LEVURES TRANSFORMEES PRODUISANT DU LYSOZYME, PLASMIDES UTILISESPOUR CETTE TRANSFORMATION, ET LEURS UTILISATIONS.
LEVURES TRANSFORMEES PRODUISANT DU LYSOZYME,PLASMIDES UTILISES POUR CETTE TRANSFORMATION,
ET LEURS UTILISATIONS.
La présente invention se rapporte à des levures renques capables,par transformation avec de l'ADN d'origine étrangère, de produire des enzymes du type 1,4-�N-acétylmuramidase.
On sait que les 1,4-p-N-acétylmuramidases sont des enzymes capables de cliver spécifiquement le lien glycosidique qui relie la N-acétylglucosamine à l'acide N-acétylmuramique qui interviennent dans la constitution des peptidoglycanes formant la paroi cellulaire des bactéries. Il en résulte une lyse de celle-ci, ce qui entraîne la mort des cellules. Ces enzymes, plus communément appelées lysozymes, agissent donc comme des bactéricides et il est admis que c'est cette propriété qui explique leur présence généralisée dans la plupart des fluides biologiques des animaux supérieurs. On en trouve en effet, en concentrations variées, dans le sang, les larmes, la salive, le lait, etc... des mammifères. On en trouve également dans le règne végétal, notamment dans le fruit du papayer.
Cependant, c'est du blanc d'oeuf de poule, où il se trouve en quantité relativement importante, que le lysozyme est extrait à l'échelle industrielle par différents procédés d'adsorption et/ ou de précipitation (brevet belge n[deg.] 694.538, 1967).
Les applications actuelles du lysozyme de poule se situent pour une bonne part dans le domaine pharmaceutique où on l'utilise pour lutter contre diverses infections. D'autres applications se situent dans le domaine alimentaire. On sait,par exemple, que le lysozyme peut être utilisé efficacement dans la fabrication des fromages à pâte pressée, cuite, pour empêcher le développement au cours de la maturation de ferments butyriques responsables de défauts de fabrication pouvant aller jusqu'à l'éclatement des meules (brevet français n[deg.] 80 03321,
1981). On peut l'utiliser également pour la préservation de divers aliments périssables, en particulier ceux à base de viande (A.Akashi, Jap.J.Zootechnical Sci. 42, 1971, 289).,
ou des vins (brevet japonais 3115/71,1971) ou du Sake(M.Yajima et al., J.Ferm.Technol.46, 1968, 782). On peut l'employer aussi pour la maternisation du lait de vache (brevet japonais n[deg.] 16780/70, 1970), etc...
Ces différentes applications représentent un marché potentiel considérable dans la mesure où le lysozyme peut être produit aisément, en quantité importante et avec un prix de revient suffisamment faible. Actuellement, les différents procédés permettant de l'extraire du blanc d'oeuf ne sont commercialement acceptables que dans la mesure où celui-ci peut être réutilisé dans l'alimentation après traitement. La capacité de production du lysozyme se trouve donc pour une part conditionnée par le marché du blanc d'oeuf, ce qui pose un problème d'autant plus difficile à résoudre que l'écoulement dans les aliments standardisés du blanc d'oeuf traité se heurte à des difficultés techniques et même, dans certains pays, à des obstacles législatifs.
Ces problèmes liés à la disponibilité des sources naturelles du lysozyme deviennent insurmontables lorsqu'il s'agit de lysozymes de mammifères, soit que leur concentration de départ soit trop faible, comme c'est le cas pour le lysozyme présent dans le lait de vache, soit que la disponibilité de la matière première soit pratiquement nulle comme c'est le cas pour le lysozyme humain. On voit donc qu'il est nécessaire de pouvoir disposer d'une technique permettant de produire du lysozyme en évitant les problèmes mentionnés ci-dessus.
L'objet principal de la présente invention est de fournir des levures rendues capables de produire du lysozyme par les techniques classiques du génie génétique. De manière plus spécifique, il s'agit de levures transformées de manière telle que leur ADN comprenne au moins une copie d'un fragment codant
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trouve exprimé sous forme de la protéine active correspondante. C'est un autre objet de l'invention de fournir des levures ainsi transformées mais également capables d'excréter le lysozyme qu'elles produisent de manière à faciliter la séparation et la purification de celui-ci. Les plasmides permettant d'assurer cette transformation constituent également un objet de l'invention, de même que le procédé permettant de produire du lysozyme par culture des levures ainsi transformées. Ces objets ainsi que d'autres implications et avantages de la présente invention apparaissent plus clairement dans la description détaillée que voici.
Il est connu de reprogrammer génétiquement des levures en les transformant avec un fragment d'ADN porteur d'une partie codante constituée par un gène hétérologue ou par le produit de la transcription inverse de l'ARN messager correspondant. Pour cela, on utilise en général comme vecteurs du fragment en question des plasmides capables de se répliquer de manière autonome dans la cellule de levure grâce à la présence d'une origine de réplication reconnue par la machinerie de réplication de la cellule hôte. Le vecteur doit également comporter un gène marqueur permettant la visualisation et la sélection des cellules qui ont effectivement été transformées
par le plasmide. Enfin, la partie codante doit être précédée d'un promoteur,c'est-à-dire une séquence reconnue par l'ARN polymérase de la cellule hôte de manière à assurer de façon efficace la transcription de la partie codante en ARN messager correspondant.
En pratique, ces techniques ont été surtout appliquées aux levures de l'espèce Saccharomyces cerevisiae pour laquelle un grand nombre de vecteurs d'expression comportant ces diffé- rents éléments ont été construits. Ceux-ci comportent en général l'origine de réplication du plasmide 2-microns présent dans la plupart des souches de cette espèce ou encore un segment de réplication autonome ARS d'origine chromosomique. Comme gène marqueur, on utilise en général un gène codant pour une enzyme intervenant dans la biosynthèse d'un métabolite essentiel, par exemple un acide aminé. Dans ce cas, on utilise comme cellule hôte une souche de levure devenue.,.par mutation,auxotrophe pour ce métabolite.
En cultivant cette souche sur un milieu exempt du métabolite en question, seules pourront se développer les cellules transformées par un plasmide porteur du gène manquant. Les gènes LEU2 ou TRP1 codant respectivement pour une enzyme intervenant dans la biosynthèse de la leucine et du tryptophane sont des exemples types de tels marqueurs. Ces vecteurs d'expression doivent également comporter ou ou de préférence plusieurs sites de restriction où insérer la partie codante intéressante ainsi que les différents éléments nécessaires à l'optimalisation de son expression : promoteurs, terminateurs, et autres éléments de contrôle.
Souvent ces plasmides comportent en outre des séquences bactériennes capables d'assurer leur réplication et leur sélection chez un hôte bactérien intermédiaire, par exemple Escherichia coli. Comme exemples classiques de tels plasmides navettes, on peut citer YEpl3 (J.R.Broach et al. Gene 8,1979,
121),pFLl-4(M.R.Chevallier et al., Gène 11 , 1980,ll),pJDB207(J.D. Beggs,
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pMHl58 et pJO158 (M.Heusterspreute et al., Gene, sous presse).
Selon un mode préféré de l'invention, principalement lorsque la cellule hôte appartient à l'espèce S.cerevisiae, on utilise un plasmide comportant au moins les fonctions
REP de la séquence du plasmide endogène 2-microns. Cellesci apportent en général au plasmide une plus grande stabilité, spécialement si la cellule hôte a été au préalable curée de ses plasmides 2-microns (C.P. Hollenberg, Curr.Top. Microbiol.Immunol. 96, 1982, 119; R.M.Walmsley et al.,Mol.Gen. Genet. 1983, 361). Des exemples classiques de tels vecteurs sont les plasmides pJDB219 et pJDB248 (J.D.Beggs, Nature 275,
1978, 104). Un autre vecteur de ce type est décrit dans les exemples qui suivent.
Enfin, pour assurer à la partie codante intéressante un niveau d'expression aussi élevé que possible, il est nécessaire de lui associer un promoteur aussi efficace que possible.Divers promoteurs forts sont connus chez la levure, notammant le promoteur de l'alcool déshydrogénase (ADHl),de l'énolase (EN08 et EN046), de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase
(GAP63 et GAP491), de la phosphoglycérate kinase (PGK)
(M.J.Dobson et al., Nucleic Acids Res.10, 1982, 2625), de la phosphatase alcaline (PH03 et PH05) (Brevet européen 0100561, Al, 1984) ou encore le promoteur _p.415 dont il sera question plus loin.
Ces différentes techniques qui ont été appliquées avec succès au clônage et à l'expression de nombreux gènes hétérologues dans la levure peuvent être évidemment mises à profit pour assurer l'expression dans celle-ci de gènes de lysozymes
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midase. Des exemples de constructions particulières sont donnés à titre d'illustration dans le présent brevet mais il est évident qu'il existe beaucoup d'autres possibilités et que diverses combinaisons d'origines de réplication, de gènes marqueurs, de promoteurs efficaces et d'autres éléments de structure peuvent être mises en oeuvre pour arriver à des résultats similaires. Les cellules transformées obtenues dans ces différents cas doivent dès lors être considérées comme comprises dans le domaine de la présente invention.
De même, bien que la plupart de ces techniques aient été surtout appliquées à la transformation de la levure
S. cerevisiae, les cellules transformées obtenues au départ d'autres espèces et genres de levures susceptibles d'être transformées par des vecteurs d'expression du type de ceux renseignés ci-dessus et de leurs variantes font également partie de la présente invention. Comme exemple d'autres le- vures, on peut citer Saccharomycopsis lipolytica,Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, etc... Toutefois, selon un mode préféré de l'invention, on utilisera comme cellules hôtes des levures transformables du genre Saccharomyces et de préférence celles appartenant à l'espèce S.cerevisiae. Comme exemples de souches transformables appartenant à cette espèce, on peut citer AH22 et GRF18 parmi bien d'autres.
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rentes sortes de levures conformément à la présente invention peuvent avoir des origines diverses. Il peut s'agir, par exemple, du lysozyme de poule qui, comme on l'a dit ci-dessus, est déjà produit industriellement. Cependant, il est évident que des parties d'ADN codant pour des lysozymes d'autres sources peuvent être exprimées de la même façon dans la levure, ceci d'autant plus que ces différents lysozymes présentent entre
eux, à des degrés divers,des homologies très marquées
(P.Jollès et al., Mol.&Cell.Biochemistry 63,1984, 165). On peut par exemple exprimer dans la levure le lysozyme d'oie dont l'activité spécifique est nettement plus élevée que celle du lysozyme de poule (R.C.Canfield et al.,in Lysozyme, Ed.E.F. Osserman et al., Académie Press 1974,p.63). Il en va de même pour le lysozyme humain, également très actif et particulièrement indiqué pour les usages pharmaceutiques ainsi que pour la formulation des laits maternisés. On peut citer encore le lysozyme de papaye ou celui codé par les virus bactériens.
Lorsque, conformément à la présente invention, une souche de levure a été amenée par manipulation génétique à produire du lysozyme de l'une ou l'autre origine, il est nécessaire, pour tirer parti de cette propriété nouvelle, de la multiplier par fermentation dans les conditions les plus favorables à sa croissance. On obtient ainsi une biomasse qui, telle quelle, peut trouver des applications dans l'alimentation animale ou humaine. On sait, par exemple, que les autolysats de levure sont de plus en plus utilisés comme additifs dans divers aliments (pâtés de viande, soupes, sauces, etc..), non seulement en raison de leur valeur alimentaire propre,mais ) aussi de leurs propriétés organoleptiques.
La présence de lysozyme dans les levures de départ présente l'avantage de préserver dans une certaine mesure les autolysats de la contamination bactérienne dont ils sont facilement l'objet ainsi que les produits alimentaires auxquels ils sont incorporés. On sait d'autre part que la présence de lysozyme permet de réduire la température de stérilisation des aliments (brevet britannique
n[deg.] 1.438.560, 1976).
D'autre part, les levures conformes à la présente invention peuvent être également utilisées comme source de lysozyme purifié, par séparation de celui-ci d'avec la levure ellemême. Il est clair cependant que cette opération peut présen� ter des difficultés considérables si le lysozyme se trouve associé, à l'intérieur de la cellule, aux autres protéines de celle-ci. C'est donc un aspect important de la présente invention de fournir des levures capables d'excréter-le lysozyme qu'elles produisent, que celui-ci se trouve libéré dans le milieu de culture d'où il pourra être récupéré par des méthodes
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vet belge n[deg.] 694.538, 1967), ou qu'il reste associé à la paroi de la levure d'où il devra être détaché par d'autres méthodes. De fait, nous avons constaté, et ceci constitue en soi un fait surprenant, que la séquence signal de 18 acides aminés présente à l'extrémité N-terminale du prélysozyme et qui permet la sécrétion de la protéine dans le lumen du réticulum endoplasmique des cellules de l'oviducte de poule est également reconnue par les cellules de levure. Les exemples qui suivent montrent en effet que lorsque l'ADN codant pour le prélysozyme de poule est exprimé dans la levure, le produit de cette expression est excrété par celle-ci.
Il en résulte qu'il suffit de fusionner le fragment de 54 nucléotides codant pour cette séquence signal avec l'ADN codant pour la partie structurale d'autres protéines, en particulier le lysozyme d'autres origines, pour que cellesci, une fois produites dans la levure, soient également excrétées.
Mais l'aspect le plus fondamental et le plus inattendu / de la présente invention est le fait qu'un gène de lysozyme puisse être exprimé dans la levure sans y exercer d'effet léthal, notamment par lyse des cellules. Le seul exemple connu de clonage et d'expression d'un gène de lysozyme dans une cellule hétérologue est celui du gène de lysozyme de poule dans des lignées de cellules humaines Hela et MCF-7 (P.D.Matthias et al., The EMBO J. 1, 1982, 1207), encore que l'expression du gène
n'y ait été mise en évidence que par la production de l'ARN messager correspondant et non de la protéine elle-même. Aucun exemple d'expression d'un gène de lysozyme dans une bactérie
n'a été rapporté à ce jour, ce qui peut s'expliquer par le fait que le lysozyme produit par la bactérie devrait normalement provoquer la lyse de celle-ci. Or, il est connu que le lysozyme est capable également d'attaquer la paroi des cellules de levure, principalement par hydrolyse de sa composante chitinique (G.N. Maksimova et al., Prikl.Biochim.Mikrobiol. 18, 1982, 529).
Comme on sait que le bourgeonnement des levures s'accompagne de
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la cellule-mère, on pouvait s'attendre à ce que la production et l'excrétion du lysozyme par les cellules de levure n'entraîne de graves altérations de leur fonction multiplicative. On pouvait s'attendre également à ce que la régénération de la paroi au départ de protoplastes après transformation de ceuxci ne s'en trouve compromise. Il est donc surprenant que par les techniques classiques du génie génétique, on puisse amener les levures non seulement à exprimer un qène de lysozyme mais encore que les cellules ainsi transformées puissent produire
et excréter celui-ci tout en se multipliant de manière active.
Ceci apparaîtra clairement dans les exemples qui suivent. Notons que ceux-ci sont donnés uniquement à titre d'illustration, toute autre construction conduisant à la production
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levure étant considéré comme faisant partie de la présente invention.
COURTE DESCRIPTION DES FIGURES
Pour les exemples donnés ci-après on se réfère aux dessins annexés dans lesquels :
La FIG.l représente la construction du plasmide plys5 qui sera ensuite utilisé pour la reconstruction du cADN complet du lysozyme de poule. Pour réaliser cette construction, on est parti du cosmide pFF2-lys-16 contenant un insert de 40 kb comprenant le gène entier de lysozyme. Un fragment HindIII de 2,1 kb comprenant le premier exon de ce gène a ensuite été in-
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La FIG.2 montre comment le cADN complet du lysozyme a été reconstruit au sein du plasmide plyslO par ligation d'un fragment AccI-HgaI provenant de plys5 et contenant l'extrémité 5' terminale du gène de lysozyme avec deux autres fragments provenant du plasmide pBR-lys-1 et contenant le reste du cADN de lysozyme.
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lysozyme débarrassé, par digestion avec l'exonucléase Bal31, de la partie non traduite de sa région 5' terminale.
La FIG.4 représente la construction de vecteurs d'expression du lysozyme par ligation univoque de fragments purifiés provenant des plasmides
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d'E.coli traitées à l'EDTA pour les rendre sensibles à l'action du lysozyme.
La FIG.6 représente la construction du plasmide YEpB2 par ligation de fragments obtenus par action de l'enzyme de restriction PstI sur le plasmide pBR322 et sur le plasmide endogène 2-microns de la levure.
La FIG.7 représente la construction du vecteur d'expression du lysozyme plys50 par ligation univoque de cinq fragments purifiés obtenus au
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EXEMPLE 1
1.1 Construction d'un clone de cADN complet de lysozyme de poule plyslO
La construction d'un clone complet de cADN a d'abord été effectuée au départ de deux clones différents: pBrlys-1 contenant le cADN de lysozyme de poule dépourvu d'une partie de son extrémité 5'(P.Balducci et al,Nucleic
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génomique de poule comprenant le gène entier du lysozyme introns compris (P.Balducci et al.Nucleic Acids Res.9,
1981,3575)(FIG.1). Aucun de ces deux clones ne convient pour assurer l'expression du lysozyme dans la levure puisque celle-ci est incapable de procéder à la maturation du produit de la transcription des gènes d'eucaryotes supérieurs (J.D. Beggs et al.,Nature 283, 1980, 835).
On pouvait envisager cependant de reconstruire un clone de cADN complet en combinant l'extrémité 3' du cADN incomplet disponible avec l'extrémité 5' du gène complet; on sait en effet, grâce aux données publiées (P.Balducci et al. 1979, réf.cit.; A.Jung et al.,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 77, 1980,
5759; M.Grez et al.,Cell 25, 1981, 743) que le gène entier ne comprend pas d'introns dans la région 5' correspondant à la partie manquante du cADN. On a dès lors sous-clôné un fragment d'ADN de 2,1 kb du cosmide pFF2-lys-16 dans pEMBL8 (L.Dente et al., Nucleic Acid Res. 11, 1983, 1645), ce qui a donné le plasmide plys5 (FIG.l). Ce clône contient l'exon 5' proximal complet du gène de lysozyme.
Un site HgaI convenablement situé est présent dans la région commune à plys5 et au clone pBR-lys-1 de cADN. Une triple ligation faisant intervenir les fragments HgaI-
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de plys5 a permis la construction d'un clône (plyslO) contenant le gène entier de lysozyme, y compris le codon d'initiation ATG, mais sans introns (FIG.2). , 1.2 Raccourcissement de la partie non traduite de la région 5' du gène de lysozyme.
La partie non codante de la région 5' du gène de lysozyme présent dans le plasmide plyslO a été supprimée par ouverture du plasmide à l'endroit du site de restriction unique AccI et digestion avec la nucléase Bal31.0n obtient ainsi une population de plasmides raccourcis qui ont ensuite été clivés au site unique PstI; les fragments compris entre le site PstI et l'extrémité digérée par Bal31 ont été insérés entre les sites PstI et SmaI du plasmide YEpZlOO ,comme décrit dans le brevet belge déposé ce jour par la demanderesse et intitulé "Promoteurs assurant l'expression de gènes étrangers chez la levure,plasmides comportant ces promoteurs et leurs utilisations pour la production de polypeptides".
La conséquence de cette opération est triple : (1) la partie non traduite de la région 5' précédant le codon ATG du lysozyme est supprimée, (2) les sites AccI et SmaI sont détruits et (3) un site BamHI aisément manipulable (immédiatement adjacent au site Smal dans YEpZlOO) se trouve attaché au commencement du gène de lysozyme. Le
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1.3 Construction des vecteurs d'expression du lysozyme.
Le cADN complet du lysozyme se trouve maintenant situé entre un site unique BamHI à son extrémité 5' et un site unique SphI à l'extrémité 3'. Puisque ce cADN comporte son propre codon d'initiation ATG,sa fusion avec un promoteur exempt d'ATG et terminé par un site BamHI devait donnerune unité d'expression fonctionnelle qu'il ne restait plus qu'à associer dans un plasmide à l'origine de réplication etau
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et la sélection dans E. coli ) ainsi qu'àl'origine de réplication du 2-microns et du gène LEU2(pour la réplication et la sélection dans la levure).
Cette construction a été réalisée par ligation simultanée des cinq fragments suivants : (a) un fragment <EMI ID=16.1>
tant le cADN complet du lysozyme; (c) un fragment EcoRISphI provenant du plasmide pKOl (K.McKenney et al.,in Gene amplification and analysis, Ed.J.G.Chirikjan & T.Panas, Elsevier/North Holland,N-ew York,1981 p.383) pour servir de jonction entre le fragment (b) et le fragment (d) ci-après;
(d) un fragment PstI-EcoRI provenant du plasmide YEpZ415 comportant l'origine de réplication et la moitié du gène <EMI ID=17.1>
de pJDB207 comprenant le segment 2-microns-LEU2 et l'autre moitié du gène de &-lactamase. Avant ligation, ces différents fragments avaient été purifiés et comme ils comportent des bouts collants différents et complémentaires les uns des autres, un seul plasmide viable pouvait résulter de l'opération : plysÀ29 (FIG.4).
En procédant de la même façon avec deux autres fragments dérivés par délétion du promoteur p415 (p415�4 et p415A4), deux autres plasmides furent obtenus : plysà49 et
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par le fait que la promoteur s'y trouve positionné à des distances variées du cADN de lysozyme, ce qui au niveau de la transcription doit se traduire par des distances différentes entre le début (l'extrémité 5') des ARN messagers correspondants et le site naturel AUG de départ de la traduction de ceux-ci.
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Les plasmides construits comme décrit ci-dessus ont ensuite été utilisés pour une transformation de la souche GRF18 (Leu-,His-) de la levure- S.cerevisiae suivie d'une sélection des clones prototrophes pour la leucine (Leu+).
Ceux-ci furent ensuite broyés avec des billes de verre et les broyats obtenus furent clarifiés par centrifugation.
L'activité lysozymique de ceux-ci fut testée en mesurant la décroissance de la densité optique d'une suspension
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1970,639). Dans la FIG.5, les valeurs initiales de l'OD650 étaient identiques pour chaque clone (0,7), mais pour plus de clarté, elles ont été décalées sur le diagramme. Les résultats de la FIG.5 dé-
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tats similaires furent obtenus avec une méthode où les cellules utilisées comme indicateur de l'action du lysozyme sont celles de la bactérie Micrococcus lysodeikticus (G.Alderton et al.,J.Biol.Chem.157,1945,
43).
Dans un autre type d'essai,le lysozyme put être mis en évidence autour de colonies transformées se développant sur boite de Petri recouvertes d'un tapis de M.lysodeikticus. Dans ce cas, l'expression était visualisée par un halo transparent de bactéries lysées autour des colonies. En accord avec les résultats obtenus au départ de broyats exempts de cellules, le halo de lyse était le plus marqué dans
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producteur de lysozyme. Ce résultat témoigne également de ce que le lysozyme est exporté de la cellule de levure puisqu'il doit nécessairement être extra-cellulaire pour pouvoir lyser l'indicateur bactérien. EXEMPLE 2
2.1 Construction du vecteur d'expression du lysozyme plys50.
Le vecteur pJDB207 sur lequel sont basés les vecteurs
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ne contient pas le plasmide 2-microns entier de la levure et par conséquent dépend de la présence de celui-ci (que l'on trouve dans la plupart des souches de S.cerevisiae) pour se maintenir dans la cellule transformée. Ceci conduit à une situation instable telle que les plasmides du type pJDB207 sont fréquemment perdus par la cellule
(E.Erhaert & C.P.Hollenberg, J.Bacteriol.156, 1983, 625:
M.Jarayam et al. Cell 34, 1983, 95). Au contraire, le plasmide naturel 2-microns se maintient et se transmet de ) manière stable. On sait d'ailleurs que les plasmides construits de telle sorte qu'ils contiennent la totalité du plasmide 2-microns, par exemple le plasmide pJDB219,se maintiennent de manière beaucoup plus stable que ceux du type pJDB207 (C.P.Hollenberg, Curr.Top.Microbiol.Immunol.
96, 1982, 119; R.M. Walmsley et al., Mol.Gen.Genet. 1983,
361).
Ces plasmides sont dès lors plus avantageux pour des cultures de longue durée, en particulier dans les fermentations industrielles.
Pour construire un tel vecteur à base du 2-microns complet, on est parti du plasmide YEpB2 (FIG.6) obtenu antérieurement par ouverture du plasmide 2-microns entier à son site unique PstI et clonage du fragment obtenu dans le site PstI, également unique, de pBR322. Deux fragments produits au départ de YEpB2 et deux autres au départ de plysA49 furent alors combinés pour donner le plasmide plys50 (FIG.7). Dans celui-ci, les trois gènes A, B et C du 2-microns sont intacts et l'expression de la partie codant pour le lysozyme y est assurée par le promoteur p415�4 comme dans le plasmide plysA49 décrit dans l'exemple précédent.
2.2 Expressions du lysozyme par le vecteur plys50.
Après transformation de la souche GRF18(Leu-,His-) de S.cerevisiae par les plasmides plys50 et pJDB207, les cellules transformées obtenues dans les deux cas ont été séparément mises en culture dans un milieu minimum additionné d'histidine (0,002%). Quand les cultures ont atteint la phase stationnaire (poids sec des cellules : environ 1,5 g/1 de culture), les cellules ont été séparées du milieu de culture par centrifugation, remises en suspension dans un tampon phosphate 0,1 M pH7 et broyées au moyen de billes de verre. L'activité lysozymique dans le surnageant et le broyat des deux cultures a été déterminée par leur capacité de lyser les cellules M.lysodeikticus, suivant la méthode de D. Shugar (Biochem.Biophys.Acta, 8,
1952, 302).
Aucune activité lysozymique ne put être mise en évidence dans le cas de la souche transformée par le plasmide pJDB207. Par contre, dans celui de la souche GRF18(plys50), une activité de 162 unités par ml de culture a été détectée avec la répartition suivante : 44 unités associées aux cellules et 118 unités en solution dans le milieu.
En dosant les protéines totales par la méthode de D.Herbert et al.(Methods in Microbiol. 5B, 1971, 209)modifiée selon C.Wang et R.L.Smith (Anal.Biochem. 63, 1975,414) et compte tenu de l'activité spécifique du lysozyme purifié commercial (Boehringer Mannheim), on a pu déduire que le lysozyme produit par la levure dans ces conditions représente environ 1 % des protéines solubles de la levure.
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Baarn, Pays-Bas (Laboratorium voor Microbiologie, Technisch
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REVENDICATIONS
1) Levure transformée caractérisée en ce que son ADN comprend
au moins une copie d'un fragment codant pour une
1,4- p -N-acétylmuramidase et que ce fragment s'y trouve exprimé sous forme de la protéine active correspondante.
PROCESSED YEASTS PRODUCING LYSOZYME, PLASMIDS USED FOR THIS PROCESSING, AND USES THEREOF.
PROCESSED YEASTS PRODUCING LYSOZYME, PLASMIDS USED FOR THIS PROCESSING,
AND THEIR USES.
The present invention relates to renal yeasts capable, by transformation with DNA of foreign origin, of producing enzymes of the 1,4 - N-acetylmuramidase type.
It is known that 1,4-p-N-acetylmuramidases are enzymes capable of specifically cleaving the glycosidic link which links N-acetylglucosamine to N-acetylmuramic acid which are involved in the constitution of peptidoglycans forming the cell wall of bacteria. This results in a lysis thereof, which results in the death of the cells. These enzymes, more commonly known as lysozymes, therefore act as bactericides and it is recognized that it is this property which explains their widespread presence in most biological fluids of higher animals. It is found, in various concentrations, in the blood, tears, saliva, milk, etc ... of mammals. It is also found in the plant kingdom, especially in the fruit of the papaya tree.
However, it is chicken egg white, where it is found in relatively large quantities, that lysozyme is extracted on an industrial scale by different adsorption and / or precipitation processes (Belgian patent n [deg. ] 694.538, 1967).
Current applications of chicken lysozyme are largely in the pharmaceutical field where it is used to fight against various infections. Other applications are in the food sector. It is known, for example, that lysozyme can be used effectively in the manufacture of pressed, cooked cheeses, to prevent the development during maturation of butyric ferments responsible for manufacturing defects which may go as far as the bursting of the millstones (French patent n [deg.] 80 03321,
nineteen eighty one). It can also be used for the preservation of various perishable foods, especially those made from meat (A. Akashi, Jap.J. Zootechnical Sci. 42, 1971, 289).,
or wines (Japanese patent 3115 / 71,1971) or Sake (M.Yajima et al., J. Ferm.Technol.46, 1968, 782). It can also be used for the mothering of cow's milk (Japanese patent n [deg.] 16780/70, 1970), etc ...
These different applications represent a considerable potential market insofar as lysozyme can be produced easily, in large quantities and at a sufficiently low cost price. Currently, the various methods for extracting egg white are commercially acceptable only to the extent that it can be reused in food after treatment. The lysozyme production capacity is therefore partly conditioned by the egg white market, which poses a problem all the more difficult to solve since the flow of treated egg white into standardized foods technical difficulties and even, in some countries, legislative obstacles.
These problems linked to the availability of natural sources of lysozyme become insurmountable when it comes to mammalian lysozymes, either because their starting concentration is too low, as is the case for lysozyme present in cow's milk, or that the availability of the raw material is practically zero as is the case for human lysozyme. It can therefore be seen that it is necessary to be able to have a technique which makes it possible to produce lysozyme while avoiding the problems mentioned above.
The main object of the present invention is to provide yeasts made capable of producing lysozyme by conventional techniques of genetic engineering. More specifically, they are yeasts transformed in such a way that their DNA comprises at least one copy of a coding fragment
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found expressed as the corresponding active protein. It is another object of the invention to provide yeasts thus transformed but also capable of excreting the lysozyme which they produce so as to facilitate the separation and the purification thereof. The plasmids enabling this transformation also constitute an object of the invention, as does the process making it possible to produce lysozyme by culture of the yeasts thus transformed. These objects as well as other implications and advantages of the present invention appear more clearly in the detailed description which follows.
It is known to genetically reprogram yeasts by transforming them with a DNA fragment carrying a coding part constituted by a heterologous gene or by the product of reverse transcription of the corresponding messenger RNA. For this, plasmids capable of replicating autonomously in the yeast cell are generally used as vectors for the fragment in question thanks to the presence of an origin of replication recognized by the replication machinery of the host cell. The vector must also contain a marker gene allowing the visualization and the selection of the cells which have actually been transformed.
by the plasmid. Finally, the coding part must be preceded by a promoter, that is to say a sequence recognized by the RNA polymerase of the host cell so as to efficiently ensure the transcription of the coding part into corresponding messenger RNA.
In practice, these techniques have mainly been applied to yeasts of the species Saccharomyces cerevisiae for which a large number of expression vectors comprising these various elements have been constructed. These generally include the origin of replication of the 2-micron plasmid present in most strains of this species or an autonomous replication segment ARS of chromosomal origin. As a marker gene, a gene coding for an enzyme involved in the biosynthesis of an essential metabolite, for example an amino acid, is generally used. In this case, a yeast strain which has become, by mutation, auxotrophic for this metabolite is used as the host cell.
By cultivating this strain on a medium free from the metabolite in question, only cells transformed by a plasmid carrying the missing gene can grow. The LEU2 or TRP1 genes coding respectively for an enzyme involved in the biosynthesis of leucine and tryptophan are typical examples of such markers. These expression vectors must also contain, or preferably, several restriction sites in which to insert the coding part of interest, as well as the various elements necessary for optimizing its expression: promoters, terminators, and other control elements.
Often, these plasmids also contain bacterial sequences capable of ensuring their replication and their selection in an intermediate bacterial host, for example Escherichia coli. As conventional examples of such shuttle plasmids, mention may be made of YEpl3 (J.R.Broach et al. Gene 8,1979,
121), pFLl-4 (M.R. Chevallier et al., Gene 11, 1980, ll), pJDB207 (J.D. Beggs,
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pMH158 and pJO158 (M.Heusterspreute et al., Gene, in press).
According to a preferred embodiment of the invention, mainly when the host cell belongs to the species S. cerevisiae, a plasmid is used comprising at least the functions
REP of the endogenous 2-micron plasmid sequence. These generally provide the plasmid with greater stability, especially if the host cell has first been cleaned of its 2-micron plasmids (CP Hollenberg, Curr.Top. Microbiol.Immunol. 96, 1982, 119; RMWalmsley et al. , Mol.Gen. Genet. 1983, 361). Typical examples of such vectors are the plasmids pJDB219 and pJDB248 (J.D. Beggs, Nature 275,
1978, 104). Another vector of this type is described in the examples which follow.
Finally, to ensure as high a level of expression as possible for the coding part of interest, it is necessary to associate with it a promoter as effective as possible. Various strong promoters are known in yeast, in particular the promoter of alcohol dehydrogenase ( ADHl), enolase (EN08 and EN046), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
(GAP63 and GAP491), phosphoglycerate kinase (PGK)
(M.J.Dobson et al., Nucleic Acids Res.10, 1982, 2625), alkaline phosphatase (PH03 and PH05) (European patent 0100561, Al, 1984) or the promoter _p.415 which will be discussed later.
These different techniques which have been successfully applied to the cloning and to the expression of numerous heterologous genes in yeast can obviously be used to ensure the expression therein of lysozyme genes.
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midase. Examples of particular constructions are given by way of illustration in the present patent, but it is obvious that there are many other possibilities and that various combinations of origins of replication, marker genes, effective promoters and others structural elements can be implemented to achieve similar results. The transformed cells obtained in these different cases must therefore be considered to be included in the field of the present invention.
Likewise, although most of these techniques have been mainly applied to the transformation of yeast
S. cerevisiae, the transformed cells obtained from other species and genera of yeasts capable of being transformed by expression vectors of the type described above and their variants are also part of the present invention. As an example of other yeasts, mention may be made of Saccharomycopsis lipolytica, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, etc. However, according to a preferred embodiment of the invention, transformable yeasts of the genus Saccharomyces and preferably will be used as host cells. those belonging to the species S. cerevisiae. As examples of transformable strains belonging to this species, mention may be made of AH22 and GRF18 among many others.
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Many kinds of yeast according to the present invention can have various origins. It can be, for example, hens lysozyme which, as mentioned above, is already produced industrially. However, it is obvious that parts of DNA coding for lysozymes from other sources can be expressed in the same way in yeast, all the more so since these different lysozymes present between
them, to varying degrees, very marked homologies
(P. Jollès et al., Mol. & Cell.Biochemistry 63,1984, 165). One can for example express in yeast the goose lysozyme whose specific activity is clearly higher than that of the hen lysozyme (RCCanfield et al., In Lysozyme, Ed. EF Osserman et al., Académie Press 1974, p.63). The same goes for human lysozyme, also very active and particularly indicated for pharmaceutical uses as well as for the formulation of infant formula. Mention may also be made of papaya lysozyme or that encoded by bacterial viruses.
When, in accordance with the present invention, a yeast strain has been caused by genetic manipulation to produce lysozyme of either origin, it is necessary, to take advantage of this new property, to multiply it by fermentation in the most favorable conditions for its growth. A biomass is thus obtained which, as such, can find applications in animal or human food. We know, for example, that yeast autolysates are increasingly used as additives in various foods (meat pies, soups, sauces, etc.), not only because of their own nutritional value, but also) their organoleptic properties.
The presence of lysozyme in the starting yeasts has the advantage of preserving to some extent the autolysates from the bacterial contamination of which they are easily the object as well as the food products in which they are incorporated. We also know that the presence of lysozyme reduces the sterilization temperature of food (British patent
n [deg.] 1,438,560, 1976).
On the other hand, the yeasts in accordance with the present invention can also be used as a source of purified lysozyme, by separation of the latter from the yeast itself. It is clear however that this operation can present � ter considerable difficulties if the lysozyme is associated, inside the cell, with the other proteins of this one. It is therefore an important aspect of the present invention to provide yeasts capable of excreting the lysozyme that they produce, that it is released into the culture medium from which it can be recovered by methods
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vet belge n [deg.] 694.538, 1967), or that it remains associated with the yeast wall from which it must be detached by other methods. In fact, we have found, and this in itself constitutes a surprising fact, that the signal sequence of 18 amino acids present at the N-terminal end of the prelysozyme and which allows the secretion of the protein in the lumen of the endoplasmic reticulum of the cells of the chicken oviduct is also recognized by yeast cells. The examples which follow show in fact that when the DNA coding for the hen prelysozyme is expressed in yeast, the product of this expression is excreted by the latter.
As a result, it suffices to merge the fragment of 54 nucleotides coding for this signal sequence with the DNA coding for the structural part of other proteins, in particular lysozyme of other origins, so that these, once produced in yeast, are also excreted.
But the most fundamental and most unexpected aspect of the present invention is the fact that a lysozyme gene can be expressed in yeast without exerting a lethal effect therein, in particular by lysis of the cells. The only known example of cloning and expression of a lysozyme gene in a heterologous cell is that of the hen lysozyme gene in human cell lines Hela and MCF-7 (PDMatthias et al., The EMBO J. 1, 1982, 1207), although the expression of the gene
has only been demonstrated by the production of the corresponding messenger RNA and not of the protein itself. No example of lysozyme gene expression in bacteria
has been reported to date, which can be explained by the fact that the lysozyme produced by the bacteria should normally cause its lysis. However, it is known that lysozyme is also capable of attacking the wall of yeast cells, mainly by hydrolysis of its chitinic component (G.N. Maksimova et al., Prikl.Biochim.Mikrobiol. 18, 1982, 529).
As we know that the budding of yeasts is accompanied by
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In the mother cell, it could be expected that the production and excretion of lysozyme by yeast cells would cause serious alterations in their multiplicative function. It was also to be expected that the regeneration of the wall from protoplasts after transformation thereof would be compromised. It is therefore surprising that by conventional techniques of genetic engineering, it is possible to cause the yeasts not only to express a qene of lysozyme but also that the cells thus transformed can produce
and excrete it while actively multiplying.
This will appear clearly in the examples which follow. Note that these are given for illustration only, any other construction leading to production
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yeast being considered to be part of the present invention.
SHORT DESCRIPTION OF THE FIGURES
For the examples given below, reference is made to the appended drawings in which:
FIG. 1 represents the construction of the plasmid plys5 which will then be used for the reconstruction of the complete cDNA of hen lysozyme. To carry out this construction, we started from the cosmid pFF2-lys-16 containing a 40 kb insert comprising the entire lysozyme gene. A 2.1 kb HindIII fragment comprising the first exon of this gene was then inserted.
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FIG. 2 shows how the complete lysozyme cDNA was reconstructed within the plasmid plys10 by ligation of an AccI-HgaI fragment originating from plys5 and containing the 5 'terminal end of the lysozyme gene with two other fragments originating from the plasmid pBR-lys-1 and containing the rest of the lysozyme cDNA.
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lysozyme rid, by digestion with exonuclease Bal31, of the untranslated part of its 5 'terminal region.
FIG. 4 represents the construction of lysozyme expression vectors by unequivocal ligation of purified fragments originating from the plasmids
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of E. coli treated with EDTA to make them sensitive to the action of lysozyme.
FIG. 6 represents the construction of the plasmid YEpB2 by ligation of fragments obtained by action of the restriction enzyme PstI on the plasmid pBR322 and on the endogenous plasmid 2-microns of the yeast.
FIG. 7 represents the construction of the expression vector for lysozyme plys50 by unequivocal ligation of five purified fragments obtained at
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EXAMPLE 1
1.1 Construction of a complete cDNA clone of hen lysozyme plyslO
The construction of a complete cDNA clone was first carried out using two different clones: pBrlys-1 containing the hen lysozyme cDNA devoid of part of its 5 ′ end (P. Balducci et al, Nucleic
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hen genomics including the whole gene of lysozyme introns included (P. Balducci et al. Nucleic Acids Res.9,
1981, 3575) (FIG. 1). Neither of these two clones is suitable for ensuring the expression of lysozyme in yeast since the latter is unable to process the transcription product of the higher eukaryotic genes (JD Beggs et al., Nature 283, 1980 , 835).
However, it could be envisaged to reconstruct a complete cDNA clone by combining the 3 'end of the incomplete cDNA available with the 5' end of the complete gene; we know indeed, thanks to the published data (P. Balducci et al. 1979, ref. cit .; A. Jung et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 77, 1980,
5759; M.Grez et al., Cell 25, 1981, 743) that the entire gene does not include introns in the 5 'region corresponding to the missing part of the cDNA. A 2.1 kb DNA fragment of the cosmid pFF2-lys-16 was therefore subcloned into pEMBL8 (L. Dente et al., Nucleic Acid Res. 11, 1983, 1645), which gave the plasmid plys5 (FIG.l). This clone contains the complete proximal 5 'exon of the lysozyme gene.
A suitably located HgaI site is present in the region common to plys5 and to the pBR-lys-1 clone of cDNA. A triple ligation involving the HgaI- fragments
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of plys5 allowed the construction of a clone (plys10) containing the entire lysozyme gene, including the initiation codon ATG, but without introns (FIG.2). , 1.2 Shortening of the untranslated part of the 5 'region of the lysozyme gene.
The non-coding part of the 5 ′ region of the lysozyme gene present in the plasmid plys10 was deleted by opening the plasmid at the site of the unique restriction site AccI and digestion with the nuclease Bal31.0n thus obtaining a population of shortened plasmids which were then cleaved at the unique PstI site; the fragments between the PstI site and the end digested by Bal31 were inserted between the PstI and SmaI sites of the plasmid YEpZlOO, as described in the Belgian patent filed today by the applicant and entitled "Promoters ensuring the expression of foreign genes in yeast, plasmids comprising these promoters and their uses for the production of polypeptides ".
The consequence of this operation is threefold: (1) the untranslated part of the 5 'region preceding the ATG codon of lysozyme is deleted, (2) the AccI and SmaI sites are destroyed and (3) an easily manipulated BamHI site (immediately adjacent to the SmaI site in YEpZlOO) is attached to the beginning of the lysozyme gene. The
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1.3 Construction of lysozyme expression vectors.
The complete lysozyme cDNA is now located between a unique BamHI site at its 5 'end and a unique SphI site at the 3' end. Since this cDNA has its own ATG initiation codon, its fusion with an ATG-free promoter and terminated with a BamHI site was to give a functional expression unit which only remained to be associated in a plasmid with the origin of replication vice
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and selection in E. coli) as well as at the origin of replication of 2-microns and of the LEU2 gene (for replication and selection in yeast).
This construction was carried out by simultaneous ligation of the following five fragments: (a) a fragment <EMI ID = 16.1>
both the complete lysozyme cDNA; (c) an EcoRISphI fragment originating from the plasmid pKOl (K. McKenney et al., in Gene amplification and analysis, Ed. JG Chirikjan & T. Panas, Elsevier / North Holland, N-ew York, 1981 p.383) junction between the fragment (b) and the fragment (d) below;
(d) a PstI-EcoRI fragment originating from the plasmid YEpZ415 comprising the origin of replication and half of the gene <EMI ID = 17.1>
of pJDB207 comprising the 2-micron-LEU2 segment and the other half of the & -lactamase gene. Before ligation, these different fragments had been purified and as they have sticky ends which are different and complementary to each other, only one viable plasmid could result from the operation: plysÀ29 (FIG. 4).
By proceeding in the same way with two other fragments derived by deletion of the p415 promoter (p415 � 4 and p415A4), two other plasmids were obtained: plysà49 and
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by the fact that the promoter is positioned there at various distances from the lysozyme cDNA, which at the level of transcription must result in different distances between the start (the 5 ′ end) of the corresponding messenger RNAs and the AUG natural site from which they are translated.
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The plasmids constructed as described above were then used for a transformation of the GRF18 (Leu-, His-) strain of the yeast- S. cerevisiae followed by a selection of the prototrophic clones for leucine (Leu +).
These were then ground with glass beads and the ground material obtained was clarified by centrifugation.
The lysozymic activity of these was tested by measuring the decrease in the optical density of a suspension.
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1970,639). In FIG. 5, the initial OD650 values were identical for each clone (0.7), but for clarity, they have been shifted on the diagram. The results of FIG. 5 de-
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Similar states were obtained with a method where the cells used as an indicator of the action of lysozyme are those of the bacterium Micrococcus lysodeikticus (G. Alderton et al., J. Biol. Chem. 157,1945,
43).
In another type of test, the lysozyme could be demonstrated around transformed colonies growing on a Petri dish covered with a M.lysodeikticus mat. In this case, the expression was visualized by a transparent halo of bacteria lysed around the colonies. In agreement with the results obtained from cell-free ground materials, the lysis halo was most marked in
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lysozyme producer. This result also testifies to the fact that lysozyme is exported from the yeast cell since it must necessarily be extracellular in order to be able to lyse the bacterial indicator. EXAMPLE 2
2.1 Construction of the lysozyme plys50 expression vector.
The vector pJDB207 on which the vectors are based
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does not contain the entire 2-micron plasmid from yeast and therefore depends on its presence (which is found in most strains of S. cerevisiae) to maintain itself in the transformed cell. This leads to an unstable situation such that plasmids of the pJDB207 type are frequently lost by the cell.
(E. Erhaert & C.P. Hollenberg, J. Bacteriol. 156, 1983, 625:
M. Jarayam et al. Cell 34, 1983, 95). On the contrary, the natural 2-micron plasmid is maintained and transmitted in a stable manner. We also know that the plasmids constructed so that they contain the entire 2-micron plasmid, for example the plasmid pJDB219, are maintained much more stable than those of the pJDB207 type (CPHollenberg, Curr.Top. Microbiol.Immunol.
96, 1982, 119; R.M. Walmsley et al., Mol.Gen.Genet. 1983,
361).
These plasmids are therefore more advantageous for long-term cultures, in particular in industrial fermentations.
To construct such a vector based on the complete 2-micron, we started from the plasmid YEpB2 (FIG. 6) previously obtained by opening the entire 2-micron plasmid at its unique PstI site and cloning of the fragment obtained in the PstI site, also single, from pBR322. Two fragments produced from YEpB2 and two others from plysA49 were then combined to give the plasmid plys50 (FIG. 7). In this one, the three genes A, B and C of 2-microns are intact and the expression of the part coding for lysozyme is ensured there by the promoter p415 � 4 as in the plasmid plysA49 described in the previous example.
2.2 Expressions of lysozyme by the vector plys50.
After transformation of the GRF18 (Leu-, His-) strain of S.cerevisiae by the plasmids plys50 and pJDB207, the transformed cells obtained in both cases were separately cultured in a minimum medium supplemented with histidine (0.002%) . When the cultures have reached the stationary phase (dry weight of the cells: approximately 1.5 g / l of culture), the cells were separated from the culture medium by centrifugation, resuspended in a 0.1 M phosphate buffer pH7 and crushed by means of glass beads. The lysozymic activity in the supernatant and the ground material of the two cultures was determined by their capacity to lyse the M.lysodeikticus cells, according to the method of D. Shugar (Biochem.Biophys.Acta, 8,
1952, 302).
No lysozymic activity could be demonstrated in the case of the strain transformed by the plasmid pJDB207. On the other hand, in that of the GRF18 strain (plys50), an activity of 162 units per ml of culture was detected with the following distribution: 44 units associated with the cells and 118 units in solution in the medium.
By assaying the total proteins by the method of D. Herbert et al. (Methods in Microbiol. 5B, 1971, 209) modified according to C. Wang and RL Smith (Anal. Biochem. 63, 1975, 414) and taking into account the he specific activity of the purified commercial lysozyme (Boehringer Mannheim), it has been possible to deduce that the lysozyme produced by the yeast under these conditions represents approximately 1% of the soluble proteins of the yeast.
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Baarn, Netherlands (Laboratorium voor Microbiologie, Technisch
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CLAIMS
1) Processed yeast characterized in that its DNA comprises
at least one copy of a fragment coding for a
1,4- p -N-acetylmuramidase and that this fragment is expressed therein in the form of the corresponding active protein.