JP2622252B2 - リソチームを生産する形質転換された酵母菌およびこの形質転換に使用するプラスミド - Google Patents
リソチームを生産する形質転換された酵母菌およびこの形質転換に使用するプラスミドInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、異質遺伝子のDNAを使用する形質転換によ
り、1,4−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼ型の酵素を生
産することができるようにされた酵母菌に関する。
り、1,4−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼ型の酵素を生
産することができるようにされた酵母菌に関する。
1,4−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼは、バクテリア
の細胞壁を形成するペプチドグリカン類中のＮ−アセチ
ルグルコサミンとＮ−アセチルムラミンとの間のグルコ
ース結合を選択的に切離すことができる酵素であること
は知られている。これらの酵素は、いっそう普通にはリ
ソチーム（リゾチーム）と呼ばれており、こうして殺バ
クテリア剤として作用し、そしてこの性質は高等動物の
生物学的流体の大部分の中のそれらの一般化された存在
を説明するように思われる。リソチームは、事実、種々
の濃度レベルで、哺乳動物の血液、涙、乳などの中に見
出される。また、植物界、例えば、パパイアにおいて見
出される。リソチームの工業的抽出は卵白から実施され
おり、ここでそれは種々の吸着および／または沈殿法
（ベルギー国特許694,538号）により、比較的大きい濃
度で存在する。
の細胞壁を形成するペプチドグリカン類中のＮ−アセチ
ルグルコサミンとＮ−アセチルムラミンとの間のグルコ
ース結合を選択的に切離すことができる酵素であること
は知られている。これらの酵素は、いっそう普通にはリ
ソチーム（リゾチーム）と呼ばれており、こうして殺バ
クテリア剤として作用し、そしてこの性質は高等動物の
生物学的流体の大部分の中のそれらの一般化された存在
を説明するように思われる。リソチームは、事実、種々
の濃度レベルで、哺乳動物の血液、涙、乳などの中に見
出される。また、植物界、例えば、パパイアにおいて見
出される。リソチームの工業的抽出は卵白から実施され
おり、ここでそれは種々の吸着および／または沈殿法
（ベルギー国特許694,538号）により、比較的大きい濃
度で存在する。
ニワトリリソチームの現在の用途は大抵が製薬学的分
野であり、ここでそれは種々の感染と戦うために使用さ
れている。他の用途は食品産業である。例えば、リソチ
ームはベーキングし圧縮されたチーズの製造において、
熟成の間のチーズの膨張をも含む製造欠陥品の原因とな
る酪酸バクテリアの発生を効率よく阻止するために使用
することができることは知られている（フランス国特許
8003321号）。それは、また、種々の腐敗性食品、例え
ば、肉製品（A.アカシ,Jap・J.Zootechnical Sci.）4
2,1971,289）、ワイン（日本国特許3115/71、1971）ま
たは酒（M.ヤジマら、J.Ferm.Technol.）46,1968,782）
の保存のために使用することができる。さらに、それは
小児科の使用のためにミルク成分の保存（日本国特許16
780/70,1970）などに使用することができる。
野であり、ここでそれは種々の感染と戦うために使用さ
れている。他の用途は食品産業である。例えば、リソチ
ームはベーキングし圧縮されたチーズの製造において、
熟成の間のチーズの膨張をも含む製造欠陥品の原因とな
る酪酸バクテリアの発生を効率よく阻止するために使用
することができることは知られている（フランス国特許
8003321号）。それは、また、種々の腐敗性食品、例え
ば、肉製品（A.アカシ,Jap・J.Zootechnical Sci.）4
2,1971,289）、ワイン（日本国特許3115/71、1971）ま
たは酒（M.ヤジマら、J.Ferm.Technol.）46,1968,782）
の保存のために使用することができる。さらに、それは
小児科の使用のためにミルク成分の保存（日本国特許16
780/70,1970）などに使用することができる。
これらの種々の用途は、リソチームを容易に、大量に
かつ十分に低いコストで生産することができるかぎり、
かなりの潜在的市場を提供する。卵白からリソチームを
抽出することを現在可能とする種々の方法は、卵白を処
理した後食品中に再使用することができる場合にのみ、
商業的に許容されうる。したがって、リソチームの生産
能力は卵白の市場により部分的に規制され、そしてこれ
は標準食品における処理された卵白の使用に反対する、
技術的困難、およびある国における法律的拘束の解決を
一層困難とする問題を生ずる。
かつ十分に低いコストで生産することができるかぎり、
かなりの潜在的市場を提供する。卵白からリソチームを
抽出することを現在可能とする種々の方法は、卵白を処
理した後食品中に再使用することができる場合にのみ、
商業的に許容されうる。したがって、リソチームの生産
能力は卵白の市場により部分的に規制され、そしてこれ
は標準食品における処理された卵白の使用に反対する、
技術的困難、およびある国における法律的拘束の解決を
一層困難とする問題を生ずる。
これらの問題は、リソチームの天然源の入手可能性に
関係し、その初期濃度が、牛週のリソチームについての
ように、低過ぎるか、あるいは原料が、ヒトのリソチー
ムのように、実際的に存在しないかどうかについて、哺
乳動物のリソチームの場合において克服不可能となる。
こうして、リソチームの生産を可能としかつ前述の問題
を回避することのできる技術が必要とされるように思わ
れる。
関係し、その初期濃度が、牛週のリソチームについての
ように、低過ぎるか、あるいは原料が、ヒトのリソチー
ムのように、実際的に存在しないかどうかについて、哺
乳動物のリソチームの場合において克服不可能となる。
こうして、リソチームの生産を可能としかつ前述の問題
を回避することのできる技術が必要とされるように思わ
れる。
本発明の主目的は、遺伝子工学の古典的技術によりリ
ソチームを生産することができるようにする酵母菌を提
供することである。さらに詳しくは、本発明は、DNAが
1,4−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼの遺伝情報を指定
する（またはコードする）断片の少なくとも１つのコピ
ーからなり、かつこの断片が対応する活性蛋白質として
その中で発現されるように形質転換された酵母菌に関す
る。本発明の他の目的は、前述のように形質形成されて
いるが、また生産したリソチームを分泌して、その分離
および精製を促進することができる酵母菌を提供するこ
とである。この形質転換を保証するプラスミドならびに
形質転換された酵母菌を生長させることによりリソチー
ムを生産する方法は、また、本発明の目的を形成する。
これらの目的ならびに本発明の他の利点および実施は以
下の説明から明らかとなるであろう。
ソチームを生産することができるようにする酵母菌を提
供することである。さらに詳しくは、本発明は、DNAが
1,4−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼの遺伝情報を指定
する（またはコードする）断片の少なくとも１つのコピ
ーからなり、かつこの断片が対応する活性蛋白質として
その中で発現されるように形質転換された酵母菌に関す
る。本発明の他の目的は、前述のように形質形成されて
いるが、また生産したリソチームを分泌して、その分離
および精製を促進することができる酵母菌を提供するこ
とである。この形質転換を保証するプラスミドならびに
形質転換された酵母菌を生長させることによりリソチー
ムを生産する方法は、また、本発明の目的を形成する。
これらの目的ならびに本発明の他の利点および実施は以
下の説明から明らかとなるであろう。
酵母菌を異種遺伝子により形成された解読部分により
形質転換することにより、あるいは対応するメッセンジ
ャーRNAの逆転写の生産物により、酵母菌を遺伝学的に
再プログラミングすることは知られている。この目的
に、宿主細胞の複製機構により認識される複製起源の存
在により酵母菌細胞中で自律的に複製することができる
プラスミドを、前記断片のベクターとして通常使用され
ている。ベクターは、また、プラスミドにより効率よく
形質転換された細胞の可視化および選択を可能とする標
識遺伝子（marker gene）を含まなくてはならない。最
後に、解読部分の前にプロモーター、すなわち、解読部
分の対応するメッセンジャーRNAへの効率よい転写を保
証するような宿主細胞のRNAポリメラーゼにより認識さ
れる配列が存在しなくてはならない。
形質転換することにより、あるいは対応するメッセンジ
ャーRNAの逆転写の生産物により、酵母菌を遺伝学的に
再プログラミングすることは知られている。この目的
に、宿主細胞の複製機構により認識される複製起源の存
在により酵母菌細胞中で自律的に複製することができる
プラスミドを、前記断片のベクターとして通常使用され
ている。ベクターは、また、プラスミドにより効率よく
形質転換された細胞の可視化および選択を可能とする標
識遺伝子（marker gene）を含まなくてはならない。最
後に、解読部分の前にプロモーター、すなわち、解読部
分の対応するメッセンジャーRNAへの効率よい転写を保
証するような宿主細胞のRNAポリメラーゼにより認識さ
れる配列が存在しなくてはならない。
実際には、これらの技術は主として種サッカロミセス
・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）の酵母
菌に適用されてきた。前記酵母菌のためには種々の要素
からなる大きい数の発現ベクター（expression vecto
r）が構成されてきている。これらのベクターは、一般
に、この種の大部分の中に存在する２−ミクロンのプラ
スミドの複製起源を含み、あるいは染色体起源の自律的
複製のARSセグメントさえを含む。標識遺伝子として、
必須代謝物、例えばアミノ酸の生物学的合成に参加する
酵素の遺伝情報を指定する遺伝子が一般に使用される。
このような場合において、使用すべき宿主は、突然変異
により、この代謝物について栄養要求変異種となった酵
母菌菌株である。この菌株を接種することにより、ミッ
シング（missing）遺伝子を有するプラスミドにより形
質転換された細胞のみが生長することができるであろ
う。このような遺伝標識の典型的な例は、遺伝子LEU２
またはTRP１であり、これらはそれぞれロイシンおよび
トリプトファンの生合成に参加する酵素の遺伝情報を指
定する。これらの発現ベクターは、また、１つあるいは
好ましくはいくつかの制限部位を含み、前記部位に問題
の解読部分、ならびにその発現を最適化するために必要
な種々の要素、すなわち、プロモーター、ターミネータ
ー、および他の調節要素が挿入される。
・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）の酵母
菌に適用されてきた。前記酵母菌のためには種々の要素
からなる大きい数の発現ベクター（expression vecto
r）が構成されてきている。これらのベクターは、一般
に、この種の大部分の中に存在する２−ミクロンのプラ
スミドの複製起源を含み、あるいは染色体起源の自律的
複製のARSセグメントさえを含む。標識遺伝子として、
必須代謝物、例えばアミノ酸の生物学的合成に参加する
酵素の遺伝情報を指定する遺伝子が一般に使用される。
このような場合において、使用すべき宿主は、突然変異
により、この代謝物について栄養要求変異種となった酵
母菌菌株である。この菌株を接種することにより、ミッ
シング（missing）遺伝子を有するプラスミドにより形
質転換された細胞のみが生長することができるであろ
う。このような遺伝標識の典型的な例は、遺伝子LEU２
またはTRP１であり、これらはそれぞれロイシンおよび
トリプトファンの生合成に参加する酵素の遺伝情報を指
定する。これらの発現ベクターは、また、１つあるいは
好ましくはいくつかの制限部位を含み、前記部位に問題
の解読部分、ならびにその発現を最適化するために必要
な種々の要素、すなわち、プロモーター、ターミネータ
ー、および他の調節要素が挿入される。
これらのプラスミドは中間のバクテリア宿主、例え
ば、E.coli中の複製および選択を保証することのできる
バクテリアの配列からしばしばなる。このようなシャト
ル（shuttle）プラスミドの古典的例として、YEp13［J.
R.ブローチ（Broach）ら，遺伝子（Gene）８,1979,12
1］、pFL1−４［M.R.チェバリエール（Cheballier）
ら，遺伝子（Gene）11,1980,11］、et pJDB207［J.D.
ベッグス（Beggs），アルフレッド・ベンソン・シンポ
ジウム（Alfred Benson Symposium）Ｎ゜16,ムンクス
ガード（Munksgaarg），コペンハーゲン（Copenhagen）
1981,383ページ］、pMH158およびpJO158［M.ヘウステル
スプレウテ（Heusterspreute）ら，遺伝子（Gene），ア
ンダー・プレス（under press）］を引用することがで
きる。
ば、E.coli中の複製および選択を保証することのできる
バクテリアの配列からしばしばなる。このようなシャト
ル（shuttle）プラスミドの古典的例として、YEp13［J.
R.ブローチ（Broach）ら，遺伝子（Gene）８,1979,12
1］、pFL1−４［M.R.チェバリエール（Cheballier）
ら，遺伝子（Gene）11,1980,11］、et pJDB207［J.D.
ベッグス（Beggs），アルフレッド・ベンソン・シンポ
ジウム（Alfred Benson Symposium）Ｎ゜16,ムンクス
ガード（Munksgaarg），コペンハーゲン（Copenhagen）
1981,383ページ］、pMH158およびpJO158［M.ヘウステル
スプレウテ（Heusterspreute）ら，遺伝子（Gene），ア
ンダー・プレス（under press）］を引用することがで
きる。
本発明の好ましい実施態様によれば、２−ミクロンの
内因性プラスミドの配列のREP機能から少なくともなる
プラスミドを、主として宿主細胞がS.cerevisiae種に属
するとき、使用する。前記機能は、とくに宿主細胞が前
もって２−ミクロンのプラスミドがキユアリングされて
いる場合［C.P.ホレンバーグ（Hollenberg）ら,Curr.To
p.Microbiol.Immunol.）96,1982,119;R.M.ワルムスレイ
（Walmsley）ら，モレキュラー・アンド・ジェネラル・
ジェネティックス（Mol.Gen.Genet.）1983,361］一般に
プラスミドに一層大きい安定性をもたらす。この型の他
のベクターは、下の実施例に記載されている。
内因性プラスミドの配列のREP機能から少なくともなる
プラスミドを、主として宿主細胞がS.cerevisiae種に属
するとき、使用する。前記機能は、とくに宿主細胞が前
もって２−ミクロンのプラスミドがキユアリングされて
いる場合［C.P.ホレンバーグ（Hollenberg）ら,Curr.To
p.Microbiol.Immunol.）96,1982,119;R.M.ワルムスレイ
（Walmsley）ら，モレキュラー・アンド・ジェネラル・
ジェネティックス（Mol.Gen.Genet.）1983,361］一般に
プラスミドに一層大きい安定性をもたらす。この型の他
のベクターは、下の実施例に記載されている。
最後に、問題の解読部分の発現をできるだけ高いレベ
ルにするために、それをプローモータとできるだけ効率
よく会合（associate）することが必要である。種々の
強いプロモーターが酵母菌において知られており、それ
らの例はアルコールデヒドロゲナーゼ（ADH1）、エノラ
ーゼ（ENO8およびENO46）、グリセルアルデヒド−３−
ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GAP63およびGAP49
1）、ホスホグリセレートキナーゼ（PGK）［M.J.ドブソ
ン（Dobson）ら，核酸研究（Nucleic Asids Res.）1
0,1982,2625］およびアルカリ性ホスファターゼ（PHO3
およびPHO5）（欧州特許出願100,561号）のプロモータ
ー、あるいはなおプロモーターp415（これについては後
述する）である。
ルにするために、それをプローモータとできるだけ効率
よく会合（associate）することが必要である。種々の
強いプロモーターが酵母菌において知られており、それ
らの例はアルコールデヒドロゲナーゼ（ADH1）、エノラ
ーゼ（ENO8およびENO46）、グリセルアルデヒド−３−
ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GAP63およびGAP49
1）、ホスホグリセレートキナーゼ（PGK）［M.J.ドブソ
ン（Dobson）ら，核酸研究（Nucleic Asids Res.）1
0,1982,2625］およびアルカリ性ホスファターゼ（PHO3
およびPHO5）（欧州特許出願100,561号）のプロモータ
ー、あるいはなおプロモーターp415（これについては後
述する）である。
これらの種々の技術は、酵母菌中の多くの異種遺伝子
のクローニングおよび発現に首尾よく適用されてきてお
り、もちろん、リソチームの遺伝子または1,4−β−Ｎ
−アセチルムラミダーゼの遺伝情報を指定するDNAの部
分の酵母菌中の発現を保証するために同様によく使用す
ることができる。特定の構造の例は、本発明において例
示のために与えられているが、多くの他の可能性が存在
すること、および複製起源、標識遺伝子、効率よいプロ
モーターおよび他の構造的要素の種々の組み合わせを使
用して同様な結果を得ることができることは明らかであ
る。したがって、種々の場合において得られる形質転換
された細胞は、本発明お範囲内に包含されるものと考え
なくてはならない。
のクローニングおよび発現に首尾よく適用されてきてお
り、もちろん、リソチームの遺伝子または1,4−β−Ｎ
−アセチルムラミダーゼの遺伝情報を指定するDNAの部
分の酵母菌中の発現を保証するために同様によく使用す
ることができる。特定の構造の例は、本発明において例
示のために与えられているが、多くの他の可能性が存在
すること、および複製起源、標識遺伝子、効率よいプロ
モーターおよび他の構造的要素の種々の組み合わせを使
用して同様な結果を得ることができることは明らかであ
る。したがって、種々の場合において得られる形質転換
された細胞は、本発明お範囲内に包含されるものと考え
なくてはならない。
同様に、これらの技術の大部分は酵母菌S.cerevisiae
の形質転換に主として適用されてきたが、また、上に述
べたのと同一の型の発現ベクターおよびそれらの変異種
により形質転換可能な酵母菌の他の種および属から得ら
れる形質転換された細胞は本発明に包含される。他の例
として、サッカロミコプシス・リポリティカ（Saccharo
mycopsis lipolytica）、スキゾサッカロミセス・ポン
ベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロミセス
・ラクチス（Kluyveromyces lactis）なとを引用する
ことができる。しかしながら、本発明の好ましい実施態
様によれば、サッカロミセス（Saccharomyces）属から
の形質転換可能な酵母菌、なお好ましくはS.cerevisiae
種からの形質転換可能な酵母菌が使用されるであろう。
この種に属する形質転換可能な例として、なかでもAH22
およびGRF18を引用することができる。
の形質転換に主として適用されてきたが、また、上に述
べたのと同一の型の発現ベクターおよびそれらの変異種
により形質転換可能な酵母菌の他の種および属から得ら
れる形質転換された細胞は本発明に包含される。他の例
として、サッカロミコプシス・リポリティカ（Saccharo
mycopsis lipolytica）、スキゾサッカロミセス・ポン
ベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロミセス
・ラクチス（Kluyveromyces lactis）なとを引用する
ことができる。しかしながら、本発明の好ましい実施態
様によれば、サッカロミセス（Saccharomyces）属から
の形質転換可能な酵母菌、なお好ましくはS.cerevisiae
種からの形質転換可能な酵母菌が使用されるであろう。
この種に属する形質転換可能な例として、なかでもAH22
およびGRF18を引用することができる。
本発明に従いこれらの種々の酵母菌により生産される
1,4−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼは異る起源を有す
ることができる。それは、例えば、ニワトリリソチーム
であることができる。ニワトリリソチームは、前述のよ
うに、すでに工業的に生産されている。しかしながら、
他の源からのリソチームの遺伝情報を指定するDNA部分
は、これらの種々のリソチームが、異る程度に、顕著な
相同性を表わす［P.ジョレス（Jolles）ら，モレキュラ
ー・アンド・バイオケミストリー（Mol.＆ Biochemist
ry）63,1984,165］ので、他の源からのリソチームの遺
伝情報を指定するDNA部分も同様に酵母菌中で発現され
うる。例えば、酵母菌中でガチョウのリソチームを発現
することができる。ガチョウのリソチームはニワトリの
リソチームよりも顕著に高い特異的活性を有する［R.C.
カンフィールド（Canfield）ら，「リソチーム（Lysozy
me）」,E.F.オッセルマン（Osserman）ら編，アカデミ
ック・プレス（Academic Press）,1974,63ページ］。
また、ヒトのリソチームを酵母菌中で発現することがで
き、このリソチームは、また、非常に活性であり、そし
てとくに製薬学的用途ならびに小児科で使用されるミル
ク組成物中に適用される。パパイアからのリソチーム、
およびバクテリアのウイルスにより解読されるものも引
用することができる。
1,4−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼは異る起源を有す
ることができる。それは、例えば、ニワトリリソチーム
であることができる。ニワトリリソチームは、前述のよ
うに、すでに工業的に生産されている。しかしながら、
他の源からのリソチームの遺伝情報を指定するDNA部分
は、これらの種々のリソチームが、異る程度に、顕著な
相同性を表わす［P.ジョレス（Jolles）ら，モレキュラ
ー・アンド・バイオケミストリー（Mol.＆ Biochemist
ry）63,1984,165］ので、他の源からのリソチームの遺
伝情報を指定するDNA部分も同様に酵母菌中で発現され
うる。例えば、酵母菌中でガチョウのリソチームを発現
することができる。ガチョウのリソチームはニワトリの
リソチームよりも顕著に高い特異的活性を有する［R.C.
カンフィールド（Canfield）ら，「リソチーム（Lysozy
me）」,E.F.オッセルマン（Osserman）ら編，アカデミ
ック・プレス（Academic Press）,1974,63ページ］。
また、ヒトのリソチームを酵母菌中で発現することがで
き、このリソチームは、また、非常に活性であり、そし
てとくに製薬学的用途ならびに小児科で使用されるミル
ク組成物中に適用される。パパイアからのリソチーム、
およびバクテリアのウイルスにより解読されるものも引
用することができる。
本発明に従い、酵母菌菌株が遺伝子工学により誘導さ
れて１つまたは他の起源からリソチームを生産すると
き、この新規な性質の利用して、それをその生長に最も
適当な条件下で発酵させることにより増殖することが必
要である。このようにして、それ自体人間または動物の
食糧中に使用できるバイオマスが得られる。例えば、酵
母菌の自己分解物は、それ自体栄養価をもつばかりでな
く、かつまた感覚器官の性質をもつため、種々の食品
（ミートパイ、スープ、ソースなど）における添加剤と
して多少使用されることは知られている。もとの酵母菌
中のリソチームの存在は、自己分解物が混入される食品
のように、自己分解物がさらされるバクテリアの汚染か
ら自己分解物を、ある程度まで、保存するという利点を
提供する。他方において、リソチームの存在は食品の滅
菌温度を低下させる（英国特許1,438,569号）。
れて１つまたは他の起源からリソチームを生産すると
き、この新規な性質の利用して、それをその生長に最も
適当な条件下で発酵させることにより増殖することが必
要である。このようにして、それ自体人間または動物の
食糧中に使用できるバイオマスが得られる。例えば、酵
母菌の自己分解物は、それ自体栄養価をもつばかりでな
く、かつまた感覚器官の性質をもつため、種々の食品
（ミートパイ、スープ、ソースなど）における添加剤と
して多少使用されることは知られている。もとの酵母菌
中のリソチームの存在は、自己分解物が混入される食品
のように、自己分解物がさらされるバクテリアの汚染か
ら自己分解物を、ある程度まで、保存するという利点を
提供する。他方において、リソチームの存在は食品の滅
菌温度を低下させる（英国特許1,438,569号）。
本発明による酵母菌は、また、リソチームを酵母菌か
ら分離することにより、精製されたリソチームの源とし
て使用することもできる。しかしながら、明らかなよう
に、この操作は、リソチームが細胞内で他の細胞蛋白質
と会合する場合、かなりの困難をもたらす。リソチーム
が古典的方法により、例えば、吸着および／または沈殿
（ベルギー国特許694,538号）により、培地からこれが
開放されるか、あるいはそれが他の方法により分離され
る細胞壁に会合してとどまるかにかかわらず、生産され
たリソチームを分泌できる酵母菌を提供することは、こ
うして、本発明の重要な面である。プレリソチーム（pr
elysozyme）のＮ−末端部分に存在しかつリソチームを
ニワトリの卵管細胞の小胞体のルーメン中に分泌させる
18個のアミノ酸のシグナル配列は、また、酵母菌細胞に
より認識されることが、驚くべきことには観測された。
次の実施例が事実示すように、ニワトリプレリソチーム
の遺伝情報を指定するDNAが酵母菌中で発現されると
き、この発現の生産物はそれから分泌される。したがっ
て、このシグナル配列の遺伝情報を指定する54−ヌクレ
オチド断片を、他の起源からのリソチームを包含する他
の蛋白質の構造部分の遺伝情報を指定するDNAと融合す
ると、前記蛋白質を生産する酵母菌細胞から前記蛋白質
は分泌されるであろう。
ら分離することにより、精製されたリソチームの源とし
て使用することもできる。しかしながら、明らかなよう
に、この操作は、リソチームが細胞内で他の細胞蛋白質
と会合する場合、かなりの困難をもたらす。リソチーム
が古典的方法により、例えば、吸着および／または沈殿
（ベルギー国特許694,538号）により、培地からこれが
開放されるか、あるいはそれが他の方法により分離され
る細胞壁に会合してとどまるかにかかわらず、生産され
たリソチームを分泌できる酵母菌を提供することは、こ
うして、本発明の重要な面である。プレリソチーム（pr
elysozyme）のＮ−末端部分に存在しかつリソチームを
ニワトリの卵管細胞の小胞体のルーメン中に分泌させる
18個のアミノ酸のシグナル配列は、また、酵母菌細胞に
より認識されることが、驚くべきことには観測された。
次の実施例が事実示すように、ニワトリプレリソチーム
の遺伝情報を指定するDNAが酵母菌中で発現されると
き、この発現の生産物はそれから分泌される。したがっ
て、このシグナル配列の遺伝情報を指定する54−ヌクレ
オチド断片を、他の起源からのリソチームを包含する他
の蛋白質の構造部分の遺伝情報を指定するDNAと融合す
ると、前記蛋白質を生産する酵母菌細胞から前記蛋白質
は分泌されるであろう。
しかしながら、本発明の最も基本的かつ最も驚くべき
面は、リソチーム遺伝子を酵母菌中でその中で致死作用
を、例えば、細胞の溶解により、及ぼさないで発現する
ことができるという事実である。異種細胞中でリソチー
ム遺伝子をクローニングしかつ発現する唯一の既知の例
は、HellaおよびMCF7−ヒト細胞系統中のニワトリリソ
チーム遺伝子のクローニングである［P.O.マチアス（Ma
tthias）ら，ユーロピアン・モレキュラー・バイオロジ
ー・オーガニゼイション・ジャーナル（EMBO J.），
１,1982,1207］であるが、遺伝子の発現は対応するメッ
センジャーRNAによってのみ証明され、そして蛋白質自
体の生産によって立証されなかった。バクテリウム中の
リソチーム遺伝子の発現の例は現在まで報告されてきて
おらず、そしてこれはバクテリウムにより生産されるリ
ソチームが通常のそ溶菌を生ずるという事実により説明
することができる。ここで、リソチームは、また、酵母
菌細胞壁を、主としてそのキチン成分の加水分解より、
攻撃しうることが知られている［G.N.マクシモバ（Maks
imova）ら,Prikl.Biochem.Mikrobiol.）18,1982,52
9］。酵母菌の出芽は芽と母細胞との間の純粋なキチン
の芽胞壁の形成を伴うことが知られており、酵母菌細胞
によるリソチームの生産および分泌はそれらの増殖機能
の重大に変更に導くことが期待されたであろう。また、
形質転換後のプロトプラストからの細胞壁の再生は弱体
化することが期待されたであろう。したがって、遺伝子
工学の古典的技術がリソチーム遺伝子を酵母菌に発現さ
せるようにすることができるばかりでなく、かつまたこ
のように形質転換された細胞がリソチームを活性的に生
長する間に生産しかつ分泌することができるであろうこ
とは、驚くべきことである。
面は、リソチーム遺伝子を酵母菌中でその中で致死作用
を、例えば、細胞の溶解により、及ぼさないで発現する
ことができるという事実である。異種細胞中でリソチー
ム遺伝子をクローニングしかつ発現する唯一の既知の例
は、HellaおよびMCF7−ヒト細胞系統中のニワトリリソ
チーム遺伝子のクローニングである［P.O.マチアス（Ma
tthias）ら，ユーロピアン・モレキュラー・バイオロジ
ー・オーガニゼイション・ジャーナル（EMBO J.），
１,1982,1207］であるが、遺伝子の発現は対応するメッ
センジャーRNAによってのみ証明され、そして蛋白質自
体の生産によって立証されなかった。バクテリウム中の
リソチーム遺伝子の発現の例は現在まで報告されてきて
おらず、そしてこれはバクテリウムにより生産されるリ
ソチームが通常のそ溶菌を生ずるという事実により説明
することができる。ここで、リソチームは、また、酵母
菌細胞壁を、主としてそのキチン成分の加水分解より、
攻撃しうることが知られている［G.N.マクシモバ（Maks
imova）ら,Prikl.Biochem.Mikrobiol.）18,1982,52
9］。酵母菌の出芽は芽と母細胞との間の純粋なキチン
の芽胞壁の形成を伴うことが知られており、酵母菌細胞
によるリソチームの生産および分泌はそれらの増殖機能
の重大に変更に導くことが期待されたであろう。また、
形質転換後のプロトプラストからの細胞壁の再生は弱体
化することが期待されたであろう。したがって、遺伝子
工学の古典的技術がリソチーム遺伝子を酵母菌に発現さ
せるようにすることができるばかりでなく、かつまたこ
のように形質転換された細胞がリソチームを活性的に生
長する間に生産しかつ分泌することができるであろうこ
とは、驚くべきことである。
以上は下の実施例に明瞭に示されている。これらの実
施例は例示をのみ目的とする。なぜなら、酵母菌菌株に
より1,4−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼの生産に導く
他の構成は、本発明の範囲に包含されると考えるべきで
あるからである。
施例は例示をのみ目的とする。なぜなら、酵母菌菌株に
より1,4−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼの生産に導く
他の構成は、本発明の範囲に包含されると考えるべきで
あるからである。
実施例１ １、１ ニワトリリソチームの完全cDNAクローンの構
成:plys10 まず、完全cDNAクローンの構成は２つの異るクローン
から出発してつくった：ニワトリリソチームcDNAを含有
するが５′未満において不完全であるpBR−lys−１［P.
バルダッシ（Baldacci）ら，核酸研究（Nucleic Asids
Res.）６,1979,2667］およびイントロンを含む全体の
リソチーム遺伝子からなる40kbのニワトリのゲノムDNA
を含有するpFF2−lys−16［P.バルダッシ（Baldacci）
ら，核酸研究（Nucleic Asids Res.）９,1981,3575］
（第１図）。これらのクローンは、高等真核レベル形質
からの転写体を正しく処理することのできない酵母菌中
でリソチームを発現するためにいずれも適当ではなかっ
た［J.D.ベッグス（Beggs）ら，ネイチャー（Nature）2
83,1980,835］。しかしながら、それは存在する不完全c
DNAの３′末端を完全遺伝子の５′未満と結合すること
により、完全cDNAクローンを再構成することが可能であ
った；事実発表されたデータから明らかである［P.バル
ズッシ（Balducci）ら,1979,op.cit.;A.ジュング（Jun
g）ら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）U
SA,77,1980,5759;M.グレズ（Grez）ら，細胞（Cell）2
5,1981,743］ように、完全遺伝子はcDNAのミッシング部
分に相当する５′区域にイントロンを含まない。こうし
て、コスミドpFF2−lys−16からの2.1kbのDNA断片をpEM
BL8［L.デンテ（Dente）ら，核酸研究（Nucleic Asids
Res.）11,1983,1645］中にサブクローニングし、プラ
スミドplys5を得た（第１図）。このクローンはリソチ
ームの完全５′隣接エクソンを含有する。便利に位置し
たHga I部位は、plys5およびcDNAクローンpBR−lys−の
間の重なる区域に存在する。pBR−lys−１の断片Hga I
−Mlu IおよびMlu I−Acc Iおよびplys5の断片Acc I−H
ga Iを含む三重結合は、ATG開始コドンを含むがイント
ロンを含まない、全体のリソチーム遺伝子を含有するク
ローン（plys10）の構成を可能とした（第２図）。
成:plys10 まず、完全cDNAクローンの構成は２つの異るクローン
から出発してつくった：ニワトリリソチームcDNAを含有
するが５′未満において不完全であるpBR−lys−１［P.
バルダッシ（Baldacci）ら，核酸研究（Nucleic Asids
Res.）６,1979,2667］およびイントロンを含む全体の
リソチーム遺伝子からなる40kbのニワトリのゲノムDNA
を含有するpFF2−lys−16［P.バルダッシ（Baldacci）
ら，核酸研究（Nucleic Asids Res.）９,1981,3575］
（第１図）。これらのクローンは、高等真核レベル形質
からの転写体を正しく処理することのできない酵母菌中
でリソチームを発現するためにいずれも適当ではなかっ
た［J.D.ベッグス（Beggs）ら，ネイチャー（Nature）2
83,1980,835］。しかしながら、それは存在する不完全c
DNAの３′末端を完全遺伝子の５′未満と結合すること
により、完全cDNAクローンを再構成することが可能であ
った；事実発表されたデータから明らかである［P.バル
ズッシ（Balducci）ら,1979,op.cit.;A.ジュング（Jun
g）ら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）U
SA,77,1980,5759;M.グレズ（Grez）ら，細胞（Cell）2
5,1981,743］ように、完全遺伝子はcDNAのミッシング部
分に相当する５′区域にイントロンを含まない。こうし
て、コスミドpFF2−lys−16からの2.1kbのDNA断片をpEM
BL8［L.デンテ（Dente）ら，核酸研究（Nucleic Asids
Res.）11,1983,1645］中にサブクローニングし、プラ
スミドplys5を得た（第１図）。このクローンはリソチ
ームの完全５′隣接エクソンを含有する。便利に位置し
たHga I部位は、plys5およびcDNAクローンpBR−lys−の
間の重なる区域に存在する。pBR−lys−１の断片Hga I
−Mlu IおよびMlu I−Acc Iおよびplys5の断片Acc I−H
ga Iを含む三重結合は、ATG開始コドンを含むがイント
ロンを含まない、全体のリソチーム遺伝子を含有するク
ローン（plys10）の構成を可能とした（第２図）。
１、２ リソチーム遺伝子の５′区域の非翻訳部分の短
縮 プラスミドplys10中に存在するリソチーム遺伝子の
５′区域の非解読部分を、独特Acc I制限部位でプラス
ミドを開きかつBAL31ヌクレアーゼで消化することによ
り欠失させた。こうして、短縮されたプラスミドの集団
が得られ、次いでこれらを独特Pst I部位において切離
した；Pst I部位とBAL31で消化された末端との間で構成
された断片を、ベルギー国特許901,222号記載されてい
るようにして、プラスミドpLG400の部位Pst IおよびSma
Iの間に挿入した。この操作は、３つの結果を与えた： （１）リソチームのATG開始コドンに先行する５′区域
の非翻訳部分が欠失され、 （２）Acc IおよびSma I部位が破壊され、そして （３）操作容易なBamH I部位（YEpZ100中のSma I部位に
直接隣接する）がリソチーム遺伝子の開始部分に取り付
けられる。
縮 プラスミドplys10中に存在するリソチーム遺伝子の
５′区域の非解読部分を、独特Acc I制限部位でプラス
ミドを開きかつBAL31ヌクレアーゼで消化することによ
り欠失させた。こうして、短縮されたプラスミドの集団
が得られ、次いでこれらを独特Pst I部位において切離
した；Pst I部位とBAL31で消化された末端との間で構成
された断片を、ベルギー国特許901,222号記載されてい
るようにして、プラスミドpLG400の部位Pst IおよびSma
Iの間に挿入した。この操作は、３つの結果を与えた： （１）リソチームのATG開始コドンに先行する５′区域
の非翻訳部分が欠失され、 （２）Acc IおよびSma I部位が破壊され、そして （３）操作容易なBamH I部位（YEpZ100中のSma I部位に
直接隣接する）がリソチーム遺伝子の開始部分に取り付
けられる。
得られるプラスミドをplys9と呼ぶ（第３図）。
１、３ リソチームの発現ベクターの構成 リソチームの完全cDNAは、ここでは５′未満における
BamH I部位と３′未満における独特Sph I部位との間に
位置する。前記cDNAはそれ自体のATG開始コドンを有す
るので、それとBamH I部位で終るATG不含プロモーター
との融合は機能的発現単位を与え、この単位はなお複製
起源およびpBR322のラクタマーゼ遺伝子と会合させ（E.
coli中のその複製およびその選択を保証する）かつ２−
ミクロンのプラスミドおよび複製起源およびLEU２遺伝
子と会合させ（酵母菌中の複製および選択のため）る。
BamH I部位と３′未満における独特Sph I部位との間に
位置する。前記cDNAはそれ自体のATG開始コドンを有す
るので、それとBamH I部位で終るATG不含プロモーター
との融合は機能的発現単位を与え、この単位はなお複製
起源およびpBR322のラクタマーゼ遺伝子と会合させ（E.
coli中のその複製およびその選択を保証する）かつ２−
ミクロンのプラスミドおよび複製起源およびLEU２遺伝
子と会合させ（酵母菌中の複製および選択のため）る。
この構成は記載する次の断片を同時に結合することに
よりつくった： （ａ）プラスミドYEpZ101△２からの、プロモーターp41
5の欠失から由来するプロモーターp415△２からなるHin
d III−BaMH I断片（ベルギー国特許901,222号）； （ｂ）plys△９からの、リソチームの完全なcDNAからな
るSph I−BamH I断片； （ｃ）断片（ｂ）と断片（ｄ）との間の結合として使用
すべきプラスミドpK01からのEcoR I−Sph I断面［K.マ
クケニー（McKenny）ら，「遺伝子の増幅および分析（G
ene amplification and analysis）」,J.G.クリリク
ジャン（Chririkjen）およびT.パナス（Panas）編，エ
ルセビーア／ノース・ホランド（Elsevier/North Holl
and），ニューヨーク,1981,383ページ］； 断片（ｂ）と断片（ｄ）との間の結合として使用すべ
きプラスミドpK01からのEcoR I−Sph I断片［K.マクケ
ニー（McKenny）ら，「遺伝子の増幅および分析（Gene
amplification and analysis）」,J.G.クリリクジ
ャン（Chririkjan）およびT.パナス（Panas）編，エル
セビーア／ノース・ホランド（Elsevier/North Hollan
d），ニューヨーク,1981,383ページ］； （ｄ）プラスミドYEpZ415からの、複製起源およびpBR32
2のβ−ラクタマーゼ遺伝子の一方の半分からなるPst I
−EcoR I断片；および （ｅ）pJDB207からの、２−ミクロン−LEU２セグメント
およびβ−ラクタマセーゼ遺伝子の他方の半分からなる
Hind III−Pst I断片。
よりつくった： （ａ）プラスミドYEpZ101△２からの、プロモーターp41
5の欠失から由来するプロモーターp415△２からなるHin
d III−BaMH I断片（ベルギー国特許901,222号）； （ｂ）plys△９からの、リソチームの完全なcDNAからな
るSph I−BamH I断片； （ｃ）断片（ｂ）と断片（ｄ）との間の結合として使用
すべきプラスミドpK01からのEcoR I−Sph I断面［K.マ
クケニー（McKenny）ら，「遺伝子の増幅および分析（G
ene amplification and analysis）」,J.G.クリリク
ジャン（Chririkjen）およびT.パナス（Panas）編，エ
ルセビーア／ノース・ホランド（Elsevier/North Holl
and），ニューヨーク,1981,383ページ］； 断片（ｂ）と断片（ｄ）との間の結合として使用すべ
きプラスミドpK01からのEcoR I−Sph I断片［K.マクケ
ニー（McKenny）ら，「遺伝子の増幅および分析（Gene
amplification and analysis）」,J.G.クリリクジ
ャン（Chririkjan）およびT.パナス（Panas）編，エル
セビーア／ノース・ホランド（Elsevier/North Hollan
d），ニューヨーク,1981,383ページ］； （ｄ）プラスミドYEpZ415からの、複製起源およびpBR32
2のβ−ラクタマーゼ遺伝子の一方の半分からなるPst I
−EcoR I断片；および （ｅ）pJDB207からの、２−ミクロン−LEU２セグメント
およびβ−ラクタマセーゼ遺伝子の他方の半分からなる
Hind III−Pst I断片。
結合の前に、これらの種々の断片を使用し、そして、
それらは異る末端および相補的接着末端を有するので、
この結合からただ１つの生存しうるプラスミドが生じ
た:plys△29（第４図）。
それらは異る末端および相補的接着末端を有するので、
この結合からただ１つの生存しうるプラスミドが生じ
た:plys△29（第４図）。
同一の方法においてプロモーターp415からの欠失によ
り誘導された２つの他の断片（p415△４およびp415△
５）を使用することにより、２つの他のプラスミドが生
産された:plys△49およびplys△59。これらの３つのプ
ラスミドは、こうして、次の事実によりのみ異る。プロ
モーターはリソチームcDNAから種々の距離に位置し、こ
れは対応するメッセンジャーRNAsの開始（５′未満）と
自然AUG翻訳開始部位との間の異る距離における転写の
間に生ずる。
り誘導された２つの他の断片（p415△４およびp415△
５）を使用することにより、２つの他のプラスミドが生
産された:plys△49およびplys△59。これらの３つのプ
ラスミドは、こうして、次の事実によりのみ異る。プロ
モーターはリソチームcDNAから種々の距離に位置し、こ
れは対応するメッセンジャーRNAsの開始（５′未満）と
自然AUG翻訳開始部位との間の異る距離における転写の
間に生ずる。
1.4 プラスミドplys△29、psys△49およびplys△59に
よるリソチームの発現 次いで、前述のように構成されたプラスミドを酵母菌
S.cerevisiaeのGRF18菌株（leu-、His-）に形質転換
し、次いでロイシンについてプロトトロープのクローン
について選択した（leu+）。
よるリソチームの発現 次いで、前述のように構成されたプラスミドを酵母菌
S.cerevisiaeのGRF18菌株（leu-、His-）に形質転換
し、次いでロイシンについてプロトトロープのクローン
について選択した（leu+）。
次いで、これらのクローンをガラスビーズで粉砕し、
そして得られたリゼイトを遠心により清澄にした。それ
らのリゼイトの活性を、E.coli細胞の懸濁液の光学濃度
の増加をMc マッケン（Macken）らの方法［ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）4
9,1970,639］の決定することにより試験した。第５図に
おいて、650nmにおける光学濃度（OD650）の初期の値は
すべてのクローンについて同一である（0.7）が、完結
を目的として線図上でシフトさせた。第５図の結果はGR
F18（plys△49）について有意の活性を示し、そしてプ
ラスミドplys△59により形質転換された細胞について多
少低い。
そして得られたリゼイトを遠心により清澄にした。それ
らのリゼイトの活性を、E.coli細胞の懸濁液の光学濃度
の増加をMc マッケン（Macken）らの方法［ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）4
9,1970,639］の決定することにより試験した。第５図に
おいて、650nmにおける光学濃度（OD650）の初期の値は
すべてのクローンについて同一である（0.7）が、完結
を目的として線図上でシフトさせた。第５図の結果はGR
F18（plys△49）について有意の活性を示し、そしてプ
ラスミドplys△59により形質転換された細胞について多
少低い。
リソチームの作用のためのインジケーターとして使用
する細胞がバクテリウムミクロコッカス・リソデイクチ
クス（Micrococcus lysodeikticus）の細胞である方法
［G.アルダートン（Alderton）ら，ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）157,19
45,43］を使用して同様な結果が得られた。
する細胞がバクテリウムミクロコッカス・リソデイクチ
クス（Micrococcus lysodeikticus）の細胞である方法
［G.アルダートン（Alderton）ら，ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）157,19
45,43］を使用して同様な結果が得られた。
異る型のアッセイにおいて、M.lysodeikictusの菌叢
で覆われたペトリ皿上で生長する形質転換されたコロニ
ーのまわりにリソチームが明示された、この場合におい
て、リソチームの発現はコロニーのまわりの溶菌の透明
なハローにより可視化された。細胞不含リゼイトを使用
する結果と一致して、溶菌のハローはplys△49を使用し
たとき最大であり、このことはこのクローンがリソチー
ムの最良の生産体であることを示した。この結果が、ま
た、示すように、リソチームは形質細胞から輸送され
た。なぜなら、バクテリアのインジケーターを溶解する
ためには、それらの細胞外に存在することがかならず必
要であったからである。
で覆われたペトリ皿上で生長する形質転換されたコロニ
ーのまわりにリソチームが明示された、この場合におい
て、リソチームの発現はコロニーのまわりの溶菌の透明
なハローにより可視化された。細胞不含リゼイトを使用
する結果と一致して、溶菌のハローはplys△49を使用し
たとき最大であり、このことはこのクローンがリソチー
ムの最良の生産体であることを示した。この結果が、ま
た、示すように、リソチームは形質細胞から輸送され
た。なぜなら、バクテリアのインジケーターを溶解する
ためには、それらの細胞外に存在することがかならず必
要であったからである。
実施例２ ２、１ リソチームの発現ベクターplys50の構成 リソチーム発現プラスミドplys△29、plys△49および
plys△59（前述した）が基づくベクターpJDB207は、全
体の２−ミクロンの酵母菌プラスミドを含有せず、結局
その連続する維持に内因性の２−ミクロンのプラスミド
（S.cerevisiaeのほとんどの菌株において見出される）
の存在に依存する。これはpJDB207型プラスミドが細胞
から頻繁に損失されるという不安定な場合に導く［E.エ
アヘルト（Erhaert）およびC.P.ホエンバーグ（Hollenb
erg），ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacte
riol.）156,1983,625およびM.ジャラヤム（Jarayam）
ら、セル（Cell）34,1983,95］。対照的に、自然２−ミ
クロンのプラスミドは安定に遺伝される。プラスミドが
全体の２−ミクロンのプラスミドpJDB219を含有するよ
うな方法で構成されたプラスミドはpJDB207型のものよ
りも安定であることは事実知られている［C.P.ホランバ
ーグ（Hollanberg）,Curr,Top.Microbiol.Immunol.）9
6,1982,119;R.M.ワルムスレイ（Walmsley）ら，モレキ
ュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Mol.
Gen.Genet.）1983,361］。それゆえ、このようなプラス
ミドは、工業的発酵における例のように、長期間の生長
のために一層有用である。
plys△59（前述した）が基づくベクターpJDB207は、全
体の２−ミクロンの酵母菌プラスミドを含有せず、結局
その連続する維持に内因性の２−ミクロンのプラスミド
（S.cerevisiaeのほとんどの菌株において見出される）
の存在に依存する。これはpJDB207型プラスミドが細胞
から頻繁に損失されるという不安定な場合に導く［E.エ
アヘルト（Erhaert）およびC.P.ホエンバーグ（Hollenb
erg），ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacte
riol.）156,1983,625およびM.ジャラヤム（Jarayam）
ら、セル（Cell）34,1983,95］。対照的に、自然２−ミ
クロンのプラスミドは安定に遺伝される。プラスミドが
全体の２−ミクロンのプラスミドpJDB219を含有するよ
うな方法で構成されたプラスミドはpJDB207型のものよ
りも安定であることは事実知られている［C.P.ホランバ
ーグ（Hollanberg）,Curr,Top.Microbiol.Immunol.）9
6,1982,119;R.M.ワルムスレイ（Walmsley）ら，モレキ
ュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Mol.
Gen.Genet.）1983,361］。それゆえ、このようなプラス
ミドは、工業的発酵における例のように、長期間の生長
のために一層有用である。
このような完全な２−ミクロンのベクターを構成する
ために、プラスミドYEpB2（第11図）を使用し、これは
全体の２−ミクロンのプラスミドをpBR322中にそれらの
独特Pst I部位においてクローニングすることにより前
もってつくられた。次いで、YEpB2からの２つの断片お
よびplys△49からの２つの断片を結合してplys50を得た
（第12図）。このプラスミドにおいて、３つの２−ミク
ロンの遺伝子Ａ、ＢおよびＣは無傷であり、そしてリソ
チーム遺伝子は前の実施例においおいて記載したplys△
49におけるようにp415△４プロモーターから発現され
る。
ために、プラスミドYEpB2（第11図）を使用し、これは
全体の２−ミクロンのプラスミドをpBR322中にそれらの
独特Pst I部位においてクローニングすることにより前
もってつくられた。次いで、YEpB2からの２つの断片お
よびplys△49からの２つの断片を結合してplys50を得た
（第12図）。このプラスミドにおいて、３つの２−ミク
ロンの遺伝子Ａ、ＢおよびＣは無傷であり、そしてリソ
チーム遺伝子は前の実施例においおいて記載したplys△
49におけるようにp415△４プロモーターから発現され
る。
２、２ ベクターplys50によるリソチームの発現 S.cerevisiaeのGRF18菌株（His-、leu-）をプラスミ
ドplys50およびpJDB207により形質転換した後、両者の
場合に得られた形質転換された細胞をヒスチジン（0.00
2％）を補充した最小培地上で別々に生長させた。培養
物が静止相（約５の光学濃度）（細胞の乾燥重量＝培養
物の約1.5g/1）に到達したとき、細胞を培地から遠心に
より分離し、0.1モルのpH7のリン酸塩緩衝液中に懸濁さ
せそしてガラスビーズで粉砕した。両者の培養物からの
上澄み液およびリゼイト中のリソチーム活性を、D.シュ
ガー（Shugar）の方法［バイオヒミカ・エト・バイオフ
ィジカ・アクタ（Biochem.Biohys.Acta），８,1952,30
2］に従い、M.lysodeikticus細胞を溶解するそれらの能
力により決定した。
ドplys50およびpJDB207により形質転換した後、両者の
場合に得られた形質転換された細胞をヒスチジン（0.00
2％）を補充した最小培地上で別々に生長させた。培養
物が静止相（約５の光学濃度）（細胞の乾燥重量＝培養
物の約1.5g/1）に到達したとき、細胞を培地から遠心に
より分離し、0.1モルのpH7のリン酸塩緩衝液中に懸濁さ
せそしてガラスビーズで粉砕した。両者の培養物からの
上澄み液およびリゼイト中のリソチーム活性を、D.シュ
ガー（Shugar）の方法［バイオヒミカ・エト・バイオフ
ィジカ・アクタ（Biochem.Biohys.Acta），８,1952,30
2］に従い、M.lysodeikticus細胞を溶解するそれらの能
力により決定した。
プラスミドpJDB207により形質転換された菌株につい
てリソチーム活性を示すことはできなかった。これに対
して、菌株GRF18（plys50）の場合において、162単位/m
l培養物の活性を決定することができ、そして次のよう
に分布することが示された： 細胞に関連する44単位/mlおよび培地中に関連する118
単位/ml。
てリソチーム活性を示すことはできなかった。これに対
して、菌株GRF18（plys50）の場合において、162単位/m
l培養物の活性を決定することができ、そして次のよう
に分布することが示された： 細胞に関連する44単位/mlおよび培地中に関連する118
単位/ml。
C.ワング（Wang）およびR.L.スミス（Smith）［アナ
リティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）63,
1975,414］により修正されたD.ハーバート（Herbert）
らの方法［メソッズ・イン・エンジモロジー（Meth.Enz
ymol.）5B,1971,209］に従い合計の蛋白質を決定し、商
業的に精製されたリソチームの特異的活性を考慮する
［ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannhei
m）］ことにより、上の条件下で酵母菌中で生産される
リソチームは可溶性酵母菌蛋白質の約１％になることが
誘導された。
リティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）63,
1975,414］により修正されたD.ハーバート（Herbert）
らの方法［メソッズ・イン・エンジモロジー（Meth.Enz
ymol.）5B,1971,209］に従い合計の蛋白質を決定し、商
業的に精製されたリソチームの特異的活性を考慮する
［ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannhei
m）］ことにより、上の条件下で酵母菌中で生産される
リソチームは可溶性酵母菌蛋白質の約１％になることが
誘導された。
菌株GRF18（plys△49）およびAH22cir゜（plys50）は
1984年12月５日に、セントラアル・ビュウロウ・ブーア
・シンメルカルチュアーズ（Centraal Bureau voor
Schimmelcultures,Oosterstraat 1,P.P.Box 273,NL−
3740 AG Baarn）（オランダ国）に受託され、ここで
それらはそれぞれ受託番号CBS 7130およびCBS 7129を
受けた。
1984年12月５日に、セントラアル・ビュウロウ・ブーア
・シンメルカルチュアーズ（Centraal Bureau voor
Schimmelcultures,Oosterstraat 1,P.P.Box 273,NL−
3740 AG Baarn）（オランダ国）に受託され、ここで
それらはそれぞれ受託番号CBS 7130およびCBS 7129を
受けた。
第１図は、ニワトリリソチームの完全cDNAの再編成のた
め後で使用するプラスミドplys5の構成を表わす。この
構成は全体のリソチーム遺伝子からなる40kbのインサー
トを含有するコスミドpFF2−lys−16から出発した。次
いで、この遺伝子の最初なエクソンからなる2.1kbのHin
d IIIインサートを、プラスミドpEMBL8中に挿入した。
こうして得られるplys5プラスミドはlacZ-であり、次い
でlacZ+であるプラスミドpEMBL8と区別されうる。 第２図は、plys5から由来しかつリソチーム遺伝子の
５′末端を含有するAcc I−Hga I断片を、プラスミドpB
R−lys−１から由来しかつリソチームのcDNAの残部を含
有する２つの他の断片と結合することにより、リソチー
ムの完全CDNAをプラスミドplys10内で再構成する方法を
示す。 第３図は、エキソヌクレアーゼBAL31で５′末端の未翻
訳部分を消化することにより欠失されたリソチームのcD
NAからなるプラスミドplys△９の構成を示す。 第４図は、YEpZ11、YEpZ101△２（または４または
５）、plys△９、pK01およびpJDB219から由来する精製
された断片の一義の結合（univocal ligation）により
リソチームの発現ベクターの構成を示す。プラスミドpl
ys△29（または49または59）は、plys△９からのリソチ
ームcDNAの発現を保証するためにプラスミドYEpZ101△
２（または４または５）からのプロモーターにより、そ
れら自体が異るだけである。 第５図は、プラスミドplys△49およびplys50により形質
転換された酵母菌の細胞抽出物が、EDTAで処理したE.co
li細胞を溶解して、それらをリソチームの作用に対して
感受性とすることを示す。 第６図は、プラスミドpBR322および２−ミクロンの内因
性酵母菌プラスミドに制限酵素Pst Iを作用させること
により得られた断片の結合によるプラスミドYEpB2の構
成を表わす。 第７図は、プラスミドYEpB2およびplys△49から得られ
る５つの精製された断片の一義的結合によるリソチーム
発現ベクターplys50の構成を表わす。
め後で使用するプラスミドplys5の構成を表わす。この
構成は全体のリソチーム遺伝子からなる40kbのインサー
トを含有するコスミドpFF2−lys−16から出発した。次
いで、この遺伝子の最初なエクソンからなる2.1kbのHin
d IIIインサートを、プラスミドpEMBL8中に挿入した。
こうして得られるplys5プラスミドはlacZ-であり、次い
でlacZ+であるプラスミドpEMBL8と区別されうる。 第２図は、plys5から由来しかつリソチーム遺伝子の
５′末端を含有するAcc I−Hga I断片を、プラスミドpB
R−lys−１から由来しかつリソチームのcDNAの残部を含
有する２つの他の断片と結合することにより、リソチー
ムの完全CDNAをプラスミドplys10内で再構成する方法を
示す。 第３図は、エキソヌクレアーゼBAL31で５′末端の未翻
訳部分を消化することにより欠失されたリソチームのcD
NAからなるプラスミドplys△９の構成を示す。 第４図は、YEpZ11、YEpZ101△２（または４または
５）、plys△９、pK01およびpJDB219から由来する精製
された断片の一義の結合（univocal ligation）により
リソチームの発現ベクターの構成を示す。プラスミドpl
ys△29（または49または59）は、plys△９からのリソチ
ームcDNAの発現を保証するためにプラスミドYEpZ101△
２（または４または５）からのプロモーターにより、そ
れら自体が異るだけである。 第５図は、プラスミドplys△49およびplys50により形質
転換された酵母菌の細胞抽出物が、EDTAで処理したE.co
li細胞を溶解して、それらをリソチームの作用に対して
感受性とすることを示す。 第６図は、プラスミドpBR322および２−ミクロンの内因
性酵母菌プラスミドに制限酵素Pst Iを作用させること
により得られた断片の結合によるプラスミドYEpB2の構
成を表わす。 第７図は、プラスミドYEpB2およびplys△49から得られ
る５つの精製された断片の一義的結合によるリソチーム
発現ベクターplys50の構成を表わす。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/36 Ｃ１２Ｒ 1:865）
Claims (21)
- 【請求項１】形質転換された酵母菌であって、そのDNA
が1,4−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼをコードする断
片の少なくとも１つのコピーを含んでなり、そして前記
断片が対応する活性蛋白質として細胞内で発現され、か
つ前記1,4−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼをコードす
る断片の前に、該断片によってコードされる前記活性蛋
白質が、酵母細胞の細胞質膜を通して排出されるように
作用するシグナルペプチド配列をコードする断片が、存
在することを特徴とする形質転換された酵母菌。 - 【請求項２】前記シグナルペプチド配列をコードする断
片がニワトリのリゾチーム遺伝子に伴うものである特許
請求の範囲第２項記載の形質転換された酵母菌。 - 【請求項３】1,4−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼをコ
ードする断片が、酵母菌中で多コピー数において自律複
製することができるベクタープラスミド中に挿入されて
いる特許請求の範囲第１〜２項のいずれかに記載の形質
転換された酵母菌。 - 【請求項４】ベクタープラスミドの複製が少なくともそ
の複製起源を含んでなる２−ミクロンのプラスミドから
の配列により保証されている特許請求の範囲第３項記載
の形質転換された酵母菌。 - 【請求項５】1,4−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼをコ
ードする断片の発現が強力な酵母プロモーターにより保
証されている特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記
載の形質転換された酵母菌。 - 【請求項６】強力な酵母プロモーターがアルコールデヒ
ドロゲナーゼ、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−
ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ホスフアグリセレート
キナーゼおよびアルカリ性ホスフアターゼをコードする
遺伝子のプロモーター、ならびにプロモーターp415およ
びその変異種から成る群より選択される特許請求の範囲
第５項記載の形質転換された酵母菌。 - 【請求項７】強力な酵母プロモーターがプロモーターp4
15またはその変異種である特許請求の範囲第６項記載の
形質転換された酵母菌。 - 【請求項８】1,4−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼをコ
ードする断片の発現がPlys△49およびplys50から成る群
より選択されるプラスミドにより保証されている特許請
求の範囲第１〜７項のいずれかに記載の形質転換された
酵母菌。 - 【請求項９】酵母菌がサツカロミセス（Saccharomyce
s）属に属する特許請求の範囲第１〜８項のいずれかに
記載の形質転換された酵母菌。 - 【請求項１０】酵母菌がサツカロミセス・セレビシアエ
（Saccharomyces cerevisiae）種に属する特許請求の範
囲第９項記載の形質転換された酵母菌。 - 【請求項１１】酵母菌が菌株GRF18および菌株AH22から
成る群より選択される特許請求の範囲第10項記載の形質
転換された酵母菌。 - 【請求項１２】酵母AH22（plys△49）である特許請求の
範囲第１〜11項のいずれかに記載の形質転換された酵母
菌。 - 【請求項１３】酵母AH22（plys50）である特許請求の範
囲第１〜11項のいずれかに記載の形質転換された酵母
菌。 - 【請求項１４】酵母GRF18（plys△49）である特許請求
の範囲第１〜11項のいずれかに記載の形質転換された酵
母菌。 - 【請求項１５】酵母GRF18（plys50）である特許請求の
範囲第１〜11項のいずれかに記載の形質転換された酵母
菌。 - 【請求項１６】1,4−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼを
コードするDNA断片を発現することができ、そして前記
断片が対応する活性蛋白質として形質転換された酵母内
で発現され、かつ前記1,4−β−Ｎ−アセチルムラミダ
ーゼをコードする断片の前に、該断片によってコードさ
れる前記活性蛋白質が、酵母細胞の細胞膜を通して排出
されるように作用するシグナルペプチド配列をコードす
る断片が存在することを特徴とする酵母菌中で自律的に
複製することができる酵母のベクタープラスミド。 - 【請求項１７】複製が２−ミクロンのプラスミドから得
られかつ少なくともその複製起源からなる配列により保
証される特許請求の範囲第16項記載のベクタープラスミ
ド。 - 【請求項１８】DNA断片の発現が強力な酵母プロモータ
ーにより保証される特許請求の範囲第16〜17項のいずれ
かに記載のベクタープラスミド。 - 【請求項１９】強力な酵母プロモーターがアルコールデ
ヒドロゲナーゼ、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３
−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ホスホグリセレート
キナーゼおよびアルカリ性ホスフアターゼをコードする
遺伝子のプロモーター、ならびにプロモーターp415およ
びその変異種から成る群より選択される特許請求の範囲
第18項記載のベクタープラスミド。 - 【請求項２０】強力な酵母プロモーターがプロモーター
p415またはその変異種である特許請求の範囲第19項記載
のベクタープラスミド。 - 【請求項２１】前記プラスミドがplys△49およびplys50
から成る群より選択される特許請求の範囲第16〜20項の
いずれかに記載のベクタープラスミド。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BE214124 | 1984-12-06 | ||
| BE0/214124A BE901223A (fr) | 1984-12-06 | 1984-12-06 | Levures transformees produisant du lysozyme plasmides utilises pour cette transformation et leurs utilisations. |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7288179A Division JP2635020B2 (ja) | 1984-12-06 | 1995-10-11 | 形質転換された酵母によるリゾチームの生産方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61185181A JPS61185181A (ja) | 1986-08-18 |
| JP2622252B2 true JP2622252B2 (ja) | 1997-06-18 |
Family
ID=3843827
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60273530A Expired - Lifetime JP2622252B2 (ja) | 1984-12-06 | 1985-12-06 | リソチームを生産する形質転換された酵母菌およびこの形質転換に使用するプラスミド |
| JP7288179A Expired - Lifetime JP2635020B2 (ja) | 1984-12-06 | 1995-10-11 | 形質転換された酵母によるリゾチームの生産方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7288179A Expired - Lifetime JP2635020B2 (ja) | 1984-12-06 | 1995-10-11 | 形質転換された酵母によるリゾチームの生産方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5336609A (ja) |
| EP (1) | EP0184575B1 (ja) |
| JP (2) | JP2622252B2 (ja) |
| AT (1) | ATE88754T1 (ja) |
| CA (1) | CA1339912C (ja) |
| DE (1) | DE3587307T2 (ja) |
Families Citing this family (12)
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|---|---|---|---|---|
| US5013652A (en) * | 1986-10-14 | 1991-05-07 | Genex Corporation | Composite yeast vectors |
| JPS6447377A (en) * | 1987-08-19 | 1989-02-21 | Agency Ind Science Techn | Mutant strain having high secretion of human lysozyme, its selection and production of human lysozyme using same |
| JPH04502260A (ja) * | 1989-10-16 | 1992-04-23 | アムジエン・インコーポレーテツド | Ｎ―アセチルムラミダーゼ ｍ１ |
| GB2249099B (en) * | 1990-09-26 | 1995-05-03 | Squibb & Sons Inc | Squalene synthetase |
| ATE342346T1 (de) * | 1997-08-05 | 2006-11-15 | Oregon State | Verfahren und zusammensetzungen zur reduzierung des bierverderbs |
| JP2997800B2 (ja) * | 1997-12-01 | 2000-01-11 | 農林水産省食品総合研究所長 | 細胞壁溶解酵素遺伝子、該遺伝子を含むベクター及び形質転換体 |
| AU2002253995A1 (en) * | 2001-03-29 | 2002-10-15 | Hybrigen, Inc. | Improved hybrid gene libraries and uses thereof |
| JP5140832B2 (ja) * | 2006-03-03 | 2013-02-13 | 国立大学法人 東京大学 | 異種タンパク質を高生産する麹菌変異株 |
| MX2017006127A (es) | 2014-11-11 | 2017-11-08 | Clara Foods Co | Metodos y composiciones para produccion de proteina de clara de huevo. |
| US10240541B2 (en) * | 2017-01-11 | 2019-03-26 | Brock Matthew Eastman | Methods and systems for overriding automotive computer controlled cylinder management |
| MX2022000374A (es) | 2019-07-11 | 2022-03-25 | Clara Foods Co | Composiciones de proteina y productos consumibles de las mismas. |
| US10927360B1 (en) | 2019-08-07 | 2021-02-23 | Clara Foods Co. | Compositions comprising digestive enzymes |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59210888A (ja) * | 1983-02-22 | 1984-11-29 | チロン・コ−ポレイシヨン | 酵母発現ベクター |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1110466A (en) * | 1966-02-28 | 1968-04-18 | Prodotti Antibiotici Spa | Process for the production of lysozyme |
| JPS5516634B2 (ja) * | 1972-07-27 | 1980-05-06 | ||
| US4775622A (en) * | 1982-03-08 | 1988-10-04 | Genentech, Inc. | Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast |
| GB2125047B (en) * | 1982-08-09 | 1986-02-19 | Ciba Geigy Ag | Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides |
| EP0181634A3 (en) * | 1984-11-14 | 1987-09-09 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Synthetic gene for human lysozyme |
| BE901222A (fr) * | 1984-12-06 | 1985-03-29 | Labofina Sa | Promoteurs assurant l'expression de genes etrangers chez la levure, plasmides comportant ces promoteurs et leurs utilisations pour la production de polypeptides. |
| BE901223A (fr) * | 1984-12-06 | 1985-03-29 | Labofina Sa | Levures transformees produisant du lysozyme plasmides utilises pour cette transformation et leurs utilisations. |
| JPS626679A (ja) * | 1985-06-26 | 1987-01-13 | Agency Of Ind Science & Technol | ヒトリゾチ−ムの微生物学的製造法 |
-
1985
- 1985-12-05 AT AT85870170T patent/ATE88754T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-12-05 US US06/804,774 patent/US5336609A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-05 DE DE8585870170T patent/DE3587307T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-05 CA CA000496943A patent/CA1339912C/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-05 EP EP85870170A patent/EP0184575B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-06 JP JP60273530A patent/JP2622252B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-10-11 JP JP7288179A patent/JP2635020B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59210888A (ja) * | 1983-02-22 | 1984-11-29 | チロン・コ−ポレイシヨン | 酵母発現ベクター |
Also Published As
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|---|---|
| DE3587307D1 (de) | 1993-06-03 |
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| JPH08205868A (ja) | 1996-08-13 |
| ATE88754T1 (de) | 1993-05-15 |
| US5336609A (en) | 1994-08-09 |
| DE3587307T2 (de) | 1993-09-02 |
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| EP0184575A3 (en) | 1987-10-07 |
| CA1339912C (en) | 1998-06-16 |
| JPS61185181A (ja) | 1986-08-18 |
| EP0184575B1 (en) | 1993-04-28 |
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