JPS59210888A - 酵母発現ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の費用） イ１毀生物系において外来性′１ｊ：ｉ伝子をＪ１ψ大
に介埒せしめるためには一般（こ、発現ベクター中に相
同性制御要票を用いるのが有利である。発現の効率（生
成物の生産）は使用するプロモーターの強力ぎのβ“、
１数であり、それに比例すると信じられる。

さらに、実験者のコントロールの下での栄養的因子によ
る芦転子発現の制御はさらに有用な操作手段を提供する
。酵母の解糖系酵素の）］″を転子ζ例えばグリセルア
ルデヒド−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ〔ｇｌｙ
ｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｃｌ
ｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）　）及びピル
ベートキナーゼ（ｐｙｒｖａｔｅ　ｋｉｎａｓｅ（Ｐｙ
Ｋ）　）についてコードするｑ転子は上記の有用な性質
、すなわち高レベルの発現（非常に効率的なプロモータ
ーが推定される）及び増殖培地の成分による制御に対す
るＰｆ−受性を有する。例えば、ＧＡＰＤＨは、市販の
パン酵母の乾燥重量の５％という大きな部分を占めるこ
とができる（　Ｋｒｅｂｓ、　Ｅ、　Ｇ、　、　Ｊ、　
Ｂｉｏｌ、　Ｏｈｅｍ。

（１９５６）　２００：Ａ７１）。さらＧこ、これらの
酵紫は非常に誘導されやすい。例えば、酵母の培養が酢
自ノ珀での増殖からグルコースでの増殖（こ移行した（
Ｊ％　台、Ｇ　Ａ　Ｐ　Ｄ　Ｈの活性は培地中の糖の濃
度に比例して２００倍まで１４Ｙ７加する（　Ｍａｉｔ
ｒａ　Ｐ、　Ｋ、　　及びＬｏｂｏ　Ｚ、、　、Ｔ−、
旦孤、髪肛、　（１９７１）ｋ掻１７５’ｌ。

これらの結果は、これらのフＰｆ転子の転写撥１）・ン
が、コレラの蹟転子の５′非コードフランク領９２中に
存イ゛１：するＤＮＡ配ダ１１のじｌｊ与により１−６
度に同宿１されることを示唆する。

この発明は、制仰町１指なｕ句メ゛７転子Ｇ　ＡＰ　Ｄ
　Ｈ及びＰｙＸの５′非コード領１９に対応するＤＮＡ
ｌ６？片の分ｊ碓、細潰、及びｆｊデ母発シｌ、プラス
ミド中での好結果を伴うイ・、Ｉｒ用に１．１する。！
ｊ、！７カな松写促１ｊｆｊ（ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　）
　１Ｈｉｉ／Ｉ：を有するＤ　Ｎ　Ａ　ｔＪ７２列を含
有するこれらの１９’ｒ片を「プロモーターｑと称する
。

このプロモーターは、その恢写ｆｌＪ慴１の下で外来性
ｊｔ伝転子よりコードされる？１を白質の開業ｒ＋９大
１工１生ｐｔ；のためのＤ　Ｎ　Ａベクターの典ｔ＋７
ｙ的な成分である。

さらに、このつ６明は、プロモーター−外来性；、′１
伝子−クーミーネークーの「カセ、ト、Ｊをイ逍成する
７１袴当なり−ミネーターをさらに片んで成るｔＩ？　
−Ｈｆ：発現ベクターに１ノ５′する。

４１＋％母中で外来性ＤＮＡを虻ガ２しようとする初ｊ
ＩＪｌの試みは失阪した（　Ｅｅｇｇｓ、　Ｊ、　Ｄ、
等、Ｎａｔｕｒｅ（１９８０）　２８３　：　２８５　
）。この報告においては、ヘモグロビンＤＮＡ（それ自
体のプロモーターと共に挿入された）は転写されたが、
このＲＮ　Ａがスプライス（５ｐｌｉｃｅ’　）されな
がった。この結果について種々の説明が可能である。す
なわち、転写ｌｊｉ］始位置の不正砧及び／又は介在配
列（イントロン）をスプライシングするための酵母のｆ
）ｉ’、力の不足である。

ｔ’：’ｒＱ　母の６葎力１のＧＡｐＤｎ’４伝子がク
ローニングされている〔Ｈｏ１ｌａｎｄ、　Ｍ、　Ｊ０
％、Ｂａ５ｉｃ　Ｌｉｆｅモーターは組候ＤＮＡ法によ
る酵母中での発現梁を構成するため（こ使用されていな
い。ＰｙＫ　Ｊ￥伝転子すでにクローニングされている
が　１ｌ１７伝的補完（ａｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏ
ｎ　）によってのみである（イ、′、ｌｌ音的１．１ｆ
死は行われていない）〔カワツキＧ、及び−ター、例え
ばアルコールデヒドｂゲナーゼＩ（ａｌｃｏｈｏｌ　ｄ
ｅｈｙｃｌｒｏｇｅｎａｓｅ　ｉ　）　のプロモーター
　ＣＶａｌｅｎｚｕｅｌａ、　Ｐ等、Ｎａｔｕｒｅ　（
１９８２）　２９８：６４７、及びＨ１ｔｙｅ＋ｎａｎ
、　Ｒ，Ａ、等Ｎａｔｕｒｅ　（１９８１）μ）３：　
７１７　：］　、並びにボホスホグセレートキナーゼ　
　Ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ　　Ｋｉｎａｓｅ
　　）　　（Ｔｕｉｔｅ、Ｍ。

Ｆｌ等、ＥＭＢＯ：ｒ、　（１９８２）　１：６０３、
及びＨｉｔｚｅｍａｎ、　Ｒ，Ａ、等、５ｃｉｅｎｃｅ
　（１９８３）　２１９　’６２０〕が、酵Ｇ７におけ
る発現のために外来性’、′！ｌｊ７伝子に連結されて
いるが、ターミネータ−は使用されなかった。この発明
は、ｔ￥Ｈユうｉ現糸のための新ｉＳｌなブロモ−クー
を、１、ｖ供し、そして強化された発現を伴う非′ｍに
４・Ｕ果的なプロモーターの利点と適切に連結されたタ
ーミネータ−の利点を結びつける。

（発明の要約） この発明は、酵母ＧＡＰＤＥプロモーター又は１も１（
４ｊｐｙｘプロモーターの転写側？、＋＋＋の下にある
外来性ＤＮＡ断片、例えば肝炎Ｂウィルス（ＨＢＶ）広
ｉｎｉ抗原（ＨＢｓＡｇ　）についＴ　：’　　）−ス
６　Ｄ　Ｎ　Ａ　　１５７片を含んでなる４ｊ′ｆ−母
発現ベクターに関する。ターミネータ−も又、適切に連
結することができる。

この発現ベクターは典型的には酵母復製開始点及び細菌
ｆｇ　ｆｉｌ開始点を有し、そしていずれのタイプの細
胞中でもＰＭ　’ｉＶすることができる。この発現ベク
ターは、酵母細胞を形質転換するのに使用された場合、
外来性ＤＮＡのセグメントによってコードされる蛋白質
の実質的なｔを生成せしめるであろう。

（発明の具体的な記載） 本来、酵母発現プラスミドは次の点を含む特定の利点を
有する。酵母は、当業界においてよく知られている方法
により、商業的生産のための大Ｊ″リド、Ｉ培着におい
て増殖することができる。これに対して、細菌は大規模
培養において、しはしは、「ファージ・アウト」（ファ
ージによる溶菌）の間に゛す（・こ遭弗する。酵母はさ
らに、呻乳動物細ｊ泡と同４ｊｌに新たに合成された蛋
白質に炭水化物を付加する能力を有するようである。細
閑はこの能力を有しない。今や、ｃＤＮＡ配列を容易に
利用することができ、イントロンを有する発現ベクター
の問題は容易に回避される。

この発明のベクター６才、非′１（ｉに１５い効率を有
するプロモーターを含り」・。ここで、プロモーターは
、眩４りするＤ　Ｎ　Ａセグメントの掻写をｌ１ｉｊ始
するた♂・テ）Ｇ二１１、ｌｊ　ｒ慇することかできる
Ｄ’ＮＡセグメントとして定、Ｑされる。・“ｌｊ＜写
と（は、プロモーター領域にトぎり≦するＤ　Ｎ　Ａ　
０９１本（１８に川ｊ′ｉ：ｊ　ｉ’Ｉ′ＪなＲＮ’Ａ
　（ここでは、メツセンシャーＦ、　Ｎ　Ａ　、すなわ
ちｍＲＮＡ、）の合成である。夏核生ｑ：１においては
、メツセンジャーＲＮＡ合１ｈはＲＮ　Ａポリメラーゼ
ＩＩと７詐する１′・置：、により伯［１桿される。プ
ロモーター１．’、ｊ、ｔ、　’ｔｉＦ４の最少８頃す
、５１、・ぜは次の１１・ｉｔ）である。′１−１＜１
″わち、１；ら−Ｔｈ写１’ｊｉＪ　ｌ’ｊｊｊのため
の出光点を４．”）イ！［すること、Ｉ（びこの出ｊ１
６　：”ｉＫ位の近くにＲＮ　Ａポリメラーゼ１■の結
イ冒４１１位ｆ４是供しメツセンジャーｎｐ＋ｈｆ目ｌ
スのだ？〕）の６、ｆｆヂ」として１１′１〉１１なり
ＮＡり１ｈのパ・：イ！＼（を［ｆｆ　（：ｉ二にする
ことである。さらに、立本：　’Ｍミブロモーターは、
ぞのコントロールの下でコードセグメントのｌ（（写の
イｌ］対的；、ｊｉ、　＞（、Ｋを！ｔｉ１１ｒｌ：ｊ
ｊするためＧこｌ’、’３　ｉ・ニーする。（′占″１
１［ミツブロモ−ターはに開方Ｄ　Ｎ　Ａコードセグメ
ントのぐン（（に（：ｊ４ｔ、：ｌ：的なｍＲＮＡの比
ｌ！ン的犬：・１の仔Ｊ■、を」５フ遇するプロモータ
ーである。

プロモーターの（台能の構造的相互関係は明確にｊ′：
！ｉ、’、γヤＥオ］ていない。プロモーターセグメン
トは逼′、り六ある］Ｉ″ご造ｊ１”ｊ伝子の５′求０
１゛、”′に１合接して存在する領域と（、てのＮｕ質
（こおいてｊ「ｉＪ定される。（腎転子の５′末９゛コ
及びろ′未整）は、これから軒写されたｍＲＬ・ＴＡの
対応するそれぞれの末り′１ｃ（１を示し、そしてコー
ドされた蛋白質のＮ　Ｈ２−末端及び−０００Ｈにそれ
ぞれ対応するものと理解される。）色々な種からの色々
な）’ｊｌｔｒ　転子のためのプロモーターのヌクレオ
チド配列の比較から、これらの間で井、ｉｉＱな、ヌク
レオ配列の類似性を有する非常Ｇこ短い領千・髪か見出
されている。これらの領域の内ｑ′ξｉ、Ｇこ８−：“
；著なものは、「ＴＡＴＡボックス」、ずなオ〕ち転写
開１．ｊ’：畠位から一般に約７０〜２６０ヌクレオチ
ド上流にイヘ゛１ｉｉ子し、一般に；：１１似するＴＡ
ＴＡＡ配列全イ１″する約５〜１０ヌクレオチドのセグ
メントである。

ＷＪ、、’、！　、’？Ｉｉ的比較全比較り！、Ｉｇ、
するためには、ＢｒｅａｔｂｎａｃｈＲ，及びＯ′ｈａ
ｍｂｏｎ　Ｐ、　、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　ｏｆ　Ｅｉ
ｏｃｈｅｍ。

（１９８１）　５０　：　３４９’ｆ［ｌｒ＜ｉ）、Ｚ
　トｏ　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ａ　ホ、、　クスは）板耳の：’
Ｉ　ＩＩｉ優こおいて機能すると信じられる。

外来性造転子は、プロモーターにｉ！！、辿する正常な
わ・ン造遺伝千由来のコドンを含有しないが又は実’（
’、ｊ上含有しないであろう。、１・つ常、外来性１ｔ
ｌｉ伝子は、）ＴＪ　％−ターを含むｊｊ、、Ｆ　開会
！′ＩＪへの非コード６′末端に１１１！Ｉ＋’ｊされ
、管１１１１ｔｌ　、ｉ”ｆ　ｆｘ子Ｏこ天然にＩｘ＋
　＞、！ｕする１、ノ：’１４：　ｊ’３．転子（ｅｎ
ｄｏｇｅｎｏｕｓ　ｇｅｎｅ　）のＮ末厨；１）のアミ
ノｊ台１ｒ）ｊ−ｊｌ：除きれるであろう。すなわち、
外来性・□、Ｉ′伝〕−にＩＩ！！糸吉された場合、ｉ
ｊｌ’ｌ　（、−１ｉｉ　４Ｅ−ｔ’ｉ　Ｊ・′、に１
呆存されるの（オろコドン（９ヌクレオチド）未７に’
ｊ−（”あろう。

コードセグメントの６′木掠５．）におけるターミネー
ター（ｉｔ’、列のイＹイＦにより元−１・１Ｊンノ弓
′、１化さゎる。このづ′・ｊ１Ａ！は一府（２に原４
正″［）１硬−べ”ｊ−Ｍうへのｒ１１ｏファクターの
１′ゴ加の」↓７）合に（，１似してよ５す、ＲＮ　Ａ
ボリメラーセの＋−′、’ｅ　ｊ、１．（ｌ旨（１度か
」ニジ？、シ、１巨写の白１．；畝、ｉ・・（，４１ひ
が上ジーμする。

ターミネータ−１′尼列（・才外米″ｉ・′；　Ｄ　Ｎ
　Ａ七グメントの４・４出しイ、４る光房１にｌｊ必′
−ソで７．「いが、こイ１をＪｕｌに連結ずれ’ｖ’；
Ｕ丸現力弓：叱出されることが理１・１：′されよう。

クーミネーターｊｌ嘩ｊ　ｊ・・・（：フ、プロモータ
ー＜７．＝ｉ城がμＪ７車するのと同一〇）又け一′ｊ
−Ｉ；る：’、：ｌｉ　７Ｌ：ＩＪ’、転子と１）℃１
連することが当然−「拝７ＩＦである。

この発明のＧＡＰＤＨ又はＰ　ｙＫ　：ｈ’、成のため
の最も〕・で当なり　Ｎ　Ａベクターはシャトルベクタ
ーである。

これらのベクターは細菌株、例えば旦９已ユ（旦」旦昌
）と酵母との間を往（Ｄ；　（５ｈｏｔｔｌｅ　）する
ことができる。なぜならこれらのベクターは細菌袴ふ１
ｊ　ｌ’３Ｊガｉ点及びｆ’ｉｒ　ｆｉｔ、　’ｆ’ｇ
ｒ　ｆｄ、；’！開始点をイｒするからである〔例えば
、Ａ、ｍｍｅｒｅｒ　Ｇ、等、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａ、ｎ
ｔ　ＤＮＡ。

エルゼビール、アムステルダムｐ　＠　Ｉ！ｆ（（のこ
と〕。

典、Ｊ：１す＋’ｔ’ｙな細ｒ￥Ｗ　’＃Ｊ　叫１ｉ」
始点は、例；ｔ　ハｐＢＲ３２２カら導かれる。ＪＩ！
も有用な酵母＋７？・Ｉ））４　ｊｊｊＪη′・点（目
、２ミクロンザークルとして知られるＱ＋！色体外１′
７伝−ヅ１朱に見出される。実１瘉室株において、２ミ
クロンプラスミドＤＮＡ８才却１胞当り約５０コピー見
出ざね、そして安定に肩］：ｆ？される。Ｊ）、％　ｆ
硯するために例えば０ｕｒｒ、　Ｔｏｐｊ−ｃｓ　Ｍｉ
ｃｒｏ、工ｍｎ、　（１９８２）　９６　：　１１９全
忌１；・シのこと。この酵母プラスミドも配列決定され
ている［：　Ｈａｒｔコ−ｅｙ、　、Ｔ、　Ｌ、等、Ｎ
ａｔｕｒｅ　（１９８０）２Ｂ６４８６０１］。

この発明の仔１（）ｉｊ−において／Ｉｉ、、川される
プラスミド及び宿主η′１（１胞の代表例力）アメリカ
ン・タイプ・カルチュアー・フレクション（ＡＴＣＣり
に寄託すれている。プラスミドｐＰｙＫ’９．１．１．
並びに［市１、Ｌ細胞形質転換体２１５０−２−３／ｐ
ＨＢｓ−５６ＧＡＰ３４７／６３、及び２１５０−２−
６／ｐＨＢｓ５６．ｐｙＫか、１９８６年２．Ｉ」１．
８　Ｂに宵臼コされ、それぞれＡＴＯＯパ３・け入れ番
号（Ａｃｃｏｓｓｉｏｎ　Ｎｏ　）　’１００６１．２
０６６５及び２０６６６か与λられた。

ン欠に記Ｉ’７するＢｌ：＆こおいて、多くの技に仁、
へ口・（Ｓ及び分子゛、′：方乙ｊ；け当＝、′、、　
Ｊｆ、４　（Ｊ：おいてずでによくり、ｌＪられている
。行にことわらない：Ｘ：」りすべてのに′素は１又Ｉ
ｔ　ｌ；　数の１・′υ）、的イ’、”　ｌＪｒ　ｉ”
ｊｊ　Ｓ　ＹｌｌえＴ；ｉｌ−丁ｅｗ　Ｅｎｇｌａｎ、
ｄＢｉｏｌ　ａｂｓ　、ベヘリー、マザチューセ、ツ；
Ｃ０１１ａ　ｂ　Ｏｒ　Ｐ−ｔ　Ｉ　Ｖ　ｅ　Ｒｅ　Ｓ
ｅ　ａ　ｒ　Ｃｈ　＋　　ウアルサム、マサチューセ、
ツ；　Ｍｊｌｅｑ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、エルク
ハート＼インナ′イアナ；　ｎｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｂ
土ｏｃｈｅｍｉｃａ−１ｓ、工？１Ｃ，インディアナポ
リス、インティアナ；及びＢｅｔｈｅｓｄａ　ＲＯｓｅ
ａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ロックビレ、メ
イランドから入手することができる。

制限酵素消化のための綬衝液及び反応条件は、特Ｇここ
とわらない限り各酵素の製造者のｆ奨に従って使用した
。他の酵素反応、ゲル電気泳動分雛及母プロトプラスト
の形質転換は本質上、ＢｅｇｇＳ。

Ｎａｔｕｒｅ　（１９７８）　２７５：　１０４に記載
されている方法により行うことかできる。

形質転換に有用なＥ。コリ株には、Ｘ　１７７６　；１
（１２ストレイン２９４　（Ａ、ＴＯＯＮ口３１４４６
　）；ＲＲｌ及び］（、Ｅ１０１が含まれる。遺伝子型
（ａ。

する１４ソ母株Ｘ　Ｖ　６１０−８ｃ　、及び遺伝子型
（Ｌｅｕ２に典型的に使用することができる。しかしな
がら、実質上すべての酵母菌株が形質転換のために有用
であると理解すべきである。細菌は、Ｍｉｌｌｅ、ｒ　
Ｊ。

コールド・スプリングハーバ−聯ラボラトリ−。

コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク（１９７２
）に記・１ジされている方故に従って増殖せしめ、そし
てｉ：ｉ８４１（することができる。酵ｆくすは次の培
地に増殖せしめることかできる。ＹＥＰＤ培地は１（Ｗ
／■）％の１・１ミイミナエキストラクト、２（Ｖ／／
’Ｖ）％のペプトン、及びクルコースを含有し、プレー
ト培地の場合にはさらＱこ３（Ｗ、／Ｖ）％の寒天を含
有Ｔ　ル。ｙ　Ｎ　Ｂ　＋　ａ　Ａ　１１＝”、７？、
地は１−ｅ「ｌｉ　６．７７　（Ｄ　イーストニトロゲ
ンベース（ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎｂａｓｅ　）
　　（ティフコのラボラドリース、ミネアポリス、ミネ
ソタ）、１０７Ｆ夕のアデニン、１ＱＩＩＩ９のウラシ
ル、５ｇ−のカサミノ１１ノ（ＯＡＡ）（ディフコ）及
び２０ｐのグルコースを含有し、プレート培地の場合に
はさらＧこ３Ｑ９のンー天を含有°する。トリプトファ
ン栄必要求″１」ミの、・′４尺は、形質転換されるイ
・′１このトリプトファン以夕）のすべての増Ｍｅｉ要
求囚子かも（ｉ完された、６７ｇのイーストニトロゲン
ベース（アミ７７％不含）を含イｆするプレート上で行
うことができる。

例１　酵母グリセルアルデヒド−６−ホスフェ＝Ｆ母Ｇ
ＡＰＤＨ：ｌ−＋：配列を含有スル相ｈ！ｉ的ＤＮＡ（
ｃＤＮＡ）　　を次のようにして調製した。

酵母Ａ３６４Ａ株からポリＡ＋ＲＮＡを分νＨｉ　した
。

Ａ、　Ｍ　Ｖ逆転写Ｎ４米（ｒｅｖａｒＳｅ　ｔｒａｎ
ｓｃｒｉ、ｐｔａｓｅ　）及びＥ、コリＤ　Ｎ　Ａポリ
メラーゼ■を用いて２重：資’、ｌ　ｃＤＮＡを合成し
た。デオキシヌクレオチドターミナルトランスフェラー
ゼ（ｄｅｏｘｙｒ＋、ｕｃｌｅｏｔｉｄ−ｅｔｅｒｍｉ
ｎａｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　）を用いて２重鎖ｃ
］）ＮＡ分子にボ’Ｊ−ｄｃ−ティル？付加した。ポリ
ーｄｃ−ディルを付加したｃＤＮＡをポリーｄＧ−ティ
ルを付加したｐＥＲ３２２にアニーリングし、そしてこ
れを用いてＥ、コ１ＪＨＢ１０１を形質転換した。１０
００個の形質転換体を、ラベルされたポリＡ＋ＲＮＡへ
のコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニン
グし、そしてサブセットを、制限ｌｖ素マツピング及び
ＤＮＡ配列決定によりさらに試験した。集団から、ＧＡ
ＰＤＨ配列を含有する３個のコロニーを分ｊ１呼した。

１つのクローン（１）ＣＧＡＰ−９）が約１２００Ｊａ
基対（ｂｐ　）の挿入部を含有しており、これをその後
の研究に使用した。

Ｂｌａｔｔｎｅｒ　ＩＩ”、、　Ｒニー等、５ｃｉｅｎ
ｃｅ　（１９７７）　　１９６　：１６１〜１６９に従
って、全酵母ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ　３Ａにより部分
消化した徒に得られた断片を」ファージ・シャロン（０
ｈａｒｏｎ　）　２８に挿入することによってｒ’ｌ１
％母遺伝子ライ転子う−栄調、製した。ＧＡＰＤＡコー
ド配列を含有するｐｐｆ／ｌの）づ１片を、ｐｃＧＡＰ
−９由来のラベルＤ　Ｎ　Ａを用いてファージライブラ
リーをスクリーニングすることにより分；”ｉｇ　シた
。これらのクローンの内の１つの酵母ＧＡＰＤＨ’＋ｉ
＋ｆ伝子を、２．１　転子　Ｂｉｎ　ｄ　ｌｌｉ　１１
ｇ１片（ｐＧＡＰ−１）　、にイＴ　１１ｇ＋参１１＜
１ンとして、又は３．５ｋｂ　Ｅａｍ　Ｈ工断片（ｐＧ
ＡＰ−２）としてｐＢＲ３２２でサブクローニングした
。これらのクローンからＧＡＰＤＨプロモーター活性１
（４１片を分α［トシた。約ｓ　ｏ　ｏ　ｂｐのＨｌｎ
　ａ　ＩＩ　−Ｈｈａ　１１：’：ｌ’ｒ片を約３５０
ｂｐのＨｈａ　Ｔ　−Ｈｌｎ　ａ　ｉｌｌ　ｌｌＪｉ片
に連結した。　４られた１０６１　ｂｐ　Ｊ（ｉｎ　ａ
’ｉｌＴ断片をゲル電気泳動により分ｐＱ　シ、そして
ｐＢＲ３２２中でクローニングしくｐＧＡＰ−３４７）
、そして配列を決定した（第２図る照）・。

フタ−の４ｉ’ｆ成 酵母中でＨＢＶ　表面抗原を発現するための、ＧＡＰＤ
Ｈプロモーター断片を用いるプラスミドベクター（１）
ＨＢＳ−５６ＧＡＰ６４７／ろ３）を、第３図に示すよ
うにして構成した。

ｐ　ＧＡＰ　−５４７をＳｐｈ　Ｉにより全消化し、次
にＢｉｎ　ｄ［１により部分消化することにより、ＧＡ
ＰＤＨプロモーターの約１０６０ｂｐとｐＢＲ３２２の
約５３０ｂＰを有する約１７０［１ｂｐ　　のＳｐｈ　
Ｉ　−Ｈｓｎ　ａｌｌ断片を得た。この１７ＤＯｂｐの
Ｓｐｈ　■−Ｗｉｎ　ｄ　Ｉ［ＴＧＡＰＤＨプロモータ
ー断片を、ａ４ｏｂｐのｕｉｎａＴＩＩ−Ｈｉｎｄ［断
片（ＨＢｓＡｇコード領域、２６塩基の５′非コード領
坊及び１２８ｂｐの６′非コード領域を含有し、ｐＨＢ
ｓ’７５６　から得られたもの）に連結し、そして次に
３５０ｂｐのＨｌｎ　ｄ　ＩＩＩ　−ｓｐｈ　ＩＨＪｒ
片（ｐＨＥｓ−５６が６分＋５ｊｆｆ　サ’ｈ、Ａ　Ｄ
　Ｈ−１ｔｇ　ｅｆｔ　Ｎｉ域を含有する）と連ねｆｉ
シた。２９００ｂｐのｓｐｈ■１ｉ７ｉ片（カセット）
を分刻し、そしてあらカルめＳｐｈ　Ｔにより消化され
たｐＨＢ５−５６　　にロクローニングした。プラスミ
ドｐＨＢ５−５６（ＡＴＯＯ受入Ｎｏ、４００４７）は
掟ｊ・ＩＩ中の米国ｑｊｒｒＦＦ出ｆｉｌｌ！ＩＮｕ　
４０２゜３３０．１９８２年７月２７日出穎、［Ｓｙ：
ｎｔｈｅｓｉｓｏｆ　　Ｈｕｍａｎ　　Ｖｉｒｕｓ　　
　Ａｎｔｉｇｅｎｓ　　ｂｙ　　Ｙｅａｓｔ　　Ｊ　　
に３己・１＋）されており、そして￥’：’ｒミ母１　
ｅ　ｕ　２］’：、ｊ転子及びｐＥＲ３２２のａ　ｍ　
ｐ　＋：・ｉｌｉｌｌ１ｔを伴う領」式のほかに完全な
２ミクロンプラスミドを含有する。プロモータ％　ａ転
子及び終紹領用；が正しく方向付けられてイル得らｔｌ
、た７５　スミ）−（ｐＨＢｓ−５６ＧＡＰ３４７／６
３）を分１１１ｉ　シ、そしてこれを用いて酵母Ａ１３
１０２ｕｒａろ−５２，ｈｉｅ４−５８０．ａｉｒｏ）
　、又は２１５０−２−３株（ＭＡＴａ、　ａｄ、ｅ　
１．１ｅｕ２−０４．　ｃｉｒｏ）を形質転換した。Ａ
Ｂ　１０２　＋Ａ３は２ミクロンプラスミドのキユアリ
ング（ｃｕｒ土ｎｇ　）により５Ｆ６５７−９Ｃから誘
導されたものである。２１５０−２−、ｌＳ株はワシン
トン大学におけるＬｅｌａｎｄ　Ｈａｒｔｗｅ１１氏の
コレクション企由来する。

プラスミドｐＨＢ５５６−３４７／ろ６を含有するＡＢ
１０２林の培養物１００ＴＬ（！を、６５　Ｄ　ｎｍ　
　における光学濃度が１になるまで増殖せしめた。ガラ
スピーズと共に措拌し、そして遠心分離によってｇ胞片
を除去することにより無細膓溶解物を調製した。ＨＢｓ
Ａｇをアボット　アウスリア■（Ａｂｂｏｔｔ　Ａｕ５
ｒｉａ　ｒｒ　）ラジオイムノ　アッセイにより）■１
１定し、そして蛋白質濃度をクーマシーブノＩバー　（
Ｏｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ　）　　結合法により測
定した。ス古果を第１表に示す。この結果は、ＧＡＰ’
ＤＨプロモーターが、酵母における蛋白質の発現のため
にＡＤＨ−１プロモーターに比べて約５倍効果的″′″
；９　Ｚｒ　Ｃ′に７Ｊ″Ｌ、Ｔ）６°　　　　　　　
以工余。

第１表　酵母しこおけるＨＢｓＡｇの元現（ａ）　　ｐ
ＨＢｓ−５６（ＡＤＨＩプロモーター）（対照）１　　
　　８．８　　　１８　　　　　０．４９２　　　１４
　　　　２５　　　　　０．５６１２．４　　　２００
．６２ （ｂ）　　ｐＨＢ５−５６０Ａ−Ｐ３４７／３３（ＧＡ
ＰＤＨプロモーター）１’　　　　３６　　　１４　　
　　　　２６２　　　３５　　　１２２．９ ３　　　６７　　　１２、’５　　　　　３．０１′ぐ
ＩユＡＢ１０２わ）この代りにＩ’ｊｆ’　４ξｆ２１
５０７２−３イニトを使用し例３２反復することにより
同様の結果か得られた。

Ｆ＞ｊｌ　４．　　ｊ：”ｊ′ｆ、母ピルベートキナー
ゼ、−Ｆ転子のクローニング ピルベートキナーゼＴ′を転子２補完 （ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ　）によりクローニ
ングした。

酵母ピルベートキナーゼマイナス変異株を、野性型酵母
ゲノム性ＤＮＡを含有する組換ＹＥｐ　２４プラスミド
のプールにより形質転換した。酵母６２８８０株（遺伝
子型：　５ＵＯ２，ｍａｌ、ｇａ１２゜盟Ｕ」）、及び
ＰｙＫ　１−５株（迫転子型：上。

ａｄｅｌ、　１ｅｕ１．　ｍｅｔ１４．　ｕｒａ３．　
ＰｙＫｌ−５）をカリホルニア大学（バークレー）、生
物物理学部（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓｉｃｓ　）　、酵母遺伝子貯蔵センター（Ｙｅａｓ
ｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ）から
イ」た。使用した酵母遺伝子バンクは、５２８８Ｃ株由
来の全ＤＮＡのＳａｕ　３’Ａ部分分解物を「シャトル
」ベクターＹＢｐ　２４のＢａｍＨＪ部位にクローニン
グしたものから成る。ベクターＹＥｐ　２４は、細菌直
前択及び増殖のためのｐＢＲ３２２配列、酵母における
選択のための酵母Ｕ　ＲＡ　３　遺伝子、及び酵母にお
けるプラスミドの複製及び分子（［（Ｓｅｇｒｅｇａｔ
ｉｏｎ　）を保証するための酵母２μサークルのＥｃｏ
ＲＴｆｌｉ片を含有する。このプールは、全酵母ゲノム
を代表するのに十分な独立の組換プラスミドを含む。

ｐｙｘｌ−ｓ　４ごｐにおける変異はＰｙＫｌ及びＵＲ
Ａ３座にあるので、この体はグルコースを含有する培地
又はウラシルを含有しない培］１１Ｌには増殖すること
ができない。この株をｙｇｐ２４ゲノムライブラリーに
よって形質も、（“：；−シ、そしてウラシルを含有せ
ずグルコースを含有す？）培Ｊ＋ｉ＋に増殖することが
できる形質転換体を了′を釈することにより、ビルベー
トキナーゼヂτ転子含有するＹＥｐ　２４を獲得したス
ミ１１胞が選択される。３．５Ｘ１０　　個のｐｙｘｌ
−５酊母絹＋１ｉ：ｉｔを１０μｇのＹＥｐ２４だ１喚
体プラスミドプールＤＮＡで形１ｊｑ　ＩＩＱ　７１；
’、Ｌすることにより、ウラシルの非存在下及びグルコ
ースの存在下で増殖する５個の独立したハラ笛転］＋−
コ体を才；）た。

これらの形質初子姿体の挿入ＤＮＡを制限酵崇分析によ
り特徴付けることにより、これらが１ｊｒしするＤＮＡ
挿入部を含有することが示された。発明背は１つの形予
ｆ　Ｑｒｇ　ｉ’＞基体、ずなわぢ７．Ｏｋｂの挿入ｔ
’？ｌｓ　（１ｎｓｅｒｔ　）を含有するｐＰｙＫ９１
に注目した。

この挿入部中のピルベートキナーゼ］Ｑ転子の位′！Ｉ
を、ピルベートキナーゼｍＲＮＡであると予想される約
１．７　ｋｂ　のｍＲＮＡにノｈイブリダイズする挿入
部特異的制限断片を決定することにより決定した。

ＰｙＫ　遺伝子の位置決定を、挿入ＤＮＡの対応側が）
をサブクローニングし、そしてＰｙＫｌ−５変異株中の
機能の補完を観察することにより＠詔した０４、４　ｋ
ｂ　挿入部上にＰｙＫＷＪ伝子を含転子るサブクローン
ｐｐｙｘ９．１．１の配列を決定し、そして発現プラス
ミドの什Ｉ成において使・用した。

１つのオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎｒｅａ
ｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ　）中の１４９７ヌクレオチド、
５′非ＷＦＡ　？Ｒ領領域９１１ヌクレオチド、及び６
′非陣訳領域の４７７ヌクレオチドを含むＰｙＫ逍伝子
転子泪２８８５ヌクレオチドの配列を決定した（第４図
参ｆ！＜？　）。この遺伝子は４９９アミノ酸のポリペ
プチドをコードし、単量体分子′ｆｔ５４゜６０８ダル
トンをもたらし、これは酵母ＰｙＫ　　の予想値とよく
一致する。ヌクレオチド配列から誘導されるアミノ酸組
成も、分離された酵母蛋白質から測定されたそれとよく
一致する。ヌクレオチド配列からカルボキシ末端がバリ
ンであることが予想され、これは酵母ピルベートキナー
ゼについて艶出されている。

２　ツ（７：）　’）’＋ｆなるｊｉ’ｒ成ｐＪ■Ｊ３
ｓ　１６　ｐｙＫ及びｐ　Ｈ］３　Ｓ５６　Ｐ　ｙ　Ｋ
　′：５：ｉ’、１．・Ｊ・＆１！シた。方法の＋ｊ’
、’＋略を第５１×１に示す。

１Ｒ３２２中に−りｏ　　＝　ンクサレタ（ｉ：ｒ　Ａ
ｊ　Ｐ　ｙ　Ｉ（；、”７伝子を含有〒ずＺ〕プラスミ
ド］っＰｙＫ　９．１．１を、±■　により消化し、−
として突出した末Σ・“、２ろ−Ｄ　Ｎ　Ａ　ホ＋）メ
ラーゼ■をｔｆＴいてデオキシヌク１７オチドにより満
たした。この生ＴＡＧ物をＢａｍＨＩで消化することに
より、Ｐｙ）Ｃプロモーター及びＰ　ｙ　Ｋコード領域
からの８少ｊＭ　；”：’−を含有ゴーる２１２ｂｐの
ＢａｍＨｉ−平Ｗ’）末Ｈｔ：ｔ）　１：：７片７〕す
ｒ、％的に分、；汁し７た。この断片を、あらかじめＮ
Ｏ○［で消化しＤＮＡポリメラーゼを用いて７滓たしそ
し、てＢａｍＨＩで消化したプラスミドＴ）ＨＢＳ−６
（：］つＢＩＲろ２２中でクローニングされたＩＩＢｓ
ｋｇ’ｙ：Ｉ転子（５′非コード領Ｊシ）が除去されて
いる）を含有する〕に連結した。Ｅ。

コリを形質転換した後、ｐｕＥｓ−６ｐｙＫｆ分離した
。このプラスミドは、ＨＢｓＡｇコード配列と同位相で
融合した６個の余分のアミノ【（夕をコードするコドン
ＡＴＧＴＯＴＡＧ　　０ＡＴＧ　　と共にＰｙＫプロモ
ーターを含有する。ｐＨＢ５−６ＰｙＫをＢａｍＨＩを
用いて完全消化し、そしてＥｃｏ　Ｒ■により部分消化
することによりＨＢ　ｓ　Ａｇ　３＋、’を転子に継合
したＰｙＫプロモーターを含有する１　７５０　ｂｐ　
Ｂａｍ　ＨＴ　−Ｅｃｏ　Ｒ■断片を分離した。この１
７５０ｂｐの断片を、Ｂａ、ｍＨｉ及びＥｃｏＲＪによ
りｐＨＢ５−１６（ＡＴＯＯＮｎ　４００４ろ、酵母中
のアデノウィルスプロモーター（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ
　Ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ）と題して１９
８２年１１月１８日に出願された米国特許出願ＮＧ、４
４２，６８７に記載されているプラスミド（引用により
この明細−ｆｊ／に組入れる）〕を消化した後（こイ↓
）られた大断片に連結し、そしてこれを用いてＥ、コリ
を形質転換した。酵母発現プラスミドｐＨＥＳ−１６Ｐ
７Ｋを得た。ｐＨＢ５−１６て１２００　ｂｐ　Ｓｐｈ
　■−Ｘｂａ　ＩＩｆ（片（ｐＢＲろ２２の２００ｂｐ
、ＰｙＫプロモーター及びＨＢ　Ｓ　Ａ　ｇ　４’ｉ、
’、ｉ伝子転子′領域のｉ　ｏ　ｏ　ｂｐを含有する）
を分１１引ρした。この１２００ｂｐＳｐｈ）−Ｘ、ｂ
ａＪｌｆｉ片を、ＨＢ　ＳＡ　ｇ　；ｆ：ｊ転子の３′
末會、）（及びＡＤＨ−１ターミネータ−を含有する１
　０７０　ｂｐ　Ｘｂａ　■−Ｓｐｈ　Ｊｉｆ；７片（
ｐＨＢｓ−５６から分・呵）に連結した。Ｓｐｈ　ｉ　
で消化した後１．ｐｙＩぐプロモーター、ＨＢ　ｓ　Ａ
　ｇｌＩｆ７伝子及びＡＤＨ−１ターミネータ−を含有
するＳｐｈ、１−ｓｐｈ　Ｔ　２３００　ｂｐｉ’、：
’ｒ片（カセ７　）　）　’＆　分１；ｌシタ。

このカセット断片を、５ｐｈＩによりあらかじめ消化し
たｐＨＢ５−５６　　中にクローニングした。Ｆ゛：γ
母う４」ＪジブラスミドｐＨＢ５−５６　ＰｙＫ　：！
！ｌ−イリた。このプラスミドを月４いて酵母ＡＢ１０
２株（例２をｇ　ｊｉ′、’ｒ　）又は２１５０−２−
ろ（・Ｋ（例２を参ｊｊ：Ｈ４）を形質転換した。

プラスミドｐＨＢ５−５６Ｐ３’Ｋを含有するＡＥ　１
０２イアにの培穆物１００ｍ１を６５０　ｎｍにおいて
光学％ｊｉ度が１〜２になるまで増殖せしめた。ガラス
ピーズと共に攪拌し、そして細胞片を遠心分画によって
除去することにより無細胞溶解物を得た。アボット・ア
ウスリア■、ラジオイムノアツセ侶こよりＨＢｓＡｇを
測定し、そしてクーマシーブル−結合法により蛋白質濃
度を測定した。結果を第２表に示す。

第２表　酵母中でのＨＢｓＡｇの合成 （ａ）　　ＰＨＢＳ−５６（対照、ＡＤＨ−Ｉプロモー
ター）１　　　　８．２　　　２４　　　　０．３４２
　　　７、２　　　２４　　　　０．３２３　　　４．
７　　　２７　　　　０２３（ｂ）　　ＰＨＢＳ　−５
６ＰｙＫ　（ＰｙＫプロモーター）１　　　　１８　　
　２．５　　　　０．６８２　　　　１０．６　２２　
　　　　０．４８３　　　　１５．２　２７　　　　　
０．５６［′）ル二母ＡＢ　１０２　＋、’ｆミの代り
に酵母２１５０−２−３株？用い、例７の方法２反代す
ることによりｉ’＋’（４・ｆ；の結果が得られた。

この発明を４、Ｊ定の」４！、体制と［５′）係させて
Ｂ［趣洩したか、この発明のＴ′・Ｌ回内において、他
のｆ・１１々の変法やｌＩｊ、川を行うことができよう
。

４１文１面のｆｉｆｉ　’Ｉ酌よｉｉ！１！明第１図は
Ｇ　Ａ　Ｐ　ｊ）　Ｈプロモーター断片の分！−！ζ及
び連結を示し、第２図は（）ＡＰＤＨプロモーターのＤ
Ｎ　Ａ配列を示し、・＃Ｓ　３　Ｉν、］はＧＡＰＤＨ
プロモーターを含有するｒ腎ＩＪ光ｊ；’１．４プラス
ミドの前成を示し、第４図はピルベートキナーゼ（Ｐｙ
Ｋ　）じ“４伝子のヌクレオチド配列を示し、そして第
５　ｉｇｉはＰｙＫプロモーター領域を含イｆする１イ
さ母兄現プラスミドのイ）・、成を示１−０　　　　　
　　　　　　　　尼ｊＴ：示１′−二ＦＩＧ、　１ （、−＼　　　　リ　　　　”−Ｌ　　　　　ｒ　　　
　　ｌｕ　　　　　；　　　　　（Ｌ第１頁の続き ０発　明　者　パブ口・ディー・ティー・バレンツエラ アメリカ合衆国カリフォルニア ・サンフランシスコ・アッパー ・テラス・ナンバー３４５５ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５９年　特許願　　第２６１７２号２、発明の名称 酵母発現ベクター及びその使用方法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名称　　チロン　コーポレイション ４、代理人 （外　４　名） ５、補正命令の日付 陥和５９年５月２９日（発送日 ６　補正の対象 図　　　面（第２図及び第４図） ７？ｉｌ＋正の内容 図面の浄■、（内容（−変更なし） ８　添付壱類の目録

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　　ｆＪｌ母クワクリセルアルデヒド−ホスフェー
   トデヒドロゲナーゼプロモーターの転写制御下にある外
   来性ＤＮＡのセグメントを含んで成り、前記セグメント
   が転写のために正しく方向付けられており、そして酵母
   グリセルアルデヒド−６−ホスフェートデヒドロゲナー
   ゼからのコドンを前記外来性ＤＮＡの５′末端（こ実質
   上含有しない酵母発現ベクター。 ２　酵母ピルベートキナーゼプロモーターの転写制御下
   にある外来性Ｄ　Ｎ　Ａのセグメントを含んで成り、こ
   のセグメントが写転のために正しく方向角けられており
   、そして酵母ピルベートキナーゼからのコドンを前記外
   来性ＤＮＡの５′末端に実右上含有しない酵母発現ベク
   ター。 ろ　外来性ＤＮＡセグメントの６′末端に連結されたタ
   ーミネータをさらに含んで成る特許請求の範囲第１項記
   載の酵母発現ベクター。 ４、外来性ＤＮＡセグメントの６′末端に連結されたタ
   ーミネータ−をさらに含んで成る特許請求の範囲第２項
   記載の酵母発現ベクター。 ５、酵母２ミクロンプラスミドＤＮＡ又はその部分をさ
   らに含んで成る特許請求の範囲第１項記載の酵母発現ベ
   クター。 ６　酵母２ミクロンプラスミドＤＮＡ又はその部分をさ
   らに含んで成る特許請求の範囲第２項記載の酵母発現ベ
   クター。 ７、　前記外来性ＤＮＡが肝炎３表面抗原又はその部分
   （こついてコードする特許請求の範囲第１項記載の酵母
   用発現ベクター。 ８、前記外来性ＤＮＡが肝炎３表面抗原又はその部分に
   ついてコードする特許請求の範囲第２項記載の酵母発現
   ベクター。 ９（ａ）　　コードセグメントを酵母発現ベクターに挿
   入し、このベクターが酵母グリセルアルデヒド−３−ホ
   スフェートデヒドロゲナーゼの５′末端からのコドンを
   実質上含有しない酵母グリセルアルデヒドー６−ホスフ
   ェートデヒドロゲナーゼプロモーター由来のＤＮＡセグ
   メントを含んで成り、前記プロモーターが、挿入された
   ＤＮＡコードセグメントの５′末端に隣接しそして該プ
   ロモーター内で開始される転写が前記コードセグメント
   を包含するように方向付けられており、このようにして
   　−ドセグメント発現ベクターを得る段階、及び、 （Ａ）　　このコードセグメント発現ベクターにより酵
   母細胞を形質転換する段階を含んで成る、酸ｆｆｌ中で
   ＤＮＡコードセグメントを発現する方法。 １０（α）コードセグメントを酵母発現ベクターに挿入
   し、このベクターが酵母ピルベートキナーゼの５′末端
   からのコドンを実質上含有しない酵母ピルベートキナー
   ゼプロモーター由来のＤＮＡセグメントを含んで成り、
   前記プロモーターが、挿入されたＤＮＡコードセグメン
   トの５′末端Ｑこ隣接しそして該プロモーター内で開始
   される転写が前記コードセグメントを包含するようシこ
   方向付けられており、このようにしてコードセグメント
   発現ベクターを得る段階、及び、 （ｂ）　　このコードセグメント発現ベクターにより酵
   母細胞を形質転換する段階を含んで成る、酵母中でＤＮ
   Ａコードセグメントを発現する方法０１１、前記酵母発
   現ベクターが、挿入されたＤＮＡコードセグメントの５
   ′末端に連結されたターミネータ−をさらに含んで成る
   特許請求の範囲第９項記載の方法。 １２、前記酵母発現ベクターが、挿入されたＤＮＡコー
   ドセグメントの６′末端に連結されたターミネータ−を
   さらに含んで成る特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １３　　前記酵母発現ベクターが細菌細胞ゆ旧聞始点を
   さらに含んで成り、そして細菌細胞中で炸製することが
   できる特許請求の範囲第１項記載の方法０ １４、前記酵母発現ベクターが細菌細胞複製開始点をさ
   らに含んで成り、そして細菌細胞中で複をすることがで
   きる特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １５、前記ターミネータ−が酵母アルコールデヒドロゲ
   ナーゼ■ターミネータ−から成る特許請求の範囲第１１
   項記載の方法。 １６、　ｔａｉＪ記ターミネータ−が酵母アルコールデ
   ヒドロゲナーゼ■ターミネータ−から成る特許ＲＨ求の
   第１２預証・擢の方法。 １７　　前記ターミネータ−が酵母ＧＡＰＤＨターミネ
   ータ−から成る特許Ｓｉ’：求σ月屯１月１第１１項記
   Ｊ＆の方法。 １８、　　ｌ？ｉｌシ己ターミネータ−が百χ母ＧＡＰ
   ＤＨクーミネーターから成る特許品′求の４（Ｉｂｊ！
   第１２」口記成の方法。 １９　　前記ターミネータ−が１葬母ＰｙＫターミネー
   タ−である特許靜１求のｊ！：ｔｉ＋　ｔｊｌ第１１項
   記載の方法。 ２０則記ターミ＊−ターカｒ！’ＩＪＪ：ｐｙＫターミ
   ＊　−ターである特ｄ干、り７“ｊ求の７１・Ｊ門弟１
   ２旧記・！・・くの方法。