CN101570753A - 仓鼠EF-1α转录调节DNA - Google Patents

Abstract

本发明涉及仓鼠EF－1α转录调节DNA。本发明进一步包括含本发明的调节DNA的表达结构，用所述调节DNA转化或转染的宿主细胞和利用所述调节DNA增强基因转录的方法。含可可操作地连接到特异基因序列的本发明调节DNA的表达结构亦被包括在内。

Description

仓鼠EF-1α转录调节DNA

本申请是申请日为1998年5月1日，申请号为98800913.7，发明名称为“仓鼠EF-1α转录调节DNA”的发明专利申请的分案申请。

发明背景

任何给定的真核基因的转录通过三种RNA聚合酶之一进行，其中的每一种对某些特定亚群的基因起作用。如果说通过RNA聚合酶I进行大核糖体RNAs的转录而通过RNA聚合酶III转录小核糖体RNA和tRNA，则编码蛋白质的DNA序列和大多数小的核RNA由RNA聚合酶II转录。对每种类型的基因来说，转录需要所述聚合酶与所述基因启动子序列的相互作用并形成稳定的转录起始复合物。一般说，所述三种聚合酶之任何一种的转录还需要一些结合因子与所述启动子序列相互作用并需要通过第二个因子识别所述结合的因子，由此使聚合酶与所述基因序列相互作用。如果说这种机制是RNA聚合酶I和III的转录的最低需要，则导致RNA聚合酶II转录的过程更为错综复杂。

据推测，由于通过RNA聚合酶II转录的基因序列的量很大和由于在相同细胞内以及不同细胞间这些基因的调节模式千差万别的事实，除了其他结合蛋白与启动子以外的调节DNA序列相互作用外，由RNA聚合酶II进行的转录还受起始复合物中许多转录因子的结合的影响。这些其他结合蛋白在一起可起激活高于基础水平转录或阻遏转录的作用。根据高等真核生物中基本转录通常很低的观察，阻遏物结合还可被认为是一种防止激活的方法。另一方面，激活通常是对某些生理信号的终末反应并且激活需要去除阻遏物结合蛋白或改变染色质结构以使形成活性转录起始复合物。

在转录复合物形成的核心(和基本水平的基因表达之先决条件)是被称为“TATA”盒的启动子序列，该序列位于聚合酶II转录起点的上游。所述TATA盒是命名为TFIID的遍在转录因子的结合部位，但如所提到的，大多数基因中的启动子序列的转录主要受另外的调节DNA序列的影响，所述序列可增强或阻遏基因转录。这种类型的DNA转录元件位于与基因中编码序列和与TATA盒有关的各种位置。这些另外的转录调节元件常以组织或细胞特异性方式发挥功能。

在重组蛋白质表达中，特别重要的是筛选调节DNA，它包括启动子TATA序列和与宿主细胞转录机制相容的其他调节元件。为此，一般优先选择对宿主细胞是内源的DNA。或者，由于病毒一般有宽宿主范围和已证明的病毒调节DNA在不同细胞型中活性，使用来自病毒基因组序列的调节DNA业已取得了显著成功。例如，众所周知的和常规利用的用于重组蛋白质表达的病毒调节DNA包括SV40早期基因启动子/增强子[Dijkema等，EMBO J.4：761(1985)]，Rous肉瘤病毒长末端重复DNA[Gorman等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)79：6777(1982b)]，牛乳头状瘤病毒片段[Sarver等，Mo.Cell.Biol.1：486(1981)]和人巨细胞病毒启动子/增强子元件[Boshart等，Cell 41：521(1985)]。尽管已经证明的病毒调节DNA在其中是有功能的细胞型的范围较宽，有可能存在非病毒启动子/增强子DNA元件，它们通过更有效的使用宿主细胞转录机制使特异性细胞系中重组蛋白质表达上升。

因此本领域存在一种鉴定同源和异源细胞型中有功能的启动子/增强子调节DNA序列的需要以增加重组蛋白质表达和提供高产率的所需要的蛋白质产物。其中特别重要的是需要鉴别可在哺乳动物细胞中被最有效利用的那类启动子/增强子调节DNA以增加重组蛋白质的体外产量，所述蛋白质以类似于体内蛋白质表达所产生的糖基化模式的方式被糖基化。以此方式表达并在治疗或预防上施用的蛋白质不大可能有抗原性而更可能具有生理活性。此类型的调节DNA序列还易于被插入宿主细胞以增强对宿主细胞是内源的基因之表达或增强通过本领域熟知并常规应用的技术被事先引入宿主细胞基因组的基因之表达。

发明概述

本发明涉及纯化和分离的多核苷酸，这些源于仓鼠细胞的多核苷酸调节基因转录。所述多核苷酸包括中国仓鼠卵巢延伸因子-1α(EF-1α)翻译区5’的调节DNA序列。本发明优选DNA被命名为CHEF1调节DNA并包括从SpeI限制酶识别位点延伸到所述EF-1α蛋白质起始甲硫氨酸(ATG)密码子的约3.7kb DNA。本发明还包括小于3.7kb的多核苷酸，小至所述较小片段能够增强由可操作地连接起来的基因的转录。通过本领域熟知的并被常规应用的缺失研究可容易鉴定被定义为能调节(即增强)基因转录的本发明DNA活性片段。本发明调节DNA包括天然来源分离到的多核苷酸，如细胞培养，以及由酶或纯化学合成法产生的多核苷酸。因此，在一个实施方案中，本发明提供从基因组库制备CHEF1 DNA。或者，通过酶促合成，应用例如聚合酶链反应(PCR)，或纯化学合成可构建所述DNA，其中单核苷酸被连续加入或重叠寡核苷酸被杂交并连接。最优选的实施方案的DNA序列在SEQ ID NO：1给出。本发明进一步包括在严谨条件下与SEQ ID NO：1中给出的DNA杂交的DNA序列。严谨条件包括在65℃在含约2X SSC和约0.1％SDS的缓冲液或相当条件下清洗。

本发明进一步包括含CHEF1调节多核苷酸的质粒DNA。本发明的质粒还可包括编码通过可操作地连接到CHEF1多核苷酸序列的目的蛋白质或目的RNA产物的DNA序列.本发明进一步包括用本发明多核苷酸或质粒转化，转染和或电穿孔的细胞.本发明质粒DNA可被整合进入所述宿主细胞的基因组中或可以闭合环状质粒的形式存在于所述细胞中.本发明优选的质粒特别易于插入需要的DNA序列，包括质粒pDEF14和pDEF2。用pDEF14和pDEF2转化的细菌宿主细胞由12301 ParklawnDrive，Rockville，Maryland 20852的典型培养物保藏中心分别在1997年4月9日，和1997年3月4日储存并分别命名为登录号98398和98343.

本发明还包括含CHEF1多核苷酸的线性载体DNA。本发明的载体可从病毒来源获得或可体外合成。本发明进一步包括用所述线性载体序列转染或电穿孔处理的宿主细胞。该类型DNA对表达可操作地连接到CHEF1 DNA序列的异源基因序列或对定点同源重组特别有用，其中CHEF1序列可被插入到宿主细胞的基因组，以调制被可操作地连接的序列之表达.

本发明进一步提供嵌合重组子DNA分子，其中CHEF1 DNA被可操作地连接到(即启动基因转录)编码需要蛋白质产物的基因序列。嵌合分子一般是那些含野生型环境中通常没有发现是结合的功能区分子；在本发明中，嵌合DNA可包括与编码仓鼠EF-1α蛋白质基因以外的一种DNA序列结合的部分或全部CHEF1调节DNA.由嵌合分子编码产生的蛋白质产物包括生理活性蛋白质，活性蛋白质的部分或亚基，以及标记(或报导)蛋白质。编码所述蛋白质产物的多核苷酸序列可从互补DNA(cDNA)，基因组DNA，合成DNA，或源于这些类型的分子之组合的DNA获得.蛋白质产物对中国仓鼠卵巢(CHO)细胞可以是内源的(即，在无通过转化，转染等DNA导入的所述CHO基因组中正常发现的)。此外，蛋白质产物可被外源来源物所编码，一种非CHO细胞基因组的外源来源物包括，例如合成DNA。本发明优选嵌合分子包括含被可操作地连接到编码下列之DNA的CHEF1 DNA的那些分子：(i)抗-ICAM3抗体ICM3的重链，(ii)ICM的轻链(iii)抗-CD11/CD18抗体hu23F2G重链，(iv)hu23F2G轻链，(v)壳多糖酶，(vi)血小板激活因子乙酰水解酶(PAF-AH)，和(vii)巨噬细胞衍生的趋化因子(MDC)。用含所述嵌合分子的质粒DNA转化的细菌宿主细胞于1997年4月1日被储存在典型培养物保藏中心并分别命名为登录号(i)98381，(ii)98382，(iii)98393，(iv)98384，(v)98385，(vi)98386，和(vii)98387。

本发明进一步涉及用本发明CHEF 1 DNAs转化或转染的宿主细胞。本发明优选的宿主细胞从中国仓鼠(Cricetulus griseus)获得，其中CHEF1调节DNA被推断能提供高水平的蛋白质表达。然而，本发明包含可替代品种来源的其他细胞类型，包括例如源于美国仓鼠(Cricetulus migratoris)或叙利亚(金)仓鼠(Mesocticetusauratus)，以及来源于其他属的动物细胞型。细胞可来源于肺，卵巢，腹膜，肌肉，脾，肾，黑素瘤，或体细胞的来源物，以及源于整个胎儿或整个胚胎。本发明上述所列宿主细胞，以及其他细胞类型例如骨髓瘤细胞系(其中CHEF1 DNA被认为能提供高水平的转录)可从美国典型培养物保藏所获得或也可直接从动物来源物培养。

包括CHEF1调节DNA在内的本发明重组分子将提供可可操作地连接的异源(即，正常情况下在无转染，转化等导入多核苷酸的宿主基因组中所未发现的)多核苷酸之mRNA表达水平的增加。根据被连接到所述CHEF1多核苷酸序列的多核苷酸的性质，转录增加将最终导致上升的多肽水平，或增加的各种RNA水平，在这些情况下其中被连接的多核苷酸编码例如转移RNA，核糖体RNA，小核RNA等。RNA的种类还可包括与内源或外源基因序列转录的mRNA互补的反义RNA。多核苷酸翻译的增加将基本取决于所述mRNA中存在的适当翻译信号的出现。

本发明进一步包括将CHEF1 DNA插入到宿主细胞基因组DNA中的特殊部位以增加内源性基因序列的转录水平的方法。可利用同源重组插入全部或部分所述CHEF1 DNA。在以此方式修饰的宿主细胞中，CHEF1DNA被可操作地连接到编码DNA序列。参见，例如PCT国际公开号WO94/12650；PCT国际公开号WO 92/20808；和PCT国际公开号WO91/09955。本发明必然包含被改变的基因组DNA序列，其中所述CHEF1调节DNA已被插入。

或者，本发明包含其中外源DNA被插入到与所述基因组中存在的CHEF1 DNA相关的临近部位和操作部位的宿主细胞。此类宿主细胞包括CHO并且所述被插入序列取代编码EF-1α的DNA或被插入在CHEF1调节DNA和编码EF-1α的DNA之间。本发明还包含非CHO细胞的宿主细胞，其中CHEF1 DNA已事先被插入到所述基因组中并且额外的DNA随后被插入到一个可操作地连接的部位。

本发明进一步提供增加所需要的基因转录的方法，包括将含仓鼠EF-1α调节序列的多核苷酸导入宿主细胞的步骤，其中调节序列以对于所需基因可操作地连接的位置整合到所述宿主基因组DNA上。本发明进一步包含增强所需要的基因转录的方法，包括将含仓鼠EF-1α调节序列和靶序列的多核苷酸导入宿主细胞的步骤，所述靶序列以一种方式构建，该方式使位于一个可操作地连接部位的所述调节序列整合到编码非EF-1α的蛋白质的所需要的基因。本发明方法包括增加对CHO细胞是内源的基因转录的方法以及增加对CHO细胞是外源的基因转录的方法。

本发明的重组分子可被用于生产转基因动物，其中将包括可操作地连接到目的物DNA序列的CHEF1 DNA之嵌合重组DNA导入一种动物的发育期精子或体细胞。例如嵌合重组分子可通过微注射法导入，并且当用精子细胞进行时，得到的动物中的细胞可全部包括本发明的嵌合重组DNA。或者，本发明的嵌合重组DNA可被导入胚胎细胞，并且所得动物的大量细胞可包含本发明DNA。

CHEF1 DNA还可用于鉴定那些密切相关的调节序列，所述序列可使增加的基因表达超过CHEF1所容许的限度。类似的，CHEF1 DNA序列的知识容许构建合成的DNAs(不管是来自从头合成或CHEF1 DNAs的单或多修饰)，得到的含合成DNAs的序列类似于CHEF1但能启动较高的基因转录水平。

发明详述

通过下列实施例解释本发明。实施例1描述仓鼠EF-1α基因的克隆和相应的CHEF1调节DNA。实施例2涉及CHEF1调节序列的亚克隆和序列分析。实施例3提供CHEF1启动子多核苷酸的特征，和实施例4提供包括CHEF1 DNA的各种表达载体的构建方法的描述。实施例5描述用于测定CHEF1调节DNA的功效的转染检测法。实施例6详述用CHEF1调节DNA或巨细胞病毒(CMV)启动子比较重组蛋白质表达水平。实施例7检测不同长度的CHEF1 DNA的调节能力的差别。

实施例1

CHEF1克隆

用编码人EF-1α的cDNA筛选中国仓鼠卵巢基因组DNA库(CHO-K1)(Stratagene，La Jolla，CA)以期分离人EF-1α基因的仓鼠同源基因。

CHO-K1库(Lambda FIX

II克隆载体中Sau3A的部分消化产物)从Stratagene(La Jolla，CA)以宿主细胞株XL-1-Blue MRA和XL1-BlueMRA(P2)的形式获得。所述宿主细胞按照厂商建议的方法经过下列修改而制备。

简言之，取自甘油储存物的细胞被划线在不含抗生素的LB平板上。筛选单克隆用于接种液体LB培养基并培养到晚对数期并且OD₆₀₀约为0.9。在此点，按照厂商建议的方法储存细胞或立即如下述方法使用。

在制备铺平板的培养物时，从如上述制备的平板中挑出单克隆用于接种并使细胞生长在50毫升LB培养基中，其中补充有0.5ml 1M硫酸镁和1毫升1％麦芽糖的去离子水溶液。继30℃生长过夜之后，通过在桌面离心机(2000rpm，室温，5分钟)离心收集细胞并重悬浮于10毫摩尔硫酸镁中，OD₆₀₀是0.5。

λ噬菌体(由厂商提供)被稀释在SM缓冲液中(制备1升储备液，其中含5.8克氯化钠，2.0克一水硫酸镁，50毫升1摩尔Tris-HCI，pH7.5，和5毫升2％[w/v]明胶)浓度范围是10倍到10⁵倍，并每份稀释液取2微升加入到400微升存在于10毫摩尔硫酸镁中的宿主细胞(OD₆₀₀＝0.5)。所得混合物培养在37℃15分钟以使噬菌体吸附到所述细胞，加入顶层琼脂(0.75％LBM琼脂糖，48℃)，每个混合物被以一式双份铺在LBM琼脂糖平板上。结果显示滴度为3X10⁶噬斑形成单位(pfu)/微升噬菌体原种。

在筛选所述库前如上所述制备新鲜宿主细胞。约50,000噬菌体pfu被加入到600微升宿主细胞(OD₆₀₀≈0.5)和6.5ml，0.75％LBM，48℃琼脂糖中。该混合物被铺在琼脂糖平板上，然后在37℃培养约8小时。随后在4℃冷却所述平板5小时以防止顶层琼脂糖粘到硝酸纤维素覆盖层。BA-85，0.45微米孔径，(S+S，Keene，NH)膜被铺在所述平板上并持续转移2分钟。从所述平板移出膜并在1.5摩尔氯化钠/0.5MnaOH中2分钟变性所述转移的DNA。在1.5M NaCI/1.0M Tris-HCI(pH8.0)中中和滤膜，印渍在Whatman3-MM滤纸上，并在80℃真空烘干约1.5到2小时。

人EF-1αcDNA序列[Uetsuki，等J.Biol，Chem.264：5791-5798(1989)](先前显示95％与CHO EF-1α编码区相同[Hayashi等，J.Biochem.106：560-563 1989])被用做筛选库的探针并如下述方法制备。从质粒M0107，一种含在EcoR1识别部位插入的人EF-1αcDNApRc/CMV(Invitrogen，San Diego，CA)载体，获得所述1.4kb人EF-1α探针。为初步证实质粒M0107含所期望的人cDNA，用3’和5’载体引物对插入DNA测序。

94-17  AGGCACAGTCGAGGCTGATC(SEQ ID NO：2)

94-18  TTCCAGGGTCAAGGAAGGCA(SEQ ID NO：3)

所述插入片段的前263bp显示与公开的人EF-1α编码序列的一致性大于90％，而其3’端序列难于准确测定，小的延伸片段可与所期望的序列对仗。综上所述，这些序列对仗表明所述质粒编码所期望的序列。

用EcoRI消化从所述质粒移出完整的人插入片段并用QIAGEN QIA快速凝胶提取试剂盒，按照厂商建议的方法凝胶纯化一条1.4kb cDNA带。所述DNA被洗脱进入50微升TE，在Microcon-10中浓缩所得溶液到25微升，用Boehringer Mannheim Random Primed DNA标记试剂盒，按照厂商建议的方法，以³²P-α-dTTP和³²P-α-dCTP标记一份反应液。用G50自旋柱纯化被标记的探针以除去未掺入的核苷酸并将纯化后的探针与掺入前反应液比较显示46％的放射性标记的掺入，计数为5X10⁵cpm/分钟/微升。

如上制备的硝酸纤维素膜被探测如下。制备预杂交/杂交储备缓冲液，其中包括22.5ml 20xSSC，30.0ml 50xDenhardt’s液，3.0ml1M磷酸盐缓冲液(pH 6.8)(69ml 1M磷酸二氢钠，31毫升1摩尔磷酸氢二钠)，0.75ml 20％SDS，和78.75毫升蒸馏水。为预杂交，将1.4ml 10mg/ml的鲑鱼精子DNA(Stratagene)与0.6毫升蒸馏水一起煮沸5分钟，然后加入7毫升蒸馏水和72毫升储备缓冲液。滤纸在预杂交缓冲液中被在65℃温孵最少2小时。

为杂交，合并30微升探针，200微升10毫克/毫升鲑鱼精子DNA和770微升蒸馏水，煮沸5分钟，并加入36毫升含3毫升蒸馏水的储备缓冲液。从所述滤纸除去预杂交溶液，加入杂交缓冲液并使所述滤纸在65℃过夜。杂交后，在65℃用含2X SSC和0.1％SDS的缓冲液换液3次共洗3小时，然后放射自显影48小时。

鉴别出47个阳性克隆并挑入含20微升氯仿的1毫升SM缓冲液中。为清除可能的丢失一个或多个内含子的假基因，在两个内含子的每个的侧翼设计成对的PCR引物：引物95-136(SEQ ID NO：4)和95-137(SEQ ID NO：5)在内含子2和3的侧翼；引物95-138(SEQ ID NO：6)和95-139(SEQ ID NO：7)在内含子3和4的侧翼；引物95-140(SEQ ID NO：8)和95-141(SEQ ID NO：9)在内含子4和5的侧翼；引物95-142(SEQ ID NO：10)和95-143(SEQ ID NO：11)在内含子6和7的侧翼。

95-136(SEQ ID NO：4)GCCACCTGATCTACAAATGT

95-137(SEQ ID NO：5)GAGATACCAGCCTCAAATTC

95-138(SEQ ID NO：6)ATGTGACCATCATTGATGCC

95-140(SEQ ID NO：8)GTTGGAATGGTGACAACATG

95-141(SEQ ID NO：9)CAGGTTTTAAAACACCAGTC

95-142(SEQ ID NO：10)AATGACCCACCAATGGAAGC

95-143(SEQ ID NO：11)ACAGCAACTGTCTGCCTCAT

使用CHO EF-1α模板DNA的PCR产物的预期大小基于公布的人EF-1α序列中内含子的大小和位置。每个PCR反应液包括2微升噬菌体，2.5微升每个适当的引物对(100微克/毫升)，2微升2毫摩尔dNTP混合物，2.5微升10X PCR缓冲液(Roche Molecular Systems，Branchburg，NJ)，1.5微升25毫摩尔氯化镁，0.125微升Taq聚合酶(5单位/微升)(Perkin Elmer)和11.8微升蒸馏水。扩增反应在94℃进行4分钟，继之以30个循环的90℃1分钟，50℃2分钟，和72℃4分钟。扩增产物在1X TAE的1.2％琼脂糖凝胶上被分离。发现47个阳性噬斑中的三个编码含全部内含子的真基因(2号，7号和40号)并且该三个阳性样品经过如下三级筛选。按10比10⁵稀释用三个阳性样品的每个所制备的原种如上述方法制备平板培养物。通过PCR筛选分离自每个原种的20到50个噬斑得到如下结果。克隆2号从20个筛选的噬斑中产生两个阳性噬斑(命名为2.12和2.17)，克隆7号在50个筛选的噬斑中产生一个阳性噬斑(命名为7.44)，而克隆40号在40个筛选中产生一个阳性噬斑(命名为阳性40.24)。从所述四个样品中的每个分离噬菌体DNA如下。

在LB琼脂糖平板上划线XL-1Blue MRA(P2)并在37℃生长过夜。分离单克隆以接种50毫升的LB培养基(含0.2％麦芽糖和10毫摩尔硫酸镁)并该培养物在30℃生长过夜。通过在台式离心机中以2000rpm室温下离心5分钟收获细胞并将所述细胞重悬浮于50毫升10毫摩尔硫酸镁中。所述重悬浮的宿主细胞(50微升)与100微升每个噬菌体原种混合并在37℃培养15分钟以使噬菌体吸附到所述细胞。加入约500微升LBM培养基并在37℃混合摇动2小时。加入另外200微升宿主细胞并在37℃再持续培养15分钟。加入顶层琼脂(8毫升0.75％LBM琼脂糖，48℃)，其后所述混合物被铺平板并在37℃过夜生长。

继过夜生长后，向每个平板加入12毫升λ稀释剂(10毫摩尔Tris-HCI，pH7.5，10毫摩尔硫酸镁)并轻摇所述平板2小时。除去该稀释剂并在台式离心机中4000xg离心10分钟。向该上清液中加入1毫克/毫升RNA酶A和DNA酶I各1微升并在37℃培养15分钟。加入等体积的沉淀缓冲液(20％PBG8000，2M氯化钠，20毫摩尔Tris-HCI，pH7.5，10毫摩尔硫酸镁)，继之以冰孵1小时，其后在8000xg离心所述混合物20分钟，弃上清，并在室温下所述沉降物空气干燥10分钟。该沉降物重悬浮于500微升TE中，简单离心以除去颗粒，将上清转移到一个干净的1.65毫升微离心管中。加入2.5微升20％SDS(65℃温孵5分钟)，随后加入2.5微升10毫克/毫升蛋白酶K(65℃温孵1小时)和10微升5摩尔氯化钠。所述混合物用等体积苯酚∶氯仿抽提1次并用等体积氯仿抽提1次。加入等体积的异丙醇，继之以-70℃孵3小时，其后在一个微离心机中以最高速离心所述混合物15分钟。所得沉降物用70％乙醇洗，空气干燥，并重悬浮于100微升TE中。

实施例2

EF-1α调节序列的次级克隆

为测定插入片段EF-1αDNA的大小，如实施例1制备的噬菌体DNA被NotI消化，并所得限制酶解片段在0.6％1x TAE琼脂糖凝胶上分离。克隆2.12和2.17显示了同样的酶解带型，除所预期的19kb和10kbλ片段侧翼之外还有11kb和4.5kb的带。克隆7.44和40.24也显示出同样的酶解带型，有12kb和7kb的插入片段带，其与克隆2.12和2.17的酶解资料一起表明了在所述EF-1αDNA中存在一个内部NotI限制酶识别点。源于克隆2.12和7.44的插入片段被如下次级克隆。

如实施例1的描述制备的噬菌体DNA(60微升)被NotI消化，其后加入20微升3摩尔醋酸钠和400微升100％乙醇沉淀被消化的DNA。通过离心收集沉淀的DNA，在200微升40％乙醇中洗，空气干燥15分钟，重悬浮于20微升TE并加热到65℃10分钟，然后加入2微升加样缓冲液用于电泳。用琼脂糖凝胶电泳分离DNA并切下4.5kb，7kb，11kb和12kb的凝胶切片。从每个凝胶切片用QLAGEN QIA快速凝胶提取试剂盒按照厂商建议的方法提取DNA。带的纯度和浓度通过分离5微升一份的每个0.6％1x TAE琼脂糖凝胶上分离的片段来评估。

各个片段被分开连接到NotI消化的pBluescript SW⁺。在与11和12kb片段连接过程中，在引入所述插入片段前用牛碱性磷酸酶处理线性化的载体。每个连接物的两微升被用于电穿孔40微升的XL-1Blue电感受态细胞。转化细胞被铺平板在LBM/carb琼脂糖平板上，每平板含有40微升5％X-gal二甲基甲酰胺(DMF)和20微升0.1摩尔IPTG。细胞在37℃培养过夜并在早晨将平板移到4℃以增加兰色的强度。

在第二轮筛选中，将白色菌落划线在如上述的含X-gal和IPTG的LBM/carb琼脂糖平板上，并在次日仍是白色菌落者在3毫升LBM/carb中37℃被进一步生长过夜。用WIZARD Plus Minipreps DNA纯化系统(Promega，Madison，WI)按照厂商建议的方法从过夜生长的白色菌落制备质粒DNA。

限制酶分析被分离的质粒DNA表明所述4.5kb，7kb和12kb片段被成功连接到pBluescipts SW⁺载体中，并且所得质粒分别是被消化的pSK/EF1.4.5，pSK/EF1.7和pSK/EF1.12。

然后用一种QIAGEN中量制备(midi prep)试剂盒按照厂商建议的方法制备每个质粒。在每个新载体上进行PCR，滴定模板DNA并使用所述编码区引物(SEQ ID NOs：4到11，如上述成对使用以筛出缺少一个或多个所述各种内含子的假基因)。在发现所有三个片段(以高浓度)包含完整的EF-1α编码区，提示可能有所述三个质粒制备物之间的交叉污染，之后进行滴定。在所述滴定中，PCR在含2.5微升浓度为0.001，0.01，0.1，1或10ng/微升的模板DNA并含2.5微升10X PCR缓冲液(Perkin Elmer)，2.0微升2毫摩尔dNTP混合物，1.5微升25毫摩尔氯化镁，0.125微升Taq聚合酶(Perkin Elmer)和11.4微升蒸馏水的反应液中进行。扩增在下列条件下进行：94℃4分钟，继之以30个循环的90℃1分钟，50℃2分钟，72℃4分钟。结果表明所述完整的EF-1α编码区位于所述4.5kb和7kb片段内。

用被设计与Lamda FIX II

载体一起使用的Stratagene FLASHNonradioactive Gene Mapping Kit对每个插入片段做限制酶图谱。然而代替使用噬菌体DNA的是使用从上述pSK载体用NotI消化切开的质粒DNA。所述作图方法基本上是厂商所建议的。简言之，用M13(SEQID NO：12)和M13反向(SEQ ID NO：13)引物(与所述pBluescriptSW⁺多克隆区内的区域互补)测序质粒以定位每个插入片段的所述NotI识别位点内的T3(SEQ ID NO：14)和T7(SEQ ID NO：15)引物序列。

M13       GTAAAACGACGGCCAGT          (SEQ ID NO：12)

M13rev    GGAAACAGCTATGACCATG        (SEQ ID NO：13)

T3        AATTAACCCTCACTAAAGGG       (SEQ ID NO：14)

T7        GTTAATACGACTCACTATAGGGC    (SEQ ID NO：15)

在所述基因作图方法中使用所述T7和73引物做探针。由于EF-1α插入片段显示包含一个内部NotI识别位点，所述片段对(4.5kb/11kb和7kb/12kb)被认为包括所述引物序列中此或彼序列，并因此确定所述4.5和12kb插入片段包含T7引物序列，而所述7kb插入片段含T3序列。

通过NotI消化从所述载体切下含EF-1α编码区的4.5kb和7kb插入片段。在琼脂糖凝胶上分离被消化的DNA，从凝胶切下被分离的片段，并用QIAGEN QIA快速凝胶提取试剂盒按照厂商建议的方法从每个凝胶切片分离DNA。用七个不同的酶在部分限制性酶解物中进行作图。在琼脂糖凝胶上分开反应产物，将DNA转移到Duralon-UV Nylon膜并用T3或T7寡核苷酸做探针进行探测。测定所述带的大小并形成限制图谱。

用原初为所述PCR筛选而设计的内部引物(SEQ ID NOs：4到11[先前描述的引物95-136-95-143])对质粒Psk/EF1.7测序以保证所述基因序列是先前认定的蛋白质序列。测定所述编码区的取向并设计能使测序到达内部NotI识别位点的另外引物。测定所述完整编码区的序列，然后将其与在Hayashi等[supra]中描述的预期cDNA序列比较。序列分析证实事实上被分离的DNA确编码与Hayashi[supra]所描述相同的EF-1α序列。此外，第一个外显子序列与先前公开的位于5’端的仓鼠EF-1αcDNA序列是相同的并且鉴定出的七个内含子给出与已知人同源序列类似的结构。

从所述7kb片段得到的序列和限制图谱表明所述5’内含子的一部分和所述启动子位于所述内部NotI识别位点5’的12kb片段中。从所述12kb插入片段切下内部NotI位点5’的一个SpeI/NotI 3kb片段并次级克隆到用同样的酶事先消化好的pBluescriptSK⁺，得到的质粒被命名为pSK/EF1.3。分别对所述3kb片段用KpnI和ClaI如上述方法作图以确认限制位点和用一种Erase-a-Base试剂盒(Promega，Madison，WI)利用造成5’和3’突出端的ClaI和KpnI位点对其测序。序列分析表明了含所述启动子，TATA盒，和与所述人基因[Uetsuki，1989，supra]中第一个内含子相同长度的5’非翻译区侧翼序列中的一个0.9kb内含子的区域。所述CHEF1启动子序列和5’内含子在SEQ ID NO：1中给出，内含子包括2699到3641核苷酸。

实施例3

CHEF调节DNA的特征

仓鼠EF-1α基因的序列的上游并包括ATG起始密码在SEQ ID NO：1中给出。所出现的大多数可鉴别的转录因子结合部位位于上游SacI位点3’，该位点位于所述EF-1α基因起始ATG密码子5’，1.56kb。然而，包括下述CHEF1序列的表达载体还含2kb的SacI位点5’的CHEF1序列。

测序表明了位于起始ATG起始密码子5’的约1kb的完全共有序列TATA盒的存在，并且所述上游SacI位点与TATA盒之间的区域包含多个潜在的转录因子结合位点[Boulikas，Crit.Rev.Euk.Gene Exp.4：117-321(1994)]，包括Sp1位点(SEQ ID NOs：16或17)，ATF位点(SEQ ID NO：18)，和NF-1位点(SEQ ID NO：19)。

      GGCGGG SEQ ID NO：16

      GGGCGG SEQ ID NO：17

  TGACGY(C/A)R SEQ ID NO：18

TTGGCN_5-6(T/G)CCR SEQ ID NO：19

类似于人EF-1α基因，[Uetsuki等，supra]，在仓鼠EF-1α基因的5’非翻译区(UTR)中有一个943bp的内含子，它显然来自剪接供体和受体序列的部位。然而，使用Geneworks DNA分析程序，发现5’UTR中的内含子序列仅与人基因中的相应序列有62％是一致的。该5’内含子包括多个潜在的转录因子结合位点，大致上等于所述SacI位点和TATA盒之间的结合位点数，这表明该5’内含子可能对从所述EF-1α启动子进行最佳转录是重要的。

使用Geneworks DNA分析程序，发现5’内含子序列下游(但不包括)的上游SacI限制位点的CHEF1序列与人EF-1α序列有64％是一致的。人和仓鼠中的转录因子结合位点的位置比较在表1中示出。完整的人EF-1α基因序列[Uetsuli等，supra]在SEQ ID NO：29中给出。

表1

Sp1位点到TATA盒间的距离

仓鼠            人

核苷酸位置      核苷酸位置

-424            -335

-304            -220

-183            -208

-171            432

-151            476

-135            573

-26             581

63              690

156

168

257

261

425

495

589

594

688

实施例4

表达质粒的构建

下面实施例中使用的多个质粒按下述方法构建。

用SphI/BamHI酶解质粒pSV2-dhfr(ATCC登录号37146)并纯化编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的1.8kb片段(片段1)。所述编码DHFR片段还包括SV40启动子/操纵子和与所述dhfr基因相关的分别位于5’和3’的多腺苷酸化序列。用HindIII消化质粒pSL1190(Pharmacia)，悬垂末端用Klenow补平，并将该平头末端的DNA重连接以破坏HindIII位点产生质粒pSL1190H，然后用SphI/BamHI消化该质粒并纯化3.4kb的片段(片段2)。所述pSV2-dhfr1.8kb片段(片段1)被连接到所述pSL11903.4kb片段(片段2)以得到质粒pSL1190H-dhfr。

修饰质粒pSL1190H-dhfr以除去几个限制位点如下。首先用Xbal/NheI(产生互补的悬垂末端)消化质粒pSL1190-dhfr并将线形质粒重连接除去所述XbaI和NheI位点。在第二个操作中，用HindIII消化pSL1190H-dhfr，用Klenow充填悬垂末端，并且线形质粒被重连接以除去所述HindIII位点。在第三个操作中，用BglII消化pSL1190H-dhfr，用Klenow充填悬垂末端，并重连接该线形质粒以除去所述BglII位点。这三个步骤的最后结果产生质粒pSL1190H-dhfr/NXHB，其中XbaI，NheI，HindIII，和BglII位点被破坏。然后用EcoRI/BamHI消化质粒Psl1190-dhfr/NXHB并插入一个NPB1/NPB2接头(从退火的寡核苷酸NPB和NPB2[SEQ ID NOs20和21])产生含唯一NotI限制位点的质粒pSL/dhfr/NotI。

NPB1  GATCGCGGCCGCGTTTAAACGGATCC(SEQ ID NO：20)

NPB2  AATTGGATCCGTTTAAACGCGGCCGC(SEQ ID NO：21)

用Asp718/BamHI消化得到的质粒pSL/dhfr/NotI并纯化编码DHFR的1.8kb片段(片段3)。用Asp718/BglII消化质粒pRc/CMV(Invitrogen，San Diego，CA)以除去CMV启动子和牛生长激素(BGH)多腺苷酸化DNA并纯化3.7kb片段(片段4)。将带有SV40启动子/操纵子和多腺苷酸化序列(片段3)的编码DHFE的1.8kb pSL/dhfr/NotI片段连接到所述3.7kb pRc/CMV片段(片断4)以产生质粒pRc/DHFR/NotI。

用Asp718/XbaI消化质粒pRc/CMV并纯化编码BGH多腺苷酸化DNA的0.8kb片段(片段5)。用BamHI/Asp718消化质粒pRc/DHFR/NotI并纯化含DHFR，SV40启动子/操纵子和多腺苷酸化序列的4kb片段(片段6)。用BglII/SacI消化质粒pCEP4(Invitrogen，San Diego，CA)并纯化编码所述CMV启动子的0.7kb片段(片段7)。0.8kbpRc/CMV片段(片段5)，4kb pRc/DHFR/NotI片段(片段6)，0.7kbpCEP4片段(片段7)，和合成的SacI/XbaI衔接头片段在一个4路(4-way)连接反应中被接合产生质粒pDC1。衔接头通过退火寡核苷酸SXP1和SXP2构建而成。

SXP1(SEQ ID NO：22)

5′-CGTTTAGTGAACCGTCAGATCTACATAACAACATTCCTC

CTCTAAAGAAGCCCCAAGCTTGATATCTGCAGAATTCT-3′

SXP(SEQ ID NO：23)

5′-CTAGAGAATTCTGCAGATATCAAGCTTGGGGCTTCTTTAGAG

GAGGAATGTTGTTATGTAGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCT-3′

因此质粒pDC1包括CMV启动子，一个多接头区，源于BGH的多腺苷酸化部位，和SV40启动子控制下的dhfr基因以及SV40剪接/多腺苷酸化序列。

用XhoI消化质粒pDC1，分离缺少CMV启动子和BHG多腺苷酸化DNA的4.5kb片段并连接以产生质粒pDCi1。然后用BamHI/XhoI消化质粒pDCi1并纯化4.5kb片段(片段8)。该4.5kb片段被连接到BamHI/SalI消化的PCR片段，该片段编码用引物96-13和96-14产生的部分CMV启动子序列(质粒pDC1做模板)以产生质粒pDCi2。

引物96-13(SEQ ID NO：24)

5′-AGTTCAGTCGACGGCGCGCCAACCCGGGAATCC

GGACGGGATCTATACATTGAATCAATATTGGCA-3′

引物96-14(SEQ ID NO：25)

ATGTCAGGATCCACGCGGAACTCCATATATGGGCTATGAACT

用Asp718/SpeI消化质粒pDCi 2并纯化编码带有SV40启动子/操纵子和多腺苷酸化序列的DHFR4.2kb片段(片段9)，并用Asp718/SpeI消化pDC1和纯化带有BGH多腺苷酸化信号的含部分CMV启动子DNA的1.5kb片段(片段10)。4.2kb pDCi2片段(片段9)被连接到1.5kb pDC1片段(片段10)以产生质粒pDC31。质粒pDC31区别于pDC1的是生成了几个新的限制位点，包括所述CMV启动子5’端的SmaI和AscI。用NotI消化质粒pDC31，用T4聚合酶齐平悬垂DNA末端并重新连接质粒以去掉NotI位点并产生质粒pDC36。质粒pDC36除所述NotI被破坏外均与pDC31相同。

用ApaI/BamHI消化质粒pDC36，填平悬垂末端，并将质粒重连接以产生pDC38。pDC38除含牛生长激素多腺苷酸化序列的ApaI/BamHI片段已被除去外均与质粒pDC36相同。用SmaI/HindIII消化质粒pDC38并纯化缺少CMV启动子DNA的4.6kb片段(片段11)。

用EcoRV/NotI/PvuI消化质粒pSK/EF1.3并纯化编码CHEF1启动子和上游DNA序列的2.9kb片段(片段12)。用NotI消化BluescriptSW⁺II(pSK⁺)并纯化2.9kb片段(片段13)。源于λ噬菌体7.4的7kb NotI片段被连接到2.9pSK⁺片段(片段13)以产生质粒pSK/EF1.7。

用HindIII/NotI消化质粒pSK⁺并纯化2.9kb片段(片段14)。用NotI/NcoI消化pSK/EF1.7质粒并纯化编码部分CHEF15’非翻译区内含子的620bp片段(片段15)。用引物96-36和96-45产生编码所述5’内含子其余部分的123bp HidIII/NcoI消化的PCR片段并纯化pSK/EF1.12作为模板(片段16)。

引物96-36(SEQ ID NO：26)

GGCTTAGCTCCGAGGAGGG

引物96-45(SEQ ID NO：27)

CGTGACAAGCTTGGTTTTCACAACAC

连接所述2.9kb pSK⁺片段(片段14)，所述620bp pSK/EF1.7片段(片段15)，和所述123bp HindIII/Ncoi片段(片段16)以产生含完整CHEF15’内含子序列的质粒pSK/5’EF-1。

用HindIII/NotI消化质粒Psk/5’EF-1并纯化编码5’内含子的0.7kb片段(片段17)。缺少CMV启动子的4.6kb pDC38片段(片段11)，带有CHEF1启动子和上游序列的2.9kbpSK/EF1.3片段(片段12)，和编码完整5’内含子的0.7kb pSK/5’EF-1片段(片段17)在3路(3-way)连接反应中接合以产生质粒pDEF1，由此该质粒含完整的5’CHEF1调节DNA序列，所述dhfr基因，和SV40复制起始区，它能使SV40T抗原转化的细胞系内的复制达到很高的拷贝水平。

用HindIII消化质粒pDEF1，填平悬垂末端，并用NotI消化所述质粒和纯化含CHEF1启动子和除部分5’内含子序列外还含上游DNA序列的2.6kb片段(片段18)。用NotI/Asp718消化质粒pDEF1并纯化编码所述5’内含子的其余部分的1.3kb片段(片段19)。用SmaI/Asp718消化质粒pDC38并纯化编码带有SV40启动子/操纵子和DNA的4kb片段(片段20)。2.6kb pDEF1片段(片段18)，1.3kb pDEF1片段(片段19)，和4kb pDC38片段(片段20)在3路(3-way)连接反应中接合以产生质粒pDEF2。在E.coli菌株XL-1Blue中的质粒pDEF2于1997年4月4日被储存在12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852的美国模式培养物保藏所，并命名为登录号98343。质粒pDEF2区别于pDEF1的是距CHEF1 TATA盒上游2.3kb的0.3kb HindIII/SpeI片段被除去并只含位于多接头区的一个HindIII位点。在要被表达的基因包括其自身的多腺苷酸化部位的情况下，使用pDEF2。

用Asp718/XbaI消化质粒pDEF2以线性化该质粒，除此之外还除去了复制起点序列，并纯化7.4kb片段(片段21)。用Asp718/XbaI消化质粒pDC1并纯化除BGH多腺苷酸化序列外还包括置换起点或复制DNA的0.8kb片段(片段22)。结合所述7.4kb pDEF2片段(片段21)和所述0.8kbpDC21片段(片段22)以产生质粒pDEF10，它区别于pDEF1的方式与pDEF2相同。质粒pDEF10区别于pDEF2的是在pDEF10的多接头区的3’端有源于所述牛生长激素基因的多腺苷酸化位点。

用HindIII/XbaI消化质粒pDEF10以线性化该质粒并纯化8.2kb片段(片段23)。用HindIII/XbaI消化质粒pDC1/MDC(一种编码人趋化因子，即巨噬细胞来源的趋化因子(MDC)的质粒)并纯化编码MDC的0.4kb片段(片段24)。将8.2kbpDEF10片段(片段23)与0.4kbpDC1/MDC片段(片段24)连接产生质粒pDEF10/MDC.1。

用BamHI消化质粒pRc/CMV，重叠末端用Klenow填满，用Asp718消化该质粒，并纯化1.5kb片段(片段25)。用NotI消化质粒pDC1，重叠末端用Klenow填满，用Asp消化该质粒，并纯化3.9kb片段(片段26)。用3.9kb片段(片段26)与1.5kb pRc/CMV片段(片段25)连接以产生质粒pNCX。

除所述dhfr基因被新霉素抗性基因(NeoR)取代外，质粒pNCX类似于所述pDC1。用Asp718/Pvu消化质粒pNCX并纯化2.1kb片段(片段27)。用Asp718/PvuI消化质粒pDEF1并纯化5.9kb片段(片段28)。将2.1kb pNXC片段(片段27)连接到5.9kb片段(片段28)以产生质粒pNEF1。pNEF1区别于pDEF1的是所述质粒携带编码抗新霉素或G418的细菌新霉素抗性基因。被插入到pNEF1的基因一般是继HindIII部分酶解或3路(3-way)连接之后插入的HindIII/XbaI片段，因为所述质粒有两个HindIII位点。

实施例5

DG44细胞的转染及繁殖力测试

对用单一质粒转染宿主DG44细胞来说，通常通过限制酶PvuI或AscI消化线性化50-100微克质粒。对于两个质粒被导CHO细胞的转染，所述质粒仍是未消化的。在转化前，乙醇沉淀质粒并用70％乙醇洗两次。简单干燥DNA沉淀物并重悬浮与400微升无菌，蒸馏水中。加入400微升无菌2X HeBS(40毫摩尔HEPES-NaOH，pH7.0；274毫摩尔NaCI；10毫摩尔KCI；1.4毫摩尔磷酸氢二钠；12毫摩尔葡萄糖)到所述重悬浮的DNA中。未受转染的DG44细胞被培养在补充有次黄嘌呤(0.01毫摩尔终浓度)和胸腺嘧啶(0.0016毫摩尔终浓度)的DMEM/F-12培养基中(还称为“HT”)。为使未被转染的和被转染的DG44细胞都生长，将透析的FBS加入到所述培养基以产生终浓度为5到10％体积。通过使培养物生长到铺满处理的150平方厘米组织培养聚苯乙烯瓶(Corning)的50％或以下来制备用于转染的DG44细胞。通过先吸出所述培养基而移出细胞，用无钙-镁磷酸盐缓冲生理盐水(CMF-PBS：2.7毫摩尔KCI；1.5毫摩尔磷酸二氢钾；137毫摩尔NaCI；8.1毫摩尔磷酸氢二钾)洗吸附细胞一次，加入4毫升含0.0125％辐射胰蛋白酶(Worthington Biochemical Corporation)的CMF-PBS液，在37℃培养数分钟。加入含胎牛血清(FBS)的培养基(4毫升)，测定细胞浓度，离心沉降每份为2X10⁷的细胞。每份细胞沉淀物在CMF-PBS中洗一次并与所需要的质粒DNA一起重悬浮于含HeBS的0.8毫升溶液中。在室温下将重悬浮的细胞转移到一只0.4厘米Gene Pulser样品池(Bio-Rad)并放置在Bio-Rad GenePulser电穿孔仪中。在室温，用一电容放电290伏和960μFD(9到11.5msec pulse)。保持细胞在样品池中约10分钟然后将其加入到10毫升5-10％透析FBS和HT补充的DMEM/F-12中。在此点测定致死率(锥虫蓝排除在外)并一般会发现是约50％。然后通过离心沉淀所述细胞，重悬浮于2毫升有5-10％透析FBS和HT的DMEM/F-12中(“非选择性培养基”)并接种到10厘米聚苯乙烯组织培养板中。生长两天后(通常在此点铺满)用胰蛋白酶如上述从平板移出所述细胞并接种到各种稀释度的补充有5-10％透析FBS而无HT(“选择性培养基”)的DMEM/F-1210平方厘米平板中。5天和9天后，用选择性培养基给所述细胞补料。约两周后，用如上述胰蛋白酶将转染的细胞集落(一般每次转染多于1,000个)从所述平板移出并在加入选择性培养基后测定所述细胞的浓度。从每次转染至少取两份2X10⁶细胞加入到含10毫升选择性培养基的10厘米平板。培养所述细胞到灭绝(extinction)，即大多数细胞由于过度拥挤而已从平板脱落的时候。通过ELISA测试所述灭绝的培养物的上清以确定平均产物滴度。

实施例6

用CHEF1生产重组蛋白质

用携带可操作地连接到CHEF1调节DNA的表3给出之基因的质粒转染实施例5中描述的DG44细胞。将编码所述测试中所用的每个基因的质粒所转化的细菌菌株于1997年4月1日储存到12301 ParklawnDrive，Rockville，Maryland 20852的美国典型培养物保藏中心并命名为如表2给出的登录号。

表2

                  质粒的登录号

编码的基因        质粒的命名        登录号

抗体ICM3重链      pDEF1/ICM3H.2     98381

抗体ICM3轻链      pNEF1/ICM3L.3     98382

抗体23F2G重链     pDEF1/F2GH.1      98383

抗体23F2G轻链     pNEF1/F2GL.1      98384

壳多糖酶          pDEF1/CTN.1       98385

血小板激活因子    pDEF2/HPH.4       98386

乙酰羟化酶

(PAF-AH)

巨噬细胞衍生      pDEF10/MDC.1      98387

趋化因子(MDC)

在筛选转染子后，用胰蛋白酶从每个平板移出每次转染得到的细胞集落(200个以上)库并将来自每次转染的一致数目的细胞再铺平板并生长到灭绝。移出上清并用ELISA或用酶测试法测试蛋白质的表达。结果在表3中示出。

表3

用CHEF1和CMV调节序列表达蛋白质

                    蛋白质滴度

转染的基因          CMV         CHEF1

ICM3 H+L            554         1862

ICM3 H+L            288         2153

Hu23F2G H+L         337         1848

MDC                 360         2100

PAF-AH              590         6574

壳多糖酶-1          3200        2300

壳多糖酶-2          8900        12850

除第一次检测壳多糖酶表达(命名为表3的壳多糖酶-1)的实验外，使用CHEF1调节DNA导致明显高水平的蛋白质产量，增加的范围比用CMV启动子的表达高3倍到11倍。

为测定在测试中观察到的壳多糖酶增加表达是一种异常还是对壳多糖酶是唯一的和/或其一种可重复的结论性特征，第二次进行了所述实验，但使用两次分开的转染，以与产生异常低数目转染子的第一次实验使用的单转染相对。此外，使用了一种不同的壳多糖酶活性测试方法，该方法证明比所述第一次实验使用的方法更精确。

第二次实验中的转染产生转染子的数目与先前使用pDEF2质粒所观察到的结果更一致，该质粒在另外的实验中产生比使用CMV质粒的转染子数目的150％还高。第二次实验得到的结果(表3中命名的壳多糖酶-2)实质上是一致的，从而给所述结果提供了进一步的证明，即使所观察到的超过用CMV启动子表达的蛋白质表达增加(约1.4倍)低于先前检测的其他蛋白质所观察的结果。

实施例7

用不同长度的CHEF1调节DNA生产重组蛋白质

一种包含额外8kb的EF-1α基因5’侧翼DNA的表达载体也被构建并被命名为pDEF14。质粒pDEF14区别于pDEF2的是pDEF14含11.7kb的仓鼠EF-1α5’侧翼DNA，而pDEF2只含3.3kb的同样序列。质粒pDEF14还包括与所述DHFR表达盒3’端临近的4kb仓鼠3’侧翼DNA。较大的pDEF14质粒如下述方法构建。

简言之，从pDEF2除去2.6kb AscI/NotI CHEF1片段并在其位置插入11kb AscI/NotI CHEF片段。插入较大的序列首先需要将位于EF-1α起点ATG 5’11.7kb的Xbal位点修饰成AscI位点。此外，将4kb平头NsiI/SalI片段(含开始于距EF-1α终止密码的3’118bp的NsiI位点的CHEF1侧翼序列)插入到位于多接头区3’端的DHER表达盒3’的PmeI/SalI位点，要被表达的基因被插入所述多接头区。完整的3’DNA序列(开始于EF-1α基因的终止密码)在SEQ ID NO：28中给出。用该质粒转化的细菌于1997年4月9日被储存在12301 ParklawnDrive，Rokville，Maryland 20852的美国典型培养物保藏中心并命名为登录号98398。产生的质粒包含伴随多HindIII位点的唯一XbaI和NotI位点，由此必须3路(3-way)连接以插入一个基因到用于表达的质粒中。例如，通过将包含所需要的基因的HindIII/XbaI片段与一个来自pDEF14的737bp NotI/HindIII片段和一个来自pDEF14的19.7kb XbaI/NotI片段连接可插入一个基因到所述质粒中。

将使用此载体的蛋白质表达与使用含较小部分的EF-1α5’侧链区的pDEF2的表达相对比。在初级实验中，编码抗体23F2G重链和轻链的DNA均被次级克隆到pDEF2和pDEF14载体中并在转染进入DG44细胞后测定表达水平如上述实施例5。编码两条抗体链的基因线性排列在所述载体中，而两个基因的表达受所述各质粒中的CHEF1序列的驱动。在每个质粒中的两条链的编码区被同样的4.3kbDNA所分开，该DNA来自人IgG43’非翻译区。

结果表明从pDEF14中较大CHEF1序列的23F2G的表达比从较小pDEF2序列的抗体表达高4倍。这个结果是意外的，因为大多数可鉴别的pDEF14转录结合因子部位也位于pDEF2中的所述DNA序列中。因此可能有一个和多个另外的未鉴别的转录因子结合部位或增强子序列位于所述pDEF14质粒的CHEF1 DNA中。或者，作为所述3’DNA序列的某些性质的结果，较大的CHEF1 DNA可提供增加转录的便利。

预期本领域专业人员能够遇到如上面解释性实施例中所述本发明的许多修饰和改变。所以，本发明应列出仅如所附权利要求中出现的限制。

序列表

(1)一般资料：

(i)申请人：Allison，Daniel S.

(ii)发明题目：仓鼠EF-1α调节DNA

(iii)序列号：29

(iv)联系地址：

(A)地址：Marshall，O’Toole，Gerstein，Murray&Borun

(B)街：233 South Wacker Drive，6300 Sears Tower

(C)城市：Chicago

(D)州：Illinois

(E)国家：USA

(F)邮编：60606

(v)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release #1.0，#1.30版

(vi)当前申请资料：

(A)申请号：US

(B)提交日期：

(C)分类：

(vii)委托/代理人资料

(D)姓名：Williams Jr.，Joseph A.

(E)注册号：38，659

(F)参考/提要号：27866/33537

(viii)电信资料：

(G)电话：312-474-6300

(H)电传：312-474-0448

(2)SEQ ID NO资料：1：

(i)序列特征：

(A)长度：3678碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线形

(ii)分子类型：DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

ACTAGTTCCA AAGATGAATT ACTAACCAGT GTTTCCAAGG AAATAAATGA AAGCAGAGAG  60

ATTAGTTCTA TTGCTAGTGT TTCATTTTCG TATATTTCTT ACAATTTCTC TTGTTACAAA    120

TAGGCACTAG GGTATCAAGA TAATTTTAAC GACTGGCTGA GAACCCTAGA AAATCTCTGT    180

GAAAAAGGGA TTTGTGAAAT GAGAGAGGGT AATGTGGCCA TTATAGAAAA GGCTTTTGTG    240

TGCCTTGCAT GCATAGACCC TGTGTTTGAT CTCTTAACAC CCTCCTTGAC CAGAAAAAGC    300

TTCTGTGGAT AGAAAATGAT TAGTTATATA TACTTTTAGG GAAACGTAGT TCTGGATTCT    360

TTGGTTACAA TTAACAGAAT TAAGTGCAAA CAAAGCCAGA AACCTCCTGA TAAATGAGAA    420

AACCTGCTTG TAGAAGGTTG TAAGGCTCTG TAATATAGGA ATTAGGAGAA AAGAAACCTG    480

TGTGGTGGGG CACGTCTGTA ATCCCAGCAT TGGGAAGTAG AGGTAGAAGA TTAGAAATCA    540

AAGGCCAGCC TCAGCAACAC AGTGAGTTTG AGGCCACCCT GAACTACATC AGGTTCTGTC    600

TCCTTTCTTT TTTTTTTTTT TTTCTTTTCT TTTTTTGGTT TCTCTGTGTA GTTTTGGAGC    660

CTATCCTGGC ACTAGCTCTG AAGAGCAGGC TGGCCTCGAA CTCAGAGATC AGCCAGCCTC    720

TGCTGGGATT AAAGGTATGC ACCACCAACG CCCCAGGTTT TGTCTCAAAC AAACAAAAAT    780

AACATCAGGA GGTGGTGAGA GGGCTCAGTG GTCACAGGCA TTCTCTGCAA AGCCTGACTC    840

TGAGTTGGAT CCTTTAGAGC TACATGGTTG AGGGAAGAGA ACTGACTCCT GGAAGGTGTC    900

CTCTGGTCCC CACACATAGC TATACACAGC ATGTGCATTC ACACACACTA AATAATGCTA    960

TTTTTAAAAA AATTAAAAAC AACAACAGTT TGGGTTGTGA AAACTAGAAC TAGATAATAG    1020

GTAAGAATCA AGTATCATGT AAATTTGCTT TCAACTCATC CCAAAATTTG TTTTATATTT    1080

CAGTTTTTTT CCTTCCTAGC TTGACTGTGG AGTCTTGTCC GGAAGCAAAT AGTTCCTTTG    1140

CAGATCCCAC ATGTGGACAC CGGACAGTAG GTCCTCAAAT GCTCCTTATT AGGTTGGTTC    1200

AATAATATCA ATTGTTTGTT ACTAGGCAGT GATGTTGTAC ATCTGGAGGA GATCTCTTGA    1260

GCCCATAATC AGGTTATTAG GAATAAATAC TCTAAGGCTA AAAATGTAGC TTAGTGATAA    1320

GAGTGCTTGC CTGGTGTGCT GAGACCCTCG GTTCCATCTC CACAACCCCA TATTCCATTA    1380

CAAAATACCT TTTCACCGTC CCTAGCATTA AGAAACAAAA CAACAAAGAA GTTTTTCTTT    1440

CTTCTGAGAT CCTGCCCGGA GAGGCATTTA AAACTGGCCA GGGCCAAAAA AAAAAAAAAA    1500

AAAAGAAAAA AAAGAAAAGA AAACAGGCTA GGGCCGGCAT GGTGGCGCAC GCCTTTAATC    1560

CCAGCACGCA GGAGGCAGAG GCAGGGCGGA TCTCTGTGAG TTTGAGGTCA GCCTGGTCTA    1620

CCTAGTGAGT TTCAGGGCAC CCAGGGCTAA AGAGACTGTC TCAAAAACAA AACAGCCACA    1680

CAATCAGAAC CACAGCAAAA CGCAGTTATG ATCCTTGGAA CTGTAGGAAT GACAAGCATT    1740

TAAATAATAG GACGAGCCAT TTTTGAGAAG CTCTGATTTC ACAAGTGTCA GGGATGGGCT    1800

CTGGGCGAGT AAGATTGCTA ATGCTGGCCT CTAAATGAGA CCACGTGGAG TTGATTAGAT    1860

TCTTTTCATG TTCCTCGTGC TCTATCAAAT AACTGTACCC AAATACACAC ACACACACAC    1920

ACACACACAA TGCGCGCACA CACAAAATCC TTTTTTAGCT TAAGAAGCCC AGAATCAGAA    1980

GTAAAGCTAA CTGTGGGACT TAAGTATTAT TCTGAACGGA ACTCCCAGGG CGTGAAGCGC    2040

GCTTCAGGCT TCCAGAGAAG CAGCTGGCGC TGGATGGAAT GAACCAAGAG GCCAGCACAG    2100

GGGCAGATCC GTCGAGCTCT CGGCCACCGA GCTGAGCCCT TAGGTTCTGG GGCTGGGAAG    2160

GGTCCCTAGG ATTGTGCACC TCTCCCGCGG GGGACAAGCA GGGGATGGCG GGGCTGACGT    2220

CGGGAGGTGG CCTCCACGGG AAGGGACACC CGGATCTCGA CACAGCCTTG GCAGTGGAGT    2280

CAGGAAGGGT AGGACAGATT CTGGACGCCC TCTTGGCCAG TCCTCACCGC CCCACCCCCG    2340

ATGGAGCCGA GAGTAATTCA TACAAAAGGA GGGATCGCCT TCGCCCCTGG GAATCCCAGG    2400

GACCGTCGCT AAATTCTGGC CGGCCTCCCA GCCCGGAACC GCTGTGCCCG CCCAGCGCGG    2460

CGGGAGGAGC CTGCGCCTAG GGCGGATCGC GGGTCGGCGG GAGAGCACAA GCCCACAGTC    2520

CCCGGCGGTG GGGGAGGGGC GCGCTGAGCG GGGGCCCGGG AGCCAGCGCG GGGCAAACTG    2580

GGAAAGTGGT GTCGTGTGCT GGCTCCGCCC TCTTCCCGAG GGTGGGGGAG AACGGTATAA    2640

AAGTGCGGTA GTCGCGTTGG ACGTTCTTTT TCGCAACGGG TTTGCCGTCA GAACGCAGGT    2700

GAGTGGCGGG TGTGGCCTCC GCGGGCCCGG GCTCCCTCCT TTGAGCGGGG TCGGACCGCC    2760

GTGCGGGTGT CGTCGGCCGG GCTTCTCTGC GAGCGTTCCC GCCCTGGATG GCGGGCTGTG    2820

CGGGAGGGCG AGGGGGGGAG GCCTGGCGGC GGCCCCGGAG CCTCGCCTCG TGTCGGGCGT    2880

GAGGCCTAGC GTGGCTTCCG CCCCGCCGCG TGCCACCGCG GCCGCGCTTT GCTGTCTGCC    2940

CGGCTGCCCT CGATTGCCTG CCCGCGGCCC GGGCCAACAA AGGGAGGGCG TGGAGCTGGC    3000

TGGTAGGGAG CCCCGTAGTC CGCATGTCGG GCAGGGAGAG CGGCAGCAGT CGGGGGGGGG    3060

ACCGGGCCCG CCCGTCCCGC AGCACATGTC CGACGCCGCC TGGACGGGTA GCGGCCTGTG    3120

TCCTGATAAG GCGGCCGGGC GGTGGGTTTT AGATGCCGGG TTCAGGTGGC CCCGGGTCCC    3180

GGCCCGGTCT GGCCAGTACC CCGTAGTGGC TTAGCTCCGA GGAGGGCGAG CCCGCCCGCC    3240

CGGCACCAGT TGCGTGCGCG GAAAGATGGC CGCTCCCGGG CCCTGTAGCA AGGAGCTCAA    3300

AATGGAGGAC GCGGCAGCCC GGCGGAGCGG GGCGGGTGAG TCACCCACAC AAAGGAAGAG    3360

GGCCTTGCCC CTCGCCGGCC GCTGCTTCCT GTGACCCCGT GGTGTACCGG CCGCACTTCA    3420

GTCACCCCGG GCGCTCTTTC GGAGCACCGC TGGCCTCCGC TGGGGGAGGG GATCTGTCTA    3480

ATGGCGTTGG AGTTTGCTCA CATTTGGTGG GTGGAGACTG TAGCCAGGCC AGCCTGGCCA    3540

TGGAAGTAAT TCTTGGAATT TGCCCATTTT GAGTTTGGAG CGAAGCTGAT TGACAAAGCT    3600

GCTTAGCCGT TCAAAGGTAT TCTTCGAACT TTTTTTTTAA GGTGTTGTGA AAACCACCGC    3660

TAATTCAAAT CCAACATG                                                  3678

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(i)序列特征：

(A)长度：20碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线形

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AGGCACAGTC GAGGCTGATC    20

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(i)序列特征：

(A)长度：20碱基对

(B)类型：核酸

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(D)拓扑结构：线形

(ii)分子类型：DNA

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TTCCAGGGTC AAGGAAGGCA    20

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(i)序列特征：

(A)长度：20碱基对

(B)类型：核酸

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(D)拓扑结构：线形

(ii)分子类型：DNA

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GCCACCTGAT CTACAAATGT    20

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(i)序列特征：

(A)长度：20碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线形

(ii)分子类型：DNA

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GAGATACCAG CCTCAAATTC    20

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(i)序列特征：

(A)长度：20碱基对

(B)类型：核酸

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ATGTGACCAT CATTGATGCC    20

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(i)序列特征：

(A)长度：20碱基对

(B)类型：核酸

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GTGACTTTCC ATCCCTTGAA    20

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(A)长度：20碱基对

(B)类型：核酸

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GTTGGAATGG TGACAACATG    20

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(A)长度：20碱基对

(B)类型：核酸

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CAGGTTTTAA AACACCAGTC    20

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(A)长度：20碱基对

(B)类型：核酸

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AATGACCCAC CAATGGAAGC    20

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(i)序列特征：

(A)长度：20碱基对

(B)类型：核酸

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ACAGCAACTG TCTGCCTCAT    20

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(i)序列特征：

(A)长度：17碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线形

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GTAAAACGAC GGCCAGT       17

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(A)长度：19碱基对

(B)类型：核酸

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GGAAACAGCTATGACCATG          19

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(i)序列特征：

(A)长度：20碱基对

(B)类型：核酸

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(D)拓扑结构：线形

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AATTAACCCT CACTAAAGGG        20

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(i)序列特征：

(A)长度：23碱基对

(B)类型：核酸

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GTTAATACGA CTCACTATAG GGC    23

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(i)序列特征：

(A)长度：6碱基对

(B)类型：核酸

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GGCGGG                      6

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(A)长度：6碱基对

(B)类型：核酸

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(D)拓扑结构：线形

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GGGCGG                          6

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TGACGYMR                        8

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(A)长度：13碱基对

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TGGCNNNNNKCCR

13

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(A)长度：26碱基对

(B)类型：核酸

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GATCGCGGCC GCGTTTAAAC GGATCC                                        26

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(B)类型：核酸

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AATTGGATCC GTTTAAACGC GGCCGC                                        26

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(i)序列特征：

(A)长度：77碱基对

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CGTTTAGTGA ACCGTCAGAT CTACATAACA ACATTCCTCC TCTAAAGAAG CCCCAAGCTT  60

GATATCTGCA GAATTCT                                                 77

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(i)序列特征：

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CTAGAGAATT CTGCAGATAT CAAGCTTGGG GCTTCTTTAG AGGAGGAATG TTGTTATGTA  60

GATCTGACGG TTCACTAAAC GAGCT                                        85

(2)SEQ ID NO：24：资料：

(i)序列特征：

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AGTTCAGTCG ACGGCGCGCC AACCCGGGAA TCCGGACGGG ATCTATACAT TGAATCAATA  60

TTGGCA                                                             66

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(i)序列特征：

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ATGTCAGGAT CCACGCGGAA CTCCATATAT GGGCTATGAA CT                     42

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(i)序列特征：

(A)长度：19碱基对

(B)类型：核酸

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GGCTTAGCTC CGAGGAGGG                19

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CGTGACAAGC TTGGTTTTCA CAACAC        26

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(i)序列特征：

(A)长度：4263碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

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(ii)分子类型：DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：

TGAATATTAC CCCTAACACC TGCCACCCCA GTCTTAATCA GTGGTGGAAG AACGGTCTCA    60

GAACTGTTTG TCTCAATTGG CCATTTAAGT TTAATAGTGA AAGACTGGTT AATGATAACA    120

ATGCATCGGA AAACCTTCAG GAGGAAAGGA GAATGTTTTG TGGAACATTT TTGTGTGTGT    180

GGCAGTTTTA AGTTATTAGT TTTCAAAATC AGTACTTTTT AATGGAAACA ACTTGACCAA    240

AAATCTGTCA CAGAATTTTG AGACCCATTA AAATACAAGT TTAATGAGAA GTCTGTCTCT    300

GTTAATGCTG AAGTCATTAC TAAGTGCTTA GCTTAGCAAG GTATGTGGAT GCCCATTTGT    360

GTTCCAAGGG ATTGGACTGT TCATCAGGAC CCAGAGCTGA GTTTCAAGGG CTCAAGAGAT    420

GGCTTATTAC CTGTGGGTGT CTTGAAGGTT CTGGTTGGGA CAAATTAGGA ATGTTTTTGG    480

CAGACATGGT GACTACCTTC ATCTGGGTGA GTTCAGTTGA TTTGTCTTGA GCCTTTGGGG    540

TTTACACAAG TAAATGACAT CATACAGTTA GTGTATTGTT AGTGAATATT AATATATGAG    600

GCAGGCTTTG CTCTAGCAAT TTTAGAACTA GTTTTCAGGA AAGGGTTCAT CTTGTGCATT    660

GGATGTTTGA TTCTATCACT TAGAGTTTAA ACTGAAAGTG CTCAAGAGGT TTTATTTAGG    720

CTGGGATATA AATAAGCCTT TCTGTAGCTT GTAATGGTAT CAGGAATTTA AAAGGCCATC    780

TGGGGCACAA AGATTAAGCA GAAAAGGTAG AAGGTGAGAT TGGGGGACTT TGAGTACTTC    840

ACACACTTTA ATGTGTGAGT GCTTTAGTGC ATATAGTACA ACTGCCAGAT AAGGGCATCC    900

ACATCTGATT GTTTGGAAGG CACCTTGTGG TTTCTGGGAA TTCAGAATTG GGAGAAAAAT    960

GCTCCCAACC GCTGAAGCCC TTGGTAATCT GCAGGGTGTT TATTTAGCAG GAGATAAGGA    1020

CAAAAAGTTA TAGTGTGGAG TTGGTTGAGT TGGTAGATGT CATTACAACA GGTGGTCTTA    1080

AATTGGGTTA GGAGTCACTT TGAAATACCT GGGCCATAAG CAAAGTGGCA TTTTCACCTT    1140

TCAGGAGAAA CTGGTACACT TATCCATTCT ATAGTGCATG CTTGTTCAAT TGGGCTGATG    1200

ACTAAACCGG TGACTAAAGG TTTGTCAGTA TAAATGGATG GGTTGTAGGC AGACGGTGAG    1260

GAATTACTAT ACCTGCAAGG AGTCATTGCC TGATCTGCCT GGAAAGGGGC AGGATTGAGT    1320

CTCAGAACGT GTACACCATA GGATATGGAA AAATTTGTCA CGCCTAGCAT TCAACTTAGT    1380

GGTGTAGCGC CACCTACTGG CACTTTAAAA GCTTAGCATA GAGGAGCATG TGTGTTAGGA    1440

GCTCGGATGG GATCCAGGGC CTCAAGGTTT GCATGTAAAT AAAAGCCCTT TACCAAATTA    1500

ACTACATACC AGCATACATC AGTCCTTTAG TGTTGAAAAA CAGAAGGGAA AGCTAATATA    1560

TATAGTGCTT GCTTTATTTA AGTCTAGCTG ATTACGTGTT TGGTTGCCAG TGTGACTAGT    1620

CTGGAGTTGA ATTTGTCCTC AGACACGTAA AATGGAATTT GGGATTCACA ACACTCTAGT    1680

ATGAGGGACC TAATGGCCTG TACCAGGCAC AAACGTGTCT ATAAACTACA CAAAACGAAG    1740

GAATTTACAG GAATTAGGAA GGTATTCTTA ACATTAAAAC ATTATGGGCA TTTTAAAAAA    1800

AGCTTTGACA GGATTTCTTT GTCATGGCTG TCCTGGAGCT AGTTGTGTAG ACCAGGCTGG    1860

GCTGAAATCT TGTCTGCCTG CCTGGCTTGG ACACTTTTTT ATTATGTATA CAACATTCTG    1920

CTTCCATGTA TATCTGCACA TTAGAAGACG GCACCAGATC TCCTAATGGA TGGTTGTGAG    1980

CCACCATGTG GTTGCTGGGA ATTGAACTCA GGACCTCTGG AAGAGCAGTG CTCTTAACCT    2040

CTGAGCCATC TCCAGCCCCA GCTTGGGCAC ATTTTTAATG GCTGGGAAAT CAAACCCCCT    2100

AGGCCTTCTG TCAGTAATGA AGGGCTTTTG GCTACCGAGA GTAGGATTTA AGGTTATTCG    2160

GAGCTGCAGG TCTGCCTCAG TGCAGGTTTG GGAGTCCAGC ATCTTAGAAA ATGCAGTGAA    2220

GCCAAGCTGA GCTATATTTT GTTTAAAAAA AAAATAAGTG GGTAAAGTGC TGCTGAGCCT    2280

GATGACCAAG CTGGGACACA AGTAGAAGAA CATAGGCCAA TGCTCTATAT TAAAAGCATG    2340

GGTCATTTTT AATGCTCTTG AGAAGGCTAT GCCTACACTA CTCTCAGCCA CCGCAGCGTG    2400

TTTAAATTAA ACTAGTTTGG AAATTTTCTT TGGGGGTAAG CTATTTAACC TAGTGCCTTG    2460

GCAGGTATAC TACTGAACTC TCCTCCTCAT TCCTTTTTGT TTTTTAAGAA TTTCAGTCAG    2520

GCTCAGGCAG CCCTTAAACT TGTGATTAAG CCTGAGAACA GTTACGATTA TGAGCCTATT    2580

AGTATACCGA TCAATATGTG AATTTTTTTG GGATGGGGGT CAGGCCTCCC TGCCTCCCAA    2640

ATACTGGGAC TAAAGGCTGC ACCACCACAA CCTGGCTCTT GAAATACTTT TCTACATTTT    2700

TTGGGGGGCA TGGGTGGGAG AGCAGGGTTT CTCTGTATTA GCCCTGGCTC TCCTGGAACT    2760

CTGTAGACCA GGCTATTCTT GAGCTCAGAT TAGCCTGTCT CTGCCTCCTA AATTCTGGGA    2820

TTAAAGGTGT GTGCTACTGC TGCCTGGCTA CAAAGACATT TTTTTTTTTC TTAAATTTAA    2880

AAACAAAAGT GGTTCTTTTA GAAGGGTGGT TGGTGTTGGC ACATACTCCA AGCACTCAGG    2940

TTTTGAGTTT GTCCCAGGAA TGAAGACTGC ATTACTGCCG CCCCTCCCTG GTAAGGGCTA    3000

CACAGAGAAA TCCTATTTGG AGCCTATCCT GGTAACTCGC TCTGTAGACC AGGCTGGCCT    3060

CGAACTCAAG AGAACCACCT GCCTCTGAAT GCTGGTATTA AGGGCAGGCA CCACCAACAC    3120

CCAGCCTAAA AAATGTCTTT TTTTTAAAGA TTTTTTTTTT TTTTTTTACA GAATAAACAT    3180

TCTGTTTACA ATATTCTGCT TCTATGTATA TCTGCACACT AGAAGAGGGC ACCCGATCTC    3240

ATAATGGATG GTTGTGAGCC ACCAAGTGGT TGCTGGGAAT TGAACTCAGA ACCTCTGGAA    3300

GAGCAGTCAG TGCTCTTAAC CTCTGAGCCA TCTCTCCAGC CCCTAAAAAT GGCTCTTGAG    3360

ATAGGGTCTC AAGTAGTTTG AGACTGAGTT GGCTATATAA ACAAGGCTGG CACATAGCAC    3420

CATGTACAGC TGGGTTTAGT TTACATGGGG TGTTTTTGTC TCTGGAGGCA GGAGGATCAT    3480

TTGAGCATAG GGAGTTAATA GTGAGGTCAT GTTTTATCTA CTCTTCTGAA TTGAGAACTA    3540

AGCTGATGCA AAGCAAGTTT GACTGAAGAA GTCCAGTTTA TGAGAACAAG GGTGGAAACT    3600

AATGTGTCAA AGATGGCCTT GCATGTGTTT TAGATGATGA CCCAGTCACT TGGGAATTAC    3660

TGGATGTGTA AGACCTATAT CTTGACAGGA GTGAACAGTG TCTTATAGGT CCTATATGAA    3720

AGAAATGAGA CATACCCATT TTGTTTCCCC TAAGAATTCA CTTTTCCTAA CCTGGTTCAT    3780

GCTATTTAGG TTATTTTACT TGCAAATCCT AGGTGCTCCC TTACCCAGTA TTGCTTATGT    3840

GGCACCAAAG TCACTCACTC CCATGATTTG CAAGTCTCTG GGAACTTCCA TGACAACCTA    3900

GAATAGCAAC TCAAATACAT TTTCTCAGTA CCAATTTTGA AGAAAAAATA TTTTGCAAAA    3960

TAGCTGTATG GATGGGTACT AAATAGTGAG GTTATCTCCA GAAGGCCTAT GAAGAATTAA    4020

GGTTGAGTTC AGTTGAGTTC AGCAGCAAGT TTAAGGTTCA TCCATTTTTG TACAGTGTTT    4080

TCCTATTACG GTAAGTGTTT TGCCTGCAGG AATATCTGTA CCACATGCTT GCCTGGTACC    4140

TATATCGGCC AGAAGAGGGC TTTGGATCCT CTGGACTTGA ATTACAGATG GGTATTAGCC    4200

ACCATTTAGG TGCTGGGAAT TGAAACCAAG TCCTCTGGAA GAACAGCAAG TGATCGAGTC    4260

GAC                                                                  4263

(2)SEQ ID NO：29：资料：

(i)序列特征：

(A)长度：4695碱基对

(B)类型：核酸

(C)链：单链

(D)拓扑结构：线形

(ii)分子类型：DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：29：

CCCGGGCTGG GCTGAGACCC GCAGAGGAAG ACGCTCTAGG GATTTGTCCC GGACTAGCGA    60

GATGGCAAGG CTGAGGACGG GAGGCTGATT GAGAGGCGAA GGTACACCCT AATCTCAATA    120

CAACCTTTGG AGCTAAGCCA GCAATGGTAG AGGGAAGATT CTGCACGTCC CTTCCAGGCG    180

GCCTCCCCGT CACCACCCCC CCCAACCCGC CCCGACCGGA GCTGAGAGTA ATTCATACAA    240

AAGGACTCGC CCCTGCCTTG GGGAATCCCA GGGACCGTCG TTAAACTCCC ACTAACGTAG    300

AACCCAGAGA TCGCTGCGTT CCCGCCCCCT CACCCGCCCG CTCTCGTCAT CACTGAGGTG    360

GAGAAGAGCA TGCGTGAGGC TCCGGTGCCC GTCAGTGGGC AGAGCGCACA TCGCCCACAG    420

TCCCCGAGAA GTTGGGGGGA GGGGTCGGCA ATTGAACCGG TGCCTAGAGA AGGTGGCGCG    480

GGGTAAACTG GGAAAGTGAT GTCGTGTACT GGCTCCGCCT TTTTCCCGAG GGTGGGGGAG    540

AACCGTATAT AAGTGCAGTA GTCGCCGTGA ACGTTCTTTT TCGCAACGGG TTTGCCGCCA    600

GAACACAGGT AAGTGCCGTG TGTGGTTCCC GCGGGCCTGG CGTCTTTACG GGTTATGGCC    660

CTTGCGTGCC TTGAATTACT TCCACGCCCC TGGCTGCAGT ACGTGATTCT TGATCCCGAG    720

CTTCGGGTTG GAAGTGGGTG GGAGAGTTCG AGGCCTTGCG CTTAAGGAGC CCCTTCGCCT    780

CGTGCTTGAG TTGAGGCCTG GCCTGGGCGC TGGGGCCGCC GCGTGCGAAT CTGGTGGCAC    840

CTTCGCGCCT GTCTCGCTGC TTTCGATAAG TCTCTAGCCA TTTAAAATTT TTGATGACCT    900

GCTGCGACGC TTTTTTTCTG GCAAGATAGT CTTGTAAATG CGGGCCAAGA TCTGCACACT    960

GGTATTTCGG TTTTTGGGGC CGCGGGCGGC GACGGGGCCC GTGCGTCCCA GCGCACATGT    1020

TCGGCGAGGC GGGGCCTGCG AGCGCGGCCA CCGAGAATCG GACGGGGGTA GTCTCAAGCT    1080

GGCCGGCCTG CTCTGGTGCC TGGCCTCGCG CCGCCGTGTA TCGCCCCGCC CTGGGCGGCA    1140

AGGCTGGCCC GGTCGGCACC AGTTGCGTGA GCGGAAAGAT GGCCGCTTCC CGGCCCTGCT    1200

GCAGGGAGCT CAAAATGGAG GACGCGGCGC TCGGGAGAGC GGGCGGGTGA GTCACCCACA    1260

CAAAGGAAAA GGGCCTTTCC GTCCTCAGCC GTCGCTTCAT GTGACTCCAC GGAGTACCGG    1320

GCGCCGTCCA GGCACCTCGA TTAGTTCTCG AGCTTTTGGA GTACGTCGTC TTTAGGTTGG    1380

GGGGAGGGGT TTTATGCGAT GGAGTTTCCC CACACTGAGT GGGTGGAGAC TGAAGTTAGG    1440

CCAGCTTGGC ACTTGATGTA ATTCTCCTTG GAATTTGCCC TTTTTGAGTT TGGATCTTGG    1500

TTCATTCTCA AGCCTCAGAC AGTGGTTCAA AGTTTTTTTC TTCCATTTCA GGTGTCGTGA    1560

AAACTACCCC TAAAAGCCAA AATGGGAAAG GAAAAGACTC ATATCAACAT TGTCGTCATT    1620

GGACACGTAG ATTCGGGCAA GTCCACCACT ACTGGCCATC TGATCTATAA ATGCGGTGGC    1680

ATCGACAAAA GAACCATTGA AAAATTTGAG AAGGAGGCTG CTGAGGTATG TTTAATACCA    1740

GAAAGGGAAA GATCAACTAA AATGAGTTTT ACCAGCAGAA TCATTAGGTG ATTTCCCCAG    1800

AACTAGTGAG TGGTTTAGAT CTGAATGCTA ATAGTTAAGA CCTTACTTAT GAAATAATTT    1860

TGCTTTTGGT GACTTCTGTA ATCGTATTGC TAGTGAGTAG ATTTGGATGT TAATAGTTAA    1920

GATCCTACTT ATAAAAGTTT GATTTTTGGT TGCTTCTGTA ACCCAAAGTG ACCAAAATCA    1980

CTTTGGACTT GGAGTTGTAA AGTGGAAACT GCCAATTAAG GGCTGGGGAC AAGGAAATTG    2040

AAGCTGGAGT TTGTGTTTTA GTAACCAAGT AACGACTCTT AATCCTTACA GATGGGAAAG    2100

GGCTCCTTCA AGTATGCCTG GGTCTTGGAT AAACTGAAAG CTGAGCGTGA ACGTGGTATC    2160

ACCATTGATA TCTCCTTGTG GAAATTTGAG ACCAGCAAGT ACTATGTGAC TATCATTGAT    2220

GCCCCAGGAC ACAGAGACTT TATCAAAAAC ATGATTACAG GGACATCTCA GGTTGGGATT    2280

AATAATTCTA GGTTTCTTTA TCCCAAAAGG CTTGCTTTGT ACACTGGTTT TGTCATTTGG    2340

AGAGTTGACA GGGATATGTC TTTGCTTTCT TTAAAGGCTG ACTGTGCTGT CCTGATTGTT    2400

GCTGCTGGTG TTGGTGAATT TGAAGCTGGT ATCTCCAAGA ATGGGCAGAC CCGAGAGCAT    2460

GCCCTTCTGG CTTACACACT GGGTGTGAAA CAACTAATTG TCGGTGTTAA CAAAATGGAT    2520

TCCACTGAGC CACCCTACAG CCAGAAGAGA TATGAGGAAA TTGTTAAGGA AGTCAGCACT    2580

TACATTAAGA AAATTGGCTA CAACCCCGAC ACAGTAGCAT TTGTGCCAAT TTCTGGTTGG    2640

AATGGTGACA ACATGCTGGA GCCAAGTGCT AACGTAAGTG GCTTTCAAGA CCATTGTTAA    2700

AAAGCTCTGG GAATGGCGAT TTCATGCTTA CACAAATTGG CATGCTTGTG TTTCAGATGC    2760

CTTGGTTCAA GGGATGGAAA GTCACCCGTA AGGATGGCAA TGCCAGTGGA ACCACGCTGC    2820

TTGAGGCTCT GGACTGCATC CTACCACCAA CTCGTCCAAC TGACAAGCCC TTGCGCCTGC    2880

CTCTCCAGGA TGTCTACAAA ATTGGTGGTA AGTTGGCTGT AAACAAAGTT GAATTTGAGT    2940

TGATAGAGTA CTGTCTGCCT TCATAGGTAT TTAGTATGCT GTAAATATTT TTAGGTATTG    3000

GTACTGTTCC TGTTGGCCGA GTGGAGACTG GTGTTCTCAA ACCCGGTATG GTGGTCACCT    3060

TTGCTCCAGT CAACGTTACA ACGGAAGTAA AATCTGTCGA AATGCACCAT GAAGCTTTGA    3120

GTGAAGCTCT TCCTGGGGAC AATGTGGGCT TCAATGTCAA GAATGTGTCT GTCAAGGATG    3180

TTCGTCGTGG CAACGTTGCT GGTGACAGCA AAAATGACCC ACCAATGGAA GCAGCTGGCT    3240

TCACTGCTCA GGTAACAATT TAAAGTAACA TTAACTTATT GCAGAGGCTA AAGTCATTTG    3300

AGACTTTGGA TTTGCACTGA ATGCAAATCT TTTTTCCAAG GTGATTATCC TGAACCATCC    3360

AGGCCAAATA AGCGCCGGCT ATGCCCCTGT ATTGGATTGC CACACGGCTC ACATTGCATG    3420

CAAGTTTGCT GAGCTGAAGG AAAAGATTGA TCGCCGTTCT GGTAAAAAGC TGGAAGATGG    3480

CCCTAAATTC TTGAAGTCTG GTGATGCTGC CATTGTTGAT ATGGTTCCTG GCAAGCCCAT    3540

GTGTGTTGAG AGCTTCTCAG ACTATCCACC TTTGGGTAAG GATGACTACT TAAATGTAAA    3600

AAAGTTGTGT TAAAGATGAA AAATACAACT GAACAGTACT TTGGGTAATA ATTAACTTTT    3660

TTTTTAATAG GTCGCTTTGC TGTTCGTGAT ATGAGACAGA CAGTTGCGGT GGGTGTCATC    3720

AAAGCAGTGG ACAAGAAGGC TGCTGGAGCT GGCAAGGTCA CCAAGTCTGC CCAGAAAGCT    3780

CAGAAGGCTA AATGAATATT ATCCCTAATA CCTGCCACCC CACTCTTAAT CAGTGGTGGA    3840

AGAACGGTCT CAGAACTGTT TGTTTCAATT GGCCATTTAA GTTTAGTAGT AAAAGACTGG    3900

TTAATGATAA CAATGCATCG TAAAACCTTC AGAAGGAAAG GAGAATGTTT TGTGGACCAC    3960

TTTGGTTTTC TTTTTTGCGT GTGGCAGTTT TAAGTTATTA GTTTTTAAAA TCAGTACTTT    4020

TTAATGGAAA CAACTTGACC AAAAATTTGT CACAGAATTT TGAGACCCAT TAAAAAAGTT    4080

AAATGAGAAA CCTGTGTGTT CCTTTGGTCA ACACCGAGAC ATTTAGGTGA AAGACATCTA    4140

ATTCTGGTTT TACGAATCTG GAAACTTCTT GAAAATGTAA TTCTTGAGTT AACACTTCTG    4200

GGTGGAGAAT AGGGTTGTTT TCCCCCCACA TAATTGGAAG GGGAAGGAAT ATCATTTAAA    4260

GCTATGGGAG GGTTTCTTTG ATTACAACAC TGGAGAGAAA TGCAGCATGT TGCTGATTGC    4320

CTGTCACTAA AACAGGCCAA AAACTGAGTC CTTGGGTTGC ATAGAAAGCT TCATGTTGCT    4380

AAACCAATGT TAAGTGAATC TTTGGAAACA AAATGTTTCC AAATTACTGG GATGTGCATG    4440

TTGAAACGTG GGTTAAAATG ACTGGGCAGT GAAAGTTGAC TATTTGCCAT GACATAAGAA    4500

ATAAGTGTAG TGGCTAGTGT ACACCCTATG AGTGGAAGGG TCCATTTTGA AGTCAGTGGA    4560

GTAAGCTTTA TGCCATTTTG ATGGTTTCAC AAGTTCTATT GAGTGCTATT CAGAATAGGA    4620

ACAAGGTTCT AATAGAAAAA GATGGCAATT TGAAGTAGCT ATAAAATTAG ACTAATTACA    4680

TTGCTTTTCT CCGAC                                                     4695

Claims (48)

1.含仓鼠EF-1α转录调节DNA的被纯化和被分离的DNA。

2.权利要求1的DNA，其中所述调节DNA包括SEQ ID NO：1给出的核酸序列。

3.权利要求1的DNA，其中调节DNA包括SEQ ID NO：1给出的核酸序列的一部分，它能促进可操作地连接到调节DNA的基因的转录。

4.权利要求3的DNA，其中调节DNA包括SEQ ID NO：1给出核苷酸的从约2114位核苷酸到约3656位核苷酸。

5.包含权利要求1到4的任何之一的DNA的宿主细胞，其中所述DNA没有被可操作地连接到EF-1α编码序列。

6.含权利要求1到4的任何之一的DNA的载体，其中所述DNA没有被可操作地连接到EF-1α编码序列。

7.用权利要求6的载体转化或转染的宿主细胞。

8.含仓鼠EF-1α调节DNA的嵌合多核苷酸，所述DNA被可操作地连接到编码蛋白质的DNA序列，所述DNA序列编码仓鼠EF-1α的蛋白质之外的蛋白质。

9.权利要求8的嵌合多核苷酸，其中调节DNA包括SEQ ID NO：1给出的核酸序列。

10.权利要求8的嵌合多核苷酸，其中调节DNA包括SEQ ID NO：1给出的核酸序列的一部分，其中该部分能促进被可操作地连接到调节DNA的基因的转录。

11.权利要求10的嵌合多核苷酸，其中调节DNA包含SEQ ID NO：1给出的核苷酸中从约2114位到约3656位核苷酸序列。

12.权利要求8的嵌合多核苷酸，其中所述编码蛋白质的DNA序列编码对仓鼠细胞是内源的非EF-1α蛋白质。

13.权利要求8的嵌合多核苷酸，其中所述DNA序列编码对仓鼠细胞是异源的蛋白质。

14.用权利要求8到13任何之一的嵌合多核苷酸转化或转染的宿主细胞。

15.包含权利要求8到13任何之一的嵌合多核苷酸的表达质粒。

16.权利要求15的表达质粒，其进一步包含SEQ ID NO：28给出的核酸序列。

17.权利要求16的表达质粒，其中根据SEQ ID NO：28的核酸序列位于嵌合多核苷酸的3’侧。

18.用权利要求15的表达质粒转化或转染的宿主细胞。

19.用权利要求16或17的表达质粒转化或转染的宿主细胞。

20.质粒pDEF2。

21.质粒pDEF14。

22.质粒pDEF1./ICM3H.2。

23.质粒pNEF1/ICM3L.3。

24.质粒pDEF1/F2GH.1。

25.质粒pNEF1/F2GL.1。

26.质粒pDEF1/CTN.1。

27.质粒pDEF2/HPH.4。

28.质粒pDEF10/MDC.1。

29.用权利要求20到28任何之一的表达质粒转化或转染的宿主细胞。

30.提高目的基因在宿主细胞中转录的方法，包括在被可操作地连接到目的基因的位置将含仓鼠EF-1α调节DNA整合到所述宿主细胞基因组的步骤。

31.权利要求30的方法，其中所述被整合的DNA进一步包括引导序列。

32.权利要求30的方法，其中所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。

33.权利要求32的方法，其中所述目的基因对中国仓鼠卵巢宿主细胞是内源的。

34.权利要求30的方法，其中所需要的基因对中国仓鼠卵巢细胞是异源的并且被稳定整合到中国仓鼠卵巢细胞基因组DNA中。

35.一种在宿主细胞中制备蛋白质的方法，其包括将嵌合多核苷酸导入宿主细胞，所述嵌合多核苷酸包含仓鼠EF-1α调节DNA，所述DNA可操作地连接到编码蛋白质的DNA序列，所述编码蛋白质的DNA序列编码仓鼠EF-1α之外的蛋白质，其中仓鼠EF-1α调节DNA选自：

(a)包含SEQ ID NO：1给出的核酸序列的DNA；

(b)包含SEQ ID NO：1给出的核酸序列的一部分的DNA，所述部分能够促进被可操作地连接到调节DNA的基因的转录；

(c)包含SEQ ID NO：1给出的核苷酸序列的从2114位核苷酸到3656位核苷酸的DNA；

(d)保藏号为ATCC 98398的质粒pDEF14中的11.7kb仓鼠EF-1α调节DNA序列；

(e)包含SEQ ID NO：28给出的核酸序列的DNA；

(f)在一定条件下与SEQ ID NO：1给出的DNA杂交的仓鼠调节DNA序列，所述条件包括在65℃下在含2X SSC和0.1％SDS的缓冲液中最终清洗；和

(g)包含SEQ ID NO：1起始ATG密码子5’侧约1.56kb序列的DNA。

36.权利要求35的方法，其中调节DNA包含SEQ ID NO：1给出的核酸序列。

37.权利要求35的方法，其中调节DNA包含SEQ ID NO：1给出的核酸序列的一部分，所述部分能够促进被可操作地连接到调节DNA的基因的转录。

38.权利要求35的方法，其中调节DNA包含SEQ ID NO：1给出的核苷酸序列的从2114位核苷酸到3656位核苷酸。

39.权利要求35的方法，其中调节DNA包含保藏号为ATCC 98398的质粒pDEF14中的11.7kb仓鼠EF-1α调节DNA序列。

40.权利要求35的方法，其中调节DNA包含SEQ ID N0：28给出的核酸序列。

41.权利要求35的方法，其中调节DNA包含在一定条件下与SEQ IDNO：1给出的DNA杂交的仓鼠调节DNA序列，所述条件包括在65℃下在含2X SSC和0.1％SDS的缓冲液中最终清洗。

42.权利要求35的方法，其中调节DNA包含SEQ ID NO：1起始ATG密码子5’侧约1.56kb序列的DNA。

43.权利要求35的方法，其中蛋白质是抗体轻链。

44.权利要求35的方法，其中蛋白质是抗体重链。

45.权利要求35的方法，其中蛋白质对仓鼠细胞是外源的。

46.权利要求35的方法，其中蛋白质对仓鼠细胞是内源的。

47.权利要求35的方法，其中宿主细胞是体外培养的哺乳动物细胞。

48.权利要求35的方法，其进一步包括在宿主细胞中表达蛋白质。