CN111154743A - 突变型纤维素酶及其在玉米青贮中的应用 - Google Patents
突变型纤维素酶及其在玉米青贮中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种纤维素酶突变体，其在SEQ ID NO.1的基础上加入了T49K、A66P、C81A、F145S和D146G突变以提供更好的低温和低pH适应性；本发明还提供了该纤维素酶突变体在玉米青贮中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及酶工程领域和饲料青贮领域，具体地，本发明提供了一种纤维素酶突变体，其在SEQ ID NO.1的基础上加入了T49K、A66P、C81A、F145S和D146G突变以提供更好的低温和低pH适应性；本发明还提供了该纤维素酶突变体在玉米青贮中的应用。
背景技术
青贮是指在密封条件下，通过青贮原料上附着的乳酸菌放入等厌氧发酵将碳水化合物转化成以乳酸为主的有机酸，使pH下降，抑制有害菌的生长，从而使饲料得以长期保存并优化其营养价值的过程。自古以来青贮就是温带寒带地区冬季畜牧业饲料的主要来源之一，可以青贮的饲料主要有玉米、苜蓿、大麦、燕麦、高粱、紫云英、甜菜、马铃薯等，玉米为我国北方主要饲料青贮品种。
为了提高青贮饲料的质量，玉米青贮中可以添加各种添加剂，常见的添加剂包括酶添加剂、微生物添加剂、化学添加剂等，其中酶添加剂可以辅助饲料中纤维素等多糖成分的降解，帮助微生物生长并提高饲料的营养价值，且酶添加剂没有微生物添加剂容易受到气候条件、发酵条件、保存条件影响的缺点，是一种理想的饲料青贮添加剂选择。
酶添加剂中常用的酶为纤维素酶，也有使用半纤维素酶和果胶酶等的报道。现有纤维素酶的问题主要在于：首先，虽然商品化大量生产的纤维素酶多已属于中性略偏酸性酶（最适pH多在5附近），但这些酶在pH4以下(优质玉米青贮饲料的pH范围)的表现一般不佳，酶活多不足50%；其次，这些现有纤维素酶的最适温度一般较高，在30-40℃的发酵温度下（我国东北地区等寒带地区的发酵温度甚至可能更低），酶活也往往损失过半。因此，寻找新的纤维素酶以提高玉米青贮中酶添加剂的效果是本领域的普遍追求之一。
发明内容
申请人在现有适用的纤维素酶的基础上，通过易错PCR的方式筛选到了一种适低温适低pH的纤维素酶突变体，其用于玉米青贮时能有效改善饲料产品在感官、pH和有机酸方面的品质并能提高其消化性能。
一方面，本申请提供了一种纤维素酶突变体，其在SEQ ID NO.1的基础上有一个或多个氨基酸突变，相比野生型所述突变体有更好的低pH和低温适应性。
进一步地，所述氨基酸突变选自T49K、A66P、C81A、F145S、D146G。
进一步地，所述氨基酸突变为T49K、A66P、C81A、F145S和D146G。
进一步的，所述纤维素酶突变体氨基酸序列为SEQ ID NO.3。
另一方面，本申请提供了一种编码纤维素酶突变体的基因，其在SEQ ID NO.2的核苷酸序列基础上有一个或多个核苷酸突变，相比野生型所述突变体有更好的低pH和低温适应性。
进一步地，所述编码纤维素酶突变体的基因核苷酸序列为SEQ ID NO.4。
另一方面，本发明提供了上述纤维素酶或编码纤维素酶的基因在玉米青贮中的应用。
另一方面，本发明提供了包含上述纤维素酶的玉米青贮添加剂。
进一步地，所述玉米青贮添加剂中还包含微生物成分。
进一步地，所述微生物成分为乳酸菌。
本申请的纤维素酶突变体可以使用对应的编码基因在任何适合的宿主菌中表达生产，包括但不限于里氏木霉，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，酵母菌，本领域技术人员可以根据分子生物学一般知识对基因进行相应改造以提高表达效果。可以将其发酵产物，发酵产物的提纯品或者工程宿主菌用于玉米青贮中。
本申请中的玉米品种不限于实施例中的使用的品种，各种现有和未来开发的青贮专用、粮饲兼用玉米均可使用。
本申请的应用和添加剂产品中不排斥使用其他添加剂成分，包括但不限于微生物添加剂和有机/无机物添加剂。
附图简述
图1为野生型和突变型纤维素酶的适合作用温度比较图；
图2为野生型和突变型纤维素酶的适合作用pH比较图。
实施例
以下部分酶学实验由合作单位完成：
实施例1 突变酶的筛选和表达
委托合作单位从现有纤维素酶(已尝试用于饲料青贮)的基础上以易错PCR构建突变酶文库，进而筛选所需的低pH低温适用纤维素酶。
合作单位以其现有纤维素酶为基础（氨基酸序列为SEQ ID NO.1、核苷酸序列为SEQ ID NO.2）, 使用安捷伦的GeneMorph II random mutagenesis kit试剂盒进行三轮易错PCR制备突变酶文库，筛选低pH低温下适用的纤维素酶，在里氏木霉工程菌中表达并测序。
筛选出的突变型纤维素酶氨基酸序列为SEQ ID NO.3、核苷酸序列为SEQ IDNO.4，经过比较其49位置上Thr突变为Lys、66位置上Ala突变为Pro、81位置上Cys突变为Ala、145位置的Phe突变为Ser、146位置上的Asp突变为Gly。
实施例2 突变酶的酶学性质
酶活单位标准为：pH 4.8，50℃时每分钟从浓度为5mg/ml 的羟甲基纤维素钠溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位（U）
在MM培养基中发酵48h后（经过初步优化的发酵条件），表达野生型纤维素酶里氏木霉工程菌的发酵液酶活为65U/mL，而表达突变型纤维素酶里氏木霉工程菌的发酵液酶活为63U/mL，两者基本在同一水平上，该突变型纤维素酶可用于实际生产。
测试了野生型纤维素酶和突变型纤维素酶的适合作用温度，结果如图1所示：显示相比野生型，突变的纤维素酶的最适温度明显下移，在类似青贮的较低温度下的活性明显提高，在35-45℃之间仍然保持38-75%的活性。
测试了野生型纤维素酶和突变型纤维素酶的适合作用pH，结果如图2所示：显示相比野生型，突变的纤维素酶的最适pH明显低移，在青贮期pH 4左右的pH下活性明显提高，保持了60%左右的活性，明显高于野生型的40%左右。
以下部分由申请人自行完成：
材料、仪器和试剂：
青贮玉米品种和基本处理过程：
玉米选择东北地区常用的中原单32号品种，实验过程所用的玉米来自固定种植基地的同批次玉米，品质基本一致（平均株高约230cm，平均果穗长约24cm，种植密度3800株/亩）。玉米收获期为抽丝期第40-43日，留茬高度为30cm，切割长度约2cm。
pH计：CT-6020A便携式pH计（柯迪达电子制造）。
离子色谱仪：ICS-2500离子色谱仪（DIONEX制造）。
纤维分析仪：A2000i纤维分析仪（ANKOM制造）。
定氮仪：KDN-08A凯式定氮仪（杭州汇尔制造）
其他试剂和仪器均为常规国产型号。
实施例3添加纤维素酶改善青贮玉米质量
实验共设置3组：
组1：不添加纤维素酶
组2：每瓶加入表达野生型纤维素酶里氏木霉工程菌的发酵液100mL（约6500U）
组3：每瓶加入表达突变型纤维素酶里氏木霉工程菌的发酵液100mL（约6300U）
实验用青贮方法和取样方法：
将切割后的玉米按照约500g/L压紧至于1L玻璃瓶中（可选地，加入纤维素酶），玻璃胶密封瓶盖接缝，20-25摄氏度的室温下避光保存；在所需测定时间取5个平行青贮罐，取出上层2-10cm处的青贮料混合供测试。
感官评定:
根据德国农业协会（DLG）评分法对嗅觉、结构、色泽评分，按照得分分为优良、良好、中等、下等四个级别。
总体定级上，组1为中等，组2和组3均可达优良级，但组2在嗅觉评分上低于组3，刺激性气味较浓（组2嗅觉得分19，组3嗅觉得分22）。
pH测定：
称取取青贮原料10g，加入100mL去离子水中，搅拌3min后两层纱布过滤，过滤后立即使用上述pH计测量浸出液的pH。
表1 青贮90日后各组pH
| pH | |
| 组1 | 3.91±0.01 |
| 组2 | 3.75±0.01 |
| 组3 | 3.56±0.03 |
结果表明，加入纤维素酶对于降解玉米青贮原料，帮助青贮过程中的乳酸菌利用纤维素成分有明显帮助，适应较低温度和较低pH的突变酶效果好于野生酶。
有机酸测定：
干物质（DM）：60摄氏度烘干48小时测定作为基础；进样前稀释20倍，50微米膜过滤，使用上述ICS-2500离子色谱仪测定有机酸（AS11柱，0.5mL/min，进样8微升，1% KOH流动相）。
表2 青贮90日后总有机酸、乳酸和乙酸生成量（%DM）
| 乳酸 | 乙酸 | 丁酸 | |
| 组1 | 8.23±0.21 | 1.72±0.04 | 0.17±0.02 |
| 组2 | 8.35±0.27 | 1.55±0.10 | 0.15±0.01 |
| 组3 | 8.41±0.18 | 0.83±0.09 | 0.14±0.02 |
比较乳酸和乙酸含量和比例可知，加入纤维素酶对于降解玉米青贮原料，帮助青贮过程中的乳酸菌利用纤维素成分有明显帮助，总有机酸增加，其中的乙酸比例降低而乳酸比例升高，营养价值和嗅觉感官表现提升，适应较低温度和较低pH的突变酶效果好于野生酶。对于容易引起酮病的丁酸，三者都处于合理水平，添加纤维素酶的组略低。
实施例4添加纤维素酶改善青贮玉米瘤胃降解性能
选取三头带有瘤胃瘘管的利木赞肉牛（500kg±30kg），每日饲喂精饲料25kg（玉米40%、豆粕30%、麸皮20%）加稻草粗饲料5kg，自由饮水。
将待测青贮料风干、粉碎、过20目筛；取10g样品至于20X20cm（50微米孔径）尼龙袋内；晨饲前投入瘤胃中，预定时间取出；冲洗至无色无味；测定：
干物质（DM）：60摄氏度烘干48小时测定；
粗蛋白（CP）：上述凯式定氮仪测定；
中性洗涤纤维（NDF）：使用上述纤维分析仪测定。
表3 青贮90日后所得饲料的48小时瘤胃降解率（风干为基础）
| DM降解率 | CP降解率 | NDF降解率 | |
| 组1 | 62.2±2.3 | 55.4±3.1 | 49.6±3.3 |
| 组2 | 63.9±1.9 | 57.2±2.4 | 53.8±2.8 |
| 组3 | 68.5±2.5 | 58.5±3.1 | 55.6±1.4 |
虽然添加纤维素酶的产品质量指标较好，但组1和组2的瘤胃降解率实际差异不大（特别在DM降解率方面，CP和NDF降解组2仍然占优），而组3的纤维素酶处理使得饲料产品的瘤胃降解性能显著改善。
综上可见，添加纤维素酶，特别是本申请的适应低温低pH的纤维素酶可以有效改善玉米青贮饲料包括感官，pH，有机酸在内的品质，并改善其消化性能。本申请的适应低温低pH的纤维素酶在生产性能不降低的情况下有效的改善了低温低pH适应性，可以更好的用于玉米青贮饲料生产。
序列表
<110> 李旭业
<120> 突变型纤维素酶及其在玉米青贮中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 304
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
Met Ala Leu Ser Lys Leu Thr Leu Leu Ala Leu Leu Pro Phe Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ser Leu Ala Val Ser Gly Thr Gly Gln Thr Thr Arg Tyr
20 25 30
Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Ala Trp Thr Gly Lys Ala Ser Leu
35 40 45
Thr Ser Gly Pro Val Gln Ala Cys Asp Lys Asn Asp Asn Val Leu Ala
50 55 60
Asp Ala Asp Thr Lys Ser Ala Cys Asp Asn Gly Gly Pro Ala Tyr Met
65 70 75 80
Cys Ser Asp Glu Ser Pro Trp Ala Val Ser Asp Ser Leu Ala Tyr Gly
85 90 95
Tyr Ala Ala Val Ser Ile Ala Gly Gly Thr Glu Ala Ser Trp Cys Cys
100 105 110
Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ser Gly Lys Lys
115 120 125
Met Ile Val Gln Ala Thr Asn Thr Gly Gly Asp Leu Gly Gln Asn Gln
130 135 140
Phe Asp Leu Gly Met Pro Gly Gly Gly Phe Gly Leu Phe Asn Ala Cys
145 150 155 160
Thr Pro Gln Tyr Gly Thr Pro Ser Thr Gly Trp Gly Ala Gln Tyr Gly
165 170 175
Gly Ile Ser Ser Arg Ser Gln Cys Asp Ala Phe Pro Thr Ala Leu Lys
180 185 190
Ala Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln Asn Ala Asp Asn Pro
195 200 205
Thr Val Ser Phe Gln Ser Val Ala Cys Pro Leu Ala Leu Thr Asn Lys
210 215 220
Ser Gly Cys Val Arg Ala Asp Asp Thr Pro Thr Gly Ser Gly Thr Val
225 230 235 240
Ser Thr Ala Ser Gly Gly Gly Ala Val Ser Ser Thr Ser Ala Gly Thr
245 250 255
Thr Thr Pro Ser Ser Gly Thr Gly Thr Gly Gly Ala Thr Val Ala Lys
260 265 270
Phe Gly Gln Cys Gly Gly Ser Gly Trp Thr Gly Gly Thr Thr Cys Ala
275 280 285
Ala Gly Ser Thr Cys Gln Val Asn Asn Gln Trp Tyr Ser Gln Cys Leu
290 295 300
<210> 2
<211> 915
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
atggctctct ccaagctcac cctcctcgcc ctcctcccct tcttcctcgc cgccccctcc 60
ctcgccgtct ccggcactgg ccaaacaacc cgctactggg actgctgcaa gccgtcctgc 120
gcctggacag gcaaggcctc cttgacgagc ggccccgtgc aggcctgtga caagaacgac 180
aacgtgctcg ccgacgcaga taccaagtcc gcctgcgaca acggcggccc agcctacatg 240
tgctctgatg agagcccatg ggccgtctcg gacagcctgg cgtatggata cgccgcggtg 300
tcgatcgcgg gcgggacgga ggcgagctgg tgctgtgcct gctacgagtt gacgtttacg 360
agcggcccgg tgtctggcaa gaagatgatc gtgcaggcga cgaatacggg tggtgacctt 420
ggccagaatc aattcgatct cggcatgccc ggcggcggct tcggcctctt caacgcctgc 480
accccccaat acggcacgcc ctccaccggc tggggcgccc aatacggcgg tatctcctcg 540
cggagccagt gcgacgcctt ccccacggcc ctcaaagccg gctgctactg gcgcttcgac 600
tggttccaga acgccgacaa cccgaccgtc agcttccaga gcgtcgcgtg tccgctggcg 660
ctgacgaata aatcgggctg cgtgcgcgcg gatgatacgc cgacggggag tgggacggtg 720
tcgacggcga gtgggggagg ggcggtgagc tcgacgagtg cggggacgac gacgccgtcg 780
agcgggacgg ggactggggg tgcgacggtg gcgaagtttg ggcagtgtgg ggggtcgggg 840
tggacggggg ggacgacttg tgcggctgga tcgacttgcc aggtgaataa ccagtggtat 900
tcgcagtgct tgtaa 915
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<211> 304
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
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1 5 10 15
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35 40 45
Lys Ser Gly Pro Val Gln Ala Cys Asp Lys Asn Asp Asn Val Leu Ala
50 55 60
Asp Pro Asp Thr Lys Ser Ala Cys Asp Asn Gly Gly Pro Ala Tyr Met
65 70 75 80
Ala Ser Asp Glu Ser Pro Trp Ala Val Ser Asp Ser Leu Ala Tyr Gly
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Tyr Ala Ala Val Ser Ile Ala Gly Gly Thr Glu Ala Ser Trp Cys Cys
100 105 110
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130 135 140
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<210> 4
<211> 915
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
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tcgcagtgct tgtaa 915
Claims (10)
1.纤维素酶突变体，其特征在于：其在SEQ ID NO.1的基础上有一个或多个氨基酸突变，相比野生型所述突变体有更好的低pH和低温适应性。
2.根据权利要求1的纤维素酶突变体，其中所述氨基酸突变选自T49K、A66P、C81A、F145S、D146G。
3.根据权利要求2的纤维素酶突变体，其中所述氨基酸突变为T49K、A66P、C81A、F145S和D146G。
4.根据权利要求3的纤维素酶突变体，其中所述纤维素酶突变体氨基酸序列为SEQ IDNO.3。
5.编码纤维素酶突变体的基因，其特征在于：其在SEQ ID NO.2的核苷酸序列基础上有一个或多个核苷酸突变，相比野生型所述突变体有更好的低pH和低温适应性。
6.根据权利要求5的编码纤维素酶突变体的基因，其中所述编码纤维素酶突变体的基因核苷酸序列为SEQ ID NO.4。
7.根据权利要求1-4任一项的纤维素酶突变体或根据权利要求5-6任一项的编码纤维素酶突变体的基因在玉米青贮中的应用。
8.玉米青贮添加剂，其特征在于：包含根据权利要求1-4任一项的纤维素酶突变体。
9.根据权利要求8的玉米青贮添加剂，其中所述玉米青贮添加剂中还包含微生物成分。
10.根据权利要求9的玉米青贮添加剂，其中所述微生物成分为乳酸菌。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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Publications (2)
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ID=70567871
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| CN202010251197.1A Active CN111154743B (zh) | 2020-04-01 | 2020-04-01 | 突变型纤维素酶及其在玉米青贮中的应用 |
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| CN (1) | CN111154743B (zh) |
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