PROMOTEURS ASSURANT L'EXPRESSION DE GENES ETRANGERS CHEZ LALEVURE, PLASMIDES COMPORTANT CES PROMOTEURS ET LEURS UTILISA-TIONS POUR LA PRODUCTION DE POLYPEPTIDES.
PROMOTEURS ASSURANT L'EXPRESSION DE GENES ETRANGERS
CHEZ LA LEVURE, PLASMIDES COMPORTANT CES PROMOTEURS
ET LEURS UTILISATIONS POUR LA PRODUCTION DE
POLYPEPTIDES.
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte à des fragments d'ADN de levure contenant un promoteur capable d'assurer dans la levure l'expression de gènes codant pour des polypeptides généralement hétérologues. Elle se rapporte également aux plasmides vecteurs comprenant ces fragments ainsi qu'aux levures transformées par ces plasmides.
FONDEMENT DE L'INVENTION
Les nouvelles techniques du génie génétique permettent l'expression dans divers organismes de gènes codant pour des protéines étrangères. A titre d'exemple, parmi beaucoup d'autres, on peut citer la synthèse d'interférons humains par la levure Saccharomyces cerevisiae (R.A.Hitzman et al.,Science
219, 1983, 620).
Une condition primordiale à l'expression d'un gène dans la levure est la mise en place en amount de celui-ci d'un promoteur reconnu par l'ARN-polymérase II de la levure et capable d'induire la synthèse de l'ARN messager correspondant. Plusieurs promoteurs de levure ont déjà été décrits. Dans de nombreux cas, cependant, les niveaux d'expression atteints sont faibles et impraticables pour des applications commerciales, spécialement lorsque ces promoteurs sont utilisés pour l'expression de gènes d'origine étrangère (T.Atkinson et al., Biochemical Soc.Trans. 12, 1984, 215). ) Pour manipuler génétiquement les levures de telle sorte qu'elles puissent être utilisées à des fins pratiques, il est donc essentiel de disposer de promoteurs efficaces. OBJETS DE L'INVENTION
La présente invention a pour objet de fournir de tels promoteurs. Elle a également pour objet de fournir des plasmides vecteurs où ces promoteurs sont fusionnés à des gènes étrangers à la levure de manière à assurer dans celle-ci l'expression de ces gènes en polypeptides correspondants. Les levures transformées par ces plasmides constituent un autre objet de la présente invention ainsi que les polypeptides nouveaux produits par ces levures. Enfin, c'est un objet de la présente invention de fournir un procédé de production de polypeptides par culture des levures ainsi transformées.
Ces différents objets sont réalisés grâce à l'utilisation comme promoteur de base d'un fragment d'ADN de levure ayant la séquence nucléotidique suivante :
<EMI ID=1.1>
-ainsi que de ses mutants et de ses sous-fragments ayant retenu la fonction de promoteur.
COURTE DESCRIPTION DES FIGURES
Pour la description détaillée de l'invention donnée ci-après et pour les exemples, on se réfère aux dessins annexés dans lesquels :
La FIG.l représente la construction du plasmide YEpZ36 utilisé comme sonde pour l'isolement de promoteurs de levure. Cette construction est réalisée par ligation d'un fragment provenant du plasmide pJDB207 contenant notamment le gène marqueur LEU2 et l'origine de réplication du plasmide levurien 2-microns avec un fragment provenant du plasmide pGL400 contenant le gène lacZ codant pour la �-galactosidase d'Escherichia coli. La FIG.2 représente la construction du plasmide YEpZ415 portant le promoteur de base de la présente invention (p415), par ligation de quatre fragments provenant des plasmides YEpZ36, YEpZ414 et pJDB207.
La FIG.3 montre la séquence du promoteur p415 comprenant la séquence levurienne comprise entre le site EcoRI et le site MboI et où l'on reconnaît les différents éléments trouvés dans d'autres promoteurs forts de levure: la boite TATA, le bloc CT suivi de peu par la séquence CAAGC.
La FIG.4 et la FIG.5 représentent respectivement la construction des plasmides YEpZIOO et pJ04 utilisés eux-mêmes, comme le montre la FIG.6, pour la construction du plasmide YEpZlOl comprenant une variante du promoteur p415 associée à un fragment HindIII-BamHI.
La FIG.7 représente la construction, au départ des plasmides YEpZlOO et YEpZlOl, de plasmides YEpZlOlà comportant différentes variantes du promoteur p415 obtenues par des délétions effectuées avec l'enzyme Ba131. Les variantes ainsi obtenues
(p415 A 2, p415� 4, et p415û.5) sont données à la FIG.8.
La FIG.9 représente la construction des vecteurs plysA29,
<EMI ID=2.1> plysA.9, pKOl et pJDB20 7.
La FIG.10 montre que des extraits cellulaires de levures trans-
<EMI ID=3.1>
lyser des cellules d'E.coli traitées à l'EDTA pour les rendre sensibles à l'action du lysozyme.
La FIG.ll représente la construction du plasmide YEpB2 par ligation des fragments obtenus par action de l'enzyme de restriction PstI sur le plasmide pBR322 et sur le plasmide endogène 2-microns de la levure.
La FIG.12 représente la construction du vecteur d'expression plys50 par ligation univoque de cinq fragments purifiés obtenus
<EMI ID=4.1>
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Principe de la méthode employée pour isoler le promoteur de base
L'isolement du promoteur de base de la présente invention,appelé ci-dessous p415, met en oeuvre des méthodes déjà connues. Il repose sur l'observation (L.Guarente, Meth.Enzymol.
<EMI ID=5.1>
que le gène lacZ codant pour la P-galactosidase d' Escherichia coli peut, dans certaines conditions, être exprimé par la levure Saccharomyces cerevisiae et que cette expression peut être mise en évidence par la couleur bleue des colonies de levures cultivées sur un milieu contenant l'indicateur chromogénique X-gal. Cette couleur bleue est due au clivage hydrolytique de l'indica-
<EMI ID=6.1>
de la quantité ' d'enzyme synthétisée. Il en résulte que l'intensité de la coloration bleue de la colonie dépend de l'ef-
<EMI ID=7.1>
tour dépend, entre autres, de la force du promoteur de levure utilisé. Dès lors, parmi les promoteurs sélectionnés, le plus fort devrait donner la couleur bleue le plus rapidement et ceci peut être vérifié par dosage enzymatique de l'activité
<EMI ID=8.1>
Construction d'une sonde pour l'isolement de promoteurs de levure.
La condition première pour l'isolement de promoteurs de levure suivant la méthode précédente est de disposer d'un vecteur capable de réplication et de sélection dans la levure, qui contienne le gène lacZ de E.coli mais qui ne puisse pas exprimer celui-ci par manque de promoteur approprié. Un tel vecteur doit répondre en outre aux conditions suivantes. Il doit être capable de se répliquer dans la levure par la présence d'une séquence reconnue par la machinerie de réplication de la levure; il doit pouvoir faire l'objet d'une sélection et se maintenir dans la levure grâce à la présence d'un gène marqueur. Il doit être potentiellement capable d'exprimer le gène lacZ dans la levure lorsqu'on lui fournit un promoteur approprié.
Il doit comporter un site de restriction unique en amont de ce gène de manière à ce qu'on puisse insérer de petits fragments d'ADN de levure susceptibles de comporter un promoteur.
La construction d'un tel plasmide se trouve représentée à la FIG.l. Il a été obtenu par combinaison, suivant des techniques classiques,de deux plasmides décrits dans la littérature scientifique : pJDB207 (J.D.Beggs et al., Nature 283,
1980, 835) et pLG400 (L.Guarente et al., Cell 20, 1980,
543-). Le plasmide YEpZ36 ainsi obtenu est capable de se répliquer dans S.cerevisiae grâce à l'origine de réplication du plasmide endogène 2-microns fournie par pJDB207. De celui-ci, il possède également le gène marqueur LEU2 permettant sa sélection et son maintien dans une levure ayant une mutation leu2 . Il possède un site unique BamHI où peuvent être insérés de petits fragments générés par action de l'enzyme de restriction MboI.
Construction du plasmide YEpZ415 portant le promoteur p415
L'isolement du promoteur de la présente invention à l'aide de la sonde construite ci-dessus a été effectué de la manière suivante.
Les fragments obtenus par digestion partielle avec l'enzyme de restriction MboI de l'ADN total de la levure
<EMI ID=9.1> ont été insérés dans le site BamHI du plasmide YEpZ36 décrit ci-dessus et l'ADN ainsi recombiné a été utilisé pour transformer une souche leu2- de la levure S.cerevisiae GRF18. Les colonies transformées furent ensuite testées sur milieu X-gal pour leur aptitude à produire la �-galactosidase. Plusieurs clones se révélèrent positifs par transfert sur milieu X-gal et
<EMI ID=10.1>
sidasique, se révèla le plus actif fut sélectionné pour l'isolement du promoteur de l'invention.
Après isolement de l'ADN plasmidique de ce clone,par transfert dans E.coli, on a pu mettre en évidence la présence d'un insert Mbol de 980 pb avec un site EcoRI à 630 pb en
<EMI ID=11.1>
que le promoteur assurant la transcription de celle-ci se trouve associé à ce fragment de 630 pb car le remplacement des 350 pb précédant le site EcoRI s'est révélé sans effet sur l'acti-
<EMI ID=12.1>
réalisée la délétion du fragment de 350 pb se trouve détaillée dans la FIG.2 où le fragment initial de 980 pb est désigné par p414. La séquence nucléotidique du fragment de 630 pb avec le début du gène lacZ de E.coli a été déterminée par la méthode de A.M.Maxam & W.Gilbert (Proc.Acad.Sci.U.S.A. 74,1977,560; Methods Enzymol.65, 1980, 499) et se trouve représentée à la FIG.3. On peut voir que deux codons ATG d'initiation de la traduction sont présents aux positions 558 et 732 en phase de lecture correcte. Cependant, on a pu montrer par des expériences de sous-clonage que seul l'ATG le plus proche du gène lacZ, en position 732, était fonctionnel. Il est intéressant de noter que cet ATG n'est pas le codon d'initiation d'un gène <EMI ID=13.1>
Dans un souci de clarté, le fragment compris entre les sites EcoRI et PvuII et comprenant ce dernier ATG sera dénommé ci-
<EMI ID=14.1> Aménagement du promoteur p415 pour le rendre facilement utilisable.
Pour faciliter l'usage du promoteur p415 tel qu'il a été isolé ci-dessus, on le garnit à chacune de ses extrémités de sites de restriction uniques et d'usage courant, ceci de manière à pouvoir le transférer d'un plasmide à l'autre, au mieux de l'application envisagée, et aussi de manière à faciliter l'insertion dans ces plasmides, en aval du promoteur, de gènes étrangers dont on désire assurer l'expression.
Dans les exemples qui suivent,on décrit en détail une construction conduisant au plasmide YEpZIOl où le promoteur de la présente invention se trouve associé à un fragment HindIII
(en amont) et BamHI (en aval), ce dernier pouvant servir à l'introduction de gènes étrangers comme on le décrit également dans les exemples. Il est évident cependant que d'autres constructions ayant pour résultat de garnir les extrémités du promoteur p415 d'autres sites de restriction comme EcoRI, ClaI,HindIII,SphI, SalI,SacI,PstI,XbaI,XhoI sont également envisageables et que les différentes variantes ainsi obtenues de ce promoteur font également partie de la présente invention.
Variantes de promoteur p415 obtenues par délétion.
D'autres variantes du promoteur p415 obtenues par diverses délétions peuvent elles aussi apporter des avantages pratiques intéressants. En effet, le promoteur p415 tel qu'il se trouve inclus dans le plasmide YEpZIOl est avantageux pour l'expression d'un gène, tel le gène lacZ de pMC1587 ou de YEpZ100 (FIG.4), dépourvu de codon d'initiation ATG car celuici est fourni par le promoteur lui-même, juste en amont du site BamHI. Cependant, dans le cas d'un gène qui possède déjà son propre codon d'initiation, le promoteur p415 du plasmide YEpZIOl ne peut pas convenir tel quel. On sait en effet que chez les eucaryotes, levure y compris, c'est le premier codon d'initiation de l'ARN messager correspondant au gène qui est normalement utilisé.
Dès lors, l'introduction d'un second codon ATG aurait deux effets suivant que celui-ci se trouve en phase ou non avec le codon ATG du promoteur. Dans ce dernier cas, un polypeptide totalement différent de celui codé par le gène serait produit;dans le premier, les acides aminés correspondant aux codons situés entre les deux ATG seraient ajoutés à l'extrémité amino terminale du polypeptide attendu. On obtiendrait ainsi un produit éventuellement actif mais néanmoins différent de celui normalement codé par le gène, ce qui est désavantageux puisque, dans la plupart des applications du génie génétique,on cherche à obtenir des substituts aussi proches que possible de produits naturels.
Cette situation est particulièrement désavantageuse lorsqu'on cherche en outre, comme on le verra dans les exemples, à tirer parti de la séquence signal d'un produit naturel pour en assurer l'excrétion par la cellule de levure transformée.
Pour ces différentes raisons, il était nécessaire d'avoir des variantes du promoteur p415 ne comportant pas le codon d'initiation ATG mais où le site de restriction installé immédiatement en aval se trouverait préservé. Dans les exemples qui suivent, on décrit de telles délétions opérées sur le plasmide YEpZIOl au départ du site BamHI. On a obtenu ainsi plusieurs variantes du promoteur p415 comportant un site BamHI
<EMI ID=15.1>
et p415 A 5. Il va de soi que les possibilités de remplacer dans ces variantes les extrémités BamHI et HindIII par d'autres sites de restriction existent tout autant que dans le cas du promoteur p415 de départ.
<EMI ID=16.1>
révélée particulièrement efficace pour l'expression dans la levure du gène de lysozyme de poule. Ce résultat, en soi surprenant dans l'état actuel des connaissances des processus de transcription et de traduction chez la levure, démontre que d'autres modifications du promoteur p415, obtenues par la même technique ou toute autre méthode in vitro ou in vivo, sont susceptibles d'apporter des-améliorations par rapport aux résultats décrits dans le présent brevet. Il est évident que les �
diverses variantes ainsi obtenues doivent être considérées comme faisant partie de la présente invention.
Transformations de levures par des plasmides vecteurs compor� tant le promoteur p415 et ses variantes
Ainsi que l'homme de l'art le réalise aisément,les promoteurs conformes à la présente invention ne peuvent servir à l'expression dans la levure de gènes étrangers que s'ils sont convenablement associés au gène à exprimer dans un plasmide vecteur capable de s'y répliquer en un nombre aussi élevé que possible de copies. Ce vecteur doit pour cela comporter une origine de réplication reconnue par la cellule hôte. Il doit comporter également un gène marqueur permettant la visualisation et la sélection des cellules qui ont effectivement été transformées par le plasmide.
Un grand nombre de vecteurs d'expression comportant ces différents éléments ont été construits, spécialement pour la transformation des levures de l'espèce Saccharomyces cerevisiae.Ils comportent en général l'origine de réplication du plasmide 2-microns présent dans le plupart des souches de cette espèce ou encore un segment de réplication autonome ARS d'origine chromosomique.
Comme gène marqueur, on utilise en général un gène codant pour une enzyme intervenant dans la biosynthèse d'un métabolite essentiel, par exemple un acide aminé.Dans ce cas, on utilise comme cellule hôte une souche de levure devenue par mutation auxotrophe pour ce métabolite. En cultivant cette souche sur un milieu exempt du métabolite en question,seules pourront se développer les cellules transformées par un plasmide porteur du gène manquant. Les gènes LEU2 ou TRP1 codant respectivement pour une enzyme intervenant dans la biosynthèse de la leucine et du tryptophane sont des exemples types de tels marqueurs.
Ces vecteurs d'expression doivent également comporter un ou de préférence plusieurs sites de restriction où insérer la partie codante intéressante ainsi que les différents éléments nécessaires à l'optimalisation de son expression:pro-moteurs, terminateurs et autres éléments de contrôle.
Souvent ces plasmides comportent en outre des séquences bactériennes capables d'assurer leur réplication et leur sélection chez un hôte bactérien intermédiaire, par exemple Escherichia coli. Comme exemples classiques de tels plasmides navettes, on peut citer YEpl3 (J.R.Broach et al.,
<EMI ID=17.1>
1980, 11) et pJDB207 (J.D.Beggs, Alfred Benson Symposium N[deg.]16, Munksgaard, Copenhaegen 1981, pp.383):
Selon un mode préféré de l'invention, principalement lorsque la cellule hôte appartient à l'espèce Saccharomyces cerevisiae, on utilise un plasmide comportant au moins les fonctions REP de la séquence du plasmide endogène 2-microns. Celles-ci apportent en général au plasmide une plus grande stabilité, spécialement si la cellule hôte a été au préalable curée de ses plasmides 2-microns (C.P.Hollenberg,Curr.Top. Microbiol.Immunol. 96, 1982, 119 ) R.M.Walmsley et al., Mol.Gen.Genet. 1983, 261). Des exemples classiques de tels vecteurs sont les plasmides pJDB219 et pJDB248 (J.D. Beggs, Nature 275, 1978, 104 ). Un autre vecteur de ce type est décrit dans les exemples qui suivent.
Ces différents plasmides peuvent être utilisés comme vecteurs pour assurer l'expression dans la levure de gènes hétérologues convenablement positionnés en amont des promoteurs de la présente invention. Des exemples de construction particulières sont donnés à titre d'illustration dans le présent brevet, mais il est évident qu'il existe beaucoup d'autres possibilités et que diverses combinaisons d'origines de réplication, de gènes marqueurs et d'autres éléments de structure peuvent être mises en oeuvre pour arriver à des résultats similaires. Les différents vecteurs d'expression que l'on peut ainsi construire pour exprimer des gènes hétérologues grâce aux promoteurs de la présente invention doivent être considérés comme faisant partie de celle-ci.
Les cellules transformées obtenues dans ces diffé- rents cas font également partie de l'invention. Bien que la plupart des techniques développées pour transformer les cellules de levure aient surtout été appliquées à l'espèce S.cerevisiae, les cellules obtenues par transformation d'autres espèces et genres de levure à l'aide de vecteurs d'expression du type de ceux renseignés ci-dessus sont également comprises dans l'invention. Comme exemples d'autres levures, on peut citer Saccharomycopsis lipolytica, Schizosaccharomyces Pombe, Kluyveromyçes lactis, etc... Toutefois, selon un mode préféré de l'invention, on utilisera comme cellules hôte des levures transformables du genre Saccharomyces et,de préférence, celles appartenant à l'espèce S.cerevisiae. Comme exemples
de souches transformables appartenant à cette espèce, on peut citer AH22 et GRF18, parmi bien d'autres.
Production de polypeptides par les levures transformées
Les fragments d'ADN que l'on peut exprimer dans la levure conformément à la présente invention peuvent être d'origines diverses. Ce peuvent être des gènes de procaryotes, comme c'est le cas du gène de 13 -galactosidase de E.coli dont l'expression est décrite dans un des exemples qui suivant. Ce peut être également un gène d'eucaryote dans la mesure où il ne comporte pas d'introns puisque la levure n'est pas capable d'assurer la maturation des ARN messagers provenant de la transcription de gènes fragmentés (J.D.Beggs et al. Nature 283, 1980, 835). Dans ce cas, cependant, on peut recourir à l'expression du cADN correspondant, comme on le décrit plus loin dans un autre exemple illustrant l'expression dans la levure du lysozyme de poule.
Bien d'autres gènes peuvent être exprimés de la même manière, qu'ils soient d'origine bactérienne, végétale, animale ou humaine. Il va de soi que les polypeptides nouveaux qui seraient ainsi exprimés font eux-mêmes partie de la présente invention.
Lorsque, conformément à la présente invention, une souche de levure a été amenée à produire l'un ou l'autre de ces polypeptides, il est nécessaire, pour tirer parti de cette propriété nouvelle, de la multiplier dans les conditions les plus favorables à sa croissance. L'homme de l'art saura déterminer aisément ces conditions en tenant compte des caractéristiques propres à la souche de levure utilisée comme hôte. Comme dans la plupart des cas, les levures transformées ont plus ou moins tendance à perdre des plasmides artificiellement construits, on aura avantage à composer le milieu de culture de manière à exercer sur elles une pression de sélection positive. Lorsque la souche est un mutant auxotrophe pour l'un
ou l'autre métabolite essentiel et que le plasmide vecteur utilisé comporte un gène marqueur capable de restaurer la prototrophie de la souche, par exemple les gènes LEU2 ou
TRP1 dont on a parlé plus haut, on pourra exercer cette pression de sélection en omettant le métabolite en question du milieu de culture. Si, au contraire, le plasmide comprend comme marqueur un gène capable de conférer à la levure une résistance plus ou moins marquée à un inhibiteur de croissance, par exemple un antibiotique comme le G418 (J.Jimenez et J.Davies, Nature 287, 1980, 869) ou un herbicide comme le diuron (brevet luxembourgeois n[deg.] 899.607 déposé au
nom de la demanderesse},on pourra exercer la pression de sélection en faveur de la levure transformée en cultivant celle-ci dans un milieu additionné de cet inhibiteur.D'autres moyens existent pour atteindre le même résultat et peuvent également être utilisés pour mettre en pratique la présente invention.
Lorsque les levures transformées ont été cultivées dans les conditions assurant la meilleure production du polypeptide intéressant, celui-ci devra encore être récupéré. Il existe de nombreuses techniques pour cela que l'homme de
l'art pourra combiner dans chaque cas particulier pour obtenir le meilleur taux de récupération et la plus grande pureté du polypeptide recherché. Cependant, suivant un mode préféré de l'invention, le gène exprimé à l'intervention du promoteur p415 ou l'une de ses variantes sera de préférence équipé d'une séquence leader codant pour un peptide signal capable d'assurer le transport du produit du gène au travers de la membrane plasmique de la cellule transformée. Dans ce cas, en effet, les opérations de séparation du polypeptide formé seront considérablement facilitées, que celui-ci se trouve libéré dans le milieu d'où il pourra être récupéré par des méthodes classiques, notamment par adsorption et/ou précipitation, ou qu'il reste associé à la paroi de la levure d'où il devra être détaché par d'autres méthodes.
Les divers aspects de la présente invention apparaîtront de manière plus spécifique dans les exemples suivants qui ne sont donnés qu'à titre purement illustratif.
EXEMPLES
1. Expression dans S.cerevisiae de la �-galactosidase d'E.coli
par le plasmide YEpZ415.
Le plasmide YEpZ415 dont la construction a servi à l'isolement du promoteur p415 de la présente invention, comme on l'a décrit plus haut, a été utilisé pour trans-
<EMI ID=18.1>
ces clones a été mesurée sur des extraits cellulaires par la méthode de J.Miller (Experiments in Molecular Genetics,
<EMI ID=19.1>
teneur en protéines des extraits a d'autre part été déterminée par la méthode de M.M.Bradford (Anal.Biochem. 72,
1976.1948). On a pu montrer ainsi que cette activité spé-
<EMI ID=20.1>
correspond à 2,57 % des protéines totales de l'extrait.
2. Expression dans S.cerevisiae du gène de la �-galactosidase
d'E.coli par le plasmide YEpZlOl.
Dans cet exemple, le promoteur p415 de la présente invention a été flanqué de deux sites de restriction constamment utilisés en génie génétique(HindIII et BamHI) et. employé sous cette forme pour exprimer le gène lacZ de E.coli dans un plasmide dénommé YEpZlOl. Cette opération a été effec-tuée en plusieurs étapes qui ont nécessité la construction de deux plasmides intermédiaires : YEpZIOO et pJ04.
2.1 YEpZIOO (FIG.4) a été construit au départ de pMC1587
(M.J.Casadaban et al., Methods in Enzymology 100, 1983,
293;) et de YEpZ415 dont il combine les avantages :
il a le début du gène lacZ ainsi que le groupe de sites de restriction EcoRI, SmaI et BamHI de pMC1587; il a la fin du gène lacZ de YEpZ415, ce qui conduit à l'élimination des gènes lacY et lacA de pMC1587 qui entraîneraient inutilement une augmentation de la taille du plasmide; il a en outre l'avantage de conserver le nombre de copies élevé propre aux plasmides dérivés, tel YEpZ415,de pJDB207 (E.Erhart & C.P.Hollenberg, J.
<EMI ID=21.1>
2.2 pJ04 (FIG.5) a été construit en introduisant le fragment RsaI-PvuII du promoteur p415 (FIG.3) dans le site
<EMI ID=22.1>
est triple :
i le codon d'initiation ATG immédiatement en amont du
site PvuII est retenu;
ii le site PvuII de p415 et le site SmaI de pMC1587
sont détruits;
iii un site BamHI est introduit immédiatement en aval
du codon ATG initiateur. Ce site est souvent utilisé pour le clonage de gènes étrangers.
2.3 YEpZIOl a ensuite été construit par combinaison de fragments d'ADN issus de trois plasmides décrits ci-dessus, par un processus faisant intervenir trois évènements de ligation (FIG.6). Dans cette construction, le gène lacZ, le gène amp , l'origine de réplication dans E.coli, le gène LEU2 et l'origine de réplication dans S.cerevisiae (provenant du plasmide 2-microns) dérivent tous de YEpZlOO. Le promoteur p415 y est reconstitué intact au départ de deux parties: la moitié terminale 5' au départ du fragment HindIII-ClaI de YEpZ415 et la moitié proximale 3' à partir du fragment ClaI-BamHI de pJ04. Le résultat net de ces opérations est que le promoteur p415 est maintenant lié par un site unique HindIII (en amont)et un site unique BamHI (en aval),ce dernier pouvant servir à l'introduction de gènes étrangers comme décrit ci-dessous.
2.4 Le plasmide YEpZlOl construit comme il vient d'être décrit a été utilisé pour transformer la levure. En opérant comme décrit dans l'exemple précédent, on a obtenu pour la �3-galactosidase une activité spécifique identique à celle conférée par le plasmide YEpZ415.
<EMI ID=23.1>
sé ce jour au nom de la demanderesse et intitulé : "Levures transformées produisant du lysozyme, plasmides utilisés pour cette transformation et leurs utilisations". Il fallait encore combiner de manière appropriée ce cADN avec un promoteur de levure comme on l'a décrit dans l'exemple pré-
<EMI ID=24.1>
les raisons invoquées plus haut, le fait que le cADN comportait son propre codon d'initiation ATG interdisait d'utiliser pour cette construction un plasmide comme YEpZIOl construit avec le promoteur p415 comprenant lui-même un codon ATG. Il fallait donc faire appel à une variante de ce plasmide dont l'ATG en question aurait été éliminé.
3.1 Une série de délétions furent effectuées avec l'enzyme
Bal31 au départ du site BamHI de YEpZIOl,en sens unique et antihoraire. Les plasmides ainsi raccourcis ont ensuite été clivés au site unique PstI et les fragments compris entre le site PstI et l'extrémité digérée par BAL31 ont été insérés entre les sites PstI et SmaI du plasmide YEpZlOO (FIG.7). La conséquence de cette opé-
<EMI ID=25.1>
i le codon d'initiation ATG immédiatement en amont du
site BamHI de YEpZlOl est détruit;
ii le site BamHI est également détruit mais il est
restauré par la fusion de l'extrémité touchée par
<EMI ID=26.1>
dans le plasmide YepZlOO.
Les délétions ainsi réalisées ont permis d'obtenir les
<EMI ID=27.1>
3.2 Il restait encore à associer, par une construction appropriée, les promoteurs ainsi obtenus avec le cADN de <EMI ID=28.1>
promoteur p415A2, cette construction a été réalisée par ligation simultanée des cinq fragments suivants :
(a) un fragment HindIII-BamHI provenant du plasmide
<EMI ID=29.1>
(b) un fragment SphI-BamHI provenant de p Alys9 et comportant le cADN complet du lysozyme.
(c) un fragment EcoRI-SphI provenant du plasmide pKOl
(K.McKenney et al., in Gene A.mplification and Analysis, Ed.J.G.Chirikjan & T.Panas, Elsevier/North Holland,New York,1981 p.383) pour servir de jonction entre le fragment (b) et le fragment (d) ciaprès;
(d) un fragment'PstI-EcoRI provenant du plasmide
YEpZ415 comportant l'origine de réplication et la moitié du gène de �-lactamase de pBR322; et
(e) un fragment HindIII-PstI de pJDB207 comprenant le segment 2-microns-LEU2 et l'autre moitié du gène de � -lactamase.
Avant ligation, ces différents fragments avaient été purifiés et comme ils comportent des bouts collants différents et complémentaires les uns des autres, un seul plasmide viable pouvait résulter de l'opération:
plys A 29 (FIG.9)..
En procédant de la même façon avec deux autres fragments
<EMI ID=30.1>
Ces trois plasmides ne se différencient donc que par le fait que le promoteur s'y trouve positionné à des distances variées du cADN de lysozyme,ce qui,au niveau de la transcription, doit se traduire par des distances différentes entre le début(l'extrémité 5') des ARN messagers correspondants et le site naturel AUG de départ de la traduction de ceux-ci.
3.3 Les plasmides construits comme décrit ci-dessus ont ensuite
été utilisés pour une transformation de la souche GRF18 de la levure S.cerevisiae suivie d'une sélection des clones prototrophes pour la leucine (Leu+). Ceux-ci furent ensuite broyés avec des billes de verre et les broyats obtenus furent clarifiés par centrifugation. L'activité lysozymique de ceux-ci fut testée en mesurant la décroissance de la densité optique d'une suspension de E.coli par la méthode
<EMI ID=31.1> Figure 10, les valeurs initiales de l'OD650 étaient identiques pour chaque clone (0,7) mais, pour plus de clarté,elles ont été décalées sur le diagramme. Les résultats de la FIG.10 <EMI ID=32.1>
sensiblement moindre chez les cellules transformées par le plasmide plysD59. Des résultats similaires furent obtenus avec une méthode où les cellules utilisées comme indicateur de l'action du lysozyme sont celles de la bactérie Micrococcus lysodeikticus (G.Alderton, J.Biol.Chem. 157, 1945, 43).
Dans un autre type d'essai, le lysozyme put être mis
en évidence autour de colonies transformées se développant sur boîte de Petri recouvertes d'un tapis de M.lysodeikticus. Dans ce cas, l'expression était visualisée par un halo transparent de bactéries lysées autour des colonies. En accord avec les résultats obtenus au départ de broyats exempts de cellules, le halo de lyse était le plus marqué dans le cas du clone plusA49, confirmant que celui-ci est bien le meilleur producteur de lysozyme. Ce résultat témoigne également de ce que le lysozyme est exporté de la cellule de levure puisqu' il doit nécessairement être extra-cellulaire pour pouvoir lyser l'indicateur bactérien.
La FIG.10 montre également qu'en opérant de la même ma-
<EMI ID=33.1>
n'a pu être observée. On voit qu'il ne suffit pas que les séquences responsables de la fonction promotrice soient présentes en amont du gène à exprimer; encore faut-il qu'elles soient convenablement positionnées par rapport à celui-ci.
4. Expression dans S.cerevisiae du lysozyme de poule par le
vecteur plys50.
4.1 Le vecteur pJDB207 sur lequel sont basés les vecteurs <EMI ID=34.1>
dessus ne contient pas le plasmide 2-microns entier de la levure et par conséquent dépend de la présence de celui-ci (que l'on trouve dans la plupart des souches de S.cerevisiae) pour se maintenir dans la cellule transformée. Ceci conduit à une situation instable telle que les plasmides du type pJDB207 sont fréquemment perdus par la cellule (E.Erhaert & C.P.Hollenberg, J.Bacteriol. 156, 1983, 625; M.Jarayam et al.,Cell 34,
1983, 95). Au contraire, le plasmide naturel 2-microns se maintient et se transmet de manière stable. On sait d'ailleurs que les plasmides construits de telle sorte qu'ils contiennent la totalité du plasmide 2-microns, par exemple le plasmide pJDB219, se maintiennent de manière beaucoup plus stable que ceux du type pJDB207
(C.P.Hollenberg, Curr.Top.Microbiol.Immunol.96, 1982,
119; R.M. Walmsley et al., Mol.Gen.Genet. 1983, 361).
Ces plasmides sont dès lors plus avantageux pour des cultures de longue durée, en particulier dans les fermentations industrielles.
Pour construire un tel vecteur à base du 2-microns complet, on est parti du plasmide YEpB2 (FIG.11) obtenu antérieurement par ouverture du plasmide 2-microns entier à son site unique PstI et clonage du fragment obtenu dans le site PstI, également unique, de pBR322. Deux fragments produits au départ de YEpB2 et deux autres au départ de plys A49 furent alors combinés pour donner le plasmide plys50 (FIG.12). Dans celui-ci, les trois gènes A, B et C du 2-microns sont intacts et l'expression de la partie codant pour le lysozyme y est assurée
<EMI ID=35.1>
plysA49 décrit dans l'exemple précédent.
4.2 Après transformation de la souche GRF18(.Leu-,His-) de
S.cerevisiae par les plasmides plys50 et JDB207, les cellules transformées obtenues dans les deux cas ont été séparément mises en culture dans un milieu minimum additionné d'histidine (0,002%). Quand les cultures ont atteint la phase stationnaire (densité optique :
environ 5), les cellules ont été séparées par centrifugation, remises en suspension dans un tampon phosphate 0,1 M pH7 et broyées au moyen de billes de verre.
L'activité lysozymique de ces broyats a été déterminée par leur capacité de lyser les cellules de M.lysodeikticus, suivant la méthode de D.Shugar
<EMI ID=36.1>
Aucune activité n'a été détectée dans le broyat de la souche transformée par le plasmide pJDB207 alors que dans celui de la souche GRF18(plys50) une activité lysozymique de 35 unités/ml de culture a pu être mise en évidence. En dosant les protéines du broyat par la méthode de D.Herbert et al.(Methods in Microbiol. 5B,
1971, 209) modifiée selon C.Wang et R.L.Smith (Anal.
Biochem. 63, 1975, 414) et compte tenu de l'activité spécifique du lysozyme purifié commercial (Boehringer Mannheim), on a pu déduire que le lysozyme produit par la levure dans ces conditions représente environ 0,8 % des protéines solubles de la levure.
<EMI ID=37.1>
(plys50) au Centraal Bureau voor Schimmelcultures,0osterstraat, 1, Baarn, Pays-Bas (Laboratorium voor Microbiologie, Technisch Hoogeschool Delft, Pays-Bas) le 5 décembre 1984.�
REVENDICATIONS
1) Promoteurs capables d'assurer dans la levure l'expression
de gènes codant pour des polypeptides généralement hétérologues, caractérisés en ce qu'ils consistent en un fragment d'ADN compris entre un site EcoRI et un site PvuII et dont la séquence nucléotidique est la suivante :
<EMI ID=38.1>
ainsi qu'en leurs mutants et sous-fragments ayant retenu
la fonction de promoteur.