CN102333866A - 生产异戊二烯和共同产物的方法 - Google Patents

生产异戊二烯和共同产物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明的特征在于从培养的细胞生产异戊二烯和共同产物例如乙醇、1，3-丙二醇、或氢的方法。本发明还提供了包括这些培养的细胞的组合物。本发明提供了包含异戊二烯和乙醇、异戊二烯和1，3-丙二醇、以及异戊二烯和氢的组合物。另外，本发明提供了通过在适合于共同生产异戊二烯和乙醇、异戊二烯和1，3-丙二醇、以及异戊二烯和氢的条件下培养细胞而共同生产异戊二烯和乙醇、异戊二烯和1，3-丙二醇、以及异戊二烯和氢的方法。

Description

生产异戊二烯和共同产物的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2008年12月30日提交的美国临时专利申请号61/141,652和2009年6月17日提交的美国临时专利申请号61/187,934的优先权，其公开内容通过引用方式全文并入本文。
背景技术
异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)是用于多种合成聚合物、特别是合成橡胶的关键起始材料。多种微生物、植物和动物物种天然地产生异戊二烯。具体地，已经鉴定了异戊二烯的生物合成的两个途径：甲羟戊酸(MVA)途径和非-甲羟戊酸(DXP)途径(图19A和19B)。但是，从天然存在的生物体生产异戊二烯的产率在商业上不具有吸引力。每年从异戊二烯的聚合生产大约800,000吨的顺式-聚异戊二烯；这些聚异戊二烯中大部分用于轮胎和橡胶工业。异戊二烯也经共聚化而用作其它产品例如鞋类、机械产品、医疗产品、体育用品和胶乳中的弹性体。
目前，轮胎和橡胶工业是基于天然和合成橡胶的使用。天然橡胶获自非洲雨林中的橡胶树或植物的乳状汁液。合成橡胶主要是基于丁二烯聚合物。对于这些聚合物，作为乙烯和丙稀生产中的共同产物而获得丁二烯。
虽然可以通过分馏石油来获得异戊二烯，但是该物质的纯化是昂贵且耗时的。碳氢化合物的C5流的石油裂解仅产生大约15％的异戊二烯。因此，需要更经济的用于生产异戊二烯的方法。特别地，需要以足以满足稳健的商业过程的需要的速率、效价和纯度生产异戊二烯的方法。同样需要用于从廉价的起始材料生产异戊二烯的系统。
发明内容
本发明提供了能够在限氧条件下共同生产异戊二烯和共同产物的细胞、限氧培养物中的共同生产异戊二烯和共同产物的细胞、生产异戊二烯和共同产物的方法、以及包含异戊二烯和共同产物的组合物。在一个方面，本文提供了能够在限氧条件下共同生产异戊二烯和选自乙醇、1，3-丙二醇、和氢的共同产物的细胞，所述细胞包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中所述细胞(i)具有大于大约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯平均体积生产率和大于大约0.1mg/L培养液/hr的共同产物平均体积生产率；或(ii)以大约400nmole/gwcm/hr至大约2.0×105nmole/gwcm/hr的速率生产异戊二烯，并且以大约0.01mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr的速率生产共同产物。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸与启动子可操作地连接。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，植物异戊二烯合酶多肽来自银白杨(Populusalba)。在一些实施方式中，细胞还包含编码MVA途径多肽、DXS多肽、或IDI多肽的异源核酸。
在一些实施方式中，MVA途径多肽是上部MVA途径多肽。在一些实施方式中，MVA途径多肽是下部MVA途径多肽。在一些实施方式中，上部MVA途径多肽选自：(i)乙酰乙酰基-辅酶A合酶(硫解酶)多肽；(ii)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A合酶多肽；和(iii)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶多肽。在一些实施方式中，上部MVA途径多肽来自肠球菌属(Enterococcus)。在一些实施方式中，上部MVA途径多肽来自粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。在一些实施方式中，下部MVA途径多肽选自：(i)甲羟戊酸激酶(MVK)；(ii)磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)；(iii)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)；和(iv)异戊烯二磷酸异构酶(IDI)。在一些实施方式中，下部MVA途径多肽是MVK多肽。在一些实施方式中，MVK多肽来自甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)。在一些实施方式中，MVK多肽来自马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)。
在一些实施方式中，共同产物是乙醇。在一些实施方式中，细胞还包含编码参与乙醇发酵的多肽的异源核酸。在一些实施方式中，参与乙醇发酵的多肽是醇脱氢酶B(adhB)多肽、醇脱氢酶E(adhE)多肽、或丙酮酸脱羧酶(pdc)多肽。在一些实施方式中，共同产物是1，3-丙二醇。在一些实施方式中，细胞还包含编码参与甘油途径或1，3-丙二醇途径的多肽的异源核酸。在一些实施方式中，参与甘油途径或1，3-丙二醇途径的多肽是二羟基丙酮磷酸还原酶(DAR1)、甘油-磷酸磷酸酶(GPP2)、甘油脱水酶B1(dhaB1)、甘油脱水酶B2(dhaB2)、甘油脱水酶B3(dhaB3)、dhaX、orfX、orfY、1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)、甘油脱氢酶(dhaD)、或二羟基丙酮激酶(dhaK)。在一些实施方式中，参与甘油途径或1，3-丙二醇途径的多肽是二羟基丙酮磷酸还原酶(DAR1)、甘油-磷酸磷酸酶(GPP2)、甘油脱水酶B1(dhaB1)、甘油脱水酶B2(dhaB2)、甘油脱水酶B3(dhaB3)、dhaX、orfX、和orfY。在一些实施方式中，共同产物是氢。在一些实施方式中，细胞还包含编码氢化酶多肽的异源核酸。在一些实施方式中，氢化酶多肽是铁氧还蛋白-依赖性氢化酶多肽、NADPH-依赖性氢化酶多肽、或氧-耐受性氢化酶多肽。
在另一个方面，本文提供了共同生产异戊二烯和共同产物的方法，所述方法包括：(a)在适于共同生产异戊二烯和共同产物的条件下，培养能够共同生产异戊二烯和选自乙醇、1，3-丙二醇、和氢的共同产物的细胞，其中所述细胞包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸；和(b)共同生产异戊二烯和共同产物，其中所述细胞(i)具有大于大约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯平均体积生产率和大于大约0.1mg/L培养液/hr的共同产物平均体积生产率；或(ii)以大约400nmole/gwcm/hr至大约2.0×105nmole/gwcm/hr的速率生产异戊二烯，并且以大约0.01mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr的速率生产共同产物。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸与启动子可操作地连接。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，植物异戊二烯合酶多肽来自银白杨(Populus alba)。在一些实施方式中，细胞还包含编码MVA途径多肽、DXS多肽、或IDI多肽的异源核酸。
在一些实施方式中，MVA途径多肽是上部MVA途径多肽。在一些实施方式中，MVA途径多肽是下部MVA途径多肽。在一些实施方式中，上部MVA途径多肽选自：(i)乙酰乙酰基-辅酶A合酶(硫解酶)多肽；(ii)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A合酶多肽；和(iii)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶多肽。在一些实施方式中，上部MVA途径多肽来自肠球菌属(Enterococcus)。在一些实施方式中，上部MVA途径多肽来自粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。在一些实施方式中，下部MVA途径多肽选自：(i)甲羟戊酸激酶(MVK)；(ii)磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)；(iii)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)；和(iv)异戊烯二磷酸异构酶(IDI)。在一些实施方式中，下部MVA途径多肽是MVK多肽。在一些实施方式中，MVK多肽来自甲烷八叠球菌属。在一些实施方式中，MVK多肽来自马氏甲烷八叠球菌。
在一些实施方式中，共同产物是乙醇。在一些实施方式中，细胞还包含编码参与乙醇发酵的多肽的异源核酸。在一些实施方式中，参与乙醇发酵的多肽是醇脱氢酶B(adhB)多肽、醇脱氢酶E(adhE)多肽、或丙酮酸脱羧酶(pdc)多肽。在一些实施方式中，共同产物是1，3-丙二醇。在一些实施方式中，细胞还包含编码参与甘油途径或1，3-丙二醇途径的多肽的异源核酸。在一些实施方式中，参与甘油途径或1，3-丙二醇途径的多肽是二羟基丙酮磷酸还原酶(DAR1)、甘油-磷酸磷酸酶(GPP2)、甘油脱水酶B1(dhaB1)、甘油脱水酶B2(dhaB2)、甘油脱水酶B3(dhaB3)、dhaX、orfX、orfY、1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)、甘油脱氢酶(dhaD)、或二羟基丙酮激酶(dhaK)。在一些实施方式中，参与甘油途径或1，3-丙二醇途径的多肽是二羟基丙酮磷酸还原酶(DAR1)、甘油-磷酸磷酸酶(GPP2)、甘油脱水酶B1(dhaB1)、甘油脱水酶B2(dhaB2)、甘油脱水酶B3(dhaB3)、dhaX、orfX、和orfY。在一些实施方式中，共同产物是氢。在一些实施方式中，细胞还包含编码氢化酶多肽的异源核酸。在一些实施方式中，氢化酶多肽是铁氧还蛋白-依赖性氢化酶多肽、NADPH-依赖性氢化酶多肽、或氧-耐受性氢化酶多肽。
在另一个方面，本文提供了限氧培养物中的共同生产异戊二烯和氢的细胞。在一些实施方式中，本发明提供了限氧培养物中的的细胞，其以大于大约400nmole异戊二烯/克湿细胞重/小时(nmole/gwcm/hr)的速率生产异戊二烯并且以大于大约125nmole氢/克湿细胞重/小时(nmole/gwcm/hr)的速率生产氢。在一些实施方式中，细胞包含(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞以大约400nmole/gwcm/hr至大约2.0×105nmole/gwcm/hr的速率生产异戊二烯，并且以大约125nmol/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr的速率生产氢。在一些实施方式中，细胞能够在限氧条件下共同生产异戊二烯和氢。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，细胞还包含编码甲羟戊酸(MVA)途径多肽、1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)多肽、或异戊烯-二磷酸δ-异构酶(IDI)多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码氢化酶多肽的异源核酸。在一些实施方式中，氢化酶多肽是铁氧还蛋白-依赖性氢化酶多肽、NADPH-依赖性氢化酶多肽、或氧-耐受性氢化酶多肽。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于：碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸盐、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生的碳源(例如，水解的生物质碳源)、多肽(例如，微生物或植物蛋白质或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，在氧的存在下在每生产1摩尔异戊二烯摄取0.5摩尔氧的条件下培养细胞。在一些实施方式中，在不存在氧的情况下细胞无氧地生长。
在另一个方面，本文提供了限氧培养物中的共同生产异戊二烯和氢的细胞，其中所述细胞具有大于大约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯平均体积生产率和大于大约0.005mg/L培养液/hr的氢平均体积生产率。在一些实施方式中，本发明提供了限氧培养物中的细胞，所述细胞具有大于大约0.5mg/L培养液/hr的异戊二烯峰值体积生产率和大于大约5mg/L培养液/hr的氢峰值体积生产率。在一些实施方式中，细胞能够在限氧条件下共同生产异戊二烯和氢。在一些实施方式中，细胞包含(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，细胞还包含编码甲羟戊酸(MVA)途径多肽、DXS多肽、或IDI多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码氢化酶多肽的异源核酸。在一些实施方式中，氢化酶多肽是铁氧还蛋白-依赖性氢化酶多肽、NADPH-依赖性氢化酶多肽、或氧-耐受性氢化酶多肽。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于：碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸盐、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生的碳源(例如，水解的生物质碳源)、多肽(例如，微生物或植物蛋白质或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，在氧的存在下在每生产1摩尔异戊二烯摄取0.5摩尔氧的条件下培养细胞。在一些实施方式中，在不存在氧的情况下细胞无氧地生长。
在另一个方面，本文提供了限氧培养物中的共同生产异戊二烯和氢的细胞，其中所述细胞将细胞培养基中大于大约0.002摩尔％的碳转化为异戊二烯，并且以相当于大于大约0.024摩尔％的所述细胞从细胞培养基中消耗的碳的量生产氢。在一些实施方式中，细胞能够在限氧条件下共同生产异戊二烯和氢。在一些实施方式中，细胞包含(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，细胞还包含编码甲羟戊酸(MVA)途径多肽、DXS多肽、或IDI多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码氢化酶多肽的异源核酸。在一些实施方式中，氢化酶多肽是铁氧还蛋白-依赖性氢化酶多肽、NADPH-依赖性氢化酶多肽、或氧-耐受性氢化酶多肽。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于：碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸盐、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生的碳源(例如，水解的生物质碳源)、多肽(例如，微生物或植物蛋白质或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，在氧的存在下在每生产1摩尔异戊二烯摄取0.5摩尔氧的条件下培养细胞。在一些实施方式中，在不存在氧的情况下细胞无氧地生长。
在另一个方面，本文提供了限氧培养物中的共同生产异戊二烯和氢的细胞，其中所述细胞以下列比例范围生产异戊二烯和氢：至少1摩尔％的异戊二烯/3摩尔％的氢至至少1摩尔％的异戊二烯/4摩尔％的氢。在一些实施方式中，细胞能够在限氧条件下共同生产异戊二烯和氢。在一些实施方式中，细胞包含(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，细胞还包含编码甲羟戊酸(MVA)途径多肽、DXS多肽、或IDI多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码氢化酶多肽的异源核酸。在一些实施方式中，氢化酶多肽是铁氧还蛋白-依赖性氢化酶多肽、NADPH-依赖性氢化酶多肽、或氧-耐受性氢化酶多肽。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于：碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸盐、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生的碳源(例如，水解的生物质碳源)、多肽(例如，微生物或植物蛋白质或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，在氧的存在下在每生产1摩尔异戊二烯摄取0.5摩尔氧的条件下培养细胞。在一些实施方式中，在不存在氧的情况下细胞无氧地生长。
在另一个方面，本文提供了限氧培养物中的共同生产异戊二烯和氢的细胞，其中所述细胞以大于大约3.6×10-6大气压(等于10μg/L废气)的体积压力生产异戊二烯，并且以大于大约0.55×10-6大气压的体积压力生产氢。在一些实施方式中，细胞以大约3.6×10-6大气压至大约0.45大气压的体积压力生产异戊二烯。在一些实施方式中，细胞以大约0.55×10-6大气压至大约1.0×10-2大气压的体积压力生产氢。在一些实施方式中，细胞能够在限氧条件下共同生产异戊二烯和氢。在一些实施方式中，细胞包含(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，细胞还包含编码甲羟戊酸(MVA)途径多肽、DXS多肽、或IDI多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码氢化酶多肽的异源核酸。在一些实施方式中，氢化酶多肽是铁氧还蛋白-依赖性氢化酶多肽、NADPH-依赖性氢化酶多肽、或氧-耐受性氢化酶多肽。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于：碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸盐、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生的碳源(例如，水解的生物质碳源)、多肽(例如，微生物或植物蛋白质或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，在氧的存在下在每生产1摩尔异戊二烯摄取0.5摩尔氧的条件下培养细胞。在一些实施方式中，在不存在氧的情况下细胞无氧地生长。
在另一个方面，本文提供了限氧培养物中的共同生产异戊二烯和氢的细胞，所述细胞包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中所述细胞：(i)以大于大约400nmole/gwcm/hr的速率生产异戊二烯，并且以大于大约125nmol/gwcm/hr的速率生产氢；(ii)具有大于大约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯平均体积生产率和大于大约0.005mg/L培养液/hr的氢平均体积生产率；或(iii)将大于大约0.002摩尔％的所述细胞从细胞培养基中消耗的碳转化为异戊二烯，并且生产的氢相当于大于大约0.024摩尔％的所述细胞从细胞培养基中消耗的碳。在一些实施方式中，细胞能够在限氧条件下共同生产异戊二烯和氢。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，细胞还包含编码甲羟戊酸(MVA)途径多肽、DXS多肽、或IDI多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码氢化酶多肽的异源核酸。在一些实施方式中，氢化酶多肽是铁氧还蛋白-依赖性氢化酶多肽、NADPH-依赖性氢化酶多肽、或氧-耐受性氢化酶多肽。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于：碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸盐、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生的碳源(例如，水解的生物质碳源)、多肽(例如，微生物或植物蛋白质或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，在氧的存在下在每生产1摩尔异戊二烯摄取0.5摩尔氧的条件下培养细胞。在一些实施方式中，在不存在氧的情况下细胞无氧地生长。
在另一个方面，本文提供了限氧培养物中的共同生产异戊二烯和氢的细胞，所述细胞包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中所述异源核酸与启动子可操作地连接，其中所述细胞以下列比例范围生产异戊二烯和氢：至少1摩尔％的异戊二烯/3摩尔％的氢至至少1摩尔％的异戊二烯/4摩尔％的氢。在一些实施方式中，细胞能够在限氧条件下共同生产异戊二烯和氢。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，细胞还包含编码甲羟戊酸(MVA)途径多肽、DXS多肽、或IDI多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码氢化酶多肽的异源核酸。在一些实施方式中，氢化酶多肽是铁氧还蛋白-依赖性氢化酶多肽、NADPH-依赖性氢化酶多肽、或氧-耐受性氢化酶多肽。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于：碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸盐、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生的碳源(例如，水解的生物质碳源)、多肽(例如，微生物或植物蛋白质或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，在氧的存在下在每生产1摩尔异戊二烯摄取0.5摩尔氧的条件下培养细胞。在一些实施方式中，在不存在氧的情况下细胞无氧地生长。
在另一个方面，本文提供了限氧培养物中的共同生产异戊二烯和2-碳(C2)或3-碳(C3)醇或二醇的细胞。在一些实施方式中，C2-或C3-醇或二醇是乙醇。因此，在一个方面，本文提供了限氧培养物中的共同生产异戊二烯和乙醇的细胞，其中所述细胞具有大于大约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯平均体积生产率和大于大约0.1mg/L培养液/hr的乙醇平均体积生产率。在一些实施方式中，本发明提供了限氧培养物中的细胞，所述细胞具有大于大约0.5mg/L培养液/hr的异戊二烯峰值体积生产率和大于大约0.1mg/L培养液/hr的乙醇峰值体积生产率。在一些实施方式中，细胞能够在限氧条件下共同生产异戊二烯和2-碳(C2)或3-碳(C3)醇或二醇。在一些实施方式中，C2-或C3-醇或二醇是乙醇。在一些实施方式中，细胞包含(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，细胞还包含编码甲羟戊酸(MVA)途径多肽、DXS多肽、或IDI多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码乙醇发酵相关多肽的异源核酸。在一些实施方式中，乙醇发酵相关多肽是醇脱氢酶多肽。在一些实施方式中，乙醇发酵相关多肽是丙酮酸脱羧酶多肽。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于：碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸盐、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生的碳源(例如，水解的生物质碳源)、多肽(例如，微生物或植物蛋白质或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，在氧的存在下在每生产1摩尔异戊二烯摄取0.5摩尔氧的条件下培养细胞。在一些实施方式中，在不存在氧的情况下细胞无氧地生长。
在一些实施方式中，C2-或C3-醇或二醇是1，2-丙二醇。因此，在另一个方面，本文提供了限氧培养物中的共同生产异戊二烯和1，2-丙二醇的细胞，其中所述细胞具有大于大约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯平均体积生产率和大于大约0.1mg/L培养液/hr的1，2-丙二醇平均体积生产率。在一些实施方式中，本发明提供了限氧培养物中的细胞，所述细胞具有大于大约0.5mg/L培养液/hr的异戊二烯峰值体积生产率和大于大约0.1mg/L培 养液/hr的1，2-丙二醇峰值体积生产率。在一些实施方式中，细胞能够在限氧条件下共同生产异戊二烯和2-碳(C2)或3-碳(C3)醇或二醇。在一些实施方式中，C2-或C3-醇或二醇是1，2-丙二醇。在一些实施方式中，细胞包含(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，细胞还包含编码甲羟戊酸(MVA)途径多肽、DXS多肽、或IDI多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码一种或多种参与甘油途径或1，3-丙二醇途径的多肽的异源核酸。在一些实施方式中参与甘油途径或1，3-丙二醇途径的多肽是二羟基丙酮磷酸还原酶(DAR1)、甘油-磷酸磷酸酶(GPP2)、甘油脱水酶B1(dhaB1)、甘油脱水酶B2(dhaB2)、甘油脱水酶B3(dhaB3)、dhaX、orfX、orfY、1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)、甘油脱氢酶(dhaD)、或二羟基丙酮激酶(dhaK)。在一些实施方式中，参与甘油途径或1，3-丙二醇途径的多肽是二羟基丙酮磷酸还原酶(DAR1)、甘油-磷酸磷酸酶(GPP2)、甘油脱水酶B1(dhaB1)、甘油脱水酶B2(dhaB2)、甘油脱水酶B3(dhaB3)、dhaX、orfX、和orfY。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于：碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸盐、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生的碳源(例如，水解的生物质碳源)、多肽(例如，微生物或植物蛋白质或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，在氧的存在下在每生产1摩尔异戊二烯摄取0.5摩尔氧的条件下培养细胞。在一些实施方式中，在不存在氧的情况下细胞无氧地生长。
在一些实施方式中，C2-或C3-醇或二醇是1，3-丙二醇。因此，在另一个方面，本文提供了限氧培养物中的共同生产异戊二烯和1，3-丙二醇的细胞，其中所述细胞具有大于大约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯平均体积生产率和大于大约0.1mg/L培养液/hr的1，3-丙二醇平均体积生产率。在一些实施方式中，本发明提供了限氧培养物中的细胞，所述细胞具有大于大约0.5mg/L培养液/hr的异戊二烯峰值体积生产率和大于大约0.1mg/L培 养液/hr的1，3-丙二醇峰值体积生产率。在一些实施方式中，细胞能够在限氧条件下共同生产异戊二烯和2-碳(C2)或3-碳(C3)醇或二醇。在一些实施方式中，C2-或C3-醇或二醇是1，3-丙二醇。在一些实施方式中，细胞包含(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，细胞还包含编码甲羟戊酸(MVA)途径多肽、DXS多肽、或IDI多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码一种或多种参与甘油途径或1，3-丙二醇途径的多肽的异源核酸。在一些实施方式中，参与甘油途径或1，3-丙二醇途径的多肽是二羟基丙酮磷酸还原酶(DAR1)、甘油-磷酸磷酸酶(GPP2)、甘油脱水酶B1(dhaB1)、甘油脱水酶B2(dhaB2)、甘油脱水酶B3(dhaB3)、dhaX、orfX、orfY、1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)、甘油脱氢酶(dhaD)、或二羟基丙酮激酶(dhaK)。在一些实施方式中，参与甘油途径或1，3-丙二醇途径的多肽是二羟基丙酮磷酸还原酶(DAR1)、甘油-磷酸磷酸酶(GPP2)、甘油脱水酶B1(dhaB1)、甘油脱水酶B2(dhaB2)、甘油脱水酶B3(dhaB3)、dhaX、orfX、和orfY。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于：碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸盐、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生的碳源(例如，水解的生物质碳源)、多肽(例如，微生物或植物蛋白质或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，在氧的存在下在每生产1摩尔异戊二烯摄取0.5摩尔氧的条件下培养细胞。在一些实施方式中，在不存在氧的情况下细胞无氧地生长。
在一些实施方式中，本文提供了共同生产异戊二烯和氢的方法，所述方法包括：(a)在适合于共同生产异戊二烯和氢的条件下培养细胞；和(b)共同生产异戊二烯和氢，其中所述细胞以大于大约400nmole/gwcm/hr的速率生产异戊二烯，并且以大于大约125nmole/gwcm/hr的速率生产氢。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，细胞包含(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞以大约400nmole/gwcm/hr至大约2.0×105nmole/gwcm/hr的速率生产异戊二烯，并且以大约125nmol/gwcm/hr至大约1.25×104nmol/gwcm/hr的速率生产氢。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，细胞还包含编码甲羟戊酸(MVA)途径多肽、DXS多肽、或IDI多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码氢化酶多肽的异源核酸。在一些实施方式中，氢化酶多肽是铁氧还蛋白-依赖性氢化酶多肽、NADPH-依赖性氢化酶多肽、或氧-耐受性氢化酶多肽。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于：碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸盐、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生的碳源(例如，水解的生物质碳源)、多肽(例如，微生物或植物蛋白质或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，在氧的存在下在每生产1摩尔异戊二烯摄取0.5摩尔氧的条件下培养细胞。在一些实施方式中，在不存在氧的情况下细胞无氧地生长。在一些实施方式中，所述方法还包括回收由细胞生产的异戊二烯和氢。在一些实施方式中，所述方法包括纯化由细胞生产的异戊二烯。在一些实施方式中，所述方法包括纯化由细胞生产的氢。在一些实施方式中，所述方法包括使异戊二烯聚合。
在另一个方面，本文提供了共同生产异戊二烯和氢的方法，所述方法包括：(a)在适合于共同生产异戊二烯和氢的条件下培养细胞；和(b)共同生产异戊二烯和氢，其中所述细胞具有大于大约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯平均体积生产率和大于大约0.05mg/L培养液/hr的氢平均体积生产率。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，细胞包含(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞以大于大约0.5mg/L培养液/hr的异戊二烯峰值体积生产率生产异戊二烯，并且以大于大约5mg/L培养液/hr的异戊二烯峰值体积生产率生产氢。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，细胞还包含编码甲羟戊酸(MVA)途径多肽、DXS多肽、或IDI多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码氢化酶多肽的异源核酸。在一些实施方式中，氢化酶多肽是铁氧还蛋白-依赖性氢化酶多肽、NADPH-依赖性氢化酶多肽、或氧-耐受性氢化酶多肽。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于：碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸盐、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生的碳源(例如，水解的生物质碳源)、多肽(例如，微生物或植物蛋白质或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，在氧的存在下在每生产1摩尔异戊二烯摄取0.5摩尔氧的条件下培养细胞。在一些实施方式中，在不存在氧的情况下细胞无氧地生长。在一些实施方式中，所述方法还包括回收由细胞生产的异戊二烯和氢。在一些实施方式中，所述方法包括纯化由细胞生产的异戊二烯。在一些实施方式中，所述方法包括纯化由细胞生产的氢。在一些实施方式中，所述方法包括使异戊二烯聚合。
在另一个方面，本文提供了共同生产异戊二烯和氢的方法，所述方法包括：(a)在适合于共同生产异戊二烯和氢的条件下培养细胞；和(b)共同生产异戊二烯和氢，其中所述细胞将大于大约0.002摩尔％的所述细胞从细胞培养基中消耗的碳转化为异戊二烯，并且生产的氢相当于大于大约0.024摩尔％的所述细胞从细胞培养基中消耗的碳。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，细胞包含(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞以大约400nmole/gwcm/hr至大约2.0×105nmole/gwcm/hr的速率生产异戊二烯，并且以大约125nmol/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr的速率生产氢。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，细胞还包含编码甲羟戊酸(MVA)途径多肽、DXS多肽、或IDI多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码氢化酶多肽的异源核酸。在一些实施方式中，氢化酶多肽是铁氧还蛋白-依赖性氢化酶多肽、NADPH-依赖性氢化酶多肽、或氧-耐受性氢化酶多肽。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于：碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸盐、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生的碳源(例如，水解的生物质碳源)、多肽(例如，微生物或植物蛋白质或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，在氧的存在下在每生产1摩尔异戊二烯摄取0.5摩尔氧的条件下培养细胞。在一些实施方式中，在不存在氧的情况下细胞无氧地生长。在一些实施方式中，所述方法还包括回收由细胞生产的异戊二烯和氢。在一些实施方式中，所述方法包括纯化由细胞生产的异戊二烯。在一些实施方式中，所述方法包括纯化由细胞生产的氢。在一些实施方式中，所述方法包括使异戊二烯聚合。
在另一个方面，本文提供了共同生产异戊二烯和2-碳(C2)或3-碳(C3)醇或二醇的方法。在一些实施方式中，C2-或C3-醇或二醇是乙醇。因此，在一个方面，本文提供了共同生产异戊二烯和乙醇的方法，所述方法包括：(a)在适合于共同生产异戊二烯和乙醇的条件下培养细胞；和(b)共同生产异戊二烯和乙醇，其中所述细胞具有大于大约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯平均体积生产率和大于大约0.1mg/L培养液/hr的乙醇平均体积生产率。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，细胞包含(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞以大于大约0.5mg/L培养液/hr的异戊二烯峰值体积生产率生产异戊二烯，并且以大于大约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯峰值体积生产率生产乙醇。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，细胞还包含编码甲羟戊酸(MVA)途径多肽、DXS多肽、或IDI多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码乙醇发酵相关多肽的异源核酸。在一些实施方式中，乙醇发酵相关多肽是醇脱氢酶多肽。在一些实施方式中，乙醇发酵相关多肽是丙酮酸脱羧酶多肽。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于：碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸盐、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生的碳源(例如，水解的生物质碳源)、多肽(例如，微生物或植物蛋白质或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，在氧的存在下在每生产1摩尔异戊二烯摄取0.5摩尔氧的条件下培养细胞。在一些实施方式中，在不存在氧的情况下细胞无氧地生长。在一些实施方式中，所述方法还包括回收由细胞生产的异戊二烯和乙醇。在一些实施方式中，所述方法包括纯化由细胞生产的异戊二烯。在一些实施方式中，所述方法包括纯化由细胞生产的乙醇。在一些实施方式中，所述方法包括使异戊二烯聚合。
在一些实施方式中，C2-或C3-醇或二醇是1，2-丙二醇。因此，在一个方面，本文提供了共同生产异戊二烯和1，2-丙二醇的方法，所述方法包括：(a)在适合于共同生产异戊二烯和1，2-丙二醇的条件下培养细胞；和(b)共同生产异戊二烯和1，2-丙二醇，其中所述细胞具有大于大约0.1mg/L培 养液/hr的异戊二烯平均体积生产率和大于大约0.1mg/L培养液/hr的1，2-丙二醇平均体积生产率。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，细胞包含(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，细胞还包含编码甲羟戊酸(MVA)途径多肽、DXS多肽、或IDI多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码一种或多种参与甘油途径或1，3-丙二醇途径的多肽的异源核酸。在一些实施方式中，参与甘油途径或1，3-丙二醇途径的多肽是二羟基丙酮磷酸还原酶(DAR1)、甘油-磷酸磷酸酶(GPP2)、甘油脱水酶B1(dhaB1)、甘油脱水酶B2(dhaB2)、甘油脱水酶B3(dhaB3)、dhaX、orfX、orfY、1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)、甘油脱氢酶(dhaD)、或二羟基丙酮激酶(dhaK)。在一些实施方式中，参与甘油途径或1，3-丙二醇途径的多肽是二羟基丙酮磷酸还原酶(DAR1)、甘油-磷酸磷酸酶(GPP2)、甘油脱水酶B1(dhaB1)、甘油脱水酶B2(dhaB2)、甘油脱水酶B3(dhaB3)、dhaX、orfX、和orfY。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于：碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸盐、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生的碳源(例如，水解的生物质碳源)、多肽(例如，微生物或植物蛋白质或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，在氧的存在下在每生产1摩尔异戊二烯摄取0.5摩尔氧的条件下培养细胞。在一些实施方式中，在不存在氧的情况下细胞无氧地生长。
在一些实施方式中，C2-或C3-醇或二醇是1，3-丙二醇。因此，在一个方面，本文提供了共同生产异戊二烯和1，3-丙二醇的方法，所述方法包括：(a)在适合于共同生产异戊二烯和1，3-丙二醇的条件下培养细胞；和(b)共同生产异戊二烯和1，3-丙二醇，其中所述细胞具有大于大约0.1mg/L培 养液/hr的异戊二烯平均体积生产率和大于大约0.1mg/L培养液/hr的1，3-丙二醇平均体积生产率。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，细胞包含(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。在一些实施方式中，细胞还包含编码甲羟戊酸(MVA)途径多肽、DXS多肽、或IDI多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码一种或多种参与甘油途径或1，3-丙二醇途径的多肽的异源核酸。在一些实施方式中，参与甘油途径或1，3-丙二醇途径的多肽是二羟基丙酮磷酸还原酶(DAR1)、甘油-磷酸磷酸酶(GPP2)、甘油脱水酶B1(dhaB1)、甘油脱水酶B2(dhaB2)、甘油脱水酶B3(dhaB3)、dhaX、orfX、orfY、1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)、甘油脱氢酶(dhaD)、或二羟基丙酮激酶(dhaK)。在一些实施方式中，参与甘油途径或1，3-丙二醇途径的多肽是二羟基丙酮磷酸还原酶(DAR1)、甘油-磷酸磷酸酶(GPP2)、甘油脱水酶B1(dhaB1)、甘油脱水酶B2(dhaB2)、甘油脱水酶B3(dhaB3)、dhaX、orfX、和orfY。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于：碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸盐、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生的碳源(例如，水解的生物质碳源)、多肽(例如，微生物或植物蛋白质或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，在氧的存在下在每生产1摩尔异戊二烯摄取0.5摩尔氧的条件下培养细胞。在一些实施方式中，在不存在氧的情况下细胞无氧地生长。
在本文描述的多个方面中的任一的一些实施方式中，MVA途径多肽是上部MVA途径多肽。在一些实施方式中，MVA途径多肽是下部MVA途径多肽。在一些实施方式中，上部MVA途径多肽选自(i)乙酰乙酰基-辅酶A合酶(硫解酶)多肽；(ii)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A合酶多肽；和(iii)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶多肽。在一些实施方式中，上部MVA途径多肽来自肠球菌属(Enterococcus)。在一些实施方式中，上部MVA途径多肽来自粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。在一些实施方式中，下部MVA途径多肽选自：(i)甲羟戊酸激酶(MVK)；(ii)磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)；(iii)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)；和(iv)异戊烯二磷酸异构酶(IDI)。在一些实施方式中，下部MVA途径多肽是MVK多肽。在一些实施方式中，MVK多肽来自甲烷八叠球菌属。在一些实施方式中，MVK多肽来自马氏甲烷八叠球菌。
在另一方面，本文提供了包含异戊二烯和氢的组合物。在一些实施方式中，所述组合物包含下列比例范围的异戊二烯和氢：至少1摩尔％的异戊二烯/3摩尔％的氢至至少1摩尔％的异戊二烯/4摩尔％的氢。在一些实施方式中，组合物还包含1-11摩尔％的异戊二烯和4-44摩尔％的氢。在一些实施方式中，组合物还包含氧、二氧化碳、或氮。在一些实施方式中，组合物还包含0-21摩尔％的氧、18-44摩尔％的二氧化碳、和0-78摩尔％的氮。在一些实施方式中，组合物还包含等于或小于1.0×10-4摩尔％的非甲烷挥发性杂质。在一些实施方式中，非甲烷挥发性杂质包括下列一项或多项：2-庚酮，6-甲基-5-庚烯-2-酮，2，4，5-三甲基吡啶，2，3，5-三甲基吡嗪，香茅醛，乙醛，甲硫醇，乙酸甲酯，1-丙醇，二乙酰，2-丁酮，2-甲基-3-丁烯-2-醇，乙酸乙酯，2-甲基-1-丙醇，3-甲基-1-丁醛，3-甲基-2-丁酮，1-丁醇，2-戊酮，3-甲基-1-丁醇，异丁酸乙酯，3-甲基-2-丁烯醛，乙酸丁酯，3-甲基丁基乙酸酯，3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯，3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯，(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯，(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯，2，3-环庚烯醇吡啶，3-己烯-1-醇，3-己烯-1-基乙酸酯，柠檬烯，香叶醇(反式-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇)和香茅醇(3，7-二甲基-6-辛烯-1-醇)或线性异戊二烯聚合物(例如源自多个异戊二烯单元的聚合的线性异戊二烯二聚体或线性异戊二烯三聚体)。在一些实施方式中，非甲烷挥发性杂质包括下列一项或多项：异戊二烯组合物包括下列一项或多项：醇、醛、酯或酮(例如本文中描述的醇、醛、酯或酮中的任意项)。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包括(i)醇和醛；(ii)醇和酮；(iii)醛和酮；或(iv)醇、醛、和酮。在一些实施方式中，非甲烷挥发性杂质包括下列一项或多项：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3-甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇、或吲哚。
应该理解，可以组合本文描述的各个实施方式的一个、一些或全部特异性以形成本发明的其它实施方式。
附图说明
图1是针对在大肠杆菌中的表达进行了密码子优化的野葛(kudzu)异戊二烯合酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。atg起始密码子以斜体表示，终止密码子以加粗字体表示，添加的PstI位点以下划线标示。
图2是pTrcKudzu的图谱。
图3A-C是pTrcKudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。RBS以下划线标示，野葛异戊二烯合酶起始密码子以加粗大写字母表示，终止密码子以加粗大写字母表示。载体骨架是pTrcHis2B。
图4是pETNHisKudzu的图谱。
图5A-C是pETNHisKudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。
图6是pCL-lac-Kudzu的图谱。
图7A-C是pCL-lac-Kudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)。
图8A的图显示了在无载体的大肠杆菌BL21细胞中生产异戊二烯。
图8B的图显示了在具有pCL-lac-Kudzu的大肠杆菌BL21细胞中生产异戊二烯。
图8C的图显示了在具有pTrcKudzu的大肠杆菌BL21细胞中生产异戊二烯。
图8D的图显示了在具有pETN-HisKudzu的大肠杆菌BL21细胞中生产异戊二烯。
图9A的图显示了在14升的补料分批发酵中，大肠杆菌BL21/pTrcKudzu的发酵随时间的OD。
图9B的图显示了在14升的补料分批发酵中，大肠杆菌BL21/pTrcKudzu的发酵随时间生产的异戊二烯。
图10A的图显示了柠檬泛菌(Pantoea citrea)中异戊二烯的生产。对照细胞中无重组野葛异戊二烯合酶。灰色菱形表示异戊二烯的合成，黑色方框表示OD600。
图10B的图显示了表达pCL-lac Kudzu的柠檬泛菌中异戊二烯的生产。灰色菱形表示异戊二烯的合成，黑色方框表示OD600。
图10C的图显示了表达pTrcKudzu的柠檬泛菌中异戊二烯的生产。灰色菱形表示异戊二烯的合成，黑色方框表示OD600。
图11的图显示了表达重组异戊二烯合酶的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中异戊二烯的生产。BG3594comK是无质粒的枯草芽孢杆菌菌株(天然的异戊二烯生产)。CF443是具有pBSKudzu的枯草芽孢杆菌菌株BG3594comK(重组的异戊二烯生产)。y轴上的IS表示异戊二烯。
图12A-C是pBS Kudzu#2的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)。
图13是针对在耶氏酵母属(Yarrowia)中的表达进行了密码子优化的野葛异戊二烯合酶的核苷酸序列(SEQ ID NO：6)。
图14是包含针对在耶氏酵母属中的表达进行了密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的pTrex3g的图谱。
图15A-C是载体pSPZ1(MAP29Spb)的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)。
图16是针对在耶氏酵母属中的表达进行了密码子优化的合成的野葛(越南葛藤(Pueraria montana))异戊二烯基因的核苷酸序列(SEQ IDNO：8)。
图17是合成的杂交白杨(poplar)(银白杨(Populus alba)x欧洲山杨(Populus tremula))异戊二烯合酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)。ATG起始密码子以加粗表示，终止密码子以下划线标示。
图18A显示了载体pYLA1、pYL1和pYL2的构建示意图。
图18B显示了载体pYLA(POP1)的构建示意图。
图18C显示了载体pYLA(KZ1)的构建示意图。
图18D显示了载体pYLI(KZ1)的构建示意图。
图18E显示了载体pYLI(MAP29)的构建示意图。
图18F显示了载体pYLA(MAP29)的构建示意图。
图19A显示了异戊二烯的MVA和DXP代谢途径(基于F.Bouvier等人，Progress in Lipid Res.44：357-429，2005)。以下描述包括该途径中的每种多肽的替代性名称，以及公开了用于测定指明的多肽的活性的测定法的参考文献(这些文献中的每一篇皆通过引用方式全文并入本文，尤其是关于测定MVA和DXP途径中的多肽的多肽活性的测定法的那些)。甲羟戊酸途径：AACT；乙酰基-辅酶A乙酰基转移酶，MvaE，EC2.3.1.9.测定法：J.Bacteriol.，184：2116-2122，2002；HMGS；羟基甲基戊二酰-辅酶A合酶，MvaS，EC 2.3.3.10.测定法：J.Bacteriol.，184：4065-4070，2002；HMGR；3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶，MvaE，EC 1.1.1.34.测定法：J.Bacteriol.，184：2116-2122，2002；MVK；甲羟戊酸激酶，ERG12，EC 2.7.1.36.测定法：Curr Genet 19：9-14，1991.PMK；磷酸甲羟戊酸激酶，ERG8，EC 2.7.4.2，测定法：Mol Cell Biol.，11：620-631，1991；DPMDC；二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，MVD1，EC 4.1.1.33.测定法：Biochemistry，33：13355-13362，1994；IDI；异戊烯-二磷酸δ-异构酶，IDI1，EC 5.3.3.2.Assay：J.Biol.Chem.264：19169-19175，1989.DXPPathway：DXS；1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶，dxs，EC 2.2.1.7.测定法：PNAS，94：12857-62，1997；DXR；1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶，dxr，EC 2.2.1.7.测定法：Eur.J.Biochem.269：4446-4457，2002；MCT；4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合酶，IspD，EC 2.7.7.60.测定法：PNAS，97：6451-6456，2000；CMK；4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶，IspE，EC 2.7.1.148.测定法：PNAS，97：1062-1067，2000；MCS；2C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸合酶，IspF，EC 4.6.1.12.测定法：PNAS，96：11758-11763，1999；HDS；1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶，ispG，EC 1.17.4.3.测定法：J.Org.Chem.，70：9168-9174，2005；HDR；1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶，IspH，EC 1.17.1.2.测定法：JACS，126：12847-12855，2004。
图19B显示了经典的和修饰的MVA途径。1，乙酰基-辅酶A乙酰基转移酶(AACT)；2，HMG-CoA合酶(HMGS)；3，HMG-CoA还原酶(HMGR)；4，甲羟戊酸激酶(MVK)；5，磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)；6，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD或DPMDC)；7，异戊烯二磷酸异构酶(IDI)；8，磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)；9，异戊烯磷酸激酶(IPK)。经典的MVA途径从反应1开始，经过反应5和6一直到达反应7，而修饰的MVA途径经过翻译8和9。结构式中的P和PP分别是磷酸和焦磷酸。该图取自Koga和Morii，Microbiology and Mol.Biology Reviews，71：97-120，2007，该文献通过引用方式全文并入本文，尤其是关于修饰的MVA途径的核酸和多肽的部分。修饰的MVA途径存在于例如一些古细菌中，例如马氏甲烷八叠球菌。
图20中的图显示了由不含(左侧)或含有(右侧)野葛异戊二烯合酶基因的重组解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)菌株生产的异戊二烯的GC-MS分析的结果。箭头表示真实的异戊二烯标准物的洗脱时间。
图21是pTrcKudzu yIDI DXS Kan的图谱。
图22A-D是pTrcKudzu yIDI DXS Kan的核苷酸序列(SEQ IDNO：10)。
图23A的图显示了在BL21/pTrcKudzukan中，从葡萄糖生产异戊二烯。时间0是以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆形代表总的异戊二烯生产率(μg/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。
图23B的图显示了在BL21/pTrcKudzu yIDI kan中，从葡萄糖生产异戊二烯。时间0是以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆形代表总的异戊二烯生产率(μg/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。
图23C的图显示了在BL21/pTrcKudzu DXS kan中，从葡萄糖生产异戊二烯。时间0是以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆形代表总的异戊二烯生产率(μg/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。
图23D的图显示了在BL21/pTrcKudzu yIDI DXS kan中，从葡萄糖生产异戊二烯。时间0是以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆形代表总的异戊二烯生产率(μg/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。
图23E的图显示了在BL21/pCL PtrcKudzu中，从葡萄糖生产异戊二烯。时间0是以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆形代表总的异戊二烯生产率(μg/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。
图23F的图显示了在BL21/pCL PtrcKudzu yIDI中，从葡萄糖生产异戊二烯。时间0是以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆形代表总的异戊二烯生产率(μg/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。
图23G的图显示了在BL21/pCL PtrcKudzu DXS中，从葡萄糖生产异戊二烯。时间0是以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆形代表总的异戊二烯生产率(μg/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。
图23H的图显示了在BL21/pTrcKudzuIDIDXSkan中，从葡萄糖生产异戊二烯。箭头指示以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。黑色菱形代表OD600，黑色三角形代表异戊二烯生产率(μg/L)，白色方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。
图24是pTrcKKDyIkIS kan的图谱。
图25A-D是pTrcKKDyIkIS kan的核苷酸序列(SEQ ID NO：11)。
图26是pCL PtrcUpperPathway的图谱。
图27A-27D是pCL PtrcUpperPathway的核苷酸序列(SEQ IDNO：12)。
图28显示了包含下部MVA途径和用于整合进入枯草芽孢杆菌染色体的nprE基因座的酵母idi的盒的图谱。nprE上游/下游表示距离nprE基因座各1kb的序列以用于整合。aprE启动子(碱性丝氨酸蛋白酶启动子)表示aprE基因的启动子(-35，-10，+1转录起始位点，RBS)。MVK1表示酵母甲羟戊酸激酶基因。RBS-PMK表示在起始位点上游具有芽孢杆菌RBS的酵母磷酸甲羟戊酸激酶基因。RBS-MPD表示在起始位点上游具有芽孢杆菌RBS的酵母二磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因。RBS-IDI表示在起始位点上游具有芽孢杆菌RBS的酵母idi基因。终止子表示来自解淀粉芽孢杆菌(B.amyliquefaciens)的终止子碱性丝氨酸蛋白酶转录终止子。SpecR表示壮观霉素抗性标志物。“用于扩增的nprE上游重复序列”表示用于扩增的上游区的直接重复序列。
图29A-D是含有下部MVA途径和用于整合进入枯草芽孢杆菌染色体的nprE基因座的酵母idi的盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：13)。
图30是p9796-poplar的图谱。
图31A-B是p9796-poplar的核苷酸序列(SEQ ID NO：14)。
图32是pTrcPoplar的图谱。
图33A-C是pTrcPoplar的核苷酸序列(SEQ ID NO：15)。
图34是pTrcKudzu yIDI Kan的图谱。
图35A-C是pTrcKudzu yIDI Kan的核苷酸序列(SEQ ID NO：16)。
图36是pTrcKudzuDXS Kan的图谱。
图37A-C是pTrcKudzuDXS Kan的核苷酸序列(SEQ ID NO：17)。
图38是pCL PtrcKudzu的图谱。
图39A-C是pCL PtrcKudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO：18)。
图40是pCL PtrcKudzu A3的图谱。
图41A-C是pCL PtrcKudzu A3的核苷酸序列(SEQ ID NO：19)。
图42是pCL PtrcKudzu yIDI的图谱。
图43A-C是pCL PtrcKudzu yIDI的核苷酸序列(SEQ ID NO：20)。
图44是pCL PtrcKudzu DXS的图谱。
图45A-D是pCL PtrcKudzu DXS的核苷酸序列(SEQ ID NO：21)。
图46A-E的图显示了从生物质原料生产异戊二烯。图板A显示了从玉米秸秆生产异戊二烯，图板B显示了从甘蔗渣生产异戊二烯，图板C显示了从软木浆生产异戊二烯，图板D显示了从葡萄糖生产异戊二烯，图板E显示了不用额外的原料从细胞生产异戊二烯。灰色方框代表在接种后的指明的时间培养物的OD600测量值，黑色三角形代表在接种后的指明的时间异戊二烯的产量。
图47A的图显示了在未添加葡萄糖的培养物中，由BL21(λDE3)pTrcKudzu yIDI DXS(kan)生产的异戊二烯。方框代表OD600，三角形代表生产的异戊二烯(μg/ml)。
图47B的图显示了由BL21(λDE3)pTrcKudzu yIDI DXS(kan)从1％的葡萄糖原料转化糖生产的异戊二烯。方框代表OD600，三角形代表生产的异戊二烯(μg/ml)。
图47C的图显示了由BL21(λDE3)pTrcKudzu yIDI DXS(kan)从1％的转化糖原料生产的异戊二烯。方框代表OD600，三角形代表生产的异戊二烯(μg/ml)。
图47D的图显示了由BL21(λDE3)pTrcKudzu yIDI DXS(kan)从1％的AFEX玉米秸秆原料生产的异戊二烯。方框代表OD600，三角形代表生产的异戊二烯(μg/ml)。
图48A-C的图显示了酵母提取物对生产异戊二烯的影响。图板A显示了加入不同量的酵母提取物的发酵器内的光密度的时间进程。图板B显示了加入不同量的酵母提取物的发酵器内的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。图板C显示了酵母提取物对于补料分批培养物中生长的大肠杆菌生产异戊二烯的影响。
图49A-C的图显示了从500L的生物反应器中由含有pTrcKudzu+yIDI+DXS质粒的大肠杆菌细胞生产的异戊二烯。图板A显示了加入了葡萄糖和酵母提取物的500L生物反应器中的光密度的时间进程。图板B显示了加入了葡萄糖和酵母提取物的500L生物反应器的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。图板C显示了从加入了葡萄糖和酵母提取物的500L生物反应器中生产的总的异戊二烯的时间进程。
图50是pJMupperpathway2的图谱。
图51A-C是pJMupperpathway2的核苷酸序列(SEQ ID NO：22)。
图52是pBS Kudzu#2的图谱。
图53A的图显示了在14升的补料分批发酵中，表达重组野葛异戊二烯合酶的芽孢杆菌的发酵时间过程中的生长。黑色菱形代表无重组异戊二烯合酶的对照菌株(BG3594comK)(天然的异戊二烯生产)，灰色三角形代表CF443，即具有pBSKudzu的芽孢杆菌菌株BG3594comK(重组的异戊二烯生产)。
图53B的图显示了在14升的补料分批发酵中，表达重组野葛异戊二烯合酶的芽孢杆菌的发酵时间过程中的异戊二烯生产。黑色菱形代表无重组异戊二烯合酶的对照菌株(BG3594comK)(天然的异戊二烯生产)，灰色三角形代表CF443，即具有pBSKudzu的芽孢杆菌菌株BG3594comK(重组的异戊二烯生产)。
图54是加入了葡萄糖的15L的生物反应器中的光密度的时间进程。
图55是加入了葡萄糖的15L的生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。
图56是从加入了葡萄糖的15L的生物反应器中生产的总的异戊二烯的时间进程。
图57是加入了甘油的15L的生物反应器中的光密度的时间进程。
图58是加入了甘油的15L的生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。
图59是从加入了甘油的15L的生物反应器中生产的总的异戊二烯的时间进程。
图60A-60C是加入了葡萄糖的150L的生物反应器中的光密度、甲羟戊酸效价、和比生产率的时间进程。
图61A-61C是加入了葡萄糖的15L的生物反应器中的光密度、甲羟戊酸效价、和比生产率的时间进程。
图62A-62C是加入了葡萄糖的15L的生物反应器中的光密度、甲羟戊酸效价、和比生产率的时间进程。
图63A-63C是加入了葡萄糖的15L的生物反应器中的光密度、异戊二烯效价、和比生产率的时间进程。
图64A-64C是加入了葡萄糖的15L的生物反应器中的光密度、异戊二烯效价、和比生产率的时间进程。
图65A-65C是加入了葡萄糖的15L的生物反应器中的光密度、异戊二烯效价、和比生产率的时间进程。
图66A-66C是加入了葡萄糖的15L的生物反应器中的光密度、异戊二烯效价、和比生产率的时间进程。
图67A-67C是加入了葡萄糖的15L的生物反应器中的光密度、异戊二烯效价、和比生产率的时间进程。
图68的图是：对于系列A，对于多个氧水平，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。图例中列出的曲线是按照它们在图中出现的顺序。例如，图例中的第一个条目(40℃空气中的异戊二烯)对应于图中最高的曲线。
图69的图是：对于系列B，对于多个氧水平与4％的水，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。图例中列出的曲线是按照它们在图中出现的顺序。
图70的图是：对于系列C，对于多个氧水平与5％的CO2，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。图例中列出的曲线是按照它们在图中出现的顺序。
图71的图是：对于系列D，对于多个氧水平与10％的CO2，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。图例中列出的曲线是按照它们在图中出现的顺序。
图72的图是：对于系列E，对于多个氧水平与15％的CO2，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。图例中列出的曲线是按照它们在图中出现的顺序。
图73的图是：对于系列F，对于多个氧水平与20％的CO2，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。图例中列出的曲线是按照它们在图中出现的顺序。
图74的图是：对于系列G，对于多个氧水平与30％的CO2，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。图例中列出的曲线是按照它们在图中出现的顺序。
图75A的表是：对于系列A，从重量％转化为体积％的CAFT模型结果。
图75B的图是：对于系列A，将图68针对体积％作图，从CAFT模型获得的可燃性结果。
图76A的表是：对于系列B，从重量％转化为体积％的CAFT模型结果。
图76B的图是：对于系列B，将图69针对体积％作图，从CAFT模型获得的可燃性结果。
图77的图显示了可燃性测试的器皿。
图78A的图是测试系列1的可燃性曲线：0％蒸汽(steam)，0psig，40℃。
图78B的表总结了测试系列1的爆炸和非爆炸数据点。
图78C的图是测试系列1的可燃性曲线与CAFT模型的比较。
图79A的图是测试系列2的可燃性曲线：4％蒸汽，0psig，40℃。
图79B的表总结了测试系列2的爆炸和非爆炸数据点。
图79C的图是测试系列2的可燃性曲线与CAFT模型的比较。
图80A-B的表是测试系列1的详细实验条件和结果。
图81的表是测试系列2的详细实验条件和结果。
图82的图是：在3个大气压下，对于多个氮/氧比例，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。
图83的图是：在1个大气压下，对于多个氮/氧比例，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。
图84的图是：使用来自图82的数据，按照实施例13描述的方法构建的可燃性包迹(envelope)。实验数据点(圆圈)来自本文描述的在1个大气压的最初系统压力下进行的测试。
图85的图是：使用来自图83的数据，按照实施例13描述的方法构建的可燃性包迹。实验数据点(圆圈)来自本文描述的在1个大气压的最初系统压力下进行的测试。
图86A是发酵废气的GC/MS色谱图。
图86B是图86A的扩展，以显示存在于发酵废气中的较少的挥发物。
图87A是在-78℃进行低温冷阱后，存在于废气中的痕量挥发物的GC/MS色谱图。
图87B是在-196℃进行低温冷阱后，存在于废气中的痕量挥发物的GC/MS色谱图。
图87C是图87B的扩展。
图87D是图87C的扩展。
图88A-B是GC/MS色谱图，比较了源自汽油的异戊二烯(图88A)与生物生产的异戊二烯(图88B)的C5烃。标准物含有在异戊二烯主峰附近洗脱的3种C5烃杂质(图88A)。与之相反，生物生产的异戊二烯含有某些量的乙醇和丙酮(运行时间为3.41分钟)(图88A)。
图89是表达野葛异戊二烯合酶并进料葡萄糖与3g/L酵母提取物的大肠杆菌BL21(DE3)pTrcIS菌株的发酵废气的分析的图。
图90显示了在结构上与异戊二烯相似并且也可以用作聚合催化剂毒的数种杂质的结构。
图91是pTrcHis2AUpperPathway(也称作pTrcUpperMVA)的图谱。
图92A-92C是pTrcHis2AUpperPathway(也称作pTrcUpperMVA)的核苷酸序列(SEQ ID NO：23)。
图93是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度的时间进程。
图94是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。
图95是进料了葡萄糖的15L生物反应器中生产的总异戊二烯的时间进程。
图96是进料了转化糖的15L生物反应器中的光密度的时间进程。
图97是进料了转化糖的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。
图98是进料了转化糖的15L生物反应器中生产的总异戊二烯的时间进程。
图99是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度的时间进程。
图100是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。
图101是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯比活性的时间进程。
图102是pCLPtrcUpperPathwayHGS2的图谱。
图103A-103C是pCLPtrcUpperPathwayHGS2的核苷酸序列(SEQID NO：24)。
图104是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度的时间进程。
图105是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。
图106是进料了葡萄糖的15L生物反应器中生产的总异戊二烯的时间进程。
图107是质粒MCM330(在attTn7处的FRT-cm-FRT-gi1.2-KKDy)的图谱。
图108A-108C是质粒MCM330的核苷酸序列(SEQ ID NO：25)。
图109是pET24D-Kudzu的图谱。
图110A-B是pET24D-Kudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO：26)。
图111A是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度的时间进程。
图111B是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。
图111C是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯比生产率的时间进程。
图112A是马氏甲烷八叠球菌远古下部途径操纵子的图谱。
图112B-C是马氏甲烷八叠球菌远古下部途径操纵子的核苷酸序列(SEQ ID NO：27)。
图113A是MCM382-pTrcKudzuMVK(mazei)的图谱。
图113B-C是MCM382-pTrcKudzuMVK(mazei)的核苷酸序列(SEQ ID NO：28)。
图114A是来自马氏甲烷八叠球菌远古Lowerin pET200D的MCM376-MVK的图谱。
图114B-C是来自马氏甲烷八叠球菌远古Lowerin pET200D的MCM376-MVK的核苷酸序列(SEQ ID NO：29)。
图115A-115D证明：MVK和异戊二烯合酶的过表达引起异戊二烯产量增加。测定了经过22小时的时间进程，MCM401和MCM343在100mL生物反应器中的葡萄糖中生长过程中(以100和200uM IPTG诱导异戊二烯生产)累积的异戊二烯和CO2。图115A是从MCM343积累的异戊二烯(％)的图。图115B是从MCM401积累的异戊二烯(％)的图。图115C是从MCM343积累的CO2(％)的图。图115D是从MCM401积累的CO2(％)的图。
图116是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度的时间进程。
图117是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。
图118是进料了葡萄糖的15L生物反应器中生产的总异戊二烯的时间进程。
图119是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的总二氧化碳释放率(TCER)或代谢活性谱的图。
图120是进料了葡萄糖的15L生物反应器中生产异戊二烯的过程中的细胞存活性的图。TVC/OD是1mL培养液中的总的活细胞计数(菌落形成单位)/光密度单位(OD550)。
图121是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度的时间进程。
图122是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。
图123是进料了葡萄糖的15L生物反应器中生产的总异戊二烯的时间进程。
图124是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的体积生产率的时间进程。体积生产率定义为每升培养液每小时生产的异戊二烯的量。
图125是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的瞬时产率的时间进程。瞬时产率定义为：数据点之间的时间间隔期间，进料到生物反应器中的每数量的葡萄糖(克)所生产的异戊二烯的量(克)(w/w)。
图126是进料了葡萄糖的15L生物反应器中，总二氧化碳释放速率(TCER)或代谢活性谱的图。
图127是进料了葡萄糖的15L生物反应器中生产异戊二烯的过程中的细胞存活性。TVC/OD是1mL培养液中的总的活细胞计数(菌落形成单位)/光密度单位(OD550)。
图128是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度的时间进程。
图129是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。
图130是从进料了葡萄糖的15L生物反应器生产总异戊二烯的时间进程。
图131是进料了葡萄糖的15L生物反应器中，总二氧化碳释放速率(TCER)或代谢活性谱的图。
图132的图显示：进入到生物反应器中的气流的瞬间降低引起废气中异戊二烯浓度的波峰，其不引起代谢活性(TCER)的显著下降。TCER或代谢活性，是总二氧化碳释放速率。
图133是进料了葡萄糖的15L生物反应器中生产异戊二烯的过程中的细胞存活性的图。TVC/OD是1mL培养液中的总的活细胞计数(菌落形成单位)/光密度单位(OD550)。
图134是进料了葡萄糖的15L生物反应器中光密度的时间进程。垂直虚线表示以1g/L/hr的速率将异戊二烯导入生物反应器时的时间间隔。
图135是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的总二氧化碳释放速率(TCER)或代谢活性谱。垂直虚线表示以1g/L/hr的速率将异戊二烯导入生物反应器时的时间间隔。
图136是进料了葡萄糖的15L生物反应器中生产异戊二烯的过程中的细胞存活性。TVC/OD是1mL培养液中的总的活细胞计数(菌落形成单位)/光密度单位(OD550)。垂直虚线表示以1g/L/hr的速率将异戊二烯导入生物反应器时的时间间隔。
图137A-B是银白杨pET24a的序列：以加粗字母着重显示了异戊二烯合酶基因(SEQ ID NO：30)。
图137C-D是欧洲黑杨(Populus nigra)pET24a的序列：以加粗字体着重显示了异戊二烯合酶基因(SEQ ID NO：31)。
图137E-F是美洲山杨(Populus tremuloides)的pET24a的序列(SEQID NO：32)。
图137G是美洲山杨异戊二烯合酶基因的氨基酸序列(SEQ IDNO：33)。
图137H-I是毛果杨(Populus trichocarpa)pET24a的序列：以加粗字体着重显示了异戊二烯合酶基因(SEQ ID NO：34)。
图137J-K是欧洲山杨×银白杨pET24a的序列：以加粗字体着重显示了异戊二烯合酶基因(SEQ ID NO：35).
图137L是MCM93的图谱，其含有在pCR2.1骨架中的野葛IspS编码序列。
图137M-N是MCM93的序列(SEQ ID NO：36)。
图137O是pET24D-Kudzu的图谱。
图137P-Q是pET24D-Kudzu的序列(SEQ ID NO：37)。
图138是在全细胞顶空测定法中测定的多个白杨物种的异戊二烯合酶表达数据。Y轴是以IPTG诱导的0.2mL培养物生产的异戊二烯的ug/L/OD。
图139是通过DMAPP测定法所测的白杨异戊二烯合酶的相对活性。白杨酶类具有的活性显著高于来自野葛的异戊二烯合酶。白杨[银白杨(alba)x欧洲山杨(tremula)]仅具有痕量(＜1％)活性，未在图中显示。
图140是pDONR221：19430-hybrid_HGS的图谱。
图141是pDONR221：19430-hybrid_HGS的核苷酸序列，为针对酵母进行了密码子优化的野葛异戊二烯合酶的序列(SEQ ID NO：38)。
图142A是pDW14的图谱。
图142B-C是pDW14的完整核苷酸序列(SEQ ID NO：39)。
图143显示了携带pDW14或pYES-DEST52的诱导的INVSc-1菌株。图143A.从以半乳糖诱导的INVSc-1菌株产生的裂解物的4-12％bistris凝胶(Novex，Invitrogen)，其经SimplyBlue SafeStain(Invitrogen)染色。图143B.使用WesternBreeze试剂盒(Invitrogen)对同一菌株的蛋白质印迹分析。泳道如下：1，INVSc-1+pYES-DEST52；2，INVSc-1+pDW14(分离物1)；3，INVSc-1+pDW14(分离物2)。标示出了MW(以kDa表示)(使用SeeBlue Plus2分子量标准物)。
图144显示了携带pDW14或pYES-DEST52的诱导的INVSc-1菌株。图144A.裂解前半乳糖诱导的菌株的OD600。y轴是OD600。图144B.对照和携带异戊二烯合酶的菌株中的异戊二烯合酶顶空的DMAPP测定。比活性计算为μgHG/L/OD。样品如下：对照，INVSc-1+pYES-DEST52；HGS-1，INVSc-1+pDW14(分离物1)；HGS-2，INVSc-1+pDW14(分离物2)。
图145A是密码子优化的异戊二烯合酶fluo-opt2v2的图谱。
图145B是密码子优化的异戊二烯合酶fluo-opt2v2的核苷酸序列(SEQ ID NO：40)。
图146A是pBBR1MCS5的图谱。
图146B-C是pBBR1MCS5的核苷酸序列(SEQ ID NO：41)。
图147A是pBBR5HGSOpt2_2的图谱。
图147B-C是pBBR5HGSOpt2_2的核苷酸序列(SEQ ID NO：42)。
图148是：对于未诱导的、以IPTG(4x50pmol)诱导的或以IPTG(2x100μmol)诱导的菌株MCM401，其CER相对于发酵时间的图。
图149显示了经pH调节的或未经调节的甘蔗溶液中，随着高压灭菌循环数目的函数(1个循环＝30分钟)变化的葡萄糖的浓度。
图150显示了恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)F1和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ATCC13525在葡萄糖、甘蔗、和转化的甘蔗上的生长曲线(OD600随着时间变化)。
图151显示了大肠杆菌BL21(DE3)、MG1655、ATCC11303和B REL606在葡萄糖、甘蔗、和转化的甘蔗上的生长曲线(OD600随着时间变化)。
图152是质粒pET24 P.alba HGS的图谱。
图153A-B是质粒pET24 P.alba HGS的核苷酸序列(SEQ IDNO：43)。
图154是示意图，其显示了用于进行核酸内切酶消化以构建质粒EWL230的限制性位点，以及BspHI与NcoI位点之间的相容性粘末端。
图155是质粒EWL230的图谱。
图156A-B是质粒EWL230的核苷酸序列(SEQ ID NO：44)。
图157是示意图，其显示了用于进行核酸内切酶消化以构建质粒EWL244的限制性位点，以及NsiI与PstI位点之间的相容性粘末端。
图158是质粒EWL244的图谱。
图159A-B是质粒EWL244的核苷酸序列(SEQ ID NO：45)。
图160A是马氏甲烷八叠球菌远古下部途径操纵子的图谱。
图160B-C是马氏甲烷八叠球菌远古下部途径操纵子的核苷酸序列(SEQ ID NO：46)。
图161A是来自马氏甲烷八叠球菌远古Lowerin pET200D的MCM376-MVK的图谱。
图161B-C是来自马氏甲烷八叠球菌远古Lowerin pET200D的MCM376-MVK的核苷酸序列(SEQ ID NO：47)。
图162是质粒pBBRCMPGI1.5-pgl的图谱。
图163A-B是质粒pBBRCMPGI1.5-pgl的核苷酸序列(SEQ IDNO：48)。
图164A-F是由表达马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶、银白杨异戊二烯合酶、和pgl(RHM111608-2)并且生长于15L级别的补料分批培养物中的大肠杆菌菌株生产异戊二烯的图。图164A显示了进料了葡萄糖的15L的生物反应器中的光密度的时间进程。图164B显示了进料了葡萄糖的15L的生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。用于计算异戊二烯的方法：在59小时内累积生产的异戊二烯，在59小时的g/发酵器体积，L[＝]g/L培养液。图164C也显示了进料了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。用于计算异戊二烯的方法：∫(瞬时异戊二烯生产速率，g/L/hr)dt从t＝0至59小时[＝]g/L发酵液。图164D显示了从进料了葡萄糖的15L生物反应器中生产总异戊二烯的时间进程。图164E显示了进料了葡萄糖的15L生物反应器中的体积生产率。图164F显示了进料了葡萄糖的15L生物反应器中的二氧化碳释放速率(CER)或代谢活性谱。
图165A-B的图显示了15L生物反应器中发酵生产的废气的分析。样品A是在64.8小时取样的菌株RM111608-2。样品B是在34.5小时取样的菌株EWL256，即大肠杆菌BL21(DE3)，pCL upper，cmR-gi1.2-yKKDyI，pTrcAlba-mMVK。对于两个样品均在基线(0.95x10-8torr)以上检测到了氢。
图166显示了表达在密封的20ml GC瓶中在SC最简培养基中以不同的碳源生长之前和之后，通过OD600测定的表达经密码子优化的KudzuIspS(DW112)的酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株或表达URA3(DW114)的对照菌株的生长。菌株无氧地生长于0.5％葡萄糖(进入时OD)，然后以额外的1％棉子糖或2％半乳糖无氧地生长48小时(无氧生长后的OD)。A.DW112的生长，其具有半乳糖可诱导的IspS。B.DW114的生长，其具有载体对照。
图167是酿酒酵母菌株生产的顶空气体的未加工的GC痕迹。A.112G-DW112(表达IspS)，在0.5％葡萄糖、2％半乳糖中生长并诱导。B.112R-DW112，在0.5％葡萄糖、1％棉子糖中生长。C.114G-DW114(对照)，在0.5％葡萄糖、2％半乳糖中生长并诱导。D.114R-DW114，在0.5％葡萄糖、1％棉子糖中生长。以圆圈标示出了异戊二烯的唯一可检出的峰值，其在样品112G中。
图168显示了酿酒酵母菌株生产的化合物的未加工的HPLC痕迹。A.112G-DW112(表达IspS)，在0.5％葡萄糖、2％半乳糖中生长并诱导。B.112R-DW112，在0.5％葡萄糖、1％棉子糖中生长。C.114G-DW114(对照)，在0.5％葡萄糖、2％半乳糖中生长并诱导。D.114R-DW114，在0.5％葡萄糖、1％棉子糖中生长。标示出了乙醇峰值。
图169显示了DXP途径和以丙酮酸脱羧酶进行的乙醇发酵途径的示意图。
图170显示了大肠杆菌中丙酮酸附近的反应的示意图。大肠杆菌内源性的酶类以蓝色显示。源自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的酶类以红色显示。箭头上显示的数字是Michaelis-Menten常数(Km)(mM)和按照该顺序的催化速率常数(Kcat)(1/s)。如果仅标示了一个数字，则是Km(mM)。
图171A是质粒pBBR5-Ptrcpdc的图谱；图171B-C是质粒pBBR5-Ptrcpdc的核苷酸序列(SEQ ID NO：148)，其编码在Trc启动子控制下的运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶。
图172A是质粒pDu-39的图谱。图172B-D是质粒pDu-39的核苷酸序列(SEQ ID NO：151)。
图173是质粒pMCM72的图谱。
图174A是质粒pMCM596的图谱。图174B-D是质粒pMCM596的核苷酸序列(SEQ ID NO：154)。
图175是菌株CMP182和菌株CMP183在TM3+0.55葡萄糖+抗生素，+0.1％(方形)或1％(三角形)酵母提取物中的生长曲线。
图176显示了含有0.1％(A)(诱导后5小时)和1％(B)(诱导后2小时)酵母提取物的培养瓶中的乙醇浓度和异戊二烯比生产率(任意单位)。两种产物同时生产。
图177显示了在1％酵母提取物的培养瓶中诱导5小时后的发酵产物。表达pdc的菌株显示出较高的乙醇浓度，这确认了以下事实：pdc被表达并且是活性的。如通过比较ldhA与pdc的Km所预期，一旦pdc被表达，则丙酮酸向乳酸的流动被打断。另外，在表达pdc的菌株中，流向乙醛的碳比流向乙酰基-辅酶A的更多，这导致乙酸的降低。
图178是质粒pDU47-3-pET24a-P.alba(-3)的图谱。
图179A-B是质粒pDU47-3-pET24a-P.alba(-3)的核苷酸序列(SEQID NO：159)。
图180是质粒pBBR-Ppdc-HGS1的图谱。
图181A-B是质粒pBBR-Ppdc-HGS1的序列(SEQ ID NO：160)。
图182显示了由运动发酵单胞菌ZM4，pBBR1-MCS和运动发酵单胞菌ZM4，pBBR1-Ppdc-HGS1生产的异戊二烯。
图183A显示了质粒pDW15的图谱(SEQ ID NO：161)，其表达来自粪肠球菌的上部MVA途径多肽mvaE和mvaS。图183B-D是pDW15的序列。
图184A显示了质粒pSYCO109的图谱。图184B-F是pSYCO109的序列(SEQ ID NO：162)。
图185A显示了质粒pSYCO109F1.1的图谱。图185B-F是pSYCO109F1.1的序列(SEQ ID NO：163)。
图186显示了pgl基因附近的大肠杆菌K12MG1655的染色体架构。括号([])表示相对于大肠杆菌K12MG1655在大肠杆菌BL21中缺失的区域，并且在大肠杆菌菌株CMP241中恢复。加圈的基因是ybgS。正向箭头(→)表示galMR引物(SEQ ID NO：187)的退火位点。反向箭头(←)表示galMF引物(SEQ ID NO：186)的退火位点。
图187A显示了在存在200μM IPTG，存在或不存在125mg/L维生素B12的情况下，由大肠杆菌菌株CMP249生产的甘油和/或1，3-丙二醇。实心的符号：甘油；空心的符号：1，3-PDO。灰色：+B12；黑色：-B12。EFT：过去的发酵时间。图187B显示了在存在200μM IPTG，存在或不存在125mg/L维生素B12的情况下，由大肠杆菌菌株CMP249生产的异戊二烯。灰色：+B12；黑色：-B12。EFT：过去的发酵时间。图187C显示了在存在200μM IPTG，存在或不存在125mg/L维生素B12的情况下，由大肠杆菌菌株CMP249生产的OD谱和葡萄糖消耗。实心的符号：甘油；空心的符号：OD。灰色：+B12；黑色：-B12。EFT：过去的发酵时间。图187D显示了在存在200μM IPTG，存在或不存在125mg/L维生素B12的情况下生长的大肠杆菌菌株CMP249的1，3-丙二醇和甘油的摩尔产率。灰色：+B12；黑色：-B12。EFT：过去的发酵时间。
图188显示了进料了葡萄糖的含有大肠杆菌菌株CMP239的15L生物反应器中的光密度的时间进程。
图189显示了进料了葡萄糖的含有大肠杆菌菌株CMP239的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。异戊二烯效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。用于计算异戊二烯效价的公式：∫(瞬时异戊二烯生产速率，g/L/小时)dt从t＝0至t小时[＝]g/L发酵液。
图190显示了进料了葡萄糖的含有大肠杆菌菌株CMP239的15L生物反应器中生产的总异戊二烯的时间进程。
图191显示了进料了葡萄糖的含有大肠杆菌菌株CMP239的15L生物反应器中的异戊二烯的比生产率。用于计算比生产率水平的公式：(mg异戊二烯t-mg异戊二烯to)/(OD550t＊L培养液t-OD550to＊L发酵液to)/(t-t0)[＝]mg异戊二烯/OD/L/hr。
图192显示了进料了葡萄糖的含有大肠杆菌菌株CMP239的15L生物反应器中的1，3-丙二醇效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的物质的量。用于计算1，3-丙二醇效价的公式：所生产的总物质，g/体积发酵器培养液，L [＝]g/L培养液。
图193显示了进料了葡萄糖的含有大肠杆菌菌株CMP239的15L生物反应器中生产的总1，3-丙二醇的时间进程。
图194显示了进料了葡萄糖的含有大肠杆菌菌株CMP239的15L生物反应器中的1，3-PDO的比生产率。用于计算比生产率水平的公式：(mg1，3-PDOt-mg 1，3-PDOto)/(OD550t＊L培养液t-OD550to＊L培养液to)/(t-t0)[＝]mg异戊二烯/OD/L/hr。
图195显示了进料了葡萄糖的含有大肠杆菌菌株CMP239的15L生物反应器中的甘油效价的时间进程。甘油效价定义为每升发酵液生产的物质的量。用于计算甘油效价的公式：所生产的总物质，g/体积发酵器培养液，L [＝]g/L培养液。
图196显示了进料了葡萄糖的含有大肠杆菌菌株CMP239的15L生物反应器中生产的总甘油的时间进程。
图197显示了进料了葡萄糖的含有大肠杆菌菌株CMP239的15L生物反应器中的甘油的比生产率。用于计算比生产率水平的公式：(mg甘油t-mg甘油to)/(OD550t＊L培养液t-OD550to＊L培养液to)/(t-t0)[＝]mg异戊二烯/OD/L/hr。
具体实施方式
本发明特别提供了用于生产异戊二烯和共同产物的组合物和方法。在一个方面，所述共同产物是氢。在另一个方面，所述共同产物是C2-或C3-醇或二醇。在一些实施方式中，所述C2-或C3-醇或二醇是乙醇。在一些实施方式中，所述C2-或C3-醇或二醇是1，2-丙二醇。在一些实施方式中，所述C2-或C3-醇或二醇是1，3-丙二醇。
本文提供了用于共同生产异戊二烯和氢的限氧培养物中的细胞、通过在适合于共同生产异戊二烯和氢的条件下培养此类细胞而共同生产异戊二烯和氢的方法、以及包含异戊二烯和氢的组合物。在一些实施方式中，组合物还包含氧、二氧化碳、或氮，和1.0×10-4摩尔％或更少的非甲烷挥发性烃。如果需要，可以回收并纯化异戊二烯和氢。可以使回收的异戊二烯聚合以生产合成的橡胶。回收的氢可用于为发酵过程提供能量，从而降低异戊二烯生产成本，减少常规发酵过程中与高氧浓度的积累相关的潜在危害，并减少该过程的总体的“碳足迹”。
现有的用于产生异戊二烯的有氧系统通过甲羟戊酸(“MVA”)途径或1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(“DXP”)途径以氧分子(O2)作为主要的电子受体产生氢气。DXP和MVA途径都起始于葡萄糖，需要氧气输入，并且释放少量的氢气。在目前的异戊二烯峰值生产率(例如～6g/L/hr)下，生产异戊二烯的有氧培养物具有＞200mmol/L/hr的氧摄入速率(“OUR”)。通过MVA途径将葡萄糖转化为氢气溢出需要被处理的过量还原当量，但是将该过量的还原当量释放至O2具有至少两个问题：第一，氢气与O2的组合具有安全隐患；第二，高OUR发酵大量耗费资金和能源。由于过量还原当量代表着潜在的能量，所以，以H2形式捕获那些过量还原当量(而非将其倾倒至O2)将是有用的。此外，所生产的H2可用于为发酵过程提供能量，从而直接降低成本，并间接降低该过程的总体“碳足迹”。已经使用重组大肠杆菌BL21通过批式和持续发酵系统生产了氢。见，例如G.Chittibabu等人，“Feasibility studies on the fermentative hydrogenproduction by recombinant Escherichia coli BL-21，”Process Biochem.41(3)：682-688(2006)，其通过引用方式并入本文，尤其是关于使用重组大肠杆菌BL21通过发酵生产氢的内容。
在细菌系统例如大肠杆菌中，存在至少三个使过量还原当量到达氢化酶的途径。第一，使用内源性细菌酶类，例如大肠杆菌丙酮酸甲酸裂解酶/甲酸脱氢酶/甲酸氢裂解酶/氢化酶-3系统。见，例如GerhardGottschalk“Bacterial Metabolism，”第194-196页(Springer Series inMicrobiology，1st ed.1979)。第二，通过提供异源电子捕获系统，例如甘油醛-3-磷酸氧化还原酶(“GAPOR”)和/或丙酮酸氧化还原酶(“POR”)与铁氧还蛋白氧化还原酶，其偶联异源氢化酶活性，例如铁氧还蛋白依赖性Clostridium acetobutulicum氢化酶A(HydA)。见，例如King等人，(2006)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于通过HydA产生氢和三种HydA相关的成熟酶类(HydE、HydG、和HydF)的内容。第三，通过提供异源电子转移系统，例如，NAD(P)H至NADPH铁氧还蛋白氧化还原酶(NFOR)(见，例如Viet等人，(2008)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于通过NFOR产生氢的内容；另外见PCT公开号wO/2007/089901，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于优化大肠杆菌菌株以生产氢的内容)，或Clostridium kluyveri NADH铁氧还蛋白氧化还原酶(RnfCDGEAB)(Henning Seedorf等人，“The genome ofClostridium kluyveri，a strict anaerobe with unique metabolic features，”Proc.Nat’l Acad.Sci.U.S.A.105(6)：2128-2133(2008)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于NADH铁氧还蛋白氧化还原酶以及关于无氧乙醇-乙酸发酵途径的内容)，其偶联异源氢化酶活性，例如铁氧还蛋白依赖性Clostridium acetobutulicum氢化酶A(HydA)。见，例如King等人，(2006)。
因此，本文提供的用于以H2形式捕获过量还原当量的一个策略包括：工程化细菌系统，以通过无氧发酵生产异戊二烯，并通过表达内源氢化酶系统共同生产氢。例如，可以工程化具有功能性H2流出的生产异戊二烯的大肠杆菌细胞，以表达大肠杆菌氢化酶-3(Hyd-3)多肽、大肠杆菌丙酮酸甲酸裂解酶(“PFL”)、和大肠杆菌甲酸氢裂解酶(FHL)复合物，其在无氧条件下在酸性pH从甲酸和CO2生产氢气(见，例如Akihito Yoshida等人，“Efficient induction of formate hydrogen lyase of aerobically grownEscherichia coli in a three-step biohydrogen production process，”Appl.Microbiol.Biotechnol.74：754-760(2007)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于在大肠杆菌中诱导表达甲酸氢裂解酶的部分)。
本文提供的用于以H2形式捕获过量还原当量的第二个策略包括：工程化杂交系统，以在限氧条件下共同生产异戊二烯和氢。此类系统将共同生产异戊二烯和氢，同时利用比现有的有氧培养条件更少的氧。多数氢化酶在一定程度上是氧敏感性的，然而，可以工程化细菌菌株以表达氧耐受性或氧不敏感性氢化酶，例如，胶状红环菌(Rubrivivax gelatinosus)氢化酶(见，例如P.C.Maness等人，“Characterization of the oxygentolerance of a hydrogenase linked to a carbon monoxide oxidationpathway in Rubrivivax gelatinosus，”Appl.Environ.Microbiol.68(6)：2633-2636(2002)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于胶状红环菌氢化酶的内容)，或真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha)氢化酶(见，例如Burgdorf等人，(2005)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于真氧产碱杆菌氢化酶多肽的内容)。或者，可以使用标准方法和测定法使编码常规的氧敏感性的氢化酶多肽的异源核酸发生突变并通过筛选鉴定O2-耐受性或O2-不敏感性氢化酶突变体(见，例如L.E.Nagy等人，“Application of gene-shuffling for the rapid generation of novel[FeFe]-hydrogenase libraries，”Biotechnol.Letts.29(3)421-430(2007)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于诱变和筛选氧耐受性氢化酶多肽的内容)。
本文提供的用于以H2形式捕获过量还原当量的第三个策略包括：工程化专性厌氧细菌以共同生产异戊二烯和氢。此类系统将在无氧培养物中共同生产异戊二烯和氢。例如，可以工程化转型厌氧菌，例如，以表达甘油醛-3-磷酸氧化还原酶(“GAPOR”)和/或丙酮酸氧化还原酶(“POR”)、铁氧还蛋白氧化还原酶、NADPH铁氧还蛋白氧化还原酶(NFOR)或Clostridium kluyveri NADH铁氧还蛋白氧化还原酶(RnfCDGEAB)，其偶联异源氢化酶活性，例如铁氧还蛋白依赖性Clostridium acetobutulicum氢化酶A(HydA)(见，例如King等人，(2006)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于通过HydA生产氢和三种HydA相关的成熟酶类(HydE、HydG、和HydF)的内容)，或NADPH依赖性Pyrococcus furiosus氢化酶(见例如J.Woodward等人，“Enzymaticproduction of biohydrogen，”Nature 405(6790)：1015-15(2000)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于通过NADPH-依赖性P.furiosus氢化酶产生氢的内容)。
在本文描述的任意策略中，也可以通过阻断非生产性的代谢途径(包括那些生产发酵副产物例如乳酸、乙酸、丙酮酸、乙醇、琥珀酸、和甘油的途径，或那些涉及氢的重新摄取的途径)和通过表达适当组合的氢化酶和/或其他代谢调节蛋白(例如氢化酶成熟蛋白或转录银子)使氢的产率最大化。见，例如Toshinori Maeda等人，“Enhanced hydrogenproduction from glucose by metabolically engineered Escherichia coli，”Appl.Microbiol.Biotechnol.77(4)：879-890(2007)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于产生具有修饰的葡萄糖代谢的大肠杆菌菌株的内容。
在一些实施方式中，C2-或C3-醇或二醇是乙醇。本文提供了用于共同生产异戊二烯和乙醇的在限氧培养物中的细胞，通过在适合于共同生产异戊二烯和乙醇的条件下培养此类细胞而共同生产异戊二烯和乙醇的方法，以及包含异戊二烯的组合物，包含乙醇的组合物，或包含异戊二烯和乙醇的组合物。在一些实施方式中，组合物还包含氧、二氧化碳、或氮，和1.0×10-4摩尔％或更少的非甲烷挥发性烃。如果需要，可以回收并纯化异戊二烯和乙醇。可以使回收的异戊二烯聚合以生产合成的橡胶。回收的乙醇可用于为发酵过程提供能量，从而降低异戊二烯生产成本，减少常规发酵过程中与高乙醇浓度的积累相关的潜在危害，并减少该过程的总体的“碳足迹”。
异戊二烯和乙醇的共同生产提供了增大通过DXP途径从葡萄糖生产异戊二烯的理论产率的方法，因为生产乙醇过程中产生的ATP可在该途径中用于制备异戊二烯。此外，该过程将无氧地进行，从而降低用于氧气转运的资金投入。该过程甚至可以在现有的乙醇设备中以搅拌槽的形式进行。可以在多种细胞类型中进行异戊二烯和乙醇的共同产生，包括酵母，例如酿酒酵母；和细菌，例如大肠杆菌和运动发酵单胞菌。虽然大肠杆菌能够在无氧生长时产生乙醇(使用adhE酶从乙酰基-辅酶A通过乙醛到达乙醇)，但是可以通过表达一种或多种与大肠杆菌或其他细菌例如运动发酵单胞菌中的丙酮酸附近的生化反应相关的酶而改善乙醇的产生。例如，可以通过共同表达来自运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶(pdc)而极大地改善大肠杆菌中乙醇的产生(见实施例28)。
在一些实施方式中，C2-或C3-醇或二醇是1，2-丙二醇。本文提供了用于共同生产异戊二烯和1，2-丙二醇的在限氧培养物中的细胞，通过在适合于共同生产异戊二烯和1，2-丙二醇的条件下培养此类细胞而共同生产异戊二烯和1，2-丙二醇的方法，以及包含异戊二烯的组合物，包含1，2-丙二醇的组合物，或包含异戊二烯和1，2-丙二醇的组合物。在一些实施方式中，组合物还包含氧、二氧化碳、或氮，和1.0×10-4摩尔％或更少的非甲烷挥发性烃。如果需要，可以回收并纯化异戊二烯和1，2-丙二醇。可以使回收的异戊二烯聚合以生产合成的橡胶。回收的1，2-丙二醇可用于为发酵过程提供能量，从而降低异戊二烯生产成本，减少常规发酵过程中与高1，2-丙二醇浓度的积累相关的潜在危害，并减少该过程的总体的“碳足迹”。
在一些实施方式中，C2-或C3-醇或二醇是1，3-丙二醇。本文提供了用于共同生产异戊二烯和1，3-丙二醇的在限氧培养物中的细胞，通过在适合于共同生产异戊二烯和1，3-丙二醇的条件下培养此类细胞而共同生产异戊二烯和1，3-丙二醇的方法，以及包含异戊二烯的组合物，包含1，3-丙二醇的组合物，或包含异戊二烯和1，3-丙二醇的组合物。在一些实施方式中，组合物还包含氧、二氧化碳、或氮，和1.0×10-4摩尔％或更少的非甲烷挥发性烃。如果需要，可以回收并纯化异戊二烯和1，3-丙二醇。可以使回收的异戊二烯聚合以生产合成的橡胶。回收的1，3-丙二醇可用于为发酵过程提供能量，从而降低异戊二烯生产成本，减少常规发酵过程中与高1，3-丙二醇浓度的积累相关的潜在危害，并减少该过程的总体的“碳足迹”。
定义
除非另有指明，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义是本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义。Singleton等人，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology，2nd ed.，John Wiley and Sons，NewYork(1994)，和Hale & Marham，The Harper Collins Dictionary ofBiology，Harper Perennial，N.Y.(1991)为技术人员提供了本发明中使用的很多术语的一般含义。应该理解：本发明不限于所描述的特定的方法、程序和试剂，因为它们是可变的。本领域技术人员还将认识到，也可以使用与本文描述的那些相似或等同的任意方法和材料来实施或测试本发明。
本文提供的小标题不是本发明的各个方面或实施方式的限制，而已通过参考作为一个整体的说明书来获得本发明。
除非另有明确指明，否则在本文中使用的术语“一个”、“一种”等是指一个或多个。
在本文中提及“大约”某数值或参数包括(并且描述)涉及该数值或参数本身的实施方式。例如，提及“大约X”的描述包括“X”的描述。数值范围包括界定该范围的数值。
应该理解，本文描述的本发明的方面和实施方式包括：“包含”、“由......组成”、和“基本上由......组成”的方面和实施方式。
如本文使用的术语“C2-或C3-醇或二醇”包括但不限于：乙醇(CASNo.64-17-5)，1-丙醇(CAS No.71-23-8)，2-丙醇(CAS No.67-63-0)，1，2-丙二醇(CAS No.57-55-6)，1，3-丙二醇(CAS No.504-63-2)，和甘油(CASNo.56-81-5)。除非另有指明，否则术语“1，2-丙二醇”是指1，2-(R)-丙二醇、1，2-(S)-丙二醇、或1，2-(R/S)-丙二醇的外消旋混合物。
如本文使用的术语“多肽”包括多肽、蛋白、肽、多肽的片段、和融合多肽。
如本文使用的“分离的多肽”不是多肽文库的一部分，所述多肽文库例如2，5，10，20，50或更多个不同多肽的文库；而是分离自天然状态下与其一起产生的至少一个成分。可以例如通过表达编码多肽的重组核酸来获得分离的多肽。
“异源多肽”意思是：氨基酸序列与在相同宿主细胞中天然表达的另一多肽的氨基酸序列不相同的多肽。具体地，异源多肽与天然状态下存在于相同宿主细胞中的野生型多肽是不同的。
“密码子简并性”是指遗传密码的多样性，其允许核苷酸序列变化而不影响所编码的多肽的氨基酸序列。技术人员熟知：特定的宿主细胞在使用核苷酸密码子来指定给定氨基酸时表现出的“密码子偏爱”。因此，当合成用于改善宿主细胞中的表达的核酸时，在一些实施方式中合乎需要地将核酸设计为使其密码子使用频率达到宿主细胞的优选密码子使用频率。
如本文使用的“核酸”是指单链或双链形式的共价连接在一起的两个或更多个脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。应该理解：在本文定义的核酸内可以发生突变，包括单核苷酸突变。
“重组核酸”意思是这样的目标核酸：其不含在所述目标核酸所源自的生物体的天然状态下存在的基因组中侧接该目标核酸的一个或多个核酸(例如基因)。因此，该术语包括例如，掺入到载体、掺入到自我复制型质粒或病毒、或掺入到原核或真核细胞的基因组DNA中的重组DNA，或作为独立于其它序列的单独的分子(例如，cDNA、基因组DNA片段、或通过PCR或限制性核酸内切酶消化产生的cDNA片段)而存在。应该理解，在本文定义的核酸内可以发生突变，包括单核苷酸突变。
“异源核酸”意思是：核酸序列与在相同宿主细胞中天然存在的另一核酸的核酸序列不相同的核酸。具体地，异源核酸与天然状态下存在于相同宿主细胞中的野生型核酸是不同的。
如本文使用的“载体”意思是能够递送并合乎需要地在宿主细胞中表达一种或多种目标核酸的构建体。载体的实例包括但不限于，质粒、病毒载体、DNA或RNA表达载体、粘粒、和噬菌体载体。
如本文使用的“表达控制序列”意思是指导目标核酸的转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，例如组成型或可诱导启动子，或增强子。“可诱导启动子”是在环境或发育调节下有活性的启动子。表达控制序列与待转录的核酸区段可操作地连接。
术语“选择性标志物”或“可选择标志物”是指能够在宿主细胞中表达以允许容易地选择含有导入的核酸或载体的那些宿主细胞的核酸。可选择标志物的实例包括但不限于，抗生素抗性核酸(例如卡那霉素、氨比西林、羧苄西林、庆大霉素、潮霉素、腐草霉素、博来霉素、新霉素、或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢优势例如营养优势的核酸。示例性的营养选择性标志物包括那些本领域已知的标志物，例如amdS、argB、和pyr4。
异戊二烯
如本文使用的术语“异戊二烯”或“2-甲基-1，3-丁二烯”(CAS#78-79-5)是指，从3，3-二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)消除焦磷酸而产生的直接的和最终的挥发性C5烃产物，并且不包括一个或多个异戊烯二磷酸(IPP)分子与一个或多个DMAPP分子的连接或聚合。除非本文另有指明，否则术语“异戊二烯”一般不意在限于其生产方法。
绝大多数的异戊二烯以不纯的C5烃级份的形式源自石油化学来源，在该物质适合于聚合之前，其需要深度纯化。有数种杂质是特别有问题的，因为它们的结构与异戊二烯具有相似性并且它们可以作为聚合催化剂毒。此类化合物包括：1，3-环戊二烯，反式-1，3-戊二烯，顺式-1，3-戊二烯，1，4-戊二烯，1-戊炔，2-戊炔，3-甲基-l-丁炔，戊-4-烯-1-炔，反式-戊-3-烯-1-炔，和顺式-戊-3-烯-1-炔(图90)。在一些实施方式中，本发明的异戊二烯组合物基本上不含任意污染性的非饱和的C5烃。如实施例10中所进一步描述，使用本文描述的方法生产的异戊二烯组合物中，不存在可检测量的除了异戊二烯之外的非饱和的C5烃(例如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁烯、反式-戊二烯、顺式-戊二烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。使用本文描述的方法生产的一些异戊二烯组合物含有乙醇、丙酮、和C5异戊二烯基醇，如通过GC/MS分析所测定。相对于存在于源自石油化学来源的异戊二烯组合物中存在的异构C5烃级份而言，所有这些成分都能更容易地从异戊二烯流中除掉。因此，在一些实施方式中，本发明的异戊二烯组合物为了达到聚合级别，需要最少的处理。
在一个方面，本发明的组合物和方法增大了异戊二烯的生产速率并且增加了所生产的异戊二烯的总量。例如，已经制备了产生4.8x104nmole/gwcm/hr异戊二烯的细胞培养物系统(表1)。这些系统将大约2.2％的细胞从细胞培养基中消耗的碳转化为异戊二烯，由此证明了其效率。如实施例和表2所示，每升培养液产生了大约3g异戊二烯。如果需要，可以使用其它条件例如本文描述的那些获得更大量的异戊二烯。在一些实施方式中，可再生的碳源用于生产异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯的生产与细胞的生长解除偶联。在一些实施方式中，异戊二烯和任意氧化剂的浓度在不可燃的范围内，以减少或消除生产或回收异戊二烯过程中可能起火的风险。本发明的组合物和方法是合乎需要的，因为它们允许获得高异戊二烯产率/细胞，高碳产率，高异戊二烯纯度，高生产率，低能量使用，低生产成本和投入，和最小的副反应。这种用于生产异戊二烯的有效率的大规模的生物合成方法提供了用于基于合成的异戊二烯的橡胶的异戊二烯来源，并且提供了替代使用天然橡胶的合乎需要的低成本的替代方式。
如下文所讨论，可以通过向细胞中导入编码异戊二烯合酶多肽(例如植物异戊二烯合酶多肽)的异源核酸极大地增加细胞生产的异戊二烯的量。异戊二烯合酶多肽将二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)转化为异戊二烯。如实施例中所示，在多种宿主细胞例如大肠杆菌、柠檬泛菌、枯草芽孢杆菌、解脂耶氏酵母、和里氏木霉(trichoderma reesei)中表达异源越南葛藤(野葛)异戊二烯合酶多肽。所有这些细胞都生产比不含异源异戊二烯合酶多肽的对应细胞更多的异戊二烯。如表1和2所示，使用本文描述的方法生产了大量的异戊二烯。例如，在14升的发酵器中，具有异源异戊二烯合酶核酸的枯草芽孢杆菌生产比对应的不含异源核酸的对照枯草芽孢杆菌细胞多10倍的异戊二烯(表2)。在发酵器中，大肠杆菌所生产的300mg异戊二烯/升培养液(mg/L，其中培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积)和枯草芽孢杆菌所生产的30mg/L表明可以产生显著量的异戊二烯(表2)。如果需要，可以在更大的规模上生产异戊二烯，或者可以使用本文描述的其它条件以进一步增加异戊二烯的量。在下文以及在实施例部分更详细地描述了表1和表2中所列的载体和实验条件。
表1：使用本发明的细胞培养物和方法从摇瓶中生产的示例性的异戊二烯产率。用于测定异戊二烯产量的测定法描述于实施例I，第II部分。对于该测定法，在一个或多个时间点从摇瓶中取出样品并培养30分钟。然后测定该样品中生产的异戊二烯的量。生产的异戊二烯的顶空浓度和比速率列于表1并在本文中有进一步描述。
Figure BDA0000086907590000571
＊就1mL的1OD600进行校正，在液体：顶空的体积比为1∶19的密封的顶空管中培养1小时
表2：使用本发明的细胞培养物和方法在发酵器中生产的示例性的异戊二烯产率。用于测定异戊二烯产量的测定法描述于实施例I，第II部分。对于该测定法，取出发酵器的废气的样品并分析其异戊二烯的量。在表2中列出了峰值顶空浓度(发酵过程中最高的顶空浓度)、效价(每升培养液生产的累积的异戊二烯的总量)和生产异戊二烯的峰值比速率(发酵过程中的最高比速率)并在本文中有进一步描述。
Figure BDA0000086907590000572
Figure BDA0000086907590000581
Figure BDA0000086907590000591
＊＊就1vvm(1体积废气/1L培养液/分钟)的废气流速进行校正
另外，可以通过增加细胞所表达的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)多肽和/或异戊烯二磷酸异构酶(IDI)多肽的量来增强含异源异戊二烯合酶核酸的细胞所生产的异戊二烯。例如，可以将DXS核酸和/或IDI核酸导入细胞。DXS核酸可以是异源核酸或内源核酸的重复拷贝。类似地，IDI核酸可以是异源核酸或内源核酸的重复拷贝。在一些实施方式中，通过将内源性DXS和/或IDI启动子或调节区替换为其它的引起DXS和/或IDI核酸的更大的转录的启动子和/或调节区来增加DXS和/或IDI多肽的量。在一些实施方式中，细胞包含编码异戊二烯合酶多肽(例如植物异戊二烯合酶多肽)的异源核酸和编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸的重复拷贝。
所编码的DXS和IDI多肽是异戊二烯的生物合成的DXP途径(图19A)的一部分。DXS多肽将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转化为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。不被任何特定理论所限，相信增加DXS多肽的量会增大通过DXP途径的碳流，引起更大的异戊二烯产量。IDI多肽催化异戊烯二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的相互转化。不被任何特定理论所限相信增加细胞中IDI多肽的量会增加被转化为DMAPP的IPP的量(和转化速率)，DMAPP继而被转化为异戊二烯。
例如，具有野葛异戊二烯合酶、酿酒酵母IDI、和大肠杆菌DXS核酸的大肠杆菌细胞的发酵用于生产异戊二烯。异戊二烯的水平经15小时的时间段在50-300μg/L变化(实施例7，第VII部分)。
在一些实施方式中，异源的或额外的内源异戊二烯合酶、IDI、和DXS核酸的存在使细胞相对于仅具有这些异源或额外的内源核酸中的一项或两项的对应细胞以繁殖力更强的方式生长或维持更长时间的存活。例如，包含异源异戊二烯合酶、IDI、和DXS核酸的细胞比仅具有异源异戊二烯合酶和DXS核酸的细胞或仅具有异源异戊二烯合酶核酸的细胞生长得更好。另外，使异源异戊二烯合酶、IDI、和DXS核酸成功地可操作地连接于维持于大肠杆菌细胞内的高拷贝数质粒的强启动子上，这提示可以在细胞中表达大量的这些多肽而不对细胞引起过量的毒性。不被任何特定理论所限，相信异源或额外的内源异戊二烯合酶和IDI核酸的存在可以降低一种或多种潜在的毒性中间体的量，如果在细胞中仅存在异源或额外内源DXS核酸，则所述毒性中间体将会累积。
在一些实施方式中，通过增加细胞表达的MVA多肽的量而提高包含异源异戊二烯合酶核酸的细胞生产的异戊二烯(图19A和19B)。示例性的MVA途径多肽包括任意下列多肽：乙酰基-辅酶A乙酰转移酶(AA-辅酶A硫解酶)多肽，3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A合酶(HMG-CoA合酶)多肽，3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)多肽，甲羟戊酸激酶(MVK)多肽，磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽，磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)多肽，异戊烯磷酸激酶(IPK)多肽，IDI多肽，和具有两个或更多个MVA途径多肽的活性的多肽(例如融合多肽)。例如，可以将一个或多个MVA途径核酸导入细胞中。在一些实施方式中，细胞包含上部MVA途径，其包括AA-辅酶A硫解酶、HMG-CoA合酶、和HMG-辅酶A还原酶核酸。在一些实施方式中，细胞包含下部MVA途径，其包括MVK、PMK、MVD、和IDI核酸。在一些实施方式中，细胞包含整个MVA途径，其包括AA-辅酶A硫解酶、HMG-辅酶A合酶、HMG-辅酶A还原酶、MVK、PMK、MVD、和IDI核酸。在一些实施方式中，细胞包含整个MVA途径，其包括AA-辅酶A硫解酶、HMG-辅酶A合酶、HMG-辅酶A还原酶、MVK、PMDC、IPK、和IDI核酸。MVA途径核酸可以是异源核酸或内源核酸的重复拷贝。在一些实施方式中，通过将MVA途径核酸的内源启动子或调节区替换为引起MVA途径核酸的更大的转录的其它启动子和/或调节区来增加一种或多种MVA途径多肽的量。在一些实施方式中，细胞包含编码异戊二烯合酶多肽(例如植物异戊二烯合酶多肽)的异源核酸和编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸的重复拷贝。
例如，包含编码野葛异戊二烯合酶多肽和编码酿酒酵母MVK、PMK、MVD、和IDI多肽的核酸的大肠杆菌细胞以6.67x10-4mol/L培养液/OD600/hr的速率产生异戊二烯(见实施例8)。另外，具有编码粪肠球菌AA-辅酶A硫解酶、HMG-辅酶A合酶、和HMG-辅酶A还原酶多肽的大肠杆菌细胞的14升发酵生产22克的甲羟戊酸(MVA途径的中间体)。这些细胞的摇瓶生产2-4克的甲羟戊酸/升。这些结果表明：异源MVA途径核酸在大肠杆菌中是有活性的。相对于仅具有下部MVA途径和野葛异戊二烯合酶的核酸的大肠杆菌细胞(菌株MCM 131)，含有上部MVA途径和下部MVA途径以及野葛异戊二烯合酶的核酸的大肠杆菌细胞(菌株MCM127)生产显著更多的异戊二烯(874ug/L)(见表3和实施例8，第VIII部分)。
在一些实施方式中，细胞中的至少一部分在持续培养(例如不稀释的持续培养)中保持异源异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径核酸至少大约5、10、20、50、75、100、200、300或更多次细胞分裂。在本发明的任意方面的一些实施方式中，包含异源或内源异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径核酸的重复拷贝的核酸还包含选择性标志物，例如卡那霉素、氨比西林、羧苄西林、庆大霉素、潮霉素、腐草霉素、博来霉素、新霉素、或氯霉素抗生素抗性核酸。
如实施例7第VI部分所示，可以通过向细胞培养基中添加酵母提取物进一步增加所生产的异戊二烯的量。在该实施例中，对于所测试的浓度，所生产的异戊二烯的量与细胞培养基中酵母提取物的量成线性比例(图48C)。另外，从含有酵母提取物和葡萄糖的细胞培养基中生产了大约0.11g异戊二烯/L培养液(实施例7，第VIII部分)。这些实验都使用了具有野葛异戊二烯合酶、酿酒酵母IDI、和大肠杆菌DXS核酸的大肠杆菌细胞来生产异戊二烯。相对于在存在酵母提取物的情况下增加葡萄糖的量，在存在葡萄糖的情况下增加酵母提取物的量生产更多的异戊二烯。另外，增加酵母提取物的量允许细胞在更长的时间生产更高水平的异戊二烯并改善细胞的健康。
还使用三种类型的水解的生物质(甘蔗、玉米秸秆、和软木浆)作为碳源证明了异戊二烯的生产(图46A-C)。具有野葛异戊二烯合酶、酿酒酵母IDI、和大肠杆菌DXS核酸的大肠杆菌细胞从这些水解的生物质碳源生产的异戊二烯与从等量的葡萄糖(例如，1％葡萄糖，w/v)生产的异戊二烯一样多。如果需要，可以在本发明的组合物和方法中使用任意其它生物质碳源。生物质碳源是合乎需要的，因为它们比很多常规的细胞培养基便宜，从而促进了异戊二烯的经济生产。
另外，证明转化糖作为碳源用于产生异戊二烯(图47C和96-98)。例如，从表达MVA途径多肽和野葛异戊二烯合酶的细胞生产了2.4g/L的异戊二烯(实施例8，第XV部分)。使用甘油作为碳源，从表达野葛异戊二烯合酶的细胞产生了2.2mg/L的异戊二烯(实施例8，第XIV部分)。除了异戊二烯合酶核酸以外，还表达DXS核酸、IDI核酸、和/或一种或多种MVA途径核酸(例如编码整个MVA途径的核酸)可以增加从甘油生产异戊二烯。
在一些实施方式中，在细胞培养基中包括油。例如，当在含有油和葡萄糖源的培养基中培养时，包含野葛异戊二烯合酶核酸的枯草芽孢杆菌细胞生产异戊二烯(实施例4，第III部分)。在一些实施方式中，在细胞培养基中包括了一种以上的油(例如2、3、4、5、或更多种油)。不被任何特定理论所限，相信：(i)油可以增加细胞中的可用于被转化为异戊二烯的碳的量；(ii)油可以增加细胞中乙酰基-辅酶A的量，从而增加经过MVA途径的碳流；和/或(iii)油可以向细胞提供额外的营养物，这是合乎需要的，因为细胞中的多数碳被转化为异戊二烯而不是其它产物。在一些实施方式中，在含有油的细胞培养基中培养的细胞天然地使用MVA途径来生产异戊二烯或经过遗传修饰以包含整个MVA途径的核酸。在一些实施方式中，在添加到细胞培养基中之前，油被部分地或全部地水解以促进宿主细胞对油的利用。
在细胞(例如细菌)中商业化生产小分子例如异戊二烯的一个主要障碍是使分子的生产与细胞的生长解除偶联。在商业上可行的生产异戊二烯的一些实施方式中，来自原料的显著量的碳被转化为异戊二烯，而非为了细胞的生长和维持(“碳效率”)。在多个实施方式中，细胞将细胞培养基中的大于或大约0.0015％、0.002％、0.005％、0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％、或8.0％的碳转化为异戊二烯。在具体的实施方式中，被转化为下游产物的来自原料的显著部分的碳被转化为异戊二烯。如实施例11中所描述，表达MVA途径和野葛异戊二烯合酶核酸的大肠杆菌细胞显示出异戊二烯或中间体甲羟戊酸的生产与生长之间的解除偶联，这导致高的碳效率。特别地，从表达来自粪肠球菌的上部MVA途径的细胞形成了甲羟戊酸。从表达来自粪肠球菌的上部MVA途径、来自酿酒酵母的下部MVA途径、和来自越南葛藤(野葛)的异戊二烯合酶的细胞形成了异戊二烯。在四种不同的大肠杆菌菌株BL21(LDE3)、BL21(LDE3)Tuner、FM5、和MG1655中证明了异戊二烯或甲羟戊酸的生产与生长的解除偶联。前两种大肠杆菌菌株是B菌株，后两种是K12菌株。在缺失了ack和pta基因的MG1655的变体中也证明了生产与生长的解除偶联。该变体还证明生产较少的乙酸。
示例性多肽和核酸
本发明的组合物和方法中可以使用多种异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子多肽和核酸。
在一些实施方式中，融合多肽包括部分或全部的第一多肽(例如，异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子多肽或其催化活性片段)，并且可以任选地包括部分或全部的第二多肽(例如，促进融合多肽的纯化或检测的多肽，例如His标签)。在一些实施方式中，融合多肽具有两种或更多种MVA途径多肽(例如AA-辅酶A硫解酶和HMG-辅酶A还原酶多肽)的活性。在一些实施方式中，多肽是具有两种或更多种MVA途径多肽的活性的天然存在的多肽(例如由粪肠球菌mvaE核酸编码的多肽)。
在多个实施方式中，多肽具有至少或大约50、100、150、175、200、250、300、350、400、或更多个氨基酸。在一些实施方式中，多肽片段包含来自全长多肽的至少或大约25、50、75、100、150、200、300、或更多个连续氨基酸并且具有至少或大约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％的对应的全长多肽的活性。在具体的实施方式中，多肽包括任意天然存在的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子多肽的核酸序列区段或整个核酸序列。在一些实施方式中，相对于野生型(即天然存在的序列)异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子多肽的序列，多肽具有一个或多个突变。
在一些实施方式中，多肽是分离的多肽。在一些实施方式中，多肽是异源多肽。
在一些实施方式中，核酸是重组核酸。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子核酸可操作地连接于编码全部或部分的另一多肽的另一核酸，从而重组核酸编码包括异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子多肽和全部或部分另一多肽(例如促进融合多肽的纯化或检测的肽，例如His-标签)的融合多肽。在一些实施方式中，部分或全部的重组核酸是化学合成的。
在一些实施方式中，核酸是异源核酸。在具体的实施方式中，核酸包括任意天然存在的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子核酸的核酸序列区段或整个核酸序列。在一些实施方式中，核酸包括来自任意天然存在的异戊二烯合酶核酸、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子核酸的至少或大约50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、或更多个连续核苷酸。在一些实施方式中，相对于野生型(即天然存在的序列)异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子核酸的序列，核酸具有一个或多个突变。在一些实施方式中，核酸具有增加异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、或转录因子核酸的转录或翻译的一个或多个突变(例如沉默突变)。在一些实施方式中，核酸是编码异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子多肽的任意核酸的简并变体。
示例性的异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径多肽和核酸的登记号列举于附件1(附件1的登记号和它们的相应的序列通过引用方式全文并入本文，尤其是关于异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径多肽和核酸的氨基酸和核酸序列的内容)。 Kegg数据库也包含多个示例性的异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径多肽和核酸的氨基酸和核酸序列(见，例如，互联网网址：“genome.jp/kegg/pathway/map/map00100.html”和本文中的序列，各自通过引用方式全文并入本文，尤其是关于异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径多肽和核酸的氨基酸和核酸序列)。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径多肽和/或核酸中的一项或多项具有于2007年12月12日或2008年9月14日公开的序列相同的序列，例如对应于附件1中的登记号的任意序列，或Kegg数据库中的任意序列。另外的示例性的异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径多肽和核酸见下文的描述。
示例性的异戊二烯合酶多肽和核酸
如上所述，异戊二烯合酶多肽将二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)转化为异戊二烯。示例性的异戊二烯合酶多肽包括具有异戊二烯合酶多肽的至少一项活性的多肽、多肽片段、肽、和融合多肽。可以通过在体外、在细胞提取物中或在体内测定多肽将DMAPP转化为异戊二烯的能力，使用标准方法来测定该多肽是否具有异戊二烯合酶多肽活性。在示例性的测定法中，按照实施例1描述的摇瓶方法使菌株(例如，本文描述的大肠杆菌/pTrcKudzu菌株)生长，以此来制备细胞提取物。诱导结束后，通过在7000xg离心10分钟沉淀大约10mL细胞，并重悬于5ml不含甘油的PEB中。使用弗氏压碎器(French Pressure cell)使用标准程序将细胞裂解。或者，在-80℃冷冻/解冻后，以溶菌酶(Ready-Lyse溶菌酶溶液；EpiCentre)处理细胞。
可以按照例如Silver等人，J.Biol.Chem.270：13010-13016，1995及其中的参考文献(其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于异戊二烯合酶多肽活性的测定法的部分)的描述来测定细胞提取物中异戊二烯合酶多肽的活性。在氮气流下，使DMAPP(Sigma)蒸发至干燥，并在pH8.2的100mM磷酸钾缓冲液中重新水化至100mM的浓度，并储存于-20℃。为了进行测定，将5μL 1M MgCl2、1mM(250μg/ml)DMAPP、65μL植物提取物缓冲液(PEB)(50mM Tris-HCl，pH 8.0，20mM MgCl2，5％甘油，和2mM DTT)的溶液加入到20ml的具有金属螺丝盖和特氟隆包被的硅隔膜的顶空瓶(Agilent Technologies)中的25μL细胞提取物中，并在37℃摇动培养15分钟。通过加入200μL 250mM EDTA使反应猝灭，按照实施例1第II部分的描述通过GC/MS进行定量测定。
示例性的异戊二烯合酶核酸包括编码具有异戊二烯合酶多肽的至少一项活性的多肽、多肽片段、肽、或融合多肽的核酸。示例性的异戊二烯合酶多肽和核酸包括来自本文描述的任意生物体来源的天然存在的多肽和核酸以及源自本文描述的任意生物体来源的突变体多肽和核酸。
在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽或核酸来自豆科(Fabaceae)，例如蝶型花亚科(Faboideae)。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽或核酸是来自下列的多肽或核酸：越南葛藤(野葛)(Sharkey等人，PlantPhysiology 137：700-712，2005)，葛根(Pueraria lobata)，白杨(例如银白杨、欧洲黑杨、毛果杨、或银白杨x欧洲山杨(CAC35696)Miller等，Planta213：483-487，2001)，白杨(aspen)(例如美洲山杨)Silver等人，JBC270(22)：13010-1316，1995)，或英国栎(夏栎(Quercus robur))(Zimmer等人，WO 98/02550)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于异戊二烯合酶核酸和异戊二烯合酶多肽的表达的内容。适宜的异戊二烯合酶包括但不限于Genbank登记号AY341431、AY316691、AY279379、AJ457070、和AY182241(其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于异戊二烯合酶核酸和多肽的序列的内容)中记载的那些。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽或核酸不是的来自夏栎天然存在的多肽或核酸(即，异戊二烯合酶多肽或核酸是除了来自夏栎的天然存在的多肽或核酸以外的异戊二烯合酶多肽或核酸)。在一些实施方式中，异戊二烯合酶核酸或多肽是来自白杨的天然存在的多肽或核酸。在一些实施方式中，异戊二烯合酶核酸或多肽不是来自白杨的天然存在的多肽或核酸。
示例性的DXS多肽和核酸
如上所述，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)多肽将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转化为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。示例性的DXS多肽包括具有DXS多肽的至少一项活性的多肽、多肽片段、肽、和融合多肽。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转化为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有DXS多肽活性。示例性的DXS核酸包括编码具有DXS多肽的至少一项活性的多肽、多肽片段、肽、或融合多肽的核酸。示例性的DXS多肽和核酸包括来自本文描述的任意生物体来源的天然存在的多肽和核酸以及源自本文描述的任意生物体来源的突变体多肽和核酸。
示例性的IDI多肽和核酸
异戊烯二磷酸异构酶多肽(异戊烯-二磷酸δ-异构酶或IDI)催化异戊烯二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的相互转化(例如，将IPP转化为DMAPP和/或将DMAPP转化为IPP)。示例性的IDI多肽包括具有IDI多肽的至少一项活性的多肽、多肽片段、肽、和融合多肽。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽使IPP和DMAPP相互转化的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有IDI多肽活性。示例性的IDI核酸包括编码具有IDI多肽的至少一项活性的多肽、多肽片段、肽、或融合多肽的核酸。示例性的IDI多肽和核酸包括来自本文描述的任意生物体来源的天然存在的多肽和核酸以及源自本文描述的任意生物体来源的突变体多肽和核酸。
示例性的MVA途径多肽和核酸
示例性的MVA途径多肽包括乙酰基-辅酶A乙酰转移酶(AA-辅酶A硫解酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A合酶(HMG-辅酶A合酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶(HMG-辅酶A还原酶)多肽、甲羟戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽、磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)多肽、异戊烯磷酸激酶(IPK)多肽、IDI多肽、和具有两个或更多个MVA途径多肽的活性的多肽(例如融合多肽)。具体地，MVA途径多肽包括具有MVA途径多肽的至少一项活性的多肽、多肽片段、肽、和融合多肽。示例性的MVA途径核酸包括编码具有MVA途径多肽的至少一项活性的多肽、多肽片段、肽、或融合多肽的核酸。示例性的MVA途径多肽和核酸包括来自本文描述的任意生物体来源的天然存在的多肽和核酸以及源自本文描述的任意生物体来源的突变体多肽和核酸。
具体地，乙酰基-辅酶A乙酰转移酶多肽(AA-辅酶A硫解酶或AACT)将两分子的乙酰基-辅酶A转化为乙酰乙酰基-辅酶A。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽将两分子的乙酰基-辅酶A转化为乙酰乙酰基-辅酶A的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有AA-辅酶A硫解酶多肽活性。
3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A合酶(HMG-辅酶A合酶或HMGS)多肽将乙酰乙酰基-辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽将乙酰乙酰基-辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有HMG-辅酶A合酶多肽活性。
3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶(HMG-辅酶A还原酶或HMGR)多肽将3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A转化为甲羟戊酸。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽将3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A转化为甲羟戊酸的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有HMG-辅酶A还原酶多肽活性。
甲羟戊酸激酶(MVK)多肽将甲羟戊酸磷酸化以形成甲羟戊酸-5-磷酸。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸-5-磷酸的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有MVK多肽活性。
磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽将甲羟戊酸-5-磷酸磷酸化以形成甲羟戊酸-5-二磷酸。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽将甲羟戊酸-5-磷酸转化为甲羟戊酸-5-二磷酸的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有PMK多肽活性。
二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD或DPMDC)多肽将甲羟戊酸-5-二磷酸转化为异戊烯二磷酸(IPP)。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽将甲羟戊酸-5-二磷酸转化为IPP的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有MVD多肽活性。
磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)多肽将甲羟戊酸-5-磷酸转化为异戊烯磷酸(IP)。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽将甲羟戊酸-5-磷酸转化为IP的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有PMDC多肽活性。
异戊烯磷酸激酶(IPK)多肽将异戊烯磷酸(IP)磷酸化以形成异戊烯二磷酸(IPP)。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽将IP转化为IPP的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有IPK多肽活性。
示例性的IDI多肽和核酸如上文所述。
示例性的氢化酶多肽和核酸
氢化酶多肽催化下列反应：在体外，该反应是可逆的，但是某些氢化酶在体内可能仅以一个方向发挥作用：氧化H2或还原H+。氢化酶多肽可以是氧敏感性的，含有复合金属辅因子作为它们的催化中心的一部分，并且有时由多个亚基组成，氢化酶基因表达有时涉及另外的辅助性多肽，例如“成熟”因子或转录调节因子(即激活子或阻抑子)。基于它们的催化中心中的金属辅因子的类型，氢化酶被分成三个主要类别：(1)镍-铁(“NiFe”)氢化酶具有镍/铁辅因子；(2)铁-铁氢化酶(“FeFe”)具有铁/铁辅因子；和(3)铁/无硫(“Fe”)氢化酶，其不含第(1)组和第(2)组中存在的4Fe4S簇，具有铁辅因子和次甲基-四氢甲烷蝶呤电子载体。见，例如Chung-Jung Chou等人，“Hydrogenesis inhyperthermophilic microorganisms：implications for biofuels，”Metabol.Eng.10：394-404(2008)，和
Figure BDA0000086907590000712
Vardar-Schara等人，“Metabolicallyengineered bacteria for producing hydrogen via fermentation，”MicrobialBiotechnol.1(2)：107-125(2008)，二者通过引用方式全文并入本文，尤其是关于多种类型和类别的氢化酶的内容。虽然很多生物体含有多种氢化酶，但是很少生物体含有NiFe和FeFe氢化酶二者的基因。
NiFe氢化酶的催化中心由镍原子和铁原子组成，各自具有两个一氧化碳(CO)和两个氰化物(CN-)配体。NiFe氢化酶全都包含至少第二亚基，其包含多个铁-硫(Fe-S)中心，用于从催化中心转移电子和将电子转移至催化中心。NiFe氢化酶可以进一步分为四个主要类别：(1)呼吸酶类，其为多酶系统的一部分，所述多酶系统将H2的氧化与末端电子受体例如SO4 2-或NO3 -的还原偶联(在无氧条件下)，或与O2偶联(在好氧微生物中)；(2)H2传感器，其激活代谢上有活性的NiFe氢化酶的表达；(3)细胞质的氢化酶，其包含能够利用NADP+的多个亚基，在体外是容易地可逆的，但是在体内可能仅氧化H2；和(4)与膜结合的、保存能量的多酶复合物，也存在于细菌和古细菌中。Chung-Jung Chou等人，“Hydrogenesis in hyperthermophilic microorganisms：implications forbiofuels，”Metabol.Eng.10：394-404(2008)。
FeFe氢化酶的催化中心含有催化性的“H簇”，其通过单一蛋白(半胱氨酸)配体将双核(FeFe)位点协调桥接成[4Fe-4S]中心。双核中心的两个铁原子各自具有两个一氧化碳(CO)和两个氰化物(CN-)配体，也通过两个硫原子(小的有机分子的一部分)桥接。多数FeFe氢化酶是大约50,000道尔顿(Da)的单体酶，并且似乎在体内的主要作用是通过将质子还原为氢气而清除过量还原当量。Chung-Jung Chou等人，“Hydrogenesisin hyperthermophilic microorganisms：implications for biofuels，”Metabol.Eng.10：394-404(2008)。
Fe氢化酶的催化中心最初被认为具有基于有机辅因子的活性位点，其中没有金属参与，但是后来证明其包含单核Fe原子。虽然三种类型的氢化酶之间存在种系发生上的差异，除了至少一个铁原子之外，所有这三种类型的氢化酶在它们的活性位点中还包含针对铁原子的至少一个一氧化碳(CO)配体，这促进了H2的催化氧化和质子的还原。Chung-JungChou等人，“Hydrogenesis in hyperthermophilic microorganisms：implications for biofuels，”Metabol.Eng.10：394-404(2008)。
示例性的氢化酶多肽包括但不限于：大肠杆菌氢化酶-1(Hyd-1)多肽，大肠杆菌氢化酶-2(Hyd-2)多肽，大肠杆菌氢化酶-3(Hyd-3)多肽，大肠杆菌氢化酶-4(Hyd-4)多肽，大肠杆菌甲酸氢裂解酶(FHL)复合物(其在无氧条件下在酸性pH时从甲酸和CO2产生氢气(见，例如，Akihito Yoshida等人，“Efficient induction of formate hydrogen lyase of aerobically grownEscherichia coli in a three-step biohydrogen production process，”Appl.Microbiol.Biotechnol.74：754-760(2007)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于在大肠杆菌中诱导甲酸氢裂解酶表达的内容))，真氧产碱杆菌H16氢化酶(真氧产碱杆菌HoxH)，不透明红球菌(Rhodococcusopacus)MR11氢化酶(不透明红球菌HoxH)多肽，蓝藻(Synechosystis sp.)PCC 6803氢化酶(Syn.PCC 6803 HoxH)多肽，巨大脱硫弧菌(Desulfovibrio gigas)氢化酶(D.gigas)多肽，和脱硫脱硫弧菌(Desulfovibriodesulfuricans)ATCC 7757氢化酶(D.desulfuricans)多肽(见，例如，Vardar-Schara等人，“Metabolically engineered bacteria for producinghydrogen via fermentation，”Microbial Biotechnol.1(2)：107-125(2008)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于多种类型和类别的氢化酶的内容)和具有两种或更多种氢化酶多肽活性的多肽(例如融合多肽)。具体地，氢化酶多肽包括具有氢化酶多肽的至少一项活性的多肽、多肽片段、肽、和融合多肽。示例性的氢化酶核酸包括编码具有氢化酶多肽的至少一项活性或表达、加工氢化酶多肽或使其成熟所需的至少一项活性的多肽、多肽片段、肽、或融合多肽的核酸。示例性的氢化酶多肽和核酸包括来自本文描述的任意生物体来源的天然存在的多肽和核酸以及源自本文描述的任意生物体来源的突变体多肽和核酸。
大肠杆菌Hyd-3是厌氧甲酸氢化酶裂解酶(FHL)复合物的一部分，其由hyc操纵子(包含hyvA、hycB、hycC、hycD、hycE、hycF、hycG、hycH、和hycI基因)编码。大肠杆菌Hyd-4由hyf操纵子(包含hyfA、hyfB、hyfC、hyfD、hyfE、hyfF、hyfG、hyfH、hyfI、hyfJ、和hyfR基因)编码。大肠杆菌FHL由来自hyc操纵子的六个基因(hycB、hycC、hycD、hycE、hycF和hycG)和fdhF基因(编码甲酸脱氢酶H(Fdh-H))编码。FHL复合物的表达可以进一步包括丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)、FhlA(激活fdhF的转录的转录因子)和hyc操纵子的表达，或HycA(由hycA基因编码的转录因子，其负性调节FHL的转录)的缺失/失活。可以通过表达或失活/缺失参与调节氢化酶和其它酶的基因表达的另外的蛋白(例如，铁-硫复合物转录调节子(iscR))来改善异戊二烯和氢的共同产生(Kalim-Akhtar等人，“Deletion of iscR stimulates recombinant Clostridial Fe/Fe hydrogenaseactivity and H2-accumulation in Escherichia coli BL21(DE3)，”Appl.Microbiol.Biotechnol.78：853-862(2008)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于梭状芽胞杆菌Fe/Fe氢化酶活性的刺激和通过缺失iscR基因而在大肠杆菌中积累氢的内容)。
在一些实施方式中，示例性的铁氧还蛋白依赖性氢化酶多肽包括但不限于：Clostridium acetobutulicum氢化酶A(HydA)(见，例如，P.W.King等人，“Functional studies of[FeFe]hydrogenase maturation in anEscherichia coli biosynthetic system，”J.Bacteriol.188(6)：163-172(2006)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于通过HydA和三种HydA相关的成熟酶(HydE、HydG、和HydF)产生氢的内容，所述酶可以单独表达或与下列一项或多项联合表达：(1)枯草芽孢杆菌NADPH铁氧还蛋白氧化还原酶(NFOR)(见，例如，Viet等人，(2008))，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于通过NFOR产生氢的内容；另外，见PCT公开号WO/2007/089901，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于优化大肠杆菌菌株以生产氢的内容)，；Clostridium kluyveri NADH铁氧还蛋白氧化还原酶(RnfCDGEAB)(Henning Seedorf等人，“The genome ofClostridium kluyveri，a strict anaerobe with unique metabolic features，”Proc.Nat’l Acad.Sci.U.S.A.105(6)：2128-2133(2008)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于NADH铁氧还蛋白氧化还原酶和关于无氧乙醇-乙酸发酵途径的成分的内容)；或Clostridium pasteuranium铁氧还蛋白氧化还原酶(Fdx)；(2)甘油醛-6-磷酸铁氧还蛋白氧化还原酶(“GAPOR”)；或(3)丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶(“POR”)，和具有两种或更多种氢化酶多肽的活性或一种或多种氢化酶多肽的活性和一种或多种铁氧还蛋白依赖性氧化还原酶的活性的多肽(例如融合多肽)。具体地，铁氧还蛋白依赖性氢化酶多肽包括具有铁氧还蛋白依赖性氢化酶多肽的至少一项活性的多肽、多肽片段、肽、和融合多肽。
示例性的NADPH依赖性氢化酶多肽包括但不限于：嗜热氢化酶多肽，例如Pyrococcus furiosus氢化酶(见，例如，J.Woodward等人，“Enzymatic production of biohydrogen，”Nature 405(6790)：1014-1015(2000))，和具有两种或更多种NADPH依赖性氢化酶多肽的活性的多肽(例如，融合多肽)。具体地，NADPH依赖性氢化酶多肽包括具有NADPH依赖性氢化酶多肽的至少一项活性的多肽、多肽片段、肽、和融合多肽。
示例性的氧耐受性或氧不敏感性氢化酶包括但不限于：胶状红环菌氢化酶(见，例如P.C.Maness等人，“Characterization of the oxygentolerance of a hydrogenase linked to a carbon monoxide oxidationpathway in Rubrivivax gelatinosus，”Appl.Environ.Microbiol.68(6)：2633-2636(2002)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于胶状红环菌氢化酶的内容)和真氧产碱杆菌氢化酶多肽(见，例如T.Burgdorf等人，“[NiFe]-hydrogenases of Ralstonia eutropha H16：modular enzymesfor oxygen-tolerant biological hydrogen oxidation，”J.Mol.Microbiol.Biotechnol.10(2-4)：181-196(2005)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于真氧产碱杆菌氢化酶多肽的内容)。或者，可以使用标准方法和测定法使编码氢化酶多肽的异源核酸突变并就O2-耐受性或O2-不敏感性进行筛选(见，例如L.E.Nagy等人，“Application of gene-shuffling for therapid generation of novel[FeFe]-hydrogenase libraries，”Biotechnol.Letts.29(3)421-430(2007)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于诱变并筛选氧耐受性氢化酶多肽的内容)。
可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽生产氢气的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有氢化酶活性。
与生产发酵副产物相关的基因的示例性多肽和核酸
除了在大肠杆菌中表达或过表达异源或天然氢化酶之外，可以通过失活无氧生物合成途径，从而阻断向在限氧或无氧途径下生产的多种代谢物(即发酵副产物)(包括但不限于乳酸、乙酸、丙酮酸、乙醇、琥珀酸、和甘油)的碳流动，从而改善异戊二烯和氢的共同生产。参与生产发酵副产物的示例性多肽包括甲酸脱氢酶Nα亚基(fdnG)、甲酸脱氢酶O大亚基(fdoG)、硝酸还原酶(narG)、甲酸转运子A(focA)、甲酸转运子B(focB)、丙酮酸氧化酶(poxB)、丙酮酸脱氢酶E1成分ackA/pta(aceE)、醇脱氢酶(adhE)、延胡索酸还原酶膜蛋白(frdC)、和乳酸脱氢酶(ldhA)。见，例如Toshinori Maeda等人，“Enhanced hydrogen production fromglucose by metabolically engineered Escherichia coli，”Appl.Microbiol.Biotechnol.77(4)：879-890(2007)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于生产具有修饰的葡萄糖代谢的大肠杆菌菌株的内容。参与生产发酵副产物中涉及的基因(其可以被失活以改善异戊二烯和氢的共同生产)的调节或表达的示例性多肽包括但不限于：甲酸氢裂解酶阻抑子(hycA)、延胡索酸还原酶调节子(fnr)、乙酰基-辅酶A合成酶(acs)、和甲酸脱氢酶调节蛋白(hycA)(其调节转录调节子fhlA(甲酸氢裂解酶转录激活子)的表达)。
与氢的重摄取相关的基因的示例性多肽和核酸
可以被失活以改善异戊二烯和氢的共同生产的参与氢的重摄取的示例性多肽包括但不限于：大肠杆菌氢化酶-1(Hyd-1)(hya操纵子)和大肠杆菌氢化酶-2(Hyd-2)(hyb操纵子)。大肠杆菌Hyd-1由hya操纵子(含hyaA、hyaB、hyaC、hyaD、hyaE、和hyaF基因)编码。大肠杆菌Hyd-2由hyb操纵子(含hybA、hybB、hybC、hybD、hybE、hybF、hybG、和hybO基因)编码。
与乙醇发酵相关的基因的示例性多肽和核酸
参与乙醇发酵的示例性多肽包括但不限于：醇脱氢酶B(adhB)、醇脱氢酶E(adhE)和丙酮酸脱羧酶(pdc)。
醇脱氢酶(adh)促进醇与醛或酮之间的相互转化，并将NAD+还原为NADH。在人和很多其它动物中，它们分解醇，不然的话这些醇可能是毒性的；在酵母和很多细菌中，一些醇脱氢酶催化相反的反应，作为发酵的一部分。在人类中，adh以多种形式作为二聚体存在，其由至少7个不同基因编码。存在五类(I-V)醇脱氢酶，但是人类中使用的主要的肝脏中的形式是I类。I类由基因ADH1A、ADH1B、和ADH1C编码的A、B、和C亚基组成。I类ADH存在于胃的内层和肝脏中，其催化乙醇氧化为乙醛：CH3CH2OH+NAD+→CH3CHO+NADH+H+。这允许消耗醇饮料，但是其最终目的可能是分解天然包含于食物中的或由消化道中的细菌产生的醇。
与人类不同，酵母和细菌不将葡萄糖发酵为乳酸。相反，它们将葡萄糖发酵为乙醇和CO2。在酵母和很多细菌中，醇脱氢酶在发酵中具有重要作用：源自糖酵解的丙酮酸被转化为乙醛和二氧化碳，然后乙醛通过被称作adhE的醇脱氢酶被还原为乙醇。后一个步骤的目的在于再生NAD+，从而可以使产能的糖酵解可以持续。丙酮酸脱羧酶是同型四聚体酶，其催化丙酮酸脱梭形成乙醛和二氧化碳。在无氧条件下，该酶是发生于酵母尤其是酵母属中的发酵过程的一部分，以通过发酵产生乙醇。丙酮酸脱羧酶也存在于很多细菌中，包括埃希菌属(Excherichia sp.)，例如大肠杆菌；和发酵单胞菌属(Zymomonas sp.)，例如运动发酵单胞菌。
示例性的甘油途径或1，3-丙二醇途径多肽和核酸
示例性的甘油途径多肽包括但不限于：DAR1(二羟基丙酮磷酸还原酶)，GPP2(甘油-磷酸磷酸酶)。示例性的1，3-丙二醇途径多肽包括但不限于：dhaB1-3(dhaB1、dhaB2、和dhaB3；甘油脱水酶B1、B2、和B3)，dhaX，orfX(蛋白X)，和orfY(蛋白Y)，以及具有改进的反应动力学的甘油脱水酶变体，包括dhaB1、dhaB2、和dhaB3的变体，例如在美国专利公开号2008/0293119A1中描述的那些，该文献通过引用方式全文并入本文，尤其是关于具有改进的反应动力学的变体甘油脱水酶变体的内容。dha调节子能够使生物体例如肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)在甘油上无氧地生长，并产生1，3-丙二醇(1，3-PD)。大肠杆菌不具有dha系统，因此不能在不存在外源电子受体的情况下在甘油上无氧地生长，并且不产生1，3-丙二醇。dha调节子包含至少4个基因：甘油脱水酶(dhaB)，1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)，甘油脱氢酶(dhaD)，和二羟基丙酮激酶(dhaK)。所有这四种活性都可以在存在甘油的情况下被诱导。
用于分离核酸的示例性方法
可以使用标准方法分离异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸。从目标来源生物体(例如细菌基因组)获得需要的核酸的方法是分子生物学领域常见的和熟知的(见，例如，WO 2004/033646及其中引用的参考文献，其各自通过引用方式全文并入本文，尤其是关于目标核酸的分离的内容)。例如，如果核酸的序列是已知的(例如本文描述的已知核酸的任意项)，可以通过限制性核酸内切酶消化来产生合适的基因组文库，并可以使用互补于需要的核酸序列的探针进行筛选。一且分离了序列，则可以使用标准的引物指导的扩增方法，例如聚合酶链式反应(PCR)(美国专利号4,683,202，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于PCR方法的内容)来扩增DNA，以获得适合于使用合适的载体进行转化的量的DNA。
或者，可以使用标准方法化学地合成异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸(例如，具有已知核酸序列的任意异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸)。
可以使用标准方法鉴定可适合用于本文描述的组合物和方法中的另外的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子多肽和核酸。例如，可以在生物体例如大肠杆菌中构建已知天然地产生异戊二烯的生物体染色体DNA的粘粒文库，然后就异戊二烯的产生进行筛选。具体地，可以产生这样的粘粒文库，其中基因组DNA的大的区段(35-45kb)被包装进入载体中，并用于转化合适的宿主。粘粒载体的独特之处在于能够容纳大量的DNA。一般地，粘粒载体具有至少一个拷贝的cos DNA序列，其对于异源DNA的包装和随后的环化是必需的。除了cos序列之外，这些载体还包含复制起始点(例如ColEI)和药物抗性标志物(例如对氨比西林或新霉素的核酸抗性)。使用粘粒载体转化合适的细菌宿主的方法在Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，ColdSpring Harbor，1989中有完善的描述，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于转化方法的内容。
通常，为了克隆粘粒，使用适当的限制性核酸内切酶分离异源DNA，并使用合适的连接酶连接至邻近的粘粒载体的cos区域。然后，使含有线性化的异源DNA的粘粒载体与DNA包装介体例如噬菌体反应。在包装过程中，cos位点被切割，并且异源DNA被包装进入细菌病毒颗粒的头部。然后，这些颗粒用于转染合适的宿主细胞，例如大肠杆菌。一旦注射进入细胞，异源DNA在cos粘末端的影响下发生环化。按照这种方式，可以将异源DNA的大区段导入宿主细胞并在其中表达。
用于获得异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸的另外的方法包括：通过测定法(例如本文描述的顶空测定法)或使用针对编码一定长度的保守性氨基酸(例如，至少3个保守性氨基酸)的核苷酸的引物通过PCR筛选宏基因组文库。可以通过比对已知的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子多肽的氨基酸序列来鉴定保守性氨基酸。可以基于已知的异戊二烯合酶多肽的比对的序列来鉴定异戊二烯合酶多肽的保守性氨基酸。可以使天然产生异戊二烯的生物体经历标准的蛋白纯化方法(其是本领域熟知的)，并且可以使用标准方法测序得到的纯化的多肽。其它方法见文献(见，例如，Julsing等人，Applied.Microbiol.Biotechnol.75：1377-84，2007；Withers等人，Appl EnvironMicrobiol.73(19)：6277-83，2007，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于鉴定参与异戊二烯合成的核酸的内容)。
另外，可以基于它们与已知的DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子多肽和核酸的初级和/或预测的多肽次级结构上的相似性，使用标准的序列比对和/或结构预测程序来鉴定另外的DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子多肽和核酸。也可以使用标准的数据库例如swissprot-trembl数据库(互联网网址为“expasy.org”，Swiss Institute of Bioinformatics Swiss-Protgroup CMU-1 rue Michel Servet CH-1211 Geneva 4，Switzerland)来鉴定异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录调节多肽和核酸。可以使用标准结构预测程序例如PredictProtein(630 West，168 Street，BB217，New York，N.Y.10032，USA)的缺省设定来预测异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子多肽的次级和/或三级结构。或者，可以使用标准方法确定异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子多肽的真实的次级和/或三级结构。还可以通过与产生于已知的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸的探针杂交来鉴定另外的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸。
示例性的启动子和载体
本文描述的任意异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸可以包含于一个或多个载体中。因此，本发明还涉及含有编码本文描述的任意异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子多肽的一个或多个核酸的载体。在一些实施方式中，所述载体包含处于表达控制序列控制下的核酸。
在一些实施方式中，载体包含选择性标志物或可选择标志物。在用于转化木霉菌属(Trichoderma)的载体系统中有用的标志物是本领域已知的(见，例如，Finkelstein，Chapter 6 in Biotechnology of FilamentousFungi，Finkelstein等人，Eds.Butterworth-Heinemann，Boston，MA，Chap.6.，1992；和Kinghorn等人，Applied Molecular Genetics ofFilamentous Fungi，Blackie Academic and Professional，Chapman andHall，London，1992，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于选择性标志物的内容)。在一些实施方式中，选择性标志物是amdS核酸，其编码乙酰胺酶，允许转化的细胞以乙酰胺作为氮源生长。使用构巢曲霉(A.nidulans)amdS核酸作为选择性标志物的描述见Kelley等人，EMBO J.4：475-479，1985和Penttila等人，Gene 61：155-164，1987(其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于选择性标志物的内容)。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录调节核酸整合进入无选择性标志物的细胞的染色体中。
合适的载体是与所用的宿主细胞相容的那些。合适的载体可以源自，例如，细菌、病毒(例如噬菌体T7或源自M-13的噬菌体)、粘粒、酵母、或植物。用于获得和使用此类载体的程序是本领域人员已知的(见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor，1989，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于载体的使用的内容)。
启动子是本领域熟知的。可以使用任意在宿主细胞中有作用的启动子在宿主细胞中表达异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸。有多种起始控制区或启动子可用于驱动异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸在多种宿主细胞中的表达，并且是本领域技术人员熟知的(见，例如，WO 2004/033646和其中引用的参考文献，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于用于表达目标核酸的载体的内容)。事实上任何能够驱动这些核酸的启动子都适合于本发明，包括但不限于：CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADCI、TRP1、URA3、LEU2、ENO、和TPI(用于在酵母属中的表达)；AOX1(用于在毕赤酵母属中的表达)；和lac、trp、λPL、λPR、T7、tac、和trc(用于在大肠杆菌中的表达)。
在一些实施方式中，使用葡萄糖异构酶启动子(见，例如美国专利号7,132,527及其中引用的参考文献，其各自通过引用方式全文并入本文，尤其是关于用于表达目标多肽的启动子和质粒系统的内容)。报道的葡萄糖异构酶启动子突变体可用于改变与葡萄糖异构酶启动子可操作地连接的核酸编码的多肽的表达水平(美国专利号7,132,527)。在多个实施方式中，葡萄糖异构酶启动子包含于低拷贝、中等拷贝、或高拷贝质粒中(美国专利号7,132,527)。
在多个实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸包含于低拷贝质粒(例如，以大约1至大约4个拷贝/细胞维持的质粒)、中等拷贝质粒(例如，以大约10至大约15个拷贝/细胞维持的质粒)、或高拷贝质粒(例如，以大约50或更多个拷贝/细胞维持的质粒)中。在一些实施方式中，异源或额外的内源的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸可操作地连接于T7启动子。在一些实施方式中，可操作地连接于T7启动子的异源或额外的内源的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸包含于中等或高拷贝质粒中。在一些实施方式中，异源或额外的内源的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸可操作地连接于Trc启动子。在一些实施方式中，可操作地连接于Trc启动子的异源或额外的内源的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸包含于中等或高拷贝质粒中。在一些实施方式中，异源或额外的内源的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸可操作地连接于Lac启动子。在一些实施方式中，可操作地连接于Lac启动子的异源或额外的内源的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸包含于低拷贝质粒中。在一些实施方式中，异源或额外的内源的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸可操作地连接于内源性启动子，例如内源性埃希菌属、Panteoa属、芽孢杆菌属、耶氏酵母属、链霉菌属、或木霉菌属启动子或内源性碱性丝氨酸蛋白酶、异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子启动子。在一些实施方式中，可操作地连接于内源性启动子的异源或额外的内源的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸包含于高拷贝质粒中。在一些实施方式中，载体是不整合到细胞的染色体中的复制质粒。在一些实施方式中，部分或全部载体整合进入细胞的染色体中。
在一些实施方式中，载体是任意的这样的载体：当被导入真菌宿主细胞中时，整合进入宿主细胞基因组并且被复制。关于载体的列表，参见Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains(FGSC，互联网网址为“fgsc.net”以及其中引用的参考文献，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于载体的内容)。在下列文献中提供了合适的表达和/或整合载体的另外的实例：Sambrook等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2nd ed.，Cold Spring Harbor，1989，Current Protocols inMolecular Biology(F.M.Ausubel等人(eds)1987，Supplement 30，section7.7.18)；van den Hondel等人in Bennett and Lasure(Eds.)More GeneManipulations in Fungi，Academic Press pp.396-428，1991；和美国专利号5,874,276，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于载体的内容。特别有用的载体包括pFB6、pBR322、PUC18、pUC100、和pENTR/D。
在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸可操作地连接于在真菌宿主细胞中显示出转录活性的适宜的启动子。启动子可以源自编码宿主细胞的内源性或异源性的多肽的一个或多个核酸。在一些实施方式中，启动子可用于木霉菌属宿主。启动子的合适的非限制性实例包括cbh1、cbh2、egl1、egl2、pepA、hfb1、hfb2、xyn1、和amy。在一些实施方式中，启动子是宿主细胞的天然启动子。例如，在一些实施方式中，当里氏木霉是宿主时，启动子是天然里氏木霉启动子。在一些实施方式中，启动子是里氏木霉cbh1，其是可诱导启动子并保藏于GenBank，保藏号为D86235，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于启动子的内容。在一些实施方式中，启动子是真菌宿主细胞的异源的启动子。有用的启动子的其它实例包括来自泡盛曲霉(A.awamori)和黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶(glaA)的基因的启动子(Nunberg等人，Mol.Cell Biol.4：2306-2315，1984和Boel等人，EMBO J.3：1581-1585，1984，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于启动子的内容)；黑曲霉α淀粉酶、米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、里氏木霉xln1、和里氏木霉纤维二糖水解酶1的基因的启动子(EP 137280，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于启动子的内容)。
在一些实施方式中，表达载体还包括终止序列。终止控制区也可以源自宿主细胞的多个天然基因。在一些实施方式中，终止序列和启动子序列源自相同的来源。在另一个实施方式中，终止序列是宿主细胞内源性的。特别适宜的终止子序列是源自木霉菌株(例如里氏木霉)的cbh1。其它有用的真菌终止子包括来自黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶核酸的终止子(Nunberg等人，Mol.Cell Biol.4：2306-2315，1984和Boel等人，EMBO J.3：1581-1585，1984；其各自通过引用方式全文并入本文，尤其是关于真菌终止子的内容)。任选地，可以包括终止位点。为了有效表达多肽，使编码多肽的DNA通过起始密码子可操作地连接于选择的表达控制区，从而表达引起形成合适的信使RNA。
在一些实施方式中，启动子、编码区、和终止子全部来自待表达的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸。在一些实施方式中，将异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸的编码区插入至一般目的的表达载体，从而使其处于表达构建体启动子和终止子序列的转录控制下。在一些实施方式中，将基因或其一部分插入至强cbh1启动子的下游。
可以使用标准技术(Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，1982，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于筛选合适的DNA序列和构建载体的内容)将异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸掺入到载体例如表达载体中。用于连接包含目标核酸(例如异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸)、启动子、终止子、和其它序列的DNA构建体以及用于将它们插入至合适的载体的方法是本领域熟知的。例如，限制性酶可用于切割异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸和载体。然后，可以连接经切割的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸和经切割的载体的相容性末端。一般通过在方便的限制性位点的连接来实现连接。如果不存在此类位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸接头(见，Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor，1989，以及Bennett和Lasure，More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press，San Diego，pp70-76，1991，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于寡核苷酸接头的内容)。另外，可以使用已知的重组技术构建载体(例如，InvitrogenLife Technologies，Gateway Technology)。
在一些实施方式中，可能需要以远高于细胞中目前天然存在的水平过表达异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸。可以通过将编码那些多肽的核酸选择性克隆进入多拷贝质粒或将那些核酸置于强可诱导或组成型启动子下来实现该结果。用于过表达需要的多肽的方法是分子生物学领域常见的和熟知的，实例可以见Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor，1989，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于克隆技术的内容。
在一些实施方式中，可能需要以远低于细胞中目前天然存在的水平低表达(例如突变、失活、或缺失)异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子多肽编码核酸。可以通过突变或失活表达异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸所需的转录调节蛋白，通过缺失异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸，或通过将那些核酸置于强可抑制启动子的控制下来实现该结果。用于突变、失活、或缺失需要的多肽的方法是分子生物学领域常见的和熟知的，实例可以见Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor，1989，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于克隆和诱变技术的内容。
以下资源包括用于本发明的另外的一般性方法的描述：Kreigler，Gene Transfer and Expression；A Laboratory Manual，1990和Ausubel等人，Eds.Current Protocols in Molecular Biology，1994，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于分子生物学和克隆技术的内容。
示例性的来源生物体
可以从任何天然包含异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸的生物体获得异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸(及其编码的多肽)。如上所述，有多种生物体天然地形成异戊二烯，例如细菌、真菌、植物、和动物。生物体包含用于产生异戊二烯的MVA途径、DXP途径、或MVA与DXP途径二者(图19A和19B)。因此，可以获得DXS核酸，例如，从包含DXP途径或含有MVA与DXP途径二者的任意生物体获得。可以从例如包含MVA途径、DXP途径、或MVA与DXP途径二者的任意生物体获得IDI和异戊二烯合酶核酸。可以从例如包含MVA途径或包含MVA与DXP途径二者的任意生物体获得MVA途径核酸。可以从例如从葡萄糖或其它碳源天然产生醇的任意生物体获得乙醇发酵相关的核酸。可以从例如天然具有以甘油作为主要碳源生长的能力的任意生物体获得甘油途径和/或1，3-丙二醇途径相关的核酸。可以从例如氧化氢或还原氢离子的任意生物体获得氢化酶核酸。可以从例如进行限氧或无氧呼吸例如糖酵解的任意生物体获得或鉴定发酵副产物基因。
在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸的核酸序列与通过下列任意生物体天然产生的核酸的序列相同。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子多肽的氨基酸序列与通过下列任意生物体天然产生的多肽的序列相同。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸或多肽是源自本文描述的任意生物体的突变体核酸或多肽。如本文使用的“源自”是指核酸或多肽的来源，所述核酸或多肽中导入了一个或多个突变。例如，“源自植物多肽”的多肽是指由于向野生型(即天然存在的序列)植物多肽的序列中导入了一个或多个突变而产生的目标多肽。
在一些实施方式中，来源生物体是真菌，其实例有：曲霉属的物种，例如米曲霉和黑曲霉；酵母属的物种，例如酿酒酵母；裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的物种，例如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；以及木霉属的物种，例如里氏木霉。在一些实施方式中，来源生物体是丝状真菌细胞。术语“丝状真菌”是指真菌亚门中的所有的丝状形式(见，Alexopoulos，C.J.(1962)，Introductory Mycology，Wiley，New York)。这些真菌的特征在于营养菌丝体，其具有由壳多糖、纤维素、和其它复合多糖组成的细胞壁。丝状真菌在形态、生理和遗传上与酵母菌不同。丝状真菌的营养生长是通过菌丝的延长，碳分解代谢是专有性好氧的。丝状真菌亲代细胞可以是下列种的细胞但不限于此：木霉属(例如，里氏木霉，红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的无性型，之前被分类为长枝木霉(T.longibrachiatum)，绿色木霉(Trichoderma viride)，康氏木霉(Trichodermakoningii)，哈茨木霉(Trichoderma harzianum)(Sheir-Neirs等人，Appl.Microbiol.Biotechnol 20：46-53，1984；ATCC No.56765和ATCC No.26921)；青霉属(Penicillium sp.)，腐质霉属(Humicola sp.)(例如，特异腐质霉(H.insolens)、H.lanuginose、或灰色腐质霉(H.grisea))；金孢属(Chrysosporium sp.)(例如，C.lucknowense)、粘帚霉(Gliocladium sp.)，曲霉属(例如，米曲霉、黑曲霉、酱油曲霉(A sojae)、日本曲霉(A.japonicus)，构巢曲霉，或泡盛曲霉)(Ward等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.39：7380743，1993和Goedegebuur等人，Genet 41：89-98，2002)，镰菌属(Fusarium sp.)(例如，粉红镰刀菌(F.roseum)、禾谷镰刀菌(F.graminum)、F.cerealis、尖孢镰刀菌(F.oxysporuim)、或F.venenatum)，脉孢霉属(Neurospora sp.)(例如，粗糙脉胞菌(N.crassa)，肉座菌属(Hypocrea sp.)，毛霉菌属(Mucor sp.)(例如，米黑毛霉菌(M.miehei)，根霉属(Rhizopussp.)，和裸胞壳属(Emericella sp.)(另外见，Innis等，Sci.228：21-26，1985)。术语“木霉菌”或“木霉菌属(Trichoderma sp.)”或“木霉菌(Trichodermaspp.)”是指之前或目前被分类为木霉菌的任意真菌属。
在一些实施方式中，真菌是构巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉、日本曲霉、里氏木霉、绿色木霉、尖孢镰刀菌、或茄镰孢(F.solani)。曲霉菌菌株公开于Ward等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.39：738-743，1993和Goedegebuur等人，Curr Gene 41：89-98，2002，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于真菌的内容。在具体的实施方式中，真菌是木霉的菌株，例如里氏木霉的菌株。里氏木霉的菌株是已知的，其非限制性实例包括ATCC No.13631、ATCC No.26921、ATCC No.56764、ATCC No.56765、ATCC No.56767、和NRRL 15709，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于里氏木霉的菌株的内容。在一些实施方式中，宿主菌株是RL-P37的衍生物。RL-P37公开于Sheir-Neiss等，Appl.Microbiol.Biotechnology 20：46-53，1984，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于里氏木霉的菌株的内容。
在一些实施方式中，来源生物体是酵母，例如酵母属、裂殖酵母属、毕赤酵母属、或假丝酵母属(Candida sp)。在一些实施方式中，酵母属是酿酒酵母。
在一些实施方式中，来源生物体是细菌，例如芽孢杆菌的菌株，例如地衣芽孢杆菌(B.lichenformis)或枯草芽孢杆菌；泛菌属的菌株，例如柠檬泛菌；假单胞菌的菌株，例如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)、恶臭假单胞菌(P.putida)、或荧光假单胞菌(P.fluorescens)；链霉菌属的菌株，例如浅青紫链霉菌(S.lividans)或锈棕色链霉菌(S.rubiginosus)；棒杆菌属(Corynebacterium sp.)的菌株，例如谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)；红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)的菌株，例如沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)；或埃希菌属的菌株，例如大肠杆菌。
如本文使用的“芽孢杆菌属”包括本领域技术人员已知的落在芽孢杆菌属内的所有物种，包括但不限于：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、B.halodurans、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽胞杆菌(B.coagulans)、环状芽胞杆菌(B.circulans)、B.lautus和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis )。认识到：芽孢杆菌属仍然会持续进行分类学上的改组。因此，该属意在包括被重新分类的物种，包括但不限于这样的生物体，例如嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)，其现在被称作“嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)”。在存在氧的条件下产生抗性内生孢子被认为是芽孢杆菌属的定义特征，虽然该特征也适用于最近被命名的脂环酸芽孢杆菌属(Aliyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、解硫胺素杆菌属(Aneurinibacillus)、无氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、线芽孢杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、热杆菌属(Thermobacillus)、Ureibacillus和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
在一些实施方式中，来源生物体是革兰氏阳性细菌。非限制性实例包括链霉菌的菌株(例如，浅青紫链霉菌、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、或灰色链霉菌(S.griseus))和芽孢杆菌属的菌株。在一些实施方式中，来源生物体是革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌；红假单胞菌属，例如沼泽红假单胞菌；假单胞菌属，例如产碱假单胞菌、恶臭假单胞菌、或荧光假单胞菌；发酵单胞菌属(Zymonomas sp.)，例如运动发酵单胞菌。
在一些实施方式中，来源生物体是植物，例如来自豆科的植物，例如蝶型花亚科。在一些实施方式中，来源生物体是野葛，白杨(例如银白杨x欧洲山杨CAC35696)、白杨(例如美洲山杨)、或夏栎。
在一些实施方式中，来源生物体是藻类，例如绿藻、红藻、灰胞藻(glaucophyte)、chlorarachniophytes、眼虫、假菌界(Chromista)、或腰鞭毛虫(dinoflagellates)。
在一些实施方式中，来源生物体是蓝细菌，例如基于形态分类为下列组的蓝细菌：色球藻目(Chroococcales)、宽球藻目(Pleurocapsales)、颤藻目(Oscillatoriales)、念珠藻目(Nostocales)、或真枝藻目(Stigonematales)。
示例性的宿主细胞
多种宿主细胞可用于要求保护的发明的方法中表达异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子多肽并共同生产异戊二烯和氢。示例性的宿主细胞包括来自前一部分小标题为“示例性来源生物体”中所列的任意生物体的细胞。宿主细胞可以是天然产生异戊二烯的细胞，或者是不天然产生异戊二烯的细胞。在一些实施方式中，宿主细胞通过DXP途径天然产生异戊二烯，并且加入异戊二烯、DXS、和/或IDI核酸以增加通过该途径产生的异戊二烯。在一些实施方式中，宿主细胞通过MVA途径天然产生异戊二烯，并且加入异戊二烯和/或一种或多种MVA途径核酸以增加通过该途径产生的异戊二烯。在一些实施方式中，宿主细胞通过DXP途径天然产生异戊二烯，并且加入一种或多种MVA途径核酸以通过部分或全部MVA途径以及DXP途径产生异戊二烯。在一些实施方式中，宿主细胞通过DXP和MVA途径天然产生异戊二烯，并且加入一种或多种异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸以增加通过这些途径之一或二者产生的异戊二烯。
在一些实施方式中，宿主细胞通过DXP和MVA途径天然产生异戊二烯，并且加入一种或多种异戊二烯、DXS、IDI、或MVA途径核酸以增加通过这些途径之一或二者产生的异戊二烯，加入一种或多种氢化酶核酸以增加氢的产生，失活或缺失一种或多种产生发酵副产物的基因以限制发酵副产物的产生。在一些实施方式中，宿主细胞通过DXP和MVA途径天然地共同产生异戊二烯和氢，并且加入一种或多种异戊二烯、DXS、IDI、或MVA途径核酸以增加通过这些途径之一或二者产生的异戊二烯，加入一种或多种氢化酶核酸以增加氢的产生，失活或缺失一种或多种产生发酵副产物的基因以限制发酵副产物的产生，并且失活或缺失一种或多种氢重摄取基因以增加氢的产生。在一些实施方式中，宿主细胞通过DXP和MVA途径天然地共同产生异戊二烯和氢，并且加入一种或多种异戊二烯、DXS、IDI、或MVA途径核酸以增加通过这些途径之一或二者产生的异戊二烯，加入一种或多种氢化酶核酸以增加氢的产生，加入一种或多种氢化酶成熟核酸以增加氢的产生，失活或缺失一种或多种产生发酵副产物的基因以限制发酵副产物的产生，并且失活或缺失一种或多种氢重摄取基因以增加氢的产生。在一些实施方式中，宿主细胞通过DXP和MVA途径天然地共同产生异戊二烯和氢，并且加入一种或多种异戊二烯、DXS、IDI、或MVA途径核酸以增加通过这些途径之一或二者产生的异戊二烯，加入一种或多种氢化酶核酸以增加氢的产生，加入一种或多种氢化酶成熟核酸以增加氢的产生，加入或失活或缺失一种或多种转录因子核酸以增加氢化酶的产生，失活或缺失一种或多种产生发酵副产物的基因以限制发酵副产物的产生，并且失活或缺失一种或多种氢重摄取基因以增加氢的产生。
示例性的转化方法
可以使用标准技术将异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸或包含它们的载体插入至宿主细胞(例如本文描述的植物细胞、真菌细胞、酵母细胞、或细菌细胞)以表达所编码的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、乙醇发酵相关的、甘油途径、1，3-丙二醇途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子多肽。可以使用例如下列技术将DNA构建体或载体导入宿主细胞中：转化、电穿孔、细胞核徼注射、转导、转染(例如脂转染介导的或DEAE-Dextrin介导的转染，或使用重组噬菌体病毒转染)、以磷酸钙DNA沉淀温育、以DNA包被的微粒高速轰击、和原生质体融合。一般性的转化技术是本领域已知的(见，例如，CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人(eds)Chapter 9，1987；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，ColdSpring Harbor，1989；和Campbell等人，Curr.Genet.16：53-56，1989，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于转化方法的内容)。在木霉中表达异源多肽的描述见美国专利号6,022,725；美国专利号6,268,328；美国专利号7,262,041；WO 2005/001036；Harkki等人，Enzyme Microb.Technol.13：227-233，1991；Harkki等人，Bio Technol.7：596-603，1989；EP244,234；EP 215,594；和Nevalainen等人，“The Molecular Biology ofTrichoderma and its Application to the Expression of Both Homologousand Heterologous Genes，”见Molecular Industrial Mycology，Eds.Leongand Berka，Marcel Dekker Inc.，NY pp.129-148，1992，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于转化和表达方法的内容)。对于曲霉菌株的转化，还参考了Cao等人，(Sci.9：991-1001，2000；EP 238023；和Yelton等人，Proceedings.Natl.Acad.Sci.USA 81：1470-1474，1984(其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于转化方法的内容)。导入的核酸可以整合进入染色体DNA或者可以维持为染色体外的复制序列。
可以使用本领域已知的任意方法来选择转化子。在一个非限制性实例中，包含amdS标志物的稳定转化子与不稳定转化子通过下列区分开：在含有乙酰胺的固体培养基上更快的生长速率和形成具有平滑而非不整齐的轮廓圆形菌落。另外，在一些情况下，通过下列进行进一步的稳定性测试：在固体非选择性培养基(例如不含乙酰胺的培养基)上生长转化子，从该培养基收集孢子，和检测随后在含有乙酰胺的选择性培养基上萌芽并生长的这些孢子的百分率。
在一些实施方式中，通过涉及原生质体形成和原生质体转化、然后通过已知方式再生细胞壁的方法转化真菌细胞。在一个具体的实施方式中，制备用于转化的木霉属包括：从真菌菌丝体制备原生质体(见，Campbell等人，Curr.Genet.16：53-56，1989，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于转化方法的内容)。在一些实施方式中，从萌芽的营养孢子获得菌丝体。以消化细胞壁的酶处理菌丝体，从而产生原生质体。然后通过悬浮培养基中渗透稳定剂的存在来保护原生质体。这些稳定剂包括山梨醇、甘露醇、氯化钾、硫酸镁等。这些稳定剂的通常的浓度是0.8M-1.2M。在悬浮培养基中使用大约1.2M的山梨醇溶液是合乎需要的。
宿主木霉属的菌株对DNA的摄取依赖于钙离子的浓度。一般而言，在摄取溶液中使用大约10mM CaCl2至50mM CaCl2。除了摄取溶液中的钙离子之外，一般包括的其它化合物是：缓冲系统，例如TE缓冲液(10Mm Tris，pH 7.4；1mM EDTA)或10mM MOPS，pH 6.0缓冲液(吗啉丙磺酸)和聚乙二醇(PEG)。不被任何特定理论所限，相信聚乙二醇的作用是融合细胞膜，因此允许培养基的内容物被递送至木霉属菌株的细胞质并使质粒DNA转移至细胞核。这种融合通常允许多个拷贝的质粒DNA整合进入宿主染色体。
通常在转化中使用含有密度为105至107/mL(例如2x106/mL)的已经过渗透性处理的木霉属原生质体或细胞的悬浮液。将体积为100μL的这些原生质体或细胞(在合适的溶液中例如，1.2M山梨醇和50mM CaCl2)与需要的DNA混合。一般而言，向摄取溶液中加入高浓度的PEG。可以向原生质体悬浮液中加入0.1-1体积的25％PEG 4000。在一些实施方式中，向原生质体悬浮液中加入大约0.25体积。也可以向摄取溶液中加入添加剂，例如二甲基亚砜、肝素、精脒，氯化钾等并辅助转化。用于其它真菌宿主细胞的类似程序是可以获得的(见，例如，美国专利号6,022,725和6,268,328，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于转化方法的内容)。
一般而言，然后将混合物在大约0℃培养10-30分钟的时间段。然后向混合物中加入另外的PEG以进一步增加需要的核酸序列的摄取。一般加入转化混合物体积的5-15倍体积的25％PEG 4000；然而，更大和更小体积可以是合适的。转化混合物体积的约10倍的25％PEG 4000是合乎需要的。加入PEG之后，然后在室温或在冰上培养转化混合物，然后加入山梨醇和CaCl2溶液。然后将原生质体悬浮液加入到生长培养基的熔化的等份中。当生长培养基包括生长选择剂(例如，乙酰胺或抗生素)时，其仅允许转化子生长。
可以根据常规方法进行细菌细胞的转化，所述常规方法例如描述于Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，1982的方法，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于转化方法的内容。
示例性的细胞培养基
本发明还包括培养物中的共同生产异戊二烯和氢的细胞或细胞群体。“培养物中的细胞”意思是在允许细胞进行一次或多次细胞分裂的溶液(例如细胞生长培养基)中的两个或更多个细胞。“培养物中的细胞”不包括这样的植物细胞：其是包含已经分化为植物组织的细胞的活的多细胞植物的一部分的植物细胞。在多个实施方式中，细胞培养物包含至少或大约10、20、50、100、200、500、1,000、5,000、10,000、或更多个细胞。
“限氧培养物中的细胞”意思是在允许细胞进行一次或多次细胞分裂的溶液(例如细胞生长培养基)中的两个或更多个细胞，其中所述溶液含有限定量的氧。术语“限氧培养物”意思是该培养物是缺氧的或含有小于支持通过还原当量生物转移至氧而呼吸所需的量的氧，并且也包括无氧培养物。在限氧培养物条件下，不能接受一些源自碳代谢的电子，这是因为氧的浓度太低，使细胞转变为产生氢(如果它们包含用于产生氢的合适的代谢途径)。当氧转移速率(“OTR”)小于氧摄取速率(“OUR”)时(由培养基中接近零的溶解氧浓度指示)，发生限氧培养条件。
可以使用任意碳源来培养宿主细胞。术语“碳源”是指能够被宿主细胞或生物体代谢的一种或多种含碳化合物。例如，用于培养宿主细胞的细胞培养基可以包含适合于维持宿主细胞存活或生长的任意碳源。
在一些实施方式中，碳源是碳水化合物(例如单糖、二糖、寡糖、或多糖)、转化糖(例如，酶处理的蔗糖糖浆)、丙三醇、甘油(例如，生产生物柴油或肥皂的工艺的甘油副产物)、二羟基丙酮、一碳源、油(例如，植物油或菜油，例如玉米油、棕榈油、或大豆油)、动物脂肪、动物油、脂肪酸(例如，饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、或多不饱和脂肪酸)、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、可再生碳源(例如，生物质碳源，例如水解的生物质碳源)、酵母提取物、来自酵母提取物的成分、聚合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、琥珀酸、乳酸、乙酸、乙醇、或前述中的两项或多项的任意组合。在一些实施方式中，碳源是光合作用的产物，包括但不限于葡萄糖。
示例性的单糖包括葡萄糖和果糖；示例性的寡糖包括乳糖和蔗糖，示例性的多糖包括淀粉和纤维素。示例性的碳水化合物包括C6糖(例如，果糖、甘露糖、半乳糖、或葡萄糖)和C5糖(例如，木糖或阿拉伯糖)。在一些实施方式中，细胞培养基包括碳水化合物以及除了碳水化合物之外的一种或多种碳源(例如，丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、或来自酵母提取物的成分)。在一些实施方式中，细胞培养基包含碳水化合物以及多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)。在一些实施方式中，微生物多肽是来自酵母或细菌的多肽。在一些实施方式中，植物多肽是来自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈、花生、向日葵、椰子、芥、油菜籽、棉花籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、或亚麻仁。
在一些实施方式中，碳水化合物的浓度是至少或大约5g/升培养液(g/L，其中培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积二者)，例如至少或大约10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、400、或更多g/L。在一些实施方式中，碳水化合物的浓度是大约50至大约400g/L，例如大约100至大约360g/L，大约120至大约360g/L，或大约200至大约300g/L。在一些实施方式中，碳水化合物的该浓度包括在培养宿主细胞之前和/或过程中加入的碳水化合物的总量。
在一些实施方式中，在限葡萄糖的条件下培养细胞。“限葡萄糖的条件”意思是加入的葡萄糖的量小于或等于细胞消耗的葡萄糖的量的大约105％(例如大约100％)。在具体的实施方式中，加入到培养基中的葡萄糖的量大约等于特定时间段期间细胞消耗的葡萄糖的量。在一些实施方式中，通过限制加入的葡萄糖的量来控制细胞生长速率，从而细胞在可以被细胞培养基中的葡萄糖的量支持的速率生长。在一些实施方式中，在细胞培养的时间期间，葡萄糖不积累。在多个实施方式中，在限葡萄糖的条件下培养细胞超过或等于大约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、或70个小时。在多个实施方式中，在限葡萄糖的条件下培养细胞超过或等于大约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％的总细胞培养时间长度。不被任何特定理论所限，相信限葡萄糖的条件可以允许更有利的细胞调节。
在一些实施方式中，在存在过量葡萄糖的条件下培养细胞。在具体的实施方式中，加入的葡萄糖的量大于大约105％(例如大约或大于110％、120％、150％、175％、200％、250％、300％、400％、或500％)或更高的细胞在特定时间段期间消耗的葡萄糖的量。在一些实施方式中，在细胞培养时间过程中葡萄糖积累。
示例性的脂质是包含一种或多种C4和以上脂肪酸的脂肪酸的任意物质，所述脂肪酸可以是饱和、不饱和、或分支的。
示例性的油是在室温为液态的脂质。在一些实施方式中，脂质包含一种或多种C4或以上的脂肪酸(例如包含一种或多种具有4个或更多个碳的饱和的、不饱和的、或分支的脂肪酸)。在一些实施方式中，油获自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈、花生、向日葵、椰子、芥、油菜籽、棉花籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、亚麻仁、油质微生物细胞、乌桕、或前述两项或更多项的任意组合。
示例性的脂肪酸包括式RCOOH的化合物，其中“R”是烃。示例性的不饱和脂肪酸包括这样的化合物：其中“R”包括至少一个碳-碳双键。示例性的不饱和脂肪酸包括但不限于油酸、异油酸、亚油酸、棕榈油酸、和花生四烯酸。示例性的多不饱和脂肪酸包括这样的化合物：其中“R”包括多个碳-碳双键。示例性的饱和脂肪酸包括这样的化合物：其中“R”是饱和的脂肪族基团。在一些实施方式中，碳源包括一种或多种C12-C22脂肪酸，例如C12饱和脂肪酸、C14饱和脂肪酸、C16饱和脂肪酸、C18饱和脂肪酸、C20饱和脂肪酸、或C22饱和脂肪酸。在示例性的实施方式中，脂肪酸是棕榈酸。在一些实施方式中，碳源是脂肪酸(例如，不饱和脂肪酸)的盐、脂肪酸(例如，不饱和脂肪酸)的衍生物、或脂肪酸(例如，不饱和脂肪酸)的衍生物的盐。合适的盐包括但不限于：锂盐、钾盐、钠盐等。甘油二酯和甘油三酯是甘油的脂肪酸酯。
在一些实施方式中，脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯的浓度是至少或大约1g/升培养液(g/L，其中培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积二者)，例如至少或大约5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、400、或更多g/L。在一些实施方式中，脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯的浓度是大约10至大约400g/L，例如大约25至大约300g/L，大约60至大约180g/L，或大约75至大约150g/L。在一些实施方式中，该浓度包括在培养宿主细胞之前和/或过程中加入的脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯的总量。在一些实施方式中，碳源包括(1)脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯和(ii)碳水化合物，例如葡萄糖。在一些实施方式中，脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯与碳水化合物的比是大约1∶1(基于碳)(即，脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯中的一个碳/碳水化合物的碳)。在具体的实施方式中，脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯的量是大约60至180g/L，并且碳水化合物的量是大约120至360g/L。
示例性的微生物多肽碳源包括来自酵母或细菌的一种或多种多肽。示例性的植物多肽碳源包括来自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈、花生、向日葵、椰子、芥、油菜籽、棉花籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、或亚麻仁的一种或多种多肽。
示例性的可再生的碳源包括干酪乳清渗透物、玉米浸液、甜菜糖蜜、大麦芽、和来自前述任意项的成分。示例性的可再生碳源还包括存在于生物质中的葡萄糖、己糖、戊糖和木糖，所述生物质例如玉米、柳枝稷、甘蔗、发酵过程的细胞废物，以及来自大豆、玉米、或小麦的研磨的蛋白质副产物。在一些实施方式中，生物质碳源是木质纤维素、半纤维素、或纤维质材料，例如但不限于草、小麦、麦秸、甘蔗渣、甘蔗渣、软木浆、玉米、玉米芯或稻壳、玉米仁、来自玉米仁的纤维、玉米秸秆、柳枝稷、稻壳产物、或从谷物(如玉米、高梁、黑麦、triticate、大麦、小麦和/或蒸馏谷物)的湿或干研磨生产的副产物。示例性的纤维质材料包括木材、纸和浆废液、草本植物、及果肉。在一些实施方式中，碳源包括任意植物部分，如茎、谷粒、根、或块茎。在一些实施方式中，任意以下植物的全部或部分用作碳源：玉米、小麦、黑麦、高梁、triticate、水稻、粟、大麦、木薯、豆类如大豆和豌豆、马铃薯、蕃薯、香蕉、甘蔗、和/或木薯。在一些实施方式中，碳源是生物质水解物，如包含木糖和葡萄糖或包含蔗糖和葡萄糖的生物质水解物。
在一些实施方式中，在添加到细胞培养基中之前预处理可再生碳源(例如生物质)。在一些实施方式中，预处理包括酶预处理、化学预处理、或酶和化学预处理的组合(见，例如，Farzaneh等人，BioresourceTechnology 96(18)：2014-2018，2005；美国专利号6,176,176；美国专利号6,106,888；其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于可再生碳源的预处理的内容)。在一些实施方式中，在添加到细胞培养基之前，将可再生碳源部分或全部水解。
在一些实施方式中，在添加到细胞培养基之前，可再生碳源(例如玉米秸秆)经历氨气爆破法(AFEX)预处理(见，例如，Farzaneh等人，Bioresource Technology 96(18)：2014-2018，2005)。在AFEX预处理过程中，在中等温度(例如大约60℃至大约100℃)和高压(例如大约250psi至大约300psi)以液态无水氨将可再生碳源处理大约5分钟。然后，迅速释放压力。在该过程中，木质素溶解、半纤维素水解、纤维素的解晶作用和增加的表面积的化学和物理的组合效应使得纤维素和半纤维素几乎能够完全酶促转化为可发酵的糖。AFEX预处理具有以下优点：几乎所有的氨都可以被回收和再利用，剩余的则作为下游过程中的微生物的氮源。另外，AFEX预处理无需洗涤流。因此，AFEX处理之后的干物质回收基本上是100％。AFEX基本上是干-干的过程。经处理的可再生碳源在长时间内是稳定的，并且可以以非常高的固体载量进料到酶促水解或发酵过程中。纤维素和半纤维素在AFEX过程中被良好保存，甚少降解或无降解。对于经历了AFEX预处理的可再生碳源而言，在酶促水解之前，无需中和。AFEX处理的碳源的酶促水解为随后的发酵用途产生清洁的糖流。
在一些实施方式中，碳源(例如可再生碳源)的浓度是至少或大约0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、或50％葡萄糖(w/v)。可以通过使用标准的HPLC方法，使用葡萄糖作为参照物来测定葡萄糖的当量，以测定从碳源生产的葡萄糖的量。在一些实施方式中，碳源(例如可再生碳源)的浓度相当于大约0.1％至大约20％葡萄糖，例如大约0.1％至大约10％葡萄糖，大约0.5％至大约10％葡萄糖，大约1％至大约10％葡萄糖，大约1％至大约5％葡萄糖，或大约1％至大约2％葡萄糖。
在一些实施方式中，碳源包括酵母提取物或酵母提取物的一种或多种成分。在一些实施方式中，酵母提取物的浓度是至少1克酵母提取物/升培养液(g/L，其中培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积二者)，例如至少或大约5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、或更多g/L。在一些实施方式中，酵母提取物的浓度是大约1至大约300g/L，例如大约1至大约200g/L，大约5至大约200g/L，大约5至大约100g/L，或大约5至大约60g/L。在一些实施方式中，该浓度包括在培养宿主细胞之前和/或过程中加入的酵母提取物的总量。在一些实施方式中，碳源包括酵母提取物(或其一种或多种成分)和另一种碳源，例如葡萄糖。在一些实施方式中，酵母提取物与其它碳源的比例是大约1∶5，大约1∶10，或1∶20(w/w)。
另外，碳源也可以是一碳底物，例如二氧化碳或甲醇。已经报道了在甲基营养酵母(Yamada等人，Agric.Biol.Chem.，53(2)541-543，1989，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于碳源的内容)和细菌(Hunter等人，Biochemistry，24，4148-4155，1985，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于碳源的内容)从单一碳源(例如，甲醇、甲醛、或甲酸)生产甘油。这些生物体可以同化单一碳化合物：从甲烷氧化态至甲酸，并且生产甘油。碳同化的途径可以经由核酮糖-磷酸、经由丝氨酸或经由木酮糖-磷酸(Gottschalk，Bacterial Metabolism，Second Edition，Springer-Verlag：New York，1986，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于碳源的内容)。核酮糖-磷酸途径包括甲酸与核酮糖-5-磷酸缩合以形成6碳糖，该6碳糖变为果糖，并最终变为3碳产物甘油醛-3-磷酸。类似地，丝氨酸途径使一碳化合物通过亚甲基四氢叶酸同化进入糖酵解途径。
除了一碳和二碳底物，还已知甲基营养生物体利用多种其它含碳化合物，例如甲胺、葡萄糖胺和多种氨基酸以用于代谢活性。例如，已知甲基营养酵母利用来自甲胺的碳以形成海藻糖或甘油(Bellion等人，Microb.Growth Cl Compd.，[Int.Symp.]，7th ed.，415-32.Editors：Murrell等人，Publisher：Intercept，Andover，UK，1993，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于碳源的内容)。类似地，假丝酵母属的多个种代谢丙氨酸或油酸(Sulter等人，Arch.Microbiol.153(5)，485-9，1990，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于碳源的内容)。
在一些实施方式中，在含有生理盐和营养物的标准培养基中培养细胞(见，例如，Pourquie，J.等人，Biochemistry and Genetics of CelluloseDegradation，eds.Aubert等人，Academic Press，pp.71-86，1988和Ilmen等人，Appl.Environ.Microbiol.63：1298-1306，1997，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于细胞培养基的内容)。示例性的生长培养基是通常商业上制备的培养基，例如Luria Bertani(LB)培养基，SabouraudDextrose(SD)培养基，或酵母培养基(YM)肉汤。也可以使用其它的确定的或合成的生长培养基，用于特定宿主细胞的生长的合适的培养基是微生物或发酵科学领域技术人员已知的。
除了合适的碳源之外，细胞培养基合乎需要地包含合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液、和本领域技术人员已知的适合于培养物生长或增加异戊二烯产量的其它成分(见，例如，WO 2004/033646及其中引用的参考文献，以及WO 96/35796及其中引用的参考文献，其各自通过引用方式全文并入本文，尤其是关于细胞培养基和细胞培养条件的内容)。在一些实施方式中，当异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸处于可诱导启动子控制下时，向培养基中合乎需要地加入有效诱导异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径多肽的表达的浓度的诱导剂(例如糖、金属盐或抗微生物剂)。在一些实施方式中，细胞培养基具有对应于载体(其具有一种或多种DXS、IDI或MVA途径核酸)上的抗生素抗性核酸(例如卡那霉素抗性核酸)的抗生素(例如卡那霉素)。
示例性的细胞培养条件
适合于维持和生长细菌培养物的材料和方法是本领域熟知的。示例性的技术可以见Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardt等人，eds)，American Society for Microbiology，Washington，D.C.(1994)或Brock in Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，Second Edition(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于细胞培养技术的内容。在一些实施方式中，在允许表达一种或多种由插入至宿主细胞内的核酸编码的异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径多肽的条件下在培养基中培养细胞。
可以使用标准的细胞培养条件来培养细胞(见，例如，WO2004/033646及其中引用的参考文献，其各自通过引用方式全文并入本文，尤其是关于细胞培养物和发酵条件的内容)。细胞生长并维持于合适的温度、气体混合物、和pH下(例如大约20℃至大约37℃，在大约6％至大约84％CO2中，以及在大约5至大约9的pH下)。在一些实施方式中，细胞在35℃生长于合适的细胞培养基中。在一些实施方式中，例如，在大约28℃在合适的培养基中在振荡培养物或发酵器中培养，直至达到所需要的量的异戊二烯和氢的共同生产。在一些实施方式中，用于发酵的pH范围是大约pH 5.0至大约pH 9.0(例如大约pH 6.0至大约pH 8.0，或大约6.5至大约7.0)。可以基于宿主细胞的需要，在有氧、缺氧或无氧条件下进行反应。在一些实施方式中，在限氧条件下培养细胞。在一些实施方式中，在氧的存在下在每生产1摩尔异戊二烯消耗0.5摩尔氧的条件下培养细胞。在一些实施方式中，在无氧条件下培养细胞。用于给定的丝状真菌的示例性培养条件是本领域已知的，可以查阅科学文献和/或从真菌来源处获得，例如American Type Culture Collection and FungalGenetics Stock Center。
在多个实施方式中，使用任意已知的发酵模式使细胞生长，例如批式、补料分批、或连续方法。在一些实施方式中，使用批式发酵方法。经典的批式发酵是封闭系统，其中在发酵开始时设定培养基的成分，并且在发酵过程中不进行人为改变。因此，在发酵开始时，将需要的宿主细胞接种于细胞培养基，进行发酵，但不向系统中加入任何物质。然而，通常来讲，“批式”发酵是就加入碳源的批而言的，通常会尝试控制因素，例如pH和氧浓度。在批式系统中，系统的代谢物和生物质组成一直在变化，直至发酵停止时。在批式培养物中，细胞经过静止的停滞期进入高速生长对数期，最终到达稳定期，在稳定期生长速率下降或停止。在一些实施方式中，处于对数期的细胞负责大量生产异戊二烯。在一些实施方式中，处于稳定期的细胞生产异戊二烯。
在一些实施方式中，使用标准的批式系统的变体，例如补料分批系统。补料分批发酵方法包括典型的批式系统，只不过随着发酵的进程以增量添加碳源。当分解代谢产物抑制倾向于抑制细胞的代谢并且需要在细胞培养基中具有有限量的碳源时，补料分批系统是有用的。可以使用有限或过量的碳源(例如葡萄糖)进行补料分批发酵。补料分批系统中的实际的碳源浓度是难以测定的，因此根据可测因素例如pH、溶解氧、和废气例如CO2的分压的变化来估计。批式和补料分批发酵是常见的并且是本领域熟知的，其实例可以见Brock，Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，Second Edition(1989)Sinauer Associates，Inc.，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于细胞培养和发酵条件的内容。
在一些实施方式中，使用连续发酵方法。连续发酵是开放的系统，其中连续向生物反应器中添加确定的发酵培养基，并且同时取出等量的条件化培养基以进行处理。连续发酵一般将培养物维持在恒定的高密度，其中细胞主要处于对数生长期。
连续发酵允许调节影响细胞生长或异戊二烯生产的一个因素或任意数目的因素。例如，一种方法将限制性营养物例如碳源或氮水平维持在固定的速率，并允许所有其它参数适度。在其它系统中，可以持续改变影响生长的多个因素，同时保持细胞浓度恒定(例如通过培养基浊度测定的浓度)。连续系统努力维持稳定状态的生长状况。因此，由于培养基排出而损失的细胞针对发酵物中的生长速率达到平衡。调节用于连续发酵方法的营养物和生长因素的方法和用于使产物形成速率最大化的技术是工业微生物学领域熟知的，多种方法描述于Brock，Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，Second Edition(1989)SinauerAssociates，Inc.，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于细胞培养和发酵条件的内容。
在一些实施方式中，细胞固定于基底上作为整个细胞催化剂并经历发酵条件以生产异戊二烯。
在一些实施方式中，将液体培养物的瓶置于振荡器上以将氧导入液体中并维持培养物的均一性。在一些实施方式中，使用温育器控制温度、湿度、振荡速度、和/或培养物生长的其它条件。最简单的温育器是具有可调节的加热器(通常最高至～65℃)的隔离箱。更精致的温育器还包括降低温度(通过致冷)的能力，或控制湿度或CO2水平的能力。多数温育器包括计时器；一些还可以程序化以在不同的温度、湿度水平等之间循环。温育器的尺寸可以是各种各样的，从台式到小型房间大小的单位。
如果需要，可以改变一部分或全部的细胞培养基以补充营养物和/或避免积累潜在有害的代谢副产物和死亡的细胞。在悬浮培养物的情况下，可以通过离心或过滤悬浮培养物而从培养基中分离细胞，然后将细胞重悬于新鲜的培养基中。在贴壁培养的情况下，可以通过吸液而直接去掉培养基并更换。在一些实施方式中，细胞培养基允许细胞中的至少一部分在连续培养物(例如未稀释的连续培养物)中分裂以进行至少或大约5、10、20、40、50、60、65、或更多次细胞分裂。
在一些实施方式中，使用组成型或渗漏启动子(例如Trc启动子)，不添加用于诱导与启动子可操作地连接的异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸的表达的化合物(例如IPTG)。在一些实施方式中，添加化合物(例如IPTG)以诱导与启动子可操作地连接的异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸的表达。
用于使异戊二烯的生产与细胞生长解除偶联的示例性方法
合乎需要地，来自原料的碳被转化为异戊二烯而非转化为细胞的生长和维持。在一些实施方式中，细胞生长至低至中等的OD600，然后开始或增大异戊二烯的生产。该策略允许将大部分的碳转化为异戊二烯。
在一些实施方式中，细胞达到的光密度使得它们不再分裂或分裂极为缓慢，但是持续数小时地产生异戊二烯(例如大约2、4、6、8、10、15、20、25、30、或更多个小时)。例如，图60A-67C显示：在细胞达到它们不再分裂或分裂极为缓慢的光密度后，细胞可以持续生产实质量的甲羟戊酸或异戊二烯。在一些情况中，550nm处的光密度随时间下降(例如，由于细胞裂解而使细胞不再处于对数生长期之后光密度的下降)，并且细胞持续生产实质量的甲羟戊酸或异戊二烯。在一些实施方式中，经一定的时间段(例如大于或大约5、10、15、20、25、30、40、50、或60个小时)，细胞在550nm处的光密度增加是小于或大约50％(例如，小于或大约40％、30％、20％、10％、5％、或0％)，并且在该时间段期间，细胞生产的异戊二烯是大于或大约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、或更多nmole异戊二烯/克细胞的湿细胞重/小时(nmole/gwcm/hr)。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约2至大约5,000nmole/gwcm/hr，例如大约2至大约100nmole/gwcm/hr，大约100至大约500nmole/gwcm/hr，大约150至大约500nmole/gwcm/hr，大约500至大约1,000nmole/gwcm/hr，大约1,000至大约2,000nmole/gwcm/hr，或大约2,000至大约5,000nmole/gwcm/hr。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约20至大约5,000nmole/gwcm/hr，大约100至大约5,000nmole/gwcm/hr，大约200至大约2,000nmole/gwcm/hr，大约200至大约1,000nmole/gwcm/hr，大约300至大约1,000nmole/gwcm/hr，或大约400至大约1,000nmole/gwcm/hr。
在一些实施方式中，经一定的时间段(例如大于或大约5、10、15、20、25、30、40、50或60个小时)，细胞在550nm处的光密度增加是小于或大约50％(例如，小于或大约40％、30％、20％、10％、5％、或0％)，并且在该时间段期间，细胞生产的异戊二烯的累积效价(总量)是大于或大约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、50,000、100,000、或更多毫克异戊二烯/升培养液(mg/L培 养液，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约2至大约5,000mg/L培养液，例如大约2至大约100mg/L培养液，大约100至大约500mg/L培养液，大约500至大约1,000mg/L培养液，大约1,000至大约2,000mg/L培养液，或大约2,000至大约5,000mg/L培养液。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约20至大约5,000mg/L培养液，大约100至大约5,000mg/L培养液，大约200至大约2,000mg/L培养液，大约200至大约1,000mg/L培养液，大约300至大约1,000mg/L培养 液，或大约400至大约1,000mg/L培养液。
在一些实施方式中，经一定的时间段(例如大于或大约5、10、15、20、25、30、40、50或60小时)，细胞在550nm处的光密度增加是小于或大约50％(例如，小于或大约40％、30％、20％、10％、5％、或0％)，并且在该时间段期间，细胞将大于或大约0.0015％、0.002％、0.005％、0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％、或8.0％的细胞培养基中的碳转化为异戊二烯。在一些实施方式中，碳向异戊二烯的转化百分率是例如大约0.002％至大约4.0％，大约0.002％至大约3.0％，大约0.002％至大约2.0％，大约0.002％至大约1.6％，大约0.002％至大约0.005％，大约0.005％至大约0.01％，大约0.01％至大约0.05％，大约0.05％至大约0.15％，0.15％至大约0.2％，大约0.2％至大约0.3％，大约0.3％至大约0.5％，大约0.5％至大约0.8％，大约0.8％至大约1.0％，或大约1.0％至大约1.6％。在一些实施方式中，碳向异戊二烯的转化百分率是大约0.002％至大约0.4％，0.002％至大约0.16％，0.04％至大约0.16％，大约0.005％至大约0.3％，大约0.01％至大约0.3％，或大约0.05％至大约0.3％。
在一些实施方式中，仅在稳定期生产异戊二烯。在一些实施方式中，在生长期和稳定期都生产异戊二烯。在多个实施方式中，在稳定期期间生产的异戊二烯的量(例如所生产的异戊二烯的总量或所生产的异戊二烯的量/升培养液/小时/OD600)是大于或大约生长期期间相同时间长度生产的异戊二烯量的2、3、4、5、10、20、30、40、50、或更多倍。在多个实施方式中，细胞在稳定期生产的异戊二烯大于或大约是所生产的异戊二烯总量(例如在发酵过程的一定的时间例如20小时生产的异戊二烯)的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、或更高。在多个实施方式中，细胞分裂缓慢或完全不分裂以致于细胞在550nm处的光密度增加小于或大约是50％(例如小于或大约40％、30％、20％、10％、5％、或0％)时生产的异戊二烯大于或大约是所生产的异戊二烯总量(例如在发酵过程的一定的时间例如20小时生产的异戊二烯)的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高。在一些实施方式中，仅在生长期生产异戊二烯。
在一些实施方式中，将一种或多种MVA途径、IDI、DXP、或异戊二烯合酶核酸置于在稳定期比在生长期具有更高活性的启动子或因子的控制下。例如，可以将一种或多种MVA途径、IDI、DXP、或异戊二烯合酶核酸置于稳定期σ因子例如RpoS的控制下。在一些实施方式中，将一种或多种MVA途径、IDI、DXP、或异戊二烯合酶核酸置于在稳定期可诱导的启动子控制下，例如可以被在稳定期有活性的应答调节子诱导的启动子。
在安全操作范围内生产异戊二烯
根据其可燃性特征在安全操作水平内生产异戊二烯简化了商业设施的设计和构建，极大地改进了安全操作的能力，并限制了起火的潜在可能。特别地，生产异戊二烯的最佳范围在安全区内，即在异戊二烯浓度的非可燃范围内。在一个这样的方面，本发明的特征在于用于在异戊二烯浓度的非可燃范围内(在异戊二烯的可燃性包迹之外)生产异戊二烯的方法。
因此，使用了计算机模拟和实验测试来确定异戊二烯(例如在存在O2、N2、CO2、或上述气体中的两种或更多种的任意组合存在时的异戊二烯)的可燃极限，以确保操作的安全性。可燃性包迹的特征在于燃烧下限(LFL)、燃烧上限(UFL)、极限氧浓度(LOC)、和极限压力。对于可燃的系统而言，必须在存在最少量的氧化剂(通常是氧)的情况下有最少量的燃料(例如异戊二烯)。LFL是使燃烧持续所需的最少量的异戊二烯，而UFL是可以存在的最大量的异戊二烯。在该极限之上，混合物富含燃料并且氧的级份太低以致于不能形成可燃混合物。LOC表示形成可燃混合物还需要存在的氧的最小级份。极限温度基于异戊二烯的闪点，其是异戊二烯的燃烧可以传播的最低温度。这些限值对于异戊二烯的浓度、氧化剂的类型和浓度、系统中存在的惰性物、系统的温度和压力是特异性的。在可燃性包迹极限内的成分会使燃烧传播并需要加工设备的设计和操作上的另外的安全考虑。
使用计算机模拟和数学分析和实验测试检测了如下条件。如果需要，可以使用本文描述的方法测试其它条件(例如其它温度、压力、和永久气体成分)以测定LFL、UFL和LOC浓度。
(1)计算机模拟和数学分析
测试组1：
异戊二烯：0wt％-14wt％
O2：6wt％-21wt％
N2：79wt％-94wt％
测试组2：
异戊二烯：0wt％-14wt％
O2：6wt％-21wt％
N2：79wt％-94wt％
以水饱和
测试组3：
异戊二烯：0wt％-14wt％
O2：6wt％-21wt％
N2：79wt％-94wt％
CO2：5wt％-30wt％
(2)用于最终测定可燃极限的实验测试
测试组1：
异戊二烯：0wt％-14wt％
O2：6wt％-21wt％
N2：79wt％-94wt％
测试组2：
异戊二烯：0wt％-14wt％
O2：6wt％-21wt％
N2：79wt％-94wt％
以水饱和
使用模拟软件以产生数种不同测试条件下的系统的可燃特性的估计。CO2没有显示出对于系统的可燃极限的显著性影响。通过实验测试确认了测试组1和2。模拟结果与实验测试结果是一致的。在加入水的情况下仅发现有少许差异。
在40℃和1个大气压下，异戊二烯、O2、N2、和CO2混合物的LOC经测定是9.5vol％。加入高达30％的CO2未对异戊二烯、O2、和N2混合物的可燃特性造成显著影响。在干燥的和水饱和的异戊二烯、O2、和N2系统之间仅显示出少许可燃特性上的差异。极限温度是大约-54℃。低于大约-54℃的温度太低以致于不能使异戊二烯的燃烧传播。
在一些实施方式中，异戊二烯的LFL范围为大约1.5vol.％至大约2.0vol％，异戊二烯的UFL范围为大约2.0vol.％至大约12.0vol.％，这取决于系统中氧的量。在一些实施方式中，LOC是大约9.5vol％氧。在一些实施方式中，异戊二烯的LFL是大约1.5vol.％至大约2.0vol％，异戊二烯的UFL是大约2.0vol.％至大约12.0vol.％，当温度是大约25℃至大约55℃(例如大约40℃)并且压力是大约1个大气压至3个大气压时，LOC是大约9.5vol％氧。
在一些实施方式中，在存在小于大约9.5vol％氧(即，低于形成异戊二烯的可燃化合物所需的LOC)的情况下生产异戊二烯。在存在大于或大约9.5vol％氧的情况下生产异戊二烯的一些实施方式中，异戊二烯的浓度低于LFL(例如低于大约1.5vol.％)。例如，可以通过以惰性气体稀释异戊二烯成分(例如，通过持续或周期性加入惰性气体，例如氮气，以保持异戊二烯成分低于LFL)而将异戊二烯的量保持在低于LFL。在存在大于或大约9.5vol％氧的情况下生产异戊二烯的一些实施方式中，异戊二烯的浓度高于UFL(例如高于大约12vol.％)。例如，可以通过使用以高于UFL的浓度生产异戊二烯的系统(例如本文描述的任意细胞培养系统)将异戊二烯的量保持高于UFL。如果需要，可以使用相对低水平的氧，从而UFL也相对低。在这种情况下，需要较低的异戊二烯浓度以保持高于UFL。
在存在大于或大约9.5vol％氧的情况下生产异戊二烯的一些实施方式中，异戊二烯浓度在可燃性包迹内(例如在LFL和UFL之间)。在异戊二烯浓度可以落在可燃性包迹内的一些实施方式中，进行一个或多个步骤以降低起火或爆炸的可能性。例如，可以避免一个或多个燃火源(例如可以产生火星的任何物质)。在一些实施方式中，进行一个或多个步骤以减少异戊二烯的浓度保持在可燃性包迹内的时间。在一些实施方式中，使用感应器来检测异戊二烯的浓度何时接近或落在可燃性包迹内。如果需要，可以在细胞培养过程中的一个或多个时间点测定异戊二烯的浓度，并且，如果异戊二烯的浓度接近或落在可燃性包迹内，可以使用标准方法调节细胞培养条件和/或惰性气体的量。在具体的实施方式中，调节细胞培养条件(例如发酵条件)以使异戊二烯的浓度降低至低于LFL或使异戊二烯的浓度升高至高于UFL。在一些实施方式中，通过以惰性气体稀释异戊二烯成分(例如，通过持续或周期性加入惰性气体以保持异戊二烯成分低于LFL)而将异戊二烯的量保持在低于LFL。
在一些实施方式中，所生产的异戊二烯的量比异戊二烯之外的其它可燃性挥发物(例如一种或多种糖)的量高至少大约2、5、10、50、75、或100倍。在一些实施方式中，除了异戊二烯气体之外的气相部分包含大约0％至大约100％(体积)的氧，例如大约0％至大约10％、大约10％至大约20％、大约20％至大约30％、大约30％至大约40％、大约40％至大约50％、大约50％至大约60％、大约60％至大约70％、大约70％至大约80％、大约90％至大约90％、或大约90％至大约100％(体积)的氧。在一些实施方式中，除了异戊二烯气体之外的气相部分包含大约0％至大约99％(体积)的氮例如大约0％至大约10％、大约10％至大约20％、大约20％至大约30％、大约30％至大约40％、大约40％至大约50％、大约50％至大约60％、大约60％至大约70％、大约70％至大约80％、大约90％至大约90％、或大约90％至大约99％(体积)的氮。
在一些实施方式中，除了异戊二烯气体之外的气相部分包含大约1％至大约50％(体积)的CO2，例如大约1％至大约10％，大约10％至大约20％，大约20％至大约30％，大约30％至大约40％，或大约40％至大约50％(体积)的CO2。
在一些实施方式中，异戊二烯组合物还包含乙醇。例如，乙醇可用于异戊二烯的提取蒸馏，从而产生包含乙醇和异戊二烯的组合物(例如中间产物流)。合乎需要地，乙醇的量在乙醇的可燃性包迹之外。乙醇的LOC是大约8.7vol％，乙醇的LFL在标准条件(例如大约1个大气压和大约60°F(NFPA 69Standard on Explosion Prevention Systems，2008版，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于LOC、LFL、和UFL值的内容)下是3.3vol％。在一些实施方式中，在存在小于形成乙醇的可燃混合物所需的LOC的情况下(例如小于大约8.7％vol％)生产包含异戊二烯和乙醇的组合物。在存在大于或大约形成乙醇的可燃混合物所需的LOC的情况下生产包含异戊二烯和乙醇的组合物的一些实施方式中，乙醇的浓度小于LFL(例如小于大约3.3vol.％)。
在多个实施方式中，氧化物(例如氧)的量低于系统中任意燃料(例如异戊二烯或乙醇)的LOC。在多个实施方式中，氧化物(例如氧)的量低于异戊二烯或乙醇的LOC的大约60％、40％、30％、20％、10％、或5％。在多个实施方式中，氧化物(例如氧)的量比异戊二烯或乙醇的LOC低至少2、4、5、或更多个绝对百分点(vol％)。在具体的实施方式中，氧的量比异戊二烯或乙醇的LOC低至少2个绝对百分点(vol％)(例如，当异戊二烯的LOC是9.5vol％时，氧的浓度低于7.5vol％。在多个实施方式中，燃料(例如异戊二烯或乙醇)的量比该燃料的LFL低或是其大约25％、20％、15％、10％、或5％。
通过发酵高效率生产和回收挥发烃异戊二烯
本文提供了生产异戊二烯的方法，包括：a)在适合生产异戊二烯的条件下培养细胞；和b)生产异戊二烯，其中异戊二烯的液相浓度小于大约200mg/L。在一些实施方式中，培养物中的异戊二烯的液相浓度小于大约下列任意值：175mg/L，150mg/L，125mg/L，100mg/L，75mg/L，50mg/L，25mg/L，20mg/L，15mg/L，10mg/L，5mg/L，或2.5mg/L。在一些实施方式中，培养物中的异戊二烯的液相浓度是大约下列任意项：0.1mg/L至200mg/L，1mg/L至200mg/L，1mg/L至150mg/L，1mg/L至100mg/L，1mg/L至50mg/L，1mg/L至25mg/L，1mg/L至20mg/L，或10mg/L至20mg/L。在一些实施方式中，生产的异戊二烯是标题为“示例性的异戊二烯的生产”的部分中所公开的任意浓度或量。在一些实施方式中，液相浓度小于异戊二烯的溶解性限值。
在方法的一些实施方式中，细胞生产大于大约400nmole/gwcm/小时的异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约下列任意项：400nmole/gwcm/小时至1mole/gwcm/小时，400nmole/gwcm/小时至1mmole/gwcm/小时，400nmole/gwcm/小时至40mmole/gwcm/小时，400nmole/gwcm/小时至4mmole/gwcm/小时，1mmole/gwcm/小时至1.5mmole/gwcm/小时，1.5mmole/gwcm/小时至3mmole/gwcm/小时，3mmole/gwcm/小时至5mmole/gwcm/小时，5mmole/gwcm/小时至25mmole/gwcm/小时，25mmole/gwcm/小时至100mmole/gwcm/小时，100mmole/gwcm/小时至500mmole/gwcm/小时，或500mmole/gwcm/小时至1000mmole/gwcm/小时。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约下列任意项：1mmole/gwcm/小时，1.5mmole/gwcm/小时，2mmole/gwcm/小时，3mmole/gwcm/小时，4mmole/gwcm/小时，或5mmole/gwcm/小时。
亨利系数的低值意思是在低鼓泡速率例如0.01vvm至2vvm可以通过气提从发酵液中回收的异戊二烯。在一些实施方式中，气体鼓泡速率是大约下列任意项：0.1vvm至1vvm，0.01vvm至0.5vvm，0.2vvm至1vvm，或0.5vvm至1vvm。在一些实施方式中，气体鼓泡速率是大约下列任意项：0.1vvm，0.25vvm，0.5vvm，0.75vvm，1vvm，1.25vvm，1.5vvm，1.75vvm，或2vvm。在一些实施方式中，在整个发酵运行进程中，生长期或静止期期间保持低鼓泡速率。在一些实施方式中，将低鼓泡速率维持大约下列任意项：1小时至5小时，5小时至10小时，10小时至20小时，20小时至30小时，30小时至40小时，40小时至50小时，或50小时至60小时。较低的合乎需要的气体鼓泡限值定义为：气相变成异戊二烯饱和并且形成有机液相的点。这仅会在低于异戊二烯的沸点(在1个大气压下是34.1℃)发生，在该点以上永远不会形成异戊二烯液相。在低于异戊二烯的沸点的温度下，液相的形成是由异戊二烯的水溶性(在25℃是大约650mg/L)决定的。虽然非常希望避免异戊二烯液相的形成，但不是绝对的，条件是细胞能够耐受液态异戊二烯的存在而不造成毒性效应。
在一些实施方式中，氧、CO2、和异戊二烯是标题为“在安全操作范围内生产异戊二烯”的部分中所讨论的任意量或浓度。在一些实施方式中，所有的氧都被细胞消耗，同时维持完全有氧代谢。在一些实施方式中，使用多余的氧以满足细胞对氧的需求。废气中氧的希望的范围是小于20％，或小于15％或小于10％(v/v)。低于异戊二烯燃烧所需的极限氧浓度(在1个大气压下是9.5％)的氧的水平是特别合乎需要的。在一些实施方式中，使用富含氧的空气，目的是允许最小的气体吹扫速度，同时满足细胞对氧的需求。在一些实施方式中，气体吹扫的气相部分包含大约0.1％至大约10％、大约10％至大约20％、或大约20％至大约30％(体积)的氧。在一些实施方式中，在高压下进行异戊二烯的发酵以使维持液相中所需的溶解氧水平所需要的多余氧的量最小化。
在一些实施方式中，通过发酵器的气体吹扫速率的降低对于联合的异戊二烯生产过程的有利之处在于：此条件使废气异戊二烯水平升高至大约30,000ug/L(大于1％v/v)而不对细胞的生理状况造成不利影响。
在一些实施方式中，降低的气体鼓泡速率不会对细胞的生理状况造成显著的不利影响。在一些实施方式中，具有降低的气体鼓泡速率的培养物中的细胞的二氧化碳释放速率是大约下列任意项：1x10-18mmol/L/小时至大约1mol/L/小时、1mmol/L/小时至1mol/L/小时，25mmol/L/小时至750mmol/L/小时，25mmol/L/小时至75mmol/L/小时，250mmol/L/小时至750mmol/L/小时，或450mmol/L/小时至550mmol/L/小时。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约下列任意项：50mmol/L/小时，100mmol/L/小时，150mmol/L/小时，200mmol/L/小时，250mmol/L/小时，300mmol/L/小时，350mmol/L/小时，400mmol/L/小时，450mmol/L/小时，或500mmol/L/小时。在一些实施方式中，具有降低的气体鼓泡速率的细胞存活率被降低小于大约下列任意项：1.75倍，1.5倍，1.25倍，1倍，0.75倍，0.5倍，或0.25倍。在一些实施方式中，具有降低的气体鼓泡速率的细胞存活率被降低大约2倍。在一些实施方式中，将表达来自一个或多个异源和/或重复拷贝的MVA途径和/或DXP途径核酸的MVA途径和/或DXP途径RNA和/或蛋白的细胞的具有降低的气体鼓泡速率的细胞存活率与不含一个或多个异源和/或重复拷贝的MVA途径和/或DXP途径的核酸的具有降低的气体鼓泡速率的对照细胞进行比较。在一些实施方式中，将在可诱导启动子控制下(其中所述启动子被诱导)表达来自一个或多个异源和/或重复拷贝的MVA途径和/或DXP途径核酸的MVA途径和/或DXP途径RNA和/或蛋白的细胞的具有降低的气体鼓泡速率的细胞存活率与包含在可诱导启动子控制下(其中所述启动子不被诱导(未诱导))的一个或多个异源和/或重复拷贝的MVA途径和/或DXP途径核酸的具有降低的气体鼓泡速率的对照细胞进行比较。在一些实施方式中，可诱导启动子是β-半乳糖苷酶启动子。
在一些实施方式中，经遗传修饰的宿主生物体的发酵将该生物体所消耗的总碳的至少5％转化为挥发性不饱和烃。在一些实施方式中，所生产的不饱和烃的速率以至少大约下列任意项的水平以这样的速率存在于发酵废气中：100ug/L，500ug/L，1000ug/L，2，500ug/L，5,000ug/L，7,500ug/L，或10,000ug/L。
在一些实施方式中，通过适合于高速率生产的方式从废气流中回收不饱和烃，这对应于废气中的浓度是至少大约下列任意项：100ug/L，500ug/L，1000ug/L，2,500ug/L，5,000ug/L，7,500ug/L，或10,000ug/L。在一些实施方式中，从发酵废气中持续提取并回收不饱和烃(特别是在低气体吹扫速率下)，从而产生废气富含目标挥发成分。在一些实施方式中，通过依赖于升高的浓度的挥发物的方法回收挥发烃。例如，通过使用加压/凝结或提取蒸馏技术有效捕获发酵废气中的异戊二烯。还考虑到使用活性炭筒，以及硅胶吸附剂、从碳筒中解吸附和浓缩异戊二烯、和/或构建和发酵宿主生物例如大肠杆菌，其可以将大约5％或更多的葡萄糖底物转化为异戊二烯并产生大于大约15,000ug/L异戊二烯的废气浓度。回收方法包括本文描述的任意方法。
本文还提供了生产化合物的方法，其中所述化合物具有选自下列的一个或多个特征：(a)亨利定律系数小于大约250M/atm和(b)在水中的溶解性小于大约100g/L。在一些实施方式中，所述方法包括：a)在适合于生产化合物的条件下培养细胞，其中以大约0.01vvm至大约2vvm的气体鼓泡速率加入气体(例如向系统例如发酵系统中加入气体)；和b)生产化合物。
在一些实施方式中，划分到细胞物质中的化合物的量不包括在液相溶解性数值内。在一些实施方式中，液相浓度低于化合物的溶解性限值。
在一些实施方式中，可以通过在中等至低气体鼓泡速率通过气提从发酵液中持续回收化合物，尤其是那些具有大约下列任意项的亨利定律系数的化合物：小于250M/atm，200M/atm，150M/atm，100M/atm，75M/atm，50M/atm，25M/atm，10M/atm，5M/atm，或1M/atm。实例包括醛，例如乙醛(15M/atm)；酮，例如丙酮(30M/atm)或2-丁酮(20M/atm)；或醇，包括甲醇(220M/atm)、乙醇(200M/atm)、1-丁醇(120m/atm)或C5醇，包括3-甲基-3-丁烯-1-醇和3-甲基-丁烯-1-醇(50-100M/atm)。醇的酯一般具有比其对应的醇低的亨利常数，例如乙酸乙酯(6-9M/atm)或C5醇的乙酸酯(＜5M/atm)。具有小于1M/atm的亨利系数的化合物是特别合乎需要的。实例包括半萜、单萜、或倍半萜，以及其它烃例如C1至C5烃(例如甲烷、乙烷、乙烯、或丙烯)。在一些实施方式中，烃例如C1至C5的烃是饱和的、不饱和的、或分支的。
一般地，在亨利定律系数与水溶性之间存在关联，非常低的系数的化合物在水中溶解性极低(几乎不溶于水)。虽然可以通过气提回收在水中具有无限溶解性的挥发物(例如丙酮或乙醇)，但是希望的溶解性限值是低于大约下列任意项：100g/L，75g/L，50g/L，25g/L，10g/L，5g/L，或1g/L。
在生产上文描述的任意化合物的任意方法的一些实施方式中，气体鼓泡速率是大约下列任意项：0.1vvm至1vvm、0.2vvm至1vvm、或0.5vvm至1vvm。在一些实施方式中，气体鼓泡速率是大约下列任意项：0.1vvm，0.25vvm，0.5vvm，0.75vvm，1vvm，1.25vvm，1.5vvm，1.75vvm，或2vvm。在一些实施方式中，在整个发酵运行进程中，生长期或静止期期间保持低鼓泡速率。在一些实施方式中，将低鼓泡速率维持大约下列任意项：1小时至5小时，5小时至10小时，10小时至20小时，20小时至30小时，30小时至40小时，40小时至50小时，或50小时至60小时。
本文描述的任意系统可用于生产上文描述的化合物的方法。将使用标准方法来进行纯化，例如在标题为“示例性纯化方法”的部分中描述的那些。可以在回收后通过例如蒸馏或选择性吸附技术来进行分离。
示例性的异戊二烯的生产
在一些实施方式中，在允许细胞生产异戊二烯的条件下在培养基中培养细胞。
“峰值绝对生产率”意思是：在细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行的细胞培养中)期间的废气中的异戊二烯的最大绝对量。“峰值绝对生产率时间点”意思是：在发酵运行期间，当废气中的异戊二烯的绝对量是细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间的最大值时的时间点。在一些实施方式中，在峰值绝对生产率时间点测定异戊二烯的量。在一些实施方式中，细胞的峰值绝对生产率是大约本文公开的任意的异戊二烯的量。
“峰值比生产率”意思是细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间每细胞生产的异戊二烯的最大量。“峰值比生产率时间点”意思是：在细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间，当每细胞生产的异戊二烯的量是最大值时的时间点。峰值比生产率是这样确定的：以总的生产率除以细胞的量，细胞的量如通过600nm处的光密度(OD600)所测定。在一些实施方式中，在峰值比生产率时间点测定异戊二烯的量。在一些实施方式中，细胞的峰值比生产率是大约本文公开的任意的异戊二烯的量/细胞。
“峰值体积生产率”意思是在细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间，每体积培养液(包括细胞和细胞培养基的体积)所生产的异戊二烯的最大量。“峰值比体积生产率时间点”意思是：在细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间，当每体积培养液生产的异戊二烯的量是最大值时的时间点。峰值比体积生产率是这样确定的：以总的生产率除以培养液的体积和时间的量。在一些实施方式中，在峰值比体积生产率时间点测定异戊二烯的量。在一些实施方式中，细胞的峰值比体积生产率是大约本文公开的任意的异戊二烯的量/体积/时间。
“峰值浓度”意思是在细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间，生产的异戊二烯的最大量。“峰值浓度时间点”意思是：在细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间，当每细胞生产的异戊二烯的量是最大值时的时间点。在一些实施方式中，在峰值浓度时间点测定异戊二烯的量。在一些实施方式中，细胞的峰值浓度是大约本文公开的任意的异戊二烯的量。
“平均体积生产率”意思是在细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间，每体积培养液(包括细胞和细胞培养基的体积)所生产的异戊二烯的平均量。平均体积生产率是这样确定的：以总的生产率除以培养液的体积和时间的量。在一些实施方式中，细胞的平均比体积生产率是大约本文公开的任意的异戊二烯的量/体积/时间。
“累积总生产率”意思是在细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间，生产的异戊二烯的累积的的总量。在一些实施方式中，测定异戊二烯的累积的总量。在一些实施方式中，细胞的累积的总生产率是大约本文公开的任意的异戊二烯的量。
“相对检测器应答”是指一个化合物(例如异戊二烯)的检测器应答(例如GC/MS面积)与一个或多个化合物(例如所有的C5烃)的检测器应答(例如GC/MS面积)之间的比率。可以按照本文的描述测定检测器应答，例如使用配有Agilent HP-5MS GC/MS柱(30mx250μm；0.25μm膜厚度)的Agilent 6890GC/MS系统进行GC/MS分析。如果需要，可以使用每种化合物的应答因子将相对检测器应答转化为重量百分率。这种应答因子是对于给定量的特定化合物产生多少信号的度量(即，检测器对于特定化合物有多灵敏)。当检测器对于所比较的化合物具有不同的灵敏性时，该应答因子可用作校正因子以将相对检测器应答转化为重量百分率。可替代地，可以通过假设“所比较的化合物的应答因子是相同的”来约计重量百分率。因此，可以假设重量百分率近似等于相对检测器应答。
在一些实施方式中，培养物中的细胞生产大于或大约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、或更多nmole的异戊二烯/克细胞的湿细胞重/小时(nmole/gwcm/hr)的异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约2至大约5,000nmole/gwcm/hr，例如大约2至大约100nmole/gwcm/hr，大约100至大约500nmole/gwcm/hr，大约150至大约500nmole/gwcm/hr，大约500至大约1,000nmole/gwcm/hr，大约1,000至大约2,000nmole/gwcm/hr，或大约2,000至大约5,000nmole/gwcm/h。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约20至大约5,000nmole/gwcm/hr，大约100至大约5,000nmole/gwcm/hr，大约200至大约2,000nmole/gwcm/hr，大约200至大约1,000nmole/gwcm/hr，大约300至大约1,000nmole/gwcm/hr，或大约400至大约1,000nmole/gwcm/hr。
可以按照如美国专利号5,849,970中公开的内容测定异戊二烯的量，单位是nmole/gwcm/hr，该文献通过引用方式全文并入本文，尤其是关于测定异戊二烯的生产的内容。例如，使用标准气相色谱系统，例如等温(85℃)操作的具有正辛烷/多孔硅C柱(Alltech Associates，Inc.，Deerfield，Ill.)并偶联于RGD2氧化汞还原气体检测器(Trace Analytical，MenloPark，CA)的系统分析2mL顶空(例如，来自于在32℃以200rpm振荡培养大约3小时的密封瓶中的2mL培养物的顶空)中的异戊二烯(见，例如，Greenberg等人，Atmos.Environ.27A：2689-2692，1993；Silver等人，Plant Physiol.97：1588-1591，1991，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于测定异戊二烯的产生的内容)。通过标准的异戊二烯浓度校正曲线将气相色谱面积单位转化为nmol异戊二烯。在一些实施方式中，通过获得细胞培养物的样品的A600值、然后基于具有已知的A600值的细胞培养物的湿重的校正曲线将A600值转化为细胞的克数，来计算湿细胞重的细胞的克数。在一些实施方式中，通过假设A600值为1的1升培养液(包括细胞培养基和细胞)具有1克湿细胞重来估计细胞的克数。还将该值除以培养物已被温育的小时数，例如3个小时。
在一些实施方式中，培养物中的细胞生产大于或大约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、100,000、或更多ng的异戊二烯/克细胞的湿细胞重/小时(ng/gwcm/h)的异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约2至大约5,000ng/gwcm/h，例如大约2至大约100ng/gwcm/h，大约100至大约500ng/gwcm/h，大约500至大约1,000ng/gwcm/h，大约1,000至大约2,000ng/gwcm/h，或大约2,000至大约5,000ng/gwcm/h。在一些实施方式中异戊二烯的量是大约20至大约5,000ng/gwcm/h，大约100至大约5,000ng/gwcm/h，大约200至大约2,000ng/gwcm/h，大约200至大约1,000ng/gwcm/h，大约300至大约1,000ng/gwcm/h，或大约400至大约1,000ng/gwcm/h。可以通过将如上讨论的单位为nmole/gwcm/hr的异戊二烯的产量值乘以68.1来计算以ng/gwcm/h表示的异戊二烯的量(如以下等式5所描述)。
在一些实施方式中，培养物中的细胞生产大于或大约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、50,000、100,000、或更多毫克的异戊二烯/L培养液(mg/L培养液，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)的异戊二烯的累积效价(总量)。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约2至大约5,000mg/L培养液，例如大约2至大约100mg/L培养液，大约100至大约500mg/L培养液，大约500至大约1,000mg/L培养液，大约1,000至大约2,000mg/L培养液，或大约2,000至大约5,000mg/L培养液。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约20至大约5,000mg/L培养液，约100至大约5,000mg/L培养液，大约200至大约2,000mg/L培养液，大约200至大约1,000mg/L培养液，大约300至大约1,000mg/L培养 液，或大约400至大约1,000mg/L培养液。
以毫克异戊二烯/升顶空(来自摇瓶或类似培养物)表示的异戊二烯的比生产率可以这样测定：在OD600值为大约1.0时从细胞培养物中取出1ml样品，将其置于20ml的瓶中，温育30分钟，然后测定顶空中的异戊二烯的量(例如实施例I第II部分中的描述)。如果OD600值不是1.0，则可以通过除以OD600值来将测定值校正为1.0的OD600值。可以通过乘以因子38而将毫克异戊二烯/升顶空的值转化为mg/L培养液/hr/培养液的OD600。可以将单位为mg/L培养液/hr/OD600的值乘以小时数和OD600值来获得单位为毫克异戊二烯/升培养液的累积效价。
在一些实施方式中，培养物中的细胞具有大于或大约0.1、1.0、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1100、1200、1300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、或更多毫克异戊二烯/升培养液/小时(mg/L培养液/hr，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)的异戊二烯的平均体积生产率。在一些实施方式中，异戊二烯的平均体积生产率是大约0.1至大约3,500mg/L培养液/hr，例如大约0.1至大约100mg/L培养液/hr，大约100至大约500mg/L培养液/hr，大约500至大约1,000mg/L培养液/hr，大约1,000至大约1,500mg/L培养液/hr，大约1,500至大约2,000mg/L培养液/hr，大约2,000至大约2,500mg/L培养液/hr，大约2,500至大约3,000mg/L培养液/hr，或大约3,000至大约3,500mg/L培养液/hr。在一些实施方式中，异戊二烯的平均体积生产率是大约10至大约3,500mg/L培养液/hr，大约100至大约3,500mg/L培养液/hr，大约200至大约1,000mg/L培养液/hr，大约200至大约1,500mg/L培养液/hr，大约1,000至大约3,000mg/L培养液/hr，或大约1,500至大约3,000mg/L培养液/hr。
在一些实施方式中，培养物中的细胞具有大于或大约0.5、1.0、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1100、1200、1300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,750、4,000、4,250、4,500、4,750、5,000、5,250、5,500、5,750、6,000、6,250、6,500、6,750、7,000、7,250、7,500、7,750、8,000、8,250、8,500、8,750、9,000、9,250、9,500、9,750、10,000、12,500、15,000、或更多毫克异戊二烯/升培养液/小时(mg/L培养液/hr，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)的异戊二烯的峰值体积生产率。在一些实施方式中，异戊二烯的峰值体积生产率是大约0.5至大约15,000mg/L培养液/hr，例如大约0.5至大约10mg/L培养液/hr，大约1.0至大约100mg/L培养液/hr，大约100至大约500mg/L培养液/hr，大约500至大约1,000mg/L培养液/hr，大约1,000至大约1,500mg/L培养液/hr，大约1,500至大约2,000mg/L培养液/hr，大约2,000至大约2,500mg/L培养液/hr，大约2,500至大约3,000mg/L培养液/hr，大约3,000至大约3,500mg/L培养液/hr，大约3,500至大约5,000mg/L培养液/hr，大约5,000至大约7,500mg/L培养液/hr，大约7,500至大约10,000mg/L培养液/hr，大约10,000至大约12,500mg/L培养液/h，或大约12,500至大约15,000mg/L培养液/hr。在一些实施方式中，异戊二烯的峰值体积生产率是大约10至大约15,000mg/L培养液/hr，大约100至大约2,500mg/L培养液/hr，大约1,000至大约5,000mg/L培养液/hr，大约2,500至大约7,500mg/L培养液/hr，大约5,000至大约10,000mg/L培养液/hr，大约7,500至大约12,500mg/L液养液/hr，或大约10,000至大约15,000mg/L培养液/hr。
发酵器中的以mg/L培养液/hr表示的瞬时异戊二烯生产速率可以这样测定：取出发酵器废气的样品，通过例如实施例I第II部分的描述分析其异戊二烯的量(单位是例如毫克异戊二烯/L气体)，并将该数值乘以废气通过每升培养液的速率(例如，在1vvm(空气体积/培养液体积/分钟)时是60L气体/小时)。因此，1mg/L气体的废气水平对应于气流为1vvm时60mg/L培养液/hr的瞬时生产速率。如果需要，可以将单位为mg/L培养液/hr的数值除以OD600值以获得单位为mg/L培养液/hr/OD的比速率。可以通过将此平均废气异戊二烯浓度乘以发酵过程中每升发酵液鼓泡的废气的总量而将以毫克异戊二烯/L气体表示的平均值转化为总产物生产率(异戊二烯克数/升发酵液，mg/L培养液)。因此，在1vvm经10小时的0.5mg/L培 养液/hr的平均废气异戊二烯浓度对应于300毫克异戊二烯/L培养液的总产物浓度。
在一些实施方式中，培养物中的细胞将大于或大约0.0015％、0.002％、0.005％、0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％、或8.0％的细胞培养基中的碳转化为异戊二烯。在一些实施方式中，碳至异戊二烯的转化百分率是例如大约0.002％至大约4.0％，大约0.002％至大约3.0％，大约0.002％至大约2.0％，大约0.002％至大约1.6％，大约0.002％至大约0.005％，大约0.005％至大约0.01％，大约0.01％至大约0.05％，大约0.05％大约0.15％，0.15％至大约0.2％，大约0.2％至大约0.3％，大约0.3％至大约0.5％，大约0.5％至大约0.8％，大约0.8％至大约1.0％，或大约1.0％至大约1.6％。在一些实施方式中，碳至异戊二烯的转化百分率是大约0.002％至大约0.4％，0.002％至大约0.16％，0.04％至大约0.16％，大约0.005％至大约0.3％，大约0.01％至大约0.3％，或大约0.05％至大约0.3％。
碳至异戊二烯的转化百分率(也称作“％碳产率”)可以这样测定：将所生产的异戊二烯中的摩尔碳除以碳源中的摩尔碳(例如批式和进料的葡萄糖和酵母提取物中的摩尔碳)。将该数值乘以100％以得到百分率数值(如等式1所示)。
等式1
％碳产率＝(所生产的异戊二烯中的摩尔碳)/(碳源中的摩尔碳)＊100
为了这个计算，可以假设酵母提取物包含505w/w的碳。举例而言，对于实施例7第VIII部分中描述的500升，可以根据等式2计算碳至异戊二烯的转化百分率。
等式2
％碳产率＝(39.1g异戊二烯＊1/68.1mol/g＊5C/mol)/[(181221g葡萄糖＊1/180mol/g＊6C/mol)+(17780g酵母提取物＊0.5＊1/12mol/g)]＊100＝0.042％
对于本文描述的两个500升的发酵(实施例7，第VII和VIII部分)，碳至异戊二烯的转化百分率是0.04％-0.06％。使用如本文描述的14升的系统，达到了0.11％-0.16％的碳产率。实施例11第v部分描述了使用本文所述的方法的碳至异戊二烯的1.53％转化。
本领域技术人员可以容易地将异戊二烯的生产速率或异戊二烯的生产量转化为任意其它单位。以下列出了用于在单位之间相互转化的示例性的等式。
用于异戊二烯生产速率(总速率和比速率)的单位
等式3
1g异戊二烯/L培养液/hr＝14.7mmol异戊二烯/L培养液/hr(总体积速率)
等式4
1nmol异戊二烯/gwcm/hr＝1nmol异戊二烯/L培养液/hr/OD600(该转化假设OD600值为1的1升培养液具有1克湿细胞重)
等式5
1nmol异戊二烯/gwcm/hr＝68.1ng异戊二烯/gwcm/hr(给出异戊二烯的分子量)
等式6
1nmol异戊二烯/L气体O2/hr＝90nmol异戊二烯/L培养液/hr(在90L/hr的O2流速每升培养液)
等式7
废气中的1ug异戊二烯/L气体异戊二烯＝在60L气体每L培养液(1vvm)的流速的60ug异戊二烯/L培养液/hr
效价的单位(总效价和比效价)
等式8
1nmol异戊二烯/mg细胞蛋白＝150nmol异戊二烯/L培养液/OD600(该转化假设OD600值为1的1升培养液具有总共大约150mg的细胞蛋白)(比生产率)
等式9
1g异戊二烯/L培养液＝14.7mmol异戊二烯/L培养液(总效价)
如果需要，等式10可用于将任何包括湿细胞重的单位转化为包括干细胞重的对应的单位。
等式10
干细胞重＝(湿细胞重)/3.3
如果需要，可以使用等式11在单位ppm与μg/L之间转化。具体地，“ppm”意思是以μg/g(w/w)定义的百万分之几。也可以使用“ppmv”(体积的百万分之几)基于体积来表示气体的浓度，以μL/L(vol/vol)定义。μg/L与ppm(例如，μg分析物/g气体)的转化可以通过测定每升废气的质量(即气体的密度)来进行。例如，在标准温度和压力(STP；101.3kPa(1bar)和273.15K)下，1升空气的密度是大约1.29g/L。因此，1ppm(μg/g)的浓度等于STP下的1.29μg/L(等式11)。ppm(μg/g)向μg/L的转化与压力、温度和废气总体成分有关。
等式11
1ppm(ug/g)在标准温度和压力(STP；101.3kPa(1bar)和273.15K)下等于1.29μg/L。
可以使用普适气体定律(等式12)进行ug/L向ppmv的转化(例如，uL分析物/升气体)。例如，1000ug/L气体的废气浓度对应于14.7umol/L气体。普适气体常数是0.082057L.atm K-1mol-1，所以使用等式12，在STP下由14.7umol HG占据的体积等于0.329mL。因此，1000ug/L HG的浓度等于STP下的329ppmv或0.0329％(v/v)。
等式12
PV＝nRT，其中“P”是压力，“V”是体积，“n”是气体的摩尔数，“R”是普适气体常数，“T”是开氏温度。
本文中通常基于重量/体积(w/v)以单位例如ug/L来测定异戊二烯组合物中的杂质的量。如果需要，可以使用等式13将单位为ug/L的测量值转化为mg/m3的单位。
等式13
1ug/L＝1mg/m3
在本发明包括的一些实施方式中，包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸的细胞生产的异戊二烯的量是在基本上相同的条件下生长的不含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸的相应的细胞生产的异戊二烯的量的至少或大约2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍、或更高。
在本发明包括的一些实施方式中，包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸和编码DXS、IDI、和/或MVA途径多肽的一种或多种异源核酸的细胞生产的异戊二烯的量是在基本上相同的条件下生长的不含异源核酸的相应的细胞生产的异戊二烯的量的至少或大约2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍、或更高。
在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含重量占组合物中所有的C5烃总重量的大于或大约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％、或100％的异戊二烯。在一些实施方式中，组合物中的异戊二烯具有组合物中所有C5烃的检测器应答的大于或大约99.90％、99.91％、99.92％、99.93％、99.94％、99.95％、99.96％、99.97％、99.98％、99.99％、或100％的相对检测器应答。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含重量为组合物中的所有C5烃的总重量的大约99.90％至大约99.92％、大约99.92％至大约99.94％、大约99.94％至大约99.96％、大约99.96％至大约99.98％、大约99.98％至100％的异戊二烯。
在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含重量占组合物中所有C5烃总重量的小于或大约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的除了异戊二烯之外的C5烃(例如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1-戊炔，2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁烯、反式-戊二烯、顺式-戊二烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，组合物中除了异戊二烯之外的C5烃具有组合物中所有C5烃的检测器应答的小于或大约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的相对检测器应答。在一些实施方式中，组合物中的1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁烯、反式-戊二烯、顺式-戊二烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔具有组合物中所有C5烃的检测器应答的小于或大约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的相对检测器应答。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含重量占组合物中所有C5烃的总重量的大约0.02％至大约0.04％、大约0.04％至大约0.06％、大约0.06％至0.08％、大约0.08％至0.10％、或大约0.10至大约0.12％的除了异戊二烯之外的C5烃(例如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁烯、反式-戊二烯、顺式-戊二烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。
在一些实施方式中，对于组合物中的抑制异戊二烯聚合的任意化合物，异戊二烯组合物包含小于或大约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005ug/L的抑制异戊二烯聚合的化合物。在一些实施方式中，对于组合物中的抑制异戊二烯聚合的任意化合物，异戊二烯组合物包含大约0.005至大约50、例如大约0.01至大约10、大约0.01至大约5、大约0.01至大约1、大约0.01至大约0.5、或大约0.01至大约0.005ug/L的抑制异戊二烯聚合的化合物。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含小于或大约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005ug/L的除了异戊二烯之外的烃(例如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁烯、反式-戊二烯、顺式-戊二烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含大约0.005至大约50、例如大约0.01至大约10、大约0.01至大约5、大约0.01至大约1、大约0.01至大约0.5、或大约0.01至大约0.005ug/L的除了异戊二烯之外的烃。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含小于或大约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005ug/L的蛋白或脂肪酸(例如与天然橡胶天然结合的蛋白或脂肪酸)。
在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含小于或大约10、5、1、0.8、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005ppm的α乙炔、戊二烯、乙腈、或1，3-环戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含小于或大约5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005ppm的硫或丙二烯。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含小于或大约30、20、15、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005ppm的所有乙炔(例如1-戊炔、2-戊炔、3-甲基-l-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、顺式-戊-3-烯-1-炔、戊炔-1、丁炔-2，2MB1-3炔、和1-戊炔-4炔)。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含小于或大约2000、1000、500、200、100、50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005ppm的异戊二烯二聚体，例如环式异戊二烯二聚体(例如，源自两个异戊二烯单元的二聚化的环式C10化合物)。
在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇(例如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)、或前述任意两项或更多项。在具体的实施方式中，异戊二烯组合物包含大于或大约0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、60、80、100、或120ug/L的乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇(例如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)、或前述任意两项或更多项。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含大约0.005至大约120、例如大约0.01至大约80、大约0.01至大约60、大约0.01至大约40、大约0.01至大约30、大约0.01至大约20、大约0.01至大约10、大约0.1至大约80、大约0.1至大约60、大约0.1至大约40、大约5至大约80、大约5至大约60、或大约5至大约40ug/L的乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇、或前述任意两项或更多项。
在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含下列成分中的一种或多种：2-庚酮，6-甲基-5-庚烯-2-酮，2，4，5-三甲基吡啶，2，3，5-三甲基吡嗪，香茅醛，乙醛，甲硫醇，乙酸甲酯，1-丙醇，二乙酰，2-丁酮，2-甲基-3-丁烯-2-醇，乙酸乙酯，2-甲基-1-丙醇，3-甲基-1-丁醛，3-甲基-2-丁酮，1-丁醇，2-戊酮，3-甲基-1-丁醇，异丁酸乙酯，3-甲基-2-丁烯醛，乙酸丁酯，3-甲基丁基乙酸酯，3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯，3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯，(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯，(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯，2，3-环庚烯醇吡啶，或线性异戊二烯聚合物(例如，源自多个异戊二烯单元的聚合的线性异戊二烯二聚体或线性异戊二烯三聚体)。在多个实施方式中，以重量％为单位，这些成分中的一种的量相对于异戊二烯的量(即，该成分的重量除以异戊二烯的重量乘以100)是大于或大约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或110％(w/w)。在一些实施方式中，第二化合物的相对检测器应答相对于异戊二烯的检测器应答是大于或大约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或110％。在多个实施方式中，以重量％为单位，这些成分中的一种的量相对于异戊二烯的量(即，该成分的重量除以异戊二烯的重量乘以100)是大约0.01％至大约105％(w/w)，例如大约0.01％至大约90，大约0.01％至大约80％，大约0.01％至大约50％，大约0.01％至大约20％，大约0.01％至大约10％，大约0.02％至大约50％，大约0.05％至大约50％，大约0.1％至大约50％，或0.1％至大约20％(w/w)。
在一些实施方式中，异戊二烯组合物包括下列一项或多项：醇、醛、酯、或酮(例如本文中描述的醇、醛、酯、或酮中的任意项)。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包括(i)醇和醛；(ii)醇和酮；(iii)醛和酮；或(iv)醇、醛、和酮。
在一些实施方式中，异戊二烯组合物包括下列一项或多项：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3-甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇、或吲哚。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含1ppm或更多的下列一项或多项：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3-甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇、或吲哚。在一些实施方式中，异戊二烯组合物(例如纯化前的废气)中的下列一项或多项的浓度是大约1至大约10,000ppm：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3-甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇、或吲哚。在一些实施方式中，异戊二烯组合物(例如经历一个或多个纯化步骤之后的废气)包括下列一项或多项：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3-甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇、或吲哚，其浓度为大约1至大约100ppm，例如大约1至大约10ppm，大约10至大约20ppm，大约20至大约30ppm，大约30至大约40ppm，大约40至大约50ppm，大约50至大约60ppm，大约60至大约70ppm，大约70至大约80ppm，大约80至大约90ppm，或大约90至大约100ppm。可以使用标准方法例如本文描述的那些方法或其它标准方法例如质子转移反应质谱(见，例如，Bunge等人，Applied and Environmental Microbiology，74(7)：2179-2186，2008，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于分析挥发性有机化合物的内容)分析来自细胞培养物的挥发性有机化合物(例如，细胞培养物的顶空中的挥发性有机化合物)。
在一些实施方式中，组合物包含大于大约2mg异戊二烯，例如大于或大约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000mg异戊二烯。在一些实施方式中，组合物包含大于或大约2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100g异戊二烯。在一些实施方式中，组合物中异戊二烯的量是大约2至大约5,000mg，例如大约2至大约100mg，大约100至大约500mg，大约500至大约1,000mg，大约1,000至大约2,000mg，或大约2,000至大约5,000mg。在一些实施方式中，组合物中异戊二烯的量是大约20至大约5,000mg，大约100至大约5,000mg，大约200至大约2,000mg，大约200至大约1,000mg，大约300至大约1,000mg，或大约400至大约1,000mg。在一些实施方式中，组合物中大于或大约20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％重量的挥发性有机级份是异戊二烯。
在一些实施方式中，组合物包含乙醇。在一些实施方式中，组合物包含大约75％至大约90％重量的乙醇，例如大约75％至大约80％、大约80％至大约85％、或大约85％至大约90％重量的乙醇。在组合物包含乙醇的一些实施方式中，组合物还包含大约4％至大约15％重量的异戊二烯，例如大约4％至大约8％、大约8％至大约12％、或大约12％至大约15％重量的异戊二烯。
在本发明包含的一些实施方式中，包含编码异戊二烯合酶多肽、DXS多肽、IDI多肽、和/或MVA途径多肽的一种或多种异源核酸的细胞生产大于或大约在基本上相同的条件下生长的不含所述一种或多种异源核酸的对应细胞生产的类异戊二烯化合物的量的2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍、或更多的量的类异戊二烯化合物(例如在一个或多个IPP分子与一个或多个DMAPP分子的反应中形成的具有10个或更多个碳原子的化合物)。在本发明包含的一些实施方式中，包含编码异戊二烯合酶多肽、DXS多肽、IDI多肽、和/或MVA途径多肽的一种或多种异源核酸的细胞生产大于或大约在基本上相同的条件下生长的不含所述一种或多种异源核酸的对应细胞生产的C5异戊二烯基醇的量的2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍、或更多的量的C5异戊二烯基醇(例如，3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)。
示例性的异戊二烯和氢的共同生产
在一些实施方式中，包含可操作地连接于启动子的编码异戊二烯合酶多肽、DXS多肽、IDI多肽、和/或MVA途径多肽的一种或多种异源核酸的本文描述的任意的生产异戊二烯的细胞还包含也可操作地连接于启动子的编码一种或多种氢化酶多肽或参与调节或表达氢化酶多肽(例如氢化酶成熟蛋白或转录因子)一种或多种多肽的异源核酸。在一些实施方式中，包含可操作地连接于启动子的编码异戊二烯合酶多肽、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径多肽、一种或多种氢化酶多肽或参与调节或表达氢化酶多肽的一种或多种多肽的一种或多种异源核酸的本文描述的任意的生产异戊二烯的细胞还包含失活下列多肽的突变或缺失：参与生产发酵副产物的一种或多种多肽，参与调节或表达用于生产发酵副产物的基因的一种或多种多肽，或参与氢的重摄取的一种或多种多肽。此类细胞能够共同生产异戊二烯和氢。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞是细菌细胞，例如革兰氏阳性细菌(例如，芽孢杆菌属细胞，例如枯草芽孢杆菌细胞；或链霉菌属细胞，例如浅青紫链霉菌、天蓝色链霉菌、或灰色链霉菌细胞)。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞是革兰氏阴性细菌细胞(例如，埃希菌属细胞，例如大肠杆菌细胞；红假单胞菌属，例如沼泽红假单胞菌细胞；假单胞菌属，例如荧光假单胞菌细胞或恶臭假单胞菌细胞；泛菌属细胞，例如柠檬泛菌细胞)。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞是真菌细胞，例如丝状真菌细胞(例如，木霉菌属细胞，例如里氏木霉细胞；或曲霉菌属细胞，例如米曲霉和黑曲霉)或酵母细胞(例如，耶氏酵母属细胞，例如解脂耶氏酵母细胞；或酵母属细胞，例如酿酒酵母)。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是来自植物的多肽，例如葛属(例如越南葛藤或葛根)，或白杨(例如美洲山杨，银白杨，欧洲黑杨，毛果杨，或杂交体银白杨x欧洲山杨)。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含编码IDI多肽的异源核酸。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含插入编码IDI多肽的内源核酸的拷贝。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含编码DXS多肽的异源核酸。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含插入编码DXS多肽的内源核酸的拷贝。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含编码IDI多肽和DXS多肽的一种或多种异源核酸。在本发明的任意方面的一些实施方式中，一个核酸编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽、和DXS多肽。在本发明的任意方面的一些实施方式中，一个载体编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽、和DXS多肽。在一些实施方式中，载体包含选择性标志物或可选择标志物，例如抗生素抗性核酸。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含编码MVA途径多肽(例如来自酿酒酵母或粪肠球菌的MVA途径多肽)的异源核酸。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含插入编码MVA途径多肽(例如来自酿酒酵母或粪肠球菌的MVA途径多肽)的内源核酸的拷贝。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞包含异戊二烯合酶、DXS、和MVA途径核酸。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞包含异戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸、和MVA途径核酸。
在一些实施方式中，MVA途径多肽是上部MVA途径多肽。在一些实施方式中，MVA途径多肽是下部MVA途径多肽。在一些实施方式中，上部MVA途径多肽选自：(i)乙酰乙酰基-辅酶A合酶(硫解酶)多肽；(ii)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A合酶多肽；和(iii)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶多肽。在一些实施方式中，上部MVA途径多肽来自肠球菌属。在一些实施方式中，上部MVA途径多肽来自粪肠球菌。在一些实施方式中，下部MVA途径多肽选自：(i)甲羟戊酸激酶(MYK)；(ii)磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)；(iii)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)；和(iv)异戊烯二磷酸异构酶(IDI)。在一些实施方式中，下部MVA途径多肽是MVK多肽。在一些实施方式中，MVK多肽来自甲烷八叠球菌属。在一些实施方式中，MVK多肽来自马氏甲烷八叠球菌。
在一些实施方式中，本文描述的生产异戊二烯的细胞还包含编码与启动子可操作地连接的氢化酶多肽的异源核酸。在一些实施方式中，氢化酶多肽包含大肠杆菌氢化酶-1(Hyd-1)、大肠杆菌氢化酶-2(Hyd-2)、大肠杆菌氢化酶-3(Hyd-3)、大肠杆菌氢化酶-4(Hyd-4)、大肠杆菌甲酸氢裂解酶(FHL)复合物(其在无氧条件下在酸性pH时从甲酸和CO2生产氢气)、不透明红球菌MR11氢化酶(不透明红球菌HoxH)、蓝藻PCC 6803氢化酶(Syn.PCC 6803HoxH)、巨大脱硫弧菌氢化酶(D.gigas)、和脱硫脱硫弧菌ATCC 7757氢化酶(D.desuifuricans)。在一些实施方式中，还包含编码与启动子可操作地连接的氢化酶多肽的异源核酸的生产异戊二烯的细胞还包含大肠杆菌氢化酶-3(Hyd-3)、大肠杆菌丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)、和大肠杆菌甲酸氢裂解酶(FHL)复合物。
在一些实施方式中，氢化酶多肽编码铁氧还蛋白依赖性氢化酶多肽。在一些实施方式中，铁氧还蛋白依赖性氢化酶多肽包括Clostridiumacetobutulicum氢化酶A(HydA)，其可以与下列一项或多项联合表达：(1)枯草芽孢杆菌NADPH铁氧还蛋白氧化还原酶(NFOR)或Clostridiumkluyveri NADH铁氧还蛋白氧化还原酶(RnfCDGEAB)，Clostridiumpasteuranium铁氧还蛋白氧化还原酶(Fdx)；(2)甘油醛-6-磷酸铁氧还蛋白氧化还原酶(GAPOR)；或(3)丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶(“POR”)。在一些实施方式中，铁氧还蛋白依赖性氢化酶多肽Clostridiumacetobutulicum氢化酶A(HydA)与三种HydA相关的成熟酶(HydE、HydG、和HydF)一起表达，并且还与下列一项或多项联合表达：(1)枯草芽孢杆菌NADPH铁氧还蛋白氧化还原酶(NFOR)或Clostridium kluyveriNADH铁氧还蛋白氧化还原酶(RnfCDGEAB)，Clostridium pasteuranium铁氧还蛋白氧化还原酶(Fdx)；(2)甘油醛-6-磷酸铁氧还蛋白氧化还原酶(GAPOR)；或(3)丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶(POR)。
在一些实施方式中，氢化酶多肽编码NADPH依赖性氢化酶多肽。在一些实施方式中，NADPH依赖性氢化酶多肽包括Pyrococcus furiosus氢化酶。在一些实施方式中，氢化酶多肽编码氧耐受性氢化酶。在一些实施方式中，氧耐受性氢化酶包括胶状红环菌氢化酶和真氧产碱杆菌氢化酶。
在一些实施方式中，本文描述的生产异戊二烯的细胞还包含失活参与调节氢化酶活性的基因的突变或缺失，例如铁-硫复合物转录调节子(iscR)(Kalim-Akhtar等人，“Deletion of iscR stimulates recombinantClostridial Fe/Fe hydrogenase activity and H2-accumulation inEscherichia coli BL21(DE3)，”Appl.Microbiol.Biotechnol.78：853-862(2008)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于梭状芽胞杆菌(Clostridial)Fe/Fe氢化酶活性的刺激和通过缺失iscR基因而在大肠杆菌中积累氢的内容)。
在一些实施方式中，本文描述的生产异戊二烯的细胞还包含失活编码一种或多种参与产生发酵副产物例如乳酸、乙酸、丙酮酸、乙醇、琥珀酸、和甘油的细胞多肽的基因的突变或缺失。在一些实施方式中，参与产生发酵副产物的失活的多肽包括编码下列的一种或多种多肽：甲酸脱氢酶Nα亚基(fdnG)，甲酸脱氢酶O大亚基(fdoG)，硝酸还原酶(narG)，甲酸转运子A(focA)，甲酸转运子B(focB)，丙酮酸氧化酶(poxB)，丙酮酸脱氢酶E1成分ackA/pta(aceE)，醇脱氢酶(adhE)，延胡索酸还原酶膜蛋白(frdC)，或乳酸脱氢酶(ldhA)。
在一些实施方式中，本文描述的生产异戊二烯的细胞还包含失活编码参与调节或表达参与产生发酵副产物的基因的一种或多种细胞多肽的基因的突变或缺失。在一些实施方式中，参与调节或表达参与产生发酵副产物的基因的失活的多肽包括甲酸氢裂解酶阻抑子(hycA)、延胡索酸还原酶调节子(fnr)、乙酰基-辅酶A合成酶(acs)、和甲酸脱氢酶调节蛋白(hycA)。
在一些实施方式中，本文描述的生产异戊二烯的细胞还包含失活编码一种或多种参与氢重摄取的细胞多肽的基因的突变或缺失。在一些实施方式中，参与氢重摄取的失活的多肽包括大肠杆菌氢化酶-1(Hyd-1)(hya操纵子)和大肠杆菌氢化酶-2(Hyd-2)(hy操纵子)。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子多肽或核酸可操作地连接于T7启动子，例如包含于中等或高拷贝质粒中的T7启动子。在本发明的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子核酸可操作地连接于Trc启动子，例如包含于中等或高拷贝质粒中的Trc启动子。在本发明的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子核酸可操作地连接于Lac启动子，例如包含于低拷贝质粒中的Lac启动子。在本发明的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子核酸可操作地连接于内源性启动子，例如内源性碱性丝氨酸蛋白酶启动子。在一些实施方式中，异源异戊二烯合酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子核酸整合进入不含选择性标志物或不含可选择标志物的细胞染色体。
在一些实施方式中，一种或多种MVA途径、IDI、DXS、异戊二烯合酶、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子核酸被置于在稳定期比在生长期活性更高的启动子或因子的控制下。例如，一种或多种MVA途径、IDI、DXS、异戊二烯合酶、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子核酸可以被置于稳定期σ因子例如RpoS控制下。在一些实施方式中，一种或多种MVA途径、IDI、DXS、异戊二烯合酶、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子核酸被置于在稳定期可被诱导的启动子控制下，例如可以被在稳定期有活性的应答调节子诱导的启动子。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞中的至少一部分在持续培养(例如不稀释的持续培养)中保持异源异戊二烯合酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子核酸至少或大约5、10、20、40、50、60、65、或更多次细胞分裂。在本发明的任意方面的一些实施方式中，包含异戊二烯合酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子核酸的核酸还包含选择性标志物或可选择标志物，例如抗生素抗性核酸。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，在限氧条件下在本文描述的任意培养基中培养共同生产异戊二烯和氢的细胞，以促进细胞共同生产异戊二烯和氢。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，细胞生长于存在0.5摩尔氧/摩尔异戊二烯的情况下。在一些实施方式中，细胞在不存在氧的情况下无氧地生长。
在一些实施方式中，本文描述的任意细胞生长于限氧培养物中并且共同生产异戊二烯和氢。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞以大于大约400nmole/gwcm/hr的速率生产异戊二烯，并且以大于大约125nmole/gwcm/hr的速率生产氢。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞以大约400nmole/gwcm/hr至大约2.0×105nmole/gwcm/hr的速率生产异戊二烯，并且以大约125nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr的速率生产氢。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞以下列速率生产异戊二烯：大约400nmole/gwcm/hr至大约2.0×105nmole/gwcm/hr，大约500nmole/gwcm/hr至大约1.5×105nmole/gwcm/hr，大约750nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约1000nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约2500nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约5000nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约7500nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，和大约1×104nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞生产大于大约400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、或更多nmole/gwcm/hr的异戊二烯。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞以下列速率生产氢：大约125nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约250nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约500nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约750nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约1000nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约1250nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约2500nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约5000nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约7500nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，和大约1.00×104nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞生产大于大约125、250、500、750、1000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、或更多nmole/gwcm/hr的氢。
在一些实施方式中，本文描述的任意细胞生长于限氧培养物中并且共同生产异戊二烯和氢。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有大于大约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯的平均体积生产率和大于大约0.005mg/L培养液/hr的氢的平均体积生产率。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有大于大约1000mg/L培养液/hr的异戊二烯的峰值体积生产率和大于大约5mg/L培养液/hr的氢的峰值体积生产率。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有大于大约3000mg/L培养液/hr的异戊二烯的峰值体积生产率和大于大约5mg/L培养液/hr的氢的峰值体积生产率。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有大于大约5000mg/L培养液/hr的异戊二烯的峰值体积生产率和大于大约5mg/L培养液/hr的氢的峰值体积生产率。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有大约0.1mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr的异戊二烯的平均体积生产率和大约0.005mg/L培养液/hr至大约5mg/L培养液/hr的氢的平均体积生产率。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有下列的异戊二烯的平均体积生产率：大约1mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约5mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约10mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约25mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约50mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约100mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约250mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约500mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约1000mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，和大约2500mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培 养液/hr；以及下列的氢的平均体积生产率：大约0.01mg/L培养液/hr至大约5mg/L培养液/hr，大约0.025mg/L培养液/hr至大约5mg/L培养液/hr，大约0.05mg/L培养液/hr至大约5mg/L培养液/hr，大约0.1mg/L培养液/hr至大约5mg/L培养液/hr，大约0.25mg/L培养液/hr至大约5mg/L培养液/hr，大约0.5mg/L培养液/hr至大约5mg/L培养液/hr，大约1mg/L培养液/hr至大约5mg/L培养液/hr，和大约2.5mg/L培养液/hr至大约5mg/L培养液/hr。
在一些实施方式中，本文描述的任意细胞生长于限氧培养物中并且共同生产异戊二烯和氢。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞将大于大约0.002摩尔％的所述细胞从细胞培养基中消耗的碳转化为异戊二烯，并且生产的氢相当于大于大约0.024摩尔％的所述细胞从细胞培养基中消耗的碳。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞将大于大约0.002摩尔％的所述细胞从细胞培养基中消耗的碳转化为异戊二烯，并且生产的氢相当于大于大约400摩尔％的所述细胞从细胞培养基中消耗的碳。
在一些实施方式中，本文描述的任意的共同生产异戊二烯和氢的细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞共同生产异戊二烯和氢，其比例范围为至少1摩尔％的异戊二烯/3摩尔％的氢至至少1摩尔％的异戊二烯/4摩尔％的氢。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞生产1至11摩尔％的异戊二烯和3至33摩尔％的氢。在一些实施方式中，细胞生产1至11摩尔％的异戊二烯和4至44摩尔％的氢。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞还生产氧、二氧化碳、或氮。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞生产0至21摩尔％的氧、18至44摩尔％的二氧化碳、和0至78摩尔％的氮。
在另一个方面，本文提供了限氧培养物中的共同生产异戊二烯和氢的细胞，其包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中所述细胞：(i)以大于大约400nmole/gwcm/hr的速率生产异戊二烯，并且以大于大约125nmole/gwcm/hr的速率生产氢；(ii)具有大于大约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯的平均体积生产率和大于大约0.005mg/L培养液/hr的氢的平均体积生产率；或(iii)将大于大约0.002摩尔％的细胞从细胞培养基中消耗的碳转化为异戊二烯，并且生产的氢相当于大于大约0.024摩尔％的所述细胞从细胞培养基中消耗的碳。在一些实施方式中，细胞能够在限氧条件下共同生产异戊二烯和氢。
在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中所述异源核酸与启动子可操作地连接，并且其中所述细胞生产大于大约400nmole/gwcm/hr的异戊二烯和大于大约125nmole/gwcm/hr的氢。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中所述异源核酸与启动子可操作地连接，并且其中所述细胞具有大于大约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯的平均体积生产率和大于大约0.005mg/L培养液/hr的氢的平均体积生产率。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中所述异源核酸与启动子可操作地连接，并且其中所述细胞将大于大约0.002摩尔％的细胞从细胞培养基中消耗的碳转化为异戊二烯，并且将大于大约0.024摩尔％的细胞从细胞培养基中消耗的碳转化为氢。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。
在一些实施方式中，包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸的限氧培养物中的细胞以下列速率生产异戊二烯：大约400nmole/gwcm/hr至大约2.0×105nmole/gwcm/hr，大约500nmole/gwcm/hr至大约1.5×105nmole/gwcm/hr，大约750nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约1000nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约2500nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约5000nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约7500nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，和大约1×104nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，并且以下列速率生产氢：大约125nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约250nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约500nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约750nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约1000nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约1250nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约2500nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约5000nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约7500nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，和大约1.00×104nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr。
在一些实施方式中，本文提供了共同生产异戊二烯和氢的方法，所述方法包括：(a)在适合于共同生产异戊二烯和氢的条件下培养细胞；和(b)共同生产异戊二烯和氢，其中所述细胞生产大于大约400nmole/gwcm/小时的异戊二烯，并且其中所述细胞生产大于大约125nmole/gwcm/hr的氢。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。
在一些实施方式中，包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸的限氧培养物中的细胞以下列速率生产异戊二烯：大约400nmole/gwcm/hr至大约2.0×105nmole/gwcm/hr，大约500nmole/gwcm/hr至大约1.5×105nmole/gwcm/hr，大约750nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约1000nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约2500nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约5000nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约7500nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，和大约1×104nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，并且以下列速率生产氢：大约125nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约250nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约500nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约750nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约1000nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约1250nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约2500nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约5000nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约7500nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，和大约1.00×104nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr。
在一些实施方式中，本文提供了共同生产异戊二烯和氢的方法，所述方法包括：(a)在适合于共同生产异戊二烯和氢的条件下培养细胞；和(b)共同生产异戊二烯和氢，其中所述细胞具有大于大约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯的平均体积生产率和大于大约0.005mg/L培养液/hr的氢的平均体积生产率。在一些实施方式中，细胞生长于限氧条件下。
在一些实施方式中，本文提供了共同生产异戊二烯和氢的方法，所述方法包括：(a)在适合于共同生产异戊二烯和氢的条件下培养细胞；和(b)共同生产异戊二烯和氢，其中所述细胞将大于大约0.002摩尔％的细胞从细胞培养基中消耗的碳转化为异戊二烯，并且生产的氢相当于大于大约0.024摩尔％的细胞从细胞培养基中消耗的碳。在一些实施方式中，细胞生长于限氧条件下。
在一些实施方式中，本文提供了组合物，其包含比例范围为至少1摩尔％的异戊二烯/3摩尔％的氢至至少1摩尔％的异戊二烯/4摩尔％的氢的异戊二烯和氢，以及0.1摩尔％或更少的挥发性杂质。在一些实施方式中，组合物还包含1至11摩尔％的异戊二烯和4至44摩尔％的氢。在一些实施方式中，组合物还包含氧、二氧化碳、或氮。在一些实施方式中，组合物还包含0至21摩尔％的氧、18至44摩尔％的二氧化碳、和0至78摩尔％的氮。在一些实施方式中，组合物还包含1.0×10-4摩尔％或更少的非甲烷挥发性杂质。在一些实施方式中，非甲烷挥发性杂质包括下列一项或多项：2-庚酮，6-甲基-5-庚烯-2-酮，2，4，5-三甲基吡啶，2，3，5-三甲基吡嗪，香茅醛，乙醛，甲硫醇，乙酸甲酯，1-丙醇，二乙酰，2-丁酮，2-甲基-3-丁烯-2-醇，乙酸乙酯，2-甲基-1-丙醇，3-甲基-1-丁醛，3-甲基-2-丁酮，1-丁醇，2-戊酮，3-甲基-1-丁醇，异丁酸乙酯，3-甲基-2-丁烯醛，乙酸丁酯，3-甲基丁基乙酸酯，3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯，3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯，(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯，(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯，2，3-环庚烯醇吡啶，3-己烯-1-醇，3-己烯-1-基乙酸酯，柠檬烯，香叶醇(反式-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇)和香茅醇(3，7-二甲基-6-辛烯-1-醇)或线性异戊二烯聚合物(例如源自多个异戊二烯单元的聚合的线性异戊二烯二聚体或线性异戊二烯三聚体)。在一些实施方式中，非甲烷挥发性杂质包括下列一项或多项：异戊二烯组合物包括下列一项或多项：醇、醛、酯、或酮(例如本文中描述的醇、醛、酯、或酮中的任意项)。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包括(i)醇和醛；(ii)醇和酮；(iii)醛和酮；或(iv)醇、醛、和酮。在一些实施方式中，非甲烷挥发性杂质包括下列一项或多项：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3-甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇、或吲哚。
本文还提供了共同生产异戊二烯和氢的方法，所述方法包括：a)在适合于共同生产异戊二烯和氢的条件下培养细胞；和b)共同生产异戊二烯和氢，其中由限氧培养物中的细胞生产的异戊二烯的峰值浓度是大于大约10ng/L培养液，并且细胞的氢释放速率是大于大约0.0025mmol/L培养液/小时。在一些实施方式中，细胞生长于限氧条件下。在任意这些方法的一些实施方式中，氢释放速率是大约下列任意项：0.0025mmol/L培养液/hr至大约10mmol/L培养液/hr，大约0.0025mmol/L培养液/hr至大约5mmol/L培养液/hr，大约0.0025mmol/L培养液/hr至大约2.5mmol/L培养液/hr，大约0.0025mmol/L培养液/hr至大约1mmol/L培养液/hr，大约0.0025mmol/L培 养液/hr至大约0.5mmol/L培养液/hr，大约0.0025mmol/L培养液/hr至大约0.25mmol/L培养液/hr，大约0.0025mmol/L培养液/hr至大约0.025mmol/L培养液/hr，大约0.025mmol/L培养液/hr至大约0.5mmol/L培养液/hr，大约0.025mmol/L培养液/hr至大约1mmol/L培养液/hr，大约0.025mmol/L培养液/hr至大约2.5mmol/L培养液/hr，大约0.025mmol/L培养液/hr至大约5mmol/L培 养液/hr，大约0.025mmol/L培养液/hr至大约10mmol/L培养液/hr，大约0.25mmol/L培养液/hr至1mmol/L培养液/hr，大约0.25mmol/L培养液/hr至2.5mmol/L培养液/hr，大约0.25mmol/L培养液/hr至2.5mmol/L培养液/hr，大约0.25mmol/L培养液/hr至10mmol/L培养液/hr，大约0.01mmol/L培养液/hr至10mmol/L培养液/hr，大约0.01mmol/L培养液/hr至50mmol/L培养液/hr，大约0.01mmol/L培养液/hr至100mmol/L培养液/hr，和大约0.01mmol/L培养 液/hr至200mmol/L培养液/hr。
本文还提供了共同生产异戊二烯和氢的方法，所述方法包括：a)在适合于共同生产异戊二烯和氢的条件下培养细胞；和b)共同生产异戊二烯和氢，其中异戊二烯的液相浓度是小于大约200mg/L，细胞生产大于大约400nmole/gwcm/小时的异戊二烯，并且细胞的氢释放速率是大于大约0.0025mmol/L/小时。在一些实施方式中，细胞生长于限氧条件下。在一些实施方式中，培养物中的异戊二烯的液相浓度是小于大约下列任意项：175mg/L，150mg/L，125mg/L，100mg/L，75mg/L，50mg/L，25mg/L，20mg/L，15mg/L，10mg/L，5mg/L，或2.5mg/L。在一些实施方式中，培养物中的异戊二烯的液相浓度是大约下列任意项：0.1mg/L至200mg/L，1mg/L至200mg/L，1mg/L至150mg/L，1mg/L至100mg/L，1mg/L至50mg/L，1mg/L至25mg/L，1mg/L至20mg/L，或10mg/L至20mg/L。在任意这些方法的一些实施方式中，氢释放速率是大约下列任意项：0.0025mmol/L培养液/hr至大约10mmol/L培养液/hr，大约0.0025mmol/L培养液/hr至大约5mmol/L培养液/hr，大约0.0025mmol/L培养液/hr至大约2.5mmol/L培养液/hr，大约0.0025mmol/L培养液/hr至大约1mmol/L培养液/hr，大约0.0025mmol/L培养液/hr至大约0.5mmol/L培养液/hr，大约0.0025mmol/L培养液/hr至大约0.25mmol/L培养液/hr，大约0.0025mmol/L培养液/hr至大约0.025mmol/L培养液/hr，大约0.025mmol/L培养液/hr至大约0.5mmol/L培养液/hr，大约0.025mmol/L培养液/hr至大约1mmol/L培养液/hr，大约0.025mmol/L培养液/hr至大约2.5mmol/L培养液/hr，大约0.025mmol/L培养液/hr至大约5mmol/L培养液/hr，大约0.025mmol/L培养液/hr至大约10mmol/L培养液/hr，大约0.25mmol/L培养液/hr至1mmol/L培养液/hr，大约0.25mmol/L培养液/hr至2.5mmol/L培养液/hr，大约0.25mmol/L培养液/hr至2.5mmol/L培养液/hr，和大约0.25mmol/L培养液/hr至10mmol/L培养液/hr。
在一个方面，本文提供了共同生产异戊二烯和氢的限氧培养物中的细胞。在一些实施方式中，限氧培养物是无氧的。在一些实施方式中，本发明提供了限氧培养物中的细胞，其生产大于大约400nmole/gwcm/hr的异戊二烯和大于大约125nmole/gwcm/hr的氢。在一些实施方式中，细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。在一些实施方式中，细胞培养于限葡萄糖的条件下。
在一些实施方式中，本文提供了限氧培养物中的细胞，其将大于大约0.002％的细胞培养基中的碳转化为异戊二烯，并且生产的氢相当于大于大约0.024摩尔％的细胞培养基中的碳。在一些实施方式中，限氧培养物是无氧的。在一些实施方式中，细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。在一些实施方式中，细胞培养于限葡萄糖的条件下。
在一些实施方式中，本文提供了限氧培养物中的细胞，其包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸。在一些实施方式中，限氧培养物是无氧的。在一些实施方式中，细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。在一些实施方式中，细胞培养于限葡萄糖的条件下。
在一个方面，本文提供了共同生产异戊二烯和另一种化合物的方法，例如使用本文描述的任意细胞共同生产异戊二烯和氢的方法。在一些实施方式中，该方法包括在足以生产大于大约400nmole/gwcm/hr异戊二烯和大于大约125nmole/gwcm/hr氢的限氧条件下培养细胞。在一些实施方式中，限氧培养物是无氧的。在一些实施方式中，该方法还包括回收细胞生产的异戊二烯和氢。在一些实施方式中，该方法还包括纯化细胞生产的异戊二烯和氢。在一些实施方式中，该方法包括使异戊二烯聚合。在一些实施方式中，细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。在一些实施方式中，细胞培养于限葡萄糖的条件下。在多个实施方式中，稳定期期间所生产的异戊二烯的量(例如生产的异戊二烯的总量或生产的异戊二烯的量/升培养液/小时/OD600)大于或大约是生长期期间的相同时间长度所生产的异戊二烯的量的2倍或更多倍。
在一些实施方式中，方法包括在足以将大于大约0.002％的细胞培养基中的碳(mol/mol)转化为异戊二烯并生产的氢相当于大于大约0.024摩尔％的细胞培养基中的碳的限氧条件下培养细胞。在一些实施方式中，限氧培养物是无氧的。在一些实施方式中，该方法还包括回收细胞生产的异戊二烯和氢。在一些实施方式中，该方法还包括纯化细胞生产的异戊二烯和氢。在一些实施方式中，该方法包括使异戊二烯聚合。在一些实施方式中，细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，微生物多肽碳源包括来自酵母或细菌的一种或多种多肽。在本发明的任意方面的一些实施方式中，植物多肽碳源包括来自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈、花生、向日葵、椰子、芥、油菜籽、棉花籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、或亚麻仁的一种或多种多肽。
在一些实施方式中，仅在稳定期共同生产异戊二烯和氢。在一些实施方式中，在生长期和稳定期都共同生产异戊二烯和氢。在多个实施方式中，在稳定期期间生产的异戊二烯的量(例如所生产的异戊二烯的总量或所生产的异戊二烯的量/升培养液/小时/OD600)是大于或大约生长期期间的相同时间长度所生产的异戊二烯量的2、3、4、5、10、20、30、40、50、或更多倍。在多个实施方式中，在稳定期期间生产的氢的量(例如所生产的氢的总量或所生产的氢的量/升培养液/小时/OD600)是大于或大约生长期期间的相同时间长度生产的氢的量的2、3、4、5、10、20、30、40、50、或更多倍。
在一些实施方式中，本文提供的组合物包含氢和重量占组合物中所有C5烃的总重量的大于或大约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％、或100％的异戊二烯。在一些实施方式中，组合物包含重量占组合物中所有C5烃总重量的小于或大约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的除了异戊二烯之外的C5烃(例如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁烯、反式-戊二烯、顺式-戊二烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，组合物具有重量占组合物中所有C5烃总重量的小于或大约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁烯、反式-戊二烯、顺式-戊二烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔。在具体的实施方式中，组合物具有大于大约2mg异戊二烯并具有重量占组合物中所有C5烃总重量的大于或大约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％、或100％的异戊二烯。在一些实施方式中，对于组合物中抑制异戊二烯聚合的任意化合物，组合物具有小于或大约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的抑制异戊二烯聚合的化合物。在具体的实施方式中，组合物还包含大于大约2mg的异戊二烯和大于大约0.48mg的氢。
在一些实施方式中，对于气相的挥发性有机级份中抑制异戊二烯聚合的任意化合物，气相的挥发性有机级份具有小于或大约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的抑制异戊二烯聚合的化合物。在一些实施方式中，气相的挥发性有机级份还具有大于大约2mg的异戊二烯和大于大约0.48mg的氢。
在一些实施方式中，本发明的的特征还在于包括本文描述的任意细胞和/或组合物的系统。在一些实施方式中，系统包括反应器，其反应室包含处在限氧培养物中的细胞，所述细胞生产大于大约400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、或更多nmole/gwcm/hr的异戊二烯和大于大约125、250、500、750、1000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、或更多nmole/gwcm/hr的氢。在一些实施方式中，系统不是封闭系统。在一些实施方式中，从系统中获取至少一部分的异戊二烯。在一些实施方式中，系统包括包含异戊二烯和氢的气相。在多个实施方式中，气相包含本文描述的任意组合物。
在一个方面，本发明提供了包含聚异戊二烯的轮胎。在一些实施方式中，聚异戊二烯是通过(i)使本文描述的任意组合物中的异戊二烯聚合；或(ii)使从本文描述的任意组合物回收的异戊二烯聚合而生产的。在一些实施方式中，聚异戊二烯包含顺式-1，4-聚异戊二烯。
在一个方面，本发明的特征在于通过本文描述的任意组合物或方法生产的产物。
示例性的异戊二烯和乙醇的共同生产
本发明还提供了用于共同生产异戊二烯和C2-或C3-醇或二醇的组合物和方法。在一些实施方式中，C2-或C3-醇或二醇是乙醇。在一些实施方式中，在一些实施方式中，包含可操作地连接于启动子的编码异戊二烯合酶多肽、DXS多肽、IDI多肽、和/或MVA途径多肽的一种或多种异源核酸的本文描述的生产异戊二烯的任意细胞还包含也可操作地连接于启动子的编码一种或多种参与乙醇发酵的多肽或参与调节或表达一种或多种参与乙醇发酵的多肽的一种或多种多肽(例如转录因子等)的异源核酸。在一些实施方式中，包含可操作地连接于启动子的编码异戊二烯合酶多肽、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径多肽、一种或多种参与乙醇发酵的多肽或参与调节或表达一种或多种参与乙醇发酵的多肽的一种或多种多肽的一种或多种异源核酸的本文描述的生产异戊二烯的任意细胞还包含失活参与产生发酵副产物的一种或多种多肽、或参与调节或表达用于产生发酵副产物的基因的一种或多种多肽的突变或缺失。此类细胞能够共同生产异戊二烯和乙醇。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞是细菌细胞，例如革兰氏阳性细菌(例如，芽孢杆菌属细胞，例如枯草芽孢杆菌细胞；或链霉菌属细胞，例如浅青紫链霉菌、天蓝色链霉菌、或灰色链霉菌细胞)。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞是革兰氏阴性细菌细胞(例如，埃希菌属细胞，例如大肠杆菌细胞；红假单胞菌属，例如沼泽红假单胞菌细胞；假单胞菌属，例如荧光假单胞菌细胞或恶臭假单胞菌细胞；泛菌属细胞，例如柠檬泛菌细胞；或发酵单胞菌属细胞，例如运动发酵单胞菌细胞)。在本发明的任意方面的一些实施方式中，革兰氏阴性细菌细胞是大肠杆菌。在本发明的任意方面的一些实施方式中，革兰氏阴性细菌细胞是运动发酵单胞菌。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞是真菌细胞，例如丝状真菌细胞(例如，木霉菌属细胞，例如里氏木霉细胞；或曲霉菌属细胞，例如米曲霉和黑曲霉)或酵母细胞(例如，耶氏酵母属细胞，例如解脂耶氏酵母细胞；或酵母属细胞，例如酿酒酵母)。在本发明的任意方面的一些实施方式中，酵母细胞是酿酒酵母。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是来自植物的多肽，例如葛属(例如越南葛藤或葛根(也称作“野葛”))，或白杨(例如美洲山杨、银白杨、欧洲黑杨、毛果杨、或杂交体银白杨x欧洲山杨)。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含编码IDI多肽的异源核酸。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含插入编码IDI多肽的内源核酸的拷贝。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含编码DXS多肽的异源核酸。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含插入编码DXS多肽的内源核酸的拷贝。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含编码IDI多肽和DXS多肽的一种或多种核酸。在本发明的任意方面的一些实施方式中，一个核酸编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽、和DXS多肽。在本发明的任意方面的一些实施方式中，一个载体编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽、和DXS多肽。在一些实施方式中，载体包含选择性标志物或可选择标志物，例如抗生素抗性核酸。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含编码MVA途径多肽(例如来自酿酒酵母或粪肠球菌的MVA途径多肽)的异源核酸。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含插入编码MVA途径多肽(例如来自酿酒酵母或粪肠球菌的MVA途径多肽)的内源核酸的拷贝。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞包含异戊二烯合酶、DXS、和MVA途径核酸。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞包含异戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸、和MVA途径核酸。
在一些实施方式中，MVA途径多肽是上部MVA途径多肽。在一些实施方式中，MVA途径多肽是下部MVA途径多肽。在一些实施方式中，上部MVA途径多肽选自：(i)乙酰乙酰基-辅酶A合酶(硫解酶)多肽；(ii)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A合酶多肽；和(iii)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶多肽。在一些实施方式中，上部MVA途径多肽来自肠球菌属。在一些实施方式中，上部MVA途径多肽来自粪肠球菌。在一些实施方式中，下部MVA途径多肽选自：(i)甲羟戊酸激酶(MVK)；(ii)磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)；(iii)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)；和(iv)异戊烯二磷酸异构酶(IDI)。在一些实施方式中，下部MVA途径多肽是MVK多肽。在一些实施方式中，MVK多肽来自甲烷八叠球菌属。在一些实施方式中，MVK多肽来自马氏甲烷八叠球菌。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含可操作地连接于启动子的编码一种或多种参与乙醇发酵的多肽或参与调节或表达一种或多种参与乙醇发酵的多肽的一种或多种多肽(例如，转录因子等)的异源核酸。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含可操作地连接于启动子的编码来自运动发酵单胞菌的醇脱氢酶B(adhB)的异源核酸。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含可操作地连接于启动子的编码来自运动发酵单胞菌的醇脱氢酶E(adhE)的异源核酸。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含可操作地连接于启动子的编码来自运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶(pdc)的异源核酸。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径、乙醇发酵相关和/或转录因子多肽或核酸可操作地连接于T7启动子，例如包含于中等或高拷贝质粒中的T7启动子。在本发明的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径、乙醇发酵相关和/或转录因子核酸可操作地连接于Trc启动子，例如包含于中等或高拷贝质粒中的Trc启动子。在本发明的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径、乙醇发酵相关和/或转录因子核酸可操作地连接于Lac启动子，例如包含于低拷贝质粒中的Lac启动子。在本发明的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径、乙醇发酵相关多肽和/或转录因子核酸可操作地连接于内源性启动子，例如内源性碱性丝氨酸蛋白酶启动子。在一些实施方式中，异源异戊二烯合酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径、乙醇发酵相关和/或转录因子核酸整合进入不含选择性标志物或不含可选择标志物的细胞染色体。
在一些实施方式中，一种或多种MVA途径、IDI、DXS、异戊二烯合酶、乙醇发酵相关和/或转录因子核酸被置于在稳定期比在生长期活性更高的启动子或因子的控制下。例如，一种或多种MVA途径、IDI、DXS、异戊二烯合酶、乙醇发酵相关和/或转录因子或转录因子核酸可以被置于稳定期σ因子例如RpoS控制下。在一些实施方式中，一种或多种MVA途径、IDI、DXS、异戊二烯合酶、乙醇发酵相关和/或转录因子或转录因子核酸被置于在稳定期可被诱导的启动子控制下，例如可以被在稳定期有活性的应答调节子诱导的启动子。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞中的至少一部分在持续培养(例如不稀释的持续培养)中保持异源异戊二烯合酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径、乙醇发酵相关和/或转录因子核酸至少或大约5、10、20、40、50、60、65、或更多次细胞分裂。在本发明的任意方面的一些实施方式中，包含异源异戊二烯合酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径、乙醇发酵相关和/或转录因子核酸的核酸还包含选择性标志物或可选择标志物，例如抗生素抗性核酸。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，在限氧条件下在本文描述的任意培养基中培养共同生产异戊二烯和乙醇的细胞，以促进细胞共同生产异戊二烯和乙醇。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，细胞生长于存在0.5摩尔氧/摩尔异戊二烯的情况下。在一些实施方式中，细胞在不存在氧的情况下无氧地生长。
在一些实施方式中，本文描述的任意细胞生长于限氧培养物中并且共同生产异戊二烯和乙醇。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有大于大约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯的平均体积生产率和大于大约0.1mg/L培养液/hr的乙醇的平均体积生产率。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有大于大约1000mg/L培养液/hr的异戊二烯的峰值体积生产率和大于大约1500mg/L培养液/hr的乙醇的峰值体积生产率。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有大于大约3000mg/L培养液/hr的异戊二烯的峰值体积生产率和大于大约4500mg/L培养液/hr的乙醇的峰值体积生产率。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有大于大约5000mg/L培养液/hr的异戊二烯的峰值体积生产率和大于大约7500mg/L培养液/hr的乙醇的峰值体积生产率。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有大约0.1mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr的异戊二烯的平均体积生产率和大约0.1mg/L培养液/hr至大约7500mg/L培养液/hr的乙醇的平均体积生产率。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有下列的异戊二烯的平均体积生产率：大约1mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养 液/hr，大约5mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约10mg/L培养 液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约25mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约50mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约100mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约250mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约500mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约1000mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，和大约2500mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr；以及下列的乙醇的平均体积生产率：大约0.1mg/L培养液/hr至大约7500mg/L培养液/hr，大约1mg/L培养液/hr至大约7500mg/L培养液/hr，大约10mg/L培养液/hr至大约7500mg/L培养液/hr，大约100mg/L培养液/hr至大约7500mg/L培养液/hr，大约500mg/L培养液/hr至大约7500mg/L培养液/hr，大约1000mg/L培养液/hr至大约7500mg/L培养液/hr，大约2500mg/L培养液/hr至大约7500mg/L培养液/hr，和大约5000mg/L培 养液/hr至大约7500mg/L培养液/hr。
在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中所述异源核酸可操作地连接于启动子，并且其中所述细胞具有大于大约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯的平均体积生产率和大于大约0.1mg/L培养液/hr的乙醇的平均体积生产率。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。
在一些实施方式中，本文提供了共同生产异戊二烯和乙醇的方法，所述方法包括：(a)在适合于共同生产异戊二烯和乙醇的条件下培养细胞；和(b)共同生产异戊二烯和乙醇，其中所述细胞具有具有大于大约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯的平均体积生产率和大于大约0.1mg/L培养液/hr的乙醇的平均体积生产率。
在一些实施方式中，本文提供了包含乙醇的组合物。在一些实施方式中，本文提供了包含异戊二烯的组合物。在一些实施方式中，组合物还包含1.0×10-4摩尔％或更少的非甲烷挥发性杂质。在一些实施方式中，非甲烷挥发性杂质包括下列一项或多项：2-庚酮，6-甲基-5-庚烯-2-酮，2，4，5-三甲基吡啶，2，3，5-三甲基吡嗪，香茅醛，乙醛，甲硫醇，乙酸甲酯，1-丙醇，二乙酰，2-丁酮，2-甲基-3-丁烯-2-醇，乙酸乙酯，2-甲基-1-丙醇，3-甲基-1-丁醛，3-甲基-2-丁酮，1-丁醇，2-戊酮，3-甲基-1-丁醇，异丁酸乙酯，3-甲基-2-丁烯醛，乙酸丁酯，3-甲基丁基乙酸酯，3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯，3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯，(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯，(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯，2，3-环庚烯醇吡啶，3-己烯-1-醇，3-己烯-1-基乙酸酯，柠檬烯，香叶醇(反式-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇)和香茅醇(3，7-二甲基-6-辛烯-1-醇)或线性异戊二烯聚合物(例如，源自多个异戊二烯单元的聚合的线性异戊二烯二聚体或线性异戊二烯三聚体)。在一些实施方式中，非甲烷挥发性杂质包括下列一项或多项：异戊二烯组合物包括下列一项或多项：醇、醛、酯、或酮(例如本文中描述的醇、醛、酯、或酮中的任意项)。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包括(i)醇和醛；(ii)醇和酮；(iii)醛和酮；或(iv)醇、醛、和酮。在一些实施方式中，非甲烷挥发性杂质包括下列一项或多项：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3-甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇、或吲哚。
本文还提供了生共同产异戊二烯和乙醇的方法，所述方法包括：a)在适合于共同生产异戊二烯和乙醇的条件下培养细胞；和b)共同生产异戊二烯和乙醇，其中由限氧培养物中的细胞生产的异戊二烯的峰值浓度是大于大约10ng/L培养液，并且细胞的乙醇生产速率是大于大约0.002mmol/L培养液/小时。在任意这些方法的一些实施方式中，乙醇生产速率是大约下列任意项：0.002mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约0.01mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约0.05mmol/L培 养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约0.1mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约0.5mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约1mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约5mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约10mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约25mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约50mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约75mmol/L培 养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约100mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，和大约150mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr。
本文还提供了共同生产异戊二烯和乙醇的方法，所述方法包括：a)在适合于共同生产异戊二烯和乙醇的条件下培养细胞；和b)共同生产异戊二烯和乙醇，其中异戊二烯的液相浓度是小于大约200mg/L，细胞生产大于大约400nmole/gwcm/小时的异戊二烯，并且细胞的乙醇生产速率是大于大约0.01mmol/L培养液/小时。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，培养物中的异戊二烯的液相浓度是小于大约下列任意项：175mg/L，150mg/L，125mg/L，100mg/L，75mg/L，50mg/L，25mg/L，20mg/L，15mg/L，10mg/L，5mg/L，或2.5mg/L。在一些实施方式中，培养物中的异戊二烯的液相浓度是大约下列任意项：0.1mg/L至200mg/L，1mg/L至200mg/L，1mg/L至150mg/L，1mg/L至100mg/L ，1 mg/L至50mg/L ，1 mg/L至25mg/L ，1 mg/L至20mg/L，或10mg/L至20mg/L。在任意这些方法的一些实施方式中，限氧培养物中的细胞以下列速率生产异戊二烯：大约400nmole/gwcm/hr至大约2.0×105nmole/gwcm/hr，大约500nmole/gwcm/hr至大约1.5×105nmole/gwcm/hr，大约750nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约1000nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约2500nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约5000nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约7500nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，和大约1×104nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，并且以大约下列任意项的速率生产乙醇：0.002mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约0.01mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约0.05mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约0.1mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约0.5mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约1mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培 养液/hr，大约5mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约10mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约25mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约50mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培 养液/hr，大约75mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约100mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，和大约150mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr。
在一个方面，本文提供了共同生产异戊二烯和乙醇的限氧培养物中的细胞。在一些实施方式中，限氧培养物是无氧的。在一些实施方式中，细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。在一些实施方式中，细胞培养于限葡萄糖的条件下。
在一些实施方式中，本文提供了限氧培养物中的细胞，其包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸。在一些实施方式中，限氧培养物是无氧的。在一些实施方式中，细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。在一些实施方式中，细胞培养于限葡萄糖的条件下。
在一个方面，本文提供了共同生产异戊二烯和另一种化合物的方法，例如使用本文描述的任意细胞共同生产异戊二烯和乙醇的方法。在一些实施方式中，该方法包括在限氧条件下培养细胞。在一些实施方式中，限氧培养物是无氧的。在一些实施方式中，该方法还包括回收细胞生产的异戊二烯和乙醇。在一些实施方式中，该方法还包括纯化细胞生产的异戊二烯和乙醇。在一些实施方式中，该方法包括使异戊二烯聚合。在一些实施方式中，细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。在一些实施方式中，细胞培养于限葡萄糖的条件下。在多个实施方式中，稳定期期间所生产的异戊二烯的量(例如生产的异戊二烯的总量或生产的异戊二烯的量/升培养液/小时/OD600)大于或大约是生长期期间的相同时间长度所生产的异戊二烯的量的2倍或更多倍。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，微生物多肽碳源包括来自酵母或细菌的一种或多种多肽。在本发明的任意方面的一些实施方式中，植物多肽碳源包括来自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈、花生、向日葵、椰子、芥、油菜籽、棉花籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、或亚麻仁的一种或多种多肽。
在一些实施方式中，仅在稳定期共同生产异戊二烯和乙醇。在一些实施方式中，在生长期和稳定期都共同生产异戊二烯和乙醇。在多个实施方式中，在稳定期期间生产的异戊二烯的量(例如所生产的异戊二烯的总量或所生产的异戊二烯的量/升培养液/小时/OD600)是大于或大约生长期期间的相同时间长度生产的异戊二烯量的2、3、4、5、10、20、30、40、50、或更多倍。在多个实施方式中，在稳定期期间生产的乙醇的量(例如所生产的乙醇的总量或所生产的乙醇的量/升培养液/小时/OD600)是大于或大约生长期期间的相同时间长度生产的乙醇的量的2、3、4、5、10、20、30、40、50、或更多倍。
在一些实施方式中，本文提供的组合物包含乙醇和重量占组合物中所有C5烃的总重量的大于或大约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％、或100％的异戊二烯。在一些实施方式中，组合物包含重量占组合物中所有C5烃总重量的小于或大约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的除了异戊二烯之外的C5烃(例如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁烯、反式-戊二烯、顺式-戊二烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，组合物具有重量占组合物中所有C5烃总重量的小于或大约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁烯、反式-戊二烯、顺式-戊二烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔。在具体的实施方式中，组合物具有大于大约2mg异戊二烯并具有重量占组合物中所有C5烃总重量的大于或大约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％、或100％的异戊二烯。在一些实施方式中，对于组合物中抑制异戊二烯聚合的任意化合物，组合物具有小于或大约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的抑制异戊二烯聚合的化合物。在具体的实施方式中，组合物还包含大于大约2mg的异戊二烯和大于大约0.48mg的乙醇。
在一些实施方式中，对于气相的挥发性有机级份中抑制异戊二烯聚合的任意化合物，气相的挥发性有机级份具有小于或大约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的抑制异戊二烯聚合的化合物。在一些实施方式中，气相的挥发性有机级份还具有大于大约2mg的异戊二烯和大于大约0.48mg的乙醇。
在一些实施方式中，本发明的的特征还在于包括本文描述的任意细胞和/或组合物的系统。在一些实施方式中，系统包括反应器，其反应室包含处在限氧培养物中的细胞，所述细胞生产大于大约400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、或更多nmole/gwcm/hr的异戊二烯和大于大约0.1、0.25、0.5、1、5、10、25、50、75、100、250、500、或更多mmol/L培养液/hr的乙醇。在一些实施方式中，系统不是封闭系统。在一些实施方式中，从系统中获取至少一部分的异戊二烯。在一些实施方式中，系统包括包含异戊二烯和乙醇的气相。在一些实施方式中，系统包括包含异戊二烯的气相和包含乙醇的液相。在多个实施方式中，气相包含本文描述的任意组合物。在多个实施方式中，液相包含本文描述的任意组合物。
在一个方面，本发明提供了包含聚异戊二烯的轮胎。在一些实施方式中，聚异戊二烯是通过(i)使本文描述的任意组合物中的异戊二烯聚合；或(ii)使从本文描述的任意组合物回收的异戊二烯聚合而生产的。在一些实施方式中，聚异戊二烯包含顺式1，4-聚异戊二烯。
在一个方面，本发明的特征在于通过本文描述的任意组合物或方法生产的产物。
示例性的异戊二烯和1，2-丙二醇或1，3-丙二醇的共同生产
在一些实施方式中，C2-或C3-醇或二醇是1，2-丙二醇。在一些实施方式中，C2-或C3-醇或二醇是1，3-丙二醇。在一些实施方式中，包含可操作地连接于启动子的编码异戊二烯合酶多肽、DXS多肽、IDI多肽、和/或MVA途径多肽的一种或多种异源核酸的本文描述的生产异戊二烯的任意细胞还包含也可操作地连接于启动子的编码甘油途径或1，3-丙二醇途径中的一种或多种多肽的异源核酸。此类细胞能够共同生产异戊二烯和1，2-丙二醇或1，3-丙二醇。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞是细菌细胞，例如革兰氏阳性细菌(例如，芽孢杆菌属细胞，例如枯草芽孢杆菌细胞；或链霉菌属细胞，例如浅青紫链霉菌、天蓝色链霉菌、或灰色链霉菌细胞)。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞是革兰氏阴性细菌细胞(例如，埃希菌属细胞，例如大肠杆菌细胞；红假单胞菌属，例如沼泽红假单胞菌细胞；假单胞菌属，例如荧光假单胞菌细胞或恶臭假单胞菌细胞；泛菌属细胞，例如柠檬泛菌细胞；或发酵单胞菌属细胞，例如运动发酵单胞菌细胞)。在本发明的任意方面的一些实施方式中，革兰氏阴性细菌细胞是大肠杆菌。在本发明的任意方面的一些实施方式中，革兰氏阴性细菌细胞是运动发酵单胞菌。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞是真菌细胞，例如丝状真菌细胞(例如，木霉菌属细胞，例如里氏木霉细胞；或曲霉菌属，例如米曲霉和黑曲霉)或酵母细胞(例如，耶氏酵母属细胞，例如解脂耶氏酵母细胞；或酵母属细胞，例如酿酒酵母)。在本发明的任意方面的一些实施方式中，酵母细胞是酿酒酵母。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是来自植物的多肽，所述植物例如葛属(例如越南葛藤或葛根(也称作“野葛”))或白杨(例如美洲山杨、银白杨、欧洲黑杨、毛果杨、或杂交体银白杨x欧洲山杨)。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含编码IDI多肽的异源核酸。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含插入编码IDI多肽的内源核酸的拷贝。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含编码DXS多肽的异源核酸。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含插入编码DXS多肽的内源核酸的拷贝。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含编码IDI多肽和DXS多肽的一种或多种核酸。在本发明的任意方面的一些实施方式中，一个核酸编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽、和DXS多肽。在本发明的任意方面的一些实施方式中，一个载体编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽、和DXS多肽。在一些实施方式中，载体包含选择性标志物或可选择标志物，例如抗生素抗性核酸。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含编码MVA途径多肽(例如来自酿酒酵母或粪肠球菌的MVA途径多肽)的异源核酸。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含插入编码MVA途径多肽(例如来自酿酒酵母或粪肠球菌的MVA途径多肽)的内源核酸的拷贝。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞包含异戊二烯合酶、DXS、和MVA途径核酸。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含异戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸、和MVA途径核酸。
在一些实施方式中，MVA途径多肽是上部MVA途径多肽。在一些实施方式中，MVA途径多肽是下部MVA途径多肽。在一些实施方式中，上部MVA途径多肽选自：(i)乙酰乙酰基-辅酶A合酶(硫解酶)多肽；(ii)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A合酶多肽；和(iii)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶多肽。在一些实施方式中，上部MVA途径多肽来自肠球菌属。在一些实施方式中，上部MVA途径多肽来自粪肠球菌。在一些实施方式中，下部MVA途径多肽选自：(i)甲羟戊酸激酶(MVK)；(ii)磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)；(iii)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)；和(iv)异戊烯二磷酸异构酶(IDI)。在一些实施方式中，下部MVA途径多肽是MVK多肽。在一些实施方式中，MVK多肽来自甲烷八叠球菌属。在一些实施方式中，MVK多肽来自马氏甲烷八叠球菌。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含可操作地连接于启动子的编码甘油途径或1，3-丙二醇途径中的一种或多种多肽的异源核酸。在一些实施方式中，参与甘油途径或1，3-丙二醇途径的多肽是可操作地连接于启动子的二羟基丙酮磷酸还原酶(DAR1)、甘油-磷酸磷酸酶(GPP2)、甘油脱水酶B1(dhaB1)、甘油脱水酶B2(dhaB2)、甘油脱水酶B3(dhaB3)、dhaX、orfX、orfY、1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)、甘油脱氢酶(dhaD)、或二羟基丙酮激酶(dhaK)。在一些实施方式中，参与甘油途径或1，3-丙二醇途径的多肽是可操作地连接于启动子的二羟基丙酮磷酸还原酶(DAR1)、甘油-磷酸磷酸酶(GPP2)、甘油脱水酶B1(dhaB1)、甘油脱水酶B2(dhaB2)、甘油脱水酶B3(dhaB3)、dhaX、orfX、和orfY。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径、甘油途径或1，3-丙二醇途径多肽或核酸可操作地连接于T7启动子，例如包含于中等或高拷贝质粒中的T7启动子。在本发明的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径、甘油途径或1，3-丙二醇途径核酸可操作地连接于Trc启动子，例如包含于中等或高拷贝质粒中的Trc启动子。在本发明的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径、甘油途径或1，3-丙二醇途径核酸可操作地连接于Lac启动子，例如包含于低拷贝质粒中的Lac启动子。在本发明的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径、甘油途径或1，3-丙二醇途径核酸可操作地连接于内源性启动子，例如内源性碱性丝氨酸蛋白酶启动子。在一些实施方式中，异源异戊二烯合酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径、甘油途径或1，3-丙二醇途径核酸整合进入不含选择性标志物或不含可选择标志物的细胞染色体。
在一些实施方式中，一种或多种MVA途径、IDI、DXS、异戊二烯合酶、甘油途径、或1，3-丙二醇途径核酸被置于在稳定期比在生长期的活性更高的启动子或因子的控制下。例如，一种或多种MVA途径、IDI、DXS、异戊二烯合酶、甘油途径或1，3-丙二醇途径核酸可以被置于稳定期σ因子例如RpoS控制下。在一些实施方式中，一种或多种MVA途径、IDI、DXS、异戊二烯合酶、甘油途径或1，3-丙二醇途径核酸被置于在稳定期可被诱导的启动子控制下，例如可以被在稳定期有活性的应答调节子诱导的启动子。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞中的至少一部分在持续培养(例如不稀释的持续培养)中保持异源异戊二烯合酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径、甘油途径或1，3-丙二醇途径核酸至少或大约5、10、20、40、50、60、65、或更多次细胞分裂。在本发明的任意方面的一些实施方式中，包含异源异戊二烯合酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径、甘油途径或1，3-丙二醇途径核酸的核酸还包含选择性标志物或可选择标志物，例如抗生素抗性核酸。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，在限氧条件下在本文描述的任意培养基中培养共同生产异戊二烯和1，2-丙二醇的细胞，以促进细胞共同生产异戊二烯和1，2-丙二醇。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，细胞生长于存在0.5摩尔氧/摩尔异戊二烯的情况下。在一些实施方式中，细胞在不存在氧的情况下无氧地生长。
在一些实施方式中，本文描述的任意细胞生长于限氧培养物中并且共同生产异戊二烯和1，2-丙二醇。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有大于大约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯的平均体积生产率和大于大约0.1mg/L培养液/hr的1，2-丙二醇的平均体积生产率。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有大于大约1000mg/L培养液/hr的异戊二烯的峰值体积生产率和大于大约1500mg/L培养液/hr的1，2-丙二醇的峰值体积生产率。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有大于大约3000mg/L培 养液/hr的异戊二烯的峰值体积生产率和大于大约4500mg/L培养液/hr的1，2-丙二醇的峰值体积生产率。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有大于大约5000mg/L培养液/hr的异戊二烯的峰值体积生产率和大于大约7500mg/L培养液/hr的1，2-丙二醇的峰值体积生产率。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有大约0.1mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培 养液/hr的异戊二烯的平均体积生产率和大约0.1mg/L培养液/hr至大约7500mg/L培养液/hr的1，2-丙二醇的平均体积生产率。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有下列的异戊二烯的平均体积生产率：大约1mg/L培 养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约5mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约10mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约25mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约50mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约100mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约250mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约500mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约1000mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，和大约2500mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr；以及下列的1，2-丙二醇的平均体积生产率：大约0.1mg/L培养液/hr至大约7500mg/L培养液/hr，大约1mg/L培养液/hr至大约7500mg/L培养液/hr，大约10mg/L培养液/hr至大约7500mg/L培养液/hr，大约100mg/L培养液/hr至大约7500mg/L培养液/hr，大约500mg/L培养液/hr至大约7500mg/L培养液/hr，大约1000mg/L培养液/hr至大约7500mg/L培养液/hr，大约2500mg/L培养液/hr至大约7500mg/L培养液/hr，和大约5000mg/L培养液/hr至大约7500mg/L培养液/hr。
在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中所述异源核酸与启动子可操作地连接，并且其中所述细胞具有大于大约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯的平均体积生产率和大于大约0.1mg/L培养液/hr的1，2-丙二醇的平均体积生产率。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。
在一些实施方式中，本文提供了共同生产异戊二烯和1，2-丙二醇的方法，所述方法包括：(a)在适合于共同生产异戊二烯和1，2-丙二醇的条件下培养细胞；和(b)共同生产异戊二烯和1，2-丙二醇，其中所述细胞具有大于大约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯的平均体积生产率和大于大约0.1mg/L培养液/hr的1，2-丙二醇的平均体积生产率。
在一些实施方式中，本文提供了包含1，2-丙二醇的组合物。在一些实施方式中，本文提供了包含异戊二烯的组合物。在一些实施方式中，组合物还包含1.0×10-4摩尔％或更少的非甲烷挥发性杂质。在一些实施方式中，非甲烷挥发性杂质包括下列一项或多项：2-庚酮，6-甲基-5-庚烯-2-酮，2，4，5-三甲基吡啶，2，3，5-三甲基吡嗪，香茅醛，乙醛，甲硫醇，乙酸甲酯，1-丙醇，二乙酰，2-丁酮，2-甲基-3-丁烯-2-醇，乙酸乙酯，2-甲基-1-丙醇，3-甲基-1-丁醛，3-甲基-2-丁酮，1-丁醇，2-戊酮，3-甲基-1-丁醇，异丁酸乙酯，3-甲基-2-丁烯醛，乙酸丁酯，3-甲基丁基乙酸酯，3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯，3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯，(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯，(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯，2，3-环庚烯醇吡啶，3-己烯-1-醇，3-己烯-1-基乙酸酯，柠檬烯，香叶醇(反式-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇)和香茅醇(3，7-二甲基-6-辛烯-1-醇)或线性异戊二烯聚合物(例如，源自多个异戊二烯单元的聚合的线性异戊二烯二聚体或线性异戊二烯三聚体)。在一些实施方式中，非甲烷挥发性杂质包括下列一项或多项：异戊二烯组合物包括下列一项或多项：醇、醛、酯、或酮(例如本文中描述的醇、醛、酯、或酮中的任意项)。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包括(i)醇和醛；(ii)醇和酮；(iii)醛和酮；或(iv)醇、醛、和酮。在一些实施方式中，非甲烷挥发性杂质包括下列一项或多项：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3-甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇、或吲哚。
本文还提供了共同生产异戊二烯和1，2-丙二醇的方法，所述方法包括：(a)在适合于共同生产异戊二烯和1，2-丙二醇的条件下培养细胞；和(b)共同生产异戊二烯和1，2-丙二醇，其中限氧培养物中的细胞生产的异戊二烯的峰值浓度是大于大约10ng/L培养液并且细胞的1，2-丙二醇生产速率是大于大约0.002mmol/L培养液/小时。在任意这些方法的一些实施方式中，1，2-丙二醇生产速率是大约下列任意项：0.002mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约0.01mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约0.05mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约0.1mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约0.5mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约1mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约5mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约10mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约25mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约50mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约75mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约100mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，和大约150mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr 。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，共同生产异戊二烯和1，3-丙二醇的细胞在限氧条件下培养于本文描述的任意培养基中，以促进细胞共同生产异戊二烯和1，3-丙二醇。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，细胞生长于存在0.5摩尔氧/摩尔异戊二烯的情况下。在一些实施方式中，细胞在不存在氧的情况下无氧地生长。
在一些实施方式中，本文描述的任意细胞生长于限氧培养物中并且共同生产异戊二烯和1，3-丙二醇。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有大于大约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯的平均体积生产率和大于大约0.1mg/L培养液/hr的1，3-丙二醇的平均体积生产率。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有大于大约1000mg/L培养液/hr的异戊二烯的峰值体积生产率和大于大约1500mg/L培养液/hr的1，3-丙二醇的峰值体积生产率。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有大于大约3000mg/L培 养液/hr的异戊二烯的峰值体积生产率和大于大约4500mg/L培养液/hr的1，3-丙二醇的峰值体积生产率。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有大于大约5000mg/L培养液/hr的异戊二烯的峰值体积生产率和大于大约7500mg/L培养液/hr的1，3-丙二醇的峰值体积生产率。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有大约0.1mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培 养液/hr的异戊二烯的平均体积生产率，和大约0.1mg/L培养液/hr至大约7500mg/L培养液/hr的1，3-丙二醇的平均体积生产率。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有下列的异戊二烯的平均体积生产率：大约1mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约5mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约10mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约25mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约50mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约100mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约250mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约500mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约1000mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培 养液/hr，和大约2500mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr；和下列的1，3-丙二醇的平均体积生产率：大约0.1mg/L培养液/hr至大约7500mg/L培养液/hr，大约1mg/L培养液/hr至大约7500mg/L培养液/hr，大约10mg/L培养液/hr至大约7500mg/L培养液/hr，大约100mg/L培养液/hr至大约7500mg/L培养液/hr，大约500mg/L培养液/hr至大约7500mg/L培养液/hr，大约1000mg/L培养液/hr至大约7500mg/L培养液/hr，大约2500mg/L培养液/hr至大约7500mg/L培养液/hr，和大约5000mg/L培养液/hr至大约7500mg/L培养液/hr。
在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中所述异源核酸可操作地连接于启动子，并且其中所述细胞具有大于大约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯的平均体积生产率和大于大约0.1mg/L培养液/hr的1，3-丙二醇的平均体积生产率。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。
在一些实施方式中，本文提供了共同生产异戊二烯和1，3-丙二醇的方法，所述方法包括：(a)在适合于共同生产异戊二烯和1，3-丙二醇的条件下培养细胞；和(b)共同生产异戊二烯和1，3-丙二醇，其中所述细胞具有具有大于大约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯的平均体积生产率和大于大约0.1mg/L培养液/hr的1，3-丙二醇的平均体积生产率。
在一些实施方式中，本文提供了包含1，3-丙二醇的组合物。在一些实施方式中，本文提供了包含异戊二烯的组合物。在一些实施方式中，组合物还包含1.0×10-4摩尔％或更少的非甲烷挥发性杂质。在一些实施方式中，非甲烷挥发性杂质包括下列一项或多项：2-庚酮，6-甲基-5-庚烯-2-酮，2，4，5-三甲基吡啶，2，3，5-三甲基吡嗪，香茅醛，乙醛，甲硫醇，乙酸甲酯，1-丙醇，二乙酰，2-丁酮，2-甲基-3-丁烯-2-醇，乙酸乙酯，2-甲基-1-丙醇，3-甲基-1-丁醛，3-甲基-2-丁酮，1-丁醇，2-戊酮，3-甲基-1-丁醇，异丁酸乙酯，3-甲基-2-丁烯醛，乙酸丁酯，3-甲基丁基乙酸酯，3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯，3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯，(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯，(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯，2，3-环庚烯醇吡啶，3-己烯-1-醇，3-己烯-1-基乙酸酯，柠檬烯，香叶醇(反式-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇)和香茅醇(3，7-二甲基-6-辛烯-1-醇)或线性异戊二烯聚合物(例如，源自多个异戊二烯单元的聚合的线性异戊二烯二聚体或线性异戊二烯三聚体)。在一些实施方式中，非甲烷挥发性杂质包括下列一项或多项：异戊二烯组合物包括下列一项或多项：醇、醛、酯、或酮(例如本文中描述的醇、醛、酯、或酮中的任意项)。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包括(i)醇和醛；(ii)醇和酮；(iii)醛和酮；或(iv)醇、醛、和酮。在一些实施方式中，非甲烷挥发性杂质包括下列一项或多项：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3-甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇、或吲哚。
本文还提供了共同生产异戊二烯和1，3-丙二醇的方法，所述方法包括：a)在适合于共同生产异戊二烯和1，3-丙二醇的条件下培养细胞；和b)共同生产异戊二烯和1，3-丙二醇，其中由限氧培养物中的细胞生产的异戊二烯的峰值浓度是大于大约10ng/L培养液，并且细胞的1，3-丙二醇生产速率是大于大约0.002mmol/L培养液/小时。在任意这些方法的一些实施方式中，1，3-丙二醇生产速率是大约下列任意项：0.002mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约0.01mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约0.05mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约0.1mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约0.5mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约1mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培 养液/hr，大约5mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约10mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约25mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约50mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培 养液/hr，大约75mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约100mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，和大约150mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr。
本文还提供了共同生产异戊二烯和1，3-丙二醇的方法，所述方法包括：a)在适合于共同生产异戊二烯和1，3-丙二醇的条件下培养细胞；和b)共同生产异戊二烯和1，3-丙二醇，其中异戊二烯的液相浓度是小于大约200mg/L，细胞生产大于大约400nmole/gwcm/小时的异戊二烯，并且细胞的1，3-丙二醇生产速率是大于大约0.01mmol/L培养液/小时。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，培养物中的异戊二烯的液相浓度是小于大约下列任意项：175mg/L，150mg/L，125mg/L，100mg/L，75mg/L，50mg/L，25mg/L，20mg/L，15mg/L，10mg/L，5mg/L，或2.5mg/L。在一些实施方式中，培养物中的异戊二烯的液相浓度是大约下列任意项：0.1mg/L至200mg/L，1mg/L至200mg/L，1mg/L至150mg/L，1mg/L至100mg/L，1mg/L至50mg/L，1mg/L至25mg/L，1mg/L至20mg/L，或10mg/L至20mg/L。在任意这些方法的一些实施方式中，限氧培养物中的细胞以下列速率生产异戊二烯：大约400nmole/gwcm/hr至大约2.0×105nmole/gwcm/hr，大约500nmole/gwcm/hr至大约1.5×105nmole/gwcm/hr，大约750nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约1000nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约2500nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约5000nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约7500nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，和大约1×104nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr；并且以大约下列任意项的速率生产1，3-丙二醇：0.002mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约0.01mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约0.05mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约0.1mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约0.5mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约1mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约5mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约10mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培 养液/hr，大约25mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约50mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约75mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，大约100mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr，和大约150mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr。
示例性的纯化方法
在一些实施方式中，本文描述的任意方法还包括回收共同生产的化合物。在一些实施方式中，本文描述的任意方法还包括回收异戊二烯。在一些实施方式中，本文描述的任意方法还包括通过低温膜、基于吸附基质的分离方法回收氢。在一些实施方式中，本文描述的任意方法还包括回收乙醇。在一些实施方式中，本文描述的任意方法还包括回收1，3-丙二醇。
可以使用标准技术回收通过本发明的组合物和方法生产的异戊二烯和共同产物，所述共同产物例如氢、乙醇、1，2-丙二醇或1，3-丙二醇，所述标准技术为例如气提、膜增强的分离、分馏、吸附/解吸附、渗透蒸发、从固相热或真空解吸附异戊二烯、或使用溶剂提取固定至或吸附至固相的异戊二烯(见，例如，美国专利号4,703,007、4,570,029、和4,740,222(“Recovery and Purification of Hydrogen from Refinery andPetrochemical Off-gas Streams”)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于异戊二烯回收和纯化方法的内容(’007和’029专利)以及关于氢的回收和纯化方法的内容(’222专利))。在具体的实施方式中，使用醇(例如乙醇、甲醇、丙醇、或其组合)的提取式蒸馏回收异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯的回收包括分离液体形式的异戊二烯(例如异戊二烯的纯溶液或异戊二烯在溶剂中的溶液)。气提包括以持续方式从发酵废气流中获取异戊二烯蒸气。这种获取可以通过数种不同方式进行，包括但不限于：吸附至固相、分入液相、或直接冷凝(例如由于暴露于冷凝旋管或由于压力增加而发生冷凝)。在一些实施方式中，在蒸气的露点以上对稀释的异戊二烯蒸气流进行膜富集，引起液体异戊二烯的冷凝。在一些实施方式中，压缩并冷凝异戊二烯。
异戊二烯的回收可以包括一个步骤或多个步骤。在一些实施方式中，从发酵废气中获取异戊二烯蒸气和将异戊二烯转化为液相是同时进行的。例如，可以从废气流中直接冷凝异戊二烯以形成液体。在一些实施方式中，从发酵废气中获取异戊二烯蒸气和将异戊二烯转化为液相是依次进行的。例如，可以使异戊二烯吸附至固相，然后使用溶剂从固相提取。
氢的回收可以包括一个步骤或多个步骤。在一些实施方式中，从发酵废气中获取氢气和将氢转化为液相是同时进行的。在一些实施方式中，从发酵废气中获取氢气和将氢转化为液相是依次进行的。例如，可以使氢吸附至固相，然后通过变压从固相解吸附。
乙醇的回收可以包括一个步骤或多个步骤。在一些实施方式中，通过蒸馏从发酵液中回收乙醇。在一些实施方式中，首先通过离心、过滤或类似方法从发酵液中清除细胞和碎片。
1，2-丙二醇或1，3-丙二醇的回收可以包括一个步骤或多个步骤。在一些实施方式中，通过蒸馏从发酵液中回收1，2-丙二醇或1，3-丙二醇。在一些实施方式中，通过色谱或其它标准方法从发酵液中回收1，2-丙二醇或1，3-丙二醇。在一些实施方式中，首先通过离心、过滤或类似方法从发酵液中清除细胞和碎片。
在一些实施方式中，本文描述的任意方法还包括纯化异戊二烯。例如，可以使用标准技术纯化使用本发明的组合物和方法生产的异戊二烯。纯化是指这样的过程：通过该过程将异戊二烯与生产异戊二烯时存在的一种或多种成分分离开。在一些实施方式中，以实质上纯的液体形式获得异戊二烯。纯化方法的实例包括(i)在液体提取剂中从溶液中蒸馏；和(ii)色谱。如本文使用的“纯化的异戊二烯”意思是已经与生产异戊二烯时存在的一种或多种成分分离的异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯是至少大约20％(按重量)，不含在生产异戊二烯时存在的其它成分。在多种实施方式中，异戊二烯是至少或大约25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、或99％(按重量)纯的。可以通过任何合适方法例如通过柱色谱、HPLC分析或GC-MS分析测定纯度。
在一些实施方式中，本文描述的任意方法还包括纯化氢。例如，可以使用标准技术纯化使用本发明的组合物和方法生产的氢。纯化是指这样的过程：通过该过程将氢与生产氢时存在的一种或多种成分分离开。在一些实施方式中，以实质上纯的气体形式获得氢。纯化方法的实例包括(i)冷凝；和(ii)固体基质吸附。如本文使用的“纯化的氢”意思是已经与生产氢时存在的一种或多种成分分离的氢。在一些实施方式中，氢是至少大约20％(按重量)，不含在生产氢时存在的其它成分。在多种实施方式中，氢是至少或大约25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、或99％(按重量)纯的。可以通过任何合适方法例如通过柱色谱或GC-MS分析测定纯度。
在一些实施方式中，通过将气相导入用于生产异戊二烯的细胞培养系统(例如发酵器)以使在获取异戊二烯的一个或多个回收步骤之后剩余的至少一部分气相再循环。
在一些实施方式中，本文描述的任意方法还包括使异戊二烯聚合。例如，可以使用标准方法使纯化的异戊二烯聚合以形成顺式-聚异戊二烯或其它下游产物(使用标准方法)。相应地，本发明的特征还在于包含聚异戊二烯的轮胎，所述聚异戊二烯例如由本文公开的任何异戊二烯组合物制备而来的顺式1，4-聚异戊二烯和/或反式-1，4-聚异戊二烯。
高异戊二烯效价时的细胞存活性
异戊二烯是由很多植物、动物、和微生物分泌的疏水性分子。细菌，例如芽孢杆菌，以非常低的水平产生异戊二烯。虽然有一些证据证明植物分泌异戊二烯以辅助热保护，已经假设异戊二烯可能具有拮抗蓝细菌或真菌的作用，或作为抗微生物剂。见，例如，Ladygina等人，ProcessBiochemistry 41：1001-1014(2006)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于异戊二烯的拮抗性作用的内容。由于在自然界中发生的非常低的产生水平已足以抗微生物，所以引起极大关注的是，商业化异戊二烯所需的异戊二烯的效价和生产率水平将杀死宿主微生物。
我们已经发现了生产用于商业化异戊二烯并同时保持细胞存活性和/或代谢活性(如通过二氧化碳释放速率或总的二氧化碳释放速率所指示)的异戊二烯效价和生产率水平的方法。
本文提供了生产异戊二烯的方法，其包括：a)在适合于生产异戊二烯的条件下培养细胞；和b)生产异戊二烯，其中所述细胞生产大于大约400nmole/gwcm/小时的异戊二烯，并且细胞的二氧化碳释放速率大于大约1x10-18mmol/L/小时。在一些实施方式中，所生产的异戊二烯是标题为“示例性的异戊二烯的生产”的部分所公开的任意浓度或量。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约下列任意项：400nmole/gwcm/小时至1mole/gwcm/小时，400nmole/gwcm/小时至1mmole/gwcm/小时，400nmole/gwcm/小时至40mmole/gwcm/小时，400nmole/gwcm/小时至4mmole/gwcm/小时，1mmole/gwcm/小时至1.5mmole/gwcm/小时，1.5mmole/gwcm/小时至3mmole/gwcm/小时，3mmole/gwcm/小时至5mmole/gwcm/小时，5mmole/gwcm/小时至25mmole/gwcm/小时，25mmole/gwcm/小时至100mmole/gwcm/小时，100mmole/gwcm/小时至500mmole/gwcm/小时，或500mmole/gwcm/小时至1000mmole/gwcm/小时。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约下列任意项：1mmole/gwcm/小时，1.5mmole/gwcm/小时，2mmole/gwcm/小时，3mmole/gwcm/小时，4mmole/gwcm/小时，或5mmole/gwcm/小时。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约下列任意项：1x10-18mmol/L/小时至大约1mol/L/小时，1mmol/L/小时至1mol/L/小时，25mmol/L/小时至750mmol/L/小时，25mmol/L/小时至75mmol/L/小时，250mmol/L/小时至750mmol/L/小时，或450mmol/L/小时至550mmol/L/小时。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约下列任意项：50mmol/L/小时，100mmol/L/小时，150mmol/L/小时，200mmol/L/小时，250mmol/L/小时，300mmol/L/小时，350mmol/L/小时，400mmol/L/小时，450mmol/L/小时，或500mmol/L/小时。
本文还提供了生产异戊二烯的方法，其包括：a)在适合于生产异戊二烯的条件下培养细胞；和b)生产异戊二烯，其中细胞生产大于大约400nmole/gwcm/小时的异戊二烯，并且细胞存活性降低小于大约2倍。在一些实施方式中，所生产的异戊二烯是标题为“示例性的异戊二烯的生产”的部分所公开的任意浓度或量。在一些实施方式中，异戊二烯的量大约下列任意项：400nmole/gwcm/小时至1mole/gwcm/小时，400nmole/gwcm/小时至1mmole/gwcm/小时，400nmole/gwcm/小时至40mmole/gwcm/小时，400nmole/gwcm/小时至4mmole/gwcm/小时，1mmole/gwcm/小时至1.5mmole/gwcm/小时，1.5mmole/gwcm/小时至3mmole/gwcm/小时，3mmole/gwcm/小时至5mmole/gwcm/小时，5mmole/gwcm/小时至25mmole/gwcm/小时，25mmole/gwcm/小时至100mmole/gwcm/小时，100mmole/gwcm/小时至500mmole/gwcm/小时，或500mmole/gwcm/小时至1000mmole/gwcm/小时。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约下列任意项：1mmole/gwcm/小时，1.5mmole/gwcm/小时，2mmole/gwcm/小时，3mmole/gwcm/小时，4mmole/gwcm/小时，或5mmole/gwcm/小时。在一些实施方式中，细胞存活性降低小于大约下列任意项：1.75倍，1.5倍，1.25倍，1倍，0.75倍，0.5倍，或0.25倍。在一些实施方式中，细胞存活性下降大约2倍。
本文还提供了生产异戊二烯的方法，其包括：a)在适合于生产异戊二烯的条件下培养细胞；和b)生产异戊二烯，其中所述培养物中的细胞生产的异戊二烯的累积总生产率是大于大约0.2mg/L培养液/小时，并且细胞的二氧化碳释放速率是大于大约1x10-18mmol/L/小时。在一些实施方式中，异戊二烯的累积总生产率是标题为“示例性的异戊二烯的生产”的部分所公开的任意浓度或量。在一些实施方式中，异戊二烯的累积总生产率是大约下列任意项：0.2mg/L培养液/小时至5g/L培养液/小时，0.2mg/L培 养液/小时至1g/L培养液/小时，1g/L培养液/小时至2.5g/L培养液/小时，2.5g/L培养液/小时至5g/L培养液/小时。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约下列任意项：1x10-18mmol/L/小时至大约1mol/L/小时，1mmol/L/小时至1mol/L/小时，25mmol/L/小时至750mmol/L/小时，25mmol/L/小时至75mmol/L/小时，250mmol/L/小时至750mmol/L/小时，或450mmol/L/小时至550mmol/L/小时。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约下列任意项：50mmol/L/小时，100mmol/L/小时，150mmol/L/小时，200mmol/L/小时，250mmol/L/小时，300mmol/L/小时，350mmol/L/小时，400mmol/L/小时，450mmol/L/小时，或500mmol/L/小时。
本文提供了生产异戊二烯的方法，其包括：a)在适合于生产异戊二烯的条件下培养细胞；和b)生产异戊二烯，其中培养物中的细胞生产的异戊二烯的累积总生产率大于大约0.2mg/L培养液/小时，并且细胞的存活性降低小于大约2倍。在一些实施方式中，异戊二烯的累积总生产率是标题为“示例性的异戊二烯的生产”部分所公开的任意浓度或量。在一些实施方式中，异戊二烯的累积总生产率是大约下列任意项：0.2mg/L培养液/小时至5g/L培养液/小时，0.2mg/L培养液/小时至1g/L培养液/小时，1g/L培养 液/小时至2.5g/L培养液/小时，2.5g/L培养液/小时至5g/L培养液/小时。在一些实施方式中，细胞存活性降低小于大约下列任意项：1.75倍，1.5倍，1.25倍，1倍，0.75倍，0.5倍，或0.25倍。
本文还提供了生产异戊二烯的方法，包括：a)在适合于生产异戊二烯的条件下培养细胞；和b)生产异戊二烯，其中培养物中的细胞生产的异戊二烯的峰值浓度大于大约10ng/L培养液，并且细胞的二氧化碳释放速率大于大约1x10-18mmol/L/小时。在一些实施方式中，异戊二烯的峰值浓度是标题为“示例性的异戊二烯的生产”的部分所公开的任意浓度或量。在一些实施方式中，异戊二烯的峰值浓度是大约下列任意项：10ng/L培 养液至500ng/L培养液，500ng/L培养液至1μg/L培养液，1μg/L培养液至5μg/L培养液，5μg/L培养液至50μg/L培养液，5μg/L培养液至100μg/L培养液，5μg/L培养液至250μg/L培养液，250μg/L培养液至500μg/L培养液，500μg/L培养液至1mg/L培养液，1mg/L培养液至50mg/L培养液，1mg/L培养液至100mg/L培养液，1mg/L培养液至200mg/L培养液，10ng/L培养液至200mg/L培养液，5μg/L培 养液至100mg/L培养液，或5μg/L培养液至200mg/L培养液。在一些实施方式中，峰值浓度是下列任意项：大约10ng/L培养液，100ng/L培养液，1μg/L培养液，5μg/L培养液，1mg/L培养液，30mg/L培养液，100mg/L培养液，或200mg/L培养液。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约下列任意项：1x10-18mmol/L/小时至大约1mol/L/小时，1mmol/L/小时至1mol/L/小时，25mmol/L/小时至750mmol/L/小时，25mmol/L/小时至75mmol/L/小时，250mmol/L/小时至750mmol/L/小时，或450mmol/L/小时至550mmol/L/小时。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约下列任意项：50mmol/L/小时，100mmol/L/小时，150mmol/L/小时，200mmol/L/小时，250mmol/L/小时，300mmol/L/小时，350mmol/L/小时，400mmol/L/小时，450mmol/L/小时，或500mmol/L/小时。
另外，本文还提供了生产异戊二烯的方法，包括：a)在适合于生产异戊二烯的条件下培养细胞；和b)生产异戊二烯，其中培养物中的细胞生产的异戊二烯的峰值浓度大于大约10ng/L培养液，并且细胞存活性降低小于大约2倍。在一些实施方式中，异戊二烯的峰值浓度是标题为“示例性的异戊二烯的生产”的部分所公开的任意浓度或量。在一些实施方式中，异戊二烯的峰值浓度是大约下列任意项：10ng/L培养液至500ng/L培养液，500ng/L培养液至1μg/L培养液，1μg/L培养液至5μg/L培养液，5μg/L培养液至50μg/L培养液，5μg/L培养液至100μg/L培养液，5μg/L培养液至250μg/L培养液，250μg/L培养液至500μg/L培养液，500μg/L培养液至1mg/L培养液，1mg/L培 养液至50mg/L培养液，1mg/L培养液至100mg/L培养液，1mg/L培养液至200mg/L培养液，10ng/L培养液至200mg/L培养液，5μg/L培养液至100mg/L培养液，或5μg/L培养液至200mg/L培养液。在一些实施方式中，峰值浓度是下列任意项：大约10ng/L培养液，100ng/L培养液，1μg/L培养液，5μg/L培养液，1mg/L培养液，30mg/L培养液，100mg/L培养液，或200mg/L培养液。在一些实施方式中，细胞存活性降低小于大约下列任意项：1.75倍，1.5倍，1.25倍，1倍，0.75倍，0.5倍，或0.25倍。在一些实施方式中，细胞存活性降低大约2倍。
还提供了培养物中的细胞，其包含编码异戊二烯合酶多肽的核酸，其中所述细胞生产大于大约400nmole/gwcm/小时的异戊二烯，并且所述细胞的二氧化碳释放速率大于大约1x10-18mmol/L/小时。在一些实施方式中，生产的异戊二烯是标题为“示例性的异戊二烯的生产”部分所公开的任意浓度和量。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约下列任意项：400nmole/gwcm/小时至1mole/gwcm/小时，400nmole/gwcm/小时至1mmole/gwcm/小时，400nmole/gwcm/小时至40mmole/gwcm/小时，400nmole/gwcm/小时至4mmole/gwcm/小时，1mmole/gwcm/小时至1.5mmole/gwcm/小时，1.5mmole/gwcm/小时至3mmole/gwcm/小时，3mmole/gwcm/小时至5mmole/gwcm/小时，5mmole/gwcm/小时至25mmole/gwcm/小时，25mmole/gwcm/小时至100mmole/gwcm/小时，100mmole/gwcm/小时至500mmole/gwcm/小时，或500mmole/gwcm/小时至1000mmole/gwcm/小时。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约下列任意项：1mmole/gwcm/小时，1.5mmole/gwcm/小时，2mmole/gwcm/小时，3mmole/gwcm/小时，4mmole/gwcm/小时，或5mmole/gwcm/小时。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约下列任意项：1x10-18mmol/L/小时至大约1mol/L/小时，1mmol/L/小时至1mol/L/小时，25mmol/L/小时至750mmol/L/小时，25mmol/L/小时至75mmol/L/小时，250mmol/L/小时至750mmol/L/小时，或450mmol/L/小时至550mmol/L/小时。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约下列任意项：50mmol/L/小时，100mmol/L/小时，150mmol/L/小时，200mmol/L/小时，250mmol/L/小时，300mmol/L/小时，350mmol/L/小时，400mmol/L/小时，450mmol/L/小时，或500mmol/L/小时。
本文还提供了培养物中的细胞，其包含编码异戊二烯合酶多肽的核酸，其中培养物中的细胞生产的异戊二烯的累积总生产率大于大约0.2mg/L培养液/小时，并且细胞的二氧化碳释放速率大于大约1x10-18mmol/L/小时。在一些实施方式中，异戊二烯的累积总生产率是标题为“示例性的异戊二烯的生产”部分所公开的任意浓度或量。在一些实施方式中，异戊二烯的累积总生产率是大约下列任意项：0.2mg/L培养液/小时至5g/L培养液/小时，0.2mg/L培养液/小时至1g/L培养液/小时，1g/L培养液/小时至2.5g/L培养液/小时，2.5g/L培养液/小时至5g/L培养液/小时。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约下列任意项：1x10-18mmol/L/小时至大约1mol/L/小时，1mmol/L/小时至1mol/L/小时，25mmol/L/小时至750mmol/L/小时，25mmol/L/小时至75mmol/L/小时，250mmol/L/小时至750mmol/L/小时，或450mmol/L/小时至550mmol/L/小时。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约下列任意项：50mmol/L/小时，100mmol/L/小时，150mmol/L/小时，200mmol/L/小时，250mmol/L/小时，300mmol/L/小时，350mmol/L/小时，400mmol/L/小时，450mmol/L/小时，或500mmol/L/小时。
另外，本文还提供了培养物中的细胞，其包含编码异戊二烯合酶多肽的核酸，其中培养物中的细胞生产的异戊二烯的峰值浓度大于大约10ng/L培养液，并且细胞的二氧化碳释放速率大于大约1x10-18mmol/L/小时。在一些实施方式中，异戊二烯的峰值浓度是标题为“示例性的异戊二烯的生产”的部分所公开的任意浓度或量。在一些实施方式中，异戊二烯的峰值浓度是大约下列任意项：10ng/L培养液至500ng/L培养液，500ng/L培养液至1μg/L培养液，1μg/L培养液至5μg/L培养液，5μg/L培养液至50μg/L培 养液，5μg/L培养液至100μg/L培养液，5μg/L培养液至250μg/L培养液，250μg/L培养液至500μg/L培养液，500μg/L培养液至1mg/L培养液，1mg/L培养液至50mg/L培养液，1mg/L培养液至100mg/L培养液，1mg/L培养液至200mg/L培养液，10ng/L培养液至200mg/L培养液，5μg/L培养液至100mg/L培养液，或5μg/L培养液至200mg/L培养液。在一些实施方式中，峰值浓度是下列任意项：大约10ng/L培养液，100ng/L培养液，1μg/L培养液，5μg/L培养液，1mg/L培养液，30mg/L培养液，100mg/L培养液，或200mg/L培养液。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约下列任意项：1x10-18mmol/L/小时至大约1mol/L/小时，1mmol/L/小时至1mol/L/小时，25mmol/L/小时至750mmol/L/小时，25mmol/L/小时至75mmol/L/小时，250mmol/L/小时至750mmol/L/小时，或450mmol/L/小时至550mmol/L/小时。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约下列任意项：50mmol/L/小时，100mmol/L/小时，150mmol/L/小时，200mmol/L/小时，250mmol/L/小时，300mmol/L/小时，350mmol/L/小时，400mmol/L/小时，450mmol/L/小时，或500mmol/L/小时。
在本文描述的任意方法和细胞的一些实施方式中，将表达来自一种或多种异源和/或重复拷贝的MVA途径和/或DXP途径核酸的MVA途径和/或DXP途径RNA和/或蛋白质的细胞的二氧化碳释放速率和/或细胞存活性与不含一种或多种异源和/或重复拷贝的MVA途径和/或DXP途径核酸的对照细胞进行比较。在一些实施方式中，将表达来自于处在可诱导启动子控制下(其中所述启动子被诱导)的一种或多种异源和/或重复拷贝的MVA途径和/或DXP途径核酸的MVA途径和/或DXP途径RNA和/或蛋白质的细胞的二氧化碳释放速率和/或细胞存活性与包含处在可诱导启动子控制下(其中所述启动子不被诱导)(未诱导)的一种或多种异源和/或重复拷贝的MVA途径和/或DXP途径核酸的对照细胞进行比较。在一些实施方式中，可诱导启动子是β-半乳糖苷酶启动子。
本发明提供了生产异戊二烯的方法，包括：a)在适合于生产异戊二烯的条件下培养细胞；和b)生产异戊二烯，其中细胞生产大于大约400nmole/gwcm/小时的异戊二烯，并且细胞的二氧化碳释放速率大于大约1x10-18mmol/L/小时。本文还提供了生产异戊二烯的方法，包括：a)在适合于生产异戊二烯的条件下培养细胞；和b)生产异戊二烯，其中培养物中的细胞生产的异戊二烯的累积总生产率大于大约0.2mg/L培养液/小时，并且细胞的二氧化碳释放速率大于大约1z10-18mmol/L/小时。本文还提供了生产异戊二烯的方法，包括：a)在适合于生产异戊二烯的条件下培养细胞；和b)生产异戊二烯，其中培养物中的细胞生产的异戊二烯的峰值浓度大于大约10ng/L培养液，并且细胞的二氧化碳释放速率大于大约1x10-18mmol/L/小时。在任意这些方法的一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约下列任意项：1x10-18mmol/L/小时至大约1mol/L/小时，1mmol/L/小时至1mol/L/小时，25mmol/L/小时至750mmol/L/小时，25mmol/L/小时至75mmol/L/小时，250mmol/L/小时至750mmol/L/小时，或450mmol/L/小时至550mmol/L/小时。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约50mmol/L/小时或大约500mmol/L/小时。
本文还提供了培养物中的细胞，其包含编码异戊二烯合酶多肽的核酸，其中所述细胞生产大于大约400nmole/gwcm/小时的异戊二烯，并且细胞的二氧化碳释放速率是大于大约1x10-18mmol/L/小时。本文还提供了培养物中的细胞，其包含编码异戊二烯合酶多肽的核酸，其中培养物中的细胞生产的异戊二烯的累积总生产率大于大约0.2mg/L培养液/小时，并且细胞的二氧化碳释放速率大于大约1x10-18mmol/L/小时。此外，本文提供了培养物中的细胞，其包含编码异戊二烯合酶多肽的核酸，其中培养物中的细胞生产的异戊二烯的峰值浓度大于大约10ng/L培养液，并且细胞的二氧化碳释放速率大于大约1x10-18mmol/L/小时。在培养物中的任意这些细胞的一些实施方式中，二氧化碳释放速率大约是下列任意项：1x10-18mmol/L/小时至大约1mol/L/小时，1mmol/L/小时至1mol/L/小时，25mmol/L/小时至750mmol/L/小时，25mmol/L/小时至75mmol/L/小时，250mmol/L/小时至750mmol/L/小时，或450mmol/L/小时至550mmol/L/小时。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约50mmol/L/小时或大约500mmol/L/小时。
本文还提供了生产异戊二烯的方法，包括：a)在适合于生产异戊二烯的条件下培养细胞；和b)生产异戊二烯，其中异戊二烯的液相浓度小于大约200mg/L，并且细胞生产大于大约400nmole/gwcm/小时的异戊二烯。在一些实施方式中，培养物中的异戊二烯的液相浓度小于大约下列任意项：175mg/L，150mg/L，125mg/L，100mg/L，75mg/L，50mg/L，25mg/L，20mg/L，15mg/L，10mg/L，5mg/L，或2.5mg/L。在一些实施方式中，培养物中的异戊二烯的液相浓度是大约下列任意项：0.1mg/L至200mg/L，1mg/L至200mg/L，1mg/L至150mg/L，1mg/L至100mg/L ，1mg/L至50mg/L，1mg/L至25mg/L，1mg/L至20mg/L，或10mg/L至20mg/L。
本文还提供了生产化合物的方法，其中所述化合物具有选自下列的一个或多个特征：(a)亨利定律系数小于大约250M/atm；和(b)在水中的溶解性小于大约100g/L。在一些实施方式中，所述方法包括：a)在适合于生产化合物的条件下培养细胞，其中以大约0.01vvm至大约2vvm的气体鼓泡速率加入气体(例如向系统例如发酵系统中加入气体)；和b)生产化合物。在一些实施方式中，化合物的亨利定律系数小于大约下列任意项：200M/atm，150M/atm，100M/atm，75M/atm，50M/atm，25M/atm，10M/atm，5M/atm，或1M/atm。在一些实施方式中，化合物在水中的溶解性小于大约下列任意项：75g/L，50g/L，25g/L，10g/L，5g/L，或1g/L。在一些实施方式中，化合物选自：异戊二烯，醛(例如，乙醛)，酮(例如丙酮或2-丁酮)，醇(例如甲醇、乙醇、1-丁醇，或C5醇，例如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基2-丁烯-1-醇)，醇的酯(例如乙酸乙酯或C5醇的乙酸酯)，或半萜、单萜、或倍半萜，以及C1至C5烃(例如甲烷、乙烷、乙烯、或丙烯)。在一些实施方式中，C1至C5烃是饱和的、非饱和的、或分支的。在具体的实施方式中，化合物是异戊二烯。在生产本文描述的任意化合物的方法的一些实施方式中，气体鼓泡速率是大约下列任意项：0.1vvm至1vvm，0.2vvm至1vvm，或0.5vvm至1vvm。
在一个方面，本发明的特征在于生产异戊二烯的培养物中的细胞。在一些实施方式中，本发明提供了培养物中的细胞，其生产大于大约400nmole异戊二烯/克细胞的湿细胞重/小时(nmole/gwcm/hr)的异戊二烯。在一些实施方式中，细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。在一些实施方式中，细胞培养于限葡萄糖的条件下。
在一些实施方式中，本发明提供了将大于大约0.002％的细胞培养基中的碳转化为异戊二烯的培养物中的细胞。在一些实施方式中，细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。在一些实施方式中，细胞培养于限葡萄糖的条件下。
在一些实施方式中，本发明提供了包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸的培养物中的细胞。在一些实施方式中，细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。在一些实施方式中，细胞培养于限葡萄糖的条件下。
在一个方面，本发明的特征在于生产异戊二烯的方法，例如使用本文描述的任意细胞生产异戊二烯的方法。在一些实施方式中，该方法包括在足以生产大于大约400nmole/gwcm/hr异戊二烯的条件下培养细胞。在一些实施方式中，该方法还包括回收细胞生产的异戊二烯。在一些实施方式中，该方法包括纯化细胞生产的异戊二烯。在一些实施方式中，该方法包括使异戊二烯聚合。在一些实施方式中，细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。在一些实施方式中，细胞培养于限葡萄糖的条件下。在多个实施方式中，稳定期期间所生产的异戊二烯的量(例如生产的异戊二烯的总量或生产的异戊二烯的量/升培养液/小时/OD600)大于或大约是生长期期间的相同时间长度所生产的异戊二烯的量的2倍或更多倍。在一些实施方式中，气相包含大于或大约9.5％(体积)的氧，并且气相中异戊二烯的浓度小于燃烧下限或高于燃烧上限。在具体的实施方式中，(i)气相中异戊二烯的浓度小于燃烧下限或高于燃烧上限；并且(ii)细胞生产大于大约400nmole/gwcm/hr的异戊二烯。
在一些实施方式中，方法包括在足以将大于大约0.002％的细胞培养基中的碳(mol/mol)转化为异戊二烯的条件下培养细胞。在一些实施方式中，该方法还包括回收细胞生产的异戊二烯。在一些实施方式中，该方法包括纯化细胞生产的异戊二烯。在一些实施方式中，该方法包括使异戊二烯聚合。在一些实施方式中，细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞培养于包括一种或多种碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、或来自酵母提取物的成分。在一些实施方式中，细胞培养于限葡萄糖条件下。
在一些实施方式中，仅在稳定期生产异戊二烯。在一些实施方式中，在生长期和稳定期都生产异戊二烯。在多个实施方式中，在稳定期期间生产的异戊二烯的量(例如所生产的异戊二烯的总量或所生产的异戊二烯的量/升培养液/小时/OD600)是大于或大约生长期期间的相同时间长度生产的异戊二烯量的2、3、4、5、10、20、30、40、50、或更多倍。
在一个方面，本发明的特征在于包含异戊二烯的组合物和系统。在一些实施方式中，组合物包含大于或大约2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000mg异戊二烯。在一些实施方式中，组合物包含大于或大约2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100g异戊二烯(w/w)，组合物中挥发性有机级份是异戊二烯。
在一些实施方式中，组合物包含重量占组合物中所有C5烃的总重量的大于或大约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％、或100％的异戊二烯。在一些实施方式中，组合物包含重量占组合物中所有C5烃总重量的小于或大约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的除了异戊二烯之外的C5烃(例如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁烯、反式-戊二烯、顺式-戊二烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，组合物具有重量占组合物中所有C5烃总重量的小于或大约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁烯、反式-戊二烯、顺式-戊二烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔。在具体的实施方式中，组合物具有大于大约2mg异戊二烯并具有重量占组合物中所有C5烃总重量的大于或大约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％、或100％的异戊二烯。
在一些实施方式中，对于组合物中抑制异戊二烯聚合的任意化合物，组合物具有小于或大约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的抑制异戊二烯聚合的化合物。在具体的实施方式中，组合物还具有大于大约2mg的异戊二烯。
在一些实施方式中，组合物具有选自乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇和具有10个或更多个碳原子的类异戊二烯化合物的一种或多种化合物。在一些实施方式中，组合物具有大于或大约0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、60、80、100或120ug/L的乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇(例如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)、或前述的任意两项或更多项。在具体的实施方式中，组合物具有大于大约2mg异戊二烯并且具有选自乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇、和具有10个或更多个碳原子的类异戊二烯化合物的一种或多种化合物。
在一些实施方式中，组合物包含异戊二烯和选自下列的一种或多种第二化合物：2-庚酮，6-甲基-5-庚烯-2-酮，2，4，5-三甲基吡啶，2，3，5-三甲基吡嗪，香茅醛，乙醛，甲硫醇，乙酸甲酯，1-丙醇，二乙酰，2-丁酮，2-甲基-3-丁烯-2-醇，乙酸乙酯，2-甲基-1-丙醇，3-甲基-1-丁醛，3-甲基-2-丁酮，1-丁醇，2-戊酮，3-甲基-1-丁醇，异丁酸乙酯，3-甲基-2-丁烯醛，乙酸丁酯，3-甲基丁基乙酸酯，3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯，3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯，(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯，(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯，和2，3-环庚烯醇吡啶。在多个实施方式中，按照重量百分率单位，这些第二成分中的一种的量相对于异戊二烯的量(即所述成分的重量除以异戊二烯的重量乘以100)是大于或大约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或110％(w/w)。
在一些实施方式中，组合物包含(i)包含异戊二烯的气相；和(ii)生产大于大约400nmole/gwcm/hr的异戊二烯的培养物中的细胞。在一些实施方式中，组合物包含封闭的系统，并且气相包含大于或大约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100ug/L的异戊二烯(当针对培养了1小时的1mL 1OD600进行校正时)。在一些实施方式中，组合物包含开放的系统，并且气相包含大于或大约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100ug/L的异戊二烯(当以1vvm的速率鼓泡时)。在一些实施方式中，气相的挥发性有机级份包含重量占挥发性有机级份中所有C5烃总重量的大于或大约99.90％，99.92％，99.94％，99.96％，99.98％、或100％的异戊二烯。在一些实施方式中，气相的挥发性有机级份包含重量占挥发性有机级份中所有C5烃总重量的小于或大约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％，0.00005％、或0.00001％的除了异戊二烯的以外的C5烃(例如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁烯、反式-戊二烯、顺式-戊二烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，气相的挥发性有机级份具有重量占挥发性有机级份中所有C5烃总重量的小于或大约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁烯、反式-戊二烯、顺式-戊二烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔。在具体的实施方式中，气相的挥发性有机级份具有大于大约2mg异戊二烯并且具有重量占挥发性有机级份中所有C5烃总重量的大于或大约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％、或100％的异戊二烯。
在一些实施方式中，对于气相的挥发性有机级份中的抑制异戊二烯聚合的任意化合物，气相的挥发性有机级份具有小于或大约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005ug/L的抑制异戊二烯聚合的化合物。在具体的实施方式中，气相的挥发性有机级份还具有大于大约2mg异戊二烯。
在一些实施方式中，气相的挥发性有机级份具有选自下列的一种或多种化合物：乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇、和具有10个或更多个碳原子的类异戊二烯化合物。在一些实施方式中，气相的挥发性有机级份具有大于或大约0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、60、80、100、或120ug/L的乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇(例如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)、或前述的任意两项或更多项。在具体的实施方式中，气相的挥发性有机级份具有大于大约2mg异戊二烯并且具有选自乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇、和具有10个或更多个碳原子的类异戊二烯化合物的一种或多种化合物。
在一些实施方式中，气相的挥发性有机级份具有异戊二烯和选自下列的一种或多种第二化合物：2-庚酮，6-甲基-5-庚烯-2-酮，2，4，5-三甲基吡啶，2，3，5-三甲基吡嗪，香茅醛，乙醛，甲硫醇，乙酸甲酯，1-丙醇，二乙酰，2-丁酮，2-甲基-3-丁烯-2-醇，乙酸乙酯，2-甲基-1-丙醇，3-甲基-1-丁醛，3-甲基-2-丁酮，1-丁醇，2-戊酮，3-甲基-1-丁醇，异丁酸乙酯，3-甲基-2-丁烯醛，乙酸丁酯，3-甲基丁基乙酸酯，3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯，3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯，(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯，(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯，和2，3-环庚烯醇吡啶。在多个实施方式中，按照重量百分率单位，这些第二成分中的一种的量相对于异戊二烯的量(即所述成分的重量除以异戊二烯的重量乘以100)是大于或大约0.01％，0.02％，0.05％，0.1％，0.5％，1％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％、或110％(w/w)的气相的挥发性有机级份。
在本发明的任意组合物的一些实施方式中，至少一部分的异戊二烯在气相中。在一些实施方式中，至少一部分的异戊二烯在液相(例如冷凝物)中。在一些实施方式中，至少一部分的异戊二烯在固相中。在一些实施方式中，至少一部分的异戊二烯吸附至固相，例如包括二氧化硅和/或活性炭的支持物。在一些实施方式中，组合物包括乙醇。在一些实施方式中，组合物包括大约75％至大约90％重量的乙醇，例如大约75％至大约80％、大约80％至大约85％、或大约85％至大约90％重量的乙醇。在一些实施方式中，组合物包含大约4％至大约15％重量的异戊二烯，例如大约4％至大约8％、大约8％至大约12％、或大约12％至大约15％重量的异戊二烯。
在一些实施方式中，本发明的特征还在于包括本文描述的任意细胞和/或组合物的系统。在一些实施方式中，系统包括反应器，其反应室包含在限氧培养物中的细胞，所述细胞生产大于大约400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、或更多nmole/gwcm/hr的异戊二烯。在一些实施方式中，系统不是封闭系统。在一些实施方式中，从系统中获取至少一部分的异戊二烯。在一些实施方式中，系统包括包含异戊二烯的气相。在多个实施方式中，气相包含本文描述的任意组合物。
在一个方面，本发明提供了包含聚异戊二烯的轮胎。在一些实施方式中，聚异戊二烯是通过(i)使本文描述的任意组合物中的异戊二烯聚合；或(ii)使从本文描述的任意组合物回收的异戊二烯聚合而生产的。在一些实施方式中，聚异戊二烯包含顺式-1，4-聚异戊二烯。
在本发明的任意组合物、系统、和方法的一些实施方式中，生产气相中的非可燃浓度的异戊二烯。在一些实施方式中，气相包含小于大约9.5％(体积)的氧。在一些实施方式中，气相包含大于或大约9.5％(体积)的氧，并且气相中的异戊二烯的浓度小于燃烧下限或大于燃烧上限。在一些实施方式中，除了异戊二烯以外的气相部分包含大约0％至大约100％(体积)的氧，例如大约10％至大约100％(体积)的氧。在一些实施方式中，除了异戊二烯以外的气相部分包含大约0％至大约99％(体积)的氮。在一些实施方式中，除了异戊二烯以外的气相部分包含大约1％至大约50％(体积)的CO2。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，培养物中的细胞生产大于或大约400，500，600，700，800，900，1,000，1,250，1,500，1,750，2,000，2,500，3,000，4,000，5,000、或更多nmole/gwcm/hr的异戊二烯。在本发明的任意方面的一些实施方式中，培养物中的细胞将大于或大约0.002％、0.005％、0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、或更多的细胞培养基中的碳转化为异戊二烯。在本发明的任意方面的一些实施方式中，培养物中的细胞以大于或大约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、100,000、或更多ng的异戊二烯/克细胞的湿细胞重/hr(ng/gwcm/h)生产异戊二烯。在本发明的任意方面的一些实施方式中，培养物中的细胞以大于或大约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、50,000、100,000、或更多毫克异戊二烯/升培养液(mg/L培养液，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)生产异戊二烯的累积效价(总量)。本文公开了异戊二烯生产的其它示例性速率和异戊二烯生产的总量。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含编码IDI多肽的异源核酸。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含插入编码IDI多肽的内源核酸的拷贝。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含编码DXS多肽的异源核酸。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含插入编码DXS多肽的内源核酸的拷贝。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含编码IDI多肽和DXS多肽的一种或多种异源核酸。在本发明的任意方面的一些实施方式中，一个核酸编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽、和DXS多肽。在本发明的任意方面的一些实施方式中，一个载体编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽、和DXS多肽。在一些实施方式中，载体包含选择性标志物，例如抗生素抗性核酸。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸可操作地连接于T7启动子，例如包含于中等或高拷贝质粒中的T7启动子。在本发明的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸可操作地连接于Trc启动子，例如包含于中等或高拷贝质粒中的Trc启动子。在本发明的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸可操作地连接于Lac启动子，例如包含于低拷贝质粒中的Lac启动子。在本发明的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸可操作地连接于内源性启动子，例如内源性碱性丝氨酸蛋白酶启动子。在一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸整合进入不含选择性标志物的细胞染色体。
在一些实施方式中，一种或多种MVA途径、IDI、DXS、或异戊二烯合酶核酸被置于在稳定期比在生长期的活性更高的启动子或因子的控制下。例如，一种或多种MVA途径、IDI、DXS、或异戊二烯合酶核酸可以被置于稳定期σ因子例如RpoS控制下。在一些实施方式中，一种或多种MVA途径、IDI、DXS、或异戊二烯合酶核酸被置于在稳定期可被诱导的启动子控制下，例如可以被在稳定期有活性的应答调节子诱导的启动子。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞中的至少一部分在持续培养(例如不稀释的持续培养)中保持异源异戊二烯合酶核酸至少或大约5、10、20、40、50、60、65、或更多次细胞分裂。在本发明的任意方面的一些实施方式中，包含异源异戊二烯合酶、IDI、或DXS核酸的核酸还包含选择性标志物，例如抗生素抗性核酸。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含编码MVA途径多肽(例如来自酿酒酵母或粪肠球菌的MVA途径多肽)的异源核酸。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含插入编码MVA途径多肽(例如来自酿酒酵母或粪肠球菌的MVA途径多肽)的内源核酸的拷贝。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含异戊二烯合酶、DXS、和MVA途径核酸。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞包含异戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸、和MVA途径核酸(除了所述IDI核酸之外)。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是来自植物的多肽，所述植物例如葛属(例如越南葛藤或葛根)，或白杨(例如美洲山杨、银白杨、欧洲黑杨、毛果杨、或杂交体银白杨x欧洲山杨)。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞是细菌细胞，例如革兰氏阳性细菌(例如，芽孢杆菌属细胞，例如枯草芽孢杆菌细胞；或链霉菌属细胞，例如浅青紫链霉菌、天蓝色链霉菌、或灰色链霉菌细胞)。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞是革兰氏阴性细菌细胞(例如埃希菌属细胞，例如大肠杆菌细胞；红假单胞菌属，例如沼泽红假单胞菌细胞；假单胞菌属，例如荧光假单胞菌细胞或恶臭假单胞菌细胞；泛菌属细胞，例如柠檬泛菌细胞)。在本发明的任意方面的一些实施方式中，细胞是真菌细胞，例如丝状真菌细胞(例如木霉菌属细胞，例如里氏木霉细胞；或曲霉菌属细胞，例如米曲霉和黑曲霉)或酵母细胞(例如耶氏酵母属细胞，例如解脂耶氏酵母细胞；或酵母属细胞，例如酿酒酵母)。
在本发明的任意方面的一些实施方式中，微生物多肽碳源包括来自酵母或细菌的一种或多种多肽。在本发明的任意方面的一些实施方式中，植物多肽碳源包括来自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈、花生、向日葵、椰子、芥、油菜籽、棉花籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、或亚麻仁的一种或多种多肽。
在一个方面，本发明的特征在于通过本发明的任意组合物或方法生产的产品。
实施例
实施例纯粹是意在例示本发明，因此不应该被解释为以任何方式限制本发明，实施例也描述并详细叙述了如上所讨论的本发明的方面和实施方式。除非另有指明，否则温度是指摄氏度，压力是在大气压下或接近大气压。前述实施例和详细描述是以举例方式而不是限制性方式提供。
本说明书中引用的所有公开物、专利申请、和专利通过引用方式并入本文，如同每篇公开物、专利申请、或专利皆特别地且单一地通过引用方式并入一样。具体地，为了描述和公开可能用于本发明的组合物和方法的目的，将本文引用的所有公开物明确地通过引用方式并入本文。虽然已经为了清楚理解的目的，通过例示和实例的方式在一定程度上详细描述了前述发明，但是本领域普通技术人员根据本发明的教导显而易见的是，可以对其作出一些变化和修饰而不脱离随附的权利要求的精神或范围。
实施例1：在表达重组野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌中生产异戊二烯
I.用于在大肠杆菌中表达野葛异戊二烯合酶的载体的构建
从GenBank获得野葛(越南葛藤)异戊二烯合酶基因(IspS)的蛋白序列(AAQ84170)。从DNA2.0购买针对大肠杆菌中的密码子使用进行了优化的野葛异戊二烯合酶基因(SEQ ID NO：1)。通过以限制性核酸内切酶BspLU11I/PstI消化从提供的质粒中切下异戊二烯合酶基因，进行凝胶纯化，并连接进入经NcoI/PstI消化的pTrcHis2B(Invitrogen)。设计构建体，使得异戊二烯合酶基因中的终止密码子在PstI位点的5’。结果是：当构建体被表达时，His-标签不附着于异戊二烯合酶蛋白。通过测序来验证得到的质粒pTrcKudzu(图2和3；SEQ ID NO：2)。
还将异戊二烯合酶基因克隆进入pET16b(Novagen)。在本例中，将异戊二烯合酶基因插入至pET16b，使得重组异戊二烯合酶蛋白包含N-末端的His标签。使用下列引物组通过PCR从pTrcKudzu扩增异戊二烯合酶基因：
pET-His-Kudzu-2F：
5’-CGTGAGATCATATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTTAC(SEQ IDNO：49)和
pET-His-Kudzu-R：
5’-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG (SEQID NO：50)。这些引物在基因的5’末端添加NdeI位点，在3’末端添加BamH1位点。如上所述的质粒pTrcKudzu用作模板DNA，根据生产商的说明书使用Herculase聚合酶(Stratagene)，加入浓度为10pMol的引物。以25μl的总体积进行PCR。以NdeI/BamH1消化PCR产物，并克隆进入经相同的酶消化的pET16b。将连接混合物转化进入大肠杆菌Top10(Invitrogen)，通过测序选择正确的克隆。得到的质粒被称作pETNHisKudzu(图4和5；SEQ ID NO：3)，其中野葛异戊二烯表达自T7启动子。
还将野葛异戊二烯合酶基因克隆进入低拷贝数的质粒pCL1920。按照上文描述使用引物从pTrcKudzu扩增异戊二烯合酶基因。正向引物向5’末端添加HindIII位点和大肠杆菌共有RBS。PstI克隆位点已经存在于pTrcKudzu中，恰在终止密码子的3’，所以反向引物被构建为使得最终的PCR产物包括PstI位点。引物的序列是：
HindIII-rbs-Kudzu F：
5’-CATATGAAAGCTTGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACC(SEQ ID NO：51)和
BamH1-Kudzu R：
5’-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG(SEQ ID NO：50)。使用Herculase聚合酶和浓度为10pmol的引物以及1ng模板DNA(pTrcKudzu)扩增PCR产物。扩增程序包括：30个循环的“95℃，1分钟；60℃，1分钟；72℃，2分钟”。以HindIII和PstI消化产物并连接进入也经过HindIII和PstI消化的pCL1920。将连接混合物转化进入大肠杆菌Top10。通过测序检查数个转化子。得到的质粒被称作pCL-lac-Kudzu(图6和7；SEQ ID NO：4)。
II.测定异戊二烯的生产
对于摇瓶培养物,将1ml的培养物从摇瓶转移至20ml CTC顶空瓶(Agilent瓶cat#51882753；盖cat#51882759)。将盖旋紧，将瓶在相同温度下在250rpm振荡温育。30分钟后，从温育箱中取出瓶并按照如下所述进行分析(关于该测定中的一些实验数值，见表1)。
在测定发酵器中的异戊二烯产量的情况下，从发酵器的废气中取出样品并按照如下所述直接进行分析(关于该测定中的一些实验数值，见表2)。
使用连接了CTC Analytics(Switzerland)CombiPAL自动取样仪(以顶空模式运行)的Agilent 6890GC/MS系统进行分析。使用AgilentHP-5MS GC/MS柱(30m x0.25mm；膜厚0.25μm)来分离分析物。将取样仪设定为注入500μL顶空气体。GC/MS法使用氦作为载气，流速为1ml/分钟。注入口维持在250℃，分流比为50∶1。在分析过程中，将烤箱温度维持在37℃持续2分钟。在m/z 67下以单离子监控(SIM)模式运行Agilent 5793N质量选择性检测器。在1.4至1.7分钟将检测器关闭，以允许洗脱永久气体。在这样的条件下，在1.78分钟观察到异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)的洗脱。使用校准表来定量测定异戊二烯的绝对量，发现在1μg/L至2000μg/L是线性的。估计使用该方法的检测限值是50-100ng/L。
III.在含有表达重组异戊二烯合酶的大肠杆菌细胞的摇瓶中生产异戊二烯
将如上描述的载体导入大肠杆菌菌株BL21(Novagen)以产生菌株BL21/ptrcKudzu、BL21/pCL-lac-Kudzu和BL21/pETHisKudzu。为了分离，将菌株涂覆于LA(Luria琼脂)+羧苄西林(50μg/ml)，并在37℃温育过夜。将单一菌落接种于250ml振荡培养瓶，其中含有20ml LuriaBertani培养基(LB)和羧苄西林(100μg/ml)。培养物在20℃在200rpm振荡生长过夜。测定过夜培养物的OD600，并将培养物在含有30mlMagicMedia(Invitrogen)+羧苄西林(100μg/ml)的250ml振荡培养瓶中稀释至OD600～0.05。将培养物在30℃在200rpm振荡温育。当OD600达到～0.5-0.8时，加入400μM IPTG，并在30℃在200rpm振荡温育细胞另6个小时。以IPTG诱导后0、2、4和6小时，收集1ml的培养物等份试样，测定OD600，并按照如上的描述测定所生产的异戊二烯的量。结果显示于图8。
IV.在14升发酵中从BL21/ptrcKudzu生产异戊二烯
从补料分批培养物测定从含有重组野葛异戊二烯合酶基因的大肠杆菌中异戊二烯的大规模生产。对于每升发酵培养基，发酵培养基(TM2)的配方如下：K2HPO413.6g，KH2PO413.6g，MgSO4＊7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，(NH4)2SO43.2g，酵母提取物5g，1000X改良痕量金属溶液(Modified Trace Metal Solution)1ml。所有成分一起加入和溶于diH2O中。使用氢氧化钾(KOH)将pH调节至6.8并定容。以0.22μm的滤器无菌过滤最终产物(仅过滤，不高压灭菌)。1000X改良痕量金属溶液的配方如下：柠檬酸＊H2O 40g，MnSO4＊H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4＊7H2O 1g，CoCl2＊6H2O 1g，ZnSO＊7H2O 1g，CuSO4＊5H2O100mg，H3BO3100mg，NaMoO4＊2H2O 100mg。每个成分逐一溶于diH2O中，使用HCl/NaOH调节pH至3.0with，然后定容并以0.22μm的滤器无菌过滤。
在需要的发酵、pH 6.7和34℃的温度，在14升生物反应器中进行该实验以监测从葡萄糖形成的异戊二烯。在大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基中制备从冷冻瓶中取出的大肠杆菌菌株BL21/ptrcKudzu的接种物。接种物生长至OD550＝0.6之后，离心2个600ml的瓶并将内容物重悬于70ml上清液中以将细胞沉淀物(70ml OD 3.1的材料)转移至生物反应器。在接种后的多个时间点，取出样品并按照上文描述测定所生产的异戊二烯的量。结果显示于图9。
实施例2：在表达重组白杨异戊二烯合酶的大肠杆菌中生产异戊二烯
从GenBank获得白杨(银白杨x欧洲山杨)异戊二烯合酶的蛋白序列(CAC35696)(Schnitzler，J-P等人(2005)Planta 222：777-786)。从DNA2.0购买针对大肠杆菌进行了密码子优化的基因(p9796-poplar，图30和31；SEQ ID NO：14)。通过以限制性核酸内切酶BspLU11I/PstI消化从提供的质粒中切下异戊二烯合酶基因，进行凝胶纯化，并连接进入已经NcoI/PstI消化的pTrcHis2B。克隆构建体，使得插入片段中的终止密码子在PstI位点之前，这导致产生这样的构建体：其中His-标签不附着于异戊二烯合酶蛋白。通过测序来验证得到的质粒pTrcPoplar(图32和33；SEQ IDNO：15)。
实施例2B：证明数种白杨异戊二烯合酶的异戊二烯合酶活性
考察了下列异戊二烯合酶：银白杨(登记号BAD98243；图137A和B；SEQ ID NO：30)，欧洲黑杨(登记号CAL69918；图137C和D；SEQ IDNO：31)，美洲山杨(登记号AAQ16588；图137E，F和G；SEQ IDNOs：32-33)，毛果杨(登记号ACD70404；图137H和I；SEQ ID NO：34)，银白杨x欧洲山杨(登记号CAJ29303；图137J和K；SEQ ID NO：35)和MCM112-Kudzu。
按照如下描述构建pET24Kudzu(也称作MCM112)：将野葛异戊二烯合酶基因从pCR2.1载体(Invitrogen)亚克隆进入pET24d载体(Novagen)。使用引物MCM505’-GATCATGCAT TCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGTGTGCGACCTCTTC TCAATTTACT(SEQID NO：52)和MCM535’-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATAC ATCAGCTG(SEQ ID NO：50)从pTrcKudzu模板DNA扩增野葛IspS基因。使用Taq DNA聚合酶(Invitrogen)进行PCR反应，将得到的PCR产物克隆进入pCR2.1-TOPO TA克隆载体(Invitrogen)，并转化进入大肠杆菌Top10化学感受态细胞(Invitrogen)。将转化子铺板于含有羧苄西林(50μg/ml)的L-琼脂，并在37℃温育过夜。将单一转化子接种于包含50μg/ml羧苄西林的5ml Luria Broth培养基。通过测序分离自1ml液体培养物(Luria Broth)的质粒DNA就正确的插入片段筛选出5个菌落，并使用QIAprep旋转微量制备试剂盒(Qiagen)纯化。得到的质粒被称作MCM93，其包含在pCR2.1骨架中的野葛IspS编码序列(图137L)。MCM93的序列(SEQ ID NO：36)显示于图137M和N。
通过以PciI和BamH1(Roche)进行限制性核酸内切酶消化切下野葛编码序列，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)凝胶纯化。以NcoI和BamHI(Roche)消化pET24d载体DNA，以虾碱性磷酸酶(Roche)处理，并使用QIAprep旋转微量制备试剂盒(Qiagen)纯化。使用快速DNA连接试剂盒(Roche)，以片段∶载体＝5∶1的比例，将野葛IspS片段连接进入经NcoI/BamH1消化的pET24d，总体积为20μl。将连接混合物的一部分(5μl)转化进入大肠杆菌Top 10化学感受态细胞，并铺板于包含卡那霉素(50μg/ml)的L琼脂。通过测序确认正确的转化子并转化进入化学感受态BL21(λDE3)pLysS细胞(Novagen)。在37℃在包含卡那霉素(50μg/ml)的L琼脂过夜生长之后选择单一菌落。得到的质粒被称作pET24D-Kudzu，其图谱显示于图137O。pET24D-Kudzu的序列(SEQ IDNO：37)显示于图137P和Q。
从DNA2.0(Menlo Park，CA)购买美洲山杨、银白杨、欧洲黑杨、和毛果杨的针对大肠杆菌优化的异戊二烯合酶基因(克隆进入pET24a表达载体(Novagen)中)。合成除掉了叶绿体转运肽序列的基因，从而表达成熟的蛋白。
野葛异戊二烯合酶的构建体用作本实施例中的对照。将质粒转化进入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)plysS，并使转化子在0.6ml TM3培养基中生长。TM3培养基的配方如下：K2HPO4(13.6g/l)，KH2PO4(13.6g/l)，MgSO4＊7H2O(2g/L)，一水柠檬酸(2g/L)，柠檬酸铁铵(0.3g/L)，(NH4)2SO4(3.2g/L)，酵母提取物(0.2g/L)，1ml 1000x痕量元素溶液，使用氢氧化铵将pH调整至6.8，以无菌DIH2O定容，并以0.22μm的滤器无菌过滤。1000X痕量元素溶液的配方如下：柠檬酸＊H2O(40g/L)，MnSO4＊H2O(30g/L)，NaCl(10g/L)，FeSO4＊7H2O(1g/L)，CoCl2＊6H2O(1g/L)，ZnSO4＊7H2O(1g/L)，CuSO4＊5H2O(100mg/L)，H3BO3(100mg/L)，NaMoO4＊2H2O(100mg/L)。每个成分逐一溶解于DIH2O中，以HCl/NaOH将pH调整至3.0，定容，并以0.22μm的滤器无菌过滤。
以400uM IPTG诱导培养物并继续生长至OD600为大约5。将培养物的等份试样转移至深孔玻璃板，以铝质平板密封器将孔密封。将平板在25℃在450rpm振荡温育30分钟。通过将温度升高至70℃持续5分钟而使反应物热灭活。通过实施例1第II部分描述的GCMS法测定全部的细胞顶空。
从按照类似方式生长的培养物获得Km值，只不过收获细胞并通过冷冻/解冻溶菌酶程序裂解。将体积为400μL的培养物转移至新的96-孔平板(Perkin Elmer，C atalog No.6008290)，通过在Beckman Coulter Allegra6R离心机中在2500x g离心来收集细胞。将沉淀物重悬于200mL低渗缓冲液(5mM MgCL2，5mM Tris HCl，5mM DTT pH 8.0)，将平板在-80℃冷冻至少60分钟的时间。通过解冻平板制备细胞裂解物并加入32mL异戊二烯合酶DMAPP测定缓冲液(57mM Tris HCl，19mM MgCl2，74mg/mL DNase I(Sigma货号DN-25)、2.63x105U/mL ReadyLyse溶菌酶溶液(Epicentre货号R1802M)、和5mg/mL分子生物学级别的BSA。将平板在25℃振荡温育30分钟，然后置于冰上。将期望浓度的DMAPP和裂解物加入到如上所述的用于全部细胞顶空测定的密封的深孔玻璃块中。使反应进行1小时，通过如上所述的加热步骤终止反应，同样按照描述测定顶空活性。
在替代性方法中，从培养于25mL体积并按照上文描述进行类似诱导的细胞测定酶活性。通过离心收集细胞并在缓冲液中以弗氏压碎器裂解沉淀物，缓冲液由1∶1混合的50％甘油与20mM Tris/HCl pH 7.4、20mM MgCl2、200mM KCl、1mM DTT组成。在含有75uL测定缓冲液(66.6mM Tris/HCl pH 8，6.66mM DMAPP，43mM MgCl2)的2mL旋盖瓶中测定体积为25uL的裂解物的异戊二烯合酶活性。反应物在30℃温育15分钟，通过瓶的隔膜加入100uL 250mM EDTA以淬灭反应。通过实施例1第II部分描述的GC/MS测定异戊二烯。
用于测定活性的所有方法均显示：来自纯繁殖白杨的白杨酶类的活性比白杨[银白杨x欧洲山杨]高数倍。图138和139分别显示了全部细胞顶空测定和DMAPP测定的结果，令人惊奇地表明：来自欧洲黑杨、美洲山杨、毛果杨、和银白杨的酶都具有比杂交体[银白杨x欧洲山杨]显著更高的活性。
按照如下描述进行DMAPP测定：将体积为400μL的培养物转移至新的96-孔平板(Perkin Elmer，货号6008290)，通过在Beckman CoulterAllegra 6R离心机中在2500x g离心来收集细胞。将沉淀物重悬于200mL低渗缓冲液(5mM MgCL2，5mM Tris HCl，5mM DTT pH 8.0)，将平板在-80℃冷冻至少60分钟的时间。通过解冻平板制备细胞裂解物并加入32mL异戊二烯合酶DMAPP测定缓冲液(57mM Tris HCl，19mMMgCl2，74mg/mL DNase I(Sigma货号DN-25)、2.63x105U/mL ReadyLyse溶菌酶溶液(Epicentre货号R1802M)、和5mg/mL分子生物学级别的BSA。将平板在25℃振荡温育30分钟，然后置于冰上。对于异戊二烯产量，将80mL的裂解物等份试样转移至96孔深孔玻璃板(Zinsser货号3600600)，加入pH 8.2的100mM K2HPO4中的20mL 10mM DMAPP溶液(Cayman Chemical货号63180)。以铝质平板密封器(BeckmanCoultor货号538619)将平板密封，并在30℃振荡温育60分钟。通过加热玻璃块(70℃，5分钟)终止酶促反应。通过实施例1第II部分的描述定量分析每个孔的细胞顶空。
值得注意的是，银白杨、美洲山杨、毛果杨具有比来自野葛的更高的异戊二烯合酶活性。在所测的所有酶类中，来自银白杨的酶表达的活性最高。相对于整个细胞顶空测定，在细胞裂解物中观察到的更高的活性可能是由于DMAPP的限制，DMAPP是由细胞的内源性脱氧木酮糖5-磷酸(DXP)途径递送的这些酶的底物。
对于测定了数值的所有的酶，Km动力学参数测定为大约2-3mM。
实施例3：在表达重组野葛异戊二烯合酶的柠檬泛菌中生产异戊二烯
将实施例1中描述的pTrcKudzu和pCL-lac Kudzu质粒电穿孔进入柠檬泛菌(美国专利号7,241,587)。分别在含有羧苄西林(200μg/ml)或壮观霉素(50μg/ml)的LA上选择转化子。从摇瓶中生产异戊二烯并按照实施例1中针对表达重组野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌菌株的描述测定所生产的异戊二烯的量。结果显示于图10。
实施例4：在表达重组野葛异戊二烯合酶的枯草芽孢杆菌中生产异戊二烯
I.用于表达野葛异戊二烯合酶的枯草芽孢杆菌复制质粒的构建
在枯草芽孢杆菌aprEnprE Pxyl-comK菌株(BG3594comK)中使用aprE启动子控制下的复制质粒(具有氯霉素抗性盒的pBS19)表达野葛异戊二烯合酶。使用PCR单独扩增异戊二烯合酶、aprE启动子和转录终止子并使它们融合。然后将构建体克隆进入pBS19并转化进入枯草芽孢杆菌。
a)aprE启动子的扩增
使用下列引物从枯草芽孢杆菌的染色体DNA扩增aprE启动子
CF 797(+)起始aprE启动子MfeI
5’-GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC(SEQ IDNO：53)
CF 07-43(-)使aprE启动子融合至Kudzu ispS
5’-
ATTGAGAAGAGGTCGCACACACTCTTTACCCTCTCCTTTTA(SEQ ID NO：54)
b)异戊二烯合酶基因的扩增
从质粒pTrcKudzu(SEQ ID NO：2)扩增野葛异戊二烯合酶基因。该基因针对大肠杆菌进行密码子优化，由DNA2.0合成。使用下列引物：
CF 07-42(+)使aprE启动子融合至野葛异戊二烯合酶基因(GTG起始密码子)
5’-
TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT(SEQ ID NO：55)
CF 07-45(-)使野葛异戊二烯合酶基因的3’末端融合至终止子
5’-
CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC(SEQ ID NO：56)
c)转录终止子的扩增
使用下列引物从之前测过序的质粒pJHPms382扩增解淀粉芽孢杆菌的碱性丝氨酸蛋白酶的终止子：
CF 07-44(+)使野葛异戊二烯合酶基因的3’末端融合至终止子
5’-
GATTAACCAGCTGATGTATGTCTAAAAAAAACCGGCCTTGG(SEQ ID NO：57)
CF 07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子的末端(BamHI)
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ IDNO：58)
使用下列引物通过PCR使野葛片段融合至终止子片段：
CF 07-42(+)使aprE启动子融合至野葛异戊二烯合酶基因(GTG起始密码子)
5’-
TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT(SEQ ID NO：55)
CF 07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子的末端(BamHI)
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ IDNO：58)
使用下列引物通过PCR使野葛终止子片段融合至启动子片段：
CF 797(+)起始aprE启动子MfeI
5’-GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC(SEQ IDNO：53)
CF 07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子的末端(BamHI)
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQ IDNO：58)
使用Qiagen试剂盒纯化融合PCR片段并以限制性酶MfeI和BamHI消化。使用Qiagen试剂盒凝胶纯化该经消化的DNA片段并连接进入载体pBS19，所述载体已经过EcoRI和BamHI消化并进行了凝胶纯化。
将连接混合物转化进入大肠杆菌Top 10细胞，在LA+50羧苄西林平板上选择菌落。选择总共6个菌落，在LA+50羧苄西林中生长过夜，然后使用Qiagen试剂盒分离质粒。以EcoRI和BamHI消化质粒以检查插入片段，将三个正确的质粒送去测序，其中使用下列引物：
CF 149(+)aprE启动子的EcoRI起始
5’-GACATGAATTCCTCCATTTTCTTCTGC(SEQ ID NO：59)
CF 847(+)pXX 049中的序列(aprE启动子的末端)
5’-AGGAGAGGGTAAAGAGTGAG(SEQ ID NO：60)
CF 07-45(-)使野葛异戊二烯合酶基因的3’末端融合至终止子
5’-
CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC(SEQ ID NO：56)
CF 07-48(+)用于野葛异戊二烯合酶的测序引物
5’-CTTTTCCATCACCCACCTGAAG(SEQ ID NO：61)
CF 07-49(+)野葛异戊二烯合酶中的测序
5’-GGCGAAATGGTCCAACAACAAAATTATC(SEQ ID NO：62)
通过测序，被称作pBS Kudzu#2(图52和12；SEQ ID NO：5)的质粒是正确的，将其转化进入枯草芽孢杆菌宿主菌株BG 3594comK。在LA+5氯霉素平板上进行选择。选择转化子并在LA+5氯霉素上划线为单一菌落，然后在LA+5氯霉素中生长直至其达到1.5的OD600。将其在-80℃在存在甘油的瓶中冷冻储存。得到的菌株被称作CF 443。
II.在含有表达重组异戊二烯合酶的枯草芽孢杆菌细胞的摇瓶中生产异戊二烯
以来自LA+氯霉素(Cm，25μg/ml)的CF 443的单一菌落接种过夜培养物。培养物在37℃在LB+Cm中在200rpm振荡生长。这些过夜培养物(1ml)用于接种含有25ml Grants II培养基和终浓度为25μg/ml的氯霉素的250ml振荡培养瓶。Grants II培养基的配方是：10g大豆胨，3ml 1M K2HPO4，75g葡萄糖，3.6g脲，100ml10X MOPS，以水定容至1L，pH 7.2；10X MOPS的配方是：83.72g MOPS，7.17g tricine，12g KOH丸，10ml 0.276M K2SO4溶液，10ml 0.528M MgCl2溶液，29.22g NaCl，100ml100X微量营养素，以水定容至1L；100X微量营养素的配方是：1.47g CaCl2＊2H2O，0.4g FeSO4＊7H20，0.1g MnSO4＊H20，0.1g ZnSO4＊H2O，0.05g CuCl2＊2H2O，0.1g CoCl2＊6H2O，0.1gNa2MoO4＊2H2O，以水定容至1L。将摇瓶在37℃温育，在第18、24、和44小时取出样品。在第18小时，对CF443和对照菌株的顶空取样。这代表18小时的异戊二烯累积。通过如实施例1描述的气相色谱测定异戊二烯的量。通过表达重组异戊二烯合酶显著增加了异戊二烯的产量(图11)。
III.在14L的发酵中通过CF443生产异戊二烯
从补料分批培养物中测定由含有在复制质粒上的重组野葛异戊二烯合酶基因的枯草芽孢杆菌大规模生产的异戊二烯。在含有大豆粉(Cargill)、磷酸钠和钾、硫酸镁和柠檬酸的溶液、氯化铁和氯化锰的营养培养基中，通过常规补料分批发酵方式培养表达野葛异戊二烯合酶基因的芽孢杆菌菌株CF 443或不表达野葛异戊二烯合酶基因的对照菌株。在发酵之前，使用酶的混合物(包括纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶)将培养基浸软90分钟(见WO95/04134)。向14L分批发酵器中进料60％wt/wt葡萄糖(Cargill DE99右旋糖，ADM Versadex greens或Danisco转化糖)和99％wt/wt油(西方家用豆油，其中99％wt/wt是加入到细胞培养基之前油的浓度)。当批次中的葡萄糖不可检出时，开始进料。进料速率经数小时渐变，调整以相同的碳要素添加油。使用28％w/v氢氧化铵将pH控制在6.8-7.4。如果起泡沫，则向培养基中加入防沫剂。将发酵温度控制在37℃，以750rpm搅拌发酵培养物。在整个过程中监测多个其它参数，例如pH、DO％、气流、和压力。将DO％维持在20以上。经36小时的时间过程取样并分析细胞生长(OD550)和异戊二烯的生产。这些实验的结果显示于图53A和53B。
IV.野葛异戊二烯合酶(ispS)整合进入枯草芽孢杆菌
将野葛异戊二烯合酶基因克隆进入整合质粒(pJH101-cmpR)，处于aprE启动子的控制下。在所测的条件下，没有检测到异戊二烯。
实施例5：在木霉中生产异戊二烯
I.用于在里氏木霉中表达野葛异戊二烯合酶的载体的构建
由DNA 2.0合成解脂耶氏酵母密码子优化的野葛IS基因(SEQ IDNO：6)(图13)。该质粒作为下列PCR扩增反应的模板：1μl质粒模板(20ng/ul)，1μl引物EL-945(10uM)5’-GCTTATGGATCCTCTAGACTATTACACGTACATCAATTGG(SEQID NO：63)，1μl引物EL-965(10uM)5’-CACCATGTGTGCAACCTCCTCCCAGTTTAC(SEQ ID NO：64)，1μl dNTP(10mM)，5μl 10x PfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶缓冲液，1μl PfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶，40μl水，总反应体积为50μl。正向引物在5’末端包含不对应于解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的另外4个核苷酸，但是这4个核苷酸对于克隆进入pENTR/D-TOPO载体是必需的。反向引物在5’末端包含不对应于解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的另外21个核苷酸，但插入这21个核苷酸以克隆进入其它载体骨架。使用MJ Research PTC-200热循环仪，按照如下进行PCR反应：95℃，2分钟(仅第一个循环)；“95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，30秒”(重复27个循环)；最后一个循环后72℃，1分钟。在1.2％E-凝胶上分析PCR产物以确认成功扩增了解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因。
然后根据生产商的说明书，使用TOPO pENTR/D-TOPO克隆试剂盒克隆PCR产物：1μl PCR反应物，1μl盐溶液，1μl TOPOpENTR/D-TOPO载体和3μl水，总反应体积是6μl。将反应物在室温温育5分钟。将1μl TOPO反应物转化进入TOP10化学感受态大肠杆菌细胞。在LA+50μg/ml卡那霉素平板上选择转化子。挑取数个菌落，每个接种于含有LB+50μg/ml卡那霉素的5ml管中，使培养物在37℃在200rpm振荡生长过夜。根据生产商的说明书，使用QIAprep旋转微量制备试剂盒从过夜培养物分离质粒。对数个质粒进行测序以验证DNA序列是正确的。
编码解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的单一pENTR/D-TOPO质粒用于Gateway克隆进入订制的pTrex3g载体。pTrex3g的构建描述于WO 2005/001036A2根据生产商关于GatewayLR Clonase II Enzyme Mix试剂盒(Invitrogen)的说明书进行反应：1μl解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因pENTR/D-TOPO供体载体，1μl pTrex3g目的载体，6μl TE缓冲液，pH 8.0，总反应物体积为8μl。将反应物在室温温育1小时，然后加入1μl蛋白酶K溶液，在37℃继续温育10分钟。然后将1μl反应物转化进入TOP10化学感受态大肠杆菌细胞。在LA+50μg/ml羧苄西林平板上选择转化子。挑取数个菌落，每个接种于含有LB+50μg/ml羧苄西林的5ml管中，使培养物在37℃在200rpm振荡生长过夜。根据生产商的说明书，使用QIAprep旋转微量制备试剂盒(Qiagen，Inc.)从过夜培养物管中分离质粒。对数个质粒进行测序以验证DNA序列是正确的。
使用Biolistic PDS-1000/HE颗粒递送系统(见WO 2005/001036A2)进行解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶pTrex3g质粒(图14)向quad缺失里氏木霉菌株的生物弹转化。使用专利公开WO 2005/001036A2的实施例11所列的程序进行稳定转化子的分离和摇瓶评价。
II.在重组里氏木霉菌株中生产异戊二烯
将如上描述的异戊二烯合酶转化子的1ml的15和36小时的培养物转移至顶空瓶中。将瓶密封并在30℃温育5小时。通过实施例1描述的方法测定顶空气体并鉴定异戊二烯。转化子中有2个显示出痕量的异戊二烯。通过14小时的温育可以增加异戊二烯的量。对于14小时的温育，两个阳性样品显示出大约0.5μg/L的异戊二烯水平。未经转化的对照未显示出可检出水平的异戊二烯。该实验证明：当提供外源异戊二烯合酶时，里氏木霉能够从内源前体生产异戊二烯。
实施例6：在耶氏酵母中生产异戊二烯
I.用于在解脂耶氏酵母中表达野葛异戊二烯合酶的载体的构建
用于在解脂耶氏酵母中表达野葛异戊二烯合酶基因的载体的构建起始点是载体pSPZ1(MAP29Spb)。该载体的完整序列(SEQ ID NO：7)显示于图15。
使用解脂耶氏酵母菌株GICC 120285的染色体DNA作为模板通过PCR扩增以下片段：URA3基因的无启动子形式，18S核糖体RNA基因的片段解脂耶氏酵母XPR2基因的转录终止子，以及包含XPR2和ICL1基因的启动子的两个DNA片段。使用以下PCR引物：
ICL13
5’-
GGTGAATTCAGTCTACTGGGGATTCCCAAATCTATATATACTGCAGGTGAC(SEQ ID NO：65)
ICL15
5’-GCAGGTGGGAAACTATGCACTCC(SEQ ID NO：66)
XPR3
5’-CCTGAATTCTGTTGGATTGGAGGATTGGATAGTGGG(SEQ ID NO：67)
XPR5
5’-GGTGTCGACGTACGGTCGAGCTTATTGACC(SEQ IDNO：68)
XPRT3
5’-GGTGGGCCCGCATTTTGCCACCTACAAGCCAG(SEQ IDNO：69)
XPRT5
5’-
GGTGAATTCTAGAGGATCCCAACGCTGTTGCCTACAACGG(SEQID NO：70)
Y18S3
5’-GGTGCGGCCGCTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCG(SEQ ID NO：71)
Y18S5
5’-GGTGGGCCCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAG(SEQ ID NO：72)
YURA3
5’-GGTGACCAGCAAGTCCATGGGTGGTTTGATCATGG(SEQID NO：73)
YURA50
5’-GGTGCGGCCGCCTTTGGAGTACGACTCCAACTATG(SEQID NO：74)
YURA51
5’-GCGGCCGCAGACTAAATTTATTTCAGTCTCC(SEQ IDNO：75)
对于PCR扩增，根据生产商的说明书，使用PfuUltraII聚合酶(Stratagene)、生产商提供的缓冲液和dNTP、2.5μM的引物和指明的模板DNA。使用下列循环进行扩增：95℃，1分钟；34x(95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，3分钟)，和在72℃，10分钟，然后在4℃温育。
从DNA 2.0获得编码针对在耶氏酵母中表达进行了密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的合成的DNA分子(图16；SEQ ID NO：8)。在图18中显示了分别携带在XPR2和ICL1启动子控制下的合成的野葛异戊二烯合酶基因的质粒pYLA(KZ1)和pYLI(KZ1)的完整详细的构建示意图。还构建了对照质粒，其中插入了交配因子基因(MAP29)以替代异戊二烯合酶基因(图18E和18F)。
类似的克隆程序可用于表达白杨(银白杨x欧洲山杨)异戊二烯合酶基因。白杨异戊二烯的序列描述于Miller B等人(2001)Planta 213，483-487并显示于图17(SEQ ID NO：9)。在图18A和B中显示了产生分别携带在XPR2和ICL1启动子控制下的合成的白杨异戊二烯合酶基因的质粒pYLA(POP1)和pYLI(POP1)的构建示意图。
II.通过解脂耶氏酵母的重组菌株生产异戊二烯
使用SacII消化载体pYLA(KZ1)、pYLI(KZ1)、pYLA(MAP29)和pYLI(MAP29)并通过标准的醋酸锂/聚乙二醇程序转化解脂耶氏酵母菌株CLIB 122至尿苷原养型。简而言之，酵母细胞在YEPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)中生长过夜，通过离心(4000rpm，10分钟)收集，以无菌水洗涤一次并悬于pH 6.0的0.1M醋酸锂中。将200μl的细胞悬浮液等份与线性化的质粒DNA溶液(10-20μg)混合，在室温温育10分钟，在相同的缓冲液中与1ml 50％PEG 4000的混合。将悬浮液在室温再温育1小时，然后在42℃热击2分钟。然后将细胞铺板于SC hisleu平板(0.67％酵母氮源，2％葡萄糖，各100mg/L的亮氨酸和组氨酸)。在30℃温育3-4天后出现转化子。
使来自pYLA(KZ1)转化的3个分离体，来自pYLI(KZ1)转化的3个分离体，来自pYLA(MAP29)转化的2个分离体和来自pYLI(MAP29)转化的2个分离体在YEP7培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，pH 7.0)中在30℃振荡生长24小时。通过离心从10ml的培养物收集细胞，重悬于3ml的新鲜YEP7中并置于15ml旋盖瓶中。将瓶在室温温育过夜，轻微(60rpm)振荡。使用如实施例1描述的质谱检测器通过气相色谱分析这些瓶的顶空中的异戊二烯含量。以pYLA(KZ1)和pYLI(KZ1)获得的所有转化子都生产容易检出的量的异戊二烯(0.5μg/L至1μg/L，图20)。在携带肌醇六磷酸酶基因而非异戊二烯合酶基因的对照菌株的顶空中未检出异戊二烯。
实施例7：在表达野葛异戊二烯合酶和idi、或dxs、或idi和dxs的大肠杆菌中生产异戊二烯
I.构建用于在大肠杆菌中生产异戊二烯的编码野葛异戊二烯合酶和idi、或dxs、或idi和dxs的载体
i)pTrcKudzuKan的构建
将pTrcKudzu(如实施例1所描述)的bla基因替换为赋予卡那霉素抗性的基因。为了除掉bla基因，以BspHI消化pTrcKudzu，以虾碱性磷酸酶(SAP)处理，在65℃热杀灭，然后以Klenow片段和dNTP进行末端填充。从琼脂糖凝胶纯化5kbp大的片段，并连接至kanr基因，所述kanr基因是使用引物MCM22 5’-GATCAAGCTTAACCGGAATTGCCAGCTG(SEQ ID NO：76)和MCM23 5’-GATCCGATCGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC(SEQ ID NO：77)从pCR-Blunt-II-TOPO通过PCR扩增而来的；以HindIII和PvuI消化，并进行末端填充。在含有50μg/ml卡那霉素的LA上选择携带赋予卡那霉素抗性的质粒(pTrcKudzuKan)的转化子。
ii)pTrcKudzu yIDI Kan的构建
以PstI消化pTrcKudzuKan，以SAP处理，热杀灭，并进行凝胶纯化。将其连接至编码具有合成的RBS的来自酿酒酵母的idi的PCR产物。用于PCR的引物是NsiI-YIDI 1F 5’-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC(SEQ IDNO：78)和PstI-YIDI 1R 5’-CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC(SEQ ID NO：79)；模板是酿酒酵母基因组DNA。以NsiI和PstI消化PCR产物，并进行凝胶纯化，然后连接。将连接混合物转化进入化学感受态TOP10细胞并在含有50μg/ml卡那霉素的LA上选择。分离了数个转化子并测序得到的质粒被称作pTrcKudzu-yIDI(kan)(图34和35；SEQ IDNO：16)。
iii)pTrcKudzu DXS Kan的构建
以PstI消化质粒pTrcKudzuKan，以SAP处理，热杀灭，并进行凝胶纯化。将其连接至编码具有合成的RBS的来自大肠杆菌的dxs的PCR产物。用于PCR的引物是：MCM135’-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG(SEQ ID NO：80)和MCM14 5’-CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT(SEQ ID NO：81)；模板是大肠杆菌基因组DNA。以NsiI和PstI消化PCR产物，并进行凝胶纯化，然后连接。将得到的转化反应物转化进入TOP10细胞并在含有50μg/ml卡那霉素的LA上选择。分离了数个转化子并测序，得到的质粒被称作pTrcKudzu-DXS(kan)(图36和37；SEQ ID NO：17)。
iv)pTrcKudzu-yIDI-dxs(kan)的构建
以PstI消化pTrcKudzu-yIDI(kan)，以SAP处理，热杀灭，并进行凝胶纯化。将其连接至编码具有合成的RBS的来自大肠杆菌的dxs的PCR产物(引物：MCM135’-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG(SEQ ID NO：80)和MCM14 5’-CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT(SEQ ID NO：81)；模板TOP10细胞)，所述PCR产物经过NsiI和PstI消化和凝胶纯化。最终的质粒被称作pTrcKudzu-yIDI-dxs(kan)(图21和22；SEQ IDNO：10)。
v)pCL PtrcKudzu的构建
使用SspI从pTrcKudzu消化包含来自实施例1的启动子、结构基因和终止子的DNA片段，并进行凝胶纯化。将其连接至经过PvuII消化、SAP处理和热杀灭的pCL1920。将得到的连接混合物转化进入TOP10细胞并在含有50μg/ml壮观霉素的LA中选择。分离了数个克隆并测序，选择了两个。pCL PtrcKudzu和pCL PtrcKudzu(A3)具有方向相反的插入片段(图38-41；SEQ ID NOs：18-19)。
vi)pCL PtrcKudzu yIDI的构建
将来自上述(ii)的NsiI-PstI消化的、凝胶纯化的IDI PCR扩增子连接进入已经过PstI消化、SAP处理、和热杀灭的pCL PtrcKudzu。将连接混合物转化进入TOP10细胞并在含有50μg/ml壮观霉素的LA中选择。分离了数个克隆并测序，得到的质粒被称作pCL PtrcKudzu yIDI(图42和43；SEQ ID NO：20)。
vii)pCL PtrcKudzu DXS的构建
将来自上述(iii)的NsiI-PstI消化的、凝胶纯化的DXS PCR扩增子连接进入已经过PstI消化、SAP处理、和热杀灭的pCL PtrcKudzu(A3)。将连接混合物转化进入TOP10细胞并在含有50μg/ml壮观霉素的LA中选择。分离了数个克隆并测序，得到的质粒被称作pCL PtrcKudzuDXS(图44和45；SEQ ID NO：21)。
II.以不同拷贝数表达野葛异戊二烯合酶、idi、和/或dxs的培养物的顶空中的异戊二烯的测定
之前经过质粒pTrcKudzu(kan)(A)、pTrcKudzu-yIDI kan(B)、pTrcKudzu-DXS kan(C)、pTrcKudzu-yIDI-DXS kan(D)转化的大肠杆菌BL21(λDE3)的培养物生长于含有50μg/mL卡那霉素的LB中。pCLPtrcKudzu(E)、pCL PtrcKudzu、pCL PtrcKudzu-yIDI(F)和pCLPtrcKudzu-DXS(G)生长于含50μg/mL壮观霉素的LB中。在时间0点(OD600是大约0.5)以400μM IPTG诱导培养物，取出样品以进行顶空异戊二烯测定(见实施例1)。结果显示于图23A-23G。
通过转化将质粒pTrcKudzu-yIDI-dxs(kan)导入大肠杆菌菌株BL21。得到的菌株BL21/pTrc Kudzu IDI DXS在20℃在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB中过夜生长，并用于接种摇瓶中的含有1％葡萄糖的TM3(13.6g K2PO4，13.6g KH2PO4，2.0g MgSO4＊7H2O，2.0g一水柠檬酸，0.3g柠檬酸铁铵，3.2g(NH4)2SO4，0.2g酵母提取物，1.0ml1000x改良痕量金属溶液，调节至pH 6.8并以水定容，无菌过滤)。将培养瓶在30℃温育直至达到OD600为0.8，然后以400μM IPTG诱导。在诱导后的不同时间取出样品并按照实施例1的描述测定顶空中的异戊二烯的量。结果显示于图23H。
III.在大肠杆菌/pTrcKudzu yIDI DXS中从生物质生产异戊二烯
测定了菌株BL21pTrcKudzuIDIDXS从三种类型的生物质：甘蔗渣、玉米秸秆和软木浆生产异戊二烯的能力，葡萄糖作为对照。通过酶促水解制备生物质的水解物(Brown，L和Torget，R.，1996，NREL标准测定法Lap-009“Enzymatic Saccharification of Lignocellulosic Biomass”)，以基于葡萄糖当量的稀释度使用。在本例中，葡萄糖当量等于1％的葡萄糖。来自BL21(DE3)pTrcKudzu yIDI DXS(kan)的新鲜转化的细胞的平板的单一菌落用于接种5ml LB+卡那霉素(50μg/ml)。培养物在25℃振荡温育过夜。次日，在25ml TM3+0.2％YE+1％原料中，将过夜培养物稀释至OD600＝0.05。原料是玉米秸秆、甘蔗渣、或软木浆。葡萄糖用作阳性对照，无葡萄糖的状况用作阴性对照。培养物在30℃在180rpm振荡温育。监测培养物的OD600，当其达到OD600＝～0.8时，按照实施例1的描述分析1小时和3小时之时培养物的异戊二烯生产。不诱导培养物。所有的包含添加的原料的培养物生产与葡萄糖阳性对照相等的异戊二烯。实验按照一式两份进行，显示于图46。
IV.在大肠杆菌/pTrcKudzuIDIDXS中从转化糖生产异戊二烯
来自BL21(λDE3)/pTrcKudzu yIDI DXS(kan)的新鲜转化的细胞的平板的单一菌落用于接种5mL LB+卡那霉素(50μg/ml)。培养物在25℃振荡温育过夜。次日，在25ml TM3+0.2％YE+1％原料中，将过夜培养物稀释至OD600＝0.05。原料是葡萄糖、转化糖或玉米秸秆。通过酶促处理蔗糖糖浆制备转化糖原料(Danisco转化糖)。按照下文的描述(第V部分)制备AFEX玉米秸秆。细胞在30℃生长，当培养物达到OD600为～0.8-1.0时(0小时)，测定第一个样品。按照实施例1的描述，在0、1和3小时分析培养物的生长(如通过OD600所测定)和异戊二烯的生产。结果显示于图47。
V.从AFEX预处理的玉米秸秆制备水解物
从Michigan Biotechnology Institute获得AFEX预处理的玉米秸秆。预处理条件是：60％的水分，1∶1的氨载量，在90℃持续30分钟，然后气干。AFEX预处理的玉米秸秆中的水分含量是21.27％。AFEX预处理的玉米秸秆中的葡聚糖和木聚糖的含量分别是31.7％和19.1％(干重)。糖化过程如下：将20g AFEX预处理的玉米秸秆加入到500ml培养瓶中，瓶中含有5ml1M柠檬酸钠缓冲液pH 4.8、2.25ml Accellerase 1000、0.1ml Grindamyl H121(来自面包制作工业的黑曲霉的Danisco木聚糖酶产物)、和72.65ml DI水。将培养瓶置于定轨振荡器上并在50℃温育96小时。从振荡器中取出1个样品并使用HPLC分析。水解物含有38.5g/l葡萄糖、21.8g/l木糖、和10.3g/l葡萄糖和/或木糖的低聚物。
VI.酵母提取物对于生长于补料分批培养物中的大肠杆菌生产异戊二烯的效应
按照之前的描述，使用含有如上所述的pTrcKudzu yIDI DXS质粒的大肠杆菌细胞以14升的规模进行发酵。以指数速率进料酵母提取物(Bio Springer，Montreal，Quebec，Canada)。在40小时的发酵过程中，输送进入发酵器的酵母提取物的总量是70-830g。在550nm的波长下测定发酵液的光密度。发酵器内的最终的光密度与加入的酵母提取物的量成比例(图48A)。按照之前的描述测定来自发酵器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程而增大(图48B)。所生产的异戊二烯的量与进料的酵母提取物的量成线性比例(图48C)。
VII.在pTrcKudzu DXS yIDI的500L发酵中生产异戊二烯
含有野葛异戊二烯合酶、酿酒酵母IDI、和大肠杆菌DXS核酸的大肠杆菌细胞(大肠杆菌BL21(λDE3)pTrc Kudzu dxs yidi)的500升发酵用于生产异戊二烯。经15小时的时间段，异戊二烯的水平介于50至300μg/L。基于平均异戊二烯浓度、流经设备的平均流和异戊二烯突破程度，经计算，所收集的异戊二烯的量是大约17g。
VIII.生长于补料分批培养物中的大肠杆菌的500L发酵生产的异戊二烯
培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO47.5g，MgSO4＊7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分同时加入并溶解于diH2O中。该溶液经高压灭菌。以氨气(NH3)将pH调节至7.0，并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺＊HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：
柠檬酸＊H2O 40g，MnSO4＊H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4＊7H2O 1g，CoCl2＊6H2O 1g，ZnSO＊7H2O 1g，CuSO4＊5H2O 100mg，H3BO3100mg，NaMoO4＊2H2O 100mg。每种成分逐一溶解于DIH2O中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，并以0.22μm的滤器无菌过滤。
在500L的生物反应器中以含有pTrcKudzu yIDI DXS质粒的大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃时从葡萄糖和酵母提取物形成的异戊二烯。在大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基中制备从冷冻瓶中取出的大肠杆菌菌株的接种物。接种物生长至OD 0.15(在550nm测定)后，使用20ml接种含有2.5L大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基的生物反应器。在该生物反应器中在30℃生长至OD1.0，将2.0L转移至500L的生物反应器。
以指数速率进料酵母提取物(Bio Springer，Montreal，Quebec，Canada)和葡萄糖。在50小时的发酵过程中输送进入生物反应器的葡萄糖和酵母提取物的总量分别是181.2kg和17.6kg。生物反应器中的光密度随时间的变化显示于图49A。按照之前的描述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程而增加(图49B)。在50小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是55.1g，生产的时间进程显示于图49C。
实施例8：在表达野葛异戊二烯合酶和重组甲羟戊酸途径基因的大肠杆菌中生产异戊二烯。
I.克隆下部MVA途径
用于克隆下部甲羟戊酸途径的策略如下。通过PCR从酿酒酵母染色体DNA扩增甲羟戊酸生物合成途径的4个基因：甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)和异戊烯二磷酸异构酶的基因，并各自克隆进入pCR BluntII TOPO质粒(Invitrogen)。在一些情况下，从大肠杆菌染色体DNA扩增idi基因。将引物设计为使得大肠杆菌共有RBS(AGGAGGT(SEQ ID NO：82)或AAGGAGG(SEQID NO：83))被插入至5’末端，在起始密码子的上游8bp处，并且在3’末端添加PstI位点。然后将基因逐个克隆进入pTrcHis2B载体，直至组装整个途径。
来自酿酒酵母S288C的染色体DNA获自ATCC(ATCC 204508D)。根据生产商的说明书，使用PfuTurbo，使用引物MVKF(5’-AGGAGGTAAAAAAACATGTCATTACCGTTCTTAACTTCTGC，SEQ ID NO：84)和MVK-Pst1-R(5’-ATGGCTGCAGGCCTATCGCAAATTAGCTTATGAAGTCCATGGTAAATTCGTG，SEQ ID NO：85)从酿酒酵母的染色体扩增MVK基因。通过在1.2％E-凝胶(Invitrogen)上的电泳鉴定正确大小的PCR产物(1370bp)，并克隆进入pZeroBLUNT TOPO。得到的质粒被称作pMVK1。以SacI和Taq1限制性核酸内切酶消化质粒pMVK1，将片段凝胶纯化并连接进入经SacI和BstBI消化的pTrcHis2B。得到的质粒被称作pTrcMVK1。
使用下列引物通过PCR扩增甲羟戊酸生物合成途径的第二个基因PMK：PstI-PMK1R(5’-GAATTCGCCCTTCTGCAGCTACC，SEQ IDNO：86)和BsiHKA I-PMK1 F(5’-CGACTGGTGCACCCTTAAGGAGGAAAAAAACATGTCAG，SEQ ID NO：87)。根据生产商的说明书使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)进行PCR反应。以PstI和BsiHKI消化正确大小的产物(1387bp)，并连接进入经PstI消化的pTrcMVK1。得到的质粒被称作pTrcKK。按照相同的方式克隆MVD和idi基因。使用引物对PstI-MVD 1R(5’-GTGCTGGAATTCGCCCTTCTGCAGC，SEQ ID NO：88)和NsiI-MVD 1F(5’-GTAGATGCATGCAGAATTCGCCCTTAAGGAGG，SEQ ID NO：89)进行PCR以扩增MVD基因，使用引物对PstI-YIDI 1R(5’-CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC，SEQ ID NO：79)和NsiI-YIDI 1 F(5’-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC，SEQID NO：78)进行PCR以扩增yIDI基因。在一些情况下，使用IPP异构酶基因，来自大肠杆菌的idi。为了从大肠杆菌染色体DNA扩增idi，使用下列引物组：PstI-CIDI 1R(5’-GTGTGATGGATATCTGCAGAATTCG，SEQ ID NO：90)和NsiI-CIDI 1 F(5’-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATG，SEQ IDNO：91)。模板DNA是通过标准方法从大肠杆菌FM5分离的染色体DNA(WO 96/35796和WO 2004/033646，其各自通过引用方式全文并入本文，尤其是关于核酸分离的内容)。最终的质粒被称作pKKDIy，其是编码酵母idi基因的构建体；或称作pKKDIc，其是编码大肠杆菌idi基因的构建体。将质粒转化进入大肠杆菌宿主BL21以进行随后的分析。在一些情况下，将来自野葛的异戊二烯合酶克隆进入pKKDIy，生产质粒pKKDIyIS 。
还将下部MVA途径克隆进入含有卡那霉素抗生素抗性标志物的pTrc。以限制性核酸内切酶ApaI和PstI消化质粒pTrcKKDIy，在1.2％的琼脂糖E-凝胶上分离5930bp的片段，并根据生产商的说明书，使用Qiagen凝胶纯化试剂盒纯化。以限制性核酸内切酶ApaI和PstI消化实施例7中描述的质粒pTrcKudzuKan，使用Qiagen凝胶纯化试剂盒从1.2％的E-凝胶上纯化包含载体的3338bp的片段。使用Roche快速连接试剂盒连接3338bp载体片段和5930bp下部MVA途径片段。将连接混合物转化进入大肠杆菌TOP10细胞，转化子在37生长过夜并在含有卡那霉素(50μg/ml)的LA上选择。通过限制性酶消化验证转化子，将一个冷冻作为贮液。该质粒被称作pTrcKanKKDIy。
II.将野葛异戊二烯合酶基因克隆进入pTrcKanKKDIy
通过PCR从实施例1中描述的pTrcKudzu扩增野葛异戊二烯合酶基因，使用引物MCM505’-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTTACT(SEQ ID NO：92)和MCM535’-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG (SEQ IDNO：50)。将得到的PCR片段克隆进入pCR2.1并转化进入大肠杆菌TOP10。该片段含有野葛异戊二烯合酶的编码序列和含有来自大肠杆菌的RBS的上游区。转化子在37℃过夜温育并在含有羧苄西林(50μg/ml)的LA上选择。通过测序验证片段的正确插入，该菌株被称作MCM93。
以限制性核酸内切酶NsiI和PstI消化来自菌株MCM93的质粒，以释放含有RBS和野葛异戊二烯合酶的1724bp的插入片段。在1.2％的琼脂糖E-凝胶上分离1724bp片段，并根据生产商的说明书使用Qiagen凝胶纯化试剂盒纯化。以限制性核酸内切酶PstI消化质粒pTrcKanKKDIy，以SAP在37℃处理30分钟，并使用Qiagen PCR清除试剂盒纯化。使用Roche快速连接试剂盒连接质粒和编码野葛异戊二烯合酶的DNA片段。将连接混合物转化进入大肠杆菌TOP10细胞，转化子在37生长过夜并在含有50μg/ml卡那霉素的LA上选择。通过限制性消化验证正确的转化子，该质粒被称作pTrcKKDyIkISKan(图24和25；SEQ IDNO：11)。将该质粒转化进入BL21(λDE3)细胞(Invitrogen)。
III.在表达重组下部甲羟戊酸途径和来自野葛的异戊二烯合酶的大肠杆菌中从甲羟戊酸生产异戊二烯
在调节至pH 7.1并补充了0.5％葡萄糖和0.5％甲羟戊酸的MOPS培养基(Neidhardt等人，(1974)J.Bacteriology 119：736-747)中培养菌株BL21/pTrcKKDyIkISKan。还使用相同的条件建立了对照培养物，只不过不加入0.5％甲羟戊酸。培养物起始于过夜种子培养物，以1％接种并在培养物达到OD600为0.3至0.5时以500μM IPTG诱导。培养物在30℃以250rpm振荡培养。在诱导后3个小时，使用实施例1中描述的顶空测定法分析异戊二烯的生产。异戊二烯的最大产量是6.67x10-4mol/L培 养液/OD600/hr，其中L培养液是培养液的体积，并且包括细胞培养基的体积和细胞的体积。未补充甲羟戊酸的对照培养物不产生可测量的异戊二烯。
IV.克隆上部MVA途径
从粪肠球菌克隆上部甲羟戊酸生物合成途径，其包含编码三种酶活性的两个基因。mvaE基因编码具有乙酰基-辅酶A乙酰转移酶和3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)还原酶(该途径中的第一个和第三个蛋白)的酶活性的蛋白，mvaS基因编码该途径中的第二个酶HMG-辅酶A合酶。使用下列引物从粪肠球菌基因组DNA(ATCC 700802D-5)扩增具有位于其前面的大肠杆菌核糖体结合位点和间隔子的mvaE基因：
CF 07-60(+)mvaE w/RBS的起始点+ATG起始密码子SacI
5’-
GAGACATGAGC TCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG(SEQ ID NO：93)
CF 07-62(-)将mvaE融合至mvaS，它们中间是RBS
5’-
TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATTGTTTTCTTAAATC(SEQ ID NO：94)
使用下列引物从粪肠球菌基因组DNA(ATCC 700802D-5)克隆具有位于其前面的来自大肠杆菌的RBS和间隔子的mvaS基因：
CF 07-61(+)将mvaE融合至mvaS，它们中间是RBS
5’-
GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAA(SEQ ID NO：95)
CF 07-102(-)mvaS基因的末端BglII
5’
-GACATGACATAGATCTTTAGTTTC GATAAGAAC GAAC GGT(SEQID NO：96)
使用下列引物通过PCR将PCR片段融合在一起：
CF 07-60(+)mvaE w/RBS的起始点+ATG起始密码子SacI
5’
-GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG(SEQ ID NO：93)
CF 07-102(-)mvaS基因的末端BglII
5’-GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQ IDNO：96)
使用Qiagen试剂盒纯化融合PCR片段并以限制性酶SacI和BglII消化。使用Qiagen试剂盒对该消化的DNA片段进行凝胶纯化并连接进入已经SacI和BglII消化和凝胶纯化的商售载体pTrcHis2A。
将连接混合物转化进入大肠杆菌Top 10细胞，在LA+50μg/ml羧苄西林平板上选择菌落。总共选择了6个菌落，在LB+50μg/ml羧苄西林中生长过夜，并使用Qiagen试剂盒分离质粒。以SacI和BglII消化质粒以检查插入片段，使用下列引物对一个正确质粒进行测序：
CF 07-58(+)mvaE基因的起始点
5’-ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC(SEQ ID NO：97)
CF 07-59(-)mvaE基因的末端
5’-ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC (SEQ IDNO：98)
CF 07-82(+)mvaS基因的起始点
5’-ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG(SEQ ID NO：99)
CF 07-83(-)mvaS基因的末端
5’-TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQ ID NO：100)
CF 07-86(+)mvaE中的序列
5’-GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC(SEQ ID NO：101)
CF 07-87(+)mvaE中的序列
5’-TTGCCAATCATATGATTGAAAATC(SEQ ID NO：102)
CF 07-88(+)mvaE中的序列
5’-GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG(SEQ ID NO：103)
CF 07-89(+)序列mvaS
5’-GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC(SEQ ID NO：104)
通过测序证明被称作pTrcHis2AUpperPathway#1的质粒是正确的，并转化进入商售大肠杆菌菌株BL21。在LA+50μg/ml羧苄西林上进行选择。选择了两个转化子并在LB+50μg/ml羧苄西林中生长直至它们达到OD600为1.5。将两个菌株在-80℃在存在甘油的情况下冷冻于瓶中。BL21分离体#1中的pTrcHis2AUpperPathway#1的菌株被称作CF449，BL21分离体#2中的pTrcHis2AUpperPathway#1的菌株被称作CF 450。当分析时，发现两个克隆的行为是相同的。
V.将上部MVA途径克隆进入pCL1920
以限制性核酸内切酶消化质粒pTrcHis2AUpperPathway以释放包含pTrc-mvaE-mvaS-(His标签)-终止子的片段。在该片段中，his-标签不被翻译。使用Qiagen凝胶纯化试剂盒从1.2％的E-凝胶纯化该平末端化的4.5kbp的片段。通过以限制性核酸内切酶PvuII消化载体、以SAP处理并使用Qiagen凝胶纯化试剂盒从1.2％的E-凝胶进行凝胶纯化而从pCL1920制备去磷酸化的平末端化的4.2kbp的片段。使用Roche快速连接试剂盒连接这两个片段并转化进入TOP10化学感受态细胞。在含有壮观霉素(50μg/ml)的LA上选择转化子。通过PCR就插入片段的存在进行筛选，从而鉴定正确的菌落。该质粒被称作pCL PtrcUpperPathway(图26和27A-27D；SEQ ID NO：12)。
VI.表达组合的上部和下部甲羟戊酸途径的菌株
为了获得具有完整的甲羟戊酸途径+野葛异戊二烯合酶的菌株，将质粒pTrcKKDyIkISkan和pCLpTrcUpperPathway都转化进入BL21(λDE3)感受态细胞(Invitrogen)，在含有卡那霉素(50μg/ml)和壮观霉素(50μg/ml)的LA上选择转化子。通过质粒制备检查转化子以确保两个质粒都保持在宿主中。该菌株被称作MCM127。
VII.在大肠杆菌/pUpperpathway中从葡萄糖生产甲羟戊酸
将BL21/pTrcHis2A-mvaE/mvaS或FM5/p pTrcHis2A-mvaE/mvaS的单一菌落接种至LB+羧苄西林(100μg/ml)，并在37℃以200rpm振荡过夜生长。将这些培养物在250ml的培养瓶中的50ml培养基中稀释至OD600为0.1。培养基是：TM3+1％或2％葡萄糖+羧苄西林(100ug/ml)或TM3+1％葡萄糖+水解的豆油+羧苄西林(100ug/ml)或TM3+生物质(制备的甘蔗渣、玉米秸秆或柳枝稷)。培养物在30℃以200rpm振荡生长大约2-3小时，直至达到OD600为0.4。在该点，通过加入IPTG(400μM)诱导从mvaE mvaS构建体的表达。再将培养物温育20或40小时，在诱导后以2小时至6小时的间隔取样，然后视需要在24、36和48小时取样。通过取出1ml培养物进行取样，测定OD600，在微量离心机中使细胞沉淀，弃上清并分析其甲羟戊酸。
以TM3培养基和2％的葡萄糖作为细胞培养基，具有编码粪肠球菌AA-辅酶A硫解酶、HMG-辅酶A合酶、和HMG-辅酶A还原酶多肽的大肠杆菌细胞的14升发酵生产了22g甲羟戊酸。以LB培养基和1％的葡萄糖作为细胞培养基，这些细胞的摇瓶生产2-4g的甲羟戊酸/升。在这些菌株中甲羟戊酸的产生表明MVA途径在大肠杆菌中是有功能的。
VIII.从含有上部和下部MVA途径+野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌BL21生产异戊二烯
通过转化进入如上所述的包含上部和下部MVA途径和野葛异戊二烯合酶基因的质粒与如实施例7描述的包含idi、dxs和dxr及异戊二烯合酶基因的质粒的多种组合而产生下列菌株。使用的宿主细胞是化学感受态BL21(λDE3)，通过标准方法进行转化。在含有卡那霉素(50μg/ml)或卡那霉素+壮观霉素(二者浓度都是50μg/ml)的L琼脂上选择转化子。平板在37℃生长。得到的菌株命名如下：
卡那霉素+壮观霉素(各50μg/ml)上生长
MCM127-pCL Upper MVA+pTrcKKDyIkIS(kan)，在BL21(λDE3)中
MCM131-pCL1920+pTrcKKDyIkIS(kan)，在BL21(λDE3)中
MCM125-pCL Upper MVA+pTrcHis2B(kan)，在BL21(λDE3)中
在卡那霉素(50μg/ml)上生长
MCM64-pTrcKudzu yIDI DXS(kan)，在BL21(λDE3)中
MCM50-pTrcKudzu(kan)，在BL21(λDE3)中
MCM123-pTrcKudzu yIDI DXS DXR(kan)，在BL21(λDE3)中
上述菌株从冷冻贮液中划线至LA+合适的抗生素，并在37℃过夜生长。来自每个平板的单一菌落用于接种摇瓶(25ml LB+合适的抗生素)。在22℃在200rpm振荡下过夜温育该瓶。次晨，将瓶转移至37℃的温育箱并在200rpm振荡下再生长4.5小时。离心25ml的培养物以使细胞沉淀，将细胞重悬于5ml LB+合适的抗生素。然后将培养物在25mlLB+1％葡萄糖+合适的抗生素中稀释至OD600为0.1。每个菌株建立2个瓶，一组以IPTG(800μM)诱导，第二组不诱导。在37℃在250rpm振荡下温育培养物。在1.50小时后(取样时间点1后即时)诱导一组培养物。在每个取样时间点，测定OD600并按照实施例1的描述测定异戊二烯的量。结果显示于表3。产生的异戊二烯的量表示为特定菌株的峰值产量时的量。
表3.大肠杆菌菌株中异戊二烯的生产
  菌株   异戊二烯(μg/升/OD/hr)
  MCM50   23.8
  MCM64   289
  MCM125   ND
  MCM131   痕量
  MCM127   874
ND：未检测
痕量：存在峰值但不可汇总。
IX.甲羟戊酸的分析
甲羟戊酸内酯(1.0g，7.7mmol)(CAS#503-48-0)由Sigma-Aldrich(WI，USA)以溶解于水中的糖浆(7.7mL)提供，以氢氧化钾(7.7mmol)处理以生产甲羟戊酸的钾盐。通过1H NMR分析确认向甲羟戊酸的转化。通过在14,000rpm离心5分钟除掉细胞、然后将300μl等份的上清液加入至900μl水中来制备用于HPLC分析的样品。然后加入高氯酸(36μl的70％溶液)，然后混合并在冰上冷却5分钟。然后再次离心样品(14,000rpm，5分钟)，将上清液转移至HPLC。通过相同的方式制备甲羟戊酸标准物(20、10、5、1和0.5g/L)。通过HPLC分析甲羟戊酸(20uL注入体积)：使用BioRad Aminex 87-H+柱(300mm乘7.0mm)，以5mM硫酸以0.6mL/分钟洗脱，并检测折射率(RI)。在这些条件下，甲羟戊酸以内酯的形式在18.5分钟时洗脱。
X.从含有上部MVA途径+野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌BL21生产异戊二烯
使用表达甲羟戊酸途径多肽和野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌的15升规模的发酵从补料分批培养物中的细胞生产异戊二烯。该实验证明在限葡萄糖条件下生长的细胞生产2.2g/L的异戊二烯。
培养基配方(每升发酵培养基)：
使用下列成分/升发酵培养基制备培养基：K2HPO47.5g，MgSO4＊7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，和1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于diH2O中。该溶液经高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺＊HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：
使用下列成分制备1000X改良痕量金属溶液：柠檬酸＊H2O 40g，MnSO4＊H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4＊7H2O 1g，CoCl2＊6H2O 1g，ZnSO＊7H2O 1g，CuSO4＊5H2O 100mg，H3BO3100mg，和NaMoO4＊2H2O 100mg。每种成分依次溶解于diH2O水中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，以0.22μm的滤器无菌过滤。
在15L的生物反应器中以含有pCL PtrcUpperPathway(图26)和pTrcKKDyIkIS质粒的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃从葡萄糖形成的异戊二烯。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)并在37℃温育。将单一菌落接种至大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至5L的生物反应器。
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。在54小时的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是3.7kg。通过加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)进行诱导。当550nm下的光密度(OD550)达到10的时候，使IPTG的浓度是25uM。当OD550达到190时，IPTG的浓度升高至50uM。在发酵38小时的时候，IPTG的浓度升高至100uM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图54。按照本文的描述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程达到最终的值2.2g/L(图55)。在54小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是15.9g，生产的时间进程显示于图56。
XI.以15L的规模在补料分批培养物中生长且表达甲羟戊酸途径的基因的大肠杆菌发酵生产异戊二烯
使用表达甲羟戊酸途径多肽和野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌的15升规模的发酵从补料分批培养物中的细胞生产异戊二烯。该实验证明在限葡萄糖条件下生长的细胞生产3.0g/L的异戊二烯。
培养基配方(每升发酵培养基)：
使用下列成分/升发酵培养基制备培养基：K2HPO47.5g，MgSO4＊7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，和1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于diH2O中。该溶液经高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺＊HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：
使用下列成分制备1000X改良痕量金属溶液：柠檬酸＊H2O 40g，MnSO4＊H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4＊7H2O 1g，CoCl2＊6H2O 1g，ZnSO＊7H2O 1g，CuSO4＊5H2O 100mg，H3BO3100mg，和NaMoO4＊2H2O 100mg。每种成分依次溶解于diH2O水中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，以0.22μm的滤器无菌过滤。
在15L的生物反应器中以含有pCL PtrcUpperMVA和pTrcKKDyIkIS质粒的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃从葡萄糖形成的异戊二烯。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)并在37℃温育。将单一菌落接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至5L的生物反应器。
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。在59小时的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是2.2kg。通过加入IPTG进行诱导。当550nm下的光密度(OD550)达到10的时候，使IPTG的浓度是25uM。当OD550达到190时，IPTG的浓度升高至50uM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图93。按照本文的描述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程达到最终的值3.0g/L(图94)。在59小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是22.8g，生产的时间进程显示于图95。用于在发酵过程中生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是2.2％。从葡萄糖生产的异戊二烯的重量百分率产率是1.0％。
XII.以15L的规模在补料分批培养物中生长且表达甲羟戊酸途径的基因的大肠杆菌发酵生产异戊二烯
使用表达甲羟戊酸途径多肽、葛根异戊二烯合酶、和野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌的15升规模的发酵从补料分批培养物中的细胞生产异戊二烯。该实验证明在限葡萄糖条件下生长的细胞生产3.3g/L的异戊二烯。
i)pCLPtrcUpperPathwayHGS2的构建
使用引物NsiI-RBS-HGS F(CTTGATGCATCCTGCATTCGCCCTTAGGAGG，SEQ ID NO：105)和pTrcR(CCAGGCAAATTCTGTTTTATCAG，SEQ ID NO：106)，使用pTrcKKDyIkIS作为模板，通过PCR从葛根扩增编码异戊二烯合酶的基因。以NsiI和PstI对由此获得的PCR产物进行限制性消化，并进行凝胶纯化。以PstI限制性消化质粒pCL PtrcUpperPathway，并根据生产商的说明书，使用rAPid碱性磷酸酶(Roche)进行去磷酸化。
将这些DNA片段连接在一起并将连接反应物转化进入大肠杆菌Top10化学感受态细胞(Invitrogen)，铺板于含有壮观霉素(50ug/ml)的L琼脂上并在37℃过夜温育。使用Qiaquick旋转微量制备试剂盒从6个克隆制备质粒DNA。以限制性酶EcoRV和MluI消化质粒DNA以鉴定具有正确方向的插入片段的克隆(即基因与pTrc启动子的方向相同)。
得到的正确的质粒被称作pCLPtrcUpperPathwayHGS2。使用本文描述的顶空测定法测定该质粒，发现其在大肠杆菌Top10中生产异戊二烯，由此验证了基因的功能性。将该质粒转化进入含有pTrcKKDyIkIS的BL21(LDE3)中以生产菌株BL21/pCLPtrcUpperPathwayHGS2-pTrcKKDyIkIS 。该菌株相对于BL21/pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS菌株(实施例8，第XI部分)具有额外的异戊二烯合酶拷贝。该菌株相对于实施例8第XI部分中使用的BL21/pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS菌株还具有增加的HMGS表达和活性。
ii)以15L的规模在补料分批培养物中生长且表达pCLPtrcUpperPathwayHGS2-pTrcKKDyIkIS的大肠杆菌发酵生产异戊二烯
培养基配方(每升发酵培养基)：
使用下列成分/升发酵培养基制备培养基：K2HPO47.5g，MgSO4＊7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，和1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于diH2O中。该溶液经高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺＊HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：
使用下列成分制备1000X改良痕量金属溶液：柠檬酸＊H2O 40g，MnSO4＊H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4＊7H2O 1g，CoCl2＊6H2O 1g，ZnSO＊7H2O 1g，CuSO4＊5H2O 100mg，H3BO3100mg，和NaMoO4＊2H2O 100mg。每种成分依次溶解于DiH2O水中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，以0.22μm的滤器无菌过滤。
在15L的生物反应器中以含有pCLPtrcUpperPathwayHGS2和pTrcKKDyIkIS质粒的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃从葡萄糖形成的异戊二烯。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)并在37℃温育。将单一菌落接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至5L的生物反应器。
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。在58小时的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是2.1kg。通过加入IPTG进行诱导。当550nm下的光密度(OD550)达到9的时候，使IPTG的浓度是25uM。当OD550达到170时，IPTG的浓度升高至50uM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图104。按照本文的描述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程提高至最终的值3.3g/L(图105)。在58小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是24.5g，生产的时间进程显示于图106。用于在发酵过程中生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是2.5％。从葡萄糖生产的异戊二烯的重量百分率产率是1.2％。分析显示：相对于表达CL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的BL21，异戊二烯合酶的活性增加了大约3-4倍(数据未显示)。
XIII.大肠杆菌中下部甲羟戊酸途径的染色体整合
含有甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、和IPP异构酶的合成操纵子被整合进入大肠杆菌的染色体。如果需要，可以通过在操纵子的5’整合不同的启动子来改变表达。
表4列出了用于该实验的引物。
表4.引物
Figure BDA0000086907590002381
Figure BDA0000086907590002391
i)靶载体构建
选择attTn7位点用于整合。通过PCR从MG1655细胞扩增同源性上游(attTn7up)(引物MCM78和MCM79)和下游(attTn7down)(引物MCM88和MCM89)的区域。将50uL的反应物(1uL 10uM引物，3uLddH2O，45uL Invitrogen Platinum PCR Supermix High Fidelity)和刮下的MG1655菌落在94℃变性2分钟进行25个循环的“94℃2分钟，50℃30秒，68℃1分钟”，在72℃延伸7分钟，并冷却至4℃。根据生产商的说明书，将得到的该DNA克隆进入pCR2.1(Invitrogen)，得到质粒MCM278(attTn7up)和MCM252(attTn7down)。从质粒MCM252消化并凝胶纯化的832bp ApaI-PvuI片段克隆进入ApaI-PvuI消化并经凝胶纯化的质粒pR6K，产生质粒MCM276。从MCM278消化并凝胶纯化的825bp PstI-NotI片段克隆进入PstI-NotI消化并经凝胶纯化的质粒MCM276，产生质粒MCM281。
ii)下部途径和启动子的克隆
根据生产商的说明书，使用Roche Expand Long PCR System，使用引物MCM104和MCM105，从pTrcKKDyIkIS扩增MVK-PMK-MVD-IDI基因。以NotI和ApaI消化该产物并克隆进入已经NotI和ApaI消化的并经凝胶纯化的MCM281。使用Stratagene Pfu UltraII，使用引物MCM120和MCM127从GeneBridges FRT-gb2-Cm-FRT模板扩增CMR盒。使用四个50μLPCR反应物(包含1uL～10ng/μL模板、1μL每种引物、1.25μL 10mM dNTP、5μL 10X缓冲液、1μL酶、和39.75μL ddH20)进行下列PCR程序：95℃变性4分钟；5个循环的“95℃20秒，55℃20秒，72℃2分钟”；25个循环的“95℃20秒，58℃20秒，72℃2分钟”；72℃，10分钟；然后冷却至4℃。将反应物合并，在Qiagen PCR清除柱上纯化，并用于电穿孔经水洗涤的包含质粒MCM296的Pir1细胞。在2mM的杯中在2.5V和200ohm进行电穿孔。在30℃在LB中恢复电穿孔反应物3小时。在含有CMP5、Kan50的LA上选择转化子MCM330(图107和108A-108C；SEQ ID NO：25)。
iii)整合进入大肠杆菌染色体
以SnaBI消化来自MCM330的微量制备的DNA(Qiaquick旋转试剂盒)并用于电穿孔BL21(DE3)(Novagen)或含有GeneBridges质粒pRedET Carb的MG1655。细胞在30℃生长至～OD1，然后在37℃以0.4％L-阿拉伯糖诱导1.5小时。在4℃ddH2O中将这些细胞洗涤3次，然后以2μL DNA进行电穿孔。在含有氯霉素(5μg/ml)的L琼脂上选择整合子，然后确认不在L琼脂+卡那霉素(50ug/ml)上生长。冷冻BL21整合子MCM331和MG1655整合子MCM333。
iv)构建编码野葛异戊二烯合酶的pET24D-Kudzu
将野葛异戊二烯合酶基因从pCR2.1载体(Invitrogen)亚克隆进入pET24d载体(Novagen)。具体地，使用引物MCM505’-GATCATGCATTCGCCCTTAG  GAGGTAAAAA  AACATGTGTG  CGACCTCTTCTCAATTTACT(SEQ ID NO：52)和MCM535’-CGGTCGACGGATCCCTGCAG TTAGACATAC ATCAGCTG(SEQ ID NO：50)从pTrcKudzu模板DNA扩增野葛异戊二烯合酶基因。使用Taq DNA聚合酶(Invitrogen)进行PCR反应，将得到的PCR产物克隆进入pCR2.1-TOPO TA克隆载体(Invitrogen)，并转化进入大肠杆菌Top10化学感受态细胞(Invitrogen)。将转化子铺板于含有羧苄西林(50μg/ml)的L琼脂上，并在37℃过夜温育。以单一转化子接种含有50μg/ml羧苄西林的5ml Luria Broth培养物，并在37℃过夜生长。通过测序分离自1ml液体培养基(Luria Broth)的质粒DNA就正确的插入片段筛选了5个菌落，使用QIAprep旋转微量制备试剂盒(Qiagen)纯化。得到的质粒被称作MCM93，其含在pCR2.1骨架中的野葛异戊二烯合酶编码序列。
通过以PciI和BamH1(Roche)进行限制性核酸内切酶消化而切下野葛编码序列，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)凝胶纯化。以NcoI和BamHI(Roche)消化pET24d载体DNA，以虾碱性磷酸酶(Roche)处理，并使用QIAprep旋转微量制备试剂盒(Qiagen)纯化。使用快速DNA连接试剂盒(Roche)，以片段∶载体＝5∶1的比例，以20μl的总体积，将野葛异戊二烯合酶片段连接进入经NcoI/BamH1消化的pET24d。将连接混合物的一部分(5μl)转化进入大肠杆菌Top 10化学感受态细胞，并铺板于含有卡那霉素(50μg/ml)的L琼脂上。通过测序验证正确的转化子并转化进入化学感受态BL21(λDE3)pLysS细胞(Novagen)。在37℃在含有卡那霉素(50μg/ml)的L琼脂上过夜生长后，选择单一的菌落。图109中显示了得到的质粒的图谱,其被称作pET24D-Kudzu。pET24D-Kudzu的序列(SEQID NO：26)显示于图110A和110B。使用顶空测定法确认异戊二烯合酶活性。
v)生产菌株
以质粒pCLPtrcupperpathway和pTrcKudzu或pETKudzu共转化菌株MCM331和MCM333，得到如表5所示的菌株。
表5.生产菌株
Figure BDA0000086907590002421
vi)以15L的规模在补料分批培养物中生长且表达甲羟戊酸途径的大肠杆菌发酵生产异戊二烯
培养基配方(每升发酵培养基)：
使用下列成分/升发酵培养基制备培养基：K2HPO47.5g，MgSO4＊7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，和1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于diH2O中。该溶液经高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺＊HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：
使用下列成分制备1000X改良痕量金属溶液：柠檬酸＊H2O 40g，MnSO4＊H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4＊7H2O 1g，CoCl2＊6H2O 1g，ZnSO＊7H2O 1g，CuSO4＊5H2O 100mg，H3BO3100mg，和NaMoO4＊2H2O 100mg。每种成分依次溶解于DiH2O水中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，以0.22μm的滤器无菌过滤。
在15L的生物反应器中以含有如上所述的gi1.2整合的下部MVA途径和pCL PtrcUpperMVA和pTrcKudzu质粒的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃从葡萄糖形成的异戊二烯。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)上并在37℃温育。将单一菌落接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至5L的生物反应器。
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。在57小时的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是3.9kg。通过加入IPTG进行诱导。当二氧化碳释放速率达到100mmol/L/hr的时候，使IPTG的浓度是100uM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图111A。按照本文的描述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程提高至最终的值1.6g/L(图111B)。发酵过程中异戊二烯的比生产率显示于图111C，峰值为1.2mg/OD/hr。在57小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是16.2g。用于在发酵过程中生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是0.9％。从葡萄糖生产的异戊二烯的重量百分率产率是0.4％。
XIV.使用甘油作为碳源从含有野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌BL21生产异戊二烯
使用表达野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌的15升规模的发酵从补料分批培养物中进料了甘油的细胞生产异戊二烯。该实验证明在存在甘油(无葡萄糖)的条件下生长的细胞生产2.2mg/L的异戊二烯。
培养基配方(每升发酵培养基)：
使用下列成分/升发酵培养基制备培养基：K2HPO47.5g，MgSO4＊7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g和1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于diH2O中。该溶液经高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入甘油5.1g、硫胺＊HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：
使用下列成分/升发酵培养基制备培养基：柠檬酸＊H2O 40g，MnSO4＊H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4＊7H2O 1g，CoCl2＊6H2O 1g，ZnSO＊7H2O 1g，CuSO4＊5H2O 100mg ，H3BO3100mg剂NaMoO4＊2H2O 100mg。每种成分依次溶解于diH2O水中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，以0.22μm的滤器无菌过滤。
在15L的生物反应器中以含有pTrcKudzu质粒的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度35℃从甘油形成的异戊二烯。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线至LA培养基琼脂平板(含有抗生素)上并在37℃温育。将单一菌落接种至大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基并在35℃生长。接种物生长至OD1.0后(在550nm测定)，使用600mL接种至7.5L的生物反应器。
以指数速率进料甘油直至细胞达到550nm下的光密度(OD550)为153。在36小时的发酵过程中输送到生物反应器中的甘油的总量是1.7kg。除了接种物中的葡萄糖，不再向生物反应器中添加葡萄糖。通过加入IPTG进行诱导。当OD550达到50的时候，使IPTG的浓度是20uM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图57。按照本文的描述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程提高至最终的值2.2mg/L(图58)。在54小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是20.9mg，生产的时间进程显示于图59。
XV.使用转化糖作为碳源在15L规模的补料分批培养物中生长且表达甲羟戊酸途径的基因的大肠杆菌发酵生产异戊二烯
使用表达甲羟戊酸途径多肽和野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌的15升规模的发酵从补料分批培养物中进料了转化糖的细胞生产异戊二烯。该实验证明在存在转化糖的条件下生长的细胞生产2.4g/L的异戊二烯。
培养基配方(每升发酵培养基)：
使用下列成分/升发酵培养基制备培养基：K2HPO47.5g，MgSO4＊7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，和1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于diH2O中。该溶液经高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入转化糖10g、硫胺＊HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：
使用下列成分制备1000X改良痕量金属溶液：柠檬酸＊H2O 40g，MnSO4＊H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4＊7H2O 1g，CoCl2＊6H2O 1g，ZnSO＊7H2O 1g，CuSO4＊5H2O 100mg，H3BO3100mg，和NaMoO4＊2H2O 100mg。每种成分依次溶解于DiH2O水中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，以0.22μm的滤器无菌过滤。
在15L的生物反应器中以含有pCL PtrcUpperMVA和pTrcKKDyIkIS质粒的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃从转化糖形成的异戊二烯。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)并在37℃温育。将单一菌落接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至5L的生物反应器。
以指数速率进料转化糖直至细胞达到稳定期。此后，降低转化糖进料以满足代谢需求。在44小时的发酵过程中输送到生物反应器中的转化糖的总量是2.4kg。通过加入IPTG进行诱导。当550nm下的光密度(OD550)达到9的时候，使IPTG的浓度是25uM。当OD550达到200时，IPTG的浓度升高至50uM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图96。按照本文的描述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程提高至最终的值2.4g/L(图97)。在44小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是18.4g，生产的时间进程显示于图98。用于在发酵过程中生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是1.7％。从葡萄糖生产的异戊二烯的重量百分率产率是0.8％。
实施例9.构建上部和下部MVA途径以整合进入枯草芽孢杆菌
I.在枯草芽孢杆菌中构建上部MVA途径
将来自粪肠球菌的上部途径整合进入枯草芽孢杆菌，处于aprE启动子的控制下。上部途径由两个基因组成：mvaE，其编码AACT和HMGR；以及mvaS，其编码HMGS。使这两个基因融合在一起，其间有终止密码子，在mvaS前面有RBS位点，并且它们处于aprE启动子的控制下。终止子位于mvaE基因之后。将氯霉素抗性标志物克隆于mvaE基因之后，使用同源性的侧接区通过双交叉(double cross over)将构建体整合于aprE基因座。
通过PCR扩增四个DNA片段，使得它们含有悬突，这将允许它们通过PCR反应而融合在一起。根据生产商的说明书，使用Herculase聚合酶进行PCR扩增。
1.PaprE
CF 07-134(+)aprE启动子PstI的起始点
5’-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC(SEQ ID NO：115)
CF 07-94(-)将PaprE融合至mvaE
5’-
CAATAATAACTACTGTTTTCACTCTTTACCCTCTCCTTTTAA(SEQ ID NO：116)
模板：枯草芽孢杆菌染色体DNA
2.mvaE
CF 07-93(+)将mvaE融合至aprE启动子(GTG起始密码子)
5’-
TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG(SEQ ID NO：117)
CF 07-62(-)将mvaE融合至mvaS，它们中间有RBS
5’-
TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATTGTTTTCTTAAATC(SEQ ID NO：94)
模板：粪肠球菌染色体DNA(来自ATCC)
3.mvaS
CF 07-61(+)将mvaE融合至mvaS，它们中间有RBS
5’-
GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAA(SEQ ID NO：95)
CF 07-124(-)将mvaS的末端融合至终止子
5’-
CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQ ID NO：118)
模板：粪肠球菌染色体DNA
4.解淀粉芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶终止子
CF 07-123(+)将mvaS的末端融合至终止子
5’-
ACCGTTCGTTCTTATCGAAACTAAAAAAAACCGGCCTTGGCCCCG(SEQ ID NO：119)
CF 07-46(-)解淀粉芽孢杆菌的末端终止子BamHI
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQ IDNO：58)
模板：解淀粉芽孢杆菌染色体DNA
PCR融合反应
5.将mvaE融合至mvaS
CF 07-93(+)将mvaE融合至aprE启动子(GTG起始密码子)
5’-
TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG(SEQ ID NO：117)
CF 07-124(-)将mvaS的末端融合至终止子
5’-
CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQ ID NO：118)
模板：来自上述的#2和3
6.将mvaE-mvaS融合至aprE启动子
CF 07-134(+)aprE启动子PstI的起始点
5’-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC(SEQ ID NO：115)
CF 07-124(-)将mvaS的末端融合至终止子
5’-
CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQ ID NO：118)
模板：来自上述的#1和#4
7.将PaprE-mvaE-mvaS融合至终止子
CF 07-134(+)aprE启动子PstI的起始点
5’-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC(SEQ ID NO：115)
CF 07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子BamHI的末端
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQ IDNO：58)
模板：#4和#6
以限制性核酸内切酶PstI/BamHI消化产物并连接进入经PstI/BamHI消化的pJM102(Perego，M.1993.Integrational vectors forgenetic manipulation in Bacillus subtilis，p.615-624.In A.L.Sonenshein，J.A.Hoch和R.Losick(ed.)，Bacillus subtilis and other gram-positivebacteria：biochemistry，physiology，and molecular genetics.AmericanSociety for Microbiology，Washington，D.C.)。将连接物转化进入大肠杆菌TOP 10化学感受态细胞，在含有羧苄西林(50μg/ml)的LA上选择转化子。通过测序鉴别正确的质粒并将其命名为pJMUpperpathway2(图50和51；SEQ ID NO：22)。将纯化的质粒DNA转化进入枯草芽孢杆菌aprEnprE Pxyl-comK，在含有氯霉素(5μg/ml)的L琼脂上选择转化子。选择正确的菌落并依次铺板于含有10、15、和25μg/ml氯霉素的L琼脂上，以扩大含有上部途径的盒的拷贝数。
通过在含有1％葡萄糖和1％的LB中生长来测试得到的菌株的甲羟戊酸的生产。通过GC分析培养物中甲羟戊酸的生产。
随后该菌株用作宿主以整合下部甲羟戊酸途径。
使用下列引物来测序以上各个构建体。
测序引物：
CF 07-134(+)aprE启动子PstI的起始点
5’-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC(SEQ ID NO：115)
CF 07-58(+)mvaE基因的起始点
5’-ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC(SEQ ID NO：97)
CF 07-59(-)mvaE基因的末端
5’-ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC (SEQ IDNO：98)
CF 07-82(+)mvaS基因的起始点
5’-ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG(SEQ ID NO：99)
CF 07-83(-)mvaS基因的末端
5’-TIAGTTTCGAIAAGAACGAACGGT(SEQ ID NO：100)
CF 07-86(+)mvaE中的序列
5’-GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC(SEQ ID NO：101)
CF 07-87(+)mvaE中的序列
5’-TTGCCAATCATATGATTGAAAATC(SEQ ID NO：102)
CF 07-88(+)mvaE中的序列
5’-GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG(SEQ ID NO：103)
CF 07-89(+)mvaS中的序列
5’-GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC(SEQ ID NO：104)
在含有浓度为5μg/ml的氯霉素的LA上选择转化子。通过测序确认了一个菌落具有正确的整合，将其铺板于LA，其中经数天逐渐增大LA中氯霉素的浓度，直至达到最终水平25μg/ml。这导致包含目标基因的盒的扩增。得到的菌株被称作CF 455：pJMupperpathway#1X枯草芽孢杆菌aprEnprE Pxyl comK(经扩增以在含有25μg/ml氯霉素的LA上生长)。
II.在枯草芽孢杆菌中构建下部MVA途径
由mvk1、pmk、mpd和idi组成的下部MVA途径组合于盒中，所述盒由下列组成：来自枯草芽孢杆菌染色体的nprE区域(整合位点)的侧接DNA区域，aprE启动子，和壮观霉素抗性标志物(见图28和29；SEQID NO：13)。该盒由DNA2.0合成，并整合进入含有在aprE基因座整合的上部MVA途径的枯草芽孢杆菌的染色体中。从实施例4描述的复制质粒表达野葛异戊二烯合酶基因并转化进入整合了上部和下部途径的菌株中。
实施例10：示例性的异戊二烯组合物及其制备方法
I.含有异戊二烯的发酵废气的成分分析
以含有两个质粒(pCL upperMev；pTrcKKDyIkIS，编码用于类异戊二烯前体生物合成的完整甲羟戊酸途径、来自酵母的异戊烯焦磷酸异构酶、和来自野葛的异戊二烯合酶)的重组大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行14L规模的发酵。在大约峰值异戊二烯生产率的时间点(27.9小时的已发酵时间(EFT))，将来自14L槽的发酵废气收集于20mL顶空瓶中，通过顶空GC/MS分析挥发性成分。
使用配有Agilent HP-5MS GC/MS柱(30m x250μm；膜厚0.25μm)的Agilent 6890GC/MS系统进行顶空分析。使用combiPAL自动注射器从20mL顶空瓶中取出500uL等份试样的样品。GC/MS法使用氦作为载气，流速为1ml/分钟。注入口维持在250℃，分流比为50∶1。最初将烤箱温度维持在37℃持续2分钟，然后以25℃/分钟的速率升高至237℃，总共的方法时间为10分钟。Agilent 5793N质量选择检测器m/z 29至m/z300扫描。该系统的检测限值是大约0.1ug/L气体或大约0.1ppm。如果需要，可以使用具有更低的检测限值的更灵敏的设备。
废气由下列组成：99.925％(v/v)的永久气体(N2，CO2和O2)，大约0.075％的异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)(～750ppmv，2100μg/L)和痕量(＜50ppmv)的乙醇、丙酮、和两种异戊二烯醇。没有测定水蒸气的量，但是估计其等于0℃时的平衡蒸气压。通过积分GC/MS色谱图中峰下的面积来确定挥发性有机级份的组成(图86A和86B)，并列于表6中。使用标准方法，通过乙醇和丙酮标准物的校正曲线将GC面积转化为气相的浓度(单位为ug/L)。
表6.发酵废气中的挥发性有机成分的组成。分析使用表达异源甲羟戊酸途径，来自酵母的异戊烯焦磷酸异构酶、和来自野葛的异戊二烯合酶的大肠杆菌BL21(DE3)菌株发酵的27.9小时的时间点时的废气。
Figure BDA0000086907590002511
Figure BDA0000086907590002521
II.在重组大肠杆菌菌株发酵过程中与异戊二烯共同生产的痕量挥发性有机化合物(VOC)的测定
以含有编码用于类异戊二烯前体生物合成的完整甲羟戊酸途径、来自酵母的异戊烯焦磷酸异构酶、和来自野葛的异戊二烯合酶的两个质粒(pCL upperMev；pTrcKKDyIkIS)的重组大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行14L规模的发酵。
使发酵废气通过冷却的顶空瓶以浓缩并鉴别痕量挥发性有机成分。以1L/分钟的速率对来自该发酵的废气取样，持续10分钟，通过配有石英毛(2g)的20mL的顶空瓶并以干冰冷却至-78℃。使用洁净的瓶盖重新将瓶盖上盖，并使用实施例10中第I部分中描述的条件通过顶空GC/MS分析捕获的VOC。图87A-87D中观察到的化合物的比率是发酵废气中总体水平、-78℃时的相对蒸气压、和质谱仪的检测应答的组合。例如，相对于氧化的挥发物(例如丙酮和乙醇)的低水平的异戊二烯与该物质的高挥发性有关，从而其在-78℃时不在顶空瓶中积累。
这些化合物中的很多化合物的存在对于源自生物来源的异戊二烯组合物是特异的。结果显示于图87A-87D并总结于表7A和7B。
表7A：在-78℃冷捕集后，由大肠杆菌BL21(DE3)(pCL upperMev；pTrcKKDyIkIS)生产的废气中存在的痕量挥发物
Figure BDA0000086907590002522
1 GC面积是对应于所列的化合物的峰下的未校正的面积。
2 面积％是以相对于所有化合物的总的峰面积表示为％的峰面积。
3 比率％是相对于2-甲基-1，3-丁二烯的峰面积表示为％的峰面积。
表7B：在-196℃冷捕集后，由大肠杆菌BL21(DE3)(pCL upperMev；pTrcKKDyIkIS)生产的废气中存在的痕量挥发物
Figure BDA0000086907590002542
Figure BDA0000086907590002551
1 GC面积是对应于所列的化合物的峰下的未校正的面积。
2 面积％是以相对于所有化合物的总的峰面积表示为％的峰面积。
3 比率％是相对于2-甲基-1，3-丁二烯的峰面积表示为％的峰面积。
III.在源自发酵的异戊二烯中不存在C5烃异构体
使用在液氦中冷却的2mL顶空瓶进行存在于发酵废气中的异戊二烯的冷捕集。首先使废气通过(1L/分钟)含有氢氧化钠珠的20mL瓶以使冰态和固态CO2在2mL瓶中的积累最小化(-196℃)。使大约10L的废气通过瓶，然后在通风的状况下使其升温至-78℃，然后以洁净的瓶盖重新将其密封，并通过GC/MS分析。
使用顶空模式下的100uL气密性注射器，以Agilent 6890GC/MS系统进行GC/MS顶空分析。使用Zebron ZB-624GC/MS柱(30m x250μm；膜厚度1.40μm)进行分析物的分离。GC自动注射器配有气密性的100uL注射器，针头高度调节为允许从2mLGC瓶注射50uL的顶空样品。GC/MS法使用氦作为载气，流速为1ml/分钟。注入口维持在200℃，分流比为20∶1。在分析过程中将烤箱温度维持在37℃，持续5分钟。在m/z 55、66、67和70以单离子监控(SIM)模式运行Agilent 5793N质量选择性检测器。在这些条件下观察到异戊二烯在2.966分钟时洗脱(图88B)。还是用该方法分析了源自石油的异戊二烯的标准物(Sigma-Aldrich)，并且发现该标准物含有另外的C5烃异构体，所述异构体在主峰之前或之后的短时间洗脱，并基于校正的GC面积进行定量(图88A)。
表8A：源自石油的异戊二烯的GC/MS分析
表8B：源自发酵的异戊二烯的GC/MS分析(占总C5烃的百分率)
Figure BDA0000086907590002571
在另外的实验中，分析了C5烃的标准混合物以确定每种化合物的检测器应答是否相同。化合物是2-甲基-1-丁烯、2-甲基-1，3-丁二烯、(E)-2-戊烯、(Z)-2-戊烯和(E)-1，3-戊二烯。在这种情况下，在维持于50℃的Agilent DB-Petro柱(100m x0.25mm，膜厚度0.50um)上进行分析15分钟。GC/MS法使用氦作为载气，流速为1ml/分钟。注入口维持在200℃，分流比为50∶1。从m/z 19至m/z 250以全扫描模式运行Agilent 5793N质量选择性检测器。在这些条件下，浓度为100ug/L的每种标准物生产实验误差内的相同检测器应答。
IV.包含吸附到固相上的异戊二烯的组合物
使生物生产的异戊二烯吸附至活性炭，生产包含50％至99.9％的碳、0.1％至50％的异戊二烯、0.01％至5％的水、和痕量(＜0.1％)其它挥发性有机成分的固相。
使发酵废气通过维持在0℃的铜冷凝旋管，然后通过颗粒硅石干燥剂过滤器以除掉水蒸气。然后使经除湿的废气通过含碳的过滤器(Koby Jr，Koby Filters，MA)达到通过GC/MS在过滤器排放中检测到异戊二烯突破(breakthrough)的点。可以通过计算废气中的浓度、总的流速和收集期间的突破百分率来间接确定吸附至筒的异戊二烯的量。或者，可以通过热、真空、或溶剂介导的解吸附从过滤器中回收吸附的异戊二烯。
V.冷凝的异戊二烯的收集和分析
将发酵废气除湿，通过经由合适的吸附剂(例如烧碱石棉)过滤而除掉CO2。然后使得到的废气流通过液氮冷却的冷凝器以使流体中的VOC冷凝。收集瓶含有叔丁基儿茶酚以抑制得到的异戊二烯冷凝物。通过GC/MS和NMR分析冷凝物以测定纯度，其中使用标准方法，例如如本文描述的那些。
VI.通过发酵生产异戊二烯醇
对来自于表达野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌BL21(DE3)菌株的废气的分析揭示出异戊二烯和3-甲基-3-丁烯-1-醇(异戊二烯醇)的存在。发酵过程中，发酵废气中的这两种化合物的水平显示于图89，如通过顶空GC/MS所测定。在该实验中得到的异戊二烯醇(3-甲基-3-丁烯-1-醇，3-MBA)的水平接近10ug/L废气。另外的实验在发酵废气中生产了大约20ug/L废气的水平。
实施例11：在补料分批培养物中发酵并表达来自甲羟戊酸途径的基因的大肠杆菌的生长与异戊二烯的生产的解除偶联
实施例11例示了从甲羟戊酸的细胞生长与异戊二烯生产之间的解除偶联。
I.发酵条件
培养基配方(每升发酵培养基)：
使用下列成分/升发酵培养基制备培养基：K2HPO47.5g，MgSO4＊7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，和1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于diH2O中。该溶液经高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺＊HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：
使用下列成分制备1000X改良痕量金属溶液：柠檬酸＊H2O 40g，MnSO4＊H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4＊7H2O 1g，CoCl2＊6H2O 1g，ZnSO＊7H2O 1g，CuSO4＊5H2O 100mg，H3BO3100mg，和NaMoO4＊2H2O 100mg。每种成分依次溶解于DiH2O水中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，以0.22μm的滤器无菌过滤。
以含有pTrcHis2AUpperPathway(也称作pTrcUpperMVA，图91和92A-92C；SEQ ID NO：23)(50μg/ml羧苄西林)或pCL PtrcUpperMVA(也称作pCL PtrcUpperPathway(图26))(50μg/ml壮观霉素)质粒的大肠杆菌细胞进行发酵。对于其中生产异戊二烯的实验，大肠杆菌细胞还含有pTrc KKDyIkIS(50μg/ml卡那霉素)质粒。进行这些实验以监测在需要的发酵pH7.0和温度30℃从葡萄糖形成的甲羟戊酸或异戊二烯。从冷冻瓶取出大肠杆菌菌株的接种物，划线至LA培养基琼脂平板(含有抗生素)并在37℃温育。将单一菌落接种至胰蛋白胨酵母提取物培养基。当接种物生长至光密度1.0时(在550nm测定)，将其用于接种至生物反应器。
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。通过加入IPTG进行诱导。通过将高氯酸(Sigma-Aldrich#244252)处理的样品(0.3M，在4℃温育5分钟)施加至有机酸HPLC柱(BioRad#125-0140)来测定发酵液中甲羟戊酸的浓度。通过将培养液甲羟戊酸峰的大小与从经高氯酸处理的甲羟戊酸内酯(Sigma-Aldrich#M4667)以形成D，L-甲羟戊酸而生产的校正曲线进行比较来测定浓度。按照本文的描述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯的水平。异戊二烯效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。
II.以150L的规模从表达pTrcUpperMVA质粒的大肠杆菌BL21(DE3)细胞生产甲羟戊酸
按照上文实施例11第I部分的解释生长于平板上的BL21(DE3)细胞接种于含有45mL胰蛋白胨-酵母提取物培养基的培养瓶中并在30℃以170rpm振荡温育5小时。将该溶液转移至5L的生物反应器中的胰蛋白胨-酵母提取物培养基中，细胞在30℃和27.5rpm生长直至培养物达到OD550为1.0。将5L的接种物接种入含有45-kg培养基的150L生物反应器中。当OD550达到10时，使IPTG的浓度为1.1mM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图60A。甲羟戊酸效价随着发酵的进程提高至最终的值61.3g/L(图60B)。整个发酵过程中的比生产率谱显示于图60C，其与图60A的对比证明了生长与甲羟戊酸生产之间的解除偶联。在52.5小时的发酵过程中从利用的14.1kg的葡萄糖生产的甲羟戊酸的总量是4.0kg。用于在发酵过程中生产甲羟戊酸的所利用的碳的摩尔产率是34.2％。
III.以15L的规模从表达pTrcUpperMVA质粒的大肠杆菌BL21(DE3)细胞生产甲羟戊酸
按照上文实施例11第I部分的解释生长于平板上的BL21(DE3)细胞接种于含有500mL胰蛋白胨-酵母提取物培养基的培养瓶中并在30℃以160rpm生长至OD550 1.0。将该物质接种入含有4.5-kg培养基的15L生物反应器中。当OD550达到10时，使IPTG的浓度为1.0mM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图61A。甲羟戊酸效价随着发酵的进程达到最终的值53.9g/L(图61B)。整个发酵过程中的比生产率谱显示于图61C，其与图61A的对比证明了生长与甲羟戊酸生产之间的解除偶联。在46.6小时的发酵过程中从利用的2.1kg的葡萄糖生产的甲羟戊酸的总量是491g。用于在发酵过程中生产甲羟戊酸的所利用的碳的摩尔产率是28.8％。
IV.以15L的规模从表达pTrcUpperMVA质粒的大肠杆菌FM5细胞生产甲羟戊酸
按照上文实施例11第I部分的解释生长于平板上的FM5细胞接种于含有500mL胰蛋白胨-酵母提取物培养基的培养瓶中并在30℃以160rpm生长至OD550 1.0。将该物质接种入含有4.5-kg培养基的15L生物反应器中。当OD550达到30时，使IPTG的浓度为1.0mM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图62A。甲羟戊酸效价随着发酵的进程提高至最终的值23.7g/L(图62B)。整个发酵过程中的比生产率谱显示于图62C，其与图62A的对比证明了生长与甲羟戊酸生产之间的解除偶联。在51.2小时的发酵过程中从利用的1.1kg的葡萄糖生产的甲羟戊酸的总量是140g。用于在发酵过程中生产甲羟戊酸的所利用的碳的摩尔产率是15.2％。
V.以15L的规模从表达pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的大肠杆菌BL21(DE3)细胞生产异戊二烯
按照上文实施例11第I部分的解释生长于平板上的表达pCLPtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的BL21(DE3)细胞接种于含有500mL胰蛋白胨-酵母提取物培养基的培养瓶中并在30℃以160rpm生长至OD550 1.0。将该物质接种入含有4.5-kg培养基的15L生物反应器中。当OD550达到10时，使IPTG的浓度为25μM。当OD550达到190时，使IPTG的浓度升高至50uM。在发酵38小时的时候使IPTG的浓度升高至100uM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图63A。异戊二烯效价随着发酵的进程提高至最终的值2.2g/L发酵液(图63B)。整个发酵过程中的比生产率谱显示于图63C，其与图63A的对比证明了生长与异戊二烯生产之间的解除偶联。在54.4小时的发酵过程中从利用的2.3kg的葡萄糖生产的异戊二烯的总量是15.9g。用于在发酵过程中生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是1.53％。
VI.以15L的规模从表达pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的大肠杆菌BL21(DE3)tuner细胞生产异戊二烯
按照上文实施例11第I部分的解释生长于平板上的表达pCLPtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的BL21(DE3)tuner细胞接种于含有500mL胰蛋白胨-酵母提取物培养基的培养瓶中并在30℃以160rpm生长至OD550 1.0。将该物质接种入含有4.5-kg培养基的15L生物反应器中。当OD550达到10时，使IPTG的浓度为26μM。当OD550达到175时，使IPTG的浓度升高至50uM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图64A。异戊二烯效价随着发酵的进程提高至最终的值1.3g/L培养液(图64B)。整个发酵过程中的比生产率谱显示于图64C，其与图64A的对比证明了生长与异戊二烯生产之间的解除偶联。在48.6小时的发酵过程中从利用的1.6kg的葡萄糖生产的异戊二烯的总量是9.9g。用于在发酵过程中生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是1.34％。
VII.以15L的规模从表达pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的大肠杆菌MG1655细胞生产异戊二烯
按照上文实施例11第I部分的解释生长于平板上的表达pCLPtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的MG1655细胞接种于含有500mL胰蛋白胨-酵母提取物培养基的培养瓶中并在30℃以160rpm生长至OD550 1.0。将该物质接种入含有4.5-kg培养基的15L生物反应器中。当OD550达到45时，使IPTG的浓度为24μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图65A。异戊二烯效价随着发酵的进程提高至最终的值393mg/L培养液(图65B)。整个发酵过程中的比生产率谱显示于图65C，其与图65A的对比证明了生长与异戊二烯生产之间的解除偶联。在67.4小时的发酵过程中从利用的520g的葡萄糖生产的异戊二烯的总量是2.2g。用于在发酵过程中生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是0.92％。
VIII.以15L的规模从表达pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的大肠杆菌MG1655ack-pta细胞生产异戊二烯
按照上文实施例11第I部分的解释生长于平板上的表达pCLPtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的MG1655ack-pta细胞接种于含有500mL胰蛋白胨-酵母提取物培养基的培养瓶中并在30℃以160rpm生长至OD550 1.0。将该物质接种入含有4.5-kg培养基的15L生物反应器中。当OD550达到10时，使IPTG的浓度为30μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图66A。异戊二烯效价随着发酵的进程达到最终的值368mg/L培养液(图66B)。整个发酵过程中的比生产率谱显示于图66C，其与图66A的对比证明了生长与异戊二烯生产之间的解除偶联。在56.7小时的发酵过程中从利用的531g的葡萄糖生产的异戊二烯的总量是1.8g。用于在发酵过程中生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是0.73％。
IX.以15L的规模从表达pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的大肠杆菌FM5细胞生产异戊二烯
按照上文实施例11第I部分的解释生长于平板上的表达pCLPtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的FM5细胞接种于含有500mL胰蛋白胨-酵母提取物培养基的培养瓶中并在30℃以160rpm生长至OD550 1.0。将该物质接种入含有4.5-kg培养基的15L生物反应器中。当OD550达到15时，使IPTG的浓度为27μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图67A。异戊二烯效价随着发酵的进程达到最终的值235mg/L培养液(图67B)。整个发酵过程中的比生产率谱显示于图67C，其与图67A的对比证明了生长与异戊二烯生产之间的解除偶联。在52.3小时的发酵过程中从利用的948g的葡萄糖生产的异戊二烯的总量是1.4g。用于在发酵过程中生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是0.32％。
实施例12：在补料分批培养物中发酵且表达甲羟戊酸途径的基因的大肠杆菌的指数生长期期间生产异戊二烯
实施例12例示了在细胞的指数生长期期间生产异戊二烯。
培养基配方(每升发酵培养基)：
使用下列成分/升发酵培养基制备培养基：K2HPO47.5g，MgSO4＊7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，和1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于diH2O中。该溶液经高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺＊HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：
使用下列成分制备1000X改良痕量金属溶液：柠檬酸＊H2O 40g，MnSO4＊H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4＊7H2O 1g，CoCl2＊6H2O 1g，ZnSO＊7H2O 1g，CuSO4＊5H2O 100mg，H3BO3100mg，和NaMoO4＊2H2O 100mg。每种成分依次溶解于DiH2O水中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，以0.22μm的滤器无菌过滤。
在15L的生物反应器中以含有pCL PtrcUpperMVA和pTrcKKDyIkIS质粒的ATCC11303大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃从葡萄糖形成的异戊二烯。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)并在37℃温育。将单一菌落接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至5L的生物反应器。
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。在50小时的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是2.0kg。通过加入IPTG进行诱导。当550nm下的光密度(OD550)达到10的时候，使IPTG的浓度是25uM。当OD550达到190时，IPTG的浓度升高至50uM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图99。按照本文的描述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程达到最终的值1.4g/L(图100)。在50小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是10.0g。生物反应器内异戊二烯的比生产率随时间变化的图谱显示于图101。在发酵过程中促成生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是1.1％。从葡萄糖生产的异戊二烯的重量百分率产率是0.5％。
实施例13：可燃性模拟和异戊二烯测试
I.可燃性模拟和异戊二烯测试的概述
对于多种烃/氧/氮/水/二氧化碳混合物进行了可燃性模拟和实验。这种模拟和实验测试旨在确定在固定的压力和温度下，在指定的蒸汽和一氧化碳浓度下的异戊二烯和氧/氮/可燃性曲线。在表9中显示了模型条件的矩阵，在表10中显示了所进行的实验的矩阵。
表9.模拟的异戊二烯可燃性的总结
Figure BDA0000086907590002651
表10.异戊二烯可燃性测试的总结
II.计算的绝热火焰温度(CAFT)模型的描述
燃烧蔓延传播的计算的绝热火焰温度(CAFT)和选择的极限火焰温度用于确定异戊二烯的可燃性包迹。在该研究中用于计算火焰温度的计算机程序是NASA Glenn Research Center CEA(Chemical Equilibriumwith Applications)软件。
使用均一燃烧机制(其中燃料和氧化剂都处于气态)的绝热火焰温度模型来确定可燃性包迹包括5个步骤：选择需要的反应剂，选择测试条件，选择极限火焰温度，修改反应剂，和从计算中构建可燃性包迹。
在第一个步骤“选择需要的反应剂”中，必须确定将存在于系统中的反应剂种类和各自的数量。在很多情况下，用于计算的计算机程序具有反应剂和产物种类的列表。如果在程序中不存在要研究的种类的任何数据，则可以从其它来源例如JANAF表或从互联网获得它们。在本模型中，水、氮、氧和二氧化碳的数据存在于程序数据库中。程序数据库中不具有异戊二烯种类；因此，人工加入热力学特性。
下一个步骤是确定最初的压力和温度条件是否是发生燃烧过程的压力和温度。在该模型中，压力是1个大气压(绝对)，温度是40℃，即异戊二烯的沸点。
可以基于理论原理选择燃烧的极限火焰温度或通过实验来确定。每种方法具有其自身的限制性。
基于之前的研究，烃的极限火焰温度在1000K至1500K的范围内。对于该模型，选择1500K的数值。其是一氧化碳至二氧化碳的反应(高度放热的反应并构成显著比例的火焰能量)形成自我持续时的温度。
一且确定了极限火焰温度，在给定的反应剂混合物(种类浓度)上进行模拟计算并确定绝热火焰温度。只有当温度高于极限火焰温度时认为发生了火焰传播。然后修改反应剂混合物的组成以生产传播和非传播混合物的数据组。
这种类型的模型显示出与实验确定的可燃极限的良好的一致性。衍生的包迹之外的区域是不可燃的，其内的区域是可燃的。包迹的性质形成前端。包迹的前端与气态燃料的极限氧浓度(LOC)相关。
III.计算的绝热火焰温度(CAFT)的结果
图68-74中的图形分别是种类A至G的CAFT模型结果。对于系列A，对于多个氧水平，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。图中绘制了针对数种氧/氮比率(按重量计)的计算的绝热火焰温度(使用NASACEA程序)，其随着燃料浓度(按重量计)而变化。高于1500K(所选的极限火焰温度)的曲线的部分含有足以维持火焰传播的燃料水平。以图68-74呈现的形式可能难以判读结果。另外，目前的形式不利于与实验数据进行比较(实验数据一般是以体积百分率的形式呈现的)。
使用系列A作为实例，图68中的数据可以按照传统的可燃包迹作图。使用图68并从纵座标上的1500K温度线读取，可以通过针对与其交叉的每条曲线(氧/氮的比率)的横坐标取正切来确定该极限火焰温度的燃料浓度。然后可以将这些数值制成表格：针对给定重量百分率的氧化剂的燃料的重量百分率(图75A)。然后，已知燃料的组成(100wt.％异戊二烯)和氧化剂的组成(水、氧和氮的相对含量)，可以建立摩尔量。
从这些摩尔量可以计算百分体积浓度。然后可以将体积百分率形式的浓度作图以生产可燃包迹(图75B)。包迹包围的面积是可爆炸的范围，其外的是非可爆炸范围。包迹的前端是极限氧浓度。图76A和76B包含从图69呈现的数据生产的系列B的可燃性包迹的计算的体积浓度。可以在图70-74呈现的数据中使用类似的方法。
IV.可燃性测试的实验设备和程序
在4升的高压容器中进行可燃性测试。容器是圆柱形的，内径为6”，内高为8.625”。使用由PID控制器控制的外部加热器维持容器(以及其中的气体)的温度。为了防止热损失，在压力容器的周围包裹陶瓷羊毛和反射绝热体。使用K型热电偶来测定气体空间的温度以及容器本身的温度。图77例示了测试容器。
在进行测试之前，排空该容器并以氮气吹扫以确保除掉之前测试中的任何气体。然后对容器吸真空。在这之后的压力通常是0.06bar(a)。由于氮气的吹扫，假设生产此最初压力的气体是氮气。然后使用分压，加入合适量的水、异戊二烯、氮气、和氧气以达到所要的测试条件。容器内的磁力驱动的混合扇确保了气体内容物的混合。使气体混合大约2分钟，在点火前大约1分钟关闭风扇。
点火器包含位于定时电路上的1.5ohm nicrome线圈和交流电源。使用示波镜测定出34.4VAC被输送至点火器，持续3.2秒。在大约一半的点火周期内产生最大为3.8amp的电流。因此，最大电能是131W，点火周期提供的总能量是大约210J。
使用连接于数据获取系统的可变阻力Validyne DP215压力传感器获得爆燃数据。如果压力上升大于或等于5％，则认为气体混合物发生爆燃。
V.可燃性测试结果
在40℃和0psig没有蒸汽的情况下进行第一个实验系列(系列1)。在不同浓度的异戊二烯和氧下进行的测试生产了图78A所示的可燃性曲线。该曲线中显示的数据点仅仅是曲线边缘的点。该系列所获取的所有数据点的详细列表显示于图80A和80B。
图78B总结了图78A所显示的可爆炸数据点。图78C是实验数据与CAFT模型预测的可燃性包迹的比较。模型与实验数据良好吻合。不一致处可能是由于测试室的非绝热性和模型的局限性造成的。模型考虑的是氧化反应的无限时间范围，不考虑任何反应动力学限制。
另外，模型受到其数据库中的平衡化学种类的数目的限制，因此，可能不能正确预测热解种类。同样地，通过模型开发的可燃性包迹使用一个极限火焰温度值(1500K)。极限火焰温度可以是1,000K至1,500K范围的值，这取决于反应化学物质种类。在高于化学计量的燃料/氧化剂水平的燃料浓度下形成的热解化学物质种类的复杂性质是该模型可能不能精确预测该系统的燃烧上限的一个原因。
在40℃和0psig以固定的4％的蒸汽浓度进行第二个实验系列(系列2)。在不同浓度的异戊二烯和氧下进行的测定生产了如图79A所示的可燃性曲线。该曲线中显示的数据点仅仅是曲线边缘的点。该系列所获取的所有数据点的详细列表显示于图81。由于系列1中的数据之间的相似性，仅测试了燃烧下限、极限氧浓度、和燃烧上限的关键点。向测试混合物中加入4％的蒸汽未显著改变可燃性包迹的关键限值。应该注意：较高浓度的蒸汽/水和或其它惰性物(inertant)的加入可能影响可燃性包迹。
图79B总结了图79A所示的爆炸数据点。图79C是实验数据与CAFT模型预测的可燃性包迹的比较。模型与实验数据良好吻合。不一致处可能是由于系列1中描述的相同的因素。
VI.计算在3个大气压的压力下空气中的异戊二烯的可燃极限
同样使用实施例13第IV部分中描述的方法计算3个大气压的绝对系统压力和40℃下异戊二烯的可燃极限。将这些结果与实施例13第I-IV部分在1个大气压的绝对系统压力和40℃下的结果进行比较。测试较高的压力，这是因为可燃性包迹随着最初系统压力的增大而延伸或变得更大。燃烧上限受到的影响最大，其次是极限氧成分。燃烧下限受到的影响最小(见，例如“Bulletin 627-Flammability Characteristics ofCombustible Gases and Vapors”，作者Michael G.Zabetakis，由以前的US Bureau of Mines出版(1965)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于计算可燃极限的内容)。
在图82中，绘制计算的绝热火焰温度，其随着异戊二烯(燃料)浓度而变，浓度表示为总燃料/氮/氧的重量百分率，其中系统压力最初是3个大气压。计算的火焰温度与在1个大气压的系统中最初测定的非常相似(图83)。结果是：当使用计算的绝热可燃数据产生可燃性包迹时，曲线是非常相似的(见图84和85)。因此，基于这些理论计算，从1个大气压至3个大气压的系统压力增大不会导致可燃性包迹的显著增大/变宽。如果需要，可以使用实验测试(例如，如本文描述的在1个大气压的压力下进行的实验测试)来验证这些模型结果。
VII.可燃性研究的总结
对于40℃和0psig下的异戊二烯/氧/氮/水/二氧化碳系统的可燃性包迹开发了计算的绝热温度模型。所开发的CAFT模型与通过本研究中进行的测试所产生的实验数据良好吻合。来自系列1和2的实验结果验证了来自系列A和B的模型结果。
实施例14：表达构建体和菌株
I.编码甲羟戊酸激酶的质粒的构建
针对在大肠杆菌中的表达进行密码子优化，合成了编码马氏甲烷八叠球菌下部MVA途径(登记号NC_003901.1、NC_003901.1、NC_003901.1、和NC_003901.1，其通过引用方式全文并入本文)的构建体。该构建体被称作马氏甲烷八叠球菌远古下部途径操纵子(图112A-112C；SEQ ID NO：27)并编码马氏甲烷八叠球菌MVK、推定的脱羧酶、IPK、和IDI酶。根据生产商的程序，使用Strategene Herculase IIFusion试剂盒，使用引物MCM165和MCM177(表11)，使用30个循环(其中使用55℃的退火温度和60秒的延伸时间)，通过PCR扩增编码MVK(登记号NC_003901.1)的基因。使用Qiagen PCR柱纯化该扩增子，然后在37℃在10μL反应中以PmeI(在存在NEB缓冲液4和BSA的情况下)消化。1个小时后，加入NsiI和Roche缓冲液H，在37℃再反应1个小时。通过Qiagen PCR柱纯化经消化的DNA并在11uL反应(5uLRoche快速连接酶缓冲液1，1uL缓冲液2，1uL质粒，3uL扩增子，和1uL连接酶)中连接于经过类似消化和纯化的质粒MCM29(MCM29是经编码野葛异戊二烯合酶的pTrcKudzu转化的大肠杆菌TOP10(Invitrogen))(室温1小时)。MCM 29是pTrcKudzuKan。将连接反应物导入Invitrogen TOP10细胞并在LA/kan50平板上选择转化子，在37℃过夜温育。对得到的质粒MCM382中的MVK插入片段进行测序(图113A-113C；SEQ ID NO：28)。
表11.寡核苷酸
Figure BDA0000086907590002711
II.产生过表达甲羟戊酸激酶和异戊二烯合酶的菌株
将质粒MCM382转化进入已经在LB培养基中生长至指数中期的MCM331细胞(其包含编码酿酒酵母甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、和IPP异构酶的染色体构建体gi1.2KKDyI)，在冰冷的无菌水中洗涤3次。将1μL DNA加入到50μL细胞悬浮液中，将该混合物在2mm杯中以2.5伏特、25uFd进行电穿孔，然后立即在500μL LB培养基中在37℃恢复1小时。在LA/kan50上选择转化子并命名为MCM391。通过相同的电穿孔程序将质粒MCM82导入该菌株，并在LA/kan50/spec50上选择。得到的菌株MCM401包含cmp-标记的染色体构建体gi1.2KKDyI，kan-标记的质粒MCM382和spec-标记的质粒MCM82(其为编码粪肠球菌mvaE和mvaS的pCL PtrcUpperPathway)。见表12。
表12.过表达甲羟戊酸激酶和异戊二烯合酶的菌株
Figure BDA0000086907590002721
III.质粒MCM376的构建-将来自马氏甲烷八叠球菌远古下部的MVK构建进入pET200D
使用Invitrogen Platinum HiFi PCR混合物，使用引物MCM161和MCM162(表11)，通过PCR扩增来自马氏甲烷八叠球菌远古下部途径操纵子(图112A-112C；SEQ ID NO：27)的MVK ORF。将45uL PCR混合物与1uL模板、1uL 10uM的每种引物、和2uL水混合。反应循环如下：94℃2分钟；30个循环的“94℃30秒，55℃30秒，和68℃1分15秒”，然后72℃7分钟，置于4℃直至冷却。根据生产商的程序，将3uL该PCR反应物连接进入Invitrogen pET200D质粒。将3uL此连接物导入Invitrogen TOP10细胞，在LA/kan50上选择转化子。分离来自转化子的质粒并对插入片段进行测序，得到MCM376(图114A-114C；SEQ ID NO：29)。
V.表达菌株MCM378的构建
根据生产商的程序，将质粒MCM376转化进入Invitrogen BL21(DE3)pLysS细胞。在LA/kan50上选择转化子MCM378。
实施例15：由以20mL的批式规模在补料分批培养物中生长且表达上部甲羟戊酸(MVA)途径、整合的下部MVA途径(gi1.2KKDyI)、来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶、和来自野葛的异戊二烯合酶的大肠杆菌中生产异戊二烯
培养基配方(每升发酵培养基)：
每升发酵培养基包含：K2HPO413.6g，KH2PO413.6g，MgSO4＊7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，(NH4)2SO43.2g，酵母提取物1g，和1000X痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于diH2O中。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至6.8并定容。以0.22μm的滤器无菌过滤培养基。灭菌后加入葡萄糖(2.5g)和抗生素并调节pH。
1000X痕量金属溶液：
1000X痕量金属溶液包含：柠檬酸＊H2O 40g，MnSO4＊H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4＊7H2O 1g，CoCl2＊6H2O 1g，ZnSO4＊7H2O 1g，CuSO4＊5H2O 100mg，H3BO3100mg，和NaMoO4＊2H2O 100mg。每种成分逐一溶解于diH2O中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，并以0.22μm的滤器无菌过滤。
菌株：
MCM343细胞是含有上部甲羟戊酸(MVA)途径(pCL Upper)、整合的下部MVA途径(gi1.2KKDyI)、和来自野葛的异戊二烯合酶(pTrcKudzu)的BL21(DE3)大肠杆菌细胞。
MCM401细胞是含有上部甲羟戊酸(MVA)途径(pCLPtrcUpperPathway)、整合的下部MVA途径(gi1.2KKDyI)、以及高表达的来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶和来自野葛的异戊二烯合酶(pTrcKudzuMVK(马氏甲烷八叠球菌))的BL21(DE3)大肠杆菌细胞。
通过在30℃的温度在100mL生物反应器中的20mL的工作体积中生长菌株来分析异戊二烯的生产。将取自冷冻瓶的大肠杆菌菌株接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)并在30℃温育。将单一菌落接种至培养基并过夜生长。将细菌稀释进入20mL的培养基以达到0.05的光密度(在550nm测定)。将100mL的生物反应器密封，以8mL/分钟的速率泵入空气。通过使用磁力搅拌子以600rpm搅拌而实现培养基的充分搅拌。使用在线Hiden HPR-20质谱仪分析来自生物反应器的废气。监测对应于异戊二烯、CO2、和空气中天然存在的其它气体的质量。通过加和各气体随时间变化的浓度(以百分率表示)而计算累积的异戊二烯和CO2的生产。从总数中减掉大气的CO2以估计由于代谢活性而释放的CO2。
将100mL生物反应器中由表达完整甲羟戊酸途径和野葛异戊二烯合酶的菌株(MCM343)生产的异戊二烯与另外还过表达来自马氏甲烷八叠球菌的MVK和野葛异戊二烯合酶的菌株(MCM401)进行比较。细菌在相同的条件下在确定的培养基中以葡萄糖作为碳源生长。通过加入终浓度为100uM或200uM的异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)进行异戊二烯生产的诱导。废气测定揭示：相对于仅表达甲羟戊酸途径和野葛异戊二烯合酶的菌株(MCM343)，过表达MVK和异戊二烯合酶的菌株(MCM401)生产显著更多的异戊二烯，如图115A-115D所示。在100uM诱导时，MCM401菌株生产的异戊二烯比MCM343菌株多2倍。在200uM诱导时，MCM401菌株生产的异戊二烯比MCM343菌株多3.4倍。对来自生物反应器的废气中的CO2(其为代谢活性的度量)进行的分析表明：代谢活性不依赖于IPTG诱导和异戊二烯的生产。
实施例16：由以15L的规模在补料分批培养物中生长且表达上部甲羟戊酸(MVA)途径、整合的下部MVA途径(gi1.2KKDyI)、来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶、和来自野葛的异戊二烯合酶的大肠杆菌生产异戊二烯
培养基配方(每升发酵培养基)：
每升发酵培养基包含：K2HPO47.5g，MgSO4＊7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g、和1000X痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加且溶解于DiH2O中。将该溶液高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺＊HCl0.1g、和抗生素并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：
1000X改良痕量金属溶液包含：柠檬酸＊H2O 40g，MnSO4＊H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4＊7H2O 1g，CoCl2＊6H2O 1g，ZnSO4＊7H2O 1g，CuSO4＊5H2O 100mg，H3BO3100mg，和NaMoO4＊2H2O 100mg。每种成分逐一溶解于DiH2O中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，并以0.22μm的滤器无菌过滤。
在15L的生物反应器中以含有上部甲羟戊酸(MVA)途径(编码粪肠球菌mvaE和mvaS的pCL PtrcUpperPathway)、整合的下部MVA途径(编码酿酒酵母甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、和IPP异构酶的gi1.2KKDyI)、以及高度表达的来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶和来自野葛的异戊二烯合酶(pTrcKudzuMVK(马氏甲烷八叠球菌))的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃从葡萄糖形成的异戊二烯。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)并在37℃温育。将单一菌落接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至15L生物反应器中的5L培养基。
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。在68小时的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是3.8kg。通过加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)进行诱导。当550nm下的光密度(OD550)达到9的时候，使IPTG的浓度是51uM。当OD550达到149时，IPTG的浓度升高至88uM。当OD550＝195时，加入另外的IPTG使浓度升高至119uM，当OD550＝210时，使IPTG浓度升高至152uM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图116。使用Hiden质谱仪测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程提高至最终的值23.8g/L(图117)。在68小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是227.2g，生产的时间进程显示于图118。通过TCER测定的代谢活性谱显示于图119。在发酵的10至39小时，总的活计数(总的菌落形成单位)降低了2个数量级(图120)。在发酵过程中用于生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是13.0％。从葡萄糖生产的异戊二烯的重量百分率产率是6.3％。
实施例17：由以15L的规模(2x100μM IPTG诱导)在补料分批培养物中生长且表达上部甲羟戊酸(MVA)途径、整合的下部MVA途径(gi1.2KKDyI)、来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶、和来自野葛的异戊二烯合酶的大肠杆菌生产异戊二烯
培养基配方(每升发酵培养基)：
每升发酵培养基包含：K2HPO47.5g，MgSO4＊7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g、和1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于DIH2O中。将该溶液高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺＊HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：
1000X改良痕量金属溶液包含：柠檬酸＊H2O 40g，MnSO4＊H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4＊7H2O 1g，CoCl2＊6H2O 1g，ZnSO4＊7H2O 1g，CuSO4＊5H2O 100mg，H3BO3100mg，和NaMoO4＊2H2O 100mg。每种成分逐一溶解于DiH2O中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，并以0.22μm的滤器无菌过滤。
在15L的生物反应器中以含有上部甲羟戊酸(MVA)途径(编码粪肠球菌mvaE和mvaS的pCL PtrcUpperPathway)、整合的下部MVA途径(编码酿酒酵母甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、和IPP异构酶的gi1.2KKDyI)、以及高度表达的来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶和来自野葛的异戊二烯合酶(pTrcKudzuMVK(马氏甲烷八叠球菌))的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃从葡萄糖形成的异戊二烯。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)并在37℃温育。将单一菌落接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至15L生物反应器中的5L培养基。
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。在55小时的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是1.9kg。通过加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)进行诱导。当550nm下的光密度(OD550)达到9的时候，使IPTG的浓度是111uM。当OD550达到155时，IPTG的浓度升高至193uM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图121。使用Hiden质谱仪测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程提高至最终的值19.5g/L(图122)。在55小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是133.8g，生产的时间进程显示于图123。瞬时体积生产率水平达到了高达1.5g异戊二烯/升培养液/小时的数值(图124)。瞬时产率水平达到了高达17.7％w/w(图125)。通过TCER测定的代谢活性谱显示于图126。在发酵的8至36小时，总的活计数(总的菌落形成单位)降低了2个数量级(图127)。在发酵过程中用于生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是15.8％。在整个发酵过程中从葡萄糖生产的异戊二烯的重量百分率产率是7.4％。
此外，作为对照，在15L的生物反应器中以含有上部甲羟戊酸(MVA)途径(编码粪肠球菌mvaE和mvaS的pCL PtrcUpperPathway)、整合的下部MVA途径(编码酿酒酵母甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、和IPP异构酶的gi1.2KKDyI)、以及高度表达的来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶和来自野葛的异戊二烯合酶(pTrcKudzuMVK(马氏甲烷八叠球菌))的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃从葡萄糖的未经诱导的细胞代谢活性(如通过CER所测)。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株(如上所述的MCM401)的接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)并在37℃温育。将单一菌落接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至15L生物反应器中的5L培养基。以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。
图148比较了如上所述的未经诱导的细胞与实施例16和17中的通过加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)进行诱导的细胞的CER谱。
实施例18：从以15L的规模(1x50μM IPTG+150μM IPTG进料诱导)在补料分批培养物中生长且表达上部甲羟戊酸(MVA)途径、整合的下部MVA途径(gi1.2KKDyI)、来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶、和来自野葛的异戊二烯合酶的大肠杆菌生产异戊二烯
培养基配方(每升发酵培养基)：
每升发酵培养基包含：K2HPO47.5g，MgSO4＊7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，和1000X痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于diH2O中。将该溶液高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺＊HCl0.1g、和抗生素并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：
1000X改良痕量金属溶液包含：柠檬酸＊H2O 40g，MnSO4＊H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4＊7H2O 1g，CoCl2＊6H2O 1g，ZnSO4＊7H2O 1g，CuSO4＊5H2O 100mg，H3BO3100mg，和NaMoO4＊2H2O 100mg。每种成分逐一溶解于DiH2O中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，并以0.22μm的滤器无菌过滤。
在15L的生物反应器中以含有上部甲羟戊酸(MVA)途径(编码粪肠球菌mvaE和mvaS的pCL PtrcUpperPathway)、整合的下部MVA途径(编码酿酒酵母甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、和IPP异构酶的gi1.2KKDyI)、以及高度表达的来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶和来自野葛的异戊二烯合酶(pTrcKudzuMVK(马氏甲烷八叠球菌))的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃从葡萄糖形成的异戊二烯。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)并在37℃温育。将单一菌落接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至15L生物反应器中的5L培养基。
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。在55小时的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是2.2kg。通过加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)进行诱导。当550nm下的光密度(OD550)达到10的时候，使IPTG的浓度是51uM。除了掺入IPTG之外，在OD550＝10时，开始恒定进料，经18小时的时间加入164mg IPTG。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图128。使用Hiden质谱仪测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程提高至最终的值22.0g/L(图129)。在55小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是170.5g，生产的时间进程显示于图130。通过TCER测定的代谢活性谱显示于图131。当通入生物反应器中的气流在大约1.7小时的时间从8slpm下降至4slpm时废气中的异戊二烯的浓度从0.51w/w％升高至0.92w/w％(图132)。异戊二烯的这些升高的水平似乎没有对细胞代谢活性(如通过总二氧化碳释放速率(TCER)所测定)造成任何不利影响，因为TCER在37.2至39.3小时仅下降了7％(图132)。在发酵的7至36小时，总的活计数(总的菌落形成单位)降低了2个数量级(图133)。在发酵过程中用于生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是16.6％。在整个发酵过程中从葡萄糖生产的异戊二烯的重量百分率产率是7.7％。
实施例19：外部添加的异戊二烯对于以1L的规模在补料分批培养物中生长的野生型大肠杆菌的影响
培养基配方(每升发酵培养基)：
每升发酵培养基包含：K2HPO47.5g，MgSO4＊7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，和1000X痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于diH2O中。将该溶液高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺＊HCl0.1g、和抗生素并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：
1000X改良痕量金属溶液包含：柠檬酸＊H2O 40g，MnSO4＊H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4＊7H2O 1g，CoCl2＊6H2O 1g，ZnSO4＊7H2O 1g，CuSO4＊5H2O 100mg，H3BO3100mg，和NaMoO4＊2H2O 100mg。每种成分逐一溶解于DiH2O中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，并以0.22μm的滤器无菌过滤。
在1L的生物反应器中以BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃异戊二烯对于葡萄糖补料分批生物反应器中的细胞存活性和代谢活性的影响。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。当接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用50mL接种至1L生物反应器中的0.5L培养基。
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。使用氮气作为载体将异戊二烯进料到生物反应器中。在生长中期(OD550＝31-44)，异戊二烯进料速率是1g/L/hr，共持续75分钟(从13.2至14.4小时)。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图134。通过TCER测定的代谢活性谱显示于图135。在将异戊二烯导入生物反应器的时间段期间，总的活计数(总的菌落形成单位)升高了14倍(图136)。
实施例20：通过酿酒酵母生产异戊二烯和表达异戊二烯合酶
根据酿酒酵母/巴斯德毕赤酵母的杂交体的密码子使用表，优化用于表达的野葛异戊二烯合酶，合成并克隆进入pDONR221：19430(由DNA2.0进行，其图谱见图140，其序列见图141(SEQ ID NO：38))。根据生产商的程序，进行
Figure BDA0000086907590002811
Cloning(Invitrogen)反应：由于pDONR221：19430是“进入”载体，所以使用LR Clonase II酶(LR反应)将密码子优化的异戊二烯合酶导入“目的”载体pYES-DEST52(Invitrogen)。
根据生产商的程序，将LR反应转化进入Top10化学感受态细胞，在含有50μg/ml羧苄西林的LA平板上选择携带具有异戊二烯合酶ORF的pYES-DEST52质粒的细菌。使用illustra PuReTaq Ready-To-GoTMPCR Beads(GE Healthcare)，使用T7正向引物和酵母异戊二烯合酶-Rev2引物(见表13)，通过菌落PCR检测单个的阳性转化子(关于引物浓度和热循环参数见下文)。
表13.用于扩增异戊二烯合酶的引物序列
Figure BDA0000086907590002821
通过微量制备(Qiagen)纯化产生正确大小(1354bp)的PCR片段的质粒并送去测序(Quintara Biosciences，Berkeley，CA)：使用T7正向和酵母异戊二烯合酶-For2引物(见表13)。将来自测序的结果与pDONR221：19430的已知序列进行比较(使用Vector NTI软件，Invitrogen)，选择了一个质粒pDW14进行进一步研究(其图谱见图142A，其完整序列见图142B和C(SEQ ID NO：39))。pDW14的序列与pDONR221：19430的序列的差异仅在于一个核苷酸(在图142B中以黑体标示)。单一核苷酸变化(G至A)没有引起ORF的变化，因为其位于编码赖氨酸的密码子的第三位。尚不知道该碱基变化是在LR克隆反应中被导入的，还是由DNA 2.0合成的原始序列中的错误。所有的经测序的质粒都含有该碱基变化。
使用S.c.EasyComp转化试剂盒(Invitrogen)中描述的程序，将纯化的pDW14转化进入酿酒酵母菌株INVSc-1。在含有2％葡萄糖而不含尿嘧啶的SC最简培养基上选择并维持携带pDW14或pYES-DEST52(其含有完整的URA3基因)的INVSc-1菌株，如pYES-DEST52Gateway Vector说明书(Invitrogen)中所描述。选择了含有pDW14的INVSc-1的两个独立的分离体和具有pYES-DEST52的单一对照菌株以进行进一步研究。
为了诱导异戊二烯合酶的表达，使培养物在液体SC最简培养基中生长过夜。然后将培养物稀释至OD600为大约0.2并生长2-3天。通过离心使培养物沉淀，洗涤一次，重悬于等体积(10ml)的含有1％棉子糖、2％半乳糖而不含尿嘧啶的SC最简培养基中，并过夜生长以诱导异戊二烯合酶的表达。测定菌株的OD600(图144A)，通过离心收获菌株并重悬于2ml裂解缓冲液(1∶1的混合物：50％甘油和PEB pH 7.4：Tris Base 2.423g/L，MgCl2(无水)1.904g/L，KCl 14.910g/L，DTT 0.154g/L，甘油50mL/L)中。
使裂解混合物通过弗氏压碎器3次，通过SDS-PAGE分析裂解物。为了进行考马斯凝胶分析(图143A)，以含有还原剂的2X SDS装载缓冲液1∶1稀释样品，载入(总体积20μl)4-12％bis-tris凝胶，在MES缓冲液中跑胶，根据生产商的程序(Invitrogen Novex system)，以SimplyBlueSafeStain染色。
使用WesternBreeze试剂盒(Invitrogen)转移并通过颜色在硝酸纤维素膜上检测异戊二烯合酶。一抗是在Invitrogen抗体稀释剂中1∶1000稀释的1799A 10week。一抗结合之后，使用以Alexa Fluor 488(InvitrogenCatalog No.A-11008)标记的二抗显影，以允许进行定量信号测定。按照Invitrogen的描述进行蛋白质印迹程序。使用蓝色滤光器设定以Molecular Dynamics Storm仪器记录荧光信号并使用MolecularDynamics ImageQuant图像分析软件包进行定量分析。从所生产的异戊二烯的量与诱导培养物的A600或通过蛋白质印迹测定的异戊二烯合酶蛋白浓度的比值计算文库成员的比活性。图143B显示：对比于携带pYES-DEST52的对照(泳道1)，异戊二烯合酶存在于携带pDW14的诱导的INVSc-1菌株中(泳道2和3)。
在来自每种菌株的25μL裂解物(其中添加了5μL 1M MgCl2、5μL100mM DMAPP、和65μL 50mM Tris pH 8)中进行异戊二烯合酶顶空的DMAPP测定。在30℃在气密性的1.8mL GC管中进行反应15分钟。通过加入100uL 250mM EDTA pH 8、.使反应终止。图144B显示了相对于对照的携带pDW14的诱导的菌株的比活性数值(以μg HG/L/OD表示)。携带pDW14的诱导的菌株显示出比不含异戊二烯合酶的对照高大约20倍的活性。
PCR循环参数
在25μl总体积/反应中，以每种浓度为0.4μM的寡核苷酸引物对使用Illustra PuReTaq Ready-To-GoTM PCR Beads(GE Healthcare)。为了分析由LR Clonase反应(Invitrogen)产生的质粒，将来自选择性平板上的单个菌落的少量细菌添加至含有如上所述的PCR混合物的每个管中。反应循环如下：1)95℃，4分钟；2)95℃，20秒；3)52℃，20秒；4)72℃，30秒；5个循环的步骤2至4；5)95℃，20秒；6)55℃，20秒；7)72℃，30秒；25个循环的步骤5至7，72℃10分钟，4℃直至冷却。
实施例21：在假单胞菌和其它革兰氏阴性细菌中生产异戊二烯，pBBR5HGSOpt2_2的构建，在假单胞菌中的接合和异戊二烯合酶活性的测定
针对不同的目标微生物物种对编码来自葛根(野葛植物)的异戊二烯合酶的基因进行密码子优化(表14；fluo-opt2v2是所选的序列)，并由DNA2.0，Menlo Park，CA合成。fluo-opt2v2的图谱和序列可以见图145A和145B(SEQ ID NO：40)。向合成的序列中加入HindIII和BamHI限制性位点以便于克隆，在ATG之前添加RBS以增强转录。
在来自葛根的不同形式的密码子优化的异戊二烯合酶中，稀少密码子的数目与微生物物种有关。数轮的优化产生了在所有的目标物种中都不具有稀少密码子的基因。
表14.稀少密码子的数目
Figure BDA0000086907590002851
基因由DNA2.0提供，处于克隆载体中。以HindIII/BamHI消化该载体，凝胶纯化对应于目标插入片段的带，并重新与HindIII/BamHI消化的pBBR1MCS5(Kovach等人，Gene 166：175-176，1995，其通过引用方式全文并入本文尤其是关于pBBR1MCS5的内容)连接，图谱见图146A，序列见图146B  和C(SEQ ID NO：41)。这产生了质粒pBBR5HGSOpt2_2(图谱见147A，序列见147B和C(SEQ ID NO：42))，其中异戊二烯合酶表达自存在于pBBR1MCS5中的lac启动子。
将该载体转化进入大肠杆菌S17-1并与恶臭假单胞菌F1ATCC700007和荧光假单胞菌ATCC 13525交配。在LB上接合之后，在M9+16mM柠檬酸钠+50ug/ml庆大霉素上选择携带质粒的假单胞菌菌株。使用Qiagen试剂盒(Valencia，CA)通过质粒制备检查由此产生的菌株中的质粒的存在。
重组菌株恶臭假单胞菌pBBR5HGSOpt2_2和荧光假单胞菌pBBR5HGSOpt2_2的异戊二烯合酶活性这样测定：使菌株在TM3培养基(如实施例1第II部分中所描述)+10g/L葡萄糖中生长，收集指数中期的生物质，通过弗氏压碎器破碎细胞并进行DMAPP测定。测定的结果显示于表15。通过DMAPP测定法测定的活性的存在确认：异戊二烯合酶在假单胞菌中表达。
检测了从lac启动子(使用质粒pBBR5HGSOpt2_2)表达异戊二烯合酶的恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌中的异戊二烯合酶活性。
表15.恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌中的异戊二烯合酶活性
Figure BDA0000086907590002861
实施例22：大肠杆菌和假单胞菌在蔗糖上的生长与在葡萄糖上的生长的对比，以及使用两种底物表达异戊二烯合酶
I.液态蔗糖的制备
按照下述方式将结晶的粗蔗糖溶解于水中：将750g H2O加入到250g糖中。搅拌该溶液并稍微加热直至溶解。一些物质不溶。溶解后将溶液的重量调整至1kg以补充蒸发的水。溶液的体积经测定是940mL。因此，该溶液的浓度是265g/L。产品标签宣称：15g粗蔗糖含14g碳水化合物。因此，该溶液的碳水化合物浓度是248g/L。经测定干固体是24.03％，非常接近预期的250g/kg。该溶液的pH是5.49。使用葡萄糖氧化酶，通过酶促/分光光度测定法测定葡萄糖浓度。葡萄糖浓度是17.4g/L。
由于多数微生物不利用蔗糖，但是能够利用葡萄糖和果糖，所以将该溶液分成2份。一半进行高压灭菌一次，持续30分钟(蔗糖维持原样)。产生了一些转化糖，因为葡萄糖含量增加至29.75g/L(见图149)。使用磷酸将该溶液的另一半调节至pH 4.0，通过高压灭菌使该溶液转化(转化的蔗糖)。3轮30分钟的循环足以获得完全转化，如图149所示。两个溶液都用于如下所述的生长曲线。
II.大肠杆菌和假单胞菌的不同菌株在蔗糖上的生长曲线与在葡萄糖上的生长曲线的对此
将表16所示的每种菌株的一个菌落接种于25ml TM3+10g/L葡萄糖，并在30℃和200rpm过夜生长。TM3如实施例7第II部分所描述。次晨，使用1ml的每种培养物接种含有25mL TM3+10g/L葡萄糖、10g/L原样蔗糖、或10g/L转化蔗糖(如上所述的蔗糖溶液)的培养瓶中。在30℃和200rpm温育培养瓶，定期取出样品以测定OD600。图150和151显示：对于葡萄糖和转化的蔗糖而言，对于假单胞菌和大肠杆菌菌株，生长速率和生物质产率是相当的。荧光假单胞菌也显示出一些能够利用未被转化的蔗糖的迹象。
表16.本研究中使用的菌株
  菌株
  大肠杆菌   BL21
  MG1655
  ATCC11303
  B REL 606
  假单胞菌   恶臭假单胞菌F1(ATCC700007)
 荧光假单胞菌(ATCC13525)
III.在葡萄糖上生长的与在蔗糖上生长的表达异戊二烯合酶的大肠杆菌生产异戊二烯的比较
如实施例14第II部分所述的含有完整MVA途径、来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶和来自葛根的异戊二烯合酶的大肠杆菌MCM401(BL21(DE3))生长于TM3+10g/L葡萄糖或10g/L转化的蔗糖(基于糖浆中的碳水化合物浓度)上。将OD600＝0.2的培养于TM3+10g/L葡萄糖的过夜培养物接种至培养瓶。视需要加入抗生素。2小时后，以400μM IPTG诱导大肠杆菌培养物。生长6小时后，通过实施例2B中描述的DMAPP测定法测定异戊二烯产量和异戊二烯合酶活性。结果显示于表17，其清楚地表明：就异戊二烯和异戊二烯合酶的产量而言(基于每个细胞)，转化的蔗糖与葡萄糖是等同的。
表17
Figure BDA0000086907590002881
实施例23：表达酿酒酵母gi1.2KKDyI操纵子、银白杨异戊二烯合酶、马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶、pCL Upper MVA(粪肠球菌mvaE和mvaS)和ybhE(pgl)的大肠杆菌菌株的构建
(i)菌株EWL201(BL21，Cm-GI1.2-KKDyI)的构建
经MCM331P1裂解物(根据Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology.John Wiley and Sons，Inc.描述的方法制备的裂解物)转导的大肠杆菌BL21(Novagen brand，EMD Biosciences，Inc.)是受体菌株。MCM331细胞含有编码酿酒酵母甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、和IPP异构酶(即来自酿酒酵母的gi1.2-KKDyI操纵子)的染色体构建体gi1.2KKDyI。通过将细胞涂覆于L琼脂和20μg/μl氯霉素上来选择转导子。将平板在30℃温育过夜。转导子分析显示：在对照平板(水+细胞对照平板，用于逆转；水+P1裂解物对照平板，用于裂解物污染)上没有菌落。
挑取了4个转导子并用于接种5mL L Broth和20μg/μl氯霉素。培养物在30℃以200rpm振荡生长过夜。为了制备用于PCR分析的每个转导子的基因组DNA制备物，离心1.5mL过夜细胞培养物。将细胞沉淀重悬于400μl重悬缓冲液(20mM Tris，1mM EDTA，50mM NaCl，pH7.5)，加入4μl不含DNA酶的RNA酶(Roche)。在37℃将管温育30分钟，然后加入4μl 10％SDS和4μl 10mg/ml的蛋白酶K贮液(Sigma-Aldrich)。在37℃将管温育1小时。将细胞裂解物转移至2mlPhase Lock Light Gel管(Eppendorf)，加入各200μl的饱和苯酚pH7.9(Ambion Inc.)和氯仿。将管混合均匀并微离心5分钟。使用400μl氯仿进行第二次提取，将含水层转移至新的eppendorf管。通过加入1ml 100％的乙醇并离心5分钟使基因组DNA沉淀。以1ml 70％的乙醇洗涤基因组DNA沉淀。除掉乙醇，使基因组DNA沉淀短暂风干。将基因组DNA重悬于重悬于200μl TE。
使用Pfu Ultra II DNA聚合酶(Stratagene)和200ng/μl基因组DNA作为模板，根据生产商的说明书制备了2组不同的PCR反应管。对于第1组，使用引物MCM130和GB Cm-Rev(表18)以确保转导子正确地整合进入attTn7基因座。用于第1组的PCR参数是：95℃2分钟(仅第一个循环)；95℃25秒，55℃25秒，72℃25秒(步骤2-4重复28个循环)；72℃1分钟。对于第2组，使用引物MVD For和MVD Rev(表18)以确保gi1.2-KKDyI操纵子正确整合。用于第2组的PCR参数是：95℃2分钟(仅第一个循环)；95℃25秒，55℃25秒，72℃10秒(步骤2-4重复28个循环)；72℃1分钟。在1.2％E-凝胶(Invitrogen Corp.)上对PCR扩增子的分析表明：所有4个转导子克隆都是正确的。挑取1个并命名为菌株EWL201。
(ii)菌株EWL204(BL21，环出-GI1.2-KKDyI)的构建
按照Datsenko和Wanner(2000)(Datsenko等人，Proc Natl.Acad.SciUSA 97：6640-6645，2000)的描述，使用质粒pCP20从菌株EWL201中环出氯霉素标志物。使用PCR产物将大肠杆菌K-12中的氯霉素基因进行一步失活(Datsenko等人，PNAS，97：6640-6645，2000)。EWL201细胞在LBroth中生长至指数中期，然后在冰冷的无菌水中洗涤3次。将50μl的细胞悬浮液等份与1μl pCP20混合，使用基因脉冲电穿孔仪(Bio-RadInc.)，在2mm杯(Invitrogen Corp.)中在2.5伏特和25uFd，将细胞悬浮液混合物进行电穿孔。立即向细胞中加入1ml LB，然后转移进入具有金属盖的14ml聚丙烯管(Sarstedt)中。通过在30℃生长1小时而使细胞恢复。在L琼脂和20μg/μl氯霉素和50μg/μl羧苄西林上选择转化子并在30℃过夜温育。次日，单一克隆在30℃在10ml L Broth和50μg/μl羧苄西林上生长直至早期对数期。然后使生长中的培养物的温度变为42℃，持续2小时。进行连续稀释，然后将细胞涂覆于LA平板(无抗生素选择)并在30℃过夜温育。次日，挑取20个菌落并点染至L琼脂(无抗生素)和LA+20μg/μl氯霉素平板。然后将平板在30℃过夜温育。能够在LA平板上生长但不能在LA+20μg/μl氯霉素平板上生长的细胞被认为是发生了氯霉素标志物环出(挑取1个并命名为菌株EWL204)。
(iii)质粒pEWL230(pTrc P.alba)的构建
基于针对大肠杆菌表达的密码子优化方法，将产生编码银白杨异戊二烯合酶(银白杨HGS)的合成基因的工作外包给DNA2.0Inc.(MenloPark，CA)。将合成的基因订制克隆进入质粒pET24a(Novagen brand，EMD Biosciences，Inc.)并冻干运输(图152，153A-B；SEQ ID NO：43)。
根据生产商的说明书，使用pET24a银白杨HGS作为模板，引物MCM182和MCM192以及Herculase II Fusion DNA聚合酶(Stratagene)，进行PCR反应以扩增银白杨异戊二烯合酶(银白杨HGS)基因。PCR条件如下：95℃2分钟(仅第一个循环)；95℃25秒，55℃20秒，72℃1分钟(重复25个循环)；最后在72℃延伸3分钟。使用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen Inc.)纯化银白杨异戊二烯合酶PCR产物。
然后在含有1μl BspHI核酸内切酶(New England Biolabs)和2μl 10XNEB缓冲液4的20μl反应物中消化银白杨异戊二烯合酶PCR产物。将反应物在37℃温育2小时。然后使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化消化的PCR片段。在含有1μl PstI核酸内切酶(Roche)和2μl 10X缓冲液H的20μl反应物中进行第二限制性消化。将反应在37℃温育2小时。然后使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化消化的PCR片段。在含有1μlNcoI核酸内切酶(Roche)、1μl PstI核酸内切酶、和2μl 10X缓冲液H的20μl反应物中消化质粒pTrcHis2B(Invitrogen Corp.)。将反应物在37℃温育2小时。使用1.2％E-凝胶(Invitrogen Corp.)凝胶纯化经消化的pTrcHis2B载体，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)提取(图154)。使用BspHI和NcoI位点的兼容性粘末端，制备20μl连接反应物，其中含有5μl银白杨异戊二烯合酶插入片段、2μl pTrc载体、1μl T4DNA连接酶(New England Biolabs)、2μl 10X连接酶缓冲液、和10μl ddH2O。将连接混合物在室温温育40分钟。使0.025μm硝酸纤维素膜滤纸(Millipore)在ddH2O的皮氏培养皿中漂浮并将连接混合物轻轻地施加于所述硝酸纤维素膜滤纸上并在室温持续30分钟，以此来使连接混合物脱盐。MCM446细胞(见第II部分)在LB中生长至指数中期，然后在冰冷的无菌水中洗涤3次。将50μl细胞悬浮液等份试样与5μl脱盐的pTrcP.albaHGS连接混合物混合在一起。使用基因脉冲电穿孔仪，在2mm杯中在2.5伏特和25uFd对细胞悬浮液混合物进行电穿孔。立即向细胞中加入1ml LB，然后转移至具有金属盖的14ml聚丙烯管(Sarstedt)。通过在30C生长2小时使细胞恢复。在L琼脂和50μg/μl羧苄西林和10mM甲羟戊酸上选择转化子并在30℃温育。次日，挑取6个转化子并在30℃在5ml L Broth和50μg/μl羧苄西林管中过夜生长。使用QIAquick旋转微量制备试剂盒(Qiagen)在过夜培养物上进行质粒制备。由于使用了BL21细胞用于繁殖质粒，所以在生产商的标准程序中引入了下列修改：以5X的PB缓冲液和3X的PE缓冲液洗涤旋转柱，以实现高质量的质粒DNA。在20μl反应中以PstI消化质粒以确保正确大小的线性片段。所有6个质粒都是正确大小，并送去Quintara Biosciences(Berkeley，CA)测序，测序使用引物MCM65、MCM66、EL1000(表18)。DNA测序结果显示：所有6个质粒都是正确的。挑取1个质粒命名为质粒EWL230(图155，156A-B；SEQ ID NO：44)。
(iv)质粒pEWL244(pTrc P.alba-mMVK)的构建
根据生产商的说明书，使用MCM376作为模板(见下文第(v)部分)、引物MCM165和MCM177(见表18)、和Pfu Ultra II Fusion DNA聚合酶(Stratagene)，进行PCR反应以扩增马氏甲烷八叠球菌(M.mazei)MVK基因。PCR条件如下：95℃2分钟(仅第一个循环)；95℃25秒，55℃25秒，72℃18秒(重复28个循环)；最后在72℃延伸1分钟。使用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen Inc.)纯化马氏甲烷八叠球菌MVK PCR产物。
然后在包含8μl PCR产物、2μl PmeI核酸内切酶(New EnglandBiolabs)、4μl 10X NEB缓冲液4、4μl 10X NEB BSA、和22μl ddH2O的40μl反应物中消化马氏甲烷八叠球菌MVK PCR产物。将反应物在37C温育3小时。然后使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化经消化的PCR片段。在含有2μl NsiI核酸内切酶(Roche)、4.7μl 10X缓冲液H、和40μl PmeI消化的马氏甲烷八叠球菌MVK片段的47μl反应物中进行第二限制性消化。将反应物在37℃温育3小时。然后使用1.2％E-凝胶对经消化的PCR片段进行凝胶纯化，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒提取。在含有10μl质粒、2μl PmeI核酸内切酶、4μl 10X NEB缓冲液4、4μl 10X NEB BSA、和20μl of ddH2O的40μl反应物中消化质粒EWL230。将反应物在37℃温育3小时。然后使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化经消化的PCR片段。在含有2μl PstI核酸内切酶、4.7μl 10X缓冲液H、和40μl PmeI消化的EWL230线性片段的47μl反应物中进行第二限制性消化。将反应物在37℃温育3小时。然后使用1.2％E-凝胶对经消化的PCR片段进行凝胶纯化，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒提取(图157)。使用NsiI和PstI位点的兼容性粘末端，制备20μl连接反应物，其中含有8μl马氏甲烷八叠球菌MVK插入片段、3μlEWL230质粒、1μlT4DNA连接酶、2μl 10X连接酶缓冲液、和6μl ddH2O。将连接混合物在16℃过夜温育。次日，通过使0.025μm硝酸纤维素膜滤纸在ddH2O的皮氏培养皿中漂浮并将连接混合物轻轻地施加于所述硝酸纤维素膜滤纸上并在室温持续30分钟而使连接混合物脱盐。MCM446细胞在LB中生长至指数中期，然后在冰冷的无菌水中洗涤3次。将50μl细胞悬浮液等份试样与5μl脱盐的pTrc P.alba-mMVK连接混合物混合在一起。使用基因脉冲电穿孔仪，在2mm杯中在2.5伏特和25uFd对细胞悬浮液混合物进行电穿孔。立即向细胞中加入1ml LB，然后将细胞转移至具有金属盖的14ml聚丙烯管。通过在30℃生长2小时使细胞恢复。在LA和50μg/μl羧苄西林和5mM甲羟戊酸平板上选择转化子并在30℃温育。次日，挑取6个转化子并在30℃在5ml LB和50μg/μl羧苄西林管中过夜生长。使用QIAquick旋转微量制备试剂盒在过夜培养物上进行质粒制备。由于使用了BL21细胞用于繁殖质粒，所以在生产商的标准程序中引入了下列修改：以5X的PB缓冲液和3X的PE缓冲液洗涤旋转柱，以实现高质量的质粒DNA。在20μl反应物中以PstI消化质粒以确保正确大小的线性片段。6个质粒中的3个是正确大小，并送去Quintara Biosciences测序，测序使用引物MCM65、MCM66、EL1000、EL1003、和EL1006(表18)。DNA测序结果显示：所有3个质粒都是正确的。挑取1个，命名为质粒EWL244(图158和159A-B；SEQ ID NO：45)。
(v)质粒MCM376的构建-将来自马氏甲烷八叠球菌远古下部的MVK构建进入pET200D
使用Invitrogen Platinum HiFi PCR混合物，使用引物MCM161和MCM162(表18)，通过PCR扩增来自马氏甲烷八叠球菌远古下部途径操纵子(图160A-C；SEQ ID NO：46)的MVK ORF。将45uL PCR混合物与1uL模板、1uL 10uM的每种引物、和2uL水混合。反应循环如下：94℃2分钟；30个循环的“94℃30秒，55℃30秒和68℃1分15秒”，然后72℃7分钟，置于4℃直至冷却。根据生产商的程序，将3uL该PCR反应物连接进入Invitrogen pET200D质粒。将3uL此连接物导入Invitrogen TOP10细胞，在LA/kan50上选择转化子。分离来自转化子的质粒并对插入片段进行测序得到MCM376(图161A-C；SEQ ID NO：47)。
(vi)菌株EWL251(BL21(DE3)，Cm-GI1.2-KKDyI，pTrcP.alba-mMVK)的构建
MCM331细胞(其含有编码酿酒酵母甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、和IPP异构酶的染色体构建体gi1.2KKDyI)在LB中生长至指数中期，然后在冰冷的无菌水中洗涤3次。将50μl细胞悬浮液与1μl质粒EWL244混合。使用基因脉冲电穿孔仪，在2mm杯中在2.5伏特和25uFd对细胞悬浮液混合物进行电穿孔。立即向细胞中加入1ml LB，然后将细胞转移至具有金属盖的14ml聚丙烯管。通过在30℃生长2小时使细胞恢复。在LA和50μg/μl羧苄西林和5mM甲羟戊酸平板上选择转化子并在37℃温育。选择1个菌落并命名为菌株EWL251。
(vii)菌株EWL256(BL21(DE3)，Cm-GI1.2-KKDyI，pTrcP.alba-mMVK，pCL Upper MVA)的构建
EWL251细胞在LB中生长至指数中期，然后在冰冷的无菌水中洗涤3次。将50μl细胞悬浮液与1μl质粒MCM82(其包含编码粪肠球菌mvaE和mvaS的pCL PtrcUpperPathway(也称作“pCL Upper MVA”))混合。根据上文的实施例8的描述构建质粒pCL Ptrc Upper Pathway。使用基因脉冲电穿孔仪，在2mm杯中在2.5伏特和25uFd对细胞悬浮液混合物进行电穿孔。立即向细胞中加入1ml LB。然后将细胞转移至具有金属盖的14ml聚丙烯管。通过在30℃生长2小时使细胞恢复。在LA和50μg/μl羧苄西林和50μg/μl壮观霉素平板上选择转化子并在37℃温育。挑取1个菌落并命名为菌株EWL256。
表18：引物序列
Figure BDA0000086907590002951
Figure BDA0000086907590002961
(viii)菌株RM111608-2(℃m-GI1.2-KKDyI，pTrc P.alba-mMVK，pCLUpper MVA，pBBRCMPGI1.5-pgl)的构建
构建生产异戊二烯的大肠杆菌BL21菌株(EWL256)，其在复制质粒pBBR1MCS5(庆大霉素)(获自K.Peterson博士，Louisiana StateUniversity)上组成型表达ybhE基因(编码大肠杆菌6-磷酸葡萄糖酸内酯酶)。
从Gene Bridges GmbH(Germany)获得基于FRT的重组盒，和用于Red/ET-介导的整合和抗生素标志物环出的质粒。根据Gene Bridges的程序进行使用这些材料的程序。根据生产商的程序，使用StratageneHerculase II Fusion试剂盒，使用引物Pgl-F(SEQ ID NO：139)和PglGI1.5-R(SEQ ID NO：140)从FRT-gb2-Cm-FRT模板扩增抗性盒。PCR反应物(最终体积为50uL)包含：5uL缓冲液，1uL模板DNA(来自GeneBridges的FRT-gb2-Cm-F)，10pmol的每种引物，和1.5uL 25mM dNTP混合物，加水至50uL。反应循环如下：1x2分钟，95℃，然后30个循环的“30秒95℃；30秒63℃；3分钟72℃)。
使用QiaQick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化得到的PCR产物并电穿孔进入如下所述的携带包含pRed-ET重组酶的质粒的电感受态MG1655细胞。细胞这样制备：在5mL L broth中在30℃生长至OD600～0.6。通过加入4％的阿拉伯糖诱导细胞表达重组酶并允许在30℃生长30分钟，然后在37℃生长30分钟。在冰冷的dH2O中将细胞的1.5mL等份试样洗涤3-4次。将最终的细胞沉淀重悬于40uL冰冷的dH2O中并加入2-5uL PCR产物。在1-mm空隙杯中在1.3kV下在基因脉冲电穿孔仪(Bio-Rad Inc.)中进行电穿孔。使细胞在30℃恢复1-2小时，并铺板于含有氯霉素的L琼脂(5ug/mL)。通过PCR分析了5个转化子并使用侧接整合位点的引物(2个引物组：pgl和49rev和3′EcoRV-pglstop；BottomPgb2和Top GB’s CMP(946))进行测序。选择正确的转化子，该菌株被称作MG1655GI1.5-pgl::CMP。
MG1655GI1.5-pgl::CMP的染色体DNA用作模板以产生包含FRT-CMP-FRT-GI1.5-ybhE构建体的PCR片段。如下所述将该构建体克隆进入pBBR1MCS5(庆大霉素)。使用5’引物Pglconfirm-F(SEQ IDNO：141)和3’引物3′EcoRV-pglstop(SEQ ID NO：142)扩增在本文中被称作CMP-GI1.5-pgl的片段。使用Invitrogen TOPO-Blunt克隆试剂盒将得到的片段克隆进入质粒载体pCR-Blunt II-TOPO，如生产商所建议。将携带CMP-GI1.5-pgl片段的NsiI片段克隆进入pBBR1MCS5(庆大霉素)的PstI位点。制备20μl的连接反应物，其包含5μl CMP-GI1.5-pgl插入片段、2μl pBBR1MCS5(庆大霉素)载体、1μl T4DNA连接酶(NewEngland Biolabs)、2μl 10X连接酶缓冲液、和10μl ddH2O。将连接混合物在室温温育40分钟，然后使用上文公开的参数将2-4uL电穿孔进入电感受态Top10细胞(Invitrogen)。在含有10ug/ml氯霉素和5ug/ml庆大霉素的L琼脂上选择转化子。使用如上所述的多个引物以及Sequetech，CA提供的自用的T3和反向引物测定所选的克隆的序列。该质粒被称作pBBRCMPGI1.5-pgl(图162、163A-B和SEQ ID NO：48)。
将质粒pBBRCMPGI1.5-pgl电穿孔进入如本文所述的EWL256，并将转化子铺板于含有氯霉素(10ug/mL)、庆大霉素(5ug/mL)、壮观霉素(50ug/mL)、和羧苄西林(50ug/mL)的L琼脂。选择1个转化子并命名为菌株RM111608-2。
引物：
Pgl-F
5’-
ACCGCCAAAAGCGACTAATTTTAGCTGTTACAGTCAGTTGAATTAACCCTCACTAAAGGGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO：139)
PglGI1.5-R
5’-
GCTGGCGATATAAACTGTTTGCTTCATGAATGCTCCTTTGGGTTACCTCCGGGAAACGCGGTTGATTTGTTTAGTGGTTGAATTATTTGCTCAGGATGTGGCATAGTCAAGGGCGTGACGGCTCGCTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAG-3’(SEQ ID NO：140)
3′EcoRV-pglstop：
5’-CTT GAT ATC TTA GTG TGC GTT AAC CAC CAC(SEQ IDNO：142)
pgl+49reV：CGTGAATTTGCTGGCTCTCAG(SEQ ID NO：143)
Bottom Pgb2：GGTTTAGTTCCTCACCTTGTC(SEQ ID NO：144)
Top GB’s CMP(946)：ACTGAAACGTTTTCATCGCTC(SEQ IDNO：145)
Pglconfirm-F
5’-ACCGCCAAAAGCGACTAATTTTAGCT-3’(SEQ ID NO：141)
实施例24：通过在大肠杆菌中组成型表达ybhE(pgl)提高异戊二烯产量
该实施例显示了相对于以野生型水平表达ybhE的对照菌株(即，EWL256)，组成型表达大肠杆菌ybhE(pgl)的菌株中的异戊二烯的生产。基因ybhE(pgl)编码大肠杆菌6-磷酸葡萄糖酸内酯酶，该酶抑制异源表达的蛋白质的翻译后葡糖酰化并提高产物溶解性和产率，同时也提高生物质产率和通过戊糖磷酸途径的流量(Aon等人，Applied and EnvironmentalMicrobiology，74(4)：950-958，2008)。
小规模分析
培养基配方(每升发酵培养基)：K2HPO413.6g，KH2PO413.6g，MgSO4＊7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，(NH4)2SO43.2g，酵母提取物1g，1000X痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于diH2O中。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至6.8并定容。培养基以0.22μm的滤器无菌过滤。灭菌后加入葡萄糖5.0g和抗生素并调节pH。
1000X痕量金属溶液(每升发酵培养基)：柠檬酸＊H2O 40g，MnSO4＊H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4＊7H2O 1g，CoCl2＊6H2O 1g，ZnSO4＊7H2O 1g，CuSO4＊5H2O 100mg，H3BO3100mg，NaMoO4＊2H2O 100mg。每种成分逐一溶解于diH2O中。以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容溶液，并以0.22μm的滤器无菌过滤。
(a)实验程序
通过使菌株在来自MicroReactor Technologies，Inc的CelleratorTM中生长而分析异戊二烯的生产。24个孔中的每一个孔中的工作体积是4.5mL。温度维持在30℃，pH设定点是7.0，氧流设定点是20sccm，搅拌速率是800rpm。将取自冷冻瓶的大肠杆菌菌株接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)并在30℃温育。将单一菌落接种进入含有抗生素的培养基中并生长过夜。将细菌稀释进入4.5mL含有抗生素的培养基，达到0.05的光密度(在550nm下测定)。
使用气体色谱-质谱仪(GC-MS)(Agilent)顶空测定法进行废气中的异戊二烯的分析。样品制备如下：将100μL完整培养液置于密封的GC瓶中并在30℃温育30分钟的固定的时间。加热杀灭步骤之后(其包括在70℃温育5分钟)，将样品装载至GC。
在运行过程中使用徼板读数器(Spectramax)获得550nm的波长下的光密度(OD)。通过将异戊二烯浓度(μg/L)除以读取的OD值和时间(小时)而获得比生产率。
在200和400uM IPTG诱导水平测定两个菌株EWL256和RM11608-2。在诱导后1、2.5、4.75、和8小时分析样品的异戊二烯生产情况和细胞生长(OD550)。以一式两份进行样品测定。
(b)结果
该实验证明：在2个不同浓度的IPTG时，表达ybhE(pgl)的菌株的异戊二烯的比生产率比对照菌株显著高2-3倍。
以15L的规模在补料分批培养物中生长并表达Cm-GI1.2-KKDyI、马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶、银白杨异戊二烯合酶、和ybhE(pgl)(RM111608-2)的大肠杆菌发酵生产异戊二烯
培养基配方(每升发酵培养基)：K2HPO47.5g，MgSO4＊7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于diH2O中。将该溶液高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺＊HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：柠檬酸＊H2O 40g，MnSO4＊H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4＊7H2O 1g，CoCl2＊6H2O 1g，ZnSO4＊7H2O 1g，CuSO4＊5H2O 100mg，H3BO3100mg，NaMoO4＊2H2O 100mg。每种成分逐一溶解于DiH2O中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，并以0.22μm的滤器无菌过滤。
在15L的生物反应器中以含有上部甲羟戊酸(MVA)途径(pCLUpper)、整合的下部MVA途径(gi1.2KKDyI)、高度表达的来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶和来自银白杨的异戊二烯合酶(pTrcAlba-mMVK)、和高度表达的大肠杆菌pgl(pBBR-pgl)的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度34℃从葡萄糖形成的异戊二烯。解冻大肠杆菌菌株的冷冻瓶并接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至15L生物反应器，使最初体积至5L。
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。在40小时(59小时)的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是3.1kg(59小时的话则是4.2kg)。通过加入IPTG进行诱导。当550nm下的光密度(OD550)达到4的时候，使IPTG的浓度是110uM。当OD550达到150时，IPTG的浓度升高至192uM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图164A。使用Hiden质谱仪测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯的效价随着发酵过程增大，在40小时的时候达到最大值33.2g/L(59小时的话则是48.6g/L)(图164B)。异戊二烯的效价随着发酵过程增大，在40小时的时候达到最大值40.0g/L(59小时的话则是60.5g/L)(图164C)。在40小时(59小时)的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是281.3g(59小时的话则是451.0g)，生产的时间进程显示于图164D。体积生产率的时间进程显示于图164E，其显示：在0至40小时，平均速率保持在1.0g/L/hr(在19至59小时保持在1.4g/L/小时)。通过CER测定的代谢活性谱显示于图164F。在40小时的情况下，发酵过程中用于生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是19.6％(59小时的话则是23.6％)。在40小时的情况下，从葡萄糖生产的异戊二烯的重量百分率产率是8.9％(59小时的话则是10.7％)。
实施例25：在表达马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶、银白杨异戊二烯合酶、pCL Upper MVA(粪肠球菌mvaE和mvaS)和ybhE(pgl)的大肠杆菌菌株中共同生产异戊二烯和氢
收集发酵废气并分析氢和异戊二烯的水平
使用菌株RM111608-2(大肠杆菌BL21(DE3)，pCL Upper MVA，cmR-gi1.2-yKKDyI，pTrcAlba-mMVK，pBBR cmR-gi1.5-pgl)和EWL256(大肠杆菌BL21(DE3)，pCL Upper MVA，cmR-gi1.2-yKKDyI，pTrcAlba-mMVK)进行发酵。细菌菌株的构建描述于上文实施例23。
从表达马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶、银白杨异戊二烯合酶、pCLUpper MVA(粪肠球菌mvaE和mvaS)并组成型表达ybhE(pgl)(RM111608-2)或正常表达ybhE(pgl)(EWL256)的大肠杆菌菌株EWL256和RM111608-2的补料分批培养物测定从大肠杆菌的大规模生产的异戊二烯。该实验证明在存在葡萄糖的情况下生长的细胞共同生产异戊二烯和氢。
每升TM2发酵培养基的发酵培养基(TM2)配方如下：K2HPO413.6g，KH2PO413.6g，MgSO4＊7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g ，(NH4)2SO43.2g，酵母提取物5g，1000X改良痕量金属溶液1ml。1000X改良痕量金属溶液：柠檬酸＊H2O 40g，MnSO4＊H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4＊7H2O 1g，CoCl2＊6H2O 1g，ZnSO4＊7H2O 1g，CuSO4＊5H2O100mg，H3BO3100mg，NaMoO4＊2H2O 100mg。对于1000X改良痕量金属溶液，将每种成分逐一溶解于DiH2O中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后以蒸馏水定容，并以0.22微米(μm)的滤器无菌过滤(该溶液不进行高压灭菌)。对于TM2发酵培养基，所有成分一起添加，溶解于diH2O中，以氢氧化钾(KOH)将pH调节至6.8，定容，培养基以0.22微米(μm)的滤器无菌过滤。葡萄糖以99DE(右旋糖当量)、71％DS(干固体)糖浆源自Cargill。
在15L的生物反应器中以含有上部甲羟戊酸(MVA)途径(pCL UpperMVA)、整合的下部MVA途径(cmR-gi1.2-yKKDyI)、来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶和来自银白杨的异戊二烯合酶(pTrcAlba-mMVK)、和组成型表达ybhE(pgl)(RM111608-2)或正常表达的ybhE(pgl)(EWL256)的大肠杆菌菌株EWL256或RM111608-2进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵条件(pH 7.0和温度34℃)从葡萄糖形成的异戊二烯。
将获自冷冻瓶的合适的大肠杆菌菌株的接种物制备于胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD550＝0.6后，使用600mL接种至含有TM2培养基的15L生物反应器。以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。在67小时的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是3.9kg。通过加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)进行诱导。当550nm下的光密度(OD550)达到9的时候，使IPTG的浓度是102uM。当OD550达到140时，IPTG的浓度升高至192uM。在诱导后的多个时间，取出样品并按照如下的描述测定所生产的异戊二烯的量。按照下文的讨论使用Hiden HPR-20质谱仪测定来自生物反应器的废气中的氢、氮、氧、二氧化碳、和异戊二烯的水平。
通过以1L废气/分钟的速率喷洒瓶10秒并以具有特氟隆-包被的间隔的金属旋盖(Agilent，CA)密封而将来自15L生物反应器的发酵废气样品收集进入20mL的玻璃顶空瓶中。在收集之后30分钟内分析该瓶。
将质谱仪的入口管置于未加盖的顶空瓶中1-2分钟，以4scc/分钟(4mL/min)的速率注入Hiden HPR-20质谱仪(Hiden Analytics，U.K.)，以进行两个样品的分析。HPR-20仪器配置为扫描对应于氢(m/z 2)、氮(m/z 28)、氧(m/z 32)、二氧化碳(m/z 44)和异戊二烯(m/z 67)的质量。Faraday检测器用于质量28、32、44和67。SEM检测器用于氢(m/z 2)。以压力的任意单位(Torr)测定检测器应答。通过与真实可靠的氢气标志物比较来估计绝对氢水平。使用MASsoft v 6.21.0.51软件(Hiden Analytics，UnitedKingdom)记录结果。
结果
从两个发酵运行获得废气样品并按照如上所述进行分析：
A)菌株RM111608-2(大肠杆菌BL21(DE3)，pCL upper，cmR-gi1.2-yKKDyI，pTrcAlba-mMVK，pBBR cmR-gi1.5-pgl)。在64.8小时取出样品进行运行，当时的发酵以无氧方式运行，以1vvm喷洒氮气。
B)菌株EWL256(大肠杆菌BL21(DE3)，pCL upper，cmR-gi1.2-yKKDyI，pTrcAlba-mMVK)。在34.5小时取出样品进行运行，当时的发酵以有氧方式运行，以1vvm喷洒空气。
结果显示于图165A-B。在两种情况下，除了异戊二烯、氧和二氧化碳，检测到低水平的氢。对于氢读取的基线是0.95x10-8Torr。样品A和B都给出大约1.3x10-8Torr的读数。基于与氢标准物的比较，存在于样品A和B的废气中的氢的量经估计是小于10ppmv(每百万体积分之几)但在基线之上。如图165A-B所示，样品A和B都包含显著量的异戊二烯和二氧化碳。
实施例26：在表达马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶、银白杨异戊二烯合酶、pCL Upper MVA(粪肠球菌mvaE和mvaS)和ybhE(pgl)的大肠杆菌菌株中共同生产异戊二烯和氢
收集发酵废气并分析氢和异戊二烯的水平
本实验的目标是在工程化的大肠杆菌菌株中共同生产氢和异戊二烯。为此目的，将编码大肠杆菌氢化酶-3的hyc操纵子的一部分在菌株EWL256[BL21(DE3)，pCL upper，cmR-gi1.2-yKKDyI，pTrcAlba-mMVK]中表达(如上所述制备)，虽然可以类似地修饰本文描述的任意细菌菌株例如RM111608-2。基于公众可获得的基因序列，通过本领域已知的标准克隆方法制备包含hyc操纵子基因hycB(gi|16130631)、hycC(gi|16130630)、hycD(gi|16130629)、hycE(gi|16130628)、hycF(gi|16130627)、和hycG(gi|16130626)的表达构建体，并导入菌株EWL256以生产新的菌株EWL256+Hyd-3。
通过下列方式，在EWL256+Hyd-3中单独或联合测定另外的突变对于共同生产氢和异戊二烯之影响：导入参与氢化酶-3的成熟或调节氢化酶-3的基因(例如，hycH(gi|16130625)和hycI(gi|16130624))；失活或缺失参与氢的摄取或运输的基因(例如，大肠杆菌氢化酶-1(hya操纵子)和氢化酶-2(hyb操纵子))或相关的蛋白(例如，甲酸脱氢酶(fahF(gi|16130624))、甲酸裂解酶的阻抑子(hycA(gi|16130632))、甲酸脱氢酶Nα亚基(fdnG(gi|16129433))、甲酸脱氢酶O大亚基(fdoG(gi|16131734))、硝酸还原酶(narG(gi|16129187))、延胡索酸还原酶调节子(fnr(gi|16129295))、和乙酰基-辅酶A合成酶(acs(gi|16131895)))；激活参与氢化酶的上调的基因(例如，甲酸氢裂解酶的激活子(fhlA(gi|16130638))；失活或缺失参与产生发酵副产物的基因(例如，乳酸脱氢酶(ldhA(gi|16129341))、延胡索酸还原酶膜蛋白(FrdC(gi|16131977))、醇脱氢酶(adhE(gi|16129202))、丙酮酸氧化酶(poxB(gi|16128839))、丙酮酸脱氢酶E1成分ackA/pta(aceE(gi|16128107))、甲酸脱氢酶调节蛋白(hycA(gi|16130632))、以及甲酸转运子A和B(FocA(gi|16128871)和FocB(gi|16130417))；或通过表达参与氢代谢的异源基因(例如，来自丙酮丁醇梭杆菌(Clostridiumacetobutylicum)的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapC(gi|15893997))。
使用菌株的工程化变体EWL 256+Hyd-3(BL21(DE3)，pCL upper，cmR-gi1.2-yKKDyI，pTrcAlba-mMVK and hycB-F)进行发酵，该变体被修饰为包含一个或多个如本文描述的另外的突变(单独或组合)，基本上如上文实施例25所描述。基本上按照如上所述通过分析废气样品测定氢和异戊二烯的共同生产。基于异戊二烯和氢的共同生产速率选择菌株进行进一步分析。
实施例27：通过酿酒酵母共同生产乙醇和异戊二烯
为了确定在酿酒酵母菌株中共同生产异戊二烯和乙醇的可行性，使表达IspS(异戊二烯合酶)的酿酒酵母在诱导条件下无氧生长48小时，测定异戊二烯和乙醇的生产。
本实施例中使用的菌株.(1)DW112：酿酒酵母(InvSC1)+编码密码子优化的IspS(野葛)的pDW14(在2-μm的质粒(ura)上；和(2)DW114：酿酒酵母(InvSC1)+pYES-DEST52-空载体对照(ura)。本实施例中使用的缩写：(1)112G(112gal)：诱导的菌株DW112(0.5％葡萄糖，2％半乳糖)；(2)112R(112raf)：未诱导的菌株DW112(0.5％葡萄糖，1％棉子糖)；(3)114G(114gal)：诱导的菌株DW114(0.5％葡萄糖，2％半乳糖)；和(4)114R(114raf)：未诱导的菌株DW114(0.5％葡萄糖，1％棉子糖)。
生长和诱导条件.在含有2％葡萄糖不含尿嘧啶(如pYES-DEST52Gateway Vector说明书(Invitrogen)中所描述)的SC最简培养基上选择携带pDW14(菌株DW112)或pYES-DEST52(菌株DW114)的INVSc-1菌株(关于载体构建的详细内容，见实施例20)。不含尿嘧啶的SC最简培养基包含：0.67％酵母氮源(不含氨基酸；含有硫酸铵)；2％碳源(例如，用于繁殖的葡萄糖或用于诱导的半乳糖)；0.01％(腺嘌呤、精氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸)；0.005％(天冬氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、缬氨酸)；和任选地2％琼脂(用于平板)。图141显示了来自野葛的密码子优化的IspS的序列；图142A显示了用于在酵母中进行半乳糖可诱导表达的复制载体的图谱；图142B-C显示了用于在酿酒酵母中进行Kudzu IspS的半乳糖可诱导的表达的表达载体的完整核苷酸序列(SEQ ID NO：39)。
为了繁殖，使菌株在30℃在含有2％葡萄糖不含尿嘧啶的固体或液体SC最简培养基中有氧地生长。过夜温育后，将菌株在20ml含有0.5％葡萄糖不含尿嘧啶的SC最简培养基中稀释至OD600为1.0。在OD600大约是1.4时(见图166)，将10ml每种菌株转移至密封的20ml气体色谱(GC)瓶中，加入棉子糖或半乳糖至终浓度分别为1％或2％。这导致产生DW112和DW114的未诱导的(R表示棉子糖)和诱导的(G表示半乳糖)的生长。密封GC瓶并在30℃温育48小时。
通过GC-MS检测异戊二烯.在密封的GC瓶中温育48小时后，通过GC-MS(方法见下文)测定异戊二烯的生产。对照样品(112R、114G、和114R)未显示出异戊二烯生产，而在存在2％半乳糖(112G)的情况下生长的含有Kudzu IspS的菌株生产可检测水平的异戊二烯(见表19和图167)。对于对照，在异戊二烯的保留时间(0.49分钟)没有可检测的峰，所以不可能产生异戊二烯的积分值(见图167)。使用校正因子888/μg，112G的峰面积对应于顶空气体中的4.97μg/L的异戊二烯浓度。
表19-GC-MS数据
用于异戊二烯检测的GC-MS方法.使用连接了CTC Analytics(Switzerland)CombiPAL自动取样仪(以顶空模式运行)的Agilent 6890GC/MS系统进行分析。使用Agilent HP-5MS GC/MS柱(15m x0.25mm；膜厚0.25μm)来分离分析物。将取样仪设定为注入100μl顶空气体。GC/MS法使用氦作为载气，流速为2ml/分钟。注入口维持在250℃，分流比为50∶1。在分析过程中，将烤箱温度维持在37℃持续2分钟。在m/z 67下以单离子监控(SIM)模式运行Agilent 5793N质量选择性检测器。在0.01至0.45分钟将检测器关闭，以允许洗脱永久气体。在这样的条件下，在0.49分钟观察到异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)的洗脱。使用校准表来定量测定异戊二烯的绝对量，发现在1μg/L至20000μg/L是线性的。估计使用该方法时的检测限值是50-100ng/L。
通过HPLC检测乙醇.通过GC-MS检测异戊二烯之后，将瓶打开，测定每个培养物的OD600。OD600值是5.0至5.7，这说明对于所有菌株而言，在48小时温育期间发生了生长(见图166)。然后通过HPLC测定所有样品中乙醇的产量(见下文)。所有4个培养物都生产乙醇。图168显示了乙醇的峰和积分值(g/L)，表20显示了来自HPLC程序的所有数据。
有机酸HPLC方法.开发了该方法以分离并定量来自发酵过程的典型的有机酸。运行缓冲液是0.01N H2SO4缓冲液(等于5mM)。按照如下制备运行缓冲液：使用4L的刻度量筒，将17.75ml 10％H2SO4贮液加入到4.0L去离子水中。该溶液用于重新填充HPLC缓冲液瓶。检测器：使用Knauer K2301RI检测器来定量峰(当它们从柱中出来时)。
用于HPLC的培养液样品的制备.按照如下所述制备用于HPLC的培养液样品：(1)将培养液倒入标记的Eppendorf管(～1.8mL)；(2)在14,000rpm将管离心5分钟以使细胞沉淀；(3)将300μL上清液转移至新的Eppendorf管；(4)将900μL水加入到上清液中。如果想要低浓度的分析物，可以稍微稀释一下样品；然而，这将会更加污染柱子。应该将样品限制为稀释4倍以下；(5)加入36μL 70％高氯酸(Sigma，货号244252)，将管反转几次以混合；(6)将管在冰上温育5分钟以使蛋白沉淀，然后在14,000rpm离心5分钟。此时，上清液就绪可用于分析。
然后将上清液倒入塑料的锥形底的HPLC瓶。将盖旋转到瓶上，将瓶在硬表面上轻叩以从底部除掉气泡(不然的话，HPLC注射针将仅除掉空气)，在HPLC上运行样品：其中装载了Aminex HPX-87H离子排阻柱300mm x7.8mm(货号125-0140；Bio Rad，Hercules，CA)，在50℃运行，装配有Microguard Cation H refill 30mm x4.6mm保护柱(货号125-0129；Bio Rad，Herculues，CA)，使用0.01N H2SO4作为运行缓冲液，流速为0.6ml/分钟，以～950psi的合适的运行压力运行，注射体积为20μl。运行时间是大约26至36分钟；例如，在大约6分钟时出现空；在8.5分钟时出现葡萄糖；在14分钟时出现乙酸；在21分钟时出现乙醇。当柱和保护柱不用时，将它们储存在0.01N H2SO4中。
表20-HPLC数据
Figure BDA0000086907590003091
Figure BDA0000086907590003101
Figure BDA0000086907590003111
实施例28：在大肠杆菌中共同生产异戊二烯(通过DXP途径)和乙醇
如图169所示，共同生产异戊二烯和乙醇是提高通过DXP途径从葡萄糖生产异戊二烯的理论产率的方式，因为在生产乙醇过程中产生的ATP可用于在该途径中生产异戊二烯。由此，最大理论质量产率(不计用于建立生物质的碳)是32.3％。假设CPI(细胞生产率指数)是5，质量产率将是29％，与之对比，仅DXP途径时则是27％。因此，当以无氧方式运行该过程时，用于氧转移的资金投入降低。该过程可以在现有的乙醇设备中进行，在槽式搅拌装置中进行。
虽然大肠杆菌能够在无氧生长时生产乙醇(使用酶adhE从乙酰基-辅酶A通过乙醛到乙醇)，但是通过表达来自发酵单胞菌属的丙酮酸脱羧酶(pdc)极大地提高了乙醇产量。如图170所示，pdc使用丙酮酸作为底物，具有低Km，并且通过pdc和adhE(大肠杆菌)或adhB(发酵单胞菌属)生产乙醇需要的还原当量小于通过pfl和adhE。虽然仅表达pdc已经显著提高了由大肠杆菌生产的乙醇的量，但是已经证明：添加来自发酵单胞菌属的adhB使生产的乙醇的浓度升高20倍以上(Ingram等人1987)。
将运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶(pdc)克隆于pBBR1-MCS5中的Trc启动子之后.
使用引物SpeI-PTrc-rbs-pdcF(5’-gttactACTAGTGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTaggaggaaaaaaaaATGAGTTATACTGTCGGTACCTATTTAG-3’；SEQ ID NO：146)和PstI-pdcR(5’-gttagatCTGCAGgtttatttaaaaactagaggagcttg-3’；SEQ ID NO：147)从运动发酵单胞菌ZM4基因组DNA(ATCC31821)扩增丙酮酸脱羧酶(pdc)。纯化得到的PCR产物，以SpeI/PstI消化并与SpeI/PstI-消化的pBBR1-MCS5(Kovach等人，Biotechniques(1994)5：800-802)重连在一起。在LB+庆大霉素(5ppm)+Xgal上选择白色菌落并从中提取质粒，通过测序发现其是正确的。该质粒克隆被称作pBBR5-Ptrcpdc(图171A显示了pBBR5-Ptrcpdc的图；图171B-C显示了pBBR5-Ptrcpdc的序列；SEQ ID NO：148)。
构建共表达pdc和DXP途径的大肠杆菌菌株
菌株MCM597(BL21(DE3)，pET24(MEA)alba+DXS+yIDI)的构建。pDU-39的构建。引物序列：(1)Alba TRC(MEA)-NdeI-F：5’-gaaactgaaaccCATATGgaagctcgtcgttctgc-3’(SEQ ID NO：149)；(2)AlbaFLTRC(-)TER-R：5’-cccgcgcttaCTCGAGgcgttcaaacggcagaatcggttcagtg-3’(SEQ IDNO：150)。通过使用引物组Alba TRC(MEA)-NdeI-F/Alba FLTRC(-)TER-R和模板pET24a P.alba HGS(见，例如，实施例23(iii)，SEQ IDNO：43，和图152、153A、以及153B)扩增基因来构建截短形式的银白杨异戊二烯合酶。PCR反应设定如下：1μl(pET24a-P.alba)；5μl 10XPfuUltraII融合缓冲液；1μl 10mM dNTP；1μl引物(50μM)Set#1正向；1μl引物(50μM)Set#1反向；41μl ddiH2O；+1μl来自Stratagene的1μlPfuUltra II Fusion DNA聚合酶。循环参数为：95℃/1分钟，然后是29个循环的“95℃/30秒，55℃/20秒，72℃/25秒”，然后是72℃/3分钟。然后将反应维持在4℃直至冷却(Eppendorf Mastercycler)。
以NdeI-XhoI限制性核酸内切酶(Roche)消化PCR产物，根据生产商的说明书，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行凝胶纯化。使用T4连接酶(New England BioLabs)，将3μl的纯化产物的等份试样连接至之前经过NdeI-XhoI消化、凝胶纯化并以虾碱性磷酸酶(SAP，Roche)处理的pET-24a载体(Invitrogen)。连接在16℃彻夜进行。.
将5uL过夜连接混合物的等份试样转化进入TOP10细胞(Invitrogen)，在37℃在含有卡那霉素(50μg/ml)的L琼脂上过夜选择转化子。根据生产商的说明书，使用QiaQuick旋转试剂盒(Qiagen)从一些转化子分离质粒。通过NdeI-XhoI限制性核酸内切酶消化来验证插入片段，以商售的T7启动子和T7终止子引物(Quintara Bio SequencingService，Berkeley，CA)测序克隆。正确的质粒被称作pDu-39(图172；SEQID NO：151)。
MCM597的构建.引物序列：(1)MCM2705’-GATCGGATCCATTCGCCCTTAGGAGGTAAA-3’(SEQ IDNO：152)；和(2)MCM2715’-GATCGCGGCCGCCAGCTGCAGGACGCGTTGTTATAGCATT-3’(SEQ ID NO：153)。
使用引物MCM270/MCM271和模板pMCM72(图173是pMCM72的图谱)，通过PCR扩增DXS-yIDI基因。根据生产商Herculase II Fusion(Stratagene)的程序，设定两个相同的PCR反应：35μL水，10μL缓冲液，1.25μL每种引物，0.5μL发dNTP，1μL聚合酶。反应循环如下：95℃/2分钟，然后是30个循环的“95℃/15秒，55℃/15秒，72℃/1分45秒”，然后是72℃/3分钟。然后将反应物保持在4℃直至冷却。
以BamHI和NotI(Roche)消化得到的PCR片段，然后使用Roche快速连接试剂盒将其连接进入经过相同的限制性核酸内切酶消化的pDu39。连接反应物建立如下：10μL，其中包含5μL缓冲液1、1μL载体、3μL插入片段和1μL连接酶，然后在室温温育1小时。将5μL等份试样转化进入大肠杆菌Top10化学感受态细胞(Invitrogen)。在37℃在含有卡那霉素(50μg/ml)的L琼脂上选择转化子。从一些转化子纯化质粒并使用Herculase II Fusion(Stratagene)通过PCR就插入片段的存在进行筛选：17.5μL水，5μL缓冲液，0.625μL每种引物，0.25μL dNTP，0.5μL聚合酶。反应循环如下：95℃/2分钟，然后是30个循环的“95℃/15秒，52℃/15秒，72℃/45秒”，然后保持在72℃/3分钟。然后将反应物保持在4℃直至冷却。对含有长度为接近1.5kbp的PCR产物的克隆进行测序(Quintara Biosciences，Berkeley CA)。正确的质粒被称作pMCM596(图174A是pMCM596的图谱；图174B-D是pMCM596的序列(SEQ ID NO：154))。然后将质粒转化进入电感受态BL21(DE3)pLysS细胞(Invitrogen)，在含有卡那霉素(50μg/ml)和氯霉素(35μg/mL)的L琼脂上选择转化子。选择了一个菌落并称作MCM597。
以pBBR5-Ptrcpdc转化MCM597(BL21(DE3)，pET24(MEA)alba+DXS+yIDI)，pBBR1-MCS5作为对照。在LB+卡那霉素50ppm、氯霉素(35ppm)、庆大霉素(5ppm)上选择菌落。各选1个菌落，并分别称作菌株CMP182和菌株CMP183。
在大肠杆菌中共同生产异戊二烯和乙醇.将菌株CMP182和CMP183的各1个菌落接种于含有1％葡萄糖和1％酵母提取物和合适的抗生素的TM3培养基中，在30℃和170rpm下过夜温育。次晨，在含有0.5％葡萄糖+0.11％或1％酵母提取物的20mL相同培养基中将培养物稀释至OD＝1，并在30℃和170rpm温育。按照一式两份进行1％酵母提取物培养瓶。这一式两份是高度相似的，所以仅呈现了来自仅一组培养瓶的结果。2小时后，加入200uM IPTG，振荡降低至40rpm。在诱导后2小时和5小时取样，并分析OD值，通过HPLC(离子排阻柱AminexHPX-87H，300mm×7.8mm)测定有机酸和异戊二烯的比生产率。按照本文的描述通过GC/MS测定废气中的异戊二烯浓度。每个菌株的比生产率表示为μg/L/OD/小时。注意：测定瓶中的“1900μl顶空：100μl培养液”的比例(温育30分钟)引起下列的“培养物中的异戊二烯μg/L”至“比生产率”的转化：(通过GC/MS测定的异戊二烯/L)×(38)/(培养物的OD600nm)。使用1％的酵母提取物的情况下，在诱导后5小时葡萄糖耗尽。
图175显示：pdc的表达不影响生长。含有1％酵母提取物的培养物生长至较高的OD。
图176显示了含有0.1％(A)(诱导后5小时)和1％(B)(诱导后2小时)酵母提取物的培养瓶中的乙醇浓度和异戊二烯比生产率(以任意单位)。可以看出：菌株正在将碳流向异戊二烯和乙醇。如从功能性pdc预期的那样，在携带pdc的菌株中生产了更多的乙醇。在携带pdc的菌株中异戊二烯的比生产率较低，因为更多的碳流向乙醇，但仍然是显著的，这表明dxs(使用丙酮酸和甘油醛作为底物)能够从pdc获得碳流。
图177显示了诱导5小时后，1％酵母提取物培养瓶中的发酵产物。表达pdc的菌株显示了较高的乙醇浓度，这确认了以下事实：pdc被表达并且是有活性的。如通过比较ldhA和pdc的Kms所预期的那样，一且pdc被表达，则向乳酸的丙酮酸流向被打断。另外，在表达pdc的菌株中，流向乙醛的碳比流向乙酰基-辅酶A的更多，导致乙酸的减少。
实施例29：在运动发酵单胞菌中共同生产异戊二烯和乙醇
用于在运动发酵单胞菌中生产异戊二烯的质粒的构建.从ATCC(Manassas，VA)获得运动发酵单胞菌ZM4(ATCC31821)。其在30℃不经振荡常规生长于含有RM培养基(20g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，2g/L KH2PO4，调整至pH 6.0)的10ml管中。运动发酵单胞菌因其产生乙醇的能力而出名。J.Swings等人(1977)Bacteriol.Rev.41：1-46。
通过PCR SOEing(聚合酶链式反应-通过重叠延伸剪接)，使用下列引物，产生PCR产物，该产物包含处于编码来自银白杨的截短的异戊二烯合酶的基因前面的运动发酵单胞菌pdc启动子：使用引物XbaI-PpdcF (5’-ctaaacTCTAGAGC TCA TGA TCG CGG CAT GTTCTG-3’；SEQ ID NO：155)和引物FusPpdc-HGSR(5’-gcagaacgacgagcttcggtcattgcttactccatatattcaaaacactatg-3’；SEQ IDNO：156)用于扩增pdc启动子；使用引物PstI-MTEARRalbahpR(5’-ctacgaCTGCAGCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAGC-3’；SEQ IDNO：157)和FusPpdc-HGSF(5’-catagtgttttgaatatatggagtaagcaAtgaccgaagctcgtcgttctgc-3’；SEQ  IDNO：158)扩增异戊二烯合酶基因，然后在步骤1获得的2个产物的混合物中使用引物XbaI-PpdcF(SEQ ID NO：155)和PstI-MTEARRalbahpR(SEQ ID NO：157)进行PCR反应。用于pdc启动子的模板是运动发酵单胞菌ZM4的基因组DNA，截短的异戊二烯合酶扩增自质粒pDU47(pDU47的图谱显示于图178质粒pDU47的序列(SEQ ID NO：159)显示于图179)。该基因的密码子偏向已经就大肠杆菌进行了优化。
以XbaI/PstI消化所获得的PCR产物，并与XbaI/PstI消化的pBBR1-MCS(Kovach等人，Biotechniques(1994)5：800-802)重连在一起。pBBR1-MCS是被证明在发酵单胞菌属中稳定复制的宿主范围广泛的质粒(Jeon等人，FEMS Microbiol.Letters(2005)244：85-92)。获得的质粒被称作pBBR-Ppdc-HGS1(质粒pBBR-Ppdc-HGS1的图谱显示于图180；质粒pBBR-Ppdc-HGS1的序列(SEQ ID NO：160)显示于图181)。
以pBBR1-MCS或pBBR1-Ppdc-HGS1转化运动发酵单胞菌ZM4.根据Conway等人(Conway等人，Appl.Environ.Microbiol.(1987)53：235-241)通过双亲交配法(biparental mating)(通过大肠杆菌S17-1)，或者根据Jeon等人(Jeon等人，FEMS Microbiol.Letters(2005)244：85-92)通过电穿孔法将质粒pBBR1-MCS和pBBR1-Ppdc-HGS1转化进入运动发酵单胞菌ZM4。在RM+氯霉素100μg/ml上选择电穿孔之后在无氧条件下在30℃在48小时后出现的转化子。在RM上过夜温育用于接合的培养物，然后在YPG(10g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，70g/L葡萄糖，pH 6.0)+40μg/ml萘啶酸+100μg/ml氯霉素上重新划线。
两种方法在RM+氯霉素100μg/ml或YPG+40μg/ml萘啶酸+氯霉素100μg/ml上都产生了丰富的菌落。使用Qiagen微量制备试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从发酵单胞菌属细胞中提取质粒，通过凝胶电泳证明其存在。
由运动发酵单胞菌ZM4，pBBR1-Ppdc-HGS1生产异戊二烯以及共同生产异戊二烯和乙醇.将运动发酵单胞菌ZM4，pBBR1-MCS和运动发酵单胞菌ZM4，pBBR1-Ppdc-HGS1的各一个菌落接种于20ml密封的顶空瓶中的10ml RM+氯霉素100μg/ml，并在30℃过夜温育。16小时后，取出一个瓶并分析顶空中的异戊二烯浓度、OD和有机酸或醇。使用如下所述的顶空测定法测定相同瓶中的异戊二烯的生产。使用连接了CTC Analytics(Switzerland)CombiPAL自动取样仪(以顶空模式运行)的Agilent 6890GC/MS系统进行分析。使用Agilent HP-5MS GC/MS柱(30m x0.25mm；膜厚0.25μm)来分离分析物。将取样仪设定为注入500μL顶空气体。GC/MS法使用氦作为载气，流速为1ml/分钟。注入口维持在250℃，分流比为50∶1。在分析过程中，将烤箱温度维持在37℃持续2分钟。在m/z 67下以单离子监控(SIM)模式运行Agilent 5793N质量选择性检测器。在1.4至1.7分钟将检测器关闭，以允许洗脱永久气体。在这样的条件下，在1.78分钟观察到异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)的洗脱。使用校准表来定量异戊二烯的绝对量，发现在1μg/L至200μg/L是线性的。估计使用该方法时的检测限值是50-100ng/L。
通过HPLC(离子排阻柱Aminex HPX-87H，300mm×7.8mm，0.005M H2SO4，0.6mL/分钟作为流动相)分析有机酸和醇。以pBBR1-MCS转化的运动发酵单胞菌ZM4的细胞比以pBBR1-Ppdc-HGS1转化的运动发酵单胞菌ZM4的细胞生长得快(数据未显示)。在培养结束时，收集细胞，通过两次通过弗氏破碎器裂解细胞，以针对纯化的银白杨异戊二烯合酶的单克隆抗体探测，通过蛋白质印迹分析提取物。在以pBBR1-Ppdc-HGS1转化的运动发酵单胞菌ZM4的细胞中检测到了蛋白，但是在以pBBR1-MCS转化的运动发酵单胞菌ZM4的细胞中未检测到。
图182显示了所检测到的异戊二烯的量除以OD。运动发酵单胞菌ZM4，pBBR1-MCS和运动发酵单胞菌ZM4，pBBR1-Ppdc-HGS1的OD600分别是1.9和2.1(非显著性差异)。运动发酵单胞菌ZM4，pBBR1-Ppdc-HGS1生产的异戊二烯/OD比运动发酵单胞菌ZM4，pBBR1-MCS多16倍。表21显示了：相对于运动发酵单胞菌ZM4，pBBR1-MCS，运动发酵单胞菌ZM4，pBBR1-Ppdc-HGS1的相对OD值和相对乙醇产量。在这些培养物中未检测到乳酸，乙酸水平小于0.1g/L。运动发酵单胞菌ZM4，pBBR1-MCS和运动发酵单胞菌ZM4，pBBR1-Ppdc-HGS1生产相同浓度的乙醇(大于9g/L)。
表21：相对于运动发酵单胞菌ZM4，pBBR1-Ppdc-HGS1，运动发酵单胞菌ZM4，pBBR1-MCS的相对OD值和相对乙醇产量。
Figure BDA0000086907590003191
已经发现：如果接种物由正在生长的培养物组成，则可以在相同的环境下获得增加的量的异戊二烯/OD(数据未显示)。
实施例30：异戊二烯和1，3-丙二醇的共同生产
在多种生物体包括酵母(例如酿酒酵母)和细菌(例如埃希菌属例如大肠杆菌；和发酵单胞菌属例如运动发酵单胞菌)中，和异戊二烯一起共同生产了其它的两碳(C2)和三碳(C3)醇和二醇，例如1，2-丙二醇或1，3-丙二醇(1，3-PDO)。根据下列等式估计异戊二烯和1，3-PDO的产率：
(1)：1.5Glc+3ATP→3AcCoA+3CO2+6NAD(P)H
(2)：3AcCoA+2NAD(P)H→MVA
(3)：MVA+3ATP→HG+CO 2 +H2O
(1)+(2)+(3)＝(4)：1.5Glc→HG+3CO2+4NAD(P)H
(5)：1/18Glc+1/3O2→2ATP+1/3H2O
(6)：0.5Glc+ATP+2NAD(P)H→PDO
(4)+(5)+2＊(6)＝(7)：23/9Glc+1/3O 2 →HG+2PDO
23/9Glc(C6H12O6)+1/3O2→C5H8+2C3H8O2+4.33CO2+3.33H2O
在CPI(细胞生产率指数)为6时，在糖上的异戊二烯产率＝13％；在糖上的PDO产率＝30％。
表达异戊二烯生产途径(通过MVA途径)和1，3-丙二醇生产途径的大肠杆菌菌株CMP250的构建.pDW15的构建.以XhoI/XbaI消化质粒pBBr1-MCS5(Kovach等人，Gene 166：175-176，1995)并与扩增自pTrcUpperPathway(图26和27A-27D；SEQ ID NO：12)的Ptrc UpperMVA片段重连在一起。得到的质粒被称作pDW15(SEQ ID NO：161；质粒图谱见图183A，质粒序列见图183B-D)。质粒pDW15表达来自粪肠球菌的上部甲羟戊酸途径多肽mvaE和mvaS。
大肠杆菌菌株CMP250的构建.以pEWL244和pDW15电穿孔菌株EWL204(程序描述于实施例23)(关于菌株EWL204和质粒pEWL244的构建的信息以及电穿孔程序见实施例23)。在LB+羧苄西林(50μg/mL)+庆大霉素(5μg/mL)上选择转化子。然后以质粒pSYCO109(见美国专利号7,371,558，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于被称作pSYCO101的质粒以及包括pSYCO109的构建的内容)(SEQ IDNO：162；质粒图谱见图184A；序列见图184B-F)电穿孔得到的菌株。质粒pSYCO109编码(1)DAR1(二羟基丙酮磷酸还原酶)和GPP2(甘油-磷酸磷酸酶)，这两个基于均来自甘油途径；(2)dhaB1-3、dhaX、orfX、和orfY，所有这些基因都来自1，3-丙二醇途径。质粒pSYCO109还包括大肠杆菌苏氨酸操纵子弱化子(Thr atten)、大肠杆菌TonB终止子(TonB term)、trc启动子(trc)和天冬氨酸氨裂解酶基因终止子(AspA term)。在LB+羧苄西林(50μg/mL)+庆大霉素(5μg/mL)+壮观霉素(50μg/mL)上选择转化子。得到的菌株被称作CMP250。
或者，将按照以下顺序包含大肠杆菌MG1655天然pgl启动子、大肠杆菌MG1655天然pgl基因(ybhE，不存在于BL21中)、和FRT-氯霉素-FRT盒的盒(GeneBridges，Heidelberg，Germany)通过Red/ET重组(GeneBridges，Heidelberg，Germany)重组于EWL204的染色体中。将整合位点选择为在ybhJ与ybhC之间。使用706-Flp(GeneBridges，Heidelberg，Germany)将标志物环出，由此产生的菌株被称作CMP251。以质粒pEWL244、pDW15和pSYCO109(按照上段描述的顺序)电穿孔菌株CMP251，以产生菌株CMP252。
构建了另外的菌株，其中缺失了参与涉及产生C2-或C3-醇或二醇例如1，3-丙二醇的代谢途径的多种基因，包括：(1)缺失了glpK和gldA基因的菌株；(2)缺失了tpiA基因的菌株；或(3)缺失了ptsHIcrr并且组成型表达galP和glk基因的菌株(见，例如美国专利号公开号2009/0142843-A1，题目是“Glucose Transport Mutants For Production OfBiomaterial，”其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于多个细菌菌株构建的内容)。构建了其它具有一个或多个有用突变的菌株，包括例如：缺失了edd、ndh、arcA、mgsA、qor、ackA-pta、poxB、ldhA、或导致gapA的下调或ppc的上调的突变。通过通常使用的方法来构建这些和其它缺失，例如从具有目标缺失的Keio突变体制备裂解物(Baba等人，Mol.Syst.Biol.2：2006.0008(于2006年2月在线公开)并将目标突变转导进入需要的细菌菌株，例如CMP250或CMP252。
异戊二烯和1，3-丙二醇的共同生产.使菌株CMP250、CMP252、或源自菌株CMP250和CMP252但引入了一个或多个如上所述的另外的突变的其它菌株无氧地生长于HM1培养基中，诱导如本文其它地方所述的引入了MVA途径多肽和/或其它异源多肽的多种质粒的表达。通过如本文其它地方描述的GC/MS法测定废气中的异戊二烯浓度，如本文其它地方所描述通过HPLC或通过本领域技术人员已知的其它合适方法测定发酵液中的1，3-丙二醇浓度。多种细菌菌株显示出具有异戊二烯和1，3-丙二醇的高生产率，以大约13∶30的质量比生产。
实施例31：构建用于共同生产异戊二烯和1，3-丙二醇的大肠杆菌菌株CMP249
基于以下等式计算共同生产异戊二烯和1，3-PDO的产率：
(1)：1.5Glc+3ATP→3AcCoA+3CO2+6NAD(P)H
(2)：3AcCoA+2NAD(P)H→MVA
(3)：MVA+3ATP→HG+CO 2 +H 2 O
(1)+(2)+(3)＝(4)：1.5Glc→HG+4CO2+4NAD(P)H
(5)：1/18Glc+1/3O2→2ATP+1/3H2O
(6)：0.5Glc+ATP+2NAD(P)H→PDO
(4)+(5)+2＊(6)＝(7)：23/9Glc+1/3O2→HG+2PDO+4.33CO2+3.33H2O
23/9C6H12O6+1/3O2→C5H8+2C3H8O2+4.33CO2+3.33H2O
在细胞生产率指数(CPI)为6时，糖上的异戊二烯产率＝13％，最大值是14.8％；糖上的1，3-丙二醇＝30％，最大值是33％。峰值氧摄取速率(OUR)～17是3g/L/hr。
共同生产菌株CMP249(BL21 PL.2 mKKDyIgldAglpK::Kan tpgl，pDW15，pEWL244，pSYCO109)的构建.质粒pEWL244、pSYCO109和pDW15.质粒pSYCO109(SEQ ID NO：162；质粒图谱见图184A；序列见图184B-F)包含用于将二羟基丙酮-磷酸通过甘油转化为1，3-丙二醇的所有的必要途径基因，其描述见美国专利号7,371,558。pSYCO109F1.1(SEQ ID NO：163；质粒图谱见图185A，质粒序列见图185B-F)包含甘油脱水酶的两个亚基的融合物(具有氨基酸改变)。质粒EWL244(pTrcAlba-mMVK)包含编码银白杨异戊二烯合酶和马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶(mMVK)的基因(转录自trc启动子，按照本文实施例23的描述构建)(SEQ ID NO：45；质粒EWL244的图谱见图158，质粒序列见图159A-B)。
pD W15(pBBR1MCS-5上的Ptrc-upper MVA path way)的构建。为了将上部MVA途径插入pBBR1MCS-5载体，使用引物Upper5′XhoI(SEQ IDNO：164)和Upper3′XbaI(SEQ ID NO：165)通过PCR从质粒MCM82(见本文实施例23的描述)扩增包含pTrc、mvaE、mvaS、和rrn终止子的完整表达盒。PCR反应物包含：1μl MCM82(大约30ng)，10μl 5X
Figure BDA0000086907590003221
缓冲液(Stratagene，La Jolla，CA)，0.5μl dNTP(100mM)，1μl Upper5′XhoI(SEQ ID NO：164)(20uM)，1μl Upper3′XbaI(SEQ IDNO：165)(20uM)，35.5μl diH2O，和1μl Herculase DNA聚合酶(Stratagene)。反应循环如下：95℃/4分钟；5个循环的“95℃/20分钟，52℃20秒，72℃4分钟”；25个循环的“95℃/20分钟，55℃20秒，72℃/4分钟”；72℃/10分钟，然后冷却至4℃。
通过凝胶电泳(E-Gel，Invitrogen，Carlsbad，CA)确认大小为大约4.2kb的PCR产物，然后根据生产商推荐的程序使用QiaQuick纯化柱(Qiagen，La Jolla，CA)纯化。然后以XbaI和XhoI限制性核酸内切酶在37℃过夜处理纯化的PCR产物和pBBR1MCS-5载体。按照如下进行消化：将6μl diH2O、2μl 10X缓冲液H(Roche)、10μl DNA(pBBR1MCS-5或PCR插入片段)、1μl XhoI(Roche)、和1μl XbaI(Roche)在37℃过夜温育。然后在65℃热灭活限制性酶20分钟，然后进行连接。
按照如下所述在4℃进行连接反应过夜：2μl diH20，1μl 10X连接酶缓冲液(New England Biolabs)，1μl T4DNA连接酶(NEB)，2μl载体(pBBR1MCS-5)，和4μl插入片段(上部MVA表达载体)。然后将反应混合物徼透析(Millipore，Billerica，MA)。根据生产商推荐的程序，将大约5μl连接反应物转化进入化学感受态的大肠杆菌TOP10细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)，在37℃在LB中恢复1小时，然后铺板于含有X-gal和10μg/ml庆大霉素的LB平板。使用引物M13Reverse和MCM163通过PCR确认插入片段的存在，以选择不显示β-半乳糖苷酶活性的菌落进行进一步分析。纯化(Qiagen)来自这些菌落中的一个的质粒并进行完全测序(Quintara Biosciences，关于引物序列见表1)以验证其以正确的方向包含完整的上部MVA途径表达盒。图183A显示了质粒pDW15(SEQ IDNO：161)的图谱，该质粒表达来自粪肠球菌的上部MVA途径多肽mvaE和mvaS。图183B-D显示了pDW15的序列。
表22.PCR和测序引物
Upper5′XhoI   atgctcgagctgttgacaattaatcatccggctc(SEQ ID NO：164)
Upper3′XbaI   cgatctagaaaggcccagtctttcgactgagcc(SEQ ID NO：165)
MCM163   GGATTTTGGCCATTTCCAGCTT(SEQ ID NO：166)
CF07-58   atgaaaacagtagttattattgatgc(SEQ ID NO：167)
CF07-59   cttaaatcatttaaaatagc(SEQ ID NO：168)
CF07-82   atgacaattgggattgataaaattag(SEQ ID NO：169)
CF07-86   gaaatagccccattagaagtatc(SEQ ID NO：170)
CF07-87   ttgccaatcatatgattgaaaatc(SEQ ID NO：171)
CF07-88   gctatgcttcattagatccttatcg(SEQ ID NO：172)
CF07-89   gaaacctacatccaatcttttgccc(SEQ ID NO：173)
菌株MCM518-521和528-531的构建：λ启动子驱动的整合的mKKDyI.根据生产商的程序，使用Stratagene Herculase II Fusion试剂盒，使用引物MCM120和MCM224从GeneBridges FRT-gb2-Cm-FRT模板扩增抗性盒。4份50μL的PCR反应物循环如下：95℃/2分钟；30个循环的“95℃/20秒，55℃/20秒，72℃/1分钟”；72℃/3分钟；冷却至4℃。将4份反应物汇集并根据生产商的程序在Qiagen PCR柱上纯化，在55℃以60μL洗脱缓冲液洗脱。
按照本文其它地方的描述，将质粒pRedET-carb(GeneBridges)电穿孔进入MCM446(大肠杆菌BL21cmR-gi1.6mKKDyI A1-3(A)，按照国际专利公开号WO 2009/076676A2构建，该文献通过引用方式并入本文)。通过在30℃在SOC培养基(Invitrogen)中振荡1个小时使转化子恢复，然后在30℃在含有羧苄西林(50ug/mL)的L琼脂上过夜选择。羧苄西林抗性菌落被冷冻为MCM508。
菌株MCM508在30℃从新鲜划线生长于含有羧苄西林(50μg/mL)的5mL L Broth上，生长至OD600为～0.5。加入40mM L-阿拉伯糖，将培养物在37℃温育1.5小时。收集细胞并按照之前的描述以3μL纯化的扩增子进行电穿孔，然后在37℃在500μLSOC中恢复1.5-3小时。在37℃在含有10μg/ml卡那霉素的L琼脂平板上选择转化子。
使用引物GB-DW(SEQ ID NO：177)和MCM208(SEQ ID NO：175)通过PCR确认扩增子在靶基因座上的重组。将得到的扩增子测序以鉴定具有以下序列的4个克隆。将羧苄西林敏感性克隆冷冻，作为菌株MCM518-521。
将MCM518-521在含有10μg/ml卡那霉素的L琼脂上重新划线并在37℃过夜生长。
在37℃在含有卡那霉素(10μg/mL)的L Broth中培养菌株MCM518-521，然后以质粒pCP20进行电转化。在500μL SOC中在30℃振荡1小时以使细胞恢复。在30℃在含有羧苄西林(50μg/mL)的L琼脂平板上选择转化子。次晨，使来自每个转化子的菌落在30℃生长于液体LB/羧苄西林(50μg/mL)中直至可以见到混浊。然后将培养物温度调为37℃，持续3小时。从该培养物将细胞划线至L琼脂平板并在37℃过夜生长。
次日，将菌落点染至L琼脂、含有羧苄西林(50μg/mL)的L琼脂、和含有卡那霉素(10μg/ml)的L琼脂。将那些既不在羧苄西林(50μg/mL)也不在卡那霉素(10μg/ml)上生长的克隆从L琼脂上的斑点培养于液体LB中，并冷冻作为MCM528-531。
菌株基因型
Figure BDA0000086907590003251
引物
MCM12  aaagtagccgaagatgacggtttgtcacatggagttggcaggatgtttgattaaaagcAATTAACCCTCACTAAAGGGC
0      GG(SEQ ID NO：174)
MCM20
8      GCTCTGAATAGTGATAGAGTCA(SEQ I D NO：175)
       taaatcttacccggcgcagaacaggataccatgtttttttacctcctttgcaccttcatggtggtcagtgcgtcctgctgatgtgctcagtat
       cac
       cgccagtggtatttaNgtcaacaccgccagagataatttatcaccgcagatggttatctgtatgttttttatatgaatttaatacgactcact
MCM22  atag
4      ggctcg(SEQ ID NO176)
GB-DW  Aaagaccgaccaagcgacgtctga(SEQ ID NO：177)
这些装配物包括插入到菌株MCM518-521中的染色体上的新的启动子，以及mMVK ORF最开始的部分。这些装配物的上游是来自GeneBridges FRT-gb2-Cm-FRT盒的序列。下游是mMVK ORF的其余部分，然后是来自菌株MCM508的下部MVA途径整合子的其余部分。
MCM518：
aaagaccgaccaagcgacgtctgagagctccctggcgaattcggtaccaataaaagagctttattttcatgatctgtgtgttggtttttgtgtgcggcgcggaagttcctattctctagaaagtataggaacttcctcgagccctatagtgagtcgtattaaattcatataaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacataaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgaccaccatgaaggtgcaaaggaggtaaaaaaacatggtatcctgttctgcgccgggtaagatttacctgttcggtgaacacgccgtagtttatggcgaaactgcaattgcgtgtgcggtggaactgcgtacccgtgttcgcgcggaactcaatgactctatcactattcagagc(SEQ ID NO：178).
MCM519：
aaagaccgaccaagcgacgtctgagagctccctggcgaattcggtaccaataaaagagctttattttcatgatctgtgtgttggtttttgtgtgcggcgcggaagttcctattctctagaaagtataggaacttcctcgagccctatagtgagtcgtattaaattcatataaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacctaaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgaccaccatgaaggtgcaaaggaggtaaaaaaacatggtatcctgttctgcgccgggtaagatttacctgttcggtgaacacgccgtagtttatggcgaaactgcaattgcgtgtgcggtggaactgcgtacccgtgttcgcgcggaactcaatgactctatcactattcagagc(SEQ ID NO：179).
MCM520：
aaagaccgaccaagcgacgtctgagagctccctggcgaattcggtaccaataaaagagctttattttcatgatctgtgtgttggtttttgtgtgcggcgcggaagttcctattctctagaaagtataggaacttcctcgagccctatagtgagtcgtattaaattcatataaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacctaaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgaccaccatgaaggtgcaaaggtaaaaaaacatggtatcctgttctgcgccgggtaagatttacctgttcggtgaacacgccgtagtttatggcgaaactgcaattgcgtgtgcggtggaactgcgtacccgtgttcgcgcggaactcaatgactctatcactattcagagc(SEQ ID NO：180).
MCM521：
aaagaccgaccaagcgacgtctgagagctccctggcgaattcggtaccaataaaagagctttattttcatgatctgtgtgttggtttttgtgtgcggcgcggaagttcctattctctagaaagtataggaacttcctcgagccctatagtgagtcgtattaaattcatataaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacgtaaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgaccaccatgaaggtgcaaaggaggtaaaaaaacatggtatcctgttctgcgccgggtaagatttacctgttcggtgaacacgccgtagtttatggcgaaactgcaattgcgtgtgcggtggaactgcgtacccgtgttcgcgcggaactcaatgactctatcactattcagagc(SEQ ID NO：181).
缺失MCM531中的glpK和gldA.从Keio集合(Baba等人2006)制备菌株JW3897(glpK::Kan)或JW5556(gldA::Kan)的P1裂解物。gldA:KanP1裂解物用于转导MCM531，在含有卡那霉素(10μg/mL)的L琼脂上选择转导子。使用引物CMP5(SEQ ID NO：184)和CMP6(SEQ ID NO：185)通过PCR筛选3个菌落以确认gldA的缺失。选择一个正确的菌落并命名为CMP212(MCM531gldA::Kan)。通过下列方式以使Kan抗生素抗性标志物环出：使用pCP20转化CMP212，在30℃在LB+50μg/L羧苄西林上选择转化子，在42℃将两个转化子在LB上划线过夜，从中选择对卡那霉素和羧苄西林敏感的菌落。得到的菌株被称作CMP219(MCM531 gldA ML)。glpK:Kan P1裂解物用于转导菌株CMP219，在含有卡那霉素(10μg/mL)的L琼脂上选择转导子。使用引物CMP1(SEQ ID NO：182)和CMP3(SEQ ID NO：183)通过PCR筛选3个菌落以验证glpK的缺失。选择一个正确的菌落并命名为CMP229(CMP219glpK::Kan)。
引物
CMP1  GCTATTCTGATGGGGCTGATCC(SEQ ID NO：182)
CMP3  GCCTTTATCGCCTACTGCCAGC(SEQ ID NO：183)
CMP5  CGTAGCGCATCAGGCAATTTTGCG(SEQ ID NO：184)
CMP6  GTGACTTCCGAAGGTCTGGCAGC(SEQ ID NO：185)
CMP239的构建.大肠杆菌菌株CMP239源自携带产生异戊二烯的途径和产生1，3-丙二醇的途径的大肠杆菌BL21。以pEWL244(SEQ IDNO：45和图158-159)和pDW15(SEQ ID NO：161和图183)电穿孔菌株CMP229(按照上文所述构建)。在含有羧苄西林(50μg/mL)和庆大霉素(5μg/mL)的L琼脂上选择转化子。以质粒pSYCO109F1.1(SEQ ID NO：163和图185；另外参考美国专利公开号US 2008/0293119A1，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于质粒pSYCO109F1.1的公开内容)电穿孔得到的菌株，在含有羧苄西林(50μg/mL)、庆大霉素(5μg/mL)和壮观霉素(50μg/mL)的L琼脂上选择转化子。由此产生的菌株被称作CMP239。
在CMP229中恢复pgl.该实施例描述了源自经P1噬菌体转导的BL21的大肠杆菌菌株的构建，所述P1噬菌体含有大肠杆菌MG1655基因组DNA并且就17,257bp的片段的重组进行了选择，所述片段存在于MG1655中但不存在于BL21和BL21(DE3)中。
制备大肠杆菌菌株MG1655的P1裂解物。使用该裂解物感染菌株CMP229。通过将细胞铺板于补充了0.5％(w/v)半乳糖(利用半乳糖的操纵子靠近pgl基因)的M9培养基来选择转导子。每升M9培养基含有200ml M9盐、2ml无菌的1M MgSO4、和100μl无菌的1M CaCl2。以蒸馏水将体积调整为1000ml，将该溶液无菌过滤。每升M9盐含有64gNa2HPO4-7H2O、15g KH2PO4、2.5g NaCl、和5.0g NH4Cl。搅拌该溶液直至盐溶解。然后使用蒸馏水将体积调整为1000ml，通过高压灭菌将该溶液灭菌。使用程序，使用galMF引物(5’-GAC GCT TTC GCC AAGTCA GG；SEQ ID NO：186)和galMR引物(5’-GTCAGGCTGGAATACTCTTCG；SEQ ID NO：187)(其退火至galM基因，如图186所示)通过PCR确认生长在M9+半乳糖上的菌落中17,257bp片段的整合。在30μL H2O中搅拌一个菌落并加热至95℃持续5分钟。将得到的溶液离心，将2μL的上清液用作以下PCR反应中的模板：在水中的2μl菌落，5μl
Figure BDA0000086907590003291
缓冲液，1μl 100mM dNTP，1μl 10μM正向引物，1μl 10μM反向引物39.5μL H2O+0.5μL来自Stratagene(La Jolla，CA)的
Figure BDA0000086907590003292
Enhanced DNA聚合酶。反应循环如下：95℃/2分钟；30个循环的“95℃/30秒，52℃(比引物的较低Tm低3℃)/30秒，72℃/60秒(～60秒/kbp)”；72℃/7分钟；然后冷却至4℃(来自ThermoHybaid的PCRExpress热循环仪)。如果模板是BL21的染色体DNA(该模板缺少获自大肠杆菌菌株MG1655的17,257bp的片段)，则使用这些引物的PCR不产生产物(见图186)。
使用DNA分子量X(Roche)作为对照物，在0.8％的E-凝胶(Invitrogen)上测定得到的PCR片段的大小。选择正确的菌落并命名为CMP241(BL21 PL.2mKKDyI(MCM531)t gldAML t glpK::Kan tpgl+4)。
大肠杆菌菌株CMP249的构建.该实验描述了源自携带用于产生异戊二烯的途径和用于产生1，3-丙二醇途径的BL21的菌株的构建。该菌株还含有存在于大肠杆菌K12菌株MG1655但不存在于BL21和BL21(DE3)中的17,257bp的片段。以pEWL244(SEQ ID NO：45和图158-159)和pDW15(SEQ ID NO：161和图183)电穿孔菌株CMP241(按照上文描述构建)。在含有羧苄西林(50μg/mL)和庆大霉素(5μg/mL)的L琼脂上选择转化子。以质粒pSYCO109F1.1电穿孔得到的菌株，在含有羧苄西林(50μg/mL)、庆大霉素(5μg/mL)和壮观霉素(50μg/mL)的L琼脂上选择转化子。由此获得的菌株被称作CMP249。
由大肠杆菌菌株CMP249共同生产异戊二烯和1，3-丙二醇(1，3-PDO).在摇瓶中测试CMP249的异戊二烯和1，3-PDO的生产。
培养条件.在250ml Erlenmeyer瓶中进行摇瓶实验，该瓶中含有25mL TM3培养基(每升：13.6g K2PO4，13.6g KH2PO4，2.0gMgSO4＊7H2O，2.0g一水柠檬酸，0.3g柠檬酸铁铵，3.2g(NH4)2SO4，0.2g酵母提取物，1.0ml 1000X改良痕量金属溶液，调节至pH 6.8，以水定容至最终体积，并无菌过滤)，TM3培养基含有2％葡萄糖\200μMIPTG和过量的酵母提取物以达到总共1g/L。在含有和不含维生素B12的情况下进行摇瓶培养。每升1000X改良痕量金属溶液含有柠檬酸＊H2O(4.0g/L)，MnSO4＊H2O(3.0g/L)，NaCl(1.0g/L)，FeSO4＊7H2O(0.10g/L)，COCl2＊6H2O(0.10g/L)，ZnSO4＊7H2O(0.10g/L)，CuSO4＊5H2O(0.010g/L)，H3BO3(0.010g/L)，和Na2MoO4＊2H2O(0.010g/L)。培养物在30℃以250rpm在Infors Multitron振荡器上振荡生长。从pSYCO109生产甘油由IPTG可诱导的Trc启动子(在存在lacI基因产物的情况下可以被诱导)驱动，1，3-PDO的生产通过添加维生素B12(浓度为5-125mg/mL)诱导。通过加入IPTG(例如200μM)诱导异戊二烯的生产。通过监测600nM波长下的光密度(OD)跟踪培养物的生长情况。
甘油和1，3-PDO的检测.所用的方法描述于美国专利公开号US2008/0176302A1，其通过引用方式并入本文，尤其是关于通过HPLC检测1，3-PDO的生产的内容。简而言之，通过HPLC监测葡萄糖向1，3-丙二醇的转化。使用标准色谱法进行分析。一种适宜的方法使用WatersAlliance HPLC系统，使用R1检测。将样品注射到Aminex HPX87H柱(7.8mm×300mm，Biorad，Hercules，CA)，该柱配备了Cation H RefillCartridge预柱(4.6mm×30mm，Biorad，Hercules，CA)，温度控制在50℃，使用5mM H2SO4作为流动相，流速为0.4mL/分钟。将该系统针对已知浓度的标志物轻微校正。通常而言，葡萄糖、甘油、1，3-丙二醇、和乙酸的保留时间分别是12.7分钟、19.0分钟、25.2分钟、和21.5分钟。
用于检测异戊二烯的顶空分析.按照国际专利公开号WO2009/076676A2中的描述进行顶空分析，该文献通过引用方式并入本文，尤其是关于用于检测异戊二烯的顶空分析的方法。简而言之，将1ml摇瓶培养物转移至20ml CTC顶空瓶(Agilent瓶的货号是51882753；盖子的货号是51882759)。将盖子旋紧，将瓶在相等温度以250rpm振荡温育。30分钟后，将瓶从温育箱中取出，并按照如下所述进行分析。该分析使用连接了CTC Analytics(Switzerland)CombiPAL自动取样仪(以顶空模式运行)的Agilent 6890GC/MS系统来进行。使用Agilent HP-5MSGC/MS柱(30m x0.25mm；膜厚0.25μm)来分离分析物。将取样仪设定为注入500μL顶空气体。GC/MS法使用氦作为载气，流速为1ml/分钟。注入口维持在250℃，分流比为50∶1。在分析过程中，将烤箱温度维持在37℃持续2分钟。在m/z 67下以单离子监控(SIM)模式运行Agilent5793N质量选择性检测器。在1.4至1.7分钟将检测器关闭，以允许洗脱永久气体。在这样的条件下，在1.78分钟观察到异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)的洗脱。使用校准表来定量异戊二烯的绝对量，发现在1μg/L至200μg/L是线性的。估计使用该方法时的检测限值是50-100ng/L。
摇瓶实验.以菌株CMP249进行摇瓶实验。测试了不同浓度的维生素B12(数据未显示)，在125mg/L及以上时显示出相同量的1，3-丙二醇(较低的浓度生产较少的1，3-丙二醇)。测定了异戊二烯和甘油或1，3-丙二醇的同时生产。图187A-D显示了来自相同组的摇瓶的数据。图187A显示了在存在200μM IPTG的情况下由大肠杆菌菌株CMP249生产的甘油和1，3-丙二醇。图187B显示了在存在200μM IPTG并且存在或不存在125mg/L维生素B12的情况下由大肠杆菌菌株CMP249生产的异戊二烯。图187C显示了在存在200μM IPTG并且存在或不存在125mg/L维生素B12的情况下OD图谱和由大肠杆菌菌株CMP249消耗的葡萄糖。图187D显示了在存在200μM IPTG并且存在或不存在125mg/L维生素B12的情况下由菌株CMP249生产的1，3-丙二醇和甘油的摩尔产率。甘油/1，3-丙二醇的摩尔产率计算如下：摩尔产率＝(所生产的甘油(g/L)/92+所生产的1，3-丙二醇(g/L)/76)/(消耗的葡萄糖(g/L)/180)。
实施例32：以15L规模在补料分批培养物中生长的大肠杆菌BL21共同生产异戊二烯和1，3-丙二醇
培养基配方(每升发酵培养基)：7.5g K2HPO4，2g MgSO4＊7H2O，2g-水柠檬酸，0.3g柠檬酸铁铵，0.5g酵母提取物，1ml 1000X改良痕量金属溶液。所有的成分一起添加溶解于diH2O水中。将溶液在121℃加热灭菌20分钟，然后使用28％的氢氧化铵将pH调节至7.0，并定容至最终体积。灭菌后加入10g葡萄糖、8mL汞维生素溶液、和合适的抗生素并调节pH。
1000X 改良痕量金属溶液(每升)：40g柠檬酸＊H2O，30gMnSO4＊H2O，10g NaCl，1g FeSO4＊7H2O，1g CoCl2＊6H2O，1gZnSO4＊7H2O，100mg CuSO4＊5H2O，100mg H3BO3，100mgNaMoO4＊2H2O。每种成分逐一溶解于diH2O，使用HCl/NaOH将pH调整为3.0，将溶液定容至最终体积，然后以0.22μm滤器无菌过滤。
汞维生素溶液(每升)：1.0g盐酸硫胺素，1.0g D-(+)-生物素，1.0g烟酸，4.8g D-泛酸，4.0g维生素B6。每种成分逐一溶解于diH2O中，使用HCl/NaOH将pH调整为3.0，将溶液定容至最终体积，然后以0.22μm滤器无菌过滤。
进料溶液(每千克)：0.57kg葡萄糖，0.38kg diH2O，7.5g K2HPO4，和10g 100％的Foamblast。所有的成分混合在一起并经高压灭菌。在溶液冷却至25℃之后添加5.6mL Macro盐溶液、0.8mL 1000X改良痕量金属溶液、和6.7mL汞维生素溶液。
Macro盐溶液(每升)：296g MgSO4＊7H2O、296g一水柠檬酸、和49.6g柠檬酸铁铵溶解于水中，定容至最终体积并以0.22μm滤器无菌过滤。
该实验监测在需要的发酵(7.0)和温度(34℃)从葡萄糖形成异戊二烯和1，3-丙二醇。在15L的生物反应器中以菌株CMP239(按照上文描述制备)的大肠杆菌BL21细胞进行发酵。菌株CMP239表达上部甲羟戊酸(MVA)途径(pDW15；见上文实施例30)、整合的下部MVA途径(PL.2mKKDyI)、来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶和来自银白杨的截短的异戊二烯合酶(pTrcAlba(MEA)mMVK(pDW34))，以及产生1，3-丙二醇所需的基因(pSYCO109F1.1)，不恢复pgl基因。解冻大肠杆菌菌株CMP239的冷冻瓶并接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至光密度1.0(在550nm测定)(OD550)时，使用500mL接种15L的生物反应器，使最初槽体积为5L。
以指数速率进料进料溶液直至达到5.8g/分钟的最大进料速率。此后，调整葡萄糖进料，以小于或等于5.8g/分钟的速率满足代谢需求。在37小时的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是4.2kg。通过表23所示的逐步方式加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)以进行诱导。
在12.8和35.8小时各加入208mg的维生素B12。生物反应器内的OD550图谱随时间的变化显示于图188。使用Hiden质谱仪测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价在发酵过程中增大，在37小时的时候达到最大值2.2g/L(图189)。在37小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是17.7g，发酵时间进程显示于图190。异戊二烯的比生产率的时间进程显示于图191。1，3-丙二醇效价在发酵过程中增大，在37小时的时候达到最大值53.3g/L(图192)。在37小时的发酵过程中生产的1，3-丙二醇的总量是507.9g，发酵时间进程显示于图193。1，3-丙二醇的比生产率的时间进程显示于图194。甘油效价在发酵过程中增大，在37小时的时候达到最大值27.3g/L(图195)。在37小时的发酵过程中生产的甘油的总量是259.8g，发酵时间进程显示于图196。甘油的比生产率的时间进程显示于图197。最终的产物产率显示于表24。
表23.发酵过程中的IPTG添加情况
Figure BDA0000086907590003341
表24.发酵37小时后的产物产率
Figure BDA0000086907590003342
附件1
示例性的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶核酸和多肽
ATH：AT3G21500(DXPS1)                    YPA：YPA_2671
 AT4G15560(CLA1)AT5G11380(DXPS3)         YPN：YPN_0911
OSA：433876843400904342614               YPP：YPDSF_2812
CME：CMF089C                             YPS：YPTB0939(dxs)
PFA：MAL13P1.186                         YPI：YpsIP31758_3112(dxs)
TAN：TA20470                             SFL：SF0357(dxs)
TPV：TP01_0516                           SFX：S0365(dxs)
ECO：b0420(dxs)                          SFV：SFV_0385(dxs)
ECJ：JW0410(dxs)                         SSN：SSON_0397(dxs)
ECE：Z0523(dxs)                          SBO：SBO_0314(dxs)
ECS：ECs0474                             SDY：SDY_0310(dxs)
ECC：c0531(dxs)                          ECA：ECA1131(dxs)
ECI：UTI89_C0443(dxs)                    PLU：plu3887(dxs)
ECP：ECP_0479                            BUC：BU464(dxs)
ECV：APECO1_1590(dxs)                    BAS：BUsg448(dxs)
ECW：EcE24377A_0451(dxs)                 WBR：WGLp144(dxs)
ECX：EcHS_A0491                          SGL：SG0656
STY：STY0461(dxs)                        KPN：KPN_00372(dxs)
STT：t2441(dxs)                          BFL：Bfl238(dxs)
SPT：SPA2301(dxs)                        BPN：BPEN_244(dxs)
SEC：SC0463(dxs)                         HIN：HI1439(dxs)
STM：STM0422(dxs)                        HIT：NTHI1691(dxs)
YPE：YPO3177(dxs)                        HIP：CGSHiEE_04795
YPK：y1008(dxs)                          HIQ：CGSHiGG_01080
YPM：YP_0754(dxs)                        HDU：HD0441(dxs)
HSO：HS_0905(dxs)                PAR：Psyc_0221(dxs)
PMU：PM0532(dxs)                 PCR：Pcryo_0245
MSU：MS1059(dxs)                 ACI：ACIAD3247(dxs)
APL：APL_0207(dxs)               SON：SO_1525(dxs)
XFA：XF2249                      SDN：Sden_2571
XFT：PD1293(dxs)                 SFR：Sfri_2790
XCC：XCC2434(dxs)                SAZ：Sama_2436
XCB：XC_1678                     SBL：Sbal_1357
XCV：XCV2764(dxs)                SLO：Shew_2771
XAC：XAC2565(dxs)                SHE：Shewmr4_2731
XOO：XOO2017(dxs)                SHM：Shewmr7_2804
XOM：XOO_1900(XOO 1900)          SHN：Shewana3_2901
VCH：VC0889                      SHW：Sputw3181_2831
VVU：VV1_0315                    ILO：IL2138(dxs)
VVY：VV0868                      CPS：CPS_1088(dxs)
VPA：VP0686                      PHA：PSHAa2366(dxs)
VFI：VF0711                      PAT：Pat1_1319
PPR：PBPRA0805                   SDE：Sde_3381
PAE：PA4044(dxs)                 PIN：Ping_2240
PAU：PA14_11550(dxs)             MAQ：Maqu_2438
PAP：PSPA7_1057(dxs)             MCA：MCA0817(dxs)
PPU：PP_0527(dxs)                FTU：FTT1018c(dxs)
PST：PSPTO_0698(dxs)             FTF：FTF1018c(dxs)
PSB：Psyr_0604                   FTW：FTW_0925(dxs)
PSP：PSPPH_0599(dxs)             FTL：FTL_1072
PFL：PFL_5510(dxs)               FTH：FTH_1047(dxs)
PFO：Pfl_5007                    FTA：FTA_1131(dxs)
PEN：PSEEN0600(dxs)              FTN：FTN_0896(dxs)
PMY：Pmen_3844                   NOC：Noc_1743
AEH：Mlg_1381                    BPD：BURPS668_A2534(dxs)
HCH：HCH_05866(dxs)              BTE：BTH_II0614(dxs)
CSA：Csal_0099                   BPE：BP2798(dxs)
ABO：ABO_2166(dxs)               BPA：BPP2464(dxs)
AHA：AHA_3321(dxs)               BBR：BB1912(dxs)
BCI：BCI_0275(dxs)               RFR：Rfer_2875
RMA：Rmag_0386                   POL：Bpro_1747
VOK：COSY_0360(dxs)              PNA：Pnap_1501
NME：NMB1867                     AJS：Ajs_1038
NMA：NMA0589(dxs)                MPT：Mpe_A2631
NMC：NMC0352(dxs)                HAR：HEAR0279(dxs)
NGO：NGO0036                     MMS：mma_0331
CVI：CV_2692(dxs)                NEU：NE1161(dxs)
RSO：RSc2221(dxs)                NET：Neut_1501
REU：Reut_A0882                  NMU：Nmul_A0236
REH：H16A_2732(dxs)              EBA：ebA4439(dxs)
RME：Rmet_2615                   AZO：azo1198(dxs)
BMA：BMAA0330(dxs)               DAR：Daro_3061
BMV：BMASAVP1_1512(dxs)          TBD：Tbd_0879
BML：BMA10299_1706(dxs)          MFA：Mfla_2133
BMN：BMA10247_A0364(dxs)         HPY：HP0354(dxs)
BXE：Bxe_B2827                   HPJ：jhp0328(dxs)
BUR：Bcep18194_B2211             HPA：HPAG1_0349
BCN：Bcen_4486                   HHE：HH0608(dxs)
BCH：Bcen2424_3879               HAC：Hac_0968(dxs)
BAM：Bamb_3250                   WSU：WS1996
BPS：BPSS1762(dxs)               TDN：Tmden_0475
BPM：BURPS1710b_A0842(dxs)       CJE：Cj0321(dxs)
BPL：BURPS1106A_A2392(dxs)       CJR：CJE0366(dxs)
CJJ：CJJ81176_0343(dxs)                ATC：AGR_C_1351
CJU：C8J_0298(dxs)                     RET：RHE_CH00913(dxs)
CJD：JJD26997_1642(dxs)                RLE：RL0973(dxs)
CFF：CFF8240_0264(dxs)                 BME：BMEI1498
CCV：CCV52592_1671(dxs)                BMF：BAB1_0462(dxs)
 CCV52592_1722                         BMS：BR0436(dxs)
CHA：CHAB381_1297(dxs)                 BMB：BruAb1_0458(dxs)
CCO：CCC13826_1594(dxs)                BOV：BOV_0443(dxs)
ABU：Abu_2139(dxs)                     BJA：bll2651(dxs)
NIS：NIS_0391(dxs)                     BRA：BRADO2161(dxs)
SUN：SUN_2055(dxs)                     BBT：BBta_2479(dxs)
GSU：GSU0686(dxs-1)GSU1764(dxs-2)      RPA：RPA0952(dxs)
GME：Gmet_1934Gmet_2822                RPB：RPB_4460
PCA：Pcar_1667                         RPC：RPC_1149
PPD：Ppro_1191Ppro_2403                RPD：RPD_4305
DVU：DVU1350(dxs)                      RPE：RPE_1067
DVL：Dvul_1718                         NWI：Nwi_0633
DDE：Dde_2200                          NHA：Nham_0778
LIP：LI0408(dsx)                       BHE：BH04350(dxs)
DPS：DP2700                            BQU：BQ03540(dxs)
ADE：Adeh_1097                         BBK：BARBAKC583_0400(dxs)
MXA：MXAN_4643(dxs)                    CCR：CC_2068
SAT：SYN_02456                         SIL：SPO0247(dxs)
SFU：Sfum_1418                         SIT：TM1040_2920
PUB：SAR11_0611(dxs)                   RSP：RSP_0254(dxsA)RSP_1134(dxs)
MLO：mlr7474                           JAN：Jann_0088Jann_0170
MES：Meso_0735                         RDE：RD1_0101(dxs)RD1_0548(dxs)
SME：SMc00972(dxs)                     MMR：Mmar10_0849
ATU：Atu0745(dxs)                      HNE：HNE_1838(dxs)
ZMO：ZMO1234(dxs)ZMO1598(dxs)            LMO：lmo1365(tktB)
NAR：Saro_0161                           LMF：LMOf2365_1382(dxs)
SAL：Sala_2354                           LIN：lin1402(tktB)
ELI：ELI_12520                           LWE：lwe1380(tktB)
GOX：GOX0252                             LLA：L108911(dxsA)L123365(dxsB)
GBE：GbCGDNIH1_0221                      LLC：LACR_1572 LACR_1843
 GbCGDNIH1_2404                          LLM：llmg_0749(dxsB)
RRU：Rru_A0054 Rru_A2619                 SAK：SAK_0263
MAG：amb2904                             LPL：lp_2610(dxs)
MGM：Mmc1_1048                           LJO：LJ0406
SUS：Acid_1783                           LAC：LBA0356
BSU：BG11715(dxs)                        LSL：LSL_0209(dxs)
BHA：BH2779                              LGA：LGAS_0350
BAN：BA4400(dxs)                         STH：STH1842
BAR：GBAA4400(dxs)                       CAC：CAC2077 CA_P0106(dxs)
BAA：BA_4853                             CPE：CPE1819
BAT：BAS4081                             CPF：CPF_2073(dxs)
BCE：BC4176(dxs)                         CPR：CPR_1787(dxs)
BCA：BCE_4249(dxs)                       CTC：CTC01575
BCZ：BCZK3930(dxs)                       CNO：NT01CX_1983
BTK：BT9727_3919(dxs)                    CTH：Cthe_0828
BTL：BALH_3785(dxs)                      CDF：CD1207(dxs)
BLI：BL01523(dxs)                        CBO：CBO_1881(dxs)
BLD：BLi02598(dxs)                       CBA：CLB_1818(dxs)
BCL：ABC2462(dxs)                        CBH：CLC_1825(dxs)
BAY：RBAM_022600                         CBF：CLI_1945(dxs)
BPU：BPUM_2159                           CKL：CKL_1231(dxs)
GKA：GK2392                              CHY：CHY_1985(dxs)
GTN：GTNG_2322                           DSY：DSY2348
DRM：Dred_1078                        CMI：CMM_1660(dxsA)
PTH：PTH_1196(dxs)                    AAU：AAur_1790(dxs)
SWO：SWol_0582                        PAC：PPA1062
CSC：Csac_1853                        TFU：Tfu_1917
TTE：TTE1298(dxs)                     FRA：Francci3_1326
MTA：Moth_1511                        FAL：FRAAL2088(dxs)
MPE：MYPE730                          ACE：Acel_1393
MGA：MGA_1268(dxs)                    SEN：SACE_1815(dxs)SACE_4351
MTU：Rv2682c(dxs1)Rv3379c(dxs2)       BLO：BL1132(dxs)
MTC：MT2756(dxs)                      BAD：BAD_0513(dxs)
MBO：Mb2701c(dxs1)Mb3413c(dxs2)       FNU：FN1208 FN1464
MLE：ML1038(dxs)                      RBA：RB2143(dxs)
MPA：MAP2803c(dxs)                    CTR：CT331(dxs)
MAV：MAV_3577(dxs)                    CTA：CTA_0359(dxs)
MSM：MSMEG_2776(dxs)                  CMU：TC0608
MMC：Mmcs_2208                        CPN：CPn1060(tktB_2)
CGL：NCgl1827(cgl1902)                CPA：CP0790
CGB：cg2083(dxs)                      CPJ：CPj1060(tktB_2)
CEF：CE1796                           CPT：CpB1102
CDI：DIP1397(dxs)                     CCA：CCA00304(dxs)
CJK：jk1078(dxs)                      CAB：CAB301(dxs)
NFA：nfa37410(dxs)                    CFE：CF0699(dxs)
RHA：RHA1_ro06843                     PCU：pc0619(dxs)
SCO：SCO6013(SC1C3.01)                TPA：TP0824
 SCO6768(SC6A5.17)                    TDE：TDE1910(dxs)
SMA：SAV1646(dxs1)SAV2244(dxs2)       LIL：LA3285(dxs)
TWH：TWT484                           LIC：LIC10863(dxs)
TWS：TW280(Dxs)                       LBJ：LBJ_0917(dxs)
LXX：Lxx10450(dxs)                    LBL：LBL_0932(dxs)
SYN：sll1945(dxs)                      BFR：BF0873 BF4306
SYW：SYNW1292(Dxs)                     BFS：BF0796(dxs)BF4114
SYC：syc1087_c(dxs)                    PGI：PG2217(dxs)
SYF：Synpcc7942_0430                   CHU：CHU_3643(dxs)
SYD：Syncc9605_1430                    GFO：GFO_3470(dxs)
SYE：Syncc9902_1069                    FPS：FP0279(dxs)
SYG：sync_1410(dxs)                    CTE：CT0337(dxs)
SYR：SynRCC307_1390(dxs)               CPH：Cpha266_0671
SYX：SynWH7803_1223(dxs)               PVI：Cvib_0498
CYA：CYA_1701(dxs)                     PLT：Plut_0450
CYB：CYB_1983(dxs)                     DET：DET0745(dxs)
TEL：tll0623                           DEH：cbdb_A720(dxs)
GVI：gll0194                           DRA：DR_1475
ANA：alr0599                           DGE：Dgeo_0994
AVA：Ava_4532                          TTH：TTC1614
PMA：Pro0928(dxs)                      TTJ：TTHA0006
PMM：PMM0907(Dxs)                      AAE：aq_881
PMT：PMT0685(dxs)                      TMA：TM1770
PMN：PMN2A_0300                        PMO：Pmob_1001
PMI：PMT9312_0893
PMB：A9601_09541(dxs)
PMC：P9515_09901(dxs)
PMF：P9303_15371(dxs)
PMG：P9301_09521(dxs)
PMH：P9215_09851
PMJ：P9211_08521
PME：NATL1_09721(dxs)
TER：Tery_3042
BTH：BT_1403 BT_4099
示例性的乙酰基-辅酶A-乙酰转移酶核酸和多肽
HSA：38(ACAT1)39(ACAT2)                AFM：AFUA_6G14200 AFUA_8G04000
PTR：451528(ACAT1)                     AOR：AO090103000012 AO090103000406
MCC：707653(ACAT1)708750(ACAT2)        CNE：CNC05280
MMU：110446(Acat1)110460(Acat2)        UMA：UM03571.1
RNO：25014(Acat1)                      DDI：DDB_0231621
CFA：484063(ACAT2)489421(ACAT1)        PFA：PF14_0484
GGA：418968(ACAT1)                     TET：TTHERM_00091590
 421587(RCJMB04_34i5)                   TTHERM_00277470 TTHERM_00926980
XLA：379569(MGC69098)                  TCR：511003.60
 414622(MGC81403)414639(MGC81256)      ECO：b2224(atoB)
 444457(MGC83664)                      ECJ：JW2218(atoB)JW5453(yqeF)
XTR：394562(acat2)                     ECE：Z4164(yqeF)
DRE：30643(acat2)                      ECS：ECs3701
SPU：759502(LOC759502)                 ECC：c2767(atoB)c3441(yqeF)
DME：Dmel_CG10932 Dmel_CG9149          ECI：UTI89_C2506(atoB)
CEL：T02G5.4T02G5.7 T02G5.8(kat-1)      UTI89_C3247(yqeF)
ATH：AT5G48230(ACAT2/EMB1276)          ECP：ECP_2268 ECP_2857
OSA：4326136 4346520                   ECV：APECO1_3662(yqeF)
CME：CMA042C CME087C                    APECO1_4335(atoB)
SCE：YPL028W(ERG10)                     APECO1_43352(atoB)
AGO：AGOS_ADR165C                      ECX：EcHS_A2365
PIC：PICST_31707(ERG 10)               STY：STY3164(yqeF)
CAL：CaO19.1591(erg10)                 STT：t2929(yqeF)
CGR：CAGL0L12364g                      SPT：SPA2886(yqeF)
SPO：SPBC215.09c                       SEC：SC2958(yqeF)
MGR：MGG_01755 MGG_13499               STM：STM3019(yqeF)
ANI：AN1409.2                          SFL：SF2854(yqeF)
SFX：S3052(yqeF)                         PSB：Psyr_0824 Psyr_3031
SFV：SFV_2922(yqeF)                      PSP：PSPPH_0850(phbA1)
SSN：SSON_2283(atoB)SSON_3004(yqeF)      PSPPH_2209(phbA2)
SBO：SBO_2736(yqeF)                      PFL：PFL_1478(atoB-2)PFL_2321
ECA：ECA1282(atoB)                        PFL_3066 PFL_4330(atoB-2)PFL_5283
ENT：Ent638_3299                         PFO：Pfl_1269 Pfl_1739 Pfl_2074 Pfl_2868
SPE：Spro_0592                           PEN：PSEEN3197 PSEEN3547(fadAx)
HIT：NTHI0932(atoB)                       PSEEN4635(phbA)
XCC：XCC1297(atoB)                       PMY：Pmen_1138 Pmen_2036 Pmen_3597
XCB：XC_2943                              Pmen_3662 Pmen_3820
XCV：XCV1401(thlA)                       PAR：Psyc_0252 Psyc_1169
XAC：XAC1348(atoB)                       PCR：Pcryo_0278 Pcryo_1236 Pcryo_1260
XOO：XOO1881(atoB)                       PRW：PsycPRwf_2011
XOM：XOO_1778(XOO1778)                   ACI：ACIAD0694 ACIAD1612
VCH：VCA0690                              ACIAD2516(atoB)
VCO：VC0395_0630                         SON：SO_1677(atoB)
VVU：VV2_0494VV2_0741                    SDN：Sden_1943
VVY：VVA1043 VVA1210                     SFR：Sfri_1338 Sfri_2063
VPA：VPA0620 VPA1123 VPA1204             SAZ：Sama_1375
PPR：PBPRB1112 PBPRB1840                 SBL：Sbal_1495
PAE：PA2001(atoB)PA2553 PA3454           SBM：Shew185_1489
 PA3589 PA3925                           SBN：Sbal195_1525
PAU：PA14_38630(atoB)                    SLO：Shew_1667 Shew_2858
PPU：PP_2051(atoB)PP_2215(fadAx)         SPC：Sputcn32_1397
 PP_3754PP_4636                          SSE：Ssed_1473 Ssed_3533
PPF：Pput_2009 Pput_2403 Pput_3523       SPL：Spea_2783
 Pput 4498                               SHE：Shewmr4_2597
PST：PSPTO_0957(phbA-1)                  SHM：Shewmr7_2664
PSPTO_3164(phbA-2)                       SHN：Shewana3_2771
SHW：Sputw3181_2704                     REU：Reut_A0138 Reut_A1348 Reut_A1353
ILO：IL0872                              Reut_B4561 Reut_B4738 Reut_B5587
CPS：CPS_1605 CPS_2626                   Reut_C5943 Reut_C6062
PHA：PSHAa0908 PSHAa1454(atoB)          REH：H16_A0170 H16_A0867 H16_A0868
 PSHAa1586(atoB)                         H16_A0872 H16_A1297
PAT：Pat1_2923                           H16_A1438(phaA)H16_A1445(bktB)
SDE：Sde_3149                            H16_A1528 H16_A1713 H16_A1720
PIN：Ping_0659 Ping_2401                 H16_A1887 H16_A2148 H16_B0380
MAQ：Maqu_2117 Maqu_2489 Maqu_2696       H16_B0381 H16_B0406 H16_B0662
 Maqu_3162                               H16_B0668 H16_B0759 H16_B1369
CBU：CBU_0974                            H16_B1771
LPN：lpg1825(atoB)                      RME：Rmet_0106 Rmet_1357 Rmet_1362
LPF：lpl1789                             Rmet_5156
LPP：lpp1788                            BMA：BMA1316 BMA1321(phbA)
NOC：Noc_1891                            BMA1436
AEH：Mlg_0688 Mlg_2706                  BMV：BMASAVP1_A1805(bktB)
HHA：Hhal_1685                           BMASAVP1_A1810(phbA)
HCH：HCH_05299                          BML：BMA10299_A0086(phbA)
CSA：Csal_0301 Csal_3068                 BMA10299_A0091
ABO：ABO_0648(fadAx)                    BMN：BMA10247_1076(bktB)
MMW：Mmwyl1_0073 Mmwyl1_3021             BMA10247_1081(phbA)
 Mmwyl1_3053 Mmwyl1_3097                BXE：Bxe_A2273 Bxe_A2335 Bxe_A2342
 Mmwyl1_4182                             Bxe_A4255Bxe_B0377Bxe_B0739
AHA：AHA_2143(atoB)                      Bxe_C0332 Bxe_C0574 Bxe_C0915
CVI：CV_2088(atoB)CV_2790(phaA)         BVI：Bcep1808_0519 Bcep1808_1717
RSO：RSc0276(atoB)RSc1632(phbA)          Bcep1808_2877 Bcep1808_3594
 RSc1637(bktB)RSc1761(RS02948)           Bcep1808_4015 Bcep1808_5507
                                         Bcep1808_5644
BUR：Bcep18194_A3629 Bcep18194_A5080         RFR：Rfer_0272 Rfer_1000 Rfer_1871
 Bcep18194_A5091 Bcep18194_A6102              Rfer_2273 Rfer_2561 Rfer_2594
 Bcep18194_B0263 Bcep18194_B1439              Rfer_3839
 Bcep18194_C6652 Bcep18194_C6802             POL：Bpro_1577 Bpro_2140 Bpro_3113
 Bcep18194_C6874 Bcep18194_C7118              Bpro_4187
 Bcep18194_C7151 Bcep18194_C7332             PNA：Pnap_0060 Pnap_0458 Pnap_0867
BCN：Bcen_1553 Bcen_1599 Bcen_2158            Pnap_1159 Pnap_2136 Pnap_2804
 Bcen_2563 Bcen_2998 Bcen_6289               AAV：Aave_0031 Aave_2478 Aave_3944
BCH：Bcen2424_0542 Bcen2424_1790              Aave_4368
 Bcen2424_2772 Bcen2424_5368                 AJS：Ajs_0014 Ajs_0124 Ajs_1931 Ajs_2073
 Bcen2424_6232 Bcen2424_6276                  Ajs_2317 Ajs_3548 Ajs_3738 Ajs_3776
BAM：Bamb_0447 Bamb_1728 Bamb_2824           VEI：Veis_1331 Veis_3818 Veis_4193
 Bamb_4717 Bamb_5771 Bamb_5969               DAC：Daci_0025 Daci_0192 Daci_3601
BPS：BPSL1426 BPSL1535(phbA)                  Daci_5988
 BPSL1540                                    MPT：Mpe_A1536 Mpe_A1776 Mpe_A1869
BPM：BURPS1710b_2325(bktB)                    Mpe_A3367
 BURPS1710b_2330(phbA)                       HAR：HEAR0577(phbA)
 BURPS1710b_2453(atoB-2)                     MMS：mma_0555
BPL：BURPS1106A_2197(bktB)                   NEU：NE2262(bktB)
 BURPS1106A_2202(phbA)                       NET：Neut_0610
BPD：BURPS668_2160(bktB)                     EBA：ebA5202 p2A409(tioL)
 BURPS668_2165(phbA)                         AZO：azo0464(fadA1)azo0469(fadA2)
BTE：BTH_I2144 BTH_I2256 BTH_I2261            azo2172(thlA)
PNU：Pnuc_0927                               DAR：Daro_0098 Daro_3022
BPE：BP0447 BP0668 BP2059                    HPA：HPAG1_0675
BPA：BPP0608 BPP1744 BPP3805 BPP4216         HAC：Hac_0958(atoB)
 BPP4361                                     GME：Gmet_1719 Gmet_2074 Gmet_2213
BBR：BB0614 BB3364 BB4250 BB4804              Gmet_2268 Gmet_3302
 BB4947                                      GUR：Gura_3043
BBA：Bd0404(atoB)Bd2095                    BMF：BAB1_1783(phbA-1)
DOL：Dole_0671 Dole_1778 Dole_2160            BAB2_0790(phbA-2)
 Dole_2187                                 BMS：BR1772(phbA-1)BRA0448(phbA-2)
ADE：Adeh_0062 Adeh_2365                    BMB：BruAb1_1756(phbA-1)
AFW：Anae109_0064 Anae109_1504              BruAb2_0774(phbA-2)
MXA：MXAN_3791                             BOV：BOV_1707(phbA-1)
SAT：SYN_02642                             OAN：Oant_1130 Oant_3107 Oant_3718
SFU：Sfum_2280 Sfum_3582                     Oant_4020
RPR：RP737                                 BJA：bll0226(atoB)bll3949 bll7400 bll7819
RCO：RC1134 RC1135                           blr3724(phbA)
RFE：RF_0163(paaJ)                         BRA：BRADO0562(phbA)
RBE：RBE_0139(paaJ)                         BRADO0983(pimB)BRADO3110
RAK：A1C_05820                              BRADO3134(atoB)
RBO：A1I_07215                             BBT：BBta_3558 BBta_3575(atoB)
RCM：A1E_04760                              BBta_5147(pimB)BBta_7072(pimB)
PUB：SAR11_0428(thlA)                       BBta_7614(phbA)
MLO：mlr3847                               RPA：RPA0513(pcaF)RPA0531
MES：Meso_3374                              RPA3715(pimB)
PLA：Plav_1573 Plav_2783                   RPB：RPB_0509 RPB_0525 RPB_1748
SME：SMa1450 SMc03879(phbA)                RPC：RPC_0504 RPC_0636 RPC_0641
SMD：Smed_0499 Smed_3117 Smed_5094          RPC_0832 RPC_1050 RPC_2005
 Smed_5096                                  RPC_2194 RPC_2228
ATU：Atu2769(atoB)Atu3475                  RPD：RPD_0306 RPD_0320 RPD_3105
ATC：AGR_C_5022(phbA)AGR_L_2713             RPD_3306
RET：RHE_CH04018(phbAch)                   RPE：RPE_0168 RPE_0248 RPE_3827
 RHE_PC00068(ypc00040)                     NWI：Nwi_3060
 RHE_PF00014(phbAf)                        XAU：Xaut_3108 Xaut_4665
RLE：RL4621(phaA)pRL100301 pRL120369       CCR：CC_0510 CC_0894 CC_3462
BME：BMEI0274 BMEII0817
SIL：SPO0142(bktB)SPO0326(phbA)                MAG：amb0842
 SPO0773 SPO3408                               MGM：Mmc1_1165
SIT：TM1040_0067 TM1040_2790                   ABA：Acid345_3239
 TM1040_3026 TM1040_3735                       BSU：BG11319(mmgA)BG13063(yhfS)
RSP：RSP_0745 RSP_1354 RSP_3184                BHA：BH1997 BH2029 BH3801(mmgA)
RSH：Rsph17029_0022 Rsph17029_2401             BAN：BA3687 BA4240 BA5589
 Rsph17029_3179 Rsph17029_3921                 BAR：GBAA3687 GBAA4240 GBAA5589
RSQ：Rsph17025_0012 Rsph17025_2466             BAA：BA_0445 BA_4172 BA_4700
 Rsph17025_2833                                BAT：BAS3418 BAS3932 BAS5193
JAN：Jann_0262 Jann_0493 Jann_4050             BCE：BC3627 BC4023 BC5344
RDE：RD1_0025 RD1_0201(bktB)                   BCA：BCE_3646 BCE_4076 BCE_5475
 RD1_3394(phbA)                                BCZ：BCZK3329(mmgA)BCZK3780(thl)
PDE：Pden_2026 Pden_2663 Pden_2870              BCZK5044(atoB)
 Pden_2907 Pden_4811 Pden_5022                 BCY：Bcer98_2722 Bcer98_3865
DSH：Dshi_0074 Dshi_3066 Dshi_3331             BTK：BT9727_3379(mmgA)
MMR：Mmar10_0697                                BT9727_3765(thl)BT9727_028(atoB)
HNE：HNE_2706 HNE_3065 HNE_3133                BTL：BALH_3262(mmgA)
NAR：Saro_0809 Saro_1069 Saro_1222              BALH_3642(fadA)BALH_4843(atoB)
 Saro_2306 Saro_2349                           BLI：BL03925(mmgA)
SAL：Sala_0781 Sala_1244 Sala_2896             BLD：BLi03968(mmgA)
 Sala_3158                                     BCL：ABC0345 ABC2989 ABC3617
SWI：Swit_0632 Swit_0752 Swit_2893              ABC3891(mmgA)
 Swit_3602 Swit_4887 Swit_5019                 BAY：RBAM_022450
 Swit_5309                                     BPU：BPUM_2374(yhfS)BPUM_2941
ELI：ELI_01475 ELI_06705 ELI_12035              BPUM_3373
GBE：GbCGDNIH1_0447                            OIH：OB0676 OB0689 OB2632 OB3013
ACR：Acry_1847 Acry_2256                       GKA：GK1658 GK3397
RRU：Rru_A0274 Rru_A1380 Rru_A1469             SAU：SA0342 SA0534(vraB)
 Rru_A1946 Rru_A3387                           SAV：SAV0354 SAV0576(vraB)
SAM：MW0330 MW0531(vraB)                    SPH：MGAS10270_Spy0121
SAR：SAR0351(thl)SAR0581                     MGAS10270_Spy0433
SAS：SAS0330 SAS0534                         MGAS10270_Spy1461(atoB)
SAC：SACOL0426 SACOL0622(atoB)              SPI：MGAS10750_Spy0124
SAB：SAB0304(thl)SAB0526                     MGAS10750_Spy0452
SAA：SAUSA300_0355                           MGAS10750_Spy1453(atoB)
 SAUSA300_0560(vraB)                        SPJ：MGAS2096_Spy0123
SAO：SAOUHSC_00336 SAOUHSC_00558             MGAS2096_Spy0451
SAJ：SaurJH9_0402                            MGAS2096_Spy1365(atoB)
SAH：SaurJH1_0412                           SPK：MGAS9429_Spy0121
SEP：SE0346 SE2384                           MGAS9429_Spy0431
SER：SERP0032 SERP0220                       MGAS9429_Spy1339(atoB)
SHA：SH0510(mvaC)SH2417                     SPF：SpyM50447(atoB2)
SSP：SSP0325 SSP2145                        SPA：M6_Spy0166 M6_Spy0466
LMO：lmo1414                                 M6_Spy1390
LMF：LMOf2365_1433                          SPB：M28_Spy0117 M28_Spy0420
LIN：lin1453                                 M28_Spy1385(atoB)
LWE：lwe1431                                SAK：SAK_0568
LLA：L11745(thiL)L25946(fadA)               LJO：LJ1609
LLC：LACR_1665 LACR_1956                    LAC：LBA0626(thiL)
LLM：llmg_0930(thiL)                        LSA：LSA1486
SPY：SPy_0140 SPy_1637(atoB)                LDB：Ldb0879
SPZ：M5005_Spy_0119 M5005_Spy_0432          LBU：LBUL_0804
 M5005_Spy_1344(atoB)                       LBR：LVIS_2218
SPM：spyM18_0136 spyM18_1645(atoB)          LCA：LSEI_1787
SPG：SpyM3_0108 SpyM3_1378(atoB)            LGA：LGAS_1374
SPS：SPs0110 SPs0484                        LRE：Lreu_0052
                                            EFA：EF1364
                                            OOE：OEOE_0529
STH：STH2913 STH725 STH804               MBB：BCG_1197 BCG_1385(fadA4)
CAC：CAC2873 CA_P0078(thiL)               BCG_3610(fadA5)BCG_3620c(fadA6)
CPE：CPE2195(atoB)                       MLE：ML1158(fadA4)
CPF：CPF_2460                            MPA：MAP2407c(fadA3)MAP2436c(fadA4)
CPR：CPR_2170                            MAV：MAV_1544 MAV_1573 MAV_1863
CTC：CTC00312                             MAV_5081
CNO：NT01CX_0538 NT01CX_0603             MSM：MSMEG_2224 MSMEG_4920
CDF：CD1059(thlA1)CD2676(thlA2)          MUL：MUL_0357
CBO：CBO3200(thl)                        MVA：Mvan_1976 Mvan_1988 Mvan_4305
CBE：Cbei_0411 Cbei_3630                  Mvan_4677 Mvan_4891
CKL：CKL_3696(thlA1)CKL_3697(thlA2)      MGI：Mflv_1347 Mflv_1484 Mflv_2040
CKL 3698(thlA3)                           Mflv_2340 Mflv_4356 Mflv_4368
AMT：Amet_4630                           MMC：Mmcs_1758 Mmcs_1769 Mmcs_3796
AOE：Clos_0084 Clos_0258                  Mmcs_3864
CHY：CHY_1288 CHY_1355(atoB)             MKM：Mkms_0251 Mkms_1540
 CHY_1604 CHY_1738                        Mkms_1805 Mkms_1816 Mkms_2836
DSY：DSY0632 DSY0639 DSY1567              Mkms_3159 Mkms_3286 Mkms_3869
 DSY1710 DSY2402 DSY3302                  Mkms_3938 Mkms_4227 Mkms_4411
DRM：Dred_0400 Dred_1491 Dred_1784        Mkms_4580 Mkms_4724 Mkms_4764
 Dred_1892                                Mkms_4776
SWO：SWol_0308 SWol_0675 SWol_0789       MJL：Mjls_0231 Mjls_1739 Mjls_1750
 SWol_1486 SWol_1934 SWol_2051            Mjls_2819 Mjls_3119 Mjls_3235
TTE：TTE0549(paaJ)                        Mjls_3800 Mjls_3850 Mjls_4110
MTA：Moth_1260                            Mjls_4383 Mjls_4705 Mjls_4876
MTU：Rv1135A Rv1323(fadA4)                Mjls_5018 Mjls_5063 Mjls_5075
 Rv3546(fadA5)                           CGL：NCgl2309(cgl2392)
MTC：MT1365(phbA)                        CGB：cg2625(pcaF)
MBO：Mb1167 Mb1358(fadA4)                CEF：CE0731 CE2295
 Mb3576(fadA5)Mb3586c(fadA6)             CJK：jk1543(fadA3)
NFA：nfa10750(fadA4)                        BGA：BG0110(fadA)
RHA：RHA1_ro01455 RHA1_ro01623              BAF：BAPKO_0110(fadA)
 RHA1_ro01876 RHA1_ro02517(catF)            LIL：LA0457(thiL1)LA0828(thiL2)
 RHA1_ro03022 RHA1_ro03024                   LA4139(fadA)
 RHA1_ro03391 RHA1_ro03892                  LIC：LIC10396(phbA)
 RHA1_ro04599 RHA1_ro05257                  LBJ：LBJ_2862(paaJ-4)
 RHA1_ro08871                               LBL：LBL_0209(paaJ-4)
SCO：SCO5399(SC8F4.03)                      SYN：slr1993(phaA)
SMA：SAV1384(fadA5)SAV2856(fadA1)           SRU：SRU_1211(atoB)SRU_1547
ART：Arth_1160 Arth_2986 Arth_3268          CHU：CHU_1910(atoB)
Arth 4073                                   GFO：GFO_1507(atoB)
NCA：Noca_1371 Noca_1797 Noca_1828          FJO：Fjoh_4612
 Noca_2764 Noca_4142                        FPS：FP0770 FP1586 FP1725
TFU：Tfu_1520 Tfu_2394                      RRS：RoseRS_3911 RoseRS_4348
FRA：Francci3_3687                          RCA：Rcas_0702 Rcas_3206
FRE：Franean1_1044 Franean1_2711            HAU：Haur_0522
 Franean_12726 Franean1_3929                DRA：DR_1072 DR_1428 DR_1960
 Franean_14037 Franean1_4577                 DR 2480 DR_A0053
FAL：FRAAL2514 FRAAL2618                    DGE：Dgeo_0755 Dgeo_1305 Dgeo_1441
 FRAAL5910(atoB)                              Dgeo_1883
ACE：Acel_0626 Acel_0672                    TTH：TTC0191 TTC0330
SEN：SACE_1192(mmgA)                        TTJ：TTHA0559
 SACE_2736(fadA6)SACE_4011(catF)            TME：Tmel_1134
 SACE_6236(fadA4)                           FNO：Fnod_0314
STP：Strop_3610                             PMO：Pmob_0515
SAQ：Sare_1316 Sare_3991                    HMA：rrnAC0896(acaB3)rrnAC2815(aca2)
RXY：Rxyl_1582 Rxyl_1842 Rxyl_2389           rrnAC3497(yqeF)rrnB0240(aca1)
 Rxyl_2530                                   rrnB0242(acaB2)rrnB0309(acaB 1)
FNU：FN0495                                 TAC：Ta0582
TVO：TVN0649
PTO：PTO1505
APE：APE_2108
SSO：SSO2377(acaB-4)
STO：ST0514
SAI：Saci_0963 Saci_1361(acaB1)
MSE：Msed_0656
PAI：PAE1220
PIS：Pisl_0029 Pisl_1301
PCL：Pcal_0781
PAS：Pars_0309 Pars_1071
CMA：Cmaq_1941
示例性的HMG-辅酶A合酶核酸和多肽
HSA：3157(HMGCS1)3158(HMGCS2)                   CNE：CNC05080 CNG02670
PTR：457169(HMGCS2)461892(HMGCS1)               UMA：UM05362.1
MCC：702553(HMGCS1)713541(HMGCS2)               ECU：ECU10_0510
MMU：15360(Hmgcs2)208715(Hmgcs1)                DDI：DDBDRAFT_0217522
RNO：24450(Hmgcs2)29637(Hmgcs1)                  DDB_0219924(hgsA)
CFA：479344(HMGCS1)607923(HMGCS2)               TET：TTHERM_00691190
BTA：407767(HMGCS1)                             TBR：Tb927.8.6110
SSC：397673(CH242-38B5.1)                       YPE：YPO1457
GGA：396379(HMGCS1)                             YPK：y2712(pksG)
XLA：380091(hmgcs1)447204(MGC80816)             YPM：YP_1349(pksG)
DRE：394060(hmgcs1)                             YPA：YPA_0750
SPU：578259(LOC578259)                          YPN：YPN_2521
DME：Dmel_CG4311(Hmgs)                          YPP：YPDSF_1517
CEL：F25B4.6                                    YPS：YPTB1475
ATH：AT4G11820(BAP1)                            CBD：COXBU7E912_1931
OSA：43314184347614                             TCX：Tcr_1719
CM E：CMM189C                                   DNO：DNO_0799
SCE：YML126C(ERG13)                             BMA：BMAA1212
AGO：AGOS_ADL356C                               BPS：BPSS1002
PIC：PICST_83020                                BPM：BURPS1710b_A2613
CAL：CaO19_7312(CaO19.7312)                     BPL：BURPS1106A_A1384
CGR：CAGL0H04081g                               BPD：BURPS668_A1470
SPO：SPAC4F8.14c(hcs)                           BTE：BTH_II1670
MGR：MGG_01026                                  MXA：MXAN_3948(tac)
ANI：AN4923.2                                    MXAN_4267(mvaS)
AFM：AFUA_3G10660AFUA_8G07210                   BSU：BG10926(pksG)
AOR：AO090003000611 AO090010000487              OIH：OB2248
SAU：SA2334(mvaS)                                 SPJ：MGAS2096_Spy0759(mvaS1)
SAV：SAV2546(mvaS)                                SPK：MGAS9429_Spy0743(mvaS1)
SAM：MW2467(mvaS)                                 SPF：SpyM51121(mvaS)
SAR：SAR2626(mvaS)                                SPA：M6_Spy0704
SAS：SAS2432S                                     PB：M28_Spy0667(mvaS.1)
SAC：SACOL2561                                    SPN：SP_1727
SAB：SAB2420(mvaS)                                SPR：spr1571(mvaS)
SAA：SAUSA300_2484                                SPD：SPD_1537(mvaS)
SAO：SAOUHSC_02860                                SAG：SAG1316
SAJ：SaurJH9_2569                                 SAN：gbs1386
SAH：SaurJH1_2622                                 SAK：SAK_1347
SEP：SE2110                                       SMU：SMU.943c
SER：SERP2122                                     STC：str0577(mvaS)
SHA：SH0508(mvaS)                                 STL：stu0577(mvaS)
SSP：SSP0324                                      STE：STER_0621
LMO：lmo1415                                      SSA：SSA_0338(mvaS)
LMF：LMOf2365_1434(mvaS)                          SSU：SSU05_1641
LIN：lin1454                                      SSV：SSU98_1652
LWE：lWe1432(mvaS)                                SGO：SGO_0244
LLA：L13187(hmcM)                                 LPL：lp_2067(mvaS)
LLC：LACR_1666                                    LJO：LJ1607
LLM：llmg_0929(hmcM)                              LAC：LBA0628(hmcS)
SPY：SPy_0881(mvaS.2)                             LSA：LSA1484(mvaS)
SPZ：M5005_Spy_0687(mvaS.1)                       LSL：LSL_0526
SPM：spyM18_0942(mvaS2)                           LDB：Ldb0881(mvaS)
SPG：SpyM3_0600(mvaS.2)                           LBU：LBUL_0806
SPS：SPs1253                                      LBR：LVIS_1363
SPH：MGAS10270_Spy0745(mvaS1)                     LCA：LSEI_1785
SPI：MGAS10750_Spy0779(mvaS1)                     LGA：LGAS_1372
LRE：Lreu_0676
PPE：PEPE_0868
EFA：EF1363
OOE：OEOE_0968
LME：LEUM_1184
NFA：nfa22120
SEN：SACE_4570(pksG)
BBU：BB0683
BGA：BG0706
BAF：BAPKO_0727
FJO：Fjoh_0678
HAL：VNG1615G(mvaB)
HMA：rrnAC1740(mvaS)
HWA：HQ2868A(mvaB)
NPH：NP2608A(mvaB_1)
 NP4836A(mvaB_2)
示例性的羟基甲基戊二酰-辅酶A还原酶核酸和多肽
HSA：3156(HMGCR)                                   VCH：VCA0723
PTR：471516(HMGCR)                                 VCO：VC0395_0662
MCC：705479(HMGCR)                                 VVU：VV2_0117
MMU：15357(Hmgcr)                                  VVY：VVA0625
RNO：25675(Hmgcr)                                  VPA：VPA0968
CFA：479182(HMGCR)                                 VFI：VFA0841
BTA：407159(HMGCR)                                 PAT：Pat1_0427
GGA：395145(RCJMB04_14m24)                         CBU：CBU_0030 CBU_0610
SPU：373355(LOC373355)                             CBD：COXBU7E912_0151
DME：Dmel_CG10367(Hmgcr)                            COXBU7E912_0622(hmgA)
CEL：F08F8.2                                       TCX：Tcr_1717
OSA：4347443                                       DNO：DNO_0797
SCE：YLR450W(HMG2)YML075C(HMG1)                    CVI：CV_1806
AGO：AGOS_AER152W                                  SUS：Acid_5728 Acid_6132
CGR：CAGL0L11506g                                  SAU：SA2333(mvaA)
SPO：SPCC162.09c(hmg1)                             SAV：SAV2545(mvaA)
ANI：AN3817.2                                      SAM：MW2466(mvaA)
AFM：AFUA_1G11230 AFUA_2G03700                     SAB：SAB2419c(mvaA)
AOR：AO090103000311 AO090120000217                 SEP：SE2109
CNE：CNF04830                                      LWE：lwe0819(mvaA)
UMA：UM03014.1                                     LLA：L10433(mvaA)
ECU：ECU10_1720                                    LLC：LACR_1664
DDI：DDB_0191125(hmgA)                             LLM：llmg_0931(mvaA)
 DDB_0215357(hmgB)                                 SPY：SPy_0880(mvaS.1)
TBR：Tb927.6.4540                                  SPM：spyM18_0941(mvaS1)
TCR：506831.40509167.20                            SPG：SpyM3_0599(mvaS.1)
LMA：LmjF30.3190                                   SPS：SPs1254
SPH：MGAS10270_Spy0744                    MEM：Memar_2365
SPI：MGAS10750_Spy0778                    MBN：Mboo_0137
SPJ：MGAS2096_Spy0758                     MTH：MTH562
SPK：MGAS9429_Spy0742                     MST：Msp_0584(hmgA)
SPA：M6_Spy0703                           MSI：Msm_0227
SPN：SP_1726                              MKA：MK0355(HMG1)
SAG：SAG1317                              AFU：AF1736(mvaA)
SAN：gbs1387                              HAL：VNG1875G(mvaA)
STC：str0576(mvaA)                        HMA：rrnAC3412(mvaA)
STL：stu0576(mvaA)                        HWA：HQ3215A(hmgR)
STE：STER_0620                            NPH：NP0368A(mvaA_2)
SSA：SSA_0337(mvaA)                        NP2422A(mvaA_1)
LPL：lp_0447(mvaA)                        TAC：Ta0406m
LJO：LJ1608                               TVO：TVN1168
LSL：LSL_0224                             PTO：PTO1143
LBR：LVIS_0450                            PAB：PAB2106(mvaA)
LGA：LGAS_1373                            PFU：PF1848
EFA：EF1364                               TKO：TK0914
NFA：nfa22110                             RCI：RCIX1027(hmgA)RCIX376(hmgA)
BGA：BG0708(mvaA)                         APE：APE_1869
SRU：SRU_2422                             IHO：Igni_0476
FPS：FP2341                               HBU：Hbut_1531
MMP：MMP0087(hmgA)                        SSO：SSO0531
MMQ：MmarC5_1589                          STO：ST1352
MAC：MA3073(hmgA)                         SAI：Saci_1359
MBA：Mbar_A1972                           PAI：PAE2182
MMA：MM_0335                              PIS：Pisl_0814
MBU：Mbur_1098                            PCL：Pcal_1085
MHU：Mhun_3004                            PAS：Pars_0796
示例性的甲羟戊酸激酶核酸和多肽
HSA：4598(MVK)                                  CBU：CBU_0608CBU_0609
MCC：707645(MVK)                                CBD：COXBU7E912_0620(mvk)
MMU：17855(Mvk)                                 LPN：lpg2039
RNO：81727(Mvk)                                 LPF：lpl2017
CFA：486309(MVK)                                LPP：lpp2022
BTA：505792(MVK)                                BBA：Bd1027(lmbP)Bd1630(mvk)
GGA：768555(MVK)                                MXA：MXAN_5019(mvk)
DRE：492477(zgc：103473)                        OIH：OB0225
SPU：585785(LOC585785)                          SAU：SA0547(mvaK1)
DME：Dmel_CG33671                               SAV：SAV0590(mvaK1)
OSA：4348331                                    SAM：MW0545(mvaK1)
SCE：YMR208W(ERG12)                             SAR：SAR0596(mvaK1)
AGO：AGOS_AER335W                               SAS：SAS0549
PIC：PICST_40742(ERG12)                         SAC：SACOL0636(mvk)
CGR：CAGL0F03861g                               SAB：SAB0540(mvaK1)
SPO：SPAC13G6.11c                               SAA：SAUSA300_0572(mvk)
MGR：MGG_06946                                  SAO：SAOUHSC_00577
ANI：AN3869.2                                   SEP：SE0361
AFM：AFUA_4G07780                               SER：SERP0238(mvk)
AOR：AO090023000793                             SHA：SH2402(mvaK1)
CNE：CNK01740                                   SSP：SSP2122
ECU：ECU09_1780                                 LMO：lmo0010
DDI：DDBDRAFT_0168621                           LMF：LMOf2365_0011
TET：TTHERM_00637680                            LIN：lin0010
TBR：Tb927.4.4070                               LWE：lwe0011(mvk)
TCR：436521.9509237.10                          LLA：L7866(yeaG)
LMA：LmjF31.0560                                LLC：LACR_0454
LLM：llmg_0425(mvk)                        LAC：LBA1167(mvaK)
SPY：SPy_0876(mvaK1)                       LSA：LSA0908(mvaK1)
SPZ：M5005_Spy_0682(mvaK1)                 LSL：LSL_0685(eRG)
SPM：spyM18_0937(mvaK1)                    LDB：Ldb0999(mvk)
SPG：SpyM3_0595(mvaK1)                     LBU：LBUL_0906
SPS：SPs1258                               LBR：LVIS_0858
SPH：MGAS10270_Spy0740(mvaK1)              LCA：LSEI_1491
SPI：MGAS10750_Spy0774(mvaK1)              LGA：LGAS_1033
SPJ：MGAS2096_Spy0753(mvaK1)               LRE：Lreu_0915
SPK：MGAS9429_Spy0737(mvaK1)               PPE：PEPE_0927
SPF：SpyM51126(mvaK1)                      EFA：EF0904(mvk)
SPA：M6_Spy0699                            OOE：OEOE_1100
SPB：M28_Spy0662(mvaK1)                    LME：LEUM_1385
SPN：SP_0381                               NFA：nfa22070
SPR：spr0338(mvk)                          BGA：BG0711
SPD：SPD_0346(mvk)                         BAF：BAPKO_0732
SAG：SAG1326                               FPS：FP0313
SAN：gbs1396                               MMP：MMP1335
SAK：SAK_1357(mvk)                         MAE：Maeo_0775
SMU：SMU.181                               MAC：MA0602(mvk)
STC：str0559(mvaK1)                        MBA：Mbar_A1421
STL：stu0559(mvaK1)                        MMA：MM_1762
STE：STER_0598                             MBU：Mbur_2395
SSA：SSA_0333(mvaK1)                       MHU：Mhun_2890
SSU：SSU05_0289                            MEM：Memar_1812
SSV：SSU98_0285                            MBN：Mboo_2213
SGO：SGO_0239(mvk)                         MST：Msp_0858(mvk)
LPL：lp_1735(mvaK1)                        MSI：Msm_1439
LJO：LJ1205                                MKA：MK0993(ERG12)
HAL：VNG1145G(mvk)
HMA：rrnAC0077(mvk)
HWA：HQ2925A(mvk)
NPH：NP2850A(mvk)
PTO：PTO1352
PHO：PH1625
PAB：PAB0372(mvk)
PFU：PF1637(mvk)
TKO：TK1474
RCI：LRC399(mvk)
APE：APE_2439
HBU：Hbut_0877
SSO：SSO0383
STO：ST2185
SAI：Saci_2365(mvk)
MSE：Msed_1602
PAI：PAE3108
PIS：Pisl_0467
PCL：Pcal_1835
示例性的磷酸甲羟戊酸激酶核酸和多肽
HSA：10654(PMVK)                          SAV：SAV0592(mvaK2)
PTR：457350(PMVK)                         SAM：MW0547(mvaK2)
MCC：717014(PMVK)                         SAR：SAR0598(mvaK2)
MMU：68603(Pmvk)                          SAS：SAS0551
CFA：612251(PMVK)                         SAC：SACOL0638
BTA：513533(PMVK)                         SAB：SAB0542(mvaK2)
DME：Dmel_CG10268                         SAA：SAUSA300_0574
ATH：AT1G31910                            SAO：SAOUHSC_00579
OSA：4332275                              SAJ：SaurJH9_0615
SCE：YMR220W(ERG8)                        SEP：SE0363
AGO：AGOS_AER354W                         SER：SERP0240
PIC：PICST_52257(ERG8)                    SHA：SH2400(mvaK2)
CGR：CAGL0F03993g                         SSP：SSP2120
SPO：SPAC343.01c                          LMO：lmo0012
MGR：MGG_05812                            LMF：LMOf2365_0013
ANI：AN2311.2                             LIN：lin0012
AFM：AFUA_5G10680                         LWE：lwe0013
AOR：AO090010000471                       LLA：L10014(yebA)
CNE：CNM00100                             LLC：LACR_0456
UMA：UM00760.1                            LLM：llmg_0427
DDI：DDBDRAFT_0184512                     SPY：SPy_0878(mvaK2)
TBR：Tb09.160.3690                        SPZ：M5005_Spy_0684(mvaK2)
TCR：507913.20508277.140                  SPM：spyM18_0939
LMA：LmjF15.1460                          SPG：SpyM3_0597(mvaK2)
MXA：MXAN_5017                            SPS：SPs1256
OIH：OB0227                               SPH：MGAS10270_Spy0742(mvaK2)
SAU：SA0549(mvaK2)                        SPI：MGAS10750_Spy0776(mvaK2)
SPJ：MGAS2096_Spy0755(mvaK2)                LRE：Lreu_0913
SPK：MGAS9429_Spy0739(mvaK2)                PPE：PEPE_0925
SPF：SpyM51124(mvaK2)                       EFA：EF0902
SPA：M6_Spy0701                             NFA：nfa22090
SPB：M28_Spy0664(mvaK2)                     BGA：BG0710
SPN：SP_0383                                BAF：BAPKO_0731
SPR：spr0340(mvaK2)                         NPH：NP2852A
SPD：SPD_0348(mvaK2)                        SSO：SSO2988
SAG：SAG_1324                               STO：ST0978
SAN：gbs1394                                SAI：Saci_1244
SAK：SAK_1355
SMU：SMU.938
STC：str0561(mvaK2)
STL：stu0561(mvaK2)
STE：STER_0600
SSA：SSA_0335(mvaK2)
SSU：SSU05_0291
SSV：SSU98_0287
SGO：SGO_0241
LPL：lp_1733(mvaK2)
LJO：LJ1207
LAC：LBA1169
LSA：LSA0906(mvaK2)
LSL：LSL_0683
LDB：Ldb0997(mvaK)
LBU：LBUL_0904
LBR：LVIS_0860
LCA：LSEI_1092
LGA：LGAS_1035
示例性的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶核酸和多肽
HSA：4597(MVD)                              LPF：lpl2018
PTR：468069(MVD)                            LPP：lpp2023
MCC：696865(MVD)                            TCX：Tcr_1734
MMU：192156(Mvd)                            DNO：DNO_0504(mvaD)
RNO：81726(Mvd)                             BBA：Bd1629
CFA：489663(MVD)                            MXA：MXAN_5018(mvaD)
GGA：425359(MVD)                            OIH：OB0226
DME：Dmel_CG8239                            SAU：SA0548(mvaD)
SCE：YNR043W(MVD1)                          SAV：SAV0591(mvaD)
AGO：AGOS_AGL232C                           SAM：MW0546(mvaD)
PIC：PICST_90752                            SAR：SAR0597(mvaD)
CGR：CAGL0C03630g                           SAS：SAS0550
SPO：SPAC24C9.03                            SAC：SACOL0637(mvaD)
MGR：MGG_09750                              SAB：SAB0541(mvaD)
ANI：AN4414.2                               SAA：SAUSA300_0573(mvaD)
AFM：AFUA_4G07130                           SAO：SAOUHSC_00578
AOR：AO090023000862                         SAJ：SaurJH9_0614
CNE：CNL04950                               SAH：SaurJH1_0629
UMA：UM05179.1                              SEP：SE0362
DDI：DDBDRAFT_0218058                       SER：SERP0239(mvaD)
TET：TTHERM_00849200                        SHA：SH2401(mvaD)
TBR：Tb10.05.0010Tb10.61.2745               SSP：SSP2121
TCR：507993.330511281.40                    LMO：lmo0011
LMA：LmjF18.0020                            LMF：LMOf2365_0012(mvaD)
CBU：CBU_0607(mvaD)                         LIN：lin0011
CBD：COXBU7E912_0619(mvaD)                  LWE：lwe0012(mvaD)
LPN：lpg2040                                LLA：L9089(yeaH)
LLC：LACR_0455                            LJO：LJ1206
LLM：llmg_0426(mvaD)                      LAC：LBA1168(mvaD)
SPY：SPy_0877(mvaD)                       LSA：LSA0907(mvaD)
SPZ：M5005_Spy_0683(mvaD)                 LSL：LSL_0684
SPM：spyM18_0938(mvd)                     LDB：Ldb0998(mvaD)
SPG：SpyM3_0596(mvaD)                     LBU：LBUL_0905
SPS：SPs1257                              LBR：LVIS_0859
SPH：MGAS10270_Spy0741(mvaD)              LCA：LSEI_1492
SPI：MGAS10750_Spy0775(mvaD)              LGA：LGAS_1034
SPJ：MGAS2096_Spy0754(mvaD)               LRE：Lreu_0914
SPK：MGAS9429_Spy0738(mvaD)               PPE：PEPE_0926
SPF：SpyM51125(mvaD)                      EFA：EF0903(mvaD)
SPA：M6_Spy0700                           LME：LEUM_1386
SPB：M28_Spy0663(mvaD)                    NFA：nfa22080
SPN：SP_0382                              BBU：BB0686
SPR：spr0339(mvd1)                        BGA：BG0709
SPD：SPD_0347(mvaD)                       BAF：BAPKO_0730
SAG：SAG1325(mvaD)                        GFO：GFO_3632
SAN：gbs1395                              FPS：FP0310(mvaD)
SAK：SAK_1356(mvaD)                       HAU：Haur_1612
SMU：SMU.937                              HAL：VNG0593G(dmd)
STC：str0560(mvaD)                        HMA：rrnAC1489(dmd)
STL：stu0560(mvaD)                        HWA：HQ1525A(mvaD)
STE：STER_0599                            NPH：NP1580A(mvaD)
SSA：SSA_0334(mvaD)                       PTO：PTO0478PTO1356
SSU：SSU05_0290                           SSO：SSO2989
SSV：SSU98_0286                           STO：ST0977
SGO：SGO_0240(mvaD)                       SAI：Saci_1245(mvd)
LPL：lp_1734(mvaD)                        MSE：Msed_1576
示例性的异戊烯基磷酸激酶(IPK)核酸和多肽
Methanobacterium thermoautotrophicum        Picrophilustorridus DSM9790(IG-57)
 gi|2621082                                  gi|48477569
詹氏甲烷球菌Methanococcus jannaschii)       Pyrococcus abyssi gi|14520758
 DSM 2661gi|1590842；                       Pyrococcus horikoshii OT3gi|3258052
詹氏甲烷球菌gi|1590842                      闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)
                                              DSM4304gi|2648231
Methanothermobacterthermautotrophicus
 gi|2621082
示例性的异戊烯基-二磷酸Δ-异构酶(IDI)核酸和多肽
HSA：3422(IDI1)91734(IDI2)                TET：TTHERM_00237280
PTR：450262(IDI2)450263(IDI1)              TTHERM_00438860
MCC：710052(LOC710052)                    TBR：Tb09.211.0700
 721730(LOC721730)                        TCR：408799.19510431.10
MMU：319554(Idi1)                         LMA：LrnjF35.5330
RNO：89784(Idi1)                          EHI：46.t00025
GGA：420459(IDI1)                         ECO：b2889(idi)
XLA：494671(LOC494671)                    ECJ：JW2857(idi)
XTR：496783(idi2)                         ECE：Z4227
SPU：586184(LOC586184)                    ECS：ECs3761
CEL：K06H7.9(idi-1)                       ECC：c3467
ATH：AT3G02780(IPP2)                      ECI：UTI89_C3274
OSA：43387914343523                       ECP：ECP_2882
CME：CMB062C                              ECV：APECO1_3638
SCE：YPL117C(IDI1)                        ECW：EcE24377A_3215(idi)
AGO：AGOS_ADL268C                         ECX：EcHS_A3048
PIC：PICST_68990(IDI1)                    STY：STY3195
CGR：CAGL0J06952g                         STT：t2957
SPO：SPBC106.15(idi1)                     SPT：SPA2907(idi)
ANI：AN0579.2                             SEC：SC2979(idi)
AFM：AFUA_6G11160                         STM：STM3039(idi)
AOR：AO090023000500                       SFL：SF2875(idi)
CNE：CNA02550                             SFX：S3074
UMA：UM04838.1                            SFV：SFV_2937
ECU：ECU02_0230                           SSN：SSON_3042SSON_3489(yhfK)
DDI：DDB_0191342(ipi)                     SBO：SBO_3103
                                          SDY：SDY_3193
ECA：ECA2789                          RBO：A1I_04755
PLU：plu3987                          RCM：A1E_02555
ENT：Ent638_3307                      RRI：A1G_04195
SPE：Spro_2201                        MLO：mlr6371
VPA：VPA0278                          RET：RHE_PD00245(yPd00046)
VFI：VF0403                           XAU：Xaut_4134
PPR：PBPRA0469(mvaD)                  SIL：SPO0131
PEN：PSEEN4850                        SIT：TM1040_3442
CBU：CBU_0607(mvaD)                   RSP：RSP_0276
CBD：COXBU7E912_0619(mvaD)            RSH：Rsph17029_1919
LPN：lpg2051                          RSQ：Rsph17025_1019
LPF：lpl2029                          JAN：Jann_0168
LPP：lpp2034                          RDE：RD1_0147(idi)
TCX：Tcr_1718                         DSH：Dshi_3527
HHA：Hhal_1623                        BSU：BG11440(yPgA)
DNO：DNO_0798                         BAN：BA1520
EBA：ebA5678p2A143                    BAR：GBAA_1520
DVU：DVU1679(idi)                     BAA：BA_2041
DDE：Dde_1991                         BAT：BAS1409
LIP：LI1134                           BCE：BC1499
BBA：Bd1626                           BCA：BCE_1626
AFW：Anae109_4082                     BCZ：BCZK1380(fni)
MXA：MXAN_5021(fni)                   BCY：Bcer98_1222
RPR：RP452                            BTK：BT9727_1381(fni)
RTY：RT0439(idi)                      BTL：BALH_1354
RCO：RC0744                           BLI：BL02217(fni)
RFE：RF_0785(fni)                     BLD：BLi02426
RBE：RBE_0731(fni)                    BAY：RBAM_021020(fni)
RAK：A1C_04190                        BPU：BPUM_2020(fni)
OIH：OB0537                           SPK：MGAS9429_Spy0740
SAU：SA2136(fni)                      SPF：SpyM51123(fni)
SAV：SAV2346(fni)                     SPA：M6_Spy0702
SAM：MW2267(fni)                      SPB：M28_Spy0665
SAR：SAR2431(fni)                     SPN：SP_0384
SAS：SAS2237                          SPR：spr0341(fni)
SAC：SACOL2341(fni)                   SPD：SPD_0349(fni)
SAB：SAB2225c(fni)                    SAG：SAG1323
SAA：SAUSA300_2292(fni)               SAN：gbs1393
SAO：SAOUHSC_02623                    SAK：SAK_1354(fni)
SEP：SE1925                           SMU：SMU.939
SER：SERP1937(fni-2)                  STC：str0562(idi)
SHA：SH0712(fni)                      STL：stu0562(idi)
SSP：SSP0556                          STE：STER_0601
LMO：lmo1383                          SSA：SSA_0336
LMF：LMOf2365_1402(fni)               SGO：SGO_0242
LIN：lin1420                          LPL：lp_1732(idi1)
LWE：lWe1399(fni)                     LJO：LJ1208
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MKA：MK0776(lldD)
示例性的异戊二烯合酶核酸和多肽
Genbank登记号
AY341431
AY316691
AY279379
AJ457070
AY182241

Claims (30)

1.能够在限氧条件下共同生产异戊二烯和选自乙醇、1，3-丙二醇、和氢的共同产物的细胞，所述细胞包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中所述细胞：(i)具有大于大约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯的平均体积生产率和大于大约0.1mg/L培养液/hr的所述共同产物的平均体积生产率；或(ii)以大约400nmole/gwcm/hr至大约2.0×105nmole/gwcm/hr的速率生产异戊二烯并且以大约0.01mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr的速率生产所述共同产物。
2.根据权利要求1所述的细胞，其中所述细胞生长于限氧培养物中。
3.根据权利要求1所述的细胞，其中所述编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接于启动子。
4.根据权利要求3所述的细胞，其中所述异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。
5.根据权利要求4所述的细胞，其中所述植物异戊二烯合酶多肽来自银白杨。
6.根据权利要求5所述的细胞，其还包含编码MVA途径多肽、DXS多肽、或IDI多肽的异源核酸。
7.根据权利要求1所述的细胞，其中所述共同产物是乙醇。
8.根据权利要求7所述的细胞，其还包含编码参与乙醇发酵的多肽的异源核酸。
9.根据权利要求8所述的细胞，其中所述参与乙醇发酵的多肽是醇脱氢酶B(adhB)多肽、醇脱氢酶E(adhE)多肽、或丙酮酸脱羧酶(pdc)多肽。
10.根据权利要求1所述的细胞，其中所述共同产物是1，3-丙二醇。
11.根据权利要求10所述的细胞，其还包含编码参与甘油途径或1，3-丙二醇途径的多肽的异源核酸。
12.根据权利要求11所述的细胞，其中所述参与甘油途径或1，3-丙二醇途径的多肽是二羟基丙酮磷酸还原酶(DAR1)、甘油-磷酸磷酸酶(GPP2)、甘油脱水酶B1(dhaB1)、甘油脱水酶B2(dhaB2)、甘油脱水酶B3(dhaB3)、dhaX、orfX、orfY、1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)、甘油脱氢酶(dhaD)、或二羟基丙酮激酶(dhaK)。
13.根据权利要求1所述的细胞，其中所述共同产物是氢。
14.根据权利要求13所述的细胞，其还包含编码氢化酶多肽的异源核酸。
15.根据权利要求14所述的细胞，其中所述氢化酶多肽是铁氧还蛋白-依赖性氢化酶多肽、NADPH-依赖性氢化酶多肽、或氧-耐受性氢化酶多肽。
16.一种共同生产异戊二烯和共同产物的方法，所述方法包括：
(a)在适合于共同生产异戊二烯和共同产物的条件下培养能够共同生产异戊二烯和选自乙醇、1，3-丙二醇、和氢的共同产物的细胞，其中所述细胞包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸；和
(b)共同生产异戊二烯和所述共同产物，其中所述细胞：(i)具有大于大约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯的平均体积生产率和大于大约0.1mg/L培养液/hr的所述共同产物的平均体积生产率；或(ii)以大约400nmole/gwcm/hr至大约2.0×105nmole/gwcm/hr的速率生产异戊二烯并且以大约0.01mmol/L培养液/hr至大约200mmol/L培养液/hr的速率生产所述共同产物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞生长于限氧培养物中。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸可操作地连接于启动子。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述植物异戊二烯合酶多肽来自银白杨。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述细胞还包含编码MVA途径多肽、DXS多肽、或IDI多肽的异源核酸。
22.根据权利要求16所述的方法，其中所述共同产物是乙醇。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞还包含编码参与乙醇发酵的多肽的异源核酸。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述参与乙醇发酵的多肽是醇脱氢酶B(adhB)多肽、醇脱氢酶E(adhE)多肽、或丙酮酸脱羧酶(pdc)多肽。
25.根据权利要求16所述的方法，其中所述共同产物是1，3-丙二醇。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述细胞还包含编码参与甘油途径或1，3-丙二醇途径的多肽的异源核酸。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述参与甘油途径或1，3-丙二醇途径的多肽是二羟基丙酮磷酸还原酶(DAR1)、甘油-磷酸磷酸酶(GPP2)、甘油脱水酶B1(dhaB1)、甘油脱水酶B2(dhaB2)、甘油脱水酶B3(dhaB3)、dhaX、orfX、orfY、1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)、甘油脱氢酶(dhaD)、或二羟基丙酮激酶(dhaK)。
28.根据权利要求16所述的方法，其中所述共同产物是氢。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述细胞还包含编码氢化酶多肽的异源核酸。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述氢化酶多肽是铁氧还蛋白-依赖性氢化酶多肽、NADPH-依赖性氢化酶多肽、或氧-耐受性氢化酶多肽。
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