CN110382520A - 过表达dna聚合酶亚基的经修饰的酵母细胞 - Google Patents
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Abstract
描述了与过表达DNA聚合酶II亚基的经修饰的酵母细胞有关的组合物和方法，所述经修饰的酵母细胞使得醇的生产增加。这类酵母细胞非常适合用于商业燃料醇生产以提高产量。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年1月18日提交的美国临时申请号62/447,845的权益，该临时申请通过引用以其全文特此并入。
技术领域
本发明的组合物和方法涉及过表达DNA聚合酶II亚基的工程化酵母，所述工程化酵母使得从含淀粉的底物生产的醇增加。这种酵母非常适合用于燃料醇生产以提高产量。
背景技术
许多国家从可发酵的底物(例如玉米淀粉、甘蔗、木薯和糖蜜)制造燃料醇。根据可再生燃料协会(美国华盛顿特区)，仅仅在美国，2015年的燃料乙醇生产就接近150亿加仑。
丁醇是一种重要的工业化学品和滴入式燃料(drop-in fuel)组分，其具有多种应用，包括用作可再生燃料添加剂、塑料工业中的原料化学品、以及食品和香料工业中的食品级提取剂。因此，对醇(例如丁醇和异丁醇)以及有效和环境友好的生产方法有很高的需求。
鉴于世界范围的大量的醇生产，即使发酵生物效率的微小提高也可产生可用醇量的巨大增加。因此，对更有效地生产醇的生物存在需求。
发明内容
描述了与过表达DNA聚合酶II亚基的经修饰的酵母细胞相关的组合物和方法、及其使用方法，所述经修饰的酵母细胞导致从含淀粉的底物生产的醇增加。所述经修饰的酵母细胞和方法的方面和实施例描述于以下独立编号的段落中。
1.在一方面，提供了衍生自亲本酵母细胞的经修饰的酵母细胞，所述经修饰的细胞包含遗传改变，所述遗传改变引起所述经修饰的细胞与亲本细胞相比产生增加量的Dpb3多肽，其中在相同发酵条件下与亲本细胞产生的醇量相比所述经修饰的细胞在发酵过程中产生增加量的醇。
2.在如段落1所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述遗传改变包括将核酸引入亲本细胞中，所述核酸能够指导Dpb3多肽以高于等同条件下生长的亲本细胞的水平表达。
3.在如段落1所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述遗传改变包括引入用于表达Dpb3多肽的表达盒。
4.在如段落1所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述遗传改变包括引入外源YBR278w c基因。
5.在如段落2所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述遗传改变包括在内源YBR278w c基因中引入更强的启动子。
6.在如段落1-5中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，与在等同条件下生长的亲本细胞中的表达水平相比，Dpb3多肽表达的增加量为至少约30倍。
7.在如段落1-5中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，与在等同条件下生长的亲本细胞中的水平相比，产生的编码Dpb3多肽的mRNA的增加量为至少约30倍。
8.在一些实施例中，如段落1-7所述的经修饰的细胞进一步包含YJL065c基因的破坏。
9.在如段落1-8中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述细胞产生减少量的功能性Dls1多肽。
10.在如段落1-9中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述细胞不产生Dls1多肽。
11.在如段落1-10中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述细胞进一步包含编码碳水化合物加工酶的外源基因。
12.在一些实施例中，如段落1-11中任一项所述的经修饰的细胞进一步包含甘油途径和/或乙酰辅酶A途径中的改变。
13.在一些实施例中，如段落1-12中任一项所述的经修饰的细胞进一步包含用于制备乙醇的备选途径。
14.在如段落1-13中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述细胞属于酵母属物种(Saccharomyces spp.)。
15.在另一方面，提供了一种用于增加从生长于碳水化合物底物上的酵母细胞生产的醇的方法，所述方法包括：向亲本酵母细胞中引入与亲本细胞中产生的量相比使Dpb3多肽的产生增加的遗传改变。
16.在如段落15所述的方法的一些实施例中，具有引入的遗传改变的细胞是经修饰的细胞，所述经修饰的细胞是如段落1-15中任一项所述的细胞。
17.在如段落15所述的方法的一些实施例中，具有引入的使Dpb3多肽的产生增加的遗传改变的细胞进一步包含与亲本细胞相比使产生的功能性Dls1多肽的量减少的遗传改变。
根据包括任何附图的说明书，本发明的组合物和方法的这些及其他方面和实施例将是清楚的。
具体实施方式
I.概述
本发明的组合物和方法涉及与其他方面相同的亲本细胞相比过表达Dpb3多肽的经遗传修饰的酵母细胞。与亲本细胞相比，经修饰的细胞产生增加量的醇，其表型分开地和组合地有利于燃料醇的生产。本文详细描述了所述组合物和方法的方面和实施例。
II.定义
在详细地描述经修饰的细胞和使用方法之前，为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语应当符合相关领域中所使用的常规含义。
如本文所使用的，“醇”是指其中羟基官能团(-OH)与饱和碳原子键合的有机化合物。
如本文所使用的，“酵母细胞”、酵母菌株、或简称“酵母”是指来自子囊菌门和担子菌门的生物。示例性酵母是来自酵母目的芽殖酵母。酵母的具体实例是酵母属物种，包括但不限于酿酒酵母(S.cerevisiae)。酵母包括用于生产燃料醇的生物以及用于生产可饮用醇的生物，包括用于制备独特味道的啤酒、葡萄酒和其他发酵饮料的特种和专有酵母菌株。
如本文所使用的，短语“变体酵母细胞”、“经修饰的酵母细胞”或类似短语(参见上文)是指包括本文所述的遗传修饰和特征的酵母。变体/经修饰的酵母不包括天然存在的酵母。
如本文所使用的，短语“基本上无活性”或相似短语意指指定活性在混合物中不可检测或以不会干扰混合物的预期目的的量存在。
如本文所使用的，术语“多肽”和“蛋白”(以及它们各自的复数形式)可互换地使用，是指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文使用氨基酸残基的常规一字母或三字母代码，并且所有序列均从N-末端到C-末端方向进行呈现。聚合物可以是线性的或支化的，它可以包含经修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还包括天然地修饰的或通过干预而修饰的氨基酸聚合物；例如，通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，如与标记组分偶联。该定义内还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。
如本文所使用的，功能上和/或结构上相似的蛋白被认为是“相关的蛋白”。此类蛋白可衍生自不同属和/或物种的生物体，或甚至不同纲的生物体(例如，细菌和真菌)。相关蛋白还涵盖通过一级序列分析确定的、通过二级或三级结构分析确定的、或者通过免疫交叉反应性确定的同源物。
如本文所使用的，术语“同源蛋白”或“同源物”是指与参考蛋白具有相似活性和/或结构的蛋白。这并不旨在意味着同源物必定与进化相关。因此，该术语旨在涵盖从不同生物体获得的相同、相似、或相应(即，在结构和功能方面)的一种或多种酶。在一些实施例中，希望鉴定与参考蛋白具有类似的四级、三级和/或一级结构的同源物。在一些实施例中，同源蛋白诱导与参考蛋白相似的一种或多种免疫应答。在一些实施例中，将同源蛋白工程化以产生具有所希望活性的酶。
序列之间的同源性程度可以使用本领域已知的任何合适的方法确定(参见，例如，Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444；威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)(遗传学计算机组公司(Genetics ComputerGroup)，麦迪逊，威斯康星州)中的程序，如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA；以及Thompson等人(1984)Nucleic Acids Res.[核酸研究]12:387-95)。
例如，PILEUP是确定序列同源性水平的有用程序。PILEUP使用渐进的、两两比对创建了来自一组相关序列的多重序列比对。它还可以标绘显示用于创建该比对的聚类关系的一个树。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进比对方法的简化(Feng和Doolittle(1987)J.Mol.Evol.[分子进化杂志]35:351-60)。该方法类似于Higgins和Sharp描述的方法((1989)CABIOS 5:151-53)。有用的PILEUP参数包括为3.00的默认空位权重，为0.10的默认空位长度权重，以及加权的末端空位。有用的算法的另一个实例是由Altschul等人((1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-10)和Karlin等人((1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5873-87)描述的BLAST算法。一个特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参见，例如，Altschul等人,(1996)Meth.Enzymol.[酶学方法]266:460-80)。参数“W”、“T”、以及“X”确定了该比对的灵敏度与速度。所述BLAST程序使用字长(W)为11、BLOSUM62得分矩阵(参见，例如，Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915)比对(B)为50、期望值(E)为10、M’5、N’-4、以及两条链的比较作为默认值。
如本文所使用的，在至少两个核酸或多肽的上下文中，短语“基本上相似”和“基本上相同”典型地意指多核苷酸或多肽包含与参考(即，野生型)序列相比具有至少约70％同一性、至少约75％同一性、至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、或甚至至少约99％同一性、或更高同一性的序列。使用具有默认参数的CLUSTAL W算法计算序列同一性百分比。参见Thompson等人(1994)Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680。CLUSTAL W算法的默认参数是：
两种多肽基本上相同的另一个指示是第一多肽与第二多肽具有免疫交叉反应性。典型地，差别在于保守氨基酸取代的多肽具有免疫交叉反应性。因此，多肽与第二多肽实质上相同，例如，其中两个肽仅相差保守取代。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子在严格条件下(例如，在中等至高严格的范围内)彼此杂交。
如本文所使用的，术语“基因”与术语“等位基因”同义，是指编码和指导蛋白或RNA表达的核酸。丝状真菌的营养体形式通常是单倍体，因此指定基因的单拷贝(即单个等位基因)足以赋予特定表型。
如本文所使用的，“表达多肽”和类似术语是指使用细胞的翻译机制(例如，核糖体)产生多肽的细胞过程。
如本文所使用的，“过表达多肽”、“提高多肽的表达”和类似术语是指与不包括指定的遗传修饰的亲本或“野生型细胞”所观察到的相比，以比正常较高的水平表达多肽。
如本文所使用的，“表达盒”是指包含氨基酸编码序列、启动子、终止子以及允许在细胞中产生所编码的多肽所需的其他核酸序列的核酸。表达盒可以是外源的(即，引入细胞中)或内源的(即，存在于细胞中)。
如本文所使用的，术语“野生型”和“天然的”可互换使用，并是指天然发现的基因、蛋白或菌株。
如本文所使用的，术语“目的蛋白”是指希望在经修饰的酵母中表达的多肽。此类蛋白质可以是酶、底物结合蛋白、表面活性蛋白、结构蛋白、选择性标记等，并且能以高水平表达。目的蛋白由相对于亲本菌株的经修饰的内源基因或异源基因(即，目的基因)编码。目的蛋白可以在细胞内表达或作为分泌的蛋白表达。
如本文所使用的，“基因缺失”是指该基因从宿主细胞的基因组中去除。当基因包括与基因编码序列不紧邻的控制元件(例如，增强子元件)时，基因的缺失是指编码序列、以及任选地相邻增强子元件(例如，包括但不限于启动子和/或终止子序列)的缺失，但未要求非相邻控制元件的缺失。
如本文所使用的，“基因的破坏”泛指任何实质上阻止细胞在宿主细胞中产生功能性基因产物(例如，蛋白)的基因或化学操作(即，突变)。示例性破坏方法包括基因的任何部分的完全或部分(包括多肽编码序列、启动子、增强子或另外的调节元件)缺失、或其诱变，其中诱变涵盖取代、插入、缺失、倒位、及其组合和变化，任何这些突变基本上阻止功能基因产物的产生。也可以使用RNAi、反义、或任何其他消除基因表达的方法破坏基因。可以通过非相邻控制元件的缺失或遗传操作来破坏基因。
如本文所使用的，术语“基因操作”和“基因改变”可互换使用，并且是指核酸序列的改变/变化。改变可包括但不限于核酸序列中至少一种核酸的取代、缺失、插入或化学修饰。
如本文所使用的，“功能性多肽/蛋白”是具有活性(如酶活性、结合活性、表面活性性质等)的蛋白，并且其未被诱变、截短或以其他方式修饰以废除或减少该活性。如所指出的，功能性多肽可以是热稳定的或不耐热的。
如本文所使用的，“功能性基因”是能够被细胞组分用于产生活性基因产物(通常是蛋白)的基因。功能性基因是破坏的基因的对立体，破坏的基因被修饰使得它们不能被细胞组分用于产生活性基因产物，或者具有减少的被细胞组分用于产生活性基因产物的能力。
如本文所使用的，如果已对酵母细胞进行遗传或化学改变以防止产生呈现出野生型蛋白质的活性特征的功能性蛋白质/多肽，则对所述酵母细胞已经进行了“修饰以防止产生特定蛋白质”。此类修饰包括但不限于编码蛋白质(如本文所述)的基因的缺失或破坏、使得编码的多肽缺乏前述活性的基因修饰、影响翻译后加工或稳定性的基因修饰、及其组合。
如本文所使用的，术语“旁系同源物”是指作为重复事件的结果的同源基因。
如本文所使用的，“途径的减弱”或“通过途径的通量的减弱”(即，生物化学途径)泛指通过代谢途径减少或完全阻止生物化学底物或中间体的通量的任何基因或化学操作。可以通过各种众所周知的方法实现途径的减弱。此类方法包括，但不限于：完全或部分缺失一个或多个基因、用编码具有减少的催化活性或增加的Km值的酶的突变体形式替代这些基因的野生型等位基因、修饰启动子或控制一种或多个基因表达的其他调控元件、针对减少的稳定性工程化所述酶或编码这些酶的mRNA、将酶错误指导进不太可能与底物和中间体相互作用的细胞区室、使用干扰RNA等。
如本文所使用的，“需氧发酵”是指在氧存在下的生长。
如本文所使用的，“厌氧发酵”是指在不存在氧的情况下的生长。
如本文所使用的，单数冠词“一个/种(a/an)”以及“所述”涵盖复数个指示物，除非上下文另外明确指明。本文引用的所有参考文献均通过引用以其全文特此并入。除非另有说明，以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：
℃ 摄氏度
AA α-淀粉酶
bp 碱基对
DNA 脱氧核糖核酸
DP 聚合度
ds或DS 干固体
EtOH 乙醇
g或gm 克
g/L 克/升
GA 葡糖淀粉酶
GAU/g ds 葡糖淀粉酶单元/克干固体
H2O 水
HPLC 高效液相色谱
hr或h 小时
kg 千克
M 摩尔
mg 毫克
mL或ml 毫升
ml/min 毫升/分钟
mM 毫摩尔
N 正常
nm 纳米
PCR 聚合酶链式反应
ppm 份/百万份
RNA 核糖核酸
Δ 与缺失有关
μg 微克
μL和μl 微升
μM 微摩尔
III.经修饰的酵母细胞具有增加的Dpb3表达
在一方面，提供了经修饰的酵母细胞，所述经修饰的细胞具有与相应的(即，其他方面相同的)亲本细胞相比导致产生增加量的Dpb3多肽的遗传改变。Dpb3是最初在酿酒酵母中鉴定的约200个氨基酸的DNA聚合酶IIε亚基(参见，例如，Araki,H.等人(1991)NucleicAcids Res.[核酸研究]19:4867-72)。
申请人已经发现，与其他方面相同的亲本细胞相比，过表达Dpb3多肽的酵母细胞产生增加量的醇。所希望的是醇生产增加，因为这提高了醇生产设施的产量，并且代表了对含有起始碳水化合物的材料更好的碳利用。
在一些实施例中，经修饰的细胞产生的Dpb3多肽的量的增加是与在相同条件下生长的亲本细胞产生的Dpb3多肽的量相比，至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％、至少1,000％、或甚至至少3,000％或更多的增加。
在一些实施例中，用于控制经修饰的细胞产生的Dpb3多肽的表达的启动子强度的增加是基于产生的mRNA的量，与控制Dpb3表达的天然启动子的强度相比，至少30倍，至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少75倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少110倍、至少120倍、至少130倍、或甚至至少135％倍或更多。
在一些实施例中，经修饰的细胞产生的Dpb3多肽的量的增加是与在相同条件下生长的亲本细胞产生的Dpb3多肽的量相比，至少30倍，至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少75倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少110倍、至少120倍、至少130倍、或甚至至少135％倍或更多的增加。
在一些实施例中，经修饰的细胞产生的醇的增加是与在相同条件下生长的亲本细胞产生的醇的量相比，至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％或更多的增加。
优选地，通过使用序列特异性分子生物学技术的遗传操作实现了Dpb3表达增加，所述遗传操作与化学诱变相反，化学诱变通常不靶向特定核酸序列。然而，不排除化学诱变作为制备经修饰的酵母细胞的方法。
在一些实施例中，本发明的组合物和方法包括向酵母细胞中引入能够指导Dpb3多肽过表达或表达增加的核酸。具体方法包括但不限于(i)将用于产生所述多肽的外源表达盒引入宿主细胞中，任选地加之内源表达盒，(ii)用允许产生增加量的多肽的内源盒取代外源表达盒，(iii)修饰内源表达盒的启动子以增加表达，和/或(iv)修饰宿主细胞的任何方面以增加所述多肽在宿主细胞中的半衰期。
在一些实施例中，被修饰的亲本细胞已经包括目的基因，例如编码选择性标记、碳水化合物加工酶或其他多肽的基因。在一些实施例中，随后将引入的基因引入经修饰的细胞中。
示例性酿酒酵母Dpb3多肽(即，EMBLE登录号Z36146.1)的氨基酸序列如以下SEQID NO:1所示：
NCBI数据库包括酿酒酵母Dpb3多肽的超过100个条目，并且预计氨基酸序列中的天然变异不会影响其功能。
基于此类BLAST和Clustal W数据，显而易见的是示例性酿酒酵母Dpb3多肽与来自其他生物体的多肽共享高度的序列同一性，并且预期功能上和/或结构上相似的蛋白质、同源蛋白质和/或基本上相似或相同的蛋白质的过表达会产生类似的有益结果。
在本发明的组合物和方法的特定实施例中，在经修饰的酵母细胞中过表达的Dpb3多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％同一性。
IV.经修饰的酵母细胞具有增加的Dpb3表达和减少的Dls1表达
由YJL065c编码的Dls1是ISW2酵母染色质可及性复合物(yCHRAC)的具有167个氨基酸的多肽亚基，所述复合物含有Isw2、Itc1、Dpb3样亚基(Dls1)和Dpb4(参见，例如，Peterson,C.L.(1996)Curr.Opin.Genet.Dev.[遗传学与发育的最新观点]6:171-75以及Winston,F.和Carlson,M.(1992)Trends Genet.[遗传学趋势]8:387-91)。申请人已经确定，在没有其他遗传修饰的情况下，具有降低细胞中功能性Dls1的量的遗传改变的酵母在醇发酵中表现出增强的稳健性，这允许更高温度和可能更短的发酵(数据未示出)。
Dpb3最初被鉴定为Dls1的旁系同源物。然而，如本文所述，尽管减少细胞中功能性Dls1的量的遗传改变增强了醇产生的稳健性，但是减少功能性Dpb3多肽的量的遗传改变则相反。因此，在本发明组合物和方法的一些实施例中，将增加Dpb3表达的酵母中的修饰与减少或消除细胞中功能性Dls1的量的修饰进行组合，这进一步增加了由所得工程化酵母产生的醇的量。
减少细胞中产生的功能性Dls1的量可以通过破坏YJL065c基因来完成。YJL065c基因的破坏可以使用基本上阻止功能性YJL065c基因产物(即，Dls1)表达的任何合适方法进行。如本领域技术人员已知的示例性破坏方法包括但不限于：完全或部分缺失YJL065c基因，包括完全或部分缺失例如Dls1编码序列、启动子、终止子、增强子或其他调节元件；以及完全或部分缺失包含YJL065c基因任何部分的染色体的一部分。破坏YJL065c基因的具体方法包括在YJL065c基因的任何部分(例如，Dls1编码序列、启动子、终止子、增强子或另一个调节元件)中进行核苷酸取代或插入。优选地，缺失、插入和/或取代(统称为突变)通过使用序列特异性分子生物学技术的遗传操作来进行，与通过化学诱变相反，化学诱变通常不靶向特定核酸序列。尽管如此，理论上，化学诱变仍可用于破坏YJL065c基因。
YJL065c基因突变可降低YJL065c启动子的效率、降低YJL065c增强子的效率、干扰YJL065c mRNA的剪接或编辑、干扰YJL065c mRNA的翻译、将终止密码子引入YJL065c编码序列以防止全长tYJL065c蛋白的翻译、改变Dls1蛋白的编码序列以产生活性更低或无活性的蛋白或减少Dls1与其他核蛋白组分或DNA的相互作用、改变Dls1蛋白的编码序列以产生更不稳定的蛋白质或靶向蛋白质进行破坏、导致Dls1蛋白质错误折叠或被错误修饰(例如，通过糖基化)、或干扰Dls1蛋白的细胞运输。在一些实施例中，这些和其他遗传操作用于减少或阻止功能性Dls1蛋白的表达，或减少或阻止Dls1的正常生物活性。
在一些实施例中，本发明的经修饰的细胞包括减少或阻止功能性Dls1蛋白表达的基因操作，或者减少或阻止Dls1的正常生物活性的基因操作；以及减少或阻止功能性Isw2、Itc1或Dpb4蛋白表达的另外的突变，或者减少或阻止Isw2、Itc1或Dpb4蛋白的正常生物活性的另外的突变。在一些实施例中，本发明的经修饰的细胞包括减少或阻止功能性Dls1蛋白表达的基因操作，或者减少或阻止Dls1的正常生物活性的基因操作；而不具有减少或阻止功能性Isw2、Itc1或Dpb4蛋白表达的另外的突变，或者减少或阻止Isw2、Itc1或Dpb4蛋白的正常生物活性的另外的突变。
示例性酿酒酵母Dls1多肽的氨基酸序列如以下SEQ ID NO:2所示：
基于此类BLAST和Clustal W数据，显而易见的是示例性酿酒酵母Dls1多肽(SEQID NO:2)与其他已知酿酒酵母Dls1多肽以及来自其他酵母属物种的Dls1多肽共享非常高程度的序列同一性。因此，完全预期本发明的组合物和方法适用于含有此类结构相似的多肽、以及其他相关的蛋白质、同源物和功能相似的多肽的酵母细胞。
在本发明的组合物和方法的一些实施例中，被破坏的Dls1蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有整体氨基酸序列同一性，为至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％同一性。
优选地，通过使用序列特异性分子生物学技术的遗传操作进行YJL065c基因的破坏，所述遗传操作与化学诱变相反，化学诱变通常不靶向特定核酸序列。然而，不排除化学诱变作为制备经修饰的酵母细胞的方法。
在一些实施例中，经修饰的细胞中功能性Dls1多肽的量的减少是与在相同条件下生长的亲本细胞中的功能性Dls1多肽的量相比，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更多的减少。在一些实施例中，经修饰的细胞中功能性Dls1蛋白的表达的减少是与在相同条件下生长的亲本细胞中的功能性Dls1多肽的量相比，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更多的减少。
在一些实施例中，与仅过表达Dpb3的细胞相比，经修饰的细胞中醇的额外增加是至少0.2％、至少0.4％、至少0.6％、至少0.8％、至少1.0％或更多的增加。
V.增加的Dpb3表达与影响醇生产的其他突变的组合
在一些实施例中，除了过表达Dpb3多肽之外，任选地与减少功能性Dls1多肽的表达组合，本发明的经修饰的酵母细胞进一步包括影响醇生产的另外的修饰。
在特定的实施例中，经修饰的酵母细胞包括由引入异源磷酸转酮酶基因和异源磷酸转乙酰酶基因产生的人工途径或备选途径。示例性磷酸转酮酶可以从阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis)(UniProt/TrEMBL登录号：WP_016786789)获得。示例性磷酸转乙酰酶可以从植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)(UniProt/TrEMBL登录号：WP_003641060)获得。
经修饰的细胞可以进一步包括导致天然甘油生物合成途径减弱的突变，已知这些突变可增加醇生产。用于减弱酵母中甘油生物合成途径的方法是已知的，并包括例如通过破坏基因GPD1、GPD2、GPP1和/或GPP2中的一个或多个来降低或消除内源性NAD依赖性甘油3-磷酸脱氢酶(GPD)或磷酸甘油磷酸酶(GPP)活性。参见例如美国专利号9,175,270(Elke等人)、8,795,998(Pronk等人)和8,956,851(Argyros等人)。
经修饰的酵母的特征可以进一步在于增加的乙酰辅酶A合酶(也称为乙酰辅酶A连接酶)活性(EC 6.2.1.1)，以清除(即捕获)通过化学或酶水解乙酰磷酸产生(或出于任何其他原因存在于酵母的培养基中)的乙酸盐并将其转化为乙酰辅酶A。这避免了乙酸盐对酵母细胞生长的不良影响，并且可以进一步有助于醇产量的提高。增加乙酰辅酶A合酶活性可以通过将异源乙酰辅酶A合酶基因引入细胞、增加内源乙酰辅酶A合酶基因的表达等来实现。用于引入细胞中的特别有用的乙酰辅酶A合酶可以从康斯力鬃毛甲烷菌(Methanosaetaconcilii)(UniProt/TrEMBL登录号：WP_013718460)获得。该酶的同源物，包括与上述来自康斯力鬃毛甲烷菌的乙酰辅酶A合酶具有至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、以及甚至至少99％氨基酸序列同一性的酶，也可用于本发明的组合物和方法中。
在一些实施例中，经修饰的细胞可进一步包括编码具有NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质的异源基因和/或编码丙酮酸甲酸裂解酶的异源基因。例如，在美国专利号8,795,998(Pronk等人)中描述了与甘油途径减弱进行组合的此类基因的引入。然而，在本发明组合物和方法的大多数实施例中，不需要引入乙酰化乙醛脱氢酶和/或丙酮酸甲酸裂解酶，因为通过减弱导致氧化还原辅因子失衡的用于制备乙酰辅酶A的天然生物合成途径消除了对这些活性的需要。因此，本发明的组合物和方法的实施例特意缺失编码乙酰化乙醛脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶或两者的一个或多个异源基因。
在一些实施例中，本发明的经修饰的酵母细胞进一步包含丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径是异丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自由以下组成的组的底物至产物的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸盐；(c)2,3-二羟基异戊酸盐至2-酮异戊酸盐；(d)2-酮异戊酸盐至异丁醛；和(e)异丁醛至异丁醇。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径包括编码具有乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、酮异戊酸脱羧酶、和醇脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。
在一些实施例中，本发明的经修饰的酵母细胞可进一步过表达糖转运体样(STL1)多肽以增加甘油的摄取(参见，例如，Ferreira等人(2005)Mol Biol Cell[细胞分子生物学]16:2068-76；等人(2015)Mol Microbiol[分子微生物学]97:541-59以及WO2015023989A1)。
在一些实施例中，包含丁醇生物合成途径的经修饰的酵母细胞进一步包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸中的修饰。在一些实施例中，酵母细胞在编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源多核苷酸中包含缺失、突变和/或取代。在一些实施例中，具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽选自下组，该组由以下组成：PDC1、PDC5、PDC6、及其组合。在一些实施例中，酵母细胞在编码FRA2、ALD6、ADH1、GPD2、BDH1、和YMR226C的一个或多个内源多核苷酸中进一步包含缺失、突变和/或取代。
GOI部分
VI.增加的Dpb3表达与其他有益突变的组合
在一些实施例中，除了过表达Dpb3多肽之外，任选地与有益于醇生产的其他遗传修饰组合，本发明的经修饰的酵母细胞进一步包含任何数目的编码目的蛋白的另外目的基因。可以在遗传操作之前、期间或之后引入另外的目的基因，所述遗传操作导致Dpb3多肽的过表达。目的蛋白包括选择性标记、碳水化合物加工酶以及其他商业上相关的多肽，包括但不限于选自下组的酶，该组由以下组成：脱氢酶、转酮醇酶、磷酸转酮酶、转醛醇酶、差向异构酶、植酸酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、磷酸酶、蛋白酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、海藻糖酶、脂肪酶、果胶酶、聚酯酶、角质酶、氧化酶、转移酶、还原酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、酯酶、异构酶、果胶酶、乳糖酶、过氧化物酶和漆酶。目的蛋白可以被分泌、糖基化和以其他方式修饰。
VII.经修饰的酵母用于增加醇生产的用途
本发明的组合物和方法包括在发酵反应中用于增加醇生产和/或减少甘油生产的方法。这类方法不限于特定的发酵过程。预期本发明的工程化酵母是任何醇发酵设施中常规酵母的“滴入式(drop-in)”替代品。虽然主要用于燃料醇生产，但本发明的酵母还可用于生产可饮用醇，包括葡萄酒和啤酒。
VIII.适合修饰的酵母细胞
酵母是被归类为真菌界成员的单细胞真核微生物，并且包括来自子囊菌门和担子菌门的生物。可用于醇生产的酵母包括但不限于酵母属物种(包括酿酒酵母)、以及克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、Lachancea属和裂殖酵母属物种(Schizosaccharomyces spp.)。许多酵母菌株是可商购的，其中许多已被选择或基因工程化以获得所希望的特征，例如高醇生产、快速生长速率等。一些酵母已经被基因工程化以产生异源酶，例如葡糖淀粉酶或α-淀粉酶。
IX.底物和产物
从许多碳水化合物底物(包括但不限于玉米淀粉、甘蔗、木薯和糖蜜)中生产醇是众所周知的，正如酶条件和化学条件以及机械方法的无数变化和改进也是众所周知的。据信本发明的组合物和方法与此类底物和条件完全相容。
醇发酵产物包括具有与碳原子键合的羟基官能团(-OH)的有机化合物。示例性醇包括但不限于甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇、2-戊醇、异戊醇、和高级醇。最常制备的燃料醇是乙醇和丁醇。
鉴于本说明书，本发明的酵母菌株和方法的这些和其他方面以及实施例对于技术人员是清楚的。以下实例旨在进一步说明但不限制所述组合物和方法。
实例
实例1.酿酒酵母中YBR278w基因的缺失
由YBR278w编码的Dpb3是由YJL065c编码的Dls1的旁系同源物(Iida,T.和Araki,H.(2004)Mol Cell Biol[分子与细胞生物学],24:217-27)。如上所述，减少酵母细胞中产生的Dls1的量(对细胞没有其他遗传修饰)增加了醇生产(数据未显示)。进行初始实验以确定减少酵母细胞中产生的Dpb3的量是否也增加醇生产。
使用标准酵母分子生物学技术，通过基本上删除Dpb3的整个编码序列来破坏YBR278w基因。所有程序均基于可公开获得的YBR278w的核酸序列，其在下文作为SEQ IDNO:3(5’至3’)提供：
用于制备经修饰的酵母细胞的宿主酵母是可商购的FERMAXTMGold(本文称为“FG”；玛翠公司(Martrex,Inc.)，查斯卡(Chaska)，明尼苏达州，美国)。通过菌落PCR确认YBR278w基因的缺失。使经修饰的酵母在非选择性培养基中生长，以除去赋予用于选择转化体的卡那霉素抗性的质粒，产生了与亲本酵母相比不需要生长补充物的经修饰的酵母。选择被命名为DPB3del-1、DPB3del-2和DPB3del-3的三种独立的经修饰的菌株用于进一步研究。
实例2：通过降低Dpb3的表达的经修饰的酵母的乙醇生产
测试了具有YBR278w基因缺失的DPB3del-1、DPB3del-2和DPB3del-3酵母与基准酵母(即，FERMAXTM Gold，其为YBR278w基因的野生型)相比在34℃和37℃的液化物中生产乙醇的能力。通过添加600ppm尿素、0.124SAPU/g ds FERMGENTM 2.5x(酸性真菌蛋白酶)、0.33GAU/g ds CS4(里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶变体)和1.46SSCU/g ds白曲霉(Aspergillus kawachii)α-淀粉酶，制备pH 4.8的液化物(即，具有干固体(ds)值为35％的玉米面粉浆液)。
将2.5克液化物称入10ml容器中，并用来自经修饰的菌株或FG菌株的菌落的新鲜过夜培养物接种，并在不同温度孵育。通过离心在65小时处收集样品，将其通过0.2μm过滤器过滤，并在55℃使用Bio-Rad Aminex HPX-87H柱(其在0.01N H2SO4洗脱液中的等度流速为0.6ml/min)通过HPLC(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)1200系列)分析葡萄糖和乙醇含量。分析结果显示在表1中。报道了相对于FG菌株的乙醇生产。
表1.发酵后对发酵液的分析
与参考菌株相比，具有YBR278w c基因缺失的酵母产生较少的乙醇，特别是在升高的温度下。
实例3：酿酒酶母中Dpb3的过表达
发现水稻中Dpb3-1的过表达与耐热性相关(Hikaro Sato,H.等人(2016)PlantBiotech J[植物生物技术],14:1756-67)。进行初始实验以确定增加酵母中Dpb3的量是否也增加耐受性和醇生产。
使用了四种不同强度的启动子：TMP1(表达增加12倍)、HTA1(表达增加28倍)、EFB1(表达增加75倍)和FBA1(表达增加135倍)。表达的倍数增加基于产生的mRNA的量(数据未显示)。使用标准技术，在上述FG宿主酵母中，将DPB3的天然启动子与上述四种启动子中的每一种交换。通过菌落PCR确认YBR278w基因的启动子交换。
使经修饰的酵母在非选择性培养基中生长，以除去赋予用于选择转化体的卡那霉素抗性的质粒，产生了与亲本酵母相比不需要生长补充物的经修饰的酵母。针对每种启动子-交换变体(命名为TMP1-DPB3、HTA1-DPB3、EFB1-DPB3和FBA1-DPB3)选择三个独立的菌株，将其用于进一步研究。
实例4：通过增加Dpb3的表达的经修饰的酵母的乙醇生产
测试了具有YBR278w基因过表达的酵母菌株与基准酵母(即，FERMAXTM Gold，其为YBR278w基因的野生型)相比在34℃和37℃的液化物中生产乙醇的能力。通过添加600ppm尿素、0.124SAPU/g ds FERMGENTM 2.5x(酸性真菌蛋白酶)、0.33GAU/g ds CS4(里氏木霉葡糖淀粉酶变体)和1.46SSCU/g ds AKAA(白曲霉α-淀粉酶)，制备pH 4.8的液化物(即，具有干固体(ds)值为35％的玉米面粉浆液)。
将2.5克液化物称入10ml容器中，并用来自经修饰的菌株或FG菌株的菌落的新鲜过夜培养物接种，并在34C孵育。离心65小时后收集样品，将其通过0.2μm过滤器过滤，并在55℃使用Bio-Rad Aminex HPX-87H柱(其在0.01N H2SO4洗脱液中的等度流速为0.6ml/min)通过HPLC(安捷伦科技公司1200系列)分析葡萄糖和乙醇含量。分析结果显示在表2至5中。报道了相对于FG菌株的乙醇生产。
表2.用具有TMP1、HTA1和EFB1启动子的酵母在34℃发酵后，对发酵液的分析
表3.用具有FBA1启动子的酵母在34℃发酵后，对发酵液的分析
表4.用具有TMP1、HTA1和EFB1启动子的酵母在37℃发酵后，对发酵液的分析
表5.用具有FBA1启动子的酵母在37℃发酵后，对发酵液的分析
与参考菌株相比，具有由EFB1和FBA1启动子控制的YBR278w基因的酵母产生显著(即，>1％)更多的乙醇，特别是在34℃下。
如表6所示，在33℃的较低温度和35.8的较高ds下，与参考菌株相比，具有由EFB1启动子控制的YBR278w基因的酵母也产生显著(即，约0.7％)更多的乙醇。
表6.用具有EFB1启动子的酵母在32℃和更高的ds下发酵后，对发酵液的分析
还测试了与根据表7中所示的温度斜坡(temperature ramp)条件孵育的液化物中的基准酵母相比，具有不同启动子的酵母生产乙醇的能力。通过添加600ppm尿素、0.124SAPU/g ds FERMGENTM 2.5x(酸性真菌蛋白酶)、0.33GAU/g ds CS4(里氏木霉葡糖淀粉酶变体)和1.46SSCU/g ds白曲霉α-淀粉酶，制备pH 4.8的液化物(即，具有干固体(ds)值为35％的玉米面粉浆液)。
表7.温度斜坡条件
| 时间(小时) | 温度(℃) |
| 0-10 | 32 |
| 10-12 | 33 |
| 12-15 | 34 |
| 15-17 | 35 |
| 17-22 | 35.5 |
| 22-27 | 34.5 |
| 27-31 | 34 |
| 31-36 | 33.5 |
| 36-41 | 33 |
| 41-55 | 32.5 |
| 55-结束 | 32 |
将30克液化物称入250ml容器中，并在温度斜坡条件下用来自经修饰的菌株或FG菌株的菌落的新鲜过夜培养物接种。基于随着时间的推移产生CO2带来的累积压力，使用气体监测系统(安卡姆科技公司(ANKOM Technology))来记录发酵速率。通过离心收集样品，将其通过0.2μm过滤器过滤，并在55℃使用Bio-Rad Aminex HPX-87H柱(其在0.01N H2SO4洗脱液中的等度流速为0.6ml/min)通过HPLC(安捷伦科技公司1200系列)分析乙醇、葡萄糖、乙酸盐和甘油含量。使用2.5μl样品注射体积。用于定量的校准标准品包括已知量的DP4+、DP3、DP2、DP1、甘油和乙醇。分析结果显示在表8中。报道了相对于FG菌株的乙醇增加。
表8.在温度斜坡条件下发酵后，对发酵液的分析
在温度斜坡条件下，与参考菌株相比，具有由EFB1启动子控制的YBR278w基因的酵母产生显著(即，>4％)更多的乙醇。基于实验数据的总体，似乎需要启动子强度增加至少30倍(基于mRNA产生)来实现由Dpb3过表达导致的醇生产的显著增加。细胞中产生的Dpb1蛋白的量的相应增加可能较低。
实例5：Dpb3的过表达与Dls1的表达减少相结合
进行实验以确定与单独地增加Dpb3相比，在酵母中增加Dpb3的量与减少Dls1(由YJL065c基因编码)的量的组合是否进一步增加耐受性和醇生产。使用标准技术，在已经进行了YJL065c的缺失的上述FG宿主酵母中，将Dpb3的天然启动子与EFB1启动子交换。通过菌落PCR证实YBR278w基因的启动子交换。测试了与根据表6中所示的温度斜坡条件孵育的液化物中的基准酵母相比，在Dpb3基因前具有YJL065c缺失和EFB1启动子的酵母生产乙醇的能力。通过添加600ppm尿素、0.124SAPU/g ds FERMGENTM 2.5x(酸性真菌蛋白酶)、0.33GAU/g ds CS4(里氏木霉葡糖淀粉酶变体)和1.46SSCU/g ds白曲霉α-淀粉酶，制备pH 4.8的液化物(即，具有干固体(ds)值为35％的玉米面粉浆液)。
将50克液化物称入125ml容器中，并在32℃和温度斜坡条件下用来自经修饰的菌株或FG菌株的菌落的新鲜过夜培养物接种。通过离心在55小时处收集样品，将其通过0.2μm过滤器过滤，并在55℃使用Bio-Rad Aminex HPX-87H柱(其在0.01N H2SO4洗脱液中的等度流速为0.6ml/min)通过HPLC(安捷伦科技公司1200系列)分析乙醇、葡萄糖、乙酸盐和甘油含量。使用2.5μl样品注射体积。用于定量的校准标准品包括已知量的DP4+、DP3、DP2、DP1、甘油和乙醇。分析结果显示在表9和表10中。报道了相对于FG菌株的乙醇增加。
表9.在温度斜坡条件下发酵后，对发酵液的分析
如表9所示，与单独的过表达Dpb3的酵母相比，除了由EFB1启动子控制的YBR278w基因(即，过表达Dpb3)之外还具有YJL065c基因缺失的酵母产生显著(即，几乎1％)更多的乙醇，并且在温度斜坡条件下比未修饰的参考菌株多4％以上。
表10.在32℃发酵后对发酵液的分析
如表10所示，与单独的过表达Dpb3的酵母相比，除了由EFB1启动子控制的YBR278w基因(即，过表达Dpb3)之外还具有YJL065c缺失的酵母产生约0.5％更多的乙醇，并且在32℃下比未修饰的参考菌株多约2％以上。
Claims (17)
1.一种衍生自亲本酵母细胞的经修饰的酵母细胞，所述经修饰的细胞包含遗传改变，所述遗传改变引起所述经修饰的细胞与亲本细胞相比产生增加量的Dpb3多肽，其中在相同发酵条件下与亲本细胞产生的醇量相比所述经修饰的细胞在发酵过程中产生增加量的醇。
2.如权利要求1所述的经修饰的细胞，其中所述遗传改变包括将核酸引入亲本细胞中，所述核酸能够指导Dpb3多肽以高于等同条件下生长的亲本细胞的水平表达。
3.如权利要求1所述的经修饰的细胞，其中所述遗传改变包括引入用于表达Dpb3多肽的表达盒。
4.如权利要求1所述的经修饰的细胞，其中所述遗传改变包括引入外源YBR278w c基因。
5.如权利要求2所述的经修饰的细胞，其中所述遗传改变包括在内源YBR278w c基因中引入更强的启动子。
6.如权利要求1-5中任一项所述的经修饰的细胞，其中与在等同条件下生长的亲本细胞中的表达水平相比，Dpb3多肽表达的增加量为至少约30倍。
7.如权利要求1-5中任一项所述的经修饰的细胞，其中与在等同条件下生长的亲本细胞中的水平相比，产生的编码Dpb3多肽的mRNA的增加量为至少约30倍。
8.如权利要求1-7中任一项所述的经修饰的细胞，其进一步包含YJL065c基因的破坏。
9.如权利要求1-8中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞产生减少量的功能性Dls1多肽。
10.如权利要求1-9中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞不产生Dls1多肽。
11.如权利要求1-10中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞进一步包含编码碳水化合物加工酶的外源基因。
12.如权利要求1-11中任一项所述的经修饰的细胞，其进一步包含甘油途径和/或乙酰辅酶A途径中的改变。
13.如权利要求1-12中任一项所述的经修饰的细胞，其进一步包含用于制备乙醇的备选途径。
14.如权利要求1-13中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞属于酵母属物种(Saccharomyces spp.)。
15.一种用于增加生长于碳水化合物底物上的酵母细胞的醇生产的方法，所述方法包括：向亲本酵母细胞中引入与亲本细胞中产生的量相比使Dpb3多肽的产生增加的遗传改变。
16.如权利要求15所述的方法，其中具有引入的遗传改变的细胞是经修饰的细胞，所述经修饰的细胞是如权利要求1-15中任一项所述的细胞。
17.如权利要求15所述的方法，其中具有引入的使Dpb3多肽的产生增加的遗传改变的细胞进一步包含与亲本细胞相比使产生的功能性Dls1多肽的量减少的遗传改变。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20191025 |