CN1026795C - 促进糖发酵速率的酵母新菌株、这些菌株的获得方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及能改善糖发酵的酵母、得到这些酵母的方法和它们的使用方法。这些酵母显示了较高的代谢速率，在含有糖如麦芽糖作为主要碳源和能源的培养基中可产生较高的二氧化碳和乙醇产量。在酵母中导入一个或多个至少含有一个编码促进转移底物摄入和/或起始代谢转化的蛋白基因的DNA构建后，提高了糖发酵速率。

Description

本发明涉及能改进糖类发酵的酵母新菌株、构建这些酵母的方法和这些改进后酵母的使用。

众所周知酵母菌株属于酵母菌属（Saccharomyces），在厌氧条件下，酵母菌株能发酵糖类产生摩尔量相等的CO₂和乙醇，酵母在面团中的发酵活性即为该发酵的结果，商业产品面包酵母以浓缩酵母或新鲜酵母和干燥酵母等数种形式出现，干燥酵母易制成活性干燥酵母和速时干燥酵母，它们分别含有6～8%和3～6%的水份。

酵母中糖代谢的最早步骤为糖分子穿过质膜，在酵母中对于不同的糖类有特异载体表达。例如，麦芽糖的摄入依赖于特异的麦芽糖渗透酶的存在。该载体有两种形式，两者的区别在于其最大速度（Vmax）和亲和常数（Km）不同（A.Busturia    and    R.Lagunas，Biochim.Biophys.Acta820，324（1985））。麦芽糖穿过酵母质膜的运输是与该膜上的电化学质子梯度相偶联的，每一个麦芽糖分子伴随着一个质子进行同向易位（R.Serrano，Eur.J.Biochem.80，97（1977））。

在细胞内，通过麦芽糖酶（α-葡糖苷酶）催化反应，将麦芽糖水解为两个葡萄糖分子。接着通过Embden-meyerhof途径，葡萄糖再转化为二氧化碳和乙醇。与发酵葡萄糖相比较，发酵麦芽糖还需另外两种酶：麦芽糖渗透酶和麦芽糖酶，麦芽糖诱导这些酶的合成，而葡萄糖、果糖或甘露糖则起抑制作用。在非糖化（“精的”）的面 团中，麦芽糖是酵母易得到的最丰富的糖。在面团中加入蔗糖时，该二糖则在细胞外由酵母水解成葡萄糖和果糖。然后由独特的渗透酶作用，这些己糖被酵母摄入。

通常发现，在含麦芽糖的面团中加入蔗糖抑制酵母细胞对麦芽糖的代谢作用，这是由于编码麦芽糖渗透酶和麦芽糖酶的基因转录受到了葡萄糖的抑制（R.B.Needleman，D.B.Kabace，R.A.Dubin，E.L.Perkins，N.G.Rosenberg，K.A.Sutherland，D.B.Forrest    and    C.A.Michels，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81，2811（1984））。

摄入和水解麦芽糖所必须的基因聚集在MAL位点上（R.B.Needleman    et    al.Supra）。酵母菌属的菌株可含有多至5个MAL位点（MAL1-4和MAL6），这些位点不是连接在一起的，而是位于不同染色体的顶枝上（J.L.Celenza    and    M.Carlson    Genetics109，661-664（1985））。一个MAL位点包含有编码麦芽糖渗透酶、麦芽糖酶和一种或几种麦芽糖诱导所需的调节蛋白（MAL调节子）的基因（R.B.Needleman    et    al.Supra;J.D.Cohen，M.J.Goldenthal，T.Chow，B.Buchferer    and    J.Marmur，Mol.gen.Genet.200，1（1985）;R.A.Dubin，E.L.Perkins，R.B.Needleman    and    C.A.Michels，Mol.Cell.Biol.6，2757（1986））。所述的基因已被分离和克隆（A.O.J.D.Cohen    et    al.Supra;R.B.Needleman    et    al.，Supra;H.J.Federoff，J.D.Cohen，T.R.Eccleshall，R.B.Needleman，B.A. Buchferer，J.Giacalone    and    J.Marmur，J.Bacteriol.149，1064（1982））。

正如上面所述的，在精面团中的酵母发酵依赖于麦芽糖作为主要底物。通过淀粉酶（通常存在于面粉中）的作用，由面团中的淀粉可产生麦芽糖。另外，在面粉中还含有不等量（0～0.5%）的游离糖类象葡萄糖、棉子糖等（H.Suomalainen，J.Dettwiler    and    E.Sinda，Process    Biochem.7，16（1972））。这些糖很快地被酵母消耗掉。一些研究报道了麦芽糖发酵和面包酵母本身的发酵活性之间的相关可能性。一些例子表明麦芽糖发酵速度和麦芽糖酶及麦芽糖渗透酶的活性正相关，然而，没有发现精面团中的发酵活性与麦芽糖酶和麦芽糖渗透酶的活性有正相关（P.Hautera    and    T.Loevgren，J.Inst.Brew.81，Microbiol.4，37（1977））。

在含有编码麦芽糖酶和麦芽糖渗透酶基因的多拷贝质粒转化的酵母细胞中，麦芽糖酶的特异活性增加四倍，而麦芽糖渗透酶的活性没有增加。导入编码调节蛋白的外源基因后，麦芽糖酶的特异活性有适度增加，但还是看不到对麦芽糖渗透酶活性有任何影响（J.D.Cohen    et    al.Supra）。这些研究者没有对所获转化体产生的二氧化碳和乙醇进行测定。事实上现有技术不主张进行这种试验，因为在精面团中，麦芽糖渗透酶的活性与二氧化碳产物（发酵活性）毫不相关，这些已得到反复的证明（H.Suomalainen，J    Dettwiler    and    E.Sinda，Supra;H.Suomalainen，Eur.J.Appl.Microbiol.1，1（1975）;P.Hautera    and    T.Loevgren，Supra;T.Loevgren    and    P.Hautera， Supra）。

我们已经找到了由下面将要描述的完整质粒转化的酵母，与没有转化的相比，它能提高麦芽糖渗透酶和麦芽糖活性水平。令人惊呀的是麦芽糖酶和麦芽糖渗透酶活性的提高与CO₂产量或发酵活性的增加是一致的，同样，在由附加载体转化的酵母中可以看到同样的现象。

这些改进酵母显示了较高的代谢速度，因而从含糖（如麦芽糖作为主要碳源和能源）的培养基中获得较高的二氧化碳和乙醇的产量。本发明提供的方法涉及重组DNA技术在不受象葡萄糖这样的糖类抑制的大大提高麦芽糖发酵速率所述酵母中的应用。

另外，这些改进的酵母菌株在面团中显示了良好的发酵活性（气体产量）。类似地，在较短的发酵时间里，这些酵母产生乙醇的速率较快，这些乙醇可作为饮用产品和工业酒精，或者在一定时间内可产生较大量的酒精。

另外，在麦芽糖（积累）抑制转化糖或淀粉的酶时，对于发酵方法来说，迅速除去麦芽糖是具备优越性的。通过本发明的方法可得到导入编码麦芽糖酶和/或麦芽糖渗透酶的外源基因的酵母。

本发明提供了一种改进糖发酵速度的转化酵母及其生产方法，其中包括至少有一个优选同源的含有至少一个编码促进转移底物摄入和/或代谢转化起始蛋白基因的DNA构建导入酵母体内，并能在其中表达。在发酵的几个阶段可以加快糖发酵速率，例如由于发酵麦芽糖或蔗糖而引起速率提高。

同源DNA则表示来源于同一个酵母属，如酵母菌属用来源于酵母菌属的DNA进行转化。这种方能够改进该酵母属的已具备特征，而不必导入该属的以前没有的新特性。在有氧和/或厌氧条件下，可 改进糖发酵速率。为完成本发明目的基因包括：渗透酶（尤其是麦芽糖渗透酶）、糖酶（尤其为麦芽糖酶）、激酶（尤其是己糖激酶和葡萄糖激酶）等等的基因。本发明可能使用的有：一个摄入葡萄糖或果糖所需的运载蛋白和催化己糖（使其在细胞内起始代谢转化）为己糖磷酸酯的己糖激酶和葡萄糖激酶。

本发明还提供了将至少一个同源DNA构建物导入酵母的有效方法。

对本发明有益的采用的一个构建物至少包括一个编码促进麦芽糖摄入和麦芽糖起始代谢转化为葡萄糖的基因。用这种方法可以得到较原始（受体）菌种有许多优越性的酵母。改进后酵母的优点在于增加了乙醇和CO₂的产量。例如当本发明应用于面包酵母，对于面包师来说将产生巨大的优越性，因为由于新菌株改进的发酵活性使得面包师仅需较少的时间或酵母即可获得精面团。

本发明的转化菌株将进一步增加，它可作为非DNA转化作用的改进方法的起源菌株，如细胞质融合、群体杂交和突出，所得菌株视为本发明的一个部分。

根据本发明的优选实施方案，在有葡萄糖存在的条件下，新菌株将消耗大量的麦芽糖。所以面包师还可省下糖的费用，因为获得甜面团仅需加很少的糖。

众所周知渗透性酵母在精面团中的发酵活性是很低的。采用渗透性酵母目的在于其在甜面团中有较好的发酵活性。在制甜面包的面团中含有10～30%的糖（基于面粉重量）。因此，根据本发明选择渗透性菌株作为受体，得到的渗透性酵母不仅可用于甜面团，而且可用于精面团，因为它发酵麦芽糖的能力用本发明的方法得以改进。于 是面包师可以很方便地只需要一种酵母用于甜面团和精面团。

对于既能在精面团又能在甜面团中有较好发酵活性的酵母菌株的要求在EP-A-128524和DE-A-2757778中已有描述。为了获得在富含糖和精面团中均发挥较好作用的酵母菌株，EP-A-128525描述了质体融合方法：DE-A-2757778描述通过杂交或突变方法制备的二倍体菌株选择这种菌株的方法。两种方法均需许多实验，而且结果不能预测和重复。利用本发明的方法，得到转化酵母菌株是可以控制和重复的。按照本发明生产的菌种，试验最少，因为除了公开的改进菌株特性外，菌株本身的特性实际上是不能改变的。

本发明提供了一种浓缩酵母，在试验B中，在165分钟内每285mg干基酵母产生至少340ml气体。在试验B′中为每285mg干基酵母产生至少170ml气体。试验B和B′在后面描述。优选的浓缩酵母在试验B中，于165分钟内，气体产量为380～450ml/285mg干基酵母，试验B′中气体产量为180～240ml/285mg干基酵母，在最佳的试验B和B′中气体产量分别为400ml/285mg和190ml/285mg干基酵母。从该浓缩酵母有益地制备速时干燥或活性干燥酵母。在浓缩酵母的干燥期内，基于干基的15～25%的发酵活性逐渐丢失。本发明还提供了一种干燥酵母（3～8wt%的水份），它在试验C中气体产量为310～360ml/285mg干基酵母（时间为165分钟），在试验C′中为145～195ml/285mg干基酵母，优选的干燥酵母在试验C和C′中气体产量分别为330ml/285mg干基酵母和155ml/285mg干基酵母。根 据本发明制备的酵母所产生的气体值，当用能买到的菌株进行试验C和C′时是达不到的。本发明得到的酵母还能在含0～6或0～10%糖的面团中显示较好的发酵活性。以这种方式可以制备浓缩酵母，其在试验B中，165分钟内，气体产量为400～500ml/285mg干基酵母，优选的浓缩酵母产生气体至少为440ml/285mg干基酵母。然后得到干燥酵母，在试验C中，165分钟内产生气体320～400ml/285mg干基酵母，优选的产生气体至少为350ml/285mg干基酵母。

已经发现这些新菌株在发酵食用产品和工业酒精时的优点是相似的。

因为当麦芽糖作为底物时，这些新菌株的总代谢速度已有增加，于是代谢物如甘油和芳香化合物的产生总速度也增加。

本发明的另一个方面为提供了携带编码一种或多种涉及麦芽糖发酵蛋白的DNA构成物载体。本发明还提供了一个微生物受体，优选的一种酵母，它属酵母菌属，用本发明公开的载体转化。这些载体可以自我复制和有益地含有选自编码麦芽糖渗透酶、麦芽糖酶和麦芽糖调节蛋白基团的一个基因或几个基因的组合。意想不到地发现用这些载体转化的酵母-加速麦芽糖发酵，在面团中的CO₂生成速度也增大。然而这些外加基因位于游离体，从参考文献中可知，在无选择繁殖期间这些染色体外分子易丢失（如特例：在G418缺失的条件下生长）（C.D.Holleuberg（1982）Gene Cloning12，Oxganisms Other than E.Coli，Eds.P.H.Hofschneider，W.Goebel，Springer Verlag，119;S.A.Parent，C.M.Fenimone，and K.A. Bostian（1985），Yeast1，83）。从实用观点来看，有益地构建一套完整的含有麦芽糖酶和/或麦芽糖渗透酶基因（优选改变的）的质粒，这里的“改变”是指用另一个启动子（优选系用同源的）与自然启动子交换。这里发展了在无选择压力的条件下，使得质粒稳定地繁延的方法，为了得到稳定的转化体，新导入DNA的整合不再是先决条件。

从文献中了解到一个含有20～100个分子组成的外源质粒的细胞（C.D.Hollenberg（1982），Supra;A.Takagi，E.N.Chun，C.Boorchird，S.Harashima    and    Y.Oshima，Appl.Microbiol.Biotechnol.23，123;J.Mellor，M.J.Dobson，N.A.Roberts，N.J.Kingsman    and    S.M.Kingusman（1985）Gene33，215）。

用外来启动子替换原始启动子，可以进一步提高游离基因的表达水平。这似乎在以后没有选择压力存在的条件下，质粒的稳定复制成为可能。

根据本发明的方法，麦芽糖酶和/或麦芽糖渗透酶基因通过线性质粒的转化有益地整合到酵母染色体中（参见T.L.Orr-Weaver，J.W.Szostak，R.Rothstein（1981）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78，6354）。所得到的酵母是稳定的转化体，即在既使无选择压力的条件下，改变的麦芽糖酶和/或麦芽糖渗透酶基因可保持在基因组内。

整合时只有质粒上的一个或几个基因拷贝整合入染色体。因此，为了得到象采用游离载体时改进CO₂产量那样的效果，采用对葡萄 糖抑制不敏感的良好组成启动子可有益地改变基因表达水平。为了补偿用游离和整合载体转化酵母之间的基因拷贝数区别和防止葡萄糖阻遏的作用，这些启动子是优选的。例如，据观察在含有麦芽糖作为主要碳源和能源及相对低浓度葡萄糖的培养基中，发酵的最初30～40分钟内，麦芽糖渗透酶和麦芽糖酶的mRNA水平下降至几乎不可检测的水平，一旦葡萄糖消耗完毕，麦芽糖对基因表达的诱导作用使得两种mRNA水平迅速升高。

可以使用自然的或野生型启动子或可由不同启动子取代的启动子基因，优选的是一个同源启动子。尤其，野生型启动子是可调节的或可诱导的，它能提供结构转录、或者是一较强或较弱启动子。相反地、野生型启动子为结构的启动子，它能提供一个可调节或可诱导启动子或一个较强或较弱的启动子。

按照需要使用强启动子，尤其是当受体中构建物拷贝数相对的低时。强启动子通常涉及在酵母生活周期中使蛋白产率处于较高水平或者是可调节的为完成本发明任务，在酵母生活周期中的某一阶段发挥作用。

与酵母的糖酵解过程相联系的启动子包括乙醇脱氢酶Ⅰ和Ⅱ，磷酸葡萄糖异构酶、葡萄糖磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、甘油醛磷酸脱氢酶、磷酸甘油激酶、烯醇化酶、磷酸甘油变位酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的启动子。其它涉及高产量蛋白质的启动子包括核糖体的表达，象起始因子、延长因子等转录的启动子。尤其是包括EF-1和EF-2等的延长因子启动子。

为了完成本发明任务，与结构基因组合的启动子的使用涉及麦芽糖代谢，尤其是麦芽糖酶、麦芽糖渗透酶和MAL调节子。这些启动 子可以是组成性的或可调节的，只要在糖发酵期间可以诱导启动子，例如，糖酵解的许多启动子可由糖或糖代谢物如乙醇激活。于是，象乙醇脱氢酶这样的启动子在面粉发酵期间显示活性。同样与细胞再育相关的那些启动子在面粉发酵期内也显示活性。另外，提供的启动子不受MAL调节子的调节，也不受葡萄糖的阻遏，还有基因不需麦芽糖诱导。

将野生型启动子与完成本发明任务的结构基因连接，可预想使得一个调节蛋白的产量有所提高。以这种方式，有诱导物存在时，调节蛋白可保持在较高水平。例如麦芽糖可使得MAL调节蛋白表达处于高水平，这样使得与麦芽糖代谢相关的其它蛋白得以表达，并受MAL调节蛋白调节。

如实验程序中详细描述的基因表达中的改变包括原始启动子加上（部分）不转译的乙醇脱氢酶Ⅰ（ADHI）的引导顺序与转译延长因子EFlαA（优选取自受体酵母，如酵母菌属）的交换。所以，表达与葡萄糖的阻遏无关和不取决于麦芽糖的诱导。

由这些整合的质粒转化的酵母与没有转化的菌株相比其麦芽糖渗透酶和麦芽糖酶活性水平得以提高。在用游离载体转化的酵母中，出乎预料地发现增强麦芽糖酶和麦芽糖渗透酶活性与CO₂产量或发酵活性增加相一致。

在贮存期间甚至提高温度如20～25℃，保持了获得的改进的发酵活性。贮存期间发酵活性的相对丢失最终与亲代菌株和本发明的菌株相一致。富含糖的面团中的发酵活性不受该新方法的影响，因为用整合质粒转化的新菌株的发酵活性是与获得这些菌株的受体菌株的发酵活性一样的。

完成本发明任务的酵母受体中至少含有一构建物的拷贝，可能有两个或多个拷贝，通常不超出约200个，这些取决于基因是否被整合进基因组，是否扩增，或有无多拷贝的外源染色体成分。根据保持制备的染色体外成分的稳定性需要、预期的拷贝数、取决于拷贝数可进行的转录水平等等，可决定是否整合。

构建物可包括具有相同或不同启动子的一个或多个结构基因，用常规方法可制备构建物，如从合适受体中分离所需要因，人工合成基因的全部或部分片段，或为它们的组合。同样，通过从自然库中分离，人工合成，或它们的组合方法可以得到调节信号、转录和转译的起始及终止区域。各种片段可受到内切酶消化（限制性）、再连接、序列测定、体外诱变、引物修复、或类似过程。各种操作在文献中是已知的，可用来完成特定的目的。

用常规方法对各种片段进行组合、克隆、分离和序列分析。每次操作后，将DNA片段或这些片段的组合插入克隆载体、该载体转化入一个克隆受体中（如大肠杆菌（E.Coli）），培养、溶解克隆受体，分离质粒和限制性分析法分析片段，进行序列测定，或它们的组合，或类似方法。

在发展构建物和受体细胞转化的过程中，采用了各种载体，这些载体有：克隆载体、表达载体，和用来整合入受体的载体或使用用于转化和整合作用的裸露DNA。

克隆载体（最重要部分）的特点为在克隆受体中有复制起点功能，有一个选自含有克隆载体受体的标记，可能有一个或几个多聚衔接物，或者适于插入，选择，操作，易测定序列、切割等的附加序列。另外，可采用穿梭载体，该载体有两个或更多个的复制起点，使得该载体能在 多子一个受体中复制，例一个原始受体和一个真核受体。

表达载体通常有一个构建物插入，该构建物含有转录和转译起始和终止区域或缺少一个或两个这些调节区域，这些区域则由表达载体上编码蛋白质产物的插入序列提供。于是，构建物可插入含有转录和转译功能区域的基因中，在5′端插入或切割基因，将构建物插入现有调节区域能够调节控制的区域中，通常期望起始密码在原有起始密码的5′端，除非一个融合产品可以接受，或起始密码超出了原始起始密码的范围。在另外一些例子中，表达载体在起始和终止调节区域之间有一个或多个限制位点，于是结构基因可在限制位点插入，且受这些区域的调节控制。为了完成本发明任务的用于表达的载体（无论用于染色体外稳定性保持或整合），受体内稳定的构建物和载体是不含外源（非酵母菌属）DNA的。

根据本发明方法的进一步特征生产具备上述描述的所有优越性的酵母，而且还去除原核细胞DNA序列，这过程用基因置换技术完成（R.J.Rothstein（1983）Methods    in    Enzymology，101，202）。本发明的这些技术现在被有益地应用于酵母菌属细胞。例如，用含有位于酵母菌属孢子形成特异性基因内编码改变麦芽糖酶和/或麦芽糖渗透酶基因的载体转化酵母菌属细胞（E.Gottlin-Ninga，D.B.Kaback（1986）Mol.Cell.Biol.6，2185）。当该DNA导入酵母菌属受体细胞后，新导入的DNA和染色体孢子形成特异性基因进行同源重组。结果，嵌入孢子形成特异性序列的改变麦芽糖酶和/或麦芽糖渗透酶基因被整合到染色体中。所得转化体根本没有原核DNA。

假如测定到麦芽糖酶和麦芽糖渗透酶活性的满意速率，甚至更好 的结果，那么这是令人满意的。通过改变启动子的两个基因或将不同数量的（改变的）麦芽糖酶和麦芽糖渗透酶基因整合到酵母基因组内（例如根据下面描述的方法，采用几个整合位点），可以得到上面的结果。采用编码麦芽糖酶和麦芽糖渗透酶的其它同Ⅰ酶的麦芽糖酶和麦芽糖渗透酶的满意速率。另外，只要具有麦芽糖酶或麦芽糖渗透酶活性的酶基因可以采用。另外，采用类似方法能将编码MAL调节蛋白的基因整合到基因组中（参见例1），该基因可由自己本身的自然启动子控制，也可以由另外一个启动子（优选的为酵母菌属）控制。这对获得麦芽糖酶和麦芽糖渗透酶活性的满意速率也是有用的。

已寄存菌株：

下列菌株已寄存在Centraal    Bureau    Voor    Schimmelcultures，Baarn，Holland：

酒酵母（Saccharomyces    cereuisial）237Ng（菌株A）于1986年3月25日在CBS寄存，登记号为158.86。

酒酵母（Saccharomyces    cerevisiae）DS15543（菌株C）于1987年9月3日在CBS寄存，登记号为406.87。

包含有质粒p21-40的大肠杆菌（Escherichia    Coli）于1987年8月28日在CBS寄存，登记号为400.87。

含质粒pYEF46的大肠杆菌子1987年8月28日已在CBS寄存，登记号为401.87。

含质粒pY6的大肠杆菌于1987年8月28日已在CBS寄存，登记号为402.87。

含质粒peG418的大肠杆菌于1987年3月25日已寄存在 CBS，登记号为160.86。

含质粒pTZ19R的大肠杆菌于1987年9月3日已在CBS寄存，登记号为405.87。

含质粒pTZ19R/ADHI的大肠杆菌于1987年9月3日在CBS寄存，登记号为404.87。

含质粒p153-215AK的大肠杆菌于1987年9月3日已在CBS寄存，登记号为403.87。

含质粒pLF24的大肠杆菌于1988年3月8日已在CBS寄存，登记号为156.88。

含质粒pUT332的大肠杆菌于1988年3月8日已在CBS寄存，登记号为158.88。

含质粒pTZ18R的大肠杆菌于1988年7月27日已在CBS寄存，登记号为480.88。

图解说明：

图1描述了质粒pGb-eMAL69的构建，箭头表示所指基因的转录方向，质粒是简图而不是详细结构。缩写：G418，对G418有对照抗性的Tn5基因（由ADHI启动子控制）;P，PvuⅠ;X，XbaⅠ;S，SalⅠ;H.HindⅢ;CIP：小牛肠道磷酸酶。

图2描述了质粒pGb-eMAL61的构建，质粒只是以简图表示而不是详细结构。缩写：△麦芽糖酶的部分缺失基因;B，BgⅡ。参见图1的说明。

图3描述了质粒pGb-eMAL63的构建，质粒以简图表示而不是详细结构。缩写：（K），填入KpnⅠ位点;（S），填入 SaⅡ位点;klenow，DNA聚合酶大亚基;H.HindⅢ。还有参见图1说明。

图4表示pGb-M6g（△-9）的构建，缩写：H，HindⅢ：St，StuⅠ;Klenow，DNA聚合酶Ⅰ的大片段;EV，EcoRⅤ;Xh，XhoⅠ;M，MluⅠ;fl    ori，噬菌体fl的复制起始点;amp氨苄青霉素抗性基因;S.P.序列引物。箭头表示5′→3′方向。缺失区域由点线和△表示。

图5表示质粒pGb-M6g（△-9）序列。

a）麦芽糖酶和麦芽糖渗透酶基因，箭头表示转录方向。St（StuⅠ）作为构建缺失突变的起点，基因间区域的相关部分在该图的下部表示。

b）pGb-m6g（△-9）序列，缺失区域从-9至-417。多聚衔接物表示寡聚核苷酸，它已连接在Ba131处理过的DNA上（还可参见图4）。

图6描述质粒pGb-iA32/G418的构建。箭头表示转录方向，质粒是示意地绘出没有按照比例。缩写：H，HindⅢ;EV，EcoRⅤ;fl    ori噬菌体fl的复制起始位点;amp氨苄青霉素抗性基因;G418，对G418有对照抗性的Tn5基因（启动子为ADHI）;S，SmaⅠ;Hc，HincⅡ，pADHⅠ，醇脱氢酶Ⅰ基因启动子十部分5′引导（镶接区域）。

图7表示质粒pGb-iRRol的构建。

a）质粒没有按照比例绘出。缩写：E，EcoRⅠ;B/Bg，BamHⅠ/BglⅡ连接;H，HindⅢ。

b）诱变pT4，将EFlαA启动子+5′引导与麦芽糖酶基的 5个N端氨基酸的密码融合，这还产生一个BglⅡ位点，显示了相关序列。

诱变引子与EFlαA序列部分互补（用点表示），不配对区域为麦芽糖酶密码和方框中BglⅡ的识别位点（注：这里诱变引子的方向为3′→5′，即BglⅡ位点应从右向左阅读（5′→3′）。

标出了麦芽糖酶序列的N端的5个氨基酸密码子。BcⅡ识别位点在框内。

在pT4-M序列中标出了涉及突变的序列。BglⅡ位点在方框内。星号表示麦芽糖酶苷酸序列的偏差，在第4个密码上的偏差是静止突变。

c）质粒没有按照比例画出。缩写：H，HindⅢ;Bc，BclⅠ，E，EcoRⅠ;Bg，BglⅡ;EⅤ，EcoRⅤ;Bg/Bc，BglⅡ/BcⅡ连接;pEFlαA（嵌在方框内），EFlαA的5′侧（启动子+5′引导序列）;fl    ori，噬菌体fl的复制起点;amp，氨苄青霉素抗性基因。

d）质粒没有按照比例画出。缩写：见c）。

图8表示质粒pGb-SNENS的构建，示意地画出质粒而不是按比例画的。缩写：E，EcoRⅠ;H，HindⅢ;Sf，SfiⅠ;N，NotⅠ;fl    ori，噬菌体fl的复制起点;amp，氨苄青霉素抗性基因。箭头表示5′→3′方向。寡聚3和4表示人工合成的寡聚脱氧核苷酸的碱基序列。

图9表示质粒pGb-RBZ的构建，质粒只是示意地画出而没有按照比例。缩写：E，EcoRⅠ，Bg，BglⅡ;H，HindⅢ，Hc，HincⅡ，B，Bam    HI;Sm，SmaⅠ;P，PstⅠ;fl ori，噬菌体fl复制起始点;amp，氨苄青霉素抗性基因。箭头表示5′→3′方向，寡聚5和6表示人工合成的寡聚脱氧核苷酸的碱基序列。划线的是所有解读框内的TAA转译终止密码。

图10表示质粒pGb    RBN3的构建。箭头表示转录方向。质粒被示意地画出而没有按照比例。缩写：Sf，SfiⅠ;Sm，SmaⅠ;H，HindⅢ;fl    ori，噬菌体fl复制起点;amp，氨苄青霉素抗性基因;G418，对G418有对照抗性的Tn5基因（由ADHI启动子控制）;EⅤ，EcoRⅤ;Hc，HincⅡ。

图11表示质粒pGb-RBRR01的构建，质粒pGb-iRR01全部在图7中描述和含受EFlαA启动子（pEFlαA）控制的麦芽糖酶基因及受醇脱氢酶Ⅰ启动子（pADHI）控制的麦芽糖渗透酶基因（两个启动子均标在方框内）。pGb-RBZ在图9中描述。在pGb-RBRR01中SIT4分为两个部分（“SIT4侧”）。质粒只是示意地画出而不是按比例的。缩写参见图10的说明。箭头表示转录方向。

图12描述一步基因破裂，步骤1用SfiⅠ消化pGb-RBN3，释放出两侧均与SIT4基因区域同源的DNA片段，它直接整合到SIT4基因中（参见R.J.Rothstein（1983）in    Methods    in    Enzymology，101，202），SIT4基因区域用条纹盒表示。示意地画出两个染色体等位基因。步骤2，用pUT332（没有消化）和SfiⅠ消化后的pGb-RBRR01转化得到的菌株ApGb-RNB3。共同转化原理已有报导（参见A.H.Brand，I.Breeden，J.Abraham，R.Steiglanz    and    K.Kasmyth（1985）Cell41，41-48    and    P. Siliciano and K.Tatchell（1984）Cell37，969-978）。第一次选择我们利用腐草霉素抗性（质体pUT332），但是，当然也可使用对其它抗生素如潮湿霉素B有抗性的2μ衍生游离质粒。pUT332和腐草霉素可以从Cayla，Avenue Larrien，Centre Commercial de Gros，31094Toulouse Cedex，France买到。在pUT332上，腐草霉素抗性基因从转位子Tn5中得到和在一个酵母启动子调节下定位。步骤3，从生长在非选择培养基中的转化体中去除游离质粒pUT332（愈合）。缩写：G418r，G418抗性基因（受ADHI启动子控制）;Sf，由SfiⅠ消化产生的DNA片段的末端;MAL，改变的麦芽糖酶和麦芽糖渗透酶基。质粒的详细细节也可参见图9和11;⁺pUT332，游离质粒pUT332。

图13表示麦芽糖渗透酶和麦芽糖酶专一活性的增加与葡萄糖从培养基A中消失的关系，对商品面包酵母如菌株A来说，这些曲线图是典型的。

图14表示在提高面团的刺激在培养基A中，菌株A及其它的rDNA衍生菌株的麦芽糖渗透酶的特异活性。

图15表示菌株A及其它的rDNA衍生菌株在提高面团刺激的含有以麦芽糖作为主要碳源和能源的培养基A中培养的麦芽糖酶的特异活性。

图16表示在提高面团的刺激下，菌株A和它的rDNA衍生菌株在含有以麦芽糖作为主要碳源和能源的培养基A中培养的麦芽糖发酵。

图17表示在提高面团的刺激下，菌株A和它的rDNA衍生菌株在含有以葡萄糖为主要碳源和能源的培养基中培养时的麦芽糖发酵。

下列实验数据详细说明本发明，我们知道，熟悉这些方法的本领域的普通技术人员可能利用其它酵母菌株和载体能达到本发明的相同目的。这些改变也属于本发明范围。

克隆技术

普通克隆技术的参考文献已由Maniatis    et    al.编成手册（T.Maniatis，E.F.Fritsch，J.Sambrook（1982）Molecular    Cloning，A    Laboratory    Manual）。利用制造商推荐的限制性酶，这些酶可以从New    England    Biolabs（Biolabs），Bethesda    Research    Laboratories（BRL）或从Boehringer    Mannheim（Boehringer）获得，通常裂解1μg的DNA需要1至5个酶单位。

采用Cacl₂技术可完成大肠杆菌的转化（T.Maniatis et al.，Supra）。

重组质粒的构建

1）pGb-eMAL6g

该质粒在酵母中能自我复制，含有编码麦芽糖渗透酶和麦芽糖酶的基因，构建概况见图1。

peG418从pEMBLYe23获得（Baldari    and    G.Cesarini（1985），Gene35.27）和在SaⅡ和HindⅢ位点之间含有Tn5基因片段（Ress    et    al.EMBOJ.（1984）3，3317），Tn5基因对G418具有抗性，受来自酵母的醇脱氢酶Ⅰ（ADHI）启动子调控，与Bennetzen和Hall描述的相似（J.C.Bennetzen    and    B.D.Hall（1982）J.Biol.Chem.257，3018）。用HindⅢ裂解peG418， 用CIP脱磷酸和与pY6×HindⅢ×PvuⅠ的消化产物连接。pY6已有描述（R.B.Needleman    and    C.Michels（1983）Mol.Cell.Biol.3，796;R.B.Needleman，D.B.Kaback，R.A.Dubin，S.L.Perkins（1984）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，2811）和含有包含MAL6g位点的7.0Kb    HindⅢ片段。产生pGb-eMAL6g

2.pGb-eMAL61

这个2μ衍生游离质粒含有编码麦芽糖酶的基因，它们组建概况参见图2。

pGb-eMAL6g含有2个BglⅡ位点，均位于麦芽糖酶基因内。用BglⅡ消化pGb-eMAL6g使1.4Kb    BglⅡ缺失，然后减缓重组合作用促进分子内连接。这种缺失损坏了麦芽糖酶功能（J.D.Cohen，M.J.Goldenthal，T.Chow，B.Buchferer    and    J.Marmur（1985）Mol.Gen.Genet.20，1）。

3.pGb-eMAL63

该2μ衍生游离质粒的DNA包括了MALp功能（调节蛋白基因或MAL调节子）。它的构建参见图3。

从p21-40（R.B Needleman and C.Michels（1983），Supra）分离K pnⅠ-SaⅡ片段，其中含有调节蛋白基因。用T₄DNA聚合酶和Klenow-DNA聚合酶获得钝性末端的片段，然后再克隆到peG418的HindⅢ位点中去。

4.pGb-M6g（△-9）

该质粒为启动子缺失突变，基因间区域中将麦芽糖渗透酶和麦芽 糖酶表达基因分开（见图4），这个区域含有两个基因的启动子（S.H.Hong和J.Marmur（1986）Gene41，75）。得到这个缺失突变为了取代原始启动子，这个构建包括下列步骤：

a）将含麦芽糖酶和麦芽糖渗透酶的约7.5Kb    HindⅢ片段（见图1）克隆到pTZ19R的HindⅢ位点中。这个质粒能够买到（Pharmacia），得到pGb-M6g。

b）用StnⅠ将pGb-M6g变成线形，在基因间区域切割。StuⅠ产生的末端作为内切酶Bal31的起点，这样逐点去除（部分）含启动子的基因间区域。StuⅠ接近麦芽糖渗透酶基因（S.H.Hong和J.Marmur（1986），Supra）。根据Maniatis    et    al（T.Maniatis，E.F.Fritsch    and    J.Sambrook（1982），Supra）描述的方法已经培养出Bal31。在合适时间，从反应中取出样品和Klenow    DNA多聚酶一起保温，得到钝性末端。然后将合成的衔接物连接到有几个限制性位点的末端上。

下列为所有的互补寡聚脱氧核苷酸：

1.5′GATATC    CTCGAG    AGGCCT    A3′

2.3′CTATAG    GAGCTC    TCCGGA    TGCGC    5′产生EcoRⅤ（GATATC）、XhoⅠ（CTCGAG），StuⅠ（AGGCCT）的双键形式的限制性位点，在钝性末端连接产生一个MluⅠ位点（ACGCGT）。根据（T.Maniatis    et    al.，（1982）Supra）描述的条件下，激酶作用后，将衔接物连接到Bal31处理过的DNA上。然后反应混合物用MluⅠ保温，通过5ml    Sepharose    Cl-2B柱层析，分离从DNA片断中没有连接的寡聚脱氧核苷酸。汇集含有该线性DNA的残片，连接到质粒 DNA中，再导入细菌。

c）将得到的缺失突变体进行序列分析，至此，利用辅助噬菌体对双键质粒进行重复感染，使之变为单链DNA（按照提供噬菌体推荐的方案）。用普通的M13程序纯化单链模板用于二次脱氧序列分析（F.Sanger，S.Nicklen和A.R.Coulson（1977）Proc.Natl.Acad.Sci.74，5463）。用人工合成寡聚脱氧核苷酸（5′-GAATTCGGTAGCGTTCACGC-3′）作为引物，与麦芽糖渗透酶基因ATG启始密码附近的伸张DNA互补。它的序列阅读方向朝向启动子（参见图4）。

选择大多数麦芽糖渗透酶启动子被去除的缺失突变体进行进一步的实验。麦芽糖启动子（部分）仍存在（注：位于基因间区域的作为内切酶处理起始点的StuⅠ位点是对称的）。图5列出了突变体pGb-M6g（△-9）缺失点序列。它是与最近测定的整个区域序列比较的（S.H.Hong    and    J.Marmur（1986）Supra），与野生型序列比较，与发表序列有一个不同：-878（根据S.H.Hong    and    J.Marmur（1986）Supra数据）的C在我们的序列中是没有的，因此，在这个位置不能用HpuⅠ或HincⅡ消化DNA。

质粒pGb-M6g（△-9）是融合其它启动子与麦芽糖渗透酶基因和麦芽糖酶基因的起始质粒。

5.pGb-rA32/G418

该质粒为一个整合酵母质粒，包括麦芽糖渗透酶基因，带有醇脱氢酶Ⅰ启动子和部分5′引导序列。它们构建如下（图6）。

a）质粒pTZ19R/ADHⅠ含有一个1.4Kb    BamHⅠ片段 和ADHⅠ启动子，起始为-15位相关的AuG密码（T.L.Bennetzen    and    B.D.Hall（1982）J.Biol.Chem.257，3018）。从该质粒分离700bp    EcoRⅤ-HincⅡ片段，与用EcoRⅤ消化pGb-M6g（△-9）的消化物连接。得到的质粒用限制性酶消化分析，对单链膜板进行二次脱氧序列分析确定合适的方向（见图6）。利用4C描述的相同的寡聚引物。

ADHⅠ启动子片断克隆后，pTZ19R（BamHⅠ-HincⅡ）的部分聚衔接物位于麦芽糖渗透酶基因和ADHⅠ启动子之间。pGb-A32的结构和序列见图6a。

b）由主要的选择标记G418^res提供质粒pGb-A32。A1.9Kb EcoRⅤ/HincⅡ片断含对G418具有抗性的由醇脱氢酶Ⅰ启动子操纵的Tn5基因。通过质粒153-215AK的EcoRV/HincⅡ双重消化分离该片断。将EcoRV/HincⅡ片断克隆到pGb-A32的SmaⅠ位点中。产生pGb-iA32/G418。

6.pGb-iRRol

该质粒是一个整合质粒，它含有由醇脱氢的Ⅰ启动子操纵的麦芽糖渗透酶基因和由翻译延长因子EFlαA的启动子操纵的麦芽糖酶基因。克隆过程由图7表示。方法如下：麦芽糖酶基因含有约位于第五个氨基酸密码附近的BcⅡ位点。所以，EFlαA编码区域是以如此方式诱变，即使得其前5个氨基酸与麦芽糖酶蛋白的氨基酸相同。BglⅡ位点在BcⅡ位点处共同导入，BclⅠ位点转化为BglⅡ位点是第四个密码的静止突变。通过BglⅡ/BclⅠ的连接作用，EFlαA启动子和引导序列可以融合到麦芽糖酶基因的其它位点。该方法包括如下步 骤：

a）起始质粒为pYEF46（S.Nagata，K.Nagashima，Y.Tsunetsugu-Yokota，K.Fuyimura，M.Miyaraki and Y.Kaziro（1984）EMBO J.3，1825），它含有编码EFlαA的全套基因。分离复盖该基因的2.5Kb BglⅡ片段，克隆到pTZ19R的BamHⅠ位点中。选出克隆pT₄（见图7a）用寡聚脱氧核苷酸直接诱变。

b）用辅助噬菌体重复感染后，分离单链（SS）DNA的pT4。400ng SS DNA、40ng热变性pTZ19R_X-BamHⅠ和100ng诱变寡聚脱氧核苷酸（见图7b）于10μl体积的7mM Tris Hcl pH7.5;50mM Nacl和7mM Mgcl₂的溶液中中于50℃保温10分钟。室温保持10分钟后，加入1μl Klenow DNA聚合酶（2U），1μl T4 DNA连接酶（4U），1μl TMD（200mM Tris Hcl pH7.5，100mM Mgcl₂，100mM DTT），4μl 2.5mM dNTP-mix，1μl 10mM ATP和2μl H₂O，开始第2链合成和连接。最终体积是20μl，在17℃保温16小时，然后再将混合物转化到大肠杆菌JM101中。利用激酶处理后的寡聚脱氧核苷酸尤其适于突变体（见图7b），通过克隆杂交筛选突变体。筛选寡聚物5′-GACTATTTCAGATCTTC-3′与导入的麦芽糖酶密码和侧面相接的核苷酸互补。杂交作用于25℃在6×NET（1×NET＝0.15M Nacl，0.015MTris Hcl pH7.5，0.001MEDTA）中16小时完成。用相同混合物于相同温度冲洗经过杂交的物质（3次10分钟），然后于25℃在3×NET中冲洗。进一步分析几个正 集群，BglⅡ消化确定BglⅡ位点的存在。另外，从含有突变（pT4-M）的BglⅡ位点分离单链DNA，利用合成的17个核苷酸的引子与EFlαA基因87-103的核苷酸互补（S.Nagata，K.Nagashima，Y.Tsunetsugu-Yokota，K.Fuyimure，M.Miyaraki    and    Y.Kaziro（1984）EMBOJ.3，1825）（5′-CAATACCACCACACTTG-3′），进行二脱氧序列分析。获得该序列确认已成功地获得所期望的突变。

c）下一步是从pT4-M分离EFlαA启动子麦芽糖酶/NH₂-末端基因片断，通过BglⅡ/BclⅠ粘性末端连接作用将其与麦芽糖酶基因的其它部分融合。这一步修复了EFlαA启动子的麦芽糖酶编码区域的下游部分和引导序列（见图7c）。为了利用BclⅠ位点（对甲基化作用敏感），用质粒pGb-Mbg（△-9）转化一种大肠杆菌诱变菌株GM113（GM113：thr，LeuB6，nroA2，tris-4，metB1，lacY1，galK2，ara-14，tsx33，thi-1，thyA12，deoB16，supE44，rpsL260，dam-3）。分离含有反除NH₂末端的麦芽糖基因的3.8Kb BclⅠ/HindⅢ片断。用BglⅡ/HindⅢ消化pT4-M，分离大的4.1Kb片断（EFlαA启动子/NH₂末端和麦芽糖酶基因）。两片断相互连接，得到pGb-EFMT-3。序列分析确证所有导入的突变的正确性。

d）最后，用EcoRⅤ和HindⅢ（部分的）消化pGb-EFMT-3，纯化4.8Kbp.EFlαA/麦芽糖酶启动子/基因片断。从pGb-iA32/G418（见图6）分离大约8.3Kb的HindⅢ（部分的）/EcoRⅤ片断，它包含pTZ19R的主链，ADHⅠ/麦 芽糖渗透酶启动子/基因片断和ADHⅠ/G418^res片断，两者连接产生pGb-iRRol（见图7d）。

7.pGb-RB2

该质粒作为将DNA碎片整合到酒酵母的SIT4基因中的克隆载体。它的构建步骤如下（见图8和9）。

a.用EcoRⅠ和HindⅢ消化pTZ19R，代替人工合成的衔接物的40个核苷酸的DNA片断。该片断通过合成的寡聚脱氧核苷酸3和4（见图8）的退火完成的。该短片断具有EcoRⅠ和HindⅢ的粘性末端。这个DNA片断向pTZ19R载体中的克隆没有修复EcoRⅠ和HindⅢ位点。该合成的DNA片断具有NotⅠ和SfiⅠ的近似限止位点和在中间有一个EcoRⅠ位点，得到的质粒称作pGb-SNENS。

b.从pLF24（已知的也有编码pLN420）中分离含SIT4基因（Gottlin-Ninga    and    Kaback，Vide    Supra）的EcoRⅠ片断，再克隆到pGb-SNENS的EcoRⅠ的位点上。产生pGb-Spons31。由于缺乏有用的参考限制性位点，它的方向是末知的。

c.质粒pGb-Spons31在SIT4基因中间含有唯一的BglⅡ位点。它可作为任何通过基因置换转化SIT4基因的DNA片断克隆位点。为了促进克隆操作，给SIT4基因提供一个人工合成的、含有几个唯一的限制性位点的DNA片断。pGb-RB2的构建如图9所示。

合成的DNA片段有两个粘性的BglⅡ末端，在pGb-RB2中的方向如图9所示，它的根据为pGb-RBN3的限制性酶分析（见 下）。

8.pGb-RBN3

将含由ADHⅠ启动子操作的G418^res基因的1.9Kb EcoRN/HincⅡ片段（也可参见pGb-iA32/G418的构建）克隆到pGb-RB2的SmaⅠ位点中。产生pGb-RBN3（图10）。

9.pGb-RBRR01

该质粒具有醇脱氢酶Ⅰ启动子操纵的麦芽糖渗透酶基因和受EFlαA启动子操纵的麦芽糖酶基因。两者均位于8.3Kb HindⅢ片断上，而后者已被克隆到SIT4基因中。它的构建参见图11。至此，用HindⅢ消化pGb-iRR01，再与pGb-RB₂xHindⅢ（用小牛肠道磷酸酶处理）连接，得到pGb-RBRR01。

10.pGb-RBREG01

该质粒具有受醇脱氢酶启动子控制的MAL调节子基因。

Ⅰ.pGb-RBREG01可由下列步骤构建。从p21-40（R.B.Needlaman and C.Michels（1983），Supra）分离具有调节蛋白基因的SalⅠ片段。将该片段克隆到pTZ18R的SalⅠ位点。该质粒能够买到（Pharmacia），它的方向是MAL调节子基因的启动子区域靠近pTZ18R的T7启动子序列的方向。采用pTZ18R的序列引子和其它根据已获DNA序列新合成的寡聚核苷酶引子，可以对MAL调节子基因的启动子区域和NH₂末端部分编码基因进行序列测定，确定AUG起始密码的位置。当在启动子区域缺少有用的限制性位点时，按照普遍方法，通过用寡聚核苷酸定点诱变，将这样一种位点（如BglⅡ）在靠近AUG终止密码处导入 也可参见节5b的重组质粒的构建。

在这种诱变后，将BglⅡ-SalⅠ片段（含有MAL调节子基因而无启动子区域）和EcoⅤ-BanHⅠ片段（含ADHⅠ启动子、可参见图7d，pGb-iRR01连接可得到pGb-RB2（见图9），该MAL调节子基因则受ADHⅠ启动子的控制。这样将产生质粒pGb-iRBREG01。用二脱氧链方法和以寡聚核苷酸单链DNA作为模板进行序列分析，很容易确认克隆步骤和启动子方向的准确性。

上面提到的质粒体构建仅仅作为实例说明本发明，其它启动子（优选地采用酵母菌属）也能使用（或同一启动子的其它部分），也可选择其它整合位点，使用酵母基因组中的一个或多子整合位点，可得到麦芽糖酶、麦芽糖渗透酶和MAL-调节子基因的组合（无论是由它们自己的启动子还是由另外一个优选于酵母菌属的启动子操纵）。最终，在整个厌氧发酵过程中，可得到麦芽糖酶和麦芽糖渗透酶活性的满意速率。

酵母菌转化

按照Ito等人的方法（H.Lto，Y.Fukuda，K.Murata，A.Kimura（1983），J.Bacteriology153，163-168），进行酵母菌株转化。这里将酵母菌属菌株在普通酵母营养培养基中培养至密度为1至25，希望为4至10OD610nm。然后收获酵母细胞，用离液序列高的离子尤其是碱金属离子、锂、铯或钕，具体些是它们的氯化物或硫酸盐，更具体一些为锂盐、浓度为2mM至1.0M，优选0.1M左右来冲洗和预处理。用离液序列高的离子将细胞培养约5至120分钟，优选60分钟，在此之后再将细胞与DNA一起在平和的温度下培养较短时间，通常约20-35℃， 培养约5-60分钟。加入25-50%的聚乙二醇，用等体积聚乙二醇稀释整个培养基，浓缩到最终所期望的浓度。聚乙二醇将从约2，000至8，000道尔顿，优选范围约为4，000至7，000道尔顿。培养时间通常较短，约5至60分钟，将培养的培养基于约35°-45℃（最好约42℃）热处理约1至10分钟，可以使用转化体选择的有用标记，如腐草霉素（D.Genilloud，M.C.Garrido，F.Moreno（1984）Gene32，225），潮霉素B（Gritz    et    al.（1983）Gene25，178）以及氨基糖苷G418（Jiminez    et    a.（1980），Nature，287，869）。

当酵母细胞已用整合的质粒转化时，采用BglⅡ消化DNA，整合作用直接于MAL位点进行。采用的整合质粒有两个BglⅡ位点，两者均在麦芽糖酶基因内，两者相距1.4Kb。这样发生双链断裂，引起基因内重组和刺激同源染色体DNA之间的反应。在整合时，通过染色体信息可修复缺口（T.L.Orr-Weaver，J.W.Szostak，R.Rothstein（1981）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78，6354）。整合过程产生一个或几个拷贝的质粒载体（J.W.Szostak，R.Cou（1979）Plasmid2，536）。用于生产CO₂实验的，这些转化体中的确切拷贝数没有测定。

为了得到不含异源DNA的稳定的酵母转化菌株，制订了一个方案。异源DNA有pTZ19R载体DNA和选有对抗生素G418、腐草霉素或潮霉素B参照抗性的基因。实验解决方案简述如下（图12）

1）通过用SfiⅠ消化pGb-RBN3后转化酵母使得SIT4基 因一步裂解。选择抗G418的转化体。结果是菌株ApGb-RBN3，其中SIT4基因已由有G418^r基因打断受ADHⅠ启动子操纵的SIT4基因所代替。

2）在用pUT332和SfiⅠ消化过的pGb-RBRR01共同转化方案中，采用菌株ApGb-RBN3作为受体菌株。pUT332为一个2μ衍生游离质粒，具有对腐草霉素有参照抗性的基因。共同转化步骤的第一次选择是在含有腐草霉素（30μg/ml）的平板上进行的。在这些腐草霉素抗性酵母细胞中有一定百分比（约为0.1至1%）细胞，其中打断的SIT4基因（和pADHl/G418^r）已被具有改变麦芽糖渗透酶和麦芽糖酶基因的共同转化SIT4片断取代。这个第二次基因取代又产生了G418敏感酵母。为了选择已发生第二次基因取代的酵母细胞，将腐草霉素抗性转化体在含G418（300μg/ml）平板上复制平板。不生长的细胞中，包含在SIT4基因序列中的G418^r基因已由改变的含于SIT4基因序列中的MAL基因取代。

3）将腐草霉素抗性G418^sens转化体在非选择培养基中（例如无腐草霉素）培养，由游离质粒pUT332愈合，培养10-20代。得到的转化菌株ApGb-pRBRR01对腐草霉素和G418均敏感且不含原核细胞序列。所有整合过程在DNA水平用Southern印迹实验检验（没有给出数据）。

获得的菌株可作为以后利用其它整合位点转化时的和/或-当酵母菌株为二倍体或多倍体时-在其它SIT4基因的等位基因上转化时的受体。菌株A是非整倍体的菌株，对于含SIT4基因的染色体是二倍体。菌株A的两个SIT4基因均可作为基因取代的目标位点。 最终产生转化体ApGb-pZRBRR01＃1。利用两个等位基因的整合最易提高转化体的遗传稳定性，因为第二次整合消除了位点的多型性。这种多型性区域对基因转变是敏感的，它使整合序列丢失。以这种方法得到的转化体用Southern印迹技术分析，杂交类型表明如期望的那样，在两SIT4基因均有基因裂解。

作为pGb-RBN3和pGb-RBRR01的起始质粒的构建的载体pGb-RB2有几个方面的有用的特征：

1.通常需要整合一个DNA片断时，通过一个酵母启动子与一个（酵母的）另外一个基因的编码区域融合。假如转化片断具有与基因组内一个目标序列的两则序列均同源，基因取代当然容易进行。所以，一个DNA片断必须按在编码区域的3′端（Vide    Supra），该片断则与启动子选自同一基因。这种方法的缺点是需要许多次克隆操作，因为通常并不都是利用同一个启动子。另外，通常选用强启动子，它来自具有完成本发明任务的功能（营养期生长，厌氧发酵等）的基因。工程片断的整合后，制造一个无功能的该基因的一个拷贝。

所以，我们希望直接在某一位点进行基因取代，它在营养生长期不表达。我们选取了SIT4基因（形成孢子诱导转录序列），其表达已有Gottlin-Ninja和Kaback（Supra）进行了仔细研究，但是其它SIT基因或一般不编码片断当然也是合适的。当完成本发明目的的DNA构建物克隆到该SIT4基因中，得到的SIT4基因两半作为重组的同源末端。

可以认为在营养生长期，基因所在的染色体区域转录不活跃，是一个静止子的结果，与描述HMR-位点相似（A.H.Brand    et    al.（1985）Cecl41，41-48）。这个静止子DNA也 由启动子操纵阻遏转录、与配对型的启动子无关，在去除启动子的2600bp后也能起作用。然而，Gotllin-Ninja和Kaback（Supra）已经显示了当HIS3基因整合到SIT4基因中，在营养生长期，它能发挥功能。

2.为了促进克隆操作，人工合成SIT4基因，其中含有几个独特的限制性位点（有克隆位点的多聚衔接物）。另外，在所有可能的解读框内，多聚衔接物在两侧具有转译终止密码（见图a）。这是终止任何可能的杂种转录产物的转译，这杂种转录产物可能跨过连接处合成。否则的话这种杂种转录产物可编码一种蛋白，它的作用是不知道的。

3.为了完成同源重组，整合在两端具有NotⅠ和SfiⅠ（两者识别8bp序列）的限制性位点的DNA片断。这些限制性位点出现的频率是相当低的，因此，将-DNA片断克隆到含两种识别位点的SIT4基因上的多聚衔接物上是非常困难的。于是，一旦将DNA片断克隆到质粒pGb-RB2的SIT4基因上，即用NolⅠ或SfiⅠ限制性作用释放出一个DNA片断，它能通过同基因组内同源序列相互作用进行重组，例在SIT4位点。尽管这些末端是NotⅠ或SfiⅠ位点的部份，所以不同源，但是其它研究表明-在细胞内明显地用限制性内切酶消化-这些序列被除去（例H.Rudolph，J.Koenig-Ranseo    and    A.Hinnen（1985）Gene36，87-95）。

4.使用pUC19衍生物时，能买到的质粒pTZ19r作为起始质粒。该载体具有高拷贝数和拥有单链噬菌体fl的复制起始的优越性。它非常容易分离-用辅助噬菌体感染后-单链DNA和借 助引子证明DNA序列越过连接处。这就大大地促进了操作DNA的详尽描述。

我们认为这些改进不仅可以应用于面包酵母，而且也可以用于其它酵母。

CO₂产量测定

a）在合成的面团培养基中（试验A）

在YEPMS培养基（1%酵母浸出液：2%细菌蛋白胨;3.75%麦芽糖;1.28%蔗糖，添加200μg/ml G418）中培养酵母细胞，在30℃中生长直至对数生长后期。从6ml培养物中收集酵母细胞，再重新悬浮于8.8ml合成面团培养基中。这个培养基的组成（每升）：蔗糖4.6克;麦芽糖64.37克;KH₂PO₄2.07克;MgSO₄·7H₂O2.76克;（NH₄）₂SO₄0.67克;酪蛋白水解物2.07克;柠檬酸4.02克;柠檬酸三钠盐44.25克;维生素B19.2毫克;维生素B69.2毫克;烟酸46毫克;D（+）泛酸钙18.2毫克;生物素0.23微克。在28℃的水浴中，适度搅拌，使悬浮液在10分钟内达到平衡，然后将装有酵母悬浮液的烧瓶通过试管与“气体滴定管”相连。该滴定管内装满液体，每升该液体有20ml指示剂溶液（1克甲基红;0.5克美蓝;溶于1升96%乙醇中），40ml 1N H₂SO₄和痕量的CuSO₄（溶于HNO₃）。该溶液体积的置换来测定CO₂产量，在165分钟内测定。

在每次实验中，得到的CO₂产量值已通过分别将环境温度和压力换算为标准的28℃和760mmHg得以校正。另外，对酵母量进行校正。为了使每CO₂测量的酵母量相平等，培养物在600nm处 的比色阅读用作校正因子。

b）在面团中（试验B和B′）

浓缩酵母生长在批量加入麦芽糖的面团中的CO₂气体释放曲线已被测定，在面团中不加糖（精面团）（试验B）或加30%糖（试验B′）。精面团制备如下：1g浓缩酵母（含28.5%的干物质），34ml盐溶液A（1.25g Nacl溶于34ml蒸馏水）和62.5g面粉在Hobart器中于速度1混合30秒，于速度2混合2分钟，这样得到处理较好的面团。

30%糖面团含有2.0g浓缩酵母（28.5%干物质），34ml盐溶液B（0.938g    Nacl溶于34ml蒸馏水），62.5克面粉和18.75克蔗糖（即相对面粉为30%的糖）。混合方法与用于精面团的方法相同。

然后将面团转移到圆底烧瓶中。混合后7.5分钟开始测定气体产量，将装有面团的烧瓶通过试管与气体滴定管相连（见第a节），于28℃进165分钟。在浓缩酵母的干物质含量不同于上面所指的值的情况下，这些酵母也被采用;然而，CO₂气体乘方的测定值再用CO₂气体乘方乘以所需干物质含量与实际测定值之比来校正。在每个实验中，得到的CO₂产量值用环境温度和压力分别为28℃和760mmHg来校正。在有些情况中还要进行其它计算，得到的气体值用批量生产的酵母的N百分比来校正（%N表示蛋白含量）。改进的相似百分比不需要最后这步校正。

c）在面团中（试验c和c′）

干燥酵母（如按照US3843800和US4341871中描述的方法制备的速时干燥酵母）在不加糖（试验c）或加30%糖 （试验c′）面团中的CO₂产生曲线已经测定。除了在试验c和c′中分别使用300mg和600mg干燥酵母（含96%干物质）外，其它过程均与试验B和B′相同。试验前用面粉混合酵母，于28℃培养10分钟。

酶的分析

于30℃，用浓度15m.M的〔U-14C〕-麦芽糖来测定酵母细胞的转移麦芽糖能力。详细过程已由R.Serrano（Supra）发表。在细胞自由浸出液中以p-硝基苯基-α-吡喃葡萄糖苷作为底物测定麦芽糖酶（E.C.3.2.1.20）。按照H.Halvorson    and    E.L.Elias，Biochim.Biophys.Acta（1958）30，28的方法进行测定。

液体培养基中的底物消耗和产物形成

用普通的HPLC技术来定量测定液体培养基中麦芽糖和葡萄糖的消耗。每升培养基含有：100g麦芽糖，10g葡萄糖，3.0g（NH₄）₂SO₄，4.0gMgSO₄·7H₂O，4gKH₂PO₄，4g酪蛋白水解物（Difco），4g柠檬酸H₂O，45g柠檬酸三钠·H₂O，10mg维生素B1，10mg维生素B6，40mg烟酸，20mg D（+）泛酸钙和0.02mg生物素。将pH调至5.7。将2ml培养基加入酵母悬浮液（20mg干重/2.0ml蒸馏水）。该混合物称作培养基A，于28℃培养。培养基B和培养基A相似但含有20倍的葡萄糖，实验在厌氧条件下进行。

蛋白质测定

细胞自由浸出物和整个细胞的蛋白用J.Goa，Scand.J.Chim.Lab.Invest.（1953）5，218的微量缩二脲方法测定， 以卵清蛋白作为标准。

保持质量

将浓缩酵母贮存在密闭塑料容器中于23℃放置4天。质量保持定义为这段时间后保持气体产生能力的百分比。

浓缩酵母的制造

将一酵母菌株于一系列发酵罐中培养，在10升实验室发酵罐中以6升净体积培养细胞，通过自动控制，使发酵pH和温度保持在期望的值。采用的发酵配方基于G.Butscheck    and    R.Kautzamann，Die    Hcfen，BandⅡ    Technologie    der    Hefen    P.501-591（1962），Verlag    Hans    Carl，Nürnberg，FRG描述的方法，由G.Reed和H.J.Peppler在Yeast    Technology，the    AVI    Publishing    Company    Inc.，Westport，Connecticat，USA（1973）中发表。最终发酵的培养条件为：

-采用的糖蜜为80%的甜菜糖蜜和20%的甘蔗糖蛋，计算基于50%的糖。

-在接种前，如入的磷酸盐是磷酸一铵。

-发酵期间的氮源是以表1中10%Mt₃的水溶液形式提供的。

-在发酵的起先8小时中，pH保持5.0，然后根据表1在发酵结束时提高到6.2。

-每公斤糖蜜含有50%的水发酵糖，在接种前加入12mg维生素B1。

将发酵得到的酵母进行浓缩，在实验室喷嘴离心机中用自来水冲洗。压缩酵母膏状物至干物质含量位于26%至32%之间。

获得的蛋白质含量（%N×6.25）在干重的42-45%之间，在发酵期间提供不同含量的氨。

表1

用于分批培养面酵母产品的发酵配方

糖蜜量    氨量

接种后小时    （加入总量的%）    pH    T（℃）    （加入总量的%）

＜0    7    5    28.0    0

0-1    -    5    28.0    0

1-2    5    5    28.0    0

2-3    6    5    28.5    1

3-4    8    5    28.5    7

4-5    8    5    29.0    11

5-6    8    5    30.0    11

6-7    10    5    30.0    12

7-8    10    5    30.0    15

8-9    10    5.3    30.0    17

9-10    10    5.6    30.0    17

10-11    10    5.9    30.0    10

11-12    8    6.2    30.0    0

例1

用2μ衍生质粒转化的、含有来自MAL6位点基因的酵母的CO₂产量。

商业面包酵母菌株A和C已用pGb-eMAL6g（麦芽糖渗透酶 和麦芽糖酶，见图1），pGb-eMAL61（麦芽糖渗透酶、见图2）和pGb-eMAL63（MAL-调节子，见图3）转化。MAL基因还包含它们的原始启动子。转化酵母菌株的命名如下：ApeG418表示用peG418转化的菌株A，其它转化菌株已用相类似方法指出。在合成面团培养基中这些质粒对CO₂产量量的效应总结于表2。用peG418（见图1）转化的受体菌株作为对照，因为我们发现仅仅有多拷贝的质粒对气体产量也有负效应。

相对于对照，所有转化体主要显示CO₂产量的改进。麦芽糖渗透酶和麦芽糖基因的额外拷贝的组合使得促进效应最高，在菌株A中约40%和在菌株C中约18%。

转化菌株ApGb-eMAL6g和CpGb-eMAL6g也在不加糖的面团中试验，这里在糖蜜中分批培养。

这样又得到CO₂产量的主要的改进（表3）。

表2

与载体转化菌株有关的、用2μ衍生MAL质粒转化的菌株A和B气体产量，CO₂产量测定在合成面团培养基中进行（见实验步骤）和校正至285mg干物质。数值是几个实验的平均值

菌株    100分钟    165分钟

ApeG418    100    100

ApGb-eMAL6g    157    141

ApGb-eMAL61    144    123

ApGb-eMAL63    119    115

菌株    100分钟    165分钟

Cpe    G418    100    100

CpGb-eMAL6g    121    118

CpGb-eMAL61    117    114

表3

用2μ-衍生质粒peG418和pGb-eMAL6g转化的菌株A和C在面团中的相对气体产量，CO₂产量校正至285mg干物质。

菌株    60分钟    100分钟    120分钟    165分钟

ApeG418    100    100    100    100

ApGb-eMAL6g    125    125    125    121

CpeG418    100    100    100    100

CpGb-eMAL6g    151    141    138    129

例2

用含重组麦芽糖酶和/或麦芽糖渗透酶基因的整合质粒转化的酵母菌株的CO₂产量。

亲代酵母菌株A已用pGb-iA32/G418（主要特性：ADH1/麦芽糖渗透酶，见图2）和pGb-iRROl（主要特性：ADH1/麦芽糖渗透酶和EFlαA/麦芽糖酶;见图7）转化。

采用常用的有氧发酵方法，将亲代菌株A和两个转化菌株在糖蜜中分批培养（见表1），收获细胞后用普通面包试验（不加糖）测定CO₂产量。本试验中分析的气体产量总结于表4。将pGb-iA32/G418整合到菌株A的染色体中后，大大改进了在面团中的气体产 量。相对改进结果根据测定时间有点变化。除改变的麦芽糖渗透酶基因之外，再采用pGb-iRRol将麦芽糖酶基因整合到商品菌株A的染色体中，气体产生能力甚至进一步改进。在这典型实验中相对于约410ml CO₂/285mg酵母干重的水平，在精面团中165分钟后多产生30%的CO₂。

在30%糖面团中，转化体与亲代菌株的CO₂产量没有明显的不同（约190ml CO₂/285mg酵母干重）。

于23℃贮藏，获得的发酵活性改进得以保持，贮藏期间发酵活性的丢失实际上对亲代菌株A和新菌株来说是一致的（见表5）。

表4

菌株A和它的具有改变麦芽糖酶和/或麦芽糖渗透酶基因的rDNA衍生菌株的相对气体产量。气体值已校正至285mg干物质。面团中没有加糖。

菌株    60分钟    100分钟    120分钟    165分钟

A.    100    100    100    100

ApGb-iA32/G418    113    115    115    111

ApGb-iRRol    131    136    138    133

表5

菌株A及其它的具有改变麦芽糖酶和/或麦芽糖渗透酶基因的rDNA衍生菌株的质量保持。浓缩酵母在23℃保持4天后，用表4的方法测定发酵活性。

菌株    保持质量（原始发酵活性的%）

A    90

ApGb-iA32/G418    91

ApGb-iRR01    88

例3

具有麦芽糖酶和麦芽糖渗透酶重组基因而不含异源DNA的酵母菌株的CO₂产量。

已对亲代菌株A进行了遗传修饰，将pADHl麦芽糖渗透酶基因和pEFlαA/麦芽糖酶基因导入两个同源染色体的SIT4基因中。该菌株其缩写为ApGb-p2RBRR01＃1，它已用前面描述的方法及质粒（见质粒pGb-RBN₃（图10）和pGb-RBRR01（图11）的转化和构建部分）和普通的通过基因取代的转化方案来构建。与常用的有氧发酵（见表1）相似，将亲代菌株A和同源转化体ApGb-p2RBRR01＃1在糖蜜中分批培养。收获细胞后，用不加糖普通面团试验测定CO₂产量。

表6总结了结果。相对于约367ml CO₂/285mg酵母干重的水平，在“精”面团中，165分钟后，改进约为18%。该菌株具有由ADHI启动子操纵的的麦芽糖渗透酶基因和受EFlαA操纵的麦芽糖酶基因的两个拷贝。表4表明菌株ApGb-iRR01约有30%的改进。对整合到菌株A的MAL位点的pGb-iRR01分子数的初步估计，表明被整合的质粒分子拷贝数至少为3。通过大大增加菌株ApGb-p2RBRR01＃1中的改变麦芽糖渗透酶和麦芽糖酶基因的拷贝数（如通过在其它形成孢子特异基因中整合），可以得到气体产量水平至少与菌株ApGb-iRR01相似的一个同源转化酵母 菌株。

表6

菌株A和它的具有改变麦芽糖酶和麦芽糖渗透酶基因的同源rDNA衍生菌株的相对气体产量。气体值已校正到285mg干物质。在面团中不加糖。

菌株    60分钟    100分钟    120分钟    165分钟

A    100    100    100    100

ApGb-p2RBRR01＃1    124    128    127    118

例4

用具有麦芽糖酶和/或麦芽糖渗透酶重组基因的整合质粒来转化的酵母菌株的酶活性和底物摄入速率。

如上所述，麦芽糖渗透酶和麦芽糖酶的表达易受麦芽糖的诱导和葡萄糖的阻遏。对菌株A野生型细胞的这种现象如图13。只有至大部分葡萄糖被利用，麦芽糖渗透酶和麦芽糖酶的特异活性才增加。

将改变麦芽糖渗透酶基因导入酵母基因组C菌株ApGb-iA32/G418，在提高面团的进攻时，麦芽糖渗透酶活性增加。

意想不到的是，在这个构建中麦芽糖酶的活性也升高（图15）。在含有麦芽糖作为主要碳源和能源的培养基A中，新菌株ApGb-iA32/G418发酵麦芽糖要比亲代菌株A快（图16）。在以葡萄糖作为主要碳源和能源的培养基B中，这种效应是不明显的（图17）。

除改变麦芽糖渗透酶基因之外在染色体中还整合改变麦芽糖酶基因产生菌株ApGb-iRR01。该菌株在培养基A中发酵麦芽糖的速率 更高（图16）和在培养基B中也高（图17）。尽管细胞外葡萄糖浓度较高，该新菌株还能代谢相当大量的麦芽糖。在面团升高期间，菌株ApGb-iRR01较亲代菌株A和菌株ApGb-iA32/G418有更高的麦芽糖酶和麦芽糖渗透酶活性（图14和15）。

Claims (14)

1、一种生产酵母菌属的转化酵母的方法，该酵母与未转化的其亲本相比当在含有麦芽糖的培养基中发酵时能够提高麦芽糖的发酵率，该方法包括将至少一个同源DNA构建物导入该酵母中，该DNA构建物至少含有一个编码促进转运麦芽糖摄入和/或起始代谢转化的蛋白的基团，且该基团选自编码麦芽糖渗透酶、麦芽糖酶或麦芽糖调节蛋白的基因。

2、根据权利要求1的组合，其特征在于该构建物至少含有两个所述基因。

3、根据要求1的方法，其特征在于所述基因分别受醇脱氢酶I（ADHI）和/或转译延长因子（EFlαA）启动子的转录控制。

4、根据权利要求1-3的任一权利要求中的方法，其特征在于所述基因或它们的组合受转录控制调节而对葡萄糖阻遏作用不敏感和/或不需麦芽糖的诱导。

5、根据权利要求1-3的任一权利要求中的方法，其特征在于所述构建物是游离成分的一部分。

6、根据权利要求1-3的任一权利要求中的方法，其特征在于所述构建物被整合到所述酵母的染色体中。

7、根据权利要求1-3的任一权利要求中的方法，其特征在于它含有至少有两个所述DNA构建物参与的导入作用。

8、根据权利要求1-3的任一权利要求的方法，其特征在于所述酵母不含异源DNA，采用基因置换技术进行基因向染色体中的整合作用。

9、根据权利要求7的方法，其特征在于一个染色体的形成孢子特异基因由具有已有权利要求1或5描述的基因插入的相同的形成孢子特异基因的DNA片断取代。

10、根据权利要求1-3的任一权利要求的方法，其特征在于所述酵母属于酵母菌属，优选的是酒酵母。

11、一种生产面团或类似产物的方法，其特征在于应用权利要求1-9的任一权利要求生产的酵母。

12、一种生产酒精饮料和其它酒精产品的方法，其特征在于使用权利要求1-9的任一权利要求生产的酵母。

13、一种生产面包或相关产品的方法，其特征在于使用了权利要求1-9任一权利要求生产的酵母。

14、一种生产具有麦芽糖酶或麦芽糖渗透酶活性的酶的方法，其特征在于使用了按照权利要求1-9的任一项权利要求的方法生产的酵母。

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