CN109844110A - 黄原胶裂解酶变体以及编码它们的多核苷酸 - Google Patents

黄原胶裂解酶变体以及编码它们的多核苷酸 Download PDF

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Abstract

本发明涉及黄原胶裂解酶变体以及用于获得黄原胶裂解酶变体的方法。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、和宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

Description

黄原胶裂解酶变体以及编码它们的多核苷酸
对序列表的引用
本申请含有处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及相对于亲本黄原胶裂解酶在一种或多种特性中表现出改变的新颖黄原胶裂解酶变体，这些特性包括：洗涤剂稳定性(例如，在洗涤剂组合物中(例如在螯合剂(例如EDTA或柠檬酸盐)的存在下)改善的稳定性)和/或储存稳定性(例如，在洗涤剂组合物中(例如在螯合剂(例如EDTA或柠檬酸盐)的存在下)改善的储存稳定性)。本发明进一步涉及对黄原胶具有活性的新颖黄原胶裂解酶变体。本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸的核酸构建体、载体、和宿主细胞，以及用于产生和使用本发明的变体的方法。本发明的变体适于在清洁过程和洗涤剂组合物中使用，例如洗衣组合物和餐具洗涤组合物，包括手洗和自动餐具洗涤组合物。本发明进一步涉及包含本发明的变体和/或内切葡聚糖酶的组合物，用于在洗涤剂中和钻探和石油工业中使用。
背景技术
黄原胶是一种衍生自野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)的细菌包衣的多糖。黄原胶通过由野油菜黄单胞菌细菌发酵葡萄糖、蔗糖、或乳糖而产生。在发酵周期后，用异丙醇将该多糖从生长培养基中沉淀、干燥、并磨成细粉。随后，将其添加至液体介质中以形成胶。黄原胶是由不同糖组成的天然多糖，这些不同糖通过若干不同键连接，例如β-D-甘露糖基-β-D-1,4-葡萄糖醛酸基键和β-D-葡糖基-β-D-1,4-葡糖基键。黄原胶在水中至少部分地可溶并且形成高黏性的溶液或凝胶。黄原胶的完全酶降解需要若干酶活性，包括黄原胶裂解酶活性和内切-β-1,4-葡聚糖酶活性。黄原胶裂解酶是切割黄原胶的β-D-甘露糖基-β-D-1,4-葡萄糖醛酸基键的酶并且已经被描述于文献中。黄原胶降解酶在本领域中是已知的，例如两种已经分离自溶藻弧菌类芽孢杆菌(Paenibacillus alginolyticus)XL-1的黄原胶裂解酶(例如，Ruijssenaars等人(1999)‘A pyruvated mannose-specificxanthan lyase involved in xanthan degradation by Paenibacillus alginolyticusXL-1[在由溶藻弧菌类芽孢杆菌XL-1降解黄原胶中涉及的一种丙酮酸甘露糖特异性黄原胶裂解酶]’，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65(6):2446-2452，和Ruijssenaars等人(2000)，‘A novel gene encoding xanthan lyase of Paenibacillusalginolyticus strain XL-1[一种编码溶藻弧菌类芽孢杆菌菌株XL-1的黄原胶降解酶的新颖基因]’,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]66(9):3945-3950)。糖苷水解酶是催化糖基键水解以释放更小的糖的酶。存在超过100种已经被分类的糖苷水解酶，参见Henrissat等人(1991)‘A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities[基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分类]’，J.Biochem.[生物化学杂志]280:309-316和Uniprot网站，www.cazy.org。糖苷水解酶家族9(GH9)由超过70种不同的酶组成，这些酶大部分是内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)和外切-β-葡糖胺酶(EC 3.2.1.165)。近年来，黄原胶已经被用作许多消费产品中的成分，包括食品(例如，在色拉调料和乳制品中作为增稠剂)和化妆品(例如，在牙膏和化妆品、乳膏和洗剂中作为稳定剂和增稠剂以阻止成分分离，并且提供产品的合适质地)。此外，已经发现了黄原胶在石油工业中作为添加剂以调节钻井液的黏度的用途等。黄原胶的广泛使用已经导致希望降解含有黄原胶的溶液、凝胶或混合物从而允许更简单地去除副产品。用于降解黄原胶的黄原胶裂解酶和内切葡聚糖酶以及此类酶用于清洁目的(例如去除含有黄原胶的污渍)以及在钻探和石油工业中的用途是已知的，例如，WO 2013167581A1。
发现已知的具有SEQ ID NO:2的黄原胶裂解酶对具有螯合剂的洗涤剂的存在敏感。为了改善此类酶的可应用性和/或成本和/或性能，持续搜寻具有改变的特性的变体，例如增加的稳定性，例如在洗涤剂组合物中(例如在螯合剂(例如EDTA或柠檬酸盐)的存在下)改善的稳定性等。然而，大酶诱变随后进行突变体文库的纯化和功能分析可能是非常昂贵并且费力的。
发明内容
由于已知的具有SEQ ID NO:2的黄原胶裂解酶是大酶(>1000个残基)，因此随机地靶向其特性来改善例如洗涤剂组合物中(例如在螯合剂的存在下)的稳定性是困难且昂贵的。
在一些方面，本发明鉴定了已知的具有SEQ ID NO:2的黄原胶裂解酶的蛋白序列/结构中的螯合剂诱导的不稳定区(当在具有EDTA的缓冲液中孵育分子时，这些区受到影响)，并且因此提供了在何处使黄原胶裂解酶突变以在洗涤剂(例如包含螯合剂的洗涤剂组合物)中使分子稳定的重要指导。
在一些方面，本发明涉及黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体在选自下组的螯合剂诱导的不稳定区中的一个或多个位置处包含改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：对应于SEQ ID NO:2的氨基酸154至176的区1、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸614至658的区2、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸731至803的区3、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸807至846的区4、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸872至885的区5、和对应于SEQ ID NO:2的氨基酸903至1004的区6。
在一些方面，本发明涉及黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体在选自下组的螯合剂诱导的不稳定区中的一个或多个位置处包含改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：对应于SEQ ID NO:2的氨基酸154至176的区1、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸614至658的区2、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸731至803的区3、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸807至846的区4、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸872至885的区5、和对应于SEQ ID NO:2的氨基酸903至1004的区6，其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％且小于100％的序列同一性，优选地所述黄原胶裂解酶变体对黄原胶具有活性。
在一些方面，本发明定义了具有以下特征中的一个或多个的亲本黄原胶裂解酶(例如，SEQ ID NO:2)的螯合剂诱导的不稳定区：在螯合剂的存在下比其相邻区中的一个或多个或全部在构象上较不稳定；和/或在螯合剂的存在下比其相邻区中的一个或多个或全部更多地暴露于所述螯合剂；和/或在螯合剂的存在下比其相邻区中的一个或多个或全部更可及(accessible)所述螯合剂；和/或在螯合剂的存在下比其相邻区中的一个或多个或全部在构象上更动态；和/或在螯合剂的存在下比其相邻区中的一个或多个或全部更容易接受氘掺入。
在一些方面，本发明涉及与SEQ ID NO:2具有至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的黄原胶裂解酶变体。
在一些方面，本发明涉及黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体在选自下组的区中的一个或多个位置处包含改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：
i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸154至176的区1，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如，使用SEQ ID NO:2的编号)，
ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸614至658的区2，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如，使用SEQ ID NO:2的编号)，
iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸731至803的区3，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如，使用SEQ ID NO:2的编号)，
iv)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸807至846的区4，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如，使用SEQ ID NO:2的编号)，
v)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸872至885的区5，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如，使用SEQ ID NO:2的编号)，
vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸903至1004的区6，例如，在选自下组的一个或多个位置处的所述改变，该组由以下组成：903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999、1000、1001、1002、1003、1004，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置(例如，使用SEQ ID NO:2的编号)。
在一些方面，本发明涉及黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体在选自下组的两个或更多个区中的一个或多个位置处包含改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：
i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸154至176的区1，
ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸614至658的区2，
iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸731至803的区3，
iv)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸807至846的区4，
v)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸872至885的区5，
vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸903至1004的区6。
在一些方面，本发明涉及在选自下组的一个或多个位置处具有改变(例如，取代、缺失或插入)的黄原胶裂解酶变体，该组由以下组成：SEQ ID NO:2的155、159、620、624、626、631、635、645、649、650、656、738、745、746、748、752、753、754、757、764、769、774、775、777、779、782、785、786、789、792、796、799、800、801、819、824、843、845、875、903、911、912、915、919、921、923、925、927、928、930、932、933、941、966、967、991和998。
在一些方面，本发明涉及具有选自下组的一个或多个取代的黄原胶裂解酶变体，该组由以下组成：Y155E、A159P、K620R、A624E、A626G、T631N、T631E、S635E、S635T、S635Q、A645S、T649V、T649K、T649R、Q650G、I656V、G738L、K745R、F746L、L748T、P752R、P752K、G753E、G753Q、G753S、S754E、S754L、S754Q、S754R、S757D、S757P、S757E、P764V、P764K、A769D、A769T、A769R、A769S、A769E、A769Q、A769*、A774V、L775M、L775Y、L775A、L775I、L775S、L775F、L775Q、D777K、D777R、P779V、Y782I、A785T、N786K、G789R、K792W、K792Y、K792V、K792A、N796Q、A799H、V800P、D801G、K819R、K819T、K824R、A843P、D845E、875T、K875E、T903A、T903Q、A911V、A911M、A911S、A912T、A912I、A912Y、T915Q、T915S、T915V、T915A、T919F、T919G、T919D、T921R、T921S、T923H、T923D、T925Q、T925D、T925R、T927K、D928W、Y930H、Y930L、Y930F、A932P、D933M、G941E、G941D、A966P、A967D、N991D和V998K。
在一些方面，本发明涉及在选自下组的一个或多个位置处具有改变(例如，取代、缺失或插入)的黄原胶裂解酶变体，该组由以下组成：624、635、649、656、738、753、754、757、769、775、777、801、843和875。
在一些方面，本发明涉及具有选自下组的一个或多个取代的黄原胶裂解酶变体，该组由以下组成：A624E、S635E、T649K、I656V、G738L、G753E、S754E、S754R、S757D、A769D、L775A、D777R、D801G、A843P和K875T。
在一些方面，本发明的黄原胶裂解酶变体在至少一个螯合剂诱导的不稳定区中的一个或多个位置处包含改变以及在至少一个相邻区中的一个或多个位置处包含改变。因此，在一些方面，除了在如上所示的以及本文其他地方所示的选自由区1、2、3、4、5和6组成的组的至少一个区中的一个或多个位置处包含改变之外，本发明的黄原胶裂解酶变体在选自下组的至少一个区中的一个或多个位置处进一步包含改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：
vii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至153的区7，
viii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸177至613的区8，
ix)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸659至730的区9，
x)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸804至806的区10，
xi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸847至871的区11，
xii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸886至902的区12，和
xiii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1005至1037的区13。
黄原胶裂解酶变体可以例如在选自由区7、8、9、10、11、12和13组成的组的两个或更多个区中的每一个中的一个或多个位置处包含改变。
在一些方面，在选自由区7、8、9、10、11、12和13组成的组的至少一个区中的一个或多个位置处的改变是在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：SEQ IDNO:2的9、15、18、46、58、66、89、95、100、106、109、183、188、190、203、204、221、229、234、238、240、242、243、257、258、284、291、293、316、317、320、324、329、333、339、341、352、354、360、372、377、399、400、419、440、450、451、454、458、481、492、505、533、567、568、576、578、579、582、664、672、703、722、726、727、728、851、855、856、867、887、892、899、900、901、902、915、1008和1016。黄原胶裂解酶变体可以例如在这些位置中的两个或更多个处(例如在这些位置中的三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个处)包含改变。
在一些方面，在选自由区7、8、9、10、11、12和13组成的组的至少一个区中的一个或多个位置处的改变包含选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：SEQ ID NO:2的K9R、N15T、T18D、L46D、A58L、S66H、Q89Y、K95E、S100D、N106Y、Q109R、Q109D、Q109F、Q109K、Q109A、K183Q、K183R、V188I、A190Q、A203P、K204R、A221P、E229N、E229S、E229V、I234V、I238W、I238L、I238M、I240W、N242S、G243V、Y257W、R258E、R284G、K291R、A293G、A293P、K316R、R317K、K320R、L324Q、K329R、K333R、L339M、I341P、V352I、S354P、K360G、K360R、Q372H、F377Y、N399K、K400R、F419Y、N440K、D450P、K451E、K451R、A454V、D458S、K481R、A492H、A492L、T505I、L533I、K567R、G568A、S578K、S578N、S578R、S579R、S579K、S582K、T664K、N672D、I703L、I722F、P726Q、T727P、M728V、S851F、K855R、E856D、P867S、K887R、N892Y、N892W、N892F、G899S、I900G、D901A、T902F、N1008D和K1016T。黄原胶裂解酶变体可以例如包含这些取代中的两个或更多个，例如所述取代中的三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个。
在一些方面，本发明的黄原胶裂解酶变体在选自由区1、2、3、4、5和6组成的组的至少一个区中的一个或多个位置处包含改变，并且在选自由区7、8、9、10、11、12和13组成的组的至少一个区中的一个或多个位置处包含改变。在一个方面，该变体在选自下组的一个或多个位置处包含改变，该组由以下组成：624、631、635、649、656、738、752、753、754、757、769、775、777、800、801、843、875、911和915，并且在选自下组的一个或多个位置处包含改变，该组由以下组成：SEQ ID NO:2的89、100、190、229、234、352、360、399、440、458、492、567、582、664、672、703、728、892、1008和1016。
该变体可以例如在选自下组的两个或更多个位置(例如三个、四个、五个或更多个位置)处包含改变，该组由以下组成：624、631、635、649、656、738、752、753、754、757、769、775、777、800、801、843、875、911和915，并且在选自下组的两个或更多个位置(例如两个、三个、四个、五个或更多个位置)处包含改变，该组由以下组成：SEQ ID NO:2的89、100、190、229、234、352、360、399、440、458、492、567、582、664、672、703、728、892、1008和1016。
在这个方面，对于改变而言优选的位置包括选自下组的一个或多个位置，该组由以下组成：624、635、649、656、738、753、754、757、769、775、777、801、843和875，和选自下组的一个或多个位置，该组由以下组成：SEQ ID NO:2的100、190、229、234、360、399、440、458、492、567、582、672、892和1008。
在这个方面的一个实施例中，黄原胶裂解酶变体包含选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：Q89Y、S100D、A190Q、E229S、I234V、V352I、K360G、N399K、N440K、D458S、A492H、A492L、K567R、S582K、T664K、N672D、I703L、M728V、N892Y、N1008D和K1016T，和选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：A624E、T631N、S635E、T649K、I656V、G738L、P752K、P752R、G753E、S754E、S754R、S757D、A769D、L775A、D777R、V800P、D801G、A843P、K875T、A911V和T915A。该变体可以例如包含选自下组的两个或更多个取代(例如三个、四个、五个或更多个取代)，该组由以下组成：Q89Y、S100D、A190Q、E229S、I234V、V352I、K360G、N399K、N440K、D458S、A492H、A492L、K567R、S582K、T664K、N672D、I703L、M728V、N892Y、N1008D和K1016T，和选自下组的两个或更多个取代(例如三个、四个、五个或更多个取代)，该组由以下组成：A624E、T631N、S635E、T649K、I656V、G738L、P752K、P752R、G753E、S754E、S754R、S757D、A769D、L775A、D777R、V800P、D801G、A843P、K875T、A911V和T915A。在这个实施例中，优选的取代包括选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：S100D、A190Q、E229S、I234V、K360G、N399K、N440K、D458S、A492H、K567R、S582K、N672D、N892Y和N1008D，和选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：A624E、S635E、T649K、I656V、G738L、G753E、S754E、S754R、S757D、A769D、L775A、D777R、D801G、A843P和K875T。
此类变体的非限制性实例包括：
●A190Q、E229S、S635E、T649K、I656V、N672D、I703L、G753E、S754E、S757D、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y、N1008D
●E229S、S635E、T649K、I656V、N672D、I703L、G753E、S754E、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y、N1008D
●E229S、V352I、S635E、T649K、I656V、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、V800P、D801G、K875T、N892Y
●E229S、K360G、D458S、S582K、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y、N1008D
●S100D、E229S、K360G、D458S、S582K、T664K、N672D、G753E、S754E、S757D、A769D、L775A、D801G、A843P、K875T、N892Y、A911V、N1008D、K1016T
●E229S、I234V、S582K、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、V800P、D801G、K875T、N892Y
●Q89Y、E229S、N440K、S582K、A624E、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y
●E229S、S635E、T649K、I656V、N672D、P752K、G753E、A769D、L775A、D801G、A843P、K875T、N892Y
●E229S、S635E、T649K、I656V、N672D、G753E、S754E、S757D、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y
●E229S、N440K、S582K、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、D801G、A843P、K875T、N892Y、N1008D
●E229S、N440K、S582K、A624E、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、V800P、D801G、K875T、N892Y
●A190Q、E229S、S635E、T649K、I656V、N672D、P752K、G753E、A769D、L775A、D801G、A843P、K875T、N892Y
●A190Q、E229S、S582K、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y
●E229S、N440K、S582K、N672D、P752R、G753E、S754E、S757D、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y、N1008D
●E229S、S582K、S635E、N672D、P752R、G753E、S754E、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y、N1008D
●A190Q、E229S、N440K、S582K、A624E、S635E、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y
●E229S、I234V、A492L、S582K、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y
●A190Q、E229S、K360G、D458S、S582K、T664K、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y、N1008D
●S100D、E229S、K360G、D458S、S582K、N672D、G753E、S754E、S757D、A769D、L775A、D801G、A843P、K875T、N892Y、T915A、N1008D
●E229S、N440K、S582K、A624E、S635E、N672D、G738L、G753E、S754E、S757D、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y
●S100D、E229S、K360G、D458S、S582K、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y、N1008D
●A190Q、E229S、D458S、T631N、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、D801G、A843P、K875T、N892Y
●A190Q、E229S、K360G、D458S、S582K、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y、N1008D
●E229S、S635E、T649K、I656V、N672D、G753E、S754R、S757D、A769D、L775A、D801G、A843P、K875T、N892Y
●E229S、D458S、S582K、T631N、S635E、N672D、M728V、G753E、S754E、S757D、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y
●A190Q、E229S、K360G、D458S、S582K、N672D、G753E、S754E、S757D、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y、N1008D
●E229S、A492L、S635E、T649K、I656V、N672D、G753E、S757D、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y
●S100D、A190Q、E229S、K360G、D458S、S582K、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y、N1008D
●A190Q、E229S、I234V、S582K、N672D、G753E、S754E、S757D、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y
●E229S、N399K、D458S、A492H、K567R、S582K、S635E、T649K、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、D777R、D801G、K875T、N892Y
●E229S、D458S、A492L、T631N、N672D、G753E、S754E、S757D、A769D、L775A、D801G、K875T、N892Y
●E229S、D458S、A492H、K567R、S582K、S635E、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、D777R、D801G、K875T、N892Y
●S100D、E229S、K360G、D458S、S582K、N672D、G753E、S754E、S757D、A769D、L775A、D801G、A843P、K875T、N892Y、N1008D
●E229S、N399K、D458S、K567R、S582K、S635E、N672D、G753E、S754E、A769D、L775A、D777R、D801G、K875T、N892Y。
在一些方面，本发明涉及对黄原胶具有活性的黄原胶裂解酶变体；优选地所述活性包含黄原胶裂解酶EC4.2.2.12活性，进一步优选地所述活性是黄原胶裂解酶EC4.2.2.12活性。
在一些方面，本发明涉及与亲本黄原胶裂解酶(例如，具有SEQ ID NO:2)相比在洗涤剂组合物中具有改善的稳定性的黄原胶裂解酶变体。
在一些方面，本发明涉及相对于亲本黄原胶裂解酶具有>1.0的半衰期改善因子(HIF)的黄原胶裂解酶变体。
在一些方面，本发明涉及包含至少一种本发明的黄原胶裂解酶变体的组合物。在另一个方面，本发明涉及包含对根据本发明的黄原胶具有活性的分离的黄原胶裂解酶变体的组合物。在一个另外的方面，该组合物进一步包含具有GH9内切葡聚糖酶活性的分离的多肽。
在另一个方面，本发明涉及包含至少一种本发明的黄原胶裂解酶变体的组合物，其中所述组合物是洗涤剂组合物。在另一个方面，本发明的洗涤剂组合物包含用于降解黄原胶的一种或多种洗涤剂组分。
在一些方面，本发明涉及本发明的组合物或本发明的黄原胶裂解酶变体的用途，其中所述用途选自下组，该组由以下组成：用于降解黄原胶的用途、用于清洁过程(例如衣物或硬表面清洁，例如餐具洗涤)中的用途、以及用于控制钻井液黏度的用途。
在一些方面，本发明进一步涉及本发明的组合物用于降解黄原胶、用于洗涤或清洁纺织品和/或硬表面(例如餐具洗涤，其中该组合物具有酶去污性益处)、或用于控制钻井液的黏度的用途。
在一些方面，本发明还涉及使用本发明的变体和组合物降解黄原胶的方法，其中黄原胶位于硬表面或纺织品的表面上，其中黄原胶在由钻井孔造成的地下地层的压裂中使用，或其中该黄原胶是钻孔滤饼中的组分。
在一些方面，本发明涉及用于获得(或产生)黄原胶裂解酶的方法，该方法包括在选自下组的螯合剂诱导的不稳定区中的一个或多个位置处向亲本黄原胶裂解酶(例如，具有SEQ ID NO:2)中引入改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：对应于SEQ IDNO:2的氨基酸154至176的区1、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸614至658的区2、对应于SEQ IDNO:2的氨基酸731至803的区3、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸807至846的区4、对应于SEQ IDNO:2的氨基酸872至885的区5、和对应于SEQ ID NO:2的氨基酸903至1004的区6，其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％且小于100％的序列同一性，并且回收所述变体。
在一些方面，本发明涉及用于获得或产生黄原胶裂解酶变体的方法，该方法包括在选自下组的区中的一个或多个位置处向亲本黄原胶裂解酶(例如，具有SEQ ID NO:2或其他亲本黄原胶裂解酶)中引入改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：
i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸154至176的区1，
ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸614至658的区2，
iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸731至803的区3，
iv)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸807至846的区4，
v)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸872至885的区5，和
vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸903至1004的区6。
在一些方面，本发明涉及用于获得(或产生)根据本发明的黄原胶裂解酶变体的方法，该黄原胶裂解酶变体在选自下组位置的一个或多个位置处具有改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：155、159、620、624、626、631、635、645、649、650、656、738、745、746、748、752、753、754、757、764、769、774、775、777、779、782、785、786、789、792、796、799、800、801、819、824、843、845、875、903、911、912、915、919、921、923、925、927、928、930、932、933、941、966、967、991和998。
在一些方面，本发明涉及用于获得(或产生)根据本发明的黄原胶裂解酶变体的方法，该黄原胶裂解酶变体具有选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：Y155E、A159P、K620R、A624E、A626G、T631N、T631E、S635E、S635T、S635Q、A645S、T649V、T649K、T649R、Q650G、I656V、G738L、K745R、F746L、L748T、P752R、P752K、G753E、G753Q、G753S、S754E、S754L、S754Q、S754R、S757D、S757P、S757E、P764V、P764K、A769D、A769T、A769R、A769S、A769E、A769Q、A769*、A774V、L775M、L775Y、L775A、L775I、L775S、L775F、L775Q、D777K、D777R、P779V、Y782I、A785T、N786K、G789R、K792W、K792Y、K792V、K792A、N796Q、A799H、V800P、D801G、K819R、K819T、K824R、A843P、D845E、K875T、K875E、T903A、T903Q、A911V、A911M、A911S、A912T、A912I、A912Y、T915Q、T915S、T915V、T915A、T919F、T919G、T919D、T921R、T921S、T923H、T923D、T925Q、T925D、T925R、T927K、D928W、Y930H、Y930L、Y930F、A932P、D933M、G941E、G941D、A966P、A967D、N991D和V998K。
在一些方面，本发明涉及用于获得(或产生)根据本发明的黄原胶裂解酶变体的方法，该黄原胶裂解酶变体在选自下组的至少一个区中的一个或多个位置处具有改变，该组由以下组成：如上所示的区1、2、3、4、5和6，并且在选自下组的至少一个区中的一个或多个位置处进一步具有改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：
vii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至153的区7，
viii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸177至613的区8，
ix)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸659至730的区9，
x)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸804至806的区10，
xi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸847至871的区11，
xii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸886至902的区12，和
xiii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1005至1037的区13。
在一些方面，本发明涉及用于获得(或产生)根据本发明的黄原胶裂解酶变体的方法，该黄原胶裂解酶变体在一个或多个位置处具有改变(例如，取代、缺失或插入)，所述方法提供了相对于亲本黄原胶裂解酶具有>1.0的半衰期改善因子(HIF)的变体。
在一些方面,本发明还涉及编码本发明的变体多肽的分离的多核苷酸；以及包含所述变体多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体、和重组宿主细胞。
序列表综述
SEQ ID NO:1是来自类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus sp.)的亲本成熟黄原胶裂解酶的DNA序列。
SEQ ID NO:2是由SEQ ID NO:1编码的成熟多肽的氨基酸序列。
定义
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工。
清洁或洗涤剂应用：术语“清洁或洗涤剂应用”意指将本申请的黄原胶裂解酶施用于任何组合物中，用于清洁或洗涤(通过手动、机械或自动化)硬表面或纺织品的目的。
清洁组合物：术语“清洁组合物”是指用于从有待清洁的物品(例如纺织品、餐具和硬表面)去除不希望的化合物的组合物。这些术语涵盖经选择用于希望的具体类型的清洁组合物和产品的形式(例如，液体、凝胶、粉末、颗粒、糊状、或喷雾组合物)的任何材料/化合物，并且包括但不限于洗涤剂组合物(例如，液体和/或固体衣物洗涤剂和精细织物洗涤剂；硬表面清洁配制品，例如用于玻璃、木材、陶瓷以及金属台面和窗户；地毯清洁剂；炉灶清洁剂；织物清新剂；织物柔软剂；以及纺织品和衣物预去污剂(pre-spotter)，以及餐具洗涤剂)。除了黄原胶裂解酶之外，该洗涤剂配制品还可以含有一种或多种另外的酶(例如黄原胶裂解酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、黄原胶裂解酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代加过氧酶(haloperoxygenase)、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶，或其任何混合物)，和/或组分(例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelating agent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、泡沫促进剂、泡沫抑制剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢助悬剂、防蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶活化剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂以及荧光染料、抗氧化剂、和增溶剂)。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由可读框确定，该可读框以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
颜色澄清：在洗涤和穿着期间，松动或破损纤维可以在织物的表面上积聚。一种后果是由于表面污染，织物的颜色看起来不太亮或不太强烈。从纺织品上去除松动或破损纤维将部分地恢复该纺织品的初始颜色和外观。如本文使用的，术语“颜色澄清”意指纺织品的原始颜色的部分恢复。
控制序列：术语“控制序列”意指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、和转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制性酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
对应于：如本文使用的，术语“对应于”是指用来确定序列中的特定氨基酸(其中参考了特定氨基酸序列)的方式。例如出于本发明的目的，当参考特定氨基酸位置时，技术人员会能够将另一氨基酸序列与所述已经被参考的氨基酸序列进行比对，从而确定哪一个特定氨基酸可能是在所述另一氨基酸序列中是感兴趣的。已经在本文其他地方描述了另一氨基酸序列与例如如在SEQ ID NO:2中所示的序列或本文列出的任何其他的氨基酸序列的比对。可使用替代性比对方法，并且这些方法为本领域技术人员所熟知。
降解黄原胶和黄原胶降解活性：术语“降解黄原胶”和“黄原胶降解活性”可互换地使用，并且定义为将黄原胶解聚、降解或分解成更小的组分。黄原胶的降解可以是去除一个或多个侧链糖，将黄原胶的骨架切成更小的组分，或去除一个或多个侧链糖并且将黄原胶的骨架切成更小的组分。用于测量黄原胶降解的优选的测定描述于本文实例4中。黄原胶降解活性的非限制性实例包括黄原胶裂解酶EC4.2.2.12活性。
δ反射值(ΔRem)：本文将术语“δ反射”或“δ反射值”定义为在460nm处的反射比或反射测量值的结果。用一种具有类似颜色的小块布样(优选来自重复洗涤的小块布样)作为背景测量该小块布样。在洗涤之前，测量代表每种小块布样类型的小块布样。Δ反射是洗涤的小块布样的反射值减去未洗涤的小块布样的反射值。
δ酶性能值(ΔRem酶值)：本文将术语“δ酶反射值”定义为在460nm处的反射比或反射测量值的结果。用一种具有类似颜色的小块布样(优选来自重复洗涤的小块布样)作为背景测量该小块布样。在洗涤之前，测量代表每种小块布样类型的小块布样。δ反射是用存在一种酶的洗涤剂洗涤的小块布样的反射值减去用不存在酶的洗涤剂洗涤的类似小块布样的反射值。
δ酶强度值(ΔInt酶值)：本文将术语“δ酶强度”或“δ酶强度值”定义为如在AMSA测定中所定义的酶强度值的结果。δ强度是用存在一种酶的洗涤剂洗涤的小块布样区的强度值减去用不存在酶的洗涤剂洗涤的小块布样区的强度值。
洗涤剂组分：本文将术语“洗涤剂组分”定义为意指可以用于洗涤剂组合物中的化学品的类型。洗涤剂组分的实例是表面活性剂、水溶助剂、助洗剂、共助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调色剂、织物调理剂、泡沫促进剂、泡沫抑制剂、分散剂、染料转移抑制剂、荧光增白剂、香料、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢助悬剂、污垢释放聚合物、抗再沉积剂、酶抑制剂或稳定剂、酶活化剂、抗氧化剂和增溶剂。洗涤剂组合物可以包含一种或多种任何类型的洗涤剂组分。
洗涤剂组合物：术语“洗涤剂组合物”是指用于从有待清洁的物品(例如纺织品、餐具和硬表面)去除不希望的化合物的组合物。洗涤剂组合物可以用于例如清洁纺织品、餐具以及硬表面，用于家用清洁剂和工业清洁两者。这些术语涵盖经选择用于希望的具体类型的清洁组合物和产品的形式(例如，液体、凝胶、粉末、颗粒、糊状、或喷雾组合物)的任何材料/化合物，并且包括但不限于洗涤剂组合物(例如，液体和/或固体衣物洗涤剂和精细织物洗涤剂；硬表面清洁配制品，例如用于玻璃、木材、陶瓷以及金属台面和窗户；地毯清洁剂；炉灶清洁剂；织物清新剂；织物柔软剂；以及纺织品和衣物预去污剂(pre-spotter)，以及餐具洗涤剂)。除了含有本发明的黄原胶裂解酶和/或GH9内切葡聚糖酶，该洗涤剂配制品还可以含有一种或多种另外的酶(例如内切葡聚糖酶、黄原胶裂解酶、蛋白酶、淀粉酶、地衣聚糖酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、黄原胶裂解酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代加过氧酶、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶，或其任何混合物)，和/或组分(例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、泡沫促进剂、泡沫抑制剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢助悬剂、防蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶活化剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂以及荧光染料、抗氧化剂、和增溶剂)。
餐具洗涤：术语“餐具洗涤”是指所有形式的洗涤餐具，例如手动或自动餐具洗涤。洗涤餐具包括但不限于，清洁所有形式的餐用器皿，例如盘子、杯子、玻璃杯、碗、所有形式的刀具(例如匙、刀、叉)、以及服务用具连同陶瓷、塑料、金属、瓷器、玻璃及丙烯酸酯。
餐具洗涤组合物：术语“餐具洗涤组合物”是指用于清洁硬表面的所有形式的组合物。本发明不限于任何特定类型的餐具洗涤组合物或任何特定的洗涤剂。
内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”或“EG”意指内切-1,4-或内切-1,3；1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键，混合的β-1,3/β-1,4葡聚糖(例如谷物β-D-葡聚糖)、木葡聚糖、黄原胶以及含有纤维素组分的其他植物材料中的β-1,4键的内切水解。可以通过测量底物黏度的降低或通过还原糖测定所确定的还原性末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性(Zhang等人，2006，Biotechnology Advances[生物技术进展]24:452-481)。
酶去污性益处：本文将术语“酶去污性益处”定义为将一种酶添加到洗涤剂中与不具有该酶的相同洗涤剂相比的有利效果。可以由酶提供的重要去污性益处是污渍去除伴随在洗涤和/或清洁之后无可见污垢或污垢非常少、防止或减少在洗涤过程中所释放的污垢再沉积(一种又称作抗再沉积的作用)、完全或部分地恢复纺织品的白度(一种又称作增白的作用)，该纺织品最初是白色的，但是在反复使用和洗涤后获得淡灰或淡黄色外观。不直接与污垢的催化污渍去除或防止污垢再沉积相关的纺织品护理益处对于酶去污性益处而言也是重要的。此类纺织品护理益处的实例是预防或减少染料从一种织物转移至另一种织物或同一种织物的另一部分(一种也被称作染料转移抑制或抗返染的作用)，从织物表面去除突出或断裂的纤维以减少起球倾向或去除已经存在的绒球或绒毛(一种也被称作抗起球的作用)，改善织物柔软性，使织物的颜色澄清以及去除陷在织物或服装的纤维中的微粒状污垢。酶法漂白是一种另外的酶去污性益处，其中通常将催化活性用于催化漂白组分(例如过氧化氢或其他过氧化物)的形成。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
片段：术语“片段”意指使一个或多个氨基酸从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺少的多肽；其中该片段具有黄原胶裂解酶活性。在一个方面，片段含有成熟多肽的氨基酸数目的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％。
内切葡聚糖酶变体对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性：将术语“对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性的内切葡聚糖酶变体”或“对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性且属于GH9类的糖基水解酶的内切葡聚糖酶”定义为一种多肽，该多肽包含属于GH9类的糖基水解酶的结构域且对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性(例如，酶活性、黄原胶降解活性、内切葡聚糖酶EC 3.2.1.4活性)。
对黄原胶具有活性的黄原胶裂解酶变体：将术语“对黄原胶具有活性的黄原胶裂解酶变体”定义为一种多肽，该多肽对黄原胶具有任何种类的活性(例如，酶活性、黄原胶降解活性、黄原胶裂解酶EC4.2.2.12活性)。用于测量黄原胶活性的优选的测定在本文实例4中披露。
半衰期：术语“半衰期”是指酶在给定的一组条件下失去其一半酶活性所需的时间。
半衰期改善因子：术语“半衰期改善因子”或“HIF”可以根据下式定义：HIF＝T1/2(变体)/T1/2(野生型)，其中T1/2(变体)＝(Ln(0.5)/Ln(RA-变体/100))*时间，其中T1/2(野生型)＝(Ln(0.5)/Ln(RA-野生型/100))*时间，其中“RA”是以百分比计的残余活性，并且“时间”是孵育时间。计算HIF的优选的方式也描述于本文实例4中。半衰期改善因子也可以基于不一定是野生型的亲本黄原胶裂解酶(参见以下“亲本”的定义)的半衰期进行计算。
硬表面清洁：本文将术语“硬表面清洁”定义为清洁硬表面，其中硬表面可以包括地板、桌子、墙壁、屋顶等，连同硬物体的表面，例如汽车(汽车洗涤)和餐具(餐具洗涤)。餐具洗涤包括但不限于，清洁盘子、杯子、玻璃杯、碗、及刀具(例如匙、刀、叉)、服务用具、陶瓷、塑料、金属、瓷器、玻璃及丙烯酸酯。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。
改善的特性：术语“改善的特性”意指与相对于亲本有所改善一种变体相关的特征。此类改善的特性包括但不限于：催化效率、催化速率、化学稳定性、氧化稳定性、pH活性、pH稳定性、比活性、在储存条件下的稳定性、螯合剂稳定性、底物结合、底物裂解、底物特异性、底物稳定性、表面性质、热活性、和热稳定性。
改善的洗涤性能：本文将术语“改善的洗涤性能”定义为一种(变体)酶(还有酶的共混物，不只是变体还有骨架，以及与某种清洁组合物组合等)相对于亲本蛋白酶变体的洗涤性能展示出蛋白变体的洗涤性能的改变，例如增加的污渍去除。术语“洗涤性能”包括在衣物洗涤以及例如在餐具洗涤中的洗涤性能。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的一种物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或全部天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。
洗涤：术语“洗涤”涉及家用洗涤和工业洗涤两者并且意指用含有本发明的清洁或洗涤剂组合物的溶液处理纺织品的过程。洗涤过程可以例如使用例如家用或工业洗衣机进行或可以手动进行。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一个方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至1037。
在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，且因此一个表达多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码成熟多肽的多核苷酸，该成熟多肽具有酶活性，例如对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性或具有黄原胶裂解酶活性。在一个方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸1至3111。
突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单-链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列引导该编码序列的表达。
亲本：术语“亲本”或“亲本黄原胶裂解酶”意指对其作出改变以产生本发明的这些酶变体的具有黄原胶裂解酶活性的任何多肽。在一个方面，亲本是具有与该变体同一的氨基酸序列但是在一个或多个这些指定位置处不具有改变的黄原胶裂解酶。应理解的是，“具有同一的氨基酸序列”的表达涉及100％序列同一性。亲本黄原胶裂解酶的非限制性实例包括具有SEQ ID NO:2的成熟亲本黄原胶裂解酶。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选版本5.0.0或更新版本)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将Needle标记的“最长同一性”的输出(使用-非简化(nobrief)选项获得)用作百分比同一性，并且如下计算：
(同一的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人，2000，同上)(优选版本5.0.0或更新版本)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，同上)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。将Needle标记的“最长同一性”的输出(使用-非简化选项获得)用作百分比同一性，并且如下计算：
(同一的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
严格条件：不同的严格条件定义如下。
术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。
子序列：术语“子序列”意指具有从成熟多肽编码序列的5'末端和/或3'末端缺少的一个或多个核苷酸的多核苷酸；其中该子序列编码具有酶活性(例如对用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶具有活性或具有黄原胶裂解酶活性)的片段。
纺织品：术语“纺织品”意指任何纺织品材料，该任何纺织品材料包括纱线、纱线中间体、纤维、非机织物材料、天然材料、合成材料、以及任何其他纺织品材料，该材料制造的织物和由该织物制成的产品(例如，服装和其他物品)。该纺织品或织物可以处于针织品、机织物、牛仔布、非机织物、毡、纱线、以及毛巾布的形式。这些纺织品可以是纤维素基的，例如天然纤维素，包括棉、亚麻/亚麻布、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维或者人造纤维素(例如，来源于木浆)，包括黏胶纤维/人造丝、苎麻、醋酸纤维素纤维(三胞)、莱赛尔纤维(lyocell)或其共混物。纺织品或织物也可以是非纤维素基的，例如天然聚酰胺，包括羊毛、驼毛、羊绒、马海毛、兔毛和蚕丝或合成聚合物如尼龙、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯和氨纶/弹性纤维(spandex/elastane)、或其共混物以及纤维素基的和非纤维素基的纤维的共混物。共混物的实例是棉和/或人造丝/黏胶纤维与一种或多种伴随材料的共混物，该伴随材料是例如羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚亚胺酯纤维、聚脲纤维、芳香族聚酰胺纤维)以及含纤维素的纤维(例如人造丝/黏胶纤维、苎麻、亚麻/亚麻布、黄麻、醋酸纤维素纤维、莱赛尔纤维)。织物可以是常规的可洗涤衣物，例如染污的家用衣物。当使用术语织物或服装时，旨在还包括广义术语纺织品。
纺织品护理益处：不直接与污垢的催化污渍去除或防止污垢再沉积相关的“纺织品护理益处”对于酶去污性益处而言也是重要的。此类纺织品护理益处的实例是预防或减少染料从一种纺织品转移至另一种纺织品或同一种纺织品的另一部分(一种也被称作染料转移抑制或抗返染的作用)，从纺织品表面去除突出或断裂的纤维以减少起球倾向或去除已经存在的绒球或绒毛(一种也被称作抗起球的作用)，改善纺织品柔软性，使纺织品的颜色澄清以及去除陷在纺织品的纤维中的微粒状污垢。酶法漂白是一种另外的酶去污性益处，其中通常将催化活性用于催化漂白组分(例如过氧化氢或其他过氧化物或其他漂白种类)的形成。
变体：术语“变体”意指在一个或多个位置处包含改变(即取代、插入、和/或缺失)的多肽(例如，黄原胶裂解酶多肽)。取代意指用不同的氨基酸替代占用某一位置的氨基酸；缺失意指去除占用某一位置的氨基酸；并且插入意指相邻于并且紧跟着占据某一位置的氨基酸之后添加一个或多个氨基酸，例如1-5个氨基酸。本发明的黄原胶裂解酶变体的非限制性实例包括对黄原胶具有活性的黄原胶裂解酶变体。本发明的变体的非限制性实例进一步包括具有SEQ ID NO:2的成熟亲本黄原胶裂解酶的至少20％(例如，至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％)黄原胶裂解酶活性的变体。用于测量黄原胶活性的优选的测定在本文实例4中披露。
稳定性：术语“稳定性”意指对变化、解折叠、崩解、变性或活性丧失的抗性或抗性程度。稳定性的非限制性实例包括构象稳定性、储存稳定性和使用期间(例如，在洗涤期间)的稳定性，并且反映了作为时间函数的多肽(例如根据本发明的黄原胶裂解酶变体)的稳定性，例如，当所述多肽(例如所述黄原胶裂解酶变体)置于溶液中(特别是在洗涤剂溶液中)时，保留多少活性。稳定性受许多因素的影响，例如一种或多种螯合剂的存在、pH、温度、洗涤剂组合物，例如一种或多种助洗剂、一种或多种表面活性剂、一种或多种螯合剂的量等。如本文实例4中描述的，可以使用半衰期改善因子(HIF)测量黄原胶裂解酶稳定性。
改善的稳定性：本文将术语“改善的稳定性”或“增加的稳定性”定义为相对于亲本黄原胶裂解酶的稳定性、相对于具有变体的同一的氨基酸序列但在一个或多个指定位置处不具有改变的黄原胶裂解酶、或相对于SEQ ID NO:2，在洗涤剂组合物中(例如在溶液中，例如在螯合剂(例如EDTA或柠檬酸盐)的存在下)增加的稳定性。术语“改善的稳定性”和“增加的稳定性”包括“改善的化学稳定性”、“洗涤剂稳定性”和“改善的洗涤剂稳定性”。
改善的化学稳定性：本文将术语“改善的化学稳定性”定义为变体酶在一种或多种天然存在的或合成的、降低亲本酶的酶活性的化学品存在下孵育一段时间之后表现为保留酶活性。改善的化学稳定性还可导致变体在此类化学品的存在下更能(例如优于亲本)催化反应。在本发明的一个具体方面，改善的化学稳定性是在洗涤剂中(特别是在液体洗涤剂中)的改善的稳定性。术语“洗涤剂稳定性”或“改善的洗涤剂稳定性”具体地是相比于亲本黄原胶裂解酶，当本发明的黄原胶裂解酶变体被混合到液体洗涤剂配制品，尤其是包含螯合剂(例如，EDTA或柠檬酸盐)的液体洗涤剂组合物中时，黄原胶裂解酶的改善的稳定性。
构象稳定性：术语“构象稳定性”意指对构象变化、解折叠或崩解的抗性或抗性程度。因此，术语“在构象上较不稳定”意指对构象变化、解折叠或崩解的抗性较小或具有较小程度的抗性。
不稳定性：术语“不稳定性”意指缺乏稳定性。不稳定性的非限制性实例包括构象不稳定性、解折叠、变性、崩解、活性丧失。
螯合剂诱导的不稳定区：术语“螯合剂诱导的不稳定区”意指在螯合剂的存在下有助于多肽的不稳定性的所述多肽的任何区。螯合剂的非限制性实例包括EDTA(乙二胺四乙酸)和柠檬酸盐。螯合剂诱导的不稳定区的非限制性实例包括具有以下特征中的一个或多个的多肽的任何区：在螯合剂的存在下比其相邻区中的一个或多个或全部在构象上较不稳定；和/或在螯合剂的存在下比其相邻区中的一个或多个或全部更多地暴露于所述螯合剂；和/或在螯合剂的存在下比其相邻区中的一个或多个或全部更可及所述螯合剂；和/或在螯合剂的存在下比其相邻区中的一个或多个或全部在构象上更动态；和/或在螯合剂的存在下比其相邻区中的一个或多个或全部更容易接受氘掺入。螯合剂诱导的不稳定区的非限制性实例进一步包括负责螯合剂诱导的不稳定性的多肽的任何区。成熟黄原胶裂解酶(例如具有SEQ ID NO:2)的螯合剂诱导的不稳定区的非限制性实例包括：对应于SEQ ID NO:2的氨基酸154至176的区1、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸614至658的区2、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸731至803的区3、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸807至846的区4、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸872至885的区5、和对应于SEQ ID NO:2的氨基酸903至1004的区6。与成熟黄原胶裂解酶(例如具有SEQ ID NO:2)的螯合剂诱导的不稳定区相邻的区的非限制性实例包括：对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至153的区7、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸177至613的区8、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸659至730的区9、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸804至806的区10、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸847至871的区11、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸886至902的区12、和对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1005至1037的区13。
相邻区：术语“相邻区”意指不是螯合剂诱导的不稳定区的多肽的任何区。成熟黄原胶裂解酶(例如具有SEQ ID NO:2)的相邻区的非限制性实例包括：对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至153的区7、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸177至613的区8、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸659至730的区9、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸804至806的区10、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸847至871的区11、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸886至902的区12、和对应于SEQ IDNO:2的氨基酸1005至1037的区13。
螯合剂暴露：术语“螯合剂暴露”意指到达多肽的螯合剂的浓度或量。因此，在本发明的上下文中，术语“更多地暴露于螯合剂”意指特定区(例如螯合剂诱导的不稳定区)的螯合剂暴露大于不同区(例如相邻区)的螯合剂暴露。在一个方面，螯合剂暴露可以用浓度、持续时间和频率(例如对于化学试剂，例如螯合剂)或强度的数值项表达。
螯合剂可及性：术语“螯合剂可及性”涵盖螯合剂的影响的开放性和接近螯合剂的容易性。因此，在本发明的上下文中，术语“更可及螯合剂”意指特定区(例如螯合剂诱导的不稳定区)的螯合剂可及性大于不同区(例如相邻区)的螯合剂可及性。
构象动态：术语“构象动态”涵盖多肽的振动、结构重排和转变(例如在溶液中)。因此，在本发明的上下文中，术语“在构象上更动态”意指特定区(例如螯合剂诱导的不稳定区)的构象动态大于不同区(例如相邻区)的构象动态。
对氘掺入的接受度：术语“对氘掺入的接受度”意指在氢-氘交换期间氢原子被氘原子替代的量。所述量可以相对(例如与另一个量比较)或绝对(例如以数字表示)项来测量。因此，在本发明的上下文中，术语“更容易接受氘掺入”意指特定区(例如螯合剂诱导的不稳定区)的氘掺入的接受度大于不同区(例如相邻区)的氘掺入的接受度。
洗涤性能：术语“洗涤性能”被用作酶在例如洗涤或硬表面清洁期间去除存在于有待清洁的物体上的污渍的能力。可以通过计算‘用于洗衣的自动机械应力测定(AMSA)’中所谓的强度值(Int)或如本文所定义的反射值(Rem)来量化洗涤性能的改善。
白度：本文将术语“白度”定义为在不同领域并且针对不同顾客具有不同含义的广义术语。白度的损失可以例如归因于灰化、黄化、或光学增亮剂/调色剂的去除。灰化和黄化可归因于污垢再沉积、身体污垢、来自例如铁和铜离子或染料转印的着色。白度可包括来自以下列表的一个或若干个问题：着色剂或染料作用；不完全污渍去除(例如身体污垢、皮脂等)；再沉积(物体的灰化、黄化或其他变色)(去除的污垢与纺织品的其他部分(弄脏的或未弄脏的)再关联)；在应用期间纺织品的化学变化；以及颜色的澄清或淡色化。
黄原胶裂解酶：本文将术语“黄原胶裂解酶”定义为对黄原胶具有活性(例如酶活性、黄原胶降解活性)的酶。黄原胶裂解酶的非限制性实例包括切割黄原胶中的β-D-甘露糖基-β-D-1,4-葡糖醛酸基键的酶(EC4.2.2.12)。
变体命名规则
出于本发明的目的，使用在SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽来确定另一种黄原胶裂解酶中相对应的氨基酸残基。将另一种黄原胶裂解酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人，2000，Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选版本5.0.0或更新版本)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定与SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。
可以通过使用若干种计算机程序，使用其相应的默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种黄原胶裂解酶中的对应氨基酸残基的鉴定，该计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数期望值的多种序列比较；版本3.5或更新版本；Edgar，2004，Nucleic AcidsResearch[核酸研究]32:1792-1797)、MAFFT(版本6.857或更新版本；Katoh和Kuma，2002，Nucleic Acids Research[核酸研究]30:3059-3066；Katoh等人，2005，Nucleic AcidsResearch[核酸研究]33:511-518；Katoh和Toh，2007，Bioinformatics[生物信息学]23:372-374；Katoh等人，2009，Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]537:39-64；Katoh和Toh，2010，Bioinformatics[生物信息学]26:1899-1900)以及采用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83或更新版本；Thompson等人，1994，Nucleic Acids Research[核酸研究]22:4673-4680)。
当其他酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽相背离，这样使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(Lindahl和Elofsson，2000，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]295:613-615)，可使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表现(谱)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生谱，并且能够检测远距离同源物(Atschul等人，1997，NucleicAcids Res.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白质结构数据库中的一个或多个代表，甚至可以实现更高的敏感度。程序，例如GenTHREADER(Jones，1999，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]287:797-815；McGuffin和Jones，2003，Bioinformatics[生物信息学]19:874-881)利用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，Gough等人，2000，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评估此类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可获得且可下载的。可以使用多种算法例如距离比对矩阵(Holm和Sander，1998，Proteins[蛋白质]33:88-96)或组合延伸(Shindyalov和Bourne，1998，Protein Engineering[蛋白质工程]11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣的结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，Holm和Park，2000，Bioinformatics[生物信息学]16:566-567)。
在描述本发明的变体中，为了便于参考，对以下描述的命名法进行了改编。采用了已接受的IUPAC单字母或三字母的氨基酸缩写。
取代.对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、被取代的氨基酸。因此，将在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代指定为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变由加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”表示在位置205和位置411处的甘氨酸(G)和丝氨酸(S)分别被精氨酸(R)和苯丙氨酸(F)取代。
缺失.对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原有氨基酸、位置、*。因此，将缺失在位置195处的甘氨酸指定为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入.对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸指定为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。将多个氨基酸的插入指定为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。在特定位置插入的指示被理解为在原始氨基酸残基之后的插入。例如，“在位置195处插入”被理解为在位置195处的原始残基之后的插入。
在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一种或多种氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的一种或多种氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是：
<u>亲本：</u> <u>变体：</u>
195 195195a 195b
G G-K-A
多种改变。包含多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如，“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”表示在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。
不同改变。在可以在某一位置引入不同改变的情况下，这些不同的改变由逗号分隔，例如，“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”指定以下变体：“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
可替代地，不同的改变或可以用括号表示，例如Arg170[Tyr，Gly]或一字母编码R170[Y，G]。
具体实施方式
已知的具有SEQ ID NO:2的黄原胶裂解酶是大酶(>1000个残基)，因此靶向其特性来改善例如洗涤剂组合物中(例如在螯合剂的存在下)的稳定性是非常费力且昂贵的。在一些方面，当尝试使用蛋白质工程将黄原胶裂解酶分子稳定至选自下组的区时，本发明缩小了靶标残基的数目，该组由以下组成：对应于SEQ ID NO:2的氨基酸154至176的区1、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸614至658的区2、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸731至803的区3、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸807至846的区4、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸872至885的区5、和对应于SEQ ID NO:2的氨基酸903至1004的区6。
在一个实施例中，当尝试使用蛋白质工程稳定黄原胶裂解酶分子时，本发明显著缩小了靶标残基的数目。
变体
在一个实施例中，本发明涉及已知的具有SEQ ID NO:2的黄原胶裂解酶的蛋白质序列中的螯合剂诱导的不稳定区(当在具有EDTA的缓冲液中孵育分子时，这些区受到影响)，所述区如下：对应于SEQ ID NO:2的氨基酸154至176的区1、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸614至658的区2、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸731至803的区3、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸807至846的区4、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸872至885的区5、和对应于SEQ ID NO:2的氨基酸903至1004的区6。这个实施例涉及在何处使黄原胶裂解酶突变以使分子在洗涤剂(例如包含螯合剂(例如EDTA或柠檬酸盐)的洗涤剂组合物)中稳定的重要指导。
在一个实施例中，本发明涉及黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体在选自下组的区中的一个或多个位置处包含改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：对应于SEQ ID NO:2的氨基酸154至176的区1、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸614至658的区2、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸731至803的区3、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸807至846的区4、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸872至885的区5、和对应于SEQ ID NO:2的氨基酸903至1004的区6，其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％且小于100％的序列同一性；优选地所述黄原胶裂解酶变体对黄原胶具有活性，进一步优选地所述活性是黄原胶降解活性。
在一个实施例中，本发明涉及黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体在选自下组的两个或更多个区中的一个或多个位置处包含改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：对应于SEQ ID NO:2的氨基酸154至176的区1、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸614至658的区2、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸731至803的区3、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸807至846的区4、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸872至885的区5、和对应于SEQ ID NO:2的氨基酸903至1004的区6，其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％且小于100％的序列同一性；优选地所述黄原胶裂解酶变体对黄原胶具有活性，进一步优选地所述活性是黄原胶降解活性。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的亲本黄原胶裂解酶(例如SEQ ID NO:2)，该亲本黄原胶裂解酶在选自由区1-6组成的组的区中的一个或多个位置处具有改变(例如，取代、缺失或插入)，其中所述区是螯合剂诱导的不稳定区，优选地所述螯合剂诱导的不稳定区具有以下特征中的一个或多个：在螯合剂的存在下比其相邻区中的一个或多个或全部在构象上较不稳定；和/或在螯合剂的存在下比其相邻区中的一个或多个或全部更多地暴露于所述螯合剂；和/或在螯合剂的存在下比其相邻区中的一个或多个或全部更可及所述螯合剂；和/或在螯合剂的存在下比其相邻区中的一个或多个或全部在构象上更动态；和/或在螯合剂的存在下比其相邻区中的一个或多个或全部更容易接受氘掺入；进一步优选地所述相邻区选自下组，该组由以下组成：对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至153的区7、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸177至613的区8、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸659至730的区9、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸804至806的区10、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸847至871的区11、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸886至902的区12、和对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1005至1037的区13，进一步最优选地所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐。
在一个实施例中，本发明的相邻区可以是以下一种或多种或全部：对应于SEQ IDNO:2的氨基酸1至153的区7、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸177至613的区8、对应于SEQ IDNO:2的氨基酸659至730的区9、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸804至806的区10、对应于SEQID NO:2的氨基酸847至871的区11、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸886至902的区12、和对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1005至1037的区13。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体在选自由(例如SEQ ID NO:2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)区1-6组成的组的区中的一个或多个位置处具有改变(例如，取代、缺失或插入)，其中在包含洗涤剂组分的水溶液中，(例如SEQ ID NO:2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)所述区比其相邻区中的一个或多个或全部更可及所述洗涤剂组分。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体在选自由(例如SEQ ID NO:2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)区1-6组成的组的区中的一个或多个位置处具有改变(例如，取代、缺失或插入)，其中在包含洗涤剂组分的水溶液中，(例如SEQ ID NO:2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)所述区比其相邻区中的一个或多个或全部更多地暴露于所述洗涤剂组分。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体在选自由(例如SEQ ID NO:2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)区1-6组成的组的区中的一个或多个位置处具有改变(例如，取代、缺失或插入)，其中在包含洗涤剂组分的水溶液中，(例如SEQ ID NO:2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)所述区比其相邻区中的一个或多个或全部在构象上更动态。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体在选自由(例如SEQ ID NO:2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)区1-6组成的组的区中的一个或多个位置处具有改变(例如，取代、缺失或插入)，其中在包含洗涤剂组分的水溶液中，(例如SEQ ID NO:2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)所述区比其相邻区中的一个或多个或全部更容易接受氘掺入。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体在选自下组的两个或更多个区中的一个或多个位置处包含改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：对应于SEQ ID NO:2的氨基酸154至176的区1、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸614至658的区2、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸731至803的区3、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸807至846的区4、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸872至885的区5、和对应于SEQ ID NO:2的氨基酸903至1004的区6，其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％且小于100％的序列同一性，优选地所述变体对黄原胶具有活性，进一步优选地所述活性是黄原胶降解活性。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体在选自下组的(例如，SEQ ID NO:2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)一个区中具有多个改变(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)，该组由以下组成：对应于SEQ ID NO:2的氨基酸154至176的区1、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸614至658的区2、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸731至803的区3、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸807至846的区4、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸872至885的区5、和对应于SEQ ID NO:2的氨基酸903至1004的区6，其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％且小于100％的序列同一性，优选地所述变体对黄原胶具有活性，进一步优选地所述活性是黄原胶降解活性。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体在选自下组的(例如，SEQ ID NO:2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)多个区(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)中具有多个改变(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)，该组由以下组成：对应于SEQ ID NO:2的氨基酸154至176的区1、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸614至658的区2、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸731至803的区3、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸807至846的区4、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸872至885的区5、和对应于SEQ ID NO:2的氨基酸903至1004的区6，其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％且小于100％的序列同一性，优选地所述变体对黄原胶具有活性，进一步优选地所述活性是黄原胶降解活性。
在一个实施例中，本发明涉及在成熟亲本多肽(例如，SEQ ID NO:2)的一个或多个位置处包含改变(例如，取代、缺失或插入)的黄原胶裂解酶变体，其中每个改变独立地是取代、插入或缺失，其中该变体具有黄原胶裂解酶活性。
在一个实施例中，该变体与亲本黄原胶裂解酶的氨基酸序列具有至少60％，例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体与SEQ ID NO:2具有至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性。
在另一个方面，变体在对应于位置155、159、620、624、626、631、635、645、649、650、656、738、745、746、748、752、753、754、757、764、769、774、775、777、779、782、785、786、789、792、796、799、800、801、819、824、843、845、875、903、911、912、915、919、921、923、925、927、928、930、932、933、941、966、967、991和998的一个或多个位置处包含改变。在另一个方面，变体在对应于位置155、159、620、624、626、631、635、645、649、650、656、738、745、746、748、752、753、754、757、764、769、774、775、777、779、782、785、786、789、792、796、799、800、801、819、824、843、845、875、903、911、912、915、919、921、923、925、927、928、930、932、933、941、966、967、991和998中的任一个的两个位置处包含改变。在另一个方面，变体在对应于位置155、159、620、624、626、631、635、645、649、650、656、738、745、746、748、752、753、754、757、764、769、774、775、777、779、782、785、786、789、792、796、799、800、801、819、824、843、845、875、903、911、912、915、919、921、923、925、927、928、930、932、933、941、966、967、991和998中的任一个的三个位置处包含改变。在另一个方面，变体在对应于位置155、159、620、624、626、631、635、645、649、650、656、738、745、746、748、752、753、754、757、764、769、774、775、777、779、782、785、786、789、792、796、799、800、801、819、824、843、845、875、903、911、912、915、919、921、923、925、927、928、930、932、933、941、966、967、991和998中的四个或更多个位置(例如五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个位置)处包含改变。
在另一个方面，该变体在对应于位置155的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置155的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代Y155E或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置159的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置159的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含取代A159P或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置620的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置620的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代K620R或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置624的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置624的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代A624E或由其组成
在另一个方面，该变体在对应于位置626的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置626的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代A626Q或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置631的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置631的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代T631N或T631E或由其组成。在对应于位置631的位置处的优选的取代是T631N。
在另一个方面，该变体在对应于位置635的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置635的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含取代S635E、S635T或S635Q或由其组成。在对应于位置635的位置处的优选的取代是S635E。
在另一个方面，该变体在对应于位置649的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置649的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代T649V、T649K或T649R或由其组成。在对应于位置649的位置处的优选的取代是T649K。
在另一个方面，该变体在对应于位置650的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置650的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代Q650G或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置656的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置656的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代I656V或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置738的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置738的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代G738L或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置745的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置745的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代K745R或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置746的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置746的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代F746L或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置748的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置748的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代L748T或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置752的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置752的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代P752R或P752K或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置753的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置753的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代G753E、G753Q或G753S或由其组成。在对应于位置753的位置处的优选的取代是G753E。
在另一个方面，该变体在对应于位置754的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置754的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代S754E、S754L、S754Q或S754R或由其组成。在对应于位置754的位置处的优选的取代是S754E或S754R。
在另一个方面，该变体在对应于位置757的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置757的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代S757D、S757P或S757E或由其组成。在对应于位置757的位置处的优选的取代是S757D。
在另一个方面，该变体在对应于位置764的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置764的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代P764V或P764K或由其组成。在对应于位置764的位置处的优选的取代是P764V。
在另一个方面，该变体在对应于位置769的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置769的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的改变A769D、A769T、A769R、A769S、A769E、A769Q或A769*或由其组成。在对应于位置769的位置处的优选的取代是A769D。
在另一个方面，该变体在对应于位置774的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置774的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代A774V或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置775的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置775的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代L775A或L775F或L775I或L775M或L775Q或L775S或L775Y或由其组成。在对应于位置775的位置处的优选的取代是L775M、L775Y或L775A。
在另一个方面，该变体在对应于位置779的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置779的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代P779V或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置782的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置782的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含取代Y782I或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置786的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置786的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含取代N786K或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置789的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置789的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含取代G789R或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置792的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置792的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代K792W、K792Y、K792V或K792A或由其组成。在对应于位置792的位置处的优选的取代是K792W或K792Y。
在另一个方面，该变体在对应于位置796的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置796的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代N796Q或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置799的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置799的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代A799H或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置800的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置800的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代V800P或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置801的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置801的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代D801G或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置819的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置819的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代K819R或K819T或由其组成。在对应于位置819的位置处的优选的取代是K819R或K819T。
在另一个方面，该变体在对应于位置824的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置824的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代K824R或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置843的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置843的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含取代A843P或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置845的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置845的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在对应于位置845的位置处的优选的取代是D845E。
在另一个方面，该变体在对应于位置875的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置875的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代K875T或K875E或由其组成。在对应于位置875的位置处的优选的取代是K875T。
在另一个方面，该变体在对应于位置903的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置903的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代T903A或T903Q或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置911的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置911的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代A911M、A911V或A911S或由其组成。在对应于位置911的位置处的优选的取代是A911V。
在另一个方面，该变体在对应于位置912的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置912的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代A912I或A912T或A912Y或由其组成。在对应于位置912的位置处的优选的取代是A912T。
在另一个方面，该变体在对应于位置915的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置915的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代T915S、T915Q、T915A或T915V或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置919的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置919的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代T919D、T919F或T919G或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置921的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置921的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代T921R或T921S或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置923的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置923的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代T923D或T923H或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置925的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置925的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代T925D或T925Q或T925R或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置927的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置927的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代T927K或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置928的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置928的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代D928W或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置930的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置930的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代Y930F或Y930H或Y930L或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置933的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置933的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代D933M或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置941的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置941的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代G941D或G941E或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置966的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置966的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代A966P或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置991的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置991的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代N991D或由其组成。
在另一个方面，该变体在对应于位置998的位置处包含改变或由其组成。在另一个方面，对应于位置998的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面，该变体包含SEQ IDNO:2的成熟多肽的取代V998K或由其组成。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体在选自下组的一个或多个位置处具有改变，该组由以下组成：SEQ ID NO:2的155、159、620、624、626、631、635、645、649、650、656、738、745、746、748、752、753、754、757、764、769、774、775、777、779、782、785、786、789、792、796、799、800、801、819、824、843、845、875、903、911、912、915、919、921、923、925、927、928、930、932、933、941、966、967、991和998，其中每个位置对应于SEQ ID NO:2的位置。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体在选自下组的一个或多个位置处具有改变，该组由以下组成：Y155E、A159P、K620R、A624E、A626G、T631N、T631E、S635E、S635T、S635Q、A645S、T649V、T649K、T649R、Q650G、I656V、G738L、K745R、F746L、L748T、P752R、P752K、G753E、G753Q、G753S、S754E、S754L、S754Q、S754R、S757D、S757P、S757E、P764V、P764K、A769D、A769T、A769R、A769S、A769E、A769Q、A769*、A774V、L775M、L775Y、L775A、L775I、L775S、L775F、L775Q、D777K、D777R、P779V、Y782I、A785T、N786K、G789R、K792W、K792Y、K792V、K792A、N796Q、A799H、V800P、D801G、K819R、K819T、K824R、A843P、D845E、K875T、K875E、T903A、T903Q、A911V、A911M、A911S、A912T、A912I、A912Y、T915Q、T915S、T915V、T915A、T919F、T919G、T919D、T921R、T921S、T923H、T923D、T925Q、T925D、T925R、T927K、D928W、Y930H、Y930L、Y930F、A932P、D933M、G941E、G941D、A966P、A967D、N991D和V998K，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
在一个具体的实施例中，本发明涉及选自下组的黄原胶裂解酶变体，该组由以下组成：本文表1中所示的黄原胶裂解酶变体。
在一个具体的实施例中，本发明涉及选自下组的黄原胶裂解酶变体，该组由以下组成：本文表2中所示的黄原胶裂解酶变体。
在一个具体的实施例中，本发明涉及选自下组的黄原胶裂解酶变体，该组由以下组成：本文表3中所示的黄原胶裂解酶变体。
在一个具体的实施例中，本发明涉及选自下组的黄原胶裂解酶变体，该组由以下组成：本文表4中所示的黄原胶裂解酶变体。
在一个具体的实施例中，本发明涉及选自下组的黄原胶裂解酶变体，该组由以下组成：本文表5中所示的黄原胶裂解酶变体。
在一个具体的实施例中，本发明涉及选自下组的黄原胶裂解酶变体，该组由以下组成：本文表6中所示的黄原胶裂解酶变体。
在一个具体的实施例中，本发明涉及选自下组的黄原胶裂解酶变体，该组由以下组成：本文表7中所示的黄原胶裂解酶变体。
在一个具体的实施例中，本发明涉及选自下组的黄原胶裂解酶变体，该组由以下组成：本文表8中所示的黄原胶裂解酶变体。
在一个具体的实施例中，本发明涉及选自下组的黄原胶裂解酶变体，该组由以下组成：本文表9中所示的黄原胶裂解酶变体。
在一个具体的实施例中，本发明涉及选自下组的黄原胶裂解酶变体，该组由以下组成：本文表10中所示的黄原胶裂解酶变体。
在一个具体的实施例中，本发明涉及选自下组的黄原胶裂解酶变体，该组由以下组成：本文表11中所示的黄原胶裂解酶变体。
在一个具体的实施例中，本发明涉及选自下组的黄原胶裂解酶变体，该组由以下组成：本文表12中所示的黄原胶裂解酶变体。
在一个具体的实施例中，本发明涉及选自下组的黄原胶裂解酶变体，该组由以下组成：本文表13中所示的黄原胶裂解酶变体。
这些变体在一个或多个其他位置上可进一步包含一个或多个另外的改变。
这些氨基酸改变可以具有次要性质，即不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-末端或羧基末端延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一官能(例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。
保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。通常不改变比活性的氨基酸取代在本领域中是已知的，并且例如由H.Neurath和R.L.Hill，1979，在The Proteins[蛋白质]，Academic Press[学术出版社]，纽约中进行了描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
可替代地，这些氨基酸改变具有这样一种性质使得多肽的物理化学特性发生改变。例如，氨基酸变化可以改善多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。
可以根据本领域中已知的程序，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，1989，Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的黄原胶裂解酶活性以鉴定对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，Hilton等人，1996，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点(contract site)氨基酸进行突变。参见，例如，de Vos等人，1992，Science[科学]255:306-312；Smith等人，1992，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS Lett.[欧洲生物化学学会联盟通讯]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体与SEQ ID NO:2相比具有在1和20之间的改变的总数，例如，在1和10之间或在1和5之间，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体对黄原胶具有活性，优选地对黄原胶的所述活性是黄原胶降解活性，进一步优选地所述黄原胶降解活性是EC4.2.2.12活性。
在一个实施例中，该变体与亲本酶(例如SEQ ID NO:2)相比在洗涤剂组合物中具有改善的稳定性。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体与亲本黄原胶裂解酶(例如，具有SEQ ID NO:2)相比在洗涤剂组合物中具有改善的稳定性；优选地所述洗涤剂组合物包含螯合剂；进一步优选地所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的黄原胶裂解酶变体，相对于亲本黄原胶裂解酶，该黄原胶裂解酶变体具有≥1.0的半衰期改善因子(HIF)；优选地该黄原胶裂解酶变体具有>1.0的半衰期改善因子(HIF)。更优选地，本发明的变体的半衰期改善因子(HIF)为至少1.2，例如至少1.5、例如至少2.0、至少3.0、至少4.0或至少5.0。计算半衰期改善因子(HIF)的优选的方式描述于本文实例4中。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的黄原胶裂解酶变体，其中半衰期改善因子(HIF)是在将所述黄原胶裂解酶变体在25℃或30℃在洗涤剂组合物中孵育从约30分钟至约20小时的时间段后确定的。
亲本
亲本黄原胶裂解酶可以是(a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％序列同一性的多肽；(b)由如下的多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格条件下与(i)SEQ IDNO:1的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补序列杂交；或(c)由如下的多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％序列同一性。
在一个方面，该亲本与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，具有黄原胶裂解酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差多达10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。
在另一个方面，该亲本包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，该亲本包含SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。在另一个方面，该亲本是SEQ ID NO:2的成熟多肽的片段，该片段含有SEQ ID NO:2的氨基酸数目的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、或95％。在另一个实施例中，该亲本是SEQ ID NO:2的成熟多肽的等位基因变体。
在另一个方面，该亲本是由如下的多核苷酸编码，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与(i)SEQ IDNO:1的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补序列杂交(Sambrook等人，1989，Molecular Cloning,A Laboratory Manual[分子克隆实验指南]，第2版，Cold SpringHarbor[冷泉港]，New York[纽约])。
可以使用SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列、以及SEQ ID NO:2的多肽或其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴定并克隆对来自不同属或种的菌株的亲本进行编码的DNA。具体地，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针来与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的对应基因。此类探针可明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，用于检测相应的基因。此类探针涵盖于本发明中。
可以针对与上文描述的探针杂交并编码亲本的DNA来筛选由此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的运载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，在DNA印迹中使用该运载体材料。
出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸与对应于以下的标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；(iii)其全长互补序列；或(iv)其子序列；杂交是在非常低至非常高严格条件下进行。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。
在一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是编码以下的多核苷酸：SEQ ID NO:2的多肽；其成熟多肽；或其片段。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:1。
在另一个实施例中，该亲本由如下的多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。
该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的一个区域在另一种多肽的一个区域的N-末端或C-末端处融合。
该亲本可以是融合多肽或可切割融合多肽，其中另一种多肽在本发明的多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于相同的启动子和终止子的控制之下。还可使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人，1993，EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人，1994，Science[科学]266:776-779)。
融合多肽可以进一步包含两种多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人，2000，J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人，1997，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人，1995，Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人，1991，Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人，1986，Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人，1995，Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人，1989，Proteins[蛋白质]；Structure，Function，and Genetics[结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens，2003，Drug Discovery World[药物发现世界]4:35-48。
该亲本可以从任何属类的微生物中获得。出于本发明的目的，如本文与给出的来源结合使用，术语“从……获得”应当意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一个方面，亲本分泌至细胞外。
亲本可以是细菌酶。例如，该亲本可以是革兰氏阳性细菌多肽，例如芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属、链球菌属、或链霉菌属酶；或革兰氏阴性细菌多肽，例如弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、或脲原体属(Ureaplasma)酶。
在一个方面，该亲本是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚硬芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)酶。
在另一个方面，该亲本是类马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌、乳房链球菌或马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)酶。
在另一个方面，该亲本是不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌或浅青紫链霉菌酶。
该亲本可以是真菌酶。例如，该亲本可以是酵母酶，例如假丝酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母、或耶氏酵母属酶；或丝状真菌酶，例如支顶孢属、伞菌属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属、毛喙壳属、金孢子菌属、麦角菌属、旋孢腔菌属、鬼伞属、乳白蚁属、棒囊壳属、隐丛赤壳菌属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、线黑粉菌属(Filibasidium)、镰孢属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属、香菇属、小腔球菌属、梨孢菌属、黑果菌属、亚灰树花菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属、假披发虫属、根毛霉菌属、裂褶菌属、柱顶孢属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、小包脚菇属、或炭角菌属酶。
在另一个方面，该亲本是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母酶。
在另一个方面，该亲本是解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、带纹金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙链孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉菌(Penicillium funiculosum)、产紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳霉(Thielavia achromatica)、成层梭抱壳菌(Thielavia albomyces)、白毛梭孢壳霉(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳霉(Thielavia australeinsis)、菲美蒂梭抱壳菌(Thielavia fimeti)、小孢梭孢壳霉(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳霉(Thielavia ovispora)、秘鲁梭孢壳霉(Thielavia peruviana)、毛梭孢壳霉(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳霉(Thielaviaspededonium)、耐热梭孢壳(Thielavia subthermophila)、土生梭孢壳霉(Thielaviaterrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride)酶。
在另一个方面，该亲本是类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus sp.)黄原胶裂解酶，例如SEQ ID NO:2的黄原胶裂解酶。
应理解的是对于前述物种，本发明涵盖完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)两者，以及其他分类学的等效物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而与它们已知的种名无关。本领域的技术人员将容易地识别适当等效物的身份。
这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection，Northern Regional Research Center，NRRL)。
可以使用上文提及的探针，从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该亲本。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一种微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合DNA样品获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用探针检测到编码亲本的多核苷酸，则可以通过利用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆多核苷酸(参见，例如Sambrook等人，1989，同上)。
变体的制备
本发明还涉及用于获得具有黄原胶裂解酶活性的变体的方法，该方法包括：(a)在对应于SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置155、159、620、624、626、631、635、645、649、650、656、738、745、746、748、752、753、754、757、764、769、774、775、777、779、782、785、786、789、792、796、799、800、801、819、824、843、845、875、903、911、912、915、919、921、923、925、927、928、930、932、933、941、966、967、991和998中的一个或多个位置处向亲本黄原胶裂解酶中引入改变，其中该变体具有黄原胶裂解酶活性；和(b)回收该变体。
可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备变体，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。
定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个突变的技术。
通过涉及使用含有所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，该盒式诱变涉及由限制性酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化质粒和寡核苷酸的限制性酶是相同的，从而允许质粒和插入物的黏性末端彼此连接。参见例如，Scherer和Davis，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]76:4949-4955；和Barton等人，1990，Nucleic Acids Res.[核酸研究]18:7349-4966。
也可以通过本领域已知的方法在体内实现定点诱变。参见，例如，美国专利申请公开号2004/0171154；Storici等人，2001，Nature Biotechnol.[自然生物技术]19:773-776；Kren等人，1998，Nat.Med.[自然医学]4:285-290；以及Calissano和Macino，1996，FungalGenet.Newslett.[真菌遗传学通讯]43:15-16。
可以在本发明中使用任何定点诱变程序。存在可以用于制备变体的许多可商购的试剂盒。
合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，例如由Tian等人(2004，Nature[自然]432:1050-1054)描述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
使用已知的诱变、重组和/或改组方法，随后进行相关的筛选程序可以做出单或多氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，这些相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625中披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等人，1991，Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)和区定向诱变(Derbyshire等人，1986，Gene[基因]46:145；Ner等人，1988，DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人，1999，Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多方面来实现半合成基因的构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定区可以从头合成，而其他区可以使用位点特异性诱变引物来扩增，然而还有其他区可以进行易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
实施例
在一个实施例中，本发明涉及包含至少一种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)本发明的黄原胶裂解酶变体的组合物。
在一个实施例中，本发明涉及包含至少一种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)本发明的黄原胶裂解酶变体的组合物，其中所述组合物是洗涤剂组合物。
在一个实施例中，本发明涉及包含至少一种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)本发明的黄原胶裂解酶变体的组合物，该组合物进一步包含一种或多种洗涤剂组分；优选地所述洗涤剂组分是螯合剂；进一步优选地所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐。
在一个实施例中，本发明涉及包含至少一种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)本发明的黄原胶裂解酶变体的组合物，其中所述组合物是进一步包含一种或多种洗涤剂组分的洗涤剂组合物；优选地所述洗涤剂组分是螯合剂；进一步优选地所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐。
在一个实施例中，本发明涉及包含至少一种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)本发明的黄原胶裂解酶变体的组合物，该组合物进一步包含选自下组的一种或多种另外的酶或由其组成，该组由以下组成：内切葡聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、黄原胶裂解酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代加过氧酶、过氧化氢酶和甘露聚糖酶，或其任何混合物。
在一个实施例中，本发明涉及包含至少一种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)本发明的黄原胶裂解酶变体的组合物，其中所述组合物是进一步包含选自下组的一种或多种另外的酶或由其组成的洗涤剂组合物，该组由以下组成：内切葡聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、黄原胶裂解酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代加过氧酶、过氧化氢酶和甘露聚糖酶，或其任何混合物。
在一个实施例中，本发明涉及包含至少一种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)本发明的黄原胶裂解酶变体的组合物，其中所述组合物是进一步包含选自下组的一种或多种洗涤剂组分和一种或多种另外的酶或由其组成的洗涤剂组合物，该组由以下组成：内切葡聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、黄原胶裂解酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代加过氧酶、过氧化氢酶和甘露聚糖酶，或其任何混合物，优选地所述洗涤剂组分是螯合剂；进一步优选地所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐。
在一个实施例中，本发明涉及包含至少一种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)本发明的黄原胶裂解酶变体的组合物，其中所述组合物是进一步包含一种或多种洗涤剂组分的洗涤剂组合物，其中所述洗涤剂组合物处于条，均匀的片剂，具有两个或更多个层的片剂，具有一个或多个室的袋，规则的或压缩的粉末，颗粒，糊剂，凝胶，或规则的、压缩的或浓缩的液体的形式。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的组合物或本发明的黄原胶裂解酶变体的用途，其中所述用途选自下组，该组包括以下或由以下组成：用于降解黄原胶的用途、用于清洁过程(例如衣物或硬表面清洁，例如餐具洗涤)中的用途，以及用于控制钻井液黏度的用途。
在一个实施例中，本发明涉及本发明的组合物的用途，其中所述组合物具有酶去污性益处
在一个实施例中，本发明涉及编码本发明的黄原胶裂解酶变体的分离的多核苷酸。
在一个实施例中，本发明涉及能够表达本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体；优选地所述核酸构建体或所述表达载体包含本发明的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导多肽在表达宿主内的产生的一个或多个控制序列。
在一个实施例中，本发明涉及包含本发明的多核苷酸的宿主细胞(例如分离的宿主细胞，分离的重组宿主细胞)；优选地所述多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列；进一步优选地所述宿主细胞是分离的宿主细胞。
在一个实施例中，本发明涉及用于获得(或产生)黄原胶裂解酶变体的方法，该方法包括在选自下组的(例如，SEQ ID NO:2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)区中的一个或多个位置处向亲本黄原胶裂解酶(例如，具有SEQ ID NO:2)中引入改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：对应于SEQ ID NO:2的氨基酸154至176的区1、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸614至658的区2、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸731至803的区3、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸807至846的区4、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸872至885的区5、和对应于SEQ IDNO:2的氨基酸903至1004的区6，其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％且小于100％的序列同一性，和回收所述变体；优选地选自由区1-6组成的组的所述区是螯合剂诱导的不稳定区；进一步优选地，所述方法进一步包括在选自由区1-6组成的组的一个或多个区中的一个或多个位置处向亲本黄原胶裂解酶(例如，具有SEQ ID NO:2)中引入改变(例如，取代、缺失或插入)。
在一个实施例中，本发明涉及用于获得(或产生)根据本发明的黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体与SEQ ID NO:2具有至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性。
在一个实施例中，本发明涉及用于获得(或产生)根据本发明的黄原胶裂解酶变体的方法，该黄原胶裂解酶变体在选自下组的一个或多个位置处具有改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：155、159、620、624、626、631、635、645、649、650、656、738、745、746、748、752、753、754、757、764、769、774、775、777、779、782、785、786、789、792、796、799、800、801、819、824、843、845、875、903、911、912、915、919、921、923、925、927、928、930、932、933、941、966、967、991和998，其中每个位置对应于SEQ ID NO:2的位置。
在一个实施例中，本发明涉及用于获得(或产生)根据本发明的黄原胶裂解酶变体的方法，该黄原胶裂解酶变体在选自下组的一个或多个位置处具有改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：Y155E、A159P、K620R、A624E、A626G、T631N、T631E、S635E、S635T、S635Q、A645S、T649V、T649K、T649R、Q650G、I656V、G738L、K745R、F746L、L748T、P752R、P752K、G753E、G753Q、G753S、S754E、S754L、S754Q、S754R、S757D、S757P、S757E、P764V、P764K、A769D、A769T、A769R、A769S、A769E、A769Q、A769*、A774V、L775M、L775Y、L775A、L775I、L775S、L775F、L775Q、D777K、D777R、P779V、Y782I、A785T、N786K、G789R、K792W、K792Y、K792V、K792A、N796Q、A799H、V800P、D801G、K819R、K819T、K824R、A843P、D845E、K875T、K875E、T903A、T903Q、A911V、A911M、A911S、A912T、A912I、A912Y、T915Q、T915S、T915V、T915A、T919F、T919G、T919D、T921R、T921S、T923H、T923D、T925Q、T925D、T925R、T927K、D928W、Y930H、Y930L、Y930F、A932P、D933M、G941E、G941D、A966P、A967D、N991D和V998K，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
在一个实施例中，本发明涉及用于获得(或产生)根据本发明的黄原胶裂解酶变体的方法，所述变体在一个或多个位置处具有改变(例如，取代、缺失或插入)，使得提供了相对于亲本黄原胶裂解酶具有≥1.0的半衰期改善因子(HIF)；优选地具有>1.0的半衰期改善因子(HIF)的变体。
在一个实施例中，本发明涉及产生黄原胶裂解酶变体的方法，该方法包括：在适于表达所述变体的条件下培养本发明的宿主细胞(例如，分离的宿主细胞，分离的重组宿主细胞)；和回收所述变体。
在一个实施例中，本发明涉及产生黄原胶裂解酶变体的方法，该方法包括：在适于表达所述变体的条件下培养宿主细胞(例如，分离的宿主细胞，分离的重组宿主细胞)；和回收所述变体，其中所述黄原胶裂解酶变体是本发明的变体。
在一个实施例中，本发明涉及用于降解黄原胶的方法，该方法包括：将本发明的组合物施用于黄原胶。
在一个实施例中，本发明涉及降解黄原胶的方法，该方法包括：将本发明的组合物施用于黄原胶，其中所述黄原胶在纺织品或硬表面的表面上，例如餐具洗涤。
在一个实施例中，本发明涉及用于降解黄原胶的方法，该方法包括：将本发明的组合物施用于黄原胶，其中所述黄原胶在由钻井孔造成的地下地层的压裂中使用。
在一个实施例中，本发明涉及用于降解黄原胶的方法，该方法包括：将本发明的组合物施用于黄原胶，其中所述黄原胶是钻孔滤饼中的组分。
在一个实施例中，本发明涉及氘用于鉴定黄原胶裂解酶多肽(例如，具有SEQ IDNO:2)或本发明的黄原胶裂解酶变体的螯合剂诱导的不稳定区的用途，优选地所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐，进一步优选地所述氘处于D2O的形式。
在一个实施例中，本发明涉及用于鉴定黄原胶裂解酶(例如具有SEQ ID NO:2的黄原胶裂解酶多肽或根据本发明的黄原胶裂解酶变体)的螯合剂诱导的不稳定区的方法，所述方法包括：
i)在螯合剂的存在下提供，优选地所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐：
a)黄原胶裂解酶多肽(例如具有SEQ ID NO:2或根据本发明的黄原胶裂解酶变体)，
ii)在不存在螯合剂的情况下提供：
b)根据a)所述的黄原胶裂解酶多肽，
iii)向i)和ii)提供氘(例如，至氘的终浓度为95％)用于氢-氘交换，优选地所述氘处于D2O的形式，
iv)用胃蛋白酶消化来自步骤iii)的氘化多肽，
v)鉴定步骤iv)中产生的胃酶解肽，
vi)在存在和不存在所述螯合剂的情况下，量化和比较掺入到来自步骤v)的单个肽中的氘。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的变体的分离的多核苷酸。
用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的且包括从基因组DNA或cDNA或其组合进行分离。可以例如通过使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如，Innis等人，1990，PCR:A Guide to Methods and Application[PCR：方法和应用指南]，Academic Press[学术出版社]，纽约。可以使用其他核酸扩增程序如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以克隆进枯草芽孢杆菌或大肠杆菌的菌株或相关生物体中，并且因此，例如可以是该多核苷酸的多肽编码区的等位基因变体或物种变体。
编码本发明的多肽的多核苷酸的修饰对于合成基本上类似于该多肽的多肽可以是必需的。术语“基本上类似”于该多肽是指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可以因某种工程化方式而与从其天然来源分离的多肽不同，例如在比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的变体。这些变体可以基于以SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列、但对应于旨在用于产生该酶的宿主生物体的密码子使用的核苷酸取代，或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如Ford等人,(1991),‘ProteinExpression and Purification[蛋白表达与纯化]’,2:95-107。
核酸构建体
本发明还涉及包含核酸构建体，这些核酸构建体包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中表达。
可以按多种方式操纵多核苷酸，以提供多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
该控制序列可为启动子，即，被宿主细胞识别用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的一种多核苷酸。该启动子含有转录控制序列，其介导该多肽的表达。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以是从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的适合的启动子的实例是从以下获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus，1994，Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人，1988，Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。另外的启动子描述于Gilbert等人，1980，Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Usefulproteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和Sambrook等人，1989，同上。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的适合的启动子的实例是从以下酶的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(Fusarium venenatum Daria)(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(Fusarium venenatum Quinn)(WO 00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉黄原胶裂解酶I、里氏木霉黄原胶裂解酶II、里氏木霉黄原胶裂解酶III、里氏木霉黄原胶裂解酶IV、里氏木霉黄原胶裂解酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导子由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替代；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。
在酵母宿主中，从以下酶的基因获得有用的启动子：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。酵母宿主细胞的其他有用的启动子由Romanos等人，1992，Yeast[酵母]8:423-488描述。
控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。
细菌宿主细胞的优选的终止子从以下酶的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
丝状真菌宿主细胞的优选的终止子从以下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
酵母宿主细胞的优选的终止子从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。酵母宿主细胞的其他有用的终止子由Romanos等人，1992，同上描述。
该控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定子区，它增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人，1995，Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。
控制序列也可以是前导子，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区。该前导子可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导子。
丝状真菌宿主细胞的优选的前导子从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
酵母宿主细胞的适合的前导子从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
控制序列也可以是多聚腺苷化序列，一种与多核苷酸3'-末端可操作地连接并在转录时由宿主细胞识别为向转录的mRNA添加聚腺苷酸残基的信号序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
丝状真菌宿主细胞的优选的聚腺苷酸化序列从以下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
酵母宿主细胞的有用的多聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，Mol.CellularBiol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。
控制序列也可为编码与多肽的N-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5'-末端可固有地含有在翻译阅读框中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5'-末端可含有对于编码序列为外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌NCIB 11837生麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。
丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉黄原胶裂解酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶。
酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其他的有用的信号肽编码序列由Romanos等人，1992，同上描述。
控制序列也可以是编码位于多肽N-末端处的前肽的前肽编码序列。所得多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下酶的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。
在信号肽序列和前肽序列两者都存在的情况下，该前肽序列位于紧邻多肽的N-末端且该信号肽序列位于紧邻该前肽序列的N-末端。
也可为希望的是添加调节序列，该调节序列调节宿主细胞生长相关的多肽的表达。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调节化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许用于基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤的存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。多个核苷酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体，其可包括一个或多个便利的限制位点以允许编码该多肽的多核苷酸在此类位点处的插入或取代。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。
载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标志。选择性标志是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养型等。
细菌选择性标志的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标志。对于酵母宿主细胞而言适合的标志包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标志包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等效物。优选的在曲霉细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。
载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，该核酸与对应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体还可以进一步包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点、以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。
用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、及ARS4与CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等人，1991，Gene[基因]98:61-67；Cullen等人，1987，Nucleic Acids Res.[核酸研究]15:9163-9175；WO00/24883)。可根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
可将本发明的多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标志基因可以获得多核苷酸的拷贝数目的增加，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择含有选择性标志基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。
用于连接上文描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人，1989，同上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如较早前描述的。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
该宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单孢菌属、沙门氏菌属和脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于类马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽疫亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，Chang和Cohen，1979，Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Young和Spizizen，1961，J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques[生物技术]6:742-751)或接合(参见例如，Koehler和Thorne，1987，J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan，1983，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人，1988，Nucleic AcidsRes.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人，2004，Folia Microbiol.(Praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49:399-405)、接合(参见例如，Mazodier等人，1989，J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)或转导(参见例如，Burke等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可以通过以下来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人，2006，J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或接合(参见例如，Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。将DNA引入到链球菌属细胞中可以通过如下方法来实现：天然感受态(naturalcompetence)(参见，例如Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如Catt和Jollick，1991，Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见，例如Buckley等人，1999，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或接合(参见，例如Clewell，1981，Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域中已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
该宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如本文使用的，“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由Hawksworth等人所定义的，在：Ainsworth andBisby's Dictionary of The Fungi[Ainsworth和Bisby的真菌大词典]，第8版，1995，CABInternational[国际CAB]，University Press[大学出版社]，Cambridge[剑桥]，英国)。
真菌宿主细胞可为酵母细胞。如本文使用的，“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可能在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast[酵母的生物学与活性](Skinner、Passmore和Davenport编辑,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9]，1980)中描述的那样定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人,1995,同上)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳多糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵性的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌属、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌、粪状金孢子菌、毡金孢子菌、昆士兰金孢子菌、热带金孢子菌、带纹金孢子菌、灰盖鬼伞、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉菌、黄孢原毛平革菌、射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
真菌细胞可以通过以下过程转化，该过程涉及原生质体形成、原生质体的转化、以及以本身已知的方式的细胞壁的再生。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合的程序描述于以下文献中：EP 238023，Yelton等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及Christensen等人，1988，Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢属物种的适合方法在Malardier等人，1989，Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787中描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente，于Abelson，J.N.和Simon，M.I.编辑，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南]，Methods in Enzymology[酶学方法]，第194卷，第182-187页，Academic Press,Inc.[学术出版社有限公司]，纽约中；Ito等人，1983，J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。
生产方法
本发明还涉及产生变体的方法(例如，体外或离体方法)，该方法包括：(a)在适于该变体的表达的条件下培养本发明的宿主细胞；和(b)回收该变体。
本发明还涉及产生本发明的变体的方法(例如，体外或离体方法)，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；和(b)回收该多肽。在一个优选的方面，该细胞是类芽孢杆菌属细胞或微杆菌属细胞。
本发明还涉及产生本发明的变体的方法(例如，体外或离体方法)，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；和(b)回收该多肽。
宿主细胞是在适于使用本领域中已知的方法产生多肽的营养培养基中培养的。例如，可以通过摇瓶培养，或者在一种适合的介质中并在允许该多肽表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养介质中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽被分泌到该营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收该多肽。如果多肽不进行分泌，那么其可以从细胞裂解液中进行回收。
该变体多肽可以使用本领域中已知的特定用于这些多肽的方法进行检测，例如用于确定纤维素或黄原胶裂解酶活性的方法。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收该变体多肽。例如，可以通过常规程序从营养培养基中回收多肽，这些常规方法包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化该变体多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦、以及尺寸排阻)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见例如，Protein Purification[蛋白质纯化]，Janson和Ryden编辑，VCH Publishers[VCH出版社]，纽约，1989)。
在一个替代性方面，不回收变体多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作变体多肽的来源。
组合物
在某一个方面，与亲本酶相比、或与具有变体的同一的氨基酸序列但在一个或多个指定位置处不具有改变(例如，取代、缺失或插入)的黄原胶裂解酶相比、或与具有SEQ IDNO:2的黄原胶裂解酶相比，根据本发明的变体在洗涤剂中具有改善的稳定性，其中如本文实例4中披露的测量洗涤剂中的活性和/或稳定性。
除了酶，这些洗涤剂组合物可以包括另外的组分。另外的组分的选择处于技术人员的能力范围内并且包括常规的成分，包括下文所示的示例性非限制性组分。对于织物护理，组分的选择可以包括以下考虑：待清洁的织物的类型、污垢的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制。尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，组分可以包含另外的功能性。
洗涤剂组合物可以适于洗涤纺织品，例如像织物、衣服或亚麻布，或用于清洁硬表面，例如像地板、桌子、或餐具洗涤。
洗涤剂组合物
在一个实施例中，可以将本发明的变体以对应于以下的量添加至一种洗涤剂组合物中：每升的洗涤液0.0001-200mg的酶蛋白，例如0.0005-100mg的酶蛋白，优选地0.001-30mg的酶蛋白，更优选地0.005-8mg的酶蛋白，甚至更优选地0.01-2mg的酶蛋白。
用于在自动洗碗机(ADW)中使用的组合物例如可以包括按该组合物的重量计0.0001％-50％，例如0.001％-20％，例如0.01％-10％，例如0.05％-5％的酶蛋白。
用于在洗衣造粒中使用的组合物例如可以包括按该组合物的重量计0.0001％-50％，例如0.001％-20％、例如0.01％-10％、例如0.05％-5％的酶蛋白。
用于在洗衣液中使用的组合物例如可以包括按该组合物的重量计0.0001％-10％，例如0.001％-7％、例如0.1％-5％的酶蛋白。
可以使用常规稳定试剂(例如，多元醇如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如芳香族硼酸酯)、或苯基硼酸衍生物(例如4-甲酰苯基硼酸)稳定本发明的洗涤剂组合物的一种或多种酶，并且可以如在例如WO 92/19709和WO 92/19708中描述的配制该组合物。
在某些市场中，不同洗涤条件并且就其本身而言，使用不同类型的洗涤剂。这披露于例如EP 1 025 240中。例如，在亚洲(日本)使用低的洗涤剂浓度体系，而美国使用中等洗涤剂浓度体系，并且欧洲使用高的洗涤剂浓度体系。
低的洗涤剂浓度体系包括以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在少于约800ppm的洗涤剂组分。日本洗涤剂典型地被认为是低的洗涤剂浓度体系，因为它们具有存在于洗涤水中的大约667ppm的洗涤剂组分。
中等洗涤剂浓度体系包括以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在约800ppm与约2000ppm之间的洗涤剂组分。北美洗涤剂通常被认为是中等洗涤剂浓度体系，因为它们具有存在于洗涤水中的大约975ppm的洗涤剂组分。
高的洗涤剂浓度体系包括以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在多于约2000ppm的洗涤剂组分。欧洲洗涤剂通常被认为是高的洗涤剂浓度体系，因为它们具有在洗涤水中的大约4500-5000ppm的洗涤剂组分。
拉丁美洲洗涤剂通常是高泡沫磷酸盐助洗剂洗涤剂并且在拉丁美洲使用的洗涤剂的范围可以落入中等和高的洗涤剂浓度两者中，因为在洗涤水中它们的洗涤剂组分的范围是从1500ppm至6000ppm。此类洗涤剂组合物都是本发明的实施例。
本发明的多肽还可以并入WO 97/07202中披露的洗涤剂配制品中，将其通过引用并入本文。
表面活性剂
该洗涤剂组合物可以包含一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子的和/或阳离子的和/或非离子的和/或半极性的和/或兼性离子的、或其混合物。在一个具体的实施例中，该洗涤剂组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子型表面活性剂的混合物。该一种或多种表面活性剂典型地以按重量计从约0.1％至60％(例如约1％至约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％)的水平存在。基于所希望的清洁应用来选择该一种或多种表面活性剂，并且包括本领域中已知的任何一种或多种常规表面活性剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何表面活性剂。
当包括在其中时，该洗涤剂将通常含有按重量计从约1％至约40％(例如从约5％至约30％，包括从约5％至约15％、或从约20％至约25％)的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地，直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(例如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯、及其组合。
当包括在其中时，该洗涤剂将通常含有按重量计从约0％至约10％的阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物、及其组合。
当包括在其中时，该洗涤剂将通常含有按重量计从约0.2％至约40％(例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，如从约3％至约5％、或从约8％至约12％)的非离子表面活性剂。非离子表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)、或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))、连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品、及其组合。
当包括在其中时，该洗涤剂将通常含有按重量计从约0％至约10％的半极性表面活性剂。半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)(例如烷基二甲基氧化胺)、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲基氧化胺和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)氧化胺、脂肪酸链烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺及其组合。
当包括在其中时，该洗涤剂将通常含有按重量计从约0％至约10％的兼性离子表面活性剂。兼性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱、及其组合。
水溶助剂
水溶助剂是如下化合物，该化合物在水溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中溶解极性物质)。典型地，水溶助剂具有亲水和疏水两种特征(所谓的两亲特性，如由表面活性剂已知的)；然而，水溶助剂的分子结构一般不利于自发性自聚集，参见例如通过Hodgdon和Kaler(2007)，Current Opinion in Colloid&Interface Science[胶体和界面科学新见]12:121-128的综述。水溶助剂并不显示临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。相反，许多水溶助剂显示连续类型的聚集过程，在该过程中聚集物的大小随着浓度增加而增长。然而，许多水溶助剂改变了含有极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。水溶助剂常规地在从药学、个人护理、食品到技术应用的各个产业中应用。水溶助剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过去除水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，例如相分离或高黏度。
该洗涤剂可以含有按重量计0-5％，如约0.5％至约5％，或约3％至约5％的水溶助剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何水溶助剂。水溶助剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。
助洗剂和共助洗剂
该洗涤剂组合物可以含有按重量计约0-65％(例如约5％至约45％)的洗涤剂助洗剂或共助洗剂、或其混合物。在餐具洗涤洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％、特别地50％-65％。助洗剂和/或共助洗剂可以特别地是与Ca和Mg形成水溶性络合物的螯合试剂。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、二乙醇胺(DEA，也称为亚氨基二乙醇)、三乙醇胺(TEA，也称为2,2',2”-次氨基三乙醇)、以及羧甲基菊粉(CMI)及其组合。
该洗涤剂组合物还可以含有按重量计0-20％(如约5％至约10％)的洗涤剂共助洗剂或其混合物。洗涤剂组合物可以包括单独的共助洗剂、或与助洗剂例如沸石助洗剂组合的共助洗剂。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐、螯合剂(例如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和磷酸盐)、以及烷基琥珀酸或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2',2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDS)、乙二胺-N,N'-二丁二酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二膦酸(HEDP)、乙二胺四-(亚甲基膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMPA或DTMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDA)、N-(2-磺甲基)-天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)-谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)-谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)以及磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(2-羟乙基)-亚乙基二胺-N,N',N'-三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)及其组合和盐。另外的示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 09/102854、US 5977053中
漂白系统
洗涤剂可以含有按重量计0-50％，例如约0.1％至约25％的漂白系统。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何漂白系统。适合的漂白系统组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠和过硼酸钠、预成型过酸及其混合物。适合的预成型过酸包括但不限于：过氧羧酸及盐、过碳酸及盐、过亚氨酸(perimidic acid)及盐、过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone(R))、及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括与过酸形成性漂白活化剂组合的过氧化物基的漂白系统，这些系统可以包含例如无机盐，包括碱金属盐，如过硼酸盐(通常是单水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐。术语漂白活化剂在本文意指与过氧化物漂白剂(像过氧化氢)反应以形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。本文有待使用的适合的漂白活化剂包括属于酯、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的实例是四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰)氧基]苯磺酸钠(ISONOBS)、二过氧月桂酸、4-(十二酰基氧基)苯磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS)、4-(壬酰基氧基)-苯磺酸盐(NOBS)、和/或披露于WO98/17767中的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP624154中并且该家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋汀)具有以下优点，它是环境友好的，因为它最终降解为柠檬酸和醇。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋汀在储存时在产品中具有良好的水解稳定性，并且它是有效的漂白活化剂。最后，ATC为衣物洗涤添加剂提供良好的助洗能力。可替代地，漂白系统可以包含例如酰胺、酰亚胺或砜类型的过氧酸。漂白系统还可以包含过酸，例如6-(苯二甲酰亚氨基)过己酸(PAP)。漂白系统还可以包括漂白催化剂。在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由以下组成：具有下式的有机催化剂：
(iii)及其混合物；其中每个R1独立地是含有从9至24个碳的支链烷基基团或含有从11至24个碳的直链烷基基团，优选地每个R1独立地是含有从9至18个碳的支链烷基基团或含有从11至18个碳的直链烷基基团，更优选地每个R1独立地选自下组，该组由以下组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正-十二烷基、正-十四烷基、正-十六烷基、正-十八烷基、异-壬基、异-癸基、异-十三基和异-十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO 2007/087259以及WO 2007/087242中。适合的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌
聚合物
该洗涤剂可以含有按重量计0-10％(例如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％)的聚合物。可以利用本领域中已知的在洗涤剂中使用的任何聚合物。该聚合物可以作为如上文提到的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污垢释放、染料转移抑制、油污清洁和/或消泡特性。一些聚合物可以具有多于一种的上文提到的特性和/或多于一种的下文提到的基序。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(亚乙基亚胺)、羧甲基菊粉(CMI)、和聚羧化物，例如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水修饰的CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯对苯二甲酸乙二酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基磺酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO 2006/130575中。还考虑了以上提到的聚合物的盐。
织物调色剂
本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂，例如染料或色素，当配制在洗涤剂组合物中时，当所述织物与洗涤液接触时织物调色剂可以沉积在织物上，该洗涤液包含所述洗涤剂组合物，并且因此通过可见光的吸收/反射改变所述织物的色彩。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，当织物调色剂吸收至少部分可见光谱时，它们改变表面的色彩。适合的织物调色剂包括染料和染料-黏土轭合物，并且还可以包括色素。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(Colour Index)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红或其混合物，例如如WO 2005/03274、WO 2005/03275、WO 2005/03276和EP1876226(通过引用并入本文)中描述的。洗涤剂组合物优选地包含从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。该组合物可以包含从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是尤其优选的。适合的调色剂还披露于例如WO2007/087257和WO 2007/087243中。
另外的酶
洗涤剂添加剂连同洗涤剂组合物可以包含一种或多种[另外的]酶，例如黄原胶裂解酶、蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、地衣聚糖酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶、和/或过氧化物酶。
一般而言，一种或多种所选酶的特性应与所选洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分的相容性等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。
纤维素酶：适合的纤维素酶包括细菌来源或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、支顶孢属的纤维素酶，例如披露于US 4,435,307、US 5,648,263、US5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰孢产生的真菌纤维素酶。
尤其适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纤维素酶。其他实例为纤维素酶变体，例如描述于WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及PCT/DK 98/00299中的那些。
表现出内切-β-1,4-葡聚糖酶活性的纤维素酶的实例(EC 3.2.1.4)是已经描述于WO 02/099091中的那些。
纤维素酶的其他实例包括描述于WO 96/29397中的家族45纤维素酶，并且尤其是在对应于WO 02/099091的SEQ ID NO:8中的以下位置的一个或多个位置处具有取代、插入和/或缺失的其变体：2、4、7、8、10、13、15、19、20、21、25、26、29、32、33、34、35、37、40、42、42a、43、44、48、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、70、72、76、79、80、82、84、86、88、90、91、93、95、95d、95h、95j、97、100、101、102、103、113、114、117、119、121、133、136、137、138、139、140a、141、143a、145、146、147、150e、150j、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160c、160e、160k、161、162、164、165、168、170、171、172、173、175、176、178、181、183、184、185、186、188、191、192、195、196、200、和/或20，优选地选自P19A、G20K、Q44K、N48E、Q119H或Q146R。
可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM、和CarezymeTM(诺维信公司(Novozymes A/S))、ClazinaseTM、和Puradax HATM(杰能科国际有限公司(Genencor InternationalInc.))以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(Kao Corporation))。
蛋白酶：另外的酶可以是另一种蛋白酶或蛋白酶变体。该蛋白酶可以是动物、植物或微生物来源的，包括化学或基因修饰的突变体。优选的是微生物来源。它可以是碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(例如胰蛋白酶)或S8家族(例如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶的蛋白酶可以例如是来自例如家族M4、M5、M7或M8的嗜热菌蛋白酶。
术语“枯草杆菌酶”是指根据Siezen等人，Protein Engng.[蛋白质工程]4(1991)719-737和Siezen等人，Protein Science[蛋白质科学]6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶的亚组。丝氨酸蛋白酶是通过在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸来表征的蛋白酶的一个亚组。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。在本发明的一个方面，该蛋白酶可以是一种类枯草杆菌蛋白酶，例如枯草杆菌蛋白酶或其变体。另外，枯草杆菌酶(以及丝氨酸蛋白酶)的特征为除了丝氨酸以外，还具有两个活性位点氨基酸残基，即组氨酸和天冬氨酸残基。
枯草杆菌蛋白酶的实例是衍生自芽孢杆菌的那些，例如枯草杆菌蛋白酶lentus、迟缓芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶Novo、嘉士伯枯草杆菌蛋白酶(subtilisin Carlsberg)、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN'、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147以及枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO 89/06279中)，以及蛋白酶PD138(WO 93/18140)。另外的丝氨酸蛋白酶实例描述于WO 98/020115、WO 01/44452、WO 01/58275、WO 01/58276、WO 03/006602以及WO 04/099401中。枯草杆菌酶变体的实例可以是在任何以下位置处具有突变的那些：使用BPN'编号的3、4、9、15、27、36、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、217、218、222、232、235、236、245、248、252和274。更优选的，这些枯草杆菌酶变体可以包含以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R、S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN'编号)。另外的优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶(如在例如WO 95/23221中描述的)、以及在WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147以及EP 1921148中描述的其变体。
胰蛋白酶样蛋白酶的实例为胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的)，以及在WO 89/06270和WO 94/25583中描述的镰孢属蛋白酶。有用的蛋白酶的实例为描述于WO 92/19729、WO98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946的变体，尤其是在以下位置中的一个或多个处具有取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。
金属蛋白酶的实例是如描述于WO 07/044993中的中性金属蛋白酶。
优选的可商购的蛋白酶包括AlcalaseTM、CoronaseTM、DuralaseTM、DurazymTM、EsperaseTM、EverlaseTM、KannaseTM、LiquanaseTM、Liquanase UltraTM、OvozymeTM、PolarzymeTM、PrimaseTM、RelaseTM、SavinaseTM和Savinase UltraTM(诺维信公司(NovozymesA/S))，AxapemTM(吉斯特-博克德斯公司(Gist-Brocases N.V.))，BLAP和BLAP X(汉高股份有限公司(Henkel AG&Co.KGaA))，ExcellaseTM、FN2TM、FN3TM、FN4TM、MaxacaTM、MaxapemTM、MaxataseTM、ProperaseTM、PurafastTM、PurafectTM、Purafect OxPTM、PurafectPrimeTM和PuramaxTM(杰能科有限公司(Genencor int.))。
脂肪酶和角质酶：适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体酶。实例包括如描述于EP 258068和EP 305216中的来自嗜热丝孢菌属(Thermomyces)(例如来自疏绵状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)(之前命名为疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa))的脂肪酶、来自腐质霉属(Humicola)(例如特异腐质霉(H.insolens)(WO96/13580))的角质酶、来自假单胞菌属(Pseudomonas)菌株(这些假单胞菌属菌株中的一些现在重命名为伯克氏菌属(Burkholderia))(例如，产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP218272))、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)、假单胞菌属物种菌株SD705(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)、GDSL型链霉菌属脂肪酶(Streptomyces)(WO 10/065455)的脂肪酶、来自稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)(WO 10/107560)的角质酶、来自门多萨假多胞菌(Pseudomonas mendocina)(US 5,389,536)的角质酶、来自嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)(WO 11/084412)的脂肪酶、嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)脂肪酶(WO 11/084417)、来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(WO 11/084599)的脂肪酶、以及来自灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)(WO 11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)(WO 12/137147)的脂肪酶。
另外的实例是有时是指酰基转移酶或过水解酶(perhydrolase)的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO 10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)、以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体，特别是用于在来自亨斯迈纺织染化私人有限公司(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)的商业化产品GentlePower Bleach(柔和漂白剂)中使用的S54V变体(WO 10/100028)。
其他实例是脂肪酶变体，例如描述于EP 407225、WO 92/05249、WO 94/01541、WO94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO 95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO 00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508和WO 09/109500中的那些。
优选的商业脂肪酶产品包括LipolaseTM、LipexTM；LipolexTM和LipocleanTM(诺维信公司(Novozymes A/S))，Lumafast(最初来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(最初来自吉斯特-博克德斯公司(Gist-Brocades))。
淀粉酶
淀粉酶可以是α-淀粉酶、β-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以是细菌或真菌来源的。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属，例如地衣芽孢杆菌的特定菌株(更详细地描述于GB 1,296,839中)获得的α-淀粉酶。
淀粉酶的实例是具有WO 95/10603中的SEQ ID NO:3的那些或与SEQ ID NO:3具有90％序列同一性的其变体。优选的变体描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 97/43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，例如在以下位置中的一个或多个处具有取代的变体：在WO 95/10603中的SEQ ID NO:3的15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408和444。
其他的淀粉酶是WO 2016/203064的SEQ ID NO:1的变体，该变体与SEQ ID NO:1具有至少75％序列同一性。优选的变体是在对应于SEQ ID NO:1的位置1、54、56、72、109、113、116、134、140、159、167、169、172、173、174、181、182、183、184、189、194、195、206、255、260、262、265、284、289、304、305、347、391、395、439、469、444、473、476、或477的一个或多个位置处包含修饰的变体，其中所述α-淀粉酶变体与SEQ ID NO:1具有至少75％但小于100％的序列同一性。
可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或与SEQ ID NO:6具有90％序列同一性的其变体。SEQ ID NO:6的优选的变体是在位置181和182处具有缺失并且在位置193处具有取代的那些。
其他淀粉酶实例是包含示出于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的衍生自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示出于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或具有90％序列同一性的其变体。这种杂合α-淀粉酶的优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209和Q264。包含示出于WO 2006/066594的SEQ IDNO:6中的衍生自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选的变体是具有以下取代的那些：
M197T；
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或
G48+T49+G107+H156+A181+N190+I201+A209+Q264。
另外的淀粉酶实例是具有WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或与SEQ IDNO:6具有90％序列同一性的其变体。SEQ ID NO:6的优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216和K269。特别优选的淀粉酶是在位置G182和H183或位置H183和G184处具有缺失的那些。
另外的淀粉酶是具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7具有90％序列同一性的其变体。SEQID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304和476。更优选的变体是在位置182和183或位置183和184处具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184处具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304和476处具有取代的那些。
可以使用的其他淀粉酶是具有WO 08/153815的SEQ ID NO:2、WO 01/66712的SEQID NO:10的淀粉酶、或与WO 08/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列同一性或与WO 01/66712的SEQ ID NO:10具有90％序列同一性的其变体。WO 01/66712中SEQ ID NO:10的优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211和264。
可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 09/061380的SEQ ID NO:2的淀粉酶或与SEQID NO:2具有90％序列同一性的其变体。SEQ ID NO:2的优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444和G475。SEQ ID NO:2的最优选的变体是在以下位置中的一个或多个处具有取代：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K，和/或在位置R180和/或S181处具有缺失的那些。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；
N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；
S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或
S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中该变体任选地在位置243处进一步包含取代和/或在位置180和/或位置181处进一步包含缺失。
淀粉酶的其他实例是具有WO01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQ IDNO:12具有至少90％，例如至少95％序列同一性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的以下位置中的一个或多个处具有取代、缺失或插入的那些：R28、R118、N174；R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314；R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有取代R118K、N195F、R320K和R458K的变体，以及在选自下组的一个或多个位置处另外具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345和A339，最优选的是在所有这些位置处另外具有取代的变体。
可商购的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM、Stainzyme TM、StainzymePlusTM、NatalaseTM和BANTM(诺维信公司(Novozymes A/S))，RapidaseTM和PurastarTM(来自杰能科国际有限公司(Genencor International Inc.))。
过氧化物酶/氧化酶：适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(例如来自灰盖鬼伞)的过氧化物酶、及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602、以及WO 98/15257中描述的那些。
可商购的过氧化物酶包括GuardzymeTM(诺维信公司(Novozymes A/S))。
可以通过添加含有一种或多种酶的单独添加剂、或通过添加包括所有这些酶的组合添加剂而将洗涤剂酶包括在洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独的或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液等。优选的洗涤剂添加剂配制品为颗粒，特别是非尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或者浆液。
非尘颗粒可以例如如在US 4,106,991和4,661,452中所披露而产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行包衣。蜡质包衣材料的实例为具有1000至20000的平均摩尔重量的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有从16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化的壬基苯酚；乙氧基化的脂肪醇，其中该醇含有从12至20个碳原子，并且其中具有15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯以及甘油三酸酯。适于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(例如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP 238,216中披露的方法来制备。
辅料
还可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防蚀剂、防缩剂、抗污垢再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、黏合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解试剂(disintegration agent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC和/或多元醇(例如丙二醇))、织物调理剂(包括黏土)、填充剂/加工助剂、荧光增白剂/光学增亮剂、泡沫促进剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污垢助悬剂、软化剂、泡沫抑制剂、晦暗抑制剂、以及芯吸剂，单独或组合使用。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何成分。此类成分的选择完全在技术人员的技术范围内。
分散剂：本发明的洗涤剂组合物还可以含有分散剂。具体地，粉末洗涤剂可以包含分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包含被不多于两个碳原子彼此分开的至少两个羧基基团。适合的分散剂例如描述于PowderedDetergents[粉末洗涤剂]，Surfactant Science Series[表面活性剂科学系列]，第71卷，Marcel Dekker,Inc.[马塞尔德克尔公司]中。
染料转移抑制剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑或其混合物。当在主题组合物中存在时，染料转移抑制剂可以按该组合物的重量计以从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％的水平存在。
荧光增白剂：本发明的洗涤剂组合物将优选地还含有另外的组分，这些组分可以给正在清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光学增亮剂。其中增亮剂优选以约0.01％至约0.5％的水平存在。在本发明的组合物中可以使用适于在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯衍生物。二氨基茋-磺酸衍生物型的荧光增白剂的实例包括以下的钠盐：4,4'-双(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)茋-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)茋-2.2'-二磺酸盐；4,4'-双(2-苯胺基-4(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)茋-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)茋-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)茋-2,2'-二磺酸盐和2-(茋基-4"-萘并-1.,2':4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸盐。优选的荧光增白剂是可从瑞士巴塞尔汽巴–嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG，Basel，Switzerland)获得的Tinopal DMS和Tinopal CBS。Tinopal DMS是4,4'-双-(2-吗啉基-4苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸盐的二钠盐。Tinopal CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)二磺酸盐的二钠盐。还优选的荧光增白剂是可商购的Parawhite KX，由印度孟买的派拉蒙矿物与化学品公司(Paramount Minerals and Chemicals，Mumbai，India)供应。适于在本发明中使用的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-氨烷基香豆素。适合的荧光增亮剂水平包括从约0.01wt％、从0.05wt％、从约0.1wt％或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。
污垢释放聚合物：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污垢释放聚合物，这些聚合物帮助从织物(例如棉和基于聚酯的织物)去除污垢，特别是从基于聚酯的织物去除疏水性污垢。污垢释放聚合物可以例如是基于非离子或阴离子对苯二甲酸的聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如PowderedDetergents[粉末洗涤剂]，Surfactant science series[表面活性剂科学系列]第71卷第7章，Marcel Dekker,Inc.[马塞尔德克尔公司]。另一种类型的污垢释放聚合物是包含核心结构和附接至该核心结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。核心结构可以包含聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，例如详细描述于WO 2009/087523中(通过引用并入本文)。此外，无规接枝共聚物是适合的污垢释放聚合物适合的接枝共聚物更详细地描述于WO 2007/138054、WO 2006/108856和WO 2006/113314中(通过引用并入本文)。其他污垢释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，例如修饰的纤维素衍生物，例如EP 1867808或WO 2003/040279中描述的那些(将两者都通过引用并入本文)。适合的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。适合的纤维素聚合物包括阴离子修饰的纤维素、非离子修饰的纤维素、阳离子修饰的纤维素、兼性离子修饰的纤维素、及其混合物。适合的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素、及其混合物。
抗再沉积剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氧乙烯和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸和马来酸的共聚物、和乙氧基化的聚乙亚胺。以上在污垢释放聚合物下描述的基于纤维素的聚合物还可以用作抗再沉积剂。
其他适合的辅料包括但不限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、黏合剂、运载体、染料、酶稳定剂、织物柔软剂、填充剂、泡沫调节剂、水溶助剂、香料、色素、泡沫抑制剂、溶剂以及用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构弹性剂。
洗涤剂产品的配制品
该洗涤剂组合物可以处于任何常规形式，例如条，均匀的片剂，具有两个或更多个层的片剂，具有一个或多个室的袋，规则的或压缩的粉末，颗粒，膏，糊剂，凝胶，或规则的、压缩的或浓缩的液体。存在多种洗涤剂配制品形式，例如层(相同或不同相)、袋、以及用于机器给药单位的形式。
袋可以被配置为单个或多个的室。它可以具有适于保存该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。该袋由水溶性膜制成，它包含了一个内部体积。可以将所述内部体积分成袋的室。优选的膜是高分子材料，优选地形成膜或薄片的聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选的是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，聚合物在膜例如PVA中的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混组合物，包含可水解降解的和水溶性的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在商品参考号M8630下，如由美国印第安纳州盖里的克里斯克拉夫特工业产品公司(Chris Craft In.Prod.Of Gary，Ind.，US)销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包含固体衣物清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在组成上可以与含有固体的室不同。参考：(US 2009/0011970 A1)。
可以由水可溶袋中的或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分彼此物理分离。因此，可以避免组分间的不良的储存相互作用。在清洗溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。
非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地含有按重量计至少20％并且最高达95％的水，如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包含在水性液体或凝胶中。水性液体或凝胶洗涤剂可以含有从0-30％的有机溶剂。液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。
洗衣皂条
本发明的酶可以添加到洗衣皂条中并用于手洗衣物、织物和/或纺织品。术语洗衣皂条包括洗衣条、皂条、组合条(combo bar)、合成洗涤剂条以及洗涤剂条。条的类型通常区别在于它们含有的表面活性剂的类型，并且术语洗衣皂条包括含有来自脂肪酸的皂和/或合成皂的那些。洗衣皂条具有在室温下为固体而非液体、凝胶或粉末的物理形式。术语固体被定义为不随时间显著变化的物理形式，即如果固体物体(例如洗衣皂条)被放置在容器里，该固体物体不会为了填充其被放置的容器而发生改变。该条是固体时典型地处于条的形式但也可能处于其他的固体形状如圆形或椭圆。
洗衣皂条可以含有一个或多个另外的酶、蛋白酶抑制剂例如肽醛类(或次硫酸盐加合物或半缩醛加合物)、硼酸、硼酸盐、硼砂和/或苯基硼酸衍生物如4-甲酸基本硼酸、一个或多个皂或合成的表面活性剂、多元醇例如甘油、pH控制化合物例如脂肪酸、柠檬酸、乙酸和/或甲酸、和/或一价阳离子和有机阴离子的盐，其中该一价阳离子可以是例如Na+、K+或NH4 +并且该有机阴离子可以是例如甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或乳酸盐，这样使得该一价阳离子和有机阴离子的盐可以是例如甲酸钠。
洗衣皂条还可以含有络合剂像EDTA和HEDP、香料和/或不同类型的填充剂、表面活性剂例如阴离子型合成表面活性剂、助洗剂、聚合的污垢释放剂、洗涤剂螯合剂、稳定试剂、填充剂、染料、着色剂、染料转移抑制剂、烷氧基化的聚碳酸酯、泡沫抑制剂、结构剂、黏合剂、浸出剂、漂白活化剂、黏土去污剂、抗再沉积剂、聚合分散剂、增亮剂、织物柔软剂、香料和/或本领域已知的其他化合物。
洗衣皂条可以在常规洗衣皂条制造设备中加工，该设备例如但不限于：混合器、压条机(例如两级真空压条机)、挤出机、切割机、徽标压模机、冷却隧道以及包装器。本发明不局限于通过任何单一方法制备洗衣皂条。可以在过程的不同阶段向皂中添加本发明的预混料。例如，可以制备含有皂、酶、任选地一种或多种另外的酶、蛋白酶抑制剂以及一价阳离子和有机阴离子的盐的预混料并且然后将该混合物压条。酶和任选的另外的酶可以作为蛋白酶抑制剂同时添加，例如以液体形式。除了混合步骤和压条步骤以外，该过程还可以进一步包含研磨、挤出、切割、压模、冷却和/或包装的步骤。
产生组合物的方法
本发明还涉及产生组合物的方法。该方法可以与洗涤剂组合物的(存储)稳定性相关：例如，皂条预混方法WO 2009155557。
用途
本发明还针对用于使用其组合物的方法。本发明可以例如用于任何需要降解黄原胶的应用中，例如在洗涤剂中以及在石油工业中。在石油工业中，将黄原胶用于增加钻井液(特别是钻探泥浆)的黏度。在所有此类用途中，还将需要通过降解黄原胶来降低黏度，并且用于这样的黏度减少，本发明的组合物包含对黄原胶具有活性的黄原胶裂解酶(例如根据本发明的其变体)。
用于降解黄原胶的用途
已经将黄原胶用作许多消费品(包括食品和化妆品)中的成分并且已经用于石油工业中。因此，黄原胶的降解可以导致改善的清洁过程，例如更容易去除含有胶质(例如黄原胶)的污渍，以及通常用于石油与钻探工业中的黄原胶的降解。因此，本发明针对本发明的黄原胶裂解酶(例如本发明的变体)或其组合物用于降解黄原胶的用途。本发明还针对本发明的黄原胶裂解酶或其组合物用于降解黄原胶的用途。一个实施例是本发明的黄原胶裂解酶(例如本发明的变体)与一种或多种内切葡聚糖酶或其组合物一起用于降解黄原胶的用途。黄原胶的降解可以优选地使用的黏度减小测定(例如ViPr测定)或者可替代地如本文实例4中描述的测量。
可替代地，可以使用由Lever(1972)，Anal.Biochem.[分析化学]47:273-279，1972开发的比色测定，通过用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶上的还原末端的评估来测量GH9内切葡聚糖酶活性。一个优选的实施例是用黄原胶裂解酶预处理的0.1％黄原胶的用途。可以通过计算空白与样品之间的差异来确定用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶的降解，其中大于0.5mAU、优选地大于0.6mAU、更优选地大于0.7mAU或甚至更优选地大于0.8mAU的差异显示用黄原胶裂解酶预处理的黄原胶的降解。
可替代地，可以使用由Lever(1972)，Anal.Biochem.[分析化学]47:273-279，1972开发的比色测定，通过黄原胶上的还原末端的评估来测量黄原胶裂解酶活性。一个优选的实施例是0.1％黄原胶的用途。可以通过计算空白与样品之间的差异来确定黄原胶的降解，其中大于0.1mAU、优选地大于0.15mAU、更优选地大于0.2mAU或甚至更优选地大于0.25mAU的差异显示黄原胶的降解。
可替代地，可以使用由Lever(1972)，Anal.Biochem.[分析化学]47:273-279，1972开发的比色测定，通过黄原胶上的还原末端的评估来测量黄原胶裂解酶(例如本发明的变体)和内切葡聚糖酶活性。一个优选的实施例是0.1％黄原胶的用途。可以通过计算空白与样品之间的差异来确定黄原胶的降解，其中大于0.4mAU、优选地大于0.5mAU、更优选地大于0.6mAU或甚至更优选地大于0.8mAU的差异显示黄原胶的降解。
本发明还涉及用于降解黄原胶的方法，这些方法包括向黄原胶施用包含一种或多种本发明的黄原胶裂解酶(例如本发明的变体)的组合物。本发明进一步涉及用于降解黄原胶的方法，这些方法包括向黄原胶施用包含一种或多种黄原胶裂解酶的组合物。一个实施例是用于降解黄原胶的方法，该方法包括将包含一种或多种本发明的黄原胶裂解酶(例如本发明的变体)的组合物与一种或多种内切葡聚糖酶一起施用于黄原胶。
在洗涤剂中的用途
本发明尤其涉及本发明的黄原胶裂解酶(例如本发明的变体)或其组合物在清洁过程中的用途，例如纺织品和织物的洗涤(例如家用衣物洗涤和工业衣物洗涤)以及家用和工业硬表面清洁，例如餐具洗涤。可以将本发明的黄原胶裂解酶(例如本发明的变体)添加至包含一种或多种洗涤剂组分的洗涤剂组合物中。
在一些方面，本发明的黄原胶裂解酶(例如本发明的变体)可以与一种或多种内切葡聚糖酶或其组合物在清洁过程中一起使用，例如纺织品和织物的洗涤(例如家用衣物洗涤和工业衣物洗涤)以及家用和工业硬表面清洁，例如餐具洗涤。可以将本发明的黄原胶裂解酶(例如本发明的变体)与内切葡聚糖酶一起添加至包含一种或多种洗涤剂组分的洗涤剂组合物中。
可以将本发明的多肽(例如本发明的变体)添加至洗涤剂组合物中并因此成为洗涤剂组合物的组分。洗涤剂组合物可以配制为例如用于家用和工业衣物清洁两者的手洗或机洗衣物洗涤剂组合物，包括适于预处理有污物的织物的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的织物软化剂组合物，或者配制为在一般家用或工业硬表面清洁操作中使用的洗涤剂组合物，或者配制用于手洗或机洗(家用和工业两者)餐具洗涤操作。在一个特定的方面，本发明涉及包含如本文描述的本发明的多肽的洗涤剂添加剂。
本发明还涉及用于降解纺织品的表面或硬表面上的黄原胶的方法(例如餐具洗涤)，这些方法包括向黄原胶施用包含一种或多种本发明的黄原胶裂解酶(例如本发明的变体)的组合物。在一些方面，本发明涉及用于降解纺织品的表面或硬表面上的黄原胶的方法(例如餐具洗涤)，这些方法包括向黄原胶施用包含一种或多种本发明的黄原胶裂解酶(例如本发明的变体)与一种或多种内切葡聚糖酶的组合物。在一些方面，本发明涉及包含一种或多种如本文描述的洗涤剂组分的组合物。具有酶去污性益处的黄原胶裂解酶(例如本发明的变体)的用途。
已经考虑过单独使用本发明的黄原胶裂解酶(例如本发明的变体)给出酶去污性益处，优选地对黄原胶的酶去污性益处。
在一些方面，本发明涉及包含一种或多种洗涤剂组分和本发明的分离的黄原胶裂解酶(例如本发明的变体)与GH9内切葡聚糖酶的洗涤剂组合物的用途。在一些方面，本发明涉及包含一种或多种洗涤剂组分和本发明的分离的黄原胶裂解酶(例如本发明的变体)与GH9内切葡聚糖酶的洗涤剂组合物的用途。
在地下地层的压裂(石油钻探)中的用途
使用水力压裂来创造自钻孔延伸至岩层的地下压裂，以便增加通过地层可以产生的流体的流速。通常，将高黏度压裂液以足够压裂地下地层的压力泵入井中。为了维持向地层的增加的暴露，将固体支撑剂添加至压裂液中，通过施用至流体的高压将其带进压裂处。一旦高黏度压裂液将该支撑剂带进地层中，破碎物用于减少流体的黏度，这允许该支撑剂停留在压裂处中并且由此增加地层向井的暴露。破碎物通过减少聚合物的分子量而工作，以此方式‘破碎’或降解聚合物。压裂处然后变为一种高渗透性管道，用于有待产生的流体和天然气回至井中。此类过程进一步披露于美国专利号7,360,593、5,806,597、5,562,160、5,201,370和5,067,566中。
因此，本发明涉及本发明的黄原胶裂解酶(例如本发明的变体)作为酶破碎物的用途。本发明的一个实施例是本发明的黄原胶裂解酶(例如本发明的变体)与GH9内切葡聚糖酶一起作为酶破碎物的用途。
因此，本发明提供了用于破碎钻井孔中的黄原胶的方法，该方法包括：(i)将包含水性流体的可胶凝压裂液、一种或多种能水合的聚合物、用于交联能水合的聚合物以形成聚合物凝胶的适合的交联剂，以及一种或多种本发明的酶(即，酶破碎物，例如本发明的变体)共混在一起；(ii)将交联聚合物凝胶在足够压裂周围地层的压力下泵入钻井孔中；和(iii)允许酶破碎物降解交联聚合物，以减少流体的黏度，这样使得可以将流体从地层泵回至井表面。因此，本发明的黄原胶裂解酶(例如本发明的变体)可用于控制压裂液的黏度。在一个实施例中，本发明的一种或多种黄原胶裂解酶(例如本发明的变体)与一种或多种GH9内切葡聚糖酶一起可用于控制压裂液的黏度。
本发明的酶破碎物(例如本发明的变体)可以是压裂液或破碎物-交联剂-聚合物复合物的一种成分，该压裂液或复合物进一步包含能水合的聚合物和交联剂。压裂液或复合物可以是凝胶或可以是可胶凝的。该复合物在以下方法中是有用的，该方法用于在一种压裂液中使用该复合物以将钻井孔周围的地下地层压裂，这是通过在足够压裂周围地下地层的压力下将该流体泵至钻井孔中的所希望的位置。该复合物可以通过维持特定条件的pH和温度来维持基本上非反应的状态，直到该流体被放置在钻井孔中的时刻并且完成所希望的压裂。一旦压力完成，该复合物维持无活性的特定条件便不再维持。当这些条件变化足够时，该复合物变得有活性并且破碎物开始催化聚合物降解，从而导致压裂液变得足够流动，以从地下地层泵至井表面。
其他用途
本发明的多肽(例如本发明的变体)可以另外用于其中去除黄原胶是有益的应用中。
方法
降解黄原胶的方法，其中黄原胶用于由钻井孔造成的地下地层的压裂中
当钻探时，储层钻井液(RDF)在钻探设备内循环以冷却并清洁钻头，去除钻井孔外的钻屑，减少钻柱与钻孔的侧边之间的摩擦力，并且形成滤饼以便阻止流体渗漏进入地层中。用于形成滤饼的驱动力是施用以维持钻孔稳定性的较高的钻井孔压力。这一滤饼限制储层流体在钻探以及完井设备的放置期间流入钻井孔。如果在井竣工之前或期间未去除在钻探期间造成的滤饼损伤，则当该井投入生产时可以出现一系列问题，即完井设备失败和受损的储层生产力。
钻井液(泥浆)(也称为储层钻井液(RDF))可以是合成/油基的或水基的。为了使钻井液对地层的侵入最小化，油基和水基泥浆滤饼两者都典型地含有桥接剂或增重剂，通常是碳酸钙颗粒、重晶石或两者的混合物，其桥接在地层的孔喉处并且由此形成相对低渗透性滤饼。油基和水基泥浆滤饼两者还都含有在钻探期间带出的称作钻屑的固体，与添加在钻井液的配制品中的桥接/增重剂截然相反。这些固体可以是石英(砂)、粉砂和/或页岩，取决于储层地层以及由钻探途径至储层穿过的地层。另外，油基钻探泥浆含有陷于滤饼的孔域中的水滴，而水基泥浆滤饼含有聚合物，例如淀粉和黄原胶，以及其他无机盐。
形成泥浆滤饼对于钻探而言通常是必须的，特别是在具有钻井孔稳定性问题并且典型地具有高渗透性的疏松地层中。然后将滤饼用不同化学品(例如螯合剂或酸)处理，以溶解方解石组分；和/或酶或氧化剂，以降解聚合物组分，从而恢复渗透性。
在一个方面，本发明提供了用于通过施用包含一种或多种本发明的酶(例如本发明的变体)的组合物来降解黄原胶的方法，其中黄原胶在由钻井孔造成的地下地层的压裂中使用。该方法包括以下步骤：(i)将包含一种或多种本发明的酶(例如本发明的变体)的处理流体泵入与有待去除的滤饼接触的钻孔中，以在该处理流体与邻接该滤饼的地层之间建立不同的压力，和(ii)在不同的压力周期期间均匀地传播滤饼的处理，以通过该处理流体延迟突破。
在一个实施例中，该方法包括在地层与钻孔之间通过处理的滤饼建立渗透性。在另一个实施例中，该滤饼包括钻探固体和黏土，并且可以形成自水性钻井液。如果希望的话，用于处理水性钻井液滤饼的处理流体还可以包括氧化剂和/或螯合剂，或它可以是基本上不含螯合剂和氧化剂添加剂的。在另一个实例中，该滤饼可以形成自油或反相乳化钻井液。如果希望的话，用于处理油或反相乳化钻井液滤饼的处理流体还可以包括互溶剂、水润湿剂或其组合,从而将疏水性组分分散在滤饼中。
在一个实施例中，该处理流体包含一种或多种本发明的黄原胶裂解酶(例如本发明的变体)。在一个优选的实施例中，该处理流体包含一种或多种本发明的黄原胶裂解酶(例如本发明的变体)以及一种或多种GH9内切葡聚糖酶。
降解黄原胶的方法，其中黄原胶是钻孔滤饼中的一种组分
在一个方面中，本发明提供了一旦钻孔滤饼被泵至表面，用于清洁该滤饼的方法，该滤饼包含聚合物，例如黄原胶和钻井液固体。钻探泥浆从泥浆池泵至钻头然后再泵出至表面，在该过程中带出除其他东西之外的破碎的或切碎的岩石(钻屑)。将钻屑滤出并且将泥浆返回至泥浆池，在泥浆池中细粒可以沉淀和/或可以将添加化学品或酶(破碎物)进行添加。
用于降解黄原胶的方法(其中黄原胶是钻孔滤饼中的组分)包括以下步骤：(i)用处理流体处理钻孔滤饼，该处理流体包含一种或多种本发明的酶(例如本发明的变体)，和(ii)将固体与流体分离。在一个实施例中，该处理流体包含一种或多种本发明的黄原胶裂解酶(例如本发明的变体)。在一个优选的实施例中，该处理流体包含一种或多种本发明的黄原胶裂解酶(例如本发明的变体)以及一种或多种GH9内切葡聚糖酶。
可以将钻孔滤饼在泥浆池中用一种或多种本发明的酶(例如本发明的变体)处理并且可以再循环钻井液。可替代地，一旦滤饼已经被一种或多种本发明的酶(例如本发明的变体)处理，使用固液分离方法(例如离心)将固体与流体分离。
本发明在以下段落中进行了进一步的定义：
1.一种黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体在选自下组的区中的一个或多个位置处包含改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：
i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸154至176的区1，
ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸614至658的区2，
iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸731至803的区3，
iv)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸807至846的区4，
v)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸872至885的区5，
vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸903至1004的区6，
其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、且小于100％的序列同一性；优选地所述黄原胶裂解酶变体对黄原胶具有活性，进一步优选地所述活性是黄原胶降解活性。
2.如段落1所述的黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体是选自下组的亲本黄原胶裂解酶的变体，该组由以下组成：
a)与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％序列同一性的多肽；
b)由如下的多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多核苷酸编码序列、或(ii)(i)的全长互补序列杂交；
c)由如下的多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％同一性；和
d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的片段，该片段具有黄原胶裂解酶活性。
3.如段落2所述的黄原胶裂解酶变体，其中该亲本黄原胶裂解酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。
4.如段落2-3中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，其中该亲本黄原胶裂解酶由如下的多核苷酸编码，该多核苷酸在低严格条件下、中严格条件下、中-高严格条件下、高严格条件下、或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或(ii)(i)的全长互补序列杂交。
5.如段落2-4中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，其中该亲本黄原胶裂解酶由如下的多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。
6.如段落2-5中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，其中该亲本黄原胶裂解酶包含SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。
7.如段落2-6中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，其中该亲本黄原胶裂解酶是SEQID NO:2的成熟多肽的片段，其中该片段具有黄原胶裂解酶活性。
8.如段落2-7中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体与该亲本黄原胶裂解酶的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。
9.如段落1-8中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，其中选自由区1-6组成的组的所述区是螯合剂诱导的不稳定区；
优选地(例如SEQ ID NO:2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)所述螯合剂诱导的不稳定区具有以下特征中的一个或多个：
i)在螯合剂的存在下，比其相邻区中的一个或多个或全部在构象上较不稳定；和/或
ii)在螯合剂的存在下，比其相邻区中的一个或多个或全部更多地暴露于所述螯合剂；和/或
iii)在螯合剂的存在下，比其相邻区中的一个或多个或全部更可及所述螯合剂；和/或
iv)在螯合剂的存在下，比其相邻区中的一个或多个或全部在构象上更动态；和/或
v)在螯合剂的存在下，比其相邻区中的一个或多个或全部更容易接受氘掺入；
进一步优选地所述相邻区选自下组，该组由以下组成：
vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至153的区7，
vii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸177至613的区8，
viii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸659至730的区9，
ix)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸804至806的区10，
x)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸847至871的区11，
xi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸886至902的区12，和
xii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1005至1037的区13，
进一步最优选地所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐。
10.如段落1-9中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，其中在包含洗涤剂组分的水溶液中，选自由区1-6组成的组的(例如SEQ ID NO:2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)所述区比其相邻区中的一个或多个或全部在构象上较不稳定；
优选地所述相邻区选自下组，该组由以下组成：
i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至153的区7，
ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸177至613的区8，
iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸659至730的区9，
iv)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸804至806的区10，
v)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸847至871的区11，
vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸886至902的区12，和
vii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1005至1037的区13，
进一步优选地所述洗涤剂组分是螯合剂；进一步最优选地所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐。
11.如段落1-10中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，其中在包含洗涤剂组分的水溶液中，选自由区1-6组成的组的(例如SEQ ID NO:2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)所述区比其相邻区中的一个或多个或全部更多地暴露于所述洗涤剂组分；
优选地所述相邻区选自下组，该组由以下组成：
i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至153的区7，
ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸177至613的区8，
iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸659至730的区9，
iv)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸804至806的区10，
v)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸847至871的区11，
vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸886至902的区12，和
vii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1005至1037的区13，
进一步优选地所述洗涤剂组分是螯合剂；进一步最优选地所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐。
12.如段落1-11中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，其中在包含洗涤剂组分的水溶液中，选自由区1-6组成的组的(例如SEQ ID NO:2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)所述区比其相邻区中的一个或多个或全部更可及所述洗涤剂组分；
优选地所述相邻区选自下组，该组由以下组成：
i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至153的区7，
ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸177至613的区8，
iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸659至730的区9，
iv)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸804至806的区10，
v)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸847至871的区11，
vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸886至902的区12，和
vii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1005至1037的区13，
进一步优选地所述洗涤剂组分是螯合剂；进一步最优选地所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐。
13.如段落1-12中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，其中在包含洗涤剂组分的水溶液中，选自由区1-6组成的组的(例如SEQ ID NO:2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)所述区比其相邻区中的一个或多个或全部在构象上更动态；
优选地所述相邻区选自下组，该组由以下组成：
i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至153的区7，
ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸177至613的区8，
iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸659至730的区9，
iv)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸804至806的区10，
v)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸847至871的区11，
vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸886至902的区12，和
vii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1005至1037的区13，
进一步优选地所述洗涤剂组分是螯合剂；进一步最优选地所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐。
14.如段落1-13中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，其中在包含洗涤剂组分的水溶液中，选自由区1-6组成的组的(例如SEQ ID NO:2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)所述区比其相邻区中的一个或多个或全部更容易接受氘掺入；
优选地所述相邻区选自下组，该组由以下组成：
i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至153的区7，
ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸177至613的区8，
iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸659至730的区9，
iv)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸804至806的区10，
v)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸847至871的区11，
vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸886至902的区12，和
vii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1005至1037的区13，
进一步优选地所述洗涤剂组分是螯合剂；进一步最优选地所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐。
15.如段落1-14中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体在选自下组的两个或更多个区中的一个或多个位置处包含改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：
i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸154至176的区1，
ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸614至658的区2，
iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸731至803的区3，
iv)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸807至846的区4，
v)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸872至885的区5，
vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸903至1004的区6，
其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、且小于100％的序列同一性，优选地所述变体对黄原胶具有活性，进一步优选地所述活性是黄原胶降解活性。
16.如段落1-15中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性。
17.如段落1-16中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，其中在一个或多个位置处的所述改变(例如，取代、缺失或插入)选自下组，该组由以下组成：在SEQ ID NO:2的位置155、159、620、624、626、631、635、645、649、650、656、738、745、746、748、752、753、754、757、764、769、774、775、777、779、782、785、786、789、792、796、799、800、801、819、824、843、845、875、903、911、912、915、919、921、923、925、927、928、930、932、933、941、966、967、991和998处的改变，其中根据SEQ ID NO:2进行编号，优选地在位置775、779或923处的改变，其中根据SEQID NO:2进行编号。
18.如段落1-17中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，其中在一个或多个位置处的所述改变选自下组，该组由以下组成：Y155E、A159P、K620R、A624E、A626G、T631N、T631E、S635E、S635T、S635Q、A645S、T649V、T649K、T649R、Q650G、I656V、G738L、K745R、F746L、L748T、P752R、P752K、G753E、G753Q、G753S、S754E、S754L、S754Q、S754R、S757D、S757P、S757E、P764V、P764K、A769D、A769T、A769R、A769S、A769E、A769Q、A769*、A774V、L775M、L775Y、L775A、L775I、L775S、L775F、L775Q、D777K、D777R、P779V、Y782I、A785T、N786K、G789R、K792W、K792Y、K792V、K792A、N796Q、A799H、V800P、D801G、K819R、K819T、K824R、A843P、D845E、K875T、K875E、T903A、T903Q、A911V、A911M、A911S、A912T、A912I、A912Y、T915Q、T915S、T915V、T915A、T919F、T919G、T919D、T921R、T921S、T923H、T923D、T925Q、T925D、T925R、T927K、D928W、Y930H、Y930L、Y930F、A932P、D933M、G941E、G941D、A966P、A967D、N991D和V998K，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
19.如段落1-18中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体在选自下组的至少一个区中的一个或多个位置处进一步包含改变，该组由以下组成：
vii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至153的区7，
viii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸177至613的区8，
ix)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸659至730的区9，
x)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸804至806的区10，
xi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸847至871的区11，
xii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸886至902的区12，和
xiii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1005至1037的区13。
20.如段落19所述的黄原胶裂解酶变体，其中在选自由区7、8、9、10、11、12和13组成的组的至少一个区中的一个或多个位置处的所述改变是在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：SEQ ID NO:2的9、15、18、46、58、66、89、95、100、106、109、183、188、190、203、204、221、229、234、238、240、242、243、257、258、284、291、293、316、317、320、324、329、333、339、341、352、354、360、372、377、399、400、419、440、450、451、454、458、481、492、505、533、567、568、576、578、579、582、664、672、703、722、726、727、728、851、855、856、867、887、892、899、900、901、902、915、1008和1016。
21.如段落20所述的黄原胶裂解酶变体，其中在选自由区7、8、9、10、11、12和13组成的组的至少一个区中的一个或多个位置处的所述改变包含选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：SEQ ID NO:2的K9R、N15T、T18D、L46D、A58L、S66H、Q89Y、K95E、S100D、N106Y、Q109R、Q109D、Q109F、Q109K、Q109A、K183Q、K183R、V188I、A190Q、A203P、K204R、A221P、E229N、E229S、E229V、I234V、I238W、I238L、I238M、I240W、N242S、G243V、Y257W、R258E、R284G、K291R、A293G、A293P、K316R、R317K、K320R、L324Q、K329R、K333R、L339M、I341P、V352I、S354P、K360G、K360R、Q372H、F377Y、N399K、K400R、F419Y、N440K、D450P、K451E、K451R、A454V、D458S、K481R、A492H、A492L、T505I、L533I、K567R、G568A、S578K、S578N、S578R、S579R、S579K、S582K、T664K、N672D、I703L、I722F、P726Q、T727P、M728V、S851F、K855R、E856D、P867S、K887R、N892Y、N892W、N892F、G899S、I900G、D901A、T902F、N1008D和K1016T。
22.如段落1-21中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体在选自下组的一个或多个位置处包含改变，该组由以下组成：624、631、635、649、656、738、752、753、754、757、769、775、777、800、801、843、875、911和915，并且在选自下组的一个或多个位置处包含改变，该组由以下组成：SEQ ID NO:2的89、100、190、229、234、352、360、399、440、458、492、567、582、664、672、703、728、892、1008和1016。
23.如段落22所述的黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体包含选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：Q89Y、S100D、A190Q、E229S、I234V、V352I、K360G、N399K、N440K、D458S、A492H、A492L、K567R、S582K、T664K、N672D、I703L、M728V、N892Y、N1008D和K1016T，和选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：A624E、T631N、S635E、T649K、I656V、G738L、P752K、P752R、G753E、S754E、S754R、S757D、A769D、L775A、D777R、V800P、D801G、A843P、K875T、A911V和T915A。
24.如段落1-23中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，其中与该亲本黄原胶裂解酶(SEQ ID NO:2)相比改变的总数是在1和20之间，例如，在1和10之间或在1和5之间，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。
25.如段落1-24中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，其中对黄原胶的所述活性是黄原胶降解活性，优选地所述黄原胶裂解酶变体具有EC4.2.2.12活性。
26.如段落1-25中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，其中所述变体与亲本黄原胶裂解酶(例如，具有SEQ ID NO:2)相比在洗涤剂组合物中具有改善的稳定性；优选地所述洗涤剂组合物包含螯合剂；进一步优选地所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐。
27.如段落1-26中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，其中相对于亲本黄原胶裂解酶，例如具有SEQ ID NO:2的黄原胶裂解酶，所述变体具有≥1.0的半衰期改善因子(HIF)；优选地所述变体具有>1.0，更优选地至少1.2，例如至少1.5、例如至少2.0的半衰期改善因子(HIF)。
28.如段落27所述的黄原胶裂解酶变体，其中所述半衰期改善因子(HIF)是在将所述黄原胶裂解酶变体在25℃在洗涤剂组合物中孵育持续从约30分钟至约20小时的时间段后确定的。
29.如段落1-28中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，其中所述变体选自下组，该组由以下组成：i)本文表1中所示的黄原胶裂解酶变体、ii)本文表2中所示的黄原胶裂解酶变体、iii)本文表3中所示的黄原胶裂解酶变体、iv)本文表4中所示的黄原胶裂解酶变体、v)本文表5中所示的黄原胶裂解酶变体、vi)本文表6中所示的黄原胶裂解酶变体、和vii)本文表7、8、9、10、11、12或13中任一个所示的黄原胶裂解酶变体。
30.一种组合物，该组合物包含至少一种如段落1-29中任一项所述的黄原胶裂解酶变体。
31.如段落30所述的组合物，其中所述组合物不是洗涤剂组合物，优选地所述组合物是钻井液。
32.如段落30所述的组合物，其中所述组合物是包含一种或多种洗涤剂组分的洗涤剂组合物；优选地所述组分是螯合剂；进一步优选地所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐。
33.如段落30-32中任一项所述的组合物，该组合物进一步包含选自下组的一种或多种另外的酶，该组由以下组成：内切葡聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、地衣聚糖酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、黄原胶裂解酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代加过氧酶、过氧化氢酶和甘露聚糖酶，或其任何混合物。
34.如段落30-33中任一项所述的组合物，其中所述组合物处于条，均匀的片剂，具有两个或更多个层的片剂，具有一个或多个室的袋，规则的或压缩的粉末，颗粒，糊剂，凝胶或规则的、压缩的或浓缩的液体的形式。
35.如段落30-34中任一项所述的组合物或如段落1-29中任一项所述的黄原胶裂解酶变体的用途，其中所述用途选自下组，该组包括以下或由以下组成：
i)用于降解黄原胶的用途，和
ii)用于控制钻井液的黏度的用途。
36.如段落35所述的用途，其中所述黄原胶裂解酶变体具有酶去污性益处。
37.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如段落1-29中任一项所述的黄原胶裂解酶变体。
38.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体能够表达如段落37所述的多核苷酸；优选地所述核酸构建体或所述表达载体包含如段落37所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导多肽在表达宿主内的产生的一个或多个控制序列。
39.一种宿主细胞(例如分离的宿主细胞，分离的重组宿主细胞)，该宿主细胞包含如段落37所述的多核苷酸；优选地所述多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列；进一步优选地所述宿主细胞是分离的宿主细胞。
40.一种用于获得或产生黄原胶裂解酶变体的方法，该方法包括在选自下组的区中的一个或多个位置处向亲本黄原胶裂解酶(例如，具有SEQ ID NO:2或其他亲本黄原胶裂解酶)中引入改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：
i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸154至176的区1，
ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸614至658的区2，
iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸731至803的区3，
iv)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸807至846的区4，
v)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸872至885的区5，和
vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸903至1004的区6，
其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、且小于100％的序列同一性；和回收所述变体；优选地选自由区1-6组成的组的(例如，SEQ IDNO:2或另一种亲本黄原胶裂解酶的)所述区是螯合剂诱导的不稳定区；进一步优选地所述方法进一步包括在选自由区1-6组成的组的一个或多个区中的一个或多个位置处向亲本黄原胶裂解酶(例如，具有SEQ ID NO:2或另一种亲本黄原胶裂解酶)中引入改变(例如，取代、缺失或插入)。
41.如段落40所述的方法，其中所述黄原胶裂解酶变体与SEQ ID NO:2具有至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性。
42.如段落40-41中任一项所述的方法，其中在一个或多个位置处的所述改变(例如，取代、缺失或插入)选自下组，该组由以下组成：该亲本黄原胶裂解酶(SEQ ID NO:2)的位置155、159、620、624、626、631、635、645、649、650、656、738、745、746、748、752、753、754、757、764、769、774、775、777、779、782、785、786、789、792、796、799、800、801、819、824、843、845、875、903、911、912、915、919、921、923、925、927、928、930、932、933、941、966、967、991和998处的改变，其中每个位置对应于SEQ ID NO:2的位置，优选地在位置775、779或923处的改变，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
43.如段落40-42中任一项所述的方法，其中在一个或多个位置处的所述改变选自下组，该组由以下组成：Y155E、A159P、K620R、A624E、A626G、T631N、T631E、S635E、S635T、S635Q、A645S、T649V、T649K、T649R、Q650G、I656V、G738L、K745R、F746L、L748T、P752R、P752K、G753E、G753Q、G753S、S754E、S754L、S754Q、S754R、S757D、S757P、S757E、P764V、P764K、A769D、A769T、A769R、A769S、A769E、A769Q、A769*、A774V、L775M、L775Y、L775A、L775I、L775S、L775F、L775Q、D777K、D777R、P779V、Y782I、A785T、N786K、G789R、K792W、K792Y、K792V、K792A、N796Q、A799H、V800P、D801G、K819R、K819T、K824R、A843P、D845E、K875T、K875E、T903A、T903Q、A911V、A911M、A911S、A912T、A912I、A912Y、T915Q、T915S、T915V、T915A、T919F、T919G、T919D、T921R、T921S、T923H、T923D、T925Q、T925D、T925R、T927K、D928W、Y930H、Y930L、Y930F、A932P、D933M、G941E、G941D、A966P、A967D、N991D和V998K，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
44.如段落40-43中任一项所述的方法，该方法进一步包括在选自下组的至少一个区中的一个或多个位置处向亲本黄原胶裂解酶中引入改变(例如，取代、缺失或插入)，该组由以下组成：
vii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至153的区7，
viii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸177至613的区8，
ix)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸659至730的区9，
x)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸804至806的区10，
xi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸847至871的区11，
xii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸886至902的区12，和
xiii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1005至1037的区13。
45.如段落44所述的方法，其中在选自由区7、8、9、10、11、12和13组成的组的至少一个区中的一个或多个位置处的所述改变是在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：SEQ ID NO:2的9、15、18、46、58、66、89、95、100、106、109、183、188、190、203、204、221、229、234、238、240、242、243、257、258、284、291、293、316、317、320、324、329、333、339、341、352、354、360、372、377、399、400、419、440、450、451、454、458、481、492、505、533、567、568、576、578、579、582、664、672、703、722、726、727、728、851、855、856、867、887、892、899、900、901、902、915、1008和1016。
46.如段落45所述的方法，其中在选自由区7、8、9、10、11、12和13组成的组的至少一个区中的一个或多个位置处的所述改变包含选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：SEQ ID NO:2的K9R、N15T、T18D、L46D、A58L、S66H、Q89Y、K95E、S100D、N106Y、Q109R、Q109D、Q109F、Q109K、Q109A、K183Q、K183R、V188I、A190Q、A203P、K204R、A221P、E229N、E229S、E229V、I234V、I238W、I238L、I238M、I240W、N242S、G243V、Y257W、R258E、R284G、K291R、A293G、A293P、K316R、R317K、K320R、L324Q、K329R、K333R、L339M、I341P、V352I、S354P、K360G、K360R、Q372H、F377Y、N399K、K400R、F419Y、N440K、D450P、K451E、K451R、A454V、D458S、K481R、A492H、A492L、T505I、L533I、K567R、G568A、S578K、S578N、S578R、S579R、S579K、S582K、T664K、N672D、I703L、I722F、P726Q、T727P、M728V、S851F、K855R、E856D、P867S、K887R、N892Y、N892W、N892F、G899S、I900G、D901A、T902F、N1008D和K1016T。
47.如段落40-46中任一项所述的方法，其中相对于亲本黄原胶裂解酶，例如具有SEQ ID NO:2的黄原胶裂解酶，在一个或多个位置处的所述改变(例如，取代、缺失或插入)提供了具有≥1.0的半衰期改善因子(HIF)的变体；优选地所述变体具有>1.0，更优选地至少1.2，例如至少1.5、例如至少2.0的半衰期改善因子(HIF)。
48.一种产生黄原胶裂解酶变体的方法，该方法包括：
i)在适于表达所述变体的条件下培养如段落39所述的宿主细胞；和
ii)回收所述变体。
49.如段落48所述的方法，其中所述黄原胶裂解酶变体是根据段落1-29中任一项所述的变体。
50.一种用于降解黄原胶的方法，该方法包括：将如段落30-34中任一项所述的组合物施用于黄原胶。
51.如段落50所述的方法，其中所述黄原胶在表面上或硬表面上。
52.如段落50所述的方法，其中所述黄原胶用于由钻井孔造成的地下地层的压裂中。
53.如段落50所述的方法，其中所述黄原胶是钻孔滤饼中的组分。
54.氘用于鉴定黄原胶裂解酶多肽(例如，具有SEQ ID NO:2或根据段落1-29中任一项所述的黄原胶裂解酶变体)的螯合剂诱导的不稳定区的用途，优选地所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐，进一步优选地所述氘处于D2O的形式。
55.一种用于鉴定黄原胶裂解酶多肽(例如，具有SEQ ID NO:2或根据段落1-29中任一项所述的黄原胶裂解酶变体)的螯合剂诱导的不稳定区的方法，所述方法包括：
i)在螯合剂的存在下提供，优选地所述螯合剂是EDTA或柠檬酸盐：
a)黄原胶裂解酶多肽(例如具有SEQ ID NO:2或根据段落1-29中任一项所述的黄原胶裂解酶变体)，
ii)在不存在螯合剂的情况下提供：
b)根据a)所述的黄原胶裂解酶多肽，
iii)向i)和ii)提供氘用于氢-氘交换，优选地所述氘处于D2O的形式
iv)用胃蛋白酶消化来自步骤iii)的氘化多肽，
v)鉴定步骤iv)中产生的胃酶解肽，
vi)在存在和不存在所述螯合剂的情况下，量化和比较掺入到来自步骤v)的单个肽中的氘。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应理解为对本发明的范围进行限制。
实例
实例1：氢交换-HDX
通过在不存在或存在5mM EDTA的情况下，添加99.9％氘化的20mM Tris、1mMCaCl2(pH 8)，启动连续的SEQ ID NO:2的亲本黄原胶裂解酶的酰胺氢/氘(H/D)交换，至氘的终浓度为85％。H/D交换在22℃以1μM的浓度一式三份进行。在从15秒至1小时范围的五个时间点，通过添加1:1(v/v)冰冷的6M盐酸胍、300mM磷酸盐(pH 2.05)至最终pH为2.6来猝灭样品。立即冷冻猝灭的样品并储存在-80℃直至LC-MS分析。按照相同的程序，但使用含有氢的正常同位素(protiated)的缓冲液来制备未氘化样品。将完全氘化样品(对于SEQ ID NO:2的亲本黄原胶裂解酶，85％D2O)通过在99.9％氘化6M盐酸胍中过夜孵育来制备并在300mM磷酸盐(pH 2.3至最终pH为2.6)中猝灭。为了研究EDTA对黄原胶裂解酶的作用的可逆性，在如下三种状态的黄原胶裂解酶(XL)上进行H/D交换10分钟：(1)XL；(2)XL+5mM EDTA；(3)XLXL，首先用5mM EDTA预孵育30分钟，并且其次用10mM CaCl2预孵育30分钟。如上文描述的猝灭样品。
将猝灭的样品加载到冷却的HDX-UPLC系统中，使用固定化的胃蛋白酶柱(美国罗克福德的皮尔斯公司(Pierce,Rockford,USA))进行在线胃蛋白酶消化。使用捕获柱(Waters VanGuard C18，1.7μM，2.1x 5mm)以200μl/min 0.23％甲酸的流速将肽脱盐3分钟，并通过反相色谱法(Waters Acquity BEH C18，1.7μm，1x 100mm)、使用两步梯度(在2分钟内从8％-18％和在10分钟内从18％-40％乙腈中0.23％甲酸)、以流速40μl/min分离肽。使用Synapt G2质谱仪(美国米尔福德的沃特斯公司(Waters,Milford,USA))对肽进行具有离子迁移率的阳离子电喷雾质谱。
使用数据独立(MSe)和数据依赖性获取方案(DDA)以及Protein Lynx GlobalServer v.2.5中的数据分析的组合，通过未氘化样品的串联质谱法来鉴定SEQ ID NO:2的成熟亲本黄原胶裂解酶的胃酶解肽。在DynamX v.3.0或在HXexpress中确定单独肽的氘掺入(M.Guttman，D.Weis，J.Engen，K.Lee，J.Am.Soc.Mass.Spectrom.[美国质谱学会杂志]2013,24,1906-1912)。采用统计分析(F-检验和学生T-检验)以确定分析的蛋白质状态之间的H/D交换(ΔDX)的统计学上显著的变化。
选择具有H/D交换显著变化的肽(ΔDX>0.5)作为鉴定SEQ ID NO:2内的螯合剂诱导的不稳定区。在SEQ ID NO:2的黄原胶裂解酶中鉴定以下螯合剂诱导的不稳定区：对应于SEQ ID NO:2的氨基酸154至176的区1、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸614至658的区2、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸731至803的区3、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸807至846的区4、对应于SEQ ID NO:2的氨基酸872至885的区5、和对应于SEQ ID NO:2的氨基酸903至1004的区6。
实例2：黄原胶裂解酶变体的构建和表达
将黄原胶裂解酶亲本基因(即SEQ ID NO:1)PCR装配成在上游含有启动子系统和在下游含有cat选择标志的线性盒。为了通过同源重组使得在枯草芽孢杆菌宿主的Pel基因座处的盒的染色体整合，在盒的两侧包括与整合位点同一的>2kb DNA序列。使用由含有黄原胶裂解酶亲本基因(SEQ ID NO:1)的菌株制备的基因组DNA作为用于产生定点突变体的模板。将诱变的正向和反向引物用于产生大约6kb PCR片段。将该片段与另一个正向引物一起用作大引物，以扩增>8kb DNA片段。将含有完整盒(启动子系统、黄原胶裂解酶和cat基因以及在Pel基因座重组所需的同源DNA序列)的该片段用于转化。
该盒中使用的三联启动子系统已描述于WO 99/43835中，并且该启动子系统由包括稳定化序列的来自地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子、和苏云金芽孢杆菌cryIIIA启动子组成。包括来自克劳氏芽孢杆菌的蛋白酶信号序列以将蛋白质输出细胞。
SEQ ID NO:2的成熟亲本黄原胶裂解酶的产生的变体示出于下表1和2中。通过测序确认改变的存在。
将含有变体的芽孢杆菌生物体接种在含有氯霉素(6μg/ml)的LB肉汤中，并在37℃生长过夜。为了表达黄原胶裂解酶变体，将2％的过夜培养物添加至1000ml带挡板的烧瓶中的300ml的10-R培养基中，并在30℃以180rpm生长96小时。
10-R培养基含有33g/L可溶性淀粉、6g/L(NH4)2HPO4、5g/L马铃薯蛋白胨、1.2g/L(MgSO4x 7H2O)、12g/L KH2PO4、5g/L(Na2HPO4x 2H2O)、18mL/L的痕量金属溶液、1.8g/LK2SO4和0.1g/L(CaCl2x 2H2O)和0.5mL/L SB2121(消泡剂)。通过混合0.49g/L(MnSO4xH2O)、1.97g/L(FeSO4x 7H2O)、0.1g/L(CuSO4x 5H2O)、0.3g/L ZnCl2和19.6g/L柠檬酸来制备痕量金属溶液。
实例3：黄原胶裂解酶变体的纯化
在纯化之前，通过在10℃以8000x g离心30分钟，随后在Buchner漏斗中使用Seitz过滤器(K250)和WHATMAN玻璃过滤器GF/F级的组合进行真空过滤来澄清枯草芽孢杆菌肉汤。最后，将上清液通过0.22μ切向流动过滤装置进行过滤。
使用三步自动串联柱色谱法来纯化黄原胶裂解酶变体。将Macro-Prep甲基HIC(Macro-Prep Methyl HIC)柱用含有1M(NH4)2SO4和1mM CaCl2缓冲液的50mM Tris(pH8.0)预平衡。在将样品加载到柱上的期间，将澄清的培养上清液(250mL)与含有2M(NH4)2SO4和1mM CaCl2缓冲液的50mM Tris(pH 8.0)以1:1稀释，使终浓度达到1M。用平衡缓冲液洗涤未结合或弱结合的蛋白质，直至在280nm处的吸光度低于0.1AU。使用含有0.5M(NH4)2SO4和1mM CaCl2的50mM Tris(pH 8)进行洗脱。将洗脱的蛋白质峰自动加载到用含有0.5M(NH4)2SO4和1mM CaCl2的50mM Tris(pH 8)预平衡的MEP-Hypercel柱上。用平衡缓冲液洗涤未结合或弱结合的蛋白质，直至在280nm处的吸光度低于0.1AU。用含有1mM CaCl2的50mMTris(pH 8)再次洗涤柱以去除杂质。用含有1mM CaCl2的50mM乙酸钠(pH 5)洗脱纯化的蛋白质。将洗脱的纯化的蛋白质自动转移到用含有1mM CaCl2的50mM MOPS(pH 8)预平衡的Sephadex G-25柱上进行脱盐。
实例4：洗涤剂稳定性测定
用于洗涤剂稳定性测定的试剂如下制备：
通过将209.26g的3-吗啉代丙磺酸溶解在Milli Q水中来制备1.0M MOPS缓冲液的储备溶液。使用NaOH将pH调节至7.5并且将缓冲液的最终体积补充至1000ml。将这一缓冲储备溶液储存在4℃直到使用。通过将50ml的1.0M储备溶液添加至950ml的Milli Q水中来制备50mM MOPS缓冲液的工作溶液。
通过将400mg的黄原胶溶解于100ml的Milli Q水中，新鲜地制备0.4％w/v黄原胶的底物溶液。
通过将106.99g的Na2CO3、47.98g的酒石酸钠钾和2.42mg的(Bi(NO3)3x 5H2O)溶解在Milli Q水中至最终体积为1000ml，制备含有1.0M Na2CO3、0.17M酒石酸钠钾和5mM(Bi(NO3)3x 5H2O)的储备溶液混合物。将该储备溶液混合物过滤并在室温下储存。
通过将1.5g的对羟基苯甲酸酰肼(PAHBAH)溶解于该储备溶液混合物中来新鲜地制备PAHBAH试剂(1.5％PAHBAH)。
洗涤剂稳定性测定：
A.培养上清液的筛选
通过在30℃用洗涤剂(70％，终浓度)孵育后测量变体或野生型对照的培养上清液中存在的酶活性来确定洗涤剂中稳定性。
通过将30μl的培养上清液和70μl的Persil Universal Gel洗涤剂(100％)添加至96孔微量滴定板(这些板在1000rpm下振荡15min)的孔中，进行洗涤剂应激。产生两个同一的板，将其中一个板在4℃孵育(非应激板)，并且将另一个板在30℃(应激板)孵育1小时。孵育后，将来自非应激和应激板的样品用稀释缓冲液(50mM MOPS，5mM CaCl2，pH 7.5)稀释50倍。
为了测量稀释的酶-洗涤剂样品的酶活性，在96孔PCR板中制备反应混合物。将50μl的稀释的样品与50μl的新鲜地制备的底物溶液混合，并在40℃孵育1小时。
孵育后，将75μl的PAHBAH试剂添加至相同PCR板中的反应混合物中，并在可编程热循环仪(T-ROBOT)中在90℃孵育10分钟，随后在10℃冷却。将样品(25μl)转移到384孔微量滴定板中，并且使用Infinite M1000读取器(TECAN，瑞士)在405nm处测量吸光度。
将变体和野生型对照的残余活性(RA)计算为在30℃经孵育后剩余的酶活性相对于在4℃经孵育后剩余的酶活性的百分比，即，减去相关背景吸光度贡献后，按照下式：
残余活性(RA)＝100％*A405(在30℃孵育的样品)/A405(在4℃孵育的样品)。
挑选出相对于生长在板中的野生型具有更高洗涤剂稳定性的变体。
B.纯化的变体的筛选
通过在30℃用洗涤剂(90％，终浓度)孵育后测量纯化的蛋白质的酶活性来确定纯化的变体的洗涤剂稳定性。
使用50mM MOPS缓冲液将纯化的变体稀释至200ppm的浓度。对于洗涤剂处理，将10μl的稀释的纯化的样品与90μl的Persil Universal Gel洗涤剂(100％)混合到96孔微量滴定板(将这些板在1000rpm下振荡20min)的孔中。产生两个同一的板，将其中一个板在4℃孵育(非应激板)，并且将另一个板在30℃(应激板)孵育1小时。孵育后，将来自非应激和应激板的样品用稀释缓冲液(50mM MOPS，1mM CaCl2，pH 7.5)稀释50倍。
如部分A描述的，对非应激和应激的样品进行酶活性分析。
C.计算半衰期和半衰期改善因子(HIF)
在给定的洗涤剂浓度和储存温度(针对野生型对照和/或变体)下计算半衰期(T1/2(以小时计))，因为降解遵循指数衰减并且孵育时间(小时)是已知的，即根据下式：
T1/2(变体)＝(Ln(0.5)/Ln(RA-变体/100))*时间
T1/2(野生型)＝(Ln(0.5)/Ln(RA-野生型/100))*时间
其中“RA”是以百分比计的残余活性，“时间”是孵育时间。
将在给定的一组储存条件(洗涤剂浓度和温度)下的半衰期改善因子(HIF)计算为HIF＝T1/2(变体)/T1/2(野生型)，其中野生型在与变体相同的储存条件下孵育。
所获得的针对纯化的变体的HIF值示出于以下表3中。
表3.纯化的变体的半衰期改善因子：
所获得的针对变体的培养上清液的HIF值示出于以下表4中。
实例5：黄原胶裂解酶变体的半衰期
如上文实例2和3中描述的制备和纯化SEQ ID NO:2的成熟亲本黄原胶裂解酶的变体。如实例4中描述的，通过在用洗涤剂孵育后测量变体的培养上清液或纯化的样品中存在的酶活性来确定变体的洗涤剂中稳定性。使用70％浓度的Persil Universal Gel洗涤剂(PUG)在30℃对培养上清液进行孵育，并且使用70％或90％浓度的PUG洗涤剂在30℃对纯化的变体进行孵育，其中对于培养上清液的变体孵育时间为1小时，并且对于纯化的变体孵育时间为1小时或3小时。
培养上清液的半衰期和计算的半衰期改善因子(HIF)值提供于下表5中。表6显示纯化的变体的半衰期和半衰期改善因子(HIF)，其中基于0.22h的野生型半衰期计算用70％洗涤剂浓度孵育的变体的HIF，并且基于0.20h的野生型半衰期计算用90％洗涤剂浓度孵育的变体的HIF。
表5.变体的培养上清液的半衰期和半衰期改善因子(HIF)
表6.纯化的变体的半衰期和半衰期改善因子(HIF)
实例6：在螯合剂诱导的不稳定区和相邻区具有突变的黄原胶裂解酶变体的半衰期
如上文实例2和3中描述的制备和纯化SEQ ID NO:2的成熟亲本黄原胶裂解酶的变体。出于该实例的目的，产生了在至少一个螯合剂诱导的不稳定区(区1、2、3、4、5、6)和在至少一个相邻区(区7、8、9、10、11、12、13)具有突变的变体。如实例4中描述的，通过在用洗涤剂孵育后测量变体的纯化样品中存在的酶活性来确定变体的洗涤剂中稳定性。使用70％、90％或95％浓度的Persil Universal Gel洗涤剂(PUG)进行孵育，其中孵育温度为30℃、32℃、35℃或37℃，并且变体孵育时间范围从1小时至多达840小时。
如上文实例4中描述的计算半衰期。在野生型和变体之间的稳定性差异太大而不能使用相同的孵育时间精确地评估野生型和变体两者的半衰期的情况下，野生型和变体的孵育时间是不同的，例如，对于野生型是1h，对于最稳定的变体是多达840h。
此外，为了确定更稳定的变体的孵育时间(例如<168h)的较短持续时间内的稳定性(半衰期)，将一些变体的孵育温度增加2℃-7℃。对于在较高温度(即>30℃)下测试的变体，无法计算基于野生型的HIF值，因为在这些温度下无法精确地确定野生型的半衰期(分钟的数量级)。因此，变体的稳定性在下表中以半衰期(以小时计)报告。
下表7-13显示了纯化的变体的半衰期以及每种变体的测试条件(温度、洗涤剂浓度、孵育时间)的信息。
表7.纯化的变体的半衰期：温度(T)30℃，洗涤剂浓度70％
表8.纯化的变体的半衰期：温度(T)30℃，洗涤剂浓度90％
表9.纯化的变体的半衰期：温度(T)30℃，洗涤剂浓度95％
表10.纯化的变体的半衰期：温度(T)32℃，洗涤剂浓度90％
表11.纯化的变体的半衰期：温度(T)35℃，洗涤剂浓度90％
表12.纯化的变体的半衰期：温度(T)35℃，洗涤剂浓度95％
表13.纯化的变体的半衰期：温度(T)37℃，洗涤剂浓度90％
序列表
<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）
<120> 黄原胶裂解酶变体以及编码它们的多核苷酸
<130> 14050-WO-PCT
<160> 2
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 3111
<212> DNA
<213> 类芽孢杆菌属物种
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(3111)
<220>
<221> 成熟肽
<222> (1)..(3111)
<400> 1
gac gag ttt gac acg cta agg gaa aag tat aag gcc atg ctg aac gga 48
Asp Glu Phe Asp Thr Leu Arg Glu Lys Tyr Lys Ala Met Leu Asn Gly
1 5 10 15
ggg aca acc tat aat ctc tcc gac ccg gat ata gcg gcg cgt gtt aat 96
Gly Thr Thr Tyr Asn Leu Ser Asp Pro Asp Ile Ala Ala Arg Val Asn
20 25 30
gcc att acg gtg act gcc cag gga tac tgg gac tcc atg ctt aaa gat 144
Ala Ile Thr Val Thr Ala Gln Gly Tyr Trp Asp Ser Met Leu Lys Asp
35 40 45
ccg aac cgt aac cgt ctt tgg aac gat gca ccc ttt ggc tcg gat tcg 192
Pro Asn Arg Asn Arg Leu Trp Asn Asp Ala Pro Phe Gly Ser Asp Ser
50 55 60
act tcc atc acc acg acc tac aga cac ctt tat gat atg gcg cta gct 240
Thr Ser Ile Thr Thr Thr Tyr Arg His Leu Tyr Asp Met Ala Leu Ala
65 70 75 80
tat acg act tat ggc tcc agt ctg cag ggc aat gcc gca ctt aaa gcg 288
Tyr Thr Thr Tyr Gly Ser Ser Leu Gln Gly Asn Ala Ala Leu Lys Ala
85 90 95
gat att atc agc ggt ttg gac tgg atg aat gcc aat caa ttt tat aat 336
Asp Ile Ile Ser Gly Leu Asp Trp Met Asn Ala Asn Gln Phe Tyr Asn
100 105 110
ggc tgc agc caa tat caa aac tgg tgg cac tgg caa att ggc ggt ccc 384
Gly Cys Ser Gln Tyr Gln Asn Trp Trp His Trp Gln Ile Gly Gly Pro
115 120 125
atg gcc ttg aat gat atc gtg gca tta atg tac acg gag cta acc gca 432
Met Ala Leu Asn Asp Ile Val Ala Leu Met Tyr Thr Glu Leu Thr Ala
130 135 140
aca caa att tcc aat tac atg gcg gcc att tat tac acc caa gcg agt 480
Thr Gln Ile Ser Asn Tyr Met Ala Ala Ile Tyr Tyr Thr Gln Ala Ser
145 150 155 160
gtt acg atg acg ggg gca aac cgg cta tgg gaa agt cag gtt att gcc 528
Val Thr Met Thr Gly Ala Asn Arg Leu Trp Glu Ser Gln Val Ile Ala
165 170 175
atc tcc gga atc ttg aat aag gat tcc gcc aga gtt gcc gct ggt cgg 576
Ile Ser Gly Ile Leu Asn Lys Asp Ser Ala Arg Val Ala Ala Gly Arg
180 185 190
gat ggc atc agc gct ttg ctg ccg tat gtc gcc aag ggt gac gga ttt 624
Asp Gly Ile Ser Ala Leu Leu Pro Tyr Val Ala Lys Gly Asp Gly Phe
195 200 205
tac aac gat gga tca ttc gtt cag cat act tat tat gct tac aac ggt 672
Tyr Asn Asp Gly Ser Phe Val Gln His Thr Tyr Tyr Ala Tyr Asn Gly
210 215 220
ggt tat ggt tca gag ctg tta tct ggc att gca gac ttg ata ttt att 720
Gly Tyr Gly Ser Glu Leu Leu Ser Gly Ile Ala Asp Leu Ile Phe Ile
225 230 235 240
ttg aat ggc tct tca tgg cag gta acg gat cct aat aaa aac aat gta 768
Leu Asn Gly Ser Ser Trp Gln Val Thr Asp Pro Asn Lys Asn Asn Val
245 250 255
tac cgt tgg att tat gat tcc tac gag cct ttc atc tat aaa ggg aat 816
Tyr Arg Trp Ile Tyr Asp Ser Tyr Glu Pro Phe Ile Tyr Lys Gly Asn
260 265 270
ctg atg gac atg gtc cgc ggt aga gag atc tca agg cat gga ttg cag 864
Leu Met Asp Met Val Arg Gly Arg Glu Ile Ser Arg His Gly Leu Gln
275 280 285
gac gat aag gca gcc gtg act gtg atg gca tcg atc att cgt ctg tca 912
Asp Asp Lys Ala Ala Val Thr Val Met Ala Ser Ile Ile Arg Leu Ser
290 295 300
caa acc gct gct tcc gcc gat gct acc gca ttt aag aga atg gtg aaa 960
Gln Thr Ala Ala Ser Ala Asp Ala Thr Ala Phe Lys Arg Met Val Lys
305 310 315 320
tat tgg ctg ctg ctg gat acg gat aag act ttc ctt aaa gca gta tcg 1008
Tyr Trp Leu Leu Leu Asp Thr Asp Lys Thr Phe Leu Lys Ala Val Ser
325 330 335
att gat ctg att att gcc gcg aac caa ctg gtg aac gat tcc acc gtt 1056
Ile Asp Leu Ile Ile Ala Ala Asn Gln Leu Val Asn Asp Ser Thr Val
340 345 350
acc tct cga ggg gag cta gtg aaa tat aaa caa ttc tcc gga atg gac 1104
Thr Ser Arg Gly Glu Leu Val Lys Tyr Lys Gln Phe Ser Gly Met Asp
355 360 365
cgc gct gta cag ctt aga cct ggc ttc ggt ttt ggg ctt agc atg ttt 1152
Arg Ala Val Gln Leu Arg Pro Gly Phe Gly Phe Gly Leu Ser Met Phe
370 375 380
tcc agc cgg atc ggt aat tat gag tcg att aat gca gag aac aac aaa 1200
Ser Ser Arg Ile Gly Asn Tyr Glu Ser Ile Asn Ala Glu Asn Asn Lys
385 390 395 400
ggc tgg cat acc ggc gac ggc atg acc tac ctt tac aat act gac ctg 1248
Gly Trp His Thr Gly Asp Gly Met Thr Tyr Leu Tyr Asn Thr Asp Leu
405 410 415
agt cag ttc aat gac cat ttc tgg gca act gtg gat aat tac cga ttg 1296
Ser Gln Phe Asn Asp His Phe Trp Ala Thr Val Asp Asn Tyr Arg Leu
420 425 430
ccg ggt acc aca gtg ctc cag aac acg acg caa acc gcg aac agc cgc 1344
Pro Gly Thr Thr Val Leu Gln Asn Thr Thr Gln Thr Ala Asn Ser Arg
435 440 445
agc gac aaa agc tgg gcc gga gga acg gat att ctt ggg caa tat ggt 1392
Ser Asp Lys Ser Trp Ala Gly Gly Thr Asp Ile Leu Gly Gln Tyr Gly
450 455 460
gtt tcc ggc atg gaa ctg cat acc gta ggt aag agc ctg aca gcc aag 1440
Val Ser Gly Met Glu Leu His Thr Val Gly Lys Ser Leu Thr Ala Lys
465 470 475 480
aaa tcc tgg ttc atg ttt gac gat gag atc gtc gcg ctg ggt tca ggt 1488
Lys Ser Trp Phe Met Phe Asp Asp Glu Ile Val Ala Leu Gly Ser Gly
485 490 495
att gcc agc acc gat ggc atc gca acc gaa acg att gta gag aat cga 1536
Ile Ala Ser Thr Asp Gly Ile Ala Thr Glu Thr Ile Val Glu Asn Arg
500 505 510
aag ctc aat agc agc ggc aat aat gca ttg att gtt aac ggg acg gcg 1584
Lys Leu Asn Ser Ser Gly Asn Asn Ala Leu Ile Val Asn Gly Thr Ala
515 520 525
aag ccg ggc tcc ctt gga tgg tcg gaa aca atg acc gga acc aat tat 1632
Lys Pro Gly Ser Leu Gly Trp Ser Glu Thr Met Thr Gly Thr Asn Tyr
530 535 540
att cat cta gcc ggc agc gta ccc ggc tcc gat atc ggt tat tat ttt 1680
Ile His Leu Ala Gly Ser Val Pro Gly Ser Asp Ile Gly Tyr Tyr Phe
545 550 555 560
cct ggt gga gca gca gtc aaa ggc ttg cgt gaa gcc cgg tcg gga agc 1728
Pro Gly Gly Ala Ala Val Lys Gly Leu Arg Glu Ala Arg Ser Gly Ser
565 570 575
tgg agc tcg ctg aat tcc tcc gca tcc tgg aag gac tcg aca ttg cat 1776
Trp Ser Ser Leu Asn Ser Ser Ala Ser Trp Lys Asp Ser Thr Leu His
580 585 590
aca cgc aac ttt atg acg ctt tgg ttc gat cat ggc atg aac ccg aca 1824
Thr Arg Asn Phe Met Thr Leu Trp Phe Asp His Gly Met Asn Pro Thr
595 600 605
aac ggt agt tat tct tat gtg ctg ctt ccg aat aag acc agc agt gcg 1872
Asn Gly Ser Tyr Ser Tyr Val Leu Leu Pro Asn Lys Thr Ser Ser Ala
610 615 620
gtg gcc agc tat gct gca acg cct cag atc agc att ctg gag aat tct 1920
Val Ala Ser Tyr Ala Ala Thr Pro Gln Ile Ser Ile Leu Glu Asn Ser
625 630 635 640
agc tcg gcg caa gcg gtg aag gag acg caa ttg aat gtc acc gga att 1968
Ser Ser Ala Gln Ala Val Lys Glu Thr Gln Leu Asn Val Thr Gly Ile
645 650 655
aac ttt tgg aac gat gag cca acc acg gtg ggc ctg gtt act tcc aat 2016
Asn Phe Trp Asn Asp Glu Pro Thr Thr Val Gly Leu Val Thr Ser Asn
660 665 670
cgg aaa gca tcc gtt atg aca aaa gaa acg gct agt gat ttc gag ata 2064
Arg Lys Ala Ser Val Met Thr Lys Glu Thr Ala Ser Asp Phe Glu Ile
675 680 685
tcc gtt tcc gac ccg acc caa agt aat gtg ggg acc atc tat att gat 2112
Ser Val Ser Asp Pro Thr Gln Ser Asn Val Gly Thr Ile Tyr Ile Asp
690 695 700
gtc aac aaa agt gca acc gga ttg att tcg aag gat aat gaa ata acg 2160
Val Asn Lys Ser Ala Thr Gly Leu Ile Ser Lys Asp Asn Glu Ile Thr
705 710 715 720
gtc att cag tac tac cca acc atg aag ttt aaa gtc aat gta aac aat 2208
Val Ile Gln Tyr Tyr Pro Thr Met Lys Phe Lys Val Asn Val Asn Asn
725 730 735
tct ggc ggg aag tcc tat aaa gta aag ttt agc ctg aca gga aca ccc 2256
Ser Gly Gly Lys Ser Tyr Lys Val Lys Phe Ser Leu Thr Gly Thr Pro
740 745 750
ggc agc aac ccg tct cca atc ccg ata ccg aat cct tac gaa gcg gaa 2304
Gly Ser Asn Pro Ser Pro Ile Pro Ile Pro Asn Pro Tyr Glu Ala Glu
755 760 765
gct ttg cca att aac gct ctg aca gat act ccc gtg gtt tac aat gat 2352
Ala Leu Pro Ile Asn Ala Leu Thr Asp Thr Pro Val Val Tyr Asn Asp
770 775 780
gcc aat gcc agt ggt ggc aag aag ctt ggc ttc aat aac aat gca gtg 2400
Ala Asn Ala Ser Gly Gly Lys Lys Leu Gly Phe Asn Asn Asn Ala Val
785 790 795 800
gat gat tat gtg gag ttc agt ctg gac gtc aca cag ccc ggc acc tac 2448
Asp Asp Tyr Val Glu Phe Ser Leu Asp Val Thr Gln Pro Gly Thr Tyr
805 810 815
gat gtc aaa tcc cgg att atg aaa tca acg aac agc ggg att tat cag 2496
Asp Val Lys Ser Arg Ile Met Lys Ser Thr Asn Ser Gly Ile Tyr Gln
820 825 830
ctg tct att aat ggg acc aac gta ggg agc gcg cag gat atg ttc tgg 2544
Leu Ser Ile Asn Gly Thr Asn Val Gly Ser Ala Gln Asp Met Phe Trp
835 840 845
acg acc tcc gag ctg tct aag gag ttt act atg ggc tca tac agc ttc 2592
Thr Thr Ser Glu Leu Ser Lys Glu Phe Thr Met Gly Ser Tyr Ser Phe
850 855 860
agc aca ccc ggg agc tat ttg ttc cga tta aaa aca acc ggc aag aat 2640
Ser Thr Pro Gly Ser Tyr Leu Phe Arg Leu Lys Thr Thr Gly Lys Asn
865 870 875 880
gtc agt tct tca gga tat aag ctg atg ctg gac aat ttt agt ctg gta 2688
Val Ser Ser Ser Gly Tyr Lys Leu Met Leu Asp Asn Phe Ser Leu Val
885 890 895
tca aca ggt att gat aca acg gtg att gtg gac aat gcc gat gca gct 2736
Ser Thr Gly Ile Asp Thr Thr Val Ile Val Asp Asn Ala Asp Ala Ala
900 905 910
ggt gtt acg aag gtg ggt act tgg acc gga acc aat acg cag acc gat 2784
Gly Val Thr Lys Val Gly Thr Trp Thr Gly Thr Asn Thr Gln Thr Asp
915 920 925
cgg tac ggc gcc gac tac att cac gat ggg aac acg ggg aaa ggt acg 2832
Arg Tyr Gly Ala Asp Tyr Ile His Asp Gly Asn Thr Gly Lys Gly Thr
930 935 940
aag agc gtt acc ttt act cca aat gta cct atc agt gga act tat cag 2880
Lys Ser Val Thr Phe Thr Pro Asn Val Pro Ile Ser Gly Thr Tyr Gln
945 950 955 960
gtt tac atg atg tgg gct gcc cat acg aat agg gca acg aat gtt ccc 2928
Val Tyr Met Met Trp Ala Ala His Thr Asn Arg Ala Thr Asn Val Pro
965 970 975
gta gac gta acg cat tca ggc ggt aca gca acg cta aat gtt aac caa 2976
Val Asp Val Thr His Ser Gly Gly Thr Ala Thr Leu Asn Val Asn Gln
980 985 990
caa ggt aat ggt ggt gtg tgg aat tta ctg ggt acg tat agc ttt aat 3024
Gln Gly Asn Gly Gly Val Trp Asn Leu Leu Gly Thr Tyr Ser Phe Asn
995 1000 1005
gct ggg tcc acg ggg gct atc aag atc cgt acg gac gcg acg aat 3069
Ala Gly Ser Thr Gly Ala Ile Lys Ile Arg Thr Asp Ala Thr Asn
1010 1015 1020
gga tat gtt gta gcc gat gcc gtg aag ctg gta aag gtc cca 3111
Gly Tyr Val Val Ala Asp Ala Val Lys Leu Val Lys Val Pro
1025 1030 1035
<210> 2
<211> 1037
<212> PRT
<213> 类芽孢杆菌属物种
<400> 2
Asp Glu Phe Asp Thr Leu Arg Glu Lys Tyr Lys Ala Met Leu Asn Gly
1 5 10 15
Gly Thr Thr Tyr Asn Leu Ser Asp Pro Asp Ile Ala Ala Arg Val Asn
20 25 30
Ala Ile Thr Val Thr Ala Gln Gly Tyr Trp Asp Ser Met Leu Lys Asp
35 40 45
Pro Asn Arg Asn Arg Leu Trp Asn Asp Ala Pro Phe Gly Ser Asp Ser
50 55 60
Thr Ser Ile Thr Thr Thr Tyr Arg His Leu Tyr Asp Met Ala Leu Ala
65 70 75 80
Tyr Thr Thr Tyr Gly Ser Ser Leu Gln Gly Asn Ala Ala Leu Lys Ala
85 90 95
Asp Ile Ile Ser Gly Leu Asp Trp Met Asn Ala Asn Gln Phe Tyr Asn
100 105 110
Gly Cys Ser Gln Tyr Gln Asn Trp Trp His Trp Gln Ile Gly Gly Pro
115 120 125
Met Ala Leu Asn Asp Ile Val Ala Leu Met Tyr Thr Glu Leu Thr Ala
130 135 140
Thr Gln Ile Ser Asn Tyr Met Ala Ala Ile Tyr Tyr Thr Gln Ala Ser
145 150 155 160
Val Thr Met Thr Gly Ala Asn Arg Leu Trp Glu Ser Gln Val Ile Ala
165 170 175
Ile Ser Gly Ile Leu Asn Lys Asp Ser Ala Arg Val Ala Ala Gly Arg
180 185 190
Asp Gly Ile Ser Ala Leu Leu Pro Tyr Val Ala Lys Gly Asp Gly Phe
195 200 205
Tyr Asn Asp Gly Ser Phe Val Gln His Thr Tyr Tyr Ala Tyr Asn Gly
210 215 220
Gly Tyr Gly Ser Glu Leu Leu Ser Gly Ile Ala Asp Leu Ile Phe Ile
225 230 235 240
Leu Asn Gly Ser Ser Trp Gln Val Thr Asp Pro Asn Lys Asn Asn Val
245 250 255
Tyr Arg Trp Ile Tyr Asp Ser Tyr Glu Pro Phe Ile Tyr Lys Gly Asn
260 265 270
Leu Met Asp Met Val Arg Gly Arg Glu Ile Ser Arg His Gly Leu Gln
275 280 285
Asp Asp Lys Ala Ala Val Thr Val Met Ala Ser Ile Ile Arg Leu Ser
290 295 300
Gln Thr Ala Ala Ser Ala Asp Ala Thr Ala Phe Lys Arg Met Val Lys
305 310 315 320
Tyr Trp Leu Leu Leu Asp Thr Asp Lys Thr Phe Leu Lys Ala Val Ser
325 330 335
Ile Asp Leu Ile Ile Ala Ala Asn Gln Leu Val Asn Asp Ser Thr Val
340 345 350
Thr Ser Arg Gly Glu Leu Val Lys Tyr Lys Gln Phe Ser Gly Met Asp
355 360 365
Arg Ala Val Gln Leu Arg Pro Gly Phe Gly Phe Gly Leu Ser Met Phe
370 375 380
Ser Ser Arg Ile Gly Asn Tyr Glu Ser Ile Asn Ala Glu Asn Asn Lys
385 390 395 400
Gly Trp His Thr Gly Asp Gly Met Thr Tyr Leu Tyr Asn Thr Asp Leu
405 410 415
Ser Gln Phe Asn Asp His Phe Trp Ala Thr Val Asp Asn Tyr Arg Leu
420 425 430
Pro Gly Thr Thr Val Leu Gln Asn Thr Thr Gln Thr Ala Asn Ser Arg
435 440 445
Ser Asp Lys Ser Trp Ala Gly Gly Thr Asp Ile Leu Gly Gln Tyr Gly
450 455 460
Val Ser Gly Met Glu Leu His Thr Val Gly Lys Ser Leu Thr Ala Lys
465 470 475 480
Lys Ser Trp Phe Met Phe Asp Asp Glu Ile Val Ala Leu Gly Ser Gly
485 490 495
Ile Ala Ser Thr Asp Gly Ile Ala Thr Glu Thr Ile Val Glu Asn Arg
500 505 510
Lys Leu Asn Ser Ser Gly Asn Asn Ala Leu Ile Val Asn Gly Thr Ala
515 520 525
Lys Pro Gly Ser Leu Gly Trp Ser Glu Thr Met Thr Gly Thr Asn Tyr
530 535 540
Ile His Leu Ala Gly Ser Val Pro Gly Ser Asp Ile Gly Tyr Tyr Phe
545 550 555 560
Pro Gly Gly Ala Ala Val Lys Gly Leu Arg Glu Ala Arg Ser Gly Ser
565 570 575
Trp Ser Ser Leu Asn Ser Ser Ala Ser Trp Lys Asp Ser Thr Leu His
580 585 590
Thr Arg Asn Phe Met Thr Leu Trp Phe Asp His Gly Met Asn Pro Thr
595 600 605
Asn Gly Ser Tyr Ser Tyr Val Leu Leu Pro Asn Lys Thr Ser Ser Ala
610 615 620
Val Ala Ser Tyr Ala Ala Thr Pro Gln Ile Ser Ile Leu Glu Asn Ser
625 630 635 640
Ser Ser Ala Gln Ala Val Lys Glu Thr Gln Leu Asn Val Thr Gly Ile
645 650 655
Asn Phe Trp Asn Asp Glu Pro Thr Thr Val Gly Leu Val Thr Ser Asn
660 665 670
Arg Lys Ala Ser Val Met Thr Lys Glu Thr Ala Ser Asp Phe Glu Ile
675 680 685
Ser Val Ser Asp Pro Thr Gln Ser Asn Val Gly Thr Ile Tyr Ile Asp
690 695 700
Val Asn Lys Ser Ala Thr Gly Leu Ile Ser Lys Asp Asn Glu Ile Thr
705 710 715 720
Val Ile Gln Tyr Tyr Pro Thr Met Lys Phe Lys Val Asn Val Asn Asn
725 730 735
Ser Gly Gly Lys Ser Tyr Lys Val Lys Phe Ser Leu Thr Gly Thr Pro
740 745 750
Gly Ser Asn Pro Ser Pro Ile Pro Ile Pro Asn Pro Tyr Glu Ala Glu
755 760 765
Ala Leu Pro Ile Asn Ala Leu Thr Asp Thr Pro Val Val Tyr Asn Asp
770 775 780
Ala Asn Ala Ser Gly Gly Lys Lys Leu Gly Phe Asn Asn Asn Ala Val
785 790 795 800
Asp Asp Tyr Val Glu Phe Ser Leu Asp Val Thr Gln Pro Gly Thr Tyr
805 810 815
Asp Val Lys Ser Arg Ile Met Lys Ser Thr Asn Ser Gly Ile Tyr Gln
820 825 830
Leu Ser Ile Asn Gly Thr Asn Val Gly Ser Ala Gln Asp Met Phe Trp
835 840 845
Thr Thr Ser Glu Leu Ser Lys Glu Phe Thr Met Gly Ser Tyr Ser Phe
850 855 860
Ser Thr Pro Gly Ser Tyr Leu Phe Arg Leu Lys Thr Thr Gly Lys Asn
865 870 875 880
Val Ser Ser Ser Gly Tyr Lys Leu Met Leu Asp Asn Phe Ser Leu Val
885 890 895
Ser Thr Gly Ile Asp Thr Thr Val Ile Val Asp Asn Ala Asp Ala Ala
900 905 910
Gly Val Thr Lys Val Gly Thr Trp Thr Gly Thr Asn Thr Gln Thr Asp
915 920 925
Arg Tyr Gly Ala Asp Tyr Ile His Asp Gly Asn Thr Gly Lys Gly Thr
930 935 940
Lys Ser Val Thr Phe Thr Pro Asn Val Pro Ile Ser Gly Thr Tyr Gln
945 950 955 960
Val Tyr Met Met Trp Ala Ala His Thr Asn Arg Ala Thr Asn Val Pro
965 970 975
Val Asp Val Thr His Ser Gly Gly Thr Ala Thr Leu Asn Val Asn Gln
980 985 990
Gln Gly Asn Gly Gly Val Trp Asn Leu Leu Gly Thr Tyr Ser Phe Asn
995 1000 1005
Ala Gly Ser Thr Gly Ala Ile Lys Ile Arg Thr Asp Ala Thr Asn
1010 1015 1020
Gly Tyr Val Val Ala Asp Ala Val Lys Leu Val Lys Val Pro
1025 1030 1035

Claims (17)

1.一种黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体在选自下组的螯合剂诱导的不稳定区中的一个或多个位置处包含改变，该组由以下组成：
i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸154至176的区1，
ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸614至658的区2，
iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸731至803的区3，
iv)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸807至846的区4，
v)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸872至885的区5，和
vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸903至1004的区6，
其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％且小于100％的序列同一性。
2.如权利要求1所述的黄原胶裂解酶变体，其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性。
3.如权利要求1或2所述的黄原胶裂解酶变体，其中在一个或多个位置处的所述改变选自下组，该组由以下组成：在位置155、159、620、624、626、631、635、649、650、656、738、745、752、753、754、757、769、775、777、779、782、786、789、792、796、799、801、819、824、843、875、903、911、912、915、919、921、923、925、927、928、930、933、941、966、991和998处的改变，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
4.如权利要求1-3中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，其中在一个或多个位置处的所述改变选自下组，该组由以下组成：Y155E、A159P、K620R、A624E、A626Q、T631N、S635E、S635T、T649V、T649K、Q650G、I656V、G738L、K745R、P752R、P752K、G753E、G753Q、G753S、S754E、S754L、S754Q、S754R、S757D、S757P、S757E、A769D、A769T、A769R、L775A、L775F、L775I、L775M、L775Q、L775S、L775Y、D777R、P779V、Y782I、N786K、G789R、K792W、K792Y、K792V、K792A、N796Q、A799H、D801G、K819R、K824R、A843P、K875T、K875E、T903A、T903Q、A911M、A911V、A911S、A912T、A912I、A912Y、T915S、T915V、T915Q、T919D、T919F、T919G、T921R、T921S、T923D、T923H、T925D、T925Q、T925R、T927K、D928W、Y930F、Y930H、Y930L、D933M、G941D、G941E、A966P、N991D和V998K，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
5.如权利要求1-4中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，该黄原胶裂解酶变体在选自下组的至少一个区中的一个或多个位置处进一步包含改变，该组由以下组成：
vii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至153的区7，
viii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸177至613的区8，
ix)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸659至730的区9，
x)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸804至806的区10，
xi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸847至871的区11，
xii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸886至902的区12，和
xiii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1005至1037的区13。
6.如权利要求5所述的黄原胶裂解酶变体，其中在选自由区7、8、9、10、11、12和13组成的组的至少一个区中的一个或多个位置处的所述改变是在选自下组的一个或多个位置处的改变，该组由以下组成：9、15、18、46、58、66、89、95、100、106、109、183、188、190、203、204、221、229、234、238、240、242、243、257、258、284、291、293、316、317、320、324、329、333、339、341、352、354、360、372、377、399、400、419、440、450、451、454、458、481、492、505、533、567、568、576、578、579、582、664、672、703、722、726、727、728、851、855、856、867、887、892、899、900、901、902、915、1008和1016，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
7.如权利要求6所述的黄原胶裂解酶变体，其中在选自由区7、8、9、10、11、12和13组成的组的至少一个区中的一个或多个位置处的所述改变包含选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：K9R、N15T、T18D、L46D、A58L、S66H、Q89Y、K95E、S100D、N106Y、Q109R、Q109D、Q109F、Q109K、Q109A、K183Q、K183R、V188I、A190Q、A203P、K204R、A221P、E229N、E229S、E229V、I234V、I238W、I238L、I238M、I240W、N242S、G243V、Y257W、R258E、R284G、K291R、A293G、A293P、K316R、R317K、K320R、L324Q、K329R、K333R、L339M、I341P、V352I、S354P、K360G、K360R、Q372H、F377Y、N399K、K400R、F419Y、N440K、D450P、K451E、K451R、A454V、D458S、K481R、A492H、A492L、T505I、L533I、K567R、G568A、S578K、S578N、S578R、S579R、S579K、S582K、T664K、N672D、I703L、I722F、P726Q、T727P、M728V、S851F、K855R、E856D、P867S、K887R、N892Y、N892W、N892F、G899S、I900G、D901A、T902F、N1008D和K1016T，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
8.如权利要求6所述的黄原胶裂解酶变体，其中该变体在选自下组的一个或多个位置处包含改变，该组由以下组成：624、631、635、649、656、738、752、753、754、757、769、775、777、800、801、843、875、911和915，并且在选自下组的一个或多个位置处包含改变，该组由以下组成：SEQ ID NO:2的89、100、190、229、234、352、360、399、440、458、492、567、582、664、672、703、728、892、1008和1016。
9.如权利要求8所述的黄原胶裂解酶变体，其中该变体包含选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：Q89Y、S100D、A190Q、E229S、I234V、V352I、K360G、N399K、N440K、D458S、A492H、A492L、K567R、S582K、T664K、N672D、I703L、M728V、N892Y、N1008D和K1016T，和选自下组的一个或多个取代，该组由以下组成：A624E、T631N、S635E、T649K、I656V、G738L、P752K、P752R、G753E、S754E、S754R、S757D、A769D、L775A、D777R、V800P、D801G、A843P、K875T、A911V和T915A。
10.如权利要求1-9中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，其中所述变体与亲本黄原胶裂解酶，例如具有SEQ ID NO:2的黄原胶裂解酶相比在洗涤剂组合物中具有改善的稳定性。
11.如权利要求1-10中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，其中相对于亲本黄原胶裂解酶，例如具有SEQ ID NO:2的黄原胶裂解酶，所述变体具有>1.0，优选地至少1.2，例如至少1.5、例如至少2.0的半衰期改善因子(HIF)。
12.一种组合物，该组合物包含至少一种如权利要求1-11中任一项所述的黄原胶裂解酶变体，其中所述组合物是包含一种或多种洗涤剂组分的洗涤剂组合物，或非洗涤剂组合物，例如钻井液。
13.如权利要求12所述的组合物或如权利要求1-11中任一项所述的黄原胶裂解酶变体的用途，其中所述用途选自下组，该组由以下组成：
i)用于降解黄原胶的用途，例如在清洁过程中，例如衣物或硬表面清洁，例如餐具洗涤，和
ii)用于控制钻井液的黏度的用途。
14.一种用于获得或产生黄原胶裂解酶变体的方法，该方法包括：在选自下组的螯合剂诱导的不稳定区中的一个或多个位置处向亲本黄原胶裂解酶中引入改变，该组由以下组成：
i)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸154至176的区1，
ii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸614至658的区2，
iii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸731至803的区3，
iv)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸807至846的区4，
v)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸872至885的区5，和
vi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸903至1004的区6，
其中根据SEQ ID NO:2进行编号，并且其中所述变体与SEQ ID NO:2具有至少60％且小于100％的序列同一性；和回收所述变体。
15.如权利要求14所述的方法，其中在一个或多个位置处的所述改变选自下组，该组由以下组成：Y155E、A159P、K620R、A624E、A626Q、T631N、S635E、S635T、T649V、T649K、Q650G、I656V、G738L、K745R、P752R、P752K、G753E、G753Q、G753S、S754E、S754L、S754Q、S754R、S757D、S757P、S757E、A769D、A769T、A769R、L775A、L775F、L775I、L775M、L775Q、L775S、L775Y、D777R、P779V、Y782I、N786K、G789R、K792W、K792Y、K792V、K792A、N796Q、A799H、D801G、K819R、K824R、A843P、K875T、K875E、T903A、T903Q、A911M、A911V、A911S、A912T、A912I、A912Y、T915S、T915V、T915Q、T919D、T919F、T919G、T921R、T921S、T923D、T923H、T925D、T925Q、T925R、T927K、D928W、Y930F、Y930H、Y930L、D933M、G941D、G941E、A966P、N991D和V998K，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
16.如权利要求14或15所述的方法，该方法进一步包括在选自下组的至少一个区中的一个或多个位置处向亲本黄原胶裂解酶中引入改变，该组由以下组成：
vii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至153的区7，
viii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸177至613的区8，
ix)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸659至730的区9，
x)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸804至806的区10，
xi)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸847至871的区11，
xii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸886至902的区12，和
xiii)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1005至1037的区13，
其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
17.如权利要求14-16中任一项所述的方法，其中相对于亲本黄原胶裂解酶，例如具有SEQ ID NO:2的黄原胶裂解酶，在一个或多个位置处的所述改变提供了具有>1.0，优选地至少1.2，例如至少1.5、例如至少2.0的半衰期改善因子(HIF)的变体。
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