JPS61181385A - 組換え安定多コピ−酵母ベクタ− - Google Patents
組換え安定多コピ−酵母ベクタ−Info
- Publication number
- JPS61181385A JPS61181385A JP60273181A JP27318185A JPS61181385A JP S61181385 A JPS61181385 A JP S61181385A JP 60273181 A JP60273181 A JP 60273181A JP 27318185 A JP27318185 A JP 27318185A JP S61181385 A JPS61181385 A JP S61181385A
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- JP
- Japan
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- yeast
- vector
- plasmid
- medium
- regulatable promoter
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/68—Stabilisation of the vector
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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- Manufacturing Cores, Coils, And Magnets (AREA)
- Production Of Multi-Layered Print Wiring Board (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、組換え多コピー酵母ベクターの作製方法、こ
れらのベクターの増殖方法、これらσノベクターσノ利
用、ならびにこれらのベクター自体く関する。
れらのベクターの増殖方法、これらσノベクターσノ利
用、ならびにこれらのベクター自体く関する。
適当な宿主生物中で遺伝子操作によって蛋白質な製造す
る場合、所望の蛋白質をコードする異種ＤＮＡな適当な
りローニングベクターの二３１［［ＤＮＡに挿入し、つ
いでこれを適当な宿主生物に導入するのが便利である。
る場合、所望の蛋白質をコードする異種ＤＮＡな適当な
りローニングベクターの二３１［［ＤＮＡに挿入し、つ
いでこれを適当な宿主生物に導入するのが便利である。
次に、宿主生物の複製システムが、本来の宿主のＤＮＡ
セクションとともに挿入ＤＮＡフラグメントを再生する
。プラスミドが適当な読み取り枠とを２モーターを含ん
でいれば、ＤＮＡが複製されるだけでなく、それがコー
ドする蛋白質も発現される。蛋白質の収率は当然、宿主
生物の複製システムの効率に依存するが、同時に発現さ
れるＤＮＡＩ（利用できろ原料の欺によっても決定され
る。
セクションとともに挿入ＤＮＡフラグメントを再生する
。プラスミドが適当な読み取り枠とを２モーターを含ん
でいれば、ＤＮＡが複製されるだけでなく、それがコー
ドする蛋白質も発現される。蛋白質の収率は当然、宿主
生物の複製システムの効率に依存するが、同時に発現さ
れるＤＮＡＩ（利用できろ原料の欺によっても決定され
る。
多くのプラスミドは細胞１個あたり１個しか存在せず、
ごく一部は細胞１個あたり２個以上のコピーが存在する
。たとえば、プラスミドＱＯｊｌ！ｉ１は、大腸菌染色
体１個に対して、１０〜２０個のコピーが存在する。ｃ
ｏｊｚｌから誘導されるプラスミドは蛋白質阻害剤の添
加により増殖させることができるが、一方、自明のよう
にこの理由で、蛋白質は蓄積されない。温度を上げると
、多くのプラスミド、いわゆる無拘束（ｒｕｎａｗａｙ
）プラスミドは刺激され、増殖する。
ごく一部は細胞１個あたり２個以上のコピーが存在する
。たとえば、プラスミドＱＯｊｌ！ｉ１は、大腸菌染色
体１個に対して、１０〜２０個のコピーが存在する。ｃ
ｏｊｚｌから誘導されるプラスミドは蛋白質阻害剤の添
加により増殖させることができるが、一方、自明のよう
にこの理由で、蛋白質は蓄積されない。温度を上げると
、多くのプラスミド、いわゆる無拘束（ｒｕｎａｗａｙ
）プラスミドは刺激され、増殖する。
しかしながら、蛋白質収率はプラスミドのコぎ一数のみ
によるものではなく、プラスミド自身の安定性によって
も決まる。酵母に適したベクターの場合、高コピー数で
増殖できるプラスミドは知られているが、不安定であり
、また一方、著しく安定だと細胞１個あたりのコーー数
が少ない。
によるものではなく、プラスミド自身の安定性によって
も決まる。酵母に適したベクターの場合、高コピー数で
増殖できるプラスミドは知られているが、不安定であり
、また一方、著しく安定だと細胞１個あたりのコーー数
が少ない。
本発明の目的は、安定に維持でき、満足できるコピー数
で使用できる、酵母に適したベクターシステムを得るこ
と（あった。
で使用できる、酵母に適したベクターシステムを得るこ
と（あった。
異種ＤＮＡをもつプラスミドの多くは、遺伝子操作によ
る蛋白質の製造には、選択条件下でのみ使用できる。そ
うでないと、非形質転換生一体が多くなりすぎるからで
ある。これらの選択条件は、抗生物質の便用によっての
み確立される場合が多い。しかしながら、抗生物質のた
めに製造費用が高価になることと、抗生物質を含む°発
酵液の廃棄（抵抗性の危険を生じる）というｒ＆１ｊ題
がある。
る蛋白質の製造には、選択条件下でのみ使用できる。そ
うでないと、非形質転換生一体が多くなりすぎるからで
ある。これらの選択条件は、抗生物質の便用によっての
み確立される場合が多い。しかしながら、抗生物質のた
めに製造費用が高価になることと、抗生物質を含む°発
酵液の廃棄（抵抗性の危険を生じる）というｒ＆１ｊ題
がある。
したがって、本＆明の目的はさらに、安定かつ非選択条
件下に培養できる組換え多複写酵母ベクターの製造にあ
った。
件下に培養できる組換え多複写酵母ベクターの製造にあ
った。
これらの目的は、酵母宿主システムと％以下に述べる適
当な様式で遺伝子操作方法によって結合した酵母発現プ
ラスミドの要巣、プロモーター、セントロメアおよび原
複製を便用することにより達成された。
当な様式で遺伝子操作方法によって結合した酵母発現プ
ラスミドの要巣、プロモーター、セントロメアおよび原
複製を便用することにより達成された。
本明細書の最後に掲げた引用文献は、従来技術を例示す
るもので、さらに詳細な記述がある。必要［Ｃじて文献
書号をカッコ内に示し、引用する。
るもので、さらに詳細な記述がある。必要［Ｃじて文献
書号をカッコ内に示し、引用する。
酵母中で異種遺伝子な発現させるために使用でキロベク
ターには多くの種類がある（１）、一群の酵母ベクター
としていわゆる酵母組込みプラスくド（ｙｅａｓｔ １
ｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ、 Ｙ工ｐ）か
らなるものがあり、これは通常１）ＢＲ３２２のような
細菌プラスミドと酵母染色体ＤＮＡのフラグメントおよ
び選択マーカーから形既される。これらのベクターに工
ろ酵母の形質転換の頻度はきわめて低い（プラスミドＤ
ＮＡ ｉμｇあたり形質転換細胞１〜１０個）。形′ｉ
転換表現型は、Ｙエルプラスミドの酵母染色体への組込
みＫよって得られる（２．３）。
ターには多くの種類がある（１）、一群の酵母ベクター
としていわゆる酵母組込みプラスくド（ｙｅａｓｔ １
ｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ、 Ｙ工ｐ）か
らなるものがあり、これは通常１）ＢＲ３２２のような
細菌プラスミドと酵母染色体ＤＮＡのフラグメントおよ
び選択マーカーから形既される。これらのベクターに工
ろ酵母の形質転換の頻度はきわめて低い（プラスミドＤ
ＮＡ ｉμｇあたり形質転換細胞１〜１０個）。形′ｉ
転換表現型は、Ｙエルプラスミドの酵母染色体への組込
みＫよって得られる（２．３）。
酵母または他の真核生物ＤＮＡのＹエルプラスミドの一
部の７ラグメントに染色体外で自己を複写する性質のあ
ることが知られて論る（４〜８）。
部の７ラグメントに染色体外で自己を複写する性質のあ
ることが知られて論る（４〜８）。
ＡＲ８要素（自動複写配列）を含むベクターはＹＲｐ（
酵母複写プラスミド）または単Ｋ ＡＲＳプラスミドと
呼ばれる。ＭＲｐプラスミドの分裂安定注の研究により
、選択生育条件下でも、きわめてわずかな細胞（５〜２
５％）のみがそのプラスミドを含むにすぎないことが明
らかにされた（ ４ 、５ 、７゜９）。しかしながら
、これらのシラスミｒのコピー数は細＠１個あたり、約
２０〜５０コピーと変動する（７．１０）。
酵母複写プラスミド）または単Ｋ ＡＲＳプラスミドと
呼ばれる。ＭＲｐプラスミドの分裂安定注の研究により
、選択生育条件下でも、きわめてわずかな細胞（５〜２
５％）のみがそのプラスミドを含むにすぎないことが明
らかにされた（ ４ 、５ 、７゜９）。しかしながら
、これらのシラスミｒのコピー数は細＠１個あたり、約
２０〜５０コピーと変動する（７．１０）。
また、酵母ベクター上のいわゆるセントロメア配列の存
在がしばしばその安定性を改善することも知られている
。しかしながら、セントロメア礪舵が細Ｆ＠１個あたり
のゾ２スミトコざ一部な改善することはなＶｈａ ｙＲｐ ｆラスミドの分裂安定注は、酵母ＤＮＡのフラ
グメントの象加により改善できる。これはセントロメア
（ｃＥＮ）の機能的要素を構成するものと思われろ（１
１，１２）。ＹＯＩ） （酵母セントロメアグラスミド
）として知られているこれらＣＩ） ｆラスミドは、選
択条件下に生育した細胞の約８０％に、細胞１個あたり
１〜２コピーの割合で存在する（１１．１２）。
在がしばしばその安定性を改善することも知られている
。しかしながら、セントロメア礪舵が細Ｆ＠１個あたり
のゾ２スミトコざ一部な改善することはなＶｈａ ｙＲｐ ｆラスミドの分裂安定注は、酵母ＤＮＡのフラ
グメントの象加により改善できる。これはセントロメア
（ｃＥＮ）の機能的要素を構成するものと思われろ（１
１，１２）。ＹＯＩ） （酵母セントロメアグラスミド
）として知られているこれらＣＩ） ｆラスミドは、選
択条件下に生育した細胞の約８０％に、細胞１個あたり
１〜２コピーの割合で存在する（１１．１２）。
酵母、サツカロミセス・セレビシェ（８ａｃｃｈａｒｏ
−ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉａｉ（１８）） Ｇ！、′
２μサークル”として知られる内在性ＤＮＡプラスミド
を含有する。
−ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉａｉ（１８）） Ｇ！、′
２μサークル”として知られる内在性ＤＮＡプラスミド
を含有する。
これは分裂的に安定で細胞１個あたり２０〜５０コピー
存在する（１３）。２μサークルはこのシラスミＶを１
細胞周期（１回以上複写できる自己増幅システムをもっ
ている（１４．１５）。多種の酵母ベクターが２μをベ
ースに構築されてきた。その大部分は非選択メジウム上
、細胞１個あたりのコピー数２０〜５０で、分裂的に６
０〜８０％まで安定である。すなわち、これらでは２μ
の安定性が部分的に失われている。
存在する（１３）。２μサークルはこのシラスミＶを１
細胞周期（１回以上複写できる自己増幅システムをもっ
ている（１４．１５）。多種の酵母ベクターが２μをベ
ースに構築されてきた。その大部分は非選択メジウム上
、細胞１個あたりのコピー数２０〜５０で、分裂的に６
０〜８０％まで安定である。すなわち、これらでは２μ
の安定性が部分的に失われている。
本発明は、酵母セントロメア機能（ｃｚｎ）が調節酵母
プロモーター由来の転写によって調節できろとのｇ識に
基づくものであろ゛ 醪母セントロメアＤＮＡは、それが強力なプロモーター
によって転写される゛と、も早、ＹＲｐプラスミドを分
裂的に安定化しないことが明らかにされている。本発明
においては、（ＪＮ配列、好ましくはＯＥＮ ３配列が
、調節可能な酵母プロモーター、好ましくはアルコール
デヒドロｒナーゼＩＩ７’Ｃ２モーターの前に位置させ
た。かくしてＹＣＲｐグ２スミドＴｓ（酵母セントロメ
ア調節）が得られた。
プロモーター由来の転写によって調節できろとのｇ識に
基づくものであろ゛ 醪母セントロメアＤＮＡは、それが強力なプロモーター
によって転写される゛と、も早、ＹＲｐプラスミドを分
裂的に安定化しないことが明らかにされている。本発明
においては、（ＪＮ配列、好ましくはＯＥＮ ３配列が
、調節可能な酵母プロモーター、好ましくはアルコール
デヒドロｒナーゼＩＩ７’Ｃ２モーターの前に位置させ
た。かくしてＹＣＲｐグ２スミドＴｓ（酵母セントロメ
ア調節）が得られた。
酵母アルコールデヒｌＩロｒナーゼ■遺伝子（ＡＤＨ２
）の発現は、グルコースの存在下に抑制され、非発酵性
の炭素源１ことえはエタノールの存在下に再活性化され
る（１８）。ＡＤＨ２遺伝子の５領域間列は他の遺伝子
に適切に結合すると、この遺伝子にグルコース抑制を付
与することができる（１９）。ＡＤＨ２プロモーターを
含む５領域調節配列（ＡＤＨ２プロモーターと省略）の
前にＣ■３配列を結合丁れば、メジウム中の炭素源を変
えるだけでＡＤ）１２− （ＫＮ ３融合の発現をコン
トロールできるはずである。５ＡＤＨ２−ＯＥＮ３融合
プラスミド（ＹＣＲｐ）で形質転換された酵母なグルコ
ースの存在下に培ｉｆると、ＡＤＨ２プロモーターは不
活性化され（ＡＤＨ２−０ＦＦ）、ＯＷＮ りはＹＯＲ
Ｉ） ７″ラスミドを分裂的に安定化する（ＣにＮ ５
− ＯＮ）。災素源ヲエタノールに変えるとＡＤＩ（２
７’ロモーターは再び活性化され（ＡＤＨ２−ＯＮ）、
ＣＥ）Ｊ ３領域を介した発現は遮断される（ＣＥＥＮ
３−０ＦＦ）。その結果、ＹＯＲｐ ｌ工も半安定で
はない。この段階で、酵母細胞中ＹＯＲｐ７’ラスミド
を所望のコピー数まで増幅することが可能である。Ｎ幅
後、これらのＹＣＲｐグラスミドは、メジウムをエタノ
ールからグルコースに変えれば、Ｆｊ＆能注のＣｌＣＮ
３配列によって安定化されることになる。
）の発現は、グルコースの存在下に抑制され、非発酵性
の炭素源１ことえはエタノールの存在下に再活性化され
る（１８）。ＡＤＨ２遺伝子の５領域間列は他の遺伝子
に適切に結合すると、この遺伝子にグルコース抑制を付
与することができる（１９）。ＡＤＨ２プロモーターを
含む５領域調節配列（ＡＤＨ２プロモーターと省略）の
前にＣ■３配列を結合丁れば、メジウム中の炭素源を変
えるだけでＡＤ）１２− （ＫＮ ３融合の発現をコン
トロールできるはずである。５ＡＤＨ２−ＯＥＮ３融合
プラスミド（ＹＣＲｐ）で形質転換された酵母なグルコ
ースの存在下に培ｉｆると、ＡＤＨ２プロモーターは不
活性化され（ＡＤＨ２−０ＦＦ）、ＯＷＮ りはＹＯＲ
Ｉ） ７″ラスミドを分裂的に安定化する（ＣにＮ ５
− ＯＮ）。災素源ヲエタノールに変えるとＡＤＩ（２
７’ロモーターは再び活性化され（ＡＤＨ２−ＯＮ）、
ＣＥ）Ｊ ３領域を介した発現は遮断される（ＣＥＥＮ
３−０ＦＦ）。その結果、ＹＯＲｐ ｌ工も半安定で
はない。この段階で、酵母細胞中ＹＯＲｐ７’ラスミド
を所望のコピー数まで増幅することが可能である。Ｎ幅
後、これらのＹＣＲｐグラスミドは、メジウムをエタノ
ールからグルコースに変えれば、Ｆｊ＆能注のＣｌＣＮ
３配列によって安定化されることになる。
本発明を工安定化要素としてＣＥＮ ３、調節要素とし
てＡＤＨ２遺伝子に限定されたもＱノではない。他の安
定化快素、たとえばＯＥＮ ６およびｃｚＮｌｌも、そ
れらが厳密に関節可能な酵母プロモーターと適当に融合
されれば利用できる。プロモーターにろじて、碌々な因
子による調節が可能になる。たとえば、過当な炭素源の
選択、熱ショック、酸素、ヘム、リンｒＲ塩等である。
てＡＤＨ２遺伝子に限定されたもＱノではない。他の安
定化快素、たとえばＯＥＮ ６およびｃｚＮｌｌも、そ
れらが厳密に関節可能な酵母プロモーターと適当に融合
されれば利用できる。プロモーターにろじて、碌々な因
子による調節が可能になる。たとえば、過当な炭素源の
選択、熱ショック、酸素、ヘム、リンｒＲ塩等である。
図面は、本発明を例示するものである。
＠１図は、ｐＢＣｓＴｉおよびＡＤＨ２ＢＳグラスミド
の制限＃素および遺伝子地図、ならびにＹＣ！Ｒｐ２Ｃ
ｌスミドＱ）製法を図示したものである。
の制限＃素および遺伝子地図、ならびにＹＣ！Ｒｐ２Ｃ
ｌスミドＱ）製法を図示したものである。
第２歯は５．：ｒＤＢ２０７プラスミドの制限酵素およ
び遺伝子地図、ならびにＹＣＲＰ ３お裏びＹＯＲｐ４
プラスミドの製法を図示したものである。
び遺伝子地図、ならびにＹＣＲＰ ３お裏びＹＯＲｐ４
プラスミドの製法を図示したものである。
第６図は、ＹＯＲＰ １７″ラスミドのコピー数（Ｉ４
＋１定のための分析である。
＋１定のための分析である。
第１表は、酵母ＳＨσ３２株におけろＹＣＲＩ） ２プ
フスミｒの安定性とコピー数のデータを示したものであ
り、謂２表は、酵母ＳＨσ３２株におけるＹＯＲｐ３プ
ラスミドの安定性とコピー数のデータを示したものであ
る。
フスミｒの安定性とコピー数のデータを示したものであ
り、謂２表は、酵母ＳＨσ３２株におけるＹＯＲｐ３プ
ラスミドの安定性とコピー数のデータを示したものであ
る。
使用したすべてのＤＮＡ制限＃累および代謝＃素はニュ
ー・イングランド・パイオラデズ（ＨｅｗＥｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）とベセスダ・リサーチ・ラボラト
リーズ（Ｂｅｔｈ＠ｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手した。、＃素は発売元の
推薦した条件、緩衝液を吊込で便用した。ＡＴＰおよび
デオキシヌクレオチド・トリホスフェートはシグマ（Ｓ
ｉｇｍａ）から、 ＤＮＡリンカ−は二ニー・イングラ
ンド・バイオラブズから入手した。
ー・イングランド・パイオラデズ（ＨｅｗＥｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）とベセスダ・リサーチ・ラボラト
リーズ（Ｂｅｔｈ＠ｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手した。、＃素は発売元の
推薦した条件、緩衝液を吊込で便用した。ＡＴＰおよび
デオキシヌクレオチド・トリホスフェートはシグマ（Ｓ
ｉｇｍａ）から、 ＤＮＡリンカ−は二ニー・イングラ
ンド・バイオラブズから入手した。
共有結合的に閉じ２大腸菌からの環状グラスミドの精良
および大腸菌の形質転換はすでに報告されている方法（
２０，２１）を用いて実施した。
および大腸菌の形質転換はすでに報告されている方法（
２０，２１）を用いて実施した。
大＃菌ミ巳スクリーンは既報のように使用した（２２）
。酵母σ−形質転換は公知方法（２）Ｋ裏って基本的に
は行ったが次の工５な改良を加えた。
。酵母σ−形質転換は公知方法（２）Ｋ裏って基本的に
は行ったが次の工５な改良を加えた。
１ｉｔ２ｘ１０７個／ｖＬｔの細胞２００−を２５−の
水で洗浄、遠心分離して絹製しｆｓａこれらの細胞を、
１Ｍンルビトール１０−１２５！！ＩＭ ｇｎｒＡ（ｐ
Ｈ８）ｂよび５ Ｑ ｍＭジチオスレイトール浴液によ
り３０℃で１０分間処理し、ついで１Ｍンルビトール１
０＠ｔで洗浄した。細胞ペレットを注意深く、ＳＯＢ
（Ｉ Ｍンルビトール、０．１Ｍクエン酸ナトリウムＰ
Ｈ８，５および０．０１ Ｍ ！！：ＤＴＡ） １０−
に再懸濁し、３０℃で１岬のチモリアーゼ５ＯＯ（キリ
ン醸造）で処理し、こσ）懸濁液１００μｍを１０％Ｓ
ＤＳ 溶液０．９−に加えて８０％スフエ０シラスティ
ングを行った。測定は＃累添卯前の細胞溶液な０％とし
て用いＡｂ８８０Ｇで比較して実施した（１０チ８ＤＳ
中での溶菌はＡ”８００の低下を生じた）。
水で洗浄、遠心分離して絹製しｆｓａこれらの細胞を、
１Ｍンルビトール１０−１２５！！ＩＭ ｇｎｒＡ（ｐ
Ｈ８）ｂよび５ Ｑ ｍＭジチオスレイトール浴液によ
り３０℃で１０分間処理し、ついで１Ｍンルビトール１
０＠ｔで洗浄した。細胞ペレットを注意深く、ＳＯＢ
（Ｉ Ｍンルビトール、０．１Ｍクエン酸ナトリウムＰ
Ｈ８，５および０．０１ Ｍ ！！：ＤＴＡ） １０−
に再懸濁し、３０℃で１岬のチモリアーゼ５ＯＯ（キリ
ン醸造）で処理し、こσ）懸濁液１００μｍを１０％Ｓ
ＤＳ 溶液０．９−に加えて８０％スフエ０シラスティ
ングを行った。測定は＃累添卯前の細胞溶液な０％とし
て用いＡｂ８８０Ｇで比較して実施した（１０チ８ＤＳ
中での溶菌はＡ”８００の低下を生じた）。
次に細胞を１Ｍンルピトール１０−で３回、１Ｍンルピ
トール、２０ ｍＭ ｃａＣＬ、およびｉ Ｑ ｍＭＴ
ｒｉｓ −ＨＣＬ （ｐ）１７．４ ）で１回洗浄し、
同じ浴液１−に外＠濁した。りｈで精製プラスミドＤＮ
Ａ ５〜ｉ５ ｎａｇを加え、１００μＪの再懸濁細胞
と１５分間注意深く混合した。２０％（Ｗ／ｖ）ポリエ
チレングリコール４０００（メルク）、１０ ｍＭ ０
ａＣｊ２および１０ ｍＭＴｒｔｓ −ＨＣＪ（ＰＨ７
−５）を含有する浴液１−を注意深く混合しながら１５
分以内に加えた。つｂで細胞を遠心分離によって分離し
、ＳＯＳ（ＩＭンルビトール、５６．５％（ｖ／ｖ）
ＹＥＰＤブイヨンおよび６．５ ｍｕ ｃａｃｊ２ ）
２０ Ｏｔｔｌ中、６０℃で２０分間インキュベート
した。この懸濁液１００μＪを＆）ムアガール（水１１
中くンルビトール１８２１グルコース２０ｊ１．ＹｘＢ
Ｏ，７＆お工びＤｉｆＣＯアガール３０．Ｆな含有）２
０−を含むペトリ皿に適用し、５０℃でトッゾアガール
〔ボトムアガールと同一組成に、さらにボトムアガール
５０−にりきアデニン（１，２ｑ／−） １ ｗ＠ｔ、
ウラシル（２，４ｍｇ／ｓｇ）１−および−ｔｒｐド０
ツブアウトミックス１−を含有； −ｔｒｐドロップア
ウトミックスは水１００−あたりａｒｇ Ｏ，２ｐ 、
ｈｉｇｏ、１ ｙ、 ｔｈｅ Ｏ，６ｊ１％ＪｅｕＯ
，６，ｌ Ａｙｅ Ｏ，４Ｆ。
トール、２０ ｍＭ ｃａＣＬ、およびｉ Ｑ ｍＭＴ
ｒｉｓ −ＨＣＬ （ｐ）１７．４ ）で１回洗浄し、
同じ浴液１−に外＠濁した。りｈで精製プラスミドＤＮ
Ａ ５〜ｉ５ ｎａｇを加え、１００μＪの再懸濁細胞
と１５分間注意深く混合した。２０％（Ｗ／ｖ）ポリエ
チレングリコール４０００（メルク）、１０ ｍＭ ０
ａＣｊ２および１０ ｍＭＴｒｔｓ −ＨＣＪ（ＰＨ７
−５）を含有する浴液１−を注意深く混合しながら１５
分以内に加えた。つｂで細胞を遠心分離によって分離し
、ＳＯＳ（ＩＭンルビトール、５６．５％（ｖ／ｖ）
ＹＥＰＤブイヨンおよび６．５ ｍｕ ｃａｃｊ２ ）
２０ Ｏｔｔｌ中、６０℃で２０分間インキュベート
した。この懸濁液１００μＪを＆）ムアガール（水１１
中くンルビトール１８２１グルコース２０ｊ１．ＹｘＢ
Ｏ，７＆お工びＤｉｆＣＯアガール３０．Ｆな含有）２
０−を含むペトリ皿に適用し、５０℃でトッゾアガール
〔ボトムアガールと同一組成に、さらにボトムアガール
５０−にりきアデニン（１，２ｑ／−） １ ｗ＠ｔ、
ウラシル（２，４ｍｇ／ｓｇ）１−および−ｔｒｐド０
ツブアウトミックス１−を含有； −ｔｒｐドロップア
ウトミックスは水１００−あたりａｒｇ Ｏ，２ｐ 、
ｈｉｇｏ、１ ｙ、 ｔｈｅ Ｏ，６ｊ１％ＪｅｕＯ
，６，ｌ Ａｙｅ Ｏ，４Ｆ。
ｎｅｔ ０．１ ｇ、ｐｈｉ ０．６ ｇおよびｔｈｒ
ｏ、ｓ ｌを含有〕１０＠ｔで処理した。こりＴｒｐ
＋選択でグラスミドＤＮＡ １μｇあたり１０３個の酵
母形質転換体を生じた。
ｏ、ｓ ｌを含有〕１０＠ｔで処理した。こりＴｒｐ
＋選択でグラスミドＤＮＡ １μｇあたり１０３個の酵
母形質転換体を生じた。
酵母内でσＳプラスミドの安定性は、細胞を選択または
非選択生育後に水で希釈し、これをＹＰＤプレート上（
非選択）に広げて試験した。２８°Ｃで３０時間生育さ
せたのち、これらの！レートをＹＮＢ ＋ ＣＡＡ ｆ
レート上（ＴＲＰ＋またはＩ、ＥＵ＋選択）レグリカ培
養した。囁プラスミド安定性は選択的に生育したコロニ
ー数を非選択的に生育したコロニー数で除し、１００を
乗じた値で表した。
非選択生育後に水で希釈し、これをＹＰＤプレート上（
非選択）に広げて試験した。２８°Ｃで３０時間生育さ
せたのち、これらの！レートをＹＮＢ ＋ ＣＡＡ ｆ
レート上（ＴＲＰ＋またはＩ、ＥＵ＋選択）レグリカ培
養した。囁プラスミド安定性は選択的に生育したコロニ
ー数を非選択的に生育したコロニー数で除し、１００を
乗じた値で表した。
７９−：Ｐスミ−のコピー数はサデーン解析（２３）に
よって測定した。選択メジウム中で生育したＳＨＵ ３
２ （ｙｃｕｐ）形質転換体の全ＤＮＡ ｉｔ Ｋｃｏ
Ｒ工制限エンＶヌクレアーゼで消化し、アガロースダル
電気泳動で分画した。ニトロセルロースフィルタ上に移
シたＱＪチ、ＤＮＡを、ニックトランスレーションによ
って放射標識したＹエル５プラスミドＤＮＡとハイブリ
ダイズした（ Ｙｚｐ ５は、酵母σＲＡ３遺伝子（Ｓ
）＆ＲｔｒｐＢＲ３２２である）、Ｘ線フィルム上に
暴繕したのち、少くとも２本のバンドが観察された。１
つは単一σＲＡ ５染色体コシーで、他はＹＣＲマゾラ
スミド７ラグメントである。ＹＣＰプラスミドで形質１
喚されたＳＨＵ３２のＤＮＡ ７°ロープは、対照とし
て利用できた。これはＹＣＰとＹＣＲｐセントａメアプ
ラスミドのコピー数を直接比較ｆろことを可能にした。
よって測定した。選択メジウム中で生育したＳＨＵ ３
２ （ｙｃｕｐ）形質転換体の全ＤＮＡ ｉｔ Ｋｃｏ
Ｒ工制限エンＶヌクレアーゼで消化し、アガロースダル
電気泳動で分画した。ニトロセルロースフィルタ上に移
シたＱＪチ、ＤＮＡを、ニックトランスレーションによ
って放射標識したＹエル５プラスミドＤＮＡとハイブリ
ダイズした（ Ｙｚｐ ５は、酵母σＲＡ３遺伝子（Ｓ
）＆ＲｔｒｐＢＲ３２２である）、Ｘ線フィルム上に
暴繕したのち、少くとも２本のバンドが観察された。１
つは単一σＲＡ ５染色体コシーで、他はＹＣＲマゾラ
スミド７ラグメントである。ＹＣＰプラスミドで形質１
喚されたＳＨＵ３２のＤＮＡ ７°ロープは、対照とし
て利用できた。これはＹＣＰとＹＣＲｐセントａメアプ
ラスミドのコピー数を直接比較ｆろことを可能にした。
一部の試験では完全酵母ＤＮＡの希釈系タリをｒル上に
展開し、ＹＯＲｐパンＶの強度と、細胞１個あたり１ま
たは２１１！のコピーしか生じないことがわかっている
対照プラスミドバンドの強度を直接比較することができ
た。
展開し、ＹＯＲｐパンＶの強度と、細胞１個あたり１ま
たは２１１！のコピーしか生じないことがわかっている
対照プラスミドバンドの強度を直接比較することができ
た。
細菌の形質転換には、大腸醒株ＲＲ１を便用した（Ｆ−
、ｐｒｏ−、Ｊｅｕ−、ｔｈｉ−、Ｊａｃ Ｖ、 ｒｐ
ｓ Ｈ。
、ｐｒｏ−、Ｊｅｕ−、ｔｈｉ−、Ｊａｃ Ｖ、 ｒｐ
ｓ Ｈ。
ｈｓｄＲ，ｈ８ｄＭ） （２１）。酵母の形質転換には
、ウィーン大学のハルティグ（Ａ、 Ｈａｒｔｉｇ）博
士から恵与されたサツカロミセス・セレビシＩσ） Ｓ
Ｈ［７３２株（１θｕ２． ｔｒｐｌ、 ｕｒａ３）を
使用した。他の酵母株も便用できることは自明である。
、ウィーン大学のハルティグ（Ａ、 Ｈａｒｔｉｇ）博
士から恵与されたサツカロミセス・セレビシＩσ） Ｓ
Ｈ［７３２株（１θｕ２． ｔｒｐｌ、 ｕｒａ３）を
使用した。他の酵母株も便用できることは自明である。
便用したＩ、Ｂメジウムはミｔ −（Ｍｉｌｌｅｒ）に
よりて報告されてｈろが（２７）、メジウム？オートク
レーブ処理し、冷却したのち、アンピシリン（ＳＫＲＶ
Ａ） ３０μｇ／−を添加した。酵母は次のメジウム、
ｙｐ（１％ｆｉ＃母エキス、２％ペゾトン紐よび炭素源
５％グルコースまたは５％エタノール）、ＹＮＢ ＋Ｃ
ｊＡＡ （０，６７係酵母窒素ペ一スｗ１０アミノ酸）
（ＤｉｆＣＯ）、０．５ ％ ｐｔｒｃｏカサミノ酸
（ＯＡＡ）および炭素源５％グルコースまたは３１エタ
ノール）上で培養した。’ｒｒｐ＋選択にはＹＮＢ＋Ｏ
ＡＡ Ｋ −ｔｒｐドロップアウト溶液（メジウム５０
−あたり５０Ｘ谷液１−）を補充し、ＬＦ、Ｕ＋選択に
際しては−Ｊｅｕドロップアウト溶液を同様にして用い
た。
よりて報告されてｈろが（２７）、メジウム？オートク
レーブ処理し、冷却したのち、アンピシリン（ＳＫＲＶ
Ａ） ３０μｇ／−を添加した。酵母は次のメジウム、
ｙｐ（１％ｆｉ＃母エキス、２％ペゾトン紐よび炭素源
５％グルコースまたは５％エタノール）、ＹＮＢ ＋Ｃ
ｊＡＡ （０，６７係酵母窒素ペ一スｗ１０アミノ酸）
（ＤｉｆＣＯ）、０．５ ％ ｐｔｒｃｏカサミノ酸
（ＯＡＡ）および炭素源５％グルコースまたは３１エタ
ノール）上で培養した。’ｒｒｐ＋選択にはＹＮＢ＋Ｏ
ＡＡ Ｋ −ｔｒｐドロップアウト溶液（メジウム５０
−あたり５０Ｘ谷液１−）を補充し、ＬＦ、Ｕ＋選択に
際しては−Ｊｅｕドロップアウト溶液を同様にして用い
た。
酵母メジウムは２．５％Ｄ４ｆｃｏアガールな加えて固
化した。
化した。
ｉｇ１図には２種のプラスミド、ｐＢＣ！３Ｔ１および
ＡＤＨ２はプラスミドｐＡＤＨ２ＢＳを示す。これらの
両プラスミドの構築九つ匹ての情報は報告されている（
１９．２８）。
ＡＤＨ２はプラスミドｐＡＤＨ２ＢＳを示す。これらの
両プラスミドの構築九つ匹ての情報は報告されている（
１９．２８）。
ＰＢＯ３Ｔ１プラスミドは、大＃［内での選択と安定な
生育のために、アンピシリン抵抗性遺伝子（ＡｐＲ）を
もつｐＢＲ３２２（１９）の部分と大腸菌起源のＩ））
ＪＡ複ｇ （ＯＲＩ）を含む。このプラスミドはまた、
ｚｃｏＲ工からｚｃｏＨ工まで酵母の染色体■からくる
１、４５ｋｂフラグメン上にＴＲＰ １遺伝子を含む（
３０）。この遺伝子はｔｒｐｌ−１４！母株内での選択
を可能にし、したがってこのプラスミドを含む酵母クロ
ーンの単離に使用できる。同じＤＮＡフラグメント上Ｋ
ＡＲ８１０自律複製配列）要素が存在する。ＡＲ８１要
素はこのＤＮＡの酵母内での自律複製、グラスミドとし
ての維持を可能にする（３ｏ）。
生育のために、アンピシリン抵抗性遺伝子（ＡｐＲ）を
もつｐＢＲ３２２（１９）の部分と大腸菌起源のＩ））
ＪＡ複ｇ （ＯＲＩ）を含む。このプラスミドはまた、
ｚｃｏＲ工からｚｃｏＨ工まで酵母の染色体■からくる
１、４５ｋｂフラグメン上にＴＲＰ １遺伝子を含む（
３０）。この遺伝子はｔｒｐｌ−１４！母株内での選択
を可能にし、したがってこのプラスミドを含む酵母クロ
ーンの単離に使用できる。同じＤＮＡフラグメント上Ｋ
ＡＲ８１０自律複製配列）要素が存在する。ＡＲ８１要
素はこのＤＮＡの酵母内での自律複製、グラスミドとし
ての維持を可能にする（３ｏ）。
１）ＢＯ３Ｔ１プフスミドはまた、酵母染色体■白米の
、Ｈｌｎｄ ［ｆｆからＢａｍＨＩまテ２．０ ｋｔ）
Ｑ）７５ｆ）１７ ）上Ｋ ＯＢＮ ３を含有する（
３１）、○ＥＮ３配列を含むグラスミドは分裂的に安定
で、細胞１個につき１〜２コピー存在する。。
、Ｈｌｎｄ ［ｆｆからＢａｍＨＩまテ２．０ ｋｔ）
Ｑ）７５ｆ）１７ ）上Ｋ ＯＢＮ ３を含有する（
３１）、○ＥＮ３配列を含むグラスミドは分裂的に安定
で、細胞１個につき１〜２コピー存在する。。
ＡＤＨ（２ＢＳプラスミドは、ＡＤＨ２遺伝子を含む酵
母遺伝子ＤＮＡの２．Ｏｋｌ） Ｂａｎ Ｈｌ 〜８ａ
ｕｌＡ７ ？クメントが唯一の１３！ｍＨ■サイトにク
ローニングされたＰＢＲ２５２である（２８）、この場
合、ＢａｍＨｌとＢａｕ ３ Ａの粘着末端の間のリゾ
−ジョンでＢａｍＨｊ制限サイトが再生し、したがって
ＡＤＨ２遺伝子はＡＤＨ２ＢＳプラスミドから１回Ｂａ
ｎ ＨＩ消化で切９ｔｋＪされる。
母遺伝子ＤＮＡの２．Ｏｋｌ） Ｂａｎ Ｈｌ 〜８ａ
ｕｌＡ７ ？クメントが唯一の１３！ｍＨ■サイトにク
ローニングされたＰＢＲ２５２である（２８）、この場
合、ＢａｍＨｌとＢａｕ ３ Ａの粘着末端の間のリゾ
−ジョンでＢａｍＨｊ制限サイトが再生し、したがって
ＡＤＨ２遺伝子はＡＤＨ２ＢＳプラスミドから１回Ｂａ
ｎ ＨＩ消化で切９ｔｋＪされる。
ＡＤＨ２遺伝子とその５′隣接領域の報告されたＤＮＡ
配列から、ＥＣ０ＲＶ制限サイトが＋６７ （ｉ（＋１
はＡＴＧコドンからのＡである）Ｋ存在する。このＫＣ
ＯＲＶサイトは上に−１２０７に存在ｆるＢａｎ）Ｉ）
サイトとともにＡＤＨ２ｆロモーターをその５隣接調節
配列すべてとともに巣離するのに使用された。
配列から、ＥＣ０ＲＶ制限サイトが＋６７ （ｉ（＋１
はＡＴＧコドンからのＡである）Ｋ存在する。このＫＣ
ＯＲＶサイトは上に−１２０７に存在ｆるＢａｎ）Ｉ）
サイトとともにＡＤＨ２ｆロモーターをその５隣接調節
配列すべてとともに巣離するのに使用された。
たとえば、ＡＤ）１２ ＢＳＳテラミ）−” ＤＮＡ
ｆ：ＫＣＯＲＶ テ完全に消化しく第１図）、フェノー
ル抽出およびエタノール沈殿で精製し、２μｇのＢｇｚ
１ホスホリル化リンカ−（５′ＣＡＧＡＴＣＴＧ！１
）（バイオラデズ）でプラント末端連結し、ＢａｆＩｌ
ｌＨ１およびＢｇＪ ７１で制限し、アガロースデル電
気泳動後、１３００ｂｐフラグメントを単離した。この
フラグメントは全調節配列とＡＤ）Ｉ ２コード領域の
小片（ｉｊｌｋ初の２２個のアミノ収をコード）ととも
（無傷のＡＤＨ２プロモーターを含有する。
ｆ：ＫＣＯＲＶ テ完全に消化しく第１図）、フェノー
ル抽出およびエタノール沈殿で精製し、２μｇのＢｇｚ
１ホスホリル化リンカ−（５′ＣＡＧＡＴＣＴＧ！１
）（バイオラデズ）でプラント末端連結し、ＢａｆＩｌ
ｌＨ１およびＢｇＪ ７１で制限し、アガロースデル電
気泳動後、１３００ｂｐフラグメントを単離した。この
フラグメントは全調節配列とＡＤ）Ｉ ２コード領域の
小片（ｉｊｌｋ初の２２個のアミノ収をコード）ととも
（無傷のＡＤＨ２プロモーターを含有する。
ｐＢＣ ３ Ｔ １グラスｊ）’ＤＮＡ５μｇをＢａＩ
ｎＨ■エンドヌクレアーゼで完全に消化し、フェノール
抽出とエタノール沈殿で精製し、ウシ小腸ホスファター
ゼ（Ｃ工Ｐ） Ｋ：より公知Ｑ方１０３３）で脱ホスホ
リル化した。さらにフェノール抽出とエタノール沈殿を
行ったのち、ＢａｍＨＩ消化、脱ホスホリル化ｐＢＣ３
Ｔ１７’フスミ ＶＤｙｈ １００ ｎｇ’ｔＡＤＨ２
７ｐａモーター０） １．３ ｋｂ Ｂａｍ ＨＩ〜Ｂ
ｇＬ■フラグメント２００ ｎｇと、たとえばＴ４ＤＮ
Ａりが一ゼで連結した。ついでこの混合物１／、でコン
ビ−テント大腸菌ＲＲｉ細胞を形質１喚した。ニックト
ランスレーションで放射標識したＡＤＨ２１，３ｋｂ
Ｂａｎ Ｈｌ 〜ＢｇｊＩＩフラグメントをプローブと
して用い、コミニーハイブリダイゼーション法でアンピ
シリン抵抗性コａニー？スクリーニングした。陽性シグ
ナルな与えた１２＋ＩｉＡのコロニーから、プラスミド
ＤＮＡを調製し、各種の制限酵素で消化して、ＡＤＨ２
グロモーターからｃｗＮ３配列までの転写が可能なよう
（適当な方向ｉｃ ＡＤＨ２グロモーターインサーシヨ
ンがクローニングされたクローンを同定した。
ｎＨ■エンドヌクレアーゼで完全に消化し、フェノール
抽出とエタノール沈殿で精製し、ウシ小腸ホスファター
ゼ（Ｃ工Ｐ） Ｋ：より公知Ｑ方１０３３）で脱ホスホ
リル化した。さらにフェノール抽出とエタノール沈殿を
行ったのち、ＢａｍＨＩ消化、脱ホスホリル化ｐＢＣ３
Ｔ１７’フスミ ＶＤｙｈ １００ ｎｇ’ｔＡＤＨ２
７ｐａモーター０） １．３ ｋｂ Ｂａｍ ＨＩ〜Ｂ
ｇＬ■フラグメント２００ ｎｇと、たとえばＴ４ＤＮ
Ａりが一ゼで連結した。ついでこの混合物１／、でコン
ビ−テント大腸菌ＲＲｉ細胞を形質１喚した。ニックト
ランスレーションで放射標識したＡＤＨ２１，３ｋｂ
Ｂａｎ Ｈｌ 〜ＢｇｊＩＩフラグメントをプローブと
して用い、コミニーハイブリダイゼーション法でアンピ
シリン抵抗性コａニー？スクリーニングした。陽性シグ
ナルな与えた１２＋ＩｉＡのコロニーから、プラスミド
ＤＮＡを調製し、各種の制限酵素で消化して、ＡＤＨ２
グロモーターからｃｗＮ３配列までの転写が可能なよう
（適当な方向ｉｃ ＡＤＨ２グロモーターインサーシヨ
ンがクローニングされたクローンを同定した。
このようなりローンが同定され、このプラスミドはＹＣ
Ｒｐ ２と命名された。ＹＯＲｐ ２プラスミドの制限
ａ＃素地図を第１図に示す。
Ｒｐ ２と命名された。ＹＯＲｐ ２プラスミドの制限
ａ＃素地図を第１図に示す。
酵母内でのプラスミドのコぎ一敗と安定性を調べろため
、酵母株ＳＨσ３２（ｔｒｐ１″″、 Ｊｅｕ ２−
ａｕｒａ ３−）をＹ（！Ｒｐ ２プラスミドＤＮＡで
形質転換した口ＴＲＰ形質転換体を単離し、その安定性
とコぎ一敗を分析した。これら０）％験のデータは第１
表に示すとおりである。
、酵母株ＳＨσ３２（ｔｒｐ１″″、 Ｊｅｕ ２−
ａｕｒａ ３−）をＹ（！Ｒｐ ２プラスミドＤＮＡで
形質転換した口ＴＲＰ形質転換体を単離し、その安定性
とコぎ一敗を分析した。これら０）％験のデータは第１
表に示すとおりである。
ｙｃＲｐ ２プラスミドの安定性は、形質転換体を炭素
源の異なるメジウム中で生育させたのちに分析した。、
ＹＯＲＩ）２形質転換体をグルコースメジタム上のみで
生育させると、このプラスミドリ安定性は他のＹＣｐプ
ラスミドの場合に類似しく約８０係）、コピー数は低か
りｒＳ（細胞１個あたり１〜２コピー）（第１民の例１
と６、第３図のカラム１と２を比較）。これは、グルコ
ースが存在すればＡＤＨ２プロモーターが不活性化しく
ＡＤＨ２−ＯＦ？）、ＣＥＮ ３配列が正常九機能でき
る（ｃｚＮ３−ＯＮ）ことから当然期待される。
源の異なるメジウム中で生育させたのちに分析した。、
ＹＯＲＩ）２形質転換体をグルコースメジタム上のみで
生育させると、このプラスミドリ安定性は他のＹＣｐプ
ラスミドの場合に類似しく約８０係）、コピー数は低か
りｒＳ（細胞１個あたり１〜２コピー）（第１民の例１
と６、第３図のカラム１と２を比較）。これは、グルコ
ースが存在すればＡＤＨ２プロモーターが不活性化しく
ＡＤＨ２−ＯＦ？）、ＣＥＮ ３配列が正常九機能でき
る（ｃｚＮ３−ＯＮ）ことから当然期待される。
しかしながら、ＹＯＲｐ ２形質転換体をエタノール含
有メジウム上で生育させると、プラスミドの安定性°は
劇的に低下する（約３６％）が、コピー数は細胞１個あ
たり５〜１０に増加した。同一条件下でもＹＣｐ プラ
スミドは依然としてきわめて安定で、コピー数も低い（
第１表の例２と４を比較Ｘこれは、再活性化されたＡＤ
Ｈ２７＃Ｏモーター（ＡＤＨ２−ＯＮ）の転写がいかに
Ｃ■３配列を遮断するか（Ｃ！ＥＮ ３−０ＦＦ）、そ
の結果ＹｃＲｐ ２プラスミドがＹＲｐプフスミドのよ
うに挙動するか（きわめて不安定であるが、コぎ一敗は
高い）を示している。
有メジウム上で生育させると、プラスミドの安定性°は
劇的に低下する（約３６％）が、コピー数は細胞１個あ
たり５〜１０に増加した。同一条件下でもＹＣｐ プラ
スミドは依然としてきわめて安定で、コピー数も低い（
第１表の例２と４を比較Ｘこれは、再活性化されたＡＤ
Ｈ２７＃Ｏモーター（ＡＤＨ２−ＯＮ）の転写がいかに
Ｃ■３配列を遮断するか（Ｃ！ＥＮ ３−０ＦＦ）、そ
の結果ＹｃＲｐ ２プラスミドがＹＲｐプフスミドのよ
うに挙動するか（きわめて不安定であるが、コぎ一敗は
高い）を示している。
驚くべきことに、ＹＣＲｐ ２プラスミドの安定性は、
メジウムなグルコースに戻しても以前よ、つむしろ高か
った。このメジウムでの安定性は約９５係、コピー数は
細胞１個あたり５〜１０コピーと一定であった（第１民
の例５、第３図のカラム３）。
メジウムなグルコースに戻しても以前よ、つむしろ高か
った。このメジウムでの安定性は約９５係、コピー数は
細胞１個あたり５〜１０コピーと一定であった（第１民
の例５、第３図のカラム３）。
グルコースは再びＡＤＨ２７’ロモーターを失活させ（
ＡＤＨ２−０ＦＦ）、ＯＩ！：Ｎ３機能が再び活性化す
る（ ＣＥＮ３− ＯＮ）。
ＡＤＨ２−０ＦＦ）、ＯＩ！：Ｎ３機能が再び活性化す
る（ ＣＥＮ３− ＯＮ）。
しかしながら、エタノール上での培養中に、酵母自体は
Ｙ（！Ｒ１） ２プラスミドのコぎ−をさらに蓄積する
ことはできなかった。ＹＮＢ ＋ＣＡＡエタノールメジ
ウム上５０世代後でさえも、コピー数は細胞あたり８〜
１２コピーを越えろことはなかった（第１表例６、第５
図カラム４参照）。
Ｙ（！Ｒ１） ２プラスミドのコぎ−をさらに蓄積する
ことはできなかった。ＹＮＢ ＋ＣＡＡエタノールメジ
ウム上５０世代後でさえも、コピー数は細胞あたり８〜
１２コピーを越えろことはなかった（第１表例６、第５
図カラム４参照）。
ＹＯＲＩ） ３および４プ２スミＦの調製を第２図に図
示した。クローニングベクターＰＪＤＢ２０７について
は丁でに報告されている（１６）。ｐＪＤＢ ２０７は
、選択と大物菌内での安定な生育のためにアンピシリン
（ＡｐＲ） ＆−よびテトラサイクリン（ＴｅｔＲ）抵
抗性遺伝子、ｃｏＪｚ１複製オリジン（ＯＲ工）をもつ
細菌ＤＡＴ１５３７’ラスミド（３４）を含有する。こ
のｆ５スミドはまた、２μＤＮＡの２−７ ｋｂＥＣＯ
ＲＬ／ＥＣ０ＲＩフラグメントももっている。このフラ
グメント上に、酵母内で染色体外複製とそれ自体の発現
の位置にそのベクターを置く２μ起源の複製サイト（１
３）ならびに２μＤＮＡのＲＥＰ３遺伝子座σノ両者が
存在する。こσ〕遺伝子座は２μ増幅システムの重要な
ｇ！−素で、プラスミドを増幅可能にするためにはシス
配置に存在しなければならなｈｏＲＥＰ １およびＲＥ
Ｐ ２のような他の必要な要素を１、トランス配回に２
μＤＮＡの野生型コピーによってコン）ｏ−ルされる（
１４．１５）、酵母染色体Ｉｔｌ Ｋ由来Ｖ選択マーカ
ーＬＸσ２はある修飾後上記２μＤＮＡフラグメントの
ｐｓｔ工切断部立にクローニングされた。
示した。クローニングベクターＰＪＤＢ２０７について
は丁でに報告されている（１６）。ｐＪＤＢ ２０７は
、選択と大物菌内での安定な生育のためにアンピシリン
（ＡｐＲ） ＆−よびテトラサイクリン（ＴｅｔＲ）抵
抗性遺伝子、ｃｏＪｚ１複製オリジン（ＯＲ工）をもつ
細菌ＤＡＴ１５３７’ラスミド（３４）を含有する。こ
のｆ５スミドはまた、２μＤＮＡの２−７ ｋｂＥＣＯ
ＲＬ／ＥＣ０ＲＩフラグメントももっている。このフラ
グメント上に、酵母内で染色体外複製とそれ自体の発現
の位置にそのベクターを置く２μ起源の複製サイト（１
３）ならびに２μＤＮＡのＲＥＰ３遺伝子座σノ両者が
存在する。こσ〕遺伝子座は２μ増幅システムの重要な
ｇ！−素で、プラスミドを増幅可能にするためにはシス
配置に存在しなければならなｈｏＲＥＰ １およびＲＥ
Ｐ ２のような他の必要な要素を１、トランス配回に２
μＤＮＡの野生型コピーによってコン）ｏ−ルされる（
１４．１５）、酵母染色体Ｉｔｌ Ｋ由来Ｖ選択マーカ
ーＬＸσ２はある修飾後上記２μＤＮＡフラグメントの
ｐｓｔ工切断部立にクローニングされた。
このＬＥσ−２−ａ遺伝子はＬｅｕ２−酵母変異株にお
ける選択を可能にし、Ｌｅｕ２−ｉ異味が１多コピーベ
クター”中にある揚台Ｑ）み、それを補足する（１６）
。
ける選択を可能にし、Ｌｅｕ２−ｉ異味が１多コピーベ
クター”中にある揚台Ｑ）み、それを補足する（１６）
。
ｙｃＲｐ ３および４プラスミドなり４製イるためには
ＹＣＲｐ ２ ＤＮＡ ５ μｇをＢｇＪ−■およびＢ
ａｍＨＩ制限エンｒヌクレアーゼで消化した。アがロー
スデルを気泳ｍｗ、４．２ ｋｂ ＢｇＪ ＩＩ／ Ｂ
ａｍＨＩフラグメントを単離した。このフラグメントは
酵母ＴＲＰ １遺伝子とＡＤＨ２−ＣＥＮ ５融合を含
有した。ｐｙＤＢ２０７プラスミドＤ４ＪＡ ５μｇを
ＢａｍＪ（）で完全に消化し、フェノール抽出とエタノ
ール沈殿で精製し、ウシ小腸ホスファターゼで既報のよ
うに（６３）脱ホスホリル化した。かくして得られたｐ
ＪＤＢ２０７デラスミドＤＮＡ １００ ｎｇをついで
４．２ｋｂＢｇＪ−■／Ｂｌ！ＬＥＩＩＨＩＹｃＲｐ
２フラグメン）２００ｎｇと連結した。大腸菌ＲＲ１ｉ
胞をこの混合物１１５で形質転換し、ＡＰＲコロニーを
単離した。全コロニーな、ニックトランスレーションし
たｙｃＲｐ ２の４．２ ｋｂフクグメントをプローブ
とし℃用いたコαニー／Ｓイブリダイゼーションによっ
てチェックした。階柱コロニーからグラスミドＤＮＡ
を単離し、これらのプラスミドの制限酵素地図を作底し
た。Ｂｇｊ ＩＩ／Ｂａｍ１０Ｉフラグメントは２種の
配向でｐ、ＴＤＢ ２０７のＢａｍＨｌ切断サイトにク
ローニングできるので、２種のプラスきドが生成した。
ＹＣＲｐ ２ ＤＮＡ ５ μｇをＢｇＪ−■およびＢ
ａｍＨＩ制限エンｒヌクレアーゼで消化した。アがロー
スデルを気泳ｍｗ、４．２ ｋｂ ＢｇＪ ＩＩ／ Ｂ
ａｍＨＩフラグメントを単離した。このフラグメントは
酵母ＴＲＰ １遺伝子とＡＤＨ２−ＣＥＮ ５融合を含
有した。ｐｙＤＢ２０７プラスミドＤ４ＪＡ ５μｇを
ＢａｍＪ（）で完全に消化し、フェノール抽出とエタノ
ール沈殿で精製し、ウシ小腸ホスファターゼで既報のよ
うに（６３）脱ホスホリル化した。かくして得られたｐ
ＪＤＢ２０７デラスミドＤＮＡ １００ ｎｇをついで
４．２ｋｂＢｇＪ−■／Ｂｌ！ＬＥＩＩＨＩＹｃＲｐ
２フラグメン）２００ｎｇと連結した。大腸菌ＲＲ１ｉ
胞をこの混合物１１５で形質転換し、ＡＰＲコロニーを
単離した。全コロニーな、ニックトランスレーションし
たｙｃＲｐ ２の４．２ ｋｂフクグメントをプローブ
とし℃用いたコαニー／Ｓイブリダイゼーションによっ
てチェックした。階柱コロニーからグラスミドＤＮＡ
を単離し、これらのプラスミドの制限酵素地図を作底し
た。Ｂｇｊ ＩＩ／Ｂａｍ１０Ｉフラグメントは２種の
配向でｐ、ＴＤＢ ２０７のＢａｍＨｌ切断サイトにク
ローニングできるので、２種のプラスきドが生成した。
Ｙｃｘｐ ３とＹＣＲＩ） ４である（第２図）。
クローン化ＡＤＨ２−ＯＥＮ ３融合の配向は、酵母内
でのＹＣＲｐシラスミＶの安定性またはコピー数に影響
を与えないことが明らかにされた。すべての結果はＹＣ
ＲＰ ３ゾ２スミドについて得られたものであるが、Ｙ
ＣＲＩ） ４プラスミドも同様に挙動する。
でのＹＣＲｐシラスミＶの安定性またはコピー数に影響
を与えないことが明らかにされた。すべての結果はＹＣ
ＲＰ ３ゾ２スミドについて得られたものであるが、Ｙ
ＣＲＩ） ４プラスミドも同様に挙動する。
ＹＯＲｐ ３７″ラスミドは２種の酵母標識遺伝子、Ｌ
Ｅσ２−ｄおよびＴＲＰ ｉを言百する。ＴＲＰ １遺
伝子は、酵母のｔｒｐ ｌ−変異株を、それが細胞あた
り１コピーしか現れなめ嚇会でも補足し、ＬＥσ−ｄ遺
伝子は、Ｌｅｕ ２−変異株を、それが多コピープラス
ミド（ｍ胞あたり５０〜１００コピー）上にある１合し
か補足しない。このシステムは、選択メジウム上に単純
に散布するだけでコぎ一敗のチェックを可能にする。Ｌ
Ｅｒｌ＋細胞は丁べて、少なくとも細胞あたり５０個の
シラスミトコぎ−を含有しなければならないが、ＴＲＰ
＋細胞は少なくとも１コぎ−のプラスミドを含有すれば
よい。また、ＢＨσ５２株はＣ１ｒ”、すなわち野生型
２ ｔｔ ＤＮＡをもち、これが２μ増幅システムのさ
らに２１ｍの成分、ＲＥＰ １とＲＥＰ ２をｙｃＲｐ
５に供給する。完全に活性な２μ増幅システムは４つ
の遺伝子座、トランスのＲＥＰ １とＲＥＰ ２、およ
びシスのＲＥＰ ３とＯＲ工を要求する。
Ｅσ２−ｄおよびＴＲＰ ｉを言百する。ＴＲＰ １遺
伝子は、酵母のｔｒｐ ｌ−変異株を、それが細胞あた
り１コピーしか現れなめ嚇会でも補足し、ＬＥσ−ｄ遺
伝子は、Ｌｅｕ ２−変異株を、それが多コピープラス
ミド（ｍ胞あたり５０〜１００コピー）上にある１合し
か補足しない。このシステムは、選択メジウム上に単純
に散布するだけでコぎ一敗のチェックを可能にする。Ｌ
Ｅｒｌ＋細胞は丁べて、少なくとも細胞あたり５０個の
シラスミトコぎ−を含有しなければならないが、ＴＲＰ
＋細胞は少なくとも１コぎ−のプラスミドを含有すれば
よい。また、ＢＨσ５２株はＣ１ｒ”、すなわち野生型
２ ｔｔ ＤＮＡをもち、これが２μ増幅システムのさ
らに２１ｍの成分、ＲＥＰ １とＲＥＰ ２をｙｃＲｐ
５に供給する。完全に活性な２μ増幅システムは４つ
の遺伝子座、トランスのＲＥＰ １とＲＥＰ ２、およ
びシスのＲＥＰ ３とＯＲ工を要求する。
酵母ＳＨσ３２株（ｃｉｒ” 、 ｔｒｐ ｉ″″＊
Ｌｅｕ２− ｅｕｒａ ３−）をＸＣＲｐ ３７’ラス
ミドＤＮＡで形質転換し、ＴＲＰ＋形質転喚体を単離し
、ＪθＵ−お工びｕｒａ−に関し試験した。試験された
形質転喚体は丁べて２ｅｕ−、ｕｒａ−であって、ＹＯ
ＲＰ ３７’ラスミ°ドは低コピー数で存在することが
明らかにされた。災累源としてグルコースのみを使用し
ていて、したがってｃｗＮ！１が完全に機能していると
思われることから、この結果は当然であった。ＯＥＭ３
ａｌｔ８が２μ増幅システムを抑制するために、プラス
ミドのコピー数を細胞あたり１〜２に安定化する（第２
表例２、第３図カラム８参照）。酵母５Ｈ０３２株内σ
ノＹＣＲＩ） ３０安定性は、グルコース上で生育させ
たときＶｃ１ヱ、ＹＣｐプラスミドの特徴を示す（約８
Ｑ％）。
Ｌｅｕ２− ｅｕｒａ ３−）をＸＣＲｐ ３７’ラス
ミドＤＮＡで形質転換し、ＴＲＰ＋形質転喚体を単離し
、ＪθＵ−お工びｕｒａ−に関し試験した。試験された
形質転喚体は丁べて２ｅｕ−、ｕｒａ−であって、ＹＯ
ＲＰ ３７’ラスミ°ドは低コピー数で存在することが
明らかにされた。災累源としてグルコースのみを使用し
ていて、したがってｃｗＮ！１が完全に機能していると
思われることから、この結果は当然であった。ＯＥＭ３
ａｌｔ８が２μ増幅システムを抑制するために、プラス
ミドのコピー数を細胞あたり１〜２に安定化する（第２
表例２、第３図カラム８参照）。酵母５Ｈ０３２株内σ
ノＹＣＲＩ） ３０安定性は、グルコース上で生育させ
たときＶｃ１ヱ、ＹＣｐプラスミドの特徴を示す（約８
Ｑ％）。
しかしながら、ＹｃＲｐ ５で形質転換しりＳＨＵ３２
を選択−Ｊｅｕエタノールメジウム上で培養すると、ｔ
ａｕ＋コａニー数で測定したプラスミドの安定性は約６
５％に低下した。ＣＢＮ ３配列はエタノールσ）存在
下に再活性化ＡＤＩ（２ｆロモーターによって転写され
、その結果、ＯＷＮ ３機能が遮断されろものと思われ
る。ＬＥＵ＋と非機能セントロメアに対する選択で、２
μ増幅システムがコントロールを引き継ぎ、高コピー数
でＹＣ！Ｒｐ ５を増幅する。
を選択−Ｊｅｕエタノールメジウム上で培養すると、ｔ
ａｕ＋コａニー数で測定したプラスミドの安定性は約６
５％に低下した。ＣＢＮ ３配列はエタノールσ）存在
下に再活性化ＡＤＩ（２ｆロモーターによって転写され
、その結果、ＯＷＮ ３機能が遮断されろものと思われ
る。ＬＥＵ＋と非機能セントロメアに対する選択で、２
μ増幅システムがコントロールを引き継ぎ、高コピー数
でＹＣ！Ｒｐ ５を増幅する。
ＳＨＵ ３２形質転換体はＬＥＵ＋となり、これらの条
件下におけるＹＯＲｐ３の安定性は２μキメラプラスミ
ドの特徴を示す（第２艮の的１および４参照）。
件下におけるＹＯＲｐ３の安定性は２μキメラプラスミ
ドの特徴を示す（第２艮の的１および４参照）。
この期待は、エタノール上で生育させたＳＨσ３２形′
Ｒ転美体をグルコース上で培養し、プラスミドのコピー
数を測定すること（よって４１ｆ１認された。
Ｒ転美体をグルコース上で培養し、プラスミドのコピー
数を測定すること（よって４１ｆ１認された。
＠３因り力２ム９〜ＩＩＫ示したデータは、ＹＣＲｐ３
のコピー数が細胞あ１こり約１００に上昇したことな示
して込る。しかも、Ｊｅｕ＋コロニー数で示されろよう
に、このプラスミドはきわめて安定であった（９０％以
上）。
のコピー数が細胞あ１こり約１００に上昇したことな示
して込る。しかも、Ｊｅｕ＋コロニー数で示されろよう
に、このプラスミドはきわめて安定であった（９０％以
上）。
セントロメア調節ＦＲ能をもつプラスミドの製造は、Ｙ
ＣＲｐゾフスミドについて示したように、酵母内での外
米性ＤＮＡの増殖と外米性蛋白質の発現にきわめて有用
である。
ＣＲｐゾフスミドについて示したように、酵母内での外
米性ＤＮＡの増殖と外米性蛋白質の発現にきわめて有用
である。
もし、外米性ＤＮＡを本発明の方法に従って多コピー酵
母ベクター内圧適当に挿入すれば、本発明の方法を用い
、調節プロモーターに影響する因子の変更、たとえばＡ
ＤＨ２プロモーターの場合には炭素源を変えろことによ
って所望の濃度までベクターを増殖させることができる
。
母ベクター内圧適当に挿入すれば、本発明の方法を用い
、調節プロモーターに影響する因子の変更、たとえばＡ
ＤＨ２プロモーターの場合には炭素源を変えろことによ
って所望の濃度までベクターを増殖させることができる
。
本発明によるベクターは、外米性蛋白質の発現に適当な
発現システムをもつ正しい配向の外米性ＤＮＡ をベク
ター内に組込む場合にとくに有用である。
発現システムをもつ正しい配向の外米性ＤＮＡ をベク
ター内に組込む場合にとくに有用である。
発酵過程の効率は発現蛋白質の性質に依存する。
たとえば、ある濃度を越えると宿主生物に毒性を示す蛋
白質が発現されろ場合、蛋白質の址が直接または間接的
にコア ） ｏ−ルできｔいと、全発酵過程が無効にな
る町粍注がある。
白質が発現されろ場合、蛋白質の址が直接または間接的
にコア ） ｏ−ルできｔいと、全発酵過程が無効にな
る町粍注がある。
本発明におけるベクターによれば、調節可能プロモータ
ーに影響する因子を単に変えることにより、たとえば炭
素源を変えてコピー数な選択したレベル、低、中等度ま
たは高値に安定させろことにより、発現プラスミドのコ
ぎ一敗を！Ｌｌｌ堅−ｒることが可能である。これらの
ベクターによれば、発酵混合物中で発現ベクターのコピ
ー数を数世代にわたって低く保持し、各プラスミドを安
定に維持することによって、宿主系に毒性を示す生成物
を得ることさえも可能になる。十分な細胞材料が形成さ
れたならば、プロモーターなたとえば炭素源を変更する
ことによって切り替えることにエリ発現プラスミドのコ
ピー数は劇的に増大する。同時に、所望の蛋白質もはる
かに高濃度に産生されろこの段階でを１蛋白質の毒性は
重要ではない。
ーに影響する因子を単に変えることにより、たとえば炭
素源を変えてコピー数な選択したレベル、低、中等度ま
たは高値に安定させろことにより、発現プラスミドのコ
ぎ一敗を！Ｌｌｌ堅−ｒることが可能である。これらの
ベクターによれば、発酵混合物中で発現ベクターのコピ
ー数を数世代にわたって低く保持し、各プラスミドを安
定に維持することによって、宿主系に毒性を示す生成物
を得ることさえも可能になる。十分な細胞材料が形成さ
れたならば、プロモーターなたとえば炭素源を変更する
ことによって切り替えることにエリ発現プラスミドのコ
ピー数は劇的に増大する。同時に、所望の蛋白質もはる
かに高濃度に産生されろこの段階でを１蛋白質の毒性は
重要ではない。
驚くべきことに、本発明のベクターは非選択的培養条件
下に便用することができる。これはとくに組換えＤＮＡ
技術操作を蛋白質の製造に便用てろ場合、）ｌ［＊ ｒ
Ｌ利点である。
下に便用することができる。これはとくに組換えＤＮＡ
技術操作を蛋白質の製造に便用てろ場合、）ｌ［＊ ｒ
Ｌ利点である。
以下の園株およびｆ−）スミドは、Ｖイツチェ・ずムル
ング・７オン・ミクロオルガニスメン（ｐｅｕｔａｃｈ
ｅ ８１！Ｌａｎｌｕｎｇ Ｗｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇ
ａｎｉａｍｏｎ、 ＤＳＭ。
ング・７オン・ミクロオルガニスメン（ｐｅｕｔａｃｈ
ｅ ８１！Ｌａｎｌｕｎｇ Ｗｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇ
ａｎｉａｍｏｎ、 ＤＳＭ。
Ｇｒｉｅｂａｃｈｓｔｒａβ＠８．Ｄ−３４００−Ｇδ
ｔｔｌｎｇｅｎ） Ｋ１９８４年１２月２８日付で寄託
された。
ｔｔｌｎｇｅｎ） Ｋ１９８４年１２月２８日付で寄託
された。
ａ） Ｌ ｃｏｘｔ ５ｔｒａｉｎ ＲＲ１０登録記
号ＲＲ１）、ＤＳＭ ３１７ Ｂ １）） ８ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅａ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉｉ（１８） ５ｔｒａｉｎ ５ａｔｒ３２（登録記
号ＢＨσ３２）：ＤＳＭ３１８２Ｃ）プラス２ドｐＢＯ
３Ｔ １ 、 Ｒｏｃｏｌｉ ＲＲＩ ＷＣ形質転換（
登録記号ｐＢ０３Ｔ１ ） ： ＤｓＭ ３１８０ｄ）
ｆラスミドｐＡＤＨ２Ｂｓ 、！、Ｃ０１ｉ ＲＲ
１１ｃ形質転換（登録記号ｐＡＤＨ２Ｂ５ ） ： Ｄ
ＳＭ ３１７９ｅ）プラスミドｐＪＤＢ ２０７ 、
ｌ Ｃａｌ ＲＲ１に形質転換（登録記号ｐｙＤＢ ２
０７ ） ： ＤＳＭ ３１８１プリ緊 ｔ りｙｒ（Ｇｕｎｇｅ、 Ｎ、） ： （１９８３
）、アニュアル・レビュ・オシ・マイクロバイオロジー
（Ａｎｎ−Ｒｅｖ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏ’１．） 、３
７．２５３２−２５７６２、ハイネｙ （Ｈｌｎｎｅｎ
、 Ａ、 Ｈ，）ほか：（１９７８）、プロシーディン
ゲス・フォア争ず・ナショナル・アカデミ、ツク・ンサ
イアテイ・オシ・サイエンシズ・オシ・ず・ユナイテッ
ド・スティノ・オシ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ−
Ａｃａｄ、 ８ｃｉ、σＳＡ）、７６゜３、 ストルー
ル（８ｔｒｕｈＬ Ｋ、）ほか：（１９７９）、プロシ
ーディンゲス・フォア・デ・ナショナル・アカデミツク
・ンサイアテイ・オシ・サイエンシズ・オシ・デ・ユナ
イテッド・スティソ・オシ・アメリカ（ｐｒｏ（！、
Ｈａｔｌ、 Ａｃａｄ、 ＳＣ１，σＳＡ）、７６．４
、 シュティンクコム（ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｌ）、 Ｄ
、 Ｔ、）ほか：（１９７９）、ネイチャー（Ｎａｔｕ
ｒす、２８２、５、 フシアオほか（ａｓｌａｏ、 Ｏ
，Ｌ、 ＆ Ｃａｒｂｏｎ。
号ＲＲ１）、ＤＳＭ ３１７ Ｂ １）） ８ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅａ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉｉ（１８） ５ｔｒａｉｎ ５ａｔｒ３２（登録記
号ＢＨσ３２）：ＤＳＭ３１８２Ｃ）プラス２ドｐＢＯ
３Ｔ １ 、 Ｒｏｃｏｌｉ ＲＲＩ ＷＣ形質転換（
登録記号ｐＢ０３Ｔ１ ） ： ＤｓＭ ３１８０ｄ）
ｆラスミドｐＡＤＨ２Ｂｓ 、！、Ｃ０１ｉ ＲＲ
１１ｃ形質転換（登録記号ｐＡＤＨ２Ｂ５ ） ： Ｄ
ＳＭ ３１７９ｅ）プラスミドｐＪＤＢ ２０７ 、
ｌ Ｃａｌ ＲＲ１に形質転換（登録記号ｐｙＤＢ ２
０７ ） ： ＤＳＭ ３１８１プリ緊 ｔ りｙｒ（Ｇｕｎｇｅ、 Ｎ、） ： （１９８３
）、アニュアル・レビュ・オシ・マイクロバイオロジー
（Ａｎｎ−Ｒｅｖ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏ’１．） 、３
７．２５３２−２５７６２、ハイネｙ （Ｈｌｎｎｅｎ
、 Ａ、 Ｈ，）ほか：（１９７８）、プロシーディン
ゲス・フォア争ず・ナショナル・アカデミ、ツク・ンサ
イアテイ・オシ・サイエンシズ・オシ・ず・ユナイテッ
ド・スティノ・オシ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ−
Ａｃａｄ、 ８ｃｉ、σＳＡ）、７６゜３、 ストルー
ル（８ｔｒｕｈＬ Ｋ、）ほか：（１９７９）、プロシ
ーディンゲス・フォア・デ・ナショナル・アカデミツク
・ンサイアテイ・オシ・サイエンシズ・オシ・デ・ユナ
イテッド・スティソ・オシ・アメリカ（ｐｒｏ（！、
Ｈａｔｌ、 Ａｃａｄ、 ＳＣ１，σＳＡ）、７６．４
、 シュティンクコム（ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｌ）、 Ｄ
、 Ｔ、）ほか：（１９７９）、ネイチャー（Ｎａｔｕ
ｒす、２８２、５、 フシアオほか（ａｓｌａｏ、 Ｏ
，Ｌ、 ＆ Ｃａｒｂｏｎ。
Ｊ、）：（１９７９）、！ロシーディングズ゛・フォア
・デ・ナショナル・アカデミツク・ンサイアテイ・オシ
・サイエンシズ・オシ・デ・ユナイテッド・スティソ・
オシ・アメリカ（ｐｒｏｃ、 Ｈａｔｌ。
・デ・ナショナル・アカデミツク・ンサイアテイ・オシ
・サイエンシズ・オシ・デ・ユナイテッド・スティソ・
オシ・アメリカ（ｐｒｏｃ、 Ｈａｔｌ。
Ａｃａｄ、８ｃ１．σ８Ａ）、７＜５．３８２９１８３
３＆ チャンほか（Ｏｈａｎ、 Ｃ！、 ８． Ｍ、
＆ ＴｙｅｍＢ−に−） ： （１９８０）、プロシー
ディンゲス゛・フォア・ヂ・ナショナル・アカデミツク
・ソサイアティ・オプ°サイエンシズ・オシ・デ・ユナ
イテット・スティソ・オシ・アメリカ（Ｐｒｏｃ。
３＆ チャンほか（Ｏｈａｎ、 Ｃ！、 ８． Ｍ、
＆ ＴｙｅｍＢ−に−） ： （１９８０）、プロシー
ディンゲス゛・フォア・ヂ・ナショナル・アカデミツク
・ソサイアティ・オプ°サイエンシズ・オシ・デ・ユナ
イテット・スティソ・オシ・アメリカ（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、ム７，６
３２９−６３３３７ ハイ−ｖ ７ （Ｈｙｍａｎ、
Ｂ、Ｄ、）は力弓（１９８２）、プロシーディングズ・
フォア・デ・ナショナル・アカデミツク・ンサイアティ
・オシ・サイエンシズ°オブ・デ・ユナイテッド・ステ
ィソ・オシ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａ
ｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、７９゜８、ずキアン（Ｚａｋ
ｉａｎ、 Ｖ、Ａ、） ： （１９８２）；グロシーデ
ィングズ・フォア・デ・ナショナル・アカデミツク・ン
サイアティ ・オシ・サイエンシズ・オシ・デ・ユナイ
テッド・スティソ・オシ・アメリカ（ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｘ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ＵＳＡ）、Ｌ旦、９ ライフ
ｒ−）ルドーヘイズ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌ、ｄ−Ｈ＆７
０Ｂ、 Ｍ、）ほか： （１９８２）、−セル（ｃｅｌ
ｌ）、２９．２３５−２４４ １０、 デキアンほか（Ｚａｋｉａｎ、 ’Ｖ、Ａ、
＆ ｚｕｐｆｅｒ）１ｔ クラークほか（Ｃ１ａｒ
ｋｅ、 Ｌ、 ＆ Ｃａｒｂｏｎ、 Ｊ、）：（１９８
０）、ネイチャー（Ｈａｔｕｒｅ）、２８７．１２、
シュテ１ンクコム（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ、Ｄ、Ｔ、
）ほか：（１９８２）、ジャーナル・オシ・モルキュラ
ー・バイオロジー（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、）、１
５８．１３、 ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ、 Ｊ、 Ｒ
，） ： （１９８１）、ず・モルキュ２−・バイオロ
ジー・オシ・イースト・サツカロミセス：ライフ・サイ
クル・アンド・インへりタンス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ＢｉＯ’１ＯＨｙ ｏｆ Ｙａａ８ｔＳａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅａ ： １．ｉｆｅ Ｃｙｃｌｅ ａｎｄ工ｎ
ｈｅｒｉｔａｎｃｅ）、ストラデーンほか（Ｊ、 ５ｔ
ｒａｔｈｅｒｎ、 Ｋ、 Ｊｏｎｅｓ ＆Ｊ、Ｒ，Ｂｒ
ｏａｃｈ）輪、コールド・スプリング・ハーバ − ・
ラシ ４ぐ ラ ト リ − （ｃｏｌｄ ｓｐｒ
ｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ） ％
ニュー ヨーク（ＮｅＷ ＹＯｒｋ）、ｐｐ ４４５−
４７０ １４、 ジエイヤラム（Ｊａ７ａｒａｍ、 Ｍ、ンは
カニ （１９８３）、セｋ （ｃｅｘｌ）、３４−９５
−１０４１５、キクチ（ｘｉｋｕｃｈｉ、Ｙ、） ：
（１９８５）、セル（ＣｏＩ２）、是、４８７−４９３ １６、 ベグズ（Ｂｅｇｇａ、 Ｊ、） ： （１９
７８） 、ネイチャー（Ｎａｔｕｒす、２７５．１０４
−１０９１Ｚ パンゼリ（ｐａｎｚθｒｉ、 Ｌ、）
ほか： （１９８３）、アブスト２クツ・オシ・ペーパ
ーズ・プレゼンテイッド・アト・デ・ミーティング・ず
・モルキューラ−・バイオロジー・オシ・イースト（Ａ
ｂａｔｒａｃｔａｏｆ ｐａｐｅｒｓ ｐｒｅｓｅｎｔ
ｅｄ ａｔ Ｔｈｅ ）Ｊｅｅｔｉｎｇｔｈｅ Ｍｏ１
ｅ−ｃｕｌａｒ Ｂ１ｏユｏｇｙ ｏｆ Ｙｅａｓｔ）
、コールド−スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（ｃ
ｏｌａ ｓｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ）、Ｐ、６９１８、−ｒング（Ｙｏｕｎｇ、 Ｔ、
ンほか：（１９８２）、デ・フェネティック・エンジニ
アリング・オシ・マイクロオーガニスムス・フォア・ケ
ミカルズ（ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｓｒ
ｉｎｇ ｏｆ ＭｌｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍＢｆｏｒ
Ｃｈｅｍｉｃａｌす、ホレンダーほか（Ａ −Ｈｏｌｌ
（１８）ｎｄｅｒ。
３２９−６３３３７ ハイ−ｖ ７ （Ｈｙｍａｎ、
Ｂ、Ｄ、）は力弓（１９８２）、プロシーディングズ・
フォア・デ・ナショナル・アカデミツク・ンサイアティ
・オシ・サイエンシズ°オブ・デ・ユナイテッド・ステ
ィソ・オシ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａ
ｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、７９゜８、ずキアン（Ｚａｋ
ｉａｎ、 Ｖ、Ａ、） ： （１９８２）；グロシーデ
ィングズ・フォア・デ・ナショナル・アカデミツク・ン
サイアティ ・オシ・サイエンシズ・オシ・デ・ユナイ
テッド・スティソ・オシ・アメリカ（ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｘ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ＵＳＡ）、Ｌ旦、９ ライフ
ｒ−）ルドーヘイズ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌ、ｄ−Ｈ＆７
０Ｂ、 Ｍ、）ほか： （１９８２）、−セル（ｃｅｌ
ｌ）、２９．２３５−２４４ １０、 デキアンほか（Ｚａｋｉａｎ、 ’Ｖ、Ａ、
＆ ｚｕｐｆｅｒ）１ｔ クラークほか（Ｃ１ａｒ
ｋｅ、 Ｌ、 ＆ Ｃａｒｂｏｎ、 Ｊ、）：（１９８
０）、ネイチャー（Ｈａｔｕｒｅ）、２８７．１２、
シュテ１ンクコム（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ、Ｄ、Ｔ、
）ほか：（１９８２）、ジャーナル・オシ・モルキュラ
ー・バイオロジー（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、）、１
５８．１３、 ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ、 Ｊ、 Ｒ
，） ： （１９８１）、ず・モルキュ２−・バイオロ
ジー・オシ・イースト・サツカロミセス：ライフ・サイ
クル・アンド・インへりタンス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ＢｉＯ’１ＯＨｙ ｏｆ Ｙａａ８ｔＳａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅａ ： １．ｉｆｅ Ｃｙｃｌｅ ａｎｄ工ｎ
ｈｅｒｉｔａｎｃｅ）、ストラデーンほか（Ｊ、 ５ｔ
ｒａｔｈｅｒｎ、 Ｋ、 Ｊｏｎｅｓ ＆Ｊ、Ｒ，Ｂｒ
ｏａｃｈ）輪、コールド・スプリング・ハーバ − ・
ラシ ４ぐ ラ ト リ − （ｃｏｌｄ ｓｐｒ
ｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ） ％
ニュー ヨーク（ＮｅＷ ＹＯｒｋ）、ｐｐ ４４５−
４７０ １４、 ジエイヤラム（Ｊａ７ａｒａｍ、 Ｍ、ンは
カニ （１９８３）、セｋ （ｃｅｘｌ）、３４−９５
−１０４１５、キクチ（ｘｉｋｕｃｈｉ、Ｙ、） ：
（１９８５）、セル（ＣｏＩ２）、是、４８７−４９３ １６、 ベグズ（Ｂｅｇｇａ、 Ｊ、） ： （１９
７８） 、ネイチャー（Ｎａｔｕｒす、２７５．１０４
−１０９１Ｚ パンゼリ（ｐａｎｚθｒｉ、 Ｌ、）
ほか： （１９８３）、アブスト２クツ・オシ・ペーパ
ーズ・プレゼンテイッド・アト・デ・ミーティング・ず
・モルキューラ−・バイオロジー・オシ・イースト（Ａ
ｂａｔｒａｃｔａｏｆ ｐａｐｅｒｓ ｐｒｅｓｅｎｔ
ｅｄ ａｔ Ｔｈｅ ）Ｊｅｅｔｉｎｇｔｈｅ Ｍｏ１
ｅ−ｃｕｌａｒ Ｂ１ｏユｏｇｙ ｏｆ Ｙｅａｓｔ）
、コールド−スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（ｃ
ｏｌａ ｓｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ）、Ｐ、６９１８、−ｒング（Ｙｏｕｎｇ、 Ｔ、
ンほか：（１９８２）、デ・フェネティック・エンジニ
アリング・オシ・マイクロオーガニスムス・フォア・ケ
ミカルズ（ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｓｒ
ｉｎｇ ｏｆ ＭｌｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍＢｆｏｒ
Ｃｈｅｍｉｃａｌす、ホレンダーほか（Ａ −Ｈｏｌｌ
（１８）ｎｄｅｒ。
Ｒ，Ｄ、 ＤｅＭｏｓｓ、 Ｓ、 Ｋａｐｌａｎ、 １
． Ｋｏｎｌａｋｙ、 Ｄ−８ａｖａｇｅ ＆ Ｒ，８
，Ｗｏｌｆｅ）縞、グレナムφパグリツシング・コーポ
レーショｙ （Ｐｍｅｎｕｍ ｐｕｂｌｌｇｈｌｎｇＣ
ｏｒｐ−） 、 ｐｐ、 ５５１−５６１１９ バイ
アーほか（Ｂｅｔｅｒ、 Ｄ、Ｒ，＆Ｙｏｕｎｇ、 Ｔ
、）：（１９８２）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３
００．２０、 クラークほか（ｃｌａｒｋｅ、 Ｌ、
＆ Ｃａｒｂｏｎ、 Ｊ、）：（１９７６）、セル（
ＣｏＩ２）、９．９１−９９２１、 ピーコック（ｐ
ｅａｃｏｃｋ、 Ｓ、Ｌ、）ほか：（１９８２）、ビオ
フエミ・工・ビオフィジーク・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ
、 Ｂ１０ｐｈｙｓ、ＡＣｔａ）、６５５．２２、
バーンボイムほか（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、 ）！、ｃｏ
＆ ＤＯ１７＃Ｊ、）：（１９７９）、ヌクレイツク・
アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ ＲθＢ
、）、７．１５１３−２５、？デー：ｙ （Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ、 Ｋ、） ： （１９７５） 。
． Ｋｏｎｌａｋｙ、 Ｄ−８ａｖａｇｅ ＆ Ｒ，８
，Ｗｏｌｆｅ）縞、グレナムφパグリツシング・コーポ
レーショｙ （Ｐｍｅｎｕｍ ｐｕｂｌｌｇｈｌｎｇＣ
ｏｒｐ−） 、 ｐｐ、 ５５１−５６１１９ バイ
アーほか（Ｂｅｔｅｒ、 Ｄ、Ｒ，＆Ｙｏｕｎｇ、 Ｔ
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９４ ２Ｚ ミ ラ −（Ｍｉｌｌｅｒ、 Ｊ、Ｈ，）
： （１９７２） 、エクスペリメンツ・イン
・モルキュジー・ジエネティツクス（ｘｘｐθｒｉｍｅ
ｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
）％コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（
Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ １．ａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ｐｐ
、４３１−４３３２８、 ウィリアムノン（Ｗｉｌｌ
ｌｉａｍｓｏｎ、 Ｖ、Ｍ、）ほか：（１９８１）、セ
ル（ｃｅｌｌ） 、 ２３．６０５−２９サリバー（Ｂ
ｏｌ、１−ｖａｒ、 Ｆ、）ほか：（１９７７）、ジ
− ｙ （Ｇｅｎｅ） 、 ３−工り、１５７−１
６６３０、 キノルトほか（ａｈｉｎａｕｌｔ、 Ａ
、Ｃ，＆ ｃａｒｂｏｎ。
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ほか：（１９８３）、ジャーナル・オプ・バイオロジカ
ル・ケミストリー （Ｊ、 Ｂ１１１． ＯＭｍ、）
、ス」Ｌｌ、２６７４−２６８２５６、 カコナス
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３４、トライラグほか（Ｔｗｉｇｇ、Ａ、 ＆ ５ｈｅ
ｒｒａｔｔ。
ｒｒａｔｔ。
Ｄ、） ： （１９８０）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ
）、２８３．２１６−２１８
）、２８３．２１６−２１８
第１図はｐＢＣ ３ Ｔ １および１）ＡＤＨ２ＢＱプ
ラスミドの制限＃素お工び遺伝子地図、ならびにｙｃＲ
ｐ ２ゾ２スミドσ）製法を図示したものである。 第２図はＩ）ＪＤＢ ２０７７’ラスミドの制限酵素お
よび遺伝子地図、ならびＶｃＹＣＲｐ６お工びＹＯＲｐ
４プラスミドの製法を図示したものである。 第３図は、ＹＣＲｐプラスミドのコピー数測定の１こめ
の分析を示している。 ＤＮＡグローブを工でべてＥＣＯＲ工で切断し、Ｙｌｐ
５プラスミドのニックトランスレーションＤＮＡトハ
イブｊノダイズした。 １− ＳＨσ３２の全ＤＮＡ ３μｇ（ｐｇＢｌｏＢ）
−典型的ＹＯｐプラスミド ２− ＳＨσ３２の全ＤＮＡ ３μｇ（ＹｅＲｐ ２）
−グルコース３−８Ｈσ３２の全ＤＮＡ ３μｇ（Ｙ（
！Ｒ：ｐ ２）−エタノール−グルコース ４− ＳＨσ３２の全ＤＮＡ ３μｇ（ｘｃＲｐ ２）
−エタノール（５０世代）→グルコース ５−５ＨＩＪ ３２の全ＤＮＡ １μｇ（ｐＪ：ｏＢ２
０７）６ − ＳＨσ ３２ σ）全 ＤＮＡ ０
．２ μｇ（ｐＪＤＢ ２０７ン７ − ８）（（７
３２υ〕全 ＤＮＡ ０．０５ μｇ（ｐＪｎＢ
２０７）３− ＢＨσ３２の全ＤＮＡ ５μｇ（ｙｃＲ
ｐ ３）−グルコース９−８Ｈσ３２の全ＤＮＡ １
μｇ（ｘｃＲｐ ３）−エタノール−グルコース １０− ＳＲσ３２の全ＤＮＡ ０．０５μ５（ＹｃＲ
ｐ ３）−エタノール−グルコース １１−８Ｈσ３２の全ＤＮＡ ０．０５μｇ（ｙｃＲｐ
３）−エタノール−グルコース 図面の浄書（内容に変更なしＪ 第１図 ＥｃｏＲＩ Ｈｉｎｄｌｌｌ 第２図
ラスミドの制限＃素お工び遺伝子地図、ならびにｙｃＲ
ｐ ２ゾ２スミドσ）製法を図示したものである。 第２図はＩ）ＪＤＢ ２０７７’ラスミドの制限酵素お
よび遺伝子地図、ならびＶｃＹＣＲｐ６お工びＹＯＲｐ
４プラスミドの製法を図示したものである。 第３図は、ＹＣＲｐプラスミドのコピー数測定の１こめ
の分析を示している。 ＤＮＡグローブを工でべてＥＣＯＲ工で切断し、Ｙｌｐ
５プラスミドのニックトランスレーションＤＮＡトハ
イブｊノダイズした。 １− ＳＨσ３２の全ＤＮＡ ３μｇ（ｐｇＢｌｏＢ）
−典型的ＹＯｐプラスミド ２− ＳＨσ３２の全ＤＮＡ ３μｇ（ＹｅＲｐ ２）
−グルコース３−８Ｈσ３２の全ＤＮＡ ３μｇ（Ｙ（
！Ｒ：ｐ ２）−エタノール−グルコース ４− ＳＨσ３２の全ＤＮＡ ３μｇ（ｘｃＲｐ ２）
−エタノール（５０世代）→グルコース ５−５ＨＩＪ ３２の全ＤＮＡ １μｇ（ｐＪ：ｏＢ２
０７）６ − ＳＨσ ３２ σ）全 ＤＮＡ ０
．２ μｇ（ｐＪＤＢ ２０７ン７ − ８）（（７
３２υ〕全 ＤＮＡ ０．０５ μｇ（ｐＪｎＢ
２０７）３− ＢＨσ３２の全ＤＮＡ ５μｇ（ｙｃＲ
ｐ ３）−グルコース９−８Ｈσ３２の全ＤＮＡ １
μｇ（ｘｃＲｐ ３）−エタノール−グルコース １０− ＳＲσ３２の全ＤＮＡ ０．０５μ５（ＹｃＲ
ｐ ３）−エタノール−グルコース １１−８Ｈσ３２の全ＤＮＡ ０．０５μｇ（ｙｃＲｐ
３）−エタノール−グルコース 図面の浄書（内容に変更なしＪ 第１図 ＥｃｏＲＩ Ｈｉｎｄｌｌｌ 第２図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）安定化機能がプロモーターによつて制御できる様
式の安定化機能を有するベクターに、調節可能なプロモ
ーターを挿入することを特徴とする組換え安定多コピー
酵母ベクターの作製方法 （２）安定化機能は酵母のセントロメアである特許請求
の範囲第１項に記載のベクターの作製方法 （３）安定化機能は酵母のセントロメア３である特許請
求の範囲第１項または第２項のいずれかに記載のベクタ
ーの作製方法 （４）調節可能なプロモーターは、アルコールデヒドロ
ゲナーゼIIプロモーターである特許請求の範囲第１項か
ら第３項までのいずれかに記載のベクターの作製方法 （５）特許請求の範囲第１項から第４項までに記載のい
ずれかの方法に従つて、ベクター内に増幅システムを挿
入することを特徴とする組換え安定多コピー酵母ベクタ
ーの作製方法 （６）増幅システムは２μ環状プラスミドのそれである
特許請求の範囲第５項に記載のベクターの作製方法 （７）増幅システムはプラスミドｐＪＤＢ２０７から生
じる特許請求の範囲第５項または第６項のいずれかに記
載のベクターの作製方法 （８）酵母セントロメア３はプラスミドｐＢＣ３Ｔ１か
ら生じる特許請求の範囲第１項から第７項までのいずれ
かに記載のベクターの作製方法 （９）調節可能なプロモーターＡＤＨ２はプラスミドｐ
ＡＤＨ２ＢＳから生じる特許請求の範囲第１項から第８
項までのいずれかに記載のベクターの作製方法 （１０）ａ）プラスミドｐＢＣ３Ｔ１をＢａｍＨ I で
切断し、生成した線状ＤＮＡを精製し、脱リン酸化を行
い、 ｂ）プラスミドＡＤＨ２ＢＳをＥｃｏＲＶで切断し、得
られた線状ＤＮＡを精製し、リン酸化ＢｇｌIIリンカー
に結合させ、得られたフラグメントをＢａｍＨ I およ
びＢｇｌIIで切断し、ついで精製し、 ｃ）工程ａ）およびｂ）からのフラグメントをＤＮＡリ
ガーゼで連結させることを特徴とする組換え安定多コピ
ー酵母ベクターの作製方法 （１１）ａ）プラスミドＹＣＲｐ２をＢｇｌIIおよびＢ
ａｍＨ I で切断して、その４．２ｋｂフラグメントを
精製し、 ｂ）プラスミドｐＪＤＢ２０７をＢａｍＨ I で切断し
、得られた線状ＤＮＡを精製し、脱リン酸化を行い、 ｃ）工程ａ）およびｂ）からのフラグメントをＤＮＡリ
ガーゼで連結させることを特徴とする組換え安定多コピ
ー酵母ベクターの作製方法 （１２）安定化機能と調節可能プロモーターとを有し、
後者によつて安定化機能が制御できることを特徴とする
組換え安定多コピー酵母ベクター （１３）安定化機能は酵母のセントロメアである特許請
求の範囲第１２項記載のベクター （１４）安定化機能は酵母のセントロメア３である特許
請求の範囲第１２項または第１３項のいずれかに記載の
ベクター （１５）調節可能なプロモーターは、アルコールデヒド
ロゲナーゼIIプロモーターである特許請求の範囲第１２
項から第１４項までのいずれかに記載のベクター （１６）特許請求の範囲第１２項から第１５項までのい
ずれかに従つて、ベクター内に増幅システムが挿入され
ていることを特徴とする組換え安定多コピー酵母ベクタ
ー （１７）増幅システムは２μ環状プラスミドのそれであ
る特許請求の範囲第１６項記載の組換え安定酵母ベクタ
ー （１８）増幅システムはプラスミドｐＪＤＢ２０７から
生じる特許請求の範囲第１６項または第１７項のいずれ
かに記載の組換え安定酵母ベクター （１９）酵母セントロメア３はプラスミドｐＢＣ３Ｔ１
から生じる特許請求の範囲第１２項から第１８項までの
いずれかに記載の組換え安定酵母ベクター（２０）調節
可能なプロモーターＡＤＨ２はプラスミドｐＡＤＨ２Ｂ
Ｓから生じる特許請求の範囲第１２項から第１９項まで
のいずれかに記載の組換え安定酵母ベクター （２１）組換え安定多コピー酵母ベクターＹＣＲｐ２ （２２）組換え安定多コピー酵母ベクターＹＣＲｐ３ （２３）組換え安定多コピー酵母ベクターＹＣＲｐ４ （２４）ａ）特許請求の範囲第１２項から第２３項まで
に記載のいずれかのベクターに適当な方法で、所望の蛋
白質をコードする異種ＤＮＡを挿入し、 ｂ）このベクターを、２μ環状プラスミドの野生型コピ
ーを有する適当な酵母宿主へ形質転換し、 ｃ）宿主を、調節可能プロモーターを不活性化するメジ
ウム上で初期培養し、 ｄ）ついで宿主を、調節可能プロモーターを再活性化す
るメジウム上で培養し、 ｅ）宿主を再び、調節可能プロモーターを不活性化する
メジウムに移して培養し、 ｆ）常法によつて細胞からベクターを単離し、精製し、 ｇ）常法によりベクターから異種ＤＮＡを単離し、精製
することを特徴とする、所望の異種蛋白質をコードする
異種ＤＮＡを増殖させる目的での特許請求の範囲第１２
項から第２３項までのいずれかに記載の酵母ベクターの
利用 （２５）特許請求の範囲第２４項における工程ｅ）を省
略する、特許請求の範囲第１２項から第２３項までのい
ずれかに記載の酵母ベクターの利用 （２６）特許請求の範囲第２４項における調節可能プロ
モーターを不活性化するメジウムは単独の炭素源として
グルコースを含有し、それを活性化するメジウムは単独
の炭素源としてエタノールを含有する、特許請求の範囲
第１５項に記載の酵母ベクターの利用 （２７）ａ）所望の蛋白質をコードする異種ＤＮＡを、
正しい方向性で発現システムとともに、特許請求の範囲
第１２項から第２３項までのいずれかに記載のベクター
に挿入し、ｂ）このベクターを２μ環状プラスミドの野
生型コピーを含む適当な酵母宿主生物へ形質転換し、 ｃ）宿主を、調節可能なプロモーターを不活性化するメ
ジウム上で初期培養し、 ｄ）ついで宿主を、調節可能なプロモーターを再活性化
するメジウム上で培養し、 ｅ）宿主を再び調節可能プロモーターを不活性化するメ
ジウムに移して培養し、 ｆ）常法によつて、所望の蛋白質を単離し、精製するこ
とを特徴とする、異種蛋白質を発現させる目的での特許
請求の範囲第１２項から第２３項までのいずれかに記載
の酵母ベクターの利用 （２８）特許請求の範囲第２７項における調節可能プロ
モーターを不活性化するメジウムは単独の炭素源として
グルコースを含有し、それを活性化するメジウムは単独
の炭素源としてエタノールを含有する、特許請求の範囲
第１５項に記載の酵母ベクターの利用 （２９）ａ）ベクターを２μ環状プラスミドの野生型コ
ピーを含む適当な酵母宿主生物へ形質転換し、 ｂ）宿主を、調節可能プロモーターを不活性化するメジ
ウム上で初期培養し、 ｃ）ついで宿主を、調節可能プロモーターを再活性化す
るメジウム上で培養し、 ｄ）次に宿主を再び調節可能プロモーターを不活性化す
るメジウムに移して培養することを特徴とする、特許請
求の範囲第１２項から第２３項までのいずれかに記載の
ベクターの増殖方法 （３０）特許請求の範囲第２９項における調節可能プロ
モーターを不活性化するメジウムは単独の炭素源として
グルコースを含有し、それを活性化するメジウムは単独
の炭素源としてエタノールを含有する、特許請求の範囲
第１５項記載のベクターの増殖方法
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3444495.5 | 1984-12-04 | ||
| DE19843444495 DE3444495A1 (de) | 1984-12-04 | 1984-12-04 | Herstellung eines multi-kopien-hefe-vektors |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61181385A true JPS61181385A (ja) | 1986-08-14 |
Family
ID=6252051
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60273181A Pending JPS61181385A (ja) | 1984-12-04 | 1985-12-04 | 組換え安定多コピ−酵母ベクタ− |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0184163A3 (ja) |
| JP (1) | JPS61181385A (ja) |
| AU (1) | AU5070685A (ja) |
| DE (1) | DE3444495A1 (ja) |
| DK (1) | DK559585A (ja) |
| ES (3) | ES8800342A1 (ja) |
| FI (1) | FI854781A (ja) |
| GR (1) | GR852891B (ja) |
| HU (1) | HU196454B (ja) |
| NO (1) | NO854864L (ja) |
| NZ (1) | NZ214422A (ja) |
| PT (1) | PT81594B (ja) |
| SU (1) | SU1364241A3 (ja) |
| YU (1) | YU186985A (ja) |
| ZA (1) | ZA859240B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016088824A1 (ja) * | 2014-12-03 | 2016-06-09 | 株式会社カネカ | セントロメアｄｎａ配列を含むベクター及びその用途 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3605035A1 (de) * | 1986-02-18 | 1987-08-20 | Strahlen Umweltforsch Gmbh | Plasmid pws101, verfahren zu seiner gewinnung und seine verwendung |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL63035A (en) * | 1980-09-09 | 1985-05-31 | Univ California | Dnas capable of replication and stable mitotic maintenance in a host eukaryote,their preparation and eukaryotic cells comprising them |
-
1984
- 1984-12-04 DE DE19843444495 patent/DE3444495A1/de not_active Withdrawn
-
1985
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- 1985-12-02 YU YU01869/85A patent/YU186985A/xx unknown
- 1985-12-02 GR GR852891A patent/GR852891B/el unknown
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- 1985-12-03 SU SU853991833A patent/SU1364241A3/ru active
- 1985-12-03 ES ES549526A patent/ES8800342A1/es not_active Expired
- 1985-12-03 NZ NZ214422A patent/NZ214422A/en unknown
- 1985-12-03 FI FI854781A patent/FI854781A/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-12-03 DK DK559585A patent/DK559585A/da not_active Application Discontinuation
- 1985-12-03 NO NO854864A patent/NO854864L/no unknown
- 1985-12-03 PT PT81594A patent/PT81594B/pt unknown
- 1985-12-03 HU HU854619A patent/HU196454B/hu not_active IP Right Cessation
- 1985-12-03 AU AU50706/85A patent/AU5070685A/en not_active Abandoned
- 1985-12-04 JP JP60273181A patent/JPS61181385A/ja active Pending
-
1986
- 1986-07-23 ES ES556976A patent/ES8801705A1/es not_active Expired
- 1986-07-23 ES ES556975A patent/ES8802075A1/es not_active Expired
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|---|---|---|---|---|
| WO2016088824A1 (ja) * | 2014-12-03 | 2016-06-09 | 株式会社カネカ | セントロメアｄｎａ配列を含むベクター及びその用途 |
| JPWO2016088824A1 (ja) * | 2014-12-03 | 2017-09-14 | 株式会社カネカ | セントロメアｄｎａ配列を含むベクター及びその用途 |
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