DE3588096T2

DE3588096T2 - Hefevektor

Info

Publication number: DE3588096T2
Application number: DE3588096T
Authority: DE
Inventors: Robert Rogers Yocum
Original assignee: Omnigene Inc
Current assignee: Omnigene Inc
Priority date: 1984-05-22
Filing date: 1985-05-22
Publication date: 1996-09-05
Anticipated expiration: 2005-05-23
Also published as: EP0707068A1; EP0163491A1; AU4270985A; FI852024A0; EP0707068B1; DK224185D0; EP0707068B2; FI852024L; BR8502400A; IL75210A0; JPS6140793A; DE3588234T3; DE3588234D1; ATE207961T1; DE3588096D1; ATE136059T1; DK224185A; EP0163491B1; CA1338857C; DE3588234T2

Description

Die Erfindung betrifft genetische Manipulationen in industriellen Hefestämmen (d.h. nichthaploiden Hefezellen).
Gegenwärtig gibt es eine Technologie zur Einschleusung von heterologen (d.h. modifizierten oder fremden) Genen in Laborstämme von Hefe der Gattung Saccharomyces, insbesondere S. cerevisiae. Zwei Typen von Plasmidvektoren wurden zu diesem Zweck, d.h. zur Replikation und zur Integration verwendet. Replikationsvektoren enthalten einen DNA-Replikationsorigin, der in Hefen funktioniert, so daß das Plasmid extrachromosomal als ein kreisförmiges Episom beibehalten wird. Integrationsvektoren enthalten keinen derartigen Origin und benötigen daher die Insertion in ein Hefechromosom, um stabil beibehalten zu werden.
Beide Plasmidtypen können in Hefezellen nach Standardtransformationsverfahren eingeschleust werden. Da die erfolgreiche Aufnahme und Etablierung der Plasmid-DNA durch kompetente Hefezellen ein relativ seltenes Ereignis ist (< 10&supmin;³) wird ein Selektionsmechanismus benötigt, um die Identifikation der Transformanten zu erlauben.
Am häufigsten wird die Selektion durch Einschleusen von auxotrophen Mutationen in den Empfänger-Hefestamm erzielt. Die üblicherweise verwendeten Mutationen sind ura3, leu2, trp1 und his3. Das Plasmid von Interesse trägt eine Wildtypkopie eines dieser Gene in sich. Da die Wildtypkopie auf dem Plasmid gegenüber dem chromosomalen Allel des Wirts dominant ist, wird die Selektion nach Zellen, die das Plasmid erhalten, leicht auf einem Minimalmedium, dem der Nährstoff fehlt, der von der auxotrophen Wirtszelle benötigt wird, erzielt.
Es gab auch Berichte über die Verwendung von Antibiotikaresistenz, um transformierte Zellen zu selektionieren. Replikationsvektoren wurden beschrieben, die auf der Empfindlichkeit der meisten Saccharomyces-Stämme gegenüber dem im Handel erhältlichen Neomycin-Analogon, dem Antibiotikum G418 beruhen, Jiminez et al. (1980), Nature 287, 869; Hollenberg (1982) in Current Tropics in Microbiology and Immunology, Hofschneider et al., Hrsg., (Springer-Verlag, NY); Webster et al. (1983) Gene 26, 243. Webster et al. beschreiben auch einen Plasmidintegrationsvektor, der nicht direkt durch eine G418-Resistenz selektioniert werden kann. Diese Vektoren enthalten ein Gen, das sogenannte kanr, neor oder G418r aus dem bakteriellen Transposon Tn903 und einem Hefe-Replikationsorigin; dem bakteriellen Gen geht sein nativer bakterieller Promotor voraus.
Naumovski und Friedberg "Construction of plasmid vectors that facilitate subcloning and recovery of yeast and E. coli DNA fragments", Gene 22 (1983), 203-209 schlagen die Selektion eines Replikationsplasmids mit G418- Resistenz vor, geben aber keine Einzelheiten an. Sie beschreiben ein Plasmid pNF2, das ein Gen, das Kanamycinresistenz codiert, einen 2µ-Replikationsorigin und eine Sequenz, die einer chromosomalen Hefesequenz (URA3) homolog ist, kombiniert. Sie beschreiben auch die Produktion eines Plasmids pNF3 aus pNF2 durch Deletion des 2µ-Replikationsfragments. Es wird vorgeschlagen, daß das so erhaltene Plasmid integriert wird, aber keine Ergebnisse werden angegeben.
Ein weiterer Replikationsvektor wurde beschrieben, der das Gen für Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Hygromycin B unter der Kontrolle eines Hefepromotors enthält; Gritz et al. (1983), Gene 25, 17B.
Die in all den vorstehenden Fällen beschriebene Arbeit betraf haploide Hefe-Laborstämme und besitzt daher keine direkte Relevanz für industrielle Hefestämme, die nichthaploid sind.
Gemäß einem Gesichtspunkt betrifft die Erfindung eine Hefezelle, die durch Integration einer Vektor-DNA in eines ihrer Chromosomen transformiert wurde, dadurch gekennzeichnet, daß die Hefe-Wirtszelle eine industrielle nichthaploide Hefezelle ist, die Vektor-DNA ein Resistenzgen für ein Antibiotikum enthält, das andernfalls die Hefezelle abtöten kann, wobei das Gen von einer Promotorsequenz transkribiert wird, die die Expression des Antibiotikumresistenzgens auf eine Höhe steigern kann, die der Zelle Antibiotikumresistenz verleiht, die Vektor-DNA eine Sequenz umfaßt, die zu einer Sequenz des Chromosoms homolog ist und darin integriert ist und daß die Vektor-DNA weiterhin ein Gen für ein gewünschtes heterologes Protein umfaßt.
Das zweite Gen ist ein Gen für ein gewünschtes heterologes Protein und kann ein Nicht-Hefegen, ein modifiziertes Gen, ein Gen aus einem anderen Hefestamm oder ein homologes Gen aus einem anderen Chromosomenort sein, das aber in jedem Fall das gewünschte Protein codiert.
Der Einschluß einer Sequenz in den Vektor, die mit einer Sequenz (einer Zielsequenz) des Wirtschromosoms homolog ist, erleichtert die Integration. Bevorzugt liegt die homologe Sequenz getrennt von der Kontrollsequenz, die das Antibiotikum-Resistenzgen kontrolliert, vor.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen codiert das zweite Gen Glucoamylase (die die Erzeugung von Glucose aus Stärke durch die Hefezelle ermöglicht), und die Wirtszelle nimmt an einem Verfahren teil, z.B. der Teigbildung, bei der ein Stoffwechselprodukt der Zelle, z.B. Kohlendioxid, verwendet wird.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen befinden sich das Antibiotikum-Resistenzgen und das zweite Gen unter der Kontrolle unterschiedlicher Promotoren, wobei der Promotor, der das zweite Gen kontrolliert, bevorzugt der stärker exprimierte der beiden ist. Das bevorzugte Integrationsverfahren ist eines, das zur Einbringung des heterologen Gens in dem Hefezellchromosom des Wirts zum Ausschluß von großen Teilen des Rests des DNA-Vektors führt, wodurch eine stark erhöhte Stabilität erhalten wird. Der Ausschluß dieser DNA beseitigt auch eine mögliche Quelle für eine Störung mit einer charakteristischen Eigenschaft, z.B. dem Geruch des Endprodukts. Wenn so ausgewählte Transformanten auf der Basis der Antibiotikaresistenz zur Verfügung stehen, kann DNA, die in dem Endprodukt, d.h. dem industriellen Hefestamm für seinen industriellen Zweck nicht mehr notwendig ist und beispielsweise das Antibiotikum-Resistenzgen einschließt, verworfen werden.
Folglich betrifft die Erfindung in einem zweiten und alternativen Gesichtspunkt eine industrielle nichthaploide Hefezelle einschließlich eines Chromosoms, umfassend DNA aus einem Vektor, wobei die Zelle eine Hefe-Wirtszelle umfaßt, in deren Chromosom die von einem Vektor stammende DNA integriert wurde oder einen Abkömmling einer derartigen Hefe-Wirtszelle, in den die von einem Vektor stammende DNA integriert wurde, wobei die von einem Vektor stammende DNA erstens ein Gen für ein gewünschtes heterologes Protein und zweitens eine mit einer Sequenz des Chromosoms in der Wirts-Hefezelle homologen DNA-Sequenz umfaßt.
Die Integration des Vektors in das Hefe-Wirtszellchromosom ergibt eine Stabilität über Generationen von Wirtsteilungen in Abwesenheit von Selektion, ein wichtiger Vorteil bei industriellen Fermentationsverfahren. Replikationsvektoren können aus Hefezellen in Raten von 1% bis 5% pro Generation verlorengehen. Die stabile Beibehaltung der integrierten Sequenzen über Generationen verhindert die Zugabe von toxischen Antibiotika zu dem Fermentationsmedium, um einen Selektionsdruck auszuüben, um die Sequenzen beizubehalten. Die erfindungsgemäßen Vektoren funktionieren auch in Hefen gut aufgrund der Tatsache, daß die Hefe-Promotorsequenz das Antibiotikum-Resistenzgen kontrolliert.
Für diploide oder polyploide industrielle Hefestämme (im Gegensatz zu haploiden Laborstämmen) ist die Einschleusung von auxotrophen Mutationen (die zur Selektion von Transformanten in haploiden Stämmen verwendet werden) schwierig. Die Verwendung der Antibiotikumresistenz in einem Integrationsvektor erlaubt die Selektion stabiler Transformanten in nichthaploiden industriellen Hefestämmen unabhängig von der Anzahl der Chromosomen oder der Anwesenheit oder Abwesenheit spezifischer Mutationen.
Die Einschleusung von Genen, die heterologe Enzyme codieren, in industrielle Hefestämme unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vektoren erleichtert die Produktion solcher Produkte, wie Alkohol, die üblicherweise auf Zuckern zur Ernährung der Hefe beruht. Ein Enzym, wie Glucoamylase, ermöglicht es der Hefe, Stärke aus billigen Quellen, wie Tapioka und Kartoffeln, abzubauen, wodurch Glucose erhalten wird, die von den Hefen verwertet werden kann. Auf ähnliche Weise kann das Brotbacken verbilligt werden, wenn Stärke (Mehl) anstelle von Zucker als primäre Energiequelle verwendet wird. Heterologe Enzyme können auch die Produktion von leichten (alkoholarmen bzw. -freien) Bieren, die einen niedrigeren Stärkegehalt als reguläres Bier besitzen, erleichtern. Ein beim Brauen von leichtem Bier gegenwärtig verwendetes Verfahren zum Abbau von Reststärke, die nach Beendigung des Mälzungsprozesses verbleibt, ist die Zugabe von Glucoamylase, die von einer Brothefe abgeleitet ist, zu der Würze, eine Stufe, die ausgelassen werden kann, wenn die beim Brauen verwendete Hefe auch ein Glucoamylase-codierendes Gen trägt und exprimiert.
Andere Enzyme können kommerzielle Fermentationsverfahren in anderen Gesichtspunkten erleichtern. Beispielsweise erlaubt bei der Weinherstellung die Insertion des Gens für das Malomilchsäureenzym oder die Malatpermease, den Hefe-Wirtszellen metabolisierte Äpfelsäure aus Weintrauben umzuwandeln, wodurch der Weinverderb durch Entfernen von Äpfelsäure, die sonst bei abbauenden Bakterien verwertet wird, verhindert wird.
Andere Besonderheiten und Vorteile der Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen, die nur als Beispiel dienen, hervor.
Zuerst werden kurz die Figuren beschrieben:
Die Figur 1 ist eine diagrammartige Darstellung eines Replikationsvektors.
Die Figuren 2, 3a und 3b sind diagrammartige Darstellungen von Integrationsvektoren.
Die Figur 4 ist eine diagrammartige Darstellung eines Mechanismus, nach dem ein Integrationsvektor in ein Hefe-Wirtschromosom integriert wird.

Plasmidstruktur

In den Figuren 1 bis 3 werden die folgenden Abkürzungen für Restriktions-Endonuklease-Spaltstellen verwendet: A, Xbal; B, BamHI, E, EcoRI; H, HindIII; K, KpnI; M, SmaI, PI, PvuI; PII, PvuII; S, SalI; TII, SstII; U, Stul; X, Xhol. (A) bezeichnet die Position einer früheren Xbal-Spaltstelle, die etwa 3 Kilobasen entfernt von dem 5'-Ende des HO-Gens lokalisiert ist. Diese Spaltstelle wurde bei der Konstruktion von pRY253 zerstört und durch eine SalI-Spaltstelle ersetzt. (PII) bezeichnet eine frühere PvuII-Spaltstelle, die auf ähnliche Weise während der Plasmidkonstruktion zerstört wurde. Vollständige Gene oder Genfusionen sind durch Kästen gezeigt. Die Abkürzungen für die Gene sind wie folgt: ampr, Ampicillin-Resistenz; G418r Resistenz gegenüber dem Antibiotikum G418; HO, Homothallismus; CYC1, iso-1-Cytochrom-c; URA3 , Orotidin-5'-monophosphatdecarboxylase; GAL1, Galactokinase; lacZ, β-Galactosidase. Die konzentrischen Pfeile innerhalb der Kreise zeigen die Segmente der DNA, deren Origin anders als der von pBR322 ist. Die Ausdehnung dieser Sequenzen wird durch die Pfeilspitzen angegeben, und die Quelle ist durch die Bezeichnungen angegeben. pBR322-Sequenzen haben keine konzentrischen Pfeile. Andere Abkürzungen sind: kb, Kilobasen-Paare; ori, E. coli Origin der Replikation.
In der Figur 4 werden die folgenden Abkürzungen verwendet: X, beliebiges Gen oder beliebige DNA-Sequenz zur Integration und Expression in ein Hefechromosom; 5, Clonierungsstelle (beispielsweise eine Restriktions-Endonuklease-Spaltstelle) in die das Gen X insertiert wird; L, eine Spaltstelle (beispielsweise eine Restriktions-Endonuklease-Spaltstelle) zur Linearisierung des Vektors innerhalb der Zielsequenz, "T" oder "Ziel"; R, eine nicht notwendigerweise spezifische Spaltstelle, an der die Rekombination zwischen homologen Vektor-abgeleiteten und Chromosom-abgeleiteten Zielsequenzen eintritt. Ein Apostroph bezeichnet die Hälfte einer Spaltstelle (wie S oder L) an, die von ihrer anderen Hälfte durch Spaltung, durch Insertion einer dazwischenliegenden DNA-Sequenz oder durch Integration in ein Chromosom getrennt wird. Ein Subskript von V oder C bezeichnet Spaltstellen oder Teile von Spaltstellen, die von dem Vektor bzw. dem Chromosom abgeleitet sind. Andere Abkürzungen sind wie in den Figuren 1-3 angegeben.
Unter Bezugnahme auf Figur 1 ist der Replikations-Plasmidvektor pRY252, beginnend in der Position 12 Uhr der Figur und Bewegung im Uhrzeigersinn aus der Sequenz E-H, einem kleinen DNA-Stück aus dem E. coli-Plasmid pBR322, der Sequenz H-H, die das Hefe-URA3-Gen einschließt (eines der Gene, die für die Fähigkeit zum Wachstum auf Uracil-Mangelnährmedien benötigt wird; dieses Gen ist ein nichtnotwendiger Artefakt in dem Plasmid, der ursprünglich insertiert wurde, um ein vergleichendes Selektionsmittel zu ergeben), die Sequenz H-S, ein weiteres Stück von pBR322, die Sequenz S-(PII), die den Hefe- CYC1-(Cytochrom c)-Promotor und den Hauptteil des G418-Resistenzgens aus dem bakteriellen Transposon Tn903 umfaßt (nicht eingeschlossen, die nichtwesentliche N-terminale Region); die Sequenz (PII)-E einschließlich des E.-coli-Replikationsorigins aus pBR322, um das ampr-Gen zur Selektion von Transformanten in E.-coli; und die Sequenz E-E, den Hefe-Replikationsorigin aus einem Hefe-2µ-kreisförmigen Plasmid.
Unter Bezugnahme auf Figur 2 ist der Intergrations-Plasmidvektor pRY253 von pRY252 so abgeleitet, daß die Hefe-Replikations-Originsequenz durch ein 7,0-kb-EcoRI-Fragment von S. cerevisiae, das das HO- (Homothallismus)-Gen enthält einschließlich der K-Insertionsstelle für ein gewünschtes heterologes Gen, ersetzt ist.
Unter Bezugnahme auf Figur 3a ist der Integrations-Plasmidvektor pRY255 von pRY253 so abgeleitet, daß ein 3,3-kb-SalI-XhoI-Fragment, das sich von einem Ende der HO-Insertion bis zum Beginn der CYC1-Promotorsequenz erstreckt und das URA3-Gen enthält, durch ein 6,0-kb-XhoI-SalI-Fragment, das eine Genfusion aus dem Hefe-GAL1-Gen und dem E.-coli-lacZ-Gen enthält, ersetzt wurde. Unter Bezugnahme auf Figur 3b ist pRY255A ähnlich pRY255 dahingehend, daß es auch von pRY253 abgeleitet ist, so daß das 6,0-kb-XhoI-SalI- Fragment, das die GALI-lacZ-Fusion enthält, gegen das 2,5-kb-SalI-Fragment von pRY253 substituiert ist.
Ebenfalls unter Bezugnahme auf Figur 3b wurde pDY3 von pRY255A durch Deletion der 1,8-kb-Region zwischen einer StuI-Spaltstelle und der SmaI-Spaltstelle stromaufwärts des CYC1-Promotors abgeleitet.
pRY255A und pDY3 können im wesentlichen auf gleiche Weise wie pRY255, wie nachstehend beschrieben, verwendet werden. Zusätzlich ist in pDY3 eine SstII-Spaltstelle in der Nähe des 3'-Endes von HO auf dem Vektor einzigartig, was diese zu einer zweckdienlicheren Spaltstelle der Linearisierung des Vektors macht.
Die Plasmide pRY252, pRY253, pRY255 und pRY255A wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt und besitzen jeweils die Hinterlegungsnummern ATCC 39687, 39688, 39689 und 39822.
Unter Bezugnahme auf Figur 4 enthält das Plasmid pRY257 ein Gen X für ein gewünschtes heterologes Protein, z.B. Glucoamylase oder Interferon, insertiert an der S-Stelle in dem Plasmid pRY255.

Konstruktion des Plasmids

Die in den Figuren 1 bis 3 dargestellten Plasmide wurden unter Verwendung herkömmlicher rekombinanter DNA-Verfahren und im Handel erhältlicher Materialien hergestellt.
Die Plasmide pRY253, pRY255, pRY255A und pDY3 leiten sich von dem Replikationsplasmid pRY252 ab, das kurz ausgedrückt, wie folgt konstruiert wurde.
Das URA3-Gen wurde in das Plasmid pBR322 wie erläutert insertiert, und dann wurde der Replikationsorigin aus dem endogenen kreisförmigen Hefe- 2µ-Plasmid ohne die drei Gene, die dieses normalerweise begleiten, insertiert. Der Vektor kann sich in Hefe-Wirtszellen, ohne diese drei Gene zu enthalten, replizieren, von denen zwei Proteine, die für die Replikation wesentlich sind, codieren, weil die Wirts-Hefezellen bereits das kreisförmige endogene 2µ-Plasmid, das diese Proteine codiert, enthalten (Botstein et al. (1979), Gene 8, 17).
Der CYC1-G418r-Fusionsanteil des Plasmids wurde durch Fusion der XhoI-Spaltstelle in der Nähe des 5'-Endes des G418r-Gens des Transposons Tn903 (beschrieben in Oka et al. (1981), J. Mol. Biol. 147, 217) an die BamHI-Spaltstelle nach dem CYC1-Promotor und dem 5'-Ende der CYC1-codierenden Sequenzen des Plasmids pLG669 (beschrieben in Guarente et al. (1981) PNAS USA 78, 2199), konstruiert, nachdem beide Enden mit Mungbohnen-Nuklease glattendig gemacht worden waren. Die DNA-Sequenz dieser Fusionsverbindung lautet (CYC1) ... TAAATTAATAATGACCGOGGCCG ...(G418r). Der Pfeil zeigt den Fusionspunkt an.
Die Plasmide pRY253, pRY255, pRY255A und pDY3 wurden aus pRY252 durch Erzeugen der Genfragmentsubstitutionen und -deletionen, wie in den Figuren gezeigt, konstruiert. Das Plasmid pRY257 kann durch Insertieren eines Gens X für ein gewünschtes Protein anstelle X von pRY255 innerhalb des HO- Gens konstruiert werden, so daß Anteile des HO-Gens auf beiden Seiten des Gens X, wie in Figur 4 gezeigt, vorhanden sind.

Verwendung des Plasmids

Die erfindungsgemäßen Vektoren können in jedem nützlichen Verfahren verwendet werden, in denen Wirtszellen eines industriellen Hefestammes ein Gen für ein gewünschtes heterologes Protein exprimieren. Das Gen für das gewünschte heterologe Protein kann unter Verwendung herkömmlicher rekombinanter DNA-Techniken, wie beispielsweise in Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, beschrieben, auf deren Offenbarung hiermit Bezug genommen wird, insertiert werden. pRY253, pRY255, pRY255A, pDY3 können auch verwendet werden, um Gene aus den Wildtyp-Hefestämmen zu deletieren. Zur Deletion von Genen wird der HO-Teil der Vektoren unbedeutend. Die Deletion eines Gens oder eines Genteils kann wie folgt durchgeführt werden:
1. Clonierung des zu deletierenden Gens mit einem gewissen benachbarten Sequenzteil auf beiden Seiten des Gens.
2. Schaffung einer Deletion des clonierten Gens in vitro wobei ein Teil jedes der 3'- und 5'-Enden des Gens, der für die homologe Rekombination ausreicht, aber nicht ausreicht, das normalerweise von dem Gen codierte Protein zu codieren, zurückgelassen wird.
3. Einbringen der die Deletion enthaltenden DNA in einen geeigneten Ort in einem der hier beschriebenen Integrationsvektoren.
4. Linearisieren des Vektors an einem Punkt in einer der Sequenzen neben der Deletion und Durchführen der Integrationstransformation, Selektion auf G418-Resistenz.
5. Nichtselektives Züchten eines stabilen Transformanten für 20 bis 40 Generationen und Absuchen nach Ereignissen zur Beseitigung des Vektors, entweder durch Verlust der blauen Koloniefarbe auf Xgal-Indikatorplatten oder durch Replikaplattierung auf G418-enthaltenden Platten.
6. Absuchen mittels Southern-Blotting unter den Kolonien, die den Vektor verworfen haben, nach denjenigen, die die deletierte Version des Gens beibehalten haben.
Die Vektoren sind besonders nützlich in industriellen Hefestämmen, die zur Produktion von Endprodukten, wie Wein, Brot und Bier, verwendet werden, die mit einer Kohlenhydratfermentation verbunden sind.

Transformation

Die Hefezellen wurden mit den Vektoren wie folgt transformiert.
Der Labor-Hefestamm DBY 745 (beschrieben in Guarente et al. (1981) PNAS USA 7B, 2199), ein Carlsberg -Brauereistamm (isoliert aus nichtpasteurisiertem Bier); Fleischmans -Bäckerhefe (in einem Supermarkt gekauft) und eine Bordeaux-Wein-Hefe (ATCC 42928) wurden in einem reichen Standardmedium, YEP- D, gezüchtet, mit Glusulase spheroplastiert und nach Standardverfahren der Hefetransformation, wie in Sherman et al. (1981) Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratories Press, Cold Spring Harbor, New York) beschrieben, der Plasmid-DNA exponiert. Das Integrationsplasmid pRY253 wurde durch Spaltung mit einer Restriktions-Endonuklease an einer einzigen SstII- Spaltstelle in der Nähe des 3'-Endes des HO-Gens linearisiert, und pRY255 wurde an einer einzigen KpnI-Spaltstelle in der Nähe des 5'-Endes des HO-Gens vor der Transformation linearisiert, um die Integration an dem HO-Ort zu steuern. Das Replikationsplasmid pRY252 wurde nicht linearisiert. Nach der Exposition gegenüber den Plasmiden wurden 10&sup8; Sphäroplasten in YEP-D plus 1,0 M Sorbit 30 Minuten lang bei 30ºC gezüchtet und in 6 ml warmer 3% Agarose-enthaltender YEP-D über 20 ml 2%igem Agar, YEP-D, 1,0 M Sorbit und 70 mM Kaliumphosphat, pH 7,0, plattiert. Nach 10minütigem Abkühlen auf Raumtemperatur wurden weitere 4 ml warmer 1%iger Agar, YEP-D, 1,0 M Sorbit über den spitzen Agar geschichtet. Die Zellen wurden dann 6 Generationen lang entsprechend 8 Stunden für DBY 745, 9 Stunden für Carlsberg, 7 Stunden für Weinhefe und 6 Stunden für Fleischman's-Hefe bei 30ºC wachsen gelassen. Nach dieser Periode des "Auswachsens" wurden 0,6 ml einer sterilen Lösung des Antibiotikums G418 in einer Konzentration von 25 mg/ml über die Agaroberfläche ausgebreitet und in einem sterilen Abzug trocknen gelassen. Die Platten wurden dann 2 bis 5 Tage lang bei 30ºC inkubiert, wonach Kolonien aus einem Hintergrund nichttransformierter Zellen erschienen. Mehrere dieser Kolonien wurden mit einem Zahnstocher auffrische YEP-D-Platten, die 500 µg/ml G418 enthielten, überführt. Zellen, die erfolgreich transformiert wurden, führten innerhalb von 24 Stunden zu sichtbaren Kolonien, während nichttransformierte Zellen keine ergaben. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse ist in der nachstehenden Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Anzahl der G418-resistenten Transformanten pro 10&sup8; kompetente Zellen aus 1 µg Plasmid-DNA Stamm Keine Carlsberg Weinhefe (ATCC #42928) Fleischman's a vor der Transformation linearisiert mit SstII b vor der Transformation linearisiert mit KpnI
Es wurde gezeigt, daß aus den Integrationsplasmiden pRY253 und pRY255 erhaltene Transformanten stabil integrierte Plasmide enthielten, indem isolierte Transformanten nichtselektiv für 10 bis 20 Generationen in YEP-D gezüchtet wurden und gezeigt wurde, daß die Reversion zu einer G418-Empfindlichkeit in einer Rate von weniger als 10&supmin;³ auftrat. Transformanten, die pRY255 enthielten, ergaben auf Platten, die Galactose als alleinige Kohlenstoffquelle, 70 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0, und Xgal als Indikatorfarbstoff (5'-Brom-4'-chlor-3'-indoyl-β-D-galactosid) enthielten, blaue Kolonien.

Verwerfen der Vektorsequenzen

Der Plasmidvektor pRY257 kann linearisiert werden und zur Transformation von Wirtszellen industrieller Hefestämme, wie vorstehend für die Plasmide pRYZS3 und pRYZSS beschrieben, verwendet werden. Wie vorstehend beschrieben, werden die Transformanten auf der Basis ihrer Antibiotikumresistenz (Figur 4) selektioniert.
Nach dieser Selektion kann, wie in Figur 4 gezeigt, eine weitere Stufe durchgeführt werden, um unnötige Teile des Vektors zu beseitigen, die die Stabilität des Transformanten, den Geschmack oder jede andere wichtige Eigenschaft des Endprodukts oder die Stoffwechselenergie, nachteilig beeinflussen könnten. In der Tat "hinterlegt" diese Absuchstufe das gewünschte Gen in dem Wirtschromosom, während Fremd-DNA ausgeschlossen wird. Der Ausschluß dieser Fremd-DNA erhöht die Stabilität des Transformanten durch Beseitigen von tandemartigen Repeatsequenzen, die unerwünschte Rekombinationsereignisse verursachen könnten, die beispielsweise zum Verlust des gewünschten heterologen Gens führen. Auch kann die Elimination des Gens für die Antibiotikumresistenz vorteilhaft sein, wenn aus irgendeinem Grund angenommen wird, daß die Verwendung des Antibiotikums zur Abtötung der Hefe notwendig werden könnte. Ferner könnte die Beseitigung aller von Escherichia coli abgeleiteten Sequenzen von der transformierten Hefe die Sicherheitsvorschriften der Regierung zur Verwendung des Organismus vereinfachen.
Das Absuchen hängt von der Anwesenheit eines Gens, das eine absuchbare Eigenschaft codiert, in dem Vektor ab. In pRYZS7 ist dies das E.-coli- lacZ-Gen, das β-Galactosidase codiert. Hefekolonien, die dieses Gen exprimieren, werden auf einer geeigneten Indikator-Petriplatte, die einen kolorimetrischen Farbstoff-Indikator, wie Xgal, enthält, blau. So werden zur Selektion von Transformanten, in denen ein Teil der Vektor-DNA einschließlich des lacZ-Gens verworfen wurde, auf eine Indikatorplatte plattiert, und diejenigen Kolonien, die auf der Platte weiß bleiben, werden als Transformanten oder Nachkommen von Transformanten, die das lacZ-Gen nicht beibehalten hatten, selektioniert.
Die Figur 4 erläutert den Verwerfungsmechanismus. In einigen Transformanten gibt es ein Cross-Over-Ereignis, zwischen Vektorsequenzen, die mit den Chromosomsequenzen homolog sind (siehe Figur 4d). Dieses Cross-Over-Ereignis verursacht das Ausgrenzen durch eine Schleife und die Deletion der Region des Vektors zwischen den homologen Sequenzen (siehe Figur 4e). Wenn das gewunschte heterologe Gen X (das beispielsweise Glucoamylase codiert) außerhalb dieser Region liegt, bleibt in dem Chromosom vorhanden. Die Häufigkeit dieses Ereignistyps kann relativ zu dem anderer unerwünschter Ereignisse (wie beispielsweise das Ausgrenzen des vollständigen Plasmids einschließlich des eingebrachten Gens durch Schleifenbildung) erhöht werden, indem das eingebrachte Gen mehr an das Ende der Zielsequenzen, die die Linearisierungs- Spaltstelle enthalten, als an das Ende der Zielsequenzen, die die Stelle zur Schleifenbildung zur Ausgrenzung enthalten, angeordnet wird.
Das gewünschte Ereignis zur Ausgrenzung durch Schleifenbildung kann von unerwünschten Ereignissen durch Absuchen nach weißen Kolonien, die das X- Gen beibehalten haben, unterschieden werden. Dies kann entweder durch einen funktionellen Assay auf das Produkt des Gens X (z.B. im Falle von Glucoamylase, Schattenbildung auf stärkehaltigen Platten) oder durch direkten Assay auf die Anwesenheit des Gens X durch Southern-Blotting-Techniken durchgeführt werden. Diese zwei Absuchverfahren können gleichzeitig, z.B. unter Verwendung eines Mediums, das sowohl Xgal als auch Stärke enthält, durchgeführt werden.
Weitere Ausführungsformen fallen unter die Lehre der vorliegenden Erfindung. Beispielsweise kann, obwohl die Häufigkeit, mit der Integrationsvektoren sich in das Wirtschromosom integrieren, durch Linearisieren des Vektors vor der Transformation erhöht wird, die Integration mit einer niedrigeren Frequenz durch Transformation mit den Vektoren in zirkularisierter Form erzielt werden. Obwohl das HO-Gen das am meisten bevorzugte Zielgen ist, kann jede andere Region des Wirtschromosoms, die am Stoffwechsel nicht beteiligt ist, verwendet werden.
Zusätzlich zu den Enzymen, die an der Produktion von Brot und alkoholischen Getränken beteiligt sind, können die Vektoren in Verfahren verwendet werden, in denen das gewünschte Endprodukt das Protein ist, z.B. therapeutische Proteine, wie Interferon, codiert von dem insertierten heterologen Gen. Das heterologe Gen kann auch ein Gen sein, das auf einem anderen Teil des Wirtschromosoms vorhanden ist. Beispielsweise könnte es vorteilhaft sein, eine weitere Kopie eines an der Alkoholproduktion beteiligten nativen Gens hinzuzufügen, um die Produktionshöhen zu erhöhen.
Die Promotorsequenz, die das Antibiotikum-Resistenzgen kontrolliert, kann auch in breitem Umfang variieren, wobei der einzig bedeutende Faktor ist, daß die Sequenz gewährleistet, daß eine ausreichende Expressionshöhe in Hefezellen aufrechterhalten wird.
Wenn ein Gen in dem Wirtschromosom unter Verwendung eines Vektors, der eine homologe Sequenz enthält, zielgerecht angegangen wird, kann die Linearisierung des Vektors vor der Transformation irgendwo innerhalb der homologen Sequenz eintreten. Im allgemeinen wird jedoch die Integrationseffiziens verbessert, wenn die Linearisierung in der Nähe der Mitte der Sequenz eintritt und abnimmt, sobald der Linearisierungspunkt eines der Enden der Sequenz erreicht.
Die absuchbare Eigenschaft, zusätzlich zur Fähigkeit, β-Galactosidase zu produzieren, kann jede beliebige Eigenschaft sein, deren Abwesenheit nachgewiesen werden kann. Zusätzlich darf, wenn die β-Galactosidaseproduktion verwendet wird, das Gen kein E.-coli-lacZ-Gen sein, beispielsweise das LAC4- Gen von Kluyeromyces-Spezies, z.B. K. lactis, das auch β-Galactosidase codiert, kann ebenfalls verwendet werden.

Claims

1. Hefezelle, welche durch Integration einer Vektor-DNA in eines ihrer Chromosomen transformiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß

die Hefe-Wirtszelle eine industrielle, nicht-haploide Hefezelle ist,

die Vektor-DNA ein Resistenzgen gegen ein Antibiotikum enthält, das andernfalls die Hefezelle töten kann, wobei das Gen ausgehend von einer Promotor-Sequenz transkribiert wird, die die Expression des Antibiotikum-Resistenzgens auf ein Niveau steigern kann, das der Zelle Antibiotikum-Resistenz verleiht,

die Vektor-DNA eine Sequenz umfaßt, die zu einer Sequenz des Chromosoms homolog ist und darin integriert wird, und daß die Vektor-DNA weiter ein Gen für ein gewünschtes heterologes Protein umfaßt.

2. Zelle nach Anspruch 1, worin die Vektor-DNA weiter dadurch gekennzeichnet ist, daß das Gen für ein gewünschtes heterologes Protein ausgehend von einer Promotor-Sequenz transkribiert wird, die von der Promotor-Sequenz, von der ausgehend das Antibiotikum-Resistenzgen transkribiert wird, verschieden ist.

3. Zelle nach Anspruch 2, worin die Vektor-DNA weiter dadurch gekennzeichnet ist, daß das Gen für ein gewünschtes heterologes Protein durch dessen Promotor-Sequenz stärker exprimiert wird, als das Antibiotikum-Resistenzgen durch dessen Promotor- Sequenz.

4. Zelle nach Anspruch 1, worin die Vektor-DNA weiter dadurch gekennzeichnet ist, daß die homologe Sequenz des Vektors keinen Teil der Promotor-Sequenz umfaßt.

5. Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 4, weiter dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz des Chromosoms mindestens einen Teil des Gens für Homothallismus der Hefe-Wirtszelle umfaßt.

6. Zelle nach Anspruch 1, worin die chromösomale DNA der Hefe-Wirtszelle ein Ziel enthält, das in der folgenden Reihenfolge umfaßt:

(a) ein erstes Ende des Ziels

(b) eine erste Zielsequenz, die durch das erste Ende und durch eine Stelle Lc begrenzt ist,

(c) die Stelle Lc,

(d) eine zweite Zielsequenz, die durch die Stelle Lc und eine Stelle Sc begrenzt ist,

(e) die Stelle Sc,

(f) eine dritte Zielsequenz, die durch eine Stelle Sc und durch das zweite Ende des Ziels begrenzt ist, und

(g) das zweite Ende des Ziels,

worin der Vektor weiter dadurch gekennzeichnet ist, daß er linearisiert ist und die folgenden Sequenzen enthält:

(i) eine erste Vektor-Sequenz, die zu der zweiten Zielsequenz homolog ist,

(ii) eine zweite Vektor-Sequenz, die zu der ersten Zielsequenz homolog ist,

(iii) eine dritte Vektor-Sequenz, die zu der dritten Zielsequenz homolog ist,

(iv) das Gen für ein gewünschtes heterologes Protein, und

(v) das Antibiotikum-Resistenzgen, und

daß die erste Vektor-Sequenz und die zweite Vektor-Sequenz durch einen teilweise nicht-homologen Bereich voneinander getrennt sind, der die Sequenzen (iii), (iv) und (v) enthält.

7. Zelle nach Anspruch 6, worin die Vektor-DNA weiter dadurch gekennzeichnet ist, daß sie eine Sequenz (vi), ein drittes Gen zum Screenen nach einem Merkmal enthält, und daß der teilweise nicht-homologe Bereich die Sequenzen (iii), (iv), (v) und (vi) enthält.

8. Zelle nach Anspruch 7, worin der Vektor weiter dadurch gekennzeichnet ist, daß die Sequenzen auf dem linearisierten Vektor in der Reihenfolge (i), (iv), (iii), (vi), (v), (ii) angeordnet sind.

9. Zelle nach Anspruch 7 oder 8, worin der Vektor weiter dadurch gekennzeichnet ist, daß das dritte Gen β-Galactosidase codiert.

10. Zelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Vektor weiter dadurch gekennzeichnet ist, daß das Antibiotikum- Resistenzgen ein Gen zur Resistenz gegenüber G418 enthält.

11. Industrielle, nicht-haploide Hefezelle, welche ein Chromosom beinhaltet, das eine von einem Vektor stammende DNA enthält, wobei die Zelle eine Hefe-Wirtszelle umfaßt, in deren Chromosom die von einem Vektor stammende DNA integriert wurde, oder einen Abkömmling einer derartigen Hefe-Wirtszelle, in den die von einem Vektor stammende DNA integriert wurde, wobei die von einem Vektor stammende DNA erstens ein Gen für ein gewünschtes heterologes Protein und zweitens eine DNA-Sequenz enthält, die zu einer Sequenz des Chromosoms in der Hefe-Wirtszelle homolog ist.

12. Zelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiter dadurch gekennzeichnet, daß das Gen für ein gewünschtes heterobges Protein Glucoamylase codiert.

13. Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 11, weiter dadurch gekennzeichnet, daß das Gen für ein gewünschtes heterologes Protein Malomilch-Enzym oder Malat-Permease codiert.

14. Zelle nach Anspruch 12, weiter dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor Expression von Glucoamylase in der Hefe-Wirtszelle ermöglicht.

15. Zelle nach Anspruch 12 oder 14, weiter dadurch gekennzeichnet, daß die Glucoamylase die Zelle zur Herstellung von Glucose aus Stärke befähigt.

16. Zelle nach Anspruch 15, weiter dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle an einem Verfahren beteiligt ist, in dem ein Metabolismus-Produkt der Zelle verwendet wird, wobei die Zelle in dem Verfahren die Glucose als eine Energiequelle verwendet.

17. Zelle nach Anspruch 16, weiter dadurch gekennzeichnet, daß das Metabolismus-Produkt Kohlendioxid ist und das Verfahren die Herstellung von Teig ist.

18. Zelle nach Anspruch 16, weiter dadurch gekennzeichnet, daß das Metabolismus-Produkt Ethanol ist.

19. Zelle nach Anspruch 13, weiter dadurch gekennzeichnet, daß die Vektor-DNA Expression des Malomilch-Enzyms oder der Malat- Permease in der Hefe-Wirtszelle ermöglicht.

20. Zelle nach Anspruch 13 oder 19, weiter dadurch gekennzeichnet, daß das Malomilch-Enzym oder die Malat-Permease die Zelle dazu befähigt, Apfelsäure zu metabolisieren.

21. Verfahren zum Steuern der Integration von Vektor-DNA in das Chromosom einer industriellen, nicht-haploiden Hefezelle unter Verwendung eines Klonierungs-Vektors, der die Vektor-DNA nach einem der Ansprüche 1 oder 6 bis 9 enthält, wobei das Verfahren umfaßt, den Vektor in die homologe Sequenz zu linearisieren und den linearisierten Vektor dann der Hefe-Wirtszelle unter Transformations-Bedingungen auszusetzen.

22. Verfahren zum Steuern der Integration eines linearisierten Vektors nach Anspruch 6 in die chromosomale DNA eines industriellen, nicht-haploiden Hefe-Stamms nach Anspruch 6, wobei mindestens ein Teil des teilweise nicht-homologen Bereichs von dem Vektor abgetrennt wird, wobei das Verfahren umfaßt

den linearisierten Vektor den Hefe-Wirtszellen unter Transformations-Bedingungen auszusetzen,

als Transformanten Hefezellen auszuwählen, die Resistenz gegenüber dem Antibiotikum zeigen, und

eine Untergruppe der Transformanten zu isolieren, die keine Resistenz mehr gegenüber dem Antibiotikum zeigen.

23. Verfahren zum Steuern der Integration von Vektor-DNA in die chromosomale DNA eines industriellen, nicht-haploiden Hefe- Stamms nach einem der Ansprüche 7, 8 oder 9 unter Ver.wendung eines linearisierten Vektors nach einem der Ansprüche 7, 8 bzw. 9, wobei mindestens ein Teil des teilweise nicht-homologen Bereichs von dem Vektor entfernt wurde, wobei das Verfahren umfaßt

als Transformanten Hefezellen zu isolieren, die Resistenz gegenüber dem Antibiotikum zeigen, und

eine Untergruppe der Transformanten oder Abkömmlinge der Transformanten, die das screenbare Merkmal nicht zeigen, zu isolieren.

24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Vektor nach Anspruch 10 verwendet wird, wobei die Isolierung der Untergruppe dadurch durchgeführt wird, daß die Transformanten auf einem Mediumµgezüchtet werden, das in Anwesenheit von β-Galactosidase die Farbe ändert und dann Transformanten, die diese Farbänderung nicht bewirken, ausgewählt werden.

25. Vektor pRY253 (ATCC Nr.39688).

26. Vektor pRY255 (ATCC Nr.39689).

27. Vektor pRY255A (ATCC Nr.39822).

28. Verfahren zur Entfernung eines Gens aus dem Chromosom einer industriellen, nicht-haploiden Hefezelle, welches umfaßt

Transformieren der Hefezelle mit einem Vektor, der ein Resistenzgen gegen ein Antibiotikum enthält, das andernfalls die Hefezelle abtöten kann, wobei das Gen ausgehend von einer Promotor-Sequenz transkribiert wird, die die Expression des Antibiotikum-Resistenzgens auf ein Niveau steigern kann, das der Zelle Antibiotikum-Resistenz verleiht, wobei der Vektor eine Sequenz enthält, die zu einer Sequenz des Chromosoms homolog ist, und weiter DNA enthält, die dem zu entfernenden Gen entspricht, wobei die DNA eine DNA-Sequenz umfaßt, die 3n - und 5'-Enden besitzt, die zu den 3'- und 5'-Enden des zu entfernenden Gens homolog sind und der das vollstsundige, zu entfernende Gen fehlt, und

Isolieren der Transformanten, denen das zu entfernende Gen fehlt.

29. Verwendung von Zellen nach Anspruch 11 zur Herstellung von Ethanol.

30. Verwendung von Zellen nach Anspruch 11 zum Brauen von kalorienarmen Bier.

31;. Verwendung von Zellen nach Anspruch 11 bei der Herstellung von Teig.

32. Verwendung von Zellen nach Anspruch 11 beim Backen von Brotprodukten.

33. Verwendung von Zellen nach Anspruch 11 bei der Fermentation von Wein.