CN105008527A - 重组酵母和用其生产乙醇的方法 - Google Patents

重组酵母和用其生产乙醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明旨在于已经引入木糖异构酶基因的同化木糖的酵母中改善木糖同化能力和乙醇发酵能力。由已经引入木糖异构酶基因的重组酵母产生的NADH的量因乙酰羟酸还原异构酶的酶促反应而降低。

Description

重组酵母和用其生产乙醇的方法
技术领域
本发明涉及具有木糖代谢能力的重组酵母和一种用其生产乙醇的方法。
背景技术
木素纤维素中所含的主要糖类是构成纤维素的葡萄糖和构成半纤维素的木糖。通过化学地或酶促地降解木素纤维素，可以获得主要包含这样的单糖的糖化组合物。以工业水平从木素纤维素产生有用物质需要能够有效利用这类糖化组合物中所含的糖并以高产率及高生产率发酵这类有用物的微生物。
从总体上看，具有高乙醇发酵能力的酵母，如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)能够利用葡萄糖、甘露糖或半乳糖，不过这类酵母不能够利用木糖。因此，为了以高效率使用木素纤维素作为原料进行发酵，需要修饰这类酵母以能够利用木糖。
例如，已经尝试产生能够利用木糖的重组酿酒酵母(专利文献1和2；非专利文献1)。专利文献1和非专利文献1分别报告了酵母的乙醇产率和木糖利用的改善，其中已经通过引入来自不同微生物的编码木糖还原酶(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)的基因，向所述酵母赋予木糖同化能力。这些文献报道，磷酸转酮酶(PK)途径增强和乙醛脱氢酶消耗NADH，以消耗因引入由XR和XDH在后续反应中所致的木糖同化途径生成的过多NADH。
专利文献2报告了使用木糖异构酶(XI)，所述木糖异构酶是将木糖转化成木酮糖的异构酶。当使用XI时，不生成过多的NADH。即，在根据专利文献2的技术中，在无任何加工情况下使用糖酵解性磷酸戊糖途径(PPP)并且不增强磷酸转酮酶途径。
尽管NADH可能因引入乙醛脱氢酶基因至同化木糖的酵母而过多消耗，其中已经向所述酵母引入XI基因，但是还已经报道因引入这类基因改善木糖的同化(专利文献3)。
引文表
[专利文献]
PTL 1：WO 2003/078643
PTL 2：JP 2005-514951A
PTL 3：JP 2010-239925A
[非专利文献]
NPL 1：Sonderegger M,Schumperli M,Sauer U.2004,Metabolicengineering of a phosphoketolase pathway for pentose catabolism inSaccharomyces cerevisiae,Appl.Environ.Microbiol.,70(5):2892-2897
发明概述
技术问题
然而，就乙醇发酵能力方面，已经引入XI基因的同化木糖的酵母不足以胜任；即，这类菌株就乙醇生产效率而言不足以胜任。在上述情况下，本发明的一个目的是提供就木糖同化能力和乙醇发酵能力而言特别优异的同化木糖的酵母。本发明的另一个目的是提供一种用于产生乙醇的方法，所述方法利用这种酵母导致优异的乙醇产率。
对问题的解决方案
发明人已经实施锐意的研究以达到上述目的。因此，他们发现，可以通过在具有木糖代谢能力的酵母中减少由乙酰羟酸还原异构酶参与的酶促反应产生的NADH的量，改善木糖同化能力和乙醇产率。这已经导致本发明的完成。
本发明如下。
(1)已经引入木糖异构酶基因的重组酵母，其中NADH的产生因乙酰羟酸还原异构酶的酶促反应减少。
(2)根据(1)的重组酵母，其中使内源乙酰羟酸还原异构酶的活性降低。
(3)根据(1)的重组酵母，其中使编码乙酰羟酸还原异构酶的内源基因的表达水平降低。
(4)根据(3)的重组酵母，其中破坏了内源基因。
(5)根据(4)的重组酵母，其中异源破坏了内源基因。
(6)根据(1)的重组酵母，其中引入编码NAD+依赖性降低和NADP+依赖性增强的突变乙酰羟酸还原异构酶的基因。
(7)根据(3)的重组酵母，其中编码乙酰羟酸还原异构酶的内源基因编码以下的蛋白质(a)或(b)：
(a)包含如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质；或
(b)蛋白质，所述蛋白质包含与如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列具有70％或更高同一性的氨基酸序列并具有将2-乙酰乳酸和NAD+分别转化成2,3-二羟异戊酸和NADH的酶活性。
(8)根据(6)的重组酵母，其中编码突变乙酰羟酸还原异构酶的基因编码以下的蛋白质(a)或(b)：
(a)包含如SEQ ID NO:4或6所示氨基酸序列的蛋白质；或
(b)蛋白质，所述蛋白质包含与如SEQ ID NO:4或6所示氨基酸序列具有70％或更高同一性的氨基酸序列并具有将2-乙酰乳酸和NADP+分别转化成2,3-二羟异戊酸和NADPH的酶活性。
(9)根据(1)的重组酵母，其中木糖异构酶基因编码以下的蛋白质(a)或(b)：
(a)包含如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的蛋白质；或
(b)蛋白质，所述蛋白质包含与如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列具有70％或更高同一性的氨基酸序列并具有将木糖转化成木酮糖的酶活性。
(10)用于产生乙醇的方法，包括在含有木糖的培养基中培养根据(1)至(9)中任一项的重组酵母以实施乙醇发酵的步骤。
发明的有利效果
本发明的重组酵母就同化培养基中木糖的能力和从木糖产生乙醇的效率而言优异。因此，采用本发明的重组酵母，在含有木糖的培养基中的乙醇产率可以显著地改善。
根据本发明用于产生乙醇的方法，利用培养基中的木糖作为糖源时的乙醇发酵效率可以维持在高水平，并且可以实现优异的乙醇产率。
附图简述
[图1]图1是显示缬氨酸/亮氨酸生物合成途径的部分的特性图。
[图2]图2是示意性显示pUC-GRE3U-P_TDH1-XI-T_CYC1-P_TDH3-XKS1-T_HIS3-LoxP-G418-LoxP-GRE3D的结构简图。
[图3]图3是示意性显示pUC-ADH2part-T_CYC1-P_TDH3-M_DLD2-ilvC突变型T_ACT1-TRP1-3U_ADH2的结构简图。
[图4]图4是示意性显示pUC-ILV5U-TRP1-ILV5D的结构简图。
[图5]图5是示意性显示pUC-ADH2part-T_CYC1-TRP1-ADH2D的结构简图。
实施方案描述
此后，参考附图和实施例更详细地描述本发明。
<重组酵母>
本发明的重组酵母是通过引入木糖异构酶基因获得的，其中因乙酰羟酸还原异构酶的酶促反应所致的NADH(即，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的产生减少。
已经向其引入木糖异构酶基因的重组酵母是其中木糖异构酶基因有功能的重组酵母。当木糖异构酶基因有功能时，已经引入的木糖异构酶基因转录和翻译，从而表达具有酶活性的木糖异构酶。
术语“已经向其中引入木糖异构酶基因的重组酵母”指以下任一种酵母：已经因向内在不具有木糖代谢能力的酵母引入木糖异构酶基因而获得木糖代谢能力的重组酵母；已经因向内在不具有木糖代谢能力的酵母引入木糖异构酶基因和另一个木糖代谢相关基因而获得木糖代谢能力的重组酵母；和已经因向内在具有木糖代谢能力的酵母引入木糖异构酶基因而具有增强的木糖代谢能力的重组酵母。
本发明的重组酵母能够同化培养基中含有的木糖以产生乙醇。培养基中所含的木糖可以通过糖化包含木糖作为组分糖的木聚糖或半纤维素获得。备选地，它可以因培养基中所含的木聚糖或半纤维素由糖化酶糖化向培养基供应。后一种情况是所谓的“同时糖化和发酵系统”。
在本发明的重组酵母中，因乙酰羟酸还原异构酶的酶促反应所产生的NADH的量降低。如图1中所示，乙酰羟酸还原异构酶是具有在缬氨酸/亮氨酸生物合成途径中将2-乙酰乳酸和NAD+分别转化成2,3-二羟异戊酸和NADH的活性的酶(即，图1中示为”ILV5”的酶)。
为了减少因乙酰羟酸还原异构酶的酶促反应产生的NADH的量，例如，可以降低重组酵母中内在的乙酰羟酸还原异构酶的活性，或可以降低重组酵母中内在的乙酰羟酸还原异构酶基因的表达水平。备选地，可以引入具有降低的NAD+依赖性和增强的NADP+依赖性的突变乙酰羟酸还原异构酶基因。即，由突变乙酰羟酸还原异构酶基因编码的突变乙酰羟酸还原异构酶的表达导致内源乙酰羟酸还原异构酶的活性相对降低。因此，由内源乙酰羟酸还原异构酶产生的NADH的量减少，并且因此，由突变乙酰羟酸还原异构酶产生的NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)的量增加。在图1中，突变乙酰羟酸还原异构酶表示为“IilvC”(NADP依赖性)。
为了降低重组酵母中内在的乙酰羟酸还原异构酶的活性水平，例如，可以允许抑制乙酰羟酸还原异构酶活性的物质或中和乙酰羟酸还原异构酶活性的抗体与乙酰羟酸还原异构酶共存。为了降低重组酵母内源的乙酰羟酸还原异构酶基因的表达水平，例如，可以修饰内源基因的启动子，或可以缺失或破坏这种基因。用于抑制基因表达的技术的例子包括转座子技术、转基因技术、转录后基因沉默技术、RNAi技术、无义介导的减退(NMD)技术、核酶技术、反义技术、miRNA(微RNA)技术和siRNA(小干扰性RNA)技术。特别地优选缺失或破坏重组酵母内源的乙酰羟酸还原异构酶基因和缺失或破坏等位基因之一。
术语“内源乙酰羟酸还原异构酶基因”指一种基因，所述基因在本发明的重组酵母中内在地存在并且编码具有将2-乙酰乳酸和NAD+分别转化成2,3-二羟异戊酸和NADH的酶活性的蛋白质。因此，不具体地限制构成内源乙酰羟酸还原异构酶基因的核苷酸序列。
例如，SEQ ID NOs:1和2分别显示酿酒酵母中内在的乙酰羟酸还原异构酶基因的核苷酸序列和由这种基因编码的乙酰羟酸还原异构酶的氨基酸序列。
乙酰羟酸还原异构酶基因不限于由SEQ ID NOs:1和2确定的基因。它可以是狭义上具有不同核苷酸序列和氨基酸序列的旁系同源基因或同源基因。
乙酰羟酸还原异构酶基因不限于由SEQ ID NOs:1和2确定的基因。例如，它可以是编码包含下述氨基酸序列且具有下述活性的蛋白质的基因，其中所述氨基酸序列与如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列具有70％或更高、优选地80％或更高、更优选地90％或更高并且最优选地95％或更高的序列相似性或同一性，所述蛋白质具有将2-乙酰乳酸和NAD+分别转化成2,3-二羟异戊酸和NADH的酶活性。可以使用配备BLAST算法的BLASTN或BLASTX程序(在默认设置下)，确定序列相似性或同一性的程度。通过以下方式确定序列相似性的程度：对一对氨基酸序列进行两两比对分析，鉴定完全相同的氨基酸残基和显示物理化学上相似功能的氨基酸残基，确定这类氨基酸残基的总数，并计算在接受比较的全部氨基酸残基中这类氨基酸残基总数的百分数。通过以下方式确定序列同一性的程度：对一对氨基酸序列进行两两比对分析，鉴定完全相同的氨基酸残基并计算在接受比较的全部氨基酸残基中这类氨基酸残基的百分数。
另外，乙酰羟酸还原异构酶基因不限于由SEQ ID NOs:1和2确定的基因。例如，它可以是编码包含下述氨基酸序列且具有下述活性的蛋白质的基因，其中所述氨基酸序列因置换、缺失、插入或添加一个或若干个氨基酸衍生自SEQID NO:2中所示的氨基酸序列，所述蛋白质具有将2-乙酰乳酸和NAD+分别转化成2,3-二羟异戊酸和NADH的酶活性。本文所用的术语“若干个”指例如，2至30个、优选地2至20个、更优选地2至10个和最优选地2至5个。
此外，乙酰羟酸还原异构酶基因不限于由SEQ ID NOs:1和2确定的基因。例如，它可以是这样的基因，所述基因在严格条件下与包含如SEQ ID NO:1中所示核苷酸序列的DNA的互补链的全长序列或其部分序列杂交并且编码具有将2-乙酰乳酸和NAD+分别转化成2,3-二羟异戊酸和NADH的酶活性的蛋白质。在“严格条件”下，形成所谓的特异性杂合体，但是不形成非特异性杂合体。这类条件可以参考例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版)适当地确定。具体而言，可以根据用于DNA印迹杂交的溶液的温度和盐浓度以及用于DNA印迹杂交中洗涤步骤的溶液的盐浓度和温度确定严格程度。在严格条件下，更具体地，钠浓度是25至500mM和优选地25至300mM，并且温度例如是42℃至68℃和优选地42℃至65℃。更具体地，钠浓度是5xSSC(83mMNaCl，83mM柠檬酸钠)，并且温度是42℃。
如上文描述，可以例如通过以下方式确定包含与SEQ ID NO:1中所示序列不同的核苷酸序列的基因或编码与SEQ ID NO:2中所示序列不同的氨基酸序列的基因是否将作为乙酰羟酸还原异构酶基因发挥作用：制备包含并入在启动子和终止子之间的适当位置处的目的基因的表达载体，使用这种表达载体转化大肠杆菌宿主并分析所表达蛋白质的乙酰羟酸还原异构酶活性。术语“乙酰羟酸还原异构酶活性”指将2-乙酰乳酸和NAD+分别转化成2,3-二羟异戊酸和NADH的活性。因此，可以通过以下方式评价乙酰羟酸还原异构酶活性：制备含有2-乙酰乳酸和NAD+作为底物的溶液，允许靶蛋白在适当的温度反应，并测量已经减少的2-乙酰乳酸和NAD+的量和/或已经产生的2,3-二羟异戊酸和NADH的量。
不具体地限制具有降低的NAD+依赖性和增强的NADP+依赖性的突变乙酰羟酸还原异构酶基因。例如，这种基因可以编码通过以下方式制备的突变酶：修饰构成野生型乙酰羟酸还原异构酶中NADPH结合位点的氨基酸残基，从而降低NAD+依赖性并增强NADP+依赖性。可以适当地使用在例如美国专利号8,097,440或Arch.Biochem.Biophys.,338,第83-89页,1997中公开的基因作为这种突变乙酰羟酸还原异构酶基因。
具体而言，可以将突变R68D、K69L、K75V和R76D引入大肠杆菌衍生的乙酰羟酸还原异构酶中，从而降低NAD+依赖性并增强NADP+依赖性。另外，可以将突变A71S、R76D、S78D、Q110V、D146G和G185R引入大肠杆菌衍生的乙酰羟酸还原异构酶中，从而降低NAD+依赖性并增强NADP+依赖性。
更具体地，在SEQ ID NO:3中显示因引入突变R68D、K69L、K75V和R76D产生的大肠杆菌衍生的突变乙酰羟酸还原异构酶基因的核苷酸序列，并且在SEQ ID NO:4中显示由这种基因编码的突变乙酰羟酸还原异构酶的氨基酸序列。另外，在SEQ ID NO:5中显示因引入突变A71S、R76D、S78D、Q110V、D146G和G185R产生的大肠杆菌衍生的突变乙酰羟酸还原异构酶基因的核苷酸序列，并且在SEQ ID NO:6中显示由这种基因编码的突变乙酰羟酸还原异构酶的氨基酸序列。
突变乙酰羟酸还原异构酶基因不限于由SEQ ID NOs:3至6确定的基因。例如，它可以是编码包含下述氨基酸序列且具有下述活性的蛋白质的基因，其中所述氨基酸序列与如SEQ ID NO:4或6所示氨基酸序列具有70％或更高、优选地80％或更高、更优选地90％或更高并且最优选地95％或更高的序列相似性或同一性，所述蛋白质具有将2-乙酰乳酸和NADP+分别转化成2,3-二羟异戊酸和NADPH的酶活性。与如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列具有给定的序列相似性或同一性水平的氨基酸序列需要保留突变R68D、K69L、K75V和R76D。另外，与如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列具有给定的序列相似性或同一性水平的氨基酸序列需要保留突变A71S、R76D、S78D、Q110V、D146G和G185R。可以使用配备BLAST算法的BLASTN或BLASTX程序(在默认设置下)，确定序列相似性或同一性的程度。
通过以下方式确定序列相似性的程度：对一对氨基酸序列进行两两比对分析，鉴定完全相同的氨基酸残基和显示物理化学上相似功能的氨基酸残基，确定这类氨基酸残基的总数，并计算在接受比较的全部氨基酸残基中这类氨基酸残基总数的百分数。通过以下方式确定序列同一性的程度：对一对氨基酸序列进行两两比对分析，鉴定完全相同的氨基酸残基并计算在接受比较的全部氨基酸残基中这类氨基酸残基的百分数。
另外，突变乙酰羟酸还原异构酶基因不限于由SEQ ID NOs:3至6确定的基因。例如，它可以是编码包含下述氨基酸序列且具有下述活性的蛋白质的基因，其中所述氨基酸序列因置换、缺失、插入或添加一个或若干个氨基酸衍生自SEQ ID NO:4或6中所示的氨基酸序列，所述蛋白质具有将2-乙酰乳酸和NADP+分别转化成2,3-二羟异戊酸和NADPH的酶活性。本文所用的术语“若干个”指例如，2至30个、优选地2至20个、更优选地2至10个和最优选地2至5个。要求通过置换、缺失、插入或添加给定数目的氨基酸从如SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列保留突变R68D、K69L、K75V和R76D。另外，要求通过置换、缺失、插入或添加给定数目的氨基酸从如SEQ IDNO:6中所示的氨基酸序列衍生的氨基酸序列保留突变A71S、R76D、S78D、Q110V、D146G和G185R。
另外，突变乙酰羟酸还原异构酶基因不限于由SEQ ID NOs:3至6确定的基因。例如，它可以是这样的基因，所述基因在严格条件下与包含如SEQ ID NO:3或5中所示的核苷酸序列的DNA的互补链的全长序列或其部分序列杂交并且编码具有将2-乙酰乳酸和NADP+分别转化成2,3-二羟异戊酸和NADPH的酶活性的蛋白质。在“严格条件”下，形成所谓的特异性杂合体，但是不形成非特异性杂合体。这类条件可以参考例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版)适当地确定。具体而言，可以根据用于DNA印迹杂交的溶液的温度和盐浓度以及用于DNA印迹杂交中洗涤步骤的溶液的盐浓度和温度确定严格程度。
在严格条件下，更具体地，钠浓度是25至500mM和优选地25至300mM，并且温度例如是42℃至68℃和优选地42℃至65℃。更具体地，钠浓度是5xSSC(83mM NaCl，83mM柠檬酸钠)，并且温度是42℃。要求在严格条件下与包含如SEQ ID NO:3中所示的核苷酸序列的DNA的互补链的全长序列或其部分序列杂交的多核苷酸编码保留了突变R68D、K69L、K75V和R76D的氨基酸序列。另外，要求在严格条件下与包含如SEQ ID NO:6中所示的核苷酸序列的DNA的互补链的全长序列或其部分序列杂交的多核苷酸编码保留了突变A71S、R76D、S78D、Q110V、D146G和G185R的氨基酸序列。
如上文描述，可以例如通过以下方式确定包含与SEQ ID NO:3或5中所示序列不同的核苷酸序列的基因或编码与SEQ ID NO:4或6中所示序列不同的氨基酸序列的基因是否将作为突变乙酰羟酸还原异构酶基因发挥作用：制备包含并入在启动子和终止子之间的适当位置处的目的基因的表达载体，使用这种表达载体转化大肠杆菌宿主并分析所表达蛋白质的突变乙酰羟酸还原异构酶活性。术语“突变乙酰羟酸还原异构酶活性”指将2-乙酰乳酸和NADP+分别转化成2,3-二羟异戊酸和NADPH的活性。因此，可以通过以下方式评价突变乙酰羟酸还原异构酶活性：制备含有2-乙酰乳酸和NADP+作为底物的溶液，允许靶蛋白在足够的温度反应，并测量已经减少的2-乙酰乳酸和NADP+的量和/或已经产生的2,3-二羟异戊酸和NADPH的量。
如上文所述，本发明的重组酵母包含已经向其中引入的木糖异构酶基因。不具体地限制木糖异构酶基因(XI基因)，并且可以使用源自任何生物物种的基因。例如，可以无具体限制地使用在JP 2011-147445 A中公开的从白蚁肠道原生生物衍生的多种木糖异构酶基因。可以使用的木糖异构酶基因的例子包括从厌氧真菌梨囊鞭菌属(Piromyces sp.)菌株E2衍生的基因(JP 2005-514951A)，从厌氧真菌Cyllamyces aberensis衍生的基因，从细菌菌株(即，多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron))衍生的基因、从另一个细菌菌株(即，Clostridiumphytofermentans)衍生的基因和从鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)簇衍生的基因。
具体而言，优选使用从黄胸散白蚁(Reticulitermes speratus)肠道原生生物衍生的木糖异构酶基因作为木糖异构酶基因。从黄胸散白蚁肠道原生生物衍生的木糖异构酶基因的编码区的核苷酸序列和由这种基因编码的蛋白质的氨基酸序列分别在SEQ ID NOs:7和8中显示。
木糖异构酶基因不限于由SEQ ID NOs:7和8确定的基因。它可以是狭义上具有不同核苷酸序列和氨基酸序列的旁系同源基因或同源基因。
木糖异构酶基因不限于由SEQ ID NOs:7和8确定的基因。例如，它可以是编码包含下述氨基酸序列且具有下述活性的蛋白质的基因，其中所述氨基酸序列与如SEQ ID NO:8所示氨基酸序列具有70％或更高、优选地80％或更高、更优选地90％或更高并且最优选地95％或更高的序列相似性或同一性，所述蛋白质具有木糖异构酶活性。可以使用配备BLAST算法的BLASTN或BLASTX程序(在默认设置下)，确定序列相似性或同一性的程度。通过以下方式确定序列相似性的程度：对一对氨基酸序列进行两两比对分析，鉴定完全相同的氨基酸残基和显示物理化学上相似功能的氨基酸残基，确定这类氨基酸残基的总数，并计算在接受比较的全部氨基酸残基中这类氨基酸残基总数的百分数。通过以下方式确定序列同一性的程度：对一对氨基酸序列进行两两比对分析，鉴定完全相同的氨基酸残基并计算在接受比较的全部氨基酸残基中这类氨基酸残基的百分数。
另外，木糖异构酶基因不限于由SEQ ID NOs:7和8确定的基因。例如，它可以是编码包含下述氨基酸序列且具有下述活性的蛋白质的基因，其中所述氨基酸序列因置换、缺失、插入或添加一个或若干个氨基酸衍生自SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列，所述蛋白质具有木糖异构酶活性。本文所用的术语“若干个”指例如，2至30个、优选地2至20个、更优选地2至10个和最优选地2至5个。
另外，木糖异构酶基因不限于由SEQ ID NOs:7和8确定的基因。例如，它可以是这样的基因，所述基因在严格条件下与包含如SEQ ID NO:7中所示的核苷酸序列的DNA的互补链的全长序列或其部分序列杂交并且编码具有木糖异构酶活性的蛋白质。在“严格条件”下，形成所谓的特异性杂合体，但是不形成非特异性杂合体。这类条件可以参考例如Molecular Cloning:A LaboratoryManual(第3版)适当地确定。具体而言，可以根据用于DNA印迹杂交的溶液的温度和盐浓度以及用于DNA印迹杂交中洗涤步骤的溶液的盐浓度和温度确定严格程度。在严格条件下，更具体地，钠浓度是25至500mM和优选地25至300mM，并且温度例如是42℃至68℃和优选地42℃至65℃。更具体地，钠浓度是5x SSC(83mM NaCl，83mM柠檬酸钠)，并且温度是42℃。
如上文描述，可以例如通过以下方式确定包含与SEQ ID NO:7中所示序列不同的核苷酸序列的基因或编码与SEQ ID NO:8中所示序列不同的氨基酸序列的基因是否将作为木糖异构酶基因发挥作用：制备包含并入在启动子和终止子之间的适当位置处的目的基因的表达载体，使用这种表达载体转化大肠杆菌宿主并分析所表达蛋白质的木糖异构酶活性。术语“木糖异构酶活性”指将木糖异构化成木酮糖的活性。因此，可以通过以下方式评价木糖异构酶活性：制备含有木糖作为底物的溶液，允许靶蛋白在适当的温度反应，并测量已经减少的木糖的量和/或已经产生的木酮糖的量。
如上文描述，除木糖异构酶基因之外，还可以将另一个木糖代谢相关基因引入本发明的重组酵母。除木糖异构酶基因之外的木糖代谢相关基因可以是编码将木糖转化成木糖醇的木糖还原酶的木糖还原酶基因、编码将木糖醇转化成木酮糖的木糖醇脱氢酶的木糖醇脱氢酶基因或编码使木酮糖磷酸化以产生木酮糖5-磷酸的木酮糖激酶的木酮糖激酶基因。由木酮糖激酶产生的木酮糖5-磷酸是由磷酸戊糖途径代谢。
木糖代谢相关基因的更具体例子包括但不具体地限于从树干毕赤酵母(Pichia stipitis)衍生的木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因和从酿酒酵母衍生的木酮糖激酶基因(参见Eliasson A.等人，Appl.Environ.Microbiol.,66:3381-3386；和Toivari M.N.等人,Metab.Eng.,3:236-249)。此外，可以使用从热带假丝酵母(Candida tropicalis)和近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)衍生的木糖还原酶基因、从热带假丝酵母和近平滑假丝酵母衍生的木糖醇脱氢酶基因和从树干毕赤酵衍生的木酮糖激酶基因。
特别优选除木糖异构酶基因之外，本发明的重组酵母包含已经向其中引入的木酮糖激酶基因。木酮糖激酶参与使用木糖异构酶产生的木酮糖作为底物产生木酮糖5-磷酸的反应。因此引入木酮糖激酶基因的情况下，可以增加其中涉及木糖异构酶的木糖代谢途径的代谢活性。
当酿酒酵母充当本发明重组酵母的宿主时，可以增强酿酒酵母中内在的木酮糖激酶基因的表达，从而可以增加其中涉及木糖异构酶的木糖代谢途径的代谢活性。酿酒酵母中内在的木酮糖激酶基因的核苷酸序列和由这种基因编码的乙酰羟酸还原异构酶的氨基酸序列分别在SEQ ID NOs:9和10中显示。
木酮糖激酶基因不限于由SEQ ID NOs:9和10确定的基因。它可以是狭义上具有不同核苷酸序列和氨基酸序列的旁系同源基因或同源基因。
木酮糖激酶基因不限于由SEQ ID NOs:9和10确定的基因。例如，它可以是编码包含下述氨基酸序列且具有下述活性的蛋白质的基因，其中所述氨基酸序列与如SEQ ID NO:10所示氨基酸序列具有70％或更高、优选地80％或更高、更优选地90％或更高并且最优选地95％或更高的序列相似性或同一性，所述蛋白质具有木酮糖激酶活性。可以使用配备BLAST算法的BLASTN或BLASTX程序(在默认设置下)，确定序列相似性或同一性的程度。通过以下方式确定序列相似性的程度：对一对氨基酸序列进行两两比对分析，鉴定完全相同的氨基酸残基和显示物理化学上相似功能的氨基酸残基，确定这类氨基酸残基的总数，并计算在接受比较的全部氨基酸残基中这类氨基酸残基总数的百分数。通过以下方式确定序列同一性的程度：对一对氨基酸序列进行两两比对分析，鉴定完全相同的氨基酸残基并计算在接受比较的全部氨基酸残基中这类氨基酸残基的百分数。
另外，木酮糖激酶基因不限于由SEQ ID NOs:9和10确定的基因。例如，它可以是编码包含下述氨基酸序列且具有下述活性的蛋白质的基因，其中所述氨基酸序列因置换、缺失、插入或添加一个或若干个氨基酸衍生自SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列，所述蛋白质具有木酮糖激酶活性。本文所用的术语“若干个”指例如，2至30个、优选地2至20个、更优选地2至10个和最优选地2至5个。
另外，木酮糖激酶基因不限于由SEQ ID NOs:9和10确定的基因。例如，它可以是这样的基因，所述基因在严格条件下与包含如SEQ ID NO:9中所示的核苷酸序列的DNA的互补链的全长序列或其部分序列杂交并且编码具有木酮糖激酶活性的蛋白质。在“严格条件”下，形成所谓的特异性杂合体，但是不形成非特异性杂合体。这类条件可以参考例如Molecular Cloning:A LaboratoryManual(第3版)适当地确定。具体而言，可以根据用于DNA印迹杂交的溶液的温度和盐浓度以及用于DNA印迹杂交中洗涤步骤的溶液的盐浓度和温度确定严格程度。在严格条件下，更具体地，钠浓度是25至500mM和优选地25至300mM，并且温度例如是42℃至68℃和优选地42℃至65℃。更具体地，钠浓度是5xSSC(83mM NaCl，83mM柠檬酸钠)，并且温度是42℃。
如上文描述，可以例如通过以下方式确定包含与SEQ ID NO:9中所示序列不同的核苷酸序列的基因或编码与SEQ ID NO:10中所示序列不同的氨基酸序列的基因是否将作为木酮糖激酶基因发挥作用：制备包含并入在启动子和终止子之间的适当位置处的目的基因的表达载体，使用这种表达载体转化大肠杆菌宿主并分析所表达蛋白质的木酮糖激酶活性。术语“木酮糖激酶活性”指将木酮糖转化成木酮糖5-磷酸的活性。因此，可以通过以下方式评价木酮糖激酶活性：制备含有木酮糖和ATP作为底物的溶液，允许靶蛋白在适当的温度反应，并测量已经减少的木酮糖和ATP的量和/或已经产生的木酮糖-5磷酸的量。
<重组酵母的制备>
可以通过将木糖异构酶基因引入宿主酵母中并通过修饰宿主以因乙酰羟酸还原异构酶的酶促反应导致NADH的量减少，制备本发明的重组酵母。不具体地限制宿主酵母。可以使用不具有木糖代谢能力的酵母或内在具有木糖代谢能力的酵母。可以使用的宿主酵母的例子包括但不具体地限于休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、树干毕赤酵母、嗜单宁管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、酿酒酵母和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，优选酿酒酵母。内在具有木糖代谢能力的酵母的例子包括但不具体地限于树干毕赤酵母、热带假丝酵母和近平滑假丝酵母。
也可以使用从实验便利角度所用的实验性酵母株或从实际有用的角度所用的产业(实用)菌株。工业菌株的例子包括用于生产葡萄酒、清酒和烧酒的酵母株。优选使用具有同宗配合特性的宿主酵母株。根据JP 2009-34036 A中公开的技术，可以利用具有同宗配合特性的酵母，将基因的多拷贝容易地引入基因组中。术语“具有同宗配合特性的酵母”与术语“同宗配合酵母”相同。不具体地限制具有同宗配合特性的酵母，并且可以使用任何酵母。具有同宗配合特性的酵母的例子是，但不限于，酿酒酵母OC-2株(NBRC2260)。具有同宗配合特性的其他酵母的例子包括产醇酵母(Taiken No.396,NBRC0216)(参考文献：“Alcoholkobo no shotokusei(产乙醇酵母的各种特性)，“Shuken Kaiho,第37期,第18-22页,1998.8)、在巴西和日本分离的产乙醇酵母(参考文献："Brazil toOkinawa de bunri shita Saccharomyces cerevisiae yaseikabu no idengakutekiseishitsu(Genetic properties of wild-type Saccharomyces cerevisiae isolated inBrazil and in Okinawa),"the Journal of the Japan Society for Bioscience,Biotechnology,and Agrochemistry,第65卷,第4期,第759-762页,1991.4)和180(reference:"Alcohol Hakkoryoku no tsuyoi kobo no screening(Screening ofyeast having potent alcohol-fermenting ability),"the Journal of the BrewingSociety of Japan,第82卷,第6期,第439-443页,1987.6)。此外，可以将HO基因以可表达方式引入显示同宗配合表型的酵母中，并且所产生的菌株可以作为具有同宗配合特性的酵母使用。即，本文所用的术语“具有同宗配合特性的酵母”还指已经将HO基因以可表达方式引入其中的酵母。
酿酒酵母OC-2株是特别地优选的，因为它此前已经用于葡萄酒酿造，并且其安全性已经验证。如下文实施例中描述，就高糖浓度时其优异的启动子活性而言，酿酒酵母OC-2株是优选的。特别地，就高糖浓度时其对于丙酮酸脱羧酶基因(PDC1)的优异启动子活性而言，酿酒酵母OC-2株是优选的。
不具体地限制待引入的木糖异构酶基因或突变乙酰羟酸还原异构酶的启动子。例如，可以使用的启动子3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(TDH3)、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)和高渗透压应答7基因(HOR7)。就其以高水平表达下游区域的靶基因的高能力而言，丙酮酸脱羧酶基因(PDC1)的启动子是特别优选的。
具体而言，可以将这种基因与调节表达的启动子或另外的调节表达的区域一起引入酵母基因组中。也可以将这种基因以下述方式引入宿主酵母基因组中，所述方式是这种基因的表达受宿主酵母中内在存在的基因的启动子或另外的调节表达的区域调节。
基因可以通过称作酵母转化技术的任何常规技术引入基因组中。具体例子包括但不限于电穿孔法(Meth.Enzym.,194,第182页,1990)、原生质体技术(Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,75,第1929页,1978)和乙酸锂法(J.Bacteriology,153,第163页,1983；Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,75,第1929页,1978；Methods in yeast genetics,2000版:A Cold Spring Harbor Laboratory CourseManual)。
<生产乙醇>
当使用本发明的重组酵母产生乙醇时，通过在至少含有木糖的培养基中培养实施乙醇发酵。具体而言，其中实施乙醇发酵的培养基至少含有木糖作为碳源。其他碳源如葡萄糖可以事先含于培养基中。
用于乙醇发酵的培养基中所含的木糖可以衍生自生物质。也就是说，用于乙醇发酵的培养基可以包含纤维素生物质和通过糖化纤维素生物质中所含有的半纤维素产生木糖的半纤维素酶。纤维素生物质可以已经经历了常规预处理技术。预处理技术的例子包括但不具体地限于用微生物降解木质素和碾磨纤维素生物质。例如，可以对研磨的纤维素生物质进行预处理，如在稀硫酸溶液、碱性溶液或离子溶液中浸泡、水热处理或细碾磨。因此，可以改善生物质糖化的效率。
当使用本发明的重组酵母产生乙醇时，培养基还可以包含纤维素和纤维素酶。在这种情况下，培养基将含有通过纤维素酶作用于纤维素所产生的葡萄糖。当用于乙醇发酵的培养基含有纤维素时，这类纤维素可以衍生自生物质。也就是说，用于乙醇发酵的培养基可以包含能够糖化纤维素生物质中所含纤维素的纤维素酶。
可以添加因糖化纤维素生物质产生的糖化溶液至用于乙醇发酵的培养基。在这种情况下，糖化溶液含有剩余的纤维素、纤维素酶和从纤维素生物质中所含的半纤维素衍生的木糖。
如上文所述，用于产生乙醇的本发明方法包括涉及使用至少木糖作为糖源的乙醇发酵步骤。根据用于产生乙醇的本发明方法，可以通过使用木糖作为糖源的乙醇发酵，产生乙醇。根据利用本发明的重组酵母产生乙醇的方法，乙醇发酵之后是从培养基回收乙醇。可以没有具体限制地通过任何常规手段回收乙醇。在完成上文提到的乙醇发酵过程后，例如，含有乙醇的液体层借助固-液分离法与含有重组酵母或固形物的固体层分离。此后，将液体层中所含的乙醇分离并通过蒸馏纯化，从而可以回收高度纯化的乙醇。可以根据乙醇的使用目的适当地决定乙醇纯化的程度。
用于产生乙醇的本发明方法可以使用所谓的同时糖化和发酵方法，其中用纤维素酶糖化培养基中所含纤维素的步骤与利用糖源(即，糖化产生的木糖和葡萄糖)实施的乙醇发酵过程同时推进。在同时糖化和发酵方法中，纤维素生物质糖化步骤与乙醇发酵步骤同时实施。
不具体地限制糖化方法，并且，可以使用例如涉及利用纤维素酶制品如纤维素酶或半纤维素酶的酶促方法。纤维素酶制品含有参与降解纤维素链和半纤维素链的多种酶，并它显示出多种类型的活性，如内切葡聚糖酶活性、内切木聚糖酶活性、纤维二糖水解酶活性、葡糖苷酶活性和木糖苷酶活性。不具体地限制纤维素酶制品。例如，可以使用里氏木霉(Trichoderma reesei)或解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)产生的纤维素酶。也可以使用市售纤维素酶制品。
在同时糖化和发酵方法中，将纤维素酶制品和上述重组微生物添加至含有纤维素生物质(可以使用预处理后的生物质)的培养基，并且将重组酵母在给定的温度培养。可以没有具体限制地在任何温度实施培养，并且从乙醇发酵的效率的观点看，温度可以是25℃至45℃，并且优选地30℃至40℃。培养液的pH水平优选地是4至6。当实施培养时，可以实施搅拌或振摇。备选地，同时糖化和发酵方法可以以下述方式不规则地实施，所述方式是首先在酶的最佳温度(40℃至70℃)实施糖化，温度降至给定的水平(30℃至40℃)，并且随后添加酵母。
实施例
此后，参考实施例更详细地描述本发明，但是本发明的技术范围不限于这些实施例。
实施例1
在本实施例中，修饰已经因引入木糖异构酶基因而获得木糖同化能力的重组酵母，从而所产生的重组酵母将因乙酰羟酸还原异构酶的酶促反应产生减少量的NADH。随后评价这种重组酵母的木糖同化能力和乙醇生产率。本实施例中制备的重组酵母因引入木酮糖激酶基因而具有改善的木糖代谢活性。
<制备用于基因引入的载体>
(1)用于引入XI和XKS1基因和破坏GRE3基因的载体
作为能够将从黄胸散白蚁肠道原生生物衍生的木糖异构酶基因和从酵母衍生的木酮糖激酶基因引入酵母的GRE3基因座同时破坏GRE3基因的载体，制备pUC-GRE3U-P_TDH1-XI-T_CYC1-P_TDH3-XKS1-T_HIS3-LoxP-G418-LoxP-GRE3D(图2)。
构建这种载体，所述载体包含其中分别添加酿酒酵母BY4742株的TDH1启动子和CYC1终止子至5'侧和3'侧的从黄胸散白蚁(Reticulitermes speratus)肠道原生生物衍生的木糖异构酶基因(RsXI-C1；参见JP 2011-147445A)；其中分别添加酿酒酵母BY4742株的TDH3启动子和HIS3终止子至5'侧和3'侧的酿酒酵母BY4742株的木酮糖激酶基因(XKS1)；待通过同源重组整合入酵母基因组的区域，即，从GRE3的5'末端起上游大约700bp的基因序列(GRE3U)和从GRE3的3'末端起下游大约800bp的DNA序列(GRE3D)；和含有G418基因的标记基因序列(G418标志物)。标记基因旁侧分布有LoxP序列，从而可以从标记基因序列移除标志物。
可以使用表1中显示的引物扩增每个DNA序列。为了引起DNA片段彼此结合，使用分别通过以下方式制备的引物扩增每个靶DNA片段，所述方式是添加DNA序列至表1中显示的引物，从而与相邻的DNA序列重叠约15bp，并且使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Takara Bio)，使DNA片段与相邻的DNA片段结合。因此，制备载体。
(2)用于引入ilvC(NADP-依赖性)基因的载体
作为用于将大肠杆菌衍生的NADP依赖性乙酰羟酸还原异构酶基因引入酵母的载体，制备pUC-ADH2part-T_CYC1-P_TDH3-M_DLD2-ilvC突变型T_ACT1-TRP1-3U_ADH2)(图3)。如此构建这种载体，从而包含从大肠杆菌K12菌株(Genebank：948286)衍生的乙酰羟酸还原异构酶ilvC基因的NADP依赖性突变体，其中将酿酒酵母BY4742株的TDH3启动子和据预测是线粒体靶向信号肽的DLD2基因片段(即，从5'末端起135个核苷酸，M_DLD2)添加至5'侧并将ACT1终止子添加至3'侧；待通过同源重组整合入酵母基因组的区域，即，从ADH2基因的3'末端起上游大约450bp的基因序列(ADH2part)和从其3'末端起下游大约700bp的DNA序列(ADH2D)；作为ADH2终止子的CYC1终止子区域；和含有TRP1基因的标记基因序列(TRP1标志物)。在本实施例中，使用这样的基因，所述基因编码具有突变R68D、K69L、K75V和R76D的氨基酸序列(Arch.Biochem.Biophys.,338,83-89,1997)并且包含其中密码子已经根据酵母密码子选择频率改变的核苷酸序列。在本实施例中，完全合成NADP依赖性ilvC基因。在本实施例中，使用另一种NADP依赖性ilvC基因，所述基因编码具有突变A71S、R76D、S78D、Q110V、D146G和G185R的氨基酸序列(美国专利8097440)并且包含其中密码子已经根据酵母密码子选择频率改变的核苷酸序列。在本实施例中，也完全合成这种NADP依赖性ilvC基因。
可以使用表1中显示的引物扩增每个DNA序列。为了引起DNA片段彼此结合，使用分别通过以下方式制备的引物扩增每个靶DNA片段，所述方式是添加DNA序列至表1中显示的引物，从而与相邻的DNA序列重叠约15bp，并且使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Takara Bio)，使DNA片段与相邻的DNA片段结合。因此，制备载体。
(3)用于破坏ILV5基因的载体
制备用于破坏ILV5基因的载体pUC-ILV5U-TRP1-ILV5D(图4)。如此构建这种载体，从而包含待通过同源重组整合入酵母基因组的区域及用于破坏乙酰羟酸还原异构酶(ILV5)基因的区域，即ILV5基因上游大约850bp的DNA序列(ILV5U)和ILV5基因下游大约800bp的DNA序列(ILV5D)；和含有TRP1的标记基因序列(TRP1标志物)。
可以使用表1中显示的引物扩增每个DNA序列。为了引起DNA片段彼此结合，使用分别通过以下方式制备的引物扩增每个靶DNA片段，所述方式是添加DNA序列至表1中显示的引物，从而与相邻的DNA序列重叠约15bp，并且使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Takara Bio)，使DNA片段与相邻的DNA片段结合。因此，制备载体。
(4)对照载体(仅标记基因)
制备用于仅引入标记基因的对照载体pUC-ADH2part-T_CYC1-TRP1-ADH2D(图5)。如此构建这种载体，从而包含待通过同源重组整合入酵母基因组的区域，即，从ADH2基因的3'末端起上游大约450bp的基因序列(ADH2part)和从其3'末端起下游大约700bp的DNA序列(ADH2D)；作为ADH2终止子的CYC1终止子序列；和含有TRP1的标记基因序列(TRP1标志物)。
可以使用表1中显示的引物扩增每个DNA序列。为了引起DNA片段彼此结合，使用分别通过以下方式制备的引物扩增每个靶DNA片段，所述方式是添加DNA序列至表1中显示的引物，从而与相邻的DNA序列重叠约15bp，并且使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Takara Bio)，使DNA片段与相邻的DNA片段结合。因此，制备载体。
表1
<制备包含引入其中的载体的酵母>
将色氨酸营养缺陷型二倍体酵母，即酿酒酵母OC2-T株(Saitoh,S.等人，J.Ferment.Bioeng.,1996,第81卷,第98-103页)，称为宿主菌株。使用Frozen-EZ酵母转化II(ZYMO RESEARCH)根据其中所包括的方案转化酵母。
首先，通过PCR扩增载体pUC-5U_GRE3-P_TDH1-XI-T_CYC1-P_TDH3-XKS1-T_HIS3-LoxP-G418-LoxP-3U_GRE3中待经历同源重组的区域，将所获得的片段转化至OC2-T株中，将获得的菌株涂布至无色氨酸的SD琼脂培养基并且随后对长出的菌落进行纯化。纯化的菌株命名为Uz979株。允许所得到的菌株在孢子形成培养基(1％磷酸钾，0.1％酵母提取物，0.05％葡萄糖和2％琼脂)中形成孢子，从而利用同宗配合特性引起二倍体化。获得了含有整合至染色体的GRE3基因座的XI基因和XKS1基因以及GRE3基因座中GRE3基因被破坏的二倍体菌株并命名为Uz979株。
随后，通过PCR扩增载体pUC-ADH2part-T_CYC1-P_TDH3-M_DLD2-ilvC突变型R68D K69L K75V R76D-T_ACT1-TRP1-3U_ADH2、pUC-ADH2part-T_CYC1-P_TDH3-M_DLD2-ilvC突变型A71S R76D S78DQ110V D146G G185R-T_ACT1-TRP1-3U_ADH2、pUC-ILV5U-TRP1-ILV5D或pUC-ADH2part-T_CYC1-TRP1-ADH2D中经历同源重组的区域，将所获得的片段转化至Uz979株中，将获得的菌株涂布至无色氨酸的SD琼脂培养基并且随后对长出的菌落进行纯化。将纯化的菌株分别命名为Uz999、Uz1000、Uz1089和Uz1034株。在每个菌株中观察到(以一个拷贝)杂合重组。
<发酵试验>
自按上文描述方式获得的每种菌株Uz999、Uz1000、Uz1089和Uz1034分别选择出显示高发酵能力的两个菌株，并且在烧瓶中按下文描述的方式对选定菌株进行发酵试验。首先，将试验菌株引入100ml带挡板的烧瓶中，所述烧瓶各自含有20g/l葡萄糖的20ml YPD液体培养基(10g/l酵母提取物，20g/l蛋白胨和20g/l葡萄糖)，并且在30℃和120转/分钟培养24小时。将菌株收集并引入各自含有10ml D5X65YPAc3培养基(5g/l葡萄糖，65g/l木糖，10g/l酵母提取物，20g/l蛋白胨和3g/l乙酸)的20ml烧瓶中(细胞密度：0.3g干细胞/l)。通过振摇培养(80转/分钟；振摇宽度：35mm；30℃)实施发酵试验。每个烧瓶用包含针头(内径：1.5mm)的橡胶盖塞住，并通过在针头顶端安装单向阀(checkvalve)维持烧瓶内部的无氧条件。
在开始发酵后90小时、114小时和138小时实施采样，并且通过HPLC(LC-10A，Shimadzu Seisakusho)在下文描述的条件下分析发酵液中的木糖浓度和乙醇浓度。从通过三次采样所获得的数据当中，使用观察到最高乙醇浓度时达到的数据作为发酵试验的结果(并且这类数据代表两个菌株的均数)。
[HPLC条件]
柱：AminexHPX-87H
流动相：0.01N H2SO4
流速：0.6mL/min
温度：30℃
检测器：差示折射计(RID-10A)
<发酵试验的结果>
表2中显示发酵试验的结果。
[表2]
如从表2显而易见，与对照Uz1034株相比，已经向其中引入NADP依赖型ilvC基因的Uz999株和Uz1000株以及包含内源ILV5基因异质破坏的Uz1089株显示木糖同化率明显改善，并且乙醇生产率因此改善。基于以上展示的结果，发现在已经向其中引入木糖异构酶基因的具有木糖同化能力的重组酵母中，通过减少因乙酰羟酸还原异构酶的酶促反应产生的NADH的量，木糖同化能力和乙醇生产率显著改善。

Claims (10)

1.已经引入木糖异构酶基因的重组酵母，其中NADH的产生因乙酰羟酸还原异构酶的酶促反应减少。
2.根据权利要求1所述的重组酵母，其中使内源乙酰羟酸还原异构酶的活性降低。
3.根据权利要求1所述的重组酵母，其中使编码乙酰羟酸还原异构酶的内源基因的表达水平降低。
4.根据权利要求3所述的重组酵母，其中破坏了内源基因。
5.根据权利要求4所述的重组酵母，其中异源破坏了内源基因。
6.根据权利要求1所述的重组酵母，其中引入编码NAD+依赖性降低和NADP+依赖性增强的突变乙酰羟酸还原异构酶的基因。
7.根据权利要求3所述的重组酵母，其中编码乙酰羟酸还原异构酶的内源基因编码以下的蛋白质(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质；或
(b)蛋白质，所述蛋白质包含与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列具有70％或更高同一性的氨基酸序列并具有将2-乙酰乳酸和NAD+分别转化成2,3-二羟异戊酸和NADH的酶活性。
8.根据权利要求6所述的重组酵母，其中编码突变乙酰羟酸还原异构酶的基因编码以下的蛋白质(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO:4或6所示氨基酸序列的蛋白质；或
(b)蛋白质，所述蛋白质包含与SEQ ID NO:4或6所示氨基酸序列具有70％或更高同一性的氨基酸序列并具有将2-乙酰乳酸和NADP+分别转化成2,3-二羟异戊酸和NADPH的酶活性。
9.根据权利要求1所述的重组酵母，其中木糖异构酶基因编码以下的蛋白质(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的蛋白质；或
(b)蛋白质，所述蛋白质包含与SEQ ID NO:8所示氨基酸序列具有70％或更高同一性的氨基酸序列并具有将木糖转化成木酮糖的酶活性。
10.用于产生乙醇的方法，包括在含有木糖的培养基中培养根据权利要求1至9中任一项所述的重组酵母以实施乙醇发酵的步骤。
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