JP2020072689A - Dc−signを発現する細胞に対して改善された形質導入の有効性を有するレンチウイルスベクター粒子 - Google Patents

Dc−signを発現する細胞に対して改善された形質導入の有効性を有するレンチウイルスベクター粒子 Download PDF

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Abstract

【課題】改善された偽型レンチウイルスベクター粒子を生成するために有用な材料および方法を提供する。【解決手段】本開示の一態様は、偽型レンチウイルスベクター粒子を生成する方法を提供する。本開示の別の態様は、(a)SAMHD1阻害剤と、(b)抗原をコードする外因性ポリヌクレオチドと、(c)DC−SIGNを発現する樹状細胞に優先的に結合するエンベロープ糖タンパク質とを含む偽型レンチウイルスベクター粒子を含む組成物を提供し、該組成物中のN連結グリカンの少なくとも60%、または少なくとも70%、または少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%は、Man5〜Man9構造、好ましくはMan9を含む。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2012年3月30日に出願された米国特許出願第13/436,472号、2012年12月4日に発行された米国特許第8,323,662号、2012年6月29日に出願された米国仮特許出願第61/666,103号、2012年12月3日に出願された同第61/732,756号、および2013年3月15日に出願された同第61/789,575号に優先権を主張し、これらのすべては、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
電子的に提出された材料の参照による援用
本明細書と同時に提出され、2013年3月29日に作成された、「46417A_SeqListing.txt」という名称の1246,173バイトのASCII(テキスト)ファイルとして特定されるコンピュータ可読のアミノ酸/ヌクレオチド配列表が、参照によりその全体が組み込まれる。
本開示は、改善された偽型レンチウイルスベクター粒子を生成するために有用な材料および方法に関する。
樹状細胞(DC)は、免疫応答の開始および制御に必須な抗原提示細胞である。DCは、抗原を捕捉および処理し、末梢からリンパ器官に移動して、主要組織適合性複合体(MHC)に制限される様式で、抗原を静止T細胞に提示することができる。これらの細胞は、骨髄(BM)に由来し、樹状形態および高い可動性を示す。特化した抗原提示細胞(APC)としてのDCの発見は、特異的抗原の表示のためにDCを標的とすることを含む、DCに基づく免疫化/ワクチン接種の戦略における試みを加速させた。組み換えウイルス系ベクターは、指定された抗原(複数を含む)をコードする遺伝子を宿主細胞に対して直接送達する機構として開発されている。所望の適応免疫応答の誘導を通して、発現された遺伝子産物が、治療的利益を提供する。
安全かつ有効なシステムの達成における課題には、所望の一連の宿主細胞を効率的に標的とするベクターを設計すること、適切な送達システムを提供すること、および指定されたヒト被検体集団にわたって広く利用され得るように、有効な免疫応答を引き起こすように所望の抗原を発現させることが含まれる。
本明細書に開示されるシンドビスウイルスおよび他のアルファウイルスのエンベロープ糖タンパク質は、ウイルス粒子膜の脂質二重層に組み込まれる。通常、ウイルス膜(エンベロープ)は、単一の前駆体タンパク質の切断から産生される、2つの糖タンパク質ヘテロ二量体E1およびE2の三量体の複数のコピーを含む。前駆体タンパク質は、そのN末端からC末端に、E3、E2、6K、およびE1タンパク質を含む。小E3糖タンパク質は、膜へのE2タンパク質の転座のためのシグナル配列として機能し、フリンまたはいくつかの他のCa2+依存セリンプロテイナーゼによって、E2から切断する。6Kタンパク質は、膜へのE1タンパク質の転座のためのシグナル配列として機能し、次いで、前駆体タンパク質から切断する。国際公開第WO2008/011636号および米国特許第2011/0064763号は、レンチウイルスパッケージングシステムを開示する。
国際公開第2008/011636号 米国特許出願公開第2011/0064763号
本発明者らは、(a)高度にマンノシル化されているアルファウイルス糖タンパク質により偽型化される、そして、(b)Vpxタンパク質を含むという2つの特徴を示すレンチウイルスベクター粒子が、DC−SIGNを発現する細胞に対して予想外に改善された形質導入の有効性を有することを発見した。これらの粒子を、これらの2つの特徴のうちの1つのみを有するレンチウイルスベクター粒子よりもさらに効率的に、DC−SIGN、特に、樹状細胞を発現する細胞に感染させる。具体的な例では、Vpxタンパク質と、対象となる配列(例えば、抗原をコードするポリヌクレオチド)を含むレンチウイルスゲノムとを含む高度にマンノシル化されている偽型レンチウイルスベクター粒子が提供される。
偽型レンチウイルスベクター粒子を生成する方法
本開示の一態様は、偽型レンチウイルスベクター粒子を生成する方法を提供し、本方法は、(a)マンノシダーゼ阻害剤、好ましくはマンノシダーゼI阻害剤を含む培養培地中で、(1)外因性抗原をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターゲノムと、(2)DC−SIGNを発現する細胞に優先的に結合するアルファウイルス糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、(3)SAMHD1阻害剤をコードするポリヌクレオチドとを含むウイルスパッケージング細胞を培養することと、(b)DC−SIGNを発現する細胞に優先的に結合する偽型レンチウイルスベクター粒子を単離することと、を含む。
本開示の別の態様は、偽型レンチウイルスベクター粒子を生成する方法を提供し、本方法は、(a)キフネンシンを含む培養培地中で、(1)外因性抗原をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターゲノムと、(2)DC−SIGNを発現する樹状細胞に優先的に結合するシンドビスE2糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、(3)SAMHD1阻害活性を保持するVpxタンパク質またはVprタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含むウイルスパッケージング細胞を培養することと、(b)DC−SIGNを発現する樹状細胞に優先的に結合する偽型レンチウイルスベクター粒子を単離することと、を含む。いくつかの実施形態において、E2糖タンパク質は、配列番号30[SIN−Var1]と90%同一である。いくつかの実施形態において、(i)E2糖タンパク質の残基160は、不在であるか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸であり、(ii)E2糖タンパク質変異体の残基70、76、もしくは159のうちの1つ以上は、非塩基性残基であり、(iii)E2糖タンパク質変異体は、シンドビスウイルスE3糖タンパク質との融合タンパク質の一部ではない。いくつかの実施形態において、E2糖タンパク質は、配列番号30[SIN−Var1]である。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、Vpxタンパク質は、SIVmac Vpx(配列番号44)と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、Vpxタンパク質は、SIVmac Vpx(配列番号44)、SIVsm Vpx(配列番号45)、SIVrcm Vpx(配列番号46)、またはHIV−2 Vpx(配列番号47)と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、Vprタンパク質は、SIVdeb Vpr(配列番号48)またはSIVmus Vpr(配列番号49)と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、抗原は、腫瘍特異的抗原またはウイルス特異的抗原である。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、腫瘍特異的抗原は、NY−ESO−1、MAGE、例えば、MAGE−A3およびMAGE−A1、MART−1/Melan−A、BAGE、RAGE、gp100、gp75、mda−7、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質、例えば、TRP2、腎細胞癌抗原、5T4、SM22−アルファ、炭酸脱水酵素I、炭酸脱水酵素IX(G250としても知られる)、HIF−1アルファ、HIF−2アルファ、VEGF、前立腺特異性膜抗原(PSMA)、前立腺特異的抗原(PSA)、前立腺酸性リン酸塩、前立腺の6−膜貫通上皮抗原(STEAP)、NKX3.1、テロメラーゼ酵素、スルビビン、メソテリン、変異型ras、bcr/abl再構成、Her2/neu、変異型p53、野生型p53、サイトクロームP450 1B1、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−V、ヒトパピローマウイルスタンパク質E6、ヒトパピローマウイルスタンパク質E7、癌胎児性抗原、メルケル細胞ウイルスT抗原癌タンパク質、およびアルファ−フェトタンパク質から成る群から選択される。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、ウイルス特異的抗原は、HIV抗原、SIV抗原、アデノウイルス抗原、エンテロウイルス抗原、コロナウイルス抗原、カリシウイルス抗原、ジステンパーウイルス抗原、エボラウイルス抗原、フラビウイルス抗原、肺炎ウイルス抗原、ヘルペスウイルス抗原、感染性腹膜炎ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、白血病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、オルトミクソウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、パラインフルエンザウイルス抗原、パラミクソウイルス抗原、パラボウイルス抗原、ペスチウイルス抗原、ピコルナウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ポックスウイルス抗原、ポリオーマウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、レオウイルス抗原、レトロウイルス抗原、またはロタウイルス抗原である。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、レンチウイルスベクターゲノムは、第2の抗原をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、第1および第2の抗原は、2つの抗原の間に自己切断型A2ペプチドを含む融合タンパク質として発現される。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、自己切断型A2ペプチドは、配列番号56または配列番号57のアミノ酸配列を含む。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、第1の抗原は、MAGE−A3であり、第2の抗原は、NY−ESO−1である。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、キフネンシンは、約0.01μg/ml〜約1mg/mlの濃度で、培養培地中に存在する。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、キフネンシンは、約0.1μg/ml〜約1μg/mlの濃度で、培養培地中に存在する。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、キフネンシンは、約0.25μg/ml〜約2μg/mlの濃度で、培養培地中に存在する。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、ウイルスパッケージング細胞は、(i)gagおよびpol遺伝子を含むポリヌクレオチドと、(ii)revタンパク質をコードするポリヌクレオチドとをさらに含む。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、gagおよびpol遺伝子は、ヒトのコドンに最適化され、配列番号54の1228〜1509位周辺に最適化されないウインドウを含む。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、gagおよびpol遺伝子を含むポリヌクレオチドは、機能的rev応答要素(RRE)を欠いている。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、gagおよびpol遺伝子を含むポリヌクレオチドは、機能的RREが欠失しているため、このRREを欠いている。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、pol遺伝子は、不活性インテグラーゼ酵素をコードする。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、インテグラーゼ酵素は、D64V突然変異体を有する。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、Vpxタンパク質またはVprタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、revタンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはgagおよびpol遺伝子を含むポリヌクレオチドと同じまたは異なるプラスミド上にある。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、レンチウイルスベクターゲノムは、HIV−1に由来する。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、レンチウイルスベクターゲノムは、不活性化された3’側の長い末端反復(LTR)または自己不活性化された3’側の長い末端反復(LTR)を有する。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、レンチウイルスベクターゲノムは、エンハンサー配列、TATAボックス、Sp1部位、NK−カッパB部位、またはポリプリン区画(PPT)のうちの少なくとも1つを欠いているU3要素を含む。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、レンチウイルスベクターゲノムは、配列番号21[SINベクター]、22[703ベクター]、または23[704ベクター]のうちのいずれか1つのヌクレオチド配列を含む。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、レンチウイルスベクターゲノムは、樹状細胞成熟/刺激因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、樹状細胞成熟/刺激因子は、GM−CSF、IL−2、IL−4、IL−6、IL−7、IL−15、IL−21、IL−23、TNFα、B7.1、B7.2、4−1BB、CD40リガンド、および薬物誘導CD40から成る群から選択される。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、抗原をコードするヌクレオチド配列は、ヒトユビキチンCプロモ−ター(UbiC)、サイトメガロウイルス前初期プロモ−ター(CMV)、ラウス肉腫ウイルスプロモ−ター(RSV)、およびテトラサイクリン応答プロモ−ターから成る群から選択されるプロモ−ターに作動可能に連結している。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、プロモ−ターは、イントロン欠損プロモーターである。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、イントロン欠損プロモーターは、UbiCである。
本開示の関連態様は、上記で挙げた方法のうちのいずれかによって産生されるレンチウイルスベクター粒子を提供する。
偽型レンチウイルスベクター粒子を含む組成物
本開示の別の態様は、(a)SAMHD1阻害剤と、(b)抗原をコードする外因性ポリヌクレオチドと、(c)DC−SIGNを発現する樹状細胞に優先的に結合するエンベロープ糖タンパク質とを含む偽型レンチウイルスベクター粒子を含む組成物を提供し、該組成物中のN連結グリカンの少なくとも60%、または少なくとも70%、または少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%は、Man〜Man構造、好ましくはManを含む。
本開示の別の態様は、(a)Vpxタンパク質と、(b)抗原をコードする外因性ポリヌクレオチドと、(c)DC−SIGNを発現する樹状細胞に優先的に結合するエンベロープ糖タンパク質とを含む偽型レンチウイルスベクター粒子を含む組成物を提供し、該組成物中のN連結グルカンの少なくとも80%は、Man構造を含む。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、Vpxタンパク質は、SIVmac Vpxタンパク質(配列番号44)と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、Vpxタンパク質は、SIVmac Vpx(配列番号44)、SIVsm Vpx(配列番号45)、SIVrcm Vpx(配列番号46)、またはHIV−2 Vpx(配列番号47)と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、Vprタンパク質は、SIVdeb Vpr(配列番号48)またはSIVmus Vpr(配列番号49)と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、偽型レンチウイルスベクター粒子を、少なくとも1%、または少なくとも5%、または少なくとも10%、または少なくとも20%のインビトロ形質導入の有効性によりDC−SIGNを発現する樹状細胞に感染させる。例えば、実施例8の手順を参照されたい。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、糖タンパク質は、シンドビスウイルスE2糖タンパク質である。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、E2糖タンパク質は、配列番号30[SIN−Var1]に対して少なくとも90%同一性を有する。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、(i)E2糖タンパク質の残基160は、不在であるか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸であり、(ii)E2糖タンパク質変異体の残基70、76、または159のうちの1つ以上が、非塩基性残基であり、(iii)E2糖タンパク質変異体は、シンドビスウイルスE3糖タンパク質との融合タンパク質の一部ではない。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、抗原は、腫瘍特異的抗原またはウイルス特異的抗原である。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、腫瘍特異的抗原は、NY−ESO−1、MAGE、例えば、MAGE−A3およびMAGE−A1、MART−1/Melan−A、BAGE、RAGE、gp100、gp75、mda−7、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質、例えば、TRP2、腎細胞癌抗原、5T4、SM22−アルファ、炭酸脱水酵素I、炭酸脱水酵素IX(G250としても知られる)、HIF−1アルファ、HIF−2アルファ、VEGF、前立腺特異性膜抗原(PSMA)、前立腺特異的抗原(PSA)、前立腺酸性リン酸塩、前立腺の6−膜貫通上皮抗原(STEAP)、NKX3.1、テロメラーゼ酵素、スルビビン、メソテリン、変異型ras、bcr/abl再構成、Her2/neu、変異型p53、野生型p53、サイトクロームP450 1B1、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−V、ヒトパピローマウイルスタンパク質E6、ヒトパピローマウイルスタンパク質E7、癌胎児性抗原、メルケル細胞ウイルスT抗原癌タンパク質、およびアルファ−フェトタンパク質から成る群から選択される。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、ウイルス特異的抗原は、HIV抗原、SIV抗原、アデノウイルス抗原、エンテロウイルス抗原、コロナウイルス抗原、カリシウイルス抗原、ジステンパーウイルス抗原、エボラウイルス抗原、フラビウイルス抗原、肺炎ウイルス抗原、ヘルペスウイルス抗原、感染性腹膜炎ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、白血病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、オルトミクソウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、パラインフルエンザウイルス抗原、パラミクソウイルス抗原、パラボウイルス抗原、ペスチウイルス抗原、ピコルナウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ポックスウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、レオウイルス抗原、レトロウイルス抗原、またはロタウイルス抗原である。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、レンチウイルスベクターゲノムは、第2の抗原をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、第1および第2の抗原は、2つの抗原の間に自己切断型A2ペプチドを含む融合タンパク質として発現される。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、自己切断型A2ペプチドは、配列番号56または配列番号57のアミノ酸配列を含む。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、第1の抗原は、NY−ESO−1であり、第2の抗原は、MAGE−A3である。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、レンチウイルスベクターゲノムは、HIV−1に由来する。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、レンチウイルスベクターゲノムは、不活性化された3’側の長い末端反復(LTR)または自己不活性化された3’側の長い末端反復(LTR)を有する。いくつかの態様において、レンチウイルスベクターゲノムは、エンハンサー配列、TATAボックス、Sp1部位、NK−カッパB部位、またはポリプリン区画(PPT)のうちの少なくとも1つを欠いているU3要素を含む。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、レンチウイルスベクターゲノムは、配列番号21[SINベクター]、22[703ベクター]、または23[704ベクター]のうちのいずれか1つのヌクレオチド配列を含む。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、レンチウイルスベクターゲノムは、樹状細胞成熟/刺激因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、樹状細胞成熟/刺激因子は、GM−CSF、IL−2、IL−4、IL−6、IL−7、IL−15、IL−21、IL−23、TNFα、B7.1、B7.2、4−1BB、CD40リガンド、および薬物誘導CD40から成る群から選択される。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、抗原をコードするヌクレオチド配列は、ヒトユビキチンCプロモ−ター(UbiC)、サイトメガロウイルス前初期プロモ−ター(CMV)、ラウス肉腫ウイルスプロモ−ター(RSV)、およびテトラサイクリン応答プロモ−ターから成る群から選択されるプロモ−ターに作動可能に連結している。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、プロモ−ターは、イントロン欠損プロモーターである。本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、イントロン欠損プロモーターは、ヒトユビキチンC(UbiC)プロモ−ターである。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、偽型レンチウイルスベクター粒子は、少なくとも10/mLのIUを有する。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、組成物は、免疫刺激剤をさらに含む。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、組成物は、アジュバントをさらに含む。例えば、本明細書に開示されるような、アジュバントは、ミョウバン、または3De−O−アシル化モノホスホリル脂質A(MPL)を含む。本明細書に開示されるアジュバントの種類には、(a)アルミニウム塩、(b)任意に他の特定の免疫刺激剤、例えば、ムラミルペプチド、または他の細菌細胞壁成分を含む、または含まない、水中油型エマルション製剤、(c)ISCOM(免疫刺激複合体)およびISCOMATRIXを含むサポニンアジュバント、(d)完全フロイントアジュバント(CFA)および不完全フロイントアジュバント(IFA)、(e)サイトカイン、ならびに(f)式(I)のアジュバントが含まれる。
式中、部分A1およびA2は、水素、リン酸塩、およびリン酸塩から成る群から独立して選択される。ナトリウムおよびカリウムは、リン酸塩の例示的な対イオンである。部分R、R、R、R、R、およびRは、独立して、C−C23によって表される、3〜23個の炭素を有するヒドロカルビルから成る群から選択される。さらなる明瞭さのために、部分が複数のメンバーを有する特定された基「から独立して選択される」とき、第1の部分のために選択されたメンバーは、第2の部分のために選択されたメンバーの選択に決して影響を及ぼさない、または限定しないことを理解すべきである。R、R、R、およびRが結合される炭素原子は非対称であり、このため、RまたはSの立体化学のいずれかで存在し得る。一実施形態において、これらの炭素原子のすべてはR立体化学であり、一方で、別の実施形態において、これらの炭素原子のすべてはS立体化学である。
本開示の様々な実施形態において、アジュバントは、式(I)の化学構造を有するが、部分A1、A2、R1、R2、R3、R4、R5、およびR6は、これらの部分のために前に提供される選択肢のうちのサブセットから選択され、これらのサブセットは、E1、E2等によって以下に特定される。
E1:Aは、リン酸またはリン酸塩であり、Aは水素である。
E2:R、R、R、およびRは、C−C21アルキルであり、RおよびRは、C−C23ヒドロカルビルである。
E3:R、R、R、およびRは、C−C17アルキルであり、RおよびRは、C−C19ヒドロカルビルである。
E4:R、R、R、およびRは、C−C15アルキルであり、RおよびRは、C−C17ヒドロカルビルである。
E5:R、R、R、およびRは、C−C13アルキルであり、RおよびRは、C11−C15ヒドロカルビルである。
E6:R、R、R、およびRは、C−C15アルキルであり、RおよびRは、C11−C17ヒドロカルビルである。
E7:R、R、R、およびRは、C−C13アルキルであり、RおよびRは、C−C15ヒドロカルビルである。
E8:R、R、R、およびRは、C11−C20アルキルであり、RおよびRは、C12−C20ヒドロカルビルである。
E9:R、R、R、およびRは、C11アルキルであり、RおよびRは、C13ヒドロカルビルである。
E10:R、R、R、およびRは、ウンデシルであり、RおよびRは、トリデシルである。
ある選択肢において、E2〜E10のそれぞれは、実施形態E1と組み合わせられるか、および/またはE2〜E9のヒドロカルビル基は、アルキル基、好ましくは直鎖アルキル基である。好ましいアジュバントは、E10と組み合わせたE1であり、(i)Aは、リン酸またはリン酸塩であり、Aは水素であり、(ii)R、R、R、およびRは、ウンデシルであり、RおよびRは、トリデシルである。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、エンベロープ糖タンパク質はまた、マウスSIGNR1を発現する細胞に結合する。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、偽型レンチウイルスベクター粒子はまた、マウスSIGNR1を発現しない細胞と比較して、マウスSIGNR1を発現する細胞をより効率的に形質導入する。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
(項目1)
(a)SAMHD1阻害活性を保持するVpxタンパク質またはVprタンパク質と、(b)抗原をコードする外因性ポリヌクレオチドと、(c)DC−SIGNを発現する細胞に優先的に結合する複数のエンベロープ糖タンパク質とを含む偽型レンチウイルスベクター粒子を含む組成物であって、マンノシダーゼ阻害剤の不在下で調製された同じ偽型レンチウイルスベクター粒子の対照組成物と比較して、より高度にマンノシル化されている、組成物。
(項目2)
前記エンベロープ糖タンパク質が、アルファウイルス糖タンパク質である、項目1に記載の組成物。
(項目3)
前記エンベロープ糖タンパク質が、シンドビス糖タンパク質である、項目2に記載の組成物。
(項目4)
高マンノシル化が、マンノシダーゼ阻害剤の不在下で調製された対照組成物よりもさらにEndoH感受性であることを特徴とする、項目1〜3のいずれかに記載の組成物。
(項目5)
EndoH感受性が、EndoH処理後、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)によって、前記エンベロープ糖タンパク質の分子量を評価することによって判定される、項目1〜3のいずれかに記載の組成物。
(項目6)
EndoHによる処理後の前記エンベロープ糖タンパク質の分子量が、(a)エンドグリコシダーゼにより処理されないエンベロープ糖タンパク質と、(b)PNGase Fにより処理されたエンベロープ糖タンパク質との間の距離の約45%以上シフトしている、項目1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
(項目7)
EndoHによる処理後の前記エンベロープ糖タンパク質の分子量が、(a)エンドグリコシダーゼにより処理されないエンベロープ糖タンパク質と、(b)PNGase Fにより処理されたエンベロープ糖タンパク質との間の距離の約70%以上シフトしている、項目6に記載の組成物。
(項目8)
EndoHによる処理後の前記エンベロープ糖タンパク質の分子量が、(a)エンドグリコシダーゼにより処理されないエンベロープ糖タンパク質と、(b)PNGase Fにより処理されたエンベロープ糖タンパク質との間の距離の約90%以上シフトしている、項目6に記載の組成物。
(項目9)
前記組成物中の前記エンベロープ糖タンパク質のうちの少なくとも30%が、マンノシダーゼ阻害剤の不在下で調製された偽型レンチウイルスベクター粒子の対照組成物中の同じアミノ酸配列(複数を含む)を有する対照糖タンパク質と比較して、増加した量のEndoH感受性グリカンを有する、項目1〜8のいずれか一項に記載の組成物。
(項目10)
前記エンベロープ糖タンパク質の大部分が、高度にマンノシル化されている、項目1〜9のいずれか一項に記載の組成物。
(項目11)
前記偽型レンチウイルスベクター粒子が、組み込み不能である、項目1〜10のいずれか一項に記載の組成物。
(項目12)
前記組成物が、シンドビスE2糖タンパク質を含む、項目1〜11のいずれか一項に記載の組成物。
(項目13)
前記E2糖タンパク質が、配列番号30[SIN−Var1]と90%同一である、項目12に記載の組成物。
(項目14)
(i)前記E2糖タンパク質の残基160が、不在であるか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸であり、(ii)前記E2糖タンパク質変異体の残基70、76、もしくは159のうちの1つ以上が、非塩基性残基であり、(iii)前記E2糖タンパク質変異体が、シンドビスウイルスE3糖タンパク質との融合タンパク質の一部ではない、項目12または13に記載の組成物。
(項目15)
前記E2糖タンパク質が、配列番号30[SIN−Var1]である、項目14に記載の組成物。
(項目16)
前記Vpxタンパク質が、SIVmac Vpx[配列番号44]と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む、項目1〜15のいずれか一項に記載の組成物。
(項目17)
前記Vpxタンパク質が、SIVmac Vpx(配列番号44)、SIVsm Vpx(配列番号45)、SIVrcm Vpx(配列番号46)、またはHIV−2 Vpx(配列番号47)と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、項目1〜15のいずれか一項に記載の組成物。
(項目18)
前記Vpxタンパク質が、SIVdeb Vpr(配列番号48)またはSIVmus
Vpr(配列番号49)と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、項目1〜14のいずれか一項に記載の組成物。
(項目19)
前記抗原が、腫瘍特異的抗原またはウイルス特異的抗原である、項目1〜18のいずれか一項に記載の組成物。
(項目20)
前記腫瘍特異的抗原が、NY−ESO−1、MAGE、MART−1/Melan−A、BAGE、RAGE、gp100、gp75、mda−7、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質、腎細胞癌抗原、5T4、SM22−アルファ、炭酸脱水酵素I、炭酸脱水酵素IX(G250としても知られる)、HIF−1アルファ、HIF−2アルファ、VEGF、前立腺特異性膜抗原(PSMA)、前立腺特異的抗原(PSA)、前立腺酸性リン酸塩、前立腺の6−膜貫通上皮抗原(STEAP)、NKX3.1、テロメラーゼ酵素、スルビビン、メソテリン、変異型ras、bcr/abl再構成、Her2/neu、変異型p53、野生型p53、サイトクロームP450 1B1、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−V、ヒトパピローマウイルスタンパク質E6、ヒトパピローマウイルスタンパク質E7、癌胎児性抗原、およびアルファ−フェトタンパク質から成る群から選択される、項目19に記載の組成物。
(項目21)
前記ウイルス特異的抗原が、HIV抗原、SIV抗原、アデノウイルス抗原、エンテロウイルス抗原、コロナウイルス抗原、カリシウイルス抗原、ジステンパーウイルス抗原、エボラウイルス抗原、フラビウイルス抗原、肺炎ウイルス抗原、ヘルペスウイルス抗原、感染性腹膜炎ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、白血病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、オルトミクソウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、パラインフルエンザウイルス抗原、パラミクソウイルス抗原、パラボウイルス抗原、ペスチウイルス抗原、ピコルナウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ポックスウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、レオウイルス抗原、レトロウイルス抗原、またはロタウイルス抗原である、項目19に記載の組成物。
(項目22)
前記レンチウイルスベクターゲノムが、第2の抗原をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目1〜21のいずれか一項に記載の組成物。
(項目23)
前記第1および第2の抗原が、前記2つの抗原の間に自己切断型A2ペプチドを含む融合タンパク質として発現される、項目22に記載の組成物。
(項目24)
自己切断型A2ペプチドが、配列番号56または配列番号57のアミノ酸配列を含む、項目23に記載の組成物。
(項目25)
前記第1の抗原が、NY−ESO−1であり、前記第2の抗原が、MAGE−A3である、項目22〜24のいずれか一項に記載の組成物。
(項目26)
前記第1および第2の抗原が、二方向性プロモーターから発現される、項目22に記載の組成物。
(項目27)
前記エンベロープ糖タンパク質が、マウスSIGNR1を発現する細胞に結合する、項目1に記載の組成物。
(項目28)
前記偽型レンチウイルスベクター粒子が、マウスSIGNR1を発現しない細胞と比較して、マウスSIGNR1を発現する細胞をより効率的に形質導入する、項目1に記載の組成物。
(項目29)
偽型レンチウイルスベクター粒子を生成する方法であって、
(a)キフネンシンを含む培養培地中で、
(1)外因性抗原をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターゲノムと、
(2)DC−SIGNを発現する樹状細胞に優先的に結合するシンドビスE2糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
(3)SAMHD1阻害活性を保持するVpxタンパク質またはVprタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、を含むウイルスパッケージング細胞を培養することと、
(b)DC−SIGNを発現する樹状細胞に優先的に結合する偽型レンチウイルスベクター粒子を単離することと、を含む、方法。
(項目30)
前記E2糖タンパク質が、配列番号30[SIN−Var1]と90%同一である、項目29に記載の方法。
(項目31)
(i)前記E2糖タンパク質の残基160が、不在であるか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸であり、(ii)前記E2糖タンパク質変異体の残基70、76、または159のうちの1つ以上が、非塩基性残基であり、(iii)前記E2糖タンパク質変異体が、シンドビスウイルスE3糖タンパク質との融合タンパク質の一部ではない、項目29または30に記載の方法。
(項目32)
前記E2糖タンパク質が、配列番号30[SIN−Var1]である、項目30に記載の方法。
(項目33)
前記Vpxタンパク質が、SIVmac Vpx[配列番号44]と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む、項目29〜32のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
前記Vpxタンパク質が、SIVmac Vpx(配列番号44)、SIVsm Vpx(配列番号45)、SIVrcm Vpx(配列番号46)、またはHIV−2 Vpx(配列番号47)と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、項目29〜32のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
前記Vpxタンパク質が、SIVdeb Vpr(配列番号48)またはSIVmus
Vpr(配列番号49)と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、項目29〜32のいずれか一項に記載の方法。
(項目36)
前記抗原が、腫瘍特異的抗原またはウイルス特異的抗原である、項目29〜35のいずれか一項に記載の方法。
(項目37)
前記腫瘍特異的抗原が、NY−ESO−1、MAGE、MART−1/Melan−A、BAGE、RAGE、gp100、gp75、mda−7、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質、腎細胞癌抗原、5T4、SM22−アルファ、炭酸脱水酵素I、炭酸脱水酵素IX(G250としても知られる)、HIF−1アルファ、HIF−2アルファ、VEGF、前立腺特異性膜抗原(PSMA)、前立腺特異的抗原(PSA)、前立腺酸性リン酸塩、前立腺の6−膜貫通上皮抗原(STEAP)、NKX3.1、テロメラーゼ酵素、スルビビン、メソテリン、変異型ras、bcr/abl再構成、Her2/neu、変異型p53、野生型p53、サイトクロームP450 1B1、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−V、ヒトパピローマウイルスタンパク質E6、ヒトパピローマウイルスタンパク質E7、癌胎児性抗原、およびアルファ−フェトタンパク質から成る群から選択される、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記ウイルス特異的抗原が、HIV抗原、SIV抗原、アデノウイルス抗原、エンテロウイルス抗原、コロナウイルス抗原、カリシウイルス抗原、ジステンパーウイルス抗原、エボラウイルス抗原、フラビウイルス抗原、肺炎ウイルス抗原、ヘルペスウイルス抗原、感染性腹膜炎ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、白血病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、オルトミクソウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、パラインフルエンザウイルス抗原、パラミクソウイルス抗原、パラボウイルス抗原、ペスチウイルス抗原、ピコルナウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ポックスウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、レオウイルス抗原、レトロウイルス抗原、またはロタウイルス抗原である、項目36に記載の方法。
(項目39)
前記レンチウイルスベクターゲノムが、第2の抗原をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目29〜38のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
前記第1および第2の抗原が、前記2つの抗原の間に自己切断型A2ペプチドを含む融合タンパク質として発現される、項目39に記載の方法。
(項目41)
自己切断型A2ペプチドが、配列番号56または配列番号57のアミノ酸配列を含む、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記第1の抗原が、NY−ESO−1であり、前記第2の抗原が、MAGE−A3である、項目39〜41のいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
前記第1および第2の抗原が、二方向性プロモーターから発現される、項目39に記載の方法。
(項目44)
前記キフネンシンが、約0.1μg/ml〜約10μg/mlの濃度で、前記培養培地中に存在する、項目29〜43のいずれか一項に記載の方法。
(項目45)
前記キフネンシンが、約0.25μg/ml〜約2μg/mlの濃度で、前記培養培地中に存在する、項目44に記載の方法。
(項目46)
前記ウイルスパッケージング細胞が、
(i)gagおよびpol遺伝子を含むポリヌクレオチドと、
(ii)revタンパク質をコードするポリヌクレオチドとをさらに含む、項目29〜45のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
前記gagおよびpol遺伝子が、ヒトのコドンに最適化され、配列番号54の1228〜1509位周辺に最適化されないウインドウを含む、項目46に記載の方法。
(項目48)
前記gagおよびpol遺伝子を含むポリヌクレオチドが、機能的rev応答要素(RRE)を欠いている、項目46または47に記載の方法。
(項目49)
前記pol遺伝子が、不活性インテグラーゼ酵素をコードする、項目46〜48のいずれか一項に記載の方法。
(項目50)
前記インテグラーゼ酵素が、D64V突然変異体を有する、項目49に記載の方法。
(項目51)
前記Vpxタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、前記revタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または前記gagおよびpol遺伝子を含むポリヌクレオチドと同じまたは異なるプラスミド上にある、項目46〜50のいずれか一項に記載の方法。(項目52)
前記レンチウイルスベクターゲノムが、HIV−1に由来する、項目29〜51のいずれか一項に記載の方法。
(項目53)
前記レンチウイルスベクターゲノムが、不活性化された3’側の長い末端反復(LTR)または自己不活性化された3’側の長い末端反復(LTR)を有する、項目29〜52のいずれか一項に記載の方法。
(項目54)
前記レンチウイルスベクターゲノムが、エンハンサー配列、TATAボックス、Sp1部位、NK−カッパB部位、またはポリプリン区画(PPT)のうちの少なくとも1つを欠いているU3要素を含む、項目53に記載の方法。
(項目55)
前記レンチウイルスベクターゲノムが、配列番号21、22、または23のうちのいずれか1つの前記ヌクレオチド配列を含む、項目29〜54のいずれか一項に記載の方法。(項目56)
前記レンチウイルスベクターゲノムが、樹状細胞成熟/刺激因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目29〜55のいずれか一項に記載の方法。
(項目57)
前記樹状細胞成熟/刺激因子が、GM−CSF、IL−2、IL−4、IL−6、IL−7、IL−15、IL−21、IL−23、TNFα、B7.1、B7.2、4−1BB、CD40リガンド、および薬物誘導CD40から成る群から選択される、項目56に記載の方法。
(項目58)
抗原をコードする前記ヌクレオチド配列が、ヒトユビキチンCプロモ−ター(UbiC)、サイトメガロウイルス前初期プロモ−ター(CMV)、ラウス肉腫ウイルスプロモ−ター(RSV)、およびテトラサイクリン応答プロモ−ターから成る群から選択されるプロモ−ターに作動可能に連結している、項目29〜57のいずれか一項に記載の方法。
(項目59)
前記プロモ−ターが、イントロン欠損プロモーターである、項目58に記載の方法。
(項目60)
前記イントロン欠損プロモーターが、UbiCプロモーターである、項目59に記載の方法。
(項目61)
項目29〜45に記載の方法によって産生される、レンチウイルスベクター粒子。
(項目62)
項目46〜60に記載の方法によって産生される、レンチウイルスベクター粒子。
(項目63)
偽型レンチウイルスベクター粒子を生成する方法であって、
(a)キフネンシンを含む培養培地中で、
(1)MAGE−A3およびNY−ESO−1をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターゲノムであって、自己切断型TA2ペプチドをコードするポリヌクレオチドが、MAGE−A3およびNY−ESO−1をコードするポリヌクレオチドとの間に配置され、前記レンチウイルスゲノムがポリプリン区画(PPT)を欠いており、MAGE−A3およびNY−ESO−1の発現が、イントロンを欠いているUbiCプロモーターによって制御される、レンチウイルスベクターゲノムと、
(2)DC−SIGNを発現する樹状細胞に優先的に結合するシンドビスE2糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
(3)ヒトのコドンに最適化されるgagおよびpol遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが機能的rev応答要素(RRE)を欠いており、前記pol遺伝子が不活性インテグラーゼ酵素をコードする、ポリヌクレオチドと、
(4)SAMHD1阻害活性を保持するVpxタンパク質またはVprタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含むウイルスパッケージング細胞を培養することと、
(b)DC−SIGNを発現する樹状細胞に優先的に結合する偽型レンチウイルスベクター粒子を単離することと、を含む、方法。
本開示の他の特性および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、この詳細な説明から、本開示の精神および範囲内の種々の変化および変更は当業者に明らかになり得るので、詳細な説明および特定の実施例は、本開示の特定の実施形態を示すが、例示のためだけに与えられると理解されるべきである。
DC−SIGN受容体を安定的に発現するHT1080細胞(1A)、またはDC−SIGNを欠いているHT1080細胞(1B)に感染させるための、様々なマンノシダーゼ阻害剤(例えば、キフネンシン、DMNJ、およびスワインソニン)の存在下で産生される偽型レンチウイルスベクター粒子の能力を示す。感染効率は、レンチウイルスベクターからのGFPの発現を判定することによって評価された。y軸は、GFP陽性細胞のパーセンテージである。
DC−SIGN受容体を安定的に発現するHT1080細胞(1A)、またはDC−SIGNを欠いているHT1080細胞(1B)に感染させるための、様々なマンノシダーゼ阻害剤(例えば、キフネンシン、DMNJ、およびスワインソニン)の存在下で産生される偽型レンチウイルスベクター粒子の能力を示す。感染効率は、レンチウイルスベクターからのGFPの発現を判定することによって評価された。y軸は、GFP陽性細胞のパーセンテージである。
DC−SIGN受容体を安定的に発現するHT1080細胞(2A)またはDC−SIGNを欠いているHT1080細胞(2B)に感染させるための、400μg/mlのDMNJまたは様々な濃度のキフネンシンの存在下で産生される偽型レンチウイルスベクター粒子の能力を示す。感染効率は、図1と同様に、評価された。
(図3A)PNGaseFおよびEndoHに対する基質特異性を示す略図である。PNGaseFは、グリコシル化プロファイルにかかわらず、すべてのN連結グリコシル化を切断する一般的なエンドグリコシダーゼである。EndoHは、高マンノースN連結グリコシル化のみを切断する特殊化したエンドグリコシダーゼである。EndoHは、高マンノースN連結グリコシル化のみを切断する(すなわち、EndoHは、キフネンシンの不在下で、SINVar1上において4つのうちの2つの部位、そして、キフネンシンの存在下で、SINVar1上において4つのうちの4つの部位を標的とする)。(図3B)ゲルシフトを使用して、SDS−PAGEゲル上で泳動し、シンドビスウイルスエンベロープに対する抗体を用いた免疫ブロット法によって、キフネンシンまたはDMNJの存在下で産生される偽型レンチウイルスベクター粒子における糖タンパク質のグリコシル化状態を判定するための実験の結果を示す。
DC−SIGN受容体を安定的に発現するHT1080細胞に感染させるための、400μg/mlのDMNJまたは様々な濃度のキフネンシンの存在下で産生される偽型レンチウイルスベクター粒子の能力を示す。感染効率は、図1と同様に、評価された。
図4Aにおいて産生された偽型レンチウイルスベクター粒子におけるE2糖タンパク質のグリコシル化状態を判定するための実験の結果を示す。
293T細胞中で発現するHAタグSIVmacVpxのウェスタンブロット(抗HA)である。CMVプロモーター(pENV−SIVmacVpxと命名された構築物)によって駆動された哺乳動物発現ベクターにクローン化された。 HAタグSIVmacVpxを含むウイルス粒子から抽出するウイルスタンパク質のウェスタンブロット(抗HA)である。抗HA抗体を用いた免疫ブロット法のために、ゲル上にウェルあたり100ngのp24を充填した。抗p24抗体は、負荷対照として使用された。
CD11cが陽性である樹状細胞にゲートをかけ、y軸にDC−SIGNをとり、GFPが陽性である細胞のパーセンテージ(x軸;Vpxを含む、または含まないVSV−Gにより偽型化した組み込み不良なレンチウイルスによる感染の結果として)を評価することによって測定された形質導入事象の散布図である。
CD11cが陽性である樹状細胞にゲートをかけ、y軸にDC−SIGNをとり、GFPが陽性である細胞のパーセンテージ(x軸;Vpxを含む、または含まないVSV−Gにより偽型化した組み込み可能なレンチウイルスによる感染の結果として)を評価することによって測定された形質導入事象の散布図である。
Vpxを含む、または含まないSINvar1により偽型化した組み込み不良なレンチウイルスにより感染し、キフネンシンの不在の存在下で産生される樹状細胞にゲートをかけることによって測定された形質導入事象の散布図である。y軸はCD11cまたはDC−SIGNが陽性であった細胞を測定し、x軸はGFPが陽性であった細胞のパーセンテージを測定する。
未処理(レーン1〜3)、400μg/mlのDMNJ(レーン4〜6)、または1μg/mlのキフネンシン(レーン7〜9)を用いて、実施例1に従って調製されたシンドビスウイルス糖タンパク質のウェスタンブロットである。粒子は、エンドグリコシダーゼにより処理されなかったか(レーン1、4、7)、EndoHで1時間インキュベートされたか(レーン2、5、8)、またはPNGaseFで1時間インキュベートされた(レーン3、6、9)。次いで、試料は、ゲルシフトアッセイ、およびシンドビスウイルスエンベロープに対する抗体を用いた免疫ブロット法を使用して分析された。
(マンノシダーゼ阻害剤なし)レーン1〜3からのそれぞれの帯およびレーン上の位置の強度プロファイルである。
(DMNJで処理された)レーン4〜6からのそれぞれの帯およびレーン上の位置の強度プロファイルである。
(キフネンシンで処理された)レーン7〜9からのそれぞれの帯およびレーン上の位置の強度プロファイルである。
293T huDC−SIGN細胞を、野生型(WT)または欠損インテグラーゼ(D64V)でパッケージ化されたベクターと、延長された3’PPT(703)または3’PPT欠失(704)を含むベクターゲノムとで形質導入した。48時間の形質導入後、形質導入細胞から抽出されたゲノムDNAにおいて、ネスト化したAlu−PCR分析が行われた。エラーバーは、三連で行われた形質導入からの平均の標準誤差を示す。図10Bおよび10Cは、2つの独立した方法を使用して、GFP−T2A−NeoRをコードするWT/703およびD64V/704ベクターの組み込み率を示す。
示されたベクターを段階希釈して、HT1080 huDC−SIGN細胞を形質導入した。G418選択下で、形質導入した細胞を成長させ、個々の組み込み事象を表すネオマイシン耐性コロニーを計数した。実施例10に記載されるように、組み込み事象を計算した。
HT1080 huDC−SIGN細胞を、示されたベクターで形質導入した。フローサイトメトリーを形質導入後の複数の時点で行って、GFPを発現する細胞のパーセンテージを決定した。エラーバーは、三連で行われたフローサイトメトリーの平均の標準誤差を示す。
ヒトPBMCを、GM−CSFおよびIL−4で3日間処理し、次いで、20ngのp24のGFPをコードするID−VP02でインキュベートした。ベクター添加時に、培養は、主として、DC、B細胞、およびT細胞から成った。形質導入から3日後、表面マーカーについて、細胞が分析され、DC(CD11c)6%、B細胞(CD11c、CD19)10%、またはT細胞(CD11c、CD3ε)80%のいずれかとして分類された。形質導入事象は、それぞれの細胞集団内でGFP陽性である細胞のパーセントを評価することによって測定された。プロット中の数字は、GFPゲート内の細胞のパーセンテージである。
ベクターゲノム部分(上)は、それぞれの端で長い末端反復(LTR)を含むことが表される。スプライスドナー(SD)およびスプライス受容体(SA)部位は、プシーパッケージングシグナル(Ψ)、部分gag配列、およびRev応答要素(RRE)の側面に位置する。抗原プロモーター(プロモーター)と3’LTRとの間の要素は、強調表示されず、そのため、フォワードスラッシュマーク(//)が使用される。WT gag/pol部分(中央)は、gag(黒色ボックス)およびpol(灰色ボックス)遺伝子、それに続いて、RREを示すことが表される。WT gag/polとベクターゲノム(RREおよびgagの初めの354bp)との間で相同である2つの要素が、括弧で表される(尺度は表示せず)。ベクターゲノムとWT gag/polとの間の組み換えの仮説領域が接続線で示される。RI gag/pol部分(下)は、コドンに最適化されたgagおよびpol遺伝子(野生型と区別するための白いボックス)を示すことが表される。gagおよびpol遺伝子との間のコドンに最適化されないフレームシフトは、その天然コドン配列(黒色および灰色ボックスを重複する)で表される。プシーgag組み換えアッセイに使用されるプライマーは、構築物上の適切な位置で示される。第一ラウンドのPCRプライマーは、閉じた矢印で表し、(プシーgagの組み換えを検出するための)対709および710または(組み込まれたベクターゲノムを検出するための)709および378である。プライマー対709および378を用いて組み込まれたベクターに対して予測された増幅は、1697bpである。ネスト化したPCRプライマーは、開いた矢印で表され、(WT gag/polによるプシーgag組み換えを検出するための)対863および835または(RI gag/polによるプシーgag組み換えを検出するための)863および864である。プシーgag組み換えプライマー対のいずれかによる予測された増幅は、937bpである。
293T細胞は、Revプラスミド(+)または空の骨格プラスミド(−)のいずれかの存在下で、WT gag/polまたはRI gag/polプラスミドのいずれかでトランスフェクトした。24時間後、細胞を溶解し、抗p24抗体を使用して、Gagタンパク質の発現について分析した。未処理のGagタンパク質(p55)およびp24を、矢印で示す。非形質転換細胞からの溶解物を、対照として含んだ。ウェルの同等負荷は、抗アクチン抗体を用いて確認した。
GFPをコードするベクターは、WT gag/polまたはRI gag/polのいずれかの2つのプラスミド量(6μgまたは3μg)で産生された。ベクター上清中の得られたp24レベルを表に示す。 293T細胞を、14A中で産生された2倍希釈のベクターで形質導入し、2日後のGFPの発現について分析した。GFU/mLを計算し、y軸上にプロットした。ベクターを作製するために使用されたgag/polプラスミドのμg量(6μgまたは3μg)を、x軸上にプロットする。WT gag/polおよびRI gag/polをそれぞれ、黒色または白色カラムで示す。
C57BL/6マウスは、完全長OVAまたはHBSSビヒクルのみをコードするLVの指示された用量(2×10、1×10、または5×10TU)で免疫化された。示されるように、LVは、組み込み可能な(INT+)または組み込み不能(INT−)のいずれかであり、WT またはRI gag/polのいずれかで生成された。免疫化から12日後、OVA257特異的膵臓CD8 T細胞の割合を、エクスビボでのペプチド再刺激後、IFN−γに対するICSによって測定した。
C57BL/6マウス(群あたり5匹)に、H−2に制限されたOVA257 CD8 T細胞エピトープを含有するポリエピトープ抗原(LV1b)をコードするWT またはRI gag/polのいずれかで生成された5×10 TUの組み込み不能(INT−)LVで免疫化し、1×10 TCID50野生型WR株ワクチンウイルス(VV−WT)、WR株組み換えOVAワクチンウイルス(rVV−OVA)で免疫化後28日目にチャレンジしたか、またはチャレンジしないままにした。33日目(チャレンジ後5日目)に、それぞれの動物の卵巣のウイルス負荷を、TCID50アッセイによって測定した。
293T細胞を、WT gag/polまたはRI gag/polベクターのいずれかで形質導入した。2日後、ゲノムDNAを単離し、図12中に図式化されるような、ベクターゲノム内で結合するプライマー対709および378を使用して、PCRによって、組み込みプロウイルスDNAについて分析した。PCR産物を、1% アガロースゲル上に視覚化した。ベクターゲノムの単位複製配列サイズを、矢印で示す。テンプレート対照は、PCRおよびゲルに含まれなかった。
図17AからのゲノムDNAを、第一ラウンドのPCR、それに続いて、ネスト化したPCRでプロウイルスプシーgag組み換えについて分析した。第一ラウンドのPCRは、それぞれ、gag/pol内でベクターゲノムおよびフレームシフトに結合するプライマー対709および710を使用した。1μLの第一ラウンドのPCR産物を、ネスト化したPCRにおいて、未希釈(1:1)、または1:100、または1:1000の希釈のいずれかの鋳型として使用した。ネスト化したPCRにおけるプライマー対は、863および835、または863および864のいずれかであった。前者の対(863、835)は、それぞれ、ベクターゲノムおよびWT gag/polに結合する。後者の対(863、864)は、ベクターゲノムおよびRI gag/polに結合する。すべてのプライマーおよびそれらの結合部位を、図12中に図式化される。鋳型のみの対照が含まれた。得られたネスト化したPCR産物を、1% アガロースゲル上に視覚化した。プシーgag組み換えの単位複製配列サイズを、矢印で示す。
WT gag/polのネスト化したPCRからの帯(1kb未満の鮮やかな帯)を、TOPO−TAベクターにクローン化し、配列決定した。WT gag/polプシーgag組み換え帯の配列を、ベクターゲノム、部分gag、またはWT gag/polを用いて配列するために印を付けた領域とともに示す。ダブルスラッシュ(//)および点は、簡潔さのために示されない配列を示す。配列上の数字は、単位複製配列上のヌクレオチド配列部位を示す。プシーgag組み換えの塩基対1−414は、ベクターゲノムを用いて配列するが、bp120−937は、WT gag/polを用いて配列する。参考までに、部分gag配列は、組み換えのbp76−439である。
RIgag/polのネスト化したPCRからの帯(1kb〜3kbの弱い帯)を、TOPO−TAベクターにクローン化し、配列決定した。RI gag/pol組み換えバンドの配列を、ベクターゲノムまたはRIgag/polを用いて配列するために印を付けた領域とともに示す。点は、簡潔さのために示されない配列を示す。配列上の数字は、単位複製配列上のヌクレオチド配列部位を示す。RI組み換えの塩基対1−1253は、ベクターゲノムを用いて配列するが、bp1254−1329は、RIgag/polを用いて配列する。参考までに、部分gag配列は、組み換えのbp76−439である。完全配列およびアラインメントを、(補足図S1B)に示す。
(A)ヒトDC−SIGN(HT1080 huDC−SIGN)、(B)マウスSIGNR1(HT1080 mSIGNR1)、(C)マウスSIGNR3(HT1080 mSIGNR3)、または(D)マウスSIGNR5(HT1080 mSIGNR5)を安定的に発現するHT1080細胞およびHT1080細胞を、キフネンシン(kifu)の不在または存在下のいずれかで産生された、濃縮した(1,000倍)GFPをコードする組み込み不能のVSV−Gにより偽型化したベクター、またはGFPをコードするID−VP02により偽型化したベクターでインキュベートした。
(A)ヒトDC−SIGN(HT1080 huDC−SIGN)、(B)マウスSIGNR1(HT1080 mSIGNR1)、(C)マウスSIGNR3(HT1080 mSIGNR3)、または(D)マウスSIGNR5(HT1080 mSIGNR5)を安定的に発現するHT1080細胞およびHT1080細胞を、キフネンシン(kifu)の不在または存在下のいずれかで産生された、濃縮した(1,000倍)GFPをコードする組み込み不能のVSV−Gにより偽型化したベクター、またはGFPをコードするID−VP02により偽型化したベクターでインキュベートした。
膵臓およびリンパ細胞におけるSIGNR1およびSIGNR5の発現を、生存している単細胞事象において分析した。SIGNR1またはSIGNR5に特異的な抗体を欠いているパターンを染色する対照を示す。 膵臓およびリンパ節からの生存している単細胞事象を、B細胞(B220+TCRβ−、R4で表示)、T細胞(TCRβ、B220、R5で表示)、およびDC(B220 TCRβ MHC−II CD11chi、R7で表示)に細分類し、続いて、SIGNR5およびSIGNR1の発現について分析した。すべてのサブセットについては、SIGNR1およびSIGNR5に特異的な抗体を欠失している陰性対照株における陽性事象の頻度は、0.00以下であった。
GFPをコードするID−VP02を用いた皮下注射後の流入領域リンパ節におけるGFPを発現する細胞の表現型を、フローサイトメトリーによって測定した。雌BALB/cマウス(群あたり15匹)に、3×1010ゲノムのGFPをコードするID−VP02、非蛍光性タンパク質をコードする対照ID−VP02を足蹠に皮下注射したか、または処置しないままにした。4日後、膝窩および頸部リンパ節を、別々に、5匹のマウスからプール(処置群あたり3つのプール)し、GFPを発現する細胞の存在について分析した。(A)膝窩(流入領域)または頸部(非流入領域)リンパ節からの生存するシングレット事象を、GFPの発現について分析した。ナイーブまたは陰性対照ID−VP02からの膝窩リンパ節細胞は、陰性対照としての役割を果たした。(B)GFPをコードするID−VP02を注射されたマウスの膝窩リンパ節からのGFP事象におけるCD11cおよびMHC−IIの頻度を、対照として、灰色で示された全B220−TCRβ−事象上に重ね合わせて黒色点として示す。(C)GFP CD11c MHC−II事象におけるSIGNR1の発現は、SIGNR1に特異的な抗体を含む(左パネル)および含まない(右パネル)ことを示す。ゲート統計は、3つの生物学的複製の平均値である。パネル(A)の値は、1×10細胞あたり陽性事象の数である一方、すべての他のゲート値は、パーセンテージである。 GFPをコードするID−VP02を用いた皮下注射後の流入領域リンパ節におけるGFPを発現する細胞の表現型を、フローサイトメトリーによって測定した。雌BALB/cマウス(群あたり15匹)に、3×1010ゲノムのGFPをコードするID−VP02、非蛍光性タンパク質をコードする対照ID−VP02を足蹠に皮下注射したか、または処置しないままにした。4日後、膝窩および頸部リンパ節を、別々に、5匹のマウスからプール(処置群あたり3つのプール)し、GFPを発現する細胞の存在について分析した。(A)膝窩(流入領域)または頸部(非流入領域)リンパ節からの生存するシングレット事象を、GFPの発現について分析した。ナイーブまたは陰性対照ID−VP02からの膝窩リンパ節細胞は、陰性対照としての役割を果たした。(B)GFPをコードするID−VP02を注射されたマウスの膝窩リンパ節からのGFP事象におけるCD11cおよびMHC−IIの頻度を、対照として、灰色で示された全B220−TCRβ−事象上に重ね合わせて黒色点として示す。(C)GFP CD11c MHC−II事象におけるSIGNR1の発現は、SIGNR1に特異的な抗体を含む(左パネル)および含まない(右パネル)ことを示す。ゲート統計は、3つの生物学的複製の平均値である。パネル(A)の値は、1×10細胞あたり陽性事象の数である一方、すべての他のゲート値は、パーセンテージである。
C57BL/6マウス(群あたり3匹)は、尾基底部に、3×1010ゲノムのID−VP02の単回の皮下注射を受けた。逆転写ベクターDNAの存在によって判定されるように、示された組織中のID−VP02の生体内分布は、注射してから1、4、8、21、または42日後に、定量的PCRによって評価された。鼠径および頸部リンパ節は、それぞれ、流入領域および非流入領域として示される。入力DNAを、200ngに正規化した。反応あたり10コピーの定量下限(LOQ)は、標準曲線上の最も低いコピー数によって定義された。40qPCRサイクル内の増幅されなかった試料は、検出されず(ND)として表記された。
(A)C57BL/6マウスを、指示された用量(ベクターゲノム)の完全長OVAをコードするID−VP02またはHBSSビヒクルのみで免疫化した。免疫化から12日後、OVA257に特異的な膵臓CD8 T細胞のパーセンテージを、ICSによって測定した。(B)OVAをコードするID−VP02に対する一次および二次CD8 T細胞応答の動態が、プライム−ブーストレジメンにおいて、35日間隔で1×1010ゲノムのID−VP02を用いてマウス(群あたり5匹)を免疫化し、指示された時点で膵臓CD8 T細胞応答を分析することによって決定された。免疫化は、すべての群が同日にICSによって分析されるように調整された。(C)ペプチド再刺激後に生存能力のあるCD8 T細胞上の代表的な細胞内IFN−γ、TNF−α、およびIL−2、および表面CD107a染色。(D)一次および二次応答のほぼピークおよび構築後の、IFN−γ、TNF−α、IL−2、およびCD107aの組み合わせを発現するCD8 T細胞の頻度。IFN−γ陰性であった少数のCD8 T細胞が、任意の他のエフェクター分子を発現した。(E)CD44hi H−2K−OVA257五量体CD8 T細胞のエフェクター/メモリ表現型は、指示された時点でCD127およびKLRG1で染色することによって評価された。 (A)C57BL/6マウスを、指示された用量(ベクターゲノム)の完全長OVAをコードするID−VP02またはHBSSビヒクルのみで免疫化した。免疫化から12日後、OVA257に特異的な膵臓CD8 T細胞のパーセンテージを、ICSによって測定した。(B)OVAをコードするID−VP02に対する一次および二次CD8 T細胞応答の動態が、プライム−ブーストレジメンにおいて、35日間隔で1×1010ゲノムのID−VP02を用いてマウス(群あたり5匹)を免疫化し、指示された時点で膵臓CD8 T細胞応答を分析することによって決定された。免疫化は、すべての群が同日にICSによって分析されるように調整された。(C)ペプチド再刺激後に生存能力のあるCD8 T細胞上の代表的な細胞内IFN−γ、TNF−α、およびIL−2、および表面CD107a染色。(D)一次および二次応答のほぼピークおよび構築後の、IFN−γ、TNF−α、IL−2、およびCD107aの組み合わせを発現するCD8 T細胞の頻度。IFN−γ陰性であった少数のCD8 T細胞が、任意の他のエフェクター分子を発現した。(E)CD44hi H−2K−OVA257五量体CD8 T細胞のエフェクター/メモリ表現型は、指示された時点でCD127およびKLRG1で染色することによって評価された。 (A)C57BL/6マウスを、指示された用量(ベクターゲノム)の完全長OVAをコードするID−VP02またはHBSSビヒクルのみで免疫化した。免疫化から12日後、OVA257に特異的な膵臓CD8 T細胞のパーセンテージを、ICSによって測定した。(B)OVAをコードするID−VP02に対する一次および二次CD8 T細胞応答の動態が、プライム−ブーストレジメンにおいて、35日間隔で1×1010ゲノムのID−VP02を用いてマウス(群あたり5匹)を免疫化し、指示された時点で膵臓CD8 T細胞応答を分析することによって決定された。免疫化は、すべての群が同日にICSによって分析されるように調整された。(C)ペプチド再刺激後に生存能力のあるCD8 T細胞上の代表的な細胞内IFN−γ、TNF−α、およびIL−2、および表面CD107a染色。(D)一次および二次応答のほぼピークおよび構築後の、IFN−γ、TNF−α、IL−2、およびCD107aの組み合わせを発現するCD8 T細胞の頻度。IFN−γ陰性であった少数のCD8 T細胞が、任意の他のエフェクター分子を発現した。(E)CD44hi H−2K−OVA257五量体CD8 T細胞のエフェクター/メモリ表現型は、指示された時点でCD127およびKLRG1で染色することによって評価された。
(A)実験スケジュール:C57BL/6マウス(群あたり5匹)を、5×1010、1×1010、または2×10ベクターゲノムのH−2に制限されたOVA257およびLCMV GP33 CD8 T細胞エピトープを含有するポリエピトープ抗原をコードするID−VP02(LV1b)で免疫化し、1×10 TCID50 野生型WR株ワクチンウイルス(VV−WT)、WR株組み換えOVAワクチンウイルス(rVV−OVA)で免疫化してから35日目にチャレンジしたか、またはチャレンジしないままにした。40日目(チャレンジから5日後)に、膵臓CD8 T細胞応答および卵巣におけるウイルス負荷を測定した。(B)OVA257およびLCMV GP33に特異的なCD8 T細胞応答は、エクスビボでの再刺激後、細胞内IFN−γおよびTNF−αに対して染色することによって測定された。CD8 T細胞サイトカインプロファイルの代表的な点プロットを示す。(C)それぞれの動物に対するOVA257に特異的なIFN−γ+CD8 T細胞の頻度。(D)それぞれの動物の卵巣内の(TCID50アッセイによって測定された)ウイルス負荷。 (A)実験スケジュール:C57BL/6マウス(群あたり5匹)を、5×1010、1×1010、または2×10ベクターゲノムのH−2に制限されたOVA257およびLCMV GP33 CD8 T細胞エピトープを含有するポリエピトープ抗原をコードするID−VP02(LV1b)で免疫化し、1×10 TCID50 野生型WR株ワクチンウイルス(VV−WT)、WR株組み換えOVAワクチンウイルス(rVV−OVA)で免疫化してから35日目にチャレンジしたか、またはチャレンジしないままにした。40日目(チャレンジから5日後)に、膵臓CD8 T細胞応答および卵巣におけるウイルス負荷を測定した。(B)OVA257およびLCMV GP33に特異的なCD8 T細胞応答は、エクスビボでの再刺激後、細胞内IFN−γおよびTNF−αに対して染色することによって測定された。CD8 T細胞サイトカインプロファイルの代表的な点プロットを示す。(C)それぞれの動物に対するOVA257に特異的なIFN−γ+CD8 T細胞の頻度。(D)それぞれの動物の卵巣内の(TCID50アッセイによって測定された)ウイルス負荷。
(A)BALB/cマウス(群あたり5匹)を、AH1A5をコードするID−VP02、OVAに連結された内因性CT26腫瘍拒絶反応エピトープAH1のヘテロクリット性(heteroclitic)突然変異体(OVA−AH1A5)、またはHBSSビヒクルのみのベクターゲノムにおいて、指示された用量で免疫化した。免疫化から12日後、AH1A5またはAH1に特異的な膵臓CD8 T細胞のパーセンテージは、ICSによって測定された。(B)免疫化から12日後、1:1:1でAH1、AH1A5、または対照ペプチドによりそれぞれパルスした色素標識した標的細胞の混合物は、免疫化およびナイーブマウス(群あたり3匹)に静脈内移入した。翌日、膵臓を採取し、それぞれの集団の相対的回復を、ナイーブマウスと免疫化したマウスを比較して、特異的な致死を計算した。(C)BALB/cマウス(群あたり10匹)を、4×10ベクターゲノムのOVA−AH1A5をコードするID−VP02で免疫化した。4週間後、マウスに、右脇腹に8×10 CT26腫瘍細胞を皮下注射し、腫瘍が100mmを超えたときに、マウスを殺処分した。(D)治療的免疫化:BALB/cマウス(群あたり10匹)に、8×10 CT26腫瘍細胞を皮下注射した。4日後、マウスを、4×10ベクターゲノムのOVA−AH1A5をコードするID−VP02で免疫化するか、または処置しないままにし、腫瘍が100mmを超えたときに、マウスを殺処分した。
(A)BALB/cマウス(群あたり5匹)を、AH1A5をコードするID−VP02、OVAに連結された内因性CT26腫瘍拒絶反応エピトープAH1のヘテロクリット性(heteroclitic)突然変異体(OVA−AH1A5)、またはHBSSビヒクルのみのベクターゲノムにおいて、指示された用量で免疫化した。免疫化から12日後、AH1A5またはAH1に特異的な膵臓CD8 T細胞のパーセンテージは、ICSによって測定された。(B)免疫化から12日後、1:1:1でAH1、AH1A5、または対照ペプチドによりそれぞれパルスした色素標識した標的細胞の混合物は、免疫化およびナイーブマウス(群あたり3匹)に静脈内移入した。翌日、膵臓を採取し、それぞれの集団の相対的回復を、ナイーブマウスと免疫化したマウスを比較して、特異的な致死を計算した。(C)BALB/cマウス(群あたり10匹)を、4×10ベクターゲノムのOVA−AH1A5をコードするID−VP02で免疫化した。4週間後、マウスに、右脇腹に8×10 CT26腫瘍細胞を皮下注射し、腫瘍が100mmを超えたときに、マウスを殺処分した。(D)治療的免疫化:BALB/cマウス(群あたり10匹)に、8×10 CT26腫瘍細胞を皮下注射した。4日後、マウスを、4×10ベクターゲノムのOVA−AH1A5をコードするID−VP02で免疫化するか、または処置しないままにし、腫瘍が100mmを超えたときに、マウスを殺処分した。
本開示は、DC−SIGNを発現する細胞(例えば、樹状細胞)に効率的に結合し、生産的に感染させる偽型レンチウイルスベクター粒子を生成するために有用な方法および材料に関する。本開示における方法および材料は、レンチウイルスベクター粒子中のVpxタンパク質と、エンベロープ内において、高度にマンノシル化されている(例えば、キフレンシンの存在下で、ウイルスパッケージング細胞を培養することによって)アルファウイルス糖タンパク質(例えば、シンドビスウイルス糖タンパク質)との組み合わせが、エンベロープ内において、Vpxタンパク質または高マンノシル化糖タンパク質のいずれかを欠いているレンチウイルスベクター粒子よりもさらに効率的に、DC−SIGN(例えば、樹状細胞)を発現する非分裂細胞に感染させるレンチウイルスベクター粒子をもたらす予想外の発見に関する。本開示の1つの有利な態様は、シンドビスウイルスE2糖タンパク質により偽型化され、キフネンシンの存在下で産生されるレンチウイルスベクター粒子が、ビリオン中にVpxタンパク質を含む場合、さらにより効率的に、樹状細胞に感染し、そのため、樹状細胞への対象となる配列(例えば、抗原をコードするポリヌクレオチド)の送達および発現を可能にすることである。

定義
ポリペプチドに関連して使用される場合、「機能的断片」という用語は、切断されている、つまり、N末端またはC末端から1つ以上のアミノ酸を欠失している、そして、所望の活性を保持する、ポリペプチドを意味する。Vpxタンパク質に関連して使用される場合、「機能的断片」とは、SAMHD1の活性を阻害する能力を保持する断片を意味する。この用語は、切断されているポリヌクレオチドに同様に適用され得る。
ポリペプチドに関連して使用される場合、「変異体」という用語は、親ポリペプチドに対して1つ以上の置換、欠失、または挿入を有するポリペプチドを意味する。いくつかの文脈において、変異体は、所望の活性を保持するものである。Vpxタンパク質に関連して使用される場合、「機能的変異体」とは、SAMHD1の活性を阻害する能力を保持する変異体を意味する。この用語は、親ポリヌクレオチドに対して1つ以上の置換、欠失、または挿入を有するポリヌクレオチドに同様に適用され得る。
本明細書で使用される、「保存的アミノ酸置換」という用語は、同様の特性、例えば、大きさ、電荷、疎水性、親水性、および/または芳香性を有する別のアミノ酸とのあるアミノ酸の置換であり、以下に示されるような、交換が含まれる。
一般的な側鎖特性を共有するアミノ酸残基は、しばしば、以下の通りに分類される。
(1)疎水性:ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile、
(2)中性の親水性:cys、ser、thr、
(3)酸性:asp、glu、
(4)塩基性:asn、gln、his、lys、arg、
(5)鎖配向に影響する残基:gly、pro、および
(6)芳香性:trp、tyr、phe。
本明細書で使用される、「組み込み不能」および「組み込み不良」という用語は、互換的に使用される。組み込み不能ウイルスベクターは、組み込むときに、組み込み可能ウイルスベクターよりも効率が少なくとも10倍(好ましくは、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、少なくとも90倍、少なくとも100倍、少なくとも150倍、少なくとも200倍、少なくとも250倍、少なくとも300倍、少なくとも350倍、少なくとも400倍、少なくとも450倍、少なくとも500倍、少なくとも550倍、少なくとも600倍、少なくとも650倍、少なくとも700倍、少なくとも750倍、少なくとも800倍、少なくとも850倍、少なくとも900倍、少なくとも950倍、または少なくとも1000倍)少ないベクターである。例えば、組み込み不能とは、組み込むときに、組み込み不良であるように修飾されていないウイルスベクターよりも効率が少なくとも約20倍〜約100倍少ないことを意味し得る。組み込みは、当該技術分野で知られているあらゆる方法、例えば、Alu要素に近い組み込み事象のPCR検出によって測定することができる。
「偽型」レンチウイルスは、レンチウイルスゲノムとは異なるウイルスによってコードされる1つ以上のエンベロープ糖タンパク質を有するレンチウイルス粒子である。エンベロープ糖タンパク質は、本明細書に記載されるように、修飾、突然変異、または操作され得る。
本明細書で使用される、「外因性抗原」という用語は、本明細書に開示されるレンチウイルスベクターに発現されるように遺伝子を操作する抗原を指す。したがって、用語は、本明細書に開示されるレンチウイルスベクターに発現されるように遺伝子を操作するHIV由来の抗原を明確に含む。
本明細書で使用される、「DC−SIGNを発現する樹状細胞に優先的に結合する」シンドビスE2糖タンパク質は、DC−SIGNを発現しない細胞よりも効率的にDC−SIGNを発現する樹状細胞に結合する糖タンパク質である。
シンドビスウイルスエンベロープタンパク質は、4つのN連結グルカン(E2タンパク質に2つ、そして、E1タンパク質に2つ)を含む。哺乳動物細胞において、マンノシダーゼI阻害剤の不在下で産生されるウイルスの2つのN−グルカンは、高マンノース構造を有し(1つは、E2 N連結グルカンであり、1つは、E1 N連結グルカン)、一方、残りの2つは、複合体構造を有する。2つの複合体構造のN−グルカンは、エンベロープタンパク質の表面上に露出しており、一方、2つの高マンノース構造のN−グルカンは、エンベロープタンパク質の三量体の中心に埋没している。参照により組み込まれる、Morizono et al.,J Virol,84:14,6923−34(2010)を参照されたい。したがって、通常、哺乳動物細胞内に産生されるシンドビスウイルス糖タンパク質を有するウイルス粒子におけるN連結グルカンの50%は、高マンノース構造を有する。「高度にマンノシル化されている」ウイルス粒子は、例えば、質量分析法(Crispin et al.,JBC 2009を参照されたい)によって測定される、ウイルスエンベロープ糖タンパク質においてN連結グルカンの少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%が、少なくともMan構造、好ましくはManを含む、粒子である。
SAMHD1阻害剤
VpxおよびVpr
いくつかのまたは任意の実施形態において、SAMHD1阻害剤は、Vpxタンパク質またはVprタンパク質である。Vpxは、とりわけ、HIV−2、SIVスーティマンガベイ(SIVsm)、SIVシロエリマンガベイ(SIVrcm)、およびSIVマカク(SIVmac)のウイルスによってコードされる。HIV−2およびSIVのVpxは、112−アミノ酸(aa)、18kDaタンパク質であり、p55gag前駆体のp6領域との相互作用を通してかなりの量のビリオン中にパッケージ化されている。Vpxは、最近、ヒト樹状および骨髄細胞に発現される制限因子、SAMHD1の活性を阻害することが示された。Laguette et al.,Nature,474,654−657(2011)。SAMHD1は、概して、HIV−1感染に効果がないヒト樹状および骨髄細胞を示す制限因子として特定された。
SIVおよびHIV−2からのVpxは、アミノ酸レベルで83%同一である。Goujon et al.,J Virol,82:24,12335−12345(2008)を参照されたい。したがって、SIVとHIV−2で異なる残基は、Vpx機能には、重要でないと仮定され得る。さらに、SIVおよびHIV−2からのVpxの突然変異分析は、その他によって行われ、本開示の材料および方法で使用するVpx変異体を生成する際に指針として使用され得る。Goujonらを参照されたい。Asn26Ala、Ser52Ala、およびSer63Ala/Ser65Ala突然変異体は、Vpx機能に影響を及ぼさない。プロリンに富むC末端11残基、Ser13Ala、Lys84Ala/Lys85Ala、Thr17Ala、Thr28Ala、Gly86Ala/Cys87Ala、Ser13Ala/Thr17Ala/Thr28Ala、His39Ala、およびTyr66Ala/Tyr68Ala/Tyr71Ala、Trp49Ala/Trp53Ala/Trp56Ala、およびLys68Ala/Lys77Ala突然変異体の欠失は、Vpx活性を抑止する。
いくつかのまたは任意の実施形態において、本明細書に記載されるレンチウイルスベクター粒子は、Vpxタンパク質またはその変異体を含む。いくつかのまたは任意の実施形態において、変異体は、SAMHD1を阻害する能力を保持する。いくつかのまたは任意の実施形態において、変異体は、配列番号45(SIVsm Vpx)と少なくとも75%、80%、85%、90%、または95%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかのまたは任意の実施形態において、変異体は、配列番号46(SIVrcm Vpx)と少なくとも75%、80%、85%、90%、または95%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかのまたは任意の実施形態において、変異体は、配列番号44(SIVmac Vpx)と少なくとも75%、80%、85%、90%、または95%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかのまたは任意の実施形態において、変異体は、配列番号47(HIV−2)と少なくとも75%、80%、85%、90%、または95%同一であるアミノ酸配列を含む。
Vpxの抗SAMHD1活性は、VpxのN末端の86残基に局在化されている。Gramberg et al.,J Virol,84:3,1387−1396。したがって、いくつかのまたは任意の実施形態において、機能的断片は、VpxのSAMHD1阻害領域、すなわち、配列番号44のアミノ酸残基1〜86を含む。
Vpxは、いくつかのレンチウイルスのみに存在するが、すべての霊長類のレンチウイルスは、Vprと称されるVpxに密接に関係する遺伝子をコードする。Vprは、細胞周期停止させることで知られている。しかしながら、最近、SIVdebおよびSIVmusから単離されたVprタンパク質は、ヒトSAMHD1を阻害することが示された。Lim et al.,Cell Host & Microbe,11,194−204(2012)。したがって、いくつかのまたは任意の実施形態において、本明細書に記載されるレンチウイルスベクター粒子は、SAMHD1を阻害するVprタンパク質、またはSAMHD1を阻害する能力を保持するその変異体を含む。いくつかのまたは任意の実施形態において、変異体は、配列番号48(SIVdeb Vpr)と少なくとも75%、80%、85%、90%、または95%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかのまたは任意の実施形態において、変異体は、配列番号49(SIVmus Vpr)と少なくとも75%、80%、85%、90%、または95%同一であるアミノ酸配列を含む。
タンパク質の配列アラインメントからの情報を使用して、上で定義されるような、機能的変異体およびVpxの機能的断片変異体を生成することができる。アミノ酸を欠失するおよび突然変異するための手技は、当該技術分野でよく知られている。Ausubel,
F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, (1998)(2011年までのすべての付録を含む)を参照されたい。概して、機能的変異体を構築するために、非保存的または保存的置換または欠失は、これらの位置が、機能を保持しながら、非保存的置換を可能にする傾向があるため、Vpxタンパク質をコードするウイルスとは異なる位置で導入することができる。ウイルスにわたって保存されたアミノ酸残基を有する位置に関しては、残基が保持されるか、または保存的置換が導入される。Vpx、Vpr、およびその変異体は、本明細書に開示されるまたは当該技術分野で知られている方法に従って、SAMHD1の活性を阻害する能力について試験される。参照によりそれらの全体が組み込まれる、Lim et al.,Cell Host & Microbe,11,194−204(2012)およびLahouassa et al.,Nature Immunol,13:3,223−229(2012)を参照されたい。
SIVmac VpxのHIV−1ビリオンへのパッケージ化が、SIVmac p6に類似しているGagタンパク質のp6領域の修飾を必要とすることを示す前の報告にもかかわらず(Sunseri et al.,J Virol,86:6(2012))、本発明者は、p6を修飾する、またはVpxをHIV−1 Vprに融合させる必要なく、本明細書に開示されるHIV−1系偽型レンチウイルスベクターに効率的にパッケージ化されることを予想外に発見している。したがって、いくつかのまたは任意の実施形態において、Vpxタンパク質は、Vprタンパク質に融合されない。同様に、いくつかのまたは任意の実施形態において、パッケージング細胞内のgagタンパク質は、その天然配列からは修飾されない。
いくつかのまたは任意の実施形態において、Vpxタンパク質は、HIV−1 Vprタンパク質に融合されない。
通常、Vpxタンパク質は、ウイルス粒子内にパッケージ化される。しかしながら、いくつかのまたは任意の実施形態において、Vpxタンパク質をコードする遺伝子は、レンチウイルスゲノム内に含まれ、ウイルス粒子を標的細胞に感染する場合に、発現される。ウイルスベクターエンベロープ
節足動物媒介性ウイルス(アルボウイルス)は、蚊等の感染した節足動物ベクターによって、ヒト、ウマ、またはトリ等の宿主に伝播するウイルスである。アルボウイルスは、正極性の一本鎖RNAゲノムと、糖タンパク質含有エンベロープとを有する、アルファウイルスおよびフラビウイルスを含む、ウイルスの亜科にさらに分割される。例えば、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、およびウエストナイルウイルスは、フラビウイルス科に属し、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルスは、アルファウイルス科の成員である(Wang et al.J.Virol.66,4992(1992))。シンドビスウイルスのエンベロープは、2つの膜貫通糖タンパク質を含み(Mukhopadhyay et al.Nature Rev.Microbio.3,13(2005))、E1は、融合に関与すると考えられ、E2は、細胞結合に関与すると考えられる。シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質は、オンコレトロウイルスおよびレンチウイルスを含む、他のレトロウイルスを偽型化することが知られている。
シンドビスウイルスおよび他のアルファウイルスのエンベロープは、ウイルス粒子膜の脂質二重層に組み込み、通常、2つの糖タンパク質、E1およびE2の複数の複製を含む。それぞれの糖タンパク質は、膜貫通領域を有し、E2は、約33残基細胞質ドメインを有するが、E1の細胞質尾部は、非常に短い(約2残基)。E1およびE2はいずれも、膜貫通領域内または付近に付着したパルミチン酸を有する。E2は、最初に、フリンまたは他のCa2+依存セリンプロテイナーゼによって、E2および小糖タンパク質であるE3に切断される、前駆体タンパク質として合成される。E2およびE1をコードする配列の間に、タンパク質をコードする配列である6Kが位置する。E3および6Kは、E2およびE1糖タンパク質をそれぞれ膜に移行させる働きをする、シグナル配列である。シンドビスウイルスゲノムにおいて、シンドビスエンベロープタンパク質のコード領域は、E3、E2、6K、およびE1をコードする配列を含む。本明細書で使用される、アルボウイルスの「エンベロープ」は、少なくともE2を含み、またE1、6K、およびE3を含んでもよい。シンドビスウイルス、HR株のエンベロープ糖タンパク質の例示的な配列は、配列番号17(E3、E2、6K、およびE1ポリタンパク質)として示される。他のアルボウイルスのエンベロープ糖タンパク質の配列は、例えば、GenBankにおいて認めることができる。例えば、デングウイルス糖タンパク質をコードする配列は、受託番号GQ252677(特にGenBankにおいて)およびNCBIにおけるウイルス変異データベース(GenBank受託番号およびウイルス変異データベースは、エンベロープ糖タンパク質配列を参照することにより組み込まれる)において認めることができ、ベネズエラウマ脳炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする配列は、受託番号NP040824(エンベロープ糖タンパク質の配列を参照することによって組み込まれる)において認めることができる。
「E2糖タンパク質の残基番号」への参照(残基160、70、76、または159等)は、シンドビス株HRのE2糖タンパク質(すなわち、「シンドビスHR参照株」)である、配列番号18のタンパク質のアミノ酸配列を参照することにより定義される。例えば、残基70が配列番号18から欠失しているシンドビスE2糖タンパク質の変異体が産生される場合、「残基160」は、そのような変異体の実際の残基159を指す。他のアルファウイルスにおいて類似した位置は、相同性を最大にするアラインメントを通して決定され得る。
「付着」、「結合」、「標的」等の用語の使用は、同義的に用いられ、シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質と細胞成分との間の相互作用の機構を示すことを意味しない。DC−SIGN(樹状細胞特異的なICAM−3(Intracellular Adhesion Molecules 3)−Grabbing Nonintegrin、CD209としても知られる)は、物質の急速結合およびエンドサイトーシスが可能なC型レクチン様受容体である(Geijtenbeek,T.B.,et al.Annu.Rev.Immunol.22:33−54,2004)。E2は、DC−SIGNを通して樹状細胞に対してウイルスを標的とすると考えられる。本明細書に示されるように、DC−SIGNを発現する細胞は、DC−SIGNを発現しない同質遺伝子細胞よりも優れた(少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、または少なくとも10倍優れた)シンドビスウイルスE2により偽型化したウイルスベクター粒子によって形質導入される。E2糖タンパク質がウイルス感染を促進する機構は、場合によって、DC−SIGNに直接結合するか、または構造もしくは一部の他の機構を変更することによって、DC−SIGNに関与すると考えられる。実際の機構に関わらず、E2による標的化は、DC−SIGNを発現する細胞、つまり樹状細胞に優先的である。
シンドビスウイルスはまた、ヘパラン硫酸を介して細胞に結合する(Klimstra
et al.,J Virol 72:7357,1998、Burmes and Griffin,J Virol 72:7349,1998)。ヘパラン硫酸および他の細胞表面グリコサミノグリカンは、大部分の細胞型の表面に見られるため、ヘパラン硫酸とシンドビスエンベロープ糖タンパク質との間の相互作用を減少させることが望ましい。これは、シンドビスウイルスエンベロープのヘパラン硫酸への結合を減少させるか、またはシンドビスウイルスエンベロープの樹状細胞への結合を増加させる、例えば、親和性を増加させるか、またはそれら両方によって達成することができる。結果として、他の細胞型によって発現され得、かつエンベロープがDC−SIGNに特異的である場合でさえも起こり得る、他の分子への非特異的結合が減少し、向上した特異性が、望ましくない副作用、例えば、望ましい免疫反応を低減し得る副作用または他の細胞型の的外れな形質導入と関連付けられる副作用を回避する役割を果たし得る。DC−SIGNを発現する細胞の比較的特異的な形質導入の利点の代替として、またはそれらに加えて、シンドビスウイルスエンベロープE2糖タンパク質により偽型化したウイルス粒子は、VSVG等の糖タンパク質により偽型化したウイルス粒子を超える他の利点を提供し得る。そのような利点の例には、補体媒介性溶解の減少および/または神経細胞標的の減少が挙げられ、これらのいずれもVSV−Gにより偽型化したウイルス粒子の投与と関連すると考えられる。
様々な実施形態において、本明細書に開示されるレンチウイルスベクター粒子は、DC−SIGNを発現する細胞に特異的に結合し、ヘパラン硫酸への結合を減少または抑止した。つまり、シンドビスウイルスエンベロープE2糖タンパク質は、他の細胞型に対してDC−SIGNを発現する樹状細胞にウイルスを優先的に配向するように修飾されてもよい。他の研究中の構造研究および分子モデリングから得られる情報に基づいて、エンベロープタンパク質の変異体配列、特にE2およびE1糖タンパク質は、糖タンパク質がエンベロープタンパク質としてのそれらの機能を維持するが、望ましい結合特異性、親和性、または結合レベルを有するように設計および生成される。それぞれの糖タンパク質に対する変異体配列の候補を作製し、下記の方法または当該技術分野で知られている他の方法を使用して分析して、最も望ましい特性を有するエンベロープ糖タンパク質を特定してもよい。
シンドビスE2のある変異体配列は、配列番号1または配列番号18(E2シンドビスHR参照配列)と比較して、残基160において少なくとも1つのアミノ酸の変更を有する。残基160は、欠失しているか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸に変更する。変更は、最も一般的に、少なくとも1つのアミノ酸の置換であるが、代替的に、変更は、1つ以上のアミノ酸の付加または欠失であり得る。好ましくは、あらゆる追加アミノ酸は、少数であり、安全性を損なう恐れがある抗原エピトープ(例えば、血球凝集素タグ配列)を含まない。2つ以上の変更がある場合、それらはいずれも同一型(例えば、置換)または異なる型(例えば、置換および欠失)であり得る。複数の変更は、タンパク質配列において分散するか、または隣接して位置付けることができる。
いくつかの実施形態において、変異体配列は、シンドビスウイルスE2(配列番号18)の約残基50〜約残基180の領域に少なくとも1つのアミノ酸変更を含む。この領域内に、ヘパラン硫酸への結合に関与するアミノ酸が存在する。E2の正味正電荷を減少させることによって、ヘパラン硫酸との静電相互作用を減少させることができ、ヘパラン硫酸への結合を減少させる。この領域内の正電荷アミノ酸の候補には、配列番号18の残基63、70、76、84、97、104、129、131、133、139、148、149、159におけるリシン、および残基65、92、128、137、157、170、172におけるアルギニンが挙げられる(Bear et al.,Virology
347:183−190,2006)。これらのアミノ酸の少なくともいくつかは、ヘパラン硫酸へのE2結合において直接関与する。正味正電荷は、リシンもしくはアルギニンの欠失、またはリシンもしくはアルギニンの中性もしくは負電荷アミノ酸による置換によって減少させることができる。例えば、これらのリシンおよびアルギニンの1つ以上は、グルタミン酸またはアスパラギン酸と置換されてもよい。ある実施形態は、リシン70、76、または159の少なくとも1つの置換を有する。E2が、E3を有するポリタンパク質として発現される場合、天然E3/E2切断部位に隣接して位置するリシンが維持される。つまり、認識配列および切断部位は未変更である。あるいは、天然エンドペプチダーゼ切断部位配列は、異なるエンドペプチダーゼの認識配列と置換される。
シンドビスウイルスE2のある変異体はまた、樹状細胞への結合に良い影響を与える方法で修飾される。参照HR配列(配列番号18)の残基160において認められるグルタミン酸の変更は、樹状細胞への結合を向上させることができる(Gardner et al.,J Virol 74,11849,2000を参照されたく、その全体が組み込まれる)。残基160の欠失または残基160の置換等の変更は、ある変異体において認められる。特定の変異体において、非電荷アミノ酸は、Gluに置換され、他の変異体において、非酸性アミノ酸は、Gluに置換される。通常、Glu160は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンを含む、小アミノ酸または脂肪族アミノ酸の1つと置換される。
他の変異体は、2つ以上(例えば、3、4、または5つ)のアミノ酸変更を含む。通常、これらの変異体において、変更の1つはGlu160であり、残りの変更(複数を含む)は、残基約50〜約180にわたる領域内のリシンおよびアルギニンの1つ以上の変更である。ある変異体は、非酸性残基へのGlu160の変更または欠失、および非塩基性アミノ酸へのリシン70、リシン76、またはリシン159の1つ以上の変更を含む。いくつかの特定の変異体は、Glyに対してGlu160、Gluに対してLys70、およびGluに対してLys159;Glyに対してGlu160、Gluに対してLys70、76、および159;Gluに対してGlu160およびLys70および159の欠失;ならびにGlu160およびGluに対してLys70、76、および159の欠失を含む。いくつかの実施形態において、E2変異体は、配列番号30〜43[SINvar1−14 E2]のいずれか1つと80〜100%(例えば、82%、85%、87%、90%、92%、95%、97%、または99%)同一である。
ある例において、E2タンパク質は、最初に、少なくともE3との融合またはリーダー配列との融合において、ポリタンパク質として発現される。リーダー配列がE3であるか、または別の配列であるかに関わらず、ウイルスエンベロープのE2は、E3または別のリーダー配列を含んではならない。言い換えれば、E2は、好ましくは、E3/E2融合タンパク質ではない。ある実施形態において、E2は、E3−E2−6K−E1ポリタンパク質の一部として発現される。これらの実施形態において、ポリタンパク質は、配列番号3〜16[SINvar1−14ポリタンパク質]のいずれか1つと80〜100%(例えば、82%、85%、87%、90%、92%、95%、97%、または99%)同一である。シンドビスウイルスは、ポリタンパク質の一部として、E2を自然に発現し、E3/E2、E2/6K、および6K/E1の接合領域は、エンドペプチダーゼによって認識および切断される配列を有する。通常、E3/E2接合は、残基65〜66の間でフリンまたはフリン様セリンエンドペプチダーゼによって切断される。フリンは、2つのアミノ酸によって分離される、対アルギニン残基に対して特異性を有する。フリンによるE3/E2切断を維持するために、残基62〜66(RSKRS、配列番号26)は、2つのアミノ酸分離を有する2つのアルギニン残基、およびセリン残基を維持しなければならない。あるいは、E3/E2フリン切断配列または他の切断配列のいずれかの代わりに、異なる切断配列を使用することができる。認識部位および切断部位は、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ(例えば、カテプシンD、キモシン、HIVプロテアーゼ)、システインエンドペプチダーゼ(ブロメライン、パパイン、カルパイン)、メタロエンドペプチダーゼ(例えば、コラーゲナーゼ、サーモリシン)、セリンエンドペプチダーゼ(例えば、キモトリプシン、IXa因子、X因子、トロンビン、トリプシン)、ストレプトキナーゼを含むが、これらに限定されない、エンドペプチダーゼのために組み込むことができる。これらの酵素の認識および切断部位は、よく知られている。
既述されるもの以外に、シンドビスウイルスE2内のアミノ酸が変更されてもよい。一般に、変異体E2配列は、参照E2配列に対して少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するか、または少なくとも82%、少なくとも85%、少なくとも87%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、または少なくとも98%の配列同一性を有してもよい。いくつかの実施形態において、変異体E2配列は、配列番号30[SINvar1]に対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するか、または少なくとも82%、少なくとも85%、少なくとも87%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、または少なくとも98%の配列同一性を有してもよい。いくつかの実施形態において、変異体E2配列は、配列番号31[SINvar2]に対して、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するか、または少なくとも82%、少なくとも85%、少なくとも87%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、または少なくとも98%の配列同一性を有してもよい。いくつかの実施形態において、変異体E2配列は、配列番号32[SINvar3]に対して、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するか、または少なくとも82%、少なくとも85%、少なくとも87%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、または少なくとも98%の配列同一性を有してもよい。
変異体糖タンパク質は、E2を含むエンベロープを有するウイルス粒子による樹状細胞の感染を促進する能力等の生物学的機能を呈しなければならない。実験は、ウイルス会合、細胞表面への付着、および感染の種々の態様において、重要な役割を有すると考えられる、エンベロープ糖タンパク質の領域が識別した。変異体を作製する場合、以下の情報をガイドラインとして使用することができる。E2の細胞質尾部−約残基408〜415は、ウイルス会合に重要である(West et al.J Virol 80:4458−4468,2006、その全体が組み込まれる)。他の領域は、二次構造の形成に関与し(約残基33〜53)、ならびに輸送およびタンパク質安定性に関与する(約残基86〜119)(Navaratmarajah et al.,J Virol 363:124−147,2007、その全体が組み込まれる)。変異体は、膜に広がる領域、約残基370〜380の疎水性を維持してもよい。変異体は、N連結した糖鎖付加部位残基NIT(残基196〜198)およびNFT(残基318〜320)の1つまたは両方を維持してもよく、パルミトイル化される部位の1つ以上を維持(C−396、C416、およびC417)(Strauss and Strauss Microbiol Rev 58,491−562,1994;pp.499−509が組み込まれる)。一方、E2の多くの領域は、有害な事象なしに変更されてもよい。例えば、E2の多くの異なる位置におけるトランスポゾンの挿入は、依然として生存ウイルスをもたらす(Navaratmarajah、同書)。
ある実施形態において、タグペプチドは、E3、6K、またはE1タンパク質に組み込まれてもよい。いくつかの目的で、タグは、E2に組み込まれてもよいが、タグは、ヒト患者に投与するための産物での使用には望ましくない。短配列である(例えば、5〜30アミノ酸)タグペプチドは、ウイルス粒子内のエンベロープ発現の欠失およびその存在の検出を促進するために使用することができる。検出目的のために、タグ配列は、通常、抗体または化学物質によって検出可能である。タグの別の用途は、ウイルス粒子の精製を促進することである。タグの結合パートナーを含有する基質は、ウイルスを吸収するために使用することができる。ウイルスの溶出は、結合パートナーからタグを移動させる部分による処理によって達成することができるか、またはタグ配列が切断可能な配列と結合している場合には適切なエンドペプチダーゼによる処理は、便宜的にウイルスの放出を可能にする。(例えば、Qiagen catalog,Factor Xa Protease Systemを参照されたい)。タグペプチドの除去は、一般に、動物被検体におけるウイルス粒子使用の安全目的で望ましい。タグが除去されない場合、タグに対する免疫反応が起こり得る。
適切なタグとしては、特に、これらの抗体が商業的に入手可能であるFLAG(DYKDDDDK)(配列番号28)(米国特許第4,703,004号、その全体が組み込まれる)、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ、ポリ(His)(米国特許第4,569,794号、その全体が組み込まれる)、チオレドキシン、HA(ヘマグルチニン)−タグが挙げられるが、これらに限定されない。ポリ(His)は、例えば、ニッケルまたはコバルト等の結合性金属イオンを含有する親和性媒体上に吸着し、低pH媒体で溶出することができる。
ウイルス粒子は、樹状細胞を標的とするウイルスに組み込まれるエンベロープ糖タンパク質の特異性を決定するように評価されてもよい。例えば、骨髄細胞の混合群を被検体から取得し、インビトロで培養することができる。あるいは、DC−SIGNを発現するか、または発現しない同質遺伝子細胞株を取得して使用することができる。組み換えウイルスを、骨髄細胞の混合群または同質遺伝子細胞株に投与することができ、ウイルスに組み込まれるレポーター遺伝子の発現は、培養細胞において分析することができる。ある実施形態は、限界希釈分析を用いてもよく、細胞の混合群は、別々の部分に分けられ、次に、漸減量のウイルス(例えば、それぞれの部分において、2倍、5倍、10倍少ないウイルス)で別々にインキュベートされる。いくつかの実施形態において、混合細胞群中の感染細胞の少なくとも約50%、より好ましくは、少なくとも約60%、70%、80%、または90%、さらにより好ましくは、少なくとも約95%が、DC−SIGNを発現する樹状細胞である。ある実施形態において、感染した樹状細胞対感染した非樹状細胞(または非DC−SIGN発現細胞)の比は、少なくとも約2:1、少なくとも約3:1、少なくとも約4:1、少なくとも約5:1、少なくとも約6:1、少なくとも約7:1、少なくとも約8:1、少なくとも約9:1、少なくとも約10:1、少なくとも約20:1、少なくとも約30:1、少なくとも約40:1、少なくとも約50:1、少なくとも約100:1、少なくとも約200:1、少なくとも約500:1、少なくとも約1000:1、少なくとも約5000:1、少なくとも約10,000:1、またはそれ以上である。限界希釈については、通常、より優れた選択性が、より高い希釈(すなわち、より低量)のウイルス投入で見られる。
偽型ウイルス粒子の活性は、多様な手技のいずれかによって決定することができる。例えば、感染効率(IU、感染単位)を測定するための好適な方法は、ウイルス粒子を細胞に投与し、ベクターゲノム内でコードされる産物の発現を測定することによるものである。分析することができるあらゆる産物を使用してもよい。便宜的な種類の産物の1つは、緑色蛍光タンパク質(GFP)等の蛍光タンパク質である。使用することができる他の産物には、細胞表面上で発現されるタンパク質(例えば、抗体結合による検出)、酵素等が含まれる。産物が抗原であり、細胞が樹状細胞である場合、感染性/活性は、免疫応答を決定することによって評価することができる。さらに、哺乳動物における副作用を確認することが可能である。樹状細胞を特異的に標的とする能力は、例えば、以下に記載されるような細胞培養において直接試験することもできる。
ウイルス粒子を調製して、それらの選択性および/または標的細胞膜の貫通を促進するそれらの能力に関して試験することもできる。未修飾糖タンパク質を有するエンベロープを有するウイルス粒子は、比較のための対照として使用することができる。つまり、エンベロープ糖タンパク質の受容体を発現する細胞を、標準感染分析を使用して、ウイルスに感染させる。規定の時間後、例えば、感染から48時間後に、細胞を採取することができ、例えば、フローサイトメトリーによって、ウイルスに感染した細胞の割合を決定することができる。選択性は、ウイルスに感染した細胞の割合を計算することによって、スコア化することができる。同様に、変異体エンベロープ糖タンパク質のウイルス力価への影響は、変異体エンベロープを含むウイルスに感染した細胞の割合を、対応する野生型(未修飾)エンベロープ糖タンパク質を含むウイルスに感染した細胞の割合で割ることによって定量化することができる。特に適切な変異体は、選択性と感染力価との最良の組み合わせを有する。変異体が選択されると、ウイルス濃度分析を行って、これらのウイルスが活性を低下させることなく濃縮され得ることを確認してもよい。ウイルスの上澄みを採取し、超遠心分離法によって濃縮する。ウイルスの力価は、ウイルス原液の限界希釈およびエンベロープ糖タンパク質の受容体を発現する細胞の感染によって決定することができ、上述されるように、ウイルスによって発現される産物の発現を測定する。
レンチウイルスベクター粒子の標的細胞への侵入は、別の種類の活性評価である。BlaM−Vpr(ベータラクタマーゼVpr)融合タンパク質を利用して、HIV−1ウイルスの貫通、BlaMおよびシンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質、例えば、E1の融合を評価するか、またはE2/E1融合タンパク質を使用して、標的細胞への融合および貫通を促進することにおける、エンベロープタンパク質の有効性を評価することができる。ウイルス粒子は、例えば、ウイルス要素BlaM−Vpr、および対象となる変異体エンベロープ(ならびに適切な場合、親和性分子)を含む1つ以上のベクターによる、パッケージング細胞の一時的トランスフェクションによって調製されてもよい。得られたウイルスを使用して、標的分子(または親和性分子)が、結合の遊離阻害剤(抗体等)の不在または存在下で、特異的に結合する、分子を発現する細胞に感染させることができる。次いで、細胞は、CO非依存性培地で洗浄し、CCF2染料(Aurora Bioscience)を充填することができる。室温でインキュベートして、切断反応を完了させた後、パラホルムアルデヒドによって細胞を固定し、フローサイトメトリーおよび顕微鏡で分析することができる。青色細胞の存在は、細胞質へのウイルスの貫通を示し、遮断抗体が添加される場合は、青色細胞が少なくなることが予想される(Cavrois
et al.Nat Biotechnol 20:1151−1154,2002;その全体が組み込まれる)。
貫通が低pHに依存するかどうかを調査し、所望のpH依存を有するエンベロープ糖タンパク質を識別するために、NHClまたはpHを変更する他の化合物を、感染ステップにおいて添加することができる(NHClは、エンドソームの酸性コンパートメントを中和する)。NHClの場合において、青色細胞の消失は、ウイルスの貫通が低pH依存であることを示す。さらに、活性がpH依存であることを確認するために、リソソーム作用剤、例えば、塩化アンモニウム、クロロキン、コンカナマイシン、バフィロマイシンAl、モネンシン、ニゲリシン等を、インキュベーション緩衝液に添加してもよい。これらの薬剤は、エンドソームコンパートメント内のpHを上昇させる(例えば、Drose and Altendorf,J.Exp.Biol.200,1−8,1997)。これらの薬剤の阻害作用は、ウイルス融合および侵入に対するpHの役割を明らかにする。異なる融合分子を示すウイルス間の異なる侵入動態を比較し、特定の適用に対して最も適切なものが選択されてもよい。
PCR系侵入分析を利用して、逆転写をモニタリングし、ウイルス侵入の動態を示すようなウイルスDNA合成の動態を測定することができる。例えば、特定のエンベロープタンパク質分子を含むウイルス粒子は、293T細胞等の標的細胞、DC、またはエンベロープタンパク質分子の適切な結合パートナー(受容体)を発現するように操作されたか、または自然に発現する、あらゆる他の細胞と共にインキュベートされる。即時または(感染を起こすための)時間増分後のいずれかで、未結合ウイルスを除去し、細胞のアリコートをウイルス核酸に関して分析する。これらのアリコートからDNAを抽出して、一般に、半定量分析において、LTR特異的プライマーでプライムする増幅分析にかける。LTR特異的DNA産物の出現は、ウイルス侵入の成功を示す。
レンチウイルスベクターゲノム
ウイルスベクター粒子は、対象となる少なくとも1つの配列(例えば、1、2、3、4、または5)を含むゲノムを含む。他の配列は、ゲノムがウイルス粒子にパッケージ化されるのを可能にする配列、および標的細胞の形質導入に続いて対象となる配列(複数を含む)の発現を促進する配列等を含んでもよい。ゲノムは、多量の適切な入手できるレンチウイルスゲノム系ベクターのいずれかに由来し得、ヒト遺伝子治療適用に対して識別されるもの、例えば、PfeiferおよびVermaによって説明されるものを含む(Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.2:177−211,2001;参照によってその全体が本明細書に組み込まれる)。簡潔さの目的で、ゲノムは、「ウイルスベクターゲノム」または「ベクターゲノム」とも称される。
骨格
適切なレンチウイルスベクターゲノムは、ヒト免疫不全ウイルス(HIV−1)、HIV−2、フェリン免疫不全ウイルス(FIV)、ウマ伝染性貧血ウイルス、サル免疫不全ウイルス(SIV)、およびマエディ/ビスナウイルスに基づくものを含む。レンチウイルスの望ましい特性は、それらが分裂および非分裂細胞の両方に感染することができることであり、標的細胞が分裂している(または標的細胞を刺激して分裂させる)必要はない。一般に、ゲノムおよびエンベロープ糖タンパク質は、得られたウイルスベクター粒子が偽型化されるように、異なるウイルスに基づく。望ましくは、ベクターゲノムの安全機能が組み込まれる。安全機能には、自己不活性化LTRおよび非組み込みゲノムが含まれる。
いくつかの例示的な実施形態において、ウイルスベクターゲノムは、レンチウイルスゲノム、例えば、HIV−1ゲノムまたはSIVゲノムからの配列を含む。ウイルスゲノム構成は、レンチウイウルスの5’および3’LTRからの配列を含み、特に、レンチウイルスの5’LTR、およびレンチウイウルスからの不活性化または自己不活性化3’LTRからのRおよびU5配列を含んでもよい。LTR配列は、あらゆる種からのあらゆるレンチウイルスからのLTR配列であってもよい。例えば、それらは、HIV、SIV、FIV、またはBIVからのLTR配列であってもよい。通常、LTR配列は、HIV LTR配列である。
ベクターゲノムは、不活性化または自己不活性化3’LTRを含んでもよい(Zufferey et al.J Virol 72:9873,1998、Miyoshi et al.,J Virol 72:8150,1998、米国公開第2010/0323403号、それらの全体がすべて組み込まれる)。自己不活性化ベクターは、一般に、3’側の長い末端反復(LTR)からのエンハンサーおよびプロモーター配列の欠失を有し、ベクター組み込み中に5’LTRに複製される。一例において、3’LTRのU3要素は、そのエンハンサー配列、ポリプリン区画(PPT)、TATAボックス、Sp1、およびNF−カッパB部位の欠失を含有する。自己不活性化3’LTRの結果として、侵入および逆転写に続いて生成されるプロウイルスは、不活性化5’LTRを含む。その論理的根拠は、ベクターゲノムの移動のリスク、およびLTRの付近の細胞プロモーターへの影響を減少させることによって、安全性を向上させることである。自己不活性化3’LTRは、当該技術分野で知られているあらゆる方法によって構成されてもよい。様々な実施形態において、偽型レンチウイルスベクターは、配列番号23の配列を含むレンチウイルスベクターゲノムを含む。このベクターは、3’PPTおよびTATAボックスの欠失を含む。したがって、ベクターは、(a)感染した標的細胞中で転写されたdsDNAベクターからの完全長ベクターゲノムの転写が防止される、(b)組み込み後の3’LTRが、プロモーターとして機能を果たし得る場合に生じ得る挿入による活性化のリスクを最小限に抑える、(c)延長したU3欠失がさらなる、重複する安全機構(例えば、インテグラーゼの突然変異)によって捕捉され得るように、自己不活性化される。
任意に、レンチウイルス5’LTRからのU3配列は、ウイルス構成のプロモーター配列、例えば、異種プロモーター配列と置換されてもよい。これは、パッケージング細胞株から回収されたウイルスの力価を増加させることができる。また、エンハンサー配列が含まれてもよい。パッケージング細胞株においてウイルスRNAゲノムの発現を増加させる、あらゆるエンハンサー/プロモーターの組み合わせが使用されてもよい。一実施例において、CMVエンハンサー/プロモーター配列が使用される(米国特許第5,385,839号および米国特許第5,168,062号、これらのそれぞれはその全体が組み込まれる)。
ある実施形態において、挿入突然変異のリスクは、レンチウイルスベクターゲノムを組み込み不良となるように構成することによって最小化される。多様なアプローチを遂行して、非組み込みベクターゲノムを産生することができる。これらのアプローチは、不活性インテグラーゼを有するタンパク質をコードするように、pol遺伝子のインテグラーゼ酵素成分への突然変異(複数を含む)を操作することを含む。ベクターゲノム自体を修飾して、例えば、付着部位の一方または両方を突然変異もしくは欠失すること、または欠失もしくは修飾を通して3’LTR−近位ポリプリン区画(PPT)を非機能的にすることによって、組み込みを回避することができる。さらに、非遺伝的アプローチが使用可能であり、これらは、インテグラーゼの1つ以上の機能を阻害する薬理作用のある薬物を含む。アプローチは、相互排他的ではなく、つまり、それらの1つより多くを一度に使用することができる。例えば、インテグラーゼおよび付着部位の両方が非機能的であり得るか、またはインテグラーゼおよびPPT部位が非機能的であり得るか、または付着部位およびPPT部位が非機能的であり得るか、またはそれらのすべてが非機能的であり得る。
上記のように、1つのアプローチは、非機能的インテグラーゼを作製および使用することである。インテグラーゼは、ウイルス二重鎖平滑末端DNAの切断と、染色体標的部位の2つの鎖において、末端を5’リン酸塩に結合することに関与する。インテグラーゼは、亜鉛結合モチーフ(HHCC)を含有するN末端ドメイン、触媒コアおよび保存DD35Eモチーフ(HIV−1におけるD64、D116、E152)を含有する中央ドメインコア、およびDNA結合特性を有するC末端ドメインの3つの機能ドメインを有する。インテグラーゼに導入される点突然変異は、正常機能を崩壊させるのに十分である。多くのインテグラーゼ突然変異が構成および特性化された(Philpott and Thrasher,Human Gene Therapy 18:483,2007、Apolonia,Thesis submitted to University College London,April 2009,pp,82−97、Engelman et al.J Virol 69:2729,1995、Nightingale
et al.Mol Therapy,13:1121,2006を参照されたく、これらのすべてはそれらの全体が組み込まれる)。インテグラーゼタンパク質をコードする配列を欠失または突然変異させて、好ましくは、逆転写酵素活性または核標的を著しく損なうことなく、タンパク質を不活性化することができ、それによって、プロウイルスの標的細胞ゲノムへの組み込みのみを回避する。許容される突然変異は、インテグラーゼ触媒、鎖移転、att部位への結合、宿主染色体DNAへの結合、および他の機能を低下させることができる。例えば、HIVまたはSIVインテグラーゼの残基35における、単一アスパラギン酸からアスパラギンへの置換は、ウイルスDNAの組み込みを完全に抑止する。インテグラーゼの欠失は、一般に、C末端ドメインに限定される。残基235〜288のコード配列の欠失は、有用な非機能的インテグラーゼをもたらす(Engelman
et al.J Virol 69:2729,1995)。さらなる実施例として、突然変異、例えば、Asp64(残基数は、HIV−1に対して指定され、他のレンチウイルスまたはレトロウイルスからのインテグラーゼの対応する残基数は、当業者によって容易に決定され得る)(例えば、D64E、D64V)、Asp116(例えば、D116N)、Asn120(例えば、N120K)、Glu152、Gln148(例えば、Q148A)、Lys156、Lys159、Trp235(例えばW235E)、Lys264(例えば、K264R)、Lys266(例えば、K266R)、Lys273(例えば、K273R)を生成することができる。他の突然変異を構成し、組み込み、導入遺伝子の発現、および任意の他の望ましいパラメーターに関して試験することができる。これらの機能に関する分析は、よく知られている。突然変異は、部位特異的突然変異誘発および核酸配列の化学合成を含む、多様な手技のいずれかによって生成することができる。1つの突然変異を作製してもよいか、または1つを超えるこれらの突然変異がインテグラーゼ内に存在することができる。例えば、インテグラーゼは、2つのアミノ酸、3つのアミノ酸、4つのアミノ酸等において、突然変異を有してもよい。
あるいは、またはインテグラーゼ変異体(複数を含む)の使用と組み合わせて、U3およびU5内の付着部位(att)を突然変異させることもできる。インテグラーゼは、これらの部位に結合し、3’末端ジヌクレオチドは、ベクターゲノムの両端で切断する。CAジヌクレオチドは、陥没した3’末端に位置付けられ、CAは、宿主染色体へのヌクレオチドブロック組み込みの突然変異を処理するために必要とされる。CAジヌクレオチドのAは、組み込みに最も重要なヌクレオチドであり、ゲノムの両端における突然変異は、最良の結果をもたらす(Brown et al J Virol 73:9011(1999)。一例示において、それぞれの末端のCAは、TGに変更される。他の例示において、それぞれの末端のCAは、一端においてTGに変更され、他端においてGTに変更される。他の例示において、それぞれの末端のCAは欠失し、他の例示において、CAのAはそれぞれの末端で欠失する。
組み込みは、ポリプリン区画(PPT)の突然変異または欠失によって阻害することもできる(国際公開第WO2009/076524号、その全体が組み込まれる)、3’LTR近位に位置付けられる。PPTは、プラス鎖DNA合成のプライマー結合部位として機能することができる、約15ヌクレオチドのポリプリン配列である。この例において、PPTの突然変異または欠失は、逆転写プロセスを標的とする。機構にとらわれることを望むものではないが、PPTを変異または欠失させることによって、線状DNAの産生は、根本的に減少し、本質的に1−LTR DNA環のみが産生される。組み込みは、線状二本鎖DNAベクターゲノムを必要とし、組み込みは、本質的にそれなしで排除される。上記のように、PPTは、変異または欠失によって非機能的にすることができる。通常、約15nt PPT全体が欠失されるが、一部の実施形態において、より短い14nt、13nt、12nt、11nt、10nt、9nt、8nt、7nt、6nt、5nt、4nt、3nt、および2ntの欠失が作製されてもよい。突然変異が作製される場合、通常、複数の突然変異が、特にPPTの5’半分で作製されるが(McWilliams
et al.,J Virol 77:11150,2003)、最初の4つの塩基における単一および二重突然変異は、依然として転写を減少させる。PPTの3’末端で作製される突然変異は、一般に、より劇的な効果を有する(Powell and Levin J Virol 70:5288,1996)。
ベクターゲノム非組み込みを作製するためのこれらの異なるアプローチは、個別または組み合わせて使用することができる。1つを超えるアプローチの使用は、重複機構によって二重安全ベクターを構築するために使用されてもよい。したがって、PPT突然変異または欠失は、att部位突然変異もしくは欠失、またはインテグラーゼ突然変異と組み合わせることができるか、またはPPT突然変異もしくは欠失は、att部位突然変異もしくは欠失およびインテグラーゼ突然変異の両方と組み合わせることができる。同様に、att部位突然変異または欠失およびインテグラーゼ突然変異は、相互に組み合わされるか、またはPPT突然変異もしくは欠失と組み合わされてもよい。
偽型レンチウイルス粒子の安全性を強化するためのさらなる手技は、gag/pol遺伝子を含むプラスミドを修飾して、レンチウイルスベクターとの潜在的な組み換え部位を排除することを含む。この手技は、単独で、または本明細書に記載される手技のいずれかと組み合わせて使用することができる。例えば、gagおよびpol遺伝子は、哺乳動物またはヒトの「コドンに最適化され」得る、すなわち、gagおよび/またはpol遺伝子の少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%のコドンが、同じアミノ酸をコードするが、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞には好まれる、コドンと置き換えられ、そのため、哺乳動物、例えば、ヒトの細胞中の発現を向上または最適化させる。gagおよびpol遺伝子のコドンに最適化するために、「野生型」コドンをヒトゲノムにおいてさらに頻繁に利用されるコドンに変更するポリヌクレオチドが、生成される。しかしながら、HIVでは、ある部分のゲノムは、そのmRNAの同じ開始コドンから出発するGagおよびPolを合成するために必要とされるフレームシフトを可能にするために、実質的には、元のコドン(例えば、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、または100%の元のコドン)を保持しなければならない。Gag−Polの翻訳は、mRNAのコドン432周辺のp7/p1接合部の5’方向(−1シフト)において、リーディングフレームのシフトを必要とする。次いで、Gag−Polの翻訳は、終止コドンが後で約3,000ヌクレオチドに達するまで、この新しいリーディングフレームで進める。リボソーム−1のフレームシフトは、特定の滑りやすいコンセンサス配列とリボソームに中断をもたらす下流の二次RNA構造の両方を必要とする非常に制御された事象である。したがって、本開示によれば、gagおよびpolをコードする核酸は、「最適化されないウインドウ」、つまり、配列番号54のほぼ1228位から開始する(またはほぼ1218〜1298、もしくは1218〜1238、もしくは1228〜1238、もしくは1218〜1228、もしくは1228〜1298、もしくは1238〜1248、もしくは1248〜1258、もしくは1258〜1268、もしくは1268〜1278、もしくは1278〜1288、もしくは1288〜1298位で開始する)(gag−polオープンリーディングフレーム)、実質的には、野生型gag−pol配列から変化しない配列番号54の1509位で終止する(または1373〜1558、もしくは1373〜1509、もしくは1373〜1500、もしくは1373〜1470、もしくは1373〜1440、もしくは1373〜1410、もしくは1373〜1401、もしくは1373〜1392、もしくは1373〜1383、もしくは1401〜1509、もしくは1440〜1509、もしくは1499〜1519、もしくは1499〜1509、もしくは1509〜1519位で終止する)領域を含む。すなわち、最適化されないウインドウは、実質的には、元のコドン(例えば、少なくとも90%、95%、または100%の元のコドン)を保持する。配列番号54のヌクレオチド1228〜1509に相当する最適化されないウインドウは、配列番号54が突然変異するか、またはより大きなヌクレオチド配列の一部であるとき、異なる実際のヌクレオチド番号付けを有し得る、例えば、プラスミドが配列番号54に対して100ヌクレオチド5’を含む場合、最適化されないウインドウは、プラスミド中のヌクレオチド1328〜1609に相当するであろうことが理解される。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド1229〜1298の領域は、実質的には、元のコドンを保持する、および/またはヌクレオチド1510〜1558の領域は、コドンに最適化される。いくつかの実施形態において、GagおよびPolをコードするコドンに最適化されるポリヌクレオチドは、配列番号54を含む。いくつかの実施形態において、コドンに最適化されるgag−polポリヌクレオチドをコードするプラスミドは、配列番号55の配列を含む。
いくつかのまたは任意の実施形態において、ヒトのコドン最適化されたgagおよびpol遺伝子をコードする(そして、上述の最適化されないウインドウを含む)プラスミドもまた、Rev応答要素(RRE)を欠いている。RREの欠失は、gag/polプラスミドとレンチウイルスベクタープラスミドとの間で同種および潜在的組み換えのさらに別の領域を排除する。組み合わせて、そのような手技は、gag/polプラスミドとレンチウイルスベクターとの間の同種の領域を排除または最小化し、そのため、複製能力のあるウイルスをもたらし得るこれらのプラスミド間の組み換えの機会を最小化する。RREは、依然として、パッケージング細胞およびプロセスに存在し得るが、異なるプラスミド上に存在することが理解される。
調節要素
本明細書に論じられるように、ウイルスベクターゲノムは、標的細胞において発現することが望ましい、対象となる配列を含む。通常、対象となる配列は、5’LTRと3’LTR配列との間に位置付けられる。さらに、対象となる配列は、好ましくは、他の遺伝要素、例えば、プロモーターまたはエンハンサーを含む転写調節配列と機能的な関係にあり、特定の様式で対象となる配列の発現を調節する。ある例において、有用な転写調節配列は、活性に関して、時間的および空間的の両方に高度に調節されるものである。成分の発現を調節するために使用され得る発現制御要素は、当該技術分野で知られており、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、エンハンサー、および他の調節要素が含まれるが、これらに限定されない。
対象となる配列およびあらゆる他の発現可能な配列は、通常、内部プロモーター/エンハンサー調節配列と機能的関係にある。「内部」プロモーター/エンハンサーは、ウイルスベクター構成において、5’LTR配列と3’LTR配列との間に位置付けられるものであり、対象となる配列に作動可能に連結される。内部プロモーター/エンハンサーは、それが機能的関係にある遺伝子の発現を増加させることが知られている、あらゆるプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター/エンハンサーの組み合わせであってもよい。「機能的関係」および「作動可能に連結された」とは、プロモーターおよび/またはエンハンサーが適切な分子と接触するとき、対象となる配列が発現される、プロモーターおよび/またはエンハンサーに関して、配列が正しい位置および配向にあることを意味するが、これらに限定されない。
内部プロモーター/エンハンサーの選択は、対象となる配列の望ましい発現パターンおよび知られているプロモーター/エンハンサーの特定の特性に基づく。したがって、内部プロモーターは、構成的に活性であってもよい。使用されてもよい構成的プロモーターの非限定例は、ユビキチンのプロモーター(米国特許第5,510,474号、国際公開第WO98/32869号、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)、CMV(Thomsen et al.,PNAS 81:659,1984、米国特許第5,168,062号、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)、ベータ−アクチン(Gunning et al.1989 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4831−4835、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)、およびpgk(例えば、Adra et al.1987 Gene 60:65−74、Singer−Sam et al.1984 Gene 32:409−417、およびDobson et al.1982 Nucleic Acids Res.10:2635−2637を参照されたく、前述のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)を含む。いくつかの実施形態において、偽型レンチウイルスベクターゲノムによってコードされた抗原の発現を制御するために使用されるプロモーターは、イントロン欠損プロモーターである。いくつかの実施形態において、ヒトユビキチンC(UbiC)プロモーターは、偽型レンチウイルスベクターゲノムによってコードされた抗原の発現を制御するために使用される。様々な実施形態において、UbiCプロモーターは、修飾して、イントロンを除去されており、つまり、このプロモーターは、イントロン欠損である。完全長UbiCプロモーターは、1250ヌクレオチドである。イントロンは、412で開始し、終端まで続く(412〜1250)。この領域は、異種ウイルスゲノム転写産物を最小化するために欠失することができる。HIVウイルスゲノムは、その中に天然イントロンを有する。したがって、UbiCプロモーターを含むレンチウイルスは、レンチウイルスゲノム中に合計2つのイントロンを有し得る。UbiCイントロンは、スプライス型および非スプライス型の両方に存在し得る。UbiCイントロンの欠失は、異種ウイルス転写産物の可能性をなくし、送達される偽型レンチウイルス粒子の同質性を確保する。
あるいは、プロモーターは、組織特異的プロモーターであってもよい。いくつかの好ましい実施形態、プロモーターは、標的細胞特異的なプロモーターである。例えば、プロモーターは、CD11c、CD103、TLR、DC−SIGN、BDCA−3、DEC−205、DCIR2、マンノース受容体、Dectin−1、Clec9A、MHCクラスIIを含む、樹状細胞によって発現される、あらゆる産物に由来し得る。さらに、プロモーターは、対象となる配列の誘導性発現を可能にするように選択されてもよい。誘導性発現のための多数なシステムが当該技術分野で知られており、テトラサイクリン応答システム、lacオペレーター−リプレッサーシステム、ならびに熱ショック、金属イオンを含む多様な環境変化または生理学的変化に応答するプロモーター、例えば、メタロチオネインプロモーター、インターフェロン、低酸素症、ステロイド、例えば、プロゲステロンまたはグルココルチコイド受容体プロモーター、放射線、例えば、VEGFプロモーターが含まれる。また、プロモーターの組み合わせを使用して、対象となる遺伝子の所望の発現を得てもよい。当業者は、対象となる有機体または標的細胞における遺伝子の所望の発現パターンに基づいて、プロモーターを選択することができる。
ウイルスゲノムは、少なくとも1つのRNAポリメラーゼIIまたはIII応答性プロモーターを含んでもよい。このプロモーターは、対象となる配列に作動可能に連結させることができ、終結配列に連結させることもできる。さらに、1つを超えるRNAポリメラーゼIIまたはIIIプロモーターを組み込んでもよい。RNAポリメラーゼIIおよびIIIプロモーターは、当業者にはよく知られている。RNAポリメラーゼIIIプロモーターの適切な範囲は、例えば、Paule and White,Nucleic Acids Research.,Vol.28,pp 1283−1298(2000)において見出され得、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。RNAポリメラーゼIIまたはIIIプロモーターはまた、下流RNAコード配列を転写するようにRNAポリメラーゼIIまたはIIIを指示することができる、あらゆる合成または操作DNA断片も含む。さらに、ウイルスベクターゲノムの一部として使用されるRNAポリメラーゼIIまたはIII(Pol IIまたはIII)プロモーター(複数を含む)は、誘導可能であり得る。あらゆる適切な誘導性Pol IIまたはIIIプロモーターが、本発明の方法とともに使用することができる。特に適したPol IIまたはIIIプロモーターは、Ohkawa and Taira,Human Gene Therapy,Vol.11,pp 577−585(2000)およびMeissner et
al.Nucleic Acids Research,Vol.29,pp 1672−1682(2001)(それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)において提供される、テトラサイクリン応答性プロモーターを含む。
内部エンハンサーはまた、対象となる遺伝子の発現を増加させるように、ウイルス構成に存在してもよい。例えば、CMVエンハンサー(Boshart et al.Cell,41:521,1985、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)を使用してもよい。HIV、CMV等のウイルスゲノム、および哺乳動物ゲノム中の多くのエンハンサーが、識別および特徴付けられた(GenBankを参照されたい)。エンハンサーは、異種プロモーターと組み合わせて使用することができる。当業者は、所望の発現パターンに基づいて適切なエンハンサーを選択することができよう。
ウイルスベクターゲノムは、通常、標的細胞によって認識され、対象となる配列に作動可能に連結されるプロモーター、ウイルス成分、および本明細書に論じられる他の配列を含有する。プロモーターは、RNAポリメラーゼの結合および転写が起こるのを可能にする、核酸配列によって形成される発現制御要素である。プロモーターは、誘導性、構成的、時間的に活性、または組織特異的であってもよい。誘導性プロモーターの活性は、生物的または非生物的要因の存在または不在によって誘導される。それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を、生物体の発生、その製造のある段階において、または特定の組織において、オンオフすることができるため、誘導性プロモーターは、遺伝子操作において有用なツールであり得る。誘導性プロモーターは、化学的に調節されるプロモーター、および物理的に調節されるプロモーターとして分類することができる。典型的な化学的に調節されるプロモーターとしては、アルコール調節されるプロモーター(例えば、アルコールデヒドロゲナーゼI(alcA)遺伝子プロモーター)、テトラサイクリン調節されるプロモーター(例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター)、ステロイド調節されるプロモーター(例えば、ラットグルココルチコイド受容体(GR)系プロモーター、ヒトエストロゲン受容体(ER)系プロモーター、モスエクジソン受容体系プロモーター、およびステロイド/レチノイド/チロイド受容体スーパーファミリーに基づくプロモーター)、金属調節されるプロモーター(例えば、メタロチオネイン遺伝子系プロモーター)、および病原性関連プロモーター(例えば、シロイヌナズナおよびトウモロコシ病原性関連(PR)タンパク質系プロモーター)が挙げられるが、これらに限定されない。典型的な物理的に調節されるプロモーターとしては、温度調節されるプロモーター(例えば、熱ショックプロモーター)、および光調節されるプロモーター(例えば、大豆SSUプロモーター)が挙げられるが、これらに限定されない。
当業者は、特定の状況に基づいて、適切なプロモーターを選択することができよう。多くの異なるプロモーターは、プロモーターを発現される遺伝子に作動可能に連結するための方法であるとして、当該技術分野でよく知られている。天然プロモーター配列および多くの異種プロモーターの両方を使用して、パッケージング細胞および標的細胞において発現を指示してもよい。しかしながら、異種プロモーターは、一般に、天然プロモーターと比較して、より優れた転写および所望のタンパク質のより高い収率を可能にするため、好ましい。
プロモーターは、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、およびサルウイルス40(SV40)等のウイルスのゲノムから得られ得る。プロモーターはまた、例えば、異種の哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターもしくは免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーター、または通常、天然配列と関連付けられるプロモーターであってもよいが、但し、そのようなプロモーターは、標的細胞と適合する。一実施形態において、プロモーターは、ウイルス発現系において自然発生するウイルスプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、樹状細胞特異的なプロモーターである。樹状細胞特異的なプロモーターは、例えば、CD11cプロモーターであり得る。
転写は、エンハンサー配列をベクター(複数を含む)に挿入することによって増加させてもよい。エンハンサーは、通常、その転写を増加させるように、プロモーターに作用する、通常、約10〜300bp長のDNAのシス作用要素である。現在、哺乳動物遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェトタンパク質、およびインスリン)、ならびに真核細胞ウイルスに由来する多くのエンハンサー配列が知られている。例には、複製起点の後期側のSV40エンハンサー(bp100〜270)、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、抗原特異的ポリヌクレオチド配列に対して5’または3’位でベクターにスプライスされてもよいが、好ましくは、プロモーターから5’部位に位置付けられる。
発現ベクターは、転写の終了およびmRNAの安定化に必要な配列を含有してもよい。これらの配列は、真核細胞またはウイルスDNAまたはcDNAの5’および場合によっては3’の未翻訳領域において見出される場合が多く、当該技術分野でよく知られている。
ウイルスベクターゲノムはまた、さらなる遺伝要素を含有してもよい。構成物に含まれてもよい要素の種類は、決して限定されず、特定の結果を達成するために選択されてもよい。例えば、標的細胞においてウイルスゲノムの核侵入を促進するシグナルが含まれてもよい。そのようなシグナルの例は、HIV−1フラップシグナルである。さらに、標的細胞内のプロウイルス組み込み部位の特徴付けを促進する要素が含まれてもよい。例えば、tRNAアンバーサプレッサーが、構成物に含まれてもよい。例えば、ニワトリβ−グロブリンからの絶縁体配列はまた、ウイルスゲノム構成物に含まれてもよい。この要素は、メチル化および異質染色質化の効果に起因して、標的細胞内で組み込みプロウイルスをサイレンシングする機会を減少させる。さらに、絶縁体は、染色体上の組み込み部位において、周囲のDNAからの正または負の位置効果から、内部エンハンサー、プロモーター、および外来遺伝子を遮断し得る。さらに、ベクターゲノムは、対象となる遺伝子の発現を強化するように設計された1つ以上の遺伝要素を含有してもよい。例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス応答要素(WRE)が構成物に配置されてもよい(Zufferey et al.1999.J.Virol.74:3668−3681、Deglon et
al.2000.Hum.Gene Ther.11:179−190、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
ウイルスベクターゲノムは、通常、パッケージジングまたは産生細胞株にトランスフェクトされ得るプラスミド形態で構成される。プラスミドは、一般に、細菌中のプラスミドの複製に有用な配列を含む。そのようなプラスミドは、当該技術分野でよく知られている。さらに、複製の原核生物起源を含むベクターは、その発現が薬物耐性等の検出可能または選択可能なマーカーを付与する遺伝子を含んでもよい。典型的な細菌薬物耐性産物は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するものである。
本明細書に記載される成分の1つ以上を含有するプラスミドは、当該技術分野でよく知られている標準手技を使用して、容易に構成される。構成されるプラスミドにおいて適切な配列を確認するための分析の場合、プラスミドは、制限エンドヌクレアーゼ消化によって精製および分析される大腸菌、または従来方法によって決定されるそのDNA配列において複製されてもよい。
また、哺乳動物細胞において一時的発現のために構成されるベクターを使用してもよい。一時的発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くの複製を蓄積するように、宿主細胞において効率的に複製することができる発現ベクターの使用を伴い、同様に、発現ベクターにおいて抗原特異的ポリヌクレオチドによってコードされる高レベルのポリペプチドを合成する。Sambrook et al.,上記、pp.16.17−16.22を参照されたい。ポリペプチドの発現に対する適合に適した他のベクターおよび方法は、当該技術分野でよく知られており、特定の状況に対して容易に適合される。
本明細書に提供される教示を使用して、当業者は、パッケージング細胞を、レポータータンパク質をコードする遺伝子を含むベクターでトランスフェクトし、適切な手技を使用して発現を測定すること、例えば、緑色蛍光タンパク質複合体からの蛍光を測定することによって、特定の発現系の有効性を試験することができることを認識するであろう。適切なレポーター遺伝子は、当該技術分野でよく知られている。
対象となる配列の種類
対象となる配列は、決して限定されず、当業者が標的細胞に組み込み、転写、および発現させることを望む、あらゆる核酸を含む。産物は、タンパク質または核酸であり得る。対象となる配列は、タンパク質、またはsiRNA、ミクロRNA、相補領域が約20リボヌクレオチド長よりも大きい自己相補二本鎖RNA、もしくはメッセージRNAに相補的なRNAを含む、核酸分子をコードすることができ、メッセージRNAに対するこの相補(アンチセンス)RNAの結合は、そのタンパク質に翻訳される能力を遮断する。場合によっては、対象となる配列は、免疫応答が望ましい抗原をコードすることができる。特に、腫瘍抗原、およびHIV、HSV、HCV、HPV、マラリア、または結核等の病原体からの感染疾患抗原が望ましい。さらに、対象となる複数の配列が、単一ベクター内に含まれ得る。
ある例において、対象となる配列は、分子の発現を下方調節する対象となる小さな阻害RNA(siRNA)またはミクロRNA(miRNA)をコードする遺伝子であり得る。例えば、siRNAまたはミクロRNAをコードする遺伝子を使用して、樹状細胞の活性化または成熟を阻害するものを含む、細胞内の負の調節因子の発現を下方調節することができる。siRNAおよびミクロRNAは、当該技術分野でよく知られている(Fire et al.,Nature 391:806,1998、“The RNA Interference Resource” of Applied Biosystems,Trang et al.,Oncogene Suppl 2:S52,2008、Taganov,K.,et al.2007.Immunity 26:133−137、Dahlberg,J.E.and E.Lund.2007.Sci.STKE 387:pe25、Tiemann and Rossi,EMBO Mol Med 1:142,2009も参照されたい)。あるいは、対象となる配列は、相補領域が約20リボヌクレオチド長よりも大きい自己相補二本鎖RNA、または約20リボヌクレオチド長よりも大きいアンチセンスRNAをコードすることができる。当業者は、siRNA、miRNA、dsRNA、およびアンチセンスRNA分子が、RNAポリメラーゼIIIプロモーターから発現し得ること、あるいは、RNAポリメラーゼIIプロモーターから転写される、非コードRNAの成分であり得ることを理解するであろう。
さらに、対象となる配列は、1つを超える産物をコードしてもよい。いくつかの構成において、送達される配列は、少なくとも1つのタンパク質、少なくとも1つのsiRNA、少なくとも1つのミクロRNA、少なくとも1つのdsRNA、もしくは少なくとも1つのアンチセンスRNA分子、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。例えば、送達される配列は、免疫応答が望ましい1つ以上の抗原をコードする1つ以上の遺伝子を含むことができる。1つ以上の抗原は、単一の疾患または障害と関連付けることができるか、またはそれらは、複数の疾患および/または障害と関連付けることができる。いくつかの例において、免疫調整タンパク質をコードする遺伝子は、免疫応答が望ましい抗原をコードする遺伝子とともに含まれることができ、その組み合わせは、免疫応答を誘発し、所望の配向および規模に調節することができる。他の例において、siRNA、ミクロRNA、dsRNA、またはアンチセンスRNA分子をコードする配列は、免疫応答が望ましい抗原をコードする遺伝子とともに構成されることができ、その組み合わせは、免疫応答の範囲を調整することができる。産物は、コード配列が1つのプロモーターと機能的関係にある、初期融合産物として産生されてもよい。あるいは、産物は、別々にコードされてもよく、それぞれのコード配列は、プロモーターと機能的関係にある。プロモーターは、同一であるか、または異なってもよい。
ある構造において、ベクターは、樹状細胞成熟/刺激因子をコードするポリヌクレオチド配列を含有する。例示的な刺激分子には、GM−CSF、IL−2、IL−4、IL−6、IL−7、IL−15、IL−21、IL−23、TNFα、B7.1、B7.2、4−1BB、CD40リガンド(CD40L)、薬物誘導CD40(iCD40)等が含まれる。これらのポリヌクレオチドは、通常、樹状細胞内でコード配列の発現を導く1つ以上の調節要素の制御下にある。樹状細胞の成熟は、良好なワクチン接種に寄与する(Banchereau,J and Palucka,A.K.Nat.Rev.Immunol.5:296−306(2005)、Schuler,G.et al.Curr.Opin.Immunol.15:138−147(2003)、Figdor,C.G.et al.Nat.Med.10:475−480(2004))。成熟は、抗原捕捉に活発に関与する細胞からのDCを、T細胞プライミングに特殊化した細胞に変換することができる。例えば、CD40LによってCD40をCD4−ヘルパーT細胞に係合することは、DC成熟に重要なシグナルであり、CD8T細胞の強力な活性をもたらす。そのような刺激分子は、成熟因子または成熟刺激因子とも称される。免疫チェックポイントは、癌における機能的細胞性免疫の活性化に対する重要な障壁を表し、CTLA4およびプログラム死−1(PD−1)を含む、T細胞上の阻害リガンドに特異的なアンタゴニスト抗体は、クリニックにおいて評価されている標的薬剤の例である。慢性感染症および癌において重要な耐性機構は、高レベルのPD−1を発現するAg特異的T細胞の機能的消耗である。治療的免疫化の有効性は、免疫チェックポイントの制御と組み合わせることによって著しく強化されることが示されたため、非限定例として、当業者は、免疫チェックポイントを阻害する代替アプローチが、プログラム死(PD)リガンド1および2(PD−L1/L2)の発現を阻害することであると理解することができる。阻害を達成するための一方法は、本明細書に記載されるもの等のRNA分子の発現によってであり、RNA分子の1つ以上をコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたDCにおいて、PD−L1/L2の発現を抑制する。DCの成熟または免疫チェックポイント、例えばPD−1リガンド等の特定の要素の発現は、MHC II等の表面マーカーの上方調節のフローサイトメトリー分析、ならびに発現したケモカインおよびサイトカインのプロファイルによって特徴付けることができる。
検出可能な産物、通常、タンパク質をコードする配列を含み、所望の産物を発現している細胞の識別を可能にすることができる。例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)等の蛍光マーカータンパク質は、(例えば、抗原をコードする)対象となる配列とともに構成物に組み込まれる。他の例において、タンパク質は、抗体によって検出可能であってもよいか、またはタンパク質は、検出可能な産物を産出するように基質に作用する酵素であっても、トランスフェクトまたは形質導入した標的細胞の選択を可能にする、例えば、ヒグロマイシン耐性等の薬物耐性を付与する産物であってもよい。典型的な選択遺伝子は、真核細胞での使用に適切な抗生物質または他の毒素、例えば、とりわけ、当該技術分野で知られている、ネオマイシン、メトトレキセート、ブラストサイジンに対する耐性を付与するか、栄養要求性欠陥を相補するか、または培地から抑制される重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。選択可能なマーカーは、任意に、別個のプラスミド上に存在し、共トランスフェクションによって導入することができる。
パッケージング細胞において所望のウイルスの産生のために必要な要素(例えば、対象となる配列(複数を含む)、エンベロープ分子、DC成熟因子)の2つ以上を含む、1つ以上の多シストロン発現単位を利用してもよい。多シストロンベクターの使用は、必要とされる核酸分子の総数を減少させ、したがって、複数のベクターゲノムからの調和した発現と関連付けられる可能な困難を回避する。多シストロンベクターにおいて、発現される種々の要素は、1つ以上のプロモーター(および必要に応じて他の発現制御要素)に作動可能に連結される。いくつかの構成において、多シストロンベクターは、対象となる配列、レポーター産物をコードする配列、およびウイルス要素を含む。対象となる配列は、通常、抗原および任意にDC成熟因子をコードする。時には、多シストロンベクターは、抗原をコードする遺伝子、DC成熟因子をコードする遺伝子、およびウイルス要素を含む。
開示される偽型レンチウイルスベクターは、一度に1つを超える、例えば、2つ、3つ、または4つの抗原を発現するように操作することができる。単一のベクターから1つを超える遺伝子を同時に発現するためのいくつかの方法は、当該技術分野で知られている。例えば、ベクターは、遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)と融合する多重プロモーター、遺伝子間でのスプライシングシグナルの挿入、単一のプロモーターにより発現が引き起こされる遺伝子の融合、遺伝子間でのタンパク質分解切断部位の挿入、遺伝子間での内部リボソーム侵入部位(IRES)の挿入、遺伝子間での二方向性プロモーターの挿入、および/または「自己切断型」2Aペプチドを含むことができる。多シストロン発現ベクターにおいて発現されるそれぞれの成分は、例えば、内部リボソーム侵入部位(IRES)要素またはウイルス2A要素によって分離して、同じプロモーターから種々のタンパク質の発現の分離を可能にすることができる。IRES要素および2A要素は、当該技術分野で知られている(米国特許第4,937,190号、de Felipe et al.2004.Traffic 5:616−626、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。一実施形態において、口蹄疫ウイルス(FMDV;F2A)、ブタテシオウイルス−1(P2A)、ウマ鼻炎Aウイルス(ERAV;E2A)、およびゾセアアジグナ(thosea asigna)ウイルス(TaV;T2A)(Szymczak et al.2004.Nat.Biotechnol.22:589−594、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)からの2A様配列と連結されるフリン切断部位配列(RAKR)(Fang et al.2005.Nat.Biotech 23:584−590、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)をコードするオリゴヌクレオチドは、多シストロンベクターにおいて遺伝要素を分離するために使用される。2Aペプチドコンセンサス配列は、D(V/I)EXNPGP(配列番号56)である。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、T2A(配列番号57)をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、2Aペプチドは、配列番号52のポリヌクレオチドによってコードされる。特定の多シストロンベクターの有効性は、標準的なプロトコルを使用し、遺伝子のそれぞれの発現を検出することによって容易に試験することができる。
2つ以上の抗原の発現はまた、内部リボソーム侵入部位(IRES)を使用しても達成することができる。IRESは、真核細胞リボソームが侵入し、5’m Gキャップ構造以外の位置でmRNAを走査することを可能にする。例えば、第1のコード領域の3’(またはシストロン)のように内部に位置する場合、IRESは、同じ転写産物内の第2のコード領域の翻訳を可能にする。第2のコード領域は、IRES後に遭遇する第1のATGによって識別される。例示的なIRES要素には、ピコルナウイルスIRESおよびカルジオウイルスIRES(例えば、米国特許第4,937,190号を参照されたい)等のウイルスIRES、ならびに5’UTR(例えば、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質(BiP)をコードする転写産物の要素(Macejak et al.,Nature,35390−4,1991)、ドロソフィラアンテナペディア(Drosophila Antennapedia)(Oh et al.,Genes Dev.6:1643−53,1992)、およびウルトラバイソラックス(Ultrabithorax)(Ye et al.,Mol.Cell Biol.,17:1714−21,1997);線維芽細胞成長因子2(Vagner et al.,Mol.Cell Biol.,15:35−44,1995);開始因子eIF4G(Gan et al.,J.Biol.Chem.273:5006−12,1998);癌原遺伝子c−myc(Nanbru et al.,J.Biol.Chem.,272:32061−6,1995、Stoneley,Oncogene,16:423−8,1998);ならびに血管内皮成長因子(VEGF)(Stein et al.,Mol.Cell Biol.,18:3112−9,1998)等において見出される非ウイルスIRES要素が含まれる。
2つ以上の抗原の発現はまた、二方向性プロモーター、すなわち、プロモーター領域または読み方向が互いから離れて指し示す2つの連続クローンプロモーターを使用しても達成することができ、これにより、プロモーター領域に隣接する2つのオープンリーディングフレームが転写される。そのようなプロモーターの例には、PDGF−A、向神経性JCウイルス、BRCA1、トランスコバラミンII、およびジペプチジルペプチダーゼIVプロモーターが含まれる。
特定の例示において、ウイルスベクターゲノムは、サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサー/プロモーター配列、HIV 5’LTRからのRおよびU5配列、パッケージング配列(ψ)、HIV−1フラップシグナル、内部エンハンサー、内部プロモーター、対象となる遺伝子、ウッドチャック肺炎ウイルス応答要素、tRNAアンバーサプレッサー配列、そのエンハンサー配列の欠失を有するU3要素、ニワトリβ−グロブリン絶縁体、ならびに3’HIV LTRのRおよびU5配列を含む。いくつかの例示において、ベクターゲノムは、無傷レンチウイルス5’LTRおよび自己不活性化3’LTR(Iwakuma et al.Virology 15:120,1999、参照によりその全体が組み込まれる)を含む。
ベクターゲノムの構成は、当該技術分野で知られている任意の適切な遺伝子操作技術を使用して達成することができ、これには、例えば、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Sambrook et al.(1989.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.)、Coffin et al.(Retroviruses.Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.(1997))、および“RNA Viruses:A Practical Approach”(Alan J.Cann,Ed.,Oxford University Press,(2000)に記載されるような、制限エンドヌクレアーゼ消化、連結、形質転換、プラスミド精製、およびDNA配列決定の標準技術が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、対象となる配列は、少なくとも1つの抗原をコードする。疾患または障害と関連する任意の抗原は、本明細書に記載されるウイルス粒子を使用して、樹状細胞に送達することができる。疾患または障害と関連する抗原は、樹状細胞を標的とするウイルス粒子の調製のために特定される。多くの疾患または障害と関連する抗原は、当該技術分野でよく知られている。抗原は、疾患または障害と関連することが既に知られていても、当該技術分野で知られている任意の方法によって特定されてもよい。例えば、腫瘍関連抗原のような、患者が罹患している一種の癌に対する抗原は、知られていても、当該技術分野で知られている多様な方法のいずれかによって腫瘍自体から特定されてもよい。
腫瘍関連抗原は、例えば、腎細胞癌、前立腺癌、黒色腫、および乳癌を含む、多様な癌で知られている。いくつかの乳癌において、例えば、Her−2受容体は、癌性細胞の表面上に過剰発現している。例示的な腫瘍抗原としては、MAGE、例えば、MAGE−A3およびMAGE−A1、BAGE、RAGE、およびNY−ESO−1(これらは精巣の免疫特権領域および多様な腫瘍細胞で発現される非突然変異しない抗原である);系統特異的腫瘍抗原、例えば、メラニン細胞−黒色腫系統抗原、MART−1/Melan−A、gp100、gp75、mda−7、チロシナーゼ、およびチロシナーゼ関連タンパク質、例えば、TRP2;腎細胞癌−5T4、SM22−アルファ、炭酸脱水酵素IおよびIX(G250としても知られる)、低酸素誘導因子(例えば、HIF−1アルファおよびHIF−2アルファ)、VEGF、または前立腺特異性膜抗原(PSMA)、前立腺特異的抗原(PSA)、前立腺酸性リン酸塩、および前立腺の6−膜貫通上皮抗原(STEAP)、NKX3.1(これらは同じ組織に由来する正常および腫瘍性細胞で発現される抗原である);正常細胞と比較して、腫瘍において異なるレベルで転写される腫瘍細胞または遺伝子で変異する遺伝子に由来するエピトープタンパク質/ペプチド、例えば、テロメラーゼ酵素、スルビビン、メソテリン、変異型ras、bcr/abl再構成、Her2/neu、変異型もしくは野生型p53、サイトクロームP450 1B1、ならびに異常に発現されるイントロン配列、例えば、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−V;骨髄腫およびB細胞リンパ腫において独自のイディオタイプを生成する免疫グロブリン遺伝子のクローン性再構成;腫瘍ウイルスプロセスに由来するエピトープタンパク質/ペプチド、例えば、ヒトパピローマウイルスタンパク質E6およびE7;腫瘍選択的発現を有する非突然変異腫瘍胎児、例えば、癌胎児性抗原およびアルファ−フェトタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。多くの腫瘍関連抗原が検討された(例えば、“Tumor−Antigens Recognized By T−Lymphocytes,” Boon T,Cerottini J C,Vandeneynde B,Vanderbruggen P,Vanpel A,Annual Review Of Immunology 12:337−365,1994、“A listing of human tumor antigens recognized by T cells,” Renkvist N,Castelli C,Robbins P F,Parmiani G.Cancer Immunology Immunotherapy 50:(1)3−15 MAR 2001、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
本明細書に記載されるいくつかのまたは任意の実施形態において、偽型レンチウイルスベクターは、MAGE−A3(配列番号58)をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、MAGE−A3は、配列番号50のポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、MAGE−A3は、配列番号50と少なくとも40、50、60、70、80、90、95、99パーセント同一であるポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、偽型レンチウイルスベクターは、配列番号58の少なくとも40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、または310のアミノ酸のMAGE−A3の断片をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号58と少なくとも40、50、60、70、80、90、95、99パーセント同一であるMAGE−A3の変異体をコードする。いくつかの実施形態において、偽型レンチウイルスベクターは、NY−ESO−1(配列番号59)をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、NY−ESO−1は、配列番号51のポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、MAGE−A3は、配列番号51と少なくとも40、50、60、70、80、90、95、99パーセント同一であるポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、偽型レンチウイルスベクターは、配列番号59の少なくとも40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、または170のアミノ酸のNY−ESO−1の断片をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号59の少なくとも40、50、60、70、80、90、95、99パーセント同一であるNY−ESO−1の変異体をコードする。いくつかの実施形態において、偽型レンチウイルスベクターは、MAGE−A3(配列番号58)をコードするポリヌクレオチドおよびNY−ESO−1(配列番号59)をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかのまたは任意の実施形態において、NY−ESO−1およびMAGE−A3は、NY−ESO−1およびMAGE−A3、ならびに2つの抗原の間に自己切断型A2ペプチドを含む融合タンパク質と同じ転写産物、例えば、配列番号56または57から発現される。抗原は、いかなる順序(例えば、第一に、NY−ESO−1、そして、第二に、MAGE−A3、または第一に、MAGE−A3、そして、第二に、NY−ESO−1)であってもよい。
抗原はまた、感染症、例えば、HIV/AIDS等と関連する抗原であり得る。抗原は、例えば、gp120であり得る(Klimstra,W.B.,et al.2003.J Virol 77:12022−12032、Bernard、K.A.,et al.2000.Virology 276:93−103、Byrnes,A.P.,et al.1998.J Virol 72:7349−7356、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。他の例示的な抗原としては、gag、pol、env、tat、nef、およびrevが挙げられるが、これらに限定されない(Lieberman,J.et al.1997.AIDS Res Hum Retroviruses 13(5):383−392、Menendez−Arias,L.et al.1998.Viral Immunol 11(4):167−181、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
ウイルス抗原の例としては、アデノウイルスポリペプチド、アルファウイルスポリペプチド、カリシウイルスポリペプチド、例えば、カリシウイルスカプシド抗原、コロナウイルスポリペプチド、ジステンパーウイルスポリペプチド、エボラウイルスポリペプチド、エンテロウイルスポリペプチド、フラビウイルスポリペプチド、肺炎ウイルス(AE)ポリペプチド、例えば、B型肝炎コアもしくは表面抗原、またはC型肝炎ウイルスE1もしくはE2糖タンパク質、コア、または非構造タンパク質、ヘルペスウイルスポリペプチド、例えば、単純ヘルペスウイルスもしくは水痘帯状ヘルペスウイルス糖タンパク質、免疫不全ウイルスポリペプチド、例えば、ヒト免疫不全ウイルスエンベロープもしくはプロテアーゼ、感染性腹膜炎ウイルスポリペプチド、インフルエンザウイルスポリペプチド、例えば、A型インフルエンザヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、またはヌクレオタンパク質、白血病ウイルスポリペプチド、マールブルグウイルスポリペプチド、オルトミクソウイルスポリペプチド、パピローマウイルスポリペプチド、パラインフルエンザウイルスポリペプチド、例えば、ヘマグルチニン/ノイラミニダーゼ、パラミクソウイルスポリペプチド、パラボウイルスポリペプチド、ペスチウイルスポリペプチド、ピコルナウイルスポリペプチド、例えば、ポリオウイルスカプシドポリペプチド、ポックスウイルスポリペプチド、例えば、ワクシニアウイルスポリペプチド、狂犬病ウイルスポリペプチド、例えば、狂犬病ウイルス糖タンパク質G、レオウイルスポリペプチド、レトロウイルスポリペプチド、およびロタウイルスポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
細菌抗原の例としては、アクチノミセスポリペプチド、バシルスポリペプチド、バクテロイドポリペプチド、ボルデテラポリペプチド、バルトネラポリペプチド、ボレリアポリペプチド、例えば、B.ライム病OspA、ブルセラポリペプチド、カンピロバクターポリペプチド、カプノサイトファーガポリペプチド、クラミジアポリペプチド、クロストリジウムポリペプチド、コリネバクテリアポリペプチド、コキシエラポリペプチド、ダーマトフィルスポリペプチド、エンテロコッカスポリペプチド、エールリヒアポリペプチド、エシェリキアポリペプチド、フランシセラポリペプチド、フソバクテリアポリペプチド、ヘモバルトネラポリペプチド、ヘモフィルスポリペプチド、例えば、H.インフルエンザ型b外膜タンパク質、ヘリコバクターポリペプチド、クレブシエラポリペプチド、L型バクテリアポリペプチド、レプトスピラポリペプチド、リステリアポリペプチド、マイコバクテリアポリペプチド、マイコプラズマポリペプチド、ナイセリアポリペプチド、ネオリケッチアポリペプチド、ノカルジアポリペプチド、パスツレラポリペプチド、ペプトコッカスポリペプチド、ペプトストレプトコッカスポリペプチド、肺炎球菌ポリペプチド、プロテウスポリペプチド、シュードモナスポリペプチド、リケッチアポリペプチド、ロカリメアポリペプチド、サルモネラポリペプチド、シゲラポリペプチド、スタフィロコッカスポリペプチド、ストレプトコッカスポリペプチド、例えば、S.ピロゲンMタンパク質、トレポネマポリペプチド、およびエルシニアポリペプチド、例えば、Y.ペスティスF1およびV抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
真菌抗原の例としては、アブシジアポリペプチド、アクレモニウムポリペプチド、アルテルナリアポリペプチド、アスペルギルスポリペプチド、バシジオボラスポリペプチド、ビポラリスポリペプチド、ブラストミセスポリペプチド、カンジダポリペプチド、コッキジオイドポリペプチド、コニジオボラスポリペプチド、クリプトコッカスポリペプチド、カーブラリアポリペプチド、表皮菌ポリペプチド、エクソフィアラポリペプチド、ゲオトリクムポリペプチド、ヒストプラズマポリペプチド、マズレラポリペプチド、マラセジアポリペプチド、小胞子菌ポリペプチド、モニリエラポリペプチド、モルティエラポリペプチド、ケカビポリペプチド、ペシロミセスポリペプチド、ペニシリウムポリペプチド、フィアレモニウムポリペプチド、フィラロフォラポリペプチド、プロトテカポリペプチド、シュードアレシェリアポリペプチド、シュードミクロドキウムポリペプチド、フハイカビポリペプチド、リノスポリジウムポリペプチド、クモノスカビポリペプチド、スコレコバシジウムポリペプチド、スポロトリクスポリペプチド、ステムフィリウムポリペプチド、白癬菌ポリペプチド、トリコスポロンポリペプチド、およびキシロハイファポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
プロトゾア寄生虫抗原の例としては、バベシアポリペプチド、バランチジウムポリペプチド、ベスノイチアポリペプチド、クリプトスポリジウムポリペプチド、エイメリアポリペプチド、エンセファリトゾーンポリペプチド、エンタモエバポリペプチド、ジアルジアポリペプチド、ハモンジアポリペプチド、ヘパトゾーンポリペプチド、イソスポラポリペプチド、リーシュマニアポリペプチド、ミクロスポリジアポリペプチド、ネオスポラポリペプチド、ノセマポリペプチド、ペンタトリコモナスポリペプチド、プラスモジウムポリペプチド、例えば、P.熱帯性サーカムスポロゾイト(PfCSP)、種虫表面タンパク質2(PfSSP2)、肝臓状態抗原1のカルボキシル末端(PfLSA1 c末端)、および輸出タンパク質1(PfExp−1)、ニューモシスティスポリペプチド、サルコシスチスポリペプチド、住血吸虫ポリペプチド、タイレリアポリペプチド、トキソプラズマポリペプチド、およびトリパノソーマポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
蠕虫寄生抗原の例としては、アカントケイロネマポリペプチド、アエルロストロンギルスポリペプチド、鉤虫ポリペプチド、住血線虫ポリペプチド、アスカリスポリペプチド、ブルギアポリペプチド、ブノストムムポリペプチド、カピラリアポリペプチド、大口腸線虫ポリペプチド、クーペリアポリペプチド、クレノソーマポリペプチド、ジクチオカウルスポリペプチド、ジオクトフィムポリペプチド、ジペタロネーマポリペプチド、ジフィロボツリウムポリペプチド、ジプリジウムポリペプチド、ジロフィラリアポリペプチド、ドラクンクルスポリペプチド、エンテロビウスポリペプチド、フィラロイドポリペプチド、ヘモンカスポリペプチド、ラゴキラスカリスポリペプチド、ロアポリペプチド、マンソネラポリペプチド、ムエレリウスポリペプチド、住血吸虫ポリペプチド、鉤虫ポリペプチド、ネマトジルスポリペプチド、腸結節虫ポリペプチド、オンコセルカポリペプチド、オピストルキスポリペプチド、オステルタギアポリペプチド、パラフィラリアポリペプチド、パラゴニムスポリペプチド、パラスカリスポリペプチド、フィサロプテラポリペプチド、プロトストロンギルスポリペプチド、セタリアポリペプチド、血色食道虫ポリペプチド スピロメトラポリペプチド、ステファノフィラリアポリペプチド、ストロンギロイドポリペプチド、ストロンギルスポリペプチド、テラジアポリペプチド、トキサスカリスポリペプチド、トキソカラポリペプチド、トリキネラポリペプチド、トリコストロンギルスポリペプチド、トリクリスポリペプチド、ウンシナリアポリペプチド、およびバンクロフト糸状虫ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
外部寄生虫抗原の例としては、ノミからのポリペプチド(保護抗原ならびにアレルゲンを含む);カタダニおよび軟ダニを含むダニ;ハエ、例えば、小昆虫、蚊、サシチョウバエ、クロバエ、ウシアブ、ノサシバエ、シカバエ、ツェツェバエ、サシバエ、ハエウジ症をもたらすハエ、およびヌカカ;アリ;クモ;シラミ;ダニ;ならびに半翅類の昆虫、例えば、トコジラミおよびサシガメが挙げられるが、これらに限定されない。
抗原が特定および選択されると、所望の抗原をコードする配列が特定される。好ましくは、配列は、cDNAを含む。ウイルス感染後、対象となる配列(例えば、抗原をコードするもの)は、標的樹状細胞によって発現される。エクスビボで接触される場合、標的樹状細胞は、例えば、注入によって患者に戻され、それらは、所望の抗原に対して免疫応答を生成することができる、免疫細胞と相互作用する。好ましい実施形態において、組み換えウイルスは、患者に注入されて、標的樹状細胞を原位置で形質導入する。次いで、樹状細胞は、治療される疾患または障害と関連付けられる特定の抗原を発現し、患者は、疾患または障害に対して有効な免疫応答を開始することができる。
ウイルスベクターゲノムは、1つを超える抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含有してもよく、標的樹状細胞の形質導入時に、細胞に送達される多数の抗原に対して免疫応答を生成する。いくつかの実施形態において、抗原は、単一疾患または障害に関連する。他の実施形態において、抗原は、複数の疾患または障害に関連する。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターゲノムは、MART−1/Melan−A、NY−ESO−1、およびMAGEをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
ウイルス粒子の産生
当該技術分野で既知の多様な方法のいずれかを使用して、そのゲノムがウイルスベクターゲノムのRNA複製を含む、感染性ウイルス、例えば、レンチウイルス粒子を産生してもよい。1つの方法において、ウイルスベクターゲノムは、ウイルスベクターゲノムから転写されるウイルスゲノムRNAをウイルス粒子にパッケージ化するために必要な成分のすべてを含有するパッケージング細胞株に導入される。あるいは、ウイルスベクターゲノムは、1つ以上の対象となる配列に加えて、ウイルス成分をコードする1つ以上の遺伝子を含んでもよい。しかしながら、標的細胞におけるゲノムの複製を防ぐために、複製に必要な内因性ウイルス遺伝子は、通常、除去され、パッケージング細胞株において別々に提供される。
一般に、レンチウイルスベクター粒子は、粒子を生成するのに必要な成分を含有する、1つ以上のプラスミドベクターでトランスフェクトされる細胞株によって産生される。これらのレンチウイルスベクター粒子は、通常、複製可能ではなく、すなわち、それらは、単に1ラウンドの感染が可能であるに過ぎない。多くの場合、複数のプラスミドベクターを利用して、レンチウイルスベクター粒子を生成する様々な遺伝子成分を分離し、主に、そうでなければ複製可能なウイルスを生成し得る組み換え事象の機会を減少させる。しかしながら、必要に応じて、レンチウイルス成分のすべてを有する単一のプラスミドベクターを使用することができる。複数のプラスミドベクターを用いるシステムの一例として、細胞株は、ウイルスベクターゲノムを含有する少なくとも1つのプラスミド(すなわち、ベクターゲノムプラスミド)でトランスフェクトされ、LTR、シス作用パッケージング配列、および多くの場合、異種プロモーターに作動可能に連結される、対象となる配列(複数を含む)、ウイルス酵素的および構造的成分をコードする少なくとも1つのプラスミド(すなわち、GagおよびPol等の成分をコードする、パッケージングプラスミド)、およびアルボウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする少なくとも1つのエンベローププラスミドを含む。追加のプラスミド、例えば、本明細書に記載され、当該技術分野で知られるようなRev発現プラスミドを使用して、レトロウイルス粒子産生を強化することができる。ウイルス粒子は、細胞膜を通して出芽し、対象となる配列を含むゲノムを含むコア、および樹状細胞を標的とするアルボウイルスエンベロープ糖タンパク質を含む。アルボウイルス糖タンパク質がシンドビスウイルスE2糖タンパク質である場合、糖タンパク質を操作して、参照株HR E2糖タンパク質(配列番号18)と比較して、ヘパラン硫酸への結合を減少させる。
本開示のプラスミドベクターによるパッケージング細胞のトランスフェクションは、よく知られている方法によって達成することができ、使用される方法は、決して限定されない。多数の非ウイルス送達システムは、当該技術分野で知られており、例えば、エレクトロポレーション、リポソームを含む脂質系送達システム、「裸の」DNAの送達、およびポリシクロデキストリン化合物を使用する送達、例えば、Schatzlein AGに記載されるものが含まれる。(2001.Non−Viral Vectors in Cancer Gene Therapy:Principles and Progresses.Anticancer Drugs、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。通常、陽イオン性脂質または塩処理方法が用いられる。例えば、Grahamら(1973.Virol.52:456、Wiglerら(1979.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:1373−76)を参照されたく、前述のそれぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。リン酸カルシウム沈殿方法が最も頻繁に使用される。しかしながら、核微量注入法および細菌原形質融合を含む、ベクターを細胞に導入するための他の方法を使用してもよい。
パッケージング細胞株は、ウイルスゲノムRNAをレンチウイルスベクター粒子にパッケージ化するためのトランスにおいて必要な、ウイルス調節および構造的タンパク質を含む成分を提供する。パッケージング細胞株は、レンチウイルスタンパク質を発現し、機能的レンチウイルスベクター粒子を産生することができる、あらゆる細胞株であってもよい。いくつかの適切なパッケージング細胞株は、293(ATCC CCL X)、293T、HeLa(ATCC CCL 2)、D17(ATCC CCL 183)、MDCK(ATCC CCL 34)、BHK(ATCC CCL−10)、およびCf2Th(ATCC CRL 1430)細胞を含む。パッケージング細胞株は、必要なウイルスタンパク質を安定して発現し得る。そのようなパッケージング細胞株は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第6,218,181号に記載される。あるいは、パッケージング細胞株は、ウイルスベクターゲノムとともに、1つ以上の必要なウイルスタンパク質をコードする核酸によって、一時的にトランスフェクトされてもよい。得られるウイルス粒子を回収し、標的細胞に感染させるために使用する。エンベロープ糖タンパク質(複数を含む)をコードする遺伝子(複数を含む)は、通常、pcDNA3(Invitrogen,CA USA)等の発現ベクターにクローン化される。真核細胞発現ベクターは、当該技術分野でよく知られており、多数の商業的供給源から入手できる。次いで、293T細胞等のパッケージング細胞を、対象となる配列をコードする(通常、抗原をコードする)ウイルスベクターゲノム、ウイルスパッキング成分をコードする少なくとも1つのプラスミド、および標的分子の発現のためのベクターで共トランスフェクトする。エンベロープは、パッケージング細胞の膜上に発現され、ウイルスベクターに組み込まれる。
ウイルスの産生は、本明細書に記載されるように測定され、容量あたりのIUとして表される。IUは、感染単位、あるいは形質導入単位(TU)であり、IUおよびTUは、ウイルスベクター粒子調製物の力価の定量的測定値として相互交換可能に使用することができる。本明細書に記載される、ゲノムが容易に測定可能な産物を発現することができる、ウイルスが産生される。蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質が好適である。レンチウイルスベクターは、通常、非組み込みである。次いで、ウイルスを標的細胞に投与し、例えば、フローサイトメトリーによって、GFPを発現する標的細胞の数を決定する。次いで、力価を計算する。力価は、可能な限り高いことが好ましいが、細胞上澄みの少なくとも1×10IU/mL、少なくとも3×10IU/mL、少なくとも1×10IU/mL、少なくとも3×10IU/mL、または少なくとも1×10IU/mLである(あらゆる濃縮前)。あるいは、力価は、同じ細胞においてVSV−Gエンベロープにより偽型化した同じレンチウイルスベクターの力価の少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも100%である。
高度にマンノシル化されているウイルス粒子の産生
シンドビスウイルスエンベロープタンパク質は、4つのN連結グルカン、つまり、E2タンパク質において2つ、そしてE1タンパク質において2つを含有する。哺乳動物細胞において、マンノシダーゼI阻害剤の不在下で産生されるウイルスの2つのN−グルカンは、高マンノース構造を有し(1つは、E2 N連結グルカンであり、1つは、E1 N連結グルカン)、一方、残りの2つは、複合体構造を有する。2つの複合体構造のN−グルカンは、エンベロープタンパク質の表面上に露出しており、一方、2つの高マンノース構造のN−グルカンは、エンベロープタンパク質の三量体の中心に埋没している。複合体N連結グルカンを有するシンドビスウイルス粒子は、それほど複雑ではない、高度にマンノシル化されている糖タンパク質を有する粒子ほど効率的にDC−SIGNに結合しない。
本開示において、発明者は、哺乳動物細胞において、マンノシダーゼI阻害剤、キフネンシンの存在下で産生されるウイルス粒子が、DMNJの存在下で産生される粒子と比較して、著しく増加したDC−SIGN結合を予想外に阻害することを示す。
いくつかのまたは任意の実施形態において、ウイルスパッケージング細胞は、マンノシダーゼI阻害剤の存在下で培養される。いくつかのまたは任意の実施形態において、マンノシダーゼI阻害剤は、キフネンシンである。いくつかの実施形態において、キフネンシンは、約0.01μg/ml〜約1mg/ml、約0.1μg/ml〜約10μg/ml、約0.1μg/ml〜約9μg/ml、約0.1μg/ml〜約8μg/ml、約0.1μg/ml〜約7μg/ml、約0.1μg/ml〜約6μg/ml、約0.1μg/ml〜約5μg/ml、約0.1μg/ml〜約4μg/ml、約0.1μg/ml〜約3μg/ml、約0.1μg/ml〜約2μg/ml、約0.1μg/ml〜約1μg/ml、約0.25μg/ml〜約10μg/ml、約0.25μg/ml〜約9μg/ml、約0.25μg/ml〜約8μg/ml、約0.25μg/ml〜約7μg/ml、約0.25μg/ml〜約6μg/ml、約0.25μg/ml〜約5μg/ml、約0.25μg/ml〜約4μg/ml、約0.25μg/ml〜約3μg/ml、約0.25μg/ml〜約2μg/ml、または約0.25μg/ml〜約1μg/mlの濃度で培地中に存在する。
偽型レンチウイルスベクター粒子がシンジビス(Sindibis)ウイルスE2糖タンパク質およびVpxタンパク質を含むいくつかのまたは任意の実施形態において、レンチウイルス粒子は、マンノシダーゼI阻害剤の存在下で産生される。いくつかの実施形態において、マンノシダーゼ阻害剤は、デオキシマンノジリマイシン(DMNJ)である。好ましい実施形態において、マンノシダーゼ阻害剤は、キフネンシンである。いくつかの実施形態において、DMNJは、約1.0μg/ml〜約1.0mg/ml、約1.0μg/ml〜約900μg/ml、約1.0μg/ml〜約800μg/ml、約1.0μg/ml〜約700μg/ml、約1.0μg/ml〜約600μg/ml、約1.0μg/ml〜約500μg/ml、約1.0μg/ml〜約400μg/ml、約1.0μg/ml〜約300μg/ml、約1.0μg/ml〜約200μg/ml、約1.0μg/ml〜約100μg/ml、約50μg/ml〜約500μg/ml、約50μg/ml〜約400μg/ml、約50μg/ml〜約300μg/ml、約50μg/ml〜約200μg/ml、約50μg/ml〜約100μg/ml、約100μg/ml〜約500μg/ml、約100μg/ml〜約400μg/ml、約100μg/ml〜約300μg/ml、約100μg/ml〜約200μg/ml、約200μg/ml〜約500μg/ml、または約200μg/ml〜約400μg/mlの濃度で培地中に存在する。
いくつかのまたは任意の実施形態において、マンノシダーゼI阻害剤(例えば、キフネンシン)の存在下で産生される偽型レンチウイルスベクター粒子は、エンベロープ糖タンパク質(例えば、シンジビスウイルスE2)を含み、N連結グルカンの少なくとも60%は、マンノース(Man)、Man、Man、Man、および/またはManの構造を含む。いくつかの実施形態において、N連結グルカンの少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%は、Man、Man、Man、Man、および/またはMan9+の構造を含む。
1つのシナリオにおいて、本明細書に記載されるように、E2等のシンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクター粒子の調製のために、1つ以上のベクターを使用して、ポリヌクレオチド配列をパッケージング細胞株に導入する。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクター粒子は、高度にマンノシル化されている。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクター粒子はまた、Vpxタンパク質またはその変異体を含む。さらに他の実施形態において、レンチウイルスベクター粒子は、高度にマンノシル化されており、Vpxタンパク質またはその変異体を含む。ベクターは、シンドビスウイルスエンベロープを含むウイルスの様々な成分、対象となる配列(複数を含む)(通常、抗原をコードする)、およびパッケージング細胞によって提供されないウイルスの産生のために必要な任意の成分をコードするポリヌクレオチド配列を含有することができる。
ウイルスエンベロープタンパク質のグリコシル化プロファイルは、当該技術分野で知られている任意の方法によって決定することができる。例えば、グリコシダーゼ(例えば、EndoHまたはPNGaseF)により処理された、または処理されない状態であるウイルス糖タンパク質におけるゲルシフトアッセイが、比較され得る。他の方法には、グリカンをウイルス糖タンパク質から切断することと、HPLCおよび質量分光分析法によって成分を分離および特定することとを含む。
ウイルスの送達
ウイルスは、ウイルスが、対象となるポリヌクレオチドの送達が所望される、標的細胞、例えば樹状細胞(DC)と接触するのを可能にする、あらゆる方法で、標的細胞に送達されてもよい。時には、適切な量のウイルスが、例えば、身体への注入を通して、ヒトまたは他の動物に直接(インビボ)導入される。適切な動物としては、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、ニワトリ、または他のトリが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルス粒子は、静脈内、皮内、皮下、結節内、腹腔内、または粘膜等の多数の経路によって注入されてもよい。ウイルスは、米国特許第7,241,275号、同第7,115,108号、同第7,108,679号、同第7,083,599号、同第7,083,592号、同第7,047,070号、同第6,971,999号、同第6,808,506号、同第6,780,171号、同第6,776,776号、同第6,689,118号、同第6,670,349号、同第6,569,143号、同第6,494,865号、同第5,997,501号、同第5,848,991号、同第5,328,483号、同第5,279,552号、同第4,886,499号(これらのすべては参照によりそれらの全体が組み込まれる)に開示されるデバイス等の皮下注入デバイスを使用して送達されてもよい。他の注入位置も適切であり、例えば、標的細胞を含む器官に直接注入される。例えば、リンパ節内注入、脾臓内注入、または骨髄内注入を使用して、ウイルスをリンパ節、脾臓、および骨髄にそれぞれ送達してもよい。特定の状況および標的細胞の性質に応じて、例えば、吸入、または上皮組織、例えば、眼、口、または皮膚の上皮組織との直接接触を含む、他の手段を通して導入を行うことができる。
あるいは、標的細胞は、例えば、培養プレートにおいて、インビトロで提供され、ウイルスと接触される。標的細胞は、通常、健康な被検体または治療を必要とするか、もしくは抗原に対する免疫応答を刺激することが望ましい被検体から得られた樹状細胞を含む細胞群である。被検体から細胞を得る方法は、当該技術分野でよく知られており、静脈切開術、外科的切開、および生検が挙げられる。ヒトDCは、CD34α+ヒト造血前駆細胞を得ること、および他の箇所に記載されるようなインビトロ培養方法を使用することによって生成されてもよい(例えば、参照によりその全体が組み込まれる、Banchereau et al.Cell 106,271−274(2001))。
ウイルスを培地中に懸濁し、培養プレート、管、または他の容器のウェルに添加してもよい。ウイルスを含有する培地は、細胞のプレーティング前、または細胞がプレーティングされた後に添加されてもよい。細胞は、通常、適量の培地中でインキュベートして、生存能力を提供し、宿主細胞の形質導入が起こるように、培地中のウイルスの適切な濃度を可能する。細胞は、好ましくは、ウイルスを細胞に感染させるのに十分な時間、ウイルスでインキュベートする。好ましくは、細胞は、少なくとも1時間、少なくとも5時間、または少なくとも10時間、ウイルスでインキュベートする。
インビボおよびインビトロ送達の両方において、所望の標的細胞に感染させるのに十分な数を含有するウイルス粒子のアリコートを使用してもよい。標的細胞が培養される場合、ウイルス粒子の濃度は、一般に、少なくとも1IU/μL、より好ましくは、少なくとも10IU/μl、さらにより好ましくは、少なくとも300IU/μL、さらにより好ましくは、少なくとも1×10IU/μL、さらにより好ましくは、少なくとも1×10IU/μL、さらにより好ましくは、少なくとも1×10IU/μL、またはさらにより好ましくは、少なくとも1×10IU/μLである。
インビトロでのウイルスによる感染後、標的細胞をヒトまたは他の動物に導入(または再導入)することができる。細胞は、皮内、皮下、または末梢血流に導入することができる。動物に導入された細胞は、好ましくは、有害な免疫応答を回避するために、その動物に由来する細胞である。類似する免疫背景を有するドナーに由来する細胞を使用してもよい。使用することもできる他の細胞は、有害な免疫応答を回避するように設計されるものを含む。
標的細胞は、例えば、対象となる配列または遺伝子(複数を含む)の組み込み、転写、および/または発現、組み込まれる遺伝子の複製数、および組み込みの位置に関して分析されてもよい。そのような分析は、あらゆる時間に行われてもよく、かつ当該技術分野で知られている任意の方法によって行われてもよい。
ウイルスまたはウイルス感染した樹状細胞が投与される被検体は、感染細胞の位置、ウイルス送達されたポリヌクレオチドまたは対象となる遺伝子の発現、免疫応答の刺激に関して分析し、当該技術分野で知られている任意の方法によって、疾患または障害と関連する症状をモニタリングすることができる。
上に開示される細胞に感染させる方法は、細胞の個別の特異的特性に依存しない。結果として、それらは、多様な動物種に容易に拡大される。いくつかの例において、ウイルス粒子は、ヒトまたはヒト樹状細胞に送達され、他の例において、それらは、マウス、ウマ、イヌ、ネコ、もしくはマウス、またはトリ等の動物に送達される。本明細書に論じられるように、ウイルスベクターゲノムを偽型化して、広範な宿主範囲ならびに標的細胞の特異性を付与する。当業者は、特定の動物種において対象となる配列の望ましい発現を達成するために適切な内部プロモーターおよび他の要素にも気付くであろう。したがって、当業者は、あらゆる種からの樹状細胞に感染させる方法を修飾することができる。
治療的および予防的免疫化
樹状細胞は、疾患または障害の予防または治療のための、本明細書に記載されるようなレンチウイルスベクター粒子、特に、患者における免疫応答の活性化が有益となるものに感染させてもよい。多くのそのような疾患は、よく知られている。例えば、本開示の方法による治療または予防の影響を受けやすい疾患または障害としては、癌、自己免疫疾患、ならびにウイルス、細菌、真菌、および寄生虫感染を含む感染が挙げられるが、これらに限定されない。1つの方法において、疾患は、対象となる配列を樹状細胞に送達するために、本明細書に記載されるウイルス粒子(例えば、Vpxタンパク質を含む高度にマンノシル化されているウイルス粒子)によって治療され、対象となる配列の発現は、疾患特異的抗原を産生し、抗原特異的細胞免疫応答および体液性免疫応答の刺激をもたらす。一般に、対象となる配列は、免疫応答が望ましい抗原をコードするが、通常は樹状細胞において発現されない。抗原は、樹状細胞によって発現および提示される。ウイルスベクターゲノムは、DC成熟因子をさらにコードしてもよい。
典型的な用途において、ウイルス粒子は、免疫応答が望ましい抗原をコードする配列を樹状細胞に送達する。樹状細胞をウイルスとインビトロで接触させることによって、送達が達成され得、感染した樹状細胞が患者に提供される。またある時には、樹状細胞にインビボで感染させるために、ウイルスを被検体に送達することによって、送達が達成され得る。次いで、樹状細胞は、患者において抗原特異的T細胞またはB細胞を刺激し、発現した抗原に対する細胞性および体液性免疫応答を誘導する。そのような方法において、疾患または障害を患っている患者は、所望の特異性を有する免疫細胞を生成することによって治療される。
ウイルスの一部において、DCの成熟を活性化および/または刺激するDC成熟因子は、対象となる配列と合わせて送達される。代替例において、DCは、ウイルスの送達前、ウイルスの送達と同時、またはウイルスの送達後に、DC成熟因子の送達によって活性化される。DC成熟因子は、ウイルスの投与とは別に提供されてもよい。
本明細書に記載されるように、1つ以上の免疫調節またはDC成熟因子は、ウイルスゲノムに含有され、ウイルスが樹状細胞に感染させた後に発現される、1つ以上の配列によってコードすることができる。免疫調節因子をコードする配列は、パッケージング細胞株において1つ以上の抗原をコードするウイルスベクターで共トランスフェクトされる、個別のベクターにおいて提供することもできる。
本明細書に記載される方法は、患者における養子免疫療法に使用することができる。上述されるように、免疫反応が所望される抗原が特定される。所望の抗原をコードするポリヌクレオチドが得られ、組み換えウイルスにパッケージ化される。標的樹状細胞を、患者から採取し、所望の抗原をコードするポリヌクレオチドを含有する組み換えウイルスで形質導入する。次いで、樹状細胞を患者に戻す。
ウイルス粒子は、インビボで注入されてもよく、それらは、DCに感染し、通常、抗原をコードする、対象となる配列を送達する。ウイルス粒子の量は、少なくとも3×10IUであり、少なくとも1×10IU、少なくとも3×10IU、少なくとも1×10IU、少なくとも3×10IU、少なくとも1×10IU、または少なくとも3×10IUであり得る。選択した間隔で、レシピエントのリンパ器官からDCを使用して、マーカー発現、例えば、GFPまたはルシフェラーゼを観察することによって、発現を測定してもよい。また、核酸モニタリング技術および逆転写(RT)活性の測定値を使用して、ウイルス粒子の生体内分布を分析することもできる。末梢血単核細胞からのT細胞、リンパ節、膵臓、またはレンチウイルスベクター粒子で治療したレシピエントの悪性もしくは標的病因に感染した組織は、抗原刺激に対する反応の規模および期間から測定されてもよい。DC以外の組織細胞、例えば、上皮細胞およびリンパ系細胞は、インビボ遺伝子送達の特異性に関して分析されてもよい。
ワクチンは、多くの場合、アジュバントを含む。本明細書に記載されるレンチウイルスベクター粒子は、アジュバントとともに投与されてもよい。アジュバントは、組み換えウイルス粒子とともに、組み換えウイルス粒子の前、または組み換えウイルス粒子の後に投与されてもよい。ウイルス粒子とともに投与される場合、望ましいアジュバントは、ウイルス粒子の完全性を著しく崩壊させない、例えば、エンベロープ糖タンパク質を含有するウイルス膜を崩壊させない。
多様なアジュバントをウイルスと合わせて使用して、ウイルスベクターゲノムにおいてコードされる抗原に対する免疫応答を引き起こすことができる。好ましいアジュバントは、応答の定量形態に影響する抗原において構造変化をもたらすことなく、抗原に対する固有応答を増補する。好ましいアジュバントは、ミョウバン、3De−O−アシル化モノホスホリル脂質A(MPL)を含む(英国特許第GB2220211号を参照されたい)。QS21は、南アフリカで見られるQuillaja Saponaria Molinaという木の枝から単離されたトリテルペン配糖体またはサポニンである(Kensil
et al.,in Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach(eds.Powell and Newman,Plenum Press,NY,1995)、米国特許第5,057,540号を参照されたい)。他のアジュバントは、モノホスホリル脂質A等の免疫刺激剤と任意に組み合わせて、水中油エマルション(例えば、スクアレンまたはピーナッツ油)である(Stoute et al.,N.Engl.J.Med.336、86−91(1997)を参照されたい)。別のアジュバントは、CpGである(Bioworld Today,Nov.15,1998)。アジュバントは、活性成分を有する治療組成物の成分として投与することができるか、または治療薬の投与前、投与と同時、または投与後に個別に投与することができる。
一群のアジュバントは、アルミニウム塩(alum)、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等である。そのようなアジュバントは、MPLまたは3−DMP、QS21、ポリマーまたは単量体アミノ酸、例えばポリグルタミン酸またはポリリシン等の他の特定の免疫刺激剤の有無に関わらず使用することができる。別の群のアジュバントは、水中油エマルション製剤である。そのようなアジュバントは、他の特定の免疫刺激剤、例えば、ムラミルペプチド(例えば、N−アセチルムラミル−L−トレオニル−D−イソグルタミン(thr−MDP)、N−アセチル−ノルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン(nor−MDP)、N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1’−2’ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミン(MTP−PE)、N−アセチルグルクサミニル−N−アセチルムラミル−L−Al−D−イソグル−L−アラ−ジパルミトキシプロピルアミド(DTP−DPP)テラミド(商標)、または他の細菌細胞壁成分の有無に関わらず使用することができる。水中油エマルションには、(a)Model 110Y ミクロ流動化剤(Microfluidics,Newton Mass.)等のミクロ流動化剤を使用してサブミクロン粒子に製剤化された5% スクアレン、0.5% Tween80、および0.5% Span85を含有する(任意に様々な量のMTP−PEを含有する)、MF59(国際公開第WO90/14837号)、(b)サブミクロンエマルションにミクロ流動化されるか、または粒径の大きいエマルションを生成するようにボルテックスされる、10% スクアラン、0.4% Tween80、5% プルロン遮断したポリマーL121、およびthr−MDPを含有するSAF、(c)2% スクアレン、0.2% Tween80、ならびにモノリン脂質A(MPL)、トレハロースジミコール酸(TDM)、および細胞壁骨格(CWS)、好ましくはMPL+CWS(Detox(商標))から成る群からの1つ以上の細菌細胞壁成分を含有する、Ribiアジュバント系(RAS)、(Ribi Immunochem,Hamilton,Mont.)が含まれる。別の群の好ましいアジュバントは、サポニンアジュバント、例えば、Stimulon(商標)(QS21,Aquila,Worcester,Mass.)、またはISCOM(免疫刺激複合体)およびISCOMATRIX等からそこで生成される粒子である。他のアジュバントは、完全フロイントアジュバント(CFA)および不完全フロイントアジュバント(IFA)を含む。他のアジュバントは、サイトカイン、例えば、インターロイキン(IL−1、IL−2、およびIL−12)、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、腫瘍壊死因子(TNF)を含む。
本明細書で組成物とともに使用することができる別のアジュバントは、化学式(I)によって特定され、
式中、部分A1およびA2は、水素、リン酸塩、およびリン酸塩から成る群から独立して選択される。ナトリウムおよびカリウムは、リン酸塩の例示的な対イオンである。部分R、R、R、R、R、およびRは、独立して、C−C23によって表される、3〜23個の炭素を有するヒドロカルビルから成る群から選択される。さらなる明瞭さのために、部分が複数のメンバーを有する特定された基「から独立して選択される」とき、第1の部分のために選択されるメンバーは、第2の部分のために選択されたメンバーの選択に決して影響を及ぼさない、または限定しないことを理解すべきである。R、R、R、およびRが結合される炭素原子は、非対称であり、このため、RまたはSの立体化学のいずれかで存在し得る。一実施形態において、これらの炭素原子のすべてはR立体化学であり、一方で、別の実施形態において、これらの炭素原子のすべてはS立体化学である。
「ヒドロカルビル」は、水素および炭素から全体的に形成される化学部分を指し、炭素原子の配置は、直鎖または分岐、非環状または環状であってもよく、隣接する炭素原子間の結合は、全体的に単一結合であってもよく、すなわち、飽和ヒドロカルビルを提供するか、またはあらゆる2つの隣接する炭素原子間に、二重結合または三重結合が存在してもよく、すなわち、不飽和ヒドロカルビルを提供し、ヒドロカルビル基内の炭素原子の数は、3〜24個の炭素原子の間である。ヒドロカルビルは、アルキルであってもよく、代表的な直鎖アルキルは、メチル、エチル、n−プロピル、n−ブチル、n−ペンチル、n−ヘキシル等を含み、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル等を含むが、分岐アルキルは、イソプロピル、sec−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、イソペンチル等を含む。代表的な飽和環状ヒドロカルビルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等を含むが、不飽和環状ヒドロカルビルは、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニル等を含む。不飽和ヒドロカルビルは、隣接する炭素原子の間に少なくとも1つの二重または三重結合を含有する(ヒドロカルビルが非環状である場合は、それぞれ「アルケニル」または「アルキニル」と称され、ヒドロカルビルが少なくとも部分的に環状である場合は、それぞれシクロアルケニルおよびシクロアルキニルと称される。代表的な直鎖および分岐アルケニルには、エチレニル、プロピレニル、1−ブテニル、2−ブテニル、イソブチレニル、1−ペンテニル、2−ペンテニル、3−メチル−1−ブテニル、2−メチル−2−ブテニル、2,3−ジメチル−2−ブテニル等が含まれるが、代表的な直鎖および分岐アルキニルには、アセチレニル、プロピニル、1−ブチニル、2−ブチニル、1−ペンチニル、2−ペンチニル、3−メチル−1−ブチニル等が含まれる。
式(I)のアジュバントは、当該技術分野で知られている合成方法、例えば、PCT国際公開第WO2009/035528号(参照により本明細書に組み込まれる)、ならびに国際公開第WO2009/035528号において特定される出版物(これらの出版物のそれぞれも参照により本明細書に組み込まれる)において開示される合成方法論によって得られてもよい。あるアジュバントはまた、商業的に得られてもよい。好ましいアジュバントは、Avanti Polar Lipids,Alabaster,ALのカタログで特定される、製品番号699800であり、E10と組み合わせた以下のE1を参照されたい。
本開示の様々な実施形態において、アジュバントは、式(I)の化学構造を有するが、部分A1、A2、R1、R2、R3、R4、R5、およびR6は、これらの部分のために前に提供される選択肢のうちのサブセットから選択され、これらのサブセットは、E1、E2等によって以下に特定される。
E1:Aは、リン酸またはリン酸塩であり、Aは水素である。
E2:R、R、R、およびRは、C−C21アルキルであり、RおよびRは、C−C23ヒドロカルビルである。
E3:R、R、R、およびRは、C−C17アルキルであり、RおよびRは、C−C19ヒドロカルビルである。
E4:R、R、R、およびRは、C−C15アルキルであり、RおよびRは、C−C17ヒドロカルビルである。
E5:R、R、R、およびRは、C−C13アルキルであり、RおよびRは、C11−C15ヒドロカルビルである。
E6:R、R、R、およびRは、C−C15アルキルであり、RおよびRは、C11−C17ヒドロカルビルである。
E7:R、R、R、およびRは、C−C13アルキルであり、RおよびRは、C−C15ヒドロカルビルである。
E8:R、R、R、およびRは、C11−C20アルキルであり、RおよびRは、C12−C20ヒドロカルビルである。
E9:R、R、R、およびRは、C11アルキルであり、RおよびRは、C13ヒドロカルビルである。
E10:R、R、R、およびRは、ウンデシルであり、RおよびRは、トリデシルである。
ある選択肢において、E2からE10のそれぞれは、実施形態E1と組み合わせられる、および/またはE2からE9のヒドロカルビル基は、アルキル基、好ましくは直鎖アルキル基である。
式(I)のアジュバントは、任意に共アジュバントとともに、薬学的組成物に製剤化されてもよく、それぞれ以下に論じられる通りである。この点において、製剤、例えば、GLAアジュバントの水性製剤(AF)および安定したエマルション製剤(SE)を提供する、米国特許公開第2008/0131466号が参照され、これらの製剤は、式(I)のアジュバントのいずれかに利用されてもよい。
アジュバントは、単一組成物として本開示のウイルスとともに投与することができるか、または本開示の組み換えウイルスの投与前、投与と同時、または投与後に投与することができる。免疫原およびアジュバントは、同一バイアルにパッケージ化して供給することができるか、または個別のバイアルにパッケージ化して、使用前に混合することができる。免疫原およびアジュバントは、通常、意図される治療的適応を示すラベルとともにパッケージ化される。免疫原およびアジュバントが別々にパッケージ化される場合、パッケージ化は、通常、使用前に混合するための説明書を含む。アジュバントおよび/または担体の選択は、アジュバントを含有するワクチンの安定性、投与経路、投薬スケジュール、ワクチン接種される種のアジュバントの有用性に依存し、ヒトにおいて、薬学的に許容されるアジュバントは、認可されたものであるか、または関連規制機関によってヒトへの投与が承認される。例えば、完全フロイントアジュバントは、ヒト投与に適切ではない。ミョウバン、MPL、およびQS21が好ましい。任意に、2つ以上の異なるアジュバントを同時に使用することができ、例えば、ミョウバンとMPL、ミョウバンとQS21、MPLとQS21、およびミョウバン、QS21とMPLを一緒に使用することができる。また、不完全フロイントアジュバントは、任意に、ミョウバン、QS21、およびMPL、ならびにそれらのすべての組み合わせと併せて、使用することができる(Chang et al.,Advanced Drug Delivery Reviews 32,173−186(1998))。
薬学的組成物およびキット
また、本明細書に提供されるウイルスおよび1つ以上の成分を含有する、薬学的組成物およびキットも、本明細書に企図される。薬学的組成物は、本明細書に提供されるウイルスベクター粒子、および薬学的担体を含むことができる。キットは、本明細書に提供される薬学的組成物および/または組み合わせ、ならびに1つ以上の成分、例えば、使用に関する説明書、化合物を被検体に投与するためのデバイス、および化合物を被検体に投与するためのデバイスを含むことができる。
本明細書に提供されるようなウイルス粒子を含有する薬学的組成物、および適切な薬学的担体が本明細書において提供される。本明細書に提供される薬学的組成物は、種々の形態、例えば、固体、液体、粉末、含水、または凍結乾燥形態であり得る。適切な薬学的担体の例は、当該技術分野で知られている。そのような担体および/または添加剤は、従来の方法によって製剤することができ、適切な用量で被検体に投与することができる。脂質、ヌクレアーゼ阻害剤、ポリマー、およびキレート化剤等の安定化剤は、体内の分解から組成物を保存することができる。
本明細書に提供されるウイルスベクター粒子は、キットとしてパッケージ化することができる。キットは、使用に関する説明書、デバイス、および追加の試薬等の1つ以上の成分、ならびに方法を実践するための管、容器、およびシリンジ等の成分を任意に含むことができる。例示的なキットには、本明細書に提供されるウイルスを含むことができ、使用に関する説明書、被検体内のウイルスを検出するためのデバイス、ウイルスを被検体に投与するためのデバイス、および化合物を被検体に投与するためのデバイスを任意に含むことができる。
対象となる遺伝子(通常、抗原)をコードするポリヌクレオチドを含むキットもまた、本明細書に企図される。キットは、ウイルスパッケージング成分をコードする少なくとも1つのプラスミド、およびシンドビスウイルスE2糖タンパク質変異体をコードするベクターを含んでもよい。一部のキットは、ウイルスパッケージング成分をコードする少なくとも1つのプラスミド、シンドビスウイルスE2糖タンパク質変異体をコードするベクター、および少なくとも1つのDC成熟因子をコードするベクターを含有する。
対象となる配列(通常、抗原)をコードするウイルスベクター、および任意にDC成熟因子をコードするポリヌクレオチド配列を含むキットもまた、本明細書に企図される。一部のキットにおいて、キットは、ウイルスパッケージング成分をコードする少なくとも1つのプラスミドおよびシンドビスウイルスE2糖タンパク質変異体をコードするベクターを含む。
キットは、説明書を含んでもよい。説明書は、通常、ウイルスを説明する具体的な表現、および任意に、キットに含まれる他の成分、およびウイルスを投与するための被検体の適切な状態、適切な投与量、および適切な投与方法を含む、投与の方法を含む。説明書は、治療期間にわたって被検体をモニタリングするためのガイダンスを含むこともできる。
本明細書に提供されるキットは、ウイルスを被検体に投与するためのデバイスを含むこともできる。薬剤またはワクチンを投与するための当該技術分野で知られている多様なデバイスのいずれかを、本明細書に提供されるキットに含めることができる。例示的デバイスには、皮下注射針、静脈注射針、カテーテル、無針注入デバイス、吸入器、および液体ディスペンサー、例えば点眼器が挙げられるが、これらに限定されない。通常、キットのウイルスを投与するためのデバイスは、キットのウイルスに適合し、例えば、高圧注入デバイス等の無針注入デバイスを、高圧注入によって損傷されないウイルスとともに、キットに含めることができるが、通常、高圧注入によって損傷されるウイルスとともに、キットに含まれない。
本明細書に提供されるキットは、DC活性剤または刺激剤等の化合物を被検体に投与するためのデバイスを含むこともできる。薬剤を被検体に投与するための当該技術分野で知られている多様なデバイスのいずれかを、本明細書に提供されるキットに含めることができる。例示的なデバイスには、皮下注射針、静脈注射針、カテーテル、無針注入デバイスが挙げられ、皮下注射針、静脈注射針、カテーテル、無針注入デバイス、吸入器、および液体ディスペンサー、例えば点眼器が挙げられるが、これらに限定されない。通常、キットの化合物を投与するためのデバイスは、化合物の投与に関する望ましい方法に適合する。
例示的な実施形態
偽型レンチウイルスベクター粒子を生成する方法
本開示のいくつかの実施形態において、偽型レンチウイルスベクター粒子を生成する方法は、
(a)マンノシダーゼI阻害剤を含む培養培地中で、
(1)外因性抗原をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターゲノムと、
(2)DC−SIGNを発現する樹状細胞に優先的に結合するアルファウイルス糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
(3)SAMHD1阻害剤をコードするポリヌクレオチドとを含むウイルスパッケージング細胞を培養することと、
(b)DC−SIGNを発現する樹状細胞に優先的に結合する偽型レンチウイルスベクター粒子を単離することと、を含む。
特定の態様において、マンノシダーゼ阻害剤は、キフネンシンまたはDMNJである。
特定の態様において、アルファウイルス糖タンパク質は、シンドビスウイルスE2糖タンパク質である。
特定の態様において、SAMHD1阻害剤は、Vpxタンパク質、例えば、SIVmac Vpxタンパク質、SIVsmタンパク質、SIVrcm、またはHIV−2 Vpxタンパク質である。特定の態様において、SAMHD1阻害剤は、抗体またはその断片である。特定の態様において、SAMHD1阻害剤は、SAMHD1を阻害する能力を有するVprタンパク質、例えば、SIVdeb Vprタンパク質またはSIVmus Vprタンパク質である。
本開示のいくつかの実施形態において、偽型レンチウイルスベクター粒子を生成する方法は、
(a)キフネンシンを含む培養培地中で、
(1)外因性抗原をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターゲノムと、
(2)DC−SIGNを発現する樹状細胞に優先的に結合するシンドビスE2糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
(3)SAMHD1阻害活性を保持するVpxタンパク質またはVprタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含むウイルスパッケージ化細胞を培養することと、
(b)DC−SIGNを発現する樹状細胞に優先的に結合する偽型レンチウイルスベクター粒子を単離することと、を含む。
特定の態様において、E2糖タンパク質は、配列番号30[SIN−Var1]と90%同一である。いくつかの態様において、(i)E2糖タンパク質の残基160は、不在であるか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸であり、(ii)E2糖タンパク質変異体の残基70、76、もしくは159のうちの1つ以上は、非塩基性残基であり、(iii)E2糖タンパク質変異体は、シンドビスウイルスE3糖タンパク質との融合タンパク質の一部ではない。いくつかの態様において、E2糖タンパク質は、配列番号30[SIN−Var1]である。
特定の態様において、Vpxタンパク質は、SIVmac Vpx(配列番号44)と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む。
特定の態様において、Vpxタンパク質は、SIVmac Vpx(配列番号44)、SIVsm Vpx(配列番号45)、SIVrcm Vpx(配列番号46)、またはHIV−2 Vpx(配列番号47)と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様において、Vpxタンパク質は、SIVmac Vpx(配列番号44)、SIVsm Vpx(配列番号45)、SIVrcm Vpx(配列番号46)、またはHIV−2 Vpx(配列番号47)と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む。
特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはレンチウイルスベクターパッケージングシステムのVprタンパク質は、SIVdeb Vpr(配列番号48)またはSIVmus Vpr(配列番号49)と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはレンチウイルスベクターパッケージングシステムのVprタンパク質は、SIVdeb Vpr(配列番号48)またはSIVmus Vpr(配列番号49)と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む。
特定の態様において、抗原は、腫瘍特異的抗原またはウイルス特異的抗原である。いくつかの態様において、腫瘍特異的抗原は、NY−ESO−1、MAGE、例えば、MAGE−A3およびMAGE−A1、MART−1/Melan−A、BAGE、RAGE、gp100、gp75、mda−7、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質、例えば、TRP2、腎細胞癌抗原、5T4、SM22−アルファ、炭酸脱水酵素I、炭酸脱水酵素IX(G250としても知られる)、HIF−1アルファ、HIF−2アルファ、VEGF、前立腺特異性膜抗原(PSMA)、前立腺特異的抗原(PSA)、前立腺酸性リン酸塩、前立腺の6−膜貫通上皮抗原(STEAP)、NKX3.1、テロメラーゼ酵素、スルビビン、メソテリン、変異型ras、bcr/abl再構成、Her2/neu、変異型p53、野生型p53、サイトクロームP450 1B1、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−V、ヒトパピローマウイルスタンパク質E6、ヒトパピローマウイルスタンパク質E7、癌胎児性抗原、メルケル細胞ウイルスT抗原癌タンパク質、およびアルファ−フェトタンパク質から成る群から選択される。いくつかの態様において、ウイルス特異的抗原は、HIV抗原、SIV抗原、アデノウイルス抗原、エンテロウイルス抗原、コロナウイルス抗原、カリシウイルス抗原、ジステンパーウイルス抗原、エボラウイルス抗原、フラビウイルス抗原、肺炎ウイルス抗原、ヘルペスウイルス抗原、感染性腹膜炎ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、白血病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、オルトミクソウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、パラインフルエンザウイルス抗原、パラミクソウイルス抗原、パラボウイルス抗原、ペスチウイルス抗原、ピコルナウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ポックスウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、レオウイルス抗原、レトロウイルス抗原、またはロタウイルス抗原である。
特定の態様において、レンチウイルスベクターゲノムは、第2の抗原をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。特定の態様において、第1および第2の抗原は、2つの抗原の間に自己切断型A2ペプチドを含む融合タンパク質として発現される。いくつかの態様において、自己切断型A2ペプチドは、配列番号56または配列番号57のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、第1の抗原は、NY−ESO−1であり、第2の抗原は、MAGE−A3である。
特定の態様において、キフネンシンは、約0.1μg/ml〜約10μg/mlの濃度で、培養培地中に存在する。いくつかの態様において、キフネンシンは、約0.25μg/ml〜約2μg/mlの濃度で、培養培地中に存在する。いくつかの態様において、キフネンシンは、約0.01μg/ml〜約1mg/mlの濃度で、培養培地中に存在する。
特定の態様において、ウイルスパッケージング細胞は、
(i)gagおよびpol遺伝子を含むポリヌクレオチドと、
(ii)revタンパク質をコードするポリヌクレオチドとをさらに含む。いくつかの態様において、Vpxタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、revタンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはgagおよびpol遺伝子を含むポリヌクレオチドと同じまたは異なるプラスミド上にある。いくつかの態様において、gagおよびpol遺伝子は、ヒトのコドンに最適化され、配列番号54の1228〜1509位周辺に最適化されないウインドウを含む。いくつかの態様において、gagおよびpol遺伝子を含むポリヌクレオチドは、機能的rev応答要素(RRE)を欠いている。いくつかの態様において、pol遺伝子は、不活性インテグラーゼ酵素をコードする。いくつかの態様において、インテグラーゼ酵素は、D64V突然変異体を有する。
特定の態様において、レンチウイルスベクターゲノムは、HIV−1由来である。
特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはパッケージングシステムのレンチウイルスベクターゲノムは、組み込みができる。
特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはパッケージングシステムのレンチウイルスベクターゲノムは、組み込み不良または組み込み不能である。例えば、レンチウイルスベクターは、組み込み可能なウイルスベクターよりも効率が少なくとも10倍(例えば、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、少なくとも90倍、少なくとも100倍、少なくとも150倍、少なくとも200倍、少なくとも250倍、少なくとも300倍、少なくとも350倍、少なくとも400倍、少なくとも450倍、少なくとも500倍、少なくとも550倍、少なくとも600倍、少なくとも650倍、少なくとも700倍、少なくとも750倍、少なくとも800倍、少なくとも850倍、少なくとも900倍、少なくとも950倍、または少なくとも1000倍)少ない頻度で組み込んでもよい。例示的な実施形態において、レンチウイルスベクターは、組み込むときに、効率が少なくとも約20倍〜約100倍少なくてもよい。
特定の態様において、レンチウイルスベクターゲノムは、不活性化された3’側の長い末端反復(LTR)または自己不活性化された3’側の長い末端反復(LTR)を有する。いくつかの態様において、レンチウイルスベクターゲノムは、エンハンサー配列、TATAボックス、Sp1部位、NK−カッパB部位、またはポリプリン区画(PPT)のうちの少なくとも1つを欠いているU3要素を含む。いくつかの態様において、pol遺伝子は、不活性インテグラーゼ酵素をコードし、レンチウイルスベクターゲノムは、機能的ポリプリン区画(PPT)を欠いている。
特定の態様において、レンチウイルスベクターゲノムは、配列番号21[SINベクター]、22[703ベクター]、または23[704ベクター]のうちのいずれか1つのヌクレオチド配列を含む。
特定の態様において、レンチウイルスベクターゲノムは、樹状細胞成熟/刺激因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの態様において、樹状細胞成熟/刺激因子は、GM−CSF、IL−2、IL−4、IL−6、IL−7、IL−15、IL−21、IL−23、TNFα、B7.1、B7.2、4−1BB、CD40リガンド、および薬物誘導CD40から成る群から選択される。
特定の態様において、抗原をコードするヌクレオチド配列は、ヒトユビキチンCプロモーター(UbiC)、サイトメガロウイルス前初期プロモ−ター(CMV)、ラウス肉腫ウイルスプロモ−ター(RSV)、およびテトラサイクリン応答プロモ−ターから成る群から選択されるプロモ−ターに作動可能に連結している。いくつかの態様において、プロモーターは、イントロン欠損プロモーターである。いくつかの態様において、イントロン欠損プロモーターは、UbiCである。
特定の態様において、段落[0206]、[0210]、または[0218]に記載の方法によって産生されるレンチウイルスベクター粒子が、提供される。
特定の態様において、段落[0216]に記載の方法によって産生されるレンチウイルスベクター粒子が、提供される。
偽型レンチウイルスベクター粒子を含む組成物
本開示のいくつかのまたは任意の実施形態において、(a)SAMHD1阻害活性を保持するVpxタンパク質またはVprタンパク質と、(b)抗原をコードする外因性ポリヌクレオチドと、(c)DC−SIGNを発現する細胞に優先的に結合する複数のエンベロープ糖タンパク質とを含む偽型レンチウイルスベクター粒子を含む組成物が提供され、この組成物は、マンノシダーゼ阻害剤の不在下で調製された同じ偽型レンチウイルスベクター粒子の対照組成物と比較して、より高度にマンノシル化されている。例えば、そのような高度にマンノシル化されている組成物は、マンノシダーゼ阻害剤の不在下で調製された対照組成物のエンベロープ糖タンパク質よりもさらにEndoH感受性であるエンベロープ糖タンパク質を含有することを特徴とする。別例として、そのような高度にマンノシル化されている組成物は、マンノシダーゼ阻害剤の不在下で調製された対照組成物のエンベロープ糖タンパク質と比較して、増加した量のEndoH感受性グリカンを示すエンベロープ糖タンパク質を含有することを特徴とする。対照組成物は、同じアミノ酸配列(複数を含む)を有するエンベロープ糖タンパク質を含むほぼ同じ数の偽型レンチウイルスベクター粒子を含有することが理解される。また、本開示は、主に、樹状細胞および高度にマンノシル化されているその変形への認識および結合に関与するアルファウイルスE2糖タンパク質に着目しているが、このアルファウイルスエンベロープもまた、高マンノシル化に影響を受けやすいE1糖タンパク質を含有することも理解される。したがって、エンベロープ糖タンパク質および高度にマンノシル化されているエンベロープ糖タンパク質への参照は、高度にマンノシル化されているアルファウイルスE2および/またはE1糖タンパク質、具体的には、高度にマンノシル化されているシンドビスE2および/またはE1糖タンパク質への参照を含む。他の種類のウイルスエンベロープ、具体的には、レトロウイルスエンベロープの高マンノシル化はまた、樹状細胞の認識を向上させる。
本開示のいくつかの実施形態において、(a)SAMHD1阻害活性を保持するVpxタンパク質またはVprタンパク質と、(b)抗原をコードする外因性ポリヌクレオチドと、(c)DC−SIGNを発現する細胞に優先的に結合する複数のシンドビスE2糖タンパク質とを含む偽型レンチウイルスベクター粒子を含む組成物が提供され、この組成物は、マンノシダーゼ阻害剤の不在下で調製された偽型レンチウイルスベクター粒子の対照組成物と比較して、より高度にマンノシル化されている。そのような組成物中の相当な数のE2糖タンパク質は、マンノシダーゼ阻害剤の不在下で調製された対照組成物中のE2糖タンパク質よりも、より高度にマンノシル化されている、例えば、よりEndoH感受性がある。
EndoHは、高マンノースN連結グリコシル化のみを切断する特殊化したエンドグリコシダーゼ(図3Aを参照されたい)、例えば、Man5〜9グリカンであり、Man3〜4グリカンは、EndoHに対して耐性がある。対照的に、PNGase Fは、低マンノースグリカン<Man5を含む、すべての種類のグリコシル化を切断する。ウイルス粒子が、キフネンシン等のマンノシダーゼI阻害剤の存在下で産生されるとき、ウイルスエンベロープ中の糖タンパク質は、EndoHによる切断の影響を受けやすいより高いマンノースグリカンを含有する(すなわち、より「EndoH感受性」がある)。ウイルス粒子の組成物中の高マンノースグリカンの存在を検出する1つの方法は、EndoH処理後、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)による電気泳動によって、エンベロープ糖タンパク質の分子量を決定することである。この「ゲルシフト」アッセイを、実施例3に示す。ウイルス粒子の試料、およびマンノシダーゼ阻害剤の不在下で調製された同じウイルス粒子の対照組成物は、10% SDS−PAGEゲル上で泳動し、シンドビス糖タンパク質に対する抗体で免疫ブロットを行った。マンノシダーゼI阻害剤の存在下で産生されるウイルスエンベロープは、対照ウイルスと比較して、さらにEndoH感受性であり、そのため、EndoH処理後、(さらに遠い)ゲル上でより速く泳動する。したがって、高マンノース糖タンパク質の存在が、EndoH処理後にゲルシフトアッセイを使用して測定することができる。
対照ウイルスは、内部にあり、産生中、マンノシダーゼIに曝露しないため、通常、高マンノースであるシンドビス糖タンパク質におけるグリコシル化部位の存在により、EndoH処理に対して部分的に感受性であり得る。したがって、10% SDS−PAGE上で泳動する場合、対照ウイルスは、そのような内部の高マンノースグリカンのEndoH切断により、EndoH処理後、分子量においていくつかのシフトを阻害し得る。しかしながら、このシフトは、対照ウイルスが、グリカンのすべてを切断するPNGase Fにより処理される場合、わずか約35%のシフトが見られ得る。
したがって、特定の態様において、EndoH感受性グリカンの量は、EndoH処理後のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)によって、シンドビス糖タンパク質の分子量を判定することによって検出される。目視検査によって判定されるように、ウイルス粒子の組成物が高度にマンノシル化されていることを示す、組成物中の増加した量のendoH感受性グリカンは、EndoH処理が、対照エンベロープ糖タンパク質と比較して、低分子量に対してシフトしている10% SDS−PAGEゲル上でエンベロープ(E2および/またはE1)糖タンパク質に対応するバンドをもたらす場合に検出される。
いくつかの例示的な実施形態において、EndoHによる処理後の当該エンベロープ糖タンパク質の分子量は、完全にシフトされており、実質的には、PNGaseFによる処理後の当該エンベロープ糖タンパク質の分子量と同じである。他の例示的な実施形態において、EndoHによる処理後の当該エンベロープ糖タンパク質の分子量は、(a)エンドグリコシダーゼにより処理されないエンベロープ糖タンパク質と、(b)PNGase
Fにより処理されるエンベロープ糖タンパク質との間の距離の約90%以上シフトしている。他の例示的な実施形態において、EndoHによる処理後の当該エンベロープ糖タンパク質の分子量は、(a)エンドグリコシダーゼにより処理されないエンベロープ糖タンパク質と、(b)PNGase Fにより処理されるエンベロープ糖タンパク質との間の距離の約90%以上シフトしている。さらに他の例示的な実施形態において、当該エンベロープ糖タンパク質の分子量は、(a)エンドグリコシダーゼにより処理されないエンベロープ糖タンパク質と、(b)PNGase Fにより処理されたエンベロープ糖タンパク質との間の距離の約40%以上、または好ましくは約45%以上、または約50%以上、または約55%以上、または約60%以上、または約65%以上、または約70%以上、または約75%以上、または約80%以上、または約85%以上シフトしている。上述のように、エンベロープ糖タンパク質への参照は、具体的には、シンドビスE2および/またはE1糖タンパク質への参照を含む。
特定の態様において、当該組成物中のエンベロープ糖タンパク質、例えば、当該組成物中のシンドビスE2および/またはE1糖タンパク質のうちの少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%が、マンノシダーゼ阻害剤の不在下で調製された偽型レンチウイルスベクター粒子の対照組成物中の同じアミノ酸配列(複数を含む)を有する対照エンベロープ糖タンパク質と比較して、増加した量のEndoH感受性グリカンを有する。
本開示のいくつかの実施形態において、組成物は、(a)SAMHD1阻害剤と、(b)対象となる配列を含むレンチウイルスゲノムと、(c)DC−SIGNを発現する細胞に優先的に結合するエンベロープ糖タンパク質とを含む偽型レンチウイルスベクター粒子を含み、当該組成物中のN連結グルカンのうちの少なくとも80%は、Man構造を含む。
特定の態様において、SAMHD1阻害剤は、Vpxタンパク質、例えば、SIVmac Vpxタンパク質、SIVsm Vpxタンパク質、SIVrcm Vpxタンパク質、またはHIV−2 Vpxタンパク質である。特定の態様において、SAMHD1阻害剤は、抗体またはその断片である。特定の態様において、SAMHD1阻害剤は、SAMHD1を阻害する能力を有するVprタンパク質、例えば、SIVdeb Vprタンパク質またはSIVmus Vprタンパク質である。
特定の態様において、対象となる配列は、タンパク質、または核酸分子、例えば、siRNA、ミクロRNA、相補領域が約20リボヌクレオチド長よりも大きい自己相補二本鎖RNA、もしくはメッセージRNAに相補的なRNAをコードし、メッセージRNAに対する当該相補(アンチセンス)RNAの結合は、そのタンパク質に翻訳される能力を遮断する。場合によっては、対象となる配列は、免疫応答が望ましい抗原をコードする。特定の態様において、対象となる配列は、腫瘍抗原、または(例えば、HIV、HSV、HCV、HPV、マラリア、または結核等の病原体からの)感染疾患抗原をコードする。特定の態様において、対象となる複数の配列は、単一ベクター内に含まれる。
本開示のいくつかの実施形態において、組成物は、(a)Vpxタンパク質と、(b)抗原をコードする外因性ポリヌクレオチドと、(c)DC−SIGNを発現する樹状細胞に優先的に結合するエンベロープ糖タンパク質とを含む偽型レンチウイルスベクター粒子を含み、当該組成物中のN連結グルカンのうちの少なくとも80%は、Man構造を含む。
特定の態様において、Vpxタンパク質は、SIVmac Vpxタンパク質(配列番号44)と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む。
特定の態様において、Vpxタンパク質は、SIVmac Vpx(配列番号44)、SIVsm Vpx(配列番号45)、SIVrcm Vpx(配列番号46)、またはHIV−2 Vpx(配列番号47)と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様において、Vpxタンパク質は、SIVmac Vpx(配列番号44)、SIVsm Vpx(配列番号45)、SIVrcm Vpx(配列番号46)、またはHIV−2 Vpx(配列番号47)と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む。
特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはレンチウイルスベクターパッケージングシステムのVprタンパク質は、SIVdeb Vpr(配列番号48)またはSIVmus Vpr(配列番号49)と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはレンチウイルスベクターパッケージングシステムのVprタンパク質は、SIVdeb Vpr(配列番号48)またはSIVmus Vpr(配列番号49)と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む。
特定の態様において、偽型レンチウイルスベクター粒子を、少なくとも少なくとも1%、または少なくとも5%、または少なくとも10%、または少なくとも20%のインビトロ形質導入の有効性によりDC−SIGNを発現する樹状細胞に感染させる。
特定の態様において、糖タンパク質は、シンドビスウイルスE2糖タンパク質である。いくつかの態様において、E2糖タンパク質は、配列番号30[SIN−Var1]と少なくとも90%同一性を有する。いくつかの態様において、(i)E2糖タンパク質の残基160は、不在であるか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸であり、(ii)E2糖タンパク質変異体の残基70、76、もしくは159のうちの1つ以上は、非塩基性残基であり、(iii)E2糖タンパク質変異体は、シンドビスウイルスE3糖タンパク質との融合タンパク質の一部ではない。
特定の態様において、抗原は、腫瘍特異的抗原またはウイルス特異的抗原である。いくつかの態様において、腫瘍特異的抗原は、NY−ESO−1、MAGE、例えば、MAGE−A3およびMAGE−A1、MART−1/Melan−A、BAGE、RAGE、gp100、gp75、mda−7、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質、例えば、TRP2、腎細胞癌抗原、5T4、SM22−アルファ、炭酸脱水酵素I、炭酸脱水酵素IX(G250としても知られる)、HIF−1アルファ、HIF−2アルファ、VEGF、前立腺特異性膜抗原(PSMA)、前立腺特異的抗原(PSA)、前立腺酸性リン酸塩、前立腺の6−膜貫通上皮抗原(STEAP)、NKX3.1、テロメラーゼ酵素、スルビビン、メソテリン、変異型ras、bcr/abl再構成、Her2/neu、変異型p53、野生型p53、サイトクロームP450 1B1、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−V、ヒトパピローマウイルスタンパク質E6、ヒトパピローマウイルスタンパク質E7、癌胎児性抗原、メルケル細胞ウイルスT抗原癌タンパク質、およびアルファ−フェトタンパク質から成る群から選択される。いくつかの態様において、ウイルス特異的抗原は、HIV抗原、SIV抗原、アデノウイルス抗原、エンテロウイルス抗原、コロナウイルス抗原、カリシウイルス抗原、ジステンパーウイルス抗原、エボラウイルス抗原、フラビウイルス抗原、肺炎ウイルス抗原、ヘルペスウイルス抗原、感染性腹膜炎ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、白血病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、オルトミクソウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、パラインフルエンザウイルス抗原、パラミクソウイルス抗原、パラボウイルス抗原、ペスチウイルス抗原、ピコルナウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ポックスウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、レオウイルス抗原、レトロウイルス抗原、またはロタウイルス抗原である。
特定の態様において、レンチウイルスベクターゲノムは、第2の抗原をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。特定の態様において、第1および第2の抗原は、2つの抗原の間に自己切断型A2ペプチドを含む融合タンパク質として発現される。いくつかの態様において、自己切断型A2ペプチドは、配列番号56または配列番号57のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、第1の抗原は、MAGE−A3であり、第2の抗原は、NY−ESO−1である。
特定の態様において、レンチウイルスベクターゲノムは、HIV−1由来である。
特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはパッケージングシステムのレンチウイルスベクターゲノムは、組み込みができる。
特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはパッケージングシステムのレンチウイルスベクターゲノムは、組み込み不能または組み込み不良である。
特定の態様において、レンチウイルスベクターゲノムは、不活性化された3’側の長い末端反復(LTR)または自己不活性化された3’側の長い末端反復(LTR)を有する。いくつかの態様において、レンチウイルスベクターゲノムは、エンハンサー配列、TATAボックス、Sp1部位、NK−カッパB部位、またはポリプリン区画(PPT)のうちの少なくとも1つを欠いているU3要素を含む。
特定の態様において、レンチウイルスベクターゲノムは、配列番号21[SINベクター]、22[703ベクター]、または23[704ベクター]のうちのいずれか1つのヌクレオチド配列を含む。
特定の態様において、レンチウイルスベクターゲノムは、樹状細胞成熟/刺激因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの態様において、樹状細胞成熟/刺激因子は、GM−CSF、IL−2、IL−4、IL−6、IL−7、IL−15、IL−21、IL−23、TNFα、B7.1、B7.2、4−1BB、CD40リガンド、および薬物誘導CD40から成る群から選択される。
特定の態様において、抗原をコードするヌクレオチド配列は、ヒトユビキチンCプロモーター(UbiC)、サイトメガロウイルス前初期プロモ−ター(CMV)、ラウス肉腫ウイルスプロモ−ター(RSV)、およびテトラサイクリン応答プロモ−ターから成る群から選択されるプロモ−ターに作動可能に連結している。いくつかの態様において、プロモーターは、修飾して、イントロンを欠損している。
いくつかの態様において、偽型レンチウイルスベクター粒子は、Revタンパク質を含む。
特定の態様において、偽型レンチウイルスベクター粒子は、少なくとも10/mLのIUを有する。
特定の態様において、組成物は、免疫刺激剤をさらに含む。
特定の態様において、組成物は、アジュバントをさらに含む。例えば、上述のような、アジュバントは、ミョウバン、または3 De−O−アシル化モノホスホリル脂質A(MPL)を含む。本明細書に開示されるアジュバントの種類には、(a)アルミニウム塩、(b)任意に他の特定の免疫刺激剤、例えば、ムラミルペプチド、または他の細菌細胞壁成分を含む、または含まない、水中油型エマルション製剤、(c)ISCOM(免疫刺激複合体)およびISCOMATRIXを含むサポニンアジュバント、(d)完全フロイントアジュバント(CFA)および不完全フロイントアジュバント(IFA)、(e)サイトカイン、ならびに(f)式(I)のアジュバントが含まれる。式(I)内で、好ましいアジュバントは、Avanti Polar Lipids,Alabaster,ALのカタログに特定される、製品番号699800であり、E10と組み合わせたE1であり、(i)Aは、リン酸またはリン酸塩であり、Aは、水素であり、(ii)R、R、R、およびRは、ウンデシルであり、RおよびRは、トリデシルである。特定の態様において、エンベロープ糖タンパク質はまた、マウスSIGNR1を発現する細胞に結合する。
特定の態様において、偽型レンチウイルスベクター粒子はまた、マウスSIGNR1を発現しない細胞と比較して、マウスSIGNR1を発現する細胞をより効率的に形質導入する。
本開示のいくつかの実施形態において、上述の偽型レンチウイルスベクター粒子は、患者における疾患または障害の治療または予防の方法で使用する。特定の態様において、疾患または障害は、癌、自己免疫疾患、または感染、例えば、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、または寄生虫感染である。
Vpxタンパク質を含むウイルスベクター粒子
本開示のいくつかの実施形態において、発現する細胞を標的とすることが可能である偽型レンチウイルスベクター粒子が提供され、
(a)非天然エンベロープ糖タンパク質と、
(b)対象となる外因性ポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターゲノムと、
(c)Vpxタンパク質または他のSAMHD1阻害剤とを含む。
いくつかの態様において、偽型レンチウイルスベクター粒子は、Revタンパク質をさらに含む。
本開示のいくつかの実施形態において、偽型レンチウイルスベクター粒子を産生するためのレンチウイルスベクターパッケージングシステムが提供され、
(i)非天然エンベロープ糖タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドと、
(ii)gagおよびpol遺伝子を含む第2のポリヌクレオチドと、
(iii)revタンパク質をコードする第3のポリヌクレオチドと、
(iv)Vpxタンパク質または他のSAMHD1阻害剤をコードする第4のポリヌクレオチドと、
(v)対象となる外因性ポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターゲノムとを含み、
2つ以上のポリヌクレオチドは、同じプラスミドまたは異なるプラスミド上にある。特定の態様において、(iv)のポリヌクレオチドは、(i)、(ii)、(iii)、または(v)のポリヌクレオチドのうちのいずれか1つ以上と同じプラスミド上にある。
特定の態様において、パッケージング細胞は、293、293T、HeLa、D17、MDCK、BHK、およびCf2Th細胞から成る群から選択される。
特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはレンチウイルスベクターパッケージングシステムのVpxタンパク質は、配列番号44(SIVmac)、任意に、SIVmac Vpxタンパク質(配列番号44)、SIVsm Vpxタンパク質(配列番号45)、SIVrcm Vpxタンパク質(配列番号46)、またはHIV−2 VPXタンパク質(配列番号47)と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはレンチウイルスベクターパッケージングシステムのVpxタンパク質は、配列番号44(SIVmac)、任意に、SIVmac Vpxタンパク質(配列番号44)、SIVsm Vpxタンパク質(配列番号45)、SIVrcm Vpxタンパク質(配列番号46)、またはHIV−2 VPXタンパク質(配列番号47)と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む。
特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはレンチウイルスベクターパッケージングシステムのVprタンパク質は、SIVdeb Vpr(配列番号48)またはSIVmus Vpr(配列番号49)と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはレンチウイルスベクターパッケージングシステムのVprタンパク質は、SIVdeb Vpr(配列番号48)またはSIVmus Vpr(配列番号49)と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む。
特定の態様において、上記の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはレンチウイルスベクターパッケージングシステムのレンチウイルスベクターゲノムは、HIV−1またはMLV由来である。
特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはパッケージングシステムのレンチウイルスベクターゲノムは、組み込みができる。
特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはパッケージングシステムのレンチウイルスベクターゲノムは、非組み込みである。
特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはパッケージングシステムの非天然エンベロープ糖タンパク質は、アルファウイルス糖タンパク質、例えば、シンドビスE2糖タンパク質、VEE E2糖タンパク質、ラブドウイルスまたはベシクロウイルス糖タンパク質等、VSV−G糖タンパク質、アレナウイルス糖タンパク質、コロナウイルス糖タンパク質、パラミクソウイルス糖タンパク質、フラビルウイルス糖タンパク質、オルトミクソウイルス糖タンパク質、およびバキュロウイルス糖タンパク質等、好ましくは、シンドビスウイルス等のアルファウイルスから成る群から選択される。
特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはパッケージングシステムの非天然エンベロープ糖タンパク質は、配列番号30[SINVar1]と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含むシンドビスウイルスE2糖タンパク質である。
特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはパッケージングシステムの非天然エンベロープ糖タンパク質は、SAMHD1を発現する細胞に優先的に結合する。いくつかの態様において、SAMHD1を発現する細胞は、骨髄細胞、任意に、樹状細胞、単球、またはマクロファージである。
特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはパッケージングシステムの非天然エンベロープ糖タンパク質は、DC−SIGNを発現する樹状細胞に優先的に結合する。
特定の態様において、対象となるポリヌクレオチドは、(i)抗原、(ii)治療的ポリペプチド、または(iii)阻害オリゴヌクレオチドをコードする。いくつかの態様において、対象となるポリヌクレオチドは、siRNAをコードする。
特定の態様において、対象となるポリヌクレオチドは、ウイルス、細菌、真菌、原虫、または癌抗原をコードする。
特定の態様において、エンベロープ糖タンパク質はまた、マウスSIGNR1を発現する細胞に結合する。
特定の態様において、偽型レンチウイルスベクター粒子はまた、マウスSIGNR1を発現しない細胞と比較して、マウスSIGNR1を発現する細胞をより効率的に形質導入する。
本開示のいくつかの実施形態において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子を産生する方法が提供され、本方法は、培養培地中で、前述の実施形態のいずれかに記載のパッケージングシステムを培養することを含む。いくつかの態様において、培養培地は、マンノシダーゼI阻害剤、任意に、キフネンシンまたはDMNJを含む。
本開示のいくつかの実施形態において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子を含む組成物が提供され、ベクター粒子は、高度にマンノシル化されている。
本開示のいくつかの実施形態において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子を含む組成物が提供され、当該組成物中のN連結グルカンの少なくとも80%は、Man構造を含む。
本開示のいくつかの実施形態において、インビトロまたはインビボでSAMHD1を発現する細胞にレンチウイルスベクターゲノムを送達する方法が提供され、本方法は、細胞を、上記の実施形態のいずれかに記載のベクター粒子と接触させることを含む。いくつかの態様において、SAMHD1を発現する細胞は、樹状細胞、単球、またはマクロファージである。
本開示のいくつかの実施形態において、免疫応答を誘発するまたは個体を免疫化する方法が提供され、本方法は、個体に、上記の実施形態のいずれかに記載のベクター粒子、好ましくはDC−SIGNを発現する樹状細胞に優先的に結合するベクター粒子を投与することを含む。
本開示のいくつかの実施形態において、上述の偽型レンチウイルスベクター粒子は、患者における疾患または障害の治療または予防の方法で使用する。特定の態様において、疾患または障害は、癌、自己免疫疾患、または感染、例えば、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、または寄生虫感染である。
高度にマンノシル化されているエンベロープ糖タンパク質を用いてウイルスベクター粒子を生成する方法
本開示のいくつかの実施形態において、DC−SIGNを発現する樹状細胞に優先的に結合するウイルスベクター粒子を生成する方法が提供され、本方法は、培養培地中で、ウイルス粒子成分を含むウイルスパッケージング細胞を培養することを含み、当該成分は、DC−SIGNを発現する樹状細胞に優先的に結合するエンベロープ糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、この培養培地は、約0.01μg/ml〜約1mg/ml、好ましくは約0.1μg/ml〜約10μg/mlの濃度でキフネンシンを含む。
特定の態様において、キフネンシンは、約0.25μg/ml〜約2μg/mlの濃度で、培養培地中に存在する。
特定の態様において、キフネンシンは、約0.1μg/ml〜約10μg/ml、または約0.25μg/ml〜約2μg/ml、または約0.5μg/ml〜約5μg/mlの濃度で、培養培地中に存在する。
特定の態様において、ウイルス粒子成分は、レンチウイルスベクターゲノムを含む。
特定の態様において、ウイルス粒子を、キフネンシンを欠いている培養培地中で産生されるウイルス粒子よりも少なくとも5倍高い形質導入効率を有するDC−SIGNを発現する細胞に感染させる。
特定の態様において、ウイルスパッケージング細胞は、
(i)エンベロープ糖タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドと、
(ii)gagおよびpol遺伝子を含む第2のポリヌクレオチドと、
(iii)revタンパク質をコードする第3のポリヌクレオチドと、
(iv)抗原をコードする第4のポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターゲノムとを含む。
特定の態様において、エンベロープ糖タンパク質は、シンドビスウイルスE2糖タンパク質である。いくつかの態様において、E2糖タンパク質は、[SINVar1]、またはそれと少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するその変異体を含む。いくつかの態様において、E2糖タンパク質は、配列番号30[SIN−Var1]と90%同一である。いくつかの態様において、(i)E2糖タンパク質の残基160は、不在であるか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸であり、(ii)E2糖タンパク質変異体の残基70、76、もしくは159のうちの1つ以上は、非塩基性残基であり、(iii)E2糖タンパク質変異体は、シンドビスウイルスE3糖タンパク質との融合タンパク質の一部ではない。いくつかの態様において、E2糖タンパク質は、配列番号30[SIN−Var1]である。
特定の態様において、レンチウイルスベクターゲノムは、HIV−1由来である。
特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはパッケージングシステムのレンチウイルスベクターゲノムは、組み込みができる。
特定の態様において、前述の実施形態のいずれかに記載の偽型レンチウイルスベクター粒子またはパッケージングシステムのレンチウイルスベクターゲノムは、組み込み不能または組み込み不良である。いくつかの態様において、pol遺伝子は、不活性インテグラーゼ酵素をコードし、レンチウイルスベクターゲノムは、機能的ポリプリン区画(PPT)を欠いている。
特定の態様において、ウイルスパッケージング細胞は、SAMHD1阻害活性を保持するVpxタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含み、任意に、SIVmac
Vpx(配列番号44)と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む。
本開示のいくつかの実施形態において、アルファウイルスE2糖タンパク質を提示するウイルス粒子を含む組成物が提供され、当該組成物中のN連結グルカンの少なくとも80%は、Man構造を含む。
特定の態様において、アルファウイルスE2糖タンパク質は、DC−SIGNを発現する樹状細胞に優先的に結合するシンドビスE2糖タンパク質である。
本開示のいくつかの実施形態において、ウイルスベクターゲノムを、DC−SIGNを発現する細胞に送達する方法が提供され、本方法は、前述の実施形態のいずれかに記載のウイルス粒子または組成物を投与することを含む。
さらなる実施形態
1.偽型レンチウイルスベクター粒子を生成する方法であって、
(a)キフネンシンを含む培養培地中で、
(1)外因性抗原をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターゲノムと、
(2)DC−SIGNを発現する樹状細胞に優先的に結合するシンドビスE2糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
(3)SAMHD1阻害活性を保持するVpxタンパク質またはVprタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含むウイルスパッケージング細胞を培養することと、(b)DC−SIGNを発現する樹状細胞に優先的に結合する偽型レンチウイルスベクター粒子を単離することと、を含む、方法。
2.前記E2糖タンパク質が、配列番号30[SIN−Var1]と90%同一である、実施形態1に記載の方法。
3.(i)前記E2糖タンパク質の残基160が、不在であるか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸であり、(ii)前記E2糖タンパク質変異体の残基70、76、または159のうちの1つ以上が、非塩基性残基であり、(iii)前記E2糖タンパク質変異体が、シンドビスウイルスE3糖タンパク質との融合タンパク質の一部ではない、実施形態1または2に記載の方法。
4.前記E2糖タンパク質が、配列番号30[SIN−Var1]である、実施形態2に記載の方法。
5.前記Vpxタンパク質が、SIVmac Vpx[配列番号44]と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む、上記の実施形態のいずれか1つに記載の方法。
6.前記Vpxタンパク質が、SIVmac Vpx(配列番号44)、SIVsm Vpx(配列番号45)、SIVrcm Vpx(配列番号46)、またはHIV−2 Vpx(配列番号47)と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態1〜4のいずれか1つに記載の方法。
7.前記Vpxタンパク質が、SIVdeb Vpr(配列番号48)またはSIVmus Vpr(配列番号49)と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態1〜4のいずれか1つに記載の方法。
8.前記抗原が、腫瘍特異的抗原またはウイルス特異的抗原である、上記の実施形態のいずれか1つに記載の方法。
9.前記腫瘍特異的抗原が、NY−ESO−1、MAGE、MART−1/Melan−A、BAGE、RAGE、gp100、gp75、mda−7、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質、腎細胞癌抗原、5T4、SM22−アルファ、炭酸脱水酵素I、炭酸脱水酵素IX(G250としても知られる)、HIF−1アルファ、HIF−2アルファ、VEGF、前立腺特異性膜抗原(PSMA)、前立腺特異的抗原(PSA)、前立腺酸性リン酸塩、前立腺の6−膜貫通上皮抗原(STEAP)、NKX3.1、テロメラーゼ酵素、スルビビン、メソテリン、変異型ras、bcr/abl再構成、Her2/neu、変異型p53、野生型p53、サイトクロームP450 1B1、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−V、ヒトパピローマウイルスタンパク質E6、ヒトパピローマウイルスタンパク質E7、癌胎児性抗原、およびアルファ−フェトタンパク質から成る群から選択される、実施形態8に記載の方法。
10.前記ウイルス特異的抗原が、HIV抗原、SIV抗原、アデノウイルス抗原、エンテロウイルス抗原、コロナウイルス抗原、カリシウイルス抗原、ジステンパーウイルス抗原、エボラウイルス抗原、フラビウイルス抗原、肺炎ウイルス抗原、ヘルペスウイルス抗原、感染性腹膜炎ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、白血病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、オルトミクソウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、パラインフルエンザウイルス抗原、パラミクソウイルス抗原、パラボウイルス抗原、ペスチウイルス抗原、ピコルナウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ポックスウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、レオウイルス抗原、レトロウイルス抗原、またはロタウイルス抗原から成る群から選択される、実施形態8に記載の方法。
11.前記レンチウイルスベクターゲノムが、第2の抗原をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、上記の実施形態のいずれか1つに記載の方法。
12.前記第1および第2の抗原が、前記2つの抗原の間に自己切断型A2ペプチドを含む融合タンパク質として発現される、実施形態11に記載の方法。
13.自己切断型A2ペプチドが、配列番号56または配列番号57のアミノ酸配列を含む、実施形態12に記載の方法。
14.前記第1の抗原が、NY−ESO−1であり、前記第2の抗原が、MAGE−A3である、実施形態11〜13のいずれか1つに記載の方法。
15.前記第1および第2の抗原が、二方向性プロモーターから発現される、実施形態11に記載の方法。
16.前記キフネンシンが、約0.1μg/ml〜約10μg/mlの濃度で、前記培養培地中に存在する、上記の実施形態のいずれか1つに記載の方法。
17.前記キフネンシンが、約0.25μg/ml〜約2μg/mlの濃度で、前記培養培地中に存在する、実施形態16に記載の方法。
18.前記ウイルスパッケージング細胞が、
(i)gagおよびpol遺伝子を含むポリヌクレオチドと、
(ii)revタンパク質をコードするポリヌクレオチドとをさらに含む、上記の実施形態のいずれか1つに記載の方法。
19.前記gagおよびpol遺伝子が、ヒトのコドンに最適化され、配列番号54の1228〜1509位周辺に最適化されないウインドウを含む、実施形態18に記載の方法。
20.前記gagおよびpol遺伝子を含むポリヌクレオチドが、機能的rev応答要素(RRE)を欠いている、実施形態18または19に記載の方法。
21.前記pol遺伝子が、不活性インテグラーゼ酵素をコードする、実施形態18〜20のいずれか1つに記載の方法。
22.前記インテグラーゼ酵素が、D64V突然変異体を有する、実施形態21に記載の方法。
23.前記Vpxタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、前記revタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または前記gagおよびpol遺伝子を含むポリヌクレオチドと同じまたは異なるプラスミド上にある、実施形態18〜22のいずれか1つに記載の方法。
24.前記レンチウイルスベクターゲノムが、HIV−1に由来する、上記の実施形態のいずれか1つに記載の方法。
25.前記レンチウイルスベクターゲノムが、不活性化された3’側の長い末端反復(LTR)または自己不活性化された3’側の長い末端反復(LTR)を有する、上記の実施形態のいずれか1つに記載の方法。
26.前記レンチウイルスベクターゲノムが、エンハンサー配列、TATAボックス、Sp1部位、NK−カッパB部位、またはポリプリン区画(PPT)のうちの少なくとも1つを欠いているU3要素を含む、実施形態25に記載の方法。
27.前記レンチウイルスベクターゲノムが、配列番号21、22、または23のいずれか1つのヌクレオチド配列を含む、上記の実施形態のいずれか1つに記載の方法。
28.前記レンチウイルスベクターゲノムが、樹状細胞成熟/刺激因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、上記の実施形態のいずれか1つに記載の方法。
29.前記樹状細胞成熟/刺激因子が、GM−CSF、IL−2、IL−4、IL−6、IL−7、IL−15、IL−21、IL−23、TNFα、B7.1、B7.2、4−1BB、CD40リガンド、および薬物誘導CD40から成る群から選択される、実施形態28に記載の方法。
30.抗原をコードする前記ヌクレオチド配列が、ヒトユビキチンCプロモ−ター(UbiC)、サイトメガロウイルス前初期プロモ−ター(CMV)、ラウス肉腫ウイルスプロモ−ター(RSV)、およびテトラサイクリン応答プロモ−ターから成る群から選択されるプロモ−ターに作動可能に連結している、上記の実施形態のいずれか1つに記載の方法。
31.前記プロモ−ターが、イントロン欠損プロモーターである、実施形態30に記載の方法。
32.前記イントロン欠損プロモーターが、UbiCプロモーターである、実施形態31に記載の方法。
33.請求項1に記載の実施形態により産生される、レンチウイルスベクター粒子。
34.請求項18に記載の実施形態により産生される、レンチウイルスベクター粒子。
35.偽型レンチウイルスベクター粒子を生成する方法であって、
(a)キフネンシンを含む培養培地中で、
(1)MAGE−A3およびNY−ESO−1をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターゲノムであって、自己切断型TA2ペプチドをコードするポリヌクレオチドが、MAGE−A3およびNY−ESO−1をコードするポリヌクレオチドとの間に配置され、前記レンチウイルスゲノムがポリプリン区画(PPT)を欠き、MAGE−A3およびNY−ESO−1の発現が、イントロンを欠いているUbiCプロモーターによって制御される、レンチウイルスベクターゲノムと、
(2)DC−SIGNを発現する樹状細胞に優先的に結合するシンドビスE2糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
(3)ヒトのコドンに最適化されるgagおよびpol遺伝子を含むポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが、機能的rev応答要素(RRE)を欠いており、前記pol遺伝子が、不活性インテグラーゼ酵素をコードする、ポリヌクレオチドと、
(4)SAMHD1阻害活性を保持するVpxタンパク質またはVprタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含むウイルスパッケージング細胞を培養することと、(b)DC−SIGNを発現する樹状細胞に優先的に結合する偽型レンチウイルスベクター粒子を単離することと、を含む、方法。
36.(a)SAMHD1阻害活性を保持するVpxタンパク質またはVprタンパク質と、(b)抗原をコードする外因性ポリヌクレオチドと、(c)DC−SIGNを発現する細胞に優先的に結合する複数のエンベロープ糖タンパク質とを含む偽型レンチウイルスベクター粒子を含む組成物であって、マンノシダーゼ阻害剤の不在下で調製された同じ偽型レンチウイルスベクター粒子の対照組成物と比較して、より高度にマンノシル化されている、組成物。
37.前記エンベロープ糖タンパク質が、アルファウイルス糖タンパク質である、実施形態36に記載の組成物。
38.前記エンベロープ糖タンパク質が、シンドビス糖タンパク質である、実施形態37に記載の組成物。
39.高マンノシル化が、マンノシダーゼ阻害剤の不在下で調製された対照組成物よりもさらにEndoH感受性であることを特徴とする、実施形態36〜38のいずれかに記載の組成物。
40.EndoH感受性が、EndoH処理後、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)によって、前記エンベロープ糖タンパク質の分子量を評価することによって判定される、実施形態36〜38のいずれかに記載の組成物。
41.EndoHによる処置後の前記エンベロープ糖タンパク質の分子量が、(a)エンドグリコシダーゼにより処理されないエンベロープ糖タンパク質と、(b)PNGase Fにより処理されたエンベロープ糖タンパク質との間の距離の約45%以上シフトしている、実施形態36〜38のいずれか1つに記載の組成物。
42.EndoHによる処置後の前記エンベロープ糖タンパク質の分子量が、(a)エンドグリコシダーゼにより処理されないエンベロープ糖タンパク質と、(b)PNGase Fにより処理されたエンベロープ糖タンパク質との間の距離の約70%以上シフトしている、実施形態41に記載の組成物。
43.EndoHによる処置後の前記エンベロープ糖タンパク質の分子量が、(a)エンドグリコシダーゼにより処理されないエンベロープ糖タンパク質と、(b)PNGase Fにより処理されたエンベロープ糖タンパク質との間の距離の約90%以上シフトしている、実施形態41に記載の組成物。
44.前記組成物中の前記エンベロープ糖タンパク質のうちの少なくとも30%が、マンノシダーゼ阻害剤の不在下で調製された偽型レンチウイルスベクター粒子の対照組成物中の同じアミノ酸配列(複数を含む)を有する対照糖タンパク質と比較して、増加した量のEndoH感受性グリカンを有する、実施形態36〜43のいずれか1つに記載の組成物。
45.前記エンベロープ糖タンパク質の大部分が、高度にマンノシル化されている、実施形態36〜44のいずれか1つに記載の組成物。
46.前記偽型レンチウイルスベクター粒子が、組み込み不能である、実施形態36〜45のいずれか1つに記載の組成物。
47.前記組成物が、シンドビスE2糖タンパク質である、実施形態36〜46のいずれか1つに記載の組成物。
48.前記E2糖タンパク質が、配列番号30[SIN−Var1]と90%同一である、実施形態47に記載の組成物。
49.(i)前記E2糖タンパク質の残基160が、不在であるか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸であり、(ii)前記E2糖タンパク質変異体の残基70、76、もしくは159のうちの1つ以上が、非塩基性残基であり、(iii)前記E2糖タンパク質変異体が、シンドビスウイルスE3糖タンパク質との融合タンパク質の一部ではない、実施形態47または48に記載の組成物。
50.前記E2糖タンパク質が、配列番号30[SIN−Var1]である、実施形態49に記載の組成物。
51.前記Vpxタンパク質が、SIVmac Vpx[配列番号44]と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態36〜50のいずれか1つに記載の組成物。
52.前記Vpxタンパク質が、SIVmac Vpx(配列番号44)、SIVsm
Vpx(配列番号45)、SIVrcm Vpx(配列番号46)、またはHIV−2
Vpx(配列番号47)と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態36〜50のいずれか1つに記載の組成物。
53.前記Vpxタンパク質が、SIVdeb Vpr(配列番号48)またはSIVmus Vpr(配列番号49)と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態36〜49のいずれか1つに記載の組成物。
54.前記抗原が、腫瘍特異的抗原またはウイルス特異的抗原である、実施形態36〜53のいずれか1つに記載の組成物。
55.前記腫瘍特異的抗原が、NY−ESO−1、MAGE、MART−1/Melan−A、BAGE、RAGE、gp100、gp75、mda−7、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質、腎細胞癌抗原、5T4、SM22−アルファ、炭酸脱水酵素I、炭酸脱水酵素IX(G250としても知られる)、HIF−1アルファ、HIF−2アルファ、VEGF、前立腺特異性膜抗原(PSMA)、前立腺特異的抗原(PSA)、前立腺酸性リン酸塩、前立腺の6−膜貫通上皮抗原(STEAP)、NKX3.1、テロメラーゼ酵素、スルビビン、メソテリン、変異型ras、bcr/abl再構成、Her2/neu、変異型p53、野生型p53、サイトクロームP450 1B1、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−V、ヒトパピローマウイルスタンパク質E6、ヒトパピローマウイルスタンパク質E7、癌胎児性抗原、およびアルファ−フェトタンパク質から成る群から選択される、実施形態54に記載の組成物。
56.前記ウイルス特異的抗原が、HIV抗原、SIV抗原、アデノウイルス抗原、エンテロウイルス抗原、コロナウイルス抗原、カリシウイルス抗原、ジステンパーウイルス抗原、エボラウイルス抗原、フラビウイルス抗原、肺炎ウイルス抗原、ヘルペスウイルス抗原、感染性腹膜炎ウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、白血病ウイルス抗原、マールブルグウイルス抗原、オルトミクソウイルス抗原、パピローマウイルス抗原、パラインフルエンザウイルス抗原、パラミクソウイルス抗原、パラボウイルス抗原、ペスチウイルス抗原、ピコルナウイルス抗原、ポリオウイルス抗原、ポックスウイルス抗原、狂犬病ウイルス抗原、レオウイルス抗原、レトロウイルス抗原、またはロタウイルス抗原である、実施形態54に記載の組成物。
57.前記レンチウイルスベクターゲノムが、第2の抗原をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態36〜56のいずれか1つに記載の組成物。
58.前記第1および第2の抗原が、前記2つの抗原の間に自己切断型A2ペプチドを含む融合タンパク質として発現される、実施形態57に記載の組成物。
59.自己切断型A2ペプチドが、配列番号56または配列番号57のアミノ酸配列を含む、実施形態58に記載の組成物。
60.前記第1の抗原が、NY−ESO−1であり、前記第2の抗原が、MAGE−A3である、実施形態57〜59のいずれか1つに記載の組成物。
61.前記第1および第2の抗原が、二方向性プロモーターから発現される、実施形態57に記載の組成物。
以下の実施例は、例証の目的で提供され、本開示の範囲を限定することを意図しない。実施例1
DC−SIGNを発現する細胞に効率的に感染させるキフネンシンの存在下で産生されるシンドビスウイルス糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクター粒子
以下の実験の目的は、高度にマンノシル化されているエンベロープ糖タンパク質により偽型レンチウイルスベクターを産生し、特徴付けようと努めることである。その際、本発明者らは、キフネンシンが、DMNJを含む他のマンノシダーゼI阻害剤と比較して、著しく少ない濃度を使用して、DC−SIGN(例えば、樹状細胞)を発現する細胞を効率的に感染させる能力を持つ偽型レンチウイルスベクターを産生する際に、より有効であることを予想外に発見した。
293T細胞は、それぞれ、ポリエチレンイミン(PEI)を使用して、レンチウイルスゲノム、Gag/Pol、Rev、およびエンベロープをコードする、4つの別々のプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションから5時間後、混合+培地を除去した。培地を添加して、指示された量のマンノシダーゼ阻害剤(すなわち、DMNJ、キフネンシン、およびスワインソニン)とともに、容器に戻した。48時間後、上清(ベクターを含有する)を回収し、0.45μm フィルターで濾過した。次いで、ヒトDC−SIGN受容体を安定的に発現するHT1080細胞を、指示された容量のベクターで形質導入した。親HT1080細胞(DC−SIGNを欠いている)は、対照として使用し、ベクターのいずれかによって形質導入しなかった。形質導入から48時間後、細胞を、GFPの発現(gfp%)について分析した。これらの結果を、図1A(DC−SIGNを発現するHT1080)および1B(親HT1080)に示す。
シンドビスウイルス糖タンパク質により偽型化し、低濃度のキフネンシン(1μg/ml)の存在下で産生されるレンチウイルスベクター粒子は、より高濃度のDMNJ(400μg/ml)またはスワインソニン(10μg/ml)の存在下で産生されるものよりも著しく良好であるDC−SIGNを発現する細胞を予想外にトランスフェクトする。したがって、マンノシダーゼI阻害剤のキフネンシンの存在下での、シンドビスウイルス糖タンパク質による偽型化したレンチウイルスベクター粒子の産生は、他のマンノシダーゼI阻害剤の存在下で産生される粒子と比較して、DC−SIGNを発現する細胞の著しく強化された感染をもたらす。
実施例2
低量のキフネンシンは、DC−SIGNを発現する細胞に効率的に感染させる偽型レンチウイルスベクター粒子を生成するために必要とされる。
この実験の目的は、DC−SIGNを発現する細胞に感染させる能力を持つ偽型レンチウイルスベクター粒子を産生する際に、最も有効なキフネンシンの濃度を決定することである。
293T細胞を、PEIを使用して、実施例1に記載されるプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションから5時間後、混合+培地を除去した。培地を添加して、指示された量のキフネンシン(μg/ml)、または400μg/mlのDMNJとともに、容器に戻した。48時間後、上清(レンチウイルスベクター粒子を含有する)を回収し、0.45μm フィルターで濾過した。ついで、ヒトDC−SIGN受容体を安定的に発現するHT1080細胞を、指示された容量のベクターを含有する上清で形質導入した。ベクターによって形質導入されなかった親HT1080細胞を、対照として使用した。形質導入から48時間後、細胞を、GFPの発現(gfp+%)について分析した。これらの結果を、図2A(DC−SIGNを発現するHT1080細胞)および2B(親HT1080細胞)に示す。
0.125μg/mlのキフネンシンの存在下で産生される粒子は、DC−SIGNを発現する細胞に感染させるために、400μg/ml DMNJの存在下で産生される粒子の能力と一致した(図2A)。0.125μg/mlを超えるすべてのキフネンシン濃度の存在下で産生される粒子を、400μg/ml DMNJの存在下で産生される粒子よりもはるかに効率的に、DC−SIGNを発現する細胞に感染させた。キフネンシンの滴定は、シンドビスウイルス糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクター粒子のDC−SIGNを発現する細胞に感染させる能力が、0.25μg/mlの存在下で産生される粒子でピークに達することを示した。
実施例3
この実験の目的は、DMNJまたはキフネンシンの存在下で産生される偽型レンチウイルス粒子のグリコシル化プロファイルを特徴付けることであった。
1μg/ml キフネンシン、DMNJの存在下、またはマンノシダーゼI阻害剤を含まない、シンドビスウイルス糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクター粒子を、実施例1に従って調製した。粒子を、PNGaseFまたはEndoHのいずれかで、1時間インキュベートした。PNGaseFは、グリコシル化プロファイルにかかわらず、すべてのN連結グリコシル化を切断する一般的なエンドグリコシダーゼである(図3Aを参照されたい)。EndoHは、高マンノースN連結グルコシル化のみを切断する特殊化したエンドグリコシダーゼである(図3Aを参照されたい)。ウイルス粒子が、マンノシダーゼI阻害剤の存在下で産生される場合、ウイルスエンベロープは、高いMan含量を有し、EndoHによる切断の影響を受けやすい糖タンパク質を有することが期待され得る。ゲルシフトアッセイを使用して、SDS−PAGEゲル上で泳動し、シンドビスウイルスエンベロープに対する抗体を用いた免疫ブロット法によって、試料を分析した
これらの結果を、図3Bに示す。
PNGaseFまたはEndoHの処理と組み合わせた、キフネンシンまたはDMNJの存在または不在で産生されるウイルスのウイルスエンベロープ(SIN−Var1)の可動の程度は、Var1のグリコシル化の程度を示す。対照ウイルス(レーン1)をグリコシル化して(その結果として、ゲル上でゆっくりと泳動して)、このグリコシル化が、(レーン2に見られるより高速な可動によって証明されるように)PNGaseFによって完全に除去され得る。任意のN連結グリコシル化を切断するPNGaseFの能力により予測されるように、DMNJまたはキフネンシンのいずれかの存在下で産生されるウイルスは、PNGaseF処理に対して感受性がある(レーン5および8)。しかしながら、マンノシダーゼI阻害剤(Var1+DMNJまたは+キフネンシン)の存在下で産生されるウイルスのみが、EndoH処理に対して感受性があり(レーン6および9)、一方、対照ウイルス(Var1)のみが、EndoHに対して部分的に感受性がある。部分的感受性は、産生中、通常、マンノシダーゼIに曝露されないE2−Var1の部位から来る可能性が高く、樹状細胞への結合の一員とならない。これらの結果は、高マンノース糖タンパク質によりウイルス粒子を産生する際に、マンノシダーゼI阻害剤キフネンシンの効率が、EndoH処理後にゲルシフトアッセイを使用して、DMNJの存在下で産生される粒子に対するその効率と比較して、測定することができることを示す。
実施例4
エンベロープ糖タンパク質中のマンノース含量は、ウイルス粒子を調製するために使用される培地中のキフネンシン濃度と相関する
この実験の目的は、キフネンシンの異なる濃度の存在下で産生される偽型レンチウイルス粒子のグリコシル化プロファイルを特徴付けることであった。
シンドビスウイルス糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクター粒子を、異なる濃度のキフネンシンまたは400μg/mlのDMNJを用いて、実施例1に従って調製した。粒子を、EndoHで、1時間インキュベートした。次いで、試料は、ゲルシフトアッセイ、およびシンドビスウイルスエンベロープに対する抗体を用いた免疫ブロット法を使用して分析した。同時に、ヒトDC−SIGN受容体を安定的に発現するHT1080細胞を、キフネンシンまたはDMNJを含むか、または含まないで調製された、指示された容量の偽型レンチウイルスベクター粒子で形質導入した。形質導入から48時間後、細胞を、(GFP陽性細胞のパーセントとしてy軸上に示される)GFPの発現について分析し、グラフを作成した。これらの結果を、図4に示す。
マンノース含量の程度は、EndoHで処理した試料のゲル上のシフトの程度(図4A)、およびGFP形質導入のパーセントをグラフにする(図4B)ことによって示されるように、HT1080 DC−SIGN細胞の形質導入の程度と相関する。すなわち、ウイルス粒子を調製するために使用される培地中の次第に高くなるキフネンシン濃度は、DC−SIGNを発現するHT1080細胞において、EndoH処理によるより大きいシフト、およびより高いGFPの発現(すなわち、感染)によって示されるように、より高いマンノース含量のエンベロープ糖タンパク質をもたらした。これらの結果は、キフネンシンが、ウイルスエンベロープにおけるマンノース含量の程度に直接影響を与え、これは、ヒトDC−SIGN受容体を発現するHT1080細胞を形質導入する能力と直接相関していることを示す。
実施例5
偽型レンチウイルスベクター粒子におけるVpx発現の確認
この実験の目的は、SIVmac Vpxが、偽型レンチウイルスベクター粒子中に発現し、検出され得るかどうかを判定することであった。
N末端HA tagを有するSIVmac Vpxが、CMVプロモーター(pENV−SIVmacVpxと命名された構築物)によって起動される発現ベクターにクローン化された。Vpxタンパク質が発現されたことを確認するために、293T細胞を、この構築物でトランスフェクトし、トランスフェクションから24時間後溶解した。溶解物は、抗HA抗体を使用する免疫ブロット法によって分析した(図5A)。Vpxがレンチウイルス粒子にパッケージ化されたことを確認するために、293Tパッケージング細胞にトランスフェクトした4つのプラスミドを使用して、レンチウイルスを調製した。これらの4つのプラスミドは、レンチウイルスゲノム、Gag/Pol(組み込み可能[Int+]、または組み込み不良[Int−])、Rev、およびエンベロープをコードする。5番目のプラスミドは、Vpxに対して含まれるか、または含まれなかった。ウイルスは、トランスフェクション後の2日間回収し、遠心分離を使用して濃縮した。抗HA抗体を用いた免疫ブロット法のために、ゲル上にウェルあたり100ngのp24を充填した(図5B)。抗p24抗体は、負荷対照として使用された。
Vpx遺伝子をコードするプラスミドでトランスフェクトした293T細胞において、Vpxタンパク質は、効率的に発現される(図5A)。同様に、Vpxは、組み込み可能な(Int+)および組み込み不良(Int−)のレンチウイルス粒子にパッケージ化される(図5B)。
実施例6
Vpxは、VSV−Gにより偽型化した組み込み不能なレンチウイルスベクター粒子によるヒト樹状細胞の効率的な形質導入のために必要である
この実験の目的は、Vpxが、VSV−Gにより偽型化した組み込み不能なレンチウイルスベクター粒子による樹状細胞の生産的感染のために必要であるかどうかを判定することであった。
ヒト末梢血単核細胞(PBMC)は、CD14+単球について富化され、続いて、GMCSFおよびIL−4を使用して、樹状細胞について富化された。これらのPBMC由来のヒト樹状細胞は、Vpxを含む、または含まない、増加する量のVSV−Gにより偽型化した組み込み不能なレンチウイルスベクター粒子(0.2ng、2ng、20ng、または200ngのp24)構築物によって形質導入された。感染から5日後、形質導入事象は、CD11cが陽性である細胞にゲートをかけ、y軸にDC−SIGNをとり、GFPが陽性である細胞のパーセント(x軸)を評価することによって測定された。AZT(逆転写酵素阻害剤)は、最高用量のレンチウイルスベクター粒子(200ng)に使用した。
これらの結果を、図6に示す。Vpxは、PBMCに由来のヒト樹状細胞を形質導入するために、組み込み不能のVSV−Gにより偽型化したレンチウイルス粒子に必要であった。効率的な形質導入は、AZTによって阻害されたため、逆転写によって異なる。
実施例7
Vpxは、VSV−Gにより偽型化した組み込み可能なレンチウイルスベクター粒子によってヒト樹状細胞の形質導入を改善する
この実験の目的は、Vpxが、VSV−Gにより偽型化した組み込み可能なレンチウイルスベクター粒子による樹状細胞の生産的感染のために必要であるかどうかを判定することであった。
ヒトPBMCは、CD14+単球について富化され、続いて、GMCSFおよびIL−4を使用して、樹状細胞について富化された。これらのPBMC由来のヒト樹状細胞は、Vpxを含む、または含まない、増加する量のVSV−Gにより偽型化した組み込み可能なレンチウイルスベクター粒子(0.2ng、2ng、または20ngのp24)構築物によって形質導入された。感染から5日後、形質導入事象は、CD11cが陽性である細胞にゲートをかけ、y軸にCD11cをとり、GFPが陽性である細胞のパーセント(x軸)を評価することによって測定された。ネビラピン(Nev、逆転写酵素阻害剤)は、最高用量のレンチウイルスベクター粒子(20ng)に使用した。
これらの結果を、図7に示す。Vpxは、PBMC由来のヒト樹状細胞を形質導入するための組み込み可能なレンチウイルスベクター粒子の能力を増強した。改善された形質導入は、ネビラピンによって阻害されたため、逆転写によって異なる。
実施例8
Vpxおよび高度にマンノシル化されているエンベロープ糖タンパク質は、シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクター粒子によってヒト樹状細胞の効率的な形質導入に必要である。
この実験の目的は、樹状細胞に生産的に感染させるための、Vpxタンパク質を含み、キフネンシンの存在下で産生されるシンドビスウイルスE2糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクター粒子の能力を試験することであった。
ヒトPBMCは、CD14+単球について富化され、続いて、GMCSFおよびIL−4を使用して、樹状細胞について富化された。これらのPBMC由来のヒト樹状細胞は、Vpxを含む、または含まない、様々な量のSINvar1により偽型化した組み込み不良なレンチウイルスベクター粒子(0.2ng、2ng、もしくは20ngのp24)構築物により形質導入されたか、またはマンノシダーゼI阻害剤、キフネンシンの存在または不在下で産生された。感染から5日後、形質導入事象は、CD11cが陽性である細胞にゲートをかけ、y軸にDC−SIGNまたはCD11cをとり、GFPが陽性である細胞のパーセント(x軸)を評価することによって測定された。ネビラピン(Nev、逆転写酵素阻害剤)は、最高用量のレンチウイルスベクター粒子(20ng)に使用した。
図8に示されるように、予想外に、Vpx、およびキフネンシンの存在下でウイルス粒子の産生の両方が、シンドビスウイルス糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスを使用して、ヒト樹状細胞を効率的に形質導入するために必要である。したがって、これらの結果は、高マンノシル化糖タンパク質の組み合わせを含む粒子(キフネンシンの存在下での粒子形成の結果)およびVpxが、レンチウイルスゲノムによってコードされたタンパク質に効率的に感染し、発現するために、相乗的に作用することを示す。つまり、Vpxまたは高マンノシル化糖タンパク質のいずれか1つがシンドビスエンベロープ糖タンパク質により偽型化した組み込み不良なレンチウイルス粒子から欠けている場合、樹状細胞は、効率的に形質導入されない。
実施例9
レンチウイルスベクター粒子エンベロープのマンノシル化を定量化する
シンドビスウイルス糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクター粒子は、未処理(図9A、レーン1〜3)、400μg/mlのDMNJ(図9A、レーン4〜6)、または1μg/mlのキフネンシン(図9A、レーン7〜9)を用いて、実施例1に従って調製された。粒子は、未処理であったか(レーン1、4、7)、EndoHで1時間インキュベートされたか(レーン2、5、8)、またはPNGaseFで1時間インキュベートされた(レーン3、6、9)。次いで、試料は、ゲルシフトアッセイ、およびシンドビスウイルスエンベロープに対する抗体を用いた免疫ブロット法を使用して分析された。
ゲルシフトデータの分析は、BioradからのQuantity Oneソフトウェアを使用して行われた。つまり、「レーン」機能を使用して、図9Aに示される9つのレーンのそれぞれの中を通って、縦線を引いた。これにより、プログラムに対して分析されるべき領域を指定する。次に、「帯属性」機能を使用して、それぞれの帯に対するピーク強度が判定された。これらの値もまた、図9Aに示す。これは、前に示された「レーン」の中を通るゲル上のそれぞれの帯のピーク強度値を与える。
次に、それぞれの帯の強度プロファイルおよびレーン上のその位置からグラフを組み立てた。これらの結果を、図9B(マンノシダーゼ処理なし)、図9C(DMNJ処理、および図9D(キフネンシン処理)に示す。
示されるように、それぞれのグラフは、酵素なし、Endo H、またはPNGaseFで消化されたエンベロープ型のそれぞれを示す。Y軸が帯の強度であり、X軸が記載されるレーンに沿った帯の位置である(つまり、「相対前(relative front)」(rf)値;rf値は、レーンの全長にわたるゲルの上からの帯の距離である)。
シフトを定量化するために、消化酵素で切断されなかった(すなわち、全グリコシル化)帯のピーク強度を、PNGaseF酵素で切断された(すなわち、すべてのグリコシル化部位が除去された)帯と比較した。そのため、いかなる酵素でも消化されなかった帯に相当するピーク強度は、0%のシフトであり、PNGaseFで消化された帯に相当するピーク強度は、100%のシフトであると見なされる。キフネンシンを添加することなく(レーン2)、EndoHゲルシフトは、PNGaseFシフトの36%である。有意には、EndoHで消化された(すなわち、高マンノースに特異的な消化)キフネンシンにより処理された試料は、PNGaseFシフトの距離の90%シフトした。したがって、ウイルスベクターエンベロープ上のグリコシル化部位のほぼすべてが、1μg/mlのキフネンシンで処理後、高マンノース状態にある。
定量分析のすべてを、表1に示す。
スペクトル強度値は、ピーク強度値−酵素を用いずに消化したエンベロープのピーク強度値である。これは、上で説明されるように、0%のシフトから100%のシフトのスペクトルにおける値を正規化するために行われる。シフトの割合(%)は、PNGaseFで処理された試料のスペクトル強度値で割られたスペクトル強度値に、100を掛けたものである。これにより、酵素を用いずに、またはPNGaseFを用いて処理された帯と関連する、EndoHで切断する帯のシフトを定量化するパーセンテージを得る。DMNJにより処理されたエンベロープは、異種N連結グリコシル化パターンを有したため、この分析から除外された。
実施例10
組み込み不能な設計要素を用いたウイルスベクター
例えば、ワクチンおよび抗原を標的とした免疫療法のために、ウイルスベクターの直接投与を必要とするが、ベクターにより送達された遺伝子の持続発現を必要としない臨床的適用のために、組み込み不能なレンチウイルスベクターは、それらの遺伝的負荷量の送達のために完全に組み込み可能なレンチウイルスベクターの適切かつ実行可能な代替物に相当する。gag/pol遺伝子内のD64Vインテグラーゼ突然変異およびベクターゲノム内のcPPT欠失が、ウイルスベクターの組み込み率におけるそれらの影響について、単独で、および組み合わせて試験された。
材料および方法
Alu−PCRによる組み込みの定量化
6ウェルプレートに5E5細胞/ウェルで播種した293T huDC−SIGN細胞に、ウェルあたり2E9ゲノムのベクターを三連で形質導入した。形質導入から48時間後、細胞を収穫し、DNeasyキット(Qiagen,Valencia,CA)を使用して、ゲノムDNAを抽出した。宿主ゲノムDNAに組み込まれるプロウイルス配列のみを増幅する、Alu−LTR系のネスト化したPCRアッセイを使用して、ゲノムDNAを分析した。以下の修飾が、Brussel et al.,Methods Mol.Biol.304,139(2005)の既に刊行されている方法に導入された。第一ラウンドの増幅のために、最終反応容量25μlにおいて、白金Taq(Life Technologies,Grand Island,NY)を使用した。第一ラウンドのPCRサイクル条件は、以下の通りであった:95℃で2分間の変性ステップ、次いで、20サイクルの増幅(95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で90秒)。ネスト化したPCRを、EXPRESS qPCR Supermix Universal(Life Technologies)、および最終容量の25μlにおいて、100nMのプローブMH60310を使用して行った。ネスト化したPCRプロトコルは、初めに50℃で2分間保持し、95℃で10分間の変性ステップ、続いて、40サイクルの増幅(95℃で15秒間、60℃で30秒間)を行った。すべての増幅反応は、Bio−Rad
CFX(−96または−384モデル、Bio−Rad Laboratories,Hercules,CA)を使用して行った。組み込まれたプロウイルスのコピー数は、知られているコピー数の組み込まれたプロウイルスを含み、5log範囲にわたって希釈された参照293T細胞株の並列ネスト化したAlu−PCRによって生成された標準曲線を参照して計算された。標準曲線中の全ゲノムDNAは、非形質導入細胞からのゲノムDNAと混合することによって正規化され、それぞれの標準および知られていない試料は、100ngの全ゲノムDNAを含有した。このアッセイにより、100ngのゲノムDNAにおいて、58個のプロウイルス(実験1)または4個のプロウイルス(実験2)の検出が可能であった。
ネオマイシン耐性による組み込みの定量化
GFP−T2A−NeoR抗原をコードするベクターを、ネオマイシン耐性コロニー形成による組み込み率について独立して分析した。HT1080 huDC−SIGN細胞を、6ウェルプレートにおいて、0.5mlの段階希釈したベクター(ゲノムにより正規化された)を用いて、2時間形質導入し、その後、2mlの完全培地を添加した。形質導入から24時間後、細胞に、800μg/mlのG418(Life Technologies,Grand Island,NY)を含有する培地を供給した。次いで、細胞を、11〜13日間、G418選択下で継代なしで成長させ、その後、コロニーを、クリスタルバイオレット(BD Biosciences,Rockville,MD)で染色することによって視覚化した。全組み込み事象は、以下の通りに計算された:(コロニーの数)×(希釈係数)=組み込み事象。
GFPの発現による組み込みの定量化
GFP−T2A−NeoR抗原をコードするベクターについては、相対的な組み込み率は、バルク培養において、経時的にGFPの発現によって測定された。HT1080 huDC−SIGN細胞を、6ウェルプレート中で、0.5mlの等量のWT/703またはD64V/704ベクター(ゲノムによって正規化された)で2時間形質導入し、続いて、2mlの完全培地を添加した。形質導入した細胞は、最大30日間、薬剤選択することなく、培地中に維持し、一定の間隔で継代した。この期間中、細胞は、フローサイトメトリー(Guava EasyCyte Plus,Millipore,Billerica,MA)によって、GFPの発現について周期的に分析した。
結果
293T huDC−SIGN細胞を、WTまたはD64V組み込みVSV−Gにより偽型化したベクターで形質導入し、WT(「703」)またはcPPTを欠失したゲノム(「704」)をパッケージ化した。形質導入から48時間後、細胞は、ネスト化したAlu−PCR分析によって組み込まれたプロウイルスの存在について分析した。図10Aに示されるように、WT/704およびD64V/703ベクターはそれぞれ、WT/703ベクターと比較して、約2log減少した組み込み率を有した。比較して、D64V/704ベクターの組み込み率は、2logを上回って減少した。これらの結果は、ID−VP02(SIVmac Vpxおよび高度にマンノシル化されているエンベロープ糖タンパク質を有し、実施例12に記載されるrev非依存性gag/polシステムを含むパッケージング細胞を使用して調製されたシンドビスウイルスE2糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクター粒子)ゲノムが、著しく低下した組み込みの可能性を有し、D64Vおよび704要素が、独立して、この表現型の一因であることを示す。
ネスト化したAlu−PCR分析を補足するために、2つのさらなる方法を採用して、ウイルスベクターゲノムの組み込み率を調査した。両方の方法において、HT1080 huDC−SIGN細胞を、自己切断型T2Aリンカーによって分離されたGFPおよびネオマイシン耐性(NeoR)(GFP−T2A−NeoR)をコードするWT/703またはD64V/704ベクターで形質導入した。これらのベクターのいずれかによる形質導入は、GFPおよびNeoRの発現をもたらした。組み込み率は、G418選択後のネオマイシン耐性コロニーの副産物によって、またはバルク培養における経時的なGFPの発現によって、抗原発現の関数として測定された。
組み込み率(すなわち、ネオマイシン耐性)を測定する第一の方法において、HT1080 huDC−SIGN細胞を、ベクターの段階希釈で形質導入し、G418選択の存在下で継代なしで成長させた。入力ベクターは、ゲノムのコピー数によって正規化した。NeoRを発現し、G418への長期被爆を生存し、コロニーを形成する細胞は、組み込まれたプロウイルスを温存すると推定された。これらのコロニーを計数し、全組み込み事象を計算した。この実験のアプローチを使用して、2つの独立した実験において、D64V/704ベクターの組み込み率は、WT/703のものと比較して、3log減少した(図10B)。
第2の方法(すなわち、GFPの発現)において、形質導入した細胞を、選択の不在下で連続継代して、形質導入後の様々な時間に、フローサイトメトリーにより分析した。形質導入後から2日目で、WT/703ベクターで形質導入した細胞の約40パーセントが、GFP陽性であった(図10C)。この集団は、実験期間中変わらないままであり、このことは、GFPの発現が、主に組み込まれたプロウイルス由来であったことを示唆している。対照的に、D64V/704ベクターで形質導入したGFPが陽性である細胞のパーセントは、形質導入後の6日目で約100倍低下し、この実験の残りの期間中、偽の形質導入した対照よりも高かったとはいえ、依然として低いままであった。これらの結果は、D64V/704形質導入事象の大部分が、形質導入後の早い時点でGFPを発現した非組み込みベクターDNAを得たが、その後の細胞分裂中失ったことを示唆している。形質導入後の9日目で依然として残っているGFPを発現する細胞のごく一部は、組み込まれたプロウイルスを得た少数の形質導入事象を表す可能性が高い。実験の完了時(30日目)に、D64V/704ベクターが、WT/703ベクターと比較して、組み込みを行う能力を386倍低下させたことを計算した。これらの所見は、ネストAlu−PCR分析からの結果に相当する。
まとめると、組み込み率(ネスト化したAlu−PCR、NeoRのコロニー副産物、およびGFPの発現の割合%)を測定するすべて3つの方法からの結果は、ウイルスベクターゲノムの組み込み率が、標準的な、組み込み可能な3代目のレンチウイルスベクター(WT/703)のものと比較して、2〜3log低下していることを示す。
実施例11
偽型レンチウイルスベクター粒子は、細胞の均質集団において樹状細胞を特異的に形質導入する
樹状細胞に対するウイルスベクターの特異性は、潜在的標的細胞の異種集団の中において評価された。ヒトPBMCは、GM−CSFおよびIL−4の存在下で3日間培養中に置かれ、DC−SIGNを発現する十分な数の単球由来のDCを含んだ初代細胞のプールを生成した。3日目に、キフネンシンの存在下で産生され、Vpxを含んだ、20ng p24のGFPをコードする偽型レンチウイルスベクターを培養に添加した。培養へのベクターの導入から3日後、細胞は、分析時に存在する細胞の主要集団内の形質導入の尺度としてGFPの発現について分析した:DC(CD11c)で6%、B細胞(CD11c、CD19)で10%、およびT細胞(CD11c、CD3ε)で80%。図11に示されるようにDC−SIGN集団は、培養内に存在するBおよびT細胞集団の両方に対する0.1%と比較して、CD11chi内の細胞の42%を形質導入した。形質導入は、逆転写阻害剤のネビラピン(RT阻害剤)が培養内に含まれた場合、すべての細胞集団において、完全になくなった。これらの結果は、DCが少数であるヒト細胞の異種集団において、偽型レンチウイルスベクターは、DC−SIGNを発現するDCを特異的に形質導入する。
実施例12
Rev非依存性gag/polプラスミドの設計
偽型化した第三世代LVの特徴を示している4つのプラスミドシステムのうちで、2つのプラスミドが、組み換えの可能性があるそれらの転写物内に配列を含有する。つまり、移入ベクター(本明細書では、LVゲノムと称される)およびgag/polプラスミド。LVゲノムとgag/polの転写物間で配列相同性がある2つの領域がある(図12)。初めに、LVゲノムは、部分gag配列を有し、続いて、gag/polプラスミドにおいて、gag配列の5’末端と同一である354の塩基対(bp)から成るプシーパッケージングシグナルを有する。この配列重複から生じる組み換え事象は、プシーgag組み換え事象と称される。第二に、LVゲノムおよびgag/polはともに、Rev応答要素(RRE)を含有し、これは、二次RNA構造を形成する234bpから成り、細胞質へのRRE含有転写物のRev依存核輸出を可能にする。これらの2つの相同配列は、gag/polプラスミドからRREを削除することによって、およびpolタンパク質産物の翻訳に必要であるgagとpolの間のフレームシフト領域を除く、gag/polオープンリーディングフレーム(ORF)をコドン最適化することによって、除去された(図12)。このフレームシフト領域は、pol遺伝子産物を翻訳するために不可欠である、翻訳時のリボソームの1レジスターシフトを生じるGagおよびpol接合部で二次RNA構造を形成する。Watts et al.,Nature,460:711−716(2009)。これらの実験のために、gag/pol ORFの塩基対1228〜1509の282bp領域は、コドンに最適化されなかった。この領域は、Gagタンパク質のリジン409をコードし、Gagの終止コドンを含むように延在する、野生型HIV−1のpNL4−3配列の塩基対1563から開始する。残りの領域(gag/polの塩基対1−1228および塩基対1510−4307)は、ヒトのコドン表に基づいて、コドンに最適化された。Nakamura et al.,Nucleic Acids Res,28:292(2000)。RI gag/polの完全ORFが、Genscriptで合成され、WT gag/polおよびRREから成るORFの代わりにクローン化された。
RREの削除は、gag/polのRNA二次構造が、核内に転写物を保持するため、核からのgag/pol転写物のRev依存輸出を排除することが知られている。Banchereau and Steinman,Nature,392(6673),245(1998)。したがって、コドン最適化は、これらの保持されている二次構造を排除することと、LVゲノムにおける部分gagにより配列相同性を最小化することとの両方の役割を果たす。もし仮に、これらの修飾により、gag/pol転写がRevの必要性を緩和するという事実により、このスキームは、ベクター産生時に、依然として、Revが必要とされるとしても、Rev非依存性gag/pol(RI gag/pol)と称される。
実施例13
RI gag/polの核輸出は、Revを必要としない
RI gag/pol転写物が、実際には、Rev非依存性であることを示すために、293T細胞は、Revをコードするプラスミドの存在または不在下で、野生型(WT gag/pol)またはRI gag/polプラスミドでトランスフェクトされた。
材料および方法
Gagタンパク質の発現
293T細胞は、1×10細胞/ウェルで、6ウェル皿中に平面培養した。24時間後、細胞は、Lipofectamine2000(Invitrogen)を使用して、0.5μgのRevプラスミドまたは0.5μgの空の骨格プラスミドの存在下で、0.5μgのWT gag/polまたはRI gag/polプラスミドでトランスフェクトされた。24時間後、細胞を、細胞抽出緩衝液(Invitrogen,カタログ番号#FNN0011)で溶解し、4〜12%のNuPAGE Bis−Trisプレキャストゲル(Invitrogen,カタログ番号#NP0321PK2)を使用してSDS−PAGEに介して分析し、続いて、ニトロセルロース膜上に移動させた。次いで、ブロットは、抗p24抗体(Abcam,カタログ番号#ab9071)または抗アクチン抗体(Santa Cruz Biotech,カタログ番号#sc−130656)のいずれかでプローブした。
結果
細胞溶解物を、抗p24抗体を用いてSDS−PAGEおよびウェスタンブロット法を使用して、gagタンパク質産物の発現について分析した。Revが存在したかどうかにかかわらず、RI gag/polプラスミドは、p24およびその前駆体を発現することができたが、WT gag/polの転写物は、タンパク質の発現のためにRevを必要とした(図13)。p55 Gagタンパク質の処理は、p55:p24タンパク質の比率に基づいて、RIとWT gag/pol転写物の間で異なるように思われ、これは、タンパク質の発現および/または処理におけるコドン最適化の効果を示唆している。これらの結果は、転写が、Revの不在下で核輸出を行うことができることを示し、RI gag/pol構築物への設計変更が、Revに対する必要条件を緩和することを確認する。
実施例14
RI gag/polは、WT gag/polに相当する力価を用いて、感染性ベクターを産生する
先行研究は、Revの不在で産生されるベクターの力価の低下を説明している。Gasmi et al.,J.Virol. 73:1828−1834(1999)、Lucke et al.,J.Virol.79:9359−9362(2005)を参照されたい。「rev非依存性」gag/pol構築物で作製されたベクターは、WT gag/polのものに相当する力価を用いて、感染性粒子を生成するかどうかを判定するために試験した。
材料および方法
ベクターの産生
ベクターは、大規模(CF10)または小規模(10cm皿)のいずれかで産生された。大規模な産生については、293T細胞を、5% 血清、L−グルタミン、および抗生物質を含有するDMEM培地中、10層細胞工場(Nunc,カタログ番号#140400)中に、5E8細胞/1Lで播種した。3日後、細胞を、3:1(mL PEI:mg
DNA)の比率でPEI(ストック1mg/mL)および全プラスミドDNAを使用して、トランスフェクトした。10層細胞工場につき、1mgのベクターゲノムプラスミドおよび0.5mgの残りのプラスミド(gag/pol、Rev、およびVSV−G)を使用した。5時間後、培地を、1Lの無血清培地(Transfx−293培地、Hycloneカタログ番号#SH30860.LS)と交換した。ベクターは、トランスフェクションから2および3日後に採取した。採取物は、プレフィルターおよび0.45μm
ステリカップフィルター(Millipore)を使用して浄化した。ベクターは、1Lの遠心分離ボトル中、16,000gで、5時間回転させることによって濃縮した。それぞれのリットル採取物からのペレットは、1mLのHBSS中で再懸濁したか、または−80℃で保存するためにアリコートされたか、または1mLのベンゾナーゼ処理用緩衝液(50mM Tris−HCL pH7.5、1mM MgCl2、5% v/v Sucrose)中で再懸濁した。ベンゾナーゼヌクレアーゼを、最終的に、250U/mLで添加し、トランスフェクションからのいかなる使い残しのプラスミドを分解するために、4℃で一晩インキュベートした。ベンゾナーゼで処理したベクター調製物を、スクロースクッション(上部に30% スクロース、下部に5% スクロース)を使用して再濃縮し、超遠心分離機中、116,000gで、4℃で1.5時間遠心分離した。ベクターペレットは、1mL HBSS中で再懸濁し、アリコートし、−80℃で保存した。小規模なベクターの産生については、293T細胞を、2.5E5細胞/プレートで、10cmプレート中で播種し、ベクターの産生を比較する場合に、gag/polプラスミドの量を変えることを除いては、上記と同様に、PEIを使用したが、6μgのベクターゲノムプラスミドおよび3μgの残りのプラスミドを用いて、翌日トランスフェクトした。小規模なトランスフェクションは、正確さのために三連で行われた。5時間後、培地を、5% 血清、L−グルタミン、および抗生物質を含有する4mLのDMEM培地と交換した。ベクターは、トランスフェクションから2および3日後に採取し、0.45μm フィルターを使用して浄化した。ベクターは、−80℃で保存した。
ベクターの定量化−p24アッセイ
p24の定量化は、製造業者の指示書に従って、Advanced Bioscience Laboratories(Rockville,MD)によるHIV−1 p24 ELISAキットを使用して行われた。
ベクターの定量化−GFUアッセイ
293T細胞を、5% 血清、L−グルタミン、および抗生物質を含有する1mL DMEM培地中、12ウェルプレート中で、2E5細胞/ウェルで平面培養した。24時間後、それぞれのウェル中の細胞を、2倍希釈したGFPをコードするベクターで形質導入した。それぞれの量のベクターは、DMEM完全培地中で、1mLの最終容量で調製される。5つの2倍段階希釈したベクターを含有する上清を調製し、ウェルあたり200μLのベクターから始めた。偽の形質導入を除外する対照として、10μMの逆転写酵素阻害剤のネビラピンは、並行ウェル中で、最高容量のベクターとともに使用した。形質導入から48時間後、細胞は、Guava machine(Guava technologies、現在はMillipore)において、GFPの発現について分析した。mLあたり緑色蛍光単位(GFU)は、EXCELのFORECAST機能を使用して、ベクターのmLあたりのGFP陽性細胞の数を予測するために、ベクターの容量および得られたパーセントGFP値に基づいた最良(最小二乗)線形回帰モデルを使用することによって計算した。1%未満のGFP陽性細胞をもたらした事象は、定量下限(LOQ)として設定された。
結果
VSV−Gにより偽型化した2つの並列ベクター調製物は、マーカーとして、緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするベクターゲノムを使用して、WT gag/polまたはRI gag/pol構築物のいずれかの2つの入力DNA量を使用して生成した。両方のベクター調製物は、p24についてアッセイされ、それらを産生するために使用されたgag/polプラスミドにかかわらず、相当する物理的粒子力価を有することが示された(図14A)。次いで、これらの調製物は、標的細胞を形質導入するそれらの能力についてアッセイされた。容量によって正規化される場合に、RI gag/polベクターは、ベクター産生時に使用された入力gag/polプラスミド量(3μgまたは6μg)の両方に対してWT gag/polに相当する形質導入事象をもたらした(図14B)。これらの結果は、rev非依存性gag/pol構築物を生成するために導入された設計要素が、レンチウイルスベクターの物理的粒子の収量または感染性を低下させなかったことを示す。
実施例15
RIおよびWT gag/polベクターは、同等の免疫応答を生じる
LVは、研究用途および臨床的状況において、インビトロでタンパク質をコードする核酸を様々な細胞型に送達するために一般的に使用される。しかしながら、直接注入可能なLVもまた、遺伝子治療および抗原を標的とした免疫治療の両方のために開発されている。RI gag/polベクターが免疫療法用途における適切なLVとしての役割を果たすかどうかを試験するために、RI gag/polベクターによってコードされた抗原導入遺伝子に対して引き起こされた免疫応答が評価された。
材料および方法
ベクターの定量化−TUアッセイ
形質導入単位(TU)が、アッセイを使用して決定され、標的細胞株における形質導入事象が、逆転写されたベクターRNA配列を増幅する定量的PCRアッセイを使用して測定された。段階希釈した試験試料および参照材料は、標的293T細胞の存在下で、96ウェル組織培養プレート中で二重にインキュベートされた。形質導入ステップは、残留プラスミドDNAによって寄与され得るバックグラウンドシグナルを評価する手段として逆転写阻害剤のネビラピンの存在および不在下の両方で行われた。形質導入から1日後、偽またはベクターを形質導入した細胞を、デオキシコール酸ナトリウム、Tween−20、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、およびプロテイナーゼKを含有する緩衝液の添加によって溶解した。次いで、細胞溶解物を、37℃、55℃、および95℃で段階的にインキュベートして、タンパク質分解およびDNA変性を確実にした。次いで、変性した細胞溶解物は、抗原プロモーター(EXPRESS qPCR Supermix Universal,Life technologies)の上流に位置する約400bpのベクターゲノム配列を増幅させるために設計されたプライマー/プローブセットを使用して、qPCRによって分析された。感染性力価は、7log範囲(5.3コピー〜5.3×10コピー)にわたって希釈された標的配列を含む線形化プラスミドDNAから成る標準曲線を参照して計算した。
免疫化
C57BL/6マウスに、2×10、1×10、または5×10TUのいずれかのLV1bをコードするLV、OVA257(SIINFEKL)(配列番号24)のH−2Kbに制限されたエピトープを含有するポリエピトープ構築物、またはHBSSビヒクルを用いて、0日目に尾基底部の皮下に免疫化した。−80℃で保存されたLVのアリコートは、室温で解凍され、氷上に置かれた。ベクターは、冷滅菌したHBSS中で段階希釈され、注入のために動物施設に輸送された。マウスは、尾基底部を接触可能して、従来の溝付き保持装置中に入れた。ベクターを、29ゲージの0.3mLのインスリン注射器(Becton Dickenson[BD])を使用して、50μLの注入を介して投与し、肛門から約1cm尾側の尾基底部の右側に皮下に挿入され、これにより、軽度ではあるが、尾基底部周辺の皮膚に顕著な膨張をもたらした。
細胞内サイトカイン染色(ICS)
膵臓は、70μMナイロンフィルターを通して圧迫することによって、均質化された。赤血球は、氷冷却した限外濾過した水への短期間の曝露による低張ショックによって溶解し、続いて、10×PBSにより、その後の等張性の回復を行った。サイトカインの分析のために、細胞は、完全RPMI(10% FCS、10mM HEPES、2μM β−メルカプトエタノール、およびL−グルタミン)中で、ペプチドあたり1μg/mLの濃度であるペプチドを含む96ウェルを、37℃で、5% COで5時間刺激した。OVA257(SIINFEKL)のペプチドは、AnaSpec(Fremont,CA)によって、95%純度で製造された。刺激後、表面染色は、FcR遮断抗体2.4G2およびLIVE/DEAD(登録商標)Fixable Near−IR(L/D NIR,Invitrogen)の存在下で、FACS緩衝液(PBS、1%FCS、2mM
EDTA、0.01% アジ化ナトリウム)中で行われた。インビボ実験において表面染色のために使用された抗体は、抗マウスCD4−PerCP−Cy5.5(eBioscience)またはCD4−Alexa Fluor 700(eBioscience)、CD8−Pacific Blue(eBioscience)、およびB220−V500(BD)を含んだ。表面染色後、細胞は、Cytofix(登録商標)(BD)で固定され、FACS緩衝液中で、4℃で一晩保存された。次いで、細胞は、5%ラット血清(Sigma Aldrich)を含有するPerm/Wash(商標)緩衝液(BD)で透過させた。細胞内染色のための抗体は、5%ラット血清を含有する希釈されたPerm/Wash(商標)緩衝液であり、透過性細胞に添加した。抗体は、抗マウスTNF−α−FITC(eBioscience)、IFN−γ−PE(eBioscience)、およびIL−2−APC(eBioscience)を含んだ。細胞は、Perm/Wash(商標)緩衝液で2回洗浄し、FACS緩衝液中で再懸濁し、ハイスループットサンプラー(High Throughput Sampler)(BD)を用いて、3レーザーLSRFortessaにおいて分析した。データは、FlowJoソフトウェア(TreeStar,Ashland,OR)を使用して分析した。生存CD8
T細胞は、リンパ球(FSCint、SSClo)、単一細胞(SSC−A=SSC−H)、生(L/D NIRlo)、B220 CD4 CD8をゲートにかけた。サイトカインゲートは、99.9パーセンタイルに基づいた(未刺激細胞において0.1%の陽性事象)。
結果
マウスを、一用量範囲のWTまたはRI gag/polベクターで免疫化し、WT(INT(+))またはD64V突然変異体インテグラーゼ(INT(−))のいずれかを含み、OVA257(SIINFEKL)(配列番号24)のH−2Kbで制限されたCD8 T細胞エピトープを含有するLV1bと称されるポリエピトープ構築物をコードした。免疫化から12日後、膵臓におけるOVA257に特異的なCD8 T細胞応答が、IFN−γに対してICSによって測定された(図15)。組み込み可能なおよび組み込み不能なベクターの両方については、RI gag/polおよびWT gag/polベクターは、相当するCD8 T細胞応答を引き起こし、gag/pol遺伝子のコドン最適化が、免疫療法のビヒクルとしてLV機能に悪影響を及ぼさなかったことを確認した。
実施例16
RIおよびWT gag/polベクターはともに、保護する抗ウイルス免疫を誘発する
主に、LV誘発CD8 T細胞応答が、RI gag/polベクターを用いて同等であったことが観察されたが、以下の実験は、これらによって誘発された機能免疫が、ベクターであり、また同様であったかどうかを判定するために行われた。これに対処するために、組み換え生ワクシニアウイルスチャレンジが、ウイルス感染のモデルとして採用された。
材料および方法
ワクシニアウイルスチャレンジ
C57BL/6マウスに、5×10TUのLV1bをコードするベクターまたはHBSSビヒクルで、0日目に尾基底部の皮下に免疫化した。4週間後、マウスは、1×10TCID50の、OVAを発現する組み換えワクシニアウイルス(rVV−OVA)、1E7 TCID50野生型ワクシニアウイルス(VV−WT)、またはHBSSビヒクルを用いて、腹腔内にチャレンジされた。チャレンジから5日後、卵巣は、TCID50アッセイによってウイルス負荷の定量化のために採取された。
結果
マウスは、WTまたはRI gag/polのいずれかでOVA257をコードする組み込み不能な(INT(−))LVベクターを用いたワクチン接種を受けさせ、4週間後、OVAをコードする組み換えワクシニアウイルス(rVV−OVA)または対照として野生型ワクシニアウイルス(VV−WT)でチャレンジされた(図16)。RI gag/polおよびWT gag/polベクターを用いたワクチン接種を受けたマウスはともに、rVV−OVAによるチャレンジ後、ウイルス負荷の劇的な減少を示した。保護が、抗原特異的であったことを確認して、VV−WTチャレンジ後のウイルス負荷は、ビヒクルとLVで処理した群の間で同様であった。これらのデータは、RI gag/pol
LVが、ウイルスチャレンジに応答し、機能免疫を与えるメモリCD8 T細胞を誘発することができることを示す。
実施例17
RI gag/pol修飾は、プシーgag組み換えを排除するが、ベクターゲノムとgag/pol転写物の間の他の組み換え事象は排除しない。
RI gag/polは、プシーgag組み換えを排除するように努めるために設計され、そのため、第三世代LVのためのRCL形成の機会をさらに最小限に抑えた。ネスト化したPCR系アプローチを使用して、プシーgag組み換えを検出するために、組み込みベクターで形質導入した細胞のゲノムDNAをスクリーニングした。
方法および材料
ベクターの定量化−ゲノムアッセイ
ゲノムRNAは、QIAamp Viral RNAミニキット(Qiagen,Valencia,CA)を使用して、ベクター粒子から単離された。 汚染DNAを排除するために、抽出された核酸を、製造業者の指示書に従って、DNAseI(Invitrogen)で消化した。2つの希釈したそれぞれのDNAseIで処理されたRNA試料は、RNA Ultrasense One−Step Quantitative RT−PCR System(Invitrogen)ならびに前述のベクター特異的プライマーおよびプローブを使用して、定量化RT−PCRによって分析された。RNAゲノムのコピー数は、7log範囲(10コピー〜1.0×10コピー)にわたって希釈された標的配列を含む線形化プラスミドDNAから成る標準曲線を参照して計算した。ここで発現したようなゲノム力価は、物理的ベクター粒子の数に反映し、ゲノムに基づいて計算され、それぞれのベクター粒子が、2つの一本鎖のゲノムRNAのコピーを含むことが予測された。
プシーgag組み換えアッセイ
293T細胞は、10cmプレート中、2E6細胞で平面培養した。翌日、細胞を、1E11ゲノムのWT gag/polまたはRI gag/polのいずれかで作られている濃縮されたVSV−Gにより偽型化したベクターで形質導入した。これらのベクターの力価は、それぞれ、1.2E13ゲノム/mLおよび1.5ゲノム/mLであった。形質導入から48時間後、細胞を採取し、血液および細胞培養DNAキット(Qiagen,カタログ番号#13323)を使用して、ゲノムDNAを単離した。100ngのゲノムDNAが、高品質プラチナtaqポリメラーゼ(Invitrogen,カタログ番号#11304−011)を使用して、第一ラウンドのPCRのための鋳型として使用され、1サイクルを94℃で2分間;40サイクルを94℃で30秒間、55℃で30秒間、68℃で90秒間;1サイクルを68℃で5分間のサイクリングパラメーターを使用した。1μl(50μlのうち)の第一のPCRは、未希釈(1:1)、または1:100で希釈、または1:1000で希釈したネスト化したPCRの鋳型として使用した。ネスト化したPCRのサイクリングパラメーターは、第一ラウンドで使用されたものと同一であった。プライマー対照は、すべての反応には含まれなかった。PCRのために使用されたプライマーは、378(TAAGGCCGAGTCTTATGAGCAGC)(配列番号60)、709(AGGACTCGGCTTGCTGAAG)(配列番号61)、710(AGCCTGTCTCTCAGTACAATC)(配列番号62)、835(TGTCTTATGTCCAGAATGCT)(配列番号63)、863(GCACGGCAAGAGGCGAGG)(配列番号64)、および864(GCCGGATGTCCAGGATGCTG)(配列番号65)であった。全50μlのうちの25μlのネスト化したPCRは、1xTAE緩衝液および臭化エチジウムで作られた1%アガロースゲル上に可視化した。帯を抽出し、ゲル抽出キット(Qiagen,カタログ番号#28704)を使用してDNAを精製し、続いて、TOPO−TAベクター(Invitrogen,カタログ番号#K4500−02)にクローン化し、M13順方向および逆方向プライマーを使用して、配列決定した(Davis Sequencing,CA)。
結果
ネスト化したPCRアプローチを使用して、第一ラウンドのPCRは、LVゲノム5’のプシーパッケージングシグナルに結合する順方向プライマー(709)ならびにRI gag/polおよびWT gag/polの両方のフレームシフト領域内で結合する逆方向プライマー(710)を使用して、行われた(図12)。次いで、この第一ラウンドからのPCR産物は、希釈し、LVゲノムに結合するネスト化した順方向プライマー(863)、およびWT gag/polまたはRI gag/pol内のgag領域にそれぞれ結合するネスト化した逆プライマー(835または864)を使用する二次PCRのための鋳型として使用した。これらの2つの逆方向プライマーは、コドン最適化によりわずかに差異がある両方の構築物において、同じ領域に結合するように設計された。仮説に基づいたプシーgag組み換えからの単位複製配列サイズは、プライマー対863および835、またはプライマー対863および864のいずれかを使用する場合、937bpであり得る。
LV1bポリエピトープをコードするベクター調製物は、RIgag/polまたはWTgag/polプラスミドのいずれかで生成され、293T細胞を形質導入するために使用した。形質導入から48時間後、ゲノムDNAを採取し、PCRを行い、続いて、アガロースゲル上で分析した。第一に、LVゲノム内のみに結合するプライマー(プライマー709および378)を使用して、陽性対照PCRを行った。これらのプライマーを用いた、予測されるLVゲノムの単位複製配列サイズは、1697bpであると予測される。WT gag/polまたはRI gag/polベクターのいずれかで形質導入した細胞培養はともに、期待された単位複製配列サイズを得、そのため、プロウイルスの形質導入および組み込みは、両方のベクターに対して同等であることを確認した(図17A)。
次に、上記のように、プシーgagの組み換えについて、ネスト化したPCRを行った。WT gag/polベクターで形質導入した細胞からのゲノムDNAは、期待されたサイズの937bpで帯を産生し、これは、プシーgagの組み換えと一致した(図17Bの左半分)。対照的に、RI gag/polで形質導入した細胞からのゲノムDNAは、1329bpで大きいが、薄い帯を産生した(図17Bの右半分)。PCR帯の性質を決定するために、WT gag/polからの937bpの帯、ならびにRI gag/polからの1329bpの帯を抽出し、TOPO−TAプラスミドにクローン化した。シークエンシングは、配列の前半がベクターゲノムとアライメントされ、その後半が部分gag配列を越えて延在したgag/pol転写物とアライメントされたという点において、WTgag/pol帯が、プシーgag組み換えと一致したことを示した(図17C)。RI gag/polからの薄い1329bp帯は、LVゲノムとアライメントされた最初の1253bpと、RI gag/polの領域とアライメントされた最後の77bpとから成る配列をコードした(図17D)。これらの結果は、プシーgag組み換えが、WT gag/polベクターで形質導入した細胞において検出可能であったが、RI gag/polベクターで形質導入した細胞においては検出不能であったことを示す。さらに、これらの結果は、一見したところ、プシーgag配列に依存していないようだが、組み換えは、依然としてRI gag/polベクターで形質導入した細胞において検出可能であったという証拠を示す。
実施例18
SINvar1のマウス受容体としてのDC−SIGNホモログSIGNR1の特定
ID−VP02ベクター粒子は、結合および侵入のために内因性マウス受容体を利用することができるかどうかを判定するために調査された。ヒトは、DC−SIGNおよび1つのパラログ、DC−SIGNRをコードするが、マウスは、DC−SIGNの8つのホモログ(SIGNR1〜SIGNR8と称される)を有する。これらのうちの6つ、つまり、SIGNR1、−R3、−R4、−R5、−R7、および−R8は、膜結合であると予測される。機能的研究に基づいて、SIGNR1、SIGNR3、およびSIGNR5(マウスDC−SIGNとも称される)が、ヒトDC−SIGNの最も近い機能的オーソログであると報告されている。したがって、これらの受容体を介して結合および侵入を媒介するSINvar1の能力を試験した。
マウスSIGNR1、SIGNR3、またはSIGNR5のいずれかを安定的に発現するHT1080細胞が生成された。様々な濃度の、SINvar1、キフネンシンで修飾された高マンノースSINvar1、または汎親和性VSV−Gにより偽型化した組み込み不能なGFPをコードするベクターを有する、これらの細胞をインキュベートした。実施例8において、マンノシダーゼI阻害剤のキフネンシンの存在で産生されるSINvar1エンベロープがDC−SIGN結合およびヒトDC形質導入に必要であることを実証した。したがって、この実験において、ヒトDC−SIGNを過剰発現するHT1080細胞は、陽性対照として使用した。ヒト受容体において観察されたように、試験した3つのマウスDC−SIGNオーソログのうち、SINvar1偽型ベクターが、マウスSIGNR1を発現する細胞のみを形質導入し、キフネンシン依存性様式においても形質導入した(図18A〜D)。ヒトDC−SIGNおよびマウスSIGNR1を発現する細胞におけるキフネンシンで修飾されたSINvar1ベクターの形質導入効率は、非常に類似しており(図18A、B)、SIGNR1が、マウスにおけるID−VP02ベクター粒子に対して機能的にオーソロガスな受容体であることを示した。
実施例19
SIGNR1は、マウスDCにおいてインビボで発現される
ヒトにおいて意図された作用機構を反映した機能的研究のためのマウスモデルの有用性をさらに調査するために、実験を行って、SIGNR1がマウス樹状細胞上に発現されたかどうかを判定した。
材料および方法
インビボでのSIGNR1および5の発現
5匹のマウスからの個々の膵臓からの細胞または10の膝窩リンパ節のプールは、FcR遮断抗体2.4G2およびLIVE/DEAD(登録商標)Fixable Near−IR(L/D NIR,Invitrogen)の存在下で、FACS緩衝液(PBS、1%FCS、2mM EDTA、0.01%アジ化ナトリウム)中で染色された。表面染色のために使用された抗体は、抗マウスCD4−PerCP−Cy5.5(eBioscience)またはCD4−Alexa Fluor 700(eBioscience)、CD8−Pacific Blue(eBioscience)、およびB220−V500(BD)を含んだ。表面染色後、細胞をCytofix(登録商標)(BD)で固定し、LSRFortessaマルチパラメーターフローサイトメーターで分析した。生存する単細胞事象(L/D NIR、SSH=SSA)を、B細胞(B220 TCRβ)、T細胞(TCRβ、B220)、およびDC(B220 TCRβ MHC−II CD11chi)に再分類した。SIGNR5およびSIGNR1の発現にゲートをかけ、これらのサブセットのそれぞれは、SIGNR1およびSIGNR5に特異的な抗体を欠失している陰性対照株を使用して設定され、そのため、陽性事象の頻度は、0.00以下になった。
結果
3つの個々の膵臓または3つの膝窩リンパ節のプールからの単細胞懸濁液はそれぞれ、T細胞、B細胞、およびDCにおいて、SIGNR1およびSIGNR5の発現について分析した。SIGNR5の発現は、定常状態において比較的まれであり、B細胞の小集団においてのみ検出された(図19)。対照的に、SIGNR1の発現は、リンパ球に限定され、約10〜12%のMHC−II CD11chi DCが、SIGNR1を発現した(図19)。SIGNR1もまた、ID−VP02ベクター粒子の機能的受容体であるため、これらのデータにより、ID−VP02ベクター粒子が、インビボでマウスDCを特異的に標的とし得るかどうかを評価することが可能になった。
実施例20
[0332]ID−VP02ベクター粒子は、インビボでリンパ節DCを流出するマウスを標的とする
シンドビスウイルスE2糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクター粒子がコードされた導入遺伝子の産物が、直接投与後、DCにおいて検出され得るかどうかを判定するために、GFPまたは非蛍光陰性対照タンパク質をコードする粒子を、レシピエントBALB/cマウスの右足蹠に注入した。
材料および方法
[0332]インビボでのID−VP02−GFPの形質導入
BALB/cマウス(n=15/群)に、3×1010ゲノムのGFPをコードするID−VP02ベクター粒子、NY−ESO−1をコードする対照粒子を足蹠に皮下注射したか、または処置しないままにした。4日後、流入領域膝窩および非流入領域頸部リンパ節を、5匹のマウスからプール(処置群あたり3つのプール)し、生存する(L/Dシングレット事象(L/D NIR−、SSH=SSA)を、GFPの存在について分析した。GFP細胞の表現型を、抗マウスCD11c−PE−Cy7(eBioscience)、MHC−II−Pacific Blue(eBioscience)、SIGNR5−PE(eBioscience)、およびSIGNR1−APC(eBioscience)で共染色することによって判定した。
結果
GFPをコードするID−VP02ベクター粒子を注射してから4日後、流入領域膝窩および非流入領域頸部リンパ節を、5匹のマウスからプール(処置群あたり3つのプール)し、GFPの発現について分析した。GFPをコードするが、非蛍光対照タンパク質をコードしないID−VP02ベクター粒子の注射により、流入領域膝窩リンパ節においてGFP細胞が検出されたが、遠位リンパ節において検出されなかった(図20A)。さらなる表面マーカー分析時、CD11cおよびMHC−II発現によって示されるように、形質導入した細胞のうちの約90%が、DCとして特定され(図20B)、これらのGFP DCのうちの1/3超が、SIGNR1であり(図20C)、このことは、インビボでのマウスDC形質導入において、この受容体に対する可能性のある役割を支持している。
実施例21
ID−VP02ベクター粒子DNAは、制限された生体内分布を有する
リンパ節細胞の分析は、インビボでのマウスDCの特異的な標的化と一致しているが、生体内分布研究は、形質導入事象が、他の、具体的には、非リンパ系組織において検出され得るかどうかを構築し、陽性組織部位でクリアランス動態を特徴付けるために行われた。
材料および方法
ベクター生体内分布
C57BL/6マウス(n=3/群)は、尾基底部の皮下に、3×1010ゲノムのポリエピトープ構築物LV1bをコードするID−VP02を受容した。逆転写されたベクターDNAの存在を、注射から1、4、8、21、または42日後、注射部位(尾基底部)、膵臓、肝臓、心臓、卵巣、脳、ならびに流入部位(鼠径部)および非流入部位(頸部)リンパ節の組織において、qPCRによって分析した。組織は、Fastprep−24ホモジナイザー(MP Biomedicals,Santa Ana,CA)を使用して、Fastprep Lysing Matrix D管中で処理し、Qiagen
DNeasy Blood & Tissueキット(Qiagen Inc.,Valencia,CA)を使用して、ホモジネートからゲノムDNAを単離した。溶出したDNA(試料あたり200ng)を、EXPRESS qPCR Supermix Universal(Life Technologies,Carlsbad,CA)、ならびにLV1bカセット内で85bpの標的配列を増幅するように設計されたプライマー/プローブセットを使用して、qPCRによって四重に分析した。すべての反応は、Bio−Rad CFX384を使用して行い、Bio−Rad CFX Managerソフトウェア(Bio−Rad Laboratories,Hercules,CA)を使用して分析した。ベクターDNAのコピー数は、7log範囲(10コピー〜10コピー)にわたって希釈された標的配列を含むプラスミドDNAから成る標準曲線を参照して計算した。
結果
LV1bと表記されるポリエピトープモデルの抗原構築物をコードするID−VP02ベクター粒子を、粒子の生体内分布を判定するために使用した。ベクター注入後、LV1bカセットに特異的なプライマーおよびプローブのセットを使用するqPCRによって、逆転写されたベクターゲノム(ベクターDNA)の存在を測定することができる。マウスに、尾の底部での単回皮下注射において、2.8×1010ゲノムの偽型ベクター粒子−LV1bを投与した。注射から1〜42日後の時間経過において、注射部位(尾基底部)、流入領域(鼠径部)および非流入領域(頸部)のリンパ節、膵臓、心臓、肝臓、脳、ならびに卵巣においてベクターDNAを定量化した。投与後の早期の時点で、ベクターDNAは、注射部位および流入領域リンパ節においてのみ検出された。これらの組織において、ベクターシグナルは、経時的に減少し、流入領域リンパ節において、8日間で定量化可能なシグナルはなく、注射部位では、シグナルは、42日間で定量下限(LOQ;10コピー)をかろうじて上回った(図21)。これらの結果は、注射部位の外側でのID−VP02ベクター粒子の分散は、その生物活性が、生じると仮説を立てられ得る流入領域リンパ節に限定され、ベクターDNAの99%超が、3週間以内に一掃されたことを示す。実施例22
ID−VP02ベクター粒子は、多官能性の一次および二次CD8 T細胞応答を誘発する
以下の実験は、シンドビスウイルスE2糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクター粒子のインビボで抗原に特異的な免疫応答を生成する能力を測定するために行われた。
材料および方法
細胞内サイトカイン染色(ICS)
膵臓は、70μMナイロンフィルターを通して圧迫することによって、均質化された。赤血球は、氷冷却した限外濾過した水への短期間の曝露による低張ショックによって溶解し、続いて、10×PBSにより、その後の等張性の回復を行った。サイトカインの分析のために、細胞は、完全RPMI(10% FCS、10mM HEPES、2μM β−メルカプトエタノール、およびL−グルタミン)中で、ペプチドあたり1μg/mLの濃度であるペプチドを含む96ウェルを、37℃で、5% COで5時間刺激した。OVA257(SIINFEKL)(配列番号24)、LCMV GP33(KAVYNFATM)(配列番号66)、AH1(SPSYVYHQF)(配列番号67)、およびAH1A5(SPSYAYHQF)(配列番号25)を含むペプチドは、AnaSpec(Fremont,CA)による95%純度で製造された。いくつかの実験において、述べたように、抗マウスCD107a−PerCP−eF710(eBioscience)は、T細胞を脱顆粒させる表面上の移行性CD107aを捕捉するために刺激カクテルに含まれた。刺激後、表面染色は、FcR遮断抗体2.4G2およびLIVE/DEAD(登録商標)Fixable Near−IR(L/D NIR,Invitrogen)の存在下で、FACS緩衝液(PBS、1%FCS、2mM EDTA、0.01% アジ化ナトリウム)中で行われた。インビボ実験において表面染色のために使用された抗体は、抗マウスCD4−PerCP−Cy5.5(eBioscience)またはCD4−Alexa Fluor 700(eBioscience)、CD8−Pacific Blue(eBioscience)、およびB220−V500(BD)を含んだ。表面染色後、細胞は、Cytofix(登録商標)(BD)で固定され、FACS緩衝液中で、4℃で一晩保存された。次いで、細胞を、5%ラット血清(Sigma Aldrich)を含有するPerm/Wash(商標)緩衝液(BD)で透過させた。細胞内染色のための抗体は、5%ラット血清を含有する希釈されたPerm/Wash(商標)緩衝液であり、透過性細胞に添加した。抗体は、抗マウスTNF−α−FITC(eBioscience)、IFN−γ−PE(eBioscience)、およびIL−2−APC(eBioscience)を含んだ。細胞は、Perm/Wash(商標)緩衝液で2回洗浄し、FACS緩衝液中で再懸濁し、ハイスループットサンプラー(High
Throughput Sampler)(BD)を用いて、3レーザーLSRFortessaにおいて分析した。データは、FlowJoソフトウェア(TreeStar,Ashland,OR)を使用して分析した。生存CD8 T細胞は、リンパ球(FSCint、SSClo)、単一細胞(SSC−A=SSC−H)、生(L/D NIRlo)、B220 CD4 CD8をゲートにかけた。サイトカインゲートは、99.9パーセンタイルに基づき(未刺激細胞において0.1%の陽性事象)、CD107aゲートは、99パーセンタイルに基づいた。
結果
インビボでのID−VP02ベクター粒子の免疫学的活性を評価するために、一用量範囲の完全長ニワトリオボアルブミンをコードするベクター(ID−VP02−OVA)が、C57BL/6マウスに皮下投与され、膵臓におけるOVA257に特異的なCD8 T細胞応答が、細胞内サイトカイン染色(ICS)によって測定された(図22A)。膵臓CD8 T細胞間でのIFN−γ+エフェクターの頻度は、7.0×1010ゲノムの一用量で約15%から2.7×10ゲノムで約1%の平均の範囲に及び、ID−VP02は、少なくとも2log用量範囲にわたって用量依存的な様式で、CD8 T細胞応答を誘発することを示す。
同種ブーストとしてID−VP02の投与を通して記憶され得るメモリT細胞を誘発したID−VP02ベクター粒子でプライミングするかどうかに対処するために、動物を、中程度の用量の1.0×1010ゲノムでプライムし、プライムから35日後、等用量でブーストした。プライムアンドブースト後の様々な時点で、CD8 T細胞応答を、ICSによって測定した。IFN−γ CD8 T細胞の頻度を分析することによって、ID−VP02−OVAによるブーストは、一次応答よりもさらに急速かつ2倍超の大きさであるOVA257に特異的な記憶応答を誘発したことが見出された(図22B)。これらのデータは、ID−VP02の適用が、アデノウイルス系ベクター等の他のウイルスベクターにとって問題であることが知られている、ベクターに特異的な免疫力による単回投与に制限されないことを示す。
IFN−γの染色に加えて、一次および二次CD8 T細胞応答の性質は、2つのさらなるサイトカイン、TNF−αおよびIL−2の同時染色、ならびにCD107aの表面転座、細胞毒性の相関によって分析された。CD107a、TNF−α、およびIL−2の解明から明らかなように、プライムアンドブースト後、応答するCD8 T細胞のほとんどは、多機能な表現型を有した(図22C、D)。特に、ブーストから35日後、実質的には、IFN−γ細胞の100%が、CD107aであり、また、大多数はTNF−αを発現し、これらの「三重陽性」細胞のかなりの割合はまた、IL−2を産生し、これにより、高機能性品質を有するメモリT細胞の形成を示す。
マーカーKLRG1およびCD127は、それぞれ、ウイルスに特異的なCD8 T細胞応答のほぼピークを測定した場合、短時間のエフェクター細胞(SLEC)およびメモリ前駆細胞(MPEC)の運命と関連している。LCMVによる感染中に観察されるように、抗原に特異的なH−2K−OVA257の多量体結合CD8 T細胞の表現型が、免疫化から9日後に分析され、細胞の割合は、KLRG1 CD127 SLECまたはKLRG1 CD127 MPECの表現型のいずれかに分極した(図22E)。興味深いことに、プライムアンドブーストの免疫化から35日後、細胞の大部分は、CD127メモリ表現型を有したが、それらは、KLRG1とKLRG1のサブセットにほぼ均等に分割され、これらはともに、SLECを上回って増加した記憶の可能性があることが報告されている。
実施例23
シンドビスウイルスE2糖タンパク質により偽型化したレンチウイルスベクター粒子により誘発されたメモリCD8 T細胞は、抗ウイルス機能を拡大し、阻害する
最小限のOVA257およびLCMV GP33ペプチド配列の両方をコードするLV1bと称される代替の抗原カセット、SINVar1の免疫化により誘発されたメモリCD8 T細胞の機能を直接評価するために、2つの強固なH−2Kbに制限されたエピトープが採用された。
材料および方法
MHC−I多量体およびメモリ表現型分析
上記のように調製された脾細胞は、2−4G2抗体の存在下、室温のFACS緩衝液中で、H−2K−OVA257 MHC−I五量体(ProImmune,Oxford、UK)で10分間染色した。細胞を一度洗浄し、表面抗体+L/D NIRで、氷上で20分間染色した。抗体は、CD127−FITC、CD44−PerCP−Cy5.5、KLRG1−APC、CD8−Alexa Fluor 700(すべて、eBioscienceから)、およびB220−V500(BD)を含んだ。細胞を洗浄し、Cytofix(登録商標)で固定し、上記のように分析した。生存能力のあるCD8 T細胞集団内で、免疫化されていないマウスにおいて、99.9パーセンタイルに基づいてゲートにかけたCD44hi H−2K−OVA257五量体事象は、KLRG1およびCD127の発現について分析した。
ワクシニアウイルスチャレンジ
C57BL/6マウスは、一用量範囲のLV1bをコードするID−VP02、OVA257(SIINFEKL)(配列番号24)およびLCMV GP33(KAVYNFATM)(配列番号66)のH−2Kに制限されたエピトープを含むポリエピトープ構築物、またはHBSSビヒクルを用いて、0日目に尾基底部の皮下に免疫化した。5週間後、マウスに、1×10TCID50の、OVAを発現する組み換えワクシニアウイルス(rVV−OVA)、1E7 TCID50野生型ワクシニアウイルス(VV−WT)、またはHBSSビヒクルを用いて、腹腔内にチャレンジした。チャレンジから5日後、上記のような、OVA257およびGP33に特異的なICSのために、膵臓を採取し、TCID50アッセイによるウイルス負荷の定量化のために、卵巣を採取した。
結果
図23Aに図式的に示されるように、ID−VP02−LV1bによる免疫化から35日後、マウスは、OVAを発現する組み換えワクシニアウイルス(rVV−OVA)によりチャレンジしたが、野生型ワクシニアウイルス(VV−WT)によりチャレンジされず、OVA257に特異的なCD8 T細胞の劇的な拡大を示し(図23B、C)、これらのメモリ細胞が、抗原に特異的な様式で記録されたことを示した。さらに、rVV−OVAは、GP33に特異的なメモリ細胞を拡大せず(図23B)、このことにより、同じ動物内で抗原特異性の必定条件を確認した。感染に応答したCD8 T細胞の用量依存的な誘導に対応して、感染したマウスの卵巣において、rVV−OVAのウイルス負荷の明らかな用量依存的な減少があった(図23D)。重要なことには、LV1b抗原構築物とrVV−OVAチャレンジ株との間に共有した単一の抗原配列は、SIINFEKL MHCクラスIエピトープであり、CD8 T細胞によって保護が媒介されたことを示した。実際には、保護が抗原に特異的であったことを確認すると、VV−WTによる感染は、免疫化により影響を及ぼさなかった。
実施例24
SINVar1免疫化は、予防および治療の両方の抗腫瘍の有効性を提供する
CT26腫瘍細胞株は、BALB/cマウスにおいて、自然発生大腸癌由来である。移植されたCT26腫瘍の拒絶反応を媒介することができる内因性エピトープが、AH1ペプチドである。MHC−TCRの相互作用が、AH1エピトープにより比較的弱いが、変更されたペプチドリガンドAH1A5は、この相互作用を安定化することができ、より多くのCD8 T細胞の増殖および抗腫瘍応答をもたらす。既に報告されているように、このエピトープをコードするSINVar1を生成するために、AH1A5配列を完全長OVA配列に挿入した抗原カセット(OVA−AH1A5)が生成された。Brockstedt et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 101(38),13832(2004)。
材料および方法
インビボ細胞毒性アッセイ
BALB/cマウス(群あたり3匹)を、OVA−AH1A5をコードするID−VP02を用いて、尾基底部の皮下に免疫化した。12日後、免疫化した未処置対照マウスに、色素標識したペプチドでパルスした標的細胞を、眼窩洞後部を介して静脈内移入した。標的細胞は、低張ショックによって赤血球を溶解し、1μg/mLのAH1(SPSYVYHQF)(配列番号67)、AH1A5(SPSYAYHQF)(配列番号25)、または陰性対照NY−ESO−181−88(RGPESRLL)(配列番号68)ペプチドのいずれかでパルスした3つの集団に細胞を分割することによって、ナイーブな脾細胞から調製された。細胞を洗浄し、次いで、2μM CFSE(Invitrogen)と、2μM、0.2μM、または0.02μMの3つの濃度のCell Trace Violet(Invitrogen)のうちの1つで標識した。標的細胞は、1:1:1の比率で混合し、5×10 全細胞をレシピエントに移入した。翌日、膵臓を採取し、それぞれの集団の相対的回復を、ナイーブマウスと免疫化したマウスを比較して、前述のように、特異的な死亡を計算した。Wonderlich et al.,Curr.Protoc.Immunol. Chapter 3,Unit(2006)。
CT26腫瘍チャレンジ
予防実験のために、BALB/cマウス(群あたり10匹)を、CT26腫瘍細胞の画定されたMHC−Iに制限された拒絶反応のエピトープを含有する抗原、OVA−AH1A5をコードするID−VP02を用いて、尾基底部の皮下に免疫化した。4週間後、免疫および未処置対照マウスに、右脇腹に8×10 CT26腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍増殖は、一週間に3回モニタリングし、腫瘍領域が100mmを超えたとき、マウスを殺処分した。ID−VP02による免疫化が、腫瘍の移植から4日後に遅延したことを除いては、治療モードで、ID−VP02を試験する実験は、同じ方法で行った。
結果
BALB/cマウスに、OVA−AH1A5をコードするID−VP02で免疫化された場合、多機能AH1A5に特異的なCD8 T細胞の用量依存的な誘発が観察され、この約半数が、内因性AH1配列と交差反応した(図24A)。細胞傷害能を有するID−VP02誘発CD8 T細胞の能力を、インビボ細胞毒性アッセイによって直接分析した。3つの脾細胞標的細胞集団を、CFSEと異なる濃度のCell Trace Violetとで同時に標識し、AH1、AH1A5、または陰性対照ペプチドによりパルスした。標的細胞は、1:1:1の比率で混合し、ID−VP02で12日前に免疫化したレシピエントマウスに共移入したか、または処置しないままにした。1日後、AH1およびAH1A5でパルスした標的の相対的回復は、ID−VP02で免疫化したマウスにおいて減少し、AH1A5に対して90%超およびAH1に対して約25%の特定の致死率を有し(図24B)、これにより、ID−VP02が免疫抗原に対して機能的細胞傷害性CD8 T細胞を誘発することを示す。
抗腫瘍の有効性の第一の試験として、ID−VP02−OVA−AH1A5またはビヒクルで同時に免疫化したマウスは、脇腹内に移植したCT26腫瘍細胞で28日後にチャレンジされた。すべての対照マウスは、21日目までに致死的な腫瘍増殖(>100mm)を有したが、ID−VP02で免疫化したマウスのうちの70%は、移植した腫瘍を拒絶することができ、これらの生存しているマウスには、少なくとも60日間腫瘍がなかった(図24C)。一療法としてID−VP02を既に移植したCT26腫瘍に適用することによって、これらの所見を拡大した。このモデルにおいて、腫瘍を5日間増殖させ、動物をID−VP02−OVA−AH1A5またはビヒクル対照で処置した。予防実験と同様に、すべての対照動物は、約3週間以内に腫瘍増殖で死亡した(図24D)。対照的に、ID−VP02で処置したすべてのマウスは、腫瘍進行への影響を示し、成長速度の遅延から明白な拒絶の範囲に及んだ。腫瘍は、免疫化群において、触知可能なサイズまで成長しないか(2/10)、または完全に退行せず(3/10)、50%のマウスは、少なくとも60日目まで腫瘍がなかった。これらのデータは、ID−VP02が、予防的および治療的設定の両方において、抗腫瘍細胞傷害性活性を発揮することができ、ヒトにおける癌の治療剤としてID−VP02の評価を支持することを示す。

Claims (1)

  1. 図面に記載の発明。
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