JP2683253B2 - 糖類の発酵速度を増大させた酵母及び該酵母の製法 - Google Patents

糖類の発酵速度を増大させた酵母及び該酵母の製法

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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は糖類の発酵を改良し得る新規の酵母に関する
と共に該酵母の構成及び該改良された酵母の用途に関す
る。
〔従来の技術〕
例えばサッカロミセス（Saccharomyces）属に属する
酵母菌株は嫌気性条件下に糖類を発酵（fermenting）さ
せてCO2とエタノールとの夫々のおよそ等モル量を産生
し得ることは公知である。ドウにおける酵母の発酵（即
ちCO2生成）活性（leavening activity）は上記の糖類
発酵の結果である。製パン用酵母の商業的製造は圧搾酵
母又は新鮮酵母及び乾燥酵母を包含する。乾燥酵母は夫
々水分含有率約６〜８％及び３〜６％の活性乾燥酵母と
して、及び即時乾燥酵母として入手され得る。
酵母の作用による糖類の代謝における初期段階のひと
つは原形質膜を横断する糖分子の移入である。各種糖類
のための特異的担体が酵母の中で発現する。例えばマル
トースの取込みは特異的なマルトース パーミアーゼの
存在に依存する。該担体は最大速度（Vmax）と親和常数
（Km）との差によって区別される二つの形態において存
在し得る〔A.Busturia and R.Lagunas,Biochem.Biophy
s.Acta 820,324（1985）〕。酵母の原形質膜を横断する
マルトースの移動は該膜中の電気化学的陽子勾配に関連
している。各ひとつのマルトース分子の取込みにはひと
つの陽子が共同的に移動する〔R.Serrano,Eur.J.Bioche
m・80,97（1977）〕。
細胞内においてマルトースは、マルターゼ（α−グル
コシダーゼ）による触媒反応において、２個のグリコー
ス分子にまで加水分解される。次いでグリコースはエム
ブデン−マイヤホフ（Embden−Meyerhof）の経路を介し
て二酸化炭素とエタノールとに転化する。グリコース発
酵に比してマルトース発酵のためには２種の追加の酵素
即ちマルトース パーミアーゼ及びマルターゼが必要で
ある。該酵素類の合成はマルトースによって誘導され、
グリコース、フラクトース又はマンノースによって抑制
される。ショ糖無添加〔“無ショ糖（lean）”〕ドウに
おいては酵母に利用される最大量の糖はマルトースであ
る。ドウに対してショ糖を添加した場合には該二糖類は
酵母による細胞外加水分解を受けてグリコースとフラク
トースとを生ずる。次いでこれらのヘキソースは別種の
パーミアーゼの作用により、酵母に取込まれる。
マルトース含有培地、例えばドウ、に対するショ糖添
加は酵母細胞によるマルトース代謝を阻害することが一
般的に見出されている。これはマルトース パーミアー
ゼ及びマルターゼをコードする遺伝子の転写がグリコー
スによって抑制される事実にもとづく〔R.B.Needleman,
D.B.Kaback,R.A.Dubin,E.L.Perkins,N.G.Rosenberg,K.
A.Sutherland,D.B.Forrest and C.A.Michels,Proc,Nat
l.Acad.Sci.USA81,2811（1984）〕。
マルトースの取込みと加水分解とに必要な遺伝子はMA
L−遺伝子座の中に集積されている（R.B.Needleman et
al.Supra）。サッカロミセスの菌株は５個以下のMAL−
遺伝子座（MAL1−４及びMAL6）を有するがこれらは不同
であって各種染色体の末端小粒のところに位置する〔J.
L.Celenza and M.Carlson Genetics109,661−664（198
5）〕。MAL−遺伝子座は、マルトース パーミアーゼ、
マルターゼ及び単数並びに複数の調節用タンパク質（MA
Lレギュレーター）をコードする遺伝子を有するが、こ
れらはマルトースによる誘導を必要とする〔R.B.Needle
man et al.Supra;J.D.Cohen,M.J.Goldenthal,T.Chow,B.
Buchferer and J.Marmur,Mol.Gen.Genet.200,1（198
5）;R.A.Dubin,E.L.Perkins,R.B.Needleman and C.A.Mi
chels,MOL.Cell.Biol.6,2757（1986）〕。該遺伝子類は
単離されてクローニングされた〔A.O.J.D.Cohen et a
l.,Supra;R.B.Needleman et al.,Supra;H.J.Federoff,
J.D.Cohen,T.R.Eccleshall,R.B.Needleman .B.A.Buchfe
re,J.Giacalone and J.Marmur,J.Bacteriol.149,1064
（1982）〕。
既述の通り無ショ糖ドウの中での酵母発酵は主基質と
してのマルトースに依存する。マルトースはドウ中でア
ミラーゼの作用によってデンプンから産生されるが該ア
ミラーゼは穀粉中に通常存在している。更に穀粉は種々
の量（０〜0.5％）のグルコース、ラフイノース等のよ
うな遊離糖類を含有する〔H.Suomalainen,J.Dettwiler
and E.Sinda,Process Biochem.7,16（1972）〕。該糖類
は酵母によって迅速に消費される。マルトース発酵と製
パン用酵母の発酵活性との間の可能性ある相関の研究に
ついて刊行物がある。或る場合にはマルトース発酵速度
とマルターゼ活性及びマルトース パーミアーゼ活性と
の間の陽性の相関が見出された。けれどもマルターゼ活
性及びマルトース パーミアーゼ活性と無ショ糖ドウの
発酵能との間の陽性相関は観察され得なかった。〔P.Ha
utera and T.Loevgren,J.Inst.Brew.81,309（1985）;T.
Loevgren and P.Hautera,Eur.J.Appl.Microbiol.4,37
（1977）〕。
マルターゼ及びマルトース パーミアーゼをコードす
る遺伝子を有るマルチコーピー（DNA多配列）のプラス
ミドを有す酵母細胞の形質転換はマルターゼの特異的活
性を４倍に増加させたけれどもマルトース パーミアー
ゼ活性は増大されなかった。調節用タンパク質をコード
する追加の遺伝子の導入はマルターゼの特異的活性を中
等度に増加させたけれども、この場合にも又、マルトー
ス パーミアーゼ活性については何の効果も観察されな
かった（J.D.Cohen et al.,Supra）。上記の研究者達
は、得られた形質転換体について二酸化炭素又はエタノ
ール産生に関する試験を行なわなかった。従来技術にお
いて該試験の遂行を断念した理由はマルトース パーミ
アーゼ活性及びマルターゼ活性と無ショ糖ドウの二酸化
炭素産生（発酵活性）との間に相関が無いということが
繰返し示された点にあったことは事実である〔H.Suomal
ainen,J.Dettwiler and E.Sinda,Supra;H.Suomalainen,
Eur.J.Appl.Microbiol.1,1（1975）;P.Hautera and T.L
oevgren,Supra;T.Loevgren and P.Hautera,Supra〕。
〔発明の開示〕
今や本発明において、統合された（組込まれた）プラ
スミドによって形質転換された酵母は、形質転換されな
い菌株に比し、マルトース パーミアーゼ活性及びマル
ターゼ活性について増大されたレベルを示すことが見出
されたがこれらに関する諸例は後文に記載される。該増
大されたマルターゼ活性及びマルトース パーミアーゼ
活性はドウのCO2の生成即ち発酵活性の増加と一致する
ことは驚異に値するし、これはエピソーム ベクター
（episomal vectors）を用いて形質転換された酵母の場
合に観察されたことでもある。
該改良された酵母は、糖類例えばマルトースを炭素及
びエネルギー源として含有する倍地中で例えば高度の二
酸化炭素及びエタノール産生を達成する高速度の代謝作
用を示す。本発明方法は組換えDNA技法の適用を包含す
るがそれによれば、該酵母のマルトース発酵速度は、他
の糖類例えばグリコースの存在とは無関係に、激裂に増
加する。
更に該改良された酵母菌株はドウ（練り粉）の中で優
秀なドウ発酵活性（ガス生成）を示す。同様に該酵母の
高速度のエタノール産生は可飲性及び工業的のアルコー
ル製造に使用される酵母の発酵時間を減ずる。即ち一定
時間内のより大量のアルコール製造を達成するのであ
る。
更に、マルトース（の集積）が糖又はデンプン転化酵
素を阻害する場合には該発酵工程においてマルトースの
迅速な除去が有利である。本発明方法の適用により、マ
ルターゼ及び（又は）マルトース パーミアーゼをコー
ドする余分の遺伝子（単数又は複数）を導入された酵母
を製造し得る。
本発明は形質転換酵母を提供すると共に糖類の発酵速
度について改良された該酵母の製造方法を提供するが該
方法は少なくともひとつの、好ましくは同種起源のDNA
構成体を酵母の中へ導入すること、該DNA構成体は、移
入された基質の取り込み及び（又は）初期の代謝的転化
を促進するタンパク質をコードする少なくともひとつの
遺伝子を該酵母の中に有すること、該遺伝子は該酵母の
中で発現し得ることを特徴とする。糖の発酵速度をドウ
発酵の数相を通じて改良し得るものであり、例えばマル
トース又はショ糖の発酵速度を増大し得る。
同種起源DNAという用語は同じ酵母の属から由来するD
NAを意味する。例えばサッカロミセス属菌はサッカロミ
セス属から由来するDNAを用いて形質転換される。かよ
うにして遺伝子に以前は存在しなかった新性質を導入す
ることなく、酵母の遺伝子の既存の諸性質を改良し得る
のである。ショ糖の発酵速度の改良は好気的及び（又
は）嫌気的な条件下で達成される。目的の遺伝子はパー
ミアーゼ、特にマルトース パーミアーゼ、サッカリダ
ーゼ、特にマルターゼ、キナーゼ、特にヘキソキナーゼ
及びグルコキナーゼ及び類似酵素の遺伝子を包含する。
本発明は例えばグルコース又はフラクトースの取込みに
必要な担体タンパク質に適用され、及びヘキソースから
フキソースリン酸エステルへの初期の細胞間代謝的転化
を触媒するヘキソキナーゼ及びグルコキナーゼに適用さ
れる。
本発明は又少なくともひとつの同種起源DNA構成体を
酵母の中へ導入する効率のよい方法をも提供する。
本発明はマルトースの取込み及びマルトースからグル
コースへの初期の代謝的転化を促進するタンパク質をコ
ードする少なくともひとつの遺伝子を有する構成体へ適
用されることが有利である。かようにしてもとの（宿主
の）菌株と比較していくつもの利点を有する酵母を製造
し得る。該改良された酵母の有利性は改良されたエタノ
ール及びCO2製造法において特別顕著にみとめられる。
例えば本発明を製パン用酵母に適用した場合に製パン業
者に莫大な利益をもたらすがその理由は無ショ糖ドウの
膨起のために所要時間と所要酵母とを減ずる点にあり、
それは新規酵母菌株のドウ発酵活性が改良されたからで
ある。
本発明に従う形質転換酵母は、DNA仲介による形質転
換ではない菌株改良技法例えば原形質体融合、集団交配
及び集団突然変異の諸技法、において出発原料菌株とし
て使用され得ることが認識されよう。その結果得られた
菌株は本発明の一部であると考えられる。
本発明の好適態様に従えば新規酵母菌株はグルコース
存在下においても実質量のマルトースを消費する。従っ
て甘味ドウ製造のためのショ糖の添加必要量を減ずるか
ら製パン強者はショ糖経費を節約し得る。
耐浸透圧性の酵母は無ショ糖ドウにおいて貧しい能力
（貧しいドウ発酵活性）を示すことが公知である。耐浸
透圧性酵母という用語は甘味性ドウにおける良好な能力
を有する酵母を意味する。甘味性ベーカリー製品のため
にドウは例えば10〜30％（穀粉重量基準）のショ糖を含
む。従って本発明に従って形質転換されるべき宿主とし
て耐浸透圧性菌株を選択した場合には、甘味性ドウに適
用されるのみならず無ショ糖ドウにも又適用される耐浸
透圧性酵母を得る、これはマルトース発酵能が本発明に
よって改良されたことに基づくのである。かようにして
製パン業者は甘味性ドウと無ショ糖ドウとの双方のため
に唯ひとつのタイプの酵母を要する便利さを得るのであ
る。
無ショ糖ドウと甘味性ドウとの双方において良好な能
力をもつ酵母菌株の必要性は例えば欧州特許出願EP−Ａ
−128524及びドイツ特許出願DE−Ａ−2757778号明細書
に記載されている。ショ糖富化及び無ショ糖のドウにお
ける良好な能力をもつ酵母の取得のために欧州出願EP−
Ａ−128525号明細書は原形質体融合法を記載している：
上記DE−Ａ−2757778号明細書は該酵母菌株取得のため
に交雑法又は突然変異法によって製造された二倍の固体
群からの菌株選択法を記載している。該両技法は莫大な
数の実験を要すると共に実験結果は予測不可能であり、
再現不可能である。本発明方法の使用により形質転換酵
母菌株の使用にもとづく制御された、再現可能な成績を
得ることができる。本発明に従って製造された菌株の試
験は最少数に止まるがその理由は菌株自体の諸性質が、
開示された改良性質に関すること以外には、実質上変更
されていない点にある。
本発明は圧搾酵母を提供するが該圧搾酵母はテストＢ
において165分間に酵母の乾物重量を285mg当り少なくと
も140mlのガス生成を示し、テストＢ′において酵母の
乾物重量285mg当り少なくとも170mlのガス生成を示す。
テストＢ及びＢ′については下文において記載される。
好まくは圧搾酵母はテストＢにおいて265分間に酵母の
乾物重量285mg当り380〜450mlのガス生成を示し、テス
トＢ′において酵母の乾物重量285mg当り180〜240mlの
ガス生成を夫々示し、更に好ましくはテストＢにおいて
酵母の乾物重量285mg当り少なくとも400ml、テストＢ′
において酵母の乾物重量280mg当り少なくとも190mlのガ
ス生成を夫々示す。有利なのはこの圧搾酵母から即時乾
燥又は活性乾燥酵母を製造することである。圧搾酵母の
乾燥中に、乾物重量基準で一般に15〜25％のドウ発酵活
性が失なわれる。本発明は又乾燥酵母（水分３〜８重量
％）を提供するが外乾燥酵母はテストＣにおいて165分
間に酵母の乾物重量285mg当り310〜360mlのガス生成、
テストＣ′において酵母の乾物重量285mg当り145〜195m
l、及び好ましくはテストＣにおいて酵母の乾物重量285
mg当り少なくとも330ml、テストＣ′において酵母の乾
物重量285mg当り少なくとも155mlのガス生成を夫々示
す。本発明に従って製造された酵母を用いて得られるガ
ス値は、たとえテストＣ及びＣ′において市販酵母菌株
がテストされたとしても、決して見出されなかったガス
値である。本発明は又０〜６或いは０〜10％のショ糖含
有ドウについてドウ発酵活性において良好な性能を示す
酵母として適用され得る。かようにして圧搾酵母の製造
が可能であり、該圧搾酵母はテストＢにおいて165分間
に酵母乾物重量285mg当り400〜500mlのガス生成を示
し、好ましくは該圧搾酵母は酵母乾物重量285mg当り少
なくとも440mlのガス生成を示すものである。次いで乾
燥酵母を得ることができるが該乾燥酵母はテストＣにお
いて165分間に酵母の乾物重量285mg当り320〜400mlのガ
ス生成を示し、好ましくは該乾燥酵母は酵母の乾物重量
285mg当り少なくとも350mlのガス生成を示す。
可飲性及び工業用アルコールの製造のための発酵にお
いて上記の新規酵母菌株は同様の利益を達成することが
見出されている。
マルトースが基質として用いられる場合に本発明の新
規酵母菌株の代謝速度は一般的に増大するので、代謝産
物例えばグリセロール及び芳香含有化合物の一般的産生
速度も又増加する。
本発明の一態様において、マルトース発酵に含まれる
単数又は複数のタンパク質をコードするDNA構成体を有
するベクターが提供される。本発明は又宿主微生物、好
ましくは酵母、例えば本発明によって開示されたベクタ
ーを用いて形質転換されたサッカロミセス属の種を提供
する。これらのベクターは自己複製性であり得るし、有
利にはマルトース パーミアーゼ、マルターゼ及びマル
トース制御タンパク質をコードする遺伝子群からえらば
れた遺伝子又は遺伝子群の組合せを有し得るものであ
る。驚くべきことに、上記のベクターを用いて形質転換
された酵母は増大された速度のマルトース発酵を示し、
その結果ドウにおける増加された速度のCO2産生をもた
らす。これらの追加の遺伝子（複数）はエピソームに座
位をもつが、文献公知の通り該染色体外の分子は非選択
的繁殖（即ちこの特別な場合においてはG418の不在下の
生育）の過程で容易に失なわれることが公知である〔C.
D.Hollenberg（1982）Gene Cloning12,Organisms other
than E.coli.Eds.P.H.Hofschneider,W.Goebel,Springe
r Verlag,119;S.A.Parent,C.M.Fenimone,and K.A.Bosti
an（1985）,Yeast 1,83〕。実際的見地からは酵母を非
選択的に培養することが好適であり、従って好ましくは
“交替処理又は変性された（altered）マルターゼ遺伝
子及び（又は）マルトース パーミアーゼ遺伝子”を有
するひとつのセットの“統合されたプラスミド”を構成
させることが有利である。なお、“交替処理又は変性さ
れた”という用語は他のプロモーター好ましくは同種起
源のプロモーターによる天然プロモーターの交換（exch
ange）を意味する。選択的加圧（selective pressure）
を行なわない時のプラスミドの安定な増殖を許すように
プロセスを進行させる場合には、新規導入のDNAの統合
は、安定な形質転換体の製造のために、前もって必要で
はない。
ひとつの細胞が分子数20〜100の余分のプラスミドを
含有することは文献公知である〔C.D.Hollenberg（198
2）,Supra;A.takagi,E.N.Chun,C.Boorchird,S.Harashim
a and Y.Oshima,Appl.Microbiol.Bioechnol.23,123;J.M
ellor,M.J.Dobson,N.A.Roberts,N.J.Kingsman and S.M.
Kingsman（1985）Gene 33,215〕。
エピソーム遺伝子の発現レベルはもとのプロモーター
を強力なプロモーターで交換することによって更に増加
させ得る。選択的加圧を行なわない場合のプラスミドの
安定な複製を可能とすることが更に好ましいように思わ
れる。
マルターゼ遺伝子及び（又は）マルトース パーミア
ーゼ遺伝子は、本発明に従い、直線型プラスミドの使用
下の形質転換を介して酵母の染色体の中へ有利に統合さ
れ（組込まれ）る〔参照文献:T.L.Orr−Weaver,J.W.Szo
stak,R.Rothstein（1981）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.7
8,6354）〕。得られた酵母は安定な形質転換体であり、
即ち選択的加圧を行なわずとも交替処理されたマルター
ゼ遺伝子及び（又は）マルトース パーミアーゼ遺伝子
はゲノム内に保有される。
統合の際に、プラスミド上に位置するひとつ又は僅か
なコピー数の遺伝子は染色体へ統合されることは公知で
ある。従ってエピソームのベクターの使用時に得られる
改良と同様な改良をCO2生成について得るために、グル
コースによる抑制に対して不感受性である強力な構成性
をもつプロモーターの適用によって、遺伝子発現レベル
を交替させることが有利である。該プロモーターが好適
である理由は、エピソーム ベクターによって転換され
た酵母と統合性ベクターによって転換された酵母との間
における遺伝子コピー数の差を補償するための、及びグ
ルコース抑制の影響を阻止するためである。例えば、比
較的低濃度のグルコースと炭素及びエネルギーの主給源
としてマルトースとを含有する倍地の中で最初の30〜40
分間の発酵を行なわせると、マルトース パーミアーゼ
とマルターゼとのmRNAレベルは判然と検出し得る程度に
降下する。グルコースが消費されるとマルトースによる
遺伝子発現の誘導は双方のmRNAレベルを急速に増加させ
る。
既述の通り、遺伝子は該遺伝子の天然型即ち野生型の
プロモーターと共に使用され得るか又はプロモーターは
異種のプロモーター、好ましくは同種起源のプロモータ
ーによって置換され得る。特に野生型プロモーターが制
御可能な又は誘導可能である場合には、それを構成的転
写のため、又はより強力な、或はより弱力なプロモータ
ーとして、提供することが望ましい。それとは逆に、野
生型プロモーターが構成可能である場合にはそれを制御
可能又は誘導可能なプロモーターとして、或いはより強
力もしくはより弱力なプロモーターとして提供すること
が有利である。
望ましくは、宿主内の構成体のコピー数が比較的に少
ない場合には強力なプロモーターを使用する。強力プロ
モーターは、酵母の活性サイクルにおいて高量に産生さ
れるタンパク質製造の際に通常含まれるものであるか又
は制御可能の場合には、酵母の生活サイクルにおける或
る時期に、本発明に関連するものである。
酵母の解糖回路に関係するプロモーターは特に興味あ
るものであり、これはアルコール デヒドロゲナーゼＩ
及びII、ホスフオグルコイソメラーゼ、グルコース−６
−ホスフェート デヒドロゲナーゼ、トリオース ホス
フェート イソメラーゼ、グリセルアルデヒド ホスフ
ェート デヒドロゲナーゼ、ホスフオグリセレート キ
ナーゼ、エノラーゼ、ホスフオグリセロミュターゼ、ピ
ルベート、キナーゼ及びラクテート デヒドロゲナーゼ
を包含する。高量の産生されるタンパク質と共に含まれ
るその他のプロモーターはリボソーム発現に関係するプ
ロモーター、例えば開始因子、延長因子及び類似因子の
転写用のプロモーターを包含する。特殊の延長因子はEF
−１及びEF−２、及びその他を包含する。
特に興味あることは、マルトース代謝に含まれる構造
遺伝子と組合されるプロモーター、特にマルターゼ、マ
ルトース パーミアーゼ及びMAL−レギュレーターの使
用である。これらのプロモーターは、該プロモーターが
糖の発酵時に誘導されるものである限り、構成可能であ
るか又は制御可能である。例えば解糖プロモーターの多
くのものは糖又は糖代謝物例えばエタノールの存在下に
活性化される。従ってプロモーター例えばアルコール
デヒドロゲナーゼは穀粉使用のドウ発酵の際に活性であ
る。同様に細胞増殖に関係するプロモーターはドウ発酵
時にも活性である。更にMALレギュレーターによって制
御されないプロモーターの提供にもとづき、グルコース
存在下においても抑制を受けることなく酵母を使用し得
る。のみならず、遺伝子は誘導のためのマルトースを必
要としない。
上記の構造遺伝子と組合されて野生型プロモーターが
使用される場合には調節用タンパク質の増産が望まし
い。かようにして調節用タンパク質は誘導物質存在時に
高いレベルに維持される。例えばマルトース存在下にMA
L調節用タンパク質は高レベルに発現され、かようにし
て該タンパク質は“マルトース代謝に関係する他のタン
パク質”及び“MAL調節用タンパク質によって制御され
る他のタンパク質”の発現のために提供される。
遺伝子発現における交替処理は、後文中の実験操作に
詳記されるように、宿主酵母例えばサッカロミセス属酵
母から好適に誘導されるアルコールデヒドロゲナーゼＩ
（IDHI）及び翻訳延長因子EF1αＡの交替処理のため
に、もとのプロモーター プラス（−部分）の未翻訳先
導配列の交換を包含する。その結果、発現はグルコース
抑制に対して不感受性となり、誘導についてマルトース
に無関係となる。
これらの統合されたプラスミドによって形質転換され
た酵母は形質転換されない菌株に比してマルトース パ
ーミアーゼ活性及びマルターゼ活性４のレベルを増大す
ることが見出された。該増大されたマルターゼ活性及び
マルトース パーミアーゼ活性は、エピソーム ベクタ
ーの使用によって転換された酵母の場合にも観察された
ように、CO2生成又はドウ発酵作用の増大と一致するの
であり、これは驚きに値する。
ドウ発酵活性における改良の成果は、昇温例えば20〜
25℃の温度における貯蔵の際にさえも保持される。貯蔵
時におけるドウ発酵活性の相対的損失は親酵母菌株と本
発明の酵母菌株とについて実質上同じである。ショ糖高
度含有ドウのドウ発酵活性は“導入された改良”によっ
て影響されないがその理由は、統合されたプラスミド使
用下に形質転換された新規菌株のドウ発酵活性は宿主菌
株を用いて得られる該活性と同じく良好であるからであ
る。
本発明で使用される酵母宿主は少なくともひとつのコ
ピーの構成体を有し、二つ又はそれ以上、通常は約200
以下のコピーに拡大されるが、これは遺伝子がゲノムの
中に統合されているか、又は多配列のコピー数を有する
染色体外の要素上に存在するかどうかに依存する。統合
か又は非統合かについては、調製された染色体外要素の
保持に必要な安定性、所望のコピー数、コピー数に対応
する可能な転写のレベル及び類似条件に依存して選択さ
れる。
本発明の構成体は、同じか又は異なるプロモーター
（複数）を有する単数又は複数の構造遺伝子を有し得
る。該構成体は常法によって製造され得るものであり、
適当な宿主からの所望の遺伝子の単離により、遺伝子の
全部又は一部分の合成により、又はそれら技法の組合せ
により製造され得る。同様に、調節用シグナル、転写用
及び翻訳用の開始或及び終了域は天然源から単離され、
又は合成され、或いは該技法の組合せによって調製され
る。各種の断片はエンドヌクレアーゼによる切断（制
限）、連結、配列形成、インビトロでの突然変異誘発、
プライマーの補修又は類似技法に付され得る。該各種の
技法は文献周知であって特異な目的達成に使用されよ
う。
各種の断片を慣用法によって結合させ、クローニング
させ、単離し及び配列化する。夫々の技法の適用後に、
DNA断片（フラグメント）又は断片の組合せをクローン
形成用ベクターの中へ挿入し、このベクター使用によっ
てクローニング用宿主例えば大腸菌（E.coli）を形質転
換させ、クローニング用宿主を成育させ、溶菌化し、プ
ラスミドを単離し、断片を制限分析によって分析し、配
列化し、組合せ、又は類似操作を施す。
構成体の拡大及び宿主細胞の形質転換の過程において
各種ベクターを使用し得る。これらのベクターはクロー
ン形成用ベクター、発現用ベクター及び宿主の中への統
合用ベクター又は形質転換と統合とのための裸の（bar
e）DNAの使用におけるベクターを包含する。
クローニング形成用ベクターは、その大部分につい
て、クローニング用宿主内で機能する複製起点、クロー
ン形成用ベクターを有する宿主の選択のためのマーカー
を有することによって特徴づけられ、該クローン形成用
ベクターは単数又は複数のポリリンカー、又は挿入、選
択、処置、配列の容易化、切除又は類似操作のための追
加の配列を有し得る。更にシヤトルベクターをも使用し
てよく、該シヤトルベクターは２個又はそれ以上の複数
開始点を有してよく、かようにして該ベクターはひとつ
以上の宿主、例えば原核性宿主及び真核性宿主、の中で
複製され得る。
発現ベクターは、通常の場合に、転写及び翻訳の開始
域と終了域とを含む構成体の挿入のためのものであり、
又は該構成体は該調節域の一方又は双方を欠失してお
り、該調節域はタンパク質産生物をコードする配列の挿
入に関する発現ベクターによって提供される。かように
して構成体は、転写機能性域と翻訳域とを有する遺伝子
の中へ挿入され、この場合は挿入は５′一末端の近傍で
行なわれ、或いは現存する遺伝子と構成体とは現存する
調節域の調節制御の下にある。通常は、溶融産生物が受
容可能である場合を除き、開始コドンは現存する開始コ
ドンの５′であることが望ましく、又は該開始コドンは
現存開始コドンを有する相の外にあることが望ましい。
他の例において、単数又は複数の制限サイトを有する発
現ベクターは開始調節域と終了調節域との中間に存在
し、かようにして構造遺伝子は制限サイト（単数又は複
数）の所で挿入され、及び該構造遺伝子は上記の域（複
数）の調節制御の下にあり得る。本発明にとって特に有
利であるのは、染色体外の安定保持のためか又は統合の
ために、発現用ベクターとして宿主内で安定形を有る構
成体及びベクターは異種起源（非サッカロミセス属）の
DNAを有していないことである。
本発明の更に他の態様に従えば、本発明において既述
する利益のすべてをもたらすのみならず原核性DNA配列
を除去した酵母を製造する諸方法を提供する。これは遺
伝子置換技法〔R.J.Rothstein（1983）Methods in Enzy
mology,101,202〕によって遂行された。本発明に従って
該技法はサッカロミセス属細胞群に対して有利に適用さ
れている。例えば交替処理されたマルターゼ及び（又
は）マルトース パーミアーゼをコードする遺伝子を有
するベクターを用いてサッカロミセス属細胞群を形質転
換させた結果、サッカロミセス属の胞子形成−特異的遺
伝子〔E.Gottlin−Ninga,D.B.Kaback（1968）Mol.Cell.
Biol.6,2185〕の中に座位が定められた。このDNAをサッ
カロミセス属の宿主細胞の中へ導入した後に、該染色体
上の胞子形成−特異的遺伝子を用いて、新規に導入され
たDNAの相同的組換えを起させた。結果として、交替処
理されたマルターゼ遺伝子及び（又は）マルトース パ
ーミアーゼ遺伝子は胞子形成−特異的配列（複数）の中
間に包埋され、該マルターゼ遺伝子及び（又は）マルト
ース パーミアーゼ遺伝子は染色体の中へ統合されたの
である。生成された形質転換体は原核形生DNAを全く欠
失していた。
もしもマルターゼ活性とマルトース パーミアーゼ活
性との最適比率が決定されているならば更に良好な成績
が得られるかもしれないことが理解されよう。このこと
は双方の遺伝子のプロモーターを変えることにより、又
は種々の数の（交替処理された）マルターゼ遺伝子及び
マルトース パーミアーゼ遺伝子を酵母のゲノムの中へ
統合させることにより、例えば、後文中に記載される方
法に従って数個の統合座位を用いることにより、遂行さ
れた、マルターゼ活性とマルトース パーミアーゼ活性
との最適比率の決定は、マルターゼ及びマルトース パ
ーミアーゼの他のアイソザイムをコードするマルターゼ
遺伝子又はマルトース パーミアーゼ遺伝子を使用する
ことによっても又遂行され得る。更に少なくともマルタ
ーゼ活性又はマルトース パーミアーゼ活性を有するい
かなる酵素をも使用し得る。更に、同様な方法（例１を
も参照のこと）により、MAL−調節用タンパク質をゲノ
ムの中へ統合させ得るが、これはそれ自体の天然のプロ
モーターに制御下で、或いは他のプロモーター、好まし
くはサッカロミセスのプロモーターの制御下で行なわれ
る。これはマルターゼ活性とマルトース パーミアーゼ
活性との最適比率を決定するためにも又有用である。
以下に、寄託された本発明による菌株を表示する。
下記の諸菌株はオランダ国、バルン中の中央寄託所
（Central Bureau voor Schimmelcultures,Baarn,Halla
nd）へ寄託されている： サッカロミセス セレビシエ237Ng（菌株Ａ）は受託
番号158.86の下に1986年３月25日にCBSへ寄託された； サッカロミセス セレビシエDS1553（菌株Ｃ）は受託
番号406.87の下に1987年９月３日にCBSへ寄託された； エシエリキア コリ宿主用プラスミドP21−40は受託
番号400.87の下に1987年８月28日にCBSへ寄託された； エシエリキア コリ宿主用プラスミドpYEF46は受託番
号401.87の下に1987年８月28日にCBSへ寄託された； エシエリキア コリ宿主用プラスミドpY6は受託番号4
02.87の下に1987年８月28日にCBSへ寄託された； エシエリキア コリ宿主用プラスミドpeG418は受託番
号160.86の下に1986年３月25日にCBSへ寄託された； エシエリキア コリ宿主用プラスミドpTZ19Rは受託番
号405.87の下に1987年９月３日にCBSへ寄託された； エシエリキア コリ宿主用プラスミドpTZ19R/ADHIは
受託番号404.87の下に1987年９月３日にCBSへ寄託され
た； エシエリキア コリ宿主用プラスミドp153−215AKは
受託番号403.87の下に1987年９月３日にCBSへ寄託され
た； エシエリキア コリ宿主用プラスミドpLF24は受託番
号156.88の下に1988年３月８日にCBSへ寄託された； エシエリキア コリ宿主用プラスミドpUT332は受託番
号158.88の下に1988年３月８日にCBSへ寄託された； エシエリキア コリ宿主用プラスミドpTZ18Rは受託番
号480.88の下に1988年７月27日にCBSへ寄託された； 実施例 以下の実験データは本発明の例証のために与えられ
た。これらの方法に熟達している当業界の技術者は本発
明の目的達成のために他の酵母菌株及びベクターも均等
に使用され得ることを理解すべきである。該交替処理は
本発明の範囲内に包含される。
クローニング技法 一般的なクローニング技法についてはマニアチス等の
ハンドブック〔T.Maniatis,E.F.Fritsch,J.Sambrook（1
982）Molecular Cloning,A.Laboratory Manual〕を参照
されたい。制限酵素としては製造業者による推奨品を使
用したがそれらはバイオラブス〔New England Biolabs
（Biolabs〕、BRL〔Bethesda Research Laboratories
（BRL）〕又はベリンゲル〔Boehringer Manheim（Boehr
inger）〕から入手される。一般には１μｇのDNAの開裂
に１え５単位の酵素を要する。
E.コリの形質転換はCaCl2技法 （T.Maniatis et al.,Supra）を用いて遂行された。
組換え体プラスミドの構成 （１） pGb−eMAL6g このプラスミドは酵母中で自己複数が可能であってマ
ルトース パーミアーゼとマルターゼとをコードする遺
伝子を有する。その構成を第１図に略解した。
peG418はpEMBLYe23〔Baldari and Gasarini（1985）G
ene35,27〕から誘導され、Sal IサイトとHind IIIサイ
トとの間にTn5遺伝子〔Reiss et al.,EMBO.J（1984）3,
3317〕を持つ断片を有し、酵母からのプロモーター ア
ルコール デヒドロゲナーゼＩ（ADHI）の指令の下にG4
18に対する抵抗性を与えるがこれはベネツエン等〔J.C.
Bennetzen and B.D.Hall（1982）J.Biol.Chem.257,301
8）による記載と類似してる。peG418はHind IIIを用い
て開裂され、CIPを用いて脱リン酸基処理され、pY6×Hi
nd III×Pvu Iの切断物へ連結された。pY6は文献に記載
〔R.B.Needleman and C.Michels（1983）Mol.Cell.Bio
l.3,796;R.B.Needleman,D.B.Kaback,R.A.Dubin,S.L.Per
kins,N.G.Rosenberg,K.A.Sutherland,D.B.Forrest,C.Mi
chels（1984）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81,2811〕さ
れ、MAL6g座位を含む7.0Kb Hind III断片を有する。こ
れはpGb−eMAL6gを生成した。
（２） pGb−eMAL61 この２μ−誘導されたエピソームのプラスミドは、マ
ルトース パーミアーゼをコードする遺伝子を有する。
その構成は第２図に略解される。
pGb−eMAL6gは二つのBgl II部位を含有し、両者共マ
ルターゼ遺伝子中にある。この1.4KbのBgl IIは、Bgl I
Iで消化されつづいて希釈再結合して分子間連結を促進
することにより、pGb−eMAL6gから欠失された。このよ
うな欠失はマルターゼ機能を破壊することが証明されて
いる〔J.D.Cohen,M.J.Goldenthal,T.Chow,B.Buchferer
and J.Marmur（1985）Mol.Gen.Genet.20,1〕 （３） pGb−eMAL63 この２μ−誘導されたエピソームのプラスミドは、MA
Lpの機能を包含するDNA（調節蛋白質遺伝子またはMAL調
節因子）を含有する。その構成は第３図に略解される。
上記の文献p21−40〔R.B.Needleman多びC.Michels（198
3）〕から、調節蛋白質遺伝式を含有するKpnI−Sal Iフ
ラグメント（断片）が単離された。このフラグメントは
T4DNAポリメラーゼ及びクレノーDNAポリメラーゼを用い
て平滑末端にされついでpeG418のフィルドイン（filled
−in）Hind III部位中にクローニングされた。
（４） pGb−M6g（△−９） このプラスミドは、拡散転写された遺伝子マルトース
パーミアーゼ及びマルターゼの遺伝子間領域中につく
られたプロモーター欠失変異体である（第４図参照のこ
と）。この領域は両方の遺伝子のプロポルモーターを含
有する。〔S.H.Hong及びJ.Marmur（1986）Gene41,7
5〕。この欠失変異体は、もとのプロモーターを置換す
るためにつくられた。この構成は以下の工程からなる。
ａ） マルターゼ及びマルトース パーミアーゼの遺伝
子を含有するHind IIIフラグメント（第１図をも参照の
こと）約7.0kbがpTZ19RのHind III部位にクローニング
された。このプラスミドは市販されている（ファーマシ
ア（（Pharmacia））。これはpGb−M6gを生じる。
ｂ） pGb−M6gはStu I直鎖状にされ、Stu Iは遺伝子間
領域中で切断する。Stu Iで発生された端部は、プロモ
ーターを含有する遺伝子間領域（の一部）をかみ取るた
めにエキソヌクレアーゼBal 31の開始点として役立つ。
Stu Iはマルトース パーミアーゼ遺伝子の一層近くに
ある〔H.H.Hong及びJ.Marmur（1986）、上記文献〕。Ba
l 31培養はManiatisらにより記載されたようにして行な
われた（T.Maniatis,E.F.Fritsch及びJ.Sambrook（198
2），上記文献）。適当な時間で試料は反応から取り出
されクレノーDNAポリメラーゼで培養され平滑末端をつ
くった。ついで合成リンカーが、幾つかの制限部位を含
有する末端部につながれた。
以下の相補的なオリゴデオキシヌクレオチドが使用さ
れた。
1.5′ GATATC CTCGAG AGGCCT A 3′ 2.3′ CTATAG GAGCTC TCCGGA TGCGC 5′ 二本鎖型において、制限部位はEco RV（GATATC）、Xh
o I（CTCGAG）,Stu I（AGGCCT）について形成され、付
着末端の連結がMlu I部位（ACGCGT）を形成する。キナ
ーゼ反応の後、リンカーはT.Maniatisら（上記文献（19
82））により記載された条件に従って、Bal 31で処理さ
れたDNAにつながれた。ついで、非連結のオリゴデオキ
シヌクレオチドをDNAフラグメントから分離するため
に、反応混合物はMlu Iで培養され5mlのセファローズ
（Sepharose）C1−2Bカラム中にクロマトグラフにかけ
られた。この直線状DNAを含む画分はプールされ、プラ
スミドDNAにつながれバクテリアに導入された。
ｃ） 欠失変異体の生成組は配列決定分析にかけられ
た。この目的のために、二本鎖のプラスミドはヘルパー
ファージによる重感染（供給者を推奨に従うプロトコ
ル）により一本線DNAに変換された。この一本線鋳型
は、ジデオキシ配列決定〔F.Sanger.S.Nicklen及びA.R.
Coulson（1977）Proc.Natl Acad.Sci・74,5463〕に使用
するための通常のM13操作により抽出された。プライマ
ーとして、本発明者らはマルトース パーミアーゼ遺伝
子のATG読み始めコドンに近いDNAの伸張に相補性の合成
オリゴ デオキシヌクレチド（５′−GAATTCGGTAGCGTTC
ACGC−３′）を使用した。その方向性は、配列がプロモ
ーターに向って読まれるようなものである（第４図をも
参照のこと）。
マルトース パーミアーゼの殆どが除去された欠失変
異体は、更に試験するために選ばれた。マルターゼプロ
モーター（の一部）はまだ存在する（エキソヌクレアー
ゼ処理の開始点としてのStu I部位は遺伝子間領域中に
非対称的に局在されることに留意すること）。第５図は
変異体pGb−M6g（△−９）の欠失点の配列を示す。これ
はこの全領域の最近決定された配列（S.H.Hong及びJ.Ma
rmur（1986）上記文献）と比較される。野生型配列に於
いて、一つの相違点が公表された配列について観察され
た。−878位（S.H.Hong及びJ.Marmur（1986）上記文献
に従って番号づける）のＣは本発明者らの配列には存在
しない。従って、DNAはこの位置ではHpa IまたはHinc I
Iで消化し得ない。
プラスミドpGb−M6g（△−９）は、その他のプロモー
ターをマルトース パーミアーゼ遺伝子及びマルターゼ
遺伝子の両者に融合する出発プラスミドである（下記を
参照のこと）。
（５） pGb−iA32/G418 このプラスミドは、組込み酵母プラスミドである。そ
れはアルコール脱水素酵素Ｉプロモーター及びその５′
リーダー（先導）配列の一部にフックされたマルトース
パーミアーゼを含有する。その構成は以下のとおりで
あった（第６図）。
ａ） プラスミドpTZ19/ADHIはAUGコドンに関して−15
位で開始する、ADHIプロモーターをもつBamH Iフラグメ
ント1.4kbを含有する（J.L.Bennetzen及びB.D Hall（19
82）J.Biol.Chem.257,3018）。このプラスミドから700b
pのEco RV−Hinc IIフラグメントが単離され次いでEco
RVで消化されたpGb−M6g（△−９）につながれた。生成
プラスミドは制限酵素消化で分析され、適切な方向性が
一本鎖鋳型のジデオキシ配列分析により確認された（第
６図参照のこと）。4C節に記載されたのと同じオリゴプ
ライマーが使用された。
ADHIプロモーターフラグメントのクローニング操作の
結果としてpTZ19Rのポリリンカーの部分（BamH I−Hinc
II）がマルトース パーミアーゼ遺伝子とADHIプロモ
ーターとの間に存在する。pGb−A32の構造及び配列は第
6a図に示される。
ｂ） プラスミドpGb−A32は優性選択マーカーG418res
が与えられた。Eco RV/Hinc IIフラグメントはプロモー
ター アルコール脱水素酵素Ｉの方向でG418に対する抵
抗性を与えるTn5遺伝子を含有する。このフラグメント
は、プラスミド153−215AKのEco RV/Hinc II二重消化に
より単離された、Eco RV/Hinc IIフラグメントはpGb−A
32のSma I部位にクローニングされた。これはpGb−iA32
/G418を生成した。
（６） pGb−iRRoI このプラスミドは組込みプラスミドである。このプラ
スミドはプロモーター アルコール脱水素酵素Ｉの方向
でマルトース パーミアーゼ遺伝子を含み、プロモータ
ー翻訳伸長因子EF1αＡの方向でマルターゼ遺伝子を含
む。クローニング経路は第７図に示される。該方法は以
下のとおりであった。マルターゼ遺伝子は５番目のアミ
ノ酸コドンの囲りにBcl I部位を含有する。それ故、EF1
αＡコード領域は、最初の５個のアミノ酸がマルターゼ
蛋白質のアミノ酸に等しくなるような方法で突然変異さ
れた。Bgl II部位はBcl I部位の位置で共導入された。B
cl I部位からBgl II部位への変換は、第４番目のコドン
中のサイレント（沈黙）突然変異である。Bgl II/Bcl I
連結により、EF1αＡプロモーター及びリーダー配列は
マルターゼ遺伝子の残部に融合し得た。その操作は以下
の工程からなった。
ａ） 出発プラスミドはpYEF46〔S.Nagata,K.Nagashim
a,Y.Tsunetsugu−Yokota,K.Fuyimura,M.Miyaraki及びY.
Kaziro（1984）EMBO J.3,1825〕であったが、これはEF1
αＡの全遺伝子コードを含む。この遺伝子を被覆するBg
l IIフラグメント2.5kbが単離されpTZ19RのBamH I部位
にクローニングされた。クローンpT4が取り出され（第7
a図参照）、オリゴデオキシヌクレオチドで方向づけら
れた突然変異誘発に使用された。
ｂ） ヘルパーファージで重感染した後、pT4の一本鎖
（ss）DNAが単離された。ssTDNA400ng、熱変性pTZ19R×
BamH I400ng及び突然変異誘発オリゴデオキシヌクレオ
チド（第7b図参照）100ngが7mMのトリスHClpH7.5、50mM
のNaCl及び7mMのMgCl2の10μ容量中56℃で10分間培養
された。室温で10分後に、１μのクレノーDNAポリメ
ラーゼ（2U）、１μのT4DNAリガーゼ（4U）、１μ
のTMD（200mM）のトリスHClpH7.5、100mMのMgCl2、100m
MのDTT）、４μの2.5mMのαNTP−ミックス、１μの
10mMのATP及び２μの水の添加により、第２鎖合成及
び連結が開始された。最終容量は20μであり、培養は
17℃で16時間行なわれ、その後混合物はE.ColiJM101に
形質転換された。変異体は、その変異体に特別なキナー
ゼ処理されたオリゴデオキシヌクレオチドでコロニーハ
イブリダイゼーションによりスクリーニングされた（第
7b参照）。このスクリーニング オリゴマー５′−GACT
ATTTCAGATCTTC−３′は、導入されたマルターゼコドン
及びフランキングヌクレオチドに相補性であった。上記
のハイブリダイゼーションは、６×NET（１×NET＝0.15
M NaCl、0.015トリスHClpH7.5、0.001MEDTA）中25℃で1
6時間行なわれた。ポスト ハイブリダイゼーション洗
浄は同温度で同じ混合物中で行ない（10分間で３回）、
続いて３×NET中で25℃洗浄した。幾つかの陽性のコロ
ニーが更に分析された。Bgl II消化はBgl II部位の存在
を確認した。更に、一本鎖DNAは、変異体（pT4−Ｍ）を
含むBgl II部位から単離され、EF1αＡ遺伝子のンクレ
オチド87−103に相補性の合成17−merプライマー（S.Na
gata,K.Nagashima,Y.Tsunetsugu−Yokota,K.Fuyimura,
M.Miyaraki及びY.Kaziro（1984）EMBO J.3,1825）
（５′−CAATACCACCACACTTG−３′）を用いてジデオキ
シ配列分析にかけられた。得られた配列は所望の突然変
異の成功した導入を確認した。
ｃ） 次の工程はpT4−ＭからEF1αＡプロモーター/NH2
末端マルターゼ遺伝子断片を単離し且つこれをマルター
ゼ遺伝子の残部にBgl II/Bcl I付着末端連結により融合
することであった。この工程はEF1αＡプロモーター及
びリーター配列の下流のマルターゼコード領域を回復す
る（第7C図参照）。Bcl I部位（これはメチル化に感受
性である）を使用し得るために、プラスミドpGb−M6g
（△−９）はGM113、E.Coli種株に形質転換された（GM1
13:thr-、leu B6、pro A2、tris−４、met B1、lac Y
1、gal K2、ara−14、tsx 33、thi−１、thy A12、deo
B16、sup E44、rps L260、dam-3）。Bcl I/hind IIIフ
ラグメント3.8kbが単離され、これはNH2−末端以外はマ
ルターゼ遺伝子を含む。pT4−ＭはBgl II/hind IIIで消
化され大きなフラグメント4kb.1が単離された（EF1αＡ
プロモーター/NH2末端及びマルターゼ遺伝子）。両フラ
グメントは互いにつながれてpGb−EFMT−３を生成し
た。配列分析は全ての導入された突然変異の正確さを確
認した。
ｄ） 最後に、pGb−EFMT−３が、Eco RV及びHind III
で消化されて4.8kbpのEF1αA/マルターゼ プロモータ
ー／遺伝子フラグメントを精製した。pGb−iA32/G418
（第６図参照）から約8.3kbのHind III（部分）/Eco RV
フラグメントが単離された。これはpTZ19R骨格、ADHI/
マルトース パーミアーゼ プロモーター／遺伝子断片
及びADHI/G418res断片からなる。両者はつながれてpGb
−iRRoIを生成した（第7b参照）。
（７） pGb−RB2 このプラスミドは、クローン形成用ビヒクルとして役
立ちDNA片をサッカロミセス セレビシエのSIT4遺伝子
に組込む。この構成は以下の工程からなる（第８及び９
図参照）。
a.pTZ19RがEco R I及びHind IIIで消化されてそのポリ
リンカーを40個のヌクレオチドの合成でつくられたDNA
断片で置換した。このDNA片は合成のオリゴデオキシヌ
クレオチド３及び４のアニーリングによりつくられる
（第８図参照）。この短いフラグメントは、Eco R I及
びHind III付着末端を含む。このDNAフラグメントからp
TZ19RベクターへのクローニングはEco R I部位及びHind
III部位を回復しない。合成のDNAフラグメントは示さ
れるようにその縁部でNot I及びSfi Iの制限部位を含
み、中間にEco R I部位を含む。生成プラスミドはpGb−
SNENSと称される。
b.SIT4遺伝子（Gottlin−Ninga及びKaback,上記を参
照）を含有するEco R IフラグメントがpLF24（またコー
ドpLN420を有することが知られる）から単離され、pGb
−SNENSのEco R I部位にクローニングされた。これはpG
b−Spons31を生成した。有用な基準制限部位を欠くた
め、その方向性は未知である。
c.プラスミドpGb−Spons31は、SIT4遺伝子の中間に特異
なBgl II部位を含む。これは、遺伝子置換によりSIT4遺
伝子に転移されるべきDNA片がクローニングし得る部位
として使用することができる。クローニング操作を容易
にするため、SIT4遺伝子には幾つかの特異な制限部位を
含む合成のDNA片が与えられた。pGb−RB2の構成は第９
図に略記される。
合成のDNAフラグメントは二つのBgl IIの付着末端を
有す。第９図に示されるように、pGb−RB2中のその方向
性は、pGb−RBN3の制限酵素分析に基づく（次を参照す
ること）。
（８） pGb−RBN3 ADHIプロモーターの制御下にG418res遺伝子を含有す
るEco R V/Hinc IIフラグメント（pGb−iA32−G418の構
成をも参照のこと）1.9kbがpGb−RB2のSma I部位にクロ
ーニングされた。こればpGb−RBN3を生成した（第10図
参照）。
（９） pGb−RBRRO1 このプラスミドはプロモーター アルコール脱水素酵
素Ｉの方向にマルトース パーミアーゼ遺伝子を含有
し、EF1αＡプロモーターの方向にマルターゼ遺伝子を
含有する。両者は、Hind IIIフラグメント8.3kbに局在
され、このフラグメントはSIT4遺伝子にクローニングさ
れていた。その構成は第11図に略記される。この目的の
ため、pGb−iRRO1はHind IIIで消化されpGb−RB2×Hind
III（子牛腸ホスファターゼで処理された）につながれ
た。これはpGb−RBRRO1を生成した。
（10） pGb−RBREGO1 このプラスミドは、プロモーター アルコール脱水素
酵素の方向でMAL−調節因子遺伝子を含有する。
pGb−RBREGO1は、以下のようにしてつくることができ
る。p21−40〔R.B.Needleman and C.Michels（1983）、
上記文献〕から、調節蛋白質遺伝子を含むSal Iフラグ
メントが単離される。このフラグメントはpTZ18RのSal
I部位にクローニングされる。このプラスミドは市販さ
れる（ファーマシア（Pharmacia））。その方向性は、M
AL−調節因子遺伝子のプロモーター領域がpTZ18RのT7−
プロモーター配列に近位するようなものである。pTZ18R
の配列プライマー及びその他の得らたDNA配列に基いて
新しくつくられたオリゴヌクレオチドプライマーを用い
て、MAL−調節因子遺伝子のプロモーター領域及びその
遺伝子のNH2末端コード部分が配列し得る。これはAUG−
開始コドンの位置を局在する。有用な制限部位がAUG−
開始コドンに近いプロモーター領域に存在しない場合、
このような部位（例えばBgl II）は通常の方法（第5b節
の組換えプラスミドの構成をも参照すること）に従って
オリゴヌクレオチドにより部位一方向づけされた突然変
異誘発によりその領域に導入し得る。
このような突然変異誘発の後に、Bgl II−Sal Iフラ
グメント（プロモーター領域を含まずMAL−調節遺伝子
を含む）及びEco V−BanH Iフラグメント（ADHIプロモ
ーターを含む、第7b図、pGb−iRRO1を参照のこと）は、
MAL−調節遺伝子がADHIプロモーターの制御下にあるよ
うにpGb−RB2（第９図参照）に一緒につなぎ得る。これ
はプラスミドpGb−iRBREGO1を生成するであろう。鋳型
としてのssDNAににオリゴヌクレオチドを用るジテオキ
シ鎖方法を用いる配列分析はクローニング工程の正確さ
及びプロモーターの方向性を容易に確認し得る。
上記のプラスミド構成は、単に本発明を説明する例と
して役立つことが理解されよう。その他のプロモーター
（好ましくはサッカロミセス）が使用でき（また同じプ
ロモーターのその他の部分が使用できる）、その他の組
込み遺伝子座が選択でき、酵母ゲノム中で一種以上の組
込み部位を用いてマルターゼ、マルトース パーミアー
ゼ及びMAL−調節因子のその他の組合せ（それら自体の
プロモーターの制御下で、又はその他の好ましくはサッ
カロミセス プロモーターの制御下で）がつくることが
できる。それは最終的には嫌気発酵の全期間中に存在す
るマルターゼ及びマルトース パーミアーゼ活性の最適
比へと導くであろう。
酵母の形質転換 酵母菌株の形質転換は、イトウらの方法 〔H.Ito,Y.Fukuda,K.Murata,A.Kimura（1983）,J.Bacte
riology153,163〜168〕に従って行なわれた。その方法
は通常の酵母栄養倍地中サッカロミセスを１〜25、望ま
しくは４〜10 OD610nmの密度に成長させることを伴な
う。
次いで酵母細胞は採取され、洗浄され、約2mM〜1.0
M、好ましくは約0.1Mの濃度のカオトロピック イオ
ン、特に塩化物または硫酸塩としてのアルカリ金属イオ
ン、リチウム、セシウムまたはルビジウム、更に特別な
リチウム塩で予備処理される。一種以上のカオトロピッ
ク イオンで約５分〜120分、好ましくは約60分細胞を
培養した後に、細胞は次いで一般には20℃〜35℃の適当
な温度で約５〜60分の短期間でDNAで培養される。望ま
しくは、ポリエチレン グリコールが約25〜50％の濃度
で添加され、ここでその全倍地は所望の最終濃度を得る
ため等容量のポリエチレン グリコール濃厚物を添加す
ることにより希釈されてもよい。ポリエチレン グリコ
ールは、約2000〜約8000ダルトン、好ましくは約4000〜
7000ダルトンのものである。培養は一般には比較的短時
間、一般には約５〜60分行なう。望ましくは、培養倍地
は約35℃〜45℃、好ましくは約42℃で約１〜10分の熱処
理にかれられる。形質転換の選択のため、フレオマイシ
ン〔D.Genilloud,M.C.Garrido,F.Moreno（1984）Gene3
2,225〕、ハイグロマイシンＢ〔Gritzら（1983）Gene2
5,178〕及びアミノグリコシドG418（Jiminezら（198
0）、Nature,287,869）の如き有用なマーカーが使用し
得る。
酵母細胞か組込みプラスミドで形質転換された場合、
組込みは、Bgl IIで消化されたDNAを用いてMAL遺伝子座
に向けられた。使用された組込みプラスミドは互いに両
者とも1.4kbのマルターゼ遺伝子中の二つのBgl II部位
を含む。これは二本鎖の切断を生じ、これらは組換え性
（recombinogenic）であり相同の染色体DNAとの相互作
用を刺激する。組込み中、ギャップは染色体情報から修
復される〔T.L.Orr−Weaver,J.W.Szostak,R.Rothstein
（1981）Proc.Natl.Acad.Sc.U.S.A.78,6354〕。組込み
はプラスミド ベクターの一個または数個のコピーを生
じる。〔J.W.Szostak,R.Cou（1979）Plasmid2,536〕。C
O2生産実験中に使用される、これらの形質転換体中の正
確なコピー数は測定されなかった。
異種DNAを含まない安定な酵母の形質転換体を得るた
めの計画が開発された。異種DNAの例はpTZ19RベクターD
NA及び抗体G418、フレオマイシンまたはハイグロマイシ
ンＢに対する抵抗性を与える選択遺伝子である。簡単に
は、計画された実験は以下のとおりであった（第12図参
照）。
１） Sfi Iで消化されたpGb−RBN3による酵母の形質転
換によるSIT4遺伝子の一工程の遺伝子分断。
形質転換体はG418に対する抵抗性に関して選択され
た。結果物はSIT4遺伝子がADHIプロモーターの制御下に
G418r遺伝子により中断されたSIT4遺伝子で置換された
菌株ApGb−RBN3であった。
２） 菌株ApGb−RBN3は、PUT332とSfi Iで消化されたp
Gb−RBRRO1とによる共形質転換プロトコル中の宿主菌株
として使用された。pUT332は、フレオマイシンに対する
抵抗性を与える遺伝子を含有する２μ−誘導されたエピ
ソームのプラミスドである。この供形質転換工程中の第
一選択はフレオマイシン（30μg/ml）を含むプレート上
で行なわれた、これらのフレオマイシンｒ酵母細胞の或
る割合（0.1〜１％程度）において、（pADHI/G418rで）
中断されたSIT4遺伝子は、変性されたマルトース パー
ミアーゼ遺伝子及びマルターゼ遺伝子を含む共形質転換
されたSIT4フラグメントにより置換された。この第二の
遺伝子置換は、再びG418に対して感受性の酵母を生成し
た。この第二の遺伝子置換が行なわれた酵母細胞を選択
するため、フレオマイシンｒ形質転換体がG418（300μg
/ml）を含むプレート上にレプリカが平板化された。成
長しなかった細胞において、SIT4遺伝子配列間に包埋さ
れたG418r遺伝子は、SIT4遺伝子配列間に包埋された変
性MAL遺伝子により置換された。
３） 次いでフレオマイシンrG418sehs形質転換体は、1
0〜20世代中で非選択性培地（即ちフレオマイシンを含
まない）ので成長によりエピソームのプラスミドpUT332
からキュアリングされた。得られる形質転換体ApGb−pR
BRRO1はフレオマイシン及びG418の両者に感受性であり
原核配列を含まない。組込みは全てサザンブロット試験
でDNA水準で確められた（データは示されない）。
生成菌株は、別の組込み遺伝子座の使用により、及び
／または（二倍体または多倍体である酵母菌株の場合に
は）SIT4遺伝子のその他の一種以上の対立遺伝子での連
続の形質転換における宿主として使用し得る。菌株Ａは
SIT4遺伝子を含む染色体の異数体であり二倍体である。
菌株ＡのSIT4遺伝子は両者共、遺伝子置換の標的部位と
して使用された。これは最終的には形質転換ApGb−p2RB
RRO1＃１を生成した。第二の組込みはその遺伝子座で多
形現像を除いたので、組込みのための両方の対立遺伝子
の使用はまた形質転換体の遺伝子安定性を殆ど増大した
ようである。このような多形性領域は、組込まれた配列
の損失を生じ得る遺伝子変換に感受性である。このよう
にして得られた形質転換はサザンブロット技術により分
析されて、両方のSIT4遺伝子での遺伝子中断から予想さ
れたハイブリダイゼーショーン パターンを示す。
pGb−RBN3及びpGb−RBRRO1の出発プラスミドとして役
立った、構成されたベクターpGb−RB2は、以下の考察に
より喚起される幾つかの有用な特徴を有している。
1.時としてDNA片が組込まれなければならず、これは酵
母プロモーターを別の遺伝子の（酵母）コード領域に融
合することにより構成される。形質転換性フラグメント
がゲノム中の標的配列に相同の配列を両側部に有する場
合、遺伝子置換が勿論容易に得られるだけである。それ
故、DNA片はコード領域（上記を参照のこと）の３′末
端にフックされなければならず、これは選択されたプロ
モーターと同じ遺伝子から誘導される。同じプロモータ
ーが常に使用されるとは限らないから、この試みの欠点
はそれが多くのクローニング操作を必要とすることであ
る。加えて、強いプロモーターが時として選ばれ、遺伝
子から誘導され、この遺伝子は関心のある段階（栄養成
長中、嫌気発酵中、等）で機能性である。処理されたフ
ラグメントの組込み後、この遺伝子の一つのコピーは非
機能性にされる。
それ故、本発明者らは、栄養成長中に形質発現されな
い、遺伝子座での遺伝子置換を指向したい。本発明者ら
は、SIT4遺伝子（胞子形成−誘発された転写配列）を選
択したが、その形質発現は、Gottlin−Ninfa及びKaback
（上記文献参照）によりよく研究されているが、勿論そ
の他のSIT遺伝子または一般的な非コード断片のSIT遺伝
子が適切である。関心のあるDNA構成がSIT4遺伝子にク
ローニングされる場合、SIT4遺伝子の二つの得られる半
分は組換えの相同末端として役立つ。
遺伝子が局在される染色体領域は、HMR−遺伝子座に
ついて記載されたサイレンサー〔A.H.Brandら（1985）C
ell 41,41〜48〕に類似するサイレンサーの結果として
栄養成長中転写非活性であると、或る者は主張したかも
しれない。また、このサイレンサーDNAは交配型プロモ
ーターとは無関係のプロモーターにより制御された転写
を抑制し2600bp離れたプロモーターに作用し得る。しか
しながらGottlin−Ninfa及びKaback（上記文献参照）
は、HIS3遺伝子がSIT4遺伝子に組込まれた時栄養成長中
に機能性であり得ることを示した。
2.クローニング操作を容易にするため、SIT4遺伝子には
数個の特異な制限部位を含有するDNAの合成片（クロー
ニング部位をもつポリリンカー）が与えられる。加え
て、ポリリンカーな両側部に全ての可能な読取り枠中の
翻訳のための停止コドンを含む（第９図参照）。これは
可能なハイブリッド転写産物の翻訳を停止する安全弁で
あり、この転写産物は接合部を横切って合成されてもよ
い。このようなハイブリッド転写産物はそうしなければ
蛋白質の符号化をすることがあり、その作用は知られて
いない。
3.相同の組換えを得るため、組込まれるべきDNA断片は
両端末部にNot I及びSfi Iの制限部位を含み、これらは
両者とも8bpの配列を認識する。これらの制限部位の発
生頻度は極めて低く、それ故SIT4遺伝子中のポリリンカ
ーにクローニングされるべきDNA断片が両方の認識部位
を含むことは殆どないようである。かくしてDNA断片が
プラスミドpGb−RB2のSIT4遺伝子に一旦クローン化され
ると、Not IまたはSfi Iによる制限はDNAフラグメント
を遊離し、これはゲノム中、即ちSIT4遺伝子座で相同の
配列との相互作用により組換え可能である。末端部はNo
t IまたはSfi I部位の一部でありそれ故相同ではない
が、その他の研究は、細胞中の制限されたエキソヌクレ
アーゼ消化により明らかにこれらの配列が除去されるこ
とを示していた〔例えば、H.Rudolph,J.Koenig−Ranseo
及びA.Hinnen（1985）Gene 36,87〜95〕。
4.出発プラスミドとして、市販のプラスミドpTZ19r、即
ちpUC19誘導体が使用される。このベクターは、多いコ
ピー数をもち、一本鎖ファージf1の複製の原点をもつと
いう利点をもつ。これば、ペルパーファージによる感染
後に一本鎖DNAを遊離すること及びプライマーの助けに
より接合部を横切ってDNA配列を変性することを極めて
容易にする。これは操作されるDNAの詳細に記載を極め
て容易にする。
これらの改良はパン酵母のみならずその他の酵母にも
適用可能であることが理解されよう。
CO2−生産測定 ａ） 合成された練り粉（ドウ）培地において（試験
Ａ） 酵母細胞がYEPMS培地（１％酵母抽出物;2％バクトペ
プトン;3.75％マルトース;200μg/mlG418で補充された
ショ糖1.25％）中で培養された。成長は対数増殖後期
（late−log phase）まで30℃であった。酵母細胞が6ml
の培養菌から集められ8.8mlの合成練り粉培地中に再懸
濁された。この培地の組成（１当り）は、ショ糖4.6
g;マルトース64.37g;KH2PO42.07g;MgSO4・7H2O2.76g;
（KH4）2SO40.67g;カザミノ酸2.07g;クエン酸4.02g;ク
エン酸三ナトリウム44.25g;ビタミンB1 9.2mg;ビタミン
B6 9.2mg;ニコチン酸46mg;Ca−Ｄ（＋）−パントテネー
ト18.2mg;ビオチン0.23μｇであった。10分間で、上記
の懸濁物は適度の撹拌により28℃の水溶中で平衡にさ
れ、その後に酵母懸濁物を含むフラスコは管により“ガ
スビュレット（gasburette）”に連結された。このビュ
レットは、１当り20mlの指示薬溶液（1gメチルレッ
ド;0.5gメチレンブルー;1の96％エタノールに溶
解）、40mlの1N H2SO4及び痕跡量のCuSO4（HNO3に溶
解）を含む溶液で満たされた。ビュレット中のこの溶液
の容量の置換はCO2生産の尺度であり、これは165分間で
測定された。
各組の実験に於いて、得られたCO2生産の値は環境温
度及び圧力について28℃及び760mmHgの標準条件に修正
された。更に、酵母の量について修正された。CO2測定
毎の酵母の量を等しくするために、培養の600nmの比色
計の読みが修正因子として用いられた。
ｂ） 練り粉において（試験Ｂ及びＢ′） 砂糖を添加しない練り粉（無ショ糖ドウ）（試験Ｂ）
または30％の砂糖を含む練り粉（試験Ｂ′）において、
糖蜜で流加回分式に成長された。圧搾酵母のCO2ガス生
成曲線が測定された。無ショ糖ドウは以下のようにして
つくった。圧搾酵母（28.5％の乾燥物を含む）1g、食塩
溶液Ａ（蒸留水34mlに溶解されたNaCl1.25g）34ml及び
小麦粉62.5gを、良く発展した練り粉を得るように、ホ
バート（Hobart）装置中速度１で30秒、速度２で２分間
混合した。
30％砂糖入り練り粉は圧搾酵母（28.5％の乾燥物の）
2.0g、食塩溶液Ｂ（34mlの蒸留水中NaCl0.938g）34ml、
小麦粉62.5g及びショ糖18.75g（即ち小麦粉に対し30％
の砂糖）を含有した。混合は無ショ糖ドウと同様にし
た。
次いで練り粉を丸底フラスコに移した。ガス生産測定
は練り粉を含むフラスコを管を経由してガスビュレット
（上記の節ａを参照のこと）に連結することにより、混
合の7.5分後に開始し28℃で165分間行なった。圧搾酵母
の乾燥物含量が上記の値と異なる場合に於いて、このよ
うな酵母が使用された。しかしながら、CO2ガス生成力
の測定値は次いで、CO2ガス生成力に、必要とされる乾
燥物含量対実際の測定値の比をかけることにより修正さ
れた。各組の試験に於いて、得られたCO2生産の値は環
境温度及び圧力に関する値を28℃、760mmgの値に夫々修
正された。或る場合には、得られたガスの値を流加回分
式に成長した酵母のＮの率（Ｎの率（％）は蛋白質含量
の目安である）について修正された付加的な計算を行な
った。改良の類似の％は、この最後の修正を含まないで
実測されたとおりであった。
ｃ） 練り粉において（試験Ｃ及びＣ′） 米国特許第3843800号明細書及び同第4341871号明細書
に記載された方法に従って調製されたインスタント（即
時）乾燥酵母の如き乾燥酵母のCO2ガス生成曲線が、砂
糖を添加しないい練り粉（試験Ｃ）及び30％の砂糖を含
む練り粉（試験Ｃ′）に於いて測定された。試験Ｃ及び
Ｃ′の夫々に於いて乾燥酵母（96％の乾燥物を含む）30
0mg及び乾燥酵母（96％の乾燥物を含む）600mgが使用さ
れた以外は、試験Ｂ及びＢ′と同様にしてこれらの試験
が行なわれた。試験の前に、酵母は小麦粉と混合され28
℃で10分間培養された。
酵素分析 酵母細胞によりマルトースを輸送する能力は、30℃で
基質として10mMの濃度の〔Ｕ−14C〕−マルトースを用
いて測定された。詳細はR.Serrano（上記文献参照）に
より記載されている。細胞を含まない抽出物中で基質と
してｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシドを
用いて、マルターゼ（E.C.3.2.1.20）が分析された。こ
の分析は文献〔H.Halvorson 及びE.L.Elias,Biochim.Bi
ophys.Acta（1958）30,28〕記載に従って行なわれた。
液体培地中の基質の消費及び生成物の生成 液体培地からのマルトース及びグルコールの消失が、
通常のHPLC技術を用いて定量された。培地１はマルト
ース100g、グルコース10g、（KH4）2SO43.0g、MgSO4・7
H2O4.0g、KH2PO44g、カザミノ酸（Difco）4g、クエン酸
・H2O4g、クエン酸三ナトリウム・2H2O45g、ビタミンB1
10mg、ビタミンB6 10mg、ニコチン酸40mg、Ca−Ｄ
（＋）−パントテネート20mg及びビオチン0.02mgを含有
していた。pHは5.7に調節された。培地2mlが酵母の懸濁
物（20mg乾燥重量／蒸留水2.0ml）に添加された。この
混合物（培地Ａと称される）は28℃で培養された。培地
Ｂは培地Ａと似ているが20倍のグルコースを含有した。
試験は嫌気条件で行なわれた。
蛋白質測定 細胞を含まない抽出物の蛋白質及び全細胞の蛋白質が
マイクロビュレット法〔J.Goa,Scand.J.Chim.Lab.Inves
t.（1953）5,218〕により測定された。オボアルブミン
が標準物として役立った。
貯蔵性 圧搾酵母が、密閉プラスチック容器中に23℃で４日間
貯蔵された。貯蔵性はこの期間後に残存するガス生成力
の率（％）として定義される。
圧搾酵母の製造 酵母菌株の培養菌が一連の発酵槽中で成長させられ
た。細胞は正味容量６の10の実験室発酵槽中で培養
された。発酵中、pH及び温度は自動制御により所望の値
に維持された。使用された発酵処方せんは文献〔G.Buts
check and R.Kautzmann.Die Hefen,Band II Technologi
e der Hafen 501〜591頁（1962）,Verlag Hans Carl,Nu
ernberg,FRG〕に記載された操作及び文献〔the AVI Pub
lishing Company Inc,Westport,Connecticut,USA（197
3）のYeast Technology〕において、G.Reed及びH.J.Pep
plerにより記載された操作に基く。最終発酵の培養条件
は特に、以下のとおりであった。
（ａ） 適用された糖蜜は50％の砂糖を基準として計算
してビート糖蜜80重量％及びさとうきび糖蜜20重量％か
らなった。
（ｂ） リン酸塩の必要量は、接種前にモノーリン酸−
アンモニウムの形態で添加された。
（ｃ） 第１表の発酵中に温度は28℃から30℃に上昇し
た。
（ｄ） 第１表に従って発酵中に窒素はNH3の10％水溶
液として供給された。
（ｅ） 第１表に従って、pHは発酵の最初の８時間中5.
0に保たれ、その後上昇して発酵の終了時には6.2に上昇
した。
（ｆ） 発酵性砂糖50％を含有する糖蜜1kg当り、12mg
のビタミンB1が接種前に添加された。
この発酵により得られた酵母は、実験室ノズル遠心分
離機中で濃縮され水道水で洗浄された。酵母クリームは
26〜32％の範囲の乾燥物含量に圧搾された。
得られた蛋白質含量（％Ｎ×6.25）は、発酵中に適用
された異なる量のアンモニアの結果として42〜55％の乾
燥重量の間で変化した。
例 １ MAL6遺伝子座から誘導された遺伝子を含む２μ−誘導れ
れたプラスミドで形質転換された酵母のCO2−生産 市販のパン酵母菌株Ａ及びＣが、pGb−eMAL6g（マル
トース パーミアーゼ及びマルターゼ第１図参照）、pG
b−eMAL61（マルトース パーミアーゼ、第２図参
照）、及びpGb−eMAL63（MAL−調節因子、第３図参照）
で形質転換された。MAL遺伝子はなおそれらのもとのプ
ロモーターを含有る。形質転換された酵母菌株の命名は
以下のとおりである。ApeG418はpeG418で形質転換され
た菌株Ａを表す。その他の形質転換された菌株は類似の
方法で示された。合成練り粉培地中のCO2−生産に及ぼ
すこれらのプラスミドの効果は表２に要約される。本願
発明者らはマルチコピープラスミドの単なる存在がカス
生産に逆効果をもつことを見い出したので、出発peG418
（第１図参照）で形質転換された宿主菌株は参考例とし
て役立つ。
全ての形質転換体は、対照に比較して大きなCO2生産
の改良を示す。マルトース パーミアーゼ遺伝子及びマ
ルターゼ遺伝子の両者のエキストラ コピー（extra co
pies）の配合は、最高の増強、即ち菌株Ａに於いて40
％、菌株Ｃに於いて18％の増強を与える。
また形質転換体ApGb−eMAL6g及びCpGb−eMAL6gは、砂
糖が添加されない練り粉に於いも試験された。この場
合、酵母は糖蜜で流加回分式に成長させられた。再度、
CO2生産の大巾な改良が得られた（第３表）。
例 ２ 組換えマルターゼ遺伝子及び／またはマルトース パー
ミアーゼ遺伝子を含む組込みプラスミドで形質転換され
た酵母菌株のCO2生産 親酵母菌株ＡがpGb−iA32/G418（主な特徴:ADHI/マル
トース パーミアーゼ；第６図参照）及びpGb−iRRo1
（主な特徴:ADHI/マルトース パーミアーゼ及びEF1αA
/マルターゼ；第７図参照）で形質転換された。
親菌株Ａ及び両組込み形質転換体は、商業的な好奇性
発酵に類似して糖蜜で流加回分式で成長させられた（第
１表参照）。細胞を採取した後に、CO2生産が砂糖を添
加しない通常の練り粉試験で測定される。この試験で分
析されたガス生産は第４表に要約される。菌株Ａの染色
体へのpGb−iA32/G418の組込みは練り粉中のガス生産を
有意に改良する。相対的な改良は、測定時間に依存して
若干変化する（第４表参照）。変性マルトース パーミ
アーゼ遺伝子に加えて変性マルターゼ遺伝子がpGb−iRR
O1を用いて市販の菌株Ａの染色体に組込まれる時に、ガ
ス生成力はさらに一層改良される。この典型的な実験に
於いて、無ショ糖練り粉中で165分後に約30％多いCO2が
生成され、これは約410mlCO2/285mgの酵母乾燥重量の水
準に相当する。
30％の砂糖を添加した練り粉に於いて、親菌株に較べ
て上記の形質転換体のCO2生産における実質的な差異は
認められなかった（約190mlCO2/285mgの酵母乾燥重
量）。
ドウ発酵活性において得られた改良は23℃の貯蔵中に
維持される。貯蔵中のドウ発酵活性の損失は実際には親
菌株Ａ及び新規菌株について同じである（第５表参
照）。
例 ３ 組換えマルターゼ遺伝子及びマルトース パーミアーゼ
遺伝子を含み異種DNAを含まない酵母菌株のCO2生産 親菌株Ａは、pADHI/マルトース パーミアーゼ遺伝子
及びpEF1αA/マルターゼ遺伝子が両方の相同の染色体の
SIT4遺伝子に導入されるように遺伝的に変性された。Ap
Gb−p2RBRRO1＃１と略記される、この菌株は前記の方法
及びプラスミド（pGb−RBN3（第10図）及びpGb−RBRRO1
（第11図）の形質転換及び構成の節及び遺伝子組換えに
よる形質転換の一般的な計画を参照のこと）を用いて構
成された。親菌株Ａ及び相同の形質転換体ApGb−p2RBRR
O1＃１は商業的な好気性発酵と同様にして糖蜜で流加回
分式に成長させられた（第１表参照のこと）。細胞を採
取した後に、砂糖を添加しない通常の練り粉中でCO2生
産が測定される。
第６表はそれらの結果を要約する。無ショ糖ドウに於
いて、改良は165分後に約18％であり、これは約367mlCO
2/285mgの酵母乾燥重量な水準に相当する。この菌株はA
DHIプロモーターの制御下にマルトース パーミアーゼ
遺伝子及びEF1αＡプロモーターの制御下にマルターゼ
遺伝子の夫々の二つのコピーを含有する。第４表には菌
株ApGb−iRRO1が約30％の改良をもつことが示される。
菌株ＡのMAL遺伝子座に組込まれたpGb−iRRO1分子の数
の最初の推定は、少くとも３の組込みプラスミド分子の
コピー数を与える。菌株ApGb−p2RBRRO1＃１に於いて変
性マルトース パーミアーゼ遺伝子及びマルターゼ遺伝
子のコピー数を更に増加することにより（例えばその他
の胞子形成性の特別な遺伝子中の組込みにより）、菌株
ApGb−iRRO1と少くとも同様のガス生産水準をもつ相同
の形質転換された酵母菌株を得ることができる。
例 ４ 組換えマルターゼ遺伝子及び／又は組換えマルトース
パーミアーゼ遺伝子を含む組込み（統合性）プラスミド
で形質転換された酵母菌株の酵素活性及び基質取込み量 上記の如く、マルトース パーミアーゼ及びマルター
ゼの形質発現はマルトース誘導及びグルコース抑制を受
ける。この現象は菌株Ａの野生型細胞に関して第13図に
示される。マルトース パーミアーゼ及びマルターゼの
特別の活性は、グルコースの大部分が利用されるまで増
加しない。
練り粉が膨張を開始する時のマルトース パーミアー
ゼ活性は、第14図に示されるように酵母ゲノム（菌株Ap
Gb−iA32/G418）への変性（交替処理）マルトース パ
ーミアーゼ遺伝子の導入による高められる。
驚くべきことに、マルターゼの活性はこの構成体にお
いて同様に高められた（第15図）。この新規な菌株ApGb
−iA32/G418は、主な炭素源及びエネルギー源としてマ
ルトースを含む培地Ａ中で親菌株Ａよりも速くマルトー
スを発酵した（第16図）。主な炭素源及びエネルギー源
としてグルコースを含む培地Ｂ中で、この効果はそれ程
顕著ではなかった（第17図）。
変性マルトース パーミアーゼ遺伝子に加えて、変性
マルターゼ遺伝子が菌株ApGb−iRRO1を生成する染色体
に組込まれ（統合され）た。この菌株は培地Ａ（第16
図）及び培地Ｂ（第17図）中で一層速い速度でマルトー
スを発酵した。グルコースの極めて高い菌体外濃度にも
かかわらず、相当量のマルトースがこの新規な菌株によ
り代謝された。菌株ApGb−iRRO1は、練り粉の膨張中に
親菌株Ａ及び菌部ApGb−iA32/G418よりも高いマルター
ゼの特別な活性及びマルトース パーミアーゼの特別な
活性を示した（第14図及び第15図）。
【図面の簡単な説明】
添付図面の第１図はプラスミドpGb−eMAL6gの構成を示
す。矢印は図中の遺伝子の転写方向を示す。プラスミド
は模式的に図示され、量的測定のためではない。記号:G
418、Tn5遺伝子（ADHIプロモーターの制御下に）G418に
耐性を与える;P,Pvu I;X,Xba I;S,Sal I;H,Hind III;CI
P:子牛の腸のホスファターゼ。 第２図はpGb−eMAL61の構成を示す。プラスミドは模式
的に図示され、量的測定のためではない。記号：△マル
ターゼ、一部欠失マルターゼ遺伝子;B,Bgl II。なお第
１図の説明を参照されたい。 第３図はプラスミドpGb−eMAL63の構成を示す。プラス
ミドは模式的に図示され、量的測定のためではない。記
号：（Ｋ），補填されるKpn Iサイト；（Ｓ），補填さ
れるSal Iサイト;Klenow,大型サブユニットDNAポリメラ
ーゼ;H,Hind III。第１図の説明も参照されたい。 第４図はpGb−M6g（△−９）の構成を示す。記号:H,Hin
d III;St,Stu I;Klenow,大型断片DNAポリメラーゼ I;E
V,Eco RV;Xh,XhO I;M,Mlu I;fl ori,複製ファージflの
起点;amp,アムピシリン耐性遺伝子;s.p.,プライマーの
配列。矢印は５′→３′の方向を示す。欠失域は点線で
示される。 第５図はプラスミドpGb−M6g（△−９）の配列を示す。 （ａ） マルターゼ遺伝子及びマルトース パーミアー
ゼ遺伝子。矢印は転写方向を示す。St（Stu I）は欠失
変異体の構成の開始点を示す。遺伝子間領域の配列の該
当部分はこの図面の下方に示されている。 （ｂ） pGb−m6g（△−９）の配列。欠失域は−９から
−417に及んでいる。ポリリンカーはオリゴヌクレオチ
ドに関係しており、これはBal 31−処理DNAに連結して
いる（第４図を参照されたい）。 第６図はプラスミドpGb−iA32/G418の構成を示す。矢印
は転写方向を示す。プラスミドは模式的に図示され、量
的測定のためではない。記号:H,Hind III;EV,Eco RV;fl
ori,複製フアージflの起点;amp,アムピシリン耐性遺伝
子;G418,Tn5遺伝子（ADHIプロモーター）G418に対する
耐性を与える;S,Sma I:Hc,Hinc II;pADHI,プロモーター
アルコール デヒドロゲナーゼＩ遺伝子＋５′先導体部
分（斜線域）。 第７図はプラスミドpGb−iRRO1の構成を示す。 （ａ） プラスミドpT4は量的測定のための図示でな
い。記号:E,Eco R I;B/Bg,BamH I/Bgl II連結;H,Hind I
II。 （ｂ） EF1αＡプロモーター＋５′先導配列をマルタ
ーゼ遺伝子の５個のＮ−末端アミノ酸へ融合させるため
のpT4上の突然変異誘発。Bgl IIサイトも又生成され
る。対応する配列を示す。 突然変異誘発プライマーはEF1αＡ配列に対し相補的で
ある（点線で示す）。マルターゼコドンと四角に囲った
Bgl II認識サイトとに不適合個所がある〔変異誘発プラ
イマーのオリエンテーションは３′→５′であること、
即ちBgl IIサイトは右から左へ（５′→３′）読まれね
ばならないことに注意〕。 マルターゼ配列においてＮ−末端の５個のアミノ酸のコ
ドンが示されている。Bcl Iの認識サイトは四角に囲ま
れている。 pT4−Ｍ配列において突然変異を包含する配列が示され
ている。Bgl IIサイトは四角で囲まれている。星印はマ
ルターゼ ヌクレオチド配列からの偏りを示す。４番目
のコドンの偏りは沈黙突然変異である。 （ｃ） プラスミドは模式的に図示され、量的測定のた
めではない。記号:H,Hind III:Bc,Bcl I;E,Eco R I;Bg,
Bgl II;EV,Eco RV;Bg/Bc,Bgl II/Bcl I連結;pEFαＡ
（斜線部分）,EF1αＡの５′側（プロモーター＋５′先
導配列）;fl ori,複製フアージflの起点:amp,アムピシ
リン耐性遺伝子。 （ｄ） プラスミドは模式的に図示され、量的測定のた
めではない。記号：前項（ｃ）参照。 第８図はプラスミドpGb−SNENSの構成を示す。プラスミ
ドは模式的に図示され、量的測定のためではない。記
号:E,Eco R I;H,Hind III;Sf,Sfi I;N,Not I;fl ori,複
製フアージflの起点:amp,アムピシリン耐性遺伝子。矢
印は５′→３′方向を示す。Oligo3及び４は既述の基礎
配列を有する合成オリゴ デオキシヌクレオチドであ
る。 第９図はプラスミドpGbRB2の構成を示す。プラスミドは
模式的に図示され、量的測定のためではない。記号:E,E
co RI;Bg,Bgl II;H,Hind III;Hc,Hinc II;B,Bam H I;S
m,Sma I;P,Pst I;fl ori,複製フアージflの起点;amp,ア
ムピシリン耐性遺伝子。矢印は５′→３′方向を示す。
オリゴ５及び６は図示の通りの基礎配列を有するオリゴ
デオキシヌクレオチドである。下線は全解読枠の中の
TAA翻訳終止コドンである。 第10図はプラスミドpGbRBN3の構成を示す。矢印は転写
の方向を示す。プラスミドは模式的に図示され、量的測
定のためではない。記号:Sf,Sfl I:Sm,Sma I;H,Hind II
I;fl ori,複数フアージflの起点;amp,アムピシリン耐性
遺伝子;G418、Tn5遺伝子（ADHIプロモーターの制御下
に）G418に耐性を与える;EV,Eco RV;Hc,Hinc II。 第11図はプラスミドpGbRBRRO1の構成を示す。プラスミ
ドpGb−iRRO1は第７図に説明されており、EF1αＡプロ
モーター（pEF1αＡ）の指令下のマルターゼ遺伝子を含
むと共にアルコール デヒドロゲナーゼＩプロモーター
（pADHI）の指令下のマルトース パーミアーゼ遺伝子
を含む〔双方のプロモーターは斜線部分で示されてい
る〕。pGb−RB2は第９図に示されている。pGb−RBRRO1
においてSIT4を含む断片は二部分（“SIT4側”）に分け
られる。プラスミドは模式的に図示され、量的測定のた
めではない。記号は第10図の記号参照。矢印は転写方向
を示す。 第12図は遺伝子の一工程開裂を示す。ステップ１におい
て、pGb−RBN3はSfi Iを用いて切断される。その結果DN
A断片を生成するがこれはその両側がSIT4遺伝子域と同
種である。これはSIT4遺伝子に対る統合を指令する〔R.
J.Rothstein（1983）in Methods in Enzymology,101,20
2参照〕。SIT4遺伝子域は斜線部分で示されている。双
方の染色体対立遺伝子は模式的に示されている。ステッ
プ２において、得られた菌株ApGb−RBN3はpUT332（末切
断）及びpGb−RBRRO1（Sfi Iによって切断）の双方によ
って形質転換される。共−形質転換の原理は文献〔A.H.
Brand,I.Breeden,J.Abraham,R.Steiglanz and K.Kasmyt
h（1985）Cell 41,41−48 and P.Siliciano and K.Tatc
hell（1984）Cell37,969−978〕に詳述されている。最
初の選択において本発明者はフレオマイシン（phleomyc
in）耐性のもの（プラスミドpUT332）を使用したけれど
も他のヒグロマイシン（hygromycin）Ｂのような抗生物
質に対する耐性を付与する２μ−誘導−エピソーム プ
ラスミドをも使用し得ることは勿論である。pUT332及び
フレオマイシンは商業的販売元（Cayla,Avenue Larrie
n,Centre Commericial de Gros,31094 Tolouse Ce′de
x,France）から入手され得る。PUT332についてはフレオ
マイシン耐性遺伝子がトランスポソンTn5から誘導さ
れ、酵母のプロモーターの指令下に配置された。ステッ
プ３においてエピソーム プラスミドPUT332が、非選択
的培地中での成育による形質転換体から取出される（キ
ュアリング）。記号:G418r,G418耐性遺伝子（ADHIプロ
モーターの指令下）;Sf,Sfi Iの切断によって生成され
たDNA断片の末端;MAL,交替処理されたマルターゼ遺伝子
及びマルトース パーミアーゼ遺伝子。各種プラスミド
の詳細については第９及び11図参照；＋pUT332,エピソ
ームプラスミドpUT332。 第13図はマルトース パーミアーゼ及びマルターゼの特
異的活性増加と培地Ａからのグルコース消失との相関を
示す。該図は市販の製パン用酵母菌株例えば菌株Ａにつ
いて典型点なものである。 第14図は培地Ａ中のドウ−膨起模擬実験の際の菌株Ａ並
びにそのrDNA誘導体のマルトース パーミアーゼの特異
的活性を示す。 第15図は炭素及びエネルギーの主給源としてマルトース
を含む培地Ａの中でのドウ膨起模擬実験の際の菌株Ａ並
びにそのrDNA誘導体に関するマルターゼの特異的活性を
示す。 第16図は炭素及びエネルギーの主給源としてマルトース
を含む培地Ａの中でのドウ−膨起模擬実験の際の菌株Ａ
並びにそのrDNA誘導体によるマルトース発酵を示す。 第17図は炭素並びにエネルギーの主給源としてグルコー
スを含む培地Ｂの中でのドウ−膨起模擬実験の際の菌株
Ａ並びにそのrDNA誘導体によるマルトース発酵を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/16 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/26 Ｃ１２Ｒ 1:865） 微生物の受託番号 ＣＢＳ ４０５．８７ 微生物の受託番号 ＣＢＳ ４０４．８７ 微生物の受託番号 ＣＢＳ ４０３．８７ 微生物の受託番号 ＣＢＳ ４８０．８８ 微生物の受託番号 ＣＢＳ ４００．８７ 微生物の受託番号 ＣＢＳ ４０１．８７ 微生物の受託番号 ＣＢＳ ４０２．８７ (72)発明者 ヨハネス ベルテュス ファン デル プラート オランダ国 2353セーカー レイデルド ルプ オルトマンスドレーフ 25 (72)発明者 ヨハネス アブラハム ド ホランデル オランダ国 2343エヌエー ウッフステ ヘースト ワッヘナールラーン ４ (56)参考文献 特開 昭61−40793（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−266（ＪＰ，Ａ) 英国公開2178431（ＧＢ，Ａ) Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ, Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．７ （1985），Ｐ. 539−545 Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ, Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．７ （1985），Ｐ. 547−551 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌ ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ. ７，Ｎｏ．７ （1987），Ｐ．2477− 2483 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒ ａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．209, Ｎｏ．３ （1987），Ｐ．508−517 Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．41，Ｎｏ．１ （1986），Ｐ．75−84 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．149，Ｎｏ．３ （1982），Ｐ．1064−1070

Claims (42)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】主たる炭素源及びエネルギー源として糖を
    含有する培地中における発酵で二酸化炭素及びエタノー
    ルを生産する形質転換酵母であって、親酵母は該糖を発
    酵することができるものであり、同一の培地中におけ
    る、形質転換されていない該親酵母の発酵よりも二酸化
    炭素及びエタノールの生産量が増大された形質転換酵母
    において、 該形質転換酵母が、形質転換の結果、少なくともひとつ
    のDNA構成体を含有し、該DNA構成体は、“移入された糖
    基質の取込み及び／又は初期の代謝的転化を促進するタ
    ンパク質をコードする少なくともひとつの遺伝子”を含
    有し、該遺伝子は、該形質転換酵母中で発現され得るも
    のであることを特徴とする前記の形質転換酵母。
  2. 【請求項２】構成体が“マルトース パーミアーゼ活
    性、マルターゼ活性又はマルトース調節用タンパク質活
    性を有する酵素をコードする少なくともひとつの遺伝
    子”又はそれらの組合せを有する請求項（１）記載の酵
    母。
  3. 【請求項３】遺伝子（複数）又はそれらの組合せが“グ
    ルコース抑制に不感受性であってマルトース誘導に関与
    しない転写制御”の下でもたらされるものである請求項
    （１）記載の酵母。
  4. 【請求項４】遺伝子が“アルコール デヒドロゲナーゼ
    Ｉ（IDHI）及び（又は）翻訳延長因子（EF1αＡ）プロ
    モーターの転写制御”の下にある請求項（２）記載の酵
    母。
  5. 【請求項５】プロモーターがサッカロミセス属に属する
    酵母からみちびかれたものである請求項（４）記載の酵
    母。
  6. 【請求項６】構成体がエピソーム要素の一部分である請
    求項（１）〜（５）のいずれか１項記載の酵母。
  7. 【請求項７】構成体が酵母の染色体の中に組込まれたも
    のである請求項（１）〜（６）のいずれか１項記載の酵
    母。
  8. 【請求項８】少なくとも二つの構成体を有する請求項
    （１）〜（７）のいずれか１項記載の酵母。
  9. 【請求項９】形質転換の結果として前記酵母内に組み込
    まれたDNA構成体が同種起源のものである請求項（１）
    〜（８）のいずれか１項記載の酵母。
  10. 【請求項１０】酵母が異種起源のDNAを有しないもので
    ある請求項（１）〜（９）のいずれか１項記載の酵母。
  11. 【請求項１１】主たる炭素源及びエネルギー源として糖
    を含有する培地中における発酵でマルトースをエタノー
    ル及び二酸化炭素へ発酵する形質転換酵母であって、親
    酵母はマルトースを発酵することができるものであり、
    同一の培地中における、形質転換されていない該親酵母
    の発酵よりも二酸化炭素及びエタノールの発酵速度が増
    大された形質転換酵母において、 該酵母が原核性DNAを実質上有していないこと、該DNAが
    下記遺伝子即ちマルターゼ活性、マルトース、パーミア
    ーゼ活性又はマルトース制御性タンパク質活性をコード
    する遺伝子のうちの少なくともひとつを有することを特
    徴とする前記の形質転換酵母。
  12. 【請求項１２】マルターゼが“翻訳延長因子（EF1α
    Ａ）プロモーターの転写遺伝子の発現制御”の下にもた
    らされたものである請求項（11）記載の酵母。
  13. 【請求項１３】マルトース、パーミアーゼが“アルコー
    ルデヒドロゲナーゼＩ（ADHI）プロモーターの転写遺伝
    子の発現制御”の下にもたらされたものである請求項
    （11）又は（12）記載の酵母。
  14. 【請求項１４】プロモーターがサッカロミセス属に属す
    る酵母からみちびかれたものである請求項（11）〜（1
    3）のいずれか１項記載の酵母。
  15. 【請求項１５】請求項（１）〜（14）のいずれか１項記
    載の酵母を乾燥することによって製造される、水分３〜
    ８％を含有する酵母。
  16. 【請求項１６】酵母がサッカロミセス属に属する酵母で
    ある請求項（15）記載の酵母。
  17. 【請求項１７】出発株として、請求項（１）〜（16）の
    いずれか１項記載の酵母を使用し、DNAによって仲介さ
    れた形質転換とは異なる酵母菌株改良技法によって得ら
    れる酵母。
  18. 【請求項１８】サッカロミセス セレビシエ ApGb−iA32/G418株、 サッカロミセス セレビシエ ApGb−iRRo1株、 サッカロミセス セレビシエ ApGb−eMAL6g株、 サッカロミセス セレビシエ ApGb−eMAL61株、 サッカロミセス セレビシエ ApGb−eMAL63株、 サッカロミセス セレビシエ CpGb−eMAL6g株、 サッカロミセス セレビシエ CpGb−eMAL61株、及び サッカロミセス セレビシエ ApGb−p2RBRR01＃１株 から成る群から選ばれた請求項（１）記載の形質転換酵
    母。
  19. 【請求項１９】請求項（１）〜（18）のいずれか１項記
    載の酵母から得られた圧搾された、即時乾燥又は活性乾
    燥酵母。
  20. 【請求項２０】テストＢにおいて165分間に酵母乾物重
    量285mg当り少なくとも340mlのガス生成を示し、テスト
    Ｂ′において165分間に酵母乾物重量285mg当り少なくと
    も170mlのガス生成を示す請求項（１）記載の形質転換
    酵母から得られた圧搾酵母。
  21. 【請求項２１】テストＢにおいて165分間に酵母乾物重
    量285mg当り400〜500mlのガス生成を示す請求項（１）
    記載の形質転換酵母から得られた圧搾酵母。
  22. 【請求項２２】請求項（20）又は（21）記載の圧搾酵母
    を乾燥することによって得られた即時乾燥又は活性乾燥
    酵母。
  23. 【請求項２３】テストＣにおいて165分間に酵母乾物重
    量285mg当り310〜360mlのガス生成、テストＣ′におい
    て165分間に酵母乾物重量285mg当り145〜195mlのガス生
    成、又はテストＣにおいて165分間に酵母乾物重量285mg
    当り320〜400mlのガス生成を示す請求項（１）記載の形
    質転換酵母から得られた乾燥酵母。
  24. 【請求項２４】pGb−eMAL6g、 pGb−eMAL61、 pGb−eMAL63、 pGb−iA32/G418、 pGb−iRRo1、 pGb−M6g（△−９）、 pGb−RBRR01、 pGb−RBN3、及び pGb−RBREG01 から成る群から選ばれたベクター。
  25. 【請求項２５】請求項（１）〜（23）のいずれか１項記
    載の酵母を含有することを特徴とするドウ又は類似製
    品。
  26. 【請求項２６】請求項（１）〜（23）のいずれか１項記
    載の酵母の使用を特徴とする穀粉性ドウ発酵製品又はア
    ルコール性飲料及び他のアルコール性製品の製造方法。
  27. 【請求項２７】主たる炭素源及びエネルギー源として糖
    を含有する培地中における発酵で二酸化炭素及びエタノ
    ールを生産する形質転換酵母であって、該親酵母は該糖
    を発酵することができるものであり、同一の培地中にお
    ける、形質転換されていない該親酵母の発酵よりも二酸
    化炭素及びエタノールの生産量が増大された形質転換酵
    母の製造方法において、 該親酵母に、“移入された糖基質の取込及び／又は初期
    の代謝的転化を促進するタンパク質をコードする少なく
    ともひとつの遺伝子”を有する少なくとも１種の同種DN
    A構成体を導入すること、 該導入がDNAによって仲介された形質転換技法を包含す
    るか又は他の酵母株改良技法を包含し、該DNAが形質転
    換される酵母種と同種の酵母起源のものであることを特
    徴とする上記の形質転換酵母の製造方法。
  28. 【請求項２８】構成体がマルターゼ活性、マルトース、
    パーミアーゼ活性又はマルトース制御タンパク質活性を
    呈する酵素をコードする少なくともひとつの遺伝子を有
    する請求項（27）記載の方法。
  29. 【請求項２９】構成体が少なくとも二つの該遺伝子を有
    する請求項（28）記載の方法。
  30. 【請求項３０】遺伝子が“アルコール デヒドロゲナー
    ゼＩ（ADHI）及び／又は翻訳延長因子（EFIαＡ）プロ
    モーターの夫々の転写制御”の下にある請求項（28）記
    載の方法。
  31. 【請求項３１】遺伝子又はそれられの組合せが“グルコ
    ース抑制に不感受性であり、及び／又はマルトース誘導
    に関与しない転写制御”の下でもたらされたものである
    請求項（27）〜（30）のいずれか１項記載の方法。
  32. 【請求項３２】構成体がエピソーム要素の一部分である
    請求項（27）〜（31）のいずれか１項記載の方法。
  33. 【請求項３３】構成体が酵母の染色体の中に組込まれた
    ものである請求項（27）〜（31）のいずれか１項記載の
    方法。
  34. 【請求項３４】少なくとも二つのDNA構成体の誘導を包
    含する請求項（28）〜（33）のいずれか１項記載の方
    法。
  35. 【請求項３５】酵母が異種起源のDNAを有せず、遺伝子
    置換技法を用いて遺伝子（複数）を染色体中に組込むこ
    とを包含する請求項（27）〜（31）又は（33）〜（34）
    のいずれか１項記載の方法。
  36. 【請求項３６】染色体の胞子形成−特異的遺伝子が“同
    一の胞子形成−特異的遺伝子を有するDNAセグメント”
    によって置換され、該セグメントの中へ請求項（27）又
    は（33）記載の遺伝子が挿入される請求項（35）記載の
    方法。
  37. 【請求項３７】プロモーターがサッカロミセス属に属す
    る酵母からみちびかれたものである請求項（30）記載の
    方法。
  38. 【請求項３８】酵母がサッカロミセス属に属する酵母で
    ある請求項（27）〜（37）のいずれか１項記載の方法。
  39. 【請求項３９】請求項（27）〜（38）のいずれか１項記
    載の方法に従って製造された酵母の適用を特徴とするド
    ウ又は類似製品の製造方法。
  40. 【請求項４０】請求項（27）〜（38）のいずれか１項記
    載の方法に従って製造された酵母の使用を特徴とするア
    ルコール性飲料及び他のアルコール性製品の製造方法。
  41. 【請求項４１】請求項（27）〜（38）のいずれか１項記
    載の方法に従って製造された酵母の使用を特徴とするパ
    ン及び関連製品の製造方法。
  42. 【請求項４２】請求項（27）〜（38）のいずれか１項記
    載の方法に従って製造された酵母の使用を特徴とするマ
    ルターゼ又はマルトース パーミアーゼ活性を有する酵
    素の製造方法。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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GB2178431A (en) 1985-07-15 1987-02-11 Bioteknika International Genetically engineered lactose utilizing yeast strains

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．７ （１９８５），Ｐ．５３９−５４５
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．７ （１９８５），Ｐ．５４７−５５１
Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．４１，Ｎｏ．１ （１９８６），Ｐ．７５−８４
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１４９，Ｎｏ．３ （１９８２），Ｐ．１０６４−１０７０
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．２０９，Ｎｏ．３ （１９８７），Ｐ．５０８−５１７
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．７ （１９８７），Ｐ．２４７７−２４８３

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