレオチド１５１０〜１５５８の領域は、コドンに最適化される。いくつかの実施形態において、ＧａｇおよびＰｏｌをコードするコドンに最適化されるポリヌクレオチドは、配列番号５４を含む。いくつかの実施形態において、コドンに最適化されるｇａｇ−ｐｏｌポリヌクレオチドをコードするプラスミドは、配列番号５５の配列を含む。

いくつかのまたは任意の実施形態において、ヒトのコドン最適化されたｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をコードする（そして、上述の最適化されないウインドウを含む）プラスミドもまた、Ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）を欠いている。ＲＲＥの欠失は、ｇａｇ／ｐｏｌプラスミドとレンチウイルスベクタープラスミドとの間で同種および潜在的組み換えのさらに別の領域を排除する。組み合わせて、そのような手技は、ｇａｇ／ｐｏｌプラスミドとレンチウイルスベクターとの間の同種の領域を排除または最小化し、そのため、複製能力のあるウイルスをもたらし得るこれらのプラスミド間の組み換えの機会を最小化する。ＲＲＥは、依然として、パッケージング細胞およびプロセスに存在し得るが、異なるプラスミド上に存在することが理解される。
調節要素

本明細書に論じられるように、ウイルスベクターゲノムは、標的細胞において発現することが望ましい、対象となる配列を含む。通常、対象となる配列は、５’ＬＴＲと３’ＬＴＲ配列との間に位置付けられる。さらに、対象となる配列は、好ましくは、他の遺伝要素、例えば、プロモーターまたはエンハンサーを含む転写調節配列と機能的な関係にあり、特定の様式で対象となる配列の発現を調節する。ある例において、有用な転写調節配列は、活性に関して、時間的および空間的の両方に高度に調節されるものである。成分の発現を調節するために使用され得る発現制御要素は、当該技術分野で知られており、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、エンハンサー、および他の調節要素が含まれるが、これらに限定されない。

対象となる配列およびあらゆる他の発現可能な配列は、通常、内部プロモーター／エンハンサー調節配列と機能的関係にある。「内部」プロモーター／エンハンサーは、ウイルスベクター構成において、５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間に位置付けられるものであり、対象となる配列に作動可能に連結される。内部プロモーター／エンハンサーは、それが機能的関係にある遺伝子の発現を増加させることが知られている、あらゆるプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーの組み合わせであってもよい。「機能的関係」および「作動可能に連結された」とは、プロモーターおよび／またはエンハンサーが適切な分子と接触するとき、対象となる配列が発現される、プロモーターおよび／またはエンハンサーに関して、配列が正しい位置および配向にあることを意味するが、これらに限定されない。

内部プロモーター／エンハンサーの選択は、対象となる配列の望ましい発現パターンおよび知られているプロモーター／エンハンサーの特定の特性に基づく。したがって、内部プロモーターは、構成的に活性であってもよい。使用されてもよい構成的プロモーターの非限定例は、ユビキチンのプロモーター（米国特許第５，５１０，４７４号、国際公開第ＷＯ９８／３２８６９号、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ＣＭＶ（Ｔｈｏｍｓｅｎｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ８１：６５９，１９８４、米国特許第５，１６８，０６２号、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ベータ−アクチン（Ｇｕｎｎｉｎｇｅｔａｌ．１９８９Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：４８３１−４８３５、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、およびｐｇｋ（例えば、Ａｄｒａｅｔａｌ．１９８７Ｇｅｎｅ６０：６５−７４、Ｓｉｎｇｅｒ−Ｓａｍｅｔａｌ．１９８４Ｇｅｎｅ３２：４０９−４１７、およびＤｏｂｓｏｎｅｔａｌ．１９８２ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１０：２６３５−２６３７を参照されたく、前述のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を含む。いくつかの実施形態において、偽型レンチウイルスベクターゲノムによってコードされた抗原の発現を制御するために使用されるプロモーターは、イントロン欠損プロモーターである。いくつかの実施形態において、ヒトユビキチンＣ（ＵｂｉＣ）プロモーターは、偽型レンチウイルスベクターゲノムによってコードされた抗原の発現を制御するために使用される。様々な実施形態において、ＵｂｉＣプロモーターは、修飾して、イントロンを除去されており、つまり、このプロモーターは、イントロン欠損である。完全長ＵｂｉＣプロモーターは、１２５０ヌクレオチドである。イントロンは、４１２で開始し、終端まで続く（４１２〜１２５０）。この領域は、異種ウイルスゲノム転写産物を最小化するために欠失することができる。ＨＩＶウイルスゲノムは、その中に天然イントロンを有する。したがって、ＵｂｉＣプロモーターを含むレンチウイルスは、レンチウイルスゲノム中に合計２つのイントロンを有し得る。ＵｂｉＣイントロンは、スプライス型および非スプライス型の両方に存在し得る。ＵｂｉＣイントロンの欠失は、異種ウイルス転写産物の可能性をなくし、送達される偽型レンチウイルス粒子の同質性を確保する。

あるいは、プロモーターは、組織特異的プロモーターであってもよい。いくつかの好ましい実施形態、プロモーターは、標的細胞特異的なプロモーターである。例えば、プロモーターは、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１０３、ＴＬＲ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＢＤＣＡ−３、ＤＥＣ−２０５、ＤＣＩＲ２、マンノース受容体、Ｄｅｃｔｉｎ−１、Ｃｌｅｃ９Ａ、ＭＨＣクラスＩＩを含む、樹状細胞によって発現される、あらゆる産物に由来し得る。さらに、プロモーターは、対象となる配列の誘導性発現を可能にするように選択されてもよい。誘導性発現のための多数なシステムが当該技術分野で知られており、テトラサイクリン応答システム、ｌａｃオペレーター−リプレッサーシステム、ならびに熱ショック、金属イオンを含む多様な環境変化または生理学的変化に応答するプロモーター、例えば、メタロチオネインプロモーター、インターフェロン、低酸素症、ステロイド、例えば、プロゲステロンまたはグルココルチコイド受容体プロモーター、放射線、例えば、ＶＥＧＦプロモーターが含まれる。また、プロモーターの組み合わせを使用して、対象となる遺伝子の所望の発現を得てもよい。当業者は、対象となる有機体または標的細胞における遺伝子の所望の発現パターンに基づいて、プロモーターを選択することができる。

ウイルスゲノムは、少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩ応答性プロモーターを含んでもよい。このプロモーターは、対象となる配列に作動可能に連結させることができ、終結配列に連結させることもできる。さらに、１つを超えるＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩプロモーターを組み込んでもよい。ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびＩＩＩプロモーターは、当業者にはよく知られている。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの適切な範囲は、例えば、ＰａｕｌｅａｎｄＷｈｉｔｅ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ．，Ｖｏｌ．２８，ｐｐ１２８３−１２９８（２０００）において見出され得、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩプロモーターはまた、下流ＲＮＡコード配列を転写するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩを指示することができる、あらゆる合成または操作ＤＮＡ断片も含む。さらに、ウイルスベクターゲノムの一部として使用されるＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩ（ＰｏｌＩＩまたはＩＩＩ）プロモーター（複数を含む）は、誘導可能であり得る。あらゆる適切な誘導性ＰｏｌＩＩまたはＩＩＩプロモーターが、本発明の方法とともに使用することができる。特に適したＰｏｌＩＩまたはＩＩＩプロモーターは、ＯｈｋａｗａａｎｄＴａｉｒａ，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１１，ｐｐ５７７−５８５（２０００）およびＭｅｉｓｓｎｅｒｅｔ
ａｌ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２９，ｐｐ１６７２−１６８２（２００１）（それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において提供される、テトラサイクリン応答性プロモーターを含む。

内部エンハンサーはまた、対象となる遺伝子の発現を増加させるように、ウイルス構成に存在してもよい。例えば、ＣＭＶエンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ，４１：５２１，１９８５、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を使用してもよい。ＨＩＶ、ＣＭＶ等のウイルスゲノム、および哺乳動物ゲノム中の多くのエンハンサーが、識別および特徴付けられた（ＧｅｎＢａｎｋを参照されたい）。エンハンサーは、異種プロモーターと組み合わせて使用することができる。当業者は、所望の発現パターンに基づいて適切なエンハンサーを選択することができよう。

ウイルスベクターゲノムは、通常、標的細胞によって認識され、対象となる配列に作動可能に連結されるプロモーター、ウイルス成分、および本明細書に論じられる他の配列を含有する。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写が起こるのを可能にする、核酸配列によって形成される発現制御要素である。プロモーターは、誘導性、構成的、時間的に活性、または組織特異的であってもよい。誘導性プロモーターの活性は、生物的または非生物的要因の存在または不在によって誘導される。それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を、生物体の発生、その製造のある段階において、または特定の組織において、オンオフすることができるため、誘導性プロモーターは、遺伝子操作において有用なツールであり得る。誘導性プロモーターは、化学的に調節されるプロモーター、および物理的に調節されるプロモーターとして分類することができる。典型的な化学的に調節されるプロモーターとしては、アルコール調節されるプロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター）、テトラサイクリン調節されるプロモーター（例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター）、ステロイド調節されるプロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体（ＧＲ）系プロモーター、ヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）系プロモーター、モスエクジソン受容体系プロモーター、およびステロイド／レチノイド／チロイド受容体スーパーファミリーに基づくプロモーター）、金属調節されるプロモーター（例えば、メタロチオネイン遺伝子系プロモーター）、および病原性関連プロモーター（例えば、シロイヌナズナおよびトウモロコシ病原性関連（ＰＲ）タンパク質系プロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。典型的な物理的に調節されるプロモーターとしては、温度調節されるプロモーター（例えば、熱ショックプロモーター）、および光調節されるプロモーター（例えば、大豆ＳＳＵプロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。

当業者は、特定の状況に基づいて、適切なプロモーターを選択することができよう。多くの異なるプロモーターは、プロモーターを発現される遺伝子に作動可能に連結するための方法であるとして、当該技術分野でよく知られている。天然プロモーター配列および多くの異種プロモーターの両方を使用して、パッケージング細胞および標的細胞において発現を指示してもよい。しかしながら、異種プロモーターは、一般に、天然プロモーターと比較して、より優れた転写および所望のタンパク質のより高い収率を可能にするため、好ましい。

プロモーターは、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびサルウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから得られ得る。プロモーターはまた、例えば、異種の哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターもしくは免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーター、または通常、天然配列と関連付けられるプロモーターであってもよいが、但し、そのようなプロモーターは、標的細胞と適合する。一実施形態において、プロモーターは、ウイルス発現系において自然発生するウイルスプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、樹状細胞特異的なプロモーターである。樹状細胞特異的なプロモーターは、例えば、ＣＤ１１ｃプロモーターであり得る。

転写は、エンハンサー配列をベクター（複数を含む）に挿入することによって増加させてもよい。エンハンサーは、通常、その転写を増加させるように、プロモーターに作用する、通常、約１０〜３００ｂｐ長のＤＮＡのシス作用要素である。現在、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェトタンパク質、およびインスリン）、ならびに真核細胞ウイルスに由来する多くのエンハンサー配列が知られている。例には、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、抗原特異的ポリヌクレオチド配列に対して５’または３’位でベクターにスプライスされてもよいが、好ましくは、プロモーターから５’部位に位置付けられる。

発現ベクターは、転写の終了およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含有してもよい。これらの配列は、真核細胞またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および場合によっては３’の未翻訳領域において見出される場合が多く、当該技術分野でよく知られている。

ウイルスベクターゲノムはまた、さらなる遺伝要素を含有してもよい。構成物に含まれてもよい要素の種類は、決して限定されず、特定の結果を達成するために選択されてもよい。例えば、標的細胞においてウイルスゲノムの核侵入を促進するシグナルが含まれてもよい。そのようなシグナルの例は、ＨＩＶ−１フラップシグナルである。さらに、標的細胞内のプロウイルス組み込み部位の特徴付けを促進する要素が含まれてもよい。例えば、ｔＲＮＡアンバーサプレッサーが、構成物に含まれてもよい。例えば、ニワトリβ−グロブリンからの絶縁体配列はまた、ウイルスゲノム構成物に含まれてもよい。この要素は、メチル化および異質染色質化の効果に起因して、標的細胞内で組み込みプロウイルスをサイレンシングする機会を減少させる。さらに、絶縁体は、染色体上の組み込み部位において、周囲のＤＮＡからの正または負の位置効果から、内部エンハンサー、プロモーター、および外来遺伝子を遮断し得る。さらに、ベクターゲノムは、対象となる遺伝子の発現を強化するように設計された１つ以上の遺伝要素を含有してもよい。例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス応答要素（ＷＲＥ）が構成物に配置されてもよい（Ｚｕｆｆｅｒｅｙｅｔａｌ．１９９９．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：３６６８−３６８１、Ｄｅｇｌｏｎｅｔ
ａｌ．２０００．Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１１：１７９−１９０、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

ウイルスベクターゲノムは、通常、パッケージジングまたは産生細胞株にトランスフェクトされ得るプラスミド形態で構成される。プラスミドは、一般に、細菌中のプラスミドの複製に有用な配列を含む。そのようなプラスミドは、当該技術分野でよく知られている。さらに、複製の原核生物起源を含むベクターは、その発現が薬物耐性等の検出可能または選択可能なマーカーを付与する遺伝子を含んでもよい。典型的な細菌薬物耐性産物は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するものである。

本明細書に記載される成分の１つ以上を含有するプラスミドは、当該技術分野でよく知られている標準手技を使用して、容易に構成される。構成されるプラスミドにおいて適切な配列を確認するための分析の場合、プラスミドは、制限エンドヌクレアーゼ消化によって精製および分析される大腸菌、または従来方法によって決定されるそのＤＮＡ配列において複製されてもよい。

また、哺乳動物細胞において一時的発現のために構成されるベクターを使用してもよい。一時的発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くの複製を蓄積するように、宿主細胞において効率的に複製することができる発現ベクターの使用を伴い、同様に、発現ベクターにおいて抗原特異的ポリヌクレオチドによってコードされる高レベルのポリペプチドを合成する。Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，上記、ｐｐ．１６．１７−１６．２２を参照されたい。ポリペプチドの発現に対する適合に適した他のベクターおよび方法は、当該技術分野でよく知られており、特定の状況に対して容易に適合される。

本明細書に提供される教示を使用して、当業者は、パッケージング細胞を、レポータータンパク質をコードする遺伝子を含むベクターでトランスフェクトし、適切な手技を使用して発現を測定すること、例えば、緑色蛍光タンパク質複合体からの蛍光を測定することによって、特定の発現系の有効性を試験することができることを認識するであろう。適切なレポーター遺伝子は、当該技術分野でよく知られている。
対象となる配列の種類

対象となる配列は、決して限定されず、当業者が標的細胞に組み込み、転写、および発現させることを望む、あらゆる核酸を含む。産物は、タンパク質または核酸であり得る。対象となる配列は、タンパク質、またはｓｉＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、相補領域が約２０リボヌクレオチド長よりも大きい自己相補二本鎖ＲＮＡ、もしくはメッセージＲＮＡに相補的なＲＮＡを含む、核酸分子をコードすることができ、メッセージＲＮＡに対するこの相補（アンチセンス）ＲＮＡの結合は、そのタンパク質に翻訳される能力を遮断する。場合によっては、対象となる配列は、免疫応答が望ましい抗原をコードすることができる。特に、腫瘍抗原、およびＨＩＶ、ＨＳＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶ、マラリア、または結核等の病原体からの感染疾患抗原が望ましい。さらに、対象となる複数の配列が、単一ベクター内に含まれ得る。

ある例において、対象となる配列は、分子の発現を下方調節する対象となる小さな阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする遺伝子であり得る。例えば、ｓｉＲＮＡまたはミクロＲＮＡをコードする遺伝子を使用して、樹状細胞の活性化または成熟を阻害するものを含む、細胞内の負の調節因子の発現を下方調節することができる。ｓｉＲＮＡおよびミクロＲＮＡは、当該技術分野でよく知られている（Ｆｉｒｅｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３９１：８０６，１９９８、“ＴｈｅＲＮＡＩｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅＲｅｓｏｕｒｃｅ” ｏｆＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｒａｎｇｅｔａｌ．，ＯｎｃｏｇｅｎｅＳｕｐｐｌ２：Ｓ５２，２００８、Ｔａｇａｎｏｖ，Ｋ．，ｅｔａｌ．２００７．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２６：１３３−１３７、Ｄａｈｌｂｅｒｇ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄＥ．Ｌｕｎｄ．２００７．Ｓｃｉ．ＳＴＫＥ３８７：ｐｅ２５、ＴｉｅｍａｎｎａｎｄＲｏｓｓｉ，ＥＭＢＯＭｏｌＭｅｄ１：１４２，２００９も参照されたい）。あるいは、対象となる配列は、相補領域が約２０リボヌクレオチド長よりも大きい自己相補二本鎖ＲＮＡ、または約２０リボヌクレオチド長よりも大きいアンチセンスＲＮＡをコードすることができる。当業者は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡ分子が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターから発現し得ること、あるいは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターから転写される、非コードＲＮＡの成分であり得ることを理解するであろう。

さらに、対象となる配列は、１つを超える産物をコードしてもよい。いくつかの構成において、送達される配列は、少なくとも１つのタンパク質、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ、少なくとも１つのミクロＲＮＡ、少なくとも１つのｄｓＲＮＡ、もしくは少なくとも１つのアンチセンスＲＮＡ分子、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。例えば、送達される配列は、免疫応答が望ましい１つ以上の抗原をコードする１つ以上の遺伝子を含むことができる。１つ以上の抗原は、単一の疾患または障害と関連付けることができるか、またはそれらは、複数の疾患および／または障害と関連付けることができる。いくつかの例において、免疫調整タンパク質をコードする遺伝子は、免疫応答が望ましい抗原をコードする遺伝子とともに含まれることができ、その組み合わせは、免疫応答を誘発し、所望の配向および規模に調節することができる。他の例において、ｓｉＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡ分子をコードする配列は、免疫応答が望ましい抗原をコードする遺伝子とともに構成されることができ、その組み合わせは、免疫応答の範囲を調整することができる。産物は、コード配列が１つのプロモーターと機能的関係にある、初期融合産物として産生されてもよい。あるいは、産物は、別々にコードされてもよく、それぞれのコード配列は、プロモーターと機能的関係にある。プロモーターは、同一であるか、または異なってもよい。

ある構造において、ベクターは、樹状細胞成熟／刺激因子をコードするポリヌクレオチド配列を含有する。例示的な刺激分子には、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＴＮＦα、Ｂ７．１、Ｂ７．２、４−１ＢＢ、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、薬物誘導ＣＤ４０（ｉＣＤ４０）等が含まれる。これらのポリヌクレオチドは、通常、樹状細胞内でコード配列の発現を導く１つ以上の調節要素の制御下にある。樹状細胞の成熟は、良好なワクチン接種に寄与する（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，ＪａｎｄＰａｌｕｃｋａ，Ａ．Ｋ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２９６−３０６（２００５）、Ｓｃｈｕｌｅｒ，Ｇ．ｅｔａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：１３８−１４７（２００３）、Ｆｉｇｄｏｒ，Ｃ．Ｇ．ｅｔａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：４７５−４８０（２００４））。成熟は、抗原捕捉に活発に関与する細胞からのＤＣを、Ｔ細胞プライミングに特殊化した細胞に変換することができる。例えば、ＣＤ４０ＬによってＣＤ４０をＣＤ４−ヘルパーＴ細胞に係合することは、ＤＣ成熟に重要なシグナルであり、ＣＤ８Ｔ細胞の強力な活性をもたらす。そのような刺激分子は、成熟因子または成熟刺激因子とも称される。免疫チェックポイントは、癌における機能的細胞性免疫の活性化に対する重要な障壁を表し、ＣＴＬＡ４およびプログラム死−１（ＰＤ−１）を含む、Ｔ細胞上の阻害リガンドに特異的なアンタゴニスト抗体は、クリニックにおいて評価されている標的薬剤の例である。慢性感染症および癌において重要な耐性機構は、高レベルのＰＤ−１を発現するＡｇ特異的Ｔ細胞の機能的消耗である。治療的免疫化の有効性は、免疫チェックポイントの制御と組み合わせることによって著しく強化されることが示されたため、非限定例として、当業者は、免疫チェックポイントを阻害する代替アプローチが、プログラム死（ＰＤ）リガンド１および２（ＰＤ−Ｌ１／Ｌ２）の発現を阻害することであると理解することができる。阻害を達成するための一方法は、本明細書に記載されるもの等のＲＮＡ分子の発現によってであり、ＲＮＡ分子の１つ以上をコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたＤＣにおいて、ＰＤ−Ｌ１／Ｌ２の発現を抑制する。ＤＣの成熟または免疫チェックポイント、例えばＰＤ−１リガンド等の特定の要素の発現は、ＭＨＣＩＩ等の表面マーカーの上方調節のフローサイトメトリー分析、ならびに発現したケモカインおよびサイトカインのプロファイルによって特徴付けることができる。

検出可能な産物、通常、タンパク質をコードする配列を含み、所望の産物を発現している細胞の識別を可能にすることができる。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光マーカータンパク質は、（例えば、抗原をコードする）対象となる配列とともに構成物に組み込まれる。他の例において、タンパク質は、抗体によって検出可能であってもよいか、またはタンパク質は、検出可能な産物を産出するように基質に作用する酵素であっても、トランスフェクトまたは形質導入した標的細胞の選択を可能にする、例えば、ヒグロマイシン耐性等の薬物耐性を付与する産物であってもよい。典型的な選択遺伝子は、真核細胞での使用に適切な抗生物質または他の毒素、例えば、とりわけ、当該技術分野で知られている、ネオマイシン、メトトレキセート、ブラストサイジンに対する耐性を付与するか、栄養要求性欠陥を相補するか、または培地から抑制される重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。選択可能なマーカーは、任意に、別個のプラスミド上に存在し、共トランスフェクションによって導入することができる。

パッケージング細胞において所望のウイルスの産生のために必要な要素（例えば、対象となる配列（複数を含む）、エンベロープ分子、ＤＣ成熟因子）の２つ以上を含む、１つ以上の多シストロン発現単位を利用してもよい。多シストロンベクターの使用は、必要とされる核酸分子の総数を減少させ、したがって、複数のベクターゲノムからの調和した発現と関連付けられる可能な困難を回避する。多シストロンベクターにおいて、発現される種々の要素は、１つ以上のプロモーター（および必要に応じて他の発現制御要素）に作動可能に連結される。いくつかの構成において、多シストロンベクターは、対象となる配列、レポーター産物をコードする配列、およびウイルス要素を含む。対象となる配列は、通常、抗原および任意にＤＣ成熟因子をコードする。時には、多シストロンベクターは、抗原をコードする遺伝子、ＤＣ成熟因子をコードする遺伝子、およびウイルス要素を含む。

開示される偽型レンチウイルスベクターは、一度に１つを超える、例えば、２つ、３つ、または４つの抗原を発現するように操作することができる。単一のベクターから１つを超える遺伝子を同時に発現するためのいくつかの方法は、当該技術分野で知られている。例えば、ベクターは、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と融合する多重プロモーター、遺伝子間でのスプライシングシグナルの挿入、単一のプロモーターにより発現が引き起こされる遺伝子の融合、遺伝子間でのタンパク質分解切断部位の挿入、遺伝子間での内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の挿入、遺伝子間での二方向性プロモーターの挿入、および／または「自己切断型」２Ａペプチドを含むことができる。多シストロン発現ベクターにおいて発現されるそれぞれの成分は、例えば、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）要素またはウイルス２Ａ要素によって分離して、同じプロモーターから種々のタンパク質の発現の分離を可能にすることができる。ＩＲＥＳ要素および２Ａ要素は、当該技術分野で知られている（米国特許第４，９３７，１９０号、ｄｅＦｅｌｉｐｅｅｔａｌ．２００４．Ｔｒａｆｆｉｃ５：６１６−６２６、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。一実施形態において、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ；Ｆ２Ａ）、ブタテシオウイルス−１（Ｐ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ；Ｅ２Ａ）、およびゾセアアジグナ（ｔｈｏｓｅａａｓｉｇｎａ）ウイルス（ＴａＶ；Ｔ２Ａ）（Ｓｚｙｍｃｚａｋｅｔａｌ．２００４．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５８９−５９４、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）からの２Ａ様配列と連結されるフリン切断部位配列（ＲＡＫＲ）（Ｆａｎｇｅｔａｌ．２００５．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ２３：５８４−５９０、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）をコードするオリゴヌクレオチドは、多シストロンベクターにおいて遺伝要素を分離するために使用される。２Ａペプチドコンセンサス配列は、Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥＸＮＰＧＰ（配列番号５６）である。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、Ｔ２Ａ（配列番号５７）をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、２Ａペプチドは、配列番号５２のポリヌクレオチドによってコードされる。特定の多シストロンベクターの有効性は、標準的なプロトコルを使用し、遺伝子のそれぞれの発現を検出することによって容易に試験することができる。

２つ以上の抗原の発現はまた、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を使用しても達成することができる。ＩＲＥＳは、真核細胞リボソームが侵入し、５’ｍ^７Ｇキャップ構造以外の位置でｍＲＮＡを走査することを可能にする。例えば、第１のコード領域の３’（またはシストロン）のように内部に位置する場合、ＩＲＥＳは、同じ転写産物内の第２のコード領域の翻訳を可能にする。第２のコード領域は、ＩＲＥＳ後に遭遇する第１のＡＴＧによって識別される。例示的なＩＲＥＳ要素には、ピコルナウイルスＩＲＥＳおよびカルジオウイルスＩＲＥＳ（例えば、米国特許第４，９３７，１９０号を参照されたい）等のウイルスＩＲＥＳ、ならびに５’ＵＴＲ（例えば、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）をコードする転写産物の要素（Ｍａｃｅｊａｋｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５３９０−４，１９９１）、ドロソフィラアンテナペディア（ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）（Ｏｈｅｔａｌ．，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．６：１６４３−５３，１９９２）、およびウルトラバイソラックス（Ｕｌｔｒａｂｉｔｈｏｒａｘ）（Ｙｅｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１７：１７１４−２１，１９９７）；線維芽細胞成長因子２（Ｖａｇｎｅｒｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１５：３５−４４，１９９５）；開始因子ｅＩＦ４Ｇ（Ｇａｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：５００６−１２，１９９８）；癌原遺伝子ｃ−ｍｙｃ（Ｎａｎｂｒｕｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：３２０６１−６，１９９５、Ｓｔｏｎｅｌｅｙ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１６：４２３−８，１９９８）；ならびに血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）（Ｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１８：３１１２−９，１９９８）等において見出される非ウイルスＩＲＥＳ要素が含まれる。

２つ以上の抗原の発現はまた、二方向性プロモーター、すなわち、プロモーター領域または読み方向が互いから離れて指し示す２つの連続クローンプロモーターを使用しても達成することができ、これにより、プロモーター領域に隣接する２つのオープンリーディングフレームが転写される。そのようなプロモーターの例には、ＰＤＧＦ−Ａ、向神経性ＪＣウイルス、ＢＲＣＡ１、トランスコバラミンＩＩ、およびジペプチジルペプチダーゼＩＶプロモーターが含まれる。

特定の例示において、ウイルスベクターゲノムは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／プロモーター配列、ＨＩＶ５’ＬＴＲからのＲおよびＵ５配列、パッケージング配列（ψ）、ＨＩＶ−１フラップシグナル、内部エンハンサー、内部プロモーター、対象となる遺伝子、ウッドチャック肺炎ウイルス応答要素、ｔＲＮＡアンバーサプレッサー配列、そのエンハンサー配列の欠失を有するＵ３要素、ニワトリβ−グロブリン絶縁体、ならびに３’ＨＩＶＬＴＲのＲおよびＵ５配列を含む。いくつかの例示において、ベクターゲノムは、無傷レンチウイルス５’ＬＴＲおよび自己不活性化３’ＬＴＲ（Ｉｗａｋｕｍａｅｔａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１５：１２０，１９９９、参照によりその全体が組み込まれる）を含む。

ベクターゲノムの構成は、当該技術分野で知られている任意の適切な遺伝子操作技術を使用して達成することができ、これには、例えば、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．（１９８９．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．）、Ｃｏｆｆｉｎｅｔａｌ．（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９７））、および“ＲＮＡＶｉｒｕｓｅｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ”（ＡｌａｎＪ．Ｃａｎｎ，Ｅｄ．，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，（２０００）に記載されるような、制限エンドヌクレアーゼ消化、連結、形質転換、プラスミド精製、およびＤＮＡ配列決定の標準技術が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、対象となる配列は、少なくとも１つの抗原をコードする。疾患または障害と関連する任意の抗原は、本明細書に記載されるウイルス粒子を使用して、樹状細胞に送達することができる。疾患または障害と関連する抗原は、樹状細胞を標的とするウイルス粒子の調製のために特定される。多くの疾患または障害と関連する抗原は、当該技術分野でよく知られている。抗原は、疾患または障害と関連することが既に知られていても、当該技術分野で知られている任意の方法によって特定されてもよい。例えば、腫瘍関連抗原のような、患者が罹患している一種の癌に対する抗原は、知られていても、当該技術分野で知られている多様な方法のいずれかによって腫瘍自体から特定されてもよい。

腫瘍関連抗原は、例えば、腎細胞癌、前立腺癌、黒色腫、および乳癌を含む、多様な癌で知られている。いくつかの乳癌において、例えば、Ｈｅｒ−２受容体は、癌性細胞の表面上に過剰発現している。例示的な腫瘍抗原としては、ＭＡＧＥ、例えば、ＭＡＧＥ−Ａ３およびＭＡＧＥ−Ａ１、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、およびＮＹ−ＥＳＯ−１（これらは精巣の免疫特権領域および多様な腫瘍細胞で発現される非突然変異しない抗原である）；系統特異的腫瘍抗原、例えば、メラニン細胞−黒色腫系統抗原、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ−７、チロシナーゼ、およびチロシナーゼ関連タンパク質、例えば、ＴＲＰ２；腎細胞癌−５Ｔ４、ＳＭ２２−アルファ、炭酸脱水酵素ＩおよびＩＸ（Ｇ２５０としても知られる）、低酸素誘導因子（例えば、ＨＩＦ−１アルファおよびＨＩＦ−２アルファ）、ＶＥＧＦ、または前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性リン酸塩、および前立腺の６−膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、ＮＫＸ３．１（これらは同じ組織に由来する正常および腫瘍性細胞で発現される抗原である）；正常細胞と比較して、腫瘍において異なるレベルで転写される腫瘍細胞または遺伝子で変異する遺伝子に由来するエピトープタンパク質／ペプチド、例えば、テロメラーゼ酵素、スルビビン、メソテリン、変異型ｒａｓ、ｂｃｒ／ａｂｌ再構成、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、変異型もしくは野生型ｐ５３、サイトクロームＰ４５０１Ｂ１、ならびに異常に発現されるイントロン配列、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ；骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫において独自のイディオタイプを生成する免疫グロブリン遺伝子のクローン性再構成；腫瘍ウイルスプロセスに由来するエピトープタンパク質／ペプチド、例えば、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６およびＥ７；腫瘍選択的発現を有する非突然変異腫瘍胎児、例えば、癌胎児性抗原およびアルファ−フェトタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。多くの腫瘍関連抗原が検討された（例えば、“Ｔｕｍｏｒ−ＡｎｔｉｇｅｎｓＲｅｃｏｇｎｉｚｅｄＢｙＴ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，” ＢｏｏｎＴ，ＣｅｒｏｔｔｉｎｉＪＣ，ＶａｎｄｅｎｅｙｎｄｅＢ，ＶａｎｄｅｒｂｒｕｇｇｅｎＰ，ＶａｎｐｅｌＡ，ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗＯｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１２：３３７−３６５，１９９４、“ＡｌｉｓｔｉｎｇｏｆｈｕｍａｎｔｕｍｏｒａｎｔｉｇｅｎｓｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｂｙＴｃｅｌｌｓ，” ＲｅｎｋｖｉｓｔＮ，ＣａｓｔｅｌｌｉＣ，ＲｏｂｂｉｎｓＰＦ，ＰａｒｍｉａｎｉＧ．ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ５０：（１）３−１５ＭＡＲ２００１、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、偽型レンチウイルスベクターは、ＭＡＧＥ−Ａ３（配列番号５８）をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＭＡＧＥ−Ａ３は、配列番号５０のポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、ＭＡＧＥ−Ａ３は、配列番号５０と少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９パーセント同一であるポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、偽型レンチウイルスベクターは、配列番号５８の少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、または３１０のアミノ酸のＭＡＧＥ−Ａ３の断片をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号５８と少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９パーセント同一であるＭＡＧＥ−Ａ３の変異体をコードする。いくつかの実施形態において、偽型レンチウイルスベクターは、ＮＹ−ＥＳＯ−１（配列番号５９）をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＮＹ−ＥＳＯ−１は、配列番号５１のポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、ＭＡＧＥ−Ａ３は、配列番号５１と少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９パーセント同一であるポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、偽型レンチウイルスベクターは、配列番号５９の少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、または１７０のアミノ酸のＮＹ−ＥＳＯ−１の断片をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号５９の少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９パーセント同一であるＮＹ−ＥＳＯ−１の変異体をコードする。いくつかの実施形態において、偽型レンチウイルスベクターは、ＭＡＧＥ−Ａ３（配列番号５８）をコードするポリヌクレオチドおよびＮＹ−ＥＳＯ−１（配列番号５９）をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかのまたは任意の実施形態において、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ａ３は、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＭＡＧＥ−Ａ３、ならびに２つの抗原の間に自己切断型Ａ２ペプチドを含む融合タンパク質と同じ転写産物、例えば、配列番号５６または５７から発現される。抗原は、いかなる順序（例えば、第一に、ＮＹ−ＥＳＯ−１、そして、第二に、ＭＡＧＥ−Ａ３、または第一に、ＭＡＧＥ−Ａ３、そして、第二に、ＮＹ−ＥＳＯ−１）であってもよい。

抗原はまた、感染症、例えば、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ等と関連する抗原であり得る。抗原は、例えば、ｇｐ１２０であり得る（Ｋｌｉｍｓｔｒａ，Ｗ．Ｂ．，ｅｔａｌ．２００３．ＪＶｉｒｏｌ７７：１２０２２−１２０３２、Ｂｅｒｎａｒｄ、Ｋ．Ａ．，ｅｔａｌ．２０００．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２７６：９３−１０３、Ｂｙｒｎｅｓ，Ａ．Ｐ．，ｅｔａｌ．１９９８．ＪＶｉｒｏｌ７２：７３４９−７３５６、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。他の例示的な抗原としては、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｎｅｆ、およびｒｅｖが挙げられるが、これらに限定されない（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｊ．ｅｔａｌ．１９９７．ＡＩＤＳＲｅｓＨｕｍＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ１３（５）：３８３−３９２、Ｍｅｎｅｎｄｅｚ−Ａｒｉａｓ，Ｌ．ｅｔａｌ．１９９８．ＶｉｒａｌＩｍｍｕｎｏｌ１１（４）：１６７−１８１、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

ウイルス抗原の例としては、アデノウイルスポリペプチド、アルファウイルスポリペプチド、カリシウイルスポリペプチド、例えば、カリシウイルスカプシド抗原、コロナウイルスポリペプチド、ジステンパーウイルスポリペプチド、エボラウイルスポリペプチド、エンテロウイルスポリペプチド、フラビウイルスポリペプチド、肺炎ウイルス（ＡＥ）ポリペプチド、例えば、Ｂ型肝炎コアもしくは表面抗原、またはＣ型肝炎ウイルスＥ１もしくはＥ２糖タンパク質、コア、または非構造タンパク質、ヘルペスウイルスポリペプチド、例えば、単純ヘルペスウイルスもしくは水痘帯状ヘルペスウイルス糖タンパク質、免疫不全ウイルスポリペプチド、例えば、ヒト免疫不全ウイルスエンベロープもしくはプロテアーゼ、感染性腹膜炎ウイルスポリペプチド、インフルエンザウイルスポリペプチド、例えば、Ａ型インフルエンザヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、またはヌクレオタンパク質、白血病ウイルスポリペプチド、マールブルグウイルスポリペプチド、オルトミクソウイルスポリペプチド、パピローマウイルスポリペプチド、パラインフルエンザウイルスポリペプチド、例えば、ヘマグルチニン／ノイラミニダーゼ、パラミクソウイルスポリペプチド、パラボウイルスポリペプチド、ペスチウイルスポリペプチド、ピコルナウイルスポリペプチド、例えば、ポリオウイルスカプシドポリペプチド、ポックスウイルスポリペプチド、例えば、ワクシニアウイルスポリペプチド、狂犬病ウイルスポリペプチド、例えば、狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ、レオウイルスポリペプチド、レトロウイルスポリペプチド、およびロタウイルスポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。

細菌抗原の例としては、アクチノミセスポリペプチド、バシルスポリペプチド、バクテロイドポリペプチド、ボルデテラポリペプチド、バルトネラポリペプチド、ボレリアポリペプチド、例えば、Ｂ．ライム病ＯｓｐＡ、ブルセラポリペプチド、カンピロバクターポリペプチド、カプノサイトファーガポリペプチド、クラミジアポリペプチド、クロストリジウムポリペプチド、コリネバクテリアポリペプチド、コキシエラポリペプチド、ダーマトフィルスポリペプチド、エンテロコッカスポリペプチド、エールリヒアポリペプチド、エシェリキアポリペプチド、フランシセラポリペプチド、フソバクテリアポリペプチド、ヘモバルトネラポリペプチド、ヘモフィルスポリペプチド、例えば、Ｈ．インフルエンザ型ｂ外膜タンパク質、ヘリコバクターポリペプチド、クレブシエラポリペプチド、Ｌ型バクテリアポリペプチド、レプトスピラポリペプチド、リステリアポリペプチド、マイコバクテリアポリペプチド、マイコプラズマポリペプチド、ナイセリアポリペプチド、ネオリケッチアポリペプチド、ノカルジアポリペプチド、パスツレラポリペプチド、ペプトコッカスポリペプチド、ペプトストレプトコッカスポリペプチド、肺炎球菌ポリペプチド、プロテウスポリペプチド、シュードモナスポリペプチド、リケッチアポリペプチド、ロカリメアポリペプチド、サルモネラポリペプチド、シゲラポリペプチド、スタフィロコッカスポリペプチド、ストレプトコッカスポリペプチド、例えば、Ｓ．ピロゲンＭタンパク質、トレポネマポリペプチド、およびエルシニアポリペプチド、例えば、Ｙ．ペスティスＦ１およびＶ抗原が挙げられるが、これらに限定されない。

真菌抗原の例としては、アブシジアポリペプチド、アクレモニウムポリペプチド、アルテルナリアポリペプチド、アスペルギルスポリペプチド、バシジオボラスポリペプチド、ビポラリスポリペプチド、ブラストミセスポリペプチド、カンジダポリペプチド、コッキジオイドポリペプチド、コニジオボラスポリペプチド、クリプトコッカスポリペプチド、カーブラリアポリペプチド、表皮菌ポリペプチド、エクソフィアラポリペプチド、ゲオトリクムポリペプチド、ヒストプラズマポリペプチド、マズレラポリペプチド、マラセジアポリペプチド、小胞子菌ポリペプチド、モニリエラポリペプチド、モルティエラポリペプチド、ケカビポリペプチド、ペシロミセスポリペプチド、ペニシリウムポリペプチド、フィアレモニウムポリペプチド、フィラロフォラポリペプチド、プロトテカポリペプチド、シュードアレシェリアポリペプチド、シュードミクロドキウムポリペプチド、フハイカビポリペプチド、リノスポリジウムポリペプチド、クモノスカビポリペプチド、スコレコバシジウムポリペプチド、スポロトリクスポリペプチド、ステムフィリウムポリペプチド、白癬菌ポリペプチド、トリコスポロンポリペプチド、およびキシロハイファポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。

プロトゾア寄生虫抗原の例としては、バベシアポリペプチド、バランチジウムポリペプチド、ベスノイチアポリペプチド、クリプトスポリジウムポリペプチド、エイメリアポリペプチド、エンセファリトゾーンポリペプチド、エンタモエバポリペプチド、ジアルジアポリペプチド、ハモンジアポリペプチド、ヘパトゾーンポリペプチド、イソスポラポリペプチド、リーシュマニアポリペプチド、ミクロスポリジアポリペプチド、ネオスポラポリペプチド、ノセマポリペプチド、ペンタトリコモナスポリペプチド、プラスモジウムポリペプチド、例えば、Ｐ．熱帯性サーカムスポロゾイト（ＰｆＣＳＰ）、種虫表面タンパク質２（ＰｆＳＳＰ２）、肝臓状態抗原１のカルボキシル末端（ＰｆＬＳＡ１ｃ末端）、および輸出タンパク質１（ＰｆＥｘｐ−１）、ニューモシスティスポリペプチド、サルコシスチスポリペプチド、住血吸虫ポリペプチド、タイレリアポリペプチド、トキソプラズマポリペプチド、およびトリパノソーマポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。

蠕虫寄生抗原の例としては、アカントケイロネマポリペプチド、アエルロストロンギルスポリペプチド、鉤虫ポリペプチド、住血線虫ポリペプチド、アスカリスポリペプチド、ブルギアポリペプチド、ブノストムムポリペプチド、カピラリアポリペプチド、大口腸線虫ポリペプチド、クーペリアポリペプチド、クレノソーマポリペプチド、ジクチオカウルスポリペプチド、ジオクトフィムポリペプチド、ジペタロネーマポリペプチド、ジフィロボツリウムポリペプチド、ジプリジウムポリペプチド、ジロフィラリアポリペプチド、ドラクンクルスポリペプチド、エンテロビウスポリペプチド、フィラロイドポリペプチド、ヘモンカスポリペプチド、ラゴキラスカリスポリペプチド、ロアポリペプチド、マンソネラポリペプチド、ムエレリウスポリペプチド、住血吸虫ポリペプチド、鉤虫ポリペプチド、ネマトジルスポリペプチド、腸結節虫ポリペプチド、オンコセルカポリペプチド、オピストルキスポリペプチド、オステルタギアポリペプチド、パラフィラリアポリペプチド、パラゴニムスポリペプチド、パラスカリスポリペプチド、フィサロプテラポリペプチド、プロトストロンギルスポリペプチド、セタリアポリペプチド、血色食道虫ポリペプチドスピロメトラポリペプチド、ステファノフィラリアポリペプチド、ストロンギロイドポリペプチド、ストロンギルスポリペプチド、テラジアポリペプチド、トキサスカリスポリペプチド、トキソカラポリペプチド、トリキネラポリペプチド、トリコストロンギルスポリペプチド、トリクリスポリペプチド、ウンシナリアポリペプチド、およびバンクロフト糸状虫ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。

外部寄生虫抗原の例としては、ノミからのポリペプチド（保護抗原ならびにアレルゲンを含む）；カタダニおよび軟ダニを含むダニ；ハエ、例えば、小昆虫、蚊、サシチョウバエ、クロバエ、ウシアブ、ノサシバエ、シカバエ、ツェツェバエ、サシバエ、ハエウジ症をもたらすハエ、およびヌカカ；アリ；クモ；シラミ；ダニ；ならびに半翅類の昆虫、例えば、トコジラミおよびサシガメが挙げられるが、これらに限定されない。

抗原が特定および選択されると、所望の抗原をコードする配列が特定される。好ましくは、配列は、ｃＤＮＡを含む。ウイルス感染後、対象となる配列（例えば、抗原をコードするもの）は、標的樹状細胞によって発現される。エクスビボで接触される場合、標的樹状細胞は、例えば、注入によって患者に戻され、それらは、所望の抗原に対して免疫応答を生成することができる、免疫細胞と相互作用する。好ましい実施形態において、組み換えウイルスは、患者に注入されて、標的樹状細胞を原位置で形質導入する。次いで、樹状細胞は、治療される疾患または障害と関連付けられる特定の抗原を発現し、患者は、疾患または障害に対して有効な免疫応答を開始することができる。

ウイルスベクターゲノムは、１つを超える抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含有してもよく、標的樹状細胞の形質導入時に、細胞に送達される多数の抗原に対して免疫応答を生成する。いくつかの実施形態において、抗原は、単一疾患または障害に関連する。他の実施形態において、抗原は、複数の疾患または障害に関連する。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターゲノムは、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、およびＭＡＧＥをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
ウイルス粒子の産生

当該技術分野で既知の多様な方法のいずれかを使用して、そのゲノムがウイルスベクターゲノムのＲＮＡ複製を含む、感染性ウイルス、例えば、レンチウイルス粒子を産生してもよい。１つの方法において、ウイルスベクターゲノムは、ウイルスベクターゲノムから転写されるウイルスゲノムＲＮＡをウイルス粒子にパッケージ化するために必要な成分のすべてを含有するパッケージング細胞株に導入される。あるいは、ウイルスベクターゲノムは、１つ以上の対象となる配列に加えて、ウイルス成分をコードする１つ以上の遺伝子を含んでもよい。しかしながら、標的細胞におけるゲノムの複製を防ぐために、複製に必要な内因性ウイルス遺伝子は、通常、除去され、パッケージング細胞株において別々に提供される。

一般に、レンチウイルスベクター粒子は、粒子を生成するのに必要な成分を含有する、１つ以上のプラスミドベクターでトランスフェクトされる細胞株によって産生される。これらのレンチウイルスベクター粒子は、通常、複製可能ではなく、すなわち、それらは、単に１ラウンドの感染が可能であるに過ぎない。多くの場合、複数のプラスミドベクターを利用して、レンチウイルスベクター粒子を生成する様々な遺伝子成分を分離し、主に、そうでなければ複製可能なウイルスを生成し得る組み換え事象の機会を減少させる。しかしながら、必要に応じて、レンチウイルス成分のすべてを有する単一のプラスミドベクターを使用することができる。複数のプラスミドベクターを用いるシステムの一例として、細胞株は、ウイルスベクターゲノムを含有する少なくとも１つのプラスミド（すなわち、ベクターゲノムプラスミド）でトランスフェクトされ、ＬＴＲ、シス作用パッケージング配列、および多くの場合、異種プロモーターに作動可能に連結される、対象となる配列（複数を含む）、ウイルス酵素的および構造的成分をコードする少なくとも１つのプラスミド（すなわち、ＧａｇおよびＰｏｌ等の成分をコードする、パッケージングプラスミド）、およびアルボウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする少なくとも１つのエンベローププラスミドを含む。追加のプラスミド、例えば、本明細書に記載され、当該技術分野で知られるようなＲｅｖ発現プラスミドを使用して、レトロウイルス粒子産生を強化することができる。ウイルス粒子は、細胞膜を通して出芽し、対象となる配列を含むゲノムを含むコア、および樹状細胞を標的とするアルボウイルスエンベロープ糖タンパク質を含む。アルボウイルス糖タンパク質がシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質である場合、糖タンパク質を操作して、参照株ＨＲＥ２糖タンパク質（配列番号１８）と比較して、ヘパラン硫酸への結合を減少させる。

本開示のプラスミドベクターによるパッケージング細胞のトランスフェクションは、よく知られている方法によって達成することができ、使用される方法は、決して限定されない。多数の非ウイルス送達システムは、当該技術分野で知られており、例えば、エレクトロポレーション、リポソームを含む脂質系送達システム、「裸の」ＤＮＡの送達、およびポリシクロデキストリン化合物を使用する送達、例えば、ＳｃｈａｔｚｌｅｉｎＡＧに記載されるものが含まれる。（２００１．Ｎｏｎ−ＶｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓｉｎＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒｏｇｒｅｓｓｅｓ．ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＤｒｕｇｓ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。通常、陽イオン性脂質または塩処理方法が用いられる。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３．Ｖｉｒｏｌ．５２：４５６、Ｗｉｇｌｅｒら（１９７９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６：１３７３−７６）を参照されたく、前述のそれぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。リン酸カルシウム沈殿方法が最も頻繁に使用される。しかしながら、核微量注入法および細菌原形質融合を含む、ベクターを細胞に導入するための他の方法を使用してもよい。

パッケージング細胞株は、ウイルスゲノムＲＮＡをレンチウイルスベクター粒子にパッケージ化するためのトランスにおいて必要な、ウイルス調節および構造的タンパク質を含む成分を提供する。パッケージング細胞株は、レンチウイルスタンパク質を発現し、機能的レンチウイルスベクター粒子を産生することができる、あらゆる細胞株であってもよい。いくつかの適切なパッケージング細胞株は、２９３（ＡＴＣＣＣＣＬＸ）、２９３Ｔ、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣＣＣＬ２）、Ｄ１７（ＡＴＣＣＣＣＬ１８３）、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣＣＣＬ３４）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣＣＣＬ−１０）、およびＣｆ２Ｔｈ（ＡＴＣＣＣＲＬ１４３０）細胞を含む。パッケージング細胞株は、必要なウイルスタンパク質を安定して発現し得る。そのようなパッケージング細胞株は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２１８，１８１号に記載される。あるいは、パッケージング細胞株は、ウイルスベクターゲノムとともに、１つ以上の必要なウイルスタンパク質をコードする核酸によって、一時的にトランスフェクトされてもよい。得られるウイルス粒子を回収し、標的細胞に感染させるために使用する。エンベロープ糖タンパク質（複数を含む）をコードする遺伝子（複数を含む）は、通常、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡＵＳＡ）等の発現ベクターにクローン化される。真核細胞発現ベクターは、当該技術分野でよく知られており、多数の商業的供給源から入手できる。次いで、２９３Ｔ細胞等のパッケージング細胞を、対象となる配列をコードする（通常、抗原をコードする）ウイルスベクターゲノム、ウイルスパッキング成分をコードする少なくとも１つのプラスミド、および標的分子の発現のためのベクターで共トランスフェクトする。エンベロープは、パッケージング細胞の膜上に発現され、ウイルスベクターに組み込まれる。

ウイルスの産生は、本明細書に記載されるように測定され、容量あたりのＩＵとして表される。ＩＵは、感染単位、あるいは形質導入単位（ＴＵ）であり、ＩＵおよびＴＵは、ウイルスベクター粒子調製物の力価の定量的測定値として相互交換可能に使用することができる。本明細書に記載される、ゲノムが容易に測定可能な産物を発現することができる、ウイルスが産生される。蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質が好適である。レンチウイルスベクターは、通常、非組み込みである。次いで、ウイルスを標的細胞に投与し、例えば、フローサイトメトリーによって、ＧＦＰを発現する標的細胞の数を決定する。次いで、力価を計算する。力価は、可能な限り高いことが好ましいが、細胞上澄みの少なくとも１×１０^５ＩＵ／ｍＬ、少なくとも３×１０^５ＩＵ／ｍＬ、少なくとも１×１０^６ＩＵ／ｍＬ、少なくとも３×１０^６ＩＵ／ｍＬ、または少なくとも１×１０^７ＩＵ／ｍＬである（あらゆる濃縮前）。あるいは、力価は、同じ細胞においてＶＳＶ−Ｇエンベロープにより偽型化した同じレンチウイルスベクターの力価の少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％である。
高度にマンノシル化されているウイルス粒子の産生

シンドビスウイルスエンベロープタンパク質は、４つのＮ連結グルカン、つまり、Ｅ２タンパク質において２つ、そしてＥ１タンパク質において２つを含有する。哺乳動物細胞において、マンノシダーゼＩ阻害剤の不在下で産生されるウイルスの２つのＮ−グルカンは、高マンノース構造を有し（１つは、Ｅ２Ｎ連結グルカンであり、１つは、Ｅ１Ｎ連結グルカン）、一方、残りの２つは、複合体構造を有する。２つの複合体構造のＮ−グルカンは、エンベロープタンパク質の表面上に露出しており、一方、２つの高マンノース構造のＮ−グルカンは、エンベロープタンパク質の三量体の中心に埋没している。複合体Ｎ連結グルカンを有するシンドビスウイルス粒子は、それほど複雑ではない、高度にマンノシル化されている糖タンパク質を有する粒子ほど効率的にＤＣ−ＳＩＧＮに結合しない。

本開示において、発明者は、哺乳動物細胞において、マンノシダーゼＩ阻害剤、キフネンシンの存在下で産生されるウイルス粒子が、ＤＭＮＪの存在下で産生される粒子と比較して、著しく増加したＤＣ−ＳＩＧＮ結合を予想外に阻害することを示す。

いくつかのまたは任意の実施形態において、ウイルスパッケージング細胞は、マンノシダーゼＩ阻害剤の存在下で培養される。いくつかのまたは任意の実施形態において、マンノシダーゼＩ阻害剤は、キフネンシンである。いくつかの実施形態において、キフネンシンは、約０．０１μｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約９μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約８μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約７μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約６μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約４μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約３μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約２μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌ、約０．２５μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、約０．２５μｇ／ｍｌ〜約９μｇ／ｍｌ、約０．２５μｇ／ｍｌ〜約８μｇ／ｍｌ、約０．２５μｇ／ｍｌ〜約７μｇ／ｍｌ、約０．２５μｇ／ｍｌ〜約６μｇ／ｍｌ、約０．２５μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌ、約０．２５μｇ／ｍｌ〜約４μｇ／ｍｌ、約０．２５μｇ／ｍｌ〜約３μｇ／ｍｌ、約０．２５μｇ／ｍｌ〜約２μｇ／ｍｌ、または約０．２５μｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌの濃度で培地中に存在する。

偽型レンチウイルスベクター粒子がシンジビス（Ｓｉｎｄｉｂｉｓ）ウイルスＥ２糖タンパク質およびＶｐｘタンパク質を含むいくつかのまたは任意の実施形態において、レンチウイルス粒子は、マンノシダーゼＩ阻害剤の存在下で産生される。いくつかの実施形態において、マンノシダーゼ阻害剤は、デオキシマンノジリマイシン（ＤＭＮＪ）である。好ましい実施形態において、マンノシダーゼ阻害剤は、キフネンシンである。いくつかの実施形態において、ＤＭＮＪは、約１．０μｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．０μｇ／ｍｌ〜約９００μｇ／ｍｌ、約１．０μｇ／ｍｌ〜約８００μｇ／ｍｌ、約１．０μｇ／ｍｌ〜約７００μｇ／ｍｌ、約１．０μｇ／ｍｌ〜約６００μｇ／ｍｌ、約１．０μｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌ、約１．０μｇ／ｍｌ〜約４００μｇ／ｍｌ、約１．０μｇ／ｍｌ〜約３００μｇ／ｍｌ、約１．０μｇ／ｍｌ〜約２００μｇ／ｍｌ、約１．０μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ〜約４００μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ〜約３００μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ〜約２００μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ〜約４００μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ〜約３００μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ〜約２００μｇ／ｍｌ、約２００μｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌ、または約２００μｇ／ｍｌ〜約４００μｇ／ｍｌの濃度で培地中に存在する。

いくつかのまたは任意の実施形態において、マンノシダーゼＩ阻害剤（例えば、キフネンシン）の存在下で産生される偽型レンチウイルスベクター粒子は、エンベロープ糖タンパク質（例えば、シンジビスウイルスＥ２）を含み、Ｎ連結グルカンの少なくとも６０％は、マンノース_５（Ｍａｎ_５）、Ｍａｎ_６、Ｍａｎ_７、Ｍａｎ_８、および／またはＭａｎ_９の構造を含む。いくつかの実施形態において、Ｎ連結グルカンの少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％は、Ｍａｎ_５、Ｍａｎ_６、Ｍａｎ_７、Ｍａｎ_８、および／またはＭａｎ_９＋の構造を含む。

１つのシナリオにおいて、本明細書に記載されるように、Ｅ２等のシンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクター粒子の調製のために、１つ以上のベクターを使用して、ポリヌクレオチド配列をパッケージング細胞株に導入する。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクター粒子は、高度にマンノシル化されている。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクター粒子はまた、Ｖｐｘタンパク質またはその変異体を含む。さらに他の実施形態において、レンチウイルスベクター粒子は、高度にマンノシル化されており、Ｖｐｘタンパク質またはその変異体を含む。ベクターは、シンドビスウイルスエンベロープを含むウイルスの様々な成分、対象となる配列（複数を含む）（通常、抗原をコードする）、およびパッケージング細胞によって提供されないウイルスの産生のために必要な任意の成分をコードするポリヌクレオチド配列を含有することができる。

ウイルスエンベロープタンパク質のグリコシル化プロファイルは、当該技術分野で知られている任意の方法によって決定することができる。例えば、グリコシダーゼ（例えば、ＥｎｄｏＨまたはＰＮＧａｓｅＦ）により処理された、または処理されない状態であるウイルス糖タンパク質におけるゲルシフトアッセイが、比較され得る。他の方法には、グリカンをウイルス糖タンパク質から切断することと、ＨＰＬＣおよび質量分光分析法によって成分を分離および特定することとを含む。
ウイルスの送達

ウイルスは、ウイルスが、対象となるポリヌクレオチドの送達が所望される、標的細胞、例えば樹状細胞（ＤＣ）と接触するのを可能にする、あらゆる方法で、標的細胞に送達されてもよい。時には、適切な量のウイルスが、例えば、身体への注入を通して、ヒトまたは他の動物に直接（インビボ）導入される。適切な動物としては、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、ニワトリ、または他のトリが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルス粒子は、静脈内、皮内、皮下、結節内、腹腔内、または粘膜等の多数の経路によって注入されてもよい。ウイルスは、米国特許第７，２４１，２７５号、同第７，１１５，１０８号、同第７，１０８，６７９号、同第７，０８３，５９９号、同第７，０８３，５９２号、同第７，０４７，０７０号、同第６，９７１，９９９号、同第６，８０８，５０６号、同第６，７８０，１７１号、同第６，７７６，７７６号、同第６，６８９，１１８号、同第６，６７０，３４９号、同第６，５６９，１４３号、同第６，４９４，８６５号、同第５，９９７，５０１号、同第５，８４８，９９１号、同第５，３２８，４８３号、同第５，２７９，５５２号、同第４，８８６，４９９号（これらのすべては参照によりそれらの全体が組み込まれる）に開示されるデバイス等の皮下注入デバイスを使用して送達されてもよい。他の注入位置も適切であり、例えば、標的細胞を含む器官に直接注入される。例えば、リンパ節内注入、脾臓内注入、または骨髄内注入を使用して、ウイルスをリンパ節、脾臓、および骨髄にそれぞれ送達してもよい。特定の状況および標的細胞の性質に応じて、例えば、吸入、または上皮組織、例えば、眼、口、または皮膚の上皮組織との直接接触を含む、他の手段を通して導入を行うことができる。

あるいは、標的細胞は、例えば、培養プレートにおいて、インビトロで提供され、ウイルスと接触される。標的細胞は、通常、健康な被検体または治療を必要とするか、もしくは抗原に対する免疫応答を刺激することが望ましい被検体から得られた樹状細胞を含む細胞群である。被検体から細胞を得る方法は、当該技術分野でよく知られており、静脈切開術、外科的切開、および生検が挙げられる。ヒトＤＣは、ＣＤ３４α＋ヒト造血前駆細胞を得ること、および他の箇所に記載されるようなインビトロ培養方法を使用することによって生成されてもよい（例えば、参照によりその全体が組み込まれる、Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ１０６，２７１−２７４（２００１））。

ウイルスを培地中に懸濁し、培養プレート、管、または他の容器のウェルに添加してもよい。ウイルスを含有する培地は、細胞のプレーティング前、または細胞がプレーティングされた後に添加されてもよい。細胞は、通常、適量の培地中でインキュベートして、生存能力を提供し、宿主細胞の形質導入が起こるように、培地中のウイルスの適切な濃度を可能する。細胞は、好ましくは、ウイルスを細胞に感染させるのに十分な時間、ウイルスでインキュベートする。好ましくは、細胞は、少なくとも１時間、少なくとも５時間、または少なくとも１０時間、ウイルスでインキュベートする。

インビボおよびインビトロ送達の両方において、所望の標的細胞に感染させるのに十分な数を含有するウイルス粒子のアリコートを使用してもよい。標的細胞が培養される場合、ウイルス粒子の濃度は、一般に、少なくとも１ＩＵ／μＬ、より好ましくは、少なくとも１０ＩＵ／μｌ、さらにより好ましくは、少なくとも３００ＩＵ／μＬ、さらにより好ましくは、少なくとも１×１０^４ＩＵ／μＬ、さらにより好ましくは、少なくとも１×１０^５ＩＵ／μＬ、さらにより好ましくは、少なくとも１×１０^６ＩＵ／μＬ、またはさらにより好ましくは、少なくとも１×１０^７ＩＵ／μＬである。

インビトロでのウイルスによる感染後、標的細胞をヒトまたは他の動物に導入（または再導入）することができる。細胞は、皮内、皮下、または末梢血流に導入することができる。動物に導入された細胞は、好ましくは、有害な免疫応答を回避するために、その動物に由来する細胞である。類似する免疫背景を有するドナーに由来する細胞を使用してもよい。使用することもできる他の細胞は、有害な免疫応答を回避するように設計されるものを含む。

標的細胞は、例えば、対象となる配列または遺伝子（複数を含む）の組み込み、転写、および／または発現、組み込まれる遺伝子の複製数、および組み込みの位置に関して分析されてもよい。そのような分析は、あらゆる時間に行われてもよく、かつ当該技術分野で知られている任意の方法によって行われてもよい。

ウイルスまたはウイルス感染した樹状細胞が投与される被検体は、感染細胞の位置、ウイルス送達されたポリヌクレオチドまたは対象となる遺伝子の発現、免疫応答の刺激に関して分析し、当該技術分野で知られている任意の方法によって、疾患または障害と関連する症状をモニタリングすることができる。

上に開示される細胞に感染させる方法は、細胞の個別の特異的特性に依存しない。結果として、それらは、多様な動物種に容易に拡大される。いくつかの例において、ウイルス粒子は、ヒトまたはヒト樹状細胞に送達され、他の例において、それらは、マウス、ウマ、イヌ、ネコ、もしくはマウス、またはトリ等の動物に送達される。本明細書に論じられるように、ウイルスベクターゲノムを偽型化して、広範な宿主範囲ならびに標的細胞の特異性を付与する。当業者は、特定の動物種において対象となる配列の望ましい発現を達成するために適切な内部プロモーターおよび他の要素にも気付くであろう。したがって、当業者は、あらゆる種からの樹状細胞に感染させる方法を修飾することができる。
治療的および予防的免疫化

樹状細胞は、疾患または障害の予防または治療のための、本明細書に記載されるようなレンチウイルスベクター粒子、特に、患者における免疫応答の活性化が有益となるものに感染させてもよい。多くのそのような疾患は、よく知られている。例えば、本開示の方法による治療または予防の影響を受けやすい疾患または障害としては、癌、自己免疫疾患、ならびにウイルス、細菌、真菌、および寄生虫感染を含む感染が挙げられるが、これらに限定されない。１つの方法において、疾患は、対象となる配列を樹状細胞に送達するために、本明細書に記載されるウイルス粒子（例えば、Ｖｐｘタンパク質を含む高度にマンノシル化されているウイルス粒子）によって治療され、対象となる配列の発現は、疾患特異的抗原を産生し、抗原特異的細胞免疫応答および体液性免疫応答の刺激をもたらす。一般に、対象となる配列は、免疫応答が望ましい抗原をコードするが、通常は樹状細胞において発現されない。抗原は、樹状細胞によって発現および提示される。ウイルスベクターゲノムは、ＤＣ成熟因子をさらにコードしてもよい。

典型的な用途において、ウイルス粒子は、免疫応答が望ましい抗原をコードする配列を樹状細胞に送達する。樹状細胞をウイルスとインビトロで接触させることによって、送達が達成され得、感染した樹状細胞が患者に提供される。またある時には、樹状細胞にインビボで感染させるために、ウイルスを被検体に送達することによって、送達が達成され得る。次いで、樹状細胞は、患者において抗原特異的Ｔ細胞またはＢ細胞を刺激し、発現した抗原に対する細胞性および体液性免疫応答を誘導する。そのような方法において、疾患または障害を患っている患者は、所望の特異性を有する免疫細胞を生成することによって治療される。

ウイルスの一部において、ＤＣの成熟を活性化および／または刺激するＤＣ成熟因子は、対象となる配列と合わせて送達される。代替例において、ＤＣは、ウイルスの送達前、ウイルスの送達と同時、またはウイルスの送達後に、ＤＣ成熟因子の送達によって活性化される。ＤＣ成熟因子は、ウイルスの投与とは別に提供されてもよい。

本明細書に記載されるように、１つ以上の免疫調節またはＤＣ成熟因子は、ウイルスゲノムに含有され、ウイルスが樹状細胞に感染させた後に発現される、１つ以上の配列によってコードすることができる。免疫調節因子をコードする配列は、パッケージング細胞株において１つ以上の抗原をコードするウイルスベクターで共トランスフェクトされる、個別のベクターにおいて提供することもできる。

本明細書に記載される方法は、患者における養子免疫療法に使用することができる。上述されるように、免疫反応が所望される抗原が特定される。所望の抗原をコードするポリヌクレオチドが得られ、組み換えウイルスにパッケージ化される。標的樹状細胞を、患者から採取し、所望の抗原をコードするポリヌクレオチドを含有する組み換えウイルスで形質導入する。次いで、樹状細胞を患者に戻す。

ウイルス粒子は、インビボで注入されてもよく、それらは、ＤＣに感染し、通常、抗原をコードする、対象となる配列を送達する。ウイルス粒子の量は、少なくとも３×１０^６ＩＵであり、少なくとも１×１０^７ＩＵ、少なくとも３×１０^７ＩＵ、少なくとも１×１０^８ＩＵ、少なくとも３×１０^８ＩＵ、少なくとも１×１０^９ＩＵ、または少なくとも３×１０^９ＩＵであり得る。選択した間隔で、レシピエントのリンパ器官からＤＣを使用して、マーカー発現、例えば、ＧＦＰまたはルシフェラーゼを観察することによって、発現を測定してもよい。また、核酸モニタリング技術および逆転写（ＲＴ）活性の測定値を使用して、ウイルス粒子の生体内分布を分析することもできる。末梢血単核細胞からのＴ細胞、リンパ節、膵臓、またはレンチウイルスベクター粒子で治療したレシピエントの悪性もしくは標的病因に感染した組織は、抗原刺激に対する反応の規模および期間から測定されてもよい。ＤＣ以外の組織細胞、例えば、上皮細胞およびリンパ系細胞は、インビボ遺伝子送達の特異性に関して分析されてもよい。

ワクチンは、多くの場合、アジュバントを含む。本明細書に記載されるレンチウイルスベクター粒子は、アジュバントとともに投与されてもよい。アジュバントは、組み換えウイルス粒子とともに、組み換えウイルス粒子の前、または組み換えウイルス粒子の後に投与されてもよい。ウイルス粒子とともに投与される場合、望ましいアジュバントは、ウイルス粒子の完全性を著しく崩壊させない、例えば、エンベロープ糖タンパク質を含有するウイルス膜を崩壊させない。

多様なアジュバントをウイルスと合わせて使用して、ウイルスベクターゲノムにおいてコードされる抗原に対する免疫応答を引き起こすことができる。好ましいアジュバントは、応答の定量形態に影響する抗原において構造変化をもたらすことなく、抗原に対する固有応答を増補する。好ましいアジュバントは、ミョウバン、３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）を含む（英国特許第ＧＢ２２２０２１１号を参照されたい）。ＱＳ２１は、南アフリカで見られるＱｕｉｌｌａｊａＳａｐｏｎａｒｉａＭｏｌｉｎａという木の枝から単離されたトリテルペン配糖体またはサポニンである（Ｋｅｎｓｉｌ
ｅｔａｌ．，ｉｎＶａｃｃｉｎｅＤｅｓｉｇｎ：ＴｈｅＳｕｂｕｎｉｔａｎｄＡｄｊｕｖａｎｔＡｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄｓ．ＰｏｗｅｌｌａｎｄＮｅｗｍａｎ，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９５）、米国特許第５，０５７，５４０号を参照されたい）。他のアジュバントは、モノホスホリル脂質Ａ等の免疫刺激剤と任意に組み合わせて、水中油エマルション（例えば、スクアレンまたはピーナッツ油）である（Ｓｔｏｕｔｅｅｔａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６、８６−９１（１９９７）を参照されたい）。別のアジュバントは、ＣｐＧである（ＢｉｏｗｏｒｌｄＴｏｄａｙ，Ｎｏｖ．１５，１９９８）。アジュバントは、活性成分を有する治療組成物の成分として投与することができるか、または治療薬の投与前、投与と同時、または投与後に個別に投与することができる。

一群のアジュバントは、アルミニウム塩（ａｌｕｍ）、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等である。そのようなアジュバントは、ＭＰＬまたは３−ＤＭＰ、ＱＳ２１、ポリマーまたは単量体アミノ酸、例えばポリグルタミン酸またはポリリシン等の他の特定の免疫刺激剤の有無に関わらず使用することができる。別の群のアジュバントは、水中油エマルション製剤である。そのようなアジュバントは、他の特定の免疫刺激剤、例えば、ムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルクサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−アラ−ジパルミトキシプロピルアミド（ＤＴＰ−ＤＰＰ）テラミド（商標）、または他の細菌細胞壁成分の有無に関わらず使用することができる。水中油エマルションには、（ａ）Ｍｏｄｅｌ１１０Ｙミクロ流動化剤（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，ＮｅｗｔｏｎＭａｓｓ．）等のミクロ流動化剤を使用してサブミクロン粒子に製剤化された５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５を含有する（任意に様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含有する）、ＭＦ５９（国際公開第ＷＯ９０／１４８３７号）、（ｂ）サブミクロンエマルションにミクロ流動化されるか、または粒径の大きいエマルションを生成するようにボルテックスされる、１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロン遮断したポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ、（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、ならびにモノリン脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））から成る群からの１つ以上の細菌細胞壁成分を含有する、Ｒｉｂｉアジュバント系（ＲＡＳ）、（ＲｉｂｉＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）が含まれる。別の群の好ましいアジュバントは、サポニンアジュバント、例えば、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）（ＱＳ２１，Ａｑｕｉｌａ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，Ｍａｓｓ．）、またはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ等からそこで生成される粒子である。他のアジュバントは、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を含む。他のアジュバントは、サイトカイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む。

本明細書で組成物とともに使用することができる別のアジュバントは、化学式（Ｉ）によって特定され、
式中、部分Ａ１およびＡ２は、水素、リン酸塩、およびリン酸塩から成る群から独立して選択される。ナトリウムおよびカリウムは、リン酸塩の例示的な対イオンである。部分Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、およびＲ^６は、独立して、Ｃ_３−Ｃ_２３によって表される、３〜２３個の炭素を有するヒドロカルビルから成る群から選択される。さらなる明瞭さのために、部分が複数のメンバーを有する特定された基「から独立して選択される」とき、第１の部分のために選択されるメンバーは、第２の部分のために選択されたメンバーの選択に決して影響を及ぼさない、または限定しないことを理解すべきである。Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５、およびＲ^６が結合される炭素原子は、非対称であり、このため、ＲまたはＳの立体化学のいずれかで存在し得る。一実施形態において、これらの炭素原子のすべてはＲ立体化学であり、一方で、別の実施形態において、これらの炭素原子のすべてはＳ立体化学である。

「ヒドロカルビル」は、水素および炭素から全体的に形成される化学部分を指し、炭素原子の配置は、直鎖または分岐、非環状または環状であってもよく、隣接する炭素原子間の結合は、全体的に単一結合であってもよく、すなわち、飽和ヒドロカルビルを提供するか、またはあらゆる２つの隣接する炭素原子間に、二重結合または三重結合が存在してもよく、すなわち、不飽和ヒドロカルビルを提供し、ヒドロカルビル基内の炭素原子の数は、３〜２４個の炭素原子の間である。ヒドロカルビルは、アルキルであってもよく、代表的な直鎖アルキルは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル等を含み、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル等を含むが、分岐アルキルは、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル等を含む。代表的な飽和環状ヒドロカルビルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等を含むが、不飽和環状ヒドロカルビルは、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニル等を含む。不飽和ヒドロカルビルは、隣接する炭素原子の間に少なくとも１つの二重または三重結合を含有する（ヒドロカルビルが非環状である場合は、それぞれ「アルケニル」または「アルキニル」と称され、ヒドロカルビルが少なくとも部分的に環状である場合は、それぞれシクロアルケニルおよびシクロアルキニルと称される。代表的な直鎖および分岐アルケニルには、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニル等が含まれるが、代表的な直鎖および分岐アルキニルには、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１−ブチニル等が含まれる。

式（Ｉ）のアジュバントは、当該技術分野で知られている合成方法、例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００９／０３５５２８号（参照により本明細書に組み込まれる）、ならびに国際公開第ＷＯ２００９／０３５５２８号において特定される出版物（これらの出版物のそれぞれも参照により本明細書に組み込まれる）において開示される合成方法論によって得られてもよい。あるアジュバントはまた、商業的に得られてもよい。好ましいアジュバントは、ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬのカタログで特定される、製品番号６９９８００であり、Ｅ１０と組み合わせた以下のＥ１を参照されたい。

ある選択肢において、Ｅ２からＥ１０のそれぞれは、実施形態Ｅ１と組み合わせられる、および／またはＥ２からＥ９のヒドロカルビル基は、アルキル基、好ましくは直鎖アルキル基である。

式（Ｉ）のアジュバントは、任意に共アジュバントとともに、薬学的組成物に製剤化されてもよく、それぞれ以下に論じられる通りである。この点において、製剤、例えば、ＧＬＡアジュバントの水性製剤（ＡＦ）および安定したエマルション製剤（ＳＥ）を提供する、米国特許公開第２００８／０１３１４６６号が参照され、これらの製剤は、式（Ｉ）のアジュバントのいずれかに利用されてもよい。

アジュバントは、単一組成物として本開示のウイルスとともに投与することができるか、または本開示の組み換えウイルスの投与前、投与と同時、または投与後に投与することができる。免疫原およびアジュバントは、同一バイアルにパッケージ化して供給することができるか、または個別のバイアルにパッケージ化して、使用前に混合することができる。免疫原およびアジュバントは、通常、意図される治療的適応を示すラベルとともにパッケージ化される。免疫原およびアジュバントが別々にパッケージ化される場合、パッケージ化は、通常、使用前に混合するための説明書を含む。アジュバントおよび／または担体の選択は、アジュバントを含有するワクチンの安定性、投与経路、投薬スケジュール、ワクチン接種される種のアジュバントの有用性に依存し、ヒトにおいて、薬学的に許容されるアジュバントは、認可されたものであるか、または関連規制機関によってヒトへの投与が承認される。例えば、完全フロイントアジュバントは、ヒト投与に適切ではない。ミョウバン、ＭＰＬ、およびＱＳ２１が好ましい。任意に、２つ以上の異なるアジュバントを同時に使用することができ、例えば、ミョウバンとＭＰＬ、ミョウバンとＱＳ２１、ＭＰＬとＱＳ２１、およびミョウバン、ＱＳ２１とＭＰＬを一緒に使用することができる。また、不完全フロイントアジュバントは、任意に、ミョウバン、ＱＳ２１、およびＭＰＬ、ならびにそれらのすべての組み合わせと併せて、使用することができる（Ｃｈａｎｇｅｔａｌ．，ＡｄｖａｎｃｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅｖｉｅｗｓ３２，１７３−１８６（１９９８））。
薬学的組成物およびキット

また、本明細書に提供されるウイルスおよび１つ以上の成分を含有する、薬学的組成物およびキットも、本明細書に企図される。薬学的組成物は、本明細書に提供されるウイルスベクター粒子、および薬学的担体を含むことができる。キットは、本明細書に提供される薬学的組成物および／または組み合わせ、ならびに１つ以上の成分、例えば、使用に関する説明書、化合物を被検体に投与するためのデバイス、および化合物を被検体に投与するためのデバイスを含むことができる。

本明細書に提供されるようなウイルス粒子を含有する薬学的組成物、および適切な薬学的担体が本明細書において提供される。本明細書に提供される薬学的組成物は、種々の形態、例えば、固体、液体、粉末、含水、または凍結乾燥形態であり得る。適切な薬学的担体の例は、当該技術分野で知られている。そのような担体および／または添加剤は、従来の方法によって製剤することができ、適切な用量で被検体に投与することができる。脂質、ヌクレアーゼ阻害剤、ポリマー、およびキレート化剤等の安定化剤は、体内の分解から組成物を保存することができる。

本明細書に提供されるウイルスベクター粒子は、キットとしてパッケージ化することができる。キットは、使用に関する説明書、デバイス、および追加の試薬等の１つ以上の成分、ならびに方法を実践するための管、容器、およびシリンジ等の成分を任意に含むことができる。例示的なキットには、本明細書に提供されるウイルスを含むことができ、使用に関する説明書、被検体内のウイルスを検出するためのデバイス、ウイルスを被検体に投与するためのデバイス、および化合物を被検体に投与するためのデバイスを任意に含むことができる。

対象となる遺伝子（通常、抗原）をコードするポリヌクレオチドを含むキットもまた、本明細書に企図される。キットは、ウイルスパッケージング成分をコードする少なくとも１つのプラスミド、およびシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質変異体をコードするベクターを含んでもよい。一部のキットは、ウイルスパッケージング成分をコードする少なくとも１つのプラスミド、シンドビスウイルスＥ２糖タンパク質変異体をコードするベクター、および少なくとも１つのＤＣ成熟因子をコードするベクターを含有する。

対象となる配列（通常、抗原）をコードするウイルスベクター、および任意にＤＣ成熟因子をコードするポリヌクレオチド配列を含むキットもまた、本明細書に企図される。一部のキットにおいて、キットは、ウイルスパッケージング成分をコードする少なくとも１つのプラスミドおよびシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質変異体をコードするベクターを含む。

キットは、説明書を含んでもよい。説明書は、通常、ウイルスを説明する具体的な表現、および任意に、キットに含まれる他の成分、およびウイルスを投与するための被検体の適切な状態、適切な投与量、および適切な投与方法を含む、投与の方法を含む。説明書は、治療期間にわたって被検体をモニタリングするためのガイダンスを含むこともできる。

本明細書に提供されるキットは、ウイルスを被検体に投与するためのデバイスを含むこともできる。薬剤またはワクチンを投与するための当該技術分野で知られている多様なデバイスのいずれかを、本明細書に提供されるキットに含めることができる。例示的デバイスには、皮下注射針、静脈注射針、カテーテル、無針注入デバイス、吸入器、および液体ディスペンサー、例えば点眼器が挙げられるが、これらに限定されない。通常、キットのウイルスを投与するためのデバイスは、キットのウイルスに適合し、例えば、高圧注入デバイス等の無針注入デバイスを、高圧注入によって損傷されないウイルスとともに、キットに含めることができるが、通常、高圧注入によって損傷されるウイルスとともに、キットに含まれない。

本明細書に提供されるキットは、ＤＣ活性剤または刺激剤等の化合物を被検体に投与するためのデバイスを含むこともできる。薬剤を被検体に投与するための当該技術分野で知られている多様なデバイスのいずれかを、本明細書に提供されるキットに含めることができる。例示的なデバイスには、皮下注射針、静脈注射針、カテーテル、無針注入デバイスが挙げられ、皮下注射針、静脈注射針、カテーテル、無針注入デバイス、吸入器、および液体ディスペンサー、例えば点眼器が挙げられるが、これらに限定されない。通常、キットの化合物を投与するためのデバイスは、化合物の投与に関する望ましい方法に適合する。
例示的な実施形態
偽型レンチウイルスベクター粒子を生成する方法

本開示のいくつかの実施形態において、偽型レンチウイルスベクター粒子を生成する方法は、
（ａ）マンノシダーゼＩ阻害剤を含む培養培地中で、
（１）外因性抗原をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターゲノムと、
（２）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に優先的に結合するアルファウイルス糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
（３）ＳＡＭＨＤ１阻害剤をコードするポリヌクレオチドとを含むウイルスパッケージング細胞を培養することと、
（ｂ）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に優先的に結合する偽型レンチウイルスベクター粒子を単離することと、を含む。

特定の態様において、マンノシダーゼ阻害剤は、キフネンシンまたはＤＭＮＪである。

特定の態様において、アルファウイルス糖タンパク質は、シンドビスウイルスＥ２糖タンパク質である。

特定の態様において、ＳＡＭＨＤ１阻害剤は、Ｖｐｘタンパク質、例えば、ＳＩＶｍａｃＶｐｘタンパク質、ＳＩＶｓｍタンパク質、ＳＩＶｒｃｍ、またはＨＩＶ−２Ｖｐｘタンパク質である。特定の態様において、ＳＡＭＨＤ１阻害剤は、抗体またはその断片である。特定の態様において、ＳＡＭＨＤ１阻害剤は、ＳＡＭＨＤ１を阻害する能力を有するＶｐｒタンパク質、例えば、ＳＩＶｄｅｂＶｐｒタンパク質またはＳＩＶｍｕｓＶｐｒタンパク質である。

本開示のいくつかの実施形態において、偽型レンチウイルスベクター粒子を生成する方法は、
（ａ）キフネンシンを含む培養培地中で、
（１）外因性抗原をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターゲノムと、
（２）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に優先的に結合するシンドビスＥ２糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
（３）ＳＡＭＨＤ１阻害活性を保持するＶｐｘタンパク質またはＶｐｒタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含むウイルスパッケージ化細胞を培養することと、
（ｂ）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に優先的に結合する偽型レンチウイルスベクター粒子を単離することと、を含む。

特定の態様において、Ｅ２糖タンパク質は、配列番号３０［ＳＩＮ−Ｖａｒ１］と９０％同一である。いくつかの態様において、（ｉ）Ｅ２糖タンパク質の残基１６０は、不在であるか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸であり、（ｉｉ）Ｅ２糖タンパク質変異体の残基７０、７６、もしくは１５９のうちの１つ以上は、非塩基性残基であり、（ｉｉｉ）Ｅ２糖タンパク質変異体は、シンドビスウイルスＥ３糖タンパク質との融合タンパク質の一部ではない。いくつかの態様において、Ｅ２糖タンパク質は、配列番号３０［ＳＩＮ−Ｖａｒ１］である。

特定の態様において、Ｖｐｘタンパク質は、ＳＩＶｍａｃＶｐｘ（配列番号４４）と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。

特定の態様において、Ｖｐｘタンパク質は、ＳＩＶｍａｃＶｐｘ（配列番号４４）、ＳＩＶｓｍＶｐｘ（配列番号４５）、ＳＩＶｒｃｍＶｐｘ（配列番号４６）、またはＨＩＶ−２Ｖｐｘ（配列番号４７）と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様において、Ｖｐｘタンパク質は、ＳＩＶｍａｃＶｐｘ（配列番号４４）、ＳＩＶｓｍＶｐｘ（配列番号４５）、ＳＩＶｒｃｍＶｐｘ（配列番号４６）、またはＨＩＶ−２Ｖｐｘ（配列番号４７）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。

特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはレンチウイルスベクターパッケージングシステムのＶｐｒタンパク質は、ＳＩＶｄｅｂＶｐｒ（配列番号４８）またはＳＩＶｍｕｓＶｐｒ（配列番号４９）と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはレンチウイルスベクターパッケージングシステムのＶｐｒタンパク質は、ＳＩＶｄｅｂＶｐｒ（配列番号４８）またはＳＩＶｍｕｓＶｐｒ（配列番号４９）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。

特定の態様において、抗原は、腫瘍特異的抗原またはウイルス特異的抗原である。いくつかの態様において、腫瘍特異的抗原は、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ、例えば、ＭＡＧＥ−Ａ３およびＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ−７、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質、例えば、ＴＲＰ２、腎細胞癌抗原、５Ｔ４、ＳＭ２２−アルファ、炭酸脱水酵素Ｉ、炭酸脱水酵素ＩＸ（Ｇ２５０としても知られる）、ＨＩＦ−１アルファ、ＨＩＦ−２アルファ、ＶＥＧＦ、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性リン酸塩、前立腺の６−膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、ＮＫＸ３．１、テロメラーゼ酵素、スルビビン、メソテリン、変異型ｒａｓ、ｂｃｒ／ａｂｌ再構成、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、変異型ｐ５３、野生型ｐ５３、サイトクロームＰ４５０１Ｂ１、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ７、癌胎児性抗原、メルケル細胞ウイルスＴ抗原癌タンパク質、およびアルファ−フェトタンパク質から成る群から選択される。いくつかの態様において、ウイルス特異的抗原は、ＨＩＶ抗原、ＳＩＶ抗原、アデノウイルス抗原、エンテロウイルス抗原、コロナウイルス抗原、カリシウイルス抗原、ジステンパーウイルス抗原、エボラウイルス抗原、フラビウイルス抗原、肺炎ウイルス抗原、ヘルペスウイルス抗原、感染性腹膜炎ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、白血病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、オルトミクソウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、パラインフルエンザウイルス抗原、パラミクソウイルス抗原、パラボウイルス抗原、ペスチウイルス抗原、ピコルナウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ポックスウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、レオウイルス抗原、レトロウイルス抗原、またはロタウイルス抗原である。

特定の態様において、レンチウイルスベクターゲノムは、第２の抗原をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。特定の態様において、第１および第２の抗原は、２つの抗原の間に自己切断型Ａ２ペプチドを含む融合タンパク質として発現される。いくつかの態様において、自己切断型Ａ２ペプチドは、配列番号５６または配列番号５７のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、第１の抗原は、ＮＹ−ＥＳＯ−１であり、第２の抗原は、ＭＡＧＥ−Ａ３である。

特定の態様において、キフネンシンは、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌの濃度で、培養培地中に存在する。いくつかの態様において、キフネンシンは、約０．２５μｇ／ｍｌ〜約２μｇ／ｍｌの濃度で、培養培地中に存在する。いくつかの態様において、キフネンシンは、約０．０１μｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの濃度で、培養培地中に存在する。

特定の態様において、ウイルスパッケージング細胞は、
（ｉ）ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含むポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）ｒｅｖタンパク質をコードするポリヌクレオチドとをさらに含む。いくつかの態様において、Ｖｐｘタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ｒｅｖタンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含むポリヌクレオチドと同じまたは異なるプラスミド上にある。いくつかの態様において、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子は、ヒトのコドンに最適化され、配列番号５４の１２２８〜１５０９位周辺に最適化されないウインドウを含む。いくつかの態様において、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含むポリヌクレオチドは、機能的ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）を欠いている。いくつかの態様において、ｐｏｌ遺伝子は、不活性インテグラーゼ酵素をコードする。いくつかの態様において、インテグラーゼ酵素は、Ｄ６４Ｖ突然変異体を有する。

特定の態様において、レンチウイルスベクターゲノムは、ＨＩＶ−１由来である。

特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはパッケージングシステムのレンチウイルスベクターゲノムは、組み込みができる。

特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはパッケージングシステムのレンチウイルスベクターゲノムは、組み込み不良または組み込み不能である。例えば、レンチウイルスベクターは、組み込み可能なウイルスベクターよりも効率が少なくとも１０倍（例えば、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍、少なくとも２００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも３００倍、少なくとも３５０倍、少なくとも４００倍、少なくとも４５０倍、少なくとも５００倍、少なくとも５５０倍、少なくとも６００倍、少なくとも６５０倍、少なくとも７００倍、少なくとも７５０倍、少なくとも８００倍、少なくとも８５０倍、少なくとも９００倍、少なくとも９５０倍、または少なくとも１０００倍）少ない頻度で組み込んでもよい。例示的な実施形態において、レンチウイルスベクターは、組み込むときに、効率が少なくとも約２０倍〜約１００倍少なくてもよい。

特定の態様において、レンチウイルスベクターゲノムは、不活性化された３’側の長い末端反復（ＬＴＲ）または自己不活性化された３’側の長い末端反復（ＬＴＲ）を有する。いくつかの態様において、レンチウイルスベクターゲノムは、エンハンサー配列、ＴＡＴＡボックス、Ｓｐ１部位、ＮＫ−カッパＢ部位、またはポリプリン区画（ＰＰＴ）のうちの少なくとも１つを欠いているＵ３要素を含む。いくつかの態様において、ｐｏｌ遺伝子は、不活性インテグラーゼ酵素をコードし、レンチウイルスベクターゲノムは、機能的ポリプリン区画（ＰＰＴ）を欠いている。

特定の態様において、レンチウイルスベクターゲノムは、配列番号２１［ＳＩＮベクター］、２２［７０３ベクター］、または２３［７０４ベクター］のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。

特定の態様において、レンチウイルスベクターゲノムは、樹状細胞成熟／刺激因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの態様において、樹状細胞成熟／刺激因子は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＴＮＦα、Ｂ７．１、Ｂ７．２、４−１ＢＢ、ＣＤ４０リガンド、および薬物誘導ＣＤ４０から成る群から選択される。

特定の態様において、抗原をコードするヌクレオチド配列は、ヒトユビキチンＣプロモーター（ＵｂｉＣ）、サイトメガロウイルス前初期プロモ−ター（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルスプロモ−ター（ＲＳＶ）、およびテトラサイクリン応答プロモ−ターから成る群から選択されるプロモ−ターに作動可能に連結している。いくつかの態様において、プロモーターは、イントロン欠損プロモーターである。いくつかの態様において、イントロン欠損プロモーターは、ＵｂｉＣである。

特定の態様において、段落［０２０６］、［０２１０］、または［０２１８］に記載の方法によって産生されるレンチウイルスベクター粒子が、提供される。

特定の態様において、段落［０２１６］に記載の方法によって産生されるレンチウイルスベクター粒子が、提供される。
偽型レンチウイルスベクター粒子を含む組成物

本開示のいくつかのまたは任意の実施形態において、（ａ）ＳＡＭＨＤ１阻害活性を保持するＶｐｘタンパク質またはＶｐｒタンパク質と、（ｂ）抗原をコードする外因性ポリヌクレオチドと、（ｃ）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞に優先的に結合する複数のエンベロープ糖タンパク質とを含む偽型レンチウイルスベクター粒子を含む組成物が提供され、この組成物は、マンノシダーゼ阻害剤の不在下で調製された同じ偽型レンチウイルスベクター粒子の対照組成物と比較して、より高度にマンノシル化されている。例えば、そのような高度にマンノシル化されている組成物は、マンノシダーゼ阻害剤の不在下で調製された対照組成物のエンベロープ糖タンパク質よりもさらにＥｎｄｏＨ感受性であるエンベロープ糖タンパク質を含有することを特徴とする。別例として、そのような高度にマンノシル化されている組成物は、マンノシダーゼ阻害剤の不在下で調製された対照組成物のエンベロープ糖タンパク質と比較して、増加した量のＥｎｄｏＨ感受性グリカンを示すエンベロープ糖タンパク質を含有することを特徴とする。対照組成物は、同じアミノ酸配列（複数を含む）を有するエンベロープ糖タンパク質を含むほぼ同じ数の偽型レンチウイルスベクター粒子を含有することが理解される。また、本開示は、主に、樹状細胞および高度にマンノシル化されているその変形への認識および結合に関与するアルファウイルスＥ２糖タンパク質に着目しているが、このアルファウイルスエンベロープもまた、高マンノシル化に影響を受けやすいＥ１糖タンパク質を含有することも理解される。したがって、エンベロープ糖タンパク質および高度にマンノシル化されているエンベロープ糖タンパク質への参照は、高度にマンノシル化されているアルファウイルスＥ２および／またはＥ１糖タンパク質、具体的には、高度にマンノシル化されているシンドビスＥ２および／またはＥ１糖タンパク質への参照を含む。他の種類のウイルスエンベロープ、具体的には、レトロウイルスエンベロープの高マンノシル化はまた、樹状細胞の認識を向上させる。

本開示のいくつかの実施形態において、（ａ）ＳＡＭＨＤ１阻害活性を保持するＶｐｘタンパク質またはＶｐｒタンパク質と、（ｂ）抗原をコードする外因性ポリヌクレオチドと、（ｃ）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞に優先的に結合する複数のシンドビスＥ２糖タンパク質とを含む偽型レンチウイルスベクター粒子を含む組成物が提供され、この組成物は、マンノシダーゼ阻害剤の不在下で調製された偽型レンチウイルスベクター粒子の対照組成物と比較して、より高度にマンノシル化されている。そのような組成物中の相当な数のＥ２糖タンパク質は、マンノシダーゼ阻害剤の不在下で調製された対照組成物中のＥ２糖タンパク質よりも、より高度にマンノシル化されている、例えば、よりＥｎｄｏＨ感受性がある。

ＥｎｄｏＨは、高マンノースＮ連結グリコシル化のみを切断する特殊化したエンドグリコシダーゼ（図３Ａを参照されたい）、例えば、Ｍａｎ５〜９グリカンであり、Ｍａｎ３〜４グリカンは、ＥｎｄｏＨに対して耐性がある。対照的に、ＰＮＧａｓｅＦは、低マンノースグリカン＜Ｍａｎ５を含む、すべての種類のグリコシル化を切断する。ウイルス粒子が、キフネンシン等のマンノシダーゼＩ阻害剤の存在下で産生されるとき、ウイルスエンベロープ中の糖タンパク質は、ＥｎｄｏＨによる切断の影響を受けやすいより高いマンノースグリカンを含有する（すなわち、より「ＥｎｄｏＨ感受性」がある）。ウイルス粒子の組成物中の高マンノースグリカンの存在を検出する１つの方法は、ＥｎｄｏＨ処理後、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による電気泳動によって、エンベロープ糖タンパク質の分子量を決定することである。この「ゲルシフト」アッセイを、実施例３に示す。ウイルス粒子の試料、およびマンノシダーゼ阻害剤の不在下で調製された同じウイルス粒子の対照組成物は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動し、シンドビス糖タンパク質に対する抗体で免疫ブロットを行った。マンノシダーゼＩ阻害剤の存在下で産生されるウイルスエンベロープは、対照ウイルスと比較して、さらにＥｎｄｏＨ感受性であり、そのため、ＥｎｄｏＨ処理後、（さらに遠い）ゲル上でより速く泳動する。したがって、高マンノース糖タンパク質の存在が、ＥｎｄｏＨ処理後にゲルシフトアッセイを使用して測定することができる。

対照ウイルスは、内部にあり、産生中、マンノシダーゼＩに曝露しないため、通常、高マンノースであるシンドビス糖タンパク質におけるグリコシル化部位の存在により、ＥｎｄｏＨ処理に対して部分的に感受性であり得る。したがって、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動する場合、対照ウイルスは、そのような内部の高マンノースグリカンのＥｎｄｏＨ切断により、ＥｎｄｏＨ処理後、分子量においていくつかのシフトを阻害し得る。しかしながら、このシフトは、対照ウイルスが、グリカンのすべてを切断するＰＮＧａｓｅＦにより処理される場合、わずか約３５％のシフトが見られ得る。

したがって、特定の態様において、ＥｎｄｏＨ感受性グリカンの量は、ＥｎｄｏＨ処理後のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって、シンドビス糖タンパク質の分子量を判定することによって検出される。目視検査によって判定されるように、ウイルス粒子の組成物が高度にマンノシル化されていることを示す、組成物中の増加した量のｅｎｄｏＨ感受性グリカンは、ＥｎｄｏＨ処理が、対照エンベロープ糖タンパク質と比較して、低分子量に対してシフトしている１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でエンベロープ（Ｅ２および／またはＥ１）糖タンパク質に対応するバンドをもたらす場合に検出される。

いくつかの例示的な実施形態において、ＥｎｄｏＨによる処理後の当該エンベロープ糖タンパク質の分子量は、完全にシフトされており、実質的には、ＰＮＧａｓｅＦによる処理後の当該エンベロープ糖タンパク質の分子量と同じである。他の例示的な実施形態において、ＥｎｄｏＨによる処理後の当該エンベロープ糖タンパク質の分子量は、（ａ）エンドグリコシダーゼにより処理されないエンベロープ糖タンパク質と、（ｂ）ＰＮＧａｓｅ
Ｆにより処理されるエンベロープ糖タンパク質との間の距離の約９０％以上シフトしている。他の例示的な実施形態において、ＥｎｄｏＨによる処理後の当該エンベロープ糖タンパク質の分子量は、（ａ）エンドグリコシダーゼにより処理されないエンベロープ糖タンパク質と、（ｂ）ＰＮＧａｓｅＦにより処理されるエンベロープ糖タンパク質との間の距離の約９０％以上シフトしている。さらに他の例示的な実施形態において、当該エンベロープ糖タンパク質の分子量は、（ａ）エンドグリコシダーゼにより処理されないエンベロープ糖タンパク質と、（ｂ）ＰＮＧａｓｅＦにより処理されたエンベロープ糖タンパク質との間の距離の約４０％以上、または好ましくは約４５％以上、または約５０％以上、または約５５％以上、または約６０％以上、または約６５％以上、または約７０％以上、または約７５％以上、または約８０％以上、または約８５％以上シフトしている。上述のように、エンベロープ糖タンパク質への参照は、具体的には、シンドビスＥ２および／またはＥ１糖タンパク質への参照を含む。

特定の態様において、当該組成物中のエンベロープ糖タンパク質、例えば、当該組成物中のシンドビスＥ２および／またはＥ１糖タンパク質のうちの少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が、マンノシダーゼ阻害剤の不在下で調製された偽型レンチウイルスベクター粒子の対照組成物中の同じアミノ酸配列（複数を含む）を有する対照エンベロープ糖タンパク質と比較して、増加した量のＥｎｄｏＨ感受性グリカンを有する。

本開示のいくつかの実施形態において、組成物は、（ａ）ＳＡＭＨＤ１阻害剤と、（ｂ）対象となる配列を含むレンチウイルスゲノムと、（ｃ）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞に優先的に結合するエンベロープ糖タンパク質とを含む偽型レンチウイルスベクター粒子を含み、当該組成物中のＮ連結グルカンのうちの少なくとも８０％は、Ｍａｎ_９構造を含む。

特定の態様において、ＳＡＭＨＤ１阻害剤は、Ｖｐｘタンパク質、例えば、ＳＩＶｍａｃＶｐｘタンパク質、ＳＩＶｓｍＶｐｘタンパク質、ＳＩＶｒｃｍＶｐｘタンパク質、またはＨＩＶ−２Ｖｐｘタンパク質である。特定の態様において、ＳＡＭＨＤ１阻害剤は、抗体またはその断片である。特定の態様において、ＳＡＭＨＤ１阻害剤は、ＳＡＭＨＤ１を阻害する能力を有するＶｐｒタンパク質、例えば、ＳＩＶｄｅｂＶｐｒタンパク質またはＳＩＶｍｕｓＶｐｒタンパク質である。

特定の態様において、対象となる配列は、タンパク質、または核酸分子、例えば、ｓｉＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、相補領域が約２０リボヌクレオチド長よりも大きい自己相補二本鎖ＲＮＡ、もしくはメッセージＲＮＡに相補的なＲＮＡをコードし、メッセージＲＮＡに対する当該相補（アンチセンス）ＲＮＡの結合は、そのタンパク質に翻訳される能力を遮断する。場合によっては、対象となる配列は、免疫応答が望ましい抗原をコードする。特定の態様において、対象となる配列は、腫瘍抗原、または（例えば、ＨＩＶ、ＨＳＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶ、マラリア、または結核等の病原体からの）感染疾患抗原をコードする。特定の態様において、対象となる複数の配列は、単一ベクター内に含まれる。

本開示のいくつかの実施形態において、組成物は、（ａ）Ｖｐｘタンパク質と、（ｂ）抗原をコードする外因性ポリヌクレオチドと、（ｃ）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に優先的に結合するエンベロープ糖タンパク質とを含む偽型レンチウイルスベクター粒子を含み、当該組成物中のＮ連結グルカンのうちの少なくとも８０％は、Ｍａｎ_９構造を含む。

特定の態様において、Ｖｐｘタンパク質は、ＳＩＶｍａｃＶｐｘタンパク質（配列番号４４）と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。

特定の態様において、偽型レンチウイルスベクター粒子を、少なくとも少なくとも１％、または少なくとも５％、または少なくとも１０％、または少なくとも２０％のインビトロ形質導入の有効性によりＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に感染させる。

特定の態様において、糖タンパク質は、シンドビスウイルスＥ２糖タンパク質である。いくつかの態様において、Ｅ２糖タンパク質は、配列番号３０［ＳＩＮ−Ｖａｒ１］と少なくとも９０％同一性を有する。いくつかの態様において、（ｉ）Ｅ２糖タンパク質の残基１６０は、不在であるか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸であり、（ｉｉ）Ｅ２糖タンパク質変異体の残基７０、７６、もしくは１５９のうちの１つ以上は、非塩基性残基であり、（ｉｉｉ）Ｅ２糖タンパク質変異体は、シンドビスウイルスＥ３糖タンパク質との融合タンパク質の一部ではない。

特定の態様において、レンチウイルスベクターゲノムは、第２の抗原をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。特定の態様において、第１および第２の抗原は、２つの抗原の間に自己切断型Ａ２ペプチドを含む融合タンパク質として発現される。いくつかの態様において、自己切断型Ａ２ペプチドは、配列番号５６または配列番号５７のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、第１の抗原は、ＭＡＧＥ−Ａ３であり、第２の抗原は、ＮＹ−ＥＳＯ−１である。

特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはパッケージングシステムのレンチウイルスベクターゲノムは、組み込み不能または組み込み不良である。

特定の態様において、レンチウイルスベクターゲノムは、不活性化された３’側の長い末端反復（ＬＴＲ）または自己不活性化された３’側の長い末端反復（ＬＴＲ）を有する。いくつかの態様において、レンチウイルスベクターゲノムは、エンハンサー配列、ＴＡＴＡボックス、Ｓｐ１部位、ＮＫ−カッパＢ部位、またはポリプリン区画（ＰＰＴ）のうちの少なくとも１つを欠いているＵ３要素を含む。

特定の態様において、抗原をコードするヌクレオチド配列は、ヒトユビキチンＣプロモーター（ＵｂｉＣ）、サイトメガロウイルス前初期プロモ−ター（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルスプロモ−ター（ＲＳＶ）、およびテトラサイクリン応答プロモ−ターから成る群から選択されるプロモ−ターに作動可能に連結している。いくつかの態様において、プロモーターは、修飾して、イントロンを欠損している。

いくつかの態様において、偽型レンチウイルスベクター粒子は、Ｒｅｖタンパク質を含む。

特定の態様において、偽型レンチウイルスベクター粒子は、少なくとも１０^５／ｍＬのＩＵを有する。

特定の態様において、組成物は、免疫刺激剤をさらに含む。

特定の態様において、組成物は、アジュバントをさらに含む。例えば、上述のような、アジュバントは、ミョウバン、または３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）を含む。本明細書に開示されるアジュバントの種類には、（ａ）アルミニウム塩、（ｂ）任意に他の特定の免疫刺激剤、例えば、ムラミルペプチド、または他の細菌細胞壁成分を含む、または含まない、水中油型エマルション製剤、（ｃ）ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸを含むサポニンアジュバント、（ｄ）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、（ｅ）サイトカイン、ならびに（ｆ）式（Ｉ）のアジュバントが含まれる。式（Ｉ）内で、好ましいアジュバントは、ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬのカタログに特定される、製品番号６９９８００であり、Ｅ１０と組み合わせたＥ１であり、（ｉ）Ａ_１は、リン酸またはリン酸塩であり、Ａ_２は、水素であり、（ｉｉ）Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^５、およびＲ^６は、ウンデシルであり、Ｒ^２およびＲ^４は、トリデシルである。特定の態様において、エンベロープ糖タンパク質はまた、マウスＳＩＧＮＲ１を発現する細胞に結合する。

特定の態様において、偽型レンチウイルスベクター粒子はまた、マウスＳＩＧＮＲ１を発現しない細胞と比較して、マウスＳＩＧＮＲ１を発現する細胞をより効率的に形質導入する。

本開示のいくつかの実施形態において、上述の偽型レンチウイルスベクター粒子は、患者における疾患または障害の治療または予防の方法で使用する。特定の態様において、疾患または障害は、癌、自己免疫疾患、または感染、例えば、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、または寄生虫感染である。
Ｖｐｘタンパク質を含むウイルスベクター粒子

本開示のいくつかの実施形態において、発現する細胞を標的とすることが可能である偽型レンチウイルスベクター粒子が提供され、
（ａ）非天然エンベロープ糖タンパク質と、
（ｂ）対象となる外因性ポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターゲノムと、
（ｃ）Ｖｐｘタンパク質または他のＳＡＭＨＤ１阻害剤とを含む。

いくつかの態様において、偽型レンチウイルスベクター粒子は、Ｒｅｖタンパク質をさらに含む。

本開示のいくつかの実施形態において、偽型レンチウイルスベクター粒子を産生するためのレンチウイルスベクターパッケージングシステムが提供され、
（ｉ）非天然エンベロープ糖タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含む第２のポリヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）ｒｅｖタンパク質をコードする第３のポリヌクレオチドと、
（ｉｖ）Ｖｐｘタンパク質または他のＳＡＭＨＤ１阻害剤をコードする第４のポリヌクレオチドと、
（ｖ）対象となる外因性ポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターゲノムとを含み、
２つ以上のポリヌクレオチドは、同じプラスミドまたは異なるプラスミド上にある。特定の態様において、（ｉｖ）のポリヌクレオチドは、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または（ｖ）のポリヌクレオチドのうちのいずれか１つ以上と同じプラスミド上にある。

特定の態様において、パッケージング細胞は、２９３、２９３Ｔ、ＨｅＬａ、Ｄ１７、ＭＤＣＫ、ＢＨＫ、およびＣｆ２Ｔｈ細胞から成る群から選択される。

特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはレンチウイルスベクターパッケージングシステムのＶｐｘタンパク質は、配列番号４４（ＳＩＶｍａｃ）、任意に、ＳＩＶｍａｃＶｐｘタンパク質（配列番号４４）、ＳＩＶｓｍＶｐｘタンパク質（配列番号４５）、ＳＩＶｒｃｍＶｐｘタンパク質（配列番号４６）、またはＨＩＶ−２ＶＰＸタンパク質（配列番号４７）と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはレンチウイルスベクターパッケージングシステムのＶｐｘタンパク質は、配列番号４４（ＳＩＶｍａｃ）、任意に、ＳＩＶｍａｃＶｐｘタンパク質（配列番号４４）、ＳＩＶｓｍＶｐｘタンパク質（配列番号４５）、ＳＩＶｒｃｍＶｐｘタンパク質（配列番号４６）、またはＨＩＶ−２ＶＰＸタンパク質（配列番号４７）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。

特定の態様において、上記の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはレンチウイルスベクターパッケージングシステムのレンチウイルスベクターゲノムは、ＨＩＶ−１またはＭＬＶ由来である。

特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはパッケージングシステムのレンチウイルスベクターゲノムは、非組み込みである。

特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはパッケージングシステムの非天然エンベロープ糖タンパク質は、アルファウイルス糖タンパク質、例えば、シンドビスＥ２糖タンパク質、ＶＥＥＥ２糖タンパク質、ラブドウイルスまたはベシクロウイルス糖タンパク質等、ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質、アレナウイルス糖タンパク質、コロナウイルス糖タンパク質、パラミクソウイルス糖タンパク質、フラビルウイルス糖タンパク質、オルトミクソウイルス糖タンパク質、およびバキュロウイルス糖タンパク質等、好ましくは、シンドビスウイルス等のアルファウイルスから成る群から選択される。

特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはパッケージングシステムの非天然エンベロープ糖タンパク質は、配列番号３０［ＳＩＮＶａｒ１］と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質である。

特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはパッケージングシステムの非天然エンベロープ糖タンパク質は、ＳＡＭＨＤ１を発現する細胞に優先的に結合する。いくつかの態様において、ＳＡＭＨＤ１を発現する細胞は、骨髄細胞、任意に、樹状細胞、単球、またはマクロファージである。

特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはパッケージングシステムの非天然エンベロープ糖タンパク質は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に優先的に結合する。

特定の態様において、対象となるポリヌクレオチドは、（ｉ）抗原、（ｉｉ）治療的ポリペプチド、または（ｉｉｉ）阻害オリゴヌクレオチドをコードする。いくつかの態様において、対象となるポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡをコードする。

特定の態様において、対象となるポリヌクレオチドは、ウイルス、細菌、真菌、原虫、または癌抗原をコードする。

特定の態様において、エンベロープ糖タンパク質はまた、マウスＳＩＧＮＲ１を発現する細胞に結合する。

本開示のいくつかの実施形態において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子を産生する方法が提供され、本方法は、培養培地中で、前述の実施形態のいずれかに記載のパッケージングシステムを培養することを含む。いくつかの態様において、培養培地は、マンノシダーゼＩ阻害剤、任意に、キフネンシンまたはＤＭＮＪを含む。

本開示のいくつかの実施形態において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子を含む組成物が提供され、ベクター粒子は、高度にマンノシル化されている。

本開示のいくつかの実施形態において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子を含む組成物が提供され、当該組成物中のＮ連結グルカンの少なくとも８０％は、Ｍａｎ_９構造を含む。

本開示のいくつかの実施形態において、インビトロまたはインビボでＳＡＭＨＤ１を発現する細胞にレンチウイルスベクターゲノムを送達する方法が提供され、本方法は、細胞を、上記の実施形態のいずれかに記載のベクター粒子と接触させることを含む。いくつかの態様において、ＳＡＭＨＤ１を発現する細胞は、樹状細胞、単球、またはマクロファージである。

本開示のいくつかの実施形態において、免疫応答を誘発するまたは個体を免疫化する方法が提供され、本方法は、個体に、上記の実施形態のいずれかに記載のベクター粒子、好ましくはＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に優先的に結合するベクター粒子を投与することを含む。

本開示のいくつかの実施形態において、上述の偽型レンチウイルスベクター粒子は、患者における疾患または障害の治療または予防の方法で使用する。特定の態様において、疾患または障害は、癌、自己免疫疾患、または感染、例えば、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、または寄生虫感染である。
高度にマンノシル化されているエンベロープ糖タンパク質を用いてウイルスベクター粒子を生成する方法

本開示のいくつかの実施形態において、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に優先的に結合するウイルスベクター粒子を生成する方法が提供され、本方法は、培養培地中で、ウイルス粒子成分を含むウイルスパッケージング細胞を培養することを含み、当該成分は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に優先的に結合するエンベロープ糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、この培養培地は、約０．０１μｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌの濃度でキフネンシンを含む。

特定の態様において、キフネンシンは、約０．２５μｇ／ｍｌ〜約２μｇ／ｍｌの濃度で、培養培地中に存在する。

特定の態様において、キフネンシンは、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、または約０．２５μｇ／ｍｌ〜約２μｇ／ｍｌ、または約０．５μｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌの濃度で、培養培地中に存在する。

特定の態様において、ウイルス粒子成分は、レンチウイルスベクターゲノムを含む。

特定の態様において、ウイルス粒子を、キフネンシンを欠いている培養培地中で産生されるウイルス粒子よりも少なくとも５倍高い形質導入効率を有するＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞に感染させる。

特定の態様において、ウイルスパッケージング細胞は、
（ｉ）エンベロープ糖タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含む第２のポリヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）ｒｅｖタンパク質をコードする第３のポリヌクレオチドと、
（ｉｖ）抗原をコードする第４のポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターゲノムとを含む。

特定の態様において、エンベロープ糖タンパク質は、シンドビスウイルスＥ２糖タンパク質である。いくつかの態様において、Ｅ２糖タンパク質は、［ＳＩＮＶａｒ１］、またはそれと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するその変異体を含む。いくつかの態様において、Ｅ２糖タンパク質は、配列番号３０［ＳＩＮ−Ｖａｒ１］と９０％同一である。いくつかの態様において、（ｉ）Ｅ２糖タンパク質の残基１６０は、不在であるか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸であり、（ｉｉ）Ｅ２糖タンパク質変異体の残基７０、７６、もしくは１５９のうちの１つ以上は、非塩基性残基であり、（ｉｉｉ）Ｅ２糖タンパク質変異体は、シンドビスウイルスＥ３糖タンパク質との融合タンパク質の一部ではない。いくつかの態様において、Ｅ２糖タンパク質は、配列番号３０［ＳＩＮ−Ｖａｒ１］である。

特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはパッケージングシステムのレンチウイルスベクターゲノムは、組み込み不能または組み込み不良である。いくつかの態様において、ｐｏｌ遺伝子は、不活性インテグラーゼ酵素をコードし、レンチウイルスベクターゲノムは、機能的ポリプリン区画（ＰＰＴ）を欠いている。

特定の態様において、ウイルスパッケージング細胞は、ＳＡＭＨＤ１阻害活性を保持するＶｐｘタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含み、任意に、ＳＩＶｍａｃ
Ｖｐｘ（配列番号４４）と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。

本開示のいくつかの実施形態において、アルファウイルスＥ２糖タンパク質を提示するウイルス粒子を含む組成物が提供され、当該組成物中のＮ連結グルカンの少なくとも８０％は、Ｍａｎ_９構造を含む。

特定の態様において、アルファウイルスＥ２糖タンパク質は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に優先的に結合するシンドビスＥ２糖タンパク質である。

本開示のいくつかの実施形態において、ウイルスベクターゲノムを、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞に送達する方法が提供され、本方法は、前述の実施形態のいずれかに記載のウイルス粒子または組成物を投与することを含む。
さらなる実施形態

１．偽型レンチウイルスベクター粒子を生成する方法であって、
（ａ）キフネンシンを含む培養培地中で、
（１）外因性抗原をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターゲノムと、
（２）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に優先的に結合するシンドビスＥ２糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
（３）ＳＡＭＨＤ１阻害活性を保持するＶｐｘタンパク質またはＶｐｒタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含むウイルスパッケージング細胞を培養することと、（ｂ）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に優先的に結合する偽型レンチウイルスベクター粒子を単離することと、を含む、方法。

２．前記Ｅ２糖タンパク質が、配列番号３０［ＳＩＮ−Ｖａｒ１］と９０％同一である、実施形態１に記載の方法。

３．（ｉ）前記Ｅ２糖タンパク質の残基１６０が、不在であるか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸であり、（ｉｉ）前記Ｅ２糖タンパク質変異体の残基７０、７６、または１５９のうちの１つ以上が、非塩基性残基であり、（ｉｉｉ）前記Ｅ２糖タンパク質変異体が、シンドビスウイルスＥ３糖タンパク質との融合タンパク質の一部ではない、実施形態１または２に記載の方法。

４．前記Ｅ２糖タンパク質が、配列番号３０［ＳＩＮ−Ｖａｒ１］である、実施形態２に記載の方法。

５．前記Ｖｐｘタンパク質が、ＳＩＶｍａｃＶｐｘ［配列番号４４］と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、上記の実施形態のいずれか１つに記載の方法。

６．前記Ｖｐｘタンパク質が、ＳＩＶｍａｃＶｐｘ（配列番号４４）、ＳＩＶｓｍＶｐｘ（配列番号４５）、ＳＩＶｒｃｍＶｐｘ（配列番号４６）、またはＨＩＶ−２Ｖｐｘ（配列番号４７）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の方法。

７．前記Ｖｐｘタンパク質が、ＳＩＶｄｅｂＶｐｒ（配列番号４８）またはＳＩＶｍｕｓＶｐｒ（配列番号４９）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の方法。

８．前記抗原が、腫瘍特異的抗原またはウイルス特異的抗原である、上記の実施形態のいずれか１つに記載の方法。

９．前記腫瘍特異的抗原が、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ−７、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質、腎細胞癌抗原、５Ｔ４、ＳＭ２２−アルファ、炭酸脱水酵素Ｉ、炭酸脱水酵素ＩＸ（Ｇ２５０としても知られる）、ＨＩＦ−１アルファ、ＨＩＦ−２アルファ、ＶＥＧＦ、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性リン酸塩、前立腺の６−膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、ＮＫＸ３．１、テロメラーゼ酵素、スルビビン、メソテリン、変異型ｒａｓ、ｂｃｒ／ａｂｌ再構成、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、変異型ｐ５３、野生型ｐ５３、サイトクロームＰ４５０１Ｂ１、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ７、癌胎児性抗原、およびアルファ−フェトタンパク質から成る群から選択される、実施形態８に記載の方法。

１０．前記ウイルス特異的抗原が、ＨＩＶ抗原、ＳＩＶ抗原、アデノウイルス抗原、エンテロウイルス抗原、コロナウイルス抗原、カリシウイルス抗原、ジステンパーウイルス抗原、エボラウイルス抗原、フラビウイルス抗原、肺炎ウイルス抗原、ヘルペスウイルス抗原、感染性腹膜炎ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、白血病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、オルトミクソウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、パラインフルエンザウイルス抗原、パラミクソウイルス抗原、パラボウイルス抗原、ペスチウイルス抗原、ピコルナウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ポックスウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、レオウイルス抗原、レトロウイルス抗原、またはロタウイルス抗原から成る群から選択される、実施形態８に記載の方法。

１１．前記レンチウイルスベクターゲノムが、第２の抗原をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、上記の実施形態のいずれか１つに記載の方法。

１２．前記第１および第２の抗原が、前記２つの抗原の間に自己切断型Ａ２ペプチドを含む融合タンパク質として発現される、実施形態１１に記載の方法。

１３．自己切断型Ａ２ペプチドが、配列番号５６または配列番号５７のアミノ酸配列を含む、実施形態１２に記載の方法。

１４．前記第１の抗原が、ＮＹ−ＥＳＯ−１であり、前記第２の抗原が、ＭＡＧＥ−Ａ３である、実施形態１１〜１３のいずれか１つに記載の方法。

１５．前記第１および第２の抗原が、二方向性プロモーターから発現される、実施形態１１に記載の方法。

１６．前記キフネンシンが、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌの濃度で、前記培養培地中に存在する、上記の実施形態のいずれか１つに記載の方法。

１７．前記キフネンシンが、約０．２５μｇ／ｍｌ〜約２μｇ／ｍｌの濃度で、前記培養培地中に存在する、実施形態１６に記載の方法。

１８．前記ウイルスパッケージング細胞が、
（ｉ）ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含むポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）ｒｅｖタンパク質をコードするポリヌクレオチドとをさらに含む、上記の実施形態のいずれか１つに記載の方法。

１９．前記ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子が、ヒトのコドンに最適化され、配列番号５４の１２２８〜１５０９位周辺に最適化されないウインドウを含む、実施形態１８に記載の方法。

２０．前記ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含むポリヌクレオチドが、機能的ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）を欠いている、実施形態１８または１９に記載の方法。

２１．前記ｐｏｌ遺伝子が、不活性インテグラーゼ酵素をコードする、実施形態１８〜２０のいずれか１つに記載の方法。

２２．前記インテグラーゼ酵素が、Ｄ６４Ｖ突然変異体を有する、実施形態２１に記載の方法。

２３．前記Ｖｐｘタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、前記ｒｅｖタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または前記ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含むポリヌクレオチドと同じまたは異なるプラスミド上にある、実施形態１８〜２２のいずれか１つに記載の方法。

２４．前記レンチウイルスベクターゲノムが、ＨＩＶ−１に由来する、上記の実施形態のいずれか１つに記載の方法。

２５．前記レンチウイルスベクターゲノムが、不活性化された３’側の長い末端反復（ＬＴＲ）または自己不活性化された３’側の長い末端反復（ＬＴＲ）を有する、上記の実施形態のいずれか１つに記載の方法。

２６．前記レンチウイルスベクターゲノムが、エンハンサー配列、ＴＡＴＡボックス、Ｓｐ１部位、ＮＫ−カッパＢ部位、またはポリプリン区画（ＰＰＴ）のうちの少なくとも１つを欠いているＵ３要素を含む、実施形態２５に記載の方法。

２７．前記レンチウイルスベクターゲノムが、配列番号２１、２２、または２３のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、上記の実施形態のいずれか１つに記載の方法。

２８．前記レンチウイルスベクターゲノムが、樹状細胞成熟／刺激因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、上記の実施形態のいずれか１つに記載の方法。

２９．前記樹状細胞成熟／刺激因子が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＴＮＦα、Ｂ７．１、Ｂ７．２、４−１ＢＢ、ＣＤ４０リガンド、および薬物誘導ＣＤ４０から成る群から選択される、実施形態２８に記載の方法。

３０．抗原をコードする前記ヌクレオチド配列が、ヒトユビキチンＣプロモ−ター（ＵｂｉＣ）、サイトメガロウイルス前初期プロモ−ター（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルスプロモ−ター（ＲＳＶ）、およびテトラサイクリン応答プロモ−ターから成る群から選択されるプロモ−ターに作動可能に連結している、上記の実施形態のいずれか１つに記載の方法。

３１．前記プロモ−ターが、イントロン欠損プロモーターである、実施形態３０に記載の方法。

３２．前記イントロン欠損プロモーターが、ＵｂｉＣプロモーターである、実施形態３１に記載の方法。

３３．請求項１に記載の実施形態により産生される、レンチウイルスベクター粒子。

３４．請求項１８に記載の実施形態により産生される、レンチウイルスベクター粒子。

３５．偽型レンチウイルスベクター粒子を生成する方法であって、
（ａ）キフネンシンを含む培養培地中で、
（１）ＭＡＧＥ−Ａ３およびＮＹ−ＥＳＯ−１をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターゲノムであって、自己切断型ＴＡ２ペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ＭＡＧＥ−Ａ３およびＮＹ−ＥＳＯ−１をコードするポリヌクレオチドとの間に配置され、前記レンチウイルスゲノムがポリプリン区画（ＰＰＴ）を欠き、ＭＡＧＥ−Ａ３およびＮＹ−ＥＳＯ−１の発現が、イントロンを欠いているＵｂｉＣプロモーターによって制御される、レンチウイルスベクターゲノムと、
（２）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に優先的に結合するシンドビスＥ２糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
（３）ヒトのコドンに最適化されるｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが、機能的ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）を欠いており、前記ｐｏｌ遺伝子が、不活性インテグラーゼ酵素をコードする、ポリヌクレオチドと、
（４）ＳＡＭＨＤ１阻害活性を保持するＶｐｘタンパク質またはＶｐｒタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含むウイルスパッケージング細胞を培養することと、（ｂ）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に優先的に結合する偽型レンチウイルスベクター粒子を単離することと、を含む、方法。

３６．（ａ）ＳＡＭＨＤ１阻害活性を保持するＶｐｘタンパク質またはＶｐｒタンパク質と、（ｂ）抗原をコードする外因性ポリヌクレオチドと、（ｃ）ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞に優先的に結合する複数のエンベロープ糖タンパク質とを含む偽型レンチウイルスベクター粒子を含む組成物であって、マンノシダーゼ阻害剤の不在下で調製された同じ偽型レンチウイルスベクター粒子の対照組成物と比較して、より高度にマンノシル化されている、組成物。

３７．前記エンベロープ糖タンパク質が、アルファウイルス糖タンパク質である、実施形態３６に記載の組成物。

３８．前記エンベロープ糖タンパク質が、シンドビス糖タンパク質である、実施形態３７に記載の組成物。

３９．高マンノシル化が、マンノシダーゼ阻害剤の不在下で調製された対照組成物よりもさらにＥｎｄｏＨ感受性であることを特徴とする、実施形態３６〜３８のいずれかに記載の組成物。

４０．ＥｎｄｏＨ感受性が、ＥｎｄｏＨ処理後、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって、前記エンベロープ糖タンパク質の分子量を評価することによって判定される、実施形態３６〜３８のいずれかに記載の組成物。

４１．ＥｎｄｏＨによる処置後の前記エンベロープ糖タンパク質の分子量が、（ａ）エンドグリコシダーゼにより処理されないエンベロープ糖タンパク質と、（ｂ）ＰＮＧａｓｅＦにより処理されたエンベロープ糖タンパク質との間の距離の約４５％以上シフトしている、実施形態３６〜３８のいずれか１つに記載の組成物。

４２．ＥｎｄｏＨによる処置後の前記エンベロープ糖タンパク質の分子量が、（ａ）エンドグリコシダーゼにより処理されないエンベロープ糖タンパク質と、（ｂ）ＰＮＧａｓｅＦにより処理されたエンベロープ糖タンパク質との間の距離の約７０％以上シフトしている、実施形態４１に記載の組成物。

４３．ＥｎｄｏＨによる処置後の前記エンベロープ糖タンパク質の分子量が、（ａ）エンドグリコシダーゼにより処理されないエンベロープ糖タンパク質と、（ｂ）ＰＮＧａｓｅＦにより処理されたエンベロープ糖タンパク質との間の距離の約９０％以上シフトしている、実施形態４１に記載の組成物。

４４．前記組成物中の前記エンベロープ糖タンパク質のうちの少なくとも３０％が、マンノシダーゼ阻害剤の不在下で調製された偽型レンチウイルスベクター粒子の対照組成物中の同じアミノ酸配列（複数を含む）を有する対照糖タンパク質と比較して、増加した量のＥｎｄｏＨ感受性グリカンを有する、実施形態３６〜４３のいずれか１つに記載の組成物。

４５．前記エンベロープ糖タンパク質の大部分が、高度にマンノシル化されている、実施形態３６〜４４のいずれか１つに記載の組成物。

４６．前記偽型レンチウイルスベクター粒子が、組み込み不能である、実施形態３６〜４５のいずれか１つに記載の組成物。

４７．前記組成物が、シンドビスＥ２糖タンパク質である、実施形態３６〜４６のいずれか１つに記載の組成物。

４８．前記Ｅ２糖タンパク質が、配列番号３０［ＳＩＮ−Ｖａｒ１］と９０％同一である、実施形態４７に記載の組成物。

４９．（ｉ）前記Ｅ２糖タンパク質の残基１６０が、不在であるか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸であり、（ｉｉ）前記Ｅ２糖タンパク質変異体の残基７０、７６、もしくは１５９のうちの１つ以上が、非塩基性残基であり、（ｉｉｉ）前記Ｅ２糖タンパク質変異体が、シンドビスウイルスＥ３糖タンパク質との融合タンパク質の一部ではない、実施形態４７または４８に記載の組成物。

５０．前記Ｅ２糖タンパク質が、配列番号３０［ＳＩＮ−Ｖａｒ１］である、実施形態４９に記載の組成物。

５１．前記Ｖｐｘタンパク質が、ＳＩＶｍａｃＶｐｘ［配列番号４４］と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態３６〜５０のいずれか１つに記載の組成物。

５２．前記Ｖｐｘタンパク質が、ＳＩＶｍａｃＶｐｘ（配列番号４４）、ＳＩＶｓｍ
Ｖｐｘ（配列番号４５）、ＳＩＶｒｃｍＶｐｘ（配列番号４６）、またはＨＩＶ−２
Ｖｐｘ（配列番号４７）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態３６〜５０のいずれか１つに記載の組成物。

５３．前記Ｖｐｘタンパク質が、ＳＩＶｄｅｂＶｐｒ（配列番号４８）またはＳＩＶｍｕｓＶｐｒ（配列番号４９）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態３６〜４９のいずれか１つに記載の組成物。

５４．前記抗原が、腫瘍特異的抗原またはウイルス特異的抗原である、実施形態３６〜５３のいずれか１つに記載の組成物。

５５．前記腫瘍特異的抗原が、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ−７、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質、腎細胞癌抗原、５Ｔ４、ＳＭ２２−アルファ、炭酸脱水酵素Ｉ、炭酸脱水酵素ＩＸ（Ｇ２５０としても知られる）、ＨＩＦ−１アルファ、ＨＩＦ−２アルファ、ＶＥＧＦ、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性リン酸塩、前立腺の６−膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、ＮＫＸ３．１、テロメラーゼ酵素、スルビビン、メソテリン、変異型ｒａｓ、ｂｃｒ／ａｂｌ再構成、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、変異型ｐ５３、野生型ｐ５３、サイトクロームＰ４５０１Ｂ１、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ７、癌胎児性抗原、およびアルファ−フェトタンパク質から成る群から選択される、実施形態５４に記載の組成物。

５６．前記ウイルス特異的抗原が、ＨＩＶ抗原、ＳＩＶ抗原、アデノウイルス抗原、エンテロウイルス抗原、コロナウイルス抗原、カリシウイルス抗原、ジステンパーウイルス抗原、エボラウイルス抗原、フラビウイルス抗原、肺炎ウイルス抗原、ヘルペスウイルス抗原、感染性腹膜炎ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、白血病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、オルトミクソウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、パラインフルエンザウイルス抗原、パラミクソウイルス抗原、パラボウイルス抗原、ペスチウイルス抗原、ピコルナウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ポックスウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、レオウイルス抗原、レトロウイルス抗原、またはロタウイルス抗原である、実施形態５４に記載の組成物。

５７．前記レンチウイルスベクターゲノムが、第２の抗原をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態３６〜５６のいずれか１つに記載の組成物。

５８．前記第１および第２の抗原が、前記２つの抗原の間に自己切断型Ａ２ペプチドを含む融合タンパク質として発現される、実施形態５７に記載の組成物。

５９．自己切断型Ａ２ペプチドが、配列番号５６または配列番号５７のアミノ酸配列を含む、実施形態５８に記載の組成物。

６０．前記第１の抗原が、ＮＹ−ＥＳＯ−１であり、前記第２の抗原が、ＭＡＧＥ−Ａ３である、実施形態５７〜５９のいずれか１つに記載の組成物。

６１．前記第１および第２の抗原が、二方向性プロモーターから発現される、実施形態５７に記載の組成物。

以下の実施例は、例証の目的で提供され、本開示の範囲を限定することを意図しない。実施例１
ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞に効率的に感染させるキフネンシンの存在下で産生されるシンドビスウイルス糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクター粒子

以下の実験の目的は、高度にマンノシル化されているエンベロープ糖タンパク質により偽型レンチウイルスベクターを産生し、特徴付けようと努めることである。その際、本発明者らは、キフネンシンが、ＤＭＮＪを含む他のマンノシダーゼＩ阻害剤と比較して、著しく少ない濃度を使用して、ＤＣ−ＳＩＧＮ（例えば、樹状細胞）を発現する細胞を効率的に感染させる能力を持つ偽型レンチウイルスベクターを産生する際に、より有効であることを予想外に発見した。

２９３Ｔ細胞は、それぞれ、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して、レンチウイルスゲノム、Ｇａｇ／Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、およびエンベロープをコードする、４つの別々のプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションから５時間後、混合＋培地を除去した。培地を添加して、指示された量のマンノシダーゼ阻害剤（すなわち、ＤＭＮＪ、キフネンシン、およびスワインソニン）とともに、容器に戻した。４８時間後、上清（ベクターを含有する）を回収し、０．４５μｍフィルターで濾過した。次いで、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ受容体を安定的に発現するＨＴ１０８０細胞を、指示された容量のベクターで形質導入した。親ＨＴ１０８０細胞（ＤＣ−ＳＩＧＮを欠いている）は、対照として使用し、ベクターのいずれかによって形質導入しなかった。形質導入から４８時間後、細胞を、ＧＦＰの発現（ｇｆｐ％）について分析した。これらの結果を、図１Ａ（ＤＣ−ＳＩＧＮを発現するＨＴ１０８０）および１Ｂ（親ＨＴ１０８０）に示す。

シンドビスウイルス糖タンパク質により偽型化し、低濃度のキフネンシン（１μｇ／ｍｌ）の存在下で産生されるレンチウイルスベクター粒子は、より高濃度のＤＭＮＪ（４００μｇ／ｍｌ）またはスワインソニン（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で産生されるものよりも著しく良好であるＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞を予想外にトランスフェクトする。したがって、マンノシダーゼＩ阻害剤のキフネンシンの存在下での、シンドビスウイルス糖タンパク質による偽型化したレンチウイルスベクター粒子の産生は、他のマンノシダーゼＩ阻害剤の存在下で産生される粒子と比較して、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞の著しく強化された感染をもたらす。
実施例２
低量のキフネンシンは、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞に効率的に感染させる偽型レンチウイルスベクター粒子を生成するために必要とされる。

この実験の目的は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞に感染させる能力を持つ偽型レンチウイルスベクター粒子を産生する際に、最も有効なキフネンシンの濃度を決定することである。

２９３Ｔ細胞を、ＰＥＩを使用して、実施例１に記載されるプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションから５時間後、混合＋培地を除去した。培地を添加して、指示された量のキフネンシン（μｇ／ｍｌ）、または４００μｇ／ｍｌのＤＭＮＪとともに、容器に戻した。４８時間後、上清（レンチウイルスベクター粒子を含有する）を回収し、０．４５μｍフィルターで濾過した。ついで、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ受容体を安定的に発現するＨＴ１０８０細胞を、指示された容量のベクターを含有する上清で形質導入した。ベクターによって形質導入されなかった親ＨＴ１０８０細胞を、対照として使用した。形質導入から４８時間後、細胞を、ＧＦＰの発現（ｇｆｐ＋％）について分析した。これらの結果を、図２Ａ（ＤＣ−ＳＩＧＮを発現するＨＴ１０８０細胞）および２Ｂ（親ＨＴ１０８０細胞）に示す。

０．１２５μｇ／ｍｌのキフネンシンの存在下で産生される粒子は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞に感染させるために、４００μｇ／ｍｌＤＭＮＪの存在下で産生される粒子の能力と一致した（図２Ａ）。０．１２５μｇ／ｍｌを超えるすべてのキフネンシン濃度の存在下で産生される粒子を、４００μｇ／ｍｌＤＭＮＪの存在下で産生される粒子よりもはるかに効率的に、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞に感染させた。キフネンシンの滴定は、シンドビスウイルス糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクター粒子のＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞に感染させる能力が、０．２５μｇ／ｍｌの存在下で産生される粒子でピークに達することを示した。
実施例３

この実験の目的は、ＤＭＮＪまたはキフネンシンの存在下で産生される偽型レンチウイルス粒子のグリコシル化プロファイルを特徴付けることであった。

１μｇ／ｍｌキフネンシン、ＤＭＮＪの存在下、またはマンノシダーゼＩ阻害剤を含まない、シンドビスウイルス糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクター粒子を、実施例１に従って調製した。粒子を、ＰＮＧａｓｅＦまたはＥｎｄｏＨのいずれかで、１時間インキュベートした。ＰＮＧａｓｅＦは、グリコシル化プロファイルにかかわらず、すべてのＮ連結グリコシル化を切断する一般的なエンドグリコシダーゼである（図３Ａを参照されたい）。ＥｎｄｏＨは、高マンノースＮ連結グルコシル化のみを切断する特殊化したエンドグリコシダーゼである（図３Ａを参照されたい）。ウイルス粒子が、マンノシダーゼＩ阻害剤の存在下で産生される場合、ウイルスエンベロープは、高いＭａｎ_９含量を有し、ＥｎｄｏＨによる切断の影響を受けやすい糖タンパク質を有することが期待され得る。ゲルシフトアッセイを使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動し、シンドビスウイルスエンベロープに対する抗体を用いた免疫ブロット法によって、試料を分析した
これらの結果を、図３Ｂに示す。

ＰＮＧａｓｅＦまたはＥｎｄｏＨの処理と組み合わせた、キフネンシンまたはＤＭＮＪの存在または不在で産生されるウイルスのウイルスエンベロープ（ＳＩＮ−Ｖａｒ１）の可動の程度は、Ｖａｒ１のグリコシル化の程度を示す。対照ウイルス（レーン１）をグリコシル化して（その結果として、ゲル上でゆっくりと泳動して）、このグリコシル化が、（レーン２に見られるより高速な可動によって証明されるように）ＰＮＧａｓｅＦによって完全に除去され得る。任意のＮ連結グリコシル化を切断するＰＮＧａｓｅＦの能力により予測されるように、ＤＭＮＪまたはキフネンシンのいずれかの存在下で産生されるウイルスは、ＰＮＧａｓｅＦ処理に対して感受性がある（レーン５および８）。しかしながら、マンノシダーゼＩ阻害剤（Ｖａｒ１＋ＤＭＮＪまたは＋キフネンシン）の存在下で産生されるウイルスのみが、ＥｎｄｏＨ処理に対して感受性があり（レーン６および９）、一方、対照ウイルス（Ｖａｒ１）のみが、ＥｎｄｏＨに対して部分的に感受性がある。部分的感受性は、産生中、通常、マンノシダーゼＩに曝露されないＥ２−Ｖａｒ１の部位から来る可能性が高く、樹状細胞への結合の一員とならない。これらの結果は、高マンノース糖タンパク質によりウイルス粒子を産生する際に、マンノシダーゼＩ阻害剤キフネンシンの効率が、ＥｎｄｏＨ処理後にゲルシフトアッセイを使用して、ＤＭＮＪの存在下で産生される粒子に対するその効率と比較して、測定することができることを示す。
実施例４
エンベロープ糖タンパク質中のマンノース含量は、ウイルス粒子を調製するために使用される培地中のキフネンシン濃度と相関する

この実験の目的は、キフネンシンの異なる濃度の存在下で産生される偽型レンチウイルス粒子のグリコシル化プロファイルを特徴付けることであった。

シンドビスウイルス糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクター粒子を、異なる濃度のキフネンシンまたは４００μｇ／ｍｌのＤＭＮＪを用いて、実施例１に従って調製した。粒子を、ＥｎｄｏＨで、１時間インキュベートした。次いで、試料は、ゲルシフトアッセイ、およびシンドビスウイルスエンベロープに対する抗体を用いた免疫ブロット法を使用して分析した。同時に、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ受容体を安定的に発現するＨＴ１０８０細胞を、キフネンシンまたはＤＭＮＪを含むか、または含まないで調製された、指示された容量の偽型レンチウイルスベクター粒子で形質導入した。形質導入から４８時間後、細胞を、（ＧＦＰ陽性細胞のパーセントとしてｙ軸上に示される）ＧＦＰの発現について分析し、グラフを作成した。これらの結果を、図４に示す。

マンノース含量の程度は、ＥｎｄｏＨで処理した試料のゲル上のシフトの程度（図４Ａ）、およびＧＦＰ形質導入のパーセントをグラフにする（図４Ｂ）ことによって示されるように、ＨＴ１０８０ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞の形質導入の程度と相関する。すなわち、ウイルス粒子を調製するために使用される培地中の次第に高くなるキフネンシン濃度は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現するＨＴ１０８０細胞において、ＥｎｄｏＨ処理によるより大きいシフト、およびより高いＧＦＰの発現（すなわち、感染）によって示されるように、より高いマンノース含量のエンベロープ糖タンパク質をもたらした。これらの結果は、キフネンシンが、ウイルスエンベロープにおけるマンノース含量の程度に直接影響を与え、これは、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ受容体を発現するＨＴ１０８０細胞を形質導入する能力と直接相関していることを示す。
実施例５
偽型レンチウイルスベクター粒子におけるＶｐｘ発現の確認

この実験の目的は、ＳＩＶｍａｃＶｐｘが、偽型レンチウイルスベクター粒子中に発現し、検出され得るかどうかを判定することであった。

Ｎ末端ＨＡｔａｇを有するＳＩＶｍａｃＶｐｘが、ＣＭＶプロモーター（ｐＥＮＶ−ＳＩＶｍａｃＶｐｘと命名された構築物）によって起動される発現ベクターにクローン化された。Ｖｐｘタンパク質が発現されたことを確認するために、２９３Ｔ細胞を、この構築物でトランスフェクトし、トランスフェクションから２４時間後溶解した。溶解物は、抗ＨＡ抗体を使用する免疫ブロット法によって分析した（図５Ａ）。Ｖｐｘがレンチウイルス粒子にパッケージ化されたことを確認するために、２９３Ｔパッケージング細胞にトランスフェクトした４つのプラスミドを使用して、レンチウイルスを調製した。これらの４つのプラスミドは、レンチウイルスゲノム、Ｇａｇ／Ｐｏｌ（組み込み可能［Ｉｎｔ＋］、または組み込み不良［Ｉｎｔ−］）、Ｒｅｖ、およびエンベロープをコードする。５番目のプラスミドは、Ｖｐｘに対して含まれるか、または含まれなかった。ウイルスは、トランスフェクション後の２日間回収し、遠心分離を使用して濃縮した。抗ＨＡ抗体を用いた免疫ブロット法のために、ゲル上にウェルあたり１００ｎｇのｐ２４を充填した（図５Ｂ）。抗ｐ２４抗体は、負荷対照として使用された。

Ｖｐｘ遺伝子をコードするプラスミドでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞において、Ｖｐｘタンパク質は、効率的に発現される（図５Ａ）。同様に、Ｖｐｘは、組み込み可能な（Ｉｎｔ＋）および組み込み不良（Ｉｎｔ−）のレンチウイルス粒子にパッケージ化される（図５Ｂ）。
実施例６
Ｖｐｘは、ＶＳＶ−Ｇにより偽型化した組み込み不能なレンチウイルスベクター粒子によるヒト樹状細胞の効率的な形質導入のために必要である

この実験の目的は、Ｖｐｘが、ＶＳＶ−Ｇにより偽型化した組み込み不能なレンチウイルスベクター粒子による樹状細胞の生産的感染のために必要であるかどうかを判定することであった。

ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ＣＤ１４＋単球について富化され、続いて、ＧＭＣＳＦおよびＩＬ−４を使用して、樹状細胞について富化された。これらのＰＢＭＣ由来のヒト樹状細胞は、Ｖｐｘを含む、または含まない、増加する量のＶＳＶ−Ｇにより偽型化した組み込み不能なレンチウイルスベクター粒子（０．２ｎｇ、２ｎｇ、２０ｎｇ、または２００ｎｇのｐ２４）構築物によって形質導入された。感染から５日後、形質導入事象は、ＣＤ１１ｃが陽性である細胞にゲートをかけ、ｙ軸にＤＣ−ＳＩＧＮをとり、ＧＦＰが陽性である細胞のパーセント（ｘ軸）を評価することによって測定された。ＡＺＴ（逆転写酵素阻害剤）は、最高用量のレンチウイルスベクター粒子（２００ｎｇ）に使用した。

これらの結果を、図６に示す。Ｖｐｘは、ＰＢＭＣに由来のヒト樹状細胞を形質導入するために、組み込み不能のＶＳＶ−Ｇにより偽型化したレンチウイルス粒子に必要であった。効率的な形質導入は、ＡＺＴによって阻害されたため、逆転写によって異なる。
実施例７
Ｖｐｘは、ＶＳＶ−Ｇにより偽型化した組み込み可能なレンチウイルスベクター粒子によってヒト樹状細胞の形質導入を改善する

この実験の目的は、Ｖｐｘが、ＶＳＶ−Ｇにより偽型化した組み込み可能なレンチウイルスベクター粒子による樹状細胞の生産的感染のために必要であるかどうかを判定することであった。

ヒトＰＢＭＣは、ＣＤ１４＋単球について富化され、続いて、ＧＭＣＳＦおよびＩＬ−４を使用して、樹状細胞について富化された。これらのＰＢＭＣ由来のヒト樹状細胞は、Ｖｐｘを含む、または含まない、増加する量のＶＳＶ−Ｇにより偽型化した組み込み可能なレンチウイルスベクター粒子（０．２ｎｇ、２ｎｇ、または２０ｎｇのｐ２４）構築物によって形質導入された。感染から５日後、形質導入事象は、ＣＤ１１ｃが陽性である細胞にゲートをかけ、ｙ軸にＣＤ１１ｃをとり、ＧＦＰが陽性である細胞のパーセント（ｘ軸）を評価することによって測定された。ネビラピン（Ｎｅｖ、逆転写酵素阻害剤）は、最高用量のレンチウイルスベクター粒子（２０ｎｇ）に使用した。

これらの結果を、図７に示す。Ｖｐｘは、ＰＢＭＣ由来のヒト樹状細胞を形質導入するための組み込み可能なレンチウイルスベクター粒子の能力を増強した。改善された形質導入は、ネビラピンによって阻害されたため、逆転写によって異なる。
実施例８
Ｖｐｘおよび高度にマンノシル化されているエンベロープ糖タンパク質は、シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクター粒子によってヒト樹状細胞の効率的な形質導入に必要である。

この実験の目的は、樹状細胞に生産的に感染させるための、Ｖｐｘタンパク質を含み、キフネンシンの存在下で産生されるシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクター粒子の能力を試験することであった。

ヒトＰＢＭＣは、ＣＤ１４＋単球について富化され、続いて、ＧＭＣＳＦおよびＩＬ−４を使用して、樹状細胞について富化された。これらのＰＢＭＣ由来のヒト樹状細胞は、Ｖｐｘを含む、または含まない、様々な量のＳＩＮｖａｒ１により偽型化した組み込み不良なレンチウイルスベクター粒子（０．２ｎｇ、２ｎｇ、もしくは２０ｎｇのｐ２４）構築物により形質導入されたか、またはマンノシダーゼＩ阻害剤、キフネンシンの存在または不在下で産生された。感染から５日後、形質導入事象は、ＣＤ１１ｃが陽性である細胞にゲートをかけ、ｙ軸にＤＣ−ＳＩＧＮまたはＣＤ１１ｃをとり、ＧＦＰが陽性である細胞のパーセント（ｘ軸）を評価することによって測定された。ネビラピン（Ｎｅｖ、逆転写酵素阻害剤）は、最高用量のレンチウイルスベクター粒子（２０ｎｇ）に使用した。

図８に示されるように、予想外に、Ｖｐｘ、およびキフネンシンの存在下でウイルス粒子の産生の両方が、シンドビスウイルス糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスを使用して、ヒト樹状細胞を効率的に形質導入するために必要である。したがって、これらの結果は、高マンノシル化糖タンパク質の組み合わせを含む粒子（キフネンシンの存在下での粒子形成の結果）およびＶｐｘが、レンチウイルスゲノムによってコードされたタンパク質に効率的に感染し、発現するために、相乗的に作用することを示す。つまり、Ｖｐｘまたは高マンノシル化糖タンパク質のいずれか１つがシンドビスエンベロープ糖タンパク質により偽型化した組み込み不良なレンチウイルス粒子から欠けている場合、樹状細胞は、効率的に形質導入されない。
実施例９
レンチウイルスベクター粒子エンベロープのマンノシル化を定量化する
シンドビスウイルス糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクター粒子は、未処理（図９Ａ、レーン１〜３）、４００μｇ／ｍｌのＤＭＮＪ（図９Ａ、レーン４〜６）、または１μｇ／ｍｌのキフネンシン（図９Ａ、レーン７〜９）を用いて、実施例１に従って調製された。粒子は、未処理であったか（レーン１、４、７）、ＥｎｄｏＨで１時間インキュベートされたか（レーン２、５、８）、またはＰＮＧａｓｅＦで１時間インキュベートされた（レーン３、６、９）。次いで、試料は、ゲルシフトアッセイ、およびシンドビスウイルスエンベロープに対する抗体を用いた免疫ブロット法を使用して分析された。

ゲルシフトデータの分析は、ＢｉｏｒａｄからのＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅソフトウェアを使用して行われた。つまり、「レーン」機能を使用して、図９Ａに示される９つのレーンのそれぞれの中を通って、縦線を引いた。これにより、プログラムに対して分析されるべき領域を指定する。次に、「帯属性」機能を使用して、それぞれの帯に対するピーク強度が判定された。これらの値もまた、図９Ａに示す。これは、前に示された「レーン」の中を通るゲル上のそれぞれの帯のピーク強度値を与える。

次に、それぞれの帯の強度プロファイルおよびレーン上のその位置からグラフを組み立てた。これらの結果を、図９Ｂ（マンノシダーゼ処理なし）、図９Ｃ（ＤＭＮＪ処理、および図９Ｄ（キフネンシン処理）に示す。

示されるように、それぞれのグラフは、酵素なし、ＥｎｄｏＨ、またはＰＮＧａｓｅＦで消化されたエンベロープ型のそれぞれを示す。Ｙ軸が帯の強度であり、Ｘ軸が記載されるレーンに沿った帯の位置である（つまり、「相対前（ｒｅｌａｔｉｖｅｆｒｏｎｔ）」（ｒｆ）値；ｒｆ値は、レーンの全長にわたるゲルの上からの帯の距離である）。

シフトを定量化するために、消化酵素で切断されなかった（すなわち、全グリコシル化）帯のピーク強度を、ＰＮＧａｓｅＦ酵素で切断された（すなわち、すべてのグリコシル化部位が除去された）帯と比較した。そのため、いかなる酵素でも消化されなかった帯に相当するピーク強度は、０％のシフトであり、ＰＮＧａｓｅＦで消化された帯に相当するピーク強度は、１００％のシフトであると見なされる。キフネンシンを添加することなく（レーン２）、ＥｎｄｏＨゲルシフトは、ＰＮＧａｓｅＦシフトの３６％である。有意には、ＥｎｄｏＨで消化された（すなわち、高マンノースに特異的な消化）キフネンシンにより処理された試料は、ＰＮＧａｓｅＦシフトの距離の９０％シフトした。したがって、ウイルスベクターエンベロープ上のグリコシル化部位のほぼすべてが、１μｇ／ｍｌのキフネンシンで処理後、高マンノース状態にある。

定量分析のすべてを、表１に示す。

スペクトル強度値は、ピーク強度値−酵素を用いずに消化したエンベロープのピーク強度値である。これは、上で説明されるように、０％のシフトから１００％のシフトのスペクトルにおける値を正規化するために行われる。シフトの割合（％）は、ＰＮＧａｓｅＦで処理された試料のスペクトル強度値で割られたスペクトル強度値に、１００を掛けたものである。これにより、酵素を用いずに、またはＰＮＧａｓｅＦを用いて処理された帯と関連する、ＥｎｄｏＨで切断する帯のシフトを定量化するパーセンテージを得る。ＤＭＮＪにより処理されたエンベロープは、異種Ｎ連結グリコシル化パターンを有したため、この分析から除外された。
実施例１０
組み込み不能な設計要素を用いたウイルスベクター

例えば、ワクチンおよび抗原を標的とした免疫療法のために、ウイルスベクターの直接投与を必要とするが、ベクターにより送達された遺伝子の持続発現を必要としない臨床的適用のために、組み込み不能なレンチウイルスベクターは、それらの遺伝的負荷量の送達のために完全に組み込み可能なレンチウイルスベクターの適切かつ実行可能な代替物に相当する。ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子内のＤ６４Ｖインテグラーゼ突然変異およびベクターゲノム内のｃＰＰＴ欠失が、ウイルスベクターの組み込み率におけるそれらの影響について、単独で、および組み合わせて試験された。
材料および方法
Ａｌｕ−ＰＣＲによる組み込みの定量化

６ウェルプレートに５Ｅ５細胞／ウェルで播種した２９３ＴｈｕＤＣ−ＳＩＧＮ細胞に、ウェルあたり２Ｅ９ゲノムのベクターを三連で形質導入した。形質導入から４８時間後、細胞を収穫し、ＤＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、ゲノムＤＮＡを抽出した。宿主ゲノムＤＮＡに組み込まれるプロウイルス配列のみを増幅する、Ａｌｕ−ＬＴＲ系のネスト化したＰＣＲアッセイを使用して、ゲノムＤＮＡを分析した。以下の修飾が、Ｂｒｕｓｓｅｌｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０４，１３９（２００５）の既に刊行されている方法に導入された。第一ラウンドの増幅のために、最終反応容量２５μｌにおいて、白金Ｔａｑ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ）を使用した。第一ラウンドのＰＣＲサイクル条件は、以下の通りであった：９５℃で２分間の変性ステップ、次いで、２０サイクルの増幅（９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で９０秒）。ネスト化したＰＣＲを、ＥＸＰＲＥＳＳｑＰＣＲＳｕｐｅｒｍｉｘＵｎｉｖｅｒｓａｌ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および最終容量の２５μｌにおいて、１００ｎＭのプローブＭＨ６０３１０を使用して行った。ネスト化したＰＣＲプロトコルは、初めに５０℃で２分間保持し、９５℃で１０分間の変性ステップ、続いて、４０サイクルの増幅（９５℃で１５秒間、６０℃で３０秒間）を行った。すべての増幅反応は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ
ＣＦＸ（−９６または−３８４モデル、Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して行った。組み込まれたプロウイルスのコピー数は、知られているコピー数の組み込まれたプロウイルスを含み、５ｌｏｇ範囲にわたって希釈された参照２９３Ｔ細胞株の並列ネスト化したＡｌｕ−ＰＣＲによって生成された標準曲線を参照して計算された。標準曲線中の全ゲノムＤＮＡは、非形質導入細胞からのゲノムＤＮＡと混合することによって正規化され、それぞれの標準および知られていない試料は、１００ｎｇの全ゲノムＤＮＡを含有した。このアッセイにより、１００ｎｇのゲノムＤＮＡにおいて、５８個のプロウイルス（実験１）または４個のプロウイルス（実験２）の検出が可能であった。
ネオマイシン耐性による組み込みの定量化

ＧＦＰ−Ｔ２Ａ−ＮｅｏＲ抗原をコードするベクターを、ネオマイシン耐性コロニー形成による組み込み率について独立して分析した。ＨＴ１０８０ｈｕＤＣ−ＳＩＧＮ細胞を、６ウェルプレートにおいて、０．５ｍｌの段階希釈したベクター（ゲノムにより正規化された）を用いて、２時間形質導入し、その後、２ｍｌの完全培地を添加した。形質導入から２４時間後、細胞に、８００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ＮＹ）を含有する培地を供給した。次いで、細胞を、１１〜１３日間、Ｇ４１８選択下で継代なしで成長させ、その後、コロニーを、クリスタルバイオレット（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で染色することによって視覚化した。全組み込み事象は、以下の通りに計算された：（コロニーの数）×（希釈係数）＝組み込み事象。
ＧＦＰの発現による組み込みの定量化

ＧＦＰ−Ｔ２Ａ−ＮｅｏＲ抗原をコードするベクターについては、相対的な組み込み率は、バルク培養において、経時的にＧＦＰの発現によって測定された。ＨＴ１０８０ｈｕＤＣ−ＳＩＧＮ細胞を、６ウェルプレート中で、０．５ｍｌの等量のＷＴ／７０３またはＤ６４Ｖ／７０４ベクター（ゲノムによって正規化された）で２時間形質導入し、続いて、２ｍｌの完全培地を添加した。形質導入した細胞は、最大３０日間、薬剤選択することなく、培地中に維持し、一定の間隔で継代した。この期間中、細胞は、フローサイトメトリー（ＧｕａｖａＥａｓｙＣｙｔｅＰｌｕｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）によって、ＧＦＰの発現について周期的に分析した。
結果

２９３ＴｈｕＤＣ−ＳＩＧＮ細胞を、ＷＴまたはＤ６４Ｖ組み込みＶＳＶ−Ｇにより偽型化したベクターで形質導入し、ＷＴ（「７０３」）またはｃＰＰＴを欠失したゲノム（「７０４」）をパッケージ化した。形質導入から４８時間後、細胞は、ネスト化したＡｌｕ−ＰＣＲ分析によって組み込まれたプロウイルスの存在について分析した。図１０Ａに示されるように、ＷＴ／７０４およびＤ６４Ｖ／７０３ベクターはそれぞれ、ＷＴ／７０３ベクターと比較して、約２ｌｏｇ減少した組み込み率を有した。比較して、Ｄ６４Ｖ／７０４ベクターの組み込み率は、２ｌｏｇを上回って減少した。これらの結果は、ＩＤ−ＶＰ０２（ＳＩＶｍａｃＶｐｘおよび高度にマンノシル化されているエンベロープ糖タンパク質を有し、実施例１２に記載されるｒｅｖ非依存性ｇａｇ／ｐｏｌシステムを含むパッケージング細胞を使用して調製されたシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクター粒子）ゲノムが、著しく低下した組み込みの可能性を有し、Ｄ６４Ｖおよび７０４要素が、独立して、この表現型の一因であることを示す。

ネスト化したＡｌｕ−ＰＣＲ分析を補足するために、２つのさらなる方法を採用して、ウイルスベクターゲノムの組み込み率を調査した。両方の方法において、ＨＴ１０８０ｈｕＤＣ−ＳＩＧＮ細胞を、自己切断型Ｔ２Ａリンカーによって分離されたＧＦＰおよびネオマイシン耐性（ＮｅｏＲ）（ＧＦＰ−Ｔ２Ａ−ＮｅｏＲ）をコードするＷＴ／７０３またはＤ６４Ｖ／７０４ベクターで形質導入した。これらのベクターのいずれかによる形質導入は、ＧＦＰおよびＮｅｏＲの発現をもたらした。組み込み率は、Ｇ４１８選択後のネオマイシン耐性コロニーの副産物によって、またはバルク培養における経時的なＧＦＰの発現によって、抗原発現の関数として測定された。

組み込み率（すなわち、ネオマイシン耐性）を測定する第一の方法において、ＨＴ１０８０ｈｕＤＣ−ＳＩＧＮ細胞を、ベクターの段階希釈で形質導入し、Ｇ４１８選択の存在下で継代なしで成長させた。入力ベクターは、ゲノムのコピー数によって正規化した。ＮｅｏＲを発現し、Ｇ４１８への長期被爆を生存し、コロニーを形成する細胞は、組み込まれたプロウイルスを温存すると推定された。これらのコロニーを計数し、全組み込み事象を計算した。この実験のアプローチを使用して、２つの独立した実験において、Ｄ６４Ｖ／７０４ベクターの組み込み率は、ＷＴ／７０３のものと比較して、３ｌｏｇ減少した（図１０Ｂ）。

第２の方法（すなわち、ＧＦＰの発現）において、形質導入した細胞を、選択の不在下で連続継代して、形質導入後の様々な時間に、フローサイトメトリーにより分析した。形質導入後から２日目で、ＷＴ／７０３ベクターで形質導入した細胞の約４０パーセントが、ＧＦＰ陽性であった（図１０Ｃ）。この集団は、実験期間中変わらないままであり、このことは、ＧＦＰの発現が、主に組み込まれたプロウイルス由来であったことを示唆している。対照的に、Ｄ６４Ｖ／７０４ベクターで形質導入したＧＦＰが陽性である細胞のパーセントは、形質導入後の６日目で約１００倍低下し、この実験の残りの期間中、偽の形質導入した対照よりも高かったとはいえ、依然として低いままであった。これらの結果は、Ｄ６４Ｖ／７０４形質導入事象の大部分が、形質導入後の早い時点でＧＦＰを発現した非組み込みベクターＤＮＡを得たが、その後の細胞分裂中失ったことを示唆している。形質導入後の９日目で依然として残っているＧＦＰを発現する細胞のごく一部は、組み込まれたプロウイルスを得た少数の形質導入事象を表す可能性が高い。実験の完了時（３０日目）に、Ｄ６４Ｖ／７０４ベクターが、ＷＴ／７０３ベクターと比較して、組み込みを行う能力を３８６倍低下させたことを計算した。これらの所見は、ネストＡｌｕ−ＰＣＲ分析からの結果に相当する。

まとめると、組み込み率（ネスト化したＡｌｕ−ＰＣＲ、ＮｅｏＲのコロニー副産物、およびＧＦＰの発現の割合％）を測定するすべて３つの方法からの結果は、ウイルスベクターゲノムの組み込み率が、標準的な、組み込み可能な３代目のレンチウイルスベクター（ＷＴ／７０３）のものと比較して、２〜３ｌｏｇ低下していることを示す。
実施例１１
偽型レンチウイルスベクター粒子は、細胞の均質集団において樹状細胞を特異的に形質導入する

樹状細胞に対するウイルスベクターの特異性は、潜在的標的細胞の異種集団の中において評価された。ヒトＰＢＭＣは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で３日間培養中に置かれ、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する十分な数の単球由来のＤＣを含んだ初代細胞のプールを生成した。３日目に、キフネンシンの存在下で産生され、Ｖｐｘを含んだ、２０ｎｇｐ２４のＧＦＰをコードする偽型レンチウイルスベクターを培養に添加した。培養へのベクターの導入から３日後、細胞は、分析時に存在する細胞の主要集団内の形質導入の尺度としてＧＦＰの発現について分析した：ＤＣ（ＣＤ１１ｃ^＋）で６％、Ｂ細胞（ＣＤ１１ｃ⁻、ＣＤ１９^＋）で１０％、およびＴ細胞（ＣＤ１１ｃ⁻、ＣＤ３ε^＋）で８０％。図１１に示されるようにＤＣ−ＳＩＧＮ^＋集団は、培養内に存在するＢおよびＴ細胞集団の両方に対する０．１％と比較して、ＣＤ１１ｃ^ｈｉ内の細胞の４２％を形質導入した。形質導入は、逆転写阻害剤のネビラピン（ＲＴ阻害剤）が培養内に含まれた場合、すべての細胞集団において、完全になくなった。これらの結果は、ＤＣが少数であるヒト細胞の異種集団において、偽型レンチウイルスベクターは、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現するＤＣを特異的に形質導入する。
実施例１２
Ｒｅｖ非依存性ｇａｇ／ｐｏｌプラスミドの設計

偽型化した第三世代ＬＶの特徴を示している４つのプラスミドシステムのうちで、２つのプラスミドが、組み換えの可能性があるそれらの転写物内に配列を含有する。つまり、移入ベクター（本明細書では、ＬＶゲノムと称される）およびｇａｇ／ｐｏｌプラスミド。ＬＶゲノムとｇａｇ／ｐｏｌの転写物間で配列相同性がある２つの領域がある（図１２）。初めに、ＬＶゲノムは、部分ｇａｇ配列を有し、続いて、ｇａｇ／ｐｏｌプラスミドにおいて、ｇａｇ配列の５’末端と同一である３５４の塩基対（ｂｐ）から成るプシーパッケージングシグナルを有する。この配列重複から生じる組み換え事象は、プシーｇａｇ組み換え事象と称される。第二に、ＬＶゲノムおよびｇａｇ／ｐｏｌはともに、Ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）を含有し、これは、二次ＲＮＡ構造を形成する２３４ｂｐから成り、細胞質へのＲＲＥ含有転写物のＲｅｖ依存核輸出を可能にする。これらの２つの相同配列は、ｇａｇ／ｐｏｌプラスミドからＲＲＥを削除することによって、およびｐｏｌタンパク質産物の翻訳に必要であるｇａｇとｐｏｌの間のフレームシフト領域を除く、ｇａｇ／ｐｏｌオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコドン最適化することによって、除去された（図１２）。このフレームシフト領域は、ｐｏｌ遺伝子産物を翻訳するために不可欠である、翻訳時のリボソームの１レジスターシフトを生じるＧａｇおよびｐｏｌ接合部で二次ＲＮＡ構造を形成する。Ｗａｔｔｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４６０：７１１−７１６（２００９）。これらの実験のために、ｇａｇ／ｐｏｌＯＲＦの塩基対１２２８〜１５０９の２８２ｂｐ領域は、コドンに最適化されなかった。この領域は、Ｇａｇタンパク質のリジン４０９をコードし、Ｇａｇの終止コドンを含むように延在する、野生型ＨＩＶ−１のｐＮＬ４−３配列の塩基対１５６３から開始する。残りの領域（ｇａｇ／ｐｏｌの塩基対１−１２２８および塩基対１５１０−４３０７）は、ヒトのコドン表に基づいて、コドンに最適化された。Ｎａｋａｍｕｒａｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，２８：２９２（２０００）。ＲＩｇａｇ／ｐｏｌの完全ＯＲＦが、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔで合成され、ＷＴｇａｇ／ｐｏｌおよびＲＲＥから成るＯＲＦの代わりにクローン化された。

ＲＲＥの削除は、ｇａｇ／ｐｏｌのＲＮＡ二次構造が、核内に転写物を保持するため、核からのｇａｇ／ｐｏｌ転写物のＲｅｖ依存輸出を排除することが知られている。ＢａｎｃｈｅｒｅａｕａｎｄＳｔｅｉｎｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３９２（６６７３），２４５（１９９８）。したがって、コドン最適化は、これらの保持されている二次構造を排除することと、ＬＶゲノムにおける部分ｇａｇにより配列相同性を最小化することとの両方の役割を果たす。もし仮に、これらの修飾により、ｇａｇ／ｐｏｌ転写がＲｅｖの必要性を緩和するという事実により、このスキームは、ベクター産生時に、依然として、Ｒｅｖが必要とされるとしても、Ｒｅｖ非依存性ｇａｇ／ｐｏｌ（ＲＩｇａｇ／ｐｏｌ）と称される。
実施例１３
ＲＩｇａｇ／ｐｏｌの核輸出は、Ｒｅｖを必要としない

ＲＩｇａｇ／ｐｏｌ転写物が、実際には、Ｒｅｖ非依存性であることを示すために、２９３Ｔ細胞は、Ｒｅｖをコードするプラスミドの存在または不在下で、野生型（ＷＴｇａｇ／ｐｏｌ）またはＲＩｇａｇ／ｐｏｌプラスミドでトランスフェクトされた。
材料および方法
Ｇａｇタンパク質の発現

２９３Ｔ細胞は、１×１０^６細胞／ウェルで、６ウェル皿中に平面培養した。２４時間後、細胞は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、０．５μｇのＲｅｖプラスミドまたは０．５μｇの空の骨格プラスミドの存在下で、０．５μｇのＷＴｇａｇ／ｐｏｌまたはＲＩｇａｇ／ｐｏｌプラスミドでトランスフェクトされた。２４時間後、細胞を、細胞抽出緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号＃ＦＮＮ００１１）で溶解し、４〜１２％のＮｕＰＡＧＥＢｉｓ−Ｔｒｉｓプレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号＃ＮＰ０３２１ＰＫ２）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥに介して分析し、続いて、ニトロセルロース膜上に移動させた。次いで、ブロットは、抗ｐ２４抗体（Ａｂｃａｍ，カタログ番号＃ａｂ９０７１）または抗アクチン抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈ，カタログ番号＃ｓｃ−１３０６５６）のいずれかでプローブした。
結果

細胞溶解物を、抗ｐ２４抗体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット法を使用して、ｇａｇタンパク質産物の発現について分析した。Ｒｅｖが存在したかどうかにかかわらず、ＲＩｇａｇ／ｐｏｌプラスミドは、ｐ２４およびその前駆体を発現することができたが、ＷＴｇａｇ／ｐｏｌの転写物は、タンパク質の発現のためにＲｅｖを必要とした（図１３）。ｐ５５Ｇａｇタンパク質の処理は、ｐ５５：ｐ２４タンパク質の比率に基づいて、ＲＩとＷＴｇａｇ／ｐｏｌ転写物の間で異なるように思われ、これは、タンパク質の発現および／または処理におけるコドン最適化の効果を示唆している。これらの結果は、転写が、Ｒｅｖの不在下で核輸出を行うことができることを示し、ＲＩｇａｇ／ｐｏｌ構築物への設計変更が、Ｒｅｖに対する必要条件を緩和することを確認する。
実施例１４
ＲＩｇａｇ／ｐｏｌは、ＷＴｇａｇ／ｐｏｌに相当する力価を用いて、感染性ベクターを産生する

先行研究は、Ｒｅｖの不在で産生されるベクターの力価の低下を説明している。Ｇａｓｍｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１８２８−１８３４（１９９９）、Ｌｕｃｋｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：９３５９−９３６２（２００５）を参照されたい。「ｒｅｖ非依存性」ｇａｇ／ｐｏｌ構築物で作製されたベクターは、ＷＴｇａｇ／ｐｏｌのものに相当する力価を用いて、感染性粒子を生成するかどうかを判定するために試験した。
材料および方法
ベクターの産生

ベクターは、大規模（ＣＦ１０）または小規模（１０ｃｍ皿）のいずれかで産生された。大規模な産生については、２９３Ｔ細胞を、５％血清、Ｌ−グルタミン、および抗生物質を含有するＤＭＥＭ培地中、１０層細胞工場（Ｎｕｎｃ，カタログ番号＃１４０４００）中に、５Ｅ８細胞／１Ｌで播種した。３日後、細胞を、３：１（ｍＬＰＥＩ：ｍｇ
ＤＮＡ）の比率でＰＥＩ（ストック１ｍｇ／ｍＬ）および全プラスミドＤＮＡを使用して、トランスフェクトした。１０層細胞工場につき、１ｍｇのベクターゲノムプラスミドおよび０．５ｍｇの残りのプラスミド（ｇａｇ／ｐｏｌ、Ｒｅｖ、およびＶＳＶ−Ｇ）を使用した。５時間後、培地を、１Ｌの無血清培地（Ｔｒａｎｓｆｘ−２９３培地、Ｈｙｃｌｏｎｅカタログ番号＃ＳＨ３０８６０．ＬＳ）と交換した。ベクターは、トランスフェクションから２および３日後に採取した。採取物は、プレフィルターおよび０．４５μｍ
ステリカップフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して浄化した。ベクターは、１Ｌの遠心分離ボトル中、１６，０００ｇで、５時間回転させることによって濃縮した。それぞれのリットル採取物からのペレットは、１ｍＬのＨＢＳＳ中で再懸濁したか、または−８０℃で保存するためにアリコートされたか、または１ｍＬのベンゾナーゼ処理用緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬｐＨ７．５、１ｍＭＭｇＣｌ２、５％ｖ／ｖＳｕｃｒｏｓｅ）中で再懸濁した。ベンゾナーゼヌクレアーゼを、最終的に、２５０Ｕ／ｍＬで添加し、トランスフェクションからのいかなる使い残しのプラスミドを分解するために、４℃で一晩インキュベートした。ベンゾナーゼで処理したベクター調製物を、スクロースクッション（上部に３０％スクロース、下部に５％スクロース）を使用して再濃縮し、超遠心分離機中、１１６，０００ｇで、４℃で１．５時間遠心分離した。ベクターペレットは、１ｍＬＨＢＳＳ中で再懸濁し、アリコートし、−８０℃で保存した。小規模なベクターの産生については、２９３Ｔ細胞を、２．５Ｅ５細胞／プレートで、１０ｃｍプレート中で播種し、ベクターの産生を比較する場合に、ｇａｇ／ｐｏｌプラスミドの量を変えることを除いては、上記と同様に、ＰＥＩを使用したが、６μｇのベクターゲノムプラスミドおよび３μｇの残りのプラスミドを用いて、翌日トランスフェクトした。小規模なトランスフェクションは、正確さのために三連で行われた。５時間後、培地を、５％血清、Ｌ−グルタミン、および抗生物質を含有する４ｍＬのＤＭＥＭ培地と交換した。ベクターは、トランスフェクションから２および３日後に採取し、０．４５μｍフィルターを使用して浄化した。ベクターは、−８０℃で保存した。
ベクターの定量化−ｐ２４アッセイ

ｐ２４の定量化は、製造業者の指示書に従って、ＡｄｖａｎｃｅｄＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）によるＨＩＶ−１ｐ２４ＥＬＩＳＡキットを使用して行われた。
ベクターの定量化−ＧＦＵアッセイ

２９３Ｔ細胞を、５％血清、Ｌ−グルタミン、および抗生物質を含有する１ｍＬＤＭＥＭ培地中、１２ウェルプレート中で、２Ｅ５細胞／ウェルで平面培養した。２４時間後、それぞれのウェル中の細胞を、２倍希釈したＧＦＰをコードするベクターで形質導入した。それぞれの量のベクターは、ＤＭＥＭ完全培地中で、１ｍＬの最終容量で調製される。５つの２倍段階希釈したベクターを含有する上清を調製し、ウェルあたり２００μＬのベクターから始めた。偽の形質導入を除外する対照として、１０μＭの逆転写酵素阻害剤のネビラピンは、並行ウェル中で、最高容量のベクターとともに使用した。形質導入から４８時間後、細胞は、Ｇｕａｖａｍａｃｈｉｎｅ（Ｇｕａｖａｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、現在はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）において、ＧＦＰの発現について分析した。ｍＬあたり緑色蛍光単位（ＧＦＵ）は、ＥＸＣＥＬのＦＯＲＥＣＡＳＴ機能を使用して、ベクターのｍＬあたりのＧＦＰ陽性細胞の数を予測するために、ベクターの容量および得られたパーセントＧＦＰ値に基づいた最良（最小二乗）線形回帰モデルを使用することによって計算した。１％未満のＧＦＰ陽性細胞をもたらした事象は、定量下限（ＬＯＱ）として設定された。
結果

ＶＳＶ−Ｇにより偽型化した２つの並列ベクター調製物は、マーカーとして、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするベクターゲノムを使用して、ＷＴｇａｇ／ｐｏｌまたはＲＩｇａｇ／ｐｏｌ構築物のいずれかの２つの入力ＤＮＡ量を使用して生成した。両方のベクター調製物は、ｐ２４についてアッセイされ、それらを産生するために使用されたｇａｇ／ｐｏｌプラスミドにかかわらず、相当する物理的粒子力価を有することが示された（図１４Ａ）。次いで、これらの調製物は、標的細胞を形質導入するそれらの能力についてアッセイされた。容量によって正規化される場合に、ＲＩｇａｇ／ｐｏｌベクターは、ベクター産生時に使用された入力ｇａｇ／ｐｏｌプラスミド量（３μｇまたは６μｇ）の両方に対してＷＴｇａｇ／ｐｏｌに相当する形質導入事象をもたらした（図１４Ｂ）。これらの結果は、ｒｅｖ非依存性ｇａｇ／ｐｏｌ構築物を生成するために導入された設計要素が、レンチウイルスベクターの物理的粒子の収量または感染性を低下させなかったことを示す。
実施例１５
ＲＩおよびＷＴｇａｇ／ｐｏｌベクターは、同等の免疫応答を生じる

ＬＶは、研究用途および臨床的状況において、インビトロでタンパク質をコードする核酸を様々な細胞型に送達するために一般的に使用される。しかしながら、直接注入可能なＬＶもまた、遺伝子治療および抗原を標的とした免疫治療の両方のために開発されている。ＲＩｇａｇ／ｐｏｌベクターが免疫療法用途における適切なＬＶとしての役割を果たすかどうかを試験するために、ＲＩｇａｇ／ｐｏｌベクターによってコードされた抗原導入遺伝子に対して引き起こされた免疫応答が評価された。
材料および方法
ベクターの定量化−ＴＵアッセイ

形質導入単位（ＴＵ）が、アッセイを使用して決定され、標的細胞株における形質導入事象が、逆転写されたベクターＲＮＡ配列を増幅する定量的ＰＣＲアッセイを使用して測定された。段階希釈した試験試料および参照材料は、標的２９３Ｔ細胞の存在下で、９６ウェル組織培養プレート中で二重にインキュベートされた。形質導入ステップは、残留プラスミドＤＮＡによって寄与され得るバックグラウンドシグナルを評価する手段として逆転写阻害剤のネビラピンの存在および不在下の両方で行われた。形質導入から１日後、偽またはベクターを形質導入した細胞を、デオキシコール酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ−２０、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、およびプロテイナーゼＫを含有する緩衝液の添加によって溶解した。次いで、細胞溶解物を、３７℃、５５℃、および９５℃で段階的にインキュベートして、タンパク質分解およびＤＮＡ変性を確実にした。次いで、変性した細胞溶解物は、抗原プロモーター（ＥＸＰＲＥＳＳｑＰＣＲＳｕｐｅｒｍｉｘＵｎｉｖｅｒｓａｌ，Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の上流に位置する約４００ｂｐのベクターゲノム配列を増幅させるために設計されたプライマー／プローブセットを使用して、ｑＰＣＲによって分析された。感染性力価は、７ｌｏｇ範囲（５．３コピー〜５．３×１０^６コピー）にわたって希釈された標的配列を含む線形化プラスミドＤＮＡから成る標準曲線を参照して計算した。
免疫化

Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２×１０^７、１×１０^８、または５×１０^８ＴＵのいずれかのＬＶ１ｂをコードするＬＶ、ＯＶＡ２５７（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）（配列番号２４）のＨ−２Ｋｂに制限されたエピトープを含有するポリエピトープ構築物、またはＨＢＳＳビヒクルを用いて、０日目に尾基底部の皮下に免疫化した。−８０℃で保存されたＬＶのアリコートは、室温で解凍され、氷上に置かれた。ベクターは、冷滅菌したＨＢＳＳ中で段階希釈され、注入のために動物施設に輸送された。マウスは、尾基底部を接触可能して、従来の溝付き保持装置中に入れた。ベクターを、２９ゲージの０．３ｍＬのインスリン注射器（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｅｎｓｏｎ［ＢＤ］）を使用して、５０μＬの注入を介して投与し、肛門から約１ｃｍ尾側の尾基底部の右側に皮下に挿入され、これにより、軽度ではあるが、尾基底部周辺の皮膚に顕著な膨張をもたらした。
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）

膵臓は、７０μＭナイロンフィルターを通して圧迫することによって、均質化された。赤血球は、氷冷却した限外濾過した水への短期間の曝露による低張ショックによって溶解し、続いて、１０×ＰＢＳにより、その後の等張性の回復を行った。サイトカインの分析のために、細胞は、完全ＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、２μＭ β−メルカプトエタノール、およびＬ−グルタミン）中で、ペプチドあたり１μｇ／ｍＬの濃度であるペプチドを含む９６ウェルを、３７℃で、５％ＣＯ_２で５時間刺激した。ＯＶＡ２５７（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）のペプチドは、ＡｎａＳｐｅｃ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）によって、９５％純度で製造された。刺激後、表面染色は、ＦｃＲ遮断抗体２．４Ｇ２およびＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）ＦｉｘａｂｌｅＮｅａｒ−ＩＲ（Ｌ／ＤＮＩＲ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、１％ＦＣＳ、２ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．０１％アジ化ナトリウム）中で行われた。インビボ実験において表面染色のために使用された抗体は、抗マウスＣＤ４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはＣＤ４−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ８−ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、およびＢ２２０−Ｖ５００（ＢＤ）を含んだ。表面染色後、細胞は、Ｃｙｔｏｆｉｘ（登録商標）（ＢＤ）で固定され、ＦＡＣＳ緩衝液中で、４℃で一晩保存された。次いで、細胞は、５％ラット血清（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）緩衝液（ＢＤ）で透過させた。細胞内染色のための抗体は、５％ラット血清を含有する希釈されたＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）緩衝液であり、透過性細胞に添加した。抗体は、抗マウスＴＮＦ−α−ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＩＦＮ−γ−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、およびＩＬ−２−ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含んだ。細胞は、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁し、ハイスループットサンプラー（ＨｉｇｈＴｈｒｏｕｇｈｐｕｔＳａｍｐｌｅｒ）（ＢＤ）を用いて、３レーザーＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａにおいて分析した。データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を使用して分析した。生存ＣＤ８
Ｔ細胞は、リンパ球（ＦＳＣ^ｉｎｔ、ＳＳＣ^ｌｏ）、単一細胞（ＳＳＣ−Ａ＝ＳＳＣ−Ｈ）、生（Ｌ／ＤＮＩＲ^ｌｏ）、Ｂ２２０⁻ ＣＤ４⁻ ＣＤ８^＋をゲートにかけた。サイトカインゲートは、９９．９パーセンタイルに基づいた（未刺激細胞において０．１％の陽性事象）。
結果

マウスを、一用量範囲のＷＴまたはＲＩｇａｇ／ｐｏｌベクターで免疫化し、ＷＴ（ＩＮＴ（＋））またはＤ６４Ｖ突然変異体インテグラーゼ（ＩＮＴ（−））のいずれかを含み、ＯＶＡ_２５７（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）（配列番号２４）のＨ−２Ｋｂで制限されたＣＤ８Ｔ細胞エピトープを含有するＬＶ１ｂと称されるポリエピトープ構築物をコードした。免疫化から１２日後、膵臓におけるＯＶＡ_２５７に特異的なＣＤ８Ｔ細胞応答が、ＩＦＮ−γに対してＩＣＳによって測定された（図１５）。組み込み可能なおよび組み込み不能なベクターの両方については、ＲＩｇａｇ／ｐｏｌおよびＷＴｇａｇ／ｐｏｌベクターは、相当するＣＤ８Ｔ細胞応答を引き起こし、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子のコドン最適化が、免疫療法のビヒクルとしてＬＶ機能に悪影響を及ぼさなかったことを確認した。
実施例１６
ＲＩおよびＷＴｇａｇ／ｐｏｌベクターはともに、保護する抗ウイルス免疫を誘発する

主に、ＬＶ誘発ＣＤ８Ｔ細胞応答が、ＲＩｇａｇ／ｐｏｌベクターを用いて同等であったことが観察されたが、以下の実験は、これらによって誘発された機能免疫が、ベクターであり、また同様であったかどうかを判定するために行われた。これに対処するために、組み換え生ワクシニアウイルスチャレンジが、ウイルス感染のモデルとして採用された。
材料および方法
ワクシニアウイルスチャレンジ

Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０^８ＴＵのＬＶ１ｂをコードするベクターまたはＨＢＳＳビヒクルで、０日目に尾基底部の皮下に免疫化した。４週間後、マウスは、１×１０^７ＴＣＩＤ_５０の、ＯＶＡを発現する組み換えワクシニアウイルス（ｒＶＶ−ＯＶＡ）、１Ｅ７ＴＣＩＤ_５０野生型ワクシニアウイルス（ＶＶ−ＷＴ）、またはＨＢＳＳビヒクルを用いて、腹腔内にチャレンジされた。チャレンジから５日後、卵巣は、ＴＣＩＤ_５０アッセイによってウイルス負荷の定量化のために採取された。
結果

マウスは、ＷＴまたはＲＩｇａｇ／ｐｏｌのいずれかでＯＶＡ_２５７をコードする組み込み不能な（ＩＮＴ（−））ＬＶベクターを用いたワクチン接種を受けさせ、４週間後、ＯＶＡをコードする組み換えワクシニアウイルス（ｒＶＶ−ＯＶＡ）または対照として野生型ワクシニアウイルス（ＶＶ−ＷＴ）でチャレンジされた（図１６）。ＲＩｇａｇ／ｐｏｌおよびＷＴｇａｇ／ｐｏｌベクターを用いたワクチン接種を受けたマウスはともに、ｒＶＶ−ＯＶＡによるチャレンジ後、ウイルス負荷の劇的な減少を示した。保護が、抗原特異的であったことを確認して、ＶＶ−ＷＴチャレンジ後のウイルス負荷は、ビヒクルとＬＶで処理した群の間で同様であった。これらのデータは、ＲＩｇａｇ／ｐｏｌ
ＬＶが、ウイルスチャレンジに応答し、機能免疫を与えるメモリＣＤ８Ｔ細胞を誘発することができることを示す。
実施例１７
ＲＩｇａｇ／ｐｏｌ修飾は、プシーｇａｇ組み換えを排除するが、ベクターゲノムとｇａｇ／ｐｏｌ転写物の間の他の組み換え事象は排除しない。

ＲＩｇａｇ／ｐｏｌは、プシーｇａｇ組み換えを排除するように努めるために設計され、そのため、第三世代ＬＶのためのＲＣＬ形成の機会をさらに最小限に抑えた。ネスト化したＰＣＲ系アプローチを使用して、プシーｇａｇ組み換えを検出するために、組み込みベクターで形質導入した細胞のゲノムＤＮＡをスクリーニングした。
方法および材料
ベクターの定量化−ゲノムアッセイ

ゲノムＲＮＡは、ＱＩＡａｍｐＶｉｒａｌＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、ベクター粒子から単離された。汚染ＤＮＡを排除するために、抽出された核酸を、製造業者の指示書に従って、ＤＮＡｓｅＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で消化した。２つの希釈したそれぞれのＤＮＡｓｅＩで処理されたＲＮＡ試料は、ＲＮＡＵｌｔｒａｓｅｎｓｅＯｎｅ−ＳｔｅｐＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲＴ−ＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ならびに前述のベクター特異的プライマーおよびプローブを使用して、定量化ＲＴ−ＰＣＲによって分析された。ＲＮＡゲノムのコピー数は、７ｌｏｇ範囲（１０コピー〜１．０×１０^７コピー）にわたって希釈された標的配列を含む線形化プラスミドＤＮＡから成る標準曲線を参照して計算した。ここで発現したようなゲノム力価は、物理的ベクター粒子の数に反映し、ゲノムに基づいて計算され、それぞれのベクター粒子が、２つの一本鎖のゲノムＲＮＡのコピーを含むことが予測された。
プシーｇａｇ組み換えアッセイ

２９３Ｔ細胞は、１０ｃｍプレート中、２Ｅ６細胞で平面培養した。翌日、細胞を、１Ｅ１１ゲノムのＷＴｇａｇ／ｐｏｌまたはＲＩｇａｇ／ｐｏｌのいずれかで作られている濃縮されたＶＳＶ−Ｇにより偽型化したベクターで形質導入した。これらのベクターの力価は、それぞれ、１．２Ｅ１３ゲノム／ｍＬおよび１．５ゲノム／ｍＬであった。形質導入から４８時間後、細胞を採取し、血液および細胞培養ＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ，カタログ番号＃１３３２３）を使用して、ゲノムＤＮＡを単離した。１００ｎｇのゲノムＤＮＡが、高品質プラチナｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号＃１１３０４−０１１）を使用して、第一ラウンドのＰＣＲのための鋳型として使用され、１サイクルを９４℃で２分間；４０サイクルを９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で９０秒間；１サイクルを６８℃で５分間のサイクリングパラメーターを使用した。１μｌ（５０μｌのうち）の第一のＰＣＲは、未希釈（１：１）、または１：１００で希釈、または１：１０００で希釈したネスト化したＰＣＲの鋳型として使用した。ネスト化したＰＣＲのサイクリングパラメーターは、第一ラウンドで使用されたものと同一であった。プライマー対照は、すべての反応には含まれなかった。ＰＣＲのために使用されたプライマーは、３７８（ＴＡＡＧＧＣＣＧＡＧＴＣＴＴＡＴＧＡＧＣＡＧＣ）（配列番号６０）、７０９（ＡＧＧＡＣＴＣＧＧＣＴＴＧＣＴＧＡＡＧ）（配列番号６１）、７１０（ＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＡＴＣ）（配列番号６２）、８３５（ＴＧＴＣＴＴＡＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣＴ）（配列番号６３）、８６３（ＧＣＡＣＧＧＣＡＡＧＡＧＧＣＧＡＧＧ）（配列番号６４）、および８６４（ＧＣＣＧＧＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＴＧＣＴＧ）（配列番号６５）であった。全５０μｌのうちの２５μｌのネスト化したＰＣＲは、１ｘＴＡＥ緩衝液および臭化エチジウムで作られた１％アガロースゲル上に可視化した。帯を抽出し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，カタログ番号＃２８７０４）を使用してＤＮＡを精製し、続いて、ＴＯＰＯ−ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号＃Ｋ４５００−０２）にクローン化し、Ｍ１３順方向および逆方向プライマーを使用して、配列決定した（ＤａｖｉｓＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＣＡ）。
結果

ネスト化したＰＣＲアプローチを使用して、第一ラウンドのＰＣＲは、ＬＶゲノム５’のプシーパッケージングシグナルに結合する順方向プライマー（７０９）ならびにＲＩｇａｇ／ｐｏｌおよびＷＴｇａｇ／ｐｏｌの両方のフレームシフト領域内で結合する逆方向プライマー（７１０）を使用して、行われた（図１２）。次いで、この第一ラウンドからのＰＣＲ産物は、希釈し、ＬＶゲノムに結合するネスト化した順方向プライマー（８６３）、およびＷＴｇａｇ／ｐｏｌまたはＲＩｇａｇ／ｐｏｌ内のｇａｇ領域にそれぞれ結合するネスト化した逆プライマー（８３５または８６４）を使用する二次ＰＣＲのための鋳型として使用した。これらの２つの逆方向プライマーは、コドン最適化によりわずかに差異がある両方の構築物において、同じ領域に結合するように設計された。仮説に基づいたプシーｇａｇ組み換えからの単位複製配列サイズは、プライマー対８６３および８３５、またはプライマー対８６３および８６４のいずれかを使用する場合、９３７ｂｐであり得る。

ＬＶ１ｂポリエピトープをコードするベクター調製物は、ＲＩｇａｇ／ｐｏｌまたはＷＴｇａｇ／ｐｏｌプラスミドのいずれかで生成され、２９３Ｔ細胞を形質導入するために使用した。形質導入から４８時間後、ゲノムＤＮＡを採取し、ＰＣＲを行い、続いて、アガロースゲル上で分析した。第一に、ＬＶゲノム内のみに結合するプライマー（プライマー７０９および３７８）を使用して、陽性対照ＰＣＲを行った。これらのプライマーを用いた、予測されるＬＶゲノムの単位複製配列サイズは、１６９７ｂｐであると予測される。ＷＴｇａｇ／ｐｏｌまたはＲＩｇａｇ／ｐｏｌベクターのいずれかで形質導入した細胞培養はともに、期待された単位複製配列サイズを得、そのため、プロウイルスの形質導入および組み込みは、両方のベクターに対して同等であることを確認した（図１７Ａ）。

次に、上記のように、プシーｇａｇの組み換えについて、ネスト化したＰＣＲを行った。ＷＴｇａｇ／ｐｏｌベクターで形質導入した細胞からのゲノムＤＮＡは、期待されたサイズの９３７ｂｐで帯を産生し、これは、プシーｇａｇの組み換えと一致した（図１７Ｂの左半分）。対照的に、ＲＩｇａｇ／ｐｏｌで形質導入した細胞からのゲノムＤＮＡは、１３２９ｂｐで大きいが、薄い帯を産生した（図１７Ｂの右半分）。ＰＣＲ帯の性質を決定するために、ＷＴｇａｇ／ｐｏｌからの９３７ｂｐの帯、ならびにＲＩｇａｇ／ｐｏｌからの１３２９ｂｐの帯を抽出し、ＴＯＰＯ−ＴＡプラスミドにクローン化した。シークエンシングは、配列の前半がベクターゲノムとアライメントされ、その後半が部分ｇａｇ配列を越えて延在したｇａｇ／ｐｏｌ転写物とアライメントされたという点において、ＷＴｇａｇ／ｐｏｌ帯が、プシーｇａｇ組み換えと一致したことを示した（図１７Ｃ）。ＲＩｇａｇ／ｐｏｌからの薄い１３２９ｂｐ帯は、ＬＶゲノムとアライメントされた最初の１２５３ｂｐと、ＲＩｇａｇ／ｐｏｌの領域とアライメントされた最後の７７ｂｐとから成る配列をコードした（図１７Ｄ）。これらの結果は、プシーｇａｇ組み換えが、ＷＴｇａｇ／ｐｏｌベクターで形質導入した細胞において検出可能であったが、ＲＩｇａｇ／ｐｏｌベクターで形質導入した細胞においては検出不能であったことを示す。さらに、これらの結果は、一見したところ、プシーｇａｇ配列に依存していないようだが、組み換えは、依然としてＲＩｇａｇ／ｐｏｌベクターで形質導入した細胞において検出可能であったという証拠を示す。
実施例１８
ＳＩＮｖａｒ１のマウス受容体としてのＤＣ−ＳＩＧＮホモログＳＩＧＮＲ１の特定

ＩＤ−ＶＰ０２ベクター粒子は、結合および侵入のために内因性マウス受容体を利用することができるかどうかを判定するために調査された。ヒトは、ＤＣ−ＳＩＧＮおよび１つのパラログ、ＤＣ−ＳＩＧＮＲをコードするが、マウスは、ＤＣ−ＳＩＧＮの８つのホモログ（ＳＩＧＮＲ１〜ＳＩＧＮＲ８と称される）を有する。これらのうちの６つ、つまり、ＳＩＧＮＲ１、−Ｒ３、−Ｒ４、−Ｒ５、−Ｒ７、および−Ｒ８は、膜結合であると予測される。機能的研究に基づいて、ＳＩＧＮＲ１、ＳＩＧＮＲ３、およびＳＩＧＮＲ５（マウスＤＣ−ＳＩＧＮとも称される）が、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮの最も近い機能的オーソログであると報告されている。したがって、これらの受容体を介して結合および侵入を媒介するＳＩＮｖａｒ１の能力を試験した。

マウスＳＩＧＮＲ１、ＳＩＧＮＲ３、またはＳＩＧＮＲ５のいずれかを安定的に発現するＨＴ１０８０細胞が生成された。様々な濃度の、ＳＩＮｖａｒ１、キフネンシンで修飾された高マンノースＳＩＮｖａｒ１、または汎親和性ＶＳＶ−Ｇにより偽型化した組み込み不能なＧＦＰをコードするベクターを有する、これらの細胞をインキュベートした。実施例８において、マンノシダーゼＩ阻害剤のキフネンシンの存在で産生されるＳＩＮｖａｒ１エンベロープがＤＣ−ＳＩＧＮ結合およびヒトＤＣ形質導入に必要であることを実証した。したがって、この実験において、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮを過剰発現するＨＴ１０８０細胞は、陽性対照として使用した。ヒト受容体において観察されたように、試験した３つのマウスＤＣ−ＳＩＧＮオーソログのうち、ＳＩＮｖａｒ１偽型ベクターが、マウスＳＩＧＮＲ１を発現する細胞のみを形質導入し、キフネンシン依存性様式においても形質導入した（図１８Ａ〜Ｄ）。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮおよびマウスＳＩＧＮＲ１を発現する細胞におけるキフネンシンで修飾されたＳＩＮｖａｒ１ベクターの形質導入効率は、非常に類似しており（図１８Ａ、Ｂ）、ＳＩＧＮＲ１が、マウスにおけるＩＤ−ＶＰ０２ベクター粒子に対して機能的にオーソロガスな受容体であることを示した。
実施例１９
ＳＩＧＮＲ１は、マウスＤＣにおいてインビボで発現される

ヒトにおいて意図された作用機構を反映した機能的研究のためのマウスモデルの有用性をさらに調査するために、実験を行って、ＳＩＧＮＲ１がマウス樹状細胞上に発現されたかどうかを判定した。
材料および方法
インビボでのＳＩＧＮＲ１および５の発現

５匹のマウスからの個々の膵臓からの細胞または１０の膝窩リンパ節のプールは、ＦｃＲ遮断抗体２．４Ｇ２およびＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）ＦｉｘａｂｌｅＮｅａｒ−ＩＲ（Ｌ／ＤＮＩＲ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、１％ＦＣＳ、２ｍＭＥＤＴＡ、０．０１％アジ化ナトリウム）中で染色された。表面染色のために使用された抗体は、抗マウスＣＤ４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはＣＤ４−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ８−ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、およびＢ２２０−Ｖ５００（ＢＤ）を含んだ。表面染色後、細胞をＣｙｔｏｆｉｘ（登録商標）（ＢＤ）で固定し、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａマルチパラメーターフローサイトメーターで分析した。生存する単細胞事象（Ｌ／ＤＮＩＲ⁻、ＳＳＨ＝ＳＳＡ）を、Ｂ細胞（Ｂ２２０^＋ＴＣＲβ⁻）、Ｔ細胞（ＴＣＲβ^＋、Ｂ２２０⁻）、およびＤＣ（Ｂ２２０⁻ ＴＣＲβ⁻ ＭＨＣ−ＩＩ^＋ＣＤ１１ｃ^ｈｉ）に再分類した。ＳＩＧＮＲ５およびＳＩＧＮＲ１の発現にゲートをかけ、これらのサブセットのそれぞれは、ＳＩＧＮＲ１およびＳＩＧＮＲ５に特異的な抗体を欠失している陰性対照株を使用して設定され、そのため、陽性事象の頻度は、０．００以下になった。
結果

３つの個々の膵臓または３つの膝窩リンパ節のプールからの単細胞懸濁液はそれぞれ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＤＣにおいて、ＳＩＧＮＲ１およびＳＩＧＮＲ５の発現について分析した。ＳＩＧＮＲ５の発現は、定常状態において比較的まれであり、Ｂ細胞の小集団においてのみ検出された（図１９）。対照的に、ＳＩＧＮＲ１の発現は、リンパ球に限定され、約１０〜１２％のＭＨＣ−ＩＩ^＋ＣＤ１１ｃ^ｈｉＤＣが、ＳＩＧＮＲ１を発現した（図１９）。ＳＩＧＮＲ１もまた、ＩＤ−ＶＰ０２ベクター粒子の機能的受容体であるため、これらのデータにより、ＩＤ−ＶＰ０２ベクター粒子が、インビボでマウスＤＣを特異的に標的とし得るかどうかを評価することが可能になった。
実施例２０
［０３３２］ＩＤ−ＶＰ０２ベクター粒子は、インビボでリンパ節ＤＣを流出するマウスを標的とする

シンドビスウイルスＥ２糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクター粒子がコードされた導入遺伝子の産物が、直接投与後、ＤＣにおいて検出され得るかどうかを判定するために、ＧＦＰまたは非蛍光陰性対照タンパク質をコードする粒子を、レシピエントＢＡＬＢ／ｃマウスの右足蹠に注入した。
材料および方法
［０３３２］インビボでのＩＤ−ＶＰ０２−ＧＦＰの形質導入

ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１５／群）に、３×１０^１０ゲノムのＧＦＰをコードするＩＤ−ＶＰ０２ベクター粒子、ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードする対照粒子を足蹠に皮下注射したか、または処置しないままにした。４日後、流入領域膝窩および非流入領域頸部リンパ節を、５匹のマウスからプール（処置群あたり３つのプール）し、生存する（Ｌ／Ｄシングレット事象（Ｌ／ＤＮＩＲ−、ＳＳＨ＝ＳＳＡ）を、ＧＦＰの存在について分析した。ＧＦＰ^＋細胞の表現型を、抗マウスＣＤ１１ｃ−ＰＥ−Ｃｙ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＭＨＣ−ＩＩ−ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＳＩＧＮＲ５−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、およびＳＩＧＮＲ１−ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で共染色することによって判定した。
結果

ＧＦＰをコードするＩＤ−ＶＰ０２ベクター粒子を注射してから４日後、流入領域膝窩および非流入領域頸部リンパ節を、５匹のマウスからプール（処置群あたり３つのプール）し、ＧＦＰの発現について分析した。ＧＦＰをコードするが、非蛍光対照タンパク質をコードしないＩＤ−ＶＰ０２ベクター粒子の注射により、流入領域膝窩リンパ節においてＧＦＰ^＋細胞が検出されたが、遠位リンパ節において検出されなかった（図２０Ａ）。さらなる表面マーカー分析時、ＣＤ１１ｃおよびＭＨＣ−ＩＩ発現によって示されるように、形質導入した細胞のうちの約９０％が、ＤＣとして特定され（図２０Ｂ）、これらのＧＦＰ^＋ＤＣのうちの１／３超が、ＳＩＧＮＲ１^＋であり（図２０Ｃ）、このことは、インビボでのマウスＤＣ形質導入において、この受容体に対する可能性のある役割を支持している。
実施例２１
ＩＤ−ＶＰ０２ベクター粒子ＤＮＡは、制限された生体内分布を有する

リンパ節細胞の分析は、インビボでのマウスＤＣの特異的な標的化と一致しているが、生体内分布研究は、形質導入事象が、他の、具体的には、非リンパ系組織において検出され得るかどうかを構築し、陽性組織部位でクリアランス動態を特徴付けるために行われた。
材料および方法
ベクター生体内分布

Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３／群）は、尾基底部の皮下に、３×１０^１０ゲノムのポリエピトープ構築物ＬＶ１ｂをコードするＩＤ−ＶＰ０２を受容した。逆転写されたベクターＤＮＡの存在を、注射から１、４、８、２１、または４２日後、注射部位（尾基底部）、膵臓、肝臓、心臓、卵巣、脳、ならびに流入部位（鼠径部）および非流入部位（頸部）リンパ節の組織において、ｑＰＣＲによって分析した。組織は、Ｆａｓｔｐｒｅｐ−２４ホモジナイザー（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＳａｎｔａＡｎａ，ＣＡ）を使用して、ＦａｓｔｐｒｅｐＬｙｓｉｎｇＭａｔｒｉｘＤ管中で処理し、Ｑｉａｇｅｎ
ＤＮｅａｓｙＢｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅキット（ＱｉａｇｅｎＩｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、ホモジネートからゲノムＤＮＡを単離した。溶出したＤＮＡ（試料あたり２００ｎｇ）を、ＥＸＰＲＥＳＳｑＰＣＲＳｕｐｅｒｍｉｘＵｎｉｖｅｒｓａｌ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ならびにＬＶ１ｂカセット内で８５ｂｐの標的配列を増幅するように設計されたプライマー／プローブセットを使用して、ｑＰＣＲによって四重に分析した。すべての反応は、Ｂｉｏ−ＲａｄＣＦＸ３８４を使用して行い、Ｂｉｏ−ＲａｄＣＦＸＭａｎａｇｅｒソフトウェア（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して分析した。ベクターＤＮＡのコピー数は、７ｌｏｇ範囲（１０^１コピー〜１０^７コピー）にわたって希釈された標的配列を含むプラスミドＤＮＡから成る標準曲線を参照して計算した。
結果

ＬＶ１ｂと表記されるポリエピトープモデルの抗原構築物をコードするＩＤ−ＶＰ０２ベクター粒子を、粒子の生体内分布を判定するために使用した。ベクター注入後、ＬＶ１ｂカセットに特異的なプライマーおよびプローブのセットを使用するｑＰＣＲによって、逆転写されたベクターゲノム（ベクターＤＮＡ）の存在を測定することができる。マウスに、尾の底部での単回皮下注射において、２．８×１０^１０ゲノムの偽型ベクター粒子−ＬＶ１ｂを投与した。注射から１〜４２日後の時間経過において、注射部位（尾基底部）、流入領域（鼠径部）および非流入領域（頸部）のリンパ節、膵臓、心臓、肝臓、脳、ならびに卵巣においてベクターＤＮＡを定量化した。投与後の早期の時点で、ベクターＤＮＡは、注射部位および流入領域リンパ節においてのみ検出された。これらの組織において、ベクターシグナルは、経時的に減少し、流入領域リンパ節において、８日間で定量化可能なシグナルはなく、注射部位では、シグナルは、４２日間で定量下限（ＬＯＱ；１０コピー）をかろうじて上回った（図２１）。これらの結果は、注射部位の外側でのＩＤ−ＶＰ０２ベクター粒子の分散は、その生物活性が、生じると仮説を立てられ得る流入領域リンパ節に限定され、ベクターＤＮＡの９９％超が、３週間以内に一掃されたことを示す。実施例２２
ＩＤ−ＶＰ０２ベクター粒子は、多官能性の一次および二次ＣＤ８Ｔ細胞応答を誘発する

以下の実験は、シンドビスウイルスＥ２糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクター粒子のインビボで抗原に特異的な免疫応答を生成する能力を測定するために行われた。
材料および方法
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）

膵臓は、７０μＭナイロンフィルターを通して圧迫することによって、均質化された。赤血球は、氷冷却した限外濾過した水への短期間の曝露による低張ショックによって溶解し、続いて、１０×ＰＢＳにより、その後の等張性の回復を行った。サイトカインの分析のために、細胞は、完全ＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、２μＭ β−メルカプトエタノール、およびＬ−グルタミン）中で、ペプチドあたり１μｇ／ｍＬの濃度であるペプチドを含む９６ウェルを、３７℃で、５％ＣＯ_２で５時間刺激した。ＯＶＡ_２５７（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）（配列番号２４）、ＬＣＭＶＧＰ_３３（ＫＡＶＹＮＦＡＴＭ）（配列番号６６）、ＡＨ１（ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ）（配列番号６７）、およびＡＨ１Ａ５（ＳＰＳＹＡＹＨＱＦ）（配列番号２５）を含むペプチドは、ＡｎａＳｐｅｃ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）による９５％純度で製造された。いくつかの実験において、述べたように、抗マウスＣＤ１０７ａ−ＰｅｒＣＰ−ｅＦ７１０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）は、Ｔ細胞を脱顆粒させる表面上の移行性ＣＤ１０７ａを捕捉するために刺激カクテルに含まれた。刺激後、表面染色は、ＦｃＲ遮断抗体２．４Ｇ２およびＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）ＦｉｘａｂｌｅＮｅａｒ−ＩＲ（Ｌ／ＤＮＩＲ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、１％ＦＣＳ、２ｍＭＥＤＴＡ、０．０１％アジ化ナトリウム）中で行われた。インビボ実験において表面染色のために使用された抗体は、抗マウスＣＤ４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはＣＤ４−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ８−ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、およびＢ２２０−Ｖ５００（ＢＤ）を含んだ。表面染色後、細胞は、Ｃｙｔｏｆｉｘ（登録商標）（ＢＤ）で固定され、ＦＡＣＳ緩衝液中で、４℃で一晩保存された。次いで、細胞を、５％ラット血清（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）緩衝液（ＢＤ）で透過させた。細胞内染色のための抗体は、５％ラット血清を含有する希釈されたＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）緩衝液であり、透過性細胞に添加した。抗体は、抗マウスＴＮＦ−α−ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＩＦＮ−γ−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、およびＩＬ−２−ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含んだ。細胞は、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁し、ハイスループットサンプラー（Ｈｉｇｈ
ＴｈｒｏｕｇｈｐｕｔＳａｍｐｌｅｒ）（ＢＤ）を用いて、３レーザーＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａにおいて分析した。データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を使用して分析した。生存ＣＤ８Ｔ細胞は、リンパ球（ＦＳＣ^ｉｎｔ、ＳＳＣ^ｌｏ）、単一細胞（ＳＳＣ−Ａ＝ＳＳＣ−Ｈ）、生（Ｌ／ＤＮＩＲ^ｌｏ）、Ｂ２２０⁻ ＣＤ４⁻ ＣＤ８^＋をゲートにかけた。サイトカインゲートは、９９．９パーセンタイルに基づき（未刺激細胞において０．１％の陽性事象）、ＣＤ１０７ａゲートは、９９パーセンタイルに基づいた。
結果

インビボでのＩＤ−ＶＰ０２ベクター粒子の免疫学的活性を評価するために、一用量範囲の完全長ニワトリオボアルブミンをコードするベクター（ＩＤ−ＶＰ０２−ＯＶＡ）が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに皮下投与され、膵臓におけるＯＶＡ_２５７に特異的なＣＤ８Ｔ細胞応答が、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によって測定された（図２２Ａ）。膵臓ＣＤ８Ｔ細胞間でのＩＦＮ−γ＋エフェクターの頻度は、７．０×１０^１０ゲノムの一用量で約１５％から２．７×１０^８ゲノムで約１％の平均の範囲に及び、ＩＤ−ＶＰ０２は、少なくとも２ｌｏｇ用量範囲にわたって用量依存的な様式で、ＣＤ８Ｔ細胞応答を誘発することを示す。

同種ブーストとしてＩＤ−ＶＰ０２の投与を通して記憶され得るメモリＴ細胞を誘発したＩＤ−ＶＰ０２ベクター粒子でプライミングするかどうかに対処するために、動物を、中程度の用量の１．０×１０^１０ゲノムでプライムし、プライムから３５日後、等用量でブーストした。プライムアンドブースト後の様々な時点で、ＣＤ８Ｔ細胞応答を、ＩＣＳによって測定した。ＩＦＮ−γ^＋ＣＤ８Ｔ細胞の頻度を分析することによって、ＩＤ−ＶＰ０２−ＯＶＡによるブーストは、一次応答よりもさらに急速かつ２倍超の大きさであるＯＶＡ_２５７に特異的な記憶応答を誘発したことが見出された（図２２Ｂ）。これらのデータは、ＩＤ−ＶＰ０２の適用が、アデノウイルス系ベクター等の他のウイルスベクターにとって問題であることが知られている、ベクターに特異的な免疫力による単回投与に制限されないことを示す。

ＩＦＮ−γの染色に加えて、一次および二次ＣＤ８Ｔ細胞応答の性質は、２つのさらなるサイトカイン、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２の同時染色、ならびにＣＤ１０７ａの表面転座、細胞毒性の相関によって分析された。ＣＤ１０７ａ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２の解明から明らかなように、プライムアンドブースト後、応答するＣＤ８Ｔ細胞のほとんどは、多機能な表現型を有した（図２２Ｃ、Ｄ）。特に、ブーストから３５日後、実質的には、ＩＦＮ−γ^＋細胞の１００％が、ＣＤ１０７ａ^＋であり、また、大多数はＴＮＦ−αを発現し、これらの「三重陽性」細胞のかなりの割合はまた、ＩＬ−２を産生し、これにより、高機能性品質を有するメモリＴ細胞の形成を示す。

マーカーＫＬＲＧ１およびＣＤ１２７は、それぞれ、ウイルスに特異的なＣＤ８Ｔ細胞応答のほぼピークを測定した場合、短時間のエフェクター細胞（ＳＬＥＣ）およびメモリ前駆細胞（ＭＰＥＣ）の運命と関連している。ＬＣＭＶによる感染中に観察されるように、抗原に特異的なＨ−２Ｋ^ｂ−ＯＶＡ_２５７の多量体結合ＣＤ８Ｔ細胞の表現型が、免疫化から９日後に分析され、細胞の割合は、ＫＬＲＧ１^＋ＣＤ１２７⁻ ＳＬＥＣまたはＫＬＲＧ１⁻ ＣＤ１２７^＋ＭＰＥＣの表現型のいずれかに分極した（図２２Ｅ）。興味深いことに、プライムアンドブーストの免疫化から３５日後、細胞の大部分は、ＣＤ１２７^＋メモリ表現型を有したが、それらは、ＫＬＲＧ１^＋とＫＬＲＧ１⁻のサブセットにほぼ均等に分割され、これらはともに、ＳＬＥＣを上回って増加した記憶の可能性があることが報告されている。
実施例２３
シンドビスウイルスＥ２糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクター粒子により誘発されたメモリＣＤ８Ｔ細胞は、抗ウイルス機能を拡大し、阻害する

最小限のＯＶＡ_２５７およびＬＣＭＶＧＰ_３３ペプチド配列の両方をコードするＬＶ１ｂと称される代替の抗原カセット、ＳＩＮＶａｒ１の免疫化により誘発されたメモリＣＤ８Ｔ細胞の機能を直接評価するために、２つの強固なＨ−２Ｋｂに制限されたエピトープが採用された。
材料および方法
ＭＨＣ−Ｉ多量体およびメモリ表現型分析

上記のように調製された脾細胞は、２−４Ｇ２抗体の存在下、室温のＦＡＣＳ緩衝液中で、Ｈ−２Ｋ^ｂ−ＯＶＡ_２５７ＭＨＣ−Ｉ五量体（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ，Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）で１０分間染色した。細胞を一度洗浄し、表面抗体＋Ｌ／ＤＮＩＲで、氷上で２０分間染色した。抗体は、ＣＤ１２７−ＦＩＴＣ、ＣＤ４４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＫＬＲＧ１−ＡＰＣ、ＣＤ８−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００（すべて、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから）、およびＢ２２０−Ｖ５００（ＢＤ）を含んだ。細胞を洗浄し、Ｃｙｔｏｆｉｘ（登録商標）で固定し、上記のように分析した。生存能力のあるＣＤ８Ｔ細胞集団内で、免疫化されていないマウスにおいて、９９．９パーセンタイルに基づいてゲートにかけたＣＤ４４^ｈｉＨ−２Ｋ^ｂ−ＯＶＡ_２５７五量体^＋事象は、ＫＬＲＧ１およびＣＤ１２７の発現について分析した。
ワクシニアウイルスチャレンジ

Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、一用量範囲のＬＶ１ｂをコードするＩＤ−ＶＰ０２、ＯＶＡ_２５７（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）（配列番号２４）およびＬＣＭＶＧＰ_３３（ＫＡＶＹＮＦＡＴＭ）（配列番号６６）のＨ−２Ｋ^ｂに制限されたエピトープを含むポリエピトープ構築物、またはＨＢＳＳビヒクルを用いて、０日目に尾基底部の皮下に免疫化した。５週間後、マウスに、１×１０^７ＴＣＩＤ_５０の、ＯＶＡを発現する組み換えワクシニアウイルス（ｒＶＶ−ＯＶＡ）、１Ｅ７ＴＣＩＤ_５０野生型ワクシニアウイルス（ＶＶ−ＷＴ）、またはＨＢＳＳビヒクルを用いて、腹腔内にチャレンジした。チャレンジから５日後、上記のような、ＯＶＡ_２５７およびＧＰ_３３に特異的なＩＣＳのために、膵臓を採取し、ＴＣＩＤ_５０アッセイによるウイルス負荷の定量化のために、卵巣を採取した。
結果

図２３Ａに図式的に示されるように、ＩＤ−ＶＰ０２−ＬＶ１ｂによる免疫化から３５日後、マウスは、ＯＶＡを発現する組み換えワクシニアウイルス（ｒＶＶ−ＯＶＡ）によりチャレンジしたが、野生型ワクシニアウイルス（ＶＶ−ＷＴ）によりチャレンジされず、ＯＶＡ_２５７に特異的なＣＤ８Ｔ細胞の劇的な拡大を示し（図２３Ｂ、Ｃ）、これらのメモリ細胞が、抗原に特異的な様式で記録されたことを示した。さらに、ｒＶＶ−ＯＶＡは、ＧＰ_３３に特異的なメモリ細胞を拡大せず（図２３Ｂ）、このことにより、同じ動物内で抗原特異性の必定条件を確認した。感染に応答したＣＤ８Ｔ細胞の用量依存的な誘導に対応して、感染したマウスの卵巣において、ｒＶＶ−ＯＶＡのウイルス負荷の明らかな用量依存的な減少があった（図２３Ｄ）。重要なことには、ＬＶ１ｂ抗原構築物とｒＶＶ−ＯＶＡチャレンジ株との間に共有した単一の抗原配列は、ＳＩＩＮＦＥＫＬＭＨＣクラスＩエピトープであり、ＣＤ８Ｔ細胞によって保護が媒介されたことを示した。実際には、保護が抗原に特異的であったことを確認すると、ＶＶ−ＷＴによる感染は、免疫化により影響を及ぼさなかった。
実施例２４
ＳＩＮＶａｒ１免疫化は、予防および治療の両方の抗腫瘍の有効性を提供する

ＣＴ２６腫瘍細胞株は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、自然発生大腸癌由来である。移植されたＣＴ２６腫瘍の拒絶反応を媒介することができる内因性エピトープが、ＡＨ１ペプチドである。ＭＨＣ−ＴＣＲの相互作用が、ＡＨ１エピトープにより比較的弱いが、変更されたペプチドリガンドＡＨ１Ａ５は、この相互作用を安定化することができ、より多くのＣＤ８Ｔ細胞の増殖および抗腫瘍応答をもたらす。既に報告されているように、このエピトープをコードするＳＩＮＶａｒ１を生成するために、ＡＨ１Ａ５配列を完全長ＯＶＡ配列に挿入した抗原カセット（ＯＶＡ−ＡＨ１Ａ５）が生成された。Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ１０１（３８），１３８３２（２００４）。
材料および方法
インビボ細胞毒性アッセイ

ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたり３匹）を、ＯＶＡ−ＡＨ１Ａ５をコードするＩＤ−ＶＰ０２を用いて、尾基底部の皮下に免疫化した。１２日後、免疫化した未処置対照マウスに、色素標識したペプチドでパルスした標的細胞を、眼窩洞後部を介して静脈内移入した。標的細胞は、低張ショックによって赤血球を溶解し、１μｇ／ｍＬのＡＨ１（ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ）（配列番号６７）、ＡＨ１Ａ５（ＳＰＳＹＡＹＨＱＦ）（配列番号２５）、または陰性対照ＮＹ−ＥＳＯ−１８１−８８（ＲＧＰＥＳＲＬＬ）（配列番号６８）ペプチドのいずれかでパルスした３つの集団に細胞を分割することによって、ナイーブな脾細胞から調製された。細胞を洗浄し、次いで、２μＭＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、２μＭ、０．２μＭ、または０．０２μＭの３つの濃度のＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のうちの１つで標識した。標的細胞は、１：１：１の比率で混合し、５×１０^６全細胞をレシピエントに移入した。翌日、膵臓を採取し、それぞれの集団の相対的回復を、ナイーブマウスと免疫化したマウスを比較して、前述のように、特異的な死亡を計算した。Ｗｏｎｄｅｒｌｉｃｈｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｈａｐｔｅｒ３，Ｕｎｉｔ（２００６）。
ＣＴ２６腫瘍チャレンジ

予防実験のために、ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたり１０匹）を、ＣＴ２６腫瘍細胞の画定されたＭＨＣ−Ｉに制限された拒絶反応のエピトープを含有する抗原、ＯＶＡ−ＡＨ１Ａ５をコードするＩＤ−ＶＰ０２を用いて、尾基底部の皮下に免疫化した。４週間後、免疫および未処置対照マウスに、右脇腹に８×１０^４ＣＴ２６腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍増殖は、一週間に３回モニタリングし、腫瘍領域が１００ｍｍ^２を超えたとき、マウスを殺処分した。ＩＤ−ＶＰ０２による免疫化が、腫瘍の移植から４日後に遅延したことを除いては、治療モードで、ＩＤ−ＶＰ０２を試験する実験は、同じ方法で行った。
結果

ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＯＶＡ−ＡＨ１Ａ５をコードするＩＤ−ＶＰ０２で免疫化された場合、多機能ＡＨ１Ａ５に特異的なＣＤ８Ｔ細胞の用量依存的な誘発が観察され、この約半数が、内因性ＡＨ１配列と交差反応した（図２４Ａ）。細胞傷害能を有するＩＤ−ＶＰ０２誘発ＣＤ８Ｔ細胞の能力を、インビボ細胞毒性アッセイによって直接分析した。３つの脾細胞標的細胞集団を、ＣＦＳＥと異なる濃度のＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔとで同時に標識し、ＡＨ１、ＡＨ１Ａ５、または陰性対照ペプチドによりパルスした。標的細胞は、１：１：１の比率で混合し、ＩＤ−ＶＰ０２で１２日前に免疫化したレシピエントマウスに共移入したか、または処置しないままにした。１日後、ＡＨ１およびＡＨ１Ａ５でパルスした標的の相対的回復は、ＩＤ−ＶＰ０２で免疫化したマウスにおいて減少し、ＡＨ１Ａ５に対して９０％超およびＡＨ１に対して約２５％の特定の致死率を有し（図２４Ｂ）、これにより、ＩＤ−ＶＰ０２が免疫抗原に対して機能的細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞を誘発することを示す。

抗腫瘍の有効性の第一の試験として、ＩＤ−ＶＰ０２−ＯＶＡ−ＡＨ１Ａ５またはビヒクルで同時に免疫化したマウスは、脇腹内に移植したＣＴ２６腫瘍細胞で２８日後にチャレンジされた。すべての対照マウスは、２１日目までに致死的な腫瘍増殖（＞１００ｍｍ^２）を有したが、ＩＤ−ＶＰ０２で免疫化したマウスのうちの７０％は、移植した腫瘍を拒絶することができ、これらの生存しているマウスには、少なくとも６０日間腫瘍がなかった（図２４Ｃ）。一療法としてＩＤ−ＶＰ０２を既に移植したＣＴ２６腫瘍に適用することによって、これらの所見を拡大した。このモデルにおいて、腫瘍を５日間増殖させ、動物をＩＤ−ＶＰ０２−ＯＶＡ−ＡＨ１Ａ５またはビヒクル対照で処置した。予防実験と同様に、すべての対照動物は、約３週間以内に腫瘍増殖で死亡した（図２４Ｄ）。対照的に、ＩＤ−ＶＰ０２で処置したすべてのマウスは、腫瘍進行への影響を示し、成長速度の遅延から明白な拒絶の範囲に及んだ。腫瘍は、免疫化群において、触知可能なサイズまで成長しないか（２／１０）、または完全に退行せず（３／１０）、５０％のマウスは、少なくとも６０日目まで腫瘍がなかった。これらのデータは、ＩＤ−ＶＰ０２が、予防的および治療的設定の両方において、抗腫瘍細胞傷害性活性を発揮することができ、ヒトにおける癌の治療剤としてＩＤ−ＶＰ０２の評価を支持することを示す。

Claims

図面に記載の発明。