JPH08205868A - 形質転換された酵母によるリゾチームの生産方法 - Google Patents
形質転換された酵母によるリゾチームの生産方法Info
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- JPH08205868A JPH08205868A JP7288179A JP28817995A JPH08205868A JP H08205868 A JPH08205868 A JP H08205868A JP 7288179 A JP7288179 A JP 7288179A JP 28817995 A JP28817995 A JP 28817995A JP H08205868 A JPH08205868 A JP H08205868A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 リゾチームの酵母を用いる製造方法の提供。
【解決手段】 １，４−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼ
をコードするＤＮＡ断片の上流にリーダーペプチド配列
をコードするＤＮＡ断片をもつＤＮＡによる形質転換体
を培養する。
をコードするＤＮＡ断片の上流にリーダーペプチド配列
をコードするＤＮＡ断片をもつＤＮＡによる形質転換体
を培養する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、異質遺伝子のＤＮ
Ａを使用する形質転換により、１，４−β−Ｎ−アセチ
ルムラミダーゼ型の酵素の生産方法に関する。
Ａを使用する形質転換により、１，４−β−Ｎ−アセチ
ルムラミダーゼ型の酵素の生産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】１，４−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼ
は、バクテリアの細胞壁を形成するペプチドグリカン類
中のＮ−アセチルグルコサミンとＮ−アセチルムラミン
との間のグルコース結合を選択的に切離すことができる
酵素であることが知られている。これらの酵素は、通
常、リゾチームと呼ばれており、こうして殺バクテリア
剤として作用し、そしてこの性質は高等動物の生物学的
流体の大部分の中のそれらの一般化された存在を説明す
るように思われる。リゾチームは、事実、種々の濃度レ
ベルで、哺乳動物の血液、涙、乳などの中に見出され
る。また、植物界、例えば、パパイアにおいて見出され
る。リゾチームの工業的抽出は卵白から実施されてお
り、ここでそれは種々の吸着および／または沈殿法（ベ
ルギー国特許６９４、５３８号）により、比較的高濃度
で存在する。
は、バクテリアの細胞壁を形成するペプチドグリカン類
中のＮ−アセチルグルコサミンとＮ−アセチルムラミン
との間のグルコース結合を選択的に切離すことができる
酵素であることが知られている。これらの酵素は、通
常、リゾチームと呼ばれており、こうして殺バクテリア
剤として作用し、そしてこの性質は高等動物の生物学的
流体の大部分の中のそれらの一般化された存在を説明す
るように思われる。リゾチームは、事実、種々の濃度レ
ベルで、哺乳動物の血液、涙、乳などの中に見出され
る。また、植物界、例えば、パパイアにおいて見出され
る。リゾチームの工業的抽出は卵白から実施されてお
り、ここでそれは種々の吸着および／または沈殿法（ベ
ルギー国特許６９４、５３８号）により、比較的高濃度
で存在する。
【０００３】ニワトリリゾチームの現在の用途は殆ど製
薬学的分野であり、ここでそれは種々の感染と戦うため
に使用されている。他の用途は食品産業である。例え
ば、リゾチームはベーキングし圧縮されたチーズの製造
において、熟成の間のチーズの膨張をも含む製造欠陥品
の原因となる酪酸バクテリアの発生を効率よく阻止する
ために使用することができることは知られている（フラ
ンス国特許８００３３２１号）。それは、また、種々の
腐敗性食品、例えば、肉製品（Ａ．アカシ、Ｊａｐ．
Ｊ．Ｚｏｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｓｃｉ．）４２、１９
７１、２８９）、ワイン（特公昭４６−３１１５号）ま
たは酒（Ｍ．ヤジマら、Ｊ．Ｆｅｒｍ．Ｔｅｃｈｎｏ
ｌ．４６、１９６８、７８２）の保存のために使用する
ことができる。さらに、それは小児科の使用のためにミ
ルク成分の保存（特公昭４５−１６７８０号）などに使
用することができる。
薬学的分野であり、ここでそれは種々の感染と戦うため
に使用されている。他の用途は食品産業である。例え
ば、リゾチームはベーキングし圧縮されたチーズの製造
において、熟成の間のチーズの膨張をも含む製造欠陥品
の原因となる酪酸バクテリアの発生を効率よく阻止する
ために使用することができることは知られている（フラ
ンス国特許８００３３２１号）。それは、また、種々の
腐敗性食品、例えば、肉製品（Ａ．アカシ、Ｊａｐ．
Ｊ．Ｚｏｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｓｃｉ．）４２、１９
７１、２８９）、ワイン（特公昭４６−３１１５号）ま
たは酒（Ｍ．ヤジマら、Ｊ．Ｆｅｒｍ．Ｔｅｃｈｎｏ
ｌ．４６、１９６８、７８２）の保存のために使用する
ことができる。さらに、それは小児科の使用のためにミ
ルク成分の保存（特公昭４５−１６７８０号）などに使
用することができる。
【０００４】これらの種々の用途は、リゾチームを容易
に、大量にかつ十分に低いコストで生産することができ
るかぎり、かなりの潜在的市場を提供する。卵白からリ
ゾチームを抽出することを現在可能とする種々の方法
は、卵白を処理した後食品中に再使用することができる
場合にのみ、商業的に許容されうる。したがって、リゾ
チームの生産能力は卵白の市場により部分的に規制さ
れ、そしてこれは標準食品における処理された卵白の使
用に反対する、技術的困難、およびある国における法律
的拘束の解決を一層困難とする問題を生ずる。
に、大量にかつ十分に低いコストで生産することができ
るかぎり、かなりの潜在的市場を提供する。卵白からリ
ゾチームを抽出することを現在可能とする種々の方法
は、卵白を処理した後食品中に再使用することができる
場合にのみ、商業的に許容されうる。したがって、リゾ
チームの生産能力は卵白の市場により部分的に規制さ
れ、そしてこれは標準食品における処理された卵白の使
用に反対する、技術的困難、およびある国における法律
的拘束の解決を一層困難とする問題を生ずる。
【０００５】これらの問題は、リゾチームの天然源の入
手可能性に関係し、その初期濃度が、牛乳のリゾチーム
についてのように、低過ぎるか、あるいは原料が、ヒト
のリゾチームのように、実際的に存在しないかどうかに
ついて、哺乳動物のリゾチームの場合において克服不可
能となる。こうして、リゾチームの生産を可能としかつ
前述の問題を回避することのできる技術が必要とされる
ように思われる。
手可能性に関係し、その初期濃度が、牛乳のリゾチーム
についてのように、低過ぎるか、あるいは原料が、ヒト
のリゾチームのように、実際的に存在しないかどうかに
ついて、哺乳動物のリゾチームの場合において克服不可
能となる。こうして、リゾチームの生産を可能としかつ
前述の問題を回避することのできる技術が必要とされる
ように思われる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の主目的は、遺
伝子工学の古典的技術によりリゾチームを生産すること
ができるような酵母を提供することである。さらに詳し
くは、本発明は、ＤＮＡが１，４−β−Ｎ−アセチルム
ラミダーゼをコードするＤＮＡ断片の少なくとも１つの
コピーからなり、かつこの断片が対応する活性蛋白質と
してその中で発現されるように形質転換された酵母菌に
関する。本発明の他の目的は、前述のように形質形成さ
れているが、また生産したリゾチームを分泌して、その
分離および精製を促進することができる酵母菌を提供す
ることである。この形質転換を保証するプラスミドの提
供を目的とする。本発明は、特に、形質転換された酵母
菌を培養することによりリゾチームを生産する方法を提
供することを目的とする。
伝子工学の古典的技術によりリゾチームを生産すること
ができるような酵母を提供することである。さらに詳し
くは、本発明は、ＤＮＡが１，４−β−Ｎ−アセチルム
ラミダーゼをコードするＤＮＡ断片の少なくとも１つの
コピーからなり、かつこの断片が対応する活性蛋白質と
してその中で発現されるように形質転換された酵母菌に
関する。本発明の他の目的は、前述のように形質形成さ
れているが、また生産したリゾチームを分泌して、その
分離および精製を促進することができる酵母菌を提供す
ることである。この形質転換を保証するプラスミドの提
供を目的とする。本発明は、特に、形質転換された酵母
菌を培養することによりリゾチームを生産する方法を提
供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、形質転
換された酵母菌であって、そのＤＮＡが１，４−β−Ｎ
−アセチルムラミダーゼをコードする断片の少なくとも
１つのコピーを含んでなり、そして前記断片が対応する
活性蛋白質として細胞内で発現され、かつ前記１，４−
β−Ｎ−アセチルムラミダーゼをコードする断片の前
に、該断片によってコードされる前記活性蛋白質が、酵
母細胞の細胞質膜を通して排出されるように作用するリ
ーダーペプチド配列が、存在する形質転換された酵母菌
を培養し、培養物からリゾチームを回収する工程を含ん
でなるリゾチームを生産する方法が提供される。
換された酵母菌であって、そのＤＮＡが１，４−β−Ｎ
−アセチルムラミダーゼをコードする断片の少なくとも
１つのコピーを含んでなり、そして前記断片が対応する
活性蛋白質として細胞内で発現され、かつ前記１，４−
β−Ｎ−アセチルムラミダーゼをコードする断片の前
に、該断片によってコードされる前記活性蛋白質が、酵
母細胞の細胞質膜を通して排出されるように作用するリ
ーダーペプチド配列が、存在する形質転換された酵母菌
を培養し、培養物からリゾチームを回収する工程を含ん
でなるリゾチームを生産する方法が提供される。
【０００８】酵母を異種遺伝子により形成された解読部
分により形質転換することにより、あるいは対応するメ
ッセンジャーＲＮＡの逆転写の生産物により、酵母を遺
伝学的に再プログラミングすることは知られている。こ
の目的に、宿主細胞の複製機構により認識される複製起
源の存在により酵母細胞中で自律的に複製することがで
きるプラスミドを、前記断片のベクターとして通常使用
されている。ベクターは、また、プラスミドにより効率
よく形質転換された細胞の可視化および選択を可能とす
る遺伝子標識を含まなくてはならない。最後に、解読部
分の前にプロモーター、すなわち、解読部分の対応する
メッセンジャーＲＮＡへの効率よい転写を保証するよう
な宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼにより認識される配列
が存在しなくてはならない。
分により形質転換することにより、あるいは対応するメ
ッセンジャーＲＮＡの逆転写の生産物により、酵母を遺
伝学的に再プログラミングすることは知られている。こ
の目的に、宿主細胞の複製機構により認識される複製起
源の存在により酵母細胞中で自律的に複製することがで
きるプラスミドを、前記断片のベクターとして通常使用
されている。ベクターは、また、プラスミドにより効率
よく形質転換された細胞の可視化および選択を可能とす
る遺伝子標識を含まなくてはならない。最後に、解読部
分の前にプロモーター、すなわち、解読部分の対応する
メッセンジャーＲＮＡへの効率よい転写を保証するよう
な宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼにより認識される配列
が存在しなくてはならない。
【０００９】実際には、これらの技術は主としてサッカ
ロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）種の酵母に適用されてきた。
前記酵母のためには種々の要素からなる多コピー発現ベ
クターが構築されてきている。これらのベクターは、一
般に、この種の大部分の中に存在する２−ミクロンのプ
ラスミドの複製起源を含み、あるいは染色体起源の自律
的複製のＡＲＳセグメントさえも含む。標識遺伝子とし
て、必須代謝物、例えばアミノ酸の生物学的合成に関与
する酵素をコードする遺伝子が一般に使用される。この
ような場合において、使用すべき宿主は、突然変異によ
り、この代謝物について栄養要求変異種となった酵母菌
株である。この菌株を接種することにより、ミッシング
（ｍｉｓｓｉｎｇ）遺伝子を有するプラスミドにより形
質転換された細胞のみが生長することができるであろ
う。このような標識遺伝子の典型的な例は、遺伝子ＬＥ
Ｕ２またはＴＲＰ１であり、これらはそれぞれロイシン
およびトリプトファンの生合成に関与する酵素をコード
している。これらの発現ベクターは、また、１つあるい
は好ましくはいくつかの制限部位を含み、前記部位に問
題の解読部分、ならびにその発現を最適化するために必
要な種々の要素、すなわち、プロモーター、ターミネー
ター、および他の調節要素が挿入される。
ロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）種の酵母に適用されてきた。
前記酵母のためには種々の要素からなる多コピー発現ベ
クターが構築されてきている。これらのベクターは、一
般に、この種の大部分の中に存在する２−ミクロンのプ
ラスミドの複製起源を含み、あるいは染色体起源の自律
的複製のＡＲＳセグメントさえも含む。標識遺伝子とし
て、必須代謝物、例えばアミノ酸の生物学的合成に関与
する酵素をコードする遺伝子が一般に使用される。この
ような場合において、使用すべき宿主は、突然変異によ
り、この代謝物について栄養要求変異種となった酵母菌
株である。この菌株を接種することにより、ミッシング
（ｍｉｓｓｉｎｇ）遺伝子を有するプラスミドにより形
質転換された細胞のみが生長することができるであろ
う。このような標識遺伝子の典型的な例は、遺伝子ＬＥ
Ｕ２またはＴＲＰ１であり、これらはそれぞれロイシン
およびトリプトファンの生合成に関与する酵素をコード
している。これらの発現ベクターは、また、１つあるい
は好ましくはいくつかの制限部位を含み、前記部位に問
題の解読部分、ならびにその発現を最適化するために必
要な種々の要素、すなわち、プロモーター、ターミネー
ター、および他の調節要素が挿入される。
【００１０】これらのプラスミドは中間のバクテリア宿
主、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ中の複製および選択を保証す
ることのできるバクテリアの配列からしばしばなる。こ
のようなシャトル（ｓｈｕｔｔｌｅ）プラスミドの古典
的例として、ＹＥｐ１３［Ｊ．Ｒ．ブローチ（Ｂｒｏａ
ｃｈ）ら、Ｇｅｎｅ ８、１９７９、１２１］、ｐＦＬ
１−４［Ｍ．Ｒ．チェバリエール（Ｃｈｅｂａｌｌｉｅ
ｒ）ら、Ｇｅｎｅ １１、１９８０、１１］、ｅｔ ｐ
ＪＤＢ２０７［Ｊ．Ｄ．ベッグス（Ｂｅｇｇｓ）、アル
フレッド・ベンソン・シンポジウム（Ａｌｆｒｅｄ Ｂ
ｅｎｓｏｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）Ｎ° １６、ムンク
スガード（Ｍｕｎｋｓｇａａｒｄ）、コペンハーゲン
（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）１９８１、３８３ページ］、
ｐＭＨ１５８およびｐＪＯ１５８［Ｍ．ヘウステルスプ
レウテ（Ｈｅｕｓｔｅｒｓｐｒｅｕｔｅ）ら、Ｇｅｎ
ｅ、アンダー・プレス（ｕｎｄｅｒ ｐｒｅｓｓ）］を
引用することができる。
主、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ中の複製および選択を保証す
ることのできるバクテリアの配列からしばしばなる。こ
のようなシャトル（ｓｈｕｔｔｌｅ）プラスミドの古典
的例として、ＹＥｐ１３［Ｊ．Ｒ．ブローチ（Ｂｒｏａ
ｃｈ）ら、Ｇｅｎｅ ８、１９７９、１２１］、ｐＦＬ
１−４［Ｍ．Ｒ．チェバリエール（Ｃｈｅｂａｌｌｉｅ
ｒ）ら、Ｇｅｎｅ １１、１９８０、１１］、ｅｔ ｐ
ＪＤＢ２０７［Ｊ．Ｄ．ベッグス（Ｂｅｇｇｓ）、アル
フレッド・ベンソン・シンポジウム（Ａｌｆｒｅｄ Ｂ
ｅｎｓｏｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）Ｎ° １６、ムンク
スガード（Ｍｕｎｋｓｇａａｒｄ）、コペンハーゲン
（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）１９８１、３８３ページ］、
ｐＭＨ１５８およびｐＪＯ１５８［Ｍ．ヘウステルスプ
レウテ（Ｈｅｕｓｔｅｒｓｐｒｅｕｔｅ）ら、Ｇｅｎ
ｅ、アンダー・プレス（ｕｎｄｅｒ ｐｒｅｓｓ）］を
引用することができる。
【００１１】本発明の好ましい実施態様によれば、２−
ミクロンの内因性プラスミドの配列のＲＥＰ機能から少
なくともなるプラスミドを、主として宿主細胞がＳ．ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ種に属するときには、使用する。前
記機能は、とくに宿主細胞が前もって２−ミクロンのプ
ラスミドがキュアリングされている場合［Ｃ．Ｐ．ホレ
ンバーグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏ
ｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６、１９
８２、１１９；Ｒ．Ｍ．ワルムスレイ（Ｗａｌｍｓｌｅ
ｙ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９８３、３６
１］一般にプラスミドに一層大きい安定性をもたらす。
この型の他のベクターは、下記の実施例に記載されてい
る。
ミクロンの内因性プラスミドの配列のＲＥＰ機能から少
なくともなるプラスミドを、主として宿主細胞がＳ．ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ種に属するときには、使用する。前
記機能は、とくに宿主細胞が前もって２−ミクロンのプ
ラスミドがキュアリングされている場合［Ｃ．Ｐ．ホレ
ンバーグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏ
ｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６、１９
８２、１１９；Ｒ．Ｍ．ワルムスレイ（Ｗａｌｍｓｌｅ
ｙ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９８３、３６
１］一般にプラスミドに一層大きい安定性をもたらす。
この型の他のベクターは、下記の実施例に記載されてい
る。
【００１２】最後に、問題の解読部分の発現をできるだ
け高いレベルにするために、それをプロモーターとでき
るだけ効率よく会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）することが
必要である。種々の強いプロモーターが酵母菌において
知られており、それらの例はアルコールデヒドロゲナー
ゼ（ＡＤＨ１）、エノラーゼ（ＥＮＯ８およびＥＮＯ４
６）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロ
ゲナーゼ（ＧＡＰ６３およびＧＡＰ４９１）、ホスホグ
リセレートキナーゼ（ＰＧＫ）［Ｍ．Ｊ．ドブソン（Ｄ
ｏｂｓｏｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｓｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１０、１９８２、２６２５］およびアルカリ性ホス
ファターゼ（ＰＨＯ３およびＰＨＯ５）（欧州特許出願
１００，５６１号）のプロモーター、あるいはなおプロ
モーターｐ４１５（これについては後述する）である。
け高いレベルにするために、それをプロモーターとでき
るだけ効率よく会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）することが
必要である。種々の強いプロモーターが酵母菌において
知られており、それらの例はアルコールデヒドロゲナー
ゼ（ＡＤＨ１）、エノラーゼ（ＥＮＯ８およびＥＮＯ４
６）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロ
ゲナーゼ（ＧＡＰ６３およびＧＡＰ４９１）、ホスホグ
リセレートキナーゼ（ＰＧＫ）［Ｍ．Ｊ．ドブソン（Ｄ
ｏｂｓｏｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｓｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１０、１９８２、２６２５］およびアルカリ性ホス
ファターゼ（ＰＨＯ３およびＰＨＯ５）（欧州特許出願
１００，５６１号）のプロモーター、あるいはなおプロ
モーターｐ４１５（これについては後述する）である。
【００１３】これらの種々の技術は、酵母中の多くの異
種遺伝子のクローニングおよび発現に首尾よく適用され
てきており、もちろん、リゾチームの遺伝子または１，
４−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼをコードするＤＮＡ
の部分の酵母中での発現を保証するために同様によく使
用することでができる。特定の構造の例は、本発明にお
いて例示のために与えられているが、多くの他の可能性
が存在すること、および複製起源、標識遺伝子、効率よ
いプロモーターおよび他の構造的要素の種々の組み合わ
せを使用して同様な結果を得ることができることは明ら
かである。したがって、種々の場合において得られる形
質転換された細胞は、本発明の範囲内に包含されるもの
と考えなくてはならない。
種遺伝子のクローニングおよび発現に首尾よく適用され
てきており、もちろん、リゾチームの遺伝子または１，
４−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼをコードするＤＮＡ
の部分の酵母中での発現を保証するために同様によく使
用することでができる。特定の構造の例は、本発明にお
いて例示のために与えられているが、多くの他の可能性
が存在すること、および複製起源、標識遺伝子、効率よ
いプロモーターおよび他の構造的要素の種々の組み合わ
せを使用して同様な結果を得ることができることは明ら
かである。したがって、種々の場合において得られる形
質転換された細胞は、本発明の範囲内に包含されるもの
と考えなくてはならない。
【００１４】同様に、これらの技術の大部分は酵母Ｓ．
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換に主として適用されて
きたが、また、上に述べたのと同一の型の発現ベクター
およびそれらの変異種により形質転換可能な酵母の他の
種および属から得られる形質転換された細胞も本発明に
包含される。他の例として、サッカロミコプシス・リポ
リティカ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｌｉｐ
ｏｌｙｔｉｃａ）、スキゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓ
ｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂ
ｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）などを挙げることができ
る。しかしながら、本発明の好ましい実施態様によれ
ば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属
からの形質転換可能な酵母、なお好ましくはＳ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ種からの形質転換可能な酵母菌が使用さ
れるであろう。この種に属する形質転換可能な例とし
て、なかでもＡＨ２２およびＧＲＦ１８を引用すること
ができる。
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換に主として適用されて
きたが、また、上に述べたのと同一の型の発現ベクター
およびそれらの変異種により形質転換可能な酵母の他の
種および属から得られる形質転換された細胞も本発明に
包含される。他の例として、サッカロミコプシス・リポ
リティカ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｌｉｐ
ｏｌｙｔｉｃａ）、スキゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓ
ｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂ
ｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）などを挙げることができ
る。しかしながら、本発明の好ましい実施態様によれ
ば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属
からの形質転換可能な酵母、なお好ましくはＳ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ種からの形質転換可能な酵母菌が使用さ
れるであろう。この種に属する形質転換可能な例とし
て、なかでもＡＨ２２およびＧＲＦ１８を引用すること
ができる。
【００１５】本発明に従い、これらの種々の酵母により
生産される１，４−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼは異
る起源を有することができる。それは、例えば、ニワト
リリゾチームであることができる。ニワトリリゾチーム
は、前述のように、すでに工業的に生産されている。し
かしながら、他の源からのリゾチームをコードするＤＮ
Ａ部分は、これらの種々のリゾチームが、異る程度に、
顕著な相同性を表わす［Ｐ．ジョレス（Ｊｏｌｌｅｓ）
ら、Ｍｏｌ．＆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ６３、１９
８４、１６５］ので、他の源からのリゾチームの遺伝情
報を指定するＤＮＡ部分も同様に酵母中で発現されう
る。例えば、酵母中でガチョウのリゾチームを発現する
ことができる。ガチョウのリゾチームはニワトリのリゾ
チームよりも顕著に高い比活性を有する［Ｒ．Ｃ．カン
フィールド（Ｃａｎｆｉｅｌｄ）ら、「リゾチーム（Ｌ
ｙｓｏｚｙｍｅ）」、Ｅ．Ｆ．オッセルマン（Ｏｓｓｅ
ｒｍａｎ）ら編、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９７４、６３ページ］。また、
ヒトのリゾチームを酵母中で発現することができ、この
リゾチームは、また、非常に活性であり、そしてとくに
製薬学的用途ならびに小児科で使用されるミルク組成物
中に適用される。パパイアからのリゾチーム、およびバ
クテリアのウイルスにより解読されるものも挙げること
ができる。
生産される１，４−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼは異
る起源を有することができる。それは、例えば、ニワト
リリゾチームであることができる。ニワトリリゾチーム
は、前述のように、すでに工業的に生産されている。し
かしながら、他の源からのリゾチームをコードするＤＮ
Ａ部分は、これらの種々のリゾチームが、異る程度に、
顕著な相同性を表わす［Ｐ．ジョレス（Ｊｏｌｌｅｓ）
ら、Ｍｏｌ．＆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ６３、１９
８４、１６５］ので、他の源からのリゾチームの遺伝情
報を指定するＤＮＡ部分も同様に酵母中で発現されう
る。例えば、酵母中でガチョウのリゾチームを発現する
ことができる。ガチョウのリゾチームはニワトリのリゾ
チームよりも顕著に高い比活性を有する［Ｒ．Ｃ．カン
フィールド（Ｃａｎｆｉｅｌｄ）ら、「リゾチーム（Ｌ
ｙｓｏｚｙｍｅ）」、Ｅ．Ｆ．オッセルマン（Ｏｓｓｅ
ｒｍａｎ）ら編、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９７４、６３ページ］。また、
ヒトのリゾチームを酵母中で発現することができ、この
リゾチームは、また、非常に活性であり、そしてとくに
製薬学的用途ならびに小児科で使用されるミルク組成物
中に適用される。パパイアからのリゾチーム、およびバ
クテリアのウイルスにより解読されるものも挙げること
ができる。
【００１６】本発明に従い、酵母菌株が遺伝子工学によ
り誘導されて１つまたは他の起源からリゾチームを生産
するとき、この新規な性質を利用して、それをその生長
に最も適当な条件下で培養させることにより増殖するこ
とが必要である。このようにして、それ自体人間または
動物の食糧中に使用できるバイオマスが得られる。例え
ば、酵母の自己消化物は、それ自体栄養価をもつばかり
でなく、かつまた感覚器官の性質をもつため、種々の食
品（ミートパイ、スープ、ソースなど）における添加剤
として多少使用されることは知られている。もとの酵母
中のリゾチームの存在は、自己消化物が混入される食品
のように、自己消化物がさらされるバクテリアの汚染か
ら自己消化物を、ある程度まで、保存するという利点を
提供する。他方において、リゾチームの存在は食品の滅
菌温度を低下させる（英国特許１，４３８，５６９
号）。
り誘導されて１つまたは他の起源からリゾチームを生産
するとき、この新規な性質を利用して、それをその生長
に最も適当な条件下で培養させることにより増殖するこ
とが必要である。このようにして、それ自体人間または
動物の食糧中に使用できるバイオマスが得られる。例え
ば、酵母の自己消化物は、それ自体栄養価をもつばかり
でなく、かつまた感覚器官の性質をもつため、種々の食
品（ミートパイ、スープ、ソースなど）における添加剤
として多少使用されることは知られている。もとの酵母
中のリゾチームの存在は、自己消化物が混入される食品
のように、自己消化物がさらされるバクテリアの汚染か
ら自己消化物を、ある程度まで、保存するという利点を
提供する。他方において、リゾチームの存在は食品の滅
菌温度を低下させる（英国特許１，４３８，５６９
号）。
【００１７】本発明による酵母は、また、リゾチームを
酵母菌から分離することにより、精製されたリゾチーム
源として使用することもできる。しかしながら、明らか
なように、この操作は、リゾチームが細胞内で他の細胞
蛋白質と会合する場合、かなりの困難をもたらす。リゾ
チームが古典的方法により、例えば、吸着および／また
は沈殿（ベルギー国特許６９４，５３８号）により、菌
体から放出されるか、あるいはそれが他の方法により分
離される細胞壁に会合してとどまるかにかかわらず、生
産されたリゾチームを分泌できる酵母菌を提供すること
が、本発明の重要な面である。プレリゾチーム（ｐｒｅ
ｌｙｓｏｚｙｍｅ）のＮ−末端部分に存在しかつリゾチ
ームをニワトリの卵管細胞の小胞体のルーメン中に分泌
させる１８アミノ酸のシグナル配列は、また、酵母菌細
胞により認識されることが、驚くべきことには観測され
た。次の実施例が事実示すように、ニワトリプレリゾチ
ームをコードするＤＮＡが酵母中で発現されるとき、こ
の発現の生産物はそれから分泌される。したがって、こ
のシグナル配列をコードする５４−ヌクレオチド断片
を、他の起源からのリゾチームを包含する他の蛋白質の
構造部分の遺伝情報をコードするＤＮＡと融合すると、
前記蛋白質を生産する酵母細胞から前記蛋白質が分泌さ
れるであろう。
酵母菌から分離することにより、精製されたリゾチーム
源として使用することもできる。しかしながら、明らか
なように、この操作は、リゾチームが細胞内で他の細胞
蛋白質と会合する場合、かなりの困難をもたらす。リゾ
チームが古典的方法により、例えば、吸着および／また
は沈殿（ベルギー国特許６９４，５３８号）により、菌
体から放出されるか、あるいはそれが他の方法により分
離される細胞壁に会合してとどまるかにかかわらず、生
産されたリゾチームを分泌できる酵母菌を提供すること
が、本発明の重要な面である。プレリゾチーム（ｐｒｅ
ｌｙｓｏｚｙｍｅ）のＮ−末端部分に存在しかつリゾチ
ームをニワトリの卵管細胞の小胞体のルーメン中に分泌
させる１８アミノ酸のシグナル配列は、また、酵母菌細
胞により認識されることが、驚くべきことには観測され
た。次の実施例が事実示すように、ニワトリプレリゾチ
ームをコードするＤＮＡが酵母中で発現されるとき、こ
の発現の生産物はそれから分泌される。したがって、こ
のシグナル配列をコードする５４−ヌクレオチド断片
を、他の起源からのリゾチームを包含する他の蛋白質の
構造部分の遺伝情報をコードするＤＮＡと融合すると、
前記蛋白質を生産する酵母細胞から前記蛋白質が分泌さ
れるであろう。
【００１８】しかしながら、本発明の最も基本的かつ最
も驚くべき面は、リゾチーム遺伝子を酵母中でその中で
致死作用（例えば、細胞の溶解）を及ぼさないで発現す
ることができるという事実である。異種細胞中でリゾチ
ーム遺伝子をクローニングしかつ発現する唯一の既知の
例は、ＨｅｌｌａおよびＭＣＦ−７ヒト細胞系統中のニ
ワトリリゾチーム遺伝子のクローニングである［Ｐ．
Ｄ．マチアス（Ｍａｔｔｈｉａｓ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ．
１、１９８２、１２０７］であるが、遺伝子の発現は対
応するメッセンジャーＲＮＡによってのみ証明され、そ
して蛋白質自体の生産によって立証されていない。バク
テリウム中のリゾチーム遺伝子の発現の例は現在まで報
告されてきておらず、そしてこれはバクテリウムにより
生産されるリゾチームが通常その溶菌作用を生ずるとい
う事実により説明することができる。ここで、リゾチー
ムは、また、酵母細胞壁を、主としてそのキチン成分の
加水分解より、攻撃しうることが知られている［Ｇ．
Ｎ．マクシモバ（Ｍａｋｓｉｍｏｖａ）ら、Ｐｒｉｋ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．）１８、１
９８２、５２９］。酵母菌の出芽は芽と母細胞との間の
純粋なキチンの芽胞壁の形成を伴うことが知られている
ので、酵母細胞によるリゾチームの生産および分泌はそ
れらの増殖機能の重大な変更をもたらすことが予期され
たであろう。また、形質転換後のプロトプラストからの
細胞壁の再生は弱体化することが予期されたであろう。
したがって遺伝子工学の古典的技術がリゾチーム遺伝子
を酵母に発現させるようにすることができるばかりでな
く、かつまたこのように形質転換された細胞が生長する
間にリゾチームを活性的に生産しかつ分泌することがで
きるであろうことは、驚くべきことである。
も驚くべき面は、リゾチーム遺伝子を酵母中でその中で
致死作用（例えば、細胞の溶解）を及ぼさないで発現す
ることができるという事実である。異種細胞中でリゾチ
ーム遺伝子をクローニングしかつ発現する唯一の既知の
例は、ＨｅｌｌａおよびＭＣＦ−７ヒト細胞系統中のニ
ワトリリゾチーム遺伝子のクローニングである［Ｐ．
Ｄ．マチアス（Ｍａｔｔｈｉａｓ）ら、ＥＭＢＯ Ｊ．
１、１９８２、１２０７］であるが、遺伝子の発現は対
応するメッセンジャーＲＮＡによってのみ証明され、そ
して蛋白質自体の生産によって立証されていない。バク
テリウム中のリゾチーム遺伝子の発現の例は現在まで報
告されてきておらず、そしてこれはバクテリウムにより
生産されるリゾチームが通常その溶菌作用を生ずるとい
う事実により説明することができる。ここで、リゾチー
ムは、また、酵母細胞壁を、主としてそのキチン成分の
加水分解より、攻撃しうることが知られている［Ｇ．
Ｎ．マクシモバ（Ｍａｋｓｉｍｏｖａ）ら、Ｐｒｉｋ
ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．）１８、１
９８２、５２９］。酵母菌の出芽は芽と母細胞との間の
純粋なキチンの芽胞壁の形成を伴うことが知られている
ので、酵母細胞によるリゾチームの生産および分泌はそ
れらの増殖機能の重大な変更をもたらすことが予期され
たであろう。また、形質転換後のプロトプラストからの
細胞壁の再生は弱体化することが予期されたであろう。
したがって遺伝子工学の古典的技術がリゾチーム遺伝子
を酵母に発現させるようにすることができるばかりでな
く、かつまたこのように形質転換された細胞が生長する
間にリゾチームを活性的に生産しかつ分泌することがで
きるであろうことは、驚くべきことである。
【００１９】
【実施例】以上は下の実施例に明瞭に示されている。こ
れらの実施例は例示をのみ目的とする。なぜなら、酵母
菌菌株により１，４−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼの
生産に導く他の構成は、本発明の範囲に包含されると考
えるべきであるからである。
れらの実施例は例示をのみ目的とする。なぜなら、酵母
菌菌株により１，４−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼの
生産に導く他の構成は、本発明の範囲に包含されると考
えるべきであるからである。
【００２０】実施例１ １．１ ニワトリリゾチームの完全ｃＤＮＡクローンの
構成：ｐｌｙｓ１０ まず、完全ｃＤＮＡクローンの構成は２つの異るクロー
ンから出発してつくった：ニワトリリゾチームｃＤＮＡ
を含有するが５′末端において不完全であるｐＢＲ−ｌ
ｙｓ−１［Ｐ．バルダッシ（Ｂａｌｄａｃｃｉ）ら、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃＡｓｉｄｓ Ｒｅｓ．６、１９７９、２６
６７］およびイントロンを含む全体のリゾチーム遺伝子
からなる４０ｋｂのニワトリのゲノムＤＮＡを含有する
ｐＦＦ２−ｌｙｓ−１６［Ｐ．バルダッシ（Ｂａｌｄａ
ｃｃｉ）ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｓｉｄｓ Ｒｅｓ．９、
１９８１、３５７５］（第１図）。これらのクローン
は、高等真核レベル形質からの転写体を正しく処理する
ことのできない酵母中でリゾチームを発現するためにい
ずれも適当ではなかった［Ｊ．Ｄ．ベッグス（Ｂｅｇｇ
ｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ２８３、１９８０、８３５］。
しかしながら、それは存在する不完全ｃＤＮＡの３′末
端を完全遺伝子の５′末端と結合することにより、完全
ｃＤＮＡクローンを再構成することが可能であった；事
実発表されたデータから明らかである［Ｐ．バルダッシ
（Ｂａｌｄａｃｃｉ）ら、１９７９、ｏｐ．ｃｉｔ．；
Ａ．ジュング（Ｊｕｎｇ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、１９８０、５７５９；
Ｍ．グレズ（Ｇｒｅｚ）ら、Ｃｅｌｌ ２５、１９８
１、７４３］ように、完全遺伝子はｃＤＮＡのミッシン
グ部分に相当する５′区域にイントロンを含まない。こ
うして、コスミドｐＦＦ２−ｌｙｓ−１６から２．１ｋ
ｂのＤＮＡ断片をｐＥＭＢＬ８［Ｌ．デンテ（Ｄｅｎｔ
ｅ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｓｉｄｓ Ｒｅｓ．１１、
１９８３、１６４５］中にサブクローニングし、プラス
ミドｐｌｙｓ５を得た（第１図）。このクローンはリゾ
チームの完全５′隣接エクソンを含有する。便利に位置
したＨｇａＩ部位は、ｐｌｙｓ５およびｃＤＮＡクロー
ンｐＢＲ−ｌｙｓ−の間の重なる区域に存在する。ｐＢ
Ｒ−ｌｙｓ−１の断片ＨｇａＩ−ＭｌｕＩおよびＭｌｕ
Ｉ−ＡｃｃＩおよびｐｌｙｓ５の断片ＡｃｃＩ−Ｈｇａ
Ｉを含む三重結合は、ＡＴＧ開始コドンを含むがイント
ロンを含まない、全体のリゾチーム遺伝子を含有するク
ローン（ｐｌｙｓ１０）の構成を可能とした（第２
図）。
構成：ｐｌｙｓ１０ まず、完全ｃＤＮＡクローンの構成は２つの異るクロー
ンから出発してつくった：ニワトリリゾチームｃＤＮＡ
を含有するが５′末端において不完全であるｐＢＲ−ｌ
ｙｓ−１［Ｐ．バルダッシ（Ｂａｌｄａｃｃｉ）ら、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃＡｓｉｄｓ Ｒｅｓ．６、１９７９、２６
６７］およびイントロンを含む全体のリゾチーム遺伝子
からなる４０ｋｂのニワトリのゲノムＤＮＡを含有する
ｐＦＦ２−ｌｙｓ−１６［Ｐ．バルダッシ（Ｂａｌｄａ
ｃｃｉ）ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｓｉｄｓ Ｒｅｓ．９、
１９８１、３５７５］（第１図）。これらのクローン
は、高等真核レベル形質からの転写体を正しく処理する
ことのできない酵母中でリゾチームを発現するためにい
ずれも適当ではなかった［Ｊ．Ｄ．ベッグス（Ｂｅｇｇ
ｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ２８３、１９８０、８３５］。
しかしながら、それは存在する不完全ｃＤＮＡの３′末
端を完全遺伝子の５′末端と結合することにより、完全
ｃＤＮＡクローンを再構成することが可能であった；事
実発表されたデータから明らかである［Ｐ．バルダッシ
（Ｂａｌｄａｃｃｉ）ら、１９７９、ｏｐ．ｃｉｔ．；
Ａ．ジュング（Ｊｕｎｇ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、１９８０、５７５９；
Ｍ．グレズ（Ｇｒｅｚ）ら、Ｃｅｌｌ ２５、１９８
１、７４３］ように、完全遺伝子はｃＤＮＡのミッシン
グ部分に相当する５′区域にイントロンを含まない。こ
うして、コスミドｐＦＦ２−ｌｙｓ−１６から２．１ｋ
ｂのＤＮＡ断片をｐＥＭＢＬ８［Ｌ．デンテ（Ｄｅｎｔ
ｅ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｓｉｄｓ Ｒｅｓ．１１、
１９８３、１６４５］中にサブクローニングし、プラス
ミドｐｌｙｓ５を得た（第１図）。このクローンはリゾ
チームの完全５′隣接エクソンを含有する。便利に位置
したＨｇａＩ部位は、ｐｌｙｓ５およびｃＤＮＡクロー
ンｐＢＲ−ｌｙｓ−の間の重なる区域に存在する。ｐＢ
Ｒ−ｌｙｓ−１の断片ＨｇａＩ−ＭｌｕＩおよびＭｌｕ
Ｉ−ＡｃｃＩおよびｐｌｙｓ５の断片ＡｃｃＩ−Ｈｇａ
Ｉを含む三重結合は、ＡＴＧ開始コドンを含むがイント
ロンを含まない、全体のリゾチーム遺伝子を含有するク
ローン（ｐｌｙｓ１０）の構成を可能とした（第２
図）。
【００２１】１．２ リゾチーム遺伝子の５′区域の非
翻訳部分の短縮 プラスミドｐｌｙｓ１０中に存在するリゾチーム遺伝子
の５′区域の非解読部分を、独特ＡｃｃＩ制限部位でプ
ラスミドを開裂し、かつＢＡＬ３１ヌクレアーゼで消化
することにより欠失させた。こうして、短縮されたプラ
スミドの集団が得られ、次いでこれらを独特ＰｓｔＩ部
位において切離した；ＰｓｔＩ部位とＢＡＬ３１で消化
された末端とに間で構成された断片を、ベルギー国特許
第９０１，２２２号記載されているようにして、プラス
ミドｐＬＧ４００の部位ＰｓｔＩおよびＳｍａＩの間に
挿入した。この操作は、３つの結果を与えた： （１）リゾチームのＡＴＧ開始コドンに先行する５′区
域の非翻訳部分が欠失され、（２）ＡｃｃＩおよびＳｍ
ａＩ部位が破壊され、そして（３）操作容易なＢａｍＨ
Ｉ部位（ＹＥｐＺ１００中のＳｍａＩ部位に直接隣接す
る）がリゾチーム遺伝子の開始部分に取り付けられる。
翻訳部分の短縮 プラスミドｐｌｙｓ１０中に存在するリゾチーム遺伝子
の５′区域の非解読部分を、独特ＡｃｃＩ制限部位でプ
ラスミドを開裂し、かつＢＡＬ３１ヌクレアーゼで消化
することにより欠失させた。こうして、短縮されたプラ
スミドの集団が得られ、次いでこれらを独特ＰｓｔＩ部
位において切離した；ＰｓｔＩ部位とＢＡＬ３１で消化
された末端とに間で構成された断片を、ベルギー国特許
第９０１，２２２号記載されているようにして、プラス
ミドｐＬＧ４００の部位ＰｓｔＩおよびＳｍａＩの間に
挿入した。この操作は、３つの結果を与えた： （１）リゾチームのＡＴＧ開始コドンに先行する５′区
域の非翻訳部分が欠失され、（２）ＡｃｃＩおよびＳｍ
ａＩ部位が破壊され、そして（３）操作容易なＢａｍＨ
Ｉ部位（ＹＥｐＺ１００中のＳｍａＩ部位に直接隣接す
る）がリゾチーム遺伝子の開始部分に取り付けられる。
【００２２】得られるプラスミドをｐｌｙｓ９と呼ぶ
（第３図）。
（第３図）。
【００２３】１．３ リゾチームの発現ベクターの構成 リゾチームの完全ｃＤＮＡは、ここでは５′末端におけ
る独特ＢａｍＨＩ部位と３′末端における独特ＳｐｈＩ
部位との間に位置する。前記ｃＤＮＡはそれ自体のＡＴ
Ｇ開始コドンを有するので、それとＢａｍＨＩ部位で終
るＡＴＧ不含プロモーターとの融合は機能的発現単位を
与え、この単位はなお複製起源およびｐＢＲ３２２のラ
クタマーゼ遺伝子と会合させ（Ｅ．ｃｏｌｉ中のその複
製およびその選択を保証する）かつ２−ミクロンのプラ
スミドおよび複製起源およびＬＥＵ２遺伝子と会合させ
（酵母菌中の複製および選択のため）る。
る独特ＢａｍＨＩ部位と３′末端における独特ＳｐｈＩ
部位との間に位置する。前記ｃＤＮＡはそれ自体のＡＴ
Ｇ開始コドンを有するので、それとＢａｍＨＩ部位で終
るＡＴＧ不含プロモーターとの融合は機能的発現単位を
与え、この単位はなお複製起源およびｐＢＲ３２２のラ
クタマーゼ遺伝子と会合させ（Ｅ．ｃｏｌｉ中のその複
製およびその選択を保証する）かつ２−ミクロンのプラ
スミドおよび複製起源およびＬＥＵ２遺伝子と会合させ
（酵母菌中の複製および選択のため）る。
【００２４】この構成は記載する次の断片を同時に結合
することによりつくった： （ａ）プラスミドＹＥｐＺ１０１△２からの、プロモー
ターｐ４１５の欠失から由来するプロモーターｐ４１５
△２からなるＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片（ベルギ
ー国特許第９０１，２２２号）； （ｂ）ｐｌｙｓ△９からの、リゾチームの完全なｃＤＮ
ＡからなるＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ断片； （ｃ）断片（ｂ）と断片（ｄ）との間の結合として使用
すべきプラスミドｐＫＯ１からのＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ
断片［Ｋ．マクケニー（ＭｃＫｅｎｎｙ）ら、Ｇｅｎｅ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓ
ｉｓ、Ｊ．Ｇ．クリリクジャン（Ｃｈｒｉｒｉｋｊａ
ｎ）およびＴ．パナス（Ｐａｎａｓ）編、エルセビーア
／ノース・ホランド（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ
Ｈｏｌｌａｎｄ）、ニューヨーク、１９８１、３８３ぺ
ージ］；断片（ｂ）と断片（ｄ）との間の結合として使
用すべきプラスミドｐＫＯ１からのＥｃｏＲＩ−Ｓｐｈ
Ｉ断片［Ｋ．マクケニー（ＭｃＫｅｎｎｙ）ら、「遺伝
子の増幅および分析（Ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ）」、Ｊ．Ｇ．クリ
リクジャン（Ｃｈｒｉｒｉｋｊａｎ）およびＴ．パナス
（Ｐａｎａｓ）編、エルセビーア／ノース・ホランド
（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ）、
ニューヨーク、１９８１、３８３ページ］； （ｄ）プラスミドＹＥｐＺ４１５からの、複製起源およ
びｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子の一方の半分
からなるＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片；および （ｅ）ｐＪＤＢ２０７からの、２−ミクロン−ＬＥＵ２
セグメントおよびβ−ラクタマーゼ遺伝子の他方の半分
からなるＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片。
することによりつくった： （ａ）プラスミドＹＥｐＺ１０１△２からの、プロモー
ターｐ４１５の欠失から由来するプロモーターｐ４１５
△２からなるＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片（ベルギ
ー国特許第９０１，２２２号）； （ｂ）ｐｌｙｓ△９からの、リゾチームの完全なｃＤＮ
ＡからなるＳｐｈＩ−ＢａｍＨＩ断片； （ｃ）断片（ｂ）と断片（ｄ）との間の結合として使用
すべきプラスミドｐＫＯ１からのＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ
断片［Ｋ．マクケニー（ＭｃＫｅｎｎｙ）ら、Ｇｅｎｅ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓ
ｉｓ、Ｊ．Ｇ．クリリクジャン（Ｃｈｒｉｒｉｋｊａ
ｎ）およびＴ．パナス（Ｐａｎａｓ）編、エルセビーア
／ノース・ホランド（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ
Ｈｏｌｌａｎｄ）、ニューヨーク、１９８１、３８３ぺ
ージ］；断片（ｂ）と断片（ｄ）との間の結合として使
用すべきプラスミドｐＫＯ１からのＥｃｏＲＩ−Ｓｐｈ
Ｉ断片［Ｋ．マクケニー（ＭｃＫｅｎｎｙ）ら、「遺伝
子の増幅および分析（Ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ）」、Ｊ．Ｇ．クリ
リクジャン（Ｃｈｒｉｒｉｋｊａｎ）およびＴ．パナス
（Ｐａｎａｓ）編、エルセビーア／ノース・ホランド
（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ）、
ニューヨーク、１９８１、３８３ページ］； （ｄ）プラスミドＹＥｐＺ４１５からの、複製起源およ
びｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子の一方の半分
からなるＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片；および （ｅ）ｐＪＤＢ２０７からの、２−ミクロン−ＬＥＵ２
セグメントおよびβ−ラクタマーゼ遺伝子の他方の半分
からなるＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片。
【００２５】結合の前に、これらの種々の断片を使用
し、そして、それらは異る末端および相補的接着末端を
有するので、この結合からただ１つの生存しうるプラス
ミドが生じた：ｐｌｙｓ△２９（第４図）。
し、そして、それらは異る末端および相補的接着末端を
有するので、この結合からただ１つの生存しうるプラス
ミドが生じた：ｐｌｙｓ△２９（第４図）。
【００２６】同一の方法においてプロモーターｐ４１５
からの欠失により誘導された２つの他の断片（ｐ４１５
△４およびｐ４１５△５）を使用することにより、２つ
の他のプラスミドが生産された：ｐｌｙｓ△４９および
ｐｌｙｓ△５９。これらの３つのプラスミドは、こうし
て、次の事実によりのみ異る。プロモーターはリゾチー
ムｃＤＮＡから種々の距離に位置し、これは対応するメ
ッセンジャーＲＮＡｓの開始（５′末端）と自然ＡＵＧ
翻訳開始部位との間の異る距離における転写の間に生ず
る。
からの欠失により誘導された２つの他の断片（ｐ４１５
△４およびｐ４１５△５）を使用することにより、２つ
の他のプラスミドが生産された：ｐｌｙｓ△４９および
ｐｌｙｓ△５９。これらの３つのプラスミドは、こうし
て、次の事実によりのみ異る。プロモーターはリゾチー
ムｃＤＮＡから種々の距離に位置し、これは対応するメ
ッセンジャーＲＮＡｓの開始（５′末端）と自然ＡＵＧ
翻訳開始部位との間の異る距離における転写の間に生ず
る。
【００２７】１．４ プラスミドｐｌｙｓ△２９、ｐｌ
ｙｓ△４９およびｐｌｙｓ△５９によるリゾチームの発
現 次いで、前述のように構成されたプラスミドを酵母菌
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＲＦ１８菌株（ｌｅ
ｕ-、Ｈｉｓ-）に形質転換し、次いでロイシンについて
プロトトロープのクローンについて選択した（ｌｅ
ｕ+）。
ｙｓ△４９およびｐｌｙｓ△５９によるリゾチームの発
現 次いで、前述のように構成されたプラスミドを酵母菌
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＲＦ１８菌株（ｌｅ
ｕ-、Ｈｉｓ-）に形質転換し、次いでロイシンについて
プロトトロープのクローンについて選択した（ｌｅ
ｕ+）。
【００２８】次いで、これらのクローンをガラスビーズ
で粉砕し、そして得られた細胞溶解物を遠心により清澄
にした。それらの細胞溶解物の活性を、Ｅ．ｃｏｌｉ細
胞の懸濁液の光学濃度の増加をＭｃマッケン（Ｍａｃｋ
ｅｎ）らの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４９、１９７
０、６３９）で測定することにより試験した。第５図に
おいて、６５０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ650）の初
期の値はすべてのクローンについて同一である（０．
７）が、完結を目的として線図上でシフトさせた。第５
図の結果はＧＲＦ１８（ｐｌｙｓ△４９）について有意
の活性を示し、そしてプラスミドｐｌｙｓ△５９により
形質転換された細胞について多少低い。
で粉砕し、そして得られた細胞溶解物を遠心により清澄
にした。それらの細胞溶解物の活性を、Ｅ．ｃｏｌｉ細
胞の懸濁液の光学濃度の増加をＭｃマッケン（Ｍａｃｋ
ｅｎ）らの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４９、１９７
０、６３９）で測定することにより試験した。第５図に
おいて、６５０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ650）の初
期の値はすべてのクローンについて同一である（０．
７）が、完結を目的として線図上でシフトさせた。第５
図の結果はＧＲＦ１８（ｐｌｙｓ△４９）について有意
の活性を示し、そしてプラスミドｐｌｙｓ△５９により
形質転換された細胞について多少低い。
【００２９】リゾチームの作用のためのインジケーター
として使用する細胞がバクテリウムミクロコッカス・リ
ソデイクチクス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄ
ｅｉｋｔｉｃｕｓ）の細胞である方法［Ｇ．アルダート
ン（Ａｌｄｅｒｔｏｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
１５７、１９４５、４３］を使用して同様な結果が得ら
れた。
として使用する細胞がバクテリウムミクロコッカス・リ
ソデイクチクス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄ
ｅｉｋｔｉｃｕｓ）の細胞である方法［Ｇ．アルダート
ン（Ａｌｄｅｒｔｏｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
１５７、１９４５、４３］を使用して同様な結果が得ら
れた。
【００３０】異る型のアッセイにおいて、Ｍ．ｌｙｓｏ
ｄｅｉｋｉｃｔｕｓの菌叢で覆われたペトリ皿上で生長
する形質転換されたコロニーのまわりにリゾチームが明
示された。この場合において、リゾチームの発現はコロ
ニーのまわりの溶菌の透明なハローにより可視化され
た。細胞不含の細胞溶解物を使用する結果と一致して、
溶菌のハローはｐｌｙｓ△４９を使用したとき最大であ
り、このことはこのクローンがリゾチームの最良の生産
体であることを示した。この結果が、また、示すよう
に、リゾチームは形質細胞から輸送された。なぜなら、
バクテリアのインジケーターを溶解するためには、それ
は細胞外に存在することがかならず必要であったからで
ある。
ｄｅｉｋｉｃｔｕｓの菌叢で覆われたペトリ皿上で生長
する形質転換されたコロニーのまわりにリゾチームが明
示された。この場合において、リゾチームの発現はコロ
ニーのまわりの溶菌の透明なハローにより可視化され
た。細胞不含の細胞溶解物を使用する結果と一致して、
溶菌のハローはｐｌｙｓ△４９を使用したとき最大であ
り、このことはこのクローンがリゾチームの最良の生産
体であることを示した。この結果が、また、示すよう
に、リゾチームは形質細胞から輸送された。なぜなら、
バクテリアのインジケーターを溶解するためには、それ
は細胞外に存在することがかならず必要であったからで
ある。
【００３１】実施例２ ２．１ リゾチームの発現ベクターｐｌｙｓ５０の構成 リゾチーム発現プラスミドｐｌｙｓ△２９、ｐｌｙｓ△
４９およびｐｌｙｓ△５９（前述した）が基づくベクタ
ーｐＪＤＢ２０７は、全体の２−ミクロンの酵母菌プラ
スミドを含有せず、結局その連続する維持に内因性の２
−ミクロンのプラスミド（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの
ほとんどの菌株において見出される）の存在に依存す
る。これはｐＪＤＢ２０７型プラスミドが細胞から頻繁
に損失されるという不安定な場合に導く［Ｅ．エアヘル
ト（Ｅｒｈａｅｒｔ）およびＣ．Ｐ．ホエンバーグ（Ｈ
ｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５
６、１９８３、６２５およびＭ．ジャラヤム（Ｊａｒａ
ｙａｍ）ら、Ｃｅｌｌ ３４、１９８３、９５］。対照
的に、自然２−ミクロンのプラスミドは安定に遺伝され
る。プラスミドが全体の２−ミクロンのプラスミドｐＪ
ＤＢ２１９を含有するような方法で構成されたプラスミ
ドはｐＪＤＢ２０７型のものよりも安定であることは事
実知られている［Ｃ．Ｐ．ホランバーグ（Ｈｏｌｌａｎ
ｂｅｒｇ）、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６、１９８２、１１９；Ｒ．Ｍ．ワ
ルムスレイ（Ｗａｌｍｓｌｅｙ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．
Ｇｅｎｅｔ．１９８３、３６１］。それゆえ、このよう
なプラスミドは、工業的発酵例におけるように、長期間
の生長のために一層有用である。
４９およびｐｌｙｓ△５９（前述した）が基づくベクタ
ーｐＪＤＢ２０７は、全体の２−ミクロンの酵母菌プラ
スミドを含有せず、結局その連続する維持に内因性の２
−ミクロンのプラスミド（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの
ほとんどの菌株において見出される）の存在に依存す
る。これはｐＪＤＢ２０７型プラスミドが細胞から頻繁
に損失されるという不安定な場合に導く［Ｅ．エアヘル
ト（Ｅｒｈａｅｒｔ）およびＣ．Ｐ．ホエンバーグ（Ｈ
ｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５
６、１９８３、６２５およびＭ．ジャラヤム（Ｊａｒａ
ｙａｍ）ら、Ｃｅｌｌ ３４、１９８３、９５］。対照
的に、自然２−ミクロンのプラスミドは安定に遺伝され
る。プラスミドが全体の２−ミクロンのプラスミドｐＪ
ＤＢ２１９を含有するような方法で構成されたプラスミ
ドはｐＪＤＢ２０７型のものよりも安定であることは事
実知られている［Ｃ．Ｐ．ホランバーグ（Ｈｏｌｌａｎ
ｂｅｒｇ）、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６、１９８２、１１９；Ｒ．Ｍ．ワ
ルムスレイ（Ｗａｌｍｓｌｅｙ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．
Ｇｅｎｅｔ．１９８３、３６１］。それゆえ、このよう
なプラスミドは、工業的発酵例におけるように、長期間
の生長のために一層有用である。
【００３２】このような完全な２−ミクロンのベクター
を構成するために、プラスミドＹＥｐＢ２（第１１図）
を使用し、これは全体の２−ミクロンのプラスミドをｐ
ＢＲ３２２中にそれらの独特ＰｓｔＩ部位においてクロ
ーニングすることにより前もってつくられた。次いで、
ＹＥｐＢ２からの２つの断片およびｐｌｙｓ△４９から
の２つの断片を結合してｐｌｙｓ５０を得た（第１２
図）。このプラスミドにおいて、３つの２−ミクロンの
遺伝子Ａ、ＢおよびＣは無傷であり、そしてリゾチーム
遺伝子は前の実施例において記載したｐｌｙｓ△４９に
おけるようにｐ４１５△４プロモーターから発現され
る。
を構成するために、プラスミドＹＥｐＢ２（第１１図）
を使用し、これは全体の２−ミクロンのプラスミドをｐ
ＢＲ３２２中にそれらの独特ＰｓｔＩ部位においてクロ
ーニングすることにより前もってつくられた。次いで、
ＹＥｐＢ２からの２つの断片およびｐｌｙｓ△４９から
の２つの断片を結合してｐｌｙｓ５０を得た（第１２
図）。このプラスミドにおいて、３つの２−ミクロンの
遺伝子Ａ、ＢおよびＣは無傷であり、そしてリゾチーム
遺伝子は前の実施例において記載したｐｌｙｓ△４９に
おけるようにｐ４１５△４プロモーターから発現され
る。
【００３３】２．２ ベクターｐｌｙｓ５０によるリゾ
チームの発現 Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ のＧＲＦ１８菌株（Ｈｉ
ｓ-、ｌｅｕ-）をプラスミドｐｌｙｓ５０およびｐＪＤ
Ｂ２０７により形質転換した後、両者の場合に得られた
形質転換された細胞をヒスチジン（０．００２％）を補
充した最小培地上で別々に生長させた。培養物が静止相
（約５の光学濃度）（細胞の乾燥重量＝培養物の約１．
５ｇ／ｌ）に到達したとき、細胞を培地から遠心により
分離し、０．１モルのｐＨ７のリン酸塩緩衝液中に懸濁
させそしてガラスビーズで粉砕した。両者の培養物から
の上澄み液および細胞溶解物中のリゾチーム活性を、
Ｄ．シュガー（Ｓｈｕｇａｒ）の方法（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｈｙｓ．Ａｃｔａ．８、１９５２、３０２）
に従い、Ｍ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ細胞を溶解す
るそれらの能力により測定した。
チームの発現 Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ のＧＲＦ１８菌株（Ｈｉ
ｓ-、ｌｅｕ-）をプラスミドｐｌｙｓ５０およびｐＪＤ
Ｂ２０７により形質転換した後、両者の場合に得られた
形質転換された細胞をヒスチジン（０．００２％）を補
充した最小培地上で別々に生長させた。培養物が静止相
（約５の光学濃度）（細胞の乾燥重量＝培養物の約１．
５ｇ／ｌ）に到達したとき、細胞を培地から遠心により
分離し、０．１モルのｐＨ７のリン酸塩緩衝液中に懸濁
させそしてガラスビーズで粉砕した。両者の培養物から
の上澄み液および細胞溶解物中のリゾチーム活性を、
Ｄ．シュガー（Ｓｈｕｇａｒ）の方法（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｈｙｓ．Ａｃｔａ．８、１９５２、３０２）
に従い、Ｍ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ細胞を溶解す
るそれらの能力により測定した。
【００３４】プラスミドｐＪＤＢ２０７により形質転換
された菌株についてリゾチーム活性を示すことはできな
かった。これに対して、菌株ＧＲＦ１８（ｐｌｙｓ５
０）の場合において、１６２単位／ｍｌ培養物の活性を
決定することができ、そして次のように分布することが
示された：細胞に関連する４４単位／ｍｌおよび培地中
に関連する１１８単位／ｍｌ。
された菌株についてリゾチーム活性を示すことはできな
かった。これに対して、菌株ＧＲＦ１８（ｐｌｙｓ５
０）の場合において、１６２単位／ｍｌ培養物の活性を
決定することができ、そして次のように分布することが
示された：細胞に関連する４４単位／ｍｌおよび培地中
に関連する１１８単位／ｍｌ。
【００３５】Ｃ．ワング（Ｗａｎｇ）およびＲ．Ｌ．ス
ミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６
３、１９７５、４１４により修正されたＤ．ハーバート
（Ｈｅｒｂｅｒｔ）らの方法（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．５Ｂ、１９７１、２０９）に従い合計の蛋白質を測
定し、商業的に精製されたリゾチームの比活性を考慮す
る［ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）］ことにより、上の条件下で酵母
菌中で生産されるリゾチームは可溶性酵母蛋白質の約１
％になることが誘導された。
ミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６
３、１９７５、４１４により修正されたＤ．ハーバート
（Ｈｅｒｂｅｒｔ）らの方法（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．５Ｂ、１９７１、２０９）に従い合計の蛋白質を測
定し、商業的に精製されたリゾチームの比活性を考慮す
る［ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）］ことにより、上の条件下で酵母
菌中で生産されるリゾチームは可溶性酵母蛋白質の約１
％になることが誘導された。
【００３６】菌株ＧＲＦ１８（ｐｌｙｓ△４９）および
ＡＨ２２ｃｉｒ°（ｐｌｙｓ５０）は１９８４年１２月
５日に、セントラアル・ビュウロウ・ブーア・シンメル
カルチュアーズ（Ｃｅｎｔｒａａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｖ
ｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｏｏｓｔ
ｅｒｓｔｒａａｔ １、Ｐ．Ｐ．Ｂｏｘ ２７３、ＮＬ
−３７４０ ＡＧ Ｂａａｒｎ）（オランダ国）に受託
され、ここでそれらはそれぞれ受託番号ＣＢＳ７１３０
およびＣＢＳ７１２９を受けた。
ＡＨ２２ｃｉｒ°（ｐｌｙｓ５０）は１９８４年１２月
５日に、セントラアル・ビュウロウ・ブーア・シンメル
カルチュアーズ（Ｃｅｎｔｒａａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｖ
ｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｏｏｓｔ
ｅｒｓｔｒａａｔ １、Ｐ．Ｐ．Ｂｏｘ ２７３、ＮＬ
−３７４０ ＡＧ Ｂａａｒｎ）（オランダ国）に受託
され、ここでそれらはそれぞれ受託番号ＣＢＳ７１３０
およびＣＢＳ７１２９を受けた。
【図面の簡単な説明】
【図１】ニワトリリゾチームの完全ｃＤＮＡの再構成の
ため後で使用するプラスミドｐｌｙｓ５の構成を表わ
す。この構成は全体のリゾチーム遺伝子からなる４０ｋ
ｂのインサートを含有するコスミドｐＦＦ２−ｌｙｓ−
１６から出発した。次いで、この遺伝子の最初のエクソ
ンからなる２．１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩインサートを、
プラスミドｐＥＭＢＬ８中に挿入した。こうして得られ
るｐｌｙｓ５プラスミドはｌａｃＺ-であり、次いでｌ
ａｃＺ+であるプラスミドｐＥＭＢＬ８と区別されう
る。
ため後で使用するプラスミドｐｌｙｓ５の構成を表わ
す。この構成は全体のリゾチーム遺伝子からなる４０ｋ
ｂのインサートを含有するコスミドｐＦＦ２−ｌｙｓ−
１６から出発した。次いで、この遺伝子の最初のエクソ
ンからなる２．１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩインサートを、
プラスミドｐＥＭＢＬ８中に挿入した。こうして得られ
るｐｌｙｓ５プラスミドはｌａｃＺ-であり、次いでｌ
ａｃＺ+であるプラスミドｐＥＭＢＬ８と区別されう
る。
【図２】ｐｌｙｓ５から由来しかつリゾチーム遺伝子の
５′末端を含有するＡｃｃＩ−ＨｇａＩ断片を、プラス
ミドｐＢＲ−ｌｙｓ−１から由来しかつリゾチームのｃ
ＤＮＡの残部を含有する２つの他の断片と結合すること
により、リゾチームの完全ｃＤＮＡをプラスミドｐｌｙ
ｓ１０内で再構成する方法を示す。
５′末端を含有するＡｃｃＩ−ＨｇａＩ断片を、プラス
ミドｐＢＲ−ｌｙｓ−１から由来しかつリゾチームのｃ
ＤＮＡの残部を含有する２つの他の断片と結合すること
により、リゾチームの完全ｃＤＮＡをプラスミドｐｌｙ
ｓ１０内で再構成する方法を示す。
【図３】エキソヌクレアーゼＢＡＬ３１で５′末端の未
翻訳部分を消化することにより欠失されたリゾチームの
ｃＤＮＡからなるプラスミドｐｌｙｓ△９の構成を示
す。
翻訳部分を消化することにより欠失されたリゾチームの
ｃＤＮＡからなるプラスミドｐｌｙｓ△９の構成を示
す。
【図４】ＹＥｐＺ１１、ＹＥｐＺ１０１△２（または４
または５）、ｐｌｙｓ△９、ｐＫＯ１およびｐＪＤＢ２
１９から由来する精製された断片の一義の結合（ｕｎｉ
ｖｏｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ）によるリゾチームの発
現ベクターの構成を示す。プラスミドｐｌｙｓ△２９
（または４９または５９）は、ｐｌｙｓ△９からのリゾ
チームｃＤＮＡの発現を保証するためにプラスミドＹＥ
ｐＺ１０１△２（または４または５）からのプロモータ
ーにより、それら自体が異るだけである。
または５）、ｐｌｙｓ△９、ｐＫＯ１およびｐＪＤＢ２
１９から由来する精製された断片の一義の結合（ｕｎｉ
ｖｏｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ）によるリゾチームの発
現ベクターの構成を示す。プラスミドｐｌｙｓ△２９
（または４９または５９）は、ｐｌｙｓ△９からのリゾ
チームｃＤＮＡの発現を保証するためにプラスミドＹＥ
ｐＺ１０１△２（または４または５）からのプロモータ
ーにより、それら自体が異るだけである。
【図５】プラスミドｐｌｙｓ△４９およびｐｌｙｓ５０
により形質転換された酵母菌の細胞抽出物が、ＥＤＴＡ
で処理したＥ．ｃｏｌｉ細胞を溶解して、それらをリゾ
チームの作用に対して感受性とすることを示す。
により形質転換された酵母菌の細胞抽出物が、ＥＤＴＡ
で処理したＥ．ｃｏｌｉ細胞を溶解して、それらをリゾ
チームの作用に対して感受性とすることを示す。
【図６】プラスミドｐＢＲ３２２および２−ミクロンの
内因性酵母菌プラスミドに制限酵素ＰｓｔＩを作用させ
ることにより得られた断片の結合によるプラスミドＹＥ
ｐＢ２の構成を表わす。
内因性酵母菌プラスミドに制限酵素ＰｓｔＩを作用させ
ることにより得られた断片の結合によるプラスミドＹＥ
ｐＢ２の構成を表わす。
【図７】プラスミドＹＥｐＢ２およびｐｌｙｓ△４９か
ら得られる５つの精製された断片の一義的結合によるリ
ゾチーム発現ベクターｐｌｙｓ５０の構成を表わす。
ら得られる５つの精製された断片の一義的結合によるリ
ゾチーム発現ベクターｐｌｙｓ５０の構成を表わす。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865）
Claims (1)
- 【請求項１】 形質転換された酵母菌であって、そのＤ
ＮＡが１，４−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼをコード
する断片の少なくとも１つのコピーを含んでなり、そし
て前記断片が対応する活性蛋白質として細胞内で発現さ
れ、かつ前記１，４−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼを
コードする断片の前に、該断片によってコードされる前
記活性蛋白質が、酵母細胞の細胞質膜を通して排出され
るように作用するシグナルペプチド配列をコードする断
片が、存在する形質転換された酵母菌を培養し、培養物
からリゾチームを回収する工程を含んでなるリゾチーム
を生産する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BE214124 | 1984-12-06 | ||
| BE0/214124A BE901223A (fr) | 1984-12-06 | 1984-12-06 | Levures transformees produisant du lysozyme plasmides utilises pour cette transformation et leurs utilisations. |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60273530A Division JP2622252B2 (ja) | 1984-12-06 | 1985-12-06 | リソチームを生産する形質転換された酵母菌およびこの形質転換に使用するプラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08205868A true JPH08205868A (ja) | 1996-08-13 |
| JP2635020B2 JP2635020B2 (ja) | 1997-07-30 |
Family
ID=3843827
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60273530A Expired - Lifetime JP2622252B2 (ja) | 1984-12-06 | 1985-12-06 | リソチームを生産する形質転換された酵母菌およびこの形質転換に使用するプラスミド |
| JP7288179A Expired - Lifetime JP2635020B2 (ja) | 1984-12-06 | 1995-10-11 | 形質転換された酵母によるリゾチームの生産方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60273530A Expired - Lifetime JP2622252B2 (ja) | 1984-12-06 | 1985-12-06 | リソチームを生産する形質転換された酵母菌およびこの形質転換に使用するプラスミド |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5336609A (ja) |
| EP (1) | EP0184575B1 (ja) |
| JP (2) | JP2622252B2 (ja) |
| AT (1) | ATE88754T1 (ja) |
| CA (1) | CA1339912C (ja) |
| DE (1) | DE3587307T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5140832B2 (ja) * | 2006-03-03 | 2013-02-13 | 国立大学法人 東京大学 | 異種タンパク質を高生産する麹菌変異株 |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5013652A (en) * | 1986-10-14 | 1991-05-07 | Genex Corporation | Composite yeast vectors |
| JPS6447377A (en) * | 1987-08-19 | 1989-02-21 | Agency Ind Science Techn | Mutant strain having high secretion of human lysozyme, its selection and production of human lysozyme using same |
| JPH04502260A (ja) * | 1989-10-16 | 1992-04-23 | アムジエン・インコーポレーテツド | Ｎ―アセチルムラミダーゼ ｍ１ |
| GB2249099B (en) * | 1990-09-26 | 1995-05-03 | Squibb & Sons Inc | Squalene synthetase |
| ATE342346T1 (de) * | 1997-08-05 | 2006-11-15 | Oregon State | Verfahren und zusammensetzungen zur reduzierung des bierverderbs |
| JP2997800B2 (ja) * | 1997-12-01 | 2000-01-11 | 農林水産省食品総合研究所長 | 細胞壁溶解酵素遺伝子、該遺伝子を含むベクター及び形質転換体 |
| AU2002253995A1 (en) * | 2001-03-29 | 2002-10-15 | Hybrigen, Inc. | Improved hybrid gene libraries and uses thereof |
| MX2017006127A (es) | 2014-11-11 | 2017-11-08 | Clara Foods Co | Metodos y composiciones para produccion de proteina de clara de huevo. |
| US10240541B2 (en) * | 2017-01-11 | 2019-03-26 | Brock Matthew Eastman | Methods and systems for overriding automotive computer controlled cylinder management |
| MX2022000374A (es) | 2019-07-11 | 2022-03-25 | Clara Foods Co | Composiciones de proteina y productos consumibles de las mismas. |
| US10927360B1 (en) | 2019-08-07 | 2021-02-23 | Clara Foods Co. | Compositions comprising digestive enzymes |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1110466A (en) * | 1966-02-28 | 1968-04-18 | Prodotti Antibiotici Spa | Process for the production of lysozyme |
| JPS5516634B2 (ja) * | 1972-07-27 | 1980-05-06 | ||
| US4775622A (en) * | 1982-03-08 | 1988-10-04 | Genentech, Inc. | Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast |
| GB2125047B (en) * | 1982-08-09 | 1986-02-19 | Ciba Geigy Ag | Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides |
| CA1341302C (en) * | 1983-02-22 | 2001-10-09 | Rae Lyn Burke | Yeast expression systems with vectors having gapdh or pyk promoters and synthesis of foreign protein |
| EP0181634A3 (en) * | 1984-11-14 | 1987-09-09 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Synthetic gene for human lysozyme |
| BE901222A (fr) * | 1984-12-06 | 1985-03-29 | Labofina Sa | Promoteurs assurant l'expression de genes etrangers chez la levure, plasmides comportant ces promoteurs et leurs utilisations pour la production de polypeptides. |
| BE901223A (fr) * | 1984-12-06 | 1985-03-29 | Labofina Sa | Levures transformees produisant du lysozyme plasmides utilises pour cette transformation et leurs utilisations. |
| JPS626679A (ja) * | 1985-06-26 | 1987-01-13 | Agency Of Ind Science & Technol | ヒトリゾチ−ムの微生物学的製造法 |
-
1985
- 1985-12-05 AT AT85870170T patent/ATE88754T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-12-05 US US06/804,774 patent/US5336609A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-05 DE DE8585870170T patent/DE3587307T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-05 CA CA000496943A patent/CA1339912C/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-05 EP EP85870170A patent/EP0184575B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-06 JP JP60273530A patent/JP2622252B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-10-11 JP JP7288179A patent/JP2635020B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5140832B2 (ja) * | 2006-03-03 | 2013-02-13 | 国立大学法人 東京大学 | 異種タンパク質を高生産する麹菌変異株 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3587307D1 (de) | 1993-06-03 |
| JP2622252B2 (ja) | 1997-06-18 |
| JP2635020B2 (ja) | 1997-07-30 |
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| US5336609A (en) | 1994-08-09 |
| DE3587307T2 (de) | 1993-09-02 |
| EP0184575A2 (en) | 1986-06-11 |
| EP0184575A3 (en) | 1987-10-07 |
| CA1339912C (en) | 1998-06-16 |
| JPS61185181A (ja) | 1986-08-18 |
| EP0184575B1 (en) | 1993-04-28 |
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