CZ28099A3 - Transkripční regulační DNA z křeččího EF-1alfa - Google Patents
Transkripční regulační DNA z křeččího EF-1alfa Download PDFInfo
- Publication number
- CZ28099A3 CZ28099A3 CZ1999280A CZ28099A CZ28099A3 CZ 28099 A3 CZ28099 A3 CZ 28099A3 CZ 1999280 A CZ1999280 A CZ 1999280A CZ 28099 A CZ28099 A CZ 28099A CZ 28099 A3 CZ28099 A3 CZ 28099A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- dna
- plasmid
- seq
- fragment
- gene
- Prior art date
Links
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims abstract description 64
- 238000013518 transcription Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 230000035897 transcription Effects 0.000 title claims abstract description 33
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 title claims abstract description 24
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 title claims description 19
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 title claims description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 183
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 98
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 119
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 105
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 35
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 27
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 27
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 27
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 9
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 7
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 5
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims 2
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 claims 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 28
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 145
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 29
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 29
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 23
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 15
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 12
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 12
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 12
- 102000006433 Chemokine CCL22 Human genes 0.000 description 11
- 108010083701 Chemokine CCL22 Proteins 0.000 description 11
- 101150003085 Pdcl gene Proteins 0.000 description 11
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 9
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 9
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 8
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 8
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 8
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 7
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 7
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 6
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010024976 Asparaginase Proteins 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102100031538 Phosphatidylcholine-sterol acyltransferase Human genes 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 4
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 101100328086 Caenorhabditis elegans cla-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 101100028920 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cfp gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 102000017143 RNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010013845 RNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 2
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 2
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 108091029842 small nuclear ribonucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- BOFUZZAQNVYZFF-UHFFFAOYSA-N 2-(3-chlorophenyl)-3-methylmorpholine Chemical compound CC1NCCOC1C1=CC=CC(Cl)=C1 BOFUZZAQNVYZFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 101710126783 Acetyl-hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710151413 Chitinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710151415 Chitinase 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100037328 Chitotriosidase-1 Human genes 0.000 description 1
- 101710132290 Chitotriosidase-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 241000699798 Cricetulus Species 0.000 description 1
- 241000699679 Cricetulus migratorius Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 101710107327 Endochitinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710107425 Endochitinase 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100027377 HBS1-like protein Human genes 0.000 description 1
- 101001009070 Homo sapiens HBS1-like protein Proteins 0.000 description 1
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000004353 Polyethylene glycol 8000 Substances 0.000 description 1
- 102000057361 Pseudogenes Human genes 0.000 description 1
- 108091008109 Pseudogenes Proteins 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- 102100039832 Ribonuclease pancreatic Human genes 0.000 description 1
- 101710123428 Ribonuclease pancreatic Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 102000006290 Transcription Factor TFIID Human genes 0.000 description 1
- 108010083268 Transcription Factor TFIID Proteins 0.000 description 1
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 229920004482 WACKER® Polymers 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000003990 capacitor Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 235000019446 polyethylene glycol 8000 Nutrition 0.000 description 1
- 229940085678 polyethylene glycol 8000 Drugs 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ZNJHFNUEQDVFCJ-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+].OCCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 ZNJHFNUEQDVFCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Transkripční regulační DNA křeččího EF-la
Oblast techniky
Vynález se týká regulačních sekvencí DNA pocházejících z křeččího genu EF-la. Dále se vynález týká expresních konstruktů obsahujících výše uvedenou regulační DNA, hostitelských buněk transformovaných nebo transfekovaných touto regulační DNA a způsobů zvyšování transkripce genu za použití této regulační DNA. Vynález se rovněž týká expresních konstruktů obsahujících výše uvedenou regulační DNA operativně připojenou ke specifickým genovým sekvencím.
Dosavadní stav techniky
Transkripce jakéhokoliv daného eukaryontního genu se provádí pomocí jednoho ze tří enzymů, RNA polymeras, z nichž každý účinkuje na konkrétní podsoubor genů. Zatímco transkripce velkých ribosomálních RNA probíhá pomocí RNA polymerasy I a malá ribosomální RNA a tRNA se přepisují RNA polymerasou III, DNA sekvence kódující proteiny a většina malých jaderných RNA jsou transkribovány RNA polymerasou II. U každého typu genu transkripce vyžaduje interakci příslušné polymerasy s promotorovými sekvencemi genu a vznik stabilního transkripčního iniciačního komplexu. Obecně je možno uvést, že trankripce od kterékoliv ze tří polymeras také vyžaduje interakci určitého vazebného faktoru s promotorovou sekvencí a rozeznání vazebného faktoru pomocí druhého faktoru, který tak umožní interakci polymerasy se sekvencí genu. Zatímco tento mechanismus je minimálním požadavkem transkripce katalyzované RNA polymerasami I a III, proces vedoucí k transkripci katalyzované RNA polymerasou II je složitější.
Vzhledem k rozsáhlému množství genových sekvencí transkribovaných RNA polymerasou II a vzhledem ke skutečnosti, že regulační schémata pro tyto geny jsou vysoce proměnlivá ve stejné buňce a liší se také od jedné buňky ke druhé, je transkripce katalyzovaná RNA polymerasou II je kromě interakcí jiných vazebných proteinů k regulačním sekvencím DNA, jiným než je promotor, ovlivněna vazbou řady trankripčních faktorů v iniciačním komplexu. Tyto jiné vazebné proteiny mohou sloužit pro aktivaci transkripce nad bazální hladinu nebo zcela potlačují transkripci. Připojení represoru lze rovněž považovat za prostředek jak zabránit aktivaci, vzhledem k tomu, že bazální trankripční hladina u vyšších eukaryotů je normálně velmi nízká. Na druhé straně, aktivace je obvyklou konečnou odpovědí na určitý fyziologický signál a vyžaduje buď odstranění represorového vazebného proteinu nebo alteraci v chromatinové struktuře, aby se umožnil vznik aktivního transkripčního iniciačního komplexu.
Jádrem vzniku transkripčního komplexu a nezbytnou podmínkou pro bazální hladinu exprese genu je promotorova sekvence, která je označována jako TATA box a která je umístěna před transkripčním startovacím místem polymerasy
II. TATA box je vazebným místem pro všudypřítomný trankripč ní faktor označovaný jako TFIID, avšak jak již bylo uvedeno transkripce od promotorové sekvence je u většiny genů silně ovlivněna dalšími regulačními oblastmi DNA, které mohou zesilovat nebo potlačovat transkripci genu. Elementy DNA tohoto typu jsou v různých polohách vzhledem ke kódující sekvenci v genu a vzhledem k TATA boxu. Tyto další transkripční regulační elementy často pracují tkáňově nebo buněčně specificky.
Při expresi rekombinantních proteinů je zvláště důležité zvolit regulační DNA, která obsahuje sekvenci
promotoru TATA a další regulační elementy kompatibilní s transkripčním aparátem hostitelské buňky. Z tohoto důvodu se obvykle dává přednost regulačním DNA, které jsou endogenní vzhledem ke zvolené hostitelské buňce. Značného úspěchu bylo také dosaženo za použití regulační DNA odvozené od sekvencí virového genomu, vzhledem k tomu, že rozmezí hostitelů je u virů široké a že byla prokázána aktivita virových regulačních DNA v různých typech buněk. Jako příklad virových regulačních DNA, jichž se běžně využívá pro expresi rekombinantního proteinu, je možno uvést promotor/zesilovač raného genu SV40 [Dijkema et al., EMBO J. 4: 761 (1985)], koncovou dlouhou repetici DNA viru Rousova sarkomu [Gorman et al., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 79: 6777 (1982b)], fragmenty hovězího papillomaviru [Sarver et al., Mol. Cell. Biol. 1: 486 (1981)] a elementy promotoru/zesilovače lidského cytomegaloviru [Boshart et al., Cell. 41: 521 (1985)]. Přes široké rozmezí buněčných typů, na nichž byla demonstrována funkčnost virových regulačních DNA, je možné, že existují nevirové DNA elementy promotoru/zesilovače, které umožňují zvýšit transkripci rekombinantního proteinu ve specifických buněčných liniích prostřednictvím účinnějšího využití transkripčního aparátu hostitelské buňky.
V tomto oboru tedy existuje potřeba identifikovat sekvence regulační DNA promotoru/zesilovače, které fungují v homologních a heterologních typech buněk, přičemž účelem je zvýšení exprese rekombinantního proteinu a vysoký výtěžek požadovaného proteinového produktu. Zvláště důležitou potřebou je identifikovat takové regulační DNA promotoru/zesilovače, které mohou být s vysokou účinností využity v savčích buňkách, za účelem zvýšení produkce rekombinantních proteinů in vitro, které jsou glykosylovány podobným způsobem, jako je tomu u glykosylačních profilů, které jsou výsledkem exprese proteinu in vivo. U takto exprimovaných proteinů při terapeutickém nebo profylaktickém podávání existuje menší «
pravděpodobnost že budou antigenní a větší pravděpodobnost, že budou fyziologicky účinné. Regulační oblasti DNA tohoto typu jsou také snadno insertovatelné do hostitelských buněk za účelem zvýšení exprese genů, které jsou endogenní vzhledem k hostitelským buňkám nebo genům dříve zavedeným do genomu hostitelské buňky, způsoby, které jsou v tomto oboru dobře známy a rutinně využívány.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou purifikované a izolované polynukleotidy odvozené z buněk křečka, které regulují transkripci genu. Tyto polynukleotidy zahrnují regulační DNA sekvence od 5' konce do translatované oblasti genu EF-la vaječníků čínského křečka. Přednostní DNA podle vynálezu je označována jako CHEF1 regulační DNA a obsahuje přibližně
3,7 kb DNA, která sahá od restrikčního místa Spěl do iniciačního methioninového kodonu (ATG) proteinu EF-la. Předmětem vynálezu jsou rovněž polynukleotidy o méně než
3,7 kb, pokud jsou tyto menší fragmenty polynukleotidů schopny zvyšovat transkripci operativně připojeného genu. Aktivní fragmenty DNA podle vynálezu, definované schopností regulovat (tj. zesilovat) transkripci genu, jsou snadno identifikovatelné delečními studiemi, které jsou v tomto oboru dobře známé a běžně využívané. Regulační DNA podle vynálezu zahrnuje polynukleotidy izolované z přírodních zdrojů, jako buněčných kultur, jakož i polynukleotidy produkované enzymatickými nebo čistě chemickými syntetickými postupy. Podle jednoho provedení tedy vynález poskytuje způsob přípravy CHEF1 DNA z genomové knihovny. Alternativně může být DNA připravena enzymatickou syntézou, která například využívá polymerázové řetězové reakce (PCR), nebo čistě chemickou syntézou, při níž se postupně přidávají jednotlivé nukleotidy nebo se hybridizuj i a ligují překrývající se oligonukleotidy. Nejvýhodnější DNA sekvence je popsána v SEQ • ·
ID NO: 1. Předmětem vynálezu jsou dále DNA sekvence, které za stringentních podmínek hybridizují s DNA popsanou v SEQ ID NO: 1. Stringentní podmínky zahrnují promytí v pufru obsahujícím asi 2X SSC a asi 0,1% SDS při asi 65 °C nebo podmínky ekvivalentní.
Předmětem vynálezu je dále DNA plasmid obsahující regulační polynukleotidy CHEF1. Plasmidy podle vynálezu rovněž mohou obsahovat DNA sekvence kódující protein, který je předmětem zájmu, nebo RNA produkt, který je předmětem zájmu, operativně připojené k polynukleotidové sekvenci CHEF1. Dále je předmětem vynálezu hostitelská buňka transformovaná, transfekovaná a/nebo elektroporovaná polynukleotidem nebo plasmidem podle vynálezu. Plasmidová DNA podle vynálezu může být zavedena do genomu hostitelské buňky nebo se v buňce může vyskytovat ve formě uzavřeného kružnicového plasmidu. Jako přednostní plasmidy podle vynálezu, které jsou zvláště přístupné pro zavedení požadované DNA sekvence, je možno uvést plasmidy pDEF14 a pDEF2. Bakteriální hostitelská buňka transformovaná pDEF14 byla uložena ve sbírce American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 9. dubna 1997 pod přírůstkovým číslem 98389 a bakteriální hostitelská buňka transformovaná pDEF2 byla uložena ve sbírce American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 4. března 1997 pod přírůstkovým číslem 98343.
Předmětem vynálezu je také lineární DNA vektor obsahující polynukleotid CHEF1. Vektor podle vynálezu je možno získat z virového zdroje nebo ho lze syntetizovat in vitro. Předmětem vynálezu je dále hostitelská buňka transfekovaná nebo elektroporovaná se sekvencí lineárního vektoru. DNA tohoto typu je zvláště užitečná pro expresi sekvence heterologního genu operativně připojené k DNA sekvenci CHEF1 nebo pro místně cílenou homologní rekombi• · naci, při níž sekvence CHEF1 může být zavedena do genomu hostitelské buňky za účelem modulace exprese operativně připojené sekvence.
Dále je předmětem vynálezu molekula chimérické rekombinantní DNA, kde je CHEF1 DNA operativně připojena (tj. podněcuje transkripci) k sekvenci genu kódující požadovaný proteinový produkt. Chimérické molekuly jsou obecně molekulami, které obsahují domény, jež se normálně nevyskytují ve spojení s prostředím divokého typu. Chimérická DNA podle vynálezu může zahrnovat část nebo celou regulační DNA CHEF1 v asociaci s DNA sekvencí, která je odlišná od genu pro křečci protein EF-Ια. Jako proteinové produkty kódované chimérickými molekulami je možno uvést fyhiologicky aktivní proteiny, části nebo podjednotky aktivních proteinů, jakož i markerové nebo reportérové proteiny. Polynukleotidová sekvence kódující proteinový produkt může být odvozena od komplementární DNA (cDNA), genomové DNA, syntetické DNA nebo DNA odvozené kombinacemi molekul těchto typů. Proteinové produkty mohou být endogenní (tj. normálně se nalézají v genomu CHO bez transformačního, transfekčního nebo podobného zavedení DNA) vzhledem k buňkám vaječníků čínského křečka (CHO). Kromě toho proteinové produkty mohou být kódovány exogenními zdroji, přičemž exogenním zdrojem je zdroj odlišný od genomu buňky CHO, jako je například syntetická DNA. Jako přednostní chimérické molekuly podle vynálezu je možno uvést molekuly, v nichž je DNA CHEF1 operativně připojena k DNA kódující: (i) těžký řetězec anti-ICAM3 protilátky ICM3, (ii) lehký řetězec ICM3, (iii) těžký řetězec anti-CDll/CD18 protilátky hu23F2G, (iv) lehký řetězec hu23F2G, (v) chitinasu, (vi) acetylhydrolasu faktoru aktivujícího destičky (PAF-AH) a (vii) chemokin odvozený od makrofágu (MDC). Bakteriální hostitelské buňky transformované plasmidovou DNA, které obsahují chimérické molekuly (i) až (vii), byly uloženy ve sbírce American Type Culture • · ♦··· ·· · · Β · Β * ♦ · · ··· Β Β β Β * · · · · · · · Β Β Β Β · Β ··· · · ♦ Β Β γ β ······ Β Β Β » · · Β Β Β
Collection 1. dubna 1997 pod přírůstkovými čísly: (i)
98381, (ii) 98382, (iii) 98383, (iv) 98384, (v) 98385, (vi) 98386 a (vii) 98387.
Předmětem vynálezu je dále hostitelská buňka transformovaná nebo transfekovaná DNA CHEF1 podle vynálezu. Přednostní hostitelská buňka podle vynálezu je odvozena z buňky čínského křečka (Circetulus cfriseus). o jejíž regulační DNA CHEF1 by se předpokládalo, že poskytne vyšší úroveň exprese proteinu. Předmětem vynálezu jsou však také další typy buněk odvozených z jiných druhů, jako například z buněk arménského křečka (Cricetulus migratoris) nebo syrského (zlatého) křečka (Mesocricetus auratus), jakož i typy buněk odvozené od buněk jiných živočišných rodů.
Buňky mohou být získány z plic, vaječníků, peritonea, svalů, sleziny, ledvin, melanomu nebo somatického zdroje, jakož i z celého zárodku nebo celého embrya. Hostitelské buňky podle vynálezu uvedené výše, jakož i další typy buněk, například myelomatické buněčné linie, o jejichž regulační DNA CHEF1 by se předpokládalo, že poskytnou vysokou úroveň transkripce, je možno získat ze sbírky American Type Culture Collection nebo je možno je napěstovat přímo z živočišného zdroje.
Rekombinantní molekuly podle vynálezu, které obsahují regulační DNA CHEF1 umožní zvýšenou úroveň exprese mRNA operativně připojených heterologních polynukleotidů (tj. těch které se bez transfekčního, transformačního nebo podobného zavedení v hostitelském genomu normálně nenacházejí).
V závislosti na povaze polynukleotidu připojeného k sekvencím polynukleotidů CHEF1, by zvýšená transkripce vedla ke zvýšeným úrovním polypeptidů nebo zvýšeným úrovním různých druhů RNA v případech, kdy připojený polynukleotid kóduje například transferovou RNA, ribosomální RNA, malou jadernou RNA apod. Takovým druhem RNA také může být kódující RNA ··
komplementární k mRNA získané transkripcí endogenní nebo exogenní genové sekvence. Zvýšená translace polypeptidu bude nezbytně záviset na přítomnosti vhodných translačních signálů přítomných v mRNA.
Předmětem vynálezu je dále způsob zavádění DNA CHEF1 do specifických míst genomové DNA hostitelských buněk za účelem zvýšení úrovně transkripce endogenní genové sekvence. Pro zavedení celé nebo části DNA CHEFl je možno použít homologní rekombinací. V hostitelských buňkách, které jsou modifikovány tímto způsobem, je DNA CHEFl operativně připojena ke kódujícím sekvencím DNA (viz například mezinárodní přihlášky PCT WO/94/12650, WO 92/20808 a WO 91/09955. Předmětem vynálezu jsou tedy nezbytně také sekvence alterované genomové DNA se zavedenou regulační DNA CHEFl.
Alternativně je předmětem vynálezu hostitelská buňka, v níž je exogenní DNA insertována v sousedství a v operativní poloze vzhledem k DNA CHEFl přítomné v genomu. Hostitelské buňky tohoto typu zahrnují CHO buňky a insertovaná sekvence bud' nahrazuje DNA kódující EF-Ια nebo je tato sekvence vložena mezi regulační DNA CHEFl a DNA kódující EF-Ια. Do rozsahu vynálezu také spadají i jiné hostitelské buňky než CHO, do jejichž genomu byla dříve insertována DNA CHEFl a poté do operativně připojené polohy insertována další DNA.
Předmětem vynálezu je dále způsob zvyšování transkripce požadovaného genu, jehož podstata spočívá v tom, že se do hostitelské buňky zavede polynukleotid zahrnující křečci regulační sekvenci EF-Ια tak, že se tato regulační sekvence začlení do genomové DNA hostitele v operativně připojené poloze vzhledem k požadovanému genu. Dále do rozsahu vynálezu spadá způsob zvyšování transkripce požadovaného genu, jehož podstata spočívá v tom, že se do
• · • * ·· hostitelské buňky zavede polynukleotid zahrnující křeččí regulační oblast EF-Ία a zaměřovači oblast, přičemž tato zaměřovači oblast je sestavena tak, že umožňuje integrovat regulační oblast v místě operativně připojeném k požadovanému genu kódujícímu protein odlišnému od EF-Ία. Do rozsahu vynálezu také spadá způsob zvyšování transkripce genů, které jsou endogenní vzhledem k CHO buňkám, jakož i způsob zvyšování transkripce genů, které jsou exogenní vzhledem k CHO buňkám.
Rekombinantních molekul podle vynálezu je možno využívat pro produkci transgenních živočichů, při níž se do vyvíjejícího se zárodku nebo somatické buňky živočicha zavede chimérická rekombinantní DNA obsahující DNA CHEF1 operativně připojenou k sekvenci DNA, která je předmětem zájmu. Chimérické rekombinantní molekuly je možno zavádět například mikroinjekcemi, a pokud se použije zárodečných buněk, mohou všechny buňky výsledného živočicha obsahovat rekombinantní DNA podle vynálezu. Alternativně lze chimérickou rekombinantní DNA podle vynálezu zavádět do buněk embrya, a v tomto případě DNA podle vynálezu může obsažena ve velkém počtu buněk výsledného živočicha.
DNA CHEF1 je rovněž užitečná při identifikaci blízce příbuzných regulačních oblastí DNA, které mohou poskytovat expresi genu vyšší a dlouhodobější, než jakou umožňuje CHEF1. Podobně, znalost sekvencí DNA CHEF1 umožní sestrojit syntetické DNA buď syntézou de novo nebo jednoduchou nebo několikanásobnou modifikací sekvencí CHEFl, přičemž výsledné syntetické DNA budou mít sekvence podobné sekvenci CHEFl, avšak budou schopny poskytnout vyšší úrovně transkripce genu.
Následuje podrobnější popis vynálezu.
• ·
4
4444 44
♦ * 4 4 • 4 4 4 • 4 4 4 · ·
4
4 ·«
Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. V příkladu 1 je popsáno klonování křeččího genu EF-Ια a příbuzné regulační DNA CHEFl. Příklad 2 se týká subklonování a sekvenční analýzy regulační oblasti CHEFl. V příkladu 3 je charakterizován polynukleotid promotoru CHEFl a v příkladu 4 je popsán způsob sestrojení různých expresních vektorů obsahujících DNA CHEFl. V příkladu 5 je popsáno transfekční stanovení pro zjištění účinnosti regulační DNA CHEFl. V příkladu 6 je podrobně popsáno porovnání úrovní exprese rekombinantního proteinu za použití buď regulační DNA CHEFl nebo promotoru cytomegaloviru (CMV). V příkladu 7 jsou zkoumány rozdíly v regulační kapacitě DNA CHEFl o různých délkách.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Klonování CHEFl
Při pokusu izolovat křeččí homolog lidského genu EF-Ια se DNA genomová knihovna buněk vaječníku čínského křečka (CHO-K1) (Stratagene, La Jolla, CA, USA) podrobí screeningu s cDNA pro lidský EF-la.
Knihovna CHO-K1, částečně štěpená Sau3A v klonovacím vektoru Lambda FIX^II, byla získána od firmy Stratagene (La Jolla, CA, USA) v hostitelské buňce kmenů XL-l-Blue MRA a XLl-Blue MRA (P2). Hostitelské buňky se připraví podle protokolu doporučeného výrobcem s modifikacemi, které jsou stručně popsány dále.
Buňky z glycerolového zásobního roztoku se v proužcích nanesou na LB misky, které neobsahují žádné antibiotikum. Pro inokulační kapalné LB médium se vyberou jednotlivé • · • ·
9 • · • *
kolonie a nechají růst do pozdní logaritmické fáze a optické hustoty OD600 asi 0,9. Poté se buňky skladují podle protokolu navrženého výrobcem nebo se jich bezprostředně použije způsobem popsaným dále.
Při přípravě kultur pro další kultivaci se jednotlivé kolonie sejmou z misek připravených výše popsaným způsobem a použije se jich pro inokulaci. Buňky se pěstují v 50 ml LB média doplněného 0,5 ml 1M síranu hořečnatého a 1 ml 10% maltosy v deionizované vodě. Buňky se pěstují přes noc při 30°C a sklidí centrifugací ve stolní centrifuze (2000 min-1 po dobu 5 minut při teplotě místnosti) a resuspendují v lOmM síranu hořečnatém při Οθθθθ 0,5.
Fág lambda dodaný výrobcem se zředí v SM pufru (1 litr zásobního roztoku obsahuje 5,8 g chloridu sodného, 2,0 g hydrátu síranu hořečnatého, 50 ml 1M Tris-HCl, pH 7,5 a 5 ml 2% (hmotnost/objem) želatiny) na 10 až 105násobné zředění. 2μ1 roztoku o každé koncentraci se přidají ke 400 μΐ hostitelských buněk v lOmM síranu hořečnatém (Οϋθθθ asi 0,5). Výsledná směs se inkubuje 15 minut při 37°C, aby se umožnilo připojení fágu k buňkám a přidá se k ní vrchní agar (0,75% LBM agarosa o teplotě 48°C). Každá směs se dvojmo nanese na LBM agarosové misky. Z výsledků je zřejmý titr 3 x 106 jednotek tvořících plak (ρίυ)/μ1 fágového zásobního roztoku.
Připraví se čerstvé hostitelské buňky za použití výše popsaného postupu před prohledáváním knihovny. Přibližně 50 000 fágových pfu se přidá k 600 μΐ hostitelských buněk (o ODgoo přibližně 0,5) s 6,5 ml 0,75% LBM agarosy o teplotě 48°C. Směs se rozprostře na agarosové misky, které se poté inkubují přibližně 8 hodin při 37°C. Misky se poté 5 hodin chladí při 4°C, aby se zabránilo přilepení vrchní agarosy ke krycí vrstvě nitrocelulosy. Na misky se umístí membrány • ·
BA-85 o velikosti pórů 0,45 μιη (S+S, Keene, NH) a v přenosu se pokračuje po dobu 2 minut. Membrány se z misek odstraní a přenesená DNA se denaturuje 2 minuty v l,5M chloridu sodném/0,5M hydroxidu sodném. Filtry se neutralizují 5 minut v 1,5M chloridu sodném/Ι,ΟΜ Tris-HCl (pH 8,0) a blotují na papír Whatman 3-MM a zahřívají za sníženého tlaku při 80°C po dobu asi 1,5 až 2 hodin.
Jako sondy pro prohledání knihovny se použije sekvence cDNA lidského EF-Ια [Uetsuki et al., J. Biol. Chem. 264: 5791 až 5798 (1989)], u níž se dříve ukázalo, že vykazuje 95% shodu s kódující oblastí CHO EF-Ια [Hayashi et al., J. Biochem. 106: 560 až 563, 1989], která se připraví následujícím postupem. l,4kb sonda lidského EF-Ια se získá z plasmidu M0107, pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA, USA) vektoru obsahujícího cDNA lidského EF-Ια insertovaného v místě EcoRI. Za účelem prvního potvrzení, že plasmid M0107 obsahuje předpokládanou lidskou cDNA, se insert DNA sekvenuje s 3' a 5' vektorovými primery.
94-17 AGGCACAGTCGAGGCTGATC (SEQ ID NO: 2) 94-18 TTCCAGGGTCAAGGAAGGCA (SEQ ID NO: 3)
Prvních 263 párů bází insertu vykazuje více než 90% shodu s publikovanou sekvencí kódující lidský EF-Ια, a zatímco u 3' konce je přesné stanovení obtížné, malé úseky by mohly být ve shodě s předpokládanou sekvenci. Souhrnně tato shoda ukazuje, že plasmid kóduje požadovanou sekvenci.
Celý humánní insert se odstraní z plasmidu štěpením
EcoRI a pás cDNA o 1,4 kb se dvakrát podrobí gelové purifikaci za použití soupravy QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit podle pokynů výrobce. DNA se eluuje 50 μΐ TE, výsledný roztok se zkoncentruje v zařízení Microcon-10 (Amicon,
00 • 0 0 0
0 0 0
000 000
0 • 0
0« 0»
0 0 0 0 0 0
0 0 0000 00
Beverly, MA, USA) na 25 μΐ, alikvot se označí 32P-a-dTTP a 32P-a-dCTP za použití soupravy pro značení Boehringer Mannheim Random Primed DNA podle pokynů výrobce. Značená sonda se purifikuje za použití rotující kolony G50, aby se odstranily nezačleněné nukleotidy. Při porovnání purifikovaná sonda vzhledem k nepurifikovanému alikvotu vykazuje 46% zavedení radioaktivní značky a 5 x 103 cpm/min/μΐ (cpm = počet impulsů za minutu).
Nitrocelulosové membrány připravené výše popsaným způsobem se zkoušejí následujícím postupem. Připraví se zásobní roztok prehybridizačního/hybridizačního pufru, který obsahuje 22,5 ml 20X SSC, 30,0 ml 50X Denhardtova roztoku, 3,0 ml ÍM fosfátového pufru (pH 6,8) (69 ml ÍM dihydrogenfosforečnanu sodného, 31 ml ÍM hydrogenfosforečnanu sodného), 0,75 ml 20% SDS a 78,75 ml destilované vody. Za účelem prehybridizace se 1,4 ml 10 mg/ml DNA lososího sperma (Stratagene) vaří 5 minut s 0,6 ml destilované vody a poté přidá k 7 ml destilované vody a 72 ml zásobního roztoku pufru. Filtry se inkubují v prehybridizačním pufru minimálně 2 hodiny při 65°C.
Za účelem hybridizace se spojí 30 μΐ sondy, 200 μΐ 10 mg/ml DNA z lososího spermatu a 770 μΐ destilované vody. Vzniklá směs se 5 minut vaří a přidá ke 36 ml zásobního pufru se 3 ml destilované vody. Z filtrů se odstraní prehybridizačni roztok a nahradí se hybridizačním pufrem. Filtry se inkubují přes noc při 65°C, po hybridizaci se filtry 3 hodiny promývájí při 65°C se třemi výměnami pufru obsahujícího 2X SSC a 0,1% SDS, a poté na 48 hodin podrobí autoradiografii.
kolonií identifikovaných jako pozitivní se zachytí do 1 ml SM pufru obsahujícího 20 μΐ chloroformu. Za účelem vyřazení možných pseudogenů, kterým chybí jeden nebo
ΦΦ ΦΦ * Φ Φ 4
ΦΦ ΦΦ ι Φ Φ 4
Φ Φ 4
ΦΦΦΦ Φ Φ více intronů, se vytvoří páry PCR primerů tak, aby lemovaly vždy dva introny: primery 95-136 (SEQ ID NO: 4) a 95-137 (SEQ ID NO:5) lemující introny 2 a 3; primery 95-138 (SEQ ID NO: 6) a 95-139 (SEQ ID NO: 7) lemující introny 3 a 4; primery 95-140 (SEQ ID NO: 8) a 95-141 (SEQ ID NO: 9) lemující introny 4 a 5; a primery 95-142 (SEQ ID NO: 10) a 95-143 (SEQ ID NO: 11) lemující introny 6 a 7.
95-136 (SEQ ID NO 95-137 (SEQ ID NO 95-138 (SEQ ID NO 95-140 (SEQ ID NO 95-141 (SEQ ID NO: 95-142 (SEQ ID NO: 95-143 (SEQ ID NO:
4) GCCACCTGATCTACAAATGT
5) GAGATACCAGCCTCAAATTC
6) ATGTGACCATCATTGATGCC
8) GTTGGAATGGTGACAACATG
9) CAGGTTTTAAAACACCAGTC
10) AATGACCCACCAATGGAAGC
11) ACAGCAACTGTCTGCCTCAT
Předpokládaná velikost PCR produktů za použití CHO EF-Ια DNA templátu je naložena na velikosti a umístění intronů v publikované sekvenci lidského EF-Ια. Každá PCR reakce zahrnuje 2 μΐ fágu, 2,5 μΐ každého vhodného páru primerů (100 μg/ml), 2 μΐ 2mM směsi dNTP, 2,5 μΐ 10X PCR pufru (Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ, USA), 1,5 μΐ 25mM chloridu hořečnatého, 0,125 μΐ Taq polymerasy (5 jednotek/μΐ) (Perkin Elmer) a 11,8 μΐ destilované vody. Amplifikace se provádí 4 minuty při 94 °C, načež následuje 30 cyklů zahrnujících 1 minutu při 90°C, 2 minuty při 50C a 4 minuty při 72°C. Amplifikační produkty se rozdělí na 1,2% agarosovém gelu za použití IX TAE. U tří ze 47 pozitivních plaků bylo zjištěno, že kódují pravé geny (č. 2, a 40) obsahující všechny introny. Tyto tři pozitivní vzorky se podrobí třetímu prohledávání za použití následujícího postupu. Výše popsaným postupem se připraví miskové kultury a pro každý ze tří pozitivních plaků se připraví • φ ·· • · * • * • · « · ···· ··
zásobní roztoky ve zředěních 10 až 105. 20 až 50 izolovaných plaků z každého zásobního roztoku se podrobí prohledávání pomocí PCR s následujícími výsledky. Klon č. 2 vykazuje 2 pozitivní plaky (označené jako 2.12 a 2.17) z celkem 22 plaků podrobených screeningu, klon č. 7 vykazuje 1 pozitivní plak (označený jako 7.44) z 50 prohledaných plaků a klon 40 vykazuje jeden pozitivní plak (označený jako 40.24) ze 40 plaků podrobených creeningu. Z každého z těchto čtyř vzorků se dále popsaným způsobem izoluje fágová DNA.
Hostitelské buňky XL-1 Blue MRA (P2) se v proužcích navzorkují na LB agarosové misky a nechají růst přes noc při 37°C. Vybere se jediná kolonie, kterou se zaočkuje 50 ml LB média (obsahujícího 0,2% maltosu a lOmM síran hořečnatý). Kultura se nechá růst přes noc při 30°C. Buňky se sklidí pětiminutovou centrifugací při teplotě místnosti při 2000 min-1 na stolní centrifuze a resuspendují v 50 ml lOmM síranu hořečnatého. Resuspendované hostitelské buňky (50 μΐ) se smísí se 100 μΐ zásobního roztoku každého z pozitivních fágů a vzniklá směs se inkubuje 15 minut při 37°C, aby se umožnil připojení fágu k buňkám. Ke směsi třepané 2 hodiny při 37“C se přidá asi 500 μΐ LBM média a poté dalších 200 μΐ hostitelských buněk. Vzniklá směs se inkubuje dalších 15 minut při 37°C. Přidá se vrchní agar (8 ml 0,75% LBM agarosy o 48°C), načež se směs nanese na misky a nechá růst přes noc při 37°C.
Poté se ke každé misce přidá 12 ml zřeďovacího roz toku lambda (lOmM Tris-HCl, pH 7,5, lOmM síran hořečnatý) a miskami se mírně kývá po dobu 2 hodin. Zřeďovací roztok se odstraní a 10 minut centrifuguje při 4000 x g ve stolní centrifuze. K supernatantu se přidá vždy 1 μΐ RNasy A o koncentraci 1 mg/ml a DNasy I o koncentraci 1 mg/ml. Vzniklá směs se inkubuje 15 minut při 37°C a přidá se k ní stejný objem srážecího pufru (20% polyethylenglykol 8000, 2M
4« • · 4 *
4 4 4 • 44 440 η
44
4· * 4 9 4 • · 4
4 · · • · ·
4444 ·· chlorid sodný, 20mM Tris-HCl, pH 7,5, lOmM síran hořečnatý) a výsledná směs se 1 hodinu inkubuje na ledu a poté 20 minut centrifuguje při 8000 x g. Superantant se odstraní, peleta se 10 minut suší na vzduchu při teplotě místnosti, resuspenduje v 500 μΐ TE, krátce centrifuguje, aby se odstranily částice a supernatant se převede do čisté l,65ml zkumavky epitube. Do zkuvky se přidá asi 2,5μ 20% SDS (směs se 5 minut inkubuje při 65°C) a přidá se k ní 2,5 μΐ proteinasy K o koncentraci 10 mg/ml (inkubace 1 hodinu při 65°c) a 10 μΐ 5M chloridu sodného. Směs se extrahuje jednou stejným objemem směsi fenolu a chloforormu a jednou stejným objemem chloroformu. Po přídavku stejného objemu isopropylalkoholu a následné tříhodinové inkubaci při -70°C se směs 15 minut centrifuguje v epifuze při nejvyšší rychlosti. Získaná peleta se promyje 70% ethanolem, vysuší na vzduchu a resuspenduje ve 100 μΐ TE.
Příklad 2
Subklonování regulačního úseku EF-la
Za účelem stanovení velikosti insertu DNA EF-la se fágová DNA připravená způsobem popsaným v příkladu 1 štěpí Notl a výsledné restrikční fragmenty se rozdělí na 0,6% IX TAE agarosovém gelu. Kromě předpokládaných lemujících fragmentů lambda o délce 19 kb a 10 kb, klony 2.12 a 2.17 vykazují identické profily štěpení s pásy o 11 kb a 4,5 kb. Rovněž klony 7.44 a 40.24 vykazují profily štěpení shodné s pásy insertu o 12 kb a 7 kb, což spolu s údaji o štěpení klonů 2.12 a 2.17, dokazuje přítomnost vnitřního restrikčního místa Notl v DNA EF-la. Fragmenty insertu z klonů 2.12 a 7.44 se subklonují následujícím postupem.
Fágová DNA (60 μΐ) připravená způsobem popsaným v příkladu 1 se štěpí Notl a štěpená DNA se vysráží přídavkem • · μΐ 3Μ octanu sodného a 400 μΐ 100% ethanolu. Vysrážená DNA se shromáždí centrifugací, promyje ve 200 μΐ 70% ethanolu, suší 15 minut na vzduchu a resuspenduje ve 20 μΐ TE. Suspenze se 10 minut zahřívá na 65 °C a přidají se k ní 2 μΐ pufru pro elektroforézu. DNA se rozdělí elektroforézou na agarosovém gelu a pásy o 4,5 kb, 7 kb, 11 kb a 12 kb se odříznou ve formě agarosových řezů. Z každého agarosového řezu se za použití soupravy pro extrakci QIAGEN QIAquick podle pokynů výrobce extrahuje DNA. Čistota pásů a koncentrace se ověří oddělením 5μ1 alikvotu z každého izolovaného fragmentu na 0,6% IX TAE agarosovém gelu.
Jednotlivé fragmenty se odděleně ligují k pBluescriptSW+ štěpenému Notl. Při ligacích 11 a 12kb fragmentů se před zavedením insertu fragmentu linearizovaný vektor ošetří telecí alkalickou fosfatasou. 2 μΐ každého ligátu se použije pro elektroporací 40 μΐ elektrokompetentních buněk XL-1 Blue. Transformované buňky se nanesou na misky s LBM/carb agarosou se 40 μΐ 5% X-gal v dimethylformamidu (DMF) a 20 μΐ 0,ÍM IPTG na misku. Buňky se inkubují přes noc při 37°C a ráno ochladí na 4’C, aby se zvýšila intenzita modré barvy.
Při druhém výběru se bílé kolonie naproužkují na misky s agarosou LBM/carb obsahující X-gal a IPTG výše popsaným způsobem a kolonie, které jsou následujícího dne bílé, se nechají růst ve 3 ml LBM/carb přes noc při 37°C. Plasmidová DNA z bílých kolonií pěstovaných přes noc se připraví za použití WIZARD Plus Minipreps DNA Purification System (Promega, Madison, WI, USA) podle protokolu navrženého výrobcem.
Restrikční analýza izolované plasmidové DNA ukáže, že 4,5kb, 7kb a 12kb fragment se úspěšně ligoval k vektoru • · ·
• 44 44 • 4 ♦ · · · pBluescript SW+ a výsledné plasmidy se označí jako pSK/EF.1.4.5, PSK/EF1.7 a pSK/EF1.12.
Každý z plasmidů se připraví za použití soupravy QIAGEN midi prep kit podle protokolu navrženého výrobcem.
PCR se podrobí každý z nových vektorů, vytitruje se templátová DNA a použije se primerů kódující oblasti (SEQ ID NO:
až 11, jichž se používá v párech způsobem popsaným výše pro selekci pseudogenů postrádajících jeden nebo větší počet různých intronů). Titrace se provádí poté co se při vysokých koncentracích zjistí, že všechny tři fragmenty obsahují úplnou oblast pro EF-Ια, což naznačuje možnou křížovou kontaminaci tří plasmidových přípravků. Při titraci se PCR provádí v reakční směsi obsahující 2,5 μΐ templátové DNA o koncentraci 0,001, 0,01, 0,1, 1 nebo 10 ng/μΐ a zahrnující
2.5 μΐ 10X PCR pufru (Perkin Elmer), 2,0 μΐ 2mM směsi dNTP,
1.5 μΐ 25mM chloridu hořečnatého, 0,125 μΐ Taq polymerasy (Perkin Elmer) a 11,4 μΐ destilované vody. Amplifikace se provádí za následujících podmínek: 4 minuty při 94°C a poté 30 cyklů, z nichž každý zahrnuje 1 minutu při 90°C, 2 minuty při 50°C a 4 minuty při 72°C. Výsledky ukazují, že úplná oblast pro EF-Ια je umístěna v 4,5kb a 7kb fragmentu.
Pro každý insert se za použití soupravy Stratagene FLASH Nonradioactive Gene Mapping Kit určené pro použití s vektorem Lambda FIX IIsestrojí restrikční mapa. Namísto fágové DNA se však použije plasmidové DNA vyštěpené Notl z vektorů pSK výše popsaným způsobem. Pro sestrojení mapy se v podstatě použije protokolu navrženého výrobcem. Tento postup lze stručně popsat takto: plasmidy se sekvenují za použití primerů Ml3 (SEQ ID NO: 12) a reversního primerů Ml3 (SEQ ID NO: 13) (komplementárního k oblastem v mnohočetné klonovací oblasti pBluescript SW+), aby se lokalizovaly sekvence primerů T3 (SEQ ID NO: 14) a T7 (SEQ ID NO: 15) vnitřních vzhledem k místu Notl pro každý insert.
• ·
| - 19 - | «··· ·» ·· | |
| M13 | GTAAAACGACGGCCAGT | (SEQ ID NO: 12) |
| M13rev | GGAAACAGCTATGACCATG | (SEQ ID NO: 13) |
| T3 | AATTAACCCTCACTAAAGGG | (SEQ ID NO: 14) |
| T7 | GTTAATACGACTCACTATAGGGC | (SEQ ID NO: 15) |
Primerů T7 a T3 se použije jako sond pro protokol sestavení genové mapy. Jelikož se ukázalo, že insert EF-la obsahuje vnitřní místo Notl, předpokládá se, že páry fragmentů (4,5kb/llkb a 7kb/l2kb) zahrnují jednu nebo druhou sekvenci primerů, a tedy se stanovilo, že 4,5 a 12kb insert obsahuje sekvenci primeru T7, zatímco 7kb insert má sekvenci T3.
4,5 a 7kb inserty obsahující oblast pro EF-la se vyštěpí z vektoru štěpením Notl. Štěpená DNA se oddělí na agarosovém gelu a oddělené fragmenty se z gelu odříznou.
Z každého agarosového řezu se za použití soupravy pro extrakci QIAGEN QIAquick podle pokynů výrobce izoluje DNA. Mapování se provádí za použití sedmi různých enzymů při částečném restrikčním štěpení. Reakční produkty se rozdělí na agarosovém gelu, DNA se převede na nylonovou membránu Duralon-UV a zkouší za požití oligonukleotidů T3 a T7 jako sondy. Stanoví se velikost pásů a sestrojí se restrikční mapy.
Plasmid pSK/EF1.7 se sekvenuje s vnitřními primery původně zkonstruovanými pro PCR prohledávání (SEQ ID NO: 4 až 11 (dříve popsané primery 95-136 až 95-143)), čímž se ověří, že sekvencí genu je sekvence dříve identifikovaného proteinu. Stanoví se orientace kódující oblasti a sestrojí se další primery, které umožňují sekvenování k vnitřnímu místu Notl. Stanoví se sekvence celé kódující oblasti, která se poté porovná s předpokládanou sekvencí cDNA popsanou v Hayashi et al. (viz výše). Analýza sekvence potvrdí, že
44 izolovaná DNA skutečně kóduje stejnou sekvenci EF-Ια, jako DNA popsaná Hayashim (viz výše). Kromě toho je oblast prvního exonu identická s dříve publikovanou oblastí sekvence křečci cDNA EF-Ια u 5' konce (Hayashi, viz výše) a bylo identifikováno sedm intronů, z čehož se zřejmé, že struktura se podová struktuře známé pro lidský homolog.
Sekvence a restrikční mapa získaná ze 7kb fragmentu ukazuje, že část 5' lemujícího intronu a promotor jsou umístěny ve 12kb fragmentu od 5' do vnitřního místa Notl.
Z 12kb insertu se vyštěpí Spel/Notl 3kb fragment od 5' do vnitřního místa Notl a subklonuje do pBluescriptSK+ předem štěpeného stejnými enzymy. Výsledný plasmid se označí jako pSK/EF1.3. 3kb fragment se mapuje výše popsaným způsobem za použití KpnI a Clal, čímž se potvrdí restrikční místa a sekvenuje za použití soupravy Erase-a-Base (Promega, Madison, WI, USA) za použití Clal a KpnI míst pro vytvoření prodloužení 5' a 3'. Sekvenční analýza ukáže oblasti obsahující promotor, TATA box a 0,9kb intron v 5' netranslatované lemující oblasti o stejné délce jako má první intron v lidském genu [Uetsuki, 1989, viz výše]. Sekvence CHEF1 promotoru a 5' intronu je uvedena v SEQ ID NO: l, přičemž intron zahrnuje nukleotidy 2699 až 3641.
Příklad 3
Charakterizace regulační DNA CHEF
Sekvence před ATG start kodonem (včetně) křeččího genu EF-Ια je popsána v SEQ ID NO: 1. Většina identifikovatelných vazebných míst transkripčního faktoru se pravděpodobně vyskytuje od 3' do (protisměrně) Sací místa umístěného
1,56 kb od 5' do iniciačního ATG kodonu genu EF-Ια. Každý z expresních vektorů obsahuje sekvence CHEF1 popsané dále, avšak obsahuje také 2 kb CHEF1 sekvence od 5' k místu Sací.
• · • · • · « · · · «· · · ft
Sekvenování ukáže přítomnost dokonale konsensuálního TATA boxu umístěného asi 1 kb od 5' směrem k iniciačnímu ATG start kodonu a oblast mezi protisměrně umístěním místem Sací a TATA boxem obsahuje řadu možných vazebných míst pro transkripční faktor [Boulikas, Crit. Rev. Euk. Gene Exp. 4: 117 až 321 (1994)3, jako jsou místa Spi (SEQ ID NO: 16 nebo 17), místa ATF (SEQ ID NO: 18) a místa NF-1 (SEQ ID NO: 19).
GGCGGG
GGGCGG
TGACGY(C/A)R
SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17
SEQ ID NO: 18
TTGGCN5.6(T/G)CCR SEQ ID NO: 19
Podobně jako u lidského genu EF-Ια [Uetsuki et al., viz výše] se zde vyskytuje 943bp intron v 5' netranslatované oblasti (UTR) křeččího genu EF-Ια, což je zřejmé z umístění sestřihů donorní a akceptorní sekvence. Avšak za použití analytického programu Geneworks DNA bylo zjištěno, že sekvence intronu v 5' UTR je pouze ze 62 % identická se sekvencí v lidském genu. Intron 5' zahrnuje řadu možných vazebných míst pro transkripční faktory, který zhruba odpovídá počtu vazebných míst mezi místem Sací a TATA boxem, což ukazuje, že intron 5' by mohl být důležitý pro optimální transkripci řízenou promotorem EF-la.
Za použití analytického programu Geneworks DNA bylo zjištěno, že sekvence CHEF1 od restrikčního místa Sací (v protisměru) až do (ale ne včetně) intronu 5’ (po směru) je ze 64 % shodná se sekvencí lidského EF-Ια. Porovnání umístění vazebných míst transkripčního faktoru Spi lidské a křeččí regulační sekvence je uvedeno v tabulce 1. Úplná sekvence lidského genu EF-Ια [Uetsuki et al., viz výše] je uvedena v SEQ ID NO: 29.
| - | 22 - | 9 « ftft · ft · · · ·· • · | · • 5» 9 · · • ftft « ••«ft ftft ftftft |
| Tabu | 1 k a | 1 |
| Vzdálenost míst | Spi od | TATA boxu |
| Křeček Poloha nukleotidu | Člověk Poloha nukleotidu |
| -424 | -335 |
| -304 | -220 |
| -183 | -208 |
| -171 | 432 |
| -151 | 476 |
| -135 | 573 |
| -26 | 581 |
| 63 | 690 |
| 156 | |
| 168 | |
| 257 | |
| 261 | |
| 425 | |
| 495 | |
| 589 | |
| 594 | |
| 688 |
Příklad 4
Konstrukce expresních plasmidů
Četné plasmidy, jichž se používá v následujících příkladech, byly získány dále popsanými postupy.
Plasmid pSV2-dhfr (přírůstkové číslo ATCC 37146) se rozštěpí SphI/BamHI a l,8kb fragment kódující dihydrofolát reduktasu (DHFR) se přečistí (fragment 1). Fragment kódující • ·
DHFR také obsahuje sekvenci promotoru/operátoru SV40 umístěnou směrem k 5' a polyadenylační sekvenci umístěnou směrem 3' vzhledem k dhfr genu. Plasmid pSL1190 (Pharmacia) se rozštěpí HindlII, posunuté konce se doplní Klenowem a tupě zakončená DNA se znovu liguje, aby se eliminovalo místo HindlII, za vzniku plasmidu pSL1190H, který se poté štěpí Sphl/BamHI a 3,4kb fragment se přečistí (fragment 2). l,8kb fragment pSV2-dhfr (fragment 1) se liguje k 3,4kb fragmentu pSL1190H (fragmentu 2), čímž se získá plasmid pSL1190H-dhfr.
Plasmid pSL1190H-dhfr se modifikuje následujícím postupem, aby se z něj odstranilo několik restrikčních míst. Plasmid se nejprve štěpí Xbal/Nhel (čímž se získají komplementární posunuté konce) a lineární plasmid se znovu liguje, čímž se odstraní obě místa Xbal a Nhel. Při druhém postupu se pSL1190H-dhfr štěpí HindlII, posunuté konce se doplní Klenovovým fragmentem a lineární plasmid se znovu liguje, čímž se eliminuje HindlII místo. Při třetím postupu se pSL1190H-dhfr se štěpí BglII, posunuté konce se doplní Klenowem a lineární plasmid se znovu liguje, čímž se odstraní místo BglII. Výsledkem těchto tří stupňů je plasmid pSL1190H-dhfr/NXHB, z něhož byla odstraněna místa Xbal,
Nhel, HindlII a BglII. Plasmid pSL1190H-dhfr/NXHB se štěpí EcoRI/BamHI, insertuje se do něj linker NPB1/NPB2 (získaný anelací oligonukleotidů NPB1 a NPB2 [SEQ ID NO: 20 a 21]) za vzniku plasmidu pSL/dhfr/Notl, který má jedinečné restrikční místo Notl.
NPB1 GATCGCGGCCGCGTTTAAACGGATCC (SEQ ID NO: 20) NPB2 AATTGGATCCGTTTAAACGCGGCCGC (SEQ ID NO: 21)
Tento plasmid pSL/dhfr/Notl se štěpí Asp718/BamHI a l,8kb fragment kódující DHFR se přečistí (fragment 3). Plasmid • · · ·
pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA, USA) se štěpí Asp718/BglII, čímž se odstraní promotor CMV a polyadenylační DNA hovězího růstového hormonu (BGH) a 3,7kb fragment se přečistí (fragment 4). l,8kb fragment pSL/dhfr/Notl kódující DHFE obsahující sekvenci promotoru/operátoru SV40 a polyadenylační sekvenci (fragment 3) se liguje k 3,7kb fragmentu pRc/CMV (fragmentu 4) za vzniku plasmidu pRc/DHFR/Notl.
Plasmid pRc/CMV se štěpí Asp718/Xbal a 0,8kb fragment kódující polyadenylační DNA BGH se přečistí (fragment 5). Plasmid pRc/DHFR/Notl se rozštěpí BamHI/Asp718 a 4kb fragment obsahující sekvence DHFR, promotoru/operátoru SV40 a polyadenylační sekvenci se přečistí (fragment 6). Plasmid pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA, USA) se štěpí BglII/SacI a 0,7kb fragment kódující promotor CMV se přečistí (fragment 7). 0,8kb fragment pRc/CMV (fragment 5), 4kb fragment pRc/DHFR/Notl (fragment 6), 0,7kb fragment pCEP4 (fragment 7) a fragment syntetického adaptoru Sacl/Xbal se spojí čtyřcestnou ligací, čímž se získá plasmid pDCl. Adaptor se vytvoří anelací oligonukleotidů SXP1 a SXP2.
SXP1 (SEQ ID NO: 22)
5'-CGITTAGTGAACCGTCAGATCTACATAACAACATTCCTC
CTCTAAAGAAGCCCCAAGCTTGATATCTGCAGAATTCT-3'
SXP (SEQ ID NO: 23)
5'-CTAGAGAATTCTGCAGATATCAAGCTTGGGGCTTCTTTAGAG GAGGAATGTTGTTATGTAGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCT-3'
Plasmid pDCl tedy obsahuje promotor CMV, oblast polylinkeru, polyadenylační místo z BGH a gen dhfr řízený promotorem SV40 a sekvencí SV40 sestřihu/polyadenylačního místa.
Plasmid pDCl se štěpí Xhol a izoluje se 4,5kb fragment, který neobsahuje promotor CMV a polyadenylační DNA
ft · • ft ♦ ftft » • · · * • ftft ftftft ♦ · « · · ft · « • ft ftft
BHG, který se liguje k plasmidu pDCii. Plasmid pDCil se poté štěpí BamHI/XhoI a 4,5kb fragment se přečistí (fragment 8). 4,5kb fragment pDCil (fragment 8) se liguje k PCR fragmentu štěpenému BamHI/SalI kódujícímu částečnou sekvenci promotoru CMV získanou ze použití primerů 96-13 a 96-14 (plasmid pDCl, jako templát), čímž se získá plasmid pDCi2.
Primer 96-13 (SEQ ID NO: 24) '-AGTTCAGTCGACGGCGCGCCAACCCGGGAATCC GGACGGGATCTATACATTGAATCAATATTGGCA-3'
Primer 96-14 (SEQ ID NO: 25)
ATGTCAGGATCCACGCGGAACTCCATATATGGGCTATGAACT
Plasmid pDCi2 se štěpí Asp718/Spel a 4,2kb fragment kódující DHFR obsahující sekvenci promotoru/operátoru SV40 a polyadenylační sekvenci se purifikuje (fragment 9) a pDCl se štěpí Asp718/Spel a l,5kb fragment obsahující částečnou DNA promotoru CMV s BGH polyadenylačními signály se purifikuje (fragment 10). 4,2kb fragment pDCi2 (fragment 9) se liguje k l,5kb fragmentu pDCl (fragmentu 10), čímž se získá plasmid pDC31. Plasmid pDC31 se od pDCl liší tím, že obsahuje několik nových restrikčních míst, jako Smál a AscI u 5' konce promotoru CMV, které byly vytvořeny. Plasmid pDC31 se štěpí Notl, posunutá DNA se otupí za použití polymerasy T4 a plasmid se znovu liguje, aby se vyloučilo místo Notl, čímž se získá plasmid pDC36. Plasmid pDC36 je stejný jako pDC31 s výjimkou místa Notl, které bylo zničeno.
Plasmid pDC36 se štěpí Apal/BamHI, posunuté konce se doplní a plasmid se znovu liguje za vzniku pDC38. pDC38 je stejný jako pDC36, až na fragment Apal/BamHI obsahující polyadenylační sekvenci hovězího růstového hormonu, která z něj byla odstraněna. Plasmid pDC38 se štěpí Smal/HindlII a • 4 • · · *
4 4 ·
4 ·
4 4 · • · ·
4444 44
44 44
4 4 4 4 4
A 4 4 4 A A
44 <44 444
4 4 4
4 4 4 A 4
4,6kb fragment, který neobsahuje DNA promotoru CMV, se purifikuje (fragment 11).
Plasmid pSK/EF1.3 se štěpí EcoRV/Notl/PvuI a 2,9kb fragment kódující sekveci promotoru CHEF1 a protisměrnou sekvenci DNA se purifikuje (fragment 12). Bluescript SW+II (pSK+) se štěpí Notl a 2,9kb fragment se purifikuje (fragment 13). 7kb Notl fragment z fágu lambda 7.4 se liguje k 2,9 pSK+ fragmentu (fragmentu 13), čímž se získá plasmid pSK/EFl.7.
Plasmid pSK+ se štěpí HindlII/Notl a 2,9kb fragment se purifikuje (fragment 14). Plasmid pSK/EF1.7 se štěpí Notl/Ncol a 620bp fragment kódující část 5' netranslaťovaného intronu CHEF1 se purifikuje (fragment 15). 123bp PCR fragment štěpený HindlII/NcoI kódující zbývající 5' intron vytvořený za použití primerů 96-36 a 96-45 a pSK/EFl.12 jako templátu se přečistí (fragment 16).
Primer 96-36 (SEQ ID NO: 26) GGCTTAGCTCCGAGGAGGG
Primer 96-45 (SEQ ID NO: 27) CGTGACAAGCTTGGTTTTCACAACAC
2,9kb fragment pSK+ (fragment 14), 620bp fragment pSK/EFl (fragment 15) a 123bp fragment HindlII/NcoI (fragment 16) se ligují, čímž se získá plasmid pSK/5'EF-l obsahující úplnou sekvenci 5' intronu CHEF1.
Plasmid pSK/5'EF-l se štěpí HindlII/Notl a 0,7kb fragment kódující 5' intron se purifikuje (fragment 17). 4,6kb fragment pDC38 neobsahující promotor CMV (fragment 11), 2,9kb fragment pSK/EF1.3 obsahující sekvenci promotoru CHEF1 a protisměrnou sekvenci (fragment 12) a 0,7kb • · • * · ···· · » · · ·«« · · » ···· # » · · · · · · 999 ··· pSK/5'EF-l fragment kódující úplný 5' intron (fragment 17) se spojí při třícestné ligaci, čímž se získá plasmid pDEFl, který tedy obsahuje kompletní 5' regulační DNA CHEF1, gen dhfr a počátek replikace SV40, který umožní replikaci za vzniku velmi vysokého počtu kopií v buňkách transformovaných antigenem SV40 T.
Plasmid pDEFl se štěpí HindlII, posunuté konce se doplní a plasmid se štěpí Notl. 2,6kb fragment obsahující kromě částečné sekvence 5' intronu sekvenci promotoru CHEF1 a protisměrnou sekvenci DNA se purifikuje (fragment 18). Plasmid pDEFl se štěpí Notl/Asp718 a l,3kb fragment kódující zbytek 5' intronu se purifikuje (fragment 19). Plasmid pDC38 se štěpí Smal/Asp718 a 4kb fragment kódující DHFR obsahující sekvenci promotoru/operátoru SV40 a polyadenylační DNA se purifikuje (fragment 20). 2,6kb fragment pDEFl (fragment 18), l,3kb fragment pDEFl (fragment 19) a 4kb fragment pDC38 (fragment 20) se spojí třícestnou ligaci, čímž se získá plasmid pDEF2. Plasmid pDEF2 v E. coli kmene XL-1 Blue byl uložen 4. března 1997 ve sbírce American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA pod přírůstkovým číslem 98343. Plasmid pDEF2 se od pDEFl liší v tom, že z něj byl odstraněn 0,3kb fragment HindlII/Spel umístěný 2,3 kb proti směru od TATA boxu CHEF1 a že obsahuje pouze jedno místo HindlII umístěné v oblasti polylikeru. pDEF2 se použije v případech, kdy gen, který má být exprimován, obsahuje vlastní polyadenylační místo.
Za účelem linearizace se plasmid pDEF2 štěpí Asp718/Xbal, přičemž se však také odstraní počátek replikačních sekvencí a 7,4kb fragment se purifikuje (fragment 21). Plasmid pDCl se štěpí Asp718/Xbal a 0,8kb fragment, který kromě polyadenylačních sekvencí BGH obsahuje záměnu počátku nebo replikační DNA, se purifikuje (fragment 22). 7,4kb fragment pDEF2 (fragment 21) a 0,8kb fragment pDC21
44 44
4 4 4 4 4 · 4 4 4 «
4 4 444 444
4 4 4 «4 «444 (fragment 22) se spojí za vzniku plasmidu pDEFlO, který se liší od pDEFl stejným způsobem jako pDEF2. Plasmid pDEFlO se od pDEF2 liší v tom, že v pDEFlO u 3' konci oblasti polylinkeru je polyadenylační místo z genu hovězího růstového hormonu.
Plasmid pDEFlO se štěpí HindlII/Xbal za účelem linearizace a 8,2kb fragment se purifikuje (fragment 23). Plasmid pDCl/MDC, plasmid kódující chemokin odvozený od chemokinu lidského makrofágů (MDC) se štěpí HindlII/Xbal, a 0,4kb fragment kódující MDC se purifikuje (fragment 24). Ligací 8,2kb fragmentu pDEFlO (fragmentu 23) s 0,4kb fragmentem pDCl/MDC (fragmentem 24) se vyrobí plasmid pDEFlO/MDC.1.
Plasmid pRc/CMV se štěpí BamHI, posunuté konce se doplní Klenowem, plasmid se štěpí Asp718, a l,5kb fragment se purifikuje (fragment 25). Plasmid pDCl se štěpí Notl, posunuté konce se doplní Klenowem, plasmid se štěpí Asp718, a 3,9 kbfragment se purifikuje (fragment 26). l,5kb fragment pRc/CMV (fragment 25) se liguje s 3,9kb fragmentem pDCl (fragmentem 26), čímž se získá plasmid pNCX.
Plasmid pNCX se podobá pDCl s tou výjimkou, že dhfr gen je nahrazen genem resistence vůči neomycinu (NeoR). Plasmid pNCX se štěpí Asp718/Pvul, a 2,lkb fragment se purifikuje (fragment 27). Plasmid pDEFl se štěpí Asp718/Pvul, a 5,9kb fragment se purifikuje (fragment 28). 2,lkb fragment pNXC (fragment 27) se liguje do 5,9kb fragmentu pDEFl (fragmentu 28) za vzniku plasmidu pNEFl. pNEFl se liší od pDEFl tím, že nese bakteriální gen resistence vůči neomycinu (NeoR), který kóduje resistenci vůči neomycinu nebo G418. Geny, které mají být insertovány do pNEFl jsou obecně fragmenty HindlII/Xbal, které se insertují po částečném • · 9 9 9
9 9 9 99
9 9 9
9 9 9 9
9 9 9
9 9 9 9 999
99 99
9 9 9 9 9
9 9 9 9 9
9 9 99 9 99 9
9 9 9
99 99 štěpení HindlII nebo třícestné ligaci, jelikož plasmid obsahuje dvě místa HindlII.
Příklad 5
Transfekce buněk DG44 a zkouška produktivity
Za účelem transfekce hostitelských buněk DG44 jediným plasmidem se obvykle linearizuje 50 až 100 μg plasmidu štěpením restrikčním enzymem Pvul nebo AscI. Při transfekcí, kdy se mají do buněk CHO zavádět dva plasmidy, se plasmidy ponechají neštěpené. Před transformací se plasmidy vysrážejí ethanolem a promyjí dvakrát 70% ethanolem. DNA pelety se krátce suší a resuspenduji ve 400 μΐ sterilní destilované vody. K resuspendované DNA se přidá 400 μΐ sterilního 2X HeBS (40mM HEPES-hydroxid sodný, pH 7,0; 274mM chlorid sodný; lOmM chlorid draselný; l,4mM hydrogenfosforečnan sodný; 12mM dextrosa). Netransfekované buňky DG44 se kultivují v médiu DMEM/F-12 doplněném hypoxanthinem (na konečnou koncentraci 0,01mM) a thymidinem (na konečnou koncentraci 0,0016mM), také označovaným jako HT. Za účelem pěstování netransfekovaných i transfekovaných buněk DG44 se k médiu přidá dialyzované FBS do konečné koncentrace 5 až 10 % objemových. Buňky DG44 se připraví na transfekcí tak, že se kultury nechají růst do asi 50% nebo nižší konfluence v 150cm2 ošetřených polystyrénových nádobách pro tkáňovou kultivaci (Corning). Buňky se z plastu odstraní tak, že se nejprve odsaje médium a ulpělé buňky se promyjí jednou solným fosfátovým pufrovacím roztokem bez vápníku a hořčíku (CMF-PBS; 2,7mM chlorid draselný; l,5mM dihydrogenfosforečnan draselný; 137mM chlorid sodný a 8,lmM hydrogenfosforečnan sodný), přidají se k nim 4 ml roztoku obsahujícího 0,0125% ozářený trypsin (Worthington Biochemical Corporation) v CMF-PBS a inkubují se několik minut při 37°C. K buňkám se přidá médium (4 ml) obsahující • ·· ΒΒ ··
Β * B Β- Β 4 4 *
Β ♦ Β · » · *
Β Β Β * ΒΒ* *ΒΒ « Β · Β Β • « · » · ΒΒ Β · hovězí fetální sérum (FBS), stanoví se koncentrace buněk a alikvóty 2 x 107 buněk se peletizují centrifugací. Každá buněčná peleta se promyje jednou v CMF-PBS a resuspenduje v 0,8 ml roztoku obsahujícího HeBS s požadovanou plasmidovou DNA. Resuspendované buňky se při teplotě místnosti převedou do 0,4cm kyvety Gene Pulser (Bio-Rad) a umístí do elektroporačního zařízení Bio-Rad GenePulser. Buňky se elektroporují při teplotě místnosti s vybíjením kondenzátoru 290 V a 960 gF (puls 9 až 11,5 ms). Buňky se asi 10 minut ponechají v kývete a poté přidají do 10 ml DMEM/F-12 doplněného 5 až 10% dialyzovaným FBS a HT. Poté se stanoví úmrtnost (vyloučení trypanové modři), která je obvykle asi 50 %. Buňky se peletizují centrifugací, pelety se resuspendují ve 2 ml DMEM/F-12 doplněném 5 až 10% dialyzovaným FBS a HT (neselektivní médium) a zaočkují na lOcm polystyrénové misky pro tkáňovou kultivaci. Po dvoudenním růstu se buňky, v tuto dobu obvykle konfluentní, z misek odstraní za použití trypsinu, jak je popsáno výše a v různých zředěních v DMEM/F-12 doplněném 5 až 10% dialyzovaným FBS a bez HT (selektivní médium) zaočkují na lOcm2 misky. Pět a devět dní poté k buňkám přidá selektivní médium. Po asi 2 týdnech se kolonie transfektantu (obvykle více než 1000 na každou transfekci) z misek odstraní za použití trypsinu, výše popsaným způsobem a po přídavku selektivního média se stanoví koncentrace buněk. Alespoň dva alikvóty 2 x 106 buněk na každou transfekci se přidají k lOcm miskám obsahujícím 10 ml selektivního média. Buňky se nechají růst až do zániku, kdy je většina buněk odpojena od desky vlivem přeplnění. Supernatant ze zaniklých kultur se zkouší metodou ELISA, čímž se stanoví průměrný titr produktu.
Příklad 6
Produkce rekombinantního proteinu za použití CHEF1
• 0 «
0·0 00
00
0 0 0
0 0 0
0 00 0 • 0 • 0 «0
Buňky DG44 popsané v příkladu 5 se transfekují plasmidy nesoucími geny uvedenými v tabulce 3 operativně připojenými k regulační DNA CHEF1. Bakteriální kmeny transformované plasmidy kódujícími každý z genů, kterých bylo použito při zkoušce, byly uloženy ve sbírce American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA, 1. dubna 1997 pod přírůstkovými čísly uvedenými v tabulce 2.
Tabulka 2
Přírůstková čísla plasmidů
| Kódovaný gen | Označení plasmidu | Přírůstkové číslo |
| Těžkého řetězce protilátky ICM3 | PDEF1/ICM3H.2 | 98381 |
| Lehkého řetězce protilátky ICM3 | PNEF1/ICM3L.3 | 98382 |
| Těžkého řetězce protilátky 23F2G | PDEF1/F2GH.1 | 98383 |
| Lehkého řetězce protilátky 23F2G | PNEF1/F2GL.1 | 98384 |
| Chitinasy | pDEFl/CTN.l | 98385 |
| Acetylhydrolasy aktivačního faktoru destiček (PAF-AH) | PDEF2/HPH.4 | 98386 |
| Chemokinu odvozeného od makrofágu (MDC) | pDEFlO/MDC.l | 98387 |
9 •
· • » · • · ·
999
9 • 9 • * » ♦··· 9 9
Po selekci na transfektanty se spojené kolonie (vice než 200) z každé transfekce odstraní z misek za použití trypsinu a stejný počet buněk z každé transfekce se nanese na misky a nechá růst do úhynu. Supernatanty se odstraní a exprese proteinu se stanovuje za použití metody ELISA nebo enzymového stanovení. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.
Tabulka 3
Exprese proteinu za použití regulačních sekvencí CHEF1 a CMV
Transfekovaný gen Titr proteinu
| CMV | CHEF1 | |
| ICM3 H+L | 554 | 1862 |
| ICM3 H+L | 288 | 2153 |
| HU23F2G H+L | 337 | 1848 |
| MDC | 360 | 2100 |
| PAF-AH | 590 | 6574 |
| Chitinasy-1 | 3200 | 2300 |
| Chitinasy-2 | 8900 | 12850 |
S výjimkou první zkoušky na expresi chitinasy (v tabulce 3 označena jako chitinasa-1) se za použití regulační DNA CHEF1 dosáhne významně vyšších úrovní produkce proteinu, které jsou třikrát až jedenáctkrát vyšší, než při expresi s promotorem CMV.
Za účelem stanovení, zda se u snížené exprese, která byla zjištěna u zkoušky na chitinasu, jedná o abnomální nebo o opakovatelný výsledek, který by byl charakteristický a/nebo jedinečný pro chitinasu, se zkouška zopakuje, avšak za použití dvou oddělených transfekcí, na rozdíl od jediné transfekce použité při první zkoušce, jejímž výsledkem byl
0
0 0 0 0 0 0 0 ·
0000
00 » 0 0 0 » 0 · *
000 000 neobvykle nízký počet získaných transfektantů. Kromě toho se použije jiné zkoušky na aktivitu chitinasy, u niž se prokázalo, že je přesnější než postupy použité při první zkoušce.
Výsledkem transfekci při druhé zkoušce je počet transfektantů, který je konsistentnější s předchozími výsledky dosaženými za použití plasmidu pDEF2, který při dalších zkouškách produkuje více než 150 % počtu transfektantů dosaženého s plasmidem CMV. Výsledky z druhého pokusu (označeného v tabulce 3 jako chitinasa-2) jsou vnitřně konsistentní, což zvyšuje důvěryhodnost výsledků, přestože zjištěné zvýšení exprese proteinu (asi l,4x), ve srovnání s expresí za použití promotoru CMV, je nižší než zvýšení zjištěná u ostatních proteinů zkoušeých dříve.
Příklad 7
Produkce rekombinantního proteinu za použití regulační DNA CHEF1 o různých délkách
Zkonstruuje se expresní vektor obsahující dalších 8 kb 5' lemující DNA z genu EF-Ια a označí se jako pDEF14. Plasmid pDEF14 se od pDEF2 liší v tom, že pDEF14 obsahuje přibližně 11,7 kb DNA lemující 5' křeččího EF-Ια, zatímco pDEF2 obsahuje pouze 3,3 kb této sekvence. Plasmid pDEF14 také obsahuje 4 kb křečci 3' lemující DNA přiléhající k 3' konci DHFR expresní kazety. Větší plasmid pDEF14 se zkonstruuje způsobem, který je stručně popsán dále.
Z pDEF2 se odstraní 2,6kb AscI/Notl fragment CHEF1 a na jeho místo se insertuje llkb AscI/Notl fragment CHEF1. Xnserce delší sekvence nejprve vyžaduje modifikaci Xbal místa umístěného 11,7 kb od 5' směrem k iniciačnímu ATG EF-Ια na místo AscI. Kromě toho se insertuje 4kb Nsil/Sall fragment s tupými konci, který je tvořen lemující sekvencí • · ·· • 4 · • ·
4 • 4
4*44 44 • 44 ·· ··
444 4 4 44 4 • · ♦ · ♦ ♦ ·
4 44 4 4 · 444 • 4 · · ·
4*4 44 ·· ·*
CHEF1 s začínající u Nsil místa 118 párů bází od 3' ke stop kodonu EF-Ια, do Pmel/Sall místa 3' k DHFR expresní kazetě umístěné na 3' konci oblasti polylinkeru, do jíž jsou insertovány geny, které mají být exprimovány. Úplná 3' DNA sekvence s počátkem při stop kodonu genu EF-Ια je uvedena v SEQ ID NO: 28. Bakterie transformovaná tímto plasmidem byla uložena ve sbírce American Type Culture Collection,
12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA, 9. dubna 1997 pod přírůstkovým číslem 98398. Výsledný plasmid pDEF14 obsahuje jedinečná Xbal a Notl místa spolu s mnohačetnými HindlII místy a inserce genu do tohoto plasmidu za účelem exprese tedy vyžaduje třícestnou ligaci. Tak například gen může být insertován do plasmidu ligaci HindlII/Xbal fragmentu obsahujícího požadovaný gen se 737bp Notl/HindlII fragmentem z pDEF14 a 19,7kb Xbal/Notl fragmentem z pDEF14.
Exprese proteinu za použití tohoto vektoru se porovná s expresí za použití vektoru pDEF2, který obsahuje menší část 5' lemující oblasti EF-Ια. Při předchozích zkouškách byla DNA kódující těžký i lehký řetězec protilátky 23F2G subklonována do vektorů pDEF2 a pDEF14 a úrovně exprese stanovené po transfekcí do buněk DG44 jsou popsány výše v příkladu 5. Geny kódující oba řetězce protilátky se ve vektorech umístí lineárně a exprese obou genů se pohání sekvencí CHEF1 v jednotlivých plasmidech. Kódující oblasti pro dva řetězce v každém plasmidu se rozdělí identickou 4,3kb DNA odvozenou z 3' netranslatované oblasti lidského IgG4.
Výsledky ukazují, že exprese 23F2G z větší CHEF1 sekvence je v pDEF14 čtyřnásobně větší, než exprese protilátky z menší sekvence pDEF2. Tento výsledek je překvapující vzhledem k tomu, že většina identifikovatelných vazebných míst transkripčního faktoru pDEF14 je také v sekvenci DNA v pDEF2. Je tedy možné, že v DNA CHEF1 v plasmidu pDEF14 je • ·
·· ·· • · · ♦ * · ··· 99 9
9
99 umístěno jedno nebo více dalších a neidentifikovaných vazebných míst transkripčního faktoru nebo sekvencí zesilovačů. Jinak řečeno, větší DNA CHEF1 může poskytovat výhodu zvýšené transkripce díky určité vlastnosti 3' DNA sekvence.
Odborníkům v tomto oboru budou zcela jistě zřejmé četné modifikace vynálezu, jak je popsán a ilustrován v předcházejícím textu. Takové modifikace a změny nepředstavují únik z rozsahu tohoto vynálezu, který je dán pouze patentovými nároky.
·· ·· · ·· ·· 444» 44 4* 4444
444 444 4444
44 44 44 ··· 444
444 444 4 4
4444 44 444 4* 44 44
SEKVENČNÍ PROTOKOL (1) OBECNÉ INFORMACE:
(i) PŘIHLAŠOVATEL: Allison, Daniel S.
(ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Transkripčni regulační DNA křeččího EF-la (iii) POČET SEKVENCÍ: 29 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:
(A) ADRESÁT: Marshall, 0'Toole, Gerstein, Murray & Borun (B) ULICE: 233 South Wacker Drive, 6300 Sears Tower (C) MĚSTO: Chicago (D) STÁT: Illinois (E) ZEMĚ: USA (F) ZIP: 60606 (v) POČÍTAČOVĚ ČITELNÁ FORMA:
(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC compatible (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, verze #1.30 (vi) ÚDAJE O SOUČASNÉ PŘIHLÁŠCE:
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:
(B) DATUM PODÁNÍ:
(C) ZATŘÍDĚNÍ:
(viii) INFORMACE O ZÁSTUPCI:
(A) JMÉNO: KAREL ČERMÁK, AKP ČERMÁK-HOŘEJŠ-VRBA,
NÁRODNÍ 32, 110 01 PRAHA 1 (C) ČÍSLO SPISU: 01-11-99-ČE (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ SPOJENÍ:
(A) TELEFON: 312-474-6300 (B) TELEFAX: 312-474-0448 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 3678 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:1:
»· • 4 4 4
4 4 4
444 44 4
4
44
| ACTAGTTCCA | AAGATGAATT | ACTAACCAGT | GTTTCCAAGG | AAATAAATGA | AAGCAGAGAG | 60 |
| ATTAGTTCTA | TTGCTAGTGT | TTCATTTTCG | TATATTTCTT | ACAATTTCTC | TTGTTACAAA | 120 |
| TAGGCACTAG | GGTATCAAGA | TAATTTTAAC | GACTGGCTGA | GAACCCTAGA | AAATCTCTGT | 180 |
| GAAAAAGGGA | TTTGTGAAAT | GAGAGAGGGT | AATGTGGCCA | TTATAGAAAA | GGCTTTTGTG | 240 |
| TGCCTTGCAT | GCATAGACCC | TGTGTTTGAT | CTCTTAACAC | CCTCCTTGAC | CAGAAAAAGC | 300 |
| TTCTGTGGAT | AGAAAATGAT | TAGTTATATA | TACTTTTAGG | GAAACGTAGT | TCTGGATTCT | 360 |
| TTGGTTACAA | TTAACAGAAT | TAAGTGCAAA | CAAAGCCAGA | AACCTCCTGA | TAAATGAGAA | 420 |
| AACCTGCTTG | TAGAAGGTTG | TAAGGCTCTG | TAATATAGGA | ATTAGGAGAA | AAGAAACCTG | 480 |
| TGTGGTGGGG | CACGTCTGTA | ATCCCAGCAT | TGGGAAGTAG | AGGTAGAAGA | TTAGAAATCA | 540 |
| AAGGCCAGCC | TCAGCAACAC | AGTGAGTTTG | AGGCCACCCT | GAACTACATC | AGGTTCTGTC | 600 |
| TCCTTTCTTT | TTTTTTTTTT | TTTCTTTTCT | TTTTTTGGTT | TCTCTGTGTA | GTTTTGGAGC | 660 |
| CTATCCTGGC | ACTAGCTCTG | AAGAGCAGGC | TGGCCTCGAA | CTCAGAGATC | AGCCAGCCTC | 720 |
| TGCTGGGATT | AAAGGTATGC | ACCACCAACG | CCCCAGGTTT | TGTCTCAAAC | AAACAAAAAT | 780 |
| AACATCAGGA | GGTGGTGAGA | GGGCTCAGTG | GTCACAGGCA | TTCTCTGCAA | AGCCTGACTC | 840 |
| TGAGTTGGAT | CCTTTAGAGC | TACATGGTTG | AGGGAAGAGA | ACTGACTCCT | GGAAGGTGTC | 900 |
| CTCTGGTCCC | CACACATAGC | TATACACAGC | ATGTGCATTC | ACACACACTA | AATAATGCTA | 960 |
| TTTTTAAAAA | AATTAAAAAC | AACAACAGTT | TGGGTTGTGA | AAACTAGAAC | TAGATAATAG | 1020 |
| GTAAGAATCA | AGTATCATGT | AAATTTGCTT | TCAACTCATC | CCAAAATTTG | TTTTATATTT | 1080 |
| CAGTTTTTTT | CCTTCCTAGC | TTGACTGTGG | AGTCTTGTCC | GGAAGCAAAT | AGTTCCTTTG | 1140 |
| CAGATCCCAC | ATGTGGACAC | CGGACAGTAG | GTCCTCAAAT | GCTCCTTATT | AGGTTGGTTC | 1200 |
| AATAATATCA | ATTGTTTGTT | ACTAGGCAGT | GATGTTGTAC | ATCTGGAGGA | GATCTCTTGA | 1260 |
| GCCCATAATC | AGGTTATTAG | GAATAAATAC | TCTAAGGCTA | AAAATGTAGC | TTAGTGATAA | 1320 |
| GAGTGCTTGC | CTGGTGTGCT | GAGACCCTCG | GTTCCATCTC | CACAACCCCA | TATTCCATTA | 1380 |
| CAAAATACCT | TTTCACCGTC | CCTAGCATTA | AGAAACAAAA | CAACAAAGAA | GTTTTTCTTT | 1440 |
| CTTCTGAGAT | CCTGCCCGGA | GAGGCATTTA | AAACTGGCCA | GGGCCAAAAA | AAAAAAAAAA | 1500 |
| AAAAGAAAAA | AAAGAAAAGA | AAACAGGCTA | GGGCCGGCAT | GGTGGCGCAC | GCCTTTAATC | 1560 |
·· · ··
44 4 444
4 4 4 4
4 4 4 4 4
4· 444
4444 44 444 44 » 4
444 • 4
| CCAGCACGCA | GGAGGCAGAG | GCAGGGCGGA | TCTCTGTGAG | TTTGAGGTCA | GCCTGGTCTA | 1620 |
| CCTAGTGAGT | TTCAGGGCAC | CCAGGGCTAA | AGAGACTGTC | TCAAAAACAA | AACAGCCACA | 1680 |
| CAATCAGAAC | CACAGCAAAA | CGCAGTTATG | ATCCTTGGAA | CTGTAGGAAT | GACAAGCATT | 1740 |
| TAAATAATAG | GACGAGCCAT | TTTTGAGAAG | CTCTGATTTC | ACAAGTGTCA | GGGATGGGCT | 1800 |
| CTGGGCGAGT | AAGATTGCTA | ATGCTGGCCT | CTAAATGAGA | CCACGTGGAG | TTGATTAGAT | 1860 |
| TCTTTTCATG | TTCCTCGTGC | TCTATCAAAT | AACTGTACCC | AAATACACAC | ACACACACAC | 1920 |
| ACACACACAA | TGCGCGCACA | CACAAAATCC | TTTTTTAGCT | TAAGAAGCCC | AGAATCAGAA | 1980 |
| GTAAAGCTAA | CTGTGGGACT | TAAGTATTAT | TCTGAACGGA | ACTCCCAGGG | CGTGAAGCGC | 2040 |
| GCTTCAGGCT | TCCAGAGAAG | CAGCTGGCGC | TGGATGGAAT | GAACCAAGAG | GCCAGCACAG | 2100 |
| GGGCAGATCC | GTCGAGCTCT | CGGCCACCGA | GCTGAGCCCT | TAGGTTCTGG | GGCTGGGAAG | 2160 |
| GGTCCCTAGG | ATTGTGCACC | TCTCCCGCGG | GGGACAAGCA | GGGGATGGCG | GGGCTGACGT | 2220 |
| CGGGAGGTGG | CCTCCACGGG | AAGGGACACC | CGGATCTCGA | CACAGCCTTG | GCAGTGGAGT | 2280 |
| CAGGAAGGGT | AGGACAGATT | CTGGACGCCC | TCTTGGCCAG | TCCTCACCGC | CCCACCCCCG | 2340 |
| ATGGAGCCGA | GAGTAATTCA | TACAAAAGGA | GGGATCGCCT | TCGCCCCTGG | GAATCCCAGG | 2400 |
| GACCGTCGCT | AAATTCTGGC | CGGCCTCCCA | GCCCGGAACC | GCTGTGCCCG | CCCAGCGCGG | 2460 |
| CGGGAGGAGC | CTGCGCCTAG | GGCGGATCGC | GGGTCGGCGG | GAGAGCACAA | GCCCACAGTC | 2520 |
| CCCGGCGGTG | GGGGAGGGGC | GCGCTGAGCG | GGGGCCCGGG | AGCCAGCGCG | GGGCAAACTG | 2580 |
| GGAAAGTGGT | GTCGTGTGCT | GGCTCCGCCC | TCTTCCCGAG | GGTGGGGGAG | AACGGTATAA | 2640 |
| AAGTGCGGTA | GTCGCGTTGG | ACGTTCTTTT | TCGCAACGGG | TTTGCCGTCA | GAACGCAGGT | 2700 |
| GAGTGGCGGG | TGTGGCCTCC | GCGGGCCCGG | GCTCCCTCCT | TTGAGCGGGG | TCGGACCGCC | 2760 |
| GTGCGGGTGT | CGTCGGCCGG | GCTTCTCTGC | GAGCGTTCCC | GCCCTGGATG | GCGGGCTGTG | 2820 |
| CGGGAGGGCG | AGGGGGGGAG | GCCTGGCGGC | GGCCCCGGAG | CCTCGCCTCG | TGTCGGGCGT | 2880 |
| GAGGCCTAGC | GTGGCTTCCG | CCCCGCCGCG | TGCCACCGCG | GCCGCGCTTT | GCTGTCTGCC | 2940 |
| CGGCTGCCCT | CGATTGCCTG | CCCGCGGCCC | GGGCCAACAA | AGGGAGGGCG | TGGAGCTGGC | 3000 |
| TGGTAGGGAG | CCCCGTAGTC | CGCATGTCGG | GCAGGGAGAG | CGGCAGCAGT | CGGGGGGGGG | 3060 |
| ACCGGGCCCG | CCCGTCCCGC | AGCACATGTC | CGACGCCGCC | TGGACGGGTA | GCGGCCTGTG | 3120 |
·· » · · · ·· · * · η · * ··· · · · · · · · ·« 4 4 44 <4 444 444
Q Q 4«·444 44
-3 Ζ7 4444 44 444 44 44 44
TCCTGATAAG GCGGCCGGGC GGTGGGTTTT AGATGCCGGG TTCAGGTGGC CCCGGGTCCC 3180
GGCCCGGTCT GGCCAGTACC CCGTAGTGGC TTAGCTCCGA GGAGGGCGAG CCCGCCCGCC 3240
CGGCACCAGT TGCGTGCGCG GAAAGATGGC CGCTCCCGGG CCCTGTAGCA AGGAGCTCAA 3300
AATGGAGGAC GCGGCAGCCC GGCGGAGCGG GGCGGGTGAG TCACGCACAC AAAGGAAGAG 3360
GGCCTTGCCC CTCGCCGGCC GCTGCTTCCT GTGACCCCGT GGTGTACCGG CCGCACTTCA 3420
GTCACCCCGG GCGCTCTTTC GGAGCACCGC TGGCCTCCGC TGGGGGAGGG GATCTGTCTA 3480
ATGGCGTTGG AGTTTGCTCA CATTTGGTGG GTGGAGACTG TAGCCAGGCC AGCCTGGCCA 3540
TGGAAGTAAT TCTTGGAATT TGCCCATTTT GAGTTTGGAG CGAAGCTGAT TGACAAAGCT 3600
GCTTAGCCGT TCAAAGGTAT TCTTCGAACT TTTTTTTTAA GGTGTTGTGA AAACCACCGC 3660
TAATTCAAAT CCAACATG 3678 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:
AGGCACAGTC GAGGCTGATC 20 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:3:
TTCCAGGGTC AAGGAAGGCA 20 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů bází ·· • · · • · 9 · • · • F »· ·» • ·· 99 99
9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9
9 9 9 999 999
9 9 9 9
999 99 99 99 (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:4:
GCCACCTGAT CTACAAATGT 20 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:
GAGATACCAG CCTCAAATTC 20 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:6:
ATGTGACCAT CATTGATGCC 20 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:7:
GTGACTTTCC ATCCCTTGAA 20
(2) ÚDAJE K SEQ ID NO:8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:8:
GTTGGAATGG TGACAACATG 20 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:9:
CAGGTTTTAA AACACCAGTC 20 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:10:
AATGACCCAC CAATGGAAGC 20 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA
(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:11:
ACAGCAACTG TCTGCCTCAT 20 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 17 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:12:
GTAAAACGAC GGCCAGT 17 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:13:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 19 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:13:
GGAAACAGCT ATGACCATG 19 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:14:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:14:
AATTAACCCT CACTAAAGGG 20 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová • · • · · · · · · * · 9 9 9
9 9 9 9 9 · 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 999 999
9 9 9 9 9 9 9
- 43 - ...... ..... ” ’· (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:15:
GTTAATACGA CTCACTATAG GGC 23 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:16:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 6 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:16:
GGCGGG 6 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 6 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:17:
GGGCGG g (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:18:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 8 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:18:
TGACGYMR 8 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:19:
4
4
4
- 44 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 13 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:19:
TGGCNNNNNKCCR 13 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:20:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 26 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:20:
GATCGCGGCC GCGTTTAAAC GGATCC 26 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:21:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 26 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETÉZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:21:
AATTGGATCC GTTTAAACGC GGCCGC 26 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:22:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 77 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:22:
4 4 4 4 4 · · 4 ·
44 44 44 444 444
4 4 4 4 4 4
CGTTTAGTGA ACCGTCAGAT CTACATAACA ACATTCCTCC TCTAAAGAAG CCCCAAGCTT 60
GATATCTGCA GAATTCT 77 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:23:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 85 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:23:
CTAGAGAATT CTGCAGATAT CAAGCTTGGG GCTTCTTTAG AGGAGGAATG TTGTTATGTA 60
GATCTGACGG TTCACTAAAC GAGCT 85 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:24:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 66 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:24:
AGTTCAGTCG ACGGCGCGCC AACCCGGGAA TCCGGACGGG ATCTATACAT TGAATCAATA 60
TTGGCA 66 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:25:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 42 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:25:
ATGTCAGGAT CCACGCGGAA CTCCATATAT GGGCTATGAA CT 42 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:26:
• · (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 19 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:26:
GGCTTAGCTC CGAGGAGGG 19 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:27:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 26 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:27:
CGTGACAAGC TTGGTTTTCA CAACAC 26 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:28:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 4263 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:28:
TGAATATTAC CCCTAACACC TGCCACCCCA GTCTTAATCA GTGGTGGAAG AACGGTCTCA 60
GAACTGTTTG TCTCAATTGG CCATTTAAGT TTAATAGTGA AAGACTGGTT AATGATAACA 120
ATGCATCGGA AAACCTTCAG GAGGAAAGGA GAATGTTTTG TGGAACATTT TTGTGTGTGT 180
GGCAGTTTTA AGTTATTAGT TTTCAAAATC AGTACTTTTT AATGGAAACA ACTTGACCAA 240
AAATCTGTCA CAGAATTTTG AGACCCATTA AAATACAAGT TTAATGAGAA GTCTGTCTCT 300
GTTAATGCTG AAGTCATTAC TAAGTGCTTA GCTTAGCAAG GTATGTGGAT GCCCATTTGT 360
GTTCCAAGGG ATTGGACTGT TCATCAGGAC CCAGAGCTGA GTTTCAAGGG CTCAAGAGAT 420 • · ·
| GGCTTATTAC | CTGTGGGTGT | CTTGAAGGTT | CTGGTTGGGA | CAAATTAGGA | ATGTTTTTGG | 480 |
| CAGACATGGT | GACTACCTTC | ATCTGGGTGA | GTTCAGTTGA | TTTGTCTTGA | GCCTTTGGGG | 540 |
| TTTACACAAG | TAAATGACAT | CATACAGTTA | GTGTATTGTT | AGTGAATATT | AATATATGAG | 600 |
| GCAGGCTTTG | CTCTAGCAAT | TTTAGAACTA | GTTTTCAGGA | AAGGGTTCAT | CTTGTGCATT | 660 |
| GGATGTTTGA | TTCTATCACT | TAGAGTTTAA | ACTGAAAGTG | CTCAAGAGGT | TTTATTTAGG | 720 |
| CTGGGATATA | AATAAGCCTT | TCTGTAGCTT | GTAATGGTAT | CAGGAATTTA | AAAGGCCATC | 780 |
| TGGGGCACAA | AGATTAAGCA | GAAAAGGTAG | AAGGTGAGAT | TGGGGGACTT | TGAGTACTTC | 840 |
| ACACACTTTA | ATGTGTGAGT | GCTTTAGTGC | ATATAGTACA | ACTGCCAGAT | AAGGGCATCC | 900 |
| ACATCTGATT | GTTTGGAAGG | CACCTTGTGG | TTTCTGGGAA | TTCAGAATTG | GGAGAAAAAT | 960 |
| GCTCCCAACC | GCTGAAGCCC | TTGGTAATCT | GCAGGGTGTT | TATTTAGCAG | GAGATAAGGA | 1020 |
| CAAAAAGTTA | TAGTGTGGAG | TTGGTTGAGT | TGGTAGATGT | CATTACAACA | GGTGGTCTTA | 1080 |
| AATTGGGTTA | GGAGTCACTT | TGAAATACCT | GGGCCATAAG | CAAAGTGGCA | TTTTCACCTT | 1140 |
| TCAGGAGAAA | CTGGTACACT | TATCCATTCT | ATAGTGCATG | CTTGTTCAAT | TGGGCTGATG | 1200 |
| ACTAAACCGG | TGACTAAAGG | TTTGTCAGTA | TAAATGGATG | GGTTGTAGGC | AGACGGTGAG | 1260 |
| GAATTACTAT | ACCTGCAAGG | AGTCATTGCC | TGATCTGCCT | GGAAAGGGGC | AGGATTGAGT | 1320 |
| CTCAGAACGT | GTACACCATA | GGATATGGAA | AAATTTGTCA | CGCCTAGCAT | TCAACTTAGT | 1380 |
| GGTGTAGCGC | CACCTACTGG | CACTTTAAAA | GCTTAGCATA | GAGGAGCATG | TGTGTTAGGA | 1440 |
| GCTCGGATGG | GATCCAGGGC | CTCAAGGTTT | GCATGTAAAT | AAAAGCCCTT | TACCAAATTA | 1500 |
| ACTACATACC | AGCATACATC | AGTCCTTTAG | TGTTGAAAAA | CAGAAGGGAA | AGCTAATATA | 1560 |
| TATAGTGCTT | GCTTTATTTA | AGTCTAGCTG | ATTACGTGTT | TGGTTGCCAG | TGTGACTAGT | 1620 |
| CTGGAGTTGA | ATTTGTCCTC | AGACACGTAA | AATGGAATTT | GGGATTCACA | ACACTCTAGT | 1680 |
| ATGAGGGACC | TAATGGCCTG | TACCAGGCAC | AAACGTGTCT | ATAAACTACA | CAAAACGAAG | 1740 |
| GAATTTACAG | GAATTAGGAA | GGTATTCTTA | ACATTAAAAC | ATTATGGGCA | TTTTAAAAAA | 1800 |
| AGCTTTGACA | GGATTTCTTT | GTCATGGCTG | TCCTGGAGCT | AGTTGTGTAG | ACCAGGCTGG | 1860 |
| GCTGAAATCT | TGTCTGCCTG | CCTGGCTTGG | ACACTTTTTT | ATTATGTATA | CAACATTCTG | 1920 |
| CTTCCATGTA | TATCTGCACA | TTAGAAGACG | GCACCAGATC | TCCTAATGGA | TGGTTGTGAG | 1980 |
CCACCATGTG GTTGCTGGGA
CTGAGCCATC TCCAGCCCCA
AGGCCTTCTG TCAGTAATGA
GAGCTGCAGG TCTGCCTCAG
GCCAAGCTGA GCTATATTTT
GATGACCAAG CTGGGACACA
GGTCATTTTT AATGCTCTTG
TTTAAATTAA ACTAGTTTGG
GCAGGTATAC TACTGAACTC
GCTCAGGCAG CCCTTAAACT
AGTATACCGA TCAATATGTG
ATACTGGGAC TAAAGGCTGC
TTGGGGGGCA TGGGTGGGAG
CTGTAGACCA GGCTATTCTT
TTAAAGGTGT GTGCTACTGC
AAACAAAAGT GGTTCTTTTA
TTTTGAGTTT GTCCCAGGAA
CACAGAGAAA TCCTATTTGG
CGAACTCAAG AGAACCACCT
CCAGCCTAAA AAATGTCTTT
TCTGTTTACA ATATTCTGCT
ATAATGGATG GTTGTGAGCC
GAGCAGTCAG TGCTCTTAAC
ATAGGGTCTC AAGTAGTTTG
CATGTACAGC TGGGTTTAGT
TTGAGCATAG GGAGTTAATA
- 48 ATTGAACTCA GGACCTCTGG
GCTTGGGCAC ATTTTTAATG
AGGGCTTTTG GCTACCGAGA
TGCAGGTTTG GGAGTCCAGC
GTTTAAAAAA AAAATAAGTG
AGTAGAAGAA CATAGGCCAA
AGAAGGCTAT GCCTACACTA
AAATTTTCTT TGGGGGTAAG
TCCTCCTCAT TCCTTTTTGT
TGTGATTAAG CCTGAGAACA
AATTTTTTTG GGATGGGGGT
ACCACCACAA CCTGGCTCTT
AGCAGGGTTT CTCTGTATTA
GAGCTCAGAT TAGCCTGTCT
TGCCTGGCTA CAAAGACATT
GAAGGGTGGT TGGTGTTGGC
TGAAGACTGC ATTACTGCCG
AGCCTATCCT GGTAACTCGC
GCCTCTGAAT GCTGGTATTA
TTTTTAAAGA TTTTTTTTTT
TCTATGTATA TCTGCACACT
ACCAAGTGGT TGCTGGGAAT
CTCTGAGCCA TCTCTCCAGC
AGACTGAGTT GGCTATATAA
TTACATGGGG TGTTTTTGTC
GTGAGGTCAT GTTTTATCTA
• · · · · • · · · · • · · · · · · · • · · • · · ·»
AAGAGCAGTG CTCTTAACCT
GCTGGGAAAT CAAACCCCCT
GTAGGATTTA AGGTTATTCG
ATCTTAGAAA ATGCAGTGAA
GGTAAAGTGC TGCTGAGCCT
TGCTCTATAT TAAAAGCATG
CTCTCAGCCA CCGCAGCGTG
CTATTTAACC TAGTGCCTTG
TTTTTAAGAA TTTCAGTCAG
GTTACGATTA TGAGCCTATT
CAGGCCTCCC TGCCTCCCAA
GAAATACTTT TCTACATTTT
GCCCTGGCTC TCCTGGAACT
CTGCCTCCTA AATTCTGGGA
TTTTTTTTTC TTAAATTTAA
ACATACTCCA AGCACTCAGG
CCCCTCCCTG GTAAGGGCTA
TCTGTAGACC AGGCTGGCCT
AGGGCAGGCA CCACCAACAC TTTTTTTACA gaataaacat
AGAAGAGGGC ACCCGATCTC
TGAACTCAGA ACCTCTGGAA
CCCTAAAAAT GGCTCTTGAG
ACAAGGCTGG CACATAGCAC
TCTGGAGGCA GGAGGATCAT
CTCTTCTGAA TTGAGAACTA
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2400
2460
2520
2580
2640
2700
2760
2820
2880
2940
3000
3060
3120
3180
3240
3300
3360
3420
3480
3540 • ·
| - 49 - | • ··· | • · · · • · · · · · · * | • • · | |||
| AGCTGATGCA | AAGCAAGTTT | GACTGAAGAA | GTCCAGTTTA | TGAGAACAAG | GGTGGAAACT | 3600 |
| AATGTGTCAA | AGATGGCCTT | GCATGTGTTT | TAGATGATGA | CCCAGTCACT | TGGGAATTAC | 3660 |
| TGGATGTGTA | AGACCTATAT | CTTGACAGGA | GTGAACAGTG | TCTTATAGGT | CCTATATGAA | 3720 |
| AGAAATGAGA | CATACCCATT | TTGTTTCCCC | TAAGAATTCA | CTTTTCCTAA | CCTGGTTCAT | 3780 |
| GCTATTTAGG | TTATTTTACT | TGCAAATCCT | AGGTGCTCCC | TTACCCAGTA | TTGCTTATGT | 3840 |
| GGCACCAAAG | TCACTCACTC | CCATGATTTG | CAAGTCTCTG | GGAACTTCCA | TGACAACCTA | 3900 |
| GAATAGCAAC | TCAAATACAT | TTTCTCAGTA | CCAATTTTGA | AGAAAAAATA | TTTTGCAAAA | 3960 |
| TAGCTGTATG | GATGGGTACT | AAATAGTGAG | GTTATCTCCA | GAAGGCCTAT | GAAGAATTAA | 4020 |
| GGTTGAGTTC | AGTTGAGTTC | AGCAGCAAGT | TTAAGGTTCA | TCCATTTTTG | TACAGTGTTT | 4080 |
| TCCTATTACG | GTAAGTGTTT | TGCCTGCAGG | AATATCTGTA | CCACATGCTT | GCCTGGTACC | 4140 |
| TATATCGGCC | AGAAGAGGGC | TTTGGATCCT | CTGGACTTGA | ATTACAGATG | GGTATTAGCC | 4200 |
| ACCATTTAGG | TGCTGGGAAT | TGAAACCAAG | TCCTCTGGAA | GAACAGCAAG | TGATCGAGTC | 4260 |
GAC 4263 (2) ÚDAJE K SEQ ID NO:29:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 4695 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:29:
Claims (34)
1. Purifikovaná a izolovaná DNA obsahující transkripční regulační DNA křeččího EF-la.
2. DNA podle nároku 1, kde uvedená regulační DNA obsahuje sekvenci nukleové kyseliny uvedenou v SEQ ID
NO:l.
3. DNA podle nároku 1, kde regulační DNA obsahuje část sekvence nukleové kyseliny uvedené v SEQ ID NO: 1, která je schopna podporovat transkripci genu operativně připojeného k regulační DNA.
4 4 4 4 4 4 4 • « «· *44 ··· • · · · ·
444 44 44 44
4. DNA podle nároku 3, kde regulační DNA obsahuje oblast od nukleotidu přibližně 2114 do nukleotidu přibližně 3656 sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1.
5. Hostitelská buňka obsahující DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kde uvedená DNA není operativně připojena k EF-Ία kódujícím sekvencím.
6. Vektor obsahující DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kde uvedená DNA není operativně připojena k EF-Ία kódujícím sekvencím.
7. Hostitelská buňka transformovaná nebo transfekovaná vektorem podle nároku 6.
8. Chimérický polynukleotid zahrnující regulační DNA křeččího EF-Ία operativně připojenou k DNA sekvenci kódující protein, kterážto sekvence DNA kóduje protein odlišný od křeččího EF-la.
• ·· 99 ·· • · · · 9 9 9 9
9. Chimérický polynukleotid podle nároku 8, kde regulační DNA obsahuje sekvenci nukleové kyseliny uvedenou v SEQ ID NO: 1.
9 9 9 9 9
999 9 9 99 99
9 « 99 999 9·9
9 9 9 9 9 9 9
10. Chimérický polynukleotid podle nároku 8, kde regulační DNA obsahuje část sekvence nukleové kyseliny uvedené v SEQ ID NO: 1, kterážto část je schopna podporovat transkripci genu operativně připojeného k regulační DNA.
11. Chimérický polynukleotid podle nároku 10, kde regulační DNA obsahuje oblast od nukleotidu přibližně 2114 do nukleotidu přibližně 3656 sekvence nukleotidů uvedené v SEQ ID NO:1.
12. Chimérický polynukleotid podle nároku 8, kde uvedená sekvence DNA kódující protein kóduje protein endogenní vzhledem ke křeččím buňkám, který je odlišný od EF-la.
13. Chimérický polynukleotid podle nároku 8, kde sekvence DNA kóduje protein heterologní vzhledem ke křeččím buňkám.
14. Hostitelská buňka transformovaná nebo transfekovaná chimérickým polynukleotidem podle kteréhokoliv z nároků 8 až 13.
15. Expresní plasmid obsahující chimérický polynukleotid podle kteréhokoliv z nároků 8 až 13.
16. Expresní plasmid podle nároku 15, který dále obsahuje sekvenci nukleové kyseliny uvedenou v SEQ ID NO:28.
···
- 55 •ftftft ·1 • ftft · ·· • · • ft ftft
17. Expresní plasmid podle nároku 16, kde sekvence nukleové kyseliny uvedená v SEQ ID NO:28 je umístněna 3' vzhledem k chimérickému polynukleotidu.
18. Hostitelská buňka transformovaná nebo transfekovaná expresním plasmidem podle nároku 15.
19. Hostitelská buňka transformovaná nebo transfekovaná expresním plasmidem podle nároku 16 nebo 17.
20. Plasmid pDEF2.
21. Plasmid pDEF14.
22. Plasmid pDEFl./ICM3H.2.
23. Plasmid pNEFl/lCM3L.3.
24. Plasmid PDEF1/F2GH.1.
25. Plasmid pNEFl/F2GL.1.
26. Plasmid pDEFl/CTN.l.
27. Plasmid PDEF2/HPH.4.
28. Plasmid pDEFlO/MDC.1.
29. Hostitelská buňka transformovaná nebo transfekovaná expresním plasmidem podle kteréhokoliv z nároků 20 až 28.
30. Způsob zvyšování transkripce genu, který je předmětem zájmu, v hostitelské buňce, vyznačuj i cí se tím, že se DNA obsahující křeččí EF-la re- 56
4444 ·4 • 44 ·* 44 • 4 · · 4 4 4 4
31. Způsob podle nároku 30, vyznačující se t í m , že DNA, která má být integrována, dále zahrnuje zaměřovači sekvenci.
Způsob podle nároku 30, vyznačující , že hostitelskou buňkou je buňka vaječníku čínsZpůsob podle nároku 32, vyznačující , že gen, který je předmětem zájmu, je endogenní vzhledem k hostitelské buňce vaječníku čínského křečka.
32.
i setím kého křečka.
33.
se tím gulační DNA integruje do genomové DNA uvedené hostitelské buňky v poloze operativně připojené ke genu, který je předmětem zájmu.
34. Způsob podle nároku 30, vyznačující se t í m , že požadovaný gen je heterologní vzhledem k buňkám vaječníku čínského křečka a je stabilně integrován do genomové DNA buněk vaječníku čínského křečka.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/847,218 US5888809A (en) | 1997-05-01 | 1997-05-01 | Hamster EF-1α transcriptional regulatory DNA |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ28099A3 true CZ28099A3 (cs) | 2000-02-16 |
| CZ296544B6 CZ296544B6 (cs) | 2006-04-12 |
Family
ID=25300098
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ0028099A CZ296544B6 (cs) | 1997-05-01 | 1998-05-01 | Purifikovaná a izolovaná transkripcní regulacní DNA kreccího EF-1alfa, hostitelské bunky, vektory, chimérické polynukleotidy, plasmidy a zpusob zvysování transkripce genu |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5888809A (cs) |
| EP (2) | EP1676916A1 (cs) |
| JP (1) | JP2000513948A (cs) |
| CN (2) | CN100430477C (cs) |
| AT (1) | ATE318900T1 (cs) |
| AU (1) | AU742561B2 (cs) |
| BR (1) | BR9804896B1 (cs) |
| CZ (1) | CZ296544B6 (cs) |
| DE (1) | DE69833649T2 (cs) |
| DK (1) | DK0920498T3 (cs) |
| ES (1) | ES2263206T3 (cs) |
| HK (1) | HK1022719A1 (cs) |
| HU (1) | HU225764B1 (cs) |
| IL (1) | IL127897A (cs) |
| NO (1) | NO323853B1 (cs) |
| PL (1) | PL195604B1 (cs) |
| PT (1) | PT920498E (cs) |
| RU (2) | RU2249617C2 (cs) |
| SK (1) | SK285664B6 (cs) |
| WO (1) | WO1998049289A1 (cs) |
Families Citing this family (120)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8183344B2 (en) * | 1996-04-24 | 2012-05-22 | University Of Michigan | Inactivation resistant factor VIII |
| US6479256B1 (en) | 1998-03-04 | 2002-11-12 | Icos Corporation | Lectomedin materials and methods |
| KR20000046969A (ko) * | 1998-12-31 | 2000-07-25 | 이선경 | 이종 유전자 유래의 유전자 발현 조절요소를 포함하는 강력한전사 활성을 가진 진핵세포 발현벡더 |
| AU2002213196A1 (en) * | 2000-10-12 | 2002-04-22 | Icos Corporation | Modulation of ligand binding/enzymatic activity of alpha beta proteins |
| AU2002230773A1 (en) * | 2000-12-18 | 2002-07-01 | Wyeth | Promoters and recombinant expression constructs |
| ES2344070T3 (es) * | 2001-07-04 | 2010-08-17 | Chromagenics B.V. | Secuencias de adn con actividad anti-represora. |
| EP1513936A2 (en) * | 2002-06-14 | 2005-03-16 | Chromagenics B.V. | Use of repression blocking sequences in methods for enhancing gene expression |
| ES2362273T3 (es) * | 2002-06-14 | 2011-06-30 | Chromagenics B.V. | Método para la producción simultánea de múltiples proteínas; vectores y células para su uso en el mismo. |
| WO2004055215A1 (en) * | 2002-12-18 | 2004-07-01 | Chromagenics B.V. | A method for improving protein production |
| EP1572994B1 (en) * | 2002-12-20 | 2007-02-21 | Chromagenics B.V. | Means and methods for producing a protein through chromatin openers that are capable of rendering chromatin more accessible to transcription factors |
| DE602004025157D1 (de) | 2003-09-23 | 2010-03-04 | Univ North Carolina | Zellen, die Vitamin-K-Reduktase und Vitamin-K-abhängiges Protein coexprimieren und deren Anwendung zur Verbesserung der Produktivität von diesem Vitamin-K-abhängigen Protein |
| US20060195935A1 (en) | 2004-11-08 | 2006-08-31 | Chromagenics B.V. | Selection of host cells expressing protein at high levels |
| SI1809750T1 (sl) | 2004-11-08 | 2012-08-31 | Chromagenics Bv | Izbira gostiteljskih celic, ki imajo visok nivo izraĹľanja proteina |
| US8039230B2 (en) * | 2004-11-08 | 2011-10-18 | Chromagenics B.V. | Selection of host cells expressing protein at high levels |
| JP5291341B2 (ja) * | 2004-11-08 | 2013-09-18 | クロマジェニックス ベー ヴェー | タンパク質を高レベルで発現する宿主細胞の選定 |
| US8999667B2 (en) * | 2004-11-08 | 2015-04-07 | Chromagenics B.V. | Selection of host cells expressing protein at high levels |
| CA2590284A1 (en) * | 2004-12-08 | 2006-06-15 | Icos Corporation | Recombinant method for making multimeric proteins |
| US20090325226A1 (en) * | 2005-03-15 | 2009-12-31 | Stafford Darrel W | Methods and Compositions for Producing Active Vitamin K-Dependent Proteins |
| WO2007008848A2 (en) | 2005-07-07 | 2007-01-18 | Seattle Genetics, Inc. | Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the c-terminus |
| CA2614436C (en) | 2005-07-07 | 2016-05-17 | Seattle Genetics, Inc. | Monomethylvaline compounds having phenylalanine side-chain modifications at the c-terminus |
| WO2007045465A1 (en) | 2005-10-21 | 2007-04-26 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for the recombinant expression of a polypeptide |
| JP5666776B2 (ja) | 2005-10-28 | 2015-02-12 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | 齧歯動物細胞におけるタンパク質発現 |
| WO2007075976A2 (en) * | 2005-12-21 | 2007-07-05 | Inspiration Biopharmaceuticals, Inc. | Method of producing biologically active vitamin k dependent proteins by recombinant methods |
| WO2007081336A1 (en) * | 2006-01-13 | 2007-07-19 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Mammalian vectors for high-level expression of recombinant proteins |
| CA2651478C (en) | 2006-05-17 | 2015-02-03 | Josef Endl | Polypeptide producing cells |
| CA2656558A1 (en) * | 2006-06-30 | 2008-01-10 | The Regents Of The University Of Michigan | Method of producing factor viii proteins by recombinant methods |
| US20090203077A1 (en) * | 2006-06-30 | 2009-08-13 | The Regents Of The University Of Michigan | Method of producing factor viii proteins by recombinant methods |
| US20090143288A1 (en) | 2007-03-13 | 2009-06-04 | Roche Palo Alto Llc | Peptide-complement conjugates |
| EP1975228A1 (en) | 2007-03-28 | 2008-10-01 | Fachhochschule Mannheim | Polynucleotides for enhancing expression of a polynucleotide of interest |
| AU2008245524A1 (en) | 2007-04-26 | 2008-11-06 | Cnj Holdings, Inc. | Recombinant vitamin K dependent proteins with high sialic acid content and methods of preparing same |
| KR101163295B1 (ko) * | 2007-06-29 | 2012-07-05 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 향상된 면역글로불린을 생산하는 중쇄 돌연변이체 |
| EP2207881A1 (en) | 2007-10-12 | 2010-07-21 | F. Hoffmann-Roche AG | Protein expression from multiple nucleic acids |
| WO2009067546A2 (en) | 2007-11-19 | 2009-05-28 | Celera Corpration | Lung cancer markers and uses thereof |
| UA101497C2 (ru) | 2008-04-24 | 2013-04-10 | Селтик Фарма Пег Лтд. | Конъюгаты фактора ix с увеличенным временем полужизни |
| CA2975228C (en) | 2008-05-02 | 2020-07-21 | Seattle Genetics, Inc. | Methods and compositions for making antibodies and antibody derivatives with reduced core fucosylation |
| CA2771410C (en) | 2009-08-06 | 2020-10-06 | Cmc Icos Biologics, Inc. | Methods for improving recombinant protein expression comprising reduction in translation efficiency of a selectable marker protein |
| WO2011033005A2 (en) | 2009-09-15 | 2011-03-24 | Medimmune Limited | Cells for transient expression and uses thereof |
| WO2011053738A1 (en) | 2009-10-30 | 2011-05-05 | Inspiration Biopharmaceuticals, Inc. | Method of producing recombinant vitamin k dependent proteins |
| EP2339009A1 (en) | 2009-12-22 | 2011-06-29 | Sandoz Ag | Cold inducible promoter sequences |
| HUE038788T2 (hu) | 2010-03-31 | 2018-11-28 | Boehringer Ingelheim Int | Anti-CD40 antitestek |
| UA112062C2 (uk) | 2010-10-04 | 2016-07-25 | Бьорінгер Інгельхайм Інтернаціональ Гмбх | Cd33-зв'язувальний агент |
| JP6126532B2 (ja) | 2010-11-04 | 2017-05-10 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 抗ｉｌ−２３抗体 |
| EP2655607A4 (en) | 2010-12-21 | 2014-05-14 | Univ North Carolina | METHOD AND COMPOSITIONS FOR PRODUCING ACTIVE VITAMIN K-DEPENDENT PROTEINS |
| US20150158934A1 (en) | 2011-09-09 | 2015-06-11 | Ucl Business Plc | Broadly neutralizing vhh against hiv-1 |
| PL2771031T3 (pl) | 2011-10-28 | 2018-09-28 | Prothena Biosciences Limited Co. | Humanizowane przeciwciała rozpoznające alfa-synukleinę |
| EA031948B1 (ru) | 2011-11-16 | 2019-03-29 | Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх | Антитело к il-36r или его антигенсвязывающий фрагмент, выделенный полинуклеотид, клетка-хозяин и способ получения этого антитела или его фрагмента, содержащая их фармацевтическая композиция и применение антитела или его фрагмента и композиции |
| JP2015503907A (ja) | 2011-12-22 | 2015-02-05 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | 真核細胞のための全長抗体提示システムおよびその使用 |
| EP3816284A1 (en) | 2011-12-22 | 2021-05-05 | F. Hoffmann-La Roche AG | Expression vector for antibody production in eukaryotic cells |
| CN113896787A (zh) | 2011-12-22 | 2022-01-07 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 表达载体元件组合、新的生产用细胞产生方法及其在重组产生多肽中的用途 |
| WO2013112945A1 (en) | 2012-01-27 | 2013-08-01 | Neotope Biosciences Limited | Humanized antibodies that recognize alpha-synuclein |
| EP2812702B1 (en) | 2012-02-10 | 2019-04-17 | Seattle Genetics, Inc. | Diagnosis and management of CD30-expressing cancers |
| US20130230901A1 (en) * | 2012-02-14 | 2013-09-05 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Process for making recombinant antidote to factor xa inhibitor |
| CN109206516A (zh) | 2012-05-03 | 2019-01-15 | 勃林格殷格翰国际有限公司 | 抗IL-23p19抗体 |
| UA118441C2 (uk) | 2012-10-08 | 2019-01-25 | Протена Біосаєнсиз Лімітед | Антитіло, що розпізнає альфа-синуклеїн |
| US20150307863A1 (en) | 2012-11-20 | 2015-10-29 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for modified factor ix proteins |
| NZ711654A (en) | 2013-03-12 | 2021-07-30 | Cmc Icos Biologics Inc | Improved recombinant protein expression using a hybrid chef1 promoter |
| EP2970453B1 (en) | 2013-03-13 | 2019-12-04 | Prothena Biosciences Limited | Tau immunotherapy |
| US10513555B2 (en) | 2013-07-04 | 2019-12-24 | Prothena Biosciences Limited | Antibody formulations and methods |
| RU2535871C1 (ru) * | 2013-07-10 | 2014-12-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ") | Плазмида для экспрессии в клетке китайского хомячка, клетка китайского хомячка - продуцент белка с Gla-доменом и способ получения белка с Gla-доменом |
| WO2015004633A1 (en) | 2013-07-12 | 2015-01-15 | Neotope Biosciences Limited | Antibodies that recognize islet-amyloid polypeptide (iapp) |
| WO2015004632A1 (en) | 2013-07-12 | 2015-01-15 | Neotope Biosciences Limited | Antibodies that recognize iapp |
| JP2017501848A (ja) | 2013-11-19 | 2017-01-19 | プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド | 便秘症状からのレビー小体病の免疫療法のモニター |
| EA033604B1 (ru) | 2014-01-31 | 2019-11-08 | Boehringer Ingelheim Int | Молекула анти-baff антитела, фармацевтическая композиция, содержащая эту молекулу, способы ее применения и кодирующий ее изолированный полинуклеотид |
| EP3116911B8 (en) | 2014-03-12 | 2019-10-23 | Prothena Biosciences Limited | Anti-mcam antibodies and associated methods of use |
| TW201623331A (zh) | 2014-03-12 | 2016-07-01 | 普羅帝納生物科學公司 | 抗黑色素瘤細胞黏著分子（ｍｃａｍ）抗體類及使用彼等之相關方法 |
| CA2938931A1 (en) | 2014-03-12 | 2015-09-17 | Prothena Biosciences Limited | Anti-laminin4 antibodies specific for lg1-3 |
| US10059761B2 (en) | 2014-03-12 | 2018-08-28 | Prothena Biosciences Limited | Anti-Laminin4 antibodies specific for LG4-5 |
| CA2944402A1 (en) | 2014-04-08 | 2015-10-15 | Prothena Biosciences Limited | Blood-brain barrier shuttles containing antibodies recognizing alpha-synuclein |
| US10507241B2 (en) | 2014-07-24 | 2019-12-17 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Biomarkers useful in the treatment of IL-23A related diseases |
| TWI781507B (zh) | 2015-01-28 | 2022-10-21 | 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 | 抗甲狀腺素運送蛋白抗體 |
| TWI769570B (zh) | 2015-01-28 | 2022-07-01 | 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 | 抗甲狀腺素運送蛋白抗體 |
| TWI718122B (zh) | 2015-01-28 | 2021-02-11 | 愛爾蘭商普羅佘納生物科技有限公司 | 抗甲狀腺素運送蛋白抗體 |
| KR102554850B1 (ko) | 2015-02-06 | 2023-07-13 | 더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐 | 최적화된 인간 응고 인자 viii 유전자 발현 카세트 및 그의 용도 |
| EP3685856A1 (en) | 2015-04-14 | 2020-07-29 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Treatment of asthma with anti-il-23a antibodies |
| JP6936217B2 (ja) | 2015-05-12 | 2021-09-15 | シンティミューン，インコーポレイティド | ヒト化型親和性成熟抗ＦｃＲｎ抗体 |
| CA2998716A1 (en) | 2015-09-16 | 2017-03-23 | Prothena Biosciences Limited | Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of giant cell arteritis, polymyalgia rheumatica or takayasu's arteritis |
| WO2017046774A2 (en) | 2015-09-16 | 2017-03-23 | Prothena Biosciences Limited | Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of giant cell arteritis, polymyalgia rheumatica or takayasu's arteritis |
| TWI733695B (zh) | 2015-09-18 | 2021-07-21 | 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 | 治療發炎性疾病之方法 |
| WO2017070167A1 (en) | 2015-10-20 | 2017-04-27 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for modified factor ix fusion proteins |
| WO2017149513A1 (en) | 2016-03-03 | 2017-09-08 | Prothena Biosciences Limited | Anti-mcam antibodies and associated methods of use |
| WO2017153953A1 (en) | 2016-03-09 | 2017-09-14 | Prothena Biosciences Limited | Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of granulomatous lung diseases |
| WO2017153955A1 (en) | 2016-03-09 | 2017-09-14 | Prothena Biosciences Limited | Use of anti-mcam antibodies for treatment or prophylaxis of granulomatous lung diseases |
| EP4410997A2 (en) | 2016-04-15 | 2024-08-07 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Methods of treating inflammatory diseases |
| US10822417B2 (en) | 2016-04-25 | 2020-11-03 | Syntimmune, Inc. | Humanized affinity matured anti-FcRn antibodies |
| WO2017191559A1 (en) | 2016-05-02 | 2017-11-09 | Prothena Biosciences Limited | Tau immunotherapy |
| CU24538B1 (es) | 2016-05-02 | 2021-08-06 | Prothena Biosciences Ltd | Anticuerpos monoclonales que compiten por unirse a tau humano con el anticuerpo 16g7 |
| CU24537B1 (es) | 2016-05-02 | 2021-07-02 | Prothena Biosciences Ltd | Anticuerpos monoclonales que compiten por unirse a tau humano con el anticuerpo 3d6 |
| WO2017208210A1 (en) | 2016-06-03 | 2017-12-07 | Prothena Biosciences Limited | Anti-mcam antibodies and associated methods of use |
| WO2018007922A2 (en) | 2016-07-02 | 2018-01-11 | Prothena Biosciences Limited | Anti-transthyretin antibodies |
| JP7017013B2 (ja) | 2016-07-02 | 2022-02-08 | プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド | 抗トランスサイレチン抗体 |
| JP7016470B2 (ja) | 2016-07-02 | 2022-02-07 | プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド | 抗トランスサイレチン抗体 |
| JP6818134B2 (ja) | 2016-09-29 | 2021-01-20 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | ポリペプチド産生細胞を選択するための改善された方法 |
| EP3677597A1 (en) | 2016-10-14 | 2020-07-08 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Methods of treating diseases |
| JP2020512344A (ja) | 2017-03-27 | 2020-04-23 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 抗ｉｌ−３６ｒ抗体併用治療 |
| IL270375B1 (en) | 2017-05-02 | 2024-08-01 | Prothena Biosciences Ltd | Antibodies that recognize tau |
| US10793634B2 (en) | 2017-06-09 | 2020-10-06 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Anti-TrkB antibodies |
| AU2017434556A1 (en) | 2017-09-28 | 2020-04-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Dosing regimes for treatment of synucleinopathies |
| CN111801424A (zh) | 2018-01-10 | 2020-10-20 | Agc生技制品公司 | 双向chef1载体 |
| CN112004826B (zh) | 2018-02-05 | 2024-06-14 | 自由大学基金会 | 反向激动性抗us28抗体 |
| WO2019156566A1 (en) | 2018-02-12 | 2019-08-15 | Umc Utrecht Holding B.V. | Bispecific molecules comprising gamma-delta tcr and t-cell or nk cell binding domain |
| WO2019226050A2 (en) | 2018-05-24 | 2019-11-28 | Wageningen Universiteit | Novel viral anti-infective reagents |
| WO2019235923A1 (en) | 2018-06-04 | 2019-12-12 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Role for low density lipoprotein receptor-related protein 10 in progressive brain diseases |
| AU2019291890A1 (en) | 2018-06-29 | 2020-12-17 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Anti-CD40 antibodies for use in treating autoimmune disease |
| CN110904127B (zh) | 2018-09-18 | 2024-09-20 | 瓦赫宁恩研究基金会 | 非洲猪瘟病毒疫苗 |
| WO2020080941A1 (en) | 2018-10-16 | 2020-04-23 | Umc Utrecht Holding B.V. | Anti- low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6 antibodies |
| CR20210272A (es) | 2018-11-26 | 2021-07-14 | Forty Seven Inc | Anticuerpos humanizados contra c-kit |
| WO2020130838A2 (en) | 2018-12-21 | 2020-06-25 | Qvq Holding B.V. | Antibodies for preventing or treating candidiasis |
| CU20210073A7 (es) | 2019-03-03 | 2022-04-07 | Prothena Biosciences Ltd | Anticuerpos que se unen dentro de la región de unión a microtúbulos de tau definida por cdrs |
| CA3132917A1 (en) | 2019-03-08 | 2020-09-17 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Anti-il-36r antibody formulations |
| KR20220019660A (ko) | 2019-04-02 | 2022-02-17 | 이뮨튠 비.브이. | 면역-자극성 조성물 및 이의 용도 |
| EP3966239A1 (en) | 2019-05-09 | 2022-03-16 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Anti-sema3a antibodies and their uses for treating eye or ocular diseases |
| TW202115112A (zh) | 2019-06-27 | 2021-04-16 | 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 | 抗-angpt2抗體 |
| CN114423788A (zh) | 2019-09-24 | 2022-04-29 | 勃林格殷格翰国际有限公司 | 抗nrp1a抗体及其用于治疗眼或眼部疾病的用途 |
| BR112022023989A2 (pt) | 2020-05-26 | 2023-02-07 | Boehringer Ingelheim Int | Anticorpos anti-pd-1 |
| JP2023533458A (ja) | 2020-06-24 | 2023-08-03 | プロシーナ バイオサイエンシーズ リミテッド | ソルチリンを認識する抗体 |
| CN117062836A (zh) | 2021-02-05 | 2023-11-14 | 勃林格殷格翰国际有限公司 | 抗il1rap抗体 |
| CA3239286A1 (en) | 2021-12-22 | 2023-06-29 | Cdr-Life Ag | Anti-c3 antibodies and antigen-binding fragments thereof and their uses for treating eye or ocular diseases |
| CN114540352A (zh) * | 2022-02-16 | 2022-05-27 | 艾瑞生命科学技术(常州)有限公司 | 一种多核苷酸、载体元件及表达载体和宿主细胞及应用 |
| WO2024096735A1 (en) | 2022-10-31 | 2024-05-10 | Stichting Amsterdam UMC | Single domain anti-cd169 antibodies |
| WO2024101989A1 (en) | 2022-11-08 | 2024-05-16 | Stichting Amsterdam UMC | Activation inducible antigen receptors for adoptive immunotherapy |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5266491A (en) * | 1989-03-14 | 1993-11-30 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | DNA fragment and expression plasmid containing the DNA fragment |
| JP3051411B2 (ja) * | 1989-03-14 | 2000-06-12 | 持田製薬株式会社 | 新規ｄｎａならびにそれを含有する発現プラスミド |
| ES2151463T5 (es) * | 1989-12-22 | 2012-10-29 | Merck Serono Sa | Constructos de ADN para la activación y la modificación de la expresión de genes endógenos |
| US5650294A (en) * | 1990-06-25 | 1997-07-22 | Basf Aktiengesellschaft | Isolated promoter and terminator of elongation factor 1-α |
| AU664847B2 (en) * | 1991-05-15 | 1995-12-07 | Cell Genesys, Inc. | Genomic modifications with homologous DNA targeting |
| CA2051085C (en) * | 1991-09-10 | 2001-08-21 | Shigekazu Nagata | Expression plasmids |
| TW402639B (en) * | 1992-12-03 | 2000-08-21 | Transkaryotic Therapies Inc | Protein production and protein delivery |
-
1997
- 1997-05-01 US US08/847,218 patent/US5888809A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-05-01 DE DE69833649T patent/DE69833649T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 HU HU0004137A patent/HU225764B1/hu unknown
- 1998-05-01 EP EP06003954A patent/EP1676916A1/en not_active Withdrawn
- 1998-05-01 AU AU72770/98A patent/AU742561B2/en not_active Expired
- 1998-05-01 CZ CZ0028099A patent/CZ296544B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-05-01 WO PCT/US1998/008906 patent/WO1998049289A1/en active Application Filing
- 1998-05-01 JP JP10547444A patent/JP2000513948A/ja active Pending
- 1998-05-01 EP EP98920128A patent/EP0920498B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 IL IL12789798A patent/IL127897A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-05-01 CN CNB988009137A patent/CN100430477C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 SK SK118-99A patent/SK285664B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-05-01 BR BRPI9804896-1B1A patent/BR9804896B1/pt active IP Right Grant
- 1998-05-01 ES ES98920128T patent/ES2263206T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-01 PT PT98920128T patent/PT920498E/pt unknown
- 1998-05-01 CN CNA2008101103936A patent/CN101570753A/zh active Pending
- 1998-05-01 DK DK98920128T patent/DK0920498T3/da active
- 1998-05-01 PL PL98331005A patent/PL195604B1/pl unknown
- 1998-05-01 AT AT98920128T patent/ATE318900T1/de active
- 1998-05-01 RU RU99101788/13A patent/RU2249617C2/ru active
-
1999
- 1999-01-04 NO NO19990025A patent/NO323853B1/no not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-03-15 HK HK00101582A patent/HK1022719A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-12-10 RU RU2004136574/13A patent/RU2004136574A/ru not_active Application Discontinuation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ28099A3 (cs) | Transkripční regulační DNA z křeččího EF-1alfa | |
| US5770421A (en) | Human ALK protein tyrosine kinase | |
| AU726386B2 (en) | Vectors and methods for tissue specific synthesis of protein in eggs of transgenic hens | |
| WO1996024603A9 (en) | InK4c-p18 AND InK4D-p19, INHIBITORS OF CYCLIN-DEPEDENT KINASES CDK4 AND CDK6, AND USES THEREOF | |
| CS267192A3 (en) | Expression systems | |
| US20020199214A1 (en) | Avian lysozyme promoter | |
| US6482937B1 (en) | Porcine Oct-4 promoter | |
| AU705640B2 (en) | Compositions and methods for mediating cell cycle progression | |
| CA2405768A1 (en) | Self-extinguishing recombinases, nucleic acids encoding them and methods of using the same | |
| JP2006262875A (ja) | 鳥類の卵管内でタンパク質を発現させるための遺伝子構築物、およびこれを用いたタンパク質の生産方法 | |
| WO1998046756A9 (en) | Secreted protein ssp-1 compositions and therapeutic and diagnostic uses therefor | |
| AU700224B2 (en) | Alpha-lactalbumin gene constructs | |
| US20100107265A1 (en) | Double-muscling in mammals | |
| CA2259145C (en) | Hamster ef-1.alpha. transcriptional regulatory dna | |
| KR100607527B1 (ko) | 인간이 아닌 형질전이된 동물로부터의 고 전사 복합체의 정제방법 | |
| KR101093835B1 (ko) | 포유동물세포 내에서 목적 유전자를 고도로 증폭시키기 위한 방법 및 벡터 | |
| EP1147184A1 (en) | Controlled expression of heterologous proteins in the mammary gland of a transgenic animal | |
| WO2002008429A2 (en) | Vdup1 promoter and methods of use thereof | |
| WO2004023869A1 (en) | Use of plag or plag-inhibitors to diagnose and/or treat disease | |
| MXPA98004115A (en) | Purification of more elevated order transcription compositions from transgenic animals no huma |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20180501 |