FR2743086A1 - Vector system for introducing foreign DNA into eukaryotic cells - Google Patents
Vector system for introducing foreign DNA into eukaryotic cells Download PDFInfo
- Publication number
- FR2743086A1 FR2743086A1 FR9515556A FR9515556A FR2743086A1 FR 2743086 A1 FR2743086 A1 FR 2743086A1 FR 9515556 A FR9515556 A FR 9515556A FR 9515556 A FR9515556 A FR 9515556A FR 2743086 A1 FR2743086 A1 FR 2743086A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- cells
- vector system
- coli
- vector
- eukaryotic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
Abstract
Description
La présente invention concerne le transfert direct d'ADN dans des cellules eucaryotes et en particulier dans des cellules de mammifères. Plus particulièrement, la présente invention fournit un système vectoriel capable de délivrer un fragment d'ADN d'intérêt étranger dans des cellules cibles eucaryotes déterminées, notamment de mammifères. The present invention relates to the direct transfer of DNA into eukaryotic cells and in particular into mammalian cells. More particularly, the present invention provides a vector system capable of delivering a foreign DNA fragment of interest into specific eukaryotic target cells, including mammals.
Il n'existe pas actuellement de système à la fois efficace et dénué d'actions secondaires pour l'introduction d'un gène dans des cellules de mammifères. Les recherches sur les systèmes vectoriels, notamment dans le cas du traitement de la mucoviscidose avec le transfert du gène CFTR, ont porté principalement sur les virus, adénovirus notamment, et les liposomes, qu'ils contiennent du cDNA du mRNA ou de la protéine CFTR tels que décrits dans W094/10323. There is currently no system that is both effective and devoid of secondary actions for the introduction of a gene into mammalian cells. Research on vector systems, especially in the case of cystic fibrosis treatment with the transfer of the CFTR gene, focused mainly on viruses, especially adenoviruses, and liposomes, whether they contain mRNA cDNA or CFTR protein. as described in WO94 / 10323.
On connait des bactéries ayant acquis des gènes permettant l'invasion ainsi que leur dissémination intercellulaire dans des cellules eucaryotes, notamment de mammifères. On entend ici par "invasion" la faculté de pénétrer à travers la membrane et d'atteindre le cytoplasme par lyse des membranes des vacuoles. Bacteria having acquired genes for invasion and their intercellular dissemination in eukaryotic cells, in particular mammals, are known. By "invasion" is meant here the ability to penetrate through the membrane and to reach the cytoplasm by lysis of the vacuole membranes.
On a décrit dans Infection and Immunity, vol. 62, n 5, 1994, pp. 1169-1676, Schödel et al. un système de vaccination dans lequel on utilise une bactérie Salmonella tvphimurium et sa factulté invasive, ladite bactérie étant transformée par de l'ADN codant une protéine immunogène du virus de l'hépatite B (HBcAg - preS). Dans ce système l'ADN codant n'est pas transféré aux cellules eucaryotes, mais ladite protéine est produite par la bactérie elle-meme. It has been described in Infection and Immunity, vol. 62, No. 5, 1994, pp. 1169-1676, Schödel et al. a vaccination system in which a Salmonella tvphimurium bacterium is used and its factual invasiveness, said bacterium being transformed by DNA encoding an immunogenic protein of the hepatitis B virus (HBcAg - preS). In this system the coding DNA is not transferred to eukaryotic cells, but said protein is produced by the bacterium itself.
On a décrit dans FR 2 686 896 un système de vaccination dans lequel on utilise des mutants atténués de Listeria monocvtorenes qui confèrent à des hôtes auxquels ils ont été administrés une protection contre une infection ultérieure par une souche pathogène de listeria monocvtogenes. A vaccination system has been described in FR 2 686 896 in which attenuated mutants of Listeria monocvtorenes are used which confer on hosts to which they have been administered protection against subsequent infection by a pathogenic strain of Listeria monoctogenes.
A ce jour, le transfert d'ADN à des cellules eucaryotes via des procaryotes n'a pu être obtenu que dans certains cas particuliers pour une levure de E. coli à Saccharomvces (1) et une plante de Agro-bacterium tumefaciens à Nicotania plumbaginifolia (2). To date, the transfer of DNA to eukaryotic cells via prokaryotes could only be obtained in certain special cases for yeast of E. coli at Saccharomyces (1) and a plant of Agro-bacterium tumefaciens at Nicotania plumbaginifolia. (2).
L'article de Sadoff et al. (Science Vol. 270, 13 octobre 1995) décrit une bactérie Shigella Flexneri atténuée utilisée comme véhicule pour délivrer de l'ADN dans des cellules épithéliales de mammifères. The article by Sadoff et al. (Science Vol 270, Oct. 13, 1995) describes an attenuated Shigella Flexneri bacterium used as a vehicle for delivering DNA into mammalian epithelial cells.
Selon la présente invention, la bactérie E. coli est modifiée génétiquement de sorte que
1) elle est capable de pénétrer et d'atteindre le cytoplasme de
cellules eucaryotes cibles déterminées,
2) elle est rendue incapable de se multiplier et de survivre dans
lesdites cellules, notamment en lysant dès son entrée dans le
cytoplasme desdites cellules eucaryotes
3) la bactérie est transformée par de l'ADN d'intérêt à transférer,
notamment via un vecteur navette procaryote-eucaryote, de
préférence réplicatif dans ladite bactérie E. coli et réplicatif ou
intégratif dans lesdites cellules eucaryotes hôtes cibles.According to the present invention, the bacterium E. coli is genetically modified so that
1) it is able to penetrate and reach the cytoplasm of
determined target eukaryotic cells,
2) she is rendered unable to multiply and survive in
said cells, in particular by lysing as soon as it enters the
cytoplasm of said eukaryotic cells
3) the bacterium is transformed by DNA of interest to be transferred,
especially via a prokaryotic-eukaryotic shuttle vector,
replicative preference in said E. coli bacteria and replicative or
integrative in said eukaryotic target host cells.
Plus précisément, la présente invention a pour objet un Système vectoriel capable de délivrer un fragment d'ADN étranger dans des cellules cibles eucaryotes, caractérisé en ce qu'il comprend une souche recombinante E. coli non pathogène et capable de pénétrer dans le cytoplasme desdites cellules, mais incapable d'y survivre, ladite souche E. More specifically, the subject of the present invention is a vector system capable of delivering a foreign DNA fragment into eukaryotic target cells, characterized in that it comprises a recombinant non-pathogenic E. coli strain capable of penetrating into the cytoplasm of said cells, but unable to survive, said strain E.
coli étant en outre transformée par ledit fragment d'ADN étranger.coli being further transformed by said foreign DNA fragment.
Les expressions "système vectoriel" et "cellule cibles" reflètent que la souche E. coli est utilisée ici comme moyen de transfert de l'ADN étranger dans lesdites cellules eucaryotes et non comme bactérie hôte pour l'expression dudit fragment d'ADN, celle-ci pouvant avoir lieu le cas échéant dans lesdites cellules cibles après pénétration de la bactérie dans le cytoplasme. Ce système vectoriel couvre également la souche recombinante d'E. coli telle que définie ci-dessus. The terms "vector system" and "target cell" reflect that the E. coli strain is used here as a means of transferring foreign DNA into said eukaryotic cells and not as a host bacterium for the expression of said DNA fragment, that it can take place where appropriate in said target cells after penetration of the bacterium into the cytoplasm. This vector system also covers the recombinant strain of E. coli. coli as defined above.
Par "fragment d'ADN" on entend toute séquence nucléotidique comportant ou non des sites de restriction enzymatique. De manière préférentielle, le fragment comporte entre 20 pb et 30 kpb. On peut utiliser comme fragment d'ADN un fragment d'ADN provenant d'un ADN génomique ou d'un ADN complémentaire. A titre d'exemple, le fragment d'ADN est constitué par un fragment d'ADNc de 2kb codant pour la protéine CFTR. By "DNA fragment" is meant any nucleotide sequence with or without enzymatic restriction sites. Preferably, the fragment comprises between 20 bp and 30 kbp. A DNA fragment from a genomic DNA or a complementary DNA can be used as the DNA fragment. By way of example, the DNA fragment consists of a 2kb cDNA fragment coding for the CFTR protein.
On entend par "fragment d'acide nucléique étranger" un fragment d'acide nucléique qui n'est pas présent dans les cellules cibles. Il peut s'agir d'un fragment exogène, c'est-à-dire qui n'est pas présent normalement dans les cellules cibles de manière endogène, mais il peut s'agir également d'un fragment qui est déjà présent dans les cellules cibles de manière endogène, mais qui ne s'exprime pas ou dont on veut modifier ou réguler l'expression. The term "foreign nucleic acid fragment" means a nucleic acid fragment that is not present in the target cells. It may be an exogenous fragment, i.e., which is not normally present in target cells endogenously, but it may also be a fragment that is already present in the cells. target cells in an endogenous way, but which does not express itself or whose expression we want to modify or regulate.
Selon la présente invention, on modifie le tropisme cellulaire de souche E coli qui, par définition, ne possède pas de tropisme spécifique pour lesdites cellules eucaryotes cibles. According to the present invention, the cellular tropism of E. coli strain which, by definition, does not have a specific tropism for said target eukaryotic cells is modified.
Avantageusement, ledit fragment d'ADN étranger comporte un fragment d'ADN codant pour une protéine d'intérêt, ce dernier fragment étant placé sous le contrôle d'éléments de régulation dans lesdites cellules cibles eucaryotes. Advantageously, said foreign DNA fragment comprises a DNA fragment encoding a protein of interest, the latter fragment being placed under the control of regulatory elements in said eukaryotic target cells.
On entend par "éléments de régulation" les séquences régulatrices appropriées pour la transcription puis la traduction telles que promoteur, y compris codons "start" et "stop", "enhancer" et "operateur". Les moyens et méthodes pour identifier et sélectionner ces éléments sont bien connus de l'homme de l'art. The term "regulatory elements" means the appropriate regulatory sequences for transcription then translation such as promoter, including codons "start" and "stop", "enhancer" and "operator". The means and methods for identifying and selecting these elements are well known to those skilled in the art.
Dans un mode de réalisation avantageux, ladite souche est transformée par un vecteur réplicatif ou non dans E. coli portant ledit fragment d'ADN et éventuellement lesdits éléments de régulation. In an advantageous embodiment, said strain is transformed by a replicative vector or not in E. coli carrying said DNA fragment and possibly said regulatory elements.
On utilise donc une bactérie E. coli capable de pénétrer et d'atteindre le cytoplasme des cellules eucaryotes cibles. Une telle souche est modifiée génétiquement par des gènes provenant d'une ou plusieurs autres bactéries ayant cette propriété. Thus, an E. coli bacterium capable of penetrating and reaching the cytoplasm of the target eukaryotic cells is used. Such a strain is genetically modified by genes from one or more other bacteria having this property.
La fonction de reconnaissance et de pénétration de la membrane cellulaire et la fonction de lyse des membranes des vacuoles ou phagosomes, cette dernière permettant d'atteindre le cytoplasme, peuvent être conférées par un ou plusieurs gènes distincts notamment deux sens distincts. The function of recognition and penetration of the cell membrane and the function of lysis of the membranes of vacuoles or phagosomes, the latter making it possible to reach the cytoplasm, may be conferred by one or more distinct genes, in particular two distinct senses.
Lorsque la spécificité de pilotage vers lesdites cellules cibles particulières est conférée par un gène provenant d'une autre bactérie codant pour la faculté de pénétrer spécifiquement lesdites cellules cibles, c'est le choix du gène responsable de la reconnaissance et pénétration de la membrane cellulaire qui confère la spécificité du pilotage. Lesdites cellules eucaryotes cibles peuvent être des cellules animales, notamment des cellules de mammifères, en particulier des cellules humaines, ou des cellules de levures ou encore des cellules de plantes. When the specificity of piloting towards said particular target cells is conferred by a gene originating from another bacterium coding for the ability to specifically penetrate said target cells, it is the choice of the gene responsible for the recognition and penetration of the cell membrane which confers the specificity of the piloting. Said eukaryotic target cells may be animal cells, in particular mammalian cells, in particular human cells, or yeast cells or even plant cells.
La nature de la bactérie d'origine du gène responsable de la reconnaissance et pénétration spécifique dans les cellules cibles déterminées, utilisé selon la présente invention, confère au système vectoriel de l'invention, une spécificité de pilotage vers un type de cellules eucaryotes cibles, en particulier des cellules de mammifères notamment humaines, correspondant au spectre d'hôte cellulaire de ladite bactérie. The nature of the bacterium of origin of the gene responsible for the recognition and specific penetration into the target cells determined, used according to the present invention, confers on the vector system of the invention a specificity of control towards a type of eukaryotic target cells, in particular mammalian cells, especially human cells, corresponding to the cellular host spectrum of said bacterium.
La plupart des bactéries pathogènes intracellulaires ont la capacité d'invasion dans les cellules epithéliales humaines (3). Toutefois, si ces bactéries sont dotées de la capacité de pénétrer dans certaines cellules cibles, elles ont souvent un effet pathogène. C'est pourquoi, il est avantageux d'utiliser selon la présente invention une bactérie E coli non pathogène, notamment une souche issue de la souche E. coli K12, modifiée par un gène d'une autre bactérie. Most intracellular pathogenic bacteria have the ability to invade human epithelial cells (3). However, if these bacteria have the ability to penetrate certain target cells, they often have a pathogenic effect. Therefore, it is advantageous to use according to the present invention a non-pathogenic E. coli bacterium, including a strain derived from E. coli strain K12, modified with a gene of another bacterium.
Ainsi à titre illustratif on utilisera
- un gène ou un ensemle de gènes de la bactérie Salmonella
tvDhimurium pour transférer de l'ADN dans des cellules de tissus
lymphoïdes et des cellules hépatiques
- un gène ou un ensemble de gènes de la bactérie Shigella flexneri
pour transférer de l'ADN dans des cellules épithéliales de mammifères
- un gène de la bactérie du genre Lézionella, notamment Lenionella
pneumophila, notamment pour transférer de l'ADN plus
spécifiquement dans des cellules épithéliales du poumon
- un gène de la bactérie Listeria monoevtozenes pour transférer de
l'ADN dans des cellules épithéliales du système nerveux central,
- un gène de la bactérie du genre Yersinia. notamment Yersinia
Dseudotuberculosis ou enterocolitica pour transférer de l'ADN dans
des cellules épithéliales, et
- un gène de bactérie du genre Mvcobactérium notamment
tuberculosis. avilum comolex, scrofulaceum pour transférer de
l'ADN dans des macrophages.So for illustrative purposes we will use
- a gene or a set of genes of Salmonella bacteria
tvDhimurium to transfer DNA into tissue cells
lymphoid and liver cells
- a gene or a set of genes of the bacterium Shigella flexneri
to transfer DNA into mammalian epithelial cells
a gene of the bacterium of the genus Lézionella, in particular Lenionella
pneumophila, especially to transfer more DNA
specifically in lung epithelial cells
- a gene of the bacterium Listeria monoevtozenes to transfer
DNA in epithelial cells of the central nervous system,
a gene of the bacterium of the genus Yersinia. especially Yersinia
Dseudotuberculosis or enterocolitica to transfer DNA into
epithelial cells, and
a bacterium gene of the genus Mvcobacterium in particular
tuberculosis. avilum comolex, scrofulaceum to transfer
DNA in macrophages.
Ainsi dans un mode de réalisation illustrant cet aspect de l'invention, on a construit une bactérie E. coli modifiée par le gène d'invasion de la bactérie Shigella Flexneri. Thus, in one embodiment illustrating this aspect of the invention, an E. coli bacterium modified with the invasion gene of the bacterium Shigella Flexneri has been constructed.
Shigella flexneri est une espèce bactérienne pathogène pour l'homme responsable de la dysentrie bacillaire difficilement transformable par de l'ADN exogène et riche en endonucléase. Cette espèce bactérienne héberge le plasmide pWR100 contenant l'opéron d'invasion ipa (invasion plasmide antigen), qui lui permet d'entrer et se multiplier dans les cellules épithéliales des mammifères. Le plasmide pWR100 (4) confère à Ecoli K12 les propriétés d'entrée et de modification intracellulaire et dissémination intercellulaire dans les cellules de mammifères (5). Shigella flexneri is a pathogenic bacterial species for humans responsible for bacillary dysentery difficult to transform with exogenous DNA and rich in endonuclease. This bacterial species hosts the plasmid pWR100 containing the invasion operon ipa (plasmid antigen invasion), which allows it to enter and multiply in the mammalian epithelial cells. Plasmid pWR100 (4) confers on Ecoli K12 the properties of intracellular entry and modification and intercellular dissemination in mammalian cells (5).
Le plasmide pWR100 de Shinella Flexneri code les deux fonctions de pénétration et de dissémination intracellulaire par lyse des membranes des vacuoles. Cependant il peut être avantageux, comme on l'a vu, de transformer la bactérie E. coli selon l'invention par deux gènes exogènes provenant de bactéries différentes. On peut utiliser en particulier le gène de l'hemolysine de Listeria monocvtoeenes ou le gène de l'hémolysine présent dans certaines bactéries E. coli pathogènes, gène d'environ 2kb qui confère la capacité de dissémination intracellulaire en lysant les membranes des vacuoles. On peut également utiliser le gène d'invasion de la bactérie Yersinia enterolitica ou pseudotuberculosis pour conférer la capacité d'entrer dans les cellules. Shinella Flexneri plasmid pWR100 encodes both functions of penetration and intracellular dissemination by lysis of vacuole membranes. However, it may be advantageous, as we have seen, to transform the E. coli bacterium according to the invention by two exogenous genes from different bacteria. In particular, it is possible to use the Listeria monocvtoeenes hemolysin gene or the hemolysin gene present in certain pathogenic E. coli bacteria, a gene of about 2 kb which confers the ability of intracellular dissemination by lysing the vacuole membranes. The invading gene of the bacterium Yersinia enterolitica or pseudotuberculosis can also be used to confer the ability to enter the cells.
Les mycobactéries ont la propriété de pénétrer dans les cellules mais elles ne lysent pas les membranes des vacuoles. Dans un mode de réalisation, on utilise un gène de mycobactérie responsable de la pénétration cellulaire et un gène d'hémolysine de E. coli ou Listeria monocvtozenes. Mycobacteria have the property of penetrating the cells but they do not lyse the membranes of the vacuoles. In one embodiment, a mycobacterium gene responsible for cell penetration and a hemolysin gene of E. coli or Listeria monocvtozenes are used.
La souche de E.coli peut être rendue incapable de se multiplier et de survivre dans les cellules eucaryotes de multiple façons, en particulier en la rendant auxotrophe pour un facteur nécessaire à sa survie et absent des cellules eucaryotes. The E. coli strain can be rendered incapable of multiplying and surviving in eukaryotic cells in multiple ways, particularly by rendering it auxotrophic for a factor necessary for its survival and absent from eukaryotic cells.
Dans le mode de réalisation préféré selon l'invention, la bactérie E. In the preferred embodiment according to the invention, the bacterium E.
coli est rendue incapable de survie en lysant dès son entrée dans le cytoplasme des cellules eucaryotes. Pour ce faire, dans le mode de réalisation préféré selon l'invention, ladite souche E coli a été modifiée de manière a être rendue auxotrophe pour l'acide diaminopimélique qui est un composé essentiel de la synthèse de la paroi bactérienne (6) dont la voie de biosynthèse est bien connue.coli is rendered incapable of survival by lysing as soon as it enters the cytoplasm of eukaryotic cells. For this purpose, in the preferred embodiment according to the invention, said E. coli strain has been modified so as to be made auxotrophic for diaminopimelic acid which is an essential compound for the synthesis of the bacterial wall (6) whose biosynthetic pathway is well known.
Dans un mode de réalisation, la bactérie E. coli est rendue dat > -- à la suite d'un double événement de recombinaison homologue dans le gène de structure de la dihydrodipicolinate synthase, auxotrophe pour l'acide diaminopimélique qui est spécifique des procaryotes (7). In one embodiment, the E. coli bacterium is reported as a result of a double homologous recombination event in the dihydrodipicolinate synthase structural gene, auxotrophic for diaminopimelic acid which is prokaryotic specific ( 7).
Le gène peut être doublement inactivé par délétion et insertioninactivation dans le gène daDA. L'inactivation de la chaîne métabolique au niveau de la première étape évite l'accumulation dans les cellules d'un intermédiaire métabolique qui peut être métabolisé par une autre enzyme de la cellule. Les deux premières étapes de la synthèse du diaminopimélate qui n'est pas présent dans les cellules de mammifères, sont catalysées par les enzymes codées par les gènes darda et dat > B (7). The gene can be doubly inactivated by deletion and insertioninactivation in the daDA gene. Inactivation of the metabolic chain in the first step avoids the accumulation in cells of a metabolic intermediate that can be metabolized by another enzyme in the cell. The first two steps in the synthesis of diaminopimelate, which is not present in mammalian cells, are catalyzed by the enzymes encoded by the darda and dat> B (7) genes.
Selon la présente invention, le fragment d'acide nucléique étranger est porté par un plasmide réplicatif et non intégratif dans la bactérie. En outre, le fragment d'ADN étranger est placé sous le controle d'éléments d'expression fonctionnelle dans les cellules eucaryotes cibles. According to the present invention, the foreign nucleic acid fragment is carried by a replicative and non-integrative plasmid in the bacterium. In addition, the foreign DNA fragment is under the control of functional expression elements in the target eukaryotic cells.
Ledit vecteur portant ledit fragment d'ADN étranger peut être réplicatif ou intégratif dans les cellules eucaryotes cibles, c'est-à-dire qu'il peut comporter des éléments permettant l'intégration dans le génome des cellules eucaryotes cibles, ou comporter une origine de réplication permettant au vecteur de se répliquer de façon extrachromosomique dans les cellules eucaryotes cibles. Said vector carrying said foreign DNA fragment may be replicative or integrative in the target eukaryotic cells, that is to say that it may comprise elements allowing integration into the genome of the target eukaryotic cells, or comprise an origin replication allowing the vector to replicate extrachromosomally in the target eukaryotic cells.
La présente invention a également pour objet un système vectoriel selon la présente invention pour une utilisation thérapeutique. The present invention also relates to a vector system according to the present invention for a therapeutic use.
Enfin la présente invention a pour objet une méthode de transfert ex vivo ou in vivo d'ADN dans des cellules eucaryotes, caractérisée en ce qu'on utilise un système vectoriel selon la présente invention. Finally, the present invention relates to a method of ex vivo or in vivo transfer of DNA in eukaryotic cells, characterized in that a vector system according to the present invention is used.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière du mode de réalisation détaillée qui va suivre. Other features and advantages of the present invention will become apparent in light of the following detailed embodiment.
La description fait référence aux figures 1 à 4 dans lesquelles
- la figure 1 représente le vecteur pAT497
- la figure 2 représente le vecteur pAT498
- la figure 3 représente la construction de E. coli BM 2710. The description refers to FIGS. 1 to 4 in which
FIG. 1 represents the vector pAT497
FIG. 2 represents the vector pAT498
- Figure 3 shows the construction of E. coli BM 2710.
- la figure 4 représente la construction de E. coli BM2710/pWR110
dans laquelle x = transfert de plasmide par conjugaison ; Tra+ =
autotransférable par conjugaison ; Tra- = non autotransférable par
conjugaison ; Mob+ = mobilisable ; KmR = résistance à la
kanamycine ; CmR = résistance au chloramphénicol.- Figure 4 shows the construction of E. coli BM2710 / pWR110
wherein x = plasmid transfer by conjugation; Tra + =
autotransferable by conjugation; Tra- = not autotransferable by
conjugation; Mob + = mobilizable; KmR = resistance to
kanamycin; CmR = resistance to chloramphenicol.
1. Constructions des vecteurs
Les vecteurs, épisomique pAT497(Figure 1) ou intégratif pAT498 (Figure 2) ont été construits.1. Constructions of the vectors
The vectors, episomal pAT497 (Figure 1) or integrative pAT498 (Figure 2) were constructed.
1.1. Construction du vecteur épisomique pAT497
Ce vecteur est représenté figure 1. Il a été construit à partir du vecteur p220-2 (12)
Le vecteur p220-2 n'est pas intégratif. Il comporte
- I'origine de réplication de pBR322, fonctionnelle chez E coli;
- un gène de résistance à l'ampicilline, bla, s'exprimant chez E coli;
- un gène de résistance à l'hygromycine B, hDh. s'exprimant chez
les cellules eucaryotes grâce au promoteur et au site de
polyadénylation de la thymidine kérase du virus de l'Herpès
simplex (tek)
- les régions EBNA-1 (Epstein-Barr nuclear antigen) et oriP du
virus Epstein-Barr qui permettent aux vecteurs de se répliquer de
manière extrachromosomique (1 à 9 copies/cellule) dans de
nombreuses cellules animales.1.1. Construction of the episomal vector pAT497
This vector is represented in FIG. 1. It was constructed from the vector p220-2 (12)
The vector p220-2 is not integrative. It comprises
The origin of replication of pBR322, functional in E. coli;
an ampicillin resistance gene, bla, expressing itself in E coli;
a hygromycin B resistance gene, hDh. speaking at
eukaryotic cells through the promoter and the site of
polyadenylation of thymidine kerase of Herpes virus
simplex (tek)
- EBNA-1 (Epstein-Barr nuclear antigen) and oriP regions of
Epstein-Barr viruses that allow vectors to replicate
extrachromosomal manner (1 to 9 copies / cell) in
many animal cells.
Le vecteur construit pAT497 consiste en un plasmide p220-2 (12) dans lequel a été cloné un fragment d'ADN de 4,75 kpb contenant le "large tumor nuclear location signal" (nls) du virus SV40 fusionné au gène lacZ (13). La protéine p-galactosidase de fusion qui en résulte (nls--Gal) est enzymatiquement active et reste associée au noyau d'un grand nombre de cellules. La synthèse de cette enzyme est un moyen de criblage rapide de la présence du plasmide dans la cellule réceptrice soit grâce à un test de coloration des cellules fixées utilisant X-gal comme substrat (10) ; soit à l'utilisation de fluorescéine Di-p-galactopyranoside (fdg) qui permet l'analyse des cellules en suspension, leur tri et leur remise en culture à l'aide d'un fluorescence activated cell sorter" (FACS). Le gène nls-lacZ s'exprime chez les cellules eucaryotes grâce au promoteur et au site de polyadénylation du virus SV40. The constructed vector pAT497 consists of a plasmid p220-2 (12) in which a 4.75 kbp DNA fragment containing the "broad tumor nuclear location signal" (nls) of the SV40 virus fused to the lacZ gene (13) was cloned. ). The resulting β-galactosidase fusion protein (nls-Gal) is enzymatically active and remains associated with the nucleus of a large number of cells. Synthesis of this enzyme is a means of rapidly screening for the presence of the plasmid in the recipient cell either through a fixed cell staining assay using X-gal as the substrate (10); or the use of fluorescein Di-β-galactopyranoside (fdg) which allows the analysis of cells in suspension, their sorting and their return to culture using a fluorescence activated cell sorter (FACS). nls-lacZ is expressed in eukaryotic cells by the SV40 promoter and polyadenylation site.
La structure du plasmide pAT497 (p220-2-nls-lacZ) est representée figure 1. Elle comporte
- pBR ori, origine de réplication procaryote;
- bila, gène de structure de la -lactamase;
- tk promoter et tk polyadénylation, promoteur et site de
polyadénylation de la thymidine kinase du virus Herpès simplex;
- hDh. gène de structure de l'hygromycine phosphotransférase
- EBNA-1, gène codant pour l'antigène nucléaire du virus Epstein
Barr;
- ori P, origine de réplication eucaryote permettant au vecteur de se
répliquer de façon extrachromosomique (1 à 90 copies par cellule)
dans de nombreuses cellules animales
- nls-lacZ, signal de localisation nucléaire de la Egalactosidase;
- SV early, promoteur précoce du virus SV40;
- SVpA, site de polyadénylation de SV40.The structure of plasmid pAT497 (p220-2-nls-lacZ) is represented in FIG.
pBR ori, prokaryotic origin of replication;
bila, structural gene of lactamase;
- tk promoter and tk polyadenylation, promoter and site of
polyadenylation of the herpes simplex virus thymidine kinase;
- hDh. structural gene of hygromycin phosphotransferase
- EBNA-1 gene coding for the nuclear antigen of the Epstein virus
Barr;
- ori P, origin of eukaryotic replication allowing the vector to
replicate extrachromosomally (1 to 90 copies per cell)
in many animal cells
nls-lacZ, nuclear localization signal of Egalactosidase;
- SV early, SV40 early promoter;
SVpA, polyadenylation site of SV40.
Les flèches indiquent la direction de transcription. Le site de coupure par endonucléase de restriction perdu au cours des clonages est indiqué entre parenthèses. La taille de ce plasmide est de 13,650 kpb. Il est composé de:
- un fragment de 8,9 kb XbaI de p220.2 (12);
- un fragment de 4.75 kb Kpnl-Xbal contenant le gène nls lacZ.The arrows indicate the direction of transcription. The restriction endonuclease cleavage site lost during cloning is indicated in parentheses. The size of this plasmid is 13.650 kbp. It is composed of:
an 8.9 kb XbaI fragment of p220.2 (12);
a 4.75 kb KpnI-XbaI fragment containing the nls lacZ gene.
Le fragment de 4,75 kb Kpnl-Xbal est purifié de l'intermédiaire constitué par un fragment Sall-BamHI de 3.5 kb de pMFG-NB (16) cloné dans le fragment Sall-Bglll de 3.26 kb de pSVE1. The 4.75 kb KpnI-XbaI fragment was purified from the 3.5 kb SalI-BamHI fragment of pMFG-NB (16) cloned into the 3.26 kb SalI-BglII fragment of pSVE1.
1.2. Construction du vecteur navette procaryote-eucaryote intégratif pAT498. 1.2. Construction of the prokaryotic-eukaryotic integrative shuttle vector pAT498.
Le plasmide pAT498 a été construit à partir du vecteur pSG21. Le vecteur pSG21 consiste en l'insertion d'un fragment nls-lacZ de 3,5 kilopaires de bases (kpb) dans le site de clonage multiple du vecteur pRc/CMV (Invitrogen). Ce fragment contient le "large tumor nuclear location signal" (nls) du virus SV40 fusionné au gène lacZ. La protéine - galactosidase de fusion qui en résulte (nls-B-Gal) est enzymatiquement active et reste associée au noyau d'un grand nombre de cellules. La synthèse de cette enzyme est un moyen de criblage rapide de la présence de plasmide dans la cellule réceptrice soit grâce à un test de coloration des cellules fixées utilisant X-Gal comme substrat (10), soit à l'utilisation de fluoresceine Dl--D-galactopyranoside (fdg) qui permet l'analyse des cellules en suspension et éventuellement leur tri et leur mise en culture à l'aide d'un "fluorescence activated cell sorter" (FACS). Le gène nls-lacZ s'exprime chez les cellules eucaryotes grâce au promoteur du cytomégalovirus et du site de polyadénylation de l'hormone de croissance bovine. Ce promoteur s'étant avéré fonctionnel également chez E. coli, on a cloné en aval, un terminateur de transcription provenant du bactériophage T4: ce nouveau vecteur a été désigné pAT498 (Figure 2). Les vecteurs pSG21 et pAT498 comportent une origine de réplication fonctionnelle chez les bactéries, un système permettant l'intégration dans le génome des cellules eucaryotes, un gène de résistance à l'ampicilline s'exprimant chez les bactéries, un gène de résistance au G418 (un dérivé de la gentamicine) s'exprimant chez les cellules eucaryotes. Plasmid pAT498 was constructed from the vector pSG21. The pSG21 vector consists of the insertion of a 3.5 kbp nls-lacZ fragment into the multiple cloning site of the pRc / CMV vector (Invitrogen). This fragment contains the "broad tumor nuclear location signal" (nls) of the SV40 virus fused to the lacZ gene. The resulting fusion protein galactosidase (nls-B-Gal) is enzymatically active and remains associated with the nucleus of a large number of cells. The synthesis of this enzyme is a means of rapidly screening for the presence of plasmid in the recipient cell either by a staining test of the fixed cells using X-Gal as substrate (10), or by the use of fluorescein D1-- D-galactopyranoside (fdg) which allows the analysis of cells in suspension and possibly their sorting and culturing using a "fluorescence activated cell sorter" (FACS). The nls-lacZ gene is expressed in eukaryotic cells by the promoter of cytomegalovirus and the polyadenylation site of bovine growth hormone. As this promoter proved functional also in E. coli, a transcription terminator from bacteriophage T4 was cloned downstream: this new vector was designated pAT498 (FIG. 2). The vectors pSG21 and pAT498 comprise a functional origin of replication in bacteria, a system allowing integration into the genome of eukaryotic cells, an ampicillin resistance gene expressing in bacteria, a G418 resistance gene ( a gentamicin derivative) expressed in eukaryotic cells.
La structure du plasmide pAT498 (pRc/CMV-nls-lacZ) est représentée figure 2. Elle comporte les éléments suivants
- pUC ori, origine de réplication procaryote;
- blq gène de structure de la -lactamase;
- CMV promoter, promoteur et enhancer du cytomégalovirus
humain;
- T7 et Sp6 promoters, production de transcrits RNA sens et antisens;
T4, terminateur de transcription;
- nls-lacZ, signal de localisation nucléaire de la Egalactosidase;
- BGH, site de polyadénylation de l'hormone de croissance bovine;
- Ru113, origine de réplication du bactériophage M13 pour la
préparation d'ADN simple-brin en vue de la séquence et de la mutagénèse
- SV early, promoteur précoce du virus SV40;
- neo. gène de structure de l'aminoside phosphotransférase de type
Il [APH(3')-ll]
- SVpA, site de polyadénylation de SV40.The structure of plasmid pAT498 (pRc / CMV-nls-lacZ) is shown in FIG. 2. It comprises the following elements
pUC ori, prokaryotic origin of replication;
- blq gene structure of the lactamase;
- CMV promoter, promoter and enhancer of cytomegalovirus
human;
- T7 and Sp6 promoters, production of sense and antisense RNA transcripts;
T4, transcription terminator;
nls-lacZ, nuclear localization signal of Egalactosidase;
- BGH, site of polyadenylation of bovine growth hormone;
- Ru113, origin of replication of bacteriophage M13 for the
single-stranded DNA preparation for sequence and mutagenesis
- SV early, SV40 early promoter;
- neo. structural gene aminoside phosphotransferase type
He [APH (3 ') - ll]
SVpA, polyadenylation site of SV40.
Les flèches indiquent la direction de transcription. La taille de ce plasmide est de 8,92 kpb. The arrows indicate the direction of transcription. The size of this plasmid is 8.92 kbp.
Il est composé de:
- un fragment BamHI de 3.5 kb contenant nls lacZ de pMFG-NB;
- un fragment Hindlll - Xbal de pRc/CMV (in vitrogen) de 5,352 bp;
- un fragment Hincll - BamHI de pTB361 (17) contenant le
terminateur de transcription du gène 32 du bactériophage T4.It is composed of:
a 3.5 kb BamHI fragment containing nls lacZ of pMFG-NB;
a HindIII-XbaI fragment of pRc / CMV (in vitrogen) of 5.352 bp;
a HinclI-BamHI fragment of pTB361 (17) containing the
bacteriophage T4 gene 32 transcription terminator.
2. Construction de la souche E coli donatrice
La souche de départ était E. coli MM294 (14) [thi-1, endAl, hsdR17(rk, mk+)]. Cette souche est:
- non cytotoxique pour les cellules réceptrices
- déficiente en endonucléase ADN spécifique I (endA) et en
endonucléase de restriction spécifique d'hôte dans le système de
restriction K [hsdR17(rk-, mk+)]. Par cinq transductions successives
à l'aide du bactériophage P1 suivies, dans chaque cas, d'un double
événement de recombinaison homologue, a été construite la souche
BM2710 (8)(figure 3). Cette dernière est: - A darda Q cat : délétion et insertion-inactivation dans le gène
darda de structure de la dihydrodipicolinate synthase (EC 4.2.1.52).2. Construction of the donating E. coli strain
The starting strain was E. coli MM294 (14) [thi-1, endAl, hsdR17 (rk, mk +)]. This strain is:
- non-cytotoxic for receptor cells
- deficient in endonuclease DNA specific I (endA) and in
host-specific restriction endonuclease in the system of
K restriction [hsdR17 (rk-, mk +)]. By five successive transductions
with bacteriophage P1 followed, in each case, by a double
homologous recombination event, was built the strain
BM2710 (8) (Figure 3). The latter is: - A darda Q cat: deletion and insertion-inactivation in the gene
structure darda of dihydrodipicolinate synthase (EC 4.2.1.52).
Le gène est doublement inactivé (par délétion et insertion), et
lorsque l'on inactive une chaîne métabolique il est plus judicieux
d'inactiver le premier maillon. Cela évite en effet, I'accumulation
dans les cellules d'un intermédiaire métabolique qui peut être
métabolisé par une autre enzyme de la cellule
- A lac : délétion de l'opération lactose. En effet, dans les
expériences préliminaires, la production chromosomique
inductible de ss-galactosidase par les bactéries gênait
l'interprétation des résultats après coloration des cellules Hela
par X-Gal;
- recA : déficience en recombinaison homologue. Cette mutation
augmente la stabilité des réplicons extrachromosomiques.The gene is doubly inactivated (by deletion and insertion), and
when we inactivate a metabolic chain it is wiser
to inactivate the first link. This avoids the accumulation of
in the cells of a metabolic intermediate that can be
metabolized by another enzyme in the cell
- At lake: deletion of the lactose operation. Indeed, in the
preliminary experiments, chromosome production
inducible of ss-galactosidase by bacteria hindered
the interpretation of the results after staining of Hela cells
by X-Gal;
- recA: deficiency in homologous recombination. This change
increases the stability of extrachromosomal replicons.
Le plasmide pWRî 10 (pWR100::Tn5) a été introduit dans BM2710 par mobilisation plasmidique à l'aide du plasmide pOX38Gm (11), dérivé du facteur F dénué de séquences d'insertion et conférant la résistance à la gentamicine. Les vecteurs épisomiques pAT497 et intégratif pAT498 ont été ensuite introduits par transformation. Plasmid pWR10 (pWR100 :: Tn5) was introduced into BM2710 by plasmid mobilization using plasmid pOX38Gm (11), derived from factor F lacking insertion sequences and conferring resistance to gentamicin. Episomal vectors pAT497 and integrative pAT498 were then introduced by transformation.
Au total les souches suivantes ont été construites
- E coli BM2710 (hôte);
- E. coli BM2710/pWRî 10 (contrôle négatif)
- E. coli BM2710/pWR110, pAT497 (donatrice)
- E. coli BM2710/pWR110, pAT498 (donatrice);
- E. coli BM2710/ pAT497 (contrôle négatif)
- E coli BM2710/pAT498 (contrôle négatif).In total the following strains were built
- E coli BM2710 (host);
E. coli BM2710 / pWRI 10 (negative control)
- E. coli BM2710 / pWR110, pAT497 (donor)
E. coli BM2710 / pWR110, pAT498 (donor);
- E. coli BM2710 / pAT497 (negative control)
- E coli BM2710 / pAT498 (negative control).
3. Transfert direct d'ADN de Ecoli aux cellules mammifères
Les vecteurs épisomiques pAT497 et intégratif pAT498 ont été
transfectés dans la lignée humaine HeLa et la lignée humaine de
carcinome pulmonaire A549 (ATCC CCL125) (15) ainsi que dans les cellules
COS et CHO ; le criblage pour le transfert s'effectuant par production de fr galactosidase (Tableau 2). L'absence de mycoplasme dans les lignées utilisées a été vérifiée dans le Laboratoire des Mycoplasmes, Institut
Pasteur (Dr. D. ROULLAND-DUSSOIX) et dans le Laboratoire de Bactériologie,
CHU Bordeaux (Pr. C. BEBEAR). Des transfectants ont été également obtenus dans les lignées A549, CHO après sélection par hygromycine B ou G418. Les clones étaient stables, après plus de deux mois de culture, mais exprimaient la ss-galactosidase de façon hétérogène après plusieurs semaines en culture.3. Direct transfer of Ecoli DNA to mammalian cells
Episomal vectors pAT497 and integrative pAT498 were
transfected into the HeLa human line and the human line of
lung carcinoma A549 (ATCC CCL125) (15) and in the cells
COS and CHO; the screening for the transfer taking place by production of galactosidase (Table 2). The absence of mycoplasma in the lines used was verified in the Laboratory of Mycoplasma, Institute
Pastor (Dr. D. ROULLAND-DUSSOIX) and in the Laboratory of Bacteriology,
CHU Bordeaux (Prof. C. BEBEAR). Transfectants were also obtained in the lines A549, CHO after selection with hygromycin B or G418. The clones were stable after more than two months of culture, but expressed s-galactosidase heterogeneously after several weeks in culture.
3.1. Le protocole de transfert est comme suit J1:
a) Préparation des cellules réceptrices (plaques en double)
- on inocule des plaques 6 puits avec 2 ml de suspension cellulaire
(soit - 5 x 104 cellulles pour COS, 1 x 105 cellules pour CHO, 2 x 105
cellules pour HeLa et A 549) en milieu DMEM + L -glutamine (2 mM)
et sérum de veau foetal (myoclone +, 10 %);
- on incube la nuit à 37"C en atmosphère enrichie à 5% en C02. 3.1. The transfer protocol is as follows J1:
a) Preparation of the receptor cells (duplicate plates)
6-well plates are inoculated with 2 ml of cell suspension
(ie - 5 x 104 cells for COS, 1 x 105 cells for CHO, 2 x 105
cells for HeLa and A 549) in DMEM + L -glutamine (2 mM)
and fetal calf serum (myoclonus +, 10%);
overnight incubation at 37 ° C in a 5% C02 enriched atmosphere.
b) Préparation des bactéries donatrices
- On inocule une culture de 5 ml de bouillon Luria supplémenté avec
0,5 mM d'acide diaminopimélique et antibiotique(s) (100pg/ml d'ampiciline)
- on incube la nuit à 30"C avec agitation.b) Preparation of donor bacteria
- Inoculate a culture of 5 ml of Luria broth supplemented with
0.5 mM diaminopimelic acid and antibiotic (s) (100 μg / ml ampicillin)
overnight incubation at 30 ° C with shaking.
J2 :
a) on incube 2 h à 37"C ;
b) on ajoute aux cellules 2 ml de DMEM + L-glu (2mM) + SVF
(myoclone +, 10 %);
c) on centrifuge les bactéries, on resuspend dans le même milieu
que les cellules et on ajoute la suspension bactérienne (de 1,5 - 106 à
2,5- 107 bactéries selon la lignée cellulaire) dans 5 puits (1 contrôle
sans bactérie par plaque)
d) on centrifuge 10 mn à 500 g à 30"C . J2:
a) Incubate 2 h at 37 ° C;
b) 2 ml of DMEM + L-glu (2mM) + FCS are added to the cells
(myoclone +, 10%);
c) the bacteria are centrifuged and resuspended in the same medium
cells and the bacterial suspension (from 1.5 - 106 to
2.5-107 bacteria according to the cell line) in 5 wells (1 control
without bacteria per plate)
d) Centrifug 10 min at 500 g at 30 ° C.
e) on incube 1h à 37 C;
f) on rince 3 fois avec 2 ml de DMEM;
g) on incube 2 jours avec 5 ml de DMEM, L-glu (3 mM), SVF
(myoclone +, 20 %), gentamicine (20 Fg/ml). e) incubate for 1 hour at 37 ° C .;
f) rinsing 3 times with 2 ml of DMEM;
g) incubate 2 days with 5 ml of DMEM, L-glu (3 mM), FCS
(myoclone +, 20%), gentamicin (20 Fg / ml).
J4 :
a) on colore une plaque avec X-Gal pour le criblage de l'activité -
galactosidase (10);
b) on incube la deuxième plaque avec de l'hygromycine B (pAT497)
ou du G418 (pAT498) pour sélectionner des clones résistants et on
laisse incuber 2 à 4 semaines.J4:
a) stain a plate with X-Gal for the screening of the activity -
galactosidase (10);
b) the second plate is incubated with hygromycin B (pAT497)
or G418 (pAT498) to select resistant clones and
incubate 2 to 4 weeks.
3.2. Résultats
L'ADN de six clones de A549 résistants à G418 obtenus indépendemment a été purifié par hybridation Southern avec une sonde spécifique du gène ash de AT498. Dans chaque transductant, un fragment d'ADN avec un mobilité électrophorétique indifférenciable de pAT498 était hybridé à la sonde. Ces résultats indiquent donc que pAT498 s'est intégré dans le génome des cellules récet > trices. 3.2. Results
DNA from six independently obtained G418-resistant A549 clones was purified by Southern hybridization with a probe specific for the AT498 ash gene. In each transductant, a DNA fragment with undifferentiated electrophoretic mobility of pAT498 was hybridized to the probe. These results therefore indicate that pAT498 has become integrated into the genome of the recipient cells.
L'ADN total de transductants résistant à l'hygromycine B obtenus dans 4 expériences indépendantes, a été analysé de manière similaire en utilisant une sonde préparée à partir de vecteur réplicatif entier, La encore, le profil d'hybridation est indifférenciable de celui de pAT497 excepté pour un ADN qui semble héberger un dimère délété dans lacZ de pAT497. The total DNA of hygromycin B-resistant transductants obtained in 4 independent experiments, was similarly analyzed using a probe prepared from whole replicative vector. Again, the hybridization profile is indistinguishable from that of pAT497. except for a DNA that seems to harbor a dimer deleted in lacZ of pAT497.
L'ADN du plasmide extrait des transductants n'était pas méthylé ce qui indique que pAT497 s'est bien répliqué dans les cellules réceptrices contrairement à celui des bactéries donnatrices. The plasmid DNA extracted from the transductants was unmethylated, indicating that pAT497 was well replicated in the recipient cells, unlike that of the donor bacteria.
Ces observations démontrent que contrairement à ce qui se passe dans les transferts par lipofection, 1'ADN transféré est zénéralement intact et n'a subi aucune altération
On a effectué quatre séries d'expériences avec des bactéries E coli hébergeant ou non le plasmide pWR110. Les résultats sont rapportés dans le tableau 1 ci-après. Ils reflètent une moyenne d'un minimum de cinq expériences indépendantes. Un transfert a été observé seulement pour les bactéries hébergeant pWR110.These observations demonstrate that unlike in lipofection transfers, the transferred DNA is zenerally intact and has not undergone any alteration.
Four series of experiments were performed with E. coli bacteria harboring or not plasmid pWR110. The results are reported in Table 1 below. They reflect an average of a minimum of five independent experiences. A transfer was observed only for bacteria harboring pWR110.
TABLEAU 1
Transfert direct d'ADN de E coli BM2710 aux cellules de mammifères
avec criblage pour la production de Egalactosidase
Lignée cellulaire
E coli BM 2710 hébergeant les plasmides
HeLa at 006 A549 pWR100 + pAT 497 +/++ ++ +++ + pAT 497 - - pWR100 + pAT 498 ++ +++ ++/++ + pAT 498 - - +/- : < 20 cellules bleues par puits + : 20 < cellules bleues par puits < 100 ++ : 100 < cellules bleues par puits < 500 : l l : 500 > cellules bleues par puits
Moyennes d'un minimum de cinq expériences indépendantes.TABLE 1
Direct transfer of E coli BM2710 DNA to mammalian cells
with screening for the production of Egalactosidase
Cell line
E coli BM 2710 harboring plasmids
HeLa at 006 A549 pWR100 + pAT 497 + / ++ ++ +++ + pAT 497 - - pWR100 + pAT 498 ++ +++ ++ / ++ + pAT 498 - - +/-: <20 blue cells per wells +: 20 <blue cells per well <100 ++: 100 <blue cells per well <500: ll: 500> blue cells per well
Averages of a minimum of five independent experiments.
La méthode de transfert selon l'invention s'avère donc une technique originale de transfert d'ADN dans les cellules de mammifères, efficace, simple et économique. Elle est en outre à large spectre de cellules réceptrices. Elle permet le transfert de vecteurs tant réplicatifs qu'intégratifs, ce qui présente un intérêt potentiel, non seulement pour la thérapie génique notamment de la mucoviscidose avec le ciblage des cellules épithéliales du poumon, mais également pour celles des cancers digestifs ainsi que pour la vaccination par stimulation de l'immunité mucosale compte tenu du ciblage des cellules épithéliales et le transfert de gène ex vivo. The transfer method according to the invention is therefore an original technique for transferring DNA into mammalian cells, efficient, simple and economical. It is also broad spectrum of receptor cells. It allows the transfer of both replicative and integrative vectors, which is of potential interest, not only for gene therapy including cystic fibrosis with the targeting of lung epithelial cells, but also for those of digestive cancers and for vaccination by stimulating mucosal immunity given the targeting of epithelial cells and ex vivo gene transfer.
Les souches suivantes ont été déposées à la CNCM (Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur, 25 rue du
Docteur Roux, Paris 75724, Cédex 15) le 27 octobre 1995:
Références d'identification Numéros d'enregistrement
E coli BM2710 1-1635
E coli BM 2710/pWR110 I - 1636
E coli BM2710/pWR110 + pAT497 I - 1637 E coli BM2710/pWR110 + pAT498 1-1638
BIBLIOGRAPHIE 1. Heinemann, J.A. & Sprague, G.F. Nature 340, 205-209 (1989).The following strains have been deposited at the CNCM (Collection
National Institute of Microorganism Cultures at the Institut Pasteur, 25 rue du
Dr. Roux, Paris 75724, Cédex 15) October 27, 1995:
Identification Credentials Registration Numbers
E coli BM2710 1-1635
E coli BM 2710 / pWR110 I - 1636
E coli BM2710 / pWR110 + pAT497 I - 1637 E coli BM2710 / pWR110 + pAT498 1-1638
BIBLIOGRAPHY 1. Heinemann, JA & Sprague, GF Nature 340, 205-209 (1989).
2. Buchanan-Wollaston, V., Passiatore, J.E, & Cannon, F. Nature 328, 170175 (1987).2. Buchanan-Wollaston, V., Passiatore, J.E., Cannon, F. Nature 328, 170175 (1987).
3. Falkow, S. Cell 65,1099-1102 (1991).3. Falkow, S. Cell 65, 1099-1102 (1991).
4. Sansonetti, P.J., Kopecko, D.J. & Formal, S.B. Infect. Immun. 35, 852-860 (1982).4. Sansonetti, P.J., Kopecko, D.J. & Formal, S.B. Infect. Immun. 35, 852-860 (1982).
5. Sansonetti, P.J. et al. Infect. Immun. 39,1392-1402 (1983).5. Sansonetti, P.J. et al. Infect. Immun. 39, 1392-1402 (1983).
6. Koch, A.L & Woeste, S.J. Bacteriol. 174,4811-4819(1992). 6. Koch, A. L & Woeste, S. J. Bacteriol. 174.4811 to 4819 (1992).
7. Cohen, G.N. & Saint Girons, I. in Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Cellular and Molecular Biology (eds Broks Low, K.,
Ingraham, J.L, Magasanik, B., Neidhardt, F.C., Schaechter, M. & Umbarger,
H.E) 429-444 (American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1987).7. Cohen, GN & Saint Girons, I. Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Cellular and Molecular Biology (Eds Broks Low, K.,
Ingraham, JL, Magasanik, B., Neidhardt, FC, Schaechter, M. & Umbarger,
HE) 429-444 (American Society for Microbiology, Washington, DC, 1987).
8. Sansonetti, P.J. et al. Infect. Immun. 60, 237-248 (1992).8. Sansonetti, P.J. et al. Infect. Immun. 60, 237-248 (1992).
9. Bachmann, B.J. in Escherichia coli and Salmonella typhimurium,
Cellular and Molecular Biology (eds Brooks Low, K., Ingraham, J.L,
Magasanik, B., Neidhardt, F.C., Schaechter, M. & Umbarger, H.E) 1190-1219 (American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1987).9. Bachmann, BJ in Escherichia coli and Salmonella typhimurium,
Cellular and Molecular Biology (Brooks Low, K., Ingraham, JL, eds.
Magasanik, B., Neidhardt, FC, Schaechter, M. & Umbarger, HE) 1190-1219 (American Society for Microbiology, Washington, DC, 1987).
10. Sanes, J.R., Rubenstein, J.LR. & Nicolas, J.F. EMBOJ. 5, 3133-3142 (1986).10. Sanes, J.R., Rubenstein, J.LR. & Nicolas, J.F. EMBOJ. 5, 3133-3142 (1986).
11. Makris, J.C., Nordmann, P.L & Renznikoff, W.S. Proc. Natn. Acad. Sci.11. Makris, J.C., Nordmann, P.L. & Renznikoff, W.S. Proc. Natn. Acad. Sci.
USA 85, 222C2228 (1988).USA 85, 222C2228 (1988).
12. Yates, J.L, Warren, N. & Sugden, B. Nature 313,812-815(1985). 12. Yates, J.L., Warren, N. & Sugden, B. Nature 313, 812-815 (1985).
13. Kalderon et al. 1984 A short amino acid sequence able to specify nuclear location. Celle 39: 499-509.13. Kalderon et al. 1984 A short amino acid sequence able to specify nuclear location. That 39: 499-509.
14. Lauer et al. 1981. Construction of overproducers of the bacteriophage 434 repressor and coproteins. J. Mol. Appl. Genet. 1:139-147. 14. Lauer et al. 1981. Construction of overproducers of the bacteriophage 434 repressor and coproteins. J. Mol. Appl. Broom. 1: 139-147.
15. Giard et al. 1973 In vitro cultivation of human tumors : establishment of cell lines derived from a serie of solid tumors J. Natl. Cancer Inst.15. Giard et al. 1973 In vitro cultivation of human tumors: Establishment of cell lines derived from a series of solid tumors J. Natl. Cancer Inst.
(Bethesda) 1417-1423. (Bethesda) 1417-1423.
16. Ferry, N. et al. Proc. Natn. Acad. Sci. USA 88, 8377-8381(1991). 16. Ferry, N. et al. Proc. Natn. Acad. Sci. USA 88, 8377-8381 (1991).
17. Brockbank, S.M. & Barth, P.T. J. Bacteriol. 175, 3269-3277 (1993).17. Brockbank, S.M. & Barth, P.T. J. Bacteriol. 175, 3269-3277 (1993).
18. Birnboim, H.C. and Doly, J. Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523 (1979). 18. Birnboim, H. C. and Doly, J. Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523 (1979).
Claims (20)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9515556A FR2743086B1 (en) | 1995-12-27 | 1995-12-27 | GENE TRANSFER IN EUKARYOTIC CELLS FROM E. COLI BACTERIA |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9515556A FR2743086B1 (en) | 1995-12-27 | 1995-12-27 | GENE TRANSFER IN EUKARYOTIC CELLS FROM E. COLI BACTERIA |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2743086A1 true FR2743086A1 (en) | 1997-07-04 |
| FR2743086B1 FR2743086B1 (en) | 1998-03-27 |
Family
ID=9486007
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9515556A Expired - Fee Related FR2743086B1 (en) | 1995-12-27 | 1995-12-27 | GENE TRANSFER IN EUKARYOTIC CELLS FROM E. COLI BACTERIA |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2743086B1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999029884A3 (en) * | 1997-12-11 | 1999-08-12 | Von Eichel Streiber Christoph | Tgc method for inducting targeted somatic transgenesis |
| EP2045331A1 (en) * | 2007-10-02 | 2009-04-08 | Institut Pasteur | Attenuated invasive E. coli strains and their applications as an intracellular vector for therapeutic molecules |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2564482A1 (en) * | 1984-05-18 | 1985-11-22 | Int Genetic Sciences | TRANSFORMATION OF LOWER EUKARYOTIC CELLS BY NATURAL FEEDING USING BACTERIA CONTAINING CHLORAMPHENICOL INDUCED PLASMIDS |
| EP0211543A1 (en) * | 1985-07-31 | 1987-02-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Invasive microorganisms |
| WO1990012867A1 (en) * | 1989-04-19 | 1990-11-01 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Invasive microorganisms |
-
1995
- 1995-12-27 FR FR9515556A patent/FR2743086B1/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2564482A1 (en) * | 1984-05-18 | 1985-11-22 | Int Genetic Sciences | TRANSFORMATION OF LOWER EUKARYOTIC CELLS BY NATURAL FEEDING USING BACTERIA CONTAINING CHLORAMPHENICOL INDUCED PLASMIDS |
| EP0211543A1 (en) * | 1985-07-31 | 1987-02-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Invasive microorganisms |
| WO1990012867A1 (en) * | 1989-04-19 | 1990-11-01 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Invasive microorganisms |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| COURVALIN, PATRICE ET AL: "Gene transfer from bacteria to mammalian cells", C. R. ACAD. SCI., SER. III (1995), 318(12), 1207-12 CODEN: CRASEV;ISSN: 0764-4469, 8 January 1996 (1996-01-08), XP002015552 * |
| DUCLUZEAU, R. ET AL: "Implantation of a mutant of Escherichia coli requiring diaminopimelic acid in the digestive tract of gnotobiotic mice", ANN. INST. PASTEUR/MICROBIOL. (1986), 137A(1), 79-87 CODEN: AIPME3, XP002015550 * |
| HEINEMANN J A ET AL: "BACTERIAL CONJUGATIVE PLASMIDS MOBILIZE DNA TRANSFER BETWEEN BACTERIA AND YEAST", NATURE (LONDON), 340 (6230). 1989. 205-209., XP002015548 * |
| HEITMANN D ET AL: "FREQUENCY AND CONDITIONS OF SPONTANEOUS PLASMID TRANSFER FROM ESCHERICHIA-COLI TO CULTURED-MAMMALIAN-CELLS", BIOSYSTEMS, 1993, 29, 37-48, XP002015547 * |
| KOTLOFF, KAREN L. ET AL: "Safety, immunogenicity, and efficacy in monkeys and humans of invasive Escherichia coli K-12 hybrid vaccine candidates expressing Shigella flexneri 2a somatic antigen", INFECT. IMMUN. (1992), 60(6), 2218-24 CODEN: INFIBR;ISSN: 0019-9567, XP002015551 * |
| SANSONETTI P J ET AL: "ALTERATIONS IN THE PATHOGENICITY OF ESCHERICHIA-COLI K-12 AFTER TRANSFER OF PLASMID AND CHROMOSOMAL GENES FROM SHIGELLA-FLEXNERI", INFECTION AND IMMUNITY, 39 (3). 1983. 1392-1402., XP002015549 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999029884A3 (en) * | 1997-12-11 | 1999-08-12 | Von Eichel Streiber Christoph | Tgc method for inducting targeted somatic transgenesis |
| AU751517B2 (en) * | 1997-12-11 | 2002-08-15 | Trinad Chakraborty | TGC method for inducting targeted somatic transgenesis |
| EP2045331A1 (en) * | 2007-10-02 | 2009-04-08 | Institut Pasteur | Attenuated invasive E. coli strains and their applications as an intracellular vector for therapeutic molecules |
| WO2009043921A1 (en) * | 2007-10-02 | 2009-04-09 | Institut Pasteur | Attenuated invasive e. coli strains and applications thereof as intracellular vector for therapeutic molecule |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2743086B1 (en) | 1998-03-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4975630B2 (en) | Bacteria vector | |
| EP2250270B1 (en) | Method for the targeted integration of multiple copies of a gene of interest in a yarrowia strain | |
| CA2222761A1 (en) | Recombinant bacterial system with environmentally limited viability | |
| EP1366176A2 (en) | Synthetic genes and bacterial plasmids devoid of cpg | |
| CA2407709A1 (en) | Regulated antigen delivery system (rads) involving bacteria | |
| PT2753364T (en) | A conditional replicating cytomegalovirus as a vaccine for cmv | |
| EP1349925A2 (en) | Functional balanced-lethal host-vector systems | |
| FR2920158A1 (en) | PLASMID PRODUCTION AND EXPRESSION OF RECOMBINANT PROTEINS IN CULTIVATED CELLS WITHOUT ANTIBIOTICS | |
| CA2121598A1 (en) | M. paratuberculosis promoter and use thereof for the expression of immunogen sequences | |
| EP0012078B1 (en) | Vector allowing the insertion of a procaryotic or eucaryotic gene, and the excretion of the expressed protein | |
| FR2743086A1 (en) | Vector system for introducing foreign DNA into eukaryotic cells | |
| WO1993008284A1 (en) | M. paratuberculosis promoter and use thereof in immunogenic sequence expression | |
| EP0258118A1 (en) | Process for stabilizing a plasmid contained in a bacterial strain, and strain obtained | |
| AU2001292051B2 (en) | Stabilisation of plasmid inheritance in bacteria by preventing multimerisation | |
| EP2310511B1 (en) | Self-replicating vector lacking an antibiotic-resistance gene | |
| CA2760275C (en) | Modification of the genome of a lytic bacteriophage by immobilizing said bacteriophage in the host bacterium thereof | |
| EP1315822A2 (en) | Modified construct downstream of the initiation codon for recombinant protein overexpression | |
| WO1993001293A1 (en) | Plasmid replication origin increasing the number of copies of the plasmid containing said origin | |
| CA2077347C (en) | Cloning vectors and/or expression, their preparation process and their use | |
| EP0760859A1 (en) | Shuttle vectors for the introduction of dna into mycobacteria and utilization of such bacteria as vaccines | |
| EP3601545B1 (en) | Production of rna by yeasts with recombinant pseudo-viral particles | |
| EP2205747A1 (en) | Attenuated invasive e. coli strains and applications thereof as intracellular vector for therapeutic molecule | |
| EP0133403A2 (en) | Nucleotide sequence coding for the signal peptide of diphteria toxin, vector containing this nucleotide sequence, its use in the transformation of microorganisms and peptide compositions obtained therefrom. | |
| Zelmer | Intracellular bacteria as DNA carriers in vitro and in vivo | |
| Endmann | Novel Salmonella vectors with in vivo amplifiable plasmids for vaccination and tumor therapy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |