JPS61185181A - リソチ−ムを生産する形質転換された酵母菌およびこの形質転換に使用するプラスミド - Google Patents
リソチ−ムを生産する形質転換された酵母菌およびこの形質転換に使用するプラスミドInfo
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- JPS61185181A JPS61185181A JP60273530A JP27353085A JPS61185181A JP S61185181 A JPS61185181 A JP S61185181A JP 60273530 A JP60273530 A JP 60273530A JP 27353085 A JP27353085 A JP 27353085A JP S61185181 A JPS61185181 A JP S61185181A
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- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、異質遺伝子のＤＮＡを使用する形質転換によ
り、１，４−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼ型の酵素を
生産することができるようにされた酵母菌に関する。
り、１，４−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼ型の酵素を
生産することができるようにされた酵母菌に関する。
１．４−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼは、バクテリア
の細胞壁を形成するペプチドグリカン鎖中のＮ−アセチ
ルグルコサミンとＮ−アセチルムラミンとの間のグルコ
ース結合を選択的に切離すことができる酵素であること
は知られている。これらの酵素は、いっそう普通にはリ
ソチームと呼ばれており、こうして殺バクテリア剤とし
て作用し、そしてこの性質は高等動物の生物学的流体の
大部分の中のそれらの一般化された存在を説明するよう
に思われる。リソチームは、事実、種々の濃度レベルで
、哺乳動物の血液、涙、乳などの中に見出される。また
、植物界、例えば、パパイアにおいて見出される。リソ
チームの工業的抽出は卵白から実施されおり、′ここで
それは種々の吸着および／または沈殿法（ベルギー国特
許６９４゜５３８号）により、比較的大きい濃度で存在
する。
の細胞壁を形成するペプチドグリカン鎖中のＮ−アセチ
ルグルコサミンとＮ−アセチルムラミンとの間のグルコ
ース結合を選択的に切離すことができる酵素であること
は知られている。これらの酵素は、いっそう普通にはリ
ソチームと呼ばれており、こうして殺バクテリア剤とし
て作用し、そしてこの性質は高等動物の生物学的流体の
大部分の中のそれらの一般化された存在を説明するよう
に思われる。リソチームは、事実、種々の濃度レベルで
、哺乳動物の血液、涙、乳などの中に見出される。また
、植物界、例えば、パパイアにおいて見出される。リソ
チームの工業的抽出は卵白から実施されおり、′ここで
それは種々の吸着および／または沈殿法（ベルギー国特
許６９４゜５３８号）により、比較的大きい濃度で存在
する。
ニワトリリソチームの現在の用途は大抵が製薬学的分野
であり、ここでそれは種々の感染と戦うために使用され
ている。他の用途は食品産業である。例えば、リソチー
ムはベーキングし圧縮されたチーズの製造において、熟
成の間のチーズの膨張をも含む製造欠陥品の原因となる
醋酸バクテリアの発生を効率よく阻止するために使用す
ることができることは知られている（フランス国特許８
００３３２１号）、それは、また、種々の腐敗性食品１
例えば、肉製品（Ａ、アカシ、Ｊａｐ。
であり、ここでそれは種々の感染と戦うために使用され
ている。他の用途は食品産業である。例えば、リソチー
ムはベーキングし圧縮されたチーズの製造において、熟
成の間のチーズの膨張をも含む製造欠陥品の原因となる
醋酸バクテリアの発生を効率よく阻止するために使用す
ることができることは知られている（フランス国特許８
００３３２１号）、それは、また、種々の腐敗性食品１
例えば、肉製品（Ａ、アカシ、Ｊａｐ。
Ｊ、Ｚｏｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｓｃｉ、）４ス、１
９７１．２８９）、 ワイン（日本国特許３１１５／７
１．１９７１）または酒（Ｍ、ヤジマら、Ｊ、Ｆｅｒｍ
、Ｔｅｃｈｎｏ１，）４６，１９６８．７８２）の保存
のために使用することができる。さらに、それは小児科
の使用のためにミルク成分の保存（日本国特許１６７８
０／７０゜１９７０）などに使用することができる。
９７１．２８９）、 ワイン（日本国特許３１１５／７
１．１９７１）または酒（Ｍ、ヤジマら、Ｊ、Ｆｅｒｍ
、Ｔｅｃｈｎｏ１，）４６，１９６８．７８２）の保存
のために使用することができる。さらに、それは小児科
の使用のためにミルク成分の保存（日本国特許１６７８
０／７０゜１９７０）などに使用することができる。
これらの種々の用途は、リソチームを容易に、大量にか
つ十分に低いコストで生産することができるかぎり、か
なりの潜在的市場を提供する。卵白からリソチームを抽
出することを現在可能とする種々の方法は、卵白を処理
した後食品中に再使用することができる場合にのみ、商
業的に許容されうる。したがって、リソチームの生産能
力は卵白の市場により部分的に規制され、そしてこれは
標準食品における処理された卵白の使用に反対する、技
術的困難、およびある国における法律的拘束の解決を一
層困難とする問題を生ずる。
つ十分に低いコストで生産することができるかぎり、か
なりの潜在的市場を提供する。卵白からリソチームを抽
出することを現在可能とする種々の方法は、卵白を処理
した後食品中に再使用することができる場合にのみ、商
業的に許容されうる。したがって、リソチームの生産能
力は卵白の市場により部分的に規制され、そしてこれは
標準食品における処理された卵白の使用に反対する、技
術的困難、およびある国における法律的拘束の解決を一
層困難とする問題を生ずる。
これらの問題は、リソチームの天然源の入手可能性に関
係し、その初期濃度が、牛乳のリソチームについてのよ
うに、低過ぎるか、あるいは原料が、ヒトのリソチーム
のように、実際的に存在しないかどうかについて、哺乳
動物のリソチームの場合において克服不可能となる。こ
うして、リソチームの生産を可能としかつ前述の問題を
回避することのでさる技術が必要とされるように思われ
る。
係し、その初期濃度が、牛乳のリソチームについてのよ
うに、低過ぎるか、あるいは原料が、ヒトのリソチーム
のように、実際的に存在しないかどうかについて、哺乳
動物のリソチームの場合において克服不可能となる。こ
うして、リソチームの生産を可能としかつ前述の問題を
回避することのでさる技術が必要とされるように思われ
る。
本発明の主目的は、遺伝子工学の古典的技術によりリソ
チームを生産することができるようにする酵母菌を提供
することである。さらに詳しくは、本発明は、ＤＮＡが
１．４−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼの遺伝情報を指
定する断片の少なくとも１つのコピーからなり、かつこ
の断片が対応する活性蛋白質としてその中で発現される
ように形質転換された酵母菌に関する０本発明の他の目
的は、前述のように形質形成されているが、また生産し
たリソチームを分泌して、その分離および精製を促進す
ることができる酵母菌を提供することである。この形質
転換を保証するプラスミドならびに形質転換された酵母
菌を生長させることによりリソチームを生産する方法は
、また、本発明の目的を形成する。これらの目的ならび
に本発明の他の利点および実施は以下の説明から明らか
となるであろう。
チームを生産することができるようにする酵母菌を提供
することである。さらに詳しくは、本発明は、ＤＮＡが
１．４−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼの遺伝情報を指
定する断片の少なくとも１つのコピーからなり、かつこ
の断片が対応する活性蛋白質としてその中で発現される
ように形質転換された酵母菌に関する０本発明の他の目
的は、前述のように形質形成されているが、また生産し
たリソチームを分泌して、その分離および精製を促進す
ることができる酵母菌を提供することである。この形質
転換を保証するプラスミドならびに形質転換された酵母
菌を生長させることによりリソチームを生産する方法は
、また、本発明の目的を形成する。これらの目的ならび
に本発明の他の利点および実施は以下の説明から明らか
となるであろう。
酵母菌を異種遺伝子により形成された解読部分により形
質転換することにより、あるいは対応するメツセンジャ
ーＲＮＡの逆転写の生産物により、酵母菌を遺伝学的に
再プログラミングすることは知られている。この目的に
、宿主細胞の複製機構により認識される複製起源の存在
により酵母菌細胞中で自律的に複製することができるプ
ラスミドを、前記断片のベクターとして通常使用されて
いる。ベクターは、また、プラスミドにより効率よく形
質転換された細胞の可視化および選択を可能とする標識
遺伝子（ｍａｒｋｅｒ ｇ ｅ ｎｅ）を含まな
くてはならない、最後に、解読部分の前にプロモーター
、すなわち、解読部分の対応するメツセンジャーＲＮＡ
への効率よい転写を保証するような宿主細胞のＲＮＡポ
リメラーゼにより認識される配列が存在しなくてはなら
ない、 ″実際には、これらの技術は主として種すツカ
ロミセス伊セレビシアｘ （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の酵母菌に適用されてき
た。前記酵母菌のためには種々の要素からなる大きい数
の発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏ
ｒ）が構成されてきている。これらのベクターは、一般
に、この種の大部分の中に存在する２−ミクロンのプラ
スミドの複製起源を含み、あるいは染色体起源の自律的
複製のＡ１互セグメントさえを含む、標識遺伝子として
、必須代謝物、例えばアミノ酸の生物学的合成に参加す
る酵素の遺伝情報を指定する遺伝子が一般に使用される
。このような場合において、使用すべき宿主は、突然変
異により、この代謝物について栄養要求変異種となった
酵母菌菌株である。この菌株を接種することにより、ミ
ッシング（ｍｉｓｓｉｎｇ）遺伝子を有するプラスミド
により形質転換された細胞のみが生長することができる
であろう。このような遺伝標識の典型的な例は、遺伝子
ＬＥＵ２またはＴＲＰＩであり、これらはそれぞれロイ
シンおよびトリプトファンの生合成に参加する酵素の遺
伝情報を指定する。これらの発現ベクターは、また、１
つあるいは好ましくはいくつかの制限部位を含み、前記
部位に問題の解読部分、ならびにその発現を最適化する
ために必要な種々の要素、すなわち、プロモーター、タ
ーミネータ−１および他の制御要素が挿入される。
質転換することにより、あるいは対応するメツセンジャ
ーＲＮＡの逆転写の生産物により、酵母菌を遺伝学的に
再プログラミングすることは知られている。この目的に
、宿主細胞の複製機構により認識される複製起源の存在
により酵母菌細胞中で自律的に複製することができるプ
ラスミドを、前記断片のベクターとして通常使用されて
いる。ベクターは、また、プラスミドにより効率よく形
質転換された細胞の可視化および選択を可能とする標識
遺伝子（ｍａｒｋｅｒ ｇ ｅ ｎｅ）を含まな
くてはならない、最後に、解読部分の前にプロモーター
、すなわち、解読部分の対応するメツセンジャーＲＮＡ
への効率よい転写を保証するような宿主細胞のＲＮＡポ
リメラーゼにより認識される配列が存在しなくてはなら
ない、 ″実際には、これらの技術は主として種すツカ
ロミセス伊セレビシアｘ （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の酵母菌に適用されてき
た。前記酵母菌のためには種々の要素からなる大きい数
の発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏ
ｒ）が構成されてきている。これらのベクターは、一般
に、この種の大部分の中に存在する２−ミクロンのプラ
スミドの複製起源を含み、あるいは染色体起源の自律的
複製のＡ１互セグメントさえを含む、標識遺伝子として
、必須代謝物、例えばアミノ酸の生物学的合成に参加す
る酵素の遺伝情報を指定する遺伝子が一般に使用される
。このような場合において、使用すべき宿主は、突然変
異により、この代謝物について栄養要求変異種となった
酵母菌菌株である。この菌株を接種することにより、ミ
ッシング（ｍｉｓｓｉｎｇ）遺伝子を有するプラスミド
により形質転換された細胞のみが生長することができる
であろう。このような遺伝標識の典型的な例は、遺伝子
ＬＥＵ２またはＴＲＰＩであり、これらはそれぞれロイ
シンおよびトリプトファンの生合成に参加する酵素の遺
伝情報を指定する。これらの発現ベクターは、また、１
つあるいは好ましくはいくつかの制限部位を含み、前記
部位に問題の解読部分、ならびにその発現を最適化する
ために必要な種々の要素、すなわち、プロモーター、タ
ーミネータ−１および他の制御要素が挿入される。
これらのプラスミドは中間のバクテリア宿主。
例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ中の複製および選択を保証するこ
とのできるバクテリアの配列からしばしばなる。このよ
うなシャトル（ｓｈｕｔｔｌｅ）プラスミドの古典的例
として、ＹＥＰ１３［Ｊ。
とのできるバクテリアの配列からしばしばなる。このよ
うなシャトル（ｓｈｕｔｔｌｅ）プラスミドの古典的例
として、ＹＥＰ１３［Ｊ。
Ｒ，ブローチ（Ｂ ｒ ｏ ａ ｃ ｈ）ら、遺伝子（
Ｇｅｎｅ）旦、１９７９．１２１］、ｐＦＬｌ−４［Ｍ
、Ｒ，チェバリエール（Ｃｈｅｂａｌｌｉｅｒ）ら、遺
伝子（Ｇｅｎｅ）１１．１９８０．１１］、ｅｔ ｐ
ＪＤＢ２０７ ［Ｊ、Ｄ、ベッグス（Ｂｅｇｇｓ）、ア
ルフレッド・ベンンンーシンポジウム（Ａｌｆｒｅｄ
Ｂｅｎ５ｏｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）Ｎ” １６
．ムンクスガード（Ｍｕｎｋｓｇａａｒｄ）、コペンハ
ーゲン（Ｃｏ ｐ ｅｎｈａｇｅｎ）１９８１．３８３
ページ］、ｐＭＨ１５８お、Ｊ：びｐ Ｊ Ｏ１５８［
Ｍ 、 ヘ’） ステ）Ｌｔスプレウテ（Ｈｅｕｓｔｅ
ｒｓｐｒｅｕｔｅ）ら。
Ｇｅｎｅ）旦、１９７９．１２１］、ｐＦＬｌ−４［Ｍ
、Ｒ，チェバリエール（Ｃｈｅｂａｌｌｉｅｒ）ら、遺
伝子（Ｇｅｎｅ）１１．１９８０．１１］、ｅｔ ｐ
ＪＤＢ２０７ ［Ｊ、Ｄ、ベッグス（Ｂｅｇｇｓ）、ア
ルフレッド・ベンンンーシンポジウム（Ａｌｆｒｅｄ
Ｂｅｎ５ｏｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）Ｎ” １６
．ムンクスガード（Ｍｕｎｋｓｇａａｒｄ）、コペンハ
ーゲン（Ｃｏ ｐ ｅｎｈａｇｅｎ）１９８１．３８３
ページ］、ｐＭＨ１５８お、Ｊ：びｐ Ｊ Ｏ１５８［
Ｍ 、 ヘ’） ステ）Ｌｔスプレウテ（Ｈｅｕｓｔｅ
ｒｓｐｒｅｕｔｅ）ら。
遺伝子（Ｇｅｎｅ）、アンダー・プレス（ｕｎｄｅｒ
ｐｒｅｓｓ）］を引用することができる。
ｐｒｅｓｓ）］を引用することができる。
本発明の好ましい実施態様によれば、２−ミクロンの内
因性プラスミドの配列のＲＥＰ機能から少なくともなる
プラスミドを、主として宿主細胞がＳ、ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ種に属するとき、使用する。前記機能は、とくに
宿主細胞が前もって２−ミクロンのプラスミドが治癒さ
れている場合［Ｃ、Ｐ 、ホスフェート（Ｈｏｌｌｅｎ
ｂｅｒｇ）ら、Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐ、Ｍｉｃｒｏ’ｂｆ。
因性プラスミドの配列のＲＥＰ機能から少なくともなる
プラスミドを、主として宿主細胞がＳ、ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ種に属するとき、使用する。前記機能は、とくに
宿主細胞が前もって２−ミクロンのプラスミドが治癒さ
れている場合［Ｃ、Ｐ 、ホスフェート（Ｈｏｌｌｅｎ
ｂｅｒｇ）ら、Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐ、Ｍｉｃｒｏ’ｂｆ。
１ 、Ｉｍｍｕｎｏ ｌ 、）９６．１９８２．１１９
；Ｒ，Ｍ、ワルムスレイ（Ｗａ １ｍｓ ｌ ｅ ｙ）
ら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネテ４−
／クス（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ 、）１９８３．
３８１３一般にプラスミドに一層大きい安定性をもたら
す、この型の他のベクターは、下の実施例に記載されて
いる。
；Ｒ，Ｍ、ワルムスレイ（Ｗａ １ｍｓ ｌ ｅ ｙ）
ら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネテ４−
／クス（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ 、）１９８３．
３８１３一般にプラスミドに一層大きい安定性をもたら
す、この型の他のベクターは、下の実施例に記載されて
いる。
最後に、問題の解読部分の発現をできるだけ高いレベル
にするために、それをプロモーターとできるだけ効率よ
く会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）することが必要である０
種々の強いプロモーターが酵母菌において知られており
、それらの例はアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＩ
）、エノラーゼ（ＥＮＯ８およびＥＮＯ４６）、 グＩ
Ｊ−１！／ｌ／７Ｊｌ／デヒドー３−ホスフェートデヒ
ドロゲナーゼ（ＧＡＰ６３およびＧＡＰ４９１）、ホス
ホグリセレートキナーゼＣＰＧＫ）［Ｍ、Ｊ、ドブンン
（Ｄ ｏ ｂ ｓ ｏ ｎ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃＡｓｉｄｓ Ｒｅｓ、）去０，１９８２．２６２
５３およびアルカリ性ホスファターゼ（ＰＨＯ３および
ＰＨ０５）（欧州特許出願１００，５６１号）のプロモ
ーター、あるいはなおプロモーターｐ４１５（これにつ
いては後述する）である。
にするために、それをプロモーターとできるだけ効率よ
く会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）することが必要である０
種々の強いプロモーターが酵母菌において知られており
、それらの例はアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＩ
）、エノラーゼ（ＥＮＯ８およびＥＮＯ４６）、 グＩ
Ｊ−１！／ｌ／７Ｊｌ／デヒドー３−ホスフェートデヒ
ドロゲナーゼ（ＧＡＰ６３およびＧＡＰ４９１）、ホス
ホグリセレートキナーゼＣＰＧＫ）［Ｍ、Ｊ、ドブンン
（Ｄ ｏ ｂ ｓ ｏ ｎ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃＡｓｉｄｓ Ｒｅｓ、）去０，１９８２．２６２
５３およびアルカリ性ホスファターゼ（ＰＨＯ３および
ＰＨ０５）（欧州特許出願１００，５６１号）のプロモ
ーター、あるいはなおプロモーターｐ４１５（これにつ
いては後述する）である。
これらの種々の技術は、酵母菌中の多くの異種遺伝子の
クローニングおよび発現に首尾よく適・用されてきてお
り、もちろん、リソチームの遺伝子または１，４−β−
Ｎ−アセチルムラミダーゼの遺伝情報を指定するＤＮＡ
の部分の酵母菌中の発現を保証するために同様によく使
用することができる。特定の構造の例は、本発明におい
て例示のために与えられているが、多くの他の可能性が
存在すること、および複製起源、標識遺伝子、効率よい
プロモーターおよび他の構造的要素の種々の組み合わせ
を使用して同様な結果を得ることができることは明らか
である。したがって、種々の場合において得られる形質
転換された細胞は１本発明お範囲内に包含されるものと
考えなくてはならない。
クローニングおよび発現に首尾よく適・用されてきてお
り、もちろん、リソチームの遺伝子または１，４−β−
Ｎ−アセチルムラミダーゼの遺伝情報を指定するＤＮＡ
の部分の酵母菌中の発現を保証するために同様によく使
用することができる。特定の構造の例は、本発明におい
て例示のために与えられているが、多くの他の可能性が
存在すること、および複製起源、標識遺伝子、効率よい
プロモーターおよび他の構造的要素の種々の組み合わせ
を使用して同様な結果を得ることができることは明らか
である。したがって、種々の場合において得られる形質
転換された細胞は１本発明お範囲内に包含されるものと
考えなくてはならない。
同様に、これらの技術の大部分は酵母菌Ｓ、ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅの形質転換に主として適用されてきたが、ま
た、上に述べたのと同一の型の発現ベクターおよびそれ
らの変異種により形質転換可能な酵母菌の他の種および
属から得られる形質転換された細胞は本発明に包含され
る。他の例とｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆａｃｔ ｉｓ）な
どを引用することができる。しかしながら、本発明の好
ましい実施態様によれば、サツカロミセス（Ｓ ａ ｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属からの形質転換可能な酵母
菌、なお好ましくはＳ、ｃｅｒｅｖｊｓｆａｅ種からの
形質転換可能な酵母菌が使用されるであろう、この種に
属する形質転換可能な例として、なかでもＡＨ２２およ
びＧＲＦ１８を引用することができる。
ｉｓｉａｅの形質転換に主として適用されてきたが、ま
た、上に述べたのと同一の型の発現ベクターおよびそれ
らの変異種により形質転換可能な酵母菌の他の種および
属から得られる形質転換された細胞は本発明に包含され
る。他の例とｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆａｃｔ ｉｓ）な
どを引用することができる。しかしながら、本発明の好
ましい実施態様によれば、サツカロミセス（Ｓ ａ ｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属からの形質転換可能な酵母
菌、なお好ましくはＳ、ｃｅｒｅｖｊｓｆａｅ種からの
形質転換可能な酵母菌が使用されるであろう、この種に
属する形質転換可能な例として、なかでもＡＨ２２およ
びＧＲＦ１８を引用することができる。
本発明に従いこれらの種々の酵母菌により生産される１
、４−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼは異る起源を有す
ることができる。それは、例えば、ニワトリリソチーム
であることができる。ニワトリリソチームは、前述のよ
うに、すでに工業的に生産されている。しかしながら、
他の源からのリソチームの遺伝情報を指定するＤＮＡ部
分は、これらの種々のリソチームが、異る程度に、顕著
な相同性を表わす（Ｐ、ジョレス（Ｊ ｏ ｌ １ａＳ
）ら、モレキュラー・アンド・バイオケミスト リー
（Ｍｏ１．＆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）且ユ、
１９８４．１６５］ので、他の源からのリソチームの遺
伝情報を指定するＤＮＡ部分も同様に酵母菌中で発現さ
れうる０例えば、酵母菌中でガチョウのリソチームを発
現することができる。ガチョウのリソチームはニワトリ
のリソチームよりも顕著に高い特異的活性を有する［Ｒ
。
、４−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼは異る起源を有す
ることができる。それは、例えば、ニワトリリソチーム
であることができる。ニワトリリソチームは、前述のよ
うに、すでに工業的に生産されている。しかしながら、
他の源からのリソチームの遺伝情報を指定するＤＮＡ部
分は、これらの種々のリソチームが、異る程度に、顕著
な相同性を表わす（Ｐ、ジョレス（Ｊ ｏ ｌ １ａＳ
）ら、モレキュラー・アンド・バイオケミスト リー
（Ｍｏ１．＆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）且ユ、
１９８４．１６５］ので、他の源からのリソチームの遺
伝情報を指定するＤＮＡ部分も同様に酵母菌中で発現さ
れうる０例えば、酵母菌中でガチョウのリソチームを発
現することができる。ガチョウのリソチームはニワトリ
のリソチームよりも顕著に高い特異的活性を有する［Ｒ
。
Ｃ，カンフイールド（Ｃａｎｆｉｅｌｄ）ら。
「リソチーム（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）Ｊ 、Ｅ、Ｆ。
オツセルマン（Ｏｓｓｅｒｍａｎ）ら編、アカデミツク
・ブレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ ｒ ｅ ｓｓ）、
１９７４．６３ページ］。また、ヒトのリソチームを酵
母菌中で発現することができ、このリソチームは、また
、非常に活性であり、そしてとくに製薬学的用途ならび
に小児科で使用されるミルク組成物中に適用される。パ
パイアからのリソチーム、およびバクテリアのウィルス
により解読されるものも引用することができる。
・ブレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ ｒ ｅ ｓｓ）、
１９７４．６３ページ］。また、ヒトのリソチームを酵
母菌中で発現することができ、このリソチームは、また
、非常に活性であり、そしてとくに製薬学的用途ならび
に小児科で使用されるミルク組成物中に適用される。パ
パイアからのリソチーム、およびバクテリアのウィルス
により解読されるものも引用することができる。
本発明に従い、酵母菌菌株が遺伝子工学により誘導され
て１つまたは他の起源からリソチームを生産するとき、
この新規な性質の利用して、それをその生長に最も適当
な条件下で発酵させることにより増殖することが必要で
ある。このようにして、それ自体人間または動物の食糧
中に使用できるバイオマスが得られる０例えば、酵母菌
の自己分解物は、それ自体栄養価をもつばかりでなく、
かつまた感覚器官の性質をもつため、種々の食品（ミー
ドパ化 スープ、ソースなど）における添加剤として多
少使用されることは知られている。
て１つまたは他の起源からリソチームを生産するとき、
この新規な性質の利用して、それをその生長に最も適当
な条件下で発酵させることにより増殖することが必要で
ある。このようにして、それ自体人間または動物の食糧
中に使用できるバイオマスが得られる０例えば、酵母菌
の自己分解物は、それ自体栄養価をもつばかりでなく、
かつまた感覚器官の性質をもつため、種々の食品（ミー
ドパ化 スープ、ソースなど）における添加剤として多
少使用されることは知られている。
もとの酵母菌中のリソチームの存在は、自己分解物が混
入される食品のように、自己分解物がさらされるバクテ
リアの汚染から自己分解物を、ある程度まで、保存する
という利点を提供する。他方において、リソチームの存
在は食品の滅菌温度を低下させる（英国特許１．４３８
．５６９号）。
入される食品のように、自己分解物がさらされるバクテ
リアの汚染から自己分解物を、ある程度まで、保存する
という利点を提供する。他方において、リソチームの存
在は食品の滅菌温度を低下させる（英国特許１．４３８
．５６９号）。
本発明による酵母菌は、また、リソチームを酵母菌から
分離することにより、精製されたリソチームの源として
使用することもできる。しかしながら、明らかなように
、この操作は、リンチー１，が細胞内で他の細胞蛋白質
と会合する場合、がなりの困難をもたらす、リソチーム
が古典的方法により１例えば、吸着および／または沈殿
（ベルギー国特許６９４，５３８号）により、培地から
これが開放されるか、あるいはそれが他の方法により分
離される細胞壁に会合してとどまるかにかかわらず、生
産されたリソチームを分泌できる酵母菌を提供すること
は、こうして、本発明の重要な面である。プレリソチー
ム（ｐｒｅｌｙｓｏｚｙｍｅ）のＮ−末端部分に存在し
かつリソチームをニワトリの卵管細胞の小胞体のルーメ
ン中に分泌させる１９アミノ酸の信号配列は、また、酵
母菌細胞により認識されることが、＊＜べきことには観
測された０次の実施例が事実示すように、ニワトリプレ
リソチームの遺伝情報を指定するＤＮＡが酵母菌中で発
現されるとき、この発現の生産物はそれから分泌される
。したがって、この信号配列の遺伝情報を指定する５４
−ヌクレオチド断片を、他の起源からのリソチームを包
含する他の蛋白質の構造部分の遺伝情報を指定するＤＮ
Ａと融合すると、前記蛋白質を生産する酵母菌細胞から
前記蛋白質は分泌されるであろう。
分離することにより、精製されたリソチームの源として
使用することもできる。しかしながら、明らかなように
、この操作は、リンチー１，が細胞内で他の細胞蛋白質
と会合する場合、がなりの困難をもたらす、リソチーム
が古典的方法により１例えば、吸着および／または沈殿
（ベルギー国特許６９４，５３８号）により、培地から
これが開放されるか、あるいはそれが他の方法により分
離される細胞壁に会合してとどまるかにかかわらず、生
産されたリソチームを分泌できる酵母菌を提供すること
は、こうして、本発明の重要な面である。プレリソチー
ム（ｐｒｅｌｙｓｏｚｙｍｅ）のＮ−末端部分に存在し
かつリソチームをニワトリの卵管細胞の小胞体のルーメ
ン中に分泌させる１９アミノ酸の信号配列は、また、酵
母菌細胞により認識されることが、＊＜べきことには観
測された０次の実施例が事実示すように、ニワトリプレ
リソチームの遺伝情報を指定するＤＮＡが酵母菌中で発
現されるとき、この発現の生産物はそれから分泌される
。したがって、この信号配列の遺伝情報を指定する５４
−ヌクレオチド断片を、他の起源からのリソチームを包
含する他の蛋白質の構造部分の遺伝情報を指定するＤＮ
Ａと融合すると、前記蛋白質を生産する酵母菌細胞から
前記蛋白質は分泌されるであろう。
しかしながら１本発明の最も基本的かつ最も驚くべき面
は、リソチーム遺伝子を酵母菌中でその中で致死作用を
１例えば、細胞の溶解により、及ぼさないで発現するこ
とができるという事実である。異種細胞中でリソチーム
遺伝子をクローニングしかつ発現する唯一の既知の例は
、Ｈｅ１ｌａおよびＭＣＦ−７ヒト細胞系統中のニワト
リリソチーム遺伝子のクローニングである（Ｐ 、 Ｄ
、マチアス（Ｍａｔｔｈｉａｓ）ら、ユーロビアン拳
モレギュラー〇バイオロジー・オーガニゼイション・ジ
ャーナル（ＥＭＢＯＪ、）、１，１９８２．１２０７］
であるが、遺伝子の発現は対応するメツセンジャーＲＮ
Ａによってのみ証明され。
は、リソチーム遺伝子を酵母菌中でその中で致死作用を
１例えば、細胞の溶解により、及ぼさないで発現するこ
とができるという事実である。異種細胞中でリソチーム
遺伝子をクローニングしかつ発現する唯一の既知の例は
、Ｈｅ１ｌａおよびＭＣＦ−７ヒト細胞系統中のニワト
リリソチーム遺伝子のクローニングである（Ｐ 、 Ｄ
、マチアス（Ｍａｔｔｈｉａｓ）ら、ユーロビアン拳
モレギュラー〇バイオロジー・オーガニゼイション・ジ
ャーナル（ＥＭＢＯＪ、）、１，１９８２．１２０７］
であるが、遺伝子の発現は対応するメツセンジャーＲＮ
Ａによってのみ証明され。
そして蛋白質自体の生産によって立証されなかった。バ
クテリウム中のリソチーム遺伝子の発現の例は現在まで
報告されてきておらず、そしてこれはバクテリウムによ
り生産されるリソチームが通常その溶菌を生ずるという
事実により説明することができる。ここで、リソチーム
は、また、酵母菌細胞壁を、主としてそのキチン成分の
加水分解より、攻撃しうることが知られている［Ｇ 、
Ｎ 。
クテリウム中のリソチーム遺伝子の発現の例は現在まで
報告されてきておらず、そしてこれはバクテリウムによ
り生産されるリソチームが通常その溶菌を生ずるという
事実により説明することができる。ここで、リソチーム
は、また、酵母菌細胞壁を、主としてそのキチン成分の
加水分解より、攻撃しうることが知られている［Ｇ 、
Ｎ 。
マクシモバ（Ｍａｋｓｉｍｏｖａ）ら、Ｐｒ１ｋ１、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、Ｍｉｋｒｏｂｉｏ１，）１旦、１９８２
，５２９］、酵母菌の出芽は芽と母廁胞との間の純粋な
キチンの芽胞壁の形成を伴うことが知られているので、
酵母菌細胞によるリソチームの生産および分泌はそれら
の増殖機能の重大な変更に導くことが期待されたであろ
う、また、形質転換後のプロトプラストからの細胞壁の
再生は弱体化することが期待されたであろう。したがっ
て、遺伝子工学の古典的技術がリソチーム遺伝子を酵母
菌に発現させるようにすることができるばかりでなく、
かつまたこのように形質転換された細胞がリソチームを
活性的に生長する間に生産しかつ分泌することができる
であろうことは、驚くべきことである。
ｉｏｃｈｅｍ、Ｍｉｋｒｏｂｉｏ１，）１旦、１９８２
，５２９］、酵母菌の出芽は芽と母廁胞との間の純粋な
キチンの芽胞壁の形成を伴うことが知られているので、
酵母菌細胞によるリソチームの生産および分泌はそれら
の増殖機能の重大な変更に導くことが期待されたであろ
う、また、形質転換後のプロトプラストからの細胞壁の
再生は弱体化することが期待されたであろう。したがっ
て、遺伝子工学の古典的技術がリソチーム遺伝子を酵母
菌に発現させるようにすることができるばかりでなく、
かつまたこのように形質転換された細胞がリソチームを
活性的に生長する間に生産しかつ分泌することができる
であろうことは、驚くべきことである。
以上は下の実施例に明瞭に示されている。これ。
らの実施例は例示をのみ目的とする。なぜなら、酵母菌
菌株により１．４−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼの生
産に導く他の構成は、本発明の範囲に包含されると考え
るべきであるからである。
菌株により１．４−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼの生
産に導く他の構成は、本発明の範囲に包含されると考え
るべきであるからである。
衷施勇」
■、ｌ ニワトリリソチームの完 ｃＤＮＡりまず、完
全ｃＤＮＡクローンの構成は２つの異るクローンから出
発しぞつくった：ニワトリリソチームｃＤＮＡを含有す
るが５゛末端において不完全であるｐＢＲ−１７ｓ−１
［Ｐ、バルダッシ（Ｂａｌｄａｃｃｉ）ら、核酸研究（
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｓ１ｄｓ Ｒｅｓ、）６，１９
７９．２６６７］およびイントロンを含む全体のリソチ
ーム遺伝子からなる４０ｋｂのニワトリのゲノムＤＮＡ
を含有するｐＦＦ２−ＩＹｓ−１６［Ｐ、バルダ７シ（
Ｂａｌｄａｃｃｉ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｓ１ｄｓ Ｒｅｓ、）９．１９８１．３５７５］
（第１図）、これらのクローンは、高等真核レベル形
質からの転写体を正しく処理することのできない酵母菌
中でリソチームを発現するためにいずれも適当ではなか
った［Ｊ。
全ｃＤＮＡクローンの構成は２つの異るクローンから出
発しぞつくった：ニワトリリソチームｃＤＮＡを含有す
るが５゛末端において不完全であるｐＢＲ−１７ｓ−１
［Ｐ、バルダッシ（Ｂａｌｄａｃｃｉ）ら、核酸研究（
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｓ１ｄｓ Ｒｅｓ、）６，１９
７９．２６６７］およびイントロンを含む全体のリソチ
ーム遺伝子からなる４０ｋｂのニワトリのゲノムＤＮＡ
を含有するｐＦＦ２−ＩＹｓ−１６［Ｐ、バルダ７シ（
Ｂａｌｄａｃｃｉ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｓ１ｄｓ Ｒｅｓ、）９．１９８１．３５７５］
（第１図）、これらのクローンは、高等真核レベル形
質からの転写体を正しく処理することのできない酵母菌
中でリソチームを発現するためにいずれも適当ではなか
った［Ｊ。
Ｄ、ベッグス（Ｂｅｇｇｓ）ら、ネイチャー（Ｎａｚｕ
ｒｅ）２８３，１９８０，８３５］、Ｌかしながら、そ
れは存在する不完全ｃＤＮＡの３゜末端を完全遺伝子の
５゛末端と結合することにより、完全ｃＤＮＡクローン
を再構成することが可能であった；事実発表されたデー
タから明らかである（Ｐ、バルズッシ（Ｂａｌｄｕｃｃ
ｉ）ら。
ｒｅ）２８３，１９８０，８３５］、Ｌかしながら、そ
れは存在する不完全ｃＤＮＡの３゜末端を完全遺伝子の
５゛末端と結合することにより、完全ｃＤＮＡクローン
を再構成することが可能であった；事実発表されたデー
タから明らかである（Ｐ、バルズッシ（Ｂａｌｄｕｃｃ
ｉ）ら。
１９７９、ｏｐ、ｃｉｔ 、；Ａ、ジュング（Ｊｕｎｇ
）ら、プロシーディンゲスやオブーナシＩナル・アカデ
ミ−Ｏオブ９サイエンシズ（Ｐ ｒ 。
）ら、プロシーディンゲスやオブーナシＩナル・アカデ
ミ−Ｏオブ９サイエンシズ（Ｐ ｒ 。
ｃ、 Ｎａｔ１， Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）ＵＳ
Ａ、７７．１９８０，５７５９．Ｍ、グレズ（Ｇｒｅｚ
）ら、細胞（Ｃｅ Ｉ １）２５．１９８１ 。
Ａ、７７．１９８０，５７５９．Ｍ、グレズ（Ｇｒｅｚ
）ら、細胞（Ｃｅ Ｉ １）２５．１９８１ 。
７４３１ように、完全遺伝子はｃＤＮＡのミッシング部
分に相当する５′区域にイントロンを含まない、こうし
て、コスミドｐＦＦ２−１７ｓ−１６からの２．１ｋｂ
のＤＮＡ断片をｐ ＥＭＢ Ｌ ８［Ｌ、デンテ（Ｄｅ
ｎｔｅ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｓ１ｄｓ
Ｒｅｓ、）１１，１９８３．１６４５］中にサブク
ローニングし、プラスミドｐｌｙｓ５を得た（第１図）
、このクローンはリソチームの完全５′隣接エクソンを
含有する。便利に位置した１呈３工部位は、ｐｌｙｓ５
およびｃＤＮＡクロー７ＰＢＲ−１ｙｓ−（７）間の改
なる区域に存在する。ｐＢＲ−１ｙｓ−１の断片Ｈｇａ
Ｉ−ＭＩｕＩおよびＭｌｕＩ−ＡｃｃＩおよびｐｌｙｓ
５の断片Ｎ９ｃＩ−ＨｇａＩを含む三重結合は、ＡＴＧ
開始コドンを含むがイントロンを含まない、全体のリソ
チーム遺伝子を含有するクローン（ｐ ｌ ｙ ｓ ｌ
Ｏ）の構成を可能とした（第２図）。
分に相当する５′区域にイントロンを含まない、こうし
て、コスミドｐＦＦ２−１７ｓ−１６からの２．１ｋｂ
のＤＮＡ断片をｐ ＥＭＢ Ｌ ８［Ｌ、デンテ（Ｄｅ
ｎｔｅ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｓ１ｄｓ
Ｒｅｓ、）１１，１９８３．１６４５］中にサブク
ローニングし、プラスミドｐｌｙｓ５を得た（第１図）
、このクローンはリソチームの完全５′隣接エクソンを
含有する。便利に位置した１呈３工部位は、ｐｌｙｓ５
およびｃＤＮＡクロー７ＰＢＲ−１ｙｓ−（７）間の改
なる区域に存在する。ｐＢＲ−１ｙｓ−１の断片Ｈｇａ
Ｉ−ＭＩｕＩおよびＭｌｕＩ−ＡｃｃＩおよびｐｌｙｓ
５の断片Ｎ９ｃＩ−ＨｇａＩを含む三重結合は、ＡＴＧ
開始コドンを含むがイントロンを含まない、全体のリソ
チーム遺伝子を含有するクローン（ｐ ｌ ｙ ｓ ｌ
Ｏ）の構成を可能とした（第２図）。
プラスミドｐｌｙｓｌｏ中に存在するリソチーム遺伝子
の５′区域の非解読部分を、独特ΔｃｃＩ制限部位でプ
ラスミドを開きかつＢＡＬ３１ヌクレアーゼで消化する
ことにより欠失させた。こうして、短縮されたプラスミ
ドの集団が得られ、次いでこれらを独特Ｐｓ±工部位に
おいて切離した；旦互工■部位とＢＡＬ３１で消化され
た末端とに間で構成された断片を、ベルギー国特許９０
１．２２２号記載されているようにして、プラスミドｐ
ＬＧ４００ｃ７）部位ＰｓｔｌおよびＳｍａ Ｉの間に
挿入した。この操作は、３つの結果を与えた： （１）リソチームのＡＴＧ開始コドンに先行する５゛区
域の非翻訳部分が欠失され、 （２）人旦至工およびΣ三３■部位が破壊され、そして （３）操作容易な且３旦ＨＩ部位（ＹＥｐＺ１００中の
ＳｍａＩ部位に直接隣接する）がリソチーム遺伝子の開
始部分に取り付けられる。
の５′区域の非解読部分を、独特ΔｃｃＩ制限部位でプ
ラスミドを開きかつＢＡＬ３１ヌクレアーゼで消化する
ことにより欠失させた。こうして、短縮されたプラスミ
ドの集団が得られ、次いでこれらを独特Ｐｓ±工部位に
おいて切離した；旦互工■部位とＢＡＬ３１で消化され
た末端とに間で構成された断片を、ベルギー国特許９０
１．２２２号記載されているようにして、プラスミドｐ
ＬＧ４００ｃ７）部位ＰｓｔｌおよびＳｍａ Ｉの間に
挿入した。この操作は、３つの結果を与えた： （１）リソチームのＡＴＧ開始コドンに先行する５゛区
域の非翻訳部分が欠失され、 （２）人旦至工およびΣ三３■部位が破壊され、そして （３）操作容易な且３旦ＨＩ部位（ＹＥｐＺ１００中の
ＳｍａＩ部位に直接隣接する）がリソチーム遺伝子の開
始部分に取り付けられる。
得られるプラスミドをｐｌｙｓ９と呼ぶ（第３図）。
１．３ リソチームの発現ベクターの構成リソチームの
完全ｃＤＮＡは、ここでは５″末端における独特Ｂａｍ
ＨＩ部位と３゛末端における独特５ｐｈＩ部位との間に
位置する。前記ｃＤＮＡはそれ自体のＡＴＧ開始コドン
を有するのでごそれとＢａｍＨＩ部位で終るＡＴＧ不含
プロモーターとの融合は機能的発現単位を午え、この中
位はなお複製起源およびｐＢＲ３２２のラクタマーゼ遺
伝子と会合させ（Ｅ、ｃｏｌｊ中のその複製およびその
選択を保証する）かつ２−ミクロンのプラスミドおよび
複製起源およびＬ１旦２遺伝子と会合させ（酵母菌中の
複製および選択のため）る。
完全ｃＤＮＡは、ここでは５″末端における独特Ｂａｍ
ＨＩ部位と３゛末端における独特５ｐｈＩ部位との間に
位置する。前記ｃＤＮＡはそれ自体のＡＴＧ開始コドン
を有するのでごそれとＢａｍＨＩ部位で終るＡＴＧ不含
プロモーターとの融合は機能的発現単位を午え、この中
位はなお複製起源およびｐＢＲ３２２のラクタマーゼ遺
伝子と会合させ（Ｅ、ｃｏｌｊ中のその複製およびその
選択を保証する）かつ２−ミクロンのプラスミドおよび
複製起源およびＬ１旦２遺伝子と会合させ（酵母菌中の
複製および選択のため）る。
この構成は記載する次の断片を同時に結合することによ
りつくった： （ａ）プラスミドＹＥｐＺ１０１Δ２からの、プロモー
ターｐ４１５の欠失から由来するプロモーターｐ ４１
５Δ２からなるＨ ｉ ｎ ｄｍ−Ｂ ａｍ）ＩＩ断片
（ベルギー国特許９０１，２２２号）；（ｂ）ｐｌｙｓ
Δ９からの、リソチームの完全なｃＤＮＡからなるΣヱ
上ニー且上凹ＨＩ断片；（ｃ）断片（ｂ）と断片（ｄ）
との間の結合として使用すべきプラスミドｐＫＯ１から
のＥｃｏＲニーΣヱ上工断片［Ｋ、マクケニー（ＭｃＫ
ｅｎｎｙ）ら、［遺伝子の増幅および分析（Ｇ ｅ ｎ
ｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａ
ｌｙｓｉｓ）」 、Ｊ、Ｇ、クリリフジャン（Ｃｈｒｉ
ｒｉｋＪａｎ）およびＴ、パナス（ＰａｎａＳ）！、エ
ルセビーア／ノース・ホランド（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎ
ｏｒｔｈ Ｈｏ１ｌａｎｄ）。
りつくった： （ａ）プラスミドＹＥｐＺ１０１Δ２からの、プロモー
ターｐ４１５の欠失から由来するプロモーターｐ ４１
５Δ２からなるＨ ｉ ｎ ｄｍ−Ｂ ａｍ）ＩＩ断片
（ベルギー国特許９０１，２２２号）；（ｂ）ｐｌｙｓ
Δ９からの、リソチームの完全なｃＤＮＡからなるΣヱ
上ニー且上凹ＨＩ断片；（ｃ）断片（ｂ）と断片（ｄ）
との間の結合として使用すべきプラスミドｐＫＯ１から
のＥｃｏＲニーΣヱ上工断片［Ｋ、マクケニー（ＭｃＫ
ｅｎｎｙ）ら、［遺伝子の増幅および分析（Ｇ ｅ ｎ
ｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａ
ｌｙｓｉｓ）」 、Ｊ、Ｇ、クリリフジャン（Ｃｈｒｉ
ｒｉｋＪａｎ）およびＴ、パナス（ＰａｎａＳ）！、エ
ルセビーア／ノース・ホランド（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎ
ｏｒｔｈ Ｈｏ１ｌａｎｄ）。
ニューヨーク、１９８１．３８３ページ］ ；断片（ｂ
）と断片（ｄ）との間の結合として使用すべきプラスミ
ドｐＫＯ１からの旦旦ユＲＩ−互ｐｈＩ断片［Ｋ、？フ
ケニー（ＭｃＫｅｎｎｙ）ら、「遺伝子の増幅および分
析（Ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎ
、ｄ ａｎａｌｙｓｉｓ）Ｊ、Ｊ、Ｇ、クリリクジ＋
７（Ｃｈｒｉｒｉｋｊａｎ）およびＴ、パナス（Ｐ ａ
ｎ ａ ｓ）編、エルセビーア／ノース・ホランＦ（
Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ Ｈｏ ｌ ｌ
ａ ｎ ｄ）。
）と断片（ｄ）との間の結合として使用すべきプラスミ
ドｐＫＯ１からの旦旦ユＲＩ−互ｐｈＩ断片［Ｋ、？フ
ケニー（ＭｃＫｅｎｎｙ）ら、「遺伝子の増幅および分
析（Ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎ
、ｄ ａｎａｌｙｓｉｓ）Ｊ、Ｊ、Ｇ、クリリクジ＋
７（Ｃｈｒｉｒｉｋｊａｎ）およびＴ、パナス（Ｐ ａ
ｎ ａ ｓ）編、エルセビーア／ノース・ホランＦ（
Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ Ｈｏ ｌ ｌ
ａ ｎ ｄ）。
ニューヨーク、１９８１．３８３ページ］ ；（ｄ）プ
ラスミドＹＥｐＺ４１５からの、複製起源およびｐＢＲ
３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子の一方の半分からなる
旦」」−■一旦旦ユＲＩ断片；および （ｅ）ｐＪＤＢ２０７からの、２−ミク’ａンーＬＥＵ
２セグメントおよびβ−ラクタマゼーゼ遺伝ｔの他方の
半分からなるＨｉｎｄｍ−Ｐｓ±１断片。
ラスミドＹＥｐＺ４１５からの、複製起源およびｐＢＲ
３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子の一方の半分からなる
旦」」−■一旦旦ユＲＩ断片；および （ｅ）ｐＪＤＢ２０７からの、２−ミク’ａンーＬＥＵ
２セグメントおよびβ−ラクタマゼーゼ遺伝ｔの他方の
半分からなるＨｉｎｄｍ−Ｐｓ±１断片。
結合の前に、これらの種々の断片を使用し、そして、そ
れらは異る末端および相補的接着末端を有するので、こ
の結合からただ１つの生存しうるプラスミドが生じた：
ｐ１ｙｓΔ２９（第４図）。
れらは異る末端および相補的接着末端を有するので、こ
の結合からただ１つの生存しうるプラスミドが生じた：
ｐ１ｙｓΔ２９（第４図）。
同一・の方法においてプロモーターＰ４１５からの欠失
により誘導された２つの他の断片（ｐ４１５Δ４および
ｐ４１５Δ５）を使用することにより、２つの他のプラ
スミドが生産された：ｐｌｙＳΔ４９およびｐｌｙｓΔ
５９．これらの３つのプラスミドは、こうして、次の事
実によりのみ異る。プロモーターはリソチームｃＤＮＡ
から種々の距離に位置し、これは対応するメツセンジャ
ーＲＮＡ５の開始（５′末端）と自然ＡＵＧ翻訳開始部
位との間の異る距離における転写の間に生ずる。
により誘導された２つの他の断片（ｐ４１５Δ４および
ｐ４１５Δ５）を使用することにより、２つの他のプラ
スミドが生産された：ｐｌｙＳΔ４９およびｐｌｙｓΔ
５９．これらの３つのプラスミドは、こうして、次の事
実によりのみ異る。プロモーターはリソチームｃＤＮＡ
から種々の距離に位置し、これは対応するメツセンジャ
ーＲＮＡ５の開始（５′末端）と自然ＡＵＧ翻訳開始部
位との間の異る距離における転写の間に生ずる。
次いで、前述のように構成されたプラスミドを酵母菌Ｓ
、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｃｒ）ＧＲＦ１８菌株（ｌｅｕ
−、Ｈｉｓ−）に形質転換し、次いでロイシンについて
プロトトロープのクローンについて選択した（ｌｅｕ”
）。
、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｃｒ）ＧＲＦ１８菌株（ｌｅｕ
−、Ｈｉｓ−）に形質転換し、次いでロイシンについて
プロトトロープのクローンについて選択した（ｌｅｕ”
）。
次いで、これらのクローンをガラスピーズで粉砕し、そ
して得られたリゼイトを遠心により清澄にした。それら
のリゼイトの活性を、Ｅ、 ｃｏ ｌ±細胞の懸濁液の
光学濃度の増加をＭｃ マツケン（Ｍａｃｋｅｎ）ら
の方法［ジャーナル参オブ・モレキュラー拳バイオロジ
ー（Ｊ、Ｍｏｌ。
して得られたリゼイトを遠心により清澄にした。それら
のリゼイトの活性を、Ｅ、 ｃｏ ｌ±細胞の懸濁液の
光学濃度の増加をＭｃ マツケン（Ｍａｃｋｅｎ）ら
の方法［ジャーナル参オブ・モレキュラー拳バイオロジ
ー（Ｊ、Ｍｏｌ。
Ｂｉｏ１，）４旦、１９７０，６３９］（７）決定する
ことにより試験した。第５図において、６５０ｎｍのお
ける光学濃度（ＯＤｓ ｓ。）の初期の値はすべてのク
ローンについて同一である（０゜７）が、完結を目的と
して線画上でシフトさせた。第５図の結果はＧＲＦ１８
（ｐｌｙｓΔ４９）について有意の活性を示し、そし
てプラスミドｐｌｙｓΔ５９により形質転換された細胞
について多少低い。
ことにより試験した。第５図において、６５０ｎｍのお
ける光学濃度（ＯＤｓ ｓ。）の初期の値はすべてのク
ローンについて同一である（０゜７）が、完結を目的と
して線画上でシフトさせた。第５図の結果はＧＲＦ１８
（ｐｌｙｓΔ４９）について有意の活性を示し、そし
てプラスミドｐｌｙｓΔ５９により形質転換された細胞
について多少低い。
リソチームの作用のためのインジケーターとしｙｓｏｄ
ｅｉｋｔ １ｃｕｓ）の細胞である方法［Ｇ、アルダー
トｙ （Ａｌｄｅｒｔ ｏｎ）ら。
ｅｉｋｔ １ｃｕｓ）の細胞である方法［Ｇ、アルダー
トｙ （Ａｌｄｅｒｔ ｏｎ）ら。
ジャーナル・オプーバイオロジカル・ケミストリー（Ｊ
、Ｂｉｏ１，Ｃｈｅｍ、）１５７，１９４５．４３］を
使用して同様な結果が得られた。
、Ｂｉｏ１，Ｃｈｅｍ、）１５７，１９４５．４３］を
使用して同様な結果が得られた。
異る型のアッセイにおいて、Ｍ、１ｙｓｏｄｅｉｋｉｃ
ｔｕｓの菌叢で覆われたペトリ皿りで生長する形質転換
されたコロニーのまわりにリソチームが明示された。こ
の場合において、リソチームの発現はコロニーのまわり
の溶菌の透明なハローにより可視化された。細胞不合リ
ゼイトを使用する結果と一致して、溶菌のハローはｐｌ
ｙＳΔ４９を使用したとき最大であり、このことはこの
クローンがリソチームの最良の生産体であることを示し
た。この結果が、また、示すように、リソチームは形質
細胞から輸送された。なぜなら、バクテリアのインジケ
ーターを溶解するためには、それは細胞外に存在すこと
がかならず必要であったからである。
ｔｕｓの菌叢で覆われたペトリ皿りで生長する形質転換
されたコロニーのまわりにリソチームが明示された。こ
の場合において、リソチームの発現はコロニーのまわり
の溶菌の透明なハローにより可視化された。細胞不合リ
ゼイトを使用する結果と一致して、溶菌のハローはｐｌ
ｙＳΔ４９を使用したとき最大であり、このことはこの
クローンがリソチームの最良の生産体であることを示し
た。この結果が、また、示すように、リソチームは形質
細胞から輸送された。なぜなら、バクテリアのインジケ
ーターを溶解するためには、それは細胞外に存在すこと
がかならず必要であったからである。
実施例２
２、■ リソチームの発現ベクターｐｌｙｓ５０の構成
リソチーム発現プラスミドｐｌｙｓΔ２９．ＰｌｙｓΔ
４９およびｐｌｙｓΔ５９（前述した）が基づくベクタ
ーｐＪＤＢ２０７は、全体の２−ミクロンの酵母菌プラ
スミドを含有せず、結局その連続する維持に内因性の２
−ミクロンのプラスミド（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの
ほとんどの菌株において見出される）の存在に依存する
。これはｐＪＤＢ２０７型プラスミドが細胞から頻繁に
損失されるという不安定な場合に導く［Ｅ、エアヘルド
（Ｅｒｈａｅｒｔ）およびＣ，Ｐ、ホエンバーグ（Ｈｏ
ｌｌｅｎｂｅｒｇ）、ジャーナルーオブ拳バクテリオロ
ジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ。
４９およびｐｌｙｓΔ５９（前述した）が基づくベクタ
ーｐＪＤＢ２０７は、全体の２−ミクロンの酵母菌プラ
スミドを含有せず、結局その連続する維持に内因性の２
−ミクロンのプラスミド（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの
ほとんどの菌株において見出される）の存在に依存する
。これはｐＪＤＢ２０７型プラスミドが細胞から頻繁に
損失されるという不安定な場合に導く［Ｅ、エアヘルド
（Ｅｒｈａｅｒｔ）およびＣ，Ｐ、ホエンバーグ（Ｈｏ
ｌｌｅｎｂｅｒｇ）、ジャーナルーオブ拳バクテリオロ
ジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ。
１、）上旦互、１９８３．６２５およびＭ、ジャラヤム
（Ｊａｒａｙａｍ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）旦、１９８３
．９５］、対照的に、目然２−ミクロンのプラスミドは
安定に遺伝される。プラスミドが全体の２−ミクロンの
プラスミドｐＪＤＢ２１９を含有するような方法で構成
されたプラスミドはｐＪＤＢ２０７型のものよりも安定
であることは事実知られている［Ｃ、Ｐ 、ホランバー
グ（Ｈｏｌｌａｎｂｅｒｇ）、Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐ。
（Ｊａｒａｙａｍ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）旦、１９８３
．９５］、対照的に、目然２−ミクロンのプラスミドは
安定に遺伝される。プラスミドが全体の２−ミクロンの
プラスミドｐＪＤＢ２１９を含有するような方法で構成
されたプラスミドはｐＪＤＢ２０７型のものよりも安定
であることは事実知られている［Ｃ、Ｐ 、ホランバー
グ（Ｈｏｌｌａｎｂｅｒｇ）、Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐ。
Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１，Ｉｍｍｕｎｏ１，）９６゜１９８
２．１１９；Ｒ，Ｍ、ワルムスレイ（Ｗａｌｍｓｌｅｙ
）ら、モレキュラー〇アンド・ジェネラル・ジェネティ
ックス（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ 、）１９８３．
３６１］、それゆえ、このようなプラスミドは、工業的
発酵における例のように、長期間の生長のために一層有
用である。
２．１１９；Ｒ，Ｍ、ワルムスレイ（Ｗａｌｍｓｌｅｙ
）ら、モレキュラー〇アンド・ジェネラル・ジェネティ
ックス（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ 、）１９８３．
３６１］、それゆえ、このようなプラスミドは、工業的
発酵における例のように、長期間の生長のために一層有
用である。
このような完全な２−ミクロンのベクターを構成するた
めに、プラスミドＹＥｐＢ２ （第１１図）を使用し、
これは全体の２−ミクロンのプラスミドをｐＢＲ３２２
中にそれらの独特ＰｓｔＩ部位においてクローニングす
ることにより前もってつくられた０次いで、ＹＥｐＢ２
からの２つの断片およびｐｌｙｓΔ４９からの２つの断
片を結合してｐｌｙＳ５０を得た（第１２図）、このプ
ラスミドにおいて、３つの２−ミクロンの遺伝子Ａ、Ｂ
およびＣは無傷であり、そしてリソチーム遺伝子は前の
実施例においおいて記載したｐｔｙＳΔ４９におけるよ
うにｐ４１５Δ４プロモーターから発現される。
めに、プラスミドＹＥｐＢ２ （第１１図）を使用し、
これは全体の２−ミクロンのプラスミドをｐＢＲ３２２
中にそれらの独特ＰｓｔＩ部位においてクローニングす
ることにより前もってつくられた０次いで、ＹＥｐＢ２
からの２つの断片およびｐｌｙｓΔ４９からの２つの断
片を結合してｐｌｙＳ５０を得た（第１２図）、このプ
ラスミドにおいて、３つの２−ミクロンの遺伝子Ａ、Ｂ
およびＣは無傷であり、そしてリソチーム遺伝子は前の
実施例においおいて記載したｐｔｙＳΔ４９におけるよ
うにｐ４１５Δ４プロモーターから発現される。
２．２ ベクターｐｌｙｓ５０によるリソチーム０＆ユ
Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＲＦ１８菌株（Ｈｉｓ−
、ｌｅｕ ）をプラスミドｐｌｙｓ５０およびｐＪＤ
Ｂ２０７により形質転換した後、１，９者の場合に得ら
れた形質転換された細胞をヒスチジン（０，００２％）
を補充した最小培地上で３１ノ々に生長させた。培ｉ物
が静止相（約５の光学Ｃ度）（細胞の乾燥重量＝培養物
の約１．５ｇ／ｌ）に到達したとき、細胞を培地から遠
心により分離し、０．１モルのｐＨ７のリン酸塩緩衝液
中に懸濁させそしてガラスピーズで粉砕した。両者の培
養物からのＬ澄み液およびリゼイト中のリソチーム活性
を、Ｄ、シュガー（Ｓｈｕｇａｒ）（７）方法［バイオ
ヒミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、Ｂｉｏｈｙｓ、Ａｃｔａ）、旦、１９５２，３０２
］に従い、Ｍ、１ｙｓｏｄｅｉｋｔ １ｃｕｓ細胞を溶
解するそれらの能力により決定した。
、ｌｅｕ ）をプラスミドｐｌｙｓ５０およびｐＪＤ
Ｂ２０７により形質転換した後、１，９者の場合に得ら
れた形質転換された細胞をヒスチジン（０，００２％）
を補充した最小培地上で３１ノ々に生長させた。培ｉ物
が静止相（約５の光学Ｃ度）（細胞の乾燥重量＝培養物
の約１．５ｇ／ｌ）に到達したとき、細胞を培地から遠
心により分離し、０．１モルのｐＨ７のリン酸塩緩衝液
中に懸濁させそしてガラスピーズで粉砕した。両者の培
養物からのＬ澄み液およびリゼイト中のリソチーム活性
を、Ｄ、シュガー（Ｓｈｕｇａｒ）（７）方法［バイオ
ヒミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、Ｂｉｏｈｙｓ、Ａｃｔａ）、旦、１９５２，３０２
］に従い、Ｍ、１ｙｓｏｄｅｉｋｔ １ｃｕｓ細胞を溶
解するそれらの能力により決定した。
プラスミドｐＪＤＢ２０７により形質転換された菌株に
ついてリソチーム活性を示すことはできなかった。これ
に対して、菌株ＧＲＦ１８（ｐｉｙｓ５０）ｃ７）場合
において、１６２単位／ｍｌ培養物の活性を決定するこ
とができ、そして次のように分布することが示された： 細胞に関連する４４単位／ｍｌおよび培地中に関連する
１１８単位／ｍ１゜ Ｃ，ワンプ（Ｗａｎｇ）およびＲ，Ｌ、スミス（Ｓｍｉ
ｔｈ）［アナリティカル・バイオケミスト リー （Ａ
ｎａ１，Ｂｉｏｃｈｅｍ、） ６３． １９７５．４
１４］により修正されたり、ハーバ−）（Ｈｅｒｂｅｒ
ｔ）らの方法［メンツズ拳インａエンジモロジ−（Ｍｅ
ｔｈ、 Ｅｎｚｙｍ。
ついてリソチーム活性を示すことはできなかった。これ
に対して、菌株ＧＲＦ１８（ｐｉｙｓ５０）ｃ７）場合
において、１６２単位／ｍｌ培養物の活性を決定するこ
とができ、そして次のように分布することが示された： 細胞に関連する４４単位／ｍｌおよび培地中に関連する
１１８単位／ｍ１゜ Ｃ，ワンプ（Ｗａｎｇ）およびＲ，Ｌ、スミス（Ｓｍｉ
ｔｈ）［アナリティカル・バイオケミスト リー （Ａ
ｎａ１，Ｂｉｏｃｈｅｍ、） ６３． １９７５．４
１４］により修正されたり、ハーバ−）（Ｈｅｒｂｅｒ
ｔ）らの方法［メンツズ拳インａエンジモロジ−（Ｍｅ
ｔｈ、 Ｅｎｚｙｍ。
１、）旦Ｂ、１９７１，２０９］に従い合計の蛋白質を
決定し、商業的に精製されたリソチームの特異的活性を
考慮する［ベーリンガー争マンハイム（Ｂｏｅｈｒｆｎ
ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ ｉｍ）］ことにより、上の条
件下で酵母菌中で生産されるリソチームは可溶性酵母菌
蛋白質の約１％になることが誘導された。
決定し、商業的に精製されたリソチームの特異的活性を
考慮する［ベーリンガー争マンハイム（Ｂｏｅｈｒｆｎ
ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ ｉｍ）］ことにより、上の条
件下で酵母菌中で生産されるリソチームは可溶性酵母菌
蛋白質の約１％になることが誘導された。
菌株ＧＲＦ１８（ｐｌＹ５Δ４９）およびＡＨ２２ｃｉ
ｒ” （ｐｌｙｓ５０）は１９８４年１２月５目に、
セントラアル・ビ゛ユウロウ・ブーア舎シンメルカルチ
ュアーズ（Ｃｅｎｔｒａａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｖｏ
ｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ、ｏｏｓｔ
ｅｒｓｔｒａａｔ ｌ 。
ｒ” （ｐｌｙｓ５０）は１９８４年１２月５目に、
セントラアル・ビ゛ユウロウ・ブーア舎シンメルカルチ
ュアーズ（Ｃｅｎｔｒａａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｖｏ
ｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ、ｏｏｓｔ
ｅｒｓｔｒａａｔ ｌ 。
Ｐ、Ｐ、Ｂｏｘ ２７３．ＮＬ−３７４０ＡＧＢａａ
ｒｎ）（オランダ国）に受託され、ここでそれらはそれ
ぞれ受託番号ＣＢＳ ７１３０およびＣＢＳ ７１
２９を受けた。
ｒｎ）（オランダ国）に受託され、ここでそれらはそれ
ぞれ受託番号ＣＢＳ ７１３０およびＣＢＳ ７１
２９を受けた。
第１図は、ニワトリリソチームの完全ｃＤＮＡの再構成
のため後で使用するプラスミドｐｌｙｓ５の構成を表わ
す、この構成は全体のリソチーム遺伝ｐからなる４０ｋ
ｂのインサートを含有するコスミドｐＦＦ２−１７ｓ−
１６から出発した。 次いで、この遺伝子の最初のエクソンからなる２、ｌｋ
ｂのＨｉｎｄｍインサートを、プラスミドｐ ＥＭＢ
Ｌ Ｂ中に挿入した。こうして得られるｐｌｙｓ５プラ
スミドは１ａｃＺ−であり、次いでｌ ａｃＺ＋である
プラスミドｐＥＭＢＬ８と区別されうる。 第２図は、ｐｌｙｓ５から由来しかつリソチーム遺伝子
の５′末端を含有する戊旦至ニー且呈ま■断片を、プラ
スミドｐＢＲ−１７ｓ−１から由来しかつリソチームの
ｃＤＮＡの残部を含有する２つの他の断片と結合するこ
とにより、リソチームの完全ＣＤＮＡをプラスミドｐｌ
ｙｓｌｏ内で再構成する方法を示す。 第３図は、エキソヌクレアーゼＢＡＬ３１で５°末端の
未翻訳部分を消化することにより欠失されたリソチーム
のｃＤＮＡからなるプラスミドｐｌｙｓΔ９の構成を示
す。 第４図は、ＹＥｐＺｌ１，ＹＥｐＺ１０１Δ２（または
４または５）、ｐｌｙｓΔ９、ｐＫＯｌおよびｐＪＤＢ
２１９から由来する精製された断片の一義の結合（ｕｎ
ｉｖｏｃａｌ Ｉｉｇａｔｉｏｎ）によるリソチーム
の発現ベクターの構成を示す、プラスミドｐｌｙｓΔ２
９（または４９または５９）は、ｐｌｙｓΔ９からのリ
ソチームｃＤＮＡの発現を保証するためにプラスミドＹ
ＥｐＺ１０１Δ２（または４または５）からのプロモー
ターにより、それら自体が異るだけでる。 第５図は、プラスミドｐ−１ｙｓΔ４９およびｐＩｙＳ
５０により形質転換された酵母菌の細胞抽出物が、ＥＤ
ＴＡで処理したＥ、ｃｏｌｉ細胞を溶解して、それらを
リソチームの作用に対して感受性とすることを示す。 第６図は、プラスミドｐＢＲ３２２および２−ミクロン
の内因性酵母菌プラスミドに制限酵素！ｓｔＩを作用さ
せることにより得られた断片の結合によるプラスミドＹ
ＥｐＢ２の構成を表わす。 ｉ７図は、プラスミドＹＥＰＢ２およびｐｔｙＳΔ４９
から得られる５つの精製された断片の一義的結合による
リソチーム発現ベクターｐｌｙｓ５０の構成を表わす。 特許出願人 ラボフィナ参ソシエテ・アノニム代 理
人 弁理士 小田島 平 吉 ＦＩＧＵＲＥ １ Ｆ’ＩＧＵＲＥ ２
のため後で使用するプラスミドｐｌｙｓ５の構成を表わ
す、この構成は全体のリソチーム遺伝ｐからなる４０ｋ
ｂのインサートを含有するコスミドｐＦＦ２−１７ｓ−
１６から出発した。 次いで、この遺伝子の最初のエクソンからなる２、ｌｋ
ｂのＨｉｎｄｍインサートを、プラスミドｐ ＥＭＢ
Ｌ Ｂ中に挿入した。こうして得られるｐｌｙｓ５プラ
スミドは１ａｃＺ−であり、次いでｌ ａｃＺ＋である
プラスミドｐＥＭＢＬ８と区別されうる。 第２図は、ｐｌｙｓ５から由来しかつリソチーム遺伝子
の５′末端を含有する戊旦至ニー且呈ま■断片を、プラ
スミドｐＢＲ−１７ｓ−１から由来しかつリソチームの
ｃＤＮＡの残部を含有する２つの他の断片と結合するこ
とにより、リソチームの完全ＣＤＮＡをプラスミドｐｌ
ｙｓｌｏ内で再構成する方法を示す。 第３図は、エキソヌクレアーゼＢＡＬ３１で５°末端の
未翻訳部分を消化することにより欠失されたリソチーム
のｃＤＮＡからなるプラスミドｐｌｙｓΔ９の構成を示
す。 第４図は、ＹＥｐＺｌ１，ＹＥｐＺ１０１Δ２（または
４または５）、ｐｌｙｓΔ９、ｐＫＯｌおよびｐＪＤＢ
２１９から由来する精製された断片の一義の結合（ｕｎ
ｉｖｏｃａｌ Ｉｉｇａｔｉｏｎ）によるリソチーム
の発現ベクターの構成を示す、プラスミドｐｌｙｓΔ２
９（または４９または５９）は、ｐｌｙｓΔ９からのリ
ソチームｃＤＮＡの発現を保証するためにプラスミドＹ
ＥｐＺ１０１Δ２（または４または５）からのプロモー
ターにより、それら自体が異るだけでる。 第５図は、プラスミドｐ−１ｙｓΔ４９およびｐＩｙＳ
５０により形質転換された酵母菌の細胞抽出物が、ＥＤ
ＴＡで処理したＥ、ｃｏｌｉ細胞を溶解して、それらを
リソチームの作用に対して感受性とすることを示す。 第６図は、プラスミドｐＢＲ３２２および２−ミクロン
の内因性酵母菌プラスミドに制限酵素！ｓｔＩを作用さ
せることにより得られた断片の結合によるプラスミドＹ
ＥｐＢ２の構成を表わす。 ｉ７図は、プラスミドＹＥＰＢ２およびｐｔｙＳΔ４９
から得られる５つの精製された断片の一義的結合による
リソチーム発現ベクターｐｌｙｓ５０の構成を表わす。 特許出願人 ラボフィナ参ソシエテ・アノニム代 理
人 弁理士 小田島 平 吉 ＦＩＧＵＲＥ １ Ｆ’ＩＧＵＲＥ ２
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ＤＮＡが１，４−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼの
遺伝情報を指定する断片の少なくとも１つのコピーから
なること、および前記断片が対応する活性蛋白質として
その中で発現されることを特徴とする形質転換された酵
母菌。 ２、１，４−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼの遺伝情報
を指定する断片より前に先導配列が存在し、前記先導配
列は前記断片により解読される蛋白質が酵母菌細胞の細
胞質膜を通して分泌されるような方法で働く特許請求の
範囲第１項記載の形質転換された酵母菌。 ３、先導配列がニワトリのリソチーム遺伝子を伴う特許
請求の範囲第２項記載の形質転換された酵母菌。 ４、１，４−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼの遺伝情報
を指定する断片が、酵母菌中で大きい数のコピーに自律
的に複製することができるベクターのプラスミド中に挿
入されている特許請求の範囲第１〜３項のいずれかに記
載の形質転換された酵母菌。 ５、ベクターのプラスミドの複製は少なくともその複製
起源からなる２−ミクロンのプラスミドからの配列によ
り保証される特許請求の範囲第４項記載の形質転換され
た酵母菌。 ６、１，４−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼの遺伝情報
を指定する断片の発現は強い酵母菌のプロモーターによ
り保証される特許請求の範囲第１〜５項のいずれかに記
載の形質転換された酵母菌。 ７、強い酵母菌のプロモーターがアルコールデヒドロゲ
ナーゼ、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフ
ェートデヒドロゲナーゼ、ホスファグリセレートキナー
ゼおよびアルカリ性ホスファターゼの遺伝情報を指定す
る遺伝子のプロモーター、ならびにプロモーターｐ４１
５およびその変異種から成る群より選択される特許請求
の範囲第６項記載の形質転換された酵母菌。 ８、強い酵母菌のプロモーターがプロモーターｐ４１５
またはその変異種である特許請求の範囲第７項記載の形
質転換された酵母菌。 ９、１，４−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼの遺伝情報
を指定する断片の発現がｐｌｙｓΔ４９およびｐｌｙｓ
５０から成る群より選択されるプラスミドにより保証さ
れる特許請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載の形質
転換された酵母菌。 １０、酵母菌が￥サッカロミセス￥（￥Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ￥）属に属する特許請求の範囲第１〜９項
のいずれかに記載の形質転換された酵母菌。 １１、酵母菌が￥サッカロミセス￥・￥セレビシアエ￥
（￥Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅ￥ ￥ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ￥）種に属する特許請求の範囲第１０項記載
の形質転換された酵母菌。 １２、酵母菌が菌株ＧＲＦ１８および菌株ＡＨ２２から
成る群より選択される特許請求の範囲第１１項記載の形
質転換された酵母菌。 １３、酵母菌ＡＨ２２（ｐｌｙｓΔ４９）。 １４、形質ＡＨ２２（ｐｌｙｓ５０）。 １５、酵母菌ＧＲＦ１８（ｐｌｙｓΔ４９）。 １６、形質ＧＲＦ１８（ｐ１ｙｓ５０）。 １７、１，４−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼの遺伝情
報を指定する断片を発現することができることを特徴と
する酵母菌中で自律的に複製することができるベクター
のプラスミド。 １８、複製が２−ミクロンのプラスミドから得られかつ
少なくともその複製起源からなる配列により保証される
特許請求の範囲第１７項記載のベクターのプラスミド。 １９、ＤＮＡ断片の発現が強い酵母菌のプロモーターに
より保証される特許請求の範囲第１７〜１８項のいずれ
かに記載のベクターのプラスミド。 ２０、強い酵母菌のプロモーターがアルコールデヒドロ
ゲナーゼ、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホス
フェートデヒドロゲナーゼ、ホスホグリセレートキナー
ゼおよびアルカリ性ホスファターゼの遺伝情報を指定す
る遺伝子のプロモーター、ならびにプロモーターｐ４１
５およびその変異種から成る群より選択される特許請求
の範囲第１９項記載のベクターのプラスミド。 ２１、強い酵母菌のプロモーターがプロモーターｐ４１
５またはその変異種である特許請求の範囲第２０項記載
のベクターのプラスミド。 ２２、前記プラスミドがｐｌｙｓΔ４９およびｐｌｙｓ
５０から成る群より選択される特許請求の範囲第１７〜
２１項のいずれかに記載のベクターのプラスミド。 ２３、特許請求の範囲第１〜１６項のいずれかに記載の
形質転換された酵母菌を生長させ、そして前記酵母菌に
より生産されるリソチームを回収することから成ること
を特徴とするリソチームを生産する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BE214124 | 1984-12-06 | ||
| BE0/214124A BE901223A (fr) | 1984-12-06 | 1984-12-06 | Levures transformees produisant du lysozyme plasmides utilises pour cette transformation et leurs utilisations. |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7288179A Division JP2635020B2 (ja) | 1984-12-06 | 1995-10-11 | 形質転換された酵母によるリゾチームの生産方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61185181A true JPS61185181A (ja) | 1986-08-18 |
| JP2622252B2 JP2622252B2 (ja) | 1997-06-18 |
Family
ID=3843827
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60273530A Expired - Lifetime JP2622252B2 (ja) | 1984-12-06 | 1985-12-06 | リソチームを生産する形質転換された酵母菌およびこの形質転換に使用するプラスミド |
| JP7288179A Expired - Lifetime JP2635020B2 (ja) | 1984-12-06 | 1995-10-11 | 形質転換された酵母によるリゾチームの生産方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7288179A Expired - Lifetime JP2635020B2 (ja) | 1984-12-06 | 1995-10-11 | 形質転換された酵母によるリゾチームの生産方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5336609A (ja) |
| EP (1) | EP0184575B1 (ja) |
| JP (2) | JP2622252B2 (ja) |
| AT (1) | ATE88754T1 (ja) |
| CA (1) | CA1339912C (ja) |
| DE (1) | DE3587307T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6447377A (en) * | 1987-08-19 | 1989-02-21 | Agency Ind Science Techn | Mutant strain having high secretion of human lysozyme, its selection and production of human lysozyme using same |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5013652A (en) * | 1986-10-14 | 1991-05-07 | Genex Corporation | Composite yeast vectors |
| JPH04502260A (ja) * | 1989-10-16 | 1992-04-23 | アムジエン・インコーポレーテツド | Ｎ―アセチルムラミダーゼ ｍ１ |
| GB2249099B (en) * | 1990-09-26 | 1995-05-03 | Squibb & Sons Inc | Squalene synthetase |
| ATE342346T1 (de) * | 1997-08-05 | 2006-11-15 | Oregon State | Verfahren und zusammensetzungen zur reduzierung des bierverderbs |
| JP2997800B2 (ja) * | 1997-12-01 | 2000-01-11 | 農林水産省食品総合研究所長 | 細胞壁溶解酵素遺伝子、該遺伝子を含むベクター及び形質転換体 |
| AU2002253995A1 (en) * | 2001-03-29 | 2002-10-15 | Hybrigen, Inc. | Improved hybrid gene libraries and uses thereof |
| JP5140832B2 (ja) * | 2006-03-03 | 2013-02-13 | 国立大学法人 東京大学 | 異種タンパク質を高生産する麹菌変異株 |
| MX2017006127A (es) | 2014-11-11 | 2017-11-08 | Clara Foods Co | Metodos y composiciones para produccion de proteina de clara de huevo. |
| US10240541B2 (en) * | 2017-01-11 | 2019-03-26 | Brock Matthew Eastman | Methods and systems for overriding automotive computer controlled cylinder management |
| MX2022000374A (es) | 2019-07-11 | 2022-03-25 | Clara Foods Co | Composiciones de proteina y productos consumibles de las mismas. |
| US10927360B1 (en) | 2019-08-07 | 2021-02-23 | Clara Foods Co. | Compositions comprising digestive enzymes |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59210888A (ja) * | 1983-02-22 | 1984-11-29 | チロン・コ−ポレイシヨン | 酵母発現ベクター |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1110466A (en) * | 1966-02-28 | 1968-04-18 | Prodotti Antibiotici Spa | Process for the production of lysozyme |
| JPS5516634B2 (ja) * | 1972-07-27 | 1980-05-06 | ||
| US4775622A (en) * | 1982-03-08 | 1988-10-04 | Genentech, Inc. | Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast |
| GB2125047B (en) * | 1982-08-09 | 1986-02-19 | Ciba Geigy Ag | Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides |
| EP0181634A3 (en) * | 1984-11-14 | 1987-09-09 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Synthetic gene for human lysozyme |
| BE901222A (fr) * | 1984-12-06 | 1985-03-29 | Labofina Sa | Promoteurs assurant l'expression de genes etrangers chez la levure, plasmides comportant ces promoteurs et leurs utilisations pour la production de polypeptides. |
| BE901223A (fr) * | 1984-12-06 | 1985-03-29 | Labofina Sa | Levures transformees produisant du lysozyme plasmides utilises pour cette transformation et leurs utilisations. |
| JPS626679A (ja) * | 1985-06-26 | 1987-01-13 | Agency Of Ind Science & Technol | ヒトリゾチ−ムの微生物学的製造法 |
-
1985
- 1985-12-05 AT AT85870170T patent/ATE88754T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-12-05 US US06/804,774 patent/US5336609A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-05 DE DE8585870170T patent/DE3587307T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-05 CA CA000496943A patent/CA1339912C/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-05 EP EP85870170A patent/EP0184575B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-06 JP JP60273530A patent/JP2622252B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-10-11 JP JP7288179A patent/JP2635020B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59210888A (ja) * | 1983-02-22 | 1984-11-29 | チロン・コ−ポレイシヨン | 酵母発現ベクター |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6447377A (en) * | 1987-08-19 | 1989-02-21 | Agency Ind Science Techn | Mutant strain having high secretion of human lysozyme, its selection and production of human lysozyme using same |
| JPH0528596B2 (ja) * | 1987-08-19 | 1993-04-26 | Kogyo Gijutsuin |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3587307D1 (de) | 1993-06-03 |
| JP2622252B2 (ja) | 1997-06-18 |
| JP2635020B2 (ja) | 1997-07-30 |
| JPH08205868A (ja) | 1996-08-13 |
| ATE88754T1 (de) | 1993-05-15 |
| US5336609A (en) | 1994-08-09 |
| DE3587307T2 (de) | 1993-09-02 |
| EP0184575A2 (en) | 1986-06-11 |
| EP0184575A3 (en) | 1987-10-07 |
| CA1339912C (en) | 1998-06-16 |
| EP0184575B1 (en) | 1993-04-28 |
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