SU1364241A3 - Способ конструировани рекомбинантных векторов УСR р 2,УСR р 3 и УСR р 4 - Google Patents
Способ конструировани рекомбинантных векторов УСR р 2,УСR р 3 и УСR р 4 Download PDFInfo
- Publication number
- SU1364241A3 SU1364241A3 SU853991833A SU3991833A SU1364241A3 SU 1364241 A3 SU1364241 A3 SU 1364241A3 SU 853991833 A SU853991833 A SU 853991833A SU 3991833 A SU3991833 A SU 3991833A SU 1364241 A3 SU1364241 A3 SU 1364241A3
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- plasmid
- ycr
- dna
- purification
- shu
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/68—Stabilisation of the vector
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Production Of Multi-Layered Print Wiring Board (AREA)
- Metal Extraction Processes (AREA)
- Manufacturing Cores, Coils, And Magnets (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к генной инженерии и качаетс способа получени рекомбинантного многокопийного дрожжевого вектора. Цель изобретени - повышение стабильности рекомбина тных векторов. Способ получени векторов YCR р 2-4 заключаетс в том, что sek- тор, который имеет стабшгазирукщую функцию, ввод т в регулируемый промотор так,что имеетс возможность с помощью этого промотора управл ть регулирукщей функцией. 2 шт. 3 табл.
Description
1
Изобретение относитс к генной инженерии и.касаетс способа получени рекомбинантного многокопийного дрожжевого вектора.
Целью изобретени вл етс повышение стабильности рекомбинантных векторов.
Стабильность векторов YCR р2-4 обеспечиваетс за счет помещени СЕЫЗ-последовательиости перед промотором алкоголь-гидрогеназы И (ADH2). При этом трансформированные с помо-, щью АПН2-СЕКЗ-ш1азмиды сли ни дрожжи культивируютс в присутствии глюкозы , то ADH2-npoMOTOp дезактивируетс (ADH2-AUS), а CEN3 митотически стабилизирует УСКр-плазмиду (CEN3-AN), При переводе источника углерода на этанол ADH2-npOMOTop реактивируетс и полностью блокируетс экспрессией с помощью.рагиона CEN3, что обеспечивает возможность амплификации до желаемого числа копий,
На фиг.1 схематически изображены карты сайтов рестрикции и генетические карты плазмид рВСЗТ и ADH2-BS и показано получение YCK р2-плазмиды , на фиг.2 - карта сайтов рестрикции и генетическа карта плазмиды IDB 20/ и показано получение YCR рЗ- и yCR р4-плазмид.
Способ осуществл ют следующим образом.
Пример 1. Плазмида рВСЗТ содержит часть pBR 322 с геном устойчивости к ампицилину (ApR) OR1 дл селекции и стабильного роста в E.coli. Кроме того, плазмида содержит ген trp I на Есо R 1/Есо R I-1- рагменте (45 kb), которьй происходит иэ хромосомы дрожжей III. Этот ген позвол ет осуществл ть отбор нужных клонов на штамме дрожжей trpl На том же са мом DHK-фрагменте находитс ARSI- фрагмент (автономно реплицирующа с последорательность). ARSI-фрагмент позвол ет DHK реплицироватьс в дрок- жах. рВСЗТ1-плазмида содержит к тому же и СЕНЗ-последовательность на . 2,0 kb Hind III Bam HI-фрагменте, которьй происходит от хромосомы дрожжей III. Плазмиды, которые содержат СЕЫЗ-последовательность, { итоти- чески стабильны ив клетке имеетс 1-2 копни.
Плаэмида AD H2BS - это PBR 322 с клонированным в BamHI сайте, kb BaraHI - Sau ЗА-фрагментом хро
1 2
мосомной DHK дрожжей, который содержит ген ADH2. При этом в результате соединений концов BamHI и Sau ЗА генерируютс места рестрикции BamHI, так что ген ADH2 из АОН25-плазмиды может вырезатьс .
Из опубликованной ДНК-последовательности дл гена ADH2 и 5 фланки- рующих регионов известно наиболее благопри тное место рестрикции в позиции +67 (причем +1 вл етс А ATG- кодона). Это место выреза EcoRV совместно с местом выреза BamHI было использовано в позиции -1027 против течени , чтобы изолировать ADH2- промотор со всеми его 5 фланкирующими регул ционньми последовательност ми .
5 мкг АГ1Н2В8-плазмидной ДНК полностью переваривают с помощью EcoRV (фиг. 1)., очищают с помощью экстракции фенолом и осаждают этанолом, св зывают тупьм концом с 2 мкг
фосфолированных BglII-звеньев
(5 CAGATCTG3) (биологическа лаборатори ) и вновь разрезают с помощью ВАт lil и Bglll; после препаративного арагоза-гель-электрофореза изолируют 1300 b р-фрагмент. Этот фрагмент содержит полньсй ADH2-npoMOTop со всеми регул ционными последовательност ми и небольшой участок кодирующего ADH2 региона.
5 мкг рВСЗТ1-плазм1адной ДНК полностью переваривают с помощью BamHI- эндонуклеазы, очищают с помощью экстракции фенола и осаждени этанола и с помощью тел чьей кишечной фосфатовы.
После новой экстракции фенолом и
осаждени Этанолом 100 нг BamHI разрезают и дефосфолированной рВСЗТ - плазмидной ДНК соедин ют с 200 нг 1,3 кЬ-фрагмента BamHI/BglII, ADH2промотора , Т.ДНК-лигазой. После этого компетентные RRI-клетки трансформируют с помощью 1/5 этой смеси. Резистентные к ампицилину колонии отбирают путем гибр1адизации колоний благодар тому, что маркированный радиоактивно с помощью ник-трасл ции 1,3 кЬ BamHI/Bglll АВН2-промоторный фрагмент был использован в качестве пробы. Из 12 про вивших себ положительно колоний получают плазмидную ДНК и перерабатывают различными ре- стрикционными эндонуклеазами, чтобы идентифицировать клоны, которые имеют АВН2-вставку с ориентацией, кото20 мл Bottom-Agar (182 г сорбитола, 20 г глюкозы, 0,7 г YNB и 30 г Difeo Agar на 1 л HjO), и 10 мл 50°С Тор- g Agar (тот же состав, что и Bot.tom- Agar, однако дополнительно с добавлением 1 мл алеина (1,2 мг/мл), 1 мл урацина (2,4 мг/мл) и 1 мл смесн без триптофана на 50 мл Bottom-Agar 10 (смесь без триптофана содержит следующие аминокислоты на 100 мл 0,2 г аргинина; 0,1 г гистидина; 0,6 г изолейцина; 0,6 г лейцина; 0,4 г лизина; 0,1 метионина; 0,6 г 15 фенилаланина и 0,5 г треонина, эта Тгр -селекци дала 10 трансформантов дрожжей на 1 мкг плазмидной ДНК.
Стабильность плазмид в дрожжах провер ют благодар тому, что клетки ра 1 М сорбитола, 25 мМ EDTA (рН 8) и 20 после селективного или неселективно- 50 мМ дитиотрейтола в течение 10 мин при 30°С и затем промывают 10 мл 1 М сорбитола. После этого пеллетирован- ные клетки ресуспендируют в 10 мл SCE (1М сорбитол, 0,1 М цитрат натри , рН 5,8, и 0,01, М EDTA) и обраба- тьшают при 30°С с помощью 1 мг цимо- лиза 5000 (фирма Кирин брауэрай). 80%-ную сферопластификацию осуществл ют путем добавки 100 мл суспензии к 0,9 мл 10%-ного раствора SDS; измерени провод т при AbS ggg с применением клеточного раствора перед добавкой фермента как 0%-ное выравнивание/лизис в 10%-ном растворе SDS при- gg,Соузерна. Всю ДНК SHU 32-(YCR р)ра дает возможность транскрипцию ADH2-npoMOTopa с помощью CEN 3-после- довательности. Этот клон изолируют.
С целью определени количества копий и стабильности плазмиды в дрожжах с помощью YCR Р2-плазмидной ДНК трансформируют в штамм дрожжей SHU, 32(trp-, leu , cw, аЗ). TRP-транс- форманты были изолированы и прове-. рены на стабильность и количество копий.
Трансформацию дрожжей осуществл ют в соответствии с известным способом со следующими модификаци ми.
200 мл клеток с концентрацией 2x10 клетка/мл очищают промыванием в 25 мл Hjp путем центрифугировани . Эти клетки обрабатывают 10 мл раство . го выращиван и разбавлены водой и плакированы на УРД-пластины (неселективно ) . После 30 ч роста при 28°С эти пластины плакируют на YNB+CAA
25 пластины (TRP или LEU селекци ). Процентную стабильность плазмид определ ют путем делени количества в колони х, которые выращены селективно , на количество в колони х, кото30 рые выращены неселективно, и последующим .умножением на 100.
Определение количества копий плазмид осуществл ют птуем анализа
вел к осаждению осадка AbS р) .
Затем клетки- трехкратно промывают 10 мл 1 М сорбитола, один раз 1. М сорбитола, 10 мМ CaClj и 10 мМ трис- НС1 (рН 7,4) и затем ресуспендируют 0 в 1 мл того же раствора. Затем добавл ют 5-15 мкг очищенной плазмидной ДНК и осторожно смешивают со 100 мкл ресуспензйрованных клеток в течение
t5 мин. При осторожном перемещивании g рый содержит 1ШАЗ-ген дрожжей). Пос- в течение 15 мин добавл ют 1 мл раст- ле экспонировани на рентгеновскую вора, который содержал 20% (W/V) по- лиэтнленгликол 4000 (Мег ск), 10 мМ CaClj и 10 мМ трис-.НС (рН 7,5). Затем клетки центрифугируют и нкубиру- gg ioT в течение 20 мин при в 200 ыкл . .раствора SOS (tM сорбитола, 33,5% ,(V/V) УЕРД-бульона и 6,5 мМ СаС,). Затем too мкл этой суспензии помещают на чашку Петри, котора содержит
трансформантов, которые выращены в селективной среде, перерабатывают с помощью Есо R 1-рестриктироваиной эндонуклеазы и фракционируют путем агарозногр-гель-электрофореза. После переноса на нитроцеллюлозные фильтры ДНК гибридизуют маркированной радиоактивно ник-трансл цпей YIp5-плas- :мидой ДНК (YIp5 - это pBR 322, котопленку наблюдают по меньшей мере две полосы. В .качестве другого контрол .- служит ДНК-проба трансформированного с помощью УСр-плазмнды SHU 32; благодар этому оказалось возможным непосредственное сравнение количества копий. YGp- и YCR р-центромерных плазмид .
Данные приведены в табл. 1.
Стабильность плазмид в дрожжах провер ют благодар тому, что клетки после селективного или неселективно- Соузерна. Всю ДНК SHU 32-(YCR р)го выращиван и разбавлены водой и плакированы на УРД-пластины (неселективно ) . После 30 ч роста при 28°С эти пластины плакируют на YNB+CAA
пластины (TRP или LEU селекци ). Процентную стабильность плазмид определ ют путем делени количества в колони х, которые выращены селективно , на количество в колони х, которые выращены неселективно, и последующим .умножением на 100.
Определение количества копий плазмид осуществл ют птуем анализа
Стабильность плазмид в дрожжах провер ют благодар тому, что клетки после селективного или неселективно- ,Соузерна. Всю ДНК SHU 32-(YCR р) рый содержит 1ШАЗ-ген дрожжей). Пос- ле экспонировани на рентгеновскую
трансформантов, которые выращены в селективной среде, перерабатывают с помощью Есо R 1-рестриктироваиной эндонуклеазы и фракционируют путем агарозногр-гель-электрофореза. После переноса на нитроцеллюлозные фильтры ДНК гибридизуют маркированной радиоактивно ник-трансл цпей YIp5-плas- :мидой ДНК (YIp5 - это pBR 322, кото рый содержит 1ШАЗ-ген дрожжей). Пос- ле экспонировани на рентгеновскую
пленку наблюдают по меньшей мере две полосы. В .качестве другого контрол служит ДНК-проба трансформированного с помощью УСр-плазмнды SHU 32; благодар этому оказалось возможным непосредственное сравнение количества копий. YGp- и YCR р-центромерных плазмид .
Данные приведены в табл. 1.
SHU 32
YCRp2
Этайол
% стабильности .плазмиды определ етс по 25 генераци м на неселективном выращивании,
Количество копий определ лось по 12 генераци м на селективной
среде..
Штамм культивировалс (12 генераций) на селективной среде этанолаJ затем на 12 генераци х провер лс на селективной Ьреде глюкозы и инркул т этой культуры был вз т дл определени
стабильности и количества копий,
АААЛ Штамм культивировалс в тех же услови х, что и в пункте , однако дл 50 генераций на этайоле.
Выла подтверждена стабильность YCR р2 плазмиды5, после того как на различных источниках углерода бьши выращены трансформанты. Если их культивируют только ча среде глнжозы, стабильность йлазмид перемещаетс в сферу других УСр-плазмид (примерно 80%); количество копий бьшо незначи- тельным (1-2 копии на клеткуг см. примеры 1 и 3 в табл. 1). Глюкоза дезактивирует АВН2 промотор (ADH2-AUS а CEN 3-последрвательность может ра- ботать нормально (CEN 3-AN).
Однако если YCR р2-трансформантъ культивируют на содержащей этанол среде, то стабильность плазмиды резко снижаетс (примерно до 36%), одна- ко количество копий возрастает (до 5-10 копий на клетку). УСр-плазмиды при одинаковых учлови х прежде были стабильны ив наличии имелось незначительное количество копий (см. приме- ры 2 и 4 в табл, 1). Это показывает, как транскрипци вновь реактивированного ADH2-npoMOTopa (ADH2-AK) блокирует CEN 3-последовательность (CEN
Таблица 1
Глюкоза
95%
8-12
3-AUS). Как результат УСН2р-ш1азмида ведет теперь себ , как УЕр-плазмидаг очень нестабильна, однако с большим количеством копий.
Стабильность УСКр2-ш1азмида стала выше, чем прежде, когда среда была вновь перемещена на глюкозу. Стабильность на зтой среде составила почти 95%, а количество копий на клетку осталось посто нным: 5-10 копий (см. пример 5 в табл, 1), Таким образом, глюкоза вновь дезактивирует ADH2-npo- мотор (ADH2--AUS) и реактивирует СЕНЗ-функцию (CEN 3-AN). Однако дрожтки во врем культивировани на этаноле не могли больше аккумулировать УСЕр2-гшазмиду, Даже после 50 генераций на среде этанола yNB-s-CAA количество копий не превышало копий на клетку (см, пример 6 в табл.)
П р и м е р 2, Получение УСК рЗ- и yCR р4-плазмид схематически представлено на фиг, 2. Вектор P.IDB207 содержит бактериальную рАТ15З-плазми ДУ (34) с резистентными генами ампи- цилина (ApR) и тетрациклина (Tet) и
7 13 OKI дл селекции и стабильного роста в E.coli. Кроме того, плазмида содержит 2,7 кЬ - EcoRI/EcoRI фрагмент 2р-ДНК. На этом фрагменте локализова- но как 2/вместо репликации, что дает возможность вектору экстрахромосомно реплицироватьс и про вл тьс , так и КЕРЗ-локус 2|и-ДНК, Этот локус вл етс важным элементом 2 системы ам- плификации и должен занимать цис-по- ложение, чтобы сделать плазмиду способной к амплификации. Селекционный маркер LEU 2, из которого происходит дрожжева хромосома III, был клонирован после нескольких модификаций в PSt 1 места разреза Упом ну;того 2 (U ДНК фрагмента. Этот ген LEU2-d дает возможность осуществл ть селекциони- ройание на Leu2 -дрожжевых мутантах и дополн ет мутацию Leu2 только тогда , когда она существует в много- копийном векторе.
Дл получени YCR рЗ- и YCR р4- плазмид перерабатывают 5 мкг YCR р2-ДНК с Bgl II- и Ваш Н1-рестршс- ционной эндонуклеазой. После препаративного электрофореза в арагозном геле изолируют фрагмент Bgl II/Bam HI размером 4,2 кЬ. Этот фрагмент содержал TRPI-ген дрожжей и ADH2-CEN 3-сли ние. 5 мкг pIDB207 плазмидного ДНК перерабатывают с Ваш HI и очищают путем экстракции фенолом и осаждеНИН этанолом и дефосфорилируют с помощью тел чьей-кишечной фрсфатазы. 100 нг полученной таким образом р1ВВ207-плазмидной ДНК лигируют с по- мощью-200 нг 4,2 кЬ - Bgl II/Bam Hi YCR р2-фрагмента. E.coli RR I клетки
трансформируют с помЬщью 1/5 этой смеси и изолируют колонии ApR. Все без исключени колонии провер ют путем их, гибридизации с применением пик-транслированного 4,2-кЬ-фраг мента YCR р2 в качестве пробы. Из про вивших себ положительно колоний изолируют плазмидную ДНК и составл ют карту сайтов рестрикции этих плаз- МИД.: Так как Bgl II/Bam HI-фрагмент- клонируют в двух различных ориекта ци х в Ват Н1-местах разреза pIDB207
8
5 О с . 0
Q
5
возникает две плазмиды: YCR p J и YCR р4 (фиг. 2).
Ориентирование кланиропанногю вли ни ADH2-CEN 3-сли ни не оказывает никакого вли ни на ст бп.пь 1ость и количество копий YCR р-плазмид1.1 в дрожжах. YCR рЗ-плазмида теперь содержит два маркирующих гена дрожжей: LEU 2-d и TRPI-ген, дополн ют одну trpl -мутацию в самих дрожжах тогда, ко.гда он содержитс только в одной копии на клетку, LEU 2-d-reH дополн ет leu 2 -мутацшо только тогда, когда он находитс на многокопийной плазмиде (50-100 копий на клетку). Эта система дает возможность осуществл ть проверку количества копий путем простого плакировани на селективной среде. Все LED клетки должны содержать по меньшей мере 50 плазмид- ных копий на клетКу, в то врем как TRP -клетки содержат по меньшей мере одну копию плазмиды. Кроме того, существует SHU 32-штаммы cir, т.е. он имеет дикий тип 2/i. ДНК, что обеспечивает YCRp3-BeKTOp двум другими компонентами системы амплификации 2iu: REP1 и REP2. Полностью активна Система амплификации 2fj. требует REP1 и REPZ в транс и REP3 и OR1 в цис.
Дрожжевой штамм SHU 32 (cir, trpl, leu 2 иг аЗ) трансформируют с помощью YCRpЗ-плaзмиднoй ДНК, TRP -трансформанты изолируют и провер ют на Leu и ига. Все трансфор- манты которые были проверены, вл лись Leu .и . ига и показали, что ТСКрЗ-плазмида существует в незначительном количестве копий. Этот результат не был неожиданным, так как в качестве источника углерода использовалась только глюкоза, т.е. CEN 3 должен был быть полностью функционально способным. CEN 3-функци преодолевает систему амплификации и стабилизирует количество копий плазмид в пределах 1-2 копии на клетку (пример 2 в табл. 2), Стабильность YCRp3 в дрожжевом штамме SHU 32 при вьфащи- вании на глюкозе также характерна дл уСр-1шазмиды (около 80%),
fSHU 32pIDB207Глюкоза
2SHU 32YCRi)3Глюкоза
3SHU 32YCRp3Этанол
4SHU 32YCRp3Этанол Однако если трансформированный с помощью YCR рЗ штамм SHU 32 культивировалс на селективной - leu - этанол-среде , то стабильность плазм ид снижалась, когда было измерено количество leu колоний, примерно на 65%, Предполагаетс , что CEN 3-последова- тельность в присутствии этанола транскрибируетс реактивированным ADH2- ..промотором. С помощью селекции на LEU и нефункционального центромера система амплификации 2 берет на себ контроль и амплифицирует YCR рЗ в большое количество копий. SHU 32- трансформанты стали LEU, а стабиль™ ность YCR рЗ-плазмид вл етс при этих услови х характерной дл 2 (л химерной плазмиды (см. примеры 1 и 4 в табл. 2). Эти ожидани нашли подтверждение , после того, как SHU 32-трансформанты затем культивирова- лись на этаноле и глюкозе, и было определено количество копий плазмид. Количество копий YCR рЗ достигает прм мерно 100 на клетку. Кроме того,с, плазмида была очень стабильна (бо- лее 90%),, что можно подтвердить с помощью количества leu колоний.
В табл. 3 представлены данные о стабильности YCR р4-плазмид.
Таблица 3
Глюкоза
75
85
1-2
Таблица 2
too
85% , 1-2
85% He определено
Глюкоза 98%
99%
100
Продолже ние табл.3
Этанол , 70% 88% Не определено в Этанол -f Глюкоза
98% 99% 100
Примечани к табл. 2 и 3 те же, что и дл табл. 1,
Получение плазмид с регулируемыми центромером функци ми, как показано дл YCR р-плазмид, имеет большую пользу дл размножени как гетерологичес- ких ДНК, так и дл выражени гетеро- логических белков и дрожжах.
Если например, в полученный в соответствии с изобретением многокопиЙ- ный дрожжевой вектор соответствуюпрш образом вводитс гетерологическа ДНК, то она путем смены воздействующих на регулируемый промотор факторов (наприм р, в случае АВН2-промотора замены источника углерода), будет размножатьс с помощью вектора до желаемой концентрации.
Еще большую пользу принос т полученные в соответствии с изобретением векторы, если гетерологическа ДНК с помощью системы вьфжени дл экспрессии гетерологических белков встраиваетс в векторы в правильной ориентации ,.
Эффективность процесса ферментации зависит от вида белка. Если, на 13
пример, экспрессируетс белок, -который , начина с определенной концентрации , вл етс токсичным дл орга- низма, то весь процесс ферментации может стать неэффективнь м, если количеством белков нельз управл ть непосредственно или косвенно.
С помощью полученных в соответс Т ВИИ с изобретением векторов можно только путем смены воздействующих на регулируемый проМотор факторов, HanpiiMep, путем смены источника углерода , количество копий экспрессной
ных плазмид устанавливать на низкое, is (pIDB207);
6) 0,2 мкг всей ДНК штамма SHU 32 (pIDB207);
; . 7) 0,05 мкг всей ДНК штамма SHU32 (pIDB207);
8) 5 мкг всей ДНК mxaMi-sa SHU 32 (YCRp3) - глюкоза; 9) 1 мкг всей ДНК .a SHU 32 (YCRpS) - этанол -f- глюкоза;
10) 0,05 мкг всей ДНК штампа
среднее или высокое значение и на соответствующем уровне стабилизировать. С помощью этих векторов даже можно цолучать токсичньш дл организма про- дукт благодар тому, что количество 20 копий векторов выражени в основании ферментации нескольких генераций мало и отдельные плазмиды поддерживают стабильными. Если затем образовано достаточно клеточно го материала, про- 25 SHU 32 (YCRp 3) - этанол - глюкоза; мотор переключаетс , напрш-iep, пу- 11) 0,05 шсг всей ДНК штамма SHU 32 тем смены источника углег ода, и коли- (УСКрЗ) - эта чество копий в зкспрессионньгх плаз- мидах резко увеличиваетс . Тем caj tbiM
одновременно производитс желательный 30 Формула белок в большой концентрации; токсичность белка к этому моменту времени маловажна.
Полученные в соответствии с изобретением векторы дают возможность выби- 5 в том, что плазмиду рВСЗТ1 расщепл - рать неселективные услови культиви- ют рестрнкционной эндонуклеаэсй BamHI
глюкоза.
изобретени
Способ конструировани рекомби- нантных векторов YCRp2, YCRp3 и YCRp4, заключающийс
ровани ; значительное преимущество прежде всего с точки зрени использовани дл получени белков на гено- технологическом пути,
28 декабр 1984 г в Немецкую коллекцию кикроорганизмов (DSM), Гризе- бахштрассе, 8, Д-3400 Геттинген бьти сданы на хранение;
E.coli штамм RRI (обозначение-НИ) под номером DSM3t76;
Saccharomyces cerevisiae штагам SHU 32 (обозначение- S.HU 32) под номе- ром DSM 3182;
шхазмида: рВСЗТ1, трансформированна в E.coli RRI (обозначение рВСЗХ1) ПОД номером DSM 3180;
плазмидаг pAD П2Ъ, тpaнcфop шpb- ванна в E.coli RRI (обозначенна pAD Н2В) под номером DSM 3179 и
плазмида: pID В207, трансформированна в E.coli RRI(обозначенна pID В207) под номером DSM 3181.
1
12
Все пробы ДНК были обрезаны с по Мощью EcoRI и гибридиэированы У1р5 плазмидной ник-трансл ционной ДНК.
1)3 мкг всей ДНК SHU 32 (рЕВ 108) - типична УСр плазм11да;
2)3 мкг всей ДНК штамма SHU 32 (YCRp2) - глюкоза;
3)3 мкг всей ДНК штамма SHU 32 (YCRp2) - этанол -« глюкоза;
4)3 мкг всей ДНК штамма SHU 32 (YCRp2) - этанол (50 генераций) - глюкоза;
5)1 мкг всей ДНК штамма SHU 32
6) 0,2 мкг всей ДНК штамма SHU 32 (pIDB207);
; . 7) 0,05 мкг всей ДНК штамма SHU32 (pIDB207);
8) 5 мкг всей ДНК mxaMi-sa SHU 32 (YCRp3) - глюкоза; 9) 1 мкг всей ДНК .a SHU 32 (YCRpS) - этанол -f- глюкоза;
10) 0,05 мкг всей ДНК штампа
SHU 32 (YCRp 3) - этанол - глюкоза; 11) 0,05 шсг всей ДНК штамма SHU 32 (УСКрЗ) - эта
- глю К штамма
глюкоза.
изобретени
Формула
в том, что плазмиду рВСЗТ1 расщепл ют рестрнкционной эндонуклеаэсй Bam
Способ конструировани рекомби- нантных векторов YCRp2, YCRp3 и YCRp4, заключающийс
с последующей очисткой и дефосфорили- рованием полученной линейной ДНК, плазмиду ADI-12BS. расщепл ют рестрик- ционной эндонуклеазэй EcoRV с последующей очисткой полученной линейной ДНК и ее св зыванием с фосфолирован- ньм линкеро Bglll и полученный при этом фрагмент расщепл ют рестрикцион- ной эндонуклеазой BamHI и Bglll с последующей очисткой фрагмента размером 1,3 Kbj полученные фрагменты св зьшают Т4-ДНК лигазой с. получением вектора YCRp25 которьй расщепл ют рестршсционной эндонуклеазой BamHI. и Bglll с последующи. выделением и очисткой-фрагмента 4,2 кЬ, а плазми- . ду pIDB207 расщепл ют рестрккцион- ной эндонуклеазой BamHI с последующщей очисткой и дефосфорилированиек полученной при этом линейной ДНК и полученные фрагменты св зывают с ДНК-лнгаасй с получением векторов YCRp3 и YCRp4,
Bgl
BaiTiHI
.eeoRV
SL.B«mHI
Truiehrlption
EcoRIHIndin
EeoRL.
mHi/Bgin
BamHI
.f
EcoR) Hind Ml
ceoRt
BamHI
EeoRIEcoRI
/BamHI/BgtH
EcoR)
EcoRI
iHI/B II
фча.г
. Вити I
Составитель H. Ку енкова Редактор A. Лежнина Техред Л.СердюковаКорректоров Бут га
Заказ 6387/58 .Тираж 500Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР
по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушска наб., д. 4/5
Производственно-полиграфическое предпри тие, г, Ужгород, ул. Проектна , 4
Claims (4)
- ла й з обретен и яСпособ нантных векторов YCRp
- 2, YCRp
- 3 и YCRp4, заключающийся в том, что плазмиду рВСЗТ1 расщепляют рестрикционной эндонуклеазой BamHI с последующей очисткой и дефосфорилированием полученной линейной ДНК, плазмиду ADH2BS расщепляют рестрикконструирования рекомбитехнологическом пути.28 декабря 1984 г в Немецкую коллекцию микроорганизмов (DSM)’’, Гризебахштрассе,' 8, Д-3400 Геттинген1 были сданы на'хранение:E.coli штамм RRI (обозначение RRI) под номером DSM3176;Saccharomyces cerevisiae штамм SHU 32 (обозначение-SHU 32) под номером DSM 3182;плазмида: рВСЗТ1, трансформированная в E.coli RRI (обозначение рВСЗТ1) под номером DSM 3180;плазмида: pAD Н2В, трансформированная в E.coli RRI (обозначенная pAD Н2В) под номером DSM 3179 и плазмида: pID В2О7, трансформированная s E.coli RRI(обозначенная pID В2О7) под номером DSM 3181.
- 4Q· ционной эндонуклеазой EcoRV с последующей очисткой полученной линейной ДНК и ее связыванием с фосфолированным линкеров Bglll и полученный при этом фрагмент расщепляют рестрикцион· 45 ной эндонуклеазой BamHI и Bglll с последующей очисткой фрагмента размером 1,3 кЬ, полученные фрагменты ’ связывают Т^-ДНК-лигазой с. получением вектора YCRp2, который расщепляют 50 рестрикционной эндонуклеазой BamHI. и Bglll с последующим выделением и очисткой· фрагмента 4,2 кЬ, а плазмиду pIDB2O7 расщепляют рестрикционной эндонуклеазой BamHI с последуюг дд щей очисткой и дефосфорилированием полученной при этом линейной ДНК и полученные фрагменты связывают с ДНК—лигазой с получением векторов YCRp3 и YCRp4.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19843444495 DE3444495A1 (de) | 1984-12-04 | 1984-12-04 | Herstellung eines multi-kopien-hefe-vektors |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU1364241A3 true SU1364241A3 (ru) | 1987-12-30 |
Family
ID=6252051
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU853991833A SU1364241A3 (ru) | 1984-12-04 | 1985-12-03 | Способ конструировани рекомбинантных векторов УСR р 2,УСR р 3 и УСR р 4 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0184163A3 (ru) |
| JP (1) | JPS61181385A (ru) |
| AU (1) | AU5070685A (ru) |
| DE (1) | DE3444495A1 (ru) |
| DK (1) | DK559585A (ru) |
| ES (3) | ES8800342A1 (ru) |
| FI (1) | FI854781A (ru) |
| GR (1) | GR852891B (ru) |
| HU (1) | HU196454B (ru) |
| NO (1) | NO854864L (ru) |
| NZ (1) | NZ214422A (ru) |
| PT (1) | PT81594B (ru) |
| SU (1) | SU1364241A3 (ru) |
| YU (1) | YU186985A (ru) |
| ZA (1) | ZA859240B (ru) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3605035A1 (de) * | 1986-02-18 | 1987-08-20 | Strahlen Umweltforsch Gmbh | Plasmid pws101, verfahren zu seiner gewinnung und seine verwendung |
| JP6754697B2 (ja) * | 2014-12-03 | 2020-09-16 | 株式会社カネカ | セントロメアｄｎａ配列を含むベクター及びその用途 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL63035A (en) * | 1980-09-09 | 1985-05-31 | Univ California | Dnas capable of replication and stable mitotic maintenance in a host eukaryote,their preparation and eukaryotic cells comprising them |
-
1984
- 1984-12-04 DE DE19843444495 patent/DE3444495A1/de not_active Withdrawn
-
1985
- 1985-11-30 EP EP85115203A patent/EP0184163A3/de not_active Withdrawn
- 1985-12-02 YU YU01869/85A patent/YU186985A/xx unknown
- 1985-12-02 GR GR852891A patent/GR852891B/el unknown
- 1985-12-03 DK DK559585A patent/DK559585A/da not_active Application Discontinuation
- 1985-12-03 NZ NZ214422A patent/NZ214422A/en unknown
- 1985-12-03 HU HU854619A patent/HU196454B/hu not_active IP Right Cessation
- 1985-12-03 ES ES549526A patent/ES8800342A1/es not_active Expired
- 1985-12-03 ZA ZA859240A patent/ZA859240B/xx unknown
- 1985-12-03 NO NO854864A patent/NO854864L/no unknown
- 1985-12-03 SU SU853991833A patent/SU1364241A3/ru active
- 1985-12-03 AU AU50706/85A patent/AU5070685A/en not_active Abandoned
- 1985-12-03 PT PT81594A patent/PT81594B/pt unknown
- 1985-12-03 FI FI854781A patent/FI854781A/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-12-04 JP JP60273181A patent/JPS61181385A/ja active Pending
-
1986
- 1986-07-23 ES ES556975A patent/ES8802075A1/es not_active Expired
- 1986-07-23 ES ES556976A patent/ES8801705A1/es not_active Expired
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Stinchcomb D.T. et al.(1982) J. Mol. Biol. 158, p.157-179. Clarke and Carbon. J. (1980) Nature, 287, p. 504-509. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES8801705A1 (es) | 1988-02-16 |
| ES8802075A1 (es) | 1988-03-16 |
| NZ214422A (en) | 1988-02-12 |
| EP0184163A2 (de) | 1986-06-11 |
| GR852891B (ru) | 1986-04-03 |
| ES549526A0 (es) | 1987-11-01 |
| PT81594B (de) | 1987-10-16 |
| ES556975A0 (es) | 1988-03-16 |
| DE3444495A1 (de) | 1986-06-05 |
| HU196454B (en) | 1988-11-28 |
| EP0184163A3 (de) | 1988-01-13 |
| ES556976A0 (es) | 1988-02-16 |
| FI854781A (fi) | 1986-06-05 |
| NO854864L (no) | 1986-06-05 |
| DK559585D0 (da) | 1985-12-03 |
| AU5070685A (en) | 1986-06-12 |
| YU186985A (en) | 1988-06-30 |
| ZA859240B (en) | 1987-08-26 |
| DK559585A (da) | 1986-06-05 |
| HUT39775A (en) | 1986-10-29 |
| ES8800342A1 (es) | 1987-11-01 |
| FI854781A0 (fi) | 1985-12-03 |
| JPS61181385A (ja) | 1986-08-14 |
| PT81594A (de) | 1986-01-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR0181179B1 (ko) | 피치아 파스토리스 산성 인산효소 유전자의 디앤에이 단편 및 이를 사용하는 방법 | |
| Marres et al. | Nucleotide sequence analysis of the nuclear gene coding for manganese superoxide dismutase of yeast mitochondria, a gene previously assumed to code for the Rieske iron‐sulphur protein | |
| US4833080A (en) | Regulation of eucaryotic gene expression | |
| Durland et al. | Mutations in the trfA replication gene of the broad-host-range plasmid RK2 result in elevated plasmid copy numbers | |
| US5077204A (en) | Yeast endopeptidase for basic amino-acid site cleavage, preparation and use | |
| HU207533B (en) | Process for clowning superoxide dismutase, expressing them in microorganisma and improving enzyme-yeald of microorganismus cultures | |
| EP0118393B1 (en) | Methods and compositions for expression of competent eukaryotic gene products | |
| Schwartz et al. | FLP Recombinase of the 2 μm circle plasmid of Saccharomyces cerevisiae bends its DNA target: Isolation of FLP mutants defective in DNA bending | |
| DE69728878T2 (de) | Verfahren zur vermehrung der hemoproteinherstellung in filamentösen fungi | |
| KR0159107B1 (ko) | 우레이트 산화효소 활성 단백질, 이 단백질을 암호화하는 재조합 유전자, 발현 벡터, 미생물 및 형질전환세포 | |
| RU2105812C1 (ru) | Полипептид, обладающий уратоксидазной активностью, фрагмент днк, обеспечивающий экспрессию полипептида с уратоксидазной активностью (варианты), вектор экспрессии, содержащий фрагмент днк, обеспечивающий экспрессию полипептида с уратоксидазной активностью (варианты), штамм, экспрессирующий полипептид, обладающий уратоксидазной активностью (варианты), способ получения полипептида, обладающего уратоксидазной активностью | |
| Toh-e et al. | A stable plasmid carrying the yeast Leu2 gene and containing only yeast deoxyribonucleic acid | |
| Bröker et al. | Expression of the human blood coagulation protein factor XIIIa in Saccharomyces cerevisiae: dependence of the expression levels from host-vector systems and medium conditions | |
| US5066591A (en) | Polypeptides of human copper/zinc superoxide dimutase | |
| SU1364241A3 (ru) | Способ конструировани рекомбинантных векторов УСR р 2,УСR р 3 и УСR р 4 | |
| Tanaka et al. | Mating type control in Saccharomyces cerevisiae: a frameshift mutation at the common DNA sequence, X, of the HMLα locus | |
| US5182195A (en) | Method for increasing gene expression using protease deficient yeasts | |
| US5710033A (en) | Superoxide dismutase cloning and expression in microorganisms | |
| US5593860A (en) | Expression plasmids containing the deo promoter, and bacterial hosts containing the plasmids | |
| Tikhomirova et al. | Transformation of methylotrophic yeast Hansenula polymorpha: cloning and expression of genes | |
| DE4020181A1 (de) | Neue promotorregion | |
| US6331421B1 (en) | DNA construct comprising a vector for expression of human cytoplasmic Cu/Zn superoxide dismutase in E. coli and method of use of same | |
| EP0134773A1 (en) | Yeast copper-metallothionein gene | |
| WO1987005935A1 (en) | Methods and compositions for expression of competent eukaryotic gene products | |
| JP2752092B2 (ja) | Ｄｅｏプロモーターを有する発現プラスミド及び該プラスミドを含む細菌宿主 |