JP5663474B2 - アルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクターおよび免疫アジュバントとしてのその使用 - Google Patents
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Description
哺乳動物の免疫系は、皮膚、腸、上気道および下気道、泌尿生殖路などの多数のニッチにおいてコロニー形成する多種多様な微生物を含む環境において生き残るために進化してきた。結腸および皮膚のようなニッチの一部は、内因性微生物叢が恒常的にコロニー形成しているが、他のニッチ(内部器官および下気道)は、通常、免疫能のある宿主では無菌の状態にある。多くの腸共生細菌の場合のように、微生物の作用が宿主にとってプラスの場合がある。他の場合では、微生物のコロニー形成が宿主にとって有害な場合がある。このようなマイナスの作用は宿主免疫系の状態に左右される。(日和見性病原体として知られる)ある特定の病原体は免疫無防備状態の個体にしか影響を及ぼさない。微生物感染の潜在的な有害作用は様々な宿主防御機構の進化につながった。有顎類には、2種類の防御:自然免疫応答および適応免疫応答がある。これらの主な違いは、病原体の認識に用いられる受容体型、応答の開始に必要な時間遅延、および記憶の有/無である。これらの2種類の防御は互いに完全に独立して機能しない。下記に見られるように、自然免疫系は特定のシグナルを適応免疫系に送って、特定の病原体に対して最も効率的な応答を開始するのを助け、逆もまた同じである。適応免疫応答もまた自然免疫系のいくつかのモジュールを活性化する。
健常個体には自然免疫が常に存在し、その主な機能は、微生物およびウイルスの侵入の阻止ならびに宿主組織の侵入に成功した病原体の迅速な排除である。自然免疫は多細胞生物を即時に保護する。
●細胞内細菌および細胞外細菌に対する抗菌機構を有する、食細胞;
●循環中および体液中で働く、急性期タンパク質および補体系;
●ウイルス感染細胞の死滅に関与する、ナチュラルキラー細胞;
●多細胞寄生生物からの防御に関与する、好酸球、好塩基球、およびマスト細胞;
●ウイルス防御において重要な役割を有する、自己誘導性のI型インターフェロンおよびタンパク質。
TLRは、PRRの中で最もよく特徴付けられているシグナル生成受容体である。TLRは重要な炎症性応答を開始し、適応免疫も形づくる。哺乳動物において公知の全てのTLR(TLR1-11)は、リガンド認識を担う細胞外ロイシンリッチリピート(LRR)ドメインおよびシグナル伝達開始に必要とされる細胞質Toll-インターロイキン-1受容体ホモロジー(TIR)ドメインを含む、I型膜内在性糖タンパク質である。TLRは、細菌、菌類、寄生生物、およびウイルスにある、核酸を含む極めて多様な微生物構成要素を認識する。TLR3、TLR7、TLR8、およびTLR9を含む、いくつかのTLRは、通常は、細胞外PAMPを検出するために原形質膜に存在するが、細胞内区画、例えば、エンドソーム内でリガンドを認識する。後者のTLRは核酸認識能を共有し、dsRNA(TLR3)、ssRNA(マウスではTLR7、ヒトではTLR8)、および非メチル化CpG DNAモチーフ(TLR9)を検出する。
TLRは、4種類のTIRドメイン含有アダプター分子:MyD88、TIRAP、Trif、およびTRAMの異なる組み合わせを動員することによって、共有のおよび別個のシグナル伝達経路を開始する。TLR3を除き、他の全てのTLRはミエロイド系分化因子88(MyD88)を動員する。MyD88は、IL-受容体関連キナーゼ(IRAK)ファミリーのメンバーに関連する(Mouldy Sioud 2006)。これらのシグナル伝達経路は、全てのTLRに共通する転写因子である核内因子κB(NF-κB)およびアクチベータータンパク質-1(AP-1)を活性化して、炎症性サイトカインおよびケモカインを産生させる。これらはまた、TLR3、4、7、8、および9において、IFN-αおよびIFN-βなどのI型インターフェロンの産生に必要な条件であるインターフェロン調節因子-3(IRF3)および/またはIRF7を活性化する(総説については、Edwards et al 2007, Vercammen et al 2008, Medzitov R 2007)。
適応免疫系はその活動のために広範囲の分子を用いる。これらの分子の一部は自然免疫系によって用いられるもの、例えば、補体タンパク質であり、抗原特異的B細胞およびT細胞受容体を含むその他の分子は適応免疫系に特有のものである。自然免疫と区別される適応免疫系の最も重要な特性は、B細胞受容体およびT細胞受容体の特異性が精巧なこと、応答の発生がゆっくりしていること、抗原への前曝露が記憶されていることである。後者の特性はワクチン接種の基盤となっている。弱毒化病原体により、病原体の選択された構成要素により、または他のやり方での(例えば、病原体に由来する選択された抗原をコードするDNAワクチンによる)感染の模倣により、免疫系が初回抗原刺激されると免疫記憶が生じ、これにより病原体に遭遇した時に応答がより素早くかつ効率的に応答が誘発される。
+鎖RNAウイルス
+鎖RNAウイルスは全てのウイルス属の1/3超を含む。+鎖RNAウイルスゲノムは翻訳および複製の鋳型であり、宿主翻訳因子間での相互作用および複数のレベルでのRNA複製につながる。公知の+鎖RNAウイルスは全て、ゲノム複製において用いられるRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)の遺伝子を有する。しかしながら、他のRNAウイルスとは異なり、このポリメラーゼは+鎖RNAウイルスのキャプシドにない。従って、新たな細胞に感染すると、ゲノムRNAが翻訳されてポリメラーゼが産生されるまで、ほとんどの+鎖RNAウイルスの場合では、さらなる複製因子が産生されるまで、ウイルスRNA複製は開始することができない。特徴付けられた+鎖RNAウイルスは全て細胞内膜上にRNA複製複合体を組み立てる。アルファウイルス様スーパーファミリーの内外で、ウイルスRNAの複製は細胞内膜の球状陥入(spherical invagination)と共に行われる。例えば、アルファウイルスは、複製複合体を組み立てるためにエンドソーム膜およびリソソーム膜を用いる。この膜は、複製因子が配置され、集中する面となる。この構成は、dsRNAにより誘導される宿主防御応答、例えば、RNA干渉またはインターフェロン誘導性応答からdsRNA複製中間体を保護するのにも役立っている(Ahlquist P et al 2003)。
ゲノム組成、ビリオン形態、および宿主域の違いにかかわらず、+鎖RNAウイルスは、ゲノム複製のために基本的に類似した戦略を有する。定義上、ウイルス(+)RNAゲノムは細胞mRNAと同じ方向性を有し、ウイルスゲノムRNAは、直接、細胞翻訳機構によって翻訳される。最初に、非構造タンパク質が前駆体ポリタンパク質として合成され、ウイルスプロテアーゼによって成熟した非構造タンパク質に切断される。ウイルスゲノムの大部分は非構造タンパク質に充てられ、非構造タンパク質はビリオンの一部でなく、ウイルス複製中に重要な機能を果たす。翻訳およびポリタンパク質プロセシング後に、RdRp、さらなるアクセサリー非構造タンパク質、ウイルスRNA、および宿主細胞因子を含む複合体が組み立てられる。これらのいわゆる複製複合体(RC)がウイルスRNA合成を行う。感染の初期にマイナスセンスウイルスRNAが合成され、複製複合体形成後に、この-鎖RNAは、完全長プラスセンスゲノムRNAならびにサブゲノムRNAを合成する鋳型として用いられる。これらの工程を担う重要な酵素がRNA依存性RNAポリメラーゼであり、レプリカーゼ複合体内で働く(Moradpour et al 2007, Miller and Krijnse-Locker 2008)。
+鎖RNAウイルスは、複製プロセスにおいて、-鎖RNA、+鎖RNA、二本鎖RNA(dsRNA)、およびサブゲノムmRNAを生成し、これらはそれ自体が自然免疫応答経路の強力な誘導物質である。この効果は、TLR3(dsRNA)、TLR7/8(ssRNA)、およびssRNAの二次構造にある特定の構造エレメントを認識する他のいくつかのTLRを介して誘導される。例えば、+鎖RNAウイルスである黄熱病ウイルスの弱毒生ワクチンは、まさしく、複数のToll様受容体を介して自然免疫を活性化する、入手可能で最も有効なワクチンの1つであり、Toll様受容体は、持続性の抗原特異的T細胞応答の質に対して特異的効果も誘導する(Querec TDおよびPulendran B Adv Exp Med Biol. 2007;590:43-53)。
免疫アジュバントは、特定の抗原と組み合わせて用いられると抗原単独より強い免疫応答を生じる物質として、1924年にRamonによって最初に述べられた。この非常に広い定義には多種多様な材料が含まれる。現在利用可能な免疫アジュバントは、大きく2つのカテゴリー:送達系および免疫増強剤に分類される(総説については、Fraser C.K., Diener K.R., Brown M.P. and Hayball J.D. (2007) Expert Reviews in Vaccines 6(4)559-578)。
[本発明1001]
免疫系を調整するためのアジュバントとして使用するための、RNA依存性RNAポリメラーゼを含むアルファウイルスレプリカーゼ。
[本発明1002]
アルファウイルスがセムリキ森林ウイルスである、本発明1001のアルファウイルスレプリカーゼ。
[本発明1003]
レプリカーゼのアミノ酸配列がSEQ ID NO:1と実質的に一致する、本発明1002のアルファウイルスレプリカーゼ。
[本発明1004]
nsP2領域に変異があり、SEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>RDRがもたらされる、本発明1003のアルファウイルスレプリカーゼ。
[本発明1005]
nsP2領域に変異があり、SEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>AAAがもたらされる、本発明1003のアルファウイルスレプリカーゼ。
[本発明1006]
免疫系を調整するためのアジュバントとして使用するための、本発明1001〜1005のいずれかのアルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクター。
[本発明1007]
DNAベクターである、本発明1006の発現ベクター。
[本発明1008]
薬学的に許容される賦形剤および/または構成物と共に処方される、本発明1001〜1007のいずれかのアルファウイルスレプリカーゼまたはアルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクター。
[本発明1009]
免疫系を調整するためのアジュバントとしての、RNA依存性RNAポリメラーゼを含むアルファウイルスレプリカーゼの使用。
[本発明1010]
アルファウイルスがセムリキ森林ウイルスである、本発明1009の使用。
[本発明1011]
レプリカーゼのアミノ酸配列がSEQ ID NO:1と実質的に一致する、本発明1009〜1010のいずれかの使用。
[本発明1012]
レプリカーゼのnsP2領域に変異があり、SEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>RDRがもたらされる、本発明1011の使用。
[本発明1013]
レプリカーゼのnsP2領域に変異があり、SEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>AAAがもたらされる、本発明1011の使用。
[本発明1014]
免疫系を調整するためのアジュバントとしての、本発明1001〜1005のいずれかのアルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクターの使用。
[本発明1015]
前記ベクターがDNAベクターである、本発明1014の使用。
[本発明1016]
レプリカーゼが、薬学的に許容される賦形剤および/または構成物と共に処方される、本発明1009〜1015のいずれかの使用。
[本発明1017]
感染症を予防および/または治療するための医薬の製造のためのワクチン組成物における、本発明1009〜1016のいずれかのアルファウイルスレプリカーゼの使用。
[本発明1018]
ワクチン組成物が細菌性疾患を予防および/または治療するために用いられる、本発明1017の使用。
[本発明1019]
癌を予防および/または治療するための医薬の製造のためのワクチン組成物における、本発明1009〜1016のいずれかのアルファウイルスレプリカーゼの使用。
[本発明1020]
レプリカーゼがウイルス性疾患を予防および/または治療するために用いられる、本発明1017の使用。
[本発明1021]
ウイルス性疾患がHIVである、本発明1020の使用。
[本発明1022]
ワクチン組成物が、タンパク質をベースとするワクチンを含む、本発明1017〜1021のいずれかの使用。
[本発明1023]
ワクチン組成物が、1つまたは複数の抗原をコードする発現ベクターを含む、本発明1017〜1021のいずれかの使用。
[本発明1024]
前記レプリカーゼと前記1つまたは複数の抗原とが同じ発現ベクターによってコードされる、本発明1023の使用。
[本発明1025]
前記1つまたは複数の抗原をコードする発現ベクターがDNAベクターである、本発明1023または1024の使用。
[本発明1026]
前記ベクターが、以下を含む、哺乳動物細胞において機能する複製起点を欠く発現ベクターである、本発明1025の使用:
(a)異種プロモーターに機能的に連結された、核アンカータンパク質をコードするDNA配列であって、核アンカータンパク質が、
(i)特定のDNA配列に結合するDNA結合ドメイン、および
(ii)核構成要素に結合する機能ドメイン
を含む、DNA配列;ならびに
(b)核アンカータンパク質のための多量体化された(multimerized)DNA結合配列。
[本発明1027]
部分(i)および/または部分(ii)が、ウシパピローマウイルス1型のE2タンパク質に由来する、本発明1026の使用。
[本発明1028]
SEQ ID NO:3のアミノ酸配列に実質的に一致する、タンパク質。
[本発明1029]
医薬としての使用のための、本発明1028のタンパク質。
[本発明1030]
SEQ ID NO:4に実質的に開示される配列を含む発現カセットを含む発現ベクターであって、SEQ ID NO:4の位置4126-4133に変異が導入されて、発現時にSEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>AAAがもたらされる(SEQ ID NO:3)、発現ベクター。
[本発明1031]
SEQ ID NO:4に実質的に開示される配列を含む発現カセットを含む発現ベクターであって、SEQ ID NO:4の位置4129-4131に変異が導入されて、発現時にSEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>RDRがもたらされる、発現ベクター。
[本発明1032]
pRSV-RDRである、本発明1031の発現ベクター。
[本発明1033]
医薬としての使用のための、本発明1030〜1031のいずれかの発現ベクター。
[本発明1034]
CGGCGGAGからGCCGCCGCへの変異がSEQ ID NO:4の位置4126-4133に導入されている、SEQ ID NO:4と実質的に一致する核酸配列。
[本発明1035]
免疫系を調整するためのアジュバントの製造のための、RNA依存性RNAポリメラーゼを含むアルファウイルスレプリカーゼの使用。
[本発明1036]
アルファウイルスがセムリキ森林ウイルスである、本発明1035のアルファウイルスレプリカーゼの使用。
[本発明1037]
レプリカーゼのアミノ酸配列がSEQ ID NO:1と実質的に一致する、本発明1036のアルファウイルスレプリカーゼの使用。
[本発明1038]
レプリカーゼのnsP2領域に変異があり、SEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>RDRがもたらされる、本発明1037のアルファウイルスレプリカーゼの使用。
[本発明1039]
レプリカーゼのnsP2領域に変異があり、SEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>AAAがもたらされる、本発明1037のアルファウイルスレプリカーゼの使用。
[本発明1040]
免疫系を調整するためのアジュバントの製造のための、本発明1035〜1039のいずれかのアルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクターの使用。
[本発明1041]
発現ベクターがpRSV-RDRである、本発明1040の使用。
[本発明1042]
前記ベクターがDNAベクターである、本発明1040または1041の発現ベクターの使用。
[本発明1043]
前記レプリカーゼまたは前記レプリカーゼをコードする発現ベクターが、薬学的に許容される賦形剤および/または構成物と共に処方される、本発明1035〜1042のいずれかのアルファウイルスレプリカーゼまたはアルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクターの使用。
「発現ベクター」は、核酸配列の形で遺伝情報を運ぶ、DNAまたはRNAベースのベクターまたはプラスミドを指す。「プラスミド」、「ベクター」、および/または「発現ベクター」という用語は本明細書において同義に用いられることがある。
本発明者らは、機能的なRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)活性を有するアルファウイルスレプリカーゼが単独で投与された時に、免疫系調整効果をもたらすために構造ウイルスタンパク質もしくは非構造ウイルスタンパク質またはゲノム核酸配列がさらに必要とされることなく、免疫系調整効果を引き起こすことができる、すなわち、免疫系調整アジュバントとして作用できることを初めて開示する。
a.異種プロモーターに機能的に連結された、核アンカータンパク質をコードするDNA配列であって、核アンカータンパク質が、
(i)特定のDNA配列に結合するDNA結合ドメイン、および
(ii)核構成要素に結合する機能ドメイン、またはその機能的等価物
を含む、DNA配列;ならびに
b.核アンカータンパク質用の多量体化された(multimerized)DNA結合配列
を含み、哺乳動物細胞において機能する複製起点を欠く発現ベクターである。
a)異種プロモーターに機能的に連結された、核アンカータンパク質をコードするDNA配列であって、核アンカータンパク質が、
(i)特定のDNA配列に結合するDNA結合ドメイン、および
(ii)核構成要素に結合する機能ドメイン、またはその機能的等価物
を含む、DNA配列;ならびに
b)核アンカータンパク質用の多量体化されたDNA結合配列
を含み、哺乳動物細胞において機能する複製起点を欠く発現ベクターである。
発現ベクター
pRSV-Nsp1234(SEQ ID NO:5)は、RSV LTRプロモーターからコドン最適化SFVレプリカーゼ(SEQ ID NO:4)を発現する10342bpプラスミドベクターである。異種ウサギβグロビン遺伝子に由来するイントロンがレプリカーゼコード配列に導入されている。
主な特徴:
始まり-終わり 説明
9933-268 pUCori
437-963 RSV LTR
1001-8869 SFVレプリカーゼコード配列とイントロン(SEQ ID NO:4)
1213-1785 イントロン
8878-9090 bgh pA
9204-9899 araD選択マーカー
主な特徴:
始まり-終わり 説明
9839-268 pUCori
367-894 heIF4A1プロモーター
907-8775 SFVレプリカーゼコード配列とイントロン(SEQ ID NO:4)
1119-1691 イントロン
8784-8996 bgh pA
9110-9805 araD選択マーカー
主な特徴:
始まり-終わり 説明
9849-268 pUCori
372-903 hEF1a/HTLV
917-8785 SFVレプリカーゼコード配列とイントロン(SEQ ID NO:4)
1129-1701 イントロン
8794-9006 bgh pA
9120 9815 araD選択マーカー
nsP2領域に変異RRR>RDRのあるSFVレプリカーゼを発現するDNAプラスミドの構築
以前に、SFVレプリカーゼタンパク質配列(非構造ポリペプチドnsP1234)(SEQ ID NO:1)を逆翻訳(back-translate)し、異種ウサギβグロビン遺伝子由来イントロンを有する(コード配列に導入した)コドン最適化合成cDNAを合成した(SEQ ID NO:4)。コドン最適化コード配列からSFVレプリカーゼを発現させるために、異なる異種PolIIプロモーターおよびUTRエレメントが用いられるように、このcDNAを発現プラスミドに挿入した(図5)。特に、ラウス肉腫ウイルス5'LTR、ヒトeIF4A1プロモーター、およびヒトEF1aプロモーター+HTLV UTRからなるキメラプロモーターを使用した。SFVレプリカーゼ(SEQ ID NO:1)を発現するベクターを、pRSV-Nsp1234(SEQ ID NO 5)、pheIF4A1-Nsp1234(SEQ ID NO 6)、およびphEF1aHTLV-Nsp1234(SEQ ID NO 7)と名付けた。さらに、nsP2 NLS領域にあるアミノ酸1185-1187 RRR>AAAの変異を、ベクターpRSV-Nsp1234、pheIF4A1-Nsp1234、およびphEF1aHTLV-Nsp1234に導入した。これらのプラスミドを、それぞれ、pRSV-AAA、pheIF4A1-AAA、およびphEF1aHTLV-AAAと名付けた。
RdRp発現によるI型インターフェロン応答の誘導
本発明者らは、I型インターフェロン発現を誘導する能力について異なるレプリカーゼ構築物を区別するために、モデル細胞株としてCop5マウス線維芽細胞細胞株(ATCC番号CRL-1804)を使用した。Cop-5細胞を、10%ウシ胎児血清、2mM L-グルタミン、およびストレプトマイシン-ペニシリンを添加したイスコブ改変ダルベッコ培地(IMDM)中で増殖させた。他の2種類のヒト細胞株HEK293およびHACATも比較のために使用した。細胞を37℃、5%CO2で増殖させ、50〜70%コンフルエンシーまで増殖させた。
Bio-Rad Gene Pulserを用いてエレクトロポレーションを行った。トランスフェクションには、10ng、200ngおよび1000ng の3種類のプラスミドDNA濃度を等モル量の対照プラスミドと共に使用した。全5種類の構築物:pRSV-Nsp1234、pRSV-RDR、pRSV-AAA、pRSV-RDR-GAA、およびpRSV-AAA-GAAを、インターフェロン応答を誘導する能力についてアッセイした。細胞をトリプシンで処理し、遠心分離によって回収し、増殖培地に懸濁し、5mM NaBesを添加した。エレクトロポレーションは、50ugの担体DNA(サケ精子DNA)の存在下で0.4mmキュベットに入れて行い、キュベット内で15分間、放置し、増殖培地で洗浄し、6ウェルプレートに播種した。
トランスフェクションの24時間後、48時間後、および72時間後に、細胞培養上清を回収し、インターフェロン-αおよび-βキット(PBL Biomedical Laboratories)を用いてさらに分析するまで-20℃で凍結した。細胞培養上清を適切に希釈し、酵素結合免疫測定法において製造業者の説明書(PBL Biomedical Laboratories)に従って使用した。
回収された上清からインターフェロン-βレベルを、酵素結合免疫測定法(ELISA)(PBL Biomedical Laboratories)によって製造業者の説明書に従って定量した。
インターフェロン応答の発生は、区画化されたRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)複合体内にあるRdRp活性によるものである。ポリメラーゼ単位の活性中心にGAA変異を導入することでRdRpの酵素活性を取り消した時に、RdRpの効果は完全に無くなった(図2)。GAA変異を含有する構築物でトランスフェクションした後の、細胞培養上清から測定したインターフェロン発現プロファイルは、酵素活性をコードしない構築物と類似していた(図1、レーンparaDMgB)。
細胞培養実験に基づいて、RDR変異を導入することによってNsp2領域において核局在化シグナル(NLS)が改変された変異体が、最も見込みのあるアジュバント候補として選択された。NLSの同じ位置に他の改変(AAA)を有する変異体または野生型RdRpも、I型インターフェロン応答を誘導する能力についてアッセイしたが、効果はかなり低かった(図1)。
本発明者らはまた、レプリカーゼ発現ベクターpRSV-Nsp1234 (SEQ ID NO:5)と、レプリカーゼならびに特定のウイルスcis配列を含有する鋳型RNAを両方とも発現するベクターpRSV-SFV-Rlucを比較した。後者は、レプリカーゼの特定の基質として作用する。IFN応答誘導アッセイの結果から、特定の鋳型RNAの存在は、インターフェロン応答の誘導において重要な要因でないことが分かった(図3)。ヒト細胞株HEK293およびHACATにおいて、本発明者らはまた、pRSV-RDRによって特定のインターフェロン-βを示すことができ、それより少ない程度でインターフェロン-α誘導を示すことができた(図4および図5)。
レプリカーゼ発現細胞の細胞質におけるdsRNAの蓄積
SFVゲノムまたはレプリカーゼ鋳型RNAの複製サイクルの間にdsRNA中間体が生成されることが知られている。細胞質区画にdsRNAが存在するとウイルス感染が細胞にシグナル伝達され、I型インターフェロン応答を含む抗ウイルス応答カスケードが開始し得る。
前記(実施例2)で述べたように、SFVレプリカーゼ発現のみで、トランスフェクト細胞においてI型インターフェロン応答が誘導される。さらに、RdRp活性を無くすGDD>GAA変異を有する発現ベクターでトランスフェクトされた後にIFN応答が観察されなかったので、レプリカーゼのRdRp活性はIFN応答に重要であることが確かめられた(実施例2)。
従って、レプリカーゼ発現ベクターのみでトランスフェクトされた細胞におけるdsRNAの存在および局在化を試験した。この目的のために、抗dsRNAモノクローナル抗体J2(Scicons, Hungary)を用いたIF分析を利用した。このアプローチは、+鎖RNAウイルス感染後の細胞内のdsRNAを検出するために以前に用いられた(Weber et al 2006)。簡単に述べると、細胞をレプリカーゼ発現ベクターでトランスフェクトし、トランスフェクション後、翌日に、抗Nsp1抗体および抗dsRNA抗体(混合)を用いて、パラホルムアルデヒド固定細胞の免疫蛍光分析を行った。蛍光顕微鏡によるシグナル検出のために、蛍光色素Alexa488およびAlexa568で標識した二次抗体およびDAPIによる核染色を用いた。
RD細胞を、0.5ugのphEF1aHTLV-Nsp1234または0.5ugのphEF1aHTLV-GAAを含むPEI-DNA複合体によってトランスフェクトした。この結果は、Nsp1シグナルが両培養物において観察されたことをはっきりと証明した。phEF1aHTLV-Nsp1234でトランスフェクトされた細胞では、抗nsP1で染色された球状パターンと共存する細胞質dsRNAシグナルが検出されたが、phEF1aHTLV-Nsp1234-GAAでトランスフェクトされた細胞では観察されなかった。
Cop5細胞を、1ugのpRSV-Nsp1234、pRSV-GAA、pRSV-RDR、またはpRSV-RDR-GAAを用いたエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。結果から、Nsp1シグナルは全ての培養物において観察されたが、レプリカーゼと共存する細胞質dsRNAは、pRSV-Nsp1234またはpRSV-RDRでトランスフェクトされた細胞において検出できたが、プラスミドpRSV-GAAまたはpRSV-RDR-GAAでトランスフェクトされた細胞では検出できなかった。
RD細胞を、0.5ugまたは1ugのpRSV-Nsp1234、pRSV-AAA、またはpRSV-RDRを含むPEI-DNA複合体によってトランスフェクトした。この結果は、Nsp1シグナルが全ての培養物において見られたことを証明した。pRSV-Nsp1234またはpRSV-RDRでトランスフェクトされた細胞では、抗nsP1で染色された球状パターンと共存する細胞質dsRNAシグナルが検出されたが、pRSV-AAAでトランスフェクトされた細胞では検出されなかった。
wt SFVレプリカーゼ、または本明細書において前に規定されたように、nsP2領域に変異RRR>RDRを有するレプリカーゼが発現されると、nsp1陽性球状パターンと共存する、トランスフェクト細胞の細胞質内の明らかなdsRNA蓄積が誘導されることが証明された。対照的に、細胞が、RdRp活性を無くすGDD>GAA変異を有するレプリカーゼでトランスフェクトされた場合、このようなdsRNA蓄積は検出されなかった。
細胞性免疫応答に対するSFVレプリカーゼ発現のアジュバント効果
3種類のマウス(Balb/c)群(1群あたり5匹のマウス)を、遺伝子銃で2週間の間隔をあけて2回、免疫化した。両免疫化とも、1マイクログラムのプラスミドDNAを投与した。プラスミドベクターGTU-MultiHIV(HIV-1に由来する選択された遺伝子をコードする)は、HIV-1用の実験DNAワクチンである。GTU-MultiHIVプラスミドとアジュバントpRSV-Nsp1234またはpRSV-RDRを同時投与した時には、0.8μgのGTU-MultiHIVおよび0.2μgのアジュバントプラスミドを一緒に混合した。GTU-MultiHIVベクターのみを与えたマウスの場合、1μgのプラスミドDNAを使用した。10日後に、マウスを屠殺した。新鮮に単離された脾細胞を用いて、インターフェロンγELISPOT分析を行った。細胞を刺激するために、HIV-1のp24タンパク質に由来する1つの単一ペプチド(AMQMLKETI)を使用した。このペプチドは、Balb/cマウスのMHCクラスI分子によって提示されることが知られている。もう1つの刺激剤は、DNAワクチンによってコードされるもう1つの構成要素であるHIV-1のRevタンパク質をカバーする重複ペプチドのプールであった。
トリインフルエンザウイルスに対する体液性免疫応答の誘導に対するSFVレプリカーゼ発現の効果
3種類のマウス群(1群あたり5匹のマウス)を、インフルエンザウイルスに由来するHA抗原およびNA抗原をコードするプラスミドベクターpETB-12m-1で免疫化した。前記実施例と同様にマウスを免疫化した(免疫化1回あたり1μgのプラスミドDNA。プラスミドと遺伝子アジュバントを同時投与した時に、4:1の比800ng免疫化ベクターおよび200ngアジュバントベクターを使用した)。2回目の免疫化の2週間後に、ELISA試験において、血液試料に特定の抗体が存在するかどうか分析した。この実験では比較のために、体液性免疫応答を増強することが知られているサイトカインGM-CSFをコードするベクターである別の遺伝子アジュバントを使用した。
これらの結果から、2回の免疫化後、遺伝子アジュバントpRSV-RDRと抗原コードプラスミドを混合した群において最高力価が検出されたことが分かる(図7)。
マウスにおける細胞性免疫応答に対するSFVレプリカーゼ発現のアジュバント効果
1群あたり4匹または5匹のマウス(Balb/c)からなる3種類のマウス群を、遺伝子銃で4週間の間隔をあけて2回、免疫化した。両免疫化とも、1マイクログラムのプラスミドDNAを投与した。プラスミドベクターGTU-MultiHIV(HIV-1に由来する選択された遺伝子をコードする)は、HIV-1用の実験DNAワクチンである。1回目または2回目の免疫化の際に、GTU-MultiHIVプラスミドとアジュバントpRSV-RDRを同時投与した時には、0.8μgのGTU-MultiHIVおよび0.2μgのアジュバントプラスミドを一緒に混合した。GTU-MultiHIVベクターのみを与えたマウスの場合、1μgのプラスミドDNAを使用した。2回目の免疫化の10日後に、マウスを屠殺した。新鮮に単離された脾細胞を用いて、インターフェロンγおよびグランザイムB ELISPOT分析を行った。細胞を刺激するために、HIV-1のp24タンパク質に由来する1つの単一ペプチド(AMQMLKETI)およびHIV-1のEnvタンパク質に由来する1つのペプチド(RGPGRAFVTI)を使用した。これらのペプチドは、Balb/cマウスのMHCクラスI分子によって提示されることが知られている。
Claims (35)
- アルファウイルスレプリカーゼを含む、免疫系を調整するためのアジュバントであって、レプリカーゼがRNA依存性RNAポリメラーゼを含む、アジュバント。
- アルファウイルスがセムリキ森林ウイルスである、請求項1記載のアジュバント。
- レプリカーゼのアミノ酸配列がSEQ ID NO:1のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有する、請求項2記載のアジュバント。
- レプリカーゼがnsP2領域に変異があり、SEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>RDRがもたらされる、請求項3記載のアジュバント。
- レプリカーゼがSEQ ID NO:4によってコードされるが、SEQ ID NO:4の位置4129-4131に変異が導入されて、発現時にSEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>RDRがもたらされる、請求項4記載のアジュバント。
- レプリカーゼがnsP2領域に変異があり、SEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>AAAがもたらされる、請求項3記載のアジュバント。
- 請求項1〜6のいずれか一項記載のアルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクターを含む、免疫系を調整するためのアジュバント。
- 発現ベクターがpRSV-RDRである、請求項7記載のアジュバント。
- ベクターがDNAベクターである、請求項7または8記載のアジュバント。
- アルファウイルスレプリカーゼまたはアルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクターが、薬学的に許容される賦形剤および/または構成物と共に処方される、請求項1〜9のいずれか一項記載のアジュバント。
- アルファウイルスレプリカーゼまたはアルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクターがワクチン組成物中に存在する、請求項1-10のいずれか一項記載のアジュバント。
- 請求項1〜10のいずれか一項記載のアジュバントを含む、感染症を予防および/または治療するためのワクチン組成物であって、該RNA依存性RNAポリメラーゼと相互作用するためのcis-シグナルを含有する鋳型RNAを含まない、前記ワクチン組成物。
- 細菌性疾患を予防および/または治療するために用いられる、請求項12記載のワクチン組成物。
- 請求項1〜10のいずれか一項記載のアジュバントを含む、癌を予防および/または治療するためのワクチン組成物であって、該RNA依存性RNAポリメラーゼと相互作用するためのcis-シグナルを含有する鋳型RNAを含まない、前記ワクチン組成物。
- レプリカーゼがウイルス性疾患を予防および/または治療するために用いられる、請求項12記載のワクチン組成物。
- ウイルス性疾患がHIVである、請求項15記載のワクチン組成物。
- タンパク質をベースとするワクチンを含む、請求項12〜16のいずれか一項記載のワクチン組成物。
- 1つまたは複数の抗原をコードする発現ベクターを含む、請求項12〜16のいずれか一項記載のワクチン組成物。
- 前記レプリカーゼと前記1つまたは複数の抗原とが同じ発現ベクターによってコードされる、請求項18記載のワクチン組成物。
- 前記1つまたは複数の抗原をコードする発現ベクターがDNAベクターである、請求項18または19記載のワクチン組成物。
- 前記ベクターが、以下を含む、哺乳動物細胞において機能する複製起点を欠く発現ベクターである、請求項20記載のワクチン組成物:
(a)異種プロモーターに機能的に連結された、核アンカータンパク質をコードするDNA配列であって、核アンカータンパク質が、
(i)特定のDNA配列に結合するDNA結合ドメイン、および
(ii)核構成要素に結合する機能ドメイン
を含む、DNA配列;ならびに
(b)核アンカータンパク質のための多量体化された(multimerized)DNA結合配列。 - 部分(i)および/または部分(ii)が、ウシパピローマウイルス1型のE2タンパク質に由来する、請求項21記載のワクチン組成物。
- 発現ベクターの1つまたは複数の抗原がHIVの1つまたは複数の構造タンパク質および/または非構造タンパク質を含む、請求項22記載のワクチン組成物。
- 1つまたは複数の抗原をコードする発現ベクターがGTU-Multi-HIVである、請求項23記載のワクチン組成物。
- SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を有する、タンパク質。
- 医薬としての使用のための、請求項25記載のタンパク質。
- SEQ ID NO:4に実質的に開示される配列を含む発現カセットを含む発現ベクターであって、SEQ ID NO:4の位置4126-4133に変異が導入されて、発現時にSEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>AAAがもたらされる(SEQ ID NO:3)、発現ベクター。
- アルファウイルスレプリカーゼをコードする発現カセットを含む発現ベクターであって、レプリカーゼが実質的にSEQ ID NO:1に一致するが、nsP2領域に変異があり、SEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>RDRがもたらされる、発現ベクター。
- 発現カセットがSEQ ID NO:4に実質的に開示される配列を含み、SEQ ID NO:4の位置4129-4131に変異が導入されて、発現時にSEQ ID NO:1の位置1185-1187に変異RRR>RDRがもたらされる(SEQ ID NO:2)、請求項28記載の発現ベクター。
- pRSV-RDRである、請求項29記載の発現ベクター。
- 医薬としての使用のための、請求項27〜30のいずれか一項記載の発現ベクター。
- レプリカーゼをコードする発現ベクターが薬学的に許容される賦形剤および/または構成物と共に処方される、請求項27〜30のいずれか一項に記載される、アルファウイルスレプリカーゼをコードする発現ベクター。
- 免疫システムを調節するためのアジュバントとして使用するための、請求項27〜32のいずれか一項記載の発現ベクター。
- CGGCGGAGからGCCGCCGCへの変異がSEQ ID NO:4の位置4126-4133に導入されている、SEQ ID NO:4に示される核酸。
- CGGからGACへの変異がSEQ ID NO:4の位置4129-4131に導入されている、SEQ ID NO:4に示される核酸。
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