EA033604B1 - Молекула анти-baff антитела, фармацевтическая композиция, содержащая эту молекулу, способы ее применения и кодирующий ее изолированный полинуклеотид - Google Patents

Молекула анти-baff антитела, фармацевтическая композиция, содержащая эту молекулу, способы ее применения и кодирующий ее изолированный полинуклеотид Download PDF

Info

Publication number
EA033604B1
EA033604B1 EA201691541A EA201691541A EA033604B1 EA 033604 B1 EA033604 B1 EA 033604B1 EA 201691541 A EA201691541 A EA 201691541A EA 201691541 A EA201691541 A EA 201691541A EA 033604 B1 EA033604 B1 EA 033604B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
seq
baff
antibody
variable domain
sequences
Prior art date
Application number
EA201691541A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201691541A1 (ru
Inventor
Scott Ronald Brodeur
Keith Canada
Pankaj Gupta
Amy Marie Nicoletti
Qi Pan
Sanjaya Singh
Michael Dziegelewski
Philip Nicholas Gorman
Ashraf Khalil
John MIGLIETTA
David Presky
Tao Wu
Haiguang Xiao
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Int
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim Int filed Critical Boehringer Ingelheim Int
Publication of EA201691541A1 publication Critical patent/EA201691541A1/ru
Publication of EA033604B1 publication Critical patent/EA033604B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

Изобретение относится к молекулам анти-BAFF антитела, которые включают новые гуманизированные анти-BAFF антитела, к фармацевтическим композициям, содержащим эти молекулы, а также к терапевтическим способам с ее использованием, а именно к способу лечения субъекта, который имеет ассоциированное с BAFF расстройство; к способу лечения воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, респираторного заболевания, метаболического расстройства или рака и к способу ингибирования связывания BAFF с одним или более рецепторами BAFF на клетке млекопитающих, а также к изолированному полинуклеотиду, включающему последовательность, кодирующую вариабельный участок легкой цепи последовательности и вариабельный участок тяжелой цепи последовательности этой молекулы.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение в общем случае относится к анти-BAFF антителам для диагностического и терапевтического применения. В частности, раскрываются анти-BAFF антитела и способы для лечения различных заболеваний и расстройств. Также раскрываются фармацевтические композиции и наборы, включающие такие соединения.
Предпосылки создания изобретения
Фактор активации В-клеток (BAFF) представляет собой цитокин, который принадлежит к суперсемейству лигандов фактора некроза опухолей (ФНО) и действует в качестве лиганда для рецепторов BAFF-R (BR3), TACI (трансмембранный активатор и партнер кальциевого модулятора и лиганда циклофилина) и ВСМА (антиген созревании В-клеток). Взаимодействие между BAFF и его рецепторами инициирует сигналы, существенные для формирования и поддержания В-клеток, которые, в свою очередь, синтезируют иммуноглобулины в ответ на инвазию чужеродным веществом. Соответствующие уровни BAFF пациента помогают поддерживать нормальные уровни иммунитета, тогда как недостаточные уровни могут приводить к иммунодефициту, а избыточные уровни могут вызывать аномально высокую выработку антител.
Когда пациент демонстрирует аутоиммунитет, он вырабатывает антитела против тканей или органов своего собственного тела. Аутоиммунные заболевания, в том числе волчанка и ревматоидный артрит, являются результатом избыточных уровней BAFF в организме. Таким образом, является важным модулировать выработку BAFF для лечения пациентов, страдающих этими заболеваниями.
BAFF может существовать в трех формах: в связанной с мембраной форме (mbBAFF), растворимого тримерного BAFF (sBAFF) и в виде мультимерной формы, состоящей из 60 мономеров BAFF. Относительная важность различных форм BAFF при нормальной физиологии и при болезни не очень понятна. Как отмечается, BAFF связывается с тремя рецепторами, BAFFR (BR3), TACI и ВСМА. Индуцирующий пролиферацию лиганд (APRIL), родственный член семейства лигандов рецептора ФНО, с высокой аффинностью связывается с TACI и ВСМА. В противовес высокой аффинности взаимодействие APRIL:ВСМА, взаимодействие BAFF:ВСМА имеет низкую аффинность (1-2 мкМ) и не играет важную роль in vivo (Bossen и Schneider, 2006).
Растворимый BAFF экспрессируется на высоком уровне у индивидуумов с системной красной волчанкой (СКВ) и в воспаленных органах-мишенях, таких как почки. Растворимый BAFF служит важным фактором для поддержания гомеостаза и выживаемости В-клеток (Kalled и др, 2005; Маккей и др, 2003; Smith, 2003 Cancro; Patke и др., 2004). Образование аутоантител зависимыми от BAFF В-клетками приводит к гломерулярному отложению IC первоначально на клубочковой базальной мембране (GBM), мезангии и интерстициальной ткани в проксимальных тубулярных эпителиальных клетках (РТЕС). Эти отложения IC приводят к фиксации комплемента и активации нейтрофилов, что приводит к локальному повреждению почек. Медиаторы воспаления (например, IL6, IL8, МСР-1), вырабатываемые поврежденными клетками почек (МС, РТЕС, почечными фибробластами, эндотелиальными клетками), запускают воспалительный цикл за счет повышения инфильтрации иммунных клеток (например, В-клеток, Т-клеток, дендритных клеток, нейтрофилов и макрофагов).
Направленное против BAFF моноклональное антитело белимумаб ((Benlysta®) продемонстрировало активность при лечении системной красной волчанки (СКВ), а также обладает способностью уменьшать образование аутоантител. Белимумаб в настоящее время одобрен для лечения активной СКВ без поражения почек. Однако не сообщалось о том, что белимумаб связывается с mbBAFF. Только ингибирование sBAFF, таким образом, представляет собой реальный путь для лечения избыточных уровней BAFF и увеличения выработки антител. В отличие от этого, сообщалось, что анти-BAFF пептитело блисибимод (А-623) и анти-BAFF моноклональное антитело табалумаб (LY2127399), как было продемонстрировано, связывают как sBAFF, так и mbBAFF (2010 пресс-релиз Anthera и 2012 пресс-релиз Lilly). Учитывая неопределенность роли различных форм BAFF в заболевании, антагонисты молекул sBAFF и mbBAFF с полезными фармакологическими свойствами могут обладать дополнительным преимуществом при лечении иммунологических и аутоиммунных заболеваний у людей.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к новой молекуле анти-BAFF антитела, которая включает вариабельный домен легкой цепи, включающий CDR1 последовательности SEQ ID NO: 5, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 8 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 9; и вариабельный домен тяжелой цепи, включающий CDR1 последовательности SEQ ID NO: 28, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 29 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 30.
В другом варианте эта молекула анти-BAFF антитела включает вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 93 и вариабельный домен тяжелой цепи последовательностей SEQ ID NO: 114.
Причем в предпочтительном варианте осуществления изобретения предложенная молекула антиBAFF нейтрализует все три формы человеческого BAFF, а именно формы, которые включают связанный с мембраной (mbBAFF), растворимый тримерный BAFF и растворимый 60-мерный BAFF, в самом предпочтительном варианте она нейтрализует только человеческий растворимый тримерный BAFF, или че
- 1 033604 ловеческий связанный с мембраной BAFF, или человеческий растворимый 60-мерный BAFF.
Эта молекула анти-BAFF в одном из вариантов включает:
a) гуманизированный вариабельный домен легкой цепи, включающий CDR последовательностей SEQ ID NO: 5, 8 и 9 и каркасные участки, имеющие аминокислотную последовательность, по крайней мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности каркасных участков вариабельного домена легкой цепи аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 93; и
b) гуманизированный вариабельный домен тяжелой цепи, который включает CDR последовательностей SEQ ID NO: 28, 29 и 30 и каркасные участки, имеющие аминокислотную последовательность, по крайней мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности каркасных участков аминокислотной последовательности вариабельного домена тяжелой цепи аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 114.
Такая молекула анти-BAFF антитела представляет собой моноклональное антитело или гуманизированное моноклональное антитело.
Еще одним объектом данного изобретения является фармацевтическая композиция для лечения субъекта, который имеет ассоциированное с BAFF расстройство, включающая описанную в документе молекулу анти-BAFF антитела и фармацевтически приемлемый носитель.
Третьим объектом данного изобретения является способ лечения субъекта, который имеет ассоциированное с BAFF расстройство, включающий введение такому субъекту молекулы анти-BAFF или фармацевтической композиции, включающей молекулу анти-BAFF антитела и фармацевтически приемлемый носитель.
Четвертым объектом данного изобретения является способ лечения воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, респираторного заболевания, метаболического расстройства или рака, включающий введение субъекту, который в этом нуждается, эффективного количества молекулы антиBAFF антитела или фармацевтической композиции, включающей молекулу анти-BAFF антитела и фармацевтически приемлемый носитель.
В предпочтительном варианте заболевание представляет собой системную красную волчанку, волчаночный нефрит или ревматоидный артрит.
Пятым объектом данного изобретения может служить способ ингибирования связывания BAFF с одним или более рецепторами BAFF на клетке млекопитающих, где BAFF рецептор представляет собой BAFF-R (BR3), TACI (трансмембранный активатор и партнер кальциевого модулятора и лиганда циклофилина) и/или ВСМА (антиген созревания В-клеток), включающий введение в клетку молекулы антиBAFF антитела.
И, наконец, последним объектом является изолированный полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую вариабельный участок легкой цепи последовательности SEQ ID NOS: 93 и вариабельный участок тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 114.
В предпочтительном варианте этого изолированного полинуклеотида вариабельный участок легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 394, а вариабельный участок тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 398.
Анти-BAFF антитела в соответствии с настоящим изобретением связываются с человеческим BAFF с высокой аффинностью, ингибируя, таким образом, патологическую продукцию иммуноглобулина.
Краткое описание фигур
Фиг. 1. Эффективность моноклонального анти-BAFF антитела против sBAFF:химерный HuIgG1 KO по сравнению с парентеральными мышиными моноклональными антителами.
Фиг. 2. Эффективность моноклонального анти-BAFF антитела против А mbBAFF:химерный HuIgG1 KO по сравнению с парентеральными мышиными моноклональными антителами.
Подробное описание
Исходные мышиные антитела могут происходить от мышиных гибридом. Иммунизацию мышей осуществляют при использовании различных способов. Например, антитела, которые являются специфическими для человеческого BAFF, могут быть индуцированными против иммуногенного антигена, такого как выделенный белок BAFF и/или любая его часть из упомянутых выше (в том числе синтетические пептиды). Получение иммуногенных антигенов и моноклональных антител может осуществляться при использовании любого подходящего способа, известного в данной области техники.
Исходные мышиные антитела были отобраны на основе их высокой аффинности к BAFF.
В соответствии с этим антитело связывается с человеческим BAFF с высокой степенью аффинности. Отобранные мышиные антитела были гуманизированы для получения гуманизированных антител. Гуманизированные антитела связываются с человеческим BAFF с высокой аффинностью. Заявленное антитело к BAFF имеет KD менее чем 100 пМ. Антитело к BAFF может иметь KD менее чем 10 пМ или KD менее чем 1 пМ.
Гуманизированное моноклональное антитело к BAFF имеет предпочтительные биофизические свойства, например качество, стабильность или растворимость.
Антитело к BAFF узнает специфический или BAFF эпитоп. Эпитопы могут быть определены с помощью различных методов, известных в данной области техники, таких как рентгеновская кристалло- 2 033604 графия, масс-спектрометрия водородно-дейтериевого обмена (HXMS), сайт-направленный мутагенез, аланин-сканирующий мутагенез, а также методов пептидного скрининга.
Определения
Общая структура антител или иммуноглобулинов хорошо известна специалистам в данной области техники. Эти молекулы представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины, как правило, с молекулярной массой 150000 Да, состоящие из двух идентичных легких цепей (L) и двух идентичных тяжелых цепей (H), и обычно именуются как полноразмерные антитела. Каждая легкая цепь ковалентно связана с тяжелой цепью дисульфидной связью с образованием гетеродимера, а гетеротетрамерная молекула образуется при ковалентном связывании дисульфидной связью двух идентичных тяжелых цепей таких гетеродимеров. Несмотря на то что легкие и тяжелые цепи связаны вместе одной дисульфидной связью, количество дисульфидных связей между двумя тяжелыми цепями варьирует в зависимости от изотипа иммуноглобулина. Каждая тяжелая и легкая цепи также содержит регулярно расположенные дисульфидные мостики внутри цепи. Каждая тяжелая цепь имеет на аминотерминальном конце вариабельный домен (VH), за которым следуют три или четыре константных домена (CH1, CH2, CH3 и CH4), а также шарнирную область между CH1 и CH2. Каждая легкая цепь имеет два домена, аминотерминальный вариабельный домен (VL) и карбокситерминальный константный домен (CL). Домен VL нековалентно связан с доменом VH, в то время как домен CL обычно ковалентно связан с доменом CH1 посредством дисульфидной связи. Считают, что определенные аминокислотные остатки образуют область раздела между вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей (Chothia и др., 1985, J. Mol. Biol. 186:651-663). Вариабельные домены также называются в данном описании как вариабельные участки.
Определенные домены в пределах вариабельных участков значительно отличаются между различными антителами, т.е. являются гипервариабельными. Эти гипервариабельные домены содержат остатки, которые непосредственно участвуют в связывании и определении специфичности каждого конкретного антитела в отношении его специфической антигенной детерминанты. Гипервариабельность в вариабельных областях обеих легкой и тяжелой цепей сконцентрирована в трех сегментах, известных как участки, определяющие комплементарность (CDR) или гипервариабельные петли (HVL).
CDR определяются путем сравнения последовательностей, как описано у Kabat и др., 1991, в Sequences of proteins of immunological interest, 5-е изд. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, в то время как HVL (которые также называются в данном документе как CDR) в структурном отношении определяются по трехмерной структуре вариабельного домена, как описано CLothia и Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917. Эти два способа приводят к несколько различающимся идентификациям CDR. По определению Kabat, CDR-L1 находится примерно в остатках 24-34, CDR-L2 примерно в остатках 50-56 и CDR-L3 примерно в остатках 89-97 вариабельного домена легкой цепи; CDR-H1 находится примерно в остатках 31-35, CDR-H2 примерно в остатках 50-65 и CDR-L3 примерно в остатках 95102 вариабельного домена тяжелой цепи.
Точное количество остатков, которые охватывают конкретный CDR, будет варьировать в зависимости от последовательности и размера CDR. Специалист в данной области техники может обычным образом определить, какие остатки включает конкретный CDR с учетом аминокислотной последовательности вариабельного участка антитела. Таким образом, CDR1, CDR2, CDR3 тяжелых и легких цепей определяют уникальные и функциональные свойства, специфические для данного антитела.
Три CDR в пределах каждой из тяжелой и легкой цепей разделены каркасными участками (FR), которые содержат последовательности с тенденцией к меньшей вариабельности. От аминотерминального конца к карбокситерминальному концу вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей FR и CDR расположены в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. В основном конфигурация β-складки FR содержит каждую из цепей в непосредственной близости друг к другу, а также к CDR из другой цепи. Полученная конформация вносит свой вклад в антигенсвязывающий сайт (см. Kabat и др., 1991, NIH Publ. № 91-3242, том I, стр. 647-669), несмотря на то, что не все остатки CDR обязательно принимают непосредственное участие в связывании антигена.
Остатки FR и константные участки Ig не принимают непосредственного участия в связывании антигена, но вносят свой вклад в связывание антигена и/или опосредуют эффекторную функцию антитела. Некоторые остатки FR могут оказывать существенное влияние на связывание антигена по меньшей мере тремя путями: нековалентное связывание непосредственно с эпитопом, взаимодействие с одним или более остатками CDR и влияние на поверхность раздела между тяжелой и легкой цепями. Константные домены непосредственно не участвуют в связывании антигена, но опосредуют различные эффекторные функции Ig, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), антителозависимом клеточном фагоцитозе (ADCP) и зависимой от комплемента цитотоксичности (CDC).
Легкие цепи иммуноглобулинов позвоночных относятся к одному из двух четко различающихся типов, каппа (к) и лямбда (λ), на основе аминокислотной последовательности константного участка. В качестве сравнения тяжелые цепи иммуноглобулинов млекопитающих относятся к одному из пяти основных классов в соответствии с последовательностью константных участков: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. IgG и IgA дополнительно подразделяются на подклассы (изотипы), например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1
- 3 033604 и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые относятся к различным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ и μ соответственно. Хорошо известны структуры субъединиц и трехмерные конфигурации классов нативных иммуноглобулинов.
Термины антитело, анти-BAFF антитело, молекула анти-BAFF антитела гуманизированное анти-BAFF антитело и вариант гуманизированного анти-BAFF антитела специфически охватывают моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультиспецифические антитела и фрагменты антител, такие как вариабельные домены и другие участки антител, которые проявляют желаемую биологическую активность, например связывание BAFF.
Термин моноклональное антитело (mAb) относится к антителу, которое является высокоспецифичным и непосредственно направленным против одной антигенной детерминанты, эпитопа. Таким образом, определение моноклональные указывает на антитела, направленные на идентичный эпитоп, и это не следует истолковывать так, что необходимо получать антитела каким-либо определенным способом. Следует понимать, что моноклональные антитела можно получить при использовании любого способа или методики, известной в данной области техники; включая, например, гибридомный метод, впервые описанный Kohler и др., 1975, Nature 256:495, или методы на основе рекомбинантной ДНК, известные в данной области техники (см., например, патент США № 4816567), или методы изоляции рекомбинантно полученного моноклонального антитела при использовании фаговой библиотеки антител с помощью способов, описанных Clackson и др., 1991, Nature, 352:624-628 и Marks и др., 1991, J. Mol. Biol. 222:581-597.
Термин мономер относится к гомогенной форме антитела. Например, для полноразмерного антитела термин мономер означает мономерное антитело, которое имеет две идентичные тяжелые цепи и две идентичные легкие цепи.
Химерные антитела состоят из вариабельных участков легкой и тяжелой цепей антитела из одного вида (например, млекопитающего, отличного от человека, такого, как мышь), а константные участки легкой и тяжелой цепей антитела - из других видов (например, человека) и могут быть получены путем связывания последовательностей ДНК, которые кодируют вариабельные участки антитела из первого вида (например, мыши), с последовательностями ДНК константных участков антитела из второго вида (например, человека) и трансформации хозяина при использовании экспрессионного вектора, содержащего связанные последовательности, для того чтобы позволить им продуцировать химерное антитело. Альтернативно, химерное антитело может быть таким, в котором один или более участков или доменов тяжелых и/или легких цепей являются идентичными, гомологичными или представляют собой вариант соответствующей последовательности в моноклональном антителе из другого класса или изотипа иммуноглобулинов. Химерные антитела могут включать фрагменты таких антител при условии, что фрагмент антитела проявляет желаемую биологическую активность исходного для него антитела, например, в отношении связывания с тем же эпитопом (см., например, патент США № 4816567 и Morrison и др., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855).
Термины фрагмент антитела, фрагмент анти-BAFF антитела, молекула анти-BAFF антитела, фрагмент анти-BAFF - эпитоп антитела, фрагмент гуманизированного анти-BAFF антитела, фрагмент гуманизированного анти-BAFF - эпитоп антитела относятся к части полноразмерного анти-BAFF антитела, у которого сохраняется вариабельный участок или функциональная способность, например, к специфическому связыванию с эпитопом BAFF. Примеры фрагментов антитела включают, но не ограничиваются такими, фрагменты Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, scFv и scFv-Fc, диатело, линейное антитело, одноцепочечное антитело, мини-тело, диатело, полученное из фрагментов антитела, и мультиспецифические антитела, полученные из фрагментов антитела.
Полноразмерные антитела могут подвергаться обработке с помощью фермента, такого как папаин или пепсин, для получения полезных фрагментов антитела. Переваривание папаином используется для получения двух идентичных антигенсвязывающих фрагментов антитела, которые называются фрагментами Fab, каждый из которых содержит один антигенсвязывающий сайт и остаточный фрагмент Fc. Fab-фрагмент также содержит константный участок легкой цепи и область CH1 тяжелой цепи. Обработка пепсином обеспечивает получение фрагмента F(ab')2, который имеет два антигенсвязывающих сайта и все еще способен к перекрестному связыванию с антигеном.
Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов наличием нескольких дополнительных остатков на С-терминальном конце домена CH1. Фрагменты F(ab')2 антитела представляют пары Fab'-фрагментов, связанные остатками цистеина в шарнирном участке. Также известны другие химические сочетания фрагментов антител.
Fv фрагмент содержит полный сайт узнавания и связывания антигена, который состоит из димера вариабельного участка одной тяжелой и одной легкой цепи в тесной нековалентной ассоциации. В данной конфигурации три CDR каждого вариабельного участка взаимодействуют с образованием антигенсвязывающего сайта на поверхности димера VH-VL. В совокупности, шесть CDR придают антителу антигенсвязывающую специфичность.
Одноцепочечный Fv или scFv''-фрагмент антитела представляет одноцепочечный вариант Fv, содержащий VH и VL домены антитела, где домены расположены в одной полипептидной цепи. Одноцепо
- 4 033604 чечный Fv способен распознавать антиген и связываться с ним. Полипептид scFv может также необязательно содержать полипептидный линкер, расположенный между доменами VH и VL, который способствует образованию трехмерной структуры для связывания антигена с помощью scFv (см., например, Pluckthun, 1994, в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, том 113, Rosenburg и Moore ред., SpringerVerlag, New York, стр. 269-315).
Термин диатело относится к небольшим фрагментам антитела, содержащим два антигенсвязывающих сайта, при этом каждый фрагмент включает вариабельный домен тяжелой цепи (VH), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в той же полипептидной цепи (VH-VL или VL-VH). Более полно диатела описаны, например, Hollinger и др., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:644-6448.
Другие признанные фрагменты антител включают те, которые содержат пару тандема Fd сегментов (VH-CH1-VH-CH1) с образованием пары антигенсвязывающих участков. Эти линейные антитела могут быть биспецифическими или моноспецифическими, как описано, например, Zapata и др., 1995, Protein Eng. 8(10):1057-1062.
Гуманизированное антитело или фрагмент гуманизированного антитела представляет собой специфический тип химерного антитела, которое включает вариант аминокислотной последовательности иммуноглобулина или ее фрагмент, которые способны связываться с предварительно определенным антигеном и которые включают один или более FR, имеющих аминокислотную последовательность человеческого иммуноглобулина, и один или более CDR, имеющих аминокислотную последовательность, отличную от человеческого иммуноглобулина. Данная последовательность иммуноглобулина, отличного от человеческого, часто называется импортной последовательностью и типично взята из домена импортного антитела, в частности, вариабельного домена. В общем случае гуманизированное антитело включает по крайней мере CDR или HVL, отличную от человеческого антитела, встроенную между FR вариабельного домена человеческой тяжелой или легкой цепи. В изобретении описаны специфические BAFF антитела, которые содержат CDR, имеющие происхождение от мышиных моноклональных антител, или гуманизированные CDR, представленные в табл. 3 и 4, встроенные между FR последовательностями вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей эмбриональной линии человека. Итак, определенные мышиные остатки FR важны для функции гуманизированных антител и, таким образом, определенные остатки последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей эмбриональной линии человека модифицированы для того, чтобы быть такими же, как и те, которые содержатся в соответствующей мышиной последовательности.
В другом аспекте гуманизированное BAFF антитело содержит в основном все по меньшей мере из одного и, как правило, двух вариабельных доменов (такие, например, как во фрагментах Fab, Fab', F(ab')2, Fabc и Fv), в которых все или существенно все CDR соответствуют таковым иммуноглобулина, отличного от человеческого, и все или существенно все FR из консенсусной последовательности или эмбриональной последовательности человеческого иммуноглобулина. В другом аспекте гуманизированное анти-BAFF антитело также включает по крайней мере часть Fc-участка иммуноглобулина, как правило, человеческого иммуноглобулина. Обычно антитело будет включать как легкую цепь, так и, по крайней мере, вариабельный домен тяжелой цепи. Антитело также может включать один или более из следующих участков: CH1 шарнирный участок, CH2, CH3 и/или CH4 участки тяжелой цепи.
Гуманизированное анти-BAFF антитело может быть выбрано из любого класса иммуноглобулинов, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любого изотипа, включая IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Например, константный домен может представлять связывающий комплемент константный участок, когда желательно, чтобы гуманизированное антитело проявляло цитотоксическую активность, а изотип, как правило, представляет IgG1. В тех случаях, когда цитотоксическая активность не является желательной, то константный участок может принадлежать к другому изотипу, например IgG2. Альтернативное гуманизированное анти-BAFF антитело может включать последовательности более чем из одного класса или изотипа иммуноглобулинов, и выбор конкретных константных участков для оптимизации желаемых эффекторных функций находится в компетенции специалистов в данной области техники. Антитела могут представлять собой IgG1 антитела, и, в частности, они являются IgG1 антителами, в которых существует нокаут эффекторных функций.
Не требуется, чтобы FR и CDR или HVL гуманизированного анти-BAFF антитела точно соответствовали исходным последовательностям. Например, один или более остатков в импортном CDR или HVL, или консенсусной последовательности FR, или таковой эмбриональной линии могут быть изменены (например, подвергнуты мутагенезу) путем замены, вставки или делеции, так что полученный аминокислотный остаток более не будет идентичен исходному остатку в соответствующем положении в любой исходной последовательности, но антитело, тем не менее, сохраняет функцию связывания с BAFF. Такое изменение, как правило, не будет значительным и будет представлять собой консервативное изменение. Как правило, по меньшей мере 75% остатков гуманизированного антитела будет соответствовать таковым в исходных консенсусных FR или FR эмбриональной линии и импортных CDR последовательностях, чаще по меньшей мере 90% и наиболее часто более чем 95%, или более чем 98%, или более чем 99%.
- 5 033604
Остатки иммуноглобулина, которые оказывают влияние на поверхность раздела между вариабельными участками тяжелой и легкой цепей (поверхность раздела Vh-Vl), представляют собой такие, которые оказывают влияние на близость или ориентацию двух цепей по отношению друг к другу. Определенные остатки, которые могут участвовать во взаимодействиях между цепями, включают остатки Vl 34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91, 96 и 98 и остатки Vh 35, 37, 39, 45, 47, 91, 93, 95, 100 и 103 (при использовании системы нумерации, представленной Kabat и др. Sequences of proteins of immunological interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987). В патенте США № 6407213 также обсуждается, что остатки, такие как остатки Vl 43 и 85 и остатки Vh 43 и 60, также могут быть вовлечены в это взаимодействие. Несмотря на то что данные остатки указаны только для человеческого IgG, они применимы и для других видов. Остатки импортного антитела, которые принимают участие во взаимодействиях цепей, выбирают для осуществления замены в консенсусной последовательности.
Термины консенсусная последовательность и консенсусное антитело относятся к аминокислотной последовательности, которая содержит наиболее часто встречаемый аминокислотный остаток в каждом положении во всех иммуноглобулинах любого конкретного класса, изотипа или структуры субъединиц, например в вариабельном участке человеческого иммуноглобулина. Консенсусная последовательность может основываться на иммуноглобулинах определенного вида или многих видов. Термин консенсусная последовательность, структура или антитело охватывает консенсусную последовательность человека и относится к аминокислотной последовательности, которая включает наиболее часто встречающиеся аминокислотные остатки в каждом положении во всех человеческих иммуноглобулинах любого конкретного класса, изотипа или структуры субъединиц. Таким образом, консенсусная последовательность включает аминокислотную последовательность, имеющую, по крайней мере, в каждом положении аминокислоту, которая находится в одном или более известном иммуноглобулине, но которая может не точно соответствовать полной аминокислотной последовательности любого одного иммуноглобулина. Консенсусную последовательность вариабельного участка не получают из любого естественно продуцированного антитела или иммуноглобулина. Kabat и др., 1991, Sequences of Proteins of Immunological
Interest, 5-е изд. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. FR консенсусных последовательностей тяжелой и легкой цепей и их варианты являются полезными последовательностями для получения гуманизированных анти-BAFF антител (см. например, патенты США № 6037454 и 6054297).
Последовательности эмбриональной линии человека встречаются в природе в человеческой популяции. Сочетание этих эмбриональных генов порождает разнообразие антител. Эмбриональные последовательности антител для легкой цепи антитела происходят от консервативных эмбриональных v-генов и j-генов каппа или лямбда человека. Подобно этому, последовательности тяжелой цепи происходят от эмбриональных v-, d- и j-генов (LeFranc, М.-Р., и LeFranc, G., The Immunoglobulin Facts Book, Academic Press, 2001).
Как используется в данном описании, термины вариант, вариант анти-BAFF антитела, вариант гуманизированного анти-BAFF антитела или вариант гуманизированного анти-BAFF антитела, каждый, относятся к гуманизированному анти-BAFF антителу, имеющему, по крайней мере, мышиный CDR вариабельного участка легкой цепи из любой последовательности, как представлено в табл. 1, или последовательность мышиного CDR тяжелой цепи, которая получена из мышиного моноклонального антитела, как представлено в табл. 2. Варианты включают такие, которые имеют одну или более замен аминокислот в вариабельных участках одной или обеих легкой или тяжелой цепях при условии, что изменение аминокислоты не оказывает существенного влияния на связывание антитела с BAFF.
Изолированное антитело представляет такое, которое было идентифицировано и выделено из и/или отделено от компонента его природной среды. Загрязняющие компоненты природной среды антитела представляют такие вещества, которые могут мешать диагностическому или терапевтическому применению антитела, и они могут представлять собой ферменты, гормоны или другие белковые или небелковые растворенные вещества. Антитело может иметь большую степень очистки, по меньшей мере 95% от веса антитела.
Изолированное антитело включает антитело in situ в рекомбинантных клетках, в которых оно вырабатывается, поскольку в данном случае не присутствует даже по меньшей один компонент природного окружения антитела. Однако обычно изолированное антитело получают при использовании по меньшей мере одного этапа очистки, при котором удаляется рекомбинантный клеточный материал.
Термин молекула антитела относится к любому из определений, описанных выше, или к его антигенсвязывающему фрагменту.
Термин функциональная способность антитела относится к факторам, которые вносят свой вклад в распознавание антителом антигена или эффективность антитела в условиях in vivo. Изменения аминокислотной последовательности антитела могут оказывать влияние на свойства антитела, такие как сборка, и могут влиять на физические факторы, такие как первоначальная скорость связывания антитела с антигеном (ka), константа диссоциации антитела и антигена (kd), константа аффинности антитела в отношении антигена (Kd), конформация антитела, стабильность белка и период полураспада антитела.
Термин нейтрализует в общем случае относится к обеспечению инактивации путем ингибирова
- 6 033604 ния биоактивности. Термин ингибирование в общем случае относится к ситуации, когда молекула является не способной выполнять свою функцию. В химии или биологии термин ингибировать означает ограничивать, предотвращать или блокировать действие или функцию, т.е. ингибировать фермент или ингибировать химическую реакцию. IC50 представляет собой концентрацию лекарственного средства, которая является необходимой для 50% ингибирования in vitro, a IC90 представляет собой концентрацию лекарственного средства, которая является необходимой для 90% ингибирования in vitro.
Термин меченый эпитоп при использовании в данном описании относится к анти-BAFF антителу, слитому с эпитопом-меткой. Эпитоп-метка представляет полипептид, содержащий достаточное количество аминокислот и сконструированный таким образом, что он не оказывает отрицательного влияния на желаемую активность гуманизированного анти-BAFF антитела. Как правило, эпитоп-метка является в достаточной мере уникальной, так что антитело, которое вырабатывается к эпитопу-метке, в основном не будет реагировать перекрестно с другими эпитопами. Приемлемые полипептиды для метки обычно содержат по меньшей мере 6 аминокислотных остатков и обычно содержат 8-50 аминокислотных остатков или примерно 9-30 остатков. Примеры эпитопов-меток и антитела, которое связывается с таким эпитопом, включают флуоресцентный полипептид-метку НА и его антитело 12СА5 (Field и др., 1988, Mol. Cell Biol. 8:2159-2165); c-myc метку и 8F9, ЗС7, 6Е10, G4, В7 и 9Е10 антитела к ней (Evan и др., Mol. Cell Biol. 5(12):3610-3616); а также гликопротеин D вируса простого герпеса (gD) и антитело к нему (Paborsky и др., 1990, Protein Engineering, 3(6):547-553). Эпитоп-метка может представлять собой эпитоп связывания рецептора реутилизации. Как используется в данном описании, термин эпитоп связывания рецептора реутилизации относится к эпитопу Fc-участка молекулы IgG (такой как IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4), который является ответственным за увеличение периода полураспада в сыворотке крови молекулы IgG.
Антитела могут быть конъюгированы с цитотоксическим агентом. Такой агент представляет собой любое вещество, которое ингибирует или предотвращает функцию клеток и/или вызывает разрушение клеток. Термин предназначается для включения радиоактивных изотопов (таких как 131I, 125I, 90Y и 186Re), химиотерапевтических препаратов и токсинов, таких как ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения и их фрагменты. Такие цитотоксические агенты можно сливать с антителом, например, гуманизированными антителами, при использовании стандартных методов и применять, например, для лечения пациента, которому показано лечение с использованием антитела.
Химиотерапевтический агент представляет собой химическое соединение, пригодное для лечения рака. Существуют многочисленные примеры химиотерапевтических агентов, которые могут быть конъюгированы с терапевтическими антителами. Примеры таких химиотерапевтических агентов включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, тритиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогенины (в частности, буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая синтетические аналоги топотекана); бриостатин; каллистатин; СС-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин, ауристатины (включая аналоги монометил-ауристатин Е и монометил-ауристатин F); дуокармицин (включая синтетические аналоги KW-2189 и CBI-TMI); элейтеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, меклоретамин, меклоретамин оксид гидрохлорид, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин; трофосфамид, урациловый иприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как антибиотики на основе энедиинов например, калихеамицин, в частности, калихемицин гамма 1I и калихемицин phiI1 (см., например, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl. 33:183-186); динемицин, включая динемицин А; бифосфонаты, такие как клодронат; эсперамицин, а также неокарзиностатиновыей хромофор и родственные антибиотические хромомофоры на основе хромопротеина энедиина, аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-Е-норлейцин, доксорубицин (Адриамицин™) (включая морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марселломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофенольная кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пуринов, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидинов, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолон пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадреналовые препараты, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; компенсаторы фолиевой кислоты, такие как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамид гликозид; аминолевулиновая
- 7 033604 кислота; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бизантрен; эдатраксат; дефофамин; демоколцин; диазиквон; элфорнитин; эллиптиний ацетат; эпотилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидамин; маитанзиноиды, такие как маитанзин и анзамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитакрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK®; разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазиквон; 2,2',2-трихлортриэтиламин; трихотецены (в частности, токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митабронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид (Ara-С); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например, паклитаксел (ТАКСОЛ®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NY) и доксетаксел (ТАКСОТЕРЕ™, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Франция); хлорамбуцил; гемцитабин (Gemzar™); 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; винорелбин (НАВЕЛБИН™); новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; СРТ-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифтометилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из перечисленных препаратов. Также в данное определение входят антигормональные препараты, которые функционируют для регуляции или подавления действия гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены и избирательные модуляторы рецепторов эстрогенов (SERM), включая, например, тамоксифен (в том числе Нолвадекс™), ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и торимифен (Fareston™); ингибиторы ароматазы, которые ингибируют фермент ароматазу, которая регулирует продукцию эстрогенов в надпочечниках, такие, например, как 4(5)-имидазолы, аминоглутетимид, мегестрол ацетат (Megace™), эксеместан, форместан, фадрозол, ворозол (Rivisor™), летрозол (Femara™) и анастрозол (Arimidex™) и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и госерелин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из перечисленных препаратов. Какой-либо один или более из этих агентов могут быть конъюгированы с гуманизированными антителами для лечения разнообразных расстройств.
Антитела также могут быть конъюгированы с пролекарственными средствами. Термин пролекарственное средство представляет собой форму предшественника или производной фармацевтически активного соединения, которая является менее цитотоксичной для опухолевых клеток по сравнению с исходным препаратом и способным активироваться или превращаться ферментативным путем в более активную форму (см. например, Wilman, 1986, Prodrugs in Cancer Chemotherapy, в Biochemical Society Transactions, 14, стр. 375-382, 615th Meeting Belfast and Stella и др., 1985, Prodrugs: a chemical approach to targeted drug delivery, в Directed Drug Delivery, Borchardt и др. (ред.), стр. 247-267, Humana Press). Пригодные пролекарственные средства включают, но не ограничиваются, фосфатсодержащие пролекарственные средства, тиофосфатсодержащие пролекарственные средства, сульфатсодержащие пролекарственные средства, пептидсодержащие пролекарственные средства, модифицированные D-аминокислотой пролекарственные средства, гликозилированные пролекарственные средства, β-лактасодержащие пролекарственные средства, необязательно замещенные феноксиацетамидсодержащие пролекарственные средства и необязательно замещенные фенилацетамидсодержащие пролекарственные средства, пролекарственные средства на основе 5-фторцитозина и другие пролекарственные средства на основе 5-фторуридина, которые могут превращаться в более активный цитотоксический свободный препарат. Примеры цитотоксических препаратов, которые могут быть дериватизированы в пролекарственные средства, включают, но не ограничиваются, химиотерапевтические препараты, описанные выше. Для диагностики, а также для целей терапевтического мониторинга антитела также могут быть конъюгированы только с меткой или с меткой и дополнительным вторым агентом (пролекарственным средством, химиотерапевтическим агентом и подобными им). Метка, в отличие от второго агента, представляет собой способное к определению соединение или композицию, которые могут быть непосредственно или опосредованно конъюгированы с гуманизированным антителом. Метка может быть способна к определению сама по себе (например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки) или в случае ферментативной метки может катализировать химическое изменение субстратного соединения или композиции. Меченое гуманизированное анти-BAFF антитело можно получить и использовать в различных применениях, включая диагностику в условиях in vitro и in vivo.
Антитела могут быть рецептированы в виде части препарата липосомы для того, чтобы обеспечить их доставку in vivo. Липосома представляет собой небольшую везикулу, которая состоит из различных типов липидов, фосфолипидов и/или поверхностно-активного вещества. Липосомы полезны для доставки млекопитающему соединения или композиции, такой как гуманизированное анти-BAFF антитело, как раскрыто в данном документе, необязательно соединенное или в комбинации с одним или более фармацевтически активными препаратами. Компоненты липосомы обычно располагаются в виде двуслойного образования, аналогично расположению липидов в биологических мембранах.
Термин изолированная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена по меньшей мере от одной загрязняющей молекулы
- 8 033604 нуклеиновой кислоты, с которой она обычно ассоциирована в природном источнике нуклеиновой кислоты антитела. Молекула изолированной нуклеиновой кислоты отличается от молекулы нуклеиновой кислоты в том виде, в котором она существует в клетках, существующих в природе.
Итак, один или более доменов гуманизированных антител могут экспрессироваться рекомбинантно. Такая рекомбинантная экспрессия может использовать одну или более регуляторных последовательностей, т.е. полинуклеотидных последовательностей, которые являются необходимыми для экспрессии, функционально связанной с кодирующей последовательностью в определенном организме-хозяине. Регуляторные последовательности, подходящие для применения в прокариотических клетках, включают, например, последовательности промотора, оператора и сайта связывания с рибосомой. Эукариотические регуляторные последовательности включают, но не ограничиваются, промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры. Данные регуляторные последовательности можно использовать для экспрессии и продукции гуманизированного анти-BAFF антитела в прокариотических и эукариотических клеткаххозяевах.
Последовательность является функционально связанной тогда, когда ее помещают в функциональную связь с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, препоследовательность нуклеиновой кислоты или секреторная лидерная последовательность является функционально связанной с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, если он экспрессируется в виде пробелка, который принимает участие в секреции полипептида; промотор или энхансер является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если они оказывают влияние на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосомы является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если он расположен таким образом, что облегчает трансляцию. Как правило, функционально связанный означает, что связанные последовательности ДНК являются непрерывными и, в случае секреторной лидерной последовательности, являются непрерывными и находятся в рамке считывания. Однако энхансеры необязательно являются непрерывными. Сочетанное связывание может осуществляться путем лигирования в соответствующих сайтах рестрикции. Если такие сайты отсутствуют, то можно использовать синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры.
В данном изобретении выражения клетка, линия клеток и культура клеток используются взаимозаменяемо, и все эти определения включают их потомство. Таким образом, трансформанты и трансформированные клетки включают первичную клетку и культуры, полученные из нее, без учета числа пассажей.
Термин млекопитающее для целей лечения относится к любому животному, которое классифицируется как млекопитающее, включая людей, домашних и сельскохозяйственных животных, и также животных из зоопарка, спортивных или комнатных животных, таких как собаки, лошади, кошки, коровы и тому подобное. Предпочтительно млекопитающее представляет собой человека.
Расстройство, как используется в данном описании, представляет собой любое состояние, которое подвергается лечению с помощью гуманизированного анти-BAFF антитела, описанного в данном документе. Оно включает хронические и острые расстройства или заболевания, в том числе патологические состояния, которые обеспечивают предрасположенность млекопитающего к данному нарушению. Неограничивающие примеры заболеваний или расстройств, которые подвергаются лечению, включают воспалительные, ангиогенные, аутоиммунные и иммунологические расстройства, респираторные расстройства, рак, гематологические злокачественные заболевания, доброкачественные и злокачественные опухоли, лейкемии и лимфоидные злокачественные образования.
Термины рак и раковый относятся или описывают физиологическое состояние у млекопитающего, которое, как правило, характеризуется неконтролируемым ростом клеток. Примеры рака включают, но не ограничиваются, такие как карцинома, лимфома, бластома, саркома и лейкемия.
Как используется в данном описании, термин ассоциированное с BAFF расстройство или ассоциированное с BAFF заболевание относится к состоянию, при котором активность BAFF осуществляет свой вклад в заболевание, и типично где BAFF подвергается экспрессии на патологическом уровне. Ассоциированное с BAFF расстройство включает заболевания и расстройства иммунной системы, такие как аутоиммунные расстройства и воспалительные расстройства. Такие состояния включают, но не ограничиваются, ревматоидный артрит (RA), системную эритематозную волчанку (SLE), склеродермию, синдром Шегрена, рассеянный склероз, псориаз, псориатический артрит, воспалительные заболевания кишечника (например, неспецифический язвенный колит и болезнь Крона), воспаление легких, астму, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ITP) и анкилозирующий спондилит
Термин внутривенная инфузия относится к введению агента в вену животного или человекапациента в течение периода времени более чем примерно 15 мин, как правило, в течение примерно от 30 до 90 мин.
Термин внутривенный болюс или внутривенное струйное введение относится к введению лекарственного препарата в вену животного или человека таким образом, что в организм препарат поступает в течение примерно 15 мин или менее, как правило, в течение 5 мин или менее.
Термин подкожное введение относится к введению препарата под кожу животного или человекапациента, предпочтительно в карман между кожей и расположенной ниже тканью, посредством мед
- 9 033604 ленной, непрерывной доставки из резервуара препарата. Сдавливание или оттягивание кожи вверх и в сторону от расположенной ниже ткани может создать карман.
Термин подкожная инфузия относится к введению препарата под кожу животного или человекапациента, предпочтительно в карман между кожей и расположенной ниже тканью, посредством медленной, непрерывной доставки из резервуара препарата в течение периода времени, включая, но без ограничения, 30 мин или менее или 90 мин или менее. Необязательно инфузию можно осуществлять путем подкожной имплантации насоса для доставки лекарственного препарата, где насос доставляет заранее определенное количество лекарственного препарата в течение заранее определенного периода времени, например, в течение 30 мин, 90 мин или периода времени, составляющего продолжительность схемы лечения.
Термин подкожный болюс относится к введению лекарственного препарата под кожу животного или человека-пациента, где доставка болюса лекарственного препарата составляет менее чем примерно 15 мин; в другом аспекте менее чем примерно 5 мин и в еще одном аспекте менее чем примерно 60 с. Введение осуществляют в карман между кожей и расположенной ниже тканью, где карман создают путем сдавливания или оттягивания кожи вверх и в сторону от расположенной ниже ткани.
Термин терапевтически эффективное количество используется по отношению к количеству активного агента, которое устраняет или ослабляет один или более симптомов расстройства, которое подвергается лечению. В другом аспекте терапевтически эффективное количество относится к целевой концентрации в сыворотке крови, которая, как было установлено, является эффективной, например, для замедления прогрессирования заболевания. Эффективность может быть измерена различными путями в зависимости от состояния, которое подвергается лечению.
Термины лечение и терапия и подобные им, как используется в данном описании, понимаются как такие, которые включают терапевтические, а также профилактические или подавляющие мероприятия в отношении заболевания или расстройства, приводящие к любому клинически желаемому или лечебному эффекту, включая, но не ограничиваясь, такие как ослабление или облегчение одного или более симптомов, регрессия, замедление или остановка прогрессирования заболевания или расстройства. Таким образом, например, термин лечение включает введение препарата до или после начала развития симптома заболевания или расстройства, для предотвращения или устранения, таким образом, одного или более симптомов заболевания или расстройства. В качестве другого примера термин включает введение препарата после клинического проявления заболевания для устранения симптомов заболевания. Кроме того, введение агента после начала развития и после появления клинических симптомов, где введение оказывает влияние на клинические параметры заболевания или расстройства так, что степень повреждения ткани, или количество, или степень метастазирования, независимо от того приводит ли лечение к ослаблению заболевания или нет, включает лечение и терапию в том смысле, в котором они используются в данном изобретении. Более того, поскольку композиции, либо отдельно, либо в комбинации с другим терапевтическим агентом, облегчают или ослабляют по крайней мере один симптом расстройства, которое подвергается лечению, по сравнению с таковым симптомом при отсутствии применения композиции гуманизированного анти-BAFF антитела, результат будет считаться эффективным лечением подвергающегося лечению расстройства, несмотря на то, ослабляются ли все симптомы расстройства или нет.
Термин вкладыш в упаковке используется для обозначения инструкций, которые обычно включаются в промышленно доступные упаковки терапевтических продуктов, содержащие информацию о показаниях, применении, введении, противопоказаниях и/или предостережениях, касающихся использования таких терапевтических продуктов.
Антитела.
В одном аспекте описываются и раскрываются анти-BAFF антитела. Особое значение для лечения аутоиммунного заболевания у человека представляют гуманизированные анти-BAFF антитела и композиции, раскрытые в данном описании. Также описываются связующие агенты, которые включают антигенсвязывающий фрагмент анти-BAFF антитела, в частности гуманизированного анти-BAFF антитела. Гуманизированные анти-BAFF антитела и связующие агенты могут ингибировать продукцию ассоциированных с BAFF цитокинов, которые способствуют хроническим аутоиммунным и воспалительным заболеваниям. Гуманизированное анти-BAFF антитела и связующие агенты, таким образом, могут быть использованы при лечении различных заболеваний или расстройств. Гуманизированное анти-BAFF антитело и агент, связывающий BAFF, каждый, включают в себя по крайней мере часть, которая специфически распознает BAFF эпитоп (т.е. антигенсвязывающий фрагмент).
При начальной характеристике мышиные антитела были выбраны на основе характеристики связывания рецептора BAFF.
В соответствии с одним аспектом антитело может иметь значение KD BAFF, в частности человеческого BAFF, менее чем 100 пМ. В другом аспекте антитело может иметь значение KD менее чем 10 пМ. или же значение KD менее чем 1 пМ.
CDR легких и тяжелых цепей различных антител против BAFF представлены в табл. 3 и 4 соответственно. Табл. 3 и 4 также показывают пять CDR легкой цепи и один CDR тяжелой цепи, которые были
- 10 033604 получены либо из 1А4, либо 5В9 мышиных антител с помощью процесса гуманизации.
Таблица 1
Анти-BAFF мыши - последовательности Vk
Обозначение Последовательность
206G9A10 GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACAACAGTAGGAGACAGGGTCAGC ATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGCGGGTGCTGCTGTAGCCTGGTTTCAACAGAAACCAG GACAATCTCCTAAACTACTGATTTACTCAGCATCCAATCGGTATACTGGAGTCCCTGATCG CTTCACAGGCAGTGGATCGGGGACAGATTTCACTCTCACCATTAGCAATGTGCAGTCTGAG GACCTGGCAGATTATATCTGTCAACAATACAGAAGCTATCCTCGGACGTTCGGAGGAGGCA CCAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 40)
DIVMTQSQKFMSTTVGDRVSITCKASQNAGAAVAWFQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRFT GSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYICQQYRSYPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 41)
227D5A7 GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACAACAGTAGGAGACAGGGTCAGC ATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGCGGGTGCTGCTGTAGCCTGGTTTCAACAGAAACCGG GACAATCTCCTAAATTACTGATTTACTCAGCATCCAATCGGTATACTGGAGTCCCTGATCGC TTCACAGGCAGTGGATCGGGGACAGATTTCACTCTCACCATTAGCAATGTGCAGTCTGAGG ACCTGGCAGATTATATCTGTCAACAATACAGAAGCTTTCCTCGGACGTTCGGAGGAGGCAC CAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 42)
DIVMTQSQKFMSTTVGDRVSITCKASQNAGAAVAWFQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRFT GSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYICQQYRSFPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 43)
250Е5А11 GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACAACAGTAGGAGACAGGGTCAGC ATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGCGGGTGCTGCTGTAGCCTGGTTTCAACAGAAACCAG GACAATCTCCTAAACTACTGATTTACTCAGCATCCAATCGGTATACTGGAGTCCCTGATCG CTTCACAGGCAGTGGATCGGGGACAGATTTCACTCTCACCATTACCAATGTGCAGTCTGAG GACCTGGCAGATTATATCTGTCAACAATACAGAAGCTTTCCTCGGACGTTCGGAGGAGGCA CTAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 44)
DIVMTQSQKFMSTTVGDRVSITCKASQNAGAAVAWFQQKPGQSPKLLIYSASNRYTGVPDRFT GSGSGTDFTLTITNVQSEDLADYICQQYRSFPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 45)
- 11 033604
227D3B11 GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAAATCATGTCCACAACAGTGGGAGACAGGGTCAGC ATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGCGGGTATTGATGTAGCCTGGTTTCAACAGAAACCAA GACAATCTCCTAAACTACTGATTTTCTCAACATCCAATCGATATACTGGAGTCCCAGATCG CTTCGCAGGCAGTGGATCGGGGACAGATTTCACTCTCACCATTTACAATGTGCAGTCTGAA GACCTGGCAGATTATTTCTGTCTGCAATATAGAAGTTATCCTCGGACGTTCGGAGGGGGGA CCAAGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 46)
DIVMTQSQKIMSTTVGDRVSITCKASQNAGIDVAWFQQKPRQSPKLLIFSTSNRYTGVPDRFAG SGSGTDFTLTIYNVQSEDLADYFCLQYRSYPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 47)
235F5B9 GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAAATCATGTCCACAACAGTGGGAGACAGGGTCAGC ATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGCGGGTATTGATGTAGCCTGGTTTCAACAGAAACCAA GACAATCTCCTAAACTACTGATTTTCTCAAAATCCAATCGATATACTGGAGTCCCAGATCG CTTCGCAGGCAGTGGATCGGGGACAGATTTCACTCTCACCATTTACAATGTGCAGTCTGAA GACCTGGCAGATTATTTCTGTCTGCAATATAGAAGTTATCCTCGGACGTTCGGAGGAGGCA CCAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 48)
DIVMTQSQKIMSTTVGDRVSITCKASQNAGIDVAWFQQKPRQSPKLLIFSKSNRYTGVPDRFAG SGSGTDFTLTIYNVQSEDLADYFCLQYRSYPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 49)
217Н12А7 GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACAACAGTAGGAGACAGGGTCAGC ATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGCGGGTACTGCTGTAGCCTGGTTTCAACAGAAACCAG GACAATCTCCTAAACTACTGATTTACTCAGCATTTAATCGGTATACTGGAGTCCCTGATCGC TTCACAGGCAGTGGATCGGGGACAGATTTCACTCTCACCATTAGCAATATGCAGTCTGAAG ACCTGGCAGATTATATCTGTCAACAATATAGAAGCTATCCTCGGACGTTCGGAGGAGGCAC CAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 50)
DIVMTQSQKFMSTTVGDRVSITCKASQNAGTAVAWFQQKPGQSPKLLIYSAFNRYTGVPDRFT GSGSGTDFTLTISNMQSEDLADYICQQYRSYPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 51)
210D9B8 GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCGTGTCCACAACACTAGGGGACAGGGTCAGCA TCACCTGCAAGGCCAGTCAGAGTGTGGGTATTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGG ACATTCTCCTAACCTACTGATTTTCTCAACATCCAATCGCTACACTGGAGTCCCTGATCGCT TCACAGGCAGCGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATTAGCGATGTGCAGTCTGAAGA CCTGGCAGATTATTTCTGTCAGCAATATAGCAGGTATCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACC AAGCTGGAGATCAAA (SEQ ID NO: 52)
DIVMTQSQKFVSTTLGDRVSITCKASQSVGIAVAWYQQKPGHSPNLLIFSTSNRYTGVPDRFTG SGSGTDFTLTISDVQSEDLADYFCQQYSRYPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 53)
214G4B7 GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACAACAGTAGGAGACAGGGTCAGC ATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGCGGGTACTGCTGTAGCCTGGTTTCAACAGAAACCAG GACAATCTCCTAAACTACTGATTTTCTCAACATCCAATCGGTATACTGGAGTCCCTGATCGC TTCACAGGCAGTGGATCGGGGACAGATTTCACTCTCACCATTAGCAATATGCAGTCTGAAG ACCTGGCAGATTATTTCTGTCTGCAATATAGAAGCTATCCTCGGACGTTCGGAGGAGGCAC CAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 54)
DIVMTQSQKFMSTTVGDRVSITCKASQNAGTAVAWFQQKPGQSPKLLIFSTSNRYTGVPDRFT GSGSGTDFTLTISNMQSEDLADYFCLQYRSYPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 55)
13J018-1A4 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCATTATCTGCCTCTCTGGGAGAAAGAGTCAGTC TCACTTGTCGGGCAAGTCAAGACATTGGTAATAGGTTAAACTGGCTTCAGCAGGAACCAGA TGGAACTATTAAACGCCTGATCTACGCCACATCCAGTTTAGATTCTGGTGTCCCCAAAAGG TTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGTCGGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTTGAGTCTGAAG ATTTTGTAGACTATTACTGTCTACAATATGCTAGTTCTCCATTCACGTTCGGCACGGGGACA AAATTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 56)
DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGNRLNWLQQEPDGTIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGS RSGSDYSLTISSLESEDFVDYYCLQYASSPFTFGTGTKLEIK (SEQ ID NO: 57)
- 12 033604
1002Е8А6 GACATCAAAATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCACTA TCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATAGCTATTTAACCTGGTTCCAGCAGAAACCAGG GAAATCTCCTGAGACCCTGATCTATCGTGCAAACAGATTGGTATCTGGGGTCCCATCAAGG TTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAATATGAAG ATATGGGAATTTATTCTTGTCTACAGTATGATGAGTTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGAC CAAGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 118 )
DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLTWFQQKPGKSPETLIYRANRLVSGVPSRFSGS GSGQDYSLTISSLEYEDMGIYSCLQYDEFPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 119)
1070А6В7 GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCAT CTCTTGCAGATGTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACGTATTTACATTGGTAC CTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCGACCGATTTTCTG GGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAGGATCAGCA GAGTGGAGGCTGACGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGCTCAC GTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA (SEQ ID NO: 120)
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRCSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSDRFSGVP DRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDLGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 121)
1094С4Е6 GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCACCA TCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGGCTACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGG GCAATCTCCTAAACTACTAATTTACTGGGCATCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGC TTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATTAGCAATGTGCAGTCTGAAG ACTTGGCAAATTATTTCTGTCAGCAATATAGCAACTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGAC CACGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 122)
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVTITCKASQDVATAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRF TGSGSGTDFTLTISNVQSEDLANYFCQQYSNYPYTFGGGTTLEIK (SEQ ID NO: 123)
27I21-3C7 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCTTATCTGCCTCTCTGGGAGAAAGAGTCAGTC TCACTTGTCGGGCAAGTCAGGACATTGGTAATAGGTTAAACTGGCTTCAGCAGGCACCAGA TGGAACTATTAAACGCCTGATCTACGCCACATCCAGTTTAGATTCTGGTGTCCCCAAAAGG TTCAGTGGCAGTCGGTCTGGGTCAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTTGAATCTGAAG ATTTTGTAGACTATTACTGTCTACAATATGCTAGTTATCCATTCACGTTCGGCACGGGGACA AAATTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 124 )
DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGNRLNWLQQAPDGTIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGS RSGSDYSLTISSLESEDFVDYYCLQYASYPFTFGTGTKLEIK (SEQ ID NO: 125)
317Н2А6 GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTTTTGTCCACAACAATAGGAGACAGGGTCAGCA TCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTTCTGCTGTAGTCTGGTATCAACAGAAACCAGG CCAACCTCCTAAACTACTGATTACCTCAGCATCCAATCGGTACAGTGGAGTCCCAGATCGC TTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCGTTAGCAATGTGCAGTCTGTAG ACCTGGCAGATTATTTCTGTCAACAATATAGCAACTATCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACC AAGCTGGAGCTGAAA (SEQ ID NO: 126)
DIVMTQSQKFLSTTIGDRVSITCKASQNVGSAVVWYQQKPGQPPKLLITSASNRYSGVPDRFTG SGSGTDFTLTVSNVQSVDLADYFCQQYSNYPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 127)
319В8А12 GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTTGTGTCGACAAGAGTTGGAGACAGGGTCAGCA TCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGCGCTGCTGTAGTCTGGTATCAACAGAAATCAGG CCAACCTCCTAAACTACTGATTAGGTCAGCATCCAATCGGTACATTGGAGTCCCTGATCGC TTCACAGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCGTTAGCGATGTGCAGTCTGGAG ACCTGGCAGATTATTTCTGTCAGCAATATAGCAACTATCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACC AAGCTGGAACTGACACGGGCTGAT (SEQ ID NO: 128)
- 13 033604
DIVMTQSQKFVSTRVGDRVSITCKASQNVGAAVVWYQQKSGQPPKLLIRSASNRYIGVPDRFT GSGSGTDFTLTVSDVQSGDLADYFCQQYSNYPLTFGAGTKLELTRAD (SEQ ID NO: 129)
320F9C5 GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACAACAGTAGGAGACAGGGTCAGC ATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTAGTGTTGTAGCCTGGTATCAACAGAGACCAG GACAATCTCCTACACTACTGATTTACTCAGCATCCAATCGGTACACTGGAGTCCCTGATCG CTTCACTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATTAGCAATATGCAGTCGGAA GACCTGGCAGATTATTTCTGTCAGCAATATAGCAGCTATCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGA CCAAGCTGGAGCTGAAA (SEQ ID NO: 130)
DIVMTQSQKFMSTTVGDRVSITCKASQNVGSVVAWYQQRPGQSPTLLIYSASNRYTGVPDRFT GSGSGTDFTLTISNMQSEDLADYFCQQYSSYPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 131)
323E9D1 GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTTGTGTCGACAAGAGTTGGAGACAGGGTCAGCA TCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGCGCTGCTGTAGTCTGGTATCAACAGAAATCAGG CCAACCTCCTAAACTACTGATTAGGTCAGCATCCAATCGGTACATTGGAGTCCCTGATCGC TTCACAGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCGTTAGCGATGTGCAGTCTGGAG ACCTGGCAGATTATTTCTGTCAGCAATATAGTAACTATCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACC AAGCTGGAACTGACA (SEQ ID NO: 132)
DIVMTQSQKFVSTRVGDRVSITCKASQNVGAAVVWYQQKSGQPPKLLIRSASNRYIGVPDRFT GSGSGTDFTLTVSDVQSGDLADYFCQQYSNYPLTFGAGTKLELT (SEQ ID NO: 133)
332С1В12 GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTACCTGTTTCTCTGGGGCAGAGGGCCACCAT CTCCTGCAGGGCCAGCAAAGGTGTCAGTACATCTAGCTATACTTTCATTCACTGGTACCAA CAGAAACCTGGACAGCCGCCCAAACTCCTCATCAAGTATGCATCCAACCTAGAATCTGGGG TCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGT GGAGGAGGAGGATGTTGCAACATATTACTGTCAGCACAGTAGGGAGTTTCCTCGGACGTTC GGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 134)
DIVLTQSPASLPVSLGQRATISCRASKGVSTSSYTFIHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPAR FSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDVATYYCQHSREFPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 135)
344B9D9 GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCA TCACATGTCGAGCAAGTGGGAATATTCACAATTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGG AAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAGTGCAATAACCTTAGCAGATGGTGTGCCATCAAGG TTCAGTGGCAGTGGATCAGAAACACAATTTTCTCTCAAGATCAACAGCCTGCAGCCTGAAG ATTTTGGGATTTATTACTGTCAACATTTTTGGAATACTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACC AAGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 136)
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYSAITLADGVPSRFSG SGSETQFSLKINSLQPEDFGIYYCQHFWNTPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 137)
348А6С1 GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTTATGTCCACAACAGTTGGAGACAGGGTCAGCA TCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTGCTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGG CCAACCTCCTAAACTACTGATTAGGTCAGCATCCAATCGGTACATTGGAGTCCCTGATCGC TTCACAGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCGTTAGCGATGTGCAGTCTGTAG ACCTGGCAGATTATTTCTGTCAGCAATATAGCAACTATCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACC AAGCTGGAACTGACACGGGCTGAT (SEQ ID NO: 138)
DIVMTQSQKFMSTTVGDRVSITCKASQNVGAAVAWYQQKPGQPPKLLIRSASNRYIGVPDRFT GSGSGTDFTLTVSDVQSVDLADYFCQQYSNYPLTFGAGTKLELTRAD (SEQ ID NO: 139)
- 14 033604
352G11A10 GACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATATATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCACTA TCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTCATAGCTATTTAAGTTGGTTCCAGCAGAAACCAGG GAAATCTCCTAAGACCCTGATGTATCGTACAAATAGATTGGTAGATGGGGTCCCATCAAGG TTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGGAGCCTGGAATATGAAG ATATGGGAAATTATTATTGTCTACAGTATGATGAATTTCCGTACACGTTCGGCGGGGGGGC CAAGTTGGAAGTAAAA (SEQ ID NO: 140)
DIKMTQSPSSIYASLGERVTITCKASQDIHSYLSWFQQKPGKSPKTLMYRTNRLVDGVPSRFSG SGSGQDYSLTIRSLEYEDMGNYYCLQYDEFPYTFGGGAKLEVK (SEQ ID NO: 141)
363D4A10 GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACAACAGTAGGAGACAGGGTCACCA TCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTAGTGCTGTAGTCTGGTATCAACAGAAACCAGG ACAATCTCCTATATTACTGATTTTCTCAGCATCCAATCGGTACACTGGAGTCCCTGATCGCA TCACAGGCAGTGGGTCTGGGGCAGAATTCACTCTCACCATTAGCAGTGTGCAGTCTGAAGA CCTGGCAGAATATTTCTGTCAGCAATATAGCAGCTATCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACC AAGCTGGAGCTGAAA (SEQ ID NO: 142)
DIVMTQSQKFMSTTVGDRVTITCKASQNVGSAVVWYQQKPGQSPILLIFSASNRYTGVPDRITG SGSGAEFTLTISSVQSEDLAEYFCQQYSSYPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 143)
381А6А9 GACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATATATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCACTA TCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATAGCTATTTAAGCTGGTTCCAGCAGAAACCAGG GAAATCTCCTAAGACCCTGATGTATCGTGCAAACAGATTGGTAGATGGGGTCCCATCAAGG TTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAATATGAAG ATATGGGAAATTATTATTGTCTACAGTATGATGAGTTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGGC CAAGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 144)
DIKMTQSPSSIYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLMYRANRLVDGVPSRFSG SGSGQDYSLTISSLEYEDMGNYYCLQYDEFPYTFGGGAKLEIK (SEQ ID NO: 145)
384D5A2 GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGTATCTGTGGGAGAAACTGTCACCA TCACATGTCGATCAAGTGAGAATATTTACAGTAGTTTAGCATGGTATCAACAGAAACAGGG AAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATGCTGCAACAAACTTAGCAAAAGGTGTGCCGTCAAGG TTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTATTCCCTCAAGATCAACAGCCTACAGTCTGAAG ATTTTGGGAGTTATTTCTGTCAACATTTTTGGGGTAGTCCATTCGCGTTCGGCTCGGGGACA AAGTTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 146)
DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRSSENIYSSLAWYQQKQGKSPQLLVYAATNLAKGVPSRFSG SGSGTQYSLKINSLQSEDFGSYFCQHFWGSPFAFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 147)
394F5A5 GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTTATGTCCACAACAATAGGAGACAGGGTCAGCA TCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTTCTGCTGTGGCCTGGTATCAACAGAAACCAGG ACAACCTCCCAAACTACTGATTTACTCAACATCCAATCGGTACACTGGAGTCCCTGATCGC TTCACAGGCAGTAGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCGTTAGCAATATGCAGTCTGAAG ACCTGGCAGATTATTTCTGTCAGCAATATGCCAGCTATCCTCTCACATTCGGTACTGGGACC AAGCTGGAGCTGAAA (SEQ ID NO: 148)
DIVMTQSQKFMSTTIGDRVSITCKASQNVGSAVAWYQQKPGQPPKLLIYSTSNRYTGVPDRFT GSRSGTDFTLTVSNMQSEDLADYFCQQYASYPLTFGTGTKLELK (SEQ ID NO: 149)
409F12A11 GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTTTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCAT CTCATGCAGGGCCACCAAAGGGGTCAGTAAATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGTACCAA CAGAAACCAGGGCAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGG TCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAATATCCATCCTGT GGAGGAGGAGGATGTTGCAACCTATTACTGTCAGCACAGTAGGGAGCTTCCGCTCACGTTC GGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA (SEQ ID NO: 150)
- 15 033604
DIVLTQSPASLALSLGQRATISCRATKGVSKSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPA RFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDVATYYCQHSRELPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 151)
418F6D9 ATTGTGCTGACCCAATCTTCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATATC CTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAATAGTCTTATGCACTGGTACCAGCAG AAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATATTGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCC CTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTGATCCTGTGGA GGCTGATGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAATAGTGAGGATCCTCGGACGTTCGGT GGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 152)
IVLTQSSASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSLMHWYQQKPGQPPKLLIYIASNLESGVPARF SGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNSEDPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 153)
431G5A3 AAAATTGTGCTGACCCAATCTTCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCA TATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATCGTTATGGCAATAGTCTTATGCACTGGTACCA GCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATATTGCATCCAACCTAGAATCTGGG GTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTGATCCTG TGGAGGCTGATGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAATAATGAGGATCCTCGGACGTT CGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 154)
KIVLTQSSASLAVSLGQRATISCRASESVDRYGNSLMHWYQQKPGQPPKLLIYIASNLESGVPA RFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNEDPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 155)
435A6B3 GACATCAAGATGACCCCGTCTCCTTCTTCCATGTATGCATCTCTCGGAGAGAGAGTCACTA TCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATAGATATTTAAGCTGGTTCCAGCAGAAACCAGG GAAATCTCCTAAGACCCTGATCTATCGTGCAAATAGATTGGTAGATGGGGTCCCATCAAGG TTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTACTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTATGAAG ATATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTATGATGAATTTCCTTACACGTTCGGAGGGGGGAC CAAGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 156 )
DIKMTPSPSSMYASLGERVTITCKASQDINRYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSG SGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 157)
436Н2С12 AACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCA TATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAATTATGGCAATAGTTTTATGCACTGGTACCA GCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTCTCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGG GTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTGATCCTG TGGAGGCTGATGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAATAATGAGGATCCTCGGACGTT CGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 158)
NIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLISLASNLESGVPA RFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNEDPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 159)
436Н6А9 GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGGTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCA TCTCTTGCAGGGCCACCAAAGGGGTCACTAAATCTGGCTATAGTTATATTCACTGGTACCA ACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCTTGCATCCAACCTACAATCTGGG GTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCGG TGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACAGTAGGGAGCTTCCGCTCACGTT CGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA (SEQ ID NO: 160)
DIVLTQSPASLGVSLGQRATISCRATKGVTKSGYSYIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLQSGVPA RFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 161)
- 16 033604
440E9D12 AACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGCCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCAT GTCCTGCAGAGCCAGTAAAAGTGTTGATAGTTATGGCACTAGTTTTATGCACTGGTACCAA CACAGACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTCTCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGG TCCCTGGCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTGATCCTGT GGAGCCTGATGATGCTGCAACCTATTACTGTCAACAAAATAATGAGGATCCTCGGACGTTC GGTGGAGGCACCACGCTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 162)
NIVLTQSPASLPVSLGQRATMSCRASKSVDSYGTSFMHWYQHRPGQPPKLLISLASNLESGVPG RFSGSGSRTDFTLTIDPVEPDDAATYYCQQNNEDPRTFGGGTTLEIK (SEQ ID NO: 163)
441E6F2 AACATTGTGTTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGACAGAGGGCCACCAT ATCCTGCAGAACCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAATAGTTTTATGTTCTGGTTCCAG CAGAAACCAGGACAGGCACCCAAACTCCTCATCTTTCTTACATCCAACCTCGAATCTGGGG TCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTGATCCTGT GGAGGCTGATGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCTCGGACGTTC GGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 164)
NIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRTSESVDSYGNSFMFWFQQKPGQAPKLLIFLTSNLESGVPAR FSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQSNEDPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 165)
443С11А12 GACATCAAGATGACCCCGTCTCCTTCTTCCATGTATGCATCTCTCGGAGAGAGAGTCACTA TCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATAGCTATTTAAGTTGGTTCCAGCAGAAACCAGG GAAATCTCCTAAGACCCTGATCTATCGTGCAAATAGATTGGTAGATGGGGTCCCATCAAGG TTCAGTGGCAGTGGATCTGGCCAAGATTACTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAATATGAAG ATATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTATGATGAATTTCCTTACACGTCCGGAGGGGGGAC CAAGCTGGAAATAAAG (SEQ ID NO: 166)
DIKMTPSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGS GSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPYTSGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 167)
444G1A10 AACATTGTGTTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGACAGAGGGCCACCAT ATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAATAGTTTTATGTTCTGGTTCCAG CAGAAACCAGGACAGGCACCCAAACTCCTCATCTTTCTTACATCCAACCTCGAATCTGGGG TCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTGATCGTGT GGAGGCTGATGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCTCGGACGTTC GGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 168)
NIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMFWFQQKPGQAPKLLIFLTSNLESGVPAR FSGSGSRTDFTLTIDRVEADDAATYYCQQSNEDPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 169)
450А2А7 ATTGTGCTGACCCAATCTTCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATATC CTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATCGTTATGGCAATAGTCTTATGCACTGGTACCAGCAG AAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATATTGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCC CTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTGATCCTGTGGA GGCTGATGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAATAATGAGGATCCTCGGACGTTCGGT GGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 170)
IVLTQSSASLAVSLGQRATISCRASESVDRYGNSLMHWYQQKPGQPPKLLIYIASNLESGVPAR FSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNEDPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 171)
- 17 033604
456Н11В7 AACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGCCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCAT GTCCTGCAGAGCCAGTAAAAGTGTTGATAGTTATGGCACTAGTTTTATGCACTGGTACCAA CACAGACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTCTCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGG TCCCTGGCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTGATCCTGT GGAGCCTGATGATGCTGCAACCTATTACTGTCAACAAAATAATGAGGATCCTCGGACGTTC GGTGGAGGCACCACGCTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 172)
NIVLTQSPASLPVSLGQRATMSCRASKSVDSYGTSFMHWYQHRPGQPPKLLISLASNLESGVPG RFSGSGSRTDFTLTIDPVEPDDAATYYCQQNNEDPRTFGGGTTLEIK (SEQ ID NO: 173)
537G7A6 GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCTTTGGCTGTGTCTGTAGGGCAGAGGGCCACCG TATCCTGCAGAGTCAGTGAAAGTGTTGATAGATATGCCGATAGTTTTATGCACTGGTACCA GCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGG GTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTGATCCTG TGGAGGCTGATGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAATAAAGAGGATCCGTACACGTT CGGAGGGGGGACCAAGCTGGAACTTAAA (SEQ ID NO: 174)
DIVLTQSPASLAVSVGQRATVSCRVSESVDRYADSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVP ARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNKEDPYTFGGGTKLELK (SEQ ID NO: 175)
551H4D6 GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCA TGTCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAATAGTTTTATACACTGGTACCA GCAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCGTGCATCCAACCTAAATTCTGGG ATCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTAGTTCTG TGGAGGCTGATGATGTTGCAACCTATTACTGTCACCAAAATAATGAGGATCCTCGGACGTT CGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 176)
DIVLTQSPASLAVSLGQRATMSCRASESVDSYGNSFIHWYQQKPGQPPRLLIYRASNLNSGIPA RFSGSGSRTDFTLTISSVEADDVATYYCHQNNEDPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID N0:177)
560Н2А7 GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCA TCTCCTGCAGAGCCAGCGAAAGTATTGATAATTATGGCCTTATTTTTATGAGCTGGTTCCAA CAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAACCGAGGATCCGGG GTCCCTGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAGCCTCAACATCCATCCTA TGGAGGAGGATGATACTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGTAAGGAGGTTCCGTGGACGTT CGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAGTCAAA (SEQ ID NO: 178)
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESIDNYGLIFMSWFQQKPGQPPKLLIYAASNRGSGVPAR FSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEVK (SEQ ID NO: 179)
606H7F8 GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCA TCACATGTCGAGCAAGTGGGAATATTCACAATTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGG AAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAATGCAAAAACCTTAGCAGATGGTGTGCCATCAAGG TTCAGTGGCAGTGGATCAGGAACACAATTTTCTCTCAAGATCAACAGCCTGCAGCCTGAAG ATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGAGTACTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGAC CAAGCTGGAAATAAAA (SEQ ID NO: 180)
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFS GSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 181)
- 18 033604
Таблица 2
Анти-BAFF мыши - последовательности Ун
Обозначение Последовательность
206G9A10 CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTG TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCAGTATCTTCTGTATACACTGGGTGCAACAGAGGC
CTGGACGAGGCCTTGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTAGTAGTGGTGGTACTAAGTACA ATGAGAAGTTCGAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACA TGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGCAAGAGGGGAGG ATTTATTAGTACGGACGGATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTC СТСА (SEQ ID NO: 58)
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFSIFCIHWVQQRPGRGLEWIGRIDPSSGGTKYNEK FESKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGEDLLVRTDAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 59)
227D5A7 CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAACTTGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTG TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCAGTATTTTCTGTGTACACTGGGTGCAACAGAGGC CTGGACGAGGCCTTGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTAGTAGTGGTGGTACTAAGTACA ATGAGAAGTTCGAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCGTCCAGCACAGCCTACA TGCAGCTCAGCAGCCTGACACCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGCAAGAGGGGAGG ATTTATTAGTACGGACGGATGCTCTGGACTACTGGGGTCAAGGATCCTCAGTCACCGTCTC CTCA (SEQ ID NO: 60)
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFSIFCVHWVQQRPGRGLEWIGRIDPSSGGTKYNEK FESKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTPEDSAVYYCARGEDLLVRTDALDYWGQGSSVTVSS (SEQ ID NO: 61)
250Е5А11 CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGACTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTG TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCAGTATCTTCTGTATACACTGGGTGCAACAGAGGC CTGGACGAGGCCTTGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTAGTAGTGGTGGCACTAAATATA ATGAGAGGTTCGAAAACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACA TGCAGCTCAGCAGTCTGACATTTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGCAAGAGGGGAGG ATTTATTAGTACGGACGGATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTC CTCA (SEQ ID NO: 62)
QVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFSIFCIHWVQQRPGRGLEWIGRIDPSSGGTKYNER FENKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTFEDSAVYYCARGEDLLVRTDAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 63)
227D3B11 CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTG TCCTGTAAGGCTTCTGGCTACTCCTTCAGCACCTTCTTTATACACTGGATACAGCAGAGGC CTGGGCGAGGCCTTGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTAATAGTGGTGGTACTAAGTACA ATGAGAAGTTCGAGAGTAAGGCCACACTGACTGTTGACAAACCCTCCAGTACAGCCTACA TGCACCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGCAAGAGGGGAGG ATTTATTGATACGGACGGATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTC CTCA (SEQ ID NO: 64)
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYSFSTFFIHWIQQRPGRGLEWIGRIDPNSGGTKYNEK FESKATLTVDKPSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYCARGEDLLIRTDAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 65)
235F5B9 CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTG TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACTCCTTCAGTACCTTCTTTATACACTGGATACAGCAGAGGC CTGGGCGAGGCCTTGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTAATAGTGGTGCTACTAAATACA ATGAGAAGTTCGAGAGTAAGGCCACACTGACTGTTGACAAACCCTCCAGTACAGCCTACA TGCACCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGCAAGAGGGGAGG ATTTATTGATTCGGACGGATGCTCTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTC CTCA (SEQ ID NO: 66)
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYSFSTFFIHWIQQRPGRGLEWIGRIDPNSGATKYNEK FESKATLTVDKPSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYCARGEDLLIRTDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 67)
217Н12А7 CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTG TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCAGTACCTTCTTAATACACTGGGTGCAGCAGAGGC CTGGACGAGGCCTTGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTAATAGTGGTGGTACTAAGTACA ATGAGAAGTTCGAGAGGAAGGCCACACTGACTGTAGACAAACCCTCCAGCACAGCCTACA
- 19 033604
TGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGCAAGAGGGGAGG ATTTATTACTACGGACGGATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTC CTCA (SEQ ID NO: 68)
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFSTFLIHWVQQRPGRGLEWIGRIDPNSGGTKYNEK FERKVTLTVDKPSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGEDLLLRTDAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 69)
210D9B8 CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGACTGAATTTGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTG TCCTGCGAGGCTTCTGGCTACACCTTCATCACCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGC CTGGACGAGGCCTTGAGTGGATTGGAGGGATTGATCCTAATAGTGGTGTTATTAAGTACA ATGAGAAGTTCAAGAGTAAGGCCACACTGACTGTAGACAAACCCTCCAGCACAGCCTACA TGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTACTATTGTGCAAGAGGGGAGG ATTTATTAATACGGACGGATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTC CTCA (SEQ ID NO: 70)
QVQLQQPGTEFVKPGASVKLSCEASGYTFITYWMHWVKQRPGRGLEWIGGIDPNSGVIKYNE KFKSKATLTVDKPSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGEDLLIRTDAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 71)
214G4B7 CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGTTTGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTG TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACTCCTTCAGTACCTTCTGTATACACTGGGTGCAGCAGAGGC CTGGGCGAGGCCTTGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTAATAGTGGTGGTACTAAATACA ATGAGAAGTTCGAGAGTAAGGCCACACTGACTATAGACAAACCCTCCAGTACAGCCTACG TGCACCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGCAAGAGGGGAGG ATTTATTGATACGGACGGATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTC CTCA (SEQ ID NO: 72)
QVQLQQPGAEFVKPGASVKLSCKASGYSFSTFCIHWVQQRPGRGLEWIGRIDPNSGGTKYNEK FESKATLTIDKPSSTAYVHLSSLTSEDSAVYYCARGEDLLIRTDAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 73)
13J018-1A4 CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGGTGGTGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATA TCCTGCAAGGCTCCTGACCATATTTTCAGTATCCACTGGATGCAGTGGGTAAGACAGAGGC CTGGACCGGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTTTTCCTGGAAGTGGTACTACTGATTATAA TGAGAAATTCAAGGGCAAGGCCACAGTGACGGTAGATAGAGGCTCCAGGTCAGCCTACAT GCAGTTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGCGGAGCCTTT GACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCTTCA (SEQ ID NO: 74)
QVQLQQSGPEVVRPGASVKISCKAPDHIFSIHWMQWVRQRPGPGLEWIGEIFPGSGTTDYNEK FKGKATVTVDRGSRSAYMQFNSLTSEDSAVYFCASGAFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 75)
1002Е8А6 GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATG TCCTGCAAGGCTTCTGGATACACAATCACTAGTTATGTTATGCACTGGGTGAAGCAGAAGC CTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTAACAATGATGGCACTAAGTACA ATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAACACAGCCTACA TGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGCAAGAGGGGACTA TAGTAACTACTTCTACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCC TCA (SEQ ID NO: 182)
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTITSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPNNDGTKYN EKFKGKATLTSDKSSNTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGDYSNYFYWYFDVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO: 183)
1070А6В7 CAGGTCCCGCTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGATGGTGAGGCCTGGGGCTTCAATGAGGTTG TCCTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTCCCCGGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGC CTAGACAAGGCCTTGAGTGGATTGCTAAGATTGATCCCTCTGATAGTGAAACTCACTACAA TCAAAACTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATATTCCAACACAGTCTACAT GCAGCTCAACAGCCTGACATCTGAAGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAACGAGGGTTG GGACAGCCTTACGAAAGTCTGGTTTGGTTGGTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCT
- 20 033604
GCA (SEQ ID NO: 184)
QVPLQQPGAEMVRPGASMRLSCKASGYTFPGYWMHWVKQRPRQGLEWIAKIDPSDSETHYN QNFKDKATLTVDKYSNTVYMQLNSLTSEDSAVYYCANEGWDSLTKVWFGWWGQGTLVTVS A (SEQ ID NO: 185)
1094С4Е6 GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTG TCCTGCACAGCTTCTGGCTTTAACATTAAAGACGACTATATGCACTGGGTGAAGCAGACGC CTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGTATGGTAATGGTAAGTATG TCCCGAAGTTCCAGGACAAGGCCACTATAACTGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACC TGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGACGGTACTA CGCTGTTAGTTCCGTAGACTATGCTCTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTC TCCTCA (SEQ ID NO: 186)
EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDDYMHWVKQTPEQGLEWIGRIDPAYGNGKYVP KFQDKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARRYYAVSSVDYALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 187)
27I21-3C7 CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGACTTCAGTGAAGATA TCCTGCAAGGCTCCTGGCTATATCTTCACCAGCCACTGGATGCAGTGGGTAAGACAGAGG CCTGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGAGACATTTTTCCTGGAAGCGGTACTACTGATTATA ATGAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACAGTGACGGTAGACAGATCCTCCAGTTCAGCCTACA TGCAGTTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGCGGAGCCTT TGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 188)
QVQLQQSGPELVRPGTSVKISCKAPGYIFTSHWMQWVRQRPGQGLEWIGDIFPGSGTTDYNEK FKDKATVTVDRSSSSAYMQFNSLTSEDSAVYFCASGAFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 189)
317Н2А6 CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGA CTTGTTCCTTCTCTGGGTTTTCACTGAGGACTTTTGGCATGGGTGTAGGCTGGATTCGTCAG CCTTCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTGGTGGAATGGTGATAAAT АСТАТ GACCCAGCCCTGAAGAGTCGGCTCACAATTTCCAAGGATACCTCCGAAAACCGGGTATTC CTCAATATCGCCAATGTGGACACTACAGATACTGCCCCATACTACTGTGTTCGAATTGGTC CTTCTATTACTACGGTAGCAGAGGGATTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGT CTCTGCA (SEQ ID NO: 190)
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLRTFGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWNGDKYYDP ALKSRLTISKDTSENRVFLNIANVDTTDTAPYYCVRIGPSITTVAEGFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 191)
319В8А12 AAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGA CTTGTTCCTTCTCTGGATTTTCACTGAGGACTTTTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTCGTCAG CCTTCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTGGTGGAATGATGAGAAATACTAT AATCCAGACCTGAAGAGTCGGCTCACAGTTTCCAAGGATTCCTCCAAAAACCAGGTATTCC TCACGATCGCCAATGTGGACACTTCAGATACTGCCCCATACTACTGTACTCGAGTTGGTCC TTCTATTTCTACGGTTGCAGAGGGATTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTC TCTGCA (SEQ ID NO: 192)
KVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLRTFGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWNDEKYYNP DLKSRLTVSKDSSKNQVFLTIANVDTSDTAPYYCTRVGPSISTVAEGFPYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 193)
320F9C5 CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGTCCTCCCAGACCCTCAGTCTGA CTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGGACCTTTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTCGTCAA CCTTCAGGGAAGGGTCTGGAATGGCTGGCACACATTTGGTGGAATGATGATAAGTCCTCTC ACCCAGCCCTGAAGAGTCGTCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAAAAACCAGGTATTCCT
- 21 033604
CAAGATCGCCAATGTGGACACTGCAGAAACTGCCACATATTATTGTGTTCGAATAGGTCCT TCAATTACTACGGTTGCAGAGGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCT CTGCA (SEQ ID NO: 194)
QVTLKESGPGILQSSQTLSLTCSFSGFSLRTFGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWNDDKSSHP ALKSRLTISKDTSKNQVFLKIANVDTAETATYYCVRIGPSITTVAEGFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 195)
323E9D1 CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGA CTTGTTCCTTCTCTGGATTTTCAATGAGGACTTTTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTCGTCAG CCTTCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTGGTGGAATGATGAGAAATACTAT AATCCAGACCTGAAGAGTCGGCTCACAGTTTCCAAGGATTCCTCCAAAAACCAGGTATTCC TCACGATCGCCAATGTGGACACTTCAGATACTGCCCCATACTACTGTACTCGAGTTGGTCC TTCTATTTCTACGATTGCAGAGGGATTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTC TCTGCA (SEQ ID NO: 196)
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSMRTFGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWNDEKYYN PDLKSRLTVSKDSSKNQVFLTIANVDTSDTAPYYCTRVGPSISTIAEGFPYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 197)
332С1В12 CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAATTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTG TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACTTTCACCAACGACAATTACTGGATGAACTGGATGAAAC AGAGGCCTGGACGAGGCCTCGAGTGGATTGGAAGGATTCGTCCTTCTGATAGTGAAACTC ACTACAATCAAAAATTCACGAACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAG CCTACATCCAACTCAGCAGCCTGACATCTGTGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGCAAGATC TTGGGAAGATTTATTACTACGATCGATGGAGGACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACC ACTCTCACAGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 198)
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTNDNYWMNWMKQRPGRGLEWIGRIRPSDSETH YNQKFTNK ATLTVDKS S ST AYIQL S SLTS VDS AVYYC ARSWEDLLLRSMED YFD YWGQGTTL TVSS (SEQ ID NO: 199)
344B9D9 GAGTTCCAACTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGGGGAGCCTGGCGCTTCAGTGAAAATC TCCTGCAAGGCTTCTGGTTTCTCATTCAGTGACTACAACATAAATTGGGTGAAGCAGAGCA ATGGAAAGAGTCTTGAGTGGATTGGAAAAGTTCATCCTAAGGATGGTACTGCTACCTACA ATCAGAAGTTCCAGGACAAGGCCACATTGACTCTAGACCAGTCTTCCAGCACAGCCTACA TGCAACTCAGCAGCCTGACATCGGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTCTCCCGCTCTACTA TGATTCCCTGACAAAAATTTTGTTTGCTTATTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCT GCA (SEQ ID NO: 200)
EFQLQQSGPELGEPGASVKISCKASGFSFSDYNINWVKQSNGKSLEWIGKVHPKDGTATYNQK FQDKATLTLDQSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCLPLYYDSLTKILFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 201)
348А6С1 CAGGTTACTCTGAGAGAGTCTGGGCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGA CTTGTTCCTTCTCTGGGTTTTCACTGAGGACCTTTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTCGTCAG CCTTCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATCTGGTGGAATGATGAGAAATATTAT AACCCAGCCCTGAAGAGTCGGCTCACAGTTTCCAAGGATTCCTCCGAAAACCAGGTATTCC TCAAGATCGCCAATGTGGACACTACAGATACTGCCCCATACTACTGTGCTCGACTTGGTCC TTCTATTACTACGGTTGCAGAGGGATTTCCGTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTC TCTGCA (SEQ ID NO: 202)
QVTLRESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLRTFGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWNDEKYYNP ALKSRLTVSKDSSENQVFLKIANVDTTDTAPYYCARLGPSITTVAEGFPYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 203)
- 22 033604
352G11A10 CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCCGGGGGTTCAGTGAGGATA TCCTGCAAGGCTTCTGGTTACAGCCTCATAAGCTACTATATACACTGGGTGAAACAGAGGC CGGGACAGGGCCTTGAGTGGATTGGATTGACTTTTCCTGGAAGTGGTAATTCTAAGTTCAT TGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACGGCAGACACATCCTCCAACACTGCCTACAT ACAGCTCAGCAGTCTAACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAGGGGGGACTTC GGTAACTACCTTGCCTACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCT CCTCA (SEQ ID NO: 204)
QVQLQQSGPELVKPGGSVRISCKASGYSLISYYIHWVKQRPGQGLEWIGLTFPGSGNSKFIEKF KGKATLTADTSSNTAYIQLSSLTSEDSAVYYCTRGDFGNYLAYWYFDVWGTGTTVTVSS (SEQ ID NO: 205)
363D4A10 CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGTCCTCCCAGACCCTCAGTCTGA CTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAAGACCTTTGGTATGGGTGTGGGCTGGATTCGTCAG CCTTCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTGGTGGAATGATGATAAATTCTATC ACCCAGCCCTGAAGAGTCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAAAAACCAGGTATTCC TCAAGATCGCCAATGTGGACACTGCAGAAACTGCCACATACTACTGTGTTCGAATTGGTCC TTCAATTACTACGGTAGCAGAGGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTC TCTGCA (SEQ ID NO: 206)
QVTLKESGPGILQSSQTLSLTCSFSGFSLKTFGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWNDDKFYHP ALKSRLTISKDTSKNQVFLKIANVDTAETATYYCVRIGPSITTVAEGFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 207)
381А6А9 CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCCGGGGGTTCAGTGAAGATA TCCTGCAAGGCTGCTGGCTACAGCCTCACAAGCTACTATATACACTGGGTGAAGCAGAGG CCGGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATTGATTTTTCCTGGAAGTGGTAATTCTAAGTACA TTGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACGGCGGACACATCCTCCAACACTGCCTACA TGCAGCTCAGCAGCCTAACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTACAAGGGGGGACTT CGGTAACTACCTTGCCTACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTC TCCTCA (SEQ ID NO: 208)
QVQLQQSGPELVKPGGSVKISCKAAGYSLTSYYIHWVKQRPGQGLEWIGLIFPGSGNSKYIEKF KGKATLTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRGDFGNYLAYWYFDVWGTGTTVTVSS (SEQ ID NO: 209)
384D5A2 CAGGTCACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGAATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGA CTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAACACTTATGGTATGGGTGTGGGTTGGATTCGTCAG CCTTCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCCAACATTTGGTGGAATGATGAT AAGT АСТАТ AACTCAGCCCTGAAGAGCCGGCTCGCAATCTCCAAAGATGCCTCCAACAGCCAGGTATTC CTCAAGATCTCCAGTGTGGACACTACAGATACTGCCACATACTACTGTGCTCAAGTAGCCG CTACTATAGTAACTACGTACGGGGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCAC TGTCTCTGCA (SEQ ID NO: 210)
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLNTYGMGVGWIRQPSGKGLEWLANIWWNDDKYYN SALKSRLAISKDASNSQVFLKISSVDTTDTATYYCAQVAATIVTTYGAWFAYWGQGTLVTVS A (SEQ ID NO: 211)
394F5A5 GTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTT GTTCCTTCTCTGGGTTTTCACTGAGGACTTTTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTCGTCAGCCT TCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTGGTGGAATGATGAGAAATATTATAAT CCAACCCTGAAGAGTCGGCTCACAATTTCCAAGGATACCTCCAAAAACCAGGTATTCCTCA GGATCGCCAATGTGGACACTGCAGTTACTGCCGCATACTACTGTGCTCGAATAGGTCCTTC TATTACTACGGTAGTAGAGGGATTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCT GCA (SEQ ID NO: 212)
VTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLRTFGMGVGWIRQPSGKGLEWL AHIWWNDEKYYNPT LKSRLTISKDTSKNQVFLRIANVDTAVTAAYYCARIGPSITTVVEGFPYWGQGTLVTVSA (SEQ
- 23 033604
ID NO: 213)
409F12A11 ATCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAATGAAGATATCG TGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACTGACAAGTATATAAACTGGGTGAAGCAGAGGCCT GGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAAGCGGTAATACTAAGTACAAT GAGAAGTTCAAGGGCATGGCCACATTGACTGTAGACACATCCTCCAATACAGCCTATATA CATCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCACGAGGAATTATTT ATTACTACGATGGTTCATACCCCTATGCTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCAC CGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 214)
IQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYTFTDKYINWVKQRPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKF KGMATLTVDTSSNTAYIHLSSLTSEDSAVYFCARGIIYYYDGSYPYALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 215)
418F6D9 CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGCCTGGAGCTTCAGTGAAGTTG TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACTGACTATAGTATACACTGGGTGAAGCAGAGTC CTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAAGTGGTAATACTAAGTACA ATGACAAGTTCAAGGGCAAGGCCACAATGACTGCAGACAAATCCTCCAGAACAGTCTACA TGCAGCTCAGCAGCCTGACGTCTGAGGAGTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGACTACCG GCGATACTATGCTATAGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 216)
QVQLQQSGPELVKPGASVKLSCKASGYTFTDYSIHWVKQSPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYND KFKGKATMTADKSSRTVYMQLSSLTSEESAVYFCARDYRRYYAIDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 217)
431G5A3 CAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGAGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGC AAGGCTTCTGGCTACACCTTCACTGACTATAGTATACACTGGGTGAAACAGAGTCCTGGAC AGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAAGTGATAATACTAAGTACAATGACA AGTTCAAGGGCAAGGCCTCAATGACTGCAGACAAATCCTCCAGAACAGTCTACATGCACC TCAGCAGCCTGACGTCTGAGGAATCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGACTACCGGCGGTA CTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 218)
QLQQSGPELVKPGASVKLSCKASGYTFTDYSIHWVKQSPGQGLEWIGWIYPGSDNTKYNDKF KGKASMTADKSSRTVYMHLSSLTSEESAVYFCARDYRRYYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 219)
435A6B3 GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAATGAAGATG TCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTATGCACTGGATGAAGCAGAAGC CTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATCTTAATCCTAACAATGATGGTACTAAGTACAA TGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACAT GGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGGGGGGACTA TAGTAATTACTTCTACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCTCCGTCTCC TCA (SEQ ID NO: 220)
E VQLQQ S GPEL VKPG ASMKMS CK AS GYTFT S Y VMHWMKQKP GQGLEWIGYLNPNND GTKY NEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGDYSNYFYWYFDVWGAGTTVSVSS (SEQ ID NO: 221)
436Н2С12 CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGAGCTTCAGTGAAGCTG TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCAGTGACTATACTATACACTGGGTGAAGCAGAGTC CTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTACCCTGGAAGGGGTAATACTAAGTACA ATGACAAGTTCAAGGGCAAGGCCACAATGACTGCTGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACA TGCAGCTCAGCAGCCTGACGTCTGAGGAATCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGACTACCG GCGGTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 222)
- 24 033604
QVQLQQSGPELVKPGASVKLSCKASGYTFSDYTIHWVKQSPGQGLEWIGWIYPGRGNTKYND KFKGKATMTADKSSSTAYMQLSSLTSEESAVYFCARDYRRYYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 223)
436Н6А9 CAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGC AAGGCTTCTGGCTACACCTTCACTGACAACTTTATAAACTGGGTGAAACAGAGGCCTGGA CAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTCTCCTGGAAGCGGTAATACTAAGAACAATGAG AAGTTCAAGGGCAAGGCCACAGTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAG CTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCACGAGGAATTATTTATT ATTATGATGGTACCTACCCCTATGCTCTGGACTACTGGGGTCAGGGAACCTCAGTCACCGT CTCCTCA (SEQ ID NO: 224)
QLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDNFINWVKQRPGQGLEWIGWISPGSGNTKNNEKFK GKATVTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARGIIYYYDGTYPYALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 225)
440E9D12 CAGGTGCGGCTGAGGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCCCAGAACCTGTTCATC ACATGCACCGTCTCAGGTTTCTCATTAACTGACTATGAAATAAACTGGGTTCGCCAGCCTC CAGGAAAGAATCTGGAGTGGCTGGGAGTGATTTGGACTGGTGGAGGCACAAAATATAATT CAGTTCTCATATCCAGACTGAACATCAGCAAAGACAATTCCAAGAGACAAGTTTTCTTTAA AATGACCAGTCTCCAGACTGATGACACAGCCATATATTACTGTGTAAGAGAGGGGAGGAG ATACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 226)
QVRLRESGPGLVAPSQNLFITCTVSGFSLTDYEINWVRQPPGKNLEWLGVIWTGGGTKYNSVL ISRLNISKDNSKRQVFFKMTSLQTDDTAIYYCVREGRRYYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 227)
441E6F2 CGGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTTCATC ACATGCACCGTCTCAGGGTTCTCATTAACCACCTATGAAATAAACTGGGTTCGCCAGTCTC CAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTGATATGGACTGGTGGAACCACAAAATATAATT CAGCTTTCATATCCAGACTGAGCATCACCAAAGACAACTCCAAGAGCCTCGTTTTCTTAAA AATGAGCAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATATATTACTGTGTAAGAGAGGGGAGGAG GTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 228)
RVQLKESGPGLVAPSQSLFITCTVSGFSLTTYEINWVRQSPGKGLEWLGVIWTGGTTKYNSAFI SRLSITKDNSKSLVFLKMSSLQTDDTAIYYCVREGRRYYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 229)
443С11А12 GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATG TCCTGCACGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTATACACTGGATGAAGCAGAAGC CTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATCTTCATCGTAACAATGATGGTACTAAGTACAA TGAGAAGTTCAAAGTCAAGGCCACACTGACTTCAGACGAATCCTCCAACACAGCCTACAT GGAACTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGGGGGGACTA TAGTAATTACTTCTACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACTACGGTCTCCGTCTCC TCA (SEQ ID NO: 230)
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCTASGYTFTSYVIHWMKQKPGQGLEWIGYLHRNNDGTKYN EKFKVKATLTSDESSNTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGDYSNYFYWYFDVWGAGTTVSVSS (SEQ ID NO: 231)
444G1A10 CGGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTTCATC ACATGCACCGTCTCAGGGTTTTCATTAACCACCTATGAAATAAACTGGGTTCGCCAGTCTC CAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTGATATGGACTGGTGGAACCACAAAATATAATT CAGCTTTCATATCCAGACTGAGCATCACCAAAGACAACTCCAAGAGCCTCGTTTTCTTAAA AATGAGCAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATATATTACTGTGTAAGAGAGGGGAGGAG GTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 232)
- 25 033604
RVQLKESGPGLVAPSQSLFITCTVSGFSLTTYEINWVRQSPGKGLEWLGVIWTGGTTKYNSAFI SRLSITKDNSKSLVFLKMSSLQTDDTAIYYCVREGRRYYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 233)
450А2А7 CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGAGCTTCAGTGAAGCTG TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACTGACTATAGTATACACTGGGTGAAACAGAGTC CTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAAGTGATAATACTAAGTACA ATGACAAGTTCAAGGGCAAGGCCTCAATGACTGCAGACAAATCCTCCAGAACAGTCTACA TGCACCTCAGCAGCCTGACGTCTGAGGAATCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGACTACCG GCGGTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 236)
QVQLQQSGPELVKPGASVKLSCKASGYTFTDYSIHWVKQSPGQGLEWIGWIYPGSDNTKYND KFKGKASMTADKSSRTVYMHLSSLTSEESAVYFCARDYRRYYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 235)
456Н11В7а CAGGTGCGGCTGAGGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCCCAGAACCTGTTCATC ACATGCACCGTCTCAGGTTTCTCATTAACTGACTATGAAATAAACTGGGTTCGCCAGCCTC CAGGAAAGAATCTGGAGTGGCTGGGAGTGATTTGGACTGGTGGAGGCACAAAATATAATT CAGTTCTCATATCCAGACTGAACATCAGCAAAGACAATTCCAAGAGACAAGTTTTCTTTAA AATGACCAGTCTCCAGACTGATGACACAGCCATATATTACTGTGTAAGAGAGGGGAGGAG ATACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 237)
QVRLRESGPGLVAPSQNLFITCTVSGFSLTDYEINWVRQPPGKNLEWLGVIWTGGGTKYNSVL ISRLNISKDNSKRQVFFKMTSLQTDDTAIYYCVREGRRYYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 238)
456Н11В7Ь CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGA CTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTTTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTCGTCAG CCTTCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTGGTGGGATGATGATAAGT АСТАТ AACCCAGCCCTGAAGAGTCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAAAAACCAGGTATTC CTCAAGATCGCCAATGTGGACACTGCAGATACTGCCACATACTACTGTGCTCGAATAGAG GGCCCCTACTACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 239)
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTFGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKYYNP ALKSRLTISKDTSKNQVFLKIANVDTADTATYYCARIEGPYYWYFDVWGTGTTVTVSS (SEQ ID NO: 240)
537G7A6 CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCACCCTCACAGAGCCTGTCCATC ACATGCACGGTCTCTGGTTTCTCATTATCCAGATATAGTGTACACTGGATTCGTCAGTCTCC AGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAATGATATGGGGGGGTGGAAACACAGACTACAATT CAGGTCTCAAATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAA AAATGAACAGTCTGGAAAATGATGACACAGCCATGTATTACTGTGCCAGCCCCTCCCTCTA TTATTATGATGTTGCCTGGTTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA (SEQ ID NO: 241)
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLSRYSVHWIRQSPGKGLEWLGMIWGGGNTDYNSGL KSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLENDDTAMYYCASPSLYYYDVAWFPYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 242)
551H4D6 GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTCAGTCGAGTTG TCCTGCACAGCTTCTGGCTTTAATATTAAAAACGACTATTTGCACTGGGTGAAGCAGAGGC CTGAACAGGGCCTGGAATGGATTGGATGGATTGATTCCGCGAATGATAAGACTAAGTATG CCCCGAAGTTCCAGGACAAGGCCACTATAACTGCAGACCCATCCTCCAACACAGCCTACC
- 26 033604
TGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTACTAGAGTTGGGGT TCAGGATGGTTACTACGTTAGGGACTTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCACTCTCACAGTC TCCTCA (SEQ ID NO: 243)
EVQLQQSGAELVRPGASVELSCTASGFNIKNDYLHWVKQRPEQGLEWIGWIDSANDKTKYAP KFQDKATITADPSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTRVGVQDGYYVRDFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 244)
560Н2А7 GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGTTCTCTGAGTCTC TCCTGTGCAGGTTCTGGATTCACCTTCAGTGATTACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGCCTC CAGGGAAGGCACTTGAGTGGTTGGCTTTGATTAGAAACAAAGCTCCTGGTTACACAACAG AATACAGTGCATCTGTGAAGGGTCGTTTCACCATCTCCAGAGATAATTCCCAAAGCATCCT CTATCTTCAAATGAATGCCCTGAGACCTGAGGACAGTGCCACTTATTACTGTGCAAGAGTC TTACGACGGGCAGACTGCTTAGACTACTGGGGCCAAGGCACCGCTCTCACAGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 245)
EVKLVESGGGLVQPGGSLSLSCAGSGFTFSDYYMSWVRQPPGKALEWLALIRNKAPGYTTEY SASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNALRPEDSATYYCARVLRRADCLDYWGQGTALTVSS (SEQ ID NO: 246)
606H7F8 GTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCC TGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGTTATGACATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAG AGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAGCCATTAATAGTTATGGTGTTAACACCTACTATCCAG ACACTGTGAAGGACCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGC AAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACAGCCTTGTATTACTGTGCAAGACTTTTAATTGG GCCTTATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 247)
VQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVAAINSYGVNTYYPDT VKDRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTALYYCARLLIGPYYYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 248)
Таблица 3
Последовательности CDR Vk
Обозначение Последовательность
VLCDR19A10 KASQNAGAAVA (SEQ ID NO: 1)
VLCDR2 9A10 SASNRYT (SEQ ID NO: 2)
VLCDR3 9A10 QQYRSYPRT (SEQ ID NO: 3)
VLCDR15A7 KASQNAGAAVA (SEQ ID NO: 1)
VLCDR2 5A7 SASNRYT (SEQ ID NO: 2)
VLCDR3 5A7 QQYRSFPRT (SEQ ID NO: 4)
VLCDR1 5A11 KASQNAGAAVA (SEQ ID NO: 1)
VLCDR2 5A11 SASNRYT (SEQ ID NO: 2)
VLCDR3 5A11 QQYRSFPRT (SEQ ID NO: 4)
VLCDR1 3B11 KASQNAGIDVA (SEQ ID NO: 5)
VLCDR2 3B11 STSNRYT (SEQ ID NO: 6)
VLCDR3 3B11 LQYRSYPRT (SEQ ID NO: 7)
VLCDR15B9 KASQNAGIDVA (SEQ ID NO: 5)
VLCDR2 5B9 SKSNRYT (SEQ ID NO: 8)
VLCDR3 5B9 LQYRSYPRT (SEQ ID NO: 9)
- 27 033604
VLCDR1 12A7 KASQNAGTAVA (SEQ ID NO: 10)
VLCDR2 12A7 SAFNRYT (SEQ ID NO: 11)
VLCDR3 12A7 QQYRSYPRT (SEQ ID NO: 12)
VLCDR19B8 KASQSVGIAVA (SEQ ID NO: 13)
VLCDR2 9B8 STSNRYT (SEQ ID NO: 6)
VLCDR3 9B8 QQYSRYPRT (SEQ ID NO: 14)
VLCDR14B7 KASQNAGTAVA (SEQ ID NO: 10)
VLCDR2 4B7 STSNRYT (SEQ ID NO: 6)
VLCDR3 4B7 LQYRSYPRT (SEQ ID NO: 7)
VLCDR11A4 RASQDIGNRLN (SEQ ID NO: 15)
VLCDR21A4 ATSSLDS (SEQ ID NO: 16)
VLCDR31A4 LQYASSPFT (SEQ ID NO: 17)
VLCDR1 c04 RASQDIGNRLS (SEQ ID NO: 76)
VLCDR2 c04 ATSSLDS (SEQ ID NO: 16)
VLCDR3 c04 LQYASSPFT (SEQ ID NO: 17)
VLCDR1 c68 RASQDIGNRLH (SEQ ID NO: 77)
VLCDR2 c68 ATSSLDS (SEQ ID NO: 16)
VLCDR3 c68 LQYASSPFT (SEQ ID NO: 17)
VLCDR1 c44 RASQDIGNRLP (SEQ ID NO: 78)
VLCDR2 c44 ATSSLDS (SEQ ID NO: 16)
VLCDR3 c44 LQYASSPFT (SEQ ID NO: 17)
VLCDR1 c03 RASQDIGNRLR (SEQ ID NO: 79)
VLCDR2 c03 ATSSLDS (SEQ ID NO: 16)
VLCDR3 c03 LQYASSPFT (SEQ ID NO: 17)
VLCDR1 clO RASQDIGNRLM (SEQ ID NO: 80)
VLCDR2 clO ATSSLDS (SEQ ID NO: 16)
VLCDR3 clO LQYASSPFT (SEQ ID NO: 17)
VLCDR1 clO.l RASESVDSYGNIFMH (SEQ ID NO: 249)
VLCDR2 cl0.1 LASNLES (SEQ ID NO: 276)
VLCDR3 cl0.1 QQNNEAPWT (SEQ ID NO: 293)
VLCDR1 clO.2 RASKSVSTSGYSYMH (SEQ ID NO: 250)
VLCDR2 clO.2 LASNLES (SEQ ID NO: 276)
VLCDR3 clO.2 QQNNEAPWT (SEQ ID NO: 293)
VLCDR18A6 KASQDINSYLT (SEQ ID NO: 251)
VLCDR2 8A6 RANRLVS (SEQ ID NO: 277)
VLCDR3 8A6 LQYDEFPYT (SEQ ID NO: 294)
VLCDR16B7 RCSQSLVHSNGNTYLH (SEQ ID NO: 252)
VLCDR2 6B7 KVSDRFS (SEQ ID NO: 278)
VLCDR3 6B7 SQSTHVPLT (SEQ ID NO: 295)
VLCDR14E6 KASQDVATAVA (SEQ ID NO: 253)
VLCDR2 4E6 WASTRHT (SEQ ID NO: 279)
VLCDR3 4E6 QQYSNYPYT (SEQ ID NO: 296)
VLCDR13C7 RASQDIGNRLN (SEQ ID NO: 15)
VLCDR2 3C7 ATSSLDS (SEQ ID NO: 16)
VLCDR3 3C7 LQYASYPFT (SEQ ID NO: 297)
- 28 033604
VLCDR12A6 KASQNVGSAVV (SEQ ID NO: 254)
VLCDR2 2A6 SASNRYS (SEQ ID NO: 280)
VLCDR3 2A6 QQYSNYPLT (SEQ ID NO: 298)
VLCDR18A12 KASQNVGAAVV (SEQ ID NO: 255)
VLCDR2 8Al2 SASNRYI (SEQ ID NO: 281)
VLCDR3 8A12 QQYSNYPLT (SEQ ID NO: 298)
VLCDR19C5 KASQNVGSVVA (SEQ ID NO: 256)
VLCDR2 9C5 SASNRYT (SEQ ID NO: 2)
VLCDR3 9C5 QQYSSYPLT (SEQ ID NO: 299)
VLCDR1 1B12 RASKGVSTSSYTFIH (SEQ ID NO: 257)
VLCDR2 IB 12 YASNLES (SEQ ID NO: 282)
VLCDR3 IB 12 QHSREFPRT (SEQ ID NO: 300)
VLCDR19D9 RASGNIHNYLA (SEQ ID NO: 258)
VLCDR2 9D9 SAITLAD (SEQ ID NO: 283)
VLCDR3 9D9 QHFWNTPYT (SEQ ID NO: 301)
VLCDR16C1 KASQNVGAAVA (SEQ ID NO: 259)
VLCDR2 6C1 SASNRYI (SEQ ID NO: 281)
VLCDR3 6C1 QQYSNYPLT (SEQ ID NO: 298)
VLCDR1 ПАЮ KASQDIHSYLS (SEQ ID NO: 260)
VLCDR2 ПАЮ RTNRLVD (SEQ ID NO: 284)
VLCDR3 ПАЮ LQYDEFPYT (SEQ ID NO: 294)
VLCDR1 4АЮ KASQNVGSAVV (SEQ ID NO: 254)
VLCDR2 4АЮ SASNRYT (SEQ ID NO: 2)
VLCDR3 4АЮ QQYSSYPLT (SEQ ID NO: 299)
VLCDR16A9 KASQDINSYLS (SEQ ID NO: 261)
VLCDR2 6A9 RANRLVD (SEQ ID NO: 285)
VLCDR3 6A9 LQYDEFPYT (SEQ ID NO: 294)
VLCDR15A2 RSSENIYSSLA (SEQ ID NO: 262)
VLCDR2 5A2 AATNLAK (SEQ ID NO: 286)
VLCDR3 5A2 QHFWGSPFA (SEQ ID NO: 302)
VLCDR15A5 KASQNVGSAVA (SEQ ID NO: 263)
VLCDR2 5A5 STSNRYT (SEQ ID NO: 6)
VLCDR3 5A5 QQYASYPLT (SEQ ID NO: 303)
VLCDR1 12 All RATKGVSKSGYSYMH (SEQ ID NO: 264)
VLCDR2 12 All LASNLES (SEQ ID NO: 276)
VLCDR3 12 All QHSRELPLT (SEQ ID NO: 304)
VLCDR16D9 RASESVDSYGNSLMH (SEQ ID NO: 265)
VLCDR2 6D9 IASNLES (SEQ ID NO: 287)
VLCDR3 6D9 QQNSEDPRT (SEQ ID NO: 305)
VLCDR15A3 RASESVDRYGNSLMH (SEQ ID NO: 266)
VLCDR2 5A3 IASNLES (SEQ ID NO: 287)
VLCDR3 5A3 QQNNEDPRT (SEQ ID NO: 306)
VLCDR16B3 KASQDINRYLS (SEQ ID NO: 267)
VLCDR2 6B3 RANRLVD (SEQ ID NO: 285)
VLCDR3 6B3 LQYDEFPYT (SEQ ID NO: 294)
- 29 033604
VLCDR1 2C12 RASESVDNYGNSFMH (SEQ ID NO: 268)
VLCDR2 2C12 LASNLES (SEQ ID NO: 276)
VLCDR3 2C12 QQNNEDPRT (SEQ ID NO: 306)
VLCDR1 H6A9 RATKGVTKSGYSYIH (SEQ ID NO: 269)
VLCDR2 H6A9 LASNLQS (SEQ ID NO: 288)
VLCDR3 H6A9 QHSRELPLT (SEQ ID NO: 304)
VLCDR19D12 RASKSVDSYGTSFMH (SEQ ID NO: 270)
VLCDR2 9D12 LASNLES (SEQ ID NO: 276)
VLCDR3 9D12 VLCDR1 6F2 VLCDR2 6F2 VLCDR3 6F2 VLCDR11A10 VLCDR21A10 VLCDR31A10 VLCDR12A7 VLCDR2 2A7 VLCDR3 2A7 VLCDR1 HB7_a VLCDR2 HB7_a VLCDR3 HB7_a VLCDR1 llB7_b VLCDR2 llB7_b VLCDR3 llB7_b VLCDR17A6 VLCDR2 7A6 VLCDR3 7A6 VLCDR14D6 QQNNEDPRT (SEQ ID NO: 306) RTSESVDSYGNSFMF (SEQ ID NO: 271) LTSNLES (SEQ ID NO: 289) QQSNEDPRT (SEQ ID NO: 307) RASESVDSYGNSFMF (SEQ ID NO: 272) LTSNLES (SEQ ID NO: 289) QQSNEDPRT (SEQ ID NO: 307) RASESVDRYGNSLMH (SEQ ID NO: 266) IASNLES (SEQ ID NO: 287) QQNNEDPRT (SEQ ID NO: 306) RASKSVDSYGTSFMH (SEQ ID NO: 270) LASNLES (SEQ ID NO: 276) QQNNEDPRT (SEQ ID NO: 306) RASKSVDSYGTSFMH (SEQ ID NO: 270) LASNLES (SEQ ID NO: 276) QQNNEDPRT (SEQ ID NO: 306) RVSESVDRYADSFMH (SEQ ID NO: 273) LASNLES (SEQ ID NO: 276) QQNKEDPYT (SEQ ID NO: 308) RASESVDSYGNSFIH (SEQ ID NO: 274)
VLCDR2 4D6 RASNLNS (SEQ ID NO: 290)
VLCDR3 4D6 HQNNEDPRT (SEQ ID NO: 309)
VLCDR1 H2A7 RASESIDNYGLIFMS (SEQ ID NO: 275)
VLCDR2 H2A7 AASNRGS (SEQ ID NO: 291)
VLCDR3 H2A7 QQSKEVPWT (SEQ ID NO: 310)
VLCDR1 7F8 RASGNIHNYLA (SEQ ID NO: 258)
VLCDR2 7F8 NAKTLAD (SEQ ID NO: 292)
VLCDR3 7F8 QHFWSTPYT (SEQ ID NO: 311)
- 30 033604
Таблица 4
Обозначение
VHCDR19Al 0
VHCDR2 9Al0
VHCDR3 9Al О
VHCDR15А7
VHCDR2 5А7
VHCDR3 5А7
VHCDR15А11
VHCDR2 5All
VHCDR3 5А11
VHCDR1ЗВИ
VHCDR2 ЗВИ
VHCDR3 ЗВИ
VHCDR15В9
VHCDR2 5В9
VHCDR3 5В9
VHCDR1 12А7
VHCDR2 12А7
VHCDR3 12А7
VHCDR19В8
VHCDR2 9В8
VHCDR3 9В8
VHCDR14В7
VHCDR2 4В7
VHCDR3 4В7
VHCDR11А4
VHCDR21А4
VHCDR31А4
VHCDR15B9AS
VHCDR2 5B9AS
VHCDR3 5B9AS
VHCDR1 с04
VHCDR2 с04
VHCDR3 с04
VHCDR1 с68
VHCDR2 с68
VHCDR3 с68
VHCDR1 с44
VHCDR2 с44
VHCDR3 с44
VHCDR1 сОЗ
VHCDR2 сОЗ
VHCDR3 сОЗ
VHCDR1 сЮ
VHCDR2 сЮ
VHCDR3 сЮ
VHCDR1 С10.1
VHCDR2 с 10.1
VHCDR3 с 10.1
VHCDR1 С10.2
VHCDR2 с 10.2
Последовательности CDR VH ____Последовательность___________________
GYTFSIFCIH (SEQ ID N0: 18)___________
RIDPSSGGTKYNEKFES (SEQ ID N0: 19) GEDLLVRTDAMDY (SEQ ID NO: 20) GYTFSIFCVH (SEQ ID NO: 21)__________
RIDPSSGGTKYNEKFES (SEQ ID NO: 19) GEDLLVRTDALDY (SEQ ID NO: 22) GYTFSIFCIH (SEQ ID NO: 23)___________
RIDPSSGGTKYNERFEN (SEQ ID NO: 24) GEDLLVRTDAMDY (SEQ ID NO: 20) GYSFSTFFIH (SEQ ID NO: 25)__________
RIDPNSGGTKYNEKFES (SEQ ID NO: 26) GEDLLIRTDAMDY (SEQ ID NO: 27) GYSFSTFFIH (SEQ ID NO: 28)__________
RIDPNSGATKYNEKFES (SEQ ID NO: 29) GEDLLIRTDALDY (SEQ ID N0:30)_____
GYTFSTFLIH (SEQ ID NO: 31)__________
RIDPNSGGTKYNEKFER (SEQ ID NO: 32) GEDLLLRTDAMDY (SEQ ID NO: 33) GYTFITYWMH (SEQ ID NO: 34)________
GIDPNSGVIKYNEKFKS (SEQ ID NO: 35) GEDLLIRTDAMDY (SEQ ID NO: 27) GYSFSTFCIH (SEQ ID NO: 36)__________
RIDPNSGGTKYNEKFES (SEQ ID NO: 26) GEDLLIRTDAMDY (SEQ ID NO: 27) DHIFSIHWMQ (SEQ ID NO: 37)_________
EIFPGSGTTDYNEKFKG (SEQ ID NO: 38) GAFDY (SEQ ID N0:39)______________
ASGYSFSTFFIH (SEQ ID NO: 81)________
RIDPNSGATKYNEKFES (SEQ ID NO: 29) GEDLLIRTDALDY (SEQ ID N0:30)_____
DHIFSIHWMQ (SEQ ID N0:37)_________
EIFPGSGTTDYNEKFKG (SEQ ID N0:38) GAFDY (SEQ ID N0:39)______________
DHIFSIHWMQ (SEQ ID NO: 37)_________
EIFPGSGTTDYNEKFKG (SEQ ID N0:38) GAFDY (SEQ ID N0:39)______________
DHIFSIHWMQ (SEQ ID N0:37)_________
EIFPGSGTTDYNEKFKG (SEQ ID N0:38) GAFDY (SEQ ID N0:39)______________
DHIFSIHWMQ (SEQ ID N0:37)_________
EIFPGSGTTDYNEKFKG (SEQ ID N0:38) GAFDY (SEQ ID N0:39)______________
DHIFSIHWMQ (SEQ ID N0:37)_________
EIFPGSGTTDYNEKFKG (SEQ ID N0:38) GAFDY (SEQ ID N0:39)______________
GYTFTSDDIN (SEQ ID NO: 312)_________
WIYPRDGRTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 337) SRRVYAMDY (SEQ ID NO: 368)________
GYTFTSDDIN (SEQ ID NO: 312)_________
WIYPRDGRTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 337)
- 31 033604
VHCDR3 с10.2 SRRVYAMDY (SEQ ID NO: 368)
VHCDR18A6 GYTITSYVMH (SEQ ID NO: 313)
VHCDR2 8A6 YINPNNDGTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 338)
VHCDR3 8A6 GDYSNYFYWYFDV (SEQ ID NO: 369)
VHCDR16B7 GYTFPGYWMH (SEQ ID NO: 314)
VHCDR2 6B7 KIDPSDSETHYNQNFKD (SEQ ID NO: 339)
VHCDR3 6B7 EGWDSLTKVWFGW (SEQ ID NO: 370)
VHCDR14E6 GFNIKDDYMH (SEQ ID NO: 315)
VHCDR2 4E6 RIDPAYGNGKYVPKFQD (SEQ ID NO: 340)
VHCDR3 4E6 RYYAVSSVDYALDY (SEQ ID NO: 371)
VHCDR13C7 GYIFTSHWMQ (SEQ ID NO: 316)
VHCDR2 3C7 DIFPGSGTTDYNEKFKD (SEQ ID NO: 341)
VHCDR3 3C7 GAFDY (SEQ ID NO: 39)
VHCDR12A6 GFSLRTFGMGVG (SEQ ID NO: 317)
VHCDR2 2A6 HIWWNGDKYYDPALKS (SEQ ID NO: 342)
VHCDR3 2A6 IGPSITTVAEGFAY (SEQ ID NO: 372)
VHCDR1 8Al 2 GFSLRTFGMGVG (SEQ ID NO: 317)
VHCDR2 8Al2 HIWWNDEKYYNPDLKS (SEQ ID NO: 343)
VHCDR3 8Al2 VGPSISTVAEGFPY (SEQ ID NO: 373)
VHCDR19C5 GFSLRTFGMGVG (SEQ ID NO: 317)
VHCDR2 9C5 HIWWNDDKSSHPALKS (SEQ ID NO: 344)
VHCDR3 9C5 IGPSITTVAEGFAY (SEQ ID NO: 372)
VHCDR19D1 GFSMRTFGMGVG (SEQ ID NO: 318)
VHCDR2 9D1 HIWWNDEKYYNPDLKS (SEQ ID NO: 343)
VHCDR3 9D1 VGPSISTIAEGFPY (SEQ ID NO: 374)
VHCDR1 1B12 GYTFTNDNYWMN (SEQ ID NO: 319)
VHCDR2 IB 12 RIRPSDSETHYNQKFTN (SEQ ID NO: 345)
VHCDR3 IB 12 SWEDLLLRSMEDYFDY (SEQ ID NO: 375)
VHCDR19D9 GFSFSDYNIN (SEQ ID NO: 320)
VHCDR2 9D9 KVHPKDGTATYNQKFQD (SEQ ID NO: 346)
VHCDR3 9D9 LYYDSLTKILFAY (SEQ ID NO: 376)
VHCDR16C1 GFSLRTFGMGVG (SEQ ID NO: 317)
VHCDR2 6C1 HIWWNDEKYYNPALKS (SEQ ID NO: 347)
VHCDR3 6C1 LGPSITTVAEGFPY (SEQ ID NO: 377)
VHCDR1 ПАЮ GYSLISYYIH (SEQ ID NO: 321)
VHCDR2 ПАЮ LTFPGSGNSKFIEKFKG (SEQ ID NO: 348)
VHCDR311A10 GDFGNYLAYWYFDV (SEQ ID NO: 378)
VHCDR1 4АЮ GFSLKTFGMGVG (SEQ ID NO: 322)
VHCDR2 4АЮ HIWWNDDKFYHPALKS (SEQ ID NO: 349)
VHCDR3 4АЮ IGPSITTVAEGFAY (SEQ ID NO: 372)
VHCDR16A9 GYSLTSYYIH (SEQ ID NO: 323)
VHCDR2 6A9 LIFPGSGNSKYIEKFKG (SEQ ID NO: 350)
VHCDR3 6A9 GDFGNYLAYWYFDV (SEQ ID NO: 378)
VHCDR15A2 GFSLNTYGMGVG (SEQ ID NO: 324)
VHCDR2 5A2 NIWWNDDKYYNSALKS (SEQ ID NO: 351)
- 32 033604
VHCDR3 5А2 VAATIVTTYGAWFAY (SEQ ID NO: 379)
VHCDR15А5 GFSLRTFGMGVG (SEQ ID NO: 317)
VHCDR2 5А5 HIWWNDEKYYNPTLKS (SEQ ID NO: 352)
VHCDR3 5А5 IGPSITTVVEGFPY (SEQ ID NO: 380)
VHCDR1 12 АН GYTFTDKYIN (SEQ ID NO: 325)
VHCDR2 12 АН WIYPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 353)
VHCDR3 12 АН GIIYYYDGSYPYALDY (SEQ ID NO: 381)
VHCDR16D9 GYTFTDYSIH (SEQ ID NO: 326)
VHCDR2 6D9 VHCDR3 6D9 VHCDR15АЗ VHCDR2 5АЗ VHCDR3 5АЗ VHCDR16ВЗ VHCDR2 6ВЗ VHCDR3 6ВЗ VHCDR1 2С12 VHCDR2 2С12 VHCDR3 2С12 VHCDR1 Н6А9 VHCDR2 Н6А9 VHCDR3 Н6А9 VHCDR1 9D12 VHCDR2 9D12 VHCDR3 9D12 VHCDR1 6F2 VHCDR2 6F2 VHCDR3 6F2 VHCDR1 11А12 VHCDR2 11А12 VHCDR3 11А12 VHCDR11А10 VHCDR21А10 VHCDR3 1А10 VHCDR12А7 VHCDR2 2А7 VHCDR3 2А7 VHCDR1 11В7_а VHCDR2 11В7_а VHCDR3 11В7_а VHCDR1 11В7_Ь VHCDR2 11В7_Ь VHCDR3 11В7_Ь VHCDR17А6 VHCDR2 7А6 WIYPGSGNTKYNDKFKG (SEQ ID NO: 354) DYRRYYAIDY (SEQ ID NO: 382) GYTFTDYSIH (SEQ ID NO: 326) WIYPGSDNTKYNDKFKG (SEQ ID NO: 355) DYRRYYAMDY (SEQ ID NO: 383) GYTFTSYVMH (SEQ ID NO: 327) YLNPNNDGTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 356) GDYSNYFYWYFDV (SEQ ID NO: 369) GYTFSDYTIH (SEQ ID NO: 328) WIYPGRGNTKYNDKFKG (SEQ ID NO: 357) DYRRYYAMDY (SEQ ID NO: 383) GYTFTDNFIN (SEQ ID NO: 329) WISPGSGNTKNNEKFKG (SEQ ID NO: 358) GIIYYYDGTYPYALDY (SEQ ID NO: 384) GFSLTDYEIN (SEQ ID NO: 330) VIWTGGGTKYNSVLIS (SEQ ID NO: 359) EGRRYYAMDY (SEQ ID NO: 385) GFSLTTYEIN (SEQ ID NO: 331) VIWTGGTTKYNSAFIS (SEQ ID NO: 360) EGRRYYAMDY (SEQ ID NO: 385) GYTFTSYVIH (SEQ ID NO: 332) YLHRNNDGTKYNEKFKV (SEQ ID NO: 361) GDYSNYFYWYFDV (SEQ ID NO: 386) GFSLTTYEIN (SEQ ID NO: 331) VIWTGGTTKYNSAFIS (SEQ ID NO: 362) EGRRYYAMDY (SEQ ID NO: 385) GYTFTDYSIH (SEQ ID NO: 326) WIYPGSDNTKYNDKFKG (SEQ ID NO: 355) DYRRYYAMDY (SEQ ID NO: 383) GFSLTDYEIN (SEQ ID NO: 330) VIWTGGGTKYNSVLIS (SEQ ID NO: 359) EGRRYYAMDY (SEQ ID NO: 385) GFSLSTFGMGVG (SEQ ID NO: 392) HIWWDDDKYYNPALKS (SEQ ID NO: 363) IEGPYYWYFDV (SEQ ID NO: 387) GFSLSRYSVH (SEQ ID NO: 333) MIWGGGNTDYNSGLKS (SEQ ID NO: 364)
VHCDR3 7А6 PSLYYYDVAWFPY (SEQ ID NO: 388)
VHCDR14D6 GFNIKNDYLH (SEQ ID NO: 334)
VHCDR2 4D6 WIDSANDKTKYAPKFQD (SEQ ID NO: 365)
VHCDR3 4D6 VGVQDGYYVRDFDY (SEQ ID NO: 389)
VHCDR1 Н2А7 GFTFSDYYMS (SEQ ID NO: 335)
VHCDR2 Н2А7 LIRNKAPGYTTEYSASVKG (SEQ ID NO: 366)
VHCDR3 Н2А7 VLRRADCLDY (SEQ ID NO: 390)
VHCDR1 H7F8 GFTFSSYDMS (SEQ ID NO: 336)
VHCDR2 H7F8 AINSYGVNTYYPDTVKD (SEQ ID NO: 367)
VHCDR3 H7F8 LLIGPYYYAMDY (SEQ ID NO: 391)
CDR, которые приведены в табл. 3 и 4, определяли при помощи системы нумерации по Chothia (Al-Lazikani и др., JMB, 273, 927-948, (1997)) или системы нумерации IGMT (Lefranc, M.-P. и др., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)). Алгоритм IgAligner IMGT представлял собой такой от Chemical Computing Group (CCG).
Fab, которые продемонстрировали лучшее или эквивалентное связывание по сравнению с химерным исходным Fab, отбирали для превращения в IgG. Превращение осуществляли в IgG1KO формате. IgG1KO (knock-out/нокаут эффекторных функций) имел две мутации в участке Fc region, Leu234Ala и Leu235Ala, которые снижают эффекторную функцию, такую как FcyR, и связывание комплемента. IgG формат описывается в литературе (см., например, Hezareh и др. (2001), Journal of Virology, 75:1216112168). Пример 2 описывает процесс гуманизации более подробно. Результаты такой гуманизации при
- 33 033604 водили к получению последовательности гуманизированного антитела. Репрезентативное количество гуманизированных вариабельных участков легкой цепи и тяжелой цепи мышиных антител 5В9 и 1А4, обеспечивается и представлено в табл. 5 и 6.
Таблица 5
Гуманизированные последовательности Vk 5B9 и 1А4
Обознач. Последовательность
148C04VK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGNRLSWLQQEPGKAPKRLIYATSSLDSGVPSRFSG SRSGTEFTLTISSLQPEDFVTYYCLQYASSPFTFGQGTKLEIK (SEQ ID N0:82)
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGAC CATCACCTGCCGCGCCAGCCAGGACATCGGCAACCGCCTGTCGTGGCTGCAGCAGGAGC CAGGCAAGGCCCCAAAGCGCCTGATCTACGCCACCAGCAGCCTGGACAGCGGTGTCCCA AGCCGCTTCAGCGGCAGCCGCAGCGGCACCGAGTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCA ACCAGAGGACTTCGTCACCTACTACTGCCTGCAATACGCCAGCAGCCCATTCACCTTCGG CCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG (SEQ ID NO: 234)
148C18VK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGNRLNWLQQEPGKAPKRLIYATSSLDSGVPKRFSS SRSGTEFTLTISSLQPEDFVDYYCLQYASSPFTFGTGTKLEIK (SEQ ID NO: 83)
148C19VK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGNRLNWYQQEPGKAPKRLIYATSSLDSGVPKRFS
GSRSGTEFTLTISSLQPEDFVDYYCLQYASSPFTFGTGTKLEIK (SEQ ID NO: 84)
148C68VK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGNRLHWYQQKPGKAPKRLIYATSSLDSGVPKRFS GSRSGTEFTLTISSLQPEDFVTYYCLQYASSPFTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 85)
148C77VK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGNRLNWYQQKPGKAPKRLIYATSSLDSGVPKRFS GSRSGTEFTLTISSLQPEDFVDYYCLQYASSPFTFGTGTKLEIK (SEQ ID NO: 86)
148c92VK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGNRLNWYQQKPGKAPKRLIYATSSLDSGVPSRFS GSRSGTEFTLTISSLQPEDFVDYYCLQYASSPFTFGTGTKLEIK (SEQ ID NO: 87)
160C16VK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGNRLNWYQQKPGKAPKRLIYATSSLDSGVPSRFS GSRSGTEFTLTISSLQPEDFVTYYCLQYASSPFTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 88)
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGAC CATCACCTGCCGCGCCAGCCAGGACATCGGCAACCGCCTGAACTGGTACCAGCAGAAGC CAGGCAAGGCCCCAAAGCGCCTGATCTACGCCACCAGCAGCCTGGACAGCGGTGTCCCA AGCCGCTTCAGCGGCAGCCGCAGCGGCACCGAGTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCA ACCAGAGGACTTCGTCACCTACTACTGCCTGCAATACGCCAGCAGCCCATTCACCTTCGG CCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG (SEQ ID NO: 393)
148C44VK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGNRLPWLQQKPGKAPKRLIYATSSLDSGVPSRFSG SGSGTEFTLTISSLQPEDFVDYYCLQYASSPFTFGTGTKLEIK (SEQ ID NO: 89)
148C03VK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGNRLRWYQQKPGKAPKRLIYATSSLDSGVPSRFS GSRSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYASSPFTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 90)
148C10VK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGNRLMWYQQKPGKAPKRLIYATSSLDSGVPSRFS GSRSGTEFTLTISSLQPEDFVTYYCLQYASSPFTFGTGTKLEIK (SEQ ID NO: 91)
145C02VK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNAGIDVAWFQQKPGKAPKLLIYSKSNRYTGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYRSYPRTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 92)
145C08VK DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQNAGIDVAWFQQKPGKAPKLLIYSKSNRYTGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYRSYPRTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 93)
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGAG CATCACCTGCAAGGCCAGCCAGAACGCCGGCATCGACGTGGCTTGGTTCCAGCAGAAGC CTGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTACAGCAAGAGCAACCGCTACACGGCGTGCCAA GCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGC CAGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTCCAGTACCGCAGCTACCCACGCACCTTCGGCC AGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG (SEQ ID NO: 3 94)
145C15VK DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQNAGIDVAWFQQKPGKAPKLLIYSKSNRYTGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYYCLQYRSYPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 94)
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCAAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTCGGCGACCGCGTGAG CATCACCTGCAAGGCCAGCCAGAACGCCGGCATCGACGTGGCTTGGTTCCAGCAGAAGC TGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTACAGCAAGAGCAACCGCTACACCGGCGTGCCAA GCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTCCAGC CAGAGGACTTCGCCGACTACTACTGCCTCCAGTACCGCAGCTACCCACGCACCTTCGGCG GCGGCACCAAGCTGGAGATCAAG (SEQ ID NO: 3 95)
145C18VK DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQNAGIDVAWFQQKPGKAPKLLIFSKSNRYTGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYYCLQYRSYPRTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 95)
145C28VK DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNAGIDVAWFQQKPGKAPKLLIFSKSNRYTGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYRSYPRTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 96)
145C36VK DIVMTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQNAGIDVAWFQQKPGKAPKLLIYSKSNRYTGVPDRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYRSYPRTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 97)
Reference 1 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSRYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSG SGSGTDSTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 98)
Reference 2 SSELTQDPAVSVALGQTVRVTCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFS GSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCSSRDSSGNHWVFGGGTELTVLGQPKAAPSVTLFPPSSE ELQANKATL VCLISDFYPGAVTV AWKAD S SP VKAGVETTTP SKQSNNKYAAS S YL SLTPEQW KSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 99)
- 34 033604
Таблица 6
Гуманизированные последовательности VH 5B9 и 1А4
Обозначен. Последовательность
148C04VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAPDHIFSIHWMQWVRQRPGQGLEWIGEIFPGSGTTDYNE KFKGKVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCASGAFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 100)
148C18VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAPDHIFSIHWMQWVRQAPGQGLEWMGEIFPGSGTTDYN EKFKGKVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASGAFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 101)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCAGGCAGCAGCGTGAAGGT CAGCTGCAAGGCCCCCGACCACATCTTCAGCATCCACTGGATGCAGTGGGTCCGCCAAGC CCCAGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCGAGATTTTCCCAGGCAGCGGCACCACCGACT ACAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGGTGACCATCACCGTCGACAAGAGCACCAGCACCGCC TACATGGAGCTGAGCAGCCTGCGCAGCGAGGACACCGCCGTCTACTACTGCGCCAGCGG CGCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC (SEQ ID NO: 396)
148C19VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKISCKAPDHIFSIHWMQWVRQRPGQGLEWIGEIFPGSGTTDYNE KFKGKVTVTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASGAFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 102)
148C68VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKISCKASDHIFSIHWMQWVRQRPGQGLEWIGEIFPGSGTTDYNE KFKGKVTVTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARGAFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 103)
148C75VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAPDHIFSIHWMQWVRQRPGQGLEWMGEIFPGSGTTDYN EKFKGKVTVTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCASGAFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 104)
148C77VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKISCKASDHIFSIHWMQWVRQAPGQGLEWMGEIFPGSGTTDYN EKFKGKVTVTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCASGAFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 105)
148C92VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAPDHIFSIHWMQWVRQAPGQGLEWIGEIFPGSGTTDYNE KFKGRATVTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCASGAFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 106)
161C01VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASDHIFSIHWMQWVRQAPGQGLEWMGEIFPGSGTTDYN EKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGAFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 107)
148C03VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKISCKAPDHIFSIHWMQWVRQAPGQGLEWIGEIFPGSGTTDYNE KFKGKVTVTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASGAFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 108)
148C10VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKISCKASDHIFSIHWMQWVRQRPGQGLEWIGEIFPGSGTTDYNE KFKGKVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASGAFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 109)
145C02VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFSTFFIHWIQQRPGQGLEWMGRIDPNSGATKYN EKFESRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGEDLLIRTDALDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 110)
145C08VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFSTFFIHWIQQRPGQGLEWMGRIDPNSGATKYN EKFESKVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGEDLLIRTDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 111)
145C15VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFSTFFIHWVRQRPGQGLEWIGRIDPNSGATKYNE KFESKVTLTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGEDLLIRTDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 112)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGCGCCAGCGTGAAGGT GAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGCTTCAGCACCTTCTTCATCCACTGGGTCCGCCAACG CCCAGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCGCATCGACCCAAACAGCGGCGCCACCAAGT ACAACGAGAAGTTCGAGAGCAAGGTCACCCTGACCCGCGACACCAGCATCAGCACCGCC TACATGGAGCTGAGCCGCCTGCGCAGCGACGACACCGCCGTCTACTACTGCGCCCGCGGC GAGGACCTGCTGATCCGCACCGACGCCCTGGATTACTGGGGTCAGGGTACTAGCGTGACC GTGAGCAGC (SEQ ID NO: 397)
145C18VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFSTFFIHWVQQRPGQGLEWMGRIDPNSGATKYN EKFESKVTLTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGEDLLIRTDALDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 113)
145C28VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFSTFFIHWVRQAPGQGLEWIGRIDPNSGATKYNE KFESRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGEDLLIRTDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 114)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCAGGCGCCAGCGTGAAGGT GAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGCTTCAGCACCTTCTTCATCCACTGGGTCCGCCAAGC CCCAGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCGCATCGACCCAAACAGCGGCGCCACCAAGT ACAACGAGAAGTTCGAGAGCCGCGTCACCATGACCCGCGACACCAGCATCAGCACCGCC TACATGGAGCTGAGCCGCCTGCGCAGCGACGACACCGCCGTCTACTACTGCGCCCGCGGC GAGGACCTGCTGATCCGCACCGACGCCCTGGATTACTGGGGTCAGGGTACTAGCGTGACC
GTGAGCAGC (SEQ ID NO: 398)
145C36VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFSTFFIHWVRQRPGQGLEWMGRIDPNSGATKYN EKFESRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGEDLLIRTDALDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 115)
Reference 1 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGSTNYNPS LKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGYYDILTGYYYYFDYWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 116)
Reference 2 Q VQLQQ S G AE VKKP GS S VRV S CK AS GGTFNNN AINW VRQ AP GQGLEWMGGIIPMFGT AKYS QNFQGRVAITADESTGTASMELSSLRSEDTAVYYCARSRDLLLFPHHALSPWGRGTMVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 117)
- 35 033604
Гуманизированные анти-BAFF антитела необязательно содержали специфические аминокислотные замены в консенсусных или эмбриональных каркасных участках. Специфические замены аминокислотных участков в этих положениях каркасных участков улучшают различные аспекты поведения антитела, включая связывающую аффинность и/или стабильность, кроме того, было продемонстрировано, что гуманизированные антитела формировались путем прямого обмена CDR или HVL в эмбриональных каркасных участках человека.
В изобретении описаны моноклональные антитела с вариабельным участком легкой цепи, которые имеют аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179 или 181, а также другие моноклональные антитела с вариабельным участком тяжелой цепи, которые имеют аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 238, 240, 242, 244, 246 или 248 (см. табл. 1 и 2, как представлено выше). CDR последовательности этих мышиных антител представлены в табл. 3 и 4. Помещение таких CDR в FR вариабельных доменов консенсусной тяжелой и легкой цепи человека обеспечивает получение полезных гуманизированных антител в соответствии с настоящим изобретением.
Возможно получение моноклональных антител с комбинациями вариабельных участков легкой и тяжелой цепей SEQ ID NO: 41/59, 43/61, 45/63, 47/65, 49/67, 51/69, 53/71, 55/73, 57/75, 119/183, 121/185, 123/187, 125/189, 127/191, 129/193, 131/195, 133/197, 135/199, 137/201, 139/203, 141/205, 143/207, 145/209, 147/211, 149/213, 151/215, 153/217, 155/219, 157/221, 159/223, 161/225, 163/227, 165/229, 167/231, 169/233, 171/235, 173/238, 173/240, 175/242, 177/244, 179/246 или 181/248. Такие вариабельные участки могут сочетаться с константными участками человека.
Кроме того, описаны гуманизированные антитела с последовательностями вариабельного участка легкой цепи, которые имеют аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 82-97, а также другие гуманизированные антитела с последовательностями вариабельного участка тяжелой цепи, которые имеют аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 100-115 (см. табл. 5 и 6 выше). CDR последовательности этих антител представлены в табл. 3 и 4. Такие вариабельные участки могут сочетаться с константными участками человека.
Гуманизированные анти-BAFF антитела, раскрытые в данном изобретении, могут включать, по меньшей мере, вариабельный домен тяжелой или легкой цепи, включающий CDR или HVL мышиных моноклональных антител или гуманизированных антител, как представлено в табл. 1-6, приведенных выше, и FR вариабельных доменов эмбриональных тяжелой и легкой цепей человека.
CDR указанных последовательностей представлены в табл. 3 и 4. Возможно получение молекулы анти-BAFF антитела, включающей легкую цепь вариабельного домена с
CDR1, выбранного из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253,
SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO:259,
SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO:265,
SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO:271,
SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 274 и SEQ ID NO: 275;
CDR2, выбранного из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291 и SEQ ID NO: 292; и
CDR3, выбранного из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID N0:14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 302, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 304, SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 306, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: 308, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 310 и SEQ ID NO: 311; и вариабельный домен тяжелой цепи с CDR1, выбранного из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: 316, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 320, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323, SEQ ID NO: 324, SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 332, SEQ ID NO: 392, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 335 и SEQ ID NO: 336;
CDR2, выбранного из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 344,
- 36 033604
SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 349,
SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 355,
SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 361,
SEQ ID NO: 362, SEQ ID NO: 363, SEQ ID NO: 364, SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 366 и SEQ ID NO: 367;
CDR3, выбранного из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO. 39, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 369, SEQ ID NO: 370, SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 372, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 379, SEQ ID N0:380, SEQ ID NO: 381, SEQ ID NO: 382, SEQ ID NO: 383, SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 385, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 387, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 390 и SEQ ID NO: 391.
Также возможно получение (a) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 1, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 2 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 3 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 18, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 19 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 20;
(b) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 1, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 2 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 4 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 21, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 19 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 22;
(c) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 1, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 2 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 4 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 23, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 24 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 20;
(d) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 5, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 6 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 7 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 25, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 26 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 27;
(e) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 5, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 8 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 9 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 28, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 29 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 30;
(f) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 10, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 11 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 12 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 31, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 32 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 33;
(g) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 13, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 6 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 14 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 34, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 35 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 27;
(h) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 10, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 6 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 7 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 36, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 26 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 27;
(i) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 15, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 16 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 17 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 37, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 38 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 39;
(j) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 76, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 16 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 17 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 37, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 38 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 39;
(k) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 77, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 16 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 17 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 37, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 38 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 39;
(l) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 78, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 16 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 17 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 37, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 38 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 39;
(m) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 79, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 16 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 17 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности
- 37 033604
SEQ ID NO: 37, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 38 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 39;
(n) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 80, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 16 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 17 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 37, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 38 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 39;
(o) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 5, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 8 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 9 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 81, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 29 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 30;
(p) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 249, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 276 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 293 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 312, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 337 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 368;
(q) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 250, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 276 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 293 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 312, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 337 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 368;
(r) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 251, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 277 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 294 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 313, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 338 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 369;
(s) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 252, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 278 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 295 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 314, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 339 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 370;
(t) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 253, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 279 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 296 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 315, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 340 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 371;
(u) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 15, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 16 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 297 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 316, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 341 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 39;
(v) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 254, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 280 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 298 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 317, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 342 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 372;
(w) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 255, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 281 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 298 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 317, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 343 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 373;
(x) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 256, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 2 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 299 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 317, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 344 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 372;
(y) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 255, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 281 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 298 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 318, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 343 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 374;
(z) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 257, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 282 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 300 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности
- 38 033604
SEQ ID NO: 319, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 345 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 375;
(aa) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 258, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 283 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 301 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 320, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 346 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 376;
(bb) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 259, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 281 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 298 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 317, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 347 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 377;
(cc) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 260, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 284 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 294 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 321, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 348 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 378;
(dd) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 254, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 2 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 299 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 322, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 349 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 372;
(ее) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 261, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 285 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 294 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 323, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 350 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 378;
(ff) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 262, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 286 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 302 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 324, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 351 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 379;
(gg) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 263, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 6 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 303 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 317, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 352 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 380;
(hh) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 264, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 276 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 304 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 325, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 353 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 381;
(ii) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 265, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 287 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 305 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 326, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 354 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 382;
(jj) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 266, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 287 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 306 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 326, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 355 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 383;
(kk) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 267, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 285 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 294 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 327, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 356 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 369;
(ll) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 268, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 276 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 306 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 328, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 357 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 383;
- 39 033604 (mm) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 269, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 288 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 304 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 329, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 358 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 384;
(nn) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 270, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 276 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 306 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 330, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 359 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 385;
(oo) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 271, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 289 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 307 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 331, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 360 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 385;
(pp) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 261, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 285 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 294 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 332, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 361 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 386;
(qq) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 272, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 289 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 307 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 331, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 362 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 385;
(rr) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 266, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 287 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 306 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 326, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 355 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 383;
(ss) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 270, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 276 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 306 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 330, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 359 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 285;
(tt) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 270, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 276 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 306 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 392, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 363 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 387;
(uu) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 273, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 276 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 308 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 333, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 364 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 388;
(vv) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 274, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 290 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 309 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 334, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 365 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 389;
(ww) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 275, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 291 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 310 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 335, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 366 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 390; и (хх) молекулы анти-BAFF антитела, где вариабельный домен легкой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 258, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 292 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 311 и вариабельный домен тяжелой цепи включает CDR1 последовательности SEQ ID NO: 336, CDR2 последовательности SEQ ID NO: 367 и CDR3 последовательности SEQ ID NO: 391.
Молекула анти-BAFF антитела может включать вариабельный участок легкой цепи любой из последовательностей SEQ ID NO: 82-97 и вариабельный участок тяжелой цепи любой из последовательно
- 40 033604 стей SEQ ID NO: 100-115. Возможно получение моноклональных антител с комбинациями вариабельных участков легкой и тяжелой цепей SEQ ID NO: 82/101, 88/101, 94/112 или 93/114. Такие вариабельные участки могут сочетаться с константными участками человека.
Молекула анти-BAFF антитела может нейтрализовать все три формы человеческого BAFF, формы, которые включают связанный с мембраной BAFF (mbBAFF), растворимый тримерный BAFF и растворимый 60-мерный BAFF. В частности, молекула анти-BAFF антител может нейтрализовать человеческий растворимый 60-мерный BAFF. Кроме того, молекула анти-BAFF антитела может нейтрализовать человеческий растворимый тримерный BAFF. В завершение, молекула анти-BAFF антитела может нейтрализовать человеческий связанный с мембраной BAFF.
Кроме того, молекула анти-BAFF антитела может включать гуманизированный вариабельный домен легкой цепи, включающий CDR последовательности SEQ ID NO: 76, 16 и 17 и каркасные участки, имеющие аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную, по меньшей мере на 93% идентичную или по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности каркасных участков вариабельного домена легкой цепи аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 82, и гуманизированный вариабельный домен тяжелой цепи, который включает CDR последовательности SEQ ID NO: 37, 38 и 39 и каркасные участки, имеющие аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную, по меньшей мере на 93% идентичную или по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности каркасных участков аминокислотной последовательности вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 101. Такая молекула анти-BAFF антитела может представлять собой гуманизированное моноклональное антитело.
Молекула анти-BAFF антитела может содержать гуманизированный вариабельный домен легкой цепи, включающий CDR последовательности SEQ ID NO: 15, 16 и 17 и каркасные участки, имеющие аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную, по меньшей мере на 93% идентичную или по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности каркасных участков вариабельного домена легкой цепи аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 88, и гуманизированный вариабельный домен тяжелой цепи, который включает CDR последовательности SEQ ID NO: 37, 38 и 39 и каркасные участки, имеющие аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную, по меньшей мере на 93% идентичную или по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности каркасных участков аминокислотной последовательности вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 101. Такая молекула анти-BAFF антитела может представлять собой гуманизированное моноклональное антитело.
Молекула анти-BAFF антитела может содержать гуманизированный вариабельный домен легкой цепи, включающий CDR последовательности SEQ ID NO: 5, 8 и 9 и каркасные участки, имеющие аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную, по меньшей мере на 93% идентичную или по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности каркасных участков вариабельного домена легкой цепи аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 94, и гуманизированный вариабельный домен тяжелой цепи, который включает CDR последовательности SEQ ID NO: 81, 29 и 30 и каркасные участки, имеющие аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную, по меньшей мере на 93% идентичную или по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности каркасных участков вариабельного домена тяжелой цепи аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 112. Такая молекула анти-BAFF антитела может представлять собой гуманизированное моноклональное антитело.
Молекула анти-BAFF антитела может содержать гуманизированный вариабельный домен легкой цепи, включающий CDR последовательности SEQ ID NO: 5, 8 и 9, и каркасные участки, имеющие аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную, по меньшей мере на 93% идентичную или по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности каркасных участков вариабельного домена легкой цепи аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 93, и гуманизированный вариабельный домен тяжелой цепи, который включает CDR последовательности SEQ ID NO: 81, 29 и 30 и каркасные участки, имеющие аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную, по меньшей мере на 93% идентичную или по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности каркасных участков вариабельного домена тяжелой цепи аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 114. Такая молекула анти-BAFF антитела может представлять собой гуманизированное моноклональное антитело.
Возможно также получение химерных антител с переключаемыми CDR участками (т.е. например, маневрирование одного или двух CDR одного из мышиных антител или гуманизированного антитела, которое происходит от них, с аналогичными CDR из другого мышиного антитела или гуманизированного антитела, которое происходит от них). Это тоже может приводить к получению полезных антител.
Гуманизированное анти-BAFF антитело может представлять собой фрагмент антитела. Различные фрагменты антител в общем случае обсуждались выше, и были разработаны различные способы получения фрагментов антител. Фрагменты можно получить посредством протеолитического расщепления интактных антител (см., например, Morimoto и др., 1992, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 и Brennan и др., 1985, Science, 229:81). Альтернативно, фрагменты можно получить непосред
- 41 033604 ственно в рекомбинантных клетках-хозяевах. Например, Fab'-SH-фрагменты можно непосредственно выделить из B.coli и химически сочетать с F(ab')2 фрагментами (см., например, Carter и др., 1992, Bio/Technology 10:163-167). При другом подходе F(ab')2 фрагменты можно выделить непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Другие методики получения фрагментов антител известны специалистам в данной области техники. В соответствии с этим фрагменты антитела, включающие CDR, тоже описаны в данном документе, в частности комбинации L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 и H-CDR3. Фрагменты антител могут включать вариабельные участки, описанные в данном документе, например одну из комбинаций вариабельных участков легкой цепи и вариабельных участков тяжелой цепи, описанных в данном документе.
Антитело или фрагмент антитела может содержать константный участок, который опосредует эффекторную функцию. Константный участок может обеспечить зависимую от антитела клеточную цитотоксичность (ADCC), антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP) и зависимую от комплемента цитотоксичность (CDC) в отношении клеток-мишеней, экспрессирующих BAFF. Эффекторный(ые) домен(ы) может(могут) представлять собой, например, Fc-участок молекулы Ig.
Эффекторный участок антитела может иметь происхождение от любого подходящего вида позвоночных и представлять собой любой изотип. Изотипы различных видов животных различаются по их способности опосредовать эффекторные функции. Например, способность человеческого иммуноглобулина опосредовать CDC и ADCC/ADCP обычно соответственно находится в следующем порядке IgM»IgG1»IgG3>IgG2>IgG4 и IgG1»IgG3>IgG2/IgM>IgG4. Мышиные иммуноглобулины опосредуют CDC и ADCC/ADCP в основном соответственно в следующем порядке: IgMMgG3>IgG2b>IgG2a>>IgG1 и IgG2b«IgG2a>IgG1>>IgG3. В одном примере мышиный IgG2a опосредует ADCC, в то время как оба мышиных IgG2a и IgM опосредуют CDC.
Модификации антитела.
Гуманизированные анти-BAFF антитела и агенты могут включать модификации гуманизированного анти-BAFF антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Например, можно модифицировать антитело в отношении проявления эффекторной функции, например, для повышения эффективности антитела при лечении рака. Одной из таких модификаций является введение остатка(ов) цистеина в Fc-участок, посредством чего происходит образование дисульфидных связей между цепями в данном участке. Полученное таким образом гомодимерное антитело может обладать повышенной способностью к интернализации и/или повышенной опосредуемой комплементом способностью приводить к гибели клеток и/или антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). См., например, Caron и др., 1992, J. Exp. Med. 176:1191-1195 и Shopes, 1992, J. Immunol. 148:2918-2922. Гомодимерные антитела, обладающие повышенной противоопухолевой активностью, также можно получить при использовании гетеробифункциональных перекрестных линкеров, описанных Wolff и др., 1993, Cancer Research, 53:25602565. Альтернативно, можно сконструировать антитело с включением двойных Fc-областей, повышая, таким образом, способность антитела к лизису комплемента и ADCC (см. Stevenson и др., 1989, Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230).
Были получены антитела с повышенной способностью поддерживать ADCC посредством модификации характера гликозилирования их Fc-участков. Это возможно, поскольку гликозилирование антитела по остатку аспарагина, N297 в домене CH2 вовлечено во взаимодействие между IgG и рецепторами Fcy, которое необходимо в качестве предварительного условия для протекания ADCC. Были созданы линии клеток-хозяев для экспрессии антител с измененным гликозилированием, так, например, с повышенным расщеплением N-ацетилглюкозамина или пониженным содержанием фукозы. Снижение уровня фукозы обеспечивает существенное усиление активности ADCC по сравнению с повышением расщепления N-ацетилглюкозамина. Более того, усиление ADCC под действием антител с низким уровнем фукозы не зависит от полиморфизма FcyRIIIa V/F.
Модификация аминокислотной последовательности Fc-участка антител является альтернативой гликозилирования с целью повышения ADCC. Исследовали сайт связывания в человеческом IgG1 для рецепторов Fcy с помощью экстенсивного мутационного анализа. Это приводило к получению гуманизированных IgG1-антител с мутациями в Fc, которые повышали аффинность связывания FcyRIIIa и усиливали ADCC в условиях in vitro. Дополнительно были получены варианты Fc со многими различными пермутациями в отношении связывающих свойств, например, с повышенным связыванием со специфическими рецепторами FcyR при неизменном или пониженном связывании с рецепторами FcyR.
Можно получать иммуноконъюгаты, содержащие гуманизированное антитело или его фрагменты, конъюгированные с цитотоксическим агентом, таким как химиотерапевтический препарат, токсин (например, ферментативно активный токсин бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или его фрагмент) или радиоактивным изотопом (т.е. радиоактивный конъюгат).
Химиотерапевтические агенты, пригодные для получения таких иммуноконъюгатов, были описаны выше. Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые можно использовать для получения пригодных иммуноконъюгатов, включают цепь А токсина возбудителя дифтерии, не связывающие активные фрагменты токсина возбудителя дифтерии, цепь А экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь
- 42 033604
А рицина, цепь А абрина, цепь А модеццина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантинов, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин, трикотецены и т.п. Кроме того, промышленно доступны различные радионуклиды для получения радиоконъюгированных гуманизированных анти-BAFF антител. Примеры включают 212Bi, 131I, 131In, 90Y и 186Re.
Конъюгаты гуманизированного анти-BAFF антитела и цитотоксического или химиотерапевтического агента могут быть получены известными способами при использовании различных бифункциональных агентов для связывания белков, таких как Юсукцинимидил-3-(2-пиридилдитиол)пропионат (SPDP), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCl), активные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидопроизводные (такие, как бис-(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие, как толуол 2,6-диизоцианат) и бисактивные фторсодержащие соединения (такие, как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицин может быть получен так, как описано Vitetta и др., 1987, Science, 238:1098. Меченная 14С 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) представляет собой типичный хелатирующий агент для конъюгации радионуклида с антителом. Также можно получить конъюгаты со способным к расщеплению линкером.
Гуманизированные анти-BAFF антитела, раскрытые в данном описании, можно рецептировать в виде иммунолипосом. Липосомы, содержащие антитело, получают при использовании способов, известных в данной области техники, таких как те, что описаны Epstein и др., 1985, Proc. Nail. Acad. Sci. USA, 82:3688; Hwang и др., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 и в патентах США № 4485045 и 4544545. Липосомы с повышенным временем нахождения в кровотоке раскрыты, например, в патенте США № 5013556.
Особенно пригодные липосомы можно получить методом выпаривания с обратной фазой при использовании липидного состава из фосфатидилхолина, холестерина и ПЭГ-дериватизованного фосфатидилэтаноламина (ПЭГ-РЕ). Липосомы экструдируют через фильтры с определенным размером пор для получения липосом желаемого диаметра. Fab'-фрагменты антитела, раскрытого в данном описании, можно конъюгировать с липосомами, как описано Martin и др., 1982, J. Biol. Chem. 257:286-288, посредством реакции обмена дисульфидов. В липосоме необязательно находится химиотерапевтический агент (такой как доксорубицин). См., например, Gabizon и др., 1989, J. National Cancer. Inst. 81(19): 1484.
Антитела, описанные и раскрытые в данном документее, также можно использовать в способах ADEPT (направленной на антитела ферментно-пролекарственной терапии) посредством конъюгации антитела с активирующим пролекарственным ферментом, который превращает пролекарственный агент (например, пептидиловый химиотерапевтический препарат) в активный противоопухолевый препарат (см. например, WO 81/01145, WO 88/07378 и патент США № 4975278). Ферментный компонент иммуноконъюгата, пригодный для ADEPT, представляет собой фермент, способный активироваться на молекуле пролекарственного средства таким образом, что он превращает его в более активную, цитотоксическую форму. Специфические ферменты, которые пригодны для ADEPT, включают, но не ограничиваются, такие как щелочная фосфатаза для превращения фосфатсодержащих пролекарственных средств в свободные препараты; арилсульфатаза для превращения сульфатсодержащих пролекарственных средств в свободные препараты; цитозиндезаминаза для превращения нетоксичного 5-фторцитозина в противоопухолевый препарат, 5-фторурацил; протеазы, такие как протеаза серратиа, термолизин, субтилизин, карбоксипептидазы и катепсины (такие, как катепсины В и L) для превращения пептид содержащих пролекарственных средств в свободные препараты; D-аланилкарбоксипептидаза для превращения пролекарственных средств, содержащих D-аминокислоты в качестве заместителей; расщепляющие углеводы ферменты, такие как β-галактозидаза и нейраминидаза, для превращения гликозилированных про лекарственных средств в свободные препараты; β-лактамаза для превращения лекарственных препаратов, дериватизованных β-лактамами, в свободные препараты; и пенициллинамидазы, такие как пенициллинамидаза V или пенициллинамидаза G, для превращения лекарственных препаратов, дериватизованных по атомам азота их аминогрупп, соответственно, феноксиацетильной или фенилацетильной группами, в свободные препараты. Альтернативно можно использовать антитела с ферментативной активностью (абзимы) для превращения пролекарственных средств в свободные активные препараты (см., например, Massey, 1987, Nature, 328:457-458). Конъюгаты антитело-абзим можно получить известными способами для доставки абзима к популяции опухолевых клеток, например, путем ковалентного связывания фермента с гуманизированным анти-BAFF антителом/гетеробифункциональными сшивающими реагентами, как обсуждалось выше. Альтернативно, можно сконструировать гибридные белки, содержащие по меньшей мере одну антигенсвязывающую область антитела, раскрытого в данном описании, связанную, по крайней мере, с функционально активным участком описанного выше фермента, с использованием методов рекомбинантной ДНК (см., например, Neuberger и др., 1984, Nature, 312:604-608).
Иногда желательно использовать фрагмент гуманизированного анти-BAFF антитела, предпочтительнее, чем интактное антитело, например, для повышения проникновения в опухоль. Можно модифи
- 43 033604 цировать фрагмент антитела для повышения периода полураспада в сыворотке крови. Этого можно достичь, например, путем включения эпитопа связывания рецептора реутилизации во фрагмент антитела. Одновременно можно изменить соответствующий участок фрагмента антитела (например, подвергнуть мутации), и эпитоп можно включить в пептид-метку, который затем подвергают гибридизации с фрагментом антитела на одном конце или в середине, например, с помощью синтеза ДНК или пептида. См., например, WO 96/32478.
Ковалентные модификации включают модификацию остатков цистеинила, остатков гистидила, остатков лизинила и аминотерминальных остатков, остатков аргинила, остатков тирозила, карбоксильных боковых групп (аспартил или глутамил), остатков глутаминила и аспарагинила или серила или остатков треонила. Другой тип ковалентной модификации включает химическое или ферментативное слияние гликозидов с антителом. Такие модификации можно осуществлять путем химического синтеза или ферментативным или химическим расщеплением антитела, если это является приемлемым. Другие типы ковалентных модификаций антитела могут быть введены в молекулу путем реакции нацеленных аминокислотных остатков с органическим дериватизирующим агентом, который способен взаимодействовать с выбранными боковыми цепями или амино- или карбокситерминальными остатками.
Удаление любых углеводных групп, присутствующих в антителе, можно осуществить химическим или ферментативным путем. Химическое дегликозилирование описано Hakimuddin и др., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 и Edge и др., 1981, Anal. Biochem. 118:131. Можно осуществлять ферментативное расщепление углеводных остатков в антителах при использовании различных эндо- и экзогликозидаз, как описано Thotakura и др., 1987, Meth. Enzymol. 138:350.
Другой тип полезной ковалентной модификации включает связывание антитела с одним из различных небелковых полимеров, например полиэтиленгликолем, пропиленгликолем или полиоксиалкиленами, с помощью способов, описанных в одном или более из следующих источников: патент США № 4640835, патент США № 4496689, патент США № 4301144, патент США № 4670417, патент США № 4791192 и патент США № 4179337.
Гуманизация и варианты аминокислотной последовательности.
Варианты аминокислотных последовательностей анти-BAFF антитела можно получить путем введения соответствующих замен нуклеотидов в ДНК анти-BAFF антитела или путем пептидного синтеза. Такие варианты включают, например, делеции, и/или инсерции, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях анти-BAFF антител в соответствии с примерами, приведенными ниже. Проводят любую комбинацию делеций, инсерции и замен для получения заключительной конструкции при условии, что заключительная конструкция обладает желаемыми характеристиками. Аминокислотные замены могут также изменить посттрансляционный процессинг гуманизированного анти-BAFF антитела или его варианта, например изменить число или положения сайтов гликозилирования.
Полезный способ для идентификации определенных остатков или участков анти-BAFF антитела, которые представляют собой предпочтительные положения для мутагенеза, называется аланин сканирующим мутагенезом, который описан Cunningham и Wells (Science, 244:1081-1085 (1989)). В данном случае идентифицируют остаток или группу остатков-мишеней (например, заряженные остатки, такие как arg, asp, his, lys и glu) и замещают их на нейтральную или отрицательно заряженную аминокислоту (как правило, аланин) для обеспечения влияния на взаимодействие аминокислот с антигеном BAFF. Данные аминокислотные положения, проявляющие функциональную чувствительность к заменам, затем удаляют введением дополнительных или других вариантов в сайты замещения или для сайтов замещения. Таким образом, несмотря на то, что сайт введения варианта аминокислотной последовательности определен заранее, природа мутации сама по себе не определяется заранее. Например, для анализа проведения мутации в данном сайте проводят аланин сканирующий или произвольный мутагенез в целевом кодоне или участке, и экспрессированные варианты анти-BAFF антитела подвергают скринингу на желаемую активность.
Инсерции аминокислотной последовательности включают амино- и/или карбокситерминальные слияния, которые колеблются по длине от одного остатка до полипептидов, содержащих сотню или более остатков, так же, как инсерции внутри последовательности одного или множества аминокислотных остатков. Примеры терминальных инсерции включают антитело к BAFF, слитое с эпитопом-меткой. Другие инсерционные варианты молекулы анти-BAFF антитела включают слияние с N- или С-терминальным концом анти-BAFF антитела фермента или пептида, которые повышают период полураспада антитела в сыворотке крови.
Другим типом варианта является вариант аминокислотной замены. Данные варианты имеют по меньшей мере один аминокислотный остаток в молекуле анти-BAFF антитела, который удален и на его место вставлен другой остаток. Сайты, которые представляют наибольший интерес для заместительного мутагенеза, включают гипервариабельные участки, но изменения FR также предусматриваются. Консервативные замены представлены ниже под заголовком Предпочтительные замены. Если такие замены приводят к изменению биологической активности, то можно ввести более существенные замены, которые обозначаются как Типичные замены или как дополнительно описано ниже со ссылкой на классы аминокислот, и продукты подвергнуть скринингу.
- 44 033604
Исходный остаток Типичные замены
Предпочтительные замены
Ala (А) val; leu; ile val
Arg (R) lys; gin; asn lys
Asn (N) gin; his; asp, lys; arg gin
Asp (D) glu; asn glu
Cys (C) ser; ala ser
Gin (Q) asn; glu asn
Glu (E) asp; gin asp
Gly (G) ala ala
His (H) arg; asn; gin; lys; arg
He (I) leu; val; met; ala; phe; норлейцин leu
Leu (L) ile; норлейцин; val; met; ala; phe ile
Lys (K) arg; gin; asn arg
Met (M) leu; phe; ile leu
Phe(F) tyr; leu; val; ile; ala; tyr
Pro (P) ala ala
Ser(S) thr thr
Thr(T) ser ser
Trp (W) tyr; phe tyr
Tyr (Y) phe;trp; thr; ser phe
Val (V) leu; ile; met; phe ala; норлейцин; leu
В белковой химии в общем случае приемлемо, чтобы биологические свойства антитела были изменены путем выбора замен, которые значительно различаются по их влиянию на поддержание (а) структуры скелета полипептида в области замены, например, в виде складчатой или спиральной конформации, (b) заряда или гидрофобности молекулы в целевом сайте или (с) размера боковой цепи. Природные остатки подразделяются на группы на основе общих свойств боковой цепи:
(1) гидрофобные: норлейцин, met, ala, val, leu, ile;
(2) нейтральные гидрофильные: cys, ser, thr;
(3) кислые: asp, glu;
(4) основные: asn, gin, lys, arg;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: gly, pro; и (6) ароматические: trp, tyr, phe.
Неконсервативные замены будут включать замену члена одного из этих классов на другой класс.
Любой остаток цистеина, не вовлеченный в поддержании правильной конформации гуманизированного анти-BAFF антитела или вариантного анти-BAFF антитела, также может быть замещен, как правило, на серин для повышения стабильности молекулы к окислению, предотвращения аберрантного перекрестного связывания или обеспечения установленных точек конъюгации с цитотоксическим или цитостатическим соединением. В противоположность этому, цистеиновая(ые) связь(и) может быть добавлена к антителу для повышения его стабильности (в частности, в тех случаях, когда антитело представляет собой фрагмент антитела, такой как Fv фрагмент).
Тип заместительного варианта включает замещение одного или более остатков гипервариабельного участка исходного антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). В общем случае полученный(ые) вариант(ы), выбранный(е) для последующей разработки, будет(ут) обладать улучшенными биологическими свойствами по сравнению с исходным антителом, из которого они получены. Удобным способом получения таких заместительных вариантов является созревание аффинности при использовании фагового дисплея. Вкратце, несколько сайтов гипервариабельного участка (например, 6-7 сайтов) подвергают мутации для получения всех возможных замен аминокислот в каждом сайте. Полученные таким образом варианты антител просматривают моновалентным образом на частицах нитчатого фага в виде гибридных конструкций с продуктом гена III M13, упакованного в каждой частице. Затем расположенные на фаге варианты подвергают скринингу на их биологическую активность (например, на аффинность связывания). Для идентификации кандидатов сайтов для модификации гипервариабельного участка можно осуществлять аланин-сканирующий мутагенез для установления остатков гипервариабельного участка, которые вносят существенный вклад в связывание антигена. Альтернативно или до полнительно к этому полезно проанализировать кристаллическую структуру комплекса антигенантитело для идентификации точек контакта между антителом и человеческим BAFF. Такие остатки для контакта и соседние остатки являются кандидатами для замещения. После получения таких вариантов панель вариантов подвергают скринингу, как описано в данном изобретении, и антитела с наилучшими свойствами, которые они проявляют в одном или более соответствующих тестах, могут быть отобраны для дальнейшего усовершенствования.
Другой тип аминокислотного варианта антитела изменяет первоначальный характер гликозилирования антитела. Под изменением понимается делеция одной или более углеводных групп, обнаружен
- 45 033604 ных в антителе, и/или добавление одного или более сайтов гликозилирования, которые отсутствуют в антителе.
Иногда желательно модифицировать антитела для добавления сайтов гликозилирования. Гликозилирование антител, как правило, является N-связанным или О-связанным. N-связанное гликозилирование относится к присоединению углеводородной группы к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где X представляет любую аминокислоту, за исключением пролина, являются последовательностями распознавания для ферментативного присоединения углеводной группы к боковой цепи остатка аспарагина. Таким образом, присутствие любой из данных трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. О-связанное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров, N-галактозамина, галактозы или ксилозы, к оксиаминокислоте, чаще всего к серину или треонину, хотя также можно использовать 5-оксипролин или 5-оксилизин.
Таким образом, для того чтобы гликозилировать данный белок, например антитело, осуществляют конструирование аминокислотной последовательности для того, чтобы она содержала одну или более представленных выше трипептидных последовательностей (для сайтов N-связанного гликозилирования). Можно также осуществлять изменение добавлением или заменой одного или более остатков серина или треонина в последовательности исходного антитела (для сайтов О-связанного гликозилирования).
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие варианты аминокислотных последовательностей анти-BAFF антитела, получают различными методами, известными в данной области техники. Данные методы включают, но не ограничены такими, выделение из природного источника, (в случае существующих в природе вариантов аминокислотной последовательности) или получение с помощью олигонуклеотид-опосредованного (или сайт-направленного) мутагенеза, ПЦР-мутагенеза или кассетного мутагенеза ранее полученного варианта или невариантной версии анти-BAFF антитела.
Полинуклеотиды, векторы, клетки-хозяева и способы рекомбинации.
Изолированные полинуклеотиды могут кодировать любую желаемую форму анти-BAFF антитела, включая, например, полноразмерные моноклональные антитела, фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv, диатела, линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител и мультиспецифические антитела, полученные из фрагментов антител.
Изолированные полинуклеотиды могут включать комбинации вариабельных участков легкой и тяжелой цепей SEQ ID NO: 40/58, 42/60, 44/62, 46/64, 48/66, 50/68, 52/70, 54/72, 56/74, 118/182, 120/184, 122/186, 124/188, 126/190, 128/192, 130/194, 132/196, 134/198, 136/200, 138/202, 140/204, 142/206, 144/208, 146/210, 148/212, 150/214, 152/216, 154/218, 156/220, 158/222, 160/224, 162/226, 164/228, 166/230, 168/232, 170/236, 172/237, 172/239, 174/241, 176/243, 178/245 или 180/247.
Они также могут содержать последовательности, которые кодируют антитело или фрагмент антитела, имеющего аминокислотную последовательность в соответствии с любой из SEQ ID NO: 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 или 97. Типичные полинуклеотидные последовательности, которые кодируют такие аминокислотные последовательности, представляют собой SEQ ID NO: 234, 392, 393 и 394. Изолированные полинуклеотиды включают последовательности, которые кодируют вариабельный участок тяжелой цепи антитела или фрагмента антитела, которые имеют аминокислотную последовательность в соответствии с любой из SEQ ID NO: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114 или 115. Типичные полинуклеотидные последовательности, которые кодируют такие аминокислотные последовательности, представляют собой SEQ ID NO: 395, 396 и 397.
Изолированный полинуклеотид может включать вариабельный участок легкой цепи, который представляет собой SEQ ID NO: 234, и вариабельный участок тяжелой цепи, который представляет собой SEQ ID NO: 396, вариабельный участок легкой цепи, который представляет собой SEQ ID NO: 393, и вариабельный участок тяжелой цепи, который представляет собой SEQ ID NO: 396, вариабельный участок легкой цепи, который представляет собой SEQ ID NO: 395, и вариабельный участок тяжелой цепи, который представляет собой SEQ ID NO: 397, или вариабельный участок легкой цепи, который представляет собой SEQ ID NO: 394, и вариабельный участок тяжелой, который представляет собой SEQ ID NO: 398.
Полинуклеотид(ы), который(е) включает(ют) последовательность, кодирующую гуманизированное анти-BAFF антитело или его фрагмент или цепь, можно сливать с одной или более регуляторной или контрольной последовательностью, известной в данной области техники, и можно помещать в подходящие экспрессирующие векторы или клетки-хозяева, известные в данной области техники. Каждую из полинуклеотидных молекул, кодирующих вариабельные участки тяжелой или легкой цепей, можно независимо сливать с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей константный участок, такой как человеческий константный участок, что позволяет осуществлять продукцию интактных антител. Альтернативно, полинуклеотиды или их участки можно сливать вместе с обеспечением матрицы для получения одноцепочечного антитела.
Для рекомбинантного получения полинуклеотид, кодирующий антитело, встраивают в вектор, способный к репликации, с последующим клонированием (амплификацией ДНК) или экспрессией. Доступны многочисленные подходящие векторы для экспрессии рекомбинантного антитела. Компоненты век
- 46 033604 торов, как правило, включают, но не ограничиваются такими, один или более следующих компонентов: сигнальная последовательность, точка начала репликации, один или более генов-маркеров, энхансер, промотор и последовательность терминации транскрипции.
Гуманизированные анти-BAFF антитела можно также получить в виде гибридных полипептидов, в которых антитело слито с гетерологичным полипептидом, таким как сигнальная последовательность, или другим полипептидом, обладающим специфическим сайтом расщепления на аминотерминальном конце зрелого белка или полипептида. Выбранная гетерологичная сигнальная последовательность, как правило, распознается и процессируется (т.е. расщепляется сигнальной пептидазой) клеткой-хозяином. Для прокариотических клеток-хозяев, которые не распознают и не процессируют сигнальную последовательность гуманизированного анти-BAFF антитела, сигнальную последовательность можно заменить на прокариотическую сигнальную последовательность. Сигнальная последовательность может представлять собой, например, щелочную фосфатазу, пенициллиназу, липопротеин, лидерные последовательности устойчивого к нагреванию энтеротоксина II и тому подобное. Для секреции у дрожжей природная сигнальная последовательность может быть заменена, например, на лидерную последовательность, полученную из дрожжевого α-фактора инвертазы (включая лидерные последовательности α-фактора Saccharomyces и Kluyveromyces), лидерные последовательности кислой фосфатазы, глюкоамилазы
С. albicans или сигнальную последовательность, описанную в WO 09/13646. В клетках млекопитающих можно использовать сигнальные последовательности млекопитающих, а также вирусные секреторные лидерные последовательности, например сигнал gD вируса простого герпеса. ДНК для такого участка лигируют в рамке считывания с ДНК, кодирующей гуманизированное анти-BAFF антитело.
Экспрессионный и клонирующий векторы содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает репликацию вектора в одной или более клетках-хозяевах. Как правило, в клонирующих векторах данная последовательность способствует репликации вектора независимо от хромосомной ДНК хозяина, и включает точки начала репликации или автономно реплицирующиеся последовательности. Такие последовательности хорошо известны для различных бактерий, дрожжей и вирусов. Точка начала репликации из плазмиды pBR322 подходит для большинства грамотрицательных бактерий, точка начала репликации плазмиды 2-υ пригодна для дрожжей, а различные вирусные точки начала репликации (SV40, полиомы, аденовируса, VSV или BPV) пригодны для клонирующих векторов в клетках млекопитающих. Обычно точка начала репликации не является необходимой для экспрессионных векторов млекопитающих (как правило, можно использовать точку начала репликации SV40 только потому, что она включает ранний промотор).
Экспрессионные и клонирующий векторы могут содержать ген, который кодирует селективный маркер, для того, чтобы способствовать идентификации экспрессии. Обычные гены селективного маркера кодируют белки, которые а) придают резистентность к антибиотикам или другим токсинам, например, ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, b) дополняют ауксотрофную недостаточность или с) поставляют важные питательные вещества, отсутствующие в сложных средах, например ген, кодирующий рацемазу D-аланина для Bacilli.
Для отбора используется препарат для остановки роста клетки-хозяина. Данные клетки, которые с успехом трансформируются гетерологичным геном, продуцируют белок, придающий резистентность к препарату, и, таким образом, выживают в этой схеме отбора. В примерах такой доминантной селекции используются препараты неомицина, микофенольной кислоты и гигромицина.
Традиционными селективными маркерами для клеток млекопитающих являются те, с помощью которых можно идентифицировать клетки, компетентные для приема нуклеиновой кислоты, кодирующей гуманизированное анти-BAFF антитело, такие как DHFR (дигидрофолатредуктаза), тимидинкиназа, металлотионеин-I и -II (такие как гены металлотионеина приматов), аденозиндезаминаза, орнитиндекарбоксилаза и т.д. Клетки, трансформированные с помощью DHFR селективного гена, сначала идентифицируют при культивировании всех трансформантов в культуральной среде, содержащей метотрексат (Mtx), конкурентный антагонист DHFR. Подходящей клеткой-хозяином в случае, когда применяется DHFR дикого типа, является линия клеток яичника китайского хомячка (СНО) с недостаточной активностью DHFR (например, DG44).
Альтернативно, можно отбирать клетки-хозяева (в частности, хозяева дикого типа, которые содержат эндогенную DHFR), трансформированные или совместно трансформированные с помощью ДНКпоследовательностей, кодирующих гуманизированное анти-BAFF антитело, белка DHFR дикого типа и других селективных маркеров, таких как аминогликозид-3'-фосфотрансфераза (АРН), при культивировании клеток в среде, содержащей селективный агент для селективного маркера, такой как антибиотик аминогликозидного ряда, например канамицин, неомицин или G418 (см., например, патент США № 4965199).
Если рекомбинантную продукцию осуществляют в дрожжевых клетках в качестве клеток-хозяев, то ген TRP1 присутствует в дрожжевой плазмиде YRp7 (Stinchcomb и др., Nature, 282:39 (1979)). Ген TRP1 обеспечивает селективный маркер для мутантного штамма дрожжей с отсутствием способности расти в среде при наличии триптофана, например АТСС № 44076 или РЕР4-1 (Jones, 1977, Genetics, 1977, 85:12).
- 47 033604
Присутствие участка TRP 1 в геноме дрожжевой клетки-хозяина, таким образом, обеспечивает эффективную среду для определения трансформации в процессе культивирования при отсутствии триптофана. Аналогично, штаммы дрожжей, дефектные по Leu2, такие как АТСС 20622 или 38626, дополняются известными плазмидами, имеющими ген LEU2.
Кроме того, векторы, полученные из 1,6 мкм кольцевой плазмиды pKD1, можно использовать для трансформации дрожжей Kluyveromyces. Альтернативно, имеются сообщения об экспрессионной системе для получения рекомбинантного бычьего химозина на основе K. lactis в промышленном масштабе (Van den Berg, 1990, Bio/Technology, 8:135). Также раскрыты стабильные мультикопийные экспрессионные векторы для секреции зрелого человеческого сывороточного альбумина промышленными штаммами Kluyveromyces (Fleer и др., 1991, Bio/Technology, 9:968-975).
Экспрессионные и клонирующие векторы, как правило, содержат промотор, который распознается организмом-хозяином и является функционально связанным с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей анти-BAFF антитело или его полипептид. Подходящие промоторы для применения с прокариотическими хозяевами включают промотор phoA, промоторные системы β-лактамазы и лактозы, щелочной фосфатазы, триптофановую (trp) промоторную систему и гибридные промоторы, такие как tacпромотор. Другие известные бактериальные промоторы также являются приемлемыми. Промоторы для применения в бактериальных системах будут содержать последовательность Шайна-Дальгарно (S.D.), функционально связанную с ДНК, кодирующей анти-BAFF антитело.
Известны многочисленные промоторные последовательности эукариот. Фактически все гены эукариот содержат обогащенный AT участок, расположенный примерно на 25-30 оснований слева от сайта начала транскрипция. Другой последовательностью, обнаруженной на 70-90 оснований слева от начала транскрипции многих генов, является область CNCAAT, где N может быть любым нуклеотидом. На 3'-конце большинства генов эукариот находится последовательность ААТААА, которая может быть сигнальной для добавления поли-А-хвоста к 3'-концу кодирующей последовательности. Все эти последовательности соответственно встраивают в эукариотические экспрессионные векторы.
Примеры подходящих промоторных последовательностей для применения в случае применения клеток дрожжей в качестве хозяев включают промоторы для 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, таких как энолаза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфатизомераза, 3 -фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, триозефосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа.
Индуцибельные промоторы обладают дополнительным преимуществом транскрипции, которая контролируется условиями роста. Они включают промоторные участки алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, ферментов, связанных с метаболизмом азота, металлотионеина, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы. Подходящие векторы и промоторы для применения при экспрессии в дрожжах дополнительно описаны в ЕР73657. Дрожжевые энхансеры также преимущественно используются с дрожжевыми промоторами.
Транскрипция гуманизированного анти-BAFF антитела из векторов в клетках-хозяевах млекопитающих регулируется, например, с помощью промоторов, полученных из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вирус птичьей оспы, аденовирус (такой как аденовирус 2), вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус птичьей саркомы, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита В и наиболее предпочтительно обезьяний вирус 40 (SV40), гетерологичными промоторами млекопитающих, например промотором актина или промотором иммуноглобулина, а также промоторами белков теплового шока при условии, что такие промоторы совместимы с системами клеток-хозяев.
Ранние и поздние промоторы вируса SV40 соответствующим образом получают в виде фрагмента рестрикции SV40, который содержит точку начала репликации вируса SV40. Немедленно-ранний промотор цитомегаловируса человека соответственно получают из фрагмента рестрикции HindIII E. Система для экспрессии ДНК в клетках млекопитающих в качестве хозяев при использовании вируса папилломы крупного рогатого скота в качестве вектора раскрывается в патенте США № 4419446. Модификация данной системы раскрыта в патенте США № 4601978; см. также Reyes и др., 1982, Nature, 297:598-601, которые описывают экспрессию кДНК человеческого β-интерферона в мышиных клетках под контролем промотора тимидинкиназы вируса простого герпеса. Альтернативно, длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса можно использовать в качестве промотора.
Другой полезный элемент, который может использоваться в рекомбинантном экспрессионном векторе, представляет собой энхансерную последовательность, которая используется для повышения транскрипции ДНК, кодирующей гуманизированное анти-BAFF антитело, раскрытое в данном описании, у высших эукариот. В настоящее время известно много энхансерных последовательностей генов млекопитающих (глобина, эластазы, альбумина, α-фетопротеина и инсулина). Однако, как правило, используют энхансер вируса эукариотических клеток. Примеры включают энхансер SV40 на поздней стороне точки начала репликации (100-270 п.н.), энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на поздней стороне точки начала репликации и энхансеры аденовируса. В Yaniv, 1982, Nature 297:17-18 описаны энхансерные элементы для активации промоторов эукариотов. Энхансер может быть сплайси
- 48 033604 рован в вектор в положении 5' или 3' по отношению к кодирующей последовательности гуманизированного анти-BAFF антитела, но предпочтительно он располагается в 5'-сайте от промотора.
Экспрессионные векторы, которые используются в эукариотических клетках-хозяевах (дрожжей, грибов, насекомых, растений, животных, человека или ядерных клетках других многоклеточных организмов), также могут содержать последовательности, необходимые для терминации транскрипции и для стабилизации мРНК. Обычно такие последовательности размещаются с 5'-конца, в некоторых случаях с 3'-конца, нетранслируемых участков эукариотических или вирусных ДНК или кДНК. Данные участки содержат нуклеотидные сегменты, транскрибируемые в виде полиаденилированных фрагментов в нетранслируемом участке мРНК, кодирующей анти-BAFF антитело. Один полезный компонент терминации транскрипции представляет собой участок полиаденилирования бычьего гормона роста. См. WO 94/11026 и экспрессионный вектор, раскрытый в данном документе. Гуманизированные анти-BAFF антитела можно экспрессировать при использовании системы CHEF (см., например, патент США № 5888809, раскрытие которого включено в данное описание в качестве ссылки).
Приемлемые клетки-хозяева для клонирования или экспрессии ДНК в векторах, описанных в данном изобретении, представляют собой прокариотические, дрожжевые или высшие эукариотические клетки, описанные выше. Приемлемые прокариоты для этой цели включают эубактерии, такие как грамотрицательные или грамположительные микроорганизмы, например Enterobacteriaceae, такие как Escherichia, например Е. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, например Salmonella typhimurium, Serratia, например Serratia marcescans и Shigella, а также Bacilli, такие как В. subtilis и В. licheniformis (например, В. licheniformis 41Р, раскрытый в DD 266710, опубликованном 12 апреля 1989 г.), Pseudomonas, такие как P. aeruginosa, и Streptomyces. Одним предпочтительным хозяином из Е. coli для клонирования является Е. coli 294 (АТСС 31 446), хотя приемлемыми являются также другие штаммы, такие как Е. coli В, Е. coli X1776 (АТСС 31537) и Е. coli W3110 (АТСС 27325). В дополнении к прокариотам, эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, подходят в качестве хозяев для клонирования или экспрессии кодирующих гуманизированное антиBAFF антитело векторов. Saccharomyces cerevisiae или обычные пекарские дрожжи представляют собой наиболее часто используемые хозяева среди низших эукариотических микроорганизмов-хозяев. Однако существует и пригодны ряд других родов, видов и штаммов, таких как Schizosaccharomyces pombe; хозяева на основе Kluyveromyces, например, такие как K. lactis, K. fragilis (АТСС 12424), K. bulgaricus (АТСС 16045), K. wickeramii (АТСС 24178), K. waltii (АТСС 56500), K. drosophilarum (АТСС 36906), K. thermotolerans и K. marxianus; Yarrowia (ЕР 402226); Pichia pastoris (EP 183070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, такие как Schwanniomyces occidentalis, и нитчатые грибы, такие как, например, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium и Aspergillus, такие как A. nidulans и A. niger.
Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированного гуманизированного анти-BAFF антитела получают из многоклеточных организмов. Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых, в том числе, например, многочисленные штаммы и варианты бакуловирусов, и соответствующие пермиссивные клетки-хозяева из насекомых таких хозяев, как Spodoptera frugiperda (бабочка-совка), Aedes aegypti (комары), Aedes melanogaster (комары), Drosophila melanogaster (дрозофила) и Bombyx mori (тутовый шелкопряд). Широко известны различные вирусные штаммы для трансфекции, например, вариант L-1 Autographa californica NPV и штамм Bm-5 Bombyx mori NPV, и такие вирусы могут использовать в данном изобретении, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.
Также можно использовать культуры растительных клеток хлопчатника, кукурузы, картофеля, сои, петуньи, томатов и табака в качестве хозяев.
В другом аспекте экспрессию гуманизированного анти-BAFF антитела осуществляют в клетках позвоночных. Размножение клеток позвоночных в культуре (культуре ткани) стало обычной процедурой, и соответствующие методы являются широко доступными. Примеры пригодных линий клеток-хозяев млекопитающих представляют собой линию клеток почек обезьяны, трансформированную с помощью SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); линию человеческих эмбриональных клеток почки (293 или клетки 293, субклонированные для культивирования в суспензионной культуре, Graham и др., 1977, J. Gen. Virol., 36:59); клетки почек молодых хомячков (BHK, ATCC CCL 10); клетки яичников китайских хомяков/DHFR (СНО, Urlaub и др., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, например, DG44); мышиные клетки Сертоли (ТМ4, Mather, 1980, Biol Reprod., 23:243-251); клетки почек обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почек африканской зеленой мартышки (VERO-76, ATCC CRL-1587); клетки карциномы шейки матки человека (HELA, ATCC CCL2); клетки почек собаки MDCK, АТСС CCL 34); клетки печени крысы (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клетки легких человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, НВ 8065); клетки опухоли молочной железы мышей (ММТ 060562, ATCC CCL51); клетки TRI (Mather и др., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68); клетки MRC 5; клетки FS4 и линия клеток человеческой гепатомы (Hep G2).
Клетки-хозяева трансформируют при использовании вышеописанных экспрессионных или клонирующих векторов для получения гуманизированного анти-BAFF антитела и культивируют в обычных питательных средах, модифицированных соответствующим образом для индукции промоторов, отбора
- 49 033604 трансформантов или амплификации генов, кодирующих желаемые последовательности.
Клетки-хозяева, используемые для продукции гуманизированного анти-BAFF антитела, описанного в данном документе, можно культивировать в различных средах. Подходящими для культивирования клеток-хозяев являются различные промышленно доступные среды, такие как среда Ham's F10 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, МО), минимальная эссенциальная среда (MEM) (Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Co.) и среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко (DMEM) (SigmaAldrich Co.). Кроме того, можно использовать любую среду, описанную, например, Ham и др., 1979, Meth. Enz. 58:44; Barnes и др., 1980, Anal. Biohem., 102:255; в патентах США № 4767704; 4657866; 4927762; 4560655; 5122469; WO 90/103430 и WO 87/00195, в качестве культуральной среды для клетокхозяев. Любая из указанных сред может быть дополнена, если это является необходимым, гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), солями (такими как хлорид натрия, кальций, магний и фосфат), буферами (такими как HEPES), нуклеотидами (такими как аденозин или тимидин), антибиотиками (такими как гентамицин), микроэлементами (определяются как неорганические соединения, которые обычно присутствуют в конечных концентрациях на микромолярном уровне), и глюкозой или равноценным источником энергии. Можно также включить другие добавки в подходящих концентрациях, которые известны специалистам в данной области техники. Условия культивирования, такие как температура, рН и т.п., ранее использовались для клетокхозяев, выбранных для экспрессии, и они очевидны специалистам в данной области техники.
При использовании рекомбинантных методик антитело можно получить внутриклеточно, в периплазматическом пространстве или непосредственно секретировать в среду. Если антитело продуцируется внутри клетки, то в качестве первой стадии клетки могут быть разрушены для высвобождения белка. Дебрис из частичек либо клетки-хозяина, либо лизированных фрагментов удаляют, например, путем центрифугирования или ультрафильтрования. Carter и др., 1992, Bio/Technology, 10:163-167 описывают методику выделения антител, которые секретируются в периплазматическое пространство Е. coli. Вкратце, клеточную массу размораживают в присутствии ацетата натрия (рН 3,5), ЭДТА и фенилметилсульфонилфторида (PMSF) в течение примерно 30 мин. Клеточный дебрис может быть удален путем центрифугирования. Когда антитело секретируется в среду, то супернатанты из таких экспрессионных систем обычно вначале концентрируют при использовании промышленно доступного фильтра для концентрирования белка, например, блок для ультрафильтрования Amicon или Millipore Pellicon. Можно вносить ингибитор протеазы, такой как PMSF, на любой из описанных выше стадий для ингибирования протеолиза, а также можно добавить антибиотики для предотвращения роста случайных контаминантов. Можно использовать различные способы для выделения антитела из клетки-хозяина.
Композицию антитела, полученную из клеток, можно очистить при использовании, например, хроматографии на гидроксилапатите, гель-электрофореза, диализа и аффинной хроматографии, при этом аффинная хроматография является типичным методом очистки. Применимость протеина А в качестве аффинного лиганда зависит от вида и изотипа Fc-домена любого иммуноглобулина, который присутствует в антителе. Протеин А можно использовать для очистки антител на основе человеческих тяжелых цепей гамма 1, гамма 2 или гамма 4 (см., например, Lindmark и др., 1983, J. Immunol. Meth., 62:1-13). Протеин G рекомендуется использовать для всех мышиных изотипов и для человеческого гамма 3 (см., например, Guss и др., 1986, EMBO J., 5:1567-1575). Матрикс, с которым связан аффинный лиганд, наиболее часто представляет собой агарозу, но другие матриксы также являются доступными. Можно использовать механически стабильные матриксы, такие как стекло с контролируемыми порами или поли(стиролдивинил)бензол для обеспечения более быстрой скорости потока и уменьшения времени обработки по сравнению с теми же показателями при использовании агарозы. В тех случаях, когда антитело содержит домен CH3, пригодной для очистки является смола Bakerbond ABX™ (J.T. Baker, Phillisburg, NY). Существуют также другие методики для очистки белка, такие как фракционирование на колонке с ионно-обменной смолой, осаждение этанолом, ВЭЖХ с обратной фазой, хроматография на силикагеле, хроматография на гепарин-Сефарозе™, хроматография на анион- или катионобменной смоле (такая как на колонке с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, SDS-ПАГЭ и осаждение сульфатом аммония, в зависимости от антитела, которое выделяют.
После проведения любой предварительной(ых) стадии(й) очистки смесь, содержащую антитело, которое представляет интерес, и примеси можно подвергать гидрофобной хроматографии в условиях с низким значением рН при использовании буфера для элюирования при значении рН в пределах примерно от 2,5 до 4,5, которую, как правило, осуществляют при низких концентрациях солей (например, приблизительно 0-0,25 М соли).
Нуклеиновые кислоты могут гибридизоваться в условиях низкой, средней и высокой жесткости, как определено в данном описании, с целой или участком (например, участком, кодирующим вариабельную область) нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 17 или комплементарной к ней последовательностью или SEQ ID NO: 20 или комплементарной к ней последовательностью. Гибридизующийся участок нуклеиновой кислоты, которую подвергают гибридизации, как правило, имеет длину по меньшей мере 15 (например, 20, 25, 30 или 50) нуклеотидов. Гибридизующийся участок нуклеино
- 50 033604 вой кислоты, которую подвергают гибридизации, по меньшей мере на 80%, например, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентичен последовательности участка или всей нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид анти-BAFF антитела (например, вариабельному участку тяжелой цепи или легкой цепи), или ее комплементарной последовательности. Нуклеиновые кислоты, которые подвергаются гибридизации, описанного в данном документе типа можно использовать, например, в виде зонда для клонирования, праймера, например праймера для ПЦР, или диагностического зонда.
Некоторые изолированные полинуклеотиды содержат последовательности, которые кодируют антитело или фрагмент антитела, имеющий аминокислотную последовательность любой из 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114 или 115 и, таким образом, являются по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичными полинуклеотидной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 234, 393, 394, 395, 396, 397 или 398.
Как используется в данном описании, термины идентичные или процент идентичности в отношении двух или более нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей относится к двум или более последовательностям или субпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент нуклеотидов или аминокислотных остатков, которые являются одинаковыми, при сравнении и выравнивании на максимальное соответствие. Для определения процента идентичности последовательности выравнивают в целях оптимального сравнения (например, можно вводить гэпы в последовательности первой аминокислотной или нуклеиново-кислотной последовательности для оптимального выравнивания со второй аминокислотной последовательностью или последовательностью нуклеиновой кислоты). Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих аминокислотных положениях или нуклеотидных положениях. В том случае, если положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, молекулы являются идентичными по данному положению. Процент идентичности между двумя последовательностями представляет собой функцию количества идентичных положений в двух последовательностях (т.е. % идентичности = # идентичных положений/общее # количество положений (например, перекрывающихся положений) х 100). Иногда две последовательности, которые сравнивают между собой, имеют одинаковую длину после введения гэпов в последовательности, там, где это является приемлемым (например, исключая дополнительную последовательность, выходящую за пределы последовательностей, которые подвергают сравнению). Например, когда сравнивают последовательности вариабельных участков, то не учитывают лидерные последовательности и/или последовательности константных участков. Для сравнения последовательностей между двумя последовательностями соответствующий CDR относится к CDR в том же положении в обеих последовательностях (например, CDR-H1 в каждой последовательности).
Определение процента идентичности или процента гомологии между двумя последовательностями можно осуществлять при использовании математического алгоритма. Предпочтительным, но не ограничивающим примером математического алгоритма, применяемого для сравнения двух последовательностей, является алгоритм Karlin и Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268 в модификации Karlin и Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877. Такой алгоритм включают в программы NBLAST и XBLAST Altschul и др., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410. Поиск нуклеотидов BLAST можно осуществлять при использовании программы NBLAST, баллы = 100, длина слов = 12 с получением нуклеотидных последовательностей, гомологичных нуклеиновой кислоте, кодирующей интересующий белок. Поиск белков BLAST можно осуществить при использовании программы XBLAST, баллы = 50, длина слов = 3 с получением аминокислотных последовательностей, гомологичных белку, который представляет интерес. Для получения сопоставлений с гэпами в целях сравнения можно использовать программу Gapped BLAST, описанную Altschul и др., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Альтернативно, можно использовать PSI-BLAST для осуществления повторного поиска, с помощью которого можно определять дальние связи между молекулами (тот же источник). При использовании программ BLAST, Gapped BLAST и PSI-BLAST можно применить параметры по умолчанию для соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). Другим предпочтительным, но не ограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, является алгоритм Myers и Miller, CABIOS (1989). Такой алгоритм включают в программу ALIGN (версия 2.0), которая является частью программного обеспечения по сопоставлению последовательностей GCG. При использовании программы ALIGN для сравнения аминокислотных последовательностей можно использовать таблицу веса остатков РАМ120, пенальти за длину гэпа 12 и пенальти за гэп 4. В данной области техники известны дополнительные алгоритмы для анализа последовательностей, и они включают ADVANCE и ADAM, описанные Torellis и Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5; а также FASTA, описанную Pearson и Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-8. В программе FASTA ktup представляет собой контрольную опцию, которая устанавливает чувствительность и скорость поиска. Если ktup = 2, то аналогичные области в двух последовательностях, которые сравниваются, устанавливают путем поиска пар сопоставляемых остатков; если ktup = 1, то исследуются единичные сопоставляемые аминокислоты. Зна
- 51 033604 чение ktup можно установить на уровне 2 или 1 для белковых последовательностей или от 1 до 6 для последовательностей ДНК. Значение по умолчанию, если не указано ktup, составляет 2 для белков и 6 для ДНК. Альтернативно, сопоставление белковых последовательностей можно осуществлять при использовании алгоритма CLUSTAL W, как описано Higgins и др., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402.
Нетерапевтическое применение.
Антитела, описанные в данном документе, пригодны в качестве агентов для аффинной очистки. В данном способе антитела иммобилизуют на твердой фазе, такой как смола на основе протеина А, при использовании методов, хорошо известных в данной области техники. Иммобилизованное антитело подвергают взаимодействию с зондом, содержащим белок BAFF (или его фрагмент), для очистки и затем подложку промывают приемлемым растворителем, который будет удалять в основном все вещества в образце, за исключением BAFF белка, который связан с иммобилизованным антителом. В завершение, подложку промывают другим приемлемым растворителем, который будет высвобождать BAFF белок из антитела.
Анти-BAFF антитела, например гуманизированные анти-BAFF антитела, также полезны в диагностических анализах для определения и/или количественной оценки белка BAFF, например определения экспрессии BAFF в специфических клетках, тканях или сыворотке. Анти-BAFF антитела могут использоваться с диагностической целью, например для мониторинга развития или прогрессирования заболевания как часть процедуры клинического исследования, например, для определения эффективности данного способа лечения и/или режима предотвращения. Определение может быть улучшено путем слияния анти-BAFF антитела с веществом, способным к определению. Примеры способных к определению веществ включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, биолюминесцентные материалы, радиоактивные материалы, излучающие позитроны металлы при использовании различных способов позитронно-эмиссионной томографии и ионов нерадиоактивных парамагнитных металлов. В патенте США № 4741900 описано применение ионов металлов, которые могут быть конъюгированы с антителами для применения в способах диагностики.
Анти-BAFF антитела могут использоваться для диагностики расстройства, ассоциированного с BAFF (например, расстройства, которое характеризуется патологической экспрессией BAFF) или для определения, имеет ли субъект повышенный риск развития расстройства, ассоциированного с BAFF. Такие способы включают контакт биологического образца, полученного от субъекта, с антителом к BAFF и определение связывания антитела с BAFF. Под биологическим образцом понимают любой биологический образец, полученный от индивидуума, линии клеток, тканевой культуры или другого источника клеток, который потенциально экспрессирует BAFF. Способы получения биопсии тканей и жидкостей организма от млекопитающих хорошо известны в области техники.
В некоторых воплощениях способ может дополнительно включать сравнение уровня BAFF в образце пациента с контрольным образцом (например, образцом, полученным от субъекта, который не имеет расстройства, ассоциированного с BAFF) для определения, имеет ли пациент расстройство, ассоциированное с BAFF, или риск развития расстройства, ассоциированного с BAFF.
Предпочтительно, например, для диагностических целей метить антитело с помощью детектируемой группы. Многочисленны детектируемые метки доступны, включая радиоизотопы, флуоресцентные метки, метки ферментного субстрата и т.п. Метка может быть опосредованно конъюгирована с антителом при использовании различных известных методов. Например, антитело может быть конъюгировано с биотином, и любая из трех широких категорий меток, упомянутых выше, может быть конъюгирована с авидином, или наоборот. Биотин селективно связывается с авидином, и, таким образом, метка может быть конъюгирована с антителом таким опосредованным образом. В качестве альтернативы для достижения опосредованной конъюгации метки с антителом антитело может быть конъюгировано с небольшим гаптеном (например, дигоксином) и одну из различных типов меток, указанных выше, конъюгируют с антителом к гаптену (например, антителом к дигоксину). Таким образом, может быть достигнута опосредованная конъюгация метки с антителом.
14 125 3 131
Типичные радиоизотопные метки включают S, С, I, H и I. Антитело можно пометить радиоизотопом при использовании методов, описанных, например, в Current Protocols in Immunology, тома 1 и 2, 1991, Coligen и др., Wiley-Interscience, New York, Pubs. Радиоактивность можно определять при использовании сцинтилляционного счетчика.
Типичные флуоресцентные метки включают метки, которые получены из хелатов редкоземельных металлов (хелаты европия) или флуоресцеина и его производных, родамина и его производных, дансила, лиссамина, фикоэритрина и техасского красного. Флуоресцентные метки можно конъюгировать с антителом при использовании известных методов, например, таких, которые раскрыты в Current Protocols in Immunology, как указано выше. Флуоресценцию можно определять при использовании флуориметра.
В этой области техники существуют разнообразные хорошо описанные фермент-субстратные метки (см., например, патент США № 4275149), где приводится обзор по некоторым из них. Фермент, как правило, катализирует химическое изменение хромогенного субстрата, которое можно определить при использовании различных методик. Например, фермент может катализировать изменение цвета субстрата, которое можно определить спектрофотометрически. Альтернативно, фермент может изменить флуорес
- 52 033604 ценцию или хемилюминесценцию субстрата. Методики для количественного определения изменения флуоресценции описаны выше. Хемилюминесцентный субстрат становится электронно-возбужденным в результате химической реакции и затем может испускать свет, который можно определить, например, при использовании хемилюминометра, или может передавать энергию акцептору флуоресценции.
Примеры ферментных меток включают люциферазы, такие как люцифераза светлячков и бактериальная люцифераза (патент США № 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, малатдегидрогеназу, уреазу, пероксидазу, такую как пероксидаза хрена (HRPO), щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, сахаридоксидазы (такие как глюкозооксидаза, галактозооксидаза и глюкоза-6фосфатдегидрогеназа), оксидазы гетероциклических соединений (такие как уриказа и ксантиноксидаза), лактопероксидазу, микропероксидазу и т.п. Методы конъюгирования ферментов с антителами описаны, например, у O'Sullivan и др., 1981, Methods for Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, в Methods in Enzym. (J. Langone и Н. Van Vunakis, ред.), Academic Press, N.Y., 73:147-166.
Примеры комбинаций фермент-субстрат, например, включают пероксидазу хрена (HRPO) с перекисью водорода в качестве субстрата, где пероксидаза окисляет предшественник краски, такой как ортофенилендиамин (OPD) или 3,3',5,5'-тетраметилбензидин гидрохлорид (ТМВ); щелочную фосфатазу (АР) с паранитрофенилфосфатом в качестве хромогенного субстрата и вЮ-галактозидазу (β-D-Gal) с хромогенным субстратом, таким как п-нитрофенил-вЮ-галактозидаза, или флюорогенным субстратом, таким как 4-метиллюмбеллиферил-вЮ-галактозидаза.
Специалистам в данной области техники известны многочисленные другие комбинации ферментсубстрат. Общий обзор по ним см. в патентах США № 4275149 и 4318980.
В другом варианте реализации гуманизированное анти-BAFF антитело используется немеченным и определяется с помощью меченого антитела, которое связывает гуманизированное анти-BAFF антитело.
Антитела можно использовать в любом известном тесте, таком как тесты конкурентного связывания, прямой и непрямой сэндвич-анализ и тесты иммунопреципитации(см., например, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, стр. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).
Антитело к BAFF или его антигенсвязывающий фрагмент могут использоваться для ингибирования связывания BAFF с одним из рецепторов BAFF. Такие способы включают введение анти-BAFF антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в клетку (например, клетку млекопитающего) или клеточное окружение, посредством чего ингибируется передача сигнала, опосредованная рецептором BAFF. Эти способы могут осуществляться in vitro или in vivo. Под клеточным окружением понимают ткань, среду, внеклеточный матрикс, который окружает клетку. Антитело к BAFF или его антигенсвязывающий фрагмент вводятся в клеточное окружение клетки таким образом, что антитело или фрагмент способен к связыванию с молекулами BAFF за пределами и в клеточном окружении, предотвращая, таким образом, связывание BAFF с его рецептором.
Диагностические наборы.
Антитело к BAFF может быть использовано в диагностическом наборе, т.е. упакованной комбинации реагентов, находящихся в заранее определенных количествах, с инструкциями по постановке диагностического анализа. В тех случаях, когда антитело метят ферментом, набор может включать субстраты и кофакторы, необходимые для фермента, такие как предшественник субстрата, который обеспечивает детектируемый хромофор или флуорофор. Кроме того, можно включать другие добавки, такие как стабилизаторы, буферы (например, блокирующий буфер или буфер для лизиса) и т.п. Относительные количества различных реагентов могут варьировать в широких пределах для обеспечения концентраций реагентов в растворе, которые существенно оптимизирует чувствительность теста. Реагенты могут находиться в виде сухих порошков, обычно в виде лиофилизованных порошков, включая наполнители, которые при растворении будут обеспечивать раствор реагента с соответствующей концентрацией.
Терапевтическое применение.
Гуманизированное анти-BAFF антитело, раскрытое в данном описании, пригодно для лечения различных нарушений, ассоциированных с экспрессией BAFF, как описано в данном документе. Способы лечения расстройства, ассоциированного с BAFF, включают введение терапевтически эффективного количества гуманизированного анти-BAFF антитела субъекту, который в этом нуждается.
Гуманизированное анти-BAFF антитело или агент можно вводить любыми подходящими способами, включая парентеральный, подкожный, внутрибрюшинный, ингаляционный и интраназальный, и, если желательно для местной иммуносупрессорной обработки, можно также вводить в область поражения (в том числе путем перфузии или иного контакта трансплантата с антителом перед трансплантацией). Гуманизированное анти-BAFF антитело или агент можно вводить, например, в виде инфузии или болюса. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, интраперитонеальное или подкожное введение. Кроме того, гуманизированное анти-BAFF антитело приемлемо для пульсирующей инфузии, в частности, со снижением доз антитела. Введение осуществляют с помощью инъекций, наиболее предпочтительно внутривенной или подкожной инъекций, частично в зависимости от того, является ли введение кратковременным или длительным.
- 53 033604
Для профилактики или лечения заболевания соответствующая дозировка антитела будет зависеть от различных факторов, таких как тип заболевания, которое подвергается лечению, как определено выше, тяжести и течения заболевания, от того, вводят ли антитело для профилактических или терапевтических целей, предшествующего лечения, анамнеза у пациента и ответной реакции на антитело и с учетом мнения лечащего врача. Антитело соответственно вводят пациенту однократно или несколько раз.
В зависимости от типа и тяжести заболевания доза в пределах примерно от 1 до 20 мкг/кг (например, 0,1-15 мг/кг) антитела представляют собой начальную возможную дозу для введения пациенту, например в виде одного или более отдельных введений, или продолжительной инфузии. Типичная суточная доза может находиться в пределах примерно от 1 до 100 мг/кг в зависимости от факторов, указанных выше. При повторных введениях в течение нескольких дней или более, в зависимости от состояния, лечение продолжают до желаемого подавления симптомов заболевания. Однако пригодны и другие схемы введения. Результативность данного способа лечения легко подвергается мониторингу при использовании обычных методов и тестов. Примерная схема введения раскрыта в WO 94/04188.
Термин супрессия используется в том же контексте, что и улучшение и облегчение для понимания ослабления одной или более характеристик заболевания.
Композицию антитела рецептируют, дозируют и вводят согласно обычной медицинской практике. Учитываемые факторы в данном контексте включают конкретное расстройство, которое подвергается лечению, конкретного млекопитающего, которое подвергается лечению, клиническое состояние отдельного пациента, течение заболевания, место доставки средства, способ введения, схемы введения и другие факторы, известные практикующим врачам. Термин терапевтически эффективное количество антитела, которое вводится, будет регулироваться такими факторами, и оно представляет собой минимальное количество, необходимое для профилактики, ослабления или лечения расстройства, связанного с экспрессией BAFF.
Антитело может не быть, но необязательно, рецептировано с одним или несколькими агентами, используемыми в настоящее время для предотвращения или лечения рассматриваемого расстройства. Эффективное количество таких других агентов зависит от количества гуманизированного анти-BAFF антитела, присутствующего в композиции, типа расстройства или лечения и других факторов, указанных выше. Такие агенты, как правило, используются в тех же дозах при использовании тех же путей введения, как использовалось ранее, или приблизительно от 1 до 99% от используемых до настоящего времени дозировок.
Расстройства, ассоциированные с BAFF.
Анти-BAFF антитела или агенты могут быть использованы для лечения или профилактики иммунологических нарушений, характеризующихся патологической экспрессией BAFF. Анти-BAFF антитела или их антигенсвязывающие фрагменты также находят свое применение в лечении или профилактике респираторных расстройств, нарушений обмена веществ, например сахарного диабета, и некоторых видов рака. Лечение или профилактика иммунологического расстройства, респираторного расстройства, нарушения обмена веществ или рака в соответствии с описанными способами достигается путем введения субъекту, нуждающемуся в таком лечении или профилактике, эффективного количества анти-BAFF антитела или агента, в результате чего антитело снижает активность болезненного состояния, ассоциированного с BAFF.
Иммунологические заболевания, которые характеризуются неприемлемой активацией иммунных клеток и которые могут подвергаться лечению или предотвращаться с помощью способов, описанных в данном документе, могут быть классифицированы, например, по типу(ам) реакции(й) гиперчувствительности, лежащих в основе расстройства. Эти реакции, как правило, подразделяются на четыре типа: анафилактические реакции, цитотоксические (цитолитические) реакции, комплексные иммунные реакции или реакции опосредованного клетками иммунитета (CMI) (также упоминаются как реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) (см., например, Fundamental Immunology, William E. Paul ред., Raven Press, N.Y., 3-е изд. 1993). Иммунологические заболевания включают воспалительные заболевания и аутоиммунные заболевания.
Конкретные примеры таких иммунологических заболеваний включают следующие: ревматоидный артрит, аутоиммунные демиелинизирующие заболевания (например, рассеянный склероз, аллергический энцефаломиелит), эндокринные офтальмопатии, увеоретинит, системную эритематозную волчанку, миастению, болезнь Грейвса, гломерулонефрит, аутоиммунное гепатологическое расстройство, воспалительное заболевание кишечника (например, болезнь Крона или язвенный колит), анафилактический шок, аллергические реакции, синдром Шегрена, сахарный диабет типа I, первичный билиарный цирроз, гранулематоз Вегенера, фибромиалгии, полимиозит, дерматомиозит, воспалительный миозит, множественную эндокринную недостаточность, синдром Шмидта, аутоиммунный увеит, болезнь Аддисона, воспаление надпочечников, тиреоидит, тиреоидит Хашимото, аутоиммунное заболевание щитовидной железы, пернициозную анемию, атрофию желудка, хронический гепатит, волчаночный гепатит, атеросклероз, подострую кожную красную волчанку, гипопаратиреоз, синдром Дресслера, аутоиммунную тромбоцитопению, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, гемолитическую анемию, пузырчатку обыкновенную, пузырчатку, герпетиформный дерматит, алопецию Арката, пемфигоид, склеродермию, про
- 54 033604 грессирующий системный склероз, синдром CREST (кальциноз, синдром Рейно, дискинезию пищевода, склеродактилию и телеангиэктазию), мужское и женское аутоиммунное бесплодие, анкилозирующий спондилит, язвенный колит, смешанное заболевание соединительной ткани, нодозный полиартериит, системный некротизирующий васкулит, атопический дерматит, атопический ринит, синдром Гудпасчера, болезнь Чагаса, саркоидоз, ревматизм, астму, рецидивирующий аборт, антифосфолипидный синдром, экзогенный аллергический альвеолит, полиморфную эритему, посткардиотомический синдром, синдром Кушинга, аутоиммунный хронический активный гепатит, легочную аллергию птицеводов, токсический эпидермальный некролиз, синдром Альпорта, альвеолит, аллергический альвеолит, фиброзирующий альвеолит, интерстициальную болезнь легких, эритему, гангренозную пиодермию, реакцию на переливание крови, артериит Такаясу, ревматическую полимиалгию, височный артериит, шистосомоз, гигантоклеточный артериит, аскаридоз, аспергиллез, синдром Самптера, экзему, лимфоматозный гранулематоз, болезнь Бехчета, синдром Каплана, болезнь Кавасаки, лихорадку денге, энцефаломиелит, эндокардит, эндомиокардиальный фиброз, эндофтальмит, эритему, псориаз, псориатический артрит, эритробластоз плода, эозинофильный фациит, синдром Шульмана, синдром Фелти, филяриоз, циклит, хронический циклит, гетерохронный циклит, циклит Фукса, IgA нефропатию, пурпуру Геноха, заболевание трансплантат против хозяина, васкулит, ассоциированный с антинейтрофильными цитоплазматическими антителами (ANCA), отторжение трансплантата, кардиомиопатию, синдром Итона-Ламберта, рецидивирующий полихондрит, криоглобулинемию, макроглобулемию Вальденстрема, синдром Эванса, острый респираторный дистресс-синдром, воспаление легких, остеопороз, гиперчувствительность замедленного типа и аутоиммунную недостаточность половой железы.
В другом аспекте анти-BAFF антитела и агенты, как описывается в данном документе, также являются полезными для лечения различных видов рака, при которых BAFF экспрессируется на патологическом уровне.
Виды рака, экспрессирующие BAFF, которые могут подвергаться лечению с помощью описанных способов включают, например, лейкемию, такую как острый лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, острый миелолейкоз (например, миелобластный, промиелоцитарный, миеломоноцитарный, моноцитарный лейкоз или эритролейкоз), хронический лейкоз, хронический миелоцитарный (гранулоцитарный) лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, болезнь Ослера; лимфому (например, болезнь Ходжкина или неходжкинскую болезнь); множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема; болезнь тяжелой цепи; солидные опухоли, такие как саркомы и карциномы (например, фибросаркома, миксосаркома, липосаркома, хондросаркома, остеогенная саркома, остеосаркома, хордома, ангиосаркома, эндотелиосаркома, лимфангиосаркома, лимфангиоэндотелиосаркома синовиома, мезотелиома, опухоль Юинга, леймиосаркома, рабдомиосаркома, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичников, рак предстательной железы, плоскоклеточный рак, базально-клеточный рак, аденокарцинома, карцинома потовых желез, карцинома сальных желез, папиллярная карцинома, папиллярная аденокарцинома, цистаденокарцинома, медуллярный рак, бронхогенный рак, почечноклеточный рак, гепатома, карцинома желчного протока, хориокарцинома, семинома, эмбриональная карцинома, опухоль Вильмса, рак шейки матки, рак матки, опухоль яичка, рак легких, мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, рак мочевого пузыря, эпителиальная карцинома, глиома, астроцитома, медуллобластома, краниофарингиома, эпендимома, пинеалома, гемангиобластома, невринома слухового нерва, олигодендроглиома, менангиома, меланома, нейробластома, ретинобластома, карцинома носоглотки или рак пищевода).
Фармацевтические композиции и их введение.
Композицию, содержащую агент, который связывает BAFF (например, анти-BAFF антитело), можно вводить субъекту, имеющему иммунологическое заболевание, или респираторное заболевание, или рак или риск развития такового. Агент, связывающий BAFF (например, анти-BAFF антитела), можно применять в производстве лекарственного средства для профилактики или лечения рака, респираторного заболевания или иммунологического заболевания. Термин субъект, как используется в данном описании, означает любого пациента-млекопитающего, которому можно вводить агент, связывающий BAFF, включая, например, людей и млекопитающих, отличных от человека, таких как приматы, грызуны и собаки. Антитела или агенты можно вводить отдельно или в комбинации с другими композициями для профилактики или лечения иммунологического расстройства, респираторного расстройства или рака. Такие композиции, которые могут быть введены в комбинации с антителами или агентами, включают метотрексат (МТХ) и иммуномодуляторы, например антитела или малые молекулы.
Примеры антител для применения в таких фармацевтических композициях представляют собой те, которые включают гуманизированное антитело или фрагмент антитела, содержащий аминокислотную последовательность вариабельного участка легкой цепи любой из последовательностей SEQ ID NO: 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 или 97. Примеры антител для применения в таких фармацевтических композициях представляют собой те, которые включают гуманизированное антитело или фрагмент антитела, содержащий аминокислотную последовательность вариабельного участка тяжелой цепи любой из последовательностей SEQ ID NO: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114 или 115.
- 55 033604
Известны различные системы доставки, и их можно использовать для введения агента, который связывает BAFF. Способы введения включают, но не ограничиваются такими, внутрикожный, внутримышечный, внутриперитонеальный, внутривенный, подкожный, интраназальный, эпидуральный и пероральный пути. Связывающий BAFF агент можно вводить, например, путем инфузии, в виде болюса или инъекции, а также можно вводить вместе с другими биологически активными агентами, такими как химиотерапевтические агенты. Введение может быть системным или местным. Композиции для таких инъекций могут быть приготовлены, например, в виде предварительно наполненных шприцев, которые могут вводиться один раз в две недели.
Композиции связывающего BAFF агента водятся путем инъекции, с помощью катетера, при использовании суппозитория или с помощью имплантата, где имплантат является пористым, непористым или гелеобразным материалом, включающим мембрану, такую как силиконовая мембрана или волокно. Как правило, при введении композиции используют вещества, которые не абсорбируют анти-BAFF антитело или агент.
Анти-BAFF антитело или агент можно вводить с помощью системы с контролируемым высвобождением, также можно использовать насос (см., например, Langer, 1990, Science, 249:1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald и др., 1980, Surgery, 88:507; Saudek и др., 1989, N. Engl. J. Med., 321:574)., полимерные материалы (см., например, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise ред., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball ред., Wiley, New York, 1984; Ranger и Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; см. также Levy и др., 1985, Science, 228:190; During и др., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard и др., 1989, J. Neurosurg. 81:105). Другие контролируемые системы высвобождения обсуждаются, например, у Langer, как описано выше.
Связывающий BAFF агент (например, анти-BAFF антитело) может вводиться в виде фармацевтических композиций, содержащих терапевтически эффективное количество связывающего агента и один или более фармацевтически совместимых ингредиентов. Обычно фармацевтические композиции для введения путем инъекции представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. В случае необходимости фармацевтическая композиция может также включать солюбилизирующий агент и местный анестетик, такой как лидокаин, для ослабления боли в месте введения. Как правило, ингредиенты используются либо по отдельности, либо смешиваются вместе в форме единичной дозы, например, в виде сухого лиофилизованного порошка или не содержащего воду концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества активного вещества. В тех случаях, когда фармацевтический препарат предназначен для введения путем инфузии, его можно разлить по флаконам для инфузий, содержащим стерильную воду или физиологический раствор фармацевтической степени чистоты. В тех случаях, когда фармацевтический препарат вводят с помощью инъекции, можно обеспечить ампулу со стерильной водой для инъекций или физиологическим раствором таким образом, чтобы ингредиенты смешивались перед введением.
Кроме того, фармацевтическую композицию можно включить в фармацевтический набор, включающий (а) контейнер, содержащий агент, который связывает BAFF (например, анти-BAFF антитело) в лиофилизованной форме, и (b) второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый растворитель (например, стерильную воду) для инъекций. Фармацевтически приемлемый растворитель можно использовать для восстановления или разведения лиофилизованного анти-BAFF антитела или агента. Необязательно, такой(ие) контейнер(ы) может(могут) содержать примечания в форме, утвержденной официальным агентством, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, где в примечании отражается разрешение агентства на производство, применение или продажу для введения людям.
Количество связывающего BAFF агента (например, анти-BAFF антитела), которое является эффективным для лечения или профилактики иммунологического расстройства или рака, может быть определено при использовании обычных клинических методов. Кроме того, необязательно можно использовать анализы в условиях in vitro, результаты которых могут помочь в установлении пределов оптимальных доз. Точная дозировка для применения в композиции также будет зависеть от пути введения и стадии развития иммунологического расстройства или рака, и она будет определяться с учетом мнения лечащего врача и обстоятельств, присущих каждому пациенту. Эффективные дозы могут быть экстраполированы из кривых зависимости доза-эффект, полученных по результатам опытов в условиях in vitro или на модельных тест-системах на животных.
Как правило, доза анти-BAFF антитела или связывающего BAFF агента, вводимая пациенту с иммунологическим расстройством или раком, обычно составляет примерно от 0,1 до примерно 100 мг/кг массы тела субъекта. Доза, вводимая субъекту, составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 1 до приблизительно 15 мг/кг или от приблизительно 1 до приблизительно 10 мг/кг массы тела субъекта.
Типичные дозы включают, но не ограничиваются такими, как от 1 нг/кг до 100 мг/кг. Иногда доза может составлять приблизительно 0,5 мг/кг, приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 2 мг/кг, приблизи
- 56 033604 тельно 3 мг/кг, приблизительно 4 мг/кг, приблизительно 5 мг/кг, приблизительно 6 мг/кг, приблизительно 7 мг/кг, приблизительно 8 мг/кг, приблизительно 9 мг/кг, приблизительно 10 мг/кг, приблизительно 11 мг/кг, приблизительно 12 мг/кг, приблизительно 13 мг/кг, приблизительно 14 мг/кг, приблизительно мг/кг или приблизительно 16 мг/кг. Дозу можно вводить, например, каждый день, раз в неделю (каж- дую неделю), два раза в неделю, три раза в неделю, четыре раза в неделю, пять раз в неделю, шесть раз в неделю, раз в две недели или месяц. Доза может составлять приблизительно 0,5 мг/кг/неделю, приблизительно 1 мг/кг/неделю, приблизительно 2 мг/кг/неделю, приблизительно 3 мг/кг/неделю, приблизительно 4 мг/кг/неделю, приблизительно 5 мг/кг/неделю, приблизительно 6 мг/кг/неделю, приблизительно мг/кг/неделю, приблизительно 8 мг/кг/неделю, приблизительно 9 мг/кг/неделю, приблизительно мг/кг/неделю, приблизительно 11 мг/кг/неделю, приблизительно 12 мг/кг/неделю, приблизительно мг/кг/неделю, приблизительно 14 мг/кг/неделю, приблизительно 15 мг/кг/неделю или приблизительно мг/кг/неделю. В некоторых вариантах осуществления пределы доз находятся приблизительно от 1 до приблизительно 15 мг/кг/неделю.
Фармацевтические композиции, содержащие агент, который связывает BAFF, могут дополнительно включать терапевтический агент, конъюгированный или неконъюгированный со связывающим агентом. Анти-BAFF антитело или агент, который связывает BAFF, можно вводить совместно с одним или более терапевтическими препаратами, применяемыми для лечения или профилактики иммунологических расстройств или рака. Такое комбинированное введение может иметь аддитивный или синергетический эффект в отношении параметров заболевания (например, тяжести проявления симптома, количества симптомов или частоты рецидивов).
В отношении схем лечения при комбинированном введении, анти-BAFF антитело или агент, который связывает BAFF, вводят совместно с терапевтическим препаратом Терапевтический агент можно вводить до или после введения анти-BAFF антитела или агента, который связывает BAFF, по крайней мере в течение от 1 ч до нескольких месяцев, например по меньшей мере в течение 1, 5, 12 ч, суток, неделей, месяца или трех месяцев до или после введения анти-BAFF антитела или агента, который связывает BAFF.
Изделия промышленного изготовления.
Изделие промышленного изготовления включает контейнер и этикетку. Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, флаконы, шприцы и пробирки. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, которая эффективна для лечения состояния, и может иметь отверстие для стерильного доступа. Например, контейнер может представлять собой пакет или флакон для внутривенного введения, имеющий запирающее устройство с инъекционной иглой для подкожного введения. Активное вещество в композиции представляет собой гуманизированное анти-BAFF антитело. На этикетке контейнера или на этикетке, ассоциированной с ним, указывается, что композиция используется для лечения выбранного состояния. Изделия промышленного изготовления могут дополнительно включать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Он может дополнительно включать другие вещества, присутствие которых желательно с коммерческой и потребительской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши в упаковку с инструкциями по применению.
Изобретение дополнительно описывается в приведенных ниже примерах, которые не предназначены для ограничения объема изобретения.
Примеры
Пример 1. Получение мышиных антител.
Исходные мышиные антитела в соответствии с настоящим изобретением были получены из гибридом мыши. Различные линии мышей иммунизировали несколько раз в течение периода до 6 месяцев. Иммунизацию мышей проводили при использовании приемлемых методов, известных в данной области техники. Например, для получения специфического иммунного ответа были использованы различные варианты рекомбинантного растворимого человеческого белка BAFF (аминокислоты 72-285), в том числе слитые белки человеческого BAFF для антигенных вакцинаций. Кроме того, некоторых мышей иммунизировали при использовании клеточной линии мышей, трансфицированной для экспрессии человеческого BAFF на поверхности клеток. Получение иммуногенных антигенов, включение адъювантов и способы иммунизации могут также осуществляться при использовании приемлемых методов, известных в данной области техники. Титры связывания сыворотки соответствовали требованиям, и лимфоциты мыши сливали при использовании различных способов, известных в области техники. Скрининг гибридом проводили с получением специфических антител с высокой аффинностью.
Пример 2. Получение Fab гуманизированных антител к BAFF.
Мышиные исходные антитела 13J018 и 235F5 превращали в химерное антитело, которое состоит из мышиных вариабельных доменов 1А4 и 5В9 соответственно и человеческого константного домена IgG1KO. Мышиные антитела 1А4 и 5В9 представлены в табл. 3 и 4, приведенных выше. IgG1KO (knock out/нокаут) имеет две мутации путем замены (Leu234Ala и Leu235Ala), которые устраняют ADCC и CDC активность путем снижения эффекторных функций, таких как FcyR, и связывание комплемента. Вариа
- 57 033604 бельные домены мышиного и химерного антител являются идентичными. Химерные антитела получают для подтверждения функции антитела и для обеспечения подтверждения получения правильной последовательности. Если были идентифицированы правильные последовательности, то мышиные вариабельные домены использовали для получения химерного Fab, в котором мышиные остатки Vk и Vh находились в рамке с человеческими Ck и Ch1 остатками соответственно. Эти химерные Fab использовали в качестве маркерных молекул для скрининга гуманизированных Fab в процессе проведения скрининга. После этого мышиные вариабельные участки (Vk и Vh) подвергали гуманизации при использовании процесса конструирования и скрининга. Получали библиотеку, где человеческие и мышиные остатки подвергали вариации таким образом, что в любом данном положении мог находиться либо мышиный, либо человеческий остаток. Такую библиотеку получали для аминокислот, которые различаются между человеческим эмбриональным и мышиным антителом. Отбирали только те клоны, которые сохраняли функцию исходного мышиного антитела при использовании химерного Fab. Репрезентативные гуманизированные вариабельные участки для антител 1А4 (13 J018) и 5В9 (235F5) представлены в табл. 5 и 6.
Пример 3. Получение рекомбинантного растворимого тримерного белка человеческого BAFF.
Человеческий BAFF (72-285) с N-терминальной гистидиновой меткой (SEQ ID: 398) подвергали транзиентной экспрессии в HEK293-6Е клетках с помощью трансфекции на основе липидов. Через 96 ч после трансфекции осаждали клетки и экспрессию белка в супернатанте поверяли с помощью анти 6xHis вестерн-блоттинга (6xHis раскрывается как SEQ ID NO: 407). Очистку супернатантов завершали при использовании аффинной хроматографии на основе Ni-сефарозы. Очищенный His-BAFF отщепляли при использовании меченной His фуринпротеазы для получения С-терминального фрагмента (аминокислоты 134-285 последовательности SEQ ID: 399). Для удаления фрагмента и выщепления видов N-терминального фрагмента из образца образец общего белка пропускали через Ni/NTA капельную колонку и собирали продукт, прошедший через колонку. Человеческий BAFF с отщепленным фурином очищали с помощью гель-фильтрационной хроматографии. Тримерное состояние подтверждали с помощью анализа на основе аналитического центрифугирования.
Последовательность для меченного His человеческого BAFF (72-285): HHHHHHENLYFQGLQGDLASLRAELQGHHAEKLPAGAGAPKAGLEEAPAVT AGLKIFEPPAPGEGNSSQNSRNKRAVQGPEETVTQDCLQLIADSETPTIQKGSYTFV PWLLSFKRGSALEEKENKILVKETGYFFIYGQVLYTDKTYAMGHLIQRKKVHVFGD ELSLVTLFRCIQNMPETLPNNSCYSAGIAKLEEGDELQLAIPRENAQISLDGDVTFFG ALKLL (SEQ ID NO: 399)
Последовательность для человеческого BAFF с отщепленным фурином (134-285):
AVQGPEETVTQDCLQLIADSETPTIQKGSYTFVPWLLSFKRGSALEEKENKILV KETGYFFIYGVLYTDKTYAMGHLIQRKKVHVFGDELSLVTLFRCIQNMPETLPNNS CYSAGIAKLEEGDELQLAIPRENAQISLDGDVTFFGALKLL (SEQ ID NO: 400) Пример 4. Связывание и данные по аффинности для анти-BAFF антитела (относится к табл. 7 и 8). Видимые аффинности связывания оценивали с помощью поверхностного плазмонного резонанса, где антитела захватывали при различных поверхностных плотностях на поверхности белка A/G. Тримерный растворимый BAFF при различных концентрациях пропускали над захваченным антителом. Кинетические параметры получали из глобальной подгонки всех поверхностных плотностей при использовании 1:1 модели Ленгмюра, данные представлены в табл. 7 и 8. Клинические ссылки на антитела (Эталон 1, включающая SEQ ID NO: 98 и 116, и Эталон 2, включающая SEQ ID NO: 99 и 117), использовали для сравнения.
- 58 033604
Таблица 7
Функциональное ингибирование и определение аффинности анти-BAFF антител
Обозначение Растворимый тримерный человеческий BAFF (52 пМ) Нейтрализация Растворимый 60мерный человеческий BAFF (4,2 пМ) Нейтрализация mbBAFF Нейтрализация Кажущаяся аффинность
IC90 (пМ) п=2 IC90 (пМ) п=2 IC90 (пМ) п=1 KD (пМ)**
Эталон 1 290,0 21,0 1052 <10
Эталон 2 1000,0 93% @ 67 нМ 151000 22.2
206G9A10 35,1 0,2 ND* <10
227D5A7 56,8 0,8 ND <10
250Е5А11 97,5 0.3 ND <10
235F5B9 107,4 2,2 1050 <10
227D3B11 127,7 1.6 ND <10
217Н12А7 129,4 13,4 ND <10
210D9B8 155,6 14,0 ND <10
214G4B7 296,1 з,о ND <10
13J018-1A4 304,8 23,0 4650 <10
218Н1С10Д 370 41 ND ND
218Н1С10,2 370 ND ND ND
* ND: не определяли.
** На уровне границы определения.
- 59 033604
Таблица 8
Функциональное ингибирование и определение аффинности анти-BAFF антител
Обозначение Растворимый тримерный человеческий BAFF (50 пМ) Нейтрализация Растворимый 60мерный человеческий BAFF (4 пМ) Нейтрализация Эффективность нейтрализации mbBAFF
IC90 (рМ) IC50 (рМ) IC90 (рМ) IC50 (рМ) IC90 (рМ) IC50 (pM)
Эталон 1 290 102 40 1052 177
Эталон 2 1000 197985 38298 151000 2180
1002Е8А6 824 107 79 29 2087 141
1070А6В7 677 43 56 20 1065 147
1094С4Е6 1099 384 20925 4048 175030 2561
27I21-3C7 326 55 33 11 ND* ND
317Н2А6 327 97 13 4 ND ND
319В8А12 331 91 24 8 ND ND
320F9C5 3107 ПО 24 10 ND ND
323E9D1 312 148 23 6 ND ND
332С1В12 457 99 40 12 ND ND
344B9D9 352 102 32 11 ND ND
348А6С1 329 ПО 29 9 ND ND
352G11A10 444 99 90 21 ND ND
363D4A10 473 21 23 9 ND ND
381А6А9 240 44 42 17 ND ND
384D5A2 765 42 44 15 ND ND
394F5A5 433 16 29 7 ND ND
409F12A11 390 31 44 16 ND ND
418F6D9 491 38 154 27 ND ND
431G5A3 336 28 100 21 ND ND
435A6B3 294 23 26 10 ND ND
436Н2С12 408 27 37 15 ND ND
436Н6А9 266 26 27 10 ND ND
440E9D12 259 31 31 11 ND ND
441E6F2 293 43 37 16 ND ND
443С11А12 309 33 30 13 ND ND
444G1A10 284 25 35 12 ND ND
450А2А7 602 36 130 24 ND ND
456Н11В7 299 32 37 12 ND ND
537G7A6 329 28 39 13 ND ND
551H4D6 257 ПО 1979 234 ND ND
560Н2А7 324 35 30 13 ND ND
606H7F8 378 29 44 12 ND ND
* ND: не определяли.
Пример 5. Функциональное ингибирование антител к растворимому тримерному человеческому BAFF (ссылки в табл. 7 и 8 и фиг. 1).
Антитела оценивали на их способность нейтрализовать активацию растворимого тримерного BAFF человеческого рецептора BAFF (BAFFR). Определенную концентрацию тримерного BAFF (52 пМ) смешивали в аналитической среде с клетками СНО, которые экспрессируют рекомбинантный человеческий BAFFR и систему репортера люциферазы, и стимулировали в течение 24 ч в термостате при 37°C, 5% CO2 в присутствии варьирующих доз анти-BAFF антител. Экспрессию люциферазы оценивали в конце периода инкубации для количественного определения уровня достигнутой нейтрализации. Значения IC50 и IC90 определяли из графиков результатов ингибирования люциферазы при титровании антитела. Клинические эталонные антитела (Эталон 1 и Эталон 2) использовали для сравнения.
Пример 6. Получение рекомбинантного растворимого 60-мерного человеческого белка BAFF.
Стабильные клетки HEK293F, которые экспрессируют человеческий BAFF (134-285) с N-терминальной гистидиновой меткой (SEQ ID NO: 401), получали при использовании лентивируса на основе методик от Clontech (pLVX-IRES-ZsGreen). Линию лентивируса получали при использовании стандартных прописей от Clontech и клетки с высокой экспрессией обогащали путем отбора клеток, которые экспрессируют зеленый флуоресцентный белок. Клетки HEK293F, которые экспрессируют BAFF (134-285), инкубировали в течение 96 ч перед тем, как клетки осаждали, и проверяли экспрессию супернатанта при использовании анти 6xHis вестерн-блоттинга (6xHis раскрывается в SEQ ID NO: 407). Очистку супернатантов завершали при использовании аффинной хроматографии на основе Ni-сефарозы в качестве первого этапа. Аффинно очищенный BAFF (134-285) подвергали доочистке с помощью гель- 60 033604 фильтрационной хроматографии при использовании смолы Сефакрил S-400. 60-мерный BAFF элюировали в качестве основного пика, который отделяли как из более крупных агрегатов, так и из видов с меньшим молекулярным весом. Молекулярный вес 60-мерного BAFF подтверждали с помощью аналитического ультрацентрифугирования и системы определения на основе эксклюзионной хроматографии с детектированием рассеивания лазерного излучения с кратными углами.
Последовательность для His-HuBAFF (134-285): HHHHHHENLYFQGAVQGPEETVTQDCLQLIADSETPTIQKGSYTFVPWLLSFK RGSALEEKENKILVKETGYFFIYGVLYTDKTYAMGHLIQRKKVHVFGDELSLVTLF RCIQNMPETLPNNSCYSAGIAKLEEGDELQLAIPRENAQISLDGDVTFFGALKLL (SEQ ID NO: 401)
Пример 7. Функциональное ингибирование антител к растворимому 60-мерному человеческому BAFF (ссылки на табл. 7 и 8).
Антитела оценивали на их способность нейтрализовать активацию растворимого 60-мерного BAFF рецептора BAFF человека (BAFFR). Определенную концентрацию тримерного BAFF (4,2 пМ) смешивали в аналитической среде с клетками СНО, которые экспрессируют рекомбинантный человеческий BAFFR и систему репортера люциферазы, и стимулировали в течение 24 ч в термостате при 37°C, 5% CO2 в присутствии варьирующих доз анти-BAFF антител. Экспрессию люциферазы оценивали в конце периода инкубации для количественного определения уровня достигнутой нейтрализации. Значения IC50 и IC90 определяли из графиков результатов ингибирования люциферазы при титровании антитела. Клинические эталонные антитела (Эталон 1 и Эталон 2) использовали для сравнения.
Пример 8. Функциональное ингибирование антител к mbBAFF (ссылки на табл. 7 и 8 и фиг. 2).
Антитела оценивали на их способность нейтрализовать активацию человеческого связанного с мембраной BAFF (mbBAFF) рецептора BAFF человека (BAFFR). Вкратце, получали клетки яичника хомячка (СНО), которые сверхэкспрессируют последовательность рекомбинантного полноразмерного человеческого BAFF, в качестве источника ассоциированного с клеткой BAFF (mbBAFF). mbBAFF-CHO фиксировали на параформальдегиде при комнатной температуре в течение 1 ч при периодическом перемешивании. Фиксированные клетки промывали и ресуспендировали в полной среде для инкубации при 37°C и 5% CO2 в течение ночи. На следующий день фиксированные mbBAFF клетки смешивали в аналитической среде при соотношении 1:3 с клетками СНО, экспрессирующими рекомбинантный человеческий BAFFR и репортерную систему люциферазы, и стимулировали в течение 24 ч в термостате при 37°C, 5% CO2 в присутствии варьирующих доз анти-BAFF антител. Экспрессию люциферазы оценивали в конце периода инкубации для количественного определения уровня достигнутой нейтрализации. Значения IC50 и IC90 определяли из графиков результатов ингибирования люциферазы при титровании антитела. Клинические эталонные антитела (Эталон 1 и Эталон 2) использовали для сравнения.
BAFF может существовать в трех формах: связанной с мембраной (mbBAFF) форме, форме растворимого тримерного BAFF и растворимого 60-мерного BAFF. Относительная важность различных форм BAFF при нормальной физиологии и при физиологии заболевания не является хорошо понятной. В предыдущих исследованиях растворимый BAFF подвергали обработке как одну структуру (Manetta и др., Journal of Inflammation Research, 2014:7, 121-131). В настоящем изобретении белки растворимого тримерного и 60-мерого BAFF человека, а также человеческий mbBAFF получали непосредственно и подтверждали их полимерное состояние. В функциональных анализах новые анти-BAFF антитела, описанные в данном документе, продемонстрировали профили, которые отличаются от таких для двух эталонных антител (Эталон 1 и Эталон 2) в отношении их способности нейтрализовать активацию растворимого тримерного человеческого BAFF, растворимого 60-мерного человеческого BAFF и связанного с мембраной человеческого BAFF рецептора BAFF человека (BAFFR).
Пример 9. Картирование эпитопов антител.
Водород/дейтерий обменную масс-спектрометрию (HXMS) использовали для картирования эпитопов из IgG антител, включающих вариабельные участки мыши (табл. 1 и 2), связывания с BAFF человека (положения субпоследовательности аминокислот 134-285, лиганд фактора некроза опухоли суперсемейства 13b, растворимая форма). Этот способ определяется чувствительностью водородов амидного скелета BAFF к обмену с D2O. Эксперимент проводили при использовании BAFF, взятого отдельно, и BAFF с добавлением антител (с дейтерием). Таким образом, были идентифицированы участки последовательности BAFF, которые демонстрируют значительную защиту от обмена благодаря связыванию антител. Разрешение этого способа определяли путем переваривания при использовании пепсина. Эти пептиды, имеющие происхождение от BAFF, были идентифицированы с помощью дополнительных контрольных экспериментов при использовании образцов без обмена с применением стандартных точных масс и технологии ВЭЖХ МС/МС.
Использовали рекомбинантный человеческий BAFF (SEQ ID NO: 401). Для каждого образца белок + антитело эквимолярное количество BAFF (0,48 мг/мл) и антитела инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре. Использовали LEAP HDX-PAL систему для обработки всех образцов. При использовании LEAP автоматической системы (планшет для обмена выдерживали при 25°C, планшет для остановки реакции выдерживали при 4°С), 8 мкл образца прибавляли к 80 мкл обменного
- 61 033604 буфера (10 мМ NaH2PO4 в D2O, pH 7,4 или 10 мМ NaH2PO4 в H2O, рН 7,4), перемешивали и оставляли для обмена в течение различных периодов времени (60, 120 и 240 с). 80 мкл этого раствора потом переносили в 80 мкл буфера для остановки реакции (4 М гуанидин-HCl, 0,5 М ТСЕР-HCl), перемешивали и выдерживали при 4°C в течение 60 с. 60 мкл этого раствора потом вводили и пропускали через колонку с пепсином (2,1x30 мм, Applied Biosystems) и помещали на Michrom C18 картридж-ловушку. Картридж промывали с помощью H2O + 0,1% муравьиная кислота в течение 2 мин при скорости 100 мкл/мин. Затем переключали клапан и картридж элюировали на колонку Phenomenex Jupiter C5, 1,0x50 мм, 5 мкм, 300 А. Мобильная фаза А представляла собой смесь вода/ацетонитрил/муравьиная кислота (99/1/0,1), а мобильная фаза В представляла собой смесь ацетонитрил/вода/муравьиная кислота (95/5/0,1). Скорость истечения составляла 100 мкл/мин. Градиент: 0 мин (0% В), 6 мин (40% В), 7 мин (40% В), 8 мин (90% В), 10 мин (90% В), 11 мин (0% В). LEAP система предварительно охлаждала мобильную фазу до ~4°C. Масс-спектрометрию осуществляли на Thermo Orbitrap Velos (0900865). Для МС экспериментов (используемых для количественной замены на D2O буфер) использовали метод однократного сканирования от 300-2000 в течение 14 мин при разрешении 60000. Для МС/МС экспериментов (используется для ID пептидов с Н2О обменным буфером) использовали способ с 7 сканами в течение 14 мин. Первый скан представлял собой функционально полный скан от 300 до 2000 при разрешении 60000. Последующие сканы представляли собой CID сканы 6 наиболее интенсивных ионов из скана # 1. Ширина изоляции составляла 1,5 ед. ат. вес, энергия столкновений составляла 35 В, а время активации было 30 мс.
Данные МС/МС подвергали анализу при использовании программы Proteome Discoverer 1.3 (Thermo Scientific). Вкратце, программа использует точный молекулярный вес иона предшественника и данные фрагментации для ионов продукта для подбора участков последовательности белка. Из этого анализа идентифицировали пептиды, полученные при использовании пепсина. МС данные анализировали с помощью собственной программы BI-SHAFT. Вкратце, вводили перечень пепсиновых пептидов, а также состояние их заряда, время удержания и белковую последовательность. Потом программа осуществляла поиск на данные, которые соответствовали критерию точной массы, и подсчитывали средний молекулярный вес распределения изотопов. Данные проверяли для выявления ошибок и, в случае если возникали ошибки, осуществляли вычисления вручную с помощью Microsoft Excel, когда это было необходимым. Области защиты идентифицировали путем сравнения контрольных данных (только белок) с экспериментальными данными (белок с антителом). Участки защиты свидетельствовали о связывании.
Участки последовательности BAFF, которые демонстрируют значительную защиту от обмена благодаря связыванию антител (тяжелая/легкая цепи, включающие SEQ ID NO: 49/67, 57/75, 41/58, 43/61, 45/63, 47/65, 51/69 и 53/71), были идентифицированы как аминокислотные остатки от 17 до 31 (SEQ ID NO: 403), от 68 до 90 (SEQ ID NO: 404), от 126 до 137 (SEQ ID NO: 405) и от 137 до 145 (SEQ ID NO: 406).
Таблица 9
Картирование последовательности эпитопов
Наименование Аминокислотная последовательность
Рекомбинантный человеческий BAFF MAVQGPEETVTQDCLQLIADSETPTIQKGSYTFVPWLLSF KRGSALEEKENKIVKETGYFFIYGQVLYTDKTYAMGHLI QRKKVHVFGDELSLVTLFRCIQNMPETLPNNSCYSAGIAK LEEGDELQLAIPRENAQISLDGDVTFFGALKLL (SEQ ID NO: 402)
Аминокислотное положение 17-31* IADSETPTIQKGSYT (SEQ ID NO: 403)
Аминокислотное положение 68-90* YTDKTYAMGHLIQRKKVHVFGDE (SEQ ID NO: 404)
Аминокислотное положение 126-137* LQLAIPRENAQI (SEQ ID NO: 405)
Аминокислотное положение 137-145* ISLDGDVTF (SEQ ID NO: 406)
* Номер положения N-концевого метионина рекомбинантного человеческого BAFF не был учтен.

Claims (16)

1. Молекула анти-BAFF антитела, которая включает вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR1 SEQ ID NO: 5, CDR2 SEQ ID NO: 8 и CDR3 SEQ ID NO: 9; и вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR1 SEQ ID NO: 28, CDR2 SEQ ID NO: 29 и CDR3 SEQ ID NO: 30.
- 62 033604
2. Молекула анти-BAFF антитела, включающая вариабельный домен легкой цепи SEQ ID NO: 93 и вариабельный домен тяжелой цепи SEQ ID NO: 114.
3. Молекула анти-BAFF антитела по п.1, которая нейтрализует все три формы человеческого BAFF, включающие связанный с мембраной (mbBAFF), растворимый тримерный BAFF и растворимый 60-мерный BAFF.
4. Молекула анти-BAFF антитела по п.3, которая нейтрализует человеческий растворимый тримерный BAFF.
5. Молекула анти-BAFF антитела по п.3, которая нейтрализует человеческий связанный с мембраной BAFF.
6. Молекула анти-BAFF антитела по п.3, которая нейтрализует человеческий растворимый 60-мерный BAFF.
7. Молекула анти-BAFF антитела по п.1, которая включает:
a) гуманизированный вариабельный домен легкой цепи, содержащий CDR SEQ ID NO: 5, 8 и 9 и каркасные участки, имеющие аминокислотную последовательность, по крайней мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности каркасных участков вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 93; и
b) гуманизированный вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий CDR SEQ ID NO: 28, 29 и 30 и каркасные участки, имеющие аминокислотную последовательность, по крайней мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности каркасных участков вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 114.
8. Молекула анти-BAFF антитела по п.1, где антитело представляет собой моноклональное антитело.
9. Молекула анти-BAFF антитела по п.8, где моноклональное антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело.
10. Фармацевтическая композиция для лечения субъекта, который имеет ассоциированное с BAFF расстройство, включающая молекулу анти-BAFF антитела по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.
11. Способ лечения субъекта, который имеет ассоциированное с BAFF расстройство, включающий введение такому субъекту молекулы анти-BAFF антитела по п.1 или фармацевтической композиции, включающей молекулу анти-BAFF антитела по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.
12. Способ лечения воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, респираторного заболевания, метаболического расстройства или рака, включающий введение субъекту, который в этом нуждается, эффективного количества молекулы анти-BAFF антитела по п. 1 или фармацевтической композиции, включающей молекулу анти-BAFF антитела по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.
13. Способ по п.12, где заболевание представляет собой системную красную волчанку, волчаночный нефрит или ревматоидный артрит.
14. Способ ингибирования связывания BAFF с одним или более рецепторами BAFF на клетке млекопитающего, где BAFF рецептор представляет собой BAFF-R (BR3), TACI (трансмембранный активатор и партнер кальциевого модулятора и лиганда циклофилина) и/или ВСМА (антиген созревания В-клеток), включающий введение в клетку молекулы анти-BAFF антитела по п.1.
15. Изолированный полинуклеотид, включающий последовательность, кодирующую вариабельный участок легкой цепи с последовательностью SEQ ID NOS: 93 и вариабельный участок тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 114 антитела по пп.1-7.
16. Изолированный полинуклеотид по п.15, включающий последовательности SEQ ID NO: 394 и SEQ ID NO: 398.
EA201691541A 2014-01-31 2015-01-30 Молекула анти-baff антитела, фармацевтическая композиция, содержащая эту молекулу, способы ее применения и кодирующий ее изолированный полинуклеотид EA033604B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461934124P 2014-01-31 2014-01-31
PCT/US2015/013711 WO2016039801A1 (en) 2014-01-31 2015-01-30 Novel anti-baff antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201691541A1 EA201691541A1 (ru) 2016-12-30
EA033604B1 true EA033604B1 (ru) 2019-11-08

Family

ID=53754266

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201691541A EA033604B1 (ru) 2014-01-31 2015-01-30 Молекула анти-baff антитела, фармацевтическая композиция, содержащая эту молекулу, способы ее применения и кодирующий ее изолированный полинуклеотид

Country Status (14)

Country Link
US (3) US9840543B2 (ru)
EP (1) EP3099715B1 (ru)
JP (1) JP6511459B2 (ru)
KR (1) KR20160113715A (ru)
CN (1) CN105873949A (ru)
AU (1) AU2015315834B2 (ru)
BR (1) BR112016014731A2 (ru)
CA (1) CA2934965A1 (ru)
CL (1) CL2016001742A1 (ru)
EA (1) EA033604B1 (ru)
IL (2) IL246113B (ru)
MX (1) MX367661B (ru)
PH (1) PH12016501366A1 (ru)
WO (1) WO2016039801A1 (ru)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JOP20140087B1 (ar) 2013-03-13 2021-08-17 Amgen Inc بروتينات مخصصة ل baff و b7rp1 وإستخداماتها
US9458246B2 (en) 2013-03-13 2016-10-04 Amgen Inc. Proteins specific for BAFF and B7RP1
CN105873949A (zh) * 2014-01-31 2016-08-17 勃林格殷格翰国际有限公司 新的抗baff抗体
MY191081A (en) * 2015-07-23 2022-05-30 Boehringer Ingelheim Int Compound targetting il-23a and b-cell activating factor (baff) and uses thereof
US20170369551A1 (en) * 2016-06-24 2017-12-28 Anthera Pharmaceuticals, Inc. METHODS OF TREATING IgA NEPHROPATHY AND HENOCH-SCHONLEIN PURPURA NEPHRITIS USING A B-CELL ACTIVATING FACTOR (BAFF) INHIBITOR
JP2019533423A (ja) * 2016-07-06 2019-11-21 シャンハイ ファーマエクスプローラー カンパニー，リミティド ＢＬｙＳ抗体及びその製造方法と応用
US10869522B2 (en) 2016-11-04 2020-12-22 Totes Isotoner Corporation Footwear, and methods of preparing same
EP3735272A4 (en) * 2018-01-05 2021-09-22 Biograph 55, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMMUNO CANCEROTHERAPY
US11505610B2 (en) 2018-04-06 2022-11-22 Atyr Pharma, Inc. Compositions and methods comprising anti-NRP2 antibodies
EP4037711A4 (en) * 2019-10-03 2024-02-14 Atyr Pharma Inc COMPOSITIONS AND METHODS USING ANTI-NRP2 ANTIBODIES
AU2021238320A1 (en) * 2020-03-18 2022-09-22 Elanco Us Inc. Anti-IL4 receptor antibodies for veterinary use
CN113637073B (zh) * 2020-05-11 2024-04-12 上海赛比曼生物科技有限公司 Bcma抗体及其制备和应用
MX2023005234A (es) 2020-11-06 2023-05-18 Novartis Ag Terapia de combinacion de agente anti-cd19 y agente de direccionamiento a celulas b para el tratamiento de neoplasias malignas de celulas b.
CN112516303A (zh) * 2020-11-18 2021-03-19 华中科技大学同济医学院附属协和医院 Baff抗体在制备脓毒血症药物中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050070694A1 (en) * 2001-08-16 2005-03-31 Gelfanova Valentina Pavlovna Antagonistic anti-htnfsf13b human antibodies
US20150218267A1 (en) * 2014-01-31 2015-08-06 Boehringer Ingelheim International Gmbh Novel anti-baff antibodies

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
GB8705477D0 (en) 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
ATE135397T1 (de) 1988-09-23 1996-03-15 Cetus Oncology Corp Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
AU687755B2 (en) 1992-08-21 1998-03-05 Genentech Inc. Method for treating an LFA-1-mediated disorder
EP1005870B1 (en) 1992-11-13 2009-01-21 Biogen Idec Inc. Therapeutic application of chimeric antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US6812327B1 (en) * 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
US6037454A (en) 1996-11-27 2000-03-14 Genentech, Inc. Humanized anti-CD11a antibodies
US5888809A (en) 1997-05-01 1999-03-30 Icos Corporation Hamster EF-1α transcriptional regulatory DNA
DE60004635T2 (de) 1999-01-25 2004-06-09 Biogen, Inc., Cambridge Baff, dessen inhibitoren und dessen verwendung zur modulierung der b-zell-antwort
WO2002002641A1 (en) * 2000-06-16 2002-01-10 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to blys
WO2006025345A1 (ja) * 2004-08-31 2006-03-09 Kowa Company, Ltd. 抗ヒトｂａｆｆ抗体
US8853367B1 (en) 2004-09-15 2014-10-07 The Uab Research Foundation Compositions and methods for modulating rank activities
US7846662B2 (en) 2004-09-15 2010-12-07 Kowa Company, Ltd. Method of screening Baff suppressor or inhibitor
US20090215071A1 (en) * 2005-07-28 2009-08-27 Teresa Cachero Methods of targeting baff
WO2007047335A2 (en) 2005-10-13 2007-04-26 Biogen Idec Ma Inc. Methods for use with baff antagonists
TW200833711A (en) 2006-12-22 2008-08-16 Genentech Inc Antibodies to insulin-like growth factor receptor
GEP20146129B (en) 2008-07-17 2014-08-11 Novartis Ag Compositions and methods of therapeutic antibodies usage
WO2010126898A1 (en) * 2009-04-27 2010-11-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods for reducing the level of alloantibodies in a subject
WO2011031835A1 (en) 2009-09-09 2011-03-17 The Uab Research Foundation Chimeric dr5 polypeptides and uses thereof
WO2011053783A2 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Ax213 and ax132 pcsk9 antagonists and variants
EP2542588A1 (en) * 2010-03-05 2013-01-09 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies against human csf-1r and uses thereof
US8878001B2 (en) 2011-10-28 2014-11-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized IL-6 and IL-6 receptor
AR090626A1 (es) 2012-04-20 2014-11-26 Lilly Co Eli Anticuerpos anti-baff-anti-il-17 biespecificos
US9458246B2 (en) 2013-03-13 2016-10-04 Amgen Inc. Proteins specific for BAFF and B7RP1

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050070694A1 (en) * 2001-08-16 2005-03-31 Gelfanova Valentina Pavlovna Antagonistic anti-htnfsf13b human antibodies
US20150218267A1 (en) * 2014-01-31 2015-08-06 Boehringer Ingelheim International Gmbh Novel anti-baff antibodies

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HSU HAILING; KHARE SANJAY D; LEE FRANCES; MINER KENT; HU YI-LING; STOLINA MARINA; HAWKINS NESSA; CHEN QING; HO SHU-YIN JOANNE; MIN: "A novel modality of BAFF-specific inhibitor AMG623 peptibody reduces B-cell number and improves outcomes in murine models of autoimmune disease.", CLINICAL AND EXPERIMENTAL RHEUMATOLOGY., PACINI, PISA, IT, vol. 30, no. 2, 1 January 2012 (2012-01-01), IT, pages 197 - 201, XP009186073, ISSN: 0392-856X *
KRISTINE KIKLY, JOSEPH MANETTA, HOLLY BINA, PAUL RYAN, NILES FOX, DERRICK R. WITCHER: "Generation and characterization of tabalumab, a human monoclonal antibody that neutralizes both soluble and membrane-bound B-cell activating factor", JOURNAL OF INFLAMMATION RESEARCH, DOVE MEDICAL PRESS, 1 August 2014 (2014-08-01), pages 121, XP055174727, ISSN: 11787031, DOI: 10.2147/JIR.S67751 *
MACKAY FABIENNE; SCHNEIDER PASCAL: "Cracking the BAFF code", NATURE REVIEWS IMMUNOLOGY, NATURE PUB. GROUP, GB, vol. 9, no. 7, 1 July 2009 (2009-07-01), GB, pages 491 - 502, XP009154275, ISSN: 1474-1733, DOI: 10.1038/nri2572 *
WILLIAM STOHL, MERRILL JOAN T., LOONEY R. JOHN, BUYON JILL, WALLACE DANIEL J., WEISMAN MICHAEL H., GINZLER ELLEN M., COOKE BLAIRE,: "Treatment of systemic lupus erythematosus patients with the BAFF antagonist "peptibody" blisibimod (AMG 623/A-623): results from randomized, double-blind phase 1a and phase 1b trials", ARTHRITIS RESEARCH & THERAPY, vol. 6, no. 1, 1 August 2015 (2015-08-01), pages 5537, XP055213755, DOI: 10.1186/s13075-015-0741-z *
ZHENG LIU; ANNE DAVIDSON;: "BAFF inhibition: A new class of drugs for the treatment of autoimmunity", EXPERIMENTAL CELL RESEARCH, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 317, no. 9, 9 February 2011 (2011-02-09), AMSTERDAM, NL, pages 1270 - 1277, XP028205665, ISSN: 0014-4827, DOI: 10.1016/j.yexcr.2011.02.005 *

Also Published As

Publication number Publication date
US10377804B2 (en) 2019-08-13
BR112016014731A2 (pt) 2017-09-19
IL246113B (en) 2019-06-30
AU2015315834A1 (en) 2016-06-23
MX367661B (es) 2019-08-30
US20180127474A1 (en) 2018-05-10
US11370818B2 (en) 2022-06-28
EP3099715A1 (en) 2016-12-07
AU2015315834B2 (en) 2019-12-12
US20150218267A1 (en) 2015-08-06
EA201691541A1 (ru) 2016-12-30
US20190309034A1 (en) 2019-10-10
EP3099715B1 (en) 2020-11-18
IL266864A (en) 2019-07-31
PH12016501366A1 (en) 2016-08-15
CN105873949A (zh) 2016-08-17
WO2016039801A1 (en) 2016-03-17
US9840543B2 (en) 2017-12-12
JP2017505622A (ja) 2017-02-23
CL2016001742A1 (es) 2017-07-28
KR20160113715A (ko) 2016-09-30
JP6511459B2 (ja) 2019-05-15
IL246113A0 (en) 2016-07-31
CA2934965A1 (en) 2016-03-17
MX2016009877A (es) 2016-10-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2018236692C1 (en) Anti-IL-23 antibodies
US11370818B2 (en) Anti-BAFF antibodies
TWI631957B (zh) 抗－ｉｌ－２３抗體
EA031948B1 (ru) Антитело к il-36r или его антигенсвязывающий фрагмент, выделенный полинуклеотид, клетка-хозяин и способ получения этого антитела или его фрагмента, содержащая их фармацевтическая композиция и применение антитела или его фрагмента и композиции
EA040834B1 (ru) ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО К IL-23p19 ИЛИ ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ, ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ УКАЗАННОЕ АНТИТЕЛО
OA16388A (en) Anti-IL-23 antibodies.
EA042716B1 (ru) Фармацевтическая композиция, содержащая антитело к il-23р19, и ее применение

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU