CN114173809A - 免疫刺激组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一组成型活性促炎半胱天冬酶，其包含洗牌的p10及p20结构域，用于一种刺激一个体的一免疫反应的方法的用途。本发明还涉及一免疫刺激组合物，其包含含有洗牌的p10及p20结构域的所述组成型活性促炎半胱天冬酶，与一药理学上可接受的赋形剂，以及其用于一种治疗一个体的方法的用途。

Description

免疫刺激组合物及其用途

技术领域和背景技术

本发明一般涉及免疫刺激组合物，包含一焦亡细胞死亡的诱导剂，如包含交换的p10和p20结构域的一组成型活性促炎半胱天冬酶。

对抗癌症及病原体的有效免疫反应需要T细胞的激活特定针对蛋白质片段(抗原)，由恶性转化或感染的细胞选择性表达。在引流淋巴结激活后，这些激活的T细胞重新进入循环并侵入受影响的组织以清除异常但不健康的细胞。在第一次遇到抗原后，这些T细胞的扩展子集会持续存在并且更容易被激活。因此，这些记忆性T细胞降低了再次感染相同或相似病原体的易感性，并且可以类似地降低癌症复发的风险。抗原特异性和记忆力都是适应性免疫系统的特征。

为了防止感染，可以通过施用抗原制剂对个体赋予免疫，抗原制剂可以来源于感染性病原体本身，也可以肽、蛋白质、mRNA或DNA的形式合成产生。这种程序，也称为疫苗接种，也可能适用于癌症的预防和治疗。先天免疫系统激活是诱导适应性免疫反应的绝对必要条件。因此，疫苗效力的关键，特别是在合成疫苗的情况下，是包含能激活先天免疫系统的细胞的一佐剂(McKee and Marrack,2017.CurrOpin Immunol 47:44-51)。

最常用的佐剂是明矾，由铝盐组成。最近开发的佐剂倾向于模仿病原体关联的分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPS)以针对先天免疫细胞上的模式识别受体(pattern recognition receptors，PRR)(Kanzler et al.,2007.Nat Med 13:552-9；Wu,2016.Immunology 148：315-25；Vasou et al.,2017.Viruses 9:pii:E186)。这些佐剂通常适用于蛋白质和肽疫苗，但不适用于由RNA或DNA组成的基因疫苗(Li andPetrovsky,2016.Expert Rev Vaccines 15:313-29)。

虽然第一种源自传染性病原体的疫苗是在18世纪制造的，但基因疫苗要年轻得多。第一种DNA疫苗是在20世纪末开发的，关于mRNA疫苗的第一份报告可追溯到2004年(Carralot等人，2004.Cell Mol Life Sci 61:2418–24)。尽管目前许多基因疫苗处于临床试验阶段，但还没有一种疫苗被批准用于人类。这个领域的一个主要挑战是发现有效的佐剂。这类佐剂通常与mRNA或DNA相结合并编码免疫刺激蛋白，例如细胞因子、趋化因子，以及最近的PRR信号通路的组成部分。在这些佐剂中，迄今为止只有两种在人体临床试验中显示出前景：细胞因子IL-12和GM-CSF(CSF2)(Li et al.,2017.Clin Vaccine Immunol 24:e00263-17；Richie et al.,2012.Hum Vaccin Immunother 8:1564-84)。

因此，需要提供先天免疫反应的有效诱导剂，可以作为基因疫苗的佐剂，即核酸基础的疫苗。

发明内容

本发明提供一种组成型活性促炎半胱天冬酶(constitutively active pro-inflammatory caspase)，用于一种刺激一个体的一免疫反应的方法，所述免疫反应优选是一T细胞介导的免疫反应，所述方法包含对所述个体施用所述组成型活性促炎半胱天冬酶。

被感染或转化的细胞可以通过它们死亡的方式提醒免疫系统。凋亡趋向于免疫沉默，因为凋亡细胞不会发出炎症信号，并且会被巨噬细胞迅速清除。相比之下，经历炎症性细胞死亡的细胞会诱导免疫激活。焦亡(pyroptosis)和坏死性凋亡是最近发现的导致损伤关联分子模式释放的程序性坏死形式(DAMPS；Wall et al.,2016.Science 352:51-58)。这些DAMPS包括在活细胞中执行非炎症功能的细胞内分子(例如ATP、高迁移率族框1(HMGB1))和细胞因子，例如IL-1β、IL-18和IL-33。焦亡和坏死性DAMPS需要膜破坏才能释放到细胞外环境中，在那里它们可以结合模式识别受体(PRR)和/或细胞因子受体来激活先天免疫细胞。

已知经历坏死性凋亡的细胞会引发抗肿瘤免疫性。将坏死性细胞注射到小鼠中会激活IFN-γ、TNF-和IL-2产生T细胞，这些T细胞对这些细胞中包含的肿瘤抗原具有特异性。这些T细胞具有细胞毒性，且可以有效清除肿瘤细胞(Yatim等人，2015.Science 350:328-334；Aaes et al.,2016.Cell Rep 15:274-278))。此外，在肿瘤细胞中一坏死性效应子分子的强制表达、混合谱系激酶结构域样(MLKL)会激活肿瘤特异性T细胞，这有助于清除肿瘤(van Hoecke et al.,2018.Nat Commun 9:3417)。受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)是这条通路中MLKL上游的一关键参与者，在肿瘤细胞中的表达经常降低，这一事实也强调了抗肿瘤免疫中坏死性凋亡的重要性。活性MLKL在细胞膜中形成孔，细胞因渗透作用在其上“爆炸”，导致大量DAMP释放。因此，坏死性凋亡可以通过触发以促炎细胞因子IFNγ和TNF为特征的一毒性反应来刺激抗肿瘤免疫性，这是一种典型的用于抗病毒免疫的免疫反应。

另一方面焦亡主要发生在暴露于沙门氏菌(Salmonella)等细菌、真菌和一些病毒的巨噬细胞中。焦亡特有的是促炎细胞因子IL18和IL1β的释放，以及细胞膜中gasdermin D(GSDMD)孔的形成(Amarante-Mendes et al.,2018.Front Immunol 9:2379-97)。GSDMD诱导一形态学上独特的细胞死亡类型，其特征是在没有渗透诱导的细胞膨胀和破裂的情况下形成焦亡体(Chen等人，2016.Cell Res 26:1007-20)。细胞因子制造和细胞死亡都依赖于促炎半胱天冬酶的激活，尤其是半胱天冬酶-1。此途径可能不利于对抗病毒感染，因为缺乏半胱天冬酶-1的小鼠不太容易受到流感感染(Ren等人，2017.Sci Rep 7:7625)和对半胱天冬酶-1的抑制延长小鼠感染狂病病毒后存活时间(Koraka et al.,2018.Vaccine10.1016/j.vaccine.2018.04.002)。因此，与坏死性凋亡相反，焦亡是在有限的细胞亚群(巨噬细胞)中作为一种抗微生物反应出现的，具有一不同的签章细胞因子谱(IL18、IL1β)和形态。因此，瞄准此途径以刺激针对病毒或癌症的一免疫反应并不显而易见。

包括US2014/037685、US2018/311343、WO 2018/049014和WO 2018/106753在内的多个文件提出，一焦亡诱导剂可能会激发一免疫反应。这种焦亡诱导剂优选是或编码一蛋白质，选自含有一CARD(ASC)的一凋亡关联的斑点蛋白、一炎性半胱天冬酶如半胱天冬酶-1、一gasdermin如gasdermin-D或gasdermin E，和/或这些蛋白质中的任何一种的变体。然而，这些文件都没有描述和展示由结构域交换产生的一组成型活性促炎半胱天冬酶。

根据本发明，一种组成型活性促炎半胱天冬酶优选是人类组成型活性促炎半胱天冬酶，包含交换的p20和p10结构域，任选通过一蛋白酶可裂解位点连接。根据本发明，所述组成型活性促炎半胱天冬酶优选是一组成型活性促炎半胱天冬酶-1。根据本发明，所述组成型活性促炎半胱天冬酶缺少一半胱天冬酶-募集结构域(caspase-recruitment domai，CARD)。

一组成型活性促炎半胱天冬酶，优选人类半胱天冬酶-1，根据本发明优选包含一甘氨酸，对应于G401(SEQ ID NO:1),，其位在离一半胱氨酸多达40个氨基酸残基的一距离，所述半胱氨酸对应于C135(SEQ ID NO:1)，优选位在一距离小于10个氨基酸残基如0-2个氨基酸残基。一优选组成型活性促炎半胱天冬酶，根据本发明优选包含对应于G403(SEQ IDNO:52)的一甘氨酸，其位在离对应于C136(SEQ ID NO:52)的一半胱氨酸0至40个氨基酸残基的一距离处，优选位在一距离为0-10个氨基酸残基如0-2个氨基酸残基。这有效地去除或替换p20结构域的多达16个N-端氨基酸和p10结构域的多达1个C-端氨基酸。

一组成型活性促炎半胱天冬酶根据本发明优选在所述蛋白质的所述N-端部分缺少一p20-p10域间连接子(IDL)。所以，所述区间N-端至所述半胱天冬酶p10结构域，所述IDL的一残余物优选比15个氨基酸更短，优选比7个氨基酸更短，更优选比2个氨基酸更短，最优选是缺少。

一优选的免疫反应直接针对一肿瘤或感染，存在于一个体或被诱导以防止一肿瘤或感染在一个体发生或复发。所述焦亡诱导剂的给药，优选所述组成型活性促炎半胱天冬酶，包含洗牌的p10和p20结构域，因此用于预防性的和/或治疗性的给药。

在一实施例中，所述焦亡诱导剂，优选所述组成型活性促炎半胱天冬酶包含洗牌的p10和p20结构域，施用于所述个体的一肿瘤内，优选通过瘤内注射。

在一实施例中，所述焦亡诱导剂，优选所述组成型活性促炎半胱天冬酶，包含洗牌的p10和p20结构域，作为一疫苗的一佐剂进行外用和/或全身给药。

所述焦亡诱导剂，优选所述组成型活性促炎半胱天冬酶，包含洗牌的p10和p20结构域，优选与一或多个辅助分子一起施用，如一免疫检查点抑制剂和/或一进一步的免疫刺激分子例如一趋化因子或一细胞因子，优选表3中举例的一或多个辅助分子。一优选的辅助分子是一免疫检查点抑制剂，例如抗体对抗PD1或其配体、抗体对抗CTLA-4和/或一细胞因子如白介素[Interleukin-12(IL12)]和/或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)(CSF2)。

在一实施例中，所述焦亡诱导剂，优选所述组成型活性促炎半胱天冬酶，包含洗牌的p10和p20结构域，作为一表达分子被提供，优选表达一焦亡诱导剂如表1-2所列的任一个，优选所述组成型活性促炎半胱天冬酶包含洗牌的p10和p20结构域。

本发明还提供一种免疫刺激组合物，包含一焦亡诱导剂，优选包含洗牌的p10和p20结构域的所述组成型活性促炎半胱天冬酶，以及一药理学上可接受的赋形剂。

所述免疫刺激组合物根据本发明优选还包含至少一抗原或抗原编码的核酸分子。所述免疫刺激组合物可额外包含一辅助免疫刺激分子如一免疫检查点抑制剂和/或一进一步的免疫刺激分子如一细胞因子和/或一趋化因子。一优选的辅助分子是或包含一或多个表3所提供的分子。

在一免疫刺激组合物中，所述焦亡诱导剂，优选包含洗牌的p10和p20结构域的所述组成型活性促炎半胱天冬酶，根据本发明优选选自表1至表2任一个所述的分子。

本发明还提供一种免疫刺激组合物，根据本发明，用于一种治疗患有一肿瘤或一感染的一个体的方法。

本发明还提供一种刺激一个体的一免疫反应的方法，优选一T细胞介导的免疫反应，所述方法包含提供本发明的一组合物，并对所述个体施用所述组合物。

附图说明

图1：半胱天冬酶-1(Caspase-1)构造。CASP1_WT(SEQ ID NO:1)构造编码for the整个野生型序列of小家鼠Casp1，同时在CASP1_C285G(SEQ ID NO:2)中所述半胱氨酸(于位置284处)在Casp1的所述活性位点中被一甘氨酸置换，使得此位点无酶活性。在CASP1_RV(SEQ ID NO:3)及CASP1_RV2(SEQ ID NO:4)中，C-端p10结构域(SEQ ID NO:5)被移到N-端且通过Il1b(SEQ ID NO:7)的所述半胱天冬酶-1裂解位点，由一向下箭头指示，从CARD-p20连接子序列隔开。CASP1_RV保留一小部分的p20(5个C-端氨基酸)于N-端，其在CASP1_RV2中已经被移除。最终，在iCASP1(SEQ ID NO:8)中一较少CARD版本的半胱天冬酶-1被一小的SGGGS连接子(SEQ ID NO:9)连接到来自FKBP(F36V-FKBP,SEQ ID NO:10)的一AP1903-诱导型二聚化结构域。F36M-FKBP(SEQ ID NO:11)在dCASP1(SEQ ID NO:12)中诱导自发的二聚化。

图2：CASP1_RV及CASP1_RV2诱导细胞死亡。以25ng的指示质粒(SEQ ID NO:NO 14-20)混合25ng的GFP-质粒(SEQ ID NO:13，标记的p53)转染B16F10细胞。转染之后两天，收获细胞并以死亡细胞的一标记物7-AAD染色。(A)半胱天冬酶-1构造。(B)对照构造。为一非相关小肽Reps1(SEQ ID NO:20)编码的一表达载体作为阴性对照，以及GSDMD_NTER(SEQ IDNO:14)作为一阳性对照。注意代表DExD/H-Box解旋酶58(Ddx58；FLAG_RIGI_NTER,SEQ IDNO:19)的N-端的一构造也诱导细胞死亡。

图3：CASP1_RV2诱导前体-IL-1β加工及IL-1β分泌。以0.6ng的所述指示质粒混合10ng空载体(empty vector)、前体-IL1β(SEQ ID NO:21,IL1B_FL,半胱天冬酶-1依赖性)或成熟IL-1β(SEQ ID NO:22,IL1B_WT,半胱天冬酶-1独立性)转染B16F10细胞。指示时，转染之后一天以10nM AP1903处理细胞。Two days after转染之后两天，收集上清液用于IL-1βELISA和LDH释放的测量。注意在这些实验条件下，没有转染导致细胞死亡，因为他们不造成显著的LDH释放(未示出数据)。

图4：CASP1_RV2改善T细胞反应及抗肿瘤免疫性。在第0天C57BL/6小鼠进行皮内接种多表位疫苗(polyepitope vaccine)(SEQ ID NO:23,10μg)与空载体对照、CASP1_RV2(SEQ ID NO:4)或参考佐剂CSF2(SEQ ID NO:24,10μg)。在接种疫苗后第6天(A)、第9天(B)、第13天(C)及第44天(D)，通过四聚体染色评估OVA-特异性CD8 T细胞反应。在第29天小鼠受到B16-OVA细胞攻击，并接着跟踪另外3个月的肿瘤生长。E.无肿瘤存活。

图5：活性形式的Ddx58(RIG-I)及Gsdmdc1(GSDMD)不会改善CD8 T细胞免疫性。C57BL/6小鼠皮内接种10μg多表位疫苗(封闭符号)或空载体(开放符号)，与10μg空载体对照(-)或编码活性形式的Ddx58(SEQ ID NO:19,FLAG_RIGI_NTER)、半胱天冬酶-1(SEQ IDNO:4,CASP1_RV2)、Gsdmdc1(SEQ ID NO:14,GSDMD_NTER)或Csf2(SEQ ID NO:24,CSF2)的质粒。在接种疫苗后第8天，通过四聚体染色评估OVA-特异性CD8 T细胞反应。

图6：组成型活性鼠半胱天冬酶-1的渐进式N-端截断揭示了在所述N-端保留部分的p20-p10域间连接子(IDL)以获得最佳CASP1_RV活性的要求。(A)CASP1_RV N-端变体的示意图。p10结构域的所述N-端序列上游是MVLLKDSVRDSEEDFLTDAIFEDD(CASP1_RV,SEQ IDNO:3)、MSEEDFLTDAIFEDD(CASP1_RV2,SEQ ID NO:4)及M(CASP1_RV2_NTR,SEQ ID NO:38)。B16-F10细胞以0.5或10ng/well(100μl)的所指示的半胱天冬酶-1(或GSDMD N-端,SEQ IDNO:14)及10ng/well IL-1βDNA质粒共转染，以及(B)IL-1β(0.5ng/well半胱天冬酶-1)及(C)LDH活性(0.5and 10ng/well半胱天冬酶-1)2天后在上清液中被测量。

图7：组成型活性鼠半胱天冬酶-1(CASP1_RV2)相较于野生型半胱天冬酶-1(CASP1_WT)更有效大约30倍。以所述指示量的半胱天冬酶-1质粒(在无插入质粒中连续稀释，以保持检测中质粒的总量恒定)与每100μl中10ng前体-IL1β质粒共转染B16-F10细胞，以及两天后评估上清液中(A)IL-1β与(B)LDH活性。CASP1_RV2[SEQ ID NO:4]和CASP1_WT[SEQ ID NO:1]的活性位点突变体分别是CASP1_RV2_C305G[SEQ ID NO:39]和CASP1_C285G[SEQ ID NO:2]。

图8：以所述指示浓度的人类半胱天冬酶-1(hCASP1)变体[SEQ ID NOs:35,44,49-52]，在空载体质粒中连续稀释以保持总DNA浓度，与10ng/well的编码(A)前体-IL1β[SEQID NO:37]或(B)人类GSDMD[SEQ ID NO:53]的质粒一起共转染293个细胞。两天后收集上清液，以确定(A)IL1β浓度或(B)LDH活性。

图9：(A)人类半胱天冬酶-1的晶体结构。注意所述p10结构域(氨基酸317-404)的C-端位在的Gly403的临近以及所述p20结构域(氨基酸135-297)的N-端Leu135。改编自Yang等人(2018)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.115:6792-6797.(B)人类与鼠的促炎半胱天冬酶的序列对齐。注意mCasp1-C135/hCASP1-C136(在hCASP1-L135旁边)及mCasp1-G401/hCASP1-G403氨基酸残基的保存。

具体实施方式

4.1：定义

如本文所用，术语“细胞死亡(cell death)”是一生物细胞停止执行其功能的事件。这可能是自然过程的结果，也可能是由例如疾病、局部损伤或包含细胞的一生物体的死亡等因素引起的。不同类型的细胞死亡，包括细胞凋亡和焦亡，通常由形态学准则来定义。

如本文所用，术语“程序性细胞死亡(programmed cell death)”是指由一活性预定分子机制参与的任何类型的细胞死亡。

如本文所用，术语“细胞凋亡(apoptosis)”是指细胞死亡伴随着细胞变圆、伪足回缩、细胞体积减少[固缩(pyknosis)]、染色质凝聚、核碎裂[核破裂(karyorrhexis)]和质膜起泡(blebbing)。

如本文所用，术语“坏死(necrosis)”是指由细胞损伤或病原体浸润引起的非程序性细胞死亡。坏死的特征在于细胞体积增加、细胞器肿胀、质膜破裂和随后的细胞内内容物的丢失。

如本文所用，术语“坏死性凋亡(necroptosis)”是指由一半胱天冬酶独立模式所引起的细胞死亡的一程序性形式，涉及混合谱系激酶结构域样[mixed lineage kinasedomain like(MLKL)]假激酶的激活和质膜的急性透化。坏死性凋亡可作为一种抗病毒防御机制，可以让细胞在病毒半胱天冬酶抑制剂存在的情况下进行“细胞自杀(cellularsuicide)”，从而限制病毒复制。

本文所用的“焦亡(pyroptosis)”是指细胞死亡的一种程序性形式，其中炎症性半胱天冬酶的激活导致加斯德明蛋白(gasdermin)的裂解和细胞膜的透化。此外，活化的半胱天冬酶可将前体-细胞因子如前体-白介素1β(proIL1β)和前体-IL18裂解成具有生物活性的形式，然后通过细胞透化释放。焦亡发生在感染细胞内病原体时。焦亡通过去除细胞内复制位点和增强宿主的防御反应，促进各种细菌和病毒感染的快速清除。

本文所用术语“T细胞介导的免疫反应”是指负责检测和破坏细胞内病原体，例如感染病毒或细菌的细胞，的一种保护机制。T细胞介导的免疫反应也可以促进肿瘤细胞的破坏。关键参与者是CD4+和CD8+T细胞，它们产生炎症细胞因子，如干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。此外，CD8+T细胞具有诱导感染和/或转化细胞的凋亡的能力。

本文所用的术语“含有CARD(ASC)的凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associatedspeck-like protein)”是指由两个蛋白质-蛋白质相互作用结构域所组成的一衔接蛋白(人类蛋白UniProt：Q9ULZ3)：一N-端的PYRIN-PAAD-DAPIN结构域(PYD)和一C-端的半胱天冬酶-募集结构域(CARD)。编码ASC的人类基因称为PYCARD(HGNC：16608；Entrez Gene：29108；Ensembl：ENSG00000103490)。激活的ASC是焦亡的一关键介质，且作为激活半胱天冬酶-1等炎症性半胱天冬酶的一支架。

本文所用的术语“半胱天冬酶-1(caspase-1)”是指一种蛋白质(人类蛋白质UniProt:P29466)，属于半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(半胱天冬酶)家族的一个成员。半胱天冬酶作为无活性的酶原存在，在保守的天冬氨酸残基处进行蛋白水解加工，产生2个亚基(subunit)，大亚基和小亚基，然后二聚化以形成活性酶。编码半胱天冬酶-1的人类基因被命名为CASP1(HGNC：1499；Entrez Gene：834；Ensembl：ENSG00000137752)。

本文所用的术语“加斯德明D(gasdermin D)”是指被一炎性半胱天冬酶裂解成一N-端和C-端部分的一蛋白质。裂解后，所述N-端部分移动到质膜处形成孔隙，从而促进成熟白介素(IL)1B和IL18的释放，且触发焦亡。全长gasdermin D包含484个氨基酸(人类蛋白UniProt：P57764)，其中氨基酸残基1-275构成所述N-端部分，以及氨基酸残基276-484为所述C-端部分。编码gasdermin D的人类基因称为GSDMD(HGNC：25697；Entrez Gene：79792；Ensembl：ENSG00000104518)。

本文所用的术语“炎(症)性半胱天冬酶”，是指能够诱发焦亡的一半胱天冬酶。所述炎性半胱天冬酶优选选自半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5和半胱天冬酶-12中的一或多个。

如本文所用，术语“蛋白质变体(protein variant)”是指与内源性蛋白质具有相似活性的一蛋白质。一蛋白质变体可以是一蛋白质的一活性部分，或一同源但不相同的蛋白质或其部分。所述同源蛋白质或其部分是有活性的，并且优选与相应的人类蛋白质有70％以上的一致性，更优选与相应的人类蛋白质至少80％一致，例如90％以上一致、95％以上一致或99％以上一致性。

本领域技术人员将理解，术语“％一致性”是指在蛋白质全长上确定的一致性％，除非蛋白质变体是指一蛋白质的一活性部分。

一优选的蛋白质变体是一活性或诱导型蛋白质。ASC、半胱天冬酶-1和gasderminD的优选蛋白质变体见表1和表2。

如本文所用，术语“活性或诱导型蛋白质”是指显性活性，不需要激活，或者其活性可以被诱导的蛋白质，例如通过过表达、转录激活或通过二聚化。诱导型转录激活的一个例子是由一四环素控制的基因表达系统提供的(Yamada et al.,2018.Cell Rep 25:487-500.e6)。诱导型二聚化的一个例子是由基于细菌和植物的光敏色素和隐花色素的相互作用结构域的一光学二聚化系统提供的。这种相互作用的结构域的例子是拟南芥隐花色素2[Arabidopsis thaliana cryptochrome 2(CRY2)]和CRY2相互作用的基础Helix-Loop-Helix(CIB1；Taslimi et al.,2016.Nature Chem Biol 12:425–430)和mTOR的一FK506-结合蛋白(FKBP)和FKBP-雷帕霉素结合[FKBP-rapamycin binding(Frb)]的结构域，可被雷帕霉素诱导二聚化(Kohler and Bertozzi,2003.Chem Biol 10:1303-11)，及其变体，例如Shield 1(Banaszynski et al.,2006.Cell 126:995–1004)。市售系统包括iDimerize诱导型Homodimer System(Takara,Kusatsu,Japan)。

如本文所用，术语“抗原”是指可被适应性免疫系统即通过B细胞和/或T细胞特异性识别的一种分子。一抗原内与一抗体或一T细胞受体结合的一序列称为一表位(epitope)。一优选的抗原包含对癌症特异或在癌症中高度表达的一或多个表位，包括新表位(neoepitope)、来自病原体如细菌和病毒的表位，和/或自然界中不存在的合成表位。如本文所用，术语“新表位(neo-epitope)”是指通过改变氨基酸编码序列的非同义体DNA突变产生的一种表位。一优选的T细胞表位包含8-20个氨基酸残基，更优选8-13个氨基酸残基。一优选的抗原是或包含一多表位，包含2-50个，优选5-25个单独的表位，优选每个包含在8-40个氨基酸残基的一序列中。可以通过间隔序列，优选1-10个氨基酸残基，来交替在一多表位中的所述单独的多个表位。

所述抗原优选还包含G-肌动蛋白、或F-肌动蛋白结合序列，例如GGVADLIKKFESISKEE(Riedl et al 2008,Nat Methods 5:605)。垂死细胞释放肌动蛋白(Actin)并与树突状细胞自然杀手凝集素组受体1[Dendritic cell Natural killerlectin Group Receptor 1(DNGR-1)]结合于常规1型DCs(cDC1s；Ahrens et al.2012,Immunity 36:635–645；Zhang et al.2012.Immunity 36:646–657)上，对于交叉引发CD8T细胞反应很重要(Schulz et al.2018,Cell Reports 24:419–428)。因此，包含肌动蛋白或肌动蛋白结合序列可能因此导致cDC1更有效地交叉引发CD8 T细胞，从而更有效地刺激免疫反应。

如本文所用的术语“辅助分子”，是指可以促进T细胞介导的免疫反应的一分子，包括一免疫检查点抑制剂以及一进一步的免疫刺激分子，如一趋化因子和/或一细胞因子。

如本文所用，术语“免疫检查点抑制剂”是指阻断免疫细胞与其他细胞或细胞因子之间的一抑制性相互作用从而可以增加对癌细胞的杀伤的一分子。检查点相互作用分子的例子是PD-1/PD-L1和CTLA-4/B7-1/B7-2。一优选的免疫检查点抑制剂是阻断PD-1和PD-L1之间相互作用的一分子。阻断PD-1与PD-L1之间的一相互作用的所述分子优选是针对PD1的一抗体和/或针对PDL1的一抗体。

本文所用的术语“进一步的免疫刺激分子”是指促进T细胞介导的免疫反应，如细胞毒性T淋巴细胞诱导，的一种分子。此类分子包括促炎细胞因子，例如白介素(IL-)，如IL-1β、IL-6、IL-12、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(CSF2)，以及肿瘤坏死因子(TNF)、趋化因子如单核细胞趋化蛋白(monocyte chemoattractant protein)或MCP-1，如表3所列。一优选的另一免疫刺激分子是一IL-12家族成员，如IL-12、IL-23、IL-27和/或IL-35和/或CSF2。

如本文所用，术语“基因的疫苗”或基因疫苗是指包含一或多种RNA或DNA核酸序列的一疫苗，所述RNA或DNA核酸序列要针对待引入的一免疫反应的抗原进行编码。诱导细胞免疫反应的基因疫苗提供了一种产生特异性细胞反应的方式，同时避免与例如减毒病原细菌或病毒等相关的风险。

如本文所用，术语“疫苗”是指一免疫刺激分子，优选抗原，其刺激一免疫反应来对抗所述分子。所述免疫反应优选通过刺激所述免疫系统攻击一试剂而赋予针对包含和/或表达所述免疫刺激分子的一试剂的主动免疫。术语疫苗包括含有一免疫刺激分子和一佐剂的一组合物。

如本文所用，术语“全身给药(systemic administration)”是指肠胃外给药，例如静脉内、腹膜内、鼻内、皮内、透皮或肌肉内给药。

如本文所用，术语“局部给药”是指外用给药至体表，例如对皮肤给药、对眼睛、对粘膜或通过吸入给药。

术语“洗牌的(shuffled)”，也称为“交换的(swapped)”，如本文所用，是指一种重组蛋白质，其中保守结构域的顺序发生了改变。包含洗牌或交换的p10和p20结构域的一半胱天冬酶是一种重组半胱天冬酶，其中p10结构域是p20结构域的N-端。

4.2：一蛋白质作为一焦亡诱导剂

在一实施例中，一焦亡诱导剂，优选所述组成型活性促炎半胱天冬酶，包含洗牌的p10和p20结构域，任选地通过一蛋白酶可裂解位点被连接，提供作为一蛋白质，所述蛋白质在一宿主细胞中表达。所述组成型活性促炎半胱天冬酶优选是一组成型活性促炎半胱天冬酶-1。

基于所述人类半胱天冬酶-1序列(UniProt登录号P29466)，半胱天冬酶-1作为一前肽而被生成。人类半胱天冬酶-1(SEQ ID NO:52)含有一半胱天冬酶募集结构域(CARD；SEQ ID NO:54)，从氨基酸残基1到氨基酸残基92。残基93-119构成CARD与p20结构域之间的一连接子，也称为CARD-结构域连接子(CDL；SEQ ID NO:55)。p20亚基结构域(SEQ ID NO:56)从氨基酸残基120延伸到氨基酸残基297，并在Cys285周围包含一个酶促活性位点。所述p20结构域后面是一个小的p20-p10域间连接子(IDL；SEQ ID NO:57)，从氨基酸残基298到氨基酸残基316，以及一个p10亚基(SEQ ID NO:58)从氨基酸残基317到氨基酸残基404。

已有人提出在活性的半胱天冬酶加工的一N-端CARD结构域中需要一个CARD结构域(Boucher等，2018.J Exp Med 215:827-840)。令人惊讶的是，根据本发明的一优选的组成型活性促炎半胱天冬酶，包含洗牌的p10和p20结构域优选缺少一半胱天冬酶-募集结构域(CARD)。

所述组成型活性促炎半胱天冬酶，基于人类凋亡诱导执行者半胱天冬酶-3和-6的组成型活性版本(Srinivasula等，1998.J Biol Chem 273:10107-11)。如本文所述，例如在活性半胱天冬酶-3的设计中，N-端p20和C-端p10结构域是交换的，并由一短(8个AA)半胱天冬酶-3裂解位点隔开。p10上游的一部分序列，包括几个p20氨基酸，也被这种交换移动了。因此，产生的活性半胱天冬酶的N-端起始于四个p20氨基酸，然后是小的p20-p10域间连接子(IDL)和p10(Srinivasula et al.,1998.J Biol Chem 273:10107-11)。

值得注意的是，无酶活性的前体-半酶天冬酶-3已经是一种稳定的二聚体，它在域间连接子(IDL)断裂时改变构象，表明是一种弹簧加载机制，其中切割IDL释放应变并允许酶重组为活性构象。相比之下，半胱天冬酶-1需要IDL裂解和二聚化才能激活。因此，研究了是否可以通过p10和p20结构域的洗牌产生一组成型活性半胱天冬酶-1。

如Srinivasula等人，1998(Srinivasula et al.,1998.J Biol Chem 273:10107-11)中所述，产生一组成型活性小鼠炎症性半胱天冬酶-1(CASP1_RV,SEQ ID NO:3)。据此，小鼠CASP1_RV的N-端以五个p20氨基酸和IDL开始。然而，测试了逐渐缺乏更多这种N-端的三个CASP1_RV变体表明，去除CASP1_RV2[SEQ ID NO:4]中的N-端p20残余物会增加，但进一步去除了CASP1_RV2_NTR[SEQ ID NO:38]中的IDL会降低CASP1_RV的活性。换句话说，最活跃的CASP1_RV2变体在其N-端处保留了大部分带负电荷的IDL序列SEEDFLTDAIFEDD。与野生型小鼠半胱天冬酶-1(CASP1_WT)相比，CASP1_RV2在体外试验中更有效约30倍。因此，尽管人类半胱天冬酶-3与小鼠半胱天冬酶-1之间存在差异，例如半胱天冬酶-1中存在一CARD结构域以及激活机制不同，但Srinivasula的方法确实产生组成型活性的鼠半胱天冬酶-1。

一组成型活性的人类半胱天冬酶-1变体(hCASP1_RV2，SEQ ID NO:35)的设计是基于小鼠CASP1_RV2，因此也是从所述域间连接子GNLSLPTTEEFEDD的14个氨基酸开始的。令人惊讶的，且与小鼠CASP1_RV2形成鲜明对比的是，去除p10(hCASP1_RV2_NTR，SEQ ID NO:49)上游的所有N-端残基会大大增加其活性。

因此，一优选的组成型活性促炎半胱天冬酶，包含洗牌的p10和p20结构域，因此是一组成型活性促炎半胱天冬酶-1，其包含在所述p10结构域之前的IDL序列中缺少一或多个带负电荷的氨基酸残基D和E的洗牌的p10和p20结构域，优选缺少所述域间连接子SVGVSGNLSLPTTEEFEDD，优选完整的域间连接子SVGVSGNLSLPTTEEFEDD。

在一优选的组成型促炎半胱天冬酶中，包含洗牌的p10和p20结构域，一起始密码子ATG优选位于p10序列的前面，优选直接在p10序列的前面。

洗牌的p10和p20结构域之间的干预序列似乎是有弹性的。半胱天冬酶-1的晶体结在其活性构象上(Yang et al.,2018.Proc Natl Acad Sci USA 115:6792-6797)似乎建议p10结构域的C-端和p20结构域的N-端之间的距离是小的。在此区间移除小鼠和人类半胱冬天酶-1的天冬氨酸蛋白酶位点，包含洗牌的p10和p20结构域[SEQ ID NO:s 40-43,45-47]，并没有影响它们加工前体pro-IL1β的能力，表明自动蛋白水解对其活性没有贡献(数据未显示)。相反，此区间似乎仅用作一个弹性的连接子。事实上，将连接子的尺寸减少到9个氨基酸并不是预期的一中性事件，而是出人意料地增加hCASP1_NTR的活性，而不管在较小连接子中是否存在自动蛋白水解目标位点。与野生型人类半胱天冬酶-1相比，所得的hCASP1_NTR_GSL[SEQ ID NO:50]在体外试验中的更有效约30倍。因此，再次与小鼠半胱天冬酶-1相比，交换的p10和p20结构域并没有显着增加人类半胱天冬酶-1的活性。然而，去除N-端处的IDL残余物并减小交换的p10和p20结构域之间的连接子的大小出人意料地确实产生一组成性活性的人类半胱天冬酶-1。

一优选的组成型活性促炎半胱天冬酶，包含洗牌的p10和p20结构域，所述组成型活性促炎半胱天冬酶包含对应于G401(SEQ ID NO:1)的一甘氨酸，其位在从对应于C135(SEQ ID NO:1)的一半胱氨酸残基0到40个氨基酸残基的一距离处，优选一距离为1-10个氨基酸残基。根据本发明的一最优选的组成型活性促炎半胱天冬酶具有G401和C135残基之间的一缩短的距离，因此缺少p10和p20之间的一连接子。

SEQ ID NO:1对应小鼠半胱天冬酶-1序列。本领域技术人员将理解，如上文所使用的术语“对应于”意在指示不同的半胱天冬酶-1序列中的等效氨基酸残基，可能不是位于不同的半胱天冬酶中的同一个位置。例如，小鼠C135对应于人类C136。相似地，小鼠中的G401对应于人类G403。因此，一优选的组成型人类活性促炎半胱天冬酶-1包含洗牌的p10和p20结构域，其包含与G403相对应的一甘氨酸，所述G403位于从对应于C136的一半胱氨酸0至40个氨基酸残基的一距离处，优选位在一距离为0至10个氨基酸残基。根据本发明一最优选的组成型活性人类促炎半胱天冬酶-1具有G403和C136残基之间的一缩短的距离，因此在洗牌的p10和p20结构域之间缺少一连接子。

所述连接子可以是包含约从1个氨基酸残基至约40个氨基酸残基的一连接子多肽，最优选至约35个氨基酸残基，例如至约30个氨基酸残基、至20个氨基酸残基、至15个氨基酸残基，至10个氨基酸残基，如2个氨基酸残基。此类连接子多肽序列的一些优选示例包括Gly-Ser连接子，例如(Gly_xSer_y)_z类型，例如(Gly₄ Ser)₃、(Gly₄ Ser)₇或(Gly₃ Ser₂)₃，如WO 99/42077中所述，以及在例如WO 06/040153和WO 06/122825中描述的GS30、GS15、GS9和GS7连接子。

用于异源蛋白制造的常用表达系统包括大肠杆菌(E.coli)、杆状病毒、酵母、中国仓鼠卵巢细胞[Chinese Hamster Ovary cells(CHO)]、人类胚胎肾(HEK)细胞及其衍生物，包括HEK293细胞，包括HEK293T、HEK293E、HEK-293F和HEK-293FT(Creative Biolabs，NY，USA)和

细胞(Thermo Fisher Scientific，MA，USA)。重组蛋白质在异源系统中的表达效率取决于许多因素，包括转录水平和转译水平两者。

焦亡的所述诱导剂例如选自ASC、半胱天冬酶-1和/或gasdermin D中的一种蛋白质，或其变体，优选一主动或诱导型变体，更优选所述组成型活性促炎半胱天冬酶，包含洗牌的p10和p20结构域，所述组成型活性促炎半胱天冬酶可使用原核细胞，优选大肠杆菌、真菌、最优选丝状真菌或酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichiapastoris)或真核细胞，优选哺乳动物细胞如HEK细胞及其衍生物来制造。可用于哺乳动物细胞中表达的商业系统，例如Expi293哺乳动物瞬时蛋白表达系统(Thermo FisherScientific，Waltham(MA)USA)。

在丝状真菌中一焦亡诱导剂的制造优选如Joosten等人，2005.J Biotechnol120:347-359所述进行，其通过引用并入本文。

在毕赤酵母中一焦亡诱导剂的制造优选如Rahbarizadeh等人，2006.J MolImmunol 43:46-435所述进行，其通过引用并入本文。

在HEK细胞和/或其衍生物中一焦亡诱导剂的制造优选按照Thomas和Smart,2005.J PharmacolToxicol Methods 51:187-200,和/或Lin等人，2015.PLOS ONE 10:e0123562所述进行。

焦亡的所述诱导剂，优选所述组成型活性促炎半胱天冬酶，包含洗牌的p10和p20结构域，优选通过向感兴趣的细胞提供焦亡的所述诱导剂的核酸编码而产生。所述核酸，优选DNA，优选通过技术人员已知的包括使用聚合酶、限制酶和连接酶的重组技术来制造。或者，通过人工基因合成提供所述核酸，例如通过合成部分或完全重叠的寡核苷酸，或通过有机化学和重组技术的组合，如技术人员已知的。所述核酸优选是密码子优化的，以增强焦亡的所述诱导剂在选定的细胞或细胞系中的表达。进一步优化优选包括去除隐蔽拼接位点、去除隐蔽polyA尾部和/或去除导致mRNA不利的折叠的序列。两侧有拼接位点的一内含子的存在可能会促进真核细胞从细胞核中输出。此外，所述核酸优选编码一个蛋白质输出信号，将焦亡的所述诱导剂分泌到细胞外，进入原核生物周质或生长培养基中，从而实现焦亡的所述诱导物的高效纯化。

一焦亡诱导剂的纯化方法是本领域已知的，并且通常以色谱法为基础，例如离子交换，以去除污染物。除了污染物之外，还可能需要去除产物本身的不需要的衍生物，例如降解产物和聚集体。Berthold和Walter,1994(Berthold and Walter,1994.Biologicals22:135-150)提供了合适的纯化工艺步骤。

作为替代或附加，焦亡的一重组诱导剂可以通过基因工程标上一特定的标签，使蛋白质附接在特定于所述标签的一管柱上，因此与杂质分离。然后用一去偶联试剂从亲和管柱中交换纯化的蛋白质。此方法越来越多地应用于重组蛋白质的纯化。用于蛋白质的常规标签，例如组氨酸标签，与特定捕获所述标签的一亲和管柱(例如，一种针对一组氨酸标签的一Ni-IDA管柱)一起使用，以将蛋白质与其他杂质分离。然后根据特定标签(例如，组氨酸标签用的咪唑)使用一去偶联试剂从所述管柱上交换蛋白质。与传统的纯化方法相比，这种方法更具特异性。合适的其他标签包括c-myc结构域、血凝素标签，以及麦芽糖-结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase)、麦芽糖-结合蛋白、FLAG标签肽、生物素受体肽、链霉亲和素结合肽(streptavidin-binding peptide)和钙调蛋白结合肽(calmodulin-binding peptide)，如(Chatterjee,2006.Cur Opin Biotech 17,353-358)所呈现。使用这些标签的方法是本领域已知并且可用于纯化焦亡的所述诱导剂。

4.3：一表达构造作为一焦亡诱导剂

根据本发明，进一步提供了一种表达构造，编码一焦亡诱导剂，优选所述组成型活性促炎半胱天冬酶，包含洗牌的p10和p20结构域。所述表达构造优选包含用于高表达水平的手段，如强启动子，例如病毒来源(例如，人类巨细胞病毒)或源自在一细胞如一哺乳动物细胞中高度表达的基因的启动子(Running Deer and Allison，2004.Biotechnol Prog20:880–889；美国专利第5888809号)。如本领域技术人员所知，所述构造优选包含一选择系统，如谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase)的表达或二氢叶酸还原酶的表达以在一合适的受体细胞中扩增所述载体。

所述构造可以是一种病毒载体，优选能够转导分裂和非分裂癌细胞的一病毒载体。所述病毒载体优选为一重组的腺关联病毒载体、一单纯疱疹病毒基础的(herpessimplex virus-based)载体、一痘病毒基础(pox virus-based)的载体例如WO2011128704中描述的修饰的安卡拉牛痘基础的载体(modified vaccinia Ankara-based vector)，或一慢病毒基础的(lentivirus-based)载体，例如一人类免疫缺陷病毒基础的(humanimmunodeficiency virus-based)载体。所述病毒载体最优选为一逆转录病毒基础的载体，如一慢病毒基础的载体，例如一人类免疫缺陷病毒基础的载体，或一γ-逆转录病毒基础的载体，例如一种基于莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)的载体，脾灶形成病毒[Spleen-FocusForming Virus(SFFV)]、骨髓增殖性肉瘤病毒[Myeloproliferative Sarcoma Virus(MPSV)]或鼠类干细胞病毒(MSCV)。一优选的逆转录病毒载体是SFGγ逆转录病毒载体(Rivière et al.,1995.PNAS 92:6733-6737)。

逆转录病毒，包括一γ-逆转录病毒基础的载体，可以被包装在一合适的补充细胞中，所述细胞提供抗原组多蛋白(Gag)-聚合酶(Pol)和/或封套(Env)蛋白。合适的包装细胞是人类胚胎肾衍生的293T细胞、Phoenix细胞(Swift等人，2001.CurrProtoc Immunol,Chapter 10:Unit 10 17C)、PG13细胞(Loew等人，2010.Gene Therapy 17:272–280))和Flp293A细胞(Schucht等人，2006.Mol Ther 14:285-92)。

一优选的表达构造是一非病毒表达构造，用于一焦亡诱导剂的体内表达，优选所述组成型活性促炎半胱天冬酶包含洗牌的p10和p20结构域。非病毒载体包括环状或线性DNA分子，以及RNA分子，如信使RNA。一非病毒表达构造可以包装在脂质体、脂质复合物或多聚复合物中，和/或作为一分子共轭物(molecular conjugate)提供。可以在体外生成不含质粒细菌DNA序列的小环状DNA分子或线性DNA分子，并且可以在体内高水平表达焦亡的一诱导剂。

所述表达构造还可以包含一核酸编码的另一免疫刺激分子，如一细胞因子。

作为替代或附加，所述表达构造可以与为另一个免疫刺激分子编码的一表达构造相组合。

4.4：诱导焦亡的应用

本发明提供了一焦亡诱导剂，优选是所述组成型的活性促炎半胱天冬酶，其包含洗牌的p10和p20结构域，用于刺激一个体的一免疫反应的方法，优选是一T细胞介导的免疫反应，包含对所述个体施用所述焦亡诱导剂。所述焦亡诱导剂，优选是包含洗牌的p10和p20结构域的所述组合型活性促炎半胱天冬酶，优选用于对患有一疾病或有患病风险的人类进行预防性或治疗性给药。所述疾病包括但不限于麻疹、风疹、霍乱、脑膜炎球菌病、流感、白喉、腮腺炎、破伤风、甲型肝炎、乙型肝炎、戊型肝炎、百日咳、肺结核、肺炎球菌疾病、伤寒、脊髓灰质炎、蜱传脑炎、b型流感嗜血杆菌、狂犬病、水痘和带状疱疹[herpes zoster(shingles)]、人类乳突病毒(human papilloma-virus)、人类免疫缺陷病毒、呼吸道融合病毒(respiratory syncytial virus)、巨细胞病毒、轮状病毒胃肠炎、黄热病、日本脑炎、疟疾、登革热、寨卡病毒相关的小头畸形(Zika virus-related microcephaly)、炭疽、鼠疫、Q热、天花，或来自一非传染性疾病，如癌症。

在一实施例中，所述疾病是癌症。所述个体可患有或可被治疗以防止一癌症复发，包括但不限于癌(carcinoma)、腺瘤(adenoma)、黑色素瘤(melanoma)、肉瘤(sarcoma)、白血病、生殖细胞癌、母细胞瘤和/或淋巴瘤。

所述癌包括腺癌(adenocarcinoma)、鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)、腺鳞癌(adenosquamous carcinoma)、间变性癌(anaplastic carcinoma)、大细胞癌和小细胞癌并且包括膀胱癌(bladder cancer)、乳腺癌(breast cancer)、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、头颈癌、鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)、结直肠癌、宫颈癌、肾细胞癌、胃癌、前列腺癌、黑色素瘤、脑癌、甲状腺癌、子宫癌、食道癌。

所述肉瘤包括阿斯金瘤(Askin'stumour)、软骨肉瘤(chondrosarcoma)、尤因氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、恶性神经鞘瘤(malignant schwannoma)、骨肉瘤(osteosarcoma)和软组织肉瘤(soft tissue sarcomas)，包括纤维肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤和横纹肌肉瘤。

所述白血病包括急性和慢性白血病，包含伯基特白血病(Burkitt's leukemia)等淋巴细胞白血病、急性髓性白血病(AML)和慢性髓性白血病(CML)等骨髓性白血病、毛细胞白血病(HCL)、T细胞幼淋巴细胞白血病(T-cell prolymphocytic leukemia)、大颗粒淋巴细胞白血病、成人T细胞白血病和克隆性嗜酸性粒细胞增多症(clonal eosinophilia)。

所述生殖癌包括精原细胞(germinomatous or seminomatous)生殖细胞瘤，如胚细胞瘤(germinoma)、无性细胞瘤(dysgerminoma)及精原细胞瘤(seminoma)，以及非精原细胞(nongerminomatous or nonseminomatous germ)生殖细胞瘤如畸胎瘤(teratoma)及多胚瘤(polyembryoma)。

所述母细胞瘤包括肝母细胞瘤(hepatoblastoma)、髓母细胞瘤(medulloblastoma)、肾母细胞瘤(nephroblastoma)、神经母细胞瘤(neuroblastoma)、胰腺母细胞瘤(pancreatoblastoma)、胸膜肺母细胞瘤(pleuropulmonary blastoma)、视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)、多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme)和性腺母细胞瘤(gonadoblastoma)。

所述淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤和淋巴浆细胞淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)。

4.5：肿瘤内给药

本发明的实施例中优选的癌症是形成一身体质量的癌症，例如肉瘤、生殖癌和癌(carcinomas)。一焦亡诱导剂，例如选自ASC、半胱天冬酶-1和/或gasdermin D的一主动或诱导型蛋白质，更优选是所述组成型活性促炎半胱天冬酶，其包含洗牌的p10和p20结构域，可以局部施用于患有一癌症的一个体，优选在肿瘤内。由此产生的癌细胞的焦亡将释放与损伤关联的分子模式伴随癌症特异性抗原、优选癌症新表位，这将激活肿瘤特异性T细胞，这些T细胞将开始攻击剩余的癌细胞，且最终甚至可能清除癌症。

所述焦亡诱导剂，例如选自ASC、半胱天冬酶-1和/或gasdermin D的一主动或诱导型蛋白质，更优选是所述组成型活性促炎半胱天冬酶，其包括洗牌的p10和p20结构域，可以作为一蛋白质或优选作为在癌细胞中表达焦亡的所述诱导剂的一表达构造来进行肿瘤内给药。进入一肿瘤的一焦亡诱导剂的所述给药优选是通过瘤内注射、优选通过注射或电穿孔，如本领域技术人员已知的。所述电穿孔可以在体外或优选在体内应用于分离的细胞。一有效量的焦亡诱导剂，优选为所述组成型活性促炎半胱天冬酶，其包括洗牌的p10和p20结构域，作为一种肿瘤内给药的蛋白质，其剂量足够大以产生癌症症状得到改善或甚至消除的预期效果。一治疗有效量优选不会引起不良副作用。通常，一治疗有效量可随所述个体的年龄、状况和性别以及疾病的程度而变化，并且可由本领域技术人员确定。如果出现任何并发症，所述剂量可由个别医生进行调整。一治疗有效量可以从约1微克到约100毫克不等，优选从约10微克到约10毫克，最优选从约0.1毫克到约1毫克，在一次或重复剂量给药中，持续一或更多天。

用于以一蛋白质转导细胞如癌细胞的合适转染试剂包括

转染试剂(Synvolux，Leiden，荷兰)。

所述有效量的一焦亡诱导剂，优选所述组成型活性促炎半胱天冬酶，包括洗牌的p10和p20结构域，作为一蛋白质优选以一缓冲溶液提供，优选具有一pH值介于5和9之间，优选介于6和8之间。所述缓冲溶液可以例如包含一磷酸盐、组氨酸或琥珀酸盐基础的缓冲液、聚山梨醇酯(polysorbate)、二水合海藻糖(trehalose dihydrate)和/或蛋氨酸(methionine)。

诸如一非病毒表达构造，表达一焦亡诱导剂的一表达构造，优选所述构成型活性促炎半胱天冬酶，其包括洗牌的p10和p20结构域，可以将所述构成型活性促炎半胱天冬酶以一有效量给予有需要的一个体。优选重复给药，例如连续2至5天或更多天重复给药，以有效诱导针对所述癌症的一免疫反应以治疗一癌症。

An expression构造such as a non-viral expression构造,expressing an焦亡诱导剂,优选said组成型活性促炎半胱天冬酶comprising洗牌的p10 and p20结构域s,优选is administered by injection or electroporation into a肿瘤.Preparations forintra肿瘤al administration may comprise sterile aqueous or non-aqueoussolutions suspensions,and emulsions.Examples of non-aqueous solvents arepropylene glycol,polyethylene glycol,vegetable oils such as olive oil,andinjectable organic esters such as ethyl oleate.Preparations for intra肿瘤aladministration优选comprise aqueous carriers such as water optionally包括一缓冲剂及盐类、盐水如氯化钠溶液、林格氏葡萄糖(Ringer's dextrose)、葡萄糖和氯化钠或乳酸化林格氏液(lactated Ringer's)。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

一种表达构造，如非病毒表达构造，表达焦亡的诱导剂，优选所说的组成型，促炎酶，包括p10和p20结构域，优选通过注射或电穿孔给药一个地方。用于局部给药的制剂可包括无菌水性或非水性溶液悬浮液和乳液。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射的有机酯如油酸乙酯。用于体内给药的制剂优选包含水性载体，例如任选包括缓冲剂和盐的水、盐水例如氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠，或乳酸林格氏液。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

表达一焦亡诱导剂的一表达构造的一治疗有效量，例如一非病毒表达构造，可从约0.001mg至约100mg变化，优选从约0.01mg至约10mg，最优选从约0.1mg至约1mg。

本发明还提供一种改善和/或治疗患有一癌症的一个体和/或预防一癌症复发的方法，所述方法包含对所述个体施用一有效量的一焦亡诱导剂，优选包含洗牌的p10和p20结构域的所述组成型活性促炎半胱天冬酶，以刺激所术个体针对一癌症新表位的一免疫反应，从而改善和/或治疗所述个体。

用于转染或转导细胞，尤其是癌细胞，具有例如一非病毒表达构造的一表达构造且合适的转染试剂包括阳离子多聚复合物，例如聚乙烯亚胺(polyethylenimine)、脂质体(liposomes)或包含阳离子脂质例如DOTAP或吡啶基础的脂质例如Saint-DNA和Saint-mRNA转染试剂(Synvolux，Leiden，荷兰)的脂质体复合物(lipoplexes)。

4.6：全身给药

本发明提供一种焦亡诱导剂，优选包括洗牌的p10和p20结构域的所述组成型活性促炎半胱天冬酶，用于刺激一个体的一免疫反应的方法，优选一T细胞介导的免疫反应，包括对所述个体施用所述焦亡诱导剂，其中所述焦亡诱导剂作为一疫苗的一佐剂进行全身给药，所述疫苗优选一基因疫苗。

对于治疗应用，如本文所述，将一焦亡诱导剂，优选包括洗牌的p10和p20结构域的所述组成型活性促炎半胱天冬酶，施用于患有诸如一癌症或一感染的一疾病的一个体，以足以至少部分中止疾病的一量，优选以治愈所述疾病和/或减少或中止任何疾病关联的并发症。足以实现这一点的一量被定义为一“治疗有效剂量”。对这种用途有效的量将取决于所术疾病的严重程度和个人健康的一般状态和给药方法。一焦亡诱导剂可根据患者需要和耐受的剂量和频率，单次或多次给药。

对于预防性应用，如本文所述，一焦亡诱导剂，优选所述组成型活性促炎半胱天冬酶，包括洗牌的p10和p20结构域，被施用于一个体以诱导一免疫反应，有助于保护一疾病的发生或复发。

一种表达构造如一非病毒表达构造，表达了一焦亡诱导剂，优选所述组成型活性促炎半胱天冬酶，其包括洗牌的p10和p20结构域，可配制成一水溶液，包括一缓冲剂、一盐水如氯化钠、林格氏葡萄糖(Ringer's dextrose)、葡萄糖和氯化钠、乳酸化林格氏液(lactated Ringer's)或固定油(fixed oils)。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

表达一焦亡诱导剂的一表达构造的一治疗有效量，优选所述组成型活性促炎半胱天冬酶，包括p10和p20结构域，例如一非病毒表达构造，可从约0.001mg至约100mg，优选从约0.01mg至约10mg，最优选从约0.1mg至约1mg。

所述疫苗，优选一基因疫苗，编码一或多种抗原，即特定蛋白质或其部分，预期针对其产生一保护性或治疗性免疫反应。所述一或多种抗原可源自一病原体，例如引起选自麻疹、风疹、霍乱、脑膜炎球菌病、流感、白喉、腮腺炎、破伤风、甲型肝炎、乙型肝炎、戊型肝炎、百日咳、肺结核、肺炎球菌病、伤寒、脊髓灰质炎、蜱传脑炎、b型流感嗜血杆菌、狂犬病、水痘和带状疱疹[herpes zoster(shingles)]、人类乳突病毒、人类免疫缺陷病毒、呼吸道融合病毒、巨细胞病毒、轮状病毒胃肠炎、黄热病、日本脑炎、疟疾、登革热、寨卡病毒相关的小头畸形、炭疽、鼠疫、Q热和天花的一种疾病的病原体，或由一癌症表达。

抗原的示例，任选地由一基因疫苗进行编码，包括人类免疫缺陷病毒(HIV)封套蛋白(gp160)、HIV-Nef、麻疹血凝素糖蛋白、麻疹融合糖蛋白、麻疹核衣壳蛋白、风疹E1蛋白、风疹E2蛋白、风疹衣壳蛋白、霍乱毒素、霍乱B亚基蛋白、脑膜炎球菌NadA D、NHBA D、FHBPD、PorA VR1 D、PorA VR2 D和/或其子变体(Brehony等人，2015.Euro Surveill 20:10.2807/1560-7917.ES.2015.20.49.30084)、流感病毒血凝素、流感病毒核蛋白、白喉类毒素、腮腺炎病毒封套糖蛋白、腮腺炎病毒血凝素-神经氨酸酶、腮腺炎病毒溶血细胞融合(F)糖蛋白、腮腺炎病毒基质封套蛋白、破伤风类毒素、甲型肝炎病毒表面抗原、乙型肝炎病毒表面抗原、戊型肝炎病毒表面抗原、百日咳毒素，百日咳丝状血凝素，百日咳杆菌黏附素(pertussis pertactin)、结核病ESAT-6、结核病CFP10(van Pinxteren等人，2000.ClinDiagn Lab Immunol 7:155–160)、肺炎球菌荚膜抗原、伤寒沙门氏菌O抗原(SalmonellaTyphi O antigen)、伤寒沙门氏菌H抗原、伤寒沙门氏菌50kDa外膜蛋白、脊髓灰质炎病毒D抗原、脊髓灰质炎病毒C抗原、蜱传脑炎病毒结构域III、HaemophilA型流感嗜血杆菌抗原、b型流感嗜血杆菌抗原、狂犬病毒糖蛋白、水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E、人类乳突病毒L1衣壳蛋白、轮状病毒E1A糖蛋白、黄热病封套(E)糖蛋白、日本脑炎封套蛋白结构域III、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)谷氨酸脱氢酶、组氨酸富蛋白(histidine rich protein)II、乳酸脱氢酶和/或果糖二磷酸醛缩酶蛋白(fructose-bisphosphate aldolase protein)、登革热病毒抗原(DEN-1到DEN-4)、寨卡病毒非结构蛋白1、炭疽毒素，鼠疫耶尔森氏菌组分1荚膜抗原(Yersinia pestis fraction 1capsular antigen)、鼠疫耶尔森氏菌组分V蛋白、Q热病毒27-kDa外膜蛋白(Com1)、痘苗病毒(vaccinia virus)A30、B7和F8抗原(Sakhatskyy等人，2008.Virology 371:98-107)，以及任何片段或它们的组合。

可由一基因疫苗编码的抗原的优选示例是癌症新表位或其他与肿瘤关联的抗原。所述癌症新表位由在一癌细胞中编码所述新表位的开放阅读框中的非同义突变、插入或缺失引起，导致与来自健康细胞的表位相比改变的氨基酸。所述癌症新表位可在不同癌症和个体患者之间有所不同。因此，所述癌症抗原优选被开发为个性化的癌症疫苗。为此，从患者身上分离出癌细胞和相应的健康细胞，然后对基因组DNA和/或转录的mRNA进行序列分析。当与相应的健康细胞相比时，从癌细胞和相应的健康细胞所获得的序列的比较结果是在癌细胞中改变的序列的鉴定。

为了开发所述个性化的癌症疫苗，已经开发了检测癌症体细胞突变并预测潜在肿瘤特异性新表位的软件工具。所述软件工具包括但不限于TSNAD：用于癌症体细胞突变和肿瘤特异性新表位检测的一种集成软件(Zhou et al.,2017.R Soc Open Sci 4:170050)；CloudNeo：用于识别患者特异性肿瘤新表位的一云管道(Bais等人，2017.Bioinformatics,33:3110–3112)；pVAC-Seq：一种基因组引导电脑模拟的识别肿瘤新表位的方法(Hundal等人，2016.Genome Medicine 8:11)和pVACtools：用于个性化的癌症疫苗设计新表位的计算选择和可视化(Kiwala等人，2018.Cancer Genetics 226-227:45–46)。

所述癌症新表位可配制成肽/蛋白质，或被编码在RNA或DNA分子中。RNA和DNA疫苗可以在一单个分子上编码多个表位。优选的基因疫苗将为了癌症新表位编码的DNA引入宿主细胞，在宿主细胞中表达并最终导致表位呈递给T细胞。

为了刺激一细胞免疫反应，包含例如癌症新表位的抗原优选被加工成8到20个残基肽，并加载到一主要组织相容性复合体(MHC)I类和/或II类分子上，以便分别被CD8+和/或CD4+T细胞认出。所述8个至20个氨基酸残基肽优选作为编码一前蛋白的一DNA表达构造被提供，也称为多表位，其被蛋白酶加工成一或多个癌症新表位。

所述前蛋白优选涵盖2-50个个别癌症新表位，更优选2-40个，更优选3-30个，更优选5-25个个别癌症新表位。所述个别癌症新表位，或包含所述新表位的序列，其两侧可有额外的氨基酸，并由小间隔序列隔开，优选1-10个氨基酸残基，优选1-5个氨基酸残基，例如2个氨基酸残基，3个氨基酸残基或4个氨基酸残基。

一基因疫苗从一RNA或DNA表达构造指导所述一或多个抗原的表达。从一DNA表达构造的抗原表达是通过一转录活性启动子如一病毒启动子来驱动。所述启动子优选选自本领域技术人员已知的一SV40启动子、一劳斯肉瘤病毒[Rous Sarcoma Virus(RSV)]启动子和最优选的，一巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子。用于提高表达率的其他修饰包括优化在真核细胞中表达的密码子使用；启动子增强子序列的插入；插入合成内含子；存在5'UTR和/或3'UTR序列，例如腺病毒三联前导(TPL)序列或Woodchuck转录后调控元件[WoodchuckPosttranscriptional Regulatory Element(WPRE)]；以及对多聚腺苷酸化和转录终止序列的修饰，以包括一强的多聚腺苷酸化/转录终止信号，例如牛生长激素或兔β-珠蛋白多聚腺苷酸化序列。

所述基因疫苗还可包含编码另一免疫刺激分子的一核酸，例如一细胞因子。一焦亡诱导剂，例如选自ASC、半胱天冬酶-1和/或gasdermin D的主动或诱导型蛋白，其非限制性实例提供于表1-2中，更优选如上文4.3中详述的一表达构造，可用于刺激一个体的一免疫反应的方法结合一疫苗一起使用，优选一基因疫苗，如上所述，其中所述焦亡诱导剂与一或多种辅助分子，如另一免疫刺激分子，如一细胞因子、一趋化因子、一激动性抗体和/或一免疫抑制分子的抑制剂，包括但不限于一拮抗性抗体和/或一可溶性配体。所述辅助分子可以作为一小分子、一蛋白质或一表达构造，与所述焦亡诱导剂和所述疫苗，优选基因疫苗同时、分开或依次给药。

优选的辅助分子选自表3所列的另一种免疫刺激分子，优选IL-12、IL-2、IL-4、CSF2、干扰素、IL-18、TNF和/或Ox-40，最优选IL-12和/或CSF2，一激动性Flt3抗体，和/或一免疫检查点抑制剂，例如一PD1或PD-L1阻断剂，例如派姆单抗[pembrolizumab(Merck)]、纳武单抗[nivolumab(Bristol-Myers Squibb)]、匹地珠单抗[pidilizumab(Medivation/Pfizer)]、MEDI0680(AMP-514；AstraZeneca)和PDR001(Novartis)；融合蛋白，例如PD-L2Fc融合蛋白(AMP-224；GlaxoSmithKline)；阿特珠单抗[atezolizumab(Roche/Genentech)]、阿维鲁单抗[avelumab(Merck/Serono and Pfizer)]、度伐单抗[durvalumab(AstraZeneca)]、BMS-936559(Bristol-Myers Squibb)；和小分子抑制剂，如PD-1/PD-L1Inhibitor 1(WO2015034820；(2S)-1-[[2,6-二甲氧基-4-[(2-甲基-3-苯基苯基)甲氧基]苯基]甲基]哌啶-2-羧酸)[(2S)-1-[[2,6-dimethoxy-4-[(2-methyl-3-phenylphenyl)methoxy]phenyl]methyl]piperidine-2-carboxylic acid)]，BMS202(PD-1/PD-L1抑制剂2；WO2015034820；N-[2-[[[2-甲氧基-6-[(2-甲基[1,1'-联苯]-3-基)甲氧基]-3-吡啶基]甲基]氨基]乙基]-乙酰胺[N-[2-[[[2-methoxy-6-[(2-methyl[1,1'-biphenyl]-3-yl)methoxy]-3-pyridinyl]methyl]amino]ethyl]-acetamide])和PD-1/PD-L1抑制剂3(WO/2014/151634；(3S,6S,12S,15S,18S,21S,24S,27S,30R,39S,42S,47aS)-3-((1H-咪唑-5-基)甲基)-12,18-双((1H-吲哚-3-基)甲基)-N,42-双(2-氨基-2-氧乙基)-36-苄基-21,24-二丁基-27-(3-胍基丙基)-15-(羟甲基)-6-异丁基-8,20,23,38,39-五甲基-1,4,7,10,13,)[(3S,6S,12S,15S,18S,21S,24S,27S,30R,39S,42S,47aS)-3-((1H-imidazol-5-yl)methyl)-12,18-bis((1H-indol-3-yl)methyl)-N,42-bis(2-amino-2-oxoethyl)-36-benzyl-21,24-dibutyl-27-(3-guanidinopropyl)-15-(hydroxymethyl)-6-isobutyl-8,20,23,38,39-pentamethyl-1,4,7,10,13,)]。其他抗PD1分子包括维拉地妥珠单抗(ladiratuzumabvedotin)(Seattle Genetics)。

一焦亡诱导剂的所述全身给药，优选所述组成型活性促炎半胱天冬酶包括洗牌的p10和p20结构域，如上文所述，以及同时、单独或依序给药的如上文所述的一基因疫苗，优选作为一表达构造被施用，优选一非病毒表达构造，优选是肠胃外给药，例如，静脉内、腹膜内、鼻内、肌肉内或最优选地，皮内。

4.7：免疫刺激组合物

本发明进一步提供一种免疫刺激组合物，包括一焦亡诱导剂、优选所述组成型活性促炎半胱天冬酶，包含洗牌的p10和p20结构域，以及一药理学上可接受的赋形剂。所述焦亡诱导剂优选选自表1-2中所示的分子，更优选的是一组成型活性促炎半胱天冬酶，包括洗牌的p10和p20结构域。

所述药学上可接受的赋形剂是一种无毒材料，不会干扰活性成分的生物活性的有效性。术语“生理上可接受的”是指与一生物系统例如细胞、细胞培养物、组织或生物体相容的一无毒材料。载体的特性将取决于给药途径。生理学和药学上可接受的赋形剂包括稀释剂、填充剂、盐类缓冲剂、稳定剂、增溶剂和本领域公知的其他材料。

根据本发明的一优选免疫刺激组合物进一步包括一基因疫苗，优选编码如上文所述的1-50个癌症新表位的一基因疫苗。

所述焦亡诱导剂，优选包含洗牌的p10和p20结构域的所述组成型活性促炎半胱天冬酶，以及本发明的一免疫刺激组合物中的所述基因疫苗优选是从一非病毒表达构造表达。非病毒表达构造包括mRNA或裸DNA，如质粒DNA和体外扩增的DNA。一非病毒表达构造可以被包装在脂质体中和/或作为一分子共轭物来提供。可以在细菌中产生不含质粒细菌DNA序列的小环DNA载体，并且可以在体内高水平表达编码一焦亡诱导剂的一核酸。

本发明进一步提供根据本发明的一免疫刺激组合物，用于治疗一癌症的一方法中。

本发明还提供一种治疗患有一癌症的一个体的方法，所述方法包括向有需要的一个体提供包含一焦亡诱导剂的一免疫刺激组合物，优选所述组成型活性促炎半胱天冬酶，包含洗牌的p10和p20结构域，以及根据本发明的一基因疫苗，从而治疗所述个体。

本发明进一步提供了包含一焦亡诱导剂的一免疫刺激组合物的用途，优选所述组成型活性促炎半胱天冬酶包含洗牌的p10和p20结构域，以及根据本发明的一基因疫苗，用于制备治疗患有一癌症的一个体的一药物中。

所述焦亡诱导剂，优选包含洗牌的p10和p20结构域的所述组成型活性促炎半胱天冬酶，优选与另一免疫刺激分子如IL-12和CSF2等的一细胞因子联合给药。

本发明进一步提供了一种刺激一个体发生一免疫反应的方法，优选一T细胞介导的免疫反应，包括提供一焦亡诱导剂，优选所述组成型活性促炎半胱天冬酶，其包括洗牌的p10和p20结构域，并将所述焦亡诱导剂施用于所述个体。

为了清楚和简明描述的目的，在本文中将特征描述为相同或单独实施例的一部分，然而，应当理解，本发明的范围可包括具有所描述的全部或一些特征的组合的实施例。

5：示例

示例1：

材料及方法：

DNA构造：

通过Gibson组装产生含有焦亡介质的DNA编码的多个表达构造(表1)。简而言之，来自D1(C57BL/6来源的一树突细胞系，见Winzler et al.,1997.J Exp Med 185:317–328)cDNA的Pycard、Casp1、Gsdmdc1、Il1b、Il18、Ripk3、Mlkl(小家鼠)、CASP1、IL1B(智人)的(片段)，或来自合成的、密码子优化的DNA(Pycard、Csf2、hCASP1_RV2；Integrated DNATechnologies,Coralville,IA,USA)并克隆到载体pD2610-v10(ATUM,Newark,CA,USA)使用一Gibson组装克隆套组(New England Biolabs,Ipswich,MA,USA)。编码dasher GFP(SEQID NO:13)、Reps1、一小的、不相关的肽序列(SEQ ID NO:20)或完全没有插入片段的构造作为对照。

在疫苗接种实验中，佐剂或对照质粒与来自C57BL/6MC38结肠癌细胞系被编码成三个肿瘤特异性抗原(Dpagt1、Reps1、Adpgk；参见SEQ ID NO:25-27)的一多表位DNA疫苗(SEQ ID NO:23)，以及来自鸡卵清蛋白的两个模型抗原(OT-II、OT-I；参见SEQ ID NO:NOs:28和29)相组合，通过由三个丙氨酸组成的一“间隔序列”隔开(参见SEQ ID NO:30)。

所有质粒都使用大肠杆菌菌株DH5α进行成长，并使用一Macherey-Nagel(Dueren，德国)的无内毒素(EF)质粒纯化试剂盒进行纯化。对于疫苗接种，质粒在一Nucleobond过滤器上进行了一个额外的纯化步骤，然后离心(30分钟，10,000g，4℃)以去除任何残留的碎片。

小鼠及细胞系：

C57BL/6(Jico)小鼠购自Jackson实验室(Bar Harbor,ME,USA)，并在符合FELASA的条件下饲养在LUMC动物设施中。B16-F10，一种C57BL/6来源的黑色素瘤细胞系，维持在由IMDM(ThermoFisher-Gibco，Waltham，MA，USA)组成的培养基中，并补充有8％的胎牛血清(Sigma-Aldrich，Zwijndrecht，荷兰)，在加湿的CO2培养箱(37℃，5％CO2)中存在有L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素(均来自ThermoFisher-Gibco)。B16-OVA是用卵清蛋白稳定转染的一B16-F10细胞系，并在相同条件下培养。

转染：

B16-F10细胞以2,000个细胞/孔的速度接种在96孔的平底板中的100μl培养基中。一天后，通过添加10μl DNA复合Saint-DNA(Synvolux产品，Leiden,the Netherlands)，一种阳离子脂质基础的转染试剂进行转染。转染两天后，通过流式细胞术、ELISA或LDH检测分析细胞死亡和/或DAMPS的释放。

流式细胞术：

通过去除细胞上清液、用PBS润洗孔并随后用胰蛋白酶(ThermoFisher-Gibco)处理剩余的贴壁细胞来收集非贴壁细胞和贴壁细胞。在96孔V型底板中混合并离心上清液和胰蛋白酶处理的细胞后，将所得细胞用FACS缓冲液(PBS、1％BSA、0.02％叠氮化物)洗涤并暴露于7-氨基放线菌素D(7-AAD)(Biolegend，San Diego，CA，USA)，一种进入已失去膜完整性的死细胞的染料，在FACS缓冲液中稀释15分钟。然后立即在配备一488nm激光的GuavaEasyCyte HT流式细胞仪(Merck MilliPore，Burlington，MA，USA)上分析细胞。

IL-1βELISA：

为了测量IL-1β，使用供应商(Biolegend，San Diego，CA)提供的方案，将细胞上清液离心以去除细胞碎片并通过三明治式ELISA进行分析。简而言之，96孔板用捕获抗体涂覆过夜。洗去未结合的抗体(4个洗涤步骤)后，加入50-1000倍稀释的上清液(和，作为参考，滴定的重组IL-1β)并在室温下培育同时震荡2小时。4个洗涤步骤后，加入生物素化检测抗体并在室温下培育1小时，然后再进行4次洗涤步骤并与链霉亲和素-HRP进行一30分钟的培育。洗去链霉亲和素-HRP之后，加入TMB底物溶液。在Tecan Infinite F50(Tecan GroupLtd,

Switzerland)上读取450nm和570nm处的吸光度。

LDH试验

使用比色法定量测量释放到培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)(LDH细胞毒性检测试剂盒，ThermoFisher-Pierce，Waltham，MA，USA)用于量化细胞死亡。此检测基于一偶联酶促反应。首先，LDH通过将NAD+还原为NADH来催化乳酸转化为丙酮酸。其次，心肌黄酶(diaphorase)使用NADH将四唑盐(INT)还原为一红色甲

(formazan)产物。因此，甲

形成的水平与培养基中释放的LDH量成正比。简而言之，将50微升(ul)反应混合物与50微升2倍稀释的培养物上清液混合。在室温避光培育30分钟后，加入终止溶液，然后在450nm和620nm处读取吸光度。百分比细胞毒性计算如下：((OD450-OD620)样品-(OD450-OD620)培养基对照)/((OD450-OD620)阳性对照-(OD450-OD620)培养基对照)x100％。

鼠的疫苗接种及肿瘤攻击：

在第0天，给雄性C57BL/6小鼠皮内注射30μl 0.9％NaCl溶液，溶液含有30μg无内毒素质粒DNA，由10μg多表位疫苗(参见SEQ ID NO:23)(或空载体对照)、10μg佐剂(或空载体)和10μg佐剂2(或空载体)组成。接种疫苗后几天抽取的血液用红细胞裂解缓冲液处理并用PE偶联的H2-Kb/SIINFEKL四聚体(PE-conjugated H2-Kb/SIINFEKL tetramers)(LUMCtetramer facility,Leiden,the Netherlands)在补充有0.1％牛血清白蛋白和0.02％叠氮化钠的PBS(PBS/BSA)中染色。在室温下黑暗中培育30分钟后，加入针对CD3、CD4、CD8的荧光染料偶联抗体(Biolegend，San Diego，CA，USA)以区分T细胞亚群，然后在冰上再培育30分钟，然后以PBS/BSA进行2清洗步骤以去除未结合的四聚体和抗体。在一BD LSRII(BectonDickinson,San Jose,CA,USA)上采集样品并使用FlowJo(FlowJo LLC)进行分析。

接种后第29天，小鼠进行皮下注射50,000个B16-OVA细胞、以卵清蛋白稳定转染的B16-F10黑色素瘤细胞。每3-4天监测肿瘤生长，肿瘤大小计算为(长x宽x宽)/2。小鼠携带超过1000mm³的肿瘤或溃疡出血的小鼠通过CO₂窒息实施安乐死。

结果：

组成型活性半胱天冬酶-1变体的设计

基于ASC(SEQ ID NO:31)、半胱天冬酶-1(SEQ ID NO:1-4,8,12)、gasdermin D(SEQ ID NO:14-15)、焦亡中的签章信号分子、cDNA序列设计一系列的构造(图1、表1、2、4)。使用非炎性半胱天冬酶的工作(Srinivasulaet al.,1998.J Biol Chem 273:10107-11；Park et al.,2006.BiochemBiophys Res Commun 347:941-8)表明由半胱天冬酶-1的p10和p20结构域所组成的一蛋白质，与野生型半胱天冬酶-1(重新洗牌)的顺序相反，并由IL-1β半胱天冬酶-1裂解位点连接，会是组成型活性的。然而，最近的一项研究表明，半胱天冬酶-1的活性形式也需要N-端CARD结构域的存在(Boucher et al.,2018.J Exp Med 215:827-840)，表明此类构造(分别为CASP1_RV和CASP1_RV2，图1；SEQ ID NO:3和4)不是活性的。在其他构造中，诱导型(iCASP1,SEQ ID NO:8)或组成型(dCASP1,SEQ ID NO:12)，二聚化结构域替换了通常连接半胱天冬酶-1到上游激活信号级联的N-端CARD结构域。最后，生成了具有一突变的活性位点(CASP1_C285G,SEQ ID NO:2)以及一野生型控制(CASP1_WT,SEQ ID NO:1)的一对照构造。

组成型活性半胱天冬酶-1变体CASP1_RV和CASP1_RV2诱导细胞死亡

激活后，半胱天冬酶-1通过裂解gasdermin D诱导焦亡的细胞死亡(Aglietti andDueber,2017.Trends Immunol 38:261-271)。这会释放gasdermin D的N-端结构域，使其在细胞质膜中形成细胞毒性孔。为了测试我们的半胱天冬酶-1变体(图1)是否诱导细胞死亡，将相应的质粒随同一GFP编码质粒(SEQ ID NO:13)一起转染B16F10细胞。转染两天后，与阴性对照(SEQ ID NO:20)相比，野生型半胱天冬酶-1(CASP1_WT)与活性位点突变体(CASP1_C285G)几乎没有诱导细胞死亡(<20％7-AAD+细胞)，同时GSDMD(SEQ ID NO:14-15)的N-端结构域杀死几乎所有(>90％)细胞(图2)。与野生型和点突变的半胱天冬酶-1对比，“重新洗牌(reshuffled)”的半胱天冬酶-1(CASP1_RV和CASP1_RV2)变体杀死了绝大多数B16F10细胞。此外，大部分死细胞都表达了GFP，这表明在一基因疫苗中加入活性半胱天冬酶-1并不会阻止DNA疫苗编码的抗原表达。因此，与较早的报告表明活性半胱天冬酶-1需要CARD结构域(Boucher等人，2018.J Exp Med 215:827-840)相比，本发明的新型无CARD重新洗牌的半胱天冬酶-1构造是组成型活性的。

组成型活性半胱天冬酶-1变体CASP1_RV和CASP1_RV2诱导IL-1β分泌

焦亡的标志之一是IL-1β的分泌，IL-1β是一致热细胞因子。此细胞因子是作为一细胞溶质前体(pro-IL-1β)产生的，其释放需要通过pro-IL-1β和gasdermin D的半胱天冬酶-1裂解(Evavold等人，2018.Immunity 48：35-44；Heilig等人，2018.Eur J Immunol 48:584-592；Montelone等人，2018.Cell Rep 24:1425-1433)。确实，活性半胱天冬酶-1变体CASP1_RV和CASP1_RV2，而不是CASP1_WT和CASP1_C285G，诱导了IL-1β从与pro-IL-1β共转染的B16-F10细胞中释放(SEQ ID NO:21，图3)。类似地，由AP1903(iCASP1)或组成型(dCASP1)诱导的半胱天冬酶-1二聚体在此测定中也产生了IL-1β分泌。

CASP1_RV2改善T细胞反应及抗肿瘤免疫性

由于半胱天冬酶-1(CASP1_RV和CASP1_RV2)的组成型活性形式诱导细胞死亡并且能够诱导IL-1β的加工和分泌，我们接下来测试了它们作为一遗传佐剂的潜力。为此，小鼠用编码一多表位疫苗(SEQ ID NO:23)的一质粒和编码一遗传佐剂的质粒以1:1混合进行接种。所述多表位疫苗包含源自卵清蛋白的CD8+T细胞表位SIINFEKL，当与H-2Kb MHC I类分子结合时，所述表位可被特定T细胞认出。由于CASP1_RV2的活性略高于CASP1_RV(图2-3)，因此使用前者。接种疫苗后不久，CASP1_RV2而非参考佐剂CSF2显着增加了血液中SIINFEKL特异性T细胞的频率(图4A)，而在稍后的时间点，CASP1_RV2和CSF2的佐剂作用相似(图4B、C)。

有趣的是，与未接受佐剂的小鼠相比，用B16-OVA攻击小鼠导致CASP1_RV2佐剂组的特异性T细胞免疫性显着增加，远高于CSF2(SEQ ID NO:24，图4D)。这可能表明这个佐剂在异源启动-加强方案中特别有效(Kardani等人，2016,Vaccine 34:413-423)。

在模拟接种的小鼠中，B16-OVA肿瘤总是在注射后三周内生长(图4E)。尽管所述多表位疫苗显着延迟了肿瘤的生长，但大多数小鼠最终还是长出了肿瘤。相比之下，大多数CASP1_RV2佐剂小鼠仍然没有肿瘤。因此，半胱天冬酶-1的一新组成型活性形式显着提高了T细胞免疫性和肿瘤保护。

RIG-I和GSDMD的组成型活性形式不会提高T细胞免疫性

半胱天冬酶-1是炎症小体通路的一核心部分。因此，我们推断此途径的其他成分也应该能够充当遗传佐剂。为了测试这个想法，我们通过去除它们的C-端异质性结构域生成了Ddx58的一组成型活性版本，也称为RIG-I(SEQ ID NO:19)和Gsdmdc1，也称为GSDMD(SEQ ID NO:14)。RIG-I可以作用于半胱天冬酶-1的上游，以促进IL-1β的加工和释放(Poeck et al.2010,Nature Immunology 11:63-69)，而GSDMD是半胱天冬酶-的下游靶点，负责膜破坏。这些构造均诱导细胞死亡(图2)。此外，与测试的所有其他构造相比，用RIG-I构造转染B16F10细胞导致产生IFNβ和IL-6(数据未显示)。然而，令人惊讶的是，当测试它们与多表位疫苗组合的佐剂活性时，只有活性的半胱天冬酶-1构造改善了T细胞反应(图5)。

示例2：

材料及方法：

DNA构造：

通过Gibson组装产生含有焦亡介质的DNA编码的多个表达构造(表1和表4)。简而言之，来自D1(C57BL/6来源的一树突细胞系，见Winzler et al.,1997.J Exp Med 185:317–328)或293cDNA的Casp1、Gsdmdc1、Il1b(小家鼠)、IL1B、GSDMD(智人)的(片段)，或来自合成的、密码子优化的DNA(CASP1；Integrated DNA Technologies,Coralville,IA,USA)并克隆到载体pD2610-v10(ATUM,Newark,CA,USA)使用一Gibson组装克隆套组(New EnglandBiolabs,Ipswich,MA,USA)。使用专用引物(primer)和Gibson组装引入这些构造中的小改动(例如，在N-端或连接子序列处的修饰，单个氨基酸取代)。所有质粒都使用大肠杆菌菌株DH5α来成长，并使用Macherey-Nagel(Dueren，德国)无内毒素(EF)质粒纯化试剂盒进行纯化。

细胞系：

B16-F10，一种C57BL/6来源的黑色素瘤细胞系，维持在由IMDM(ThermoFisher-Gibco，Waltham，MA，USA)组成的培养基中，并补充有8％的胎牛血清(Sigma-Aldrich，Zwijndrecht，荷兰)在加湿的CO2培养箱(37℃，5％CO2)中存在有L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素(均来自ThermoFisher-Gibco)。在相同条件下培养源自人类胚胎肾细胞的一上皮细胞系293(ATCC CRL-1573)。

转染：

B16-F10细胞(2,000个细胞/孔)或293细胞(20,000个细胞/孔)被接种在96孔的平底板中的100μl培养基中。一天后，通过添加10μl(20-40ng)DNA复合Saint-DNA(Synvolux产品，Leiden,the Netherlands)，一种阳离子脂质基础的转染试剂进行转染。转染两天后，通过LDH检测或ELISA分析细胞死亡和/或DAMPS的释放。

IL-1βELISA：

为了测量IL-1β，使用供应商(Biolegend，San Diego，CA)提供的方案，将细胞上清液离心以去除细胞碎片并通过三明治式ELISA进行分析。简而言之，96孔板用捕获抗体涂覆过夜。洗去未结合的抗体(4个洗涤步骤)后，加入50-1000倍稀释的上清液(和，作为参考，滴定的重组IL-1β)并在室温下培育同时震荡2小时。4个洗涤步骤后，加入生物素化检测抗体，并在室温下培育1小时，然后再进行4次洗涤步骤并与链霉亲和素-HRP进行一30分钟的培育。洗去链霉亲和素-HRP之后，加入TMB底物溶液。在Tecan Infinite F50(Tecan GroupLtd,

Switzerland)上读取450nm和570nm处的吸光度。

LDH试验：

LDH-Glo细胞毒性试验(Promega，Madison，WI，USA)用于测量培养物上清液中的LDH活性。在此测定中，从受损细胞释放的LDH催化乳酸氧化，同时将NAD+还原为NADH。还原酶利用NADH和还原酶底物产生荧光素(luciferin)，经Ultra-GloTMr荧光素酶转化为一生物发光信号。产生的发光信号与存在的LDH量成正比。简而言之，将10微升(ul)的培养物上清液用90微升LDH储存缓冲液(200mM Tris-HCl(pH 7.3)、10％甘油、1％BSA)进行稀释。在LDH储存缓冲液中再稀释10倍后，将50微升的100倍稀释的上清液与50微升LDH检测试剂混合，并在室温下黑暗中培育，然后在一Tecan Infinite F50(Tecan Group Ltd,

Switzerland)上在读取在30和60分钟时的发光读数(Tecan Group Ltd,

瑞士)。数据表示为相对光单位[Relative Light Units(RLU)]。

结果：

小鼠CASP1_RV2功能取决于N-端IDL序列的存在

我们最初设计的组成型活性小鼠炎症半胱天冬酶-1(CASP1_RV,SEQ ID NO:3)是由组成型活性版本的人类凋亡诱导人类刽子手半胱天冬酶-3和-6(Srinivasula等人，1998.J Biol Chem 273:10107-11)的设计领导的。例如，在活性半胱天冬酶-3的设计中，N-端p20和C-端p10结构域是交换的，并被一个短的(8个AA)半胱天冬酶-3裂解位点隔开。p10上游的一部分序列，包括几个p20氨基酸，也被这种交换移动，产生的活性半胱天冬酶的N-端从四个p20氨基酸开始，然后是小的(6个AA)p20-p10域间连接子和p10(Srinivasula等人，1998.J Biol Chem 273：10107-11)。因此，小鼠CASP1_RV的N-端以五个p20氨基酸和IDL开始。由于与CASP1_RV(SEQ ID:3，图2-3)相比，去除CASP1_RV2(SEQ ID NO:4)中的p20残余物似乎增加了活性，我们测试了缺乏IDL的额外变体CASP1_RV2_NTR(SEQ ID NO:38)。测试这三个CASP1_RV变体逐渐缺乏更多这种N-端表明，CASP1_RV2中N-端p20残余物的去除增加，但CASP1_RV2_NTR中IDL的进一步去除则降低了CASP1_RV的活性(图6)。换句话说，最活跃的CASP1_RV2变体在其N-端保留了大部分高度带负电荷的IDL序列SEEDFLTDAIFEDD。与野生型小鼠半胱天冬酶-1(CASP1_WT)相比，CASP1_RV2在体外试验中具有更高有效性约30倍(图7)。因此，尽管人类半胱天冬酶-3和小鼠半胱天冬酶-1之间存在关键差异，例如半胱天冬酶-1中存在一CARD结构域以及在激活机制上的差异，但Srinivasula的方法确实产生了组成型活性的小鼠半胱天冬酶-1。

人类CASP1_RV2功能性依赖于N-端IDL序列的缺失

一组成型活性的人类半胱天冬酶-1变体(hCASP1_RV2，SEQ ID NO:35)的设计是基于小鼠CASP1_RV2，因此也从域间连接子(IDL)的14个氨基酸：GNLSLPTTEEFEDD开始。然而，hCASP1_RV2的活性并不明显高于野生型人类半胱天冬酶-1(hCASP1_WT，图8)。因此，与小鼠半胱天冬酶-1相比，Srinivasula的方法并没有显着增加人类半胱天冬酶-1的活性。令人惊讶的是，与小鼠CASP1_RV2(图6)形成鲜明对比，尽管它与酶促活性位点(Yang等人，2018.Proc Natl Acad Sci USA 115:6792-6797)相距甚远，但去除了p10(hCASP1_RV2_NTR,SEQ ID NO:49)上游的所有N-端残基确实大大增加了其活性(图8)。

p10-p20连接子尺寸的减少进一步增加组成性活性的人类半胱天冬酶-1效力

接下来，我们将注意力转向p10和p20之间的中间序列。在小鼠和人类CASP1_RV2[SEQ ID NOs 40-43,45-47]的这个区间去除天冬氨酸蛋白酶位点没有显着影响它们处理pro-IL1β的能力，表明自动蛋白水解对其活性没有贡献(数据未显示)。相反，此区间似乎仅用作一弹性的连接子。半胱天冬酶-1在其活性构象上的晶体结构(Yang et al.,2018.ProcNatl Acad Sci USA 115:6792-6797)表明p10结构域的C-端与p20结构域的N-端之间的距离相当小(图9)。事实上，我们发现将连接子的大小减少到9个氨基酸并不是我们所预期的一中性事件，而是令人惊讶地增加了hCASP1_NTR的活性(图8B)。这与此较小连接子(图8B)中一自动蛋白水解目标位点的存在(hCASP1_NTR_CCS中的AYVHDAPVR，SEQ ID NO:51)或不存在(hCASP1_NTR_GSL中的GSGSGSGSG，SEQ ID NO:50)无关。与野生型人类半胱天冬酶-1相比，hCASP1_NTR_GSL(SEQ ID NO:50)在体外试验中的效力更有效约30倍(图8)。因此，虽然Srinivasula方法没有显着增加人类半胱天冬酶-1的活性，但去除N-端残基并在一个较小程度上意外地减少连接子尺寸确实产生了一组成型活性的人类半胱天冬酶-1。

表1：焦亡关联的构造。用于半胱天冬酶-1构造的一详细描述，见图1。

表2：氨基酸序列

表3：共刺激分子概述

表4：半胱天冬酶-1构造。用于半胱天冬酶-1构造的一详细描述，也参见图6。

Claims (17)

1.一种组成型活性促炎半胱天冬酶，优选人类半胱天冬酶，其特征在于：所述组成型活性促炎半胱天冬酶包含交换的p10及p20结构域，任选地通过一蛋白酶可裂解位点连接。

2.根据权利要求1所述的组成型活性促炎半胱天冬酶，其特征在于：所述组成型活性促炎半胱天冬酶是一组成型活性促炎半胱天冬酶-1，优选为人类半胱天冬酶1。

3.根据前述权利要求任一项所述的组成型活性促炎半胱天冬酶，其特征在于：所述组成型活性促炎半胱天冬酶缺少一半胱天冬酶-募集结构域。

4.根据前述权利要求任一项所述的组成型活性促炎半胱天冬酶，其特征在于：对应于SEQ ID NO:52的G403的一甘氨酸位于离对应于SEQ ID NO:52的C136的一半胱氨酸0至40个氨基酸残基的一距离处，优选位于0至10个氨基酸残基的一距离处。

5.根据前述权利要求任一项所述的组成型活性促炎半胱天冬酶，其特征在于：所述组成型活性促炎半胱天冬酶缺少一p20至p10的域间连接子。

6.一种将前述权利要求任一项所述的组成型活性促炎半胱天冬酶用于刺激一个体的一免疫反应的一方法的用途，优选为一T细胞介导的免疫反应，其特征在于：所述用途包含对所述个体施用所述组成型活性促炎半胱天冬酶。

7.根据权利要求6的所述组成型活性促炎半胱天冬酶的用途，其特征在于：所述免疫反应直接针对存在于所述个体中的一肿瘤或感染。

8.根据权利要求6至7任一项的所述的组成型活性促炎半胱天冬酶的用途，其特征在于：所述半胱天冬酶优选通过瘤内注射被施用于所述个体的一肿瘤内。

9.根据权利要求6至7任一项的所述的组成型活性促炎半胱天冬酶的用途，其特征在于：将所述半胱天冬酶作为一疫苗的一佐剂进行全身给药。

10.根据权利要求6至9任一项的所述的组成型活性促炎半胱天冬酶的用途，其特征在于：所述半胱天冬酶结合一或多种辅助分子，如一免疫检查点抑制剂及/或一进一步的免疫刺激分子，如一细胞因子或一趋化因子一起施用。

11.根据权利要求10的所述的组成型活性促炎半胱天冬酶的用途，其特征在于：从表3选择所述辅助分子。

12.根据权利要求10或11的所述的组成型活性促炎半胱天冬酶的用途，其特征在于：从IL-12及/或CSF2选择所述辅助分子。

13.一种免疫刺激组合物，其特征在于，所述免疫刺激组合物包含根据权利要求1至5任一项所述的组成型活性促炎半胱天冬酶以及一药理学上可接受的赋形剂。

14.根据权利要求13所述的免疫刺激组合物，其特征在于：所述免疫刺激组合物还包含至少一抗原或抗原编码的核酸分子。

15.根据权利要求13或14所述的免疫刺激组合物，其特征在于：所述免疫刺激组合物还包含一辅助免疫刺激分子，如一免疫检查点抑制剂及/或一进一步的免疫刺激分子，如一细胞因子或趋化因子。

16.一种将根据权利要求13至15任一项的免疫刺激组合物用于一治疗患有一肿瘤或感染的一个体的方法。

17.一种刺激一个体中的一免疫反应的方法，优选为一T细胞介导的免疫反应，其特征在于，所述方法包含：提供根据权利要求13至15任一项所述的一组合物，以及对所述个体施用所述组合物。

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