JPS6140793A

JPS6140793A - 酵母ベクタ−

Info

Publication number: JPS6140793A
Application number: JP11008385A
Authority: JP
Inventors: ロバート・ロジヤーズ・ヤカム
Original assignee: Biotechnica International Inc
Current assignee: Biotechnica International Inc
Priority date: 1984-05-22
Filing date: 1985-05-22
Publication date: 1986-02-27
Also published as: CA1338857C; EP0707068B1; DE3588096T2; BR8502400A; DK224185D0; AU4270985A; EP0707068B2; ATE207961T1; FI852024A0; DE3588096D1; EP0163491A1; DE3588234D1; DE3588234T2; DK224185A; IL75210A0; ATE136059T1; EP0163491B1; DE3588234T3; FI852024L; EP0707068A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】異種遺伝子（例えば、修飾遺伝子又は外来遺伝子）をサ
ツカロミセス属の酵母の実験室ストレイン、特ニサツカ
ロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓ□ａ
ｅ）に導゛入する技術は近年知られている。この目的の
為に二種のタイプのプラスミドベクター（複製ベクター
と組み込みばフタ−）が使用されている。複＃、、＊ク
ターは酵母内で作用するＤＮＡ複製の転写開始部を有し
、このプラスミドは環状エピソームとして染色体外に保
持される。組み込みベクターはそのような転写開始部を
持たず、そのため安定して維持されるためには、酵母染
色体に挿入される必要がある。

両タイプのプラスミドとも標準的形質転換法で酵母細胞
に導入可能である。活性酵母細胞によるプラスミドＤＮ
Ａの取り込みおよび定着の成功は比較的稀にしか生じな
い（＜１０　　）ため、形質転換体の同定には選択機構
を必要とする。最も一般的には、選択は受容酵母種に栄
養要求性突然変異を導入することによって達成される。

一般に使用される突然変異はｕｒａ　３　、　ｌｅｕ　
２　、　ｔｒｐ　１およびｈｉｓ　３である。問題とす
るプラスミドはこれらの遺伝子の一つの野性型コピーを
有する。プラスミド上の野性型コピーは宿主の染色体対
立遺伝子にたいして優性であるから、シラスミド１を受
入れた細胞の選択は、栄養要求性宿主細胞が要求する栄
養素を含まない最小培地によって容易に達成される。

形質転換細胞を選択するために抗生物質耐性を使用する
報告もある。市販のネオマイシン同属体゛である抗生物
’Ｊ１’０４１８にたいする、多くのサツカロミセス種
の感受性にもとすく複製はフタ−は報告されている：ジ
メネツツら（Ｊｉｍｅｎｅｚ　ｅｔ　ａｌ、）（１９８
０）　　ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　２８７．８６９
　；ホレンベルグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ）　（１９８
２）微生物学および免疫学の最近の話題（Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ　Ｔｏ　ｐｉｃｓ−ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
　ａｎｄ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　、ホフシュナイダ
ーら（Ｈｏｆｓｃｈｎｅｉｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　）編
集スプリンガー出版　＝ユ　ｇ−り（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ
　”　Ｖｅｒｌａｇ。

ＮＹ）；ウェブスターら（Ｗｅｂｓｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ
、　）（１９８３）　　ジー７　（Ｇｅｎｅ）　２６　
＋　２４３゜ウェブスター（Ｗｅｂｓｔｅｒ　）等は、
Ｇ４１８に対する耐性により直接には選択出来ない組み
込みプラスミドベクターをも報告している。これらのベ
クターはバクテリアトランスポゾンＴｎ９（１３）から
のｋａｎ　。

ｎｅｏ’、又は０４１８’と呼！ｆれる遺伝子および酵
母の複製転写開始部を含有しており、該バクテリア遺伝
子はその天然バクテリアプロモーターの後に続いている
。

酵母プロモーターの支配下に抗生物質ヒグロマイシンＢ
に耐性のｉ伝子を含有する、他の複製べフターも報告さ
れているニゲリッツら（Ｇｒｉｔｚ　ｅｔａｌ、）（１
９＆３）　　ジー：ｙ　（Ｇｅｎｅ）　２５．１７８゜
体発明は、酵母プロモーター配列または合成プロモータ
ー配列から転写され、宿主酵母細胞を死滅させうる抗生
物質に耐性な遺伝子を含有するベクターであって宿主酵
母細胞の染色体に組み込むことが出来、直接選択できる
はフタ−に関する。

宿主酵母細胞に異種である遺伝子（例えば、非酵母遺伝
子、修飾遺伝子、異なる酵母種の遺伝子または異なる染
色体位置からの相同遺伝子）をこのベクターに挿入し、
このベクターを宿主細胞の形質転換に使用し、形質転換
体を抗生物質の耐性によって選択することができる。

好ましい態様においては、このベクターは、組み込みを
容易ならしめるため宿主染色体の配列（「ターゲット」
配列）と相同の配列を含有する。

好ましくはこの相同配列は抗生物質耐性遺伝子を調節す
る調節配列から隔てられており、好ましくはターゲット
は宿主細胞の代謝が阻害されない色域に存在する。

他の態様においては、この異種遺伝子は酵素、例えば、
グルコアミラーゼ（この酵素は酵母細胞による鍬粉から
のグルコースの生成を促進する）をコードし、そして該
宿主細胞は例えば、生地（ドウ）の生成ように細胞の代
謝生成物（例えば、炭酸ガス）を使用する方法に寄与す
る。

他の好ましい態様においては、該抗生物質耐性遺伝子お
よび異種遺伝子は異なるプロモーターの調節下にあり、
好ましくは両者のうち異種遺伝子を調節するプロモータ
ーがより高発現性である。

好ましい組み込み方法は、ベクターＤＮＡの残りの大部
分を排除して宿主酵母細胞の染色体に異種遺伝子の組み
込みを可能ならしめ、非常に高い安定性を提供しうるも
のである。このような、ＤＮＡの排除は、生産物の例え
ば香りのような特性を損なう危険要因を減少させる。

他の観点において、本発明は、酵母の調節性配列の調節
下にあるＧ４１８に耐性の遺伝子を含む複製ベクターに
関する。

本発明０組み込みベクターは、選択なしに何計代の宿主
分裂において安定性を提供し、これは近代醗酵工業にお
いては重要な利点である：複製はフタ−は酵母細胞から
世代あたり１％乃至５％の率で消失する。複数世代にわ
たって組み込み配列を安定に維持することは、該配列を
維持するための選択機能を発揮させるための醗酵培地へ
の毒性抗生物質の添加を不要にする。本発明のベクター
は、抗生物質耐性遺伝子を調節するのが酵母プロモータ
ー配列であるため、酵母内でも良好に作用する。更に、
工業用酵母種は通常二倍体又は多倍数体（実験室用半数
体と異なる）であるため、これら酵母に栄養要求性突然
変異（半数体ストレインの形質転換体の選択に使用され
る）を導入するのは困難である。組み込みベクターに抗
生物質耐性を使用することは、染色体数または特定突然
変異の存在・不在に関係なく任意の酵母種に安定な形質
転換体の選択を可能にする。

本発明のベクターを使用して工業用酵母に異種酵素をコ
ート１する遺伝子を導入することは、通常は酵母に供給
する糖に依存するアルブールのような生産物の生産を容
易にするであろう。グルコアミラーゼのような酵素は酵
母が澱粉をタピオカやじゃがいものような安価な供給源
からの澱粉を該酵母が食べて分解してグルコースな生ず
るたすけになるであろう。同様に、主エネルギー源とし
て、糖の代わりに澱粉（澱粉粉末）を使用することはパ
ンの製造を安価にするであろう。

異種酵素はレギュラービールに比べて澱粉含量が少ない
ライトビールの製造も容易にするであろう。ライトビー
ル醸造において、麦芽処理工程の完了後の残存澱粉を分
解するために近年使用される一つの方法は、パンかびか
らのグルコアミラーゼを麦芽汁に添加することであるが
、このような工程は醸造に使用される酵母がグルコアミ
ラーゼをコート９する遺伝子を有し、これを発現するな
らば省略できることである。

他の観点において、他の酵素も工業的醗酵工程を可能に
する。例えば、ワイン製造において、マロラフティック
酵素（ｍａｌｏｌａｃｔｉｃ　ｅｎｚｙｍｅ、　）もし
くは・マレイド・パーミニイス（ｍａｌａｔｅ　ｐｒｅ
ｍｅａｓｅ）の遺伝子の挿入は宿主酵母細胞が葡萄の代
謝リンゴ酸を変化させることを可能ならしめ、有害バク
テリアが食するリンゴ酸を除去することにより、ワイン
の損傷を防止する。

他の態様ならびに利点は以下に記述する好ましい態様及
び特許請求の範囲の記載から明らかになるであろう。

第１図は本発明の複製ベクターの模式図であり、第２図
、第３ａ図、第３ｂ図は夫々本発明の組み込みベクター
の模式図であり、第４図は組み込みベクターを宿主酵母細胞染色体に組み
込む機構を示す模式図である。

第１図ないし第３図において、制限エンド１ヌクレアー
ゼ開裂部位は下記の略号で示す。

Ａ　：　Ｘｂａｌ；　Ｂ　：　ＢａｍＨＩ；　Ｅ　：　
ＥｃｏＲＩ；　　Ｈ：ＨｉｎｄエエＸ；　Ｋ　：　Ｋｐ
ｎ工；　Ｍ　：　ＳｍａＩ；　ＰＩ：Ｐｖｕ工；ＰＩＩ
：Ｐｖｕ工工；　Ｓ　：　Ｓａｌ工；　ＴＩＩ：５ｓｔ
Ｘ工；　Ｕ　：Ｓｔ、ｕｌ；　Ｘ　：　Ｘｈｏｌ。　（
Ａ）はＨＯ遺伝子の５′末端から約３キロベース離れて
存在する元のＸｂａ１部位を示す。この部位はｐＲＹ２
５３の造成に、おいて破壊され、Ｓａｌ、ｒ部位に入れ
換えられた（ｐｒＤは同様にプラスミド造成中に破壊さ
れた元のＰｖｕ　Ｉ　工部位を示す。完全遺伝子又は遺
伝子融合物は四角で示す。遺伝子の略号は次のとおりで
ある。

ａｍｐγ：アンピシリン耐性；　　Ｇ４１８：抗生物質
Ｇ４１８耐性；　　ＨＯ：ホモタリズム；　　ＣＭＣＩ
＝イソ−１−チトクロームｃ；　　ＵＲＡ３ニオロチジ
ン−５′−モノホスフェート・デカルボキシラーゼ；　
　ＧＡＬＬニガラクトキナーゼ；　　１ａｃＺ：イータ
−ガラクトシダーゼ。環内の同心円状の矢印は、起源が
ｐＢＲ３２２以外のＤＩＪＡセグメントを示す。

これらの配列の範囲は矢印の頭部で示され、供給源は標
識によって示されている。ｐＢＲ３２２配列は同心円矢
印を有していない。他の略号は、ｋｂ：キロベース塩基
対；ｏｒｉ：大腸菌の複製開始部。

第、４図において、−下記の略号が使用されている。−
Ｘ：酵母染色体に組み込まれ、発現されるべき任意の遺
伝子またはＤＮＡ配列；　Ｓ：遺伝子Ｘが挿入されるク
ローニング部位（例えば、制限エンド９ヌクシアーゼ部
位）；　Ｌ：ターゲット配列中のベクターを゛ターゲッ
ト配列ｔｔＴ”または”Ｔａｒｇｅｔ”に直線化させる
部位（例えば、制限エンドヌクレアーゼ部位）；　Ｒ：
必ずしも特異的ではないが、相同ベクターから誘導され
たターゲット配列および染色体から誘導されたターゲッ
ト配列の組換えが生じる部位。ダッシュ記号が付された
ものは、　　−開裂によって、介在ＤＮＡ配列の挿入に
よって、または染色体への組み込みによって他の半分か
ら分離した部分の半分（たとえばＳまたはＬ）を示す。

■またはＣのサブスクリプトは、夫々ベクターまたは染
色体から誘導された部位または部位の部分を示す。他の
略号は第１図〜第３図の場合と同様である。

第１図において、１２時のところから始めて時計回りに
回転して、大腸菌プラスミＭｐＢＲ３２２からのＤＮＡ
小片である配列Ｅ−Ｈ，酵母ＵＲＡ３遺伝子（ウラシル
不含有培地で増殖する能力に必要な遺伝子の一つ；この
遺伝子は元々比較選択手段を提供するため挿入された不
必要な人工産物である）を含むＨ−Ｈ配列、ｐＢＲ３２
２の別の片である配列Ｈ−３；酵母ｃＹｃｌ　（チトク
ロームＣ）プロモーターおよびバクテリアのトランスポ
ゾンＴｎ９（１３）からのＧ４１８耐性遺伝子の大部分
（非本質的Ｎ−末端領域は含まれない）を含む配列５−
（ＰＩＩ）；　　ｐＢＲ３２２由来の大腸菌の複製開始
部および大腸菌で形質転換体を選択するためのａｍｐγ
遺伝子を含む配列（ＰＩ　Ｉ　）　−”　ｙおよび酵母
２ミクロン環からの酵母複製開始部である配・列Ｅ−Ｅ
よりなる、複製プラスミドベクターｐＲＹ２５２　を造
成した。

第２図において、組み込みプラスミドベクターｐＲＹ２
５３をｐＲＹ２５２から誘導したが、この中で酵母の複
製開始部配列を、所望異種遺伝子の挿入のためのに部位
を含めて、ＨＯ（ホモタリズム）遺伝子を含むサツカロ
ミ、セス・セレビシェの７．０１ｃｂ　ＥｃｏＲＺ断片
に置きかえた。

第３ａ図において、組み込みプラスミドベクターｐＲＹ
２５５をｐＲＹ　２５３から誘導したが、その中でＨＯ
挿入片の一端からＣＹ０１プロモーター配列の韓まりま
で延長し、ＵＲＡ３遺伝子を含む３．３キロイースのＳ
ａｌ工からＸｈｏｌまでの断片を、酵母ＧＡＬｌ遺伝子
および大腸菌１ａｃＺ遺伝子の遺伝子融合物を含むＸｈ
ｏｌから５ａｌＩまでの６，０キロベ一ス断片に置きか
えた。第３ｂ図において、ｐＲＹ２５５ＡはｐＲＹ２５
３　から誘導された点でｐＲＹ２５５　と同様であり、
ＧＡＬＬ−１ａｃＺ融合物を含むＸｈｏｌからＳａｌ工
までの６．０キロベ一ス断片でｐＲＹ２５３の２．５キ
ｇ　−＜　−スＳ　ａ　ｌ　Ｉ断片を置きかえた。

さらに再び第３ｂ図において、ｐＤＹ３はｐＲＹ２５５
Ａから、ＣＹＣＩプロモーターから上流の５ｔｕ１部位
とＳｍａ１部位の間の１，８キロベース領域を削除して
誘導された。

ｐＲＹ２５５ＡおよびｐＤＹ３は、下記のとおりｐＲＹ
２５５　と実質的に同様に使用できる。また、　ｐＤＹ
３において、該ベクター上に独特のＨＯのご末端に近い
５ｓｔＪ、″Ｌ部位は、ベクターの直線化に一層便利な
部位を提供する。

プラスミ１ｊｐＲＹ２５２．　ｐＲＹ２５３．　ｐＲＹ
２５５およびＩ）ＲＹ２５５Ａ　　ば、米国メリーラン
ド、ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に、各々ＡＴＣＣ３９６
８７，３９６８８，３９６８９および３９８２２の寄託
番号で寄託されている。

第４図において、プラスミ）’ｐＲＹ２５７は、所望の
異種蛋白質、例えばグルコアミラーゼまたはインターフ
ェロンの遺伝子Ｘを、プラスミｌ−’ｐＲＹ２５５のＳ
部位に挿入されて有する。であろう。

プラスミドの造成第１図ないし第３図に示すプラスミドは、慣用の組み変
えＤＮＡ法および一般に入手可能な材料を用いて製造さ
れた。

プラスミドｐＲＹ２５３．　　ｐＲＹ２５５．　　ｐＲ
Ｙ２５５ＡおよびｐＤＹ３は、複製プラスミドｐＲ−Ｙ
２５２かも誘導され、このｐＲＹ２５２は下記のよ〜に
製造された。

ＵＲＡ３遺伝子を、前記のとおりプラスミド”　ｐＢＲ
３２２に挿入し、次いで内因性酵母２ミクロン環からの
複製開始部を、通常はそれに付随する３つの遺伝子を伴
なわずに、挿入した。このベクターは、宿主酵母細胞中
で、これら３つの遺伝子（そのうち２つは複製に必須の
蛋白質をコードする）を有することなく複製可能である
。何故なら、宿主酵母細胞は、これらの蛋白質をコード
する内因性２ミクロン環を既に含んでいるからである〔
ホトシュタイン（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ）ら、（１９７９）
　　ジーン（ｇｅｎｅ）　８．１７　）。

プラスミドのＣＹＣＩ−Ｇ４１８γ　融合部は、トラン
スホゾｙＴｎ９（１３）（岡ら、（１９８１）ジエイー
モル・パイオル、　（Ｊ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　）　
１４７．２１７）のＧ４１８γ遺伝子の５′末端に近い
Ｘｈｏ１部位を、プラスミドｐＬＧ６６９〔ガレンテ（
Ｇｕａｒｅｎｔｅ　）ら、（１９８１）　　ピーエヌエ
イエス・ニーニスエイ（ＰＮＡＳ　ＵＳＡ）　　７８．
　２１９９）のＣ，ＹＣ１プロモーターおよびＣＹＣＩ
コード配列の５′末端に続（ＢａｍＨ１部位に、両部位
をマング豆のヌクレアーゼで平滑にしてから融合させる
ことによって構成した。この融合結合部のＤＮＡ配列は
、（ＣＹＣｌ）、ＴＡＡＡＴＴＡＡＴＡＡＴＧＡＣＣＧ
ＧＧＣＣＧ８．（Ｇ４１８ｒ）である。矢印は融合点を
示す。

プラスミ）”ｐＲＹ２５３．ｐＲＹ２５５．ｐＲＹ２５
５ＡおよびｐＤＹ３は、ｐＲＹ　２５２から、図に示し
たように遺伝子断片の置換および除去を行って構成した
。プラスミドｐＲＹ２５７は、所望蛋白質の遺伝子Ｘを
、ＨＯ遺伝子のｐＲＹ２５５　のＳ部位へ挿入し、第４
図に示すとおり、遺伝子Ｘの両側にＨＯ遺伝子の一部が
存在するようにして構成することができる。

プラスミドの用途本発明のベクターは、宿主酵母細胞が所望の異種遺伝子
を発現させる任意の有用方法に使用できる。所望の異種
遺伝子を、慣用の組換えＤＮＡ技術、例えばマニアチス
（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、（１９８２）モレキュラーク
ローニンク：ア・ラボラトリ−マニュアル、コールドス
フリングハーバ−プレス。

コール上々スフリングハーバ−、ニューヨーク（Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｅｒ　Ｐｒｅｓｓ、
　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、の記載に従って挿入できる。ｐＲ
Ｙ２５３、ｐＲＹ２５５．ｐＲＹ２５５Ａ、ｐＤＹ３も
また、野性型酵母ストレインから遺伝子を削除するため
に使用できる。遺伝子の削除のためには、ベクターのＨ
Ｏ部分は不適当となる。遺伝子または遺伝子の部分の削
除は次のようにして行いうる：１、　削除すべき遺伝子
を該遺伝子の両側の隣接　。

配列とともにクローン化する。

２、インビトロでクローン化遺伝子の削除を行ない、相
同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｔｉｏｎ）には十分であるが該遺伝子により通常コード
される蛋白質をコードするには不十分な３′および５′
末端の遺伝子部分を残す。

３、削除部含有ＤＮＡを、本明細書に記載された組み込
みべ゛フタ−の１つの適当な位置に配置する。

４、削除部に隣接する配列の１つの一点でベクターを直
線化し、組み込み形質転換を行ない、０４１８耐性体を
選択する。

５、安定な形質転換体を２０ないし４０世代にわたり非
選択的に増殖させ、そしてＸｇａｌ指示プレート上の青
コロニー色の消失またはＧ４１８含有プレートへのレプ
リカプレーテインダ（ｒｅｐｌｉｃａｐｌａｔｉｎｇ　
）によってベクターの削除をスクリーニングする。

６、ベクターを削除したコロニー中から、サチンプロッ
ト法（５ｏｕｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　）によっ
て削除遺伝子を保持するものをスクリーニングする。

このベクターは、炭水化物醗酵を含むワイン、パン、お
よびビールのような最終生産物で使用される工業用酵母
種において特に有用である。

形質転換酵母細胞を次のようにしてベクターで形質転換した。

実験室用酵母ストレインＤＢＹ７４５（ガレ／力（Ｇｕ
ａｔｅｎｔｅ）ら、（１９８１）　　ピーエヌエイエス
・ニーニスエイ（ＰＮＡＳ　ＵＳＡ）７８，２１９９　
　）；カールスベルグＲ（ＣａｒｌｓｂｅｒｇＲ）醸造
種（未殺菌処理ビールから分離した酵母）；　フライス
マンズＲ（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎ’　ｓＲ）パン酵母（
スーパーマーケットでの市販品）；　ボルドーワイン酵
母（ＡＴＣＣ４２９２８）　　を標準的栄養培地、　Ｙ
ＥＰ−Ｄ。

で増殖させ、グルシュラーゼ（ｇｌｕｓｕｌａｓｅ　）
でセファロプラスト化し、ジャーマン（Ｓｈｅｒｍａｎ
　）　ラ、（１９８１）　　メソツヅ・イン・イースト
・ジエネテイツクス（コールド５・スプリング・ハーバ
−・ラボラトリーズ・プレス、コールド・スプリング・
ハーバ−、ニューヨーク）　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＰｒｅｓ
ｓ、　Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎＯＨａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ
　Ｙｏｒｋ　）　）に記載の酵母形質転換の標準法によ
りプラスミｌ−”ｌ；）ＮＡに暴露した。ＨＯコロ−ス
で組み込みを行なうために、形質転換前に組み込みプラ
スミ）’ｐＲｙ２５３は制限エンドヌクレアーゼ消化に
よりＨＯ遺伝子の３′末端に近い独特の５ｓｔＩＩ部位
で直線化し、ｐＲＹ２５５はＨＯ遺伝子の５′末端に近
い独特のＫｐｎＩ部位で直線化した。複製プラスミドｐ
ＲＹ２５２は直線化しなかった。

プラスミドへの暴露の後、スフェロプラスト１０８をＹ
ＥＰ−Ｄプラス１．０Ｍソルビトール中で３０分間３０
Ｃで増殖させ、次いでＹＥＰ−Ｄを含む３チアガロース
加帰液５　ｒｎｌに分散させて、２チ寒天、ＹＥＰ−Ｄ
、　　ｌ、ＱＭソルビトール、７０ｍＭリン酸カリウム
、ｐＨ７，０，２Ｑｒｎｌ上に接種した。

室温で１０分間冷却した後、寒天上に１％寒天、ＹＥＰ
−Ｄ、１．ＯＭソルビトール加温液４ｍｌの追加分を重
層した。次いで細胞を３０Ｃで６世代増殖させた：これ
はＣ）ＢＹ７４５　では８時間、カールスベルグ（Ｃａ
ｒｌｓｂｅｒｇ　）では９時間、ワイン酵母では７時間
、そしてフライスマンズ（Ｆ’ｌｅｉｓｈｍａｎ’ｓ）
では６時間に相当する。この増殖期間の後、抗生物質Ｇ
４１８　（２５ｍ９／ｒｒｔｌ）の滅菌溶液０．６　ｍ
Ｊを寒天表面に拡散させ、無菌７−ド中で乾燥させた。

次いでプレートを３００で２８）５日間日間インキュト
ートと、非形質転換細胞の背景から、コロニーが出現す
る。これらのコロニーの数個をつまようじで０４１８を
５００　ｐｉ／ｍｌ含有する新しイＹＥＰ−Ｄプレート
上に拾い上げた。形質転換に成功した細胞は、２４時間
以内に肉眼視可能なコロニーを生じ、これに対し、非形
質転換細胞はそのようなコロニーを生じなかった。これ
らの結果の概要を次の表１に示す。

表１　　プラスミｒｊＤＮＡ１μ夕　からの１０　活性
細胞ＤＢＹ７４５　　　０　　５２００　　８９０　　
　８００カールスベルグ　　　０　　　　２６０　　　
　１３　　　　　　７ａ）形質転換前にＳｓ　ｔｎ　　
で直線化ｂ）形質転換前にＫｐｎ　Ｉ　　で直線化組み
込みプラスミＫｐＲＹ２５３およびｐＲＹ２５５から得
られた形質転換体は、分離した該形質転換体をＹＥＰ’
−Ｄ中で非選択的に１０ないし２０世代増通させ、そし
て０４１８感受性への復帰が１０−３より小さい割合で
起ったことによって、安定に組み込まれたプラスミドを
有することが示された。

ｐＲＹ　２５５　を有する形質転換体は、単一炭素源と
してのガラクトース、７０ｍＭリンサンカリウムバッフ
ァー、ｐＨ７，０およびＸｇａｌ指示色素（５′−一ブ
ロモー４’−１０ロー３′−インドイル−ベーターＤ−
ガラクトシド）を含むプレート上で青色コーロニーを生
じた。

ベクター配列の削除プラスミドベクターｐＲＹ２５７　は、プラスミドゝｐ
ＲＹ２５３およびｐＲＹ２５５　について上に述べたよ
うにして直線化し、宿主酵母細胞の形質転換に使用でき
る。上記のとおり、形質転換体は抗生物質耐性に基づい
て選択される（第４図）。

この選択にひき続いて、第４図に示したとおり、形質転
換体の安定性、最終生成物の味または他のｆｔ要な特性
に悪影響を及ぼしたり、代謝エネルギーを浪費したりす
るベクターの不要部分を削除するため、追加工程を行な
いうる。要するに、このスクリーニング工程は、宿主染
色体に所望遺伝子を蓄積し、外来のＤＮＡを除去する。

この外来ＤＮＡの削除は、例えば所望の異種遺伝子の消
失をひき起すような不所望の組み換えの原因となりうる
二列繰返し配列を削除することにより、形質転換体の安
定性を増大させる。また、抗生物質耐性遺伝子の削除も
また、もし何らかの理由で酵母を殺すために抗生物質の
使用が必要になると予測されるならば、有利であろう。

最終的に、形質転換酵母から、大腸菌由来の全配列を削
除することは、微生物使用のための支配的調節クリアラ
ンス　−を単純化するであろう。

スクリーニングは、（フタ−中でのスクリーニング可能
特性をコードするベクターの存在に依存する：　ｐＲＹ
２５７においては、これはβ−ガラクトシダーゼをコー
ト９する大腸菌１ａｃＺ遺伝子である。この遺伝子を発
現する酵母コロニーは、Ｘｇａｌのような発色指示色素
を含有する適当な指示イトリブレート上で青色に変化す
る。従って、上ａｃＺ遺伝子を含めてベクターＤＮＡの
一部が削除された形質転換体を選択するには、形質転換
体を指示プレート上に接種し、プレート上で白色のまま
でいるコロニーを、１ａｃＺ遺伝子を残有しない形質転
換体またはその子孫として選択する。

第４図は削除機構を説明する。ある形質転換体において
は、染色体配列と相同のベクター配列同士で交叉を有す
るであろう（第４図ｄ参照）。この交叉現象は相同配列
間でベクター領域のループ脱落および欠失をひきおこす
（第４図ｅ参照）。

所望であれば（例えばグルフアミラーゼをコードする）
異種遺伝子Ｘをこの領域外にすれば、染色体中に残る。

この種の現象の頻度を他の不所望の現象（例えば貯蔵遺
伝子を含む全プラスミドのループ脱落）に比べて高める
ためには、貯蔵遺伝子も、直線化部位を有するターゲッ
ト配列の末端に゛近いところに位置させることができる
。

所望のループ脱落現象は、白色コロニー間で遺伝子Ｘを
保有するものをスクリーニングすることによって、不所
望現象から識別可能である。これを行うには、遺伝子Ｘ
の生産物を検出する機能的検定法（例えばダルコアミラ
ーゼの場合は、澱粉含有プレート上での同心円）、また
はサチンプロット法による遺伝子Ｘの存在の直接検定法
によって行う。二つのスクリーニングは、例えばＸｇａ
ｌおよび澱粉の両者を含有する培地を用いて、一度に行
うこともできる。

竹の態様他の態様は特許請求の範囲の記載から明らかである。

例えば、形質転換の前にはフタ−を直線化することによ
り、組み込みベクターが宿主染色体に組み込まれる頻度
は高まるが、環状のベクターによって形質転換の低頻度
組み込みも行いうる。ＨＯ遺伝子が最も好ましいターゲ
ット遺伝子ではあるが、代謝に関与しない宿主染１色体
の他の任意の領域を使用できる。例えば、野生型ＨＯ遺
伝子と若干具なる多（の実験室用酵母ストレーンの突然
変異性的同質（ホモタリズム）遺伝子（ｈｏ遺伝子）を
ターゲットとして使用できる：このｈａ遺伝子はＨＯ遺
伝子と同様に大寸法であり（約２，０００塩基対）およ
び二倍体または多倍体細胞の代謝に関与しないという利
点を持つ。

パンおよびアルコール飲料の生産に利用される酵素の他
に、本発明のベクターは、゛所望最終生産物が蛋白質、
例えば医療用蛋白質例えば挿入異種遺伝子にコードされ
るインターフェロンである方法に使用できる。異種遺伝
子は宿主染色体の異なる部位に既に保有されている遺伝
子であってよく、例えば生産レズル上昇のために、アル
コール生産に関与する天然遺伝子の追加コピーを与える
ために有利であろう。

抗生物質耐性遺伝子を調節するプロモーター配列も変化
させてよ（、唯一の重要因子はプロモーター配列が酵母
細胞中にて十分なレベルの発現の保持を与えることのみ
である。

相同配列を有するばフタ−の採用により、宿主染色体中
の遺伝子がターゲットとされるときは、形質転換に先立
つベクターの直線化は、相同配列の任意の場所で生じう
るが：しかしながら、一般には、直線化が配列の中心付
近で生じたとき組み込み効率は向上し、直線化９部位が
配列のいずれかの末端に近いと低下する。

スクリーニング可能特性は、ベーターガラクトシダーゼ
産生能以外に、その不存在が検出できる。

任意の特性でもよい。さらに、ベーターガラクトシダー
ゼ生産能を用いるとき、遺伝子は大腸菌１ａｃＺ遺伝子
でなくても良く、例えば、クルイエロミセス種（Ｋｌｕ
ｙｅｒｏｍｙｃｅｓ　５ｐｅｃｉｅｓ）、例えばに、ラ
クチス（Ｋ、　１ａｃｔｉｓ　）のＬＡＣ４°遺伝子を
使用してよく、この遺伝子もまたベーターガラクトシダ
ーゼをコードする。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の複製ベクターの模式図であり、第２図
は本発明の組み込みベクターの模式図であり、第３図ａおよび第３図すも夫々本発明の組み込酵母細胞
の染色体＆組み込υ機構ン７ｒ：丁模式図である。（外５名）図面の浄書（内容に変更なし）（Ｐｎ）ＦＩＧ、　　１手　　続　　補　　正　　−１１１昭和／／年　グ月２１日

Claims

【特許請求の範囲】

（１）酵母プロモーター配列または合成プロモーター配
列から転写開始される、通常宿主酵母細胞を殺しうる抗
生物質に対して耐性の遺伝子を含んでなる前記宿主酵母
細胞の染色体に組み可能なベクター。
（２）宿主細胞に異種である遺伝子をさらに含む特許請
求の範囲第１項記載のベクター。
（３）宿主酵母細胞の染色体の配列に相同の配列を含む
特許請求の範囲第１項記載のベクター。
（４）ベクターの前記相同配列にプロモーター配列の部
分が含まれない特許請求の範囲第３項記載のベクター。
（５）ベクターの前記染色体の前記配列への組み込みが
、宿主酵母細胞の代謝を阻害しない特許請求の範囲第３
項または第４項記載のベクター。
（６）染色体の前記配列が、前記宿主酵母細胞の性的同
質（ホモタリズム）遺伝子の少なくとも一部を含む、特
許請求の範囲第５項記載のベクター。
（７）異種遺伝子が酵素をコードする特許請求の範囲第
２項記載のベクター。
（８）酵素がグルコアミラーゼである特許請求の範囲第
７項記載のベクター。
（９）グルコアミラーゼが宿主細胞による澱粉からグル
コースの発生を可能にする特許請求の範囲第８項記載の
ベクター。
（１０）宿主酵母細胞が宿主酵母細胞の代謝生産物を利
用する方法に関与し、該方法において該宿主酵母細胞が
グルコースをエネルギー源として利用するものである特
許請求の範囲第９項記載のベクター。
（１１）代謝生産物が二酸化炭素であり、前記方法がド
ウ（生地）の生産方法である特許請求の範囲第１０項記
載のベクター。
（１２）代謝生産物がエタノールである特許請求の範囲
第１０項記載のベクター。
（１３）酵素がマロラクチック酵素（ｍａｌｏｌａｃｔ
ｉｃ　ｅｎｚｙｍｅ）またはマレイトパーミアーゼ（ｍ
ａｌａｔｅ　ｐｅｒｍｅａｓｅ）である特許請求の範囲
第７項記載のベクター。
（１４）マロラクチック酵素またはマレイトパーミアー
ゼが、宿主細胞によるリンゴ酸の代謝を可能にする特許
請求の範囲第１３項記載のベクター。
（１５）異種遺伝子が、抗生物質耐性の該遺伝子が転写
される際のプロモーター配列と異なるプロモーター配列
から転写される特許請求の範囲第２項記載のベクター。
（１６）異種遺伝子のプロモーター配列が、抗生物質耐
性遺伝子のプロモーターより一層高発現性である特許請
求の範囲第１５項記載のベクター。
（１７）抗生物質耐性遺伝子が、Ｇ４１８に耐性な遺伝
子である特許請求の範囲第１項記載のベクター。
（１８）グルコアミラーゼをコードする遺伝子を含み、
宿主酵母細胞中でグルコアミラーゼの発現を可能にする
クローニングベクター。
（１９）グルコアミラーゼが宿主細胞による澱粉からの
グルコースの発生を可能ならしめる特許請求の範囲第１
８項記載のベクター。
（２０）宿主酵母細胞が宿主酵母細胞の代謝生産物を利
用する方法に関与し、該方法において該宿主酵母細胞が
グルコースをエネルギー源として利用するものである特
許請求の範囲第１９項記載のベクター。
（２１）代謝生産物が二酸化炭素であり、前記方法がド
ウの生産方法である特許請求の範囲第２０項記載のベク
ター。
（２２）代謝生産物がエタノールである特許請求の範囲
第２０項記載のベクター。
（２３）マロラクチック酵素またはマレイトパーミアー
ゼをコードする遺伝子を含み、宿主酵母細胞中でマロラ
クチック酵素またはマレイトパーミアーゼの発現を可能
ならしめるクローニングベクター。
（２４）マロラクチック酵素またはマレイトパーミアー
ゼが宿主酵母細胞中でリンゴ酸の代謝を可能とする特許
請求の範囲第２３項記載のベクター。
（２５）宿主酵母細胞の染色体の配列と相同の配列を含
み、宿主酵母細胞の染色体に組み込み可能で、該組み込
みが宿主酵母細胞の代謝を阻害しないベクター。
（２６）染色体の前記配列が、宿主酵母細胞の性的同質
遺伝子の少なくとも一部を含む、特許請求の範囲第２５
項記載のベクター。
（２７）特許請求の範囲第３項記載のクローニングベク
ターを前記相同配列中で直線化し、次いでこの直線化ベ
クターを形質転換条件で宿主酵母細胞に暴露することか
らなる、特許請求の範囲第３項記載のクローニングベク
ターを宿主酵母細胞の染色体へ組み込ませる方法。
（２８）ベクターが直線化されており、前記染色体の前
記配列が第１末端および第２末端を有し、該ベクターが
夫々前記第１末端および第２末端に相同の第１配列およ
び第２配列を有し、該配列は部分的非相同性領域により
互いに分離されている特許請求の範囲第３項記載のベク
ターであつて、所望の異種蛋白質の遺伝子、宿主染色体の相当領域に相同の第３配列、抗生物質耐性遺伝子、およびスクリーニング可能特性の遺伝子、を含む特許請求の範囲第３項記載のベクター。
（２９）直線化ベクター上での前記配列が、第１相同配
列、所望異種蛋白質の遺伝子、第３相同配列、スクリーニング可能特性の遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、および第２相同配列の順に配列されている特許請求の範囲第２８項記載のベ
クター。
（３０）異種遺伝子がグルコアミラーゼをコードする特
許請求の範囲第２８項記載のベクター。
（３１）異種遺伝子がマロラクチック酵素またはマレイ
トパーミアーゼをコードする特許請求の範囲第２８項記
載のベクター。
（３２）スクリーニング可能特性の遺伝子が、ベーター
ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を含む特許請求の
範囲第２８項記載のベクター。
（３３）直線化ベクターを形質転換条件下に宿主酵母細
胞に暴露し、抗生物質に耐性を生じた形質転換酵母細胞を選択し、そ
して前記スクリーニング可能特性を有しない前記形質転換体
のサブグループまたは前記形質転換体の子孫を選択する
、ことにより、前記部分的相同性の領域の少くとも一部をベクターから
削除することよりなる、特許請求の範囲第２８項の直線
化ベクターを宿主酵母細胞の染色体に組み込ませる方法
。
（３４）スクリーニング可能特性が、ベーターガラクト
シダーゼの産生であり、サブグループの選択は、前記形
質転換体をβ−ガラクトシダーゼの存在下で色の変化を
ひき起す培地で増殖させ、次いでそのような色の変化を
生じない形質転換体を選択することによる、特許請求の
範囲第３３項記載の方法。
（３５）酵母プロモーター配列の調節下にある抗生物質
Ｇ４１８に耐性の遺伝子を含む、宿主酵母細胞内で複製
可能なベクター。
（３６）異種遺伝子が不所望遺伝子の３′末端および５
′末端と相同性の３′末端および５′末端を含み、完全
な不所望遺伝子を含まない、特許請求の範囲第２項のベ
クターで酵母細胞を形質転換し、そして該不所望遺伝子
を欠いた形質転換体を選択することよりなる、酵母細胞の染色体から不所望の遺伝子を削除する方法。