MX2010012587A - Vector de expresion que codifica el virus alfa replicasa y uso del mismo como adyuvante inmunologico. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una replicasa alfavírica, especialmente replicasa del Virus del Bosque Semliki, o un vector de expresión que codifica una replicasa alfavírica, la replicasa alfavírica que comprende actividad de polimerasa de ARN dependiente de ARN, para uso como un adyuvante modulador del sistema inmunitario. La replicasa alfavírica se puede usar en la combinación con una vacuna al proporcionar una función adyuvante de la misma, que cuando se presenta ahí generará un estimulo adicional a la respuesta inmunitaria en el sujeto a quien esta combinación se administra como se compara cuando la vacuna solo se administra a un sujeto que necesita del mismo. El propósito de la presente invención es proporcionar un adyuvante independiente de especie, eficiente y fácil de administrar que proporcionará ventajas a los adyuvantes usados junto con vacunas de hoy en día.

Description

VECTOR DE EXPRESION QUE CODIFICA EL VIRUS ALFA REPLICASA Y USO DEL MISMO COMO ADYUVANTE INMUNOLOGICO Campo de la Invención La presente invención se refiere al campo de herramientas inmunológicas y en particular al campo de vacunas y a adyuvantes apropiados para usar en composiciones de vacuna .

Antecedentes de la Invención El sistema inmunitario de mamífero se ha transformado con objeto de sobrevivir en el ambiente que contiene una gran variedad de microorganismos, que los colonizan en un número de nichos tipo piel, intestino, tracto respiratorio superior e inferior, tracto urogenital etc. Algunos de los nichos tipo colon y piel se colonizan constitutivamente por una microbiota endógena, mientras que otros nichos (órganos internos y tracto respiratorio inferior) se mantienen normalmente estériles en un hospedero inmunocompetente . Los efectos del microorganismo pueden ser positivos para el hospedero, como es el caso para las bacterias simbióticas intestinales. En otros casos, la colonización microbiana puede ser perjudicial al hospedero. Tal como efectos negativos que dependen del estado del sistema inmunitario del hospedero - ciertos patógenos (conocidos como patógenos Ref . :215210 oportunistas) afectan sólo individuos inmunocromprometidos . El efecto perjudicial potencial de las infecciones por microbios ha llevado a- la evolución de una variedad de mecanismos de defensa del hospedero. En vertebrados de mandíbula, hay dos tipos de defensa: respuestas inmunitarias innatas y adaptativas. La principal distinción entre estas es los tipos de receptor usados para reconocer patógenos, el tiempo de espera necesario para lanzar la respuesta y la presencia/ausencia de memoria. Los dos tipos de defensa no operan completamente de forma independiente uno del otro. Como se aprecia enseguida, el sistema inmunitario innato manda señales específicas al sistema inmunitario adaptativo, ayudándolo a montar la respuesta que es más eficiente para el patógeno específico; y al contrario - la respuesta inmunitaria adatativa también activa algunos módulos del sistema inmunitario innato.

Respuesta inmunitaria innata La inmunidad innata siempre se presenta en individuos saludables y su función principal es bloquear la entrada de microbios y virus así como proporcionar una eliminación rápida de patógenos que intentan entrar en los tejidos hospederos. Proporciona protección inmediata para el organismo multicelular.

El sistema inmunitario innato no es una entidad sencilla. Es una colección de módulos o subsistemas distintos que aparecen en diferentes etapas de la evolución: • Epitelio mucosal que produce péptidos antimicrobianos, protege el hospedero de invasión por patógenos; · fagocitos con sus mecanismos anti-microbianos contra bacterias intra- y extracelular; • proteínas en fase aguda y sistemas de complemento que se operan en la circulación y fluidos corporales; • células eliminadoras naturales, que están involucradas en la eliminación de células infectadas con virus; • eosinófilos, basófilos y mastocitos, que están involucrados contra la protección de parásitos multicelulares; • interferones tipo I y proteínas inducidas por estos, que tienen un papel crucial en la defensa contra virus.

La respuesta inmunitaria innata es responsable por la detección y destrucción temprana de microbios invasores, y se basa en un conjunto de receptores de reconocimiento de patrón codificados por línea geminal (PRRs, por sus siglas en inglés) limitados. Para iniciar las respuestas inmunitarias , los PRRs reconocen patrones moleculares asociados con patógeno (PAMPs) e inducen varias cascadas de activación extracelular tal como la trayectoria de complemento y varias trayectorias de señalización intracelular, que llevan a la respuesta inflamatoria.

El sistema inmunitario innato utiliza PRRs presenten en tres compartimientos diferentes: fluidos corporales, membranas celulares, y citoplasma. Los PRRs en los fluidos corporales juegan papeles principales en la ópzonización de PA P, la activación de trayectorias de complemento, y en algunos casos la transferencia de PAPs a otros PRRs. Los PRRs localizados en la membrana celular tienen diversas funciones, tales como la presentación de PAMPs a otros PRRs, la promoción de absorción de microbios por fagocitosis, y el inicio de trayectorias de señalización principales.

Hay varias clases distintas de funcionalidad de PRRs. La mejor clase caractertizada es los receptores tipo Toll (TLRs, por sus siglas en inglés) . Hay tres receptores de transmembrana que reconocen ácidos nucleicos víricos y varios productos bacterianos, incluyendo lipopolisacáridos y ácidos lipoteicoicos y son los PRRs que generan la señal primaria (Akira, S 2006) . Además, los PRRs citoplásmicos que pueden agruparse en tres clases: proteínas inducibles por interferon (IFN) , helicasas del dominio de reclutamiento de caspasa (CARD) , y receptores tipo dominio de oligomerización unidos al nucleótido (NOD) (NLRs) . Entre las proteínas antivíricas que indicen IFN mejor estudiadas están la familia de proteínas con resistencia al mioxovirus (Mx) , proteína cinasa R (PKR) , oligoadenilato sintetasa (2'.5' OAS) . Estas proteínas antivíricas y helicasas CARD tales como RIG-I y Mda5 están involucradas en la defensa antivírica. En contraste, los NLRs principalmente están involucrados en respuestas inmunitarias antibacterianas.

Receptores tipo Toll (TLRs) Los TLR son los receptores que generan señal mejor caracterizados entre los PRRs . Estos inician respuestas inflamatorias clave y también forman inmunidad adaptativa. Todos los TLR (TLR1-11) conocidos, en mamíferos son glicoproteínas de membrana integral de tipo I que contienen un dominio de repetición rico en leucina extracelular (LRR responsable del reconocimiento del ligando y un dominio de homología del receptor Toll-interleucina-1 citoplásmico (TIR) requerido para iniciar la señalización. Los TLRs reconocen completamente diversos componentes microbianos en bacterias, hongos, parásitos, y virus que incluyen ácidos nucleicos. Aunque se presentan normalmente en la membrana del plasma para detectar PAMPs extracellares , algunos TLRs, incluyendo TLR3 , TLR7, TLR8 , y TLR9 , reconocen sus ligandos en los compartimientos intracelulares tales como endosomas . Los últimos TLR comparten la capacidad de reconocimiento de ácido nucleico, detactan dsAR (TLR3) , ssARN (TLR7 en ratones, TLR8 en humanos) , y porciones CpG ADN no metiladas (TLR9) .

Los TLRs comienzan a compartir y distinguen trayectorias de señalización al reclutar diferentes combinaciones de cuatro moléculas adaptadoras que contienen el dominio TIR: MyD88 , TIRAP, Trif, y TRAM . Con excepción de TLR3 , todos los otros TLRs reclutan el factor de diferenciación mieloide 88 (MyD88) , que se asocia con miembros de la cinasa asociada con la familia del receptor IL (IRAK) (Mouldy Sioud 2006) . Estas trayectorias de señalización activan los factores de transcripción factor nuclear kappa B (NF-??) y la proteína activadora 1 (AP-1) , que es común para todos los TLRs, lo que lleva a la producción de citocinas y quimiocinas inflamatorias. También activan el factor regulador de interferón 3 (IRF3) y/o IRF7 en TLRs 3, 4, 7, 8, y 9 que es un prerrequisito para la producción de interferones tipo I tales como IFN- e IFN-ß (Para revisión Edwards et al 2007, Vercammen et al 2008, Medzitov R 2007) .

Además de la activación directa de mecanismos de defensa de hospedero innatos, algunos PRR se acoplan a la inducción de respuestas inmunitarias adaptativas. Las células T y B, las dos principales clases de células en el sistema inmunitario adaptativo, expresan receptores de enlace al antígeno con especificidades aleatorias y por lo tanto reconocen antígenos que carecen de cualquiera de las características intrínsecas que indican su origen. Por lo tanto, los linfocitos T y B requieren instrucciones que indiquen el origen del antígeno que reconocen. Estas instrucciones vienen del sistema inmunitario innato en la forma de señales especializadas inducibles por PRRs. Para las células T esta asociación se interpreta por céluals dendríticas. Los interferones tipo I están involucrados en la activación y migración de células dendríticas (descritas en más detalla bajo la respuesta antivírica) . Cuando la célula dendrítica activada migra al ganglio linfático, presenta los antígenos derivados de patógeno, junto con señales que inducen PRR, a las células T. Esto resulta en la activación de célula T y diferenciación de células auxiliares T (Th) en uno de varios tipos de células Th efectoras (células Thl, Th2 y Th-17) . Por ejemplo el enganchado de TLR induce la producción de IL-12 por células dendríticas, lo que dirige a las células Th a diferencia en células Thl. El tipo de respuesta efectora es de esta manera dictado por el sistema inmunitario innato. Además, los interferones tipo I también regulan la función de células T citotóxicas y células NK, ya sea directamente o indirectamente al inducir la producción de IL-15.

El sistema inmunitario innato también recibe señales de retroalimentación positivas del sistema inmunitario adaptativo. Por ejemplo, las células Th efectoras producen citocinas apropiadas que activan los módulos especifícaos del sistema inmunitario innato: se activan los macrófagos por citocinas (interferón ?) secretadas de células Thl, se activan los neutrófilos por células Th-17 ( interleucina 17) , se activan mastocitos y basófilos por células Th2 ( interleucina 4 y 5). Similármente , los anticuerpos enlazados (IgG) activas las proteínas de complemento y ayudan a la fagocitosis por patógenos opsonizados.

Respuestas Inmunitarias Adaptativas El sistema inmunitario adaptativo usa un amplio < intervalo de moléculas para sus actividades. Algunas de estas moléculas también se usan por el sistema inmunitario innato, por ejemplo, proteínas de complemento, otras, incluyendo células B específicas de antígeno y receptores de célula T, son únicas para el sistema inmunitario adaptativo. Los perfiles más importantes del sistema inmunitario adaptativo, que se distingen de su inmunidad innata, son una especificidad fina de receptores de célula B y T, y un desarrollo más lento de la respuesta y memoria de exposición previa al antígeno. La última propiedad forma la base de la vacunación - cebado del sistema inmunitario por patógeno atenuado, al seleccionar componentes del patógeno o al imitar la infección de otras maneras (por ejemplo, por vacuna de ADN que codifica antígenos seleccionados de un patógeno) resulta en el desarrollo de memoria inmunológica, que dispara la respuesta más rápidamente y más eficientemente durante el encuentro con patógeno.

Hay dos tipos de inmunidad adaptativo, la inmunidad humoral y la inmunidad mediada por célula. La inmunidad humoral está mediada por células B. Las células B comienzan a secretar los receptores en los fluidos de circulación y mucosales, que en este caso se refieren como anticuerpos ( inmunoglobulinas) . Los genes que codifican estos receptores se ensamblan de fragmentos variables y constantes en el proceso de recombinación somática, antes del encuentro con el patógeno, lo que proporciona un repertorio diverso de receptores. Cada célula B o T es capaz de sintetizar inmunoglobulinas o receptores de célula T de una especificidad sencilla que se enlaza a una estructura molecular específica (epítopo) . Los anticuerpos se enlazan no covalentemente a antígenos específicos para inmovilizarlos, lo que los vuelve inofensivos o etiqueta el antígeno para destrucción (por ejemplo, por ptoeínas de complemento o por macrófagos) y se remueve por otros componentes del sistema inmunitario. La inmunidad mediada por célula está mediada por células T. las células T son jugadores clave en las respuestas inmunitarias más adaptativas. Estas participan directamente en eliminar células infectadas (células T citotóxicas CD8+) u orquestan y regulan la actividad de otras células al producir varias citocinas (células auxiliares T CD4+ ) . También la inducción de anticuerpos por células B es en una mayoría de casos dependiente de las células auxiliares T. La característica distintiva de los receptores de antígeno de célula T es su incapacidad de reconocer moléculas solubles - pueden reconocer fragmentos de péptido de antígenos de proteína en la superficie de célula enlazada a moléculas que exhiben el péptido especializado, llamadas complejo de histocompatibilidad principal (MHC, por sus siglas en inglés) . Las células auxiliares T necesitan moléculas de clase II MHC para reconocer gragmentos de péptido antigénicos, y las células T citotóxicas necesitan moléculas de clase I MHC. Esta característica permite que las célula T detecten patógenos intracelulares, que de otra manera podrína mantenerse indetectables por el sistema inmunitario, debido a que los péptidos cortos (9-10 aminoácidos) de todas las proteínas sintetizadas en células eucarióticas (incluyendo péptidos derivados de patógenos) se exponen en la superficie celular en los bolsillos de péptido de las moléculas MHC. La respuesta inmunitaria adaptativa se inicia después de la captura del patógeno por células que presentan antígeno profesional (APCs, por sus siglas en inglés) . Los linfocitos T inactivos necesitan ver antígenos presentados por antígenos MHC en APC . Estas células se presentan en todo el epitelio del cuerpo, que es la interface entre el cuerpo y el ambiente externo. Además de esto, las APCs se presentan en números más pequeños en la mayoría de los otros órganos. Las APCs en el epitelio pertenecen al linaje de células dendríticas. En la piel, las células dendríticas epidérmicas se llaman células Langerhans. Las células dendríticas capturan antígenos de microbios que entran en el epitelio, por el proceso defagocitosis o pinocitosis. Después de que el antígeno captura células dendríticas que lo rodean y pierde su adhesividad al epitelio, dejan el epitelio y migran por medio de vasos linfáticos al ganglio linfático drenando tal epitelio. Durante el proceso de migración las células dendríticas maduran en células capaces de estimular células T. esta maduración se refleja en síntesis incrementada y expresión estable de moléculas MHC, que exhiben antígeno a células T, y otras moléculas, co-estimuladores , que se requieren para respuestas de célula T completa. El resultado de esta secuencia de eventos es que los antígenos de proteína de los microbios se transportan a las regiones específicas de los ganglios linfáticos donde los antígenos son más posibles de que encuentren linfocitos T. los linfocitos T inactivos recirculan continuamente a través de los ganglios linfáticos, y se estima que cada célula T inactiva en el cuerpo puede tener un ciclo a través de algunos ganglios linfáticos al menos una vez al día. De esta manera, el encuentro inicial de células T con antígenos pasa en los ganglios linfáticos y esto se llama cebado. Las células auxiliares T CD4+ cebadas comienzan a secretar una variedad de citocinas, que ayudan a otras células del sistema inmunitario a responder. Las células dendríticas llevan a los ganglios linfáticos no sólo fragmentos de péptido desde los patógenos, sino también señales que inducen PRR enviadas desde el sistema inmunitario innato (como se menciona arriba, activación de influencia IFNs tipo I y diferenciación de células dendríticas) . Las células dendríticas convierten esta información en activación de clones específicos de células T (que reconocen péptidos patogénicos) y diferenciación del tipo apropiado de células auxiliares T. El cebado de células T CD8+ también se realiza por células dendríticas, pero la proliferación y maduración adicional de células T CD8+ en células eliminadoras completamente funcionales depende de las citocinas secretadas por las células auxiliares T.

Tomado en conjunto, entre el sistema inmunitario innacto y adaptativo hay una interacción continua y complicada. El éxito en el desarrollo de vacunas contra patógenos "difíciles" donde no hay vacunas actualmente disponibles (VIH-l, TB y malaria) puede depender de explotar métodos completamente nuevos para producir una respuesta inmunitaria protectora.

.Respuesta antivírica a virus de ARN de hebra positiva y sus subproductos de replicación Virus de ARN de hebra positiva Los virus de ARN de hebra positiva abarcan arriba de un tercio de todo el género de virus. Los genomas de virus de ARN de hebra positiva son plantillas para tanto la traducción como la replicación, lo que lleva a interacciones entre factores de traducción hospederas y replicación de ARN a niveles múltiples. Todos los virus de ARN de hebra positiva conocidos portan genes para una polimerasa de ARN dependiente de ARN (RdRp) usados en la replicación del genoma . Sin emabargo, al contrario de otros virus de ARN, los virus de ARN de hebra positiva no encapsidan esta polimerasa. De esta manera, durante la infección de una nueva célula, la replicación de ARN vírico no inicia hasta que el ARN genómico se traduce para producir polimerasa y, para la mayoría de virus de ARN de hebra positiva, los factores de replicación adicionales. Todos los virus de ARN de hebra positiva caracterizados ensamblan sus complejos de replicación de ARN en membranas intracelulares . En y más allá de la superfamilia tipo virus alfa la replicación de ARN vírico se presenta en asociación con invaginaciones esféricas de membranas intracelulares. Por ejemplo, los virus alfa usan membranas endosomales y lisosomales para su ensamble de complejo de replicación. La membrana proporciona una superficie en la cual los factores de replicación se localizan y concentran. Esta organización también ayuda a proteger contra los intermediarios de replicación de dsARN de respuestas de defensa de hospedero indicidas por dsARN tal como interferencia de ARN o respuestas inducidas por interferon (Ahlquist P et al 2003) .

A pesar de las diferencias en la organización del genoma, la morfología del virión y el intervalo hospedero, los virus de ARN- de hebra positiva tienen estrategias fundamentalmente similares para replicación del genoma. Por definición, el genoma de (+) ARN vírico tiene la misma polaridad como el mARN celular y el ARN genómico vírico se traduce directamente por la maquinaria de traducción celular. Primeramente, se sintetizan las proteínas no estructurales como proliproteínas precursoras y se desdoblan en proteínas no estructurales maduras por proteasas víricas. Una gran parte del genoma vírico está unido a proteínas no estructurales, que no son parte del virión y transportan funciones importantes durante la replicación vírica. Después de la traducción y procesamiento de poliproteína, se ensambla el- complejo que incluye el RdRp, proteínas no estructurales accesorio adicionales, ARN vírico y factores de célula hospedera. Estos complejos llamados de replicación (RCs, por sus siglas en inglés) transportan la síntesis virus-ARN. El ARN vírico de sentido negativo se sintetiza temprano en la infección y después de la formación de complejos de replicación este ARN de hebra negativa se usa como una plantilla para sintetizar el ARN genómico de sentido positivo de longitud completa así como el ARN subgenómico. La enzima clave responsable de estas etapas es la polimerasa de ARN dependiente de ARN, que actúa dentro del complejo de replicasa (Moradpour et al 2007, Miller and Krijnse-Locker 2008) .

Sensibilización de ARN vírico Los virus de ARN de hebra positiva producidos en el proceso de replicacion de ARN de hebra negativa, ARN de hebra positiva, ARN de hebra doble (dsARN) y mARN subgenómico, que por sí mismos son inductores poderosos de las trayectorias de respuesta inmunitaria innatas . El efecto se induce a través de TLR3 (dsARN) , TLR7/8 (ssARN) , y algunos otros TLRs que reconocen los elementos estructurales específicos en la estructura secundaria del ssARN. Por ejemplo, el virus de ARN de hebra positiva, vacuna atenuada viva de virus de fiebre amarilla es definitivamente una de las vacunas más efectivas disponibles que activan la inmunidad innata por medio de receptores tipo Toll múltiples que también inducen los efectos diferenciales en la calidad de la respuesta de célula T específica de antígeno de larga duración (Querec TD and Pulendran B Adv Exp Med Biol . 2007 ; 590 : 3 - 53).

Como se establece arriba, las células poseen receptores y trayectorias de señalización para inducir la expresión de gen antivírico en respuesta a presencia vírica citosólica. Las citocinas múltiples se inducen por infección por virus que incluye interleucina 6 (IL-6), IL-12 p40, y factor de necrosis de tumor (TNF, por sus siglas en inglés) , pero el distintivo de las respuestas antivíricas es la producción de interferones tipo I . Los interferones tipo I pueden producirse por todoas las células nucleadas, incluyendo células epiteliales, fibroblastos en superficies mucosales, y células dendríticas, en respuesta a la infección por virus. Además todas las células pueden responder a los interferones tipo I a través del receptor de interferon tipo I (IFNAR, por sus siglas en inglés), que enlaza todos los subtipos.

Los genes que codifican los PRR citosólicos y los componentes de las trayectorias de señalización cadena abajo son pro sí mismos inducibles por interferon, lo que lleva a un rizo de retroalimentación positivo que puede amplificar mayormente las respuestas antivíricas innatas. Se ha considerado que este rizo se establece en movimiento por la presencia de dsARN en células. El dsARN satisface los criterios para ser un marcador de infección por virus, en tanto las moléculas dsARN estén ausentes de células no infectadas pero pueden formarse por la alineación en sus pares base de dos hebras de ARN producidas durante la replicación de virus de ARN. El dsARN se conoce que activa el factor nuclear activado kappa B (NF-??) y factores 3 reguladores del interferon (IRF-3) y 7, que son esenciales en la síntesis de IFN tipo I. Los interferones median su respuesta antivírica por medio de receptores de superficie celular específicos, IFNAR, que activan los transductores de señal citoplásmica y activadores de transcripción (STATs) , que se translocalizan en el núcleo y activan numerosis genes estimlados por IFN (ISGs) (Rautsi et al 2007) .

El gen I inducible por ácido retinoico (RIG-I) y el gen 5 asociado con la diferenciación de melanoma (MDA5) son helicasas de ARN de caja DExD/H inducibles por IFN que pueden detectar productos víricos intracelulares , tales como ARN genómico, y señal para activación de IRF3 e IRF7 y para la inducción de expresión de gen IFN- , ß, y ?. El RIG-I es una proteína citosólica que contiene dominio de helicasa enlazado a ARN y dos dominios de activación y reclutamiento de caspasa (CARDs) . Al igual que RIG-1, MDA5 porta un dominio de helicasa de ARN y dos CARDs. Ambos señalan a través del estimulador 1 del promotor de interferon ß (IPS-1). El adaptador de señal IPS-1 se localiza en mitocondria y contiene un CARD de N-terminal que forma interacciones homotípicas con CARDs de RIG-I y Mda5. Esto resulta en la activación del dominio catalítico de C-terminal y el inicio de una cascada de señalización que culmina en la transcripción de los genes de citocina a través de la activación de NF-?? e IRF3.

Aunque tanto RIG-I como Mda5 enlazan poly(I:C), un dsARN sintético, y una señal por medio de una trayectoria común, responden a virus diferentes. Por ejemplo RIG-I detecta el virus de influenza A, virus de estomatitis vesicular (VSV) , virus de encefalitis japonés (JEV) , y virus Sendai (SeV) , mientras que MDA5 detecta picomavirus, tal como virus de encefalomiocarditis (EMCV) , virus de encefalomielitis Theiler, y mengovirus. Independientemente de la propiedad de hebra sencilla o doble el elemento crítico en la estimulación RIG-I por AR es la presencia de 5 ' -trifosfatos . Que también proporciona explicación para la especificidad del virus de RIG-I .

Los interferones tipo I afectan varios subtipos de células dendríticas (DCs, por sus siglas en inglés). Estos pueden actuar como factores de sobrevivencia autocrinos para ciertas células que producen interferon naturales, promover la diferenciación de monocitos de sangre periférica para DCs e inducir su maduración fenotípica y funcional. Ya que la mayoría de tipos de células son capaces de expresar interferones tipo I, la maduración de DCs en tejidos no linfoides puede dispararse después de la infección de células vecinas. Estos DCs adquirirán la capacidad para migrar a órganos linfoides e iniciar respuestas de célula T (LeBon and Tough 2002) .

La señalización de interferon de tipo I también sobreregula la producción de IFN-? por DCs y células T y por ello favorece la inducción y mantenimiento de células Thl . Adicionalmente , al actuar directamente o indirectamente, pueden influenciar la expresión y función de una variedad de citocinas. Por ejemplo señalización de interleucina 6 (IL-6) aumentada, y producción de factor de crecimiento transformante ß (TGF-ß) anti - inflamatorio, antagonista del receptor IL-1 y receptores del factor de necrosis de tumor (TNF) solubles. Los interferones de tipo I o sus inductores también pueden presenta expresión IL-15 alta por DCs, por ello causando una estimulación fuerte y selectiva de células T CD8+ de fenotipo de memoria (Theofilopoulos et al 2005) .

Los patrones relacionados con infección por patógenos víricos específicos (tipo acumulación del dsARN en citoplasma de las células infectadas con virus) , los factores de reconocimiento responden a estos patrones (por ejemplo, receptores tipo Toll) , y las trayectorias de defensa antivíricas diferentes disparadas por estas interacciones se han descrito arriba. El sistema complejo llamado inmunidad innata se dirige a llevar la cascada de eventos desde el reconocimiento del patógeno hasta destruir las células infectadas por virus y la rápida limpieza de la infección vírica del cuerpo. Además, la activación del sistema inmunitaria innato es una determinante importante de la calidad y cantidad de la respuesta inmunitaria adaptativa evocada contra los antígenos víricos (Germain R 2004) .

Adyuvantes inmunológicos Los adyuvantes inmunológicos se describieron originalmente por Ramón en 1924 como sustancias usadas en combinación con un antígeno específico que produce una respuesta inmunitaria más robusta que el antígeno solo. Esta definición muy amplia incluye una amplia variedad de materiales . Los adyuvantes inmunológicos disponibles hoy en día caen ampliamente en dos categorías: sistemas de suministro y potenciadores inmunitarios (para revisión Fraser C.K, Diener K.R, Brown M.P and Hayball J.D (2007) Expert Reviews in Vaccines 6(4)559-578) .

Los sistemas de suministro pueden- cambiar la presentación del antígeno dentro de la vacuna maximizando de esta manera la exposición del antígeno al sistema inmunitario, dirigiendo al antígeno en cierta forma a ubicaciones fisiológicas específicas por ello . asegurando recoger el antígeno por las Células que Presentan Antígeno (APCs, por sus siglas en inglés) profesionales. Los ejemplos de adyuvantes inmunológicos presentados como adyuvantes de tipo sistema de suministro en las formulaciones de vacunas son alumbre, emulsiones, saponinas y lípidos catiónicos.

Los activadores inmunitarios actúan directamente en células inmunitarias al activar las trayectorias importantes para la inducción de inmunidad adaptativa. Estos pueden ser microbios exógenos o componentes víricos, sus derivados sintéticos o compuestos inmunoactivos endógenos tales como citocinas, quimiocinas y moléculas coestimulantes. Este tipo de moléculas puede aumentar la inmunidad específica del antígeno objetivo. Como hoy en día, los agonistas del receptor tipo toll, agonistas del receptor tipo dominio de oligomerización de nculeótido, compuestos endógenos recombinantes tipo citocinas, quimiocinas o moléculas coestimulatorias están disponibles y pueden servir como protenciadores inmunitarios . Es importante sin embargo enfatizar que las citocinas y quimiocinas son moléculas específicas de especies y por lo tanto no son fácilmente comparables en animales diferentes. En estos casos, necesitan usarse los homólogos de las moléculas respectivas, lo que complica considerablemente el uso de tales adyuvantes así como la interpretación de los resultados experimentales en una especie y la extrapolación del mismo a otra especie.

Las vacunas de ADN como varias otras vacunas genéticas se han desarrollado durante varios años y presentan un enfoque prometedor en la inducción de respuestas inmunitarias específicas en animales de prueba. Sin embargo, estas vacunas se han vuelto ineficaces en humanos y animales grandes. Una de las razones es probablemente que la reactividad e inmunogenicidad es menor que las vacunas tradicionales. Una razón posible para esta deficiencia es la capacidad limitada para expresión de proteína in vivo, que es de mayor importancia en animales de apareamiento, incluyendo humanos así como la naturaleza más homogénea y carecen de ingredientes derivados de patógeno contaminantes en la preparación de vacuna actual.

Esto ha causado la necesidad para el desarrollo de adyuvantes inmunológicos finamente afinados para la preparación de vacunas, que dirigirían la activación del sistema inmunitario sin efectos tóxicos profundos. Como un resultado de esta necesidad, se han hecho esfuerzos para combinar vacunas de ADN con citocinas o quimiocinas, tipo factores de crecimiento hematopoyéticos , tales como GM-CSF, o quimiocinas tipo MIP-la, que pueden mejorar las respuestas inmunitarias contra el antígeno codificado por la vacuna ADN. Sin embargo, desafortunadamente estos efectos todavía son completamente débiles. El co-suministro de las citocinas y quimiocinas como proteínas requiere enorme trabajo antes de que pueda producirse una proteína de alta calidad para uso actual en animales o humanos .

Respecto al uso de vectores de expresión basados en ácido nucleico para la expresión de un adyuvante para uso en combinación con vacunas de ADN, las preguntas que se levantan con respecto al nivel y sitio apropiado de expresión de una molécula adyuvante particular y el efecto de esta expresión en el tejido en el cual se administra la vacuna.

Las observaciones acerca del efecto útil potencial de los adyuvantes en la estimulación inmunitaria se hicieron en los días previos por Gastón Ramón quien encontró que se desarrollaron titulaciones de anticuerpo más altas en los caballos que desarrolan accesos posteriores a la vacunación. El concepto de usar adyuvantes inmonológicos para majorar las respuestas inmunitarias específicas de antígeno se ha ligado inseparablemente desde los primeros hallazgos con su capacidad para inducir procesos inflamatorios debido a contaminaciones. Como resultado, el uso de tales adyuvantes inmunológicos puede causar toxicidad clínicamente inaceptable y asuntos de salud serios. Por lo tanto, el único adyuvante globalmente autorizado para uso humano es el alumbre, un adyuvante débil capaz sólo de inducir inmunidad humoral. Todos los otros adyuvantes más fuertes capaces de inducir tanto inmunidad mediada por célula como humoral disponibles hoy en día se confinan sólo al uso experimental .

Se ha mostrado que el repertorio actual de adyuvantes de vacuna es inadecuado para generar vacunas efectivas contra patógenos importantes incluyendo VIHl, malaria y tuberculosis (Riedmann et al. 2007; Fraser et al. 20007) . La combinación de adyuvantes conocidos puede vencer algunos de los problemas asociados con las cacunas que están disponibles, sin embargo, ciertamente es necesaria una nueva generación confiable, segura y avanzada de moduladores inmunitarios en la forma de adyuvantes .

En vista de los problemas todavía presentes en el arte previo explicado en lo anterior, el objetivo de la presente ivnención fue de esta manera encontrar un adyuvante más eficiente para acompañar y mejorar las respuestas a vacunas disponibles hoy en día. El adyuvante de acuerdo con la presente invención, es un moduloador del sistema inmunitario, lo que significa que mejorará y reforzará la respuesta inmunitaria en un sujeto al cual se le administra la vacuna.

Breve Descripción de la Invención Los problemas anteriores asociados con los adyuvantes disponibles en la técnica hoy en día se solucionan por la presente invención al proporcionar un uso médico novedoso de una replicasa alfavírica o de un vector de expresión que codifica una replicasa alfavírica como un adyuvante modulador del sistema inmunitario que es independiente de la especie, más eficiente y más fácil de administrar que los adyuvantes moduladores del sistema inmunitario disponible soy en día.

La presente invención se basa en el descubrimiento sorprendente de que la provisión de una replicasa alfavírica sola, que comprende actividad de polimerasa de ARN dependiente del ARN (RdRp) y compartimentar al compartimiento correcto en la célula, es capaz de inducir respuesta inmunitarias innatas en una célula. Esto es posible sin la presencia de genoma vírico o cualquiera de otras proteínas víricas no estructurales o estructurales.

En consecuencia, esto es un descubrimiento de gran avance que permite el desarrollo de adyuvantes eficientes que son capaces de activar la respuesta inmunitaria al proporcionar una respuesta cuantitativamente y cualitativamente más eficiente a un antígeno de vacuna que cuando se administra una vacuna en sí misma.

Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención abarca una replicasa alfavírica que comprende una polimerasa de ARN dependiente de ARN (RdRp) para uso como un adyuvante para modular la respuesta inmunitaria. También, la presente invención por supuesto se refiere al uso de una replicasa alfavírica, la replicasa que comprende una polimerasa de ARN dependiente de ARN, en la fabricación de un adyuvante para modular la respuesta inmunitaria. En una modalidad preferida, la replicasa se codifica por un vector de expresión, tal como un vector de ADN para uso como un adyuvante para modular el sistema inmunitario. En una modalidad preferida, la replicasa es una replicasa SFV (siglas en inglés del Virus del Bosque Semliki) .

La eficacia de la actividad que modula el sistema inmunitario de la replicasa alfavírica puede ajustarse a través de mutaciones específicas en la región de localización nuclear de la subunidad nSP2 de la replicasa. En consecuencia, la presente invención se refiere a replicasas alfavíricas que tienen mutaciones específicas en la región nSP2 de la replicasa tipo natural, para usar como adyuvantes para modular el sistema inmunitario y a replicasas alfavíricas que codifican vectores de expresión que tienen mutaciones específicas en la región nSP2 de la replicasa tipo natural para usar como adyuvantes para modular el sistema inmunitario, cuyos mutantes se han mostrado para ser aún más eficientes en inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto cuando se administra junto con una vacuna alternativa. Las mutaciones específicas muestran ser efectivas en el contexto actual son mutantes RDR y AAA presentados en las posiciones 1185-1187 de la secuencia de aminoácido de replicasa SFV tipo natural, que además se describen en la presente.

La replicasa alfavírica se ha mostrado que es excepcionalmente adecuada como un adyuvante al ser capaz de estimular e incrementar la respuesta inmunitaria en un sujeto a quien se le administra una vacuna, por ejemplo, en la forma de una vacuna basada en ácido nucleico. Los inventores muestran que la respuesta de interferón se incrementa in vivo cuando el adyuvante en la forma de una replicasa se administra junto con una vacuna, en comparación con cuando solamente la vacuna se administra.

Por otra parte, la invención se refiere al uso de la replicasa alfavírica o un vector de expresión que codifica una replicasa alfavírica como un adyuvante para modular la respuesta inmunitaria. La presente invención también se refiere al uso de una replicasa alfavírica como se describe en la presente como un adyuvante en una composición de vacuna para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad infecciosa. La vacuna que acompaña al adyuvante puede ser por ejemplo en la forma de una vacuna basada en ácido nucleico o una vacuna basada en proteína. Además, un método para preparar una composición de vacuna que comprende el adyuvante de acuerdo con la invención se proporciona en la presente. La presente invención también se refiere a una proteína novedosa con actividad de replicasa así como un vector de expresión que codifica la replicasa.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1. IFN-beta medida de sobrenadantes de cultivo celular Cop5 transíectados con RdRp usando diferentes concentraciones de ADN. lOng, 200ng, o lOOOng de vectores de expresión pRSV-Nspl234 , pRSV-RDR, pRSV-AAA, o vector de expresión multiantigen de VIH paraDMgB (control negativo, sin actividad RdRp) se transíectaron en células Cop5. Los sobrenadantes de cultivo celular se colectaron en tres puntos de tiempo (24h, 48h, y 72h) y analizaron para expresión de interferón- ß .

Figura 2. IFN-beta medida de sobrenadantes de cultivo celular Cop5 transíectados con RdRp usando diferentes concentraciones de ADN. lOng, 200ng, o lOOOng de pRSV-RDR, pRSV-GAA, pRSV-RDR-GAA, y pRSV-AAA-GAA se transíectaron en células Cop5. Los sobrenadantes de cultivo celular se colectaron en tres puntos de tiempo (24h, 48h, y 72h) y analizaron para expresión de interferón- ß .

Figura 3. IFN-beta medida de sobrenadantes de cultivo celular Cop5 transfec.tados con cualquier transreplicasa o constructos RdRp . lOng, 200ng, o lOOOng de pRSV-SFV-Rluc , pRSV-Nspl234 , y KS123M4-RL (control negativo, sin actividad RdRp) se transfectaron en células Cop5. Los sobrenadantes de cultivo celular se colectaron en tres puntos de tiempo (24h, 48h, y 72h) y analizaron para expresión de interferón- ß .

Figura 4. IFN-beta en células HEK293. Las células HEK293 se transfectaron con electroporación y con la adición de ADN de portador. Se usó 1 µg de ADN de plásmido o poli(I:C). Los sobrenadantes se colectaron en tres puntos de tiempo (24h, 48h, y 72h) y analizaron para expresión de interferón- ß .

Figura 5. IFN-a y -b en células HACAT. Las células se transfectaron por electroporación y con la adición de ADN de portador. 1 yg de ADN de plásmido o poli(I:C) se usó. Los sobrenadantes se colectaron en tres puntos de tiempo (24h, 48h, y 72h) y analizaron para expresión de interferón- ß y -a. Carriles 1, 5, 9 pRSV-RDR; carriles 2, 6, 10 pRSV-RDR-GAA; carriles 3,—7-,-.11 poli(I:C); carriles 4, 8, 12 transfectado simulado .

Figura 6. ELISPOT IFN-gamma de ratones. Aumento de respuesta inmunitaria celular en ratones cuando el ADN de plásmido se co-administra con el pRSV-RDR de plásmido en relación 4:1 (800 ng vector de vacuna y 200 ng vector adyuvante) . Grupo 1 GTU-MultiVIH; grupo 2 GTU-MultiVIH+pRSV-Nspl234; grupo 3 GTU-MultiVIH+pRSV-RDR; grupo 4 grupo control .

Figura 7. Aumento de la respuesta inmunitaria humoral contra los antígenos de virus de influenza cuando el vector de plásmido que codifica virus de influenza HA y NA se coadministra con el pRSV-RDR de plásmido ADN.

Figura 8. Resultados IFN-gama ELISPOT acumulados contra dos epitopos reconocidos en Gag y Env, promedio de grupo. Tres grupos de ratones Balb/C se inmunizaron dos veces (semana 0 y semana 4) con ADN de plásmido que codifica antígeno MultiVIH solo o junto con pRSV-RDR que se agregó ya sea con la primera o la segunda inmunización. El cuarto grupo estuvo sin tratamiento. El interferón gama Elispot se hizo a partir de células del bazo recientemente aisladas 10 días después de la segunda inmunización. Grupo 1 GTU-MultiVIH, grupo 2 GTU-MultiVIH+pRSV.-RDR con 2da inmunización, grupo 3 GTU-MultiVIH+pRSV-RDR con Ira inmunización, grupo 4 ratones sin tratamiento.

Figura 9. Resultados de Granzyme B ELISPOT acumulados contra dos epitopos reconocidos en Gag y Env, promedio de grupo. Tres grupos de ratones Balb/C se inmunizaron dos veces (semana 0 y semana 4) con ADN de plásmido que codifica antígeno MultiVIH solo o junto con pRSV-RDR que se agregó ya sea con la primera o la segunda inmunización. El cuarto grupo estuvo sin tratamiento. La Granzyme B Elispot se hizo a partir de células del bazo recientemente aisladas 10 días después de la segunda inmunización. Grupo 1 GTU-MultiVIH, grupo 2 GTU-MultiVIH+pRSV-RDR con 2da inmunización, grupo 3 GTU-MultiVIH+pRSV-RDR con Ira inmunización, grupo 4 ratones sin tratamiento.

Descripción Detallada de la Invención Definiciones Un "vector de expresión" se refiere a un vector o plásmido basado en ADN y ARN que lleva información genética en la forma de una secuencia de ácido nucleico. Los términos "plásmido", "vector" y/o "vector de expresión" se pueden usar intercambiablemente en la presente.

Una "polimerasa de ARN dependiente de ARN" o un "RdRp", es una enzima, proteína o péptido que tiene una actividad enzimática que cataliza la síntesis de de novo de ARN a partir de una plantilla de ARN. Una replicasa es una poliproteína viral o complejo de poliproteína que procesa productos que tienen actividad RdRp y cataliza la replicación de ARN viral específico. Se codifican comúnmente por virus que tienen un genoma de ARN. En consecuencia, una replicasa proporciona la función de una polimerasa de ARN dependiente de AR , pero también además comprende sub-unidades de poliproteína no estructural viral adicional al proporcionar otras funciones además de la actividad RdRp. Un RdRp "compartimentado" (CRdRp) se define en la presente como un RdRp de una replicasa que es capaz de proporcionar la actividad RdRp y que es capaz de dirigir al compartimiento correcto en la célula para proporcionar su función.

Los términos "antígeno" y "gen de interés" como se refiere en la presente, comprende entidades, que cuando se administran a un sujeto que necesita del mismo, por ejemplo en la forma de un vector de expresión o en la forma de un péptido o una proteína, directamente o indirectamente puede generar una respuesta inmunitaria en el sujeto al que se le administra. Cuando el antígeno es un gen que se puede proporcionar para la expresión de una proteína/péptido antigénico también se puede referir como un "gen de interés". Si el gen de interés se administra en la forma de un vector de expresión, tal como un vector de ADN, la respuesta inmunitaria se provocará cuando los genes codificados por el vector se expresan en el hospedero.

Una "vacuna" como se refiere en la presente, es una preparación que se usa para mejorar la inmunidad a una enfermedad particular. Una vacuna puede comprender uno o más antígenos derivados de un patógeno que cuando se administra a un sujeto que necesita del mismo, provocará una respuesta inmunitaria a uno o más antígenos, de tal modo que induce una inmunidad en el sujeto al proporcionar protección hacia una infección "real" posterior con el patógeno en cuestión. Las vacunas pueden ser profilácticas, por ejemplo, prevenir o disminuir los efectos de una infección futura por cualquier patógeno natural, o que pueden actuar terapéuticamente cuando la infección ya está presente. En el contexto de la presente invención, la replicasa alfavírica o el vector de expresión que codifica la replicasa alfavírica se pretende que se use como un adyuvante para modular la respuesta inmunitaria junto con ambas una vacuna preventiva y/o una vacuna terapéutica. Las vacunas pueden ser microorganismos muertos o inactivados o productos purificados derivados de ellos. En general, hay cuatro tipos de vacunas tradicionales. Estas son vacunas que contienen microorganismos muertos que son microorganismos previamente virulentos, microorganismos de virus atenuado vivo, toxoides que son compuestos tóxicos inactivados, o subunidades del microorganismo atenuado o inactivado. Una vacuna puede estar en la forma de una proteína, o puede ser indirecta en la forma de . un vector de expresión del cual uno o más antígenos se expresan de tal modo que inducen una respuesta inmunitaria en un sujeto. En una composición de vacuna como se describe en la presente, cualquier vacuna, ejemplos de los cuales se proporcionan en lo anterior, se pueden administrar junto con el adyuvante de acuerdo con la invención. Por lo tanto, en el contexto presente, una "vacuna" se refiere a cualquier entidad que comprende uno o más antígenos o que codifica uno o más genes de interés, y que cuando se administran generarán una respuesta inmunitaria como se explica en la presente. Una "vacuna" puede también comprender componentes adicionales que ayudan en la administración a un sujeto que necesita del mismo, tal como un constituyente y/o excipiente, ejemplos de los cuales se dan en la presente.

Un "adyuvante" como se refiere en la presente, se puede definir como un agente inmunológico que puede activar el sistema inmunitario innato y modificar el efecto de otros agentes, tal como una vacuna. Un adyuvante es un agente que puede estimular el sistema inmunitario e incrementar la respuesta a una vacuna, al proporcionar una respuesta inmunológica más fuerte y más eficiente al sujeto que ha sido vacunado, que cuando la vacuna se administra por sí mismo. Por lo tanto, los adyuvantes se usan frecuentemente para incrementar o de cualquier otra forma influenciar el efecto de una vacuna por ejemplo estimulando el sistema inmunitario para responder a la vacuna más vigorosamente, así proporcionando inmunidad incrementada a una enfermedad en particular. Los adyuvantes pueden realizar esta tarea al imitar conjuntos específicos de moléculas conservadas evolutivamente. Los ejemplos de tales moléculas son liposomas, lipopolisacárido (LPS) , componentes de pared celular bacterial, ARN de hebra doble (dsAR ) , ADN de hebra sencilla (ssADN) , y ADN que contiene dinucleótido CpG no metilado etc. La presencia de un adyuvante en conjunto con la vacuna puede incrementar en gran medida la respuesta inmunitaria innata al antígeno al imitar una infección natural. Cuando un "adyuvante" se refiere en la presente, que se pretende es una replicasa alfavírica o un vector de expresión que codifica una replicasa alfavírica con polimerasa de ARN dependiente de actividad de ARN como se describe en la presente, que proporciona la función de adyuvante. El adyuvante puede también ser un vector de expresión, , tal como un vector de ADN, que proporciona la expresión de una replicasa alfavírica que comprende la polimerasa de ARN dependiente de actividad de ARN. Por lo tanto, la replicasa alfavírica se puede administrar como es, o se puede administrar en la forma de un vector de expresión, del cual la replicasa alfavírica se expresa proporcionando la función de adyuvante. Una composición de vacuna como se refiere en la presente, puede en algunas modalidades comprender más de una entidad de vacuna, tal como en la forma de uno o más vectores de expresión, que codifican uno o más genes de interés, o proporcionando uno o más antígenos siendo por ejemplo, una vacuna basada en proteína, de tal modo al proporcionar un cóctel de vacunas para administrarse al paciente que necesita del mismo.

Por "modular el sistema inmunitario" , "modular la respuesta inmunitaria" , o una "actividad de modulación de sistema inmunitario" significa las acciones o actividades que se proporcionan por el adyuvante, como se define en la presente, y que los efectos se explican además con el término adyuvante en lo anterior. Esto puede ser por ejemplo en la forma de estimular el sistema inmunitario para responder a la vacuna más vigorosamente y/o proporcionar inmunidad incrementada a una enfermedad particular. El adyuvante de acuerdo con la invención se caracteriza por que esto cuando se administra junto con una vacuna proporcionará una respuesta incrementada al antígeno que se administra en la forma de una vacuna, que cuando la vacuna se administra por sí sola sin el adyuvante.

Un "cásete de expresión" como se describe en la presente, comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más genes o que codifica secuencias opcionalmente acompañadas por diversas secuencias reguladoras para regular la expresión de los genes. Estos genes pueden formar parte de una vacuna que codifica diversos antígenos que cuando expresados generarán una respuesta inmunitaria en el hospedero.

Una "mutación" como se refiere en la presente, constituye una eliminación, sustitución, inserción y/o mutación de punto específica que se ha realizado en una secuencia de ácido nucleico para cambiar el desempeño de la función de adyuvante de acuerdo con la invención. Las mutaciones específicas introducidas en la replicasa para mejorar las propiedades de adyuvante del mismo de acuerdo a la presente invención se ejemplifican además en la presente.

Un "promotor", es una región reguladora ubicada ascendente hacia la región 3' de la hebra anti-sentido de un gen, al proporcionar un punto de control para transcripción de gen regulada. El promotor contiene secuencias de ADN específicas, también llamadas elementos de respuesta que se reconocen por factores de transcripción que enlazan a las secuencias de promotor que reclutan polimerasa de ARN, la enzima que sintetiza el ARN de la región de codificación del gen.

En el contexto presente, cuando una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácido "esencialmente corresponde a" un cierto ácido nucleico o secuencia de aminoácido, esto se refiere a una secuencia que tiene desde 90% de identidad con la secuencia mencionada, tal como alrededor de 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 99 o cerca de 100% de identidad con la secuencia presente. Por supuesto, en algunas modalidades el ácido nucleico o secuencia de aminoácido también consiste de la secuencia especificada.

Los presentes inventores describen por primera vez que una replicasa alfavírica, que lleva . actividad de polimerasa de ARN dependiente del AR (RdRp) funcional, es capaz de provocar un sistema inmunitario que modula el efecto, esto es, para actuar como un adyuvante modulador del sistema inmunitario, cuando se administra solo sin la necesidad de ninguna proteínas víricas no estructurales o structurales adicionales o secuencias de ácido nucleico genómico para proporcionar este efecto.

En la presente se muestra por primera vez que una replicasa alfavírica que comprende un RdRp funcional administrado solo a las células es capaz de inducir inducción de interferones tipo I, que activan la inmunidad innata y mejoran la calidad y eficacia de las respuestas inmunitaria celulares y humorales adaptativas. Se prevé que la replicasa alfavírica con el RdRp funcional se puede principalmente usar como adyuvante modulador del sistema inmunitario en combinación con cualquier tipo de vacuna o antígeno.

Por otra parte, se muestra que la función de la replicasa alfavírica como an adyuvante modulador del sistema inmunitario se podría además mejorarse al introducir mutaciones específicas en una región de la replicasa definida como la señal de localización nuclear de la subunidad nSP2 (Rikkonen et al 1992) .

Es importante notar que ningún ARN de plantilla vírica específico que contiene señales cis para interacción con el RdRp de la replicasa se necesita para su actividad como un adyuvante modulador del sistema inmunitario, que significa que, sin querer limitarse por la teoría, el RdRp puede usar algún ARN celular como una plantilla para iniciar la síntesis de los intermediarios de replicación de ARN en el citoplasma de la célula. Esto es un gran avance que se proporciona para un enfoque novedoso para construir un adyuvante, solamente haciéndolo necesario para administrar una replicasa alfavírica, por ejemplo, en la forma de una proteína o codificada por un vector de expresión, tal como un vector de ADN, son ninguna de otras partes del virus, para obtener una activación de la respuesta inmunitaria.

En consecuencia, en un primer aspecto la presente invención se refiere a una replicasa alfavírica que comprende una polimerasa de ARN dependiente de ARN, para usar como un adyuvante para modular el sistema inmunitario. Se debe entender que en la presente, siempre que se refiera a una replicasa alfavírica que comprende una polimerasa de ARN dependiente de ARN para uso como un adyuvante para modular el sistema inmunitario en la presente, cualquiera de la modalidad, también se refiere al uso de una replicasa alfavírica que comprende una polimerasa de ARN dependiente de ARN para la fabricación de un adyuvante para modular la respuesta inmunitaria. Por lo tanto, en consecuencia, la presente invención también en un aspecto similar se refiere al uso de una replicasa alfavírica que comprende polimerasa de ARN dependiente de ARN, tal como en la forma de un vector de expresión, para la fabricación de un adyuvante para modular la respuesta inmunitaria.

En un aspecto preferido de la invención, el alfavirus es el virus del Bosque Semliki. Se debe entender que en la presente, siempre que una replicasa se refiere a, siempre se comprende la opción de la replicasa que es una replicasa de SFV. En una modalidad, la secuencia de aminoácido de la replicasa del virus del Bosque Semliki esencialmente corresponde a SEQ ID NO 1, que es adecuado para usar como un adyuvante para modular el sistema inmunitario. La secuencia de aminoácido de la replicasa del virus del Bosque Semliki puede también consistir de la secuencia que corresponde a SEQ ID NO 1, o de las secuencias que corresponden a las replicasas mutantes . En una modalidad preferida, la replicasa se muta en la región nSP2 que genera el RRR>RDR mutante en las posiciones 1185-1187 de la SEQ ID NO 1, que es adecuada para usar como un adyuvante para modular el sistema inmunitario. Esta secuencia mutada corresponde a la secuencia de aminoácido proporcionada en la SEQ ID NO 2 , y se abarca también por la presente invención para usar como un adyuvante para modular la respuesta inmunitaria. En otra modalidad preferida, la replicasa se muta en la región nSP2 que genera el RRR>AAA mutante en las posiciones 1185-1187 de la SEQ ID NO 1, que son también adecuadas para usar como un adyuvante para modular el sistema inmunitario. Esta secuencia mutada corresponda a la secuencia de aminoácido como se proporciona en la SEQ ID NO 3 y se abarca también por la presente invención para usar como un adyuvante para modular la respuesta inmunitaria. La invención por supuesto también se refiere a un vector de expresión que codifica una replicasa como se define en cualquier modalidad en la presente, para usar como un adyuvante para modular la respuesta inmunitaria. La replicasa, ya sea en la forma de un péptido y/o una proteína, y/o codificada por un vector de expresión, se puede formular, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o constituyente, los ejemplos de los cuales se dan en la presente. En aún otra modalidad, una mezcla de ambas o cualquiera de - las replicasas mutadas como se menciona en la presente y/o junto con la replicasa tipo natural, opcionalmente expresada por uno o más vectores de expresión se usa como un adyuvante para modular la respuesta inmunitaria .

Es importante notar que los presentes inventores han descubierto por primera vez que una replicasa alfavírica, sin la presencia de ninguno de los antígenos víricos adicionales, puede en sí mismo actuar como un adyuvante modulador del sistema inmunitario. Por ejemplo, cuando en la forma de un vector de expresión, el vector de expresión cuando se expresa puede causar en sistema inmunitario que modula el efecto en un sujeto aún en la ausencia de la administración simultánea de secuencias de ácido nucleico adicional que codifica un antígeno heterólogo o cualquier otra de las secuencias de cido nucleico alfavíricas. Para proporcionar este efecto, se ha mostrado que la actividad RdRp de la replicasa es crucial así como la capacidad de la replicasa para proceder al compartimiento correcto en el citoplasma celular, esto es, el procedimiento de compartimentación de la replicasa, que se describe además abajo.

Sin desear limitarse por la teoría, cuando el adyuvante se administra en la forma de un vector de expresión, la replicasa parece activarse para expresión en el núcleo de la célula de las células transíectadas del tejido objetivo. Se prevé además que sobre la transcripción del vector de expresión, el mARN que codifica la replicasa se transporta al citoplasma, donde se traduce en la proteína de replicasa que posee actividad de polimerasa de ARN dependiente de ARN citoplásmico . Esta enzima se compartimenta a los compartimentos citoplásmicos específicos, donde la actividad de polimerasa de ARN dependiente de ARN genera moléculas efectoras, que incluyen, pero posiblemente no limitan a, ARN de hebra doble, dentro del citoplasma celular, que provoca una respuesta antivírica celular masiva, fuerte y duradera, incluyendo la inducción de expresión de interferones tipo I.

Este tipo de inducción de la respuesta antivírica es universal, independiente de la especie y activa ambas respuestas inmunitarias humorales y mediadas por la célula.

En consecuencia, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un vector de expresión que codifica una replicasa alfavírica, tal como replicasa SFV, como se define en la presente, preferiblemente un vector de ADN, tal como un vector de expresión de ADN plásmido, el cual en una modalidad es pRSV-Nspl234 , que corresponde esencialmente a la secuencia como se describe en la SEQ ID NO 5, para usar como un adyuvante para modular el sistema inmunitario. La secuencia de ácido nucleico de la replicasa del virus del Bosque Semliki puede también consistir de la secuencia que corresponde a SEQ ID NO 5, o de las secuencias que •corresponden a las replicasas mutantes. En algunas modalidades, la replicasa codificada por el vector de expresión se muta en la región nSP2. Como una referencia general, la región nSP2 de una replicasa SFV (SEQ ID NO 1) se ubica aproximadamente en posiciones de aminoácidos 538-1336 de la SEQ ID NO 1. En una modalidad, el vector de expresión codifica una replicasa que se muta en la región nSP2 que genera el RRR>RDR mutante en las posiciones 1185-1187 de la SEQ ID NO 1, que es adecuada para usar como un adyuvante para modular el sistema inmunitario. En una modalidad, el vector de expresión se codifica por la secuencia que corresponde esencialmente a la SEQ ID NO 4, pero en donde una mutación se ha introducido en las posiciones 4129-4131 de esta secuencia, tal como en una modalidad la mutación CGG a GAC, para usar como un adyuvante para modular la respuesta inmunitaria . La secuencia de ácido nucleico de la replicasa del Virus del Bosque Semliki puede también consistir de la secuencia que corresponde a la SEQ ID NO 4, pero en donde una mutación se ha introducido en posiciones 4129-4131 de esta secuencia, tal como en una modalidad la mutación CGG a GAC. En otra modalidad, el vector de expresión codifica una replicasa que se muta en la región nSP2 que genera el RRR>AAA mutante en las posiciones 1185-1187 de la SEQ ID NO 1, que se usa como un adyuvante para modular el sistema inmunitario. En una modalidad, el vector de expresión se codifica por la secuencia que corresponde esencialmente a la SEQ ID NO 4, pero en donde una mutación se ha introducido en las posiciones 4126-4133 de esta secuencia, tal como en una modalidad la mutación CGGCGGAG a GCCGCCGC, para usar como un adyuvante para modular la respuesta inmunitaria. La secuencia de ácido nucleico de la replicasa del SFV puede también consistir de la secuencia que corresponde a la SEQ ID NO 4, pero en donde una mutación se ha introducido en las posiciones 4126-4133 de esta secuencia, tal como en una modalidad la mutación CGGCGGAG a GCCGCCGC. Esto significa que en las respectivas secuencias de aminoácido, la secuencia de aminoácido tipo natural se ha alterado de RRR a RDR y AAA, respectivamente, en las posiciones 1185-1187 en la SEQ ID NO 1. El vector de expresión, mutado o no, puede en una modalidad preferida ser un vector de ADN. El vector puede también ser un vector de expresión viral, tal como un vector adenoviral o un vector basado en virus de herpes o cualquier otro vector de expresión viral, útil. En una modalidad, el vector de expresión es un vector basado en ARN. En aún otra modalidad, el adyuvante se administra en la forma de mARN de replicasa alfavírica. En una modalidad, la invención se refiere a un vector de expresión de ADN plásmido de replicasa alfavírica que es pRSV-AAA, que corresponde esencialmente a la secuencia de ácido nucleico descrita en la SEQ ID NO 5, en donde las posiciones 5126-5133 se han mutado de CGGCGGAG a GCCGCCGC, -para usar como un adyuvante para modular el sistema inmunitario. En otra modalidad, la invención se refiere a un vector de expresión de ADN plásmido alfavírico que es pRSV-RDR, que corresponde esencialmente a la SEQ ID NO 5, en donde las posiciones 5129-5131 se han mutado de CGG a GAC, para usar como un adyuvante para modular el sistema inmunitario. La secuencia de ácido nucleico de la replicasa del Virus del Bosque Semliki puede también consistir de la secuencia que corresponde a la SEQ ID NO 5, o de las secuencias que corresponden a las replicasas mutantes mencionadas anteriormente.

Como se entiende por la persona experta, un vector de expresión de acuerdo a la invención que codifica la replicasa para usar como un adyuvante para modular el sistema inmunitario puede por supuesto también comprender componentes comúnmente usados adicionales que ayudan en la expresión del vector, tal como diversas secuencias reguladoras en la forma de promotores, aumentadores , etc. El vector de expresión que codifica una replicasa como se define en la presente para usar como un adyuvante para modular el sistema inmunitario puede también comprender un origen de replicación y/o un marcador de selección, tal como un marcador de selección antibiótico o un sistema de selección basado sobre el gen araD, como está previsto por los propios solicitantes la solicitud publicada como WO2005/026364. Tal sistema de selección como se describe en la WO2005/026364 comprende una célula bacteriana deficiente de un gen araD en el cual un vector que lleva un gen araD, preferiblemente un gen araD bacterial, tal como un gen araD de E coli, una secuencia complementaria del mismo, o un fragmento catalíticamente activo del - mismo se ha agregado como un marcador de selección. El gen araD codifica una 4-epimerasa de L-ribulosa-5-fosfato (EC 5.1.3.4.).

Como se demuestra en la sección experimental, la expresión de las formas mutadas de la replicasa, también actúa como adyuvantes de modulación del sistema inmunitario.

Por otra parte, las mutaciones pueden modular la actividad de adyuvante de la replicasa el imitante RDR ha aumentado la capacidad de inducción IFN de tipo I comparado con expresión de replicasa tn (tipo natural) (Ejemplo 2) . La replicasa con la mutación RRR>AAA actúa como un adyuvante modulador del sistema inmunitario similarmente a la replicasa tipo natural (Ejemplo 2) . También se demuestra en la sección experimental que la transfección de las células de ratón y de humano diferentes con vectores de expresión basados en replicasa solo inducen la activación de producción de interferón tipo I (Ejemplo 2) .

Los resultados descritos en la sección experimental claramente demuestran que la actividad de polimerasa de ARN (RdRp) dependiente de ARN de la replicasa es absolutamente necesaria para la actividad de modulación inmunitaria. La porción GDD de firma de polimerasas de ARN virales se ubica en la región de nsp4 de la replicasa alfavírica en donde la actividad enzimática RdRp se ubica. La mutación GDD>GAA en esta porción destruye la actividad RdRp (Tomar et al 2006) . La introducción de la mutación GDD>GAA en la replicasa suprime completamente la inducción de la respuesta de interferón de Tipo I (Ejemplo 2), de tal modo demostrando la necesidad de la actividad RdRp para el efecto de modulación del sistema inmunitario.

Los datos experimentales también muestran que la expresión de replicasas con una actividad RdRp funcional pero no las replicasas con la mutación GDD>GAA resultan en la acumulación del dsRNA en el citoplasma de las células transíectadas . Sin desear limitarse por la teoría, estos resultados ndican que la actividad que modula el sistema inmunitario de la replicasa puede al menos parcialmente mediarse por la trayectoria de reconocimiento de dsAR , en donde la replicasa produce dsRNA a partir de ARN endógeno en el citoplasma. Sin embargo, no se excluye que otras trayectorias (por ejemplo, por medio de reconocimiento de ARN destapado) se impliquen. En algunos casos, la inducción de la respuesta IFN tipo I se observó sin indicación de acumulación de dsARN en citoplasma (Ejemplo 3) .

Además, diferentes patrones cinéticos se observaron cuando la respuesta IFN se indujo por la expresión de replicasa SFV comparados con la inducción por transfección de dsARN sintético (poli I:C). En los experiementos con las transíecciones de vector de expresión de replicasa, el nivel de IFN se incrementó durante los primeros días después de la transfección. En contraste, el nivel IFN muestra el valor máximo en el primer punto de tiempo (24h) después' de la transfección con dsARN sintético, y disminuye posteriormente (Ejemplo 2) .

Los datos inmunológicos presentados en la sección experimental claramente demuestran que la co-administración de la vacuna de ADN de antígeno MultiVIH (Blazevic et al 20?6) junto con el vector de expresión que codifica la replicasa, en este caso la replicasa SFV, significativamente aumentan cuantitativamente la respuesta inmunitaria mediada por la célula si se compara con la inmunización con solo la vacuna de ADN (medida por los ensayos ELISPOT) (Figura 6) . Además, los valores fueron claramente mayores en el caso con la replicasa con la mutación RRR>RDR que la replicasa tipo natural (Ejemplo 4). Así, los datos inmunológicos correlacionados con los resultados de inducción de respuesta IFN: ningún efecto positivo a la inmunidad mediada por célula se observó si la replicasa con mutación de actividad RdRp (GDD>GAA) destruida se co-administró con la vacuna de ADN. Esto claramente muestra la importancia de la actividad RdRp para proporcionar el efecto adyuvante de acuerdo con la invención.

El accionar de respuestas inmunitarias innatas, como respuesta tipo IFN por infección SFV, es bien conocido en la técnica. También se ha visto que la actividad de modulación inmunitaria de los virus alfa se pueden ajustar al introducir mutacións en la región nSP2 del polipéptido no estructural de la replicasa. La infección de fibroblastos de ratón primarios con SFV (Virus del Bosque Semliki) que tunía mutación RRR>RDR de punto sencillo en nsP2 NLS, resultando en expresión incrementada de IFN tipo I y el TNF- de citocina proinflamatoria en células infectadas por virus, si se compara con infección wt SFV (Breakwell et al. 2007) . Sin embargo se debe señalar que en Breakwell et al., las células se infectaron con partículas de virus completo que resultan en suministro, expresión y replicación del genoma vírico completo, y, de tal modo generando la respuesta IFN.

Sin embargo, diferentemente de la técnica, la presente invención ha demostrado que la inducción de respuesta IFN no se enlaza a infección viral y replicación de genoma vírico por sí mismo, pero también se puede obtener por la expresión de la poliproteína no estructural viral, esto es, la replicasa, sola sin incluir el genoma vírico, las partículas víricas o proteínas estructurales. Por otra parte, se demuestra que la replicasa SFV se puede expresar de cADN optimizado de codón que tiene homología baja con ácidos nucleicos naturales de SFV y todavía proporciona el efecto adyuvante. Un ejemplo de tal secuencia optimizada por codón se proporciona en la SEQ ID NO: 4. Cuando se expresa, la SEQ ID NO : 4 proporciona para la secuencia de aminoácido como se describe en la SEQ ID NO : 1.

Es de entenderse que el ácido nucleico y secuencias de aminoácido como se refiere en la presente que forman parte de la presente invención también comprenden ácido nucleico y secuencias de aminoácido con aproximadamente 90% de identidad a estas secuencias, tal como 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99% de identidad con la secuencias. Esto significa que la secuencias pueden ser más cortas o más largas o tener la misma longitud como las secuencias descritas en la presente, pero en donde algunas posiciones en la secuencia de ácido nucleico o la secuencia de aminoácido se han alterado en una manera adecuada. Sin embargo, cuando una replicasa alfavírica mutada se usa, la secuencia mutada siempre estará presente y por lo tanto se excluirá cuando determina la identidad de una secuencia con la secuencia específica descrita en la presente. La secuencia usada en la presente invención se puede por lo tanto alterar en cualquier forma adecuada para el propósito pretendido, tal como por la introducción, cambio y/o eliminación de un ácido nucleico específico en la secuencia de ácido nucleico, o un aminoácido en la secuencia de aminoácido. Es importante notar que aún si la secuencia se altera, la actividad de polimerasa de ARN dependiente de ARN de la replicasa expresada del vector de expresión permanece.

En algunas modalidades de la presente invención, el adyuvante como se define en la presente, para usar como un adyuvante para modular el sistema inmunitario, se formula junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o constituyente. Tal excipiente farmacéuticamente aceptable y/o constituyente se puede elegir de cualquier fuente adecuada. Los ejemplos de excipientes farmacéuticos son líquidos, tal cómo agua o un aceite, incluyendo aquellos de origen de petróleo, animal, vegetal, o sintético, tal como aceite de cacahuete, aceite de soya, aceite mineral, aceite de ajonjolí y similares. Los excipientes farmacéuticos pueden ser solución salina, goma acacia, gelatina, pasta de almidón, talco, queratina, sílice coloidal, urea y similares. Además, se pueden usar agentes auxiliares, estabilizadores, espesantes, lubricantes, y colorantes. En una modalidad, los excipientes farmacéuticamente aceptables son estériles cuando se administra a un animal. Las soluciones salinas y dextrosa acuosa y soluciones de glicerol se pueden también emplear como excipientes líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados también incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, gis, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Una composición con el adyuvante puede, si se desea, también contener menores cantidades de agentes humectantes o emulsificantes , o agentes amortiguadores de pH . Las composiciones presentes pueden también tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsión, comprimidos, pildoras, pastillas, cápsulas, cápsulas que contienen líquidos, polvos, formulaciones de liberación sostenida, supositorios, emulsiones, aerosoles, rociadores, suspensiones, o cualquier otra forma adecuada para usar. En una modalidad, la composición es en la forma de una cápsula. Otros ejemplos de excipientes farmacéuticos adecuados se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 1447-1676 (Alfonso R. Gennaro ed, 19th ed. 1995) . En una modalidad, el adyuvante de acuerdo con la invención se formula de acuerdo con procedimientos de rutina como una composición adaptada para administración oral a los seres humanos. Las composiciones para suministro oral pueden ser en la forma de comprimidos, pastillas, suspensiones acuosas y aceitosas, gránulos, polvos, emulsiones, cápsulas, jarabes, o elixires, por ejemplo. Las composiciones orales pueden incluir excipientes estándar tales como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, y carbonato de magnesio. En una modalidad, los excipientes son de grado farmacéutico. En otra modalidad preferida, el adyuvante se puede formular para administración intravenosa. Típicamente, las composiciones para administración intravenosa comprenden solución amortiguadora acuosa isotónica estéril. En caso necesario, las composiciones pueden también incluir un agente de solubilización.

Los métodos de administración del vector de expresión de acuerdo a la invención comprenden, pero no se limitan a, intradermal, intramuscular, intraperitoneal , intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural, oral, sublingual, intracerebral , intravaginal , transdermal, rectal, por inhalación, o tópica, particularmente a los oídos, nariz, ojos, o piel. El modo de administración se puede dejar a la discreción del médico. En una modalidad especialmente preferida, el adyuvante de acuerdo a la invención, opcionalmente en combinación con una vacuna adecuada, se administra a un paciente que necesita del mismo por una metodología de Pistola de Gen (Klein et al 1992) , por inyecciones combinadas con electroporación ( "electroporation-mediated DNA drug delivery" ; intradermal o intramuscular) , por administración tópica en las superficies de mucosas (por ejemplo, en la forma de rocío intranasal) . El adyuvante genético se puede también combinar con adyuvantes de suministro específico, que facilita la absorción de ADN de plásmido por células (por ejemplo, polietilenimida y otro similar) .

La electroporación (EP) utiliza la aplicación in vivo de los campos eléctricos para aumentar el suministro intracelular de agentes de interés en una región específica de tejido. La técnica de suministro de EP depende de la propagación de campos eléctricos de nivel de umbral en todo el sitio de tejido objetivo después de que el agente de interés se ha distribuido dentro del espacio intersticial del tejido. Esta "co-localización" espacial y temporal de los campos eléctricos y agente terapéutico en el tejido objetivo es un requisito crítico para alcanzar suministro de ADN efectivo.

La electroporación se ha demostrado que es efectiva en ambas células procarióticas y eucarióticas y es capaz de introducir ADN, grandes macromoléculas (por ejemplo, anticuerpos) , proteínas, colorantes, precursores metabólicos (por ejemplo, 32P-ATP) , y fármacos no permeables y metabolitos en células con alta eficacia. (De Lise et al, Developmental Biology Protocols; Jan 21; 2000).

En un aspecto de la presente invención, el adyuvante se puede administrar opcionalmente junto con la vacuna de elección en una composición de vacuna como una primera inmunización al paciente que necesita del mismo. Algunos resultados proporcionados por los presentes inventores han mostrado que tal modo de administración del adyuvante puede proporcionar una respuesta inmunitaria mejorada con respecto a cuando el adyuvante se administra junto con la vacuna en la segunda ronda de inmunización (ver Figura 8 y 9) . Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención se refiere a un método para administrar una composición de vacuna como se define en la presente, la composición de vacuna que comprende un adyuvante como se define en la presente, en donde el adyuvante se administra como parte de la composición de vacuna en la primera inmunización del paciente que necesita del tratamiento. Opcionalmente la co-administración del adyuvante con la vacuna en una composición de vacuna se realiza solamente con la primera dosis de inmunización, esto es, no se administra adyuvante si las dosis adicionales de la vacuna se administran en una etapa posterior al individuo que necesita del mismo.

Por lo tanto, aún otro aspecto de la presente invención se refiere a una replicasa alfavírica, la replicasa que comprende una polimerasa de ARN dependiente de ARN, para usar en una composición de vacuna a administrarse como una primera dosis de inmunización. En consecuencia, en un aspecto la presente invención se refiere a un método para administrar un adyuvante en una composición de vacuna como se define en la presente, el adyuvante que comprende una replicasa alfavírica, la replicasa que comprende una polimerasa de ARN dependiente de ARN, en donde la administración del adyuvante se realiza con la primera dosis de inmunización de la composición de vacuna a un paciente que necesita del mismo. En el contexto presente, la "primera dosis de inmunización" se refiere a cuando la vacuna que comprende uno o más antígenos se administra al paciente que necesita del mismo por primera vez, posteriormente provocando una respuesta inmunitaria a la vacuna (esto es, uno o más antígenos administrados con ellos) . En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de una replicasa alfavírica, la replicasa que comprende una polimerasa de ARN dependiente de ARN en la fabricación de una composición de vacuna en donde el adyuvante es para administrarse con la primera dosis de inmunizació .

Sin embargo se debe notar que la presente invención no se limita al modo de administración mencionado en lo anterior, esto es, para administrarse (solamente opcionalmente) con la primera dosis de inmunización, y también puede ser así para que el médico experto encontrará métodos de administración alternativos adicionales que funcionarán en una manera similar e igualmente preferida.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de una replicasa alfavírica, o un vector de expresión que codifica una replicasa alfavírica, la replicasa que comprende una polimerasa de ARN dependiente de ARN, como un adyuvante para modular el sistema inmunitario. En una modalidad, el virus alfa es el virus del Bosque Semliki. En aún otra modalidad, la replicasa usada como un adyuvante para modular el sistema inmunitario corresponde a la secuencia de aminoácido esencialmente como se describe en la SEQ ID NO : 1. La secuencia de aminoácido de la replicasa del virus del Bosque Semliki puede también consistir de la secuencia que corresponde a la SEQ ID N0:1, o de las secuencias que corresponden a las replicasas mutantes. En otra modalidad preferida, la invención se refiere al uso de una replicasa alfavírica, la replicasa que comprende una polimerasa de ARN dependiente de ARN, como un adyuvante para modular el sistema inmunitario, en donde la replicasa se muta en la región nSP2 que genera el RRR>RDR mutante en las posiciones 1185-1187 de la SEQ ID N0:1, representada por la SEQ ID NO: 2. En otra modalidad preferida, la replicasa se muta en la región nSP2 que genera el RRR>AAA mutante en las posiciones 1185-1187 de la SEQ ID NO 1, representadas por la SEQ ID NO 2. En algunas modalidades, la replicasa definida como ta se codifica por un vector de expresión, que en algunas modalidades es un vector de ADN. Opcionalmente , la replicasa se puede formular junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o constituyente.

Como se demuestra en el ejemplo 5, la replicasa con la mutación RRR>RDR también aumenta la cantidad de respuesta de anticuerpo evocada por inmunización con vacuna de ADN que expresa los antígenos de influenza. Los datos experimentales muestran que los niveles de anticuerpo fueron más altos en los casos cuando la unidad de replicasa SFV se co-administra con vacuna de ADN de influenza, dando aún mayores valores que vector de expresión GM-CSF de adyuvante bien definido cuando se co-administra con la vacuna vector.

En aún otro aspecto preferido, la invención se refiere al uso de una replicasa alfavírica, que es ya sea tipo natural, optimizada por codón o mutada, tal como con un RDR o una mutación AAA como además se define en la presente, o un vector de expresión, tal como un vector de ADN, que codifica una replicasa alfavírica como se define en la presente, la replicasa que comprende una polimerasa de AR dependiente de AR , como un adyuvante para modular la respuesta inmunitaria cuando se presenta en una composición de vacuna, para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad infecciosa. La presente invención también se refiere al uso de una replicasa alfavírica, como se define en la presente, como un adyuvante, en la fabricación de una composición de vacuna. La composición de vacuna se usa preferiblemente para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad infecciosa. La presente invención también se refiere a una replicasa alfavírica, como se define en la presente que es ya sea tipo natural, optimizada por codón o mutada, tal como con un RDR o una mutación AAA como además se define en la presente, o un vector de expresión que codifica una replicasa alfavírica, la replicasa que comprende una polimerasa de ARN dependiente de ARN, para usar como un adyuvante para modular la respuesta inmunitaria cuando está presente en una composición de vacuna, para la prevención y/o tratamiento de un enfermedad infecciosa. Como se ha establecido previamente en la presente, la replicasa puede corresponder esencialmente a las secuencias de aminoácidos como se describe en las SEQ ID NO 1, 2 o 3. Por otra parte, la replicasa puede consistir de las secuencias como se describe en la SEQ ID NO 1, 2 o 3. En una modalidad, la composición de vacuna, en donde la replicasa alfavírica está presente como un adyuvante, opcionalmente codificada por un vector de expresión, se usa para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad infecciosa. En una modalidad, la composición de vacuna en donde la replicasa alfavírica, opcionalmente codificada por un vector de expresión, está presente como un adyuvante se usa para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad bacteriana. En otra modalidad, la composición de vacuna en donde la replicasa alfavírica, opcionalmente codificada por un vector de expresión, está presente como un adyuvante se usa para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad vírica, cuya enfermedad vírica preferiblemente se causa por VIH (Virus de Inmunodeficiencia Humana, VIH-I, VIH-II), que lleva potencialmente a SIDA. En aún otra modalidad, la composición de vacuna en donde la replicasa alfavírica está presente, opcionalmente codificada por un vector de expresión, como un adyuvante se usa para la prevención y/o tratamiento de cáncer. La vacuna que se administra en combinación con la replicasa al proporcionar las propiedades de adyuvante de la composición puede ser cualquier vacuna adecuada para el propósito presente. En algunas modalidades, la vacuna se basa en proteína, y en otras modalidades la vacuna es un vector de expresión que codifica uno o más antígenos o genes de interés. El vector de expresión puede ser cualquier vector de expresión basado en ácido nucleico adecuado que codifica uno o más genes de interés o antígenos capaces de inducir una respuesta inmunológica específica en un hospedero al cual la composición de vacuna se administra. En una modalidad preferida, el vector de la composición de vacuna se basa en un virus de influenza.

En consecuencia, en un aspecto, la presente invención se refiere a una composición de vacuna que comprende una replicasa alfavírica como se define en cualquiera de las modalidades en la presente al proporcionar un efecto adyuvante, y una vacuna de elección, también como se define en la presente. La vacuna puede opcionalmente ser GTU-MultiVIH (Blazevic V, et al AIDS Res Hum Retroviruses 2006 Jul , 22(7) 667-77). En consecuencia, la vacuna en la composición de vacuna puede en algunos aspectos contener una o más proteínas de VIH estructurales o no estructurales de elección, tal como los antígenos que se describen en la propia publicación del solicitante WO02090558.

La replicasa adyuvante y el antígeno pueden en el contexto de la presente invención codificarse por el mismo vector de expresión, en donde la replicasa proporciona las propiedades de adyuvante y la vacuna parte del vector es una parte independiente separada del vector al proporcionar su función independientemente de la replicasa. A pesar de eso, la replicasa se puede fusionar opcionalmente a cualquier otra secuencia de codificación en cualquier vector de expresión que codifica un antígeno. El vector de expresión que codifica el adyuvante y/o la vacuna pueden en algunas modalidades ser un vector de ADN. Como se entenderá por el experto, la composición de vacuna de acuerdo con la invención puede también comprender más de una unidad de vacuna, lo que significa que un cóctel de diversas vacunas se puede administrar a un sujeto que necesita del mismo junto con el adyuvante de acuerdo con la invención.

En aún otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de una replicasa alfavírica como se define en la presente en una composición de vacuna como un adyuvante para modular la respuesta inmunitaria para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad infecciosa o el uso de una replicasa alfavírica como se define en la presente como un adyuvante para la fabricación de una composición de vacuna, en donde la vacuna que comprende uno o más genes de interés es un vector de expresión que comprende: a. una secuencia de ADN que codifica una proteína de anclaje nuclear operativamente ligada a un promotor heterólogo, la proteína de anclaje nuclear comprende (i) un dominio de enlace de ADN que se enlaza a una secuencia de ADN específica, y (ii) un dominio funcional que enlaza a un componente nuclear, o un equivalente funcional del mismo, y b. una secuencia de enlace de ADN multimerizado para la proteína de anclaje nuclear, en donde el vector carece de un origen de replicación funccional en células de mamífero.

La composición de vacuna como se define en la presente se pueden usar en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad infecciosa, tal como infección de VIH, así como en el tratamiento de una enfermedad bacteriana o cáncer.

La presente invención también se refiere a una replicasa alfavírica como se define en la presente para usar como un adyuvante para modular la respuesta inmunitaria en una composición de vacuna para la prevención y/o tratamiento de un enfermedad infecciosa, en donde la vacuna que comprende uno o más genes de interés es un vector de expresión que comprende a) una secuencia de ADN que codifica una proteína de anclaje nuclear operativamente ligada a un promotor heterólogo, la proteína de anclaje nuclear comprende (i) un dominio de enlace de ADN que se enlaza a una secuencia de ADN específica, y (ii) un dominio funcional que enlaza a un componente nuclear, o un equivalente funcional del mismo, y b) una secuencia de enlace de ADN multimerizado para la proteína de anclaje nuclear, en donde el vector carece de un origen de replicación funcional en células de mamífero.

El término "proteína de anclaje nuclear" se refiere a una proteína, que se enlaza a una secuencia de ADN específica y que es capaz de proporcionar una función de compartimentación nuclear al vector, esto es, a una proteína, que es capaz de anclar o enlazar el vector a un compartimiento nuclear específico En una modalidad, la proteína de anclaje nuclear es la proteína E2 del Virus de Papiloma Bovino Tipo 1. En otra modalidad preferida, parte (i) y/o parte (ii) , esto es, el dominio de enlace de ADN que enlaza a una secuencia de ADN específica y/o el dominio funcional que se enlaza a un componente nuclear, se obtiene de la proteína E2 del Virus de Papiloma de Bovino tipo 1. En una modalidad, la proteína es una proteína recombinante y/o una sintética Un componente nuclear puede por ejemplo ser cromatina mitótica, la matriz nuclear, dominio nuclear 10 (ND10) , o dominio nuclear POD.

Tales vectores que pueden formar parte de las composiciones de vacuna para usar junto con la replicasa adyuvante de acuerdo a la invención se describen además en la propia solicitud de los solicitantes publicada como WO02090558, así como en (Blazevic V, et al. AIDS Res Hum Retroviruses . 2006 Jul ; 22 (7) : 667-77. ) . Se debe notar que estos vectores son sin embargo solamente ejemplos de vectores que se pueden combinar con la replicasa para usar como un adyuvante de acuerdo a la presente invención que forma una composición de vacuna como se describe en la presente. Cualquier vector de expresión adecuado que funciona como una vacuna se puede formular junto con la replicasa para usar como un adyuvante en esto de acuerdo a la invención para producir una composición que generará una respuesta inmunológica más fuerte y más eficiente en el sujeto al cual el vector se administra, que la administración de una vacuna sola. En una modalidad, la presente invención se refiere al uso de una replicasa alfavírica la replicasa que comprende una polimerasa de ARN dependiente de ARN para usar como un adyuvante para modular el sistema inmunitario en una composición de vacuna para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad infecciosa .

Con respecto a las composiciones de vacuna, en donde la replicasa se usa como un adyuvante, cabe señalar que corresponde al médico experto para determinar la dosificación adecuada y las cantidades del adyuvante y/o la vacuna presente en la composición de vacuna para el sujeto que necesita de un tratamiento con el adyuvante como se describe en la presente. En un aspecto preferido, la replicasa que es parte de la composición de vacuna se codifica por un vector de expresión, que preferiblemente es un vector de ADN. La vacuna puede también en algunas modalidades ser un vector de expresión, tal como un vector de ADN, o puede ser una vacuna basada en proteína.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para preparar una composición de vacuna como se describe en la presente que comprende en él una replicasa alfavírica para usar como un adyuvante, que comprende mezclar una cantidad adecuada de la replicasa alfavírica o un vector de expresión que codifica una replicasa alfavírica que comprende una polimerasa de ARN dependiente de ARN con una cantidad adecuada de la vacuna y opcionalmente agregar un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o constituyente. Las cantidades adecuadas de los respectivos ingredientes se pueden determinar por el médico experto; sin embargo ejemplos de algunas dosis preferidas también se dan en la presente.

En aún otro aspecto, la presente invención se refiere a un método que comprende administrar una cantidad adecuada de una composición de vacuna que comprende en él una replicasa alfavírica o un vector de expresión que codifica una replicasa alfavírica para usar como un adyuvante de acuerdo con la presente invención a un sujeto que necesita del mismo. La vía de administración para la composición de vacuna puede ser cualquier vía adecuada como se determina por el médico experto, los ejemplos de los cuales se dan en la presente. Un sujeto que necesita del mismo puede ser cualquier mamífero, tal como un ser humano o un animal .

En aún otro aspecto, la invención se refiere a un método para administrar una replicasa alfavírica que comprende polimerasa de AR dependiente de ARN, opcionalmente codificada por un vector de expresión, como un adyuvante para modular la respuesta inmunitaria a un sujeto que necesita del mismo, el adyuvante que se administra en combinación con una vacuna en una cantidad adecuada, cuando se administra al proporcionar un incremento en la respuesta inmunitaria en el sujeto a quien el adyuvante y la vacuna se le administra en comparación a cuando la vacuna se administra por su propia cuenta.

En aún otro aspecto, la. invención se refiere a una proteína que corresponde esencialmente a la secuencia de aminoácido descrita en la SEQ ID NO: 3. La proteína puede también consistir de la secuencia de aminoácido como se describe en la SEQ ID NO: 3. En aún otro aspecto, la invención se refiere a una proteína que corresponde esencialmente una SEQ ID NO: 1, pero en donde una mutación que genera el cambio en aminoácidos de RRR a AAA se ha realizado en las posiciones 1185-1187 de la SEQ ID NO : 1. La proteína puede también consistir de la secuencia que corresponde a la SEQ ID NO : 1 , pero en donde una mutación que genera el cambio en aminoácidos de RRR a AAA se ha realizado en las posiciones 1185-1187 de la SEQ ID NO: 1. En aún otro aspecto, la invención se refiere a una proteína que corresponde esencialmente a la secuencia de aminoácido como se describe en la SEQ ID N0:3, para usar como un medicamento. En aún otro aspecto, la invención se refiere a una proteína que consiste de la secuencia de aminoácido como se describe en la SEQ ID NO: 3, para usar como un medicamento. En aún otro aspecto, la presente invención se refiere a una proteína que corresponde esencialmente a la secuencia de aminoácido como se describe en la SEQ ID NO: 3, para usar como un adyuvante para modular la respuesta inmunitaria. En aún otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de una proteína que corresponde esencialmente a la secuencia de aminoácido como se describe en la SEQ ID NO: 3, para la fabricación de un adyuvante para modular la respuesta inmunitaria. En aún otro aspecto, la invención se refiere a una proteína codificada por una secuencia de ácido nucleico que corresponde esencialmente a la secuencia como se describe en la SEQ ID NO : 4 , pero en donde una mutación' se ha introducido en posiciones 4126-4133 que cambian CGGCGGAG a GCCGCCGC. En aún otro aspecto, la invención se refiere a una proteína codificada por una secuencia de ácido nucleico que consiste de la secuencia como se describe en la SEQ ID NO: 4, pero en donde una mutación se ha introducido en posiciones 4126-4133 que cambian CGGCGGAG a GCCGCCGC. En aún otro aspecto, la invención también se refiere a una secuencia de ácido nucleico que corresponde esencialmente a la secuencia como se describe en la SEQ ID NO : 4 , pero en donde una mutación se ha introducido en las posiciones 4126-4133 que cambian CGGCGGAG a GCCGCCGC. Por otra parte, la invención también se refiere a una secuencia de ácido nucleico que consiste de la secuencia como se describe en la SEQ ID NO : 4 , pero en donde una mutación se ha introducido en las posiciones 4126-4133 que cambian CGGCGGAG a GCCGCCGC.

En aún otro aspecto, la invención se refiere a un vector de expresión que comprende un cásete de expresión que comprende una secuencia que corresponde esencialmente a la secuencia como se describe en la SEQ ID NO : 4 , pero en donde una mutación se ha introducido en las posiciones 4126-4133 de la SEQ ID NO:4, generando cuando se expresa el RRR>AAA mutante en las posiciones 1185-1187 de la SEQ ID NO : 1 (SEQ ID NO: 3) . En aún otro aspecto, la invención se refiere a un vector de expresión que comprende un cásete de expresión que consiste de una secuencia que corresponde esencialmente a la secuencia como se describe en la SEQ ID NO: 4, pero en donde una mutación se ha introducido en las posiciones 4126-4133 de la SEQ ID N0:4, generando cuando se expresa el RRR>AAA mutante en las posiciones 1185-1187 de la SEQ ID NO : 1 (SEQ ID N0:3). En aún otro aspecto, la invención se refiere a un vector de expresión que comprende un cásete de expresión que comprende una secuencia que corresponde esencialmente a la secuencia como se describe en la SEQ ID NO : 4 , en donde una mutación se ha introducido en las posiciones 4126-4133 de la SEQ ID NO: 4, generando cuando se expresa el RRR>AAA mutante en las posiciones 1185-1187 de la SEQ ID NO: 1, generando cuando se muta la secuencia de aminoácido como se describe en la SEQ ID NO : 3 , para usar como un medicamento.

En aún otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de una replicasa alfavírica, la replicasa que comprende una polimerasa de ARN dependiente de ARN, para la fabricación de un adyuvante para modular el sistema inmunitario. El virus alfa puede opcionalmente ser el virus del Bosque Semliki. En algunos aspectos, la secuencia de aminoácido de la replicasa esencialmente corresponde a SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácido de la replicasa puede también consistir de la secuencia que corresponde a la SEQ ID NO: 1, o de las versiones mutadas de la replicasa mencionada en la presente. En otros aspectos, la replicasa se muta en la región nSP2 que genera el RRR>RDR mutante en las posiciones 1185-1187 de la SEQ ID NO : 1. En aún otro aspecto, la replicasa se muta en la región nSP2 que. genera el RRR>AAA mutante en las posiciones 1185-1187 de la SEQ ID NO : 1.

La presente invención también se refiere al uso de un vector de expresión que codifica una replicasa alfavírica como se define en la presente, para la fabricación de un adyuvante para modular el sistema inmunitario. En algunos aspectos, el vector de expresión es un vector de ADN. La replicasa o el vector de expresión que codifica la replicasa se puede también formular junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o constituyente.

SECCION EXPERIMENTAL Vectores de expresión El pRSV-Nspl234 (SEQ ID NO: 5) es un vector plásmido de 10342 bp que expresa replicasa SFV optimizada por codón (SEQ ID NO: 4) de un promotor RSV LTR. El gen de beta-globina de conejo heterólogo derivado de intrón se introduce en la secuencia de codificación de replicasa.

Características principales: Inicio-Fin Descripción 9933-268 pUCori 437-963 RSV LTR 1001-8869 Secuencia de codificación de replicasa SFV con intrón (SEQ ID NO: 4) 1213-1785 intrón 8878-9090 bgh pA 9204-9899 marcador de selección araD El pRSV-AAA es idéntico a pRSV-Nspl234 (SEQ ID NO: 5) pero contiene la mutación RRR hasta AAA en la aa 1185-1187 de SEQ ID NO: 1: la secuencia de nucleótido en las posiciones 5126-5133 se muta de CGGCGGAG hasta GCCGCCGC .

El pRSV-RDR es idéntico a pRSV-Nspl234 (SEQ ID NO: 5) pero contiene la mutación RRR hasta RDR en la aa 1185-1187 de SEQ ID NO: 1: la secuencia de nucleótido en las posiciones 5129-5131 se muta de CGG hasta GAC.

El pRSV-GAA es idéntico a pRSV-Nspl234 (SEQ ID NO: 5) pero contiene la mutación GDD hasta GAA en la aa 2283-2285 de SEQ ID NO : 1: la secuencia de nucleótido en las posiciones 8424-8427 se muta de ACGA hasta CCGC .

El pRSV-AAA-GAA es idéntico a pRSV-Nspl234 (SEQ ID NO: 5) pero contiene la mutación RRR hasta AAA en la aa 1185-1187 de SEQ ID NO: 1: la secuencia de nucleótido en las posiciones 5126-5133 se muta CGGCGGAG hasta GCCGCCGC; y mutación GDD hasta GAA en la aa 2283-2285 de Nspl234 : la secuencia de nucleótido en las posiciones 8424-8427 se muta de ACGA hasta CCGC.

El pRSV-RDR-GAA es idéntico a pRSV-Nspl234 (SEQ ID NO: 5) pero contiene la mutación RRR hasta RDR en la aa 1185-1187 de SEQ ID NO: 1: la secuencia de nucleótido en las posiciones 5129-5131 se muta de CGG hasta GAC; y mutación GDD hasta GAA en la aa 2283-2285 de Nspl234 : la secuencia de nucleótido en las posiciones 8424-8427 se muta de ACGA hasta CCGC.

El phelF4Al-Nspl234 (SEQ ID NO: 6) es un vector plásmido de 10248 bp que expresa replicasa SFV optimizada por codón (SEQ ID NO: 4) de promotor elF4Al humano. El gen beta-globina de conejo heterólogo derivado de intrón se introduce en la secuencia de codificación de replicasa.

Características principales: Inicio-Fin Descripción 9839-268 pUCori 367-894 promotor helF4Al 907-8775 Secuencia de codificación de replicasa SFV con intrón (SEQ ID NO:4) 1119-1691 intrón 8784-8996 bgh pA 9110-9805 marcador de selección araD El phelF4Al -AAA es idéntico a phelF4Al -Nspl234 (SEQ ID NO: 6) pero contiene la mutación RRR hasta AAA en la aa 1185-1187 de SEQ ID NO: 1: la secuencia de nucleótido en las posiciones 5032-5039 se muta de CGGCGGAG gasta GCCGCCGC .

El phelF4Al-RDR es idéntico a phelF4Al-Nspl234 (SEQ ID NO: 6) pero contiene la mutación RRR hasta RDR en la aa 1185-1187 de SEQ ID NO: 1: la secuencia de nucleótido en las posiciones 5035-5037 se muta de CGG hasta GAC.

El phEFlaHTLV-Nspl234 (SEQ ID NO : 7) es vector plásmido de 10258 bp que expresa replicasa SFV optimizada por codón (SEQ ID NO: 4) de promotor—EFla humano- más HTLV UTR. El gen beta-globina de conejo heterólogo derivado de intrón se introduce en la secuencia de codificación de replicasa.

Características principales: Inicio-Fin Descripción 9849-268 pUCori 372-903 hEFla/HTLV 917-8785 Secuencia de codificación de replicasa SFV con intrón (SEQ ID NO: ) 1129-1701 intrón 8794-9006 bgh pA 9120 9815 marcador de selección araD phEFlaHTLV-AAA es idéntico a phEFlaHTLV-Nspl234 (SEQ ID NO: 7) pero contiene la mutación RRR hasta AAA en la aa 1185-1187 de SEQ ID NO : 1: la secuencia de nucleótido en las posiciones 5042-5049 se muta de CGGCGGAG hasta GCCGCCGC.

El phEFlaHTLV-RDR es idéntico a phEFlaHTLV-Nspl234 (SEQ ID NO: 7) pero contiene la mutación RRR hasta RDR en la aa 1 185-1187 de SEQ ID NO: 1: la secuencia de nucleótido en las posiciones 5045-5047 se muta de CGG hasta GAC .

El phEFlaHTLV-GAA es idéntico a phEFlaHTLV-Nspl234 (SEQ ID NO: 7) pero contiene la mutación GDD hasta GAA en la aa 2283-2285 de SEQ ID NO: 1: la secuencia de nucleótido en las posiciones 8340-8343 se muta de ACGA hasta CCGC.

Ejemplo 1. Construcción de los plásmidos de ADN que expresan la replicasa SFV con mutación RRR>RDR en región nsP2.

Previamente, la secuencia de proteína de replicasa SFV (polipéptido no estructural nsP1234) (SEQ ID NO: 1) se traslado de nuevo y cADN sintético optimizado de codón con el gen beta-globina de conejo heterólogo derivado de intrón (introducido en la secuencia de codificación) se sintetizó (SEQ ID NO: 4) . El cADN se insertó en los plásmidos de expresión de manera que el promotor Pol II heterólogo diferente y elementos UTR se usaron para expresión de replicasa SFV de la secuencia de codificación optimizada por codón (figura 5) . Particularmente, se utilizaron virus de sarcoma Rous 5'LTR, promotor elF4Al humano y promotor quimérico consisten de promotor EFla humano más HTLV UTR. Los vectores que expresan replicasa SFV (SEQ ID NO: 1) se nombraron pRSV-Nspl234 (SEQ ID NO 5) , phelF4Al-Nspl234 (SEQ ID NO 6) , y phEFlaHTLV-Nspl234 (SEQ ID NO 7) . Además, las mutaciones en aminoácidos 1185-1187 RRR>AAA, en la región nsP2 NLS, se introdujeron en los vectores pRSV-Nspl234 , phelF4Al-Nspl234 , y phEFlaHTLV-Nspl234. Los plásmidos se nombraron pRSV-AAA, phelF4Al-AAA, y phEFlaHTLV-AAA, respectivamente.

Se conoce por los datos de literatura que una mutación particular en aa 1185-1187, RRR>RDR, del gene que codifica la replicasa SFV tipo natural significativamente potencia la inducción de respuesta IFN en células infectadas por virus comparadas con células infectadas con virus tn (Breakwell et al. 2007). De esta manera, la mutación RRR>RDR se introdujo en los vectores pRSV-Nspl234 , phelF4Al-Nspl234 , y phEFlaHTLV-Nspl234. Los plásmidos se nombraron pRSV-RDR, phelF4Al -RDR, y phEFlaHTLV-RDR, respectivamente.

Se conoce por los datos de literatura que la mutación GDD>GAA en la porción GDD altamente conservada de la proteína alfavirus nsP4 (aa 2283-2285 del SFV Nspl234) suprime completamente la actividad de polimerasa de AR dependiente de ARN (Tomar et al. 2006). Previamente, la mutación GDD>GAA se introdujo en la replicasa codificada por los vectores pRSV-Nspl234 , y pRSV-AAA. Los vectores clonados se nombran como pRSV-GAA, y pRSV-AAA-GAA, respectivamente. Además, la mutación GDD>GAA se introdujo en el contexto del plásmido pEFlaHTLV-Nspl234 , resultando en el vector pEFlaHTLV-GAA. Con la intención de construir el vector de control con la mutación RRR>RDR en la región nSP2, la mutación GDD>GAA se introdujo en el vector pRSV-RDR resultando en el pRSV-RDR-GAA de plásmido.

Ejemplo 2: Inducción de respuesta de interferón tipo I por expresión RdRp Usamos línea celular de fibroblasto de ratón Cop5 (ATCC número CRL-1804) como una línea celular modelo para discriminar entre los constructos de replicase diferentes por su capacidad para inducir expresión de interferón tipo I. las células Cbp-5 se propagaron en Medio de Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM, por sus siglas en inglés) complementado con suero de becerro fetal al 10%, L-Glutamina 2mM, y estreptomicina-penicilina. Dos otras líneas celulares humanas también se usaron comparativamente - HEK293 y HACAT. Las células se propagaron a 37°C bajo C02 al 5% y se hacen crecer hasta 50 hasta 70% de confluencia.

Transfecciones La electroporación se llevo a cabo con un Bio-Rad Gene Pulser. Tres concentraciones de ADN plásmido se usaron para transfecciones con 10 ng, 200 ng y 1000 ng y cantidades equimolares de plásmidos de control. Todos los cinco constructos diferentes se procesaron por ensayo por su capacidad para inducir respuesta de interferón: pRSV-Nspl234 , pRSV-RDR, pRSV-AAA, pRSV-RDR-GAA, y pRSV-AAA-GAA. Las células se trataron con tripsina, cosecharon por centrifugación y suspendieron en medio de crecimiento y com lementaron con NaBes 5mM. La electroporación se realizó en cubetas de 0.4 mm en la presencia de 50 ug de ADN de portador (ADN de esperma de salmón) y se dejó en la cubeta durante 15 minutos, lavói con medio de crecimiento, y sembró en placas de 6 pozos.

Ensayo de Interferón-ß Los sobrenadantes de cultivo celular se cosecharon 24h, 48h, y 72h después de la transfección y congelaron a -20°C hasta el análisis adicional usando kits de interferón-a y ß (PBL Biomedical Laboratories) . Los sobrenadantes de cultivo celular se diluyeron apropiadamente y usaron en el ensayo inmunosorbente ligado a la enzima de acuerdo a las instrucciones del fabricante (PBL Biomedical Laboratories) .

Resul tados Los niveles de interferón-ß se cuantificaron de sobrenadantes recolectados por ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) (PBL Biomedical Laboratories) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Conclusiones La generación de respuesta de interferón es debido a la actividad de ARN-polimerasa dependiente de ARN (RdRp) en el complejo RdRp compartimentado . El efecto RdRp se revocó completamente cuando la actividad enzimática de RdRp se canceló al introducir una mutación GAA en el centro activo de la unidad de polimerasa (Fig 2) . El perfil de expresión de interferón medido de sobrenadantes de cultivo celular después de la transfección con constructos que contienen mutación GAA fue similar al constructo que no codifica ninguna actividad enzimática (Fig 1, carril paraDMgB) .

En la base de experimentos de cultivo celulares, el mutante donde la señal de localización nuclear (NLS) se ha modificado en la región nSP2 al introducir una mutación RDR se eligió como el candidato de adyuvante más prometedor. El mutante con otras modificaciones (AAA) en la misma posición del NLS o RdRp de tipo natural también se procesó por ensayo por su capacidad para inducir respuesta de interferón tipo I, pero con efectos sustancialmente inferiores (Fig 1) . También comparamos el vector de expresión de replicasa pRSV-Nspl234 (SEQ ID NO 5) con el vector pRSV-SFV-Rluc que expresa tanto la replicasa así como cis-secuencias víricas específicas que contienen el ARN de plantilla. El último actúa como sustrato específico para la replicasa. Los resultados de ensayo de inducción de respuesta In IFN muestra que la existencia de ARN de plantilla específica no fue el factor crucial al inducir la respuesta de interferón (Fig 3) . En líneas celulares humanas HEK293 y HACAT también fuimos capaces de mostrar interferón-ß específico, y a una extensión menor, inducción de interferón-oí por pRSV-RDR (Fig 4 y 5) .

Ejemplo 3. Acumulación de dsARN en citoplasma de células que expresan replicasa.

Se conoce que los intermediarios dsARN se producen durante el ciclo de replicación del genoma SFV o el ARN de plantilla de replicasa. La presencia del dsARN en el compartimiento citoplasmát ica señala la infección vírica para la célula y puede llevar a la cascada de respuesta antivírica, incluyendo la respuesta de interferón de Tipo I.

Como se documenta arriba (Ejemplo 2), la expresión de replicasa SFV solo induce la respuesta de interferón de Tipo I en células transfectadas . Además, se determinó que la actividad RdRp de la replicasa es crítica para la respuesta IFN, debido a que no se observó respuesta IFN después de la transfección con los vectores de expresión que portan la mutación GDD>GAA que abóle la actividad RdRp (Ejemplo 2) .

De esta manera, la presencia y localización de dsARN en células transfectadas con los vectores de expresión de replicasa solo se estudió. Para este propósito el análisis IF usando anticuerpo monoclonal anti-dsARN J2 (Scicons, Hungría) se utilizó. Este enfoque se usó previamente para detección de dsARN en las células después de la infección con virus de ARN +hebra (Weber et al 2006) . Brevemente, las células se transfectaron con vectores de expresión de replicase y al día siguiente después de la transfección se realizó el análisis de inmunofluorescencia de células fijas de paraformaldehído con anticuerpos anti-Nspl y anti-dsARN (mezclados) . Para detección de señal por microscopía de fluorescencia, se usaron anticuerpos secundarios etiquetados con fluorocromos Alexa488 y Alexa568 y tiñen el núcleo por DAPI .

Experimento 1 Las células RD se transfectaron por complejo PEI-ADN con 0 5 ug de phEFlaHTLV-Nspl234 o con 0 5 ug de phEFlaHTLV-GAA. Los resultados claramente demuestran que la señal Nspl se observó en ambos cultivos. La señal de dsARN citoplásmico que se co-localiza con los patrones esféricos teñido anti-nsPl se detectó en las células transfectadas con el phEFlaHTLV-Nspl234 pero no' en células transfectadas con phEFlaHTLV-Nspl234-GAA.

Experimento 2 Las células Cop5 se transfectaron por electroporación con 1 ug de pRSV-Nspl234 , pRSV-GAA, pRSV-RDR o con pRSV-RDR-GAA. Los resultados muestran que aunque la señal Nspl se observó en todos los cultivos, el dsARN citoplásmica colocalizada de replicasa fue detectable en células transfectadas con pRSV-Nspl234 o pRSV-RDR, pero no en células transfectadas con los plásmidos pRSV-GAA o con pRSV-RDR-GAA.

Experimento 3 Las células RD se transfectaron por complejo PEI-ADN con 0.5 o 1 ug de pRSV-Nspl234 , pRSV-AAA o con pRSV-RDR. Los resultados demuestran que la señal Nspl se observo en todos los cultivos. La señal dsARN citoplásmica que se co-localiza con los patrones esféricos teñidos anti-nsPl se detectó en la células transfectadas con el pRSV-Nspl234 o pRSV-RDR pero no en células transfectadas con pRSV-AAA.

Conclusión Se demostró que la expresión de la replicasa SFV tn o la replicasa con la mutación RRR>RDR en la región nSP2, como se define previamente en la presente, induce la acumulación dsARN clara en el citoplasma de células transfectadas que se co-localizan con los patrones esféricos positivos nspl . En contraste, no se detectó tal acumulación dsARN si las células que se transfectaron con replicase portan la mutación GDD>GAA que abloe su actividad RdRp .

De esta manera, estos resultados la correlación entre acumulación dsARN e inducción IFN de tipo I por los diferentes mutantes de replicasa. Sin embargo, no se detectó acumulación dsARN después de la transfección con el imitante RRR>AAA de la replicasa, pero la inducción de la respuesta IFN de tipo I todavía se observó. Esto puede indicar que la respuesta IFN inducida no se disparó solo por señalización dsARN, sino también por otras trayectorias relacionadas con la actividad RdRp de la replicasa. Sin embargo, no puede excluirse que las cantidades más pequeñas de dsARN se producen por el mutante de replicasa RRR>AAA que no. es detectable por las condiciones del ensayo usadas.

Ejemplo 4. Efecto adyuvante de la expresión de la replicasa SFV en la respuesta inmune mediada por célula.

Tres grupos diferentes de ratones (Balb/c) 5 ratones por grupo) se inmunizaron con goma de gen 2 veces con intervalos de 2 semanas. Un microgramo de ADN plásmido se administró con ambas inmunizaciones. El vector plásmido GTU-MultiVIH (genes seleccionados codificados de VIH-1) es una vacuna de ADN experimental para VIH-1. Cuando el plásmido GTU-MultiVIH se co-administró con los adyuvantes pRSV-Nspl234 o pRSV-RDR entonces 0.8 pg de GTU-MultiVIH y 0.2 g de adyuvante plásmido se mezclaron juntos. Para aquellos ratones que reciben solo vector de GTU-MultiVIH, 1 pg de ADN plásmido se usó. Los ratones se sacrificaron 10 días después. Se realizó el análisis Interferón ? ELISPOT con esplenocitos aislados frescamente. Para células estimuladas un péptido de señal derivado de proteína p24 de VIH-1 (AMQMLKETI) se usó, que se conoce para presentarse por moléculas clase I MHC de ratones Balb/c. Otro estimulante fue un grupo de péptidos traslapadas que cubren la Rev-proteína de VIH-1, otro componente codificado por la vacuna de ADN.

Los resultados indican que cuando una vacuna de ADN se coadministró con el vector que codifica la replicasa de SFV, el aumento de respuesta inmunitaria celular hasta 3 veces se observó (Figura 6) .

Ejemplo 5. Efecto de la expresión de replicasa SFV en la inducción de la respuesta inmunitaria humoral contra el virus de la influenza aviar.

Tres grupos diferentes de ratones (5 ratones por grupo) se inmunizaron con el vector plásmido pETB-12m-l, qµe codifica antigenos HA y NA del virus de la influenza. Los ratones se inmunizaron en la forma similar como en el ejemplo previo (1 ig de ADN plásmido por inmunización, cuando el plásmido se co-administró con el adyuvante genético luego la relación 4:1 se usó -800 ng de vector inmunizado y 200 ng de vector adyuvante) . Las muestras de sangre se analizaron por la presencia de anticuerpos específicos en prueba ELISA 2 semanas después de la 2a inmunización. En este experimento otro adyuvante genético, el vector que codifica citocina GM-CSF, conocida para estimular la respuesta inmunitaria humoral, se usó para comparación.

Los resultados indican que después de dos inmunizaciones las mejores titulaciones se detectaron en el grupo donde el adyuvante genético pRSV-RDR se mezcló con el antígeno que codifica el plásmido (Figura 7) .

Ejemplo 6 Efecto adyuvante de la expresión de la replicasa SFV en la respuesta inmune mediada por célula en ratones.

Tres diferentes grupos de ratones (Balb/c) 4 ó 5 ratones por grupo se inmunizaron con goma de gen 2 veces con intervalos de 4 semanas. Un microgramo de ADN plásmido se administró con ambas inmunizaciones. El vector plásmido GTU-MultiVIH (genes seleccionados codificados de VIH-1) es una vacuna de ADN para VIH-1. Cuando el plásmido GTU-MultiVIH se co-administró con el adyuvante pRSV-RDR ya sea en la primera o la segunda inmunización entonces 0.8 ]ig de GTU-MultiVIH y 0.2 yg de adyuvante plásmido se mezclaron juntos. Para aquellos ratones que reciben solo vector GTU-MultiVIH, 1 yg de ADN plásmido se usó. Los ratones se sacrificaron 10 días después de la segunda inmunización. Se realizó el análisis Interferón ? y Granzyme B ELISPOT · con esplenocitos frescamente aislados. Para células estimuladas un péptido sencillo derivado de proteína p24 de VIH-1 (AMQMLKETI ) y uno de proteína Env de VIH-1 (RGPGRAFVTI) se usó, que se conocen para presentarse por moléculas clase I MHC de ratones Balb/c.

Los resultados indican que el tiempo de coadministración de la replicasa SFV de adyuvante tiene un efecto complejo en la respuesta inmunitaria celular. Agregar el adyuvante a la mezcla de inmunización incrementa la respuesta de interferón gamma comparada con animales que reciben solo GTU-MultiVIH. Las capacidades funcionales diferentes de las células se revelan después del análisis de expresión Granzyme B. El adyuvante aumenta la respuesta de Granzyme B casi 3 veces cuando se administra a ratones con la primera inmunización.

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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (29)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones.

1. El uso de una replicasa alfavírica, la replicasa comprende una polimerasa de ARN dependiente de AR , para la fabricación de un adyuvante para modular el sistema inmune.

2. El uso de una replicasa alfavlrica de conformidad con la reivindicación 1, en donde el virus alfa es el virus del Bosque Semliki.

3. El uso de una replicasa alfavírica de conformidad con la reivindicación 2, en donde la secuencia de aminoácido de la replicasa corresponde en al menos 90% de identidad con la SEQ ID NO: 1.

4. El uso de una replicasa alfavírica de conformidad con la reivindicación 3, en donde la replicasa se muta en la región nSP2 que genera el mutante RRR>RDR en las posiciones 1185-1187 de la SEQ ID NO: 1.

5. El uso de una replicasa alfavírica de conformidad con la reivindicación 3, en donde la replicasa se muta en la región nSP2 que genera el mutante RRR>AAA en las posiciones 1185-1187 de la SEQ ID NO: 1.

6. El uso de una replicasa alfavírica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para la fabricación de un adyuvante para modular el sistema inmunitario, en donde la replicasa se codifica por un vector de expresión.

7. El uso de conformidad con la reivindicación 6, en donde el vector de expresión es pRSV-RDR.

8. El uso de un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, en donde el vector es un vector de ADN.

9. El uso de una replicasa alfavírica o un vector de expresión que codifica una replicasa alfavírica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la replicasa o el vector de expresión que codifica la replicasa se formula junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o constituyente.

10. El uso de una replicasa alfavírica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la replicasa se presenta en una composición de vacuna.

11. El uso de una replicasa alfavírica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en una composición de vacuna para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad infecciosa .

12. El uso de conformidad con la reivindicación 11, en donde la composición de vacuna se usa para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad bacteriana.

13. El uso de una replicasa alfavírica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en una composición de vacuna para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de cáncer.

14. El uso de conformidad con la reivindicación 11, en donde la replicasa se usa para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad vírica.

15. El uso de conformidad con la reivindicación 14, en donde la enfermedad vírica es VIH.

16. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-15, en donde la composición de vacuna comprende una vacuna que está basada en proteína.

17. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-15, en donde la composición de vacuna comprende un vector de expresión que codifica uno o más antígenos.

18. El uso de conformidad con la reivindicación 17, en donde la replicasa y el uno o más antígenos se codifican por el mismo vector de expresión.

19. El uso de conformidad con la reivindicación 17 ó 18, en donde el vector de expresión que codifica uno o más antígenos es un vector de ADN.

20. El uso de conformidad con la reivindicación 19, en donde el vector es un vector de expresión que comprende: a) una secuencia de ADN que codifica una proteína de anclaje nuclear operativamente ligada a un promotor heterólogo, la proteína de anclaje nuclear que comprende i) un dominio de enlace ADN que enlaza a una secuencia de ADN específica, y ii) un dominio funcional que enlaza a un componente nuclear; y b) una secuencia de enlace ADN multimerizada para la proteína de anclaje nuclear en donde el vector carece de un origen de replicación funcional en células mamíferas.

21. El uso de conformidad con la reivindicación 20, en donde la parte i) y/o parte ii) se obtiene de la proteína E2 del Virus de Papiloma Bovino tipo 1.

22. Una proteína caracterizada porque corresponde en al menos 90% de identidad con la secuencia de aminoácido en la SEQ ID NO: 3.

23. Una proteína de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque es para uso como un medicamento.

24. Un vector de expresión que comprende un c sete de expresión que comprende una secuencia esencialmente como se describe en la SEQ ID NO: 4, caracterizado porque una mutación se ha introducido en las posiciones 4126-4133 de la SEQ ID NO: 4, generado cuando se expresa el mutante RRR>AAA en las posiciones 1185-1187 de SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 3) .

25. Un vector de expresión que comprende un cásete de expresión que comprende una secuencia esencialmente como se describe en la SEQ ID NO: ID NO: 4, caracterizado porque una mutación se ha introducido en las posiciones 4129-4131 de la SEQ ID NO: ID NO: 4, generado cuando se expresa el mutante RRR>RDR en las posiciones 1185-1187 de la SEQ ID NO: ID NO: 1.

26. Un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el vector de expresión es pRSV-RDR.

27. Un vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-26, caracterizado porque es para uso como un medicamento.

28. Una secuencia de ácido nucleico que corresponde esencialmente a la SEQ ID NO: 4, caracterizada porque la mutación CGGCGGAG hasta GCCGCCGC se ha introducido en las posiciones 4126-4133 de la SEQ ID NO: 4..

29. Una secuencia de ácido nucleico que corresponde esencialmente a la SEQ ID NO: 4, caracterizada porque la mutación CGG hasta GAC se ha introducido en las posiciones 4129-4131 de la SEQ ID NO: 4.