CN102712895A - 无甘油的乙醇发酵生产 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种酵母细胞，尤其涉及一种重组酵母细胞，所述细胞缺乏NADH依赖的甘油合成所需的酶活性，或者与所述细胞相应的野生型酵母细胞相比，所述细胞具有降低的与NADH依赖的甘油合成有关的酶活性；所述细胞包括一个或多个编码NAD⁺依赖的乙酰化乙醛脱氢酶(EC 1.2.1.10)活性的异源核酸序列。本发明进一步涉及根据本发明的细胞在乙醇制造中的用途。

Description

无甘油的乙醇发酵生产

技术领域

本发明涉及一种具有生产理想发酵产品能力的重组酵母细胞、通过基因改造构建所述酵母细胞、以及一种使用所述酵母细胞生产发酵产品的工艺。

背景技术

按体积计，目前利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)生产乙醇是工业生物技术中一种最大规模的发酵工艺。正在进行的一项全球性研究工作的目的是：扩大酿酒酵母的底物范围，以使该底物能够包括木质纤维素水解产物，尤其是能够包括来自非食品原料(如富含纤维素、半纤维素和/或果胶的能源作物、农业残留物、林业残留物或工业/消费者废物)的木质纤维素生物质的水解产物，从而提高生产能力、稳健性和产品产量。

木质纤维素生物质是丰富的，然而通常情况下，野生型生产乙醇的微生物比如酿酒酵母并不易于对该木质纤维素生物质进行发酵。该生物质必须先进行水解，水解产物常常是各种单糖和寡糖的混合物，且并非所有这些产物都是野生型微生物的适宜底物。进一步地，该水解产物通常包含乙酸，尤其在水解果胶或半纤维素时会形成作为副产物的乙酸；依赖于水解类型，该水解产物还包含一种或多种其他副产物、或对发酵可能有不利影响的残留试剂。尤其是，据报道，乙酸对野生型和基因改造型酿酒酵母菌株进行糖发酵的动力学和/或化学计量学有不利影响，并且在培养基pH值较低时会大大增强乙酸的毒性(Helle等Enzyme Microb Technol 33(2003)786-792；Bellissimi等FEMS Yeast Res 9(2009)358-364)。

现已提出了各种方法，以通过基因改造来改善生产乙醇生物体的发酵性能、以及改善生物质水解工艺。例如，A.van Maris等以综述形式给出了由生物质水解产物进行乙醇发酵生产的进展概述(Antonie van Leeuwenhoek(2006)90：391-418)。其中，引用了酿酒酵母各种可能的改造方式和各种水解木质纤维素生物质的方法。

与基于酵母进行乙醇生产的化学计量学相关的主要挑战是：总会以副产物的形式形成大量甘油。据估计，在典型的工业乙醇生产工艺中，会有高达约4％(重量)的糖原料转化成甘油(Nissen等Yeast 16(2000)463-474)。在厌氧生长的理想条件下，转化为甘油的糖原料甚至会更高，如高达约10％。

厌氧条件下的甘油生成，主要与氧化还原代谢相关。在酿酒酵母的厌氧生长过程中，通过乙醇发酵发生糖异化作用。该过程中，在糖酵解的甘油醛-3-磷酸脱氢酶反应中形成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)；通过丙酮酸的脱羧作用形成的乙醛经由NAD⁺依赖的乙醇脱氢酶转化成乙醇，同时NADH通过该过程被再氧化。当NAD⁺至NADH的纯还原反应发生在代谢的其他地方时，氧化还原中性异化途径的固定化学计量学会出现问题。厌氧条件下，酿酒酵母中NADH的再氧化严格依赖于糖至甘油的还原反应。由糖酵解中间产物二羟丙酮磷酸至3-磷酸甘油的还原起始甘油的形成；其中，由NAD⁺依赖的甘油3-磷酸脱氢酶催化二羟丙酮磷酸至3-磷酸甘油的还原反应。随后，该反应中形成的3-磷酸甘油被甘油3-磷酸酶水解，产生甘油和无机磷酸。因此，甘油是利用酿酒酵母进行乙醇厌氧生产过程中的主要副产物，而这是不期望的，因为甘油的生成降低了糖至乙醇的整体转化。进一步地，乙醇生产厂废水中存在的甘油，可能会带来废水处理的成本。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种新的重组细胞，所述重组细胞适合由碳水化合物、尤其是从木质纤维素生物质获得的碳水化合物进行乙醇的厌氧发酵生产；当所述重组细胞用于乙醇的发酵生产时，与所述重组细胞相应的野生型生物体相比，所述重组细胞生成的甘油降低，或者缺乏甘油的生成。

本发明进一步的目的是提供一种在厌氧酵母培养物中发酵制造乙醇的新方法；在所述方法中，不形成甘油，或者形成的甘油至少低于使用已知酿酒酵母菌株的方法。

本发明可以满足的一个或更多进一步目的在说明书和权利要求书中是显而易见的。

本发明人已经意识到，能够通过提供特定的重组细胞来满足这些目的中的一个或多个；其中，所述特定的重组细胞中已并入其他特定的酶活性，从而能够使碳水化合物发酵过程形成的NADH再氧化；另外，所述特定的重组细胞缺少NADH依赖的甘油合成所需的酶活性时，也能够使碳水化合物发酵过程形成的NADH再氧化。

因此，本发明涉及一种重组酵母细胞，所述细胞包含一个或多个编码NAD⁺依赖的乙酰化乙醛脱氢酶(EC 1.2.1.10)活性的重组的、尤其是异源的核酸序列。

本发明人尤其意识到有利地是提供一种细胞，所述细胞无NADH依赖的甘油合成所需的酶活性，或者所述细胞具有降低的NADH依赖的甘油合成所需的酶活性。

因此，本发明尤其涉及一种重组酵母细胞，所述重组酵母细胞包含一个或多个编码NAD⁺依赖的乙酰化乙醛脱氢酶活性编码的异源核酸序列，其中，所述细胞缺乏NADH依赖的甘油合成所需的酶活性(即没有所述活性)，或者其中与所述细胞相应的野生型酵母细胞相比，所述细胞具有降低的与NADH依赖的甘油合成相关的酶活性。

本发明进一步意在一种根据本发明所述的细胞在乙醇制造中的用途。

尤其是，本发明进一步意在一种制造乙醇的方法，所述方法包括由可发酵碳水化合物和由乙酸制造乙醇，所述制造过程使用酵母细胞在厌氧发酵条件下进行，所述细胞表达乙酰-辅酶A合成酶活性和NAD⁺依赖的乙酰化乙醛脱氢酶活性；优选地，所述细胞缺乏由碳水化合物合成甘油的生化途径所需的酶活性，或与野生型酿酒酵母细胞相比，所述细胞具有降低的与由碳水化合物合成甘油的生化途径相关的酶活性。

有利地是，根据本发明所述，在甘油∶乙醇的摩尔比小于0.04∶1、尤其小于0.02∶1、优选小于0.01∶1的情况下，生产乙醇。根据本发明的方法，可能不存在(未检测到)甘油生成，但至少在一些实施例(其中，NADH依赖的甘油合成降低，但不能完全禁止)中，可能作为副产物生成一些甘油，如甘油∶乙醇的比例为0.001∶1或更高。

附图说明

图1示意性示出了基因改造过程，该过程可作为制造根据本发明细胞的一部分而进行；

图2示出了生长在葡萄糖(20g/l)上的不同酿酒酵母菌株的厌氧分批培养物中的生物质和产物浓度；乙酸(2.0g/l)自发酵开始便存在(图A和B)、或者在箭头指示的时间点进行添加(图C和D)；生长条件：T＝30℃，pH5.0；符号：▲，660nm处的光密度；●，葡萄糖；○，乙醇；■，乙酸；口，甘油；每个曲线图代表两个独立重复试验中一个的值，得到的数据差异小于5％；图A：酿酒酵母IME076(GPD1 GPD2)；图B：酿酒酵母IMZ132(gpd1Δgpd2Δ过表达大肠杆菌(E.coli)mhpF基因)；图C：酿酒酵母IMZ132(gpd1Δgpd2Δ过表达E.coli mhpF基因)；图D：生长在葡萄糖(20g/l)上的酿酒酵母IMZ127(gpd1Δgpd2Δ)。

具体实施方式

本发明通过提供一种重组酵母细胞、尤其是酿酒酵母，能够完全消除甘油的产生、或者至少显著降低甘油的产生，这样可以通过NADH依赖的乙酸至乙醇的还原反应使NADH再氧化

这不仅有利于避免甘油的产生或至少降低甘油的产生，而且由于NADH再氧化过程中形成的产物也是期望产物，即乙醇，所以本发明的方法也提供了增加的产物产量；其中，产物产量是由转化原料的％(重量)确定的，原料即转化成乙醇的碳水化合物和乙酸。

由于一般可在木质纤维素水解产物中获得大量的乙酸，使得本发明在使用木质纤维素生物质作为可发酵碳水化合物源制造乙醇的过程中尤其有利。进一步地，可能包含相当数量乙酸的碳水化合物源包括甜菜糖蜜(其水解产物)和含淀粉物(例如来自玉米干磨加工和玉米湿磨加工的废物、来自例如使用酒糟循环的淀粉废物处理的废物)。本发明有利于降低抑制化合物乙酸的水平，并且水解产物中较大部分实际变成用于乙醇生产的底物。

如实例中所示，已使用没有明显NADH依赖的甘油合成所需酶活性的酵母细胞取得了较好结果。然而，发明人设想根据本发明具有NADH依赖的甘油合成活性的酵母细胞也可有利地用于例如乙醇生产中。设想所述细胞可以使用乙酸再氧化至少一部分NADH。因此，乙酸可竞争NADH依赖的甘油合成途径，从而潜在地降低甘油合成。此外，存在于用于乙醇生产的原料如木质纤维素水解产物中的乙酸，可以转化成乙醇，从而提高产物产量。

除非另有规定，本文使用的术语“一种”定义为“至少一种”。

当提到单数形式的名词(如一种化合物、一种添加剂等)时，应包括其复数形式。因此，除非另有规定，当提到特定部分(moiety)，如“化合物”，则意味着“至少一个”该特定部分，如“至少一种化合物”。

本文使用的术语“或者”理解为“和/或”。

当本文提到羧酸如乙酸时，也包括相应的羧基酸(其共轭酸)及其盐，反之亦然。

当本文提到存在一些同分异构体(如D和L对映体)的化合物时，该化合物原则上包括该化合物可用于本发明特定方法中的所有对映体、非对映体和顺/反式同分异构体。尤其当提到如化合物时，则包括该化合物的天然异构体。

本文使用传统意义上的术语“发酵”、“发酵的”等，即指在厌氧条件下正在进行或已进行的工艺。本文的厌氧条件定义为没有任何氧气的条件、或其中酵母细胞基本上没有氧气消耗，尤其是酵母细胞常对应于氧气消耗小于5mmol/l.h、尤其是氧气消耗小于2.5mmol/l.h、或者小于1mmol/l.h。这通常对应于培养液中溶解的氧浓度小于5％空气饱和度、尤其是小于1％空气饱和度、或者小于0.2％空气饱和度。

术语“酵母”或者“酵母细胞”指单细胞真菌的系统发育多样化组，其中大部分是子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)部分。出芽酵母(“真酵母”)被分类在酵母目(Saccharomycetales)中，其中酿酒酵母是最广为人知的物种。

本文使用的术语“重组(细胞)”指一种菌株(细胞)，所述菌株(细胞)含使用重组DNA技术和/或其他诱变技术进行一次或多次基因改造而产生的核酸。尤其是重组细胞可以包含相应野生型细胞中不存在的核酸；其中，所述核酸通过重组DNA技术已经导入菌株(细胞)(转基因细胞)；或者，所述野生型细胞中不存在的核酸是所述野生型细胞中存在的核酸序列(如编码野生型多肽的基因)经过一次或多次突变产生的，如使用重组DNA技术或其他如紫外线(UV)照射等诱变技术；或者，对某一基因的核酸序列进行改造，使其(该基因编码的)多肽产物被靶向另一细胞隔室。进一步地，术语“重组(细胞)”尤其涉及一种菌株(细胞)，已使用重组DNA技术去除了所述菌株(细胞)中的DNA序列。

本文使用的术语“转基因(酵母)细胞”指包含非自身天然存在的核酸的菌株(细胞)，并且该核酸已经使用重组DNA技术导入到该菌株(细胞)中，即重组细胞。

本文使用的术语“突变的”蛋白或多肽是指通过对编码氨基酸的核酸进行诱变，而使原来编码的野生型或天然存在的蛋白或多肽序列中有至少一个氨基酸被不同的氨基酸所取代、或序列中插入或缺失至少一个氨基酸。诱变是现有技术中众所周知的方法，包括如借助多聚酶链反应(PCR)或经由Sambrook等编辑的《分子克隆-实验室手册(第2版)》(Molecular Cloning-A LaboratoryManual，2nd)第1-3卷(1989)中所述的寡核苷酸介导的诱变方法进行定点突变。本文使用的术语“突变的”基因指该基因的核酸序列或其调控序列中有至少一个核苷酸已经被不同的核苷酸所取代、或者经诱变从该序列中删除至少一个核苷酸，导致蛋白序列转录在功能上有定性定量的改变或该基因被敲除。

本文使用的术语“基因”指包括核酸聚合酶(真核细胞中为RNA聚合酶II)使用模板的核酸序列。基因转录成mRNA，然后mRNA翻译成蛋白。

本文使用的术语“核酸”包括单链或双链形式存在的脱氧核糖核苷酸聚合物或核糖核苷酸聚合物，即多核苷酸；除非另有限定，核酸包括具有天然核苷酸本质特征的已知类似物，该类似物以与天然存在的核苷酸类似的形式与单链核酸杂交，如肽核酸。多核苷酸可以是内源或异源的结构基因或调控基因的全长或其子序列。除非另有说明，该术语包括提到的特定序列及其互补序列。因此，具有为稳定或其他原因进行骨架改造的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)也属于本文所指的“多核苷酸”。此外，包括如肌苷等稀有碱基或如三苯甲基化(tritylated)碱基等改造碱基(仅举这两个实例)的DNA和RNA，也属于本文使用的术语多核苷酸。应理解地是，本领域技术人员已知为了许多有用的目的而对DNA和RNA进行各种改造。本文使用的术语多核苷酸包含多核苷酸经化学、酶或代谢改造的形式，以及包含病毒和细胞(尤其包括简单或复杂细胞)特有的DNA和RNA的化学形式。

本文使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白”可互换，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于如下的氨基酸聚合物：其中的一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人造化学类似物；这些术语也适用于天然存在的氨基酸聚合物。所述天然存在的氨基酸的类似物的本质特征是：当该类似物并入蛋白时，该蛋白与完全由天然存在的氨基酸组成的相应蛋白的抗体也具有特异性反应。术语“多肽”、“肽”和“蛋白”还包括改造的多肽、肽和蛋白；其中该改造包含但不限定于糖基化、脂附着、硫化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟基化以及二磷酸腺苷(ADP)-核糖基化。

当酶与酶种类(Enzyme Class，EC)一起提起时，酶种类是根据生物化学和分子生物学国际联盟命名委员会(NC-IUBMB)提供的酶命名法，将酶分成的种类或者可将酶分成的种类，该命名法可在网站http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/上找到。本发明还包括其他没有(或还没有)被分成特定种类、但可以根据该分类方法进行分类的合适的酶。

如果本文通过引用登记号提到一种蛋白或核酸序列，如某一基因，除非另有规定，则该登记号尤其用于指具有可以在网站www.ncbi.nlm.nih.gov/(如2009年7月13日时可用的)上找到序列的蛋白或核酸序列(基因)。

这里，通过参考遗传密码子，每个编码多肽的核酸序列还描述了该核酸每种可能的沉默变异。术语“保守性改造的变异体”适用于氨基酸序列和核酸序列。对于特定的核酸序列，保守性改造的变异体指由于遗传密码子的简并性而编码相同的氨基酸序列或编码该氨基酸序列保守性改造变异体的核酸。术语“遗传密码子的简并性”指大量功能相同的核酸编码任意给定蛋白的事实。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。这样，在每个被密码子指定为丙氨酸的位置，密码子可以变成上述任何相应的密码子，且同时不会改变编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，并且代表一类保守性改造的变异体。

本文使用的术语中，具有特定序列(如SEQ ID NO：2)的多肽的“功能同系物”(或简称“同系物”)，是指包含所述特定序列的多肽，但条件是所述多肽中取代、缺失、添加和/或插入了一个或多个氨基酸，且所述多肽具有(定性地)相同的底物转化的酶功能。例如，NAD⁺依赖的乙酰化乙醛脱氢酶(EC 1.2.1.10)的活性同系物能够将乙醛转化成乙醇，该功能可以使用检测系统进行测试。所述检测系统包括：重组酵母细胞，所述重组酵母细胞包含用于在酵母中表达同系物的表达载体，所述表达载体包含编码同源多肽的异源核酸序列，所述异源核酸序列可操作地连接至在酵母中有功能的启动子上，所述同源多肽具有在要测试的酵母细胞中将乙酰-辅酶A转化成乙醛的酶活性；且评估所述转化是否发生在所述细胞中。可以使用in silico相似性分析鉴别候选的同系物。所述分析的详细实例在WO2009/013159的实例2中有描述。技术人员能够随意根据密码子(对)的最优化得出如何发现合适的候选同系物，且能够使用如上所述的合适的检测系统测试所述候选同系物的所需功能。合适的同系物代表一种多肽，该多肽的氨基酸序列与特定多肽相比具有高于50％、优选60％或更高、尤其是至少70％、更尤其至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的相似性。例如，合适的同系物代表与SEQ ID NO：2具有氨基酸序列相似性的多肽，且具有将乙酰-辅酶A转化成乙醛所需酶功能的多肽。对于核酸序列，术语功能同系物旨在包括由于基因密码子的简并性而与另一核酸序列不同、但编码相同多肽序列的核酸序列。

本文的序列一致性定义为通过比较序列而确定的、两个或多个氨基酸(多肽或蛋白)序列或两个或多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系。通常，序列一致性或相似性是通过对比较序列的整个长度进行比较。本领域中，根据具体情况，“一致性”也指氨基酸序列或核酸序列之间序列相关性的程度，这是由所述序列链之间的匹配度确定的。

确定一致性的优选方法是给予测试序列最大的匹配度。可通过公开可用的计算机程序编制确定一致性和相似性的方法。确定两个序列之间一致性和相似性的优选计算机程序方法包括如可从NCBI公开获得的BestFit、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)，或其他来源(BLAST手册，Altschul，S等，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894))。使用BLASTP的氨基酸序列比较的优选参数是缺口打开11.0、缺口扩展1和Blosum62矩阵。

“表达”指如下过程：基因转录为结构RNA(rRNA和tRNA)或信使RNA(mRNA)，mRNA随后翻译成蛋白。

本文使用的“异源”核酸或蛋白是源自异质物种的核酸或蛋白，或者如果源自相同物种，则是通过有意人为干预对其构成和/或基因座的内源形式进行实质性改造得到的核酸或蛋白。例如，可操作地连接至异源结构基因的启动子来源于不同于该结构基因所来源的物种；或者该启动子和结构基因来源于相同物种，但已对其中一个或两个的天然形式进行了实质性改造。异源蛋白可能来源于异质物种，或者来源于相同物种，但已通过有意人为干预对其天然形式进行了实质性改造。

术语“异源表达”指异源核酸序列在宿主细胞中的表达。如酵母等真核宿主细胞系统中异源蛋白的表达对于本领域技术人员是众所周知的。可在所述真核系统中表达多核苷酸，所述多核苷酸包含编码具有特定活性的酶的基因的核酸序列。在一些实施例中，可使用转化/转染的酵母细胞作为酶表达的表达系统。酵母中异源蛋白的表达是众所周知的。冷泉港实验室(1982)的Sherman，F.等的《酵母遗传学方法》(Methods in Yeast Genetics)是描述在酵母中表达蛋白的各种方法的知名著作。两种广泛利用的酵母是酿酒酵母和毕赤酵母(Pichiapastoris)。载体、菌株、及在酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵母属(Pichia)中表达的方案在本领域中是已知的，也可以从商业供应商(如英杰公司(Invitrogen))获得。合适的载体常常具有所需的表达控制序列(如启动子，包括3-磷酸甘油酸激酶或醇氧化酶启动子等)、复制起始点、终止序列等。

本文使用的“启动子”是指导(结构)基因转录的DNA序列。典型地，启动子位于基因的5′区域，且邻近(结构)基因的转录起始位点。启动子序列可以是组成型的、可诱导的或可抑制的。如果启动子是可诱导的启动子，则响应于诱导剂而提高转录速率。

本文使用的术语“载体”包括常染色体表达载体、及用于整合至染色体上的整合载体。

术语“表达载体”指线性或环形的DNA分子，所述DNA分子包括在额外核酸片段控制下的(即，可操作地链接)、编码感兴趣多肽的片段，其中额外核酸片段为所述编码感兴趣多肽的片段提供转录。所述额外片段可以包括启动子和终止子序列，也可以选择性地包括一个或多个复制起始点、一个或多个选择性标记、增强子、多聚腺苷酸化信号等。表达载体通常来源于质粒或病毒DNA，或者可同时包括质粒或病毒DNA中的元件。尤其是表达载体包括核酸序列，所述核酸序列以5′-3′方向包括可操作链接的：(a)酵母识别的转录和翻译起始区域；(b)感兴趣多肽的编码序列；以及，(c)酵母识别的转录和翻译终止区域。“质粒”指自主复制的染色体外DNA，染色体外DNA不整合入微生物的基因组中，且实际上常常是环形的。

“整合载体”指线性或环形的DNA分子，所述DNA分子可并入微生物的基因组中、且为编码感兴趣多肽的基因提供稳定遗传。整合载体一般包括在额外核酸片段控制下的(即可操作地链接)、编码感兴趣多肽的基因序列的一个或多个片段，其中额外核酸片段为所述一个或多个片段提供转录。所述额外片段可以包括启动子和终止子序列、以及常常可通过同源重组过程将感兴趣基因并入靶细胞基因组的一个或多个片段。通常，整合载体是能转移到靶细胞中的载体，但其中具有的复制子在该生物体中没有功能。如果包含感兴趣基因的片段包含适当的标记，则可以选择出整合有该片段的生物体。

本文使用的术语“可操作地连接”指处于邻近位置，其中，所述组分之间的关系允许其以预期方式起作用。控制序列“可操作地连接”至另一控制序列和/或编码序列指以如下方式结合：编码序列的转录和/或表达在与控制序列兼容的条件下完成。通常，可操作地连接意味着连接的核酸序列是连续的，当需要连接两个蛋白编码区域时，该两个蛋白编码区域连续且在同一阅读框内。

“宿主细胞”指包含载体且支持载体进行复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是：原核细胞，如大肠杆菌；或真核细胞，如酵母、昆虫、两栖动物、或哺乳动物细胞。优选地，宿主细胞是放线菌(Actinomycetales)目的细胞、最优选酵母细胞、最优选酿酒酵母细胞。

本文使用的“转化”和“进行转化”指将外源多核苷酸插入宿主细胞中，而不考虑插入的方法，例如，可使用直接摄取、转导、f-交配或电穿孔。外源多核苷酸可以保持为非整合载体(如质粒)、或也可以是整合到宿主细胞的基因组中。

根据本发明的细胞优选选自由酵母科组成的组，更优选选自由酵母属(Saccharomyces)细胞、接合酵母属(Zygosaccharomyces)细胞和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)细胞组成的组。使用酿酒酵母宿主细胞已经达到尤其好的结果。拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces baillii)尤其由于其高乙酸耐受性和高乙醇耐受性，因此是另一优选细胞。

进一步地，根据本发明的细胞可能是选自由木糖发酵的酵母组成的组中的酵母细胞，更优选为毕赤酵母属，如树干毕赤酵母(Pichia stipitis)或安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)(也称为多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha))。

进一步的实施例中，根据本发明的宿主细胞是天然缺乏NADH依赖的甘油合成所需酶活性的宿主细胞，如属于间型酒香酵母(Brettanomyces intermedius)种的酵母细胞。

根据本发明的优选细胞无NADH依赖的甘油合成所需的酶活性，或与其相应的野生型酵母细胞相比，所述细胞具有降低的与NADH依赖的生化途径相关的酶活性。其中，所述NADH依赖的生化途径用于由碳水化合物合成甘油。

降低的酶活性可以通过改造一个或多个编码NAD依赖的甘油3-磷酸脱氢酶活性(GPD)的基因、或一个或多个编码磷酸甘油磷酸酶活性(GPP)的基因来完成，这样使酶的表达大大低于野生型细胞，或者基因编码的多肽具有降低的活性。这种改造可以使用常用已知的生物技术进行，并且尤其可在编码GPD和/或GPP结构基因的启动子区域或编码区域中包括一个或多个敲除突变或定点诱变。可选择地，可以通过随机诱变，随后选择具有降低、或无GPD和/或GPP活性的菌株，从而获得甘油生成存在缺陷的酵母菌株。酿酒酵母GDP1、GPD2、GPP1和GPP2基因如SEQ ID NO：24-27所示。

优选地，完全删除至少一个编码GPD的基因或至少一个编码GPP的基因；或者删除基因的至少一部分，其中该部分编码对酶活性必不可少的酶的一部分。尤其使用酿酒酵母细胞已得到很好的结果，其中，GPD1基因和GPD2基因的开放阅读框的活性已失活。结构基因(靶基因)的失活可由本领域技术人员综合合成或其他方法构建DNA片段来实现，其中该DNA片段由可选择的标记基因及其两侧的DNA序列组成，且该两侧的DNA序列与要删除的宿主细胞基因组区域的两侧翼序列相同。尤其是，已通过整合标记基因kanMX和hphMX4，使酿酒酵母中GPD1和GPD2基因失活，从而取得良好的结果。随后将该DNA片段转化进宿主细胞中。例如通过诊断性聚合酶链反应或Southern杂交，对表达显性标记基因的转化细胞进行检测，以获得已正确取代计划要删除区域的细胞。

如上所述，根据本发明的细胞包含编码NAD⁺依赖的乙酰化乙醛脱氢酶(EC1.2.1.10)的异源核酸序列。该酶催化乙酰-辅酶A至乙醛的转化。该转化可用以下平衡反应式表示：

这样，当由生长培养基中存在的乙酸生成乙酰-辅酶A时，该酶能够使NADH再氧化，从而不再需要用于辅助氧化还原平衡的甘油的合成。

编码NAD⁺依赖的乙酰化乙醛脱氢酶的核酸序列原则上可来源于任何包含编码上述脱氢酶的核酸序列的生物体。

已知能够催化乙酰-辅酶A至乙醛的NADH依赖的还原反应的NAD⁺依赖的乙酰化乙醛脱氢酶，通常可以分成三类NAD⁺依赖的乙酰化乙醛脱氢酶功能性同系物：

1)催化乙酰-辅酶A至乙醛的可逆转化、以及随后的乙醛至乙醇的可逆转化的双功能蛋白。该类型蛋白的实例是大肠杆菌中的AdhE蛋白(基因数据库(GenBank)号：NP_415757)。AdhE蛋白似乎是基因融合的进化产物。AdhE蛋白的NH₂末端区域与乙醛：NAD₊氧化还原酶高度同源，而COOH末端区域与Fe²⁺依赖的乙醇：NAD⁺氧化还原酶家族具有同源性(Membrillo-Hernandez等，(2000)J.Biol.Chem.275：33869-33875)。大肠杆菌的AdhE受限于金属催化的氧化反应，因此是氧敏感性的(Tamarit等(1998)J.Biol.Chem.273：3027-32)。

2)在严格或兼性厌氧微生物中催化乙酰-辅酶A至乙醛的可逆转化、但不具有乙醇脱氢酶活性的蛋白。该类型蛋白的实例在克氏梭菌(Clostridiumkluyveri)中已有报道(Smith等(1980)Arch.Biochem.Biophys.203：663-675)。乙酰化乙醛脱氢酶已在克氏梭菌DSM555基因组中注明(GenBank号：EDK33116)。且已在植物乳酸菌(Lactobacillus plantarum)中发现了同源蛋白AcdH(GenBank号：NP_784141)。该类型蛋白的另一实例是拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NRRL B593中所述的基因产物(Toth等(1999)Appl.Environ.Microbiol.65：4973-4980，GenBank号：AAD31841)。

3)参与4-羟基-2-酮戊酸分解代谢的双功能醛缩酶-脱氢酶复合物的一部分蛋白。所述双功能酶催化儿茶酚间位裂解途径的最后两步，儿茶酚是许多细菌物种中酚类、甲苯甲酸盐、萘、多氯联苯和其他芳香族化合物降解的中间产物(Powlowski和Shingler(1994)Biodegradation 5，219-236)。4-羟基-2-酮戊酸首先在4-羟基-2-酮戊酸醛缩酶催化下转化成丙酮酸盐和乙醛，接着乙醛在乙酰化乙醛脱氢酶催化下转化成乙酰-辅酶A。该类型的乙酰化乙醛脱氢酶的实例是假单胞菌属(Pseudomonas sp.)CF600中的DmpF蛋白(GenBank号：CAA43226)(Shingler等(1992)J.Bacteriol.174：711-24)。大肠杆菌MphF蛋白(Ferrandez等(1997)J.Bacteriol.179：2573-2581，GenBank号：NP_414885)与假单胞菌CF600中的DmpF蛋白同源。

适宜的核酸序列尤其可以在选自以下组的生物体中找到：埃希氏菌属(Escherichia)，尤其是大肠杆菌；分支杆菌属(Mycobacterium)，尤其是分支杆菌(Mycobacterium marinum)、溃疡分支杆菌(Mycobacterium ulcerans)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；氧化碳嗜热菌属(Carboxydothermus)，尤其是生氢氧化碳嗜热菌(Carboxydothermushydrogenoformans)；内阿米巴属(Entamoeba)，尤其是痢疾阿米巴(Entamoebahistolytica)；志贺氏菌属(Shigella)，尤其是索氏志贺菌(Shigella sonnei)；伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)，尤其是类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderiapseudomallei)；克雷伯菌属(Klebsiella)，尤其是肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)；固氮菌属(Azotobacter)，尤其是棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)；固氮弓菌属(Azoarcus sp)；贪铜菌属(Cupriavidus)，尤其是台湾贪铜菌(Cupriavidus taiwanensis)；假单胞菌属(Pseudomonas)，尤其是假单胞菌属CF600；消化球菌属(Pelomaculum)，尤其是喜温发酵菌(Pelotomaculumthermopropionicum)。优选地，编码NAD⁺依赖的乙酰化乙醛脱氢酶的核酸序列源于埃希氏菌属，更优选地源于大肠杆菌。

尤其适宜的是来自大肠杆菌的mhpF基因或其功能同系物。该基因在Ferrández等(1997)J.Bacteriol.179：2573-2581中有描述。采用酿酒酵母已获得良好的结果，其中，该酿酒酵母中已并入来自大肠杆菌的mhpF基因。

在进一步的有利实施例中，编码(乙酰化)乙醛脱氢酶的核酸序列来自于尤其是假单胞菌属的假单胞菌属CF600的dmpF。

原则上，编码NAD⁺依赖的乙酰化乙醛脱氢酶的核酸序列可以是野生型核酸序列。

优选的核酸序列编码NAD⁺依赖的乙酰化乙醛脱氢酶，所述NAD⁺依赖的乙酰化乙醛脱氢酶表示为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：29的序列、或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：29的功能同系物。该核酸序列尤其包括根据SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：28的序列、或SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：28的功能同系物。

进一步地，乙酰化乙醛脱氢酶(或编码该活性的核酸序列)可以例如选自由大肠杆菌adhE、痢疾阿米巴菌(Entamoebahistolytica)adh2、金黄色葡萄糖球菌(Staphylococcus aureus)adhE、厌气性瘤胃真菌属(Piromyces sp.)E2 adhE、克氏梭菌(Clostridium kluyveri)EDk33116、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)acdH和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)YP001268189所组成的组。对于这些酶序列、编码这些酶的核酸序列以及将这些核酸序列并入宿主细胞的方法可参考WO2009/013159，尤其是其中实例3的表1(第26页)及其中提到的序列识别(ID)号；其中，WO2009/013159公布的表1和代表所述表中提到的序列ID号的序列通过引用并入本文中。

通常，根据本发明的细胞还包含乙酰-辅酶A合成酶，该酶催化由乙酸形成乙酰-辅酶A。该酶可存在于野生型细胞中，例如酿酒酵母包括由ACS1[SEQ IDNO：17]和ACS2[SEQ ID NO：18]基因编码的两个乙酰-辅酶A合成酶的同功酶(van den Berg等(1996)J.Biol.Chem.271：28953-28959)；或者可为宿主细胞提供一个或多个编码该活性的异源基因，例如可将酿酒酵母的ACS1和/或ACS2基因、或其功能同系物并入缺少乙酰-辅酶A合成酶同功酶活性的细胞中。

进一步地，尤其鉴于高效的乙醇生产以及高效的NADH氧化，细胞优选包含NAD⁺依赖的乙醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)。该酶催化乙醛至乙醇的转化。所述细胞可以天然包含编码所述脱氢酶的基因，例如酿酒酵母(ADH1-5)[SEQ ID NO：19-23]一样，参见“Lutstorf和Megnet.1968 Arch.Biochem.Biophys.126：933-944”和“Ciriacy，1975，Mutat.Res.29：315-326”；或者可为宿主细胞提供一个或多个编码该活性的异源基因，例如可将酿酒酵母的所有ADH1-5、或ADH1-5基因中的一个、或其功能同系物并入缺乏NAD⁺依赖的乙醇脱氢酶活性的细胞中。

根据本发明，特别优选的细胞是2009年7月16日收藏在皇家荷兰生物科技研究所培养物保藏中心(Centraalbureau voor Schimmel cultures)(荷兰，乌特勒支)、保藏编号为CBS125049的酿酒酵母菌株细胞。

具体方面，本发明的目的在于制造根据本发明的重组酵母细胞的方法。

细胞的基因改造包括将一个或多个异源核酸序列并入宿主细胞、且通常包括对编码NADH依赖的甘油合成所需酶活性的基因的突变(包括彻底删除)。所述细胞的基因改造可以基于常见的一般知识，例如，本领域公知的标准遗传和分子生物学技术，且已对所述细胞的基因改造进行了描述，如：Maniatis等，1982年的《分子克隆：实验室手册》(Molecular cloning：a laboratory manual)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(N.Y.)；Miller，1972年的《分子遗传学实验》(Experiments in molecular genetics)，冷泉港实验室，冷泉港；Sambrook和Russell，2001年的《分子克隆：实验室手册(第三版)》(Molecular cloning：alaboratory manual(3rd edition))，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版；F.Ausubel等编辑，《现代分子生物学实验技术》(Current protocols in molecular biology)，Green Publishing and Wiley Interscience出版社，纽约1987。

根据本发明的重组酵母细胞的制造方法，包括：

(a)提供酵母细胞，优选地，该酵母细胞选自由缺少NADH依赖的甘油合成所需酶活性的酵母细胞、及与其相应的野生型酵母细胞相比具有对甘油合成酶活性降低的酵母细胞所组成的组；

(b)获得包含基因的核酸片段，所述基因与所述酵母细胞异源、且编码具有NAD⁺依赖的乙酰化乙醛脱氢酶活性的酶；其中，所述基因可操作地连接至在所述酵母细胞中具有功能的启动子上；

(c)如果需要(例如如果酵母细胞缺少乙酰-辅酶A合成酶活性，或者酵母细胞中乙酰-辅酶A合成酶活性限制乙酸至乙醇转化途径在体内的整个活性，或者酵母细胞在某一细胞隔室内表达乙酰-辅酶A合成酶、但该表达与乙酰-辅酶A合成酶在本发明中的用途不兼容)，则获得包含基因的核酸片段，所述基因与所述酵母细胞异源、且编码具有乙酰-辅酶A合成酶活性的酶，其中，所述基因可操作地连接至在所述酵母细胞中有功能的启动子上；

(d)如果需要(例如如果酵母细胞缺少NAD⁺依赖的乙醇脱氢酶活性，或者酵母细胞中NAD⁺依赖的乙醇脱氢酶活性限制乙酸至乙醇转化途径在体内的整个活性，或者酵母细胞在某一细胞隔室内表达NAD⁺依赖的乙醇脱氢酶、但该表达与NAD⁺依赖的乙醇脱氢酶本发明中的用途不兼容)，则获得包含基因的核酸片段，所述基因与所述的酵母细胞异源、且编码具有NAD⁺依赖的乙醇脱氢酶活性的酶，其中，所述基因可操作地连接至在所述酵母细胞中有功能的启动子上；以及

(e)使用所述核酸片段或多个核酸片段转化酵母细胞，从而提供一种表达所述异源基因的重组酵母细胞；其中，在发酵条件下与相应的非重组酵母细胞相比，所述重组的酵母细胞显示了NADH依赖的甘油合成降低，或者在发酵条件下不存在NADH依赖的甘油合成。

本领域中，酵母细胞的启动子是已知的，可以是例如：磷酸丙糖脱氢酶TPI1启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶TDH3启动子、翻译延伸因子EF-1的αTEF1启动子、乙醇脱氢酶ADH1启动子、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶gpdA和ZWF1启动子、蛋白酶启动子(如pepA、pepB和pepC)、葡糖糖化酶glaA启动子、淀粉酶amyA和amyB启动子、过氧化氢酶catR或catA启动子、葡糖氧化酶goxC启动子、β-半乳糖苷酶lacA启动子、α-葡萄糖苷酶aglA启动子、翻译延长因子tefA启动子、木聚糖酶启动子(如xlnA、xlnB、xlnC和xlnD)、纤维素酶启动子(如eglA、eglB和cbhA)、转录调节因子(如areA、creA、xlnR、pacC、prtT等)的启动子、或其他启动子，以及NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)上可以找到的其他启动子。

在一个优选实施例中，制造本发明的重组酵母细胞时，将要导入酵母细胞中的异源核酸序列并入载体中，且使用该载体转化细胞。如果要并入多个异源核酸序列(编码不同酶活性或共同编码单个酶活性)，这些核酸序列可存在于单个载体中，或者可作为不同载体的一部分并入这些核酸序列。

因此，本发明进一步的目的在于在酵母细胞中表达异源多肽的载体，尤其在酵母细胞中，所述表达载体包括一个或多个异源核酸序列，所述异源核酸序列可操作地连接至在酵母细胞中具有功能的启动子上；所述异源核酸序列编码多肽，且所述多肽具有在所述酵母细胞(胞浆)内使乙酰-辅酶A转化为乙醛的酶活性；其中，所述多肽优选包括根据SEQ ID NO：2的序列或其功能同系物。

本发明的(方法中使用的)载体可以是噬菌体载体、细菌载体、着丝粒质粒载体、游离质粒载体或整合质粒载体、或病毒载体。

在一个优选实施例中，载体是在酵母属、尤其是在酿酒酵母中表达的载体。尽管已使用野生型编码核酸序列得到了良好的结果，但在所述实施例中，编码具有NAD⁺依赖的乙酰化乙醛脱氢酶活性的异源核酸序列还可以是在酵母属、尤其是在酿酒酵母中优化表达的密码子(对)。

为了实现在特定细胞(如酿酒酵母)内的最佳表达，可以通过任何一种合成基因设计软件包对异源基因的密码子(对)进行优化，例如，PCT/EP2007/05594描述的来自GeneartAG公司(雷根斯堡，德国)的用于密码子使用最优化或密码子对使用最优化的

密码子使用的所述适应性变化确保了异源基因例如细菌来源的基因，可通过酵母的转录和翻译机制进行有效地加工。密码子对使用的最优化将导致酵母细胞内蛋白表达的增强。例如，可将优化序列克隆到高拷贝酵母表达质粒中，且与在真菌(酵母)内有功能的(优选组成型的)启动子可操作地连接。

如上所述，本发明进一步的目的是乙醇的制造。

对于制造乙醇的方法，使用根据本发明的细胞，所述细胞在厌氧条件下发酵糖，从而形成乙醇。用于发酵糖的合适的酵母细胞通常是已知的，且尤其包括酿酒酵母。本发明的方法中，使用的酵母细胞还产生NAD⁺依赖的乙酰化乙醛脱氢酶(EC 1.2.1.10)。可使用如上所述的方法、以及本文以下实例中所示的方法，获得所述细胞。如果用于制造乙醇，所述细胞最好还包含乙酰-辅酶A合成酶活性。如果用于制造乙醇，所述细胞优选还包括NAD⁺依赖的乙醇脱氢酶活性。这些活性可以是天然存在的，如在酿酒酵母内，或通过基因改造(如上所述)的方法提供给所述细胞。

发酵条件原则上基于一般已知的条件，如上面所引用的Van Maris的综述中描述的条件、或者该综述中所引用的参考文献，条件是通常进行发酵的培养基除了可发酵糖外还包含乙酸。

根据本发明进行改造的酵母细胞厌氧培养所消耗的乙酸与碳水化合物的摩尔比通常至少是0.004、尤其至少是0.01、至少0.03、至少0.1、或至少0.2。木质纤维素生物质的水解产物中存在的乙酸与碳水化合物的摩尔比通常少于0.70、尤其是0.5或更少、更尤其是0.3或更少、或0.2或更少。本文中，碳水化合物的摩尔数基于单糖单位，即1摩尔具有n单糖单位的低聚糖/多糖视为n摩尔。

从绝对值来看，可发酵碳水化合物的浓度常常在65-400g/L的范围内、尤其是100-250g/L的范围内。

从绝对值来看，乙酸浓度常常在0.5-20g/L的范围内、尤其在1-15g/L的范围内、更尤其在2-12g/L的范围内。

基于一般常识或者可以常规确定，且根据所使用的生物体可以接受的pH来选择pH。发酵常常在中性或酸性pH条件、尤其在pH值为2-7的范围、更尤其在pH值为3-6的范围、甚至更尤其在3.5-5.5的条件下进行。其中，在发酵进行的温度下测量发酵培养基内的表观pH值。

可以根据所使用的生物体可以接受的温度来选择温度，该温度常常在15℃-50℃范围内、尤其在25℃-45℃的范围内。

作为可发酵碳水化合物，原则上可以使用任何可被特定重组细胞代谢的碳水化合物，其中代谢产物为乙醇。所述细胞可能天生包含需要的代谢酶系统，或者所述细胞可能已经为此目的经过基因改造，如Van Maris的综述所述、该综述引用的参考文献所述、或者本发明所述。优选地，水解产物中可发酵的碳水化合物包括至少一种碳水化合物，其中碳水化合物选自由己糖、戊糖、和包含一个或多个己糖和/或戊糖单元的寡糖所组成的组。尤其对于来自酵母属群、优选酿酒酵母的重组细胞来说，使用至少一种选自葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖的碳水化合物。现已使用葡萄糖获得了良好的结果。

根据本发明的方法尤其适合使用至少一种聚合物的水解产物来制造乙醇；其中该聚合物选自纤维素、半纤维素和果胶，优选选自半纤维素和果胶。通常通过这些聚合物的水解而释放出乙酸、或作为分解产物而形成乙酸。尤其是水解产物可以是水解的木质纤维素材料，如木质纤维素生物质。例如，木质纤维素材料可以选自农业木质纤维素材料，如棉花、稻草、(象)草、甘蔗渣、玉米秸秆、木质纤维素水植物材料、甜菜浆、柑橘皮、林业的木质纤维素材料(例如来自树木或灌木(修剪的/剪掉的/未修剪的植物材料、锯屑等)的木质纤维素废物材料、或特定作为木质纤维素材料原料生长的树或灌木(如白杨树))、工业(木质)纤维素废物(如木纸浆和废纸)。

优选地，木质纤维素水解产物包括一种或多种在水解过程中形成的可发酵糖(尤其是葡萄糖、木糖和阿拉伯糖)和乙酸。因此，在本发明的一个优选实施例中，乙醇的制造包括其中木质纤维素材料被水解、从而形成水解产物的步骤；其中，所述水解产物包括一种或多种可发酵碳水化合物和乙酸，所述碳水化合物尤其是葡萄糖、及可选的一种或多种其他己糖、戊糖。所述水解产物随后与本发明的重组细胞接触。与本发明重组细胞接触的基质内的乙酸和可发酵碳水化合物的相对浓度，可以通过优化水解条件、混合不同水解产物、和/或与碳水化合物(部分)精炼源和/或乙酸混合而进行改变。

合适的水解方法可以基于引用的Van Maris综述或该综述引用的参考文献中所述的方法，包括酶法水解、热水解、化学水解、及其组合。聚合物通常水解到至少50％、优选至少90％、尤其至少95％的链降解为单糖单元、或单糖单元和二糖单元。

现由以下实例对本发明进行说明。

实例

实例1

材料和方法

菌株的构建和保持

使用的酿酒酵母菌株(表1)来源于CEK.PK科，已识别该CEK.PK科具有作为组合基因和生理研究的合适的背景(van Dijken等(2000)Enzyme Microb.Technol.26：706-714)。

表1：使用的酿酒酵母菌株

为了中断GPD1基因(YDL022W)，可以通过根据Güldener等(1996，NucleicAcids Res.24：2519-2524)中PCR方法扩增loxP-KanMX-loxP中断盒；其中，PCR扩增使用的引物组包含与GPD1基因内序列同源的45-核苷酸侧翼区、及与pUG6中断块序列同源的约20-核苷酸(Güldener等(1996)Nucleic Acids Res.24：2519-2524)(图2，表2)。同样，质粒pAG32(Goldstein和McCusker(1999)Yeast 15：1541-1553)可用作hphMX4中断块进行PCR扩增的模板。为了构建GPD2(YOL059W)中断盒，可以使用的引物组包含与GPD2基因内序列同源的45-核苷酸侧翼区、及与pAG 32中断块序列同源的20-核苷酸。

表2：用于使GPD1和GPD2基因失活的寡核苷酸、及通过诊断PCR验证正确中断的寡核苷酸。基因中断寡核苷酸；大写字母表示与要删除的基因的左侧(5’侧)或右侧(3’侧)序列同源的核苷酸；小写字母表示与中断盒序列同源的核苷酸。

PCR扩增的GPD1和GPD2中断盒至酿酒酵母菌株CEN.PK102-3A(表1)的转化可以根据Güldener等(Nucleic Acids Res.(1996)24：2519-2524)中描述的方案进行，随后使用酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)天然培养基(complexmedium)(Burke等，(2000)《(酵母基因学方法》(Methods in yeast genetics)，冷泉港出版社普莱恩维尤，纽约)进行转化菌株的选择；其中，含有200mg/LG-418的YPD培养基用于选择转化有KanMX中断盒的菌株，含有300mg/L潮霉素B的YPD培养基用于选择转化有hphMX4中断盒的菌株。可使用引物组5′GPD1\KANA和3′GPD1\KANB(表2)的组合，由菌落PCR确认GPD1基因中断盒的正确整合。类似地，可使用引物组5′GPD2\KANA和3′GPD2\KANB(表2)验证GPD2的正确失活。在菌株CEN.PK102-3A(MATa ura3 leu2)的GPD1和GPD2基因的开放阅读框内具有缺失的菌株RWB0094从荷兰鹿特丹港市的BIRD Engineering处获得；其中，GPD1和GPD2基因的开放阅读框分别被loxP-KanMX-loxP盒和hphMX4盒取代。菌株RWB0094的KanMX标记因Cre重组酶的表达而被移除(Güldener等(1996)Nucleic Acids Res.24：2519-2524)，菌株RWB0094的亮氨酸营养缺陷表型则通过转化LEU2承载的质粒YEPlac181得到补偿(Gietz，R.D.和S.Akio.(1988)，Gene 74：527-534)，从而得到菌株IMZ008。图12示意性示出了基因中断的过程，GPD1 ORF被KanMX取代和GPD2 ORF被hphMX4取代。箭头指示寡核苷酸引物，用于通过诊断PCR来确认正确的基因失活。

使用URA3承载的mhpF表达质粒pUDE43(见下文)转化菌株IMZ008，得到原养型mhpF表达菌株IMZ132；使用URA3承载的“空”载体p426_GPD转化菌株IMZ008，得到菌株IMZ127。最后，使用质粒p426_GPD转化菌株CEN.PK113-5D(ura3)，得到原养型GPD1 GPD2参照菌株IME076。将用中断盒转化的培养物涂在含G418(200mg/l)或潮霉素(200mg/l)的YPD复合培养基上。由诊断PCR确认该中断盒的成功整合。

所有菌株的储存培养物在有100ml合成培养基(见下文)的摇瓶内生长，其中合成培养基含作为碳源的20g/l葡萄糖。添加30％(v/v)甘油后，将1ml分装的固定相培养物保存于-80℃。

质粒构建

大肠杆菌mhpF基因(欧洲分子生物学实验室(EMBL)登记号Y09555.7)是从大肠杆菌K12菌株JM109基因组DNA中经PCR扩增得到的，其中PCR使用引物对为分别包含attB1和attB2序列的mhpF-FW(5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGAGTAAGCGTAAAGTCGCCA-TTATCGG -3′，[SEQ  ID  NO  ：3])和mhpF-RV(5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTCATGCCGCTTCTCCTGCCTTGC-3′，[SEQ ID NO：4])。根据制造商说明书，使用热启动高保真DNA聚合酶(Finnzymes Oy公司，埃斯波，芬兰)、在PCR扩增仪(BiometraTGradient Thermocycler)(Biometra公司，哥廷根，德国)中进行聚合酶链反应(PCR)，其中该PCR扩增仪设置如下：25个98℃变性10秒、72℃退火和延伸30秒的循环。使用

克隆技术(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州(CA)，美国)克隆1011bp的PCR产物。采用BP反应，使用质粒pDONR221创建入门克隆，且将该入门克隆命名为质粒pUD64。从该入门克隆和多拷贝质粒pAG426GPD-ccdB(Addgene公司，剑桥，马赛诸萨州(MA)，美国)，采用LR反应构建酵母表达质粒pUDE43。根据Z-Competent^TM大肠杆菌转化试剂盒(Zymoresearch公司，奥兰治市(Orange)，美国)，将重组反应产物转化进大肠杆菌K12菌株JM109的感受态细胞中，并将转化的细胞涂在含氨苄西林(100mg/l)或卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上。根据Burke等(《酵母遗传学方法》(2000)(冷泉港实验室出版社普莱恩维尤，纽约(NY))中所述的方法进行酵母转化。使用酵母表达质粒进行转化后，将细胞涂在合成培养基。使用克隆的引物，经诊断PCR确认多拷贝质粒pUED43的成功插入。

培养和培养基

30℃、在合成培养基(46)内进行摇瓶培养。灭菌前，用2M的KOH将培养基的pH值调节至6.0。将(1ml)冷冻的储存培养物接种到在500mL摇瓶中的100ml含20g/l葡萄糖的培养基中，以制备预培养物。在30℃的

震荡培养箱(200rpm，New Brunswick Scientific公司，新泽西州(NJ)，美国)内培养24小时后，将培养物转移至生物反应器。

在30℃，在具有1升工作体积的2升实验室生物反应器(Applikon公司，斯希丹(Schiedam)，荷兰)中进行厌氧分批发酵。使用含20g/l葡萄糖的合成培养基(46)进行所有发酵，并且该合成培养基中补充有100μl/l的硅酮消泡剂(Silcolapse 5020，Caldic Belgium公司，Bleustar硅酮)、以及厌氧生长因子、溶解在乙醇中的麦角固醇(0.01g/l)和吐温(Tween)80(0.42g/l)。这导致培养基中含有11-13mM乙醇。需要指出，接种前添加有浓度为2g/l的乙酸，从而将pH值重新调节至5.0。通过自动添加2M的KOH，将培养物pH值维持在5.0。培养物以800rpm的转速进行搅拌，且以0.5L/min的速度喷射氮气(＜10ppm氧气)。由高压灭菌氧电极(Applisens公司，斯希丹，荷兰)监控溶解的氧。为减少氧气扩散，为生物反应器设置了Norprene管(科尔帕仪器公司(ColePalmer Instrument Company)，弗农山(Vernon Hills)，美国)。所有发酵都进行至少两次重复。

培养物干重和光密度的测定

在选定的时间间隔，培养物样品(10ml)在预称重的硝化纤维过滤器(孔径为0.45μm，Gelman实验室，安阿伯市(Ann Arbor)，美国)上进行过滤。去除培养基后，过滤器用去离子水清洗，且在350W的微波炉(博世公司(Bosch)，斯图加特，德国)中烘干20分钟，然后称重。重复测定的差异小于1％。另外，通过在

II分光光度计的660nm波长下的光密度读数，来监控培养物的生长。

气体分析

排出的气体在冷凝器(2℃)中冷却，且用MD-110-48P-4型号的Permapure烘干机(Permapure公司，汤姆斯河，美国)烘干。通过NGA2000分析器(罗斯蒙特分析公司(Rosemount Analytical)，奥维尔，美国)测定氧气和二氧化碳浓度。如前文所述(3)，测定排出的气流流速和二氧化碳生产率。计算这些生物质比速率时，对由于回收培养物样品而引起的体积变化进行校正。

代谢产物分析

培养物样品通过离心获得上清液，且在包括Biorad HPX 87H柱(伯乐公司(Biorad)，赫拉勒斯(Hercules)，美国)的Waters Alliance 2690高效液相色谱(HPLC)仪(沃特世公司(Waters)，米尔福德(Milford)，美国)上，经由HPLC对该培养物样品进行葡萄糖、乙酸、琥珀酸、乳酸、甘油和乙醇的分析。在60℃，使用0.5g/1H₂SO₄以0.6ml/min的流速对柱子进行洗脱。通过Waters 2410示差折光检测器和Waters 2487紫外检测器进行检测。进一步通过酶测定试剂盒(拜发公司(R-BiopharmAG)，达姆施塔特，德国)测定初始甘油浓度和最终甘油浓度。在喷射氮气的生物反应器中进行培养的过程中，很大一部分乙醇经由挥发的气体而丢失。为了克服这个问题，对生物反应器中的乙醇进行蒸发动力学分析；其中生物反应器在相同条件、无菌合成培养基的不同工作体积下进行运作。考虑到取样引起的体积变化，使用得到的体积依赖的乙醇蒸发常数(为此设置等于0.0080除以以升为单位的体积，用h^-1表示)来校正培养物上清液中乙醇浓度的HPLC测量值。

酶活性检测

如前所述(Abbott等Appl.Environ.Microbiol.75：2320-2325)，从指数生长的厌氧分批培养物中制备细胞提取物，用于NAD⁺依赖的乙醛脱氢酶(乙酰化)活性检测。在30℃，通过监控340nm处NADH的氧化，测量NAD⁺依赖的乙醛脱氢酶(乙酰化)活性。反应混合物(总体积为1ml)包含50mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)、15mM的NADH和细胞提取物。通过添加0.5mM乙酰-辅酶A起始该反应。对于甘油3-磷酸脱氢酶(EC 1.1.1.8)活性测定，除了磷酸缓冲液由三乙醇胺缓冲液(10mM，pH5)(5，19)取代外，根据如上所述方法制备细胞提取物。如前所述(Blomberg和Adler(1989)，J.Bacteriol.171：1087-1092.)，30℃，在细胞提取物中检测甘油3-磷酸脱氢酶活性。反应速率与添加的细胞提取物的量成比例。以牛血清白蛋白作为标准，通过罗氏(Lowry)法(Lowry等(1951)J.Biol.Chem.193：265-275)测定蛋白浓度。

结果

厌氧分批培养物的生长和产物形成

当为原养型参照菌株酿酒酵母IME076(GPD1 GPD2)的培养物补充2.0g/l乙酸时，比生长速率(0.32h^-1)与报道的无乙酸生长的培养物(0.34h^-1)(Kuyper等(2005)FEMS Yeast Res.5：399-409)相同。但乙酸的添加导致生物质产量略有下降，从而相对于无乙酸生长的培养物使基于葡萄糖的甘油产量下降(图2，表3)。

这种效果已被归因于由于乙酸扩散到细胞内，而使用于细胞内pH动态平衡的葡萄糖异化作用速率较高，反过来导致基于葡萄糖的生物质产量较低。相同条件下，等基因型gpd1Δgpd2Δ菌株完全无法进行厌氧生长(图2)，这符合经由Gpd1和Gpd2的甘油生成对酿酒酵母厌氧培养物中NADH再氧化是必不可少的观念；已确认在等基因型gpd1Δgpd2Δ菌株的细胞提取物中没有NAD⁺依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶的活性(表2)。

表3：在含葡萄糖乙酸混合物的合成培养基(pH5)上进行厌氧分批培养过程中，酿酒酵母的工程菌株IMZ132或空载体参照菌株IME076的生理机能。

n.a.：不适用。

当葡萄糖是唯一碳源时，因为gpd1Δgpd2Δ菌株中的大肠杆菌mhpF基因的表达不能进行厌氧生长，而且导致细胞提取物中乙酰-辅酶A依赖的NADH还原速率为0.020μmol/min(mg蛋白)(表3)。然而，当向培养基中补充2.0g/l乙酸时，可以看到菌株以0.14h^-1比生长速率进行指数生长，且培养过程中没有形成甘油(图2，表3)。gpd1Δgpd2Δ菌株培养物中存在的微量(＜1mM)甘油源于从冷冻甘油储存液开始的接种培养物。乙醇是主要的有机产物，并且生成的少量琥珀酸和乳酸与生长在相同条件下参照菌株的培养物中所观察到的相似(数据未示出)。

可以看到，IMZ132发酵(40h)持续时间超过野生型菌株(15h)的发酵时间，并且向厌氧分批培养物喷射氮气。因此，对于菌株IMZ132经蒸发丢失的乙醇部分是较高的。在测定无菌对照实验中乙醇蒸发动力学且对乙醇产量进行校正后，根据本发明的工程菌株使用乙酸至乙醇NADH依赖的还原反应的线性途径(表3)，从而显示基于葡萄糖的表观乙醇产量提高13％。

讨论

本研究依据化学计量学为如下原理提供了证据：甘油作为酿酒酵母厌氧生长中的氧化还原汇的作用，可以完全被乙酸至乙醇NADH依赖的还原反应的线型途径所取代。本研究也为由包含乙酸(如木质纤维素水解产物)的原料进行乙醇大规模生产提供了有趣的前景。

除了降低消耗培养基的有机碳含量且增加乙醇产量，乙酸至乙醇的还原反应至少可局部缓解乙酸对酵母生长和代谢的抑制作用，其中这种抑制作用尤其在低pH值以及工程酵母菌株消耗戊糖的过程中存在问题。

实例2

本实例涉及通过gpd1Δgpd2Δ酿酒酵母菌株进行无甘油的乙醇发酵生产，其中该酿酒酵母菌株表达来自假单胞菌属CF600的野生型dmpF基因(GenBank号：CAA43226)(Shingler等(1992)J.Bacteriol.174：711-24)的密码子优化版本(SEQ ID NO：28)。

为此，使用了与用于菌株IMZ132(gpd1Δgpd2ΔmhpF)的构建和性能评估相同的步骤和技术。这些步骤和技术在实例1的材料和方法部分中有描述。在本工作中，使用承载URA3的dmpF表达质粒pUDE47转化菌株IMZ008(gpd1Δgpd2ura3Δ)，以得到原养型表达dmpF的菌株IMZ130。为了构建质粒pUDE47，将来自假单胞菌属CF600的dmpF基因(EMBL登记号X60835.1)的密码子优化拷贝连接到p426_GPD质粒中。由BaseClear BV(莱顿市，荷兰)进行酿酒酵母中表达的密码子优化，且将该优化的密码子连接到质粒p426_GPD中。通过诊断菌落PCR来确认多拷贝质粒pUDE47的成功插入，该PCR反应使用引物对为dmpF-FW(CATTGATTGCGCCATACG)和dmpF-RV(CCGGTAATATCGGAACAGAC)。

结果

厌氧分批培养物的生长和产物形成

gpd1Δgpd2Δ酿酒酵母中假单胞菌属CF600的dmpF基因的表达与在相同菌种中表达大肠杆菌mhpF基因所获得的结果相似。厌氧分批发酵中，与菌株IMZ132(gpd1Δgpd2ΔmhpF)相似，dmpF基因的功能性表达、且同时补充含2.0g/l乙酸的培养基，会导致菌株以0.11h^-1(图1)比生长速率进行指数生长。菌株IMZ130(gpd1Δgpd2ΔdmpF)的批次反应时间(55h)比菌株IMZ132(40h)稍长。培养过程中，初始浓度为20g/l的葡萄糖完全被消耗，但并没有观察到甘油的形成。同时，乙酸从2.1g/l的初始浓度被消耗到1.6g/l的最终浓度。乙醇是主要的有机产物，显示有0.48g/g基于葡萄糖的乙醇产量(经乙醇蒸发进行校正的产量)。产生了少量的琥珀酸和乳酸，这类似于对在相同条件下生长的参照菌株的培养物所观察到的情况。

图3所示的是接种有IMZ130(gpd1Δgpd2ΔdmpF)的分批发酵的流出流体中，所含CO₂的体积百分比。为显示指数生长，该曲线图的y轴以对数尺度表示，且计算出了最大比生长速率。

来自假单胞菌属CF600的基因dmpF的合成密码子优化拷贝的插入提供了另一实例，即依据化学计量学，作为酿酒酵母厌氧生长中的氧化还原汇的甘油形成可能被乙酸至乙醇NADH依赖的还原反应的线型途径所取代。本实例也显示了gpd1Δgpd2Δ酿酒酵母菌株中插入(乙酰化)乙醛脱氢酶，会导致较高的基于葡萄糖的乙醇产量，且没有形成副产物甘油，另外发酵抑制剂化合物乙酸的消耗较高。

序列

SEQ ID NO：1

大肠杆菌mhpF基因乙醛脱氢酶，乙酰化

ATGAGTAAGCGTAAAGTCGCCATTATCGGTTCTGGCAACATTGGTACCG

ATCTGATGATTAAAATTTTGCGTCACGGTCAGCATCTGGAGATGGCGGTG

ATGGTTGGCATTGATCCTCAGTCCGACGGTCTGGCGCGCGCCAGACGTAT

GGGCGTCGCCACCACCCATGAAGGGGTGATCGGACTGATGAACATGCCT

GAATTTGCTGATATCGACATTGTATTTGATGCGACCAGCGCCGGTGCTCA

TGTGAAAAACGATGCCGCTTTACGCGAAGCGAAACCGGATATTCGCTTA

ATTGACCTGACGCCTGCTGCCATCGGCCCTTACTGCGTGCCGGTGGTTAA

CCTCGAGGCGAACGTCGATCAACTGAACGTCAACATGGTCACCTGCGGC

GGCCAGGCCACCATTCCAATGGTGGCGGCAGTTTCACGCGTGGCGCGTG

TTCATTACGCCGAAATTATCGCTTCTATCGCCAGTAAATCTGCCGGACCT

GGCACGCGTGCCAATATCGATGAATTTACGGAAACCACTTCCCGAGCCA

TTGAAGTGGTGGGCGGCGCGGCAAAAGGGAAGGCGATTATTGTGCTTAA

CCCAGCAGAGCCACCGTTGATGATGCGTGACACGGTGTATGTATTGAGC

GACGAAGCTTCACAAGATGATATCGAAGCCTCAATCAATGAAATGGCTG

AGGCGGTGCAGGCTTACGTACCGGGTTATCGCCTGAAACAGCGCGTGCA

GTTTGAAGTTATCCCGCAGGATAAACCGGTCAATTTACCGGGCGTGGGG

CAATTCTCCGGACTGAAAACAGCGGTCTGGCTGGAAGTCGAAGGCGCAG

CGCATTATCTGCCTGCCTATGCGGGCAACCTCGACATTATGACTTCCAGT

GCGCTGGCGACAGCGGAAAAAATGGCCCAGTCACTGGCGCGCAAGGCA

GGAGAAGCGGCATGA

SEQ ID NO：2

大肠杆菌乙醛脱氢酶OS＝大肠杆菌(菌株K12)GN＝mhpF PE＝1 SV＝1

MSKRKVAIIGSGNIGTDLMIKILRHGQHLEMAVMVGIDPQSDGLARARRMG

VATTHEGVIGLMNMPEFADIDIVFDATSAGAHVKNDAALREAKPDIRLIDLT

PAAIGPYCVPVVNLEANVDQLNVNMVTCGGQATIPMVAAVSRVARVHYAE

IIASIASKSAGPGTRANIDEFTETTSRAIEVVGGAAKGKAIIVLNPAEPPLMMR

DTVYVLSDEASQDDIEASINEMAEAVQAYVPGYRLKQRVQFEVIPQDKPVN

LPGVGQFSGLKTAVWLEVEGAAHYLPAYAGNLDIMTSSALATAEKMAQSL

ARKAGEAA

SEQ ID NO：3

引物mhpF-FW

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGAGTAAGCGTAAAGTCGC

CATTATCGG

SEQ ID NO：4

引物mhpF-RV

GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTCATGCCGCTTCTCCTGCC

TTGC

SEQ ID NO：5 GPD1/YDL022Wfw基因中断引物

TTGTACACCCCCCCCCTCCACAAACACAAATATTGATAATATAAAcagctgaagc

ttcgtacgc

SEQ ID NO：6GPD1/YDL022Wrv基因中断引物

AATCTAATCTTCATGTAGATCTAATTCTTCAATCATGTCCGGCGgcataggccacta

gtggatctg

SEQ ID NO：7GPD2/YDL059Wfw基因中断引物

TCAATTCTCTTTCCCTTTCCTTTTCCTTCGCTCCCCTTCCTTATCccaggctgaagc

ttcgtacg

SEQ ID NO：8GPD2/YDL059Wrv基因中断引物

GTGTCTATTCGTCATCGATGTCTAGCTCTTCAATCATCTCCGGTAGgcataggcc

actagtggatc

SEQ ID NO：9GPD1/YDL022Wfw验证引物

CCCACCCACACCACCAATAC

SEQ ID NO：10GPD1/YDL022Wrv验证引物

CGGACGCCAGATGCTAGAAG

SEQ ID NO：11GPD2/YDL059Wfw验证引物

GTTCAGCAGCTCTTCTCTAC

SEQ ID NO：12GPD2/YDL059Wrv验证引物

CCAAATGCGACATGAGTCAC

SEQ ID NO：13GPD1/YDL022Wfw中断盒特异性验证引物

CGCACGTCAAGACTGTCAAG

SEQ ID NO：14GPD1/YDL022Wrv中断盒特异性验证引物

TCGTATGTGAATGCTGGTCG

SEQ ID NO：15GPD2/YOL059Wfw中断盒特异性验证引物

CGCACGTCAAGACTGTCAAG

SEQ ID NO：16GPD2/YOL059Wrv中断盒特异性验证引物

TCGTATGTGAATGCTGGTCG

SEQ ID NO：17酿酒酵母ACS1基因

ATGTCGCCCTCTGCCGTACAATCATCAAAACTAGAAGAACAGTCAAGTG

AAATTGACAAG

TTGAAAGCAAAAATGTCCCAGTCTGCCGCCACTGCGCAGCAGAAGAAGG

AACATGAGTAT

GAACATTTGACTTCGGTCAAGATCGTGCCACAACGGCCCATCTCAGATA

GACTGCAGCCC

GCAATTGCTACCCACTATTCTCCACACTTGGACGGGTTGCAGGACTATCA

GCGCTTGCAC

AAGGAGTCTATTGAAGACCCTGCTAAGTTCTTCGGTTCTAAAGCTACCCA

ATTTTTAAAC

TGGTCTAAGCCATTCGATAAGGTGTTCATCCCAGACCCTAAAACGGGCA

GGCCCTCCTTC

CAGAACAATGCATGGTTCCTCAACGGCCAATTAAACGCCTGTTACAACT

GTGTTGACAGA

CATGCCTTGAAGACTCCTAACAAGAAAGCCATTATTTTCGAAGGTGACG

AGCCTGGCCAA

GGCTATTCCATTACCTACAAGGAACTACTTGAAGAAGTTTGTCAAGTGGC

ACAAGTGCTG

ACTTACTCTATGGGCGTTCGCAAGGGCGATACTGTTGCCGTGTACATGCC

TATGGTCCCA

GAAGCAATCATAACCTTGTTGGCCATTTCCCGTATCGGTGCCATTCACTC

CGTAGTCTTT

GCCGGGTTTTCTTCCAACTCCTTGAGAGATCGTATCAACGATGGGGACTC

TAAAGTTGTC

ATCACTACAGATGAATCCAACAGAGGTGGTAAAGTCATTGAGACTAAAA

GAATTGTTGAT

GACGCGCTAAGAGAGACCCCAGGCGTGAGACACGTCTTGGTTTATAGAA

AGACCAACAAT

CCATCTGTTGCTTTCCATGCCCCCAGAGATTTGGATTGGGCAACAGAAAA

GAAGAAATAC

AAGACCTACTATCCATGCACACCCGTTGATTCTGAGGATCCATTATTCTT

GTTGTATACG

TCTGGTTCTACTGGTGCCCCCAAGGGTGTTCAACATTCTACCGCAGGTTA

CTTGCTGGGA

GCTTTGTTGACCATGCGCTACACTTTTGACACTCACCAAGAAGACGTTTT

CTTCACAGCT

GGAGACATTGGCTGGATTACAGGCCACACTTATGTGGTTTATGGTCCCTT

ACTATATGGT

TGTGCCACTTTGGTCTTTGAAGGGACTCCTGCGTACCCAAATTACTCCCG

TTATTGGGAT

ATTATTGATGAACACAAAGTCACCCAATTTTATGTTGCGCCAACTGCTTT

GCGTTTGTTG

AAAAGAGCTGGTGATTCCTACATCGAAAATCATTCCTTAAAATCTTTGCG

TTGCTTGGGT

TCGGTCGGTGAGCCAATTGCTGCTGAAGTTTGGGAGTGGTACTCTGAAA

AAATAGGTAAA

AATGAAATCCCCATTGTAGACACCTACTGGCAAACAGAATCTGGTTCGC

ATCTGGTCACC

CCGCTGGCTGGTGGTGTTACACCAATGAAACCGGGTTCTGCCTCATTCCC

CTTCTTCGGT

ATTGATGCAGTTGTTCTTGACCCTAACACTGGTGAAGAACTTAACACCAG

CCACGCAGAG

GGTGTCCTTGCCGTCAAAGCTGCATGGCCATCATTTGCAAGAACTATTTG

GAAAAATCAT

GATAGGTATCTAGACACTTATTTGAACCCTTACCCTGGCTACTATTTCAC

TGGTGATGGT

GCTGCAAAGGATAAGGATGGTTATATCTGGATTTTGGGTCGTGTAGACG

ATGTGGTGAAC

GTCTCTGGTCACCGTCTGTCTACCGCTGAAATTGAGGCTGCTATTATCGA

AGATCCAATT

GTGGCCGAGTGTGCTGTTGTCGGATTCAACGATGACTTGACTGGTCAAGC

AGTTGCTGCA

TTTGTGGTGTTGAAAAACAAATCTAGTTGGTCCACCGCAACAGATGATG

AATTACAAGAT

ATCAAGAAGCATTTGGTCTTTACTGTTAGAAAAGACATCGGGCCATTTGC

CGCACCAAAA

TTGATCATTTTAGTGGATGACTTGCCCAAGACAAGATCCGGCAAAATTAT

GAGACGTATT

TTAAGAAAAATCCTAGCAGGAGAAAGTGACCAACTAGGCGACGTTTCTA

CATTGTCAAAC

CCTGGCATTGTTAGACATCTAATTGATTCGGTCAAGTTGTAA

SEQ ID NO：18酿酒酵母ACS2基因

ATGACAATCAAGGAACATAAAGTAGTTTATGAAGCTCACAACGTAAAGG

CTCTTAAGGCT

CCTCAACATTTTTACAACAGCCAACCCGGCAAGGGTTACGTTACTGATAT

GCAACATTAT

CAAGAAATGTATCAACAATCTATCAATGAGCCAGAAAAATTCTTTGATA

AGATGGCTAAG

GAATACTTGCATTGGGATGCTCCATACACCAAAGTTCAATCTGGTTCATT

GAACAATGGT

GATGTTGCATGGTTTTTGAACGGTAAATTGAATGCATCATACAATTGTGT

TGACAGACAT

GCCTTTGCTAATCCCGACAAGCCAGCTTTGATCTATGAAGCTGATGACGA

ATCCGACAAC

AAAATCATCACATTTGGTGAATTACTCAGAAAAGTTTCCCAAATCGCTGG

TGTCTTAAAA

AGCTGGGGCGTTAAGAAAGGTGACACAGTGGCTATCTATTTGCCAATGA

TTCCAGAAGCG

GTCATTGCTATGTTGGCTGTGGCTCGTATTGGTGCTATTCACTCTGTTGTC

TTTGCTGGG

TTCTCCGCTGGTTCGTTGAAAGATCGTGTCGTTGACGCTAATTCTAAAGT

GGTCATCACT

TGTGATGAAGGTAAAAGAGGTGGTAAGACCATCAACACTAAAAAAATTG

TTGACGAAGGT

TTGAACGGAGTCGATTTGGTTTCCCGTATCTTGGTTTTCCAAAGAACTGG

TACTGAAGGT

ATTCCAATGAAGGCCGGTAGAGATTACTGGTGGCATGAGGAGGCCGCTA

AGCAGAGAACT

TACCTACCTCCTGTTTCATGTGACGCTGAAGATCCTCTATTTTTATTATAC

ACTTCCGGT

TCCACTGGTTCTCCAAAGGGTGTCGTTCACACTACAGGTGGTTATTTATT

AGGTGCCGCT

TTAACAACTAGATACGTTTTTGATATTCACCCAGAAGATGTTCTCTTCAC

TGCCGGTGAC

GTCGGCTGGATCACGGGTCACACCTATGCTCTATATGGTCCATTAACCTT

GGGTACCGCC

TCAATAATTTTCGAATCCACTCCTGCCTACCCAGATTATGGTAGATATTG

GAGAATTATC

CAACGTCACAAGGCTACCCATTTCTATGTGGCTCCAACTGCTTTAAGATT

AATCAAACGT

GTAGGTGAAGCCGAAATTGCCAAATATGACACTTCCTCATTACGTGTCTT

GGGTTCCGTC

GGTGAACCAATCTCTCCAGACTTATGGGAATGGTATCATGAAAAAGTGG

GTAACAAAAAC

TGTGTCATTTGTGACACTATGTGGCAAACAGAGTCTGGTTCTCATTTAAT

TGCTCCTTTG

GCAGGTGCTGTCCCAACAAAACCTGGTTCTGCTACCGTGCCATTCTTTGG

TATTAACGCT

TGTATCATTGACCCTGTTACAGGTGTGGAATTAGAAGGTAATGATGTCGA

AGGTGTCCTT

GCCGTTAAATCACCATGGCCATCAATGGCTAGATCTGTTTGGAACCACCA

CGACCGTTAC

ATGGATACTTACTTGAAACCTTATCCTGGTCACTATTTCACAGGTGATGG

TGCTGGTAGA

GATCATGATGGTTACTACTGGATCAGGGGTAGAGTTGACGACGTTGTAA

ATGTTTCCGGT

CATAGATTATCCACATCAGAAATTGAAGCATCTATCTCAAATCACGAAA

ACGTCTCGGAA

GCTGCTGTTGTCGGTATTCCAGATGAATTGACCGGTCAAACCGTCGTTGC

ATATGTTTCC

CTAAAAGATGGTTATCTACAAAACAACGCTACTGAAGGTGATGCAGAAC

ACATCACACCA

GATAATTTACGTAGAGAATTGATCTTACAAGTTAGGGGTGAGATTGGTCC

TTTCGCCTCA

CCAAAAACCATTATTCTAGTTAGAGATCTACCAAGAACAAGGTCAGGAA

AGATTATGAGA

AGAGTTCTAAGAAAGGTTGCTTCTAACGAAGCCGAACAGCTAGGTGACC

TAACTACTTTG

GCCAACCCAGAAGTTGTACCTGCCATCATTTCTGCTGTAGAGAACCAATT

TTTCTCTCAA

AAAAAGAAATAA

SEQ ID NO：19酿酒酵母ADH1

ATGTCTATCCCAGAAACTCAAAAAGGTGTTATCTTCTACGAATCCCACGG

TAAGTTGGAA

TACAAAGATATTCCAGTTCCAAAGCCAAAGGCCAACGAATTGTTGATCA

ACGTTAAATAC

TCTGGTGTCTGTCACACTGACTTGCACGCTTGGCACGGTGACTGGCCATT

GCCAGTTAAG

CTACCATTAGTCGGTGGTCACGAAGGTGCCGGTGTCGTTGTCGGCATGGG

TGAAAACGTT

AAGGGCTGGAAGATCGGTGACTACGCCGGTATCAAATGGTTGAACGGTT

CTTGTATGGCC

TGTGAATACTGTGAATTGGGTAACGAATCCAACTGTCCTCACGCTGACTT

GTCTGGTTAC

ACCCACGACGGTTCTTTCCAACAATACGCTACCGCTGACGCTGTTCAAGC

CGCTCACATT

CCTCAAGGTACCGACTTGGCCCAAGTCGCCCCCATCTTGTGTGCTGGTAT

CACCGTCTAC

AAGGCTTTGAAGTCTGCTAACTTGATGGCCGGTCACTGGGTTGCTATCTC

CGGTGCTGCT

GGTGGTCTAGGTTCTTTGGCTGTTCAATACGCCAAGGCTATGGGTTACAG

AGTCTTGGGT

ATTGACGGTGGTGAAGGTAAGGAAGAATTATTCAGATCCATCGGTGGTG

AAGTCTTCATT

GACTTCACTAAGGAAAAGGACATTGTCGGTGCTGTTCTAAAGGCCACTG

ACGGTGGTGCT

CACGGTGTCATCAACGTTTCCGTTTCCGAAGCCGCTATTGAAGCTTCTAC

CAGATACGTT

AGAGCTAACGGTACCACCGTTTTGGTCGGTATGCCAGCTGGTGCCAAGT

GTTGTTCTGAT

GTCTTCAACCAAGTCGTCAAGTCCATCTCTATTGTTGGTTCTTACGTCGGT

AACAGAGCT

GACACCAGAGAAGCTTTGGACTTCTTCGCCAGAGGTTTGGTCAAGTCTCC

AATCAAGGTT

GTCGGCTTGTCTACCTTGCCAGAAATTTACGAAAAGATGGAAAAGGGTC

AAATCGTTGGT

AGATACGTTGTTGACACTTCTAAATAA

SEQ ID NO：20酿酒酵母ADH2

ATGTCTATTCCAGAAACTCAAAAAGCCATTATCTTCTACGAATCCAACGG

CAAGTTGGAG

CATAAGGATATCCCAGTTCCAAAGCCAAAGCCCAACGAATTGTTAATCA

ACGTCAAGTAC

TCTGGTGTCTGCCACACCGATTTGCACGCTTGGCATGGTGACTGGCCATT

GCCAACTAAG

TTACCATTAGTTGGTGGTCACGAAGGTGCCGGTGTCGTTGTCGGCATGGG

TGAAAACGTT

AAGGGCTGGAAGATCGGTGACTACGCCGGTATCAAATGGTTGAACGGTT

CTTGTATGGCC

TGTGAATACTGTGAATTGGGTAACGAATCCAACTGTCCTCACGCTGACTT

GTCTGGTTAC

ACCCACGACGGTTCTTTCCAAGAATACGCTACCGCTGACGCTGTTCAAGC

CGCTCACATT

CCTCAAGGTACTGACTTGGCTGAAGTCGCGCCAATCTTGTGTGCTGGTAT

CACCGTATAC

AAGGCTTTGAAGTCTGCCAACTTGAGAGCAGGCCACTGGGCGGCCATTT

CTGGTGCTGCT

GGTGGTCTAGGTTCTTTGGCTGTTCAATATGCTAAGGCGATGGGTTACAG

AGTCTTAGGT

ATTGATGGTGGTCCAGGAAAGGAAGAATTGTTTACCTCGCTCGGTGGTG

AAGTATTCATC

GACTTCACCAAAGAGAAGGACATTGTTAGCGCAGTCGTTAAGGCTACCA

ACGGCGGTGCC

CACGGTATCATCAATGTTTCCGTTTCCGAAGCCGCTATCGAAGCTTCTAC

CAGATACTGT

AGGGCGAACGGTACTGTTGTCTTGGTTGGTTTGCCAGCCGGTGCAAAGTG

CTCCTCTGAT

GTCTTCAACCACGTTGTCAAGTCTATCTCCATTGTCGGCTCTTACGTGGG

GAACAGAGCT

GATACCAGAGAAGCCTTAGATTTCTTTGCCAGAGGTCTAGTCAAGTCTCC

AATAAAGGTA

GTTGGCTTATCCAGTTTACCAGAAATTTACGAAAAGATGGAGAAGGGCC

AAATTGCTGGT

AGATACGTTGTTGACACTTCTAAATAA

SEQ ID NO：21酿酒酵母ADH3

ATGTTGAGAACGTCAACATTGTTCACCAGGCGTGTCCAACCAAGCCTATT

TTCTAGAAAC

ATTCTTAGATTGCAATCCACAGCTGCAATCCCTAAGACTCAAAAAGGTGT

CATCTTTTAT

GAGAATAAGGGGAAGCTGCATTACAAAGATATCCCTGTCCCCGAGCCTA

AGCCAAATGAA

ATTTTAATCAACGTTAAATATTCTGGTGTATGTCACACCGATTTACATGC

TTGGCACGGC

GATTGGCCATTACCTGTTAAACTACCATTAGTAGGTGGTCATGAAGGTGC

TGGTGTAGTT

GTCAAACTAGGTTCCAATGTCAAGGGCTGGAAAGTCGGTGATTTAGCAG

GTATCAAATGG

CTGAACGGTTCTTGTATGACATGCGAATTCTGTGAATCAGGTCATGAATC

AAATTGTCCA

GATGCTGATTTATCTGGTTACACTCATGATGGTTCTTTCCAACAATTTGCG

ACCGCTGAT

GCTATTCAAGCCGCCAAAATTCAACAGGGTACCGACTTGGCCGAAGTAG

CCCCAATATTA

TGTGCTGGTGTTACTGTATATAAAGCACTAAAAGAGGCAGACTTGAAAG

CTGGTGACTGG

GTTGCCATCTCTGGTGCTGCAGGTGGCTTGGGTTCCTTGGCCGTTCAATA

TGCAACTGCG

ATGGGTTACAGAGTTCTAGGTATTGATGCAGGTGAGGAAAAGGAAAAAC

TTTTCAAGAAA

TTGGGGGGTGAAGTATTCATCGACTTTACTAAAACAAAGAATATGGTTTC

TGACATTCAA

GAAGCTACCAAAGGTGGCCCTCATGGTGTCATTAACGTTTCCGTTTCTGA

AGCCGCTATT

TCTCTATCTACGGAATATGTTAGACCATGTGGTACCGTCGTTTTGGTTGG

TTTGCCCGCT

AACGCCTACGTTAAATCAGAGGTATTCTCTCATGTGGTGAAGTCCATCAA

TATCAAGGGT

TCTTATGTTGGTAACAGAGCTGATACGAGAGAAGCCTTAGACTTCTTTAG

CAGAGGTTTG

ATCAAATCACCAATCAAAATTGTTGGATTATCTGAATTACCAAAGGTTTA

TGACTTGATG

GAAAAGGGCAAGATTTTGGGTAGATACGTCGTCGATACTAGTAAATAA

SEQ ID NO：22酿酒酵母ADH4

ATGTCTTCCGTTACTGGGTTTTACATTCCACCAATCTCTTTCTTTGGTGAA

GGTGCTTTA

GAAGAAACCGCTGATTACATCAAAAACAAGGATTACAAAAAGGCTTTGA

TCGTTACTGAT

CCTGGTATTGCAGCTATTGGTCTCTCCGGTAGAGTCCAAAAGATGTTGGA

AGAACGTGAC

TTAAACGTTGCTATCTATGACAAAACTCAACCAAACCCAAATATTGCCAA

TGTCACAGCT

GGTTTGAAGGTTTTGAAGGAACAAAACTCTGAAATTGTTGTTTCCATTGG

TGGTGGTTCT

GCTCACGACAATGCTAAGGCCATTGCTTTATTGGCTACTAACGGTGGGGA

AATCGGAGAC

TATGAAGGTGTCAATCAATCTAAGAAGGCTGCTTTACCACTATTTGCCAT

CAACACTACT

GCTGGTACTGCTTCCGAAATGACCAGATTCACTATTATCTCTAATGAAGA

AAAGAAAATC

AAGATGGCTATCATTGACAACAACGTCACTCCAGCTGTTGCTGTCAACGA

TCCATCTACC

ATGTTTGGTTTGCCACCTGCTTTGACTGCTGCTACTGGTCTAGATGCTTTG

ACTCACTGT

ATCGAAGCTTATGTTTCCACCGCCTCTAACCCAATCACCGATGCCTGTGC

TTTGAAGGGT

ATTGATTTGATCAATGAAAGCTTAGTCGCTGCATACAAAGACGGTAAAG

ACAAGAAGGCC

AGAACTGACATGTGTTACGCTGAATACTTGGCAGGTATGGCTTTCAACAA

TGCTTCTCTA

GGTTATGTTCATGCCCTTGCTCATCAACTTGGTGGTTTCTACCACTTGCCT

CATGGTGTT

TGTAACGCTGTCTTGTTGCCTCATGTTCAAGAGGCCAACATGCAATGTCC

AAAGGCCAAG

AAGAGATTAGGTGAAATTGCTTTGCATTTCGGTGCTTCTCAAGAAGATCC

AGAAGAAACC

ATCAAGGCTTTGCACGTTTTAAACAGAACCATGAACATTCCAAGAAACTT

GAAAGAATTA

GGTGTTAAAACCGAAGATTTTGAAATTTTGGCTGAACACGCCATGCATG

ATGCCTGCCAT

TTGACTAACCCAGTTCAATTCACCAAAGAACAAGTGGTTGCCATTATCAA

GAAAGCCTAT

GAATATTAA

SEQ ID NO：23酿酒酵母ADH5

ATGCCTTCGCAAGTCATTCCTGAAAAACAAAAGGCTATTGTCTTTTATGA

GACAGATGGA

AAATTGGAATATAAAGACGTCACAGTTCCGGAACCTAAGCCTAACGAAA

TTTTAGTCCAC

GTTAAATATTCTGGTGTTTGTCATAGTGACTTGCACGCGTGGCACGGTGA

TTGGCCATTT

CAATTGAAATTTCCATTAATCGGTGGTCACGAAGGTGCTGGTGTTGTTGT

TAAGTTGGGA

TCTAACGTTAAGGGCTGGAAAGTCGGTGATTTTGCAGGTATAAAATGGTT

GAATGGGACT

TGCATGTCCTGTGAATATTGTGAAGTAGGTAATGAATCTCAATGTCCTTA

TTTGGATGGT

ACTGGCTTCACACATGATGGTACTTTTCAAGAATACGCAACTGCCGATGC

CGTTCAAGCT

GCCCATATTCCACCAAACGTCAATCTTGCTGAAGTTGCCCCAATCTTGTG

TGCAGGTATC

ACTGTTTATAAGGCGTTGAAAAGAGCCAATGTGATACCAGGCCAATGGG

TCACTATATCC

GGTGCATGCGGTGGCTTGGGTTCTCTGGCAATCCAATACGCCCTTGCTAT

GGGTTACAGG

GTCATTGGTATCGATGGTGGTAATGCCAAGCGAAAGTTATTTGAACAATT

AGGCGGAGAA

ATATTCATCGATTTCACGGAAGAAAAAGACATTGTTGGTGCTATAATAA

AGGCCACTAAT

GGCGGTTCTCATGGAGTTATTAATGTGTCTGTTTCTGAAGCAGCTATCGA

GGCTTCTACG

AGGTATTGTAGGCCCAATGGTACTGTCGTCCTGGTTGGTATGCCAGCTCA

TGCTTACTGC

AATTCCGATGTTTTCAATCAAGTTGTAAAATCAATCTCCATCGTTGGATC

TTGTGTTGGA

AATAGAGCTGATACAAGGGAGGCTTTAGATTTCTTCGCCAGAGGTTTGAT

CAAATCTCCG

ATCCACTTAGCTGGCCTATCGGATGTTCCTGAAATTTTTGCAAAGATGGA

GAAGGGTGAA

ATTGTTGGTAGATATGTTGTTGAGACTTCTAAATGA

SEQ ID NO：24酿酒酵母GPD1

ATGTCTGCTGCTGCTGATAGATTAAACTTAACTTCCGGCCACTTGAATGC

TGGTAGAAAG

AGAAGTTCCTCTTCTGTTTCTTTGAAGGCTGCCGAAAAGCCTTTCAAGGT

TACTGTGATT

GGATCTGGTAACTGGGGTACTACTATTGCCAAGGTGGTTGCCGAAAATT

GTAAGGGATAC

CCAGAAGTTTTCGCTCCAATAGTACAAATGTGGGTGTTCGAAGAAGAGA

TCAATGGTGAA

AAATTGACTGAAATCATAAATACTAGACATCAAAACGTGAAATACTTGC

CTGGCATCACT

CTACCCGACAATTTGGTTGCTAATCCAGACTTGATTGATTCAGTCAAGGA

TGTCGACATC

ATCGTTTTCAACATTCCACATCAATTTTTGCCCCGTATCTGTAGCCAATTG

AAAGGTCAT

GTTGATTCACACGTCAGAGCTATCTCCTGTCTAAAGGGTTTTGAAGTTGG

TGCTAAAGGT

GTCCAATTGCTATCCTCTTACATCACTGAGGAACTAGGTATTCAATGTGG

TGCTCTATCT

GGTGCTAACATTGCCACCGAAGTCGCTCAAGAACACTGGTCTGAAACAA

CAGTTGCTTAC

CACATTCCAAAGGATTTCAGAGGCGAGGGCAAGGACGTCGACCATAAGG

TTCTAAAGGCC

TTGTTCCACAGACCTTACTTCCACGTTAGTGTCATCGAAGATGTTGCTGG

TATCTCCATC

TGTGGTGCTTTGAAGAACGTTGTTGCCTTAGGTTGTGGTTTCGTCGAAGG

TCTAGGCTGG

GGTAACAACGCTTCTGCTGCCATCCAAAGAGTCGGTTTGGGTGAGATCAT

CAGATTCGGT

CAAATGTTTTTCCCAGAATCTAGAGAAGAAACATACTACCAAGAGTCTG

CTGGTGTTGCT

GATTTGATCACCACCTGCGCTGGTGGTAGAAACGTCAAGGTTGCTAGGCT

AATGGCTACT

TCTGGTAAGGACGCCTGGGAATGTGAAAAGGAGTTGTTGAATGGCCAAT

CCGCTCAAGGT

TTAATTACCTGCAAAGAAGTTCACGAATGGTTGGAAACATGTGGCTCTGT

CGAAGACTTC

CCATTATTTGAAGCCGTATACCAAATCGTTTACAACAACTACCCAATGAA

GAACCTGCCG

GACATGATTGAAGAATTAGATCTACATGAAGATTAG

SEQ ID NO：25酿酒酵母GPD2

ATGCTTGCTGTCAGAAGATTAACAAGATACACATTCCTTAAGCGAACGC

ATCCGGTGTTA

TATACTCGTCGTGCATATAAAATTTTGCCTTCAAGATCTACTTTCCTAAG

AAGATCATTA

TTACAAACACAACTGCACTCAAAGATGACTGCTCATACTAATATCAAAC

AGCACAAACAC

TGTCATGAGGACCATCCTATCAGAAGATCGGACTCTGCCGTGTCAATTGT

ACATTTGAAA

CGTGCGCCCTTCAAGGTTACAGTGATTGGTTCTGGTAACTGGGGGACCAC

CATCGCCAAA

GTCATTGCGGAAAACACAGAATTGCATTCCCATATCTTCGAGCCAGAGG

TGAGAATGTGG

GTTTTTGATGAAAAGATCGGCGACGAAAATCTGACGGATATCATAAATA

CAAGACACCAG

AACGTTAAATATCTACCCAATATTGACCTGCCCCATAATCTAGTGGCCGA

TCCTGATCTT

TTACACTCCATCAAGGGTGCTGACATCCTTGTTTTCAACATCCCTCATCA

ATTTTTACCA

AACATAGTCAAACAATTGCAAGGCCACGTGGCCCCTCATGTAAGGGCCA

TCTCGTGTCTA

AAAGGGTTCGAGTTGGGCTCCAAGGGTGTGCAATTGCTATCCTCCTATGT

TACTGATGAG

TTAGGAATCCAATGTGGCGCACTATCTGGTGCAAACTTGGCACCGGAAG

TGGCCAAGGAG

CATTGGTCCGAAACCACCGTGGCTTACCAACTACCAAAGGATTATCAAG

GTGATGGCAAG

GATGTAGATCATAAGATTTTGAAATTGCTGTTCCACAGACCTTACTTCCA

CGTCAATGTC

ATCGATGATGTTGCTGGTATATCCATTGCCGGTGCCTTGAAGAACGTCGT

GGCACTTGCA

TGTGGTTTCGTAGAAGGTATGGGATGGGGTAACAATGCCTCCGCAGCCA

TTCAAAGGCTG

GGTTTAGGTGAAATTATCAAGTTCGGTAGAATGTTTTTCCCAGAATCCAA

AGTCGAGACC

TACTATCAAGAATCCGCTGGTGTTGCAGATCTGATCACCACCTGCTCAGG

CGGTAGAAAC

GTCAAGGTTGCCACATACATGGCCAAGACCGGTAAGTCAGCCTTGGAAG

CAGAAAAGGAA

TTGCTTAACGGTCAATCCGCCCAAGGGATAATCACATGCAGAGAAGTTC

ACGAGTGGCTA

CAAACATGTGAGTTGACCCAAGAATTCCCATTATTCGAGGCAGTCTACCA

GATAGTCTAC

AACAACGTCCGCATGGAAGACCTACCGGAGATGATTGAAGAGCTAGACA

TCGATGACGAA

TAG

SEQ ID NO：26酿酒酵母GPP1

ATGCCTTTGACCACAAAACCTTTATCTTTGAAAATCAACGCCGCTCTATT

CGATGTTGAC

GGTACCATCATCATCTCTCAACCAGCCATTGCTGCTTTCTGGAGAGATTT

CGGTAAAGAC

AAGCCTTACTTCGATGCCGAACACGTTATTCACATCTCTCACGGTTGGAG

AACTTACGAT

GCCATTGCCAAGTTCGCTCCAGACTTTGCTGATGAAGAATACGTTAACAA

GCTAGAAGGT

GAAATCCCAGAAAAGTACGGTGAACACTCCATCGAAGTTCCAGGTGCTG

TCAAGTTGTGT

AATGCTTTGAACGCCTTGCCAAAGGAAAAATGGGCTGTCGCCACCTCTG

GTACCCGTGAC

ATGGCCAAGAAATGGTTCGACATTTTGAAGATCAAGAGACCAGAATACT

TCATCACCGCC

AATGATGTCAAGCAAGGTAAGCCTCACCCAGAACCATACTTAAAGGGTA

GAAACGGTTTG

GGTTTCCCAATTAATGAACAAGACCCATCCAAATCTAAGGTTGTTGTCTT

TGAAGACGCA

CCAGCTGGTATTGCTGCTGGTAAGGCTGCTGGCTGTAAAATCGTTGGTAT

TGCTACCACT

TTCGATTTGGACTTCTTGAAGGAAAAGGGTTGTGACATCATTGTCAAGAA

CCACGAATCT

ATCAGAGTCGGTGAATACAACGCTGAAACCGATGAAGTCGAATTGATCT

TTGATGACTAC

TTATACGCTAAGGATGACTTGTTGAAATGGTAA

SEQ ID NO：27酿酒酵母GPP2

ATGGGATTGACTACTAAACCTCTATCTTTGAAAGTTAACGCCGCTTTGTT

CGACGTCGAC

GGTACCATTATCATCTCTCAACCAGCCATTGCTGCATTCTGGAGGGATTT

CGGTAAGGAC

AAACCTTATTTCGATGCTGAACACGTTATCCAAGTCTCGCATGGTTGGAG

AACGTTTGAT

GCCATTGCTAAGTTCGCTCCAGACTTTGCCAATGAAGAGTATGTTAACAA

ATTAGAAGCT

GAAATTCCGGTCAAGTACGGTGAAAAATCCATTGAAGTCCCAGGTGCAG

TTAAGCTGTGC

AACGCTTTGAACGCTCTACCAAAAGAGAAATGGGCTGTGGCAACTTCCG

GTACCCGTGAT

ATGGCACAAAAATGGTTCGAGCATCTGGGAATCAGGAGACCAAAGTACT

TCATTACCGCT

AATGATGTCAAACAGGGTAAGCCTCATCCAGAACCATATCTGAAGGGCA

GGAATGGCTTA

GGATATCCGATCAATGAGCAAGACCCTTCCAAATCTAAGGTAGTAGTAT

TTGAAGACGCT

CCAGCAGGTATTGCCGCCGGAAAAGCCGCCGGTTGTAAGATCATTGGTA

TTGCCACTACT

TTCGACTTGGACTTCCTAAAGGAAAAAGGCTGTGACATCATTGTCAAAA

ACCACGAATCC

ATCAGAGTTGGCGGCTACAATGCCGAAACAGACGAAGTTGAATTCATTT

TTGACGACTAC

TTATATGCTAAGGACGATCTGTTGAAATGGTAA

SEQ ID NO：28为酿酒酵母优化的dmpF ORF合成密码子。

参照序列：假单胞菌属CF600

EMBL登记号：X60835.1

ATGAATCAGAAACTGAAAGTAGCTATCATAGGTTCCGGTAATATCGGAAC

AGACCTGATGATTAAGGTACTGCGTAATGCAAAGTACTTAGAAATGGGCG

CGATGGTCGGTATCGATGCAGCCTCTGATGGACTGGCCAGAGCTCAAAGA

ATGGGCGTTACGACTACTTATGCAGGTGTAGAAGGGCTAATCAAGCTTCC

TGAATTTGCAGACATAGATTTCGTCTTCGATGCTACATCTGCATCAGCCC

ACGTTCAGAACGAGGCTTTATTAAGACAAGCTAAACCTGGTATTAGATTG

ATCGACCTTACCCCGGCGGCAATCGGTCCTTACTGTGTCCCCGTAGTTAA

TCTCGAGGAACATTTGGGCAAGTTGAACGTTAACATGGTTACTTGCGGTG

GCCAAGCTACTATTCCGATGGTCGCAGCTGTCTCACGTGTAGCCAAAGTC

CATTATGCTGAGATTGTTGCTTCTATTTCAAGCAAGAGTGCCGGACCTGG

AACCAGAGCCAATATAGATGAATTCACTGAGACAACCAGTAAAGCCATAG

AAGTTATTGGTGGTGCTGCAAAGGGTAAAGCTATAATTATTATGAACCCA

GCTGAACCACCATTGATTATGAGGGATACGGTGTATGTGCTTTCCGCCGC

CGCTGATCAAGCCGCTGTCGCAGCTTCTGTGGCTGAAATGGTTCAAGCGG

TTCAAGCATACGTGCCAGGCTATAGGTTAAAACAACAGGTTCAGTTTGAC

GTGATTCCCGAGTCCGCGCCACTAAACATCCCCGGTTTGGGGAGATTCAG

CGGGTTGAAAACAAGTGTGTTCCTAGAAGTAGAAGGTGCTGCTCATTATT

TGCCAGCATACGCAGGAAACTTAGATATTATGACTTCCGCAGCGTTAGCT

ACAGCCGAACGTATGGCGCAATCAATGTTGAATGCATAG

SEQ ID NO：29dmpF ORF

MNQKLKVAIIGSGNIGTDLMIKVLRNAKYLEMGAMVGIDAASDGLARAQR

MGVTTTYAGVEGLIKLPEFADIDFVFDATSASAHVQNEALLRQAKPGIRL

IDLTPAAIGPYCVPVVNLEEHLGKLNVNMVTCGGQATIPMVAAVSRVAKV

HYAEIVASISSKSAGPGTRANIDEFTETTSKAIEVIGGAAKGKAIIIMNP

AEPPLIMRDTVYVLSAAADQAAVAASVAEMVQAVQAYVPGYRLKQQVQFD

VIPESAPLNIPGLGRFSGLKTSVFLEVEGAAHYLPAYAGNLDIMTSAALA

TAERMAQSMLNA

SEQ ID NO：30引物dmpF-FW

CATTGATTGCGCCATACG

SEQ ID NO：31引物dmpF-RV

CCGGTAATATCGGAACAGAC

SEQ ID NO：32来自假单胞菌属CF600的dmpF基因的野生型序列。

EMBL登记号：X60835.1

ATGAACCAGAAACTCAAAGTCGCGATCATCGGTTCGGGCAATATCGGCAC

CGACCTGATGATCAAGGTGCTGCGCAACGCCAAGTACCTGGAAATGGGCG

CCATGGTCGGCATCGACGCCGCCTCCGACGGCCTGGCCCGCGCCCAGCGC

ATGGGCGTGACGACCACCTATGCCGGCGTCGAAGGGCTGATCAAGCTGCC

CGAATTCGCCGACATCGATTTCGTCTTCGACGCCACCTCGGCCAGTGCCC

ACGTGCAGAACGAGGCGCTGCTGCGCCAGGCCAAACCTGGCATCCGCCT

GATCGACCTGACCCCGGCGGCCATCGGCCCGTACTGCGTGCCGGTGGTCA

ATCTGGAGGAGCACCTCGGCAAGCTCAACGTCAACATGGTTACCTGCGGC

GGCCAGGCGACCATCCCGATGGTCGCCGCGGTCTCCCGTGTGGCCAAGGT

CCATTACGCCGAGATCGTCGCCTCGATCAGCAGCAAGTCGGCCGGACCCG

GCACCCGCGCCAACATCGACGAGTTCACCGAGACCACCAGCAAAGCCAT

CGAAGTGATCGGTGGTGCGGCCAAGGGCAAGGCGATCATCATCATGAACC

CGGCTGAGCCGCCGCTGATCATGCGCGACACCGTGTATGTGCTGTCCGCC

GCCGCCGATCAGGCCGCCGTCGCGGCCTCGGTGGCGGAAATGGTTCAGG

CGGTGCAGGCCTACGTGCCCGGCTATCGCCTGAAGCAGCAGGTGCAGTTC

GACGTGATCCCCGAGTCCGCGCCGCTGAACATCCCCGGTCTCGGCCGGTT

CAGCGGGTTGAAGACCTCGGTGTTCCTCGAAGTCGAAGGCGCCGCCCATT

ACCTGCCGGCCTACGCCGGCAACCTCGACATCATGACCTCCGCCGCGCTG

GCTACCGCCGAGCGTATGGCGCAGTCGATGTTGAACGCCTGA

Claims (15)

1.一种重组的酵母细胞，尤其是一种转基因酵母细胞，所述细胞包含一个或多个编码NAD⁺依赖的乙酰化乙醛脱氢酶(EC 1.2.1.10)活性的重组的、尤其是异源的核酸序列；所述细胞缺乏NADH依赖的甘油合成所需的酶活性，或者与所述细胞相应的野生型酵母细胞相比，所述细胞具有降低的与NADH依赖的甘油合成有关的酶活性。

2.根据权利要求1所述的细胞，其中，所述细胞包含一个或多个编码NAD⁺依赖的乙酰化乙醛脱氢酶的异源核酸序列；所述NAD⁺依赖的乙酰化乙醛脱氢酶表示为SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：29、或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：29的功能同系物；优选地，所述同系物与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：29具有至少60％、尤其至少70％、更尤其至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列一致性。

3.根据权利要求2所述的细胞，其中，所述细胞包含编码所述脱氢酶的核酸序列，所述核酸序列包括根据SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：32的序列，或所述核酸序列包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：32的功能同系物；优选地，所述同系物与SEQ ID NO：1具有至少60％、尤其至少70％、更尤其至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列一致性。

4.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中，所述细胞无NAD依赖的甘油3-磷酸脱氢酶活性，或者与所述细胞相应的野生型细胞相比，所述细胞具有降低的NAD依赖的甘油3-磷酸脱氢酶活性；和/或，其中，所述细胞无磷酸甘油磷酸酶活性，或者与所述细胞相应的野生型细胞相比，所述细胞具有降低的磷酸甘油磷酸酶活性。

5.根据权利要求4所述的细胞，其中，所述细胞的基因组在至少一个基因中包含突变，所述基因选自由GPD1、GPD2、GPP1和GPP2所组成的组；所述突变可以是敲除突变；与所述细胞相应的野生型酵母基因相比，所述敲除突变可以是所述至少一个基因的彻底缺失。

6.根据权利要求4或5所述的细胞，其中，所述细胞无编码NAD⁺依赖的甘油3-磷酸脱氢酶(EC 1.1.1.8)的基因。

7.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，所述细胞包含一个或多个编码乙酰-辅酶A合成酶活性(EC 6.2.1.1)的核酸序列和一个或多个编码NAD⁺依赖的乙醇脱氢酶活性(EC 1.1.1.1)的核酸序列。

8.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中，所述细胞是选自酵母科(Saccharomycetaceae)的酵母细胞，尤其选自由以下所组成的组：酵母属(Saccharomyces)，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)，如马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)；毕赤酵母属(Pichia)，如树干毕赤酵母(Pichia stipitis)或安格斯毕赤酵母(Pichiaangusta)；接合酵母属(Zygosaccharomyces)，如拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)；以及，酒香酵母属(Brettanomyces)，如间型酒香酵母(Brettanomyces intermedius)。

9.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中，所述细胞是于2009年7月16日收藏在皇家荷兰生物科技研究所培养物保藏中心、保藏编号为CBS125049的酿酒酵母菌株。

10.一种根据前述权利要求中任一项所述的细胞在乙醇制造中的用途。

11.一种用于异源多肽在酵母细胞中进行功能性表达的载体，所述表达载体包括异源核酸序列，所述异源核酸序列可操作地连接至在所述酵母细胞中有功能的启动子上；所述异源核酸序列编码多肽，且所述多肽具有在所述酵母细胞(胞浆)内使乙酰-辅酶A转化为乙醛的酶活性；其中，所述多肽优选包括根据SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：29的序列、或任意所述SEQ ID NO：2、SEQID NO：29序列的功能同系物

12.一种用于制造乙醇的方法，所述方法包括由乙酸和由可发酵碳水化合物制造乙醇，所述碳水化合物尤其选自由葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖所组成的组；其中，所述制造过程使用酵母细胞在厌氧条件下进行；所述细胞包含乙酰-辅酶A合成酶活性和NAD⁺依赖的乙酰化乙醛脱氢酶活性；优选地，所述细胞选自由：缺乏所述NADH依赖的甘油合成所需酶活性的细胞，及与所述细胞相应的野生型酵母细胞相比，具有降低的与NADH依赖的甘油合成相关酶活性的细胞所组成的组。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述制造过程在发酵培养基中进行；所述发酵培养基包含乙酸和碳水化合物，且所述乙酸和碳水化合物的摩尔比为0.7或更低、尤其至少为0.004至0.5、更尤其为0.05至0.3。

14.根据权利要求13或14所述的方法，其中，通过水解多糖而获得至少一部分所述碳水化合物和至少一部分所述乙酸；所述多糖选自由木质纤维素、纤维素、半纤维素和果胶所组成的组。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述木质纤维素生物质已经水解，从而获得所述可发酵的碳水化合物和乙酸。

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