CN109715794A - 果胶裂解酶变体以及编码它们的多核苷酸 - Google Patents

果胶裂解酶变体以及编码它们的多核苷酸 Download PDF

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Abstract

本发明涉及相对于表现出果胶裂解酶活性的亲本酶表现出改变的果胶裂解酶变体；一种生产此类酶的方法；以及用于在纺织品、洗涤剂和纤维素纤维加工工业中使用此类酶的方法。与该亲本酶相比，本发明的果胶裂解酶变体在洗涤剂中表现出改善的稳定性。

Description

果胶裂解酶变体以及编码它们的多核苷酸
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技术领域
本发明涉及相对于亲本酶表现出改变的果胶裂解酶变体；一种生产此类酶的方法；以及用于在纺织品、洗涤剂和纤维素纤维加工工业中使用此类酶的方法。与亲本酶相比，本发明的果胶裂解酶变体在洗涤剂中表现出改善的稳定性，和/或例如在洗衣过程和/或衣物和/或餐具洗涤剂中表现出改善的热稳定性。
相关技术的说明
果胶聚合物是植物细胞壁的重要成分。果胶是一种主链由交替的同聚半乳糖醛酸聚糖(平滑区)和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(毛状区)组成的杂多糖。这些平滑区是1,4-连接的α-D-半乳糖醛酸的线性聚合物。半乳糖醛酸残基可以通常以非随机方式在羧基基团上被不同程度地甲基酯化，其中多个聚半乳糖醛酸嵌段被完全甲基酯化。
果胶裂解酶(果胶酶)可以根据它们的优选底物(高度甲基酯化的果胶或低甲基酯化的果胶和聚半乳糖醛酸(果胶酸))以及它们的反应机制(β-消除或水解)进行分类。果胶酶可以主要是内切作用，即在链内随机位点切割聚合物以产生寡聚物混合物；或者它们可以是外切作用，即从聚合物的一端进行攻击并产生单体或二聚体。酶命名法(1992)提供的酶分类中包括了几种作用于果胶平滑区的果胶酶活性，如果胶裂解酶(EC 4.2.2.2)、果胶裂解酶(EC 4.2.2.10)、聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)、外切聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.67)、外切聚半乳糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.9)和外切聚α-半乳糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.82)。
已经从不同的细菌属如欧文氏菌属(Erwinia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和黄单孢菌属(Xanthomonas)克隆了果胶裂解酶。还描述了从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(Nasser等人(1993)FEBS 335:319-326)和芽孢杆菌属(Bacillus sp.)YA-14(Kim等人(1994)Biosci.Biotech.Biochem.[生物科学生物技术和生物化学]58:947-949)克隆果胶裂解酶。
来自枯草芽孢杆菌的果胶裂解酶的变体已在专利申请WO 2002/092741和WO2003/095638中进行了披露。
果胶裂解酶通常特征在于碱性最适pH和对二价阳离子的绝对需要，Ca2+最有刺激性。
本发明的目的是提供一种细胞壁降解酶变体，一种果胶降解酶变体，尤其是果胶裂解酶变体，当应用于例如洗涤剂或纺织品工业过程中时这些变体表现出相对于亲本果胶裂解酶改善的性能。
发明内容
诸位发明人现在已发现，果胶裂解酶中的某些氨基酸取代产生与亲本酶相比，在中性或碱性pH范围内具有改善的性能和/或稳定性的酶变体，例如，所述性能和/或稳定性特别是在储存之后和/或在储存期间得以改善。当用于洗涤剂组合物中时，本发明的果胶裂解酶变体具有改善的储存稳定性，即在高温下对洗涤剂组分的较低敏感度或改善的稳定性。
因此，在一些方面，本发明涉及一种果胶裂解酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：位置编号250、176、124、108、149和325，其中该一个或多个改变独立地是：
(i)在占据该位置的氨基酸的下游插入氨基酸，
(ii)缺失占据该位置的氨基酸，或者
(iii)用不同的氨基酸取代占据该位置的氨基酸，
并且其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体果胶裂解酶与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％一致性。
在一些方面(例如，上文提及的任何方面)，本发明的果胶裂解酶变体包含在选自下组的位置处的一个或多个改变，该组由以下组成：位置250、176、124、325、108和149(例如，按给定顺序)，例如，最优选地，该变体包含位置250处的改变，进一步优选地，该变体包含位置176处的改变；进一步优选地，该变体包含位置124处的改变；进一步优选地，该变体包含位置325处的改变，进一步优选地，该变体包含位置108处的改变，进一步优选地，该变体包含位置149处的改变。
根据一个方面的这种变体果胶裂解酶优选地包含选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：E108A、E108G、E108H、E108K、E108L、E108M、E108N、E108R、E108S、E108T、E108V、E108W、D124A、D124E、D124F、D124G、D124I、D124L、D124M、D124N、D124P、D124Q、D124R、D124S、D124T、D124V、D124W、D124Y、S149K、S149L、S149R、S149W、S176A、S176C、S176D、S176E、I250A、I250G、I250L、I250M、I250N、I250S、I250T、I325F、I325L、以及I325Y。
本发明的变体可以包含进一步改变；或者可以是根据另一个方面的变体果胶裂解酶，这些变体果胶裂解酶优选地包含选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：P48A、P48F、P48H、P48I、P48K、P48L、P48N、P48Q、P48R、P48S、P48T、P48W、P48Y、T49F、T49H、T49I、T49K、T49L、T49M、T49N、T49Q、T49R、T49V、T49W、T49Y、K99A、K99C、K99D、K99E、K99F、K99G、K99H、K99I、K99L、K99M、K99N、K99P、K99Q、K99S、K99T、K99V、K99W、K99Y、E108A、E108G、E108H、E108K、E108L、E108M、E108N、E108R、E108S、E108T、E108V、E108W、D124A、D124E、D124F、D124G、D124I、D124L、D124M、D124N、D124P、D124Q、D124R、D124S、D124T、D124V、D124W、S149K、S149L、S149R、S149W、S176A、S176C、S176D、S176E、S229I、S229K、S229L、S229M、S229Q、S229T、S229V、S229Y、I250A、I250G、I250L、I250M、I250N、I250S、I250T、K257A、K257C、K257D、K257H、K257I、K257L、K257M、K257Q、K257S、K257V、K257W、I325F、I325L、I325Y、Q356D、Q356E、Q356F、Q356G、Q356H、Q356I、Q356L、Q356N、Q356R、Q356T、Q356W、Q356Y、K99D+S176D+I325F、T49R+K99D+S176D+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+S176D+I325F+Q356F、K99D+D124W+S176D+I325F+Q356F、P48W+K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+E108N+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+E108N+S176D+I325F+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49W+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、S229I+I250N、S229I+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+E108N+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+I250N+I325F+K257L+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、P48W+K257L、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356F、以及S229I+I250N+Q356F。
在另一个方面，本发明涉及一种亲本酶的变体，该变体具有果胶裂解酶活性(EC4.2.2.2)并且包含选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：P48A、P48F、P48H、P48I、P48K、P48L、P48N、P48Q、P48R、P48S、P48T、P48W、P48Y、T49F、T49H、T49I、T49K、T49L、T49M、T49N、T49Q、T49R、T49V、T49W、T49Y、K99A、K99C、K99D、K99E、K99F、K99G、K99H、K99I、K99L、K99M、K99N、K99P、K99Q、K99S、K99T、K99V、K99W、K99Y、E108A、E108G、E108H、E108K、E108L、E108M、E108N、E108R、E108S、E108T、E108V、E108W、D124A、D124E、D124F、D124G、D124I、D124L、D124M、D124N、D124P、D124Q、D124R、D124S、D124T、D124V、D124W、S149K、S149L、S149R、S149W、S176A、S176C、S176D、S176E、S229I、S229K、S229L、S229M、S229Q、S229T、S229V、S229Y、I250A、I250G、I250L、I250M、I250N、I250S、I250T、K257A、K257C、K257D、K257H、K257I、K257L、K257M、K257Q、K257S、K257V、K257W、I325F、I325L、I325Y、Q356D、Q356E、Q356F、Q356G、Q356H、Q356I、Q356L、Q356N、Q356R、Q356T、Q356W、Q356Y、K99D+S176D+I325F、T49R+K99D+S176D+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+S176D+I325F+Q356F、K99D+D124W+S176D+I325F+Q356F、P48W+K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+E108N+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+E108N+S176D+I325F+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49W+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、S229I+I250N、S229I+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+E108N+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+I250N+I325F+K257L+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、P48W+K257L、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356F、以及S229I+I250N+Q356F，其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置(例如，使用SEQ ID NO:1的编号)，并且其中该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％一致性。
在另一个方面，本发明涉及一种亲本酶的变体，该变体具有果胶裂解酶活性(EC4.2.2.2)并且包含选自下组的一个或多个取代，该组由在此以下中描述的取代组成：i)实例2的表1、ii)实例3的表2、iii)实例3的表3、iv)实例4的表4、v)实例5的表5，其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置(例如，使用SEQID NO:1的编号)，并且其中该变体与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少75％一致性。
在另一个方面，本发明涉及一种编码果胶裂解酶变体的核酸序列。
在本发明的另一个方面，提供了一种表达载体。
在本发明的另一个方面，提供了一种用上述表达载体转化的微生物宿主细胞。
在本发明的另一个方面，提供了一种用于改善果胶裂解酶的洗涤剂稳定性的方法，该方法包括改变一个或多个氨基酸。
在本发明的另一个方面，提供了用于生产根据本发明的果胶裂解酶变体的方法，这些方法包括培养已经引入了如上文披露的表达载体的细胞，由此所述细胞表达由核酸序列编码的变体；并且回收该果胶裂解酶变体。
本发明的果胶裂解酶变体可用于处理纤维素材料，尤其是含纤维素的纤维、纱线、织造或非织造织物；处理机械造纸浆或回收利用的废纸；以及用于浸解纤维。该处理可以在将纤维素材料加工成准备用于服装制造或织物制造的材料的过程中进行，例如，在退浆或煮练步骤中进行；或者在这种织物或服装的工业或家用洗涤过程中进行。
因此，在其他方面，本发明涉及一种洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含具有实质性细胞壁降解活性的果胶裂解酶变体；并且涉及本发明的果胶裂解酶变体用于处理(例如清洁)含纤维素的纤维、纱线、织造或非织造织物的用途。此外，本发明的另外的方面涉及一种酶组合物，该酶组合物包含本发明的果胶裂解酶变体与其他酶的组合；并且涉及一种清洁或洗涤剂组合物，优选衣物或餐具洗涤组合物，该组合物包含本发明的果胶裂解酶变体。
本发明的果胶裂解酶变体非常有效地用于纤维素材料的制备中的酶促煮练过程中，例如以用于在随后的染色操作中得到适当地响应。
本发明的另一个方面涉及葡萄酒和果汁的加工。酶或酶制剂可以用于处理来自水果和蔬菜的糊状物，以改善糊状物的可提取性或可降解性。
此外，本发明的一个方面是作为动物饲料添加剂的应用。当添加到含有来自大豆、油菜籽、羽扇豆等的植物材料的饲料中时，该果胶裂解酶变体显著改善植物细胞壁材料的体内分解，由此实现动物对植物营养物的更好利用。
此外，本发明的一个方面是本发明的变体用于降解含果胶的天然和加工食品污渍的用途。
序列简要说明
SEQ ID NO:1示出亲本果胶裂解酶，本发明的变体是基于该亲本果胶裂解酶。亲本果胶裂解酶是专利申请WO 2002/092741中披露的来自枯草芽孢杆菌的果胶裂解酶的变体。
SEQ ID NO:2示出同样适合作为亲本果胶裂解酶的同源物多肽(UNIPROT：Q6LEQ4-Kim,J等人Biosci Biotechnol Biochem.[生物科学生物技术和生物化学]1994 58:947-949)。
定义
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录物是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列步骤进行加工，包括剪接。
编码序列：术语“编码序列”意指多核苷酸，该多核苷酸直接规定了变体的氨基酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指为编码本发明的变体的多核苷酸的表达所需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有接头。
对应于：如在此使用的术语“对应于”是指用来确定序列中的特定氨基酸(其中参考了特定氨基酸序列)的方式。例如出于本发明的目的，当参考特定氨基酸位置时，技术人员会能够将另一氨基酸序列与所述已经被参考的氨基酸序列进行比对，从而确定哪一个特定氨基酸可能是在所述另一氨基酸序列中是感兴趣的。已经在此其他地方描述了另一氨基酸序列与例如如SEQ ID NO:1或2中所示的成熟序列或在此列出的任何其他序列的比对。可使用可替代的比对方法，并且这些方法为本领域技术人员所熟知。
洗涤剂稳定性”或“储存稳定性：术语“洗涤剂稳定性”或“储存稳定性”意图是指蛋白质在含有洗涤剂(例如阴离子表面活性剂)的配制品中的稳定性。阴离子表面活性剂的特征在于阴离子基团和疏水性尾的组合。当与蛋白质结合时，带正电荷的残基(如赖氨酸或精氨酸)和疏水区域因此可能是相互作用点。类似地，特别柔性的区将按动力学方式打开以使通常埋在蛋白质内部的氨基酸可被接近。这些残基典型地是疏水的，并且因此对表面活性剂的尾部具吸引力。酶与表面活性剂之间的化学相互作用极为肯定地将使酶失活。因此改善的洗涤剂或储存稳定性意指在一定洗涤剂浓度和温度下，在一定时间段后将保留较高的酶活性(较高的残余活性)。
因此，热稳定性和洗涤剂稳定性是蛋白质或酶的两个独立特征。
当进行实例3和/或实例4中所述的分析方法时，与亲本果胶裂解酶相比，具有改善的洗涤剂稳定性的本发明的果胶裂解酶变体可以表现出至少120％(优选至少140％、更优选至少160％、甚至更优选至少180％、甚至更优选至少200％、最优选至少250％并且特别是至少300％)残余活性。
表达：术语“表达”包括涉及变体的产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，该分子包含编码变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
半衰期改善因子：术语“半衰期改善因子”或“HIF”可以根据下式定义：HIF＝T1/2(变体)/T1/2(参考多肽，例如亲本或主链多肽)。计算HIF的优选方式也在下文的实例2中进行了描述，其通过引用结合在此。
硬表面清洁：在此将术语“硬表面清洁”定义为清洁硬表面，其中硬表面可以包括地板、桌子、墙壁、屋顶等，连同硬物体的表面，例如汽车(汽车洗涤)和餐具(餐具洗涤)。餐具洗涤包括但不限于，清洁盘子、杯子、玻璃杯、碗、用餐工具(例如匙、刀、叉)、上菜用具、陶瓷、塑料、金属、瓷器、玻璃及丙烯酸酯。
改善的洗涤性能：术语“改善的洗涤性能”在此定义为相对于亲本酶的洗涤性能，例如通过增加的去污展示增加的洗涤性能的变体酶。术语“改善洗涤性能”包括在衣物洗涤并且例如在硬表面清洁如自动化餐具洗涤(ADW)中的洗涤性能。
改善的特性：术语“改善的特性”意指与相对于亲本有所改善一种变体相关的特征。此类改善的性质包括但不限于洗涤剂稳定性，例如在液体洗涤剂中的稳定性、化学稳定性、氧化稳定性、pH稳定性、在储存条件下的稳定性。
分离的：术语“分离的”意指在自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，所述物质至少部分地从与其性质相关的一个或多个或所有天然存在的成分中除去；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。
修饰：在本发明的多肽的上下文中，术语“修饰”意指通过用不同的氨基酸取代、通过插入氨基酸、或通过缺失(优选地通过至少一个缺失)而改变在参考氨基酸序列(即SEQID NO:1或2)内的一个或多个氨基酸。术语“修饰”、“改变”和“突变”可以互换地使用并且构成相同的含义和目的。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单-链或双链的核酸分子，所述核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，所述核酸分子包含一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意思指这样一种配置，在所述配置中，一个控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，这样使得所述控制序列引导所述编码序列的表达。
亲本或亲本果胶裂解酶：术语“亲本”或“亲本果胶裂解酶”意指对其作出改变以产生本发明的这些酶变体的具有果胶裂解酶活性的任何多肽。示例性亲本果胶裂解酶在SEQID NO:1中示出。同样适合作为亲本果胶裂解酶的同源物多肽是从Kim等人(1994)Biosci.Biotech.Biochem.[生物科学生物技术和生物化学]58:947-949(UNIPROT：Q6LEQ4)已知的。
果胶裂解酶：术语“果胶裂解酶”意指催化(1→4)-α-D-聚半乳糖醛酸(galacturonan)的消除性裂解以产生在其非还原端具有4-脱氧-α-D-半乳-4-烯醛酸糖基基团的寡糖的活性(EC 4.2.2.2)。
出于本发明的目的，可以根据在方法或实例3和/或实例4中所描述的程序确定果胶裂解酶活性。在一个方面，本发明的变体具有SEQ ID NO:1的成熟多肽的果胶裂解酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％。
果胶：术语“果胶”表示可以被酯化至更高或更低程度的果胶酸、聚半乳糖醛酸和果胶。
果胶酶：术语“果胶酶”表示根据本领域定义的果胶酶，并且包括裂解果胶物质中的多糖和/或寡糖链的酶，例如聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸)及其衍生物(参见参考文献Sakai等人，Pectin,pectinase and protopectinase:production,properties andapplications[果胶、果胶酶和原果胶酶：生产、性质和应用],第213-294页于：Advances inApplied Microbiology[应用微生物学进展]第39卷,1993中)。果胶酶的非限制性实例包括水解酶型果胶酶(例如，鼠李糖半乳糖醛酸聚糖水解酶)和裂解酶型果胶酶(例如，果胶裂解酶)。优选地，本发明的果胶酶是通过反式消去(transelimination)催化果胶酸(也称为聚半乳糖醛酸)中α-1,4-糖苷键联的随机裂解的果胶酶，如聚半乳糖醛酸裂解酶类(EC4.2.2.2)(PGL)，也称为聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)裂解酶，也称为果胶裂解酶。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European MolecularBiology Open Software Suite)，Rice等人，2000，Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用Needle标记的“最长一致性”的输出(使用-nobrief选项获得)作为一致性百分比并且计算如下：
(一致的残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch，1970，见上文)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列一致性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序所实施的。使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。使用Needle标记的“最长一致性”的输出(使用-nobrief选项获得)作为一致性百分比并且计算如下：
(一致的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
样本：术语“样本”是指实例中使用的纺织品，这些纺织品从测试材料中心(Centerfor Testmaterials)BV，邮政信箱120，3133KT弗拉尔丁恩(Vlaardingen)，荷兰(Netherlands)获得。
变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如若干个)位置处包含改变，即取代、插入、和/或缺失的具有果胶裂解酶活性的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指除去占据某一位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占据某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。
本发明的变体具有SEQ ID NO:1的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的果胶裂解酶活性。
野生型果胶裂解酶：如在此使用的术语“野生型果胶裂解酶”是指由天然存在的微生物(如自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌)表达的果胶裂解酶。
变体命名规则
出于本发明的目的，使用在SEQ ID NO:1中披露的成熟多肽来确定另一种果胶裂解酶中相对应的氨基酸残基。将另一种果胶裂解酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人，2000，Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定与SEQ ID NO:1中所披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。
可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种果胶裂解酶中的相对应氨基酸残基的鉴定，这些计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多序列比较；版本3.5或更新版本；Edgar，2004，Nucleic Acids Research[核酸研究]32:1792-1797)、MAFFT(版本6.857或更新版本；Katoh和Kuma，2002，NucleicAcids Research[核酸研究]30:3059-3066；Katoh等人，2005，Nucleic Acids Research[核酸研究]33:511-518；Katoh和Toh，2007，Bioinformatics[生物信息学]23:372-374；Katoh等人，2009，Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]537:39-64；Katoh和Toh，2010，Bioinformatics[生物信息学]26:1899-1900)以及采用ClustalW(1.83或更新版本；Thompson等人，1994，Nucleic Acids Research[核酸研究]22:4673-4680)的EMBOSS EMMA。
当其他酶与SEQ ID NO:1的成熟多肽相背离，这样使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(Lindahl和Elofsson，2000，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]295:613-615)，可使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用搜索程序来获得，这些搜索程序采用多肽家族的概率表现(谱)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(Atschul等人，1997，Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白结构数据库中的一个或多个代表，甚至可以实现更高的敏感度。例如如GenTHREADER的程序(Jones，1999，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]287:797-815；McGuffin和Jones，2003，Bioinformatics[生物信息学]19:874-881)利用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，Gough等人，2000，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评估此类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白质，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白质的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问且可下载的。可以使用多种算法例如距离比对矩阵(Holm和Sander,1998,Proteins[蛋白质]33:88-96)或组合延伸(Shindyalov和Bourne,1998,Protein Engineering[蛋白质工程]11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，Holm和Park,2000,Bioinformatics[生物信息学]16:566-567)。
在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于引用方便。采用了已接受的IUPAC单字母和三字母的氨基酸缩写。
取代.对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、被取代的氨基酸。因此，将在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或者“T226A”。多个突变由加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表分别在位置205和位置411处甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代，并且丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。
缺失.对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，将在位置195处的甘氨酸的缺失表示为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入.对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸被表示为“Gly195GlyLys”或者“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是：
<u>亲本：</u> <u>变体：</u>
195 195 195a 195b
G G-K-A
多种改变.包含多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如，“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”表示在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。
不同改变.在可以在某一位置引入不同的改变的情况下，这些不同的改变由逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”表示在位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”指定以下变体：
“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
具体实施方式
本发明涉及亲本果胶裂解酶(EC 4.2.2.2)的变体。与亲本酶相比，这些变体具有改善的性质，尤其是洗涤剂组合物中的洗涤剂稳定性或储存稳定性得以改善。
在改善亲本果胶裂解酶的性质的过程中，诸位发明人发现亲本多肽主链中特定氨基酸的改变将显著改变所产生的变体的洗涤剂稳定性。
变体
在一个方面，本发明提供了果胶裂解酶变体，这些变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：位置250、176、124、108、149和325，其中根据SEQ IDNO:1的成熟多肽进行编号，并且其中该一种或多种改变独立地是：
(i)在占据该位置的氨基酸的下游插入氨基酸；
(ii)缺失占据该位置的氨基酸；或者
(iii)用不同的氨基酸取代占据该位置的氨基酸，
并且其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体果胶裂解酶与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％一致性。
在一个实施例中，这些果胶裂解酶变体包含在对应于位置250、176、124、108、149和325的一个或多个(例如，若干个)位置中的取代，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，并且其中该变体具有果胶裂解酶活性。
在一个具体实施例中，该果胶裂解酶变体包含在以下位置中的取代：250+124、250+108、250+149、250+325、176+124、176+108、176+149、176+325、124+108、124+149、124+325、108+149、108+325、149+325、250+176+124、250+176+108、250+176+149、250+176+325、250+124+108、250+124+149、250+124+325、250+108+149、250+108+325、250+149+325、176+124+108、176+124+149、176+124+325、176+108+149、176+108+325、176+149+325、124+108+149、124+108+325、124+149+325、108+149+325、250+176+124+108、250+176+124+149、250+176+124+325、250+176+108+149、250+176+108+325、250+176+149+325、250+124+108+149、250+124+108+325、250+124+149+325、250+108+149+325、176+124+108+149、176+124+108+325、176+124+149+325、176+108+149+325、124+108+149+325、250+176+124+108+149、250+176+124+108+325、250+176+124+149+325、250+176+108+149+325、250+124+108+149+325、176+124+108+149+325、以及250+176+124+108+149+325，其中根据SEQ ID NO:1的成熟多肽进行编号，并且其中该变体具有果胶裂解酶活性。
在另一个方面，本发明提供了果胶裂解酶变体，这些变体包含在对应于位置48、49、99、108、124、149、176、229、250、257、325、以及356(例如，相对于SEQ ID NO:1进行编号)的一个或多个(例如，若干个)位置处的取代，其中该变体具有果胶裂解酶活性。
在一个实施例中，这些果胶裂解酶变体包含在以下位置中的取代：48+49、48+99、48+108、48+124、48+149、48+176、48+229、48+250、48+257、48+325、48+356、49+99、49+108、49+124、49+149、49+176、49+229、49+250、49+257、49+325、49+356、99+108、99+124、99+149、99+176、99+229、99+250、99+257、99+325、99+356、108+124、108+149、108+176、108+229、108+250、108+257、108+325、108+356、124+149、124+176、124+229、124+250、124+257、124+325、124+356、149+176、149+229、149+250、149+257、149+325、149+356、176+229、176+250、176+257、176+325、176+356、229+250、229+257、229+325、229+356、250+257、250+325、250+356、257+325、257+356、325+356、48+49+99、48+49+108、48+49+124、48+49+149、48+49+176、48+49+229、48+49+250、48+49+257、48+49+325、48+49+356、48+99+108、48+99+124、48+99+149、48+99+176、48+99+229、48+99+250、48+99+257、48+99+325、48+99+356、48+108+124、48+108+149、48+108+176、48+108+229、48+108+250、48+108+257、48+108+325、48+108+356、48+124+149、48+124+176、48+124+229、48+124+250、48+124+257、48+124+325、48+124+356、48+149+176、48+149+229、48+149+250、48+149+257、48+149+325、48+149+356、48+176+229、48+176+250、48+176+257、48+176+325、48+176+356、48+229+250、48+229+257、48+229+325、48+229+356、48+250+257、48+250+325、48+250+356、48+257+325、48+257+356、48+325+356、49+99+108、49+99+124、49+99+149、49+99+176、49+99+229、49+99+250、49+99+257、49+99+325、49+99+356、49+108+124、49+108+149、49+108+176、49+108+229、49+108+250、49+108+257、49+108+325、49+108+356、49+124+149、49+124+176、49+124+229、49+124+250、49+124+257、49+124+325、49+124+356、49+149+176、49+149+229、49+149+250、49+149+257、49+149+325、49+149+356、49+176+229、49+176+250、49+176+257 49+176+325、49+176+356、49+229+250、49+229+257、49+229+325、49+229+356、49+250+257、49+250+325、49+250+356、49+257+325、49+257+356、49+325+356、99+108+124、99+108+149、99+108+176、99+108+229、99+108+250、99+108+257、99+108+325、99+108+356、99+124+149、99+124+176、99+124+229、99+124+250、99+124+257、99+124+325、99+124+356、99+149+176、99+149+229、99+149+250、99+149+257、99+149+325、99+149+356、99+176+229、99+176+250、99+176+257、99+176+325、99+176+356、99+229+250、99+229+257、99+229+325、99+229+356、99+250+257、99+250+325、99+250+356、99+257+325、99+257+356、99+325+356、108+124+149、108+124+176、108+124+229、108+124+250、108+124+257、108+124+325、108+124+356、108+149+176、108+149+229、108+149+250、108+149+257、108+149+325、108+149+356、108+176+229、108+176+250、108+176+257、108+176+325、108+176+356、108+229+250、108+229+257、108+229+325、108+229+356、108+250+257、108+250+325、108+250+356、108+257+325、108+257+356、108+325+356、124+149+176、124+149+229、124+149+250、124+149+257、124+149+325、124+149+356、124+176+229、124+176+250、124+176+257、124+176+325、124+176+356、124+229+250、124+229+257、124+229+325、124+229+356、124+250+257、124+250+325、、124+250+356、124+257+325、124+257+356、124+325+356、149+176+229、149+176+250、149+176+257、149+176+325、149+176+356、149+229+250、149+229+257、149+229+325、149+229+356、149+250+257、149+250+325、149+250+356、149+257+325、149+257+356、149+325+356、176+229+250、176+229+257、176+229+325、176+229+356、176+250+257、176+250+325、176+250+356、176+257+325、176+257+356、176+325+356、229+250+257、229+250+325、229+250+356、229+257+325、229+257+356、229+325+356、250+257+325、250+257+356、250+325+356、以及257+325+356，其中根据SEQ ID NO:1的成熟多肽进行编号，并且该变体具有果胶裂解酶活性。
本发明进一步提供了果胶裂解酶变体，这些变体包含在对应于以下位置的一个或多个(例如，若干个)位置处的取代(或多个取代)：48、49、99、108、124、149、176、229、250、257、325、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、99+176+325+356、99+49+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、229+250、229+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356、48+229、229+257、229+250、229+356、48+257、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、229+250+356(例如，相对于SEQ ID NO:1进行编号)，其中该变体具有果胶裂解酶活性。
在一个优选的实施例中，该变体包含在位置48、49、108、124和149中的一个或多个中对携带正电荷的氨基酸(即对赖氨酸或精氨酸)的取代(例如，根据SEQ ID NO:1进行编号)。因此，本发明的优选变体包括其中通过在位置48、49、108、124和149(例如，根据SEQ IDNO:1进行编号)中的一个或多个中的取代使酶的总电荷更加阳性的变体。
在一个实施例中，该变体与亲本果胶裂解酶的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在另一个实施例中，该亲本与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。
在一个方面，在本发明的变体中的改变数目是1-20个，例如1-10个和1-5个，如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个改变。
在另一个方面，该变体包含在对应于位置48的位置处的取代。优选地，在对应于位置48的位置处的氨基酸被Ala、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr取代，优选地被Arg、Lys或Thr取代。
在另一个方面，该变体包含在对应于位置49的位置处的取代。优选地，在对应于位置49的位置处的氨基酸被Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Val、Trp或Tyr取代，优选地被Arg、Lys或Trp取代。
在另一个方面，该变体包含在对应于位置99的位置处的取代。优选地，在对应于位置99的位置处的氨基酸被Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代，优选地被Cys或Glu或Asp取代。
在另一个方面，该变体包含在对应于位置108的位置处的取代。优选地，在对应于位置108的位置处的氨基酸被Ala、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Arg、Ser、Thr、Val或Trp取代，优选地被Lys、Asn或Arg取代。
在另一个方面，该变体包含在对应于位置124的位置处的取代。优选地，在对应于位置124的位置处的氨基酸被Ala、Glu、Phe、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr取代，优选地被Arg或Trp取代。
在另一个方面，该变体包含在对应于位置149的位置处的取代。优选地，在对应于位置149的位置处的氨基酸被Lys、Leu、Arg或Trp取代，优选地被Lys或Arg取代。
在另一个方面，该变体包含在对应于位置176的位置处的取代。优选地，在对应于位置176的位置处的氨基酸被Ala、Cys、Asp或Glu取代，优选地被Cys或Asp取代。
在另一个方面，该变体包含在对应于位置229的位置处的取代。优选地，在对应于位置229的位置处的氨基酸被Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Val、Thr或Tyr取代，优选地被Ile、Lys、Tyr或Val取代。
在另一个方面，该变体包含在对应于位置250的位置处的取代。优选地，在对应于位置250的位置处的氨基酸被Ala、Gly、Leu、Met、Asn、Ser或Thr取代，优选地被Leu、Asn或Thr取代。
在另一个方面，该变体包含在对应于位置257的位置处的取代。优选地，在对应于位置257的位置处的氨基酸被Ala、Cys、Asp、His、Ile、Leu、Met、Gln、Ser、Val或Trp取代，优选地被Leu、Met、Gln、His、Cys或Asp取代。
在另一个方面，该变体包含在对应于位置325的位置处的取代。优选地，在对应于位置325的位置处的氨基酸被Phe、Leu或Tyr取代，优选地被Phe取代。
在另一个方面，该变体包含在对应于位置356的位置处的取代。优选地，在对应于位置356的位置处的氨基酸被Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Leu、Asn、Arg、Thr、Trp或Tyr取代，优选地被Glu或Phe取代。
这种变体果胶裂解酶优选地包含选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：P48A、P48F、P48H、P48I、P48K、P48L、P48N、P48Q、P48R、P48S、P48T、P48W、P48Y、T49F、T49H、T49I、T49K、T49L、T49M、T49N、T49Q、T49R、T49V、T49W、T49Y、K99A、K99C、K99D、K99E、K99F、K99G、K99H、K99I、K99L、K99M、K99N、K99P、K99Q、K99S、K99T、K99V、K99W、K99Y、E108A、E108G、E108H、E108K、E108L、E108M、E108N、E108R、E108S、E108T、E108V、E108W、D124A、D124E、D124F、D124G、D124I、D124L、D124M、D124N、D124P、D124Q、D124R、D124S、D124T、D124V、D124W、S149K、S149L、S149R、S149W、S176A、S176C、S176D、S176E、S229I、S229K、S229L、S229M、S229Q、S229T、S229V、S229Y、I250A、I250G、I250L、I250M、I250N、I250S、I250T、K257A、K257C、K257D、K257H、K257I、K257L、K257M、K257Q、K257S、K257V、K257W、I325F、I325L、I325Y、Q356D、Q356E、Q356F、Q356G、Q356H、Q356I、Q356L、Q356N、Q356R、Q356T、Q356W、Q356Y、K99D+S176D+I325F、T49R+K99D+S176D+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+S176D+I325F+Q356F、K99D+D124W+S176D+I325F+Q356F、P48W+K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+E108N+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+E108N+S176D+I325F+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49W+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、S229I+I250N、S229I+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+E108N+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+I250N+I325F+K257L+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、P48W+K257L、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F I250N+Q356F、以及S229I+I250N+Q356F，其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％一致性。
更优选地，该变体果胶裂解酶包含选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：S229I、I250L、T49R、S229V、S229K、I250N、以及I250T。
甚至更优选地，该变体果胶裂解酶包含选自下组的一个或两个取代，该组由以下组成：S229I和I250N。因此，在一个实施例中，该果胶裂解酶变体包含选自下组的取代或由选自下组的取代组成，该组由以下组成：S229I+I250L、S229I+I250N、S229I+I250T、I250L+S229V、I250L+S229K、S229V+I250N、S229V+I250T、S229K+I250N、以及S229K+I250T，其中根据SEQ ID NO:1的成熟多肽进行编号，并且其中该变体具有果胶裂解酶活性。
在另一个方面，该变体包含在对应于位置48和229的位置处的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面，该变体包含在对应于位置49和229的位置处的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。因此，在一个实施例中，该果胶裂解酶变体包含选自下组的取代或由选自下组的取代组成，该组由以下组成：S229I+T49R、T49R+S229V、以及T49R+S229K，其中根据SEQ ID NO:1的成熟多肽进行编号，并且该变体具有果胶裂解酶活性。
在另一个方面，该变体包含在对应于位置48和250的位置处的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。因此，在一个实施例中，该果胶裂解酶变体包含选自下组的取代或由选自下组的取代组成，该组由以下组成：I250L+T49R、T49R+I250N、以及T49R+I250T，其中根据SEQ ID NO:1的成熟多肽进行编号，并且该变体具有果胶裂解酶活性。
在另一个方面，该变体包含以下项或由以下项组成：在对应于位置229和257的位置处的改变，如上文描述的那些。
在另一个方面，该变体在对应于位置229和250的位置处包括改变或由其组成，如以上所述的那些。
在另一个方面，该变体包含在对应于位置229和356的位置处的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面，该变体包含在对应于位置250和257的位置处的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面，该变体包含在对应于位置49、99、176、229、257、325、以及356的位置处的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在另一个方面，该变体包含在对应于位置49、99、176、229、250、257、325、以及356的位置处的改变，或由这些改变组成，如上文描述的那些。
在一个优选的方面，该变体包含选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：49R、99D、108N/K/R、124R、149K/R、229I/V/Y、250L/N/T、257C/D/H/M/Q和325F。
目前预期，当与亲本酶相比时，这些取代中的一个或多个单独地或组合地提高了果胶裂解酶变体的洗涤剂稳定性。
提高变体果胶裂解酶的洗涤剂稳定性的优选多重取代包括：P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、P48W+K257L、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356F、K99D+S176D+I325F、T49R+K99D+S176D+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+S176D+I325F+Q356F、K99D+D124W+S176D+I325F+Q356F、P48W+K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+E108N+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+E108N+S176D+I325F+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+E108N+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+I250N+I325F+K257L+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49W+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F T49R+K99D+D124W+S176D+K257L+I325F+Q356F、以及S229I+I250N+Q356F，并且其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致性，该变体具有果胶裂解酶活性。
提高洗涤剂稳定性的更优选的多重取代包括：T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+I250N+I325F+K257L+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229+I Q356F、I250N+K257L、P48W+I250N、以及I250N+Q356F。
甚至更优选地，该变体包含选自下组的取代组合，该组由以下组成：T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、S229I+I250N、以及S229I+Q356F。
在一个方面，该变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S299I或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致性的具有果胶裂解酶活性的多肽或由其组成，并且另外与SEQ ID NO:1的成熟果胶裂解酶相比，该变体具有改善的稳定性。在此方面，该变体与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致性。
在一个方面，该变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代I250N或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致性的具有果胶裂解酶活性的多肽或由其组成，并且另外与SEQ ID NO:1的成熟果胶裂解酶相比，该变体具有改善的稳定性。在此方面，该变体与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致性。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致性的具有果胶裂解酶活性的多肽或由其组成，并且另外与SEQ ID NO:1的成熟果胶裂解酶相比，该变体具有改善的稳定性。在此方面，该变体与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致性。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代T49R+K99D+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致性的具有果胶裂解酶活性的多肽或由其组成，并且另外与SEQ ID NO:1的成熟果胶裂解酶相比，该变体具有改善的稳定性。在此方面，该变体与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致性。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S229I+I250N或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致性的具有果胶裂解酶活性的多肽或由其组成，并且另外与SEQ ID NO:1的成熟果胶裂解酶相比，该变体具有改善的稳定性。在此方面，该变体与SEQID NO:1的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致性。
在另一个方面，该变体包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的取代S229I+Q356F或由其组成，或者包含与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致性的具有果胶裂解酶活性的多肽或由其组成，并且另外与SEQ ID NO:1的成熟果胶裂解酶相比，该变体具有改善的稳定性。在此方面，该变体与SEQID NO:1的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致性。
该变体可以进一步包含选自下组的一个或多个另外的取代，该组由以下组成：SEQID NO:1成熟多肽的1、2、3、4、6、7、8、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、27、29、32、33、34、35、36、38、39、41、42、43、44、53、55、56、57、58、59、60、62、63、65、66、67、72、73、77、78、80、81、82、83、84、85、88、89、90、92、93、94、95、96、97、98、100、101、102、103、104、108、109、110、112、113、114、117、119、120、121、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、135、137、138、142、143、144、145、147、149、150、151、152、153、154、155、157、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、183、184、187、188、190、191、192、195、197、198、200、203、205、205、207、208、209、210、211、212、214、216、217、219、220、221、222、223、225、226、227、230、231、232、233、236、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、252、253、254、255、259、260、261、262、263、364、265、266、267、268、269、270、271、273、274、275、276、278、279、280、281、282、283、284、285、287、288、289、290、291、292、293、294、296、297、299、300、304、306、309、310、311、312、313、315、317、318、319、320、321、322、325、327、328、329、330、342、343、344、345、346、347、348、350、351、352、353、354、355、358、359、360、361、362、364、365、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、379、380、382、383、385、386、388、390、392、394、395、396、398、以及399，或者包含与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致性的具有果胶裂解酶活性的多肽，并且另外与SEQ ID NO:1的成熟果胶裂解酶相比，该变体具有改善的稳定性。
该变体还可以包含选自下组的一个或多个另外的取代，该组由以下组成：SEQ IDNO:1的成熟多肽的5、9、11、26、28、30、31、37、40、45、46、47、48、49、50、51、52、54、61、64、68、69、70、71、74、75、76、79、86、87、91、99、105、106、107、111、115、116、118、122、123、134、136、139、140、141、146、148、156、158、170、182、185、186、189、193、194、196、199、201、202、204、213、215、218、224、228、229、234、235、237、251、256、257、258、272、277、286、295、298、301、302、303、305、307、308、314、316、323、324、326、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、349、356、357、363、366、378、381、384、386、387、389、390、391、393、以及397，或者包含与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％一致性的具有果胶裂解酶活性的多肽，并且另外与SEQ ID NO:1的成熟果胶裂解酶相比，该变体具有改善的稳定性。
此类另外的取代还可以包括微小性质的氨基酸变化，即不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；通常为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-末端或羧基末端延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能(如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化的小延伸。
保守取代的实例在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
可替代地，这些氨基酸改变具有这样一种性质，使得多肽的物理化学性质发生改变。例如，氨基酸改变可以改善多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。显著影响变体性质的此类另外的取代包括在专利申请WO 2002/092741和WO 2003/095638中披露的那些。
可以根据本领域已知的程序(如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085))来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的果胶裂解酶活性以鉴定对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性位点还可以通过对结构的物理分析来确定，如通过这样的技术确定：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。参见例如，de Vos等人,1992,Science[科学]255:306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。
SEQ ID NO:1中的果胶裂解酶用作一种亲本酶的实例。亲本果胶裂解酶可以是(a)与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽，该多肽具有果胶裂解酶活性。在特定实施例中，亲本酶是与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少96％序列一致性的亲本果胶裂解酶。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的成熟多肽相差多达10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
在另一个方面，该亲本包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，该亲本包含SEQ ID NO:1的成熟多肽或由其组成。
该多肽可以是杂合多肽，其中一个多肽的区域在另一个多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。
该亲本可以是融合多肽或可裂解融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明的多核苷酸融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，以使得它们在框内，并且融合多肽的表达处于一个或多个相同的启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。
融合多肽可以进一步包含两种多肽之间的裂解位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被裂解，从而释放这两种多肽。裂解位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人，1989,Proteins[蛋白质]；Structure,Function,and Genetics[结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World[世界药物发现]4:35-48。
该亲本可以从任何属类的微生物中获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从……中获得”应意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或者由已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，亲本是胞外分泌的。
该亲本可以是细菌果胶裂解酶。例如，该亲本可以是革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)果胶裂解酶；或革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)果胶裂解酶。
在一个方面，该亲本是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)果胶裂解酶。
这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection,Northern Regional Research Center，NRRL)。
可以使用上文提及的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得所述亲本。用于直接地从自然生活环境分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可通过类似地筛选另一种微生物或混合DNA样品的基因组DNA或cDNA文库来获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码亲本的多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的技术来分离或克隆该多核苷酸(参见例如，Sambrook等人，1989，见上文)。
变体的制备
本发明还涉及用于获得具有果胶裂解酶活性的变体的方法，这些方法包括：(a)向亲本果胶裂解酶(例如，具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)中在对应于以下位置的一个或多个(例如，若干个)位置处引入取代：48、49、99、108、124、149、176、229、250、257、325、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、99+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、229+250、229+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356、以及48+257(例如，使用根据SEQ ID NO:1的编号)和/或(b)向亲本果胶裂解酶(例如，具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)中引入选自下组的取代中的一个或多个，该组由以下组成：SEQ ID NO:1的成熟多肽的P48A、P48F、P48H、P48I、P48K、P48L、P48N、P48Q、P48R、P48S、P48T、P48W、P48Y、T49F、T49H、T49I、T49K、T49L、T49M、T49N、T49Q、T49R、T49V、T49W、T49Y、K99A、K99C、K99D、K99E、K99F、K99G、K99H、K99I、K99L、K99M、K99N、K99P、K99Q、K99S、K99T、K99V、K99W、K99Y、E108A、E108G、E108H、E108K、E108L、E108M、E108N、E108R、E108S、E108T、E108V、E108W、D124A、D124E、D124F、D124G、D124I、D124L、D124M、D124N、D124P、D124Q、D124R、D124S、D124T、D124V、D124W、S149K、S149L、S149R、S149W、S176A、S176C、S176D、S176E、S229I、S229K、S229L、S229M、S229Q、S229T、S229V、S229Y、I250A、I250G、I250L、I250M、I250N、I250S、I250T、K257A、K257C、K257D、K257H、K257I、K257L、K257M、K257Q、K257S、K257V、K257W、I325F、I325L、I325Y、Q356D、Q356E、Q356F、Q356G、Q356H、Q356I、Q356L、Q356N、Q356R、Q356T、Q356W、Q356Y、K99D+S176D+I325F、T49R+K99D+S176D+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+S176D+I325F+Q356F、K99D+D124W+S176D+I325F+Q356F、P48W+K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+E108N+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+E108N+S176D+I325F+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49W+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、S229I+I250N、S229I+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+E108N+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+I250N+I325F+K257L+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、P48W+K257L、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、以及I250N+Q356F，其中该变体具有果胶裂解酶活性；并且(c)回收该变体。
在一个优选的实施例中，该方法包括：(a)向亲本果胶裂解酶(例如，具有SEQ IDNO:1)中引入选自下组的改变(或多个改变)，该组由以下组成：
SEQ ID NO:1的成熟多肽的P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、P48W+K257L、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356F、K99D+S176D+I325F、T49R+K99D+S176D+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+S176D+I325F+Q356F、K99D+D124W+S176D+I325F+Q356F、P48W+K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+E108N+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+E108N+S176D+I325F+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+E108N+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+I250N+I325F+K257L+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49W+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+K257L+I325F+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、P48W+K257L、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356F、K99D+S176D+I325F、T49R+K99D+S176D+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+S176D+I325F+Q356F、K99D+D124W+S176D+I325F+Q356F、P48W+K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+E108N+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+E108N+S176D+I325F+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+E108N+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+I250N+I325F+K257L+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49W+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+K257L+I325F+Q356F、以及S229I+I250N+Q356F，其中该变体具有果胶裂解酶活性；并且(b)回收该变体。
在另一方面，本发明还涉及用于获得具有果胶裂解酶活性的变体的方法，这些方法包括：(a)向亲本果胶裂解酶(例如，具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)中在对应于位置250、176、124、108、149和325的一个或多个(例如，若干个)位置处引入取代，其中根据SEQID NO:1的成熟多肽进行编号，其中该变体具有果胶裂解酶活性；并且(b)任选地，回收该变体。
在一些方面(例如，上述方面中的任一个)，该方法进一步包括纯化该变体。
可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备变体，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。
定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。
通过涉及使用含有所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，该盒式诱变涉及由限制酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将包含突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制酶是相同的，从而允许该质粒的粘性末端以及插入片段彼此连接。参见，例如，Scherer和Davis，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]76:4949-4955；以及Barton等人，1990，Nucleic Acids Res.[核酸研究]18:7349-4966。
还可以通过本领域已知的方法在体内实现定点诱变。参见例如，美国专利申请公布号2004/0171154；Storici等人，2001，Nature Biotechnol.[自然生物技术]19:773-776；Kren等人，1998，Nat.Med.[自然医学]4:285-290；以及Calissano和Macino，1996，FungalGenet.Newslett.[真菌遗传学简讯]43:15-16。
任何定点诱变程序可用于本发明。存在许多可以用于制备变体的可商购的试剂盒。
合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，例如由Tian等人(2004，Nature[自然]432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
使用已知的诱变、重组和/或改组方法，随后进行相关的筛选程序可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，这些相关的筛选程序是如由以下文献披露的那些：Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625。其他可使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人，1986，Gene[基因]46:145；Ner等人,1988,DNA7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可以从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许迅速确定多肽中个体氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多方面来实现半合成基因的构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，然而还有其他区域可以进行易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的变体的多核苷酸。因此，在一个方面，本发明涉及编码变体的多核苷酸，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：250、176、124、325、108、149、48、49、99、229、257、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、99+176+325+356、99+49+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356、48+257、以及229+250+356，其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少65％、但小于100％一致性。
在另一个方面，本发明涉及编码变体的多核苷酸，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：位置250、176、124、108、149和325，其中根据SEQ IDNO:1进行编号，并且其中该一种或多种改变独立地是：
(i)在占据该位置的氨基酸的下游插入氨基酸；
(ii)缺失占据该位置的氨基酸；或者
(iii)用不同的氨基酸取代占据该位置的氨基酸，
并且其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体果胶裂解酶与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％一致性。
核酸构建体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与这些控制序列相容的条件下指导编码序列在合适的宿主细胞中表达。因此，在一个方面，本发明涉及核酸构建体，这些核酸构建体包含编码变体的多核苷酸，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：250、176、124、325、108、149、48、49、99、229、257、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、99+176+325+356、99+49+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356、48+257、以及229+250+356，其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少65％、但小于100％一致性，这些核酸构建体可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列在与这些控制序列相容的条件下指导编码序列在合适的宿主细胞中表达。
在另一个方面，本发明涉及核酸构建体，这些核酸构建体包含编码变体的多核苷酸，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：位置250、176、124、108、149和325，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，并且其中该一种或多种改变独立地是：
(i)在占据该位置的氨基酸的下游插入氨基酸；
(ii)缺失占据该位置的氨基酸；或者
(iii)用不同的氨基酸取代占据该位置的氨基酸，
并且其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体果胶裂解酶与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％一致性，这些核酸构建体可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列在与这些控制序列相容的条件下指导编码序列在合适的宿主细胞中表达。
可以按多种方式来操纵多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可为希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域已知的。
控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人,1988,Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述于Gilbert等人,1980,Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Usefulproteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和在Sambrook等人,1989,同上。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导子由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替代；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替换未翻译的前导序列)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。
在酵母宿主中，从以下酶的基因获得有用的启动子：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。酵母宿主细胞的其他有用的启动子由Romanos等人,1992,Yeast[酵母]8：423-488描述。
控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子序列被可操作地连接至编码变体的多核苷酸的3’-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。
用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。
丝状真菌宿主细胞的优选终止子获得自以下各项的基因：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的优选的终止子从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。酵母宿主细胞的其他有用的终止子由Romanos等人,1992,同上描述。
所述控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定子区域，它增加所述基因的表达。
合适的mRNA稳定子区域的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人，1995，Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。
控制序列也可以是前导子，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区域。前导子序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
酵母宿主细胞的合适的前导序列从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
该控制序列还可以是一种多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至该变体编码序列的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
丝状真菌宿主细胞的优选多聚腺苷酸化从针对以下的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸酯合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉-α葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、和尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶。
酵母宿主细胞的有用的多聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。
控制序列还可以是信号肽编码区，其编码与变体的N-末端连接的信号肽，并且指导变体进入细胞的分泌通路。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地含有信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，该编码序列的5’末端可以包含对于该编码序列来说是外来的信号肽编码序列。在编码序列天然地不含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列，以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢杆菌prsA。Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews[微生物学评论]57:109-137描述了另外的信号肽。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因中获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑毛霉天冬氨酸蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。其他的有用的信号肽编码序列由Romanos等人,1992,同上描述。
所述控制序列还可以是编码位于变体的N-末端的前肽的前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下酶的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，前肽序列定位成紧邻变体的N-末端并且信号肽序列定位成紧邻前肽序列的N-末端。
还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节变体的表达的调控序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调控序列的其他实例是那些允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将与该调控序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。因此，在一个方面，本发明涉及重组表达载体，这些重组表达载体包含编码变体的多核苷酸，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：250、176、124、325、108、149、48、49、99、229、257、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、99+176+325+356、99+49+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356、48+257、以及229+250+356，其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少65％、但小于100％一致性；启动子；以及转录和翻译终止信号。
在另一个方面，本发明涉及重组表达载体，这些重组表达载体包含编码变体的多核苷酸，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：位置250、176、124、108、149和325，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，并且其中该一种或多种改变独立地是：
(i)在占据该位置的氨基酸的下游插入氨基酸；
(ii)缺失占据该位置的氨基酸；或者
(iii)用不同的氨基酸取代占据该位置的氨基酸，
并且其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体果胶裂解酶与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％一致性；启动子；以及转录和翻译终止信号。
各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，所述重组表达载体可以包括一个或多个合宜的限制位点以允许在这样的位点处插入或取代编码变体的多核苷酸。可替代地，多核苷酸可通过将所述多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生所述表达载体时，所述编码序列位于所述载体中使得所述编码序列与所述用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可方便地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何装置。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。
载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标志。选择性标志是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养性等。
细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。酵母宿主细胞的合适的标志包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等效物。优选地用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。
载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码所述变体的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的载体的任何其他元件。可替代地，所述载体可含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，整合的元件应包含足够数量的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，其与相应的靶序列具有高度的序列一致性以增强同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一个方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步包含使载体能够在所讨论的宿主细胞中自主地进行复制的复制起点。复制起点可为在细胞中有功能的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是容许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，以及容许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人,1991,Gene[基因]98:61-67；Cullen等人,1987,Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含所述基因的质粒或载体的构建。
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与所述多核苷酸一起的可扩增的选择性标志基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择含有选择性标志基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此所述多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域的技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等人,1989,同上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，所述一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。因此，在一个方面，本发明涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导变体的产生，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：250、176、124、325、108、149、48、49、99、229、257、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、99+176+325+356、99+49+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356、48+257、以及229+250+356，其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少65％、但小于100％一致性。
在另一个方面，本发明涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码变体的多核苷酸，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：位置250、176、124、108、149和325，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，并且其中该一种或多种改变独立地是：
(i)在占据该位置的氨基酸的下游插入氨基酸；
(ii)缺失占据该位置的氨基酸；或者
(iii)用不同的氨基酸取代占据该位置的氨基酸，
并且其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体果胶裂解酶与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％一致性。
将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码变体的基因及其来源。
宿主细胞可以是在变体的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可为任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可为任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)和马链球菌(Streptococcus equi)兽瘟(Zooepidemicus)亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen，1979，Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Young和Spizizen,1961，J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829；或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques[生物技术]6:742-751)或轭合(参见例如，Koehler和Thorne，1987，J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人,1988,Nucleic AcidsRes.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人，2004,Folia Microbiol.(Praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49:399-405)、接合(参见例如，Mazodier等人，1989，J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)或转导(参见例如，Burke等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可以通过以下来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人,2006,J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或接合(参见例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(naturalcompetence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick，1991，Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见，例如，Buckley等人，1999，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或接合(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
该宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人所定义的，在：Ainsworth andBisby’s Dictionary of The Fungi[Ainsworth和Bisby的真菌大词典],第8版,1995,CABInternational[国际CAB],University Press[大学出版社],Cambridge[剑桥],英国)。
真菌宿主细胞可为酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast[酵母的生物学与活性](Skinner,Passmore和Davenport编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9]，1980)中所描述的那样定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)细胞、汉逊酵母属(Hansenula)细胞、克鲁弗酵母属(Kluyveromyces)细胞、毕赤酵母属(Pichia)细胞、酵母菌属(Saccharomyces)细胞、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)或耶罗维亚酵母属(Yarrowia)细胞、例如乳酸克鲁弗酵母(Kluyveromyces lactis)细胞、卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)细胞、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)细胞、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)细胞、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)细胞、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)细胞、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)细胞或解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人,1995,同上)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳多糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵性的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌属(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、梨囊鞭菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、毡金孢子菌、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
真菌细胞可以通过以下过程转化，所述过程涉及原生质体形成、原生质体的转化、以及以本身已知的方式的细胞壁的再生。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适程序描述于以下文献中：EP 238023，Yelton等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及Christensen等人，1988，Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢菌属物种的适合方法在Malardier等人，1989，Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787中描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente在Abelson,J.N.和Simon,M.I.编辑,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南],Methods in Enzymology[酶学方法],第194卷,第182-187页,Academic Press,Inc.[学术出版社有限公司],纽约；Ito等人,1983,J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。
产生方法
本发明还涉及产生变体的方法，这些方法包括：(a)在适合于该变体的表达的条件下培养本发明的宿主细胞；并且(b)回收该变体。因此，在一个方面，本发明涉及产生变体的方法，这些方法包括：(a)在适合于该变体的表达的条件下培养表达变体的宿主细胞，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：250、176、124、325、108、149、48、49、99、229、257、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、99+176+325+356、99+49+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356、48+257、以及229+250+356，其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置；并且(b)任选地，回收该变体。
在另一个方面，本发明涉及产生变体的方法，这些方法包括：(a)在适合于该变体的表达的条件培养表达变体的宿主细胞，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：位置250、176、124、108、149和325，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，并且其中该一种或多种改变独立地是：
(i)在占据该位置的氨基酸的下游插入氨基酸；
(ii)缺失占据该位置的氨基酸；或者
(iii)用不同的氨基酸取代占据该位置的氨基酸，
并且其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体果胶裂解酶与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％一致性；并且(b)任选地，回收该变体。
使用本领域已知的方法在适合于产生变体的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在合适的培养基中并在允许变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养细胞。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的合适的营养培养基中。合适的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果变体被分泌到营养培养基中，则变体可以直接从培养基中回收。如果变体没有分泌，则它可以从细胞裂解液中回收。
可以使用本领域已知的对这些变体特异的方法检测这些变体。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定所述变体的活性。
变体可以使用本领域已知的方法回收。例如，可以通过多种常规程序从营养培养基中回收变体，所述常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
可以通过本领域已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，所述程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦和尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见例如，Protein Purification[蛋白质纯化],Janson和Ryden编辑,VCH Publishers[VCH出版社],纽约,1989)。
在可替代的方面，没有回收变体，而是将表达变体的本发明的宿主细胞用作变体的来源。
变体的用途
在洗涤剂工业中的用途
在其他方面，本发明涉及一种洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含本发明的果胶裂解酶变体或果胶裂解酶变体制剂。因此，在一个方面，本发明涉及一种洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含果胶裂解酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：250、176、124、325、108、149、48、49、99、229、257、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、99+176+325+356、99+49+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356、48+257、以及229+250+356，其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置；或包含变体的果胶裂解酶变体制剂，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：250、176、124、325、108、149、48、49、99、229、257、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、99+176+325+356、99+49+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356、48+257、以及229+250+356，其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置。
在另一个方面，本发明涉及一种洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含果胶裂解酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：位置250、176、124、108、149和325，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，并且其中该一种或多种改变独立地是：
(i)在占据该位置的氨基酸的下游插入氨基酸；
(ii)缺失占据该位置的氨基酸；或者
(iii)用不同的氨基酸取代占据该位置的氨基酸，
并且其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体果胶裂解酶与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％一致性；或包含变体的果胶裂解酶变体制剂，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：位置250、176、124、108、149和325，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，并且其中该一种或多种改变独立地是：
(i)在占据该位置的氨基酸的下游插入氨基酸；
(ii)缺失占据该位置的氨基酸；或者
(iii)用不同的氨基酸取代占据该位置的氨基酸，
并且其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体果胶裂解酶与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％一致性。
本发明的洗涤剂组合物可以例如被配制为手洗或机洗衣物洗涤剂组合物，包括适用于预处理有污迹的织物的洗衣添加剂组合物和组合物、漂洗添加的织物软化剂组合物，以及用于一般家用硬表面清洁操作和餐具洗涤操作的组合物。
在本发明的一个实施例中，可以将本发明的变体以对应于以下的量添加至洗涤剂组合物中：每升的洗液0.001mg-200mg的蛋白质，如0.005mg-100mg的蛋白质，优选0.01mg-50mg的蛋白质，更优选0.05mg-20mg的蛋白质，甚至更优选0.1mg-10mg的蛋白质。在一个实施例中，本发明涉及洗涤剂组合物，这些洗涤剂组合物包含与一种或多种另外的清洁组合物组分组合的本发明的变体。另外的组分的选择处于技术人员的能力范围内并且包括常规的成分，包括下文所述的示例性非限制性组分。
对于纺织品护理，组分的选择可以包括以下考虑：有待清洁的纺织品的类型、污物的类型和/或程度、进行清洁时的温度以及洗涤剂产品的配制。尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，组分可以包含另外的功能性。
在一个实施例中，本发明涉及自动餐具洗涤(ADW)组合物，这些组合物包含与一种或多种另外的ADW组合物组分组合的本发明的变体。另外的组分的选择处于技术人员的能力范围内并且包括常规的成分，包括下文所述的示例性非限制性组分。
该洗涤剂组合物可以包含一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子的和/或阳离子的和/或非离子的和/或半极性的和/或两性离子的、或其混合物。在一个具体的实施例中，该洗涤剂组合物包含一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子型表面活性剂的混合物。该一种或多种表面活性剂典型地以按重量计从约0.1％至60％(如约1％至约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％)的水平存在。基于所希望的清洁应用来选择这种或这些表面活性剂，并且这种或这些表面活性剂可以包括本领域中已知的任何常规表面活性剂。
当被包含于其中时，该洗涤剂通常将包含按重量计从约1％至约40％的阴离子型表面活性剂，如从约5％至约30％，包括从约5％至约15％、或从约15％至约20％、或从约20％至约25％的阴离子型表面活性剂。阴离子型表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地，直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或脂肪酸盐(皂)的二酯和单酯及其组合。
当被包含于其中时，该洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％的阳离子型表面活性剂，例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，如从约3％至约5％、从约8％至约12％或从约10％至约12％。阳离子型表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基-二甲基-铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物、酯季铵以及其组合。
当被包含于其中时，该洗涤剂将通常包含按重量计从约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，如从约3％至约5％、从约8％至约12％或从约10％至约12％。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)、或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))、连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品、及其组合。
该洗涤剂可以包含半极性表面活性剂。半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，如烷基二甲胺氧化物、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲胺氧化物和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)胺氧化物以及其组合。
该洗涤剂可以包含两性离子表面活性剂。两性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱，如烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱及其组合。
该洗涤剂组合物可以包含一种或多种表面活性剂水溶助剂。水溶助剂是如下化合物，该化合物在水性溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中溶解极性物质)。典型地，水溶助剂具有亲水和疏水两种特征(所谓的两亲特性，如由表面活性剂已知的)；然而，水溶助剂的分子结构一般不利于自发性自聚集，参见例如通过Hodgdon和Kaler(2007)，Current Opinion inColloid&Interface Science[胶体和界面科学新见]12:121-128的综述。水溶助剂并不显示临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。相反，许多水溶助剂显示连续类型的聚集过程，在该过程中聚集物的大小随着浓度增加而增长。然而，许多水溶助剂改变了含有极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。水溶助剂常规地在从药学、个人护理、食品到技术应用的各个产业中应用。水溶助剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过除去水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，如相分离或高黏度。
洗涤剂可以包含按重量计0-10％，例如按重量计0-5％，例如约0.5至约5％、或约3％至约5％的水溶助剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何水溶助剂。水溶助剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。
洗涤剂组合物可以包含按重量计约0-65％，如约5％至约50％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂、或其混合物。在餐具洗涤洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％、特别是50％-65％。助洗剂和/或共助洗剂可以特别地是与Ca和Mg形成水溶性络合物的螯合试剂。可以利用本领域中已知的用于在衣物和/或ADW洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如硅酸钠、层状硅酸盐(例如，来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、二乙醇胺(DEA，也称为2,2’-亚氨基二乙-1-醇)、三乙醇胺(TEA，也称为2,2’,2”-次氮基三乙-1-醇)、以及羧甲基菊粉(CMI)、及其组合。
该洗涤剂组合物还可以包含按重量计0-50％，例如约5％至约30％的洗涤剂共助洗剂。洗涤剂组合物可以包括单独的共助洗剂、或与助洗剂如沸石助洗剂组合的共助洗剂。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐、螯合剂(例如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和磷酸盐)、以及烷基琥珀酸或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二丁二酸(IDS)、乙二胺-N,N’-二丁二酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二膦酸(HEDP)、乙二胺四(亚甲基膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基-三胺-五(亚甲基膦酸)(DTMPA或DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDA)、N-(2-磺甲基)-天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)-谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)-谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)以及磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(2-羟乙基)-亚乙基二胺-N,N’,N”-三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基-三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)及其组合和盐。另外的示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 09/102854、US 5977053中。
洗涤剂可以包含按重量计0-30％，如约1％至约20％的漂白系统。可以使用本领域中已知用于衣物和/或ADW洗涤剂中的任何漂白系统。合适的漂白系统组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠、过硼酸钠和过氧化氢―尿素(1:1)、预成型过酸及其混合物。合适的预成型过酸包括但不限于过氧羧酸及盐、二过氧二羧酸、过亚氨酸(perimidic acid)及盐、过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone(R))及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括与过酸形成性漂白活化剂组合的过氧化物基的漂白系统，这些系统可以包含例如无机盐，包括碱金属盐，如过硼酸盐(通常是单水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐。术语漂白活化剂在此意指与过氧化氢反应以经由过水解反应形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。在此有待使用的合适的漂白活化剂包括属于酯、酰亚胺或酸酐类别的那些。合适的实例是四乙酰乙二胺(TAED)、4-[(3，5，5-三甲基己酰基)氧基]苯-1-磺酸钠(ISONOBS)、4-(十二酰基氧基)苯-1-磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯-1-磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS或DOBA)、4-(壬酰氧基)苯-1-磺酸盐(NOBS)和/或披露于WO 98/17767中的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP 624154中并且该家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋汀)具有以下优点，它是环境友好的。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋汀在存储时在产品中具有良好的水解稳定性，并且是一种有效的漂白活化剂。最后，ATC是多功能的，因为在过水解反应中释放的柠檬酸盐可以作为助洗剂起作用。可替代地，漂白系统可以包含例如酰胺、酰亚胺或砜类型的过氧酸。漂白系统还可以包含过酸，如6-(苯二甲酰亚氨基)过己酸(PAP)。漂白系统还可以包括漂白催化剂。在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由以下组成：具有下式的有机催化剂：
(i)
(ii)
(iii)及其混合物；
其中每个R1独立地是含有从9至24个碳的支链烷基基团或含有从11至24个碳的直链烷基基团，优选地每个R1独立地是含有从9至18个碳的支链烷基基团或含有从11至18个碳的直链烷基基团，更优选地每个R1独立地选自下组，该组由以下组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基以及异十五烷基。
优选地，除了漂白催化剂，特别是有机漂白催化剂以外，漂白组分还包含过酸源。过酸源可以选自(a)预形成的过酸；(b)过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐(过氧化氢源)，优选与一种漂白活化剂组合；和(c)过水解酶以及酯，用于在纺织品或硬表面处理步骤中在水的存在下原位形成过酸。
该洗涤剂组合物可以包含按重量计0％-10％，如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物。可以利用本领域中已知的在洗涤剂中使用的任何聚合物。该聚合物可以作为如上文提到的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污垢释放、染料转移抑制、油污清洁和/或抑泡特性。一些聚合物可以具有多于一种的上文提到的特性和/或多于一种的下文提到的基序。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(亚乙基亚胺)、羧甲基菊粉(CMI)、和聚羧化物，例如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水修饰CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯对苯二甲酸乙二酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。进一步的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基磺酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO 2006/130575中。还考虑了以上提到的聚合物的盐。
本发明的洗涤剂组合物还可以包含织物调色剂(如染料或色素)，当配制在洗涤剂组合物中时，当所述织物与洗涤液接触时这些织物调色剂可以沉积在织物上，该洗涤液包含所述洗涤剂组合物，并且因此通过可见光的吸收/反射改变所述织物的色彩。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，当织物调色剂吸收至少部分可见光谱时，它们改变表面的色彩。合适的织物调色剂包括染料和染料-粘土轭合物，并且还可以包括色素。合适的染料包括小分子染料和聚合物染料。合适的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(Colour Index)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红或其混合物，例如如描述于WO2005/03274、WO2005/03275、WO2005/03276和EP1876226(通过引用结合在此)中。洗涤剂组合物优选地包含从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。该组合物可以包含从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是尤其优选的。合适的调色剂还披露于例如WO2007/087257和WO 2007/087243中。
洗涤剂添加剂连同洗涤剂组合物可以包含一种或多种另外的酶，如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、和/或过氧化物酶。
一般而言，一种或多种选定酶的特性应与选定洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分的相容性等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。
合适的纤维素酶包括细菌来源或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、支顶孢属的纤维素酶，例如披露于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰孢产生的真菌纤维素酶。
尤其合适的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。这类纤维素酶的实例是描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纤维素酶。其他实例是例如WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及WO 99/001544中所述的那些纤维素酶变体。
其他纤维素酶是具有以下序列的内切-β-1,4-葡聚糖酶，该序列与WO 2002/099091的SEQ ID NO:2的位置1至位置773的氨基酸序列具有至少97％的一致性，或家族44木葡聚糖酶，该木葡聚糖酶具有以下序列，该序列与WO 2001/062903的SEQ ID NO:2的位置40-559具有至少60％的一致性。
可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM和CarezymeTM(诺维信公司(Novozymes A/S))、Carezyme PremiumTM(诺维信公司(Novozymes A/S))、CellucleanTM(诺维信公司(Novozymes A/S))、Celluclean ClassicTM(诺维信公司(Novozymes A/S))、CellusoftTM(诺维信公司(Novozymes A/S))、WhitezymeTM(诺维信公司(Novozymes A/S))、ClazinaseTM、和Puradax HATM(杰能科国际公司(Genencor International Inc.))，以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(Kao Corporation))。
合适的甘露聚糖酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学或基因修饰的突变体。该甘露聚糖酶可以是家族5或26的碱性甘露聚糖酶。它可以是一种来自芽孢杆菌属或腐质霉属的野生型，特别是粘琼脂芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌或特异腐质霉。合适的甘露聚糖酶描述于WO 1999/064619中。可商购的甘露聚糖酶是Mannaway(诺维信公司(Novozymes A/S))。
合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(例如来自灰盖鬼伞)的过氧化物酶、及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602、以及WO 98/15257中描述的那些。可商购的过氧化物酶包括GuardzymeTM(诺维信公司(Novozymes A/S))。
合适的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物来源的那些，例如植物或微生物来源。优选的是微生物来源。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。它可以是碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如M4家族的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，例如来自M5、M7或M8家族的那些。
术语“枯草杆菌蛋白酶”是指根据Siezen等人，Protein Engng.[蛋白质工程]4(1991)719-737和Siezen等人，Protein Science[蛋白质科学]6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是通过在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸来表征的蛋白酶的一个亚组。枯草杆菌蛋白酶(subtilase)可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(Thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶(Lantibioticpeptidase)家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。
枯草杆菌酶的实例是来源于芽孢杆菌属的那些，例如描述于US 7262042和WO 09/021867中的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌；和描述于WO 89/06279中的枯草杆菌蛋白酶lentus、枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO 93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO 92/175177、WO 01/016285、WO 02/026024以及WO 02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢属蛋白酶(描述于WO89/06270、WO94/25583和WO 05/040372中)，以及源自纤维单胞菌(Cellumonas)的胰凝乳蛋白酶(描述于WO05/052161和WO05/052146中)。
进一步优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如描述于例如WO 95/23221中)、及其变体(描述于WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147以及EP1921148中)。
合适的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体酶。实例包括例如描述于EP258068和EP305216中的来自嗜热丝孢菌属(Thermomyces)(例如来自疏绵状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)(之前命名为疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa))的脂肪酶、来自腐质霉属(Humicola)(例如特异腐质霉(H.insolens)(WO96/13580))的角质酶、来自假单胞菌属(Pseudomonas)菌株(这些假单胞菌属菌株中的一些现在重命名为伯克氏菌属(Burkholderia))(例如，产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP218272))、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP331376)、假单胞菌属物种菌株SD705(WO95/06720&WO96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO96/12012)、GDSL型链霉菌属脂肪酶(Streptomyces)(WO10/065455)的脂肪酶、来自稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)(WO10/107560)的角质酶、来自门多萨假多胞菌(Pseudomonas mendocina)(US5,389,536)的角质酶、来自嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)(WO11/084412)的脂肪酶、嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)脂肪酶(WO11/084417)、来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(WO11/084599)的脂肪酶、以及来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)(WO11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)(WO12/137147)的脂肪酶。
优选的商业化脂肪酶产品包括LipolaseTM、LipexTM；LipolexTM和LipocleanTM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades))。
再其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO 10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业产品Gentle Power Bleach中所用的S54V变体)(WO 10/100028)。
可以与本发明的变体一起使用的合适的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以具有细菌或真菌起源。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属，例如地衣芽孢杆菌的特定菌株(更详细地描述于GB 1,296,839中)获得的α-淀粉酶。
合适的淀粉酶包括具有在WO 95/10603中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ IDNO:3具有90％序列一致性的变体。优选的变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中。
可商购的淀粉酶是DURAMYL<TM>、LIQUEZYMETM、TERMAMYL<TM>、NATALASE<TM>、Everest<TM>、FUNGAMYL<TM>和BAN<TM>、Amplify<TM>、Amplify Prime<TM>、Stainzyme<TM>、Stainzyme Plus<TM>(诺维信公司(Novozymes A/S))、Preferenz S100、Preferenz S110、Preferenz S1000、Excellenz S110、Excellenz S1000、Excellenz S2000、RAPIDASE<TM>和PURASTAR<TM>(来自杰能科国际公司(Genencor International Inc.)/杜邦公司(DuPont))。
该组合物可以包含过氧化物酶和/或氧化酶。
过氧化物酶是由酶分类EC 1.11.1.7囊括的过氧化物酶。
合适的过氧化物酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自拟鬼伞属，例如来自灰盖拟鬼伞(C.cinerea)的过氧化物酶(EP 179,486)，及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602以及WO 98/15257中描述的那些。
根据本发明的过氧化物酶还包括卤代过氧化物酶，例如氯过氧化物酶、溴过氧化物酶以及展示出氯过氧化物酶或溴过氧化物酶活性的化合物。卤代过氧化物酶是根据其对卤素离子的特异性进行分类的。氯过氧化物酶(E.C.1.11.1.10)催化从氯根离子形成次氯酸盐。
根据本发明的氧化酶具体包括由酶分类EC 1.10.3.2囊括的任何漆酶或源自其中的展示出漆酶活性的片段、或展示出类似活性的化合物，例如儿茶酚氧化酶(EC1.10.3.1)、邻氨基苯酚氧化酶(EC 1.10.3.4)或胆红素氧化酶(EC 1.3.3.5)。
优选的漆酶是微生物来源的酶。这些酶可以源自植物、细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)。
优选的是源自拟鬼伞属或毁丝霉属的漆酶；特别是源自灰盖拟鬼伞的漆酶，如披露于WO 97/08325中；或源自嗜热毁丝霉，如披露于WO 95/33836中。
可以通过添加含有一种或多种酶的单独添加剂、或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂而将洗涤剂酶包括在洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独的或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液等。优选的洗涤剂添加剂剂型为颗粒，特别是非尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或者浆液。
非尘化的颗粒可以例如如在US 4,106,991和4,661,452中所披露而产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行包衣。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚乙二醇(PEG)；具有16至50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚；具有12至20个碳原子并且存在15至80个环氧乙烷单位的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯和甘油三酯。适合于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(例如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP 238,216中披露的方法来制备。
还可以利用本领域中已知用于在衣物和/或ADW洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。此类任选的洗涤剂组分包括防腐蚀剂、防缩剂、抗污垢再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解试剂(disintegration agent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC和/或多元醇如丙二醇)、织物调理剂(包括黏土)、填充剂/加工助剂、荧光增白剂/光学增亮剂、增泡剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污垢悬浮剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂以及芯吸剂，单独或组合使用。此类成分的选择完全在技术人员的技术范围内。
本发明的洗涤剂组合物还可以含有分散剂。具体地说，粉状洗涤剂可以包括分散剂。合适的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包含被不多于两个碳原子彼此分开的至少两个羧基。合适的分散剂例如描述于Powdered Detergents[粉末洗涤剂]，Surfactant Science Series[表面活性剂科学系列]，第71卷，马塞尔德克尔公司(Marcel Dekker,Inc)中。
本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制试剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当在主题组合物中存在时，染料转移抑制剂可以按该组合物的重量计以从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％的水平存在。
本发明的洗涤剂组合物还可以包含另外的组分，这些组分可以给正清洁的物品着色，如荧光增白剂或光学增亮剂。当存在时，该增亮剂优选地以约0.01％至约0.5％的水平存在。在本发明的组合物中可以使用适合用于在衣物洗涤洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨基芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。荧光增白剂的二氨芪-磺酸衍生物型的实例包括以下各项的钠盐：4,4’-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2’-二磺酸盐、4,4’-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2’-二磺酸盐、4,4’-双-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2’-二磺酸盐、4,4’-双-(4-苯基-1,2,3-三唑-2-基)芪-2,2’-二磺酸盐以及5-(2H-萘并[1,2-d][1,2,3]三唑-2-基)-2-[(E)-2-苯基乙烯基]苯磺酸钠。优选的荧光增白剂是可从汽巴–嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4’-双-(2-吗啉代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2’-二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2’-双-(苯基-苯乙烯基)-二磺酸盐的二钠盐。还优选荧光增白剂，是可商购的Parawhite KX，由派拉蒙矿物与化学品公司(Paramount Minerals and Chemicals)，孟买，印度供应。适合用于本发明中使用的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-氨烷基香豆素。
合适的荧光增白剂水平包括从约0.01wt％、从0.05wt％、从约0.1wt％或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。
本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污物释放聚合物，这些聚合物帮助从织物(如棉布和基于聚酯的织物)移除污物，特别是从基于聚酯的织物移除疏水性污物。污垢释放聚合物可以例如是基于非离子型或阴离子型对苯二甲酸的聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接合的共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如Powdered Detergents[粉末洗涤剂]，Surfactant science series[表面活性剂科学系列]第71卷第7章，MarcelDekker，Inc.[马塞尔·德克尔公司]。另一种类型的污垢释放聚合物是包括核心结构和附接至该核心结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。核心结构可以包含聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如WO 2009/087523中详细描述的(将其通过引用结合在此)。此外，随机接枝共聚物是合适的污垢释放聚合物。合适的接合共聚物更详细地描述于WO 2007/138054、WO 2006/108856和WO 2006/113314中(通过引用结合在此)。其他污物释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，例如修饰的纤维素衍生物，例如EP 1867808或WO 2003/040279中描述的那些(将二者都通过引用结合在此)。合适的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺以及其混合物。合适的纤维素聚合物包括阴离子修饰的纤维素、非离子修饰的纤维素、阳离子修饰的纤维素、两性离子修饰的纤维素及其混合物。合适的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。
本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氧乙烯和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸和马来酸的共聚物、和乙氧基化的聚乙亚胺。以上在污物释放聚合物下描述的基于纤维素的聚合物的功能还可以是抗再沉积剂。
本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种流变改性剂、结构剂或增稠剂，不同于降粘剂。流变改性剂选自下组，该组由以下各项组成：非聚合物结晶、羟基功能材料、聚合物流变改性剂，它们为液体洗涤剂组合物的水性液相基质赋予剪切稀化特征。可以通过本领域已知的方法修饰和调整洗涤剂的流变学和粘度，例如如在EP 2169040中所示。
其他合适的成分包括但不限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、黏合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物柔软剂、填充剂、泡沫调节剂、水溶助剂、香料、色素、抑泡剂、溶剂以及用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构弹性剂。
包含本发明的变体的洗涤剂组合物可以处于任何常规形式，例如，条，均质片剂，具有两个或更多个层的片剂，具有一个或多个室的袋，常规或压型粉末，颗粒，糊剂，凝胶或常规、压型或浓缩液体。
袋可以被配置为单一室或多室。它可以具有适合容持该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。该袋由水溶性膜制成，它包含了一个内部体积。可以将所述内部体积分成袋的室。优选的膜是高分子材料，优选地形成膜或薄片的聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，聚合物在膜例如PVA中的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混组合物，包含可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考号M8630下，如由美国印第安纳州的MonoSol有限责任公司(MonoSol LLC)出售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包含固体衣物清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在构成上可以与包含固体的室不同：US 2009/0011970A1。
可以由水可溶袋中的或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分彼此物理分离。因此，可以避免组分间的不良的储存相互作用。在清洗溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。
非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地包括按重量计至少20％并且高达95％的水，例如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体或凝胶中。水性液体或凝胶洗涤剂可以包含从0％-30％的有机溶剂。液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。
本发明的变体可以被添加至洗衣皂条中并且用于手洗衣物、织物和/或纺织品。术语洗衣皂条包括洗衣条、皂条、组合条(combo bar)、合成洗涤剂条以及洗涤剂条。条的类型通常区别在于他们含有的表面活性剂的类型，并且术语洗衣皂条包括含有来自脂肪酸的皂和/或合成皂的那些。洗衣皂条具有在室温下为固体而非液体、凝胶或粉末的物理形式。术语固体被定义为不随时间显著变化的物理形式，即如果固体物体(例如洗衣皂条)被放置在容器里，该固体物体不会为了填充其被放置的容器而发生改变。该条是固体时典型地是条的形式但也可能是其他的固体形状如圆形或椭圆。
该洗衣皂条可以包含一种或多种另外的酶、蛋白酶抑制剂如肽醛类(或次硫酸盐加合物或半缩醛加合物)、硼酸、硼酸盐、硼砂和/或苯基硼酸衍生物如4-甲酸基本硼酸、一个或多个皂或合成的表面活性剂、多元醇如甘油、pH控制化合物如脂肪酸、柠檬酸、乙酸和/或甲酸、和/或一价阳离子和有机阴离子的盐，其中该一价阳离子可以是例如Na+、K+或NH4 +并且该有机阴离子可以是例如甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或乳酸盐，这样使得该一价阳离子和有机阴离子的盐可以是例如甲酸钠。
洗衣皂条还可以包括络合剂像EDTA和HEDP，香料和/或不同类型的填充剂，表面活性剂例如阴离子型合成表面活性剂，助洗剂，聚合的污物释放剂，洗涤剂螯合剂，稳定剂，填充剂，染料，着色剂，染料转移抑制剂，烷氧基化的聚碳酸酯，抑泡剂，结构剂，粘合剂，浸出剂，漂白活化剂，粘土去污剂，抗再沉积剂，聚合分散剂，增白剂，织物柔软剂，香料和/或本领域已知的其他化合物。
洗衣皂条可以在常规洗衣皂条制造设备中加工，该设备如但不限于：混合器、压条机(例如两级真空压条机)、挤出机、切割机、徽标压模机、冷却隧道以及包装器。本发明不局限于通过任何单一方法制备衣物皂条。可以在过程的不同阶段向肥皂中添加本发明的预混料。例如，可以制备含有肥皂、本发明的变体、任选的一种或多种另外的酶、蛋白酶抑制剂以及一价阳离子和有机阴离子的盐的预混物并且然后将该混合物压条。可以同时添加作为例如处于液态的蛋白酶抑制剂的变体以及任选的另外的酶。除了混合步骤和压条步骤以外，该过程还可以进一步包含研磨、挤出、切割、压模、冷却和/或包装的步骤。
本发明的酶可以被配制为颗粒，例如，配制为结合一种或多种酶的共颗粒。然后，每种酶将存在于多种颗粒中，这些颗粒确保酶在洗涤剂中的分布更均匀。这还减少了由于不同的粒度，不同酶的物理隔离。用于生产针对洗涤剂工业的多酶共颗粒的方法披露于IP.com披露内容IPCOM000200739D中。
通过使用共颗粒的酶的配制品的另一个实例披露于WO 2013/188331中，其涉及包含以下各项的洗涤剂组合物：(a)多酶共颗粒；(b)少于10wt沸石(无水基底)；和(c)少于10wt磷酸盐(无水基底)，其中所述酶共颗粒包含从10wt％至98wt％的水分汇组分，并且该组合物另外还包含从20wt％至80wt％的洗涤剂水分汇组分。
WO 2013/188331还涉及处理和/或清洁表面的方法，优选地织物表面，该方法包括以下步骤：(i)将所述表面与在含水洗涤液中如在此要求保护的并且描述的洗涤剂组合物接触，(ii)冲洗和/或干燥该表面。
该多酶共颗粒可以包含本发明的酶和(a)选自下组的一种或多种酶，该组由以下各项组成：脂肪酶、清洁纤维素酶、木葡聚糖酶、过水解酶、过氧化物酶、脂氧合酶、漆酶以及其混合物；和(b)选自下组的一种或多种酶，该组由以下组成：半纤维素酶、蛋白酶、护理纤维素酶、纤维二糖脱氢酶、木聚糖酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、果胶裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质酶、普鲁兰酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、地衣聚糖酶、葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、玻璃酸酶、软骨素酶、淀粉酶、以及其混合物。
在纺织品和纤维素纤维加工工业中的用途
本发明的果胶裂解酶变体可以与其他碳水化合物降解酶(例如半纤维素酶，如阿拉伯聚糖酶、木葡聚糖酶、甘露聚糖酶和果胶酶)组合用于纤维的生物制备或者与洗涤剂组合用于清洁纤维。因此，在一个方面，本发明涉及变体的用途，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：250、176、124、325、108、149、48、49、99、229、257、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、99+176+325+356、99+49+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356、48+257、以及229+250+356，其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体与SEQID NO:1的氨基酸序列具有至少65％、但小于100％一致性，该变体与其他碳水化合物降解酶(如半纤维素酶，更具体地阿拉伯聚糖酶、木葡聚糖酶、甘露聚糖酶和果胶酶)组合用于纤维的生物制备或者与洗涤剂组合用于清洁纤维。
在另一个方面，本发明涉及变体的用途，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：位置250、176、124、108、149和325，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，并且其中该一种或多种改变独立地是：
(i)在占据该位置的氨基酸的下游插入氨基酸；
(ii)缺失占据该位置的氨基酸；或者
(iii)用不同的氨基酸取代占据该位置的氨基酸，
并且其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体果胶裂解酶与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％一致性，该变体与其他碳水化合物降解酶(如半纤维素酶，更具体地阿拉伯聚糖酶、木葡聚糖酶、甘露聚糖酶和果胶酶)组合用于纤维的生物制备或者与洗涤剂组合用于清洁纤维。
棉纤维由含有果胶的初生细胞壁层和主要含有纤维素的次生层组成。在棉花制备或棉花精制下，将除去初生细胞壁的一部分。因此，可以施加本发明的变体以帮助在棉花精制过程中用于除去初生细胞壁，或者在棉花清洁期间用于除去残留的果胶物质并防止纺织品变灰。
在本上下文中，术语“纤维素材料”旨在表示由棉、棉混纺或天然或人造纤维素(例如源自含木聚糖的纤维素纤维，如来自木浆)或其共混物制成的纤维、缝制和非缝制织物，包括针织物、织造物、斜纹粗棉布、纱线和毛巾布。共混物的实例是棉布或人造丝/粘胶纤维与一种或多种伴随材料的共混物，该伴随材料是如羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚偏氯乙烯纤维、聚氨酯纤维、聚脲纤维、芳香族聚酰胺纤维)以及含纤维素的纤维(例如人造丝/粘胶纤维、苎麻、亚麻/亚麻布、黄麻、醋酸纤维素纤维、莱赛尔纤维)。
本发明的变体在纤维素纤维加工工业中适用于预处理大麻、亚麻或亚麻布或从大麻、亚麻或亚麻布浸解纤维。
将用于纺织工业的纤维素材料(例如像棉纤维)加工成准备用于服装制造的材料涉及若干步骤：将该纤维纺成纱线；从该纱线构造织造或针织织物以及随后的制备、染色和整理操作。织造品是通过在一系列经纱间织入纬纱构造的；纱线可以是两种不同的类型。针织品是通过从一条连续长度的纱线形成互锁环的网络构造的。纤维素纤维也可以用于非织造织物。
该制备过程使纺织品准备用于在染色操作中得到适当的响应。制备中涉及的子步骤是
a.退浆(用于织造品)，在编织前添加聚合浆料例如像淀粉、CMC或PVA以提高整经速度；在进一步加工之前必须除去这种材料。
b.煮练，其目的是从棉纤维中除去非纤维素材料，尤其是角质层(主要由蜡组成)和初生细胞壁(主要由果胶、蛋白质和木葡聚糖组成)。适当除蜡是获得高润湿性所必需的，是获得良好染色的措施。除去初生细胞壁-尤其是果胶-可以改善除蜡并确保更均匀的染色。此外，这提高了漂白过程中的白度。煮练中使用的主要化学药品是高温(80℃-95℃)、高浓度(高达70g/kg棉)的氢氧化钠；以及
c.漂白；通常在煮练之后使用过氧化氢作为氧化剂进行漂白，以获得完全漂白的(白色)织物或确保染料的纯洁色泽。
该行业还使用一步组合的洗涤/漂白工艺。虽然这些过程最常在织物状态中使用；但煮练、漂白和染色操作也可以在纤维或纱线阶段进行。
加工方案可以是分批的或连续的，其中使织物以平幅或绳子形式与液体加工流接触。连续操作通常使用饱和器，由此将每重量的织物大约相等重量的化学品浴(chemicalbath)施加到织物上，然后是加热的停留室，在该停留室中发生化学反应。然后洗涤段使织物准备用于下一个加工步骤。分批加工通常在一个加工浴中发生，由此织物与其重量的大约8-15倍的化学品浴接触。在反应期后，排出化学品，漂洗织物并且施加下一种化学品。不连续的浸轧-堆放处理涉及使用饱和器，由此将每重量织物大约相等重量的化学品浴施加到织物上，之后为停留期，在冷浸轧-堆放的情况下该停留期可以是一天或多天。
织造品是纺织品织物结构的最普遍形式。织造过程要求将弯曲的纱“上浆”以保护其免受磨损。淀粉、聚乙烯醇(PVA)、羧甲基纤维素、蜡和丙烯酸粘合剂是由于可获得性和成本而使用的典型上浆化学品的实例。在织造过程之后必须除去浆料，作为制备织造品的第一步骤。使呈绳状或平幅形式的上浆的织物与含有退浆剂的加工液体接触。所使用的退浆剂取决于待除去的浆料的类型。对于PVA浆料，通常使用热水或氧化过程。最常见的棉织物上浆剂是基于淀粉。因此，最常见的是，通过热水、酶α-淀粉酶(以水解淀粉)和润湿剂或表面活性剂的组合使织造棉织物退浆。使纤维素材料与退浆化学品一起静置足够长以完成退浆的“保持期”。保持期取决于加工方案的类型和温度，并且可以从15分钟至2小时变化，或者在一些情况下，若干天。典型地，将这些退浆化学品施加于通常在从约15℃至约55℃范围内的饱和器浴中。然后将织物保持在例如“J-盒”的提供充足热量(通常在约55℃与约100℃之间)的设备中，以增强退浆剂的活性。在保持期结束后，将这些化学品(包括除去的上浆剂)从织物上洗掉。
为了确保高白度或良好的润湿性以及由此产生的可染性，必须彻底除去浆料化学品(size chemical)和其他施加的化学品。通常据信，有效的退浆对以下过程至关重要：煮练和漂白。
煮练过程除去棉花中天然存在的大部分非纤维素化合物。除了天然非纤维素杂质外，煮练还可以除去污垢、污物和残留的制造引入的材料，如纺纱、络筒(coning)或浆纱(slashing)润滑剂。煮练过程使用氢氧化钠或相关的苛化剂，如碳酸钠、氢氧化钾或其混合物。通常，将碱稳定的表面活性剂添加至该过程中以增强疏水性化合物的溶解和/或防止它们再沉积回到织物上。处理通常在高温(80℃-100℃)下使用煮练剂的强碱性溶液(pH 13-14)进行。由于化学过程的非特异性质，不仅杂质而且纤维素本身受到侵蚀，从而导致强度或其他所希望的织物性质的损害。纤维素织物的柔软度随残留天然棉蜡而变化。高温强碱性煮练过程的非特异性质不能区分所希望的天然棉润滑剂和制造引入的润滑剂。此外，常规煮练过程可能引起由于来自这些过程的高碱性流出物所致的环境问题。煮练阶段制备织物以在漂白中获得最佳响应。在随后的漂白阶段，煮练不充分的织物将需要更高水平的漂白化学品。
漂白步骤使天然棉色素脱色，并除去在轧棉、梳棉或煮练过程中未完全除去的任何残留的天然木质棉渣组分。目前使用的主要方法是碱性过氧化氢漂白。在许多情况下，尤其是当不需要非常高的白度时，漂白可以与煮练组合。
煮练步骤可以使用本发明的果胶裂解酶变体在约50℃-80℃的温度和约7-11的pH下进行，从而取代或补充高度苛化剂。优化的酶促过程确保高果胶去除率和完全润湿性。
用于植物材料的降解或修饰的用途
由于本发明的果胶裂解酶变体的高植物细胞壁降解活性，根据本发明的变体优选地用作降解或修饰植物细胞壁或任何源自植物细胞壁的含果胶材料的试剂。因此，在本发明的一个方面，变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：250、176、124、325、108、149、48、49、99、229、257、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、99+176+325+356、99+49+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356、48+257、以及229+250+356，其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少65％、但小于100％一致性，用作降解或修饰植物细胞壁或任何源自植物细胞壁的含果胶材料的试剂，这归因于果胶裂解酶变体的高植物细胞壁降解活性，该果胶裂解酶变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：250、176、124、325、108、149、48、49、99、229、257、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、99+176+325+356、99+49+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356、48+257、以及229+250+356，其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体与SEQID NO:1的氨基酸序列具有至少65％、但小于100％一致性。
在本发明的另一个方面，变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：位置250、176、124、108、149和325，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，并且其中该一种或多种改变独立地是：
(i)在占据该位置的氨基酸的下游插入氨基酸；
(ii)缺失占据该位置的氨基酸；或者
(iii)用不同的氨基酸取代占据该位置的氨基酸，并且其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体果胶裂解酶与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％一致性，用作降解或修饰植物细胞壁或任何源自植物细胞壁的含果胶材料的试剂，这归因于果胶裂解酶变体的高植物细胞壁降解活性，该果胶裂解酶变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：位置250、176、124、108、149和325，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，并且其中该一种或多种改变独立地是：
(i)在占据该位置的氨基酸的下游插入氨基酸；
(ii)缺失占据该位置的氨基酸；或者
(iii)用不同的氨基酸取代占据该位置的氨基酸，并且其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体果胶裂解酶与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％一致性。
本发明的果胶裂解酶变体可以单独使用或与其他酶如葡聚糖酶、果胶酶和/或半纤维素酶一起使用，以改善从富含油的植物材料中提取油，如从大豆中提取大豆油、从橄榄中提取橄榄油、从油菜籽中提取菜籽油或从向日葵中提取葵花油。
本发明的果胶裂解酶变体可以用于分离植物细胞材料的组分。特别有意义的是将富含糖或淀粉的植物材料分离成具有相当可观的商业意义的组分(如从甜菜分离蔗糖或从马铃薯分离淀粉)和意义不大的组分(如浆或壳部分)。此外，特别有意义的是将富含蛋白质或富含油的作物分离成有价值的蛋白质和油以及无价值的壳部分。可以通过使用本领域中已知的方法来进行分离过程。
本发明的果胶裂解酶变体还可以用于制备水果或蔬菜汁以提高产量，并且可以用于酶促水解各种植物细胞壁来源的材料或废物材料(例如，来自葡萄酒或果汁生产)，或农业残余物如蔬菜壳、豆壳、甜菜浆、橄榄浆、马铃薯浆等。
可以对植物材料进行降解以改善不同种类的加工、促进除半乳聚糖之外的其他组分的纯化或提取(如从柑橘中纯化果胶)、提高饲料价值、降低水结合能力、提高废水厂的降解能力、提高植物材料向青贮料的转化等。
借助于本发明的变体，有可能调节加工的水果或蔬菜的稠度和外观。已显示稠度和外观是用于加工的酶的实际组合的产物，即与本发明的果胶裂解酶变体组合的酶的特异性。实例包括例如从苹果、梨或浆果生产清澈果汁；例如从苹果、梨、浆果、柑橘或番茄生产混浊的稳定果汁；以及例如从胡萝卜和番茄生产果酱。
本发明的果胶裂解酶变体可以用于改变植物细胞壁来源的材料的粘度。例如，果胶裂解酶变体可以用于降低含半乳聚糖的饲料的粘度并促进含粘性半乳聚糖的材料的加工。可以通过在合适的条件下用本发明的变体处理含有半乳聚糖的植物材料以使含有半乳聚糖的材料完全或部分降解来获得粘度降低。
果胶裂解酶变体可以例如，与其他酶组合用于从植物纤维中除去果胶物质。这种除去例如在生产纺织品纤维或其他纤维素材料中是必需的。为此目的，在合适的条件下用适合量的本发明的果胶裂解酶处理植物纤维材料，以获得与植物纤维材料相关的果胶物质的完全或部分降解。
作为动物饲料添加剂的用途
本发明的果胶裂解酶变体可以用于改变动物饲料并且可以在体外(通过改变饲料的组分)或体内发挥其作用。因此，果胶裂解酶变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：250、176、124、325、108、149、48、49、99、229、257、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、99+176+325+356、99+49+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356、48+257、以及229+250+356，其中每个位置对应于具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少65％、但小于100％一致性，可以用于改变动物饲料并且可以在体外(通过改变饲料的组分)或体内发挥其作用。
在另一个方面，果胶裂解酶变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：位置250、176、124、108、149和325，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，并且其中该一种或多种改变独立地是：
(i)在占据该位置的氨基酸的下游插入氨基酸；
(ii)缺失占据该位置的氨基酸；或者
(iii)用不同的氨基酸取代占据该位置的氨基酸，并且其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体果胶裂解酶与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％一致性，可以用于改变动物饲料并且可以在体外(通过改变饲料的组分)或体内发挥其作用。
果胶裂解酶变体特别适用于添加到含有大量阿拉伯半乳聚糖或半乳聚糖的动物饲料组合物(例如含有来自大豆、油菜籽、羽扇豆等的植物材料的饲料)中。当添加到饲料中时，该果胶裂解酶变体显著改善植物细胞壁材料的体内分解，由此实现动物对植物营养物的更好利用。由此，改善了动物的生长速率和/或饲料转化率(即摄入的饲料的重量相对于体重增加的比例)。例如，通过果胶裂解酶(例如与β-半乳糖苷酶组合)将难消化的半乳聚糖降解为可被动物消化的半乳糖或半乳糖低聚物，并且因此有助于饲料的可用能量。此外，通过降解半乳聚糖，果胶裂解酶可以提高非碳水化合物饲料成分(如蛋白质、脂肪和矿物质)的可消化性和摄取。
在葡萄酒和果汁加工中的用途
本发明的变体可以用于蔬菜或果汁中(尤其是苹果汁或梨汁中)的去果胶化和粘度降低。因此，果胶裂解酶变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：250、176、124、325、108、149、48、49、99、229、257、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、99+176+325+356、99+49+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356、48+257、以及229+250+356，其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少65％、但小于100％一致性，可以用于蔬菜或果汁中(尤其是苹果汁或梨汁中)的去果胶化和任选的粘度降低。
在另一个方面，果胶裂解酶变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：位置250、176、124、108、149和325，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，并且其中该一种或多种改变独立地是：
(i)在占据该位置的氨基酸的下游插入氨基酸；
(ii)缺失占据该位置的氨基酸；或者
(iii)用不同的氨基酸取代占据该位置的氨基酸，并且其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体果胶裂解酶与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％一致性，可以用于蔬菜或果汁中(尤其是苹果汁或梨汁中)的去果胶化和任选的粘度降低。
这可以通过用可有效降解水果或蔬菜汁中含有的含果胶材料的量的本发明变体处理水果或蔬菜汁来实现。
该变体可以用于处理来自水果和蔬菜的糊状物，以改善糊状物的可提取性或可降解性。例如，该变体可以用于处理来自用于果汁生产的苹果和梨的糊状物，以及用于葡萄酒生产的葡萄的糊状物处理。
本发明在以下段落中进行了进一步的定义：
1.一种果胶裂解酶变体，其中所述变体具有果胶裂解酶活性(例如，EC4.2.2.2)并且包含在选自下组的一个或多个位置处的一种或多种改变(例如，一个或多个取代、一个或多个插入或一个或多个缺失)，该组由以下组成：位置(例如，位置的组合)48、49、99、108、124、149、176、229、250、257、325、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、99+176+325+356、99+49+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、229+250、229+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356、48+229、229+257、229+250、229+356、48+257、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、229+250+356，其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置(例如，使用SEQ ID NO:1的编号)，并且其中该变体与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少65％，例如，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％、但小于100％一致性。
2.如段落1所述的变体，该变体是选自下组的亲本果胶裂解酶的变体，该组由以下组成：
a)多肽，该多肽与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；
b)多肽，该多肽在低、中或高严格条件下由与(i)编码SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的多肽的序列、或者(ii)(i)的全长补体杂交的多核苷酸编码；
c)多肽，该多肽由与编码SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的多肽的序列具有至少75％，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的多核苷酸编码；以及
d)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的多肽的片段，该片段具有果胶裂解酶活性。
3.如段落2所述的变体，其中该亲本果胶裂解酶包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。
4.如前述段落中任一项所述的变体，其中所述变体与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少65％，例如至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％、但小于100％一致性。
5.如任一前述段落所述的变体，其中所述改变是取代。
6.如段落5所述的变体，其中所述取代是用带正电荷的氨基酸取代，优选地所述带正电荷的氨基酸是赖氨酸或精氨酸。
7.如前述段落中任一项所述的变体，其中该变体包含选自下组的一个或多个取代，该组由以下取代(例如，取代的组合)组成：P48A、P48F、P48H、P48I、P48K、P48L、P48N、P48Q、P48R、P48S、P48T、P48W、P48Y、T49F、T49H、T49I、T49K、T49L、T49M、T49N、T49Q、T49R、T49V、T49W、T49Y、K99A、K99C、K99D、K99E、K99F、K99G、K99H、K99I、K99L、K99M、K99N、K99P、K99Q、K99S、K99T、K99V、K99W、K99Y、E108A、E108G、E108H、E108K、E108L、E108M、E108N、E108R、E108S、E108T、E108V、E108W、D124A、D124E、D124F、D124G、D124I、D124L、D124M、D124N、D124P、D124Q、D124R、D124S、D124T、D124V、D124W、S149K、S149L、S149R、S149W、S176A、S176C、S176D、S176E、S229I、S229K、S229L、S229M、S229Q、S229T、S229V、S229Y、I250A、I250G、I250L、I250M、I250N、I250S、I250T、K257A、K257C、K257D、K257H、K257I、K257L、K257M、K257Q、K257S、K257V、K257W、I325F、I325L、I325Y、Q356D、Q356E、Q356F、Q356G、Q356H、Q356I、Q356L、Q356N、Q356R、Q356T、Q356W、Q356Y、K99D+S176D+I325F、T49R+K99D+S176D+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+S176D+I325F+Q356F、K99D+D124W+S176D+I325F+Q356F、P48W+K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+E108N+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+E108N+S176D+I325F+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49W+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、S229I+I250N、S229I+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+E108N+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+I250N+I325F+K257L+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、P48W+K257L、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、以及I250N+Q356F和S229I+I250N+Q356F。
8.如前述段落中任一项所述的变体，其中该变体选自下组，该组由以下组成：
a)多肽，该多肽与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少75％，例如至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、但小于100％序列一致性；
b)多肽，该多肽在低、中或高严格条件下由与(i)编码SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的多肽的序列、或者(ii)(i)的全长补体杂交的多核苷酸编码；
c)多肽，该多肽由与编码SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的多肽的序列具有至少75％，例如至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％一致性的多核苷酸编码；以及
d)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的多肽的片段，该片段具有果胶裂解酶活性。
9.如前述段落中任一项所述的变体，其中该变体包含在选自下组的位置中的一个或多个中的取代，该组由以下组成：位置250、176、124、325、108、和149。
10.如前述段落中任一项所述的变体，其中该变体包含在选自下组的位置中的一个或多个中的对赖氨酸或精氨酸的取代，该组由以下组成：位置48、49、108、124、和149。
11.如前述段落中任一项所述的变体，其中与亲本酶相比，该变体具有在洗涤剂中的改善的稳定性(例如，如在此的实例2中所示，例如使用半衰期改善因子作为在洗涤剂中的稳定性的量度；或如在此的实例4中所示，例如使用残余洗涤性能测定作为在洗涤剂中的稳定性的量度)或改善的热稳定性(例如，如在此的实例5中所示，例如使用热漂移测定作为热稳定性的量度)。
12.如前述段落中任一项所述的变体，其中该变体具有>1.0的半衰期改善因子(HIF)，例如，>2.0的HIF、>3.0的HIF、>4.0的HIF、>5.0的HIF、>6.0的HIF、>7.0的HIF、>8.0的HIF、>9.0的HIF、>10.0的HIF、>11.0的HIF、>12.0的HIF、>13.0的HIF、>14.0的HIF、>15.0的HIF、>16.0的HIF、>17.0的HIF、>18.0的HIF。
13.如前述段落中任一项所述的变体，其中与SEQ ID NO 1或SEQ ID NO:2相比，改变的总数是1-20个，例如1-10个和1-5个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。
14.一种组合物，该组合物包含如前述段落中任一项所述的变体。
15.如段落14所述的组合物，其中所述组合物是清洁或洗涤剂组合物，优选地衣物或餐具洗涤组合物。
16.如前述段落中任一项所述的组合物，该组合物进一步包含一种或多种洗涤剂组分。
17.如段落16所述的组合物，其中该洗涤剂组分选自下组，该组由以下组成：表面活性剂、水溶助剂、助洗剂、共助洗剂、螯合剂、漂白组分、聚合物、织物调色剂、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、分散剂、染料转移抑制剂、荧光增白剂、香料、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污物悬浮剂、污物释放聚合物、抗再沉积剂、酶抑制剂、酶稳定剂、酶活化剂、抗氧化剂、以及增溶剂。
18.如前述段落中任一项所述的组合物，该组合物进一步包含一种或多种另外的酶。
19.如前述段落中任一项所述的组合物，该组合物进一步包含选自下组的一种或多种另外的酶，该组由以下组成：蛋白酶、淀粉酶、地衣聚糖酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧合酶、过氧化氢酶、甘露聚糖酶、氧化还原酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、酯酶、阿拉伯聚糖酶、另一种果胶裂解酶、DNA酶、过水解酶、淀粉酶、蛋白酶、过氧化物酶、纤维素酶、β葡聚糖酶、木葡聚糖酶、半纤维素酶、黄原胶酶、黄原胶裂解酶、脂肪酶、酰基转移酶、磷脂酶、酯酶、漆酶、过氧化氢酶、芳基酯酶、淀粉酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、角质酶、果胶酶、果胶裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质酶、角叉菜胶酶、普鲁兰酶、鞣酸酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、其他内切-β-甘露聚糖酶、外切-β-甘露聚糖酶、果胶甲基酯酶、纤维二糖水解酶、转谷氨酰胺酶或其组合。
20.如前述段落中任一项所述的组合物，其中所述组合物是清洁或洗涤剂组合物，该清洁或洗涤剂组合物呈以下形式：条，均质片剂，具有两个或更多个层的片剂，具有一个或多个室的袋，常规或压型粉末，颗粒，糊剂，凝胶，或常规、压型或浓缩液体。
21.如前述段落中任一项所述的果胶裂解酶变体或组合物的用途，其中所述用途选自下组，该组包括以下或由以下组成：
i)用于裂解果胶物质，优选地所述果胶物质包括聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸)或其衍生物，
ii)用于清洁过程，如衣物或硬表面清洁如餐具洗涤，
iii)用于加工纺织品和/或纤维素纤维，
iv)用于从纺织品中酶促除去细胞壁材料，
v)用于加工葡萄酒或果汁，以及
vi)用作动物饲料添加剂。
22.如前述段落中任一项所述的变体在洗涤剂组合物中的用途，优选地所述洗涤剂组合物是衣物和/或餐具洗涤洗涤剂组合物。
23.如前述段落中任一项所述的变体或组合物用于裂解果胶物质的用途，优选地所述果胶物质包括聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸)或其衍生物。
24.如前述段落中任一项所述的变体或组合物用于加工纺织品和/或纤维素纤维的用途。
25.如前述段落中任一项所述的变体或组合物用于从纺织品中酶促除去细胞壁材料的用途。
26.如前述段落中任一项所述的变体或组合物用于加工葡萄酒或果汁的用途。
27.如前述段落中任一项所述的变体或组合物用作动物饲料添加剂的用途。
28.如前述段落中任一项所述的变体或组合物用于清洁过程如衣物或硬表面清洁如餐具洗涤的用途。
29.如前述段落中任一项所述的变体或组合物的用途，其中所述变体具有酶去污性益处。
30.如前述段落中任一项所述的变体或组合物用于洗涤或清洁纺织品和/或硬表面，如包括自动餐具洗涤(ADW)的餐具洗涤的用途。
31.一种酶促煮练方法，该方法包括使细胞壁材料与如前述段落中任一项所述的果胶裂解酶变体或组合物接触。
32.一种用于从纺织品中酶促除去细胞壁材料的方法，该方法包括使该纺织品与如前述段落中任一项所述的果胶裂解酶变体或组合物接触。
33.一种用于从表面除去污渍的方法，该方法包括使该表面与如前述段落中任一项所述的果胶裂解酶变体或组合物接触。
34.一种裂解果胶物质的方法，该方法包括将如前述段落中任一项所述的果胶裂解酶变体或组合物施加至所述果胶物质，优选地所述果胶物质包括聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸)或其衍生物。
35.如段落34所述的方法，其中所述果胶物质是在纺织品或硬表面如餐具洗涤的表面上。
36.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如前述段落中任一项所述的变体。
37.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体能够表达如段落36所述的多核苷酸，优选地所述核酸构建体或所述表达载体包含如段落36所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导多肽在表达宿主内产生的一个或多个控制序列。
38.一种微生物宿主细胞，该微生物宿主细胞用如段落37所述的核酸构建体或表达载体转化。
39.如段落38所述的微生物宿主细胞，其中该细胞是细菌，优选芽孢杆菌，更优选枯草芽孢杆菌。
40.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含如段落36所述的多核苷酸，优选地所述多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列，进一步优选地所述重组宿主细胞是分离的重组宿主细胞。
41.一种用于生产(或获得)如前述段落中任一项所述的果胶裂解酶变体的方法，其中将如前述段落中任一项所述的微生物宿主细胞在有利于该变体的表达和分泌的条件下进行培养并且回收该变体。
42.一种用于改善果胶裂解酶(例如，亲本果胶裂解酶，例如，具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)的洗涤剂稳定性的方法，该方法包括：向所述果胶裂解酶(例如，所述亲本果胶裂解酶，例如具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)中在选自下组的一个或多个位置处引入一种或多种改变(例如，一个或多个取代、一个或多个插入或一个或多个缺失)，该组由以下组成：位置(例如，位置的组合)48、49、99、108、124、149、176、229、250、257、325、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、99+176+325+356、99+49+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、229+250、229+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356、48+229、229+257、229+250、229+356、48+257、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、229+250+356，其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该果胶裂解酶(例如，该改变的果胶裂解酶，例如包含在一个或多个位置处的所述一种或多种改变)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少75％，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、但小于100％序列一致性。
43.如段落41所述的方法，该方法进一步包括：向亲本果胶裂解酶中在选自下组的一个或多个位置处引入一种或多种改变(例如，一个或多个取代、一个或多个插入或一个或多个缺失)，该组由以下组成：位置(例如，位置的组合)48、49、99、108、124、149、176、229、250、257、325、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、99+176+325+356、99+49+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、229+250、229+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356、48+229、229+257、229+250、229+356、48+257、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、229+250+356，其中该果胶裂解酶变体具有氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的氨基酸序列具有至少75％，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、但小于100％序列一致性。
44.如段落20-21中任一项所述的方法，其中所述改变是在选自下组的一个或多个位置中的取代，该组由以下组成：位置48、49、108、124、和149，并且其中所述取代是用带正电荷的氨基酸取代，优选地所述带正电荷的氨基酸是赖氨酸或精氨酸。
45.如段落42-43中任一项所述的方法，其中在一个或多个位置处的所述改变选自下组，该组由以下取代(例如，取代的组合)组成：P48A、P48F、P48H、P48I、P48K、P48L、P48N、P48Q、P48R、P48S、P48T、P48W、P48Y、T49F、T49H、T49I、T49K、T49L、T49M、T49N、T49Q、T49R、T49V、T49W、T49Y、K99A、K99C、K99D、K99E、K99F、K99G、K99H、K99I、K99L、K99M、K99N、K99P、K99Q、K99S、K99T、K99V、K99W、K99Y、E108A、E108G、E108H、E108K、E108L、E108M、E108N、E108R、E108S、E108T、E108V、E108W、D124A、D124E、D124F、D124G、D124I、D124L、D124M、D124N、D124P、D124Q、D124R、D124S、D124T、D124V、D124W、S149K、S149L、S149R、S149W、S176A、S176C、S176D、S176E、S229I、S229K、S229L、S229M、S229Q、S229T、S229V、S229Y、I250A、I250G、I250L、I250M、I250N、I250S、I250T、K257A、K257C、K257D、K257H、K257I、K257L、K257M、K257Q、K257S、K257V、K257W、I325F、I325L、I325Y、Q356D、Q356E、Q356F、Q356G、Q356H、Q356I、Q356L、Q356N、Q356R、Q356T、Q356W、Q356Y、K99D+S176D+I325F、T49R+K99D+S176D+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+S176D+I325F+Q356F、K99D+D124W+S176D+I325F+Q356F、P48W+K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+E108N+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+E108N+S176D+I325F+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49W+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、S229I+I250N、S229I+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+E108N+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+I250N+I325F+K257L+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、P48W+K257L、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、以及I250N+Q356F、S229I+I250N+Q356F。
46.一种用于改善果胶裂解酶(例如，亲本果胶裂解酶，例如，具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)的洗涤剂稳定性的方法，该方法包括：向所述果胶裂解酶(例如，所述亲本果胶裂解酶，例如，具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)中在选自下组的一个或多个位置处引入一种或多种改变(例如，一个或多个取代、一个或多个插入或一个或多个缺失)，该组由以下组成：位置(例如，位置的组合)250、176、124、108、149和325，其中每个位置对应于具有SEQID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该果胶裂解酶(例如，该改变的果胶裂解酶，例如，包含在一个或多个位置处的所述一种或多种改变)与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少75％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％序列一致性。
47.如前述段落中任一项所述的方法，其中该亲本果胶裂解酶选自下组，该组由以下组成：
a)多肽，该多肽与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少75％，例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％或100％序列一致性；
b)多肽，该多肽在中或高严格条件下由与(i)编码SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的多肽的序列、或者(ii)(i)的全长补体杂交的多核苷酸编码；
c)多肽，该多肽由与编码SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的多肽的序列具有至少75％一致性的多核苷酸编码；
d)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的多肽的片段，该片段具有果胶裂解酶活性。
48.如前述段落中任一项所述的方法，其中在一个或多个位置处的所述改变提供了如下变体，该变体具有>1.0的半衰期改善因子(HIF)，例如，>2.0的HIF、>3.0的HIF、>4.0的HIF、>5.0的HIF、>6.0的HIF、>7.0的HIF、>8.0的HIF、>9.0的HIF、>10.0的HIF、>11.0的HIF、>12.0的HIF、>13.0的HIF、>14.0的HIF、>15.0的HIF、>16.0的HIF、>17.0的HIF、>18.0的HIF。
方法
用于果胶裂解酶活性的定量的微量滴定测定
果胶裂解酶通过反式消除机制裂解聚半乳糖醛酸。这意味着它为每次底物分裂留下双C-C键。此键在235nm处吸收，从而允许通过测量该波长处的吸光度而直接检测可溶性聚半乳糖醛酸上的果胶裂解酶作用。
将酶样品在测定缓冲液(100mM Tris-HCl，0.68mM CaCl2，pH 8.0)中稀释至5与100ng/ml之间的浓度。如果酶样品含有洗涤剂，则应相对于洗涤剂稀释至少1000倍。将100μl的酶缓冲液稀释液与100μl的底物(1％(w/v)聚半乳糖醛酸，例如来自西格玛公司(Sigma)的P-3850)混合，在测定缓冲液中搅拌至少15分钟并在2300g下离心5分钟，上清液(用于)加热板中并在加热块(优选PCR机或具有等效精度和加热速度的设备)中加热至40℃持续10分钟。
将100μl酶/底物溶液与100μl终止试剂(50mM H3PO4)在UV-透明微量滴定板中混合。短暂且轻轻地振动UV板，并在微量滴定光谱仪(例如，Molecular Devices，SpectraMAX190)中测量235nm处的吸光度。通过从所有测量值中减去(在没有添加的酶时运行的)对照样品的吸光度，相对于背景吸光度校正吸光度读数。
基于WO 2003/095638中的SEQ ID NO:2的果胶裂解酶(来自作为IFO 3134保藏的枯草芽孢杆菌)的活性的标准曲线在反应混合物中在2.5与100ng/ml酶之间是线性的：
可替代地，果胶裂解酶的催化活性可以通过粘度测定，APSU确定。
粘度测定，APSU
APSU单位：APSU测定测量在没有添加的钙离子的情况下聚半乳糖醛酸溶液的粘度变化。将5％w/v聚半乳糖醛酸钠(例如，Sigma P-1879)溶液溶解于pH 10的0.1M甘氨酸缓冲液中。将4ml的此溶液在40℃预孵育5分钟。然后，添加250微升酶(或酶稀释液)，之后将反应物在混合器中以最高速度混合10秒，并在40℃或另一温度下孵育20分钟。
使用粘度计(例如，MIVI 600粘度计，Sofraser，45700 Villemandeur，法国)测量粘度。在10秒后粘度被测量为mV。对于APSU单位的计算，使用以下标准曲线：
APSU/ml 0.00 4.00 9.00 14.00 19.00 24.00 34.00 49.00 99.00
mV 300 276 249 227 206 188 177 163 168
测试材料
在从测试材料中心(Center for Testmaterials)BV，邮政信箱120，3133 KT弗拉尔丁恩(Vlaardingen)，荷兰(Netherlands)获得的测试材料(样本)上研究果胶裂解酶的洗涤性能。商业“EU重垢液体洗涤剂”在2013年2月在英国超市购买。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应理解为对本发明的范围进行限制。
实例
实例1：果胶裂解酶变体的克隆、发酵和纯化。
基于具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的果胶裂解酶主链，通过在枯草芽孢杆菌中表达制备了如下文披露的变体。使用分子生物学的标准方法进行所有DNA操作和转化。
使用编码果胶裂解酶变体的重组枯草芽孢杆菌构建体来接种含有富营养培养基(100g/L蔗糖、40g/L大豆壳(大豆粉)、10g/L Na2HPO4.12H2O、0.1ml/L Dowfax63N10(例如，简称Dow)的摇瓶。Dowfax63N1是非离子型表面活性剂。在30℃在220rpm的振荡下培养4天。将表达果胶裂解酶变体的枯草芽孢杆菌的发酵培养物以13000rpm离心20分钟并且然后将上清液通过0.22μm过滤器过滤。将滤液添加硫酸铵(AmS)至1M浓度，并施加到于50mMHEPES，1M AmS，pH 7中预先平衡的MEP柱上。从柱上洗掉未结合的物质并且随后使用100mMCH3COOH(pH 4.5)洗脱结合的蛋白质。此后使用Sephadex G-25柱将洗脱液缓冲液交换到25mM CH3COOH(pH 4.5)中，并施加到在相同缓冲液中预先平衡的Source 15S柱上。在洗掉未结合的蛋白质后，使用在25mM CH3COOH(pH 4.5)中的从0至1M NaCl的线性梯度洗脱果胶裂解酶。
制备了具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的果胶裂解酶主链的以下变体：P48A、P48F、P48H、P48I、P48K、P48L、P48N、P48Q、P48R、P48S、P48T、P48W、P48Y、T49F、T49H、T49I、T49K、T49L、T49M、T49N、T49Q、T49R、T49V、T49W、T49Y、K99A、K99C、K99D、K99E、K99F、K99G、K99H、K99I、K99L、K99M、K99N、K99P、K99Q、K99S、K99T、K99V、K99W、K99Y、E108A、E108G、E108H、E108K、E108L、E108M、E108N、E108R、E108S、E108T、E108V、E108W、D124A、D124E、D124F、D124G、D124I、D124L、D124M、D124N、D124P、D124Q、D124R、D124S、D124T、D124V、D124W、S149K、S149L、S149R、S149W、S176A、S176C、S176D、S176E、S229I、S229K、S229L、S229M、S229Q、S229T、S229V、S229Y、I250A、I250G、I250L、I250M、I250N、I250S、I250T、K257A、K257C、K257D、K257H、K257I、K257L、K257M、K257Q、K257S、K257V、K257W、I325F、I325L、I325Y、Q356D、Q356E、Q356F、Q356G、Q356H、Q356I、Q356L、Q356N、Q356R、Q356T、Q356W、Q356Y、K99D+S176D+I325F、T49R+K99D+S176D+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+S176D+I325F+Q356F、K99D+D124W+S176D+I325F+Q356F、P48W+K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+E108N+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+E108N+S176D+I325F+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49W+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、S229I+I250N、S229I+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+E108N+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+I250N+I325F+K257L+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、P48W+K257L、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、以及I250N+Q356F、S229I+I250N+Q356F(例如，如在此以下实例2的表1、实例3的表2、实例3的表3、实例4的表4、实例5的表5中所述)。
实例2：测量果胶裂解酶在液体洗涤剂中的稳定性
通过在酶-洗涤剂混合物孵育后测量变体的活性来评估果胶裂解酶变体的洗涤剂中稳定性。在15％标准A洗涤剂中测定半衰期改善因子(HIF)。
残余活性测定：将20微升酶溶液(培养上清液)与30微升的“标准A洗涤剂”(在水中预先稀释至25％v/v)在384孔微板(聚苯乙烯)中混合。从每个孔中将10微升转移到两个新的384孔微板中。将两个相同的板中的一个在5℃储存，而另一个在45.5℃孵育16小时。在孵育后，将40微升的测定缓冲液(100mM Tris-HCL，0.68mM CaCI2，pH 8.0)添加至两个板中的样品中并剧烈混合。用测定缓冲液将两个板中的所有样品进一步稀释8倍。
将在5℃储存的板在弱洗涤剂溶液(测定缓冲液中0.47％v/v洗涤剂)中进一步稀释5倍。通过将20微升稀释的酶-洗涤剂混合物与20微升新鲜制备的底物溶液(在测定缓冲液中的1％聚半乳糖醛酸)在UV-透明的384孔微板中混合并使用分光光度计测量235nm处的吸光度来测量酶活性。
残余活性被计算为相对于在5℃储存的样品中的酶活性，在45.5℃孵育16小时的样品的酶活性。残余活性(RA)＝100％*活性[45.5℃的样品]/活性[5℃的样品]。
计算半衰期改善因子(HIF)：
将变体(RA-var)的残余活性与主链(SEQ ID NO:1)参考(RA-Bb)的残余活性进行比较。可以计算主链/参考和样品的半衰期值(T1/2(小时))，因为降解遵循指数衰减并且孵育时间(小时)是已知的。半衰期改善因子(HIF)被计算为T1/2(变体)/T1/2(Bb)。由于两个样品都孵育相同的时间段，因此等式可以简化并减少为：HIF＝Ln(RA-Bb/100)/Ln(RA-var/100)。所获得的HIF值列于以下表1中。
关于在洗涤剂中的改善的稳定性和/或改善的热稳定性，尤其显著的是在位置48、49、108、124和149中对带有正电荷的氨基酸(即对赖氨酸或精氨酸)的取代。
实例3：变体在90％液体洗涤剂中的稳定性改善的确定
在90％“EU重垢液体洗涤剂”中测定半衰期改善因子(HIF)。通过如下所述在酶-洗涤剂混合物孵育后测量变体的活性来评估果胶裂解酶变体的洗涤剂稳定性。半衰期改善因子(HIF)确定测定：样品是稀释至1000ppm的纯化酶或摇瓶培养物上清液。将20微升样品与180微升“EU重垢液体洗涤剂”混合。
将等分部分的混合物在PCR机(PTC200)中于55℃(纯化的样品)或56℃(上清液)下孵育。随时间变化，将等分部分用测定缓冲液稀释250倍并分析酶活性的含量-如上文实例2中所述。因此，对于每中变体，获得随时间变化降解的信息。预期并且对于所有样品观察到酶活性的指数衰减。
Excel(Microsoft版本2010)“Logest”函数用于计算最佳拟合所提供的y-值和x-值集合的指数曲线(y＝b*m^x，其中运算符“^”(或插入符号)使数字升幂，并且运算符“*”(或星号)使数字相乘)。孵育时间用作X-值，并且酶活性是Y-值，以获得数据最佳拟合至指数衰减：y＝b*m^x并用于计算指数衰减常数(k＝Ln(m))，并且最后T1/2时间(T1/2＝Ln2/k)。半衰期改善因子最终计算为：HIF＝T1/2(变体)/T1/2(主链)。所获得的HIF值列于以下表2(纯化的样品)和表3(上清液样品)中。
具有以下取代组合：P48W+T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49W+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F和T49R+K99D+D124W+S176D+K257L+I325F+Q356F的变体也进行了发酵、纯化并且发现在液体洗涤剂中储存后具有提高的残余活性。
实例4：在液体洗涤剂中的稳定性的测定
通过在标准A液体洗涤剂中储存后的残余洗涤性能来测量果胶裂解酶变体的储存稳定性(表4)。通过以下方式来测定稳定性：在37℃在液体洗涤剂中储存果胶裂解酶变体4周，然后使用购自CFT的污渍C-S-53(在棉上果胶酸酯与色素)和PC-S-53(在聚酯/棉上的炭黑与果胶酸酯)在mini-Terg-O-tometer(mini-TOM)洗涤测定中进行洗涤性能评价。Mini-TOM洗涤类似于TOM洗涤，但是，使用400mL烧杯代替常规的2000mL烧杯。其余条件不变。使用15°dH(Ca:Mg:HCO3 -＝4:1:7.5)在30℃以120RPM进行mini-TOM洗涤30分钟，并且洗涤剂剂量为在200mL总洗涤体积中3.33g/L。在冲洗洗涤污渍后，干燥并使用Digi-Eye分光光度计定量强度。
具体地，每种果胶裂解酶在封闭的玻璃容器中在标准A液体洗涤剂(对应于洗涤中的0.05ppm酶)中以0.015mg酶蛋白/g洗涤剂给与，并在37℃的加热箱中孵育4周。将相同的参考样品置于-18℃。在4周后，将储存在37℃的变体的洗涤性能与储存在-18℃的样品的洗涤性能进行比较，以计算每种变体的残余洗涤性能。每种变体的残余洗涤性能被计算为：残余洗涤性能＝(ΔINT37℃)/(ΔINT-18℃)，其中ΔINT被计算为在特定条件与相对应的无酶空白之间获得的强度。
具有以下取代组合：S229I+I250N、S229I+Q356F和T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F的变体也进行了发酵，纯化并且发现具有如在液体洗涤剂中储存后通过mini-TOM洗涤测量的改善的残余洗涤性能。
实例5：热稳定性的测定
使用蛋白质热解折叠分析(TSA，热漂移测定)(表5)测定热稳定性。
使用实时PCR仪(例如，应用生物系统公司(Applied Biosystems)；Step-One-Plus)用宝石橙(Sypro Orange)(英杰公司，S-6650)监测蛋白质热解折叠。在96孔白色PCR板中，将在100mM HEPES；20mM EDTA pH 8,0中的15微升样品(纯化的酶100ppm)与宝石橙(浓度＝10X；来自供应商的储备溶液＝5000X)混合(1:1)。用光学PCR密封件密封该板。将PCR仪的扫描速率设置为每小时76℃，起始于25℃并且结束于96℃。使用用于激发的内置(in-built)LED蓝光和ROX-滤波器(610nm，发射)每20秒监测荧光。Tm值被计算为第一衍生物的最大值(dF/dK)(Gregory等人；J Biomol Screen[生物分子筛选杂志]2009 14:700)。
序列表
<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）
<120> 果胶裂解酶变体以及编码它们的多核苷酸
<130> 13260-WO-PCT
<160> 2
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 399
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 亲本果胶裂解酶是WO 2002/09274中披露的来自枯草芽孢杆菌的果胶裂解酶的变体。
<400> 1
Ala Asp Leu Gly His Gln Thr Leu Glu Ser Asn Asp Gly Trp Gly Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Thr Gly Thr Thr Gly Gly Ser Lys Ala Ser Ser Ser His Val
20 25 30
Tyr Thr Val Ser Asn Arg Asn Gln Leu Val Ser Ala Leu Gly Lys Pro
35 40 45
Thr Asn Thr Thr Pro Lys Ile Ile Tyr Ile Lys Gly Thr Ile Asp Phe
50 55 60
Asn Val Asp Asp Asn Leu Lys Pro Leu Gly Leu Asn Asp Tyr Lys Asp
65 70 75 80
Pro Glu Tyr Asp Leu Asp Lys Tyr Leu Lys Ala Tyr Asp Pro Ser Thr
85 90 95
Trp Gly Lys Lys Glu Pro Ser Gly Pro Leu Glu Glu Ala Arg Ala Arg
100 105 110
Ser Gln Lys Asn Gln Lys Ala Arg Val Met Val Asp Ile Pro Ala Asn
115 120 125
Thr Thr Ile Val Gly Ser Gly Thr Asn Ala Ile Ile Val Gly Gly Asn
130 135 140
Phe His Ile Lys Ser Asp Asn Val Ile Ile Arg Asn Ile Glu Phe Gln
145 150 155 160
Asp Ala Tyr Asp Tyr Phe Pro Gln Trp Asp Pro Thr Asp Gly Ser Ser
165 170 175
Gly Asn Trp Asn Ser Gln Tyr Asp Asn Ile Thr Ile Asn Gly Gly Thr
180 185 190
His Ile Trp Ile Asp His Cys Thr Phe Asn Asp Gly Ser Arg Pro Asp
195 200 205
Ser Thr Ser Pro Thr Tyr Phe Gly Arg Pro Tyr Gln His His Asp Gly
210 215 220
Gln Thr Asp Ala Ser Asn Gly Ala Asn Tyr Ile Thr Met Ser Tyr Asn
225 230 235 240
Tyr Tyr His Asp His Asp Lys Ser Ser Ile Phe Gly Ser Ser Asp Ser
245 250 255
Lys Ile Ser Asp Asp Gly Lys Leu Lys Ile Thr Leu His His Asn Arg
260 265 270
Tyr Lys Asn Ile Val Gln Arg Ala Pro Arg Val Arg Phe Gly Gln Val
275 280 285
His Val Tyr Asn Asn Tyr Tyr Glu Gly Ser Thr Ser Ser Ser Asp Tyr
290 295 300
Pro Phe Ser Tyr Ala Trp Gly Ile Gly Lys Ser Ser Lys Ile Tyr Ala
305 310 315 320
Gln Asn Asn Val Ile Asp Val Pro Gly Leu Pro Ala Ala Lys Thr Ile
325 330 335
Lys Val Phe Ser Gly Gly Thr Ala Leu Tyr Asp Ser Gly Thr Leu Leu
340 345 350
Asn Gly Thr Gln Ile Asn Ala Ser Ala Ala Asn Gly Leu Ser Ser Ser
355 360 365
Val Gly Trp Thr Pro Ser Leu His Gly Thr Ile Asp Ala Ser Ala His
370 375 380
Val Lys Ser Asn Val Ile Ser Gln Ala Gly Ala Gly Lys Leu Asn
385 390 395
<210> 2
<211> 399
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 2
Ala Asp Leu Gly His Gln Thr Leu Gly Ser Asn Asp Gly Trp Gly Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Thr Gly Thr Thr Gly Gly Ser Lys Ala Ser Ser Ser Asn Val
20 25 30
Tyr Thr Val Ser Asn Arg Asn Gln Leu Val Ser Ala Leu Gly Lys Glu
35 40 45
Thr Asn Thr Thr Pro Lys Ile Ile Tyr Ile Lys Gly Thr Ile Asp Met
50 55 60
Asn Val Asp Asp Asn Leu Lys Pro Leu Gly Leu Asn Asp Tyr Lys Asp
65 70 75 80
Pro Glu Tyr Asp Leu Asp Lys Tyr Leu Lys Ala Tyr Asp Pro Ser Thr
85 90 95
Trp Gly Lys Lys Glu Pro Ser Gly Thr Gln Glu Glu Ala Arg Ala Arg
100 105 110
Ser Gln Lys Asn Gln Lys Ala Arg Val Met Val Asp Ile Pro Ala Asn
115 120 125
Thr Thr Ile Val Gly Ser Gly Thr Asn Ala Lys Val Val Gly Gly Asn
130 135 140
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145 150 155 160
Asp Ala Tyr Asp Tyr Phe Pro Gln Trp Asp Pro Thr Asp Gly Ser Ser
165 170 175
Gly Asn Trp Asn Ser Gln Tyr Asp Asn Ile Thr Ile Asn Gly Gly Thr
180 185 190
His Ile Trp Ile Asp His Cys Thr Phe Asn Asp Gly Ser Arg Pro Asp
195 200 205
Ser Thr Ser Pro Lys Tyr Tyr Gly Arg Lys Tyr Gln His His Asp Gly
210 215 220
Gln Thr Asp Ala Ser Asn Gly Ala Asn Tyr Ile Thr Met Ser Tyr Asn
225 230 235 240
Tyr Tyr His Asp His Asp Lys Ser Ser Ile Phe Gly Ser Ser Asp Ser
245 250 255
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260 265 270
Tyr Lys Asn Ile Val Gln Arg Ala Pro Arg Val Arg Phe Gly Gln Val
275 280 285
His Val Tyr Asn Asn Tyr Tyr Glu Gly Ser Thr Ser Ser Ser Ser Tyr
290 295 300
Pro Phe Ser Tyr Ala Trp Gly Ile Gly Lys Ser Ser Lys Ile Tyr Ala
305 310 315 320
Gln Asn Asn Val Ile Asp Val Pro Gly Leu Ser Ala Ala Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Val Phe Ser Gly Gly Thr Ala Leu Tyr Asp Ser Gly Thr Leu Leu
340 345 350
Asn Gly Thr Gln Ile Asn Ala Ser Ala Ala Asn Gly Leu Ser Ser Ser
355 360 365
Val Gly Trp Thr Pro Ser Leu His Gly Ser Ile Asp Ala Ser Ala Asn
370 375 380
Val Lys Ser Asn Val Ile Asn Gln Ala Gly Ala Gly Lys Leu Asn
385 390 395

Claims (18)

1.一种果胶裂解酶变体，其中所述变体具有果胶裂解酶活性并且包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：250、176、124、325、108、149、48、49、99、229、257、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、99+176+325+356、99+49+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356、48+257、以及229+250+356，其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体与SEQID NO:1的氨基酸序列具有至少65％、但小于100％一致性。
2.如权利要求1所述的变体，该变体是与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的亲本果胶裂解酶的变体。
3.如权利要求1至2中任一项所述的变体，其中所述改变是带正电荷的氨基酸，优选地所述带正电荷的氨基酸是赖氨酸或精氨酸，进一步优选地，所述改变是在选自下组的位置中的一个或多个中对赖氨酸或精氨酸的取代，该组由以下组成：位置48、49、108、124、和149。
4.如权利要求1至2中任一项所述的变体，其中该变体包含选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：P48A、P48F、P48H、P48I、P48K、P48L、P48N、P48Q、P48R、P48S、P48T、P48W、P48Y、T49F、T49H、T49I、T49K、T49L、T49M、T49N、T49Q、T49R、T49V、T49W、T49Y、K99A、K99C、K99D、K99E、K99F、K99G、K99H、K99I、K99L、K99M、K99N、K99P、K99Q、K99S、K99T、K99V、K99W、K99Y、E108A、E108G、E108H、E108K、E108L、E108M、E108N、E108R、E108S、E108T、E108V、E108W、D124A、D124E、D124F、D124G、D124I、D124L、D124M、D124N、D124P、D124Q、D124R、D124S、D124T、D124V、D124W、S149K、S149L、S149R、S149W、S176A、S176C、S176D、S176E、S229I、S229K、S229L、S229M、S229Q、S229T、S229V、S229Y、I250A、I250G、I250L、I250M、I250N、I250S、I250T、K257A、K257C、K257D、K257H、K257I、K257L、K257M、K257Q、K257S、K257V、K257W、I325F、I325L、I325Y、Q356D、Q356E、Q356F、Q356G、Q356H、Q356I、Q356L、Q356N、Q356R、Q356T、Q356W、Q356Y、K99D+S176D+I325F、T49R+K99D+S176D+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+S176D+I325F+Q356F、K99D+D124W+S176D+I325F+Q356F、P48W+K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+E108N+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+E108N+S176D+I325F+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49W+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、S229I+I250N、S229I+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+E108N+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+I250N+I325F+K257L+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、P48W+K257L、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356F、以及S229I+I250N+Q356F。
5.一种果胶裂解酶变体，该变体包含在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：位置250、176、124、108、149和325，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，并且其中该一种或多种改变独立地是：
(i)在占据该位置的氨基酸的下游插入氨基酸；
(ii)缺失占据该位置的氨基酸；或者
(iii)用不同的氨基酸取代占据该位置的氨基酸，
并且其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该变体果胶裂解酶与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％一致性。
6.如权利要求5所述的变体，该变体是与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的亲本果胶裂解酶的变体。
7.如权利要求1至6中任一项所述的变体，其中，与亲本酶相比，该变体具有在洗涤剂中的改善的稳定性或改善的热稳定性，优选地使用半衰期改善因子或残余洗涤性能作为在洗涤剂中的稳定性的量度，进一步优选地使用热漂移测定作为热稳定性的量度。
8.一种组合物，该组合物包含如权利要求1至7中任一项所述的变体。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述组合物是清洁或洗涤剂组合物，优选地是衣物或餐具洗涤组合物。
10.如权利要求8至9中任一项所述的组合物，该组合物进一步包含：
i)一种或多种洗涤剂组分，优选地所述洗涤剂组分选自下组，该组由以下组成：表面活性剂、水溶助剂、助洗剂、共助洗剂、螯合剂、漂白组分、聚合物、织物调色剂、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、分散剂、染料转移抑制剂、荧光增白剂、香料、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污物悬浮剂、污物释放聚合物、抗再沉积剂、酶抑制剂、酶稳定剂、酶活化剂、抗氧化剂、以及增溶剂；和/或
ii)一种或多种另外的酶，优选地所述另外的酶选自下组，该组由以下组成：蛋白酶、淀粉酶、地衣聚糖酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧合酶、过氧化氢酶、甘露聚糖酶、氧化还原酶、半纤维素酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、酯酶、阿拉伯聚糖酶、果胶裂解酶、DNA酶、过水解酶、β葡聚糖酶、黄原胶裂解酶、酰基转移酶、磷脂酶、漆酶、芳基酯酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质酶、角叉菜胶酶、普鲁兰酶、鞣酸酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、果胶乙酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、内切-β-甘露聚糖酶、外切-β-甘露聚糖酶、果胶甲基酯酶、纤维二糖水解酶、转谷氨酰胺酶、或其组合。
11.如前述权利要求中任一项所述的果胶裂解酶变体或组合物的用途，其中所述用途选自下组，该组由以下组成：
i)用于裂解果胶物质，优选地所述果胶物质包括聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸)或其衍生物，
ii)用于清洁过程，如衣物或硬表面清洁如餐具洗涤，
iii)用于加工纺织品和/或纤维素纤维，
iv)用于从纺织品中酶促除去细胞壁材料，
v)用于加工葡萄酒或果汁，以及
vi)用作动物饲料添加剂。
12.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1至7中任一项所述的变体。
13.一种分离的宿主细胞，该分离的宿主细胞包含如权利要求12所述的多核苷酸。
14.一种用于改善亲本果胶裂解酶的洗涤剂稳定性的方法，该方法包括：向所述亲本果胶裂解酶中在选自下组的一个或多个位置处引入改变，该组由以下组成：48、49、99、108、124、149、176、229、250、257、325、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、99+176+325+356、99+49+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、229+250、229+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356、48+229、229+257、229+250、229+356、48+257、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、以及229+250+356，其中每个位置对应于具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该改变的果胶裂解酶与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％、但小于100％序列一致性。
15.如权利要求14所述的方法，其中在一个或多个位置处的所述改变选自下组，该组由以下组成：P48A、P48F、P48H、P48I、P48K、P48L、P48N、P48Q、P48R、P48S、P48T、P48W、P48Y、T49F、T49H、T49I、T49K、T49L、T49M、T49N、T49Q、T49R、T49V、T49W、T49Y、K99A、K99C、K99D、K99E、K99F、K99G、K99H、K99I、K99L、K99M、K99N、K99P、K99Q、K99S、K99T、K99V、K99W、K99Y、E108A、E108G、E108H、E108K、E108L、E108M、E108N、E108R、E108S、E108T、E108V、E108W、D124A、D124E、D124F、D124G、D124I、D124L、D124M、D124N、D124P、D124Q、D124R、D124S、D124T、D124V、D124W、S149K、S149L、S149R、S149W、S176A、S176C、S176D、S176E、S229I、S229K、S229L、S229M、S229Q、S229T、S229V、S229Y、I250A、I250G、I250L、I250M、I250N、I250S、I250T、K257A、K257C、K257D、K257H、K257I、K257L、K257M、K257Q、K257S、K257V、K257W、I325F、I325L、I325Y、Q356D、Q356E、Q356F、Q356G、Q356H、Q356I、Q356L、Q356N、Q356R、Q356T、Q356W、Q356Y、K99D+S176D+I325F、T49R+K99D+S176D+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+S176D+I325F+Q356F、K99D+D124W+S176D+I325F+Q356F、P48W+K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+E108N+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+E108N+S176D+I325F+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49W+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、S229I+I250N、S229I+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+E108N+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+I250N+I325F+K257L+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、P48W+K257L、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356F、以及S229I+I250N+Q356F。
16.一种用于改善果胶裂解酶(例如，亲本果胶裂解酶，例如，具有SEQ ID NO:1或SEQID NO:2)的洗涤剂稳定性的方法，该方法包括：向所述果胶裂解酶(例如，所述亲本果胶裂解酶，例如，具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)中在选自下组的一个或多个位置处引入一种或多种改变(例如，一个或多个取代、一个或多个插入或一个或多个缺失)，该组由以下组成：位置(例如，位置的组合)250、176、124、108、149和325，其中每个位置对应于具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的果胶裂解酶的氨基酸序列的位置，并且其中该果胶裂解酶(例如，该改变的果胶裂解酶，例如，包含在一个或多个位置处的所述一种或多种改变)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少75％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％序列一致性。
17.如权利要求14至16中任一项所述的方法，其中该亲本果胶裂解酶是与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％序列一致性的多肽。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在一个或多个位置处的所述改变提供了与该亲本果胶裂解酶相比具有>1.0的半衰期改善因子(HIF)的变体。
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