KR102483218B1 - 크산탄 리아제 변이체 i을 포함하는 세제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물 및 상기 조성물의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

크산탄 리아제 변이체 I을 포함하는 세제 조성물

서열 목록에 대한 참조

본 출원은 컴퓨터 판독가능한 형태의 서열 목록을 함유하며, 이는 본원에 참조로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 세제 안정성 (예를 들어 세제 조성물에서의, 예를 들어 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA 또는 시트레이트의 존재 하에서의 개선된 안정성) 및/또는 저장 안정성 (예를 들어 세제 조성물에서의, 예를 들어 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA 또는 시트레이트의 존재 하에서의 개선된 저장 안정성)을 포함한 1종 이상의 특성에서 모 크산탄 리아제에 비해 변경을 나타내는 신규 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물, 예컨대 세탁 조성물 및 수동 세척 및 자동 식기 세척 조성물을 포함한 식기 세척 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 크산탄 검에 대해 활성을 갖는 신규 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 세제 조성물을 생산하는 방법 및 세정 적용분야에서의 상기 세제 조성물의 용도에 관한 것이다.

크산탄 검은 크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris)의 박테리아 코트에서 유래된 폴리사카라이드이다. 이는 크산토모나스 캄페스트리스 박테리아에 의한 글루코스, 수크로스 또는 락토스의 발효에 의해 생산된다. 발효 기간 후, 폴리사카라이드는 이소프로필 알콜을 함유하는 성장 배지로부터 침전되고, 건조되고, 미세 분말로 분쇄된다. 그 후, 이는 액체 배지에 첨가되어 검을 형성한다. 크산탄 검은 여러 상이한 결합, 예컨대 β-D-만노실-β-D-1,4-글루쿠로노실 결합 및 β-D-글루코실-β-D-1,4-글루코실 결합에 의해 연결된 상이한 당으로 이루어진 천연 폴리사카라이드이다. 크산탄 검은 물 중 적어도 부분적으로 가용성이고, 고도로 점성인 용액 또는 겔을 형성한다. 크산탄 검의 완전한 효소적 분해는 크산탄 리아제 활성 및 엔도-β-1,4-글루카나제 활성을 포함한 여러 효소적 활성을 필요로 한다. 크산탄 리아제는 크산탄의 β-D-만노실-β-D-1,4-글루쿠로노실 결합을 절단하는 효소로, 문헌에 기재되어 있다. 크산탄 리아제는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 2종의 크산탄 리아제가 파에니바실루스 알기놀리티쿠스(Paenibacillus alginolyticus) XL-1로부터 단리된 바 있다 (예를 들어 문헌 [Ruijssenaars et al. (1999) 'A pyruvated mannose-specific xanthan lyase involved in xanthan degradation by Paenibacillus alginolyticus XL-1', Appl. Environ. Microbiol. 65(6): 2446-2452, and Ruijssenaars et al. (2000), 'A novel gene encoding xanthan lyase of Paenibacillus alginolyticus strain XL-1', Appl. Environ. Microbiol. 66(9): 3945-3950]). 글리코시드 히드롤라제는 글리코실 결합의 가수분해를 촉매하여 보다 작은 당을 방출하는 효소이다. 분류되어 있는 100종 초과의 부류의 글리코실 히드롤라제가 존재하고, 문헌 [Henrissat et al. (1991) 'A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities', J. Biochem. 280: 309-316] 및 유니프롯(Uniprot) 웹사이트 www.cazy.org를 참조한다. 글리코시드 히드롤라제 패밀리 9 (GH9)는 대부분 엔도-글루카나제 (EC 3.2.1.4), 셀로비오히드롤라제 (EC 3.2.1.91), β-글루코시다제 (EC 3.2.1.21) 및 엑소-β-글루코사미니다제 (EC 3.2.1.165)인 70종 초과의 상이한 효소로 이루어진다. 최근 수년간 크산탄 검은 식품 (예를 들어 샐러드 드레싱 및 유제품의 증점제로서) 및 화장품 (예를 들어 성분이 분리되는 것을 방지하고 제품의 올바른 텍스처를 제공하기 위한 치약 및 메이크-업 크림 및 로션의 안정화제 및 증점제로서)을 포함한 많은 소비자 제품의 성분으로서 사용되어 왔다. 추가로, 크산탄 검은 석유 사업에서 시추 유체 등의 점도를 조절하기 위한 첨가제로서의 용도가 발견된 바 있다. 크산탄 검의 광범위한 용도는 크산탄 검을 함유하는 용액, 겔 또는 혼합물을 분해하여 보다 용이한 부산물의 제거를 가능하게 하고자 하는 목적으로 이어졌다. 크산탄 검의 분해를 위한 크산탄 리아제 및 엔도글루카나제, 및 세정 목적, 예컨대 크산탄 검 함유 얼룩의 제거를 위한, 및 시추 및 석유 산업에서의 이러한 효소의 용도가 관련 기술분야, 예를 들어 WO2013167581A1에 공지되어 있다.

서열식별번호(SEQ ID NO): 2를 갖는 공지된 크산탄 리아제는 킬레이트화제를 함유하는 세제의 존재에 민감한 것으로 발견되었다. 이러한 효소의 적용성 및/또는 비용 및/또는 성능을 개선시키기 위해, 변경된 특성, 예를 들어 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA 또는 시트레이트 등의 존재 하의 세제 조성물에서 예컨대 증가된 안정성, 예를 들어 개선된 안정성을 갖는 변이체에 대한 연구가 계속되고 있다. 그러나, 대형 효소의 돌연변이유발에 이은 돌연변이체 라이브러리의 정제 및 기능적 분석은 매우 고비용이고 노동적일 수 있다.

서열식별번호: 2를 갖는 공지된 크산탄 리아제는 대형 효소 (>1000개 잔기)이기 때문에, 예를 들어 킬레이트화제의 존재 하의, 예를 들어 세제 조성물에서 안정성의 개선을 위해 그의 특성을 무작위로 표적화하는 것은 어렵고 고비용이다.

일부 측면에서, 본 발명은 분자가 EDTA를 함유하는 완충제 중에서 인큐베이션될 때 영향을 받는 서열식별번호: 2를 갖는 공지된 크산탄 리아제의 단백질 서열/구조 내 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역을 확인하고, 이에 따라 세제, 예를 들어 킬레이트화제를 포함하는 세제 조성물에서 분자를 안정화하기 위해 크산탄 리아제를 돌연변이시킬 부분에 대한 중요한 안내를 제공한다.

일부 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 2의 아미노산 154 내지 176에 상응하는 영역 1, 서열식별번호: 2의 아미노산 614 내지 658에 상응하는 영역 2, 서열식별번호: 2의 아미노산 731 내지 803에 상응하는 영역 3, 서열식별번호: 2의 아미노산 807 내지 846에 상응하는 영역 4, 서열식별번호: 2의 아미노산 872 내지 885에 상응하는 영역 5, 및 서열식별번호: 2의 아미노산 903 내지 1004에 상응하는 영역 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역의 1개 이상의 위치에서 변경 (예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입)을 포함하는, 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.

일부 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 2의 아미노산 154 내지 176에 상응하는 영역 1, 서열식별번호: 2의 아미노산 614 내지 658에 상응하는 영역 2, 서열식별번호: 2의 아미노산 731 내지 803에 상응하는 영역 3, 서열식별번호: 2의 아미노산 807 내지 846에 상응하는 영역 4, 서열식별번호: 2의 아미노산 872 내지 885에 상응하는 영역 5, 및 서열식별번호: 2의 아미노산 903 내지 1004에 상응하는 영역 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역의 1개 이상의 위치에서 변경 (예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입)을 포함하는, 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 변이체는 서열식별번호: 2와 적어도 60% 및 100% 미만의 서열 동일성을 갖고, 바람직하게는 상기 크산탄 리아제 변이체는 크산탄 검에 대해 활성을 갖는다.

일부 측면에서, 본 발명은 하기 특색 중 1종 이상을 갖는 모 크산탄 리아제 (예를 들어, 서열식별번호: 2)의 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역을 규정한다: 킬레이트화제의 존재 하에 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 상대적으로 덜 입체형태적으로 안정함; 및/또는 킬레이트화제의 존재 하에 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 상기 킬레이트화제에 상대적으로 더 노출됨; 및/또는 킬레이트화제의 존재 하에 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 상기 킬레이트화제에 상대적으로 더 접근가능함; 및/또는 킬레이트화제의 존재 하에 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 상대적으로 더 입체형태적으로 동적임; 및/또는 킬레이트화제의 존재 하에 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 중수소 혼입을 상대적으로 더 잘 수용함. 본 발명에서, "상대적으로"라고 언급할 때, 이는 상기 제시된 바와 같은 주어진 위치의 특색이 킬레이트화제의 존재 하에서의 그의 특색 및/또는 특성과, 킬레이트화제의 부재 하에서의 그의 특색 및/또는 특성 사이에서 관찰되는 차이에 기초한다는 것을 의미한다 (즉 킬레이트화제의 영향을 결정하기 위해, 각각의 영역이 상기 킬레이트화제의 부재 하에 그 자체로 비교되고, 킬레이트화제의 부재 하의 그의 천연 특색/특성 대비 임의의 변화가 결정됨) (또한 실시예 1 참조).

일부 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 2와 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.

일부 측면에서, 본 발명은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 영역의 1개 이상의 위치에서 변경 (예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입)을 포함하는 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다:

i) 서열식별번호: 2의 아미노산 154 내지 176에 상응하는 영역 1, 예를 들어, 서열식별번호: 2의 아미노산 위치에 상응하는 위치: 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서의 상기 변경 (예를 들어, 서열식별번호: 2의 넘버링을 사용함),

ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 614 내지 658에 상응하는 영역 2, 예를 들어, 서열식별번호: 2의 아미노산 위치에 상응하는 위치: 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서의 상기 변경 (예를 들어, 서열식별번호: 2의 넘버링을 사용함),

iii) 서열식별번호: 2의 아미노산 731 내지 803에 상응하는 영역 3, 예를 들어, 서열식별번호: 2의 아미노산 위치에 상응하는 위치: 731, 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 741, 742, 743, 744, 745, 746, 747, 748, 749, 750, 751, 752, 753, 754, 755, 756, 757, 758, 759, 760, 761, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793, 794, 795, 796, 797, 798, 799, 800, 801, 802, 803로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서의 상기 변경 (예를 들어, 서열식별번호: 2의 넘버링을 사용함),

iv) 서열식별번호: 2의 아미노산 807 내지 846에 상응하는 영역 4, 예를 들어, 서열식별번호: 2의 아미노산 위치에 상응하는 위치: 807, 808, 809, 810, 811, 812, 813, 814, 815, 816, 817, 818, 819, 820, 821, 822, 823, 824, 825, 826, 827, 828, 829, 830, 831, 832, 833, 834, 835, 836, 837, 838, 839, 840, 841, 842, 843, 844, 845, 846로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서의 상기 변경 (예를 들어, 서열식별번호: 2의 넘버링을 사용함),

v) 서열식별번호: 2의 아미노산 872 내지 885에 상응하는 영역 5, 예를 들어, 서열식별번호: 2의 아미노산 위치에 상응하는 위치: 872, 873, 874, 875, 876, 877, 878, 879, 880, 881, 882, 883, 884, 885로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서의 상기 변경 (예를 들어, 서열식별번호: 2의 넘버링을 사용함),

vi) 서열식별번호: 2의 아미노산 903 내지 1004에 상응하는 영역 6, 예를 들어, 서열식별번호: 2의 아미노산 위치에 상응하는 위치: 903, 904, 905, 906, 907, 908, 909, 910, 911, 912, 913, 914, 915, 916, 917, 918, 919, 920, 921, 922, 923, 924, 925, 926, 927, 928, 929, 930, 931, 932, 933, 934, 935, 936, 937, 938, 939, 940, 941, 942, 943, 944, 945, 946, 947, 948, 949, 950, 951, 952, 953, 954, 955, 956, 957, 958, 959, 960, 961, 962, 963, 964, 965, 966, 967, 968, 969, 970, 971, 972, 973, 974, 975, 976, 977, 978, 979, 980, 981, 982, 983, 984, 985, 986, 987, 988, 989, 990, 991, 992, 993, 994, 995, 996, 997, 998, 999, 1000, 1001, 1002, 1003, 1004로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서의 상기 변경 (예를 들어, 서열식별번호: 2의 넘버링을 사용함). 일부 측면에서, 상기 언급된 변이체는 서열식별번호: 2와 적어도 60% 및 100% 미만의 서열 동일성을 갖고, 바람직하게는 상기 크산탄 리아제 변이체는 크산탄 검에 대해 활성을 갖는다.

일부 측면에서, 본 발명은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 또는 모든 6개 영역의 1개 이상의 위치에서 변경 (예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입)을 포함하는 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다:

i) 서열식별번호: 2의 아미노산 154 내지 176에 상응하는 영역 1,

ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 614 내지 658에 상응하는 영역 2,

iii) 서열식별번호: 2의 아미노산 731 내지 803에 상응하는 영역 3,

iv) 서열식별번호: 2의 아미노산 807 내지 846에 상응하는 영역 4,

v) 서열식별번호: 2의 아미노산 872 내지 885에 상응하는 영역 5,

vi) 서열식별번호: 2의 아미노산 903 내지 1004에 상응하는 영역 6.

일부 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 2의 위치: 155, 159, 620, 624, 626, 631, 635, 645, 649, 650, 656, 738, 745, 746, 748, 752, 753, 754, 757, 764, 769, 774, 775, 777, 779, 782, 785, 786, 789, 792, 796, 799, 800, 801, 819, 824, 843, 845, 875, 903, 911, 912, 915, 919, 921, 923, 925, 927, 928, 930, 932, 933, 941, 966, 967, 991 및 998로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 변경 (예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입)을 갖는 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.

일부 측면에서, 본 발명은 하기: Y155E, A159P, K620R, A624E, A626G, T631N, T631E, S635E, S635T, S635Q, A645S, T649V, T649K, T649R, Q650G, I656V, G738L, K745R, F746L, L748T, P752R, P752K, G753E, G753Q, G753S, S754E, S754L, S754Q, S754R, S757D, S757P, S757E, P764V, P764K, A769D, A769T, A769R, A769S, A769E, A769Q, A769*, A774V, L775M, L775Y, L775A, L775I, L775S, L775F, L775Q, D777K, D777R, P779V, Y782I, A785T, N786K, G789R, K792W, K792Y, K792V, K792A, N796Q, A799H, V800P, D801G, K819R, K819T, K824R, A843P, D845E, 875T, K875E, T903A, T903Q, A911V, A911M, A911S, A912T, A912I, A912Y, T915Q, T915S, T915V, T915A, T919F, T919G, T919D, T921R, T921S, T923H, T923D, T925Q, T925D, T925R, T927K, D928W, Y930H, Y930L, Y930F, A932P, D933M, G941E, G941D, A966P, A967D, N991D 및 V998K로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환을 갖는 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.

일부 측면에서, 본 발명은 하기: 624, 635, 649, 656, 738, 753, 754, 757, 769, 775, 777, 801, 843 및 875로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 변경 (예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입)을 갖는 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.

일부 측면에서, 본 발명은 하기: A624E, S635E, T649K, I656V, G738L, G753E, S754E, S754R, S757D, A769D, L775A, D777R, D801G, A843P 및 K875T로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환을 갖는 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 세제 조성물의 일부 측면에서, 크산탄 리아제 변이체는 적어도 1개의 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역의 1개 이상의 위치에서의 변경 뿐만 아니라의 적어도 1개의 인접 영역의 1개 이상의 위치에서의 변경을 포함한다. 따라서, 일부 측면에서 크산탄 리아제 변이체는, 상기 및 본원의 다른 곳에 제시된 바와 같은 영역 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 영역의 1개 이상의 위치에서의 변경에 더하여, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 영역의 1개 이상의 위치에서의 변경 (예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입)을 추가로 포함한다:

vii) 서열식별번호: 2의 아미노산 1 내지 153에 상응하는 영역 7,

viii) 서열식별번호: 2의 아미노산 177 내지 613에 상응하는 영역 8,

ix) 서열식별번호: 2의 아미노산 659 내지 730에 상응하는 영역 9,

x) 서열식별번호: 2의 아미노산 804 내지 806에 상응하는 영역 10,

xi) 서열식별번호: 2의 아미노산 847 내지 871에 상응하는 영역 11,

xii) 서열식별번호: 2의 아미노산 886 내지 902에 상응하는 영역 12, 및

xiii) 서열식별번호: 2의 아미노산 1005 내지 1037에 상응하는 영역 13.

크산탄 리아제 변이체는 예를 들어 영역 7, 8, 9, 10, 11, 12 및 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 또는 모든 7개 영역 각각의 1개 이상의 위치에서 변경을 포함할 수 있다.

일부 측면에서, 영역 7, 8, 9, 10, 11, 12 및 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 영역의 1개 이상의 위치에서의 변경은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서의 변경이다: 서열식별번호: 2의 9, 15, 18, 46, 58, 66, 89, 95, 100, 106, 109, 183, 188, 190, 203, 204, 221, 229, 234, 238, 240, 242, 243, 257, 258, 284, 291, 293, 316, 317, 320, 324, 329, 333, 339, 341, 352, 354, 360, 372, 377, 399, 400, 419, 440, 450, 451, 454, 458, 481, 492, 505, 533, 567, 568, 576, 578, 579, 582, 664, 672, 703, 722, 726, 727, 728, 851, 855, 856, 867, 887, 892, 899, 900, 901, 902, 915, 1008 및 1016. 크산탄 리아제 변이체는 예를 들어 이들 위치 중 2개 이상에서, 예를 들어 이들 위치 중 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개에서 변경을 포함할 수 있다.

일부 측면에서, 영역 7, 8, 9, 10, 11, 12 및 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 영역의 1개 이상의 위치에서의 변경은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환을 포함한다: 서열식별번호: 2의 K9R, N15T, T18D, L46D, A58L, S66H, Q89Y, K95E, S100D, N106Y, Q109R, Q109D, Q109F, Q109K, Q109A, K183Q, K183R, V188I, A190Q, A203P, K204R, A221P, E229N, E229S, E229V, I234V, I238W, I238L, I238M, I240W, N242S, G243V, Y257W, R258E, R284G, K291R, A293G, A293P, K316R, R317K, K320R, L324Q, K329R, K333R, L339M, I341P, V352I, S354P, K360G, K360R, Q372H, F377Y, N399K, K400R, F419Y, N440K, D450P, K451E, K451R, A454V, D458S, K481R, A492H, A492L, T505I, L533I, K567R, G568A, S578K, S578N, S578R, S579R, S579K, S582K, T664K, N672D, I703L, I722F, P726Q, T727P, M728V, S851F, K855R, E856D, P867S, K887R, N892Y, N892W, N892F, G899S, I900G, D901A, T902F, N1008D 및 K1016T. 크산탄 리아제 변이체는 예를 들어 이들 치환 중 2개 이상, 예를 들어 상기 치환 중 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개를 포함할 수 있다.

본 발명의 세제 조성물의 일부 측면에서, 크산탄 리아제 변이체는 영역 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 영역의 1개 이상의 위치에서의 변경 및 영역 7, 8, 9, 10, 11, 12 및 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 영역의 1개 이상의 위치에서의 변경을 포함한다. 한 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 위치 624, 631, 635, 649, 656, 738, 752, 753, 754, 757, 769, 775, 777, 800, 801, 843, 875, 911 및 915로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서의 변경, 및 위치 89, 100, 190, 229, 234, 352, 360, 399, 440, 458, 492, 567, 582, 664, 672, 703, 728, 892, 1008 및 1016으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서의 변경을 포함한다.

변이체는, 예를 들어, 서열식별번호: 2의 위치 624, 631, 635, 649, 656, 738, 752, 753, 754, 757, 769, 775, 777, 800, 801, 843, 875, 911 및 915로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 위치, 예를 들어 3, 4, 5개 이상의 위치에서의 변경, 및 위치 89, 100, 190, 229, 234, 352, 360, 399, 440, 458, 492, 567, 582, 664, 672, 703, 728, 892, 1008 및 1016으로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 위치, 예를 들어 2, 3, 4, 5개 이상의 위치에서의 변경을 포함할 수 있다.

이러한 측면에서 변경을 위한 바람직한 위치는 위치 624, 635, 649, 656, 738, 753, 754, 757, 769, 775, 777, 801, 843 및 875로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치 및 서열식별번호: 2의 위치 100, 190, 229, 234, 360, 399, 440, 458, 492, 567, 582, 672, 892 및 1008로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치를 포함한다.

이러한 측면의 한 실시양태에서, 크산탄 리아제 변이체는 Q89Y, S100D, A190Q, E229S, I234V, V352I, K360G, N399K, N440K, D458S, A492H, A492L, K567R, S582K, T664K, N672D, I703L, M728V, N892Y N1008D 및 K1016T로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환, 및 A624E, T631N, S635E, T649K, I656V, G738L, P752K, P752R, G753E, S754E, S754R, S757D, A769D, L775A, D777R, V800P, D801G, A843P, K875T, A911V 및 T915A로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환을 포함한다. 변이체는, 예를 들어, Q89Y, S100D, A190Q, E229S, I234V, V352I, K360G, N399K, N440K, D458S, A492H, A492L, K567R, S582K, T664K, N672D, I703L, M728V, N892Y N1008D 및 K1016T로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 치환, 예를 들어 3, 4, 5개 이상의 치환, 및 A624E, T631N, S635E, T649K, I656V, G738L, P752K, P752R, G753E, S754E, S754R, S757D, A769D, L775A, D777R, V800P, D801G, A843P, K875T, A911V 및 T915A로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 치환, 예를 들어 3, 4, 5개 이상의 치환을 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서 바람직한 치환은 S100D, A190Q, E229S, I234V, K360G, N399K, N440K, D458S, A492H, K567R, S582K, N672D, N892Y 및 N1008D로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환 및 A624E, S635E, T649K, I656V, G738L, G753E, S754E, S754R, S757D, A769D, L775A, D777R, D801G, A843P 및 K875T로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환을 포함한다.

이러한 변이체의 비제한적 예는 하기를 포함한다:

A190Q, E229S, S635E, T649K, I656V, N672D, I703L, G753E, S754E, S757D, A769D, L775A, D801G, K875T, N892Y, N1008D

E229S, S635E, T649K, I656V, N672D, I703L, G753E, S754E, A769D, L775A, D801G, K875T, N892Y, N1008D

E229S, V352I, S635E, T649K, I656V, N672D, G753E, S754E, A769D, L775A, V800P, D801G, K875T, N892Y

E229S, K360G, D458S, S582K, N672D, G753E, S754E, A769D, L775A, D801G, K875T, N892Y, N1008D

S100D, E229S, K360G, D458S, S582K, T664K, N672D, G753E, S754E, S757D, A769D, L775A, D801G, A843P, K875T, N892Y, A911V, N1008D, K1016T

E229S, I234V, S582K, N672D, G753E, S754E, A769D, L775A, V800P, D801G, K875T, N892Y

Q89Y, E229S, N440K, S582K, A624E, N672D, G753E, S754E, A769D, L775A, D801G, K875T, N892Y

E229S, S635E, T649K, I656V, N672D, P752K, G753E, A769D, L775A, D801G, A843P, K875T, N892Y

E229S, S635E, T649K, I656V, N672D, G753E, S754E, S757D, A769D, L775A, D801G, K875T, N892Y

E229S, N440K, S582K, N672D, G753E, S754E, A769D, L775A, D801G, A843P, K875T, N892Y, N1008D

E229S, N440K, S582K, A624E, N672D, G753E, S754E, A769D, L775A, V800P, D801G, K875T, N892Y

A190Q, E229S, S635E, T649K, I656V, N672D, P752K, G753E, A769D, L775A, D801G, A843P, K875T, N892Y

A190Q, E229S, S582K, N672D, G753E, S754E, A769D, L775A, D801G, K875T, N892Y

E229S, N440K, S582K, N672D, P752R, G753E, S754E, S757D, A769D, L775A, D801G, K875T, N892Y, N1008D

E229S, S582K, S635E, N672D, P752R, G753E, S754E, A769D, L775A, D801G, K875T, N892Y, N1008D

A190Q, E229S, N440K, S582K, A624E, S635E, N672D, G753E, S754E, A769D, L775A, D801G, K875T, N892Y

E229S, I234V, A492L, S582K, N672D, G753E, S754E, A769D, L775A, D801G, K875T, N892Y

A190Q, E229S, K360G, D458S, S582K, T664K, N672D, G753E, S754E, A769D, L775A, D801G, K875T, N892Y, N1008D

S100D, E229S, K360G, D458S, S582K, N672D, G753E, S754E, S757D, A769D, L775A, D801G, A843P, K875T, N892Y, T915A, N1008D

E229S, N440K, S582K, A624E, S635E, N672D, G738L, G753E, S754E, S757D, A769D, L775A, D801G, K875T, N892Y

S100D, E229S, K360G, D458S, S582K, N672D, G753E, S754E, A769D, L775A, D801G, K875T, N892Y, N1008D

A190Q, E229S, D458S, T631N, N672D, G753E, S754E, A769D, L775A, D801G, A843P, K875T, N892Y

A190Q, E229S, K360G, D458S, S582K, N672D, G753E, S754E, A769D, L775A, D801G, K875T, N892Y, N1008D

E229S, S635E, T649K, I656V, N672D, G753E, S754R, S757D, A769D, L775A, D801G, A843P, K875T, N892Y

E229S, D458S, S582K, T631N, S635E, N672D, M728V, G753E, S754E, S757D, A769D, L775A, D801G, K875T, N892Y

A190Q, E229S, K360G, D458S, S582K, N672D, G753E, S754E, S757D, A769D, L775A, D801G, K875T, N892Y, N1008D

E229S, A492L, S635E, T649K, I656V, N672D, G753E, S757D, A769D, L775A, D801G, K875T, N892Y

S100D, A190Q, E229S, K360G, D458S, S582K, N672D, G753E, S754E, A769D, L775A, D801G, K875T, N892Y, N1008D

A190Q, E229S, I234V, S582K, N672D, G753E, S754E, S757D, A769D, L775A, D801G, K875T, N892Y

E229S, N399K, D458S, A492H, K567R, S582K, S635E, T649K, N672D, G753E, S754E, A769D, L775A, D777R, D801G, K875T, N892Y

E229S, D458S, A492L, T631N, N672D, G753E, S754E, S757D, A769D, L775A, D801G, K875T, N892Y

E229S, D458S, A492H, K567R, S582K, S635E, N672D, G753E, S754E, A769D, L775A, D777R, D801G, K875T, N892Y

S100D, E229S, K360G, D458S, S582K, N672D, G753E, S754E, S757D, A769D, L775A, D801G, A843P, K875T, N892Y, N1008D

E229S, N399K, D458S, K567R, S582K, S635E, N672D, G753E, S754E, A769D, L775A, D777R, D801G, K875T, N892Y.

일부 측면에서, 본 발명은 크산탄 검에 대해 활성을 갖는 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이고; 바람직하게는 상기 활성은 크산탄 리아제 EC 4.2.2.12 활성을 포함하고, 추가로 바람직하게는 상기 활성은 크산탄 리아제 EC 4.2.2.12 활성이다.

일부 측면에서, 본 발명은 모 크산탄 리아제 (예를 들어, 서열식별번호: 2를 가짐)와 비교하여 상기 세제 조성물에서 개선된 안정성을 갖는 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.

일부 측면에서, 본 발명은 모 크산탄 리아제에 비해 >1.0의 반감기 개선 지수 (HIF)를 갖는 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.

일부 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 크산탄 검에 대해 활성을 갖는 단리된 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다. 추가 측면에서, 세제 조성물은 GH9 엔도글루카나제 활성을 갖는 단리된 폴리펩티드를 추가로 포함한다.

일부 측면에서, 본 발명의 세제 조성물은 크산탄 검을 분해하는 1종 이상의 세제 성분을 포함한다.

일부 측면에서, 본 발명은 본 발명의 세제 조성물의 용도에 관한 것이며, 여기서 상기 용도는 크산탄 검을 분해하는 용도 및 세정 과정, 예컨대 세탁 또는 경질 표면 세정 예컨대 식기 세척에서의 용도로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 측면에서, 본 발명은 추가로 크산탄 검을 분해하거나 또는 텍스타일 및/또는 경질 표면을 세척 또는 세정, 예컨대 식기 세척을 위한 본 발명의 세제 조성물의 용도에 관한 것이며, 여기서 조성물은 효소 세제력 이익을 갖는다.

일부 측면에서, 본 발명은 또한 본 발명의 세제 조성물을 사용하여 크산탄 검을 분해하는 방법에 관한 것이며, 여기서 크산탄 검은 경질 표면 또는 텍스타일의 표면 상에 존재한다.

서열 목록의 개요

서열식별번호: 1은 파에니바실루스 종의 균주로부터의 모 성숙 크산탄 리아제의 DNA 서열이다.

서열식별번호: 2는 서열식별번호: 1에 의해 코딩된 성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.

정의

cDNA: 용어 "cDNA"는 진핵 또는 원핵 세포로부터 수득된 성숙, 스플라이싱된 mRNA 분자로부터 역전사에 의해 제조될 수 있는 DNA 분자를 의미한다. cDNA는 상응하는 게놈 DNA에 존재할 수 있는 인트론 서열이 결여되어 있다. 초기의, 1차 RNA 전사체는 성숙 스플라이싱된 mRNA로의 출현 전에, 스플라이싱을 포함한 일련의 단계를 통해 프로세싱되는 mRNA의 전구체이다.

세정 또는 세제 적용분야: 용어 "세정 또는 세제 적용분야"는 손, 기계 또는 자동화에 의한 경질 표면 또는 텍스타일의 세정 또는 세척 목적으로 임의의 조성물 중 적용분야의 크산탄 리아제를 적용하는 것을 의미한다.

세정 조성물: 용어 "세정 조성물"은 세정하고자 하는 물품, 예컨대 텍스타일, 식기, 및 경질 표면으로부터 바람직하지 않은 화합물의 제거에 사용되는 조성물을 지칭한다. 상기 용어는 특정한 유형의 목적하는 세정 조성물 및 제품의 형태 (예를 들어, 액체, 겔, 분말, 과립화, 페이스트, 또는 분무 조성물)에 대해 선택된 임의의 물질/화합물을 포괄하고, 세제 조성물 (예를 들어, 액체 및/또는 고체 세탁 세제 및 미분 직물 세제; 경질 표면 세정 제제, 예컨대 유리, 목재, 세라믹 및 금속 주방 조리대 및 창문용; 카펫 클리너; 오븐 클리너; 직물 청정제; 섬유 유연제; 및 텍스타일 및 세탁 프리-스팟터, 뿐만 아니라 식기 세척 세제)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 크산탄 리아제에 더하여, 세제 제제는 1종 이상의 추가의 효소 (예컨대 크산탄 리아제, 프로테아제, 아밀라제, 리파제, 큐티나제, 셀룰라제, 크산탄 리아제, 크실로글루카나제, 펙티나제, 펙틴 리아제, 크산타나제, 퍼옥시다제, 할로퍼옥시게나제, 카탈라제 및 만난아제, 또는 그의 임의의 혼합물), 및/또는 성분 예컨대 계면활성제, 빌더, 킬레이트화제 또는 킬레이트화 작용제, 표백 시스템 또는 표백 성분, 중합체, 직물 컨디셔너, 폼 부스터, 비누거품 억제제, 염료, 퍼퓸, 갈화 억제제, 광학 증백제, 살박테리아제, 살진균제, 오염 현탁화제, 부식방지제, 효소 억제제 또는 안정화제, 효소 활성화제, 트랜스퍼라제(들), 가수분해성 효소, 옥시도 리덕타제, 블루잉제 및 형광 염료, 항산화제, 및 가용화제를 함유할 수 있다.

코딩 서열: 용어 "코딩 서열"은 폴리펩티드의 아미노산 서열을 직접적으로 구체화하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 코딩 서열의 경계는 일반적으로 개시 코돈, 예컨대 ATG, GTG, 또는 TTG에서 시작하고 정지 코돈, 예컨대 TAA, TAG, 또는 TGA에서 종결되는 오픈 리딩 프레임에 의해 결정된다. 코딩 서열은 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA, 또는 그의 조합일 수 있다.

색상 명확화: 세척 및 착용 동안 느슨해지거나 파손된 섬유가 직물 표면에 축적될 수 있다. 하나의 결과는 직물의 색상이 표면 오염으로 인해 덜 밝거나 또는 덜 강하게 나타날 수 있다는 것이다. 텍스타일로부터 느슨해지거나 또는 파손된 섬유를 제거하면 부분적으로 원래의 색상 및 텍스타일의 외양이 복원될 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "색상 명확화"는, 텍스타일의 초기 색상을 부분적으로 복원하는 것을 의미한다.

제어 서열: 용어 "제어 서열"은 본 발명의 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 위해 필요한 핵산 서열을 의미한다. 각각의 제어 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대해 천연 (즉, 동일한 유전자로부터의 것) 또는 외래 (즉, 상이한 유전자로부터의 것)일 수 있거나 또는 서로 천연 또는 외래일 수 있다. 이러한 제어 서열은 리더, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터, 신호 펩티드 서열, 및 전사 종결인자를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 최소한, 제어 서열은 프로모터, 및 전사 및 번역 정지 신호를 포함한다. 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코딩 영역과 제어 서열의 라이게이션을 용이하게 하는 특정 제한 부위를 도입하기 위해 링커가 제어 서열에 제공될 수 있다.

그에 상응하는: 본원에 사용된 용어 "그에 상응하는"은 특정 아미노산 서열을 참조하는 서열의 특정 아미노산을 결정하는 방법을 지칭한다. 예를 들어 본 발명의 목적상, 특정 아미노산 위치를 참조할 때, 통상의 기술자는 특정 아미노산이 또 다른 아미노산 서열에서 관심사가 될 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 참조하고자 하는 상기 아미노산 서열에 상기 또 다른 아미노산 서열을 정렬시킬 수 있을 것이다. 예를 들어 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같은 서열 또는 본원에 열거된 임의의 다른 아미노산 서열과 또 다른 아미노산 서열의 정렬은, 본원의 다른 곳에 기재되어 있다. 대안적인 정렬 방법이 사용될 수 있고, 이는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.

크산탄 검 분해 및 크산탄 검 분해 활성: 용어 "크산탄 검 분해" 및 "크산탄 검 분해 활성"은 상호교환가능하게 사용되고, 크산탄 검의 보다 작은 성분으로의 탈중합, 분해 또는 절단으로 정의된다. 크산탄 검의 분해는 1개 이상의 측쇄 사카라이드의 제거, 크산탄 검의 백본의 보다 작은 성분으로의 절단 또는 1개 이상의 측쇄 사카라이드의 제거 및 크산탄 검의 백본의 보다 작은 성분으로의 절단일 수 있다. 크산탄 검의 분해를 측정하기 위한 바람직한 검정은 본원의 실시예 4에 기재되어 있다. 크산탄 검 분해 활성의 비제한적 예는 크산탄 리아제 EC 4.2.2.12 활성을 포함한다.

세제 성분: 용어 "세제 성분"은 세제 조성물에 사용될 수 있는 화학물질의 유형을 의미하는 것으로 본원에 정의된다. 세제 성분의 예는 계면활성제, 굴수성제, 빌더, 코-빌더, 킬레이트화제 또는 킬레이트화 작용제, 표백 시스템 또는 표백 성분, 중합체, 직물 색조부여제, 직물 컨디셔너, 폼 부스터, 비누거품 억제제, 분산제, 이염 억제제, 형광 미백제, 퍼퓸, 광학 증백제, 살박테리아제, 살진균제, 오염 현탁화제, 방오 중합체, 재부착방지제 작용제, 효소 억제제 또는 안정화제, 효소 활성화제, 항산화제, 및 가용화제이다. 세제 조성물은 임의의 유형의 세제 성분 중 1종 이상을 포함할 수 있다.

세제 조성물: 용어 "세제 조성물"은 세정하고자 하는 물품, 예컨대 텍스타일, 식기, 및 경질 표면으로부터 바람직하지 않은 화합물의 제거에 사용되는 조성물을 지칭한다. 세제 조성물은 예를 들어 가정용 세정 및 산업용 세정 둘 다를 위해 텍스타일, 식기 및 경질 표면을 세정하는데 사용될 수 있다. 상기 용어는 특정한 유형의 목적하는 세정 조성물 및 제품의 형태 (예를 들어, 액체, 겔, 분말, 과립화, 페이스트, 또는 분무 조성물)에 대해 선택된 임의의 물질/화합물을 포괄하고, 세제 조성물 (예를 들어, 액체 및/또는 고체 세탁 세제 및 미분 직물 세제; 경질 표면 세정 제제, 예컨대 유리, 목재, 세라믹 및 금속 주방 조리대 및 창문용; 카펫 클리너; 오븐 클리너; 직물 청정제; 섬유 유연제; 및 텍스타일 및 세탁 프리-스팟터, 뿐만 아니라 식기 세척 세제)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 크산탄 리아제 및/또는 GH9 엔도글루카나제를 함유하는 것에 더하여, 세제 제제는 1종 이상의 추가의 효소 (예컨대 엔도글루카나제, 크산탄 리아제, 프로테아제, 아밀라제, 리케나제, 리파제, 큐티나제, 셀룰라제, 크산탄 리아제, 크실로글루카나제, 펙티나제, 펙틴 리아제, 크산타나제, 퍼옥시다제, 할로퍼옥시게나제, 카탈라제 및 만난아제 또는 그의 임의의 혼합물), 및/또는 성분 예컨대 계면활성제, 빌더, 킬레이트화제 또는 킬레이트화 작용제, 표백 시스템 또는 표백 성분, 중합체, 직물 컨디셔너, 폼 부스터, 비누거품 억제제, 염료, 퍼퓸, 갈화 억제제, 광학 증백제, 살박테리아제, 살진균제, 오염 현탁화제, 부식방지제, 효소 억제제 또는 안정화제, 효소 활성화제, 트랜스퍼라제(들), 가수분해성 효소, 옥시도 리덕타제, 블루잉제 및 형광 염료, 항산화제, 및 가용화제를 함유할 수 있다.

식기 세척: 용어 "식기 세척"은, 예를 들어, 수동 또는 자동 식기 세척에 의한 모든 형태의 식기 세척을 지칭한다. 식기를 세척하는 것은 모든 형태의 크로커리, 예컨대 플레이트, 컵, 글라스, 보울, 모든 형태의 커트러리, 예컨대 스푼, 나이프, 포크 및 서빙 기구 뿐만 아니라 세라믹, 플라스틱, 금속, 자기, 글라스 및 아크릴의 세정을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

식기 세척 조성물: 용어 "식기 세척 조성물"은 경질 표면을 세정하기 위한 모든 형태의 조성물을 지칭한다. 본 발명은 임의의 특정한 유형의 식기 세척 조성물 또는 임의의 특정한 세제에 제한되지 않는다.

엔도글루카나제: 용어 "엔도글루카나제" 또는 "EG"는 셀룰로스, 셀룰로스 유도체 (예컨대 카르복시메틸 셀룰로스 및 히드록시에틸 셀룰로스), 리케닌의 1,4-베타-D-글리코시드 연결, 혼합된 베타-1,3/베타-1,4 글루칸 예컨대 곡류 베타-D-글루칸, 크실로글루칸, 크산탄 및 다른 식물 물질 함유 셀룰로스 성분의 베타-1,4 결합의 가수분해를 촉매하는 엔도-1,4- 또는 엔도-1,3;1,4-베타-D-글루칸 4-글루카노히드롤라제 (예를 들어, EC 3.2.1.4)를 의미한다. 엔도글루카나제 활성은 기질 점도의 감소 또는 환원당 검정 (Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481)에 의해 결정되는 환원 말단의 증가를 측정함으로써 결정될 수 있다.

효소 세제력 이익: 용어 "효소 세제력 이익"은 효소가 그러한 효소를 함유하지 않는 동일한 세제와 비교하여 세제에 부가할 수 있는 유리한 효과로서 본원에 정의된다. 효소에 의해 제공될 수 있는 중요한 세제력 이익은 세척 및 또는 세정 후 전혀 보이지 않거나 거의 보이지 않는 오염물을 동반한 얼룩을 제거하는 것, 재부착방지로도 불리는 효과인, 세척 과정에서 방출된 오염물의 재부착을 방지 또는 감소시키는 것, 미백으로도 불리는 효과인, 원래는 백색이었지만 반복적인 사용과 세척 후에 회색빛 또는 황색빛의 외관이 생성된 텍스타일의 백색도를 완전히 또는 부분적으로 회복시키는 것이다. 촉매적 얼룩 제거 또는 오염물의 재부착 방지와 직접적으로 관련되지 않은 텍스타일 관리 이익이 또한 효소 세제력 이익에 중요하다. 이러한 텍스타일 관리 이익의 예는, 이염 억제 또는 역염색방지로도 불리는 효과인, 한 직물에서 또 다른 직물로의 이염 또는 동일한 직물의 또 다른 부분으로의 이염의 방지 또는 감소, 보풀형성방지로도 불리는 효과인, 직물 표면으로부터 돌출되거나 파손된 섬유를 제거하여 보풀형성 경향의 감소 또는 이미 존재하는 보풀 또는 솜털의 제거, 직물-부드러움 개선, 직물의 색상 명확화, 및 직물 또는 의류의 섬유에 갇혀 있는 미립자 오염물의 제거이다. 효소적 표백이 추가의 효소 세제력 이익이며, 여기서 촉매 활성은 일반적으로 표백 성분, 예컨대 과산화수소 또는 다른 과산화물의 형성을 촉매하기 위해 사용된다.

발현: 용어 "발현"은 전사, 전사후 변형, 번역, 번역후 변형, 및 분비를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 폴리펩티드의 생산에 수반되는 임의의 단계를 포함한다.

발현 벡터: 용어 "발현 벡터"는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 그의 발현을 제공하는 제어 서열에 작동가능하게 연결된 선형 또는 원형 DNA 분자를 의미한다.

단편: 용어 "단편"은 성숙 폴리펩티드의 아미노 및/또는 카르복실 말단에 부재하는 1개 이상의 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 의미하며; 여기서 단편은 크산탄 리아제 활성을 갖는다. 한 측면에서, 단편은 성숙 폴리펩티드의 아미노산 개수의 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95%를 함유한다.

크산탄 리아제로 전처리된 크산탄 검에 대해 활성을 갖는 엔도글루카나제 변이체: 용어 "크산탄 리아제로 전처리된 크산탄 검에 대해 활성을 갖는 엔도글루카나제 변이체" 또는 "크산탄 리아제로 전처리된 크산탄 검에 대해 활성을 갖고 글리코실 히드롤라제의 GH9 부류에 속하는 엔도글루카나제"는 글리코실 히드롤라제의 GH9 부류에 속하고 크산탄 리아제로 전처리된 크산탄 검에 대해 활성 (예를 들어, 효소적 활성, 크산탄 분해 활성, 엔도글루카나제 EC 3.2.1.4 활성)을 갖는 도메인을 포함하는 폴리펩티드로 정의된다.

크산탄 검에 대해 활성을 갖는 크산탄 리아제 변이체: 용어 "크산탄 검에 대해 활성을 갖는 크산탄 리아제 변이체"는 크산탄의 β-D-만노실-β-D-1,4-글루쿠로노실 결합을 절단하는 (예를 들어, 크산탄 리아제 EC 4.2.2.12 활성) 폴리펩티드로 정의된다. 크산탄 검에 대한 활성을 측정하기 위한 바람직한 검정은 본원의 실시예 4에 개시되어 있다. 크산탄 검에 대해 활성을 갖는 크산탄 리아제 변이체의 예는 크산탄의 β-D-만노실-β-D-1,4-글루쿠로노실 결합을 절단하는 폴리펩티드와 같은 크산탄 리아제 폴리펩티드이다.

반감기: 용어 "반감기"는 효소가 주어진 조건의 세트 하에 그의 효소적 활성의 절반을 상실하는데 걸린 시간을 지칭한다. 이는 T_½로 표시되고, 시간 (hr)으로 측정된다. 분해는 지수 붕괴에 따르고 인큐베이션 시간 (시간)은 공지되어 있기 때문에, 반감기는 모 효소 (예를 들어 야생형) 및/또는 변이체에 대해 주어진 세제 농도 및 저장 온도에서, 즉 하기 식에 따라 계산될 수 있다:

T1/2 (변이체) = (Ln (0.5)/Ln (RA-변이체/100))*시간

T1/2 (야생형) = (Ln (0.5)/Ln (RA-야생형/100))*시간

여기서 'RA'는 퍼센트 단위의 잔류 활성이고, '시간'은 시간 단위의 인큐베이션 시간이다.

반감기 개선 지수: 용어 "반감기 개선 지수" 또는 "HIF"는 모 폴리펩티드, 예컨대 모 크산탄 리아제와 비교하여 변이체의 반감기의 개선이다. 주어진 저장 조건 세트 (세제 농도 및 온도) 하에서의 반감기 개선 지수 (HIF)는 하기와 같이 계산될 수 있다:

여기서 야생형 (wt)은 변이체와 동일한 저장 조건 (세제 농도 및 인큐베이션 온도) 하에 인큐베이션된다. 야생형과 변이체 사이의 안정성에서의 차이가 너무 커서 동일한 인큐베이션 시간을 사용하여 야생형 및 변이체 둘 다에 대한 반감기를 정확하게 평가할 수 없는 경우에, 야생형 및 변이체에 대한 인큐베이션 시간은 예를 들어 야생형의 경우 1시간 및 가장 안정한 변이체의 경우 840시간으로 상이하다.

경질 표면 세정: 용어 "경질 표면 세정"은 경질 표면의 세정으로서 본원에 정의되며, 여기서 경질 표면은 바닥, 테이블, 벽, 지붕 등 뿐만 아니라 단단한 물체, 예컨대 차 (차 세척) 및 식기 (식기 세척)의 표면을 포함할 수 있다. 식기 세척은 플레이트, 컵, 글라스, 보울, 및 커트러리, 예컨대 스푼, 나이프, 포크, 서빙 기구, 세라믹, 플라스틱, 금속, 자기, 글라스 및 아크릴의 세정을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

숙주 세포: 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구축물 또는 발현 벡터에 의한 형질전환, 형질감염, 형질도입 등에 감수성인 임의의 세포 유형을 의미한다. 용어 "숙주 세포"는 복제 동안 발생한 돌연변이로 인해 모 세포와 동일하지 않은 모 세포의 임의의 자손을 포괄한다.

개선된 특성: 용어 "개선된 특성"은 모 효소와 비교하여 개선된, 변이체와 연관된 특징을 의미한다. 이러한 개선된 특성은 촉매 효율, 촉매 속도, 화학적 안정성, 산화 안정성, pH 활성, pH 안정성, 비활성, 저장 조건 하에서의 안정성, 킬레이트화제 안정성, 기질 결합, 기질 절단, 기질 특이성, 기질 안정성, 표면 특성, 열 활성, 및 열안정성을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

개선된 세척 성능: 용어 "개선된 세척 성능"은, 예를 들어 증가된 얼룩 제거에 의해, 모 프로테아제 변이체의 세척 성능에 비해 프로테아제 변이체의 세척 성능의 변경을 나타내는 (변이체) 효소 (또한 효소의 블렌드, 반드시 변이체 뿐만 아니라 백본, 및 특정 세정 조성물과 조합된 것 등)로서 본원에 정의된다. 용어 "세척 성능"은 세탁물에서의 세척 성능 뿐만 아니라 예를 들어 식기 세척에서의 세척 성능도 포함한다.

단리된: 용어 "단리된"은 자연에서는 존재하지 않는 형태 또는 환경에서의 물질을 의미한다. 단리된 물질의 비제한적 예는 (1) 임의의 비-자연 발생 물질, (2) 자연에서 회합된 자연 발생 성분 중 1종 이상 또는 모두로부터 적어도 부분적으로 제거된, 임의의 효소, 변이체, 핵산, 단백질, 펩티드 또는 보조인자를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 물질; (3) 자연에서 발견되는 물질에 비해 사람의 손에 의해 변형된 임의의 물질; 또는 (4) 자연 회합된 다른 성분에 비해 물질의 양을 증가시킴으로써 변형된 임의의 물질 (예를 들어, 물질을 코딩하는 유전자의 다중 카피; 물질을 코딩하는 유전자와 자연 회합된 프로모터보다 더 강력한 프로모터의 사용)을 포함한다. 단리된 물질은 발효 브로쓰 샘플에 존재할 수 있다.

세탁: 용어 "세탁"은 가정용 세탁 및 산업용 세탁 둘 다에 관한 것이고, 텍스타일을 본 발명의 세정 또는 세제 조성물을 함유하는 용액으로 처리하는 과정을 의미한다. 세탁 과정은 예를 들어 가정용 또는 산업용 세탁기를 사용하여 예를 들어 수행될 수 있거나, 또는 손으로 수행될 수 있다.

성숙 폴리펩티드: 용어 "성숙 폴리펩티드"는 번역 및 임의의 번역후 변형, 예컨대 N-말단 프로세싱, C-말단 말단절단, 글리코실화, 인산화 등 후의 그의 최종 형태의 폴리펩티드를 의미한다. 한 측면에서, 성숙 폴리펩티드는 서열식별번호: 2의 아미노산 1 내지 1037이다.

숙주 세포가 동일한 폴리뉴클레오티드에 의해 발현된 2개 이상의 상이한 성숙 폴리펩티드 (즉, 상이한 C-말단 및/또는 N-말단 아미노산을 가짐)의 혼합물을 생산할 수 있다는 것이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 또한, 상이한 숙주 세포는 폴리펩티드를 상이하게 프로세싱하므로, 폴리뉴클레오티드를 발현하는 하나의 숙주 세포는 동일한 폴리뉴클레오티드를 발현하는 또 다른 숙주 세포와 비교하여 상이한 성숙 폴리펩티드 (예를 들어, 상이한 C-말단 및/또는 N-말단 아미노산을 가짐)를 생산할 수 있는 것으로 관련 기술분야에 공지되어 있다.

성숙 폴리펩티드 코딩 서열: 용어 "성숙 폴리펩티드 코딩 서열"은 효소적 활성 예컨대 크산탄 리아제로 전처리된 크산탄 검에 대해 활성 또는 크산탄 리아제 활성을 갖는 성숙 폴리펩티드를 코딩한 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 한 측면에서, 성숙 폴리펩티드 코딩 서열은 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 1 내지 3111이다.

돌연변이체: 용어 "돌연변이체"는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.

핵산 구축물: 용어 "핵산 구축물"은 자연 발생 유전자로부터 단리되거나, 또는 자연에서 달리 존재하지 않거나 또는 합성인 방식으로 핵산의 절편을 함유하도록 변형된, 1개 이상의 제어 서열을 포함하는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 핵산 분자를 의미한다.

작동가능하게 연결된: 용어 "작동가능하게 연결된"은 제어 서열이 코딩 서열의 발현을 지시하도록, 제어 서열이 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열에 대해 적절한 위치에 놓인 구성을 의미한다.

모 효소: 용어 "모 효소" 또는 "모 크산탄 리아제"는 크산탄 리아제 활성을 갖는 임의의 폴리펩티드를 의미하며, 그에 대한 변경은 본 발명의 효소 변이체를 생산한다. 한 측면에서, 모 효소는 변이체의 동일한 아미노산 서열을 갖지만, 명시된 위치 중 1개 이상에서 변경을 갖지 않는 크산탄 리아제이다. 표현 "동일한 아미노산 서열을 갖는"은 100% 서열 동일성에 관한 것으로 이해될 것이다. 모 크산탄 리아제의 비제한적 예는 서열식별번호: 2를 갖는 성숙 모 크산탄 리아제를 포함한다.

서열 동일성: 2개의 아미노산 서열 사이 또는 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 관련성은 파라미터 "서열 동일성"에 의해 기재된다. 본 발명의 목적상, 2개의 아미노산 서열 사이의 서열 동일성은 EMBOSS 패키지 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), 바람직하게는 버전 5.0.0 이후의 니들(Needle) 프로그램에서 구현되는 바와 같은 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)을 사용하여 결정된다. 사용되는 파라미터는 갭 오픈 패널티 10, 갭 연장 페널티 0.5, 및 EBLOSUM62 (BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. "최장 동일성" (-nobrief 옵션을 사용하여 수득됨)으로 라벨링된 니들의 결과는 퍼센트 동일성으로서 사용되고 하기와 같이 계산된다:

(동일한 잔기 x 100)/(정렬의 길이 - 정렬 내의 갭의 총수).

본 발명의 목적상, 2개의 데옥시리보뉴클레오티드 서열 사이의 서열 동일성은 EMBOSS 패키지 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, 상기 문헌), 바람직하게는 버전 5.0.0 이후의 니들 프로그램에서 구현되는 바와 같은 니들만-분쉬 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, 상기 문헌)을 사용하여 결정된다. 사용되는 파라미터는 갭 오픈 패널티 10, 갭 연장 페널티 0.5, 및 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. "최장 동일성" (-nobrief 옵션을 사용하여 수득됨)으로 라벨링된 니들의 결과는 퍼센트 동일성으로서 사용되고 하기와 같이 계산된다:

(동일한 데옥시리보뉴클레오티드 x 100)/(정렬의 길이 - 정렬 내의 갭의 총수).

엄격도 조건: 상이한 엄격도 조건은 하기와 같이 정의된다.

용어 "매우 낮은 엄격도 조건"은 적어도 100개의 뉴클레오티드 길이의 프로브, 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 마이크로그램/ml 전단 및 변성된 연어 정자 DNA, 및 25% 포름아미드 중 42℃에서의 사전혼성화 및 혼성화, 12 내지 24시간 동안 표준 서던 블롯팅 절차를 따르는 것을 의미한다. 캐리어 물질은 45℃에서 2X SSC, 0.2% SDS를 사용하여 각각 15분 동안 3회 최종 세척된다.

용어 "낮은 엄격도 조건"은 적어도 100개의 뉴클레오티드 길이의 프로브, 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 마이크로그램/ml 전단 및 변성된 연어 정자 DNA, 및 25% 포름아미드 중 42℃에서의 사전혼성화 및 혼성화, 12 내지 24시간 동안 표준 서던 블롯팅 절차를 따르는 것을 의미한다. 캐리어 물질은 50℃에서 2X SSC, 0.2% SDS를 사용하여 각각 15분 동안 3회 최종 세척된다.

용어 "중간 엄격도 조건"은 적어도 100개의 뉴클레오티드 길이의 프로브, 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 마이크로그램/ml 전단 및 변성된 연어 정자 DNA, 및 35% 포름아미드 중 42℃에서의 사전혼성화 및 혼성화, 12 내지 24시간 동안 표준 서던 블롯팅 절차를 따르는 것을 의미한다. 캐리어 물질은 55℃에서 2X SSC, 0.2% SDS를 사용하여 각각 15분 동안 3회 최종 세척된다.

용어 "중간-높은 엄격도 조건"은 적어도 100개의 뉴클레오티드 길이의 프로브, 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 마이크로그램/ml 전단 및 변성된 연어 정자 DNA, 및 35% 포름아미드 중 42℃에서의 사전혼성화 및 혼성화, 12 내지 24시간 동안 표준 서던 블롯팅 절차를 따르는 것을 의미한다. 캐리어 물질은 60℃에서 2X SSC, 0.2% SDS를 사용하여 각각 15분 동안 3회 최종 세척된다.

용어 "높은 엄격도 조건"은 적어도 100개의 뉴클레오티드 길이의 프로브, 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 마이크로그램/ml 전단 및 변성된 연어 정자 DNA, 및 50% 포름아미드 중 42℃에서의 사전혼성화 및 혼성화, 12 내지 24시간 동안 표준 서던 블롯팅 절차를 따르는 것을 의미한다. 캐리어 물질은 65℃에서 2X SSC, 0.2% SDS를 사용하여 각각 15분 동안 3회 최종 세척된다.

용어 "매우 높은 엄격도 조건"은 적어도 100개의 뉴클레오티드 길이의 프로브, 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 마이크로그램/ml 전단 및 변성된 연어 정자 DNA, 및 50% 포름아미드 중 42℃에서의 사전혼성화 및 혼성화, 12 내지 24시간 동안 표준 서던 블롯팅 절차를 따르는 것을 의미한다. 캐리어 물질은 70℃에서 2X SSC, 0.2% SDS를 사용하여 각각 15분 동안 3회 최종 세척된다.

하위서열: 용어 "하위서열"은 성숙 폴리펩티드 코딩 서열의 5' 및/또는 3' 말단에서 1개 이상의 뉴클레오티드가 부재하는 폴리뉴클레오티드를 의미하며; 여기서 하위서열은 효소적 활성, 예컨대 크산탄 리아제로 전처리된 크산탄 검에 대해 활성 또는 크산탄 리아제 활성을 갖는 단편을 코딩한다.

텍스타일: 용어 "텍스타일"은 원사, 원사 중간체, 섬유, 부직포 물질, 천연 물질, 합성 물질, 및 임의의 다른 텍스타일 물질을 포함한 임의의 텍스타일 물질, 이들 물질로 만든 직물 및 직물로부터 제조된 제품 (예를 들어, 의류 및 다른 제품)을 의미한다. 텍스타일 또는 직물은 니트, 직조물, 데님, 부직물, 펠트, 원사, 및 타월천의 형태일 수 있다. 텍스타일은 셀룰로스 기반, 예컨대 면, 아마/린넨, 황마, 라미, 사이잘 또는 코이어를 포함한 천연 셀룰로스, 또는 비스코스/레이온, 라미, 셀룰로스 아세테이트 섬유 (트리셀), 리오셀 또는 그의 블렌드를 포함한 인공 셀룰로스 (예를 들어, 목재 펄프로부터 유래하는 것)일 수 있다. 텍스타일 또는 직물은 또한, 비-셀룰로스 기반, 예컨대 울, 낙타, 캐시미어, 모헤어, 토끼 및 실크를 포함한 천연 폴리아미드, 또는 합성 중합체, 예컨대 나일론, 아라미드, 폴리에스테르, 아크릴계, 폴리프로필렌 및 스판덱스/엘라스탄, 또는 그의 블렌드 뿐만 아니라 셀룰로스 기반 섬유와 비-셀룰로스 기반 섬유의 블렌드일 수 있다. 블렌드의 예는 면 및/또는 레이온/비스코스와 1종 이상의 동반 물질, 예컨대 울, 합성 섬유 (예를 들어 폴리아미드 섬유, 아크릴계 섬유, 폴리에스테르 섬유, 폴리비닐 알콜 섬유, 폴리비닐 클로라이드 섬유, 폴리우레탄 섬유, 폴리우레아 섬유, 아라미드 섬유), 및 셀룰로스-함유 섬유 (예를 들어 레이온/비스코스, 라미, 아마/린넨, 황마, 셀룰로스 아세테이트 섬유, 리오셀)의 블렌드이다. 직물은 전통적인 세척가능한 세탁물, 예를 들어 얼룩진 가정 세탁물일 수 있다. 용어 직물 또는 의류가 사용되는 경우, 이는 더 넓은 범위의 용어 텍스타일을 또한 포함하는 것으로 의도된다.

텍스타일 관리 이익: 촉매적 얼룩 제거 또는 오염물의 재부착 방지와 직접적으로 관련되지 않은 "텍스타일 관리 이익"이 또한 효소 세제력 이익에 중요하다. 이러한 텍스타일 관리 이익의 예는, 이염 억제 또는 역염색방지로도 불리는 효과인, 한 텍스타일에서 또 다른 텍스타일로의 이염 또는 동일한 텍스타일의 또 다른 부분으로의 이염의 방지 또는 감소, 보풀형성방지로도 불리는 효과인, 텍스타일 표면으로부터 돌출되거나 파손된 섬유를 제거하여 보풀형성 경향의 감소 또는 이미 존재하는 보풀 또는 솜털의 제거, 텍스타일-부드러움 개선, 텍스타일의 색상 명확화, 및 텍스타일의 섬유에 갇혀 있는 미립자 오염물의 제거이다. 효소적 표백이 추가의 효소 세제력 이익이며, 여기서 촉매 활성은 일반적으로 표백 성분, 예컨대 과산화수소 또는 다른 과산화물 또는 다른 표백 종의 형성을 촉매하기 위해 사용된다.

변이체: 용어 "변이체"는 1개 이상의 위치에서 변경, 즉, 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하는 폴리펩티드 (예를 들어, 크산탄 리아제 폴리펩티드)를 의미한다. 치환은 위치를 차지하는 아미노산의 상이한 아미노산으로의 대체를 의미하고; 결실은 위치를 차지하는 아미노산의 제거를 의미하고; 삽입은 위치를 차지하는 아미노산에 인접하여 그에 바로 후속하여 1개 이상의 아미노산, 예를 들어, 1-5개의 아미노산의 부가를 의미한다. 본 발명의 크산탄 리아제 변이체의 비제한적 예는 크산탄 검에 대해 활성을 갖는 크산탄 리아제 변이체를 포함한다. 본 발명의 변이체의 비제한적 예는 추가로 서열식별번호: 2의 성숙 모 크산탄 리아제의 크산탄 리아제 활성의 적어도 20%, 예를 들어, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100%를 갖는 변이체를 포함한다. 크산탄 검에 대한 활성을 측정하기 위한 바람직한 검정은 본원의 실시예 4에 개시되어 있다.

안정성: 용어 "안정성"은 변화, 언폴딩, 붕해, 변성 또는 활성 손실에 대한 저항성 또는 저항성의 정도를 의미한다. 안정성의 비제한적 예는 입체형태적 안정성, 저장 안정성 및 사용 동안, 예를 들어 세척 과정 동안의 안정성을 포함하고, 이는 시간의 함수로서 폴리펩티드 (예를 들어 본 발명에 따른 크산탄 리아제 변이체)의 안정성, 예를 들어 상기 폴리펩티드 (예를 들어 상기 크산탄 리아제 변이체)가 용액, 특히 세제 용액 중에 유지되는 경우 얼마나 많은 활성이 보유되는지를 반영한다. 안정성은 많은 인자, 예를 들어 킬레이트화제(들)의 존재, pH, 온도, 세제 조성물, 예를 들어 빌더(들), 계면활성제(들), 킬레이트화제(들)의 양 등에 의해 영향을 받는다. 크산탄 리아제 안정성은 본원의 실시예 4에 기재된 바와 같은 반감기 개선 지수 (HIF)를 사용하여 측정될 수 있다.

개선된 안정성: 용어 "개선된 안정성" 또는 "증가된 안정성"은 모 크산탄 리아제의 안정성에 비해, 변이체와 동일한 아미노산 서열을 갖지만 명시된 위치 중 1개 이상에서 변경을 갖지 않는 크산탄 리아제에 비해, 또는 서열식별번호: 2에 비해 세제 조성물 중 (예를 들어, 용액 중, 예를 들어 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA 또는 시트레이트의 존재 하에)에서의 증가된 안정성으로서 본원에 정의된다. 용어 "개선된 안정성" 및 "증가된 안정성"은 "개선된 화학적 안정성", "세제 안정성" 및 "개선된 세제 안정성"을 포함한다.

개선된 화학적 안정성: 용어 "개선된 화학적 안정성"은 모 효소의 효소적 활성을 감소시키는 자연 발생 또는 합성인 화학물질 또는 화학물질들의 존재 하에서의 인큐베이션 기간 후, 효소적 활성을 보유함을 나타내는 변이체 효소로서 본원에 정의된다. 개선된 화학적 안정성은 또한 변이체가 이러한 화학물질의 존재 하에서 반응을 더 잘 (예를 들어, 모 효소보다 더 우수하게) 촉매할 수 있도록 할 수 있다. 본 발명의 특정한 측면에서 개선된 화학적 안정성은 세제 중, 특히 액체 세제 중에서의 개선된 안정성이다. 용어 "세제 안정성" 또는 "개선된 세제 안정성"은, 본 발명의 크산탄 리아제 변이체가 액체 세제 제제 내로, 특히 킬레이트화제 (예를 들어 EDTA 또는 시트레이트)를 포함하는 액체 세제 제제 내로 혼합된 경우, 특히 모 크산탄 리아제와 비교하여 크산탄 리아제의 개선된 안정성이다.

입체형태적 안정성: 용어 "입체형태적 안정성"은 입체형태적 변화, 언폴딩 또는 붕해에 대한 저항성 또는 저항성의 정도를 의미한다. 따라서, 용어 "덜 입체형태적으로 안정한"은 입체형태적 변화, 언폴딩 또는 붕해에 대해 덜 저항성이거나 더 낮은 정도의 저항성을 갖는 것을 의미한다.

불안정성: 용어 "불안정성"은 안정성의 결여를 의미한다. 불안정성의 비제한적 예는 입체형태적 불안정성, 언폴딩, 변성, 붕해, 활성 손실을 포함한다.

킬레이트화제-유도된 불안정성 영역: 용어 "킬레이트화제-유도된 불안정성 영역"은 킬레이트화제의 존재 하에 상기 폴리펩티드의 불안정성에 기여하는 폴리펩티드의 임의의 영역을 의미한다. 킬레이트화제의 비제한적 예는 EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산) 및 시트레이트를 포함한다. 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역의 비제한적 예는 하기 특색 중 1종 이상을 갖는 폴리펩티드의 임의의 영역을 포함한다: 킬레이트화제의 존재 하에 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 덜 구조적으로 안정함; 및/또는 킬레이트화제의 존재 하에 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 상기 킬레이트화제에 더 노출됨; 및/또는 킬레이트화제의 존재 하에 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 상기 킬레이트화제에 더 접근가능함; 및/또는 킬레이트화제의 존재 하에 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 더 입체형태적으로 동적임; 및/또는 킬레이트화제의 존재 하에 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 중수소 혼입을 더 잘 수용함. 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역의 비제한적 예는 추가로 킬레이트화제-유도된 불안정성의 원인이 되는 폴리펩티드의 임의의 영역을 포함한다. 성숙 크산탄 리아제 (예를 들어 서열식별번호: 2를 가짐)의 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역의 비제한적 예는 하기를 포함한다: 서열식별번호: 2의 아미노산 154 내지 176에 상응하는 영역 1, 서열식별번호: 2의 아미노산 614 내지 658에 상응하는 영역 2, 서열식별번호: 2의 아미노산 731 내지 803에 상응하는 영역 3, 서열식별번호: 2의 아미노산 807 내지 846에 상응하는 영역 4, 서열식별번호: 2의 아미노산 872 내지 885에 상응하는 영역 5, 및 서열식별번호: 2의 아미노산 903 내지 1004에 상응하는 영역 6. 성숙 크산탄 리아제 (예를 들어 서열식별번호: 2를 가짐)의 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역에 인접한 영역의 비제한적 예는 하기를 포함한다: 서열식별번호: 2의 아미노산 1 내지 153에 상응하는 영역 7, 서열식별번호: 2의 아미노산 177 내지 613에 상응하는 영역 8, 서열식별번호: 2의 아미노산 659 내지 730에 상응하는 영역 9, 서열식별번호: 2의 아미노산 804 내지 806에 상응하는 영역 10, 서열식별번호: 2의 아미노산 847 내지 871에 상응하는 영역 11, 서열식별번호: 2의 아미노산 886 내지 902에 상응하는 영역 12, 및 서열식별번호: 2의 아미노산 1005 내지 1037에 상응하는 영역 13.

인접 영역: 용어 "인접 영역"은 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역이 아닌 폴리펩티드의 임의의 영역을 의미한다. 성숙 크산탄 리아제 (예를 들어 서열식별번호: 2를 가짐)의 인접 영역의 비제한적 예는 하기를 포함한다: 서열식별번호: 2의 아미노산 1 내지 153에 상응하는 영역 7, 서열식별번호: 2의 아미노산 177 내지 613에 상응하는 영역 8, 서열식별번호: 2의 아미노산 659 내지 730에 상응하는 영역 9, 서열식별번호: 2의 아미노산 804 내지 806에 상응하는 영역 10, 서열식별번호: 2의 아미노산 847 내지 871에 상응하는 영역 11, 서열식별번호: 2의 아미노산 886 내지 902에 상응하는 영역 12, 및 서열식별번호: 2의 아미노산 1005 내지 1037에 상응하는 영역 13.

킬레이트화제 노출: 용어 "킬레이트화제 노출"은 폴리펩티드에 도달한 킬레이트화제의 농도 또는 양을 의미한다. 따라서, 본 발명의 문맥에서 용어 "킬레이트화제에 보다 더 노출된"은 특정한 영역 (예를 들어 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역)의 킬레이트화제 노출이 상이한 영역 (예를 들어 인접 영역)의 킬레이트화제 노출보다 더 크다는 것을 의미한다. 한 측면에서, 킬레이트화제 노출은 농도, 지속시간, 및 빈도 (예를 들어 화학적 작용제, 예를 들어 킬레이트화제에 대한) 또는 강도의 수치 용어로 표현될 수 있다.

킬레이트화제 접근성: 용어 "킬레이트화제 접근성"은 킬레이트화제에 의한 영향에 대한 개방성 및 킬레이트화제에 의한 접근의 용이성을 포괄한다. 따라서, 본 발명의 문맥에서 용어 "킬레이트화제에 더 접근가능한"은 특정한 영역 (예를 들어 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역)의 킬레이트화제 접근성이 상이한 영역 (예를 들어 인접 영역)의 킬레이트화제 접근성보다 더 크다는 것을 의미한다.

입체형태적 동적: 용어 "입체형태적 동적"은 (예를 들어 용액 중) 폴리펩티드의 진동, 구조적 재배열 및 전이를 포괄한다. 따라서, 본 발명의 문맥에서 용어 "더 입체형태적으로 동적인"은 특정한 영역 (예를 들어 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역)의 입체형태적 동적이 상이한 영역 (예를 들어 인접 영역)의 입체형태적 동적보다 더 크다는 것을 의미한다.

중수소 혼입에 대한 수용성: 용어 "중수소 혼입에 대한 수용성"은 수소-중수소 교환 동안 중수소 원자에 의해 대체되는 수소 원자의 양을 의미한다. 상기 양은 상대적 (예를 들어 또 다른 양과 비교됨) 또는 절대적 (예를 들어 수치로 표현됨) 용어로 측정될 수 있다. 따라서, 본 발명의 문맥에서 용어 "중수소 혼입을 더 잘 수용하는"은 특정한 영역 (예를 들어 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역)의 중수소 혼입에 대한 수용성이 상이한 영역 (예를 들어 인접 영역)의 중수소 혼입에 대한 수용성보다 더 크다는 것을 의미한다.

세척 성능: 용어 "세척 성능"은, 예를 들어 세척 또는 경질 표면 세정 동안 세정될 물체 상에 존재하는 얼룩을 제거할 수 있는 효소의 능력으로서 사용된다. 세척 성능의 개선은 '세탁물에 대한 자동 기계적 스트레스 검정 (AMSA)'에서의 소위 강도 값 (Int) 또는 완화 값 (Rem)을 계산함으로써 정량화될 수 있다.

변이체의 명칭에 대한 규정

본 발명의 목적상, 서열식별번호: 2에 개시된 성숙 폴리펩티드는 또 다른 크산탄 리아제에서 상응하는 아미노산 잔기를 결정하는데 사용된다. 또 다른 크산탄 리아제의 아미노산 서열은 서열식별번호: 2에 개시된 성숙 폴리펩티드와 정렬되고, 정렬에 기초하여, 서열식별번호: 2에 개시된 성숙 폴리펩티드의 임의의 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 위치 번호는 EMBOSS 패키지 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), 바람직하게는 버전 5.0.0 이후의 니들 프로그램에서 구현되는 바와 같은 니들만-분쉬 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)을 사용하여 결정된다. 사용되는 파라미터는 갭 오픈 패널티 10, 갭 연장 페널티 0.5, 및 EBLOSUM62 (BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다.

또 다른 크산탄 리아제에서 상응하는 아미노산 잔기의 확인은 MUSCLE (로그-예상에 의한 다중 서열 비교; 버전 3.5 이후; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (버전 6.857 이후; Katoh and Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh and Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh and Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900), 및 ClustalW를 사용하는 EMBOSS EMMA (1.83 이후; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 여러 컴퓨터 프로그램을 사용하여, 그의 각각의 디폴트 파라미터를 사용하여 다중 폴리펩티드 서열을 정렬함으로써 결정될 수 있다.

전통적인 서열-기반 비교가 그들의 관계를 검출하는데 실패하도록 다른 효소가 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드로부터 분기된 경우 (Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615), 다른 쌍별 서열 비교 알고리즘이 사용될 수 있다. 서열-기반 검색에서의 보다 큰 감도는, 데이터베이스 검색을 위해 폴리펩티드 패밀리의 확률론적 표현 (프로파일)을 사용하는 검색 프로그램을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, PSI-BLAST 프로그램은 반복 데이터베이스 검색 과정을 통해 프로파일을 생성하고, 이는 원격 상동체를 검출할 수 있다 (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). 폴리펩티드에 대한 패밀리 또는 슈퍼패밀리가 단백질 구조 데이터베이스에 1종 이상의 표현을 갖는 경우에 심지어 더 큰 감도가 달성될 수 있다. GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881)와 같은 프로그램은 입력내용으로서 다양한 공급원 (PSI-BLAST, 2차 구조 예측, 구조적 정렬 프로파일, 및 용매화 잠재력)으로부터 질의 서열에 대한 구조적 폴딩을 예측하는 뉴럴 네트워크까지의 정보를 사용한다. 유사하게, 문헌 [Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919]의 방법을 사용하여 미지의 구조의 서열을 SCOP 데이터베이스에 존재하는 슈퍼패밀리 모델과 정렬시킬 수 있다. 차례로 이들 정렬을 사용하여 폴리펩티드에 대한 상동성 모델을 생성할 수 있고, 평가 목적을 위해 개발된 다양한 툴을 사용하여 이러한 모델을 정확도에 대해 평가할 수 있다.

공지된 구조의 단백질의 경우, 구조적 정렬을 검색하고 생성하기 위해 여러 툴 및 리소스가 이용가능하다. 예를 들어 단백질의 SCOP 슈퍼패밀리가 구조적으로 정렬된 바 있고, 그러한 정렬은 접근가능하고 다운로드가능하다. 다양한 알고리즘, 예컨대 거리 정렬 매트릭스 (Holm and Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) 또는 조합 연장 (Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747)을 사용하여 2개 이상의 단백질 구조를 정렬할 수 있고, 가능한 구조적 상동체를 발견하기 위해 관심 구조를 갖는 구조 데이터베이스를 질의하는데 이들 알고리즘의 구현이 추가적으로 사용될 수 있다 (예를 들어, Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).

본 발명의 변이체를 기재함에 있어서, 하기 기재된 명명법이 참조의 용이성을 위해 적합화된다. 적합화된 IUPAC 단일 문자 또는 3문자 아미노산 약어가 사용된다.

치환. 아미노산 치환의 경우, 하기 명명법이 사용된다: 원래의 아미노산, 위치, 치환된 아미노산. 따라서, 위치 226의 트레오닌의 알라닌에 의한 치환은 "Thr226Ala" 또는 "T226A"로 표시된다. 다중 돌연변이는 부가 마크 ("+")에 의해 분리되고, 예를 들어 "Gly205Arg + Ser411Phe" 또는 "G205R + S411F"는 각각 위치 205 및 411에서의 글리신 (G)의 아르기닌 (R)에 의한 치환 및 세린 (S)의 페닐알라닌 (F)에 의한 치환을 나타낸다.

결실. 아미노산 결실의 경우, 하기 명명법이 사용된다: 원래의 아미노산, 위치, *. 따라서, 위치 195의 글리신의 결실은 "Gly195*" 또는 "G195*"로 표시된다. 다중 결실은 부가 마크 ("+")에 의해, 예를 들어, "Gly195* + Ser411*" 또는 "G195* + S411*"로 분리된다.

삽입. 아미노산 삽입의 경우, 하기 명명법이 사용된다: 원래의 아미노산, 위치, 원래의 아미노산, 삽입된 아미노산. 따라서 위치 195의 글리신 다음의 리신의 삽입은 "Gly195GlyLys" 또는 "G195GK"로 표시된다. 다중 아미노산의 삽입은 [원래의 아미노산, 위치, 원래의 아미노산, 삽입된 아미노산 #1, 삽입된 아미노산 #2; 등]으로 표시된다. 예를 들어, 위치 195의 글리신 다음의 리신 및 알라닌의 삽입은 "Gly195GlyLysAla" 또는 "G195GKA"로 표시된다. 특정한 위치에서의 삽입의 표시는 원래의 아미노산 잔기 다음의 삽입인 것으로 이해된다. 예를 들어, "위치 195에서의 삽입"은 위치 195에서의 원래의 잔기 다음의 삽입인 것으로 이해된다.

이러한 경우에 삽입된 아미노산 잔기(들)는 삽입된 아미노산 잔기(들)에 선행하는 아미노산 잔기의 위치 번호에의 소문자의 부가에 의해 넘버링된다. 상기 예에서, 서열은 따라서 하기일 것이다:

다중 변경. 다중 변경을 포함하는 변이체는 부가 마크 ("+")에 의해 분리되고, 예를 들어 "Arg170Tyr+Gly195Glu" 또는 "R170Y+G195E"는 각각 위치 170 및 195에서의 아르기닌 및 글리신의 티로신 및 글루탐산에 의한 치환을 나타낸다.

상이한 변경. 상이한 변경이 한 위치에 도입될 수 있는 경우에, 상이한 변경은 콤마에 의해 분리되고, 예를 들어 "Arg170Tyr,Glu"는 위치 170의 아르기닌의 티로신 또는 글루탐산에 의한 치환을 나타낸다. 따라서, "Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala"는 하기 변이체를 표시한다: "Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly", 및 "Tyr167Ala+Arg170Ala".

대안적으로, 상이한 변경은 괄호를 사용하여, 예를 들어, Arg170[Tyr, Gly]로 또는 1-문자 코드 R170 [Y,G]로 표시될 수 있다.

발명의 상세한 설명

서열식별번호: 2를 갖는 공지된 크산탄 리아제는 대형 효소 (>1000개 잔기)이고, 따라서 개선을 위해 그의 특성, 예를 들어 세제 조성물 중, 예를 들어 킬레이트화제의 존재 하에서의 안정성을 표적화하는 것은 극도로 노동적이고 고비용이다. 일부 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 2의 아미노산 154 내지 176에 상응하는 영역 1, 서열식별번호: 2의 아미노산 614 내지 658에 상응하는 영역 2, 서열식별번호: 2의 아미노산 731 내지 803에 상응하는 영역 3, 서열식별번호: 2의 아미노산 807 내지 846에 상응하는 영역 4, 서열식별번호: 2의 아미노산 872 내지 885에 상응하는 영역 5, 및 서열식별번호: 2의 아미노산 903 내지 1004에 상응하는 영역 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 영역에 대한 단백질 조작을 사용하여 크산탄 리아제 분자를 안정화하고자 하여, 표적화를 위한 잔기의 수를 감소시켰다.

한 실시양태에서 본 발명은 단백질 조작을 사용하여 크산탄 리아제 분자를 안정화하고자 하여, 표적화를 위한 잔기의 수를 상당히 감소시켰다.

변이체

한 실시양태에서, 분자를 EDTA를 함유하는 완충제 중에서 인큐베이션한 경우에 영향을 받는, 서열식별번호: 2를 갖는 공지된 크산탄 리아제의 단백질 서열 내 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역은 하기와 같다: 서열식별번호: 2의 아미노산 154 내지 176에 상응하는 영역 1, 서열식별번호: 2의 아미노산 614 내지 658에 상응하는 영역 2, 서열식별번호: 2의 아미노산 731 내지 803에 상응하는 영역 3, 서열식별번호: 2의 아미노산 807 내지 846에 상응하는 영역 4, 서열식별번호: 2의 아미노산 872 내지 885에 상응하는 영역 5, 및 서열식별번호: 2의 아미노산 903 내지 1004에 상응하는 영역 6. 이는 세제, 예를 들어 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA 또는 시트레이트를 포함하는 세제 조성물에서 분자를 안정화하기 위해 크산탄 리아제를 돌연변이하기 위한 부분에 대한 중요한 지침과 관련된다.

한 실시양태에서 본 발명은 서열식별번호: 2의 아미노산 154 내지 176에 상응하는 영역 1, 서열식별번호: 2의 아미노산 614 내지 658에 상응하는 영역 2, 서열식별번호: 2의 아미노산 731 내지 803에 상응하는 영역 3, 서열식별번호: 2의 아미노산 807 내지 846에 상응하는 영역 4, 서열식별번호: 2의 아미노산 872 내지 885에 상응하는 영역 5, 및 서열식별번호: 2의 아미노산 903 내지 1004에 상응하는 영역 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 영역의 1개 이상의 위치에서 변경 (예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입)을 포함하는, 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 변이체는 서열식별번호: 2와 적어도 60% 및 100% 미만의 서열 동일성을 갖고; 바람직하게는 상기 크산탄 리아제 변이체는 크산탄 검에 대해 활성을 갖고, 추가로 바람직하게는 상기 활성은 크산탄 검 분해 활성이다.

한 실시양태에서 본 발명은 서열식별번호: 2의 아미노산 154 내지 176에 상응하는 영역 1, 서열식별번호: 2의 아미노산 614 내지 658에 상응하는 영역 2, 서열식별번호: 2의 아미노산 731 내지 803에 상응하는 영역 3, 서열식별번호: 2의 아미노산 807 내지 846에 상응하는 영역 4, 서열식별번호: 2의 아미노산 872 내지 885에 상응하는 영역 5, 및 서열식별번호: 2의 아미노산 903 내지 1004에 상응하는 영역 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 영역의 1개 이상의 위치에서 변경 (예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입)을 포함하는, 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 변이체는 서열식별번호: 2와 적어도 60% 및 100% 미만의 서열 동일성을 갖고; 바람직하게는 상기 크산탄 리아제 변이체는 크산탄 검에 대해 활성을 갖고, 추가로 바람직하게는 상기 활성은 크산탄 검 분해 활성이다.

한 실시양태에서 본 발명은 영역 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 영역의 1개 이상의 위치에서 변경 (예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입)을 갖는, 본원에 기재된 바와 같은 (예를 들어, 서열식별번호: 2) 모 크산탄 리아제를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 영역은 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역이고, 바람직하게는 상기 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역은 하기 특색: 킬레이트화제의 존재 하에 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 덜 입체형태적으로 안정함; 및/또는 킬레이트화제의 존재 하에 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 상기 킬레이트화제에 더 노출됨; 및/또는 킬레이트화제의 존재 하에 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 상기 킬레이트화제에 더 접근가능함; 및/또는 킬레이트화제의 존재 하에 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 더 입체형태적으로 동적임; 및/또는 킬레이트화제의 존재 하에 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 중수소 혼입을 상대적으로 더 잘 수용함 중 1종 이상을 갖고; 추가로 바람직하게는 상기 인접 영역은 서열식별번호: 2의 아미노산 1 내지 153에 상응하는 영역 7, 서열식별번호: 2의 아미노산 177 내지 613에 상응하는 영역 8, 서열식별번호: 2의 아미노산 659 내지 730에 상응하는 영역 9, 서열식별번호: 2의 아미노산 804 내지 806에 상응하는 영역 10, 서열식별번호: 2의 아미노산 847 내지 871에 상응하는 영역 11, 서열식별번호: 2의 아미노산 886 내지 902에 상응하는 영역 12, 및 서열식별번호: 2의 아미노산 1005 내지 1037에 상응하는 영역 13으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 추가로 가장 바람직하게는 상기 킬레이트화제는 EDTA 또는 시트레이트이다.

한 실시양태에서 인접 영역은 하기: 서열식별번호: 2의 아미노산 1 내지 153에 상응하는 영역 7, 서열식별번호: 2의 아미노산 177 내지 613에 상응하는 영역 8, 서열식별번호: 2의 아미노산 659 내지 730에 상응하는 영역 9, 서열식별번호: 2의 아미노산 804 내지 806에 상응하는 영역 10, 서열식별번호: 2의 아미노산 847 내지 871에 상응하는 영역 11, 서열식별번호: 2의 아미노산 886 내지 902에 상응하는 영역 12, 및 서열식별번호: 2의 아미노산 1005 내지 1037에 상응하는 영역 13 중 1개 이상 또는 모두일 수 있다.

한 실시양태에서 본 발명은 (예를 들어, 서열식별번호: 2의 또는 또 다른 모 크산탄 리아제의) 영역 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 영역의 1개 이상의 위치에서 변경 (예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입)을 갖는 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이며, 여기서 세제 성분을 포함하는 수용액 중 (예를 들어, 서열식별번호: 2의 또는 또 다른 모 크산탄 리아제의) 상기 영역은 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 상기 세제 성분에 상대적으로 더 접근가능하다.

한 실시양태에서 본 발명은 (예를 들어, 서열식별번호: 2의 또는 또 다른 모 크산탄 리아제의) 영역 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 영역의 1개 이상의 위치에서 변경 (예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입)을 갖는 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이며, 여기서 세제 성분을 포함하는 수용액 중 (예를 들어, 서열식별번호: 2의 또는 또 다른 모 크산탄 리아제의) 상기 영역은 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 상기 세제 성분에 상대적으로 더 노출된다.

한 실시양태에서 본 발명은 (예를 들어, 서열식별번호: 2의 또는 또 다른 모 크산탄 리아제의) 영역 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 영역의 1개 이상의 위치에서 변경 (예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입)을 갖는 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이며, 여기서 세제 성분을 포함하는 수용액 중 (예를 들어, 서열식별번호: 2의 또는 또 다른 모 크산탄 리아제의) 상기 영역은 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 상대적으로 더 입체형태적으로 동적이다.

한 실시양태에서 본 발명은 (예를 들어, 서열식별번호: 2의 또는 또 다른 모 크산탄 리아제의) 영역 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 영역의 1개 이상의 위치에서 변경 (예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입)을 갖는 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이며, 여기서 세제 성분을 포함하는 수용액 중 (예를 들어, 서열식별번호: 2의 또는 또 다른 모 크산탄 리아제의) 상기 영역은 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 중수소 혼입을 상대적으로 더 잘 수용한다.

한 실시양태에서 본 발명은 서열식별번호: 2의 아미노산 154 내지 176에 상응하는 영역 1, 서열식별번호: 2의 아미노산 614 내지 658에 상응하는 영역 2, 서열식별번호: 2의 아미노산 731 내지 803에 상응하는 영역 3, 서열식별번호: 2의 아미노산 807 내지 846에 상응하는 영역 4, 서열식별번호: 2의 아미노산 872 내지 885에 상응하는 영역 5, 및 서열식별번호: 2의 아미노산 903 내지 1004에 상응하는 영역 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 영역의 1개 이상의 위치에서 변경 (예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입)을 포함하는, 본 발명의 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 변이체는 서열식별번호: 2와 적어도 60% 및 100% 미만의 서열 동일성을 갖고, 바람직하게는 상기 변이체는 크산탄 검에 대해 활성을 갖고, 추가로 바람직하게는 상기 활성은 크산탄 검 분해 활성이다.

한 실시양태에서 본 발명은 서열식별번호: 2의 아미노산 154 내지 176에 상응하는 영역 1, 서열식별번호: 2의 아미노산 614 내지 658에 상응하는 영역 2, 서열식별번호: 2의 아미노산 731 내지 803에 상응하는 영역 3, 서열식별번호: 2의 아미노산 807 내지 846에 상응하는 영역 4, 서열식별번호: 2의 아미노산 872 내지 885에 상응하는 영역 5, 및 서열식별번호: 2의 아미노산 903 내지 1004에 상응하는 영역 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 (예를 들어, 서열식별번호: 2의 또는 또 다른 모 크산탄 리아제의) 1개의 영역에서 다중 변경 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)을 갖는 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 변이체는 서열식별번호: 2와 적어도 60% 및 100% 미만의 서열 동일성을 갖고, 바람직하게는 상기 변이체는 크산탄 검에 대해 활성을 갖고, 추가로 바람직하게는 상기 활성은 크산탄 검 분해 활성이다.

한 실시양태에서 본 발명은 서열식별번호: 2의 아미노산 154 내지 176에 상응하는 영역 1, 서열식별번호: 2의 아미노산 614 내지 658에 상응하는 영역 2, 서열식별번호: 2의 아미노산 731 내지 803에 상응하는 영역 3, 서열식별번호: 2의 아미노산 807 내지 846에 상응하는 영역 4, 서열식별번호: 2의 아미노산 872 내지 885에 상응하는 영역 5, 및 서열식별번호: 2의 아미노산 903 내지 1004에 상응하는 영역 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 (예를 들어, 서열식별번호: 2의 또는 또 다른 모 크산탄 리아제의) 다중 영역 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)에서 다중 변경 (예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개)을 갖는 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 변이체는 서열식별번호: 2와 적어도 60% 및 100% 미만의 서열 동일성을 갖고, 바람직하게는 상기 변이체는 크산탄 검에 대해 활성을 갖고, 추가로 바람직하게는 상기 활성은 크산탄 검 분해 활성이다.

한 실시양태에서 본 발명은 성숙 모 폴리펩티드 (예를 들어, 서열식별번호: 2)의 1개 이상의 위치에서 변경 (예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입)을 포함하는 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이며, 여기서 각각의 변경은 독립적으로 치환, 삽입 또는 결실이고, 여기서 변이체는 크산탄 리아제 활성을 갖는다.

한 실시양태에서, 변이체는 모 크산탄 리아제의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%이나, 100% 미만의 서열 동일성을 갖는다.

한 실시양태에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드와 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 예컨대 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%이나, 100% 미만의 서열 동일성을 갖는다.

한 실시양태에서 본 발명은 서열식별번호: 2와 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는, 본원에 기재된 바와 같은 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 155, 159, 620, 624, 626, 631, 635, 645, 649, 650, 656, 738, 745, 746, 748, 752, 753, 754, 757, 764, 769, 774, 775, 777, 779, 782, 785, 786, 789, 792, 796, 799, 800, 801, 819, 824, 843, 845, 875, 903, 911, 912, 915, 919, 921, 923, 925, 927, 928, 930, 932, 933, 941, 966, 967, 991 및 998에 상응하는 1개 이상의 위치에서 변경을 포함한다. 또 다른 측면에서, 변이체는 위치 155, 159, 620, 624, 626, 631, 635, 645, 649, 650, 656, 738, 745, 746, 748, 752, 753, 754, 757, 764, 769, 774, 775, 777, 779, 782, 785, 786, 789, 792, 796, 799, 800, 801, 819, 824, 843, 845, 875, 903, 911, 912, 915, 919, 921, 923, 925, 927, 928, 930, 932, 933, 941, 966, 967, 991 및 998 중 임의의 것에 상응하는 2개의 위치에서 변경을 포함한다. 또 다른 측면에서, 변이체는 위치 155, 159, 620, 624, 626, 631, 635, 645, 649, 650, 656, 738, 745, 746, 748, 752, 753, 754, 757, 764, 769, 774, 775, 777, 779, 782, 785, 786, 789, 792, 796, 799, 800, 801, 819, 824, 843, 845, 875, 903, 911, 912, 915, 919, 921, 923, 925, 927, 928, 930, 932, 933, 941, 966, 967, 991 및 998 중 임의의 것에 상응하는 3개의 위치에서 변경을 포함한다. 또 다른 측면에서, 변이체는 위치 155, 159, 620, 624, 626, 631, 635, 645, 649, 650, 656, 738, 745, 746, 748, 752, 753, 754, 757, 764, 769, 774, 775, 777, 779, 782, 785, 786, 789, 792, 796, 799, 800, 801, 819, 824, 843, 845, 875, 903, 911, 912, 915, 919, 921, 923, 925, 927, 928, 930, 932, 933, 941, 966, 967, 991 및 998에 상응하는 4개 이상의 위치, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 위치에서 변경을 포함한다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 155에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 155에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 Y155E를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 159에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 159에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 치환 A159P를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 620에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 620에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 K620R을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 624에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 624에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 A624E를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 626에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 626에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 A626Q를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 631에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 631에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 T631N 또는 T631E를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 위치 631에 상응하는 위치에서의 바람직한 치환은 T631N이다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 635에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 635에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 치환 S635E, S635T 또는 S635Q를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 위치 635에 상응하는 위치에서의 바람직한 치환은 S635E이다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 649에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 649에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 T649V, T649K 또는 T649R을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 위치 649에 상응하는 위치에서의 바람직한 치환은 T649K이다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 650에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 650에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 Q650G를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 656에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 656에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 I656V를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 738에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 738에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 G738L을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 745에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 745에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 K745R을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 746에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 746에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 F746L을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 748에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 748에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 L748T를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 752에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 752에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 P752R 또는 P752K를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 753에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 753에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 G753E, G753Q 또는 G753S를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 위치 753에 상응하는 위치에서의 바람직한 치환은 G753E이다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 754에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 754에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 S754E, S754L, S754Q 또는 S754R을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 위치 754에 상응하는 위치에서의 바람직한 치환은 S754E 또는 S754R이다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 757에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 757에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 S757D, S757P 또는 S757E를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 위치 757에 상응하는 위치에서의 바람직한 치환은 S757D이다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 764에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 764에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 P764V 또는 P764K를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 위치 764에 상응하는 위치에서의 바람직한 치환은 P764V이다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 769에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 769에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 변경 A769D, A769T, A769R, A769S, A769E, A769Q 또는 A769*를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 위치 769에 상응하는 위치에서의 바람직한 치환은 A769D이다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 774에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 774에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 A774V를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 775에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 775에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 L775A 또는 L775F 또는 L775I 또는 L775M 또는 L775Q 또는 L775S 또는 L775Y를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 위치 775에 상응하는 위치에서의 바람직한 치환은 L775M, L775Y 또는 L775A이다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 779에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 779에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 P779V를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 782에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 782에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 치환 Y782I를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 786에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 786에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 치환 N786K를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 789에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 789에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 치환 G789R을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 792에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 792에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 K792W, K792Y, K792V 또는 K792A를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 위치 792에 상응하는 위치에서의 바람직한 치환은 K792W 또는 K792Y이다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 796에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 796에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 N796Q를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 799에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 799에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 A799H를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 800에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 800에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 V800P를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 801에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 801에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 D801G를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 819에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 819에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 K819R 또는 K819T를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 위치 819에 상응하는 위치에서의 바람직한 치환은 K819R 또는 K819T이다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 824에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 824에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 K824R을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 843에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 843에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 치환 A843P를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 845에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 845에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 위치 845에 상응하는 위치에서의 바람직한 치환은 D845E이다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 875에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 875에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 K875T 또는 K875E를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 위치 875에 상응하는 위치에서의 바람직한 치환은 K875T이다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 903에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 903에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 T903A 또는 T903Q를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 911에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 911에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 A911M, A911V 또는 A911S를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 위치 911에 상응하는 위치에서의 바람직한 치환은 A911V이다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 912에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 912에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 A912I 또는 A912T 또는 A912Y를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 위치 912에 상응하는 위치에서의 바람직한 치환은 A912T이다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 915에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 915에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 T915S, T915Q, T915A 또는 T915V를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 919에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 919에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 T919D, T919F 또는 T919G를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 921에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 921에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 T921R 또는 T921S를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 923에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 923에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 T923D 또는 T923H를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 925에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 925에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 T925D 또는 T925Q 또는 T925R을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 927에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 927에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 T927K를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 928에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 928에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 D928W를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 930에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 930에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 Y930F 또는 Y930H 또는 Y930L을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 933에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 933에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 D933M을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 941에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 941에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 G941D 또는 G941E를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 966에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 966에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 A966P를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 991에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 991에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 N991D를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

또 다른 측면에서, 변이체는 위치 998에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 위치 998에 상응하는 위치의 아미노산은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val로 치환된다. 또 다른 측면에서, 변이체는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 치환 V998K를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.

한 실시양태에서 본 발명은 위치: 서열식별번호: 2의 155, 159, 620, 624, 626, 631, 635, 645, 649, 650, 656, 738, 745, 746, 748, 752, 753, 754, 757, 764, 769, 774, 775, 777, 779, 782, 785, 786, 789, 792, 796, 799, 800, 801, 819, 824, 843, 845, 875, 903, 911, 912, 915, 919, 921, 923, 925, 927, 928, 930, 932, 933, 941, 966, 967, 991 및 998로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 변경을 갖는 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이며, 여기서 각각의 위치는 서열식별번호: 2의 위치에 상응한다.

한 실시양태에서 본 발명은 Y155E, A159P, K620R, A624E, A626G, T631N, T631E, S635E, S635T, S635Q, A645S, T649V, T649K, T649R, Q650G, I656V, G738L, K745R, F746L, L748T, P752R, P752K, G753E, G753Q, G753S, S754E, S754L, S754Q, S754R, S757D, S757P, S757E, P764V, P764K, A769D, A769T, A769R, A769S, A769E, A769Q, A769*, A774V, L775M, L775Y, L775A, L775I, L775S, L775F, L775Q, D777K, D777R, P779V, Y782I, A785T, N786K, G789R, K792W, K792Y, K792V, K792A, N796Q, A799H, V800P, D801G, K819R, K819T, K824R, A843P, D845E, K875T, K875E, T903A, T903Q, A911V, A911M, A911S, A912T, A912I, A912Y, T915Q, T915S, T915V, T915A, T919F, T919G, T919D, T921R, T921S, T923H, T923D, T925Q, T925D, T925R, T927K, D928W, Y930H, Y930L, Y930F, A932P, D933M, G941E, G941D, A966P, A967D, N991D 및 V998K로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 변경을 갖는 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이며, 여기서 넘버링은 서열식별번호: 2에 따른다.

특정한 실시양태에서, 본 발명은 본원의 표 1에 제시된 크산탄 리아제 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.

특정한 실시양태에서, 본 발명은 본원의 표 2에 제시된 크산탄 리아제 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.

특정한 실시양태에서, 본 발명은 본원의 표 3에 제시된 크산탄 리아제 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.

특정한 실시양태에서, 본 발명은 본원의 표 4에 제시된 크산탄 리아제 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.

특정한 실시양태에서, 본 발명은 본원의 표 5에 제시된 크산탄 리아제 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.

특정한 실시양태에서, 본 발명은 본원의 표 6에 제시된 크산탄 리아제 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.

특정한 실시양태에서, 본 발명은 본원의 표 7에 제시된 크산탄 리아제 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.

특정한 실시양태에서, 본 발명은 본원의 표 8에 제시된 크산탄 리아제 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.

특정한 실시양태에서, 본 발명은 본원의 표 9에 제시된 크산탄 리아제 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.

특정한 실시양태에서, 본 발명은 본원의 표 10에 제시된 크산탄 리아제 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.

특정한 실시양태에서, 본 발명은 본원의 표 11에 제시된 크산탄 리아제 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.

특정한 실시양태에서, 본 발명은 본원의 표 12에 제시된 크산탄 리아제 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.

특정한 실시양태에서, 본 발명은 본원의 표 13에 제시된 크산탄 리아제 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.

변이체는 1개 이상의 다른 위치에 1개 이상의 추가의 변경을 추가로 포함할 수 있다.

아미노산 변화는 경도의 속성일 수 있고, 즉 단백질의 폴딩 및/또는 활성에 유의한 영향을 미치지 않는 보존적 아미노산 치환 또는 삽입; 전형적으로 1-30개 아미노산의 작은 결실; 작은 아미노- 또는 카르복실-말단 연장, 예컨대 아미노-말단 메티오닌 잔기; 20-25개 이하 잔기의 작은 링커 펩티드; 또는 알짜 전하 또는 또 다른 기능, 예컨대 폴리-히스티딘 트랙트, 항원성 에피토프 또는 결합 도메인를 변화시킴으로써 정제를 용이하게 하는 작은 연장일 수 있다.

보존적 치환의 예는 염기성 아미노산 (아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산 (글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산 (글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산 (류신, 이소류신 및 발린), 방향족 아미노산 (페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 및 작은 아미노산 (글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌 및 메티오닌)의 군 내이다. 특이적 활성을 일반적으로 변경시키지 않는 아미노산 치환이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [H. Neurath and R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York]에 기재되어 있다. 통상적인 치환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 및 Asp/Gly이다.

대안적으로, 아미노산 변화는 폴리펩티드의 물리-화학적 특성을 변경시키는 이러한 속성의 것이다. 예를 들어, 아미노산 변화는 폴리펩티드의 열적 안정성을 개선시키고, 기질 특이성을 변경시키고, pH 최적을 변화시킬 수 있는 것 등이다.

폴리펩티드에서 필수 아미노산은 관련 기술분야에 공지된 절차, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발에 따라 확인될 수 있다 (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). 후자의 기술에서, 단일 알라닌 돌연변이는 분자의 모든 잔기에 도입되고, 생성된 돌연변이체 분자는 분자의 활성에 중요한 아미노산 잔기를 확인하기 위해 크산탄 리아제 활성에 대해 시험된다. 또한, 문헌 [Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708]을 참조한다. 효소 또는 다른 생물학적 상호작용의 활성 부위는 또한 추정 접촉 부위 아미노산의 돌연변이와 함께, 핵 자기 공명, 결정학, 전자 회절 또는 광친화성 표지화와 같은 기술에 의해 결정되는 바와 같은, 구조의 물리적 분석에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64]을 참조한다. 필수 아미노산의 동일성은 또한 관련 폴리펩티드와의 정렬로부터 추론될 수 있다.

한 실시양태에서 본 발명은 서열식별번호: 2와 비교하여 1 내지 20개, 예를 들어 1 내지 10개 또는 1 내지 5개, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 변경의, 변경의 총수를 갖는 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.

한 실시양태에서 본 발명은 크산탄 검에 대한 활성을 갖는 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이고, 바람직하게는 상기 크산탄 검에 대한 활성은 크산탄 검 분해 활성이고, 추가로 바람직하게는 상기 크산탄 검 분해 활성은 EC 4.2.2.12 활성이다.

한 실시양태에서, 변이체는 모 효소 (예를 들어, 서열식별번호: 2)와 비교하여 세제 조성물에서 개선된 안정성을 갖는다.

한 실시양태에서 본 발명은 (예를 들어, 서열식별번호: 2를 갖는) 모 크산탄 리아제와 비교하여 세제 조성물에서 개선된 안정성을 갖는 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이고; 바람직하게는 상기 세제 조성물 (여기서 이는 개선된 안정성을 가짐, 및 임의로 또한 본 발명의 세제 조성물)은 킬레이트화제를 포함하고; 추가로 바람직하게는 상기 킬레이트화제는 EDTA 또는 시트레이트이다.

한 실시양태에서 본 발명은 모 크산탄 리아제에 비해 ≥1.0의 반감기 개선 지수 (HIF); 바람직하게는 >1.0의 반감기 개선 지수 (HIF)를 갖는 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 변이체의 반감기 개선 지수 (HIF)는 적어도 1.2, 예컨대 적어도 1.5, 예를 들어 적어도 2.0, 적어도 3.0, 적어도 4.0 또는 적어도 5.0이다. 반감기 개선 지수 (HIF)를 계산하는 바람직한 방법은 본원의 실시예 4에 기재되어 있다.

한 실시양태에서 본 발명은 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이며, 여기서 반감기 개선 지수 (HIF)는 세제 조성물 중 25℃ 또는 30℃에서의 약 30분 내지 약 20시간의 기간 동안의 상기 크산탄 리아제 변이체의 인큐베이션 후에 결정된다.

모 효소

모 크산탄 리아제는 (a) 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드와 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드; (b) 낮은 엄격도 조건 하에 (i) 서열식별번호: 1의 성숙 폴리펩티드 코딩 서열, 또는 (ii) (i)의 전장 상보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드; 또는 (c) 서열식별번호: 1의 성숙 폴리펩티드 코딩 서열과 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드일 수 있다.

한 측면에서, 모 효소는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드와 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖고, 크산탄 리아제 활성을 갖는다. 한 측면에서, 모 효소의 아미노산 서열은 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드와 최고 10개의 아미노산만큼, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개만큼 상이하다.

또 다른 측면에서, 모 효소는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 모 효소는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 측면에서, 모 효소는 서열식별번호: 2의 아미노산의 수의 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95%를 함유하는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 모 효소는 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 대립유전자 변이체이다.

또 다른 측면에서, 모 효소는 매우 낮은 엄격도 조건, 낮은 엄격도 조건, 중간 엄격도 조건, 중간-높은 엄격도 조건, 높은 엄격도 조건, 또는 매우 높은 엄격도 조건 하에 (i) 서열식별번호: 1의 성숙 폴리펩티드 코딩 서열 또는 (ii) (i)의 전장 상보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다 (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York).

서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 하위서열, 뿐만 아니라 서열식별번호: 2의 폴리펩티드 또는 그의 단편은 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 따라 상이한 속 또는 종의 균주로부터 모 효소를 코딩하는 DNA를 확인하고 클로닝하기 위해 핵산 프로브를 설계하는데 사용될 수 있다. 특히, 이러한 프로브는 관심 세포의 게놈 DNA 또는 cDNA 내의 상응하는 유전자를 확인하고 단리하기 위해 표준 서던 블롯팅 절차에 따라 관심 세포의 게놈 DNA 또는 cDNA와의 혼성화에 사용될 수 있다. 이러한 프로브는 전체 서열보다 상당히 더 짧을 수 있지만, 적어도 15, 예를 들어, 적어도 25, 적어도 35, 또는 적어도 70개 뉴클레오티드 길이이어야 한다. 바람직하게는, 핵산 프로브는 적어도 100개 뉴클레오티드 길이, 예를 들어, 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드, 적어도 500개 뉴클레오티드, 적어도 600개 뉴클레오티드, 적어도 700개 뉴클레오티드, 적어도 800개 뉴클레오티드, 또는 적어도 900개 뉴클레오티드 길이이다. DNA 및 RNA 프로브 둘 다가 사용될 수 있다. 프로브는 전형적으로 상응하는 유전자를 검출하기 위해 (예를 들어, ³²P, ³H, ³⁵S, 비오틴 또는 아비딘으로) 라벨링된다. 이러한 프로브는 본 발명에 포괄된다.

이러한 다른 균주로부터 제조된 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리는 상기 기재된 프로브와 혼성하고 모 효소를 코딩하는 DNA에 대해 스크리닝될 수 있다. 이러한 다른 균주로부터의 게놈 또는 다른 DNA는 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 또는 다른 분리 기술에 의해 분리될 수 있다. 라이브러리로부터의 DNA 또는 분리된 DNA는 니트로셀룰로스 또는 다른 적합한 캐리어 물질 위로 옮겨져 고정될 수 있다. 서열식별번호: 1 또는 그의 하위서열과 혼성하는 클론 또는 DNA를 확인하기 위해, 캐리어 물질이 서던 블롯에 사용된다.

본 발명의 목적상, 혼성화는 폴리뉴클레오티드가 매우 낮은 내지 매우 높은 엄격도 조건 하에 (i) 서열식별번호: 1; (ii) 서열식별번호: 1의 성숙 폴리펩티드 코딩 서열; (iii) 그의 전장 상보체; 또는 (iv) 그의 하위서열에 상응하는 표지된 핵산 프로브와 혼성화하는 것을 나타낸다. 이들 조건 하에 핵산 프로브가 혼성화하는 분자는, 예를 들어, X선 필름 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 검출 수단을 사용하여 검출될 수 있다.

한 측면에서, 핵산 프로브는 서열식별번호: 1의 성숙 폴리펩티드 코딩 서열이다. 또 다른 측면에서, 핵산 프로브는 서열식별번호: 2의 폴리펩티드; 그의 성숙 폴리펩티드; 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 또 다른 측면에서, 핵산 프로브는 서열식별번호: 1이다.

또 다른 실시양태에서, 모 효소는 서열식별번호: 1의 성숙 폴리펩티드 코딩 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.

폴리펩티드는 하나의 폴리펩티드의 영역이 또 다른 폴리펩티드의 영역의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 하이브리드 폴리펩티드일 수 있다.

모 효소는 또 다른 폴리펩티드가 본 발명의 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 융합 폴리펩티드 또는 절단가능한 융합 폴리펩티드일 수 있다. 융합 폴리펩티드는 또 다른 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 융합시키는 것에 의해 생산된다. 융합 폴리펩티드를 생산하는 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 서열을 인 프레임으로, 융합 폴리펩티드의 발현이 동일한 프로모터(들) 및 종결인자의 제어 하에 있도록 라이게이션하는 것을 포함한다. 융합 폴리펩티드는 또한 인테인 기술을 사용하여 구축될 수 있고, 여기서 번역후 융합 폴리펩티드가 생성된다 (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

융합 폴리펩티드는 추가로 2개의 폴리펩티드 사이에 절단 부위를 포함할 수 있다. 융합 단백질의 분비 시, 부위는 절단되어 2개의 폴리펩티드를 방출한다. 절단 부위의 예는 문헌 [Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; 및 Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; 및 Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48]에 개시된 부위를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

모 효소는 임의의 속의 미생물로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 목적상, 주어진 공급원과 관련하여 본원에 사용된 용어 "로부터 수득된"은 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 모 효소가 상기 공급원에 의해 생산되거나, 또는 공급원으로부터의 폴리뉴클레오티드가 삽입된 균주에 의해 생산된다는 것을 의미할 것이다. 한 측면에서, 모 효소는 세포외 분비된다.

모 효소는 박테리아 효소일 수 있다. 예를 들어, 모 효소는 그람-양성 박테리아 폴리펩티드 예컨대 바실루스(Bacillus), 클로스트리디움(Clostridium), 엔테로코쿠스(Enterococcus), 게오바실루스(Geobacillus), 락토바실루스(Lactobacillus), 락토코쿠스(Lactococcus), 오세아노바실루스(Oceanobacillus), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 또는 스트렙토미세스(Streptomyces) 효소, 또는 그람-음성 박테리아 폴리펩티드 예컨대 캄필로박터(Campylobacter), 이. 콜라이(E. coli), 플라보박테리움(Flavobacterium), 푸소박테리움(Fusobacterium), 헬리코박터(Helicobacter), 일리오박터(Ilyobacter), 네이세리아(Neisseria), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella), 또는 우레아플라스마(Ureaplasma) 효소일 수 있다.

한 측면에서, 모 효소는 바실루스 알칼로필루스(Bacillus alkalophilus), 바실루스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실루스 브레비스(Bacillus brevis), 바실루스 시르쿨란스(Bacillus circulans), 바실루스 클라우시이(Bacillus clausii), 바실루스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실루스 피르무스(Bacillus firmus), 바실루스 라우투스(Bacillus lautus), 바실루스 렌투스(Bacillus lentus), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실루스 푸밀루스(Bacillus pumilus), 바실루스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis) 효소이다.

또 다른 측면에서, 모 효소는 스트렙토코쿠스 에퀴시밀리스(Streptococcus equisimilis), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 우베리스(Streptococcus uberis), 또는 스트렙토코쿠스 에퀴 아종 주에피데미쿠스(Zooepidemicus) 효소이다.

또 다른 측면에서, 모 효소는 스트렙토미세스 아크로모게네스(Streptomyces achromogenes), 스트렙토미세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis), 스트렙토미세스 코엘리콜로르(Streptomyces coelicolor), 스트렙토미세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 또는 스트렙토미세스 리비단스(Streptomyces lividans) 효소이다.

모 효소는 진균 효소일 수 있다. 예를 들어, 모 효소는 효모 효소 예컨대 칸디다(Candida), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 사카로미세스(Saccharomyces), 쉬조사카로미세스(Schizosaccharomyces) 또는 야로위아(Yarrowia) 효소; 또는 사상 진균 효소 예컨대 아크레모니움(Acremonium), 아가리쿠스(Agaricus), 알테르나리아(Alternaria), 아스페르길루스(Aspergillus), 아우레오바시디움(Aureobasidium), 보트리오스파에리아(Botryosphaeria), 세리포리옵시스(Ceriporiopsis), 카에토미디움(Chaetomidium), 크리소스포리움(Chrysosporium), 클라비셉스(Claviceps), 코클리오볼루스(Cochliobolus), 코프리놉시스(Coprinopsis), 코프토테르메스(Coptotermes), 코리나스쿠스(Corynascus), 크리포넥트리아(Cryphonectria), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 디플로디아(Diplodia), 엑시디아(Exidia), 필로바시디움(Filobasidium), 푸사리움(Fusarium), 지베렐라(Gibberella), 홀로마스티고토이데스(Holomastigotoides), 휴미콜라(Humicola), 이프렉스(Irpex), 렌티눌라(Lentinula), 렙토스파에리아(Leptosphaeria), 마그나포르테(Magnaporthe), 멜라노카르푸스(Melanocarpus), 메리필루스(Meripilus), 뮤코르(Mucor), 미셀리오프토라(Myceliophthora), 네오칼리마스틱스(Neocallimastix), 뉴로스포라(Neurospora), 파에실로미세스(Paecilomyces), 페니실리움(Penicillium), 파네로카에테(Phanerochaete), 피로미세스(Piromyces), 포이트라시아(Poitrasia), 슈도플렉타니아(Pseudoplectania), 슈도트리코님파(Pseudotrichonympha), 리조뮤코르(Rhizomucor), 쉬조필룸(Schizophyllum), 스키탈리디움(Scytalidium), 탈라로미세스(Talaromyces), 써모아스쿠스(Thermoascus), 티엘라비아(Thielavia), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 트리코더마(Trichoderma), 트리코파에아(Trichophaea), 베르티실리움(Verticillium), 볼바리엘라(Volvariella), 또는 크실라리아(Xylaria) 효소일 수 있다.

또 다른 측면에서, 모 효소는 사카로미세스 칼스베르겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로미세스 디아스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus), 사카로미세스 도우글라시이(Saccharomyces douglasii), 사카로미세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 사카로미세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis) 또는 사카로미세스 오비포르미스(Saccharomyces oviformis) 효소이다.

또 다른 측면에서, 모 효소는 아크레모니움 셀룰롤리티쿠스(Acremonium cellulolyticus), 아스페르길루스 아쿨레아투스(Aspergillus aculeatus), 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스페르길루스 포에티두스(Aspergillus foetidus), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 자포니쿠스(Aspergillus japonicus), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae), 크리소스포리움 이놉스(Chrysosporium inops), 크리소스포리움 케라티노필룸(Chrysosporium keratinophilum), 크리소스포리움 룩크노웬세(Chrysosporium lucknowense), 크리소스포리움 메르다리움(Chrysosporium merdarium), 크리소스포리움 판니콜라(Chrysosporium pannicola), 크리소스포리움 퀸스란디쿰(Chrysosporium queenslandicum), 크리소스포리움 트로피쿰(Chrysosporium tropicum), 크리소스포리움 조나툼(Chrysosporium zonatum), 푸사리움 박트리디오이데스(Fusarium bactridioides), 푸사리움 세레알리스(Fusarium cerealis), 푸사리움 크루크웰렌세(Fusarium crookwellense), 푸사리움 쿨모룸(Fusarium culmorum), 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 그라미눔(Fusarium graminum), 푸사리움 헤테로스포룸(Fusarium heterosporum), 푸사리움 네군디(Fusarium negundi), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 푸사리움 레티쿨라툼(Fusarium reticulatum), 푸사리움 로세움(Fusarium roseum), 푸사리움 삼부시눔(Fusarium sambucinum), 푸사리움 사르코크로움(Fusarium sarcochroum), 푸사리움 스포로트리키오이데스(Fusarium sporotrichioides), 푸사리움 술푸레움(Fusarium sulphureum), 푸사리움 토루로숨(Fusarium torulosum), 푸사리움 트리코테키오이데스(Fusarium trichothecioides), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum), 휴미콜라 그리세아(Humicola grisea), 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens), 휴미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa), 이르펙스 락테우스(Irpex lacteus), 뮤코르 미에헤이(Mucor miehei), 미셀리오프토라 써모필라(Myceliophthora thermophila), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 페니실리움 푸니쿨로숨(Penicillium funiculosum), 페니실리움 푸르푸로게눔(Penicillium purpurogenum), 파네로카에테 크리소스포리움(Phanerochaete chrysosporium), 티엘라비아 아크로마티카(Thielavia achromatica), 티엘라비아 알보미세스(Thielavia albomyces), 티엘라비아 알보필로사(Thielavia albopilosa), 티엘라비아 아우스트랄리엔시스(Thielavia australiensis), 티엘라비아 피메티(Thielavia fimeti), 티엘라비아 미크로스포라(Thielavia microspora), 티엘라비아 오비스포라(Thielavia ovispora), 티엘라비아 페루비아나(Thielavia peruviana), 티엘라비아 세토사(Thielavia setosa), 티엘라비아 스페데도니움(Thielavia spededonium), 티엘라비아 서브써모필라(Thielavia subthermophila), 티엘라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris), 트리코더마 하르지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코더마 코닌기이(Trichoderma koningii), 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum), 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei) 또는 트리코더마 비리데(Trichoderma viride) 효소이다.

또 다른 측면에서, 모 효소는 파에니바실루스 종 크산탄 리아제, 예를 들어, 서열식별번호: 2의 크산탄 리아제이다.

상기 언급된 종의 경우, 본 발명은 공지된 종 명칭에 관계없이, 완전한 상태 및 불완전한 상태 둘 다, 및 다른 분류학상 등가물, 예를 들어, 불완전세대를 포괄하는 것으로 이해될 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 적절한 등가물의 실체를 용이하게 인지할 것이다.

이들 종의 균주는 수많은 컬쳐 콜렉션, 예컨대 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (ATCC), 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) (DSMZ), 센트라알부레아우 부르 쉼멜쿨투레스(Centraalbureau Voor Schimmelcultures) (CBS), 및 아그리컬쳐럴 리서치 서비스 페이턴트 컬쳐 콜렉션(Agricultural Research Service Patent Culture Collection), 노던 리져널 리서치 센터(Northern Regional Research Center) (NRRL)에서 대중이 용이하게 접근가능하다.

모 효소는 자연 (예를 들어, 토양, 퇴비, 물 등)으로부터 단리된 미생물 또는 상기-언급된 프로브를 사용하여 천연 물질 (예를 들어, 토양, 퇴비, 물 등)로부터 직접적으로 수득된 DNA 샘플을 포함한 다른 공급원으로부터 확인되고 수득될 수 있다. 천연 서식지로부터 미생물 및 DNA를 직접적으로 단리하는 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 모 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 이어서 또 다른 미생물 또는 혼합된 DNA 샘플의 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 유사하게 스크리닝함으로써 수득될 수 있다. 모 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 프로브(들)에 의해 검출되면, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 기술을 사용하여 폴리뉴클레오티드가 단리되고 클로닝될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Sambrook et al., 1989, 상기 문헌] 참조).

변이체의 제조

크산탄 리아제 활성을 갖는 변이체를 수득하는 방법은 (a) 모 크산탄 리아제 내로 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 위치 155, 159, 620, 624, 626, 631, 635, 645, 649, 650, 656, 738, 745, 746, 748, 752, 753, 754, 757, 764, 769, 774, 775, 777, 779, 782, 785, 786, 789, 792, 796, 799, 800, 801, 819, 824, 843, 845, 875, 903, 911, 912, 915, 919, 921, 923, 925, 927, 928, 930, 932, 933, 941, 966, 967, 991 및 998에 상응하는 1개 이상의 위치에 변경을 도입하는 단계이며, 여기서 변이체는 크산탄 리아제 활성을 갖는 것인 단계; 및 (b) 변이체를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

변이체는 관련 기술분야에 공지된 임의의 돌연변이유발 절차, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발, 합성 유전자 구축, 반합성 유전자 구축, 무작위 돌연변이유발, 셔플링 등을 사용하여 제조될 수 있다.

부위-지정 돌연변이유발은 모 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 1개 이상의 한정된 부위에 1개 이상의 돌연변이를 도입하는 기술이다.

부위-지정 돌연변이유발은 목적하는 돌연변이를 함유하는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 사용을 수반하는 PCR에 의해 시험관내 달성될 수 있다. 부위-지정 돌연변이유발은 또한 모 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 내 부위의 제한 효소에 의한 절단 및 폴리뉴클레오티드 내 돌연변이를 함유하는 올리고뉴클레오티드의 후속 라이게이션을 수반하는 카세트 돌연변이유발에 의해 시험관내 수행될 수 있다. 통상적으로 플라스미드 및 올리고뉴클레오티드를 소화시키는 제한 효소는 동일하고, 이는 플라스미드 및 삽입물의 점착성 말단이 서로 라이게이션되게 한다. 예를 들어, 문헌 [Scherer and Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955; 및 Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966]을 참조한다.

부위-지정 돌연변이유발은 또한 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 생체내 달성될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0171154; 문헌 [Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290; 및 Calissano and Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16]을 참조한다.

임의의 부위-지정 돌연변이유발 절차가 본 발명에서 사용될 수 있다. 변이체를 제조하는데 사용될 수 있는 이용가능한 많은 상업용 키트가 존재한다.

합성 유전자 구축은 관심 폴리펩티드를 코딩하기 위해 설계된 폴리뉴클레오티드 분자의 시험관내 합성을 수반한다. 유전자 합성은 수많은 기술, 예컨대 문헌 [Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054)]에 기재된 멀티플렉스 마이크로칩-기반 기술, 및 올리고뉴클레오티드가 합성되고 광-프로그램가능한 마이크로유체 칩 상에서 어셈블리되는 유사한 기술을 사용하여 수행될 수 있다.

단일 또는 다중 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입은 돌연변이유발, 재조합, 및/또는 셔플링에 이은 관련 스크리닝 절차, 예컨대 문헌 [Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156]; WO 95/17413; 또는 WO 95/22625에 개시된 것의 공지된 방법을 사용하여 이루어질 수 있고 시험될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 방법은 오류-유발 PCR, 파지 디스플레이 (예를 들어, 문헌 [Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837]; 미국 특허 번호 5,223,409; WO 92/06204) 및 영역-지정 돌연변이유발 (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127)을 포함한다.

돌연변이유발/셔플링 방법은 숙주 세포에 의해 발현된 클로닝된, 돌연변이유발된 폴리펩티드의 활성을 검출하기 위해 고처리량, 자동화 스크리닝 방법과 조합될 수 있다 (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). 활성 폴리펩티드를 코딩하는 돌연변이유발된 DNA 분자는 숙주 세포로부터 회수될 수 있고, 관련 기술분야의 표준 방법을 사용하여 신속하게 서열분석될 수 있다. 이들 방법은 폴리펩티드 내 중요한 개별 아미노산 잔기의 신속한 결정을 가능하게 한다.

반합성 유전자 구축은 합성 유전자 구축 및/또는 부위-지정 돌연변이유발 및/또는 무작위 돌연변이유발 및/또는 셔플링의 측면을 조합하는 것에 의해 달성된다. 반합성 구축은, PCR 기술과 조합하여, 합성된 폴리뉴클레오티드 단편을 사용하는 과정에 의해 전형화된다. 따라서 유전자의 규정된 영역이 신생 합성될 수 있는 한편, 부위-특이적 돌연변이유발 프라이머를 사용하여 다른 영역이 증폭될 수 있는 한편, 또 다른 영역은 오류-유발 PCR 또는 비-오류 유발 PCR 증폭에 적용될 수 있다. 이어서 폴리뉴클레오티드 하위서열이 셔플링될 수 있다.

실시양태

한 실시양태에서 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 적어도 1종 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10종)의 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.

한 실시양태에서 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 적어도 1종 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10종)의 크산탄 리아제 변이체를 포함하고, 추가로 1종 이상의 세제 성분을 포함하는 세제 조성물에 관한 것이며; 바람직하게는 상기 세제 성분은 킬레이트화제를 포함하고; 추가로 바람직하게는 상기 킬레이트화제는 EDTA 또는 시트레이트이다.

한 실시양태에서 본 발명은 적어도 1종 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10종)의 크산탄 리아제 변이체를 포함하고, 추가로 엔도글루카나제, 프로테아제, 아밀라제, 리파제, 큐티나제, 셀룰라제, 크산탄 리아제, 크실로글루카나제, 펙티나제, 펙틴 리아제, 크산타나제, 퍼옥시다제, 할로퍼옥시게나제, 카탈라제 및 만난아제, 또는 그의 임의의 혼합물을 포함하거나 또는 이로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 추가의 효소를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다.

한 실시양태에서 본 발명은 적어도 1종 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10종)의 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 조성물은 엔도글루카나제, 프로테아제, 아밀라제, 리파제, 큐티나제, 셀룰라제, 크산탄 리아제, 크실로글루카나제, 펙티나제, 펙틴 리아제, 크산타나제, 퍼옥시다제, 할로퍼옥시게나제, 카탈라제 및 만난아제, 또는 그의 임의의 혼합물을 포함하거나 또는 이로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 세제 성분 및 1종 이상의 추가의 효소를 추가로 포함하고, 바람직하게는 상기 세제 성분은 킬레이트화제를 포함하고; 추가로 바람직하게는 상기 킬레이트화제는 EDTA 또는 시트레이트이다.

한 실시양태에서 본 발명은 적어도 1종 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10종)의 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 조성물은 1종 이상의 세제 성분을 추가로 포함하고, 여기서 상기 세제 조성물은 바, 균질 정제, 2개 이상의 층을 갖는 정제, 1개 이상의 구획을 갖는 파우치, 레귤러 또는 콤팩트 분말, 과립, 페이스트, 겔, 또는 레귤러, 콤팩트 또는 농축 액체의 형태이다.

한 실시양태에서 본 발명은 본 발명의 세제 조성물의 용도에 관한 것이며, 여기서 상기 용도는 크산탄 검을 분해하는 용도 및 세정 과정, 예컨대 세탁 또는 경질 표면 세정 예컨대 식기 세척에서의 용도를 포함하거나 또는 이로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 실시양태에서 본 발명은 본 발명의 세제 조성물의 용도에 관한 것이며, 여기서 상기 세제 조성물은 효소 세제력 이익을 갖는다

한 실시양태에서 본 발명은 본 발명의 세제 조성물을 크산탄 검에 적용하는 것을 포함하는 크산탄 검을 분해하는 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서 본 발명은 본 발명의 세제 조성물을 크산탄 검에 적용하는 것을 포함하는 크산탄 검을 분해하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 크산탄 검은 텍스타일 또는 경질 표면, 예컨대 식기 세척의 표면 상에 존재한다.

폴리뉴클레오티드

본 발명의 변이체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 본원에 개시된다. 변이체를 코딩하는 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 (a) i) 서열식별번호: 2의 아미노산 154 내지 176에 상응하는 영역 1, ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 614 내지 658에 상응하는 영역 2, iii) 서열식별번호: 2의 아미노산 731 내지 803에 상응하는 영역 3, iv) 서열식별번호: 2의 아미노산 807 내지 846에 상응하는 영역 4, v) 서열식별번호: 2의 아미노산 872 내지 885에 상응하는 영역 5, 및 vi) 서열식별번호: 2의 아미노산 903 내지 1004에 상응하는 영역 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역의 1개 이상의 위치에서 변경을 포함하는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 단리하거나 클로닝하는데 사용되는 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 게놈 DNA 또는 cDNA 또는 그의 조합으로부터의 단리를 포함한다. 게놈 DNA로부터 폴리뉴클레오티드의 클로닝은, 예를 들어, 널리 공지된 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 또는 발현 라이브러리의 항체 스크리닝을 사용하여 공유된 구조적 특색을 갖는 클로닝된 DNA 단편을 검출함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York]을 참조한다. 다른 핵산 증폭 절차 예컨대 리가제 연쇄 반응 (LCR), 라이게이션 활성화된 전사 (LAT) 및 폴리뉴클레오티드-기반 증폭 (NASBA)이 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 바실루스 서브틸리스 또는 이. 콜라이 균주 또는 관련 유기체에서 클로닝될 수 있고, 따라서, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 영역을 코딩하는 폴리펩티드의 대립유전자 또는 종 변이체일 수 있다.

본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변형은 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드를 합성하는데 필요할 수 있다. 용어 폴리펩티드와 "실질적으로 유사한"은 폴리펩티드의 비-자연 발생 형태를 지칭한다. 이들 폴리펩티드, 예를 들어, 그의 특이적 활성, 열안정성, pH 최적 등에서 상이한 변이체는 그의 천연 공급원으로부터 단리된 폴리펩티드와 일부 조작 방식에서 상이할 수 있다. 변이체는 서열식별번호: 1의 성숙 폴리펩티드 코딩 서열, 예를 들어, 그의 하위서열로서 제시되는 폴리뉴클레오티드를 기반으로 하고/거나, 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 변화를 야기하지 않되 효소의 생산을 위해 의도되는 숙주 유기체의 코돈 용법에 상응하는 뉴클레오티드 치환의 도입에 의해, 또는 상이한 아미노산 서열을 발생시킬 수 있는 뉴클레오티드 치환의 도입에 의해 구축될 수 있다. 뉴클레오티드 치환의 일반적 설명에 대해, 문헌 [Ford et al., (1991), 'Protein Expression and Purification', 2: 95-107]을 참조한다.

핵산 구축물

또한, 제어 서열과 상용인 조건 하에 적합한 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현을 지시하는 1개 이상의 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 본원에 기재된 바와 같은 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구축물이 본원에 개시된다. 따라서, (a) 제어 서열과 상용인 조건 하에 적합한 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현을 지시하는 1개 이상의 제어 서열에 작동가능하게 연결된, i) 서열식별번호: 2의 아미노산 154 내지 176에 상응하는 영역 1, ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 614 내지 658에 상응하는 영역 2, iii) 서열식별번호: 2의 아미노산 731 내지 803에 상응하는 영역 3, iv) 서열식별번호: 2의 아미노산 807 내지 846에 상응하는 영역 4, v) 서열식별번호: 2의 아미노산 872 내지 885에 상응하는 영역 5, 및 vi) 서열식별번호: 2의 아미노산 903 내지 1004에 상응하는 영역 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역의 1개 이상의 위치에서 변경을 포함하는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구축물이 개시된다.

폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드의 발현을 제공하기 위해 다양한 방식으로 조작될 수 있다. 벡터 내로의 그의 삽입 전의 폴리뉴클레오티드의 조작은 발현 벡터에 따라 바람직하거나 필요할 수 있다. 재조합 DNA 방법을 이용하여 폴리뉴클레오티드를 변형하는 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.

제어 서열은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 위해 숙주 세포에 의해 인식되는 폴리뉴클레오티드인 프로모터일 수 있다. 프로모터는 폴리펩티드의 발현을 매개하는 전사 제어 서열을 함유한다. 프로모터는 돌연변이체, 말단절단된 프로모터, 및 하이브리드 프로모터를 포함한, 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 숙주 세포에 대해 동종 또는 이종인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로부터 수득될 수 있다.

박테리아 숙주 세포에서 본 발명의 핵산 구축물의 전사를 지시하는데 적합한 프로모터의 예는 바실루스 아밀로리퀘파시엔스 알파-아밀라제 유전자 (amyQ), 바실루스 리케니포르미스 알파-아밀라제 유전자 (amyL), 바실루스 리케니포르미스 페니실리나제 유전자 (penP), 바실루스 스테아로써모필루스 말토제닉 아밀라제 유전자 (amyM), 바실루스 서브틸리스 레반수크라제 유전자 (sacB), 바실루스 서브틸리스 xylA 및 xylB 유전자, 바실루스 투린기엔시스 cryIIIA 유전자 (Agaisse and Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), 이. 콜라이 lac 오페론, 이. 콜라이 trc 프로모터 (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), 스트렙토미세스 코엘리콜로르 아가라제 유전자 (dagA), 및 원핵 베타-락타마제 유전자 (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), 뿐만 아니라 tac 프로모터 (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25)로부터 수득된 프로모터이다. 추가의 프로모터는 문헌 ["Useful proteins from recombinant bacteria" in Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; 및 Sambrook et al., 1989, 상기 문헌]에 기재되어 있다. 탠덤 프로모터의 예는 WO 99/43835에 개시되어 있다.

사상 진균 숙주 세포에서 본 발명의 핵산 구축물의 전사를 지시하는데 적합한 프로모터의 예는 아스페르길루스 니둘란스 아세타미다제, 아스페르길루스 니거 중성 알파-아밀라제, 아스페르길루스 니거 산 안정 알파-아밀라제, 아스페르길루스 니거 또는 아스페르길루스 아와모리 글루코아밀라제 (glaA), 아스페르길루스 오리자에 TAKA 아밀라제, 아스페르길루스 오리자에 알칼리성 프로테아제, 아스페르길루스 오리자에 트리오스 포스페이트 이소머라제, 푸사리움 옥시스포룸 트립신-유사 프로테아제 (WO 96/00787), 푸사리움 베네나툼 아밀로글루코시다제 (WO 00/56900), 푸사리움 베네나툼 다리아(Daria) (WO 00/56900), 푸사리움 베네나툼 쿠인(Quinn) (WO 00/56900), 리조뮤코르 미에헤이 리파제, 리조뮤코르 미에헤이 아스파르트산 프로테이나제, 트리코더마 레에세이 베타-글루코시다제, 트리코더마 레에세이 셀로비오히드롤라제 I, 트리코더마 레에세이 셀로비오히드롤라제 II, 트리코더마 레에세이 크산탄 리아제 I, 트리코더마 레에세이 크산탄 리아제 II, 트리코더마 레에세이 크산탄 리아제 III, 트리코더마 레에세이 크산탄 리아제 IV, 트리코더마 레에세이 크산탄 리아제 V, 트리코더마 레에세이 크실라나제 I, 트리코더마 레에세이 크실라나제 II, 트리코더마 레에세이 베타-크실로시다제에 대한 유전자로부터 수득된 프로모터, 뿐만 아니라 NA2-tpi 프로모터 (비번역 리더가 아스페르길루스 트리오스 포스페이트 이소머라제 유전자로부터의 비번역 리더에 의해 대체된, 아스페르길루스 중성 알파-아밀라제 유전자로부터 변형된 프로모터; 비제한적 예는 비번역 리더가 아스페르길루스 니둘란스 또는 아스페르길루스 오리자에 트리오스 포스페이트 이소머라제 유전자로부터의 비번역 리더에 의해 대체된, 아스페르길루스 니거 중성 알파-아밀라제 유전자로부터 변형된 프로모터를 포함함); 및 그의 돌연변이체, 말단절단된 프로모터, 및 하이브리드 프로모터이다.

효모 숙주에서, 유용한 프로모터는 사카로미세스 세레비지아에 엔올라제 (ENO-1), 사카로미세스 세레비지아에 갈락토키나제 (GAL1), 사카로미세스 세레비지아에 알콜 데히드로게나제/글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (ADH1, ADH2/GAP), 사카로미세스 세레비지아에 트리오스 포스페이트 이소머라제 (TPI), 사카로미세스 세레비지아에 메탈로티오네인 (CUP1), 및 사카로미세스 세레비지아에 3-포스포글리세레이트 키나제에 대한 유전자로부터 수득된다. 효모 숙주 세포를 위한 다른 유용한 프로모터는 문헌 [Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488]에 기재되어 있다.

제어 서열은 또한 숙주 세포에 의해 전사를 종결하도록 인식되는 전사 종결인자일 수 있다. 종결인자는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3'-말단에 작동가능하게 연결된다. 숙주 세포에서 기능적인 임의의 종결인자가 본 발명에 사용될 수 있다.

박테리아 숙주 세포를 위한 바람직한 종결인자는 바실루스 클라우시이 알칼리성 프로테아제 (aprH), 바실루스 리케니포르미스 알파-아밀라제 (amyL), 및 에스케리키아 콜라이 리보솜 RNA (rrnB)에 대한 유전자로부터 수득된다.

사상 진균 숙주 세포를 위한 바람직한 종결인자는 아스페르길루스 니둘란스 안트라닐레이트 신타제, 아스페르길루스 니거 글루코아밀라제, 아스페르길루스 니거 알파-글루코시다제, 아스페르길루스 오리자에 TAKA 아밀라제, 및 푸사리움 옥시스포룸 트립신-유사 프로테아제에 대한 유전자로부터 수득된다.

효모 숙주 세포를 위한 바람직한 종결인자는 사카로미세스 세레비지아에 엔올라제, 사카로미세스 세레비지아에 시토크롬 C (CYC1), 및 사카로미세스 세레비지아에 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제에 대한 유전자로부터 수득된다. 효모 숙주 세포를 위한 다른 유용한 종결인자는 문헌 [Romanos et al., 1992, 상기 문헌]에 기재되어 있다.

제어 서열은 또한 유전자의 발현을 증가시키는, 프로모터의 하류 및 유전자의 코딩 서열의 상류의 mRNA 안정화 영역일 수 있다.

적합한 mRNA 안정화 영역의 예는 바실루스 투린기엔시스 cryIIIA 유전자 (WO 94/25612) 및 바실루스 서브틸리스 SP82 유전자 (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471)으로부터 수득된다.

제어 서열은 또한 숙주 세포에 의한 번역에 중요한 mRNA의 비번역 영역인 리더일 수 있다. 리더는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에 작동가능하게 연결된다. 숙주 세포에서 기능적인 임의의 리더가 사용될 수 있다.

사상 진균 숙주 세포를 위한 바람직한 리더는 아스페르길루스 오리자에 TAKA 아밀라제 및 아스페르길루스 니둘란스 트리오스 포스페이트 이소머라제에 대한 유전자로부터 수득된다.

효모 숙주 세포를 위한 적합한 리더는 사카로미세스 세레비지아에 엔올라제 (ENO-1), 사카로미세스 세레비지아에 3-포스포글리세레이트 키나제, 사카로미세스 세레비지아에 알파-인자, 및 사카로미세스 세레비지아에 알콜 데히드로게나제/글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (ADH2/GAP)에 대한 유전자로부터 수득된다.

제어 서열은 또한 폴리뉴클레오티드의 3'-말단에 작동가능하게 연결되어, 전사되었을 때 숙주 세포에 의해 전사된 mRNA에 폴리아데노신 잔기를 부가하는 신호로서 인식되는 서열인 폴리아데닐화 서열일 수 있다. 숙주 세포에서 기능적인 임의의 폴리아데닐화 서열이 사용될 수 있다.

사상 진균 숙주 세포를 위한 바람직한 폴리아데닐화 서열은 아스페르길루스 니둘란스 안트라닐레이트 신타제, 아스페르길루스 니거 글루코아밀라제, 아스페르길루스 니거 알파-글루코시다제 아스페르길루스 오리자에 TAKA 아밀라제, 및 푸사리움 옥시스포룸 트립신-유사 프로테아제에 대한 유전자로부터 수득된다.

효모 숙주 세포에 유용한 폴리아데닐화 서열은 문헌 [Guo and Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990]에 기재되어 있다.

제어 서열은 또한 폴리펩티드의 N-말단에 연결된 신호 펩티드를 코딩하고, 폴리펩티드를 세포의 분비 경로로 지시하는 신호 펩티드 코딩 영역일 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열의 5'-말단은 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 서열의 절편과 번역 리딩 프레임으로 자연적으로 연결된 신호 펩티드 코딩 서열을 고유하게 함유할 수 있다. 대안적으로, 코딩 서열의 5'-말단은 코딩 서열에 외래인 신호 펩티드 코딩 서열을 함유할 수 있다. 외래 신호 펩티드 코딩 서열은 코딩 서열이 신호 펩티드 코딩 서열을 자연적으로 함유하지 않는 경우에 필요할 수 있다. 대안적으로, 외래 신호 펩티드 코딩 서열은 폴리펩티드의 분비를 증진시키기 위해 천연 신호 펩티드 코딩 서열을 간단하게 대체할 수 있다. 그러나, 발현된 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로로 지시하는 임의의 신호 펩티드 코딩 서열이 사용될 수 있다.

박테리아 숙주 세포를 위한 효과적인 신호 펩티드 코딩 서열은 바실루스 NCIB 11837 말토제닉 아밀라제, 바실루스 리케니포르미스 서브틸리신, 바실루스 리케니포르미스 베타-락타마제, 바실루스 스테아로써모필루스 알파-아밀라제, 바실루스 스테아로써모필루스 중성 프로테아제 (nprT, nprS, nprM), 및 바실루스 서브틸리스 prsA에 대한 유전자로부터 수득된 신호 펩티드 코딩 서열이다. 추가의 신호 펩티드가 문헌 [Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137]에 기재되어 있다.

사상 진균 숙주 세포를 위한 효과적인 신호 펩티드 코딩 서열은 아스페르길루스 니거 중성 아밀라제, 아스페르길루스 니거 글루코아밀라제, 아스페르길루스 오리자에 TAKA 아밀라제, 휴미콜라 인솔렌스 셀룰라제, 휴미콜라 인솔렌스 크산탄 리아제 V, 휴미콜라 라누기노사 리파제, 및 리조뮤코르 미에헤이 아스파르트산 프로테이나제에 대한 유전자로부터 수득된 신호 펩티드 코딩 서열이다.

효모 숙주 세포에 유용한 신호 펩티드는 사카로미세스 세레비지아에 알파-인자 및 사카로미세스 세레비지아에 인버타제에 대한 유전자로부터 수득된다. 다른 유용한 신호 펩티드 코딩 서열은 문헌 [Romanos et al., 1992, 상기 문헌]에 기재되어 있다.

제어 서열은 또한 폴리펩티드의 N-말단에 위치하는 프로펩티드를 코딩하는 프로펩티드 코딩 서열일 수 있다. 생성된 폴리펩티드는 전구효소 또는 프로폴리펩티드 (또는 일부 경우에 지모겐)로 공지된다. 프로폴리펩티드는 일반적으로 불활성이고, 프로폴리펩티드로부터 프로펩티드의 촉매적 또는 자가촉매적 절단에 의해 활성 폴리펩티드로 전환될 수 있다. 프로펩티드 코딩 서열은 바실루스 서브틸리스 알칼리성 프로테아제 (aprE), 바실루스 서브틸리스 중성 프로테아제 (nprT), 미셀리오프토라 써모필라 락카제 (WO 95/33836), 리조뮤코르 미에헤이 아스파르트산 프로테이나제, 및 사카로미세스 세레비지아에 알파-인자에 대한 유전자로부터 수득될 수 있다.

신호 펩티드 및 프로펩티드 서열 둘 다가 존재하는 경우에, 프로펩티드 서열은 폴리펩티드의 N-말단 다음에 위치하고 신호 펩티드 서열은 프로펩티드 서열의 N-말단 다음에 위치한다.

또한, 숙주 세포의 성장과 관련하여 폴리펩티드의 발현을 조절하는 조절 서열을 부가하는 것이 바람직할 수 있다. 조절 시스템의 예는, 조절 화합물의 존재를 포함한 화학적 또는 물리적 자극에 반응하여 유전자의 발현이 켜지거나 꺼지도록 하는 시스템이다. 원핵 시스템의 조절 시스템은 lac, tac, 및 trp 오퍼레이터 시스템을 포함한다. 효모에서, ADH2 시스템 또는 GAL1 시스템이 사용될 수 있다. 사상 진균에서, 아스페르길루스 니거 글루코아밀라제 프로모터, 아스페르길루스 오리자에 TAKA 알파-아밀라제 프로모터, 및 아스페르길루스 오리자에 글루코아밀라제 프로모터가 사용될 수 있다. 조절 서열의 다른 예는 유전자 증폭을 가능하게 하는 서열이다. 진핵 시스템에서, 이들 조절 서열은 메토트렉세이트의 존재 하에 증폭되는 디히드로폴레이트 리덕타제 유전자, 및 중금속에 의해 증폭되는 메탈로티오네인 유전자를 포함한다. 이들 경우에, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 조절 서열과 작동가능하게 연결될 것이다.

발현 벡터

또한, 본원에 기재된 바와 같은 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 프로모터, 및 전사 및 번역 정지 신호를 포함하는 재조합 발현 벡터가 본원에 개시된다. 따라서, 또한 (a) i) 서열식별번호: 2의 아미노산 154 내지 176에 상응하는 영역 1, ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 614 내지 658에 상응하는 영역 2, iii) 서열식별번호: 2의 아미노산 731 내지 803에 상응하는 영역 3, iv) 서열식별번호: 2의 아미노산 807 내지 846에 상응하는 영역 4, v) 서열식별번호: 2의 아미노산 872 내지 885에 상응하는 영역 5, 및 vi) 서열식별번호: 2의 아미노산 903 내지 1004에 상응하는 영역 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역의 1개 이상의 위치에서 변경을 포함하는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 프로모터, 및 전사 및 번역 정지 신호를 포함하는 재조합 발현 벡터를 수득하는 방법이 본원에 개시된다.

다양한 뉴클레오티드 및 제어 서열이 함께 연결되어 재조합 발현 벡터를 생산할 수 있고, 이는 1개 이상의 편리한 제한 부위를 포함하여 이러한 부위에서 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 삽입 또는 치환을 가능하게 할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드는 발현에 적절한 벡터 내로 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구축물을 삽입함으로써 발현될 수 있다. 발현 벡터를 생성하는데 있어서, 코딩 서열은 코딩 서열이 발현에 적절한 제어 서열과 작동가능하게 연결되도록 벡터 내에 위치한다.

재조합 발현 벡터는 재조합 DNA 절차에 편리하게 적용될 수 있고 폴리뉴클레오티드의 발현을 일으킬 수 있는 임의의 벡터 (예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스)일 수 있다. 벡터의 선택은 전형적으로 벡터가 도입될 숙주 세포와 벡터의 상용성에 좌우될 것이다. 벡터는 선형 또는 닫힌 원형 플라스미드일 수 있다.

벡터는 그의 복제가 염색체 복제와 독립적인 자율 복제 벡터, 즉, 염색체외 실체로서 존재하는 벡터, 예를 들어, 플라스미드, 염색체외 요소, 미니염색체, 또는 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 자가-복제를 보장하는 임의의 수단을 함유할 수 있다. 대안적으로, 벡터는 숙주 세포 내로 도입되는 경우 게놈 내로 통합되고, 통합된 염색체(들)과 함께 복제되는 것일 수 있다. 또한, 단일 벡터 또는 플라스미드, 또는 숙주 세포의 게놈 내로 도입될 전체 DNA를 함께 함유하는 2개 이상의 벡터 또는 플라스미드, 또는 트랜스포손이 사용될 수 있다.

벡터는 바람직하게는, 형질전환된, 형질감염된, 형질도입된 등의 세포의 용이한 선택을 가능하게 하는 1개 이상의 선택 마커를 함유한다. 선택 마커는 그의 생성물이 살생물제 또는 바이러스 저항성, 중금속에 대한 저항성, 영양요구체에 대한 원영양성 등을 제공하는 유전자이다.

박테리아 선택 마커의 예는 바실루스 리케니포르미스 또는 바실루스 서브틸리스 dal 유전자, 또는 항생제 저항성 예컨대 암피실린, 클로람페니콜, 카나마이신, 네오마이신, 스펙티노마이신 또는 테트라시클린 저항성을 부여하는 마커이다. 효모 숙주 세포에 적합한 마커는 ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, 및 URA3을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 사상 진균 숙주 세포에 사용하기 위한 선택 마커는 amdS (아세타미다제), argB (오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제), bar (포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제), hph (히그로마이신 포스포트랜스퍼라제), niaD (니트레이트 리덕타제), pyrG (오로티딘-5'-포스페이트 데카르복실라제), sC (술페이트 아데닐트랜스퍼라제), 및 trpC (안트라닐레이트 신타제), 뿐만 아니라 그의 등가물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 아스페르길루스 세포에 사용하기에 바람직한 것은 아스페르길루스 니둘란스 또는 아스페르길루스 오리자에 amdS 및 pyrG 유전자 및 스트렙토미세스 히그로스코피쿠스 bar 유전자이다.

벡터는 바람직하게는 벡터가 숙주 세포의 게놈 내로 통합되게 하거나 또는 벡터가 게놈과 독립적으로 세포 내에서 자율 복제되게 하는 요소(들)를 함유한다.

숙주 세포 게놈 내로의 통합을 위해, 벡터는 상동 또는 비-상동 재조합에 의한 게놈 내로의 통합을 위해 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열 또는 벡터의 임의의 다른 요소에 의존할 수 있다. 대안적으로, 벡터는 염색체(들)의 정확한 위치(들)에서의 숙주 세포의 게놈 내로의 상동 재조합에 의한 통합을 지시하는 추가의 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 정확한 위치에서의 통합 가능성을 증가시키기 위해, 통합 요소는 상동 재조합의 확률을 증진시키도록 상응하는 표적 서열과 높은 정도의 서열 동일성을 갖는 충분한 개수의 핵산, 예컨대 100 내지 10,000개 염기 쌍, 400 내지 10,000개 염기 쌍, 및 800 내지 10,000개 염기 쌍을 함유해야 한다. 통합 요소는 숙주 세포의 게놈 내의 표적 서열과 상동인 임의의 서열일 수 있다. 또한, 통합 요소는 비-코딩 또는 코딩 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 한편, 벡터는 비-상동 재조합에 의해 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다.

자율 복제를 위해, 벡터는 벡터가 해당 숙주 세포 내에서 자율 복제할 수 있게 하는 복제 기점을 추가로 포함할 수 있다. 복제 기점은 세포에서 기능하는 자율 복제를 매개하는 임의의 플라스미드 복제자일 수 있다. 용어 "복제 기점" 또는 "플라스미드 복제자"는 플라스미드 또는 벡터가 생체내 복제할 수 있게 하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.

박테리아 복제 기점의 예는 이. 콜라이에서의 복제를 가능하게 하는 플라스미드의 복제 기점 pBR322, pUC19, pACYC177, 및 pACYC184, 및 바실루스에서의 복제를 가능하게 하는 pUB110, pE194, pTA1060, 및 pAMβ1이다.

효모 숙주 세포에서 사용하기 위한 복제 기점의 예는 2 μ 복제 기점, ARS1, ARS4, ARS1 및 CEN3의 조합, 및 ARS4 및 CEN6의 조합이다.

사상 진균 세포에 유용한 복제 기점의 예는 AMA1 및 ANS1이다 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). AMA1 유전자의 단리 및 상기 유전자를 포함하는 플라스미드 또는 벡터의 구축은 WO 00/24883에 개시된 방법에 따라 달성될 수 있다.

본 발명의 1개 초과의 카피의 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 삽입하여 폴리펩티드의 생산을 증가시킬 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 카피수의 증가는 서열의 적어도 1개의 추가의 카피를 숙주 세포 게놈 내로 통합시킴으로써, 또는 증폭가능한 선택 마커 유전자를 폴리뉴클레오티드와 함께 포함시킴으로써 수득될 수 있고, 여기서 선택 마커 유전자의 증폭된 카피를 함유하고 이에 의해 폴리뉴클레오티드의 추가의 카피를 함유하는 세포는 적절한 선택 작용제의 존재 하에 세포를 배양함으로써 선택될 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터를 구축하기 위해 상기 기재된 요소를 라이게이션하는데 사용되는 절차는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어 문헌 [Sambrook et al., 1989, 상기 문헌] 참조).

숙주 세포

또한, 본 발명의 변이체의 생산을 지시하는 1개 이상의 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 본원에 기재된 바와 같은 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 숙주 세포가 본원에 개시된다. 따라서, 변이체의 생산을 지시하는 1개 이상의 제어 서열에 작동가능하게 연결된, (a) i) 서열식별번호: 2의 아미노산 154 내지 176에 상응하는 영역 1, ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 614 내지 658에 상응하는 영역 2, iii) 서열식별번호: 2의 아미노산 731 내지 803에 상응하는 영역 3, iv) 서열식별번호: 2의 아미노산 807 내지 846에 상응하는 영역 4, v) 서열식별번호: 2의 아미노산 872 내지 885에 상응하는 영역 5, 및 vi) 서열식별번호: 2의 아미노산 903 내지 1004에 상응하는 영역 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역의 1개 이상의 위치에서 변경을 포함하는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 숙주 세포가 본원에 개시된다.

폴리뉴클레오티드를 포함하는 구축물 또는 벡터는 구축물 또는 벡터가 앞서 기재된 바와 같이 염색체 구성요소로서 또는 자기-복제 염색체외 벡터로서 유지되도록 숙주 세포 내로 도입된다. 용어 "숙주 세포"는 복제 동안 발생하는 돌연변이로 인해 모 세포와 동일하지 않은 모 세포의 임의의 자손을 포괄한다. 숙주 세포의 선택은 대부분 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 및 그의 공급원에 좌우될 것이다.

숙주 세포는 본 발명의 폴리펩티드의 재조합 생산에 유용한 임의의 세포, 예를 들어 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다.

원핵 숙주 세포는 임의의 그람-양성 또는 그람-음성 박테리아일 수 있다. 그람-양성 박테리아는 바실루스, 클로스트리디움, 엔테로코쿠스, 게오바실루스, 락토바실루스, 락토코쿠스, 오세아노바실루스, 스타필로코쿠스, 스트렙토코쿠스 및 스트렙토미세스를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 그람-음성 박테리아는 캄필로박터, 이. 콜라이, 플라보박테리움, 푸소박테리움, 헬리코박터, 일리오박터, 네이세리아, 슈도모나스, 살모넬라 및 우레아플라스마를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

박테리아 숙주 세포는 바실루스 알칼로필루스, 바실루스 아밀로리퀘파시엔스, 바실루스 브레비스, 바실루스 시르쿨란스, 바실루스 클라우시이, 바실루스 코아굴란스, 바실루스 피르무스, 바실루스 라우투스, 바실루스 렌투스, 바실루스 리케니포르미스, 바실루스 메가테리움, 바실루스 푸밀루스, 바실루스 스테아로써모필루스, 바실루스 서브틸리스 및 바실루스 투린기엔시스 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 임의의 바실루스 세포일 수 있다.

박테리아 숙주 세포는 또한 스트렙토코쿠스 에퀴시밀리스, 스트렙토코쿠스 피오게네스, 스트렙토코쿠스 우베리스, 및 스트렙토코쿠스 에퀴 아종 주에피데미쿠스 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 임의의 스트렙토코쿠스 세포일 수 있다.

박테리아 숙주 세포는 또한 스트렙토미세스 아크로모게네스, 스트렙토미세스 아베르미틸리스, 스트렙토미세스 코엘리콜로르, 스트렙토미세스 그리세우스 및 스트렙토미세스 리비단스 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 임의의 스트렙토미세스 세포일 수 있다.

DNA의 바실루스 세포 내로의 도입은 원형질체 형질전환 (예를 들어, 문헌 [Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115] 참조), 적격 세포 형질전환 (예를 들어, 문헌 [Young and Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, 또는 Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221] 참조), 전기천공 (예를 들어, 문헌 [Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751] 참조), 또는 접합 (예를 들어, 문헌 [Koehler and Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278] 참조)에 의해 이루어질 수 있다. DNA의 이. 콜라이 세포 내로의 도입은 원형질체 형질전환 (예를 들어, 문헌 [Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580] 참조) 또는 전기천공 (예를 들어, 문헌 [Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145] 참조)에 의해 이루어질 수 있다. DNA의 스트렙토미세스 세포 내로의 도입은 원형질체 형질전환, 전기천공 (예를 들어, 문헌 [Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405] 참조), 접합 (예를 들어, 문헌 [Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585] 참조), 또는 형질도입 (예를 들어, 문헌 [Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294] 참조)에 의해 이루어질 수 있다. DNA의 슈도모나스 세포 내로의 도입은 전기천공 (예를 들어, 문헌 [Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397] 참조) 또는 접합 (예를 들어, 문헌 [Pinedo and Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57] 참조)에 의해 이루어질 수 있다. DNA의 스트렙토코쿠스 세포 내로의 도입은 천연 적격성 (예를 들어, 문헌 [Perry and Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297] 참조), 원형질체 형질전환 (예를 들어, 문헌 [Catt and Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207] 참조), 전기천공 (예를 들어, 문헌 [Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804] 참조), 또는 접합 (예를 들어, 문헌 [Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436] 참조)에 의해 이루어질 수 있다. 그러나, DNA를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다.

숙주 세포는 또한 진핵생물, 예컨대 포유동물, 곤충, 식물, 또는 진균 세포일 수 있다.

숙주 세포는 진균 세포일 수 있다. 본원에 사용된 "진균"은 문 아스코미코타(Ascomycota), 바시디오미코타(Basidiomycota), 키트리디오미코타(Chytridiomycota), 및 지코미코타(Zygomycota) 뿐만 아니라 오오미코타(Oomycota) 및 모든 불완전 진균 (문헌 [Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK]에 정의된 바와 같음)을 포함한다.

진균 숙주 세포는 효모 세포일 수 있다. 본원에서 사용된 "효모"는 자낭포자 효모 (엔도미세탈레스(Endomycetales)), 담자균 효모, 및 불완전 균류 (블라스토미세테스(Blastomycetes))에 속하는 효모를 포함한다. 효모의 분류는 향후 바뀔 수 있기 때문에, 본 발명의 목적상, 효모는 문헌 [Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, and Davenport, editors, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980)]에 기재된 바와 같이 정의될 것이다.

효모 숙주 세포는 칸디다, 한세눌라(Hansenula), 클루이베로미세스, 피키아, 사카로미세스, 쉬조사카로미세스 또는 야로위아 세포, 예컨대 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 사카로미세스 칼스베르겐시스, 사카로미세스 세레비지아에, 사카로미세스 디아스타티쿠스, 사카로미세스 도우글라시이, 사카로미세스 클루이베리, 사카로미세스 노르벤시스, 사카로미세스 오비포르미스 또는 야로위아 리폴리티카 세포일 수 있다.

진균 숙주 세포는 사상 진균 세포일 수 있다. "사상 진균"은 하위부문 유미코타(Eumycota) 및 오오미코타의 모든 사상 형태를 포함한다 (문헌 [Hawksworth et al., 1995, 상기 문헌]에 정의된 바와 같음). 사상 진균은 일반적으로 키틴, 셀룰로스, 글루칸, 키토산, 만난, 및 다른 복합 폴리사카라이드로 구성된 균사체 벽을 특징으로 한다. 영양 성장은 균사 신장에 의하고, 탄소 이화작용은 편성 호기성이다. 대조적으로, 효모 예컨대 사카로미세스 세레비지아에에 의한 영양 성장은 단세포 엽상체의 출아에 의하고, 탄소 이화작용은 발효적일 수 있다.

사상 진균 숙주 세포는 아크레모니움, 아스페르길루스, 아우레오바시디움, 브제르칸데라(Bjerkandera), 세리포리옵시스, 크리소스포리움, 코프리누스(Coprinus), 코리올루스(Coriolus), 크립토코쿠스, 필로바시디움, 푸사리움, 휴미콜라, 마그나포르테, 뮤코르, 미셀리오프토라, 네오칼리마스틱스, 뉴로스포라, 파에실로미세스, 페니실리움, 파네로카에테, 플레비아, 피로미세스, 플레우로투스, 쉬조필룸, 탈라로미세스, 써모아스쿠스, 티엘라비아, 톨리포클라디움, 트라메테스 또는 트리코더마 세포일 수 있다.

예를 들어, 사상 진균 숙주 세포는 아스페르길루스 아와모리, 아스페르길루스 포에티두스, 아스페르길루스 푸미가투스, 아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 니둘란스, 아스페르길루스 니거, 아스페르길루스 오리자에, 브제르칸데라 아두스타(Bjerkandera adusta), 세리포리옵시스 아네이리나(Ceriporiopsis aneirina), 세리포리옵시스 카레기에아(Ceriporiopsis caregiea), 세리포리옵시스 길베스켄스(Ceriporiopsis gilvescens), 세리포리옵시스 판노신타(Ceriporiopsis pannocinta), 세리포리옵시스 리불로사(Ceriporiopsis rivulosa), 세리포리옵시스 수브루파(Ceriporiopsis subrufa), 세리포리옵시스 수브베르미스포라(Ceriporiopsis subvermispora), 크리소스포리움 이놉스, 크리소스포리움 케라티노필룸, 크리소스포리움 룩크노웬세, 크리소스포리움 메르다리움, 크리소스포리움 판니콜라, 크리소스포리움 퀸스란디쿰, 크리소스포리움 트로피쿰, 크리소스포리움 조나툼, 코프리누스 시네레우스(Coprinus cinereus), 코리올루스 히르수투스(Coriolus hirsutus), 푸사리움 박트리디오이데스, 푸사리움 세레알리스, 푸사리움 크루크웰렌세, 푸사리움 쿨모룸, 푸사리움 그라미네아룸, 푸사리움 그라미눔, 푸사리움 헤테로스포룸, 푸사리움 네군디, 푸사리움 옥시스포룸, 푸사리움 레티쿨라툼, 푸사리움 로세움, 푸사리움 삼부시눔, 푸사리움 사르코크로움, 푸사리움 스포로트리키오이데스, 푸사리움 술푸레움, 푸사리움 토루로숨, 푸사리움 트리코테키오이데스, 푸사리움 베네나툼, 휴미콜라 인솔렌스, 휴미콜라 라누기노사, 뮤코르 미에헤이, 미셀리오프토라 써모필라, 뉴로스포라 크라사, 페니실리움 푸르푸로게눔, 파네로카에테 크리소스포리움, 플레비아 라디아타(Phlebia radiata), 플레우로투스 에린기이(Pleurotus eryngii), 티엘라비아 테레스트리스, 트라메테스 빌로사(Trametes villosa), 트라메테스 베르시콜로르(Trametes versicolor), 트리코더마 하르지아눔, 트리코더마 코닌기이, 트리코더마 롱기브라키아툼, 트리코더마 레에세이 또는 트리코더마 비리데 세포일 수 있다.

진균 세포는 원형질체 형성, 원형질체의 형질전환, 및 세포벽의 재생을 수반하는 과정에 의해 그 자체로 공지된 방식으로 형질전환될 수 있다. 아스페르길루스 및 트리코더마 숙주 세포의 형질전환에 적합한 절차는 EP 238023, 문헌 [Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, 및 Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422]에 기재되어 있다. 푸사리움 종을 형질전환시키는데 적합한 방법은 문헌 [Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156], 및 WO 96/00787에 기재되어 있다. 효모는 문헌 [Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; 및 Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920]에 기재된 절차를 사용하여 형질전환될 수 있다.

생산 방법

또한 (a) 본 발명의 숙주 세포를 변이체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계; 및 (b) 변이체를 회수하는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 변이체를 생산하는 방법 (예를 들어, 시험관내 또는 생체외 방법)이 본원에 개시된다. 따라서, (a) i) 서열식별번호: 2의 아미노산 154 내지 176에 상응하는 영역 1, ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 614 내지 658에 상응하는 영역 2, iii) 서열식별번호: 2의 아미노산 731 내지 803에 상응하는 영역 3, iv) 서열식별번호: 2의 아미노산 807 내지 846에 상응하는 영역 4, v) 서열식별번호: 2의 아미노산 872 내지 885에 상응하는 영역 5, 및 vi) 서열식별번호: 2의 아미노산 903 내지 1004에 상응하는 영역 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역의 1개 이상의 위치에서 변경을 포함하는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 변이체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계; 및 (b) 임의로, 변이체를 회수하는 단계를 포함하는, 변이체를 생산하는 방법 (예를 들어, 시험관내 또는 생체외 방법)이 본원에 개시된다.

추가로, (a) 그의 야생형 형태에서 폴리펩티드를 생산하는 세포를, 폴리펩티드의 생산에 도움이 되는 조건 하에 배양하는 단계; 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 변이체를 생산하는 방법 (예를 들어, 시험관내 또는 생체외 방법)이 본원에 개시된다. 바람직한 측면에서, 세포는 파에니바실루스 세포 또는 미크로박테리움 세포이다.

또한 (a) 본 발명의 재조합 숙주 세포를 폴리펩티드의 생산에 도움이 되는 조건 하에 배양하는 단계; 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 변이체를 생산하는 방법 (예를 들어, 시험관내 또는 생체외 방법)이 본원에 개시된다.

숙주 세포는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 폴리펩티드의 생산에 적합한 영양 배지에서 배양된다. 예를 들어, 세포는 적합한 배지에서 폴리펩티드의 발현 및/또는 단리를 가능하게 하는 조건 하에 수행되는 진탕 플라스크 배양, 또는 실험실 또는 산업용 발효기에서의 소규모 또는 대규모 발효 (연속, 회분식, 유가식 또는 고체 상태 발효 포함)에 의해 배양될 수 있다. 배양은 탄소 및 질소 공급원 및 무기 염을 포함하는 적합한 영양 배지에서, 관련 기술분야에 공지된 절차를 사용하여 이루어진다. 적합한 배지는 상업적 공급업체로부터 입수가능하거나, 또는 (예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션의 카탈로그에) 공개된 조성에 따라 제조될 수 있다. 폴리펩티드가 영양 배지로 분비되면, 폴리펩티드는 배지로부터 직접 회수될 수 있다. 폴리펩티드가 분비되지 않으면, 이는 세포 용해물로부터 회수될 수 있다.

변이체 폴리펩티드는 셀룰로스 또는 크산탄 리아제 활성을 결정하는 방법과 같은, 폴리펩티드에 특이적인 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 이들 검출 방법은 특이적 항체의 사용, 효소 생성물의 형성, 또는 효소 기질의 소멸을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 효소 검정은 폴리펩티드의 활성을 결정하는데 사용될 수 있다.

변이체 폴리펩티드는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 회수될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 수집, 원심분리, 여과, 추출, 분무-건조, 증발 또는 침전을 포함하나 이에 제한되지는 않는 통상적인 절차에 의해 영양 배지로부터 회수될 수 있다.

변이체 폴리펩티드는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화도, 소수성, 크로마토포커싱, 및 크기 배제), 전기영동 절차 (예를 들어, 정제용 등전 포커싱), 시차 용해도 (예를 들어, 황산암모늄 침전), SDS-PAGE 또는 추출 (예를 들어, 문헌 [Protein Purification, Janson and Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989] 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 다양한 절차에 의해 정제되어 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 수득할 수 있다.

대안적 측면에서, 변이체 폴리펩티드는 회수되지 않지만, 오히려 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포가 변이체 폴리펩티드의 공급원으로서 사용된다.

조성물

하나의 특정 측면에서, 본 발명에 따른 변이체는 모 효소와 비교하여 또는 변이체와 동일한 아미노산 서열을 갖지만 명시된 위치 중 1개 이상에서 변경 (예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입)을 갖지 않는 크산탄 리아제와 비교하여, 또는 서열식별번호: 2를 갖는 크산탄 리아제와 비교하여 세제 중에서 개선된 안정성을 갖고, 여기서 세제 중에서의 활성 및/또는 안정성은 본원의 실시예 4에 개시된 바와 같이 측정된다.

효소 외에 세제 조성물은 추가의 성분을 포함할 수 있다. 추가의 성분의 선택은 통상의 기술자의 기술 수준 내이며, 하기에 제시된 예시적인 비제한적 성분을 포함한 통상적인 성분을 포함한다. 성분의 선택은 직물 관리의 경우, 세정하고자 하는 직물의 유형, 오염물형성의 유형 및/또는 정도, 세정이 이루어질 온도, 및 세제 생성물의 제형을 고려하는 것을 포함할 수 있다. 하기 언급된 성분이 특정한 기능성에 따라 일반적 표제에 의해 카테고리화되지만, 성분은 통상의 기술자가 인지할 추가적인 기능성을 포함할 수 있기 때문에, 이것이 제한으로서 해석되서는 안된다.

세제 조성물은 텍스타일 예컨대 예를 들어 직물, 의류 또는 리넨의 세탁에, 또는 경질 표면 예컨대 예를 들어 바닥, 테이블의 세정, 또는 식기 세척에 적합할 수 있다.

세제 조성물

한 실시양태에서, 본원에 기재된 변이체는 세척액 리터당 0.0001-200 mg의 효소 단백질, 예컨대 0.0005-100 mg의 효소 단백질, 바람직하게는 0.001-30 mg의 효소 단백질, 보다 바람직하게는 0.005-8 mg의 효소 단백질, 보다 더 바람직하게는 0.01-2 mg의 효소 단백질에 상응하는 양으로 세제 조성물에 첨가될 수 있다.

자동 식기세척 (ADW)에 사용하기 위한 조성물은, 예를 들어, 조성물의 중량 기준으로 0.0001%-50%, 예컨대 0.001%-20%, 예컨대 0.01%-10%, 예컨대 0.05-5%의 효소 단백질을 포함할 수 있다.

세탁 과립 또는 고체/과립상 세탁 조성물에 사용하기 위한 조성물은 일반적으로, 예를 들어, 조성물의 중량 기준으로 0.0001%-50%, 예컨대 0.001%-20%, 예컨대 0.01%-10%, 예컨대 0.05%-5%의 효소 단백질을 포함할 수 있다.

세탁 액체에 사용하기 위한 조성물은, 예를 들어, 조성물의 중량 기준으로 0.0001%-10%, 예컨대 0.001-7%, 예컨대 0.1%-5%의 효소 단백질을 포함할 수 있다.

본 발명의 세제 조성물의 효소(들)는 통상적인 안정화제, 예를 들어, 폴리올, 예컨대 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤, 당 또는 당 알콜, 락트산, 붕산, 또는 붕산 유도체, 예를 들어, 방향족 보레이트 에스테르, 또는 페닐 보론산 유도체, 예컨대 4-포르밀페닐 보론산을 사용하여 안정화될 수 있고, 조성물은 예를 들어 WO92/19709 및 WO92/19708에 기재된 바와 같이 제제화될 수 있다.

특정 시장에서 상이한 세척 조건이 사용되고, 이에 따라 상이한 유형의 세제가 사용된다. 이는 예를 들어 EP 1 025 240에 개시되어 있다. 예를 들어, 아시아 (일본)에서는 낮은 세제 농도 시스템이 사용되는 반면에, 미국에서는 중간 세제 농도 시스템이 사용되고, 유럽에서는 높은 세제 농도 시스템이 사용된다.

낮은 세제 농도 시스템은 약 800 ppm 미만의 세제 성분의 세척수 중에 존재하는 세제를 포함한다. 일본 세제는 세척수 중에 대략 667 ppm의 세제 성분이 존재하기 때문에 전형적으로 낮은 세제 농도 시스템으로 간주된다.

중간 세제 농도는 약 800 ppm 내지 약 2000ppm의 세제 성분이 세척수 중에 존재하는 세제를 포함한다. 북미 세제는 세척수 중에 대략 975 ppm의 세제 성분이 존재하기 때문에 일반적으로 중간 세제 농도 시스템인 것으로 간주된다.

높은 세제 농도 시스템은 약 2000 ppm 초과의 세제 성분이 세척수 중에 존재하는 세제를 포함한다. 유럽 세제는 세척수 중에 대략 4500-5000 ppm의 세제 성분을 갖기 때문에 일반적으로 높은 세제 농도 시스템인 것으로 간주된다.

라틴 아메리카 세제는 일반적으로 높은 비누거품 포스페이트 빌더 세제이고, 라틴 아메리카에서 사용되는 세제의 범위는 그들이 세척수 중 1500 ppm 내지 6000 ppm의 세제 성분 범위이기 때문에 중간 및 높은 세제 농도 둘 다에 속할 수 있다. 이러한 세제 조성물은 본 발명의 모든 실시양태이다.

본 발명의 폴리펩티드는 또한, 본원에 참조로 포함되는 WO97/07202에 개시된 세제 제제에 혼입될 수 있다.

계면활성제

세제 조성물은 음이온성 및/또는 양이온성 및/또는 비이온성 및/또는 반-극성 및/또는 쯔비터이온성, 또는 그의 혼합물일 수 있는 1종 이상의 계면활성제를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 세제 조성물은 1종 이상의 비이온성 계면활성제 및 1종 이상의 음이온성 계면활성제의 혼합물을 포함한다. 계면활성제(들)는 전형적으로 중량 기준으로 약 0.1% 내지 60%, 예컨대 약 1% 내지 약 40%, 또는 약 3% 내지 약 20%, 또는 약 3% 내지 약 10%의 수준으로 존재한다. 계면활성제(들)는 목적하는 세정 적용분야에 기초하여 선택되고, 관련 기술분야에 공지된 임의의 통상적인 계면활성제(들)를 포함한다. 세제에 사용하기 위해 관련 기술분야에 공지된 임의의 계면활성제가 사용될 수 있다.

그에 포함되는 경우 세제는 통상적으로 중량 기준으로 약 1% 내지 약 40%, 예컨대 약 5% 내지 약 15%, 또는 약 20% 내지 약 25%를 포함한 약 5% 내지 약 30%의 음이온성 계면활성제를 포함할 것이다. 음이온성 계면활성제의 비제한적 예는 술페이트 및 술포네이트, 특히, 선형 알킬벤젠술포네이트 (LAS), LAS의 이성질체, 분지형 알킬벤젠술포네이트 (BABS), 페닐알칸술포네이트, 알파-올레핀술포네이트 (AOS), 올레핀 술포네이트, 알켄 술포네이트, 알칸-2,3-디일비스(술페이트), 히드록시알칸술포네이트 및 디술포네이트, 알킬 술페이트 (AS), 예컨대 소듐 도데실 술페이트 (SDS), 지방 알콜 술페이트 (FAS), 1급 알콜 술페이트 (PAS), 알콜 에테르술페이트 (AES 또는 AEOS 또는 FES, 또한 알콜 에톡시술페이트 또는 지방 알콜 에테르 술페이트로도 공지됨), 2급 알칸술포네이트 (SAS), 파라핀 술포네이트 (PS), 에스테르 술포네이트, 술폰화 지방산 글리세롤 에스테르, 메틸 에스테르 술포네이트 (MES)를 포함한 알파-술포 지방산 메틸 에스테르 (알파-SFMe 또는 SES), 알킬- 또는 알케닐숙신산, 도데세닐/테트라데세닐 숙신산 (DTSA), 아미노산의 지방산 유도체, 술포-숙신산의 디에스테르 및 모노에스테르 또는 비누, 및 그의 조합을 포함한다.

그에 포함되는 경우 세제는 통상적으로 중량 기준으로 약 0% 내지 약 10%의 양이온성 계면활성제를 포함할 것이다. 양이온성 계면활성제의 비제한적 예는 알킬디메틸에탄올아민 쿼트 (ADMEAQ), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB), 디메틸디스테아릴암모늄 클로라이드 (DSDMAC), 및 알킬벤질디메틸암모늄, 알킬 4급 암모늄 화합물, 알콕실화 4급 암모늄 (AQA) 화합물, 및 그의 조합을 포함한다.

그에 포함되는 경우 세제는 통상적으로 중량 기준으로 약 0.2% 내지 약 40%, 예를 들어 약 0.5% 내지 약 30%, 특히 약 1% 내지 약 20%, 약 3% 내지 약 10%, 예컨대 약 3% 내지 약 5%, 또는 약 8% 내지 약 12%의 비이온성 계면활성제를 포함할 것이다. 비이온성 계면활성제의 비제한적 예는 알콜 에톡실레이트 (AE 또는 AEO), 알콜 프로폭실레이트, 프로폭실화 지방 알콜 (PFA), 알콕실화 지방산 알킬 에스테르, 예컨대 에톡실화 및/또는 프로폭실화 지방산 알킬 에스테르, 알킬페놀 에톡실레이트 (APE), 노닐페놀 에톡실레이트 (NPE), 알킬폴리글리코시드 (APG), 알콕실화 아민, 지방산 모노에탄올아미드 (FAM), 지방산 디에탄올아미드 (FADA), 에톡실화 지방산 모노에탄올아미드 (EFAM), 프로폭실화 지방산 모노에탄올아미드 (PFAM), 폴리히드록시 알킬 지방산 아미드, 또는 글루코사민의 N-아실 N-알킬 유도체 (글루카미드, GA 또는 지방산 글루카미드, FAGA), 뿐만 아니라 상표명 스팬(SPAN) 및 트윈(TWEEN) 하에 입수가능한 제품, 및 그의 조합을 포함한다.

그에 포함되는 경우 세제는 통상적으로 중량 기준으로 약 0% 내지 약 10%의 반극성 계면활성제를 포함할 것이다. 반극성 계면활성제의 비제한적 예는 아민 옥시드 (AO) 예컨대 알킬디메틸아민옥시드, N-(코코 알킬)-N,N-디메틸아민 옥시드 및 N-(탈로우-알킬)-N,N-비스(2-히드록시에틸)아민 옥시드, 지방산 알칸올아미드 및 에톡실화 지방 산 알칸올아미드, 및 그의 조합을 포함한다.

그에 포함되는 경우 세제는 통상적으로 중량 기준으로 약 0% 내지 약 10%의 쯔비터이온성 계면활성제를 포함할 것이다. 쯔비터이온성 계면활성제의 비제한적 예는 베타인, 알킬디메틸베타인, 술포베타인, 및 그의 조합을 포함한다.

굴수성제

굴수성제는 수용액 중의 소수성 화합물 (또는 반대로, 비-극성 환경에서 극성 물질)을 가용화시키는 화합물이다. 전형적으로, 굴수성제는 친수성 및 소수성 특징 둘 다를 갖지만 (계면활성제로부터 공지된 바와 같은 소위 친양쪽성 특성); 굴수성제의 분자 구조는 일반적으로 자발적인 자기-응집을 선호하지 않는다 (예를 들어, 문헌 [Hodgdon and Kaler (2007), Current Opinion in Colloid & Interface Science 12: 121-128]에 의한 고찰 참조). 굴수성제는 미셀러, 층상 또는 다른 널리 정의된 중간상을 형성하는, 계면활성제 및 지질에 대해 발견되는 바와 같이 그 초과에서 자기-응집이 일어나는 임계 농도를 나타내지 않는다. 대신, 많은 굴수성제는 농도가 증가함에 따라 응집체의 크기가 커지는 연속형 응집 과정을 보여준다. 그러나, 많은 굴수성제는 물, 오일, 계면활성제 및 중합체의 혼합물을 포함하여 극성 및 비-극성 특징의 물질을 함유하는 시스템의 상 거동, 안정성 및 콜로이드 특성을 변경시킨다. 굴수성제는 제약, 개인 위생, 식품에서 기술 적용분야까지 산업 전반에 걸쳐 고전적으로 사용된다. 굴수성제를 세제 조성물에 사용하면, 예를 들어, 상 분리 또는 고 점도와 같은 바람직하지 않은 현상을 유도하지 않으면서 계면활성제의 보다 농축된 제제가 가능하게 된다 (물을 제거함으로써 액체 세제를 압착하는 과정에서와 같음).

세제는 중량 기준으로 0-5%, 예컨대 약 0.5 내지 약 5%, 또는 약 3% 내지 약 5%의 굴수성제를 포함할 수 있다. 세제에 사용하기 위해 관련 기술분야에 공지된 임의의 굴수성제가 사용될 수 있다. 굴수성제의 비제한적 예는 나트륨 벤젠 술포네이트, 나트륨 p-톨루엔 술포네이트 (STS), 나트륨 크실렌 술포네이트 (SXS), 나트륨 쿠멘 술포네이트 (SCS), 나트륨 시멘 술포네이트, 아민 옥시드, 알콜 및 폴리글리콜에테르, 나트륨 히드록시나프토에이트, 나트륨 히드록시나프탈렌 술포네이트, 나트륨 에틸헥실 술페이트, 및 그의 조합을 포함한다.

빌더 및 코-빌더

세제 조성물은 중량 기준으로 약 0-65%, 예컨대 약 5% 내지 약 45%의 세제 빌더 또는 코-빌더, 또는 그의 혼합물을 포함할 수 있다. 식기 세척 세제에서, 빌더의 수준은 전형적으로 40-65%, 특히 50-65%이다. 빌더 및/또는 코-빌더는 특히, Ca 및 Mg와 수용성 착물을 형성하는 킬레이트화제일 수 있다. 세탁 세제에 사용하기 위한 관련 기술분야에 공지된 임의의 빌더 및/또는 코-빌더가 사용될 수 있다. 빌더의 비제한적 예는 제올라이트, 디포스페이트 (피로포스페이트), 트리포스페이트, 예컨대 소듐 트리포스페이트 (STP 또는 STPP), 카르보네이트, 예컨대 소듐 카르보네이트, 가용성 실리케이트, 예컨대 소듐 메타실리케이트, 층상 실리케이트 (예를 들어, 훽스트(Hoechst)로부터의 SKS-6), 에탄올아민 예컨대 2-아미노에탄-1-올 (MEA), 디에탄올아민 (DEA, 또한 이미노디에탄올로도 공지됨), 트리에탄올아민 (TEA, 또한 2,2',2"-니트릴로트리에탄올로도 공지됨), 및 카르복시메틸 이눌린 (CMI), 및 그의 조합을 포함한다.

세제 조성물은 또한 중량 기준으로 0-20%, 예컨대 약 5% 내지 약 10%의 세제 코-빌더, 또는 그의 혼합물을 포함할 수 있다. 세제 조성물은 코-빌더를 단독으로 포함할 수 있거나, 또는 빌더, 예를 들어 제올라이트 빌더와 조합하여 포함할 수 있다. 코-빌더의 비제한적 예는 폴리아크릴레이트의 단독중합체 또는 그의 공중합체, 예컨대 폴리(아크릴산) (PAA) 또는 코폴리(아크릴산/말레산) (PAA/PMA)를 포함한다. 추가의 비제한적 예는 시트레이트, 킬레이트화제 예컨대 아미노카르복실레이트, 아미노폴리카르복실레이트 및 포스포네이트, 및 알킬- 또는 알케닐숙신산을 포함한다. 추가의 구체적 예는 2,2',2"-니트릴로트리아세트산 (NTA), 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA), 이미노디숙신산 (IDS), 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 (EDDS), 메틸글리신디아세트산 (MGDA), 글루탐산-N,N-디아세트산 (GLDA), 1-히드록시에탄-1,1-디포스폰산 (HEDP), 에틸렌디아민테트라-(메틸렌포스폰산) (EDTMPA), 디에틸렌트리아민펜타키스(메틸렌포스폰산) (DTPMPA 또는 DTMPA), N-(2-히드록시에틸)이미노디아세트산 (EDG), 아스파르트산-N-모노아세트산 (ASMA), 아스파르트산-N,N-디아세트산 (ASDA), 아스파르트산-N-모노프로피온산 (ASMP), 이미노디숙신산 (IDA), N-(2-술포메틸)-아스파르트산 (SMAS), N-(2-술포에틸)-아스파르트산 (SEAS), N-(2-술포메틸)-글루탐산 (SMGL), N-(2-술포에틸)-글루탐산 (SEGL), N-메틸이미노디아세트산 (MIDA), α-알라닌-N,N-디아세트산 (α-ALDA), 세린-N,N-디아세트산 (SEDA), 이소세린-N,N-디아세트산 (ISDA), 페닐알라닌-N,N-디아세트산 (PHDA), 안트라닐산-N,N-디아세트산 (ANDA), 술파닐산-N,N-디아세트산 (SLDA), 타우린-N,N-디아세트산 (TUDA) 및 술포메틸-N,N-디아세트산 (SMDA), N-(2-히드록시에틸)-에틸리덴디아민-N,N',N'-트리아세테이트 (HEDTA), 디에탄올글리신 (DEG), 디에틸렌트리아민 펜타(메틸렌포스폰산) (DTPMP), 아미노트리스(메틸렌포스폰산) (ATMP), 및 그의 조합 및 염을 포함한다. 추가의 예시적인 빌더 및/또는 코-빌더는 예를 들어 WO 09/102854, US 5977053에 기재되어 있다.

표백 시스템

세제는 중량 기준으로 0-50%, 예컨대 약 0.1% 내지 약 25%의 표백 시스템을 포함할 수 있다. 세탁 세제에 사용하기 위한 관련 기술분야에 공지된 임의의 표백 시스템이 사용될 수 있다. 적합한 표백 시스템 성분은 표백 촉매, 광표백제, 표백 활성화제, 과산화수소의 공급원, 예컨대 과탄산나트륩 및 과붕산나트륨, 미리 형성된 과산 및 그의 혼합물을 포함한다. 적합한 미리 형성된 과산은 퍼옥시카르복실산 및 염, 과탄산 및 염, 퍼이미드산 및 염, 퍼옥시모노황산 및 염, 예를 들어, 옥손 (R), 및 그의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 표백 시스템의 비제한적 예는, 예를 들어, 과산-형성 표백 활성화제와 조합하여, 알칼리 금속 염, 예컨대 퍼보레이트 (통상적으로 1수화물 또는 4수화물), 퍼카르보네이트, 퍼술페이트, 퍼포스페이트, 퍼실리케이트 염의 나트륨 염을 포함한 무기 염을 포함할 수 있는 과산화물-기반 표백 시스템을 포함한다. 용어 표백 활성화제는 본원에서, 과산화수소와 같은 과산소 표백제와 반응하여 과산을 형성하는 화합물로서 의도된다. 이에 따라 형성된 과산은 활성화된 표백제를 구성한다. 본원에서 사용하기에 적합한 표백 활성화제는 에스테르, 아미드, 이미드 또는 무수물 부류에 속하는 것을 포함한다. 적합한 예는 테트라아세틸에틸렌 디아민 (TAED), 소듐 4-[(3,5,5-트리메틸헥사노일)옥시]벤젠 술포네이트 (ISONOBS), 디퍼옥시 도데칸산, 4-(도데카노일옥시)벤젠술포네이트 (LOBS), 4-(데카노일옥시)벤젠술포네이트, 4-(데카노일옥시)벤조에이트 (DOBS), 4-(노나노일옥시)-벤젠술포네이트 (NOBS), 및/또는 WO98/17767에 개시된 것이다. 특정한 패밀리의 관심 표백 활성화제가 EP624154에 개시되어 있고, 그러한 패밀리에서 특히 바람직한 것은 아세틸 트리에틸 시트레이트 (ATC)이다. ATC 또는 트리아세틴과 같은 단쇄 트리글리세리드는 결과적으로 시트르산 및 알콜로 분해되기 때문에 환경 친화적이라는 이점을 갖는다. 더욱이, 아세틸 트리에틸 시트레이트 및 트리아세틴은 저장 시 생성물 내에서 우수한 가수분해 안정성을 갖고, 이는 효율적인 표백 활성화제이다. 마지막으로 ATC는 세탁 첨가제에 우수한 빌딩 능력을 제공한다. 대안적으로, 표백 시스템은, 예를 들어, 아미드, 이미드, 또는 술폰 유형의 퍼옥시산을 포함할 수 있다. 표백 시스템은 또한 과산, 예컨대 6-(프탈이미도)퍼옥시헥산산 (PAP)을 포함할 수 있다. 표백 시스템은 또한, 표백 촉매를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서 표백 성분은 하기 화학식을 갖는 유기 촉매:

(iii) 및 그의 혼합물

로 이루어진 군으로부터 선택된 유기 촉매일 수 있고; 여기서 각각의 R¹은 독립적으로 9 내지 24개의 탄소를 함유하는 분지형 알킬 기 또는 11 내지 24개의 탄소를 함유하는 선형 알킬 기이고, 바람직하게는 각각의 R¹은 독립적으로 9 내지 18개의 탄소를 함유하는 분지형 알킬 기 또는 11 내지 18개의 탄소를 함유하는 선형 알킬 기이고, 보다 바람직하게는 각각의 R¹은 독립적으로 2-프로필헵틸, 2-부틸옥틸, 2-펜틸노닐, 2-헥실데실, n-도데실, n-테트라데실, n-헥사데실, n-옥타데실, 이소-노닐, 이소-데실, 이소-트리데실 및 이소-펜타데실로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 예시적인 표백 시스템이, 예를 들어 WO2007/087258, WO2007/087244, WO2007/087259 및 WO2007/087242에 기재되어 있다. 적합한 광표백제는 예를 들어 술폰화 아연 프탈로시아닌일 수 있다.

중합체

세제는 중량 기준으로 0-10%, 예컨대 0.5-5%, 2-5%, 0.5-2% 또는 0.2-1%의 중합체를 포함할 수 있다. 세제에 사용하기 위한 관련 기술분야에 공지된 임의의 중합체가 사용될 수 있다. 중합체는 상기 언급된 바와 같은 코-빌더로서 기능할 수 있거나, 또는 재부착방지, 섬유 보호, 방오, 이염 억제, 그리스 세정 및/또는 소포 특성을 제공할 수 있다. 일부 중합체는 상기 언급된 특성 중 1종 초과 및/또는 하기 언급된 모티프 중 1종 초과를 가질 수 있다. 예시적인 중합체는 (카르복시메틸)셀룰로스 (CMC), 폴리(비닐 알콜) (PVA), 폴리(비닐피롤리돈) (PVP), 폴리(에틸렌글리콜) 또는 폴리(에틸렌 옥시드) (PEG), 에톡실화 폴리(에틸렌이민), 카르복시메틸 이눌린 (CMI), 및 폴리카르복실레이트 예컨대 PAA, PAA/PMA, 폴리-아스파르트산, 및 라우릴 메타크릴레이트/아크릴산 공중합체, 소수성 변형된 CMC (HM-CMC) 및 실리콘, 테레프탈산 및 올리고머 글리콜의 공중합체, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트) 및 폴리(옥시에텐 테레프탈레이트)의 공중합체 (PET-POET), PVP, 폴리(비닐이미다졸) (PVI), 폴리(비닐피리딘-N-옥시드) (PVPO 또는 PVPNO) 및 폴리비닐피롤리돈-비닐이미다졸 (PVPVI)을 포함한다. 추가적 예시적인 중합체는 황산화 폴리카르복실레이트, 폴리에틸렌 옥시드 및 폴리프로필렌 옥시드 (PEO-PPO) 및 디쿼터늄 에톡시 술페이트를 포함한다. 다른 예시적인 중합체가 예를 들어 WO 2006/130575에 개시되어 있다. 상기 언급된 중합체의 염이 또한 고려된다.

직물 색조부여제

본 발명의 세제 조성물은 또한, 세제 조성물 중에 제제화되는 경우에, 직물이 상기 세제 조성물을 포함하는 세척액과 접촉될 때 직물 상에 침착되어 가시 광선의 흡수/반사를 통해 직물의 색조를 변경시킬 수 있는 직물 색조부여제, 예컨대 염료 또는 안료를 포함할 수 있다. 형광 미백제는 적어도 일부 가시 광선을 방출한다. 대조적으로, 직물 색조부여제는 이것이 적어도 일부의 가시 광선 스펙트럼을 흡수하기 때문에 표면의 색조를 변경시킨다. 적합한 직물 색조부여제는 염료 및 염료-점토 접합체를 포함하고, 또한 안료를 포함할 수 있다. 적합한 염료는 소분자 염료 및 중합체 염료를 포함한다. 적합한 소분자 염료는, 예를 들어 WO2005/03274, WO2005/03275, WO2005/03276 및 EP1876226 (본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은, 다이렉트 블루, 다이렉트 레드, 다이렉트 바이올렛, 애시드 블루, 애시드 레드, 애시드 바이올렛, 베이직 블루, 베이직 바이올렛 및 베이직 레드의 색 지수 (C.I.) 분류에 속하는 염료로 이루어진 군으로부터 선택된 소분자 염료, 또는 그의 혼합물을 포함한다. 세제 조성물은 바람직하게는, 약 0.00003 wt% 내지 약 0.2 wt%, 약 0.00008 wt% 내지 약 0.05 wt%, 또는 심지어 약 0.0001 wt% 내지 약 0.04 wt% 직물 색조부여제를 포함한다. 조성물은 0.0001 wt% 내지 0.2 wt% 직물 색조부여제를 포함할 수 있고, 이는 조성물이 단위 용량 파우치의 형태일 때 특히 바람직할 수 있다. 적합한 색조부여제는 또한, 예를 들어 WO 2007/087257 및 WO2007/087243에 개시되어 있다.

추가의 효소

세제 첨가제 뿐만 아니라 세제 조성물은 1종 이상의 [추가의] 효소 예컨대 크산탄 리아제, 프로테아제, 리파제, 큐티나제, 아밀라제, 리케나제, 카르보히드라제, 셀룰라제, 펙티나제, 만난아제, 아라비나제, 갈락타나제, 크실라나제, 옥시다제, 예를 들어, 락카제 및/또는 퍼옥시다제를 포함할 수 있다.

일반적으로, 선택된 효소(들)의 특성은 선택된 세제와 상용성이어야 하고 (즉, pH-최적, 다른 효소적 및 비-효소적 성분과의 상용성 등), 효소(들)는 유효량으로 존재해야 한다.

셀룰라제: 적합한 셀룰라제는 박테리아 또는 진균 기원의 것을 포함한다. 화학적으로 변형된 또는 단백질 조작된 돌연변이체가 포함된다. 적합한 셀룰라제는 속 바실루스, 슈도모나스, 휴미콜라, 푸사리움, 티엘라비아, 아크레모니움으로부터의 셀룰라제, 예를 들어 US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 및 WO 89/09259에 개시된 휴미콜라 인솔렌스, 티엘라비아 테레스트리스, 미셀리오프토라 써모필라 및 푸사리움 옥시스포룸으로부터 생산된 진균 셀룰라제를 포함한다.

특히 적합한 셀룰라제는 색상 관리 이익을 갖는 알칼리성 또는 중성 셀룰라제이다. 이러한 셀룰라제의 예는 EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940에 기재된 셀룰라제이다. 다른 예는 WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 및 PCT/DK98/00299에 기재된 것과 같은 셀룰라제 변이체이다.

엔도-베타-1,4-글루카나제 활성 (EC 3.2.1.4)을 나타내는 셀룰라제의 예는 WO02/099091에 기재된 것이다.

셀룰라제의 다른 예는 WO96/29397에 기재된 패밀리 45 셀룰라제, 및 특히 WO 02/099091의 서열식별번호: 8의 하기 위치: 2, 4, 7, 8, 10, 13, 15, 19, 20, 21, 25, 26, 29, 32, 33, 34, 35, 37, 40, 42, 42a, 43, 44, 48, 53, 54, 55, 58, 59, 63, 64, 65, 66, 67, 70, 72, 76, 79, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 91, 93, 95, 95d, 95h, 95j, 97, 100, 101, 102, 103, 113, 114, 117, 119, 121, 133, 136, 137, 138, 139, 140a, 141, 143a, 145, 146, 147, 150e, 150j, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160c, 160e, 160k, 161, 162, 164, 165, 168, 170, 171, 172, 173, 175, 176, 178, 181, 183, 184, 185, 186, 188, 191, 192, 195, 196, 200, 및/또는 20에 상응하는 위치 중 1개 이상에서, 바람직하게는 P19A, G20K, Q44K, N48E, Q119H 또는 Q146 R 중에서 선택된 치환, 삽입 및/또는 결실을 갖는 그의 변이체를 포함한다.

상업적으로 입수가능한 셀룰라제는 셀루자임(Celluzyme)™, 및 케어자임(Carezyme)™ (노보자임스 A/S(Novozymes A/S)), 클라지나제(Clazinase)™, 및 푸라닥스 HA(Puradax HA)™ (제넨코어 인터내셔널 인크.(Genencor International Inc.)) 및 KAC-500(B)™ (카오 코포레이션(Kao Corporation))을 포함한다.

프로테아제: 추가의 효소는 또 다른 프로테아제 또는 프로테아제 변이체일 수 있다. 프로테아제는 화학적으로 또는 유전자 변형된 돌연변이체를 포함한, 동물, 식물 또는 미생물 기원의 것일 수 있다. 미생물 기원이 바람직하다. 이는 알칼리성 프로테아제, 예컨대 세린 프로테아제 또는 메탈로프로테아제일 수 있다. 세린 프로테아제는, 예를 들어 S1 패밀리의 것, 예컨대 트립신, 또는 S8 패밀리의 것, 예컨대 서브틸리신일 수 있다. 메탈로프로테아제 프로테아제는 예를 들어 패밀리 M4, M5, M7 또는 M8로부터의 예를 들어 써모리신일 수 있다.

용어 "서브틸라제"는 문헌 [Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 및 Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523]에 따른 세린 프로테아제의 하위-군을 지칭한다. 세린 프로테아제는 기질과 함께 공유 부가물을 형성하는, 활성 부위에 세린을 갖는 것을 특징으로 하는 프로테아제의 하위군이다. 서브틸라제는 6가지 하위-부문, 즉 서브틸리신 패밀리, 써미타제 패밀리, 프로테이나제 K 패밀리, 란티바이오틱 펩티다제 패밀리, 켁신 패밀리 및 피롤리신 패밀리로 나뉠 수 있다. 본 발명의 한 측면에서 프로테아제는 서브틸라제, 예컨대 서브틸리신 또는 그의 변이체일 수 있다. 추가로 서브틸라제 (및 세린 프로테아제)는 세린에서 떨어진 2개의 활성 부위 아미노산 잔기, 즉 히스티딘 및 아스파르트산 잔기를 갖는 것을 특징으로 한다.

서브틸리신의 예는 WO 89/06279에 기재된 바실루스로부터 유래된 것 예컨대 서브틸리신 렌투스, 바실루스 렌투스, 서브틸리신 노보, 서브틸리신 칼스버그, 바실루스 리케니포르미스, 서브틸리신 BPN', 서브틸리신 309, 서브틸리신 147 및 서브틸리신 168 및 프로테아제 PD138 (WO 93/18140)이다. 추가의 세린 프로테아제 예는 WO 98/020115, WO 01/44452, WO 01/58275, WO 01/58276, WO 03/006602 및 WO 04/099401에 기재되어 있다. 서브틸라제 변이체의 예는 BPN' 넘버링을 사용하여 위치: 3, 4, 9, 15, 27, 36, 68, 76, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 217, 218, 222, 232, 235, 236, 245, 248, 252 및 274 중 임의의 것에서 돌연변이를 갖는 것일 수 있다. 보다 바람직한 서브틸라제 변이체는 돌연변이: S3T, V4I, S9R, A15T, K27R, *36D, V68A, N76D, N87S,R, *97E, A98S, S99G,D,A, S99AD, S101G,M,R S103A, V104I,Y,N, S106A, G118V,R, H120D,N, N123S, S128L, P129Q, S130A, G160D, Y167A, R170S, A194P, G195E, V199M, V205I, L217D, N218D, M222S, A232V, K235L, Q236H, Q245R, N252K, T274A (BPN' 넘버링을 사용함)를 포함할 수 있다. 추가의 바람직한 프로테아제는, 예를 들어 WO 95/23221에 기재된 바와 같은 바실루스 렌투스 DSM 5483으로부터의 알칼리성 프로테아제, 및 WO 92/21760, WO 95/23221, EP 1921147 및 EP 1921148에 기재된 그의 변이체이다.

트립신-유사 프로테아제의 예는 (예를 들어 돼지 또는 소 기원의) 트립신 및 WO 89/06270 및 WO 94/25583에 기재된 푸사리움 프로테아제이다. 유용한 프로테아제의 예는 WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, 및 WO 98/34946에 기재된 변이체, 특히 하기 위치: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235, 및 274 중 1개 이상에서 치환을 갖는 변이체이다.

메탈로프로테아제의 예는 WO 07/044993에 기재된 바와 같은 중성 메탈로프로테아제이다.

바람직한 상업적으로 입수가능한 프로테아제 효소는 알칼라제(Alcalase)™, 코로나제(Coronase)™, 듀랄라제(Duralase)™, 듀라자임(Durazym)™, 에스페라제(Esperase)™, 에벌라제(Everlase)™, 칸나제(Kannase)™, 리쿠아나제(Liquanase)™, 리쿠아나제 울트라(Liquanase Ultra)™, 오보자임(Ovozyme)™, 폴랄자임(Polarzyme)™, 프리마제(Primase)™, 렐라제(Relase)™, 사비나제(Savinase)™ 및 사비나제 울트라™, (노보자임스 A/S), 악사펨(Axapem)™ (기스트-브로카세스 엔.브이.(Gist-Brocases N.V.)), BLAP 및 BLAP X (헨켈 아게 & 캄파니 카게아아(Henkel AG & Co. KGaA)), 엑셀라제(Excellase)™, FN2™, FN3™, FN4™, 막사카(Maxaca)™, 막사펨(Maxapem)™, 막사타제(Maxatase)™, 프로페라제(Properase)™, 퓨라파스트(Purafast)™, 퓨라펙트(Purafect)™, 퓨라펙트 OxP™, 퓨라펙트 프라임™ 및 퓨라막스(Puramax)™ (제넨코어 인터내셔널(Genencor int.))를 포함한다.

리파제 및 큐티나제: 적합한 리파제 및 큐티나제는 박테리아 또는 진균 기원의 것을 포함한다. 화학적으로 변형되거나 단백질 조작된 돌연변이체 효소가 포함된다. 예는 써모미세스로부터의, 예를 들어 EP258068 및 EP305216에 기재된 바와 같은 티. 라누기노수스 (이전에 휴미콜라 라누기노사로 명명됨)로부터의 리파제, 휴미콜라, 예를 들어 에이치. 인솔렌스로부터의 큐티나제 (WO96/13580), 슈도모나스 (이들 중 일부는 현재 부르크홀데리아로 개명됨), 예를 들어 피. 알칼리게네스 또는 피. 슈도알칼리게네스 (EP218272), 피. 세파시아 (EP331376), 피. 에스피. 균주 SD705 (WO95/06720 & WO96/27002), 피. 위스콘시넨시스 (WO96/12012) 균주로부터의 리파제, GDSL-유형 스트렙토미세스 리파제 (WO10/065455), 마그나포르테 그리세아로부터의 큐티나제 (WO10/107560), 슈도모나스 멘도시나로부터의 큐티나제 (US5,389,536), 써모비피다 푸스카로부터의 리파제 (WO11/084412), 게오바실루스 스테아로써모필루스 리파제 (WO11/084417), 바실루스 서브틸리스로부터의 리파제 (WO11/084599), 및 스트렙토미세스 그리세우스 (WO11/150157) 및 에스. 프리스티나에스피랄리스 (WO12/137147)로부터의 리파제를 포함한다.

추가의 예는 아실트랜스퍼라제 또는 퍼히드롤라제, 예를 들어 칸디다 안타르크티카(Candida antarctica) 리파제 A (WO10/111143)와 상동성을 갖는 아실트랜스퍼라제, 미코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis)로부터의 아실트랜스퍼라제 (WO05/56782), CE 7 패밀리로부터의 퍼히드롤라제 (WO09/67279), 및 엠. 스메그마티스 퍼히드롤라제의 변이체, 특히 헌츠만 텍스타일 이펙츠 프라이빗 리미티드(Huntsman Textile Effects Pte Ltd)로부터의 상업용 제품 젠틀 파워 블리치(Gentle Power Bleach) (WO10/100028)에 사용된 S54V 변이체로서 때때로 지칭되는 리파제이다.

다른 예는 EP407225, WO92/05249, WO94/01541, WO94/25578, WO95/14783, WO95/30744, WO95/35381, WO95/22615, WO96/00292, WO97/04079, WO97/07202, WO00/34450, WO00/60063, WO01/92502, WO07/87508 및 WO09/109500에 기재된 것과 같은 리파제 변이체이다.

바람직한 상업적 리파제 제품은 리폴라제(Lipolase)™, 리펙스(Lipex)™; 리폴렉스(Lipolex)™ 및 리포클린(Lipoclean)™ (노보자임스 A/S), 루마패스트(Lumafast) (원래 제넨코어로부터의 것) 및 리포맥스(Lipomax) (원래 기스트-브로카데스(Gist-Brocades)로부터의 것)를 포함한다.

아밀라제

아밀라제는 알파-아밀라제, 베타-아밀라제 또는 글루코아밀라제일 수 있고, 박테리아 또는 진균 기원의 것일 수 있다. 화학적으로 변형되거나 단백질 조작된 돌연변이체가 포함된다. 아밀라제는, 예를 들어, GB 1,296,839에 보다 상세히 기재된, 바실루스, 예를 들어, 바실루스 리케니포르미스의 특수 균주로부터 수득된 알파-아밀라제를 포함한다.

아밀라제의 예는 WO 95/10603의 서열식별번호: 3을 갖는 것 또는 서열식별번호: 3과 90% 서열 동일성을 갖는 그의 변이체이다. 바람직한 변이체는 WO 94/02597, WO 94/18314, WO 97/43424, 및 WO 99/019467의 서열식별번호: 4에 기재되어 있고, 예컨대 변이체는 WO 95/10603의 서열식별번호: 3의 하기 위치: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 178, 179, 181, 188, 190, 197, 201, 202, 207, 208, 209, 211, 243, 264, 304, 305, 391, 408, 및 444 중 1개 이상에서 치환을 갖는다.

다른 아밀라제는 WO 2016/203064의 서열식별번호: 1과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 WO 2016/203064의 서열식별번호: 1의 변이체이다. 바람직한 변이체는 서열식별번호: 1의 위치 1, 54, 56, 72, 109, 113, 116, 134, 140, 159, 167, 169, 172, 173, 174, 181, 182, 183, 184, 189, 194, 195, 206, 255, 260, 262, 265, 284, 289, 304, 305, 347, 391, 395, 439, 469, 444, 473, 476, 또는 477에 상응하는 1개 이상의 위치에서 변형을 포함하는 변이체이며, 여기서 상기 알파-아밀라제 변이체는 서열식별번호: 1과 적어도 75%이지만 100% 미만의 서열 동일성을 갖는다.

추가의 아밀라제는 WO 02/010355의 서열식별번호: 6을 갖는 아밀라제, 또는 서열식별번호: 6과 90% 서열 동일성을 갖는 그의 변이체이다. 서열식별번호: 6의 바람직한 변이체는 위치 181 및 182에서 결실을 갖고 위치 193에서 치환을 갖는 것이다.

다른 아밀라제는 예는 WO 2006/066594의 서열식별번호: 6에 제시된 비. 아밀로리퀘파시엔스로부터 유래된 알파-아밀라제의 잔기 1-33, 및 WO 2006/066594의 서열식별번호: 4에 제시된 비. 리케니포르미스 알파-아밀라제의 잔기 36-483을 포함하는 하이브리드 알파-아밀라제, 또는 그의 90% 서열 동일성을 갖는 변이체이다. 이러한 하이브리드 알파-아밀라제의 바람직한 변이체는 하기 위치: G48, T49, G107, H156, A181, N190, M197, I201, A209 및 Q264 중 1개 이상에서 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 것이다. WO 2006/066594의 서열식별번호: 6에 제시된 비. 아밀로리퀘파시엔스로부터 유래된 알파-아밀라제의 잔기 1-33 및 서열식별번호: 4의 잔기 36-483을 포함하는 하이브리드 알파-아밀라제의 가장 바람직한 변이체는 하기 치환을 갖는 것이다:

M197T;

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S; 또는

G48+T49+G107+H156+A181+N190+I201+A209+Q264.

추가의 아밀라제 예는 WO 99/019467의 서열식별번호: 6을 갖는 아밀라제, 또는 서열식별번호: 6과 90% 서열 동일성을 갖는 그의 변이체이다. 서열식별번호: 6의 바람직한 변이체는 하기 위치: R181, G182, H183, G184, N195, I206, E212, E216 및 K269 중 1개 이상에서 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 것이다. 특히 바람직한 아밀라제는 위치 G182 및 H183 또는 위치 H183 및 G184에서 결실을 갖는 것이다.

추가의 아밀라제는 WO 96/023873의 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 7을 갖는 것 또는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 7과 90% 서열 동일성을 갖는 그의 변이체이다. 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 7의 바람직한 변이체는 하기 위치: 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 212, 243, 260, 269, 304 및 476 중 1개 이상에서 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 것이다. 보다 바람직한 변이체는 위치 182 및 183 또는 위치 183 및 184에서 결실을 갖는 것이다. 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 7의 가장 바람직한 아밀라제 변이체는 위치 183 및 184에서 결실을 갖고 위치 140, 195, 206, 243, 260, 304 및 476에서 치환을 갖는 것이다.

사용될 수 있는 다른 아밀라제는 WO 08/153815의 서열식별번호: 2, WO 01/66712의 서열식별번호: 10을 갖는 아밀라제, 또는 WO 08/153815의 서열식별번호: 2와 90% 서열 동일성 또는 WO 01/66712의 서열식별번호: 10과 90% 서열 동일성을 갖는 그의 변이체이다. WO 01/66712의 서열식별번호: 10의 바람직한 변이체는 하기 위치: 176, 177, 178, 179, 190, 201, 207, 211 및 264 중 1개 이상에서 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 것이다.

사용될 수 있는 추가의 아밀라제는 WO 09/061380의 서열식별번호: 2를 갖는 아밀라제 또는 서열식별번호: 2와 90% 서열 동일성을 갖는 그의 변이체이다. 서열식별번호: 2의 바람직한 변이체는 하기 위치: Q87, Q98, S125, N128, T131, T165, K178, R180, S181, T182, G183, M201, F202, N225, S243, N272, N282, Y305, R309, D319, Q320, Q359, K444 및 G475 중 1개 이상에서 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 것이다. 서열식별번호: 2의 보다 바람직한 변이체는 하기 위치: Q87E,R, Q98R, S125A, N128C, T131I, T165I, K178L, T182G, M201L, F202Y, N225E,R, N272E,R, S243Q,A,E,D, Y305R, R309A, Q320R, Q359E, K444E 및 G475K 중 1개 이상에서 치환 및/또는 위치 R180 및/또는 S181에서 결실을 갖는 것이다. 서열식별번호: 2의 가장 바람직한 아밀라제 변이체는 하기 치환을 갖는 것이다:

N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K;

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K;

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K; 또는

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K 여기서 변이체는 임의로 추가로, 위치 243에서 치환 및/또는 위치 180 및/또는 위치 181에서 결실을 포함한다.

아밀라제의 다른 예는 WO01/66712의 서열식별번호: 12를 갖는 알파-아밀라제 또는 서열식별번호: 12와 적어도 90%, 예컨대 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 변이체이다. 바람직한 아밀라제 변이체는 WO01/66712의 서열식별번호: 12의 하기 위치: R28, R118, N174; R181, G182, D183, G184, G186, W189, N195, M202, Y298, N299, K302, S303, N306, R310, N314; R320, H324, E345, Y396, R400, W439, R444, N445, K446, Q449, R458, N471, N484 중 1개 이상에서 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 것이다. 특히 바람직한 아밀라제는 D183 및 G184의 결실을 갖고 치환 R118K, N195F, R320K 및 R458K를 갖는 변이체, 및 군: M9, G149, G182, G186, M202, T257, Y295, N299, M323, E345 및 A339로부터 선택된 1개 이상의 위치에서 치환을 추가적으로 갖는 변이체를 포함하고, 가장 바람직한 변이체는 모든 이들 위치에서 치환을 추가적으로 갖는 것이다.

상업적으로 입수가능한 아밀라제는 듀라밀(Duramyl)™, 테르마밀(Termamyl)™, 푼가밀(Fungamyl)™, 스테인자임(Stainzyme)™, 스테인자임 플러스™, 나탈라제(Natalase)™ 및 BAN™ (노보자임스 A/S), 라피다제(Rapidase)™ 및 푸라스타(Purastar)™ (제넨코어 인터내셔널 인크.로부터의 것)이다.

퍼옥시다제/옥시다제: 적합한 퍼옥시다제/옥시다제는 식물, 박테리아 또는 진균 기원의 것을 포함한다. 화학적으로 변형되거나 단백질 조작된 돌연변이체가 포함된다. 유용한 퍼옥시다제의 예는 코프리누스, 예를 들어 WO 93/24618, WO 95/10602, 및 WO 98/15257에 기재된 바와 같은 씨. 시네레우스로부터의 퍼옥시다제 및 그의 변이체를 포함한다.

상업적으로 입수가능한 퍼옥시다제는 가드자임(Guardzyme)™ (노보자임스 A/S)을 포함한다.

세제 효소(들)는 1종 이상의 효소를 함유하는 개별 첨가제를 첨가하거나, 또는 이들 효소를 모두 포함하는 조합 첨가제를 첨가함으로써 세제 조성물에 포함될 수 있다. 본 발명의 세제 첨가제, 즉 개별 첨가제 또는 조합 첨가제는, 예를 들어, 과립, 액체, 슬러리 등으로서 제제화될 수 있다. 바람직한 세제 첨가제 제형은 과립, 특히 비-산포 과립, 액체, 특히 안정화된 액체, 또는 슬러리이다.

비-산포 과립은, 예를 들어 US 4,106,991 및 4,661,452에 개시된 바와 같이 생성될 수 있고, 임의로 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 코팅될 수 있다. 왁스 코팅 물질의 예는 1000 내지 20000의 평균 몰 중량을 갖는 폴리(에틸렌 옥시드) 생성물 (폴리에틸렌글리콜, PEG); 16 내지 50개의 에틸렌 옥시드 단위를 갖는 에톡실화 노닐페놀; 알콜이 12 내지 20개의 탄소 원자를 함유하고 15 내지 80개의 에틸렌 옥시드 단위가 있는 에톡실화 지방 알콜; 지방 알콜; 지방산; 및 지방산의 모노- 및 디- 및 트리글리세리드이다. 유동층 기술에 의해 적용하기에 적합한 필름-형성 코팅 물질의 예가 GB 1483591에 제공된다. 액체 효소 제제는, 예를 들어, 확립된 방법에 따라 폴리올, 예컨대 프로필렌 글리콜, 당 또는 당 알콜, 락트산 또는 붕산을 첨가함으로써 안정화될 수 있다. 보호된 효소는 EP 238,216에 개시된 방법에 따라 제조될 수 있다.

보조 물질

세탁 세제에 사용하기 위한 관련 기술분야에 공지된 임의의 세제 성분이 또한 사용될 수 있다. 다른 임의적인 세제 성분은 부식 방지제, 수축 방지제, 오염물 재부착 방지제, 주름 방지제, 살박테리아제, 결합제, 부식 억제제, 붕해제/붕해 작용제, 염료, 효소 안정화제 (붕산, 보레이트, CMC, 및/또는 폴리올, 예컨대 프로필렌 글리콜 포함), 점토를 포함한 직물 컨디셔너, 충전제/프로세싱 보조제, 형광 미백제/광학 증백제, 폼 부스터, 폼 (비누거품) 조절제, 퍼퓸, 오염물 현탁화제, 연화제, 비누거품 억제제, 변색 억제제, 및 위킹 작용제를 단독으로 또는 조합하여 포함한다. 세탁 세제에 사용하기 위한 관련 기술분야에 공지된 임의의 성분이 사용될 수 있다. 이러한 성분의 선택은 통상의 기술자의 기술 수준 내이다.

분산제: 본 발명의 세제 조성물은 또한 분산제를 함유할 수 있다. 특히 분말 세제는 분산제를 포함할 수 있다. 적합한 수용성 유기 물질은 단독- 또는 공-중합체 산 또는 그의 염을 포함하며, 여기서 폴리카르복실산은 2개 이하의 탄소 원자에 의해 서로 분리된 적어도 2개의 카르복실 라디칼을 포함한다. 적합한 분산제는, 예를 들어 문헌 [Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc.]에 기재되어 있다.

이염 억제제: 본 발명의 세제 조성물은 또한 1종 이상의 이염 억제제를 포함할 수 있다. 적합한 중합체 이염 억제제는 폴리비닐피롤리돈 중합체, 폴리아민 N-옥시드 중합체, N-비닐피롤리돈과 N-비닐이미다졸의 공중합체, 폴리비닐옥사졸리돈 및 폴리비닐이미다졸 또는 그의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 대상 조성물에 존재할 때, 이염 억제제는 조성물의 중량 기준으로 약 0.0001 % 내지 약 10%, 약 0.01% 내지 약 5% 또는 심지어 약 0.1% 내지 약 3%의 수준으로 존재할 수 있다.

형광 미백제: 본 발명의 세제 조성물은 바람직하게는 또한, 세정되는 물품에 색조를 부여할 수 있는 추가의 성분, 예컨대 형광 미백제 또는 광학 증백제를 함유할 것이다. 존재하는 경우에, 증백제는 바람직하게는 약 0.01% 내지 약 0.5%의 수준이다. 세탁 세제 조성물에 사용하기에 적합한 임의의 형광 미백제가 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 가장 통상적으로 사용되는 형광 미백제는 디아미노스틸벤-술폰산 유도체, 디아릴피라졸린 유도체 및 비스페닐-디스티릴 유도체의 부류에 속하는 것들이다. 형광 미백제의 디아미노스틸벤-술폰산 유도체 유형의 예는 4,4'-비스-(2-디에탄올아미노-4-아닐리노-s-트리아진-6-일아미노) 스틸벤-2,2'-디술포네이트; 4,4'-비스-(2,4-디아니리노-s-트리아진-6-일아미노) 스틸벤-2.2'-디술포네이트; 4,4'-비스-(2-아닐리노-4(N-메틸-N-2-히드록시-에틸아미노)-s-트리아진-6-일아미노) 스틸벤-2,2'-디술포네이트, 4,4'-비스-(4-페닐-2,1,3-트리아졸-2-일)스틸벤-2,2'-디술포네이트; 4,4'-비스-(2-아닐리노-4(1-메틸-2-히드록시-에틸아미노)-s-트리아진-6-일아미노) 스틸벤-2,2'-디술포네이트 및 2-(스틸빌-4"-나프토-1.,2':4,5)-1,2,3-트리졸-2"-술포네이트의 나트륨 염을 포함한다. 바람직한 형광 미백제는 스위스 바젤 소재의 시바-가이기 아게(Ciba-Geigy AG)로부터 입수가능한 티노팔(Tinopal) DMS 및 티노팔 CBS이다. 티노팔 DMS는 4,4'-비스-(2-모르폴리노-4 아닐리노-s-트리아진-6-일아미노) 스틸벤 디술포네이트의 이나트륨 염이다. 티노팔 CBS는 2,2'-비스-(페닐-스티릴)-디술포네이트의 이나트륨 염이다. 형광 미백제가 인도 뭄바이 소재의 파라마운트 미네랄즈 앤드 케미칼스(Paramount Minerals and Chemicals)에 의해 공급된 상업적으로 입수가능한 파라화이트 KX(Parawhite KX)인 것이 또한 바람직하다. 본 발명에 사용하기에 적합한 다른 형광제는 1-3-디아릴 피라졸린 및 7-알킬아미노쿠마린을 포함한다. 적합한 형광 증백제 수준은 약 0.01, 0.05, 약 0.1 또는 심지어 약 0.2 wt%의 하위 수준 내지 0.5 또는 심지어 0.75 wt%의 상위 수준을 포함한다.

방오 중합체: 본 발명의 세제 조성물은 또한, 직물, 예컨대 면 및 폴리에스테르 기반 직물로부터의 오염물의 제거, 특히 폴리에스테르 기반 직물로부터의 소수성 오염물의 제거를 보조하는 1종 이상의 방오 중합체를 포함할 수 있다. 방오 중합체는, 예를 들어 비이온성 또는 음이온성 테레프탈레이트 기반 중합체, 폴리비닐 카프로락탐 및 관련 공중합체, 비닐 그라프트 공중합체, 폴리에스테르 폴리아미드일 수 있고, 예를 들어 문헌 [Chapter 7 in Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc.]을 참조한다. 또 다른 유형의 방오 중합체는 코어 구조와 그러한 코어 구조에 부착된 복수의 알콕실레이트 기를 포함하는 친양쪽성 알콕실화 그리스 세정 중합체이다. 코어 구조는 WO 2009/087523 (본원에 참조로 포함됨)에 상세히 기재된 바와 같은 폴리알킬렌이민 구조 또는 폴리알칸올아민 구조를 포함할 수 있다. 또한 무작위 그라프트 공중합체가 적합한 방오 중합체이다. 적합한 그라프트 공중합체가 WO 2007/138054, WO 2006/108856 및 WO 2006/113314 (본원에 참조로 포함됨)에 보다 상세하게 기재되어 있다. 다른 방오 중합체는 치환된 폴리사카라이드 구조, 특히 치환된 셀룰로스 구조, 예컨대 변형된 셀룰로스 유도체, 예컨대 EP 1867808 또는 WO 2003/040279 (둘 다 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것이다. 적합한 셀룰로스 중합체는 셀룰로스, 셀룰로스 에테르, 셀룰로스 에스테르, 셀룰로스 아미드 및 그의 혼합물을 포함한다. 적합한 셀룰로스 중합체는 음이온성으로 변형된 셀룰로스, 비이온성으로 변형된 셀룰로스, 양이온성으로 변형된 셀룰로스, 쯔비터이온성으로 변형된 셀룰로스, 및 그의 혼합물을 포함한다. 적합한 셀룰로스 중합체는 메틸 셀룰로스, 카르복시 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 히드록실 에틸 셀룰로스, 히드록실 프로필 메틸 셀룰로스, 에스테르 카르복시 메틸 셀룰로스, 및 그의 혼합물을 포함한다.

재부착 방지제: 본 발명의 세제 조성물은 또한, 1종 이상의 재부착 방지제, 예컨대 카르복시메틸셀룰로스 (CMC), 폴리비닐 알콜 (PVA), 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 폴리옥시에틸렌 및/또는 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 아크릴산의 단독중합체, 아크릴산과 말레산의 공중합체, 및 에톡실화 폴리에틸렌이민을 포함할 수 있다. 상기 방오 중합체 하에 기재된 셀룰로스 기반 중합체가 또한 재부착 방지제로서 기능할 수 있다.

다른 적합한 보조 물질은 수축 방지제, 주름 방지제, 살박테리아제, 결합제, 담체, 염료, 효소 안정화제, 섬유 유연제, 충전제, 거품 조절제, 굴수성제, 퍼퓸, 안료, 비누거품 억제제, 용매, 및 액체 세제용 구조화제 및/또는 구조 탄성화제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

세제 생성물의 제형

세제 조성물은 임의의 편리한 형태, 예를 들어, 바, 균질 정제, 2개 이상의 층을 갖는 정제, 1개 이상의 구획을 갖는 파우치, 레귤러 또는 콤팩트 분말, 과립, 페이스트, 겔, 또는 레귤러, 콤팩트 또는 농축 액체일 수 있다. 수많은 세제 제형 형태 예컨대 층 (동일하거나 상이한 상), 파우치, 뿐만 아니라 기계 투여 단위를 위한 형태가 존재한다.

파우치는 단일 또는 다중 구획으로 구성될 수 있다. 이는, 예를 들어 물과 접촉하기 전에 조성물이 파우치로부터 방출되지 않도록 하면서, 조성물을 보유하기에 적합한 임의의 형태, 형상 및 물질일 수 있다. 파우치는 내부 용적을 둘러싸는 수용성 필름으로 만들어진다. 상기 내부 용적은 파우치의 구획들로 나뉠 수 있다. 바람직한 필름은 중합체 물질, 바람직하게는 필름 또는 시트로 성형되는 중합체이다. 바람직한 중합체, 공중합체 또는 그의 유도체는 선택된 폴리아크릴레이트, 및 수용성 아크릴레이트 공중합체, 메틸 셀룰로스, 카르복시 메틸 셀룰로스, 나트륨 덱스트린, 에틸 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸 셀룰로스, 말토 덱스트린, 폴리 메타크릴레이트, 가장 바람직하게는 폴리비닐 알콜 공중합체 및 히드록시프로필 메틸 셀룰로스 (HPMC)이다. 바람직하게는 필름 내의 중합체, 예를 들어 PVA의 수준은 적어도 약 60%이다. 바람직한 평균 분자량은 전형적으로 약 20,000 내지 약 150,000일 것이다. 필름은 또한 가수분해에 의해 분해가능하고 수용성인 중합체 블렌드 예컨대 폴리락티드 및 폴리비닐 알콜 (미국 인디애나주 게리 소재의 크리스 크라프트 In. Prod.(Chris Craft In. Prod.)에 의해 판매되는 상표 참조 M8630 하에 공지됨) 플러스 글리세롤, 에틸렌 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨 및 그의 혼합물과 같은 가소제를 포함하는 블렌드 조성물일 수 있다. 파우치는 고체 세탁 세정 조성물 또는 부분 성분 및/또는 액체 세정 조성물 또는 수용성 필름에 의해 분리된 부분 성분을 포함할 수 있다. 액체 성분을 위한 구획은 고체를 함유하는 구획과 조성에서 상이할 수 있다. 참조: (US2009/0011970 A1).

세제 성분은 물 용해성 파우치 또는 상이한 층의 정제 내에서 구획에 의해 서로 물리적으로 분리될 수 있다. 이로써 성분들 사이의 부정적인 저장 상호작용을 피할 수 있다. 각각의 구획의 상이한 용해 프로파일은 또한, 세척 용액에서 선택된 성분의 지연된 용해를 일으킬 수 있다.

단위 투여되지 않는 액체 또는 겔 세제는, 전형적으로 중량 기준으로 적어도 20% 및 최대 95%의 물, 예컨대 최대 약 70%의 물, 최대 약 65%의 물, 최대 약 55%의 물, 최대 약 45%의 물, 최대 약 35%의 물을 함유하는 수성일 수 있다. 비제한적으로, 알칸올, 아민, 디올, 에테르 및 폴리올을 포함하는 다른 유형의 액체가 수성 액체 또는 겔에 포함될 수 있다. 수성 액체 또는 겔 세제는 0-30%의 유기 용매를 함유할 수 있다. 액체 또는 겔 세제는 비-수성일 수 있다.

세탁 비누 바

본 발명의 효소는 세탁 비누 바에 첨가될 수 있고, 세탁물, 직물 및/또는 텍스타일을 손 세척하는데 사용될 수 있다. 용어 세탁 비누 바는 세탁 바, 비누 바, 콤보 바, 합성세제 바 및 세제 바를 포함한다. 바의 유형은 통상적으로 이들이 함유하는 계면활성제의 유형에 있어서 상이하고, 용어 세탁 비누 바는 지방산으로부터의 비누 및/또는 합성 비누를 함유하는 것을 포함한다. 세탁 비누 바는 실온에서 고체이고 액체, 겔 또는 분말이 아닌 물리적 형태를 갖는다. 용어 고체는 시간의 경과에 따라 유의하게 변하지 않는 물리적 형태로서 정의되고, 즉 고체 물체 (예를 들어, 세탁 비누 바)가 용기 내부에 놓이면, 고체 물체는 그것이 놓인 용기를 채우기 위해 변화되지 않는다. 바는 전형적으로 바 형태의 고체이지만 원형 또는 타원형과 같은 다른 고체 형상일 수 있다.

세탁 비누 바는 1종 이상의 추가의 효소, 프로테아제 억제제, 예컨대 펩티드 알데히드 (또는 히드로술파이트 부가물 또는 헤미아세탈 부가물), 붕산, 보레이트, 보락스 및/또는 페닐보론산 유도체, 예컨대 4-포르밀페닐보론산, 1종 이상의 비누 또는 합성 계면활성제, 폴리올, 예컨대 글리세린, pH 제어 화합물, 예컨대 지방산, 시트르산, 아세트산 및/또는 포름산, 및/또는 1가 양이온 및 유기 음이온의 염을 함유할 수 있고, 여기서 1가 양이온은 예를 들어 Na⁺, K⁺ 또는 NH₄ ⁺일 수 있고, 유기 음이온은 예를 들어 포르메이트, 아세테이트, 시트레이트 또는 락테이트일 수 있으므로, 1가 양이온 및 유기 음이온의 염은, 예를 들어 포름산나트륨일 수 있다.

세탁 비누 바는 또한, 착물화제, 예컨대 EDTA 및 HEDP, 퍼퓸 및/또는 상이한 유형의 충전제, 계면활성제, 예를 들어 음이온성 합성 계면활성제, 빌더, 중합체 방오 작용제, 세제 킬레이트화제, 안정화제, 충전제, 염료, 착색제, 이염 억제제, 알콕실화 폴리카르보네이트, 비누거품 억제제, 구조화제, 결합제, 침출제, 표백 활성화제, 점토 오염물 제거제, 재부착 방지제, 중합체 분산제, 증백제, 섬유 유연제, 퍼퓸 및/또는 관련 기술분야에 공지된 다른 화합물을 함유할 수 있다.

세탁 비누 바는 통상적인 세탁 비누 바 제조 장비, 예컨대 비제한적으로 혼합기, 플로더, 예를 들어 2개의 단계의 진공 플로더, 압출기, 커터, 로고-스탬퍼, 냉각 터널 및 포장기에서 가공될 수 있다. 본 발명은 임의의 단일 방법에 의해 세탁 비누 바를 제조하는 것에 제한되지 않는다. 본 발명의 프리믹스는 과정의 상이한 단계에서 비누에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 비누, 효소, 임의로 1종 이상의 추가의 효소, 프로테아제 억제제, 및 1가 양이온과 유기 음이온의 염을 함유하는 프리믹스가 제조될 수 있고, 이어서 혼합물은 플로드된다. 효소 및 임의적인 추가의 효소는, 예를 들어 액체 형태로 프로테아제 억제제와 동시에 첨가될 수 있다. 혼합 단계 및 플로딩 단계 외에, 상기 과정은 밀링, 압출, 커팅, 스탬핑, 냉각 및/또는 포장 단계를 추가로 포함할 수 있다.

조성물을 생산하는 방법

본 발명은 또한 조성물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 방법은 세제 조성물의 (저장) 안정성과 관련될 수 있다: 예를 들어 비누 바 프리믹스 방법 WO2009155557.

용도

본 발명은 또한 그의 세제 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 예를 들어 크산탄 검의 분해를 필요로 하는 임의의 세제 적용분야에 사용될 수 있다.

크산탄 검을 분해하기 위한 용도

크산탄 검은 식품 및 화장품을 포함한 많은 소비자 제품의 성분으로서 사용되어 왔고, 석유 산업에서 용도가 발견되었다. 따라서 크산탄 검의 분해는 개선된 세정 과정, 예컨대 보다 용이한 검 예컨대 크산탄 검 함유 얼룩의 제거를 발생시킬 수 있다. 따라서 본 발명은 크산탄 검을 분해하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 크산탄 리아제 (예를 들어 변이체)를 포함하는 세제 조성물의 용도에 관한 것이다. 한 실시양태는 크산탄 검을 분해하기 위한, 엔도글루카나제(들)와 함께 본원에 기재된 바와 같은 크산탄 리아제 (예를 들어 변이체)를 포함하는 세제 조성물의 용도이다. 크산탄 검의 분해는 바람직하게는 점도 감소 검정 (예를 들어, ViPr 검정)을 사용하여 또는 대안적으로 본원의 실시예 4에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다.

GH9 엔도글루카나제 활성은 대안적으로 문헌 [Lever (1972), Anal. Biochem. 47: 273-279, 1972]에 개발된 비색 검정을 사용하여 크산탄 리아제로 전처리된 크산탄 검의 환원 말단의 평가에 의해 측정될 수 있다. 바람직한 실시양태는 크산탄 리아제로 전처리된 0.1% 크산탄 검의 사용이다. 크산탄 리아제로 전처리된 크산탄 검의 분해는 블랭크와 샘플 사이의 차이를 계산함으로써 결정될 수 있고, 여기서 0.5 mAU 초과, 바람직하게는 0.6 mAU 초과, 보다 바람직하게는 0.7 mAU 초과 또는 보다 더 바람직하게는 0.8 mAU 초과의 차이가 크산탄 리아제로 전처리된 크산탄 검의 분해를 나타낸다.

크산탄 리아제 활성은 대안적으로 문헌 [Lever (1972), Anal. Biochem. 47: 273-279, 1972]에 개발된 비색 검정을 사용하여 크산탄 검의 환원 말단의 평가에 의해 측정될 수 있다. 바람직한 실시양태는 0.1% 크산탄 검의 사용이다. 크산탄 검의 분해는 블랭크와 샘플 사이의 차이를 계산함으로써 결정될 수 있고, 여기서 0.1 mAU 초과, 바람직하게는 0.15 mAU 초과, 보다 바람직하게는 0.2 mAU 초과 또는 보다 더 바람직하게는 0.25 mAU 초과의 차이가 크산탄 검의 분해를 나타낸다.

크산탄 리아제 (예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 변이체) 및 엔도글루카나제 활성은 대안적으로 문헌 [Lever (1972), Anal. Biochem. 47: 273-279, 1972]에 개발된 비색 검정을 사용하여 크산탄 검의 환원 말단의 평가에 의해 측정될 수 있다. 바람직한 실시양태는 0.1% 크산탄 검의 사용이다. 크산탄 검의 분해는 블랭크와 샘플 사이의 차이를 계산함으로써 결정될 수 있고, 여기서 0.4 mAU 초과, 바람직하게는 0.5 mAU 초과, 보다 바람직하게는 0.6 mAU 초과 또는 보다 더 바람직하게는 0.8 mAU 초과의 차이가 크산탄 검의 분해를 나타낸다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 1종 이상의 크산탄 리아제 (예를 들어 변이체)를 포함하는 세제 조성물을 크산탄 검에 적용하는 것을 포함하는, 크산탄 검을 분해하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 1종 이상의 크산탄 리아제를 포함하는 세제 조성물을 크산탄 검에 적용하는 것을 포함하는, 크산탄 검을 분해하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태는 본원에 기재된 바와 같은 1종 이상의 크산탄 리아제 (예를 들어 변이체)를 포함하는 세제 조성물을 1종 이상의 엔도글루카나제와 함께 크산탄 검에 적용하는 것을 포함하는, 크산탄 검을 분해하는 방법이다.

세제에서의 용도

본 발명은 특히 세정 과정, 예컨대 텍스타일 및 직물의 세탁 (예를 들어, 가정용 세탁 세척 및 산업용 세탁 세척) 뿐만 아니라 가정용 및 산업용 경질 표면 세정, 예컨대 식기 세척에 있어서의 본원에 기재된 바와 같은 크산탄 리아제 (예를 들어 변이체)를 포함하는 세제 조성물의 용도에 관한 것이다. 이를 위해, 크산탄 리아제 (예를 들어 변이체)는 1종 이상의 세제 성분을 포함하는 세제 조성물에 첨가될 수 있다.

일부 측면에서 본원에 기재된 바와 같은 크산탄 리아제 (예를 들어 변이체)는 세정 과정, 예컨대 텍스타일 및 직물의 세탁 (예를 들어, 가정용 세탁 세척 및 산업용 세탁 세척) 뿐만 아니라 가정용 및 산업용 경질 표면 세정, 예컨대 식기 세척을 위해 세제 조성물 중 엔도글루카나제(들)와 함께 사용될 수 있다. 이를 위해, 크산탄 리아제 (예를 들어 변이체)는 엔도글루카나제(들)와 함께 1종 이상의 세제 성분을 포함하는 세제 조성물에 첨가될 수 있다.

본원에 기재된 폴리펩티드 (예를 들어 변이체)는 세제 조성물에 첨가되어 이에 따라 그의 성분이 될 수 있다. 세제 조성물은, 예를 들어, 얼룩진 직물의 전처리에 적합한 세탁 첨가제 조성물 및 린스 첨가된 섬유 유연제 조성물을 포함한, 가정용 및 산업용 세탁 세정 둘 다를 위한 손 또는 기계 세탁 세제 조성물로서 제형화될 수 있거나, 또는 일반적 가정용 또는 산업용 경질 표면 세정 작업에 사용하기 위한 세제 조성물로서 제형화될 수 있거나, 또는 손 또는 기계 (가정용 및 산업용 둘 다) 식기세척 작업을 위해 제형화될 수 있다. 구체적 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 포함하는 세제 첨가제에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 본원에 기재된 바와 같은 1종 이상의 크산탄 리아제 (예를 들어 변이체)를 포함하는 세제 조성물을 크산탄 검에 적용하는 것을 포함하는, 텍스타일의 표면 또는 경질 표면, 예컨대 식기 세척 시의 크산탄 검을 분해하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 1종 이상의 크산탄 리아제 (예를 들어 변이체)를 1종 이상의 엔도글루카나제와 함께 포함하는 세제 조성물을 크산탄 검에 적용하는 것을 포함하는, 텍스타일의 표면 또는 경질 표면, 예컨대 식기 세척 시의 크산탄 검을 분해하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 1종 이상의 세제 성분을 포함하는 세제 조성물에 관한 것이다. 또한, 상기 세제 조성물에서 효소 세제력 이익을 갖는 크산탄 리아제 (예를 들어 변이체)의 용도를 포괄한다.

본원에 기재된 바와 같은 크산탄 리아제 (예를 들어 변이체)의 단독 사용은 효소 세제력 이익, 바람직하게는 크산탄 검에 대한 효소 세제력 이익을 제공하는 것으로 고려된다.

일부 측면에서 본 발명은 1종 이상의 세제 성분 및 본원에 기재된 바와 같은 단리된 크산탄 리아제 (예를 들어 변이체)를 GH9 엔도글루카나제와 함께 포함하는 세제 조성물의 용도에 관한 것이다. 일부 측면에서 본 발명은 1종 이상의 세제 성분 및 단리된 크산탄 리아제 (예를 들어 본원에 기재된 변이체)를 GH9 엔도글루카나제와 함께 포함하는 세제 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 하기 단락에서 추가로 규정된다:

1. i) 서열식별번호: 2의 아미노산 154 내지 176에 상응하는 영역 1,

ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 614 내지 658에 상응하는 영역 2,

iii) 서열식별번호: 2의 아미노산 731 내지 803에 상응하는 영역 3,

iv) 서열식별번호: 2의 아미노산 807 내지 846에 상응하는 영역 4,

v) 서열식별번호: 2의 아미노산 872 내지 885에 상응하는 영역 5,

vi) 서열식별번호: 2의 아미노산 903 내지 1004에 상응하는 영역 6

으로 이루어진 군으로부터 선택된 영역의 1개 이상의 위치에서 변경 (예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입)을 포함하는 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물이며,

여기서 상기 변이체는 서열식별번호: 2와 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 및 100% 미만의 서열 동일성을 갖고; 바람직하게는 상기 크산탄 리아제 변이체는 크산탄 검에 대해 활성을 갖고, 추가로 바람직하게는 상기 활성은 크산탄 검 분해 활성인 세제 조성물.

2. 단락 1에 있어서, 크산탄 리아제 변이체가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 모 크산탄 리아제의 변이체인 세제 조성물:

a) 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드와 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;

b) 낮은 엄격도 조건 하에 (i) 서열식별번호: 1의 성숙 폴리펩티드 코딩 서열, 또는 (ii) (i)의 전장 상보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드;

c) 서열식별번호: 1의 성숙 폴리펩티드 코딩 서열과 적어도 60% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드; 및

d) 크산탄 리아제 활성을 갖는, 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 단편.

3. 단락 2에 있어서, 모 크산탄 리아제가 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드와 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 것인 세제 조성물.

4. 단락 2 또는 3에 있어서, 모 크산탄 리아제가 낮은 엄격도 조건, 중간 엄격도 조건, 중간-높은 엄격도 조건, 높은 엄격도 조건, 또는 매우 높은 엄격도 조건 하에 (i) 서열식별번호: 1의 성숙 폴리펩티드 코딩 서열 또는 (ii) (i)의 전장 상보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 것인 세제 조성물.

5. 단락 2 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 모 크산탄 리아제가 서열식별번호: 1의 성숙 폴리펩티드 코딩 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 것인 세제 조성물.

6. 단락 2 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 모 크산탄 리아제가 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나 또는 이로 이루어진 것인 세제 조성물.

7. 단락 2 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 모 크산탄 리아제가 서열식별번호: 2의 성숙 폴리펩티드의 단편이며, 여기서 단편은 크산탄 리아제 활성을 갖는 것인 세제 조성물.

8. 단락 2 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 크산탄 리아제 변이체가 모 크산탄 리아제의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 동일성, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%이나, 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 것인 세제 조성물.

9. 단락 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 영역 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 상기 영역이 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역이며;

바람직하게는 (예를 들어, 서열식별번호: 2 또는 또 다른 모 크산탄 리아제의) 상기 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역은 하기 특색:

i) 킬레이트화제의 존재 하에 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 덜 입체형태적으로 안정함; 및/또는

ii) 킬레이트화제의 존재 하에 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 상기 킬레이트화제에 더 노출됨; 및/또는

iii) 킬레이트화제의 존재 하에 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 상기 킬레이트화제에 더 접근가능함; 및/또는

iv) 킬레이트화제의 존재 하에 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 더 입체형태적으로 동적임; 및/또는

v) 킬레이트화제의 존재 하에 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 중수소 혼입을 더 잘 수용함

중 1종 이상을 갖고;

추가로 바람직하게는 상기 인접 영역은

vi) 서열식별번호: 2의 아미노산 1 내지 153에 상응하는 영역 7,

vii) 서열식별번호: 2의 아미노산 177 내지 613에 상응하는 영역 8,

viii) 서열식별번호: 2의 아미노산 659 내지 730에 상응하는 영역 9,

ix) 서열식별번호: 2의 아미노산 804 내지 806에 상응하는 영역 10,

x) 서열식별번호: 2의 아미노산 847 내지 871에 상응하는 영역 11,

xi) 서열식별번호: 2의 아미노산 886 내지 902에 상응하는 영역 12, 및

xii) 서열식별번호: 2의 아미노산 1005 내지 1037에 상응하는 영역 13

으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

추가로 가장 바람직하게는 상기 킬레이트화제는 EDTA 또는 시트레이트인 세제 조성물.

10. 단락 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 세제 성분을 포함하는 수용액 중 영역 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 (예를 들어, 서열식별번호: 2의 또는 또 다른 모 크산탄 리아제의) 상기 영역이 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 덜 입체형태적으로 안정하고;

바람직하게는 상기 인접 영역은

i) 서열식별번호: 2의 아미노산 1 내지 153에 상응하는 영역 7,

ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 177 내지 613에 상응하는 영역 8,

iii) 서열식별번호: 2의 아미노산 659 내지 730에 상응하는 영역 9,

iv) 서열식별번호: 2의 아미노산 804 내지 806에 상응하는 영역 10,

v) 서열식별번호: 2의 아미노산 847 내지 871에 상응하는 영역 11,

vi) 서열식별번호: 2의 아미노산 886 내지 902에 상응하는 영역 12, 및

vii) 서열식별번호: 2의 아미노산 1005 내지 1037에 상응하는 영역 13

으로 이루어진 군으로부터 선택되고,

추가로 바람직하게는 상기 세제 성분은 킬레이트화제를 포함하고; 추가로 가장 바람직하게는 상기 킬레이트화제는 EDTA 또는 시트레이트인 세제 조성물.

11. 단락 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 세제 성분을 포함하는 수용액 중 영역 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 (예를 들어, 서열식별번호: 2의 또는 또 다른 모 크산탄 리아제의) 상기 영역이 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 상기 세제 성분에 더 노출되고;

바람직하게는 상기 인접 영역은

i) 서열식별번호: 2의 아미노산 1 내지 153에 상응하는 영역 7,

ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 177 내지 613에 상응하는 영역 8,

iii) 서열식별번호: 2의 아미노산 659 내지 730에 상응하는 영역 9,

iv) 서열식별번호: 2의 아미노산 804 내지 806에 상응하는 영역 10,

v) 서열식별번호: 2의 아미노산 847 내지 871에 상응하는 영역 11,

vi) 서열식별번호: 2의 아미노산 886 내지 902에 상응하는 영역 12, 및

vii) 서열식별번호: 2의 아미노산 1005 내지 1037에 상응하는 영역 13

으로 이루어진 군으로부터 선택되고,

추가로 바람직하게는 상기 세제 성분은 킬레이트화제를 포함하고; 추가로 가장 바람직하게는 상기 킬레이트화제는 EDTA 또는 시트레이트인 세제 조성물.

12. 단락 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 세제 성분을 포함하는 수용액 중 영역 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 (예를 들어, 서열식별번호: 2의 또는 또 다른 모 크산탄 리아제의) 상기 영역이 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 상기 세제 성분에 더 접근가능하고;

바람직하게는 상기 인접 영역은

i) 서열식별번호: 2의 아미노산 1 내지 153에 상응하는 영역 7,

ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 177 내지 613에 상응하는 영역 8,

iii) 서열식별번호: 2의 아미노산 659 내지 730에 상응하는 영역 9,

iv) 서열식별번호: 2의 아미노산 804 내지 806에 상응하는 영역 10,

v) 서열식별번호: 2의 아미노산 847 내지 871에 상응하는 영역 11,

vi) 서열식별번호: 2의 아미노산 886 내지 902에 상응하는 영역 12, 및

vii) 서열식별번호: 2의 아미노산 1005 내지 1037에 상응하는 영역 13

으로 이루어진 군으로부터 선택되고,

추가로 바람직하게는 상기 세제 성분은 킬레이트화제를 포함하고; 추가로 가장 바람직하게는 상기 킬레이트화제는 EDTA 또는 시트레이트인 세제 조성물.

13. 단락 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 세제 성분을 포함하는 수용액 중 영역 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 (예를 들어, 서열식별번호: 2의 또는 또 다른 모 크산탄 리아제의) 상기 영역이 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 더 입체형태적으로 동적이고;

바람직하게는 상기 인접 영역은

i) 서열식별번호: 2의 아미노산 1 내지 153에 상응하는 영역 7,

ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 177 내지 613에 상응하는 영역 8,

iii) 서열식별번호: 2의 아미노산 659 내지 730에 상응하는 영역 9,

iv) 서열식별번호: 2의 아미노산 804 내지 806에 상응하는 영역 10,

v) 서열식별번호: 2의 아미노산 847 내지 871에 상응하는 영역 11,

vi) 서열식별번호: 2의 아미노산 886 내지 902에 상응하는 영역 12, 및

vii) 서열식별번호: 2의 아미노산 1005 내지 1037에 상응하는 영역 13

으로 이루어진 군으로부터 선택되고,

추가로 바람직하게는 상기 세제 성분은 킬레이트화제를 포함하고; 추가로 가장 바람직하게는 상기 킬레이트화제는 EDTA 또는 시트레이트인 세제 조성물.

14. 단락 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 세제 성분을 포함하는 수용액 중 영역 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 (예를 들어, 서열식별번호: 2의 또는 또 다른 모 크산탄 리아제의) 상기 영역이 1개 이상 또는 모든 그의 인접 영역보다 중수소 혼입을 더 잘 수용하고;

바람직하게는 상기 인접 영역은

i) 서열식별번호: 2의 아미노산 1 내지 153에 상응하는 영역 7,

ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 177 내지 613에 상응하는 영역 8,

iii) 서열식별번호: 2의 아미노산 659 내지 730에 상응하는 영역 9,

iv) 서열식별번호: 2의 아미노산 804 내지 806에 상응하는 영역 10,

v) 서열식별번호: 2의 아미노산 847 내지 871에 상응하는 영역 11,

vi) 서열식별번호: 2의 아미노산 886 내지 902에 상응하는 영역 12, 및

vii) 서열식별번호: 2의 아미노산 1005 내지 1037에 상응하는 영역 13

으로 이루어진 군으로부터 선택되고,

추가로 바람직하게는 상기 세제 성분은 킬레이트화제를 포함하고; 추가로 가장 바람직하게는 상기 킬레이트화제는 EDTA 또는 시트레이트인 세제 조성물.

15. 단락 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 크산탄 리아제 변이체가

i) 서열식별번호: 2의 아미노산 154 내지 176에 상응하는 영역 1,

ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 614 내지 658에 상응하는 영역 2,

iii) 서열식별번호: 2의 아미노산 731 내지 803에 상응하는 영역 3,

iv) 서열식별번호: 2의 아미노산 807 내지 846에 상응하는 영역 4,

v) 서열식별번호: 2의 아미노산 872 내지 885에 상응하는 영역 5,

vi) 서열식별번호: 2의 아미노산 903 내지 1004에 상응하는 영역 6

으로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 영역의 1개 이상의 위치에서 변경 (예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입)을 포함하고,

여기서 상기 변이체는 서열식별번호: 2와 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 및 100% 미만의 서열 동일성을 갖고, 바람직하게는 상기 변이체는 크산탄 검에 대해 활성을 갖고, 추가로 바람직하게는 상기 활성은 크산탄 검 분해 활성인 세제 조성물.

16. 단락 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 변이체가 서열식별번호: 2와 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 것인 세제 조성물.

17. 단락 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 위치에서의 상기 변경 (예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입)이 서열식별번호: 2의 위치: 155, 159, 620, 624, 626, 631, 635, 645, 649, 650, 656, 738, 745, 746, 748, 752, 753, 754, 757, 764, 769, 774, 775, 777, 779, 782, 785, 786, 789, 792, 796, 799, 800, 801, 819, 824, 843, 845, 875, 903, 911, 912, 915, 919, 921, 923, 925, 927, 928, 930, 932, 933, 941, 966, 967, 991 및 998에서의 변경으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 넘버링은 서열식별번호: 2에 따르고, 바람직하게는 위치: 775, 779 또는 923에서의 변경으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 넘버링은 서열식별번호: 2에 따른 것인 세제 조성물.

18. 단락 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 위치에서의 상기 변경이 Y155E, A159P, K620R, A624E, A626G, T631N, T631E, S635E, S635T, S635Q, A645S, T649V, T649K, T649R, Q650G, I656V, G738L, K745R, F746L, L748T, P752R, P752K, G753E, G753Q, G753S, S754E, S754L, S754Q, S754R, S757D, S757P, S757E, P764V, P764K, A769D, A769T, A769R, A769S, A769E, A769Q, A769*, A774V, L775M, L775Y, L775A, L775I, L775S, L775F, L775Q, D777K, D777R, P779V, Y782I, A785T, N786K, G789R, K792W, K792Y, K792V, K792A, N796Q, A799H, V800P, D801G, K819R, K819T, K824R, A843P, D845E, K875T, K875E, T903A, T903Q, A911V, A911M, A911S, A912T, A912I, A912Y, T915Q, T915S, T915V, T915A, T919F, T919G, T919D, T921R, T921S, T923H, T923D, T925Q, T925D, T925R, T927K, D928W, Y930H, Y930L, Y930F, A932P, D933M, G941E, G941D, A966P, A967D, N991D 및 V998K로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 넘버링은 서열식별번호: 2에 따른 것인 세제 조성물.

19. 단락 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서,

vii) 서열식별번호: 2의 아미노산 1 내지 153에 상응하는 영역 7,

viii) 서열식별번호: 2의 아미노산 177 내지 613에 상응하는 영역 8,

ix) 서열식별번호: 2의 아미노산 659 내지 730에 상응하는 영역 9,

x) 서열식별번호: 2의 아미노산 804 내지 806에 상응하는 영역 10,

xi) 서열식별번호: 2의 아미노산 847 내지 871에 상응하는 영역 11,

xii) 서열식별번호: 2의 아미노산 886 내지 902에 상응하는 영역 12, 및

xiii) 서열식별번호: 2의 아미노산 1005 내지 1037에 상응하는 영역 13

으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 영역의 1개 이상의 위치에서 변경을 추가로 포함하는 세제 조성물.

20. 단락 19에 있어서, 영역 7, 8, 9, 10, 11, 12 및 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 영역의 1개 이상의 위치에서의 상기 변경이 서열식별번호: 2의 9, 15, 18, 46, 58, 66, 89, 95, 100, 106, 109, 183, 188, 190, 203, 204, 221, 229, 234, 238, 240, 242, 243, 257, 258, 284, 291, 293, 316, 317, 320, 324, 329, 333, 339, 341, 352, 354, 360, 372, 377, 399, 400, 419, 440, 450, 451, 454, 458, 481, 492, 505, 533, 567, 568, 576, 578, 579, 582, 664, 672, 703, 722, 726, 727, 728, 851, 855, 856, 867, 887, 892, 899, 900, 901, 902, 915, 1008 및 1016으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서의 변경인 세제 조성물.

21. 단락 20에 있어서, 영역 7, 8, 9, 10, 11, 12 및 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 영역의 1개 이상의 위치에서의 상기 변경이 서열식별번호: 2의 K9R, N15T, T18D, L46D, A58L, S66H, Q89Y, K95E, S100D, N106Y, Q109R, Q109D, Q109F, Q109K, Q109A, K183Q, K183R, V188I, A190Q, A203P, K204R, A221P, E229N, E229S, E229V, I234V, I238W, I238L, I238M, I240W, N242S, G243V, Y257W, R258E, R284G, K291R, A293G, A293P, K316R, R317K, K320R, L324Q, K329R, K333R, L339M, I341P, V352I, S354P, K360G, K360R, Q372H, F377Y, N399K, K400R, F419Y, N440K, D450P, K451E, K451R, A454V, D458S, K481R, A492H, A492L, T505I, L533I, K567R, G568A, S578K, S578N, S578R, S579R, S579K, S582K, T664K, N672D, I703L, I722F, P726Q, T727P, M728V, S851F, K855R, E856D, P867S, K887R, N892Y, N892W, N892F, G899S, I900G, D901A, T902F, N1008D 및 K1016T로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환을 포함하는 것인 세제 조성물.

22. 단락 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 크산탄 리아제 변이체가 서열식별번호: 2의 위치 624, 631, 635, 649, 656, 738, 752, 753, 754, 757, 769, 775, 777, 800, 801, 843, 875, 911 및 915로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서의 변경 및 위치 89, 100, 190, 229, 234, 352, 360, 399, 440, 458, 492, 567, 582, 664, 672, 703, 728, 892, 1008 및 1016으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서의 변경을 포함하는 것인 세제 조성물.

23. 단락 22에 있어서, 크산탄 리아제 변이체가 Q89Y, S100D, A190Q, E229S, I234V, V352I, K360G, N399K, N440K, D458S, A492H, A492L, K567R, S582K, T664K, N672D, I703L, M728V, N892Y N1008D 및 K1016T로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환 및 A624E, T631N, S635E, T649K, I656V, G738L, P752K, P752R, G753E, S754E, S754R, S757D, A769D, L775A, D777R, V800P, D801G, A843P, K875T, A911V 및 T915A로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환을 포함하는 것인 세제 조성물.

24. 단락 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 모 크산탄 리아제 (예를 들어, 서열식별번호: 2)와 비교하여 변경의 총수가 1 내지 20개, 예를 들어 1 내지 10개 또는 1 내지 5개, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 변경인 세제 조성물.

25. 단락 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 크산탄 검에 대한 상기 활성이 크산탄 검 분해 활성이고, 바람직하게는 상기 크산탄 리아제 변이체가 EC 4.2.2.12 활성을 갖는 것인 세제 조성물.

26. 단락 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 변이체가 (예를 들어, 서열식별번호: 2를 갖는) 모 크산탄 리아제와 비교하여 세제 조성물에서 개선된 안정성을 갖고; 바람직하게는 상기 세제 조성물은 킬레이트화제를 포함하고; 추가로 바람직하게는 상기 킬레이트화제는 EDTA 또는 시트레이트인 세제 조성물.

27. 단락 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 변이체가 모 크산탄 리아제, 예를 들어 서열식별번호: 2를 갖는 크산탄 리아제에 비해 ≥1.0의 반감기 개선 지수 (HIF)를 갖고; 바람직하게는 상기 변이체가 >1.0, 보다 바람직하게는 적어도 1.2, 예컨대 적어도 1.5, 예를 들어 적어도 2.0의 반감기 개선 지수 (HIF)를 갖는 것인 세제 조성물.

28. 단락 27에 있어서, 상기 반감기 개선 지수 (HIF)가 세제 조성물 중 25℃에서의 약 30분 내지 약 20시간의 기간 동안의 상기 크산탄 리아제 변이체의 인큐베이션 후에 결정되는 것인 세제 조성물.

29. 단락 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 변이체가 i) 본원의 표 1에 제시된 크산탄 리아제 변이체; ii) 본원의 표 2에 제시된 크산탄 리아제 변이체; iii) 본원의 표 3에 제시된 크산탄 리아제 변이체; iv) 본원의 표 4에 제시된 크산탄 리아제 변이체; v) 본원의 표 5에 제시된 크산탄 리아제 변이체; vi) 본원의 표 6에 제시된 크산탄 리아제 변이체, 및 vii) 본원의 표 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13 중 임의의 것에 제시된 크산탄 리아제 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 세제 조성물.

30. 단락 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 1종 이상의 세제 성분을 포함하고; 바람직하게는 상기 성분은 킬레이트화제를 포함하고; 추가로 바람직하게는 상기 킬레이트화제는 EDTA 또는 시트레이트인 세제 조성물.

31. 단락 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 엔도글루카나제, 프로테아제, 아밀라제, 리케나제, 리파제, 큐티나제, 셀룰라제, 크산탄 리아제, 크실로글루카나제, 펙티나제, 펙틴 리아제, 크산타나제, 퍼옥시다제, 할로퍼옥시게나제, 카탈라제 및 만난아제, 또는 그의 임의의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 추가의 효소를 추가로 포함하는 조성물.

32. 단락 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 바, 균질 정제, 2개 이상의 층을 갖는 정제, 1개 이상의 구획을 갖는 파우치, 레귤러 또는 콤팩트 분말, 과립, 페이스트, 겔, 또는 레귤러, 콤팩트 또는 농축 액체의 형태인 조성물.

34. 크산탄 검을 분해하기 위한, 단락 1 내지 32 중 어느 하나의 세제 조성물의 용도.

35. 단락 34에 있어서, 상기 크산탄 리아제 변이체가 효소 세제력 이익을 갖는 것인 용도.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 기재되며, 이는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되서는 안된다.

실시예

실시예 1: 수소 교환 - HDX

5 mM EDTA의 부재 또는 존재 하의 99.9% 중수소화 20mM 트리스, 1mM CaCI2, pH 8을 85%의 최종 중수소 농도로 첨가하여 서열식별번호: 2의 모 크산탄 리아제의 연속 아미드 수소/중수소 (H/D) 교환을 개시하였다. H/D 교환은 1μM의 농도에서 22℃에서 삼중으로 수행하였다. 15초에서 1시간 범위의 5개의 시점에 1:1 (v/v) 빙냉 6M 구아니디늄 히드로클로라이드, 300 mM 포스페이트, pH 2.05를 2.6의 최종 pH까지 첨가하여 샘플을 켄칭하였다. 켄칭된 샘플을 즉시 냉동시키고, LC-MS 분석까지 -80℃에서 저장하였다. 비-중수소화 샘플은 동일한 절차에 따르되 수소동위원소 함유 완충제를 사용하여 제조하였다. 99.9% 중수소화 6M 구아니디늄 히드로클로라이드에서의 밤샘 인큐베이션에 의해 완전히 중수소화된 샘플 (서열식별번호: 2의 모 크산탄 리아제의 경우 85% D₂O)을 제조하고, 300mM 포스페이트, pH 2.3에서 최종 pH 2.6까지 켄칭하였다. 크산탄 리아제에 대한 EDTA의 효과의 가역성을 연구하기 위해 3가지 상태의 크산탄 리아제 (XL)에 대해 H/D 교환을 10분 동안 행하였다: (1) XL; (2) XL + 5 mM EDTA; (3) 첫번째 5mM EDTA와 30분 동안 및 두번째 10 mM CaCl2와 30분 동안 사전인큐베이션된 XL XL. 샘플을 상기 기재된 바와 같이 켄칭하였다.

켄칭된 샘플을 고정된 펩신 칼럼을 사용하는 온라인 펩신 소화를 위한 냉각된 HDX-UPLC 시스템 (피어스(Pierce), 미국 록포드)에 로딩하였다. 포획 칼럼 (워터스 뱅가드(Waters VanGuard) C18, 1.7μM, 2.1 x 5mm)을 사용하여 3분 동안 200μl/분 0.23% 포름산의 유량으로 펩티드를 탈염시키고, 역상 크로마토그래피 (워터스 액퀴티(Waters Acquity) BEH C18, 1.7μm, 1 x 100mm)에 의해 아세토니트릴 중 0.23% 포름산의 2분간 8-18% 및 10분간 18-40%의 2-단계 구배를 40μl/분의 유량으로 사용하여 펩티드를 분리하였다. 펩티드에 대해 시냅트(Synapt) G2 질량 분광계 (워터스, 미국 밀포드)를 사용하여 이온 이동성에 의한 양성 전기분무 이온화 질량 분광측정법을 수행하였다.

프로테인 링스 글로벌 서버(Protein Lynx Global Server) v. 2.5에서의 데이터 비의존성 (MSe) 및 데이터 의존성 획득 스킴 (DDA)의 조합 및 데이터-분석을 사용하여 비-중수소화 샘플의 탠덤 질량 분광측정법에 의해 서열식별번호: 2의 성숙 모 크산탄 리아제의 펩신 펩티드를 확인하였다. 개별 펩티드의 중수소 혼입은 DynamX v. 3.0 또는 HXexpress (M. Guttman, D. Weis, J. Engen, K. Lee, J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 2013, 24, 1906-1912)에서 결정하였다. 통계적 분석 (F-검정 및 스튜던트 T-검정)을 사용하여 분석된 단백질 상태 사이의 H/D 교환에서의 통계적으로 유의한 변화 (ΔDX)를 결정하였다.

H/D 교환에서 유의한 변화 (ΔDX>0.5)를 갖는 펩티드가 서열식별번호: 2 내의 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역을 확인시켜주는 것으로서 선택되었다. 하기 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역이 서열식별번호: 2의 크산탄 리아제 내에서 확인되었다: 서열식별번호: 2의 아미노산 154 내지 176에 상응하는 영역 1, 서열식별번호: 2의 아미노산 614 내지 658에 상응하는 영역 2, 서열식별번호: 2의 아미노산 731 내지 803에 상응하는 영역 3, 서열식별번호: 2의 아미노산 807 내지 846에 상응하는 영역 4, 서열식별번호: 2의 아미노산 872 내지 885에 상응하는 영역 5, 및 서열식별번호: 2의 아미노산 903 내지 1004에 상응하는 영역 6.

실시예 2: 크산탄 리아제 변이체의 구축 및 발현

크산탄 리아제 모 유전자 (즉, 서열식별번호: 1)를 상류에 프로모터 시스템 및 하류에 cat 선택 마커를 함유하는 선형 카세트 내로 PCR 어셈블리하였다. 비. 서브틸리스 숙주의 Pel 유전자좌에서의 상동 재조합에 의한 카세트의 염색체 통합을 가능하게 하기 위해, 통합 부위와 동일한 >2 kb DNA 서열을 카세트의 양쪽에 포함시켰다. 크산탄 리아제 모 유전자 (서열식별번호: 1)를 함유하는 균주로부터 제조된 게놈 DNA를 부위-지정 돌연변이체 생성을 위한 주형으로서 사용하였다. 돌연변이유발 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 대략 6 kb PCR 단편을 생성하였다. 이 단편을 메가프라이머로서 또 다른 정방향 프라이머와 함께 사용하여 >8 kb DNA 단편을 증폭시켰다. 이 단편은 완전한 카세트 (Pel 유전자좌에서의 재조합에 필요한 상동 DNA 서열과 함께, 프로모터 시스템, 크산탄 리아제 및 cat 유전자)를 함유하였고, 형질전환에 사용되었다.

카세트에 사용된 3중 프로모터 시스템은 WO 99/43835에 기재되어 있고, 이는 바실루스 리케니포르미스 알파-아밀라제 유전자 (amyL), 바실루스 아밀로리퀘파시엔스 알파-아밀라제 유전자 (amyQ)로부터의 프로모터, 및 안정화 서열을 포함하는 바실루스 투린기엔시스 cryIIIA 프로모터로 이루어진다. 바실루스 클라우시이로부터의 프로테아제 신호 서열은 세포에서 단백질을 유출시키기 위해 포함시켰다.

서열식별번호: 2의 성숙 모 크산탄 리아제의 생성된 변이체를 하기 표 1 및 2에 제시한다. 변경의 존재는 서열분석에 의해 확인되었다.

변이체를 함유하는 바실루스 유기체를 클로람페니콜 (6 μg/ml)을 함유하는 LB 브로쓰에 접종하고, 37℃에서 밤새 성장시켰다. 크산탄 리아제 변이체의 발현을 위해, 밤샘 배양물 2%를 1000 ml 배플형 플라스크에 담긴 10-R 배지 300 ml에 첨가하고, 30℃에서 96시간 동안 180 rpm에서 성장시켰다.

10-R 배지는 33 g/L 가용성 전분, 6 g/L (NH4)2HPO4, 5 g/L 감자 펩톤, 1.2 g/L (MgSO4 x 7H2O), 12 g/L KH2PO4, 5 g/L (Na2HPO4 x 2H2O), 18 mL/L 미량 금속 용액, 1.8 g/L K2SO4 및 0.1 g/L (CaCl2 x 2H2O) 및 0.5 mL/L SB2121 (소포제)을 함유하였다. 미량 금속 용액은 0.49 g/L (MnSO4 x H2O), 1.97 g/L (FeSO4 x 7H2O), 0.1 g/L (CuSO4 x 5H2O), 0.3 g/L ZnCl2 및 19.6 g/L 시트르산을 혼합하여 제조하였다.

실시예 3: 크산탄 리아제 변이체의 정제

정제 전에, 바실루스 서브틸리스 브로쓰를 8000 x g에서 10℃에서 30분 동안 원심분리한 다음, 부흐너 깔때기에서 자이츠 필터 (K250) 및 와트만 유리 필터 GF/F 등급의 조합을 사용하여 진공 여과하여 정화하였다. 마지막으로, 상청액을 0.22μ 접선 흐름 여과 유닛을 통해 여과하였다.

크산탄 리아제 변이체를 3-단계 자동화된 탠덤 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 마크로-프렙 메틸 HIC 칼럼을 1 M (NH4)2SO4 및 1 mM CaCl2 완충제를 함유하는 50 mM 트리스, pH 8.0으로 사전-평형화하였다. 칼럼에의 샘플 로딩 동안, 정화된 배양물 상청액 (250 mL)을 2 M (NH4)2SO4 및 1 mM CaCl2 완충제를 함유하는 50 mM 트리스, pH 8.0으로 1:1 인-라인 희석하여 최종 농도 1 M이 되게 하였다. 280 nm에서의 흡광도가 0.1 AU 미만이 될 때까지 비결합된 또는 약하게 결합된 단백질을 평형 완충제로 세척하였다. 0.5 M (NH4)2SO4 및 1 mM CaCl2를 함유하는 50 mM 트리스 pH 8을 사용하여 용리를 수행하였다. 용리된 단백질 피크는 0.5 M (NH4)2SO4 및 1 mM CaCl2를 함유하는 50 mM 트리스, pH 8으로 사전-평형화된 MEP-하이퍼셀 칼럼 상에 자동 로딩되었다. 280 nm에서의 흡광도가 0.1 AU 미만이 될 때까지 비결합된 또는 약하게 결합된 단백질을 평형 완충제로 세척하였다. 칼럼을 다시 1mM CaCl2를 함유하는 50 mM 트리스, pH 8로 세척하여 불순물을 제거하였다. 정제된 단백질을 1 mM CaCl2를 함유하는 50 mM Na-아세테이트, pH 5로 용리시켰다. 용리된 정제된 단백질은 탈염을 위해 1 mM CaCl2를 함유하는 50 mM MOPS, pH 8로 사전-평형화된 세파덱스 G-25 칼럼으로 자동 전달되었다.

실시예 4: 세제 안정성 검정

세제 안정성 검정을 위한 시약은 다음과 같이 제조하였다:

1.0 M MOPS 완충제의 스톡은 3-모르폴리노프로판술폰산 209.26 g을 밀리 Q 물에 용해시켜 제조하였다. NaOH를 사용하여 pH를 7.5로 조정하고, 완충제의 최종 부피를 1000 ml로 만들었다. 이러한 완충제 스톡을 사용 시까지 4℃에서 저장하였다. MOPS 완충제의 50 mM 작업 용액은 1.0 M 스톡 50 ml를 밀리 Q 물 950 ml에 첨가하여 제조하였다.

0.4% w/v 크산탄 검의 기질 용액은 크산탄 검 400 mg을 밀리 Q 물 100 ml 중에 용해시켜 새로이 제조하였다.

1.0 M Na2CO3, 0.17 M 타르타르산나트륨칼륨 및 5 mM (Bi (NO3)3 x 5H2O)을 함유하는 원액 믹스는 Na2CO3 106.99 g, 타르타르산나트륨칼륨 47.98 g 및 (Bi (NO3)3 x 5H2O) 2.42 mg을 최종 부피 1000 ml로 밀리 Q 물에 용해시켜 제조하였다. 이러한 원액 믹스를 여과하고, 실온에서 저장하였다.

PAHBAH 시약 (1.5% PAHBAH)은 p-히드록시벤조산 히드라지드 (PAHBAH) 1.5 g을 원액 믹스 중에 용해시켜 새로이 제조하였다.

세제 안정성 검정:

A. 변이체의 배양물 상청액의 스크리닝

세제-중 안정성은 30℃에서 세제 (70%, 최종 농도)와의 인큐베이션 후에 변이체 또는 야생형 대조군의 배양물 상청액에 존재하는 효소적 활성을 측정함으로써 결정하였다.

1000 rpm에서 15분 동안 진탕시킨 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 배양물 상청액 30μl 및 퍼실 유니버셜 겔 세제 (100%) 70μl를 첨가하여 세제 스트레스를 수행하였다. 2개의 동일한 플레이트를 생성하여 그의 하나의 플레이트는 4℃ (비스트레스 플레이트)에서 인큐베이션하고 다른 플레이트는 30℃ (스트레스 플레이트)에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 비스트레스 및 스트레스 플레이트로부터의 샘플을 희석 완충제 (50mM MOPS, 5 mM CaCl2, pH 7.5)로 50X 희석하였다.

희석된 효소-세제 샘플의 효소 활성을 측정하기 위해, 반응 혼합물을 96-웰 PCR 플레이트에 준비하였다. 희석된 샘플 50 μl를 새롭게 제조한 기질 용액 50μl와 혼합하고, 40℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.

인큐베이션 후에, PAHBAH 시약 75μl를 동일한 PCR 플레이트에서 반응 혼합물에 첨가하고, 90℃에서 10분 동안 프로그램가능한 써멀 사이클러 (티-로보트(T-ROBOT))에서 인큐베이션한 다음, 10℃에서 후속 냉각시켰다. 샘플 (25μl)을 384 웰 마이크로타이터 플레이트로 옮기고, 인피니트 M1000(Infinite M1000) 판독기 (테칸(TECAN), 스위스)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

변이체 및 야생형 대조군에 대한 잔류 활성 (RA)은 4℃에서의 인큐베이션 후에 남아있는 효소적 활성 대비 30℃에서의 인큐베이션 후에 남아있는 효소적 활성의 백분율로서, 즉, 관련 배경 흡광도 기여를 차감한 후 하기 식에 따라 계산하였다:

잔류 활성 (RA) = 100% * Abs405 (30℃에서 인큐베이션한 샘플)/Abs405 (4℃에서 인큐베이션한 샘플).

플레이트에서 성장시킨 야생형과 관련하여 보다 높은 세제 안정성을 갖는 변이체를 골라내었다.

B. 정제된 변이체의 스크리닝

정제된 변이체의 세제 안정성은 30℃에서 세제 (90%, 최종 농도)와의 인큐베이션 후에 정제된 단백질의 효소 활성을 측정함으로써 결정하였다.

정제된 변이체를 50 mM MOPS 완충제를 사용하여 200 ppm의 농도로 희석하였다. 세제 처리를 위해, 1000 rpm에서 20분 동안 진탕시킨 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에서 희석된 정제된 샘플 10μl를 퍼실 유니버셜 겔 세제 (100%) 90μl와 혼합하였다. 2개의 동일한 플레이트를 생성하여 그의 하나의 플레이트는 4℃ (비스트레스 플레이트)에서 인큐베이션하고 다른 플레이트는 30℃ (스트레스 플레이트)에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 비스트레스 및 스트레스 플레이트로부터의 샘플을 희석 완충제 (50 mM MOPS, 1mM CaCl2, pH 7.5)로 50X 희석하였다.

비스트레스 및 스트레스 샘플의 효소적 활성 분석을 섹션 A에 기재된 바와 같이 수행하였다.

C. 반감기 및 반감기 개선 지수 (HIF)의 계산

분해는 지수 붕괴에 따르고 인큐베이션 시간 (시간)은 공지되어 있기 때문에, 반감기 (T½ (시간 단위))를 야생형 대조군 및/또는 변이체에 대해 주어진 세제 농도 및 저장 온도에서, 즉 하기 식에 따라 계산하였다:

T1/2 (변이체) = (Ln (0.5)/Ln (RA-변이체/100))*시간

T1/2 (야생형) = (Ln (0.5)/Ln (RA-야생형/100))*시간

여기서 "RA"는 상기 계산된 바와 같은 퍼센트 단위의 잔류 활성이고, "시간"은 시간 단위의 인큐베이션 시간이다.

주어진 저장 조건 세트 (세제 농도 및 온도) 하에서의 반감기 개선 지수 (HIF)는 HIF = T½ (변이체)/T½ (야생형)와 같이 계산될 수 있고, 여기서 야생형은 변이체와 동일한 저장 조건 하에 인큐베이션된다.

정제된 변이체에 대해 수득된 HIF 값을 하기 표 3에 제시한다.

표 3. 정제된 변이체의 반감기 개선 지수:

변이체의 배양물 상청액에 대해 수득된 HIF 값을 하기 표 4에 제시한다.

실시예 5: 크산탄 리아제 변이체의 반감기

상기 실시예 2 및 3에 기재된 바와 같이 서열식별번호: 2의 성숙 모 크산탄 리아제의 변이체를 제조하고 정제하였다. 변이체의 세제-중 안정성을 실시예 4에 기재된 바와 같이, 세제와의 인큐베이션 후에 변이체의 배양물 상청액 또는 정제된 샘플에 존재하는 효소적 활성을 측정함으로써 결정하였다. 인큐베이션은 배양물 상청액의 경우 30℃에서 70% 농도의 퍼실 유니버셜 겔 세제 (PUG)를 사용하여 수행하고, 정제된 변이체의 경우 30℃에서 70% 또는 90% 농도의 PUG 세제를 사용하여 수행하였고, 변이체 인큐베이션 시간은 배양물 상청액의 경우 1시간 및 정제된 변이체의 경우 1시간 또는 3시간으로 하였다.

배양물 상청액에 대한 반감기 및 계산된 반감기 개선 지수 (HIF) 값을 하기 표 5에 제공한다. 표 6은 정제된 변이체에 대한 반감기 및 반감기 개선 지수 (HIF)를 제시하고, 여기서 HIF는 70% 세제 농도와 함께 인큐베이션된 변이체의 경우에 야생형 반감기 0.22시간에 기초하여 계산하였고, 90% 세제 농도와 함께 인큐베이션된 변이체의 경우에 야생형 반감기 0.20시간에 기초하여 계산하였다.

표 5. 변이체의 배양물 상청액의 반감기 및 반감기 개선 지수 (HIF)

표 6. 정제된 변이체의 반감기 및 반감기 개선 지수 (HIF)

실시예 6: 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역 및 인접 영역에서 돌연변이를 갖는 크산탄 리아제 변이체의 반감기

상기 실시예 2 및 3에 기재된 바와 같이 서열식별번호: 2의 성숙 모 크산탄 리아제의 변이체를 제조하고 정제하였다. 본 실시예의 목적상, 적어도 1개의 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역 (영역 1, 2, 3, 4, 5, 6) 및 적어도 1개의 인접 영역 (영역 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13)에서 돌연변이를 갖는 변이체를 생산하였다. 변이체의 세제-중 안정성을 실시예 4에 기재된 바와 같이, 세제와의 인큐베이션 후에 변이체의 정제된 샘플에 존재하는 효소적 활성을 측정함으로써 결정하였다. 인큐베이션은 70%, 90% 또는 95% 농도의 퍼실 유니버셜 겔 세제 (PUG)를 사용하여 수행하였고, 30, 32, 35 또는 37℃의 온도에서 1시간 내지 최대 840시간 범위의 변이체 인큐베이션 시간으로 인큐베이션하였다.

반감기를 상기 실시예 4에 기재된 바와 같이 계산하였다. 야생형 및 변이체 사이의 안정성에서의 차이가 너무 커서 동일한 인큐베이션 시간을 사용하여 야생형 및 변이체 둘 다에 대한 반감기를 정확하게 평가할 수 없는 경우, 야생형 및 변이체에 대한 인큐베이션 시간을, 예를 들어 야생형의 경우 1시간 및 가장 안정한 변이체의 경우 최대 840시간으로 상이하게 하였다.

또한, 보다 안정한 변이체에 대해 보다 짧은 지속기간의 인큐베이션 시간, 예를 들어 <168시간 내에 안정성 (반감기)를 결정하기 위해, 일부 변이체의 경우 인큐베이션 온도를 2-7℃만큼 증가시켰다. 보다 높은 온도 (즉 >30℃)에서 시험된 변이체의 경우, 이들 온도에서는 야생형의 반감기 (분 단위의 자리수)를 정확하게 결정할 수 없었기 때문에 야생형에 기초한 HIF 값을 계산할 수 없었다. 따라서 하기 표의 변이체의 안정성은 반감기 (시간 단위)의 면에서 보고된다.

하기 표 7-13은 각각의 변이체에 대한 시험 조건 (온도, 세제 농도, 인큐베이션 시간)에 대한 정보와 함께 정제된 변이체에 대한 반감기를 제시한다.

표 7. 정제된 변이체의 반감기: 온도 (T) 30℃, 세제 농도 70%

표 8. 정제된 변이체의 반감기: 온도 (T) 30℃, 세제 농도 90%

표 9. 정제된 변이체의 반감기: 온도 (T) 30℃, 세제 농도 95%

표 10. 정제된 변이체의 반감기: 온도 (T) 32℃, 세제 농도 90%

표 11. 정제된 변이체의 반감기: 온도 (T) 35℃, 세제 농도 90%

표 12. 정제된 변이체의 반감기: 온도 (T) 35℃, 세제 농도 95%

표 13. 정제된 변이체의 반감기: 온도 (T) 37℃, 세제 농도 90%

SEQUENCE LISTING <110> Henkel AG & Co. KGaA <120> DETERGENT COMPOSITION COMPRISING XANTHAN LYASE VARIANTS <130> PT034077PCT <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3111 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(3111) <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(3111) <400> 1 gac gag ttt gac acg cta agg gaa aag tat aag gcc atg ctg aac gga 48 Asp Glu Phe Asp Thr Leu Arg Glu Lys Tyr Lys Ala Met Leu Asn Gly 1 5 10 15 ggg aca acc tat aat ctc tcc gac ccg gat ata gcg gcg cgt gtt aat 96 Gly Thr Thr Tyr Asn Leu Ser Asp Pro Asp Ile Ala Ala Arg Val Asn 20 25 30 gcc att acg gtg act gcc cag gga tac tgg gac tcc atg ctt aaa gat 144 Ala Ile Thr Val Thr Ala Gln Gly Tyr Trp Asp Ser Met Leu Lys Asp 35 40 45 ccg aac cgt aac cgt ctt tgg aac gat gca ccc ttt ggc tcg gat tcg 192 Pro Asn Arg Asn Arg Leu Trp Asn Asp Ala Pro Phe Gly Ser Asp Ser 50 55 60 act tcc atc acc acg acc tac aga cac ctt tat gat atg gcg cta gct 240 Thr Ser Ile Thr Thr Thr Tyr Arg His Leu Tyr Asp Met Ala Leu Ala 65 70 75 80 tat acg act tat ggc tcc agt ctg cag ggc aat gcc gca ctt aaa gcg 288 Tyr Thr Thr Tyr Gly Ser Ser Leu Gln Gly Asn Ala Ala Leu Lys Ala 85 90 95 gat att atc agc ggt ttg gac tgg atg aat gcc aat caa ttt tat aat 336 Asp Ile Ile Ser Gly Leu Asp Trp Met Asn Ala Asn Gln Phe Tyr Asn 100 105 110 ggc tgc agc caa tat caa aac tgg tgg cac tgg caa att ggc ggt ccc 384 Gly Cys Ser Gln Tyr Gln Asn Trp Trp His Trp Gln Ile Gly Gly Pro 115 120 125 atg gcc ttg aat gat atc gtg gca tta atg tac acg gag cta acc gca 432 Met Ala Leu Asn Asp Ile Val Ala Leu Met Tyr Thr Glu Leu Thr Ala 130 135 140 aca caa att tcc aat tac atg gcg gcc att tat tac acc caa gcg agt 480 Thr Gln Ile Ser Asn Tyr Met Ala Ala Ile Tyr Tyr Thr Gln Ala Ser 145 150 155 160 gtt acg atg acg ggg gca aac cgg cta tgg gaa agt cag gtt att gcc 528 Val Thr Met Thr Gly Ala Asn Arg Leu Trp Glu Ser Gln Val Ile Ala 165 170 175 atc tcc gga atc ttg aat aag gat tcc gcc aga gtt gcc gct ggt cgg 576 Ile Ser Gly Ile Leu Asn Lys Asp Ser Ala Arg Val Ala Ala Gly Arg 180 185 190 gat ggc atc agc gct ttg ctg ccg tat gtc gcc aag ggt gac gga ttt 624 Asp Gly Ile Ser Ala Leu Leu Pro Tyr Val Ala Lys Gly Asp Gly Phe 195 200 205 tac aac gat gga tca ttc gtt cag cat act tat tat gct tac aac ggt 672 Tyr Asn Asp Gly Ser Phe Val Gln His Thr Tyr Tyr Ala Tyr Asn Gly 210 215 220 ggt tat ggt tca gag ctg tta tct ggc att gca gac ttg ata ttt att 720 Gly Tyr Gly Ser Glu Leu Leu Ser Gly Ile Ala Asp Leu Ile Phe Ile 225 230 235 240 ttg aat ggc tct tca tgg cag gta acg gat cct aat aaa aac aat gta 768 Leu Asn Gly Ser Ser Trp Gln Val Thr Asp Pro Asn Lys Asn Asn Val 245 250 255 tac cgt tgg att tat gat tcc tac gag cct ttc atc tat aaa ggg aat 816 Tyr Arg Trp Ile Tyr Asp Ser Tyr Glu Pro Phe Ile Tyr Lys Gly Asn 260 265 270 ctg atg gac atg gtc cgc ggt aga gag atc tca agg cat gga ttg cag 864 Leu Met Asp Met Val Arg Gly Arg Glu Ile Ser Arg His Gly Leu Gln 275 280 285 gac gat aag gca gcc gtg act gtg atg gca tcg atc att cgt ctg tca 912 Asp Asp Lys Ala Ala Val Thr Val Met Ala Ser Ile Ile Arg Leu Ser 290 295 300 caa acc gct gct tcc gcc gat gct acc gca ttt aag aga atg gtg aaa 960 Gln Thr Ala Ala Ser Ala Asp Ala Thr Ala Phe Lys Arg Met Val Lys 305 310 315 320 tat tgg ctg ctg ctg gat acg gat aag act ttc ctt aaa gca gta tcg 1008 Tyr Trp Leu Leu Leu Asp Thr Asp Lys Thr Phe Leu Lys Ala Val Ser 325 330 335 att gat ctg att att gcc gcg aac caa ctg gtg aac gat tcc acc gtt 1056 Ile Asp Leu Ile Ile Ala Ala Asn Gln Leu Val Asn Asp Ser Thr Val 340 345 350 acc tct cga ggg gag cta gtg aaa tat aaa caa ttc tcc gga atg gac 1104 Thr Ser Arg Gly Glu Leu Val Lys Tyr Lys Gln Phe Ser Gly Met Asp 355 360 365 cgc gct gta cag ctt aga cct ggc ttc ggt ttt ggg ctt agc atg ttt 1152 Arg Ala Val Gln Leu Arg Pro Gly Phe Gly Phe Gly Leu Ser Met Phe 370 375 380 tcc agc cgg atc ggt aat tat gag tcg att aat gca gag aac aac aaa 1200 Ser Ser Arg Ile Gly Asn Tyr Glu Ser Ile Asn Ala Glu Asn Asn Lys 385 390 395 400 ggc tgg cat acc ggc gac ggc atg acc tac ctt tac aat act gac ctg 1248 Gly Trp His Thr Gly Asp Gly Met Thr Tyr Leu Tyr Asn Thr Asp Leu 405 410 415 agt cag ttc aat gac cat ttc tgg gca act gtg gat aat tac cga ttg 1296 Ser Gln Phe Asn Asp His Phe Trp Ala Thr Val Asp Asn Tyr Arg Leu 420 425 430 ccg ggt acc aca gtg ctc cag aac acg acg caa acc gcg aac agc cgc 1344 Pro Gly Thr Thr Val Leu Gln Asn Thr Thr Gln Thr Ala Asn Ser Arg 435 440 445 agc gac aaa agc tgg gcc gga gga acg gat att ctt ggg caa tat ggt 1392 Ser Asp Lys Ser Trp Ala Gly Gly Thr Asp Ile Leu Gly Gln Tyr Gly 450 455 460 gtt tcc ggc atg gaa ctg cat acc gta ggt aag agc ctg aca gcc aag 1440 Val Ser Gly Met Glu Leu His Thr Val Gly Lys Ser Leu Thr Ala Lys 465 470 475 480 aaa tcc tgg ttc atg ttt gac gat gag atc gtc gcg ctg ggt tca ggt 1488 Lys Ser Trp Phe Met Phe Asp Asp Glu Ile Val Ala Leu Gly Ser Gly 485 490 495 att gcc agc acc gat ggc atc gca acc gaa acg att gta gag aat cga 1536 Ile Ala Ser Thr Asp Gly Ile Ala Thr Glu Thr Ile Val Glu Asn Arg 500 505 510 aag ctc aat agc agc ggc aat aat gca ttg att gtt aac ggg acg gcg 1584 Lys Leu Asn Ser Ser Gly Asn Asn Ala Leu Ile Val Asn Gly Thr Ala 515 520 525 aag ccg ggc tcc ctt gga tgg tcg gaa aca atg acc gga acc aat tat 1632 Lys Pro Gly Ser Leu Gly Trp Ser Glu Thr Met Thr Gly Thr Asn Tyr 530 535 540 att cat cta gcc ggc agc gta ccc ggc tcc gat atc ggt tat tat ttt 1680 Ile His Leu Ala Gly Ser Val Pro Gly Ser Asp Ile Gly Tyr Tyr Phe 545 550 555 560 cct ggt gga gca gca gtc aaa ggc ttg cgt gaa gcc cgg tcg gga agc 1728 Pro Gly Gly Ala Ala Val Lys Gly Leu Arg Glu Ala Arg Ser Gly Ser 565 570 575 tgg agc tcg ctg aat tcc tcc gca tcc tgg aag gac tcg aca ttg cat 1776 Trp Ser Ser Leu Asn Ser Ser Ala Ser Trp Lys Asp Ser Thr Leu His 580 585 590 aca cgc aac ttt atg acg ctt tgg ttc gat cat ggc atg aac ccg aca 1824 Thr Arg Asn Phe Met Thr Leu Trp Phe Asp His Gly Met Asn Pro Thr 595 600 605 aac ggt agt tat tct tat gtg ctg ctt ccg aat aag acc agc agt gcg 1872 Asn Gly Ser Tyr Ser Tyr Val Leu Leu Pro Asn Lys Thr Ser Ser Ala 610 615 620 gtg gcc agc tat gct gca acg cct cag atc agc att ctg gag aat tct 1920 Val Ala Ser Tyr Ala Ala Thr Pro Gln Ile Ser Ile Leu Glu Asn Ser 625 630 635 640 agc tcg gcg caa gcg gtg aag gag acg caa ttg aat gtc acc gga att 1968 Ser Ser Ala Gln Ala Val Lys Glu Thr Gln Leu Asn Val Thr Gly Ile 645 650 655 aac ttt tgg aac gat gag cca acc acg gtg ggc ctg gtt act tcc aat 2016 Asn Phe Trp Asn Asp Glu Pro Thr Thr Val Gly Leu Val Thr Ser Asn 660 665 670 cgg aaa gca tcc gtt atg aca aaa gaa acg gct agt gat ttc gag ata 2064 Arg Lys Ala Ser Val Met Thr Lys Glu Thr Ala Ser Asp Phe Glu Ile 675 680 685 tcc gtt tcc gac ccg acc caa agt aat gtg ggg acc atc tat att gat 2112 Ser Val Ser Asp Pro Thr Gln Ser Asn Val Gly Thr Ile Tyr Ile Asp 690 695 700 gtc aac aaa agt gca acc gga ttg att tcg aag gat aat gaa ata acg 2160 Val Asn Lys Ser Ala Thr Gly Leu Ile Ser Lys Asp Asn Glu Ile Thr 705 710 715 720 gtc att cag tac tac cca acc atg aag ttt aaa gtc aat gta aac aat 2208 Val Ile Gln Tyr Tyr Pro Thr Met Lys Phe Lys Val Asn Val Asn Asn 725 730 735 tct ggc ggg aag tcc tat aaa gta aag ttt agc ctg aca gga aca ccc 2256 Ser Gly Gly Lys Ser Tyr Lys Val Lys Phe Ser Leu Thr Gly Thr Pro 740 745 750 ggc agc aac ccg tct cca atc ccg ata ccg aat cct tac gaa gcg gaa 2304 Gly Ser Asn Pro Ser Pro Ile Pro Ile Pro Asn Pro Tyr Glu Ala Glu 755 760 765 gct ttg cca att aac gct ctg aca gat act ccc gtg gtt tac aat gat 2352 Ala Leu Pro Ile Asn Ala Leu Thr Asp Thr Pro Val Val Tyr Asn Asp 770 775 780 gcc aat gcc agt ggt ggc aag aag ctt ggc ttc aat aac aat gca gtg 2400 Ala Asn Ala Ser Gly Gly Lys Lys Leu Gly Phe Asn Asn Asn Ala Val 785 790 795 800 gat gat tat gtg gag ttc agt ctg gac gtc aca cag ccc ggc acc tac 2448 Asp Asp Tyr Val Glu Phe Ser Leu Asp Val Thr Gln Pro Gly Thr Tyr 805 810 815 gat gtc aaa tcc cgg att atg aaa tca acg aac agc ggg att tat cag 2496 Asp Val Lys Ser Arg Ile Met Lys Ser Thr Asn Ser Gly Ile Tyr Gln 820 825 830 ctg tct att aat ggg acc aac gta ggg agc gcg cag gat atg ttc tgg 2544 Leu Ser Ile Asn Gly Thr Asn Val Gly Ser Ala Gln Asp Met Phe Trp 835 840 845 acg acc tcc gag ctg tct aag gag ttt act atg ggc tca tac agc ttc 2592 Thr Thr Ser Glu Leu Ser Lys Glu Phe Thr Met Gly Ser Tyr Ser Phe 850 855 860 agc aca ccc ggg agc tat ttg ttc cga tta aaa aca acc ggc aag aat 2640 Ser Thr Pro Gly Ser Tyr Leu Phe Arg Leu Lys Thr Thr Gly Lys Asn 865 870 875 880 gtc agt tct tca gga tat aag ctg atg ctg gac aat ttt agt ctg gta 2688 Val Ser Ser Ser Gly Tyr Lys Leu Met Leu Asp Asn Phe Ser Leu Val 885 890 895 tca aca ggt att gat aca acg gtg att gtg gac aat gcc gat gca gct 2736 Ser Thr Gly Ile Asp Thr Thr Val Ile Val Asp Asn Ala Asp Ala Ala 900 905 910 ggt gtt acg aag gtg ggt act tgg acc gga acc aat acg cag acc gat 2784 Gly Val Thr Lys Val Gly Thr Trp Thr Gly Thr Asn Thr Gln Thr Asp 915 920 925 cgg tac ggc gcc gac tac att cac gat ggg aac acg ggg aaa ggt acg 2832 Arg Tyr Gly Ala Asp Tyr Ile His Asp Gly Asn Thr Gly Lys Gly Thr 930 935 940 aag agc gtt acc ttt act cca aat gta cct atc agt gga act tat cag 2880 Lys Ser Val Thr Phe Thr Pro Asn Val Pro Ile Ser Gly Thr Tyr Gln 945 950 955 960 gtt tac atg atg tgg gct gcc cat acg aat agg gca acg aat gtt ccc 2928 Val Tyr Met Met Trp Ala Ala His Thr Asn Arg Ala Thr Asn Val Pro 965 970 975 gta gac gta acg cat tca ggc ggt aca gca acg cta aat gtt aac caa 2976 Val Asp Val Thr His Ser Gly Gly Thr Ala Thr Leu Asn Val Asn Gln 980 985 990 caa ggt aat ggt ggt gtg tgg aat tta ctg ggt acg tat agc ttt aat 3024 Gln Gly Asn Gly Gly Val Trp Asn Leu Leu Gly Thr Tyr Ser Phe Asn 995 1000 1005 gct ggg tcc acg ggg gct atc aag atc cgt acg gac gcg acg aat 3069 Ala Gly Ser Thr Gly Ala Ile Lys Ile Arg Thr Asp Ala Thr Asn 1010 1015 1020 gga tat gtt gta gcc gat gcc gtg aag ctg gta aag gtc cca 3111 Gly Tyr Val Val Ala Asp Ala Val Lys Leu Val Lys Val Pro 1025 1030 1035 <210> 2 <211> 1037 <212> PRT <213> Paenibacillus sp. <400> 2 Asp Glu Phe Asp Thr Leu Arg Glu Lys Tyr Lys Ala Met Leu Asn Gly 1 5 10 15 Gly Thr Thr Tyr Asn Leu Ser Asp Pro Asp Ile Ala Ala Arg Val Asn 20 25 30 Ala Ile Thr Val Thr Ala Gln Gly Tyr Trp Asp Ser Met Leu Lys Asp 35 40 45 Pro Asn Arg Asn Arg Leu Trp Asn Asp Ala Pro Phe Gly Ser Asp Ser 50 55 60 Thr Ser Ile Thr Thr Thr Tyr Arg His Leu Tyr Asp Met Ala Leu Ala 65 70 75 80 Tyr Thr Thr Tyr Gly Ser Ser Leu Gln Gly Asn Ala Ala Leu Lys Ala 85 90 95 Asp Ile Ile Ser Gly Leu Asp Trp Met Asn Ala Asn Gln Phe Tyr Asn 100 105 110 Gly Cys Ser Gln Tyr Gln Asn Trp Trp His Trp Gln Ile Gly Gly Pro 115 120 125 Met Ala Leu Asn Asp Ile Val Ala Leu Met Tyr Thr Glu Leu Thr Ala 130 135 140 Thr Gln Ile Ser Asn Tyr Met Ala Ala Ile Tyr Tyr Thr Gln Ala Ser 145 150 155 160 Val Thr Met Thr Gly Ala Asn Arg Leu Trp Glu Ser Gln Val Ile Ala 165 170 175 Ile Ser Gly Ile Leu Asn Lys Asp Ser Ala Arg Val Ala Ala Gly Arg 180 185 190 Asp Gly Ile Ser Ala Leu Leu Pro Tyr Val Ala Lys Gly Asp Gly Phe 195 200 205 Tyr Asn Asp Gly Ser Phe Val Gln His Thr Tyr Tyr Ala Tyr Asn Gly 210 215 220 Gly Tyr Gly Ser Glu Leu Leu Ser Gly Ile Ala Asp Leu Ile Phe Ile 225 230 235 240 Leu Asn Gly Ser Ser Trp Gln Val Thr Asp Pro Asn Lys Asn Asn Val 245 250 255 Tyr Arg Trp Ile Tyr Asp Ser Tyr Glu Pro Phe Ile Tyr Lys Gly Asn 260 265 270 Leu Met Asp Met Val Arg Gly Arg Glu Ile Ser Arg His Gly Leu Gln 275 280 285 Asp Asp Lys Ala Ala Val Thr Val Met Ala Ser Ile Ile Arg Leu Ser 290 295 300 Gln Thr Ala Ala Ser Ala Asp Ala Thr Ala Phe Lys Arg Met Val Lys 305 310 315 320 Tyr Trp Leu Leu Leu Asp Thr Asp Lys Thr Phe Leu Lys Ala Val Ser 325 330 335 Ile Asp Leu Ile Ile Ala Ala Asn Gln Leu Val Asn Asp Ser Thr Val 340 345 350 Thr Ser Arg Gly Glu Leu Val Lys Tyr Lys Gln Phe Ser Gly Met Asp 355 360 365 Arg Ala Val Gln Leu Arg Pro Gly Phe Gly Phe Gly Leu Ser Met Phe 370 375 380 Ser Ser Arg Ile Gly Asn Tyr Glu Ser Ile Asn Ala Glu Asn Asn Lys 385 390 395 400 Gly Trp His Thr Gly Asp Gly Met Thr Tyr Leu Tyr Asn Thr Asp Leu 405 410 415 Ser Gln Phe Asn Asp His Phe Trp Ala Thr Val Asp Asn Tyr Arg Leu 420 425 430 Pro Gly Thr Thr Val Leu Gln Asn Thr Thr Gln Thr Ala Asn Ser Arg 435 440 445 Ser Asp Lys Ser Trp Ala Gly Gly Thr Asp Ile Leu Gly Gln Tyr Gly 450 455 460 Val Ser Gly Met Glu Leu His Thr Val Gly Lys Ser Leu Thr Ala Lys 465 470 475 480 Lys Ser Trp Phe Met Phe Asp Asp Glu Ile Val Ala Leu Gly Ser Gly 485 490 495 Ile Ala Ser Thr Asp Gly Ile Ala Thr Glu Thr Ile Val Glu Asn Arg 500 505 510 Lys Leu Asn Ser Ser Gly Asn Asn Ala Leu Ile Val Asn Gly Thr Ala 515 520 525 Lys Pro Gly Ser Leu Gly Trp Ser Glu Thr Met Thr Gly Thr Asn Tyr 530 535 540 Ile His Leu Ala Gly Ser Val Pro Gly Ser Asp Ile Gly Tyr Tyr Phe 545 550 555 560 Pro Gly Gly Ala Ala Val Lys Gly Leu Arg Glu Ala Arg Ser Gly Ser 565 570 575 Trp Ser Ser Leu Asn Ser Ser Ala Ser Trp Lys Asp Ser Thr Leu His 580 585 590 Thr Arg Asn Phe Met Thr Leu Trp Phe Asp His Gly Met Asn Pro Thr 595 600 605 Asn Gly Ser Tyr Ser Tyr Val Leu Leu Pro Asn Lys Thr Ser Ser Ala 610 615 620 Val Ala Ser Tyr Ala Ala Thr Pro Gln Ile Ser Ile Leu Glu Asn Ser 625 630 635 640 Ser Ser Ala Gln Ala Val Lys Glu Thr Gln Leu Asn Val Thr Gly Ile 645 650 655 Asn Phe Trp Asn Asp Glu Pro Thr Thr Val Gly Leu Val Thr Ser Asn 660 665 670 Arg Lys Ala Ser Val Met Thr Lys Glu Thr Ala Ser Asp Phe Glu Ile 675 680 685 Ser Val Ser Asp Pro Thr Gln Ser Asn Val Gly Thr Ile Tyr Ile Asp 690 695 700 Val Asn Lys Ser Ala Thr Gly Leu Ile Ser Lys Asp Asn Glu Ile Thr 705 710 715 720 Val Ile Gln Tyr Tyr Pro Thr Met Lys Phe Lys Val Asn Val Asn Asn 725 730 735 Ser Gly Gly Lys Ser Tyr Lys Val Lys Phe Ser Leu Thr Gly Thr Pro 740 745 750 Gly Ser Asn Pro Ser Pro Ile Pro Ile Pro Asn Pro Tyr Glu Ala Glu 755 760 765 Ala Leu Pro Ile Asn Ala Leu Thr Asp Thr Pro Val Val Tyr Asn Asp 770 775 780 Ala Asn Ala Ser Gly Gly Lys Lys Leu Gly Phe Asn Asn Asn Ala Val 785 790 795 800 Asp Asp Tyr Val Glu Phe Ser Leu Asp Val Thr Gln Pro Gly Thr Tyr 805 810 815 Asp Val Lys Ser Arg Ile Met Lys Ser Thr Asn Ser Gly Ile Tyr Gln 820 825 830 Leu Ser Ile Asn Gly Thr Asn Val Gly Ser Ala Gln Asp Met Phe Trp 835 840 845 Thr Thr Ser Glu Leu Ser Lys Glu Phe Thr Met Gly Ser Tyr Ser Phe 850 855 860 Ser Thr Pro Gly Ser Tyr Leu Phe Arg Leu Lys Thr Thr Gly Lys Asn 865 870 875 880 Val Ser Ser Ser Gly Tyr Lys Leu Met Leu Asp Asn Phe Ser Leu Val 885 890 895 Ser Thr Gly Ile Asp Thr Thr Val Ile Val Asp Asn Ala Asp Ala Ala 900 905 910 Gly Val Thr Lys Val Gly Thr Trp Thr Gly Thr Asn Thr Gln Thr Asp 915 920 925 Arg Tyr Gly Ala Asp Tyr Ile His Asp Gly Asn Thr Gly Lys Gly Thr 930 935 940 Lys Ser Val Thr Phe Thr Pro Asn Val Pro Ile Ser Gly Thr Tyr Gln 945 950 955 960 Val Tyr Met Met Trp Ala Ala His Thr Asn Arg Ala Thr Asn Val Pro 965 970 975 Val Asp Val Thr His Ser Gly Gly Thr Ala Thr Leu Asn Val Asn Gln 980 985 990 Gln Gly Asn Gly Gly Val Trp Asn Leu Leu Gly Thr Tyr Ser Phe Asn 995 1000 1005 Ala Gly Ser Thr Gly Ala Ile Lys Ile Arg Thr Asp Ala Thr Asn 1010 1015 1020 Gly Tyr Val Val Ala Asp Ala Val Lys Leu Val Lys Val Pro 1025 1030 1035

Claims (13)

1. i) 서열식별번호: 2의 아미노산 731 내지 803에 상응하는 영역 3,
   ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 903 내지 1004에 상응하는 영역 6,
   iii) 서열식별번호: 2의 아미노산 154 내지 176에 상응하는 영역 1,
   iv) 서열식별번호: 2의 아미노산 614 내지 658에 상응하는 영역 2,
   v) 서열식별번호: 2의 아미노산 807 내지 846에 상응하는 영역 4, 및
   vi) 서열식별번호: 2의 아미노산 872 내지 885에 상응하는 영역 5
   로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 킬레이트화제-유도된 불안정성 영역의 1개 이상의 위치에서 변경을 포함하는, 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물이며,
   여기서 1개 이상의 위치에서의 상기 변경이 Y155E, A159P, K620R, A624E, A626Q, T631N, S635E, S635T, T649V, T649K, Q650G, I656V, G738L, K745R, P752R, P752K, G753E, G753Q, G753S, S754E, S754L, S754Q, S754R, S757D, S757P, S757E, A769D, A769T, A769R, L775A, L775F, L775I, L775M, L775Q, L775S, L775Y, D777R, P779V, Y782I, N786K, G789R, K792W, K792Y, K792V, K792A, N796Q, A799H, V800P, D801G, K819R, K824R, A843P, K875T, K875E, T903A, T903Q, A911M, A911V, A911S, A912T, A912I, A912Y, T915S, T915V, T915Q, T915A, T919D, T919F, T919G, T921R, T921S, T923D, T923H, T925D, T925Q, T925R, T927K, D928W, Y930F, Y930H, Y930L, D933M, G941D, G941E, A966P, N991D 및 V998K로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 넘버링은 서열식별번호: 2에 따른 것인 세제 조성물.
2. 제1항에 있어서, 크산탄 리아제 변이체가
   vii) 서열식별번호: 2의 아미노산 1 내지 153에 상응하는 영역 7,
   viii) 서열식별번호: 2의 아미노산 177 내지 613에 상응하는 영역 8,
   ix) 서열식별번호: 2의 아미노산 659 내지 730에 상응하는 영역 9,
   x) 서열식별번호: 2의 아미노산 804 내지 806에 상응하는 영역 10,
   xi) 서열식별번호: 2의 아미노산 847 내지 871에 상응하는 영역 11,
   xii) 서열식별번호: 2의 아미노산 886 내지 902에 상응하는 영역 12, 및
   xiii) 서열식별번호: 2의 아미노산 1005 내지 1037에 상응하는 영역 13
   으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 영역의 1개 이상의 위치에서 변경을 추가로 포함하고,
   여기서 영역 7, 8, 9, 10, 11, 12 및 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 영역의 1개 이상의 위치에서의 상기 변경이 K9R, N15T, T18D, L46D, A58L, S66H, Q89Y, K95E, S100D, N106Y, Q109R, Q109D, Q109F, Q109K, Q109A, K183Q, K183R, V188I, A190Q, A203P, K204R, A221P, E229N, E229S, E229V, I234V, I238W, I238L, I238M, I240W, N242S, G243V, Y257W, R258E, R284G, K291R, A293G, A293P, K316R, R317K, K320R, L324Q, K329R, K333R, L339M, I341P, V352I, S354P, K360G, K360R, Q372H, F377Y, N399K, K400R, F419Y, N440K, D450P, K451E, K451R, A454V, D458S, K481R, A492H, A492L, T505I, L533I, K567R, G568A, S578K, S578N, S578R, S579R, S579K, S582K, T664K, N672D, I703L, I722F, P726Q, T727P, M728V, S851F, K855R, E856D, P867S, K887R, N892Y, N892W, N892F, G899S, I900G, D901A, T902F, N1008D 및 K1016T로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환을 포함하며, 여기서 넘버링은 서열식별번호: 2에 따른 것인 세제 조성물.
3. 제2항에 있어서, 크산탄 리아제 변이체가 서열식별번호: 2의 위치 624, 631, 635, 649, 656, 738, 752, 753, 754, 757, 769, 775, 777, 800, 801, 843, 875, 911 및 915로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서의 변경, 및 위치 89, 100, 190, 229, 234, 352, 360, 399, 440, 458, 492, 567, 582, 664, 672, 703, 728, 892, 1008 및 1016으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 위치에서의 변경을 포함하는 것인 세제 조성물.
4. 제3항에 있어서, 크산탄 리아제 변이체가 Q89Y, S100D, A190Q, E229S, I234V, V352I, K360G, N399K, N440K, D458S, A492H, A492L, K567R, S582K, T664K, N672D, I703L, M728V, N892Y, N1008D 및 K1016T로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환 및 A624E, T631N, S635E, T649K, I656V, G738L, P752K, P752R, G753E, S754E, S754R, S757D, A769D, L775A, D777R, V800P, D801G, A843P, K875T, A911V 및 T915A로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 치환을 포함하는 것인 세제 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크산탄 리아제 변이체가 모 크산탄 리아제, 예를 들어 서열식별번호: 2를 갖는 크산탄 리아제와 비교하여 세제 조성물에서 개선된 안정성을 갖는 것인 세제 조성물.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크산탄 리아제 변이체가 모 크산탄 리아제, 예를 들어 서열식별번호: 2를 갖는 크산탄 리아제에 비해 >1.0 또는 적어도 1.2, 예컨대 적어도 1.5, 예를 들어 적어도 2.0의 반감기 개선 지수 (HIF)를 갖는 것인 세제 조성물.
7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 세제 성분을 추가로 포함하는, 적어도 1종의 크산탄 리아제 변이체를 포함하는 세제 조성물.
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 예를 들어 세정 과정, 예컨대 세탁 또는 경질 표면 세정 예컨대 식기 세척에서 크산탄 검을 분해하기 위해 사용되는 세제 조성물.
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