CN114302958A - 用于增加发酵联产物中赖氨酸含量的经修饰的酵母和方法 - Google Patents
用于增加发酵联产物中赖氨酸含量的经修饰的酵母和方法 Download PDFInfo
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Abstract
描述的是菌株和方法,所述菌株和方法涉及基因工程化的酵母细胞,其以可调的方式,通过经由LYS20和LYS21高柠檬酸合酶多肽改变赖氨酸合成途径的反馈抑制来过量生产赖氨酸。所述酵母可以在常规生物乙醇生产设施中使用以生产醇以及增加量的赖氨酸,从而提高发酵产物和联产物如动物饲料成分的质量和商业价值。
Description
技术领域
本发明的菌株和方法涉及基因工程化的酵母细胞,其以可调的方式,通过经由LYS20和LYS21高柠檬酸合酶多肽改变赖氨酸合成途径的反馈抑制来过量生产赖氨酸。所述酵母可以在常规生物乙醇生产设施中使用以生产醇以及增加量的赖氨酸,从而提高发酵产物和联产物(如动物饲料成分)的质量和商业价值。
背景技术
许多国家从可发酵的底物(例如玉米淀粉、甘蔗、木薯和糖蜜)制造燃料醇。根据可再生燃料协会(美国华盛顿特区),仅仅在美国,2015年的燃料乙醇生产就接近150亿加仑。
除了生产约2.8加仑乙醇外,在干磨乙醇工厂加工的一蒲式耳(56磅)玉米还生产约17.5磅的动物饲料。动物饲料通常呈具溶解物的干酒糟(distillers dried grainswith solute,DDGS)的形式,并且代表耗尽淀粉的玉米部分加上用于发酵的酵母的生物质。按单位重量,DDGS对动物比未加工玉米更有营养,因为它更富含蛋白质和脂肪。除了DDGS,干磨乙醇工厂还能够生产用于动物饲料应用的其他富含蛋白质的玉米联产物。
赖氨酸是大多数动物的必需氨基酸,如果不能在DDGS中足量供应赖氨酸以满足饲料转化预期,则必须补充赖氨酸。合成的赖氨酸昂贵,并且可意味着动物饲料的一个重要成本。存在对改善或维持从含淀粉原料生产醇同时提高动物饲料联产物的营养价值的方法的需要。
发明内容
描述的是组合物和方法,所述组合物和方法涉及具有遗传突变的酵母细胞,所述遗传突变增加了酵母中的赖氨酸生产,使得乙醇发酵产物和联产物具有增加的营养价值。所述组合物和方法的方面和实施例描述于以下独立编号的段落中。
1.在一方面,提供了非天然存在的变体高柠檬酸合酶多肽,其与SEQ ID NO:1具有至少80%氨基酸序列同一性,并且包含一个或多个选自由以下组成的组的相对于SEQ IDNO:1的突变:F36Y、N38K、N289D R349K、Q352E、V375D、R376T和I380M,其中与缺乏所述一个或多个突变的在其他方面相同的高柠檬酸合酶多肽相比,所述变体高柠檬酸合酶多肽表现出降低的赖氨酸抑制。
2.在如段落1所述的非天然存在的变体高柠檬酸合酶多肽的一些实施例中,所述一个或多个突变是F36Y和N38K。
3.在相关方面,提供了一种非天然存在的变体高柠檬酸合酶多肽,其与SEQ IDNO:2具有至少80%氨基酸序列同一性,并且包含一个或多个选自由以下组成的组的相对于SEQ ID NO:2的突变:N52D、D125N、R289I、N303D和N393D,其中与缺乏所述一个或多个突变的在其他方面相同的高柠檬酸合酶多肽相比,所述变体高柠檬酸合酶多肽表现出降低的赖氨酸抑制。
4.在另一方面,提供了一种酵母细胞,所述酵母细胞生产如段落1-3中任一项所述的变体高柠檬酸合酶多肽。
5.在如段落4所述的酵母细胞的一些实施例中,所述细胞属于酵母属(Saccharomyces)物种。
6.在如段落4或5所述的酵母细胞的一些实施例中,所述细胞进一步包含磷酸转酮酶途径的一个或多个基因。
7.在如段落6所述的酵母细胞的一些实施例中,所述磷酸转酮酶途径的基因选自由以下组成的组:磷酸转酮酶、磷酸转乙酰酶、和乙酰化乙酰基脱氢酶。
8.在如段落4-7中任一项所述的酵母细胞的一些实施例中,所述细胞进一步包含编码碳水化合物加工酶的外源基因。
9.在一些实施例中,如段落4-8中任一项所述的酵母细胞进一步包含在甘油途径和/或乙酰辅酶A途径中的改变。
10.在一些实施例中,如段落4-9中任一项所述的酵母细胞进一步包含用于制备乙醇的替代途径(alternative pathway)。
11.在另一方面,提供了一种用于增加来自乙醇生产设施的发酵后产物中存在的赖氨酸的量的方法,所述方法包括:(i)用α-淀粉酶水解含淀粉原料以生产淀粉液化物;(ii)用葡糖淀粉酶糖化所述淀粉液化物以生产葡萄糖;(iii)用衍生自亲本酵母细胞的经修饰的酵母细胞发酵所述葡萄糖,所述经修饰的酵母细胞包含遗传改变,所述遗传改变降低了如通过赖氨酸生产途径中的高柠檬酸合酶多肽所介导的赖氨酸生产途径的反馈抑制;以及(iv)回收相比从使用所述亲本酵母、在其他方面相同的工艺中回收的发酵后副产物富集了赖氨酸的发酵后副产物。
12.在如段落11所述的方法的一些实施例中,所述发酵后产物选自由以下组成的组:发酵液、全釜馏物、稀釜馏物、干酒糟、具溶解物的干酒糟、浓缩酒糟可溶物或其他含蛋白质联产物。
13.在如段落11或12所述的方法的一些实施例中,以同时或重叠的方式组合一个或多个步骤(i)-(iv)。
14.在另一方面,提供了用于增加发酵产物中存在的赖氨酸的量的方法,所述方法包括:(i)用衍生自亲本酵母细胞的经修饰的酵母细胞发酵葡萄糖或另一种糖,所述经修饰的酵母细胞包含遗传改变,所述遗传改变降低了如通过赖氨酸生产途径中的高柠檬酸合酶多肽所介导的赖氨酸生产途径的反馈抑制;以及(ii)回收相比从使用所述亲本酵母、在其他方面相同的工艺中回收的发酵产物富集了赖氨酸的发酵产物。
15.在如段落11-14中任一项所述的方法的一些实施例中,在所述亲本酵母细胞或常规酵母细胞的进一步存在下,进行用所述经修饰的酵母细胞发酵所述葡萄糖。
16.在如段落15所述的方法的一些实施例中,通过在不同时间将所述经修饰的酵母细胞和亲本或常规酵母细胞添加至发酵罐,进行在所述亲本酵母细胞或常规酵母细胞的进一步存在下用所述经修饰的酵母细胞发酵所述葡萄糖。
17.在如段落11-16中任一项所述的方法的一些实施例中,所述高柠檬酸合酶多肽是LYS20和/或LYS21。
18.在如段落17所述的方法的一些实施例中,与其他方面相同的酵母相比,所述经修饰的酵母生产了改变量的LYS20和/或LYS21多肽。
19.在如段落17所述的方法的一些实施例中,与其他方面相同的酵母相比,所述经修饰的酵母生产了变体LYS20和/或LYS21多肽。
20.在如段落11-19中任一项的方法的一些实施例中,所述经修饰的酵母是如段落1-10中任一项所述的酵母。
21.在另一方面,提供了发酵后产物,其通过如段落11-20中任一项所述的方法生产。
22.在另一方面,提供了组合物或方法,所述组合物或方法具有如段落1-22所述的特征或说明书中所提及的特征中的任一个。
根据包括任何附图的说明书,本发明的经修饰的细胞和方法的这些和其他方面以及实施例将是清楚的。
具体实施方式
I.概述
描述的是方法,所述方法涉及具有遗传突变的酵母,所述遗传突变经由LYS20和LYS21高柠檬酸合酶多肽降低了赖氨酸合成途径中的反馈抑制的量。所述酵母可以在常规生物乙醇生产设施中使用以生产醇以及增加量的赖氨酸,从而提高发酵产物和联产物(如动物饲料成分)的质量和商业价值。
II.定义
在详细地描述本发明的菌株和方法之前,为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语应当符合这些术语在相关领域中所用的普通含义。
如本文所使用的,“醇”是指其中羟基官能团(-OH)与饱和碳原子结合的有机化合物。
如本文所使用的,短语“聚合度”(DP)是指给定的糖中脱水吡喃葡萄糖单元的数目(n)。DP1的实例是单糖葡萄糖和果糖。DP2的实例是二糖麦芽糖和蔗糖。DP1、DP12、DP3、DP4、DP4+等的意思在碳水化合物加工科学中是熟知的。
如本文所使用的,“酵母细胞”“酵母菌株”或简称“酵母”是指来自子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)的生物。示例性酵母是来自酵母目(Saccharomycetales)的芽殖酵母。酵母的特定实例是酵母属物种,包括但不限于酿酒酵母(S.cerevisiae)。酵母包括用于生产燃料醇的生物以及用于生产可饮用醇的生物,包括用于制造独特味道的啤酒、葡萄酒和其他发酵饮料的特种和专有酵母菌株。
如本文所使用的,短语“变体酵母细胞”、“经修饰的酵母细胞”或类似短语(参见上文)是指包括本文所述的遗传修饰和特征的酵母。变体/经修饰的酵母不包括天然存在的酵母。
如本文所使用的,短语“基本上无活性”或相似短语意指指定活性在混合物中不可检测或以不会干扰混合物的预期目的的量存在。
如本文所使用的,术语“多肽”和“蛋白质”(和/或它们各自的复数形式)可互换地使用,来指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文使用氨基酸残基的常规一字母或三字母代码,并且所有序列均从N-末端到C-末端方向进行呈现。聚合物可以是线性的或支化的,它可以包含修饰的氨基酸,并且它可以被非氨基酸中断。所述术语还涵盖天然地修饰的或通过干预(例如,通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰,如与标记组分缀合)而修饰的氨基酸聚合物。所述定义内还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。
如本文所使用的,功能上和/或结构上类似的蛋白质被认为是“相关的蛋白质”。此类蛋白质可衍生自不同属和/或物种的生物、或甚至不同纲的生物(例如,细菌和真菌)。相关的蛋白质还涵盖通过一级序列分析确定的、通过二级或三级结构分析确定的、或者通过免疫交叉反应性确定的同源物。
如本文所使用的,术语“同源蛋白”是指与参考蛋白具有相似活性和/或结构的蛋白质。这并不旨在意味着同源物必定是进化上相关的。因此,所述术语旨在涵盖从不同生物获得的(即,在结构和功能方面)相同、相似、或相应的一种或多种酶。在一些实施例中,希望鉴定与参考蛋白具有类似的四级、三级和/或一级结构的同源物。在一些实施例中,同源蛋白作为参考蛋白诱导相似的一种或多种免疫应答。在一些实施例中,同源蛋白经过工程化以产生具有一种或多种所希望的活性的酶。
序列之间的同源性程度可以使用本领域已知的任何合适的方法确定(参见,例如,Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482;Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],48:443;Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444;威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)(遗传学计算机组公司(Genetics ComputerGroup),威斯康星州麦迪逊)中的程序,如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA;以及Devereux等人(1984)Nucleic Acids Res.[核酸研究]12:387-95)。
例如,PILEUP是确定序列同源性水平的有用程序。PILEUP使用渐进的、两两比对创建了来自一组相关序列的多重序列比对。它还可以绘制显示用于创建所述比对的聚类关系的一个树。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进比对方法的简化(Feng和Doolittle(1987)J.Mol.Evol.[分子进化杂志]35:351-60)。所述方法类似于Higgins和Sharp描述的方法((1989)CABIOS[计算机在生物学中的应用]5:151-53)。有用的PILEUP参数包括为3.00的默认空位权重,为0.10的默认空位长度权重,以及加权的末端空位。有用算法的另一个实例是BLAST算法,由以下描述:Altschul等人((1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-10)以及Karlin等人((1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5873-87)。一个特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参见,例如,Altschul等人(1996)Meth.Enzymol.[酶学方法]266:460-80)。参数“W”、“T”、以及“X”确定了所述比对的灵敏度与速度。所述BLAST程序使用字长(W)为11、BLOSUM62得分矩阵(参见,例如,Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915)比对(B)为50、期望值(E)为10、M'5、N'-4、以及两条链的比较作为默认值。
如本文所使用的,在至少两个核酸或多肽的上下文中,短语“基本上相似”和“基本上相同”典型地意指多核苷酸或多肽包含与参考(即,野生型)序列相比具有至少约70%同一性、至少约75%同一性、至少约80%同一性、至少约85%同一性、至少约90%同一性、至少约91%同一性、至少约92%同一性、至少约93%同一性、至少约94%同一性、至少约95%同一性、至少约96%同一性、至少约97%同一性、至少约98%同一性、或甚至至少约99%同一性、或更高同一性的序列。使用具有默认参数的CLUSTAL W算法计算序列同一性百分比。参见Thompson等人(1994)Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680。CLUSTAL W算法的默认参数是:
两种多肽基本上相同的另一个指示是第一多肽与第二多肽具有免疫交叉反应性。典型地,差别在于保守氨基酸取代的多肽具有免疫交叉反应性。因此,多肽与第二多肽基本上相同,例如,其中两个肽的区别仅在于保守取代。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子在严格条件下(例如,在中等至高严格的范围内)彼此杂交。
如本文所使用的,术语“基因”与术语“等位基因”同义,是指编码和指导蛋白或RNA表达的核酸。丝状真菌的营养体形式通常是单倍体,因此指定基因的单拷贝(即单个等位基因)足以赋予指定表型。
如本文所使用的,术语“野生型”和“天然的”可互换使用,并是指天然发现的基因、蛋白质或菌株。
如本文所使用的,术语“目的蛋白”是指希望在经修饰的酵母中表达的多肽。这样的蛋白质可以是酶、底物结合蛋白、表面活性蛋白、结构蛋白、选择性标记等,并且能以高水平表达。目的蛋白由相对于亲本菌株的经修饰的内源基因或异源基因(即,目的基因)编码。目的蛋白可以在细胞内表达或作为分泌的蛋白表达。
如本文所使用的,“基因的缺失”是指所述基因从宿主细胞的基因组中除去。当基因包括与基因编码序列不紧邻的控制元件(例如,增强子元件)时,基因的缺失是指编码序列、以及任选地相邻增强子元件(例如,包括但不限于启动子和/或终止子序列)的缺失,但未要求非相邻控制元件的缺失。
如本文所使用的,“基因的破坏”泛指任何实质上阻止细胞在宿主细胞中生产功能性基因产物(例如,蛋白质)的遗传的或化学的操作(即,突变)。示例性破坏方法包括基因的任何部分的完全或部分(包括多肽编码序列、启动子、增强子或另一调节元件)缺失、或其诱变,其中诱变涵盖取代、插入、缺失、倒位、及其组合和变化,任何这些突变基本上阻止功能基因产物的产生。也可以使用RNAi、反义、或任何其他消除基因表达的方法破坏基因。可以通过非相邻控制元件的缺失或遗传操作来破坏基因。
如本文所使用的,术语“遗传操作”和“遗传改变”可互换地使用,并且是指核酸序列的改变/变化。改变可包括但不限于核酸序列中至少一种核酸的取代、缺失、插入或化学修饰。
如本文所使用的,“主要遗传决定子”是指基因或其遗传操作,所述基因或其遗传操作对于在不存在其他基因或其遗传操作的情况下赋予特定表型是必要和充分的。然而,特定基因对于赋予特定表型是必要和充分的,这并不排除通过进一步的遗传操作可以实现对表型产生额外的作用的可能性。
如本文所使用的,“功能性多肽/蛋白”是具有活性(例如酶活性、结合活性、表面活性特性等)的蛋白质,并且其未被诱变、截短、或以其他方式修饰以消除或减少此活性。如所指出的,功能性多肽可以是热稳定的或不耐热的。
如本文所使用的,“功能性基因”是能够被细胞组分用于产生活性基因产物(典型地是蛋白质)的基因。功能性基因是破坏的基因的对立体,破坏的基因被修饰使得它们不能被细胞组分用于产生活性基因产物,或者具有降低的被细胞组分用于产生活性基因产物的能力。
如本文所使用的,如果已对酵母细胞进行遗传或化学改变以阻止产生呈现出野生型蛋白质的活性特征的功能性蛋白/多肽,则对所述酵母细胞已经进行了“修饰以阻止产生指定蛋白”。这样的修饰包括但不限于编码蛋白质(如本文所述)的基因的缺失或破坏、使得编码的多肽缺乏前述活性的基因修饰、影响翻译后加工或稳定性的基因修饰、及其组合。
如本文所使用的,“发酵液”是用酵母发酵后但蒸馏前的乙醇生产设施的产物。
如本文所使用的,“全釜馏物”是蒸馏后乙醇生产设施的副产物。
如本文所使用的,“稀釜馏物”是分离固体材料后全釜馏物的液体部分。
如本文所使用的,“酒糟(DG)”是全釜馏物的固体/浆料组分。
如本文所使用的,“干酒糟(DDG)是已干燥的DG。
如本文所使用的,“具溶解物的干酒糟(DDGS)”是与浓缩的稀釜馏物一起进行干燥以增加营养价值的DG。
如本文所使用的,“湿的”蒸馏副产物含有按重量计至少20%的水。
如本文所使用的,“干的”蒸馏副产物含有按重量计少于20%的水。
如本文所使用的,“需氧发酵”是指在氧气存在下生长。
如本文所使用的,“厌氧发酵”是指在不存在氧的情况下的生长。
如本文所使用的,除非上下文另外明确指明,否则单数冠词“一个/种(a/an)”以及“所述”涵盖复数个指示物。本文引用的所有参考文献均通过援引以其全文特此并入。除非另外说明,以下缩写/首字母缩略词具有以下含义:
℃ 摄氏度
DG 酒糟
DDG 干酒糟
DDGS 具溶解物的干酒糟
DNA 脱氧核糖核酸
DP 聚合度
DS 干固体
EtOH 乙醇
g或gm 克
g/L 克/升
GA 葡糖淀粉酶
GAU/g DS 葡糖淀粉酶单元/克干固体
HPLC 高效液相色谱
hr或h 小时
kDa 千道尔顿
M 摩尔
mg 毫克
mL或ml 毫升
ml/min 毫升/分钟
mM 毫摩尔
N 当量浓度
na 不适用
PCR 聚合酶链式反应
ppm 百万分率
SAPU/g DS 蛋白酶单元/克干固体
SSCU/g DS 真菌α-淀粉酶单元/克干固体
Δ 与缺失有关
μg 微克
μL和μl 微升
μM和μm 微摩尔
AEC 氨乙基半胱氨酸
III.具有赖氨酸生物合成途径的降低的反馈抑制的酵母细胞
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和其他酵母中的赖氨酸生物合成途径的特征在于通过赖氨酸与两种核高柠檬酸合酶同工酶(称为LYS20和LYS21)的相互作用进行的产物反馈抑制。同种型以不同的敏感性响应赖氨酸。已经描述了具有LYS20和LYS21氨基酸序列中的改变的突变酵母,其导致对赖氨酸反馈的敏感性降低(Feller等人(1999)Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]261:163-170)。
本发明的组合物和方法是基于如下发现:对赖氨酸反馈抑制脱敏的酵母代表了显著改善商业乙醇生产设施生产的动物饲料联产物质量的有效方式。实质上增加例如具溶解物的干酒糟(DDGS)中赖氨酸的量的能力意味着需要较少的合成赖氨酸来补充动物饲料产品,从而为牧场主和农民节省大量成本。
描述的是LYS20和LYS21中的突变,所述突变导致酵母中游离赖氨酸含量增加高达350倍以上,可以预期在动物饲料联产物(如发酵液、全釜馏物、稀釜馏物、干酒糟、具溶解物的干酒糟、浓缩酒糟可溶物或其他含蛋白质联产物)中生产增加高达100倍的赖氨酸。
在一些实施例中,通过过表达LYS20和LYS21,使得细胞不能生产足量的赖氨酸来抑制细胞核中所有的LYS20和LYS21,实现对赖氨酸反馈抑制的脱敏。在优选实施例中,对酵母进行修饰以生产变体LYS20和LYS21多肽。如本文所述,通过选择仅允许几倍赖氨酸过量生产或几百倍过量生产的特定变体LYS20和LYS21变体,可以针对特定应用选择变体多肽来调整或“调节”赖氨酸过量生产。
预期赖氨酸过量生产将与醇生产竞争,因此选择使多少碳转向赖氨酸的能力对商业醇生产商是重要的。使用本发明的酵母,生产商只需在发酵罐中分批添加不同的酵母就可以选择使多少碳直接导向赖氨酸。生产商也可以选择在不同时间或以不同比例将本发明的酵母和更常规的酵母添加至发酵罐中,以进一步微调醇和赖氨酸的生产。
在本发明的组合物和方法的一些实施例中,所述酵母生产了变体LYS20多肽,其与SEQ ID NO:1的氨基酸具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、但小于100%并且包含一个或多个选自由以下组成的组的相对于SEQ ID NO:1的突变:F36Y、N38K、N289D R349K、Q352E、V375D、R376T和I380M。在特定实施例中,所述突变是F36Y和N38K。在本发明的组合物和方法的一些实施例中,所述酵母生产了变体LYS20多肽,其与SEQ ID NO:2的氨基酸具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、但小于100%并且包含一个或多个选自由以下组成的组的相对于SEQ IDNO:2的突变:N52D、D125N、R289I、N303D和N393D。
在一些实施例中,所述经修饰的细胞包含增加赖氨酸生产的其他基因或其他修饰。
IV.降低的赖氨酸反馈抑制和有利于醇生产的突变的组合
在一些实施例中,除了具有经由LYS20和/或LYS21降低赖氨酸生物合成途径中的反馈抑制外,本发明的经修饰的酵母细胞进一步包括有利于醇生产的额外的修饰。
在特定的实施例中,经修饰的酵母细胞包含由引入异源磷酸转酮酶(PKL)基因、异源磷酸转乙酰酶(PTA)基因和异源乙酰化乙酰基脱氢酶(AADH)基因产生的人工或替代乙醇生产途径,如WO 2015148272(Miasnikov等人)中所述,将这些酶引入使通道碳通量远离甘油途径并且朝向乙酰辅酶A的合成,所述乙酰辅酶A然后转化为乙醇。
所述经修饰的细胞可以进一步包括导致天然甘油生物合成途径减弱的突变,已知所述突变可增加醇生产。用于减弱酵母中甘油生物合成途径的方法是已知的,并包括例如通过破坏基因GPD1、GPD2、GPP1和/或GPP2中的一个或多个来降低或消除内源NAD依赖性甘油3-磷酸脱氢酶(GPD)或磷酸甘油磷酸酶(GPP)活性。参见例如美国专利号9,175,270(Elke等人)、8,795,998(Pronk等人)和8,956,851(Argyros等人)。
经修饰的酵母的特征可以进一步在于增加的乙酰辅酶A合酶(也称为乙酰辅酶A连接酶)活性(EC 6.2.1.1)以清除(即捕获)通过化学或酶水解乙酰-磷酸生产(或出于任何其他原因存在于酵母的培养基中)的乙酸盐并将其转化为Ac-CoA。这避免了乙酸盐对酵母细胞生长的不良影响,并且可以进一步有助于醇产量的提高。增加乙酰辅酶A合酶活性可以通过将异源乙酰辅酶A合酶基因引入细胞、增加内源乙酰辅酶A合酶基因的表达等来实现。用于引入细胞中的特别有用的乙酰辅酶A合酶可以从康斯力鬃毛甲烷菌(Methanosaetaconcilii)(UniProt/TrEMBL登录号:WP_013718460)获得。这些酶的同源物,包括与上述来自康斯力鬃毛甲烷菌的乙酰辅酶A合酶具有至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%、以及甚至至少99%氨基酸序列同一性的酶,也可用于本发明的组合物和方法中。
在一些实施例中,经修饰的细胞可进一步包括编码具有NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质的异源基因和/或编码丙酮酸甲酸裂解酶的异源基因。例如,在美国专利号8,795,998(Pronk等人)中描述了与甘油途径减弱进行组合的这样的基因的引入。
在一些实施例中,本发明的经修饰的酵母细胞可以进一步过表达糖转运蛋白样(STL1)多肽(参见,例如,Ferreira等人(2005)Mol Biol Cell[细胞分子生物学]16:2068-76;等人(2015)Mol Microbiol[分子微生物学]97:541-59和WO 2015023989 A1)以增加乙醇生产和减少乙酸盐。
在一些实施例中,本发明的经修饰的酵母细胞可以进一步过表达聚腺苷酸结合蛋白,例如PAB1,从而增加醇生产并且减少乙酸盐生产。
在一些实施例中,本发明的经修饰的酵母细胞进一步包含丁醇生物合成途径。在一些实施例中,所述丁醇生物合成途径是异丁醇生物合成途径。在一些实施例中,所述异丁醇生物合成途径包含编码多肽的多核苷酸,所述多肽催化选自由以下组成的组的底物至产物的转化:(a)丙酮酸盐至乙酰乳酸盐;(b)乙酰乳酸盐至2,3-二羟基异戊酸盐;(c)2,3-二羟基异戊酸盐至2-酮异戊酸盐;(d)2-酮异戊酸盐至异丁醛;和(e)异丁醛至异丁醇。在一些实施例中,所述异丁醇生物合成途径包含编码具有乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、酮异戊酸脱羧酶、和醇脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。
在一些实施例中,包含丁醇生物合成途径的经修饰的酵母细胞进一步包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸中的修饰。在一些实施例中,酵母细胞在编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源多核苷酸中包含缺失、突变和/或取代。在一些实施例中,具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽选自由以下组成的组:PDC1、PDC5、PDC6、及其组合。在一些实施例中,酵母细胞在编码FRA2、ALD6、ADH1、GPD2、BDH1、和YMR226C的一个或多个内源多核苷酸中进一步包含缺失、突变和/或取代。
V.降低的赖氨酸反馈抑制与其他有益突变的组合
在一些实施例中,除了具有经由LYS20和/或LYS21降低赖氨酸生物合成途径中的反馈抑制之外,任选地与有益于醇生产的基因修饰组合,本发明的经修饰的酵母细胞进一步包括任何数目的编码目的蛋白的额外的目的基因。可以在遗传操作之前、期间或之后引入额外的目的基因,所述遗传操作导致赖氨酸反馈抑制降低或醇生产增加。目的蛋白包括选择性标记、碳水化合物加工酶以及其他商业上相关的多肽,包括但不限于选自由以下组成的组的酶:脱氢酶、转酮醇酶、磷酸转酮酶、转醛醇酶、差向异构酶、植酸酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、磷酸酶、蛋白酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、海藻糖酶、脂肪酶、果胶酶、聚酯酶、角质酶、氧化酶、转移酶、还原酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、酯酶、异构酶、果胶酶、乳糖酶、过氧化物酶和漆酶。目的蛋白可以被分泌、糖基化并以其他方式修饰。
VI.适合修饰的酵母细胞
酵母是被归类为真菌界成员的单细胞真核微生物,并且包括来自子囊菌门和担子菌门的生物。可以用于醇生产的酵母包括但不限于酵母属物种,包括酿酒酵母、以及克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、拉茜斯酵母属(Lachancea)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种。许多酵母菌株是可商购的,其中许多已被选择或基因工程化以获得所需的特征,诸如高乙醇生产、快速生长速率等。许多酵母已被基因工程化以生产异源酶或甚至包括异源途径。据信,任何具有赖氨酸生物合成途径中的LYS20和/或LYS21的同系物的酵母是所述修饰的候选物。
VII.底物和条件
从许多碳水化合物底物(包括但不限于玉米淀粉、甘蔗、木薯和糖蜜)中生产醇是众所周知的,正如酶条件和化学条件以及机械方法的无数变化和改善也是众所周知的。据信本发明的组合物和方法与这样的底物和条件完全相容。
乙醇生产工艺存在多种变化,包括冷蒸煮或无蒸煮,涉及处于糊化温度或低于糊化温度下的液化、同时糖化和发酵、分馏工艺等。预期上述工艺均与本发明的组合物和方法相容。
VIII.发酵产物和联产物
典型的醇发酵产物包括具有与碳原子结合的羟基官能团(-OH)的有机化合物。示例性醇包括但不限于甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇、2-戊醇、异戊醇、和高级醇。最常制备的燃料醇是乙醇和丁醇。
醇生产(特别是干磨乙醇生产)的有价值的副产物(或联产物)是动物饲料产品,通常呈干酒糟(DDG)或更常见的具溶解物的干酒糟(DDGS)的形式。这些动物饲料产品在许多方面比用于乙醇生产的初始原料更有营养,因为其中的碳水化合物消耗殆尽,但富含来自原料和发酵生物(即,产乙醇菌(ethanologen))的氨基酸。
DDGS或其他玉米联产物的特定氨基酸组成对动物饲料的质量十分重要,因为一些氨基酸远比其他氨基酸更重要。赖氨酸是大多数农场动物的必需氨基酸,如果没有通过DDG、DDGS或其他发酵后联产物适当地足量提供,则必须补充赖氨酸以使饲料转化率最大化。合成的赖氨酸昂贵,并且意味着动物饲料的一个重要成本。
因为酵母代表发酵后产物中的重要组分,因此酵母的氨基酸含量显著影响发酵液、全釜馏物、稀釜馏物、干酒糟、具溶解物的干酒糟、浓缩酒糟可溶物或其他含蛋白质的发酵后联产物的氨基酸含量。用本发明的酵母替代常规酵母提高了这样的发酵后产物中赖氨酸的量,从而提高了它们作为动物饲料产品的价值。
使用本发明的经修饰的酵母,可以实现赖氨酸增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍或更多。
鉴于本说明书,本发明的菌株和方法的这些和其他方面以及实施例对于技术人员将是清楚的。以下实例旨在进一步说明但不限制所述菌株和方法。
实例
实例1:通过表达变体LYS20多肽的酵母生产增加的赖氨酸
使用标准分子生物学技术,将易错PCR用于在编码高柠檬酸合酶多肽LYS20的酿酒酵母基因YDL182w中产生数千个随机突变。将所得变体基因文库转化至Gold酵母(玛翠公司(Martrex,Inc.),美国明尼苏达州查斯卡,在本文中为“FG”)中,其是一种熟知的用于燃料乙醇生产的酿酒酵母菌株,其中缺失了编码LYS20的天然基因,从而得到LYS20-FG)。允许转化体在基本生长培养基中作为库竞争,所述基本生长培养基用增加浓度的赖氨酸有毒类似物(氨乙基半胱氨酸;AEC)补充至100mM。选择后,将培养物进行离心以回收活细胞,提取基因组DNA,并且进行PCR以扩增编码变体LYS20多肽的变体基因。使用Illumina平台进行靶基因测序后,使用标准作图工具和突变将测序读数映射到天然序列,并分析其相对频率(参见,例如,Fowler,D.M.和Fields,S.(2014)Nat.Methods[自然方法]11:801-07以及Starita,L.M.和Fields,S.(2015)Cold Spring Harb Protoc.[冷泉港指南]2015:777-80)。
流程是基于YDL182w(LYS20,chr IV:133437..134723)的核酸序列,其如下SEQ IDNO:4所示:
ATGACTGCTGCTAAACCAAATCCATATGCTGCCAAACCGGGCGACTATCTTTCTAATGTAAATAATTTCCAGTTAATCGATTCGACGCTGAGAGAAGGTGAACAATTTGCCAACGCATTCTTCGATACTGAAAAAAAGATCGAAATTGCTAGAGCCTTGGACGATTTCGGTGTGGACTACATCGAGTTAACCTCACCAGTAGCATCTGAACAATCAAGAAAGGACTGTGAAGCTATATGTAAACTAGGTTTAAAGGCCAAGATCCTTACACACATTCGTTGTCATATGGATGACGCCAAAGTCGCCGTAGAGACTGGTGTCGACGGTGTCGATGTCGTTATCGGCACCTCCAAATTTTTAAGACAATATTCCCACGGTAAGGATATGAACTACATCGCCAAGAGTGCTGTTGAAGTCATTGAATTTGTCAAATCCAAAGGTATTGAAATCAGATTTTCCTCTGAAGATTCCTTCAGAAGTGATCTCGTTGATCTTTTGAACATTTATAAAACCGTTGACAAGATCGGTGTAAATAGAGTCGGTATTGCCGACACAGTTGGATGTGCCAACCCAAGACAAGTATATGAACTGATCAGAACTTTGAAGAGTGTTGTTTCATGTGACATCGAATGCCATTTCCACAACGATACTGGTTGTGCCATCGCAAACGCCTACACTGCTTTGGAAGGTGGTGCCAGATTGATTGACGTCAGTGTACTGGGTATTGGTGAAAGAAACGGTATCACTCCTCTAGGTGGGCTCATGGCAAGAATGATTGTTGCCGCACCAGACTATGTCAAGTCCAAATACAAGTTGCACAAGATCAGAGACATTGAAAACCTGGTCGCTGATGCTGTGGAAGTTAACATTCCATTCAACAACCCTATCACCGGGTTCTGTGCATTCACACATAAAGCAGGTATCCATGCCAAGGCCATTTTGGCTAACCCATCTACCTACGAAATCTTGGACCCTCACGATTTCGGTATGAAGAGGTATATCCACTTCGCCAACAGACTAACTGGCTGGAACGCCATCAAAGCCAGAGTCGACCAGTTGAACTTGAATTTGACAGATGACCAAATCAAGGAAGTTACTGCTAAGATTAAGAAGCTGGGTGATGTCAGATCGCTGAATATCGATGATGTTGACTCTATCATCAAGAACTTCCACGCAGAGGTCAGCACTCCTCAAGTACTATCTGCAAAAAAGAACAAGAAGAATGACAGCGATGTACCGGAACTGGCCACCATCCCCGCCGCCAAGCGGACTAAGCCATCCGCCTAA
YDL182w编码高柠檬酸合酶多肽LYS20(Genbank登录号NP_010099),如下SEQ IDNO:2所示:
对于初始筛选,探索了40%的突变空间,并确定数据集中每个突变的富集评分(E-评分)变化。表1中总结了最高评分突变,即在存在赖氨酸有毒类似物的情况下能够生长的酵母菌群中最过高占比的突变。未示出E-评分较低的突变。
表1.耐受赖氨酸有毒类似物的高LYS20变体的平均E-评分变化
突变 | 平均E |
N289突变为D、H、I、K、S或T | 2.12 |
Q352突变为E、H、K、L或R | 1.64 |
I380突变为M、N或T | 1.56 |
V375突变为F、G或D | 1.52 |
N38突变为D、H、I、K、T或Y | 1.51 |
R376突变为T、S或I | 1.026 |
将编码八个单一位置变体和一个组合变体的基因单独引入新的LYS20-FG。转化体在含有脯氨酸作为氮源的不良培养基(Gasent-Ramírez,J.M.和Benítez,T.(1997)Appliedand Environmental Microbiology[应用与环境微生物学]63:4800-4806)中生长持续26小时。使用邻苯二甲醛进行衍生化处理和衍生化赖氨酸的测量(通过HPLC(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)1260),使用Eclipse Plus C18柱(4.6x150mm,3.5微米),在40℃在磷酸盐缓冲液(pH 7.8)和乙腈:甲醇:水(45:45:10)的梯度中检测)后,分析样品中的L-赖氨酸含量。用于定量的校准标准品包括已知量的赖氨酸或包括已知量的L-赖氨酸的氨基酸标准混合物(安捷伦科技公司)。
如表2所示,与未经修饰的参考菌株产生的量相比,表达变体LYS20多肽的酵母生产了广泛的、增加2.7至33倍的游离细胞内赖氨酸。
表2.单个变体LYS20转化体中生产的游离细胞内赖氨酸
选择四个表达变体LYS20多肽的转化体用于进一步分析。菌株在不良培养基中生长48小时后生产的总蛋白在110℃用6N HCl处理24小时进行水解(Zumwalt,R.W.等人(1987)J.Assoc.Off.Anal.Chem.[官方分析化学家协会杂志]70:147-51)。如上所述,使用邻苯二甲醛衍生化处理后,分析样品中的总氨基酸组成以及特别是赖氨酸含量。如上测量衍生化赖氨酸,并且结果总结于表3中。报告了相对于野生型FG菌株的赖氨酸增加。与未经修饰的FG参考菌株相比,表达变体LYS20多肽的酵母多生产了1.5至2.7倍的蛋白质赖氨酸。
表3.LYS20变体酵母生产的蛋白质赖氨酸的倍数增加
突变 | 倍数增加 |
FG | na |
FG N38K | 2.10 |
FG N289D | 1.50 |
FG R349K | 1.58 |
FG Q352E | 2.69 |
实例2:通过表达变体LYS21多肽的酵母生产增加的赖氨酸
对于编码LYS21的基因,部分重复了实例1中描述的实验。使用标准分子生物学技术,在编码高柠檬酸合酶多肽LYS21的酿酒酵母基因YDL131w中数千个随机突变。如上所述筛选所得的文库。
流程是基于YDL131w(LYS21,chr IV:227393..228715)的核酸序列,
其如下SEQ ID NO:3所示:
ATGTCTGAAAATAACGAATTCCAGAGTGTCACCGAATCGACGACTGCTCCAACCACTAGTAACCCATATGGCCCAAATCCTGCGGATTATCTATCCAATGTTAAGAATTTCCAGTTGATTGATTCAACACTAAGAGAGGGTGAACAATTTGCCAACGCATTCTTCGATACTGAAAAAAAGATTGAAATTGCTAGAGCCTTGGATGATTTCGGTGTGGACTACATCGAGTTAACCTCTCCCGTAGCATCCGAACAATCAAGAAAGGACTGTGAAGCTATATGTAAACTAGGTTTAAAGGCCAAGATCCTTACACACATTCGTTGTCACATGGACGATGCCAGAGTCGCCGTAGAGACTGGTGTCGACGGTGTCGATGTTGTTATCGGCACCTCCAAATTTTTAAGACAATATTCCCACGGTAAGGATATGAACTACATCGCCAAGAGTGCTGTTGAAGTCATTGAATTTGTCAAATCCAAAGGTATTGAAATCAGATTTTCCTCTGAAGATTCCTTCAGAAGTGATCTCGTTGATCTTTTGAACATTTATAAAACCGTTGACAAGATCGGTGTAAATAGAGTCGGTATTGCCGACACAGTTGGATGTGCCAACCCAAGACAAGTATATGAACTGATCAGAACTTTGAAGAGTGTTGTCTCATGTGACATCGAATGCCATTTCCACAATGATACCGGTTGTGCCATTGCAAACGCCTACACTGCTTTGGAAGGTGGTGCCAGATTGATTGACGTCAGTGTACTGGGTATTGGTGAAAGAAACGGTATCACTCCTCTAGGTGGGCTCATGGCAAGAATGATTGTTGCCGCACCAGACTATGTCAGATCTAAATACAAGCTGCACAAGATCAGAGACATCGAAAACCTGGTCGCTGATGCTGTGGAAGTTAACATTCCATTCAACAACCCTATCACCGGGTTCTGTGCATTCACACATAAAGCAGGTATCCATGCCAAGGCCATTTTGGCTAACCCATCTACCTACGAAATCTTGGACCCTCACGATTTCGGTATGAAGAGGTATATCCACTTCGCCAACAGACTAACTGGTTGGAATGCAATCAAATCAAGAGTCGACCAATTGAACTTGAATTTGACGGATGATCAAATCAAGGAAGTTACTGCTAAGATTAAGAAGCTGGGTGATGTCAGACCGCTAAATATTGATGATGTAGACTCCATTATCAAGGACTTCCATGCAGAATTGAGCACCCCACTTTTAAAACCAGTAAATAAGGGTACAGATGACGACAATATCGATATTTCCAATGGGCATGTTTCTAAAAAGGCAAAGGTCACCAAATAG
YDL131w编码高柠檬酸合酶多肽LYS21(Genbank登录号AY692941),如下SEQ IDNO:1所示:
细胞内游离赖氨酸含量(mM)是在不良培养基中生长24小时后如前所述进行测量,并通过HPLC分析。结果总结于表4中。与未经修饰的FG参考菌株相比,表达LYS21的变体的酵母多生产了60至350倍的游离细胞内赖氨酸。
变体LYS21转化体中生产的游离细胞内赖氨酸
突变 | 赖氨酸 | 倍数增加 |
FG | 0.6 | na |
N52D | 65.8 | 114 |
D125N | 202.7 | 353 |
R289I | 35.1 | 61 |
N303D | 65.9 | 114 |
N393D | 99.1 | 172 |
Claims (22)
1.一种非天然存在的变体高柠檬酸合酶多肽,所述变体高柠檬酸合酶多肽与SEQ IDNO:1具有至少80%氨基酸序列同一性,并且包含一个或多个选自由以下组成的组的相对于SEQ ID NO:1的突变:F36Y、N38K、N289D、R349K、Q352E、V375D、R376T和I380M,其中与缺乏所述一个或多个突变的在其他方面相同的高柠檬酸合酶多肽相比,所述变体高柠檬酸合酶多肽表现出降低的赖氨酸抑制。
2.如权利要求1所述的非天然存在的变体高柠檬酸合酶多肽,其中所述一个或多个突变是F36Y和N38K。
3.一种非天然存在的变体高柠檬酸合酶多肽,所述变体高柠檬酸合酶多肽与SEQ IDNO:2具有至少80%氨基酸序列同一性,并且包含一个或多个选自由以下组成的组的相对于SEQ ID NO:2的突变:N52D、D125N、R289I、N303D和N393D,其中与缺乏所述一个或多个突变的在其他方面相同的高柠檬酸合酶多肽相比,所述变体高柠檬酸合酶多肽表现出降低的赖氨酸抑制。
4.一种酵母细胞,所述酵母细胞生产如权利要求1-3中任一项所述的变体高柠檬酸合酶多肽。
5.如权利要求4所述的酵母细胞,其中所述细胞属于酵母属(Saccharomyces)物种。
6.如权利要求4或5所述的酵母细胞,其中所述细胞进一步包含磷酸转酮酶途径的一个或多个基因。
7.如权利要求6所述的酵母细胞,其中所述磷酸转酮酶途径的基因选自由以下组成的组:磷酸转酮酶、磷酸转乙酰酶、和乙酰化乙酰基脱氢酶。
8.如权利要求4-7中任一项所述的酵母细胞,其中所述细胞进一步包含编码碳水化合物加工酶的外源基因。
9.如权利要求4-8中任一项所述的酵母细胞,所述酵母细胞进一步包含在甘油途径和/或乙酰辅酶A途径中的改变。
10.如权利要求4-9中任一项所述的酵母细胞,所述酵母细胞进一步包含用于制备乙醇的替代途径。
11.一种用于增加来自乙醇生产设施的发酵后产物中存在的赖氨酸的量的方法,所述方法包括:
(i)用α-淀粉酶水解含淀粉原料以生产淀粉液化物;
(ii)用葡糖淀粉酶糖化所述淀粉液化物以生产葡萄糖;
(iii)用衍生自亲本酵母细胞的经修饰的酵母细胞发酵所述葡萄糖,所述经修饰的酵母细胞包含遗传改变,所述遗传改变降低了如通过赖氨酸生产途径中的高柠檬酸合酶多肽所介导的赖氨酸生产途径的反馈抑制;以及
(iv)回收相比从使用所述亲本酵母、在其他方面相同的工艺中回收的发酵后副产物富集了赖氨酸的发酵后副产物。
12.如权利要求11所述的方法,其中所述发酵后产物选自由以下组成的组:发酵液、全釜馏物、稀釜馏物、干酒糟、具溶解物的干酒糟、浓缩酒糟可溶物或其他含蛋白质联产物。
13.如权利要求11或12所述的方法,其中以同时或重叠的方式组合一个或多个步骤(i)-(iv)。
14.一种用于增加发酵产物中存在的赖氨酸的量的方法,所述方法包括:
(i)用衍生自亲本酵母细胞的经修饰的酵母细胞发酵葡萄糖或另一种糖,所述经修饰的酵母细胞包含遗传改变,所述遗传改变降低了通过赖氨酸生产途径中的高柠檬酸合酶多肽所介导的赖氨酸生产途径的反馈抑制;以及
(ii)回收相比从使用所述亲本酵母、在其他方面相同的工艺中回收的发酵产物富集了赖氨酸的发酵产物。
15.如权利要求11-14中任一项所述的方法,其中在所述亲本酵母细胞或常规酵母细胞的进一步存在下,进行用所述经修饰的酵母细胞发酵所述葡萄糖。
16.如权利要求15所述的方法,其中,通过在不同时间将所述经修饰的酵母细胞和亲本或常规酵母细胞添加至发酵罐,进行在所述亲本酵母细胞或常规酵母细胞的进一步存在下用所述经修饰的酵母细胞发酵所述葡萄糖。
17.如权利要求11-16中任一项所述的方法,其中所述高柠檬酸合酶多肽是LYS20和/或LYS21。
18.如权利要求17所述的方法,其中与其他方面相同的酵母相比,所述经修饰的酵母生产了改变量的LYS20和/或LYS21多肽。
19.如权利要求17所述的方法,其中与其他方面相同的酵母相比,所述经修饰的酵母生产了变体LYS20和/或LYS21多肽。
20.如权利要求11-19中任一项的方法,其中所述经修饰的酵母是如权利要求1-10中任一项所述的酵母。
21.一种发酵后产物,所述发酵后产物通过如权利要求11-20中任一项所述的方法生产。
22.一种组合物或方法,所述组合物或方法具有权利要求1-22的特征或说明书中所提及的特征中的任一个。
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