HU225764B1 - Hamster ef-1alpha transcriptional regulatory dna - Google Patents
Hamster ef-1alpha transcriptional regulatory dna Download PDFInfo
- Publication number
- HU225764B1 HU225764B1 HU0004137A HUP0004137A HU225764B1 HU 225764 B1 HU225764 B1 HU 225764B1 HU 0004137 A HU0004137 A HU 0004137A HU P0004137 A HUP0004137 A HU P0004137A HU 225764 B1 HU225764 B1 HU 225764B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- dna
- plasmid
- seq
- sequence
- fragment
- Prior art date
Links
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims description 52
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 title claims description 23
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 title claims description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 127
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 119
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 89
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 88
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 43
- 101001009070 Homo sapiens HBS1-like protein Proteins 0.000 claims description 41
- 102100027377 HBS1-like protein Human genes 0.000 claims description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 30
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 30
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 30
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 27
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 27
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 20
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 14
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims 12
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims 3
- 206010029897 Obsessive thoughts Diseases 0.000 claims 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 146
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 25
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 23
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 101100028920 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cfp gene Proteins 0.000 description 13
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 12
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 12
- 102000006433 Chemokine CCL22 Human genes 0.000 description 11
- 108010083701 Chemokine CCL22 Proteins 0.000 description 11
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 9
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 8
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 8
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 6
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 6
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 108010024976 Asparaginase Proteins 0.000 description 5
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 5
- 102100031538 Phosphatidylcholine-sterol acyltransferase Human genes 0.000 description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 3
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 3
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101710151413 Chitinase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101710151415 Chitinase 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100037328 Chitotriosidase-1 Human genes 0.000 description 2
- 101710132290 Chitotriosidase-1 Proteins 0.000 description 2
- 101710107327 Endochitinase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101710107425 Endochitinase 2 Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 102000057361 Pseudogenes Human genes 0.000 description 2
- 108091008109 Pseudogenes Proteins 0.000 description 2
- 102000017143 RNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010013845 RNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 241000699798 Cricetulus Species 0.000 description 1
- 241000699679 Cricetulus migratorius Species 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010064600 Intercellular Adhesion Molecule-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100037871 Intercellular adhesion molecule 3 Human genes 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 1
- 101100096342 Mus musculus Spdef gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108020003217 Nuclear RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000043141 Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 1
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 1
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010053551 Sp1 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000006290 Transcription Factor TFIID Human genes 0.000 description 1
- 108010083268 Transcription Factor TFIID Proteins 0.000 description 1
- 102100030246 Transcription factor Sp1 Human genes 0.000 description 1
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000003990 capacitor Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000010030 laminating Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 101150116497 sacm1l gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- ZNJHFNUEQDVFCJ-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+].OCCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 ZNJHFNUEQDVFCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Bármely adott eukarióta gén transzkripciója a három eltérő típusú RNS-polimeráz enzim egyikével megy végbe, ezek mindegyike a gének egy adott alcsoportjára hat. Amíg a nagy riboszomális RNS-t az RNS-polimeráz I, a kis riboszomális RNS-t és a tRNS-t a polimeráz lll írja át, addig a fehérjét kódoló DNS-szekvenciák és a legtöbb mag-RNS transzkripciója a polimeráz ll-vel történik. Mindegyik géntípusnál a transzkripció a megfelelő polimeráz és a gén promoterszekvenciájának kölcsönhatását és a stabil transzkripciós iniciációs komplex kialakulását követeli meg. Általában a három polimeráz bármelyikével történő transzkripció néhány kötőfaktor promoterszekvenciával való kölcsönhatását és a kötőfaktor egy másik, a polimeráz és a génszekvencia kölcsönhatását megengedő faktor által történő felismerését igényli. Míg ez a mechanizmus az RNS-polimeráz I és lll vonatkozásában a transzkripció minimális követelménye, addig az RNS-polimeráz ll-vel a transzkripció sokkal bonyolultabb folyamat eredménye.
Az RNS-polimeráz ll-vel átírt gének széles spektrumának és annak a ténynek a következtében, hogy ezek a gének ugyanabban a sejtben és sejtről sejtre nagymértékben eltérőek, feltételezhető, hogy az RNSpolimeráz ll-vel történő átírás az iniciációs komplexben lévő számos transzkripciós faktor kötődése által befolyásolt, ráadásul a promoteren kívüli más szabályozó DNS-szekvenciákhoz kapcsolódó egyéb fehérjék kölcsönhatása is szerepet játszhat. Ezek az egyéb kötőfehérjék az alapszintnél nagyobb átírás indukálására vagy a transzkripció egészének elnyomására szolgálhatnak. A represszor kötődését úgy is tekinthetjük, mint egy eszközt az aktiváció megakadályozására, tehetjük ezt annak a megfigyelésnek a tükrében, hogy normálisan a magasabb rendű eukariótákban a transzkripció alapszintje nagyon alacsony. Az aktiváció, ami általánosságban nem más, mint néhány fiziológiai jelre adott végső válasz, az aktív iniciációs komplex kialakulásához a represszor-kötőfehérjék eltávolítását vagy a kromatinstruktúra megváltoztatását követeli meg.
A transzkripciós komplex magjának és a génexpresszió alapszintjeinek kialakulásához előfeltétel a „TATA” boxnak nevezett promoterszekvencia, ami a polimeráz II átírási starthelyétől 5’-irányban helyezkedik el. A TATA box a TFIID-nek nevezett, általánosan előforduló, transzkripciós faktor kötőhelye, de az is ismeretes, hogy a legtöbb gén promoterszekvencia által történő átírását további génátírást erősítő vagy elnyomó, szabályozó DNS-szekvenciák erőteljesen befolyásolják. Az ilyen típusú DNS-elemek a gén kódolószekvenciájához és a TATA boxhoz viszonyítva különböző helyzetben lehetnek. Ezek a további transzkripciós szabályozóelemek hatásukat gyakran szövet- vagy sejtspecifikusan fejtik ki.
A rekombináns fehérjék expressziójában különösen fontos olyan szabályozó DNS-ek kiválasztása, amelyek TATA szekvenciával bíró promotert és a gazdasejtek transzkripciós mechanizmusával összeegyeztethető szabályozóelemeket tartalmaznak. Ezért előnyben részesítjük a választott gazdasejtre nézve endogén szabályozó DNS-szekvenciákat. Alternatívaként, figyelemre méltó siker érhető el olyan szabályozó DNS-ekkel, amelyek a vírusok genomiális szekvenciáiból származnak, mivel a vírusok általában széles gazdaspecifitásúak, és különböző sejttípusokban a virális szabályozó DNS-ek aktivitását kimutatták. A rekombináns fehérjék expressziójához jól ismert és rutinszerűen alkalmazott virális szabályozószekvenciák például a következők: az SV40 gén promoter/enhancer elemei [Dijkema és munkatársai: EMBO J., 4, 761 (1985)], a Rousszarkóma-vírus hosszú kódolószekvenciáját határoló ismétlődések DNS-e [Gorman és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 9, 6777 (1982b)], a borjú-papillomavírusfragmensek [Sarver és munkatársai: Molecular & Cellular Biology, 1, 486 (1981)] és a humán citomegalovírus promoter/enhancer elemei [Boshart és munkatársai: Cell 41, 521 (1985)]. Annak ellenére, hogy az olyan sejttípusok választéka széles, amelyekben a virális szabályozóelemek funkcionális működését kimutatták, mégis lehetséges, hogy olyan nem virális promoter/enhancer DNSelemek léteznek, amelyek a specifikus sejttípusokban a gazdasejt transzkripciós gépezetének hatékonyabb használatával a rekombináns fehérjék megnövekedett transzkripcióját lehetővé teszik.
Ezért a szakirodalomban szükség van arra, hogy olyan promoter/enhancer szabályozó DNS-szekvenciákat azonosítsanak, amelyek működésük révén a homológ és heterológ sejtekben a rekombináns fehérje expresszióját növelik, és a kívánt fehérjetermék magas kihozatalát biztosítják. Különösen fontos azoknak a promoter/enhancer szabályozó DNS-szekvenciáknak az azonosítása, amelyeket a rekombináns fehérjék leghatékonyabb in vitro termelésének növelésére olyan emlőssejtekben lehet felhasználni, amelyek hasonló glikozilezési mintázattal glikozilezik a fehérjét, mint amilyen az in vivő fehérjeexpresszió eredményeként létrejön. Az így expresszált és terápiásán vagy megelőzésnél alkalmazott fehérjék valószínűleg kevésbé antigének és fiziológiásán sokkal aktívabbak. Az ilyen típusú szabályozó DNS-szekvenciák gazdasejtekbe történő inszertálása szintén számításba jöhet azért, hogy a gazdasejt endogén génjeinek, vagy a jól ismert és a szakirodalomban rutinban alkalmazott technikákkal a gazdasejt genomjába előzőleg bejuttatott gének expresszióját növeljük.
A jelen találmány hörcsögsejtekből származó tisztított és izolált polinukleotidokra vonatkozik, amelyek a gén transzkripcióját szabályozzák. A polinukleotidok olyan szabályozó DNS-szekvenciákat tartalmaznak, amelyek a kínai hörcsög ovariális EF-1a gén transzlációs régióitól 5’-irányban vannak. A találmány előnyben részesített DNS-ét CHEF1 szabályozó DNS-nek nevezzük, és hozzávetőleg egy 3,7 kb nagyságú DNS, ami az EF-1a fehérje iniciációs metionin (ATG) kodonjától az Spcl restrikciós helyig tart. A 3,7 kb-nál kisebb polinukleotidok szintén a találmány tárgyát képezik addig, amíg a polinukleotidok kisebb fragmensei egy működésében kötött gén transzkripcióját képesek növelni. A találmány DNS-einek aktív fragmenseit, amelyeket a génátírás szabályozásának (például növelésének) ké2
HU 225 764 Β1 pessége jellemez, az irodalomból jól ismert és rutinban alkalmazott deléciós kísérletekkel könnyen azonosíthatjuk. A találmány szabályozó DNS-ei közé ugyanúgy beletartoznak azok a polinukleotidok, amelyeket természetes forrásokból, mint például tenyésztett sejtekből izolálnak, mint amelyeket enzimatikusan vagy tisztán kémiai szintézissel állítanak elő. így a találmány egyik megvalósítási formájában a CHEF1 DNS genomiális könyvtárból történő előállításához biztosít egy eljárást. Alternatívaként, a DNS enzimatikus szintézissel is előállítható, felhasználva például a polimeráz-láncreakciót (PCR) vagy tisztán egy kémiai szintézist, ahol a nukleotidokat vagy egymás után adják, vagy az átfedő oligonukleotidokat hibridizálják és ligálják. A leginkább előnyben részesített megvalósítási forma DNS-szekvenciáját az 1-es számú szekvenciavázlaton tettük közzé. A találmány ezenkívül olyan DNS-szekvenciákat is átfog, amelyek szigorú hibridizációs körülmények között a közzétett 1-es számú DNS-szekvenciával hibridizálnak. A szigorú körülmények a következőket foglalják magukban: mosás körülbelül 65 °C-on olyan pufferben, amely 2*SSC-t és körülbelül 0,1% SDS-t tartalmaz, vagy ezzel egyenértékű körülményeknek felelnek meg.
A találmány továbbá a CHEF1 szabályozópolinukleotidokat tartalmazó plazmid-DNS-eket is magában foglalja. A találmány plazmidjai olyan DNS-szekvenciákat is tartalmaznak, amelyek a CHEF1 polinukleotidszekvenciákhoz működésében kötötten a szóban fogó fehérjét vagy a szóban forgó RNS-terméket kódolják. A találmány ezenkívül magában foglalja a találmány polinukleotidjaival vagy plazmidjaival transzformált, transzfektált vagy elektroporált gazdasejteket. A találmány plazmidja a gazdasejt genomjába integrálódhat, vagy a gazdasejtben zárt kör alakú plazmid formájában létezhet. A találmány előnyben részesített plazmidjai között a kívánt DNS-szekvencia beépítése szempontjából különösen a pDEF14 és a pDEF2 plazmidok jöhetnek számításba. A pDEF14 és a pDEF2-vel transzformáit bakteriális gazdasejteket az American Type Culture Collection letéteményes szervnél (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852) 98398, illetőleg 98343 hozzáférési számon 1997. április 9-én, illetőleg 1997. március 4-én letétbe helyeztük.
A találmány a CHEF1 polinukleotidokat tartalmazó lineáris vektor-DNS-eket is magában foglalja. A találmány vektorai virális forrásokból nyerhetők vagy in vitro szintézissel kaphatók meg. A találmány továbbá lineáris vektorszekvenciákkal transzfektált vagy elektroporált gazdasejteket foglal magában. Ezek a DNS-típusok a CHEF1 DNS-szekvenciákhoz működésében kötött heterológ génszekvenciák expressziójához vagy a helyspecifikus homológ rekombinációkhoz különösen hasznosak, amelyekkel a CHEF1 szekvenciát a gazdasejt genomjába lehet inszertálni azért, hogy egy működésében kapcsolt szekvencia expresszióját modulálja.
A találmány ezenkívül kiméra rekombináns DNSmolekulákat is biztosít, ahol a CHEF1 DNS a kívánt fehérjeterméket kódoló génszekvenciákhoz működésében kötött, azaz elősegíti a génszekvenciák transzkripcióját. Általában a kiméra molekulák azok, amelyek olyan domént tartalmaznak, amelyek a vad típusú környezetből hiányoznak: a jelen találmányban a kiméra DNS a CHEF1 szabályozó DNS egy részét vagy teljes egészét egy hörcsög EF-1a fehérjét kódoló génszekvenciától eltérő DNS-szekvenciához kapcsolva tartalmazhatja. A kiméra molekulák kódolta fehérjetermékek közé fiziológiailag aktív fehérjék, az aktív fehérjék részei vagy alegységei, valamint jelző értékű molekulák (marker- és riporterfehérjék) tartoznak. A fehérjeterméket kódoló polinukleotidszekvenciák komplementer DNS-ből (cDNS), genomiális DNS-ből, szintetikus DNS-ből vagy ilyen típusú molekulák kombinálásával létrejövő DNS-ből származhatnak. A fehérjetermékek a kínai hörcsög ovariális (CHO) sejtekre nézve lehetnek endogének (azaz normálisan megtalálhatók azokban a CHO-genomokban, amelyekbe transzformációval, transzfekcióval vagy hasonlóval nem juttatták be). Ráadásul a fehérjetermékeket exogén forrásokból származó polinukleotidok is kódolhatják, az exogén forrás más, mint a CHO-sejt genomja, például szintetikus DNS is lehet. A találmány előnyben részesített kiméra molekulái közé tartoznak azok, amelyek a CHEF1 DNS-hez működésében kötötten (i) az ICAM3 elleni ICM3 ellenanyag nehéz láncát, (ii) az ICM3 könnyű láncát, (iii) a CD11/CD18 elleni hu23F2G ellenanyag nehéz láncát, (iv) a hu23F2G könnyű láncát, (v) a kitinázt, (vi) a vérlemezke-aktiválófaktor-acetil-hidrolázt (PAF-AH) és (vii) a makrofágeredetű kemokint kódoló DNS-t tartalmazzák. A kiméra molekulákat tartalmazó vektorokkal transzformált bakteriális gazdasejteket 1997. április 1-jén az American Type Culture Collection letéteményes szervnél a következő számokon letétbe helyeztük: (i) 98381, (ii) 98382, (iii) 98383, (iv) 98384, (v) 98385, (vi) 98386, illetőleg (vii) 98387.
A találmány ezenkívül a találmány CHEF1 DNS-ével transzformált vagy transzfektált gazdasejtekre vonatkozik. A találmány előnyben részesített gazdasejtjei a kínai hörcsögből (Cricetulus griseus) származnak, amelyekben a CHEF1 szabályozó DNS-től elvárható, hogy magas szintű fehérjeexpressziót biztosítsanak. Ennek ellenére a találmány más, alternatív fajokból származó sejttípusokat is felölel, mint például az örmény hörcsög (Cricetulus mlgratoris) vagy a szíriai (arany-) hörcsögök (Mesocricetus auratus), valamint más genuszokból származó állatok sejttípusait. A sejteket a tüdőből, a petefészekből, a peritoneumból, az izomból, a hasnyálmirigyből, a veséből, melanomából vagy testi forrásból, valamint a teljes magzatból vagy embrióból nyerhetjük. A találmány fenti listáján bemutatott gazdasejtek, valamint más sejttípusok, mint például mielóma-sejtvonalak, amelyekben a CHEF1 szabályozó fehérjétől elvárható, hogy magas szintű fehérjeexpressziót biztosítson, az American Type Culture gyűjteményből beszerezhetők, vagy alternatívaként közvetlenül állati forrásokból tenyészthetők.
A találmány CHEF1 szabályozó DNS-t tartalmazó rekombináns molekulái a működésében kötött heterológ (azaz normálisan nem találhatók meg azokban a gazdagenomokban, amelyekbe a polinukleotidokat
HU 225 764 Β1 transzformációval, transzfekcióval vagy hasonlóval nem juttatták be) polinukleotidok mRNS-expressziójának megnövekedett szintjéről gondoskodnak. A CHEF1 polinukleotidszekvenciákhoz kötött polinukleotidok tulajdonságaitól függően a megnövekedő transzkripció végül egy nagyobb szintű polipeptidszintet eredményezhet, vagy a különböző RNS-ek megnövekedett szintjét, azokban az esetekben, ahol a kapcsolt polinukleotid például transzfer RNS-t, riboszomális RNS-t, kisméretű mag-RNS-t vagy hasonlókat kódol. Az RNS-fajták közé egy endogén vagy exogén génszekvenciáról átírt mRNS-sel komplementer antiszensz RNS is tartozhat. Szükségképpen a megnövekedett polipeptidtranszláció a jelen lévő mRNS megfelelő transzlációs jelétől függhet.
A találmány továbbá olyan eljárásokról gondoskodik, amelyekkel a CHEF1 DNS-t a gazdasejt genomiális DNS-ének specifikus helyeire lehet beépíteni azért, hogy egy endogén génszekvencia transzkripciós szintje megnőjön. A CHEF1 DNS egészének vagy egy részének inszertálásához a homológ rekombináció felhasználható. Az így módosított gazdasejtekben a CHEF1 DNS működésében kódoló DNS-szekvenciákhoz kötött. Lásd például a következő nemzetközi szabadalmi bejelentéseket: WO 94/12650; WO 92/20808; és WO 91/09955. Szükségképpen a találmány olyan megváltoztatott genomiális DNS-szekvenciákat is felölel, amelyekbe a CHEF1 szabályozó DNS-t beépítették.
Alternatívaként, a találmány olyan gazdasejteket is felölel, amelyekben az exogén DNS-t szomszédosán és működőképes helyzetben a genomban jelen lévő CHEF1 DNS-hez kötötték. Az ilyen típusú gazdasejtek közé tartozik a CHO. Az inszertált szekvencia vagy az EF-1a-t kódoló DNS helyébe, vagy a CHEF1 szabályozó DNS és az EF-1a-t kódoló DNS közé épül. A találmány olyan gazdasejteket is felölel, amelyek mások, mint a CHO-sejtek, amelyek genomjába a CHEF1 DNS-t előzőleg beépítik, majd a további DNS-t működésében kapcsolt helyzetbe inszertálják.
A találmány továbbá a kívánt gén transzkripciójának növelésére olyan eljárásokról gondoskodik, amelyek a hörcsög EF-1a szabályozószekvenciát tartalmazó polinukleotid gazdasejtbe történő bejuttatásának lépését tartalmazzák úgy, hogy a szabályozószekvencia a gazda genomiális DNS-ébe a kívánt génnel működésében kapcsolt helyzetbe integrálódik. A találmány továbbá a kívánt gén transzkripciójának növelésére egy olyan eljárást foglal magában, amely a hörcsög EF-1a szabályozószekvenciát és egy célszekvenciát tartalmazó pollnukleotidnak gazdasejtbe történő bejuttatási lépését tartalmazza. A szóban forgó célszekvenciát úgy készítik el, hogy az a szabályozószekvenciáknak az EF-1a-tól különböző fehérjét kódoló kívánt génhez történő integrálódását működésében kapcsolt helyzetbe lehetővé tegye. A találmány eljárásai a CHO-sejtekre endogén gének, valamint a CHO-sejtekre exogén gének transzkripciójának növeléséhez eszközként szolgának.
A találmány rekombináns molekulái olyan transzgenikus állatok létrehozására használhatók, amelyekbe a kiméra rekombináns DNS-t, beleértve az érdeklődésre számot tartó DNS-hez működésében kötött CHEF1 DNS-t, az állat fejlődő ivari vagy testi sejtjein keresztül juttatják be. A kiméra rekombináns molekulák bejuttatása például mikroinjektálással valósítható meg. Ivarsejtek alkalmazásakor az eredményül kapott állat sejtjeinek mindegyike a találmány rekombináns DNS-molekuláit tartalmazhatja. Alternatívaként, a találmány kiméra rekombináns DNS-e egy embrió sejtjeibe is bejuttatható, és ennek megfelelően az eredményül kapott állat sejtjeinek többsége a találmány DNS-ét tartalmazhatja.
A CHEF1 DNS az olyan szorosan rokon szabályozó DNS-szekvenciák azonosítására is felhasználható, amelyek a CHEF1 által engedélyezett génexpressziónál nagyobb és azon túli génexpresszió-növekedést eredményezhetnek. Hasonlóan, a CHEF1 DNS-szekvencia ismerete lehetővé teszi szintetikus DNS-ek előállítását akár de novo szintézissel, akár a CHEF1 szekvenciák egyszeres vagy többszörös módosításával, a szintézissel eredményül kapott DNS-szekvenciák a CHEF1-gyel szekvenciájukban hasonlóak, de a gének transzkripcióját magasabb szinten képesek előmozdítani.
A jelen találmányt a következő példák mutatják be. Az 1. példa a hörcsög EF-1a gén és a rokon CHEF1 szabályozó DNS-ek klónozását írja le. A 2. példa a CHEF1 szabályozószekvencia elemzésével és szubklónozásával foglalkozik. A 3. példa a CHEF1 promoterpolinukleotid jellemzéséről gondoskodik. A 4. példa egy olyan leírást nyújt, amely a különböző, de CHEF1 DNS-t tartalmazó expressziós vektorok előállítását mutatja be. Az 5. példa a CHEF1 szabályozó DNS hatékonyságának meghatározására szolgáló transzfekciós vizsgálati módszert írja le. A 6. példa a CHEF1 szabályozószekvenciával vagy a citomegalovírus (CMV)-promoterrel végrehajtott kísérletekben a rekombináns fehérje expressziós szintjeinek összehasonlítását részletezi. A 7. példa a különböző hosszúságú CHEF1 DNS-ek szabályozóképességeinek különbözőségét vizsgálja.
1. példa
A CHEF1 klónozása
A humán EF-1a génre homológ hörcsög gén izolálásához egy kínai hörcsög ovariális DNS-könyvtárat (CHO-K1) (Stratagene, La Jolla, CA) a humán EF-1a-t kódoló cDNS-sel szűrtünk.
A Lambda FIX®II klónozóvektorban lévő részleges Sau3A-emésztményből kialakított CHO-K1 könyvtárat a Stratagene-től (La Jolla, CA) az XL-1-Blue MRA és az XL-1-Blue MRA (P2) gazdasejttörzsekben szereztük be. A gazdasejteket a gyártó által javasolt eljárásnak megfelelően, de a következő módosításokkal állítottuk elő.
Röviden, a glicerines törzsoldatból a sejteket antibiotikumot nem tartalmazó LB lemezekre csíkoztuk. Az egyedülálló kolóniákat a folyékony inokulum táptalajba egyenként leoltottuk és OD600-on mérve hozzávetőleg 0,9-ig, a késői logfázisig növesztettük. Ezután a sejte4
HU 225 764 Β1 két a gyártó által javasolt eljárással tároltuk vagy a következőkben leírtak szerint azonnal felhasználtuk.
A tenyészetek lemezeinek elkészítéséhez a fentiekben leírtak szerint elkészített lemezekről az egyedi kolóniákat kiemeltük és azokat leoltottuk, ezután a sejteket 0,5 ml 1 M MgSO4-tal és 1 ml 10% maltózzal kiegészített, ionmentes vízzel készített, 50 ml LB táptalajban növesztettük. Az egy éjszakán át 30 °C-on végzett tenyésztés után a sejteket centrifugálással (2000 rpm, 5 perc, szobahőmérsékleten) összegyűjtöttük, és 10 mM MgSO4-ban OD60o-on mérve 0,5 értéknek megfelelő koncentrációban újra felvettük.
A gyártó által biztosított lambda fágot SM pufferrel [az 1 liter törzsoldatot úgy készítettük el, hogy az 5,8 g NaCI-ot, 2,0 g MgSO4xH2O-ot, 50 ml 1 M TRISZ-HCIot, pH=7,5, és 5 ml 2% (térfogat%) zselatint tartalmazott] 10-105-szeres tartományban hígítottuk, és mindegyik hígítás 2 μΙ-éhez 10 mM MgSO4-ban 400 μΙ gazdasejtet (ODgoo-on mérve körülbelül 0,5) adtunk. Az eredményül kapott elegyet 15 percig 37 °C-on inkubáltuk azért, hogy a fágok sejtekhez tapadása végbemenjen, majd a fedőagar (0,75% LBM agaróz, 48 °C-os) hozzáadása után az elegyeket két-két LBM agaróz lemezre öntöttük. Az eredmények azt mutatják, hogy a fág törzsoldatának titere 3*10® plakk-képző egység (PFU)/pl.
A friss gazdasejteket a fentiekben leírtaknak megfelelően a könyvtár szűrése előtt készítettük el. Hozzávetőleg 50 000 fág plakk-képző egységet adtunk 600 μΙ gazdasejthez (OD60o-on mérve körülbelül 0,5), majd
6,5 ml 0,75% LBM agarózt (48 °C-os) öntöttünk rá. Az elegyet agarózlemezeken szétterítettük, amelyeket ezután hozzávetőleg 8 óráig 37 °C-on inkubáltuk. A fedőagaróz nitro-cellulóz-membránokhoz történő tapadásának megakadályozására a lemezeket ezután 5 óra alatt 4 °C-osra hűtöttük. A BA-85, 0,45 pm pórusméretű (S+S, Keene, NH) membránokat a lemezekre helyeztük, és az átvitelt 2 percig folytattuk. A membránokat a lemezekről eltávolítottuk, és az átvitt DNS-t 2 percig 1,5 M NaCI/0,5 M NaOH-dal denaturáltuk. A szűrőket 5 percig 1,5 M NaCI/1,0 M TRISZ-HCI-dal (pH=8,0) Whatman 3-MM papírra lenyomatoltuk, és vákuumban 80 °C-on hozzávetőleg 1,5-2 óráig sütöttük.
A humán EF-1a cDNS-szekvenciát [Uetsuki és munkatársai: J. Bioi. Chem., 264, 5791-5798 (1989)], amiről előzőleg kimutatták, hogy 95%-ban azonos a CHO EF-1a kódolórégíójával [Hayashi és munkatársai: J. Biochem., 106, 560-563 (1989)], a könyvtár szűrésére próbaként használtuk, és az alábbiaknak megfelelően állítottuk elő. Az 1,4 kb nagyságú EF-1a próba az M0107 plazmidból származott, ez egy EcoRI helyre inszertált EF-1a cDNS-t tartalmazó pRc/CMV vektor (Invitrogen, San Diego, CA). Azért, hogy először az elvárt humán cDNS M0107 plazmidban való jelenlétét megerősítsük, az inszertált szekvenciát 3'- és 5’-vektorprimerekkel szekvenáltuk.
94-17 AGGCACAGTCGAGGCTGATC (2. számú szekvencia)
94-18 TTCCAGGGTCAAGGAAGGCA (3. számú szekvencia)
Az inszert első 263 bp-ja nagyobb mint 90%-os azonosságot mutatott a publikált humán EF-1a kódolószekvenciájával, és míg 3'-végét nehéz volt pontosan meghatározni, addig rövid szakaszokat a várt szekvenciának megfelelően lehetett sorba rendezni. Ezen elrendezések kombinálásával megállapítottuk, hogy a plazmid a kívánt szekvenciát kódolta.
EcoRI-emésztéssel a plazmidból eltávolítottuk a teljes humán inszertet, és a QIAGEN QIAquick Gél Extraction készlet felhasználásával, a gyártó által javasolt eljárással, az 1,4 kb nagyságú cDNS-csíkot kétszer tisztítottuk. A DNS-t 50 pl TE-be eluáltuk, az eredményül kapott oldatot egy Microcon-10-ben (Amicon, Beverly, MA) 25 μΙ-re koncentráltuk, és az egyik aliquotját, a Boehringer Mannheim Random Prímed DNA jelölőkészlete segítségével, a gyártó által ajánlott eljárás szerint, 32P-a-dTTP-vel és 32P-a-dCTP-vel jelöltük. A beépületlen nukleotidok eltávolítása érdekében a jelölt próbát G50 spin oszlopon tisztítottuk, a tisztított és a tisztítatlan (pre-spin) próbák aliquotjainak összevetése 46%-os radioaktív jelbeépülést, 5*105 szám/perc/μΙ beütést mutatott.
A fentiekben leírtaknak megfelelően készített nitrocellulóz-membránokat a próbákkal a következőképpen vizsgáltuk. A prehibridizációs/hibridizációs puffer törzsoldatait elkészítettük, ezek összetétele a következő:
22,5 ml 20 X SSC, 30,0 ml 50 X Denhardt-féle oldat, 3,0 ml 1 M foszfátpuffer (pH=6,8) (69 ml 1 M NaH2PO4, 31 ml 1 M Na2HPO4), 0,75 ml 20% SDS és 78,75 ml desztillált H2O. Az előhibridizációhoz az 1,4 ml 10 mg/ml lazacsperma-DNS-t (Stratagene) 5 percig 0,6 ml desztillált H2O-dal forraltuk, ezután 7 ml desztillált H2O-ot és 72 ml puffertörzsoldatot adtunk hozzá. A szűrőket 65 °C-on minimálisan két óráig az előhibridizációs pufferben inkubáltuk.
A hibridizációhoz 30 μΙ próbát, 200 μΙ 10 mg/ml lazacsperma-DNS-t és 770 μΙ desztillált vizet összekevertünk, 5 percig forraltunk, ezután 36 ml puffertörzsoldatot és 3 ml desztillált vizet adtunk még hozzá. Az előhlbridizációs oldatot a szűrőkről eltávolítottuk, a hibridizációs puffért hozzáadtuk, és a szűrőket 65 °C-on egy éjszakán át inkubáltuk. A hibridizáció után a szűrőket 3 óráig 65 °C-on a 2 X SSC-t és 0,1% SDS-t tartalmazó puffer háromszori cseréje mellett mostuk, és ezután 48 óráig autoradiografáltuk.
pozitív kolóniát azonosítottunk, és ezeket egyenként 20 μΙ kloroformot tartalmazó 1 ml SM-pufferbe helyeztük. Az egy vagy több intronhiánnyal bíró pszeudogének előfordulási lehetőségének kizárására a PCR-primereket úgy terveztük, hogy azok egyszerre két intront határoljanak: a 95-136 primer (4. számú szekvencia) és a 95-137 primer (5. számú szekvencia) a 2-es és 3-as intront íveli át; a 95-138 primer (6. számú szekvencia) és a 95-139 primer (7. számú szekvencia) a 3-as és 4-es intront íveli át; a 95-140 primer (8. számú szekvencia) és a 95-141 primer (9. számú szekvencia) a 4-es és 5-ös intront íveli át; és a 95-142 primer (10. számú szekvencia) és a 95-143 primer (11. számú szekvencia) a 6-os és a 7-es intront íveli át;
HU 225 764 Β1
95-136 (4. számú szekvencia) GCCACCTGATCTACAAATGT
95-137 (5. számú szekvencia) GAGATACCAGCCTCAAATTC
95-138 (6. számú szekvencia) ATGTGACCATCATTGATGCC
95-140 (8. számú szekvencia) GTTGGAATGGTGACAACATG
95-141 (9. számú szekvencia) CAGGTTTTAAAACACCAGTC
95-142 (10. számú szekvencia) AATGACCCACCAATGGAAGC
95-143 (11. számú szekvencia) ACAGCAACTGTCTGCCTCAT
A CHO EF-1a templát-DNS felhasználásakor a PCR-termék előre jelzett mérete a publikált humán EF-1a szekvenciában lévő intronok méretén és helyzetén alapult. Mindegyik PCR-reakcióelegy 2 μΙ fágot, a megfelelő pár mindegyik primeréből 2,5 μΙ-t (100 pg/ml), 2 μΙ 2 mM dNTP-keveréket, 2,5 μΙ 10 X PCR-puffert (Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ), 1,5 μΙ 25 mM MgCI2-ot, 0,125 μΙ Taq polimerázt (5 egység/μΙ) (Perkin-Elmer) és 11,8 μΙ desztillált H2O-ot tartalmazott. A sokszorozást 4 percig 94 °C-on végeztük, ezt követte 30 ciklus, mely 1 percig 90 ’C-on, 2 percig 50 °C-on, és 4 percig 72 ’C-on történt. A sokszorozott terméket 1,2% agarózgélen 1 X TEA-pufferben választottuk szét. A 47 pozitív plakk közül 3-ról azt találtuk, hogy az igazi, mindegyik intront tartalmazó géneket kódolja (számaik: 2, 7 és 40), és a három pozitív mintát harmadszori szűrésnek is alávetettük. A lemezeléshez a tenyészeteket a fentiekben leírtaknak megfelelően készítettük el, mindhárom pozitív klón törzsoldatait 10-105-szeresére hígítottuk. Mindegyik törzsoldatból 20-40 plakkot izoláltunk, és PCR-es szűrés után a következő eredményeket kaptuk. A 2-es klón a 20 újraszűrt kiónja közül kettő pozitív volt (jelük: 2.12 és 2.17), a 7-es klón a 40 újraszűrt kiónja közül egy pozitív volt (jele: 7.44), a 40-es klón a 40 újraszűrt kiónja közül egy szintén pozitív volt (jele: 40.24). A következőkben leírtaknak megfelelően a négy minta mindegyikéből fág DNS-t izoláltunk.
Az XL-1 Blue MRA (P2) gazdasejteket LB agarózra csíkoztuk és egy éjszakán át 37 °C-on tenyésztettük. 50 ml LB táptalaj (ami 0,2% maltózt és 10 mM MgSO4ot tartalmazott) leoltáshoz kiválasztottunk egy kolóniát, és a tenyészetet 30 °C-on egy éjszakán át növesztettük. A sejteket szobahőmérsékleten végzett, 5 percig tartó, 2000 rpm-es centrifugálással egy asztali centrifugában összegyűjtöttük, és a sejteket 50 ml 10 mM MgSO4-ban felvettük. Az újraszuszpendált gazdasejteket (50 μΙ) mindegyik pozitív fág törzsoldatának 100 μΙével fertőztük, és az elegyet a fágok sejtekhez történő kapcsolódásának elősegítésére 15 percig 37 °C-on inkubáltuk. Majd hozzávetőleg 500 μΙ LBM táptalajt adtunk hozzá, és az elegyet 2 óráig 37 ’C-on rázattuk. Ezután további 200 μΙ gazdasejtet adtunk, és az inkubálást 37 °C-on további 15 percig végeztük. Afedőagar (8 ml 0,75% LBM agaróz, 48 °C-os) hozzáadása után a keveréket lemezekre öntöttük és egy éjszakán át 37 °C-on tenyésztettük.
Az egy éjszakán át tartó növesztés után mindegyik lemezhez 12 ml lambda hígítóoldatot (10 mM trisz-HCI, pH=7,5, 10 mM MgSO4) adtunk, és a lemezeket óráig gyengén mozgattuk. A hígítóoldatot eltávolítottuk és 10 percig 4000*g-vel egy asztali centrifugában centrifugáltuk. A felülúszó mindegyikéhez 1 μΙ 1 mg/ml RNáz A-t adtunk, és az inkubálást 37 ’C-on 15 percig végeztük. Az egyenlő térfogatú kicsapási puffer (20% PEG 8000, 2 M NaCI, 20 mM trisz-HCI, pH=7,5,10 mM MgSO4) hozzáadása után az inkubációt jégen 1 óráig folytattuk. Miután az elegyet 8000*g-vel 20 percig centrifugáltuk, a felülúszót eltávolítottuk, és a csapadékot 10 percig szobahőmérsékleten szárítottuk. A csapadékot 500 μΙ TE-ben felvettük, és a részecskék eltávolítása érdekében rövid ideig centrifugáltuk. A felülúszót tiszta 1,65 ml-es csövekbe (epitube) tettük át. Hozzávetőleg 2,5 μΙ 20% SDS-t, majd 2,5 μΙ 10 mg/ml proteináz K-t (egy óráig tartó inkubáció 65 ’C-on) és μΙ 5 M NaCI-ot adtunk hozzá. A keveréket egyszer egyenlő térfogatú fenol-kloroform eleggyel és egyszer egyenlő térfogatú kloroformmal extraháltuk. Egyenlő térfogatú izopropanol hozzáadása után -70 ’C-on óráig inkubáltuk, majd a keveréket 15 percig a legnagyobb sebesség mellett mikrocentrifugában (epifuge) centrifugáltuk. A kapott csapadékot 70%-os etanollal mostuk, levegőn megszárítottuk és 100 μΙ TE-ben felvettük.
2. példa
Az EF-1 a szabályozószekvencia szubklónozása
Az EF-1 a DNS inszert méretének meghatározásához a fág DNS-t az 1. példában leírtaknak megfelelően Notl-emésztéssel készítettük el, és az eredményül kapott restrikciós fragmenseket 0,6% 1 X TAE agarózgélben különítettük el. A 2.12 és a 2.17 kiónok egyező hasítási mintázatot mutattak, és az elvárt 19 kb és 10 kb nagyságú szegélyező lambda fragmenseken kívül kb és 4,5 kb nagyságú csíkokat tartalmaztak. A 7.44 és a 40.24 kiónok is azonos hasítási mintázatot mutattak, 12 kb és 7 kb nagyságú inszerteket tartalmaztak, ami a 2.12 és a 2.17 kiónok hasítási információt is figyelembe véve az EF-1 a DNS-ben egy belső Notl restrikciós hely jelenlétére utal. A 2.12 és a 7.44 klónokból származó inszerteket a következő eljárással szubklónoztuk.
Az 1. példában leírtaknak megfelelően készített fág DNS-t (60 μΙ) Notl restrikciós endonukleázzal emésztettük, ezután az emésztett DNS-t 20 μΙ 3 M nátriumacetát és 400 μΙ 100% etanol hozzáadásával kicsaptuk. A kicsapott DNS-t centrifugálással összegyűjtöttük, 200 μΙ 70%-os etanollal mostuk, 15 perc alatt levegőn megszárítottuk, 20 μΙ TE-ben újra felszuszpendáltuk, és 65 ’C-on történő 10 perces hőkezelés után az elektroforézishez 2 μΙ felvitelhez használt pufferben felvettük. A DNS szétválasztását agarózgél-elektroforézissel végeztük, és a 4,5 kb, a 7 kb, a 11 kb és a 12 kb nagyságú csíkokat az agarózból kivágtuk. A DNS-t mindegyik gélcsíkból QIAGEN QIAquick gél extraction készlettel a gyártó által javasolt eljárással extraháltuk. A csíkok tisztaságát és koncentrációját az izolált frag6
HU 225 764 Β1 mensek mindegyikének 5 μΙ-éből 0,6% 1 X TAB agarózgélen való elválasztással megbecsültük.
Az egyedi fragmenseket külön-külön a Notl-gyel emésztett pBluescript SW+ vektorba ligáltuk. A 11 és 12 kb nagyságú fragmensek ligálásakor, a fragmens inszertek beépítése előtt, a linearizált vektort borjú alkalikus foszfatázzal emésztettük. 40 μΙ XL-1 Blue elektrokompetens sejt elektroporálásához mindegyik ligációs elegyből 2 μΙ-t használtunk fel. A transzformált sejteket olyan LBM/carb agaróz lemezekre szélesztettük, amihez lemezenként dimetil-formamidban (DMF) oldott 40 μΙ 5% X-gal-t, és 20 μΙ 0,1 M IPTG-t adtunk. A sejteket egy éjszakán át 37 °C-on inkubáltuk, és reggel a lemezeket 4 °C-ra helyeztük azért, hogy a kék szín intenzitása erőteljesebb legyen.
A második szűrésben a fehér kolóniákat LBM/carb agaróz lemezekre kicsíkoztuk, amelyek a fentiekben leírt mennyiségű X-gal-t és IPTG-t tartalmaztak, és a következő napra kinőtt fehér kolóniákat 3 ml LBM/carbban egy éjszakán át 37 °C-on tenyésztettük. Az egy éjszakán át növesztett, fehér színű kolóniákból származó tenyészetből WIZARD Plus Minipreps DNA Purification rendszerrel (Promega, Madison, Wl) a gyártó által javasolt eljárással plazmidot izoláltunk.
Az izolált plazmid-DNS restrikciós analízise azt mutatta, hogy a 4,5 kb, a 7 kb és a 12 kb nagyságú fragmensek sikeresen beépültek a pBluescript SW+ vektorba, és az eredményül kapott plazmidokat pSK/EF1.4.5-nek, pSK/EF1.7-nek, illetőleg pSK/EF1.12nek neveztük el.
Ezután a plazmidokat a QIAGEN midi prep készlettel, a gyártó által ajánlott eljárással, nagyobb mennyiségben is előállítottuk. A templát-DNS kititrálására a primerek kódolórégióinak felhasználásával (a szekvenciák száma: 4-től -11-ig, az egy vagy több intronhiányos pszeudogének kiszűrésére a primereket a fentiekben leírtak szellemében párosán használtuk) mindegyik új vektorral PCR-t végeztünk. A titrálást azután hajtottuk végre, miután nagy koncentrációknál azt találtuk, hogy mind a három fragmens a teljes EF-1a kódolórégióját tartalmazza, mindez a három plazmidkészítmény közötti lehetséges keresztszennyeződésére utal. A titráláskor a PCR-t a következő összetételű reakcióelegyben végeztük: 2,5 μΙ templát-DNS (0,001, 0,01, 0,1,1 vagy 10 ng/μΙ koncentrációkban), valamint 2,5 μΙ 10 X PCR-puffer (Perkin-Elmer), 2,0 μΙ 2 mM dNTPkeverék, 1,5 μΙ 25 mM MgCI2, 0,125 μΙ Taq polimeráz (Perkin-Elmer) és 11,4 μΙ desztillált H2O. A sokszorozást 4 percig 94 °C-on, majd 30 ciklusban ciklusonként 1 percig 90 °C-on, 2 percig 50 °C-on és 4 percig 72 °C-on végeztük. Az eredmények azt mutatják, hogy az EF-1a kódolórégió a 4,5 kb és a 7 kb nagyságú fragmensek belsejében helyezkedik el.
Mindegyik inszert restrikciós térképét Stratagene FLASH Nonradioactive Gene Mapping készlettel állapítottuk meg, amit a Lambda FIX II® vektor alkalmazásához terveztek. A fág DNS helyett a fentiekben leírt pSK vektorokból a Notl-gyel kivágott plazmid-DNS-t használtuk fel. A térképezési eljárás a gyártó által ajánlottal lényegében megegyezett. Röviden, a T3 (a szekvencia száma: 14) és a T7 (15. számú szekvencia) primerszekvenciák helyzetének megállapításához, amelyek mindegyik inszert Notl helyének közelében találhatók, a plazmidokat az M13 (12. számú szekvencia) és az M13 reverz primerekkel (13. számú szekvencia) (ezek a pBluescript SW+ többszörös klónozási régióival komplementerek) szekvenáltuk.
M13 GTAAAACGACGGCCAGT (12. számú szekvencia)
M13rev GGAAACAGCTATGACCATG (13. számú szekvencia)
T3 AATTAACCCTCACTAAAGGG (14. számú szekvencia)
T7 GTTAATACGACTCACTATAGGGC (15. számú szekvencia)
A T7 és a T3 primereket a géntérképezésnél próbaként használtuk. Mivel az EF-1a inszertről kimutattuk, hogy egy belső Notl hellyel rendelkezik, a fragmenspárok (4,5 kb/11 kb és 7 kb/12 kb) előreláthatóan a primerszekvenciák egyikét vagy másikát tartalmazzák, és így meghatároztuk, hogy a 4,5 és a 12 kb nagyságú inszertek a T7 primerszekvenciát, míg a 7 kb nagyságú inszert a T3 szekvenciát tartalmazza.
Az EF-1a kódolórégióját tartalmazó 4,5 kb és 7 kb nagyságú fragmenseket Notl-emésztéssel vágtuk ki a vektorból. Az emésztett DNS-t agarózgélen elkülönítettük, az elkülönített fragmenseket a gélből kivágtuk, és mindegyik DNS-t QIAGEN QIAquick Gél Extraction készlet felhasználásával, a gyártó által javasolt eljárással, a gélcsíkokból extraháltuk. A térképezést úgy végeztük, hogy a részleges restrikciós emésztésekben hét különböző enzimet használtunk fel. A reakciók termékeit agarózgélen elkülönítettük, a DNS-t DuralonUV Nylon membránra vittük át, és a próbákat T3 vagy T7 primerek felhasználásával végeztük. A csíkok méretét meghatároztuk, és a restrikciós térképeket megszerkesztettük.
A pSK/EF1.7 plazmidot az eredetileg a PCR-szűréshez tervezett belső primerekkel (a szekvenciák száma: 4-től -11-ig, az előzőekben leírt 95-136-95-143 primerek) szekvenáltuk, tettük ezt azért, hogy az előzőleg azonosított fehérje génszekvenciájában biztosak legyünk. A kódolórégió irányát meghatároztuk, és egy további prímért terveztünk a belső Notl hely szekvenálásához. A teljes kódolórégió szekvenciáját meghatároztuk, amit ezután a Hayashi és munkatársai által leírt várható cDNS-szekvenciával egybevetettünk [Hayashi és munkatársai: J. Biochem., 106, 560-563 (1989)]. A szekvenciaanalízis megerősítette, hogy az izolált DNS valóban ugyanazt az EF-1a szekvenciát kódolja, mint amit Hayashi és munkatársai leírtak [Hayashi és munkatársai: J. Biochem., 106, 560-563 (1989)]. Ráadásul az első exon szekvenciája 5’-végén azonos volt a korábban izolált hörcsög EF-1 a cDNS-szekvenciával [Hayashi és munkatársai: J. Biochem., 106, 560-563 (1989)], és hét intront azonosítottunk, amelyek hasonló struktúrát adtak, mint az ismert humán homológ.
A 7 kb nagyságú fragmens szekvenciája és restrikciós térképe azt mutatta, hogy az 5’ szegélyezőintron egy része és a promoter a 12 kb nagyságú fragmens
HU 225 764 Β1 belső Notl helyéhez képest 5’-irányban helyezkedik el. A belső Notl helyhez képest 5’-irányban lévő Spel/Notl 3 kb nagyságú fragmenst a 12 kb nagyságú fragmensből kivágtuk, és az előzőleg ugyanezekkel az enzimekkel emésztett pBluescriptSK+ vektorba szubklónoztuk. Az eredményül kapott plazmidot pSK/EF1.3-nak neveztük. A restrikciós helyek megerősítésére a 3 kb nagyságú fragmenst a fentiekben leírtaknak megfelelően Kpnl és Clal restrikciós endonukleázokkal térképeztük és az Erase-a-Base készlettel (Promega, Madison, Wl) szekvenáltuk, az 5' és a 3' kinyúló végek elkészítéséhez a Clal, illetőleg a Kpnl helyeket használtuk fel. A szekvenciaanallzis olyan régiókat mutatott, amelyek promotert, TATA boxot és az 5’ nem transziáit szegélyezőrégióban egy 0,9 kb nagyságú intront tartalmazott, ez utóbbi ugyanolyan hosszú volt, mint a humán génben lévő első intron [Uetsuki és munkatársai: J. Bioi. Chem, 264, 5791-5798 (1989)]. A CHEF1 promoter és az 5’ intron szekvenciáját az 1-es szekvenciaszámon tettük közzé, az intron 2699-től 3641-ig tartó nukleotidokat tartalmaz.
3. példa
A CHEF szabályozó DNS jellemzése
A hörcsög EF-1a gén 5’-irányú, ATG startkodont tartalmazó szekvenciáját az 1-es számon tettük közzé. A legtöbb azonosítható transzkripciós faktor kötőhely az EF-1a gén kezdő ATG kodonjától 5’-irányban lévő 1,56 kb nagyságú Sacl fragmenstől 3'-irányban helyezkedik el. Az expressziós vektorok mindegyike a fentiekben leírt CHEF1 szekvencián kívül a Sacl helytől 5’irányban egy 2 kb nagyságú CHEF1 fragmenst is tartalmaz.
A szekvenálás azt mutatta, hogy a startkodontól 5’irányban, hozzávetőleg 1 kb távolságra, egy tökéletes konszenzus TATA box található, és az 5’-irányban lévő Sacl hely és a TATA box közötti régióban számos potenciális transzkripciós faktor kötőhely van [Boulikas: Crit. Rév. Euk. Gene Exp., 4, 117-321 (1994)], beleértve az Sp1 helyeket (16. vagy 17. számú szekvencia), az ATF helyeket (18. számú szekvencia) és az NF-1 helyeket (19. számú szekvencia).
GGCGGG (16. számú szekvencia)
GGGCGG (17. számú szekvencia)
TGACGY(C/A)R (18. számú szekvencia) TTGGCN5_e(T/G)CCR (19. számú szekvencia)
Ugyanúgy, mint a humán EF-1a génnél [Uetsuki és munkatársai: J. Bioi. Chem., 264, 5791-5798 (1989)], a hörcsög EF-1a génje is tartalmaz egy 5’ nem transziáit régióban lévő (UTR) 943 bp nagyságú intront, ami az összekapcsolódás donor- és akceptorszekvenciáinak helyzetéből nyilvánvaló. A Geneworks DNS-analízis-programjának alkalmazásakor az 5' UTR-ben lévő intron szekvenciájáról kimutatták, hogy a humán génben lévő szekvenciával 62%-ban azonos. Az 5’ intron számos potenciális transzkripciós faktor kötőhelyet tartalmaz, számuk durván megegyezik a Sacl hely és a TATA box között lévő kötőhelyekkel, ami arra utal, hogy az EF-1a promoterről történő optimális átírásához az 5’ intron fontos lehet.
A Geneworks DNS-analízis-programjának alkalmazásával kiderült, hogy a CHEF1 szekvencia az 5’ Sacl restrikciós helytől 3’-irányban van, de ez nem tartalmazza azt az intronszekvenciát, ami a humán EF-1a szekvenciával 64%-ban azonos. A humán és a hörcsög szabályozószekvenciáiban lévő Sp1 transzkripciós faktor kötőhelyek összehasonlítását az 1. táblázatban mutatjuk be. A teljes humán EF-1a génszekvenciáját [Uetsuki és munkatársai: J. Bioi. Chem., 264, 5791-5798 (1989)] a 29-es számon tettük közzé.
1. táblázat
Az Sp1 helyek távolsága a TATA boxtól
| A nukleotidok helyzete | |
| Hörcsög | Humán |
| -424 | -335 |
| -304 | -220 |
| -183 | -208 |
| -170 | 432 |
| -151 | 476 |
| -135 | 573 |
| -26 | 581 |
| 63 | 690 |
| 156 | |
| 168 | |
| 257 | |
| 261 | |
| 425 | |
| 495 | |
| 589 | |
| 594 | |
| 688 |
4. példa
Az expressziós plazmidok előállítása A következő példákban használt plazmidok közül többet a következő eljárásokkal állítottunk elő.
A pSV2-dhfr plazmidot (ATCC hozzáférési száma:
37146) Sphl/BamHI restrikciós enzimekkel emésztettük, és az 1,8 kb nagyságú dihidrofolát-reduktázt (DHFR) kódoló fragmenst (1-es fragmens) tisztítottuk. A DHFR-t kódoló fragmens az SV40 promoter/operátor és a dhfr génhez viszonyítva 5’- és 3'-irányban elhelyezkedő poliadenilációs szekvenciákat tartalmazott. A pSL1190 plazmidot (Pharmacia) Hindlll-mal emésztettük, a kinyúló végeket a Hindlll helyek megsemmisítése érdekében Klenow-val feltöltöttük, és a csonka végű DNS-eket újra ligáltuk, az így kapott pSL1190H plazmidot ezután Sphl/BamHI enzimekkel emésztettük, és a 3,4 kb nagyságú fragmenst megtisztítottuk (2-es fragmens). A pSL1190H-dhfr kialakítása érdekében a pSV2-dhfr 1,8 kb nagyságú fragmensét (1-es
HU 225 764 Β1 fragmens) a pSL1190H 3,4 kb nagyságú fragmenséhez (2-es fragmens) ligáltuk.
Több restrikciós hely eltávolítása érdekében a pSL1190H-dhfr plazmidot a következőképpen módosítottuk. A plazmidot először Xbal/Nhel enzimekkel emésztettük (ez az emésztési pár komplementer kinyúló szálakat eredményez), és a lineáris plazmid ismételt ligálásával az Xbal és a Nhel helyeket megszüntettük. A második lépésben a pSL1190H-dhfr plazmidot Hindlll-mal emésztettük, a kinyúló végeket Klenow-val feltöltöttük, és a Hindlll hely megszüntetése érdekében a plazmidot újra ligáltuk. A harmadik lépésben a pSL1190H-dhfr plazmidot Bglll-vel emésztettük, a kinyúló végeket Klenow-val feltöltöttük, és a Bglll hely megszüntetése érdekében a plazmidot újra ligáltuk.
Ezen három lépés eredményeként egy olyan pSL1190H-dhfr plazmidot kaptunk, amelyből az Xbal, Nhel, Hindlll és a Bglll restrikciós helyek hiányoztak. A pSL1190H-dhfr/NXHB plazmidot ezután EcoRI/BamHI-gyel emésztettük, és ezután az NPB1/NPB2 linkért beépítettük [amit az NPB1 és a NPB2 (20. és 21. számú szekvencia) oligonukleotidok összeolvasztásával készítettünk] azért, hogy egy olyan pSL/dhfr/Notl plazmidot nyerjünk, amiben csak egy Notl hasítási hely van.
NPB1 GATCGCGGCCGCGTTTAAACGGATCC (20. számú szekvencia)
NPB2 AATTGGATCCGTTTAAACGCGGCCGC (21. számú szekvencia)
Az eredményül kapott pSL/dhfr/Notl plazmidot Asp718/BamHI-gyel emésztettük, és az 1,8 kb nagyságú DHFR kódolófragmenst kitisztítottuk (3-as fragmens). A pRc/CMV plazmidot (Invitrogen, San Diego, CA) a CMV-promoter és a borjú növekedési hormon (BGH) poliadenilációs DNS-ének eltávolítása érdekében Asp718/Bglll-vel emésztettük, és a 3,7 kb nagyságú fragmenst tisztítottuk (4-es fragmens). A pRc/DHFR/Notl plazmid előállításához az 1,8 kb nagyságú, DHFR-t kódoló, pSL/dhfr/Notl fragmenst az SV40 promoter/operátorral és a poliadenilációs szekvenciával (3-as fragmens) együtt hozzáligáltuk a 3,7 kb nagyságú pRc/CMV fragmenshez.
A pRc/CMV plazmidot Asp718/Xbal-gyel emésztettük, és a 0,8 kb nagyságú fragmenst, ami a BGH poliadenilációs DNS-t kódolja, tisztítottuk (5-ös fragmens). A pRc/DHFR/Notl plazmidot BamHI/Asp718-cal emésztettük, és a 4 kb nagyságú fragmenst, a DHFRrel, az SV40 promoter/operátorral és a poliadenilációs szekvenciákkal, tisztítottuk (6-os fragmens). A pCEP4 plazmidot (Invitrogen, San Diego, CA) Bglll/Sacl-gyel emésztettük, és a 0,7 kb nagyságú fragmenst, ami a CMV-promotert kódolja, tisztítottuk (7-es fragmens). A pDC1 plazmid kialakítása érdekében a 0,8 kb nagyságú pRc/CMV fragmenst (5-ös fragmens), a 4 kb nagyságú pRc/DHFR/Notl fragmenst (6-os fragmens), a 0,7 kb nagyságú pCEP4 fragmenst (7-es fragmens) és a szintetikus Sacl/Xbal adaptorfragmenst egy négyutas ligációban egyesítettük. Az adaptert az SXP1 és az SXP2 oligonukleotidok összeolvasztásával készítettük el.
SXP1 (22. számú szekvencia)
5'-CGTTTAGTGAACCGTCAGATCTACATAACAACATTCCTC
CTCTAAAGAAGCCCCAAGCTTGATATCTGCAGAATTCT-3’
SXP (23. számú szekvencia)
5’-CTAG AG AATTCTGC AG AT ATC AAG CTTGGGGCTTCTITAGAG
GAGGAATGTTGTTATGTAGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCT-3'
Ezért a pDC1 plazmid a CMV-promotert, egy polilinkerrégiót, egy BGH-ból származó poliadenilációs helyet, valamint az SV40 promoter szabályozása alatt álló dhfr gént és az SV40 összekapcsoló/poliadenilációs szekvenciát tartalmazza.
A pDC1 plazmidot Xhol-gyel emésztettük, a 4,5 kb nagyságú fragmenst, amiből a CMV-promoter és a BHG poliadenilációs DNS hiányzik, izoláltuk és a pDCil plazmid kialakításához ligáltuk. A pDCil plazmidot ezután BamHI/Xhol-gyel emésztettük, és a 4,5 kb nagyságú fragmenst tisztítottuk (8-as fragmens). A pDCi2 plazmid kialakításához a 4,5 kb nagyságú pDCil fragmenst (8as fragmens) a BamHI/Sall-emésztett PCR-fragmenshez ligáltuk, ami a CMV-promoter részleges szekvenciáját kódolja, és amit a 96-13 és a 96-14 primerek felhasználásával készítettünk (a pDC1 plazmidot templátként használtuk fel).
Primer 96-13 (24. számú szekvencia)
5’-AGTTCAGTCGACGGCGCGCCAACCCGGGAATCC
GGACGGGATCTATACATTGAATCAATATTGGCA-3’ Primer 96-14 (25. számú szekvencia) ATGTCAGGATCCACGCGGAACTCCATATATGGGCTATGAACT
A pDCi2 plazmidot Asp718/Spel-gyel emésztettük, és a 4,2 kb nagyságú fragmenst, ami a DHFR-t az SV40 promoter/operátor és a poliadenilációs szekvenciákat tartalmazza, tisztítottuk (9-es fragmens), és a pDC1 plazmidot Asp718/Spel-gyel emésztettük, és az
1,5 kb fragmenst, ami a részleges CMV-promoter DNS-t a BGH poliadenilációs jellel együtt tartalmazza, tisztítottuk (10-es fragmens). A pDC31 plazmid kialakításához a 4,2 kb pDCi2 fragmenst (9-es fragmens) az
1,5 kb pDC1 (10-es fragmens) fragmenshez ligáltuk. A pDC31 plazmid a pDC1 plazmidtól abban különbözik, hogy több új restrikciós helyet építettünk bele, beleértve a CMV-promoter 5’-végén a Smal és az Ascl hasítási helyeket. A pDC31 plazmidot Notl-gyel emésztettük, a DNS kinyúló végét T4 polimeráz felhasználásával megszüntettük, és a pDC36 plazmid létrehozása és a Notl hely eltávolítása érdekében ismét ligáltuk. A pDC36 plazmid ugyanolyan, mint a pDC31 plazmid, de már Notl helyet nem tartalmaz.
A pDC36 plazmidot Apal/BamHI-gyel emésztettük, a kinyúló végeket feltöltöttük, és a pDC38 plazmid létrehozásához az emésztett plazmidot újra ligáltuk. A pDC38 plazmid ugyanolyan, mint a pDC36 plazmid, azzal a különbséggel, hogy a borjú növekedési hormon poliadenilációs szekvenciáját tartalmazó Apal/BamHI fragmenst eltávolítottuk belőle. A pDC38 plazmidot
HU 225 764 Β1
Smal/HindlII-mal emésztettük, és a 4,6 kb nagyságú fragmenst, amiből a CMV-promoter DNS hiányzik, tisztítottuk (11-es fragmens).
A pSK/EF1.3 plazmidot EcoRV/Notl/Pvul-gyel emésztettük, és a 2,9 kb nagyságú fragmenst, ami a CHEF1 promotert és az 5'-irányú DNS-szekvenciát tartalmazza, tisztítottuk (12-es fragmens). A Bluescript SW+ll(pSK+) plazmidot Notl-gyel emésztettük, és a
2,9 kb fragmenst tisztítottuk (fragmens 13). A pSK/EF1.7 plazmid kialakításához a lambda fág 7.4ből származó 7 kb nagyságú NotI fragmenst a
2,9 pSK+ fragmenshez ligáltuk (13-as fragmens).
A pSK* plazmidot HindlII/Notl-gyel emésztettük, és a 2,9 kb nagyságú fragmenst tisztítottuk (14-es fragmens). A pSK/EF1.7 plazmidot Notl/Ncol-gyel emésztettük, és a 620 bp nagyságú fragmenst, ami a CHEF1 5' nem transziáit intron egy részét tartalmazza, tisztítottuk (15-ös fragmens). Az 5' intron maradék részét tartalmazó 123 bp nagyságú HindlII/Ncol-emésztett PCR-fragmenst, amit a 96-36 és a 96-45 primerekkel és a pSK/EF1.12 templáttal készítettünk el, tisztítottuk (16-os fragmens).
Primer 96-36 (26. számú szekvencia)
GGCTTAGCTCCGAGGAGGG
Primer 96-45 (27. számú szekvencia)
CGTGACAAGCTTGGTTTTCACAACAC
A teljes CHEF1 5' intront tartalmazó pSK/5’EF-1 plazmid előállításához a 2,9 kb pSK+ fragmenst (14-es fragmens), a 620 bp pSK/EF1.7 fragmenst (15-ös fragmens) és a 123 bp Hindlll/Ncol fragmenst (16-os fragmens) egymáshoz ligáltuk.
A pSK/5'EF-1 plazmidot HindlII/Notl-gyel emésztettük, és a 0,7 kb nagyságú 5' intront tartalmazó fragmenst tisztítottuk (17-es fragmens). A pDEF1 plazmid létrehozásához a 4,6 kb pDC38 fragmenst, amiből a CMV-promoter (11-es fragmens) hiányzik, a 2,9 kb fragmenst a CHEF1 promoter és az 5’-irányú szekvenciákkal (12-es fragmens) és a teljes 5’ intront tartalmazó 0,7 kb nagyságú pSK/5'EF-1 fragmenst (17-es fragmens) egy háromutas ligálásban egyesitettük. így a pDEF1 plazmid az 5' CHEF1 szabályozó DNS-t, a dhfr gént és az SV40 replikációs origót tartalmazza, amely utóbbi nagy kópiaszámú replikációt biztosít egy SV40 T-antigénnel transzformált sejtvonalban.
A pDEF1 plazmidot Hindill-mal emésztettük, a kinyúló végeket feltöltöttük, ezután a plazmidot Notl-gyel emésztettük, és a 2,6 kb nagyságú fragmenst, ami a CHEF1 promotert és az 5’-irányú DNS-szekvenciákat, valamint a részleges 5’ intronszekvenciát tartalmazza, tisztítottuk (18-as fragmens). A pDEF1 plazmidot Notl/Asp718-cal emésztettük, és az 1,3 kb nagyságú fragmenst, ami az 5’ intron maradék részét tartalmazza, tisztítottuk (19-es fragmens). A pDC38 plazmidot Smal/Asp718-cal emésztettük, és a DHFR-t kódoló 4 kb nagyságú fragmenst, ami ezenkívül az SV40 promoter/operátor és a poliadenilációs DNS-t is tartalmazza, tisztítottuk (20-as fragmens). A pDEF2 plazmid kialakításához a 2,6 kb pDEF1 fragmenst (18-as fragmens), az 1,3 kb pDEF1 fragmenst (19-es fragmens) és a 4 kb pDC38 fragmenst (20-as fragmens) egy háromutas ligációban egyesítettük. Az Escherichia coli XL-1 Blue törzsben lévő pDEF2 plazmidot 1997. március 4-én az American Type Culture Collection letéteményes szervnél (12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, hozzáférési száma: 98343) letétbe helyeztük. A pDEF2 plazmid abban különbözik a pDEF1 plazmidtól, hogy a CHEF1 TATA boxtól 5’-irányban lévő 0,3 kb Hindlll/Spel fragmensét eltávolítottuk, és polilinkerrégiójában csak egy Hindlll helyet tartalmaz. A pDEF2 plazmidot azokban az esetekben használtuk, amikor az expresszálandó gén saját poliadenilációs helyet tartalmazott.
A plazmid linearizálásához a pDFF2 plazmidot Asp718/Xbal-gyel emésztettük, de ez az emésztés a replikációs origót is eltávolítja, ezután a 7,4 kb nagyságú fragmenst tisztítottuk (21-es fragmens). A pDC1 plazmidot Asp718/Xbal-gyel emésztettük, és a 0,8 kb nagyságú fragmenst, beleértve az origóáthelyezés vagy a DNS-replikáció, valamint a BGH poliadenilációs szekvenciákat, tisztítottuk (22-es fragmens). A 7,4 kb nagyságú pDEF2 fragmenst (21-es fragmens) és a 0,8 kb pDC21 fragmenst (22-es fragmens) a pDEF10 plazmid kialakítása érdekében egyesítettük, az eredményül kapott plazmid ugyanúgy különbözik a pDEF1-től, mint ahogy a pDEF2-től. A pDEF10 a pDEF2-től abban különbözik, hogy a pDEF10 3’-végi polilinkerén lévő borjú növekedési hormon génből származó poliadenilációs hellyel rendelkezik.
A plazmid linearizálásához a pDEF10 plazmidot HindlII/Xbal-gyel emésztettük, és a 8,2 kb nagyságú fragmenst tisztítottuk (23-as fragmens). A humán kemokin-makrofág eredetű kemokint (MDC) kódoló pDC1/MDC plazmidot HindlII/Xbal-gyel emésztettük, és az MDC-t kódoló 0,4 kb fragmenst tisztítottuk (24-es fragmens). A 8,2 kb pDEF10 fragmens (23-as fragmens) ligálása a 0,4 kb nagyságú pDC1/MDC fragmenssel (24-es fragmens) a pDEF10/MDC.1 plazmid kialakításához vezetett.
A pRc/CMV plazmidot BamHI-gyel emésztettük, a kinyúló végeket Klenow-val feltöltöttük, a plazmidot Asp718-cal emésztettük, és az 1,5 kb nagyságú fragmenst tisztítottuk (25-ös fragmens). A pDC1 plazmidot Notl-gyel emésztettük, a kinyúló végeket Klenow-val feltöltöttük, a plazmidot Asp718-cal emésztettük, és a
3,9 kb nagyságú fragmenst tisztítottuk (26-os fragmens). Az 1,5 kb pRc/CMV fragmenst (25-ös fragmens) a pNCX plazmid kialakítása érdekében a 3,9 kb nagyságú pDC1 fragmenshez (26-os fragmens) ligáltuk.
A pNCX plazmid megegyezik a pDC1 plazmiddal, azzal az eltéréssel, hogy a dhfr gént kicseréltük a neomicinrezisztencia (NeoR)-génre. A pNCX plazmidot Asp718/Pvul-gyel emésztettük, és a 2,1 kb nagyságú fragmenst tisztítottuk (27-es fragmens). A pDEF1 plazmidot Asp718/Pvul-gyel emésztettük, és az 5,9 kb nagyságú fragmenst tisztítottuk (28-as fragmens). A 2,1 kb pNXC fragmenst (27-es fragmens) a pNEF1 plazmid kialakítása érdekében az 5,9 kb pDEF1 fragmenshez (28-as fragmens) ligáltuk. A pNEF1 plazmid a pDEF1 plazmidtól abban különbö10
HU 225 764 Β1 zik, hogy a bakteriális neomicinrezisztencia-gént hordozza, amely a neomicin- vagy a G418-rezisztenciát kódolja. A pNEF1 plazmidba a kívánt gének inszertálását általában Hindi ll/Xbal-gyel emésztett fragmensek felhasználásával egy háromutas ligációban végeztük, miután a plazmidot részlegesen Hindlll-mal emésztettük, mivel a plazmidnak két Hindlll helye van.
5. példa
A DG44 sejtek transzfektálása és a termelés mérésének vizsgálati módszere A DG44 sejtek egy adott plazmiddal történő transzfekciójához 50-100 pg plazmidot Pvul vagy Ascl restrikciós enzimekkel végzett emésztéssel linearizáltunk. Ahol egyszerre két plazmidot használtunk a CHO-sejtek transzfekciójához, a plazmidot emésztetlenül hagytuk. A transzformáció előtt a plazmidokat etanollal kicsaptuk és kétszer 70% etanollal mostuk. A DNS-üledéket rövid idő alatt megszárítottuk és 400 pl steril desztillált vízben felvettük. A felszuszpendált DNS-hez 400 μΙ steril 2 X HeBS-t adtunk (40 mM HEPES-NaOH, pH=7,0; 274 mM NaCI; 10 mM KCI; 1,4 mM Na2HPO4; 12 mM dextróz). A nem transzfektált DG44 sejteket hipoxantinnal (0,01 mM végkoncentrációban) és timidinnel (0,0016 mM végkoncentrációban) kiegészített DMEM/F-12 médiumban tenyésztettük, ezt „HT”-nek neveztük el. A nem transzfektált és a transzfektált DG44 sejtek növesztésekor a táptalajhoz 5-10 térfogat% végkoncentrációig dializált FBS-t adtunk. A transzfekcióhoz a DG44 sejteket kezelt 150 cm2-es polisztirén szövettenyésztő edényekben (Corning) körülbelül 50%-os vagy annál kisebb telítettségig növesztettük. A tenyészedényből a felülethez nem tapadt sejteket tenyészfolyadék-leszívással eltávolítottuk, majd a letapadt sejtekhez kalcium-magnézium-mentes foszfáttal puffereit sóoldatban (CMF-PBS: 2,7 mM KCI;
1,5 mM KH2PO4; 137 mM NaCI; 8,1 mM Na2HPO4) oldott, 0,0125%-os besugározott tripszines oldatból (Worthington Biochemical Corporation) 4 ml-t adtunk, és 37 °C-on több percig inkubáltuk. Ezután a foetalis borjúszérumot tartalmazó tenyészfolyadékból 4 ml-t adtunk, a sejtek koncentrációját meghatároztuk, és a 2*107 sejtet tartalmazó aliquot részeket centrifugálással ülepítettük. Az üledékeket CMP-PBS-ben egyszer mostuk, és a HeBS-t és a kívánt plazmid-DNS-t tartalmazó 0,8 ml oldatban újra felvettük. A felszuszpendált sejteket szobahőmérsékleten egy 0,4 cm-es Gene Pulser küvettába (Bio-Rad) átraktuk, és ezt egy Bio-Rad GenePulser elektroporációs készülékbe helyeztük. A sejteket szobahőmérsékleten, 290 V és 960 pFD (9-11,5 ms pulzus) kondenzátorfeltöltési értéknél elektroporáltuk. A sejteket körülbelül 10 percig a küvettában tartottuk, mielőtt a 10 ml 5-10% dializált FBS-sel és HT-vel kiegészített DMEM/F-12-t hozzáadtuk. A pusztulási rátát ezen a ponton meghatároztuk (tripánkékes kizárási teszt), és ez tipikusan körülbelül 50%-nak adódott. A sejteket ezután centrifugálással ülepítettük, majd 2 ml 5-10% dializált FBS-sel és HTvel kiegészített DMEM/F-12-t („nem szelektív táptalaj”) adtunk hozzá, és 10 cm2-es polisztirol szövettenyésztő lemezekbe vittük át. Két napig tartó növesztés után, ez általában elég a telítettség eléréséhez, a sejteket a fentiekben leírt tripszines kezeléssel a lemezek felületéről eltávolítottuk, és az 5-10% dializált FBS-sel kiegészített, de HT-t nem tartalmazó, DMEM/F-12-ben („szelektív táptalaj”) készített különböző hígításokat a 10 cm2-es lemezekbe kiraktuk. Körülbelül két hét után a lemezekből a transzfektált kolóniákat (tipikusan több mint 1000 mindegyik transzfekciónál) a fentiekben leírt tripszines kezeléssel eltávolítottuk, majd a szelekciós táptalaj hozzáadása után a sejtek koncentrációját meghatároztuk. Mindegyik transzfekciónál a 10 ml szelektív táptalajt tartalmazó 10 cm2-es lemezekhez legalább 2*106 sejtet adtunk. A sejteket a táptalaj kimerüléséig tartottuk fenn, addigra a túlzsúfoltság miatt a lemezek felületéről a sejtek leváltak. A pusztuló tenyészetekből származó felülúszót az átlagterméktiterre nézve ELISA-val megvizsgáltuk.
6. példa
Rekombináns fehérje termelés
CHEF1 felhasználásával
Az 5. példában leírt DG44 sejteket a 3. táblázatban közzétett, CHEF1-gyel működésében kapcsolt géneket hordozó plazmidokkal transzfektáltuk. Az egyes gének kódjait tartalmazó plazmidokkal transzformált bakteriális törzseket vizsgálatuk után 1997. április 1-jén az American Type Culture Collection letéteményes szervnél (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852) a 2. táblázatban közzétett hozzáférési számokon letétbe helyeztük.
2. táblázat
A plazmidok hozzáférési száma
| A kódolt gén | A plazmid neve | Hozzáférési száma |
| ICM3 ellenanyag nehéz lánca | pDEF1/ICM3H.2 | 98381 |
| ICM3 ellenanyag könnyű lánca | PNEF1/ICM3L.3 | 98382 |
| 23F2G ellenanyag nehéz lánca | PDEF1/F2GH.1 | 98383 |
| 23F2G ellenanyag könnyű lánca | PNEF1/F2GL.1 | 98384 |
| Kitináz | pDEFI/CTN.1 | 98385 |
| Vérlemezke-aktiválófaktor-acetilhidroláz (PAFAH) | PDEF2/HPH.4 | 98386 |
| Makrofágeredetű kemokin (MDC) | pDEF10/MDC.1 | 98387 |
A transzfektánsok szelekciója után mindegyik transzfektánsból egy kolóniahalmazt (több mint 200) mindegyik lemez felületéről tripszines kezeléssel eltávolítottunk, és mindegyik transzfekcióból azonos számú sejtet újra lemezeltünk, és a sejteket a táptalaj ki11
HU 225 764 Β1 merüléséig tenyésztettük. A felülúszókat eltávolítottuk, és a fehérje mérésére szolgáló módszerrel, ELISA-val vagy enzimes mérési módszerrel vizsgáltuk. Az eredményeket a 3. táblázatban mutatjuk be.
3. táblázat
A fehérjeexpresszió mértéke CHEF1 és CMV szabályozószekvenciák alkalmazásakor
| A fehérje titere | ||
| A transzfekcióhoz használt gén | CMV | CHEF1 |
| ICM3 H+L | 554 | 1 862 |
| ICM3 H+L | 288 | 2 153 |
| Hu23F2G H+L | 337 | 1 848 |
| MDC | 360 | 2 100 |
| PAF-AH | 590 | 6 574 |
| Kitináz-1 | 3200 | 2 300 |
| Kitináz-2 | 8900 | 12 850 |
A kitinázexpressziót vizsgáló első kísérlet kivételével (a 3. táblázatban kitináz-1-gyei jelölve) a CHEF1 szabályozó DNS használata jelentősen nagyobb fehérjetermelést eredményezett, a növekedés 3-11-szeresen nagyobb, mint CMV-vel történő expressziókor.
A kitinázmérési módszerben megfigyelt expressziócsökkenés jellegének meghatározásához, vajon ez egy anomália, vagy egy megismételhető és/vagy csak a kitinázra jellemző sajátosság, a kísérletet másodszor is megismételtük, de két egymástól független transzfekciót végeztünk, mivel az első kísérletben egyszeri transzfekciókor szokatlanul kis számú transzfektánst kaptunk. Ráadásul a kitinázaktivitás mérésére egy másik eljárást használtunk, ami sokkal pontosabb technika, mint az, amit az első kísérletben alkalmaztunk.
A második kísérletben kapott transzfektánsok száma inkább megfelelt az előzőleg megfigyelt transzfekciós eredménynek, amikor a pDEF2 plazmidot alkalmaztuk, ami a többi kísérletben a CMV-t tartalmazó plazmiddal történő transzfekcióval szemben 150%-nál nagyobb számú transzfektánst eredményezett. A második kísérletből származó eredmények (a 3. táblázatban kitináz-2-vel jelölve) önmagukban következetesek voltak, és az eredmények további hiteléül szolgálnak, még akkor is, ha a CMV-promoterrel szembeni fehérjetúlexpresszió mértéke kevesebb volt (hozzávetőlegesen 1,4-szeres), mint az előzőekben megfigyelt más fehérjéknél.
7. példa
Rekombináns fehérje termelés különböző hosszúságú CHEF1 szabályozó DNS-ek felhasználásával
A pDEF14 jelű expressziós vektort is elkészítettük, ami az EF-1a gén 5’ szegélyező DNS-ének további 8 kb nagyságú részét is tartalmazza. A pDEF14 plazmid abban különbözik a pDEF2 plazmidtól, hogy hozzávetőleg 11,7 kb nagyságú hörcsögből származó EF-1 α 5' szegélyező DNS-t tartalmaz, míg a pDEF2 ugyanezen szekvenciának csak 3,3 kb nagyságú részét hordozza. A pDEF14 plazmid a DHFR expressziós kazetta 3'-végével szomszédos hörcsög 3' szegélyező DNS-ének 4 kb nagyságú részét is tartalmazza. A nagyobb pDEF14 plazmidot az alábbiakban leírtaknak megfelelően állítottuk elő.
Röviden, a 2,6 kb Ascl/Notl CHEF1 fragmenst a pDEF2 plazmidból eltávolítottuk, és a 11 kb Ascl/Notl CHEF1 fragmenst beépítettük helyére. A nagyobb szekvencia inszertálása először az Xbal hely módosítását tette szükségessé, ami az EF-1a kezdést biztosító ATG-hez és egy Ascl helyhez képest 5’-irányban
11.7 kb-ra helyezkedik el. Ráadásul a 4 kb nagyságú, tompa végű Nsil/Sall fragmenst, ami egy olyan CHEF1 szegélyezőszekvenciát tartalmaz, ami az EF-1a stopkodontól 3’-irányban 118 bp-ra lévő Nsil helynél kezdődik, a DHFR expressziós kazetta 3'-végénél lévő Pmel/Sall helyre inszertáltuk, ami a gének expressziós célból történő inszertálásához alkalmazható polilinkerrégiótól 3’-irányban van. A teljes 3’ DNS-szekvenciát, ami az EF-1a gén stopkodonjánál kezdődik, 28-as számon tettük közzé. Az ilyen plazmidokkal transzformált baktériumokat 1997. április 9-én az American Type Culture Collection letéteményes szervnél (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852) 98398 hozzáférési számon letétbe helyeztük. Az eredményül kapott pDEF14 plazmid egyetlen Xbal és Notl helyet, valamint több Hindlll helyet tartalmaz, ezért az expresszióra szolgáló plazmidokba történő géninszertáláshoz egy háromutas ligálás vált szükségessé. Például a gén plazmidba inszertálható egy Hindlll/Xbal fragmens ligálásával, ahol a kívánt gént a pDEF14-ből származó 737 bp Notl/Hindlll fragmens és a pDEF 14-ből származó
19.7 kb Xbal/Notl fragmens együtt tartalmazza.
Ennek a vektornak és a pDEF2 vektornak, ami az
EF-1a 5’ szegélyezőrégiójának kisebb részét tartalmazza, alkalmazásával összehasonlítottuk a segítségükkel létrehozott fehérjeexpressziót. Egy előkísérletben a 23F2G ellenanyag mind nehéz, mind könnyű láncát kódoló DNS-ét mind a pDEF2, mind a pDEF14 vektorokba szubklónoztuk, és az expresszió szintjét a fenti 5. példában leírt DG44 sejtek transzfekcióját követően meghatároztuk. A mindkét ellenanyagláncot kódoló géneket a vektorokban lineárisan elrendeztük, és mindkét gén expresszióját külön-külön plazmidban a CHEF1 szekvencia jelenlétében indítottuk el. Mindkét plazmidban a két lánc kódolórégióit azonos 4,3 kb nagyságú humán lgG4 nem transziáit régiójából származó DNS választotta el egymástól.
Az eredmények azt mutatják, hogy a pDEF14 plazmid segítségével a 23F2G ellenagyag expressziója a hosszabb CHEF1 szekvenciával négyszer nagyobb volt, mint a kisebb pDEF2 szekvenciával. Ez az eredmény meglepő, mivel a legtöbb azonosítható pDEF14 transzkripciós kötőfaktorhely a pDEF2 DNSszekvenciájában is megtalálható. Ezért lehetséges, mert egy vagy több további és azonosítatlan transzkrip12
HU 225 764 Β1 ciós kötőhely vagy enhancerszekvencia található a pDEF14 plazmid CHEF1 DNS-én. Alternatívaként, a nagyobb CHEF1 DNS azzal az előnnyel járhat, hogy a 3’ DNS-szekvencia néhány sajátságának eredményeként a transzkripciót növeli. 5
A találmány előzőekben közzétett, bemutató jellegű példáinak többféle módosítása és változtatása a szakirodalomban jártas szakemberektől elvárható. Ennek megfelelően a csatolt igénypontok csak olyan korlátozásokat tartalmaznak, amelyek ezek helyébe léphetnek.
Claims (34)
1. Tisztított és izolált hörcsög EF-1a transzkripciós szabályozó DNS, amely lehet
a) az 1. számú szekvencialista szerinti nukleinsavszekvenciát tartalmazó DNS;
b) az 1. számú szekvencialista szerinti nukleinsavszekvencia egy részét tartalmazó DNS, amely a szabályozó DNS szekvenciájához működésében kötött gén transzkripcióját képes elősegíteni;
c) az 1. számú szekvencialista szerinti nukleotidban lévő mintegy 2114-től 3656-ig terjedő nukleotidból álló DNS;
d) 11,7 kb hörcsög EF-1a szabályozó DNS-szekvencia a pDEF14 plazmidban (ATCC letét száma: 98389);
e) a 28. számú szekvencialista szerinti nukleinsavszekvenciát tartalmazó DNS;
f) egy hörcsög szabályozó DNS-szekvencia, amely hibridizálja az 1. számú szekvencialista szerinti DNSállományt olyan körülmények között, amely végső mosást tartalmaz 65 °C-on 2*SSC-t és 0,1% SDS-t tartalmazó pufferben; vagy
g) az 1. számú szekvencialista szerinti ATG indítókodontól 5’-irányban 1,56 kb-t tartalmazó DNS.
2. Az 1. igénypont szerinti DNS, amelyben a szabályozó DNS az 1-es számú szekvencialista szerinti nukleinsavszekvenciát tartalmazza.
3. Az 1. igénypont szerinti DNS, amelyben a szabályozó DNS az 1-es számú szekvencialista szerinti nukleinsavszekvencia egy olyan részét tartalmazza, amely a szabályozó DNS szekvenciájához működésében kötött gén transzkripcióját képes elősegíteni.
4. A 3. igénypont szerinti DNS, amelyben a szabályozó DNS az 1-es számú szekvencialista szerinti nukleinsavszekvencla mintegy 2114-től 3656-ig terjedő nukleotidjait tartalmazza.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti DNS-t tartalmazó gazdasejt, amelyben a szóban forgó DNS az EF-1a kódolószekvenciájához nem működőképesen kötött.
6. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti DNS-t tartalmazó vektor, amelyben a szóban forgó DNS az EF-1 a kódolószekvenciájához nem működőképesen kötött.
7. A 6. igénypont szerinti vektorral transzformált vagy transzfektált gazdasejt.
8. Kiméra polinukleotid, amely egy fehérjét kódoló DNS-szekvenciához működőképesen kötve az 1. igénypont szerinti hörcsög EF-1a szabályozószekvenciát tartalmazza, ahol a szóban forgó fehérjét kódoló DNS-szekvencia a hörcsög EF-1a-tól eltérő fehérjét kódol.
9. A 8. igénypont szerinti kiméra polinukleotid, amelyben a szabályozó DNS az 1-es számú szekvencialista szerinti nukleinsavszekvenciát tartalmazza.
10. A 8. igénypont szerinti kiméra polinukleotid, amelyben a szabályozó DNS az 1-es számú szekvencialista szerinti nukleinsavszekvencia egy részét tartalmazza, ahol ez a nukleinsavszekvencia-rész a szabályozó DNS-hez működőképesen kötött gén transzkripcióját képes elősegíteni.
11. A 10. igénypont szerinti kiméra polinukleotid, amelyben a szabályozó DNS az 1-es számú szekvencialista szerinti nukleinsavszekvencia mintegy 2114-től 3656-ig terjedő nukleotidját tartalmazza.
12. A 8. igénypont szerinti kiméra polinukleotid, amelyben a szóban forgó fehérjét kódoló DNS-szekvencia a hörcsögsejtekre nézve az EF-1a-tól eltérő endogén fehérjét kódol.
13. A 8. igénypont szerinti kiméra polinukleotid, amelyben a DNS-szekvencia a hörcsögsejtekre nézve heterológ fehérjét kódol.
14. A 8-13. igénypontok bármelyike szerinti kiméra polinukleotiddal transzformált vagy transzfektált gazdasejt.
15. A 8-13. igénypontok bármelyike szerinti kiméra polinukleotidot tartalmazó expressziós plazmid.
16. A 15. igénypont szerinti expressziós plazmid, amely ezenkívül a 28-as számú szekvencialista szerinti nukleinsavszekvenciát tartalmazza.
17. A 16. igénypont szerinti expressziós plazmid, amelyben a 28-as számú szekvencialista szerinti nukleinsavszekvencia a kiméra polinukleotidhoz képes 3'helyzetben helyezkedik el.
18. A 15. igénypont szerinti expressziós plazmiddal transzformált vagy transzfektált gazdasejt.
19. A 16. vagy 17. igénypont szerinti expressziós plazmiddal transzformált vagy transzfektált gazdasejt.
20. A pDEF2 plazmid (ATCC letét száma 98343).
21. A pDEF14 plazmid (ATCC letét száma 98398).
22. A pDEF1/ICM3H.2 plazmid (ATCC letét száma 98381).
23. A pNEF1/ICM3L.3 plazmid (ATCC letét száma 98382).
24. A pDEF1/F2GH.1 plazmid (ATCC letét száma 98383).
25. A pNEF1/F2GL.1 plazmid (ATCC letét száma 98384).
26. A pDEF1/CTN.1 plazmid (ATCC letét száma 98385).
27. A pDEF2/HPH.4 plazmid (ATCC letét száma 98386).
28. A pDEF10/MDC.1 plazmid (ATCC letét száma 98387).
29. A 20-28. igénypontok bármelyike szerinti expressziós plazmiddal transzformált vagy transzfektált gazdasejt.
30. Eljárás valamely érdeklődésre számot tartó gén gazdasejtben történő transzkripciójának növelésére, azzal jellemezve, hogy a gazdasejt genomiális DNS-ében az 1. igénypont szerinti hörcsög EF-1 a szabályozó DNS-t integráljuk olyan pozícióban, ahol az az érdeklődésre számot tartó génhez működőképesen kötődik.
31. A 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóban forgó DNS a beépüléshez további célszekvenciát is tartalmaz.
HU 225 764 Β1
32. A 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóban forgó gazdasejt kínai hörcsög petefészek sejt.
33. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az érdeklődésre számot tartó gén a kínai hör- 5 csög petefészek sejtekre nézve endogén.
34. A 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kívánt gén a kínai hörcsög ovariális sejtekre nézve heterológ, és a kínai hörcsög ovariális sejtek genomiális DNS-ébe stabilan beépül.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/847,218 US5888809A (en) | 1997-05-01 | 1997-05-01 | Hamster EF-1α transcriptional regulatory DNA |
| PCT/US1998/008906 WO1998049289A1 (en) | 1997-05-01 | 1998-05-01 | HAMSTER EF-1α TRANSCRIPTIONAL REGULATORY DNA |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0004137A2 HUP0004137A2 (en) | 2001-03-28 |
| HUP0004137A3 HUP0004137A3 (en) | 2003-08-28 |
| HU225764B1 true HU225764B1 (en) | 2007-08-28 |
Family
ID=25300098
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0004137A HU225764B1 (en) | 1997-05-01 | 1998-05-01 | Hamster ef-1alpha transcriptional regulatory dna |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5888809A (hu) |
| EP (2) | EP0920498B1 (hu) |
| JP (1) | JP2000513948A (hu) |
| CN (2) | CN100430477C (hu) |
| AT (1) | ATE318900T1 (hu) |
| AU (1) | AU742561B2 (hu) |
| BR (1) | BR9804896B1 (hu) |
| CZ (1) | CZ296544B6 (hu) |
| DE (1) | DE69833649T2 (hu) |
| DK (1) | DK0920498T3 (hu) |
| ES (1) | ES2263206T3 (hu) |
| HK (1) | HK1022719A1 (hu) |
| HU (1) | HU225764B1 (hu) |
| IL (1) | IL127897A (hu) |
| NO (1) | NO323853B1 (hu) |
| PL (1) | PL195604B1 (hu) |
| PT (1) | PT920498E (hu) |
| RU (2) | RU2249617C2 (hu) |
| SK (1) | SK285664B6 (hu) |
| WO (1) | WO1998049289A1 (hu) |
Families Citing this family (119)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8183344B2 (en) * | 1996-04-24 | 2012-05-22 | University Of Michigan | Inactivation resistant factor VIII |
| US6479256B1 (en) | 1998-03-04 | 2002-11-12 | Icos Corporation | Lectomedin materials and methods |
| KR20000046969A (ko) * | 1998-12-31 | 2000-07-25 | 이선경 | 이종 유전자 유래의 유전자 발현 조절요소를 포함하는 강력한전사 활성을 가진 진핵세포 발현벡더 |
| EP1325341A2 (en) * | 2000-10-12 | 2003-07-09 | Icos Corporation | Modulation of ligand binding/enzymatic activity of alpha beta proteins |
| WO2002050264A2 (en) * | 2000-12-18 | 2002-06-27 | Wyeth | Promoters and recombinant expression constructs |
| ATE466941T1 (de) * | 2001-07-04 | 2010-05-15 | Chromagenics Bv | Dns-sequenzen mit anti-repressor-aktivität |
| ATE500331T1 (de) * | 2002-06-14 | 2011-03-15 | Chromagenics Bv | Verfahren zur gleichzeitigen herstellung von multiplen proteinen; vektoren und zellen, die hierfür verwendung finden |
| WO2003106674A2 (en) * | 2002-06-14 | 2003-12-24 | Chromagenics B.V. | Means and methods for regulating gene expression |
| DK1573058T3 (da) * | 2002-12-18 | 2012-01-16 | Chromagenics Bv | Fremgangsmåde til forbedring af proteinproduktion |
| WO2004056986A2 (en) * | 2002-12-20 | 2004-07-08 | Chromagenics B.V. | Means and methods for producing a protein through chromatin openers that are capable of rendering chromatin more accessible to transcription factors |
| EP2380985B1 (en) | 2003-09-23 | 2014-01-01 | University of North Carolina at Chapel Hill | Cells expressing vitamin K epoxide reductase and use thereof |
| US8999667B2 (en) * | 2004-11-08 | 2015-04-07 | Chromagenics B.V. | Selection of host cells expressing protein at high levels |
| US8039230B2 (en) * | 2004-11-08 | 2011-10-18 | Chromagenics B.V. | Selection of host cells expressing protein at high levels |
| US20060195935A1 (en) | 2004-11-08 | 2006-08-31 | Chromagenics B.V. | Selection of host cells expressing protein at high levels |
| MX2007004595A (es) * | 2004-11-08 | 2007-08-15 | Chromagenics Bv | Seleccion de celulas hospederas que expresan proteinas en altas concentraciones. |
| US20060172382A1 (en) | 2004-11-08 | 2006-08-03 | Chromagenics B.V. | Selection of host cells expressing protein at high levels |
| CA2590284A1 (en) * | 2004-12-08 | 2006-06-15 | Icos Corporation | Recombinant method for making multimeric proteins |
| AU2005329450A1 (en) | 2005-03-15 | 2006-09-28 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for producing active Vitamin K-dependent proteins |
| WO2007008848A2 (en) | 2005-07-07 | 2007-01-18 | Seattle Genetics, Inc. | Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the c-terminus |
| JP5171621B2 (ja) | 2005-07-07 | 2013-03-27 | シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド | フェニルアラニン側鎖修飾をｃ末端に有するモノメチルバリン化合物 |
| US7807409B2 (en) * | 2005-10-21 | 2010-10-05 | Roche Palo Alto Llc | Method for the recombinant expression of a polypeptide |
| CA2624685C (en) | 2005-10-28 | 2014-06-03 | Ulrich Goepfert | Protein expression in rodent cells |
| EP1969127B8 (en) * | 2005-12-21 | 2017-12-13 | Aptevo BioTherapeutics LLC | Method of producing biologically active vitamin k dependent proteins by recombinant methods |
| WO2007081336A1 (en) * | 2006-01-13 | 2007-07-19 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Mammalian vectors for high-level expression of recombinant proteins |
| EP2208792B1 (en) | 2006-05-17 | 2015-05-06 | Hoffmann-La Roche AG | Polypeptide producing cells |
| US20090203077A1 (en) * | 2006-06-30 | 2009-08-13 | The Regents Of The University Of Michigan | Method of producing factor viii proteins by recombinant methods |
| AU2007269233B2 (en) * | 2006-06-30 | 2011-06-09 | Cnj Holdings, Inc. | Method of producing Factor VIII proteins by recombinant methods |
| TW200902544A (en) | 2007-03-13 | 2009-01-16 | Hoffmann La Roche | Peptide-complement conjugates |
| EP1975228A1 (en) | 2007-03-28 | 2008-10-01 | Fachhochschule Mannheim | Polynucleotides for enhancing expression of a polynucleotide of interest |
| US20100081187A1 (en) | 2007-04-26 | 2010-04-01 | Griffith Michael J | Recombinant vitamin k dependent proteins with high sialic acid content and methods of preparing same |
| US8314225B2 (en) * | 2007-06-29 | 2012-11-20 | Hoffman-La Roche Inc. | Heavy chain mutant leading to improved immunoglobulin production |
| US8771988B2 (en) | 2007-10-12 | 2014-07-08 | Hoffmann-La Roche Inc. | Protein expression from multiple nucleic acids |
| CA2705486C (en) | 2007-11-19 | 2019-04-02 | Celera Corporation | Lung cancer markers and uses thereof |
| CN102046205A (zh) | 2008-04-24 | 2011-05-04 | 凯尔特药物Peg有限公司 | 具有延长的半衰期的因子ix缀合物 |
| US8163551B2 (en) | 2008-05-02 | 2012-04-24 | Seattle Genetics, Inc. | Methods and compositions for making antibodies and antibody derivatives with reduced core fucosylation |
| EP2462237B1 (en) | 2009-08-06 | 2015-12-23 | Cmc Icos Biologics, Inc. | Methods for improving recombinant protein expression |
| DK2478107T3 (da) | 2009-09-15 | 2019-01-02 | Medimmune Ltd | Celler til transient ekspression og anvendelser deraf |
| JP5851410B2 (ja) | 2009-10-30 | 2016-02-03 | シーエヌジェイ ホールディングス、インク． | 組換えビタミンｋ依存性タンパク質の生成法 |
| EP2339009A1 (en) | 2009-12-22 | 2011-06-29 | Sandoz Ag | Cold inducible promoter sequences |
| MA34091B1 (fr) | 2010-03-31 | 2013-03-05 | Boehringer Ingelheim Int | Anticorps anti-cd40 |
| UA112062C2 (uk) | 2010-10-04 | 2016-07-25 | Бьорінгер Інгельхайм Інтернаціональ Гмбх | Cd33-зв'язувальний агент |
| PT2635601T (pt) | 2010-11-04 | 2016-09-27 | Boehringer Ingelheim Int | Anticorpos anti-il-23 |
| EP2655607A4 (en) | 2010-12-21 | 2014-05-14 | Univ North Carolina | METHOD AND COMPOSITIONS FOR PRODUCING ACTIVE VITAMIN K-DEPENDENT PROTEINS |
| EP2753644A1 (en) | 2011-09-09 | 2014-07-16 | Universiteit Utrecht Holding B.V. | Broadly neutralizing vhh against hiv-1 |
| EP3378535B1 (en) | 2011-10-28 | 2023-01-04 | Prothena Biosciences Limited | Humanized antibodies that recognize alpha-synuclein |
| CA2852994C (en) | 2011-11-16 | 2023-02-14 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Anti il-36r antibodies |
| MX2014007262A (es) | 2011-12-22 | 2014-08-01 | Hoffmann La Roche | Sistema de exhibicion de anticuerpos de longitud completa para celulas eucarioticas y su uso. |
| SI2794878T1 (sl) | 2011-12-22 | 2020-07-31 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Organizacija ekspresijskega vektorja, postopki izdelave nove proizvodne celice in njihova uporaba za rekombinantno proizvodnjo polipeptidov |
| SG11201403443WA (en) | 2011-12-22 | 2014-07-30 | Hoffmann La Roche | Expression vector element combinations, novel production cell generation methods and their use for the recombinant production of polypeptides |
| CA2863953A1 (en) | 2012-01-27 | 2013-08-01 | Neotope Biosciences Limited | Humanized antibodies that recognize alpha-synuclein |
| CN104254778A (zh) | 2012-02-10 | 2014-12-31 | 西雅图遗传学公司 | Cd30+癌症的检测和治疗 |
| US20130230901A1 (en) * | 2012-02-14 | 2013-09-05 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Process for making recombinant antidote to factor xa inhibitor |
| EP4039275A1 (en) | 2012-05-03 | 2022-08-10 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Anti-il-23p19 antibodies |
| UA118441C2 (uk) | 2012-10-08 | 2019-01-25 | Протена Біосаєнсиз Лімітед | Антитіло, що розпізнає альфа-синуклеїн |
| CA2892038C (en) | 2012-11-20 | 2021-12-28 | Darrel W. Stafford | Methods and compositions for modified factor ix proteins |
| CN105209625B (zh) | 2013-03-12 | 2019-03-29 | Cmc依科斯生技制品公司 | 使用杂合chef1启动子的改善重组蛋白表达 |
| EP2970453B1 (en) | 2013-03-13 | 2019-12-04 | Prothena Biosciences Limited | Tau immunotherapy |
| US10513555B2 (en) | 2013-07-04 | 2019-12-24 | Prothena Biosciences Limited | Antibody formulations and methods |
| RU2535871C1 (ru) * | 2013-07-10 | 2014-12-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ") | Плазмида для экспрессии в клетке китайского хомячка, клетка китайского хомячка - продуцент белка с Gla-доменом и способ получения белка с Gla-доменом |
| WO2015004633A1 (en) | 2013-07-12 | 2015-01-15 | Neotope Biosciences Limited | Antibodies that recognize islet-amyloid polypeptide (iapp) |
| WO2015004632A1 (en) | 2013-07-12 | 2015-01-15 | Neotope Biosciences Limited | Antibodies that recognize iapp |
| JP2017501848A (ja) | 2013-11-19 | 2017-01-19 | プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド | 便秘症状からのレビー小体病の免疫療法のモニター |
| EA033604B1 (ru) | 2014-01-31 | 2019-11-08 | Boehringer Ingelheim Int | Молекула анти-baff антитела, фармацевтическая композиция, содержащая эту молекулу, способы ее применения и кодирующий ее изолированный полинуклеотид |
| JP2017512772A (ja) | 2014-03-12 | 2017-05-25 | プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド | Ｌｇ１〜３に特異的な抗ラミニン４抗体 |
| TW201623331A (zh) | 2014-03-12 | 2016-07-01 | 普羅帝納生物科學公司 | 抗黑色素瘤細胞黏著分子（ｍｃａｍ）抗體類及使用彼等之相關方法 |
| JP6728053B2 (ja) | 2014-03-12 | 2020-07-22 | プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド | 抗ｍｃａｍ抗体及び関連する使用方法 |
| EP3116907A1 (en) | 2014-03-12 | 2017-01-18 | Prothena Biosciences Limited | Anti-laminin4 antibodies specific for lg4-5 |
| US10562973B2 (en) | 2014-04-08 | 2020-02-18 | Prothena Bioscience Limited | Blood-brain barrier shuttles containing antibodies recognizing alpha-synuclein |
| EP3172339A1 (en) | 2014-07-24 | 2017-05-31 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Biomarkers useful in the treatment of il-23a related diseases |
| TWI781507B (zh) | 2015-01-28 | 2022-10-21 | 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 | 抗甲狀腺素運送蛋白抗體 |
| TWI711631B (zh) | 2015-01-28 | 2020-12-01 | 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 | 抗甲狀腺素運送蛋白抗體 |
| TWI786505B (zh) | 2015-01-28 | 2022-12-11 | 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 | 抗甲狀腺素運送蛋白抗體 |
| EP3253786A4 (en) | 2015-02-06 | 2018-10-17 | The University of North Carolina at Chapel Hill | Optimized human clotting factor viii gene expression cassettes and their use |
| AU2016247921A1 (en) | 2015-04-14 | 2017-08-31 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Methods of treating diseases |
| KR20180023900A (ko) | 2015-05-12 | 2018-03-07 | 신티뮨, 인크. | 인간화된 친화성 성숙 항-FcRn 항체 |
| JP2018530540A (ja) | 2015-09-16 | 2018-10-18 | プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド | 巨細胞動脈炎、リウマチ性多発筋痛症又は高安動脈炎の処置又は予防のための抗ｍｃａｍ抗体の使用 |
| WO2017046774A2 (en) | 2015-09-16 | 2017-03-23 | Prothena Biosciences Limited | Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of giant cell arteritis, polymyalgia rheumatica or takayasu's arteritis |
| TWI733695B (zh) | 2015-09-18 | 2021-07-21 | 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 | 治療發炎性疾病之方法 |
| WO2017070167A1 (en) | 2015-10-20 | 2017-04-27 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for modified factor ix fusion proteins |
| WO2017149513A1 (en) | 2016-03-03 | 2017-09-08 | Prothena Biosciences Limited | Anti-mcam antibodies and associated methods of use |
| WO2017153955A1 (en) | 2016-03-09 | 2017-09-14 | Prothena Biosciences Limited | Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of granulomatous lung diseases |
| WO2017153953A1 (en) | 2016-03-09 | 2017-09-14 | Prothena Biosciences Limited | Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of granulomatous lung diseases |
| MX2018012410A (es) | 2016-04-15 | 2019-02-21 | Boehringer Ingelheim Int | Metodos para tratar enfermedades inflamatorias. |
| KR20190015704A (ko) | 2016-04-25 | 2019-02-14 | 신티뮨, 인크. | 인간화된 친화성 성숙 항-fcrn 항체 |
| KR20230070336A (ko) | 2016-05-02 | 2023-05-22 | 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 | 타우 인식 항체 |
| WO2017191559A1 (en) | 2016-05-02 | 2017-11-09 | Prothena Biosciences Limited | Tau immunotherapy |
| UA124148C2 (uk) | 2016-05-02 | 2021-07-28 | Протена Біосайенсіс Лімітед | Антитіла, що розпізнають тау |
| WO2017208210A1 (en) | 2016-06-03 | 2017-12-07 | Prothena Biosciences Limited | Anti-mcam antibodies and associated methods of use |
| EP3478714A2 (en) | 2016-07-02 | 2019-05-08 | Prothena Biosciences Limited | Anti-transthyretin antibodies |
| EP3478716A2 (en) | 2016-07-02 | 2019-05-08 | Prothena Biosciences Limited | Anti-transthyretin antibodies |
| EP3478715A2 (en) | 2016-07-02 | 2019-05-08 | Prothena Biosciences Limited | Anti-transthyretin antibodies |
| JP6818134B2 (ja) | 2016-09-29 | 2021-01-20 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | ポリペプチド産生細胞を選択するための改善された方法 |
| US20180105588A1 (en) | 2016-10-14 | 2018-04-19 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Methods of treating diseases |
| EP3601350A1 (en) | 2017-03-27 | 2020-02-05 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Anti il-36r antibodies combination therapy |
| BR112019022906A2 (pt) | 2017-05-02 | 2020-05-26 | Prothena Biosciences Limited | Anticorpos que reconhecem tau |
| US10793634B2 (en) | 2017-06-09 | 2020-10-06 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Anti-TrkB antibodies |
| AU2017434556A1 (en) | 2017-09-28 | 2020-04-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Dosing regimes for treatment of synucleinopathies |
| CN111801424A (zh) | 2018-01-10 | 2020-10-20 | Agc生技制品公司 | 双向chef1载体 |
| WO2019151865A1 (en) | 2018-02-05 | 2019-08-08 | Stichting Vu | Inverse agonistic anti-us28 antibodies |
| WO2019156566A1 (en) | 2018-02-12 | 2019-08-15 | Umc Utrecht Holding B.V. | Bispecific molecules comprising gamma-delta tcr and t-cell or nk cell binding domain |
| WO2019226050A2 (en) | 2018-05-24 | 2019-11-28 | Wageningen Universiteit | Novel viral anti-infective reagents |
| WO2019235923A1 (en) | 2018-06-04 | 2019-12-12 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Role for low density lipoprotein receptor-related protein 10 in progressive brain diseases |
| JP2021529754A (ja) | 2018-06-29 | 2021-11-04 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 自己免疫疾患の処置における使用のための抗ｃｄ４０抗体 |
| CN110904127A (zh) | 2018-09-18 | 2020-03-24 | 瓦赫宁恩研究基金会 | 非洲猪瘟病毒疫苗 |
| WO2020080941A1 (en) | 2018-10-16 | 2020-04-23 | Umc Utrecht Holding B.V. | Anti- low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6 antibodies |
| KR20210094610A (ko) | 2018-11-26 | 2021-07-29 | 포티 세븐, 인코포레이티드 | c-Kit에 대한 인간화 항체 |
| WO2020130838A2 (en) | 2018-12-21 | 2020-06-25 | Qvq Holding B.V. | Antibodies for preventing or treating candidiasis |
| SG11202108414UA (en) | 2019-03-03 | 2021-08-30 | Prothena Biosciences Ltd | Antibodies recognizing tau |
| WO2020185479A1 (en) | 2019-03-08 | 2020-09-17 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Anti-il-36r antibody formulations |
| KR20220019660A (ko) | 2019-04-02 | 2022-02-17 | 이뮨튠 비.브이. | 면역-자극성 조성물 및 이의 용도 |
| US11267880B2 (en) | 2019-05-09 | 2022-03-08 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Anti-Sema3A antibodies and their uses for treating eye or ocular diseases |
| TW202115112A (zh) | 2019-06-27 | 2021-04-16 | 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 | 抗-angpt2抗體 |
| TW202126685A (zh) | 2019-09-24 | 2021-07-16 | 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 | 抗nrp1a抗體及其用於治療眼或眼部疾病之用途 |
| IL298431A (en) | 2020-05-26 | 2023-01-01 | Boehringer Ingelheim Int | Anti-pd-1 antibodies |
| JP2024505674A (ja) | 2021-02-05 | 2024-02-07 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 抗ｉｌ１ｒａｐ抗体 |
| WO2023118312A1 (en) | 2021-12-22 | 2023-06-29 | Cdr-Life Ag | Anti-c3 antibodies and antigen-binding fragments thereof and their uses for treating eye or ocular diseases |
| CN114540352A (zh) * | 2022-02-16 | 2022-05-27 | 艾瑞生命科学技术(常州)有限公司 | 一种多核苷酸、载体元件及表达载体和宿主细胞及应用 |
| WO2024096735A1 (en) | 2022-10-31 | 2024-05-10 | Stichting Amsterdam UMC | Single domain anti-cd169 antibodies |
| WO2024101989A1 (en) | 2022-11-08 | 2024-05-16 | Stichting Amsterdam UMC | Activation inducible antigen receptors for adoptive immunotherapy |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3051411B2 (ja) * | 1989-03-14 | 2000-06-12 | 持田製薬株式会社 | 新規ｄｎａならびにそれを含有する発現プラスミド |
| US5266491A (en) * | 1989-03-14 | 1993-11-30 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | DNA fragment and expression plasmid containing the DNA fragment |
| DE69031172T2 (de) * | 1989-12-22 | 1998-03-12 | Applied Research Systems | Modifikation der endogenen genexpression mit hilfe eines regulatorischen elements mittels homologe rekombination |
| US5650294A (en) * | 1990-06-25 | 1997-07-22 | Basf Aktiengesellschaft | Isolated promoter and terminator of elongation factor 1-α |
| AU664847B2 (en) * | 1991-05-15 | 1995-12-07 | Cell Genesys, Inc. | Genomic modifications with homologous DNA targeting |
| CA2051085C (en) * | 1991-09-10 | 2001-08-21 | Shigekazu Nagata | Expression plasmids |
| TW402639B (en) * | 1992-12-03 | 2000-08-21 | Transkaryotic Therapies Inc | Protein production and protein delivery |
-
1997
- 1997-05-01 US US08/847,218 patent/US5888809A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-05-01 EP EP98920128A patent/EP0920498B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 SK SK118-99A patent/SK285664B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-05-01 EP EP06003954A patent/EP1676916A1/en not_active Withdrawn
- 1998-05-01 IL IL12789798A patent/IL127897A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-05-01 AT AT98920128T patent/ATE318900T1/de active
- 1998-05-01 DK DK98920128T patent/DK0920498T3/da active
- 1998-05-01 BR BRPI9804896-1B1A patent/BR9804896B1/pt active IP Right Grant
- 1998-05-01 ES ES98920128T patent/ES2263206T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 PT PT98920128T patent/PT920498E/pt unknown
- 1998-05-01 WO PCT/US1998/008906 patent/WO1998049289A1/en active Application Filing
- 1998-05-01 RU RU99101788/13A patent/RU2249617C2/ru active
- 1998-05-01 HU HU0004137A patent/HU225764B1/hu unknown
- 1998-05-01 PL PL98331005A patent/PL195604B1/pl unknown
- 1998-05-01 AU AU72770/98A patent/AU742561B2/en not_active Expired
- 1998-05-01 DE DE69833649T patent/DE69833649T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 CZ CZ0028099A patent/CZ296544B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-05-01 CN CNB988009137A patent/CN100430477C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 CN CNA2008101103936A patent/CN101570753A/zh active Pending
- 1998-05-01 JP JP10547444A patent/JP2000513948A/ja active Pending
-
1999
- 1999-01-04 NO NO19990025A patent/NO323853B1/no not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-03-15 HK HK00101582A patent/HK1022719A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-12-10 RU RU2004136574/13A patent/RU2004136574A/ru not_active Application Discontinuation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU225764B1 (en) | Hamster ef-1alpha transcriptional regulatory dna | |
| JP4999293B2 (ja) | 人工染色体、該染色体の使用および人工染色体の製造方法 | |
| JP5124539B2 (ja) | 人工染色体、該染色体の使用および人工染色体の製造方法 | |
| DK2173869T3 (en) | Fusion protein comprising a CASPASEDOMÆNE AND A NUKLÆRHORMONRECEPTORBINDINGSDOMÆNE AND METHODS AND USES THEREOF | |
| JP2002507895A (ja) | 段階的なトランス活性化能を有する転写活性化因子 | |
| US20110088106A1 (en) | Compositions and methods for mediating cell cycle progression | |
| CS267192A3 (en) | Expression systems | |
| KR101215855B1 (ko) | 감마-세크레타제의 억제제를 스크리닝하는 방법 | |
| EP1274854B1 (en) | Self-extinguishing recombinases, nucleic acids encoding them and methods of using the same | |
| CA2259145C (en) | Hamster ef-1.alpha. transcriptional regulatory dna | |
| KR101479671B1 (ko) | Ｃｍｐ－아세틸뉴라미닌산 히드록실라아제 타겟팅 벡터 및 그 응용 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GB9A | Succession in title |
Owner name: CMC ICOS BIOLOGICS, INC., US Free format text: FORMER OWNER(S): ICOS CORP., US |