BR112012001642B1

BR112012001642B1 - células de levedura transgênica e método para preparar etanol a partir de acetato e um carboidrato fermentável

Info

Publication number: BR112012001642B1
Application number: BR112012001642A
Authority: BR
Inventors: Jeroen Adriaan Van Maris Antonius; Thomas Pronk Jacobus; Gabriel Guadalupe Medina Victor
Original assignee: Dsm Ip Assets Bv; Univ Delft Tech
Priority date: 2009-07-24
Filing date: 2010-07-23
Publication date: 2018-09-11
Also published as: BR112012001642A2; ZA201200703B; EP2277989A1; JP5836271B2; US20210230613A1; US20110275130A1; MX2012001062A; CA2768897A1; US11174489B2; EP2456851A1; US10738317B2; US20200299704A1; US10533181B2; JP2013500006A; US10883110B2; DK2456851T3; WO2011010923A1; CN102712895A; CN102712895B; EP2456851B1

Description

(54) Título: CÉLULAS DE LEVEDURA TRANSGÊNICA E MÉTODO PARA PREPARAR ETANOL A

PARTIR DE ACETATO E UM CARBOIDRATO FERMENTÁVEL (51) Int.CI.: C12N 1/18; C12N 9/02; C12P 7/06; C12P 7/10; C12N 15/53 (30) Prioridade Unionista: 24/07/2009 EP 09166360.9 (73) Titular(es): DSM IP ASSETS B.V.

(72) Inventor(es): JACOBUS THOMAS PRONK; ANTONIUS JEROEN ADRIAAN VAN MARIS; VICTOR GABRIEL GUADALUPE MEDINA (85) Data do Início da Fase Nacional: 24/01/2012

1/54 “CÉLULAS DE LEVEDURA TRANSGÊNICA E MÉTODO PARA PREPARAR ETANOL A PARTIR DE ACETATO E UM CARBOIDRATO FERMENTÁVEL” [001] A presente invenção diz respeito a uma célula de levedura recombinante com a capacidade de produzir um produto de fermentação desejado, a construção da dita célula de levedura por modificação genética e a um processo para sintetizar um produto de fermentação, em que a dita célula de levedura é usada.

[002] A produção de etanol por Saccharomyces cerevisiae é atualmente, em volume, o maior processo de fermentação na biotecnologia industrial. Um esforço de investigação global está em curso para expandir a faixa de substrato de S. cerevisiae para incluir hidrolisados lignocelulósicos, em particular biomassa lignocelulósica hidrolisada de matérias primas não alimentares (por exemplo, culturas agrícolas energéticas e resíduos agrícolas, resíduos de silvicultura ou materiais residuais da indústria/de consumo que são ricos em celulose, hemicelulose e/ou pectina), e para aumentar a produtividade, fartura e rendimento do produto.

[003] A biomassa lignocelulósica é abundante, entretanto, em geral não é facilmente fermentada por microrganismos tipo selvagem produtores de etanol, tal como S. cerevisiae. A biomassa tem que ser hidrolisada. O hidrolisado resultante é frequentemente uma mistura de vários monossacarídeos e oligossacarídeos, que podem não ser todos substratos adequados para o microrganismo tipo selvagem. Adicionalmente, os hidrolisados compreendem tipicamente o ácido acético formado como um subproduto, em particular durante a hidrólise da pectina ou hemicelulose

2/54 e, dependendo do tipo de hidrólise, um ou mais outros subprodutos ou reagentes residuais que podem afetar de maneira adversa a fermentação. Em particular, relata-se que o ácido acético afeta negativamente a cinética e/ou estequiometria de fermentação de açúcar por cepas tipo selvagem e geneticamente modificadas de S. cerevisiae, e sua toxicidade é muito aumentada em cultivo com baixo pH (Helle et al. Enzyme Microb Technol 33 (2003) 786-792; Bellissimi et al. FEMS Yeast Res 9 (2009) 358-364).

[004] Várias abordagens foram propostas para melhorar as propriedades fermentativas de organismos produtores de etanol por modificação genética, e para melhorar o processo de hidrólise da biomassa. Por exemplo, uma perspectiva do desenvolvimento na produção fermentativa de etanol a partir de hidrolisados da é fornecida em uma revisão de A. van Maris et al. (Antonie van Leeuwenhoek (2006) 90:391-418) . É feita referência a várias maneiras nas quais S. cerevisiae pode ser modificada e a vários métodos de hidrolisar a biomassa lignocelulósica.

[005] Um desafio principal com relação à estequiometria de produção de etanol a base de levedura é que quantidades substanciais de glicerol são invariavelmente formadas como um subproduto. Estima-se que, em processos típicos de etanol industrial, até cerca de 4 %

em peso	da matéria	prima	do	açúcar seja	convertida	em
glicerol	(Nissen et	al.	Yeast 16 (2000)	463-474).	Em
condições	que são ideais para	o crescimento	anaeróbico,	a
conversão	em glicerol	pode	ser	ainda maior, até cerca de	10

o, % .

[006] A produção de glicerol em condições anaeróbicas

3/54 está ligada principalmente ao metabolismo redox. Durante o crescimento anaeróbico de S. cerevisiae, a dissimilação do açúcar ocorre por meio da fermentação alcoólica. Neste processo, o NADH formado na reação glicolítica da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase é reoxidado convertendo o acetaldeído formado por descarboxilação de piruvato em etanol por meio de álcool desidrogenase dependente de NAD⁺. A estequiometria fixa desta via dissimilatória redox-neutro causa problemas quando uma redução líquida de NAD⁺ em NADH ocorre em qualquer etapa no metabolismo. Em condições anaeróbicas, a reoxidação do NADH em S. cerevisiae é estritamente dependente da redução de açúcar em glicerol. A formação de glicerol é iniciada pela redução do intermediário glicolítico diidroxiacetona fosfato em glicerol 3-fosfato, uma reação catalisada por glicerol 3-fosfato desidrogenase dependente de NAD⁺. De maneira subsequente, o glicerol 3-fosfato formado nesta reação é hidrolisado por glicerol-3-fosfatase para render glicerol e fosfato inorgânico. Consequentemente, o glicerol é um subproduto importante durante a produção anaeróbica de etanol por S. cerevisiae, o que não é desejado uma vez que reduz completamente a conversão de açúcar em etanol. Adicionalmente, a presença de glicerol em efluentes das usinas de produção de etanol pode impor custos para o tratamento de água residual.

[007] É um objetivo da invenção fornecer uma célula recombinante inédita, que é adequada para a produção fermentativa anaeróbica de etanol a partir de um carboidrato, em particular um carboidrato obtido da biomassa lignocelulósica, que apresenta uma produção

4/54 reduzida de glicerol comparada ao organismo tipo selvagem correspondente ou que precisa da produção de glicerol se a célula for usada para a preparação fermentativa de etanol.

[008] É um objetivo adicional fornecer um método inédito para prepara fermentativamente o etanol em culturas de levedura anaeróbica, em cujo método nenhum glicerol é formado, ou pelo menos em que é formado menos glicerol que em um método que faz uso de cepas conhecidas de S. cerevisiae.

[009] Um ou mais objetivos adicionais que podem ser atingidos são evidentes a partir da descrição e/ou reivindicações.

[010] Os inventores entendem que é possível atingir um ou mais destes objetivos fornecendo uma célula recombinante específica, em que uma outra atividade enzimática específica foi incorporada, o que permite a reoxidação de NADH formado na fermentação de um carboidrato também na ausência de atividade enzimática necessária para a síntese de glicerol dependente de NADH.

[011] Dessa maneira, a presente invenção diz respeito a uma célula de levedura recombinante, a célula compreendendo uma ou mais sequências recombinantes de ácidos nucleicos, em particular uma ou mais sequências heterólogas de ácidos nucleicos que codificam uma atividade de acetaldeído acetilante desidrogenase dependente de NAD⁺(EC 1.2.1.10) .

[012] Os inventores entenderam, em particular, que é vantajoso fornecer uma célula sem atividade enzimática necessária para a síntese de glicerol dependente de NADH, ou uma célula com atividade enzimática reduzida necessária

5/54 para a síntese de glicerol dependente de NADH.

[013] Dessa maneira, a invenção diz respeito em particular a uma célula de levedura recombinante que compreende uma ou mais sequências heterólogas de ácidos nucleicos que codificam uma atividade de acetaldeído acetilante desidrogenase dependente de NAD+, em que a célula não apresenta a atividade enzimática necessária para a síntese de glicerol dependente de NADH (isto é, é livre de tal atividade), ou em que a célula apresenta uma atividade enzimática reduzida com relação à síntese de glicerol dependente de NADH, comparada à célula de levedura tipo selvagem correspondente.

[014] A invenção diz respeito adicionalmente ao uso de uma célula, de acordo com a invenção, para a preparação de etanol.

[015] Em particular, a invenção diz respeito adicionalmente a um método para preparar etanol, compreendendo preparar o etanol a partir de um carboidrato fermentável e de acetato, cuja preparação é realizada em condições fermentativas anaeróbicas usando uma célula de levedura, a dita célula expressando a atividade de acetilCoenzima A sintetase e a atividade de acetaldeído acetilante desidrogenase dependente de NAD⁺, a dita célula preferivelmente sem atividade enzimática necessária com relação à via bioquímica para a síntese de glicerol a partir de um carboidrato, ou com uma atividade enzimática reduzida com relação à via bioquímica para a síntese de glicerol a partir de um carboidrato, comparada a uma célula tipo selvagem de S. cerevisiae.

[016] Vantajosamente, de acordo com a invenção, o

6/54 etanol é produzido em uma razão molar de glicerol: etanol menor que 0,04:1, em particular menor que 0,02:1, preferivelmente menor que 0,01:1. A produção de glicerol pode estar ausente (não detectável), embora pelo menos em algumas modalidades (em que a síntese de glicerol dependente de NADH é reduzida, porém não é completamente proibida) um pouco de glicerol possa ser produzido como um produto secundário, por exemplo, em uma razão glicerol para etanol de 0,001:1 ou mais.

[017] A figura 1 mostra esquematicamente um procedimento de modificação genética que pode ser realizado como parte da produção de uma célula de acordo com a invenção.

[018] A figura 2 mostra concentrações de biomassa e produtos em culturas anaeróbias em lotes de diferentes cepas de S. cerevisiae em glicose (20 g L^-1) . O ácido acético (2,0 g L^-1) surgiu a partir do início da fermentação (painel A, B) ou foi adicionado no ponto de tempo indicado pela seta (painel C, D). Condições de crescimento: T = 30 °C, pH 5,0. Símbolos: A, densidade ótica a 660 nm;·, glicose; o, etanol;·, acetato; □, glicerol. Cada gráfico representa valores a partir de duas réplicas independentes, rendendo dados que diferem em menos de 5 %. Painel A: S. cerevisiae IME076 (GPD1 GPD2). Painel B: S. cerevisiae IMZ132 (GPD1A gpd2A que superexpressa o gene mhpF de E. coli) . Painel C: S. cerevisiae IMZ132 (GPD1A gpd2A que superexpressa o gene mhpF de E. coli) . Painel D: S. cerevisiae IMZ127 (GPD1A gpd2A) crescida em glicose (20 g.L^-1).

[019] A presente invenção permite a eliminação

7/54 completa da produção de glicerol, ou pelo menos uma redução significativa deste, fornecendo uma célula de levedura recombinante, em particular S. cerevisiae, de maneira tal que ela possa reoxidar NADH pela redução de ácido acético em etanol, por meio de reações dependentes de NADH.

[020] Isto não é vantajoso apenas quando a produção de glicerol é evitada ou pelo menos reduzida, mas uma vez que o produto formado na reoxidação de NADH é também o produto desejado, ou seja, etanol, um método da invenção também pode oferecer um maior rendimento do produto (determinado como o % em peso da matéria prima convertida, isto é, carboidrato e ácido acético, que é convertida em etanol).

[021] Uma vez que o ácido acético é geralmente disponível em quantidades significativas de hidrolisados lignocelulósicos, isto torna a presente invenção particularmente vantajosa para a preparação de etanol usando a biomassa lignocelulósica como uma fonte para o carboidrato fermentável. Adicionalmente, as fontes de carboidrato que podem conter uma quantidade considerável de acetato incluem melaços de beterraba (hidrolisados) e que contêm amido (por exemplo, produtos residuais de processos de moagem seca do milho, a partir de processos de moagem úmida do milho; a partir processos residuais do amido, por exemplo, com reciclagens de resíduo de destilaria). A invenção contribui para uma diminuição dos níveis do composto inibidor de ácido acético, e uma maior fração do hidrolisado se torna efetivamente um substrato para a produção do etanol.

[022] Bons resultados foram atingidos com uma célula

8/54 de levedura sem atividade enzimática notável necessária para a síntese de glicerol dependente de NADH, da maneira ilustrada no exemplo. Entretanto, os inventores contemplam também que uma célula de levedura, de acordo com a invenção, com atividade de síntese de glicerol dependente de NADH pode ser vantajosamente usada, por exemplo, para a produção de etanol. Contempla-se que tal célula pode usar o acetato para reoxidar pelo menos parte do NADH. Por meio disso, o acetato pode competir com a via da síntese de glicerol dependente de NADH e, assim, reduzir potencialmente a síntese de glicerol. Além do mais, o acetato presente em uma matéria prima usada para a produção de etanol, tal como um hidrolisado lignocelulósico, pode ser convertido em etanol, aumentando por meio disso o rendimento do produto.

[023] O termo um ou uma, da maneira aqui usada, é definido como pelo menos um, a menos que de outra forma especificada.

[024] Quando se refere a um substantivo (por exemplo, um composto, um aditivo, etc.) no singular, significa que o plural está incluído. Assim, quando se refere a uma fração específica, por exemplo, composto, isto significa pelo menos uma desta fração, por exemplo, pelo menos um composto, a menos que de outra forma especificada.

[025] O termo ou, da maneira aqui usada, deve ser entendido como e/ou.

[026] Quando se refere aqui a um carboxilato, por exemplo, acetato, significa que o ácido carboxílico correspondente (seu ácido conjugado), bem como um sal deste deve ser incluído, e vice versa.

9/54 [027] Quando se refere a um composto no qual vários isômeros existem (por exemplo, um D e um L enantiômero) , o composto inclui a princípio todos os enantiômeros, diastereômeros e isômeros cis/trans deste composto que pode ser usado no método particular da invenção; em particular, quando se refere ao composto, inclui o(s) isômero(s) natural(s).

[028] O termo fermentação, fermentativo e similares são aqui usados em um sentido clássico, isto é, para indicar se um processo é ou foi realizado em condições anaeróbicas. As condições anaeróbicas são aqui definidas como condições sem nenhum oxigênio. ou em que essencialmente nenhum oxigênio é consumido pela célula de levedura, em particular uma célula de levedura, e em geral corresponde a um consumo de oxigênio menor que 5 mmol/L.h, em particular a um consumo de oxigênio menor que 2,5 mmol/L.h ou menor que 1 mmol/L.h.. Isto corresponde em geral a uma concentração de oxigênio dissolvido no caldo de cultivo menor que 5 % de saturação de ar, em particular a uma concentração de oxigênio dissolvido menor que 1 % de saturação de ar, ou menor que 0,2 % de saturação de ar.

[029] O termo levedura ou célula de levedura refere-se a um grupo filogeneticamente diverso de fungos de célula única, a maioria dos quais estão na divisão de Ascomycota e Basidiomycota. As leveduras em brotamento (leveduras verdadeiras) são classificadas na ordem Saccharomycetales, com Saccharomyces cerevisiae como a espécie mais bem conhecida.

[030] O termo (célula) recombinante, da maneira aqui usada, refere-se a uma cepa (célula) que contém ácido

10/54 nucleico, que é o resultado de uma ou mais modificações genéticas usando técnica(s) do DNA recombinante e/ou uma(s) outra(s) técnica(s) mutagênica(s). Em particular, uma célula recombinante pode compreender o ácido nucleico que não está presente em uma célula tipo selvagem correspondente, cujo ácido nucleico foi introduzido nesta cepa (célula) usando técnicas de DNA recombinante (uma célula transgênica), ou cujo ácido nucleico não presente na dita célula tipo selvagem é o resultado de uma ou mais mutações, por exemplo, usando técnicas de DNA recombinante ou uma outra técnica de mutagênese, tal como irradiação por UV, em uma sequência de ácido nucleico presente na dita célula tipo selvagem (tal como um gene que codifica um polipeptídeo tipo selvagem), ou em que a sequência de ácidos nucleicos de um gene foi modificada para alvejar o produto de polipeptídeo (codificando-o) em um outro compartimento celular. Adicionalmente, o termo (célula)

recombinante diz	respeito	em	particular a uma	cepa
(célula) a partir	da qual	as	sequências de DNA	foram
removidas usando técnicas de	DNA	recombinante.
[031] O termo	célula	(levedura) transgênica	, da

maneira aqui usada, refere-se a uma cepa (célula) que contém o ácido nucleico de ocorrência não natural nesta cepa (célula) e que foi introduzido nesta cepa (célula) usando técnicas de DNA recombinante, isto é, uma célula recombinante).

[032] O termo mutado, da maneira aqui usada, com relação a proteínas ou polipeptídeos, significa que pelo menos um aminoácido na sequência de proteínas ou polipeptídeos tipo selvagem ou de ocorrência natural foi

11/54 substituído por um aminoácido diferente, inserido ou deletado da sequência por meio de mutagênese de ácidos nucleicos que codificam estes aminoácidos. A mutagênese é um método bem conhecido na técnica e inclui, por exemplo, mutagênese sítio direcionada por meio de PCR ou por meio de mutagênese mediada por oligonucleotídeo, da maneira descrita em Sambrook et al., Molecular Cloning- A Laboratory Manual, 2nd ed., Vol. 1-3 (1989). O termo mutado, da maneira aqui usada com relação aos genes, significa que pelo menos um nucleotídeo na sequência de ácidos nucleicos deste gene, ou uma sequência regulatória deste, foi substituído por um nucleotídeo diferente, ou foi deletado da sequência por meio de mutagênese, o que resulta na transcrição de uma sequência de proteínas com uma função qualitativa ou quantitativamente alterada, ou na neutralização deste gene.

[033] O termo gene, da maneira aqui usada, referese a uma sequência de ácido nucleico que contém um molde para uma polimerase de ácido nucleico, em eucariotos, RNA polimerase II. Os genes são transcritos em RNAms que são então traduzidos em proteína.

[034] O termo ácido nucleico, da maneira aqui usada, inclui a referência a um polímero de desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo, isto é, um polinucleotídeo tanto na forma de fita simples quanto de fita dupla e, a menos que de outra forma limitada, inclui análogos conhecidos com a natureza essencial de nucleotídeos naturais em que eles hibridizam em ácidos nucleicos de fita simples de uma maneira similar aos nucleotídeos de ocorrência natural (por exemplo, ácidos

12/54 nucleicos peptídicos). Um polinucleotídeo pode ser de tamanho completo ou uma subsequência de um gene natural, estrutural heterólogo ou regulatório. A menos que de outra forma indicada, o termo inclui referência à sequência especificada, bem como à sequência complementar deste. Assim, DNAs ou RNAs com estruturas principais modificadas com relação à estabilidade ou por outras razões são polinucleotídeos, da maneira que o termo é aqui pretendido. Além do mais, DNAs ou RNAs que compreendem as bases não comuns tal como inosina, ou as bases modificadas tais como bases tritiladas, para denominar apenas dois exemplos, são polinucleotídeos da maneira que termo é aqui usado. Entende-se que uma grande variedade de modificações foi realizada no DNA e RNA que atendem a muitos propósitos usados conhecidos pelos versados na técnica. O termo polinucleotídeo, da maneira que é aqui empregada, inclui tais formas química, enzimática ou metabolicamente modificadas de polinucleotídeos, bem como as formas químicas características de DNA e RNA de vírus e células, incluindo entre outras coisas, células simples e complexas.

[035] Os termos polipeptídeo, peptídeo e proteína são aqui usados indiferentemente para se referir a um polímero de resíduos de aminoácido. Os termos aplicamse aos polímeros de aminoácido em que um ou mais resíduo aminoácido é um análogo químico artificial de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, bem como aos polímeros de aminoácido de ocorrência natural. A natureza essencial de tais análogos de aminoácidos de ocorrência natural é que, quando incorporados em uma proteína, esta proteína é especificamente reativa aos anticorpos

13/54 elicitados na mesma proteína, mas que consistem completamente em aminoácidos de ocorrência natural. Os termos polipeptídeo, peptídeo e proteína são também inclusivos de modificações incluindo, mas sem limitações, glicosilação, anexação de lipídeo, sulfatação, gamacarboxilação de resíduos de ácido glutâmico, hidroxilação e ADP-ribosilação.

[036] Quando uma enzima é mencionada com referência a uma classe de enzima (EC), a classe de enzima é uma classe em que a enzima é classificada, ou pode ser classificada, na base da Enzyme Nomenclature fornecida pelo Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB), cuja nomenclatura pode ser encontrada em http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/. Outras enzimas adequadas que não foram (ainda) classificadas em uma classe específica, mas podem ser classificadas como tal, devem ser incluídas.

[037] Se for aqui referido a uma proteína ou uma sequência de ácido nucleico, tal como um gene, por referência a um número de acesso, este número é usado em particular para se referir a uma proteína ou sequência de ácidos nucleicos (gene) com uma sequência que pode ser encontrada por meio de www.ncbi.nlm.nih.gov/, (disponível em 13 de julho de 2009) , a menos que de outra forma especificada.

[038] Cada sequência de ácidos nucleicos aqui que codifica um polipeptídeo, por referência ao código genético, também descreve cada possível variação silenciosa do ácido nucleico. O termo variantes modificados de maneira conservativa aplica-se tanto às sequências de

14/54 aminoácidos quanto de ácidos nucleicos. Com relação às sequências particulares de ácidos nucleicos, os variantes modificados de maneira conservativa referem-se àqueles ácidos nucleicos que codificam variantes idênticos ou modificados de maneira conservativa das sequências de aminoácidos, em virtude da degeneração do código genético. O termo degeneração do código genético refere-se ao fato de que um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codifica qualquer dada proteína. Por exemplo, todos os códons GCA, GCC, GCG e GCU codificam o aminoácido alanina. Assim, em cada posição onde uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado em qualquer dos códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácido nucleico são variações silenciosas e representam uma espécie de variação modificada de maneira conservativa.

[039] O termo homólogo funcional (ou resumidamente homólogo) de um polipeptídeo com uma sequência específica (por exemplo, SEQ ID NO: 2), da maneira aqui usada, referese a um polipeptídeo que compreende a dita sequência específica estipulando que um ou mais aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos, e que o polipeptídeo apresenta (qualitativamente) a mesma funcionalidade enzimática para a conversão de substrato, por exemplo, uma atividade homóloga de acetaldeído acetilante desidrogenase dependente de NAD⁺ (EC 1.2.1.10) é capaz de converter acetaldeído em etanol. Esta funcionalidade pode ser testada para uso de um sistema de ensaio que compreende uma célula de levedura recombinante compreendendo um vetor de expressão para a expressão de

15/54 homólogo em levedura, o dito vetor de expressão compreendendo uma sequência heteróloga de ácidos nucleicos operavelmente ligada a um promotor funcional na levedura, e a dita sequência heteróloga de ácidos nucleicos codificando o polipeptídeo homólogo a partir do qual a atividade enzimática para converter acetil-Coenzima A em acetaldeído na célula de levedura deve ser testada, e avaliando se a dita conversão ocorre nas ditas células. Os homólogos candidatos podem ser identificados usando análises de similaridade in silico. Um exemplo detalhado de uma análise como esta é descrito no exemplo 2 de WO2009/013159. Os versados na técnica são capazes de derivar a partir daí como os homólogos adequados de candidato podem ser encontrados e, opcionalmente mediante otimização de códon (par), serão capazes de testar a funcionalidade exigida de tais homólogos candidatos usando um sistema de ensaio adequado da maneira descrita anteriormente. Um homólogo adequado representa um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos similar a um polipeptídeo específico em mais de 50 %, preferivelmente em 60 % ou mais, em particular em pelo menos 70 %, mais em particular em pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 %, por exemplo, com uma similaridade de sequência de aminoácidos como esta em SEQ ID NO: 2, e com a funcionalidade enzimática exigida para converter acetil-Coenzima A em acetaldeído. Com relação às sequências de ácidos nucleicos, o termo homólogo funcional deve incluir as sequências de ácidos nucleicos que diferem de uma outra sequência de ácidos nucleicos, em virtude da degeneração do código genético, e codificam a mesma

16/54 sequência de polipeptídeo.

[040] A identidade de sequência é aqui definida como uma relação entre duas ou mais sequências de aminoácidos (polipeptídeos ou proteínas) ou duas ou mais sequências de ácidos nucleicos (polinucleotídeos), da maneira determinada para comparar as sequências. Em geral, as identidades ou similaridades de sequência são comparadas com o tamanho total das sequências comparadas. Na técnica, identidade também significa o grau de relação de sequência entre sequências de aminoácidos ou ácidos nucleicos, como no caso pode ser, da maneira determinada pela combinação entre cadeias de tais sequências.

[041] Os métodos preferidos para determinar a identidade são determinado para fornecer a melhor combinação entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade e similaridade são codificados em programas de computador disponíveis publicamente. Os métodos preferidos de programa de computador para determinar a identidade e similaridade entre duas sequências incluem, por exemplo, o BestFit, BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul, S. F. et al, J. MoI. Biol. 215:403-410 (1990), disponíveis publicamente no NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S., et al, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894) . Os parâmetros preferidos para a comparação de sequências de aminoácidos usando BLASTP são abertura de intervalo 11.0, extensão de intervalo 1, matriz Blosum 62.

[042] A expressão refere-se à transcrição de um gene no RNA estrutural (RNAr, RNAt) ou RNA mensageiro (RNAm) com tradução subsequente em uma proteína.

[043] Da maneira aqui usada, heterólogo, em

17/54 referência a um ácido nucleico ou proteína, é um ácido nucleico ou proteína que origina-se de uma espécie estrangeira ou, se for da mesma espécie, é substancialmente modificado a partir de sua forma natural em composição e/ou locus genômico por intervenção humana deliberada. Por exemplo, um promotor operavelmente ligado a um gene estrutural heterólogo é de uma espécie diferente daquela a partir da qual o gene estrutural foi derivado ou, se for da mesma espécie, um ou ambos são substancialmente modificados a partir de sua forma original. Uma proteína heteróloga pode se originar de uma espécie estrangeira ou, se for da mesma espécie, é substancialmente modificada a partir de sua forma original por intervenção humana deliberada.

[044] O termo expressão heteróloga refere-se à expressão de ácidos nucleicos heterólogos em uma célula hospedeira. A expressão de proteína heterólogas em sistemas de célula hospedeira eucariótica, tal como levedura, é bem conhecida pelos versados na técnica. Um polinucleotídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico de um gene que codifica uma enzima com uma atividade específica pode ser expresso em um sistema de eucarioto como este. Em algumas modalidades, as células de levedura transformadas/transfectadas podem ser empregadas como sistemas de expressão para a expressão das enzimas. A expressão de proteína heterólogas em levedura é bem conhecida. Sherman, F., et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) é um trabalho bem reconhecido que descreve os vários métodos disponívei para expressar as proteínas em levedura. Duas leveduras amplamente utilizadas são Saccharomyces cerevisiae e Pichia

18/54 pastoris. Os vetores, cepas e protocolos para a expressão em Saccharomyces e Pichia são conhecidos na técnica e disponíveis a partir de fornecedores comerciais (por exemplo, Invitrogen). Os vetores adequados apresentam em geral as sequências controle de expressão, tais como promotores, incluindo 3-fosfoglicerato quinase ou álcool oxidase, e uma origem de replicação, sequências de finalização e similares da maneira desejada.

[045] Da maneira aqui usada, o promotor é uma sequência de DNA que direciona a transcrição de um gene (estrutural). Tipicamente, um promotor está localizado na região 5' de um gene, próximo ao sítio inicial transcricional de um gene (estrutural). As sequências promotoras podem ser constitutivas, indutíveis ou repressíveis. Se um promotor for um promotor indutível, então a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agente de indução.

[046] O termo vetor, da maneira aqui usada, inclui referência a um vetor de expressão autossômico e a um vetor de integração usado para a integração no cromossomo.

[047] O termo vetor de expressão refere-se a uma molécula de DNA, linear ou circular, compreendendo um segmento que codifica um polipeptídeo de interesse no controle de (isto é, operavelmente ligado a) segmentos adicionais de ácido nucleico que fornecem sua transcrição. Tais segmentos adicionais podem incluir sequências promotoras e finalizadoras, e podem incluir opcionalmente uma ou mais origens de replicação, um ou mais marcadores selecionáveis, um melhorador, um sinal de poliadenilação e similares. Os vetores de expressão são derivados em geral

19/54 do DNA plasmidial ou viral, ou podem conter elementos de ambos. Em particular, um vetor de expressão apresenta uma sequência de ácido nucleico que compreende na direção 5' para 3' e é operavelmente ligada a: (a) uma região de início de tradução e de transcrição reconhecida em levedura, (b) uma sequência codificante para um polipeptídeo de interesse, e (c) uma região de finalização de tradução e de transcrição reconhecida em levedura. Plasmídeo refere-se ao DNA extracromossômico que se replica de maneira autônoma, que não está integrado em um genoma de microrganismo, e é em geral circular na natureza.

[048] Um vetor de integração refere-se a uma molécula de DNA, linear ou circular, que pode ser incorporada em um genoma do microrganismo e fornece características hereditárias estáveis de um gene que codifica um polipeptídeo de interesse. O vetor de integração compreende em geral um ou mais segmentos compreendendo uma sequência do gene que codifica um polipeptídeo de interesse no controle de (isto é, operavelmente ligado a) segmentos adicionais de ácido nucleico que fornece sua transcrição. Tais segmentos adicionais podem incluir sequências promotoras e finalizadoras, e um ou mais segmentos que direcionam a incorporação do gene de interesse no genoma da célula alvo, em geral pelo processo de recombinação homóloga. Tipicamente, o vetor de integração será aquele que pode ser transferido para a célula alvo, mas que apresenta um replicon que é não funcional neste organismo. A integração do segmento que compreende o gene de interesse pode ser selecionada se um marcador apropriado for incluído neste

20/54 segmento.

[049] Da maneira aqui usada, o termo operavelmente ligado refere-se a uma justaposição, em que os componentes assim descritos estão em uma relação que permite que os mesmo funcionem em sua maneira pretendida. Uma sequência controle operavelmente ligada a uma outra sequência controle e/ou a uma sequência codificante está ligada de uma maneira tal que a transcrição e/ou expressão da sequência codificante seja atingida em condições compatíveis com a sequência controle. Em geral, operavelmente ligada significa que as sequências de ácidos nucleicos que são ligadas são contíguas e, onde necessário unir duas regiões codificantes de proteína, contíguas e no mesmo quadro de leitura.

[050] Célula hospedeira significa uma célula que contém um vetor e auxilia a replicação e/ou expressão do vetor. As células hospedeiras podem ser células procarióticas tal como E. coli, ou células eucarióticas tais como células de levedura, inseto, anfíbio ou mamífero. Preferivelmente, as células hospedeiras são as células da ordem de Actinomycetales, mais preferivelmente células de levedura, mais preferivelmente células de Saccharomyces cerevisiae.

[051] Transformação e transformar, da maneira aqui usada, refere-se à inserção de um polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira, independente do método usado para a inserção, por exemplo, absorção direta, transdução, conjugação do tipo f ou eletroporação. O polinucleotídeo exógeno pode ser mantido como um vetor não integrado, por exemplo, um plasmídeo ou, alternativamente,

21/54 pode ser integrado no genoma da célula hospedeira.

[052] Uma célula de acordo com a invenção é preferivelmente selecionada do grupo de Saccharomycetaceae, mais preferivelmente do grupo de células de Saccharomyces, células de Zygosaccharomyces e de Kluyveromyces. Em particular, bons resultados foram atingidos com uma célula hospedeira Saccharomyces cerevisiae. Zygosaccharomyces baillii é uma outra célula particularmente preferida, especialmente por sua tolerância a altas concentrações de acetato e sua tolerância a altas concentrações de etanol.

[053] Adicionalmente, uma célula de acordo com a invenção pode ser uma célula de levedura selecionada do grupo de leveduras que fermentam xilose, mais preferivelmente uma espécie de Pichia, por exemplo, Pichia stipitis ou Pichia angusta (também conhecida como Hansenula polymorpha) .

[054] Em uma modalidade adicional, uma célula hospedeira de acordo com a invenção é uma célula hospedeira que não apresentam naturalmente a atividade enzimática necessária para a síntese de glicerol dependente de NADH, por exemplo, células de levedura que pertencem à espécie Brettanomyces intermedins.

[055] Uma célula preferida, de acordo com a invenção, é livre de atividade enzimática necessária para a síntese de glicerol dependente de NADH, ou apresenta uma atividade enzimática reduzida com relação à via bioquímica dependente de NADH para a síntese de glicerol a partir de um carboidrato, comparada à sua célula de levedura tipo selvagem correspondente.

[056] Uma atividade enzimática reduzida pode ser

22/54 atingida modificando um ou mais genes que codificam uma atividade de 3-fosfato glicerol desidrogenase dependente de NAD (GPD), ou um ou mais genes que codificam uma atividade de glicerol fosfato fosfatase (GPP), de maneira tal que a enzima seja expressa consideravelmente menos que na tipo selvagem, ou de maneira tal que o gene codifique um polipeptídeo com atividade reduzida. Tais modificações podem ser realizadas usando técnicas biotecnológicas comumente conhecidas, e podem incluir em particular uma ou mais mutações do tipo knock-out ou mutagênese sítio direcionada de regiões promotoras ou regiões codificações dos genes estruturais que codificam GPD e/ou GPP. Alternativamente, as cepas de levedura que são deficientes na produção de glicerol podem ser obtidas por mutagênese aleatória, seguido pela seleção de cepas com atividade de GPD e/ou GPP reduzida ou ausente. Os genes GDP1, GDP2, GPP1 e GPP2 de S. cerevisiae são mostrados em SEQ ID NO: 24-27.

[057] Preferivelmente, pelo menos um gene que codifica um GPD ou pelo menos um gene que codifica um GPP é completamente deletado, ou pelo menos uma parte do gene que é deletado codifica uma parte da enzima que é essencial para sua atividade. Em particular, bons resultados foram atingidos com uma célula de S. cerevisiae, em que os quadros abertos de leitura do gene GPD1 e do gene GPD2 foram inativados. A inativação de um gene estrutural (gene alvo) pode ser realizada pelos versados na técnica sintetizando de maneira sintética, ou construindo de outra forma, um fragmento de DNA que consiste em um gene de marcador selecionável flanqueado por sequências de DNA, que são idênticas às sequências que flanqueiam a região do

23/54 genoma da célula hospedeira que deve ser deletada. Em particular, bons resultados foram obtidos com a inativação dos genes GPD1 e GPD2 em Saccharomyces cerevisiae por integração dos genes marcadores kanMX e hphMX4. De maneira subsequente, este fragmento de DNA é transformado em uma célula hospedeira. As células transformadas que expressam o gene marcador dominante são verificadas com relação à substituição correta da região que foi determinada para ser deletada, por exemplo, por um diagnóstico de reação em cadeia da polimerase ou hibridização do tipo Southern.

[058] Da maneira indicada anteriormente, uma célula de acordo com a invenção compreende uma sequência heteróloga de ácidos nucleicos que codifica uma acetaldeído acetilante desidrogenase dependente de NAD⁺ (EC 1.2.1.10). Esta enzima catalisa a conversão de acetil-Coenzima A em acetaldeído. Esta conversão pode ser representada pela fórmula de reação de equilíbrio:

acetil-Coenzima A + NADH + H+ <-> acetaldeído + NAD+ +

Coenzima A.

[059] Assim, esta enzima permite a reoxidação de NADH quando a acetil-Coenzima A é gerada a partir do acetato presente no meio de crescimento e, por meio disso, a síntese de glicerol não é mais necessária para balancear o cofator redox.

[060] A sequência de ácidos nucleicos que codifica a acetaldeído acetilante desidrogenase dependente de NAD⁺pode se originar, a princípio, de qualquer organismo que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica a dita desidrogenase.

[061] A acetaldeído acetilante desidrogenase

24/54 dependente de NAD+s conhecida que pode catalisar a redução de acetil-Coenzima A dependente de NADH em acetaldeído, em geral, pode estar dividida em três tipos de homólogos funcionais de acetaldeído acetilante desidrogenase dependente de NAD+:

1) Proteínas bifuncionais que catalisam a conversão reversível de acetil-Coenzima A em acetaldeído, e a subsequente conversão reversível de acetaldeído em etanol. Um exemplo deste tipo de proteínas é a proteína AdhE em E. coli (Gen Bank No: NP_415757). AdhE parece ser o produto evolutivo de uma fusão de gene. A região terminal NH2 da proteína AdhE é altamente homóloga à aldeído:NAD⁺oxidoredutases, ao passo que a região terminal COOH é homóloga à uma família de etanol dependente de Fe²⁺:NAD⁺oxidoredutases (Membrillo-Hernandez et al., (2000) J. Biol. Chem. 275: 33869-33875) . A AdhE de E. coli é submetida à oxidação catalisada pelo metal e, portanto, é sensível ao

oxigênio	(Tamarit et	al.	(1998) J. Biol.	Chem.	273:3027-
32).	2)	Proteínas	que	catalisam a conversão	reversível
de	acetil-Coenzima	A	em acetaldeído,	em	condições

estritamente anaeróbicos ou facultativos, mas não possuem a atividade de álcool desidrogenase. Um exemplo deste tipo de

proteínas foi relatado	em Clostridium	kluyveri (Smith	et
al. (1980)	Arch. Biochem. Biophys.	203:	663-675).	Uma
acetaldeído	acetilante	desidrogenase	foi	detectada	no
genoma de	Clostridium	kluyveri DSM	555	(GenBank	No:
EDK33116).	Uma proteína	homóloga AcdH	é	identificada	no

genoma de Lactobacillus plantarum (GenBank No: NP_784141 ). Um outro exemplo deste tipo de proteínas é o dito produto

25/54 de gene em Clostridium beijerinckii NRRL B593 (Toth et al. (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65: 4973-4980, GenBank No: AAD31841).

3) Proteínas que são parte de um complexo bifuncional aldolase-desidrogenase envolvido no catabolismo de 4-hidroxi-2-cetovalerato. Tais enzimas bifuncionais catalisam as duas etapas finais da via de meta-clivagem para catecol, um intermediário em muitas espécies bacterianas na degradação de fenóis, toluatos, naftaleno, bifenis e outros compostos aromáticos (Powlowski e Shingler (1994) Biodegradation 5, 219-236). O 4-hidroxi-2cetovalerato é o primeiro convertido por 4-hidroxi-2cetovalerato aldolase em piruvato e acetaldeído, de maneira subsequente, o acetaldeído é convertido acetilando a acetaldeído desidrogenase em acetil-CoA. Um exemplo deste tipo de acetaldeído acetilante desidrogenase é a proteína DmpF em Pseudomonas sp CF600 (GenBank No: CAA43226) (Shingler et al. (1992) J. Bacteriol. 174:71 1-24). A proteína MphF de E. coli (Ferrandez et al. (1997) J. Bacteriol. 179: 2573-2581, GenBank No: NP_414885) é homóloga à proteína DmpF em Pseudomonas sp. CF600.

[062] Uma sequência adequada de ácidos nucleicos pode ser encontrada, em particular, em um organismo selecionado Escherichia, em particular E. coli; em particular Mycobacterium marinum, ulcerans, Mycobacterium tuberculosis; em particular Carboxydothermus do grupo de Mycobacterium, Mycobacterium

Carboxydothermus, hydrogenoformans; Entamoeba, em particular Entamoeba histolytica; Shigella, em particular Shigella sonnei; Burkholderia, em particular Burkholderia pseudomallei,

26/54

Klebsiella, em particular Klebsiella pneumoniae; Azotobacter, em particular Azotobacter vinelandii; Azoarcus sp; Cupriavidus, em particular Cupriavidus taiwanensis; Pseudomonas, em particular Pseudomonas sp. CF600; Pelomaculum, em particular Pelotomaculum thermopropionicum. Preferivelmente, a sequência de ácidos nucleicos que codifica a acetaldeído acetilante desidrogenase dependente de NAD⁺ origina-se de Escherichia, mais preferivelmente de E. coli.

[063] Particularmente adequado é um gene mhpF de E. coli, ou um homólogo funcional deste. este gene é descrito em Ferrandez et al. (1997) J. Bacteriol. 179:2573-2581. Bons resultados foram obtidos com S. cerevisiae, em que um gene mhpF de E. coli foi incorporado.

[064] Em uma modalidade vantajosa adicional, a sequência de ácidos nucleicos que codifica uma acetaldeído desidrogenase (acetilante) é em particular de Pseudomonas, dmpF de Pseudomonas sp. CF600.

[065] A princípio, a sequência de ácidos nucleicos que codifica a acetaldeído acetilante desidrogenase dependente de NAD⁺ pode ser uma sequência de ácidos nucleicos tipo selvagem.

[066] Uma sequência preferida de ácidos nucleicos codifica a acetaldeído acetilante desidrogenase dependente de NAD+ representada por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 29, ou um homólogo funcional de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 29. Em particular, a sequência de ácidos nucleicos compreende uma sequência de acordo com SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 28 ou um homólogo funcional de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 28.

[067] Adicionalmente, uma sequência de acetaldeído

27/54 acetilante desidrogenase (ou sequência de ácidos nucleicos que codifica tal atividade), por exemplo, pode ser selecionada do grupo de adhE de Escherichia coli, adh2 de Entamoeba histolytica, adhE de Staphylococcus aureus, adhE E2 de Piromyces sp., EDK33116 de Clostridium kluyveri, acdH de Lactobacillus plantarum e YP 001268189 de Pseudomonas putida. Para as sequências destas enzimas, sequências de ácidos nucleicos que codificam estas enzimas e metodologia para incorporar a sequência de ácidos nucleicos em uma célula hospedeira, é feita referência à WO 2009/013159, em particular o exemplo 3, tabela 1 (página 26) e os números ID de sequência mencionados, cuja tabela 1 da publicação e as sequências representadas pelos números ID de sequência mencionados na dita tabela são aqui incorporadas pela referência.

[068] Em geral, uma célula de acordo com a invenção também compreende uma acetil-Coenzima A sintetase, cuja enzima catalisa a formação de acetil-coenzima A, a partir de acetato. Esta enzima pode estar presente na célula tipo selvagem, por exemplo, como é o caso de S. cerevisiae que contém duas isoenzimas acetil-Coenzima A sintetase codificadas pelos genes ACSl [SEQ ID NO: 17] e ACS2 [SEQ ID NO: 18] (van den Berg et al (1996) J. Biol. Chem. 271:28953-28959), ou uma célula hospedeira pode ser fornecida com um ou mais gene(s) heterólogo(s) que codifica(m) esta atividade, por exemplo, o gene ACSl e/ou ACS2 de S. cerevisiae ou um homólogo funcional deste pode ser incorporado em uma célula que não apresenta a atividade de acetil-Coenzima A sintetase isoenzima.

[069] De maneira adicional, particularmente em vista

28/54 de uma produção eficiente de etanol, mas também com relação à uma oxidação eficiente de NADH, é preferível que a célula compreenda uma álcool desidrogenase (EC 1.1.1.1) dependente de NAD+. Esta enzima catalisa a conversão de acetaldeído em etanol. A célula pode compreender naturalmente um gene que codifica uma desidrogenase como esta, como é o caso de S. cerevisiae (ADHl-S) [SEQ ID NO: 19-23], ver 'Lutstorf e Megnet. 1968 Arch. Biochem. Biophys. 126:933-944', ou 'Ciriacy, 1975, Mutat. Res. 29:315-326'), ou uma célula hospedeira pode ser fornecida com um ou mais gene(s) heterólogo(s) que codifica(m) esta atividade, por exemplo, qualquer um dos genes ADH1-5 de S. cerevisiae ou homólogos funcionais deste pode ser incorporado em uma célula que não apresenta atividade de álcool desidrogenase dependente de NAD⁺.

[070] As células especificamente preferidas, de acordo com a invenção, são as células da cepa de S. cerevisiae depositada em 16 de julho de 2009 no Centraalbureau voor Schimmelcultures (Utrecht, Holanda) com número de depósito CBS125049.

[071] Em aspecto específico, a presente invenção é direcionada a um método de preparar uma célula de levedura recombinante de acordo com a invenção.

[072] A modificação genética de uma célula, compreendendo a incorporação de uma ou mais sequências heterólogas de ácidos nucleicos em uma célula hospedeira, e em geral compreendendo mutação (incluindo deleção completa) de um gene que codifica uma atividade enzimática necessária para a síntese de glicerol dependente de NADH, pode basearse no conhecimento geral comum, por exemplo, por técnicas

29/54 padrões de biologia molecular e genética, geralmente conhecidas na técnica e que foram previamente descritas (por exemplo, Maniatis et al. 1982 Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; Miller 1972 Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor; Sambrook e Russell 2001 Molecular cloning: A laboratory manual (3^a edição), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press; F. Ausubel et al., eds., Current protocolos in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, Nova Iorque 1987) .

[073] Um método da	invenção prepara uma	célula de
levedura recombinante	de	acordo	com a	invenção
compreendendo:
(a) fornecer uma	célula	de	levedura,
preferivelmente uma célula	de	levedura	selecionada do grupo
de células de levedura	que não	apresenta	atividade
enzimática necessária para	a	síntese de glicerol	dependente

de NADH, e célula de levedura com uma atividade enzimática reduzida com relação a síntese de glicerol comparada à sua célula de levedura tipo selvagem correspondente;

(b) obter um segmento de ácido nucleico compreendendo um gene que é heterólogo à dita célula de levedura e codifica uma enzima que apresenta a atividade de acetaldeído acetilante desidrogenase dependente de NAD+, e em que o dito gene é operavelmente ligado a um promotor funcional na dita célula de levedura;

(c) se	desej ado	(por exemplo,	se a célula	de
levedura não	apresentar	atividade de	acetil-Coenzima	A
sintetase, ou	em que a	atividade de	acetil-Coenzima	A

30/54 sintetase(s) limita completamente a atividade in vivo da via para conversão de acetato em etanol, ou expressa acetil-Coenzima A sintetase em um compartimento celular que não é compatível com seu uso na invenção), obter um segmento de ácido nucleico compreendendo um gene que é heterólogo à dita célula de levedura e codifica uma enzima que apresenta uma atividade de acetil-Coenzima A sintetase, e em que o dito gene é operavelmente ligado a um promotor funcional na dita célula de levedura;

(d) se desejado (por exemplo, se a célula de levedura não apresentar a atividade de álcool desidrogenase dependente de NAD⁺, ou em que a atividade de álcool desidrogenase dependente de NAD⁺ limita a atividade in vivo da via para conversão de acetato em etanol, ou expressa álcool desidrogenase dependente de NAD⁺ em um compartimento celular que não é compatível com seu uso na invenção), obter um segmento de ácido nucleico compreendendo um gene que é heterólogo à dita célula de levedura e codifica uma enzima que apresenta a atividade de uma álcool desidrogenase dependente de NAD⁺, e em que o dito gene é operavelmente ligado a um promotor funcional na dita célula de levedura; e (e) transformar uma célula de levedura com o dito segmento ou segmentos de ácido nucleico, fornecendo por meio disso uma célula de levedura recombinante que expressa o dito gene heterólogo, e em que a dita célula de levedura recombinante exibe síntese reduzida de glicerol dependente de NADH em condições fermentativas, comparada a uma célula de levedura não recombinante correspondente, ou em que na dita célula de levedura a síntese de glicerol dependente de

31/54

NADH em condições fermentativas é ausente.

[074] Os promotores para as células de levedura são conhecidos na técnica e podem ser, por exemplo, os promotores de triose-fosfato desidrogenase TPI1, promotores de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase TDH3, promotores do fator de alongamento translacional EF-I alfa TEF1, os promotores de álcool desidrogenase ADH1, promotores de glicose-6-fosfato desidrogenase gpdA e ZWF1, promotores de protease tais como pepA, pepB, pepC, os promotores de glicoamilase glaA, promotores de amilase amyA, amyB, os promotores de catalase catR ou catA, promotor de glicose oxidase goxC, promotor de beta-galactosidase lacA, promotor de alfa-glucosidase aglA, promotor do fator de alongamento de tradução tefA promotor, promotores de xilanase tais como xlnA, xlnB, xlnC, xlnO, promotores de celulase tais como eglA, eglB, cbhA, promotores de reguladores transcricionais tais como areA, creA, xlnR, pacC, prtY, etc, ou qualquer outro, e podem ser encontrados, entre outros, no site da web NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/).

[075] Em uma modalidade preferida, a sequência heteróloga de ácidos nucleicos a ser introduzida em uma célula de levedura, durante o preparo de uma célula de levedura recombinante da invenção, é incorporada em um vetor e a transformação da célula é realizada com o vetor. Se mais de uma sequência heteróloga de ácidos nucleicos (que codificam diferentes atividades enzimáticas ou que codificam juntas uma única atividade enzimática) devem ser incorporadas, estas sequências de ácidos nucleicos podem estar presente em um vetor único ou estas sequências de ácidos nucleicos podem ser incorporadas como parte de

32/54 vetores separados.

[076] Dessa maneira, a invenção diz respeito adicionalmente a um vetor para a expressão de um polipeptídeo heterólogo em uma célula de levedura, em particular uma célula de levedura, o dito vetor de expressão compreendendo uma ou mais sequências heterólogas de ácidos nucleicos operavelmente ligadas a um promotor funcional na célula de levedura, e a(s) dita(s) sequência(s) heteróloga(s) de ácidos nucleicos que codifica(m) um polipeptídeo com atividade enzimática para converter acetil-Coenzima A em acetaldeído (o citosol de) na dita célula de levedura, em que o dito polipeptídeo compreende preferivelmente uma sequência de acordo com SEQ ID NO: 2, ou um homólogo funcional desta.

[077] O vetor (usado em um método) da invenção pode ser um vetor de fago, um vetor bacteriano, um vetor de plasmídeo centromérico, epissomal ou de integração, ou um vetor viral.

[078] Em uma modalidade preferida, o vetor é um vetor para a expressão em Saccharomyces, em particular S. cerevisiae. Em tal modalidade, a sequência heteróloga de ácidos nucleicos que codifica a atividade de acetaldeído acetilante desidrogenase dependente de NAD⁺ pode ser otimizada por códon (par) para a expressão em Saccharomyces, em particular S. cerevisiae, embora bons resultados tenham sido atingidos com uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a tipo selvagem.

[079] A fim de atingir a expressão ideal em uma célula específica (tal como S. cerevisiae ), o uso do códon (par) do gene heterólogo pode ser otimizado usando qualquer

33/54 um de uma variedade de pacotes de software de determinação de gene sintético, por exemplo, GeneOptimizer® da Geneart AG (Regensburg, Alemanha) para otimização de uso de códon ou otimização de uso de par de códon da maneira descrita em PCT/EP2007/05594. Tal adaptação de uso de códon garante que os genes heterólogos, que são de origem bacteriana, por exemplo, sejam processados eficientemente pela maquinaria de transcrição e tradução de levedura. A otimização do uso de par de códon resultará em melhor expressão de proteína na célula de levedura. As sequências otimizadas, por exemplo, podem ser clonadas em um plasmídeo de expressão de levedura de muitas cópias, operavelmente ligado a um promotor (preferivelmente constitutivo) funcional em um fungo (levedura).

[080] Da maneira indicada anteriormente, a invenção diz respeito adicionalmente à preparação de etanol.

[081] Para um método de preparar etanol, uma célula de acordo com a invenção que é usada em condições anaeróbicas fermenta um açúcar, formando por meio disso etanol. As células de levedura adequadas para fermentar o açúcar são em geral conhecidas e incluem, entre outras, S. cerevisiae. Em um método da invenção, uma célula de levedura que é usada também produz uma acetaldeído acetilante desidrogenase dependente de NAD⁺ (EC 1.2.1.10). Esta célula pode ser obtida da maneira descrita anteriormente e é ilustrada no exemplo aqui a seguir. Se for usada para a preparação de etanol, a célula também inclui preferivelmente uma atividade de acetil-Coenzima A sintetase. Se for usada para a preparação de etanol, a célula também inclui preferivelmente uma atividade de

34/54 álcool desidrogenase dependente de NAD+. Estas atividades podem estar presentes naturalmente, como em S. cerevisiae, ou são fornecidas por modificação genética (ver também aqui anteriormente).

[082] As condições de fermentação podem ser, a princípio, baseadas em condições geralmente conhecidas, por exemplo, da maneira descrita na revisão por Van Maris citada anteriormente, ou as referências citadas nesta, estipulando que, tipicamente, o meio não qual a fermentação é realizada compreende acetato além do(s) carboidrato(s) fermentável(s).

[083] A razão molar acetato para carboidrato consumido por culturas anaeróbicas das células de levedura, modificadas de acordo com a invenção, é em geral pelo menos 0,004, em particular pelo menos 0,01, pelo menos 0,03, pelo menos 0,1, ou pelo menos 0,2. A razão molar acetato para carboidrato presente em hidrolisados da biomassa lignocelulósica é em geral menos que 0,70, em particular 0,5 ou menos, mais em particular 0,3 ou menor, ou 0,2 ou menos. Aqui, o número de mols de carboidrato baseia-se em unidades de monossacarídeo, isto é, um mol de um oligo/polissacarídeo com n contagens de unidades de monossacarídeo como n mol.

[084] Em termos absolutos, a concentração de carboidrato fermentável está em geral na faixa de 65 a 400 g/L, em particular na faixa de 100 a 250 g/L.

[085] Em termos absolutos, a concentração de acetato está em geral na faixa de 0,5 a 20 g/L, em particular na faixa de 1-15 g/L, mais em particular na faixa de 2 a 12 g/L.

35/54 [086] O pH pode ser escolhido dependendo de como é aceitável pelo organismo que é usado, com base no conhecimento geral comum, ou pode ser determinado de maneira rotineira. Em geral, a fermentação é realizada em um pH neutro ou ácido, em particular em um pH na faixa de 2-7, mais em particular em um pH de 3-6, ainda mais em particular 3,5-5,5 (pH aparente, da maneira medida no meio de fermentação na temperatura que a fermentação ocorre).

[087] A temperatura pode ser escolhida dependendo de como é aceitável pelo organismo que é usado. Em geral, a temperatura está na faixa de 15-50 graus C, em particular na faixa de 25-45 graus C.

[088] Como um carboidrato fermentável, a princípio, qualquer carboidrato que pode ser usado é metabolizado pela célula recombinante específica, com etanol como um produto metabólico. A célula pode compreender naturalmente o sistema de enzima metabólica exigido, ou a célula pode ter sido geneticamente modificada para este propósito, por exemplo, da maneira descrita pela revisão por Van Maris, as referências citadas nesta, ou da maneira descrita na presente revelação. Preferivelmente, os carboidratos fermentáveis no hidrolisado compreendem pelo menos um carboidrato selecionado do grupo de hexoses, pentoses e oligossacarídeos que compreendem uma ou mais unidades de hexose e/ou pentose. Em particular, no caso da célula recombinante ser do grupo Saccharomyces, preferivelmente S. cerevisiae, pelo menos um carboidrato selecionado de glicose, frutose, sacarose, maltose, galactose, xilose, arabinose e manose é usado. Bons resultados foram obtidos com a glicose.

36/54 [089] Um método de acordo com a invenção é adequado, em particular, para preparar etanol usando um hidrolisado de pelo menos um polímero selecionado de celulose, hemicelulose e pectina, preferivelmente pelo menos um polímero selecionado de hemicelulose e pectina, em decorrência de na hidrólise destes polímeros o acetato ser tipicamente liberado por hidrólise ou formado como um produto de decomposição. Em particular, o hidrolisado pode ser material lignocelulósico hidrolisado, tal como a biomassa lignocelulósica. Por exemplo, o material lignocelulósico pode ser selecionado a partir do material lignocelulósico agrícola, por exemplo, algodão, palha, capim elefante, bagaço, palha de milho, material lignocelulósico de planta aquática, polpa de beterraba, cascas de frutas cítricas, materiais lignocelulósicos da floresta tais como material de resíduos lignocelulósicos de árvores ou arbustos (material vegetal aparado/podado/cortado, serragem, etc) ou árvores ou arbustos crescidos especificamente como uma fonte para materiais lignocelulósicos, por exemplo, árvores de álamo, resíduos (ligno)celulósicos da indústria, por exemplo, polpa de madeira, papel residual.

[090] Preferivelmente, um hidrolisado lignocelulósico compreende um ou mais açúcares fermentáveis (particularmente glicose, xilose e arabinose) e acetato, que foram formados durante a hidrólise. Assim, em uma modalidade preferida da invenção, a preparação de etanol compreende uma etapa em que um material lignocelulósico é hidrolisado, formando por meio disso um hidrolisado que compreende um ou mais carboidratos fermentáveis, em

37/54 particular glicose, e opcionalmente uma ou mais outras hexoses e pentoses e acetato, cujo hidrolisado é a partir daqui colocado em contado com uma célula recombinante da invenção. As concentrações relativas de acetato e carboidratos fermentáveis, no substrato que é colocado em contato com a célula recombinante da invenção, podem ser modificadas para otimizar as condições para hidrólise, misturando diferentes hidrolisados e/ou misturando (parcialmente) com fontes refinadas de carboidratos e/ou ácido acético.

[091] A metodologia de hidrólise adequada pode ser baseada na revisão de Van Maris citada anteriormente, ou suas referências citadas, e inclui hidrólise enzimática, hidrólise térmica, hidrólise química e combinações destas. Os polímeros que são hidrolisados em geral até a extensão de pelo menos 50 %, preferivelmente pelo menos 90 %, em particular pelo menos 95 % das cadeias, são degradados em unidades de monossacarídeo ou unidades de monossacarídeo e unidades de dissacarídeo.

[092] A invenção é agora ilustrada pelos exemplos a seguir:

EXEMPLOS

EXEMPLO 1

Materiais e Métodos

Construção e manutenção de cepa [093] As cepas de Saccharomyces cerevisiae usadas (tabela 1) originam-se da família CEN.PK, que foi previamente identificada como uma base adequada para estudos genéticos e fisiológicos combinados (van Dijken et al. (2000) Enzyme Microb. Technol. 26:706-714).

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Tabela 1. Cepas de Saccharomyces cerevisiae usadas

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Cepa	Genótipo relevante	Fonte/referência
CEN.PK113-5D	MATa ura3 GPD1 GPD2	Cepa da coleção de EUROSCARF, Frankfurt, Alemanha
IME076	MATa ura3 GPD1 GPD2
(Referência)	p426 GPD(URA3)
CEN.PK102-3A	MATa ura3 leu2 GPD1 GPD2	Cepa da coleção de EUROSCARF, Frankfurt, Alemanha
RWB0094	MATa ura3 leu2 gpd1(-	BIRD
	1,1133)::loxP-KanMX-loxP	Engineering,
	gpd2(-2,1281)::hphMX4	Rotterdam
IMZ008	MATa ura3 leu2 gpd1 (- 1,1133)::loxP gpd2(- 2,1281)::hphMX4 YEplac181(LEU2)
IMZ132	MATa ura3 leu2 gpd1(-	Depositada no
(CBS125049)	1,1133)::loxP gpd2(-	Centraalbureau
	2,1281)::hphMX4	voor
	YEplac181(LEU2)	Schimmelcultures
	pUDE43(URA3 pTHD3::mhpF	em 16 de julho
	(E.coli)::CYC1t)	de 2009.
IMZ127	MATa ura3 leu2 gpd1(- 1,1133)::loxP gpd2A(- 2,1281)::hphMX4 YEplac181(LEU2) p426 GPD(URA3)

[094] Para interromper o gene GPD1 (YDL022W), o

40/54 cassete de interrupção loxP-KanMX-loxP pode ser amplificado por PCR, de acordo com Güldener et al. (1996, Nucleic Acids Res. 24:2519-2524), usando um conjunto de oligonucleotídeo iniciador contendo regiões flanqueantes do nucleotídeo 45 homólogas às sequências no gene GPD1, e aproximadamente do nucleotídeo 20 homólogas às sequências do módulo de interrupção de pUG6 (Gúldener et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:2519-2524) (Figura 2, Tabela 2). Similarmente, o plasmídeo pAG32 ((Goldstein e McCusker (1999) Yeast 15:1541-1553) pode ser usado como um molde para amplificação por PCR do módulo de interrupção hphMX4. Para a construção de um cassete de interrupção GPD2 (YOL059W), um conjunto de oligonucleotídeo iniciador pode ser usado, contendo regiões flanqueantes do nucleotídeo 45 homólogas às sequências no gene GPD2 e sequências de 20 ácidos nucleicos homólogas às sequências do módulo de interrupção de pAG32 (tabela 2).

Tabela 2. Oligonucleotídeos para a inativação dos genes GPD1 e GPD2 e para a verificação da interrupção correta por PCR de diagnóstico. Os oligonucleotídeos de interrupção de gene, nucleotídeos homólogos às sequência tanto à esquerda (lado 5') quanto à direita (lado 3') dos genes a serem deletados são indicados em letras maiúsculas; as letras minúsculas indicam nucleotídeos homólogos às sequência dos cassetes de interrupção.

Gene alvo	GPD1/YDL022W	GPD2/YOL059W
Oligonuc	fw	fw
leotídeo	5'TTGTACACCCCCCCCCTCCAC	5'TCAATTCTCTTTCCCTTTCCTTTT
s	AAACACAAATATTGATAATATAA	CCTTCGCTCCCCTTCCTTATC

41/54

iniciado	Acagctgaagcttcgtacgc	ccaggctgaagcttcgtacg
res de	[SEQ ID NO: 5]	[SEQ ID NO: 7]
interrup
ção de	rv	rv
gene	5'AATCTAATCTTCATGTAGATC	5'GTGTCTATTCGTCATCGATGTCTA
	TAATTCTTCAATCATGTCCGGCG	GCTCTTCAATCATCTCCGGTAGgcat
	gcataggccactagtggatctg	aggccactagtggatc
	[SEQ ID NO: 6]	[SEQ ID NO: 8]
Oligonuc
leotídeo	fw 5' GPD1
s	5' CCCACCCACACCACCAATAC	fw 5' GPD2
iniciado	[SEQ ID NO: 9]	5' GTTCAGCAGCTCTTCTCTAC
res de		[SEQ ID NO: 11]
verifica	rv 3' GPD1
ção -	5' CGGACGCCAGATGCTAGAAG	rv 3' GPD2
gene		5' CCAAATGCGACATGAGTCAC
[SEQ ID NO: 10]
alvo		[SEQ ID NO: 12]
específi
co
Oligonuc
leotídeo	fw KANB	Fw KANB
s	5' CGCACGTCAAGACTGTCAAG	5' CGCACGTCAAGACTGTCAAG
iniciado	[SEQ ID NO: 13]	[SEQ ID NO: 15]
res de
verifica	rv KANA	rv KANA
ção -	5' TCGTATGTGAATGCTGGTCG	5' TCGTATGTGAATGCTGGTCG
cassete	[SEQ ID NO: 14]	[SEQ ID NO: 16]
de
interrup

42/54

ção específi co

[095] A transformação dos cassetes de interrupção GPD1 e GPD2 amplificados por PCR na cepa Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-3A (Tabela 1) pode ser realizada de acordo com o protocolos descritos por Guldener et al (Nucleic Acids Res. (1996) 24:2519-2524), seguido por seleção de transformantes no meio complexo YPD (Burke et al. (2000) Methods in yeast genetics. Cold Spring Harbour Press Plainview, NY) com 200 mg/L de G-418 para as cepas transformadas com o cassete de interrupção KanMX e 300 mg/L de higromicina B para as cepas transformadas com o cassete de interrupção hphMX4. A confirmação da integração correta do cassete de interrupção do gene GPD1 pode ser verificada por PCR de colônia, usando combinações de conjunto de oligonucleotídeos iniciadores 5' GPD1\KANA e 3' GPD1\KANB (Tabela 2). A inativação correta de GPD2 pode ser verificada similarmente com o conjunto de oligonucleotídeos iniciadores 5' GPD2\KANA e 3' GPD2\KANB (Tabela 2). A cepa RWB0094, que carrega deleções nos quadros abertos de leitura dos genes GPD1 e GPD2 da cepa CEN.PK102-3A (MATa ura3 Ieu2) que foram substituídos pelo cassete loxP-KanMXloxP e o cassete hphMX4, respectivamente, foi adquirida da BIRD Engineering, Rotterdam, Holanda. O marcador KanMX da cepa RWB0094 foi removido pela expressão da Cre recombinase (Guldener et al (1996) Nucleic Acids Res. 24:2519-2524) e sua auxotrofia para leucina foi complementada por transformação com o plasmídeo YEPlac181 que carrega LEU2 (Gietz, R. D. e S. Akio. (1988) Gene 74:527-534.), rendendo

43/54 a cepa IMZ008. A figura 1 2 mostra esquematicamente o procedimento de interrupção de gene, a substituição do GPD1 ORF por KanMX e GPD2 ORF por hphMX4. As setas indicam os oligonucleotídeos iniciadores para a verificação por PCR de diagnóstico da inativação correta de gene.

[096] A transformação da cepa IMZ008 com o plasmídeo pUDE43 de expressão mhpF que carrega URA3 (ver a seguir) rendeu a cepa IMZ132 prototrófica que carrega que expressa mhpF, a transformação com o vetor p426_GPD vazio que carrega URA3 rendeu a cepa IMZ127. Finalmente, a transformação de cepa CEN.PK113-5D (ura3) com p426_GPD rendeu a cepa IME076 de referência GPD1 GPD2 prototrófica. As culturas transformadas com os cassetes de deleção foram plaqueadas em meio complexo YPD contendo G418 (200 mg L^-1) ou higromicina (200 mg L^-1) . A integração satisfatória dos cassetes de deleção foi confirmada por PCR de diagnóstico. As culturas de estoque de todas as cepas foram crescidas em frascos de agitação contendo 100 mL de meio sintético (ver a seguir), com 20 g L^{-1 de} glicose como fonte de carbono. Após adicionar 30 % (v/v) de glicerol, alíquotas de 1 mL de culturas em fase estacionária foram armazenadas a -80 °C.

Construção de plasmídeo [097] O gene mhpF de E. coli (número de acesso EMBL Y09555.7) foi amplificado por PCR, a partir do DNA genômico da cepa E. coli K12 JM109, usando os pares de oligonucleotídeo iniciador mhpF-sentido (5'GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGAGTAAGCGTAAAGTCGCCATTATCGG-3' [SEQ ID NO: 3]) e mhpF-reverso (5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTCATGCCGCTTCTCCTGCCTTGC-3',

44/54 [SEQ ID NO: 4]), que continham as sequências attBl e attB2, respectivamente. A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada usando DNA polimerase de alta fidelidade Phusion® Hot Start (Finnzymes Oy, Espoo, Finlândia), de acordo com as especificações do fabricante e em um termociclador Biometra TGradient (Biometra, Gottingen, Alemanha) com os seguintes ajustes: 25 ciclos de 10 segundos, desnaturação a 98 °C, e 3 0 segundos de anelamento e extensão a 72 °C. O produto de PCR de 1011 bp foi clonado usando a tecnologia de clonagem Gateway® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). O plasmídeo pDONR221, usando a reação BP, foi usada para criar o clone de entrada, determinado como plasmídeo pUD64. A partir deste clone de entrada e do plasmídeo multicópias pAG426GPD-ccdB (Addgene, Cambridge, MA, USA), o plasmídeo de expressão pUDE43 de levedura foi construído empregando a reação LR. As transformações dos produtos da reação de recombinação na cepa de E. coli K12 JM109 competente foram realizadas de acordo com o estojo de transformação de E. coli Z-Competent™ (Zymoresearch Corporation, Orange, USA) , e plaqueadas no meio LB contendo tanto ampicilina (100 mg L^-1) quanto canamicina (50 mg.L^-1). As transformações em levedura foram realizadas de acordo com Burke et al. (Methods in yeast genetics (2000.) Cold Spring Harbor Laboratory Press Plainview, NY.) Após as transformações com o plasmídeo de expressão em levedura, as células foram plaqueadas em meio sintético. A inserção satisfatória do plasmídeo multicópias pUDE43 foi confirmada por PCR de diagnóstico usando os pares de oligonucleotídeo iniciador para clonagem.

45/54

Cultivo e meios [098] O cultivo em frasco de agitação foi realizado a 30 °C em um meio sintético (46). O pH do meio foi ajustado para 6,0 com KOH 2 M antes da esterilização.

[099] Os pré-cultivos foram preparados inoculando 100 mL de meio contendo 20 g L^-1 de glicose em um frasco de agitação de 500 mL com (1 mL) cultura estoque congelada. Após 24 horas de incubação a 3 0 °C em uma incubadora com agitador Innova® (200 rpm, New Brunswick Scientific, NJ,

USA), as culturas foram transferidas para os biorreatores. As fermentações em condições anaeróbias foram realizadas a 30 °C em biorreatores de laboratório de 2 litros (Applikon, Schiedam, Holanda) com um volume funcional de 1 litro. O meio sintético com 20 g I-¹ de glicose (46) foi usado para todas as fermentações e foi suplementado com 100 pL L^-1 de anti-espuma de silicone (Silcolapse 5020, Caldic Belgium, Bleustar Silicones), bem como com os fatores de crescimento anaeróbico, ergosterol (0,01 g L^-1) e Tween 80 (0,42 g L^-1) dissolvidos em etanol. Isto resultou em etanol 11-13 mM no meio. Onde indicado, o ácido acético foi adicionado em uma concentração de 2 g L^-1 e o pH foi reajustado para 5,0 antes da inoculação. O pH da cultura foi mantido a 5,0 pela adição automática de KOH 2M. As culturas foram agitadas a 800 rpm e dispersadas com 0,5 L min^-1 de nitrogênio (<10 ppm de oxigênio). O oxigênio dissolvido foi monitorado com um eletrodo de oxigênio autoclavável (Applisens, Schiedam, Holanda). Para minimizar a difusão de oxigênio, os biorreatores foram equipados com tubos de Norprene (Cole Palmer Instrument Company, Vernon Hills, USA). Todas as fermentações foram realizadas pelo menos em duplicata.

46/54

Determinação de peso seco e densidade ótica da cultura [100] As amostras de cultura (10 mL) em tempos de intervalo selecionados foram filtradas com filtros de nitrocelulose pré-pesados (tamanho do poro 0,45 pm; Gelman Laboratory, Ann Arbor, USA) . Após a remoção do meio, os filtros foram lavados com água desmineralizada e seco em um forno micro-ondas (Bosch, Stuttgart, Alemanha) por 20 minutos a 350 W e pesados. As determinações de duplicata variaram em menos de 1 %. O crescimento da cultura também foi monitorado por meio de leituras de densidade ótica em um comprimento de onda de 660 nm em um espectrofotômetro ®

Novaspec II.

Análise de gás [101] O gás de escape foi resfriado em um condensador (2 °C) e seco com uma secadora Permapure do tipo MD-11048P-4 (Permapure, Toms River, USA) . As concentrações de oxigênio e dióxido de carbono foram determinadas com um analisador NGA 2000 (Rosemount Analytical, Orrville, USA) . A vazão do gás de escape e as taxas de produção de dióxido de carbono foram determinadas da maneira descrita previamente (3). No cálculo destas taxas específicas de biomassa, uma correção foi feita para mudanças de volume causadas pela remoção de amostras de cultura.

Análise de metabólito [102] O sobrenadante obtido por centrifugação de amostras de cultura foi analisado com relação à glicose, ácido acético, ácido succínico, ácido lático, glicerol e etanol, por meio de análise HPLC em um aparelho de HPLC Waters Alliance 2690 (Waters, Milford, USA) contendo uma coluna Biorad HPX 87H (Biorad, Hercules, USA). A coluna foi

47/54 eluída a 60 °C com 0,5 g L^-1 de H₂SO₄ em uma vazão de 0,6 mL min^-1. A detecção foi por meio de um detector de índice refrativo Waters 2410 e um detector de UV Waters 2487. As concentrações determinadas determinação glicerol foram um estojo de AG, Darmstadt, inicial e final de adicionalmente usando enzimática (R-Biopharm

Alemanha). Durante o cultivo em biorreatores que é dispersado com gás nitrogênio, uma fração significativa do etanol é perdida por meio do gás de exaustão. Para corrigir isto, a cinética de evaporação do etanol foi analisada em biorreatores operados em condições idênticas, em diferentes volumes de funcionamento com meio sintético estéril. As constantes de evaporação de etanol dependentes do volume resultante (para isto, configuração igual a 0,0080 dividido pelo volume em litros, expresso em h^-1) foram usadas para corrigir as medições de HPLC das concentrações de etanol nos sobrenadantes da cultura, levando-se em consideração as mudanças em volume que foram causadas por amostragem.

Ensaios de atividade de enzima [103] Os extratos celulares para ensaios de atividade de acetaldeído desidrogenase (acetilante) dependente de NAD⁺ foram preparados a partir de cultivos de crescimento exponencial em condições anaeróbias, da maneira previamente descrita (Abbott et al., Appl. Environ. Microbiol. 75:23202325). A atividade de acetaldeído desidrogenase (acetilante) dependente de NAD+ foi medida a 30 °C monitorando a oxidação de NADH a 340 nm. A mistura de reação (volume total 1 mL) continha tampão de fosfato de potássio 50 mM (pH 7,5), NADH 15 mM e extrato celular. A

48/54 reação iniciou por adição de acetil-Coenzima A 0,5 mM. Para a determinação da atividade de glicerol 3-fosfato desidrogenase (EC 1.1.1.8), os extratos celulares foram preparados da maneira descrita anteriormente, com a exceção de que o tampão fosfato foi substituído pelo tampão trietanolamina (10 mM, pH 5) (5,19). As atividades de glicerol-3-fosfato desidrogenase foram ensaiadas em extratos celulares a 30 °C, da maneira descrita previamente (Blomberg e Adler (1989), J. Bacteriol. 171:1087-1092. As taxas de reação foram proporcionais às quantidades de extrato celular adicionado. As concentrações de proteína foram determinadas pelo método Lowry (Lowry et al (1951) J. Biol. Chem. 193:265-275) usando albumina sérica bovina como um padrão.

Resultados

Crescimento e formação de produto em culturas anaeróbias em lotes [104] Quando as culturas da cepa prototrófica de S. cerevisiae IME076 (GPD1 GPD2) foram suplementadas com 2,0 g L^-1 de ácido acético, a taxa de crescimento específico (0,32 h^-1) foi idêntica àquela relatada para o crescimento de culturas na ausência de ácido acético (0,34 h^-1), Kuyper et al. (2005) FEMS Yeast Res. 5:399-409. A adição de ácido acético levou a uma pequena diminuição do rendimento da biomassa e, consequentemente, uma diminuição do rendimento de glicerol na glicose com relação às culturas crescidas na ausência de ácido acético (Figura 2, Tabela 3).

[105] Este efeito foi atribuído à maior taxa de dissimilação de glicose para a homeostase do pH

49/54 intracelular, em virtude da difusão de ácido acético na célula, o que por sua vez resulta em um menor rendimento da biomassa em glicose. Nas mesmas condições, uma cepa isogênica gpd1A gpd2A, na qual a ausência da atividade de glicerol-3-fosfato desidrogenase dependente de NAD+ foi confirmada em extratos celulares (Tabela 2), foi completamente incapaz de crescer anaerobicamente (Figura 2), consistente com a noção de que a produção de glicerol por meio de Gpd1 e Gpd2 é essencial para a reoxidação de NADH em culturas anaeróbicas de S. cerevisiae.

Tabela 3. Fisiologia da cepa de S. cerevisiae IMZ132 geneticamente modificada e da cepa de referência de vetor vazio IME076, durante o cultivo anaeróbico em lotes em meio sintético (pH 5) com misturas de glicose-acetato.

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Cepa de levedura	IME076	IMZ132
Genótipo relevante	GPD1 GPD2	gpdlA gpd2A + mhpF
Glicerol 3-fosfato
desidrogenase (pmol	mg	0,034 ±	0,003	< 0,002
proteína^-1 min^-1)
Acetaldeído desidrogenase
(acetilante)		< 0,002	0,020 ± 0,004
(pmol mg proteína^-1 min^-1	)
Taxa de crescimento específico (h^-1)	0,32 ±	0,01	0,14 ± 0,01
Rendimento da biomassa glicose (g g^-1)	em	0,083 ±	0,000	0,082 ± 0,009
Rendimento da biomassa acetato (g g^-1)	em	n,a	^,	3,8 ± 0,5
Rendimento de glicerol glicose (g g^-1)	em	0,073 ±	0,007	< 0,002
Rendimento de etanol	em
glicose (g g^-1) Não correlacionado evaporação	com	0,39 ±	0,01	0,43 ± 0,01
Rendimento de etanol	em
glicose (g g^-1) Correlacionado evaporação	com	0,41 ±	0,01	0,47 ± 0,01

n.a., não aplicável.

[106] A expressão do gene mhpF de E. coli em uma cepa gpdlA gpd2A, resultando em taxas dependentes de acetil-CoA da redução do NADH em extratos celulares de 0,020 pmol min¹ (mg de proteína)^-1 (Tabela 3), não possibilitou o

51/54 crescimento anaeróbico quando a glicose foi a única fonte de carbono. Entretanto, quando o meio foi suplementado com 2,0 g L^-1 de ácido acético, o crescimento exponencial foi observado em uma taxa de crescimento específico de 0,14 h¹. Nenhuma formação de glicerol ocorreu durante o cultivo. (Figura 2, Tabela 3). As quantidades traço (<1 mM) de glicerol presente em culturas das cepas gpd1A gpd2A originam-se do inoculo de culturas que iniciou a partir dos estoques de glicerol congelado. O etanol foi o principal produto orgânico e as pequenas quantidades de succinato e lactato produzidas foram similares àquelas observadas em culturas da cepa de referência crescida nas mesmas condições (dados não mostrados).

[107] Observa-se que as fermentações de IMZ 132 (40 horas) demoraram mais que as da cepa tipo selvagem (15 h) e as culturas anaeróbias em lotes foram dispersadas com gás nitrogênio. Dessa maneira, a fração de etanol perdida por meio de evaporação foi maior para a cepa IMZ 132. Após a determinação da cinética de evaporação de etanol em experimentos controle estéril e da correção dos rendimentos de etanol, um rendimento de etanol de 13 % aparentemente maior em glicose foi mostrado para a cepa geneticamente modificada de acordo com a invenção, usando a via linear par a redução dependente de NADH de ácido acético em etanol (Tabela 3).

Discussão [108] O presente estudo fornece uma prova do princípio que, estequiometricamente, o papel do glicerol como uma dissipação do potencial redox no crescimento

52/54 anaeróbico de S. cerevisiae pode ser completamente substituído por uma via linear para a redução dependente de NADH de acetato em etanol. Isto oferece perspectivas interessantes para a produção em grande escala de etanol a partir de matérias primas que contêm o ácido acético, tais como hidrolisados lignocelulósicos.

[109] Além de reduzir o teor de carbono orgânico dos meios exauridos e aumentar o rendimento de etanol, a redução de ácido acético em etanol pode facilitar pelo menos parcialmente a inibição de acetato no crescimento e metabolismo de leveduras, o que é especialmente problemático em pH baixo, e durante o consumo de açúcares pentoses por cepas de levedura geneticamente modificadas.

EXEMPLO 2:

[110] Este exemplo diz respeito à produção fermentativa de etanol sem glicerol por uma cepa gpd1A gpd2A de Saccharomyces. cerevisiae, que expressa uma versão otimizada do códon (SEQ ID NO: 28) do gene tipo selvagem dmpF de Pseudomonas sp. CF600 (GenBank No: CAA43226) (Shingler et al. (1992) J. Bacteriol. 174:71 1-24) .

[111] Com este propósito, os mesmo procedimentos e técnicas usados para a construção e avaliação do desempenho da cepa IMZ132 (gpd1Agpd2A mhpF) foram usados. Estes procedimentos e técnicas são descritos na seção de materiais e métodos do exemplo 1. Neste trabalho, a transformação da cepa IMZ008 (gpd1Agpd2Aura3A) com o plasmídeo de expressão pUDE47 dmpf que carrega URA3 rendeu a cepa prototrófica IMZ130 que expressa dmpF. Para a construção do plasmídeo pUDE47, uma cópia otimizada do

53/54 códon do gene dmpF (número de acesso EMBL X60835.1) de Pseudomonas sp. CF600 foi ligada no plasmídeo p426_GPD. A otimização do códon para a expressão em S. cerevisiae e a ligação no plasmídeo p426_GPD foram realizadas por BaseClear BV (Leiden, Holanda). A inserção satisfatória do plasmídeo pUDE47 multicópias foi confirmada usando o diagnóstico de PCR de colônia, que usa os pares de oligonucleotídeo iniciador dmpF-sentido (CATTGATTGCGCCATACG) e dmpF-reverso (CCGGTAATATCGGAACAGAC).

Resultados

Crescimento e formação de produto em culturas anaeróbias em lotes [112] A expressão do gene dmpF de Pseudomonas sp. CF6 00 em uma cepa gpd1A gpd2A de S. cerevisiae forneceu resultados similares aos obtidos para a expressão do gene mhpF de E. coli na mesma cepa. Nas fermentações anaeróbicas em lotes, similar à cepa IMZ132 (gpd1A gpd2A mhpF), a expressão funcional do gene dmpF junto com a suplementação do meio com 2,0 g L^-1 de ácido acético, resultou em crescimento exponencial com uma taxa de crescimento específica de 0,11 h^-1 (Figura 1) . A cepa IMZ130 (gpd1A gpd2A dmpF) apresentou um tempo de processamento em série um pouco maior (55 h) que a cepa IMZ132 (40 h). Durante o cultivo, a concentração inicial de 20 g L^-1 de glicose foi completamente consumida, enquanto nenhuma formação de glicerol foi observada. Ao mesmo tempo, o acetato foi consumido a partir da concentração inicial de 2,1 g L^-1 até a concentração final de 1,6 g L^-1. O etanol foi o principal produto orgânico, exibindo um rendimento de etanol em

54/54 glicose de 0,48 g g^-1 (rendimento corrigido por evaporação de etanol). Pequenas quantidades de succinato e lactato foram produzidas, similares àquelas observadas em culturas da cepa de referência crescida nas mesmas condições.

A figura 3 mostra o percentual volumétrico de CO₂ presente no escoamento de uma fermentação em lotes inoculado com a cepa IMZ130 (gpd1A gpd2A dmpF). O gráfico é apresentado em uma escala logarítmica no eixo y, a fim de demonstrar o crescimento exponencial e calcular a taxa de crescimento específica máxima.

[113] A inserção de uma cópia otimizada de códon sintético do gene dmpF de Pseudomonas sp. CF600 fornece um outro exemplo que é estequiometricamente possível para substituir a formação de glicerol como uma dissipação do potencial redox no crescimento anaeróbico de S. cerevisiae, por uma via metabólica linear para a redução dependente de NADH de acetato em etanol. Igualmente, este exemplo mostra que a inserção de acetaldeído desidrogenase (acetilante) em uma cepa gpd1A gpd2A de S. cerevisiae resultou em maiores rendimentos de etanol em glicose, nenhuma formação de subproduto de glicerol, e no consumo do composto de acetato inibidor de fermentação.

1/2

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Células de levedura transgênica, caracterizadas pelo fato de que compreendem uma ou mais sequências de ácido nucleico recombinantes heterólogas que codificam uma proteína que possui atividade de acetaldeído acetilante desidrogenase dependente de NAD+ (EC 1.2.1.10), em que as referidas células não possuem atividade enzimática necessária para síntese de glicerol dependente de NADH, ou as referidas células possuem atividade enzimática reduzida em relação a síntese de glicerol dependente de NADH comparada com uma célula de levedura do tipo selvagem correspondente, e em que as referidas células são livres de atividade de glicerol 3 fosfato desidrogenase dependente de NAD ou possuem reduzida atividade de glicerol 3 fosfato desidrogenase dependente de NAD comparada com as células do tipo selvagem correspondentes, e/ou em que as células são livres de atividade de glicerol fosfato fosfatase ou possuem reduzida atividade glicerol fosfato fosfatase comparada com as células do tipo selvagem correspondentes, e que compreendem uma mutação genômica em pelo menos um gene selecionado do grupo consistindo em GPD1, GPD2, GPP1 e GPP2, e em que as referidas células compreendem ainda uma ou mais sequências de ácido nucleico codificando uma atividade de acetil-coenzima A sintetase (EC 6.2.1.1) e uma ou mais sequências de ácido nucleico codificando atividade de desidrogenase alcoólica dependente de NAD+ (EC 1.1.1.1), e

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2/2 em que as referidas células são da cepa de Saccharomyces cerevisiae.

2. Células de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que as células estão livres de genes codificando 3-fosfato glicerol desidrogenases dependentes de NAD+ (EC 1.1.1.8).
3. Método para preparar etanol a partir de acetato e um carboidrato fermentável, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar as células de levedura como definidas na reivindicação 1 sob condições anaeróbicas.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o referido cultivo é realizado em um meio fermentativo compreendendo o acetato e o carboidrato em uma fração molar de 0,7 ou menos.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que pelo menos parte do carboidrato e pelo menos parte do acetato foi obtido por hidrólise de um polissacarídeo selecionado do grupo de lignoceluloses, celuloses, hemiceluloses, e pectinas.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a biomassa lignocelulósica foi hidrolisada de forma a obter o carboidrato fermentável e acetato.
7. Células de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que pelo menos uma da referida mutação é uma deleção completa do referido gene em comparação com o gene de levedura correspondente do tipo selvagem.
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Flanco GDP1 5’ Flanco GDP1 3

3’ GPD1 ΚΑΝΑ

2/4 glicose; etanol (g Γ^Ί) OD₆₆₀ glicose; etanol (g I ); OD₆₆₀