PROMOTEURS ASSURANT L'EXPRESSION DE GENES ETRANGERS CHEZ LALEVURE, PLASMIDES COMPORTANT CES PROMOTEURS ET LEURS UTILISA-TIONS POUR LA PRODUCTION DE POLYPEPTIDES.
PROMOTEURS ASSURANT L'EXPRESSION DE GENES ETRANGERS
CHEZ LA LEVURE, PLASMIDES COMPORTANT CES PROMOTEURS
ET LEURS UTILISATIONS POUR LA PRODUCTION DE
POLYPEPTIDES.
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte à des fragments d'ADN de levure contenant un promoteur capable d'assurer dans la levure l'expression de gènes codant pour des polypeptides généralement hétérologues. Elle se rapporte également aux plasmides vecteurs comprenant ces fragments ainsi qu'aux levures transformées par ces plasmides.
FONDEMENT DE L'INVENTION
Les nouvelles techniques du génie génétique permettent l'expression dans divers organismes de gènes codant pour des protéines étrangères. A titre d'exemple, parmi beaucoup d'autres, on peut citer la synthèse d'interférons humains par la levure Saccharomyces cerevisiae (R.A.Hitzman et al.,Science
219, 1983, 620).
Une condition primordiale à l'expression d'un gène dans la levure est la mise en place en amount de celui-ci d'un promoteur reconnu par l'ARN-polymérase II de la levure et capable d'induire la synthèse de l'ARN messager correspondant. Plusieurs promoteurs de levure ont déjà été décrits. Dans de nombreux cas, cependant, les niveaux d'expression atteints sont faibles et impraticables pour des applications commerciales, spécialement lorsque ces promoteurs sont utilisés pour l'expression de gènes d'origine étrangère (T.Atkinson et al., Biochemical Soc.Trans. 12, 1984, 215). ) Pour manipuler génétiquement les levures de telle sorte qu'elles puissent être utilisées à des fins pratiques, il est donc essentiel de disposer de promoteurs efficaces. OBJETS DE L'INVENTION
La présente invention a pour objet de fournir de tels promoteurs. Elle a également pour objet de fournir des plasmides vecteurs où ces promoteurs sont fusionnés à des gènes étrangers à la levure de manière à assurer dans celle-ci l'expression de ces gènes en polypeptides correspondants. Les levures transformées par ces plasmides constituent un autre objet de la présente invention ainsi que les polypeptides nouveaux produits par ces levures. Enfin, c'est un objet de la présente invention de fournir un procédé de production de polypeptides par culture des levures ainsi transformées.
Ces différents objets sont réalisés grâce à l'utilisation comme promoteur de base d'un fragment d'ADN de levure ayant la séquence nucléotidique suivante :
<EMI ID=1.1>
-ainsi que de ses mutants et de ses sous-fragments ayant retenu la fonction de promoteur.
COURTE DESCRIPTION DES FIGURES
Pour la description détaillée de l'invention donnée ci-après et pour les exemples, on se réfère aux dessins annexés dans lesquels :
La FIG.l représente la construction du plasmide YEpZ36 utilisé comme sonde pour l'isolement de promoteurs de levure. Cette construction est réalisée par ligation d'un fragment provenant du plasmide pJDB207 contenant notamment le gène marqueur LEU2 et l'origine de réplication du plasmide levurien 2-microns avec un fragment provenant du plasmide pGL400 contenant le gène lacZ codant pour la �-galactosidase d'Escherichia coli. La FIG.2 représente la construction du plasmide YEpZ415 portant le promoteur de base de la présente invention (p415), par ligation de quatre fragments provenant des plasmides YEpZ36, YEpZ414 et pJDB207.
La FIG.3 montre la séquence du promoteur p415 comprenant la séquence levurienne comprise entre le site EcoRI et le site MboI et où l'on reconnaît les différents éléments trouvés dans d'autres promoteurs forts de levure: la boite TATA, le bloc CT suivi de peu par la séquence CAAGC.
La FIG.4 et la FIG.5 représentent respectivement la construction des plasmides YEpZIOO et pJ04 utilisés eux-mêmes, comme le montre la FIG.6, pour la construction du plasmide YEpZlOl comprenant une variante du promoteur p415 associée à un fragment HindIII-BamHI.
La FIG.7 représente la construction, au départ des plasmides YEpZlOO et YEpZlOl, de plasmides YEpZlOlà comportant différentes variantes du promoteur p415 obtenues par des délétions effectuées avec l'enzyme Ba131. Les variantes ainsi obtenues
(p415 A 2, p415� 4, et p415û.5) sont données à la FIG.8.
La FIG.9 représente la construction des vecteurs plysA29,
<EMI ID=2.1> plysA.9, pKOl et pJDB20 7.
La FIG.10 montre que des extraits cellulaires de levures trans-
<EMI ID=3.1>
lyser des cellules d'E.coli traitées à l'EDTA pour les rendre sensibles à l'action du lysozyme.
La FIG.ll représente la construction du plasmide YEpB2 par ligation des fragments obtenus par action de l'enzyme de restriction PstI sur le plasmide pBR322 et sur le plasmide endogène 2-microns de la levure.
La FIG.12 représente la construction du vecteur d'expression plys50 par ligation univoque de cinq fragments purifiés obtenus
<EMI ID=4.1>
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Principe de la méthode employée pour isoler le promoteur de base
L'isolement du promoteur de base de la présente invention,appelé ci-dessous p415, met en oeuvre des méthodes déjà connues. Il repose sur l'observation (L.Guarente, Meth.Enzymol.
<EMI ID=5.1>
que le gène lacZ codant pour la P-galactosidase d' Escherichia coli peut, dans certaines conditions, être exprimé par la levure Saccharomyces cerevisiae et que cette expression peut être mise en évidence par la couleur bleue des colonies de levures cultivées sur un milieu contenant l'indicateur chromogénique X-gal. Cette couleur bleue est due au clivage hydrolytique de l'indica-
<EMI ID=6.1>
de la quantité ' d'enzyme synthétisée. Il en résulte que l'intensité de la coloration bleue de la colonie dépend de l'ef-
<EMI ID=7.1>
tour dépend, entre autres, de la force du promoteur de levure utilisé. Dès lors, parmi les promoteurs sélectionnés, le plus fort devrait donner la couleur bleue le plus rapidement et ceci peut être vérifié par dosage enzymatique de l'activité
<EMI ID=8.1>
Construction d'une sonde pour l'isolement de promoteurs de levure.
La condition première pour l'isolement de promoteurs de levure suivant la méthode précédente est de disposer d'un vecteur capable de réplication et de sélection dans la levure, qui contienne le gène lacZ de E.coli mais qui ne puisse pas exprimer celui-ci par manque de promoteur approprié. Un tel vecteur doit répondre en outre aux conditions suivantes. Il doit être capable de se répliquer dans la levure par la présence d'une séquence reconnue par la machinerie de réplication de la levure; il doit pouvoir faire l'objet d'une sélection et se maintenir dans la levure grâce à la présence d'un gène marqueur. Il doit être potentiellement capable d'exprimer le gène lacZ dans la levure lorsqu'on lui fournit un promoteur approprié.
Il doit comporter un site de restriction unique en amont de ce gène de manière à ce qu'on puisse insérer de petits fragments d'ADN de levure susceptibles de comporter un promoteur.
La construction d'un tel plasmide se trouve représentée à la FIG.l. Il a été obtenu par combinaison, suivant des techniques classiques,de deux plasmides décrits dans la littérature scientifique : pJDB207 (J.D.Beggs et al., Nature 283,
1980, 835) et pLG400 (L.Guarente et al., Cell 20, 1980,
543-). Le plasmide YEpZ36 ainsi obtenu est capable de se répliquer dans S.cerevisiae grâce à l'origine de réplication du plasmide endogène 2-microns fournie par pJDB207. De celui-ci, il possède également le gène marqueur LEU2 permettant sa sélection et son maintien dans une levure ayant une mutation leu2 . Il possède un site unique BamHI où peuvent être insérés de petits fragments générés par action de l'enzyme de restriction MboI.
Construction du plasmide YEpZ415 portant le promoteur p415
L'isolement du promoteur de la présente invention à l'aide de la sonde construite ci-dessus a été effectué de la manière suivante.
Les fragments obtenus par digestion partielle avec l'enzyme de restriction MboI de l'ADN total de la levure
<EMI ID=9.1> ont été insérés dans le site BamHI du plasmide YEpZ36 décrit ci-dessus et l'ADN ainsi recombiné a été utilisé pour transformer une souche leu2- de la levure S.cerevisiae GRF18. Les colonies transformées furent ensuite testées sur milieu X-gal pour leur aptitude à produire la �-galactosidase. Plusieurs clones se révélèrent positifs par transfert sur milieu X-gal et
<EMI ID=10.1>
sidasique, se révèla le plus actif fut sélectionné pour l'isolement du promoteur de l'invention.
Après isolement de l'ADN plasmidique de ce clone,par transfert dans E.coli, on a pu mettre en évidence la présence d'un insert Mbol de 980 pb avec un site EcoRI à 630 pb en
<EMI ID=11.1>
que le promoteur assurant la transcription de celle-ci se trouve associé à ce fragment de 630 pb car le remplacement des 350 pb précédant le site EcoRI s'est révélé sans effet sur l'acti-
<EMI ID=12.1>
réalisée la délétion du fragment de 350 pb se trouve détaillée dans la FIG.2 où le fragment initial de 980 pb est désigné par p414. La séquence nucléotidique du fragment de 630 pb avec le début du gène lacZ de E.coli a été déterminée par la méthode de A.M.Maxam & W.Gilbert (Proc.Acad.Sci.U.S.A. 74,1977,560; Methods Enzymol.65, 1980, 499) et se trouve représentée à la FIG.3. On peut voir que deux codons ATG d'initiation de la traduction sont présents aux positions 558 et 732 en phase de lecture correcte. Cependant, on a pu montrer par des expériences de sous-clonage que seul l'ATG le plus proche du gène lacZ, en position 732, était fonctionnel. Il est intéressant de noter que cet ATG n'est pas le codon d'initiation d'un gène <EMI ID=13.1>
Dans un souci de clarté, le fragment compris entre les sites EcoRI et PvuII et comprenant ce dernier ATG sera dénommé ci-
<EMI ID=14.1> Aménagement du promoteur p415 pour le rendre facilement utilisable.
Pour faciliter l'usage du promoteur p415 tel qu'il a été isolé ci-dessus, on le garnit à chacune de ses extrémités de sites de restriction uniques et d'usage courant, ceci de manière à pouvoir le transférer d'un plasmide à l'autre, au mieux de l'application envisagée, et aussi de manière à faciliter l'insertion dans ces plasmides, en aval du promoteur, de gènes étrangers dont on désire assurer l'expression.
Dans les exemples qui suivent,on décrit en détail une construction conduisant au plasmide YEpZIOl où le promoteur de la présente invention se trouve associé à un fragment HindIII
(en amont) et BamHI (en aval), ce dernier pouvant servir à l'introduction de gènes étrangers comme on le décrit également dans les exemples. Il est évident cependant que d'autres constructions ayant pour résultat de garnir les extrémités du promoteur p415 d'autres sites de restriction comme EcoRI, ClaI,HindIII,SphI, SalI,SacI,PstI,XbaI,XhoI sont également envisageables et que les différentes variantes ainsi obtenues de ce promoteur font également partie de la présente invention.
Variantes de promoteur p415 obtenues par délétion.
D'autres variantes du promoteur p415 obtenues par diverses délétions peuvent elles aussi apporter des avantages pratiques intéressants. En effet, le promoteur p415 tel qu'il se trouve inclus dans le plasmide YEpZIOl est avantageux pour l'expression d'un gène, tel le gène lacZ de pMC1587 ou de YEpZ100 (FIG.4), dépourvu de codon d'initiation ATG car celuici est fourni par le promoteur lui-même, juste en amont du site BamHI. Cependant, dans le cas d'un gène qui possède déjà son propre codon d'initiation, le promoteur p415 du plasmide YEpZIOl ne peut pas convenir tel quel. On sait en effet que chez les eucaryotes, levure y compris, c'est le premier codon d'initiation de l'ARN messager correspondant au gène qui est normalement utilisé.
Dès lors, l'introduction d'un second codon ATG aurait deux effets suivant que celui-ci se trouve en phase ou non avec le codon ATG du promoteur. Dans ce dernier cas, un polypeptide totalement différent de celui codé par le gène serait produit;dans le premier, les acides aminés correspondant aux codons situés entre les deux ATG seraient ajoutés à l'extrémité amino terminale du polypeptide attendu. On obtiendrait ainsi un produit éventuellement actif mais néanmoins différent de celui normalement codé par le gène, ce qui est désavantageux puisque, dans la plupart des applications du génie génétique,on cherche à obtenir des substituts aussi proches que possible de produits naturels.
Cette situation est particulièrement désavantageuse lorsqu'on cherche en outre, comme on le verra dans les exemples, à tirer parti de la séquence signal d'un produit naturel pour en assurer l'excrétion par la cellule de levure transformée.
Pour ces différentes raisons, il était nécessaire d'avoir des variantes du promoteur p415 ne comportant pas le codon d'initiation ATG mais où le site de restriction installé immédiatement en aval se trouverait préservé. Dans les exemples qui suivent, on décrit de telles délétions opérées sur le plasmide YEpZIOl au départ du site BamHI. On a obtenu ainsi plusieurs variantes du promoteur p415 comportant un site BamHI
<EMI ID=15.1>
et p415 A 5. Il va de soi que les possibilités de remplacer dans ces variantes les extrémités BamHI et HindIII par d'autres sites de restriction existent tout autant que dans le cas du promoteur p415 de départ.
<EMI ID=16.1>
révélée particulièrement efficace pour l'expression dans la levure du gène de lysozyme de poule. Ce résultat, en soi surprenant dans l'état actuel des connaissances des processus de transcription et de traduction chez la levure, démontre que d'autres modifications du promoteur p415, obtenues par la même technique ou toute autre méthode in vitro ou in vivo, sont susceptibles d'apporter des-améliorations par rapport aux résultats décrits dans le présent brevet. Il est évident que les �
diverses variantes ainsi obtenues doivent être considérées comme faisant partie de la présente invention.
Transformations de levures par des plasmides vecteurs compor� tant le promoteur p415 et ses variantes
Ainsi que l'homme de l'art le réalise aisément,les promoteurs conformes à la présente invention ne peuvent servir à l'expression dans la levure de gènes étrangers que s'ils sont convenablement associés au gène à exprimer dans un plasmide vecteur capable de s'y répliquer en un nombre aussi élevé que possible de copies. Ce vecteur doit pour cela comporter une origine de réplication reconnue par la cellule hôte. Il doit comporter également un gène marqueur permettant la visualisation et la sélection des cellules qui ont effectivement été transformées par le plasmide.
Un grand nombre de vecteurs d'expression comportant ces différents éléments ont été construits, spécialement pour la transformation des levures de l'espèce Saccharomyces cerevisiae.Ils comportent en général l'origine de réplication du plasmide 2-microns présent dans le plupart des souches de cette espèce ou encore un segment de réplication autonome ARS d'origine chromosomique.
Comme gène marqueur, on utilise en général un gène codant pour une enzyme intervenant dans la biosynthèse d'un métabolite essentiel, par exemple un acide aminé.Dans ce cas, on utilise comme cellule hôte une souche de levure devenue par mutation auxotrophe pour ce métabolite. En cultivant cette souche sur un milieu exempt du métabolite en question,seules pourront se développer les cellules transformées par un plasmide porteur du gène manquant. Les gènes LEU2 ou TRP1 codant respectivement pour une enzyme intervenant dans la biosynthèse de la leucine et du tryptophane sont des exemples types de tels marqueurs.
Ces vecteurs d'expression doivent également comporter un ou de préférence plusieurs sites de restriction où insérer la partie codante intéressante ainsi que les différents éléments nécessaires à l'optimalisation de son expression:pro-moteurs, terminateurs et autres éléments de contrôle.
Souvent ces plasmides comportent en outre des séquences bactériennes capables d'assurer leur réplication et leur sélection chez un hôte bactérien intermédiaire, par exemple Escherichia coli. Comme exemples classiques de tels plasmides navettes, on peut citer YEpl3 (J.R.Broach et al.,
<EMI ID=17.1>
1980, 11) et pJDB207 (J.D.Beggs, Alfred Benson Symposium N[deg.]16, Munksgaard, Copenhaegen 1981, pp.383):
Selon un mode préféré de l'invention, principalement lorsque la cellule hôte appartient à l'espèce Saccharomyces cerevisiae, on utilise un plasmide comportant au moins les fonctions REP de la séquence du plasmide endogène 2-microns. Celles-ci apportent en général au plasmide une plus grande stabilité, spécialement si la cellule hôte a été au préalable curée de ses plasmides 2-microns (C.P.Hollenberg,Curr.Top. Microbiol.Immunol. 96, 1982, 119 ) R.M.Walmsley et al., Mol.Gen.Genet. 1983, 261). Des exemples classiques de tels vecteurs sont les plasmides pJDB219 et pJDB248 (J.D. Beggs, Nature 275, 1978, 104 ). Un autre vecteur de ce type est décrit dans les exemples qui suivent.
Ces différents plasmides peuvent être utilisés comme vecteurs pour assurer l'expression dans la levure de gènes hétérologues convenablement positionnés en amont des promoteurs de la présente invention. Des exemples de construction particulières sont donnés à titre d'illustration dans le présent brevet, mais il est évident qu'il existe beaucoup d'autres possibilités et que diverses combinaisons d'origines de réplication, de gènes marqueurs et d'autres éléments de structure peuvent être mises en oeuvre pour arriver à des résultats similaires. Les différents vecteurs d'expression que l'on peut ainsi construire pour exprimer des gènes hétérologues grâce aux promoteurs de la présente invention doivent être considérés comme faisant partie de celle-ci.
Les cellules transformées obtenues dans ces diffé- rents cas font également partie de l'invention. Bien que la plupart des techniques développées pour transformer les cellules de levure aient surtout été appliquées à l'espèce S.cerevisiae, les cellules obtenues par transformation d'autres espèces et genres de levure à l'aide de vecteurs d'expression du type de ceux renseignés ci-dessus sont également comprises dans l'invention. Comme exemples d'autres levures, on peut citer Saccharomycopsis lipolytica, Schizosaccharomyces Pombe, Kluyveromyçes lactis, etc... Toutefois, selon un mode préféré de l'invention, on utilisera comme cellules hôte des levures transformables du genre Saccharomyces et,de préférence, celles appartenant à l'espèce S.cerevisiae. Comme exemples
de souches transformables appartenant à cette espèce, on peut citer AH22 et GRF18, parmi bien d'autres.
Production de polypeptides par les levures transformées
Les fragments d'ADN que l'on peut exprimer dans la levure conformément à la présente invention peuvent être d'origines diverses. Ce peuvent être des gènes de procaryotes, comme c'est le cas du gène de 13 -galactosidase de E.coli dont l'expression est décrite dans un des exemples qui suivant. Ce peut être également un gène d'eucaryote dans la mesure où il ne comporte pas d'introns puisque la levure n'est pas capable d'assurer la maturation des ARN messagers provenant de la transcription de gènes fragmentés (J.D.Beggs et al. Nature 283, 1980, 835). Dans ce cas, cependant, on peut recourir à l'expression du cADN correspondant, comme on le décrit plus loin dans un autre exemple illustrant l'expression dans la levure du lysozyme de poule.
Bien d'autres gènes peuvent être exprimés de la même manière, qu'ils soient d'origine bactérienne, végétale, animale ou humaine. Il va de soi que les polypeptides nouveaux qui seraient ainsi exprimés font eux-mêmes partie de la présente invention.
Lorsque, conformément à la présente invention, une souche de levure a été amenée à produire l'un ou l'autre de ces polypeptides, il est nécessaire, pour tirer parti de cette propriété nouvelle, de la multiplier dans les conditions les plus favorables à sa croissance. L'homme de l'art saura déterminer aisément ces conditions en tenant compte des caractéristiques propres à la souche de levure utilisée comme hôte. Comme dans la plupart des cas, les levures transformées ont plus ou moins tendance à perdre des plasmides artificiellement construits, on aura avantage à composer le milieu de culture de manière à exercer sur elles une pression de sélection positive. Lorsque la souche est un mutant auxotrophe pour l'un
ou l'autre métabolite essentiel et que le plasmide vecteur utilisé comporte un gène marqueur capable de restaurer la prototrophie de la souche, par exemple les gènes LEU2 ou
TRP1 dont on a parlé plus haut, on pourra exercer cette pression de sélection en omettant le métabolite en question du milieu de culture. Si, au contraire, le plasmide comprend comme marqueur un gène capable de conférer à la levure une résistance plus ou moins marquée à un inhibiteur de croissance, par exemple un antibiotique comme le G418 (J.Jimenez et J.Davies, Nature 287, 1980, 869) ou un herbicide comme le diuron (brevet luxembourgeois n[deg.] 899.607 déposé au
nom de la demanderesse},on pourra exercer la pression de sélection en faveur de la levure transformée en cultivant celle-ci dans un milieu additionné de cet inhibiteur.D'autres moyens existent pour atteindre le même résultat et peuvent également être utilisés pour mettre en pratique la présente invention.
Lorsque les levures transformées ont été cultivées dans les conditions assurant la meilleure production du polypeptide intéressant, celui-ci devra encore être récupéré. Il existe de nombreuses techniques pour cela que l'homme de
l'art pourra combiner dans chaque cas particulier pour obtenir le meilleur taux de récupération et la plus grande pureté du polypeptide recherché. Cependant, suivant un mode préféré de l'invention, le gène exprimé à l'intervention du promoteur p415 ou l'une de ses variantes sera de préférence équipé d'une séquence leader codant pour un peptide signal capable d'assurer le transport du produit du gène au travers de la membrane plasmique de la cellule transformée. Dans ce cas, en effet, les opérations de séparation du polypeptide formé seront considérablement facilitées, que celui-ci se trouve libéré dans le milieu d'où il pourra être récupéré par des méthodes classiques, notamment par adsorption et/ou précipitation, ou qu'il reste associé à la paroi de la levure d'où il devra être détaché par d'autres méthodes.
Les divers aspects de la présente invention apparaîtront de manière plus spécifique dans les exemples suivants qui ne sont donnés qu'à titre purement illustratif.
EXEMPLES
1. Expression dans S.cerevisiae de la �-galactosidase d'E.coli
par le plasmide YEpZ415.
Le plasmide YEpZ415 dont la construction a servi à l'isolement du promoteur p415 de la présente invention, comme on l'a décrit plus haut, a été utilisé pour trans-
<EMI ID=18.1>
ces clones a été mesurée sur des extraits cellulaires par la méthode de J.Miller (Experiments in Molecular Genetics,
<EMI ID=19.1>
teneur en protéines des extraits a d'autre part été déterminée par la méthode de M.M.Bradford (Anal.Biochem. 72,
1976.1948). On a pu montrer ainsi que cette activité spé-
<EMI ID=20.1>
correspond à 2,57 % des protéines totales de l'extrait.
2. Expression dans S.cerevisiae du gène de la �-galactosidase
d'E.coli par le plasmide YEpZlOl.
Dans cet exemple, le promoteur p415 de la présente invention a été flanqué de deux sites de restriction constamment utilisés en génie génétique(HindIII et BamHI) et. employé sous cette forme pour exprimer le gène lacZ de E.coli dans un plasmide dénommé YEpZlOl. Cette opération a été effec-tuée en plusieurs étapes qui ont nécessité la construction de deux plasmides intermédiaires : YEpZIOO et pJ04.
2.1 YEpZIOO (FIG.4) a été construit au départ de pMC1587
(M.J.Casadaban et al., Methods in Enzymology 100, 1983,
293;) et de YEpZ415 dont il combine les avantages :
il a le début du gène lacZ ainsi que le groupe de sites de restriction EcoRI, SmaI et BamHI de pMC1587; il a la fin du gène lacZ de YEpZ415, ce qui conduit à l'élimination des gènes lacY et lacA de pMC1587 qui entraîneraient inutilement une augmentation de la taille du plasmide; il a en outre l'avantage de conserver le nombre de copies élevé propre aux plasmides dérivés, tel YEpZ415,de pJDB207 (E.Erhart & C.P.Hollenberg, J.
<EMI ID=21.1>
2.2 pJ04 (FIG.5) a été construit en introduisant le fragment RsaI-PvuII du promoteur p415 (FIG.3) dans le site
<EMI ID=22.1>
est triple :
i le codon d'initiation ATG immédiatement en amont du
site PvuII est retenu;
ii le site PvuII de p415 et le site SmaI de pMC1587
sont détruits;
iii un site BamHI est introduit immédiatement en aval
du codon ATG initiateur. Ce site est souvent utilisé pour le clonage de gènes étrangers.
2.3 YEpZIOl a ensuite été construit par combinaison de fragments d'ADN issus de trois plasmides décrits ci-dessus, par un processus faisant intervenir trois évènements de ligation (FIG.6). Dans cette construction, le gène lacZ, le gène amp , l'origine de réplication dans E.coli, le gène LEU2 et l'origine de réplication dans S.cerevisiae (provenant du plasmide 2-microns) dérivent tous de YEpZlOO. Le promoteur p415 y est reconstitué intact au départ de deux parties: la moitié terminale 5' au départ du fragment HindIII-ClaI de YEpZ415 et la moitié proximale 3' à partir du fragment ClaI-BamHI de pJ04. Le résultat net de ces opérations est que le promoteur p415 est maintenant lié par un site unique HindIII (en amont)et un site unique BamHI (en aval),ce dernier pouvant servir à l'introduction de gènes étrangers comme décrit ci-dessous.
2.4 Le plasmide YEpZlOl construit comme il vient d'être décrit a été utilisé pour transformer la levure. En opérant comme décrit dans l'exemple précédent, on a obtenu pour la �3-galactosidase une activité spécifique identique à celle conférée par le plasmide YEpZ415.
<EMI ID=23.1>
sé ce jour au nom de la demanderesse et intitulé : "Levures transformées produisant du lysozyme, plasmides utilisés pour cette transformation et leurs utilisations". Il fallait encore combiner de manière appropriée ce cADN avec un promoteur de levure comme on l'a décrit dans l'exemple pré-
<EMI ID=24.1>
les raisons invoquées plus haut, le fait que le cADN comportait son propre codon d'initiation ATG interdisait d'utiliser pour cette construction un plasmide comme YEpZIOl construit avec le promoteur p415 comprenant lui-même un codon ATG. Il fallait donc faire appel à une variante de ce plasmide dont l'ATG en question aurait été éliminé.
3.1 Une série de délétions furent effectuées avec l'enzyme
Bal31 au départ du site BamHI de YEpZIOl,en sens unique et antihoraire. Les plasmides ainsi raccourcis ont ensuite été clivés au site unique PstI et les fragments compris entre le site PstI et l'extrémité digérée par BAL31 ont été insérés entre les sites PstI et SmaI du plasmide YEpZlOO (FIG.7). La conséquence de cette opé-
<EMI ID=25.1>
i le codon d'initiation ATG immédiatement en amont du
site BamHI de YEpZlOl est détruit;
ii le site BamHI est également détruit mais il est
restauré par la fusion de l'extrémité touchée par
<EMI ID=26.1>
dans le plasmide YepZlOO.
Les délétions ainsi réalisées ont permis d'obtenir les
<EMI ID=27.1>
3.2 Il restait encore à associer, par une construction appropriée, les promoteurs ainsi obtenus avec le cADN de <EMI ID=28.1>
promoteur p415A2, cette construction a été réalisée par ligation simultanée des cinq fragments suivants :
(a) un fragment HindIII-BamHI provenant du plasmide
<EMI ID=29.1>
(b) un fragment SphI-BamHI provenant de p Alys9 et comportant le cADN complet du lysozyme.
(c) un fragment EcoRI-SphI provenant du plasmide pKOl
(K.McKenney et al., in Gene A.mplification and Analysis, Ed.J.G.Chirikjan & T.Panas, Elsevier/North Holland,New York,1981 p.383) pour servir de jonction entre le fragment (b) et le fragment (d) ciaprès;
(d) un fragment'PstI-EcoRI provenant du plasmide
YEpZ415 comportant l'origine de réplication et la moitié du gène de �-lactamase de pBR322; et
(e) un fragment HindIII-PstI de pJDB207 comprenant le segment 2-microns-LEU2 et l'autre moitié du gène de � -lactamase.
Avant ligation, ces différents fragments avaient été purifiés et comme ils comportent des bouts collants différents et complémentaires les uns des autres, un seul plasmide viable pouvait résulter de l'opération:
plys A 29 (FIG.9)..
En procédant de la même façon avec deux autres fragments
<EMI ID=30.1>
Ces trois plasmides ne se différencient donc que par le fait que le promoteur s'y trouve positionné à des distances variées du cADN de lysozyme,ce qui,au niveau de la transcription, doit se traduire par des distances différentes entre le début(l'extrémité 5') des ARN messagers correspondants et le site naturel AUG de départ de la traduction de ceux-ci.
3.3 Les plasmides construits comme décrit ci-dessus ont ensuite
été utilisés pour une transformation de la souche GRF18 de la levure S.cerevisiae suivie d'une sélection des clones prototrophes pour la leucine (Leu+). Ceux-ci furent ensuite broyés avec des billes de verre et les broyats obtenus furent clarifiés par centrifugation. L'activité lysozymique de ceux-ci fut testée en mesurant la décroissance de la densité optique d'une suspension de E.coli par la méthode
<EMI ID=31.1> Figure 10, les valeurs initiales de l'OD650 étaient identiques pour chaque clone (0,7) mais, pour plus de clarté,elles ont été décalées sur le diagramme. Les résultats de la FIG.10 <EMI ID=32.1>
sensiblement moindre chez les cellules transformées par le plasmide plysD59. Des résultats similaires furent obtenus avec une méthode où les cellules utilisées comme indicateur de l'action du lysozyme sont celles de la bactérie Micrococcus lysodeikticus (G.Alderton, J.Biol.Chem. 157, 1945, 43).
Dans un autre type d'essai, le lysozyme put être mis
en évidence autour de colonies transformées se développant sur boîte de Petri recouvertes d'un tapis de M.lysodeikticus. Dans ce cas, l'expression était visualisée par un halo transparent de bactéries lysées autour des colonies. En accord avec les résultats obtenus au départ de broyats exempts de cellules, le halo de lyse était le plus marqué dans le cas du clone plusA49, confirmant que celui-ci est bien le meilleur producteur de lysozyme. Ce résultat témoigne également de ce que le lysozyme est exporté de la cellule de levure puisqu' il doit nécessairement être extra-cellulaire pour pouvoir lyser l'indicateur bactérien.
La FIG.10 montre également qu'en opérant de la même ma-
<EMI ID=33.1>
n'a pu être observée. On voit qu'il ne suffit pas que les séquences responsables de la fonction promotrice soient présentes en amont du gène à exprimer; encore faut-il qu'elles soient convenablement positionnées par rapport à celui-ci.
4. Expression dans S.cerevisiae du lysozyme de poule par le
vecteur plys50.
4.1 Le vecteur pJDB207 sur lequel sont basés les vecteurs <EMI ID=34.1>
dessus ne contient pas le plasmide 2-microns entier de la levure et par conséquent dépend de la présence de celui-ci (que l'on trouve dans la plupart des souches de S.cerevisiae) pour se maintenir dans la cellule transformée. Ceci conduit à une situation instable telle que les plasmides du type pJDB207 sont fréquemment perdus par la cellule (E.Erhaert & C.P.Hollenberg, J.Bacteriol. 156, 1983, 625; M.Jarayam et al.,Cell 34,
1983, 95). Au contraire, le plasmide naturel 2-microns se maintient et se transmet de manière stable. On sait d'ailleurs que les plasmides construits de telle sorte qu'ils contiennent la totalité du plasmide 2-microns, par exemple le plasmide pJDB219, se maintiennent de manière beaucoup plus stable que ceux du type pJDB207
(C.P.Hollenberg, Curr.Top.Microbiol.Immunol.96, 1982,
119; R.M. Walmsley et al., Mol.Gen.Genet. 1983, 361).
Ces plasmides sont dès lors plus avantageux pour des cultures de longue durée, en particulier dans les fermentations industrielles.
Pour construire un tel vecteur à base du 2-microns complet, on est parti du plasmide YEpB2 (FIG.11) obtenu antérieurement par ouverture du plasmide 2-microns entier à son site unique PstI et clonage du fragment obtenu dans le site PstI, également unique, de pBR322. Deux fragments produits au départ de YEpB2 et deux autres au départ de plys A49 furent alors combinés pour donner le plasmide plys50 (FIG.12). Dans celui-ci, les trois gènes A, B et C du 2-microns sont intacts et l'expression de la partie codant pour le lysozyme y est assurée
<EMI ID=35.1>
plysA49 décrit dans l'exemple précédent.
4.2 Après transformation de la souche GRF18(.Leu-,His-) de
S.cerevisiae par les plasmides plys50 et JDB207, les cellules transformées obtenues dans les deux cas ont été séparément mises en culture dans un milieu minimum additionné d'histidine (0,002%). Quand les cultures ont atteint la phase stationnaire (densité optique :
environ 5), les cellules ont été séparées par centrifugation, remises en suspension dans un tampon phosphate 0,1 M pH7 et broyées au moyen de billes de verre.
L'activité lysozymique de ces broyats a été déterminée par leur capacité de lyser les cellules de M.lysodeikticus, suivant la méthode de D.Shugar
<EMI ID=36.1>
Aucune activité n'a été détectée dans le broyat de la souche transformée par le plasmide pJDB207 alors que dans celui de la souche GRF18(plys50) une activité lysozymique de 35 unités/ml de culture a pu être mise en évidence. En dosant les protéines du broyat par la méthode de D.Herbert et al.(Methods in Microbiol. 5B,
1971, 209) modifiée selon C.Wang et R.L.Smith (Anal.
Biochem. 63, 1975, 414) et compte tenu de l'activité spécifique du lysozyme purifié commercial (Boehringer Mannheim), on a pu déduire que le lysozyme produit par la levure dans ces conditions représente environ 0,8 % des protéines solubles de la levure.
<EMI ID=37.1>
(plys50) au Centraal Bureau voor Schimmelcultures,0osterstraat, 1, Baarn, Pays-Bas (Laboratorium voor Microbiologie, Technisch Hoogeschool Delft, Pays-Bas) le 5 décembre 1984.�
REVENDICATIONS
1) Promoteurs capables d'assurer dans la levure l'expression
de gènes codant pour des polypeptides généralement hétérologues, caractérisés en ce qu'ils consistent en un fragment d'ADN compris entre un site EcoRI et un site PvuII et dont la séquence nucléotidique est la suivante :
<EMI ID=38.1>
ainsi qu'en leurs mutants et sous-fragments ayant retenu
la fonction de promoteur.
PROMOTERS PROVIDING EXPRESSION OF FOREIGN GENES IN YEAST, PLASMIDS COMPRISING SUCH PROMOTERS AND THEIR USES FOR THE PRODUCTION OF POLYPEPTIDES.
PROMOTERS ENSURING THE EXPRESSION OF FOREIGN GENES
IN YEAST, PLASMIDS INCLUDING THESE PROMOTERS
AND THEIR USES FOR THE PRODUCTION OF
POLYPEPTIDES.
FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to yeast DNA fragments containing a promoter capable of ensuring in yeast the expression of genes coding for generally heterologous polypeptides. It also relates to the vector plasmids comprising these fragments as well as to the yeasts transformed by these plasmids.
FOUNDATION OF THE INVENTION
The new techniques of genetic engineering allow the expression in various organisms of genes coding for foreign proteins. By way of example, among many others, mention may be made of the synthesis of human interferons by the yeast Saccharomyces cerevisiae (R.A. Hitzman et al., Science
219, 1983, 620).
An essential condition for the expression of a gene in yeast is the amount of a promoter recognized by the yeast RNA polymerase II capable of inducing the synthesis of the Corresponding messenger RNA. Several yeast promoters have already been described. In many cases, however, the expression levels achieved are low and impractical for commercial applications, especially when these promoters are used for the expression of genes of foreign origin (T. Atkinson et al., Biochemical Soc.Trans 12, 1984, 215). ) To genetically manipulate yeasts so that they can be used for practical purposes, it is therefore essential to have effective promoters. OBJECTS OF THE INVENTION
The object of the present invention is to provide such promoters. It also aims to provide vector plasmids where these promoters are fused to genes foreign to yeast so as to ensure therein the expression of these genes in corresponding polypeptides. Another object of the present invention is the yeasts transformed by these plasmids, as are the new polypeptides produced by these yeasts. Finally, it is an object of the present invention to provide a process for producing polypeptides by culturing yeasts thus transformed.
These various objects are achieved through the use as a basic promoter of a yeast DNA fragment having the following nucleotide sequence:
<EMI ID = 1.1>
as well as its mutants and its subfragments which have retained the promoter function.
SHORT DESCRIPTION OF THE FIGURES
For the detailed description of the invention given below and for the examples, reference is made to the appended drawings in which:
FIG. 1 represents the construction of the plasmid YEpZ36 used as a probe for the isolation of yeast promoters. This construction is carried out by ligation of a fragment coming from the plasmid pJDB207 containing in particular the marker gene LEU2 and the origin of replication of the yeast plasmid 2-microns with a fragment coming from the plasmid pGL400 containing the gene lacZ coding for � -galactosidase from Escherichia coli. FIG. 2 represents the construction of the plasmid YEpZ415 carrying the basic promoter of the present invention (p415), by ligation of four fragments originating from the plasmids YEpZ36, YEpZ414 and pJDB207.
FIG. 3 shows the sequence of the p415 promoter comprising the yeast sequence between the EcoRI site and the MboI site and where the different elements found in other strong yeast promoters are recognized: the TATA box, the CT block followed just by the CAAGC sequence.
FIG. 4 and FIG. 5 respectively represent the construction of the plasmids YEpZIOO and pJ04 used themselves, as shown in FIG. 6, for the construction of the plasmid YEpZlOl comprising a variant of the p415 promoter associated with a HindIII-BamHI fragment .
FIG. 7 represents the construction, starting from the plasmids YEpZlOO and YEpZlOl, of plasmids YEpZlOlà comprising different variants of the p415 promoter obtained by deletions carried out with the enzyme Ba131. The variants thus obtained
(p415 A 2, p415 � 4, and p415û.5) are given in FIG. 8.
FIG. 9 represents the construction of the plysA29 vectors,
<EMI ID = 2.1> plysA.9, pKOl and pJDB20 7.
FIG. 10 shows that cell extracts of yeast trans-
<EMI ID = 3.1>
lyse E. coli cells treated with EDTA to make them sensitive to the action of lysozyme.
FIG. 11 represents the construction of the plasmid YEpB2 by ligation of the fragments obtained by the action of the restriction enzyme PstI on the plasmid pBR322 and on the endogenous plasmid 2-microns of yeast.
FIG. 12 represents the construction of the expression vector plys50 by unequivocal ligation of five purified fragments obtained
<EMI ID = 4.1>
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Principle of the method used to isolate the basic promoter
The isolation of the basic promoter of the present invention, called p415 below, uses methods already known. It is based on observation (L. Guarente, Meth.Enzymol.
<EMI ID = 5.1>
that the lacZ gene coding for Escherichia coli P-galactosidase can, under certain conditions, be expressed by the yeast Saccharomyces cerevisiae and that this expression can be demonstrated by the blue color of the yeast colonies cultivated on a medium containing l chromogenic indicator X-gal. This blue color is due to the hydrolytic cleavage of the indica-
<EMI ID = 6.1>
the amount of enzyme synthesized. It follows that the intensity of the blue coloration of the colony depends on the eff-
<EMI ID = 7.1>
turn depends, among other things, on the strength of the yeast promoter used. Therefore, among the promoters selected, the strongest should give the blue color most quickly and this can be verified by enzymatic assay of the activity.
<EMI ID = 8.1>
Construction of a probe for the isolation of yeast promoters.
The first condition for the isolation of yeast promoters according to the previous method is to have a vector capable of replication and selection in yeast, which contains the lacZ gene of E. coli but which cannot express it for lack of suitable promoter. Such a vector must also meet the following conditions. It must be able to replicate in yeast by the presence of a sequence recognized by the yeast replication machinery; it must be able to be subject to selection and to remain in yeast thanks to the presence of a marker gene. It must potentially be able to express the lacZ gene in yeast when provided with an appropriate promoter.
It must have a unique restriction site upstream of this gene so that it is possible to insert small fragments of yeast DNA which may contain a promoter.
The construction of such a plasmid is shown in FIG.l. It was obtained by combining, according to conventional techniques, two plasmids described in the scientific literature: pJDB207 (J.D. Beggs et al., Nature 283,
1980, 835) and pLG400 (L. Guarente et al., Cell 20, 1980,
543-). The plasmid YEpZ36 thus obtained is capable of replicating in S.cerevisiae thanks to the origin of replication of the endogenous 2-micron plasmid provided by pJDB207. From it, it also has the LEU2 marker gene allowing its selection and maintenance in a yeast having a leu2 mutation. It has a unique BamHI site into which small fragments generated by the action of the restriction enzyme MboI can be inserted.
Construction of the plasmid YEpZ415 carrying the p415 promoter
The isolation of the promoter of the present invention using the probe constructed above was carried out as follows.
Fragments obtained by partial digestion with the restriction enzyme MboI of total yeast DNA
<EMI ID = 9.1> were inserted into the BamHI site of the plasmid YEpZ36 described above and the DNA thus recombined was used to transform a leu2- strain of the yeast S.cerevisiae GRF18. The transformed colonies were then tested on X-gal medium for their ability to produce & -galactosidase. Several clones were found to be positive by transfer to X-gal medium and
<EMI ID = 10.1>
sidasique, proved to be the most active was selected for the isolation of the promoter of the invention.
After isolation of the plasmid DNA of this clone, by transfer into E.coli, it was possible to demonstrate the presence of a Mbol insert of 980 bp with an EcoRI site at 630 bp in
<EMI ID = 11.1>
that the promoter ensuring the transcription thereof is associated with this fragment of 630 bp because the replacement of the 350 bp preceding the EcoRI site has been shown to have no effect on the activity
<EMI ID = 12.1>
the deletion of the 350 bp fragment is detailed in FIG. 2 where the initial fragment of 980 bp is designated by p414. The nucleotide sequence of the 630 bp fragment with the start of the lacZ gene from E. coli was determined by the method of AMMaxam & W. Gilbert (Proc.Acad.Sci.USA 74,1977,560; Methods Enzymol.65, 1980, 499) and is shown in FIG. 3. It can be seen that two ATG codons for initiating translation are present at positions 558 and 732 in the correct reading phase. However, it was possible to show by subcloning experiments that only the ATG closest to the lacZ gene, at position 732, was functional. It is interesting to note that this ATG is not the gene initiation codon <EMI ID = 13.1>
For the sake of clarity, the fragment between the EcoRI and PvuII sites and comprising the latter ATG will be referred to below.
<EMI ID = 14.1> Arrangement of the p415 promoter to make it easily usable.
To facilitate the use of the p415 promoter as it was isolated above, it is lined at each of its ends with unique restriction sites and in common use, so that it can be transferred from a plasmid to the other, to the best of the intended application, and also so as to facilitate the insertion into these plasmids, downstream of the promoter, of foreign genes whose expression is desired.
In the examples which follow, a construction is described in detail leading to the plasmid YEpZIOl where the promoter of the present invention is associated with a HindIII fragment
(upstream) and BamHI (downstream), the latter being able to be used for the introduction of foreign genes as also described in the examples. It is obvious, however, that other constructions which result in lining the ends of the p415 promoter with other restriction sites such as EcoRI, ClaI, HindIII, SphI, SalI, SacI, PstI, XbaI, XhoI are also possible and that the different variants thus obtained of this promoter also form part of the present invention.
Variants of p415 promoter obtained by deletion.
Other variants of the p415 promoter obtained by various deletions can also bring interesting practical advantages. In fact, the promoter p415 as it is found included in the plasmid YEpZIOl is advantageous for the expression of a gene, such as the lacZ gene of pMC1587 or of YEpZ100 (FIG. 4), lacking an ATG initiation codon because this is provided by the promoter himself, just upstream from the BamHI site. However, in the case of a gene which already has its own start codon, the promoter p415 of the plasmid YEpZIOl may not be suitable as it is. We indeed know that in eukaryotes, including yeast, it is the first codon of initiation of the messenger RNA corresponding to the gene which is normally used.
Therefore, the introduction of a second ATG codon would have two effects depending on whether or not it is in phase with the promoter's ATG codon. In the latter case, a polypeptide totally different from that encoded by the gene would be produced; in the first, the amino acids corresponding to the codons located between the two ATGs would be added to the amino terminal end of the expected polypeptide. We would thus obtain a possibly active product but nevertheless different from that normally encoded by the gene, which is disadvantageous since, in most applications of genetic engineering, we seek to obtain substitutes as close as possible to natural products.
This situation is particularly disadvantageous when it is further sought, as will be seen in the examples, to take advantage of the signal sequence of a natural product to ensure its excretion by the transformed yeast cell.
For these different reasons, it was necessary to have variants of the p415 promoter which did not include the ATG initiation codon but where the restriction site installed immediately downstream would be preserved. In the examples which follow, such deletions operated on the plasmid YEpZIO1 from the BamHI site are described. Several variants of the p415 promoter comprising a BamHI site were thus obtained.
<EMI ID = 15.1>
and p415 A 5. It goes without saying that the possibilities of replacing the BamHI and HindIII ends in these variants with other restriction sites exist as much as in the case of the starting p415 promoter.
<EMI ID = 16.1>
particularly effective for the expression in yeast of the hen lysozyme gene. This result, surprising in itself in the current state of knowledge of the transcription and translation processes in yeast, demonstrates that other modifications of the p415 promoter, obtained by the same technique or any other method in vitro or in vivo, are likely to provide improvements over the results described in this patent. It is obvious that the �
various variants thus obtained should be considered as part of the present invention.
Yeast transformations by vector plasmids comprising: both the promoter p415 and its variants
As those skilled in the art readily realize, the promoters in accordance with the present invention can be used for the expression in yeast of foreign genes only if they are suitably associated with the gene to be expressed in a vector plasmid capable of replicate in as many copies as possible. This vector must therefore have an origin of replication recognized by the host cell. It must also contain a marker gene allowing the visualization and selection of the cells which have actually been transformed by the plasmid.
A large number of expression vectors comprising these various elements have been constructed, especially for the transformation of yeasts of the species Saccharomyces cerevisiae. They generally comprise the origin of replication of the 2-micron plasmid present in most strains of this species or an ARS autonomous replication segment of chromosomal origin.
As a marker gene, a gene coding for an enzyme involved in the biosynthesis of an essential metabolite, for example an amino acid, is generally used. In this case, a yeast strain which has become an auxotrophic mutation for this metabolite is used as the host cell. . By cultivating this strain on a medium free from the metabolite in question, only cells transformed by a plasmid carrying the missing gene can grow. The LEU2 or TRP1 genes coding respectively for an enzyme involved in the biosynthesis of leucine and tryptophan are typical examples of such markers.
These expression vectors must also include one or preferably several restriction sites in which to insert the coding part of interest as well as the various elements necessary for optimizing its expression: pro-motors, terminators and other control elements.
Often, these plasmids also contain bacterial sequences capable of ensuring their replication and their selection in an intermediate bacterial host, for example Escherichia coli. As conventional examples of such shuttle plasmids, mention may be made of YEpl3 (J.R.Broach et al.,
<EMI ID = 17.1>
1980, 11) and pJDB207 (J.D. Beggs, Alfred Benson Symposium N [deg.] 16, Munksgaard, Copenhaegen 1981, pp.383):
According to a preferred embodiment of the invention, mainly when the host cell belongs to the species Saccharomyces cerevisiae, a plasmid using at least the REP functions of the sequence of the endogenous 2-micron plasmid is used. These generally provide the plasmid with greater stability, especially if the host cell has previously been cleaned of its 2-micron plasmids (CPHollenberg, Curr.Top. Microbiol.Immunol. 96, 1982, 119) RMWalmsley and al., Mol.Gen.Genet. 1983, 261). Typical examples of such vectors are the plasmids pJDB219 and pJDB248 (J.D. Beggs, Nature 275, 1978, 104). Another vector of this type is described in the examples which follow.
These different plasmids can be used as vectors to ensure the expression in yeast of heterologous genes suitably positioned upstream of the promoters of the present invention. Examples of particular constructions are given by way of illustration in this patent, but it is obvious that there are many other possibilities and that various combinations of origins of replication, marker genes and other structural elements can be implemented to achieve similar results. The different expression vectors which can thus be constructed to express heterologous genes by means of the promoters of the present invention must be considered to be part of the latter.
The transformed cells obtained in these different cases also form part of the invention. Although most of the techniques developed to transform yeast cells have mainly been applied to the species S. cerevisiae, cells obtained by transformation of other yeast species and genera using expression vectors of the type those indicated above are also included in the invention. As examples of other yeasts, mention may be made of Saccharomycopsis lipolytica, Schizosaccharomyces Pombe, Kluyveromyçes lactis, etc. However, according to a preferred embodiment of the invention, transformable yeasts of the genus Saccharomyces will be used as host cells and, preferably, those belonging to the species S. cerevisiae. As examples
of transformable strains belonging to this species, there may be mentioned AH22 and GRF18, among many others.
Production of polypeptides by transformed yeasts
The DNA fragments which can be expressed in yeast in accordance with the present invention can be of various origins. They can be prokaryotic genes, as is the case for the 13-galactosidase gene from E. coli, the expression of which is described in one of the examples which follows. It can also be a eukaryotic gene insofar as it does not contain introns since the yeast is not capable of ensuring the maturation of messenger RNAs originating from the transcription of fragmented genes (JDBeggs et al. Nature 283, 1980, 835). In this case, however, recourse can be had to the expression of the corresponding cDNA, as described below in another example illustrating the expression in yeast of hen lysozyme.
Many other genes can be expressed in the same way, whether they are of bacterial, plant, animal or human origin. It goes without saying that the new polypeptides which would thus be expressed are themselves part of the present invention.
When, in accordance with the present invention, a yeast strain has been induced to produce one or other of these polypeptides, it is necessary, in order to take advantage of this new property, to multiply it under the conditions most favorable to his growth. Those skilled in the art will readily be able to determine these conditions, taking into account the characteristics specific to the yeast strain used as host. As in most cases, transformed yeasts more or less tend to lose artificially constructed plasmids, it will be advantageous to compose the culture medium so as to exert on them a positive selection pressure. When the strain is an auxotrophic mutant for one
or the other essential metabolite and that the vector plasmid used contains a marker gene capable of restoring the prototrophy of the strain, for example the LEU2 genes or
TRP1 which we mentioned above, we can exert this selection pressure by omitting the metabolite in question from the culture medium. If, on the contrary, the plasmid comprises as marker a gene capable of conferring on the yeast a more or less marked resistance to a growth inhibitor, for example an antibiotic such as G418 (J. Jimenez and J. Davies, Nature 287, 1980 , 869) or a herbicide such as diuron (Luxembourg patent n [deg.] 899,607 filed in
name of the plaintiff}, we can exert the selection pressure in favor of the transformed yeast by cultivating it in a medium supplemented with this inhibitor. Other means exist to achieve the same result and can also be used to practice the present invention.
When the transformed yeasts have been cultivated under the conditions ensuring the best production of the polypeptide of interest, it will still have to be recovered. There are many techniques for this that the man of
the art may combine in each particular case to obtain the best recovery rate and the highest purity of the polypeptide sought. However, according to a preferred embodiment of the invention, the gene expressed by the intervention of the p415 promoter or one of its variants will preferably be equipped with a leader sequence coding for a signal peptide capable of ensuring the transport of the product. of the gene across the plasma membrane of the transformed cell. In this case, in fact, the operations of separation of the polypeptide formed will be considerably facilitated, whether the latter is released in the medium from which it can be recovered by conventional methods, in particular by adsorption and / or precipitation, or that 'it remains associated with the yeast wall from where it must be detached by other methods.
The various aspects of the present invention will appear more specifically in the following examples which are given purely by way of illustration.
EXAMPLES
1. Expression in S. cerevisiae of E. coli-galactosidase
by the plasmid YEpZ415.
The plasmid YEpZ415, the construction of which served to isolate the p415 promoter of the present invention, as described above, was used for trans-
<EMI ID = 18.1>
these clones were measured on cellular extracts by the method of J. Miller (Experiments in Molecular Genetics,
<EMI ID = 19.1>
protein content of the extracts was further determined by the method of M.M.Bradford (Anal.Biochem. 72,
1976.1948). We were able to show that this specific activity
<EMI ID = 20.1>
corresponds to 2.57% of the total proteins of the extract.
2. Expression in S.cerevisiae of the gal-galactosidase gene
of E. coli by the plasmid YEpZ101.
In this example, the p415 promoter of the present invention was flanked by two restriction sites constantly used in genetic engineering (HindIII and BamHI) and. used in this form to express the lacZ gene of E. coli in a plasmid called YEpZ101. This operation was carried out in several stages which required the construction of two intermediate plasmids: YEpZIOO and pJ04.
2.1 YEpZIOO (FIG.4) was built from pMC1587
(M.J. Casadaban et al., Methods in Enzymology 100, 1983,
293;) and YEpZ415, the advantages of which it combines:
it has the start of the lacZ gene as well as the EcoRI, SmaI and BamHI restriction site group of pMC1587; it has the end of the lacZ gene of YEpZ415, which leads to the elimination of the lacY and lacA genes of pMC1587 which would unnecessarily increase the size of the plasmid; it also has the advantage of retaining the high copy number specific to plasmids derived, such as YEpZ415, from pJDB207 (E.Erhart & C.P. Hollenberg, J.
<EMI ID = 21.1>
2.2 pJ04 (FIG.5) was constructed by introducing the RsaI-PvuII fragment of the p415 promoter (FIG.3) into the site
<EMI ID = 22.1>
is threefold:
i the ATG initiation codon immediately upstream of the
PvuII site is retained;
ii the PvuII site of p415 and the SmaI site of pMC1587
are destroyed;
iii a BamHI site is introduced immediately downstream
of the initiating ATG codon. This site is often used for the cloning of foreign genes.
2.3 YEpZIOl was then constructed by combining DNA fragments from three plasmids described above, by a process involving three ligation events (FIG.6). In this construct, the lacZ gene, the amp gene, the origin of replication in E.coli, the LEU2 gene and the origin of replication in S.cerevisiae (from the 2-micron plasmid) all derive from YEpZlOO. The p415 promoter is reconstituted therein intact from two parts: the 5 ′ terminal half from the HindIII-ClaI fragment of YEpZ415 and the 3 ′ proximal half from the ClaI-BamHI fragment from pJ04. The net result of these operations is that the p415 promoter is now linked by a single HindIII site (upstream) and a single BamHI site (downstream), the latter being able to be used for the introduction of foreign genes as described below.
2.4 The plasmid YEpZlOl constructed as described above was used to transform the yeast. By operating as described in the previous example, a specific activity identical to that conferred by the plasmid YEpZ415 was obtained for ide-galactosidase.
<EMI ID = 23.1>
dried today in the name of the applicant and entitled: "Transformed yeasts producing lysozyme, plasmids used for this transformation and their uses". It was still necessary to appropriately combine this cDNA with a yeast promoter as described in the example above.
<EMI ID = 24.1>
for the reasons given above, the fact that the cDNA had its own ATG initiation codon prevented the use for this construction of a plasmid such as YEpZIOl constructed with the p415 promoter itself comprising an ATG codon. It was therefore necessary to use a variant of this plasmid from which the ATG in question had been eliminated.
3.1 A series of deletions were made with the enzyme
Bal31 from the BamHI site of YEpZIOl, one way and counterclockwise. The plasmids thus shortened were then cleaved at the unique PstI site and the fragments between the PstI site and the end digested with BAL31 were inserted between the PstI and SmaI sites of the plasmid YEpZlOO (FIG. 7). The consequence of this operation
<EMI ID = 25.1>
i the ATG initiation codon immediately upstream of the
BamHI site of YEpZlOl is destroyed;
ii the BamHI site is also destroyed but it is
restored by the fusion of the end affected by
<EMI ID = 26.1>
in the plasmid YepZlOO.
The deletions thus carried out made it possible to obtain the
<EMI ID = 27.1>
3.2 It was still necessary to associate, by appropriate construction, the promoters thus obtained with the cDNA of <EMI ID = 28.1>
promoter p415A2, this construction was carried out by simultaneous ligation of the following five fragments:
(a) a HindIII-BamHI fragment from the plasmid
<EMI ID = 29.1>
(b) a SphI-BamHI fragment originating from p Alys9 and comprising the complete lysozyme cDNA.
(c) an EcoRI-SphI fragment originating from the plasmid pKOl
(K. McKenney et al., In Gene A. amplification and Analysis, Ed. JG Chirikjan & T. Pinas, Elsevier / North Holland, New York, 1981 p.383) to serve as a junction between fragment (b) and the fragment (d) below;
(d) a PstI-EcoRI fragment from the plasmid
YEpZ415 comprising the origin of replication and half of the β-lactamase gene from pBR322; and
(e) a HindIII-PstI fragment from pJDB207 comprising the 2-micron-LEU2 segment and the other half of the � -lactamase.
Before ligation, these different fragments had been purified and as they have sticky ends which are different and complementary to each other, a single viable plasmid could result from the operation:
plys A 29 (FIG. 9) ..
By proceeding in the same way with two other fragments
<EMI ID = 30.1>
These three plasmids therefore differ only in that the promoter is positioned there at various distances from the lysozyme cDNA, which, at the level of transcription, must result in different distances between the start (the end 5 ′) of the corresponding messenger RNAs and the natural AUG site from which they are translated.
3.3 The plasmids constructed as described above then have
were used for a transformation of the GRF18 strain of the yeast S.cerevisiae followed by a selection of the prototrophic clones for leucine (Leu +). These were then ground with glass beads and the ground material obtained was clarified by centrifugation. The lysozymic activity of these was tested by measuring the decrease in the optical density of an E.coli suspension by the method
<EMI ID = 31.1> Figure 10, the initial OD650 values were identical for each clone (0.7) but, for clarity, they have been shifted on the diagram. The results of FIG. 10 <EMI ID = 32.1>
significantly less in cells transformed with the plasmid plysD59. Similar results were obtained with a method where the cells used as an indicator of the action of lysozyme are those of the bacterium Micrococcus lysodeikticus (G. Alderton, J. Biol. Chem. 157, 1945, 43).
In another type of test, lysozyme could be put
in evidence around transformed colonies growing on a Petri dish covered with a M.lysodeikticus carpet. In this case, the expression was visualized by a transparent halo of bacteria lysed around the colonies. In agreement with the results obtained from cell-free ground materials, the lysis halo was most marked in the case of the clone plusA49, confirming that it is indeed the best producer of lysozyme. This result also shows that lysozyme is exported from the yeast cell since it must necessarily be extra-cellular in order to lyse the bacterial indicator.
FIG. 10 also shows that by operating in the same way
<EMI ID = 33.1>
could not be observed. We see that it is not enough that the sequences responsible for the promoter function are present upstream of the gene to be expressed; still it is necessary that they are properly positioned in relation to it.
4. Expression in S.cerevisiae of hen lysozyme by the
plys50 vector.
4.1 The vector pJDB207 on which the vectors are based <EMI ID = 34.1>
above does not contain the entire 2-micron plasmid of yeast and therefore depends on the presence of it (which is found in most strains of S. cerevisiae) to maintain itself in the transformed cell. This leads to an unstable situation such that plasmids of the pJDB207 type are frequently lost by the cell (E.Erhaert & C.P. Hollenberg, J. Bacteriol. 156, 1983, 625; M.Jarayam et al., Cell 34,
1983, 95). On the contrary, the natural 2-micron plasmid is maintained and transmitted stably. We also know that plasmids constructed so that they contain all of the 2-micron plasmid, for example the plasmid pJDB219, are maintained much more stable than those of the pJDB207 type.
(C.P. Hollenberg, Curr.Top.Microbiol.Immunol. 96, 1982,
119; R.M. Walmsley et al., Mol.Gen.Genet. 1983, 361).
These plasmids are therefore more advantageous for long-term cultures, in particular in industrial fermentations.
To construct such a vector based on the complete 2-micron, we started from the plasmid YEpB2 (FIG. 11) previously obtained by opening the entire 2-micron plasmid at its unique PstI site and cloning of the fragment obtained in the PstI site, also single, from pBR322. Two fragments produced from YEpB2 and two others from plys A49 were then combined to give the plasmid plys50 (FIG.12). In it, the three genes A, B and C of 2-microns are intact and the expression of the part coding for lysozyme is ensured there.
<EMI ID = 35.1>
plysA49 described in the previous example.
4.2 After transformation of the GRF18 (.Leu-, His-) strain of
S.cerevisiae by the plasmids plys50 and JDB207, the transformed cells obtained in the two cases were separately cultured in a minimum medium supplemented with histidine (0.002%). When the cultures have reached the stationary phase (optical density:
about 5), the cells were separated by centrifugation, resuspended in 0.1 M phosphate buffer pH7 and ground using glass beads.
The lysozymic activity of these shreds was determined by their capacity to lyse the cells of M.lysodeikticus, according to the method of D. Shugar
<EMI ID = 36.1>
No activity was detected in the ground material of the strain transformed by the plasmid pJDB207 while in that of the strain GRF18 (plys50) a lysozymic activity of 35 units / ml of culture could be demonstrated. By assaying the proteins of the ground material by the method of D. Herbert et al. (Methods in Microbiol. 5B,
1971, 209) modified according to C.Wang and R.L. Smith (Anal.
Biochem. 63, 1975, 414) and taking into account the specific activity of the purified commercial lysozyme (Boehringer Mannheim), it has been possible to deduce that the lysozyme produced by the yeast under these conditions represents approximately 0.8% of the soluble proteins of the yeast.
<EMI ID = 37.1>
(plys50) at the Centraal Bureau voor Schimmelcultures, 0osterstraat, 1, Baarn, Netherlands (Laboratorium voor Microbiologie, Technisch Hoogeschool Delft, Netherlands) on December 5, 1984. �
CLAIMS
1) Promoters capable of ensuring expression in yeast
genes coding for generally heterologous polypeptides, characterized in that they consist of a DNA fragment between an EcoRI site and a PvuII site and whose nucleotide sequence is as follows:
<EMI ID = 38.1>
as well as their mutants and sub-fragments having retained
the function of promoter.