CN1055502C - 表达多肽的方法 - Google Patents

Abstract

用含有编码生理学活性多肽之结构基因的重组DNA转化蓝绿藻细胞，以在蓝绿藻细胞中表达该多肽的方法，特征在于所用的重组DNA含有编码生理学活性多肽的结构基因、位于结构基因上游的Anacystis nidulans RuBisCO基因之转录起始区，以及位于结构基因下游的RuBisCO基因的转录终止区。根据本方法，可使用蓝绿藻有效地表达生理学活性多肽。

Description

表达多肽的方法

本发明涉及表达多肽的方法，特别是涉及使用蓝绿藻细胞作为宿主，并用含有编码多肽之结构基因的载体转化这些宿主以有效地表达该生理学活性多肽的方法。

蓝绿藻(也称蓝藻细菌)，如大肠杆菌等是没有核膜的原核细胞。但蓝绿藻具有与较高等植物特别是红藻相似的光合作用系统，可利用太阳光作为能源，由水和二氧化碳及少量无机盐生物合成有机物质，并可大量自养增殖。

另外，很久以前就知道许多种蓝绿藻(如螺旋藻、隐杆藻、念珠藻等)可供食用，且一直未见有关于它们的致病性及可在动物体内寄生的报导。因此，蓝绿藻很适于用作基因重组的宿主，并具有极好的安全性。

如果能够将编码有用生理学活性肽的基因导入蓝绿藻内并大量表达之，便有可能以低成本、低能耗和更便宜的来源生产食物、功能性食品或饲料，而不会象生产农作物那样受到季节和气候的影响，另外还可望能够生产药品，不包括在医药中但可用于治序目的的化学物质、以及化妆品等的原料。

近年来，使用蓝绿藻的宿主一载体系统已得到迅速发展，并已报导使用Anacystis nidulans R2(SynechococcusPCC7942)、Agmenellus quadruplicatum(Synechococcus  PCC 7002)、SynechocystisPCC 6803和Anabaena PCC 7120等菌种表达许多异源蛋白质基因〔参见G.D.Price and M.R.Badger，Plant Physiol，91：505-513(1989)表达人碳酸酐酶和大肠杆菌的lac IQ 阻遏蛋白；R.deLorimier et al.，J.Bacteriol，169：1830-1835(1987)表达较高等藻类Cyanophoraparadoxa的别藻蓝蛋白；I.V.Elanskaya and I.B.Morzunova，Mol.Genet.Mikrobiol.Virusol，0(9)：7-11(1989)表达Bacillusamyloliquefaciens A50的α淀粉酶；N.Tandeau deMarsac et al.，Mol.Gen.Genet.209：396-398(1987)表达B.shaericus 1593M的杀昆虫蛋白；C.Angsuthanasombat and S.Panyim，ApplEnviron.Microbid.55：2428-2430(1989)，表达B.thuringiensis var.israelensis的130KDaδ-内毒素；Y.Cai and C.P.Wolk，J.Bacteriol，172：3138-3145(1990)表达B.subtilis的果聚糖生成酶；G.Schmetterer etal.，J.Bacteriol，167：411-414(1986)表达Vibrio harvei和V.fischeri的荧光素酶；D.J.Scanlan et al.，Gene 90：43-49(1990)，M.R.Schaefer and S.S.Golden，J.Bacteriol，171：3973-3981(1989)和J.S.Buzby et al.，Science 230：805-807(1985)表达Escherichia coli的β半乳糖苷酶；D.A.Lightfoot et al.，Plant Mol.Biol，11：335-344(1988)表达Escherichia coli的谷氨酸脱氢酶； R.C.Murphy et al.，J.Bacteriol，172：967-976(1990)表达Escherichia coli的recA蛋白；M.Y.Gruber et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2608-2612(1990)表达Escherichia coli的Mn超氧化物歧化酶；J.Pierce et al.，Proc，Natl.Acad.Sci.USA86：5753-5757(1989)光合细菌Rhodospiri-llum rubrum之RuBis CO的表达；D.Friedbergand J.Seijffers，Mol.Gen.Genet.203：505-510(1986)λ噬菌体之cI阻遏蛋白的表达〕。

但在上述许多报导中，都是使用宿主基因本身的转录起始区来表达编码异源蛋白质的基因，而且所表达的目的蛋白质的量很小。另外，在涉及使用tac启动子或OLPL启动子表达异源蛋白质(人碳酸酐酶、λ噬菌体cI阻遏蛋白)的报导中提到，为了提高所需蛋白质的表达量，例如也曾试图将编码这些启动子之调控蛋白的基因导入同一载体中。然而，就报导中揭示的人碳酸酐酶表达量来看，表达量实际很小，只占可溶性蛋白质的大约0.3％，远未达到预期的水平。

另一方面，有的报导中提到用蓝绿藻宿主的转录起始区作为表达异源蛋白质(大肠杆菌的β半乳糖苷酶)的转录起始区〔Gene 90：43-49(1990)and J.Bacteriol.171：3973-3981(1989)〕。然而，在每种情况下因为将β半乳糖苷酶引入蓝绿藻的结构基因中，所以β半乳糖苷酶基因是作为融合蛋白质表达的，从而对于所需异源蛋白质的生产又带来新的问题。

因此，为了使用蓝绿藻作为宿主细胞有效地表达生理学活性蛋白质，本发明人首先将Anacystic nidulans 之RuBis CO基因的转录起始区和转录终止区连接到待表达的结构基因上，并使用所得连接产物对可在蓝绿藻中发挥功能之操纵子的制备问题作了广泛的研究。结果发现，可使用RuBis CO的转录起始区和转录终止区有效地表达该结构基因，并可根据向其中引入的已制备之操纵子的载体的种类来影响表达量。

此外，还发现从有些报导中已提到的大肠杆菌等宿主中之SD序列到ATG(转译起始位点)的碱基数目可影响结构基因的表达，然后可借助优化碱基数目来显著提高其表达量，从而完成了本发明。

本发明提供了用携带编码多肽之结构基因的载体DNA转化蓝绿藻细胞，以在蓝绿藻细胞中表达生理学活性多肽的方法，特征在于所用的载体DNA含有编码生理学活性多肽的结构基因位于结构基因上游的Anacystis nidulans RuBis CO基因的转录起始区，以及位于结构基因下游的RuBis CO基因的转录终止区。

现对本发明的表达方法详述如下。〔1〕载体DNA的产生

制备载体DNA的特定方法如后面的实施例中所述，其中将编码生理学活性多肽的结构基因(为方便起见以下有时称之为“有用结构基因”)连接到核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCO)〔参见K.Shinozaki and M.Sugiura，Mol.Gen.Genet.200：27-32(1985)，Masanobu Kumano and Masahiro Sugiura，Iden(heredity)38(12)：26-31(1984)等〕的转录起始区、类SD序列和转录终止区上。

(1)Rubis CO转录起始(启动子)区的制备

可按常规方法(T.Maniatis et al.，MolecularCloning-A Labrotory Manual，published byCold Spring Harbor Laboratory)用限制性核酸内切酶EcoRI、SacI和PstI切割K.Shinozaki等人文章〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：4050-4054(1983)〕中公开的质粒pANE18(其中在pBR322的EcoRI位点插入了一个含有RuBisCO启动子区的约5.6MDa的EcoRI片段)，从中得到含有RuBis CO启动子的DNA片段。

(2)RuBis CO转录终止(终止子)区的制备

可使用限制性核酸内切酶PstI和Eco52I切割Shinozaki等人的文章〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA80：4050-4054(1983)〕中公开的质粒pANP1155(其中在pBR322的PstI位点插入了含有RuBis CO终止子区域的约1.5MDa的PstI片段)，从中得到RuBis CO的终止子区域。

(3)类SD序列的制备

在有用结构基因的上游和启动子区下游之间，将作为核糖体识别序列的类SD序列导入用于本发明的重组DNA中。

类SD序列最好是与宿主蓝绿藻的核糖体RNA互补的，且在使用Anacystis nidulans 6301作为蓝绿藻宿主细胞株时，可用碱基序列GGAG作为类SD序列。但类SD序列不仅限于此，也可使用其他已知可作为类SD序列的碱基序列。这些类SD序列的碱基数目很少，一般可用合成方法制得。

另外，类SD序列通常定位在ATG(转译起始位点)的前面，而且从类SD序列到ATG的长度(碱基数目)可能对有用结构基因的表达有影响，因此，可望根据宿主种类、结构基因的碱基序列等因素调整其长度，从而使表达量达到最佳化。该长度依据宿主蓝绿藻的种类、结构基因的碱基序列等因素有所不同，但一般是大约3到10个碱基，可根据宿主结构基因的碱基序列等因素实验确定最适长度。

通常可使用ATG(转译起始位点)前面的序列或包括ATG的序列制备含类SD序列的DNA片段，并可按照已知的基因操作技术很容易地合成该类SD DNA片段〔参见“Zoku SeikagakuJikken Koza I Idenshi Kenkyu Ho II”(Lectures of Biochemical Experiments Imethods for Studying Genes II)，edited byJapan Society for Biochemistry andpublished by Tokyo Kagaku Dojin Co.，Ltd(1987)〕。

(4)有用结构基因的制备

能够用本发明的方法表达的生理学活性多肽(为方便起见下文中有时称之为“有用肽”)不仅限于特定的肽，各种有用的肽均可按照本发明的方法得以有效表达。

可按本发明方法表达的有用肽包括SOD，(人、小鼠等的)白细胞介素、人的α、β或γ干扰素、人胰岛素、人肿瘤坏死因子(TNF)、人细胞集落剌激因子(CSF)、人组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)、人尿激酶原、尿激酶、人凝血因子(I-V，VII-VIII)、人红细胞生成素、人神经生长因子、人心房钠尿肽(α-hANP)、人胰泌胰蛋白酶抑制剂、(人、牛、猪、鸡、鱼)生长激素、生长激素释放因子、抗体(免疫球蛋白)、杀昆虫蛋白(BT蛋白等)、种子储存蛋白(云扁豆蛋白、玉米醇溶蛋白、麦谷蛋白、大豆球蛋白、大麦醇溶蛋白等)等，以及与这些有用肽有基本上相同氨基酸序列的多肽。

本文中所说的与有用肽具有基本上相同氨基酸序列的多肽，包括有用肽本身及与有用肽类似的多肽，其中在基本上没有丧失有用肽之固有活性的情况下有用肽的部分氨基酸序列可被其他氨基酸取代。

因此，如以下文实施例中描述的人SOD为例，“基本上与人SOD有相同氨基酸序列的多肽”包括除具有Jabusch等人〔Biochemistry，19：2310-2316(1980)和Barra等人〔FEBS Letters 120：53-55(1980)〕所报导之氨基酸序列的hSOD多肽外，还包括在基本上不丧失hSOD之酶促活性的情况下，其部分氨基酸序列(一般为5个或更少，较好是2个或更少)被其他氨基酸(一种或多种)取代的hSOD多肽类似物。具体实例是：

(a)hSOD

(b)其中hSOD的第6个半胱氨基酸残基(Cys)被丙

   氨酸残基(Ala)取代的多肽(参见日本专利公开号

   156884/1990)。

(c)其中hSOD的第111位半胱氨酸残基被丝氨酸残基

   (Ser)取代的多肽(参见已出版的日本专利公开号

   130684/1987)

(d)其中第6位半胱氨酸残基被丙氨酸残基取代，且第111

   位半胱氨酸残基被丝氨酸残基取代的多肽(参见日本专

   利公开号273473/1988)。

可从具有产生有用肽之能力的动物、植物或微生物供体来源提取并克隆或用化学合成方法制得编码有用肽的有用结构基因。

(5)能够表达的含有用结构基因之操纵子的构建

按照产生能在蓝绿藻细胞中表达之操纵子的已知方法，以(启动子区)-(含类SD序列之DNA片段)-(转译起始密码子，ATG)-(有用结构基因)-(转译终止密码子)-(终止子区)的顺序，将如此制得的RuBis CO启动子区、含类SD序列的DNA片段和RuBis CO终止子区、连同编码生理学活性多肽的有用结构基因连接在一起。

启动子和类SD序列的数目不一定分别是一个，而有可能在同一序列中使用两个或多个启动子，和/或使用两个或多个类SD序列。

有可能根据基本上取决于宿主和/或操纵子种类等因素的状态，用上述含有用结构基因的操纵子转化宿主，但通常是一旦将操纵子导入适用于该宿主的载体(质粒)中，即可将其用于转化。

(6)载体

可使用多种适用于蓝绿藻细胞的载体作为向其中导入上述能够被表达之操纵子的载体。这类载体包括pUC104和pUC105〔C.J.Kuhlemeier et al.，Mol.Gen.Genet.184：249-254(1981)〕，pLS103〔L.A.Sherman and P.van de Putte，J.Bacteriol，150：410-413(1982)〕、pDPL13〔S.Gendel et al.，J.Bacteriol，156：148-154(1983)〕、pUC303〔C.J.Kuhlemeieret al.，Plasmid 10：156-163(1983)〕，pSG111〔S.S.Golden and L.A.Sherman，J.Bacteriol，155：966-972(1983)〕、pPUC29〔C.J.Kuhlemeier et al.，Gene 31：109-116(1984)〕、pPLANBal〔D.E.Landenbach et al.，Mol.Gen.Genet，199：300-305(1985)〕、pBAS18〔K.Shinozakiet al.，Gene19：221-223(1982)〕等。

另外必要时也可由质粒和病毒衍生得到这样的载体，例如可有利地使用能够在大肠杆菌和蓝绿藻细胞中复制的穿梭载体pBAX18、pBAX20等，这些穿梭载体是本发明人使用衍生于Ancysticnidulans之质粒pBA1的OriA区、质粒pUC的多克隆区和大肠杆菌Co1E1质粒的OriE区产生的(参见下述实施例和本申请人于1991年5月8日提交的发明名称为“新的质粒”的专利申请(日本专利申请号67774/1992)〕。

(7)载体DNA的构建

可按已知的基因操作技术将上面(5)中所述的能被表达并含有有用结构基因的操纵子引入上面(6)中所述的载体(质粒)中。

例如，可将按上面(5)中所述方法，使用编码hSOD的有用结构基因制备的hSOD操纵子DNA片段与例如用核酸内切酶EcoRI切割可在Anacystis nidulans细胞中复制的pBAS18或pBAX18的EcoRI识别位点，而得到的DNA片段相连接，然后用T₄ DNA连接酶处理，以得到其中已引入了有用结构基因的hSOD表达载体。插入载体中的操纵子的数目不一定是1个，只要处于相同方向，有可能向其中导入2、3、4或更多个操纵子的拷贝。

可按常规方法(T.Maniatis et al.，MolecularCloning-A Laboratory Manual，Published byCold Spring Harbor Laboratory)将如此得到的hSOD表达载体克隆到大肠杆菌中。〔2〕转化

可用如此产生之载体DNA转化的蓝绿藻细胞例如可以是：

Anacystis nidulans 6301(Synechococcus

PCC6301)，

Anacystis nidulans R2(Synechococcus

PCC7942)，

Synechococcus PCC7002，

Synechococcus PCC 7418(Aphanothece

halophitica)Synechocystis PCC6803，

Synechocystis PCC6714，

Spirulina platensis，

Anabaena PCC7120(Nostoc PCC7120)，

Nostoc PCC7119(Anabaena PCC7119)

Calothrix PCC7601等。

可按照例如R.D.Porter〔CRC CriticalReviews in Microbiology 13(2)：111-132〕、D.A.Lightfoot等人〔J.GeneralMicrobiology 134：1509-1514(1988)〕、S.S.Golden等人〔J.Bacteriol，158：36-42(1984)〕、H.Daniell等人〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：2546-2550(1986)〕、T.Matsunage等人〔Appl.Biochem.Biotechnol.24/25：151-160(1990)〕等所述的已知方法用上述载体DNA转化这些蓝绿藻宿主细胞。

例如可按D.A.Lightfoot等人的方法将hSOD表达载体转化到Anacystis nidulans中。

在根据氨苄青霉素抗性等选择标志选择所得转化体后，可用免疫印迹法、Ouchterlony法、对聚丙烯酰胺凝胶中SOD活性物质染色及检测SOD活性等方法进一步证实由所需转化体产生的目的产物。

可在适于宿主细胞增殖的已知培养基中，于光照下培养如此得到的转化体，以表达生理学活性多肽。所用培养基优选含有适当量用于选择性增殖转化体的药物，如氨苄青霉素。

当所用转化体宿主是Anacystis nidulans时，适当的培养基是BG-11培养基、MDM培养基等，适当的培养温度(作为一种培养条件)一般为10至35℃，优选25至30℃。另外，培养基的适当PH一般在7-8之间，适当的照度为500至5,000lux。培养可在这些条件下进行大约5至20天。另外可在静止或搅拌下进行培养。

根据本发明的上述方法，可以以高表达效率得到有用肽，并可按已知方法分离并回收蓝绿藻细胞中产生的有用肽。例如，可用离心法从培养液中收集细胞，破碎细胞后，可用下列一种或多种方法从中分离和回收目的产物，例如盐析、透析、离子交换层析、凝胶过滤层析、色层聚焦、疏水相互作用层析、亲合层析及电泳等方法。

可将如此制得的生理学活性多肽用作医药，不包括在临床药物中，但可用于医学治疗的化学物质、化妆品等。

另外，在培养后在光照下培养的转化之蓝绿藻可经离心收集等方法，并将其用作食品、饲料或功能性食品。

用于本发明重组DNA中的RuBis CO启动子可在光控制下诱导位于其下游之有用结构基因的大量表达，因此该启动子具有不必使用那些在以大肠杆菌的lac、tac或trp启动子等诱导表达时通常使用的昂贵药物之优点。

附图说明

图1显示Anacystis nidulans.RuBis CO表达调节区(EcoRI-PstI片段)的制备过程。

图2是为合成含类SD序列区(PstI-HindIII片段)而化学合成的CO寡核苷酸的碱基序列。

图3显示含类SD序列区域(PstI-HindIII片段)的制备过程。

图4显示RuBis CO表达调节区(EcoRI-HindIII片段)的制备过程。

图5显示RuBis CO转录终止区的制备和pUC-hSODt质粒的构建过程。

图6显示hSOD操纵子的产生。

图7是hSOD操纵子(SOD7)的碱基序列。

图8显示载体质粒pBAX18和20的构建。

图9显示SOD之活性染色的结果。

图10显示Western印迹分析的结果。

图11显示Ouchterlony试验的结果。

以下借助实施例更具体地描述本发明。

实施例1

I、表达调节区的制备

(I～1)克隆pANE18

将4ng(1μl)pANE18(参见K.Shinozakiet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80：4050-4054(1983)，其中已在pBR322的EcoRI位点插入了一个含有Anacystis nidulans6301核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶基因之启动子区的5,600bp片段)加到100μl用50mM细胞处理之大肠杆菌HB101菌株的细胞悬液中，并轻轻混匀该混合物。将混合物置于冰水浴中保温30分钟，再在42℃下保温3分钟，以使细胞摄入DNA。向该悬浮液中加入1ml LB培养基(10g/L细菌胰酶解胨、5g/L酵母浸膏、10g/L NaCl)，并在37℃下振荡保温1小时。分别取100μl和200μl该细胞悬浮液并铺敷在LB琼脂培养基(含有50μg/ml氨苄青霉素和1.5％琼脂)上。将该平皿置于37℃下保温24小时，然后分离所得菌落。

取1白金耳接种分离的菌落到2ml 2YT液体培养基(含有16g/L细菌胰酶解胨、10g/L酵母浸膏、5g/L NaCl和50μg/ml氨苄青霉素)中，并于37℃保温过夜。取1ml培养物加到200ml 2YT液体培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素)中，并在37℃下保温过夜。以8,000rpm离心10分钟以收集培养的细胞，并按SDS-碱方法(B.Perbal，A.Practical Guide to Molecular Cloning，pp273-276，John Wiley and Sons Inc.)由其中大量制备质粒DNA。

〔I-2)SacI-SphI片段的分离(参见图1)

在Eppendorf管(容积1.5ml)中加入10μl(10μg)大量制备的pANE18DNA、10μl10× Low缓冲液(100mM Tris-HCl(PH7.5)、100mMMgCl₂、10mM二硫苏糖醇(DTT))和50单位SacI(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，加入无菌水至总体积为100μl、并于37℃下使混合物反应3小时。反应后，加入15μl10× High缓冲液(500mM Tris-HCl(PH7.5)、100mM MgCl₂、10mM DTT、100mMNaCl)、50单位SphI(Takara Shuzo Co.，Ltd.)和30μl无菌水，再于37℃下继续反应3小时。反应后，加入1/10体积3M乙酸钠(PH4.8)和2.5体积乙醇，在-20℃下将此混合物放置2小时或更长时间。以15,000rpm，4℃下离心10分钟收集所形成的沉淀物，用70％乙醇洗涤并减压下干燥之。将残留物溶解于50μl TE(10mM Tris-HCl(PH8.0)、1mM EDTA)中，加入1/10体积电泳标志物(0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯胺(Xylenecyanol)30％甘油)，将混合物点在1.5％琼脂糖上，并使用TAE缓冲液(40mM Tris-乙酸，2mM EDTA)以50V电泳1.5小时。电泳后，将该凝胶放在0.5μg/ml溴乙锭溶液(在TAE中)中浸泡15分钟，以使DNA染色。将染色的凝胶固定在透照器上并用紫外线照射，然后切下含有所需DNA的带。使用DNA纯化药盒Geneclean(BIO101Co.生产)纯化所需的DNA片段(约1,200bp)。

(I-3)在pUC18中克隆SacI-SphI片段

(1)用SacI-SphI消化pUC18

在Eppendorf管(容积1.5ml)中加入10μl(10μg)pUC18DNA、5μl10× Low缓冲液50单位SacI，然后加无菌水至总体积50μl，并使混合物于37℃下反应3小时。反应后，加入7.5μl10× High缓冲液、50单位SphI和37.5μl无菌水，再于37℃下继续反应3小时。向反应溶液中加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液，快速搅拌该混合物并在4℃下以15,000rpm离心4小时，然后分离水层。向该水层中加入1/10体积的3M乙酸钠(PH4.8)和2.5体积的乙醇，以沉淀DNA。4℃下以15,000rpm离心10分钟，收集沉淀物，用70％乙醇洗该沉淀物并在减压下干燥之。将残留物溶解在20μl TE中用于下面的实验。

(2)将SacI-SphI片段(1,200bp)插入pUC18

   (SacI-SphI)中

向0.1μg(2μl)SacI-SphI片段DNA和0.5μg(1μl)pUC18(SacI-SphI)中加入24μlTakara DNA连接药盒A液体(Takara Shuzo Co.，Ltd生产)，然后充分搅拌之。向该溶液中加入3μl TakaraDNA连接药盒B液体，充分搅拌所得混合物并于16℃下保温1小时。反应后用该溶液转化大肠杆菌JM109。

(3)大量制备pARup 18

向5μl(100μg)连接反应液中加入100μl用CaCl₂处理之大肠杆菌JM109的细胞悬浮液，然后轻轻混匀。将混合物在冰水上保温30分钟，然后在42℃下保温2分钟，以使细胞摄入DNA。向该悬浮液内加入1ml 2YT液体培养基，并在振荡下于37℃保温1小时。分别取100μl和200μl该细胞悬浮液并铺敷在2YT琼脂培养基(含有50μg/ml氨苄青霉素、40mg/L，5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-硫代半乳糖苷(x-gal)、23.83mg/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和1.5％琼脂)上。将该平皿在37℃下保温24小时，再将所得白色菌落点布在新鲜的2YT琼脂培养基(含有50μg/ml氨苄青霉素、X-gal、IPTG和1.5％琼脂)上并在37℃下保温过夜以分离白色菌落。

用白金耳将分离的白色菌落接种到2ml 2YT液体培养基(含有50μg/ml氨苄青霉素)中并于37℃保温过夜。取1ml培养物转移到1.5ml Eppendorf管中，并以15,000rpm离心30秒钟以收集细胞。将收集的细胞悬浮于150μlSET缓冲液(20％蔗糖、50mM Tris-HCl(PH7.6)、50mM EDTA)中，加入5μl核糖核酸酶(RNase)溶液(10mg/ml核糖核酸酶A、0.1M乙酸钠(PH4.8)、0.3mM EDTA)，并用涡旋混合器充分搅拌混合物。向其中加入350μl溶解液(1％SDS、0.2N NaOH)，将该管上下颠倒几次以使细胞得到慢慢搅拌而完全溶解。将所得溶胞液体在冰水上保温10分钟，加入250μl3M乙酸钠(PH4.8)，并充分混匀之，然后在冰水上放置30分钟。4℃下将该混合的液体以15,000rpm离心10分钟，以沉淀SD和染色体DNA。将上清液转移到另一个Eppendorf管中，加入等量的异丙醇，充分混合该混合物，然后4℃下以15,000rpm离心7分钟，并收集沉淀的质粒DNA。将沉淀物溶解在无菌水中，对部分溶液进行限制性核酸内切酶EcoRI和HindIII(均为Takara ShuzoCo.，Ltd.生产)消化。将消化产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，以进一步证实该1,200bp的SacI-SphI片段已被插到pUC18中。

将已证实SacI-SphI片段被插入到pUC18中的克隆转移到400ml 2YT液体培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素)中并培养过夜。4℃下以8,000rpm离心10分钟以收集培养的细胞，并用SDS-碱方法大量制备质粒DNA。

(I-4)分离EcoRI-PstI片段(参见图1)

(1).分离EcoRI-HindIII片段

在Eppendorf管(容积1.5ml)加入10μl(10μg)大量制备的pARup 18DNA溶液、20μl10× K缓冲液(200mM Tris-HCl(PH8.5)、100mMMgCl₂ 100mM DTT、1,000mM KCl)和40单位HindIII，然后加无菌水至总体积200μl。总共制备20个含有上述同样内容物的Eppandorf管，并于37℃下反应3小时。反应后将混合物用苯酚-氯仿处理，用乙醇沉淀DNA并将收集的DNA溶解于155μl无菌水中。向该溶液中加入40μl5×EcoRI缓冲液(50mM Tris-HCl(PH7.5)、35mM MgCl₂、250mM NaCl、35mM 2-巯基乙醇、0.05％牛血清白蛋白(BSA)和40单位EcoRI、使总体积达到200μl。使反应在所得20个Eppendorf管(容积1.5ml)中分别于37℃下进行3小时。反应后，同样用苯酚-氯仿处理反应混合物并用乙醇沉淀，以回收DNA。经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离预期的DNA片段(约1,200bp)并用DNA纯化药盒Geneclean纯化之。

(2).分离EcoRI-PstI片段(约350bp)

向加在Eppendorf管(容积1.5ml)内的40μg(86μl)纯化的DNA片段中加入10μl10× High缓冲液和48单位PstI(Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)，使总体积为100μl，然后于37℃反应3小时。反应后，在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳以分离预期的DNA片段(约350bp)。从凝胶上电洗脱该DNA并使用核酸纯化药筒Nensorb 20(Dupond Co.生产)纯化之。

(I-5)合成PstI-HindIII片段

(1)合成并纯化寡核苷酸

为了合成含有Shine Dalgarno(S/D)序列的表达调节区，使380A型DNA合成仪(Applied BiosystemsJapan Co.生产)以磷酰胺化法合成10个寡核苷酸(参见图2)。合成过程完成后，在硅凝胶柱上加入总共2ml氨水(27％或27％以上)，每次加0.5ml并间隔15分钟，然后从硅胶载体上切下每个寡核苷酸并收集到小瓶内。再向小瓶内加入1ml氨水，用瓶盖和石蜡等密封小瓶并在55℃下加热8小时或更长时间，以除去碱基部分上的保护基团(酰基基团)。从恒温浴中取出小瓶置于室温环境，去掉瓶盖后在减压下将内容物浓缩至于。干燥后，将残留物溶解在200μl0.01M三乙胺-乙酸溶液(TEAA，PH7.5)中，然后使用AM-313-ODS装置(YamamuraKagaku Kenkyusho Co.，Ltd.生产)进行HPLC分离，用乙腈和0.1M TEAA的浓度梯度洗脱并于各馏份洗脱物中收集主要峰值部分。在减压下将所得峰值部分浓缩至干，加入100μl 80％乙酸(乙腈溶液)，将该混合物混匀后在室温下放置30分钟，以除去5′末端上的二甲基三苯甲基(DMTr)基团并使之转化为OH基团。30分钟后，使混合物迅速浓缩至干，将残留物溶解于200μl0.01M TEAA(PH7.5)中，加入等体积二乙醚，并经提取除去DMTr基团。于减压下将所得溶液浓缩至干，将残留物溶解在110μl0.01M TEAA(PH7.5)中并再次用制备HPLC纯化之。减压下将含有寡核苷酸的洗脱物各馏份浓缩至干，并将残留物溶解于TE中用于下面的实验。

(2).用激酶使合成的寡核苷酸磷酸化

各4μg纯化的寡核苷酸与各120μl激酶缓冲液(50mMTris-HCl(PH7.6)、10mM MgCl₂、0.1mMEDTA、5mM DTT、0.1mM亚精胺、1.7μm ATP)混合，加入9单位T₄多核苷酸激酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)，并于37℃下保温15分钟。然后加入ATP至终浓度为1mM，再加入9单位T₄多核苷酸激酶，并于37℃下保温25分钟。反应后将混合物于90℃下加热处理5分钟以使酶失活。使用核酸纯化药筒Nensorb 20纯化巳磷酸化的寡核苷酸。

(3).制备PstI-HindIII片段

用T₄DNA连接酶直接连接各寡核苷酸，制备彼此有不同碱基数目的4个PstI-HindIII片段(参见图3)。将20μl5×连接缓冲液(250mM Tris-HCl(PH7.6)、10mM MgCl₂)和无菌水加到1.5μg在构成各PstI-HindIII片段之寡核苷酸中定位在下面一条链5′端的寡核苷酸及各1μg其他寡核苷酸中，使总体积达到80μl。将所得溶液在90℃下加热5分钟并在2小时内逐渐冷却到4℃，加入100mMDTT和10mM ATP各10μl，再加入2.5单位T₄连接酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)并于4℃下保温15小时。用等体积苯酚-氯仿处理反应溶液，经乙醇沉淀回收DNA并用于下面的实验。

(I-6)制备EcoRI-HindIII片段(参见图4)

(1).直接连接EcoRI-PstI片段(启动子区)和各

PstI-HindIII片段

将上面(I-4)中分离的1.0μg各分EcoRI-PstI片段和各0.5μg有不同碱基数目的4个PstI-HindIII片段分别与5μl等分的0.3M NaCl混合。向所得各溶液内加入5μl Takara连接药盒B液体并在26℃下保温1小时或更长时间。反应后，用苯酚-氯仿处理该溶液，并按常规方法经乙醇沉淀回收DNA。

(2)用HindIII-EcoRI消化连接反应混合物

将各回收的DNA残留物分别溶解于14.5μl各分无菌水中。向各溶液内加入4μl5× HindIII缓冲液(50mMTris-HCl(PH7.5)、35mM MgCl₂、300mM NaCl)和12单位(1.5μl)HindIII，在37℃下反应1.5小时。反应后，再各加入4μl5× EcoRI缓冲液、12单位(1.0μl)EcoRI和5μl无菌水，并于37℃下反应1.5小时。用等量苯酚-氯仿处理反应溶液，然后经乙醇沉淀回收DNA。

(I-7)克隆四个彼此有不同碱基数目的表达调节区EcoRI

     -HindIII片段(参见图4)

(1)pUC18的EcoRI-HindIII消化

在Eppendorf管(容积1.5ml)中加入25μg pUC18、10μl10× K缓冲液(200mM Tris-HCl(PE8.5)、100mM MgCl₂、10mM DTT、100mM KCl)和64单位(8μl)HindIII，然后加入无菌水使总体达到100μl，并于37℃下使反应进行3小时。用等体积苯酚-氯仿处理反应溶液并经乙醇沉淀回收DNA。将DNA残留物溶解于75μl无菌水中，加入20μl5× EcoRI缓冲液和60单位(5μl)EcoRI，并于37℃下反应3小时。反应后，同样用苯酚-氯仿处理反应混合物并用乙醇沉淀DNA。将回收的DNA溶解在TE中(0.25μg/μl)并用于下面的实验。

(2)在pUC18(EcoRI-HindIII)中插入四个表达

   调节区EcoRI-HindIII片段

在Eppendorf管中分别加入各60ng(1μl)四个EcoRI-HindIII片段和每份500ng(2μl)的pUC18(EcoRI-HindIII)，再加入各分24μl的Takara连接药盒A液体，然后充分混合之。另外向这些混合的溶液中加入各分3μl的Takara连接药盒B液体，混合后使反应在16℃下进行2小时或更长时间。将这些溶液用于以下的实验中。

(3)大量制备pARup 1、2、3和4

向各3μl(56ng)连接溶液中加入各份100μl用CaCl₂处理的大肠杆菌JM109细胞悬浮液，然后轻轻搅拌。将混匀的溶液置于冰水中保温30分钟，再于42℃下保温2分钟，以使细胞摄入DNA。向这些悬浮液中加入各分1ml的2YT液体培养基，37℃下振荡培养1小时后将各混合物分别铺敷在2YT琼脂培养基(含有50μg/ml氨苄青霉素、40mg/L X-gal、23.83mg/l IPTG和1.5％琼脂)上。从得到的白色菌落制备质粒并分析限制性核酸内切酶图谱，筛选出分别携带所需质粒pARup 1、2、3和4的菌落。

将分别携带质粒pARup 1、2、3和4的菌落培养在各分200ml的2YT液体培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素)中，并用SDS-碱法大量制备各质粒DNA。

(I-8)分离Eco RI-HindIII片段

将大量制备的各20μg(20μl)质粒DNA(pARup 1、2、3和4)分别放在Eppendorf管中，向其中加入各份20μl的10× K缓冲液，各份120单位的HindIII和无菌水，使总体积各达到200μl。对每种质粒准备6个这样的Eppendorf管。于37℃下保温3小时。反应后用苯酚-氯仿处理反应混合物，用乙醇沉淀DNA并将收集的DNA溶解在各份150μl的无菌水中。向这些DNA溶液中加入各份40μl的5× EcoRI缓冲液和各份120单位的EcoRI，并于37℃下保温3小时。反应后经乙醇沉淀回收DNA。用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离所需的各DNA片段。分别从凝胶中电洗脱各DNA，并使用核酸纯化药筒Nensorb20(pARup1、2、3和4)纯化之。

II.制备转录终止(终止子)区(参见图5)

(II-1)克隆pANP1155

向100μl用50mM CaCl₂处理的大肠杆菌JM109细胞悬浮液中加入500ng(0.5μl)pANP1155(K.Shinozaki et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80：4050-4054(1983))——其中在pBR322的PstI位点插入了含有Anacystis nidulans 6301之核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶基因终止子区域的约1,500bp片段，然后轻轻搅拌。将混合的液体置于冰水中保温30分钟，再于42℃下保温2分钟，以使细胞摄入DNA。向该悬浮液中加入1ml LB液体培养基，于37℃下振荡培养1小时后将混合物铺敷在LB琼脂培养基(含有12.5μg/ml四环素和1.5％琼脂)上，并分离所得菌落。

将分离的菌落培养在2.8升2YT液体培养基(含有25μg/ml四环素)中，用SDS-碱法大量制备质粒DNA。

(II-2)制备EcoRI-PstI片段

(1).分离PstI片段

在Eppendorf管(容积1.5ml)中加入20μg(20μl)大量制备的pANP1155DNA、20μl10× High缓冲液和120单位(10μl)PstI，然后加无菌水使总体积达到200μl。总共准备6个含有上述同样内容物的Eppendorf管(容积1.5ml)各管于37℃下保温3小时。反应后，经乙醇沉淀回收DNA，并经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离所需的DNA片段(约1,500bp)。用Geneclean纯化分离的DNA并用于下述实验中。

(2)用Eco52I消化PstI片段

向64.5μl(约10μg)PstI片段DNA溶液中加入7.5μl10× Eco52I缓冲液(100mMTris-HCl(PH9.0)、30mM MgCl₂、1,000mMNaCl、0.1％BSA)和18单位(3μl)Eco 52I(Toyobo Co.，Ltd.生产)，并于37℃保温1小时。保温后，用苯酚-氯仿处理混合物并用乙醇沉淀DNA，然后回收之，将回收的DNA溶解在8μl无菌水中。

(II-3 )产生pARut 13

(1)将Eco52I-PstI片段切成平头

将1μl DNA平端切割药盒(Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)×10缓冲液加到8μl上述II-2中制得的Eco52I-PstI片段DNA溶液中，于70℃保温5分钟后，将混合物转移到37℃恒温浴中。向该溶液内加入1μl DNA平端切割药盒中的T₄DNA聚合酶，并用吸管轻轻将混合物混匀，然后于37℃下反应5分钟。反应后，向该溶液中加入40μl DNA平端切割药盒中的DNA稀释缓冲液，用涡旋器剧烈搅拌混合物以使酶失活。

(2)用SmaI消化pUC13并脱磷酸化

向20μg(20μl)pUC13DNA中加入40μl5×SmaI缓冲液(50mM Tris-HCl(PH8.0)、35mM MgCl₂、100mM KCl、35mM2-巯基乙醇、0.05％BSA)、80单位(10μl)SmaI(TakaraZhuzo Co.，Ltd.生产)和130μl无菌水，然后于30℃反应4小时。反应后，用苯酚-氯仿处理反应混合物，用乙醇沉淀以回收DNA。将回收的DNA溶解在100μl、0.1MTris-HCl(PH8.0)中，加入10μl碱性磷酸酶溶液(1.0单位碱性磷酸酶(A P.Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)10mM Tris-HCl(PH7.5)、50mM NaCl、1mM ZnSO₄)、使反应在37℃下进行2小时。反应后再加10μl碱性磷酸酶溶液，然后于65℃保温30分钟。用苯酚-氯仿处理反应溶液，用乙醇沉淀DNA，将收集的DNA溶解在TE中(0.5μg/μl)。

(3)将切成平头的片段插入pUC13(SmaI，AP)中

将32μl Takara连接药盒A液体加入2μl(约100ng)、修成平头的片段DNA溶液和2μl(1.0μg)碱性磷酸酶处理的pUC13DNA溶液中，然后充分搅拌之。向该溶液内加入4μl Takara连接药盒B液体，搅拌混匀后在16℃下保温1或数小时。反应后，用该溶液转化大肠杆菌JM109。

(II-4)制备BamHI-EcoRI片段

(1)大量制备pARut 13

将1μl(约40ng)连接溶液加到100μl用50mMCaCl₂处理的大肠杆菌JM109细胞悬浮液中，然后轻轻混匀。将混匀的溶液置于冰水中保温30分钟，再于42℃下保温2分钟，以使细胞摄入DNA。向该悬浮液内加入1ml2YT液体培养基，于37℃振荡培养1小时后，将悬浮液铺敷在2YT琼脂培养基(含有50μg/ml氨苄青霉素、40mg/L X-gal、23.83mg/L IPTG和1.5％琼脂)上。从所得的白色菌落制备质粒，分析其限制性核酸内切酶图谱，进而筛选出携带质粒pARut 13的菌落。将筛选的菌落培养在400ml 2YT液体培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素)中，并用SDS-碱法大量制备质粒DNA。

(2)分离BamHI-EcoRI片段

准备8个各含有15μg(15μl)大量制备之质粒DNA(pARut13)的Eppendorf管(容积1.5ml)，向其中加入20μl10× K缓冲液、120单位(10μl)BamHI(Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)及无菌水以使总体积达到200μl。将这些管于30℃下保温3小时。反应后用苯酚-氯仿处理反应混合物，用乙醇沉淀以收集DNA并分别溶解于各份110μl的无菌水中。向这些DNA溶液内加入各份30μl的5× EcoRI缓冲液及各份120单位(10μl)的EcoRI，然后于37℃下保温3小时。反应后经乙醇沉淀回收DNA，并经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离所需的DNA片段(约300bp)。

分别从凝胶中电洗脱DNA，并使用核酸纯化药筒Nensorb20纯化之。

III.产生h操纵子

(III-1)将转录终止区连接到h基因上

(1)用BamHI-EcoRI消化pUC13-h-SOD

在Eppendorf管中加入10μg(20μl)pUC13-h-SOD(参见日专利申请No.210129/1989说明书中的实施例1)——其中已在pUC13的HindIII-BamHI位点插入了编码人过氧化物歧化酶的全长(475bp)DNA片段，然后加入40μl5× EcoRI缓冲液、120单位(10μl)EcoRI和无菌水，使总体达到200μl，并于37℃下保温3小时。反应后用苯酚-氯仿处理反应混合物，经乙醇沉淀收集DNA并溶解在215μl无菌水中。向该溶液内加入25μl10× K缓冲液和100单位(10μl)BamHI，并于30℃下反应3小时。反应后使用Geneclean纯化DNA。

(2)将转录终止区(BamHI-EcoRI)插入pUC13-

   h-SOD(BamHI-EcoRI)中

向500ng(1μl)pUC13-h-SOD(BamHI-EcoRI)DNA和60ng(0.4μl)II中制备的转录终止区中加入11.2μl Takara连接药盒A液体，然后充分混匀。向该溶液中加入1.4μl Takara连接药盒B液体，充分搅拌后在16℃下保温30分钟。反应后用该溶液转化大肠杆菌JM109。

(III-2)制备HindIII-EcoRI(hSOD-终止子)片段

(1)大量制备pUC13-hSODt

向2μl(约70ng)连接溶液内加入100μl用50mMCaCl₂处理的大肠杆菌JM109细胞悬浮液，然后轻轻混匀。在冰水中将该混合的溶液保温30分钟，然后再于42℃下保温2分钟以使细胞摄入DNA。加入1ml 2YT液体培养基后，将所得混合物在37℃下振荡培养1小时，然后铺敷在2YT琼脂培养基(含有50μg/ml氨苄青霉素、40mg/L X-gal、23.83mg/L IPTG和1.5％琼脂)上。从所得白色菌落制备质粒，并分析其限制性核酸内切酶图谱以筛选携带所需DNA片段的菌落。将筛选的菌落培养在60ml 2YT液体培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素)中并用SDS-碱法制备质粒DNA。

(2)分离HindIII-EcoRI片段

在两个加有如上制备的50μl(25μg)pUC13-hSODt DNA溶液的Eppendorf管(容积1.5ml)内各加入20μl10× K缓冲液、120单位(15μl)HindIII及无菌水，使总体积达到200μl。将各管在37℃下保温3小时。反应后，用苯酚-氯仿处理反应混合物，经乙醇沉淀收集DNA，并将其分别溶解在150μl无菌水中。向这些溶液内各加入40μl5× EcoRI缓冲液和120单位(10μl)EcoRI，于37℃下保温3小时。反应后，用乙醇沉淀DNA，经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离所需的DNA片段(约790bp)。用Geneclean纯化DNA。

(III-3)将HindIII-EcoRI(hSOD-终止子)片段连

       接到表达调节区ARup 1、2、3和4上(参见图6)

准备各加有1.12μg(2.1μl)表达调节区(ARup 1、2、3和4)和2.11μg(2.2μl)HindIII-EcoRI片段的Eppendorf管，向其中分别加入4μl5×连接缓冲液(250mM Tris-HCl(PH7.6)、50mM MgCl₂)2μl100mM DTT、2μl ATP、2.5单位(1μl)T₄DNA连接酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)和无菌水，使总体积达到20μl。将这些管置于15℃下保温过夜，然后于60℃加热处理10分钟以终止反应。向这些溶液中分别加入10μl5× EcoRI缓冲液、12单位(1μl)EcoRI及无菌水。分别使总体积达到50μl，然后分别于37℃下保温3小时。反应后经2％琼脂糖凝胶电泳分离预期的各DNA片段(参见图7，各自约1200bp)，并使用Geneclean纯化之。

(III-4)克隆四个hSOD基因表达DNA片段

(1)用EcoRI消化pUC18，然后用碱性磷酸酶处理

在Eppendorf管中加入20μg(30μl)质粒pUC18DNA、40μl 5× EcoRI缓冲液、120单位(10μl)EcoRI，再加无菌水至总体积为200μl，于37℃下保温3小时。反应后，用苯酚-氯仿处理反应混合物，用乙醇沉淀DNA，然后将收集的DNA溶解在100μl0.1M Tris-HCl(PH8.0)中。向该溶液内加入10μl碱性磷酸酶溶液并于37℃下保温1小时。反应后再加入10μl碱性磷酸酶溶液并于65℃保温30分钟。用苯酚-氯仿处理反应溶液，经乙醇沉淀收集DNA并溶解于TE中(0.16μg/μl)。

(2)将hSOD操纵子片段插入pUC18(EcoRI和AP

   处理过的)中

分别向各100ng(1μl)hSOD操纵子(启动子-SOD-终止子1、2、3和4)DNA和320ng(2μl)EcoRI与碱性磷酸酶处理的pUC18DNA中加入24μl Takara连接药盒A液体，然后充分搅拌。再分别加入3μl Takara连接药盒B液体，充分搅拌后于1℃下保温过夜。

(3)大量制备pUC18-Rupt-hSOD1、2、3和4

向各4μl(约50μg)连接溶液内加入各份200μl用50mM CaCl₂处理的大肠杆菌JM109菌株的细胞悬浮液，然后轻轻混合之。将这些混合的液体置于冰水中保温30分钟，再于42℃保温2分钟以使细胞摄入DNA。向这些细胞悬浮液中各加入1ml 2YT液体培养基，于37℃振荡培养1小时后，将混合物铺敷在各份2YT琼脂培养基(含有50μg/ml氨苄青霉素、40mg/ml X-gal、23.83mg/l IPTG和1.5％琼脂)上。从所得白色菌落制备质粒，经分析它们的限制性核酸内切酶图谱筛选出分别携带各所需质粒(pUC18-Rupt-hSOD1、2、3和4)的菌落。将筛选的各菌落培养在各份200ml的2YT液体培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素)中，并用SDS-碱法大量制备各质粒DNA。

(4)分离EcoRI片段(约1200bp)

对每种质粒各准备3个Eppendorf管，向各份含20μg(20μl)大量制备之不同质粒(pUC18-Rupt-hSOD1、2、3和4)的管内分别加入40μl5× EcoRI缓冲液、120单位(10μl)EcoRI和130μl无菌水。上述混合物在37℃下保温3小时。反应后经乙醇沉淀收集DNA并将各质粒DNA分别溶解在100μl TE中。用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离各所需的DNA片段(约1,200bp)并用Geneclean纯化之。

N产生适用于蓝绿藻的hSOD基因表达载体(参见图8)

(IV-1)将得自pUC18的多克隆位点引入pBR322中

(1)用EcoRI-HindIII消化pBR322并随后用碱性磷

   酸酶处理

向20μl(10μg)pBR322DNA溶液中加入40μl5× HindIII缓冲液(50mM Tris-HCl(PH7.5)、35mM MgCl₂、300mM NaCl)、80单位(10μl)HindIII和130μl无菌水，并于37℃保温2小时。反应后向该溶液内加入40μl5× EcoRI缓冲液、120单位(10μl)EcoRI和50μl无菌水，并于37℃继续反应2小时。反应后用苯酚-氯仿处理反应混合物，经乙醇沉淀收集DNA并将其溶解于100μl0.1M Tris-HCl(PH8.0)中。向该溶液内加入10μl碱性磷酸酶溶液，并于37℃保温1小时。反应后再加入10μl碱性磷酸酶溶液，并于65℃保温30分钟。用苯酚-氯仿处理该溶液，并经乙醇沉淀回收DNA。

(2)从pUC18中分离多克隆位点(EcoRI-HindIII)

准备两个各加有30μl(20μg)pUC18DNA溶液的Eppendorf管，然后各加入20μl10× K缓冲液、80单位(10μl)HindIII和140μl无菌水，于37℃保温3小时。反应后用苯酚-氯仿处理反应混合物，经乙醇沉淀收集各DNA并分别溶解于112，5μl无菌水中。向这些溶液内分别加入30μl5× EcoRI缓冲液和90单位(7.5μl)EcoRI，并于37℃保温3小时。经乙醇沉淀收集DNA，然后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳以分离所需的DNA片段(约50bp)。从凝胶中电洗脱DNA并经苯酚-氯仿处理和乙醇沉淀纯化该DNA。

(3)使pBR322(EcoRI-HindIII消化)与多克隆位

   点连接

将1μl TE和24μl Takara连接药盒A液体加到0.2μg(1μl)pBR322(EcoRI-HindIII，AP处理)DNA和0.2μg(1μl)多克隆位点DNA中，然后充分搅拌之。向该溶液内加入3μl Takara连接药盒B液体并于76℃保温4小时。

(4)克隆质粒pBR322M

向3μl(40ng)连接溶液内加入200μl用CaCl₂处理的大肠杆菌HB101细胞悬浮液，然后轻轻混匀。将该混合物放在冰水中保温30分钟，然后于42℃保温2分钟以使细胞摄入DNA。向该悬浮液中加入1.8ml 2YT液体培养基，于37℃下振荡培养1小时后将混合物铺敷在LB琼脂培养基(含有50μg/ml氨苄青霉素)上。从所得菌落中制取质粒并分析它们的限制性核酸内切酶图谱，以筛选携带所需质粒(pBR322M)的菌落。在200ml 2YT液体培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素)中培养筛选的菌落，然后用SDS-碱法大量制备质粒DNA。

(IV-2)分离PvuIIEco 47III片段(2550bp)

在各装有10μg(10μl)上述(IV-1)中制备之pBR322M质粒DNA的三个Eppendorf管内，分别加入20μl10× M缓冲液(100mM Tris-HCl(PH7.5)、10mM MgCl₂、10mM DTT、500mM NaCl)、120单位(10μl)PvuII(Takara Shuzo Co.，Ltd.)和无菌水，使总体积达到200μl。在这些管中将上述内容物于37℃保温3小时。反应后用苯酚-氯仿处理反应混合物，经乙醇沉淀收集DNA并将其溶解于各份174μl的无菌水中。向这些溶液内各加入20μl10× H缓冲液和24单位Eco47III(Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)，并于37℃下保温3小时。用乙醇沉淀并回收DNA，经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离所需的DNA片段(2550bp)。使用Genclean纯化分离的DNA片段并溶解在50μl0.1M Tris-HCl(PH8.0)中。向该溶液内加入5μl碱性磷酸酶溶液并于37℃保温1小时。反应后再加入5μl碱性磷酸酶溶液，并于65℃下保温30分钟。反应后用苯酚-氯仿处理反应混合物，经乙醇沉淀收集DNA并溶解于20μl TE中。

(IV-3)在A.nidulans中分离pBAS18的复制起始

      点

将大肠杆菌和A.nidulans之间的穿梭载体pBAS18(K.Shinozaki et al.，Gene 19：221-224(1982))——其中A.nidulans 6301的内源质粒(用pBA1和BamHI消化过的)已被插入pBR322的BamHI位点——导入大肠杆菌HB101中。在LB液体培养基(含有50μg/ml氨苄青霉素)中培养所得菌株，并用SDS-碱法大量制备载体。

在三个各加有14μg(20μl)上述pBAS18DNA的Eppendorf管中分别加入20μl10× K缓冲液、100单位(10μl)BamHI和无菌水，使总体积达到200μl，并于30℃下保温3小时。反应后经乙醇沉淀回收DNA并经1％琼脂糖凝胶电泳分离所需的DNA片段(pBA1，约8.0kbp)，然后用Geneclean纯化之。

向2μg(5μl)分离并纯化的pBA1(已用BamHI消化)DNA中加入5μl10× K缓冲液、24单位(2μl)XhoI和38μl无菌水，并于37℃下保温3小时。反应后用苯酚-氯仿处理反应混合物并经乙醇沉淀收集DNA。使用Takara连接药盒将所得BamHI-XhoI消化之DNA的两末端修或平头。

(IV-4)产生小型化大肠杆菌-A.nidulans穿梭载体

      pBAX18(6.9kbp)

(1)制备pBAX18(约6.9kb)

将48μl Takara连接药盒A液体加到40ng(2μl)切成平头的DNA和200ng(4μl)PvuII-Eco47III片段DNA中，充分搅拌后加入6μl B液体并于16℃保温4小时。使用该溶液转化大肠杆菌HB101菌株并将其铺敷在LB琼脂培养基(含有50μg/ml氨苄青霉素和1.5％琼脂)上，使形成菌落。由所得菌落制备质粒，并分析它们的限制性核酸内切酶图谱以筛选携带所需质粒pBAX18的菌落。在2YT液体培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素)中培养筛选的菌落并用SDS-碱法制备质粒。

(2)制备pBAX20(约5.8kb)

将2μl10×M缓冲液、1μl(12单位)PvuII和13μl无菌水加到1μg(4μl)上面(IV-3)中制备的BamHI-XhoI(切成平头的)DNA片段中，并于37℃保温3小时。向2μl(100ng)该反应溶液中加入100ng(2μl)在(2)中制备的PvuII-Eco47 DNA片段和16μl Takara连接药盒A液体，充分搅拌后加入4μl B液体并于16℃下保温2小时。反应后，使用该溶液转化大肠杆菌HB101并将细胞铺敷在LB琼脂培养基(含有50μg/ml氨苄青霉素和1.5％琼脂)以得到菌落。从所得菌落中筛选携带所需质粒(pBAX20)者并培养在200ml 2YT液体培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素)中，用SDS-碱法制备质粒。

(IV-5)克隆hSOD基因表达载体

(1)用EcoRI消化pBAX18然后用碱性磷酸酶(AP)

   处理

准备两个加有10μg(20μl)pBAX18DNA的Eppendorf管，然后各加入40μl5× EcoRI缓冲液、120单位(10μl)EcoRI和130μl无菌水，使总体积达到200μl。上述内容物在各管中于37℃保温3小时，用Geneclean纯化DNA并溶解于100μl0.1MTris-HCl(PH8.0)中。向该溶液内加入10μl碱性磷酸酶溶液，于37℃保温1小时，再加入10μl碱性磷酸酶溶液后于65℃保温30分钟。反应后用苯酚-氯仿处理反应混合物，用乙醇沉淀并收集DNA。

(2)将hSOD操纵子连接到pBAX18(EcoRI和AP

   处理过的)上，然后大量制备

将各份0.5μg(1μl)用EcoRI和AP处理过的pBAX18分别加到各0.25μg(1μl)四种上面(III-4)中制备的hSOD操纵子(约1.2kbp)中，然后使用Takara连接药盒连接之。分别用这些连接溶液转化大肠杆菌HB101菌株，并将所得含有转化体的液体分别铺敷在LB琼脂培养基(含有50μg/ml氨苄青霉素)上以得到不同转化株的菌落。从所得菌落中制备质粒，经分析它们的限制性核酸内切酶图谱筛选携带所需不同质粒(pBAX SOD6、pBAX SOD7、pBAX SOD8、pBAX SOD9、pBAX SOD6-4、pBAX SOD7-4和pBAX SOD8-4)。将筛选的各菌落分别培养在50mlLB液体培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素)中，用SDS-碱法制备质粒DNA。

(3)用EcoRI消化pBAS18然后进行碱性磷酸酶(AP)

   处理

在加有18μg(30μl)pBAS18DNA的Eppendorf管中加入40μl5× EcoRI缓冲液、12单位(10μl)EcoRI和120μl无菌水，使总体积达到200μl并于37℃下保温3小时。反应后用苯酚-氯仿处理，然后再单用氯仿处理反应混合物，并经乙醇沉淀回收DNA。将回收的DNA溶解在100μl0.1M Tris-HCl(PH8.0)中，加入10μl碱性磷酸酶溶液(1单位/10μl)并于37℃下保温1小时。然后再加入10μl碱性磷酸酶溶液，并于65℃下保温30分钟。反应后先用苯酚-氯仿再单用氯仿处理反应混合物，经化DNA并经乙醇沉淀回收之。

(4)将hSOD操纵子连接到用EcoRI和AP处理过的

   pBAS18上并进行大量制备

将各份1.5μg(2μl)EcoRI和AP处理的pBAS18加到各0.25μg(1μl)上面(III-4)中制备的四种hSOD操纵子(约1.2kb)中，并使用Takara连接药盒连接之。分别用这些反应溶液转化大肠杆菌HB101菌株，并铺敷在LB琼脂培养基(含有50μg/ml氨苄青霉素和1.5％琼脂)上以得到菌落。从所得菌落制备质粒，分析它们的限制性核酸内切酶图谱以筛选携带所需质粒(pBASOD6、pBASOD7、pBASOD8和pBASOD9)的菌落。将筛选的菌落分别培养在200ml2YT液体培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素)中，使用SDS-碱法制备质粒DNA。

V.使用蓝绿藻Anacystic·nidulans 6301和R2

  表达hSOD基因

(V-1)转化A.nidulans 6301(Synechococcus

     pCC6301)和R2(Synechococcus

     pCC7942)

以8,000rpm离心5分钟，收集已分别在各份100mlBG-11液体培养基中培养了1-5天的细胞，然后分别悬浮于每份10ml的新鲜液体培养基(10⁸-10⁹细胞/ml)中。各取1ml细胞悬浮液加入聚乙烯塑料管(Falcon 2059)中。并分别在各管内以0.1-10μg不同浓度放入已制备的质粒DNA。分别用铝箔片盖住各管，于30℃培养过夜后去掉铝箔片，然后在光照(光源：冷白荧光灯；1,000-2,000lux)下继续于30℃下培养6小时。各取100-500μl细胞悬浮液并铺敷在BG-11琼脂培养基(含有1mM硫代磺酸钠、1-5μg/ml氨苄青霉素和1.5％琼脂)上。将这些平皿在光照(光源：冷白荧光灯；2,000-3,000lux)下培养4-10天。

(V-2 )培养物

将如此得到的菌落转移到每份2ml的BG-11液体培养基(含有10μg/ml氨苄青霉素)中并在光照(光源：冷白荧光灯；2,000-3,000lux)下培养10天。然后将这些培养物分别转移到每份100ml的BG-11液体培养基(含有10μg/ml氨苄青霉素)中并在光照下(2,000-3,000lux)培养20天。将这些培养物各取10ml，转移到各份100ml的BG-11液体培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)中，在光照下培养20天。4℃下以8,000rpm离心10分钟，收集各份细胞，重新悬浮于1mM Hepes缓冲液(PH7.0)中，并经离心洗这些细胞。洗后分别储存于-20℃下以备在继后的实验中使用。

(V-3)检测hSOD

(1)h-SOD活性染色

使用核黄素以光聚合法制备的聚丙烯酰胺凝胶〔Tanpakushi-tsu Kakusan Koso(Protein.Nucleic Acidand Enzyme)11：744(1966)〕.进行电泳。电泳后用50mM磷酸钾(PH7.8)-0.5mM EDTA将凝胶洗2至3次(每次5分钟)，然后在硝基蓝四唑鎓(NBT)溶液(2.5mM NBT、50mM磷酸钾、0.5mM EDTA，PH7.8)中浸泡7分钟。然后再浸入核黄素溶液(100μM核黄素、30mM四甲基乙二胺、50mM磷酸钾、0.5mMEDTA，PH7.8)中，并在白光下染色直到凝胶中出现明显反差。结果示于图9中。该附图中，有SOD活性的部分未着染，而其他部分则染成紫红色。从中可以看出，除了Anacystisnidulans本身具有的Fe-SOD活性外，在转化体中还检测到hSOD活性。

(2)用抗人SOD抗体检测

(2-1)Western吸印试验

使用20％SDS-聚丙烯酰胺凝胶，在Laemmli等人(Nature 237，680(1970))所述条件下以还原态进行电泳。电泳后，将凝胶中的蛋白质电转移到硝酸纤维素膜(Amasham Co.，Hybond(C)生产)上。将该膜在含有0.3％H₂O₂的50％甲醇中浸泡20分钟，以使内源过氧化物酶失活，然后再在含有5％脱脂乳和0.1％Tween20的TBS(20mM Tris-HCl、0.9％NaCl、PH7.4)中37℃浸泡2小时(封闭)。用洗液(含0.05％Tween20的TBS)将经过封闭处理的膜洗5分钟，然后在含有1/1000抗人SOD抗体(羊IgG，Binding Site Co.生产)和0.1％Tween20的TBS中37℃保温2小时。用洗液将膜洗20分钟(5分钟×5)，然后用40ml含有10mg二氨基联苯胺(DAB)和15μl 32％H₂O₂的0.1M Tris-HCl(PH7.4)染色。

结果，在加有转化体提取物(已经过电泳分离)的泳道上及与标准样品hSOD(Sigma Co.生产)相同的位置上检出染成棕色的带(见图10)。

(2-2)Ouchterlony方法〔Menekigaku JikkenNyumon(A Gide to Immunological Experi-ments)74-77页，Gakkai Shuppan Center出版)

在Petri平皿(Falcon 1029)中加入1.2％琼脂糖溶液(含有10mM磷酸盐缓冲液(PH7.2)、0.15MNaCl和0.1％NaN₂)、固化后形成2-3mm厚的凝胶层，并在适当位置上打孔。在中心孔中加入10μl抗人SOD抗体，并分别在周围各孔中加入不同转化体的提取物(各10μl)、作为对照的A.nidulans R2提取物(40μl)以及hSOD标准样品，然后在4℃下保温过夜。保温后，从平皿中取出琼脂片，浸没有PBS(10mM磷酸盐缓冲液(PH7.2)、0.15M NaCl)中，以充分除去蛋白质(PBS更换几次，浸2-3天)。然后再将该凝胶片浸入0.5％酰胺黑溶液(90ml甲醇、10ml冰乙酸)中染色。结果显示，在抗人SOD抗体和标准样品hSOD间、以及抗人SOD抗体和转化体提取物(6-4、8-4)间形成了沉淀线。另外所出现沉淀线彼此相接而成为一条单一线(呈形)，从而进一步证实转化体中产生了与标准样品hSOD完全相同的抗原(人SOD)(图11)。

(3)检测hSOD活性

虽然Anacystis nidulans具有内源SOD(Fe-SOD)，但有可能根据1mM KCN对不同SOD之抑制作用的差异来检测与内源SOD(Fe-SOD)不同的hSOD(Cu、Zn-SOD)活性。在光学检测样品杯(1ml)中加入50mM磷酸钾(PH7.8)、0.1mM EDTA、0.1mM黄嘌呤、10μM细胞色素C(马心III型，Sigma Co.生产)和样品(SOD)，使总体积达到980μl。向其中加入20μl黄质氧化酶(Boehringer-Mannheim Co.生产)以开始反应，根据550nm处吸光率增加的初速度(30至60秒)确定细胞色素C减少量，该数值以γ表示。用v表示不加SOD样品时的细胞色素C减少速率。假定在这些条件下可抑制50％细胞色素C减少的SOD为1/3单位，可根据公式(v/γ-1)确定样品中的总单位数(Shokubutsu Koso Tanpakushitsu KenkyuHO(Plant Enzyme Protein-StudyingMethods)pp.373，Koji Asada，KyoritsuPublisher Co.，Ltd.出版)。另外，向已测定了γ值的反应溶液中加入100mM KCl(10μl)，确定细胞色素C减少速率γ′及单位数(v/γ′-1)。进而确定Anacystisnidulans细胞中生成的hSOD活性{(v/γ-1)-(v/γ′-1)}。

得自转化体之粗提物的比活性(每1个A₂₈₀单位的活性)高达0.7-12单位/A₂₈₀(表1)。表1

起始载体质粒	表达载体	hSOD表达量(比活性单位/A280)
			pBAS18	pBASOD6pBASOD7pBASOD8pBASOD9	6.578.857.615.98
pBAX18	pBAXSOD6pBAXSOD7pBAXSOD8pBAXSOD9	7.189.9811.796.78

另外，这些比活性在很大程度上受到初始载体种类及类SD序列和ATG间碱基数目的影响，且pBAXSOD8(其SD和ATG间的碱基数基于pBAX18)具有最高比活性。

工业实用性

根据上述本发明，有可能使用蓝绿藻细胞作为宿主，以极高的效率表达有用的肽，可将制得的有用肽用作医药，不包括在药品中但可用于临床治疗的化学物质及用于化妆品等中。且培养的已转化之蓝绿藻可用作食物、饲料和/或功能性食品。

Claims (6)

1.一种在蓝绿藻细胞中表达生理学活性多肽的方法，该方法是通过用含有编码所述多肽的结构基因的载体DNA转化蓝绿藻细胞而完成的，该方法的特征在于所用的载体DNA是含有编码生理学活性多肽的结构基因，位于结构基因上游的Anacystis nidulans RuBisCO基因之转录起始区，以及位于结构基因下游的RuBisCO基因之转录终止区的载体DNA。

2.根据权利要求1的方法，其中载体DNA是载体质粒，其中引入了含有编码生理学活性多肽之结构基因，位于结构基因上游的Anacystis nidulans RuBisCO基因之转录起始区，以及位于结构基因下游的RuBisCO基因之表达终止区的操纵子。

3.根据权利要求2的方法，其中载体质粒是质粒pBAS18、pBAX18或pBAX20。

4.根据权利要求1的方法，其中生理学活性多肽是基本上与人SOD有相同氨基酸序列的多肽。

5.根据权利要求1的方法，其中生理学活性多肽是人SOD。

6.根据权利要求1的方法，其中被转化的蓝绿藻细胞是被转化的Anacystis nidulans 6301株，保藏号为CCTCC M92008。

Images