JPH01153082A - 糖類の発酵速度を増大させた酵母及び該酵母の製法 - Google Patents

糖類の発酵速度を増大させた酵母及び該酵母の製法

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は糖類の発酵を改良し得る新規の酵母に関すると
共に該酵母の構成及び該改良された酵母の用途に関する
。
〔従来の技術〕
例えばサツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）
属に属する酵母菌株は嫌気性条件下に糖類を発酵（ｆｅ
ｒｍｅｎｔｉｎｇ）させてＣＯ，とエタノールとの夫々
のおよそ等モル量を産生じ得ることは公知である。
ドウにおける酵母の発酵（即ちＣＯ□生成）活性（ｌｅ
ａｖｅｎｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）は上記の糖類発酵
の結果である。製パン用酵母の商業的製造は圧搾酵母又
は新鮮酵母及び乾燥酵母を包含する。乾燥酵母は夫々水
分含有率約６〜８％及び３〜６％の活性乾燥酵母として
、及び即時用乾燥酵母として入手され得る。
酵母の作用による糖類の代謝における初期段階のひとつ
は原形質膜を横断する糖分子の移入である。各種糖類の
ための特異的担体が酵母の中で発現する。例えばマルト
ースの取込みは特異的なマルトース　パーミアーゼの存
在に依存する。該担体は最大速度（Ｖｏ＋ａｘ）と親和
常数（Ｋｍ）との差によって区別される二つの形態にお
いて存在し得る［Ａ、　Ｂｕｓｔｕｒｉａ　ａｎｄ　Ｒ
ｏＬａｇｕｎａｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ。
Ａｃｔａ　　８２０．３２４　（１９８５）　〕ｅ酵母
の原形質膜を横断するマルトースの移動は該膜中の電気
化学的陽子勾配に関連している。各ひとつのマルトース
分子の取込みにはひとつの陽子が共同的に移動する［：
ＲｏＳｅｒｒａｎｏ　、　Ｂｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ
　−８０，９７（１９７７）］。
細胞内においてマルトースは、マルターゼ（α−グルコ
シダーゼ）による触媒反応において、２個のグリコース
分子にまで加水分解される。
次いでグリコースはエムブデンーマイヤホフ（８ｍｂｄ
ｅｎ−Ｍｅｙｅｒｈｏｆ）の経路を介して二酸化炭素と
エタノールとに転化する。グリコース発酵に比してマル
トース発酵のためには２種の追加の酵素即ちマルトース
　パーミアーゼ及びマルターゼが必要である。該酵素類
の合成はマルトースによって誘導され、グリコース、フ
ラクトース又はマンノースによって抑制される。ショ糖
無添加〔“無ショ糖（ｌｅａｎ）”〕ドウにおいては酵
母に利用される最大量の糖はマルトースである。ドウに
対してショ糖を添加した場合には該二糖類は酵母による
細胞外加水分解を受けてグリコースとフラクトースとを
生ずる。次いでこれらのヘキソースは別種のパーミアー
ゼの作用により、酵母に取込まれる。
マルトース含有培地、例えばドウ、に対するショ糖添加
は酵母細胞によるマルトース代謝を阻害することが一般
的に見出されている。これはマルトース　パーミアーゼ
及びマルターゼをコードする遺伝子の転写がグリコース
によって抑制される事実にもとづ＜　（Ｒ，Ｂ、　Ｎｅ
ｅｄｌｅｍａｎ、　Ｄ、　Ｂ、にａｂａｃｋ。
Ｒｏ　＾、　ロｕｂｉｎ、　　Ｅ、　Ｌ、　Ｐｅｒｋｉ
ｎｓ、　　Ｎ、　Ｇ、　　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ。
Ｋ、＾、５ｕｔｈｅｒｌａｎｄ、　Ｄ、　Ｂ、Ｆｏｒｒ
ｅｓｔ　　ａｎｄＣ５＾、　Ｍｉｃｈｅｌｓ、　Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔ１、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ８１．２
８１１　（１９８４）］。
マルトースの取込みと加水分解とに必要な遺伝子はＭＡ
Ｌ−遺伝子座の中に集積されている（ＲｏＢ、！ｔｅｅ
ｄｌｅｍａｎ　ｅｔ　ａ１、　５ｕｐｒａ）　Ｑサツカ
ロミセスの菌株は５個以下のＭＡＬ−遺伝子座（ＭＡＬ
Ｉ　　４及びＭＡＬ６）を有するがこれらは不同であっ
て各種染色体の末端小粒のところに位置する（　Ｊ、Ｌ
、　Ｃｅ１ｅｎｚａ　ａｎｄ　Ｍ、ＣａｒｌｓｏｎＧｅ
ｎｅｔｉｃｓ１０９．６６１−６６４　（１９８５））
。
ＭＡＬ−遺伝子座は、マルトース　パーミアーゼ、マル
ターゼ及び単数並びに複数の調節用タンパク質（ＭＡＬ
レギ二レーター）をコードする遺伝子を有するが、これ
らはマルトースによる誘導を必要とする［　Ｒ，Ｂ、Ｎ
ｅｅｄｌｅｍａｎ　ｅｔ　ａ１、５ｕｐｒａ　　；Ｊ、
　Ｄ、　Ｃｏｈｅｎ、　　Ｍ、Ｊ、　Ｇｏｌｄｅｎｔｈ
ａ１、　　Ｔ、　Ｃｈｏｗ。
Ｂ、　Ｂｕｃｈｆｅｒｅｒ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｍａｒｍｕ
ｒ、　　Ｍｏ１、　　Ｇｅｎ。
Ｇｅｎｅｔ、２００．　１　　（１９８５）　　；Ｒｏ
Ａ、Ｄｕｂｉｎ。
Ｂ、Ｌ、Ｐｅｒｋｉｎｓ、　ＲｌＢ、Ｎｅｅｄｌｅｍａ
ｎ　　ａｎｄ　Ｃ１＾。
Ｍｉｃｈｅｌｓ、　Ｍｏ１、　Ｃｅ１１、　Ｂｉｏ１、
６．２７５７　（１９８６）　）。
該遺伝子類は単離されてクローニングされた〔＾、　　
０．　　Ｊ、　　　ロ、　　Ｃｏｈｅｎ　　　ｅｔ　　
ａ１、、　　　　５ｕｐｒａ　　；　　Ｒｏ　　Ｂ。
Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ　ｅｔ　ａ１、、　５ｕｐｒａ　；
　Ｈ，Ｊ、Ｆｅｄｅｒｏｆｆ。
Ｊ、Ｄ、Ｃｏｈｅｎ　、　Ｔ、　Ｒ，εｃｃｌｅｓｈａ
ｌ１、　ＲｏＢ。
Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ　　、Ｂ、　　Ａ、Ｂｕｃｈｆｅｒ
ｅｒ　、　　Ｊ、　　Ｇｉａｃａｌｏｎｅａｎｄ　Ｊｏ
Ｍａｒｍｕｒ、　　Ｊ、　　Ｂａｃｔｅｒｉｏ１、ｌ　
４９．　　ｌ　Ｑ　５４（１９ｇ２））。
既述の通り無ショ糖ドウの中での酵母発酵は主基質とし
てのマルトースに依存する。マルトースはドウ中でアミ
ラーゼの作用によってデンプンから産生されるが該アミ
ラーゼは穀粉中に通常存在している。更に穀粉は種々の
量（０〜０．５％）のグルコース、ラフィノース等のよ
うな遊離糖類を含有する（　ＨｏＳｕｏｍａｌａｉｎｅ
ｎ、　Ｊ、　Ｄｅｔｔｗｉｌｅｒ　ａｎｄε、　５ｉｎ
ｄａ、　Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、７．　１６
　　（１９７２）　）。
該糖類は酵母によって迅速に消費される。マルトース発
酵と製パン用酵母の発酵活性との間の可能性ある相関の
研究について刊行物がある。成る場合にはマルトース発
酵速度とマルターゼ活性及びマルトース　パーミアーゼ
活性との間の陽性の相関が見出された。けれどもマルタ
ーゼ活性及びマルトース　パーミアーゼ活性と無ショ糖
ドウの発酵能との間の陽性相関は観察され得なかった（
Ｐ、　Ｈａｕｔｅｒａ　ａｎｄ　Ｔ、Ｌｏｅｖｇｒｅｎ
、　Ｊ、Ｉｎ５ｔ、Ｂｒｅｗ。
８１、　３０９　　（１９７５）　　；Ｔ、　　Ｌｏｅ
ｖｇｒｅｎａｎｄＰ、　　）ｌａｕｔｅｒａ、　　εｕ
ｒ、Ｊ、＾ｐｐ１、　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１、４．　３
７（１９７７））。
マルターセ及ヒマルトース　パーミアーゼをコードする
遺伝子を有するマルチコピー（ＤＮＡ多配列）のプラス
ミドを有する酵母細胞の形質転換はマルターゼの特異的
活性を４倍に増加させたけれどもマルトース　パーミア
ーゼ活性は増大されなかった。調節用タンパク質をコー
ドする追加の遺伝子の導入はマルターゼの特異的活性を
中等度に増加させたけれども、この場合にも又、マルト
ース　パーミアーゼ活性については何の効果も観察され
なかった（Ｊ、　Ｄ、　Ｃｏｈｅｎ　ｅｔ　ａ１、、　
５ｕｐｒａ）。
上記の研究者達は、得られた形質転換体について二酸化
炭素又はエタノール産生に関する試験を行なわなかった
。従来技術に右いて該試験の遂行を断念した理由はマル
トース　パーミアーゼ活性及びマルターゼ活性と無ショ
糖ドウの二酸化炭素産生（発酵活性）との間に相関が無
いということが繰返し示された点にあったことは事実で
ある〔Ｈｏ　Ｓｕｏｍａｌａｉｎｅｎ、　　Ｊ、　　ロ
ｅｔｔｗｉｌｅｒ　　ａｎｄ　　ε、　　５ｉｎｄａ。
５ｕｐｒａ　；　ＨｌＳｕｏｍａｌａｉｎｅｎ　、　　
Ｂｕｒ、　　Ｊ、　　＾ｐｐ１゜Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１、
　１．　１　　（１９７５）　　；　　Ｐ、　　Ｈａｕ
ｔｅｒａａｎｄ　　Ｔ、Ｌｏｅｖｇｒｅｎ　、　　５ｕ
ｐｒａ　；　Ｔ、　　Ｌｏｅｖｇｒｅｎ　　ａｎｄＰ、
Ｈａｕｔｅｒａ、５ｕｐｒａ）。
〔発明の開示〕
今や本発明において、統合されたく組込まれた）プラス
ミドによって形質転換された酵母は、形質転換されない
菌株に比し、マルトース　パーミアーゼ活性及びマルタ
ーゼ活性について増大されたレベルを示すことが見出さ
れたがこれらに関する諸例は後文に記載される。該増大
されたマルターゼ活性及びマルトース　パーミアーゼ活
性はドウの００２生成即ち発酵活性の増加と一致するこ
とは驚異に値するし、これはエピソーム　ベクター（ｅ
ｐｉｓｏｍａｌ　ｖｅｃｔｏｒｓ）を用いて形質転換さ
れた酵母の場合に観察されたことでもある。
該改良された酵母は、糖類例えばマルトースを炭素及び
エネルギー源として含有する培地中で例えば高度の二酸
化炭素及びエタノール産生を達成する高速度の代謝作用
を示す。本発明方法は紐換えＤＮＡ技法の適用を包含す
るがそれによれば、該酵母のマルトース発酵速度は、他
の糖類例えばグリコースの存在とは無関係に、激裂に増
加する。
更に該改良された酵母菌株はドウ（練り粉）の中で優秀
なドウ発酵活性（ガス生成）を示す。同様に該酵母の高
速度のエタノール産生は回数性及び工業的のアルコール
製造に使用される酵母の発酵時間を減する。即ち一定時
間内のより大量のアルコール製造を達成するのである。
更に、マルトース（の集積）が糖又はデンプン転化酵素
を阻害する場合には該発酵工程においてマルトースの迅
速な除去が有利である。本発明方法の適用により、マル
ターゼ及び（又は）マルトース　パーミアーゼをコード
する余分の遺伝子（単数又は複数）を導入された酵母を
製造し得る。
本発明は形質転換酵母を提供すると共に糖類の発酵速度
について改良された該酵母の製造方法を提供するが該方
法は少なくともひとつの、好ましくは同種起源のＤＮＡ
構成体を酵母の中へ導入すること、該ＤＮＡ構成体は、
移入された基質の取込み及び（又は）初期の代謝的転化
を促進するタンパク質をコードする少なくともひとつの
遺伝子を該酵母の中に有すること、該遺伝子は該酵母の
中で発現し得ることを特徴とする。糖の発酵速度をドウ
発酵の数組を通じて改良し得るものであり、例えばマル
トース又はショ糖の発酵速度を増大し得る。
同種起源ＤＮＡという用語は同じ酵母の属から由来する
ＤＮＡを意味する。例えばサツカロミセス属菌はサツカ
ロミセス属から由来するＤＮＡを用いて形質転換される
。かようにして遺伝子に以前は存在しなかった新性質を
導入することなく、酵母の遺伝子の既存の諸性質を改良
し得るのである。ショ糖の発酵速度の改良は好気的及び
（又は）嫌気的な条件下で達成される。目的の遺伝子は
パーミアーゼ、特にマルトース　パーミアーゼ、サラカ
リダーゼ、特にマルターゼ、キナーゼ、特にヘキソキナ
ーゼ及びグルコキナーゼ及び類似酵素の遺伝子を包含す
る。本発明は例えばグルコース又はフラクトースの取込
みに必要な担体タンパク質に適用され、及びヘキソース
からヘキソースリン酸エステルへの初期の細胞間代謝的
転化を触媒するヘキソキナーゼ及びグルコキナーゼに適
用される。
本発明は又少なくともひとつの同種起源ＤＮＡ構成体を
酵母の中へ導入する効率のよい方法をも提供する。
本発明はマルトースの取込み及びマルトースからグルコ
ースへの初期の代謝的転化を促進するタンパク質をコー
ドする少なくともひとつの遺伝子を有する構成体へ適用
されることが有利である。
かようにしてもとの（宿主の）菌株と比較していくつも
の利点を有する酵母を製造し得る。該改良された酵母の
有利性は改良されたエタノール及びＣＣ）ａ製造法にお
いて特別顕著にみとめられる。
例えば本発明を製パン用酵母に適用した場合に製パン業
者に莫大な利益をもたらすがその理由は無ショ糖ドウの
膨起のために所要時間と所要酵母とを減する点にあり、
それは新規酵母菌株のドウ発酵活性が改良されたからで
ある。
本発明に従う形質転換酵母は、ＤＮＡ仲介による形質転
換ではない菌株改良技法例えば原形質体融合、集団交配
及び集団突然変異の諸技法、において出発原料菌株とし
て使用され得ることが認識されよう。その結果得られた
菌株は本発明の一部であると考えられる。
本発明の好適態様に従えば新規酵母菌株はグルコース存
在下においても実質量のマルトースを消費する。従って
甘味ドウ製造のためのショ糖の添加必要量を減するから
製パン業者はショ糖経費を節約し得る。
耐浸透圧性の酵母は無ショ糖ドウにおいて貧しい能力（
貧しいドウ発酵活性）を示すことが公知である。耐浸透
圧性酵母という用語は甘味性ドウにおける良好な能力を
有する酵母を意味する。甘味性ベーカリ−製品のための
ドウは例えば１０〜３０％（穀粉重量基準）のショ糖を
含む。従って本発明に従って形質転換されるべき宿主と
して耐浸透圧性菌株を選択した場合には、甘味性ドウに
適用されるのみならず無ショ糖ドウにも又適用される耐
浸透圧性酵母を得る。これはマルトース発酵能が本発明
によって改良されたことに基づくのである。かようにし
て製パン業者は甘味性ドウと無ショ糖ドウとの双方のた
めに唯ひとつのタイプの酵母を要する便利さを得るので
ある。
無ショ糖ドウと甘味性ドウとの双方において良好な能力
をもつ酵母菌株の必要性は例えば欧州特許出願Ｅ　Ｐ　
−Ａ−１２８５２４及びドイツ特許出願ＤＥ−Ａ−２７
５７７７８号明細書に記載されている。ショ糖富化及び
無ショ糖のドウにおける良好な能力をもつ酵母の取得の
ために欧州出願ＥＰ−Ａ−１２８５２５号明細書は原形
質体融合法を記載している：上記Ｄ　Ｅ　−Ａ−２７５
７７７８号明細書は該酵母菌株取得のために交雑法又は
突然変異法によって製造された二倍体の固体群からの菌
株選択法を記載している。該両枝法は莫大な数の実験を
要すると共に実験結果は予測不可能であり、再現不可能
である。本発明方法の使用により形質転換酵母菌株の使
用にもとづく制御された、再現可能な成績を得ることか
できる。本発明に従って製造された菌株の試験は最少数
に止まるがその理由は菌株自体の諸性質が、開示された
改良性質に関すること以外には、実質上変更されていな
い点にある。
本発明は圧搾酵母を提供するが該圧搾酵母はテストＢに
おいて１６５分間に酵母の乾物重量２８５ｍｇ当り少な
くとも３４０ｍｌ！のガス生成を示し、テストＢ′にお
いて酵母の乾物重量２８５ｍｇ当り少なくとも１７０ｍ
ｌのガス生成を示す。テストＢ及びＢ′については下文
において記載される。
好ましくは圧搾酵母はテストＢにおいて１６５分間に酵
母の乾物重量２８５ｍｇ当り３８０〜４５〇−のガス生
成を示し、テストＢ′において酵母の乾物重量２８５ｍ
ｇ当り１８０〜２４０ｒｎＩ！のガス生成を夫々示し、
更に好ましくはテスト已において酵母の乾物重量２８５
ｍｇ当り少なくとも４００ｍｌ、テストＢ’において酵
母の乾物重量２８５ｍｇ当り少なくとも１９０ｍｌ！の
ガス生成を夫々示す。有利なのはこの圧搾酵母から即時
用乾燥又は活性乾燥酵母を製造することである。圧搾酵
母の乾燥中に、乾物重量基準で一般に１５〜２５％のド
ウ発酵活性が失なわれる。本発明は又乾燥酵母（水分３
〜８重量％）を提供するが該乾燥酵母はテストＣにおい
て１６５分間に酵母の乾物重量２８５ｍｇ当り３１０〜
３６０ｍｊ？のガス生成、テストＣ′において酵母の乾
物重量２８５ｍｇ当り１４５〜１９５ｍｌ、及び好まし
くはテストＣにおいて酵母の乾物重量２８５ｍｇ当り少
なくとも３３０ｍｌ、テストＣ′において酵母の乾物重
量２８５　ｍｇ当り少なくとも１５５ｍｌのガス生成を
夫々示す。本発明に従って製造された酵母を用いて得ら
れるガス値は、たとえテストＣ及びＣ′において市販酵
母菌株がテストされたとしても、決して見出されなかっ
たガス値である。本発明は又０〜６或いは０〜１０％の
ショ糖含有ドウについてドウ発酵活性において良好な性
能を示す酵母として適用され得る。かようにして圧搾酵
母の製造が可能であり、該圧搾酵母はテスト已において
１６５分間に酵母乾物重量２８５ｍｇ当り４００〜５０
０ｍｌのガス生成を示し、好ましくは該圧搾酵母は酵母
乾物重量２８５ｍｇ当り少なくとも４４０ｒｎｌのガス
生成を示すものである。次いで乾燥酵母を得ることがで
きるが該乾燥酵母はテストＣにおいて１６５分間に酵母
の乾物重量２８５ｍｇ当り３２０〜４００ｒｎｌのガス
生成を示し、好ましくは該乾燥酵母は酵母の乾物重量２
８５ｍｇ当り少なくとも３５０−のガス生成を示す。
回数性及び工業用アルコールの製造のための発酵におい
て上記の新規酵母菌株は同様の利益を達成することが見
出されている。
マルトースが基質として用いられる場合に本発明の新規
酵母菌株の代謝速度は一般的に増大するので、代謝産物
例えばグリセロール及び芳香含有化合物の一般的産生速
度も又増加する。
本発明の一態様において、マルトース発酵に含まれる単
数又は複数のタンパク質をコードするＤＮＡ構成体を有
するベクターが提供される。本発明は又宿主微生物、好
ましくは酵母、例えば本発明によって開示されたベクタ
ーを用いて形質転換されたサツカロミセス属の種を提供
する。これらのベクターは自己複製性であり得るし、有
利にはマルトース　パーミアーゼ、マルターゼ及びマル
トース制御タンパク質をコードする遺伝子群からえらば
れた遺伝子又は遺伝子群の組合せを有し得るものである
。驚くべきことに、上記のベクターを用いて形質転換さ
れた酵母は増大された速度のマルトース発酵を示し、そ
の結果ドウにおける増加された速度の００２産生をもた
らす。これらの追加の遺伝子（複数）はエピソームに座
位をもつが、文献公知の通り該染色体外の分子は非選択
的繁殖（即ちこの特別な場合においてはＧ４１８の不在
下の生育）の過程で容易に失なわれることが公知である
［Ｃ０Ｄ、Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ　（１９８２）Ｇｅｎ
ｅ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　１　２　、　　ロｒｇａｎｉｓ
ｍｓ　　ｏｔｈｅｒ　　ｔｈａｎ　　　ε。
ｃｏｌｉ、　Ｅｄｓ、Ｐ、　Ｈ，Ｈｏｆｓｃｈｎｅｉｄ
ｅｒ、　Ｗ、Ｇｏｅｂｅｌ。
Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ、　ｌ　ｌ　９　；　
Ｓ、＾、　Ｐａｒｅｎｔ、　Ｃ，Ｍ。
Ｆｅｎｉｍｏｎｅ、　ａｎｄ　Ｋ、　Ａ、　Ｂｏｓｔｉ
ａｎ　　（１９３５）　。
Ｙｅａｓｔ　　１．　８３）。実際的見地からは酵母を
非選択的に培養することが好適であり、従って好ましく
は“交替処理又は変性された（ａｌｔｅｒｅｄ）マルタ
ーゼ遺伝子及び（又は）マルトース　ノく−ミアーゼ遺
伝子”を有するひとつのセットの“統合されたプラスミ
ド”を構成させることが有利である。
なお“交替処理又は変性された”という用語（よ、他の
プロモーター好ましくは同種起源のプロモーターによる
天然プロモーターの交換（ｅｘｃｈａｎｇｅ）全意味ス
ル。選択的加圧（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｐｒｅｓｓｕｒ
ｅ）を行なわない時のプラスミドの安定な増殖を許すよ
うにプロセスを進行させる場合には、新規導入のＤＮＡ
の統合は、安定な形質転換体の製造のために、前もって
必要ではない。
ひとつの細胞が分子数２０〜１０００余分のプラスミド
を含有することは文献公知である（Ｃ０Ｄ、Ｈｏｌｌｅ
ｎｂｅｒｇ　（１９８２）　、　５ｕｐｒａ　：＾、Ｔ
ａｋａｇｉ　、　Ｅ、Ｎ、Ｃｈｕｎ　、　Ｃ１Ｂｏｏｒ
ｃｈｉｒｄ　。
Ｓ、　Ｈａｒａｓｈｉｍａ　ａｎｄ　Ｙ、　Ｏｓｈｉｍ
ａ　、　Ａｐｐ１、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１、　　２３．　１２３　；　　Ｊ
、　　Ｍｅｌｌｏｒ　。
Ｍ、Ｊ、　Ｄｏｂｓｏｎ　、　Ｎ、　　Ａ、Ｒｏｂｅｒ
ｔｓ　、　　Ｎ、Ｊ。
Ｋｉｎｇｓｍａｎ　　ａｎｄ　　Ｓ、　　Ｍ、　　Ｋｉ
ｎｇｓｍａｎ　　（１９８５）Ｇｅｎｅ　　３３．２１
５］。
エビソーム遺伝子の発現レベルはもとのプロモーターを
強力なプロモーターで交換することによって更に増加さ
せ得る。選択的加圧を行なわない場合のプラスミドの安
定な複製を可能とすることが更に好ましいように思われ
る。
マルターゼ遺伝子及び（又は）マルトース　パーミアー
ゼ遺伝子は、本発明に従い、直線型プラスミドの使用下
の形質転換を介して酵母の染色体の中へ有利に統合され
（組込まれ）る〔参照文献：Ｔ、　Ｌ、０ｒｒ−Ｗｅａ
ｖｅｒ　、Ｊ、Ｗ、５ｚｏｓｔａｋ、ＲｏＲｏｔｈｓｔ
ｅｉｎ（１９８１）　　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１、＾ｃａｄ
、　Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ。
７８、６３５４）　］。得られた酵母は安定な形質転換
体であり、即ち選択的加圧を行なわすとも交替処理され
たマルターゼ遺伝子及び（又は）マルトース　パーミア
ーゼ遺伝子はゲノム内に保有される。
統合の際に、プラスミド上に位置するひとつ又は僅かな
コピー数の遺伝子は染色体へ統合されることは公知であ
る。従ってエビソームのベクターの使用時に得られる改
良と同様な改良をＣＯ□生成について得るために、グル
コースによる抑制に対して不感受性である強力な構成性
をもつプロモーターの適用によって、遺伝子発現レベル
を交替させることが有利である。該プロモーターが好適
である理由は、エピソーム　ベクターによって転換され
た酵母と統合性ベクターによって転換された酵母との間
における遺伝子コピー数の差を補償するための、及びグ
ルコース−抑制の影響を阻止するためである。例えば、
比較的低濃度のグルコースと炭素及びエネルギーの主給
源としてマルトースとを含有する培地の中で最初の３０
〜４０分間の発酵を行なわせると、マルトース　パーミ
アーゼとマルターゼとのｍＲＮＡレベルは判然と検出し
得る程度に降下する。グルコースが消費されるとマルト
ースによる遺伝子発現の誘導は双方のｍＲＮＡレベルを
急速に増加させる。
既述の通り、遺伝子は該遺伝子の天然型即ち野生型のプ
ロモーターと共に使用され得るか又はプロモーターは異
種のプロモーター、好ましくは同種起源のプロモーター
によって置換され得る。特に野性型プロモーターが制御
可能又は誘導可能である場合には、それを構成的転写の
ため、又はより強力な、或はより弱力なプロモーターと
して、提供することが望ましい。それとは逆に、野生型
プロモーターが構成可能である場合にはそれを制御可能
又は誘導可能なプロモーターとして、或いはより強力も
しくはより弱力なプロモーターとして提供することが有
利である。
望ましくは、宿主内の構成体のコピー数が比較的に少な
い場合には強力プロモーターを使用する。
強力プロモーターは、酵母の活性サイクルにおいて高量
に産生されるタンパク質製造の際に通常含まれるもので
あるか又は制御可能の場合には、酵母の生活サイクルに
おける成る時期に、本発明に関連するものである。
酵母の解糖回路に関係するプロモーターは特に興味ある
ものであり、これはアルコール　デヒドロゲナーゼＩ及
び■、ホスフォグルコイソメラーゼ、グルコース−６−
ホスフェート　デヒドロゲナーゼ、トリオース　ホスフ
ェート　イソメラーゼ、グリセルアルデヒド　ホスフェ
ート　デヒドロゲナーゼ、ホスフォグリセレート　キナ
ーゼ、エノラーゼ、ホスフオグリセ口ミ二ターゼ、ピル
ベート　キナーゼ及びラクテート　デヒドロゲナーゼを
包含する。高１の産生されるタンパク質と共に含まれる
その他のプロモーターはリポソーム発現に関係するプロ
モーター、例えば開始因子、延長因子及び類似因子の転
写用のプロモーターを包含する。特殊の延長因子はＥＦ
−１及びＥＦ−２、及びその他を包含する。
特に興味あることは、マルトース代謝に含まれる構造遺
伝子と組合されるプロモーター、特にマルターゼ、マル
トース　パーミアーゼ及びＭＡＬ−レギュレーターの使
用である。これらのプロモーターは、該プロモーターが
糖の発酵時に誘導されるものである限り、構成可能であ
るか又は制御可能である。例えば解糖プロモーターの多
くのものは糖又は糖代謝物例えばエタノールの存在下に
活性化される。従ってプロモーター例えばアルコール　
デヒドロゲナーゼは穀粉使用のドウ発酵の際に活性であ
る。同様に細胞増殖に関係するプロモーターはドウ発酵
時にも活性である。更にＭＡＬレギュレーターによって
制御されないプロモーターの提供にもとづき、グルコー
ス存在下においても抑制を受けることなく酵母を使用し
得る。
のみならず、遺伝子は誘導のためのマルトースを必要と
しない。
上記の構造遺伝子と組合されて野生型プロモーターが使
用される場合には調節用タンパク質の増産が望ましい。
かようにして調節用タンパク質は誘導物質存在時に高い
レベルに維持される。例えばマルトース存在下にＭＡＬ
調節用タンパク質は高レベルに発現され、かようにして
該タンパク質は“マルトース代謝に関係する他のタンパ
ク質”及び“ＭＡＬ調節用タンパク質によって制御され
る他のタンパク質”の発現のために提供される。
遺伝子発現における交替処理は、後文中の実験操作に詳
記されるように、宿主酵母例えばサブ力ロミセス属酵母
から好適に誘導されるアルコールデヒドロゲナーゼＩ　
　（ＡＤＨり及び翻訳延長因子ＥＦＩαＡの交替処理の
ために、もとのプロモーター　プラス（一部分）未翻訳
先導配列の交換を包含する。その結果、発現はグルコー
ス抑制に対して不感受性となり、誘導についてマルトー
スに無関係となる。
これらの統合されたプラスミドによって形質転換された
酵母は形質転換されない菌株に比してマルトース　パー
ミアーゼ活性及びマルターゼ活性のレベルを増大するこ
とが見出された。該増大されたマルターゼ活性及びマル
トース　パーミアーゼ活性は、エピソーム　ベクターの
使用によって転換された酵母の場合にも観察されたよう
に、ＣＯ２生成又はドウ発酵作用の増大と一致するので
あり、これは驚きに値する。
ドウ発酵活性における改良の成果は、昇温例えば２０〜
２５℃の温度にふける貯蔵の際にさえも保持される。貯
蔵時に右けるドウ発酵活性の相対的損失は親酵母菌株と
本発明の酵母菌株とについて実質上同じである。ショ糖
高度含有ドウのドウ発酵活性は“導入された改良”によ
って影響されないがその理由は、統合されたプラスミド
使用下に形質転換された新規菌株のドウ発酵活性は宿主
菌株を用いて得られる該活性と同じく良好であるからで
ある。
本発明で使用される酵母宿主は少なくともひとつのコピ
ーの構成体を有し、二つ又はそれ以上、通常は約２００
以下のコピーに拡大されるが、これは遺伝子がゲノムの
中に統合されているか、又は多配列のコピー数を有する
染色体外の要素上に存在するかどうかに依存する。統合
か又は非統合かについては、調製された染色体外要素の
保持に必要な安定性、所望のコピー数、コピー数に対応
する可能な転写のレベル及び類似条件に依存して選択さ
れる。
本発明の構成体は、同じか又は異なるプロモーター（複
数）を有する単数又は複数の構造遺伝子を有し得る。該
構成体は常法によって製造され得るものであり、適当な
宿主からの所望の遺伝子の単離により、遺伝子の全部又
は一部分の合成により、又はそれら技法の組合せにより
製造され得る。
同様に、調節用シグナル、転写用及び翻訳用の開始域及
び終了域は天然源から単離され、又は合成され、或いは
該技法の組合せによって調製される。
各種の断片はエンドヌクレアーゼによる切断（制限）、
連結、配列形成、インビトロでの突然変異誘発、プライ
マーの補修又は類似技法に付され得る。該各種の技法は
文献周知であって特異な目的達成に使用されよう。
各種の断片を慣用法によって結合させ、クローニングさ
せ、単離し及び配列化する。夫々の技法の適用後に、Ｄ
ＮＡ断片（フラグメント）又は断片の組合せをクローン
形成用ベクターの中へ挿入し、このベクター使用によっ
てクローニング用宿主例えば大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）
を形質転換させ、クローニング用宿主を成育させ、溶菌
化し、プラスミドを単離し、断片を制限分析によって分
析し、配列化し、組合せ、又は類似操作を施す。
構成体の拡大及び宿主細胞の形質転換の過程にふいて各
種ベクターを使用し得る。これらのベクターはクローン
形成用ベクター、発現用ベクター及び宿主の中への統合
用ベクター又は形質転換と統合とのための裸の（ｂａｒ
ｅ）　Ｄ　Ｎ　Ａの使用におけるベクターを包含する。
クローニング形成用ベクターは、その大部分について、
クローニング用宿主内で機能する複製起点、クローン形
成用ベクターを有する宿主の選択のためのマーカーを有
することによって特徴づけられ、該クローン形成用ベク
ターは単数又は複数のポリリンカー、又は挿入、選択、
処置、配列の容易化、切除又は類似操作のための追加の
配列を有し得る。更にシャトルベクターをも使用してよ
く、該シャトルベクターは２個又はそれ以上の複製開始
点を有してよく、かようにして該ベクターはひとつ以上
の宿主、例えば原核性宿主及び真核性宿主、の中で複製
され得る。
発現ベクターは、通常の場合に、転写及び翻訳の開始域
と終了域とを含む構成体の挿入のためのものであり、又
は該構成体は該調節域の一方又は双方を欠失しており、
該調節域はタンパク質産生物をコードする配列の挿入に
関する発現ベクターによって提供される。かようにして
構成体は、転写機能性域と翻訳域とを有する遺伝子の中
へ挿入され、この場合に挿入は５′−末端の近傍で行な
われ、或いは現存する遺伝子と構成体とは現存する調節
域の調節制御の下にある。通常は、溶融産生物が受容可
能である場合を除き、開始コドンは現存する開始コドン
の５′であることが望ましく、又は該開始コドンは現存
開始コドンを有する相の外にあることが望ましい。他の
例において、単数又は複数の制限サイトを有する発現ベ
クターは開始調節域と終了調節域との中間に存在し、か
ようにして構造遺伝子は制限サイト（単数又は複数）の
所で挿入され、及び該構造遺伝子は上記の域（複数）の
調節制御の下にあり得る。本発明にとって特に有利であ
るのは、染色体外の安定保持のためか又は統合のために
、発現用ベクターとして宿主内で安定形を有する構成体
及びベクターは異種起源（非サツカロミセス属）のＤＮ
Ａを有していないことである。
本発明の更に他の態様に従えば、本発明において既述す
る利益のすべてをもたらすのみならず原抜性ＤＮＡ配列
を除去した酵母を製造する諸方法を提供する。これは遺
伝子置換技法（Ｒ，Ｊ。
Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ　　（１９８３）　Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。
１（１１．２０２）によって遂行された。本発明に従っ
て該技法はサツカロミセス属細胞群に対して有利に適用
されている。例えば交替処理されたマルターゼ及び（又
は）マルトース　パーミアーゼをコードする遺伝子を有
するベクターを用いてサツカロミセス属細胞群を形質転
換させた結果、サツカロミセス属の胞子形成−特異的遺
伝子［Ｅ。
Ｇｏｔｔｌｉｎ　　−Ｎｉｎｇａ　　、　　ロ、　　　
Ｂ、　　　Ｋａｂａｃｋ　　（１９６８）Ｍｏ１、　Ｃ
ｅ１１．Ｂｉｏ１、　６．２１８５］の中に座位が定め
られた。このＤＮＡをサツカロミセス属の宿主細胞の中
へ導入した後に、該染色体上の胞子形成−特異的遺伝子
を用いて、新規に導入されたＤＮＡの相同的組換えを起
させた。結果として、交替処理されたマルターゼ遺伝子
及び（又は）マルトースパーミアーゼ遺伝子は胞子形成
−特異的配列（複数）の中間に包埋され、該マルターゼ
遺伝子及び（又は）マルトース　パーミアーゼ遺伝子は
染色体の中へ統合されたのである。生成された形質転換
体は原核型性ＤＮＡを全く欠失していた。
もしもマルターゼ活性とマルトース　パーミアーゼ活性
との最適比率が決定されているならば更に良好な成績が
得られるかもしれないことが理解されよう。このことは
双方の遺伝子のプロモーターを変えることにより、又は
種々の数のく交替処理された）マルターゼ遺伝子及びマ
ルトース　パーミアーゼ遺伝子を酵母のゲノムの中へ統
合させることにより、例えば、後文中に記載される方法
に従って数個の統合座位を用いることにより、遂行され
た。マルターゼ活性とマルトース　パーミアーゼ活性と
の最適比率の決定は、マルターゼ及びマルトース　パー
ミアーゼの他のアイソザイムをコードするマルターゼ遺
伝子又はマルトースパーミアーゼ遺伝子を使用すること
によっても又遂行され得る。更に少なくともマルターゼ
活性又はマルトース　パーミアーゼ活性を有するいかな
る酵素をも使用し得る。更に、同様な方法（例１をも参
照のこと）により、ＭＡＬ−調節用タンパク質をゲノム
の中へ統合させ得るが、これはそれ自体の天然のプロモ
ーターの制御下で、或いは他のプロモーター、好ましく
はサツカロミセスのプロモーターの制御下で行なわれる
。これはマルターゼ活性とマルトース　パーミアーゼ活
性との最適比率を決定するためにも又有用である。
以下に、寄託された本発明による菌株を表示する。
下記の諸菌株はオランダ国、バルンの中央寄託所（Ｃｅ
ｎｔｒａｌ　Ｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅ
ｌｃｕｌｔｕｒｅｓ。
Ｂａａｒｎ　、　）ｌａｌｌａｎｄ　）　ヘ寄託されて
いる：サツカロミセス　セレビシェ２３７Ｎｇ　（菌株
Ａ）は受託番号１５８．８６の下に１９８６年３月２５
日にＣＢＳへ寄託された； サツカロミセス　セレピシより　Ｓ　１５５４３　　（
菌株Ｃ）は受託番号４０６．８７の下に１９８７年９月
３日にＣＢＳへ寄託された； エシェリキア　コリ宿主用プラスミドｐ２１−４０は受
託番号４００．８７の下に１９８７年８月２８日にＣＢ
Ｓへ寄託された； エシェリキア　コリ宿主用プラスミドｐＹＥＦ４６は受
託番号４（１１．８７の下に１９８７年８月２８日にＣ
ＢＳへ寄託された； エシェリキア　コリ宿主用プラスミドｐＹ６は受託番号
４０２．８７の下に１９８７年８月２８日にＣＢＳへ寄
託された； エシェリキア　コリ宿主用プラスミドｐｅＧ４１８は受
託番号１６０．８６の下に１９８６年３月２５日にＣＢ
Ｓへ寄託された； エシェリキア　コリ宿主用プラスミドｐＴＺ１９Ｒは受
託番号４０５．８７の下に１９８７年９月３日にＣＢＳ
へ寄託された； エシェリキア　コリ宿主用プラスミドｐＴｚ１９Ｒ／Ａ
ＤＨＩは受託番号４０４．８７の下に１９８７年９月３
日にＣＢＳへ寄託された；エシェリキア　コリ宿主用プ
ラスミドｐ１５３−２１５ＡＫは受託番号４０３．８７
の下に１９８７年９月３日にＣＢＳへ寄託された；エシ
ェリキア　コリ宿主用プラスミドｐＬＦ２４は受託番号
１５６．８８の下に１９８８年３月８日にＣＢＳへ寄託
された； エシェリキア　コリ宿主用プラスミドｐＵＴ３３２は受
託番号１５８．８８の下に１９８８年３月８日にＣＢＳ
へ寄託された； エシェリキア　コリ宿主用プラスミドｐＴＺ１８Ｒは受
託番号４８０．８８の下に１９８８年７月２７日にＣＢ
Ｓへ寄託された； 実施例 以下の実験データは本発明の例証のために与えられた。
これらの方法に熟達している当業界の技術者は本発明の
目的達成のために他の酵母菌株及びベクターも均等に使
用され得ることを理解すべきである。該交替処理は本発
明の範囲内に包含される。
クローニング技法 一般的なりローニング技法についてはマニアチス等のハ
ンドブック（Ｔ９Ｍａｎｉａｔｉｓ　、　Ｅ、Ｆ。
Ｆｒ１ｔｓｃｈ　、　Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　　（１９
８２）　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　、　Ａ　
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ〕を参照された
い。制限酵素としては製造業者による推奨品を使用した
がそれらはバイオラプスＣＮｅｗ　ＢｎｇｌａｎｄＢｉ
ｏｌａｂｓ　　（Ｂｉｏｌａｂｓ）］　、ＢＲＬ　（Ｂ
ｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ　　（Ｂ　ＲＬ　）　］又はベリンゲル（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ））から入手される。一般には１μｇのＤＮＡ
の開裂に１〜５単位の酵素を要する。
Ｅ、コリの形質転換はＣａＣｌ　２技法（ＴｌＭａｎｉ
ａｔｉｓ　ｅｔ　ａ１、、　５ｕｐｒａ　）を用いて遂
行された。
組換え体プラスミドの構成 （１）　　ｐＧｂ−ｅＭＡＬ６ｇ このプラスミドは酵母中で自己複製が可能であってマル
トース　パーミアーゼとマルターゼとをコードする遺伝
子を有する。その構成を第１図に略解した。
ｐｅＧ４１８はｐＥＭＢＬＹｅ２３ ［：Ｂａ１ｄａｒｉ　ａｎｄ　Ｇ、　Ｃａ５ａｒｉｎｉ
　　（１９３５）　Ｇｅｎｅ３５．２７］から誘導され
、Ｓａｌ　　ＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトとの間に
Ｔｎ５遺伝子（Ｒｅｉｓｓ　ｅｔａ１、、εＭＢＯＪ、
（１９８４）３．３３１７１を持つ断片を有し、酵母か
らのプロモーター　アルコール　デヒドロゲナーゼＩ　
　（ＡＤＨＩ）の指令の下に０４１８に対する抵抗性を
与えるがこれはベネツエン等（Ｊ、　Ｃ，Ｂｅｎｎｅｔ
ｚｅｎ　ａｎｄＢ、Ｄ、Ｈａｌｌ　（１９８２）　Ｊ、
　Ｂｉｏ１、　　Ｃｈｅｍ。
２５７．３（１１８）による記載と類似している。
ｐｅＧ４１８は旧ｎｄＩＩＩを用いて開裂され、ＣＩＰ
を用いて脱リン酸基処理され、 ｐＹ６ｘ旧ｎｄＩＩＩＸＰｖｕ　　Ｉの切断物へ連結さ
れた。
ｐＹ６は文献に記載（Ｒ，Ｂ、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ　　
ａｎｄＣ，Ｍｉｃｈｅｌｓ　（１９８３）　Ｍｏ１、　
Ｃｅ１１．Ｂｉｏ１、　３゜７９６　；　Ｒ，Ｂ、Ｎｅ
ｅｄｌｅｍａｎ、　Ｄ、　Ｂ、Ｋａｂａｃｋ。
Ｒ，Ａ、Ｄｕｂｉｎ、　Ｓ、　　Ｌ、Ｐｅｒｋｉｎｓ、
　　Ｎ、　Ｇ。
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　、に、Ａ、　５ｕｔｈｅｒｌａｎ
ｄ　、Ｄ、　Ｂ、Ｆｏｒｒｅｓｔ。
Ｃ１Ｍ１ｃｈｅｌｓ　（１９８４）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
１、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、　　Ｕ、Ｓ、Ａ、８１．２８１１１され、ＭＡ
Ｌ６ｇ座位を含む７．０にｂ　　）ＩｉｎｄｎＩ断片を
有する。これはｐＧｂ−ｅＭＡＬ６ｇを生成した。
（２）　　ｐＧｂ−ｅＭＡＬ６１ この２μ−誘導されたエピソームのプラスミドは、マル
トース　パーミアーゼをコードする□　遺伝子を有する
。その構成は第２図に略解される。
ｐＧｂ−ｅＭＡＬ６ｇは二つのＢｇＩ　　ｎ部位を含有
し、両者共マルターゼ遺伝子中にある。この１．４Ｋｂ
のＢｇＩ　　ＩＩは、Ｂｇｌ　　ＩＩで消化されつづい
て希釈再結合して分子間連結を促進することにより、ｐ
Ｇｂ−ｅＭＡＬ６ｇから欠失された。
このような欠失はマルターゼ機能を破壊することが証明
されている（Ｊ、口、Ｃｏｈｅｎ　、　Ｍ、Ｊ。
Ｇｏｌｄｅｎｔｈａ１、　Ｔ、Ｃｈｏｗ、　Ｂ、Ｂｕｃ
ｈｆｅｒｅｒ　ａｎｄ　Ｊ。
Ｍａｒｍｕｒ　（１９８５）　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、　Ｇｅ
ｎｅｔ、　２Ｑ、　　ｌ］（３）　　ｐＧｂ−ｅＭＡＬ
６３ この２μ＝誘導されたエピソームのプラスミドは、ＭＡ
Ｌｐ機能を包含するＤＮＡ　（調節蛋白質遺伝子または
ＭＡＬ調節因子）を含有する。
その構成は第３図に略解される。上記の文献ｐ２１−４
０　　（ＲｌＢ、　　Ｎｅｅｄｌｅ＋＋＋ａｎ及びＣ０
Ｍ１ｃｈｅｌｓ（１９８３）］から、調節蛋白質遺伝子
を含有するＫｐｎＩ　−３ａｌ　　Ｉフラグメント（断
片）が単離された。このフラグメントはＴ４ＤＮＡポリ
メラーゼ及びクレノーＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑
末端にされついでｐ　ｅ０４１８のフィルドイン（ｆｉ
ｌｌｅｄ−ｉｎ）　ＨｉｎｄＩ［［１位中にクローニン
グされた。
（４）　　ｐＧｂ−Ｍ６ｇ（△−９） このプラスミドは、拡散転写された遺伝子マルトース　
パーミアーゼ及びマルターゼの遺伝子開領域中につくら
れたプロモーター欠失変異体である（第４図参照のこと
）。この領域は両方の遺伝子のプロモーターを含有する
（Ｓ、Ｈ。
Ｈｏｎｇ及びＪ、　Ｍａｒｍｕｒ　（１９８６）　　Ｇ
ｅｎｅ　４１゜７５〕。この欠失変異体は、もとのプロ
モーターを置換するためにつくられた。この構成は以下
の工程からなる。
ａ）　マルターゼ及びマルトース　パーミアーゼの遺伝
子を含有する旧ｎｄＩＩＩフラグメント（第１図をも参
照のこと）約７．Ｑｋｂが　ｐＴＺ１９Ｒの旧ｎｄＩ［
［部位にクローニングされた。
このプラスミドは市販されている（ファーマシ７（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）　）　。これはｐＧｂ−Ｍ６ｇを生じ
る。
ｂ）　　ｐＧｂ−Ｍ６ｇは３ｔｕ　　Ｉで直鎖状にされ
、Ｓｔｕ　　Ｉは遺伝子開領域中で切断する。Ｓｔｕ　
　１で発生された端部は、プロモーターを含有する遺伝
子開領域（の一部）をかみ取るためにエキソヌクレアー
ゼＢａ１３１の開始点として役立つ。Ｓｔｕ　　Ｉはマ
ルトース　パーミアーゼ遺伝子の一層近くにあるＣ８．
　ＨｏＨｏｎｇ　　及びＪ、　Ｍａｒｍａｒ　　（１９
８６）　、上記文献〕。
Ｂａ１３１培養はＭａｎｉａｔｉｓ　らにより記載され
たようにして行なわれた（　Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　
。
Ｂ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ及びＪ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　（
１９ｇ　２）。
上記文献）。適当な時間で試料は反応から取り出されク
レノーＤＮＡポリメラーゼで培養され平滑末端をつくっ
た。ついで合成リンカ−が、幾つかの制限部位を含有す
る末端部につながれた。
以下の相補的なオリゴデオキシヌクレオチドが使用され
た。
１、　　５’　　ＧＡＴＡＴＣＣＴＣ’ＧＡＧ　ＡＧＧ
Ｃ’（’Ｔ　Ａ　　３’２、　３’　　ＣＴＡＴＡＧ　
ＧＡＧＣＴＣＴＣＣＧＧＡ　ＴＧＣＧＣ５’二本鎖型に
おいて、制限部位はＥｃｏＲＶ（ＧＡＴＡＴＣ）　、Ｘ
ｈｏ　　Ｉ　　（ＣＴＣＧＡＧ）。
Ｓｔｕ　　Ｉ　　（ＡＧＧＣＣＴ）について形成され、
付着末端の連結が！Ｊｌｕ　　１部位（ＡＣＧＣＧＴ）
を形成する。キナーゼ反応の後、リンカ−はＴ、　Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ　ら（上記文献（１９８２））により記載
された条件に従って、Ｂａ１３１で処理されたＤＮＡに
つながれた。ついで、非連結のオリゴデオキシヌクレオ
チドをＤＮＡフラグメントから分離するために、反応混
合物は１Ｊｌｕ　　Ｉで培養され５ｒｒｔｌ！のセファ
ローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　Ｃ１−２Ｂカラム中に
クロマトグラフにかけられた。この直線状ＤＮＡを含む
画分はプールされ、プラスミドＤＮＡにつながれバクテ
リアに導入された。
Ｃ）　欠失変異体の生成組は配列決定分析にかけられた
。この目的のために、二本鎖のプラスミドはへルバーフ
ァージによる重感染（供給者の推奨に従うプロトコル）
により一本鎖ＤＮＡに変換された。この−重鎖鋳型は、
ジデオキシ配列決定（Ｆ、　Ｓａｎｇｅｒ、　Ｓ、　Ｎ
１ｃｋｌｅｎ及びＡ、　　Ｒ，［ｏｕｌｓｏｎ　　（１
９７７）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　７４．　５４６３）に使用するた
めの通常のＭｌ　３ｉ作により抽出された。
ブライマーとして、本発明者らはマルトース　パーミア
ーゼ遺伝子のＡＴＧ読み始めコドンに近いＤＮＡの伸張
に相補性の合成オリゴ　デオキシヌクレチド （５’−Ｇ＾＾ＴＴＣＧＧＴＡＧＣＧＴＴＣＡＣＧＣ−
３’　）を使用した。その方向性は、配列がプロモータ
ーに向って読まれるようなものである（第４図をも参照
のこと）。
マルトース　パーミアーゼの殆どが除去された欠失変異
体は、更に試験するために選ばれた。マルターゼプロモ
ーター（の一部）はまだ存在する（エキソヌクレアーゼ
処理の開始点としてのＳｔｕ　　１部位は遺伝子開領域
中に非対称的に局在されることに留意すること）。
第５図は変異体ｐｃｂ−Ｍ６ｇ　（△−９）の欠失点の
配列を示す。これはこの全領域の最近決定された配列（
Ｓ、　Ｈ，Ｈｏｎｇ及びＪ、　ｌａｒｍｕｒ（１９８６
）上記文献）と比較される。野生型配列に於いて、一つ
の相違点が公表された配列について観察された。−８７
８位（Ｓ、　Ｈ。
Ｈｏｎｇ及びＪ、　Ｍａｒｍｕｒ　　（１９８６）上記
文献に従って番号づける）のＣは本発明者らの配列には
存在しない。従って、ＤＮＡはこの位置ではＨｐａ　　
Ｉまたは旧ｎＣ■で消化し得ない。
プラスミドｐＧｂ−Ｍ６ｇ　（△−９）は、その他のプ
ロモーターをマルトース　パーミアーゼ遺伝子及びマル
ターゼ遺伝子の両者に融合する出発プラスミドである（
下記を参照のこと）。
（５）　　ｐＧｂ−ｉＡ３２／Ｇ４１８このプラスミド
は、組込み酵母プラスミドである。それはアルコール脱
水素酵素■プロモーター及びその５′　リーダー（先導
）配列の一部にフックされたマルトース　パーミアーゼ
を含有する。その構成は以下のとおりであった（第６図
）。
ａ）　プラスミドｐＴＺ　１９Ｒ／ＡＤＨＩはＡＵＧコ
ドンに関して一１５位で開始する、ＡＤＨＩプロモータ
ーをもつＢａｍＨｎフラグメント１．４ｋｂを含有する
。（Ｊ、Ｌ、　Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ及びＢ、Ｄ　Ｈａｌ
ｌ　（１９８２）　Ｊ、　Ｂｉｏ１、　Ｃｈｅｍ。
２５７．３（１１８）。このプラスミドから７００　ｂ
ｐ（ＤＥｃｏ　ＲＶ　−）１ｉｎｃ　ＩＩ　７　ラグメ
ントが単離され次いでＥｃｏＲＶで消化されたｐＧｂ−
Ｍ６ｇ（八−９）につながれた。生成プラスミドは制限
酵素消化で分析され、適切な方向性が一本鎖鋳型のジデ
オキシ配列分析により確認された（第６図参照のこと）
。４Ｃ節に記載されたのと同じオリゴプライマーが使用
された。
ＡＤＨ１プロモーターフラグメントのクローニング操作
の結果としてｐ’ｒｚ　１９　Ｈのポリリンカーの部分
（ＢａｍＨＩ　−ｔｌｉｎｃ　ｆｌ　）がマルトース　
パーミアーゼ遺伝子とＡＤＨＩプロモーターとの間に存
在する。ｐＧｂ−Ａ３２の構造及び配列は第６ａ図に示
される。
ｂ）　プラスミドｐｃｂ−Ａ３２は優性選択マーカーＧ
４１８ｒｅＳが与えられた。ＥｃｏＲＶ／ＨｉｎｃＩＩ
フラグメントはプロモーター　アルコール脱水素酵素Ｉ
の方向でＧ４１８に対する抵抗性を与えるＴｎ５遺伝子
を含有する。このフラグメントは、プラスミド１５３−
２１５ＡＫのＥｃｏ　ＲＶ　／　Ｈｉｎｃ　Ｉに重油化
により単離されたｏ　Ｂｃｏ　ＲＶ／ＨｉｎｃＩＩフラ
グメントＩｔ　ｐＧｂ−Ａ３２のＳｍａ　　１部位にク
ローニングされた。これはｐＧｂ−ｉＡ３２／Ｇ４１ｇ
を生成した。
（６）　　ｐｃｂ−ｉＲＲｏＩ このプラスミドは組込みプラスミドである。
このプラスミドはプロモーター　アルコール脱水素酵素
■の方向でマルトース　パーミアーゼ遺伝子を含み、プ
ロモーター翻訳伸長因子ＥＦＩαＡの方向でマルターゼ
遺伝子を含む。
クローニング経路は第７図に示される。該方法は以下の
とおりであった。マルターゼ遺伝子は５番目のアミノ酸
コドンの囲りにＢｃｌ　　１部位を含有する。それ故、
ＥＦＩαＡコード領域は、最初の５個のアミノ酸がマル
ターゼ蛋白質のアミノ酸に等しくなるような方法で突然
変異された。ＢｇＩ　　ｎ部位はＢｃｌ　　ｎ部位の位
置で共導入された。Ｂｃｌ　　ｎ部位からＢｇｌ　Ｉｎ
部位への変換は、第４番目のコドン中のサイレント（沈
黙）突然変異である。Ｂｇｌ　ＩＩ／Ｂｃｌ　　Ｉ連結
により、ＥＦＩαＡプロモーター及びリーダー配列はマ
ルターゼ遺伝子の残部に融合し得た。その操作は以下の
工程からなった。
ａ）　出発プラスミドはｐ　Ｙ　Ｅ　Ｆ　４６　（Ｓ、
　ＮａｇａｔＪに、Ｎａｇａｓｈｉｍａ　、　Ｙ、Ｔｓ
ｕｎｅｔｓｕｇｕ−ＹｏｋｏｔＰに、　　Ｆｕｙｉｍｕ
ｒａ　　、　　Ｍ、　　Ｍｉｙａｒａｋｉ　　ｐシ、び
Ｙ、　し、ａｚｉｒ。
（１９８４）ＥＭＢＯＪ３．３．１８２５）であったが
、これはＥＦＩαＡの全遺伝子コードを含む。この遺伝
子を被覆するＢｇＩ　　ｎフラグメント２．５ｋｂが単
離されｐＴＺ１９Ｒの３ａｍＨｎ部位にクローニングさ
れた。クローンｐＴ４が取り出され（第７ａ図参照）、
オリゴデオキシヌクレオチドで方向づけられた突然変異
誘発に使用された。
ｂ）　へルバーファージで重感染した後、ｐＴ４の一本
鎖（ｓｓ）ＤＮＡが単離された。５ｓＤＮＡ　４００ｎ
ｇ、熱変性ｐ　Ｔ　Ｚ１９ＲｘＢａｍＨＩ４００ｎｇ及
び突然変異誘発オリゴデオキシヌクレオチド（第７ｂ図
参照）１００ｎｇが７ｍＭのトリスＨＣｊ２ｐＨ７，５
，５０ｍＭのＮａＣｊ！及び７ｍＭの！ＪｇＣβ２の１
０ｐｌ容量中５６℃で１０分間培養された。室温で１０
分後に、１μβのクレノーＤＮＡポリメラーゼ（２Ｕ）
、１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（４Ｕ）、１μｌｌのＴ
ＭＤ　（２００ｍＭ）のトリスＨＣＩ！ｐＨ７，５，１
００ｍＭのＭｇＣｌａ　、１００ｍＭのＤＴＴ）　、４
ｔ−ｔ１２の２．５ｍＭのαＮＴＰ−ミックス、１μｆ
の１０ｍＭのＡＴＰ及び２μβの水の添加により、第２
鎖合成及び連結が開始された。最終容量は２０μｌであ
り、培養は１７℃で１６時間行なわれ、その後混合物は
Ｅ、ＣｏＣｏ１１Ｊ　（１１に形質転換された。
変異体は、その変異体に特別なキナーゼ処理されたオリ
ゴデオキシヌクレオチドでコロニーハイブリダイゼーシ
ョンによりスクリーニングされた（第７ｂ参照）。この
スクリーニング　オリゴマー５’　−ＧＡＣＴＡＴＴＴ
ＣＡＧＡＴＣＴＴＣ−３′は、導入されたマルターゼコ
ドン及びフランキングヌクレオチドに相補性であった。
上記のハイブリダイゼーションは、６ｘＮＥＴ　（１ｘ
ＮＥＴ＝０．１５Ｍ　　ＮａＣ１，０，（１１５Ｍトリ
スＨＣｌｐＨ７，５，０，０（１１ＭＥＤＴＡ）中２５
℃で１６時間行なわれた。
ボスト　ハイブリダイゼーション洗浄は同温度で同じ混
合物中で行ない（１０分間で３回）、続いてａｘＮＥＴ
中で２５℃で洗浄した。幾つかの陽性のコロニーが更に
分析された。ＢｇＩ　　ｎ消化はＢｇｌ　　１１部位の
存在を確認した。更に、−木調ＤＮＡは、変異体（ｐＴ
４−Ｍ）を含むＢｇｌ　ＩＩ部位から単離され、ＥＦ１
αＡ遺伝子のヌクレオチド８７−１０３に相補性の合成
１７−ｍａｒプライマー（Ｓ、　Ｎａｇａｔａ。
Ｋ、　Ｎａｇａｓｈｉｍａ　、Ｙ、　Ｔｓｕｎｅｔｓｕ
ｇｕ−Ｙｏｋｏｔａ　。
Ｋ、　Ｆｕｙｉｍｕｒａ　、　ＭｏＭｉｙａｒａｋｉ及
びＹ、１（ａｚｉｒ。
（１９８４）ＥＭＢＯＪ、３．１８２５）（５’　−Ｃ
ＡＡＴＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣＴＴＧ　−３’　）を用い
てジデオキシ配列分析にかけられた。得られた配列は所
望の突然変異の成功した導入を確ｇ忍した。
Ｃ）　次の工程はｐＴ４−ＭからＥＦＩαＡプロモータ
ー／　Ｎ　Ｈ２末端マルタ一ゼ遺伝子断片を単離し且つ
これをマルターゼ遺伝子の残部にＢｇｌ　　ＩＩ／Ｂｃ
ｌ　　Ｉ付着末端連結により融合することであった。こ
の工程はＥＦＩαＡプロモーター及びリーダー配列の下
流のマルターゼコード領域を回復する（第７Ｃ図参照）
。
Ｂｃｌ　　Ｉ部位（これはメチル化に感受性である）を
使用し得るために、プラスミドｐＧｂ−Ｍ６ｇ（△−９
）は０Ｍ１１３、Ｅ、　Ｃｏ１１種株に形質転換された
（ＧＭ　１１３　：　　ｔｈｒ、Ｉｅｕ　Ｂ　５、ｐｒ
ｏ　Ａ　２、ｔｒｉｓ　−４、ｍｅｔ　Ｂ　１、ｌａｃ
　Ｙ１、ｇａｌ　　Ｋ２、ａｒａ−１４、ｔｓｘ３３、
ｔｈ＋　　　ｌ　、ｔｈｙ　Ａ　１２、ｄｅｏ　Ｂ　１
６、ｓ”ｐＥ４４、ｒｐｓ　　Ｌ　２６　ＵＳｄａｍ−
３＞　。８ｃｌ　　Ｉ／ｈｉｎｄＩ［［フラグメント３
．８ｋｂが単離され、これはＮＨ２−末端以外はマルタ
ーゼ遺伝子を含む。ｐＴ４−ＭはＢｇｌ　　ＩＩ／）ｌ
ｉｎｄＩ［［で消化され大きなフラグメン）４．１ｋｂ
が単離された（ＥＦＩαＡプロモーター／ＮＨ２末端及
びマルターゼ遺伝子）。両フラグメントは互いにつなが
れてｐＧｂ−ＥＦＭＴ−３を生成した。配列分析は全て
の導入された突然変異の正確さを確認した。
ｄ）　最後に、ｐＧｂ−ＥＦＭＴ−３が、εｃｏ　ＲＶ
及び旧ｎｄＩ［Ｉで消化されて４．８ｋｂｐのＥＦ１α
Ａ／マルターゼ　プロモーター／遺伝子フラグメントを
精製した。ｐＧｂ−ｉＡ３２／Ｇ４１８（第６図参照）
から約８．３ｋｂの旧ｎｄＩ［Ｉ（部分）　／Ｅｃｏ　
ＲＶフラグメントが単離された。これはｐＴＺ１９Ｒ骨
格、ＡＤＨＩ／マルトース　パーミアーゼ　プロモータ
ー／遺伝子断片及びＡＤＨＩ／Ｇ　４１８”’断片から
なる。両者はつながれてｐＧｂ−ｉＲＲ。
■を生成した（第７ｄ図参照）。
（７）　　ｐ　Ｇ　ｂ　−ＲＢ　２ このプラスミドは、クローン形成用ビヒクルとして役立
ちＤＮＡ片をサツカロミセス　セレビシェの５ＩＴ４遺
伝子に組込む。この構成は以下の工程からなる（第８及
び９図参照）。
ａ、ｐＴＺ１９ＲがＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄＩ［［テ消化
されてそのポリリンカーを４０個のヌクレオチドの合成
でつくられたＤＮＡ断片で置換した。このＤＮＡ片は合
成のオリゴデオキシヌクレオチド３及び４のアニーリン
グによりつくられる（第８図参照）。この短いフラグメ
ントは、ＢｃｏＲＩ及び旧ｎｄＩ［Ｉ付着末端を含む。
このＤＮＡフラグメントからｐＴＺ１９Ｒベクターへの
クローニングはＢｃｏＲ１部位及び旧ｎｄＩ［［部位を
回復しない。合成のＤＮＡフラグメントは示されるよう
にその縁部でＮ０ｔＩ°及びＳｆｉ　　Ｉの制限部位を
含み、中間にＥｃ。
ＲＩ部位を含む。生成プラスミドはｐＧｂ−３ＮＥＮＳ
と称される。
ｂ、５ＩＴ４遺伝子（Ｇｏｔｔｌｉｎ−Ｎｉｎｇａ及び
１（ａｂａｃｋ　、上記゛を参照）を含有するＥｃｏＲ
ＩフラグメントがｐＬＦ２４　　（またコードｐＬＮ４
２０を有することが知られる）から単離され、ｐＧｂ−
３ＮＥＮＳのＥｃｏＲＩ部位にクローニングされた。こ
れはｐ　Ｇ　ｂ　−３ｐｏｎｓ３１を生成した。有用な
基準制限部位を欠くため、その方向性は未知である。
Ｃ，プラスミドｐ　Ｇ　ｂ　−３ｐｏｎｓ　　３１は、
５ＩＴ４遺伝子の中間に特異なりｇｌＩＩｌｆｆ１位を
含む。
これは、遺伝子置換により５ＩＴ４遺伝子に転移される
べきＤＮＡ片がクローニングし得る部位として使用する
ことができる。クローニング操作を容易にするため、５
ＩＴ４遺伝子には幾つかの特異な制限部位を含む合成の
ＤＮＡ片が与えられた。ｐｃ、ｂ−ＲＢ２の構成は第９
図に略記される。
合成のＤＮＡフラグメントは二つのＢｇｌ　ＩＩの付着
末端を有する。第９図に示されるように、ｐＧｂ−ＲＢ
２中のその方向性は、ｐＧｂ−ＲＢＮ３の制限酵素分析
に基づく　（次を参照すること）。　　　　　　　　　
　　　　　　　１（８）　　ｐＧ　ｂ　−ＲＢ　Ｎ　３ ＡＤＨＩプロモーターの制御下にＧ４１８”ゝ遺伝子を
含有するＥｃｏ　ＲＶ　／Ｈｉｎｃ　ＩＩフラグメント
（ｐＧｂ−ｉ　Ａ３２／Ｇ４１８の構成をも参照のこと
）１．９ｋｂがｐＧｂ−ＲＢ２の３ｍａ　　Ｉ部位にク
ローニングされた。これはｐＧｂ　−ＲＢＮ　　３を生
成した（第１０図参照）。
（９）　　ｐ　Ｇ　ｂ　−ＲＢ　ＲＲＯｌこのプラスミ
ドはプロモーター　アルコール脱水素酵素Ｉの方向にマ
ルトース　パーミアーゼ遺伝子を含有し、ＥＦＩαＡプ
ロモーターの方向にマルターゼ遺伝子を含有する。両者
は、ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント８，３ｋｂに局在され
、このフラグメントは５ＩＴ４遺伝子にクローニングさ
れていた。その構成は第１１図に略記される。
この目的のため、ｐＧｂ−ｉＲＲＯｌはＨｉｎｄＩＩＩ
で消化されｐＧｂ−ＲＢ２ｘＨｉｎｄＩＩ［（子牛腸ホ
スファターゼで処理された）につながれた。これはｐＧ
ｂ−ＲＢＲＲＯｌを生成した。
α（Ｉ　　ｐＧｂ−ＲＢＲＥＧＯＩ このプラスミドは、プロモーター　アルコール脱水素酵
素の方向でＭＡＬ−調節因子遺伝子を含有する。
ｐＧｂ−ＲＢＲＥＧＯｌは、以下のようにしてつくるこ
とができる。ｐ２１−４０　［Ｒ，Ｂ。
Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃ０Ｍ１ｃｈｅｌｓ　（
１９８３）　、上記文献〕から、調節蛋白質遺伝子を含
むＳａｌ　　Ｉフラグメントが単離される。このフラグ
メントはｐＴＺ１８ＲのＳａｌ　　１部位にクローニン
グされる。
このプラスミドは市販される（ファーマシア（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）　）　、その方向性は、ＭＡＬ−調節因子
遺伝子のプロモーター領域がｐＴＺ１８ＲのＴ７−プロ
モーター配列に近位するようなものである。ｐＴＺ１８
Ｒの配列プライマー及びその他の得られたＤＮＡ配列に
基いて新しくつくられたオリゴヌクレオチドブライマー
を用いて、ＭＡＬ−調節因子遺伝子のプロモーター領域
及びその遺伝子のＮＨ２末端コード部分が配列し得る。
これはＡＵＧ−開始コトンの位置を局在する。有用な制
限部位がＡＵＧ−開始コトンに近いプロモーター領域に
存在しない場合、このような部位（例えばＢｇｌＩＩ）
は通常の方法（第５ｂ節の組換えプラスミドの構成をも
参照すること）に従ってオリゴヌクレオチドにより部位
一方向づけされた突然変異誘発によりその領域に導入し
得る。
このような突然変異誘発の後に、Ｂｇｌ　　ＩＩ　−３
ａｌ■フラグメント（プロモーター領域を含まずＭＡＬ
−調節遺伝子を含む）及びＥｃｏ　Ｖ　−ＢａｎＨＩフ
ラグメント（ＡＤＨＩプロモーターを含む、第７ｄ［！
１、ｐＧｂ−ｉ　ＲＲＯｌを参照のこと）は、ＭＡＬ−
調節遺伝子が　ＡＤＨＩプロモーターの制御下にあるよ
うにｐＧｂ−ＲＢ２（第９図参照）に−緒につなぎ得る
。これはプラスミドｐＧ　ｂ　−１ＲＢＲ８ＧＯ１を生
成するであろう。
鋳型としてのｓｓ　ＤＮＡににオリゴヌクレオチドを用
いるジデオキシ鎖方法を用いる配列分析はクローニング
工程の正確さ及びプロモーターの方向性を容易に確認し
得る。
上記のプラスミド構成は、単に本発明を説明する例とし
て役立つことが理解されよう。その他のプロモーター（
好ましくはサツカロミセス）が使用でき（または同じプ
ロモーターのその他の部分が使用できる）、その他の組
込み遺伝子座が選択でき、酵母ゲノム中で一種以上の組
込み部位を用いてマルターゼ、マルトース　パーミアー
ゼ及びＭＡＬ−調節因子のその他の組合せ（それら自体
のプロモーターの制御下で、又はその他の好ましくはサ
ツカロミセス　プロモーターの制御下で）がつくること
ができる。それは最終的には嫌気発酵の全期間中に存在
するマルターゼ及びマルトース　パーミアーゼ活性の最
適比へと導くであろう。
酵母の形質転換 酵母菌株の形質転換は、イトウらの方法（ＨｏＩｔｏ　
、Ｙ、　Ｆｕｋｕｄａ　、　Ｋ、　Ｍｕｒａｔａ　、Ａ
、　Ｋｉｍｕｒａ（１９８３）、　　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙｌ　５３．　１６３〜１６８〕に従って行
なわれた。その方法は通常の酵母栄養培地中サツカロミ
セスを１〜２５、望ましくは４〜１０　０Ｄ６１゜ｎｍ
の密度に成長させることを伴なう。
次いで酵母細胞は採取され、洗浄され、約２ｍＭ〜１．
０Ｍ、好ましくは約０．１Ｍの濃度のカオトロピック　
イオン、特に塩化物または硫酸塩としてのアルカリ金属
イオン、リチウム、セシウムまたはルビジウム、更に特
別にはリチウム塩で予備処理される。一種以上のカオト
ロピック　イオンで約５分〜１２０分、好ましくは約６
０分細胞を培養した後に、細胞は次いで一般には２０℃
〜３５℃の適当な温度で約５〜６０分の短期間でＤＮＡ
で培養される。望ましくは、ポリエチレン　グリコール
が約２５〜５０％の濃度で添加され、ここでその全培地
は所望の最終濃度を得るため等容量のポリエチレン　グ
リコール濃厚物を添加することにより希釈されてもよい
。ポリエチレン　グリコールは、約２０００〜約８００
０ダルトン、好ましくは約４０００〜７０００ダルトン
のものである。培養は一般には比較的短時間、一般には
約５〜６０分行なう。望ましくは、培養培地は約３５℃
〜４５℃、好ましくは約４２℃で約１〜１０分の熱処理
にかけられる。形質転換体の選択のため、フレオマイシ
ン〔口、Ｇｅｎ１ｌｌｏｕｄ。
Ｍ、　Ｃ，Ｇａｒｒｉｄｏ、　ＦｏＭｏｒｅｎｏ　　（
１９８４）　Ｇｅｎｅ３２．２２５）、ハイグ０？イシ
ンＢ　ＣＧｒｉｔｚら（１９８３）Ｇｅｎｅ　　２５．
１７８）及びアミノグリコシドＧ　４１８　（Ｊｉｍｉ
ｎｅｚら（１９８０）、Ｎａｔｕｒｅ　、　２８７．　
８６９）の如き有用なマーカーが使用し得る。
酵母細胞が組込みプラスミドで形質転換された場合、組
込みは、Ｂｇｌ　ＩＩで消化されたＤＮＡを用いてＭＡ
Ｌ遺伝子座に向けられた。使用された組込みプラスミド
は互いに両者とも１，４ｋｂのマルターゼ遺伝子中の二
つのＢｇｌ　　１１部位を含む。これは二本鎖の切断を
生じ、これらは組換え性（ｒｅｃｏｍ−ｂｉｎｏｇｅｎ
ｉｃ　）であり相同の染色体ＤＮＡとの相互作用を刺激
する。組込み中、ギャップは染色体情報から修復される
［　Ｔ、Ｌ、　　Ｏｒｒ　−Ｗｅａｖｅｒ　、　Ｊ。
（ツ、５ｚｏｓｔａｋ　、Ｒ，Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ　　
（１９８１）　　ｐｒｏｃ。
Ｎａｔ１、　　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、　７８
．　６３５４：ｌ。
組込みはプラスミド　ベクターの一個または数個のコピ
ーを生じる。（Ｊ、Ｗ、５ｚｏｓｔａｋ　、　Ｒ，Ｃｏ
ｕ（１９７９）　Ｐｌａｓｍｉｄ　２．　５３６）　。
ＣＯ２生産実験中に使用される、これらの形質転換体中
の正確なコピー数は測定されなかった。
異種ＤＮＡを含まない安定な酵母の形質転換体を得るた
めの計画が開発された。異種ＤＮＡの例はｐＴＺｌ　９
ＲベクターＤＮＡ及び抗体Ｇ４１８、フレオマイシンま
たはハイグロマイシンＢに対する抵抗性を与える選択遺
伝子である。簡単には、計画された実験は以下のとおり
であった（第１２図参照）。
１）　　Ｓｆｉ　　Ｉで消化されたｐＧｂ−ＲＢＮ３に
よる酵母の形質転換による５ＩＴ４遺伝子の一工程の遺
伝子分断。
形質転換体はＧ４１８に対する抵抗性に関して選択され
た。結果物は５ＩＴ４遺伝子がＡＤＨＩブロモ−クーの
制御下に０４１８’遺伝子により中断されたＳ　ＩＴ４
遺伝子で置換された菌株ＡｐＧｂ−ＲＢＮ３であった。
２）　菌株ＡｐＧｂ−ＲＢＮ３は、ＰＵＴ３３２とＳｆ
ｉ　　Ｉで消化されたｐＧｂ−ＲＢＲＲＯｌとによる共
形質転換プロトコル中の宿主菌株として使用された。ｐ
ＵＴ３３２は、フレオマイシンに対する抵抗性を与える
遺伝子を含有する２μｍ誘導されたエピソームのプラス
ミドである。
この共形質転換工程中の第一選択はフレオマイシン（３
０μｇ　／ｍｆ）を含むプレート上で行なわれた。これ
らの７レオマイシン１酵母細胞の成る割合（０，１〜１
％程度）において、（ｐＡＤＨＩ／Ｇ　４１８　ｒで）
中断された５ＩＴ４遺伝子は、変性されたマルトース　
パーミアーゼ遺伝子及びマルターゼ遺伝子を含む共形質
転換されたＳ　ＩＴ４フラグメントにより置換された。
この第二の遺伝子置換は、再びＧ４１８に対して感受性
の酵母を生成した。この第二の遺伝子置換が行なわれた
酵母細胞を選択するため、フレオマイシン１形質転換体
がＧ４１８　（３００μｇ／ｍＩりを含むプレート上に
レプリカ平板化された。成長しなかった細胞において、
Ｓ　ＩＴ４遺伝子配列間に包埋されたＧ４１８ｒ遺伝子
は、Ｓ　ＩＴ４遺伝子配列間に包埋された変性ＭＡＬ遺
伝子により置換された。
３）　次いでフレオマイシン’　０４１８””形質転換
体は１０〜２０世代中で非選択性培地（即ちフレオマイ
シンを含まない）での成長によりエピソームのプラスミ
ドｐＵＴ３３２からキニアリングされた。得られる形質
転換体ＡｐＧｂ−ｐＲＢＲＲＯ１はフレオマイシン及び
Ｇ４１８の両者に感受性であり原核配列を含まない。組
込みは全てサザンプロット試験でＤＮＡ水準で確められ
たくデータは示されない）。
生成菌株は、別の組込み遺伝子座の使用により、及び／
または（二倍体または多倍体である酵母菌株の場合には
）ＳＩＴ４遺伝子のその他の一種以上の対立遺伝子での
連続の形質転換における宿主として使用し得る。菌株Ａ
は５ＩＴ４遺伝子を含む染色体の異数体であり二倍体で
ある。菌株ＡのＳ　ＩＴ４遺伝子は両者共、遺伝子置換
の標的部位として使用された。これは最終的には形質転
換体ＡｐＧｂ−ｐ２ＲＢＲＲＯ１＃１を生成した。第二
の組込みはその遺伝子座で多形現象を除いたので、組込
みのための両方の対立遺伝子の使用はまた形質転換体の
遺伝子安定性を殆ど増大したようである。このような多
形性領域は、組込まれた配列の損失を生じ得る遺伝子変
換に感受性である。このようにして得られた形質転換体
はサザンプロット技術により分析されて、両方の５ＩＴ
４遺伝子での遺伝子中断から予想されたハイブリダイゼ
ーション　パターンを示す。
ｐＧｂ−ＲＢＮ３及びｐＧｂ−ＲＢＲＲＯｌの出発プラ
スミドとして役立った、構成されたベクターｐＧｂ−Ｒ
Ｂ２は、以下の考察により喚起される幾つかの有用な特
徴を有している。
１、　時としてＤＮＡ片が組込まれなければならず、こ
れは酵母プロモーターを別の遺伝子の（酵母）コード領
域に融合することにより構成される。
形質転換性フラグメントがゲノム中の標的配列に相同の
配列を両側部に有する場合、遺伝子置−換が勿論容易に
得られるだけである。それ故、ＤＮＡ片はコード領域（
上記を参照のこと）の３′末端にフックされなければな
らず、これは選択されたプロモーターと同じ遺伝子から
誘導される。同じプロモーターが常に使用されるとは限
らないから、この試みの欠点はそれが多くのクローニン
グ操作を必要とすることである。
加えて、強いプロモーターが時として選ばれ、遺伝子か
ら誘導され、この遺伝子１′ま関心のある段階（栄養成
長中、嫌気発酵中、等）で機能性である。処理されたフ
ラグメントの組込み後、この遺伝子の一つのコピーは非
機能性にされる。
それ故、本発明者らは、栄養成長中に形質発現されない
、遺伝子座での遺伝子置換を指向したい。本発明者らは
、５ＩＴ４遺伝子（胞子形成−誘発された転写配列）を
選択したが、その形質発現は、Ｇｏｔｔｌｉｎ−Ｎｉｎ
ｆａ及びＫａｂａｃｋ　（上記文献参照）によりよく研
究されているが、勿論その他のＳＩＴ遺伝子または一般
的な非コード断片のＳＩＴ遺伝子が適切である。関心の
あるＤＮＡ構成がこの５ＩＴ４遺伝子にクローニングさ
れる場合、Ｓ　ＩＴ４遺伝子の二つの得られる半分は組
換えの相同末端として役立つ。
遺伝子が局在される染色体領域は、ＨＭＲ−遺伝子座に
ついて記載されたサイレンサー〔Ａ。
ＨｏＢｒａｎｄ　　ら（１９８５）Ｃｅｌｌ　　４１．
４１〜４８〕に類似するサイレンサーの結果として栄養
成長中転写非活性であると、成る者は主張したかもしれ
ない。また、このサイレンサーＤＮＡは交配型プロモー
ターとは無関係のプロモーターにより制御された転写を
抑制し２６００ｂｐ離れたプロモーターに作用し得る。
しかしながらＧｏｔｔｌｉｎ−Ｎｉｎｆａ及びＫａｂａ
ｃｋ　（上記文献参照）は、ＨＩＳ３遺伝子が５ＩＴ４
遺伝子に組込まれた時栄養成長中に機能性であり得るこ
とを示した。
２、　クローニング操作を容易にするため、５ＩＴ４遺
伝子には数個の特異な制限部位を含有するＤＮＡの合成
片（クローニング部位をもつポリリンカー）が与えられ
る。加えて、ポリリンカーは両側部に全ての可能な読取
り枠中の翻釈のための停止コピ・”！含む（第９図参照
）２こｔ・は可能なバイア、ラド転写産物のしｌ′訳を
停止する安全弁であ鳳この転写産物は接合部を横切って
合成、・チ゛もよい。このようなハイブリッ）”、”ｘ
物４そうしなければ蛋白質の符号化をＩることがあり、
その作用は知られていない。
亀　相同の組換えを得るため、組込まれるべきＤＮＡ断
片は両末端部にＮｏｔ　　Ｉ及ｕｓｆｉ　　Ｉの制限部
位を含み、これらは両者とも８ｂｐの配列を認識する。
これらの制限部位の発生頻度は極めて低く、それ故５Ｉ
Ｔ４遺伝子中のポリリンカーにクローニングされるべき
ＤＮＡ断片が両方の認識部位を含むことは殆どないよう
である。
かくしてＤＮＡ断片がプラスミドｐＧｂ−ＲＢ２のＳ　
ＩＴ４遺伝子に一部クローン化されると、Ｎｏｔ　　Ｉ
またはＳｆｉ　　Ｉによる制限はＤＮＡフラグメントを
遊離し、これはゲノム中、即ち５ＩＴ４遺伝子座で相同
の配列との相互作用により組、〆え可能である。末端部
はＮｏｔ　　ＩまたはＳｆｉ　　Ｉ部位の一部でありそ
れ故相同ではないが、その他の研究は、細胞中の制限さ
れたエキソヌクレアーゼ消化により明らかにこれらの配
列が除去されることを示していた〔例えば、Ｈ，Ｒｕｄ
ｏｌｐｈ。
Ｊ、Ｋｏｅｎｉｇ−Ｒａｎｓｅｏ及びＡ、　）ｌｉｎｎ
ｅｎ　（１９８５）Ｇｅｎｅ　　３６．　８７〜９５：
］。
４、　出発プラスミドとして、市販のプラスミドｐ’ｒ
ｚ　１９　ｒ、即ちｐＵｃ１９誘導体が使用される。こ
のベクターは、多いコピー数をもち、−木調ファージｆ
１の複製の原点をもっという利点をもつ。これは、ベル
パーファージによる感染後に一本鎖ＤＮＡを遊離するこ
と及びブライマーの助けにより接合部を横切ってＤＮＡ
配列を変性することを極めて容易にする。これは操作さ
れるＤ　Ｎ　Ａの詳細な記載を極めて容易にする。
これらの改良はパン酵母のみならずその他の酵母にも適
用可能であることが理解されよう。
Ｃ０２−生産測定 ａ）　合成された練り粉（ドウ）培地において（試験Ａ
） 酵母細胞がＹＥＰＭＳ培地（１％酵母抽出物；２％バク
トペブトン；　３．７５％マルトース；２００μｇ／ｒ
ｒｆ！　Ｇ４１８で補充されたショ糖１゜２５％）中で
培養された。成長は対数増殖後期（ｌａｔｅ−１ｏｇ　
ｐｈａｓｅ）まで３０℃であった。酵母細胞が６１ｎｌ
の培養菌から集められ８．８　ｍｆの合成練り粉培地中
に再懸濁された。この培地の組成（［当り）は、シヨ糖
４．６ｇ；’マルトース６４．３７ｇ　；ＫＨ２ＰＯ４
２，０７ｇ　；Ｍｇ５Ｏ＜　　・７　Ｈ２０２，７６ｇ
　：　　（ＮＨ４＞２Ｓ○４０．６７ｇ；カザミノ酸２
．０７ｇ；クエン酸４．０２ｇ；クエン酸三ナトリウム
４４．２５ｇ；ビタミン８１　９．２　ｍｇ　；ビタミ
ン８６　９．２ｍｇ；二：］チン酸４５ｍｇ　；Ｃａ−
Ｄ　（＋）−パントチネート１８、２　ｍｇ　；ビオチ
ン０．２３μｇであった。１０分間で、上記の懸濁物は
適度の撹拌により２８℃の水浴中で平衡にされ、その後
に酵母懸濁物を含むフラスコは管により“ガスビニレッ
ト（ｇａｓｂｕｒｅｔｔｅ）”に連結された。このビニ
レットは、１１当り２０−の指示薬溶液（１ｇメチルレ
ッド；　０．５　ｇメチレンブルー；１１の９６％エタ
ノールに溶解）、４０ｍｌのＩＮ　　Ｈ２ＳＯ，及び痕
跡量のＣｕ５Ｏｓ（ＨＮＯｓに溶解）を含む溶液で満た
された。ビニレット中のこの溶液の容量の置換はＣＯ２
生産の尺度であり、これは１６５分間で測定された。
各組の実験に於いて、得られたＣＯ□生産の値は環境温
度及び圧力について２８℃及び７６０ｍｍＨｇの標準条
件に修正された。更に、酵母の量について修正された。
ＣＯ□測定毎の酵母の量を等しくするために、培養の６
００ｎｍＯ比色計の読みが修正因子として用いられた。
ｂ）　練り粉において（試験Ｂ及びＢ’　）砂糖を添加
しない練り粉（無ショ糖ドウ）（試験Ｂ）または３０％
の砂糖を含む練り粉（試験Ｂ”）において、糖蜜で流加
回分式に成長させられた。圧搾酵母のＣＯ２ガス生成曲
線が測定された。無ショ糖ドウは以下のようにしてつく
った。圧搾酵母（２８，５％の乾燥物を含む）Ｉｇ、食
塩溶液Ａ（蒸留水３４ｍ７！に溶解されたＮａＣ１１，
２５ｇ）３４ｒｎｌ及び小麦粉６２．５ｇを、良く発展
した練り粉を得るように、ホバー）　（Ｈｏｂａｒｔ）
装置中速度１で３０秒、速度２で２分間混合した。
３０％砂糖入り練り粉は圧搾酵母（２８，５％の乾燥物
の）２．０ｇ、食塩溶液Ｂ（３４ｒｒｔｌ！の蒸留水中
ＮａＣ１０，９３８ｇ）　３４ｍ１、小麦粉６２、５　
ｇ及びシヨ糖１８．７５ｇ（即ち小麦粉に対し３０％の
砂糖）を含有した。混合は無ショ糖ドウと同様にした。
次いで練り粉を丸底フラスコに移した。ガス生産測定は
練り粉を含むフラスコを管を経由してガスビニレット（
上記の節ａを参照のこと）に連結することにより、混合
の７．５分後に開始し２８℃で１６５分間行なった。圧
搾酵母の乾燥物含量が上記の値と異なる場合に於いて、
このような酵母が使用された。しかしながら、ＣＯ２ガ
ス生成力の測定値は次いで、Ｃ０２ガス生成力に、必要
とされる乾燥物含量対実際の測定値の比をかけることに
より修正された。各組の試験に於いて、得られたＣＯ□
生産の値は環境温度及び圧力に関する値を２８℃、７６
０ｍｍｇの値に夫々修正された。成る場合には、得られ
たガスの値を流加回分式に成長した酵母のＮの率（Ｎの
率（％）は蛋白質含量の目安である）について修正され
た付加的な計算を行なった。改良の類似の％は、この最
後の修正を含まないで実測されたとおりであった。
Ｃ）　練り粉において（試験Ｃ及びＣ’　）米国特許第
３８４３８００号明細書及び同第４３４１８７１号明細
書に記載された方法に従って調製されたインスタント（
即時用）乾燥酵母の如き乾燥酵母のＣｏ２ガス生成曲線
が、砂糖を添加しない練り粉（試験Ｃ）及び３０％の砂
糖を含む練り粉（試験Ｃ′）に於いて測定された。試験
Ｃ及びＣ′の夫々に於いて乾燥酵母（９６％の乾燥物を
含む）３００ｍｇ及び乾燥酵母（９６％の乾燥物を含む
）６００ｍｇが使用された以外は、試験Ｂ及びＢ′と同
様にしてこれらの試験が行なわれた。試験の前に、酵母
は小麦粉と混合され２８℃で１０分間培養された。
酵素分析 酵母細胞によりマルトースを輸送する能力は、３０℃で
基質として１５ｍＭの濃度の（Ｕ−”Ｃ）−マルトース
を用いて測定された。詳細はＲｏＳｅｒｒａｎｏ　（上
記文献参照）により記載されている。
細胞を含まない抽出物中で基質としてｐ−ニトロフェニ
ル−α−Ｄ−グルコピラノシドを用いて、マルターゼ（
Ｅ、　Ｃ，３，２，１，２０）が分析された。この分析
は文献（ＨｌＨａｌｖｏｒｓｏｎ　　及びＥ。
Ｌ、Ｂ１１ａｓ、　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ
　、Ａｃｔａ（ｌ　９５３　）３０．２８）記載に従っ
て行なわれた。
液体培地中の基質の消費及び生成物の生成液体培地から
のマルトース及びゲルコールの消失が、通常のＨＰＬＣ
技術を用いて定量された。
培地ＩＩ２はマルトース１００ｇ、グルコース１０ｇ、
　　（ＮＨ４）２　　ＳＯ４３，Ｏｇ、ＭｇＳＯ４・７
Ｈ２０４，０ｇ５ＫＨ２ＰＯ４４ｇ、カヂミノ酸（Ｄｉ
ｆｃｏ＞４ｇ１クエン酸・Ｈ２Ｏ４ｇ、クエン酸三ナト
リウム−２Ｈ２０４５ｇ、ビタミンＢｌ　　１０ｍｇ。
ビタミン８６　１０ｍｇ、二：ｌチン酸４０ｍｇ。
Ｃａ−Ｄ（＋）−パントテネー）２０ｍｇ及びビオチン
０．０２　ｍｇを含有していた。ｐＨは５．７に調節さ
れた。培地２ｍｉ！が酵母の懸濁物（２０■乾燥重量／
蒸留水２．０ｒｎｌ）に添加された。この混合物（培地
Ａと称される）は２８℃で培養された。培地Ｂは培地Ａ
と似ているが２０倍のグルコースを含有した。試験は嫌
気条件で行なわれた。
蛋白質測定 細胞を含まない抽出物の蛋白質及び全細胞の蛋白質がマ
イクロビユレット法［Ｊ、　Ｇｏａ　、　５ｃａｎｄ。
Ｊ、　Ｃｈｉｍ、Ｌａｂ、Ｉｎｖｅｓｔ、（１９５３）
　５．　２１８：］により測定された。オボアルブミン
が標準物として役立った。
貯蔵性 圧搾酵母が、密閉プラスチック容器中に２３℃で４日間
貯蔵された。貯蔵性はこの期間後に残存するガス生成力
の率（％）として定義される。
圧搾酵母の製造 酵母菌株の培養菌が一連の発酵槽中で成長させられた。
細胞は正味容量６１の１（１１の実験室発酵槽中で培養
された。発酵中、ｐＨ及び温度は自動制御により所望の
値に維持された。使用された発酵処方せんは文献（Ｇ、
Ｂｕｔｓｃｈｅｃｋ　　ａｎｄ　　Ｒ。
Ｋａｕｔｚｍａｎｎ、Ｄｉｅ　Ｈｅｆｅｎ、　Ｂａｎｄ
ＩＩ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ　ｄｅｒＨｅｆｅｎ５（
１１〜５９１頁（１９６２）　、　ＶｅｒｌａｇＨａｎ
ｓ　Ｃａｒ１、　Ｎｕｅｒｎｂｅｒｇ　、　Ｆ　ＲＧ）
に記載された操作及び文献Ｃｔｈｅ　ＡＶ　Ｉ　Ｐｕｂ
ｌｉｓｈｉｎｇ　　ＣｏｍｐａｎｙＩｎｃ　　、　　Ｗ
ｅｓｔｐｏｒｔ　　、　　Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ　　
、Ｕ　　Ｓ　　Ａ　　（１９７３）のＹｅａｓｔ　Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ　）においてＧ、Ｒｅｅｄ　　及びＨ
，Ｊ、　Ｐｅｐｐｌｅｒにより記載された操作に基く。
最終発酵の培養条件は特に、以下のとおりであった。
（ａ）　　適用された糖蜜は５０％の砂糖を基準として
計算してビート糖蜜８０重量％及びさとうきび糖蜜２０
重量％からなった。
う）リン酸塩の必要量は、接種前にモノ−リン酸−アン
モニウムの形態で添加された。
（Ｃ）　　第１表の発酵中に温度は２８℃から３０℃に
上昇した。
（６）第１表に従って発酵中に窒素はＮ　Ｈｓの１０％
水溶液として供給された。
（ｅ）　　第１表に従って、ｐＨは発酵の最初の８時間
中５．０に保たれ、その後上昇して発酵の終了時には６
．２に上昇した。
（ｆ）　　発酵性砂糖５０％を含有する糖蜜１ｋｇ当り
、１２■のビタミンＢ１が接種前に添加された。
この発酵により得られた酵母は、実験室ノズル遠心分離
機中で濃縮され水道水で洗浄された。酵母クリームは２
６〜３２％の範囲の乾燥物含量に圧搾された。
得られた蛋白質含量（％ＮＸ６．２５）は、発酵中に適
用された異なる量のアンモニアの結果として４２〜５５
％の乾燥重量の間で変化した。
第　　　１　　　表 ＜０　　　　　　７　　　　５２８．０　　　　　００
−１　　５２８．０　０ １−２　５　５２８．０　０ ２−３　６　５２８．５　１ ３−４　８　５２８．５　７ ４−５　８　５２９．０　１１ ５−６　８　５３０．０　１１ ６−７　１０　５３０．０　１２ ７−８　１０　５３０．０　１５ ８−９　１０　５．３３０．０　１７ ９−１０　１０　５．６３０．０　１７１０−１１　１
０　５．９３０．０　　ｔ。
１１−１２　８　６．２３０．０　０ 例　　Ｉ ＭＡＬ６遺伝子座から誘導された遺伝子を含む２μｍ誘
導れれたプラスミドで形質転換された酵母のＣＯ２−生
産 市販のパン酵母菌株Ａ及びＣが、ｐＧｂ　−ｅＭＡ１６
ｇ（マルトース　パーミアーゼ及びマルターゼ、第１図
参照）　、ｐＧｂ−ｅＭＡＬ６１　　（？ルトース　パ
ーミアーゼ、第２図参照）、及びｐＧｂ−ｅＭＡＬ６３
　（ＭＡＬ−調節因子、第３図参照）で形質転換された
。ＭＡＬ遺伝子はなおそれらのもとのプロモーターを含
有する。形質転換された酵母菌株の命名は以下のと右り
である。Ａｐ　ｅＧ４１８はｐｅＧ４１８で形質転換さ
れた菌株Ａを表す。その他の形質転換された菌株は類似
の方法で示された。合成練り粉培地中のＣＯ２−生産に
及ぼすこれらのプラスミドの効果は表２に要約される。
本願発明者らはマルチコピープラスミドの単なる存在が
カス生産に逆効果をもつことを見い出したので、出発ｐ
ｅ０４１８（第１図参照）で形質転換された宿主菌株は
参考例として役立つ。
全ての形質転換体は、対照に比較して大きなＣＯ□生産
の改良を示す。マルトース　パーミアーゼ遺伝子及びマ
ルターゼ遺伝子の両者のエキストラ　コピー（ｅｘｔｒ
ａ　ｃｏｐｉｅｓ）の配合は、最高の増強、即ち菌株Ａ
に於いて４０％、菌株Ｃに於いて１８％の増強を与える
。
また形質転換体ＡｐＧｂ−ｅＭＡＬ６ｇ及びＣｐＧｂ−
ｅＭＡＬ６ｇは、砂糖が添加されない練り粉に於いても
試験された。この場合、酵母は糖蜜で流加回分式に成長
させられた。再度、ＣＯ２生産の大巾な改良が得られた
（第３表）。
第　　　２　　　表 上記のベクターで形質転換された菌株に比較して２μｍ
誘導されたＭＡＬプラスミドで形質転換された菌株Ａ及
び菌株Ｃのガス生産。ＣＯ２生産が合成練り粉培地中で
測定され（実験操作を参照のこと）、２８５ｍｇの乾燥
物に修正された。デーＡｐｅＧ４１８　　　　　　１０
０　　１００Ａｐ１００ＡｐＧｂ−ｅ　　　１５７　　
１４１ＡｐＧｂ−ｅＭＡＬ６１　　１４４　　１２３Ａ
ｐＧｂ−ｅＭＡＬ６３　　１１９　　１１５ＣｐｅＧ４
１８　　　　　　１００　　１００Ｃｐ１００ＣｐＧｂ
−ｅ　　　１２ｔ　　１１８ＣｐＧｂ−ｅＭＡＬ６１　
　１１７　　１１４第　　　３　　　表 ２μｍ誘導されたプラスミドｐｅＧ４１８及びｐＧｂ−
ｅＭＡＬ６ｇで形質転換された菌株Ａ及びＣの練り粉中
の相対的なガス生産、ＣＯ２生産ＡｐｅＧ　４１８　　
　１００　１００　１００　１００ＡｐＧｂ−ｅ！ＪＡ
Ｌ６ｇ　　　１２５　１２５　１２５　１２１ＣｐｅＧ
　４１８　　　１００　１００　１００　１００ＣｐＧ
ｂ−ｅＭＡＬ６ｇ　　１５１　１４１　１３８　１２９
例　　２ 組換えマルターゼ遺伝子及び／またはマルトース　パー
ミアーゼ遺伝子を含む組込みプラスミドで形質転換され
た酵母菌株のＣＯ□生産親酵母菌株ＡがｐＧｂ−ｉＡ３
２／Ｇ４１８（主な特徴：ＡＤＨＩ／マルトース　パー
ミアーゼ；第６図参照）及びｐＧｂ−ｉＲＲｏｌ　　（
主な特１！：ＡＤＨＩ／マルトース　パーミアーゼ及び
ＥＦＩαＡ／マルターゼ；第７図参照）で形質転換され
た。
親菌株Ａ及び両組込み形質転換体は、商業的な好気性発
酵に類似して糖蜜で流加回分式で成長させられた（第１
表参照）。細胞を採取した後に、ＣＯ２生産が砂糖を添
加しない通常の練り粉試験で測定される。この試験で分
析されたガス生産は第４表に要約される。菌株Ａの染色
体へのｐｃｂ−ｉＡ３２／Ｇ４１８の組込みは練り粉中
のガス生産を有意に改良する。相対的な改良は、測定時
間に依存して若干変化する（第４表参照）。変性マルト
ース　パーミアーゼ遺伝子に加えて変性マルターゼ遺伝
子がｐＧｂ−ＩＲＲｏｌを用いて市販の菌株Ａの染色体
に組込まれる時に、ガス生成力はさらに一層改良される
。この典型的な実験に於いて、無シヨ糖練り粉中で１６
５分後に約３０％多いＣＯ２が生成され、これは約４１
０ｍｆＣＯ２／２８５ｍｇの酵母乾燥重量の水準に相当
する。
３０％の砂糖を添加した練り粉に於いて、親菌株に較べ
て上記の形質転換体のＣＯ□生産における実質的な差異
は認められなかった（約１９０ｒｄＣ○２　／　２８５
　ｍｇの酵母乾燥重量）。
ドウ発酵活性において得られた改良は２３℃の貯蔵中に
維持される。貯蔵中のドウ発酵活性の損失は実際には親
菌株Ａ及び新規菌株について同じである（第５表参照）
。
第　　　４　　　表 菌株Ａ及び変性マルターゼ遺伝子及び／またはマルトー
ス　パーミアーゼ遺伝子が与えられたそのｒＤＮＡ誘導
体の相対的なガス生産。ガス生成値は２８５ｍｇの乾燥
物に修正された。砂糖は練り、Ａ　　　　　　　　１０
０　　１００　　１００　　１００ＡｐＧｂ−ｉＡ３２
／Ｇ４１８　１１３　　１１５　　１１５　　１１１Ａ
ｐＧｂ−ｉＲＲｏｌ　　　　１３１　　１３６　　１３
８　　１３３第　　　５　　　表 菌株Ａ及び変性マルターゼ遺伝子及び／またはマルトー
ス　パーミアーゼ遺伝子が与えられたそのｒＤＮＡ誘導
体の貯蔵性。圧搾酵母を２３℃で４日間保った後にドウ
発酵活性を表４のようにしＡ　　　　　　　　　　　　
　　　９０ＡｐＧｂ−ＩＡ３２／Ｇ４１８　　　　　　
　９１ＡｐＧｂ−ＩＲＲｏｌ　　　　　　　　　　８８
例３ 組換えマルターゼ遺伝子及びマルトース　パーミアーゼ
遺伝子を含み異種ＤＮＡを含まない酵母菌株のＣＯ２生
産 親菌株Ａは、ｐＡＤＨＩ／マルトース　パーミアーゼ遺
伝子及びｐＥＦ１αＡ／マルターゼ遺伝子が両方の相同
の染色体の５ＩＴ４遺伝子に導入されるように遺伝的に
変性された。ＡｐＧｂ−ｐ２ＲＢＲＲＯ１＃１と略記さ
れる、この菌株は前記の方法及びプラスミド（ｐＧｂ−
ＲＢＮ３（第１Ｏ図）及びｐＧｂ−ＲＢＲＲＯＩ　（第
１１図）の形質転換及び構成の節及び遺伝子組換えによ
る形質転換の一般的な計画を参照のこと）を用いて構成
された。親菌株Ａ及び相同の形質転換体ＡｐＧｂ−ｐ２
ＲＢＲＲＯ１＃１は商業的な好気性発酵と同様にして糖
蜜で流加回分式に成長させられた（第１表参照のこと）
。細胞を採取した後に、砂糖を添加しない通常の練り粉
中でＣＯ２生産が測定される。
第６表はそれらの結果を要約する。無ショ糖ドウに於い
て、改良は１６５分後に約１８％であり、これは約３６
７ｍｌＩＣｏｓ　／　２８５ｍｇの酵母乾燥重量の水準
に相当する。この菌株はＡＤＨＩプロモーターの制御下
にマルトース　パーミアーゼ遺を子及びＥＦＩαＡプロ
モーターの制御下にマルターゼ遺伝子の夫々二つのコピ
ーを含有する。第４表ニハ菌株Ａ　ｐ　Ｇ　ｂ　−ｉ　
ＲＲＯ１が約３０％の改良をもつことが示される。菌株
ＡのＭＡＬ遺伝子座に組込まれたｐＧｂ−ｉＲＲＯ１分
子の数の最初の推定は、少くとも３０組込みプラスミド
分子のコピー数を与える。菌株Ａ　ｐ　Ｇ　ｂ　−ｐ　
２ＲＢＲＲＯ１＃１に於いて変性マルトース　パーミア
ーゼ遺伝子及びマルターゼ遺伝子のコピー数を更に増加
することにより（例えばその他の胞子形成性の特別な遺
伝子中の組込みにより）、菌株ＡｐＧｂ−ｉ　ＲＲＯｌ
と少くとも同様のガス生産水準をもつ相同の形質転換さ
れた酵母菌株を得ることができる。
第　　　６　　　表 菌株Ａ及び変性マルターゼ遺伝子及びマルトース　パー
ミアーゼ遺伝子が与えられたその相同のｒＤＮＡ誘導体
の相対的なガス生産。ガス生成値は２８５■の乾燥物に
修正された。砂糖は練り粉Ａ　　　　　　　　１００　
　１００　　１００　　１００ＡｐＧｂ−ｐ２ＲＢＲＲ
Ｏ１＃１１２４　　１２８　　１２７　　１１８例４ 組換えマルターゼ遺伝子及び／又は組換えマルトース　
パーミアーゼ遺伝子を含む組込み（統合性）プラスミド
で形質転換された酵母菌株の酵素活性及び基質取込み量 上記の如く、マルトース　パーミアーゼ及びマルターゼ
の形質発現はマルトース誘導及びグルコース抑制を受け
る。この現象は菌株Ａの野生型細胞に関して第１３図に
示される。マルトース　パーミアーゼ及びマルターゼの
特別の活性は、グルコースの大部分が利用されるまで増
加しない。
練り粉が膨張を開始する時のマルトース　パーミアーゼ
活性は、第１４図に示されるように酵母ゲノム（菌株Ａ
ｐＧｂ−ｉＡ３２／Ｇ４１８）への変性（交替処理）マ
ルトース　パーミアーゼ遺伝子の導入により高められる
。
驚くべきことに、マルターゼの活性はこの構成体におい
て同様に高められた（第１５図）。この新規な菌株Ａｐ
Ｇｂ−ｉＡ３２／Ｇ４１８は、主な炭素源及びエネルギ
ー源としてマルトースを含む培地Ａ中で親菌株Ａよりも
速くマルトースを発酵した（第１６図）。主な炭素源及
びエネルギー源としてグルコースを含む培地Ｂ中で、こ
の効果はそれ程顕著ではなかったく第１７図）。
変性マルトース　パーミアーゼ遺伝子に加えて、変性マ
ルターゼ遺伝子が菌株Ａ　ｐ　Ｇ　ｂ　−１ＲＲ（１１
を生成する染色体に組込まれ（統合され）た。この菌株
は培地Ａ（第１６図）及び培地Ｂ（第１７図）中で一層
速い速度でマルトースを発酵した。グルコースの極めて
高い菌体外濃度にもかかわらず、相当量のマルトースが
この新規な菌株により代謝された。菌株ＡｐＧｂ−ｉ　
ＲＲＯｌは、練り粉の膨張中に親菌株Ａ及び菌株ＡｐＧ
ｂ−ｉＡ３２／Ｇ４１８よりも高いマルターゼの特別な
活性及びマルトース　パーミアーゼの特別な活性を示し
た（第１４図及び第１５図）。
【図面の簡単な説明】
添付図面の第１図はプラスミドｐＧｂ−ｅＭＡＬ６ｇの
構成を示す。矢印は図中の遺伝子の転写方向を示す。プ
ラスミドは模式的に図示され、量的測定のためではない
。記号：Ｇ４１８、Ｔｎ５遺伝子（ＡＤＨＩプロモータ
ーの制御下に）Ｇ４１８に耐性を与える；　Ｐ、　Ｐｖ
ｕ　　Ｉ　；Ｘ、　Ｘｂａ　　Ｉ　；Ｓ。 Ｓａｌ　　Ｉ　；Ｈ，ＨｉｎｄＩ［Ｉ；ＣＩＰ：子牛の
腸のホスファターゼ・ 第２図はｐＧｂ−ｅＭＡＬ６１の構成を示す。 プラスミドは模式的に図示され、量的測定のためではな
い。記号＝Δマルターゼ、一部欠失マルターゼ遺伝子；
Ｂ、ＢｇｌＩＩ。なお第１図の説明を参照されたい。 第３図はプラスミドｐＧｂ−ｅＭＡＬ６３の構成を示す
。プラスミドは模式的に図示され、量的測定のためでは
ない。記号：（Ｋ）、補填されるＫｐｎ　　Ｉサイト；
　　（Ｓ）、補填されるＳａｌ　　Ｉサイト；Ｋｌｅｎ
ｏｗ　、大型サブユニットＤＮＡポリメラーゼ；Ｈ，Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ。第１図の説明も参照されたい。 第４図はｐＧｂ−Ｍ６ｇ　（△−９）の構成を示す。記
号：　Ｈ，Ｈｉｎｄ［［；Ｓｔ　、　Ｓｔｕ　Ｉ　；　
Ｋｌｅｎｏｗ　、大型断片ＤＮＡポリメラーゼＩ　；　
ＥＶ、　Ｂｃｏ　ＲＶ　；Ｘｈ　、　　ＸｈＯＩ　；Ｍ
　、　ＭｌｕＴ　；ｆｌ　　ｏｒｉ　、　　複製ファー
ジｆｌの起点；ａｍｐ、　　アムビシリン耐性遺伝子；
Ｓ、ｐ、、プライマーの配列。矢印は５′→３′の方向
を示す。欠失域は点線で示される。 第５図はプラスミドｐＧｂ−Ｍ５ｇ（△−９）の配列を
示す。 （ａ）　　マルターゼ遺伝子及びマルトース　パーミア
ーゼ遺伝子。矢印は転写方向を示す。５ｔ（Ｓｔｕ　Ｉ
　）は欠失変異体の構成の開始点を示す。遺伝子開領域
の配列の該当部分はこの図面の下方に示されている。 （ｂ）　　ｐＧｂ−ｍ６ｇ　（△−９）の配列。欠失域
は−９から−４１７に及んでいる。ポリリンカーはオリ
ゴヌクレオチドに関係しており、これはＢａ１３１−処
理ＤＮＡに連結している（第４図を参照されたい）。 第６図はプラスミドｐＧｂ−ｉＡ３２／Ｇ４１８の構成
を示す。矢印は転写方向を示す。プラスミドは模式的に
図示され、量的測定のためではない。 記号：　Ｈ，ＨｉｎｄＩＩＩ　；　ＥＶ、　Ｂｃｏ　Ｒ
Ｖ　；　　ｆｌ　ｏｒｉ　。 複製ファージｆ１の起点；ａｍｐ、　　アムビシリン耐
性・遺伝子：Ｇ４１８．Ｔｎ５遺伝子（ＡＤＨＩプロモ
ーター）Ｇ４１８に対する耐性を与える；Ｓ。 Ｓｍａ　　Ｉ　；Ｈｃ　、旧ｎｃ　ＩＩ　；　ｐ　Ａ　
Ｄ　ＨＩ　、プロモーターアルコール　デヒドロゲナー
ゼ■遺伝子＋５′先導体部分（斜線域）。 第７図はプラスミドｐＧｂ−ｉＲＲＯ１の構成を示す。 （ａ）　　プラスミドｐＴ４は量的測定のための図示で
ない。記号：　Ｅ、　Ｂｃｏ　ＲＩ　；　Ｂ／Ｂｇ　、
　ＢａｍＨＩ／ＢｇＩ　ｎ連結；　Ｈ，Ｈｉｎｄ［。 （ｂ）ＥＦＩαＡプロモーター＋５′先導配列をマルタ
ーゼ遺伝子の５個のＮ−末端アミノ酸へ融合させるため
のｐＴｄ上の突然変異誘発。Ｂｇｌ■サイトも又生成さ
れる。対応する配列を示す。 突然変異誘発プライマーはＥＦＩαＡ配列に対し相補的
である（点線で示す）。マルターゼコドンと四角に囲っ
たＢｇｌ　　Ｉｆ認識サイトとに不適合個所がある〔変
異誘発プライマーのオリエンテーションは３′→５′で
あること、即ちＢｇｌ　　ＩＩサイトは右がら左へ（５
’　−３’　）読まれねばならないことに注意〕。 マルターゼ配列においてＮ−末端の５個のアミノ酸のコ
ドンが示されている。Ｂｃｌ　　Ｉの認識サイトは四角
に囲まれている。 ｐＴ４−Ｍ配列において突然変異を包含する配列が示さ
れている。Ｂｇｌ　ＩＦサイトは四角で囲まれている。 星印はマルターゼ、ヌクレオチド配列からの偏りを示す
。４番目のコドンの偏りは沈黙突然変異である。 （Ｃ）　　プラスミドは模式的に図示され、量的測定の
ためテハない。記号：　Ｈ、ｔｌ＋ｎｄ　ＩＩＩ　；　
　Ｂｃ。 Ｂｃｌ　　Ｉ　；Ｅ、　Ｅｃｏ　ＲＩ　；Ｂｇ、　Ｂｇ
ｌ　　ＩＩ　；ＥＶ。 Ｅｃｏ　ＲＶ　；Ｂｇ／Ｂｃ　、ＢｇＩ　　ｎ／Ｂｃｌ
　　Ｉ連結；ｐＥＦ１αＡ（斜線部分）、ＥＦＩαＡの
５′側（プロモータ−＋５′先導配列）　　；ｆｌ　ｏ
ｒｉ　。 複製ファージｆｌの起点；ａｍｐ、　　アムピシリン耐
性遺伝子。 （ｄ）　　プラスミドは模式的に図示され、量的測定の
ためではない。記号：前項（Ｃ）参照。 第８図はプラスミドｐＧｂ−３ＮＥＮＳの構成を示す。 プラスミドは模式的に図示され、量的測定のためではな
い。記号：Ｅ、　８ｃｏ　ＲＩ　；Ｈ。 ｔｌｉｎｄ　ｆｆｌ　；Ｓｆ、　Ｓｆｉ　　Ｉ　；Ｎ、
　Ｎｏｔ　　Ｉ　；ｆｌ　ｏｒｉ　、複製ファージｆｌ
の起点；ａｍｐ、　　アムピシリン耐性遺伝子。矢印は
５′→３′方向を示す。Ｏｌｉｇｏ　３及び４は既述の
基礎配列を有する合成オリゴ　デオキシヌクレオチドで
ある。 第９図はプラスミドｐＧｂＲＢ２の構成を示す。 プラスミドは模式的に図示され、量的測定のためではな
い。記号：　Ｅ、　Ｅｃｏ　ＲＩ　；Ｂｇ、　Ｂｇｌ　
　ＩＩ　；Ｈ，ｔｌｉｎｄ　ＩＩＩ；Ｈｃ、　Ｈｉｎｃ
　ＩＩ　；Ｅ３．　Ｂａｍ　ＨＩ　；Ｓｍ、　Ｓｍａ　
　Ｉ　；　Ｐ、　Ｐｓｔ　　Ｉ　；　ｆｌ　ｏｒｉ　、
複製ファージｆｌの起点；ａｍｐ、　　アムピシリン耐
性遺伝子。矢印は５′→３′方向を示す。オリゴ５及び
６は図示の通りの基礎配列を有するオリゴ　デオキシヌ
クレオチドである。下線は全解読枠の中のＴＡＡ翻訳終
止コドンである。 第１０図はプラスミドｐＧｂＲＢＮ３の構成を示す。矢
印は転写の方向を示す。プラスミドは模式的に図示され
、量的測定のためではない。 記号：Ｓｆ、　Ｓｆｉ　　Ｉ　；Ｓ＋ｔ＋、　Ｓｍａ　
　Ｉ　；　Ｈ，ＨｉｎｄＩ［［；ｆｌ　ｏｒｉ　、複製
ファージｆｌの起点；ａｍｐ、　　アムピシリン耐性遺
伝子；Ｇ４１８、Ｔｎ５遺伝子（ＡＤ旧プロモーターの
制御下に）Ｇ４１８に耐性を与える；　ＥＶ、　Ｂｃｏ
　ＲＶ　；Ｈｃ　、　Ｈｉｎｃ　ＩＩ。 第１１図はプラスミ）’ｐＧｂＲＢＲＲｏ１（７）構成
を示す。プラスミドｐＧｂ−ｉＲＲＯ１は第７図に説明
されており、ＥＦＩαＡプロモーター（ｐＥＦ１αＡ）
の指令下のマルターゼ遺伝子を含むと共にアルコール　
デヒドロゲナーゼＩ７’ロモーター（ｐＡＤＨＩ）の指
令下のマルトースパーミアーゼ遺伝子を含む〔双方のプ
ロモーターは斜線部分で示されている〕。ｐＧｂ−ＲＢ
２は第９図に示されている。ｐＧｂ−ＲＢＲＲＯｌにお
いて５ＩＴ４を含む断片は二部分（“Ｓ　ＩＴ４側”）
に分けられる。プラスミドは模式的に図示され、量的測
定のためではない。記号は第１０図の記号参照。矢印は
転写方向を示す。 第１２図は遺伝子の一工程開裂を示す。ステップ１にお
いて、ｐｃｂ−ＲＢＮ３はＳｆｉ　　Ｉを用いて切断さ
れる。その結果ＤＮＡ断片を生成するがこれはその両側
が５ＩＴ４遺伝子域と同種である。 これは５ＩＴ４遺伝子に対する統合を指令する（Ｒ，Ｊ
、　Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ　　（１９８３）　ｉｎ　Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎ巳ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　、　１（１１
　、　２０２参照］。５ＩＴ４遺伝子域は斜線部分で示
されている。双方の染色体対立遺伝子は模式的に示され
ている。ステップ２において、得られた菌株ＡｐＧｂ−
ＲＢＮ３はｐＵＴ３３２（未切断）及びｐＧｂ−ＲＢＲ
ＲＯＩ（Ｓｆｉ　　Ｉによって切断）の双方によって形
質転換される。共−形質転換の原理は文献ＣＡ、Ｈ１Ｂ
ｒａｎｄ、　Ｉ、　Ｂｒｅｅｄｅｎ、　Ｊ、Ａｂｒａｈ
ａｍ　、　ＲｏＳｔｅｉｇｌａｎｚａｎｄ　Ｋ、Ｋａｓ
ｍｙｔｈ　（１９８５）Ｃｅｌｌ　　４１．　４１−４
３　ａｎｄ　　Ｐ、５ｉｌｉｃｉａｎｏ　　ａｎｄ　　
Ｋ、　Ｔａｔｃｈｅｌｌ（１９８４）Ｃｅｌｌ　　３７
，９６９−９７８）に詳述されている。最初の選択にお
いて本発明者はフレオマイシン（ｐｈｌｅｏｍｙｃｉｎ
　）耐性のもの（プラスミドｐＵＴ３３２）を使用した
けれども他のヒグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）
　Ｂのような抗生物質に対する耐性を付与する２μｍ誘
導−二ピソームプラスミドをも使用し得ることは勿論で
ある。 ｐＵＴ３３２及びフレオマイシンは商業的販売元（Ｃａ
ｙｌａ　　、　　Ａｖｅｎｕｅ　　　Ｌａｒｒｉｅｎ　
　、　　Ｃｅｎｔｒｅ　　Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｄｅ　
Ｇｒｏｓ　、　３１０９４　Ｔｏｌｏｕｓｅ　　Ｃｅ’
ｄｅｘ　、　Ｆｒａｎｃｅ）から人手され得る。ＰＵＴ
３３２についてはフレオマイシン耐性遺伝子がトランス
ポランＴｎ５から誘導され、酵母のプロモーターの指令
下に配置された。ステップ３においてエピソーム　プラ
スミドｐＵＴ３３２が、非選択的培地中での成育による
形質転換体から取出される（キユアリング）。記号：Ｇ
４１８’、Ｇ４１８耐性遺伝子（Ａ［１ＨＩ）。 モーターの指令下）　　；Ｓｆ、　Ｓｆｉ　　Ｉの切断
によって生成されたＤＮＡ断片の末端；ＭＡＬ、交替処
理されたマルターゼ遺伝子及びマルトース　パーミアー
ゼ遺伝子。各種プラスミドの詳細については第９及び１
１図参照；＋ｐＵＴ３３２．エピソームプラスミドｐＵ
Ｔ３３２゜ 第１３図はマルトース　パーミアーゼ及びマルターゼの
特異的活性増加と培地Ａからのグルコース消失との相関
を示す。該図は市販の製パン用酵母菌株例えば菌株Ａに
ついて典型的なものである。 第１４図は培地Ａ中のトウー膨起模擬実験の際の菌株Ａ
並びにそのｒＤＮＡ誘導体のマルトースパーミアーゼの
特異的活性を示す。 第１５図は炭素及びエネルギーの主給源としてマルトー
スを含む培地Ａの中でのドウ膨起模擬実験の際の菌株Ａ
並びにそのｒＤＮＡ誘導体に関するマルターゼの特異的
活性を示す。 第１６図は炭素及びエネルギーの主給源としてマルトー
スを含む培地Ａの中でのトウー膨起模擬実験の際の菌株
Ａ並びにそのｒＤＮＡ誘導体によるマルトース発酵を示
す。 第１７図は炭素並びにエネルギーの主給源としてグルコ
ースを含む培地Ｂの中でのトウー膨起模擬実験の際の菌
株Ａ並びにそのｒＤＮＡ誘導体によるマルトース発酵を
示す。 口 め　　　　　工 ！− Ｎ口 ｌ）−リ ｃｃａａ”ｍｃａｃｃｏｗａａｏｃｅｃｃｍｃａｒｎｃ
ｃｏｍｃａａ　　ｓ’）Ｉｉｇｏ３及び４

Claims (41)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）形質転換されない親株酵母よりも糖類発酵速度を
    増大した形質転換酵母において、該形質転換酵母が形質
    転換の結果少なくともひとつの、好ましくは同種起源の
    ＤＮＡ構成体を該酵母中に存在させており、該ＤＮＡ構
    成体は“移入された糖基質の取込み及び（又は）初期の
    代謝的転化を促進するタンパク質をコードして該酵母内
    に発現させる少なくともひとつの遺伝子”を含有し、該
    遺伝子は該酵母内で発現され得るものであることを特徴
    とする前記の形質転換された酵母。
  2. （２）構成体が“マルトースパーミアーゼ活性、マルタ
    ーゼ活性又はマルトース調節用タンパク質活性を有する
    酵素をコードする少なくともひとつの遺伝子”又はそれ
    らの組合せを有する請求項（１）記載の酵母。
  3. （３）遺伝子（複数）又はそれらの組合せが“グルコー
    ス抑制に不感受性であってマルトース誘導に関与しない
    転写制御”の下でもたらされたものである請求項２記載
    の酵母。
  4. （４）遺伝子が“アルコールデヒドロゲナーゼ I （Ａ
    ＤＨＩ）及び（又は）翻訳延長因子 （ＥＦ１αＡ）プロモーターの転写制御”の下にある請
    求項（２）記載の酵母。
  5. （５）プロモーターが“サッカロミセス属に属する酵母
    、好ましくはサッカロミセスセレビシエ”からみちびか
    れたものである請求項（４）記載の酵母。
  6. （６）構成体がエピソーム要素の一部分である請求項（
    １）〜（５）のいずれか１項記載の酵母。
  7. （７）構成体が酵母の染色体の中へ統合され（組込まれ
    ）たものである前各項のいずれか１項記載の酵母。
  8. （８）少なくとも二つの構成体を有する前各項のいずれ
    か１項記載の酵母。
  9. （９）酵母が異種起源のＤＮＡを有しないものである前
    各項のいずれか１項記載の酵母。
  10. （１０）マルトースをエタノールと二酸化炭素とへ転化
    させる発酵の速度を改良し得る形質転換酵母において、
    該酵母が原核性ＤＮＡを実質上有していないこと、該Ｄ
    ＮＡが下記遺伝子即ちマルターゼ活性、マルトース　パ
    ーミアーゼ活性又はマルトース制御性タンパク質活性を
    コードする遺伝子のうちの少なくともひとつを有するこ
    とを特徴とする前記の酵母。
  11. （１１）マルターゼが“翻訳延長因子（ＥＦ１αＡ）プ
    ロモーターの転写遺伝子の発現制御”の下にもたらされ
    たものである請求項（１０）記載の酵母。
  12. （１２）マルトースパーミアーゼが“アルコールデヒド
    ロゲナーゼ I （ＡＤＨＩ）プロモーターの転写遺伝子
    の発現制御”の下にもたらされたものである請求項（１
    ０）又は（１１）記載の酵母。
  13. （１３）プロモーターがサッカロミセス属に属する酵母
    からみちびかれたものである請求項（１０）〜（１２）
    のいずれか１項記載の酵母。
  14. （１４）請求項（１）〜（１３）のいずれか１項記載の
    態様に従って得られた酵母を乾燥することによって製造
    されたことを特徴とする水分３〜８％を含有する酵母。
  15. （１５）酵母がサッカロミセス属に属する酵母、好まし
    くはサッカロミセスセレビシエである請求項（１４）記
    載の酵母。
  16. （１６）請求項（１）〜（１５）のいずれか１項記載の
    酵母を使用するＤＮＡによって仲介された形質転換とは
    異なる酵母菌株改良技法によって得られたことを特徴と
    する酵母。
  17. （１７）サッカロミセスセレビシエ ＡｐＧｂ−ｉＡ３２／Ｇ４１８株、 サッカロミセスセレビシエ ＡｐＧｂ−ｉＲＲｏ１株、 サッカロミセスセレビシエ ＡｐＧｂ−ｅＭＡＬ６ｇ株、 サッカロミセスセレビシエ ＡｐＧｂ−ｅＭＡＬ６１株、 サッカロミセスセレビシエ ＡｐＧｂ−ｅＭＡＬ６３株、 サッカロミセスセレビシエ ＣｐＧｂ−ｅＭＡＬ６ｇ株、 サッカロミセスセレビシエ ＡｐＧｂ−ｅＭＡＬ６１株、及び サッカロミセスセレビシエ ＡｐＧｂ−ｐ２ＲＢＲＲＯ１＃１株 から成る群から選ばれた酵母。
  18. （１８）請求項（１）〜（１７）のいずれか１項記載の
    酵母から得られた圧搾された、即時用乾燥又は活性乾燥
    酵母。
  19. （１９）テストＢにおいて１６５分間に酵母乾物重量２
    ８５ｍｇ当り少なくとも３４０ｍｌのガス生成を示し、
    テストＢ′において１６５分間に酵母乾物重量２８５ｍ
    ｇ当り少なくとも１７０ｍｌのガス生成を示し、好まし
    くはテストＢにおいて１６５分間に酵母乾物重量２８５
    ｍｇ当り３８０〜４５０ｍｌのガス生成及びテストＢ′
    において１６５分間に酵母乾物重量２８５ｍｇ当り１８
    ０〜２４０ｍｌのガス生成を示し、更に好ましくはテス
    トＢにおいて１６５分間に酵母乾物重量２８５ｍｇ当り
    少なくとも４００ｍｌのガス生成及びテストＢ′におい
    て１６５分間に酵母乾物重量２８５ｍｇ当り少なくとも
    １９０ｍｌのガス生成を示す請求項（１）記載の性質転
    換酵母から得られた圧搾酵母。
  20. （２０）テストＢにおいて１６５分間に酵母乾物重量２
    ８５ｍｇ当り４００〜５００ｍｌのガス生成、好ましく
    はテストＢにおいて１６５分間に酵母乾物重量２８５ｍ
    ｇ当り４４０ｍｌのガス生成を示す請求項（１）記載の
    形質転換酵母から得られた圧搾酵母。
  21. （２１）請求項（１９）、又は（２０）記載の圧搾酵母
    を乾燥することによって得られた即時用乾燥又は活性乾
    燥酵母。
  22. （２２）テストＣにおいて１６５分間に酵母乾物重量２
    ８５ｍｇ当り３１０〜３６０ｍｌのガス生成、テストＣ
    ′において１６５分間に酵母乾物重量２８５ｍｇ当り１
    ４５〜１９５ｍｌのガス生成を夫々示し、好ましくはテ
    ストＣにおいて１６５分間に酵母乾物重量２８５ｍｇ当
    り少なくとも３３０ｍｌのガス生成、テストＣ′におい
    て１６５分間に酵母乾物重量２８５ｍｇ当り少なくとも
    １５５ｍｌのガス生成を示し、又はテストＣにおいて１
    ６５分間に酵母乾物重量２８５ｍｇ当り３２０〜４００
    ｍｌのガス生成を示し、好ましくはテストＣにおいて１
    ６５分間に酵母乾物重量２８５ｍｇ当り少なくとも３５
    ０ｍｌのガス生成を示す請求項（１）記載の形質転換酵
    母から得られた乾燥酵母。
  23. （２３）ｐＧｂ−ｅＭＡＬ６ｇ、 ｐＧｂ−ｅＭＡＬ６１、 ｐＧｂ−ｅＭＡＬ６３、 ｐＧｂ−ｉＡ３２／Ｇ４１８、 ｐＧｂ−ｉＲＲｏ１、 ｐＧｂ−Ｍ６ｇ（△−９）、 ｐＧｂ−ＲＢＲＲＯ１、 ｐＧｂ−ＲＢＮ３、及び ｐＧｂ−ＲＢＲＥＧＯ１ から成る群から選ばれたベクター。
  24. （２４）請求項（１）〜（２２）のいずれか１項記載の
    酵母を含有することを特徴とするドウ又は類似製品。
  25. （２５）請求項（１）〜（２２）のいずれか１項記載の
    酵母の使用を特徴とする穀粉性ドウ発酵製品又はアルコ
    ール性飲料及び他のアルコール性製品の製造方法。
  26. （２６）糖類の発酵速度を改良し得る形質転換酵母の製
    造のために少なくともひとつの同種起源のＤＮＡ構成体
    を酵母内へ導入する方法において、該構成体が“移入さ
    れた糖基質の取込み及び（又は）初期の代謝的転化を促
    進するタンパク質をコードする少なくともひとつの遺伝
    子”を有すること、該導入がＤＮＡによって仲介された
    形質転換技法を包含するか又は他の酵母株改良技法を包
    含することを特徴とする上記の形質転換酵母製造方法。
  27. （２７）構成体がマルターゼ活性、マルトース　パーミ
    アーゼ活性又はマルトース制御タンパク質活性を呈する
    酵素をコードする少なくともひとつの遺伝子を有する請
    求項（２６）記載の方法。
  28. （２８）構成体が少なくとも二つの該遺伝子を有する請
    求項（２７）記載の方法。
  29. （２９）遺伝子が“アルコールデヒドロゲナーゼ I （
    ＡＤＨＩ）及び（又は）翻訳延長因子 （ＥＦ１αＡ）プロモーターの夫々の転写制御”の下に
    ある請求項（２７）項記載の方法。
  30. （３０）遺伝子又はそれらの組合せが“グルコース抑制
    に不感受性であり、及び（又は）マルトース誘導に関与
    しない転写制御”の下でもたらされたものである請求項
    （２６）〜（２９）のいずれか１項記載の方法。
  31. （３１）構成体がエピソーム要素の一部分である請求項
    （２６）〜（３０）のいずれか１項記載の方法。
  32. （３２）構成体が酵母の染色体の中へ統合され（組込ま
    れ）たものである請求項（２６）〜（３０）のいずれか
    １項記載の方法。
  33. （３３）少なくとも二つのＤＮＡ構成体の誘導を包含す
    る請求項（２７）〜（３２）のいずれか１項記載の方法
    。
  34. （３４）酵母が異種起源のＤＮＡを有せず、遺伝子置換
    技法を用いて遺伝子（複数）を染色体の中へ統合するこ
    とを包含する請求項（２６）〜（３０）のいずれか１項
    記載の方法。
  35. （３５）染色体の胞子形成−特異的遺伝子が“同一の胞
    子形成−特異的遺伝子を有するＤＮＡセグメント”によ
    って置換され、該セグメントの中に請求項（２６）又は
    （３２）記載の遺伝子が挿入される請求項（３４）記載
    の方法。
  36. （３６）プロモーターがサッカロミセス属に属する酵母
    からみちびかれたものである請求項（２９）記載の方法
    。
  37. （３７）酵母がサッカロミセス属に属する酵母、好まし
    くはサッカロミセスセレビシエである請求項（２６）〜
    （３６）のいずれか１項記載の方法。
  38. （３８）請求項（２６）〜（２７）のいずれか１項記載
    の方法に従って製造された酵母の適用を特徴とするドウ
    又は類似製品の製造方法。
  39. （３９）請求項（２６）〜（２７）のいずれか１項記載
    の方法に従って製造された酵母の使用を特徴とするアル
    コール性飲料及び他のアルコール性製品の製造方法。
  40. （４０）請求項（２６）〜（２７）のいずれか１項記載
    の方法に従って製造された酵母の使用を特徴とするパン
    及び関連製品の製造方法。
  41. （４１）請求項（２６）〜（２７）のいずれか１項記載
    の方法に従って製造された酵母の使用を特徴とするマル
    ターゼ又はマルトースパーミアーゼ活性を有する酵素の
    製造方法。
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