CN112105726A

CN112105726A - 使用gcy1和dak1来增加酵母的乙醇生产的组合物和方法

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Publication number: CN112105726A
Application number: CN201980029505.1A
Authority: CN
Inventors: Q·Q·朱; P·J·M·特尼森
Original assignee: Danisco US Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2018-03-06
Filing date: 2019-03-04
Publication date: 2020-12-18
Also published as: WO2019173217A1; US20210047660A1; UY38135A; AR114130A1; EP3762488A1; BR112020018041A2

Abstract

本文描述了组合物和方法，所述组合物和方法涉及与外源磷酸转酮酶途径组合的表达甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶多肽的酵母，并且涉及甘油脱氢酶‑二羟基丙酮激酶双功能融合多肽；以及所述组合物和方法在用于醇生产的淀粉水解过程中的各种使用和组合使用。

Description

使用GCY1和DAK1来增加酵母的乙醇生产的组合物和方法

技术领域

本发明的组合物和方法涉及与外源磷酸转酮酶途径组合的表达甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶多肽的酵母，并且涉及甘油脱氢酶-二羟基丙酮激酶双功能融合多肽；以及所述组合物和方法在用于醇生产的淀粉水解过程中的使用。

背景技术

基于酵母的乙醇生产是基于糖向乙醇的转化。当前通过此方法实现的年燃料乙醇产量在世界范围内为约900亿升。据估计，乙醇生产成本的约70％是原料。因为乙醇生产量如此之大，所以甚至小的产率提升对于该产业也具有巨大的经济影响。一摩尔葡萄糖转化为两摩尔乙醇和两摩尔二氧化碳的转化是氧化还原中性的，其最大理论产率为约51％。当前的工业产率为约45％；因此，存在增加乙醇生产的机会。

二氧化碳、甘油和酵母生物质是乙醇发酵的主要副产物。在酵母生长和发酵期间，生成过剩的NADH，其用于产生甘油以用于氧化还原平衡和渗透保护的目的。甘油被认为是低价值产品，并且已采用若干种方法来减少甘油产生。然而，减少甘油合成可能导致其他代谢副产物诸如乙酸的增加。乙酸是不期望的副产物，因为它不利地影响乙醇生产速率、效价和酵母发酵的产率。

先前已经描述了具有异源磷酸转酮酶途径的工程化酵母细胞(例如，WO2015148272)。这些细胞表达异源磷酸转酮酶(PKL；EC 4.1.2.9)和磷酸转乙酰酶(PTA；EC2.3.1.8)，任选地具有其他酶，以使碳通量远离甘油途径导向，并且朝向乙酰辅酶A的合成导向，所述乙酰辅酶A然后转化为乙醇。与在其他方面相同的亲本酵母细胞相比，这些细胞能够在发酵过程中增加乙醇生产。

尽管酵母生产率有所提高，但仍需要进一步改变酵母代谢途径来最大化乙醇生产，同时不增加不期望副产物的产生。

发明内容

本发明的组合物和方法涉及与外源磷酸转酮酶途径组合的表达甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶多肽的酵母细胞，甘油脱氢酶-二羟基丙酮激酶双功能融合多肽和表达它们的酵母细胞，以及所述组合物和方法在用于醇生产的淀粉水解过程中的各种使用和组合使用。所述组合物和方法的方面和实施例描述于以下独立编号的段落中。

1.在一方面，提供了一种融合多肽，该融合多肽包含与具有二羟基丙酮激酶活性的第二氨基酸序列融合的具有甘油脱氢酶活性的第一氨基酸序列，其中当在酵母细胞中表达时，所述融合多肽能够将甘油转化为二羟基丙酮磷酸盐。

2.在如段落1所述的融合多肽的一些实施例中，所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列经由接头肽融合。

3.在如段落1或2所述的融合多肽的一些实施例中，所述第一氨基酸序列存在于所述融合多肽的N-末端处，并且所述第二氨基酸序列存在于所述融合多肽的C-末端处。

4.在如段落1或2所述的融合多肽的一些实施例中，所述第二氨基酸序列存在于融合多肽的N-末端处，并且所述第一氨基酸序列存在于所述融合多肽的C-末端处。

5.在如前述段落中任一项所述的融合多肽的一些实施例中，所述第一氨基酸序列是来自酵母属物种(Saccharomyces sp.)的甘油脱氢酶或其结构上或功能上的同源物。

6.在如前述段落中任一项所述的融合多肽的一些实施例中，所述第二氨基酸序列是来自酵母属物种的二羟基丙酮激酶或其结构上或功能上的同源物。

7.在另一方面，提供了编码如前述段落中任一项所述的融合多肽的DNA序列，与不带有所述DNA序列的亲本酵母相比，基于mRNA水平,与GCY1或DAK1之一或二者的单个表达水平相比，所述DNA序列任选地能过表达所述融合多肽。

8.在另一方面，提供了包含如段落7所述的DNA序列的酵母细胞。

9.在另一方面，提供了表达或过表达如段落1-8中任一项所述的融合多肽的酵母细胞。

10.在如段落9所述的酵母细胞的一些实施例中，所述酵母细胞进一步包含外源磷酸转酮酶途径。

11.在如段落9或10中任一项所述的酵母细胞的一些实施例中，所述酵母细胞进一步包含甘油途径和/或乙酰辅酶A途径中的改变。

12.在如段落9-11中任一项所述的酵母细胞的一些实施例中，所述酵母细胞不额外地过表达具有甘油脱氢酶活性和/或二羟基丙酮激酶活性的单独多肽。

13.在另一方面，提供了包含导致细胞过表达具有甘油脱氢酶活性的多肽和过表达具有二羟基丙酮激酶活性的多肽的基因修饰的经修饰的酵母细胞，并且所述经修饰的酵母细胞进一步包含外源磷酸转酮酶途径。

14.在如段落13所述的经修饰的酵母细胞的一些实施例中，所述具有甘油脱氢酶活性的多肽和具有二羟基丙酮激酶活性的多肽作为能够将甘油转化为二羟基丙酮磷酸的双功能融合多肽生产。

15.在如段落13或14所述的经修饰的酵母细胞的一些实施例中，与其他未经修饰的或亲本酵母相比，所述酵母产生降低量的二羟基丙酮。

16.在如段落13-15中任一项所述的经修饰的酵母细胞的一些实施例中，所述的经修饰酵母细胞进一步包含甘油途径和/或乙酰辅酶A途径中的改变。

17.在如段落13-16中任一项所述的经修饰的酵母的一些实施例中，所述的经修饰的酵母进一步包含编码碳水化合物加工酶的外源基因。

18.在如段落13-17中任一项所述的经修饰的酵母细胞的一些实施例中，所述酵母细胞来自酵母属物种。

19.在另一方面，提供了用于在碳水化合物底物发酵期间通过酵母细胞增加醇生产的方法，所述方法包括使碳水化合物底物与具有外源磷酸转酮酶途径和产生具有甘油脱氢酶活性的多肽和具有二羟基丙酮激酶活性的多肽的经修饰的酵母细胞接触，其中与不产生具有甘油脱氢酶活性的多肽和/或具有二羟基丙酮激酶活性的多肽的酵母细胞相比，所述经修饰的酵母细胞在发酵期间产生增加量的乙醇。

20.在如段落19所述的方法的一些实施例中，所述经修饰的酵母细胞是如段落9-11中任一项所述的酵母细胞。

21.在如段落19或20中任一项所述的方法的一些实施例中，所述具有甘油脱氢酶活性的多肽和具有二羟基丙酮激酶活性的多肽作为能够将甘油转化为二羟基丙酮磷酸的双功能融合多肽表达。

22.在如段落21所述的方法的一些实施例中，所述双功能融合多肽是如段落1-6中任一项所述的融合多肽。

根据包括附图的说明书，本发明的经修饰的细胞和方法的这些和其他方面以及实施例将是清楚的。

附图说明

图1是通过用EcoRI消化从质粒pTOPO II-Blunt ura3-loxP-KanMX-loxP-ura3释放的2,018-bp ura3-loxP-KanMX-loxP-ura3盒的图谱。

图2是通过用SwaI消化从质粒pZKIIC-YL1K释放的4,776-bp GCY1-L1-DAK1表达盒的图谱。

图3是通过用SwaI消化从质粒pZKIIC-YL2K释放的4,731-bp GCY1-L2-DAK1表达盒的图谱。

图4是通过用SwaI消化从质粒pZKIIC-KL1Y释放的4,776-bp DAK1-L1-GCY1表达盒的图谱。

图5是通过用SwaI消化从质粒pZKIIC-KL2Y释放的4,731-bp DAK1-L2-GCY1表达盒的图谱。

图6是通过用SwaI消化从质粒pZKIIC-HYKK释放的5,668-bp GCY1和DAK1的单独表达盒的图谱。

图7是通过用SwaI消化从质粒pZK41W-GLAF12释放的12,372-bp PKL途径表达盒的图谱。

具体实施方式

I.定义

在详细地描述本发明的酵母菌株和方法之前，为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语应当符合相关领域中所使用的常规含义。

如本文所使用的，“醇”是指其中羟基官能团(-OH)与饱和碳原子键合的有机化合物。

如本文所使用的，“酵母细胞”“酵母菌株”或简称“酵母”是指来自子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)的生物。示例性酵母是来自酵母目的芽殖酵母。酵母的具体实例是酵母属物种，包括但不限于酿酒酵母(S.cerevisiae)。酵母包括用于生产燃料醇的生物体以及用于生产可饮用醇的生物体，包括用于制备独特味道的啤酒、葡萄酒和其他发酵饮料的特种和专有酵母菌株。

如本文所使用的，短语“工程化的酵母细胞”、“变体酵母细胞”、“经修饰的酵母细胞”、或相似短语是指包括本文所述的基因修饰和特征的酵母。变体/经修饰的酵母不包括天然存在的酵母。

如本文所使用的，术语“外源的”是指在受试者生物体中不是被天然发现的并且通过遗传操作引入生物体的基因或其编码的蛋白质、活性、或影响。

如本文所使用的，术语“磷酸转酮酶途径”是指包括磷酸转酮酶(PKL)酶的细胞代谢途径。PKL途径中包括额外的酶，包括但不限于磷酸转乙酰酶(PTA)、乙酰化乙酰基脱氢酶(AADH)、和/或乙酰辅酶A合酶(ACS)。

如本文所使用的，术语“多肽”、“蛋白质”、“氨基酸序列”(和它们各自的复数形式)可互换地使用，是指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文使用氨基酸残基的常规一字母或三字母代码，并且所有序列均从N-末端到C-末端方向进行呈现。聚合物可以包含经修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还包括天然地修饰的或通过干预而修饰的氨基酸聚合物；例如，通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，如与标记组分偶联。所述定义内还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。

如本文所使用的，功能上和/或结构上相似的蛋白质被认为是“相关的蛋白质”。这类蛋白质可以衍生自不同属和/或物种的生物体，或不同纲的生物体(例如，细菌和真菌)，或者是人工设计的蛋白质。相关的蛋白质还涵盖通过一级序列分析确定的、通过二级或三级结构分析确定的、或通过酶活性确定的、或者通过免疫交叉反应性确定的同源物。

如本文所使用的，术语“同源蛋白”是指与参考蛋白具有相似活性和/或结构的蛋白。这并不旨在意味着同源物必定与进化相关。因此，所述术语旨在涵盖从不同生物体获得的相同、相似、或相应(即，在结构和功能方面)的一种或多种酶。在一些实施例中，希望鉴定与参考蛋白具有类似的四级、三级和/或一级结构的同源物。在一些实施例中，同源蛋白作为参考蛋白诱导相似的一种或多种免疫应答。在一些实施例中，同源蛋白经过工程化以产生具有一种或多种所需活性的酶。

序列之间的同源性程度可以使用本领域已知的任何适合方法确定(参见，例如，Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444；威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)(遗传学计算机组公司(Genetics ComputerGroup)，麦迪逊，威斯康星州)中的程序，如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA；以及Devereux等人(1984)Nucleic Acids Res.[核酸研究]12:387-95)。

例如，PILEUP是确定序列同源性水平的有用程序。PILEUP使用渐进的、两两比对创建了来自一组相关序列的多重序列比对。它还可以标绘显示用于创建所述比对的聚类关系的一个树。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进比对方法的简化(Feng和Doolittle(1987)J.Mol.Evol.[分子进化杂志]35:351-60)。所述方法类似于Higgins和Sharp描述的方法((1989)CABIOS[计算机在生物学中的应用]5:151-53)。有用的PILEUP参数包括为3.00的默认空位权重，为0.10的默认空位长度权重，以及加权的末端空位。有用算法的另一个实例是BLAST算法，由以下描述：Altschul等人((1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-10)以及Karlin等人((1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5873-87)。一个特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参见，例如，Altschul等人(1996)Meth.Enzymol.[酶学方法]266:460-80)。参数“W”、“T”、以及“X”确定了该比对的灵敏度与速度。所述BLAST程序使用字长(W)为11、BLOSUM62得分矩阵(参见，例如，Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915)比对(B)为50、期望值(E)为10、M’5、N’-4、以及两条链的比较作为默认值。

如本文所使用的，在至少两个核酸或多肽的上下文中，短语“基本上相似”和“基本上相同”典型地意指多核苷酸或多肽包含与参考(即，野生型)序列相比具有至少约70％同一性、至少约75％同一性、至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、或甚至至少约99％同一性、或更高同一性的序列。使用具有默认参数的CLUSTAL W算法计算序列同一性百分比。参见Thompson等人(1994)Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680。CLUSTAL W算法的默认参数是：

空位开放罚分： 10.0

空位延伸罚分： 0.05

蛋白质权重矩阵： BLOSUM系列

DNA权重矩阵： IUB

延迟发散序列％： 40

空位分隔距离： 8

DNA转换权重： 0.50

列表亲水残基： GPSNDQEKR

使用负性矩阵：关

切换特殊残基罚分：开

切换亲水罚分：开

切换结束空位分隔罚分关

两种多肽基本上相同的另一个指示是第一多肽与第二多肽具有免疫交叉反应性。典型地，差别在于保守氨基酸取代的多肽具有免疫交叉反应性。因此，多肽与第二多肽基本上相同，例如，其中两个肽仅相差保守取代。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子在严格条件下(例如，在中等至高严格的范围内)彼此杂交。

如本文所使用的，术语“基因”与术语“等位基因”同义，是指编码和指导蛋白或RNA表达的核酸。丝状真菌的营养体形式通常是单倍体，因此指定基因的单拷贝(即单个等位基因)足以赋予特定表型。

如本文所使用的，术语“表达多肽”和相似术语是指使用细胞的翻译机器(例如，核糖体)产生多肽的细胞过程。在本文中，“表达”和“产生”无区别地使用。

如本文所使用的，“过表达多肽”、“提高多肽的表达”和类似术语是指与不包括指定的遗传修饰的亲本或“野生型”细胞所观察到的相比，以比正常较高的水平表达多肽。

如本文所使用的，“表达盒”是指包含氨基酸编码序列、启动子、终止子以及允许在细胞中产生所编码的多肽所需的其他核酸序列的核酸。表达盒可以是外源的(即，引入细胞中)或内源的(即，存在于细胞中)。

如本文所使用的，术语“野生型”和“天然的”可互换使用，并是指天然发现的基因、蛋白质或菌株。

如本文所使用的，关于两个多肽的术语“融合的”和“融合”是指致使多肽变成单个分子的物理键合。

如本文所使用的，术语“目的蛋白”是指希望在经修饰的酵母中表达的多肽。此类蛋白质可以是酶、底物结合蛋白、表面活性蛋白、结构蛋白、选择性标记等，并且能以高水平表达。目的蛋白由相对于亲本菌株的内源基因、经修饰的内源基因、或异源基因(即，目的基因)编码。目的蛋白可以在细胞内表达或作为分泌的蛋白表达。

如本文所使用的，“基因缺失”是指所述基因从宿主细胞的基因组中除去。当基因包括与基因编码序列不紧邻的控制元件(例如，增强子元件)时，基因的缺失是指编码序列、以及任选地相邻增强子元件(例如，包括但不限于启动子和/或终止子序列)的缺失，但未要求非相邻控制元件的缺失。基因缺失也指编码序列的一部分、或与编码序列紧邻或不紧邻的启动子的一部分的缺失，其中工程化细胞中不存在目的基因的功能活性。

如本文所使用的，术语“遗传操作”和“遗传改变”可互换使用，并且是指核酸序列的改变/变化。改变可包括但不限于核酸序列中至少一种核酸的取代、缺失、插入或化学修饰。

如本文所使用的，“功能性多肽/蛋白”是具有活性(例如酶活性、信号转导、受体、转运体、转录因子、翻译因子、辅因子、结合活性、表面活性特性等)的蛋白质，并且其未被诱变、截短、或以其他方式修饰以消除或减少此活性。如所指出的，功能性多肽可以是热稳定的或不耐热的。

如本文所使用的，“需氧发酵”是指在氧存在下的生长。

如本文所使用的，“厌氧发酵”是指在不存在氧的情况下的生长。

如本文所使用的，单数冠词“一个/一种(a/an)”以及“所述”涵盖复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。本文引用的所有参考文献均通过引用以其全文特此并入。除非另外说明，以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：

EC 酶学委员会

GCY 甘油脱氢酶

DAK 二羟基丙酮激酶

PKL 磷酸转酮酶

PTA 磷酸转乙酰酶

XFP 木酮糖5-磷酸/果糖6-磷酸

磷酸转酮酶

AADH 乙醛脱氢酶

ADH 醇脱氢酶

EtOH 乙醇

AA α-淀粉酶

GA 葡糖淀粉酶

TrGA 木霉属(Trichoderma)葡糖淀粉酶

℃ 摄氏度

bp 碱基对

DHA 二羟基丙酮

DNA 脱氧核糖核酸

DP 聚合度

ds或DS 干固体

g或gm 克

g/L 克/升

GAU/g ds 葡糖淀粉酶单元/克干固体

H₂O 水

HPLC 高效液相色谱

hr或h 小时

kg 千克

M 摩尔的

mg 毫克

mL或ml 毫升

ml/min 毫升/分钟

mM 毫摩尔

N 正常

nm 纳米

OD 光密度

PCR 聚合酶链式反应

ppm 份/百万份

SSCU/g ds 真菌α-淀粉酶单元/克干固体

Δ 与缺失有关

μg 微克

μL和μl 微升

μM 微摩尔的

SSF 同时糖化和发酵

MTP 微量滴定板

II.引言

在野生型酵母菌株中，已经证明了两个基因(甘油脱氢酶(GCY1)和二羟基丙酮激酶(DAK1))一起过表达以减少甘油产生并且增加乙醇产量(Zhang等人(2013)J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物与生物技术杂志]40:1153-60)。迄今为止，没有蛋白质被鉴定出具有甘油脱氢酶和二羟基丙酮激酶二者的活性。

本发明的组合物和方法的第一方面涉及双功能GCY1-DAK1融合多肽，其包括两种酶的活性部分。融合多肽对在酵母中提高乙醇产量和在酵母中降低有毒中间体二羟基丙酮(DHA)的积累至少同样有效，并且在一些情况下显著地更有效。

本发明的组合物和方法的第二方面涉及在与单独带有PKL途径的酵母相比的带有PKL途径以进一步增加乙醇产量的酵母中，GCY1和DAK1分别或一起(作为双功能融合多肽)的过表达。基于工程化的酵母比亲本酵母产生显著地更多的乙醇，同时产生基本上更少的作为废碳的甘油的能力，这种工程化酵母在燃料乙醇工业中的使用是理想的。

本发明的组合物和方法的第三方面特别地涉及在与仅单独带有PKL途径的酵母相比的带有PKL途径以进一步增加乙醇产量的酵母中，GCY1和DAK1作为双功能融合多肽一起表达(相对于分别地)。基于高度工程化酵母产生更多乙醇、更少甘油、和更少DHA的能力，这类高度工程化酵母在燃料乙醇工业中的使用是理想的。

III.GCY1和DAK1多肽

示例性的GCY1和DAK1多肽是来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Genbank登录号NP_014763)S288C的全长GCY1和来自酿酒酵母S288C(Genbank登录号NP_013641)的全长DAK1。

DAK1的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1)所示：

MSAKSFEVTDPVNSSLKGFALANPSITLVPEEKILFRKTDSDKIALISGGGSGHEPTHAGFIGKGMLSGAVVGEIFASPSTKQILNAIRLVNENASGVLLIVKNYTGDVLHFGLSAERARALGINCRVAVIGDDVAVGREKGGMVGRRALAGTVLVHKIVGAFAEEYSSKYGLDGTAKVAKIINDNLVTIGSSLDHCKVPGRKFESELNEKQMELGMGIHNEPGVKVLDPIPSTEDLISKYMLPKLLDPNDKDRAFVKFDEDDEVVLLVNNLGGVSNFVISSITSKTTDFLKENYNITPVQTIAGTLMTSFNGNGFSITLLNATKATKALQSDFEEIKSVLDLLNAFTNAPGWPIADFEKTSAPSVNDDLLHNEVTAKAVGTYDFDKFAEWMKSGAEQVIKSEPHITELDNQVGDGDCGYTLVAGVKGITENLDKLSKDSLSQAVAQISDFIEGSMGGTSGGLYSILLSGFSHGLIQVCKSKDEPVTKEIVAKSLGIALDTLYKYTKARKGSSTMIDALEPFVKEFTASKDFNKAVKAAEEGAKSTATFEAKFGRASYVGDSSQVEDPGAVGLCEFLKGVQSAL

GCY1的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:2)所示：

MPATLHDSTKILSLNTGAQIPQIGLGTWQSKENDAYKAVLTALKDGYRHIDTAAIYRNEDQVGQAIKDSGVPREEIFVTTKLWCTQHHEPEVALDQSLKRLGLDYVDLYLMHWPARLDPAYIKNEDILSVPTKKDGSRAVDITNWNFIKTWELMQELPKTGKTKAVGVSNFSINNLKDLLASQGNKLTPAANQVEIHPLLPQDELINFCKSKGIVVEAYSPLGSTDAPLLKEPVILEIAKKNNVQPGHVVISWHVQRGYVVLPKSVNPDRIKTNRKIFTLSTEDFEAINNISKEKGEKRVVHPNWSPFEVFK

GCY1和DAK1酶是众所周知的酶，并且已经克隆和表征了大量酶。公共数据库包括许多GCY1和DAK1序列。预期其他的GCY1和DAK1多肽如所述起作用，包括结构上和功能上的同源物，包括但不限于，与示例性GCY1和DAK1具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或更多的氨基酸序列同一性和/或同源性的那些。

在一些实施例中，GCY1和DAK1多肽包括基本上不影响多肽的结构和/或功能的取代。示例性取代是保守突变，如表1中总结的。

表1.示例性氨基酸取代

在一些实施例中，表达(即，产生)GCY1和DAK1多肽的酵母比不表达所述多肽的酵母从碳水化合物底物中产生至少0.5％、至少0.8％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、或甚至至少6％或更多的乙醇。在一些实施例中，表达GCY1和DAK1多肽的酵母比不表达所述多肽的酵母从碳水化合物底物产生至少3％、至少5％、至少10％、至少15％、或甚至至少20％、更少的甘油。

在一些实施例中，基于mRNA水平，与GCY1和DAK1的正常单个表达水平相比，本发明的酵母过表达GCY1和DAK1多肽至少50％、至少100％、至少200％、至少300％、至少500％、或更多，和/或至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、或更多。

IV.双功能GCY1-DAK1融合多肽

示例性双功能GCY1-DAK1融合多肽的设计是相对简单的，因为它们包括以两种不同的排列顺序经由两种不同接头中的一种(即，L1或L2)连接的对应于SEQ ID NO:2的全长GCY1和对应于SEQ ID NO:1的全长DAK1。

接头1(L1)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:3)所示：

GAGPARPAGLPPATYYDSLAV

接头2(L2)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:4)所示：

AGGGGV

DAK1-L1-GCY1的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:5)所示，接头以粗体和斜体示出：

DAK1-L2-GCY1的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:6)所示，接头以粗体和斜体示出：

GCY1-L1-DAK1的氨基酸序列如下(SEQ ID NO: 7)所示，接头以粗体和斜体示出：

GCY1-L1-DAK2的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:8)所示，接头以粗体和斜体示出：

如上作述，GCY1和DAK1酶是众所周知的酶，并且已经克隆和表征了大量酶。因此，预期其他GCY1和DAK1多肽适用于制备双功能融合多肽(包括以上所述的那些)。还预期，融合多肽内的GCY1和DAK1多肽的取向不是关键的，并且GCY1或DAK1多肽可以位于融合多肽的N-末端或C-末端处。

进一步预期，GCY1-DAK1融合多肽可以包括额外的功能性和结构特征，包括但不限于荧光蛋白、另外的酶、抗体标签、抗生素抗性标记等，其可以在GCY1-DAK1融合多肽的N-末端和/或C-末端，可以将GCY1-DAK1融合多肽分开，或者可以包含在GCY1-DAK1融合多肽的接头区域内(例如，如下所述)。

预期多种接头如所述起作用，包括与接头1和接头2具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或更高氨基酸序列同一性的那些。未来的实验可能鉴定使酶活性优化的接头。优选的接头是肽，但是也可以使用更大的接头(包括功能蛋白质)作为接头。这类接头可以例如允许分离酶，提供荧光标签，包括另外的酶活性等。理想地，接头、GCY1和DAK1是可以使用正常翻译机器在细胞中制备的单一连续的氨基酸序列；然而，连接GCY1和DAK1酶的原理包括将合成接头化学添加到GCY1和DAK1多肽的可能性。

在一些实施例中，表达双功能GCY1-DAK1融合多肽的酵母比缺乏所述双功能蛋白的酵母从底物产生至少0.5％、至少0.8％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、或甚至至少6％更多的乙醇。在一些实施例中，表达双功能GCY1-DAK1融合多肽的酵母比表达单独的GCY1和DAK1多肽的酵母从底物产生至少0.2％、至少0.5％、至少1％、至少2％、至少3％、和甚至至少4％更多的乙醇。在一些实施例中，含有双功能GCY1-DAK1融合多肽的酵母比缺乏所述双功能蛋白的酵母从底物产生至少3％、至少5％、至少10％、至少15％、或甚至至少20％更少的甘油。在一些实施例中，含有双功能GCY1-DAK1融合多肽的酵母比表达单独的GCY1和DAK1多肽的酵母从底物产生至少1％、至少3％、至少5％、至少10％、至少15％、或甚至至少20％更少的甘油。

在一些实施例中，基于mRNA水平，与GCY1或DAK1任一(或，如果说明，两者)的正常单个表达水平相比，本发明的酵母过表达GCY1-DAK1双功能多肽至少50％、至少100％、至少200％、至少300％、至少500％、或更多，和/或至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、或更多。

在一些实施例中，表达双功能GCY1-DAK1融合多肽的酵母不额外地过表达单独的GCY1和DAK1多肽。在其他实施例中，表达双功能GCY1-DAK1融合多肽的酵母也过表达单独的GCY1和/或DAK1多肽。V.额外地具有异源磷酸转酮酶途径的酵母

先前已经描述了具有异源磷酸转酮酶途径的工程化酵母(例如，WO 2015148272，Miasnikov等人)。这些细胞表达异源磷酸转酮酶(PKL)和磷酸转乙酰酶(PTA)，任选地具有其他酶，诸如乙酰化乙酰基脱氢酶(AADH)和/或乙酰辅酶A合酶(ACS)，以使碳通量远离甘油途径导向，并且朝向乙酰辅酶A的合成导向，所述乙酰辅酶A然后转化为乙醇。

与在其他方面相同的亲本酵母细胞相比，此类经修饰的细胞能够在发酵过程中增加乙醇生产。GCY1和DAK1的表达可与PKL途径中的基因表达组合以进一步增加乙醇产量。

VI.GCY1和DAK1表达与有益于醇生产的其他基因修饰的组合

在一些实施例中，除表达作为单独多肽或作为双功能融合多肽的GCY1和DAK1之外，本发明的经修饰的酵母细胞包括影响乙醇生产的另外的修饰。

所述经修饰的细胞可以进一步包括导致天然甘油生物合成途径减弱的突变，已知所述突变可增加醇生产。用于减弱酵母中甘油生物合成途径的方法是已知的，并包括例如通过破坏基因GPD1、GPD2、GPP1和/或GPP2中的一个或多个来降低或消除内源性NAD依赖性甘油3-磷酸脱氢酶(GPD)或磷酸甘油磷酸酶(GPP)活性。参见例如美国专利号9,175,270(Elke等人)、8,795,998(Pronk等人)和8,956,851(Argyros等人)。

经修饰的酵母的特征可以进一步在于增加的乙酰辅酶A合酶(也称为乙酰辅酶A连接酶)活性(EC 6.2.1.1)以清除(即捕获)通过化学或酶水解乙酰-磷酸产生(或出于任何其他原因存在于酵母的培养基中)的乙酸并将其转化为乙酰辅酶A。这避免了乙酸对酵母细胞生长的不良影响，并且可以进一步有助于醇产率的提高。增加乙酰辅酶A合酶活性可以通过将异源乙酰辅酶A合酶基因引入细胞、增加内源乙酰辅酶A合酶基因的表达等来实现。

在一些实施例中，经修饰的细胞可进一步包括编码具有NAD⁺依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质的异源基因和/或编码丙酮酸甲酸裂解酶的异源基因。例如，在美国专利号8,795,998(Pronk等人)中描述了与甘油途径减弱进行组合的此类基因的引入。在本发明的组合物和方法的一些实施例中，酵母特意缺乏编码乙酰化乙醛脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶或两者的一种或多种异源基因。

在一些实施例中，本发明的经修饰的酵母细胞可以进一步过表达糖转运蛋白样(STL1)多肽以增加甘油的摄入(参见，例如，Ferreira等人(2005)Mol Biol cell[细胞分子生物学]16:2068-76；

等人(2015)Mol Microbiol[分子微生物学]97:541-59和WO2015023989 A1)。在一些实施例中，本发明的经修饰的酵母细胞可进一步过表达ATP依赖性葡萄糖特异性转运多肽以增加乙醇生产。

在一些实施例中，本发明的经修饰的酵母细胞进一步包含丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径是异丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自由以下组成的组的底物至产物的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸盐；(c)2,3-二羟基异戊酸盐至2-酮异戊酸盐；(d)2-酮异戊酸盐至异丁醛；和(e)异丁醛至异丁醇。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径包括编码具有乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、酮异戊酸脱羧酶、和醇脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。

在一些实施例中，包含丁醇生物合成途径的经修饰的酵母细胞进一步包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸中的修饰。在一些实施例中，酵母细胞在编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源多核苷酸中包含缺失、突变和/或取代。在一些实施例中，具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽选自下组，该组由以下组成：PDC1、PDC5、PDC6、及其组合。在一些实施例中，所述酵母细胞在编码FRA2、ALD6、ADH1、GPD2、BDH1、和YMR226C的一个或多个内源多核苷酸中进一步包含缺失、突变和/或取代。

VII.GCY1和DAK1表达与其他有益突变的组合

在一些实施例中，除表达作为单独多肽或作为双功能融合多肽的GCY1和DAK1之外，任选地与有益于醇生产的其他基因修饰组合，本发明的经修饰的酵母细胞进一步包含任何数量的编码目的蛋白质的另外目的基因。可以在基因操作之前、期间或之后引入另外的目的基因，所述基因操作导致融合多肽的表达。目的蛋白包括选择性标记、碳水化合物加工酶以及其他商业上相关的多肽，包括但不限于选自下组的酶，该组由以下组成：脱氢酶、转酮醇酶、磷酸转酮酶、转醛醇酶、差向异构酶、植酸酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、磷酸酶、蛋白酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、海藻糖酶、脂肪酶、果胶酶、聚酯酶、角质酶、氧化酶、转移酶、还原酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、酯酶、异构酶、果胶酶、乳糖酶、过氧化物酶和漆酶。目的蛋白可以被分泌、糖基化和以其他方式修饰。

VIII.经修饰的酵母用于增加醇生产的用途

本发明的组合物和方法包括用于在发酵反应中使用经修饰的酵母增加醇生产的方法。此类方法不限于特定的发酵过程。预期本发明的工程化酵母是任何醇发酵设施中常规酵母的“滴入式(drop-in)”替代品。虽然主要旨在用于燃料乙醇生产，但是本发明的酵母也可以用于生产可饮用酒精，包括葡萄酒和啤酒。

IX.适合修饰的酵母细胞

酵母是被归类为真菌界成员的单细胞真核微生物，并且包括来自子囊菌门和担子菌门的生物。可以用于醇生产的酵母包括但不限于酵母属物种，包括酿酒酵母、以及克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、Lachancea属和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种。许多酵母菌株是可商购获得的，其中许多已被选择或基因工程化以获得所需的特征，例如高乙醇生产、快速生长速率等。一些酵母已经被基因工程化以产生异源酶，例如葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、蛋白酶、或其他酶。

X.底物和产物

从许多碳水化合物底物(包括但不限于玉米淀粉、甘蔗、木薯和糖蜜)中生产醇是众所周知的，正如酶条件和化学条件以及机械方法的无数变化和改善也是众所周知的。据信本发明的组合物和方法与此类底物和条件完全相容。

鉴于本说明书，本发明的菌株和方法的这些和其他方面以及实施例对于技术人员是清楚的。以下实例旨在进一步说明但不限制菌株和方法。

实例

实例1

材料和方法

液化物制备

液化物(磨细的玉米浆料)通过添加600ppm尿素、0.124SAPU/g ds FERMGEN^TM 2.5X(酸性真菌蛋白酶)、0.33GAU/g ds TrGA变体葡糖淀粉酶以及1.46SSCU/g ds GC626(曲霉属(Aspergillus)α-淀粉酶)，调整至pH 4.8来制备。

AnKom测定

将300μL浓缩的酵母过夜培养物添加到填充有30g制备的液化物的多个ANKOM瓶中的每个，以达到0.3的最终OD。然后将所述瓶在振荡(150RPM)下在32℃孵育65小时。

HPLC分析

通过在14,000RPM下离心12分钟在Eppendorf管中采集来自血清瓶和AnKom实验的样品。将上清液用0.2μM PTFE过滤器过滤，并且然后在以下条件下用于HPLC(AgilentTechnologies 1200系列)分析：Bio-Rad Aminex HPX-87H柱，运行温度为55℃。0.6ml/min等度流速，0.01N H₂SO₄，2.5μL注射体积。使用校准标准物用于定量乙酸、乙醇、甘油、和葡萄糖。通过在14,000RPM下离心15分钟在Eppendorf管中采集来自摇瓶实验的样品。使用5mMH₂SO₄并在95℃下孵育5min来将上清液稀释11倍。在冷却之后，将样品用0.2μM CorningFiltrEX CLS3505过滤器过滤，并且然后用于HPLC分析。将10μl注入配备有折射率检测器的Agilent 1200系列HPLC中。所使用的分离柱是Phenomenex Rezex-RFQ Fast Acid H+(8％)柱。流动相为5mM H₂SO₄，并且在85℃下流速为1.0mL/min。使用来自Bion Analytical的HPLC校准标准混合物用于定量乙酸、乙醇、甘油、和葡萄糖。除非另外指明，所有值以g/L表达。

生长确定

将含有500μL YPD的两个96微量滴定板(MTP)接种20μL浓缩的酵母过夜培养物以达到0.1的OD。将MTP在振荡(150RPM)下在32℃或36℃孵育24小时。将酵母培养物在脱盐水中稀释50倍以在500μL体积平底透明板(Greiner Bio-one 655101)中达到100μL的最终体积。在660nm的波长下测量OD。

实例2

带有编码N-末端甘油脱氢酶和C-末端二羟基丙酮激酶的融合基因的质粒的构建

合成的GCY1-L1-DAK1和GCY1-L2-DAK1是融合基因，所述融合基因包括分别通过接头1(SEQ ID NO:3)和接头2(SEQ ID NO:4)融合的密码子优化的甘油脱氢酶(GCY1，SEQ IDNO:2)和二羟基丙酮激酶(DAK1，SEQ ID NO:1)。融合多肽GCY-L1-DAK1和GCY1-L2-DAK1的氨基酸序列，分别通过SEQ ID NO:5和6表示。

质粒pZKIIC-YL1K含有表达盒以在ACT1启动子(YFL039C基因座)和FBA1终止子(YKL060C基因座)的控制下表达GCY1-L1-DAK1融合多肽。将质粒pZKIIC-YL1K设计成将表达盒整合到酵母属染色体II的345856和350891的位置上。质粒pZKIIC-YL1K的功能和结构组成在表2中描述。

表2.质粒pZKIIC-YL1K的功能和结构元件

质粒pZKIIC-YL2K含有表达盒以在ACT1启动子(YFL039C基因座)和FBA1终止子(YKL060C基因座)的控制下表达GCY1-L2-DAK1融合多肽。将质粒pZKIIC-YL1K设计成将表达盒整合到酵母属染色体II的345856和350891的位置上。质粒pZKIIC-YL2K的功能和结构组成与如表2所述的确切相同，除了表达盒是ACT1启动子::GCY1-L2-DAK1::FBA1终止子。

实例3

带有编码N-末端二羟基丙酮激酶和C-末端甘油脱氢酶的融合基因的质粒的构建

合成的DAK1-L1-GCY1和DAK1-L2-GCY1是融合基因，所述融合基因包括分别通过接头1(SEQ ID NO:3)和接头2(SEQ ID NO:4)融合的密码子优化的二羟基丙酮激酶(DAK1，SEQID NO:1)和甘油脱氢酶(GCY1，SEQ ID NO:2)。融合多肽DAK-L1-GCY1和DAK1-L2-GCY1的氨基酸序列分别通过SEQ ID NO:7和8表示。

质粒pZKIIC-KL1Y和pZKIIC-KL2Y含有表达盒以在ACT1启动子(YFL039C基因座)和FBA1终止子(YKL060C基因座)的控制下表达DAK-L1-GCY1和DAK1-L2-GCY1融合多肽。pZKIIC-KL1Y和pZKIIC-KL2Y二者均设计成将表达盒整合到酵母属染色体II的345856和350891的位置上。质粒pZKIIC-KL1Y和pZKIIC-KL2Y的功能和结构组成与如表2所述的确切相同，除了表达盒是ACT1启动子::DAK1-L1-GCY1::FBA1终止子(在质粒pZKIIC-KL1Y中)和ACT1启动子::DAK1-L2-GCY1::FBA1终止子(在pZKIIC-KL2Y中)。

实例4

具有作为单个基因的GCY1和DAK1的质粒pZKIIC-HYWK

将质粒pZKIIC-HYWK设计为用于测试用于以上所述的GCY1-DAK1双功能融合蛋白的表达的质粒的作用的对照。pZKIIC-HYWK含有两个表达盒。单独地控制密码子优化的GCY1和DAK1的表达。GCY1的表达在HXT3启动子和FBA1终止子的控制下进行，但密码子优化的DAK1的表达在CWP2启动子(YKL096W-A基因座)和PGK1终止子(YCR012W基因座)的控制下进行。RNAseq数据(参见，例如Wang,Z.等人(2009)Nature Rev.Gen.[自然综述基因]10:57-63)表明HXT3和CWP2启动子的转录活性比用于GCY1和DAK1融合基因的表达的ACT1启动子强的多。将质粒pZKIIC-HYWK设计成将两个表达盒整合到酵母属染色体II的345856和350891的位置上。质粒pZKIIC-HYWK的功能和结构组成在表3中描述。

表3.质粒pZKIIC-HYWK的功能和结构元件

实例5

生成具有ura3基因型的FG-ura3菌株

酿酒酵母菌株FERMAX^TM Gold Label(玛翠公司(Martrex,Inc.)，明尼苏达州，美国；下文中缩写为“FG”)在细粒乙醇工业中是众所周知的，并且用作亲本“野生型”菌株以制备本发明的工程化酵母。

将质粒pTOPO II-Blunt ura3-loxP-KanMX-loxP-ura3设计成用突变的ura3和URA3-loxP-TEFp-KanMX-TEFt-loxP-URA3片段替代菌株FG中的URA3基因。质粒的功能和结构元件在表4中列出。

表4.pTOPO II-Blunt ura3-loxP-KanMX-loxP-ura3的功能/结构元件

含有ura3-loxP-KanMX-loxP-ura3盒的2,018-bp DNA片段通过EcoRI消化从质粒TOPO II-Blunt ura3-loxP-KanMX-loxP-ura3释放(图1)。通过电穿孔使用所述片段转化酿酒酵母FG细胞。能够在含有G418的培养基上生长的转化的菌落在含有20μg/ml尿嘧啶和2mg/ml 5-氟乳清酸(5-FOA)的合成小型板上划线。通过SD-Ura板上表型的生长和通过PCR进一步确认能够在5-FOA板上生长的菌落的URA3缺失。ura3缺失转化体不能在SD-Ura板上生长。用测试引物获得单个1.98-kb PCR片段。相比之下，使用来自亲本FG菌株的DNA，相同的引物对生成1.3-kb片段，从而指示完整ura3基因的存在。ura3缺失菌株命名为FG-KanMX-ura3。

为了从菌株FG-KanMX-ura3去除KanMX表达盒，使用质粒pGAL-Cre-316通过电穿孔用于转化菌株FG-KanMX-ura3的细胞。使用此质粒的目的是暂时表达Cre酶，这样使得LoxP夹层KanMX基因将从菌株FG-KanMX-ura3去除以生成菌株FG-ura3。pGAL-Cre-316是随后从菌株FG-ura3去除的自我复制的环状质粒。来自pGAL-cre-316的所有序列元件均不插入到菌株FG-ura3基因座中。质粒pGAL-Cre-316的功能和结构元件在表5中列出。

表5.pGAL-Cre-316的功能和结构元件。

将转化的细胞铺板在SD-Ura板上。将单个菌落转移到YPG板上，并且在30℃孵育2至3天。然后将菌落转移到新的YPD板，额外持续2天。最后，将来自YPD板的细胞悬浮液点样在以下板上：YPD，G418(150μg/ml)，5-FOA(2mg/ml)和SD-Ura。选择能够在YPD和5-FOA上生长并且不能够在G418和SD-Ura板上生长的细胞用于如上所述的PCR确认。预期的PCR产物大小是0.4-kb，并且确认衍生自FG-KanMX-ura3的KanMX(遗传霉素)敏感性ura3缺失菌株的身份。此菌株命名为FG-ura3。

实例7

生成表达GCY1和DAK1为融合多肽或单独多肽的菌株

使用FG-ura3菌株作为亲本酵母用于引入以上所述的GCY1和DAK1基因。用以下物质转化细胞：(i)含有来自质粒pZKIIC-YL1K的GCY1-L1-DAK1表达盒的4,776-bp SwaI片段(图2)，(ii)含有来自质粒pZKIIC-YL2K的GCY1-L2-DAK1表达盒的4,731-bp SwaI片段(图3)，(iii)含有来自质粒pZKIIC-KL1Y的DAK1-L1-GCY1表达盒的4776-bp SwaI片段(图4)，(iv)含有来自质粒pZKIIC-KL2Y的DAK1-L2-GCY1表达盒的4,731-bp SwaI片段(图5)，或(v)含有来自质粒pZKIIC-HYKK的GCY1和DAK1单个表达盒的5,668-bp SwaI片段(图6)。如表6所示选择和命名转化体。

表6.选择的转化体的名称

实例8

AnKom测定中表达GCY1和DAK1为融合多肽或为单独多肽的菌株的比较

为了确认双功能蛋白的益处，在AnKom测定中分析菌株G1424、G1426、G1429、G1430、和G1537的性能，如实例1中所述。关于乙醇、甘油和乙酸生产(以g/L为单位)的性能在表7中示出。

表7.在AnKom测定中比较FG与G1424、G1426、G1429和G1430

菌株	表达的一种或多种转基因	EtOH	甘油	乙酸
					FG	无	143.14	15.96	0.56
G1424	DAK1-L1-GCY1融合蛋白	144.00	15.92	0.75
					G1426	DAK1-L2-GCY1融合蛋白	143.82	15.91	0.72
G1429	GCY1-L1-DAK1融合蛋白	144.33	15.78	0.71
					G1430	GCY1-L2-DAK1融合蛋白	144.00	15.90	0.63

表8.在AnKom测定中比较FG与G1537

菌株	表达的一种或多种转基因	EtOH	甘油	乙酸
					FG	无	143.10	16.23	0.91
G1537	DAK1和GCY1，单个的	143.98	16.53	0.98

尽管GCY1-DAK1融合基因在ACT1启动子的控制下，所述ACT1启动子比用于菌株G1537中的GCY1和DAK1的单个表达的HXT3和CWP2启动子弱的多，但是与G1537菌株增加0.6％相比，用G1424、G1426、G1429、和G1430菌株的乙醇生产分别增加0.6％、0.5％、0.8％、和0.6％。

实例9

编码PKL-PTA双功能融合蛋白的质粒的构建

合成的磷酸转酮酶和磷酸转乙酰酶融合基因1(GvPKL-L1-LpPTA)包括用合成接头L1(SEQ ID NO:3)和短氨基酸序列VTS接合的针对来自阴道加德纳菌(Gardnerellavaginalis(GvPKL))的磷酸转酮酶和来自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum(LpPTA))的磷酸转乙酰酶的密码子优化的编码区，所述短氨基酸序列VTS提供用于添加促进克隆的限制性酶位点的额外的九个核苷酸。所得的融合多肽的氨基酸序列由SEQ ID NO:9表示。

GvPKL-L1-LpPTA的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:9)所示，接头和VTS以粗体和斜体示出：

质粒pZK41W-GLAF12含有三个盒以表达GvPKL-L1-LpPTA融合多肽、来自Desulfospira joergensenii的乙酰化乙醛脱氢酶(DjAADH)、和来自鬃毛甲烷菌的乙酰辅酶A合酶(McACS)。DjAADH和McACS两者均进行密码子优化。GvPKL-L1-LpPTA的表达在HXT3启动子和FBA1终止子的控制下进行。DjAADH的表达在TDH3启动子和ENO2终止子的控制下进行。McACS的表达在PDC1启动子和PDC1终止子的控制下进行。将质粒pZK41W-GLAF12设计成将三个表达盒整合到YHL041W基因座下游的酵母属染色体中。质粒pZK41W-GLAF12的功能和结构组成在表9中描述。

表9.质粒pZK41W-GLAF12的功能和结构元件

实例10

生成表达PKL和PTA为融合多肽的菌株

使用FG-ura3菌株(实例5)作为亲本以引入以上所述的GvPKL-L1-LpPTA基因。用含有用于PKL途径的表达盒的pZK41W-GLAF12的12,372-bp SwaI片段转化细胞(图7)。如表10所示选择和命名转化体。

表10.选择的转化体的名称

实例11

表达PKL-PTA双功能融合多肽的酵母的分析

为了确认双功能GvPKL-L1-LpPTA多肽的益处，在AnKom测定中精确地分析菌株G176和其亲本菌株FG的性能，如实例1中所述。关于乙醇、甘油和乙酸生产(以g/L为单位)的性能在表11中示出。

表11.在AnKom测定中比较FG与G176

G176菌株的乙醇生产增加超过其亲本FG菌株约5.8％。

实例12

生成表达GvPKL-L1-LpPTA以及表达GCY1和DAK1为融合多肽或为单独多肽的菌株

通过用以下任一项转化具有GvPKL-L1-LpPTA融合的菌株来构建表达GvPKL-L1-LpPTA融合蛋白以及表达融合或非融合的GCY1和DAK1基因的酵母菌株：(i)含有来自质粒pZKIIC-YL1K的GCY1-L1-DAK1表达盒的4,776-bp SwaI片段(图2)，(ii)含有来自质粒pZKIIC-YL2K的GCY1-L2-DAK1表达盒的4,731-bp SwaI片段(图3)，(iii)含有来自质粒pZKIIC-KL1Y的DAK1-L1-GCY1表达盒的4776-bp SwaI片段(图4)，(iv)含有来自质粒pZKIIC-KL2Y的DAK1-L2-GCY1表达盒的4,731-bp SwaI片段(图5)，或(v)含有来自质粒pZKIIC-HYKK的GCY1和DAK1单个表达盒的5,668-bp SwaI片段(图6)。如表12所示选择和命名转化体。所有菌株表达GvPKL-L1-LpPTA融合蛋白。

表12.选择的转化体的名称

实例9

在AnKom测定中，表达GvPKL-L1-LpPTA以及表达GCY1和DAK1为融合多肽或单独多肽的菌株的比较

为了确认在表达GvPKL-L1-LpPTA、DjAADH、和McACS的菌株G176中的GCY1-DAK1双功能蛋白的益处，在AnKom测定中分析菌株G1272、G1275、G1277、G1280、和G1532的性能，如实例1中所述。关于乙醇、甘油和乙酸生产(以g/L为单位)的性能在表13和表14中示出。

表13.在AnKom测定中比较G176与G1272、G1275、G1277、G1280

尽管GCY1-DAK1融合基因在ACT1启动子的控制下，所述ACT1启动子比用于菌株G1532中的GCY1和DAK1的单个表达的HXT3和CWP2启动子弱的多(参见下文)，但是用G1272、G1275、G1277、和G1280菌株的乙醇生产分别比其亲本菌株G176增加约1.3％、1.7％、1.2％、和1.5％。这些观察到的差异是在实例8中观察到的差异的约两倍，其中亲本酵母是FG菌株，这表明GCY1-DAK1双功能融合多肽赋予额外地带有外源磷酸转酮酶途径的工程化的酵母更大的益处。

表14.在AnKom测定中比较G176与G1532

G1532菌株的乙醇生产比其亲本菌株G176增加约0.8％，这表明GCY1和DAK1蛋白的过表达分别增加额外地带有外源磷酸转酮酶途径的工程化的酵母的乙醇生产。然而，与GCY1-DAK1多肽的过表达相比，在这类工程化酵母中GCY1-DAK1双功能融合多肽的表达分别地赋予约2倍多的益处。

Claims

1.一种融合多肽，所述融合多肽包含与具有二羟基丙酮激酶活性的第二氨基酸序列融合的具有甘油脱氢酶活性的第一氨基酸序列，其中当在酵母细胞中表达时，所述融合多肽能够将甘油转化为二羟基丙酮磷酸。

2.如权利要求1所述的融合多肽，其中所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列经由接头肽融合。

3.如权利要求1或2所述的融合多肽，其中所述第一氨基酸序列存在于所述融合多肽的N-末端处，并且所述第二氨基酸序列存在于所述融合多肽的C-末端处。

4.如权利要求1或2所述的融合多肽，其中所述第二氨基酸序列存在于所述融合多肽的N-末端处，并且所述第一氨基酸序列存在于所述融合多肽的C-末端处。

5.如前述权利要求中任一项所述的融合多肽，其中所述第一氨基酸序列是来自酵母属物种(Saccharomyces sp.)的甘油脱氢酶或其结构上或功能上的同源物。

6.如前述权利要求中任一项所述的融合多肽，其中所述第二氨基酸序列是来自酵母属物种的二羟基丙酮激酶或其结构上或功能上的同源物。

7.一种DNA序列，所述DNA序列编码如前述权利要求中任一项所述的融合多肽，与不带有所述DNA序列的亲本酵母相比，基于mRNA水平,与GCY1或DAK1之一或二者的单个表达水平相比，所述DNA序列任选地能过表达所述融合多肽。

8.酵母细胞，所述酵母细胞包含如权利要求7所述的DNA序列。

9.酵母细胞，所述酵母细胞表达或过表达如权利要求1-8中任一项所述的融合多肽。

10.如权利要求9所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞进一步包含外源磷酸转酮酶途径。

11.如权利要求9或10中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞进一步包含在甘油途径和/或乙酰辅酶A途径中的改变。

12.如权利要求9-11中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞不额外地过表达具有甘油脱氢酶活性和/或二羟基丙酮激酶活性的单独多肽。

13.经修饰的酵母细胞，所述经修饰的酵母细胞包含导致细胞过表达具有甘油脱氢酶活性的多肽并过表达具有二羟基丙酮激酶活性的多肽的基因修饰，并且所述经修饰的酵母细胞进一步包含外源磷酸转酮酶途径。

14.如权利要求13所述的经修饰的酵母细胞，其中所述具有甘油脱氢酶活性的多肽和所述具有二羟基丙酮激酶活性的多肽作为能够将甘油转化为二羟基丙酮磷酸的双功能融合多肽生产。

15.如权利要求13或14所述的经修饰的酵母细胞，其中与其他未经修饰的或亲本酵母相比，所述酵母产生降低量的二羟基丙酮。

16.如权利要求13-15中任一项所述的经修饰的酵母细胞，所述经修饰的酵母进一步包含甘油途径和/或乙酰辅酶A途径中的改变。

17.如权利要求13-16中任一项所述的经修饰的酵母，所述经修饰的酵母进一步包含编码碳水化合物加工酶的外源基因。

18.如权利要求13-17中任一项所述的经修饰的酵母细胞，其中所述酵母细胞来自酵母属物种。

19.一种用于在碳水化合物底物发酵期间通过酵母细胞增加醇生产的方法，所述方法包括使所述碳水化合物底物与具有外源磷酸转酮酶途径且产生具有甘油脱氢酶活性的多肽和具有二羟基丙酮激酶活性的多肽的经修饰的酵母细胞接触，其中与不产生具有甘油脱氢酶活性的多肽和/或具有二羟基丙酮激酶活性的多肽的酵母细胞相比，所述经修饰的酵母细胞在发酵期间产生增加量的乙醇。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述经修饰的酵母细胞是如权利要求9-11中任一项所述的酵母细胞。

21.如权利要求19或20中任一项所述的方法，其中所述具有甘油脱氢酶活性的多肽和具有二羟基丙酮激酶活性的多肽作为能够将甘油转化为二羟基丙酮磷酸的双功能融合多肽表达。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述双功能融合多肽是如权利要求1-6中任一项所述的融合多肽。