CN102803185A - 包含异戊二烯衍生物的燃料组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了使用从可再生碳衍生的生物异戊二烯以产生多种烃燃料和燃料添加物的方法、组合物和系统。

Description

包含异戊二烯衍生物的燃料组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年6月17日提交的美国临时专利申请号61/187,959的优先权，其公开内容通过引用方式全文并入本文。
背景技术
开发可再生交通运输燃料是21世纪的关键挑战之一。当前市场由衍生自酵母发酵蔗糖和淀粉的乙醇主导，并且在较低程度上由衍生自甘油三酯的生物柴油(脂肪酸酯)主导。乙醇具有作为液体燃料相对于烃而言能量密度较低的局限性。此外，因其水亲和性和腐蚀性本质，乙醇不能在常规基本设施中运输。用于可再生碳源(生物质、糖、油)转化成烃燃料的方法提供了有吸引力的生物乙醇替代品。
异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)是一种主要用于生产合成橡胶的重要工业化学品。目前，异戊二烯通过石脑油和其他轻质石油馏分的裂化直接地或经化学合成间接地从石油化学源衍生(见，例如，H.Pommer和A.Nurrenbach，Industrial Synthesis of Terpene Compounds，Pure Appl.Chem.，1975，43，527-551；H.M.Weitz和E.Loser，异戊二烯，引自Ullmann′s Encyclopedia of Industrial Chemistry，第七版，电子版发行，Wiley-VCH Verlag GMBH，Weinheim，2005；和H.M.Lybarger，异戊二烯，引自Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology，第4版，Wiley，New York(1995)，14，934-952.)。所得的粗制异戊二烯流一般地经历深度纯化过程以除去众多化学上相似的杂质，它们中的一些可能干扰异戊二烯后续转变成聚合物和其他化学品。
相反，从生物来源衍生的异戊二烯含有极少烃杂质，并且反而含有许多氧化的化合物，如乙醇、乙醛和丙酮。这些化合物中的一些可以通过与水接触或者穿过氧化铝或其他吸收剂来轻易地除去。
工业依赖石油化学原料以生产异戊二烯，并且在异戊二烯可以转化成聚合物和其他化学品之前，需要深度纯化工作。需要有成本效益的方法以利用生物异戊二烯的高纯度和/或独特杂质情况将生物方式产生的异戊二烯转化成有价值的化学产品。
本文中所引用的全部专利、专利申请、文献和文章都通过引用的方式全文并入本文。
发明内容
公开了用于从高纯异戊二烯产生燃料组分的方法和系统以及自高纯异戊二烯产生的燃料组合物。
在一个方面，本发明提供一种用于从生物异戊二烯组合物产生燃料组分的方法，所述方法包括将该生物异戊二烯组合物中的大部分异戊二烯化学地转变成非异戊二烯化合物。在一个实施方式中，通过下述方式化学地转变所述生物异戊二烯组合物：使该生物异戊二烯组合物经历适于异戊二烯二聚化的热或催化条件以产生异戊二烯二聚体，并且随后催化地氢化异戊二烯二聚体以形成饱和的C10燃料组分。在另一个实施方式中，通过(i)部分地氢化生物异戊二烯组合物以产生异戊烯，(ii)使异戊烯与选自异戊烯、丙烯和异丁烯的单烯烃二聚化以形成二聚物(dimate)，和(iii)完全氢化该二聚物以产生燃料组分。在一些实施方式中，生物异戊二烯组合物中至少约95％的异戊二烯在化学转变期间转化成非异戊二烯化合物。在一些实施方式中，加热生物异戊二烯组合物到约150℃至约250℃以产生不饱和的环状异戊二烯二聚体并且催化地氢化不饱和的环状异戊二烯二聚体以产生饱和的环状异戊二烯二聚体燃料组分。在一些实施方式中，所述方法包括：(i)使生物异戊二烯组合物与用于催化异戊二烯的环二聚化的催化剂接触以产生不饱和的环状异戊二烯二聚体，并且催化地氢化不饱和的环状异戊二烯二聚体以产生饱和的环状异戊二烯二聚体燃料组分。在一些实施方式中，用于催化异戊二烯的环二聚化的催化剂包括选自镍催化剂、铁催化剂和铬催化剂的催化剂。在一些实施方式中，部分地氢化生物异戊二烯组合物的步骤包括使生物异戊二烯组合物与氢气和用于催化异戊二烯的部分氢化的催化剂接触。在一些实施方式中，用于催化异戊二烯的部分氢化的催化剂包括钯催化剂。在一些实施方式中，使异戊烯与单烯烃二聚化的步骤包括使异戊烯与单烯烃在用于催化单烯烃二聚化的催化剂存在下接触。在一些实施方式中，用于催化单烯烃二聚化的催化剂包括酸催化剂。在一些实施方式中，该方法还包括在将所述生物异戊二烯组合物化学地转变成燃料组分之前纯化来自生物异戊二烯组合物的异戊二烯。
在一个方面，本发明提供一种用于从生物异戊二烯组合物产生燃料组分的系统，其中将该生物异戊二烯组合物中的大部分异戊二烯化学地转化成非异戊二烯化合物，该系统包含生物异戊二烯组合物和(a)(i)能够使生物异戊二烯组合物中的异戊二烯二聚化的一种或多种化学品或能够使生物异戊二烯组合物中的异戊二烯二聚化的热源；和(ii)能够氢化异戊二烯二聚体以形成饱和的C10燃料组分的催化剂；或(b)(i)能够部分地氢化生物异戊二烯组合物中的异戊二烯以产生异戊烯的化学品，(ii)能够使异戊烯与选自异戊烯、丙烯和异丁烯的单烯烃二聚化以形成二聚物(dimate)的化学品和(iii)能够完全氢化该二聚物以产生燃料组分的化学品。
在该系统的一些实施方式中，生物异戊二烯组合物包含大于约2mg的异戊二烯并且包含重量占该组合物中全部C5烃的总重量的大于或约99.94％的异戊二烯。在该系统的一些实施方式中，能够使异戊二烯二聚化的一种或多种化学品包括用于催化异戊二烯的环二聚化的催化剂，所述催化剂包括选自钌催化剂、镍催化剂、铁催化剂和铬催化剂的催化剂。在该系统的一些实施方式中，用于氢化不饱和异戊二烯二聚体的催化剂包括选自钯催化剂、镍催化剂、钌催化剂和铑催化剂的催化剂。在该系统的一些实施方式中，能够部分地氢化异戊二烯的化学品包括钯催化剂。在该系统的一些实施方式中，能够使异戊烯与单烯烃二聚化的化学品包括酸催化剂。
在一个方面，本发明提供燃料组合物，其包含通过本文中所述方法产生的燃料组分。在一些实施方式中，该燃料组合物基本上不含异戊二烯。在一些实施方式中，该燃料组合物具有大于-22‰或在-32‰至-24‰范围内的δ13C值。
在一些方面，本发明提供用于从异戊二烯产生燃料组分的系统，该系统包含：(a)商业上有益量的高纯异戊二烯；和(b)从至少一部分高纯异戊二烯产生的燃料组分；其中至少一部分的商业上有益量的高纯异戊二烯经历化学转变。
在该系统的一些实施方式中，商业上有益量的高纯异戊二烯包含大于约2mg的异戊二烯并且包含重量占该组合物中全部C5烃的总重量的大于或约99.94％的异戊二烯。在一些实施方式中，商业上有益量的高纯异戊二烯包含大于约2mg的异戊二烯并且包含选自乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇和具有10个或更多个碳原子的类异戊二烯化合物的一种或多种化合物。在一些实施方式中，商业上有益量的高纯异戊二烯包含大于约2mg的异戊二烯并且包含选自乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、异丁烯醛、甲基乙烯基酮、2-甲基-2-乙烯基环氧乙烷、顺式-和反式-3-甲基-1，3-戊二烯、C5异戊二烯基醇、2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，4，5-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡嗪、香茅醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、丁二酮、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、异丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3-甲基丁酯、3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯、3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯、3-己烯-1-醇、3-己烯-1-基乙酸酯、苧烯、香叶醇(反式-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇)、香茅醇(3，7-二甲基-6-辛烯-1-醇)、(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、和2，3-环庚烯醇吡啶的一种或多种第二化合物；其中相对于异戊二烯的量，第二化合物的量是大于或约0.01％(w/w)。在一些实施方式中，商业上有益量的高纯异戊二烯包含大于约2mg的异戊二烯并且对于该组合物中抑制异戊二烯聚合的任意化合物包含小于或约0.5μg/L每种化合物。在一些优选的实施方式中，商业上有益量的高纯异戊二烯通过生物过程产生。
在该系统的一些实施方式中，燃料组分包含选自环状异戊二烯二聚体与三聚体、线性异戊二烯低聚物、芳族及脂环族异戊二烯衍生物、和氧化异戊二烯衍生物的一种或多种化合物。在一些实施方式中，氧化异戊二烯衍生物是选自衍生自异戊二烯的醇、酮、酯和醚的化合物。
在一些实施方式中，燃料组分包含环状异戊二烯二聚体，并且化学转变包括异戊二烯的二聚化反应。在一些实施方式中，所述二聚化反应通过加热商业上有益量的高纯异戊二烯进行。在一些实施方式中，所述异戊二烯的二聚化反应产生包含不饱和异戊二烯二聚体的产物，并且所述化学转变还包括不饱和异戊二烯二聚体的氢化反应。在一些实施方式中，该系统还包含用于催化不饱和异戊二烯二聚体的氢化反应的催化剂。在一些实施方式中，用于催化不饱和异戊二烯二聚体的氢化反应的催化剂包括选自钯催化剂、镍催化剂、钌催化剂和铑催化剂的催化剂。
在一些实施方式中，所述二聚化反应通过使商业上有益量的高纯异戊二烯与用于催化异戊二烯的环二聚化的催化剂接触来进行。在一些实施方式中，用于催化异戊二烯的环二聚化的催化剂包括选自钌催化剂、镍催化剂、铁催化剂和铬催化剂的催化剂。在一些实施方式中，用于催化异戊二烯的环二聚化的催化剂是镍催化剂，并且燃料组分包含异戊二烯的一种或多种八元环二聚体。
在一些实施方式中，燃料组分包含异戊二烯的线性和/或环状三聚体，并且化学转变包括异戊二烯的催化三聚化。
在一个方面，本发明提供一种用于从异戊二烯产生燃料组分的方法，该方法包括：(a)获得商业上有益量的高纯异戊二烯；和(b)将至少一部分商业上有益量的高纯异戊二烯化学地转变成燃料组分。在一些实施方式中，商业上有益量的高纯异戊二烯包含生物异戊二烯。
在一些实施方式中，商业上有益量的高纯异戊二烯通过以下步骤获得，所述步骤包括：(i)在产生异戊二烯的合适培养条件下培养包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸的细胞，其中所述细胞(1)产生大于约400nmole/gwcm/小时的异戊二烯，(2)将多于约0.002摩尔％的所述细胞从细胞培养基中消耗的碳转化成异戊二烯，或(3)具有大于约0.1mg/L培养液/小时的异戊二烯的异戊二烯平均体积生产率，并且(ii)产生异戊二烯。在一些实施方式中，细胞还包含编码异戊二烯合酶多肽或MVA途径多肽的异源核酸。
在本文所述的方法的一些实施方式中，将至少一部分商业上有益量的高纯异戊二烯化学地转变成燃料组分包括：i)加热商业上有益量的高纯异戊二烯到约150℃至约250℃；(ii)将至少一部分商业上有益量的高纯异戊二烯转化成不饱和的环状异戊二烯二聚体；(iii)氢化不饱和的环状异戊二烯二聚体以产生饱和的环状异戊二烯二聚体；和(iv)产生燃料组分。在一些实施方式中，商业上有益量的高纯异戊二烯中至少约20％至约100％的异戊二烯转化成不饱和的环状异戊二烯二聚体。
在该方法的一些实施方式中，将至少一部分商业上有益量的高纯异戊二烯化学地转变成燃料组分包括：(i)使商业上有益量的高纯异戊二烯与用于催化异戊二烯的环二聚化的催化剂接触；(ii)将至少一部分商业上有益量的高纯异戊二烯转化成环状异戊二烯二聚体；和(iii)产生燃料组分。
在该方法的一些实施方式中，将至少一部分商业上有益量的高纯异戊二烯化学地转变成燃料组分包括：i)使商业上有益量的高纯异戊二烯与用于催化异戊二烯的环二聚化的催化剂接触；(ii)将至少一部分商业上有益量的高纯异戊二烯转化成不饱和的环状异戊二烯二聚体；(iii)氢化不饱和的环状异戊二烯二聚体以产生饱和的环状异戊二烯二聚体；和(iv)产生燃料组分。在该方法的一些实施方式中，用于催化异戊二烯的环二聚化的催化剂包括选自镍催化剂、铁催化剂和铬催化剂的催化剂。
在该方法的一些实施方式中，将至少一部分商业上有益量的高纯异戊二烯化学地转变成燃料组分包括：(i)使高纯异戊二烯组合物与催化剂体系接触；(ii)将至少一部分起始异戊二烯组合物转化成不饱和的异戊二烯二聚体和/或三聚体；和(iii)氢化不饱和的二聚体和/或三聚体以产生饱和的C10和/或C15烃。
在一些实施方式中，用于从异戊二烯产生燃料组分的方法包括：(a)获得商业上有益量的本文中所述的任何高纯异戊二烯起始组合物；(b)将至少一部分起始异戊二烯组合物转化成氧化异戊二烯衍生物；和任选地(c)氢化任何不饱和的氧化异戊二烯衍生物以产生饱和的氧化产物(oxygenate)。在一些实施方式中，氧化异戊二烯衍生物是选自衍生自异戊二烯的醇、酮、酯和醚的化合物。
在一些实施方式中，本文中所述的任何方法还包括在将至少一部分商业上有益量的高纯异戊二烯化学地转变成燃料组分之前，纯化商业上有益量的高纯异戊二烯。
在一个方面，提供了一种用于从异戊二烯产生燃料组分的连续方法，所述连续方法包括：(a)连续地产生商业上有益量的高纯异戊二烯；和(b)连续地将至少一部分商业上有益量的高纯异戊二烯化学地转变成燃料组分。在一些实施方式中，商业上有益量的高纯异戊二烯包括含有异戊二烯的气相。在一些实施方式中，该方法还包括使包含异戊二烯的气相通过用于将至少一部分商业上有益量的高纯异戊二烯化学地转变成燃料组分的反应器。在优选的实施方式中，商业上有益量的高纯异戊二烯包含生物异戊二烯。
还提供燃料组合物，其包含通过本文中所述的任何方法产生的燃料组分。在一些实施方式中，在经历根据本文中所述方法的步骤后，所述燃料组分包含少于或约0.5μg/L的来自除异戊二烯之外的C5烃中的产物。在一些实施方式中，在经历根据本文中所述方法的步骤后，该燃料组分包含来自一种或多种化合物的一种或多种产物，其中所述化合物选自乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、异丁烯醛、甲基乙烯基酮、2-甲基-2-乙烯基环氧乙烷、顺式-和反式-3-甲基-1，3-戊二烯、C5异戊二烯基醇、2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，4，5-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡嗪、香茅醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、丁二酮、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、异丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3-甲基丁酯、3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯、3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯、3-己烯-1-醇、3-己烯-1-基乙酸酯、苧烯、香叶醇(反式-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇)、香茅醇(3，7-二甲基-6-辛烯-1-醇)、(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯和2，3-环庚烯醇吡啶。
在一些实施方式中，该燃料组合物包含具有大于-22‰的δ13C值的燃料组合物。在一些实施方式中，该燃料组合物具有在-22‰至-10‰或-34‰至-24‰范围内的δ13C值。在一些实施方式中，该燃料组合物具有大于0.9的fM值。还提供本文中所述任何燃料组合物与石油基燃料的掺合物，基于总燃料组合物的总重量或体积，所述石油基燃料的量为按重量或体积计的约1％至约95％。
附图说明
图1是针对在大肠杆菌中的表达进行了密码子优化的野葛(kudzu)异戊二烯合酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。atg起始密码子以斜体表示，终止密码子以加粗字体表示，添加的PstI位点以下划线标示。
图2是pTrcKudzu的图谱。
图3A-C是pTrcKudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。RBS以下划线标示，野葛异戊二烯合酶起始密码子以加粗大写字母表示，终止密码子以加粗大写字母表示。载体骨架是pTrcHis2B。
图4是pETNHisKudzu的图谱。
图5A-C是pETNHisKudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。
图6是pCL-lac-Kudzu的图谱。
图7A-C是pCL-lac-Kudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)。
图8A的图显示了在无载体的大肠杆菌BL21细胞中生产异戊二烯。
图8B的图显示了在具有pCL-lac-Kudzu的大肠杆菌BL21细胞中生产异戊二烯。
图8C的图显示了在具有pTrcKudzu的大肠杆菌BL21细胞中生产异戊二烯。
图8D的图显示了在具有pETN-HisKudzu的大肠杆菌BL21细胞中生产异戊二烯。
图9A的图显示了在14升的补料分批发酵中，大肠杆菌BL21/pTrcKudzu的发酵随时间的OD。
图9B的图显示了在14升的补料分批发酵中，大肠杆菌BL21/pTrcKudzu的发酵随时间生产的异戊二烯。
图10A的图显示了柠檬泛菌(Pantoea citrea)中异戊二烯的生产。对照细胞中无重组野葛异戊二烯合酶。灰色菱形表示异戊二烯的合成，黑色方框表示OD600。
图10B的图显示了表达pCL-lac Kudzu的柠檬泛菌中异戊二烯的生产。灰色菱形表示异戊二烯的合成，黑色方框表示OD600。
图10C的图显示了表达pTrcKudzu的柠檬泛菌中异戊二烯的生产。灰色菱形表示异戊二烯的合成，黑色方框表示OD600。
图11的图显示了表达重组异戊二烯合酶的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中异戊二烯的生产。BG3594comK是无质粒的枯草芽孢杆菌菌株(天然的异戊二烯生产)。CF443是具有pBSKudzu的枯草芽孢杆菌菌株BG3594comK(重组的异戊二烯生产)。y轴上的IS表示异戊二烯。
图12A-C是pBS Kudzu#2的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)。
图13是针对在耶氏酵母属(Yarrowia)中的表达进行了密码子优化的野葛异戊二烯合酶的核苷酸序列(SEQ ID NO：6)。
图14是包含针对在耶氏酵母属中的表达进行了密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的pTrex3g的图谱。
图15A-C是载体pSPZ1(MAP29Spb)的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)。
图16是针对在耶氏酵母属中的表达进行了密码子优化的合成的野葛(越南葛藤(Pueraria montana))异戊二烯基因的核苷酸序列(SEQ IDNO：8)。
图17是合成的杂交白杨(poplar)(银白杨(Populus alba)x欧洲山杨(Populus tremula))异戊二烯合酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)。ATG起始密码子以加粗表示，终止密码子以下划线标示。
图18A(图18A1和18A2)显示了载体pYLA 1、pYL1和pYL2(SEQ IDNO：75、73、72、71、70、69)的构建示意图。
图18B显示了载体pYLA(POP1)(SEQ ID NO：68、69)的构建示意图。
图18C显示了载体pYLA(KZ1)的构建示意图。
图18D显示了载体pYLI(KZ1)(SEQ ID NO：66、67)的构建示意图。
图18E显示了载体pYLI(MAP29)的构建示意图。
图18F显示了载体pYLA(MAP29)的构建示意图。
图19A显示了异戊二烯的MVA和DXP代谢途径(基于F.Bouvier等人，Progress in Lipid Res.44：357-429，2005)。以下描述包括该途径中的每种多肽的替代性名称，以及公开了用于测定指明的多肽的活性的测定法的参考文献(这些文献中的每一篇皆通过引用方式全文并入本文，尤其是关于测定MVA和DXP途径中的多肽的多肽活性的测定法的那些)。甲羟戊酸途径：AACT；乙酰基-辅酶A乙酰基转移酶，MvaE，EC2.3.1.9.测定法：J.Bacteriol.，184：2116-2122，2002；HMGS；羟基甲基戊二酰-辅酶A合酶，MvaS，EC 2.3.3.10.测定法：J.Bacteriol.，184：4065-4070，2002；HMGR；3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶，MvaE，EC 1.1.1.34.测定法：J.Bacteriol.，184：2116-2122，2002；MVK；甲羟戊酸激酶，ERG12，EC 2.7.1.36.测定法：Curr Genet 19：9-14，1991.PMK；磷酸甲羟戊酸激酶，ERG8，EC 2.7.4.2，测定法：Mol Cell Biol.，11：620-631，1991；DPMDC；二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，MVD1，EC 4.1.1.33.测定法：Biochemistry，33：13355-13362，1994；IDI；异戊烯-二磷酸δ-异构酶，IDI1，EC 5.3.3.2.Assay：J.Biol.Chem.264：19169-19175，1989.DXPPathway：DXS；1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶，dxs，EC 2.2.1.7.测定法：PNAS，94：12857-62，1997；DXR；1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶，dxr，EC 2.2.1.7.测定法：Eur.J.Biochem.269：4446-4457，2002；MCT；4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合酶，IspD，EC 2.7.7.60.测定法：PNAS，97：6451-6456，2000；CMK；4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶，IspE，EC 2.7.1.148.测定法：PNAS，97：1062-1067，2000；MCS；2C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸合酶，IspF，EC 4.6.1.12.测定法：PNAS，96：11758-11763，1999；HDS；1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶，ispG，EC 1.17.4.3.测定法：J.Org.Chem.，70：9168-9174，2005；HDR；1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶，IspH，EC 1.17.1.2.测定法：JACS，126：12847-12855，2004。
图19B显示了经典的和修饰的MVA途径。1，乙酰基-辅酶A乙酰基转移酶(AACT)；2，HMG-CoA合酶(HMGS)；3，HMG-CoA还原酶(HMGR)；4，甲羟戊酸激酶(MVK)；5，磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)；6，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD或DPMDC)；7，异戊烯二磷酸异构酶(IDI)；8，磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)；9，异戊烯磷酸激酶(IPK)。经典的MVA途径从反应1开始，经过反应5和6一直到达反应7，而修饰的MVA途径经过翻译8和9。结构式中的P和PP分别是磷酸和焦磷酸。该图取自Koga和Morii，Microbiology and Mol.Biology Reviews，71：97-120，2007，该文献通过引用方式全文并入本文，尤其是关于修饰的MVA途径的核酸和多肽的部分。修饰的MVA途径存在于例如一些古细菌中，例如马氏甲烷八叠球菌。
图20中的图(图20A和20B)显示了由不含(左侧)或含有(右侧)野葛异戊二烯合酶基因的重组解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)菌株生产的异戊二烯的GC-MS分析的结果。箭头表示真实的异戊二烯标准物的洗脱时间。
图21是pTrcKudzu yIDI DXS Kan的图谱。
图22A-D是pTrcKudzu yIDI DXS Kan的核苷酸序列(SEQ IDNO：10)。
图23A的图显示了在BL21/pTrcKudzukan中，从葡萄糖生产异戊二烯。时间0是以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆形代表总的异戊二烯生产率(μg/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。
图23B的图显示了在BL21/pTrcKudzu yIDI kan中，从葡萄糖生产异戊二烯。时间0是以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆形代表总的异戊二烯生产率(μg/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。
图23C的图显示了在BL21/pTrcKudzu DXS kan中，从葡萄糖生产异戊二烯。时间0是以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆形代表总的异戊二烯生产率(μg/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。
图23D的图显示了在BL21/pTrcKudzu yIDI DXS kan中，从葡萄糖生产异戊二烯。时间0是以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆形代表总的异戊二烯生产率(μg/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。
图23E的图显示了在BL21/pCL PtrcKudzu中，从葡萄糖生产异戊二烯。时间0是以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆形代表总的异戊二烯生产率(μg/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。
图23F的图显示了在BL21/pCL PtrcKudzu yIDI中，从葡萄糖生产异戊二烯。时间0是以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆形代表总的异戊二烯生产率(μg/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。
图23G的图显示了在BL21/pCL PtrcKudzu DXS中，从葡萄糖生产异戊二烯。时间0是以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆形代表总的异戊二烯生产率(μg/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。
图23H的图显示了在BL21/pTrcKudzuIDIDXSkan中，从葡萄糖生产异戊二烯。箭头指示以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。黑色菱形代表OD600，黑色三角形代表异戊二烯生产率(μg/L)，白色方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。
图24是pTrcKKDyIkIS kan的图谱。
图25A-D是pTrcKKDyIkIS kan的核苷酸序列(SEQ ID NO：11)。
图26是pCL PtrcUpperPathway的图谱。
图27A-27D是pCL PtrcUpperPathway的核苷酸序列(SEQ IDNO：12)。
图28显示了包含下部MVA途径和用于整合进入枯草芽孢杆菌染色体的nprE基因座的酵母idi的盒的图谱。nprE上游/下游表示距离nprE基因座各1kb的序列以用于整合。aprE启动子(碱性丝氨酸蛋白酶启动子)表示aprE基因的启动子(-35，-10，+1转录起始位点，RBS)。MVK1表示酵母甲羟戊酸激酶基因。RBS-PMK表示在起始位点上游具有芽孢杆菌RBS的酵母磷酸甲羟戊酸激酶基因。RBS-MPD表示在起始位点上游具有芽孢杆菌RBS的酵母二磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因。RBS-IDI表示在起始位点上游具有芽孢杆菌RBS的酵母idi基因。终止子表示来自解淀粉芽孢杆菌(B.amyliquefaciens)的终止子碱性丝氨酸蛋白酶转录终止子。SpecR表示壮观霉素抗性标志物。“用于扩增的nprE上游重复序列”表示用于扩增的上游区的直接重复序列。
图29A-D是含有下部MVA途径和用于整合进入枯草芽孢杆菌染色体的nprE基因座的酵母idi的盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：13)。
图30是p9796-poplar的图谱。
图31A-B是p9796-poplar的核苷酸序列(SEQ ID NO：14)。
图32是pTrcPoplar的图谱。
图33A-C是pTrcPoplar的核苷酸序列(SEQ ID NO：15)。
图34是pTrcKudzu yIDI Kan的图谱。
图35A-C是pTrcKudzu yIDI Kan的核苷酸序列(SEQ ID NO：16)。
图36是pTrcKudzuDXS Kan的图谱。
图37A-C是pTrcKudzuDXS Kan的核苷酸序列(SEQ ID NO：17)。
图38是pCL PtrcKudzu的图谱。
图39A-C是pCL PtrcKudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO：18)。
图40是pCL PtrcKudzu A3的图谱。
图41A-C是pCL PtrcKudzu A3的核苷酸序列(SEQ ID NO：19)。
图42是pCL PtrcKudzu yIDI的图谱。
图43A-C是pCL PtrcKudzu yIDI的核苷酸序列(SEQ ID NO：20)。
图44是pCL PtrcKudzu DXS的图谱。
图45A-D是pCL PtrcKudzu DXS的核苷酸序列(SEQ ID NO：21)。
图46A-E的图显示了从生物质原料生产异戊二烯。图板A显示了从玉米秸秆生产异戊二烯，图板B显示了从甘蔗渣生产异戊二烯，图板C显示了从软木浆生产异戊二烯，图板D显示了从葡萄糖生产异戊二烯，图板E显示了不用额外的原料从细胞生产异戊二烯。灰色方框代表在接种后的指明的时间培养物的OD600测量值，黑色三角形代表在接种后的指明的时间异戊二烯的产量。
图47A的图显示了在未添加葡萄糖的培养物中，由BL21(λDE3)pTrcKudzu yIDI DXS(kan)生产的异戊二烯。方框代表OD600，三角形代表生产的异戊二烯(μg/ml)。
图47B的图显示了由BL21(λDE3)pTrcKudzu yIDI DXS(kan)从1％的葡萄糖原料转化糖生产的异戊二烯。方框代表OD600，三角形代表生产的异戊二烯(μg/ml)。
图47C的图显示了由BL21(λDE3)pTrcKudzu yIDI DXS(kan)从1％的转化糖原料生产的异戊二烯。方框代表OD600，三角形代表生产的异戊二烯(μg/ml)。
图47D的图显示了由BL21(λDE3)pTrcKudzu yIDI DXS(kan)从1％的AFEX玉米秸秆原料生产的异戊二烯。方框代表OD600，三角形代表生产的异戊二烯(μg/ml)。
图48A-C的图显示了酵母提取物对生产异戊二烯的影响。图板A显示了加入不同量的酵母提取物的发酵器内的光密度的时间进程。图板B显示了加入不同量的酵母提取物的发酵器内的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。图板C显示了酵母提取物对于补料分批培养物中生长的大肠杆菌生产异戊二烯的影响。
图49A-C的图显示了从500L的生物反应器中由含有pTrcKudzu+yIDI+DXS质粒的大肠杆菌细胞生产的异戊二烯。图板A显示了加入了葡萄糖和酵母提取物的500L生物反应器中的光密度的时间进程。图板B显示了加入了葡萄糖和酵母提取物的500L生物反应器的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。图板C显示了从加入了葡萄糖和酵母提取物的500L生物反应器中生产的总的异戊二烯的时间进程。
图50是pJMupperpathway2的图谱。
图51A-C是pJMupperpathway2的核苷酸序列(SEQ ID NO：22)。
图52是pBS Kudzu#2的图谱。
图53A的图显示了在14升的补料分批发酵中，表达重组野葛异戊二烯合酶的芽孢杆菌的发酵时间过程中的生长。黑色菱形代表无重组异戊二烯合酶的对照菌株(BG3594comK)(天然的异戊二烯生产)，灰色三角形代表CF443，即具有pBSKudzu的芽孢杆菌菌株BG3594comK(重组的异戊二烯生产)。
图53B的图显示了在14升的补料分批发酵中，表达重组野葛异戊二烯合酶的芽孢杆菌的发酵时间过程中的异戊二烯生产。黑色菱形代表无重组异戊二烯合酶的对照菌株(BG3594comK)(天然的异戊二烯生产)，灰色三角形代表CF443，即具有pBSKudzu的芽孢杆菌菌株BG3594comK(重组的异戊二烯生产)。
图54是加入了葡萄糖的15L的生物反应器中的光密度的时间进程。
图55是加入了葡萄糖的15L的生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。
图56是从加入了葡萄糖的15L的生物反应器中生产的总的异戊二烯的时间进程。
图57是加入了甘油的15L的生物反应器中的光密度的时间进程。
图58是加入了甘油的15L的生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。
图59是从加入了甘油的15L的生物反应器中生产的总的异戊二烯的时间进程。
图60A-60C是加入了葡萄糖的150L的生物反应器中的光密度、甲羟戊酸效价、和比生产率的时间进程。
图61A-61C是加入了葡萄糖的15L的生物反应器中的光密度、甲羟戊酸效价、和比生产率的时间进程。
图62A-62C是加入了葡萄糖的15L的生物反应器中的光密度、甲羟戊酸效价、和比生产率的时间进程。
图63A-63C是加入了葡萄糖的15L的生物反应器中的光密度、异戊二烯效价、和比生产率的时间进程。
图64A-64C是加入了葡萄糖的15L的生物反应器中的光密度、异戊二烯效价、和比生产率的时间进程。
图65A-65C是加入了葡萄糖的15L的生物反应器中的光密度、异戊二烯效价、和比生产率的时间进程。
图66A-66C是加入了葡萄糖的15L的生物反应器中的光密度、异戊二烯效价、和比生产率的时间进程。
图67A-67C是加入了葡萄糖的15L的生物反应器中的光密度、异戊二烯效价、和比生产率的时间进程。
图68的图是：对于系列A，对于多个氧水平，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。图例中列出的曲线是按照它们在图中出现的顺序。例如，图例中的第一个条目(40℃空气中的异戊二烯)对应于图中最高的曲线。
图69的图是：对于系列B，对于多个氧水平与4％的水，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。图例中列出的曲线是按照它们在图中出现的顺序。
图70的图是：对于系列C，对于多个氧水平与5％的CO2，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。图例中列出的曲线是按照它们在图中出现的顺序。
图71的图是：对于系列D，对于多个氧水平与10％的CO2，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。图例中列出的曲线是按照它们在图中出现的顺序。
图72的图是：对于系列E，对于多个氧水平与15％的CO2，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。图例中列出的曲线是按照它们在图中出现的顺序。
图73的图是：对于系列F，对于多个氧水平与20％的CO2，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。图例中列出的曲线是按照它们在图中出现的顺序。
图74的图是：对于系列G，对于多个氧水平与30％的CO2，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。图例中列出的曲线是按照它们在图中出现的顺序。
图75A的表是：对于系列A，从重量％转化为体积％的CAFT模型结果。
图75B的图是：对于系列A，将图68针对体积％作图，从CAFT模型获得的可燃性结果。
图76A的表是：对于系列B，从重量％转化为体积％的CAFT模型结果。
图76B的图是：对于系列B，将图69针对体积％作图，从CAFT模型获得的可燃性结果。
图77的图显示了可燃性测试的器皿。
图78A的图是测试系列1的可燃性曲线：0％蒸汽(steam)，0psig，40℃。
图78B的表总结了测试系列1的爆炸和非爆炸数据点。
图78C的图是测试系列1的可燃性曲线与CAFT模型的比较。
图79A的图是测试系列2的可燃性曲线：4％蒸汽，0psig，40℃。
图79B的表总结了测试系列2的爆炸和非爆炸数据点。
图79C的图是测试系列2的可燃性曲线与CAFT模型的比较。
图80A-B的表是测试系列1的详细实验条件和结果。
图81的表是测试系列2的详细实验条件和结果。
图82的图是：在3个大气压下，对于多个氮/氧比例，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。
图83的图是：在1个大气压下，对于多个氮/氧比例，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。
图84的图是：使用来自图82的数据，按照实施例13描述的方法构建的可燃性包迹(envelope)。实验数据点(圆圈)来自本文描述的在1个大气压的最初系统压力下进行的测试。
图85的图是：使用来自图83的数据，按照实施例13描述的方法构建的可燃性包迹。实验数据点(圆圈)来自本文描述的在1个大气压的最初系统压力下进行的测试。
图86A是发酵废气的GC/MS色谱图。
图86B是图86A的扩展，以显示存在于发酵废气中的较少的挥发物。
图87A是在-78℃进行低温冷阱后，存在于废气中的痕量挥发物的GC/MS色谱图。
图87B是在-196℃进行低温冷阱后，存在于废气中的痕量挥发物的GC/MS色谱图。
图87C是图87B的扩展。
图87D是图87C的扩展。
图88A-B是GC/MS色谱图，比较了源自汽油的异戊二烯(图88A)与生物生产的异戊二烯(图88B)的C5烃。标准物含有在异戊二烯主峰附近洗脱的3种C5烃杂质(图88A)。与之相反，生物生产的异戊二烯含有某些量的乙醇和丙酮(运行时间为3.41分钟)(图88A)。
图89是表达野葛异戊二烯合酶并进料葡萄糖与3g/L酵母提取物的大肠杆菌BL21(DE3)pTrcIS菌株的发酵废气的分析的图。
图90显示了在结构上与异戊二烯相似并且也可以用作聚合催化剂毒的数种杂质的结构。
图91是pTrcHis2AUpperPathway(也称作pTrcUpperMVA)的图谱。
图92A-92C是pTrcHis2AUpperPathway(也称作pTrcUpperMVA)的核苷酸序列(SEQ ID NO：23)。
图93是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度的时间进程。
图94是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。
图95是进料了葡萄糖的15L生物反应器中生产的总异戊二烯的时间进程。
图96是进料了转化糖的15L生物反应器中的光密度的时间进程。
图97是进料了转化糖的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。
图98是进料了转化糖的15L生物反应器中生产的总异戊二烯的时间进程。
图99是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度的时间进程。
图100是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。
图101是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯比活性的时间进程。
图102是pCLPtrcUpperPathwayHGS2的图谱。
图103A-103C是pCLPtrcUpperPathwayHGS2的核苷酸序列(SEQID NO：24)。
图104是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度的时间进程。
图105是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。
图106是进料了葡萄糖的15L生物反应器中生产的总异戊二烯的时间进程。
图107是质粒MCM330(在attTn7处的FRT-cm-FRT-gi1.2-KKDy)的图谱。
图108A-108C是质粒MCM330的核苷酸序列(SEQ ID NO：25)。
图109是pET24D-Kudzu的图谱。
图110A-B是pET24D-Kudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO：26)。
图111A是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度的时间进程。
图111B是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。
图111C是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯比生产率的时间进程。
图112A是马氏甲烷八叠球菌远古下部途径操纵子的图谱。
图112B-C是马氏甲烷八叠球菌远古下部途径操纵子的核苷酸序列(SEQ ID NO：27)。
图113A是MCM382-pTrcKudzuMVK(mazei)的图谱。
图113B-C是MCM382-pTrcKudzuMVK(mazei)的核苷酸序列(SEQ ID NO：28)。
图114A是pET200D中来自马氏甲烷八叠球菌远古Lower的MCM376-MVK的图谱。
图114B-C是pET200D中来自马氏甲烷八叠球菌远古Lower的MCM376-MVK的核苷酸序列(SEQ ID NO：29)。
图115A-115D证明：MVK和异戊二烯合酶的过表达引起异戊二烯产量增加。测定了经过22小时的时间进程，MCM401和MCM343在100mL生物反应器中的葡萄糖中生长过程中(以100和200μM IPTG诱导异戊二烯生产)累积的异戊二烯和CO2。图115A是从MCM343积累的异戊二烯(％)的图。图115B是从MCM401积累的异戊二烯(％)的图。图115C是从MCM343积累的CO2(％)的图。图115D是从MCM401积累的CO2(％)的图。
图116是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度的时间进程。
图117是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。
图118是进料了葡萄糖的15L生物反应器中生产的总异戊二烯的时间进程。
图119是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的总二氧化碳释放率(TCER)或代谢活性谱的图。
图120是进料了葡萄糖的15L生物反应器中生产异戊二烯的过程中的细胞存活性的图。TVC/OD是1mL培养液中的总的活细胞计数(菌落形成单位)/光密度单位(OD550)。
图121是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度的时间进程。
图122是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。
图123是进料了葡萄糖的15L生物反应器中生产的总异戊二烯的时间进程。
图124是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的体积生产率的时间进程。体积生产率定义为每升培养液每小时生产的异戊二烯的量。
图125是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的瞬时产率的时间进程。瞬时产率定义为：数据点之间的时间间隔期间，进料到生物反应器中的每数量的葡萄糖(克)所生产的异戊二烯的量(克)(w/w)。
图126是进料了葡萄糖的15L生物反应器中，总二氧化碳释放速率(TCER)或代谢活性谱的图。
图127是进料了葡萄糖的15L生物反应器中生产异戊二烯的过程中的细胞存活性。TVC/OD是1mL培养液中的总的活细胞计数(菌落形成单位)/光密度单位(OD550)。
图128是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度的时间进程。
图129是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。
图130是从进料了葡萄糖的15L生物反应器生产总异戊二烯的时间进程。
图131是进料了葡萄糖的15L生物反应器中，总二氧化碳释放速率(TCER)或代谢活性谱的图。
图132的图显示：进入到生物反应器中的气流的瞬间降低引起废气中异戊二烯浓度的波峰，其不引起代谢活性(TCER)的显著下降。TCER或代谢活性，是总二氧化碳释放速率。
图133是进料了葡萄糖的15L生物反应器中生产异戊二烯的过程中的细胞存活性的图。TVC/OD是1mL培养液中的总的活细胞计数(菌落形成单位)/光密度单位(OD550)。
图134是进料了葡萄糖的15L生物反应器中光密度的时间进程。垂直虚线表示以1g/L/hr的速率将异戊二烯导入生物反应器时的时间间隔。
图135是进料了葡萄糖的15L生物反应器中的总二氧化碳释放速率(TCER)或代谢活性谱。垂直虚线表示以1g/L/hr的速率将异戊二烯导入生物反应器时的时间间隔。
图136是进料了葡萄糖的15L生物反应器中生产异戊二烯的过程中的细胞存活性。TVC/OD是1mL培养液中的总的活细胞计数(菌落形成单位)/光密度单位(OD550)。垂直虚线表示以1g/L/hr的速率将异戊二烯导入生物反应器时的时间间隔。
图137A-B是银白杨pET24a的序列：以加粗字母着重显示了异戊二烯合酶基因(SEQ ID NO：30)。
图137C-D是欧洲黑杨(Populus nigra)pET24a的序列：以加粗字体着重显示了异戊二烯合酶基因(SEQ ID NO：31)。
图137E-F是美洲山杨(Populus tremuloides)的pET24a的序列(SEQID NO：32)。
图137G是美洲山杨异戊二烯合酶基因的氨基酸序列(SEQ IDNO：33)。
图137H-I是毛果杨(Populus trichocarpa)pET24a的序列：以加粗字体着重显示了异戊二烯合酶基因(SEQ ID NO：34)。
图137J-K是欧洲山杨×银白杨pET24a的序列：以加粗字体着重显示了异戊二烯合酶基因(SEQ ID NO：35).
图137L是MCM93的图谱，其含有在pCR2.1骨架中的野葛IspS编码序列。
图137M-N是MCM93的序列(SEQ ID NO：36)。
图137O是pET24D-Kudzu的图谱。
图137P-Q是pET24D-Kudzu的序列(SEQ ID NO：37)。
图138是在全细胞顶空测定法中测定的多个白杨物种的异戊二烯合酶表达数据。Y轴是以IPTG诱导的0.2mL培养物生产的异戊二烯的μg/L/OD。
图139是通过DMAPP测定法所测的白杨异戊二烯合酶的相对活性。白杨酶类具有的活性显著高于来自野葛的异戊二烯合酶。白杨[银白杨(alba)x欧洲山杨(tremula)]仅具有痕量(＜1％)活性，未在图中显示。
图140是pDONR221：19430-hybrid_HGS的图谱。
图141是pDONR221：19430-hybrid_HGS的核苷酸序列，为针对酵母进行了密码子优化的野葛异戊二烯合酶的序列(SEQ ID NO：38)。
图142A是pDW14的图谱。
图142B-C是pDW14的完整核苷酸序列(SEQ ID NO：39)。
图143显示了携带pDW14或pYES-DEST52的诱导的INVSc-1菌株。图143A.从以半乳糖诱导的INVSc-1菌株产生的裂解物的4-12％bistris凝胶(Novex，Invitrogen)，其经SimplyBlue SafeStain(Invitrogen)染色。图143B.使用WesternBreeze试剂盒(Invitrogen)对同一菌株的蛋白质印迹分析。泳道如下：1，INVSc-1+pYES-DEST52；2，INVSc-1+pDW14(分离物1)；3，INVSc-1+pDW14(分离物2)。标示出了MW(以kDa表示)(使用SeeBlue Plus2分子量标准物)。
图144(图144A和144B)显示了携带pDW14或pYES-DEST52的诱导的INVSc-1菌株。图144A.裂解前半乳糖诱导的菌株的OD600。y轴是OD600。图144B.对照和携带异戊二烯合酶的菌株中的异戊二烯合酶顶空的DMAPP测定。比活性计算为μg HG/L/OD。样品如下：对照，INVSc-1+pYES-DEST52；HGS-1，INVSc-1+pDW14(分离物1)；HGS-2，INVSc-1+pDW14(分离物2)。
图145A是密码子优化的异戊二烯合酶fluo-opt2v2的图谱。
图145B是密码子优化的异戊二烯合酶fluo-opt2v2的核苷酸序列(SEQ ID NO：40)。
图146A是pBBR1MCS5的图谱。
图146B-C是pBBR1MCS5的核苷酸序列(SEQ ID NO：41)。
图147A是pBBR5HGSOpt2_2的图谱。
图147B-C是pBBR5HGSOpt2_2的核苷酸序列(SEQ ID NO：42)。
图148是：对于未诱导的、以IPTG(4x 50μmol)诱导的或以IPTG(2x 100μmol)诱导的菌株MCM401，其CER相对于发酵时间的图。
图149显示了经pH调节的或未经调节的甘蔗溶液中，随着高压灭菌循环数目的函数(1个循环＝30分钟)变化的葡萄糖的浓度。
图150显示了恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)F1和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ATCC13525在葡萄糖、甘蔗、和转化的甘蔗上的生长曲线(OD600随着时间变化)。
图151显示了大肠杆菌BL21(DE3)、MG1655、ATCC11303和B REL606在葡萄糖、甘蔗、和转化的甘蔗上的生长曲线(OD600随着时间变化)。
图152是质粒pET24P.alba HGS的图谱。
图153A-B是质粒pET24P.alba HGS的核苷酸序列(SEQ IDNO：43)。
图154是示意图，其显示了用于进行核酸内切酶消化以构建质粒EWL230的限制性位点，以及BspHI与NcoI位点之间的相容性粘末端。
图155是质粒EWL230的图谱。
图156A-B是质粒EWL230的核苷酸序列(SEQ ID NO：44)。
图157是示意图，其显示了用于进行核酸内切酶消化以构建质粒EWL244的限制性位点，以及NsiI与PstI位点之间的相容性粘末端。
图158是质粒EWL244的图谱。
图159A-B是质粒EWL244的核苷酸序列(SEQ ID NO：45)。
图160A是马氏甲烷八叠球菌远古下部途径操纵子的图谱。
图160B-C是马氏甲烷八叠球菌远古下部途径操纵子的核苷酸序列(SEQ ID NO：46)。
图161A是pET200D中来自马氏甲烷八叠球菌远古Lower的MCM376-MVK的图谱。
图161B-C是pET200D中来自马氏甲烷八叠球菌远古Lower的MCM376-MVK的核苷酸序列(SEQ ID NO：47)。
图162是质粒pBBRCMPGI1.5-pgl的图谱。
图163A-B是质粒pBBRCMPGI1.5-pgl的核苷酸序列(SEQ IDNO：48)。
图164A-F是由表达马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶、银白杨异戊二烯合酶、和pgl(RHM111608-2)并且生长于15L级别的补料分批培养物中的大肠杆菌菌株生产异戊二烯的图。图164A显示了进料了葡萄糖的15L的生物反应器中的光密度的时间进程。图164B显示了进料了葡萄糖的15L的生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。用于计算异戊二烯的方法：在59小时内累积生产的异戊二烯，在59小时的g/发酵器体积，L[＝]g/L培养液。图164C也显示了进料了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。用于计算异戊二烯的方法：∫(瞬时异戊二烯生产速率，g/L/hr)dt从t＝0至59小时[＝]g/L发酵液。图164D显示了从进料了葡萄糖的15L生物反应器中生产总异戊二烯的时间进程。图164E显示了进料了葡萄糖的15L生物反应器中的体积生产率。图164F显示了进料了葡萄糖的15L生物反应器中的二氧化碳释放速率(CER)或代谢活性谱。
图165A-B的图显示了15L生物反应器中发酵生产的废气的分析。样品A是在64.8小时取样的菌株RM111608-2。样品B是在34.5小时取样的菌株EWL256，即大肠杆菌BL21(DE3)，pCL upper，cmR-gi1.2-yKKDyI，pTrcAlba-mMVK。对于两个样品均在基线(0.95x10-8torr)以上检测到了氢。
图166A显示示例性生物异戊二烯TM回收装置。
图166B显示示例性生物异戊二烯TM解吸附/冷凝装置。
图167显示生物异戊二烯TM产品的GC/FID色谱图。测定该物质具有99.7％纯度。
图168A-C显示生物异戊二烯TM样品在处理之前(A)和用氧化铝(B)或二氧化硅(C)处理之后的GC/FID色谱图。在这些色谱图中未显示异戊二烯峰。
图169显示用于从发酵废气纯化异戊二烯的工艺和相关装置的示意图。
图170显示部分氢化的生物异戊二烯TM单体的GC/FID色谱图。化合物1(RT＝12.30分钟)＝3-甲基-1-丁烯，化合物2(RT＝12.70分钟)＝2-甲基丁烷，化合物3(RT＝13.23分钟)＝2-甲基-1-丁烯，化合物4(RT＝13.53分钟)＝异戊二烯，化合物5(RT＝14.01分钟)＝2-甲基-2-丁烯)。
图171显示从Amberlyst-15酸性树脂催化的2-甲基-2-丁烯二聚化衍生的产物的GC/MS总离子色谱图。
图172显示从Amberlyst 15酸性树脂催化的生物异戊二烯TM单体寡聚化衍生的产物的GC/MS总离子色谱图。
图173显示了使用二聚化反应器将C5流转化成C10/C15产物流的工艺流程图。C5流包含生物异戊二烯TM单体和/或生物异戊二烯TM单体的C5衍生物。
具体实施方式
本发明特别提供了用于从异戊二烯产生燃料组分的组合物和方法。本文提供燃料组分或添加物，例如，环状异戊二烯二聚体与三聚体、线性异戊二烯低聚物、芳族及脂环族异戊二烯衍生物和氧化异戊二烯衍生物。燃料组分可以通过化学转变包含商业上有益量的高纯异戊二烯的原料产生。在一个方面，商业上有益量的高纯异戊二烯包含生物异戊二烯。在另一个方面，商业上有益量的高纯异戊二烯可以是生物异戊二烯。在另一个方面，商业上有益量的高纯异戊二烯可以是通过培养表达异源异戊二烯合酶的细胞所产生的高纯异戊二烯组合物。在其他方面，高纯异戊二烯经历寡聚化以形成不饱和的异戊二烯低聚物，如环状二聚体或三聚体和线性低聚物。不饱和的低聚物可以被氢化以产生饱和的烃燃料组分。在一些实施方式中，高纯异戊二烯与醇类在酸催化剂存在下的反应产生燃料氧化产物。在另一方面，将高纯异戊二烯部分地氢化以产生异戊烯。在一些实施方式中，从高纯异戊二烯衍生的异戊烯产物经历二聚化以形成异癸烯。在一些实施方式中，从高纯异戊二烯衍生的异戊烯产物与醇类在酸催化剂存在下反应以产生燃料氧化产物。
从可再生碳衍生的生物异戊二烯可以通过化学催化作用转化成多种烃燃料。本文提供用于从发酵中回收异戊二烯并随后通过化学催化成分子量较高的化合物来转化成烃燃料的方法。这些方法包括，但不限于回收和纯化来自发酵废气的异戊二烯并且随后气相或液相催化以提供具有燃料价值的化合物。本发明范围内构思了连续和分批模式过程。
如本文进一步详述，生物异戊二烯组合物与石油异戊二烯组合物的区别之处在于，生物异戊二烯组合物基本上不含通常存在于石油异戊二烯组合物中的任何污染性不饱和C5烃，如，但不限于1，3-环戊二烯、反式-1，3-戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、3-甲基-1-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、和顺式-戊-3-烯-1-炔。如果任何污染性不饱和的C5烃存在于本文中所述的生物异戊二烯原料中，则它们以比石油-异戊二烯组合物中低的水平存在。因此，从本文所述的生物异戊二烯组合物衍生的任何燃料产品基本上不含或以低于衍生自石油异戊二烯的燃料产品中的水平含有任何污染性不饱和的C5烃或从此类染性不饱和C5烃衍生的产物。此外，生物异戊二烯组合物中的硫水平低于石油-异戊二烯组合物中的硫水平。从生物异戊二烯组合物衍生的燃料产品比石油-异戊二烯衍生的燃料产品含有较低水平的硫。
生物异戊二烯与石油异戊二烯的区别之处在于，产生的生物异戊二烯具有石油-异戊二烯组合物中不存在的或以低得多的水平存在的其他生物副产物(从生物源和/或相关生物过程中衍生的随生物异戊二烯一起获得的化合物)，如醇、醛、酮等。所述生物副产物可以包括，但不限于乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、异丁烯醛、甲基乙烯基酮、2-甲基-2-乙烯基环氧乙烷、顺式-和反式-3-甲基-1，3-戊二烯、C5异戊二烯基醇(如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)、2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，4，5-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡嗪、香茅醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、丁二酮、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、异丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3-甲基丁酯、3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯、3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯、3-己烯-1-醇、3-己烯-1-基乙酸酯、苧烯、香叶醇(反式-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇)、香茅醇(3，7-二甲基-6-辛烯-1-醇)、(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、2，3-环庚烯醇吡啶、或线性异戊二烯聚合物(如从多个异戊二烯单元聚合衍生的线性异戊二烯二聚体或线性异戊二烯三聚体)。从生物异戊二烯衍生的燃料产品含有一种或多种生物副产物或从所述生物副产物中任何者衍生的化合物。此外，从生物异戊二烯衍生的燃料产品可以含有在后续化学转化期间从这些生物副产物形成的化合物。此类化合物的实例包括从Diels-Alder环加成亲双烯体为异戊二烯或其燃料衍生物、氧化异戊二烯或燃料衍生物所衍生的那些化合物。
此外，生物异戊二烯与石油异戊二烯的区别之处在于碳指纹。在一个方面，生物异戊二烯比石油-异戊二烯具有更高的放射性碳-14(14C)含量或更高的14C/12C比。生物异戊二烯从可再生碳源产生，因而生物异戊二烯中的14C含量或14C/12C比与当前大气相同。另一方面，石油-异戊二烯从成千至上百万年前沉积的化石燃料衍生，因而14C含量或14C/12C比因放射性衰变减少。如本文更详细地讨论，从生物异戊二烯衍生的燃料产品比衍生自石油-异戊二烯的燃料产品具有更高的14C含量或14C/12C比。在一个实施方式中，从本文中所述的生物异戊二烯衍生的燃料产品具有与大气中相似的14C含量或14C/12C比。在另一方面，生物异戊二烯可以因稳定的碳同位素比(13C/12C)与石油异戊二烯在分析水平上相区别，所述的稳定碳同位素比可以报道为由δ13C符号所示的“Δ值”。例如，对于从萃取蒸馏来自炼油厂的C5流衍生的异戊二烯，δ13C是约-22‰至约-24‰。该范围常见于从石油衍生的轻质不饱和烃，并且从基于石油的异戊二烯衍生的产物一般含有δ13C相同的异戊二烯单元。通过在伴有最小量的其他含碳营养物(例如，酵母提取物)情况下发酵玉米衍生的葡萄糖(δ13C-10.73‰)所产生的生物异戊二烯产生了这样的异戊二烯，所述异戊二烯可以聚合成具有δ13C-14.66‰至-14.85‰的聚异戊二烯。从这类生物异戊二烯产生的产品预期具有比从基于石油的异戊二烯衍生的那些δ13C值更负的δ13C值。
通过这些方法产生的化合物包括环状异戊二烯二聚体和三聚体、线性低聚物、芳族和脂环族衍生物。通过包括部分氢化生物异戊二烯组合物的方法产生二异戊烯。异戊二烯的这些化学衍生物可用作交通运输液体燃料(IsoFuelsTM)并且用作燃料添加物。
本文还提供了用于产生异戊二烯氧化衍生物(包括醇、酮、酯和醚)的方法。使用均相和多相催化剂，也可以在液相或气相中进行用于合成异戊二烯氧化衍生物的方法。这个化学类型的化合物也可用作交通运输液体燃料，并且可以用在燃料掺合物中作为减排用燃料氧化产物和作为燃料调节物，例如作为柴油的十六烷增进剂。
虽然异戊二烯可以通过分馏石油来获得，但是该物质的纯化是昂贵且耗时的。烃的C5流的石油裂解仅产生约15％的异戊二烯。异戊二烯也天然地由多个微生物、植物、和动物物种产生。具体地，已经鉴定了生物合成异戊二烯的两条途径：甲羟戊酸(MVA)途径和非-甲羟戊酸(DXP)途径。基因修饰的细胞培养在生物反应器中已经以更大的量和更高纯度和/或伴随独特杂质情况而更高效地产生异戊二烯，如2007年12月13日提交的美国临时专利申请号61/013,386和61/013,574；WO2009/076676；2008年7月2日提交的美国临时专利申请号61/134,094、61/134,947、61/134,011和61/134,103；WO 2010/003007；2008年9月15日提交的美国临时专利申请号61/097,163；WO 2010/031079；2008年9月15日提交的美国临时专利申请号61/097,186；WO 2010/031062；2008年9月15日提交的美国临时专利申请号61/097,189；WO 2010/031077；2008年9月15日提交的美国临时专利申请号61/097,200；WO2010/031068；2008年9月15日提交的美国临时专利申请号61/097,204；WO 2010/031076；2008年12月30日提交的美国临时专利申请号61/141,652；PCT/US09/069862；2008年12月15日提交的美国专利申请号12/335,071(US 2009/0203102A1)和2009年4月23日提交的美国专利申请号12/429,143(US 2010/0003716A1)，所述文献通过引用方式全文并入。
定义
除非本文另外定义，本文中所用的全部技术术语及科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同意义。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料用于本发明的实施中，然而本文描述了优选的方法和材料。因而，通过整体地参考本说明书更充分地描述下文立即定义的术语。所引用的全部文献在有关的部分中通过引用的方式并入本文。然而，对任何文献的引用不得解释为承认该文献相对于本文发明而言是现有技术。
如本文中所用，单数术语“一个(a)”、“一种(an)”、和“该(the)”包括复数指称，除非上下文另外清晰地说明。
意图在本说明书通篇范围内给出的每个最大数字界限包括每个较小的数字界限，如同在本文中明确地写出此类较小的数字界限。在本说明书通篇范围内给出的每个最小数字界限将包括每个较高的数字界限，如同在本文中明确地写出此类较高的数字界限。在本说明书通篇范围内给出的每个数字范围将包括属于这种较宽泛数字范围内的每个较窄的数字范围，如同在本文中完全明确地写出此类较窄的数字范围。
术语“异戊二烯”指2-甲基-1，3-丁二烯(CAS#78-79-5)，它是从3，3-二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)消去焦磷酸而来的直接和最终的挥发性C5烃产物，并且不包括[一个]IPP分子与[一个]DMAPP分子的连接或聚合。术语“异戊二烯”通常不意图受限于其产生方法，除非本文另外指明。
如本文中所用，“生物产生的异戊二烯”或“生物异戊二烯”是通过任何生物学手段产生的异戊二烯，如通过基因修饰的细胞培养物、天然微生物、植物或动物产生。
“生物异戊二烯组合物”指可以通过任何生物学手段(如工程化以产生异戊二烯的系统(例如，细胞))产生的组合物。它含有异戊二烯和随异戊二烯一起共同产生和/或分离的其他化合物(包括杂质)。生物异戊二烯组合物通常含有比产自石油化学源的异戊二烯更少的烃杂质，并且经常需要最少处理以达到聚合级。如本文详述，生物异戊二烯组合物还具有与石油化学地产生的异戊二烯组合物不同的杂质情况。
如本文中所用，“至少一部分异戊二烯起始组合物”可以指经历化学转变的至少约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、或100％的异戊二烯起始组合物。
如本文中所用，IsoFuelsTM指这样的燃料，所述燃料包括从异戊二烯衍生的交通运输液体燃料。BioIsoFuelsTM指这样燃料，所述燃料包括从生物异戊二烯衍生的交通运输液体燃料。
如本文中所用的术语“寡聚化”指合并两个或更多个单体单元的化学过程。异戊二烯的“寡聚化”产生从异戊二烯的两个或更多个分子衍生的异戊二烯衍生物，如异戊二烯的线性二聚体、异戊二烯的环状二聚体、异戊二烯的线性三聚体、异戊二烯的环状三聚体等。
将“完全氢化”、“完全地氢化”或“充分地氢化”定义为添加氢(H2)(一般在氢化催化剂存在下)至前体化合物内的全部的不饱和官能团如碳-碳双键以产生充分饱和的产物化合物。例如，异戊二烯的完全氢化形成异戊烷，从而每摩尔异戊二烯消耗2摩尔H2。
将“部分氢化”或“部分地氢化”定义为添加氢(H2)(一般在氢化催化剂存在下)至前体化合物内部至少一个、但非全部的不饱和官能团如碳-碳双键。部分氢化的产物可以进一步完全地氢化以产生充分饱和的产物化合物。二烯的部分氢化形成一种或多种单烯烃。例如，异戊二烯的部分氢化可以产生3种异构异戊烯(2-甲基丁-1-烯、2-甲基丁-2-烯和3-甲基丁-1-烯)，从而每摩尔异戊二烯消耗1摩尔H2。
将“选择性氢化”或“选择性地氢化”定义为添加氢(H2)(一般在氢化催化剂存在下)至前体化合物内的至少一个、但非全部的不饱和官能团如碳-碳双键，从而在所选的条件下，某些不饱和官能团比其他不饱和基团优先地氢化。例如，异戊二烯的选择性氢化可以优先地形成2-甲基-2-丁烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁烯或其混合物。
如本文使用的术语“多肽”包括多肽、蛋白、肽、多肽的片段、和融合多肽。
如本文使用的“分离的多肽”不是多肽文库的一部分，所述多肽文库例如2、5、10、20、50或更多个不同多肽的文库；而是分离自天然状态下与其一起产生的至少一个成分。可以例如通过表达编码多肽的重组核酸来获得分离的多肽。
“异源多肽”意思是：氨基酸序列与在相同宿主细胞中天然表达的另一多肽的氨基酸序列不相同的多肽。具体地，异源多肽与天然状态下存在于相同宿主细胞中的野生型多肽是不同的。
“密码子简并性”是指遗传密码的多样性，其允许核苷酸序列变化而不影响所编码的多肽的氨基酸序列。技术人员熟知：特定的宿主细胞在使用核苷酸密码子来指定给定氨基酸时表现出的“密码子偏爱”。因此，当合成用于改善宿主细胞中的表达的核酸时，在一些实施方式中合乎需要地将核酸设计为使其密码子使用频率达到宿主细胞的优选密码子使用频率。
如本文使用的“核酸”是指单链或双链形式的共价连接在一起的两个或更多个脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。
“重组核酸”意思是这样的目标核酸：其不含在所述目标核酸所源自的生物体的天然状态下存在的基因组中侧接该目标核酸的一个或多个核酸(例如基因)。因此，该术语包括例如，掺入到载体、掺入到自我复制型质粒或病毒、或掺入到原核或真核细胞的基因组DNA中的重组DNA，或作为独立于其它序列的单独的分子(例如，cDNA、基因组DNA片段、或通过PCR或限制性核酸内切酶消化产生的cDNA片段)而存在。
“异源核酸”意思是：核酸序列与在相同宿主细胞中天然存在的另一核酸的核酸序列不相同的核酸。具体地，异源核酸与天然状态下存在于相同宿主细胞中的野生型核酸是不同的。
如本文使用的“载体”意思是能够递送并合乎需要地在宿主细胞中表达一种或多种目标核酸的构建体。载体的实例包括但不限于，质粒、病毒载体、DNA或RNA表达载体、粘粒、和噬菌体载体。
如本文使用的“表达控制序列”意思是指导目标核酸的转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，例如组成型或可诱导启动子，或增强子。“可诱导启动子”是在环境或发育调节下有活性的启动子。表达控制序列与待转录的核酸区段可操作地连接。
术语“选择性标志物”或“可选择标志物”是指能够在宿主细胞中表达以允许容易地选择含有导入的核酸或载体的那些宿主细胞的核酸。可选择标志物的实例包括但不限于，抗生素抗性核酸(例如卡那霉素、氨比西林、羧苄西林、庆大霉素、潮霉素、腐草霉素、博来霉素、新霉素、或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢优势例如营养优势的核酸。示例性的营养选择性标志物包括那些本领域已知的标志物，例如amdS、argB、和pyr4。
组合物和系统
从石油化学源衍生的异戊二烯通常是不纯的C5烃级分，所述不纯的C5烃级分在该物质适合聚合或其他化学转变之前，需要深度纯化。鉴于几种杂质与异戊二烯的结构相似性和它们可以充当聚合催化剂毒物的事实，这些杂质特别带来麻烦。此类化合物包括，但不限于1，3-环戊二烯、顺式-和反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、3-甲基-1-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、和顺式-戊-3-烯-1-炔。如下文详述，生物产生的异戊二烯可以基本上不含任何污染性不饱和C5烃，无需经历深度纯化。一些生物产生的异戊二烯组合物含有乙醇、丙酮、和C5异戊二烯基醇。这些组分比衍生自石油化学源的异戊二烯组合物中存在的异构C5烃级分更容易地从异戊二烯流中除去。另外，可以在生物过程中管控这些杂质，例如通过对生产菌株作基因修饰、碳原料、替代性发酵条件、回收过程调节和额外或替代性纯化方法。
在一个方面，本发明的特征在于用于从异戊二烯产生燃料组分的组合物和系统，所述的组合物和系统包含：(a)商业上有益量的高纯异戊二烯起始组合物；和(b)从至少一部分高纯异戊二烯起始组合物产生的燃料组分；其中至少一部分商业上有益量的高纯异戊二烯起始组合物经历化学转变。高纯异戊二烯原料经历化学反应以产生商业上有益量的用于制造燃料的产物。在一个方面，商业上有益量的高纯异戊二烯包含生物异戊二烯。在一个方面，商业上有益量的高纯异戊二烯可以是生物异戊二烯。
示例性的起始异戊二烯组合物
在一些实施方式中，商业上有益量的高纯异戊二烯起始组合物包含大于或约2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000mg的异戊二烯。在一些实施方式中，起始异戊二烯组合物包含大于或约2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100g的异戊二烯。在一些实施方式中，起始异戊二烯组合物包含大于或约0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000kg的异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯在起始组合物中的量是约2至约5,000mg，如约2至约100mg、约100至约500mg、约500至约1,000mg、约1,000至约2,000mg、或约2,000至约5,000mg。在一些实施方式中，异戊二烯在起始组合物中的量是约20至约5,000mg、约100至约5,000mg、约200至约2,000mg、约200至约1,000mg、约300至约1,000mg、或约400至约1,000mg。在一些实施方式中，异戊二烯在起始组合物中的量是约2至约5,000g，如约2至约100g、约100至约500g、约500至约1,000g、约1,000至约2,000g、或约2,000至约5,000g。在一些实施方式中，异戊二烯在起始组合物中的量是约2至约5,000kg、约10至约2,000kg、约20至约1,000kg、约20至约500kg、约30至约200kg、或约40至约100kg。在一些实施方式中，起始组合物的大于或约20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％(w/w)的挥发性有机级分是异戊二烯。
在一些实施方式中，高纯异戊二烯起始组合物包含重量占该起始组合物中全部C5烃的总重量的大于或约98.0％、98.5％、99.0％、99.5％、或100％的异戊二烯。在一些实施方式中，高纯异戊二烯起始组合物包含重量占该起始组合物中全部C5烃的总重量的大于或约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％、或100％的异戊二烯。在一些实施方式中，该起始组合物具有异戊二烯的占该起始组合物中全部C5烃的检测器应答的大于或约98.0％、98.5％、99.0％、99.5％、或100％的相对检测器应答。在一些实施方式中，该起始组合物具有异戊二烯的占该起始组合物中全部C5烃的检测器应答的大于或约99.90％、99.91％、99.92％、99.93％、99.94％、99.95％、99.96％、99.97％、99.98％、99.99％、或100％的相对检测器应答。在一些实施方式中，该起始异戊二烯组合物包含重量占该起始组合物中全部C5烃的总重量的约98.0％至约98.5％、约98.5％至约99.0％、约99.0％至约99.5％、约99.5％至约99.8％、约99.8％至100％的异戊二烯。在一些实施方式中，该起始异戊二烯组合物包含重量占该起始组合物中全部C5烃的总重量的约99.90％至约99.92％、约99.92％至约99.94％、约99.94％至约99.96％、约99.96％至约99.98％、约99.98％至100％的异戊二烯。
在一些实施方式中，高纯异戊二烯起始组合物包含重量占该起始组合物中全部C5烃的总重量的小于或约2.0％、1.5％、1.0％、0.5％、0.2％、0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的除异戊二烯之外的C5烃(如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，该起始组合物具有除异戊二烯之外的C5烃的占该起始组合物中全部C5烃的检测器应答的小于或约2.0％、1.5％、1.0％、0.5％、0.2％、0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的相对检测器应答。在一些实施方式中，该起始组合物具有1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔的占该起始组合物中全部C5烃的检测器应答的小于或约2.0％、1.5％、1.0％、0.5％、0.2％、0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的相对检测器应答。在一些实施方式中，该高纯异戊二烯起始组合物包含重量占该起始组合物中全部C5烃的总重量的约0.02％至约0.04％、约0.04％至约0.06％、约0.06％至0.08％、约0.08％至0.10％、或约0.10至约0.12％的除异戊二烯之外的C5烃(如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。
在一些实施方式中，对于起始组合物中抑制异戊二烯聚合的任意化合物，高纯异戊二烯起始组合物包含小于或约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的抑制异戊二烯聚合的化合物。在一些实施方式中，对于起始组合物中抑制异戊二烯聚合的任意化合物，该起始异戊二烯组合物包含约0.005至约50、例如约0.01至约10、约0.01至约5、约0.01至约1、约0.01至约0.5、或约0.01至约0.005μg/L的抑制异戊二烯聚合的化合物。在一些实施方式中，该起始异戊二烯组合物包含小于或约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的除异戊二烯之外的烃(如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，该起始异戊二烯组合物包含约0.005至约50，例如约0.01至约10、约0.01至约5、约0.01至约1、约0.01至约0.5、或约0.01至约0.005μg/L的除异戊二烯之外的烃。在一些实施方式中，该起始异戊二烯组合物包含小于或约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的的蛋白质或脂肪酸(例如与天然橡胶天然结合的蛋白质或脂肪酸)。
在一些实施方式中，高纯异戊二烯起始组合物包含小于或约10、5、1、0.8、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005ppm的α乙炔、戊二烯、乙腈、或1，3-环戊二烯。在一些实施方式中，该起始异戊二烯组合物包含小于或约5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005ppm的硫或丙二烯。在一些实施方式中，该起始异戊二烯组合物包含小于或约30、20、15、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005ppm的全部乙炔类(如1-戊炔、2-戊炔、3-甲基-1-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、和顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，该起始异戊二烯组合物包含小于或约2000、1000、500、200、100、50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005ppm的异戊二烯二聚体，例如环状异戊二烯二聚体(例如，从两个异戊二烯单元的二聚化衍生的环状C10化合物)。
在一些实施方式中，高纯异戊二烯起始组合物包含乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、异丁烯醛、甲基乙烯基酮、2-甲基-2-乙烯基环氧乙烷、顺式-和反式-3-甲基-1，3-戊二烯、C5异戊二烯基醇(如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)、或前述任意两项或更多项。在具体的实施方式中，起始异戊二烯组合物包含大于或约0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、60、80、100、或120μg/L的乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、异丁烯醛、甲基乙烯基酮、2-甲基-2-乙烯基环氧乙烷、顺式-和反式-3-甲基-1，3-戊二烯、C5异戊二烯基醇(如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)、或前述任意两项或更多项。在一些实施方式中，该异戊二烯组合物包含约0.005至约120，例如约0.01至约80、约0.01至约60、约0.01至约40、约0.01至约30、约0.01至约20、约0.01至约10、约0.1至约80、约0.1至约60、约0.1至约40、约5至约80、约5至约60、或约5至约40μg/L的乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、异丁烯醛、甲基乙烯基酮、2-甲基-2-乙烯基环氧乙烷、顺式-和反式-3-甲基-1，3-戊二烯、C5异戊二烯基醇、或前述任意两项或更多项。
在一些实施方式中，高纯异戊二烯起始组合物包含以下组分中的一种或多种：2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，4，5-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、丁二酮、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、异丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3-甲基丁酯、3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯、3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯、3-己烯-1-醇、3-己烯-1-基乙酸酯、苧烯、香叶醇(反式-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇)、香茅醇(3，7-二甲基-6-辛烯-1-醇)、(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、2，3-环庚烯醇吡啶、或线性异戊二烯聚合物(例如，从多个异戊二烯单元的聚合衍生的线性异戊二烯二聚体或线性异戊二烯三聚体)。在多种实施方式中，以重量％为单位，这些组分之一的量相对于异戊二烯的量(即，该组分的重量除以异戊二烯的重量乘以100)是大于或约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或110％(w/w)。在一些实施方式中，第二化合物的相对检测器应答相对于异戊二烯的检测器应答是大于或约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或110％。在多种实施方式中，以重量％为单位，这些组分之一的量相对于异戊二烯的量(即，该组分的重量除以异戊二烯的重量乘以100)是约0.01％至约105％(w/w)，例如约0.01％至约90％，约0.01％至约80％，约0.01％至约50％，约0.01％至约20％，约0.01％至约10％，约0.02％至约50％，约0.05％至约50％，约0.1％至约50％，或0.1％至约20％(w/w)。
在一些实施方式中，至少一部分高纯异戊二烯起始组合物处于气相中。在一些实施方式中，至少一部分高纯异戊二烯起始组合物处于液相(如冷凝物)中。在一些实施方式中，至少一部分高纯异戊二烯起始组合物处于固相中。在一些实施方式中，至少一部分异戊二烯吸附于固体支持物，例如包括二氧化硅和/或活性炭的支持物。在一些实施方式中，起始异戊二烯组合物与一种或多种溶剂混合。在一些实施方式中，起始异戊二烯组合物与一种或多种气体混合。
在其他实施方式中，商业上有益量的高纯起始组合物通过生物过程产生。在一些优选的实施方式中，高纯异戊二烯起始组合物是通过培养细胞产生的生物异戊二烯组合物，其中所述细胞产生大于约400nmole异戊二烯/克细胞的细胞湿重/小时(nmole/gwcm/小时)的异戊二烯。在一些实施方式中，通过培养将细胞培养基中多于约0.002％的碳转化成异戊二烯的细胞产生所述生物异戊二烯组合物。在其他实施方式中，细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽(例如来自植物如葛属(Pueraria)的天然存在的多肽)且(ii)与启动子(例如T7启动子)可操作连接的异源核酸。其他异戊二烯合酶多肽，例如，来自白杨和天然存在的以及亲代异戊二烯合酶的变体，可以用来产生生物异戊二烯。可以使用的异戊二烯合酶及其变体的实例在美国专利申请号12/429,143中描述，该文献通过引用的方式全文并入本文。
在一些实施方式中，细胞在包含碳源的培养基中培养，所述碳源例如是，但不限于碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的组分或前述二者或更多者的任意组合。在一些实施方式中，细胞在限葡萄糖的条件下培养。在一些实施方式中，细胞还包含编码IDI多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码MDV途径多肽的异源核酸。在一些实施方式中，起始异戊二烯组合物是如2008年7月2日提交的美国临时专利申请号61/134,094、WO2010/003007、和2008年12月15日提交的美国专利申请号12/335,071(US2009/0203102 A1)中所述的异戊二烯组合物或通过培养在前述文献中描述的任何细胞所产生的异戊二烯组合物，所述文献通过引用方式全文并入。
在一些实施方式中，高纯异戊二烯起始组合物包含由培养物中产生异戊二烯的细胞所产生的气相(废气)。在一些实施方式中，该气相具有非可燃浓度的异戊二烯。在一些实施方式中，该气相包含小于约9.5％(体积)的氧。在一些实施方式中，该气相包含大于或约9.5％(体积)的氧，并且异戊二烯在气相中的浓度小于燃烧下限或高于燃烧上限。在一些实施方式中，除了异戊二烯以外的气相部分包含约0％至约100％(体积)的氧，例如约10％至约100％(体积)的氧。在一些实施方式中，除了异戊二烯以外的气相部分包含约0％至约99％(体积)的氮。在一些实施方式中，除了异戊二烯以外的气相部分包含约1％至约50％(体积)的CO2。
在一些实施方式中，高纯异戊二烯起始组合物包含以下一项或多项：醇、醛、酯、或酮(例如本文所述醇、醛、酯或酮的任意项)。在一些实施方式中，该异戊二烯组合物包括(i)醇和醛；(ii)醇和酮；(iii)醛和酮；或(iv)醇、醛、和酮。在一些实施方式中，所述异戊二烯组合物的任意者还包含酯。
在一些实施方式中，从生物来源(如细胞培养物)衍生的高纯异戊二烯起始组合物包含以下一项或多项：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3-甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇、或吲哚。在一些实施方式中，该异戊二烯起始组合物含有1ppm或更多的以下一项或多项：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3-甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇、或吲哚。在一些实施方式中，在起始异戊二烯组合物(例如纯化前的废气)中，下列一项或多项的浓度是约1至约10,000ppm：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3-甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇、或吲哚。在一些实施方式中，起始异戊二烯组合物(例如经历一个或多个纯化步骤之后的废气)包含浓度为约1至约100ppm(如约1至约10ppm、约10至约20ppm、约20至约30ppm、约30至约40ppm、约40至约50ppm、约50至约60ppm、约60至约70ppm、约70至约80ppm、约80至约90ppm、或约90至约100ppm)的下列一项或多项：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3-甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇、或吲哚。在一些实施方式中，该起始异戊二烯组合物含有小于1ppm的甲硫醇(一种强力的催化剂毒物和燃料终产品中的硫源)。可以使用标准方法例如本文描述的那些方法或其它标准方法例如质子转移反应质谱(见，例如，Bunge等人，Appliedand Environmental Microbiology，74(7)：2179-2186，2008，该文献通过引用方式全文并入本文，尤其关于分析挥发性有机化合物的方面)分析来自细胞培养物的挥发性有机化合物(例如，细胞培养物的顶空中的挥发性有机化合物)。
本发明也构思了从共同产生异戊二烯和氢的生物源(如细胞培养物)衍生的高纯异戊二烯起始组合物的用途。在一些实施方式中，起始生物异戊二烯组合物以下述的比率包含异戊二烯和氢：从至少1摩尔％的异戊二烯/3摩尔％的氢至至少1摩尔％的异戊二烯/4摩尔％的氢。在一些实施方式中，起始生物异戊二烯组合物以约1比9、2比8、3比7、4比6、5比5、6比4、7比3、8比2或9比1的摩尔比包含异戊二烯和氢。在一些实施方式中，该组合物还包含1至11摩尔％的异戊二烯和4至44摩尔％的氢。在一些实施方式中，该组合物还包含氧、二氧化碳、或氮。在一些实施方式中，该组合物还包含0至21摩尔％的氧、18至44摩尔％的二氧化碳、和0至78摩尔％的氢。在一些实施方式中，该组合物还包含1.0×10-4摩尔％或更少的非甲烷挥发性杂质。在一些实施方式中，非甲烷挥发性杂质包括以下一项或多项：2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，4，5-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、丁二酮、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、异丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3-甲基丁酯、3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯、3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯、3-己烯-1-醇、3-己烯-1-基乙酸酯、苧烯、香叶醇(反式-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇)、香茅醇(3，7-二甲基-6-辛烯-1-醇)、(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、2，3-环庚烯醇吡啶、或线性异戊二烯聚合物(例如，从多个异戊二烯单元的聚合衍生的线性异戊二烯二聚体或线性异戊二烯三聚体)。在一些实施方式中，非甲烷挥发性杂质包括以下一项或多项：该异戊二烯组合物包含下列一项或多项：醇、醛、或酮(例如本文所述的醇、醛、或酮的任意项)。在一些实施方式中，该异戊二烯组合物包括(i)醇和醛；(ii)醇和酮；(iii)醛和酮；或(iv)醇、醛、和酮。在一些实施方式中，非甲烷挥发性杂质包括以下一项或多项：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3-甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇、或吲哚。
用于在产生异戊二烯的细胞培养物中产生异戊二烯的技术在下述文献中描述：2007年12月13日提交的美国临时专利申请号61/013,386和61/013,574；WO 2009/076676；2008年7月2日提交的美国临时专利申请号61/134,094、61/134,947、61/134,011、和61/134,103；WO 2010/003007；2008年9月15日提交的美国临时专利申请号61/097,163；WO2010/031079；2008年9月15日提交的美国临时专利申请号61/097,186；WO 2010/031062；2008年9月15日提交的美国临时专利申请号61/097,189；WO 2010/031077；2008年9月15日提交的美国临时专利申请号61/097,200；WO 2010/031068；2008年9月15日提交的美国临时专利申请号61/097,204；WO 2010/031076；2008年12月30日提交的美国临时专利申请号61/141,652；PCT/US09/069862；2008年12月15日提交的美国专利申请号12/335,071(US 2009/0203102 A1)和2009年4月23日提交的美国专利申请号12/429,143(US 2010/0003716 A1)，所述文献的教导通过引用方式并入本文，目的在于教授通过这种过程产生和回收异戊二烯的技术。在任何情况下，下述文献教授了用于在细胞培养物中产生增加量的异戊二烯的组合物和方法：2007年12月13日提交的美国临时专利申请号61/013,386和61/013,574；WO 2009/076676；2008年7月2日提交的美国临时专利申请号61/134,094、61/134,947、61/134,011、和61/134,103；WO 2010/003007；2008年9月15日提交的美国临时专利申请号61/097,163；WO 2010/031079；2008年9月15日提交的美国临时专利申请号61/097,186；WO 2010/031062；2008年9月15日提交的美国临时专利申请号61/097,189；WO 2010/031077；2008年9月15日提交的美国临时专利申请号61/097,200；WO 2010/031068；2008年9月15日提交的美国临时专利申请号61/097,204；WO 2010/031076；2008年12月30日提交的美国临时专利申请号61/141,652；PCT/US09/069862；2008年12月15日提交的美国专利申请号12/335,071(US 2009/0203102A1)和2009年4月23日提交的美国专利申请号12/429,143(US2010/0003716 A1)。美国专利申请号12/335,071(2008年12月15日提交)和US 2009/0203102 A1进一步教授用于从培养的细胞共同产生异戊二烯和氢的组合物和方法。特别地，这些组合物和方法提高异戊二烯产生的速率并且增加产生的异戊二烯的总量。例如，已经产生了生成4.8x 104nmole/gwcm/小时的异戊二烯的细胞培养系统(表1)。这些系统的效率通过细胞从细胞培养基中消耗的约2.2％的碳转化成异戊二烯来证明。如实施例和表2中所示，每升培养液大约生成3g异戊二烯。如果需要，使用其他条件，如本文中所述的那些条件，可以获得甚至更大的量的异戊二烯。在一些实施方式中，可再生碳源用于异戊二烯的产生。在一些实施方式中，异戊二烯的产生与细胞的生长解偶联。在一些实施方式中，异戊二烯和任意氧化剂的浓度处于不可燃范围内，以减少或消除产生或回收异戊二烯过程中可能出现火灾的风险。所述组合物和方法是合乎需要的，因为它们允许每细胞的高异戊二烯产率、高碳产率、高异戊二烯纯度、高生产率、低能量消耗、低生产成本及投资、和最少的副反应。这种用于异戊二烯生产的高效大规模生物合成方法为基于合成性异戊二烯的产品(如橡胶)提供了异戊二烯源并且为使用天然橡胶提供了合乎需要的低成本替代方式。
如下文进一步讨论，可以通过将编码异戊二烯合酶多肽(例如，植物异戊二烯合酶多肽)的异源核酸导入细胞而大大增加由所述细胞产生的异戊二烯的量。异戊二烯合酶多肽将二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)转化成异戊二烯。如实施例中所示，异源越南葛藤(野葛)异戊二烯合酶多肽在多种宿主细胞如大肠杆菌(Escherichia coli)、柠檬泛菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、和里氏木霉(Yarrowia lipolytica)中表达。全部这些细胞比没有异源异戊二烯合酶多肽的相应细胞产生更多的异戊二烯。如表1和表2中所示，使用本文所述的方法，产生大量的异戊二烯。例如，具有异源异戊二烯合酶核酸的枯草芽孢杆菌细胞在14升发酵器中比没有该异源核酸的相应的对照枯草芽孢杆菌细胞产生约10倍的更多的异戊二烯(表2)。发酵器中大肠杆菌的每升培养液300mg异戊二烯的生产量(mg/L，其中培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积)和枯草芽孢杆菌的30mg/L异戊二烯的生产量表明可以产生显著量的异戊二烯(表2)。如果需要，可以在甚至更大的规模上产生异戊二烯，或者本文中所述的其他条件可以用来进一步增加异戊二烯的量。表1和表2中列出的载体和实验条件在下文和实施例部分中进一步详细描述。
表1：使用本文所述的细胞培养物和方法，来自摇瓶的异戊二烯的示例性产率。用于测量异戊二烯产生量的测定法在实施例I，第II部分中描述。对于该测定法，在一个或多个时间点从摇瓶取得样品并且将其培养30分钟。随后测量该样品中产生的异戊二烯的量。异戊二烯产生量的顶空浓度和比速率在表1中列出并且在本文中进一步描述。
Figure BDA0000135567880000451
Figure BDA0000135567880000461
*就1mL的1OD600进行校正，在液体∶顶空的体积比为1∶19的密封的顶空管中培养1小时。
表2：使用本文所述的细胞培养物和方法，发酵器中异戊二烯的示例性产率。用于测量异戊二烯产生量的测定法在实施例I，第II部分中描述。对于该测定法，取得发酵器废气的样品并且分析异戊二烯的量。峰值顶空浓度(其是发酵期间的最高顶空浓度)、效价(其是每升培养液所产生异戊二烯的累积总量)和异戊二烯产生量的峰值比速率(其是发酵期间的最高比速率)在表2中列出并且在本文中进一步描述。
Figure BDA0000135567880000462
Figure BDA0000135567880000471
Figure BDA0000135567880000481
**就1vvm(1体积废气/1L培养液/分钟)的废气流速进行校正。
另外，由含有异源异戊二烯合酶核酸的细胞的异戊二烯生产可以通过增加由所述细胞表达的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)多肽和/或异戊烯基二磷酸异构酶(IDI)多肽的量来增强。例如，可以将DXS核酸和/或IDI核酸导入该细胞中。DXS核酸可以是异源核酸或是内源核酸的重复拷贝。类似地，IDI核酸可以是异源核酸或是内源核酸的重复拷贝。在一些实施方式中，通过将内源DXS和/或IDI启动子或调节区替换为引起DXS核酸和/或IDI核酸更多转录的其他启动子和/或调节区来增加DXS和/或IDI多肽的量。在一些实施方式中，所述细胞含有编码异戊二烯合酶多肽(例如，植物异戊二烯合酶核酸)的异源核酸和编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸的重复拷贝。
编码的DXS和IDI多肽是生物合成异戊二烯的DXP途径(图19A)的一部分。DXS多肽将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转化成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。尽管不意图受到任何具体理论限制，然而认为，增加DXS多肽的量增加经过DXP途径的碳流量，从而导致更大的异戊二烯产生量。IDI多肽催化异戊烯二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的互变。尽管不意图受到任何具体理论限制，然而认为，增加细胞中IDI多肽的量增加了转化成DMAPP的IPP的量(和转化速率)，所述DMAPP继而转化成异戊二烯。
例如，使用具有野葛异戊二烯合酶核酸、酿酒酵母(S.cerevisia)IDI核酸、和大肠杆菌DXS核酸的大肠杆菌细胞的发酵来产生异戊二烯。异戊二烯的水平在15小时的时间段范围从50μg/L至300μg/L变动(实施例7，第VII部分)。
在一些实施方式中，异源的或额外内源的异戊二烯合酶核酸、IDI核酸、和DXS核酸的存在引起细胞与仅具有这些异源的或额外内源的核酸中一种或两种的相应细胞相比更可重现地生长或更长地保持活力。例如，含有异源异戊二烯合酶核酸、IDI核酸、和DXS核酸的细胞比仅具有异源异戊二烯合酶核酸和DXS核酸或仅具有异源异戊二烯合酶核酸的细胞生长得更好。另外，异源异戊二烯合酶核酸、IDI核酸、和DXS核酸成功地与大肠杆菌细胞维持的高拷贝质粒上的强启动子可操作地连接，这提示可以在细胞中表达大量的这些多肽，而不对细胞造成过多量的毒性。尽管不意图受到具体理论限制，认为存在异源的或额外内源的异戊二烯合酶核酸和IDI核酸可以减少一种或多种潜在有毒的中间体的量，其中如果细胞中仅存在异源的或额外内源的DXS核酸，则所述有毒的中间体会累积。
在一些实施方式中，含有异源异戊二烯合酶核酸的细胞的异戊二烯产生量通过增加由所述细胞表达的MVA多肽的量来强化(图19A和图19B)。示例性MVA途径多肽包括以下多肽中任一项：乙酰-CoA乙酰转移酶(AA-CoA硫解酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合酶(HMG-CoA合酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)多肽、甲羟戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽、磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)多肽、异戊烯基磷酸激酶(IPK)多肽、IDI多肽、和具有两种或更多种MVA途径多肽的活性的多肽(例如融合多肽)。例如，可以将一种或多种MVA途径核酸导入所述细胞中。在一些实施方式中，所述细胞含有包括AA-CoA硫解酶核酸、HMG-CoA合酶核酸、和HMG-CoA还原酶核酸的上部MVA途径。在一些实施方式中，所述细胞含有包括MVK核酸、PMK核酸、MVD核酸、和IDI核酸的下部MVA途径。在一些实施方式中，所述细胞含有包括AA-CoA硫解酶核酸、HMG-CoA合酶核酸、HMG-CoA还原酶核酸、MVK核酸、PMK核酸、MVD核酸、和IDI核酸的完整MVA途径。在一些实施方式中，所述细胞含有包括AA-CoA硫解酶核酸、HMG-CoA合酶核酸、HMG-CoA还原酶核酸、MVK核酸、PMDC核酸、IPK核酸、和IDI核酸的完整MVA途径。MVA途径核酸可以是异源核酸或是内源核酸的重复拷贝。在一些实施方式中，通过将MVA途径核酸的内源启动子或调节区替换为引起所述MVA途径核酸更多转录的其他启动子和/或调节区而增加一种或多种MVA途径多肽的量。在一些实施方式中，所述细胞含有编码异戊二烯合酶多肽(例如，植物异戊二烯合酶核酸)的异源核酸和编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸的重复拷贝。
例如，含有编码野葛异戊二烯合酶多肽的核酸和编码酿酒酵母MVK多肽、PMK多肽、MVD多肽、和IDI多肽的核酸的大肠杆菌细胞以6.67x 10-4mol/L培养液/OD600/小时的速率产生异戊二烯(见实施例8)。额外地，具有编码粪肠球菌AA-CoA硫解酶多肽、HMG-CoA合酶多肽、和HMG-CoA还原酶多肽的核酸的大肠杆菌细胞的14升发酵产生22克甲羟戊酸(MVA途径的中间体)。一个摇瓶的这些细胞产生每升2-4克甲羟戊酸。这些结果表明：异源MVA途径核酸在大肠杆菌中是有活性的。与仅具有下部MVA途径和野葛异戊二烯合酶的核酸的大肠杆菌细胞(菌株MCM 131)相比，含有上部MVA途径和下部MVA途径以及野葛异戊二烯合酶的核酸的大肠杆菌细胞(菌株MCM 127)产生显著更多的异戊二烯(874μg/L)(见表3和实施例8，第VIII部分)。
在一些实施方式中，至少一部分细胞在连续培养(如无稀释的连续培养)下维持异源异戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸、和/或MVA途径核酸持续至少约5、10、20、50、75、100、200、300次、或更多次的细胞分裂。在本文所述的任一方面的一些实施方式中，包含异源异戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸、和/或MVA途径核酸或内源异戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸、和/或MVA途径核酸的重复拷贝的核酸也包含选择性标记物，如卡那霉素、氨苄西林、羧苄西林、庆大霉素、潮霉素、腐草霉素、博来霉素、新霉素、或氯霉素抗生素抗性核酸。
如实施例7第VI部分所示，可以通过添加酵母提取物至细胞培养基中进一步增加所产生的异戊二烯的量。在这个实施例中，对于测试的浓度，所产生的异戊二烯的量与细胞培养基中酵母提取物的量成线性比例(图48C)。另外，从具有酵母提取物和葡萄糖的细胞培养基中大约产生每升培养液0.11克异戊二烯(实施例7，第VIII部分)。这些实验均使用具有野葛异戊二烯合酶核酸、酿酒酵母IDI核酸、和大肠杆菌DXS核酸的大肠杆菌细胞以产生异戊二烯。与酵母提取物存在下增加葡萄糖的量相比，在葡萄糖存在下增加酵母提取物的量导致更多的异戊二烯产生。另外，增加酵母提取物的量允许细胞更长时间地产生高水平的异戊二烯，并且改善细胞的健康。
使用三种水解的生物质(甘蔗渣、玉米秸秆、和软木浆)作为碳源，也显示异戊二烯产生(图46A-C)。具有野葛异戊二烯合酶核酸、酿酒酵母IDI核酸、和大肠杆菌DXS核酸的大肠杆菌细胞从这些水解的生物质碳源中产生与从等同量葡萄糖(例如，1％葡萄糖，w/v)中一样多的异戊二烯。如果需要，任何其他的生物质碳源可以用于本文所述的组合物和方法中。生物质碳源是合乎需要的，因为它们比许多常规细胞培养基更便宜，因而促进经济地产生异戊二烯。
另外，显示转化糖充当用于产生异戊二烯的碳源(图47C和96-98)。例如，从表达MVA途径多肽和野葛异戊二烯合酶的细胞产生2.4g/L的异戊二烯(实施例8，第XV部分)。甘油也用作从表达野葛异戊二烯合酶的细胞产生2.2mg/L异戊二烯的碳源(实施例8，第XIV部分)。除异戊二烯合酶核酸以外，DXS核酸、IDI核酸、和/或一种或多种MVA途径核酸(例如编码整个MVA途径的核酸)的表达也可以增加从甘油产生异戊二烯。
在一些实施方式中，细胞培养基中包含油。例如，在含有油和葡萄糖源的细胞培养基中培养时，含有野葛异戊二烯合酶核酸的枯草芽孢杆菌细胞产生异戊二烯(实施例4，第III部分)。作为另一个实例，在含有棕榈油和葡萄糖源的细胞培养基中培养时，含有上部和下部MVA途径外加野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌fadR atoC突变细胞产生异戊二烯(实施例27，第II部分)。在一些实施方式中，细胞培养基中包含多于一种油((如2、3、4、5、或更多种油)。尽管不意图受到任何具体理论限制，认为：(i)油可以增加细胞中可用于转化成异戊二烯的碳的量，(ii)油可以增加细胞中乙酰-CoA的量，因而通过MVA途径增加碳流量，和/或(ii)油可以为细胞提供额外的营养物，这是合乎需要，因为细胞中的大量碳转化成异戊二烯而非其他产物。在一些实施方式中，在含有油的细胞培养基中培养的细胞天然地使用MVA途径来产生异戊二烯或被遗传地修饰以含有完整MVA途径的核酸。在一些实施方式中，将油在添加至细胞培养基之前部分或彻底地水解以促进宿主细胞使用油。
在细胞(例如细菌)中商业化产生小分子(例如异戊二烯)的主要障碍之一是使分子的产生与细胞的生长解偶联。在商业上可行地产生异戊二烯的一些实施方式中，显著量的来自原料的碳转化成异戊二烯，而非为了细胞的生长和维持(“碳效率”)。在多种实施方式中，细胞将细胞培养基中的大于或约0.0015、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.12、0.14、0.16、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、或8.0％的碳转化成异戊二烯。在具体的实施方式中，显著部分的来自原料中转化成下游产物的碳转化成异戊二烯。如实施例11中进一步所描述，表达MVA途径和野葛异戊二烯合酶核酸的大肠杆菌细胞显示异戊二烯或中间体甲羟戊酸的产生与生长解偶联，从而导致高的碳效率。特别地，甲羟戊酸从表达来自粪肠球菌的上部MVA途径的细胞中形成。异戊二烯从表达来自粪肠球菌的上部MVA途径、来自酿酒酵母的下部MVA途径、和来自越南葛藤(野葛)的异戊二烯合酶的细胞中形成。异戊二烯或甲羟戊酸产生与生长的这种解偶联在4种不同大肠杆菌菌株：BL21(LDE3)、BL21(LDE3)Tuner、FM5、和MG1655中证明。头两种大肠杆菌菌株是B菌株，并且后两种是K12菌株。生产与生长的解偶联还在ack和pta基因缺失的MG1655的变体中证明。该变体还证明乙酸盐的较少产生。
示例性的多肽和核酸
多种异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子多肽和核酸可以用于本文所述的组合物和方法中。
在一些实施方式中，融合多肽包括部分或全部的第一多肽(例如，异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子多肽或其催化活性片段)，并且可以任选地包括部分或全部的第二多肽(例如，促进融合多肽的纯化或检测的肽，例如His标签)。在一些实施式案中，融合多肽具有两种或更多种MVA途径多肽(如AA-CoA硫解酶和HMG-CoA还原酶多肽)的活性。在一些实施方式中，该多肽是具有两种或更多种MVA途径多肽的活性的天然存在多肽(如由粪肠球菌mvaE核酸编码的多肽)。
在多种实施方式中，多肽具有至少或约50、100、150、175、200、250、300、350、400、或更多个氨基酸。在一些实施方式中，多肽片段含有来自全长多肽的至少或约25、50、75、100、150、200、300、或更多个连续氨基酸并且具有相应全长多肽的至少或约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％活性。在具体的实施方式中，所述多肽包括任意的天然存在的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子多肽的区段或其完整氨基酸序列。在一些实施方式中，与野生型异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子多肽的序列(即，自然界中存在的序列)相比，所述多肽具有一个或多个突变。
在一些实施方式中，该多肽是分离的多肽。在一些实施方式中，该多肽是异源多肽。
在一些实施方式中，该核酸是重组核酸。在一些实施方式中，异戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸、MVA途径核酸、氢化酶核酸、氢化酶成熟或转录因子多肽核酸可操作地连接于编码另一多肽的全部或部分的另一核酸，从而该重组核酸编码融合多肽，所述融合多肽包括异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径多肽、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子多肽和另一多肽(例如，辅助纯化或检测该融合多肽的肽，如His标记)的全部或部分。在一些实施方式中，化学地合成重组核酸的部分或全部。应该理解可以在如本文定义的核酸中出现突变，包括单核苷酸突变。
在一些实施方式中，该核酸是异源核酸。在具体的实施方式中，该核酸包括任意的天然存在的异戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸、MVA途径核酸、氢化酶核酸、氢化酶成熟或转录因子核酸的区段或其完整核酸序列。在一些实施方式中，该核酸包括来自天然存在的异戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸、MVA途径核酸、氢化酶核酸、氢化酶成熟或转录因子核酸的至少或约50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、或更多个连续核苷酸。在一些实施方式中，与野生型异戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸、MVA途径核酸、氢化酶核酸、氢化酶成熟或转录因子核酸的序列(即，自然界中存在的序列)相比，该核酸具有一个或多个突变。在一些实施方式中，该核酸具有增加异戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸、MVA途径核酸、氢化酶核酸、或转录因子核酸的转录或翻译的一个或多个突变(例如，沉默突变)。在一些实施方式中，该核酸是编码异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子多肽的任意核酸的简并变体。
示例性的异戊二烯合酶DXS、IDI、和/或MVA途径多肽和核酸的登录号列于附件1(附件1的登记号和它们的相应的序列通过引用方式全文并入本文，尤其关于异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径多肽和核酸的氨基酸序列和核酸序列的方面)。Kegg数据库也含有众多示例性的异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径多肽和核酸的氨基酸序列和核酸序列(见，例如，在互联网“genome.jp/kegg/pathway/map/map00100.html”处及其中序列，所述的网址和序列因而各自通过引用方式全文并入本文，尤其关于异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径多肽和核酸的氨基酸序列和核酸序列的方面)。在一些实施方式中，一种或多种异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径多肽和/或核酸与2007年12月12日或2008年9月14日公众可获得的序列(如与附件1中的任意登录号相对应的任意序列或存在于Kegg数据库中的任意序列)具有序列同一性。下文进一步描述额外的示例性异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径多肽和核酸。
示例性异戊二烯合酶多肽和核酸
如上文所述，异戊二烯合酶多肽将二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)转化成异戊二烯。示例性异戊二烯合酶多肽包括具有异戊二烯合酶多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽、和融合多肽。可以使用标准方法以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中、或在体内将DMAPP转化成异戊二烯的能力来确定该多肽是否具有异戊二烯合酶多肽活性。在示例性的测定法中，通过以如实施例1中描述的摇瓶方法培育菌株(例如，本文所述的大肠杆菌/pTrcKudzu菌株)来制备细胞提取物。在诱导结束后，将大约10mL细胞通过以7000x g离心10分钟沉淀并且重悬于无甘油的5ml PEB中。使用弗氏压碎器，使用标准流程裂解细胞。或者，在-80℃冷冻/融化后，细胞用溶菌酶(Ready-Lyse溶菌酶溶液；EpiCentre)处理。
细胞提取物中的异戊二烯合酶多肽活性例如可以如Silver等人，J.Biol.Chem.270：13010-13016，1995和其参考文献中所述那样测量，所述文献因而各自通过引用的方式全文并入，尤其关于异戊二烯合酶多肽活性的测定法的方面。在氮气流下，使DMAPP(Sigma)蒸发至干燥，并在pH8.2的100mM磷酸钾缓冲液中重新水化至100mM的浓度，并储存于-20℃。为了进行测定，将5μL 1M MgCl2、1mM(250μg/ml)DMAPP、65μL植物提取物缓冲液(PEB)(50mM Tris-HCl，pH 8.0，20mM MgCl2，5％甘油，和2mM DTT)的溶液加入到20ml的具有金属螺丝盖和特氟隆包被的硅隔膜的顶空瓶(Agilent Technologies)中的25μL细胞提取物中，并在37℃摇动培养15分钟。通过加入200μL 250mM EDTA使反应猝灭，按照实施例1第II部分的描述通过GC/MS进行定量测定。
示例性的异戊二烯合酶核酸包括编码具有异戊二烯合酶多肽的至少一项活性的多肽、多肽片段、肽、或融合多肽的核酸。示例性的异戊二烯合酶多肽和核酸包括来自本文描述的任意生物体来源的天然存在的多肽和核酸以及源自本文描述的任意生物体来源的突变体多肽和核酸。
在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽或核酸来自豆科(Fabaceae)，例如蝶型花亚科(Faboideae)。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽或核酸是来自下列的多肽或核酸：越南葛藤(野葛)(Sharkey等人，PlantPhysiology 137：700-712，2005)，葛根(Pueraria lobata)，白杨(例如银白杨、欧洲黑杨、毛果杨、或银白杨x欧洲山杨(CAC35696)Miller等，Planta213：483-487，2001)，白杨(aspen)(例如美洲山杨)Silver等人，JBC270(22)：13010-1316，1995)，或英国栎(夏栎(Quercus robur))(Zimmer等人，WO 98/02550)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于异戊二烯合酶核酸和异戊二烯合酶多肽的表达的内容。适宜的异戊二烯合酶包括但不限于Genbank登记号AY341431、AY316691、AY279379、AJ457070、和AY182241(其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于异戊二烯合酶核酸和多肽的序列的内容)中记载的那些。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽或核酸不是的来自夏栎天然存在的多肽或核酸(即，异戊二烯合酶多肽或核酸是除了来自夏栎的天然存在的多肽或核酸以外的异戊二烯合酶多肽或核酸)。在一些实施方式中，异戊二烯合酶核酸或多肽是来自白杨的天然存在的多肽或核酸。在一些实施方式中，异戊二烯合酶核酸或多肽不是来自白杨的天然存在的多肽或核酸。
示例性的DXS多肽和核酸
如上所述，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)多肽将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转化为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。示例性的DXS多肽包括具有DXS多肽的至少一项活性的多肽、多肽片段、肽、和融合多肽。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转化为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有DXS多肽活性。示例性的DXS核酸包括编码具有DXS多肽的至少一项活性的多肽、多肽片段、肽、或融合多肽的核酸。示例性的DXS多肽和核酸包括来自本文描述的任意生物体来源的天然存在的多肽和核酸以及源自本文描述的任意生物体来源的突变体多肽和核酸。
示例性的IDI多肽和核酸
异戊烯二磷酸异构酶多肽(异戊烯-二磷酸δ-异构酶或IDI)催化异戊烯二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的相互转化(例如，将IPP转化为DMAPP和/或将DMAPP转化为IPP)。示例性的IDI多肽包括具有IDI多肽的至少一项活性的多肽、多肽片段、肽、和融合多肽。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽使IPP和DMAPP相互转化的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有IDI多肽活性。示例性的IDI核酸包括编码具有IDI多肽的至少一项活性的多肽、多肽片段、肽、或融合多肽的核酸。示例性的IDI多肽和核酸包括来自本文描述的任意生物体来源的天然存在的多肽和核酸以及源自本文描述的任意生物体来源的突变体多肽和核酸。
示例性的MVA途径多肽和核酸
示例性的MVA途径多肽包括乙酰基-辅酶A乙酰转移酶(AA-辅酶A硫解酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A合酶(HMG-辅酶A合酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶(HMG-辅酶A还原酶)多肽、甲羟戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽、磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)多肽、异戊烯磷酸激酶(IPK)多肽、IDI多肽、和具有两个或更多个MVA途径多肽的活性的多肽(例如融合多肽)。具体地，MVA途径多肽包括具有MVA途径多肽的至少一项活性的多肽、多肽片段、肽、和融合多肽。示例性的MVA途径核酸包括编码具有MVA途径多肽的至少一项活性的多肽、多肽片段、肽、或融合多肽的核酸。示例性的MVA途径多肽和核酸包括来自本文描述的任意生物体来源的天然存在的多肽和核酸以及源自本文描述的任意生物体来源的突变体多肽和核酸。
具体地，乙酰基-辅酶A乙酰转移酶多肽(AA-辅酶A硫解酶或AACT)将两分子的乙酰基-辅酶A转化为乙酰乙酰基-辅酶A。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽将两分子的乙酰基-辅酶A转化为乙酰乙酰基-辅酶A的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有AA-辅酶A硫解酶多肽活性。
3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A合酶(HMG-辅酶A合酶或HMGS)多肽将乙酰乙酰基-辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽将乙酰乙酰基-辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有HMG-辅酶A合酶多肽活性。
3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶(HMG-辅酶A还原酶或HMGR)多肽将3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A转化为甲羟戊酸。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽将3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A转化为甲羟戊酸的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有HMG-辅酶A还原酶多肽活性。
甲羟戊酸激酶(MVK)多肽将甲羟戊酸磷酸化以形成甲羟戊酸-5-磷酸。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸-5-磷酸的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有MVK多肽活性。
磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽将甲羟戊酸-5-磷酸磷酸化以形成甲羟戊酸-5-二磷酸。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽将甲羟戊酸-5-磷酸转化为甲羟戊酸-5-二磷酸的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有PMK多肽活性。
二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD或DPMDC)多肽将甲羟戊酸-5-二磷酸转化为异戊烯二磷酸(IPP)。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽将甲羟戊酸-5-二磷酸转化为IPP的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有MVD多肽活性。
磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)多肽将甲羟戊酸-5-磷酸转化为异戊烯磷酸(IP)。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽将甲羟戊酸-5-磷酸转化为IP的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有PMDC多肽活性。
异戊烯磷酸激酶(IPK)多肽将异戊烯磷酸(IP)磷酸化以形成异戊烯二磷酸(IPP)。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽将IP转化为IPP的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有IPK多肽活性。
示例性的IDI多肽和核酸如上文所述。
示例性的氢化酶多肽和核酸
氢化酶多肽催化下列反应：
Figure BDA0000135567880000591
在体外，该反应是可逆的，但是某些氢化酶在体内可能仅以一个方向发挥作用：氧化H2或还原H+。氢化酶多肽可以是氧敏感性的，含有复合金属辅因子作为它们的催化中心的一部分，并且有时由多个亚基组成，氢化酶基因表达有时涉及另外的辅助性多肽，例如“成熟”因子或转录调节因子(即激活子或阻抑子)。基于它们的催化中心中的金属辅因子的类型，氢化酶被分成三个主要类别：(1)镍-铁(“NiFe”)氢化酶具有镍/铁辅因子；(2)铁-铁氢化酶(“FeFe”)具有铁/铁辅因子；和(3)铁/无硫(“Fe”)氢化酶，其不含第(1)组和第(2)组中存在的4Fe4S簇，具有铁辅因子和次甲基-四氢甲烷蝶呤电子载体。见，例如Chung-Jung Chou等人，“Hydrogenesis inhyperthermophilic microorganisms：implications for biofuels，”Metabol.Eng.10：394-404(2008)，和
Figure BDA0000135567880000601
Vardar-Schara等人，“Metabolicallyengineered bacteria for producing hydrogen via fermentation，”MicrobialBiotechnol.1(2)：107-125(2008)，二者通过引用方式全文并入本文，尤其是关于多种类型和类别的氢化酶的内容。虽然很多生物体含有多种氢化酶，但是很少生物体含有NiFe和FeFe氢化酶二者的基因。
NiFe氢化酶的催化中心由镍原子和铁原子组成，各自具有两个一氧化碳(CO)和两个氰化物(CN-)配体。NiFe氢化酶全都包含至少第二亚基，其包含多个铁-硫(Fe-S)中心，用于从催化中心转移电子和将电子转移至催化中心。NiFe氢化酶可以进一步分为四个主要类别：(1)呼吸酶类，其为多酶系统的一部分，所述多酶系统将H2的氧化与末端电子受体例如SO4 2-或NO3 -的还原偶联(在无氧条件下)，或与O2偶联(在好氧微生物中)；(2)H2传感器，其激活代谢上有活性的NiFe氢化酶的表达；(3)细胞质的氢化酶，其包含能够利用NADP+的多个亚基，在体外是容易地可逆的，但是在体内可能仅氧化H2；和(4)与膜结合的、保存能量的多酶复合物，也存在于细菌和古细菌中。Chung-Jung Chou等人，“Hydrogenesis in hyperthermophilic microorganisms：implications forbiofuels，”Metabol.Eng.10：394-404(2008)。
FeFe氢化酶的催化中心含有催化性的“H簇”，其通过单一蛋白(半胱氨酸)配体将双核(FeFe)位点协调桥接成[4Fe-4S]中心。双核中心的两个铁原子各自具有两个一氧化碳(CO)和两个氰化物(CN-)配体，也通过两个硫原子(小的有机分子的一部分)桥接。多数FeFe氢化酶是大约50,000道尔顿(Da)的单体酶，并且似乎在体内的主要作用是通过将质子还原为氢气而清除过量还原当量。Chung-Jung Chou等人，“Hydrogenesis in hyperthermophilic microorganisms：implications forbiofuels，”Metabol.Eng.10：394-404(2008)。
Fe氢化酶的催化中心最初被认为具有基于有机辅因子的活性位点，其中没有金属参与，但是后来证明其包含单核Fe原子。虽然三种类型的氢化酶之间存在种系发生上的差异，除了至少一个铁原子之外，所有这三种类型的氢化酶在它们的活性位点中还包含针对铁原子的至少一个一氧化碳(CO)配体，这促进了H2的催化氧化和质子的还原。Chung-JungChou等人，“Hydrogenesis in hyperthermophilic microorganisms：implications for biofuels，”Metabol.Eng.10：394-404(2008)。
示例性的氢化酶多肽包括但不限于：大肠杆菌氢化酶-1(Hyd-1)多肽，大肠杆菌氢化酶-2(Hyd-2)多肽，大肠杆菌氢化酶-3(Hyd-3)多肽，大肠杆菌氢化酶-4(Hyd-4)多肽，大肠杆菌甲酸氢裂解酶(FHL)复合物(其在无氧条件下在酸性pH时从甲酸和CO2产生氢气(见，例如，Akihito Yoshida等人，“Efficient induction of formate hydrogen lyase of aerobically grownEscherichia coli in a three-step biohydrogen production process，”Appl.Microbiol.Biotechnol.74：754-760(2007)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于在大肠杆菌中诱导甲酸氢裂解酶表达的内容))，真氧产碱杆菌H16氢化酶(真氧产碱杆菌HoxH)，不透明红球菌(Rhodococcusopacus)MR11氢化酶(不透明红球菌HoxH)多肽，蓝藻(Synechosystis sp.)PCC 6803氢化酶(Syn.PCC 6803 HoxH)多肽，巨大脱硫弧菌(Desulfovibrio gigas)氢化酶(D.gigas)多肽，和脱硫脱硫弧菌(Desulfovibriodesulfuricans)ATCC 7757氢化酶(D.desulfuricans)多肽(见，例如，
Figure BDA0000135567880000611
Vardar-Schara等人，“Metabolically engineered bacteria for producinghydrogen via fermentation，”Microbial Biotechnol.1(2)：107-125(2008)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于多种类型和类别的氢化酶的内容)和具有两种或更多种氢化酶多肽活性的多肽(例如融合多肽)。具体地，氢化酶多肽包括具有氢化酶多肽的至少一项活性的多肽、多肽片段、肽、和融合多肽。示例性的氢化酶核酸包括编码具有氢化酶多肽的至少一项活性或表达、加工氢化酶多肽或使其成熟所需的至少一项活性的多肽、多肽片段、肽、或融合多肽的核酸。示例性的氢化酶多肽和核酸包括来自本文描述的任意生物体来源的天然存在的多肽和核酸以及源自本文描述的任意生物体来源的突变体多肽和核酸。
大肠杆菌Hyd-3是厌氧甲酸氢化酶裂解酶(FHL)复合物的一部分，其由hyc操纵子(包含hycA、hycB、hycC、hycD、hycE、hycF、hycG、hycH、和hycI基因)编码。大肠杆菌Hyd-4由hyf操纵子(包含hyfA、hyfB、hyfC、hyfD、hyfE、hyfF、hyfG、hyfH、hyfI、hyfJ、和hyfR基因)编码。大肠杆菌FHL由来自hyc操纵子的六个基因(hycB、hycC、hycD、hycE、hycF和hycG)和fdhF基因(编码甲酸脱氢酶H(Fdh-H))编码。FHL复合物的表达可以进一步包括丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)、FhlA(激活fdhF的转录的转录因子)和hyc操纵子的表达，或HycA(由hycA基因编码的转录因子，其负性调节FHL的转录)的缺失/失活。可以通过表达或失活/缺失参与调节氢化酶和其它酶的基因表达的另外的蛋白(例如，铁-硫复合物转录调节子(iscR))来改善异戊二烯和氢的共同产生(Kalim-Akhtar等人，“Deletion of iscR stimulates recombinant Clostridial Fe/Fehydrogenase activity and H2-accumulation in Escherichia coliBL21(DE3)，”Appl.Microbiol.Biotechnol.78：853-862(2008)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于梭状芽胞杆菌Fe/Fe氢化酶活性的刺激和通过缺失iscR基因而在大肠杆菌中积累氢的内容)。
在一些实施方式中，示例性的铁氧还蛋白依赖性氢化酶多肽包括但不限于：Clostridium acetobutulicum氢化酶A(HydA)(见，例如，P.W.King等人，“Functional studies of[FeFe]hydrogenase maturation in anEscherichia coli biosynthetic system，”J.Bacteriol.188(6)：163-172(2006)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于通过HydA和三种HydA相关的成熟酶(HydE、HydG、和HydF)产生氢的内容，所述酶可以单独表达或与下列一项或多项联合表达：(1)枯草芽孢杆菌NADPH铁氧还蛋白氧化还原酶(NFOR)(见，例如，Viet等人，(2008))，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于通过NFOR产生氢的内容；另外，见PCT公开号WO/2007/089901，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于优化大肠杆菌菌株以生产氢的内容)，；Clostridium kluyveri NADH铁氧还蛋白氧化还原酶(RnfCDGEAB)(Henning Seedorf等人，“The genome ofClostridium kluyveri，a strict anaerobe with unique metabolic features，”Proc.Nat’l Acad.Sci.U.S.A.105(6)：2128-2133(2008)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于NADH铁氧还蛋白氧化还原酶和关于无氧乙醇-乙酸发酵途径的成分的内容)；或Clostridium pasteuranium铁氧还蛋白氧化还原酶(Fdx)；(2)甘油醛-6-磷酸铁氧还蛋白氧化还原酶(“GAPOR”)；或(3)丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶(“POR”)，和具有两种或更多种氢化酶多肽的活性或一种或多种氢化酶多肽的活性和一种或多种铁氧还蛋白依赖性氧化还原酶的活性的多肽(例如融合多肽)。具体地，铁氧还蛋白依赖性氢化酶多肽包括具有铁氧还蛋白依赖性氢化酶多肽的至少一项活性的多肽、多肽片段、肽、和融合多肽。
示例性的NADPH依赖性氢化酶多肽包括但不限于：嗜热氢化酶多肽，例如Pyrococcus furiosus氢化酶(见，例如，J.Woodward等人，“Enzymatic production of biohydrogen，”Nature 405(6790)：1014-1015(2000))，和具有两种或更多种NADPH依赖性氢化酶多肽的活性的多肽(例如，融合多肽)。具体地，NADPH依赖性氢化酶多肽包括具有NADPH依赖性氢化酶多肽的至少一项活性的多肽、多肽片段、肽、和融合多肽。
示例性的氧耐受性或氧不敏感性氢化酶包括但不限于：胶状红环菌氢化酶(见，例如P.C.Maness等人，“Characterization of the oxygentolerance of a hydrogenase linked to a carbon monoxide oxidationpathway in Rubrivivax gelatinosus，”Appl.Environ.Microbiol.68(6)：2633-2636(2002)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于胶状红环菌氢化酶的内容)和真氧产碱杆菌氢化酶多肽(见，例如T.Burgdorf等人，“[NiFe]-hydrogenases of Ralstonia eutropha H16：modular enzymesfor oxygen-tolerant biological hydrogen oxidation，”J.Mol.Microbiol.Biotechnol.10(2-4)：181-196(2005)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于真氧产碱杆菌氢化酶多肽的内容)。或者，可以使用标准方法和测定法使编码氢化酶多肽的异源核酸突变并就O2-耐受性或O2-不敏感性进行筛选(见，例如L.E.Nagy等人，“Application of gene-shuffling for therapid generation of novel[FeFe]-hydrogenase libraries，”Biotechnol.Letts.29(3)421-430(2007)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于诱变并筛选氧耐受性氢化酶多肽的内容)。
可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽生产氢气的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有氢化酶活性。
与生产发酵副产物相关的基因的示例性多肽和核酸
除了在大肠杆菌中表达或过表达异源或天然氢化酶之外，可以通过失活无氧生物合成途径，从而阻断向在限氧或无氧途径下生产的多种代谢物(即发酵副产物)(包括但不限于乳酸、乙酸、丙酮酸、乙醇、琥珀酸、和甘油)的碳流动，从而改善异戊二烯和氢的共同生产。参与生产发酵副产物的示例性多肽包括甲酸脱氢酶Nα亚基(fdnG)、甲酸脱氢酶O大亚基(fdoG)、硝酸还原酶(narG)、甲酸转运子A(focA)、甲酸转运子B(focB)、丙酮酸氧化酶(poxB)、丙酮酸脱氢酶E1成分ackA/pta(aceE)、醇脱氢酶(adhE)、延胡索酸还原酶膜蛋白(frdC)、和乳酸脱氢酶(ldhA)。见，例如Toshinori Maeda等人，“Enhanced hydrogen production fromglucose by metabolically engineered Escherichia coli，”Appl.Microbiol.Biotechnol.77(4)：879-890(2007)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于生产具有修饰的葡萄糖代谢的大肠杆菌菌株的内容。参与生产发酵副产物中涉及的基因(其可以被失活以改善异戊二烯和氢的共同生产)的调节或表达的示例性多肽包括但不限于：甲酸氢裂解酶阻抑子(hycA)、延胡索酸还原酶调节子(fnr)、乙酰基-辅酶A合成酶(acs)、和甲酸脱氢酶调节蛋白(hycA)(其调节转录调节子fhlA(甲酸氢裂解酶转录激活子)的表达)。
与氢的重摄取相关的基因的示例性多肽和核酸
可以被失活以改善异戊二烯和氢的共同生产的参与氢的重摄取的示例性多肽包括但不限于：大肠杆菌氢化酶-1(Hyd-1)(hya操纵子)和大肠杆菌氢化酶-2(Hyd-2)(hyb操纵子)。大肠杆菌Hyd-1由hya操纵子(含hyaA、hyaB、hyaC、hyaD、hyaE、和hyaF基因)编码。大肠杆菌Hyd-2由hyb操纵子(含hybA、hybB、hybC、hybD、hybE、hybF、hybG、和hybO基因)编码。
用于分离核酸的示例性方法
可以使用标准方法分离异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸。从目标来源生物体(例如细菌基因组)获得需要的核酸的方法是分子生物学领域常见的和熟知的(见，例如，WO 2004/033646及其中引用的参考文献，其各自通过引用方式全文并入本文，尤其是关于目标核酸的分离的内容)。例如，如果核酸的序列是已知的(例如本文描述的已知核酸的任意项)，可以通过限制性核酸内切酶消化来产生合适的基因组文库，并可以使用互补于需要的核酸序列的探针进行筛选。一旦分离了序列，则可以使用标准的引物指导的扩增方法，例如聚合酶链式反应(PCR)(美国专利号4,683,202，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于PCR方法的内容)来扩增DNA，以获得适合于使用合适的载体进行转化的量的DNA。
或者，可以使用标准方法化学地合成异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸(例如，具有已知核酸序列的任意异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸)。
可以使用标准方法鉴定可适合用于本文描述的组合物和方法中的另外的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子多肽和核酸。例如，可以在生物体例如大肠杆菌中构建已知天然地产生异戊二烯的生物体染色体DNA的粘粒文库，然后就异戊二烯的产生进行筛选。具体地，可以产生这样的粘粒文库，其中基因组DNA的大的区段(35-45kb)被包装进入载体中，并用于转化合适的宿主。粘粒载体的独特之处在于能够容纳大量的DNA。一般地，粘粒载体具有至少一个拷贝的cos DNA序列，其对于异源DNA的包装和随后的环化是必需的。除了cos序列之外，这些载体还包含复制起始点(例如ColEI)和药物抗性标志物(例如对氨比西林或新霉素的核酸抗性)。使用粘粒载体转化合适的细菌宿主的方法在Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor，1989中有完善的描述，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于转化方法的内容。
通常，为了克隆粘粒，使用适当的限制性核酸内切酶分离异源DNA，并使用合适的连接酶连接至邻近的粘粒载体的cos区域。然后，使含有线性化的异源DNA的粘粒载体与DNA包装介体例如噬菌体反应。在包装过程中，cos位点被切割，并且异源DNA被包装进入细菌病毒颗粒的头部。然后，这些颗粒用于转染合适的宿主细胞，例如大肠杆菌。一旦注射进入细胞，异源DNA在cos粘末端的影响下发生环化。按照这种方式，可以将异源DNA的大区段导入宿主细胞并在其中表达。
用于获得异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸的另外的方法包括：通过测定法(例如本文描述的顶空测定法)或使用针对编码一定长度的保守性氨基酸(例如，至少3个保守性氨基酸)的核苷酸的引物通过PCR筛选宏基因组文库。可以通过比对已知的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子多肽的氨基酸序列来鉴定保守性氨基酸。可以基于已知的异戊二烯合酶多肽的比对的序列来鉴定异戊二烯合酶多肽的保守性氨基酸。可以使天然产生异戊二烯的生物体经历标准的蛋白纯化方法(其是本领域熟知的)，并且可以使用标准方法测序得到的纯化的多肽。其它方法见文献(见，例如，Julsing等人，Applied.Microbiol.Biotechnol.75：1377-84，2007；Withers等人，Appl Environ Microbiol.73(19)：6277-83，2007，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于鉴定参与异戊二烯合成的核酸的内容)。
另外，可以基于它们与已知的DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子多肽和核酸的初级和/或预测的多肽次级结构上的相似性，使用标准的序列比对和/或结构预测程序来鉴定另外的DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子多肽和核酸。也可以使用标准的数据库例如swissprot-trembl数据库(互联网网址为“expasy.org”，Swiss Institute of Bioinformatics Swiss-Prot group CMU-1rue Michel Servet CH-1211 Geneva 4，Switzerland)来鉴定异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录调节多肽和核酸。可以使用标准结构预测程序例如PredictProtein(630West，168Street，BB217，New York，N.Y.10032，USA)的缺省设定来预测异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子多肽的二级和/或三级结构。或者，可以使用标准方法确定异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子多肽的真实的二级和/或三级结构。还可以通过与产生于已知的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸的探针杂交来鉴定另外的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸。
示例性的启动子和载体
本文描述的任意异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸可以包含于一个或多个载体中。因此，本文中还描述了含有编码本文描述的任意异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子多肽的一个或多个核酸的载体。在一些实施方式中，所述载体包含处于表达控制序列控制下的核酸。
在一些实施方式中，载体包含选择性标志物或可选择标志物。在用于转化木霉菌属(Trichoderma)的载体系统中有用的标志物是本领域已知的(见，例如，Finkelstein，Chapter 6in Biotechnology of FilamentousFungi，Finkelstein等人，Eds.Butterworth-Heinemann，Boston，MA，Chap.6.，1992；和Kinghorn等人，Applied Molecular Genetics ofFilamentous Fungi，Blackie Academic and Professional，Chapman andHall，London，1992，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于选择性标志物的内容)。在一些实施方式中，选择性标志物是amdS核酸，其编码乙酰胺酶，允许转化的细胞以乙酰胺作为氮源生长。使用构巢曲霉(A.nidulans)amdS核酸作为选择性标志物的描述见Kelley等人，EMBO J.4：475-479，1985和Penttila等人，Gene 61：155-164，1987(其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于选择性标志物的内容)。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录调节核酸整合进入无选择性标志物的细胞的染色体中。
合适的载体是与所用的宿主细胞相容的那些。合适的载体可以源自，例如，细菌、病毒(例如噬菌体T7或源自M-13的噬菌体)、粘粒、酵母、或植物。用于获得和使用此类载体的程序是本领域人员已知的(见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor，1989，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于载体的使用的内容)。
启动子是本领域熟知的。可以使用任意在宿主细胞中有作用的启动子在宿主细胞中表达异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸。有多种起始控制区或启动子可用于驱动异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸在多种宿主细胞中的表达，并且是本领域技术人员熟知的(见，例如，WO 2004/033646和其中引用的参考文献，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于用于表达目标核酸的载体的内容)。事实上，可以使用任何能够驱动这些核酸的启动子，其包括但不限于：CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADCI、TRP1、URA3、LEU2、ENO、和TPI(用于在酵母属中的表达)；AOX1(用于在毕赤酵母属中的表达)；和lac、trp、λPL、λPR、T7、tac、和trc(用于在大肠杆菌中的表达)。
在一些实施方式中，使用葡萄糖异构酶启动子(见，例如美国专利号7,132,527及其中引用的参考文献，其各自通过引用方式全文并入本文，尤其是关于用于表达目标多肽的启动子和质粒系统的内容)。报道的葡萄糖异构酶启动子突变体可用于改变与葡萄糖异构酶启动子可操作地连接的核酸编码的多肽的表达水平(美国专利号7,132,527)。在多个实施方式中，葡萄糖异构酶启动子包含于低拷贝、中等拷贝、或高拷贝质粒中(美国专利号7,132,527)。
在多个实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸包含于低拷贝质粒(例如，以大约1至大约4个拷贝/细胞维持的质粒)、中等拷贝质粒(例如，以大约10至大约15个拷贝/细胞维持的质粒)、或高拷贝质粒(例如，以大约50或更多个拷贝/细胞维持的质粒)中。在一些实施方式中，异源或额外的内源的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸可操作地连接于T7启动子。在一些实施方式中，可操作地连接于T7启动子的异源或额外的内源的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸包含于中等或高拷贝质粒中。在一些实施方式中，异源或额外的内源的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸可操作地连接于Trc启动子。在一些实施方式中，可操作地连接于Trc启动子的异源或额外的内源的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸包含于中等或高拷贝质粒中。在一些实施方式中，异源或额外的内源的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸可操作地连接于Lac启动子。在一些实施方式中，可操作地连接于Lac启动子的异源或额外的内源的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸包含于低拷贝质粒中。在一些实施方式中，异源或额外的内源的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸可操作地连接于内源性启动子，例如内源性埃希菌属、Panteoa属、芽孢杆菌属、耶氏酵母属、链霉菌属、或木霉菌属启动子或内源性碱性丝氨酸蛋白酶、异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子启动子。在一些实施方式中，可操作地连接于内源性启动子的异源或额外的内源的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸包含于高拷贝质粒中。在一些实施方式中，载体是不整合到细胞的染色体中的复制质粒。在一些实施方式中，部分或全部载体整合进入细胞的染色体中。
在一些实施方式中，载体是任意的这样的载体：当被导入真菌宿主细胞中时，整合进入宿主细胞基因组并且被复制。关于载体的列表，参见Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains(FGSC，互联网网址为“fgsc.net”以及其中引用的参考文献，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于载体的内容)。在下列文献中提供了合适的表达和/或整合载体的另外的实例：Sambrook等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2nd ed.，Cold Spring Harbor，1989，Current Protocols inMolecular Biology(F.M.Ausubel等人(eds)1987，Supplement 30，section7.7.18)；van den Hondel等人in Bennett and Lasure(Eds.)More GeneManipulations in Fungi，Academic Press pp.396-428，1991；和美国专利号5,874,276，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于载体的内容。特别有用的载体包括pFB6、pBR322、PUC18、pUC100、和pENTR/D。
在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸可操作地连接于在真菌宿主细胞中显示出转录活性的适宜的启动子。启动子可以源自编码宿主细胞的内源性或异源性的多肽的一个或多个核酸。在一些实施方式中，启动子可用于木霉菌属宿主。启动子的合适的非限制性实例包括cbh1、cbh2、egl1、egl2、pepA、hfb1、hfb2、xyn1、和amy。在一些实施方式中，启动子是宿主细胞的天然启动子。例如，在一些实施方式中，当里氏木霉是宿主时，启动子是天然里氏木霉启动子。在一些实施方式中，启动子是里氏木霉cbh1，其是可诱导启动子并保藏于GenBank，保藏号为D86235，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于启动子的内容。在一些实施方式中，启动子是真菌宿主细胞的异源的启动子。有用的启动子的其它实例包括来自泡盛曲霉(A.awamori)和黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶(glaA)的基因的启动子(Nunberg等人，Mol.Cell Biol.4：2306-2315，1984和Boel等人，EMBO J.3：1581-1585，1984，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于启动子的内容)；黑曲霉α淀粉酶、米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、里氏木霉xln1、和里氏木霉纤维二糖水解酶1的基因的启动子(EP 137280，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于启动子的内容)。
在一些实施方式中，表达载体还包括终止序列。终止控制区也可以源自宿主细胞的多个天然基因。在一些实施方式中，终止序列和启动子序列源自相同的来源。在另一个实施方式中，终止序列是宿主细胞内源性的。特别适宜的终止子序列是源自木霉菌株(例如里氏木霉)的cbh1。其它有用的真菌终止子包括来自黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶核酸的终止子(Nunberg等人，Mol.Cell Biol.4：2306-2315，1984和Boel等人，EMBO J.3：1581-1585，1984；其各自通过引用方式全文并入本文，尤其是关于真菌终止子的内容)。任选地，可以包括终止位点。为了有效表达多肽，使编码多肽的DNA通过起始密码子可操作地连接于选择的表达控制区，从而表达引起形成合适的信使RNA 。
在一些实施方式中，启动子、编码区、和终止子全部来自待表达的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸。在一些实施方式中，将异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸的编码区插入至一般目的的表达载体，从而使其处于表达构建体启动子和终止子序列的转录控制下。在一些实施方式中，将基因或其一部分插入至强cbh1启动子的下游。
可以使用标准技术(Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，1982，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于筛选合适的DNA序列和构建载体的内容)将异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸掺入到载体例如表达载体中。用于连接包含目标核酸(例如异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸)、启动子、终止子、和其它序列的DNA构建体以及用于将它们插入至合适的载体的方法是本领域熟知的。例如，限制性酶可用于切割异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸和载体。然后，可以连接经切割的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸和经切割的载体的相容性末端。一般通过在方便的限制性位点的连接来实现连接。如果不存在此类位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸接头(见，Sambrook等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor，1989，以及Bennett和Lasure，More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press，San Diego，pp 70-76，1991，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于寡核苷酸接头的内容)。另外，可以使用已知的重组技术构建载体(例如，Invitrogen Life Technologies，Gateway Technology)。
在一些实施方式中，可能需要以远高于细胞中目前天然存在的水平过表达异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸。可以通过将编码那些多肽的核酸选择性克隆进入多拷贝质粒或将那些核酸置于强可诱导或组成型启动子下来实现该结果。用于过表达需要的多肽的方法是分子生物学领域常见的和熟知的，实例可以见Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor，1989，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于克隆技术的内容。
在一些实施方式中，可能需要以远低于细胞中目前天然存在的水平低表达(例如突变、失活、或缺失)异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子多肽编码核酸。可以通过突变或失活表达异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸所需的转录调节蛋白，通过缺失异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸，或通过将那些核酸置于强可抑制启动子的控制下来实现该结果。用于突变、失活、或缺失需要的多肽的方法是分子生物学领域常见的和熟知的，实例可以见Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor，1989，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于克隆和诱变技术的内容。
以下资源包括根据本文所述组合物和方法有用的另外的一般性方法的描述：Kreigler，Gene Transfer and Expression；A LaboratoryManual，1990和Ausubel等人，Eds.Current Protocols in MolecularBiology，1994，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于分子生物学和克隆技术的内容。
示例性的来源生物体
可以从任何天然包含异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸的生物体获得异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸(及其编码的多肽)。如上所述，有多种生物体天然地形成异戊二烯，例如细菌、真菌、植物、和动物。生物体包含用于产生异戊二烯的MVA途径、DXP途径、或MVA与DXP途径二者(图19A和19B)。因此，可以获得DXS核酸，例如，从包含DXP途径或含有MVA与DXP途径二者的任意生物体获得。可以从例如包含MVA途径、DXP途径、或MVA与DXP途径二者的任意生物体获得IDI和异戊二烯合酶核酸。可以从例如包含MVA途径或包含MVA与DXP途径二者的任意生物体获得MVA途径核酸。可以从例如氧化氢或还原氢离子的任意生物体获得氢化酶核酸。可以从例如进行限氧或无氧呼吸例如糖酵解的任意生物体获得或鉴定发酵副产物基因。
在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸的核酸序列与通过下列任意生物体天然产生的核酸的序列相同。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子多肽的氨基酸序列与通过下列任意生物体天然产生的多肽的序列相同。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸或多肽是源自本文描述的任意生物体的突变体核酸或多肽。如本文使用的“源自”是指核酸或多肽的来源，所述核酸或多肽中导入了一个或多个突变。例如，“源自植物多肽”的多肽是指由于向野生型(即天然存在的序列)植物多肽的序列中导入了一个或多个突变而产生的目标多肽。
在一些实施方式中，来源生物体是真菌，其实例有：曲霉属的物种，例如米曲霉和黑曲霉；酵母属的物种，例如酿酒酵母；裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的物种，例如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；以及木霉属的物种，例如里氏木霉。在一些实施方式中，来源生物体是丝状真菌细胞。术语“丝状真菌”是指真菌亚门中的所有的丝状形式(见，Alexopoulos，C.J.(1962)，Introductory Mycology，Wiley，New York)。这些真菌的特征在于营养菌丝体，其具有由壳多糖、纤维素、和其它复合多糖组成的细胞壁。丝状真菌在形态、生理和遗传上与酵母菌不同。丝状真菌的营养生长是通过菌丝的延长，碳分解代谢是专有性好氧的。丝状真菌亲代细胞可以是下列种的细胞但不限于此：木霉属(例如，里氏木霉，红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的无性型，之前被分类为长枝木霉(T.longibrachiatum)，绿色木霉(Trichoderma viride)，康氏木霉(Trichodermakoningii)，哈茨木霉(Trichoderma harzianum)(Sheir-Neirs等人，Appl.Microbiol.Biotechnol 20：46-53，1984；ATCC No.56765和ATCC No.26921)；青霉属(Penicillium sp.)，腐质霉属(Humicola sp.)(例如，特异腐质霉(H.insolens)、H.lanuginose、或灰色腐质霉(H.grisea))；金孢属(Chrysosporium sp.)(例如，C.lucknowense)、粘帚霉(Gliocladium sp.)，曲霉属(例如，米曲霉、黑曲霉、酱油曲霉(A sojae)、日本曲霉(A.japonicus)，构巢曲霉，或泡盛曲霉)(Ward等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.39：7380743，1993和Goedegebuur等人，Genet 41：89-98，2002)，镰菌属(Fusarium sp.)(例如，粉红镰刀菌(F.roseum)、禾谷镰刀菌(F.graminum)、F.cerealis、尖孢镰刀菌(F.oxysporuim)、或F.venenatum)，脉孢霉属(Neurospora sp.)(例如，粗糙脉胞菌(N.crassa)，肉座菌属(Hypocrea sp.)，毛霉菌属(Mucor sp.)(例如，米黑毛霉菌(M.miehei)，根霉属(Rhizopus sp.)，和裸胞壳属(Emericella sp.)(另外见，Innis等，Sci.228：21-26，1985)。术语“木霉菌”或“木霉菌属(Trichoderma sp.)”或“木霉菌(Trichoderma spp.)”是指之前或目前被分类为木霉菌的任意真菌属。
在一些实施方式中，真菌是构巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉、日本曲霉、里氏木霉、绿色木霉、尖孢镰刀菌、或茄镰孢(F.solani)。曲霉菌菌株公开于Ward等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.39：738-743，1993和Goedegebuur等人，Curr Gene 41：89-98，2002，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于真菌的内容。在具体的实施方式中，真菌是木霉的菌株，例如里氏木霉的菌株。里氏木霉的菌株是已知的，其非限制性实例包括ATCC No.13631、ATCC No.26921、ATCC No.56764、ATCC No.56765、ATCC No.56767、和NRRL 15709，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于里氏木霉的菌株的内容。在一些实施方式中，宿主菌株是RL-P37的衍生物。RL-P37公开于Sheir-Neiss等，Appl.Microbiol.Biotechnology 20：46-53，1984，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于里氏木霉的菌株的内容。
在一些实施方式中，来源生物体是酵母，例如酵母属、裂殖酵母属、毕赤酵母属、或假丝酵母属(Candida sp)。在一些实施方式中，酵母属是酿酒酵母。
在一些实施方式中，来源生物体是细菌，例如芽孢杆菌的菌株，例如地衣芽孢杆菌(B.lichenformis)或枯草芽孢杆菌；泛菌属的菌株，例如柠檬泛菌；假单胞菌的菌株，例如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)、恶臭假单胞菌(P.putida)、或荧光假单胞菌(P.fluorescens)；链霉菌属的菌株，例如浅青紫链霉菌(S.lividans)或锈棕色链霉菌(S.rubiginosus)；棒杆菌属(Corynebacterium sp.)的菌株，例如谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)；红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)的菌株，例如沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)；或埃希菌属的菌株，例如大肠杆菌。
如本文使用的“芽孢杆菌属”包括本领域技术人员已知的落在芽孢杆菌属内的所有物种，包括但不限于：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、B.halodurans、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽胞杆菌(B.coagulans)、环状芽胞杆菌(B.circulans)、B.lautus和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。认识到：芽孢杆菌属仍然会持续进行分类学上的改组。因此，该属意在包括被重新分类的物种，包括但不限于这样的生物体，例如嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)，其现在被称作“嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)”。在存在氧的条件下产生抗性内生孢子被认为是芽孢杆菌属的定义特征，虽然该特征也适用于最近被命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、解硫胺素杆菌属(Aneurinibacillus)、无氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、线芽孢杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、热杆菌属(Thermobacillus)、Ureibacillus和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
在一些实施方式中，来源生物体是革兰氏阳性细菌。非限制性实例包括链霉菌的菌株(例如，浅青紫链霉菌、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、或灰色链霉菌(S.griseus))和芽孢杆菌属的菌株。在一些实施方式中，来源生物体是革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌；红假单胞菌属，例如沼泽红假单胞菌；假单胞菌属，例如产碱假单胞菌、恶臭假单胞菌、或荧光假单胞菌。
在一些实施方式中，来源生物体是植物，例如来自豆科的植物，例如蝶型花亚科。在一些实施方式中，来源生物体是野葛，白杨(例如银白杨x欧洲山杨CAC35696)、白杨(例如美洲山杨)、或夏栎。
在一些实施方式中，来源生物体是藻类，例如绿藻、红藻、灰胞藻(glaucophyte)、chlorarachniophytes、眼虫、假菌界(Chromista)、或腰鞭毛虫(dinoflagellates)。
在一些实施方式中，来源生物体是蓝细菌，例如基于形态分类为下列组的蓝细菌：色球藻目(Chroococcales)、宽球藻目(Pleurocapsales)、颤藻目(Oscillatoriales)、念珠藻目(Nostocales)、或真枝藻目(Stigonematales)。
在一些实施方式中，来源生物体是厌氧生物体。厌氧生物可以包括，但不限于专性厌氧菌、兼性厌氧菌、和耐氧厌氧菌。此类生物体可以是上文所列生物体、细菌、酵母等中任一者。在一个实施方式中，专性厌氧菌可以是选自Clostridium ljungdahlii、Clostridium autoethanogenum、粘液真杆菌(Eurobacterium limosum)、Clostridium carboxydivorans、延展消化链球菌(Peptostreptococcus productus)、和甲基营养丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)的任一者或组合。应该理解本文所述的任意来源生物体的任意组合可以用于本发明的其他实施方式。
示例性的宿主细胞
多种宿主细胞可用于本文所述方法中表达异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子多肽并共同生产异戊二烯和氢。示例性的宿主细胞包括来自前一部分小标题为“示例性来源生物体”中所列的任意生物体的细胞。宿主细胞可以是天然产生异戊二烯的细胞，或者是不天然产生异戊二烯的细胞。在一些实施方式中，宿主细胞通过DXP途径天然产生异戊二烯，并且加入异戊二烯、DXS、和/或IDI核酸以增加通过该途径产生的异戊二烯。在一些实施方式中，宿主细胞通过MVA途径天然产生异戊二烯，并且加入异戊二烯和/或一种或多种MVA途径核酸以增加通过该途径产生的异戊二烯。在一些实施方式中，宿主细胞通过DXP途径天然产生异戊二烯，并且加入一种或多种MVA途径核酸以通过部分或全部MVA途径以及DXP途径产生异戊二烯。在一些实施方式中，宿主细胞通过DXP和MVA途径天然产生异戊二烯，并且加入一种或多种异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸以增加通过这些途径之一或二者产生的异戊二烯。
在一些实施方式中，宿主细胞通过DXP和MVA途径天然产生异戊二烯，并且加入一种或多种异戊二烯、DXS、IDI、或MVA途径核酸以增加通过这些途径之一或二者产生的异戊二烯，加入一种或多种氢化酶核酸以增加氢的产生，失活或缺失一种或多种产生发酵副产物的基因以限制发酵副产物的产生。在一些实施方式中，宿主细胞通过DXP和MVA途径天然地共同产生异戊二烯和氢，并且加入一种或多种异戊二烯、DXS、IDI、或MVA途径核酸以增加通过这些途径之一或二者产生的异戊二烯，加入一种或多种氢化酶核酸以增加氢的产生，失活或缺失一种或多种产生发酵副产物的基因以限制发酵副产物的产生，并且失活或缺失一种或多种氢重摄取基因以增加氢的产生。在一些实施方式中，宿主细胞通过DXP和MVA途径天然地共同产生异戊二烯和氢，并且加入一种或多种异戊二烯、DXS、IDI、或MVA途径核酸以增加通过这些途径之一或二者产生的异戊二烯，加入一种或多种氢化酶核酸以增加氢的产生，加入一种或多种氢化酶成熟核酸以增加氢的产生，失活或缺失一种或多种产生发酵副产物的基因以限制发酵副产物的产生，并且失活或缺失一种或多种氢重摄取基因以增加氢的产生。在一些实施方式中，宿主细胞通过DXP和MVA途径天然地共同产生异戊二烯和氢，并且加入一种或多种异戊二烯、DXS、IDI、或MVA途径核酸以增加通过这些途径之一或二者产生的异戊二烯，加入一种或多种氢化酶核酸以增加氢的产生，加入一种或多种氢化酶成熟核酸以增加氢的产生，加入或失活或缺失一种或多种转录因子核酸以增加氢化酶的产生，失活或缺失一种或多种产生发酵副产物的基因以限制发酵副产物的产生，并且失活或缺失一种或多种氢重摄取基因以增加氢的产生。
示例性的转化方法
可以使用标准技术将异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子核酸或包含它们的载体插入至宿主细胞(例如本文描述的植物细胞、真菌细胞、酵母细胞、或细菌细胞)以表达所编码的异戊二烯合酶、DXS、IDI、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟和/或转录因子多肽。可以使用例如下列技术将DNA构建体或载体导入宿主细胞中：转化、电穿孔、细胞核微注射、转导、转染(例如脂转染介导的或DEAE-Dextrin介导的转染，或使用重组噬菌体病毒转染)、以磷酸钙DNA沉淀温育、以DNA包被的微粒高速轰击、和原生质体融合。一般性的转化技术是本领域已知的(见，例如，Current Protocols inMolecular Biology(F.M.Ausubel等人(eds)Chapter 9，1987；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold SpringHarbor，1989；和Campbell等人，Curr.Genet.16：53-56，1989，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于转化方法的内容)。在木霉中表达异源多肽的描述见美国专利号6,022,725；美国专利号6,268,328；美国专利号7,262,041；WO 2005/001036；Harkki等人，Enzyme Microb.Technol.13：227-233，1991；Harkki等人，Bio Technol.7：596-603，1989；EP 244,234；EP 215,594；和Nevalainen等人，“The Molecular Biology of Trichodermaand its Application to the Expression of Both Homologous andHeterologous Genes，”见Molecular Industrial Mycology，Eds.Leong andBerka，Marcel Dekker Inc.，NY pp.129-148，1992，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于转化和表达方法的内容)。对于曲霉菌株的转化，还参考了Cao等人，(Sci.9：991-1001，2000；EP 238023；和Yelton等人，Proceedings.Natl.Acad.Sci.USA 81：1470-1474，1984(其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于转化方法的内容)。导入的核酸可以整合进入染色体DNA或者可以维持为染色体外的复制序列。
可以使用本领域已知的任意方法来选择转化子。在一个非限制性实例中，包含amdS标志物的稳定转化子与不稳定转化子通过下列区分开：在含有乙酰胺的固体培养基上更快的生长速率和形成具有平滑而非不整齐的轮廓圆形菌落。另外，在一些情况下，通过下列进行进一步的稳定性测试：在固体非选择性培养基(例如不含乙酰胺的培养基)上生长转化子，从该培养基收集孢子，和检测随后在含有乙酰胺的选择性培养基上萌芽并生长的这些孢子的百分率。
在一些实施方式中，通过涉及原生质体形成和原生质体转化、然后通过已知方式再生细胞壁的方法转化真菌细胞。在一个具体的实施方式中，制备用于转化的木霉属包括：从真菌菌丝体制备原生质体(见，Campbell等人，Curr.Genet.16：53-56，1989，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于转化方法的内容)。在一些实施方式中，从萌芽的营养孢子获得菌丝体。以消化细胞壁的酶处理菌丝体，从而产生原生质体。然后通过悬浮培养基中渗透稳定剂的存在来保护原生质体。这些稳定剂包括山梨醇、甘露醇、氯化钾、硫酸镁等。这些稳定剂的通常的浓度是0.8M-1.2M。在悬浮培养基中使用大约1.2M的山梨醇溶液是合乎需要的。
宿主木霉属的菌株对DNA的摄取依赖于钙离子的浓度。一般而言，在摄取溶液中使用大约10mM CaCl2至50mM CaCl2。除了摄取溶液中的钙离子之外，一般包括的其它化合物是：缓冲系统，例如TE缓冲液(10Mm Tris，pH 7.4；1mM EDTA)或10mM MOPS，pH 6.0缓冲液(吗啉丙磺酸)和聚乙二醇(PEG)。不被任何特定理论所限，相信聚乙二醇的作用是融合细胞膜，因此允许培养基的内容物被递送至木霉属菌株的细胞质并使质粒DNA转移至细胞核。这种融合通常允许多个拷贝的质粒DNA整合进入宿主染色体。
通常在转化中使用含有密度为105至107/mL(例如2x 106/mL)的已经过渗透性处理的木霉属原生质体或细胞的悬浮液。将体积为100μL的这些原生质体或细胞(在合适的溶液中，例如，1.2M山梨醇和50mM CaCl2)与需要的DNA混合。一般而言，向摄取溶液中加入高浓度的PEG。可以向原生质体悬浮液中加入0.1-1体积的25％PEG 4000。在一些实施方式中，向原生质体悬浮液中加入大约0.25体积。也可以向摄取溶液中加入添加剂，例如二甲基亚砜、肝素、精脒，氯化钾等并辅助转化。用于其它真菌宿主细胞的类似程序是可以获得的(见，例如，美国专利号6,022,725和6,268,328，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于转化方法的内容)。
一般而言，然后将混合物在大约0℃培养10-30分钟的时间段。然后向混合物中加入另外的PEG以进一步增加需要的核酸序列的摄取。一般加入转化混合物体积的5-15倍体积的25％PEG 4000；然而，更大和更小体积可以是合适的。转化混合物体积的约10倍的25％PEG 4000是合乎需要的。加入PEG之后，然后在室温或在冰上培养转化混合物，然后加入山梨醇和CaCl2溶液。然后将原生质体悬浮液加入到生长培养基的熔化的等份中。当生长培养基包括生长选择剂(例如，乙酰胺或抗生素)时，其仅允许转化子生长。
可以根据常规方法进行细菌细胞的转化，所述常规方法例如描述于Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，1982的方法，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于转化方法的内容。
示例性的细胞培养基
本文中还描述了培养物中的共同生产异戊二烯和氢的细胞或细胞群体。“培养物中的细胞”意思是在允许细胞进行一次或多次细胞分裂的溶液(例如细胞生长培养基)中的两个或更多个细胞。“培养物中的细胞”不包括这样的植物细胞：其是包含已经分化为植物组织的细胞的活的多细胞植物的一部分的植物细胞。在多个实施方式中，细胞培养物包含至少或大约10、20、50、100、200、500、1,000、5,000、10,000、或更多个细胞。
“限氧培养物中的细胞”意思是在允许细胞进行一次或多次细胞分裂的溶液(例如细胞生长培养基)中的两个或更多个细胞，其中所述溶液含有限定量的氧。术语“限氧培养物”意思是该培养物是缺氧的或含有小于支持通过还原当量生物转移至氧而呼吸所需的量的氧，并且也包括无氧培养物。在限氧培养物条件下，不能接受一些源自碳代谢的电子，这是因为氧的浓度太低，使细胞转变为产生氢(如果它们包含用于产生氢的合适的代谢途径)。当氧转移速率(“OTR”)小于氧摄取速率(“OUR”)时(由培养基中接近零的溶解氧浓度指示)，发生限氧培养条件。
可以使用任意碳源来培养宿主细胞。术语“碳源”是指能够被宿主细胞或生物体代谢的一种或多种含碳化合物。例如，用于培养宿主细胞的细胞培养基可以包含适合于维持宿主细胞存活或生长的任意碳源。
在一些实施方式中，碳源是碳水化合物(例如单糖、二糖、寡糖、或多糖)、转化糖(例如，酶处理的蔗糖糖浆)、丙三醇、甘油(例如，生产生物柴油或肥皂的工艺的甘油副产物)、二羟基丙酮、一碳源、油(例如，植物油或菜油，例如玉米油、棕榈油、或大豆油)、动物脂肪、动物油、脂肪酸(例如，饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、或多不饱和脂肪酸)、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、可再生碳源(例如，生物质碳源，例如水解的生物质碳源)、酵母提取物、来自酵母提取物的成分、聚合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、琥珀酸、乳酸、乙酸、乙醇、或前述中的两项或更多项的任意组合。在一些实施方式中，碳源是光合作用的产物，包括但不限于葡萄糖。
示例性的单糖包括葡萄糖和果糖；示例性的寡糖包括乳糖和蔗糖，示例性的多糖包括淀粉和纤维素。示例性的碳水化合物包括C6糖(例如，果糖、甘露糖、半乳糖、或葡萄糖)和C5糖(例如，木糖或阿拉伯糖)。在一些实施方式中，细胞培养基包括碳水化合物以及除了碳水化合物之外的碳源(例如，丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、或来自酵母提取物的成分)。在一些实施方式中，细胞培养基包含碳水化合物以及多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)。在一些实施方式中，微生物多肽是来自酵母或细菌的多肽。在一些实施方式中，植物多肽是来自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈、花生、向日葵、椰子、芥、油菜籽、棉花籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、或亚麻仁。
在一些实施方式中，碳水化合物的浓度是至少或大约5g/升培养液(g/L，其中培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积二者)，例如至少或大约10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、400、或更多g/L。在一些实施方式中，碳水化合物的浓度是大约50至大约400g/L，例如大约100至大约360g/L，大约120至大约360g/L，或大约200至大约300g/L。在一些实施方式中，碳水化合物的该浓度包括在培养宿主细胞之前和/或过程中加入的碳水化合物的总量。
在一些实施方式中，在限葡萄糖的条件下培养细胞。“限葡萄糖的条件”意思是加入的葡萄糖的量小于或等于细胞消耗的葡萄糖的量的大约105％(例如大约100％)。在具体的实施方式中，加入到培养基中的葡萄糖的量大约等于特定时间段期间细胞消耗的葡萄糖的量。在一些实施方式中，通过限制加入的葡萄糖的量来控制细胞生长速率，从而细胞在可以被细胞培养基中的葡萄糖的量支持的速率生长。在一些实施方式中，在细胞培养的时间期间，葡萄糖不积累。在多个实施方式中，在限葡萄糖的条件下培养细胞超过或等于大约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、或70个小时。在多个实施方式中，在限葡萄糖的条件下培养细胞超过或等于大约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％的总细胞培养时间长度。不被任何特定理论所限，相信限葡萄糖的条件可以允许更有利的细胞调节。
在一些实施方式中，在存在过量葡萄糖的条件下培养细胞。在具体的实施方式中，加入的葡萄糖的量大于大约105％(例如大约或大于110％、120％、150％、175％、200％、250％、300％、400％、或500％)或更高的细胞在特定时间段期间消耗的葡萄糖的量。在一些实施方式中，在细胞培养时间过程中葡萄糖积累。
示例性的脂质是包含一种或多种C4和以上脂肪酸的脂肪酸的任意物质，所述脂肪酸可以是饱和、不饱和、或分支的。
示例性的油是在室温为液态的脂质。在一些实施方式中，脂质包含一种或多种C4或以上的脂肪酸(例如包含一种或多种具有4个或更多个碳的饱和的、不饱和的、或分支的脂肪酸)。在一些实施方式中，油获自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈、花生、向日葵、椰子、芥、油菜籽、棉花籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、亚麻仁、油质微生物细胞、乌桕、或前述两项或更多项的任意组合。
示例性的脂肪酸包括式RCOOH的化合物，其中“R”是烃。示例性的不饱和脂肪酸包括这样的化合物：其中“R”包括至少一个碳-碳双键。示例性的不饱和脂肪酸包括但不限于油酸、异油酸、亚油酸、棕榈油酸、和花生四烯酸。示例性的多不饱和脂肪酸包括这样的化合物：其中“R”包括多个碳-碳双键。示例性的饱和脂肪酸包括这样的化合物：其中“R”是饱和的脂肪族基团。在一些实施方式中，碳源包括一种或多种C12-C22脂肪酸，例如C12饱和脂肪酸、C14饱和脂肪酸、C16饱和脂肪酸、C18饱和脂肪酸、C20饱和脂肪酸、或C22饱和脂肪酸。在示例性的实施方式中，脂肪酸是棕榈酸。在一些实施方式中，碳源是脂肪酸(例如，不饱和脂肪酸)的盐、脂肪酸(例如，不饱和脂肪酸)的衍生物、或脂肪酸(例如，不饱和脂肪酸)的衍生物的盐。合适的盐包括但不限于：锂盐、钾盐、钠盐等。甘油二酯和甘油三酯是甘油的脂肪酸酯。
在一些实施方式中，脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯的浓度是至少或大约1g/升培养液(g/L，其中培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积二者)，例如至少或大约5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、400、或更多g/L。在一些实施方式中，脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯的浓度是大约10至大约400g/L，例如大约25至大约300g/L，大约60至大约180g/L，或大约75至大约150g/L。在一些实施方式中，该浓度包括在培养宿主细胞之前和/或过程中加入的脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯的总量。在一些实施方式中，碳源包括(1)脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯和(ii)碳水化合物，例如葡萄糖。在一些实施方式中，脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯与碳水化合物的比是大约1∶1(基于碳)(即，脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯中的一个碳/碳水化合物的碳)。在具体的实施方式中，脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯的量是大约60至180g/L，并且碳水化合物的量是大约120至360g/L。
示例性的微生物多肽碳源包括来自酵母或细菌的一种或多种多肽。示例性的植物多肽碳源包括来自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈、花生、向日葵、椰子、芥、油菜籽、棉花籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、或亚麻仁的一种或多种多肽。
示例性的可再生的碳源包括干酪乳清渗透物、玉米浸液、甜菜糖蜜、大麦芽、和来自前述任意项的成分。示例性的可再生碳源还包括存在于生物质中的葡萄糖、己糖、戊糖和木糖，所述生物质例如玉米、柳枝稷、甘蔗、发酵过程的细胞废物，以及来自大豆、玉米、或小麦的研磨的蛋白质副产物。在一些实施方式中，生物质碳源是木质纤维素、半纤维素、或纤维质材料，例如但不限于草、小麦、麦秸、甘蔗渣、甘蔗渣、软木浆、玉米、玉米芯或稻壳、玉米仁、来自玉米仁的纤维、玉米秸秆、柳枝稷、稻壳产物、或从谷物(如玉米、高粱、黑麦、triticate、大麦、小麦和/或蒸馏谷物)的湿或干研磨生产的副产物。示例性的纤维质材料包括木材、纸和浆废液、草本植物、及果肉。在一些实施方式中，碳源包括任意植物部分，如茎、谷粒、根、或块茎。在一些实施方式中，任意以下植物的全部或部分用作碳源：玉米、小麦、黑麦、高粱、triticate、水稻、粟、大麦、木薯、豆类如大豆和豌豆、马铃薯、蕃薯、香蕉、甘蔗、和/或木薯。在一些实施方式中，碳源是生物质水解物，如包含木糖和葡萄糖或包含蔗糖和葡萄糖的生物质水解物。
在一些实施方式中，在添加到细胞培养基中之前预处理可再生碳源(例如生物质)。在一些实施方式中，预处理包括酶预处理、化学预处理、或酶和化学预处理的组合(见，例如，Farzaneh等人，BioresourceTechnology 96(18)：2014-2018，2005；美国专利号6,176,176；美国专利号6,106,888；其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于可再生碳源的预处理的内容)。在一些实施方式中，在添加到细胞培养基之前，将可再生碳源部分或全部水解。
在一些实施方式中，在添加到细胞培养基之前，可再生碳源(例如玉米秸秆)经历氨气爆破法(AFEX)预处理(见，例如，Farzaneh等人，Bioresource Technology 96(18)：2014-2018，2005)。在AFEX预处理过程中，在中等温度(例如大约60℃至大约100℃)和高压(例如大约250psi至大约300psi)以液态无水氨将可再生碳源处理大约5分钟。然后，迅速释放压力。在该过程中，木质素溶解、半纤维素水解、纤维素的解晶作用和增加的表面积的化学和物理的组合效应使得纤维素和半纤维素几乎能够完全酶促转化为可发酵的糖。AFEX预处理具有以下优点：几乎所有的氨都可以被回收和再利用，剩余的则作为下游过程中的微生物的氮源。另外，AFEX预处理无需洗涤流。因此，AFEX处理之后的干物质回收基本上是100％。AFEX基本上是干-干的过程。经处理的可再生碳源在长时间内是稳定的，并且可以以非常高的固体载量进料到酶促水解或发酵过程中。纤维素和半纤维素在AFEX过程中被良好保存，甚少降解或无降解。对于经历了AFEX预处理的可再生碳源而言，在酶促水解之前，无需中和。AFEX处理的碳源的酶促水解为随后的发酵用途产生清洁的糖流。
在一些实施方式中，碳源(例如可再生碳源)的浓度是至少或大约0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、或50％葡萄糖(w/v)。可以通过使用标准的HPLC方法，使用葡萄糖作为参照物来测定葡萄糖的当量，以测定从碳源生产的葡萄糖的量。在一些实施方式中，碳源(例如可再生碳源)的浓度相当于大约0.1％至大约20％葡萄糖，例如大约0.1％至大约10％葡萄糖，大约0.5％至大约10％葡萄糖，大约1％至大约10％葡萄糖，大约1％至大约5％葡萄糖，或大约1％至大约2％葡萄糖。
在一些实施方式中，碳源包括酵母提取物或酵母提取物的一种或多种成分。在一些实施方式中，酵母提取物的浓度是至少1克酵母提取物/升培养液(g/L，其中培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积二者)，例如至少或大约5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、或更多g/L。在一些实施方式中，酵母提取物的浓度是大约1至大约300g/L，例如大约1至大约200g/L，大约5至大约200g/L，大约5至大约100g/L，或大约5至大约60g/L。在一些实施方式中，该浓度包括在培养宿主细胞之前和/或过程中加入的酵母提取物的总量。在一些实施方式中，碳源包括酵母提取物(或其一种或多种成分)和另一种碳源，例如葡萄糖。在一些实施方式中，酵母提取物与其它碳源的比例是大约1∶5，大约1∶10，或1∶20(w/w)。
另外，碳源也可以是一碳底物，例如二氧化碳或甲醇。已经报道了在甲基营养酵母(Yamada等人，Agric.Biol.Chem.，53(2)541-543，1989，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于碳源的内容)和细菌(Hunter等人，Biochemistry，24，4148-4155，1985，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于碳源的内容)从单一碳源(例如，甲醇、甲醛、或甲酸)生产甘油。这些生物体可以同化单一碳化合物：从甲烷氧化态至甲酸，并且生产甘油。碳同化的途径可以经由核酮糖一磷酸、经由丝氨酸或经由木酮糖一磷酸(Gottschalk，Bacterial Metabolism，Second Edition，Springer-Verlag：New York，1986，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于碳源的内容)。核酮糖一磷酸途径包括甲酸与核酮糖-5-磷酸缩合以形成6碳糖，该6碳糖变为果糖，并最终变为3碳产物甘油醛-3-磷酸。类似地，丝氨酸途径使一碳化合物通过亚甲基四氢叶酸同化进入糖酵解途径。
除了一碳和二碳底物，还已知甲基营养生物体利用多种其它含碳化合物，例如甲胺、葡萄糖胺和多种氨基酸以用于代谢活性。例如，已知甲基营养酵母利用来自甲胺的碳以形成海藻糖或甘油(Bellion等人，Microb.Growth Cl Compd.，[Int.Symp.]，7th ed.，415-32.Editors：Murrell等人，Publisher：Intercept，Andover，UK，1993，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于碳源的内容)。类似地，假丝酵母属的多个种代谢丙氨酸或油酸(Sulter等人，Arch.Microbiol.153(5)，485-9，1990，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于碳源的内容)。
在一些实施方式中，在含有生理盐和营养物的标准培养基中培养细胞(见，例如，Pourquie，J.等人，Biochemistry and Genetics of CelluloseDegradation，eds.Aubert等人，Academic Press，pp.71-86，1988和Ilmen等人，Appl.Environ.Microbiol.63：1298-1306，1997，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于细胞培养基的内容)。示例性的生长培养基是通常商业上制备的培养基，例如Luria Bertani(LB)培养基，SabouraudDextrose(SD)培养基，或酵母培养基(YM)肉汤。也可以使用其它的确定的或合成的生长培养基，用于特定宿主细胞的生长的合适的培养基是微生物或发酵科学领域技术人员已知的。
除了合适的碳源之外，细胞培养基合乎需要地包含合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液、和本领域技术人员已知的适合于培养物生长或增加异戊二烯产量的其它成分(见，例如，WO 2004/033646及其中引用的参考文献，以及WO 96/35796及其中引用的参考文献，其各自通过引用方式全文并入本文，尤其是关于细胞培养基和细胞培养条件的内容)。在一些实施方式中，当异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸处于可诱导启动子控制下时，向培养基中合乎需要地加入有效诱导异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径多肽的表达的浓度的诱导剂(例如糖、金属盐或抗微生物剂)。在一些实施方式中，细胞培养基具有对应于载体(其具有一种或多种DXS、IDI或MVA途径核酸)上的抗生素抗性核酸(例如卡那霉素抗性核酸)的抗生素(例如卡那霉素)。
示例性的细胞培养条件
适合于维持和生长细菌培养物的材料和方法是本领域熟知的。示例性的技术可以见Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardt等人，eds)，American Society for Microbiology，Washington，D.C.(1994)或Brock in Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，Second Edition(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于细胞培养技术的内容。在一些实施方式中，在允许表达一种或多种由插入至宿主细胞内的核酸编码的异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径多肽的条件下在培养基中培养细胞。
可以使用标准的细胞培养条件来培养细胞(见，例如，WO2004/033646及其中引用的参考文献，其各自通过引用方式全文并入本文，尤其是关于细胞培养物和发酵条件的内容)。细胞生长并维持于合适的温度、气体混合物、和pH下(例如大约20℃至大约37℃，在大约6％至大约84％CO2中，以及在大约5至大约9的pH下)。在一些实施方式中，细胞在35℃生长于合适的细胞培养基中。在一些实施方式中，例如，在大约28℃在合适的培养基中在振荡培养物或发酵器中培养，直至达到所需要的量的异戊二烯和氢的共同生产。在一些实施方式中，用于发酵的pH范围是大约pH 5.0至大约pH 9.0(例如大约pH 6.0至大约pH 8.0，或大约6.5至大约7.0)。可以基于宿主细胞的需要，在有氧、缺氧或无氧条件下进行反应。在一些实施方式中，在限氧条件下培养细胞。在一些实施方式中，在氧的存在下在每生产1摩尔异戊二烯消耗0.5摩尔氧的条件下培养细胞。在一些实施方式中，在无氧条件下培养细胞。用于给定的丝状真菌的示例性培养条件是本领域已知的，可以查阅科学文献和/或从真菌来源处获得，例如American Type Culture Collection and FungalGenetics Stock Center。
在多个实施方式中，使用任意已知的发酵模式使细胞生长，例如批式、补料分批、或连续方法。在一些实施方式中，使用批式发酵方法。经典的批式发酵是封闭系统，其中在发酵开始时设定培养基的成分，并且在发酵过程中不进行人为改变。因此，在发酵开始时，将需要的宿主细胞接种于细胞培养基，进行发酵，但不向系统中加入任何物质。然而，通常来讲，“批式”发酵是就加入碳源的批而言的，通常会尝试控制因素，例如pH和氧浓度。在批式系统中，系统的代谢物和生物质组成一直在变化，直至发酵停止时。在批式培养物中，细胞经过静止的停滞期进入高速生长对数期，最终到达稳定期，在稳定期生长速率下降或停止。在一些实施方式中，处于对数期的细胞负责大量生产异戊二烯。在一些实施方式中，处于稳定期的细胞生产异戊二烯。
在一些实施方式中，使用标准的批式系统的变体，例如补料分批系统。补料分批发酵方法包括典型的批式系统，只不过随着发酵的进程以增量添加碳源。当分解代谢产物抑制倾向于抑制细胞的代谢并且需要在细胞培养基中具有有限量的碳源时，补料分批系统是有用的。可以使用有限或过量的碳源(例如葡萄糖)进行补料分批发酵。补料分批系统中的实际的碳源浓度是难以测定的，因此根据可测因素例如pH、溶解氧、和废气例如CO2的分压的变化来估计。批式和补料分批发酵是常见的并且是本领域熟知的，其实例可以见Brock，Biotechnology：A Textbook of  Industrial Microbiology，Second Edition(1989)Sinauer Associates，Inc.，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于细胞培养和发酵条件的内容。
在一些实施方式中，使用连续发酵方法。连续发酵是开放的系统，其中连续向生物反应器中添加确定的发酵培养基，并且同时取出等量的条件化培养基以进行处理。连续发酵一般将培养物维持在恒定的高密度，其中细胞主要处于对数生长期。
连续发酵允许调节影响细胞生长或异戊二烯生产的一个因素或任意数目的因素。例如，一种方法将限制性营养物例如碳源或氮水平维持在固定的速率，并允许所有其它参数适度。在其它系统中，可以持续改变影响生长的多个因素，同时保持细胞浓度恒定(例如通过培养基浊度测定的浓度)。连续系统努力维持稳定状态的生长状况。因此，由于培养基排出而损失的细胞针对发酵物中的生长速率达到平衡。调节用于连续发酵方法的营养物和生长因素的方法和用于使产物形成速率最大化的技术是工业微生物学领域熟知的，多种方法描述于Brock，Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，Second Edition(1989)SinauerAssociates，Inc.，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于细胞培养和发酵条件的内容。
在一些实施方式中，细胞固定于基底上作为整个细胞催化剂并经历发酵条件以生产异戊二烯。
在一些实施方式中，将液体培养物的瓶置于振荡器上以将氧导入液体中并维持培养物的均一性。在一些实施方式中，使用温育器控制温度、湿度、振荡速度、和/或培养物生长的其它条件。最简单的温育器是具有可调节的加热器(通常最高至～65℃)的隔离箱。更精致的温育器还包括降低温度(通过致冷)的能力，或控制湿度或CO2水平的能力。多数温育器包括计时器；一些还可以程序化以在不同的温度、湿度水平等之间循环。温育器的尺寸可以是各种各样的，从台式到小型房间大小的单位。
如果需要，可以改变一部分或全部的细胞培养基以补充营养物和/或避免积累潜在有害的代谢副产物和死亡的细胞。在悬浮培养物的情况下，可以通过离心或过滤悬浮培养物而从培养基中分离细胞，然后将细胞重悬于新鲜的培养基中。在贴壁培养的情况下，可以通过吸液而直接去掉培养基并更换。在一些实施方式中，细胞培养基允许细胞中的至少一部分在连续培养物(例如未稀释的连续培养物)中分裂以进行至少或大约5、10、20、40、50、60、65、或更多次细胞分裂。
在一些实施方式中，使用组成型或渗漏启动子(例如Trc启动子)，不添加用于诱导与启动子可操作地连接的异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸的表达的化合物(例如IPTG)。在一些实施方式中，添加化合物(例如IPTG)以诱导与启动子可操作地连接的异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸的表达。
用于使异戊二烯的生产与细胞生长解除偶联的示例性方法
合乎需要地，来自原料的碳被转化为异戊二烯而非转化为细胞的生长和维持。在一些实施方式中，细胞生长至低至中等的OD600，然后开始或增大异戊二烯的生产。该策略允许将大部分的碳转化为异戊二烯。
在一些实施方式中，细胞达到的光密度使得它们不再分裂或分裂极为缓慢，但是持续数小时地产生异戊二烯(例如大约2、4、6、8、10、15、20、25、30、或更多个小时)。例如，图60A-67C显示：在细胞达到它们不再分裂或分裂极为缓慢的光密度后，细胞可以持续生产实质量的甲羟戊酸或异戊二烯。在一些情况中，550nm处的光密度随时间下降(例如，由于细胞裂解而使细胞不再处于对数生长期之后光密度的下降)，并且细胞持续生产实质量的甲羟戊酸或异戊二烯。在一些实施方式中，经一定的时间段(例如大于或大约5、10、15、20、25、30、40、50、或60个小时)，细胞在550nm处的光密度增加是小于或大约50％(例如，小于或大约40％、30％、20％、10％、5％、或0％)，并且在该时间段期间，细胞生产的异戊二烯是大于或大约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、或更多nmole异戊二烯/克细胞的细胞湿重/小时(nmole/gwcm/hr)。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约2至大约5,000nmole/gwcm/hr，例如大约2至大约100nmole/gwcm/hr，大约100至大约500nmole/gwcm/hr，大约150至大约500nmole/gwcm/hr，大约500至大约1,000nmole/gwcm/hr，大约1,000至大约2,000nmole/gwcm/hr，或大约2,000至大约5,000nmole/gwcm/hr。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约20至大约5,000nmole/gwcm/hr，大约100至大约5,000nmole/gwcm/hr，大约200至大约2,000nmole/gwcm/hr，大约200至大约1,000nmole/gwcm/hr，大约300至大约1,000nmole/gwcm/hr，或大约400至大约1,000nmole/gwcm/hr 。
在一些实施方式中，经一定的时间段(例如大于或大约5、10、15、20、25、30、40、50或60个小时)，细胞在550nm处的光密度增加是小于或大约50％(例如，小于或大约40％、30％、20％、10％、5％、或0％)，并且在该时间段期间，细胞生产的异戊二烯的累积效价(总量)是大于或大约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、50,000、100,000、或更多毫克异戊二烯/升培养液(mg/L培 养液，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约2至大约5,000mg/L培养液，例如大约2至大约100mg/L培养液，大约100至大约500mg/L培养液，大约500至大约1,000mg/L培养液，大约1,000至大约2,000mg/L培养液，或大约2,000至大约5,000mg/L培养液。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约20至大约5,000mg/L培养 液，大约100至大约5,000mg/L培养液，大约200至大约2,000mg/L培养液，大约200至大约1,000mg/L培养液，大约300至大约1,000mg/L培养液，或大约400至大约1,000mg/L培养液。
在一些实施方式中，经一定的时间段(例如大于或大约5、10、15、20、25、30、40、50或60小时)，细胞在550nm处的光密度增加是小于或大约50％(例如，小于或大约40％、30％、20％、10％、5％、或0％)，并且在该时间段期间，细胞将大于或大约0.0015％、0.002％、0.005％、0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％、或8.0％的细胞培养基中的碳转化为异戊二烯。在一些实施方式中，碳向异戊二烯的转化百分率是例如大约0.002％至大约4.0％，大约0.002％至大约3.0％，大约0.002％至大约2.0％，大约0.002％至大约1.6％，大约0.002％至大约0.005％，大约0.005％至大约0.01％，大约0.01％至大约0.05％，大约0.05％至大约0.15％，0.15％至大约0.2％，大约0.2％至大约0.3％，大约0.3％至大约0.5％，大约0.5％至大约0.8％，大约0.8％至大约1.0％，或大约1.0％至大约1.6％。在一些实施方式中，碳向异戊二烯的转化百分率是大约0.002％至大约0.4％，0.002％至大约0.16％，0.04％至大约0.16％，大约0.005％至大约0.3％，大约0.01％至大约0.3％，或大约0.05％至大约0.3％。
在一些实施方式中，仅在稳定期生产异戊二烯。在一些实施方式中，在生长期和稳定期都生产异戊二烯。在多个实施方式中，在稳定期期间生产的异戊二烯的量(例如所生产的异戊二烯的总量或所生产的异戊二烯的量/升培养液/小时/OD600)是大于或大约生长期期间相同时间长度生产的异戊二烯量的2、3、4、5、10、20、30、40、50、或更多倍。在多个实施方式中，细胞在稳定期生产的异戊二烯大于或大约是所生产的异戊二烯总量(例如在发酵过程的一定的时间例如20小时生产的异戊二烯)的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、或更高。在多个实施方式中，细胞分裂缓慢或完全不分裂以致于细胞在550nm处的光密度增加小于或大约是50％(例如小于或大约40％、30％、20％、10％、5％、或0％)时生产的异戊二烯大于或大约是所生产的异戊二烯总量(例如在发酵过程的一定的时间例如20小时生产的异戊二烯)的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高。在一些实施方式中，仅在生长期生产异戊二烯。
在一些实施方式中，将一种或多种MVA途径、IDI、DXP、或异戊二烯合酶核酸置于在稳定期比在生长期具有更高活性的启动子或因子的控制下。例如，可以将一种或多种MVA途径、IDI、DXP、或异戊二烯合酶核酸置于稳定期σ因子例如RpoS的控制下。在一些实施方式中，将一种或多种MVA途径、IDI、DXP、或异戊二烯合酶核酸置于在稳定期可诱导的启动子控制下，例如可以被在稳定期有活性的应答调节子诱导的启动子。
在安全操作范围内生产异戊二烯
根据其可燃性特征在安全操作水平内生产异戊二烯简化了商业设施的设计和构建，极大地改进了安全操作的能力，并限制了起火的潜在可能。特别地，生产异戊二烯的最佳范围在安全区内，即在异戊二烯浓度的非可燃范围内。在一个这样的方面，本文描述了用于在异戊二烯浓度的非可燃范围内(在异戊二烯的可燃性包迹之外)生产异戊二烯的方法。
因此，使用了计算机模拟和实验测试来确定异戊二烯(例如在存在O2、N2、CO2、或上述气体中的两种或更多种的任意组合存在时的异戊二烯)的可燃极限，以确保操作的安全性。可燃性包迹的特征在于燃烧下限(LFL)、燃烧上限(UFL)、极限氧浓度(LOC)、和极限压力。对于可燃的系统而言，必须在存在最少量的氧化剂(通常是氧)的情况下有最少量的燃料(例如异戊二烯)。LFL是使燃烧持续所需的最少量的异戊二烯，而UFL是可以存在的最大量的异戊二烯。在该极限之上，混合物富含燃料并且氧的级份太低以致于不能形成可燃混合物。LOC表示形成可燃混合物还需要存在的氧的最小级份。极限温度基于异戊二烯的闪点，其是异戊二烯的燃烧可以传播的最低温度。这些限值对于异戊二烯的浓度、氧化剂的类型和浓度、系统中存在的惰性物、系统的温度和压力是特异性的。在可燃性包迹极限内的成分会使燃烧传播并需要加工设备的设计和操作上的另外的安全考虑。
使用计算机模拟和数学分析和实验测试检测了如下条件。如果需要，可以使用本文描述的方法测试其它条件(例如其它温度、压力、和永久气体成分)以测定LFL、UFL和LOC浓度。
(1)计算机模拟和数学分析
测试组1：
异戊二烯：0wt％-14wt％
O2：6wt％-21wt％
N2：79wt％-94wt％
测试组2：
异戊二烯：0wt％-14wt％
O2：6wt％-21wt％
N2：79wt％-94wt％
以水饱和
测试组3：
异戊二烯：0wt％-14wt％
O2：6wt％-21wt％
N2：79wt％-94wt％
CO2：5wt％-30wt％
(2)用于最终测定可燃极限的实验测试
测试组1：
异戊二烯：0wt％-14wt％
O2：6wt％-21wt％
N2：79wt％-94wt％
测试组2：
异戊二烯：0wt％-14wt％
O2：6wt％-21wt％
N2：79wt％-94wt％
以水饱和
使用模拟软件以产生数种不同测试条件下的系统的可燃特性的估计。CO2没有显示出对于系统的可燃极限的显著性影响。通过实验测试确认了测试组1和2。模拟结果与实验测试结果是一致的。在加入水的情况下仅发现有少许差异。
在40℃和1个大气压下，异戊二烯、O2、N2、和CO2混合物的LOC经测定是9.5vol％。加入高达30％的CO2未对异戊二烯、O2、和N2混合物的可燃特性造成显著影响。在干燥的和水饱和的异戊二烯、O2、和N2系统之间仅显示出少许可燃特性上的差异。极限温度是大约-54℃。低于大约-54℃的温度太低以致于不能使异戊二烯的燃烧传播。
在一些实施方式中，异戊二烯的LFL范围为大约1.5vol.％至大约2.0vol％，异戊二烯的UFL范围为大约2.0vol.％至大约12.0vol.％，这取决于系统中氧的量。在一些实施方式中，LOC是大约9.5vol％氧。在一些实施方式中，异戊二烯的LFL是大约1.5vol.％至大约2.0vol％，异戊二烯的UFL是大约2.0vol.％至大约12.0vol.％，当温度是大约25℃至大约55℃(例如大约40℃)并且压力是大约1个大气压至3个大气压时，LOC是大约9.5vol％氧。
在一些实施方式中，在存在小于大约9.5vol％氧(即，低于形成异戊二烯的可燃化合物所需的LOC)的情况下生产异戊二烯。在存在大于或大约9.5vol％氧的情况下生产异戊二烯的一些实施方式中，异戊二烯的浓度低于LFL(例如低于大约1.5vol.％)。例如，可以通过以惰性气体稀释异戊二烯成分(例如，通过持续或周期性加入惰性气体，例如氮气，以保持异戊二烯成分低于LFL)而将异戊二烯的量保持在低于LFL。在存在大于或大约9.5vol％氧的情况下生产异戊二烯的一些实施方式中，异戊二烯的浓度高于UFL(例如高于大约12vol.％)。例如，可以通过使用以高于UFL的浓度生产异戊二烯的系统(例如本文描述的任意细胞培养系统)将异戊二烯的量保持高于UFL。如果需要，可以使用相对低水平的氧，从而UFL也相对低。在这种情况下，需要较低的异戊二烯浓度以保持高于UFL。
在存在大于或大约9.5vol％氧的情况下生产异戊二烯的一些实施方式中，异戊二烯浓度在可燃性包迹内(例如在LFL和UFL之间)。在异戊二烯浓度可以落在可燃性包迹内的一些实施方式中，进行一个或多个步骤以降低起火或爆炸的可能性。例如，可以避免一个或多个燃火源(例如可以产生火星的任何物质)。在一些实施方式中，进行一个或多个步骤以减少异戊二烯的浓度保持在可燃性包迹内的时间。在一些实施方式中，使用感应器来检测异戊二烯的浓度何时接近或落在可燃性包迹内。如果需要，可以在细胞培养过程中的一个或多个时间点测定异戊二烯的浓度，并且，如果异戊二烯的浓度接近或落在可燃性包迹内，可以使用标准方法调节细胞培养条件和/或惰性气体的量。在具体的实施方式中，调节细胞培养条件(例如发酵条件)以使异戊二烯的浓度降低至低于LFL或使异戊二烯的浓度升高至高于UFL。在一些实施方式中，通过以惰性气体稀释异戊二烯成分(例如，通过持续或周期性加入惰性气体以保持异戊二烯成分低于LFL)而将异戊二烯的量保持在低于LFL。
在一些实施方式中，所生产的异戊二烯的量比异戊二烯之外的其它可燃性挥发物(例如一种或多种糖)的量高至少大约2、5、10、50、75、或100倍。在一些实施方式中，除了异戊二烯气体之外的气相部分包含大约0％至大约100％(体积)的氧，例如大约0％至大约10％、大约10％至大约20％、大约20％至大约30％、大约30％至大约40％、大约40％至大约50％、大约50％至大约60％、大约60％至大约70％、大约70％至大约80％、大约90％至大约90％、或大约90％至大约100％(体积)的氧。在一些实施方式中，除了异戊二烯气体之外的气相部分包含大约0％至大约99％(体积)的氮，例如大约0％至大约10％、大约10％至大约20％、大约20％至大约30％、大约30％至大约40％、大约40％至大约50％、大约50％至大约60％、大约60％至大约70％、大约70％至大约80％、大约90％至大约90％、或大约90％至大约99％(体积)的氮。
在一些实施方式中，除了异戊二烯气体之外的气相部分包含大约1％至大约50％(体积)的CO2，例如大约1％至大约10％，大约10％至大约20％，大约20％至大约30％，大约30％至大约40％，或大约40％至大约50％(体积)的CO2。
在一些实施方式中，异戊二烯组合物还包含乙醇。例如，乙醇可用于异戊二烯的提取蒸馏，从而产生包含乙醇和异戊二烯的组合物(例如中间产物流)。合乎需要地，乙醇的量在乙醇的可燃性包迹之外。乙醇的LOC是大约8.7vol％，乙醇的LFL在标准条件(例如大约1个大气压和大约60℉(NFPA 69 Standard on Explosion Prevention Systems，2008版，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于LOC、LFL、和UFL值的内容)下是3.3vol％。在一些实施方式中，在存在小于形成乙醇的可燃混合物所需的LOC的情况下(例如小于大约8.7％vol％)生产包含异戊二烯和乙醇的组合物。在存在大于或大约形成乙醇的可燃混合物所需的LOC的情况下生产包含异戊二烯和乙醇的组合物的一些实施方式中，乙醇的浓度小于LFL(例如小于大约3.3vol.％)。
在多个实施方式中，氧化物(例如氧)的量低于系统中任意燃料(例如异戊二烯或乙醇)的LOC。在多个实施方式中，氧化物(例如氧)的量低于异戊二烯或乙醇的LOC的大约60％、40％、30％、20％、10％、或5％。在多个实施方式中，氧化物(例如氧)的量比异戊二烯或乙醇的LOC低至少2、4、5、或更多个绝对百分点(vol％)。在具体的实施方式中，氧的量比异戊二烯或乙醇的LOC低至少2个绝对百分点(vol％)(例如，当异戊二烯的LOC是9.5vol％时，氧的浓度低于7.5vol％。在多个实施方式中，燃料(例如异戊二烯或乙醇)的量比该燃料的LFL低或是其大约25％、20％、15％、10％、或5％。
通过发酵高效率生产和回收挥发烃异戊二烯
本文提供了生产异戊二烯的方法，包括：a)在适合生产异戊二烯的条件下培养细胞；和b)生产异戊二烯，其中异戊二烯的液相浓度小于大约200mg/L。在一些实施方式中，培养物中的异戊二烯的液相浓度小于大约下列任意值：175mg/L，150mg/L，125mg/L，100mg/L，75mg/L，50mg/L，25mg/L，20mg/L，15mg/L，10mg/L，5mg/L，或2.5mg/L。在一些实施方式中，培养物中的异戊二烯的液相浓度是大约下列任意项：0.1mg/L至200mg/L，1mg/L至200mg/L，1mg/L至150mg/L，1mg/L至100mg/L，1mg/L至50mg/L，1mg/L至25mg/L，1mg/L至20mg/L，或10mg/L至20mg/L。在一些实施方式中，生产的异戊二烯是标题为“示例性的异戊二烯的生产”的部分中所公开的任意浓度或量。在一些实施方式中，液相浓度小于异戊二烯的溶解性限值。
在方法的一些实施方式中，细胞生产大于大约400nmole/gwcm/小时的异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约下列任意项：400nmole/gwcm/小时至1mole/gwcm/小时，400nmole/gwcm/小时至1mmole/gwcm/小时，400nmole/gwcm/小时至40mmole/gwcm/小时，400nmole/gwcm/小时至4mmole/gwcm/小时，1mmole/gwcm/小时至1.5mmole/gwcm/小时，1.5mmole/gwcm/小时至3mmole/gwcm/小时，3mmole/gwcm/小时至5mmole/gwcm/小时，5mmole/gwcm/小时至25mmole/gwcm/小时，25mmole/gwcm/小时至100mmole/gwcm/小时，100mmole/gwcm/小时至500mmole/gwcm/小时，或500mmole/gwcm/小时至1000mmole/gwcm/小时。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约下列任意项：1mmole/gwcm/小时，1.5mmole/gwcm/小时，2mmole/gwcm/小时，3mmole/gwcm/小时，4mmole/gwcm/小时，或5mmole/gwcm/小时。
亨利系数的低值(单位M atm-1)意思是在低鼓泡速率例如0.01vvm至2vvm可以通过气提从发酵液中回收的异戊二烯。在一些实施方式中，气体鼓泡速率是大约下列任意项：0.1vvm至1vvm，0.01vvm至0.5vvm，0.2vvm至1vvm，或0.5vvm至1vvm。在一些实施方式中，气体鼓泡速率是大约下列任意项：0.1vvm，0.25vvm，0.5vvm，0.75vvm，1vvm，1.25vvm，1.5vvm，1.75vvm，或2vvm。在一些实施方式中，在整个发酵运行进程中，生长期或静止期期间保持低鼓泡速率。在一些实施方式中，将低鼓泡速率维持大约下列任意项：1小时至5小时，5小时至10小时，10小时至20小时，20小时至30小时，30小时至40小时，40小时至50小时，或50小时至60小时。较低的合乎需要的气体鼓泡限值定义为：气相变成异戊二烯饱和并且形成有机液相的点。这仅会在低于异戊二烯的沸点(在1个大气压下是34.1℃)发生，在该点以上永远不会形成异戊二烯液相。在低于异戊二烯的沸点的温度下，液相的形成是由异戊二烯的水溶性(在25℃是大约650mg/L)决定的。虽然非常希望避免异戊二烯液相的形成，但不是绝对的，条件是细胞能够耐受液态异戊二烯的存在而不造成毒性效应。
在一些实施方式中，氧、CO2、和异戊二烯是标题为“在安全操作范围内生产异戊二烯”的部分中所讨论的任意量或浓度。在一些实施方式中，所有的氧都被细胞消耗，同时维持完全有氧代谢。在一些实施方式中，使用多余的氧以满足细胞对氧的需求。废气中氧的希望的范围是小于20％，或小于15％或小于10％(v/v)。低于异戊二烯燃烧所需的极限氧浓度(在1个大气压下是9.5％)的氧的水平是特别合乎需要的。在一些实施方式中，使用富含氧的空气，目的是允许最小的气体吹扫速度，同时满足细胞对氧的需求。在一些实施方式中，气体吹扫的气相部分包含大约0.1％至大约10％、大约10％至大约20％、或大约20％至大约30％(体积)的氧。在一些实施方式中，在高压下进行异戊二烯的发酵以使维持液相中所需的溶解氧水平所需要的多余氧的量最小化。
在一些实施方式中，通过发酵器的气体吹扫速率的降低对于联合的异戊二烯生产过程的有利之处在于：此条件使废气异戊二烯水平升高至大约30,000μg/L(大约1％v/v)而不对细胞的生理状况造成不利影响。
在一些实施方式中，降低的气体鼓泡速率不会对细胞的生理状况造成显著的不利影响。在一些实施方式中，具有降低的气体鼓泡速率的培养物中的细胞的二氧化碳释放速率是大约下列任意项：1x 10-18mmol/L/小时至大约1mol/L/小时、1mmol/L/小时至1mol/L/小时，25mmol/L/小时至750mmol/L/小时，25mmol/L/小时至75mmol/L/小时，250mmol/L/小时至750mmol/L/小时，或450mmol/L/小时至550mmol/L/小时。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约下列任意项：50mmol/L/小时，100mmol/L/小时，150mmol/L/小时，200mmol/L/小时，250mmol/L/小时，300mmol/L/小时，350mmol/L/小时，400mmol/L/小时，450mmol/L/小时，或500mmol/L/小时。在一些实施方式中，具有降低的气体鼓泡速率的细胞存活率被降低小于大约下列任意项：1.75倍，1.5倍，1.25倍，1倍，0.75倍，0.5倍，或0.25倍。在一些实施方式中，具有降低的气体鼓泡速率的细胞存活率被降低大约2倍。在一些实施方式中，将表达来自一个或多个异源和/或重复拷贝的MVA途径和/或DXP途径核酸的MVA途径和/或DXP途径RNA和/或蛋白的细胞的具有降低的气体鼓泡速率的细胞存活率与不含一个或多个异源和/或重复拷贝的MVA途径和/或DXP途径的核酸的具有降低的气体鼓泡速率的对照细胞进行比较。在一些实施方式中，将在可诱导启动子控制下(其中所述启动子被诱导)表达来自一个或多个异源和/或重复拷贝的MVA途径和/或DXP途径核酸的MVA途径和/或DXP途径RNA和/或蛋白的细胞的具有降低的气体鼓泡速率的细胞存活率与包含在可诱导启动子控制下(其中所述启动子不被诱导(未诱导))的一个或多个异源和/或重复拷贝的MVA途径和/或DXP途径核酸的具有降低的气体鼓泡速率的对照细胞进行比较。在一些实施方式中，可诱导启动子是β-半乳糖苷酶启动子。
在一些实施方式中，经遗传修饰的宿主生物体的发酵将该生物体所消耗的总碳的至少5％转化为挥发性不饱和烃。在一些实施方式中，所生产的不饱和烃的速率以至少大约下列任意项的水平以这样的速率存在于发酵废气中：100μg/L，500μg/L，1000μg/L，2，500μg/L，5,000μg/L，7,500μg/L，或10,000μg/L。
在一些实施方式中，通过适合于高速率生产的方式从废气流中回收不饱和烃，这对应于废气中的浓度是至少大约下列任意项：100μg/L，500μg/L，1000μg/L，2,500μg/L，5,000μg/L，7,500μg/L，或10,000μg/L。在一些实施方式中，从发酵废气中持续提取并回收不饱和烃(特别是在低气体吹扫速率下)，从而产生废气富含目标挥发成分。在一些实施方式中，通过依赖于升高的浓度的挥发物的方法回收挥发烃。例如，通过使用加压/凝结或提取蒸馏技术有效捕获发酵废气中的异戊二烯。还考虑到使用活性炭筒，以及硅胶吸附剂、从碳筒中解吸附和浓缩异戊二烯、和/或构建和发酵宿主生物例如大肠杆菌，其可以将大约5％或更多的葡萄糖底物转化为异戊二烯并产生大于大约15,000μg/L异戊二烯的废气浓度。回收方法包括本文描述的任意方法。
本文还提供了生产化合物的方法，其中所述化合物具有选自下列的一个或多个特征：(a)亨利定律系数小于大约250M/atm和(b)在水中的溶解性小于大约100g/L。在一些实施方式中，所述方法包括：a)在适合于生产化合物的条件下培养细胞，其中以大约0.01vvm至大约2vvm的气体鼓泡速率加入气体(例如向系统例如发酵系统中加入气体)；和b)生产化合物。
在一些实施方式中，划分到细胞物质中的化合物的量不包括在液相溶解性数值内。在一些实施方式中，液相浓度低于化合物的溶解性限值。
在一些实施方式中，可以通过在中等至低气体鼓泡速率通过气提从发酵液中持续回收化合物，尤其是那些具有大约下列任意项的亨利定律系数的化合物：小于250M/atm，200M/atm，150M/atm，100M/atm，75M/atm，50M/atm，25M/atm，10M/atm，5M/atm，或1M/atm。实例包括醛，例如乙醛(15M/atm)；酮，例如丙酮(30M/atm)或2-丁酮(20M/atm)；或醇，包括甲醇(220M/atm)、乙醇(200M/atm)、1-丁醇(120M/atm)或C5醇，包括3-甲基-3-丁烯-1-醇和3-甲基-丁烯-1-醇(50-100M/atm)。醇的酯一般具有比其对应的醇低的亨利常数，例如乙酸乙酯(6-9M/atm)或C5醇的乙酸酯(＜5M/atm)。具有小于1M/atm的亨利系数的化合物是特别合乎需要的。实例包括半萜、单萜、或倍半萜，以及其它烃例如C1至C5烃(例如甲烷、乙烷、乙烯、或丙烯)。在一些实施方式中，烃例如C1至C5的烃是饱和的、不饱和的、或分支的。
一般地，在亨利定律系数与水溶性之间存在关联，非常低的系数的化合物在水中溶解性极低(几乎不溶于水)。虽然可以通过气提回收在水中具有无限溶解性的挥发物(例如丙酮或乙醇)，但是希望的溶解性限值是低于大约下列任意项：100g/L，75g/L，50g/L，25g/L，10g/L，5g/L，或1g/L。
在生产上文描述的任意化合物的任意方法的一些实施方式中，气体鼓泡速率是大约下列任意项：0.1vvm至1vvm、0.2vvm至1vvm、或0.5vvm至1vvm。在一些实施方式中，气体鼓泡速率是大约下列任意项：0.1vvm，0.25vvm，0.5vvm，0.75vvm，1vvm，1.25vvm，1.5vvm，1.75vvm，或2vvm。在一些实施方式中，在整个发酵运行进程中，生长期或静止期期间保持低鼓泡速率。在一些实施方式中，将低鼓泡速率维持大约下列任意项：1小时至5小时，5小时至10小时，10小时至20小时，20小时至30小时，30小时至40小时，40小时至50小时，或50小时至60小时。
本文描述的任意系统可用于生产上文描述的化合物的方法。将使用标准方法来进行纯化，例如在标题为“示例性纯化方法”的部分中描述的那些。可以在回收后通过例如蒸馏或选择性吸附技术来进行分离。
示例性的生物异戊二烯的生产
在一些实施方式中，在允许细胞生产异戊二烯的条件下在培养基中培养细胞。
“峰值绝对生产率”意思是：在细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行的细胞培养中)期间的废气中的异戊二烯的最大绝对量。“峰值绝对生产率时间点”意思是：在发酵运行期间，当废气中的异戊二烯的绝对量是细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间的最大值时的时间点。在一些实施方式中，在峰值绝对生产率时间点测定异戊二烯的量。在一些实施方式中，细胞的峰值绝对生产率是大约本文公开的任意的异戊二烯的量。
“峰值比生产率”意思是细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间每细胞生产的异戊二烯的最大量。“峰值比生产率时间点”意思是：在细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间，当每细胞生产的异戊二烯的量是最大值时的时间点。峰值比生产率是这样确定的：以总的生产率除以细胞的量，细胞的量如通过600nm处的光密度(OD600)所测定。在一些实施方式中，在峰值比生产率时间点测定异戊二烯的量。在一些实施方式中，细胞的峰值比生产率是大约本文公开的任意的异戊二烯的量/细胞。
“峰值体积生产率”意思是在细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间，每体积培养液(包括细胞和细胞培养基的体积)所生产的异戊二烯的最大量。“峰值比体积生产率时间点”意思是：在细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间，当每体积培养液生产的异戊二烯的量是最大值时的时间点。峰值比体积生产率是这样确定的：以总的生产率除以培养液的体积和时间的量。在一些实施方式中，在峰值比体积生产率时间点测定异戊二烯的量。在一些实施方式中，细胞的峰值比体积生产率是大约本文公开的任意的异戊二烯的量/体积/时间。
“峰值浓度”意思是在细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间，生产的异戊二烯的最大量。“峰值浓度时间点”意思是：在细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间，当每细胞生产的异戊二烯的量是最大值时的时间点。在一些实施方式中，在峰值浓度时间点测定异戊二烯的量。在一些实施方式中，细胞的峰值浓度是大约本文公开的任意的异戊二烯的量。
“平均体积生产率”意思是在细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间，每体积培养液(包括细胞和细胞培养基的体积)所生产的异戊二烯的平均量。平均体积生产率是这样确定的：以总的生产率除以培养液的体积和时间的量。在一些实施方式中，细胞的平均比体积生产率是大约本文公开的任意的异戊二烯的量/体积/时间。
“累积总生产率”意思是在细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间，生产的异戊二烯的累积的的总量。在一些实施方式中，测定异戊二烯的累积的总量。在一些实施方式中，细胞的累积的总生产率是大约本文公开的任意的异戊二烯的量。
如本文中所用，“相对检测器应答”是指一个化合物(例如异戊二烯)的检测器应答(例如GC/MS面积)与一个或多个化合物(例如所有的C5烃)的检测器应答(例如GC/MS面积)之间的比率。可以按照本文的描述测定检测器应答，例如使用配有Agilent HP-5MS GC/MS柱(30m x 250μm；0.25μm膜厚度)的Agilent 6890GC/MS系统进行GC/MS分析。如果需要，可以使用每种化合物的应答因子将相对检测器应答转化为重量百分率。这种应答因子是对于给定量的特定化合物产生多少信号的度量(即，检测器对于特定化合物有多灵敏)。当检测器对于所比较的化合物具有不同的灵敏性时，该应答因子可用作校正因子以将相对检测器应答转化为重量百分率。可替代地，可以通过假设“所比较的化合物的应答因子是相同的”来约计重量百分率。因此，可以假设重量百分率近似等于相对检测器应答。
在一些实施方式中，培养物中的细胞以大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、12,500、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000、100,000、125,000、150,000、188,000或更多纳摩尔异戊二烯/克细胞的细胞湿重/小时(nmole/gwcm/小时)产生异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯的量在约2至约200,000nmole/gwcm小时之间，如在约2至约100nmole/gwcm/小时、约100至约500nmole/gwcm/小时、约150至约500nmole/gwcm/小时、约500至约1,000nmole/gwcm/小时、约1,000至约2,000nmole/gwcm/小时，或约2,000至约5,000nmole/gwcm/小时、约5,000至约10,000nmole/gwcm/小时、约10,000至约50,000nmole/gwcm/小时、约50,000至约100,000nmole/gwcm/小时、约100,000至约150,000nmole/gwcm/小时，或约150,000至约200,000nmole/gwcm/小时之间。在一些实施方式中，异戊二烯的量在约20至约5,000nmole/gwcm/小时、约100至约5,000nmole/gwcm/小时、约200至约2,000nmole/gwcm/小时、约200至约1,000nmole/gwcm/小时、约300至约1,000nmole/gwcm/小时，或约400至约1,000nmole/gwcm/小时、约1,000至约5,000nmole/gwcm/小时、约2,000至约20,000nmole/gwcm/小时、约5,000至约50,000nmole/gwcm/小时、约10,000至约100,000nmole/gwcm/小时、约20,000至约150,000nmole/gwcm/小时，或约20,000至约200,000nmole/gwcm/小时之间。
可以按照如美国专利号5,849,970中公开的内容测定异戊二烯的量，单位是nmole/gwcm/hr，该文献通过引用方式全文并入本文，尤其是关于测定异戊二烯的生产的内容。例如，使用标准气相色谱系统，例如等温(85℃)操作的具有正辛烷/多孔硅C柱(Alltech Associates，Inc.，Deerfield，Ill.)并偶联于RGD2氧化汞还原气体检测器(Trace Analytical，MenloPark，CA)的系统分析2mL顶空(例如，来自于在32℃以200rpm振荡培养大约3小时的密封瓶中的2mL培养物的顶空)中的异戊二烯(见，例如，Greenberg等人，Atmos.Environ.27A：2689-2692，1993；Silver等人，Plant Physiol.97：1588-1591，1991，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于测定异戊二烯的产生的内容)。通过标准的异戊二烯浓度校正曲线将气相色谱面积单位转化为nmol异戊二烯。在一些实施方式中，通过获得细胞培养物的样品的A600值、然后基于具有已知的A600值的细胞培养物的湿重的校正曲线将A600值转化为细胞的克数，来计算细胞湿重的细胞的克数。在一些实施方式中，通过假设A600值为1的1升培养液(包括细胞培养基和细胞)具有1克细胞湿重来估计细胞的克数。还将该值除以培养物已被温育的小时数，例如3个小时。
在一些实施方式中，培养物中的细胞生产大于或大约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、100,000、或更多ng的异戊二烯/克细胞的细胞湿重/小时(ng/gwcm/h)的异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约2至大约5,000ng/gwcm/h，例如大约2至大约100ng/gwcm/h，大约100至大约500ng/gwcm/h，大约500至大约1,000ng/gwcm/h，大约1,000至大约2,000ng/gwcm/h，或大约2,000至大约5,000ng/gwcm/h。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约20至大约5,000ng/gwcm/h，大约100至大约5,000ng/gwcm/h，大约200至大约2,000ng/gwcm/h，大约200至大约1,000ng/gwcm/h，大约300至大约1,000ng/gwcm/h，或大约400至大约1,000ng/gwcm/h。可以通过将如上讨论的单位为nmole/gwcm/hr的异戊二烯的产量值乘以68.1来计算以ng/gwcm/h表示的异戊二烯的量(如以下等式5所描述)。
在一些实施方式中，培养物中的细胞生产大于或大约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、50,000、100,000、或更多毫克的异戊二烯/L培养液(mg/L培养液，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)的异戊二烯的累积效价(总量)。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约2至大约5,000mg/L培养液，例如大约2至大约100mg/L培养液，大约100至大约500mg/L培养液，大约500至大约1,000mg/L培养液，大约1,000至大约2,000mg/L培养液，或大约2,000至大约5,000mg/L培养液。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约20至大约5,000mg/L培养 液，大约100至大约5,000mg/L培养液，大约200至大约2,000mg/L培养液，大约200至大约1,000mg/L培养液，大约300至大约1,000mg/L培养液，或大约400至大约1,000mg/L培养液。
以毫克异戊二烯/升顶空(来自摇瓶或类似培养物)表示的异戊二烯的比生产率可以这样测定：在OD600值为大约1.0时从细胞培养物中取出1ml样品，将其置于20ml的瓶中，温育30分钟，然后测定顶空中的异戊二烯的量(例如实施例I第II部分中的描述)。如果OD600值不是1.0，则可以通过除以OD600值来将测定值校正为1.0的OD600值。可以通过乘以因子38而将毫克异戊二烯/升顶空的值转化为mg/L培养液/hr/培养液的OD600。可以将单位为mg/L培养液/hr/OD600的值乘以小时数和OD600值来获得单位为毫克异戊二烯/升培养液的累积效价。
在一些实施方式中，培养物中的细胞具有大于或大约0.1、1.0、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1100、1200、1300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、或更多毫克异戊二烯/升培养液/小时(mg/L培养液/hr，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)的异戊二烯的平均体积生产率。在一些实施方式中，异戊二烯的平均体积生产率是大约0.1至大约3,500mg/L培养液/hr，例如大约0.1至大约100mg/L培养液/hr，大约100至大约500mg/L培养液/hr，大约500至大约1,000mg/L培养液/hr，大约1,000至大约1,500mg/L培养液/hr，大约1,500至大约2,000mg/L培养液/hr，大约2,000至大约2,500mg/L培养液/hr，大约2,500至大约3,000mg/L培养液/hr，或大约3,000至大约3,500mg/L培养液/hr。在一些实施方式中，异戊二烯的平均体积生产率是大约10至大约3,500mg/L培养液/hr，大约100至大约3,500mg/L培养液/hr，大约200至大约1,000mg/L培养液/hr，大约200至大约1,500mg/L培养液/hr，大约1,000至大约3,000mg/L培养液/hr，或大约1,500至大约3,000mg/L培养液/hr。
在一些实施方式中，培养物中的细胞具有大于或大约0.5、1.0、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1100、1200、1300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,750、4,000、4,250、4,500、4,750、5,000、5,250、5,500、5,750、6,000、6,250、6,500、6,750、7,000、7,250、7,500、7,750、8,000、8,250、8,500、8,750、9,000、9,250、9,500、9,750、10,000、12,500、15,000、或更多毫克异戊二烯/升培养液/小时(mg/L培养液/hr，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)的异戊二烯的峰值体积生产率。在一些实施方式中，异戊二烯的峰值体积生产率是大约0.5至大约15,000mg/L培养液/r，例如大约0.5至大约10mg/L培养液/hr，大约1.0至大约100mg/L培养液/hr，大约100至大约500mg/L培养液/hr，大约500至大约1,000mg/L培养液/hr，大约1,000至大约1,500mg/L培养液/hr，大约1,500至大约2,000mg/L培养液/hr，大约2,000至大约2,500mg/L培养液/hr，大约2,500至大约3,000mg/L培养液/hr，大约3,000至大约3,500mg/L培养液/hr，大约3,500至大约5,000mg/L培养液/hr，大约5,000至大约7,500mg/L培养液/hr，大约7,500至大约10,000mg/L培养液/hr，大约10,000至大约12,500mg/L培养液/h，或大约12,500至大约15,000mg/L培养液/hr。在一些实施方式中，异戊二烯的峰值体积生产率是大约10至大约15,000mg/L培养液/hr，大约100至大约2,500mg/L培养液/hr，大约1,000至大约5,000mg/L培养液/hr，大约2,500至大约7,500mg/L培养液/hr，大约5,000至大约10,000mg/L培养液/hr，大约7,500至大约12,500mg/L培养液/hr，或大约10,000至大约15,000mg/L培养液/hr。
发酵器中的以mg/L培养液/r表示的瞬时异戊二烯生产速率可以这样测定：取出发酵器废气的样品，通过例如实施例I第II部分的描述分析其异戊二烯的量(单位是例如毫克异戊二烯/L气体)，并将该数值乘以废气通过每升培养液的速率(例如，在1vvm(空气体积/培养液体积/分钟)时是60L气体/小时)。因此，1mg/L气体的废气水平对应于气流为1vvm时60mg/L培养液/hr的瞬时生产速率。如果需要，可以将单位为mg/L培养液/hr的数值除以OD600值以获得单位为mg/L培养液/hr/OD的比速率。可以通过将此平均废气异戊二烯浓度乘以发酵过程中每升发酵液鼓泡的废气的总量而将以毫克异戊二烯/L气体表示的平均值转化为总产物生产率(异戊二烯克数/升发酵液，mg/L培养液)。因此，在1vvm经10小时的0.5mg/L培养液/hr的平均废气异戊二烯浓度对应于300毫克异戊二烯/L培养液的总产物浓度。
在一些实施方式中，培养物中的细胞将细胞培养基中大于或约0.0015、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.12、0.14、0.16、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、16.0、17.0、18.0、19.0、20.0、21.0、22.0、23.0、23.2、23.4、23.6、23.8、24.0、25.0、30.0、31.0、32.0、33.0、35.0、37.5、40.0、45.0、47.5、50.0、55.0、60.0、65.0、70.0、75.0、80.0、85.0、或90.0摩尔％的碳转化成异戊二烯。在一些实施方式中，碳转化成异戊二烯的百分率为约0.002至约90.0摩尔％，如约0.002至约0.005％、约0.005至约0.01％、约0.01至约0.05％、约0.05至约0.15％、0.15至约0.2％、约0.2至约0.3％、约0.3至约0.5％、约0.5至约0.8％、约0.8至约1.0％、约1.0至约1.6％、约1.6至约3.0％、约3.0至约5.0％、约5.0至约8.0％、约8.0至约10.0％、约10.0至约15.0％、约15.0至约20.0％、约20.0至约25.0％、约25.0％至30.0％、约30.0％至35.0％、约35.0％至40.0％、约45.0％至50.0％、约50.0％至55.0％、约55.0％至60.0％、约60.0％至65.0％、约65.0％至70.0％、约75.0％至80.0％、约80.0％至85.0％、或约85.0％至90.0％。在一些实施方式中，碳转化成异戊二烯的百分率为约0.002至约0.4摩尔％、0.002至约0.16摩尔％、0.04至约0.16摩尔％、约0.005至约0.3摩尔％、约0.01至约0.3摩尔％、约0.05至约0.3摩尔％、约0.1至0.3摩尔％、约0.3至约1.0摩尔％、约1.0至约5.0摩尔％、约2至约5.0摩尔％、约5.0至约10.0摩尔％、约7至约10.0摩尔％、约10.0至约20.0摩尔％、约12至约20.0摩尔％、约16至约20.0摩尔％、约18至约20.0摩尔％、约18至23.2摩尔％、约18至23.6摩尔％、约18至约23.8摩尔％、约18至约24.0摩尔％、约18至约25.0摩尔％、约20至约30.0摩尔％、约30至约40.0摩尔％、约30至约50.0摩尔％、约30至约60.0摩尔％、约30至约70.0摩尔％、约30至约80.0摩尔％、或约30至约90.0摩尔％。
碳至异戊二烯的转化百分率(也称作“％碳产率”)可以这样测定：将所生产的异戊二烯中的摩尔碳除以碳源中的摩尔碳(例如批式和进料的葡萄糖和酵母提取物中的摩尔碳)。将该数值乘以100％以得到百分率数值(如等式1所示)。
等式1
％碳产率＝(所生产的异戊二烯中的摩尔碳)/(碳源中的摩尔碳)*100
为了这个计算，可以假设酵母提取物包含505w/w的碳。举例而言，对于实施例7第VIII部分中描述的500升，可以根据等式2计算碳至异戊二烯的转化百分率。
等式2
％碳产率＝(39.1g异戊二烯*1/68.1mol/g*5C/mol)/[(181221g葡萄糖*1/180mol/g*6C/mol)+(17780g酵母提取物*0.5*1/12mol/g)]*100＝0.042％
对于本文描述的两个500升的发酵(实施例7，第VII和VIII部分)，碳至异戊二烯的转化百分率是0.04％-0.06％。使用如本文描述的14升的系统，达到了0.11％-0.16％的碳产率。实施例11第V部分描述了使用本文所述的方法的碳至异戊二烯的1.53％转化。
本领域技术人员可以容易地将异戊二烯的生产速率或异戊二烯的生产量转化为任意其它单位。以下列出了用于在单位之间相互转化的示例性的等式。
用于异戊二烯生产速率(总速率和比速率)的单位
等式3
1g异戊二烯/L培养液/hr＝14.7mmol异戊二烯/L培养液/hr(总体积速率)
等式4
1nmol异戊二烯/gwcm/hr＝1nmol异戊二烯/L培养液/hr/OD600(该转化假设OD600值为1的1升培养液具有1克细胞湿重)
等式5
1nmol异戊二烯/gwcm/hr＝68.1ng异戊二烯/gwcm/hr(给出异戊二烯的分子量)
等式6
1nmol异戊二烯/L气体O2/hr＝90nmol异戊二烯/L培养液/hr(在90L/hr的O2流速每升培养液)
等式7
废气中的1μg异戊二烯/L气体异戊二烯＝在60L气体每L培养液(1vvm)的流速的60μg异戊二烯/L培养液/hr
效价的单位(总效价和比效价)
等式8
1nmol异戊二烯/mg细胞蛋白＝150nmol异戊二烯/L培养液/OD600(该转化假设OD600值为1的1升培养液具有总共大约150mg的细胞蛋白)(比生产率)
等式9
1g异戊二烯/L培养液＝14.7mmol异戊二烯/L培养液(总效价)
如果需要，等式10可用于将任何包括细胞湿重的单位转化为包括干细胞重的对应的单位。
等式10
干细胞重＝(细胞湿重)/3.3
如果需要，可以使用等式11在单位ppm与μg/L之间转化。具体地，“ppm”意思是以μg/g(w/w)定义的百万分之几。也可以使用“ppmv”(体积的百万分之几)基于体积来表示气体的浓度，以μL/L(vol/vol)定义。μg/L与ppm(例如，μg分析物/g气体)的转化可以通过测定每升废气的质量(即气体的密度)来进行。例如，在标准温度和压力(STP；101.3kPa(1bar)和273.15K)下，1升空气的密度是大约1.29g/L。因此，1ppm(μg/g)的浓度等于STP下的1.29μg/L(等式11)。ppm(μg/g)向μg/L的转化与压力、温度和废气总体成分有关。
等式11
1ppm(μg/g)在标准温度和压力(STP；101.3kPa(1bar)和273.15K)下等于1.29μg/L。
可以使用普适气体定律(等式12)进行μg/L向ppmv的转化(例如，uL分析物/升气体)。例如，1000μg/L气体的废气浓度对应于14.7μmol/L气 体。普适气体常数是0.082057L.atm K-1mol-1，所以使用等式12，在STP(等式11)下由14.7μmol HG占据的体积等于0.329mL。因此，1000μg/L HG的浓度等于STP下的329ppmv或0.0329％(v/v)。
等式12
PV＝nRT，其中“P”是压力，“V”是体积，“n”是气体的摩尔数，“R”是普适气体常数，“T”是开氏温度。
本文中通常基于重量/体积(w/v)以单位例如μg/L来测定异戊二烯组合物中的杂质的量。如果需要，可以使用等式13将单位为μg/L的测量值转化为mg/m3的单位。
等式13
1μg/L＝1mg/m3
在本文所述的一些实施方式中，包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸的细胞生产的异戊二烯的量是在基本上相同的条件下生长的不含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸的相应的细胞生产的异戊二烯的量的至少或大约2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍、或更高。
在本文所述的一些实施方式中，包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸和编码DXS、IDI、和/或MVA途径多肽的一种或多种异源核酸的细胞生产的异戊二烯的量是在基本上相同的条件下生长的不含异源核酸的相应的细胞生产的异戊二烯的量的至少或大约2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍、或更高。
在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含重量占组合物中所有的C5烃总重量的大于或大约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％、或100％的异戊二烯。在一些实施方式中，组合物中的异戊二烯具有组合物中所有C5烃的检测器应答的大于或大约99.90％、99.91％、99.92％、99.93％、99.94％、99.95％、99.96％、99.97％、99.98％、99.99％、或100％的相对检测器应答。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含重量为组合物中的所有C5烃的总重量的大约99.90％至大约99.92％、大约99.92％至大约99.94％、大约99.94％至大约99.96％、大约99.96％至大约99.98％、大约99.98％至100％的异戊二烯。
在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含重量占组合物中所有C5烃总重量的小于或大约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的除了异戊二烯之外的C5烃(例如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，组合物中除了异戊二烯之外的C5烃具有组合物中所有C5烃的检测器应答的小于或大约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的相对检测器应答。在一些实施方式中，组合物中的1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔具有组合物中所有C5烃的检测器应答的小于或大约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的相对检测器应答。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含重量占组合物中所有C5烃的总重量的大约0.02％至大约0.04％、大约0.04％至大约0.06％、大约0.06％至0.08％、大约0.08％至0.10％、或大约0.10至大约0.12％的除了异戊二烯之外的C5烃(例如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。
在一些实施方式中，对于组合物中的抑制异戊二烯聚合的任意化合物，异戊二烯组合物包含小于或大约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的抑制异戊二烯聚合的化合物。在一些实施方式中，对于组合物中的抑制异戊二烯聚合的任意化合物，异戊二烯组合物包含大约0.005至大约50、例如大约0.01至大约10、大约0.01至大约5、大约0.01至大约1、大约0.01至大约0.5、或大约0.01至大约0.005μg/L的抑制异戊二烯聚合的化合物。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含小于或大约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的除了异戊二烯之外的烃(例如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含大约0.005至大约50、例如大约0.01至大约10、大约0.01至大约5、大约0.01至大约1、大约0.01至大约0.5、或大约0.01至大约0.005μg/L的除了异戊二烯之外的烃。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含小于或大约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的蛋白或脂肪酸(例如与天然橡胶天然结合的蛋白或脂肪酸)。
在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含小于或大约10、5、1、0.8、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005ppm的α乙炔、戊二烯、乙腈、或1，3-环戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含小于或大约5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005ppm的硫或丙二烯。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含小于或大约30、20、15、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005ppm的所有乙炔(例如1-戊炔、2-戊炔、3-甲基-1-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔和顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含小于或大约2000、1000、500、200、100、50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005ppm的异戊二烯二聚体，例如环式异戊二烯二聚体(例如，源自两个异戊二烯单元的二聚化的环式C10化合物)。
在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇(例如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)、或前述任意两项或更多项。在具体的实施方式中，异戊二烯组合物包含大于或大约0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、60、80、100、或120μg/L的乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇(例如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)、或前述任意两项或更多项。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含大约0.005至大约120、例如大约0.01至大约80、大约0.01至大约60、大约0.01至大约40、大约0.01至大约30、大约0.01至大约20、大约0.01至大约10、大约0.1至大约80、大约0.1至大约60、大约0.1至大约40、大约5至大约80、大约5至大约60、或大约5至大约40μg/L的乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇、或前述任意两项或更多项。
在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含下列成分中的一种或多种：2-庚酮，6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，4，5-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、丁二酮、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、异丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、3-甲基丁基乙酸酯、3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯、3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯、3-己烯-1-醇、3-己烯-1-基乙酸酯、苧烯、香叶醇(反式-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇)、香茅醇(3，7-二甲基-6-辛烯-1-醇)、(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯，(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯，2，3-环庚烯醇吡啶，或线性异戊二烯聚合物(例如，源自多个异戊二烯单元的聚合的线性异戊二烯二聚体或线性异戊二烯三聚体)。在多个实施方式中，以重量％为单位，这些成分中的一种的量相对于异戊二烯的量(即，该成分的重量除以异戊二烯的重量乘以100)是大于或大约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或110％(w/w)。在一些实施方式中，第二化合物的相对检测器应答相对于异戊二烯的检测器应答是大于或大约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或110％。在多个实施方式中，以重量％为单位，这些成分中的一种的量相对于异戊二烯的量(即，该成分的重量除以异戊二烯的重量乘以100)是大约0.01％至大约105％(w/w)，例如大约0.01％至大约90，大约0.01％至大约80％，大约0.01％至大约50％，大约0.01％至大约20％，大约0.01％至大约10％，大约0.02％至大约50％，大约0.05％至大约50％，大约0.1％至大约50％，或0.1％至大约20％(w/w)。
在一些实施方式中，异戊二烯组合物包括下列一项或多项：醇、醛、或酮(例如本文中描述的醇、醛、或酮中的任意项)。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包括(i)醇和醛；(ii)醇和酮；(iii)醛和酮；或(iv)醇、醛、和酮。
在一些实施方式中，异戊二烯组合物包括下列一项或多项：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3-甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇、或吲哚。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含1ppm或更多的下列一项或多项：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3-甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇、或吲哚。在一些实施方式中，异戊二烯组合物(例如纯化前的废气)中的下列一项或多项的浓度是大约1至大约10,000ppm：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3-甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇、或吲哚。在一些实施方式中，异戊二烯组合物(例如经历一个或多个纯化步骤之后的废气)包括下列一项或多项：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3-甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇、或吲哚，其浓度为大约1至大约100ppm，例如大约1至大约10ppm，大约10至大约20ppm，大约20至大约30ppm，大约30至大约40ppm，大约40至大约50ppm，大约50至大约60ppm，大约60至大约70ppm，大约70至大约80ppm，大约80至大约90ppm，或大约90至大约100ppm。可以使用标准方法例如本文描述的那些方法或其它标准方法例如质子转移反应质谱(见，例如，Bunge等人，Applied and Environmental Microbiology，74(7)：2179-2186，2008，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于分析挥发性有机化合物的内容)分析来自细胞培养物的挥发性有机化合物(例如，细胞培养物的顶空中的挥发性有机化合物)。
在一些实施方式中，组合物包含大于大约2mg异戊二烯，例如大于或大约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000mg异戊二烯。在一些实施方式中，组合物包含大于或大约2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100g异戊二烯。在一些实施方式中，组合物中异戊二烯的量是大约2至大约5,000mg，例如大约2至大约100mg，大约100至大约500mg，大约500至大约1,000mg，大约1,000至大约2,000mg，或大约2,000至大约5,000mg。在一些实施方式中，组合物中异戊二烯的量是大约20至大约5,000mg，大约100至大约5,000mg，大约200至大约2,000mg，大约200至大约1,000mg，大约300至大约1,000mg，或大约400至大约1,000mg。在一些实施方式中，组合物中大于或大约20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％重量的挥发性有机级份是异戊二烯。
在一些实施方式中，组合物包含乙醇。在一些实施方式中，组合物包含大约75％至大约90％重量的乙醇，例如大约75％至大约80％、大约80％至大约85％、或大约85％至大约90％重量的乙醇。在组合物包含乙醇的一些实施方式中，组合物还包含大约4％至大约15％重量的异戊二烯，例如大约4％至大约8％、大约8％至大约12％、或大约12％至大约15％重量的异戊二烯。
在本文所述的一些实施方式中，包含编码异戊二烯合酶多肽、DXS多肽、IDI多肽、和/或MVA途径多肽的一种或多种异源核酸的细胞生产大于或大约在基本上相同的条件下生长的不含所述一种或多种异源核酸的对应细胞生产的类异戊二烯化合物的量的2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍、或更多的量的类异戊二烯化合物(例如在一个或多个IPP分子与一个或多个DMAPP分子的反应中形成的具有10个或更多个碳原子的化合物)。在本文所述的一些实施方式中，包含编码异戊二烯合酶多肽、DXS多肽、IDI多肽、和/或MVA途径多肽的一种或多种异源核酸的细胞生产大于或大约在基本上相同的条件下生长的不含所述一种或多种异源核酸的对应细胞生产的C5异戊二烯基醇的量的2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍、或更多的量的C5异戊二烯基醇(例如，3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)。
示例性的生物异戊二烯和氢的共同生产
在一些实施方式中，包含可操作地连接于启动子的编码异戊二烯合酶多肽、DXS多肽、IDI多肽、和/或MVA途径多肽的一种或多种异源核酸的本文描述的任意的生产异戊二烯的细胞还包含也可操作地连接于启动子的编码一种或多种氢化酶多肽或参与调节或表达氢化酶多肽(例如氢化酶成熟蛋白或转录因子)一种或多种多肽的异源核酸。在一些实施方式中，包含可操作地连接于启动子的编码异戊二烯合酶多肽、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径多肽、一种或多种氢化酶多肽或参与调节或表达氢化酶多肽的一种或多种多肽的一种或多种异源核酸的本文描述的任意的生产异戊二烯的细胞还包含失活下列多肽的突变或缺失：参与生产发酵副产物的一种或多种多肽，参与调节或表达用于生产发酵副产物的基因的一种或多种多肽，或参与氢的重摄取的一种或多种多肽。此类细胞能够共同生产异戊二烯和氢。
在本文所述的任意方面的一些实施方式中，细胞是细菌细胞，例如革兰氏阳性细菌(例如，芽孢杆菌属细胞，例如枯草芽孢杆菌细胞；或链霉菌属细胞，例如浅青紫链霉菌、天蓝色链霉菌、或灰色链霉菌细胞)。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，细胞是革兰氏阴性细菌细胞(例如，埃希菌属细胞，例如大肠杆菌细胞；红假单胞菌属，例如沼泽红假单胞菌细胞；假单胞菌属，例如荧光假单胞菌细胞或恶臭假单胞菌细胞；泛菌属细胞，例如柠檬泛菌细胞)。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，细胞是真菌细胞，例如丝状真菌细胞(例如，木霉菌属细胞，例如里氏木霉细胞；或曲霉菌属细胞，例如米曲霉和黑曲霉)或酵母细胞(例如，耶氏酵母属细胞，例如解脂耶氏酵母细胞；或酵母属细胞，例如酿酒酵母)。
在本文所述的任意方面的一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是来自植物的多肽，例如葛属(例如越南葛藤或葛根)，或白杨(例如美洲山杨，银白杨，欧洲黑杨，毛果杨，或杂交体银白杨x欧洲山杨)。
在本文所述的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含编码IDI多肽的异源核酸。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含插入编码IDI多肽的内源核酸的拷贝。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含编码DXS多肽的异源核酸。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含插入编码DXS多肽的内源核酸的拷贝。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含编码IDI多肽和DXS多肽的一种或多种异源核酸。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，一个核酸编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽、和DXS多肽。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，一个载体编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽、和DXS多肽。在一些实施方式中，载体包含选择性标志物或可选择标志物，例如抗生素抗性核酸。
在本文所述的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含编码MVA途径多肽(例如来自酿酒酵母或粪肠球菌的MVA途径多肽)的异源核酸。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含插入编码MVA途径多肽(例如来自酿酒酵母或粪肠球菌的MVA途径多肽)的内源核酸的拷贝。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，细胞包含异戊二烯合酶、DXS、和MVA途径核酸。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，细胞包含异戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸、和MVA途径核酸。
在一些实施方式中，本文描述的生产异戊二烯的细胞还包含编码与启动子可操作地连接的氢化酶多肽的异源核酸。在一些实施方式中，氢化酶多肽包含大肠杆菌氢化酶-1(Hyd-1)、大肠杆菌氢化酶-2(Hyd-2)、大肠杆菌氢化酶-3(Hyd-3)、大肠杆菌氢化酶-4(Hyd-4)、大肠杆菌甲酸氢裂解酶(FHL)复合物(其在无氧条件下在酸性pH时从甲酸和CO2生产氢气)、不透明红球菌MR11氢化酶(不透明红球菌HoxH)、蓝藻PCC 6803氢化酶(Syn.PCC 6803 HoxH)、巨大脱硫弧菌氢化酶(D.gigas)、和脱硫脱硫弧菌ATCC 7757氢化酶(D.desulfuricans)。在一些实施方式中，还包含编码与启动子可操作地连接的氢化酶多肽的异源核酸的生产异戊二烯的细胞还包含大肠杆菌氢化酶-3(Hyd-3)、大肠杆菌丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)、和大肠杆菌甲酸氢裂解酶(FHL)复合物。
在一些实施方式中，氢化酶多肽编码铁氧还蛋白依赖性氢化酶多肽。在一些实施方式中，铁氧还蛋白依赖性氢化酶多肽包括Clostridiumacetobutulicum氢化酶A(HydA)，其可以与下列一项或多项联合表达：(1)枯草芽孢杆菌NADPH铁氧还蛋白氧化还原酶(NFOR)或Clostridiumkluyveri NADH铁氧还蛋白氧化还原酶(RnfCDGEAB)，Clostridiumpasteuranium铁氧还蛋白氧化还原酶(Fdx)；(2)甘油醛-6-磷酸铁氧还蛋白氧化还原酶(GAPOR)；或(3)丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶(“POR”)。在一些实施方式中，铁氧还蛋白依赖性氢化酶多肽Clostridiumacetobutulicum氢化酶A(HydA)与三种HydA相关的成熟酶(HydE、HydG、和HydF)一起表达，并且还与下列一项或多项联合表达：(1)枯草芽孢杆菌NADPH铁氧还蛋白氧化还原酶(NFOR)或Clostridiumkluyveri NADH铁氧还蛋白氧化还原酶(RnfCDGEAB)，Clostridiumpasteuranium铁氧还蛋白氧化还原酶(Fdx)；(2)甘油醛-6-磷酸铁氧还蛋白氧化还原酶(GAPOR)；或(3)丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶(POR)。
在一些实施方式中，氢化酶多肽编码NADPH依赖性氢化酶多肽。在一些实施方式中，NADPH依赖性氢化酶多肽包括Pyrococcus furiosus氢化酶。在一些实施方式中，氢化酶多肽编码氧耐受性氢化酶。在一些实施方式中，氧耐受性氢化酶包括胶状红环菌氢化酶和真氧产碱杆菌氢化酶。
在一些实施方式中，本文描述的生产异戊二烯的细胞还包含失活参与调节氢化酶活性的基因的突变或缺失，例如铁-硫复合物转录调节子(iscR)(Kalim-Akhtar等人，“Deletion of iscR stimulates recombinantClostridial Fe/Fe hydrogenase activity and H2-accumulation inEscherichia coli BL21(DE3)，”Appl.Microbiol.Biotechnol.78：853-862(2008)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于梭状芽胞杆菌(Clostridial)Fe/Fe氢化酶活性的刺激和通过缺失iscR基因而在大肠杆菌中积累氢的内容)。
在一些实施方式中，本文描述的生产异戊二烯的细胞还包含失活编码一种或多种参与产生发酵副产物例如乳酸、乙酸、丙酮酸、乙醇、琥珀酸、和甘油的细胞多肽的基因的突变或缺失。在一些实施方式中，参与产生发酵副产物的失活的多肽包括编码下列的一种或多种多肽：甲酸脱氢酶Nα亚基(fdnG)，甲酸脱氢酶O大亚基(fdoG)，硝酸还原酶(narG)，甲酸转运子A(focA)，甲酸转运子B(focB)，丙酮酸氧化酶(poxB)，丙酮酸脱氢酶E1成分ackA/pta(aceE)，醇脱氢酶(adhE)，延胡索酸还原酶膜蛋白(frdC)，或乳酸脱氢酶(ldhA)。
在一些实施方式中，本文描述的生产异戊二烯的细胞还包含失活编码参与调节或表达参与产生发酵副产物的基因的一种或多种细胞多肽的基因的突变或缺失。在一些实施方式中，参与调节或表达参与产生发酵副产物的基因的失活的多肽包括甲酸氢裂解酶阻抑子(hycA)、延胡索酸还原酶调节子(fnr)、乙酰基-辅酶A合成酶(acs)、和甲酸脱氢酶调节蛋白(hycA)。
在一些实施方式中，本文描述的生产异戊二烯的细胞还包含失活编码一种或多种参与氢重摄取的细胞多肽的基因的突变或缺失。在一些实施方式中，参与氢重摄取的失活的多肽包括大肠杆菌氢化酶-1(Hyd-1)(hya操纵子)和大肠杆菌氢化酶-2(Hyd-2)(hyb操纵子)。
在本文所述的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子多肽或核酸可操作地连接于T7启动子，例如包含于中等或高拷贝质粒中的T7启动子。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子核酸可操作地连接于Trc启动子，例如包含于中等或高拷贝质粒中的Trc启动子。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子核酸可操作地连接于Lac启动子，例如包含于低拷贝质粒中的Lac启动子。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子核酸可操作地连接于内源性启动子，例如内源性碱性丝氨酸蛋白酶启动子。在一些实施方式中，异源异戊二烯合酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子核酸整合进入不含选择性标志物或不含可选择标志物的细胞染色体。
在一些实施方式中，一种或多种MVA途径、IDI、DXS、异戊二烯合酶、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子核酸被置于在稳定期比在生长期活性更高的启动子或因子的控制下。例如，一种或多种MVA途径、IDI、DXS、异戊二烯合酶、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子核酸可以被置于稳定期σ因子例如RpoS控制下。在一些实施方式中，一种或多种MVA途径、IDI、DXS、异戊二烯合酶、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子核酸被置于在稳定期可被诱导的启动子控制下，例如可以被在稳定期有活性的应答调节子诱导的启动子。
在本文所述的任意方面的一些实施方式中，细胞中的至少一部分在持续培养(例如不稀释的持续培养)中保持异源异戊二烯合酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子核酸至少或大约5、10、20、40、50、60、65、或更多次细胞分裂。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，包含异戊二烯合酶、DXS多肽、IDI多肽、MVA途径、氢化酶、氢化酶成熟或转录因子核酸的核酸还包含选择性标志物或可选择标志物，例如抗生素抗性核酸。
在本文所述的任意方面的一些实施方式中，在限氧条件下在本文描述的任意培养基中培养共同生产异戊二烯和氢的细胞，以促进细胞共同生产异戊二烯和氢。在一些实施方式中，细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，细胞生长于存在0.5摩尔氧/摩尔异戊二烯的情况下。在一些实施方式中，细胞在不存在氧的情况下无氧地生长。
在一些实施方式中，本文描述的任意细胞生长于限氧培养物中并且共同生产异戊二烯和氢。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞以大于大约400nmole/gwcm/hr的速率生产异戊二烯，并且以大于大约125nmole/gwcm/hr的速率生产氢。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞以大约400nmole/gwcm/hr至大约2.0×105nmole/gwcm/hr的速率生产异戊二烯，并且以大约125nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr的速率生产氢。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞以下列速率生产异戊二烯：大约400nmole/gwcm/hr至大约2.0×105nmole/gwcm/hr，大约500nmole/gwcm/hr至大约1.5×105nmole/gwcm/hr，大约750nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约1000nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约2500nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约5000nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约7500nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，和大约1×104nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞生产大于大约400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、或更多nmole/gwcm/hr的异戊二烯。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞以下列速率生产氢：大约125nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约250nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约500nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约750nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约1000nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约1250nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约2500nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约5000nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约7500nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，和大约1.00×104nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞生产大于大约125、250、500、750、1000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、或更多nmole/gwcm/hr的氢。
在一些实施方式中，本文描述的任意细胞生长于限氧培养物中并且共同生产异戊二烯和氢。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有大于大约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯的平均体积生产率和大于大约0.005mg/L培养液/hr的氢的平均体积生产率。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有大于大约1000mg/L培养液/hr的异戊二烯的峰值体积生产率和大于大约5mg/L培养液/hr的氢的峰值体积生产率。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有大于大约3000mg/L培养液/hr的异戊二烯的峰值体积生产率和大于大约5mg/L培养液/hr的氢的峰值体积生产率。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有大于大约5000mg/L培养液/hr的异戊二烯的峰值体积生产率和大于大约5mg/L培养液/hr的氢的峰值体积生产率。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有大约0.1mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr的异戊二烯的平均体积生产率和大约0.005mg/L培养液/hr至大约5mg/L培养液/hr的氢的平均体积生产率。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞具有下列的异戊二烯的平均体积生产率：大约1mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约5mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约10mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约25mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约50mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约100mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约250mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约500mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，大约1000mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr，和大约2500mg/L培养液/hr至大约5000mg/L培养液/hr；以及下列的氢的平均体积生产率：大约0.01mg/L培养液/hr至大约5mg/L培养液/hr，大约0.025mg/L培养液/hr至大约5mg/L培养液/hr，大约0.05mg/L培养液/hr至大约5mg/L培养液/hr，大约0.1mg/L培养液/hr至大约5mg/L培养液/hr，大约0.25mg/L培养液/hr至大约5mg/L培养液/hr，大约0.5mg/L培养液/hr至大约5mg/L培养液/hr，大约1mg/L培养液/hr至大约5mg/L培养液/hr，和大约2.5mg/L培养液/hr至大约5mg/L培养液/hr。
在一些实施方式中，本文描述的任意细胞生长于限氧培养物中并且共同生产异戊二烯和氢。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞将大于大约0.002摩尔％的所述细胞从细胞培养基中消耗的碳转化为异戊二烯，并且生产的氢相当于大于大约0.024摩尔％的所述细胞从细胞培养基中消耗的碳。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞将大于大约0.002摩尔％的所述细胞从细胞培养基中消耗的碳转化为异戊二烯，并且生产的氢相当于大于大约400摩尔％的所述细胞从细胞培养基中消耗的碳。
在一些实施方式中，本文描述的任意的共同生产异戊二烯和氢的细胞生长于限氧培养物中。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞共同生产异戊二烯和氢，其比例范围为至少1摩尔％的异戊二烯/3摩尔％的氢至至少1摩尔％的异戊二烯/4摩尔％的氢。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞生产含有1至11摩尔％异戊二烯和3至33摩尔％氢的废气。在一些实施方式中，细胞生产含有1至11摩尔％的异戊二烯和4至44摩尔％氢的废气。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞还生产氧、二氧化碳、或氮。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞生产含有0至21摩尔％氧、18至44摩尔％二氧化碳、和0至78摩尔％氮的废气。
在另一个方面，本文提供了限氧培养物中的共同生产异戊二烯和氢的细胞，其包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中所述细胞：(i)以大于大约400nmole/gwcm/hr的速率生产异戊二烯，并且以大于大约125nmole/gwcm/hr的速率生产氢；(ii)具有大于大约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯的平均体积生产率和大于大约0.005mg/L培养液/hr的氢的平均体积生产率；或(iii)将大于大约0.002摩尔％的细胞从细胞培养基中消耗的碳转化为异戊二烯，并且生产的氢相当于大于大约0.024摩尔％的所述细胞从细胞培养基中消耗的碳。
在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中所述异源核酸与启动子可操作地连接，并且其中所述细胞生产大于大约400nmole/gwcm/hr的异戊二烯和大于大约125nmole/gwcm/hr的氢。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中所述异源核酸与启动子可操作地连接，并且其中所述细胞具有大于大约0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯的平均体积生产率和大于大约0.005mg/L培养液/hr的氢的平均体积生产率。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，其中所述异源核酸与启动子可操作地连接，并且其中所述细胞将大于大约0.002摩尔％的细胞从细胞培养基中消耗的碳转化为异戊二烯，并且将大于大约0.024摩尔％的细胞从细胞培养基中消耗的碳转化为氢。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。
在一些实施方式中，包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸的限氧培养物中的细胞以下列速率生产异戊二烯：大约400nmole/gwcm/hr至大约2.0×105nmole/gwcm/hr，大约500nmole/gwcm/hr至大约1.5×105nmole/gwcm/hr，大约750nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约1000nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约2500nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约5000nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约7500nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，和大约1×104nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，并且以下列速率生产氢：大约125nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约250nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约500nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约750nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约1000nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约1250nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约2500nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约5000nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约7500nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，和大约1.00×104nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr。
在一些实施方式中，本文提供了共同生产异戊二烯和氢的方法，所述方法包括：(a)在适合于共同生产异戊二烯和氢的条件下培养细胞；和(b)共同生产异戊二烯和氢，其中所述细胞生产大于大约400nmole/gwcm/小时的异戊二烯，并且其中所述细胞生产大于大约125nmole/gwcm/hr的氢。
在一些实施方式中，包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸的限氧培养物中的细胞以下列速率生产异戊二烯：大约400nmole/gwcm/hr至大约2.0×105nmole/gwcm/hr，大约500nmole/gwcm/hr至大约1.5×105nmole/gwcm/hr，大约750nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约1000nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约2500nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约5000nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，大约7500nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，和大约1×104nmole/gwcm/hr至大约1×105nmole/gwcm/hr，并且以下列速率生产氢：大约125nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约250nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约500nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约750nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约1000nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约1250nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约2500nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约5000nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，大约7500nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr，和大约1.00×104nmole/gwcm/hr至大约1.25×104nmole/gwcm/hr。
在一些实施方式中，本文提供了共同产生异戊二烯和氢的方法，所述方法包括：(a)在适合共同产生异戊二烯和氢的条件下培养细胞；和(b)共同产生异戊二烯和氢，其中所述细胞具有大于约0.1mg/L培养液/小时的异戊二烯平均体积生产率和大于约0.005mg/L培养液/小时的氢平均体积生产率。
在一些实施方式中，本文提供了共同产生异戊二烯和氢的方法，所述方法包括：(a)在适合共同产生异戊二烯和氢的条件下培养细胞；和(b)共同产生异戊二烯和氢，其中所述细胞将多于约0.002摩尔％的所述细胞从细胞培养基中消耗的碳转化为异戊二烯，并且产生与多于约0.024摩尔％的所述细胞从细胞培养基中消耗的碳等同的氢。
在一些实施方式中，本文提供了组合物，其包含比例范围为至少1摩尔％的异戊二烯/3摩尔％的氢至至少1摩尔％的异戊二烯/4摩尔％的氢的异戊二烯和氢，以及0.1摩尔％或更少的挥发性杂质。在一些实施方式中，组合物还包含1至11摩尔％的异戊二烯和4至44摩尔％的氢。在一些实施方式中，组合物还包含氧、二氧化碳、或氮。在一些实施方式中，组合物还包含0至21摩尔％的氧、18至44摩尔％的二氧化碳、和0至78摩尔％的氮。在一些实施方式中，组合物还包含1.0×10-4摩尔％或更少的非甲烷挥发性杂质。在一些实施方式中，非甲烷挥发性杂质包括下列一项或多项：2-庚酮，6-甲基-5-庚烯-2-酮，2，4，5-三甲基吡啶，2，3，5-三甲基吡嗪，香茅醛，乙醛，甲硫醇，乙酸甲酯，1-丙醇，丁二酮，2-丁酮，2-甲基-3-丁烯-2-醇，乙酸乙酯，2-甲基-1-丙醇，3-甲基-1-丁醛，3-甲基-2-丁酮，1-丁醇，2-戊酮，3-甲基-1-丁醇，异丁酸乙酯，3-甲基-2-丁烯醛，乙酸丁酯，3-甲基丁基乙酸酯，3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯，3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯，3-己烯-1-醇，3-己烯-1-基乙酸酯，柠檬烯，香叶醇(反式-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇)，香茅醇(3，7-二甲基-6-辛烯-1-醇)，(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯，(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯，2，3-环庚烯醇吡啶，或线性异戊二烯聚合物(例如，源自多个异戊二烯单元的聚合的线性异戊二烯二聚体或线性异戊二烯三聚体)。在一些实施方式中，非甲烷挥发性杂质包括下列一项或多项：异戊二烯组合物包括下列一项或多项：醇、醛、或酮(例如本文中描述的醇、醛、或酮中的任意项)。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包括(i)醇和醛；(ii)醇和酮；(iii)醛和酮；或(iv)醇、醛、和酮。在一些实施方式中，非甲烷挥发性杂质包括下列一项或多项：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3-甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇、或吲哚。
本文还提供了共同生产异戊二烯和氢的方法，所述方法包括：a)在适合于共同生产异戊二烯和氢的条件下培养细胞；和b)共同生产异戊二烯和氢，其中由限氧培养物中的细胞生产的异戊二烯的峰值浓度是大于大约10ng/L培养液，并且细胞的氢释放速率是大于大约0.0025mmol/L培养 液/小时。在任意这些方法的一些实施方式中，氢释放速率是大约下列任意项：0.0025mmol/L培养液/hr至大约10mmol/L培养液/hr，大约0.0025mmol/L培养液/hr至大约5mmol/L培养液/hr，大约0.0025mmol/L培养液/hr至大约2.5mmol/L培养液/hr，大约0.0025mmol/L培养液/hr至大约1mmol/L培 养液/hr，大约0.0025mmol/L培养液/hr至大约0.5mmol/L培养液/hr，大约0.0025mmol/L培养液/hr至大约0.25mmol/L培养液/hr，大约0.0025mmol/L培养液/hr至大约0.025mmol/L培养液/hr，大约0.025mmol/L培养液/hr至大约0.5mmol/L培养液/hr，大约0.025mmol/L培养液/hr至大约1mmol/L培养液/hr，大约0.025mmol/L培养液/hr至大约2.5mmol/L培养液/hr，大约0.025mmol/L培 养液/hr至大约5mmol/L培养液/hr，大约0.025mmol/L培养液/hr至大约10mmol/L培养液/hr，大约0.25mmol/L培养液/hr至1mmol/L培养液/hr，大约0.25mmol/L培养液/hr至2.5mmol/L培养液/hr，大约0.25mmol/L培养液/hr至2.5mmol/L培养液/hr，和大约0.25mmol/L培养液/hr至10mmol/L培养液/hr。
本文还提供了共同生产异戊二烯和氢的方法，所述方法包括：a)在适合于共同生产异戊二烯和氢的条件下培养细胞；和b)共同生产异戊二烯和氢，其中异戊二烯的液相浓度是小于大约200mg/L，细胞生产大于大约400nmole/gwcm/小时的异戊二烯，并且细胞的氢释放速率是大于大约0.0025mmol/L/小时。在一些实施方式中，培养物中的异戊二烯的液相浓度是小于大约下列任意项：175mg/L，150mg/L，125mg/L，100mg/L，75mg/L，50mg/L，25mg/L，20mg/L，15mg/L，10mg/L，5mg/L，或2.5mg/L。在一些实施方式中，培养物中的异戊二烯的液相浓度是大约下列任意项：0.1mg/L至200mg/L，1mg/L至200mg/L，1mg/L至150mg/L，1mg/L至100mg/L，1mg/L至50mg/L，1mg/L至25mg/L，1mg/L至20mg/L，或10mg/L至20mg/L。在任意这些方法的一些实施方式中，氢释放速率是大约下列任意项：0.0025mmol/L培养液/hr至大约10mmol/L培养液/hr，大约0.0025mmol/L培养液/hr至大约5mmol/L培养液/hr，大约0.0025mmol/L培养液/hr至大约2.5mmol/L培养液/hr，大约0.0025mmol/L培养液/hr至大约1mmol/L培养液/hr，大约0.0025mmol/L培养液/hr至大约0.5mmol/L培养液/hr，大约0.0025mmol/L培养液/hr至大约0.25mmol/L培养液/hr，大约0.0025mmol/L培养液/hr至大约0.025mmol/L培养液/hr，大约0.025mmol/L培养液/hr至大约0.5mmol/L培养液/hr，大约0.025mmol/L培养液/hr至大约1mmol/L培养液/hr，大约0.025mmol/L培养液/hr至大约2.5mmol/L培养液/hr，大约0.025mmol/L培养液/hr至大约5mmol/L培养液/hr，大约0.025mmol/L培养液/hr至大约10mmol/L培养液/hr，大约0.25mmol/L培养液/hr至1mmol/L培养液/hr，大约0.25mmol/L培养液/hr至2.5mmol/L培养液/hr，大约0.25mmol/L培养液/hr至2.5mmol/L培养液/hr，和大约0.25mmol/L培养液/hr至10mmol/L培养液/hr。
在一个方面，本文提供了共同生产异戊二烯和氢的限氧培养物中的细胞。在一些实施方式中，限氧培养物是无氧的。在一些实施方式中，限氧培养物中的细胞生产大于大约400nmole/gwcm/hr的异戊二烯和大于大约125nmole/gwcm/hr的氢。在一些实施方式中，细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞培养于包括碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的成分、或前述两项或更多项的任意组合。在一些实施方式中，细胞培养于限葡萄糖的条件下。
在一些实施方式中，本文提供了限氧培养物中的细胞，其将大于大约0.002％的细胞培养基中的碳转化为异戊二烯，并且生产的氢相当于大于大约0.024摩尔％的细胞培养基中的碳。在一些实施方式中，限氧培养物是无氧的。在一些实施方式中，细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞培养于包括碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的成分、或前述两项或更多项的任意组合。在一些实施方式中，细胞培养于限葡萄糖的条件下。
在一些实施方式中，本文提供了限氧培养物中的细胞，其包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸。在一些实施方式中，限氧培养物是无氧的。在一些实施方式中，细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞培养于包括碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的成分，或前述两项或更多项的任意组合。在一些实施方式中，细胞培养于限葡萄糖的条件下。
在一个方面，本文提供了共同生产异戊二烯和另一种化合物的方法，例如使用本文描述的任意细胞共同生产异戊二烯和氢的方法。在一些实施方式中，该方法包括在足以生产大于大约400nmole/gwcm/hr异戊二烯和大于大约125nmole/gwcm/hr氢的限氧条件下培养细胞。在一些实施方式中，限氧培养物是无氧的。在一些实施方式中，该方法还包括回收细胞生产的异戊二烯和氢。在一些实施方式中，该方法还包括纯化细胞生产的异戊二烯和氢。在一些实施方式中，该方法包括使异戊二烯聚合。在一些实施方式中，细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞培养于包括碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的成分，或前述两项或更多项的任意组合。在一些实施方式中，细胞培养于限葡萄糖的条件下。在多个实施方式中，稳定期期间所生产的异戊二烯的量(例如生产的异戊二烯的总量或生产的异戊二烯的量/升培养液/小时/OD600)大于或大约是生长期期间的相同时间长度所生产的异戊二烯的量的2倍或更多倍。
在一些实施方式中，方法包括在足以将大于大约0.002％的细胞培养基中的碳(mol/mol)转化为异戊二烯并生产的氢相当于大于大约0.024摩尔％的细胞培养基中的碳的限氧条件下培养细胞。在一些实施方式中，限氧培养物是无氧的。在一些实施方式中，该方法还包括回收细胞生产的异戊二烯和氢。在一些实施方式中，该方法还包括纯化细胞生产的异戊二烯和氢。在一些实施方式中，该方法包括使异戊二烯聚合。在一些实施方式中，细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞培养于包括碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的成分，或前述两项或更多项的任意组合。
在本文所述的任意方面的一些实施方式中，微生物多肽碳源包括来自酵母或细菌的一种或多种多肽。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，植物多肽碳源包括来自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈、花生、向日葵、椰子、芥、油菜籽、棉花籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、或亚麻仁的一种或多种多肽。
在一些实施方式中，仅在稳定期共同生产异戊二烯和氢。在一些实施方式中，在生长期和稳定期都共同生产异戊二烯和氢。在多个实施方式中，在稳定期期间生产的异戊二烯的量(例如所生产的异戊二烯的总量或所生产的异戊二烯的量/升培养液/小时/OD600)是大于或大约生长期期间的相同时间长度所生产的异戊二烯量的2、3、4、5、10、20、30、40、50、或更多倍。在多个实施方式中，在稳定期期间生产的氢的量(例如所生产的氢的总量或所生产的氢的量/升培养液/小时/OD600)是大于或大约生长期期间的相同时间长度生产的氢的量的2、3、4、5、10、20、30、40、50、或更多倍。
在一些实施方式中，本文提供的组合物包含氢和重量占组合物中所有C5烃的总重量的大于或大约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％、或100％的异戊二烯。在一些实施方式中，组合物包含重量占组合物中所有C5烃总重量的小于或大约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的除了异戊二烯之外的C5烃(例如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，组合物具有重量占组合物中所有C5烃总重量的小于或大约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔。在具体的实施方式中，组合物具有大于大约2mg异戊二烯并具有重量占组合物中所有C5烃总重量的大于或大约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％、或100％的异戊二烯。在一些实施方式中，对于组合物中抑制异戊二烯聚合的任意化合物，组合物具有小于或大约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的抑制异戊二烯聚合的化合物。在具体的实施方式中，组合物还包含大于大约2mg的异戊二烯和大于大约0.48mg的氢。
在一些实施方式中，对于气相的挥发性有机级份中抑制异戊二烯聚合的任意化合物，气相的挥发性有机级份具有小于或大约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的抑制异戊二烯聚合的化合物。在具体的实施方式中，气相的挥发性有机级份还具有大于大约2mg的异戊二烯和大于大约0.48mg的氢。
在一些实施方式中，该系统包括本文所述的任意的细胞和/或组合物。在一些实施方式中，该系统包括反应器，其反应室包含在限氧培养物中的细胞，所述细胞产生大于约400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、或更多nmole/gwcm/小时的异戊二烯和大于约125、250、500、750、1000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500、10,000、或更多nmole/gwcm/小时的氢。在一些实施方式中，该系统不是封闭的系统。在一些实施方式中，至少一部分异戊二烯从该系统移出。在一些实施方式中，该系统包括了包含异戊二烯和氢的气相。在多种实施方式中，所述气相包含本文所述的任意组合物。
在一个方面，通过本文所述的任意组合物或方法产生的产物是本文的特征。
高异戊二烯效价时的细胞存活性
异戊二烯是由很多植物、动物、和微生物分泌的疏水性分子。细菌，例如芽孢杆菌，以非常低的水平产生异戊二烯。虽然有一些证据证明植物分泌异戊二烯以辅助热保护，已经假设异戊二烯可能具有拮抗蓝细菌或真菌的作用，或作为抗微生物剂。见，例如，Ladygina等人，ProcessBiochemistry 41：1001-1014(2006)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于异戊二烯的拮抗性作用的内容。由于在自然界中发生的非常低的产生水平已足以抗微生物，所以引起极大关注的是，商业化异戊二烯所需的异戊二烯的效价和生产率水平将杀死宿主微生物。
我们已经发现了生产用于商业化异戊二烯并同时保持细胞存活性和/或代谢活性(如通过二氧化碳释放速率或总的二氧化碳释放速率所指示)的异戊二烯效价和生产率水平的方法。
本文提供了生产异戊二烯的方法，其包括：a)在适合于生产异戊二烯的条件下培养细胞；和b)生产异戊二烯，其中所述细胞生产大于大约400nmole/gwcm/小时的异戊二烯，并且细胞的二氧化碳释放速率大于大约1x 10-18mmol/L/小时。在一些实施方式中，所生产的异戊二烯是标题为“示例性的异戊二烯的生产”的部分所公开的任意浓度或量。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约下列任意项：400nmole/gwcm/小时至1mole/gwcm/小时，400nmole/gwcm/小时至1mmole/gwcm/小时，400nmole/gwcm/小时至40mmole/gwcm/小时，400nmole/gwcm/小时至4mmole/gwcm/小时，1mmole/gwcm/小时至1.5mmole/gwcm/小时，1.5mmole/gwcm/小时至3mmole/gwcm/小时，3mmole/gwcm/小时至5mmole/gwcm/小时，5mmole/gwcm/小时至25mmole/gwcm/小时，25mmole/gwcm/小时至100mmole/gwcm/小时，100mmole/gwcm/小时至500mmole/gwcm/小时，或500mmole/gwcm/小时至1000mmole/gwcm/小时。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约下列任意项：1mmole/gwcm/小时，1.5mmole/gwcm/小时，2mmole/gwcm/小时，3mmole/gwcm/小时，4mmole/gwcm/小时，或5mmole/gwcm/小时。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约下列任意项：1x 10-18mmol/L/小时至大约1mol/L/小时，1mmol/L/小时至1mol/L/小时，25mmol/L/小时至750mmol/L/小时，25mmol/L/小时至75mmol/L/小时，250mmol/L/小时至750mmol/L/小时，或450mmol/L/小时至550mmol/L/小时。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约下列任意项：50mmol/L/小时，100mmol/L/小时，150mmol/L/小时，200mmol/L/小时，250mmol/L/小时，300mmol/L/小时，350mmol/L/小时，400mmol/L/小时，450mmol/L/小时，或500mmol/L/小时。
本文还提供了生产异戊二烯的方法，其包括：a)在适合于生产异戊二烯的条件下培养细胞；和b)生产异戊二烯，其中细胞生产大于大约400nmole/gwcm/小时的异戊二烯，并且细胞存活性降低小于大约2倍。在一些实施方式中，所生产的异戊二烯是标题为“示例性的异戊二烯的生产”的部分所公开的任意浓度或量。在一些实施方式中，异戊二烯的量大约下列任意项：400nmole/gwcm/小时至1mole/gwcm/小时，400nmole/gwcm/小时至1mmole/gwcm/小时，400nmole/gwcm/小时至40mmole/gwcm/小时，400nmole/gwcm/小时至4mmole/gwcm/小时，1mmole/gwcm/小时至1.5mmole/gwcm/小时，1.5mmole/gwcm/小时至3mmole/gwcm/小时，3mmole/gwcm/小时至5mmole/gwcm/小时，5mmole/gwcm/小时至25mmole/gwcm/小时，25mmole/gwcm/小时至100mmole/gwcm/小时，100mmole/gwcm/小时至500mmole/gwcm/小时，或500mmole/gwcm/小时至1000mmole/gwcm/小时。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约下列任意项：1mmole/gwcm/小时，1.5mmole/gwcm/小时，2mmole/gwcm/小时，3mmole/gwcm/小时，4mmole/gwcm/小时，或5mmole/gwcm/小时。在一些实施方式中，细胞存活性降低小于大约下列任意项：1.75倍，1.5倍，1.25倍，1倍，0.75倍，0.5倍，或0.25倍。在一些实施方式中，细胞存活性下降大约2倍。
本文还提供了生产异戊二烯的方法，其包括：a)在适合于生产异戊二烯的条件下培养细胞；和b)生产异戊二烯，其中所述培养物中的细胞生产的异戊二烯的累积总生产率是大于大约0.2mg/L培养液/小时，并且细胞的二氧化碳释放速率是大于大约1x 10-18mmol/L/小时。在一些实施方式中，异戊二烯的累积总生产率是标题为“示例性的异戊二烯的生产”的部分所公开的任意浓度或量。在一些实施方式中，异戊二烯的累积总生产率是大约下列任意项：0.2mg/L培养液/小时至5g/L培养液/小时，0.2mg/L培养液/小时至1g/L培养液/小时，1g/L培养液/小时至2.5g/L培养液/小时，2.5g/L培 养液/小时至5g/L培养液/小时。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约下列任意项：1x 10-18mmol/L/小时至大约1mol/L/小时，1mmol/L/小时至1mol/L/小时，25mmol/L/小时至750mmol/L/小时，25mmol/L/小时至75mmol/L/小时，250mmol/L/小时至750mmol/L/小时，或450mmol/L/小时至550mmol/L/小时。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约下列任意项：50mmol/L/小时，100mmol/L/小时，150mmol/L/小时，200mmol/L/小时，250mmol/L/小时，300mmol/L/小时，350mmol/L/小时，400mmol/L/小时，450mmol/L/小时，或500mmol/L/小时。
本文提供了生产异戊二烯的方法，其包括：a)在适合于生产异戊二烯的条件下培养细胞；和b)生产异戊二烯，其中培养物中的细胞生产的异戊二烯的累积总生产率大于大约0.2mg/L培养液/小时，并且细胞的存活性降低小于大约2倍。在一些实施方式中，异戊二烯的累积总生产率是标题为“示例性的异戊二烯的生产”部分所公开的任意浓度或量。在一些实施方式中，异戊二烯的累积总生产率是大约下列任意项：0.2mg/L培养 液/小时至5g/L培养液/小时，0.2mg/L培养液/小时至1g/L培养液/小时，1g/L培养液/小时至2.5g/L培养液/小时，2.5g/L培养液/小时至5g/L培养液/小时。在一些实施方式中，细胞存活性降低小于大约下列任意项：1.75倍，1.5倍，1.25倍，1倍，0.75倍，0.5倍，或0.25倍。
本文还提供了生产异戊二烯的方法，包括：a)在适合于生产异戊二烯的条件下培养细胞；和b)生产异戊二烯，其中培养物中的细胞生产的异戊二烯的峰值浓度大于大约10ng/L培养液，并且细胞的二氧化碳释放速率大于大约1x 10-18mmol/L/小时。在一些实施方式中，异戊二烯的峰值浓度是标题为“示例性的异戊二烯的生产”的部分所公开的任意浓度或量。在一些实施方式中，异戊二烯的峰值浓度是大约下列任意项：10ng/L培养液至500ng/L培养液，500ng/L培养液至1μg/L培养液，1μg/L培养液至5μg/L培养 液，5μg/L培养液至50μg/L培养液，5μg/L培养液至100μg/L培养液，5μg/L培养液至250μg/L培养液，250μg/L培养液至500μg/L培养液，500μg/L培养液至1mg/L培养液，1mg/L培养液至50mg/L培养液，1mg/L培养液至100mg/L培养液，1mg/L培养液至200mg/L培养液，10ng/L培养液至200mg/L培养液，5μg/L培养液至100mg/L培养液，或5μg/L培养液至200mg/L培养液。在一些实施方式中，峰值浓度是下列任意项：大约10ng/L培养液，100ng/L培养液，1μg/L培养液，5μg/L培养液，1mg/L培养液，30mg/L培养液，100mg/L培养液，或200mg/L培养液。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约下列任意项：1x 10-18mmol/L/小时至大约1mol/L/小时，1mmol/L/小时至1mol/L/小时，25mmol/L/小时至750mmol/L/小时，25mmol/L/小时至75mmol/L/小时，250mmol/L/小时至750mmol/L/小时，或450mmol/L/小时至550mmol/L/小时。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约下列任意项：50mmol/L/小时，100mmol/L/小时，150mmol/L/小时，200mmol/L/小时，250mmol/L/小时，300mmol/L/小时，350mmol/L/小时，400mmol/L/小时，450mmol/L/小时，或500mmol/L/小时。
另外，本文还提供了生产异戊二烯的方法，包括：a)在适合于生产异戊二烯的条件下培养细胞；和b)生产异戊二烯，其中培养物中的细胞生产的异戊二烯的峰值浓度大于大约10ng/L培养液，并且细胞存活性降低小于大约2倍。在一些实施方式中，异戊二烯的峰值浓度是标题为“示例性的异戊二烯的生产”的部分所公开的任意浓度或量。在一些实施方式中，异戊二烯的峰值浓度是大约下列任意项：10ng/L培养液至500ng/L培养 液，500ng/L培养液至1μg/L培养液，1μg/L培养液至5μg/L培养液，5μg/L培养液至50μg/L培养液，5μg/L培养液至100μg/L培养液，5μg/L培养液至250μg/L培养液，250μg/L培养液至500μg/L培养液，500μg/L培养液至1mg/L培养液，1mg/L培养液至50mg/L培养液，1mg/L培养液至100mg/L培养液，1mg/L培养液至200mg/L培养液，10ng/L培养液至200mg/L培养液，5μg/L培养液至100mg/L培养液，或5μg/L培养液至200mg/L培养液。在一些实施方式中，峰值浓度是下列任意项：大约10ng/L培养液，100ng/L培养液，1μg/L培养液，5μg/L培养液，1mg/L培养液，30mg/L培养液，100mg/L培养液，或200mg/L培养液。在一些实施方式中，细胞存活性降低小于大约下列任意项：1.75倍，1.5倍，1.25倍，1倍，0.75倍，0.5倍，或0.25倍。在一些实施方式中，细胞存活性降低大约2倍。
还提供了培养物中的细胞，其包含编码异戊二烯合酶多肽的核酸，其中所述细胞生产大于大约400nmole/gwcm/小时的异戊二烯，并且所述细胞的二氧化碳释放速率大于大约1x 10-18mmol/L/小时。在一些实施方式中，生产的异戊二烯是标题为“示例性的异戊二烯的生产”部分所公开的任意浓度和量。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约下列任意项：400nmole/gwcm/小时至1mole/gwcm/小时，400nmole/gwcm/小时至1mmole/gwcm/小时，400nmole/gwcm/小时至40mmole/gwcm/小时，400nmole/gwcm/小时至4mmole/gwcm/小时，1mmole/gwcm/小时至1.5mmole/gwcm/小时，1.5mmole/gwcm/小时至3mmole/gwcm/小时，3mmole/gwcm/小时至5mmole/gwcm/小时，5mmole/gwcm/小时至25mmole/gwcm/小时，25mmole/gwcm/小时至100mmole/gwcm/小时，100mmole/gwcm/小时至500mmole/gwcm/小时，或500mmole/gwcm/小时至1000mmole/gwcm/小时。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约下列任意项：1mmole/gwcm/小时，1.5mmole/gwcm/小时，2mmole/gwcm/小时，3mmole/gwcm/小时，4mmole/gwcm/小时，或5mmole/gwcm/小时。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约下列任意项：1x 10-18mmol/L/小时至大约1mol/L/小时，1mmol/L/小时至1mol/L/小时，25mmol/L/小时至750mmol/L/小时，25mmol/L/小时至75mmol/L/小时，250mmol/L/小时至750mmol/L/小时，或450mmol/L/小时至550mmol/L/小时。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约下列任意项：50mmol/L/小时，100mmol/L/小时，150mmol/L/小时，200mmol/L/小时，250mmol/L/小时，300mmol/L/小时，350mmol/L/小时，400mmol/L/小时，450mmol/L/小时，或500mmol/L/小时。
本文还提供了培养物中的细胞，其包含编码异戊二烯合酶多肽的核酸，其中培养物中的细胞生产的异戊二烯的累积总生产率大于大约0.2mg/L培养液/小时，并且细胞的二氧化碳释放速率大于大约1x 10-18mmol/L/小时。在一些实施方式中，异戊二烯的累积总生产率是标题为“示例性的异戊二烯的生产”部分所公开的任意浓度或量。在一些实施方式中，异戊二烯的累积总生产率是大约下列任意项：0.2mg/L培养液/小时至5g/L培养液/小时，0.2mg/L培养液/小时至1g/L培养液/小时，1g/L培养液/小时至2.5g/L培养液/小时，2.5g/L培养液/小时至5g/L培养液/小时。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约下列任意项：1x 10-18mmol/L/小时至大约1mol/L/小时，1mmol/L/小时至1mol/L/小时，25mmol/L/小时至750mmol/L/小时，25mmol/L/小时至75mmol/L/小时，250mmol/L/小时至750mmol/L/小时，或450mmol/L/小时至550mmol/L/小时。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约下列任意项：50mmol/L/小时，100mmol/L/小时，150mmol/L/小时，200mmol/L/小时，250mmol/L/小时，300mmol/L/小时，350mmol/L/小时，400mmol/L/小时，450mmol/L/小时，或500mmol/L/小时。
另外，本文还提供了培养物中的细胞，其包含编码异戊二烯合酶多肽的核酸，其中培养物中的细胞生产的异戊二烯的峰值浓度大于大约10ng/L培养液，并且细胞的二氧化碳释放速率大于大约1x 10-18mmol/L/小时。在一些实施方式中，异戊二烯的峰值浓度是标题为“示例性的异戊二烯的生产”的部分所公开的任意浓度或量。在一些实施方式中，异戊二烯的峰值浓度是大约下列任意项：10ng/L培养液至500ng/L培养液，500ng/L培养液至1μg/L培养液，1μg/L培养液至5μg/L培养液，5μg/L培养液至50μg/L培养液，5μg/L培养液至100μg/L培养液，5μg/L培养液至250μg/L培养液，250μg/L培养液至500μg/L培养液，500μg/L培养液至1mg/L培养液，1mg/L培养液至50mg/L培养液，1mg/L培 养液至100mg/L培养液，1mg/L培养液至200mg/L培养液，10ng/L培养液至200mg/L培养液，5μg/L培养液至100mg/L培养液，或5μg/L培养液至200mg/L培养液。在一些实施方式中，峰值浓度是下列任意项：大约10ng/L培养液，100ng/L培养液，1μg/L培养液，5μg/L培养液，1mg/L培养液，30mg/L培养液，100mg/L培养液，或200mg/L培养液。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约下列任意项：1x 10-18mmol/L/小时至大约1mol/L/小时，1mmol/L/小时至1mol/L/小时，25mmol/L/小时至750mmol/L/小时，25mmol/L/小时至75mmol/L/小时，250mmol/L/小时至750mmol/L/小时，或450mmol/L/小时至550mmol/L/小时。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约下列任意项：50mmol/L/小时，100mmol/L/小时，150mmol/L/小时，200mmol/L/小时，250mmol/L/小时，300mmol/L/小时，350mmol/L/小时，400mmol/L/小时，450mmol/L/小时，或500mmol/L/小时。
在本文描述的任意方法和细胞的一些实施方式中，将表达来自一种或多种异源和/或重复拷贝的MVA途径和/或DXP途径核酸的MVA途径和/或DXP途径RNA和/或蛋白质的细胞的二氧化碳释放速率和/或细胞存活性与不含一种或多种异源和/或重复拷贝的MVA途径和/或DXP途径核酸的对照细胞进行比较。在一些实施方式中，将表达来自于处在可诱导启动子控制下(其中所述启动子被诱导)的一种或多种异源和/或重复拷贝的MVA途径和/或DXP途径核酸的MVA途径和/或DXP途径RNA和/或蛋白质的细胞的二氧化碳释放速率和/或细胞存活性与包含处在可诱导启动子控制下(其中所述启动子不被诱导)(未诱导)的一种或多种异源和/或重复拷贝的MVA途径和/或DXP途径核酸的对照细胞进行比较。在一些实施方式中，可诱导启动子是β-半乳糖苷酶启动子。
在一些实施方式中，生产异戊二烯的方法包括：a)在适合于生产异戊二烯的条件下培养细胞；和b)生产异戊二烯，其中细胞生产大于大约400nmole/gwcm/小时的异戊二烯，并且细胞的二氧化碳释放速率大于大约1x 10-18mmol/L/小时。本文还提供了生产异戊二烯的方法，包括：a)在适合于生产异戊二烯的条件下培养细胞；和b)生产异戊二烯，其中培养物中的细胞生产的异戊二烯的累积总生产率大于大约0.2mg/L培养液/小时，并且细胞的二氧化碳释放速率大于大约1x 10-18mmol/L/小时。本文还提供了生产异戊二烯的方法，包括：a)在适合于生产异戊二烯的条件下培养细胞；和b)生产异戊二烯，其中培养物中的细胞生产的异戊二烯的峰值浓度大于大约10ng/L培养液，并且细胞的二氧化碳释放速率大于大约1x 10-18mmol/L/小时。在任意这些方法的一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约下列任意项：1x 10-18mmol/L/小时至大约1mol/L/小时，1mmol/L/小时至1mol/L/小时，25mmol/L/小时至750mmol/L/小时，25mmol/L/小时至75mmol/L/小时，250mmol/L/小时至750mmol/L/小时，或450mmol/L/小时至550mmol/L/小时。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约50mmol/L/小时或大约500mmol/L/小时。
本文还提供了培养物中的细胞，其包含编码异戊二烯合酶多肽的核酸，其中所述细胞生产大于大约400nmole/gwcm/小时的异戊二烯，并且细胞的二氧化碳释放速率是大于大约1x 10-18mmol/L/小时。本文还提供了培养物中的细胞，其包含编码异戊二烯合酶多肽的核酸，其中培养物中的细胞生产的异戊二烯的累积总生产率大于大约0.2mg/L培养液/小时，并且细胞的二氧化碳释放速率大于大约1x 10-18mmol/L/小时。此外，本文提供了培养物中的细胞，其包含编码异戊二烯合酶多肽的核酸，其中培养物中的细胞生产的异戊二烯的峰值浓度大于大约10ng/L培养液，并且细胞的二氧化碳释放速率大于大约1x 10-18mmol/L/小时。在培养物中的任意这些细胞的一些实施方式中，二氧化碳释放速率大约是下列任意项：1x 10-18mmol/L/小时至大约1mol/L/小时，1mmol/L/小时至1mol/L/小时，25mmol/L/小时至750mmol/L/小时，25mmol/L/小时至75mmol/L/小时，250mmol/L/小时至750mmol/L/小时，或450mmol/L/小时至550mmol/L/小时。在一些实施方式中，二氧化碳释放速率是大约50mmol/L/小时或大约500mmol/L/小时。
本文还提供了生产异戊二烯的方法，包括：a)在适合于生产异戊二烯的条件下培养细胞；和b)生产异戊二烯，其中异戊二烯的液相浓度小于大约200mg/L，并且细胞生产大于大约400nmole/gwcm/小时的异戊二烯。在一些实施方式中，培养物中的异戊二烯的液相浓度小于大约下列任意项：175mg/L，150mg/L，125mg/L，100mg/L，75mg/L，50mg/L，25mg/L，20mg/L，15mg/L，10mg/L，5mg/L，或2.5mg/L。在一些实施方式中，培养物中的异戊二烯的液相浓度是大约下列任意项：0.1mg/L至200mg/L，1mg/L至200mg/L，1mg/L至150mg/L，1mg/L至100mg/L，1mg/L至50mg/L，1mg/L至25mg/L，1mg/L至20mg/L，或10mg/L至20mg/L。
本文还提供了生产化合物的方法，其中所述化合物具有选自下列的一个或多个特征：(a)亨利定律系数小于大约250M/atm；和(b)在水中的溶解性小于大约100g/L。在一些实施方式中，所述方法包括：a)在适合于生产化合物的条件下培养细胞，其中以大约0.01vvm至大约2vvm的气体鼓泡速率加入气体(例如向系统例如发酵系统中加入气体)；和b)生产化合物。在一些实施方式中，化合物的亨利定律系数小于大约下列任意项：200M/atm，150M/atm，100M/atm，75M/atm，50M/atm，25M/atm，10M/atm，5M/atm，或1M/atm。在一些实施方式中，化合物在水中的溶解性小于大约下列任意项：75g/L，50g/L，25g/L，10g/L，5g/L，或1g/L。在一些实施方式中，化合物选自：异戊二烯，醛(例如，乙醛)，酮(例如丙酮或2-丁酮)，醇(例如甲醇、乙醇、1-丁醇，或C5醇，例如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基2-丁烯-1-醇)，醇的酯(例如乙酸乙酯或C5醇的乙酸酯)，或半萜、单萜、或倍半萜，以及C1至C5烃(例如甲烷、乙烷、乙烯、或丙烯)。在一些实施方式中，C1至C5烃是饱和的、非饱和的、或分支的。在具体的实施方式中，化合物是异戊二烯。在生产本文描述的任意化合物的方法的一些实施方式中，气体鼓泡速率是大约下列任意项：0.1vvm至1vvm，0.2vvm至1vvm，或0.5vvm至1vvm。
在一个方面，培养物中的细胞用来生产异戊二烯。在一些实施方式中，培养物中的细胞生产大于大约400nmole异戊二烯/克细胞的细胞湿重/小时(nmole/gwcm/hr)的异戊二烯。在一些实施方式中，细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞培养于包括碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的成分、或前述两项或更多项的任意组合。在一些实施方式中，细胞培养于限葡萄糖的条件下。
在一些实施方式中，本发明提供了将大于大约0.002％的细胞培养基中的碳转化为异戊二烯的培养物中的细胞。在一些实施方式中，细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞培养于包括碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的成分、或前述两项或更多项的任意组合。在一些实施方式中，细胞培养于限葡萄糖的条件下。
在一些实施方式中，本发明提供了包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸的培养物中的细胞。在一些实施方式中，细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞培养于包括碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的成分、或前述两项或更多项的任意组合。在一些实施方式中，细胞培养于限葡萄糖的条件下。
在一个方面，本文描述了生产异戊二烯的方法，例如使用本文描述的任意细胞生产异戊二烯的方法。在一些实施方式中，该方法包括在足以生产大于大约400nmole/gwcm/hr异戊二烯的条件下培养细胞。在一些实施方式中，该方法还包括回收细胞生产的异戊二烯。在一些实施方式中，该方法包括纯化细胞生产的异戊二烯。在一些实施方式中，该方法包括使异戊二烯聚合。在一些实施方式中，细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞培养于包括碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的成分、或前述两项或更多项的任意组合。在一些实施方式中，细胞培养于限葡萄糖的条件下。在多个实施方式中，稳定期期间所生产的异戊二烯的量(例如生产的异戊二烯的总量或生产的异戊二烯的量/升培养液/小时/OD600)大于或大约是生长期期间的相同时间长度所生产的异戊二烯的量的2倍或更多倍。在一些实施方式中，气相包含大于或大约9.5％(体积)的氧，并且气相中异戊二烯的浓度小于燃烧下限或高于燃烧上限。在具体的实施方式中，(i)气相中异戊二烯的浓度小于燃烧下限或高于燃烧上限；并且(ii)细胞生产大于大约400nmole/gwcm/hr的异戊二烯。
在一些实施方式中，方法包括在足以将大于大约0.002％的细胞培养基中的碳(mol/mol)转化为异戊二烯的条件下培养细胞。在一些实施方式中，该方法还包括回收细胞生产的异戊二烯。在一些实施方式中，该方法包括纯化细胞生产的异戊二烯。在一些实施方式中，该方法包括使异戊二烯聚合。在一些实施方式中，细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)与启动子可操作地连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞培养于包括碳源的培养基中，所述碳源例如但不限于碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的成分、或前述两项或更多项的任意组合。在一些实施方式中，细胞培养于限葡萄糖条件下。
在一些实施方式中，仅在稳定期生产异戊二烯。在一些实施方式中，在生长期和稳定期都生产异戊二烯。在多个实施方式中，在稳定期期间生产的异戊二烯的量(例如所生产的异戊二烯的总量或所生产的异戊二烯的量/升培养液/小时/OD600)是大于或大约生长期期间的相同时间长度生产的异戊二烯量的2、3、4、5、10、20、30、40、50、或更多倍。
在一个方面，本文描述了包含异戊二烯的组合物和系统。在一些实施方式中，组合物包含大于或大约2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000mg异戊二烯。在一些实施方式中，组合物包含大于或大约2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100g异戊二烯(w/w)，组合物中挥发性有机级份是异戊二烯。
在一些实施方式中，组合物包含重量占组合物中所有C5烃的总重量的大于或大约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％、或100％的异戊二烯。在一些实施方式中，组合物包含重量占组合物中所有C5烃总重量的小于或大约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的除了异戊二烯之外的C5烃(例如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，组合物具有重量占组合物中所有C5烃总重量的小于或大约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔。在具体的实施方式中，组合物具有大于大约2mg异戊二烯并具有重量占组合物中所有C5烃总重量的大于或大约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％、或100％的异戊二烯。
在一些实施方式中，对于组合物中抑制异戊二烯聚合的任意化合物，组合物具有小于或大约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的抑制异戊二烯聚合的化合物。在具体的实施方式中，组合物还具有大于大约2mg的异戊二烯。
在一些实施方式中，组合物具有选自乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇和具有10个或更多个碳原子的类异戊二烯化合物的一种或多种化合物。在一些实施方式中，组合物具有大于或大约0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、60、80、100或120μg/L的乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇(例如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)、或前述的任意两项或更多项。在具体的实施方式中，组合物具有大于大约2mg异戊二烯并且具有选自乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇、和具有10个或更多个碳原子的类异戊二烯化合物的一种或多种化合物。
在一些实施方式中，组合物包含异戊二烯和选自下列的一种或多种第二化合物：2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，4，5-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、丁二酮、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、异丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、3-甲基丁基乙酸酯、3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯、3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯、3-己烯-1-醇、3-己烯-1-基乙酸酯、苧烯、香叶醇(反式-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇)、香茅醇(3，7-二甲基-6-辛烯-1-醇)、(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯，和2，3-环庚烯醇吡啶。在多个实施方式中，按照重量百分率单位，这些第二成分中的一种的量相对于异戊二烯的量(即所述成分的重量除以异戊二烯的重量乘以100)是大于或大约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或110％(w/w)。
在一些实施方式中，组合物包含(i)包含异戊二烯的气相；和(ii)生产大于大约400nmole/gwcm/hr的异戊二烯的培养物中的细胞。在一些实施方式中，组合物包含封闭的系统，并且气相包含大于或大约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/L的异戊二烯(当针对培养了1小时的1mL 1OD600进行校正时)。在一些实施方式中，组合物包含开放的系统，并且气相包含大于或大约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/L的异戊二烯(当以1vvm的速率鼓泡时)。在一些实施方式中，气相的挥发性有机级份包含重量占挥发性有机级份中所有C5烃总重量的大于或大约99.90％，99.92％，99.94％，99.96％，99.98％、或100％的异戊二烯。在一些实施方式中，气相的挥发性有机级份包含重量占挥发性有机级份中所有C5烃总重量的小于或大约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％，0.00005％、或0.00001％的除了异戊二烯的以外的C5烃(例如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，气相的挥发性有机级份具有重量占挥发性有机级份中所有C5烃总重量的小于或大约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔。在具体的实施方式中，气相的挥发性有机级份具有大于大约2mg异戊二烯并且具有重量占挥发性有机级份中所有C5烃总重量的大于或大约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％、或100％的异戊二烯。
在一些实施方式中，对于气相的挥发性有机级份中的抑制异戊二烯聚合的任意化合物，气相的挥发性有机级份具有小于或大约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的抑制异戊二烯聚合的化合物。在具体的实施方式中，气相的挥发性有机级份还具有大于大约2mg异戊二烯。
在一些实施方式中，气相的挥发性有机级份具有选自下列的一种或多种化合物：乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇、和具有10个或更多个碳原子的类异戊二烯化合物。在一些实施方式中，气相的挥发性有机级份具有大于或大约0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、60、80、100、或120μg/L的乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇(例如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)、或前述的任意两项或更多项。在具体的实施方式中，气相的挥发性有机级份具有大于大约2mg异戊二烯并且具有选自乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇、和具有10个或更多个碳原子的类异戊二烯化合物的一种或多种化合物。
在一些实施方式中，气相的挥发性有机级份具有异戊二烯和选自下列的一种或多种第二化合物：2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，4，5-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、丁二酮、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、异丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、3-甲基丁基乙酸酯、3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯、3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯、3-己烯-1-醇、3-己烯-1-基乙酸酯、苧烯、香叶醇(反式-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇)、香茅醇(3，7-二甲基-6-辛烯-1-醇)、(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯，和2，3-环庚烯醇吡啶。在多个实施方式中，按照重量百分率单位，这些第二成分中的一种的量相对于异戊二烯的量(即所述成分的重量除以异戊二烯的重量乘以100)是大于或大约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或110％(w/w)的气相的挥发性有机级份。
在本文所述的任意组合物的一些实施方式中，至少一部分的异戊二烯在气相中。在一些实施方式中，至少一部分的异戊二烯在液相(例如冷凝物)中。在一些实施方式中，至少一部分的异戊二烯在固相中。在一些实施方式中，至少一部分的异戊二烯吸附至固相，例如包括二氧化硅和/或活性炭的支持物。在一些实施方式中，组合物包括乙醇。在一些实施方式中，组合物包括大约75％至大约90％重量的乙醇，例如大约75％至大约80％、大约80％至大约85％、或大约85％至大约90％重量的乙醇。在一些实施方式中，组合物包含大约4％至大约15％重量的异戊二烯，例如大约4％至大约8％、大约8％至大约12％、或大约12％至大约15％重量的异戊二烯。
在一些实施方式中，该系统包括本文描述的任意细胞和/或组合物的。在一些实施方式中，系统包括反应器，其反应室包含在限氧培养物中的细胞，所述细胞生产大于大约400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、或更多nmole/gwcm/hr的异戊二烯。在一些实施方式中，系统不是封闭系统。在一些实施方式中，从系统中获取至少一部分的异戊二烯。在一些实施方式中，系统包括包含异戊二烯的气相。在多个实施方式中，气相包含本文描述的任意组合物。
在本文所述的任意组合物、系统、和方法的一些实施方式中，生产气相中的非可燃浓度的异戊二烯。在一些实施方式中，气相包含小于大约9.5％(体积)的氧。在一些实施方式中，气相包含大于或大约9.5％(体积)的氧，并且气相中的异戊二烯的浓度小于燃烧下限或大于燃烧上限。在一些实施方式中，除了异戊二烯以外的气相部分包含大约0％至大约100％(体积)的氧，例如大约10％至大约100％(体积)的氧。在一些实施方式中，除了异戊二烯以外的气相部分包含大约0％至大约99％(体积)的氮。在一些实施方式中，除了异戊二烯以外的气相部分包含大约1％至大约50％(体积)的CO2。
在本文所述的任意方面的一些实施方式中，培养物中的细胞生产大于或大约400，500，600，700，800，900，1,000，1,250，1,500，1,750，2,000，2,500，3,000，4,000，5,000、或更多nmole/gwcm/hr的异戊二烯。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，培养物中的细胞将大于或大约0.002％、0.005％、0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、或更多的细胞培养基中的碳转化为异戊二烯。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，培养物中的细胞以大于或大约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、100,000、或更多ng的异戊二烯/克细胞的细胞湿重/hr(ng/gwcm/h)生产异戊二烯。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，培养物中的细胞以大于或大约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、50,000、100,000、或更多毫克异戊二烯/升培养液(mg/L培 养液，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)生产异戊二烯的累积效价(总量)。本文公开了异戊二烯生产的其它示例性速率和异戊二烯生产的总量。
在本文所述的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含编码IDI多肽的异源核酸。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含插入编码IDI多肽的内源核酸的拷贝。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含编码DXS多肽的异源核酸。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含插入编码DXS多肽的内源核酸的拷贝。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含编码IDI多肽和DXS多肽的一种或多种异源核酸。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，一个核酸编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽、和DXS多肽。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，一个载体编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽、和DXS多肽。在一些实施方式中，载体包含选择性标志物，例如抗生素抗性核酸。
在本文所述的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸可操作地连接于T7启动子，例如包含于中等或高拷贝质粒中的T7启动子。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸可操作地连接于Trc启动子，例如包含于中等或高拷贝质粒中的Trc启动子。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸可操作地连接于Lac启动子，例如包含于低拷贝质粒中的Lac启动子。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸可操作地连接于内源性启动子，例如内源性碱性丝氨酸蛋白酶启动子。在一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸整合进入不含选择性标志物的细胞染色体。
在一些实施方式中，一种或多种MVA途径、IDI、DXS、或异戊二烯合酶核酸被置于在稳定期比在生长期的活性更高的启动子或因子的控制下。例如，一种或多种MVA途径、IDI、DXS、或异戊二烯合酶核酸可以被置于稳定期σ因子例如RpoS控制下。在一些实施方式中，一种或多种MVA途径、IDI、DXS、或异戊二烯合酶核酸被置于在稳定期可被诱导的启动子控制下，例如可以被在稳定期有活性的应答调节子诱导的启动子。
在本文所述的任意方面的一些实施方式中，细胞中的至少一部分在持续培养(例如不稀释的持续培养)中保持异源异戊二烯合酶核酸至少或大约5、10、20、40、50、60、65、或更多次细胞分裂。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，包含异源异戊二烯合酶、IDI、或DXS核酸的核酸还包含选择性标志物，例如抗生素抗性核酸。
在本文所述的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含编码MVA途径多肽(例如来自酿酒酵母或粪肠球菌的MVA途径多肽)的异源核酸。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含插入编码MVA途径多肽(例如来自酿酒酵母或粪肠球菌的MVA途径多肽)的内源核酸的拷贝。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，细胞还包含异戊二烯合酶、DXS、和MVA途径核酸。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，细胞包含异戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸、和MVA途径核酸(除了所述IDI核酸之外)。
在本文所述的任意方面的一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是来自植物的多肽，所述植物例如葛属(例如越南葛藤或葛根)，或白杨(例如美洲山杨、银白杨、欧洲黑杨、毛果杨、或杂交体银白杨x欧洲山杨)。
在本文所述的任意方面的一些实施方式中，细胞是细菌细胞，例如革兰氏阳性细菌(例如，芽孢杆菌属细胞，例如枯草芽孢杆菌细胞；或链霉菌属细胞，例如浅青紫链霉菌、天蓝色链霉菌、或灰色链霉菌细胞)。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，细胞是革兰氏阴性细菌细胞(例如，埃希菌属细胞，例如大肠杆菌细胞；红假单胞菌属，例如沼泽红假单胞菌细胞；假单胞菌属，例如荧光假单胞菌细胞或恶臭假单胞菌细胞；泛菌属细胞，例如柠檬泛菌细胞)。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，细胞是真菌细胞，例如丝状真菌细胞(例如，木霉菌属细胞，例如里氏木霉细胞；或曲霉菌属细胞，例如米曲霉和黑曲霉)或酵母细胞(例如，耶氏酵母属细胞，例如解脂耶氏酵母细胞；或酵母属细胞，例如酿酒酵母)。
在本文所述的任意方面的一些实施方式中，微生物多肽碳源包括来自酵母或细菌的一种或多种多肽。在本文所述的任意方面的一些实施方式中，植物多肽碳源包括来自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈、花生、向日葵、椰子、芥菜、油菜、棉籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、或亚麻籽的一种或多种多肽。
使用合成气作为能源在厌氧微生物中产生异戊二烯
在一些实施方式中，如2009年12月22日提交的美国临时专利申请号61/289,347和61/289,355中所述，在厌氧微生物中使用合成气作为能源产生生物异戊二烯组合物，所述文献的公开内容通过引用的方式全文并入本文。
通过厌氧生物从合成气产生异戊二烯可以提供胜过由需氧生物从糖类产生异戊二烯的许多优点。首先，异戊二烯的最大理论质量产率可以相对于需氧生物而言更大，如下文进一步讨论。其次，厌氧生物没有必须借助细胞生长来周转的NAD(P)H形式的过多还原力、副产物(如甘油、乳酸、或乙醇)的形成或使用分子氧的氧化作用。在没有这种NAD(P)H周转要求的情况下，厌氧生物可以具有更高的能量产率、更低的氧需要、更低的发酵热、和运行该过程的更低使用成本。第三，由于该系统中缺少氧，厌氧生物可以具有废气中更大的异戊二烯浓度、产生可燃性异戊二烯-氧混合物的更小可能性、更易回收、和更高的异戊二烯品质。第四，可以通过使用现存基本设施(如设计用于生产生物乙醇的现存机械设备)更容易地培育厌氧生物。
用于异戊二烯产生的厌氧生物可以包括专性厌氧菌、兼性厌氧菌、和耐氧厌氧菌。专性厌氧菌可以是选自Clostridium ljungdahlii、Clostridium autoethanogenum、粘液真杆菌、Clostridiumcarboxydivorans、延展消化链球菌、和甲基营养丁酸杆菌的任一者或组合。用作能源以产生异戊二烯的合成气可以通过多种过程(包括甲烷重整、煤液化、共燃烧、发酵反应、酶促反应、和生物质气化)从原料衍生。
示例性的纯化方法
在一些实施方式中，本文所述的任意方法还包括回收共同产生的化合物。在一些实施方式中，本文所述的任意方法还包括回收异戊二烯。在一些实施方式中，本文所述的任意方法还包括通过基于低温膜、吸附基质的分离方法回收氢。
可以使用标准技术回收通过本文描述的组合物和方法所产生的异戊二烯和氢，所述标准技术例如是从固相中气提、膜增强分离、分馏、吸附/解吸附、渗透蒸发、从固相热或真空解吸附异戊二烯、或使用溶剂提取固定至或吸附至固相的异戊二烯(见，例如，美国专利号4,703,007、4,570,029、和4,740,222(“Recovery and Purification ofHydrogen from Refinery and Petrochemical Off-gas Streams”)，所述文献通过引用方式全文并入本文，尤其关于异戊二烯回收和纯化方法的方面(’007和’029专利)以及关于氢回收和纯化方法的方面(’222专利))。在具体的实施方式中，使用醇(例如乙醇、甲醇、丙醇、或其组合)萃取蒸馏法用来回收异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯的回收涉及分离液体形式的异戊二烯(如异戊二烯的净溶液或异戊二烯在溶剂中的溶液)。气提法涉及以连续方式从发酵废气流取出异戊二烯蒸气。这种取出可以以几种不同的方式实现，包括，但不限于吸附至固相、分配入液相中、或直接冷凝(例如因暴露于冷凝盘管或因压力增加所致的冷凝)。在一些实施方式中，膜富集异戊二烯蒸气露点上的稀薄异戊二烯蒸气流导致液态异戊二烯的冷凝。在一些实施方式中，压缩并冷凝异戊二烯。
异戊二烯的回收可以包括一个步骤或多个步骤。在一些实施方式中，从发酵废气取出异戊二烯蒸气和异戊二烯转化成液相同时地进行。例如，异戊二烯可以从废气流直接冷凝以形成液体。在一些实施方式中，从发酵废气取出异戊二烯蒸气和异戊二烯转化成液相依次地进行。例如，异戊二烯可以吸附至固相并且随后用溶剂从固相提取出来。
氢的回收可以包括一个步骤或多个步骤。在一些实施方式中，从发酵废气取出氢气和氢转化成液相同时地进行。在一些实施方式中，从发酵废气取出氢气和氢转化成液相依次地进行。例如，氢可以吸附至固相并随后通过变压从固相解吸附。在一些实施方式中，浓缩并且压缩回收的氢气。
在一些实施方式中，本文所述的任意方法还包括纯化异戊二烯。例如，可以使用标准技术纯化利用本文所述的组合物和方法所产生的异戊二烯。纯化指这样的过程：通过所述过程将异戊二烯与产生该异戊二烯时存在的一种或多种组分分开。在一些实施方式中，异戊二烯作为基本上纯的液体获得。纯化方法的实例包括(i)从液态提取剂中的溶液蒸馏和(ii)色谱。如本文中所用，“纯化的异戊二烯”意指与产生异戊二烯时存在的一种或多种组分分开的异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯以重量计至少约20％不含在产生异戊二烯时存在的其他组分。在多种实施方式中，异戊二烯具有以重量计至少或约25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、或99％的纯度。可以通过适宜的任何方法(例如通过柱色谱法、HPLC分析法、或GC-MS分析法)测定纯度。
在一些实施方式中，本文所述的任意方法还包括纯化氢。例如，可以使用标准技术纯化利用本文所述的组合物和方法所产生的氢。纯化指这样的过程：通过所述过程将氢与产生氢时存在的一种或多种组分分开。在一些实施方式中，氢作为基本上纯的气体获得。在一些实施方式中，氢作为基本上纯的液体获得。纯化方法的实例包括(i)低温冷凝和(ii)固体基质吸附。如本文中所用，“纯化的氢”意指已经与产生氢时存在的一种或多种组分分开的氢。在一些实施方式中，氢以重量计至少约20％不含在产生氢时存在的其他组分。在多种实施方式中，氢具有以重量计至少或约25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、或99％的纯度。可以通过任何适宜的方法(例如通过柱色谱法或GC-MS分析法)测定纯度。
在一些实施方式中，通过将气相导入用于产生异戊二烯的细胞培养系统(例如发酵器)中，再循环在一个或多个用于移出异戊二烯的回收步骤之后剩余的至少一部分气相。
在2009年12月18日提交的美国临时专利申请号61/88,142中描述了用于从发酵器废气纯化生物异戊二烯组合物的方法和装置，所述文献通过引用方式全文并入本文。
来自发酵器废气的生物异戊二烯组合物可以含有生物异戊二烯，伴以挥发性杂质和生物副产物杂质。在一些实施方式中，使用以下方法纯化来自发酵器废气的生物异戊二烯组合物，所述方法包括：(a)在第一柱中使发酵器废气与溶剂接触以形成：包含所述溶剂、主要部分异戊二烯和主要部分生物副产物杂质的富异戊二烯溶液；和包含主要部分挥发性杂质的蒸气；(b)将富异戊二烯溶液从第一柱转移至第二柱；和(c)在第二柱中从富异戊二烯溶液中汽提异戊二烯以形成：包含主要部分生物副产物杂质的乏异戊二烯溶液；和纯化的异戊二烯组合物。
图169显示纯化异戊二烯的示例性的方法和示例性的装置。包含异戊二烯的发酵器废气可以从可再生资源(例如，碳源)通过本领域的任何方法产生，所述方法例如在美国临时专利申请号61/187,944中描述，所述文献的内容因而通过引用方式并入，尤其关于产生包含异戊二烯的发酵器废气的方法方面。可以引导从一个或多个独立发酵器12(例如，串联和/或并联的1、2、3、4、5、6、7、8、或更多个发酵器)产生的发酵器废气至第一塔14。如下文所述，发酵器废气可以被引导穿过分离单元16和/或由压缩手段如压缩系统18压缩。另外，可以任选地在任意点降低发酵器废气的温度，例如，以形成冷凝物或部分冷凝物，随后与溶剂(其可以辅助一种或多种废气组分如异戊二烯增溶)接触。发酵器废气可以在塔14处与溶剂(例如，本文所述的任意溶剂，如非极性高沸点溶剂)接触(例如，被吸附)。具有在溶剂(尤其非极性高沸点溶剂)中较小吸附倾向的挥发性杂质与剩余的溶剂/发酵器废气混合物分离，从而产生包含主要部分挥发性杂质(例如，在出口20处离开)的蒸气和具有主要部分异戊二烯和主要部分生物副产物杂质的富异戊二烯溶液(例如，在出口22处)。溶剂可以任选地在与发酵器废气接触之前、同时和/或之后由任意的合适手段(例如，由蒸汽)加热，这可以辅助从剩余的溶液中分离挥发性杂质。蒸汽可以被引导穿过所述的塔(在任何的合适位置，如图169中所示在废气的进口和/或挥发性杂质出口的反向端附近)以提供可以辅助除去挥发性杂质的扫除蒸气相。
可以引导(例如，在出口22处)具有主要部分异戊二烯和主要部分生物副产物杂质的富异戊二烯溶液至第二塔24。第二塔可以与第一塔14分离(如169图中所示)或可以是包含第一塔和第二塔的单个塔(singlecolumn)的一部分(例如，其中溶剂在一端处或附近进入第一塔并且在反向端处或附近离开第二塔的串联塔)。异戊二烯可以在第二塔中从富异戊二烯溶液汽提以产生纯化的异戊二烯组合物(例如，在出口26处)和包含主要部分生物副产物杂质的乏异戊二烯溶液(例如，在出口28处)。富异戊二烯溶液可以由任意的合适手段(例如，由蒸汽)加热，这可以辅助从剩余的溶液中汽提异戊二烯。蒸汽可以被引导穿过该塔(在任何的合适位置，如图169中所示，在富异戊二烯溶液的进入点的反向端和/或在乏异戊二烯溶液出口的一端附近)。
如本文所述，所述塔可以是常规的并且具有任何合适的尺寸。示例类型的塔是从制造商处可商业获得的，所述制造商包括Koch ModularProcess Systems(Paramus，NJ)、Fluor公司(Irving，TX)、Kuhni USA(Mount Holly，NC)。通常，将塔设计成使蒸气/液体接触最大化，旨在实现合乎需要的效率。通过用沿该塔以规律间距间隔的填充材料或盘填充该塔而实现这一点。合适的填充材料包括基于金属、玻璃、聚合物或陶瓷材料的无规或结构化类型。示例性的无规填料类型包括拉西环、鲍尔环、A-PAK环、矩鞍环、Pro-Pak、Heli-Pak、陶瓷矩鞍环和FLEXIRINGS
Figure BDA0000135567880001581
。结构化填料包括金属筛和穿孔金属盘型材料。专营塔填料的制造商包括ACS Separations & Mass-Transfer Products(Houston，TX)、Johnson Bros.Metal Froming公司(Berkeley，IL)和Koch Glitsch，Inc.Knight Div.(East Canton，OH)。气提塔的效率以塔中理论塔板高度和塔板总数表述。通常，存在的理论塔板数越大，塔的效率越高。实验室规模的塔可以从Ace Glass(Vineland，NJ)、Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)和Chemglass(Vineland，NJ)购买。合适类型的玻璃塔包括Vigreux、Snyder、Hemple和穿孔塔板型塔。塔可以包含填充材料或含有设计成使蒸气/液体接触最大化的特征。实验室规模的气体洗涤器单元(part#CG-1830-10)是从Chemglass可获得的，并且由填充的玻璃塔、溶剂储器和溶剂再循环泵组成。
来自第二塔24的纯化的异戊二烯组合物(例如，在出口26处离开)可以通过任意的合适手段进一步纯化(例如，通过使用回流冷凝器34和/或吸附系统36，如二氧化硅吸附系统)。回流减少异戊二烯产物中的溶剂组合物。可以将乏异戊二烯溶液再循环返回至第一塔再利用(例如，如169图中所示在入口30处)。在再循环至第一塔14以减少生物副产物的量之前，可以通过任意的合适手段(例如，通过液-液萃取和/或吸附系统32，如二氧化硅吸附系统)纯化乏异戊二烯溶液。另外，在再循环至第一塔14之前(例如，在任选地纯化异戊二烯溶液之前、同时和/或之后)，可以通过任意的合适手段降低乏异戊二烯溶液的温度。图169显示在纯化乏异戊二烯溶液前降低乏异戊二烯溶液在出口40处温度的实例(在这种情况下，使用降温用冷却剂)。
包含主要部分挥发性杂质的蒸气(例如，在图169中出口20处离开的蒸气)可以包含小部分的异戊二烯(例如，未留在富异戊二烯溶液中的残余异戊二烯)。残余异戊二烯可以从包含主要部分挥发性杂质的蒸气通过任意的合适手段(例如，吸附系统38，如活化碳吸附系统)再收集利用，并且在一些情况下，如169图中所示，可以与纯化的异戊二烯组合物(例如，在额外纯化之前、期间或之后，如类似于系统36的吸附系统)组合。图169还显示任选的捕获装置42(例如，热氧化器和/或CO2捕获系统)，所述捕获装置能够减少从该蒸气释放至大气的不合需要的组分(例如，CO2)的量。
异戊二烯的示例性化学转变
虽然异戊二烯的目前工业用途主要是生产合成橡胶，但是异戊二烯是活泼的共轭二烯并且经历多种化学转变以形成氧化产物和高分子量烃。例如，钯(0)络合物(Pd(acac)2-Ph3P和Pd(OAc)2-Ph3P)催化醇溶剂中异戊二烯的二聚化和调聚以产生线性异戊二烯二聚体(例如2，7-二甲基-1，3，7-辛三烯)和甲氧二甲基辛二烯(Zakharkin，L.I.和Babich，S.A.Russ.Chem.Bull.(1976)，第1967-1968页)。Adams，J.M.和Clapp，T.V.(Clay and Clay Minerals(1986)，34(3)，287-294)报道了异戊二烯在二价和三价过渡金属交换的蒙脱石(例如Cr3+-蒙脱石)上的反应以产生异戊二烯二聚体和与甲醇的加合物。由Ni(0)-氨基次磷酸盐系统催化的异戊二烯线性二聚化产生区域选择性尾-对-尾线性二聚体，伴有竞争性环二聚化反应(Denis，Philippe；Croizy，Jean Francois；Mortreux，Andre；Petit，Francis，Journal of Molecular Catalysis(1991)，68(2)，159-75.Denis，Philippe；Jean，Andre；Croizy，Jean Francois；Mortreux，Andre；Petit，Francis，Journal of the American ChemicalSociety(1990)，112(3)，1292-4.)。研究了新的手性氨基次磷酸盐配体，例如(+)-MeCH2CHMeCH(NH2)CH2OPPh2，作为异戊二烯线性二聚化中导致高于50％转化率的均相催化剂(Masotti，Henriette；Peiffer，Gilbert；Siv，Chhan；Courbis，Pierre；Sergent，Michelle；Phan TanLuu，Roger，Bulletin des Societes Chimiques Belges(1991)，100(1)，63-77)。
异戊二烯在110-250°在作为聚合抑制剂的二硝基甲酚存在下的热二聚化产生高产量的二聚体和少量聚合物(美国专利号4,973,787)。Ni催化的异戊二烯二聚化产生由80％1，5-二甲基-1，5-环辛二烯和20％1，6-二甲基-1，5-环辛二烯组成的二甲基-1，5-环辛二烯混合物(Doppelt，Pascal；Baum，Thomas H.；Ricard，Louis，Inorganic Chemistry(1996)，35(5)，1286-91)。用Cp*Ru(η4-异戊二烯)Cl和AgOTf的催化性amt.将异戊二烯转化成二甲基环辛二烯(Itoh，Kenji；Masuda，Katsuyuki；Fukahori，Takahiko；Nakano，Katsumasa；Aoki，Katsuyuki；Nagashima，Hideo，Organometallics(1994)，13(3)，1020-9)。JP59065026A(1984)报道了通过在包含羧酸Fe或β-二酮化合物、有机-Al或Mg化合物、和具有供电子基团的2，2′-二吡啶基衍生物的催化剂存在下异戊二烯的环二聚化制备1，6-二甲基-1，5-环辛二烯。通过异戊二烯在3-组分催化剂上的环二聚化制备二甲基环辛二烯，所述3组分催化剂含有羧酸Ni或β-酮、有机铝或有机镁化合物和取代的三苯基亚磷酸盐(JP58055434A，1983)。通过在100-300°在惰性有机溶剂中在含有Fe(3)盐、有机铝化合物和活化剂的均相催化剂存在下(SU615056A1，1978)，在含有乙酰丙酮合Ni、三芳基亚磷酸盐和perhydroalumophenolene的均相催化剂存在下(SU493455A1，1975)，在含有羧酸Ni或Ni羧酸盐或螯合化合物及1-羟基-3-羰基化合物、三烷基铝、二烷基镁或从共轭二烯与Mg获得的活性有机Mg化合物、三芳基亚磷酸盐和叔胺的混合物的催化剂存在下(JP48064049A，1973)，或在由环烷酸Ni、Et3Al、和磷酸邻三甲酚酯组成的催化剂存在下(Suga，K.；Watanabe，S.；Fujita，T.；Shimada，T.，Israel Journal of Chemistry(1972)，10(1)，15-18)的异戊二烯的环二聚化而制备1，5-二甲基-1，5-环辛二烯。美国专利号3,954,665公开了在[(η3-C6H5)NiBr]2或[M(NO)2X]2(M＝Fe、Co；X＝Cl、I、Br)与羰基Fe、Co或Ni的反应产物存在下的异戊二烯的二聚化。欧洲专利号2411(1981)公开异戊二烯在-5°至+20°在Fe(NO)2Cl-双(1，5-环辛二烯)镍催化剂上环二聚化以产生1-甲基-及2-甲基-4-异丙烯基-1-环己烯和1，4-及2，4-二甲基-4-乙烯基-1-环己烯。美国专利号4,189,403公开了通过使异戊二烯与三(取代的烃基)亚磷酸盐、亚砷酸盐、或亚锑酸盐和VIII族金属(0)化合物(例如乙酰丙酮合Ni)的混合催化剂接触而制备1，5-二甲基-1，5-环辛二烯和1，4-二甲基-4-乙烯基-1-环己烯。Jackstell，R.；Grotevendt，A.；Michalik，D.；El Firdoussi，L.；Beller，M.J.Organometallic Chem.(2007)692(21)，4737-4744提出钯/卡宾催化剂用于异戊二烯二聚化的用途。Bowen，L.；Charernsuk，M.；Wass，D.F.Chem.Commun.(2007)2835-2837描述了铬N，N-双(二芳基膦)胺催化剂用于产生异戊二烯线性和环状三聚体的用途。
异戊二烯按报道方式在Ni催化剂存在下二聚化以产生顺式-2-异丙烯基-1-甲基乙烯基环丁烷(Billups，W.E.；Cross，J.H.；Smith，C.V.，Journal of the American Chemical Society(1973)，95(10)，3438-9)。在作为电子供体的多种亚磷酸盐存在下由环烷酸镍和异戊二烯镁催化的异戊二烯[78-79-5]寡聚化产生含有二甲基环辛二烯[39881-79-3]的环状二聚体；尤其在1，1，1-三(羟甲基)丙烷亚磷酸盐[39865-19-5]存在下，选择性地产生三甲基环十二碳三烯[39881-80-6](Suga，Kyoichi；Watanabe，Shoji；Fujita，Tsutomu；Shimada，Takashi，Journal of AppliedChemistry & Biotechnology(1973)，23(2)，131-8)。WO2006/051011公开了通过在包含Ni和/或Ti、一种或多种有机金属化合物、和VA族化合物的催化剂体系存在下的异戊二烯三聚化制备用于香料和香精中的三甲基环十二碳三烯，并且公开了该反应在含有羟基的溶剂中进行。Ligabue，R.A.；Dupont，J.；de Souza，R.F.，Alegre，R.S.J.Mol.Cat.A：Chem.(2001)，169(1-2)，11-17描述了使用离子液体中的亚硝酰基铁催化剂将异戊二烯选择性二聚化成6元二聚体。Huchette，D.；Nicole，J.；Petit，F.，Tetrahedron Letters(1979)，(12)，1035-8描述了电化学地产生亚硝酰基铁催化剂和将异戊二烯二聚化成环己烯二聚体的后续用途。Zakharkin，L.I.；Zhigareva，G.G.；Pryanishnikov，A.P.ZhurnalObshchei Khimii(1987)，57(11)，2551-6描述了在络合镍和铁催化剂上异戊二烯的环寡聚化。
使用所引用参考文献中公开的每种催化剂体系和反应条件，化学地转变本文所述的高纯异戊二烯起始组合物。本领域技术人员可以使本领域已知的其他催化剂和反应条件(例如应用于化学转变1，3-丁二烯的催化剂和反应条件)适应异戊二烯起始组合物。
二聚化和三聚化
在一些实施方式中，商业上有益量的高纯异戊二烯原料经历催化性化学转变以产生二聚体和三聚体。使用本领域已知的方法鉴定催化剂体系。优选的催化剂包括已知以高效率将异戊二烯转化成二聚体和三聚体的那些催化剂。实例包括基于钯、镍、钴、铁、和铬的那些催化剂。
在一些实施方式中，商业上有益量的高纯异戊二烯原料经历热或催化性二聚化。异戊二烯起始组合物通过在压力下加热该起始组合物转化成包含不饱和的6元和8元环的二聚体的混合物。在一些实施方式中，将起始异戊二烯组合物在压力下加热至超过或约100、125、150、175、200、225或250℃。在一些实施方式中，将起始异戊二烯组合物在防止自由基介导的聚合的抗氧化剂(例如2，6-二-叔丁基-4-甲基苯酚)存在加热。在一些实施方式中，通过一种或多种催化剂加速该反应，所述催化剂选自本领域已知的用于催化异戊二烯环二聚化的催化剂，例如，美国专利4,144,278、4,181,707、5,545,789和欧洲专利EP0397266A2中所述的卤化亚硝酰基铁催化剂。离子液体中亚硝酰基铁催化剂的用途由Ligabue等人.(2001)J.Mol.Catalysis A：Chemical，169(2)，11-17描述。催化剂的实例包括但不限于Fe(NO)2Cl2和Cr3+-蒙脱石。在另一个实例中，使用钌催化剂，将异戊二烯起始组合物转化成C10环状二聚体(例如，二甲基-环辛二烯的混合物)(Itoh，Kenji；Masuda，Katsuyuki；Fukahori，Takahiko；Nakano，Katsumasa；Aoki，Katsuyuki；Nagashima，Hideo，Organometallics(1994)，13(3)，1020-9)。
在具体的实施方式中，将处于液态的异戊二烯起始组合物在压力下并且在抗氧化剂存在下加热至超过100℃以产生二聚体的混合物，所述混合物包括6-元环和8-元环类，例如，苧烯(1-甲基-4-(丙-1-烯-2-基)环己-1-烯)、1-甲基-5-(丙-1-烯-2-基)环己-1-烯、1，4-二甲基-4-乙烯基环己烯、2，4-二甲基-4-乙烯基环己烯、1，5-二甲基环辛-1，5-二烯、1，6-二甲基环辛-1，5-二烯、2，6-二甲基-1，3-环辛二烯、2，6-二甲基-1，4-环辛二烯、3，7-二甲基-1，5-环辛二烯、3，7-二甲基-1，3-环辛二烯、3，6-二甲基-1，3-环辛二烯和如Organometallics(1994)、13(3)、1020-9中所述的其他8-元环异戊二烯二聚体。构思了这些化合物的全部立体异构体。异戊二烯至二聚体的转化最好在氧不存在下进行以避免产生不合乎需要的反应产物。
在一些实施方式中，商业上有益量的高纯异戊二烯原料经历光二聚化以产生4-元环二聚体。将异戊二烯起始组合物通过光照射转化成包含以下一项或多项的混合物：1，2-二(丙-1-烯-2-基)环丁烷、1，3-二(丙-1-烯-2-基)环丁烷、1-甲基-1-乙烯基-3-(丙-1-烯-2-基)环丁烷、1-甲基-1-乙烯基-2-(丙-1-烯-2-基)环丁烷、1，3-二甲基-1，3-二乙烯基环丁烷、1，2-二甲基-1，2-二乙烯基环丁烷及其立体异构体。在一些实施方式中，除6-和8-元环外，高纯异戊二烯原料在催化剂(例如镍催化剂)或光敏剂(例如二苯酮)存在下二聚化以产生4-元环二聚体，例如顺式-2-异丙烯基-1-甲基乙烯基环丁烷[见：Hammond，J.S.；Turro，N.J.；Liu，R.S.H.(1963)″Mechanisms of Photochemical Reactions in Solution.XVI.Photosensitized Dimerization of Conjugated Dienes.J.Org.Chem.，28，3297-3303.]。
在一些实施方式中，商业上有益量的高纯异戊二烯原料在催化剂体系存在下转化成环状三聚体。在一些实施方式中，该环状三聚体是三甲基环十二碳三烯。在一些实施方式中，该催化剂体系包含镍催化剂。在一些实施方式中，该催化剂体系包含钛化合物。在一些实施方式中，该催化剂体系包含镍催化剂和钛化合物。在一些实施方式中，该催化剂体系包含一种或多种有机金属化合物和VA族化合物。在一些实施方式中，催化性转变在含有羟基的溶剂中进行。在具体的实施方式中，起始异戊二烯组合物在包含Ni和/或Ti、一种或多种有机金属化合物、和VA族化合物的催化剂体系存在下转化成三甲基环十二碳三烯，并且该反应在含有羟基的溶剂中进行。
在一些实施方式中，通过用C2至C5不饱和烃处理，商业上有益量的高纯异戊二烯原料经历热或催化性转化，成为C7至C14范围内的烃。C2至C5烃可以是烯、二烯或炔。例如，在一些实施方式中，异戊二烯与乙烯和适宜的催化剂接触以产生C7化合物。在另一个实施方式中，异戊二烯与1，3-丁二烯接触以形成环状C9烃。这些C7至C14烃的氢化产生适合用作喷气发动机燃料和其他航空燃料的组合物。在又一个实施方式中，异戊二烯和一种或多种不饱和烃衍生的不饱和的C7至C14烃经历脱氢以形成芳族衍生物，所述芳族衍生物适合用作喷气发动机燃料和其他航空燃料，或用作此类燃料的调和用储料。
在一些实施方式中，使用醇溶剂中的催化剂体系，将商业上有益量的高纯异戊二烯原料转化成线性二聚体和三聚体的混合物。在甲醇或乙醇中进行时，该反应还产生烷氧基衍生物。在一些实施方式中，该催化剂体系是基于钯的催化剂体系，例如，乙酰丙酮合钯-三苯膦体系或乙酸钯-三苯膦体系。在一些实施方式中，醇溶剂是甲醇、乙醇或异丙醇。产物的性质取决于所用的催化剂和溶剂。例如，在异丙醇溶剂中使用基于钯的催化剂体系(例如，Pd(acac)2-Ph3P或Pd(OAc)2-Ph3P)时，形成异戊二烯的线性二聚体，例如2，7-二甲基-1，3，7-辛三烯和2，7-二甲基-2，4，6-辛三烯。当该反应在甲醇中进行时，除线性异戊二烯二聚体如二甲基辛三烯之外，还形成甲氧基二甲基辛二烯(例如，1-甲氧基-2，7-二甲基-2，7-辛二烯和3-甲氧基-2，7-二甲基-1，7-辛二烯)。一些反应产生异戊二烯的线性三聚体，如α-法呢烯(3，7，11-三甲基-1，3，6，10-十二碳四烯)、β-法呢烯(7，11-二甲基-3-亚甲基-1，6，10-十二碳三烯)和其他位置异构体(例如来自异戊二烯单元的尾对尾和头对头加成)。在另一个实例中，使用铬N，N-双(二芳基膦)胺催化剂，将异戊二烯转化成线性和环状C15三聚体(Bowen，L.；Charernsuk，M.；Wass，D.F.Chem.Commun.(2007)2835-2837)。
转化成氧化产物
在一些实施方式中，商业上有益量的高纯异戊二烯原料在酸催化剂存在下通过与乙醇和其他醇的反应转化成燃料氧化产物。在一个实施方式中，酸催化剂是硫酸。在另一个实施方式中，酸催化剂是固相硫酸(例如，Dowex Marathon)。其他催化剂包括液相和固相氟磺酸，例如，三氟甲磺酸和Nafion-H(DuPont)。沸石催化剂(例如β-沸石)也可以在与Hensel等人[Hensen，K.；Mahaim，C.；Holderich，W.F.，AppliedCatalysis A：General(1997)140(2)，311-329.]所述的那些条件相似的条件下用于苧烯和相关单萜烯的甲氧基化。在一些实施方式中，通过羟基化/酯化过程或本领域已知的烯的其他反应(例如用过酸(如过乙酸和3-氯过苯甲酸)过氧化成环氧化物；和用i)水和酸催化剂和ii)硼氢化方法水合成醇和二醇)，将高纯异戊二烯原料转化成醇和酯。此类反应在例如Michael B.Smith和Jerry March，Advanced Organic Chemistry：Reactions，Mechanisms，and Structure，第6版，John Wiley & Sons，2007中描述。图3和图4显示可以从起始异戊二烯组合物产生的醇和氧化产物的实例。
部分氢化
在一些实施方式中，将商业上有益量的高纯异戊二烯原料部分地氢化成单烯烃(例如2-甲基丁-1-烯、3-甲基-丁-1-烯和2-甲基丁-2-烯)。在一些实施方式中，使用常规的烃正离子催化，如用来将异丁烯转化成异辛烷的烃正离子催化，所述单烯烃经历与其他烯烃的二聚化或反应。见，例如，Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology，第4版，Wiley，New York(1995)，14，934-952中的H.M.Lybarger.异戊二烯。在一些优选的实施方式中，高纯异戊二烯原料是生物异戊二烯组合物。
在一些实施方式中，商业上有益量的高纯异戊二烯原料经历部分氢化以形成单烯烃(例如2-甲基丁-1-烯、3-甲基-丁-1-烯和2-甲基丁-2-烯)。在一些优选的实施方式中，高纯异戊二烯原料是生物异戊二烯组合物。在一些实施方式中，异戊二烯原料的部分氢化产生高产量的单烯烃，同时转化成异戊烷最少并且残余异戊二烯水平低。在一些实施方式中，产生单烯烃和异戊烷的混合物，伴以低水平的残余异戊二烯。在一些实施方式中，所述部分氢化是其中优先产生特殊单烯烃如2-甲基丁-2-烯、2-甲基丁-1-烯、或3-甲基丁-1-烯的选择性氢化。优选的氢化催化剂产生高催化活性，经久维持催化活性，并且对异戊二烯转化单烯烃具有高度选择性。
用于部分氢化异戊二烯起始组合物的合适催化剂可以含有元素形式的铂系金属如铂、钯、铑、或钌、或过渡金属如镍、钴、铜、铁、钼、或贵金属如银或金，或者带有机和无机配体的盐或络合物。在一些情况下，也可以使用这些金属的合金。这些金属和其衍生物可以是纯的或与其他活性和惰性材料混合。催化剂可以吸附于支持材料(如活性炭、氧化铝、或二氧化硅)，旨在最大化有效表面积。氢化催化剂的物理形态已知对它们的性能产生重大影响。优选的氢化催化剂包括多相钯催化剂，如处于与支持材料相比0.1％Pd至20％Pd(w/w)的等级内的钯/碳(Pd/C)、钯/氧化铝(Pd/Al2O3)、或钯/二氧化硅(Pd/SiO2)。合适的选择性氢化催化剂的实例是LD 2773，一种耐硫的增进型Pd/氧化铝(Axens，Rueil-Malmaison Cedex，法国)。在转化成异戊烷最少的情况下允许异戊二烯转化成异戊烯的部分氢化催化剂包括Lindlar催化剂(用喹啉处理的Pd/BaSO4)、用第15族元素(N、P、As)的三苯基衍生物处理的Pd/C、用含硫化合物硫化钼处理的Pd/C、和Pd/Fe合金。一种优选的催化剂包含吸附于卵壳型氧化铝(δ-Al2O3)的钯。特别优选炼油工业中用于从裂解汽油中除去二烯烃和炔的催化剂，例如基于Ni/Al2O3和Pd/Al2O3的催化剂。另一个合适类型的用于转化异戊二烯成异戊烯的催化剂是工业中用于加氢处理裂解汽油的那些催化剂。见例如美国专利号7,014,750和6,9949,686和其中所引用的参考文献。通常，裂解气加氢处理中所用的催化剂允许将乙炔和二烯烃(例如异戊二烯和间戊二烯)选择性转化成单烯烃。
氢源可以是氢气或是包括但不限于氢气(H2)、甲酸、肼、或异丙醇的氢源。可以化学地或生物地衍生氢源。在一些实施方式中，用于氢化的氢在发酵期间随异戊二烯共同产生。氢化可以在范围从0.5atm至200atm或更高的氢压下进行。温度可以是从0℃至200℃。
来自生物异戊二烯组合物部分氢化的产物预期含有最初存在于起始异戊二烯组合物中的某些杂质和/或这些杂质的氢化衍生物，如丙酮、乙醇、戊醇、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、甲乙酮和其他饱和的极性杂质。
在一些实施方式中，异戊二烯起始组合物在钯催化剂存在下经历部分氢化或选择性氢化。例如，显示钯催化剂(如Pd/CaCO3、Pd/BaSO4、Pd/C、Pd黑、Pd/SiO3、Pd/Al2O3、或Pd/SiO2)以大于95％的选择性将异戊二烯转化成单烯烃，而非充分还原的C5烷类。这些钯催化剂的使用产生单烯烃产物的混合物，其中5％Pd/CaCO3具有针对3-甲基丁-1-烯的最大选择并且5％Pd/SiO2具有针对2-甲基丁-2-烯的最大选择。(见G.C.Bond和A.F.Rawle.J.Mol.Catalysis A：Chemical 109(1996)261-271)。Bond和Rawle还已经显示，钯-金和钯-银催化剂(例如，Pd-Au/SiO2和Pd-Ag/SiO2)具有将异戊二烯还原成单烯烃而非充分还原的C5烷类的高度选择。在一些实施方式中，二氧化硅支持的聚酰胺型胺(PAMAM)树枝状聚合物-钯络合物已经用来选择性地催化环状和非环状二烯还原成单烯烃异构体的混合物。针对多种单烯烃异构体的选择性取决于该催化剂中所用的确切PAMAM配体。(见P.P.Zweni和H.Alper.Adv.Synth.Catal.348(2006)725-731)。在一些实施方式中，异戊二烯还原成单烯烃可以使用无机支持物(例如，金属沸石)上的VIB族金属作为催化剂进行。例如，使用Mo/Al2O3催化剂选择性地将1，3-丁二烯还原成相应的单烯烃。(见US 6,235,954B1)。在一些实施方式中，异戊二烯可以使用VIII族金属催化剂还原成单烯烃，其中所述VIII族金属催化剂由来自IB、VIB、VIIB族的金属或锌增进以降低对催化剂的毒害。(见US 6,949,686B2)。在一些实施方式中，异戊二烯可以使用整体式催化剂床还原成单烯烃，所述整体式催化剂床可以为蜂房结构。整体式催化剂床的催化剂支持材料可以包括金属如镍、铂、钯、铑、钌、银、铁、铜、钴、铬、铱、锡、及其合金或混合物。(见US 7,014,750B2)。在一些实施方式中，异戊二烯可以使用卵壳型Pd/δ-Al2O3催化剂还原成单烯烃，尤其该反应是在无水下进行时。卵壳型Pd/δ-Al2O3催化剂对单烯烃而非充分还原的烷类具有选择性，并且2-甲基丁-2-烯是热力学上有利的异构体(见J.-R.Chang和C.-H.Cheng.Ind.Eng.Chem.Res.36(1997)4094-4099)。
轻质烯烃(C3-C6)可以使用酸催化剂轻易地二聚化以产生又称作二聚物(dimate)的高级烯烃(C6-C12)。例如，本领域充分描述了使用包括硫酸、磷酸和其他无机酸、磺酸、氟磺酸、沸石、和酸性粘土的多种酸性催化剂将异丁烯(2-甲基丙烯)转化成异辛烯。
在一些实施方式中，异戊二烯起始组合物经历部分氢化或选择性氢化以形成单烯烃，并且使用常规的烃正离子催化，如用来将异丁烯转化成异辛烷的烃正离子催化(例如硫酸、磷酸和其他无机酸、磺酸、氟磺酸、沸石和酸性粘土)，所述单烯烃经历与其他烯烃的二聚化或反应。见，例如，Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology，第4版，Wiley，New York(1995)，14，934-952中的H.M.Lybarger.异戊二烯。在一些优选的实施方式中，高纯异戊二烯原料是生物异戊二烯组合物。可以使用液体和固体形式的酸性催化剂。酸性树脂是优选的，并且包括Amberlyst 15、35、XE586、XN1010(Rohm和Haas)和相似的酸性离子交换树脂。酸性分子筛也是优选的催化剂，其包括中度孔酸性分子筛如ZSM-5、镁碱沸石(ferrierite)、ZSM-22和ZSM-23。
在一些实施方式中，异戊二烯起始组合物经历部分氢化或选择性氢化以形成异戊烯。在一些实施方式中，将异戊烯二聚化以产生C10二聚物如异癸烯。在一些实施方式中，将异戊烯与烯烃如丙烯、丁烷或异丁烯二聚化以产生C8-C10二聚物。在一些实施方式中，单烯烃经历了使用树脂催化剂(例如，Amberlyst、Amberlyst 35、Amberlyst 15、Amberlyst XN1010、Amberlyst XE586)的二聚化以产生二异戊烯。此类树脂催化剂的使用已经显示使裂化和进一步寡聚化反应最小化，并且在最佳条件下，这些树脂催化剂提供针对二聚体的大于92％的选择性，同时三聚体形成小于8％。见，例如，M.Marchionna等人.CatalysisToday 65(2001)397-403。在一些实施方式中，单烯烃经历了使用含有酸性中孔分子筛(如嵌入沸石结构内的中孔筛、ZSM-5、镁碱沸石、ZSM-22、或ZSM-23)的催化材料的二聚化。在具体的实施方式中，该催化材料是在高温(例如，至少900℃)下热稳定的。在另一个具体的实施方式中，单烯烃基本上不含多不饱和烃，如异戊二烯。用于二聚化的含有酸性中孔分子筛的催化材料的使用可以导致针对二聚体的多于80％的选择性。见，例如US 2007/0191662 A1。在一些实施方式中，单烯烃经历使用固态酸性催化剂(例如，固态磷酸催化剂、酸性离子交换树脂)的二聚化。使用固态磷酸催化剂时针对二聚体的选择性可以是至少75％、至少85％或至少90％。见，例如US 2009/0099400 A1和US6,660,898 B1。
高效二聚化有时可能需要进料流中存在极性组分，如水和氧化的化合物。实例包括醇类如甲醇、乙醇和叔丁醇，醚如甲基叔丁基醚(MTBE)和甲基叔戊基醚(TAME)或酯如C1至C5乙酸酯。在一些实施方式中，异戊烯可以在酸催化剂存在下通过醇处理转化成醚如TAME。
在一些实施方式中，通过本文所述的任何方法产生的单烯烃的C10二聚体可以还原成充分饱和的C10烷基化物(例如，通过氢化)。在具体的实施方式中，异戊二烯或单烯烃可以使用催化剂还原成烷基化物，其中所述催化剂含有与聚合物组分如聚丙烯酸酯混合的酸组分，如硫酸、氟磺酸、全卤烷基磺酸、离子液体、或者布朗斯特酸与路易斯酸的混合物。(见US 2010/0094072 A1)。
在一些实施方式中，商业上有益量的高纯异戊二烯原料在酸催化剂存在下经历寡聚化以产生二聚体、三聚体、高级低聚物、芳族产物、和/或聚合产物。虽然胶质形成和结焦是导致催化剂失活的已知问题，但是对反应的动力学控制可以有利于某些产物，例如低级低聚物。
示例性示例性不饱和的异戊二烯衍生物
在一些实施方式中，用于从异戊二烯产生燃料组分的组合物和系统还包含用于将异戊二烯起始组合物化学转变成燃料组分的不饱和烃或氧化产物中间体。在一些实施方式中，不饱和烃中间体包括选自以下的一种或多种不饱和的异戊二烯二聚体：1，2-二(丙-1-烯-2-基)环丁烷、1，3-二(丙-1-烯-2-基)环丁烷、1-甲基-1-乙烯基-3-(丙-1-烯-2-基)环丁烷、1-甲基-1-乙烯基-2-(丙-1-烯-2-基)环丁烷、1，3-二甲基-1，3-二乙烯基环丁烷、1，2-二甲基-1，2-二乙烯基环丁烷、1-甲基-4-(丙-1-烯-2-基)环己-1-烯)、1-甲基-5-(丙-1-烯-2-基)环己-1-烯、1，4-二甲基-4-乙烯基环己烯、2，4-二甲基-4-乙烯基环己烯、1，5-二甲基环辛-1，5-二烯、1，6-二甲基环辛-1，5-二烯、1，4-二甲基-4-乙烯基-1-环己烯、2，4-二甲基-4-乙烯基-1-环己烯、2，7-二甲基-1，3，7-辛三烯、2，7-二甲基-2，4，6-辛三烯、2，6-二甲基-1，3-环辛二烯、2，6-二甲基-1，4-环辛二烯、3，7-二甲基-1，5-环辛二烯、3，7-二甲基-1，3-环辛二烯和3，6-二甲基-1，3-环辛二烯。在一些实施方式中，不饱和烃中间体包括一种或多种不饱和的三聚体，如α-法呢烯、β-法呢烯、三甲基环十二碳三烯(例如1，5，9-三甲基-(1E，5E，9E)-环十二碳三烯及其位置异构体和几何异构体)和三甲基十二碳四烯等。在一些实施方式中，不饱和的氧化产物中间体包含一种或多种不饱和的甲基醚，如1-甲氧基-2，7-二甲基-2，7-辛二烯和3-甲氧基-2，7-二甲基-1，7-辛二烯等。在一些实施方式中，不饱和的氧化产物中间体包含一种或多种不饱和的乙基醚，如乙基3-甲基-3-丁烯基醚、乙基1，1-二甲基-2-丙烯基醚、乙基1，2-二甲基-2-丙烯基醚、乙基2-甲基-3-丁烯基醚等。在一些实施方式中，不饱和的氧化产物中间体包括一种或多种不饱和醇，如3-甲基-3-丁烯-1-醇、2-甲基-3-丁烯-2-醇、3-甲基-3-丁烯-2-醇、2-甲基-3-丁烯-1-醇等。在一些实施方式中，不饱和的氧化产物中间体包括一种或多种不饱和酯，如3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯、2-甲基-3-丁烯-2-基乙酸酯、3-甲基-3-丁烯-2-基乙酸酯、2-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯和其他C3-C18脂族羧酸的酯等。在一些实施方式中，不饱和烃中间体包括一种或多种异戊烯，例如2-甲基丁-1-烯、3-甲基-丁-1-烯和2-甲基丁-2-烯。在一些实施方式中，不饱和烃中间体包括一种或多种从异戊烯二聚化衍生的二异戊烯。
示图I.示例性不饱和的6-元和8-元环中间体
Figure BDA0000135567880001721
示图II.示例性不饱和的4-元环中间体
Figure BDA0000135567880001722
示图III.示例性不饱和异戊二烯调聚物和氧化产物中间体
Figure BDA0000135567880001731
示图IV.示例性不饱和的乙基醚中间体
示图VI.示例性不饱和酯中间体
Figure BDA0000135567880001741
不饱和中间体的示例性氢化
不饱和异戊二烯衍生物在氢化催化剂存在下经历氢化以产生饱和的化合物。表征饱和的化合物，并且评定它们作为燃料的价值。在一些实施方式中，用于氢化的氢源是氢气。在一些实施方式中，氢气随生物异戊二烯共同产生，如美国临时专利申请号61/141,652(2008年12月30日提交)和US 2009/0203102 A1中所述。在一些实施方式中，氢化催化剂是基于钯的催化剂如Pd/C(例如5％(wt)Pd/C)。在一些实施方式中，氢化催化剂是雷尼镍催化剂。在一些实施方式中，氢化催化剂是均相催化剂如基于钌或铑的均相氢化催化剂。在一些实施方式中，将不饱和异戊二烯二聚体和三聚体氢化以产生适于制造燃料的饱和C10和C15烃。在一些实施方式中，将不饱和的环状二聚体氢化以产生饱和的环状C10烃，如1，2-双(异丙基)环丁烷、1，2-双(异丙基)环丁烷、1-甲基-4-异丙基环己烷、1-甲基-3-异丙基环己烷、1-乙基-1，4-二甲基环己烷、1-乙基-1，3-二甲基环己烷、1，5-二甲基环辛烷和1，4-二甲基环辛烷。在一些实施方式中，将不饱和的环状三聚体氢化以产生饱和的环状C15烃，如1，5，9-三甲基环十二烷和1，5，10-三甲基环十二烷(见示图VII)。在一些实施方式中，将不饱和的线性二聚体氢化以产生饱和的脂族C10烃，如2，6-二甲基辛烷、2，7-二甲基辛烷和3，6-二甲基辛烷。在一些实施方式中，将不饱和的线性三聚体氢化以产生饱和的脂族C15烃，如2，6，10-三甲基十二烷、2，7，10-三甲基十二烷和3，7，10-三甲基十二烷(见示图VIII)。在一些实施方式中，将异戊烯(二戊烯或C10二聚物)二聚化的产物充分氢化成异链烷烃(例如2，3，4，4-四甲基己烷、2，2，3，4-四甲基己烷、2，3，3，4-四甲基己烷和3，3，5-三甲基庚烷)(见示图VIIIa)。在一些实施方式中，将商业上有益量的高纯异戊二烯起始组合物氢化以产生包含2-甲基丁烷的产物。在一些实施方式中，将不饱和异戊二烯羟基化物(hydroxylate)氢化以产生饱和的羟基化物如C5醇和二醇(例如3-甲基-丁-1-醇、2-甲基-丁-1-醇和2-甲基-丁-2-醇、3-甲基-丁-1，3-二醇和2-甲基-丁-2，3-二醇)、C-10醇和二醇(例如3，7-二甲基辛-1-醇、2，7-二甲基辛-1-醇、2，7-二甲基辛-2-醇和2，7-二甲基辛-2，7-二醇)和环状C-10醇(例如2-(4-甲基环己基)丙-2-醇、2-(4-甲基环己基)丙-1-醇、2-(1，4-二甲基环己基)乙醇和4-乙基-1，4-二甲基环己醇)(见示图IX)。在一些实施方式中，将不饱和异戊二烯氧化产物氢化以产生饱和醚，如1，3-二乙氧基-3-甲基丁烷、1-乙氧基-3-甲基丁烷、1-甲氧基-2，7-二甲基辛烷和3-甲氧基-2，7-二甲基辛烷(见示图X)。应当理解当烯部分被氢化时，产生一种或多种立体异构体。立体异构体之间的相对比率取决于所用的反应条件和催化剂。当可应用时，每一个和每种立体异构体意图是本文所述的饱和烃和氧化产物。
示图VII.从异戊二烯衍生的环状烃的实例
Figure BDA0000135567880001761
示图VIII.从异戊二烯衍生的脂族烃的实例
Figure BDA0000135567880001771
示图VIIIa.从异戊烯衍生的异癸烷的实例
Figure BDA0000135567880001772
示图IX.从异戊二烯衍生的IsoFuelTM醇的实例
Figure BDA0000135567880001781
示图X.从异戊二烯衍生的IsoFuelTM氧化产物的实例
Figure BDA0000135567880001791
在一些实施方式，通过化学转变商业上有益量的高纯异戊二烯起始组合物所产生的燃料组分包含饱和的异戊二烯衍生物。在一些实施方式中，燃料组分包含从异戊二烯衍生的饱和C10和C15烃。在一些实施方式中，燃料组分包含选自以下的一种或多种饱和的环状C10烃：1，2-双(异丙基)环丁烷、1，2-双(异丙基)环丁烷、1-甲基-4-异丙基环己烷、1-甲基-3-异丙基环己烷、1-乙基-1，4-二甲基环己烷、1-乙基-1，3-二甲基环己烷、1，5-二甲基环辛烷和1，4-二甲基环辛烷。在一些实施方式中，燃料组分包含选自以下的一种或多种饱和的环状C15烃：1，5，9-三甲基环十二烷和1，5，10-三甲基环十二烷。在一些实施方式中，燃料组分包含选自以下的一种或多种饱和的脂族C10烃：2，6-二甲基辛烷、2，7-二甲基辛烷和3，6-二甲基辛烷。在一些实施方式中，燃料组分包含选自以下的一种或多种饱和的脂族C15烃：2，6，10-三甲基十二烷、2，7，10-三甲基十二烷和3，7，10-三甲基十二烷。在一些实施方式中，燃料组分包含2-甲基丁烷。在一些实施方式中，燃料组分包含选自以下的一种或多种异链烷烃：2，3，4，4-四甲基己烷、2，2，3，4-四甲基己烷、2，3，3，4-四甲基己烷和3，3，5-三甲基庚烷。在一些实施方式中，燃料组分包含选自以下的一种或多种饱和的羟基化物：3-甲基-丁-1-醇、2-甲基-丁-1-醇和2-甲基-丁-2-醇、3-甲基-丁-1，3-二醇、2-甲基-丁-2，3-二醇、3，7-二甲基辛-1-醇、2，7-二甲基辛-1-醇、2，7-二甲基辛-2-醇、2，7-二甲基辛-2，7-二醇、2-(4-甲基环己基)丙-2-醇、2-(4-甲基环己基)丙-1-醇、2-(1，4-二甲基环己基)乙醇和4-乙基-1，4-二甲基环己醇。在一些实施方式中，燃料组分包含选自以下的一种或多种饱和醚：1，3-二乙氧基-3-甲基丁烷、1-乙氧基-3-甲基丁烷、1-甲氧基-2，7-二甲基辛烷和3-甲氧基-2，7-二甲基辛烷。在一些实施方式中，燃料组分包含选自以下的一种或多种异戊二烯氧化产物：3-甲基四氢呋喃、3-甲基-2-丁酮和乙酸异戊酯。
在一些实施方式中，用于从异戊二烯产生燃料组分的组合物和系统还包含用于催化异戊二烯起始组合物化学转变成燃料组分或用于制造燃料组分的中间体的催化剂。在一些实施方式中，用于从异戊二烯产生燃料组分的组合物和系统还包含用于催化不饱和中间体的氢化以产生饱和燃料组分的催化剂。在一些实施方式中，该催化剂是所描述的任意催化剂或本文所述的催化剂中一项或多项的组合。
用于产生燃料的方法和/或过程
本发明提供了用于从异戊二烯产生燃料组分的方法和/或过程，其包括：(a)获得商业上有益量的高纯异戊二烯；和(b)将至少一部分商业上有益量的高纯异戊二烯化学地转变成燃料组分。在一个实施方式中，高纯异戊二烯组合物在连续的化学过程中转变成燃料组分。在另一个实施方式中，高纯异戊二烯组合物在化学转变成燃料组合物之前经进一步纯化。在又一个实施方式中，将高纯异戊二烯化学地转变成中间体组合物；该中间体组合物经历进一步化学转变以产生燃料或燃料组分。在又一个实施方式中，产生的燃料组分与石油馏出液和其他任选的添加物混合以制造燃料。在一些优选的实施方式中，高纯异戊二烯是生物异戊二烯组合物。
在一些实施方式中，用于从异戊二烯产生燃料组分的方法包括获得商业上有益量的高纯异戊二烯组合物。在一些实施方式中，用于本发明中的高纯异戊二烯组合物包含大于或约2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000mg的异戊二烯。在一些实施方式中，高纯异戊二烯组合物包含大于或约2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100g的异戊二烯(w/w)。在一些实施方式中，起始异戊二烯组合物包含大于或约0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000kg的异戊二烯(w/w)。
在一些实施方式中，用于从异戊二烯产生燃料组分的方法包括获得商业上有益量的高纯异戊二烯组合物。在一些实施方式中，高纯异戊二烯起始组合物包含重量占该起始组合物中全部C5烃的总重量的大于或约98.0％、98.5％、99.0％、99.5％、或100％的异戊二烯。在一些实施方式中，在本发明中有用的高纯异戊二烯组合物包含重量占该组合物中全部C5烃的总重量的大于或约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％、或100％的异戊二烯。在一些实施方式中，高纯异戊二烯组合物包含重量占该组合物中全部C5烃的总重量的小于或约2.0％、1.5％、1.0％、0.5％、0.2％、0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的除异戊二烯之外的C5烃(如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，高纯异戊二烯组合物具有重量占该组合物中全部C5烃的总重量的小于或约2.0％、1.5％、1.0％、0.5％、0.2％、0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔。在具体的实施方式中，高纯异戊二烯组合物具有大于约2mg的异戊二烯，并且具有重量占该组合物中全部C5烃的总重量的大于或约98.0％、98.5％、99.0％、99.5％、99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％、或100％的异戊二烯。
在一些实施方式中，用于从异戊二烯产生燃料组分的方法包括获得商业上有益量的高纯异戊二烯组合物。在一些实施方式中，对于组合物中抑制异戊二烯聚合的任意化合物，本发明中有用的高纯异戊二烯组合物具有小于或约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的抑制异戊二烯聚合的化合物。在具体的实施方式中，该组合物还具有大于约2mg的异戊二烯。
在一些实施方式中，用于从异戊二烯产生燃料组分的方法包括获得商业上有益量的高纯异戊二烯组合物。在一些实施方式中，本发明中有用的高纯异戊二烯组合物具有选自乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇、和具有10个或更多个碳原子的类异戊二烯化合物的一种或多种化合物。在一些实施方式中，高纯异戊二烯组合物具有大于或约0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、60、80、100、或120μg/L的乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇(例如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)、或前述任意两项或更多项。在一些实施方式中，高纯异戊二烯组合物具有大于约2mg的异戊二烯，并且具有选自乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇、和具有10个或更多个碳原子的类异戊二烯化合物的一种或多种化合物。
在一些实施方式中，用于从异戊二烯产生燃料组分的方法包括获得商业上有益量的高纯异戊二烯组合物。在一些实施方式中，本发明中有用的高纯异戊二烯组合物包含异戊二烯和选自2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，4，5-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、丁二酮、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、异丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3-甲基丁酯、3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯、3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯、3-己烯-1-醇、3-己烯-1-基乙酸酯、苧烯、香叶醇(反式-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇)、香茅醇(3，7-二甲基-6-辛烯-1-醇)、(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、和2，3-环庚烯醇吡啶的一种或多种第二化合物。在多种实施方式中，以重量％为单位，这些第二组分中一种组分的量相对于异戊二烯的量(即，该成分的重量除以异戊二烯的重量乘以100)是大于或约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或110％(w/w)。在一些实施方式中，以重量％为单位，甲硫醇的量相对于异戊二烯的量是小于0.01％(w/w)。
在一些实施方式中，用于从异戊二烯产生燃料组分的方法包括获得商业上有益量的高纯异戊二烯组合物。在一些实施方式中，该方法包括从生物过程获得商业上有益量的高纯异戊二烯组合物，所述生物过程包括：(a)在产生异戊二烯的合适培养条件下培养包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸的细胞；其中所述细胞(i)产生大于约400nmole/gwcm/时的异戊二烯，(ii)将多于约0.002摩尔％的所述细胞从细胞培养基中消耗的碳转化成异戊二烯，或(iii)具有大于约0.1mg/L培养液/小时异戊二烯的异戊二烯平均体积生产率，并且(iii)产生异戊二烯。在一些实施方式中，细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽(例如来自植物如葛属的天然存在多肽)且(ii)与启动子(例如T7启动子)可操作连接的异源核酸。在一些实施方式中，细胞在包含碳源的培养基中培养，所述碳源例如是，但不限于碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的组分、或前述二者或更多者的任意组合。在一些实施方式中，细胞在限葡萄糖的条件下培养。在一些实施方式中，细胞还包含编码IDI多肽的异源核酸。在一些实施方式中，细胞还包含编码MDV途径多肽的异源核酸。在一些实施方式中，该方法包括使用在2008年7月2日提交的美国临时专利申请号61/134,094、WO 2010/003007、和2008年12月15日提交的美国专利申请号12/335,071(US 2009/0203102 A1)中描述的方法产生异戊二烯，所述文献通过引用方式全文并入。
在一些实施方式中，该方法包括获得由培养物中的产生异戊二烯的细胞所产生的气相(废气)。在所述方法的一些实施方式中，处于培养物中的细胞产生大于约400nmole/gwcm/小时的异戊二烯。在一些实施方式中，以1vvm的速率鼓泡时，该气相包含大于或约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/L的异戊二烯。在一些实施方式中，该气相的挥发性有机级分包含重量占该挥发性有机级分中全部C5烃的总重量大于或约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％、或100％的异戊二烯。在一些实施方式中，该气相的挥发性有机级分包含重量占该挥发性有机级分中全部C5烃的总重量的小于或约2.0％、1.5％、1.0％、0.5％、0.2％、0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的除异戊二烯之外的C5烃(如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，该气相的挥发性有机级分具有重量占该挥发性有机级分中全部C5烃的总重量的小于或约2.0％、1.5％、1.0％、0.5％、0.2％、0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-l-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔。在一些实施方式中，气相的挥发性有机级分具有大于约2mg的异戊二烯，并且具有重量占该挥发性有机级分中全部C5烃的总重量的大于或约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％、或100％的异戊二烯。
在一些实施方式中，该方法包括获得由培养物中产生异戊二烯的细胞所产生的气相(废气)。在一些实施方式中，对于气相的挥发性有机级分中抑制异戊二烯聚合的任意化合物，气相的挥发性有机级分具有小于或约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的抑制异戊二烯聚合的化合物。在具体的实施方式中，气相的挥发性有机级分还具有大于约2mg异戊二烯。在一些实施方式中，气相的挥发性有机级分具有选自乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇、和具有10个或更多个碳原子的类异戊二烯化合物的一种或多种化合物。在一些实施方式中，气相的挥发性有机级分具有大于或约0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、60、80、100、或120μg/L的乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇(例如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)、或前述任意两项或更多项。在具体的实施方式中，气相的挥发性有机级分具有大于约2mg异戊二烯并且具有选自乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇、和具有10个或更多个碳原子的类异戊二烯化合物的一种或多种化合物。在一些实施方式中，气相的挥发性有机级分具有异戊二烯和选自下述的一种或多种第二化合物2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，4，5-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、丁二酮、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、异丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3-甲基丁酯、3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯、3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯、3-己烯-1-醇、3-己烯-1-基乙酸酯、苧烯、香叶醇(反式-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇)、香茅醇(3，7-二甲基-6-辛烯-1-醇)、(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、和2，3-环庚烯醇吡啶。在多个实施方式中，在气相的挥发性有机级分中，以重量％为单位，这些第二组分中一种组分的量相对于异戊二烯的量(即，该成分的重量除以异戊二烯的重量乘以100)是大于或约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或110％(w/w)。在一些实施方式中，所述方法还包括从气相回收异戊二烯。例如，包含异戊二烯的气相中的异戊二烯可以使用标准技术回收，如从固相中气提、膜增强分离、分馏、吸附/解吸附、渗透蒸发、从固相热或真空解吸附异戊二烯、或用溶剂提取固定至或吸附至固相的异戊二烯(见，例如，美国专利号4,703,007和4,570,029，所述文献因而各自通过引用方式全文并入，特别关于异戊二烯回收与纯化方法的方面)。在一些具体的实施方式中，使用醇(例如乙醇、甲醇、丙醇、或其组合)萃取蒸馏法用来回收异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯的回收涉及分离液体形式的异戊二烯(如异戊二烯的净溶液或异戊二烯在溶剂中的溶液)。气提法涉及以连续方式从发酵废气流取出异戊二烯蒸气。这种取出可以以几种不同的方式实现，包括，但不限于吸附至固相、分配入液相中、或直接冷凝(例如因暴露于冷凝盘管或因压力增加所致的冷凝)。在一些实施方式中，膜富集异戊二烯蒸气露点上的稀薄异戊二烯蒸气流导致液态异戊二烯的冷凝。在一些实施方式中，压缩并冷凝回收的异戊二烯。
异戊二烯的回收可以包括一个步骤或多个步骤。在一些实施方式中，从发酵废气取出异戊二烯蒸气和异戊二烯转化成液相同时地进行。例如，异戊二烯可以从废气流直接冷凝以形成液体。在一些实施方式中，从发酵废气取出异戊二烯蒸气和异戊二烯转化成液相依次地进行。例如，异戊二烯可以吸附至固相并且随后用溶剂从固相提取出来。
在一些实施方式中，提供了用于产生异戊二烯的环状二聚体的方法，所述方法包括加热净生物异戊二烯。产生的异戊二烯环状二聚体可以是6元环二聚体(例如[2+4]电环化产物如苧烯)或8元环二聚体或其混合物。6元环二聚体的实例包括但不限于1-甲基-4-(丙-1-烯-2-基)环己-1-烯、1-甲基-5-(丙-1-烯-2-基)环己-1-烯、1，4-二甲基-4-乙烯基环己烯、2，4-二甲基-4-乙烯基环己烯等。8元环二聚体的实例包括但不限于1，5-二甲基环辛-1，5-二烯、1，6-二甲基环辛-1，5-二烯等。在一个实施方式中，生物产生的净异戊二烯通过加热至约100℃至约300℃、优选地约150℃至约250℃的温度二聚化。将压力维持在约2至3个大气压。在另一个实施方式中，可以使用适于催化共轭二烯二聚化的催化剂。可以通过催化剂和其他反应条件控制产物混合物中多种二聚体的比例。例如，镍催化剂可以促进8-元环二聚体的形成。
在一些实施方式中，提供了用于产生异戊二烯的环状二聚体的方法，所述方法包括生物异戊二烯的光二聚化。所产生的异戊二烯的环状二聚体可以是一种或多种4-元环二聚体或其混合物。4-元环二聚体的实例包括但不限于1，2-二(丙-1-烯-2-基)环丁烷、1，3-二(丙-1-烯-2-基)环丁烷、1-甲基-1-乙烯基-3-(丙-1-烯-2-基)环丁烷、1-甲基-1-乙烯基-2-(丙-1-烯-2-基)环丁烷、1，3-二甲基-1，3-二乙烯基环丁烷、1，2-二甲基-1，2-二乙烯基环丁烷等。在一个实施方式中，生物产生的净异戊二烯通过用紫外光照射，优选地在光敏剂(如二苯酮)存在下二聚化。
异戊二烯二聚体可以氢化以形成可以充当燃料或掺合至燃料中的饱和的C10烃。在一个实施方式中，不饱和的异戊二烯二聚体经历催化氢化以产生部分氢化的和/或充分氢化的产物。充分氢化的产物的实例包括但不限于1-甲基-4-异丙基环己烷和1-甲基-5-异丙基环己烷、1，4-二甲基-4-乙基环己烷、2，4-二甲基-4-乙基环己烷、1，2-二异丙基环丁烷和1，3-二异丙基环丁烷、1-甲基-1-乙烯基-3-(丙-1-烯-2-基)环丁烷、1-甲基-1-乙基-2-(丙-2-基)环丁烷、1，3-二甲基-1，3-乙基环丁烷、1，2-二甲基-1，2-二乙基环丁烷、1，5-二甲基环辛烷、1，6-二甲基环辛烷等。
在一些实施方式中，用于从异戊二烯产生燃料组分的方法包括：(a)获得商业上有益量的本文所述的任意的高纯异戊二烯起始组合物；和(b)将至少一部分高纯异戊二烯起始组合物化学地转变成燃料组分，这包括：(i)在压力下加热所述高纯异戊二烯组合物至超过或约100℃；(ii)将至少一部分起始异戊二烯组合物转化成不饱和的环状异戊二烯二聚体；和(iii)氢化不饱和的环状异戊二烯二聚体以产生饱和的环状异戊二烯二聚体。在一些实施方式中，将起始异戊二烯组合物在压力下加热至超过或约100、125、150、175、200、225或250℃。在一些实施方式中，将起始异戊二烯组合物在防止自由基介导的聚合的抗氧化剂(例如2，6-二-叔丁基-4-甲基苯酚)存在下加热。在一个实施方式中，异戊二烯的热二聚化在作为聚合抑制剂的二硝基甲酚存在下进行。可以使用合适的抗氧化剂作为聚合抑制剂。在一些实施方式中，至少一部分起始异戊二烯组合物转化成不饱和二聚体的混合物，所述混合物包括6-元环和8-元环，例如，苧烯(1-甲基-4-(丙-1-烯-2-基)环己-1-烯)、1-甲基-5-(丙-1-烯-2-基)环己-1-烯、1，4-二甲基-4-乙烯基环己烯、2，4-二甲基-4-乙烯基环己烯、1，5-二甲基环辛-1，5-二烯、1，6-二甲基环辛-1，5-二烯、2，6-二甲基-1，3-环辛二烯、2，6-二甲基-1，4-环辛二烯、3，7-二甲基-1，5-环辛二烯、3，7-二甲基-1，3-环辛二烯和3，6-二甲基-1，3-环辛二烯。在一些实施方式中，起始异戊二烯组合物中大于或约20、30、40、50、60、70、75、80、85、90、95、98、99或100％的异戊二烯转化成不饱和的环状异戊二烯二聚体。在一些实施方式中，不饱和的环状异戊二烯二聚体的氢化由氢化催化剂如基于钯的催化剂(例如Pd/C，例如5％(wt)Pd/C)催化。在一些实施方式中，饱和的环状异戊二烯二聚体包含选自以下的一种或多种C10烃：1-甲基-4-异丙基环己烷、1-甲基-3-异丙基环己烷、1，5-二甲基环辛烷和1，4-二甲基环辛烷。在一些优选的实施方式中，起始异戊二烯组合物是生物异戊二烯组合物。
在一些实施方式中，用于从异戊二烯产生燃料组分的方法包括：(a)获得商业上有益量的本文所述的任意的高纯异戊二烯起始组合物；和(b)将至少一部分高纯异戊二烯起始组合物化学地转变成燃料组分，这包括：(i)使高纯异戊二烯组合物与催化剂体系接触；(ii)将至少一部分起始异戊二烯组合物转化成不饱和的异戊二烯二聚体和/或三聚体；和(iii)氢化不饱和的二聚体和/或三聚体以产生饱和的C10和/或C15烃。在一些实施方式中，起始异戊二烯组合物中大于或约20、30、40、50、60、70、75、80、85、90、95、98、99或100％的异戊二烯转化成异戊二烯的不饱和二聚体和/或三聚体。在一些实施方式中，起始异戊二烯组合物与本领域已知的适宜催化剂体系接触以产生选自以下的一种或多种不饱和的环状异戊二烯二聚体：1，2-二(丙-1-烯-2-基)环丁烷、1，3-二(丙-1-烯-2-基)环丁烷、1-甲基-1-乙烯基-3-(丙-1-烯-2-基)环丁烷、1-甲基-1-乙烯基-2-(丙-1-烯-2-基)环丁烷、1，3-二甲基-1，3-二乙烯基环丁烷、1，2-二甲基-1，2-二乙烯基环丁烷、1-甲基-4-(丙-1-烯-2-基)环己-1-烯)、1-甲基-5-(丙-1-烯-2-基)环己-1-烯、1，4-二甲基-4-乙烯基环己烯、2，4-二甲基-4-乙烯基环己烯、1，5-二甲基环辛-1，5-二烯、1，6-二甲基环辛-1，5-二烯、1，4-二甲基-4-乙烯基-1-环己烯、2，4-二甲基-4-乙烯基-1-环己烯、2，7-二甲基-1，3，7-辛三烯、2，7-二甲基-2，4，6-辛三烯、2，6-二甲基-1，3-环辛二烯、2，6-二甲基-1，4-环辛二烯、3，7-二甲基-1，5-环辛二烯、3，7-二甲基-1，3-环辛二烯和3，6-二甲基-1，3-环辛二烯。在一些实施方式中，起始异戊二烯组合物与本领域已知的适宜催化剂体系接触以产生一种或多种不饱和的环状异戊二烯三聚体，如三甲基环十二碳三烯和三甲基十二碳四烯等。在一些实施方式中，起始异戊二烯组合物与本领域已知的适宜催化剂体系接触以产生一种或多种不饱和的异戊二烯线性二聚体和/或三聚体，如二甲基辛三烯(例如2，7-二甲基-1，3，7-辛三烯和2，7-二甲基-2，4，6-辛三烯)和三甲基十二碳四烯(例如2，6，10-三甲基-1，5，9，11-十二碳四烯、α-法呢烯和β-法呢烯)等。在一些优选的实施方式中，起始异戊二烯组合物是生物异戊二烯组合物。
在一些实施方式中，用于从异戊二烯产生燃料组分的方法包括使高纯异戊二烯组合物与催化剂体系接触以将至少一部分起始异戊二烯组合物转变成不饱和的异戊二烯二聚体和/或三聚体。在一些实施方式中，该催化剂体系包含Ni、Fe或Co催化剂，并且起始组合物中的异戊二烯转化成包含二甲基环辛二烯(如1，5-二甲基环辛-1，5-二烯和1，6-二甲基环辛-1，5-二烯)的8-元环异戊二烯二聚体。在一些实施方式中，该催化剂体系包含镍化合物。Ni-催化的异戊二烯二聚化产生由约90对10、80对20、70对30、60对40、50对50、40对60、30对70、20对80和10对90比率的1，5-二甲基-1，5-环辛二烯对1，6-二甲基-1，5-环辛二烯组成的二甲基-1，5-环辛二烯混合物。在一个实施方式中，该催化剂体系包含3-组分催化剂，所述的3组分催化剂含有羧酸Ni或β-酮、有机铝或有机镁化合物和取代的三苯基亚磷酸盐。例如，高纯异戊二烯起始组合物在无水甲苯中的脱气溶液与Ni(acac)2、Et3Al、和三(3，4-双(二甲氨基)苯基)亚磷酸盐在氮气氛下混合，并且混合物在95℃加热以产生二甲基环辛二烯。在另一个实施方式中，该催化剂体系包含羧酸Fe或β-二酮化合物、有机-Al或Mg化合物、和具有供电子基团的2，2′-二吡啶基衍生物。例如，将起始异戊二烯组合物与乙酰丙酮合Fe、4，4′-二甲基-2，2′-二吡啶基、和Et3Al的混合物在甲苯中加热，从而以良好产率产生1，6-二甲基-1，5-环辛二烯。在一些优选的实施方式中，起始异戊二烯组合物是生物异戊二烯组合物。
在一些实施方式中，用于从异戊二烯产生燃料组分的方法包括使高纯异戊二烯组合物与催化剂体系接触以将至少一部分起始异戊二烯组合物转化成不饱和的异戊二烯二聚体和/或三聚体。在一些实施方式中，该催化剂体系包含Ru、Fe、Ni、或Pd催化剂或其组合，并且起始组合物中的异戊二烯转化成包含6-元环异戊二烯二聚体的混合物。在一个实施方式中，该催化剂体系是Fe(NO)2Cl-双(1，5-环辛二烯)镍催化剂体系，并且使起始组合物中的异戊二烯在低温(例如-5至+20℃)下环二聚化以产生1-甲基-及2-甲基-4-异丙烯基-1-环己烯和1，4-及2，4-二甲基-4-乙烯基-1-环己烯。在另一个实施方式中，与三(取代的烃基)亚磷酸盐、亚砷酸盐、或亚锑酸盐和VIII族金属(0)化合物(例如乙酰丙酮合Ni)的混合催化剂的接触使起始组合物中的异戊二烯转化成1，4-二甲基-4-乙烯基-1-环己烯和1，5-二甲基-1，5-环辛二烯。在另一个实施方式中，异戊二烯起始组合物与钌催化剂的接触(例如见Itoh，Kenji；Masuda，Katsuyuki；Fukahori，Takahiko；Nakano，Katsumasa；Aoki，Katsuyuki；Nagashima，Hideo，Organometallics(1994)，13(3)，1020-9)使异戊二烯转化成C10环状二聚体(例如，二甲基-环辛二烯的混合物)。钌催化剂可以在两个步骤中从RuCl3和五甲基环戊二烯(C5Me5H)合成。该方法可以以分批模式进行，并且可以回收和再循环该催化剂。在一些优选的实施方式中，起始异戊二烯组合物是生物异戊二烯组合物。此方法的一个实施方式在示图XI中显示。
在一些实施方式中，用于从异戊二烯产生燃料组分的方法包括使高纯异戊二烯组合物与催化剂体系接触以将至少一部分起始异戊二烯组合物转化成不饱和的异戊二烯二聚体和/或三聚体。在一些实施方式中，该催化剂体系包含Ni、Ti、Al、或Mg催化剂或其混合物，并且起始组合物中的异戊二烯转化成包含环状异戊二烯三聚体(如三甲基环十二碳三烯)的混合物。在一个实施方式中，用于异戊二烯三聚化的催化剂体系包含Ni和/或Ti、一种或多种有机金属化合物、和VA族化合物。该反应可以在含有羟基的溶剂中进行。在另一个实施方式中，在作为电子供体的多种亚磷酸盐存在下由环烷酸镍和异戊二烯镁催化的异戊二烯的寡聚化产生含有二甲基环辛二烯的环状二聚体；尤其在1，1，1-三(羟甲基)丙烷亚磷酸盐存在下，选择性地产生三甲基环十二碳三烯。
示图XI
Figure BDA0000135567880001911
在一些实施方式中，用于从异戊二烯产生燃料组分的方法包括使高纯异戊二烯组合物与催化剂体系接触以将至少一部分起始异戊二烯组合物转化成不饱和的异戊二烯二聚体和/或三聚体。在一些实施方式中，该催化剂体系包含Ni、Pd或Cr催化剂或其混合物，并且起始组合物中的异戊二烯转化成调聚物或线性二聚体和/或三聚体。在一个实施方式中，包含Pd(0)络合物(例如Pd(acac)2-Ph3P和Pd(OAc)2-Ph3P)的催化剂体系催化异戊二烯的二聚化和调聚反应以产生线性异戊二烯二聚体(例如2，7-二甲基-1，3，7-辛三烯)。在一个变型中，该反应在作为溶剂的甲醇中进行，并且产生甲基醚如甲氧基二甲基辛二烯(例如1-甲氧基-2，7-二甲基-2，7-辛二烯和3-甲氧基-2，7-二甲基-1，7-辛二烯)。在另一个实施方式中，该催化剂体系包含二价和三价过渡金属交换的蒙脱石(例如Cr3+-蒙脱石)。在另一个实施方式中，该催化剂体系包含Ni(0)-氨基次磷酸盐催化剂，并且起始组合物中的异戊二烯转化成区域选择性尾-对-尾线性二聚体。在一些变型中，线性二聚体形成伴有竞争性环二聚化反应。在另一个实施方式中，该催化剂体系包含铬N，N-双(二芳基膦)胺催化剂(例如，见Bowen，L.；Charernsuk，M.；Wass，D.F.Chem.Commun.(2007)2835-2837)，并且异戊二烯转化成线性和环状C15三聚体。在一个变型中，所述铬催化剂从CrCl3(THF)3和PNP膦配体原位地产生。
在一些实施方式中，用于从生物异戊二烯组合物产生燃料组分的方法包括通过(i)使该生物异戊二烯组合物与用于催化异戊二烯三聚化的催化剂接触以产生不饱和异戊二烯三聚体和(ii)氢化所述异戊二烯三聚体以产生燃料组分，化学地转变该生物异戊二烯组合物中的大部分异戊二烯。在一些实施方式中，该生物异戊二烯组合物中至少约95％的异戊二烯在化学转变期间转化成非异戊二烯化合物。
在一些实施方式中，用于从异戊二烯产生燃料组分的方法包括：(a)获得商业上有益量的本文中所述的任何高纯异戊二烯起始组合物；(b)将至少一部分起始异戊二烯组合物转化成不饱和的异戊二烯衍生物；和(c)氢化不饱和异戊二烯衍生物以产生饱和的化合物。在一些实施方式中，以分批模式进行不饱和的异戊二烯衍生物氢化成饱和的化合物。在一些实施方式中，以连续模式进行不饱和的异戊二烯衍生物氢化成饱和的化合物。此方法的一个实施方式在示图XII中显示。
示图XII
Figure BDA0000135567880001931
在一些实施方式中，用于从异戊二烯产生燃料组分的方法包括：(a)获得商业上有益量的本文中所述的任何高纯异戊二烯起始组合物；(b)将至少一部分起始异戊二烯组合物转化成氧化的异戊二烯衍生物；和任选地(c)氢化任何不饱和的氧化的异戊二烯衍生物以产生饱和的氧化产物(oxygenate)。在一些实施方式中，异戊二烯起始组合物与催化剂在醇(例如甲醇或乙醇或其混合物)存在下接触以形成氧化的异戊二烯衍生物，包含一种或多种不饱和或饱和的醚(例如甲基醚或乙基醚或其混合物)。在一些实施方式中，该催化剂是酸催化剂如硫酸、固相硫酸(例如，DowexMarathon
Figure BDA0000135567880001932
)、液相和固相氟磺酸(例如三氟甲磺酸和Nafion-H(DuPont))。沸石催化剂(例如β-沸石)也可以在与Hensel等人[Hensen，K.；Mahaim，C.；Holderich，W.F.，Applied Catalysis A：General(1997)140(2)，311-329.]所述的那些条件相似的条件下用于苧烯和相关单萜烯的甲氧基化。在一些实施方式中，所述异戊二烯起始组合物或不饱和的异戊二烯二聚体或三聚体经历氧化/氢化以形成羟基化的异戊二烯衍生物，包含一种或多种醇如C5、C10和C15醇和二醇。在一些实施方式中，该异戊二烯起始组合物经历羟基化/酯化以形成醇和酯。例如，生物异戊二烯或不饱和的中间体经历过氧化以用过酸(如过乙酸和3-氯过苯甲酸)过氧化成环氧化物；和用i)水和酸催化剂和ii)硼氢化方法水合成醇和二醇。此类反应在例如Michael B.Smith和Jerry March，Advanced Organic Chemistry：Reactions，Mechanisms，and Structure，第6版，John Wiley & Sons，2007中描述。在一些优选的实施方式中，起始异戊二烯组合物是生物异戊二烯组合物。
在一些实施方式中，用于从异戊二烯产生燃料组分的方法包括：(a)获得商业上有益量的本文中所述的任何高纯异戊二烯起始组合物；(b)将起始异戊二烯组合物部分地氢化成单烯烃(例如2-甲基丁-1-烯、3-甲基-丁-1-烯和2-甲基丁-2-烯)；并且(c)从所述单烯烃产生燃料组分。在一个实施方式中，所述单烯烃经历二聚化。在另一个实施方式中，使用常规的烃正离子催化，如用来将异丁烯转化成异辛烷的烃正离子催化，所述单烯烃与其他烯烃反应。与其他烯烃二聚化或反应的产物随后经历氢化以产生饱和的燃料组分。在一些优选的实施方式中，高纯异戊二烯是生物异戊二烯组合物。在一些实施方式中，使用钯催化剂如Pd/CaCO3、Pd/BaSO4、Pd/C、Pd黑、Pd/SiO3、Pd/Al2O3、或Pd/SiO2部分地氢化起始异戊二烯组合物。在一些实施方式中，使用二氧化硅支持的聚酰胺型胺(PAMAM)树枝状聚合物-钯络合物部分地氢化起始异戊二烯组合物。在一些实施方式中，使用钯-金和钯-银催化剂(例如，Pd-Au/SiO2和Pd-Ag/SiO2)部分地氢化起始异戊二烯组合物，所述钯-金和钯-银催化剂具有将异戊二烯还原成单烯烃而非充分还原的C5烷类的高度选择性。在一些实施方式中，使用无机支持物(例如，金属沸石)上的VIB族金属作为催化剂(例如Mo/Al2O3催化剂)，部分地氢化起始异戊二烯组合物。在一些实施方式中，使用整体式催化剂床部分地氢化起始异戊二烯组合物，所述整体式催化剂床可以为蜂房结构。整体式催化剂床的催化剂支持材料可以包括金属如镍、铂、钯、铑、钌、银、铁、铜、钴、铬、铱、锡、及其合金或混合物。在一些实施方式中，使用卵壳型Pd/δ-Al2O3催化剂部分地氢化起始异戊二烯组合物，尤其该反应是在无水下进行时。在一些实施方式中，使用VIII族金属催化剂部分地氢化起始异戊二烯组合物，所述VIII族金属催化剂由来自IB、VIB、VIIB族的金属或锌增进以降低对催化剂的毒害。用于转化异戊二烯成异戊烯(单烯烃)的方法可以使用均相或多相催化剂以连续或分批模式进行。此方法的一个实施方式在示图XIII中显示。
在一些实施方式中，来自异戊二烯部分氢化的异戊烯产物在液相中在离子交换树脂和沸石上经历三聚化。见，GranGranollers，Ind.Eng.Chem.Res.，49(8)，第3561-3570(2001)页。
示图XIII
Figure BDA0000135567880001951
在一些实施方式中，用于从异戊二烯产生燃料组分的方法包括：(a)获得商业上有益量的本文中所述的任何高纯异戊二烯起始组合物；(b)将起始异戊二烯组合物部分地氢化成单烯烃(例如2-甲基丁-1-烯、3-甲基-丁-1-烯和2-甲基丁-2-烯)；(c)使单烯烃与用于单烯烃二聚化的催化剂接触以与另一单烯烃形成二聚物；和(d)使二聚化的产物(二聚物)氢化以产生饱和烃燃料组分。在一些优选的实施方式中，高纯异戊二烯是生物异戊二烯组合物。在一些实施方式中，另一单烯烃是从高纯异戊二烯起始组合物衍生的异戊烯。在一些实施方式中，另一种单烯烃是来自另一个来源的烯烃，如丙烯、丁烷或异丁烯。在一些实施方式中，用于二聚化的催化剂是树脂催化剂(例如，Amberlyst、Amberlyst 35、Amberlyst 15、Amberlyst XN1010、Amberlyst XE586)。在一些实施方式中，用于二聚化的催化剂是含有酸性中孔分子筛(如嵌入沸石结构内的中孔筛、ZSM-5、镁碱沸石、ZSM-22、或ZSM-23)的催化材料。在一些实施方式中，用于二聚化的催化剂是在高温(例如，至少900℃)下热稳定的催化材料。在一些实施方式中，用于二聚化的催化剂是含有酸性中孔分子筛的催化材料。在一些实施方式中，用于二聚化的催化剂是固态酸性催化剂(例如，固态磷酸催化剂、酸性离子交换树脂)。此方法的一个实施方式在示图XIV中显示。
示图XIV
Figure BDA0000135567880001961
在一些实施方式中，用于从异戊二烯产生燃料组分的方法包括：(a)获得商业上有益量的本文中所述的任何高纯异戊二烯起始组合物；(b)将起始异戊二烯组合物部分地氢化成异戊烯(例如2-甲基丁-1-烯、3-甲基-丁-1-烯和2-甲基丁-2-烯)；(c)使异戊烯与醇和催化剂接触以形成氧化产物；并且(d)从异戊烯氧化产物产生燃料组分。在一些优选的实施方式中，高纯异戊二烯是生物异戊二烯组合物。在一些实施方式中，异戊烯与乙醇接触，并且形成的燃料氧化产物是醚，如TAME。
在一些实施方式中，本文所述的任意方法还包括在化学转变之前纯化起始异戊二烯组合物。例如，使用本发明组合物和方法所产生的异戊二烯可以使用标准技术纯化。纯化指这样的过程，通过所述过程将异戊二烯与产生该异戊二烯时存在的一种或多种组分分开。在一些实施方式中，异戊二烯作为基本上纯的液体获得。纯化方法的实例包括(i)从液态提取剂中的溶液蒸馏和(ii)色谱。如本文中所用，“纯化的异戊二烯”意指与产生异戊二烯时存在的一种或多种组分分开的异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯以重量计至少约20％不含在产生异戊二烯时存在的其他组分。在多种实施方式中，异戊二烯具有以重量计至少或约25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、或99％的纯度。可以通过适宜的任何方法(例如通过柱色谱法、HPLC分析法、或GC-MS分析法)测定纯度。在一些实施方式中，通过初始吸附于活性炭从发酵废气回收生物异戊二烯，随后解吸附和冷凝以产生用于化学转变成燃料组分的液态异戊二烯组合物。
用于产生燃料的连续法
本发明还提供了用于从异戊二烯产生燃料组分的连续法，其包括：(a)连续地产生商业上有益量的高纯异戊二烯；和(b)连续地将至少一部分商业上有益量的高纯异戊二烯化学地转变成燃料组分。在根据本发明的连续法中，连续地产生高纯异戊二烯流，例如，通过生物过程(例如培养产生异戊二烯的细胞)，并且使其经过用于化学转变的反应器。在一些实施方式中，使用萃取蒸馏、冷凝、吸附或膜在其中降低氧水平至ppm级别并且除去其他目的杂质的连续纯化装置内，将来自发酵废气的异戊二烯与水和其他永久气体(例如，O2、N2和CO2)分开；使用多相催化剂，将异戊二烯蒸气催化地转化成二聚体(C10)和三聚体(C15)；分离合乎需要的产物并且将未反应的异戊二烯返回反应器以进一步转化。在一些实施方式中，通过测量气相中合乎需要的C10烃的水平监测催化性二聚化。
在一些实施方式中，使生物产生的异戊二烯流通过维持在约100℃至约300℃温度下的化学反应器(例如，反应管)，在所述化学反应器中生物产生的异戊二烯经历二聚化反应。在一个变型中，将异戊二烯二聚体从产物流分离，并且将至少一部分未反应的异戊二烯再循环返回化学反应器。在一个实施方式中，产生的不饱和异戊二烯二聚体与第二化学反应器中的氢化催化剂和氢源接触，产生部分氢化的和/或充分氢化的产物。该方法可以进一步包括从产生异戊二烯的生物反应器的废气中回收异戊二烯的步骤。
在一些实施方式中，首先将含有共同产生的氢的生物异戊二烯流与氢气分开，使该生物异戊二烯流通过维持在约100℃至约300℃温度下的化学反应器(例如，反应管)，在所述化学反应器中生物产生的异戊二烯经历二聚化反应。在一个变型中，将异戊二烯二聚体从产物流分离，并且将至少一部分未反应的异戊二烯再循环返回化学反应器。在一个实施方式中，产生的不饱和异戊二烯二聚体与第二化学反应器中的氢化催化剂和氢源接触，产生部分氢化的和/或充分氢化的产物。在一个变型中，从异戊二烯-氢共同生产中分离的氢流用于氢化步骤中。该方法可以进一步包括从产生异戊二烯的生物反应器的废气中回收异戊二烯的步骤。该方法可以进一步包括使用本领域已知的纯化方法(如低温冷凝法和固体基质吸附法)纯化从异戊二烯-氢共同生产中分离的氢流的步骤。
从燃料产品除去二烯和聚合物
燃料组合物经常含有不饱和的化合物(烯烃、二烯属烃和聚烯烃)，所述不饱和化合物可以随时间形成胶质、树脂、聚合物和其他不合乎需要的副产物(例如，见Pereira和Pasa(2006)Fuel，85，1860-1865及其中参考文献)。通常，随着给定化合物的不饱和度增加，该化合物更可能形成此类副产物。在燃料组合物中时，异戊二烯是轻易形成不合乎需要的聚合副产物的1，3-二烯。尽管存在可以降低副产物形成程度的燃料添加物(抗氧化剂、自由基猝灭剂等)，此类副产物仍可以随时间形成。一旦从燃料中蒸发而释放入大气时或者因含烯烃燃料的不完全燃烧，烯烃也可能有助于地平面臭氧的形成。
因此，完全或部分地从异戊二烯衍生的燃料组合物应当含有少量异戊二烯至不含异戊二烯。一系列方法可以用来从燃料组合物除去异戊二烯，如通过蒸馏法纯化、与醇反应以形成醚，或氢化以将异戊二烯转化饱和的衍生物。另外，异戊二烯可以用亲双烯体如顺酐处理，从而产生对不合乎需要的副产物形成无帮助的惰性加合物。
提供了基本上不含异戊二烯的包含异戊二烯衍生物的燃料组合物。在一些实施方式中，燃料组合物含有小于0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、10％或15％的异戊二烯。还提供了用于将生物异戊二烯组合物化学地转变成包含异戊二烯衍生物的燃料组合物的方法，所述燃料组合物基本上不含异戊二烯。在一些实施方式中，大部分来自生物异戊二烯组合物的异戊二烯转化成燃料组分。在一些实施方式中，大部分来自生物异戊二烯组合物的异戊二烯转化成中间体，可以进一步转化所述中间体以产生燃料组分。在一些实施方式中，大部分来自生物异戊二烯组合物的异戊二烯转化成除异戊二烯之外的化合物。“大部分”是99.99％、99.9％、99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％。
在一些实例中，异戊二烯和其他共轭二烯可以形成具有胶质样稠度的聚合产物，所述聚合产物可以减少合乎需要的产物的产率和/或使催化剂失活。(见，例如，R.C.C.Pereira和V.M.D.Pasa.Fuel 85(2006)1860-1865)。在一些实施方式中，提供了用于测定产物混合物中存在的共轭二烯的量的方法。D.F.Andrade等人描述了用于测定存在的共轭二烯的量的多种方法(Fuel(2010)，doi：10.106/j.fuel/2010.01.003)，它们包括以下方法：1)UOP-326法(马来酸酐法)，一种其中通过与二烯的Diels-Alder反应测量所消耗马来酸酐的量的半定量方法；2)极谱法；3)气相色谱法，其中二烯可以与衍生化试剂如4-甲基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(MTAD)或4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)反应；4)HPLC；5)超临界流体色谱法；6)NMR；7)UV和近IR光谱法；和8)可以包括首先用氟硼酸对硝基苯重氮盐(p-nitrobenezenediazonium fluoroborate)衍生化二烯的其他光谱方法。
本文提供了用于使胶质形成最小化和/或减少已经产生的胶质的量的方法。在一些实施方式中，抗氧化剂用来使胶质形成最小化。在其他实施方式中，将聚合副产物再循环返回至工艺流。在一些实施方式中，通过烯烃复分解作用进行聚合副产物的解聚。烯烃复分解可以使用钼或钨催化剂如2，6-二异丙基苯亚氨基亚新苯基钼双(2-叔丁基酚盐)进行。(见US 5,446,102)。
在一些实施方式中，本文所述的任意方法还包括表征这些反应的产物和评定潜在的燃料价值。例如，所述产物由本领域已知的标准方法表征，例如GC/MS、NMR、UV-Vis和IR光谱法、沸腾温度、密度和其他物理属性。所述产物可以由双重碳同位素指纹法进一步表征(见，美国专利号7,169,588)。通过测量燃料属性评定所述产物的潜在燃料价值，所述燃料属性例如是能量密度、热值、水溶解度、辛烷/十六烷值、密度、粘度、表面张力、蒸发熵、蒸气扩散系数、闪点、自燃点、燃烧极限、浊点和化学稳定性。
就商业石油燃料，可以测试BioIsoFuelTM产品的酸度、密度、微量元素含量、苯、总芳族含量、含水量、和腐蚀性。为确保BioIsoFuelTM产品中的微量杂质没有不利地影响其物质属性，也可以通过标准ASTM试验如用于水的卡尔·费歇尔法和用于腐蚀性的铜条法测试样品的腐蚀性和与燃料系统的相容性。
燃料组合物
本发明提供燃料组合物，其包含通过本文所述的任何方法和过程产生的燃料组分。在一些实施方式中，燃料组分包含选自衍生自异戊二烯的饱和C10及C15烃和异戊二烯的氧化衍生物的烃中一项或多项。烃BioIsoFuelTM产物预期与石油汽油和柴油完全相容。BioIsoFuelTM与商业石油燃料的掺合物预期具有更合乎需要的特性，因为它们不含酸、硫、芳族、或其他不合乎需要的杂质。
在一些优选的实施方式中，燃料组分包含生物异戊二烯的衍生物。预计对衍生自生物异戊二烯的燃料存在显著需求，所述生物异戊二烯从可再生的基于非石油化学品资源产生。据信相对于用衍生自石油化学工艺的异戊二烯制成的那些燃料组分，工业用户和消费者将优选购买衍生自此类环境友好来源的燃料组分。还相信用户会愿意为采用可再生资源制成的此类环境友好产品支付额外价格。从本文所述的生物异戊二烯组合物衍生的燃料组分提供如从基于非石油化学品资源衍生那样可证实的益处。
在一些实施方式中，燃料组分包含一种或多种饱和的环状C10烃，如1，2-双(异丙基)环丁烷、1，2-双(异丙基)环丁烷、1-甲基-4-异丙基环己烷、1-甲基-3-异丙基环己烷、1-乙基-1，4-二甲基环己烷、1-乙基-1，3-二甲基环己烷、1，5-二甲基环辛烷和1，4-二甲基环辛烷。在一些实施方式中，燃料组分包含一种或多种饱和的环状C15烃，如1，5，9-三甲基环十二烷和1，5，10-三甲基环十二烷。在一些实施方式中，燃料组分包含一种或多种饱和的脂族C10烃，如2，6-二甲基辛烷、2，7-二甲基辛烷和3，6-二甲基辛烷。在一些实施方式中，燃料组分包含一种或多种饱和的脂族C15烃，如2，6，10-三甲基十二烷、2，7，10-三甲基十二烷和3，7，10-三甲基十二烷。在一些实施方式中，燃料组分包含2-甲基丁烷。在一些实施方式中，燃料组分包含选自以下的一种或多种烃：1，2-双(异丙基)环丁烷、1，2-双(异丙基)环丁烷、1-甲基-4-异丙基环己烷、1-甲基-3-异丙基环己烷、1-乙基-1，4-二甲基环己烷、1-乙基-1，3-二甲基环己烷、1，5-二甲基环辛烷、1，4-二甲基环辛烷、1，5，9-三甲基环十二烷、1，5，10-三甲基环十二烷、2，6-二甲基辛烷、2，7-二甲基辛烷、3，6-二甲基辛烷、2，6，10-三甲基十二烷、2，7，10-三甲基十二烷、3，7，10-三甲基十二烷和2-甲基丁烷。
在一些实施方式中，燃料组分包含一种或多种饱和的羟基化物，如C5醇和二醇(例如3-甲基-丁-1-醇、2-甲基-丁-1-醇和2-甲基-丁-2-醇、3-甲基-丁-1，3-二醇和2-甲基-丁-2，3-二醇)、C-10醇和二醇(例如3，7-二甲基辛-1-醇、2，7-二甲基辛-1-醇、2，7-二甲基辛-2-醇和2，7-二甲基辛-2，7-二醇)和环状C-10醇(例如2-(4-甲基环己基)丙-2-醇、2-(4-甲基环己基)丙-1-醇、2-(1，4-二甲基环己基)乙醇和4-乙基-1，4-二甲基环己醇)。在一些实施方式中，燃料组分包含一种或多种饱和醚，如1，3-二乙氧基-3-甲基丁烷、1-乙氧基-3-甲基丁烷、1-甲氧基-2，7-二甲基辛烷和3-甲氧基-2，7-二甲基辛烷。在一些实施方式中，燃料组分包含选自以下的一种或多种异戊二烯衍生的氧化产物：3-甲基-丁-1-醇、2-甲基-丁-1-醇、2-甲基-丁-2-醇、3-甲基-丁-1，3-二醇、2-甲基-丁-2，3-二醇、3，7-二甲基辛-1-醇、2，7-二甲基辛-1-醇、2，7-二甲基辛-2-醇、2，7-二甲基辛-2，7-二醇、2-(4-甲基环己基)丙-2-醇、2-(4-甲基环己基)丙-1-醇、2-(1，4-二甲基环己基)乙醇、4-乙基-1，4-二甲基环己醇、1，3-二乙氧基-3-甲基丁烷、1-乙氧基-3-甲基丁烷、1-甲氧基-2，7-二甲基辛烷和3-甲氧基-2，7-二甲基辛烷。
在一些实施方式中，在经历根据本文所述任何方法和过程的步骤后，燃料组分包含少于或约0.5μg/L的来自除异戊二烯之外的C5烃的产物。在一个实施方式中，在经历根据本文所述任何方法和过程的步骤后，燃料组分基本上不含来自除异戊二烯之外的C5烃的产物。在一些实施方式中，燃料组分包含重量占起始组合物中全部C5烃的总重量的小于或约0.2％、0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的除异戊二烯之外的C5烃(如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，该燃料组分包含浓度为小于100、10、1、0.1或0.01ppm的除异戊二烯之外的C5烃(如1，3-环戊二烯、反式-1，3-戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。
应当理解，本文所述的生物异戊二烯组合物中除异戊二烯之外的组分将在经历本文所述的多个过程后转化成不同的产物。所述方法/过程中所用的金属基催化剂对除异戊二烯之外的组分的敏感度根据这些组分的性质和水平是不同。对于热二聚化过程，会耐受范围更宽的化合物。在一些情况下，除异戊二烯之外的组分会与异戊二烯反应以产生加合物，例如异丁烯醛和甲基乙烯基酮与异戊二烯的Diels-Alder反应以产生6元环产物。不饱和的加合物可以进一步氢化成燃料组分和组合物中存在的饱和衍生物，例如1，4-二甲基-1-(羟甲基)环己烷和1-(1-羟乙基)-4-甲基环己烷(见示图XV)。
示图XV.从生物异戊二烯TM衍生的痕量杂质的实例
Figure BDA0000135567880002031
在一些实施方式中，在经历根据本文所述任意方法和过程的步骤后，燃料组分包含来自下述化合物的产物，所述化合物选自乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇、和具有10个或更多个碳原子的类异戊二烯化合物。在一些实施方式中，在经历根据本文所述任意方法和过程的步骤后，燃料组分包含来自以下一种或多种化合物的产物，所述化合物选自乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、异丁烯醛、甲基乙烯基酮、2-甲基-2-乙烯基环氧乙烷、顺式-和反式-3-甲基-1，3-戊二烯、C5异戊二烯基醇(如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)、2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，4，5-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡嗪、香茅醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、丁二酮、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、异丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3-甲基丁酯、3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯、3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯、3-己烯-1-醇、3-己烯-1-基乙酸酯、苧烯、香叶醇(反式-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇)、香茅醇(3，7-二甲基-6-辛烯-1-醇)、(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、和2，3-环庚烯醇吡啶。在一些实施方式中，燃料组分包含选自1，4-二甲基-1-(羟甲基)环己烷、1-(1-羟乙基)-4-甲基环己烷、2-甲基丁烷、3-甲基戊烷、2-丙醇、2-甲基-1-丙醇、2-丁醇、3-甲基-1-丁醇、乙酸乙酯和乙酸3-甲基-1-丁酯的一种或多种化合物。在一些实施方式中，燃料组分包含水平大于或约10ppm、1ppm、100ppb、10ppb或1ppb的选自1，4-二甲基-1-(羟甲基)环己烷、1-(1-羟乙基)-4-甲基环己烷、2-甲基丁烷、3-甲基戊烷、2-丙醇、2-甲基-1-丙醇、2-丁醇、3-甲基-1-丁醇、乙酸乙酯和乙酸3-甲基-1-丁酯的一种或多种化合物。
在一些实施方式中，燃料组分包含水平大于或约10ppm、1ppm、100ppb、10ppb或1ppb的一种或多种化合物，所述化合物选自乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、异丁烯醛、甲基乙烯基酮、2-甲基-2-乙烯基环氧乙烷、顺式-和反式-3-甲基-1，3-戊二烯、C5异戊二烯基醇(如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)、2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，4，5-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡嗪、香茅醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、丁二酮、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、异丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、乙酸3-甲基丁酯、3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯、3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯、3-己烯-1-醇、3-己烯-1-基乙酸酯、苧烯、香叶醇(反式-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇)、香茅醇(3，7-二甲基-6-辛烯-1-醇)、(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、和2，3-环庚烯醇吡啶。
碳指纹
从生物异戊二烯衍生的BioIsoFuel可以基于双重碳同位素指纹法区别于从石油化学碳衍生的燃料。另外，生物源碳的具体来源(例如葡萄糖对甘油)可以由双重碳同位素指纹法确定(见，美国专利号7,169,588，其通过引用的方式并入本文)。
该方法有用地区别化学上相同的材料，并且通过生物圈(植物)组分的生长的来源(并且可能是年份)分配产物中的碳。同位素14C和13C为这个问题带来补充信息。具有5730年核半衰期的放射性碳纪年同位素(14C)允许在化石(″死″)原料和生物圈(″活″)原料之间清晰地分配标本碳[Currie，L.A.″Source Apportionment of Atmospheric Particles，″Characterization of Environmental Particles，J.Buffle和H.P.vanLeeuwen，编著，IUPAC环境分析化学丛书第I卷1(Lewis Publishers，Inc)(1992)374]。放射性碳纪年法中的基本假设是，大气中14C浓度的恒定性导致活生物中14C的恒定性。当处理分离的样品时，可以通过关系式t＝(-5730/0.693)ln(A/AO)(等式14)大致推断样品的年龄，其中t＝年数，5730年是放射性碳的半衰期，并且A和AO分别是样品和现代标准物(modem standard)的比14C活度[Hsieh，Y.，Soil Sci.Soc.Am J.，56，460，(1992)]。然而，因为自1950年以来的大气核试验和自1850年以来燃烧化石燃料，14C已经获得第二位地球化学时间特征。大气CO2中-并且因而活生物圈中的14C浓度在20世纪六十代中期核试验高峰时大致翻一番。此后，它已经逐步返回至大约1.2x10-12的宇生(大气)稳态基线同位素率(14C/12C)，近似弛豫(relaxation)半衰期为7-10年。(后一种半衰期不得作字面理解；相反，必须使用详细的大气核输入量/衰变函数以追踪自核时代开启以来大气和生物圈14C的变动)。正是后一种生物圈14C时间特征才提供了新近生物圈碳纪年的希望。14C可以通过加速器质谱法(AMS)测量，结果以″现代碳分数″(fM)为单位给出。fM由分别称作草酸标准物HOxI和HOxII的国家标准技术研究院(NIST)标准参比物质(SRM)4990B和4990C定义。基础定义涉及0.95乘以14C/12C同位素率HOxI(参考AD1950)。这大体上等同于衰变校正的前工业革命木材。对于现今的活生物圈(植物材料)，fM～1.1。
稳定的碳同位素比(13C/12C)提供了来源区分和分配的补充途径。给定生物源材料中的13C/12C比是二氧化碳固定时大气二氧化碳中13C/12C比的结果，并且还反映了精确的代谢途径。也存在区域变异。石油、C3植物(阅叶类)、C4植物(草类)、和海洋碳酸盐均显示13C/12C和相应δ13C值方面的显著差异。另外，由于代谢途径所致，相对于从相同植物的碳水化合物组分衍生的材料，差异地分析C3植物和C4植物的脂类物质。在测量精度范围内，13C因同位素分馏效应而显示巨大变异，对于本发明而言，最明显的同位素分馏效应是光合机制。植物中碳同位素比差异的主要原因与植物中光合碳代谢途径、尤其原初羧基化(即大气CO2初始固定)期间发生的反应方面的差异密切相关。两大类植被是并入″C3″(或Calvin-Benson)光合循环的那些植被和并入″C4″(或Hatch-Slack)光合循环的那些植被。C3植物如阅叶树和针叶树在温带气候占据主导。在C3植物中，原初CO2固定或羧基化反应包括核糖-1，5-二磷酸羧化酶，并且第一稳定产物是3碳化合物。另一方面，C4植物包括此类植物，如热带草、玉米和甘蔗。在C4植物中，涉及另一个酶即磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的额外羧基化反应是原初羧基化反应。第一稳定的碳化合物是随后脱羧的4碳化合物。如此释放的CO2由C3循环再固定。
C4和C3植物均显示一系列13C/12C同位素比，但常见是每百万份大约-10对-14(C4)和每百万份-21对-26(C3)[Weber等人.，J.Agric.FoodChem.，45，2942(1997)]。煤和石油总体上落入后一个范围内。13C测量量表最初由箭石属(pee dee belemnite)(PDB)石灰石所设定的零定义，其中以来自该材料的份数/千标准偏差为单位给出各值。“δ13C”值以缩写为‰的每千(每百万)份数为单位，并且如下计算(等式15)：
Figure BDA0000135567880002071
由于PDB参比物质(RM)已经用完，已经与IAEA、USGS、NIST、和选择的其他国际同位素实验室合作开发了一系列替代性RM。来自PDB的每百万标准偏差的表示法是δ13C。通过针对质量44、45和46的分子状离子的高精度稳定比质谱法(IRMS)，对CO2进行测量。
对于从萃取蒸馏来自炼油厂的C5流所衍生的异戊二烯，δ13C是约-22‰至约-24‰。该范围常见于从石油衍生的轻质不饱和烃，并且从基于石油的异戊二烯衍生的产物一般含有δ13C相同的异戊二烯单元。例如，通过在伴有最小量的其他含碳营养物(例如，酵母提取物)情况下发酵玉米衍生的葡萄糖(δ13C-10.73‰)所产生的生物异戊二烯产生了异戊二烯，所述异戊二烯可以聚合成具有δ13C-14.66‰至-14.85‰的聚异戊二烯。从这类生物异戊二烯产生的产品预期具有比从基于石油的异戊二烯衍生的那些更负的δ13C值。对于衍生自异丁烯与甲醛反应的异戊二烯，δ13C值可以是约-34.4‰，因为甲醛往往从δ13C值明显更负的原料衍生。
用来自细胞培养物的异戊二烯制成的本发明燃料和燃料组分可以本身借助它们的δ13C值和其他燃料特征进行鉴定，其中所述细胞培养物使用生物可再生碳源。在一些实施方式中，从生物异戊二烯衍生的燃料组分具有大于(负得更少的)-22‰的δ13C值。在一些实施方式中，从生物异戊二烯衍生的燃料组分具有大于-20‰、-18‰、-16‰、-14‰、-12‰、或-10‰的δ13C值。在一些实施方式中，从生物异戊二烯衍生的燃料组分具有在-22‰至-10‰、-21‰至-12‰、或-20‰至-14‰范围内的δ13C值。在一些实施方式中，从生物异戊二烯衍生的燃料组分具有在-34至-24‰、-34至-25‰、-33至-25‰、-32至-24‰、-32至-25‰、-31至-25‰、-30至-29‰、-30.0至-29.5‰、-29.5至-28.5、或-29.0至-28.5‰范围内的δ13C值。
在一些实施方式中，从生物异戊二烯衍生的燃料组分包含放射性碳-14。在一些实施方式中，14C/12C比是大于或约1.0x 10-12、1.05x 10-12、1.1x 10-12、1.15x 10-12、或1.2x 10-12。在一些实施方式中，从生物异戊二烯衍生的燃料组分具有大于或约0.9、0.95、1.0、1.05或1.1的fM值。在一些实施方式中，从生物异戊二烯衍生的燃料组分具有大于或约0.9、0.95、1.0、1.05或1.1的fM值和大于(负得更少的)-22‰的δ13C值。在一些实施方式中，从生物异戊二烯衍生的燃料组分具有大于或约0.9、0.95、1.0、1.05或1.1的fM值和在-22‰至-10‰、-21‰至-12‰、或-20‰至-14‰范围内的δ13C值。在一些实施方式中，从生物异戊二烯衍生的燃料组分具有大于或约0.9、0.95、1.0、1.05或1.1的fM值和在-34‰至-24‰、-34‰至-25‰、-33‰至-25‰、-32‰至-24‰、-32‰至-25‰、-31‰至-25‰、-30‰至-29‰、-30.0‰至-29.5‰、-29.5‰至-28.5‰、或-29.0‰至-28.5‰范围内的δ13C值。
所述生物异戊二烯衍生物和相关的BioIsoFuel、中间体、和混合物可以基于14C(fM)和双重碳同位素指纹法完全区别于石油化学衍生的其对应物，表明了新物质组成。
在一些实施方式中，本发明的燃料组分具有高于乙醇的能量密度。在一些实施方式中，该燃料组分提高燃料(如石油基染料)的十六烷值。在一些实施方式中，该燃料组分减少石油基燃料的排放。在一些实施方式中，所述燃料组合物具有约80至约120范围内的辛烷值。在一些实施方式中，所述燃料组合物具有约30至约130范围内的十六烷值。
在一些实施方式中，本发明的燃料组合物包含一种或多种二甲基环辛烷化合物。在一些实施方式中，本发明的燃料组合物包含一种或多种C10烃，如取代的环己烷。在一些实施方式中，本发明的燃料组合物包含本文所述的一种或多种异戊二烯衍生氧化产物。在一些实施方式中，本文所述的任意燃料组合物基于总燃料组合物的总重量或体积，还包含按重量或体积计的量为约1％至约95％的石油基燃料。
本发明还提供用于制备燃料组合物的方法，所述方法包括获得石油馏出物和添加本发明的燃料组分。
本发明可以通过参考以下实施例进一步理解，所述实施例以说明方式提供并且不意图是限制性的。
实施例
实施例1：在表达重组野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌中生产异戊二烯
I.用于在大肠杆菌中表达野葛异戊二烯合酶的载体的构建
从GenBank获得野葛(越南葛藤)异戊二烯合酶基因(IspS)的蛋白序列(AAQ84170)。从DNA2.0购买针对大肠杆菌中的密码子使用进行了优化的野葛异戊二烯合酶基因(SEQ ID NO：1)。通过以限制性核酸内切酶BspLU11I/PstI消化从提供的质粒中切下异戊二烯合酶基因，进行凝胶纯化，并连接进入经NcoI/PstI消化的pTrcHis2B(Invitrogen)。设计构建体，使得异戊二烯合酶基因中的终止密码子在PstI位点的5’。结果是：当构建体被表达时，His-标签不附着于异戊二烯合酶蛋白。通过测序来验证得到的质粒pTrcKudzu(图2和3；SEQ ID NO：2)。
还将异戊二烯合酶基因克隆进入pET16b(Novagen)。在本例中，将异戊二烯合酶基因插入至pET16b，使得重组异戊二烯合酶蛋白包含N-末端的His标签。使用下列引物组通过PCR从pTrcKudzu扩增异戊二烯合酶基因：
pET-His-Kudzu-2F：
5’-CGTGAGATCATATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTTAC(SEQ IDNO：49)和
pET-His-Kudzu-R：
5’-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG(SEQID NO：50)。这些引物在基因的5’末端添加NdeI位点，在3’末端添加BamH1位点。如上所述的质粒pTrcKudzu用作模板DNA，根据生产商的说明书使用Herculase聚合酶(Stratagene)，加入浓度为10pMol的引物。以25μl的总体积进行PCR。以NdeI/BamH1消化PCR产物，并克隆进入经相同的酶消化的pET16b。将连接混合物转化进入大肠杆菌Top10(Invitrogen)，通过测序选择正确的克隆。得到的质粒被称作pETNHisKudzu(图4和5；SEQ ID NO：51)，其中野葛异戊二烯表达自T7启动子。
还将野葛异戊二烯合酶基因克隆进入低拷贝数的质粒pCL1920。按照上文描述使用引物从pTrcKudzu扩增异戊二烯合酶基因。正向引物向5’末端添加HindIII位点和大肠杆菌共有RBS。PstI克隆位点已经存在于pTrcKudzu中，恰在终止密码子的3’，所以反向引物被构建为使得最终的PCR产物包括PstI位点。引物的序列是：
HindIII-rbs-Kudzu F：
5’-CATATGAAAGCTTGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACC(SEQ ID NO：51)和
BamH1-Kudzu R：
5’-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG(SEQ ID NO：50)。使用Herculase聚合酶和浓度为10pmol的引物以及1ng模板DNA(pTrcKudzu)扩增PCR产物。扩增程序包括：30个循环的“95℃，1分钟；60℃，1分钟；72℃，2分钟”。以HindIII和PstI消化产物并连接进入也经过HindIII和PstI消化的pCL1920。将连接混合物转化进入大肠杆菌Top10。通过测序检查数个转化子。得到的质粒被称作pCL-lac-Kudzu(图6和7；SEQ ID NO：4)。
II.测定异戊二烯的生产
对于摇瓶培养物，将1ml的培养物从摇瓶转移至20ml CTC顶空瓶(Agilent瓶cat#51882753；盖cat#51882759)。将盖旋紧，将瓶在相同温度下在250rpm振荡温育。30分钟后，从温育箱中取出瓶并按照如下所述进行分析(关于该测定中的一些实验数值，见表1)。
在测定发酵器中的异戊二烯产量的情况下，从发酵器的废气中取出样品并按照如下所述直接进行分析(关于该测定中的一些实验数值，见表2)。
使用连接了CTC Analytics(Switzerland)CombiPAL自动取样仪(以顶空模式运行)的Agilent 6890GC/MS系统进行分析。使用AgilentHP-5MS GC/MS柱(30m x 0.25mm；膜厚0.25μm)来分离分析物。将取样仪设定为注入500μL顶空气体。GC/MS法使用氦作为载气，流速为1ml/分钟。注入口维持在250℃，分流比为50∶1。在分析期间，将烤箱温度维持在37℃持续2分钟。在m/z 67下以单离子监控(SIM)模式运行Agilent 5793N质量选择性检测器。在1.4至1.7分钟将检测器关闭，以允许洗脱永久气体。在这样的条件下，在1.78分钟观察到异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)的洗脱。使用校准表来定量异戊二烯的绝对量，发现在1μg/L至70,000μg/L是线性的。估计使用该方法的检测限值是50-100ng/L。
III.在含有表达重组异戊二烯合酶的大肠杆菌细胞的摇瓶中生产异戊二烯
将如上描述的载体导入大肠杆菌菌株BL21(Novagen)以产生菌株BL21/ptrcKudzu、BL21/pCL-lac-Kudzu和BL21/pETHisKudzu。为了分离，将菌株涂覆于LA(Luria琼脂)+羧苄西林(50μg/ml)，并在37℃温育过夜。将单一菌落接种于250ml振荡培养瓶，其中含有20ml LuriaBertani培养基(LB)和羧苄西林(100μg/ml)。培养物在20℃在200rpm振荡生长过夜。测定过夜培养物的OD600，并将培养物在含有30mlMagicMedia(Invitrogen)+羧苄西林(100μg/ml)的250ml振荡培养瓶中稀释至OD600～0.05。将培养物在30℃在200rpm振荡温育。当OD600达到～0.5-0.8时，加入400μM IPTG，并在30℃在200rpm振荡温育细胞另6个小时。以IPTG诱导后0、2、4和6小时，收集1ml的培养物等份试样，测定OD600，并按照如上的描述测定所生产的异戊二烯的量。结果显示于图8。
IV.在14升发酵中从BL21/ptrcKudzu生产异戊二烯
从补料分批培养物测定从含有重组野葛异戊二烯合酶基因的大肠杆菌中异戊二烯的大规模生产。对于每升发酵培养基，发酵培养基(TM2)的配方如下：K2HPO4 13.6g，KH2PO4 13.6g，MgSO4*7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，(NH4)2SO4 3.2g，酵母提取物5g，1000X改良痕量金属溶液(M0dified Trace Metal Solution)1ml。所有成分一起加入和溶于diH2O中。使用氢氧化钾(KOH)将pH调节至6.8并定容。以0.22μm的滤器无菌过滤最终产物(仅过滤，不高压灭菌)。1000X改良痕量金属溶液的配方如下：柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3 100mg，NaMoO4*2H2O 100mg。每个成分逐一溶于diH2O中，使用HCl/NaOH调节pH至3.0with，然后定容并以0.22μm的滤器无菌过滤。
在需要的发酵、pH 6.7和34℃的温度，在14升生物反应器中进行该实验以监测从葡萄糖形成的异戊二烯。在大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基中制备从冷冻瓶中取出的大肠杆菌菌株BL21/ptrcKudzu的接种物。接种物生长至OD550＝0.6之后，离心2个600ml的瓶并将内容物重悬于70ml上清液中以将细胞沉淀物(70ml OD 3.1的材料)转移至生物反应器。在接种后的多个时间点，取出样品并按照上文描述测定所生产的异戊二烯的量。结果显示于图9。
实施例2：在表达重组白杨异戊二烯合酶的大肠杆菌中生产异戊二烯
从GenBank获得白杨(银白杨x欧洲山杨)异戊二烯合酶的蛋白序列(CAC35696)(Schnitzler，J-P等人(2005)Planta 222：777-786)。从DNA2.0购买针对大肠杆菌进行了密码子优化的基因(p9796-poplar，图30和31；SEQ ID NO：14)。通过以限制性核酸内切酶BspLU11I/PstI消化从提供的质粒中切下异戊二烯合酶基因，进行凝胶纯化，并连接进入已经NcoI/PstI消化的pTrcHis2B。克隆构建体，使得插入片段中的终止密码子在PstI位点之前，这导致产生这样的构建体：其中His-标签不附着于异戊二烯合酶蛋白。通过测序来验证得到的质粒pTrcPoplar(图32和33；SEQ IDNO：15)。
实施例2B：证明数种白杨异戊二烯合酶的异戊二烯合酶活性
考察了下列异戊二烯合酶：银白杨(登记号BAD98243；图137A和B；SEQ ID NO：30)，欧洲黑杨(登记号CAL69918；图137C和D；SEQ IDNO：31)，美洲山杨(登记号AAQ16588；图137E，F和G；SEQ IDNOs：32-33)，毛果杨(登记号ACD70404；图137H和I；SEQ ID NO：34)，银白杨x欧洲山杨(登记号CAJ29303；图137J和K；SEQ ID NO：35)和MCM112-Kudzu。
按照如下描述构建pET24Kudzu(也称作MCM112)：将野葛异戊二烯合酶基因从pCR2.1载体(Invitrogen)亚克隆进入pET24d载体(Novagen)。使用引物MCM505’-GATCATGCAT TCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGTGTGCGACCTCTTC TCAATTTACT(SEQID NO：52)和MCM53 5’-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATAC ATCAGCTG(SEQ ID NO：50)从pTrcKudzu模板DNA扩增野葛IspS基因。使用Taq DNA聚合酶(Invitrogen)进行PCR反应，将得到的PCR产物克隆进入pCR2.1-TOPO TA克隆载体(Invitrogen)，并转化进入大肠杆菌Top10化学感受态细胞(Invitrogen)。将转化子铺板于含有羧苄西林(50μg/ml)的L-琼脂，并在37℃温育过夜。将单一转化子接种于包含50μg/ml羧苄西林的5ml Luria Broth培养基。通过测序分离自1ml液体培养物(Luria Broth)的质粒DNA就正确的插入片段筛选出5个菌落，并使用QIAprep旋转微量制备试剂盒(Qiagen)纯化。得到的质粒被称作MCM93，其包含在pCR2.1骨架中的野葛IspS编码序列(图137L)。MCM93的序列(SEQ ID NO：36)显示于图137M和N。
通过以PciI和BamH1(Roche)进行限制性核酸内切酶消化切下野葛编码序列，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)凝胶纯化。以NcoI和BamHI(Roche)消化pET24d载体DNA，以虾碱性磷酸酶(Roche)处理，并使用QIAprep旋转微量制备试剂盒(Qiagen)纯化。使用快速DNA连接试剂盒(Roche)，以片段∶载体＝5∶1的比例，将野葛IspS片段连接进入经NcoI/BamH1消化的pET24d，总体积为20μl。将连接混合物的一部分(5μl)转化进入大肠杆菌Top 10化学感受态细胞，并铺板于包含卡那霉素(50μg/ml)的L琼脂。通过测序确认正确的转化子并转化进入化学感受态BL21(λDE3)pLysS细胞(Novagen)。在37℃在包含卡那霉素(50μg/ml)的L琼脂过夜生长之后选择单一菌落。得到的质粒被称作pET24D-Kudzu，其图谱显示于图137O。pET24D-Kudzu的序列(SEQ IDNO：37)显示于图137P和Q。
从DNA2.0(Menlo Park，CA)购买美洲山杨、银白杨、欧洲黑杨、和毛果杨的针对大肠杆菌优化的异戊二烯合酶基因(克隆进入pET24a表达载体(Novagen)中)。合成除掉了叶绿体转运肽序列的基因，从而表达成熟的蛋白。
野葛异戊二烯合酶的构建体用作本实施例中的对照。将质粒转化进入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)plysS，并使转化子在0.6ml TM3培养基中生长。TM3培养基的配方如下：K2HPO4(13.6g/l)，KH2PO4(13.6g/l)，MgSO4*7H2O(2g/L)，一水柠檬酸(2g/L)，柠檬酸铁铵(0.3g/L)，(NH4)2SO4(3.2g/L)，酵母提取物(0.2g/L)，1ml 1000x痕量元素溶液，使用氢氧化铵将pH调整至6.8，以无菌DI H2O定容，并以0.22μm的滤器无菌过滤。1000X痕量元素溶液的配方如下：柠檬酸*H2O(40g/L)，MnSO4*H2O(30g/L)，NaCl(10g/L)，FeSO4*7H2O(1g/L)，CoCl2*6H2O(1g/L)，ZnSO4*7 H2O(1g/L)，CuSO4*5H2O(100mg/L)，H3BO3(100mg/L)，NaMoO4*2 H2O(100mg/L)。每个成分逐一溶解于DI H2O中，以HCl/NaOH将pH调整至3.0，定容，并以0.22μm的滤器无菌过滤。
以400μM IPTG诱导培养物并继续生长至OD600为大约5。将培养物的等份试样转移至深孔玻璃板，以铝质平板密封器将孔密封。将平板在25℃在450rpm振荡温育30分钟。通过将温度升高至70℃持续5分钟而使反应物热灭活。通过实施例1第II部分描述的GCMS法测定全部的细胞顶空。
从按照类似方式生长的培养物获得Km值，只不过收获细胞并通过冷冻/解冻溶菌酶程序裂解。将体积为400μL的培养物转移至新的96-孔平板(Perkin Elmer，Catalog No.6008290)，通过在Beckman Coulter Allegra6R离心机中在2500x g离心来收集细胞。将沉淀物重悬于200mL低渗缓冲液(5mM MgCL2，5mM Tris HCl，5mM DTT pH 8.0)，将平板在-80℃冷冻至少60分钟的时间。通过解冻平板制备细胞裂解物并加入32mL异戊二烯合酶DMAPP测定缓冲液(57mM Tris HCl，19mM MgCl2，74mg/mL DNase I(Sigma货号DN-25)、2.63x105U/mL ReadyLyse溶菌酶溶液(Epicentre货号R1802M)、和5mg/mL分子生物学级别的BSA。将平板在25℃振荡温育30分钟，然后置于冰上。将期望浓度的DMAPP和裂解物加入到如上所述的用于全部细胞顶空测定的密封的深孔玻璃块中。使反应进行1小时，通过如上所述的加热步骤终止反应，同样按照描述测定顶空活性。
在替代性方法中，从培养于25mL体积并按照上文描述进行类似诱导的细胞测定酶活性。通过离心收集细胞并在缓冲液中以弗氏压碎器裂解沉淀物，缓冲液由1∶1混合的50％甘油与20mM Tris/HCl pH 7.4、20mM MgCl2、200mM KCl、1mM DTT组成。在含有75μL测定缓冲液(66.6mM Tris/HCl pH 8，6.66mM DMAPP，43mM MgCl2)的2mL旋盖瓶中测定体积为25μL的裂解物的异戊二烯合酶活性。反应物在30℃温育15分钟，通过瓶的隔膜加入100μL 250mM EDTA以淬灭反应。通过实施例1第II部分描述的GC/MS测定异戊二烯。
用于测定活性的所有方法均显示：来自纯繁殖白杨的白杨酶类的活性比白杨[银白杨x欧洲山杨]高数倍。图138和139分别显示了全部细胞顶空测定和DMAPP测定的结果，令人惊奇地表明：来自欧洲黑杨、美洲山杨、毛果杨、和银白杨的酶都具有比杂交体[银白杨x欧洲山杨]显著更高的活性。
按照如下描述进行DMAPP测定：将体积为400μL的培养物转移至新的96-孔平板(Perkin Elmer，货号6008290)，通过在Beckman CoulterAllegra 6R离心机中在2500x g离心来收集细胞。将沉淀物重悬于200mL低渗缓冲液(5mM MgCL2，5mM Tris HCl，5mM DTT pH 8.0)，将平板在-80℃冷冻至少60分钟的时间。通过解冻平板制备细胞裂解物并加入32mL异戊二烯合酶DMAPP测定缓冲液(57mM Tris HCl，19mMMgCl2，74mg/mL DNase I(Sigma货号DN-25)、2.63x105U/mL ReadyLyse溶菌酶溶液(Epicentre货号R1802M)、和5mg/mL分子生物学级别的BSA。将平板在25℃振荡温育30分钟，然后置于冰上。对于异戊二烯产量，将80mL的裂解物等份试样转移至96孔深孔玻璃板(Zinsser货号3600600)，加入pH 8.2的100mM KHPO4中的20mL 10mM DMAPP溶液(Cayman Chemical货号63180)。以铝质平板密封器(BeckmanCoultor货号538619)将平板密封，并在30℃振荡温育60分钟。通过加热玻璃块(70℃，5分钟)终止酶促反应。通过实施例1第II部分的描述定量分析每个孔的细胞顶空。
值得注意的是，银白杨、美洲山杨、毛果杨具有比来自野葛的更高的异戊二烯合酶活性。在所测的所有酶类中，来自银白杨的酶表达的活性最高。相对于整个细胞顶空测定，在细胞裂解物中观察到的更高的活性可能是由于DMAPP的限制，DMAPP是由细胞的内源性脱氧木酮糖5-磷酸(DXP)途径递送的这些酶的底物。
对于测定了数值的所有的酶，Km动力学参数测定为大约2-3mM。
实施例3：在表达重组野葛异戊二烯合酶的柠檬泛菌中生产异戊二烯
将实施例1中描述的pTrcKudzu和pCL-lac Kudzu质粒电穿孔进入柠檬泛菌(美国专利号7,241,587)。分别在含有羧苄西林(200μg/ml)或壮观霉素(50μg/ml)的LA上选择转化子。从摇瓶中生产异戊二烯并按照实施例1中针对表达重组野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌菌株的描述测定所生产的异戊二烯的量。结果显示于图10。
实施例4：在表达重组野葛异戊二烯合酶的枯草芽孢杆菌中生产异戊 二烯
I.用于表达野葛异戊二烯合酶的枯草芽孢杆菌复制质粒的构建
在枯草芽孢杆菌aprEnprE Pxyl-comK菌株(BG3594comK)中使用aprE启动子控制下的复制质粒(具有氯霉素抗性盒的pBS19)表达野葛异戊二烯合酶。使用PCR单独扩增异戊二烯合酶、aprE启动子和转录终止子并使它们融合。然后将构建体克隆进入pBS19并转化进入枯草芽孢杆菌。
a)aprE启动子的扩增
使用下列引物从枯草芽孢杆菌的染色体DNA扩增aprE启动子
CF 797(+)起始aprE启动子MfeI
5’-GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC(SEQ IDNO：53)
CF 07-43(-)使aprE启动子融合至Kudzu ispS
5’-ATTGAGAAGAGGTCGCACACACTCTTTACCCTCTCCTTTTA(SEQ ID NO：54)
b)异戊二烯合酶基因的扩增
从质粒pTrcKudzu(SEQ ID NO：2)扩增野葛异戊二烯合酶基因。该基因针对大肠杆菌进行密码子优化，由DNA 2.0合成。使用下列引物：
CF 07-42(+)使aprE启动子融合至野葛异戊二烯合酶基因(GTG起始密码子)
5’-TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT(SEQ ID NO：55)
CF 07-45(-)使野葛异戊二烯合酶基因的3’末端融合至终止子
5’-CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC(SEQ ID NO：56)
c)转录终止子的扩增
使用下列引物从之前测过序的质粒pJHPms382扩增解淀粉芽孢杆菌的碱性丝氨酸蛋白酶的终止子：
CF 07-44(+)使野葛异戊二烯合酶基因的3’末端融合至终止子
5’-GATTAACCAGCTGATGTATGTCTAAAAAAAACCGGCCTTGG(SEQ ID NO：57)
CF 07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子的末端(BamHI)
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQ IDNO：58)
使用下列引物通过PCR使野葛片段融合至终止子片段：
CF 07-42(+)使aprE启动子融合至野葛异戊二烯合酶基因(GTG起始密码子)
5’-TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT(SEQ ID NO：55)
CF 07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子的末端(BamHI)
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQ IDNO：58)
使用下列引物通过PCR使野葛终止子片段融合至启动子片段：
CF 797(+)起始aprE启动子MfeI
5’-GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC(SEQ IDNO：53)
CF 07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子的末端(BamHI)
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQ IDNO：58)
使用Qiagen试剂盒纯化融合PCR片段并以限制性酶MfeI和BamHI消化。使用Qiagen试剂盒凝胶纯化该经消化的DNA片段并连接进入载体pBS19，所述载体已经过EcoRI和BamHI消化并进行了凝胶纯化。
将连接混合物转化进入大肠杆菌Top 10细胞，在LA+50羧苄西林平板上选择菌落。选择总共6个菌落，在LA+50羧苄西林中生长过夜，然后使用Qiagen试剂盒分离质粒。以EcoRI和BamHI消化质粒以检查插入片段，将三个正确的质粒送去测序，其中使用下列引物：
CF 149(+)aprE启动子的EcoRI起始
5’-GACATGAATTCCTCCATTTTCTTCTGC(SEQ ID NO：59)
CF 847(+)pXX 049中的序列(aprE启动子的末端)
5’-AGGAGAGGGTAAAGAGTGAG(SEQ ID NO：60)
CF 07-45(-)使野葛异戊二烯合酶基因的3’末端融合至终止子
5’-CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC(SEQ ID NO：56)
CF 07-48(+)用于野葛异戊二烯合酶的测序引物
5’-CTTTTCCATCACCCACCTGAAG(SEQ ID NO：61)
CF 07-49(+)野葛异戊二烯合酶中的测序
5’-GGCGAAATGGTCCAACAACAAAATTATC(SEQ ID NO：62)
通过测序，被称作pBS Kudzu#2(图52和12；SEQ ID NO：5)的质粒是正确的，将其转化进入枯草芽孢杆菌宿主菌株BG 3594comK。在LA+5氯霉素平板上进行选择。选择转化子并在LA+5氯霉素上划线为单一菌落，然后在LA+5氯霉素中生长直至其达到1.5的OD600。将其在-80℃在存在甘油的瓶中冷冻储存。得到的菌株被称作CF 443。
II.在含有表达重组异戊二烯合酶的枯草芽孢杆菌细胞的摇瓶中生产异戊二烯
以来自LA+氯霉素(Cm，25μg/ml)的CF 443的单一菌落接种过夜培养物。培养物在37℃在LB+Cm中在200rpm振荡生长。这些过夜培养物(1ml)用于接种含有25ml Grants II培养基和终浓度为25μg/ml的氯霉素的250ml振荡培养瓶。Grants II培养基的配方是：10g大豆胨，3ml 1M K2HPO4，75g葡萄糖，3.6g脲，100ml 10X MOPS，以水定容至1L，pH 7.2；10X MOPS的配方是：83.72g MOPS，7.17g tricine，12g KOH丸，10ml 0.276M K2SO4溶液，10ml 0.528M MgCl2溶液，29.22g NaCl，100ml 100X微量营养素，以水定容至1L；100X微量营养素的配方是：1.47g CaCl2*2H2O，0.4g FeSO4*7H2O，0.1g MnSO4*H2O，0.1g ZnSO4*H2O，0.05g CuCl2*2H2O，0.1g CoCl2*6H2O，0.1gNa2MoO4*2H2O，以水定容至1L。将摇瓶在37℃温育，在第18、24、和44小时取出样品。在第18小时，对CF443和对照菌株的顶空取样。这代表18小时的异戊二烯累积。通过如实施例1描述的气相色谱测定异戊二烯的量。通过表达重组异戊二烯合酶显著增加了异戊二烯的产量(图11)。
III.在14L的发酵中通过CF443生产异戊二烯
从补料分批培养物中测定由含有在复制质粒上的重组野葛异戊二烯合酶基因的枯草芽孢杆菌大规模生产的异戊二烯。在含有大豆粉(Cargill)、磷酸钠和钾、硫酸镁和柠檬酸的溶液、氯化铁和氯化锰的营养培养基中，通过常规补料分批发酵方式培养表达野葛异戊二烯合酶基因的芽孢杆菌菌株CF 443或不表达野葛异戊二烯合酶基因的对照菌株。在发酵之前，使用酶的混合物(包括纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶)将培养基浸软90分钟(见WO95/04134)。向14L分批发酵器中进料60％wt/wt葡萄糖(Cargill DE99右旋糖，ADM Versadex greens或Danisco转化糖)和99％wt/wt油(西方家用豆油，其中99％wt/wt是加入到细胞培养基之前油的浓度)。当批次中的葡萄糖不可检出时，开始进料。进料速率经数小时渐变，调整以相同的碳要素添加油。使用28％w/v氢氧化铵将pH控制在6.8-7.4。如果起泡沫，则向培养基中加入防沫剂。将发酵温度控制在37℃，以750rpm搅拌发酵培养物。在整个过程中监测多个其它参数，例如pH、DO％、气流、和压力。将DO％维持在20以上。经36小时的时间过程取样并分析细胞生长(OD550)和异戊二烯的生产。这些实验的结果显示于图53A和53B 。
IV.野葛异戊二烯合酶(ispS)整合进入枯草芽孢杆菌
将野葛异戊二烯合酶基因克隆进入整合质粒(pJH101-cmpR)，处于aprE启动子的控制下。在所测的条件下，没有检测到异戊二烯。
实施例5：在木霉中生产异戊二烯
I.用于在里氏木霉中表达野葛异戊二烯合酶的载体的构建
由DNA 2.0合成解脂耶氏酵母密码子优化的野葛IS基因(SEQ IDNO：6)(图13)。该质粒作为下列PCR扩增反应的模板：1μl质粒模板(20ng/ul)，1μl引物EL-945(10μM)5’-GCTTATGGATCCTCTAGACTATTACACGTACATCAATTGG(SEQID NO：63)，1μl引物EL-965(10μM)5’-CACCATGTGTGCAACCTCCTCCCAGTTTAC(SEQ ID NO：64)，1μl dNTP(10mM)，5μl 10x PfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶缓冲液，1μl PfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶，40μl水，总反应体积为50μl。正向引物在5’末端包含不对应于解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的另外4个核苷酸，但是这4个核苷酸对于克隆进入pENTR/D-TOPO载体是必需的。反向引物在5’末端包含不对应于解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的另外21个核苷酸，但插入这21个核苷酸以克隆进入其它载体骨架。使用MJ Research PTC-200热循环仪，按照如下进行PCR反应：95℃，2分钟(仅第一个循环)；“95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，30秒”(重复27个循环)；最后一个循环后72℃，1分钟。在1.2％E-凝胶上分析PCR产物以确认成功扩增了解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因。
然后根据生产商的说明书，使用TOPO pENTR/D-TOPO克隆试剂盒克隆PCR产物：1μl PCR反应物，1μl盐溶液，1μl TOPOpENTR/D-TOPO载体和3μl水，总反应体积是6μl。将反应物在室温温育5分钟。将1μl TOPO反应物转化进入TOP10化学感受态大肠杆菌细胞。在LA+50μg/ml卡那霉素平板上选择转化子。挑取数个菌落，每个接种于含有LB+50μg/ml卡那霉素的5ml管中，使培养物在37℃在200rpm振荡生长过夜。根据生产商的说明书，使用QIAprep旋转微量制备试剂盒从过夜培养物分离质粒。对数个质粒进行测序以验证DNA序列是正确的。
编码解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的单一pENTR/D-TOPO质粒用于Gateway克隆进入订制的pTrex3g载体。pTrex3g的构建描述于WO 2005/001036A2。根据生产商关于GatewayLR Clonase II Enzyme Mix试剂盒(Invitrogen)的说明书进行反应：1μl解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因pENTR/D-TOPO供体载体，1μl pTrex3g目的载体，6μl TE缓冲液，pH 8.0，总反应物体积为8μl。将反应物在室温温育1小时，然后加入1μl蛋白酶K溶液，在37℃继续温育10分钟。然后将1μl反应物转化进入TOP10化学感受态大肠杆菌细胞。在LA+50μg/ml羧苄西林平板上选择转化子。挑取数个菌落，每个接种于含有LB+50μg/ml羧苄西林的5ml管中，使培养物在37℃在200rpm振荡生长过夜。根据生产商的说明书，使用QIAprep旋转微量制备试剂盒(Qiagen，Inc.)从过夜培养物管中分离质粒。对数个质粒进行测序以验证DNA序列是正确的。
使用Biolistic PDS-1000/HE颗粒递送系统(见WO 2005/001036 A2)进行解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶pTrex3g质粒(图14)向quad缺失里氏木霉菌株的生物弹转化。使用专利公开WO2005/001036 A2的实施例11所列的程序进行稳定转化子的分离和摇瓶评价。
II.在重组里氏木霉菌株中生产异戊二烯
将如上描述的异戊二烯合酶转化子的1ml的15和36小时的培养物转移至顶空瓶中。将瓶密封并在30℃温育5小时。通过实施例1描述的方法测定顶空气体并鉴定异戊二烯。转化子中有2个显示出痕量的异戊二烯。通过14小时的温育可以增加异戊二烯的量。对于14小时的温育，两个阳性样品显示出大约0.5μg/L的异戊二烯水平。未经转化的对照未显示出可检出水平的异戊二烯。该实验证明：当提供外源异戊二烯合酶时，里氏木霉能够从内源前体生产异戊二烯。
实施例6：在耶氏酵母中生产异戊二烯
I.用于在解脂耶氏酵母中表达野葛异戊二烯合酶的载体的构建
用于在解脂耶氏酵母中表达野葛异戊二烯合酶基因的载体的构建起始点是载体pSPZ1(MAP29Spb)。该载体的完整序列(SEQ ID NO：7)显示于图15。
使用解脂耶氏酵母菌株GICC 120285的染色体DNA作为模板通过PCR扩增以下片段：URA3基因的无启动子形式，18S核糖体RNA基因的片段，解脂耶氏酵母XPR2基因的转录终止子，以及包含XPR2和ICL1基因的启动子的两个DNA片段。使用以下PCR引物：
ICL13
5’-GGTGAATTCAGTCTACTGGGGATTCCCAAATCTATATATACTGCAGGTGAC(SEQ ID NO：65)
ICL15
5’-GCAGGTGGGAAACTATGCACTCC(SEQ ID NO：66)
XPR 3
5’-CCTGAATTCTGTTGGATTGGAGGATTGGATAGTGGG(SEQ ID NO：67)
XPR 5
5’-GGTGTCGACGTACGGTCGAGCTTATTGACC(SEQ IDNO：68)
XPRT3
5’-GGTGGGCCCGCATTTTGCCACCTACAAGCCAG(SEQ IDNO：69)
XPRT 5
5’-GGTGAATTCTAGAGGATCCCAACGCTGTTGCCTACAACGG(SEQID NO：70)
Y18S3
5’-GGTGCGGCCGCTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCG(SEQ ID NO：71)
Y18S 5
5’-GGTGGGCCCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAG(SEQ ID NO：72)
YURA3
5’-GGTGACCAGCAAGTCCATGGGTGGTTTGATCATGG(SEQID NO：73)
YURA 50
5’-GGTGCGGCCGCCTTTGGAGTACGACTCCAACTATG(SEQID NO：74)
YURA 51
5’-GCGGCCGCAGACTAAATTTATTTCAGTCTCC(SEQ IDNO：75)
对于PCR扩增，根据生产商的说明书，使用PfuUltraII聚合酶(Stratagene)、生产商提供的缓冲液和dNTP、2.5μM的引物和指明的模板DNA。使用下列循环进行扩增：95℃，1分钟；34x(95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，3分钟)，和在72℃，10分钟，然后在4℃温育。
从DNA 2.0获得编码针对在耶氏酵母中表达进行了密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的合成的DNA分子(图16；SEQ ID NO：8)。在图18中显示了分别携带在XPR2和ICL1启动子控制下的合成的野葛异戊二烯合酶基因的质粒pYLA(KZ1)和pYLI(KZ1)的完整详细的构建示意图。还构建了对照质粒，其中插入了交配因子基因(MAP29)以替代异戊二烯合酶基因(图18E和18F)。
类似的克隆程序可用于表达白杨(银白杨x欧洲山杨)异戊二烯合酶基因。白杨异戊二烯的序列描述于Miller B等人(2001)Planta 213，483-487并显示于图17(SEQ ID NO：9)。在图18A和B中显示了产生分别携带在XPR2和ICL1启动子控制下的合成的白杨异戊二烯合酶基因的质粒pYLA(POP1)和pYLI(POP1)的构建示意图。
II.通过解脂耶氏酵母的重组菌株生产异戊二烯
使用SacII消化载体pYLA(KZ1)、pYLI(KZ1)、pYLA(MAP29)和pYLI(MAP29)并通过标准的醋酸锂/聚乙二醇程序转化解脂耶氏酵母菌株CLIB 122至尿苷原养型。简而言之，酵母细胞在YEPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)中生长过夜，通过离心(4000rpm，10分钟)收集，以无菌水洗涤一次并悬于pH 6.0的0.1M醋酸锂中。将200μl的细胞悬浮液等份与线性化的质粒DNA溶液(10-20μg)混合，在室温温育10分钟，在相同的缓冲液中与1ml 50％PEG 4000的混合。将悬浮液在室温再温育1小时，然后在42℃热击2分钟。然后将细胞铺板于SC hisleu平板(0.67％酵母氮源，2％葡萄糖，各100mg/L的亮氨酸和组氨酸)。在30℃温育3-4天后出现转化子。
使来自pYLA(KZ1)转化的3个分离体，来自pYLI(KZ1)转化的3个分离体，来自pYLA(MAP29)转化的2个分离体和来自pYLI(MAP29)转化的2个分离体在YEP7培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，pH 7.0)中在30℃振荡生长24小时。通过离心从10ml的培养物收集细胞，重悬于3ml的新鲜YEP7中并置于15ml旋盖瓶中。将瓶在室温温育过夜，轻微(60rpm)振荡。使用如实施例1描述的质谱检测器通过气相色谱分析这些瓶的顶空中的异戊二烯含量。以pYLA(KZ1)和pYLI(KZ1)获得的所有转化子都生产容易检出的量的异戊二烯(0.5μg/L至1μg/L，图20)。在携带肌醇六磷酸酶基因而非异戊二烯合酶基因的对照菌株的顶空中未检出异戊二烯。
实施例7：在表达野葛异戊二烯合酶和idi、或dxs、或idi和dxs的 大肠杆菌中生产异戊二烯
I.构建用于在大肠杆菌中生产异戊二烯的编码野葛异戊二烯合酶和idi、或dxs、或idi和dxs的载体
i)pTrcKudzuKan的构建
将pTrcKudzu(如实施例1所描述)的bla基因替换为赋予卡那霉素抗性的基因。为了除掉bla基因，以BspHI消化pTrcKudzu，以虾碱性磷酸酶(SAP)处理，在65℃热杀灭，然后以Klenow片段和dNTP进行末端填充。从琼脂糖凝胶纯化5kbp大的片段，并连接至kanr基因，所述kanr    基因是使用引物MCM22 5’-GATCAAGCTTAACCGGAATTGCCAGCTG(SEQ ID NO：76)和MCM23 5’-GATCCGATCGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC(SEQ ID NO：77)从pCR-Blunt-II-TOPO通过PCR扩增而来的；以HindIII和PvuI消化，并进行末端填充。在含有50μg/ml卡那霉素的LA上选择携带赋予卡那霉素抗性的质粒(pTrcKudzuKan)的转化子。
ii)pTrcKudzu yIDI Kan的构建
以PstI消化pTrcKudzuKan，以SAP处理，热杀灭，并进行凝胶纯化。将其连接至编码具有合成的RBS的来自酿酒酵母的idi的PCR产物。用于PCR的引物是NsiI-YIDI 1 F 5’-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC(SEQ IDNO：78)和PstI-YIDI 1 R 5’-CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC(SEQ ID NO：79)；模板是酿酒酵母基因组DNA。以NsiI和PstI消化PCR产物，并进行凝胶纯化，然后连接。将连接混合物转化进入化学感受态TOP10细胞并在含有50μg/ml卡那霉素的LA上选择。分离了数个转化子并测序，得到的质粒被称作pTrcKudzu-yIDI(kan)(图34和35；SEQ IDNO：16)。
iii)pTrcKudzu DXS Kan的构建
以PstI消化质粒pTrcKudzuKan，以SAP处理，热杀灭，并进行凝胶纯化。将其连接至编码具有合成的RBS的来自大肠杆菌的dxs的PCR产物。用于PCR的引物是：MCM135’-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG(SEQ ID NO：80)和MCM14 5’-CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT(SEQ ID NO：81)；模板是大肠杆菌基因组DNA。以NsiI和PstI消化PCR产物，并进行凝胶纯化，然后连接。将得到的转化反应物转化进入TOP10细胞并在含有50μg/ml卡那霉素的LA上选择。分离了数个转化子并测序，得到的质粒被称作pTrcKudzu-DXS(kan)(图36和37；SEQ ID NO：17)。
iv)pTrcKudzu-yIDI-dxs(kan)的构建
以PstI消化pTrcKudzu-yIDI(kan)，以SAP处理，热杀灭，并进行凝胶纯化。将其连接至编码具有合成的RBS的来自大肠杆菌的dxs的PCR产物(引物：MCM135’-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG(SEQ ID NO：80)和MCM14 5’-CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT(SEQ ID NO：81)；模板TOP10细胞)，所述PCR产物经过NsiI和PstI消化和凝胶纯化。最终的质粒被称作pTrcKudzu-yIDI-dxs(kan)(图21和22；SEQ IDNO：10)。
v)pCL PtrcKudzu的构建
使用SspI从pTrcKudzu消化包含来自实施例1的启动子、结构基因和终止子的DNA片段，并进行凝胶纯化。将其连接至经过PvuII消化、SAP处理和热杀灭的pCL1920。将得到的连接混合物转化进入TOP10细胞并在含有50μg/ml壮观霉素的LA中选择。分离了数个克隆并测序，选择了两个。pCL PtrcKudzu和pCL PtrcKudzu(A3)具有方向相反的插入片段(图38-41；SEQ ID NOs：18-19)。
vi)p CL PtrcKudzu yIDI的构建
将来自上述(ii)的NsiI-PstI消化的、凝胶纯化的IDI PCR扩增子连接进入已经过PstI消化、SAP处理、和热杀灭的pCL PtrcKudzu。将连接混合物转化进入TOP10细胞并在含有50μg/ml壮观霉素的LA中选择。分离了数个克隆并测序，得到的质粒被称作pCL PtrcKudzu yIDI(图42和43；SEQ ID NO：20)。
vii)p CL PtrcKudzu DXS的构建
将来自上述(iii)的NsiI-PstI消化的、凝胶纯化的DXS PCR扩增子连接进入已经过PstI消化、SAP处理、和热杀灭的pCL PtrcKudzu(A3)。将连接混合物转化进入TOP10细胞并在含有50μg/ml壮观霉素的LA中选择。分离了数个克隆并测序，得到的质粒被称作pCL PtrcKudzuDXS(图44和45；SEQ ID NO：21)。
II.以不同拷贝数表达野葛异戊二烯合酶、idi、和/或dxs的培养物的顶空中的异戊二烯的测定
之前经过质粒pTrcKudzu(kan)(A)、pTrcKudzu-yIDI kan(B)、pTrcKudzu-DXS kan(C)、pTrcKudzu-yIDI-DXS kan(D)转化的大肠杆菌BL21(λDE3)的培养物生长于含有50μg/mL卡那霉素的LB中。pCLPtrcKudzu(E)、pCL PtrcKudzu、pCL PtrcKudzu-yIDI(F)和pCLPtrcKudzu-DXS(G)生长于含50μg/mL壮观霉素的LB中。在时间0点(OD600是大约0.5)以400μM IPTG诱导培养物，取出样品以进行顶空异戊二烯测定(见实施例1)。结果显示于图23A-23G。
通过转化将质粒pTrcKudzu-yIDI-dxs(kan)导入大肠杆菌菌株BL21。得到的菌株BL21/pTrc Kudzu IDI DXS在20℃在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB中过夜生长，并用于接种摇瓶中的含有1％葡萄糖的TM3(13.6g K2PO4，13.6g KH2PO4，2.0g MgSO4*7H2O，2.0g一水柠檬酸，0.3g柠檬酸铁铵，3.2g(NH4)2SO4，0.2g酵母提取物，1.0ml1000x改良痕量金属溶液，调节至pH 6.8并以H2O定容，无菌过滤)。将培养瓶在30℃温育直至达到OD600为0.8，然后以400μM IPTG诱导。在诱导后的不同时间取出样品并按照实施例1的描述测定顶空中的异戊二烯的量。结果显示于图23H。
III.在大肠杆菌/pTrcKudzu yIDI DXS中从生物质生产异戊二烯
测定了菌株BL21pTrcKudzuIDIDXS从三种类型的生物质：甘蔗渣、玉米秸秆和软木浆生产异戊二烯的能力，葡萄糖作为对照。通过酶促水解制备生物质的水解物(Brown，L和Torget，R.，1996，NREL标准测定法Lap-009“Enzymatic Saccharification of Lignocellulosic Biomass”)，以基于葡萄糖当量的稀释度使用。在本例中，葡萄糖当量等于1％的葡萄糖。来自BL21(DE3)pTrcKudzu yIDI DXS(kan)的新鲜转化的细胞的平板的单一菌落用于接种5ml LB+卡那霉素(50μg/ml)。培养物在25℃振荡温育过夜。次日，在25ml TM3+0.2％YE+1％原料中，将过夜培养物稀释至OD600＝0.05。原料是玉米秸秆、甘蔗渣、或软木浆。葡萄糖用作阳性对照，无葡萄糖的状况用作阴性对照。培养物在30℃在180rpm振荡温育。监测培养物的OD600，当其达到OD600＝～0.8时，按照实施例1的描述分析1小时和3小时之时培养物的异戊二烯生产。不诱导培养物。所有的包含添加的原料的培养物生产与葡萄糖阳性对照相等的异戊二烯。实验按照一式两份进行，显示于图46。
IV.在大肠杆菌/pTrcKudzuIDIDXS中从转化糖生产异戊二烯
来自BL21(λDE3)/pTrcKudzu yIDI DXS(kan)的新鲜转化的细胞的平板的单一菌落用于接种5mL LB+卡那霉素(50μg/ml)。培养物在25℃振荡温育过夜。次日，在25ml TM3+0.2％YE+1％原料中，将过夜培养物稀释至OD600＝0.05。原料是葡萄糖、转化糖或玉米秸秆。通过酶促处理蔗糖糖浆制备转化糖原料(Danisco转化糖)。按照下文的描述(第V部分)制备AFEX玉米秸秆。细胞在30℃生长，当培养物达到OD600为～0.8-1.0时(0小时)，测定第一个样品。按照实施例1的描述，在0、1和3小时分析培养物的生长(如通过OD600所测定)和异戊二烯的生产。结果显示于图47。
V.从AFEX预处理的玉米秸秆制备水解物
从Michigan Biotechnology Institute获得AFEX预处理的玉米秸秆。预处理条件是：60％的水分，1∶1的氨载量，在90℃持续30分钟，然后气干。AFEX预处理的玉米秸秆中的水分含量是21.27％。AFEX预处理的玉米秸秆中的葡聚糖和木聚糖的含量分别是31.7％和19.1％(干重)。糖化过程如下：将20g AFEX预处理的玉米秸秆加入到500ml培养瓶中，瓶中含有5ml 1M柠檬酸钠缓冲液pH 4.8、2.25ml Accellerase 1000、0.1ml Grindamyl H121(来自面包制作工业的黑曲霉的Danisco木聚糖酶产物)、和72.65ml DI水。将培养瓶置于定轨振荡器上并在50℃温育96小时。从振荡器中取出1个样品并使用HPLC分析。水解物含有38.5g/l葡萄糖、21.8g/l木糖、和10.3g/l葡萄糖和/或木糖的低聚物。
VI.酵母提取物对于生长于补料分批培养物中的大肠杆菌生产异戊二烯的效应
按照之前的描述，使用含有如上所述的pTrcKudzu yIDI DXS质粒的大肠杆菌细胞以14升的规模进行发酵。以指数速率进料酵母提取物(Bio Springer，Montreal，Quebec，Canada)。在40小时的发酵过程中，输送进入发酵器的酵母提取物的总量是70-830g。在550nm的波长下测定发酵液的光密度。发酵器内的最终的光密度与加入的酵母提取物的量成比例(图48A)。按照之前的描述测定来自发酵器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程而增大(图48B)。所生产的异戊二烯的量与进料的酵母提取物的量成线性比例(图48C)。
VII.在pTrcKudzu DXS yIDI的500L发酵中生产异戊二烯
含有野葛异戊二烯合酶、酿酒酵母IDI、和大肠杆菌DXS核酸的大肠杆菌细胞(大肠杆菌BL21(λDE3)pTrc Kudzu dxs yidi)的500升发酵用于生产异戊二烯。经15小时的时间段，异戊二烯的水平介于50至300μg/L。基于平均异戊二烯浓度、流经设备的平均流和异戊二烯突破程度，经计算，所收集的异戊二烯的量是大约17g。
VIII.生长于补料分批培养物中的大肠杆菌的500L发酵生产的异戊二烯
培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO4 7.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分同时加入并溶解于diH2O中。该溶液经高压灭菌。以氨气(NH3)将pH调节至7.0，并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺*HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：
柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3 100mg，NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分逐一溶解于DI H2O中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，并以0.22μm的滤器无菌过滤。
在500L的生物反应器中以含有pTrcKudzu yIDI DXS质粒的大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃时从葡萄糖和酵母提取物形成的异戊二烯。在大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基中制备从冷冻瓶中取出的大肠杆菌菌株的接种物。接种物生长至OD 0.15(在550nm测定)后，使用20ml接种含有2.5L大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基的生物反应器。在该生物反应器中在30℃生长至OD1.0，将2.0L转移至500L的生物反应器。
以指数速率进料酵母提取物(Bio Springer，Montreal，Quebec，Canada)和葡萄糖。在50小时的发酵过程中输送进入生物反应器的葡萄糖和酵母提取物的总量分别是181.2kg和17.6kg。生物反应器中的光密度随时间的变化显示于图49A。按照之前的描述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程而增加(图49B)。在50小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是55.1g，生产的时间进程显示于图49C 。
实施例8：在表达野葛异戊二烯合酶和重组甲羟戊酸途径基因的大肠 杆菌中生产异戊二烯
I.克隆下部MVA途径
用于克隆下部甲羟戊酸途径的策略如下。通过PCR从酿酒酵母染色体DNA扩增甲羟戊酸生物合成途径的4个基因：甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)和异戊烯二磷酸异构酶的基因，并各自克隆进入pCR BluntII TOPO质粒(Invitrogen)。在一些情况下，从大肠杆菌染色体DNA扩增idi基因。将引物设计为使得大肠杆菌共有RBS(AGGAGGT(SEQ ID NO：82)或AAGGAGG(SEQID NO：83))被插入至5’末端，在起始密码子的上游8bp处，并且在3’末端添加PstI位点。然后将基因逐个克隆进入pTrcHis2B载体，直至组装整个途径。
来自酿酒酵母S288C的染色体DNA获自ATCC(ATCC 204508D)。根据生产商的说明书，使用PfuTurbo，使用引物MVKF(5’-AGGAGGTAAAAAAACATGTCATTACCGTTCTTAACTTCTGC，SEQ ID NO：84)和MVK-Pst1-R(5’-ATGGCTGCAGGCCTATCGCAAATTAGCTTATGAAGTCCATGGTAAATTCGTG，SEQ ID NO：85)从酿酒酵母的染色体扩增MVK基因。通过在1.2％E-凝胶(Invitrogen)上的电泳鉴定正确大小的PCR产物(1370bp)，并克隆进入pZeroBLUNT TOPO。得到的质粒被称作pMVK1。以SacI和Taq1限制性核酸内切酶消化质粒pMVK1，将片段凝胶纯化并连接进入经SacI和BstBI消化的pTrcHis2B。得到的质粒被称作pTrcMVK1。
使用下列引物通过PCR扩增甲羟戊酸生物合成途径的第二个基因PMK：PstI-PMK1 R(5’-GAATTCGCCCTTCTGCAGCTACC，SEQ IDNO：86)和BsiHKA I-PMK1 F(5’-CGACTGGTGCACCCTTAAGGAGGAAAAAAACATGTCAG，SEQ ID NO：87)。根据生产商的说明书，使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)进行PCR反应。以PstI和BsiHKI消化正确大小的产物(1387bp)，并连接进入经PstI消化的pTrcMVK1。得到的质粒被称作pTrcKK。按照相同的方式克隆MVD和idi基因。使用引物对PstI-MVD 1 R(5’-GTGCTGGAATTCGCCCTTCTGCAGC，SEQ ID NO：88)和NsiI-MVD 1 F(5’-GTAGATGCATGCAGAATTCGCCCTTAAGGAGG，SEQ ID NO：89)进行PCR以扩增MVD基因，使用引物对PstI-YIDI 1 R(5’-CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC，SEQ ID NO：79)和NsiI-YIDI 1 F(5’-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC，SEQID NO：78)进行PCR以扩增yIDI基因。在一些情况下，使用IPP异构酶基因，来自大肠杆菌的idi。为了从大肠杆菌染色体DNA扩增idi，使用下列引物组：PstI-CIDI 1R(5’-GTGTGATGGATATCTGCAGAATTCG，SEQ ID NO：90)和NsiI-CIDI 1 F(5’-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATG，SEQ IDNO：91)。模板DNA是通过标准方法从大肠杆菌FM5分离的染色体DNA(WO 96/35796和WO 2004/033646，其各自通过引用方式全文并入本文，尤其是关于核酸分离的内容)。最终的质粒被称作pKKDIy，其是编码酵母idi基因的构建体；或称作pKKDIc，其是编码大肠杆菌idi基因的构建体。将质粒转化进入大肠杆菌宿主BL21以进行随后的分析。在一些情况下，将来自野葛的异戊二烯合酶克隆进入pKKDIy，生产质粒pKKDIyIS。
还将下部MVA途径克隆进入含有卡那霉素抗生素抗性标志物的pTrc。以限制性核酸内切酶ApaI和PstI消化质粒pTrcKKDIy，在1.2％的琼脂糖E-凝胶上分离5930bp的片段，并根据生产商的说明书，使用Qiagen凝胶纯化试剂盒纯化。以限制性核酸内切酶ApaI和PstI消化实施例7中描述的质粒pTrcKudzuKan，使用Qiagen凝胶纯化试剂盒从1.2％的E-凝胶上纯化包含载体的3338bp的片段。使用Roche快速连接试剂盒连接3338bp载体片段和5930bp下部MVA途径片段。将连接混合物转化进入大肠杆菌TOP10细胞，转化子在37°生长过夜并在含有卡那霉素(50μg/ml)的LA上选择。通过限制性酶消化验证转化子，将一个冷冻作为贮液。该质粒被称作pTrcKanKKDIy。
II.将野葛异戊二烯合酶基因克隆进入pTrcKanKKDIy
通过PCR从实施例1中描述的pTrcKudzu扩增野葛异戊二烯合酶基因，使用引物MCM505’-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTTACT(SEQ ID NO：52)和MCM53 5’-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG(SEQ IDNO：50)。将得到的PCR片段克隆进入pCR2.1并转化进入大肠杆菌TOP10。该片段含有野葛异戊二烯合酶的编码序列和含有来自大肠杆菌的RBS的上游区。转化子在37℃过夜温育并在含有羧苄西林(50μg/ml)的LA上选择。通过测序验证片段的正确插入，该菌株被称作MCM93。
以限制性核酸内切酶NsiI和PstI消化来自菌株MCM93的质粒，以释放含有RBS和野葛异戊二烯合酶的1724bp的插入片段。在1.2％的琼脂糖E-凝胶上分离1724bp片段，并根据生产商的说明书使用Qiagen凝胶纯化试剂盒纯化。以限制性核酸内切酶PstI消化质粒pTrcKanKKDIy，以SAP在37℃处理30分钟，并使用Qiagen PCR清除试剂盒纯化。使用Roche快速连接试剂盒连接质粒和编码野葛异戊二烯合酶的DNA片段。将连接混合物转化进入大肠杆菌TOP10细胞，转化子在37°生长过夜并在含有50μg/ml卡那霉素的LA上选择。通过限制性消化验证正确的转化子，该质粒被称作pTrcKKDyIkISKan(图24和25；SEQ ID NO：11)。将该质粒转化进入BL21(λDE3)细胞(Invitrogen)。
III.在表达重组下部甲羟戊酸途径和来自野葛的异戊二烯合酶的大肠杆菌中从甲羟戊酸生产异戊二烯
在调节至pH 7.1并补充了0.5％葡萄糖和0.5％甲羟戊酸的MOPS培养基(Neidhardt等人，(1974)J.Bacteriology 119：736-747)中培养菌株BL21/pTrcKKDyIkISKan。还使用相同的条件建立了对照培养物，只不过不加入0.5％甲羟戊酸。培养物起始于过夜种子培养物，以1％接种并在培养物达到OD600为0.3至0.5时以500μM IPTG诱导。培养物在30℃以250rpm振荡培养。在诱导后3个小时，使用实施例1中描述的顶空测定法分析异戊二烯的生产。异戊二烯的最大产量是6.67x 10-4mol/L培 养液/OD600/hr，其中L培养液是培养液的体积，并且包括细胞培养基的体积和细胞的体积。未补充甲羟戊酸的对照培养物不产生可测量的异戊二烯。
IV.克隆上部MVA途径
从粪肠球菌克隆上部甲羟戊酸生物合成途径，其包含编码三种酶活性的两个基因。mvaE基因编码具有乙酰基-辅酶A乙酰转移酶和3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)还原酶(该途径中的第一个和第三个蛋白)的酶活性的蛋白，mvaS基因编码该途径中的第二个酶HMG-辅酶A合酶。使用下列引物从粪肠球菌基因组DNA(ATCC 700802D-5)扩增具有位于其前面的大肠杆菌核糖体结合位点和间隔子的mvaE基因：
CF 07-60(+)mvaEw/RBS的起始点+ATG起始密码子SacI
5’-GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG(SEQ ID NO：93)
CF 07-62(-)将mvaE融合至mvaS，它们中间是RBS
5’-TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATTGTTTTCTTAAATC(SEQ ID NO：94)
使用下列引物从粪肠球菌基因组DNA(ATCC 700802D-5)克隆具有位于其前面的来自大肠杆菌的RBS和间隔子的mvaS基因：
CF 07-61(+)将mvaE融合至mvaS，它们中间是RBS
5’-GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAA(SEQ ID NO：95)
CF 07-102(-)mvaS基因的末端BglII
5’-GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQID NO：96)
使用下列引物通过PCR将PCR片段融合在一起：
CF 07-60(+)mvaEw/RBS的起始点+ATG起始密码子SacI
5’-GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG(SEQ ID NO：93)
CF 07-102(-)mvaS基因的末端BglII
5’-GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQ ID NO：96)
使用Qiagen试剂盒纯化融合PCR片段并以限制性酶SacI和BglII消化。使用Qiagen试剂盒对该消化的DNA片段进行凝胶纯化并连接进入已经SacI和BglII消化和凝胶纯化的商售载体pTrcHis2A。
将连接混合物转化进入大肠杆菌Top 10细胞，在LA+50μg/ml羧苄西林平板上选择菌落。总共选择了6个菌落，在LB+50μg/ml羧苄西林中生长过夜，并使用Qiagen试剂盒分离质粒。以SacI和BglII消化质粒以检查插入片段，使用下列引物对一个正确质粒进行测序：
CF 07-58(+)mvaE基因的起始点
5’-ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC(SEQ ID NO：97)
CF 07-59(-)mvaE基因的末端
5’-ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC(SEQ IDNO：98)
CF 07-82(+)mvaS基因的起始点
5’-ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG(SEQ ID NO：99)
CF 07-83(-)mvaS基因的末端
5’-TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQ ID NO：100)
CF 07-86(+)mvaE中的序列
5’-GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC(SEQ ID NO：101)
CF 07-87(+)mvaE中的序列
5’-TTGCCAATCATATGATTGAAAATC(SEQ ID NO：102)
CF 07-88(+)mvaE中的序列
5’-GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG(SEQ ID NO：103)
CF 07-89(+)序列mvaS
5’-GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC(SEQ ID NO：104)
通过测序证明被称作pTrcHis2AUpperPathway#1的质粒是正确的，并转化进入商售大肠杆菌菌株BL21。在LA+50μg/ml羧苄西林上进行选择。选择了两个转化子并在LB+50μg/ml羧苄西林中生长直至它们达到OD600为1.5。将两个菌株在-80℃在存在甘油的情况下冷冻于瓶中。BL21分离体#1中的pTrcHis2AUpperPathway#1的菌株被称作CF449，BL21分离体#2中的pTrcHis2AUpperPathway#1的菌株被称作CF 450。当分析时，发现两个克隆的行为是相同的。
V.将上部MVA途径克隆进入pCL1920
以限制性核酸内切酶消化质粒pTrcHis2AUpperPathway以释放包含pTrc-mvaE-mvaS-(His标签)-终止子的片段。在该片段中，his-标签不被翻译。使用Qiagen凝胶纯化试剂盒从1.2％的E-凝胶纯化该平末端化的4.5kbp的片段。通过以限制性核酸内切酶PvuII消化载体、以SAP处理并使用Qiagen凝胶纯化试剂盒从1.2％的E-凝胶进行凝胶纯化而从pCL1920制备去磷酸化的平末端化的4.2kbp的片段。使用Roche快速连接试剂盒连接这两个片段并转化进入TOP10化学感受态细胞。在含有壮观霉素(50μg/ml)的LA上选择转化子。通过PCR就插入片段的存在进行筛选，从而鉴定正确的菌落。该质粒被称作pCLPtrcUpperPathway(图26和27A-27D；SEQ ID NO：12)。
VI.表达组合的上部和下部甲羟戊酸途径的菌株
为了获得具有完整的甲羟戊酸途径+野葛异戊二烯合酶的菌株，将质粒pTrcKKDyIkISkan和pCLpTrcUpperPathway都转化进入BL21(λDE3)感受态细胞(Invitrogen)，在含有卡那霉素(50μg/ml)和壮观霉素(50μg/ml)的LA上选择转化子。通过质粒制备检查转化子以确保两个质粒都保持在宿主中。该菌株被称作MCM127。
VII.在大肠杆菌/pUpperpathway中从葡萄糖生产甲羟戊酸
将BL21/pTrcHis2A-mvaE/mvaS或FM5/p pTrcHis2A-mvaE/mvaS的单一菌落接种至LB+羧苄西林(100μg/ml)，并在37℃以200rpm振荡过夜生长。将这些培养物在250ml的培养瓶中的50ml培养基中稀释至OD600为0.1。培养基是：TM3+1％或2％葡萄糖+羧苄西林(100μg/ml)或TM3+1％葡萄糖+水解的豆油+羧苄西林(100μg/ml)或TM3+生物质(制备的甘蔗渣、玉米秸秆或柳枝稷)。培养物在30℃以200rpm振荡生长大约2-3小时，直至达到OD600为0.4。在该点，通过加入IPTG(400μM)诱导从mvaE mvaS构建体的表达。再将培养物温育20或40小时，在诱导后以2小时至6小时的间隔取样，然后视需要在24、36和48小时取样。通过取出1ml培养物进行取样，测定OD600，在微量离心机中使细胞沉淀，弃上清并分析其甲羟戊酸。
以TM3培养基和2％的葡萄糖作为细胞培养基，具有编码粪肠球菌AA-辅酶A硫解酶、HMG-辅酶A合酶、和HMG-辅酶A还原酶多肽的大肠杆菌细胞的14升发酵生产了22g甲羟戊酸。以LB培养基和1％的葡萄糖作为细胞培养基，这些细胞的摇瓶生产2-4g的甲羟戊酸/升。在这些菌株中甲羟戊酸的产生表明MVA途径在大肠杆菌中是有功能的。
VIII.从含有上部和下部MVA途径+野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌BL21生产异戊二烯
通过转化进入如上所述的包含上部和下部MVA途径和野葛异戊二烯合酶基因的质粒与如实施例7描述的包含idi、dxs和dxr及异戊二烯合酶基因的质粒的多种组合而产生下列菌株。使用的宿主细胞是化学感受态BL21(λDE3)，通过标准方法进行转化。在含有卡那霉素(50μg/ml)或卡那霉素+壮观霉素(二者浓度都是50μg/ml)的L琼脂上选择转化子。平板在37℃生长。得到的菌株命名如下：
卡那霉素+壮观霉素(各50μg/ml)上生长
MCM127-pCL Upper MVA+pTrcKKDyIkIS(kan)，在BL21(λDE3)中
MCM131-pCL1920+pTrcKKDyIkIS(kan)，在BL21(λDE3)中
MCM125-pCL Upper MVA+pTrcHis2B(kan)，在BL21(λDE3)中
在卡那霉素(50μg/ml)上生长
MCM64-pTrcKudzu yIDI DXS(kan)，在BL21(λDE3)中
MCM50-pTrcKudzu(kan)，在BL21(λDE3)中
MCM123-pTrcKudzu yIDI DXS DXR(kan)，在BL21(λDE3)中
上述菌株从冷冻贮液中划线至LA+合适的抗生素，并在37℃过夜生长。来自每个平板的单一菌落用于接种摇瓶(25ml LB+合适的抗生素)。在22℃在200rpm振荡下过夜温育该瓶。次晨，将瓶转移至37℃的温育箱并在200rpm振荡下再生长4.5小时。离心25ml的培养物以使细胞沉淀，将细胞重悬于5ml LB+合适的抗生素。然后将培养物在25mlLB+1％葡萄糖+合适的抗生素中稀释至OD600为0.1。每个菌株建立2个瓶，一组以IPTG(800μM)诱导，第二组不诱导。在37℃在250rpm振荡下温育培养物。在1.50小时后(取样时间点1后即时)诱导一组培养物。在每个取样时间点，测定OD600并按照实施例1的描述测定异戊二烯的量。结果显示于表3。产生的异戊二烯的量表示为特定菌株的峰值产量时的量。
表3.大肠杆菌菌株中异戊二烯的生产
  菌株   异戊二烯(μg/升/OD/hr)
  MCM50   23.8
  MCM64   289
  MCM125   ND
  MCM131   痕量
  MCM127   874
ND：未检测
痕量：存在峰值但不可汇总。
IX.甲羟戊酸的分析
甲羟戊酸内酯(1.0g，7.7mmol)(CAS# 503-48-0)由Sigma-Aldrich(WI，USA)以溶解于水中的糖浆(7.7mL)提供，以氢氧化钾(7.7mmol)处理以生产甲羟戊酸的钾盐。通过1H NMR分析确认向甲羟戊酸的转化。通过在14,000rpm离心5分钟除掉细胞、然后将300μl等份的上清液加入至900μl水中来制备用于HPLC分析的样品。然后加入高氯酸(36μl的70％溶液)，然后混合并在冰上冷却5分钟。然后再次离心样品(14,000rpm，5分钟)，将上清液转移至HPLC。通过相同的方式制备甲羟戊酸标准物(20、10、5、1和0.5g/L)。通过HPLC分析甲羟戊酸(20μL注入体积)：使用BioRad Aminex 87-H+柱(300mm乘7.0mm)，以5mM硫酸以0.6mL/分钟洗脱，并检测折射率(RI)。在这些条件下，甲羟戊酸以内酯的形式在18.5分钟时洗脱。
X.从含有上部MVA途径+野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌BL21生产异戊二烯
使用表达甲羟戊酸途径多肽和野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌的15升规模的发酵从补料分批培养物中的细胞生产异戊二烯。该实验证明在限葡萄糖条件下生长的细胞生产2.2g/L的异戊二烯。
培养基配方(每升发酵培养基)：
使用下列成分/升发酵培养基制备培养基：K2HPO4 7.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，和1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于diH2O中。该溶液经高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺*HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：
使用下列成分制备1000X改良痕量金属溶液：柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3 100mg，和NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分依次溶解于Di H2O水中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，以0.22μm的滤器无菌过滤。
在15L的生物反应器中以含有pCL PtrcUpperPathway(图26)和pTrcKKDyIkIS质粒的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃从葡萄糖形成的异戊二烯。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)并在37℃温育。将单一菌落接种至大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至5L的生物反应器。
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。在54小时的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是3.7kg。通过加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)进行诱导。当550nm下的光密度(OD550)达到10的时候，使IPTG的浓度是25μM。当OD550达到190时，IPTG的浓度升高至50μM。在发酵38小时的时候，IPTG的浓度升高至100μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图54。按照本文的描述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程达到最终的值2.2g/L(图55)。在54小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是15.9g，生产的时间进程显示于图56。
XI.以15L的规模在补料分批培养物中生长且表达甲羟戊酸途径的基因的大肠杆菌发酵生产异戊二烯
使用表达甲羟戊酸途径多肽和野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌的15升规模的发酵从补料分批培养物中的细胞生产异戊二烯。该实验证明在限葡萄糖条件下生长的细胞生产3.0g/L的异戊二烯。
培养基配方(每升发酵培养基)：
使用下列成分/升发酵培养基制备培养基：K2HPO4 7.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，和1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于Di H2O中。该溶液经高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺*HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：
使用下列成分制备1000X改良痕量金属溶液：柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3 100mg，和NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分依次溶解于Di H2O水中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，以0.22μm的滤器无菌过滤。
在15L的生物反应器中以含有pCL PtrcUpperMVA和pTrcKKDyIkIS质粒的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃从葡萄糖形成的异戊二烯。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)并在37℃温育。将单一菌落接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至5L的生物反应器。
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。在59小时的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是2.2kg。通过加入IPTG进行诱导。当550nm下的光密度(OD550)达到10的时候，使IPTG的浓度是25μM。当OD550达到190时，IPTG的浓度升高至50μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图93。按照本文的描述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程达到最终的值3.0g/L(图94)。在59小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是22.8g，生产的时间进程显示于图95。用于在发酵过程中生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是2.2％。从葡萄糖生产的异戊二烯的重量百分率产率是1.0％。
XII.以15L的规模在补料分批培养物中生长且表达甲羟戊酸途径的基因的大肠杆菌发酵生产异戊二烯
使用表达甲羟戊酸途径多肽、葛根异戊二烯合酶、和野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌的15升规模的发酵从补料分批培养物中的细胞生产异戊二烯。该实验证明在限葡萄糖条件下生长的细胞生产3.3g/L的异戊二烯。
i)pCLPtrcUpperPathwayHGS2的构建
使用引物NsiI-RBS-HGS F(CTTGATGCATCCTGCATTCGCCCTTAGGAGG，SEQ ID NO：105)和pTrcR(CCAGGCAAATTCTGTTTTATCAG，SEQ ID NO：106)，使用pTrcKKDyIkIS作为模板，通过PCR从葛根扩增编码异戊二烯合酶的基因。以NsiI和PstI对由此获得的PCR产物进行限制性消化，并进行凝胶纯化。以PstI限制性消化质粒pCL PtrcUpperPathway，并根据生产商的说明书，使用rAPid碱性磷酸酶(Roche)进行去磷酸化。
将这些DNA片段连接在一起并将连接反应物转化进入大肠杆菌Top10化学感受态细胞(Invitrogen)，铺板于含有壮观霉素(50μg/ml)的L琼脂上并在37℃过夜温育。使用Qiaquick旋转微量制备试剂盒从6个克隆制备质粒DNA。以限制性酶EcoRV和MluI消化质粒DNA以鉴定具有正确方向的插入片段的克隆(即基因与pTrc启动子的方向相同)。
得到的正确的质粒被称作pCLPtrcUpperPathwayHGS2。使用本文描述的顶空测定法测定该质粒，发现其在大肠杆菌Top10中生产异戊二烯，由此验证了基因的功能性。将该质粒转化进入含有pTrcKKDyIkIS的BL21(LDE3)中以生产菌株BL21/pCLPtrcUpperPathwayHGS2-pTrcKKDyIkIS。该菌株相对于BL21/pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS菌株(实施例8，第XI部分)具有额外的异戊二烯合酶拷贝。该菌株相对于实施例8第XI部分中使用的BL21/pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS菌株还具有增加的HMGS表达和活性。
ii)以15L的规模在补料分批培养物中生长且表达pCLPtrcUpperPathwayHGS2-pTrcKKDyIkIS的大肠杆菌发酵生产异戊二烯
培养基配方(每升发酵培养基)：
使用下列成分/升发酵培养基制备培养基：K2HPO4 7.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，和1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于Di H2O中。该溶液经高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺*HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：
使用下列成分制备1000X改良痕量金属溶液：柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3 100mg，和NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分依次溶解于Di H2O水中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，以0.22μm的滤器无菌过滤。
在15L的生物反应器中以含有pCLPtrcUpperPathwayHGS2和pTrcKKDyIkIS质粒的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃从葡萄糖形成的异戊二烯。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)并在37℃温育。将单一菌落接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至5L的生物反应器。
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。在58小时的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是2.1kg。通过加入IPTG进行诱导。当550nm下的光密度(OD550)达到9的时候，使IPTG的浓度是25μM。当OD550达到170时，IPTG的浓度升高至50μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图104。按照本文的描述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程提高至最终的值3.3g/L(图105)。在58小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是24.5g，生产的时间进程显示于图106。用于在发酵过程中生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是2.5％。从葡萄糖生产的异戊二烯的重量百分率产率是1.2％。分析显示：相对于表达CL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的BL21，异戊二烯合酶的活性增加了大约3-4倍(数据未显示)。
XIII.大肠杆菌中下部甲羟戊酸途径的染色体整合
含有甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、和IPP异构酶的合成操纵子被整合进入大肠杆菌的染色体。如果需要，可以通过在操纵子的5’整合不同的启动子来改变表达。
表4列出了用于该实验的引物。
表4.引物
Figure BDA0000135567880002451
Figure BDA0000135567880002461
i)靶载体构建
选择attTn7位点用于整合。通过PCR从MG1655细胞扩增同源性上游(attTn7up)(引物MCM78和MCM79)和下游(attTn7down)(引物MCM88和MCM89)的区域。将50μL的反应物(1μL 10μM引物，3μLddH2O，45μL Invitrogen Platinum PCR Supermix High Fidelity)和刮下的MG1655菌落在94℃变性2分钟，进行25个循环的“94℃ 2分钟，50℃30秒，68℃ 1分钟”，在72℃延伸7分钟，并冷却至4℃。根据生产商的说明书，将得到的该DNA克隆进入pCR2.1(Invitrogen)，得到质粒MCM278(attTn7up)和MCM252(attTn7down)。从质粒MCM252消化并凝胶纯化的832bp ApaI-PvuI片段克隆进入ApaI-PvuI消化并经凝胶纯化的质粒pR6K，产生质粒MCM276。从MCM278消化并凝胶纯化的825bp PstI-NotI片段克隆进入PstI-NotI消化并经凝胶纯化的质粒MCM276，产生质粒MCM281。
ii)下部途径和启动子的克隆
根据生产商的说明书，使用Roche Expand Long PCR System，使用引物MCM104和MCM105，从pTrcKKDyIkIS扩增MVK-PMK-MVD-IDI基因。以NotI和ApaI消化该产物并克隆进入已经NotI和ApaI消化的并经凝胶纯化的MCM281。使用Stratagene PfuUltra II，使用引物MCM120和MCM127从GeneBridgesFRT-gb2-Cm-FRT模板扩增CMR盒。使用四个50μL PCR反应物(包含1μL～10ng/μL模板、1μL每种引物、1.25μL 10mM dNTP、5μL 10×缓冲液、1μL酶、和39.75μL ddH2O)进行下列PCR程序：95℃变性4分钟；5个循环的“95℃ 20秒，55℃ 20秒，72℃ 2分钟”；25个循环的“95℃ 20秒，58℃ 20秒，72℃ 2分钟”；72℃，10分钟；然后冷却至4℃。将反应物合并，在Qiagen PCR清除柱上纯化，并用于电穿孔经水洗涤的包含质粒MCM296的Pir1细胞。在2mM的杯中在2.5V和200ohm进行电穿孔。在30℃在LB中恢复电穿孔反应物3小时。在含有CMP5、Kan50的LA上选择转化子MCM330(图107和108A-108C；SEQID NO：25)。
iii)整合进入大肠杆菌染色体
以SnaBI消化来自MCM330的微量制备的DNA(Qiaquick旋转试剂盒)并用于电穿孔BL21(DE3)(Novagen)或含有GeneBridges质粒pRedET Carb的MG1655。细胞在30℃生长至～OD1，然后在37℃以0.4％L-阿拉伯糖诱导1.5小时。在4℃ddH2O中将这些细胞洗涤3次，然后以2μL DNA进行电穿孔。在含有氯霉素(5μg/ml)的L琼脂上选择整合子，然后确认不在L琼脂+卡那霉素(50μg/ml)上生长。冷冻BL21整合子MCM331和MG1655整合子MCM333。
iv)构建编码野葛异戊二烯合酶的pET24D-Kudzu
将野葛异戊二烯合酶基因从pCR2.1载体(Invitrogen)亚克隆进入pET24d载体(Novagen)。具体地，使用引物MCM505’-GATCATGCATTCGCCCTTAG GAGGTAAAAA AACATGTGTG CGACCTCTTCTCAATTTACT(SEQ ID NO：52)和MCM53 5’-CGGTCGACGGATCCCTGCAG TTAGACATAC ATCAGCTG(SEQ ID NO：50)从pTrcKudzu模板DNA扩增野葛异戊二烯合酶基因。使用Taq DNA聚合酶(Invitrogen)进行PCR反应，将得到的PCR产物克隆进入pCR2.1-TOPO TA克隆载体(Invitrogen)，并转化进入大肠杆菌Top10化学感受态细胞(Invitrogen)。将转化子铺板于含有羧苄西林(50μg/ml)的L琼脂上，并在37℃过夜温育。以单一转化子接种含有50μg/ml羧苄西林的5ml Luria Broth培养物，并在37℃过夜生长。通过测序分离自1ml液体培养基(Luria Broth)的质粒DNA就正确的插入片段筛选了5个菌落，使用QIAprep旋转微量制备试剂盒(Qiagen)纯化。得到的质粒被称作MCM93，其含在pCR2.1骨架中的野葛异戊二烯合酶编码序列。
通过以PciI和BamH1(Roche)进行限制性核酸内切酶消化而切下野葛编码序列，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)凝胶纯化。以NcoI和BamHI(Roche)消化pET24d载体DNA，以虾碱性磷酸酶(Roche)处理，并使用QIAprep旋转微量制备试剂盒(Qiagen)纯化。使用快速DNA连接试剂盒(Roche)，以片段∶载体＝5∶1的比例，以20μl的总体积，将野葛异戊二烯合酶片段连接进入经NcoI/BamH1消化的pET24d。将连接混合物的一部分(5μl)转化进入大肠杆菌Top 10化学感受态细胞，并铺板于含有卡那霉素(50μg/ml)的L琼脂上。通过测序验证正确的转化子并转化进入化学感受态BL21(λDE3)pLysS细胞(Novagen)。在37℃在含有卡那霉素(50μg/ml)的L琼脂上过夜生长后，选择单一的菌落。图109中显示了得到的质粒的图谱，其被称作pET24D-Kudzu。pET24D-Kudzu的序列(SEQID NO：26)显示于图110A和110B。使用顶空测定法确认异戊二烯合酶活性。
v)生产菌株
以质粒pCLPtrcupperpathway和pTrcKudzu或pETKudzu共转化菌株MCM331和MCM333，得到如表5所示的菌株。
表5.生产菌株
Figure BDA0000135567880002481
vi)以15L的规模在补料分批培养物中生长且表达甲羟戊酸途径的大肠杆菌发酵生产异戊二烯
培养基配方(每升发酵培养基)：
使用下列成分/升发酵培养基制备培养基：K2HPO4 7.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，和1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于diH2O中。该溶液经高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺*HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：
使用下列成分制备1000X改良痕量金属溶液：柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3 100mg，和NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分依次溶解于di H2O水中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，以0.22μm的滤器无菌过滤。
在15L的生物反应器中以含有如上所述的gi1.2整合的下部MVA途径和pCL PtrcUpperMVA和pTrcKudzu质粒的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃从葡萄糖形成的异戊二烯。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)上并在37℃温育。将单一菌落接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至5L的生物反应器。
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。在57小时的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是3.9kg。通过加入IPTG进行诱导。当二氧化碳释放速率达到100mmol/L/hr的时候，使IPTG的浓度是100μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图111A。按照本文的描述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程提高至最终的值1.6g/L(图111B)。发酵过程中异戊二烯的比生产率显示于图111C，峰值为1.2mg/OD/hr。在57小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是16.2g。用于在发酵过程中生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是0.9％。从葡萄糖生产的异戊二烯的重量百分率产率是0.4％。
XIV.使用甘油作为碳源从含有野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌BL21生产异戊二烯
使用表达野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌的15升规模的发酵从补料分批培养物中进料了甘油的细胞生产异戊二烯。该实验证明在存在甘油(无葡萄糖)的条件下生长的细胞生产2.2mg/L的异戊二烯。
培养基配方(每升发酵培养基)：
使用下列成分/升发酵培养基制备培养基：K2HPO4 7.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g和1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于DI H2O中。该溶液经高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入甘油5.1g、硫胺*HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：
使用下列成分/升发酵培养基制备培养基：柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3 100mg，和NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分依次溶解于DI H2O水中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，以0.22μm的滤器无菌过滤。
在15L的生物反应器中以含有pTrcKudzu质粒的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度35℃从甘油形成的异戊二烯。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线至LA培养基琼脂平板(含有抗生素)上并在37℃温育。将单一菌落接种至大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基并在35℃生长。接种物生长至OD1.0后(在550nm测定)，使用600mL接种至7.5L的生物反应器。
以指数速率进料甘油直至细胞达到550nm下的光密度(OD550)为153。在36小时的发酵过程中输送到生物反应器中的甘油的总量是1.7kg。除了接种物中的葡萄糖，不再向生物反应器中添加葡萄糖。通过加入IPTG进行诱导。当OD550达到50的时候，使IPTG的浓度是20μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图57。按照本文的描述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程提高至最终的值2.2mg/L(图58)。在54小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是20.9mg，生产的时间进程显示于图59。
XV.使用转化糖作为碳源在15L规模的补料分批培养物中生长且表达甲羟戊酸途径的基因的大肠杆菌发酵生产异戊二烯
使用表达甲羟戊酸途径多肽和野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌的15升规模的发酵从补料分批培养物中进料了转化糖的细胞生产异戊二烯。该实验证明在存在转化糖的条件下生长的细胞生产2.4g/L的异戊二烯。
培养基配方(每升发酵培养基)：
使用下列成分/升发酵培养基制备培养基：K2HPO4 7.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，和1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于DI H2O中。该溶液经高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入转化糖10g、硫胺*HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：
使用下列成分制备1000X改良痕量金属溶液：柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3 100mg，和NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分依次溶解于DiH2O水中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，以0.22μm的滤器无菌过滤。
在15L的生物反应器中以含有pCL PtrcUpperMVA和pTrcKKDyIkIS质粒的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃从转化糖形成的异戊二烯。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)并在37℃温育。将单一菌落接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至5L的生物反应器。
以指数速率进料转化糖直至细胞达到稳定期。此后，降低转化糖进料以满足代谢需求。在44小时的发酵过程中输送到生物反应器中的转化糖的总量是2.4kg。通过加入IPTG进行诱导。当550nm下的光密度(OD550)达到9的时候，使IPTG的浓度是25μM。当OD550达到200时，IPTG的浓度升高至50μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图96。按照本文的描述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程提高至最终的值2.4g/L(图97)。在44小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是18.4g，生产的时间进程显示于图98。用于在发酵过程中生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是1.7％。从葡萄糖生产的异戊二烯的重量百分率产率是0.8％。
实施例9.构建上部和下部MVA途径以整合进入枯草芽孢杆菌
I.在枯草芽孢杆菌中构建上部MVA途径
将来自粪肠球菌的上部途径整合进入枯草芽孢杆菌，处于aprE启动子的控制下。上部途径由两个基因组成：mvaE，其编码AACT和HMGR；以及mvaS，其编码HMGS。使这两个基因融合在一起，其间有终止密码子，在mvaS前面有RBS位点，并且它们处于aprE启动子的控制下。终止子位于mvaE基因之后。将氯霉素抗性标志物克隆于mvaE基因之后，使用同源性的侧接区通过双交叉(double cross over)将构建体整合于aprE基因座。
通过PCR扩增四个DNA片段，使得它们含有悬突，这将允许它们通过PCR反应而融合在一起。根据生产商的说明书，使用Herculase聚合酶进行PCR扩增。
1.PaprE
CF 07-134(+)aprE启动子PstI的起始点
5’-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC(SEQ ID NO：115)
CF 07-94(-)将PaprE融合至mvaE
5’-CAATAATAACTACTGTTTTCACTCTTTACCCTCTCCTTTTAA(SEQ ID NO：116)
模板：枯草芽孢杆菌染色体DNA
2.mvaE
CF 07-93(+)将mvaE融合至aprE启动子(GTG起始密码子)
5’-TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG(SEQ ID NO：117)
CF 07-62(-)将mvaE融合至mvaS，它们中间有RBS
5’-TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATTGTTTTCTTAAATC(SEQ ID NO：94)
模板：粪肠球菌染色体DNA(来自ATCC)
3.mvaS
CF 07-61(+)将mvaE融合至mvaS，它们中间有RBS
5’-GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAA(SEQ ID NO：95)
CF 07-124(-)将mvaS的末端融合至终止子
5’-CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQ ID NO：118)
模板：粪肠球菌染色体DNA
4.解淀粉芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶终止子
CF 07-123(+)将mvaS的末端融合至终止子
5’-ACCGTTCGTTCTTATCGAAACTAAAAAAAACCGGCCTTGGCCCCG(SEQ ID NO：119)
CF 07-46(-)解淀粉芽孢杆菌的末端终止子BamHI
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQ IDNO：58)
模板：解淀粉芽孢杆菌染色体DNA
PCR融合反应
5.将mvaE融合至mvaS
CF 07-93(+)将mvaE融合至aprE启动子(GTG起始密码子)
5’-TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG(SEQ ID NO：117)
CF 07-124(-)将mvaS的末端融合至终止子
5’-CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQ ID NO：118)
模板：来自上述的#2和3
6.将mvaE-mvaS融合至aprE启动子
CF 07-134(+)aprE启动子PstI的起始点
5’-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC(SEQ ID NO：115)
CF 07-124(-)将mvaS的末端融合至终止子
5’-CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQ ID NO：118)
模板：来自上述的#1和#4
7.将PaprE-mvaE-mvaS融合至终止子
CF 07-134(+)aprE启动子PstI的起始点
5’-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC(SEQ ID NO：115)
CF 07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子BamHI的末端
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQ IDNO：58)
模板：#4和#6
以限制性核酸内切酶PstI/BamHI消化产物并连接进入经PstI/BamHI消化的pJM102(Perego，M.1993.Integrational vectors forgenetic manipulation in Bacillus subtilis，p.615-624.In A.L.Sonenshein，J.A.Hoch和R.Losick(ed.)，Bacillus subtilis and other gram-positivebacteria：biochemistry，physiology，and molecular genetics.AmericanSociety for Microbiology，Washington，D.C.)。将连接物转化进入大肠杆菌TOP 10化学感受态细胞，在含有羧苄西林(50μg/ml)的LA上选择转化子。通过测序鉴别正确的质粒并将其命名为pJMUpperpathway2(图50和51)。将纯化的质粒DNA转化进入枯草芽孢杆菌aprEnprE Pxyl-comK，在含有氯霉素(5μg/ml)的L琼脂上选择转化子。选择正确的菌落并依次铺板于含有10、15、和25μg/ml氯霉素的L琼脂上，以扩大含有上部途径的盒的拷贝数。
通过在含有1％葡萄糖和1％的LB中生长来测试得到的菌株的甲羟戊酸的生产。通过GC分析培养物中甲羟戊酸的生产。
随后该菌株用作宿主以整合下部甲羟戊酸途径。
使用下列引物来测序以上各个构建体。
测序引物：
CF 07-134(+)aprE启动子PstI的起始点
5’-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC(SEQ ID NO：115)
CF 07-58(+)mvaE基因的起始点
5’-ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC(SEQ ID NO：97)
CF 07-59(-)mvaE基因的末端
5’-ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC  (SEQ IDNO：98)
CF 07-82(+)mvaS基因的起始点
5’-ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG(SEQ ID NO：99)
CF 07-83(-)mvaS基因的末端
5’-TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQ ID NO：100)
CF 07-86(+)mvaE中的序列
5’-GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC(SEQ ID NO：101)
CF 07-87(+)mvaE中的序列
5’-TTGCCAATCATATGATTGAAAATC(SEQ ID NO：102)
CF 07-88(+)mvaE中的序列
5’-GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG(SEQ ID NO：103)
CF 07-89(+)mvaS中的序列
5’-GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC(SEQ ID NO：104)
在含有浓度为5μg/ml的氯霉素的LA上选择转化子。通过测序确认了一个菌落具有正确的整合，将其铺板于LA，其中经数天逐渐增大LA中氯霉素的浓度，直至达到最终水平25μg/ml。这导致包含目标基因的盒的扩增。得到的菌株被称作CF 455：pJMupperpathway#1X枯草芽孢杆菌aprEnprE Pxyl comK(经扩增以在含有25μg/ml氯霉素的LA上生长)。
II.在枯草芽孢杆菌中构建下部MVA途径
由mvk1、pmk、mpd和idi组成的下部MVA途径组合于盒中，所述盒由下列组成：来自枯草芽孢杆菌染色体的nprE区域(整合位点)的侧接DNA区域，aprE启动子，和壮观霉素抗性标志物(见图28和29；SEQID NO：13)。该盒由DNA2.0合成，并整合进入含有在aprE基因座整合的上部MVA途径的枯草芽孢杆菌的染色体中。从实施例4描述的复制质粒表达野葛异戊二烯合酶基因并转化进入整合了上部和下部途径的菌株中。
实施例10：示例性的异戊二烯组合物及其制备方法
I.含有异戊二烯的发酵废气的成分分析
以含有两个质粒(pCL upperMev；pTrcKKDyIkIS，编码用于类异戊二烯前体生物合成的完整甲羟戊酸途径、来自酵母的异戊烯焦磷酸异构酶、和来自野葛的异戊二烯合酶)的重组大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行14L规模的发酵。在大约峰值异戊二烯生产率的时间点(27.9小时的已发酵时间(EFT))，将来自14L槽的发酵废气收集于20mL顶空瓶中，通过顶空GC/MS分析挥发性成分。
使用配有Agilent HP-5MS GC/MS柱(30m x 250μm；膜厚0.25μm)的Agilent 6890GC/MS系统进行顶空分析。使用combiPAL自动注射器从20mL顶空瓶中取出500μL等份试样的样品。GC/MS法使用氦作为载气，流速为1ml/分钟。注入口维持在250℃，分流比为50∶1。最初将烤箱温度维持在37℃持续2分钟，然后以25℃/分钟的速率升高至237℃，总共的方法时间为10分钟。Agilent 5793N质量选择检测器m/z 29至m/z300扫描。该系统的检测限值是大约0.1μg/L气体或大约0.1ppm。如果需要，可以使用具有更低的检测限值的更灵敏的设备。
废气由下列组成：99.925％(v/v)的永久气体(N2，CO2和O2)，大约0.075％的异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)(～750ppmv，2100μg/L)和痕量(＜50ppmv)的乙醇、丙酮、和两种异戊二烯醇。没有测定水蒸气的量，但是估计其等于0℃时的平衡蒸气压。通过积分GC/MS色谱图中峰下的面积来确定挥发性有机级份的组成(图86A和86B)，并列于表6中。使用标准方法，通过乙醇和丙酮标准物的校正曲线将GC面积转化为气相的浓度(单位为μg/L)。
表6.发酵废气中的挥发性有机成分的组成。分析使用表达异源甲羟戊酸途径，来自酵母的异戊烯焦磷酸异构酶、和来自野葛的异戊二烯合酶的大肠杆菌BL21(DE3)菌株发酵的27.9小时的时间点时的废气。
Figure BDA0000135567880002571
II.在重组大肠杆菌菌株发酵过程中与异戊二烯共同生产的痕量挥发性有机化合物(VOC)的测定
以含有编码用于类异戊二烯前体生物合成的完整甲羟戊酸途径、来自酵母的异戊烯焦磷酸异构酶、和来自野葛的异戊二烯合酶的两个质粒(pCL upperMev；pTrcKKDyIkIS)的重组大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行14L规模的发酵。
使发酵废气通过冷却的顶空瓶以浓缩并鉴别痕量挥发性有机成分。以1L/分钟的速率对来自该发酵的废气取样，持续10分钟，通过配有石英毛(2g)的20mL的顶空瓶并以干冰冷却至-78℃。使用洁净的瓶盖重新将瓶盖上盖，并使用实施例10中第I部分中描述的条件通过顶空GC/MS分析捕获的VOC。图87A-87D中观察到的化合物的比率是发酵废气中总体水平、-78℃时的相对蒸气压、和质谱仪的检测应答的组合。例如，相对于氧化的挥发物(例如丙酮和乙醇)的低水平的异戊二烯与该物质的高挥发性有关，从而其在-78℃时不在顶空瓶中积累。
这些化合物中的很多化合物的存在对于源自生物来源的异戊二烯组合物是特异的。结果显示于图87A-87D并总结于表7A和7B。
表7A：在-78℃冷捕集后，由大肠杆菌BL21(DE3)(pCL upperMev；pTrcKKDyIkIS)生产的废气中存在的痕量挥发物
Figure BDA0000135567880002581
Figure BDA0000135567880002591
  化合物   RT(分钟)   GC面积1   面积％2   比率％3
  香茅醛   7.756   208092   0.251   2.08
  2，3-环庚烯醇吡啶   8.98   1119947   1.349   11.18
1 GC面积是对应于所列的化合物的峰下的未校正的面积。
2 面积％是以相对于所有化合物的总的峰面积表示为％的峰面积。
3 比率％是相对于2-甲基-1，3-丁二烯的峰面积表示为％的峰面积。
表7B：在-196℃冷捕集后，由大肠杆菌BL21(DE3)(pCL upperMev；pTrcKKDyIkIS)生产的废气中存在的痕量挥发物
  化合物   RT(分钟)   GC面积1   面积％2   比率％3
  乙醛   1.54   1655710   0.276   0.33
  甲硫醇   1.584   173620   0.029   0.03
  乙醇   1.631   10259680   1.707   2.03
  丙酮   1.722   73089100   12.164   14.43
  2-甲基-1，3-丁二烯   1.771   506349429   84.269   100.00
  乙酸甲酯   1.852   320112   0.053   0.06
  1-丙醇   1.983   156752   0.026   0.03
  丁二酮   2.148   67635   0.011   0.01
  2-丁酮   2.216   254364   0.042   0.05
  2-甲基-3-丁烯-2-醇   2.312   684708   0.114   0.14
  乙酸乙酯   2.345   2226391   0.371   0.44
  2-甲基-1-丙醇   2.451   187719   0.031   0.04
  3-甲基-1-丁醛   2.696   115723   0.019   0.02
  3-甲基-2-丁酮   2.751   116861   0.019   0.02
  1-丁醇   2.792   54555   0.009   0.01
  2-戊酮   3.034   66520   0.011   0.01
  3-甲基-3-丁烯-1-醇   3.516   1123520   0.187   0.22
  3-甲基-1-丁醇   3.561   572836   0.095   0.11
Figure BDA0000135567880002611
1 GC面积是对应于所列的化合物的峰下的未校正的面积。
2 面积％是以相对于所有化合物的总的峰面积表示为％的峰面积。
3 比率％是相对于2-甲基-1，3-丁二烯的峰面积表示为％的峰面积。
III.在源自发酵的异戊二烯中不存在C5烃异构体
使用在液氮中冷却的2mL顶空瓶进行存在于发酵废气中的异戊二烯的冷捕集。首先使废气通过(1L/分钟)含有氢氧化钠珠的20mL瓶以使冰态和固态CO2在2mL瓶中的积累最小化(-196℃)。使大约10L的废气通过瓶，然后在通风的状况下使其升温至-78℃，然后以洁净的瓶盖重新将其密封，并通过GC/MS分析。
使用顶空模式下的100μL气密性注射器，以Agilent 6890GC/MS系统进行GC/MS顶空分析。使用Zebron ZB-624GC/MS柱(30m x 250μm；膜厚度1.40μm)进行分析物的分离。GC自动注射器配有气密性的100μL注射器，针头高度调节为允许从2mLGC瓶注射50μL的顶空样品。GC/MS法使用氦作为载气，流速为1ml/分钟。注入口维持在200℃，分流比为20∶1。在分析过程中将烤箱温度维持在37℃，持续5分钟。在m/z 55、66、67和70以单离子监控(SIM)模式运行Agilent 5793N质量选择性检测器。在这些条件下，观察到异戊二烯在2.966分钟时洗脱(图88B)。还是用该方法分析了源自石油的异戊二烯的标准物(Sigma-Aldrich)，并且发现该标准物含有另外的C5烃异构体，所述异构体在主峰之前或之后的短时间洗脱，并基于校正的GC面积进行定量(图88A)。
表8A：源自石油的异戊二烯的GC/MS分析
Figure BDA0000135567880002621
表8B：源自发酵的异戊二烯的GC/MS分析(占总C5烃的百分率)
Figure BDA0000135567880002622
在另外的实验中，分析了C5烃的标准混合物以确定每种化合物的检测器应答是否相同。化合物是2-甲基-1-丁烯、2-甲基-1，3-丁二烯、(E)-2-戊烯、(Z)-2-戊烯和(E)-1，3-戊二烯。在这种情况下，在维持于50℃的Agilent DB-Petro柱(100m x 0.25mm，膜厚度0.50um)上进行分析15分钟。GC/MS法使用氦作为载气，流速为1ml/分钟。注入口维持在200℃，分流比为50∶1。从m/z 19至m/z 250以全扫描模式运行Agilent 5793N质量选择性检测器。在这些条件下，浓度为100μg/L的每种标准物生产实验误差内的相同检测器应答。
IV.包含吸附到固相上的异戊二烯的组合物
使生物生产的异戊二烯吸附至活性炭，生产包含50％至99.9％的碳、0.1％至50％的异戊二烯、0.01％至5％的水、和痕量(＜0.1％)其它挥发性有机成分的固相。
使发酵废气通过维持在0℃的铜冷凝旋管，然后通过颗粒硅石干燥剂过滤器以除掉水蒸气。然后使经除湿的废气通过含碳的过滤器(KobyJr，Koby Filters，MA)达到通过GC/MS在过滤器排放中检测到异戊二烯突破(breakthrough)的点。可以通过计算废气中的浓度、总的流速和收集期间的突破百分率来间接确定吸附至筒的异戊二烯的量。或者，可以通过热、真空、或溶剂介导的解吸附从过滤器中回收吸附的异戊二烯。
V.冷凝的异戊二烯的收集和分析
将发酵废气除湿，通过经由合适的吸收剂(例如烧碱石棉)过滤而除掉CO2。然后使得到的废气流通过液氮冷却的冷凝器以使流体中的VOC冷凝。收集瓶含有叔丁基儿茶酚以抑制得到的异戊二烯冷凝物。通过GC/MS和NMR分析冷凝物以测定纯度，其中使用标准方法，例如如本文描述的那些。
VI.通过发酵生产异戊二烯醇
对来自于表达野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌BL21(DE3)菌株的废气的分析揭示出异戊二烯和3-甲基-3-丁烯-1-醇(异戊二烯醇)的存在。发酵过程中，发酵废气中的这两种化合物的水平显示于图89，如通过顶空GC/MS所测定。在该实验中得到的异戊二烯醇(3-甲基-3-丁烯-1-醇，3-MBA)的水平接近10μg/L废气。另外的实验在发酵废气中生产了大约20μg/L废气的水平。
实施例11：在补料分批培养物中发酵并表达来自甲羟戊酸途径的基 因的大肠杆菌的生长与异戊二烯的生产的解除偶联
实施例11例示了从甲羟戊酸的细胞生长与异戊二烯生产之间的解除偶联。
I.发酵条件
培养基配方(每升发酵培养基)：
使用下列成分/升发酵培养基制备培养基：K2HPO4 7.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，和1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于Di H2O中。该溶液经高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺*HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：
使用下列成分制备1000X改良痕量金属溶液：柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3 100mg，和NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分依次溶解于DiH2O水中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，以0.22μm的滤器无菌过滤。
以含有pTrcHis2AUpperPathway(也称作pTrcUpperMVA，图91和92A-92C；SEQ ID NO：23)(50μg/ml羧苄西林)或pCL PtrcUpperMVA(也称作pCL PtrcUpperPathway(图26))(50μg/ml壮观霉素)质粒的大肠杆菌细胞进行发酵。对于其中生产异戊二烯的实验，大肠杆菌细胞还含有pTrc KKDyIkIS(50μg/ml卡那霉素)质粒。进行这些实验以监测在需要的发酵pH7.0和温度30℃从葡萄糖形成的甲羟戊酸或异戊二烯。从冷冻瓶取出大肠杆菌菌株的接种物，划线至LA培养基琼脂平板(含有抗生素)并在37℃温育。将单一菌落接种至胰蛋白胨酵母提取物培养基。当接种物生长至光密度1.0时(在550nm测定)，将其用于接种至生物反应器。
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。通过加入IPTG进行诱导。通过将高氯酸(Sigma-Aldrich#244252)处理的样品(0.3M，在4℃温育5分钟)施加至有机酸HPLC柱(BioRad#125-0140)来测定发酵液中甲羟戊酸的浓度。通过将培养液甲羟戊酸峰的大小与从经高氯酸处理的甲羟戊酸内酯(Sigma-Aldrich #M4667)以形成D，L-甲羟戊酸而生产的校正曲线进行比较来测定浓度。按照本文的描述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯的水平。异戊二烯效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。
II.以150L的规模从表达pTrcUpperMVA质粒的大肠杆菌BL21(DE3)细胞生产甲羟戊酸
按照上文实施例11第I部分的解释生长于平板上的BL21(DE3)细胞接种于含有45mL胰蛋白胨-酵母提取物培养基的培养瓶中并在30℃以170rpm振荡温育5小时。将该溶液转移至5L的生物反应器中的胰蛋白胨-酵母提取物培养基中，细胞在30℃和27.5rpm生长直至培养物达到OD550为1.0。将5L的接种物接种入含有45-kg培养基的150L生物反应器中。当OD550达到10时，使IPTG的浓度为1.1mM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图60A。甲羟戊酸效价随着发酵的进程提高至最终的值61.3g/L(图60B)。整个发酵过程中的比生产率谱显示于图60C，其与图60A的对比证明了生长与甲羟戊酸生产之间的解除偶联。在52.5小时的发酵过程中从利用的14.1kg的葡萄糖生产的甲羟戊酸的总量是4.0kg。用于在发酵过程中生产甲羟戊酸的所利用的碳的摩尔产率是34.2％。
III.以15L的规模从表达pTrcUpperMVA质粒的大肠杆菌BL21(DE3)细胞生产甲羟戊酸
按照上文实施例11第I部分的解释生长于平板上的BL21(DE3)细胞接种于含有500mL胰蛋白胨-酵母提取物培养基的培养瓶中并在30℃以160rpm生长至OD5501.0。将该物质接种入含有4.5-kg培养基的15L生物反应器中。当OD550达到10时，使IPTG的浓度为1.0mM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图61A。甲羟戊酸效价随着发酵的进程达到最终的值53.9g/L(图61B)。整个发酵过程中的比生产率谱显示于图61C，其与图61A的对比证明了生长与甲羟戊酸生产之间的解除偶联。在46.6小时的发酵过程中从利用的2.1kg的葡萄糖生产的甲羟戊酸的总量是491g。用于在发酵过程中生产甲羟戊酸的所利用的碳的摩尔产率是28.8％。
IV.以15L的规模从表达pTrcUpperMVA质粒的大肠杆菌FM5细胞生产甲羟戊酸
按照上文实施例11第I部分的解释生长于平板上的FM5细胞接种于含有500mL胰蛋白胨-酵母提取物培养基的培养瓶中并在30℃以160rpm生长至OD550 1.0。将该物质接种入含有4.5-kg培养基的15L生物反应器中。当OD550达到30时，使IPTG的浓度为1.0mM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图62A。甲羟戊酸效价随着发酵的进程提高至最终的值23.7g/L(图62B)。整个发酵过程中的比生产率谱显示于图62C，其与图62A的对比证明了生长与甲羟戊酸生产之间的解除偶联。在51.2小时的发酵过程中从利用的1.1kg的葡萄糖生产的甲羟戊酸的总量是140g。用于在发酵过程中生产甲羟戊酸的所利用的碳的摩尔产率是15.2％。
V.以15L的规模从表达pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的大肠杆菌BL21(DE3)细胞生产异戊二烯
按照上文实施例11第I部分的解释生长于平板上的表达pCLPtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的BL21(DE3)细胞接种于含有500mL胰蛋白胨-酵母提取物培养基的培养瓶中并在30℃以160rpm生长至OD5501.0。将该物质接种入含有4.5-kg培养基的15L生物反应器中。当OD550达到10时，使IPTG的浓度为25μM。当OD550达到190时，使IPTG的浓度升高至50μM。在发酵38小时的时候使IPTG的浓度升高至100μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图63A。异戊二烯效价随着发酵的进程提高至最终的值2.2g/L发酵液(图63B)。整个发酵过程中的比生产率谱显示于图63C，其与图63A的对比证明了生长与异戊二烯生产之间的解除偶联。在54.4小时的发酵过程中从利用的2.3kg的葡萄糖生产的异戊二烯的总量是15.9g。用于在发酵过程中生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是1.53％。
VI.以15L的规模从表达pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的大肠杆菌BL21(DE3)tuner细胞生产异戊二烯
按照上文实施例11第I部分的解释生长于平板上的表达pCLPtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的BL21(DE3)tuner细胞接种于含有500mL胰蛋白胨-酵母提取物培养基的培养瓶中并在30℃以160rpm生长至OD5501.0。将该物质接种入含有4.5-kg培养基的15L生物反应器中。当OD550达到10时，使IPTG的浓度为26μM。当OD550达到175时，使IPTG的浓度升高至50μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图64A。异戊二烯效价随着发酵的进程提高至最终的值1.3g/L培养液(图64B)。整个发酵过程中的比生产率谱显示于图64C，其与图64A的对比证明了生长与异戊二烯生产之间的解除偶联。在48.6小时的发酵过程中从利用的1.6kg的葡萄糖生产的异戊二烯的总量是9.9g。用于在发酵过程中生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是1.34％。
VII.以15L的规模从表达pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的大肠杆菌MG1655细胞生产异戊二烯
按照上文实施例11第I部分的解释生长于平板上的表达pCLPtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的MG1655细胞接种于含有500mL胰蛋白胨-酵母提取物培养基的培养瓶中并在30℃以160rpm生长至OD5501.0。将该物质接种入含有4.5-kg培养基的15L生物反应器中。当OD550达到45时，使IPTG的浓度为24μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图65A。异戊二烯效价随着发酵的进程提高至最终的值393mg/L培养液(图65B)。整个发酵过程中的比生产率谱显示于图65C，其与图65A的对比证明了生长与异戊二烯生产之间的解除偶联。在67.4小时的发酵过程中从利用的520g的葡萄糖生产的异戊二烯的总量是2.2g。用于在发酵过程中生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是0.92％。
VIII.以15L的规模从表达pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的大肠杆菌MG1655ack-pta细胞生产异戊二烯
按照上文实施例11第I部分的解释生长于平板上的表达pCLPtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的MG1655ack-pta细胞接种于含有500mL胰蛋白胨-酵母提取物培养基的培养瓶中并在30℃以160rpm生长至OD5501.0。将该物质接种入含有4.5-kg培养基的15L生物反应器中。当OD550达到10时，使IPTG的浓度为30μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图66A。异戊二烯效价随着发酵的进程达到最终的值368mg/L培养液(图66B)。整个发酵过程中的比生产率谱显示于图66C，其与图66A的对比证明了生长与异戊二烯生产之间的解除偶联。在56.7小时的发酵过程中从利用的531g的葡萄糖生产的异戊二烯的总量是1.8g。用于在发酵过程中生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是0.73％。
IX.以15L的规模从表达pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的大肠杆菌FM5细胞生产异戊二烯
按照上文实施例11第I部分的解释生长于平板上的表达pCLPtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的FM5细胞接种于含有500mL胰蛋白胨-酵母提取物培养基的培养瓶中并在30℃以160rpm生长至OD5501.0。将该物质接种入含有4.5-kg培养基的15L生物反应器中。当OD550达到15时，使IPTG的浓度为27μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图67A。异戊二烯效价随着发酵的进程达到最终的值235mg/L培养液(图67B)。整个发酵过程中的比生产率谱显示于图67C，其与图67A的对比证明了生长与异戊二烯生产之间的解除偶联。在52.3小时的发酵过程中从利用的948g的葡萄糖生产的异戊二烯的总量是1.4g。用于在发酵过程中生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是0.32％。
实施例12：在补料分批培养物中发酵且表达甲羟戊酸途径的基因的 大肠杆菌的指数生长期期间生产异戊二烯
实施例12例示了在细胞的指数生长期期间生产异戊二烯。
培养基配方(每升发酵培养基)：
使用下列成分/升发酵培养基制备培养基：K2HPO4 7.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，和1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于DI H2O中。该溶液经高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺*HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：
使用下列成分制备1000X改良痕量金属溶液：柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3 100mg，和NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分依次溶解于Di H2O水中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，以0.22μm的滤器无菌过滤。
在15L的生物反应器中以含有pCL PtrcUpperMVA和pTrcKKDyIkIS质粒的ATCC11303大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃从葡萄糖形成的异戊二烯。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)并在37℃温育。将单一菌落接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至5L的生物反应器。
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。在50小时的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是2.0kg。通过加入IPTG进行诱导。当550nm下的光密度(OD550)达到10的时候，使IPTG的浓度是25μM。当OD550达到190时，IPTG的浓度升高至50μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图99。按照本文的描述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程达到最终的值1.4g/L(图100)。在50小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是10.0g。生物反应器内异戊二烯的比生产率随时间变化的图谱显示于图101。在发酵过程中促成生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是1.1％。从葡萄糖生产的异戊二烯的重量百分率产率是0.5％。
实施例13：可燃性模拟和异戊二烯测试
I.可燃性模拟和异戊二烯测试的概述
对于多种烃/氧/氮/水/二氧化碳混合物进行了可燃性模拟和实验。这种模拟和实验测试旨在确定在固定的压力和温度下，在指定的蒸汽和一氧化碳浓度下的异戊二烯和氧/氮/可燃性曲线。在表9中显示了模型条件的矩阵，在表10中显示了所进行的实验的矩阵。
表9.模拟的异戊二烯可燃性的总结
Figure BDA0000135567880002701
表10.异戊二烯可燃性测试的总结
Figure BDA0000135567880002702
II.计算的绝热火焰温度(CAFT)模型的描述
燃烧蔓延传播的计算的绝热火焰温度(CAFT)和选择的极限火焰温度用于确定异戊二烯的可燃性包迹。在该研究中用于计算火焰温度的计算机程序是NASA Glenn Research Center CEA(Chemical Equilibriumwith Applications)软件。
使用均一燃烧机制(其中燃料和氧化剂都处于气态)的绝热火焰温度模型来确定可燃性包迹包括5个步骤：选择需要的反应剂，选择测试条件，选择极限火焰温度，修改反应剂，和从计算中构建可燃性包迹。
在第一个步骤“选择需要的反应剂”中，必须确定将存在于系统中的反应剂种类和各自的数量。在很多情况下，用于计算的计算机程序具有反应剂和产物种类的列表。如果在程序中不存在要研究的种类的任何数据，则可以从其它来源例如JANAF表或从互联网获得它们。在本模型中，水、氮、氧和二氧化碳的数据存在于程序数据库中。程序数据库中不具有异戊二烯种类；因此，人工加入热力学特性。
下一个步骤是确定最初的压力和温度条件是否是发生燃烧过程的压力和温度。在该模型中，压力是1个大气压(绝对)，温度是40℃，即异戊二烯的沸点。
可以基于理论原理选择燃烧的极限火焰温度或通过实验来确定。每种方法具有其自身的限制性。
基于之前的研究，烃的极限火焰温度在1000K至1500K的范围内。对于该模型，选择1500K的数值。其是一氧化碳至二氧化碳的反应(高度放热的反应并构成显著比例的火焰能量)形成自我持续时的温度。
一旦确定了极限火焰温度，在给定的反应剂混合物(种类浓度)上进行模拟计算并确定绝热火焰温度。只有当温度高于极限火焰温度时认为发生了火焰传播。然后修改反应剂混合物的组成以生产传播和非传播混合物的数据组。
这种类型的模型显示出与实验确定的可燃极限的良好的一致性。衍生的包迹之外的区域是不可燃的，其内的区域是可燃的。包迹的性质形成前端。包迹的前端与气态燃料的极限氧浓度(LOC)相关。
III.计算的绝热火焰温度(CAFT)的结果
图68-74中的图形分别是种类A至G的CAFT模型结果。对于系列A，对于多个氧水平，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。图中绘制了针对数种氧/氮比率(按重量计)的计算的绝热火焰温度(使用NASACEA程序)，其随着燃料浓度(按重量计)而变化。高于1500K(所选的极限火焰温度)的曲线的部分含有足以维持火焰传播的燃料水平。以图68-74呈现的形式可能难以判读结果。另外，目前的形式不利于与实验数据进行比较(实验数据一般是以体积百分率的形式呈现的)。
使用系列A作为实例，图68中的数据可以按照传统的可燃包迹作图。使用图68并从纵座标上的1500K温度线读取，可以通过针对与其交叉的每条曲线(氧/氮的比率)的横坐标取正切来确定该极限火焰温度的燃料浓度。然后可以将这些数值制成表格：针对给定重量百分率的氧化剂的燃料的重量百分率(图75A)。然后，已知燃料的组成(100wt.％异戊二烯)和氧化剂的组成(水、氧和氮的相对含量)，可以建立摩尔量。
从这些摩尔量可以计算百分体积浓度。然后可以将体积百分率形式的浓度作图以生产可燃包迹(图75B)。包迹包围的面积是可爆炸的范围，其外的是非可爆炸范围。包迹的前端是极限氧浓度。图76A和76B包含从图69呈现的数据生产的系列B的可燃性包迹的计算的体积浓度。可以在图70-74呈现的数据中使用类似的方法。
IV.可燃性测试的实验设备和程序
在4升的高压容器中进行可燃性测试。容器是圆柱形的，内径为6”，内高为8.625”。使用由PID控制器控制的外部加热器维持容器(以及其中的气体)的温度。为了防止热损失，在压力容器的周围包裹陶瓷羊毛和反射绝热体。使用K型热电偶来测定气体空间的温度以及容器本身的温度。图77例示了测试容器。
在进行测试之前，排空该容器并以氮气吹扫以确保除掉之前测试中的任何气体。然后对容器吸真空。在这之后的压力通常是0.06bar(a)。由于氮气的吹扫，假设生产此最初压力的气体是氮气。然后使用分压，加入合适量的水、异戊二烯、氮气、和氧气以达到所要的测试条件。容器内的磁力驱动的混合扇确保了气体内容物的混合。使气体混合大约2分钟，在点火前大约1分钟关闭风扇。
点火器包含位于定时电路上的1.5ohm nicrome线圈和交流电源。使用示波镜测定出34.4VAC被输送至点火器，持续3.2秒。在大约一半的点火周期内产生最大为3.8amp的电流。因此，最大电能是131W，点火周期提供的总能量是大约210J。
使用连接于数据获取系统的可变阻力Validyne DP215压力传感器获得爆燃数据。如果压力上升大于或等于5％，则认为气体混合物发生爆燃。
V.可燃性测试结果
在40℃和0psig没有蒸汽的情况下进行第一个实验系列(系列1)。在不同浓度的异戊二烯和氧下进行的测试生产了图78A所示的可燃性曲线。该曲线中显示的数据点仅仅是曲线边缘的点。该系列所获取的所有数据点的详细列表显示于图80A和80B 。
图78B总结了图78A所显示的可爆炸数据点。图78C是实验数据与CAFT模型预测的可燃性包迹的比较。模型与实验数据良好吻合。不一致处可能是由于测试室的非绝热性和模型的局限性造成的。模型考虑的是氧化反应的无限时间范围，不考虑任何反应动力学限制。
另外，模型受到其数据库中的平衡化学种类的数目的限制，因此，可能不能正确预测热解种类。同样地，通过模型开发的可燃性包迹使用一个极限火焰温度值(1500K)。极限火焰温度可以是1,000K至1,500K范围的值，这取决于反应化学物质种类。在高于化学计量的燃料/氧化剂水平的燃料浓度下形成的热解化学物质种类的复杂性质是该模型可能不能精确预测该系统的燃烧上限的一个原因。
在40℃和0psig以固定的4％的蒸汽浓度进行第二个实验系列(系列2)。在不同浓度的异戊二烯和氧下进行的测定生产了如图79A所示的可燃性曲线。该曲线中显示的数据点仅仅是曲线边缘的点。该系列所获取的所有数据点的详细列表显示于图81。由于系列1中的数据之间的相似性，仅测试了燃烧下限、极限氧浓度、和燃烧上限的关键点。向测试混合物中加入4％的蒸汽未显著改变可燃性包迹的关键限值。应该注意：较高浓度的蒸汽/水和或其它惰性物(inertant)的加入可能影响可燃性包迹。
图79B总结了图79A所示的爆炸数据点。图79C是实验数据与CAFT模型预测的可燃性包迹的比较。模型与实验数据良好吻合。不一致处可能是由于系列1中描述的相同的因素。
VI.计算在3个大气压的压力下空气中的异戊二烯的可燃极限
同样使用实施例13第IV部分中描述的方法计算3个大气压的绝对系统压力和40℃下异戊二烯的可燃极限。将这些结果与实施例13第I-IV部分在1个大气压的绝对系统压力和40℃下的结果进行比较。测试较高的压力，这是因为可燃性包迹随着最初系统压力的增大而延伸或变得更大。燃烧上限受到的影响最大，其次是极限氧成分。燃烧下限受到的影响最小(见，例如“Bulletin 627-Flammability Characteristics ofCombustible Gases and Vapors”，作者Michael G.Zabetakis，由以前的US Bureau of Mines出版(1965)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于计算可燃极限的内容)。
在图82中，绘制计算的绝热火焰温度，其随着异戊二烯(燃料)浓度而变，浓度表示为总燃料/氮/氧的重量百分率，其中系统压力最初是3个大气压。计算的火焰温度与在1个大气压的系统中最初测定的非常相似(图83)。结果是：当使用计算的绝热可燃数据产生可燃性包迹时，曲线是非常相似的(见图84和85)。因此，基于这些理论计算，从1个大气压至3个大气压的系统压力增大不会导致可燃性包迹的显著增大/变宽。如果需要，可以使用实验测试(例如，如本文描述的在1个大气压的压力下进行的实验测试)来验证这些模型结果。
VII.可燃性研究的总结
对于40℃和0psig下的异戊二烯/氧/氮/水/二氧化碳系统的可燃性包迹开发了计算的绝热温度模型。所开发的CAFT模型与通过本研究中进行的测试所产生的实验数据良好吻合。来自系列1和2的实验结果验证了来自系列A和B的模型结果。
实施例14：表达构建体和菌株
I.编码甲羟戊酸激酶的质粒的构建
针对在大肠杆菌中的表达进行密码子优化，合成了编码马氏甲烷八叠球菌下部MVA途径(登记号NC_003901.1、NC_003901.1、NC_003901.1、和NC_003901.1，其通过引用方式全文并入本文)的构建体。该构建体被称作马氏甲烷八叠球菌远古下部途径操纵子(图112A-112C；SEQ ID NO：27)并编码马氏甲烷八叠球菌MVK、推定的脱羧酶、IPK、和IDI酶。根据生产商的程序，使用Strategene Herculase IIFusion试剂盒，使用引物MCM165和MCM177(表11)，使用30个循环(其中使用55℃的退火温度和60秒的延伸时间)，通过PCR扩增编码MVK(登记号NC_003901.1)的基因。使用Qiagen PCR柱纯化该扩增子，然后在37℃在10μL反应中以PmeI(在存在NEB缓冲液4和BSA的情况下)消化。1个小时后，加入NsiI和Roche缓冲液H，在37℃再反应1个小时。通过Qiagen PCR柱纯化经消化的DNA并在11μL反应(5μLRoche快速连接酶缓冲液1，1μL缓冲液2，1μL质粒，3μL扩增子，和1μL连接酶)中连接于经过类似消化和纯化的质粒MCM29(MCM29是经编码野葛异戊二烯合酶的pTrcKudzu转化的大肠杆菌TOP10(Invitrogen))(室温1小时)。MCM 29是pTrcKudzuKan。将连接反应物导入Invitrogen TOP10细胞并在LA/kan50平板上选择转化子，在37℃过夜温育。对得到的质粒MCM382中的MVK插入片段进行测序(图113A-113C；SEQ ID NO：28)。
表11.寡核苷酸
Figure BDA0000135567880002751
II.产生过表达甲羟戊酸激酶和异戊二烯合酶的菌株
将质粒MCM382转化进入已经在LB培养基中生长至指数中期的MCM331细胞(其包含编码酿酒酵母甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、和IPP异构酶的染色体构建体gi1.2KKDyI)，在冰冷的无菌水中洗涤3次。将1μL DNA加入到50μL细胞悬浮液中，将该混合物在2mm杯中以2.5伏特、25uFd进行电穿孔，然后立即在500μL LB培养基中在37℃恢复1小时。在LA/kan50上选择转化子并命名为MCM391。通过相同的电穿孔程序将质粒MCM82导入该菌株，并在LA/kan50/spec50上选择。得到的菌株MCM401包含cmp-标记的染色体构建体gi1.2KKDyI，kan-标记的质粒MCM382和spec-标记的质粒MCM82(其为编码粪肠球菌mvaE和mvaS的pCLPtrcUpperPathway)。见表12。
表12.过表达甲羟戊酸激酶和异戊二烯合酶的菌株
Figure BDA0000135567880002762
III.质粒MCM376的构建-将来自马氏甲烷八叠球菌远古下部的MVK构建进入pET200D
使用Invitrogen Platinum HiFi PCR混合物，使用引物MCM161和MCM162(表11)，通过PCR扩增来自马氏甲烷八叠球菌远古下部途径操纵子(图112A-112C；SEQ ID NO：27)的MVK ORF。将45μL PCR混合物与1μL模板、1μL 10μM的每种引物、和2μL水混合。反应循环如下：94℃ 2分钟；30个循环的“94℃ 30秒，55℃ 30秒，和68℃ 1分15秒”，然后72℃ 7分钟，置于4℃直至冷却。根据生产商的程序，将3μL该PCR反应物连接进入Invitrogen pET200D质粒。将3μL此连接物导入Invitrogen TOP10细胞，在LA/kan50上选择转化子。分离来自转化子的质粒并对插入片段进行测序，得到MCM376(图114A-114C；SEQ ID NO：29)。
IV.表达菌株MCM378的构建
根据生产商的程序，将质粒MCM376转化进入Invitrogen BL21(DE3)pLysS细胞。在LA/kan50上选择转化子MCM378。
实施例15：由以20mL的批式规模在补料分批培养物中生长且表达 上部甲羟戊酸(MVA)途径、整合的下部MVA途径(gi1.2KKDyI)、来自马 氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶、和来自野葛的异戊二烯合酶的大肠杆 菌中生产异戊二烯
培养基配方(每升发酵培养基)：
每升发酵培养基包含：K2HPO4 13.6g，KH2PO4 13.6g，MgSO4*7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，(NH4)2SO4 3.2g，酵母提取物1g，和1000X痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于Di H2O中。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至6.8并定容。以0.22μm的滤器无菌过滤培养基。灭菌后加入葡萄糖(2.5g)和抗生素并调节pH。
1000X痕量金属溶液：
1000X痕量金属溶液包含：柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO4*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3 100mg，和NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分逐一溶解于di H2O中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，并以0.22μm的滤器无菌过滤。
菌株：
MCM343细胞是含有上部甲羟戊酸(MVA)途径(pCL Upper)、整合的下部MVA途径(gi1.2KKDyI)、和来自野葛的异戊二烯合酶(pTrcKudzu)的BL21(DE3)大肠杆菌细胞。
MCM401细胞是含有上部甲羟戊酸(MVA)途径(pCLPtrcUpperPathway)、整合的下部MVA途径(gi1.2KKDyI)、以及高表达的来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶和来自野葛的异戊二烯合酶(pTrcKudzuMVK(马氏甲烷八叠球菌))的BL21(DE3)大肠杆菌细胞。
通过在30℃的温度在100mL生物反应器中的20mL的工作体积中生长菌株来分析异戊二烯的生产。将取自冷冻瓶的大肠杆菌菌株接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)并在30℃温育。将单一菌落接种至培养基并过夜生长。将细菌稀释进入20mL的培养基以达到0.05的光密度(在550nm测定)。将100mL的生物反应器密封，以8mL/分钟的速率泵入空气。通过使用磁力搅拌子以600rpm搅拌而实现培养基的充分搅拌。使用在线Hiden HPR-20质谱仪分析来自生物反应器的废气。监测对应于异戊二烯、CO2、和空气中天然存在的其它气体的质量。通过加和各气体随时间变化的浓度(以百分率表示)而计算累积的异戊二烯和CO2的生产。从总数中减掉大气的CO2以估计由于代谢活性而释放的CO2。
将100mL生物反应器中由表达完整甲羟戊酸途径和野葛异戊二烯合酶的菌株(MCM343)生产的异戊二烯与另外还过表达来自马氏甲烷八叠球菌的MVK和野葛异戊二烯合酶的菌株(MCM401)进行比较。细菌在相同的条件下在确定的培养基中以葡萄糖作为碳源生长。通过加入终浓度为100μM或200μM的异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)进行异戊二烯生产的诱导。废气测定揭示：相对于仅表达甲羟戊酸途径和野葛异戊二烯合酶的菌株(MCM343)，过表达MVK和异戊二烯合酶的菌株(MCM401)生产显著更多的异戊二烯，如图115A-115D所示。在100μM诱导时，MCM401菌株生产的异戊二烯比MCM343菌株多2倍。在200μM诱导时，MCM401菌株生产的异戊二烯比MCM343菌株多3.4倍。对来自生物反应器的废气中的CO2(其为代谢活性的度量)进行的分析表明：代谢活性不依赖于IPTG诱导和异戊二烯的生产。
实施例16：由以15L的规模在补料分批培养物中生长且表达上部甲 羟戊酸(MVA)途径、整合的下部MVA途径(gi1.2KKDyI)、来自马氏甲烷 八叠球菌的甲羟戊酸激酶、和来自野葛的异戊二烯合酶的大肠杆菌生产 异戊二烯
培养基配方(每升发酵培养基)：
每升发酵培养基包含：K2HPO4 7.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g、和1000X痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加且溶解于DI H2O中。将该溶液高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺*HCl0.1g、和抗生素并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：
1000X改良痕量金属溶液包含：柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO4*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3 100mg，和NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分逐一溶解于DI H2O中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，并以0.22μm的滤器无菌过滤。
在15L的生物反应器中以含有上部甲羟戊酸(MVA)途径(编码粪肠球菌mvaE和mvaS的pCL PtrcUpperPathway)、整合的下部MVA途径(编码酿酒酵母甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、和IPP异构酶的gi1.2KKDyI)、以及高度表达的来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶和来自野葛的异戊二烯合酶(pTrcKudzuMVK(马氏甲烷八叠球菌))的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃从葡萄糖形成的异戊二烯。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)并在37℃温育。将单一菌落接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至15L生物反应器中的5L培养基。
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。在68小时的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是3.8kg。通过加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)进行诱导。当550nm下的光密度(OD550)达到9的时候，使IPTG的浓度是51μM。当OD550达到149时，IPTG的浓度升高至88μM。当OD550＝195时，加入另外的IPTG使浓度升高至119μM，当OD550＝210时，使IPTG浓度升高至152μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图116。使用Hiden质谱仪测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程提高至最终的值23.8g/L(图117)。在68小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是227.2g，生产的时间进程显示于图118。通过TCER测定的代谢活性谱显示于图119。在发酵的10至39小时，总的活计数(总的菌落形成单位)降低了2个数量级(图120)。在发酵过程中用于生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是13.0％。从葡萄糖生产的异戊二烯的重量百分率产率是6.3％。
实施例17：由以15L的规模(2x 100μM IPTG诱导)在补料分批培养 物中生长且表达上部甲羟戊酸(MVA)途径、整合的下部MVA途径 (gi1.2KKDyI)、来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶、和来自野葛的 异戊二烯合酶的大肠杆菌生产异戊二烯
培养基配方(每升发酵培养基)：
每升发酵培养基包含：K2HPO4 7.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g、和1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于DI H2O中。将该溶液高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺*HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：
1000X改良痕量金属溶液包含：柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO4*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3 100mg，和NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分逐一溶解于DI H2O中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，并以0.22μm的滤器无菌过滤。
在15L的生物反应器中以含有上部甲羟戊酸(MVA)途径(编码粪肠球菌mvaE和mvaS的pCL PtrcUpperPathway)、整合的下部MVA途径(编码酿酒酵母甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、和IPP异构酶的gi1.2KKDyI)、以及高度表达的来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶和来自野葛的异戊二烯合酶(pTrcKudzuMVK(马氏甲烷八叠球菌))的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃从葡萄糖形成的异戊二烯。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)并在37℃温育。将单一菌落接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至15L生物反应器中的5L培养基。
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。在55小时的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是1.9kg。通过加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)进行诱导。当550nm下的光密度(OD550)达到9的时候，使IPTG的浓度是111μM。当OD550达到155时，IPTG的浓度升高至193μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图121。使用Hiden质谱仪测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程提高至最终的值19.5g/L(图122)。在55小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是133.8g，生产的时间进程显示于图123。瞬时体积生产率水平达到了高达1.5g异戊二烯/升培养液/小时的数值(图124)。瞬时产率水平达到了高达17.7％w/w(图125)。通过TCER测定的代谢活性谱显示于图126。在发酵的8至36小时，总的活计数(总的菌落形成单位)降低了2个数量级(图127)。在发酵过程中用于生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是15.8％。在整个发酵过程中从葡萄糖生产的异戊二烯的重量百分率产率是7.4％。
此外，作为对照，在15L的生物反应器中以含有上部甲羟戊酸(MVA)途径(编码粪肠球菌mvaE和mvaS的pCL PtrcUpperPathway)、整合的下部MVA途径(编码酿酒酵母甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、和IPP异构酶的gi1.2KKDyI)、以及高度表达的来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶和来自野葛的异戊二烯合酶(pTrcKudzuMVK(马氏甲烷八叠球菌))的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃从葡萄糖的未经诱导的细胞代谢活性(如通过CER所测)。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株(如上所述的MCM401)的接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)并在37℃温育。将单一菌落接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至15L生物反应器中的5L培养基。以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。
图148比较了如上所述的未经诱导的细胞与实施例16和17中的通过加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)进行诱导的细胞的CER谱。
实施例18：从以15L的规模(1x 50μM IPTG+150μM IPTG进料诱导) 在补料分批培养物中生长且表达上部甲羟戊酸(MVA)途径、整合的下部 MVA途径(gi1.2KKDyI)、来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶、和来 自野葛的异戊二烯合酶的大肠杆菌生产异戊二烯
培养基配方(每升发酵培养基)：
每升发酵培养基包含：K2HPO4 7.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，和1000X痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于Di H2O中。将该溶液高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺*HCl0.1g、和抗生素并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：
1000X改良痕量金属溶液包含：柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO4*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3 100mg，和NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分逐一溶解于DI H2O中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，并以0.22μm的滤器无菌过滤。
在15L的生物反应器中以含有上部甲羟戊酸(MVA)途径(编码粪肠球菌mvaE和mvaS的pCL PtrcUpperPathway)、整合的下部MVA途径(编码酿酒酵母甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、和IPP异构酶的gi1.2KKDyI)、以及高度表达的来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶和来自野葛的异戊二烯合酶(pTrcKudzuMVK(马氏甲烷八叠球菌))的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃从葡萄糖形成的异戊二烯。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)并在37℃温育。将单一菌落接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至15L生物反应器中的5L培养基。
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。在55小时的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是2.2kg。通过加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)进行诱导。当550nm下的光密度(OD550)达到10的时候，使IPTG的浓度是51μM。除了掺入IPTG之外，在OD550＝10时，开始恒定进料，经18小时的时间加入164mg IPTG。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图128。使用Hiden质谱仪测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程提高至最终的值22.0g/L(图129)。在55小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是170.5g，生产的时间进程显示于图130。通过TCER测定的代谢活性谱显示于图131。当通入生物反应器中的气流在大约1.7小时的时间从8slpm下降至4slpm时，废气中的异戊二烯的浓度从0.51w/w％升高至0.92w/w％(图132)。异戊二烯的这些升高的水平似乎没有对细胞代谢活性(如通过总二氧化碳释放速率(TCER)所测定)造成任何不利影响，因为TCER在37.2至39.3小时仅下降了7％(图132)。在发酵的7至36小时，总的活计数(总的菌落形成单位)降低了2个数量级(图133)。在发酵过程中用于生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是16.6％。在整个发酵过程中从葡萄糖生产的异戊二烯的重量百分率产率是7.7％。
实施例19：外部添加的异戊二烯对于以1L的规模在补料分批培养 物中生长的野生型大肠杆菌的影响
培养基配方(每升发酵培养基)：
每升发酵培养基包含：K2HPO4 7.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，和1000X痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于DI H2O中。将该溶液高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺*HCl0.1g、和抗生素并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：
1000X改良痕量金属溶液包含：柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO4*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3 100mg，和NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分逐一溶解于DiH2O中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，并以0.22μm的滤器无菌过滤。
在1L的生物反应器中以BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃异戊二烯对于葡萄糖补料分批生物反应器中的细胞存活性和代谢活性的影响。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。当接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用50mL接种至1L生物反应器中的0.5L培养基。
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。使用氮气作为载体将异戊二烯进料到生物反应器中。在生长中期(OD550＝31-44)，异戊二烯进料速率是1g/L/hr，共持续75分钟(从13.2至14.4小时)。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图134。通过TCER测定的代谢活性谱显示于图135。在将异戊二烯导入生物反应器的时间段期间，总的活计数(总的菌落形成单位)升高了14倍(图136)。
实施例20：通过酿酒酵母生产异戊二烯和表达异戊二烯合酶
根据酿酒酵母/巴斯德毕赤酵母的杂交体的密码子使用表，优化用于表达的野葛异戊二烯合酶，合成并克隆进入pDONR221：19430(由DNA2.0进行，其图谱见图140，其序列见图141(SEQ ID NO：38))。根据生产商的程序，进行Gateway
Figure BDA0000135567880002851
Cloning(Invitrogen)反应：由于pDONR221：19430是“进入”载体，所以使用LR Clonase II酶(LR反应)将密码子优化的异戊二烯合酶导入“目的”载体pYES-DEST52(Invitrogen)。
根据生产商的程序，将LR反应转化进入Top10化学感受态细胞，在含有50μg/ml羧苄西林的LA平板上选择携带具有异戊二烯合酶ORF的pYES-DEST52质粒的细菌。使用illustra PuReTaq Ready-To-GoTMPCR Beads(GE Healthcare)，使用T7正向引物和酵母异戊二烯合酶-Rev2引物(见表13)，通过菌落PCR检测单个的阳性转化子(关于引物浓度和热循环参数见下文)。
表13.用于扩增异戊二烯合酶的引物序列
Figure BDA0000135567880002861
通过微量制备(Qiagen)纯化产生正确大小(1354bp)的PCR片段的质粒并送去测序(Quintara Biosciences，Berkeley，CA)：使用T7正向和酵母异戊二烯合酶-For2引物(见表13)。将来自测序的结果与pDONR221：19430的已知序列进行比较(使用Vector NTI软件，Invitrogen)，选择了一个质粒pDW14进行进一步研究(其图谱见图142A，其完整序列见图142B和C(SEQ ID NO：39))。pDW14的序列与pDONR221：19430的序列的差异仅在于一个核苷酸(在图142B中以黑体标示)。单一核苷酸变化(G至A)没有引起ORF的变化，因为其位于编码赖氨酸的密码子的第三位。尚不知道该碱基变化是在LR克隆反应中被导入的，还是由DNA 2.0合成的原始序列中的错误。所有的经测序的质粒都含有该碱基变化。
使用S.c.EasyComp转化试剂盒(Invitrogen)中描述的程序，将纯化的pDW14转化进入酿酒酵母菌株INVSc-1。在含有2％葡萄糖而不含尿嘧啶的SC最简培养基上选择并维持携带pDW14或pYES-DEST52(其含有完整的URA3基因)的INVSc-1菌株，如pYES-DEST52Gateway Vector说明书(Invitrogen)中所描述。选择了含有pDW14的INVSc-1的两个独立的分离体和具有pYES-DEST52的单一对照菌株以进行进一步研究。
为了诱导异戊二烯合酶的表达，使培养物在液体SC最简培养基中生长过夜。然后将培养物稀释至OD600为大约0.2并生长2-3天。通过离心使培养物沉淀，洗涤一次，重悬于等体积(10ml)的含有1％棉子糖、2％半乳糖而不含尿嘧啶的SC最简培养基中，并过夜生长以诱导异戊二烯合酶的表达。测定菌株的OD600(图144A)，通过离心收获菌株并重悬于2ml裂解缓冲液(1∶1的混合物：50％甘油和PEB pH 7.4：Tris Base2.423g/L，MgCl2(无水)1.904g/L，KCl 14.910g/L，DTT 0.154g/L甘油50mL/L)中。
使裂解混合物通过弗氏压碎器3次，通过SDS-PAGE分析裂解物。为了进行考马斯凝胶分析(图143A)，以含有还原剂的2X SDS装载缓冲液1∶1稀释样品，载入(总体积20μl)4-12％bis-tris凝胶，在MES缓冲液中跑胶，根据生产商的程序(Invitrogen Novex system)，以SimplyBlueSafeStain染色。
使用WesternBreeze试剂盒(Invitrogen)转移并通过颜色在硝酸纤维素膜上检测异戊二烯合酶。一抗是在Invitrogen抗体稀释剂中1∶1000稀释的1799A 10week。一抗结合之后，使用以Alexa Fluor 488(InvitrogenCatalog No.A-11008)标记的二抗显影，以允许进行定量信号测定。按照Invitrogen的描述进行蛋白质印迹程序。使用蓝色滤光器设定以Molecular Dynamics Storm仪器记录荧光信号并使用MolecularDynamics ImageQuant图像分析软件包进行定量分析。从所生产的异戊二烯的量与诱导培养物的A600或通过蛋白质印迹测定的异戊二烯合酶蛋白浓度的比值计算文库成员的比活性。图143B显示：对比于携带pYES-DEST52的对照(泳道1)，异戊二烯合酶存在于携带pDW14的诱导的INVSc-1菌株中(泳道2和3)。
在来自每种菌株的25μL裂解物(其中添加了5μL 1M MgCl2、5μL100mM DMAPP、和65μL 50mM Tris pH 8)中进行异戊二烯合酶顶空的DMAPP测定。在30℃在气密性的1.8mL GC管中进行反应15分钟。通过加入100μL 250mM EDTA pH 8、.使反应终止。图144B显示了相对于对照的携带pDW14的诱导的菌株的比活性数值(以μg HG/L/OD表示)。携带pDW14的诱导的菌株显示出比不含异戊二烯合酶的对照高大约20倍的活性。
PCR循环参数
在25μl总体积/反应中，以每种浓度为0.4μM的寡核苷酸引物对使用Illustra PuReTaq Ready-To-GoTM PCR Beads(GE Healthcare)。为了分析由LR Clonase反应(Invitrogen)产生的质粒，将来自选择性平板上的单个菌落的少量细菌添加至含有如上所述的PCR混合物的每个管中。反应循环如下：1)95℃，4分钟；2)95℃，20秒；3)52℃，20秒；4)72℃，30秒；5个循环的步骤2至4；5)95℃，20秒；6)55℃，20秒；7)72℃，30秒；25个循环的步骤5至7，72℃10分钟，4℃直至冷却。
实施例21：在假单胞菌和其它革兰氏阴性细菌中生产异戊二烯， pBBR5HGSOpt2_2的构建，在假单胞菌中的接合和异戊二烯合酶活性的 测定
针对不同的目标微生物物种对编码来自葛根(野葛植物)的异戊二烯合酶的基因进行密码子优化(表14；fluo-opt2v2是所选的序列)，并由DNA2.0，Menlo Park，CA合成。fluo-opt2v2的图谱和序列可以见图145A和145B(SEQ ID NO：40)。向合成的序列中加入HindIII和BamHI限制性位点以便于克隆，在ATG之前添加RBS以增强转录。
在来自葛根的不同形式的密码子优化的异戊二烯合酶中，稀少密码子的数目与微生物物种有关。数轮的优化产生了在所有的目标物种中都不具有稀少密码子的基因。
表14.稀少密码子的数目
Figure BDA0000135567880002881
Figure BDA0000135567880002891
基因由DNA2.0提供，处于克隆载体中。以HindIII/BamHI消化该载体，凝胶纯化对应于目标插入片段的带，并重新与HindIII/BamHI消化的pBBR1MCS5(Kovach等人，Gene 166：175-176，1995，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于pBBR1MCS5的内容)连接，图谱见图146A，序列见图146B和C(SEQ ID NO：41)。这产生了质粒pBBR5HGSOpt2_2(图谱见147A，序列见147B和C(SEQ ID NO：42))，其中异戊二烯合酶表达自存在于pBBR1MCS5中的lac启动子。
将该载体转化进入大肠杆菌S17-1并与恶臭假单胞菌F1ATCC700007和荧光假单胞菌ATCC 13525交配。在LB上接合之后，在M9+16mM柠檬酸钠+50μg/ml庆大霉素上选择携带质粒的假单胞菌菌株。使用Qiagen试剂盒(Valencia，CA)通过质粒制备检查由此产生的菌株中的质粒的存在。
重组菌株恶臭假单胞菌pBBR5HGSOpt_2和荧光假单胞菌pBBR5HGSOpt2_2的异戊二烯合酶活性这样测定：使菌株在TM3培养基(如实施例1第II部分中所描述)+10g/L葡萄糖中生长，收集指数中期的生物质，通过弗氏压碎器破碎细胞并进行DMAPP测定。测定的结果显示于表15。通过DMAPP测定法测定的活性的存在确认：异戊二烯合酶在假单胞菌中表达。
检测了从lac启动子(使用质粒pBBR5HGSOpt2_2)表达异戊二烯合酶的恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌中的异戊二烯合酶活性。
表15.恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌中的异戊二烯合酶活性
Figure BDA0000135567880002892
Figure BDA0000135567880002901
实施例22：大肠杆菌和假单胞菌在蔗糖上的生长与在葡萄糖上的生 长的对比，以及使用两种底物表达异戊二烯合酶
I.液态蔗糖的制备
按照下述方式将结晶的粗蔗糖溶解于水中：将750g H2O加入到250g糖中。搅拌该溶液并稍微加热直至溶解。一些物质不溶。溶解后将溶液的重量调整至1kg以补充蒸发的水。溶液的体积经测定是940mL。因此，该溶液的浓度是265g/L。产品标签宣称：15g粗蔗糖含14g碳水化合物。因此，该溶液的碳水化合物浓度是248g/L。经测定干固体是24.03％，非常接近预期的250g/kg。该溶液的pH是5.49。使用葡萄糖氧化酶，通过酶促/分光光度测定法测定葡萄糖浓度。葡萄糖浓度是17.4g/L。
由于多数微生物不利用蔗糖，但是能够利用葡萄糖和果糖，所以将该溶液分成2份。一半进行高压灭菌一次，持续30分钟(蔗糖维持原样)。产生了一些转化糖，因为葡萄糖含量增加至29.75g/L(见图149)。使用磷酸将该溶液的另一半调节至pH 4.0，通过高压灭菌使该溶液转化(转化的蔗糖)。3轮30分钟的循环足以获得完全转化，如图149所示。两个溶液都用于如下所述的生长曲线。
II.大肠杆菌和假单胞菌的不同菌株在蔗糖上的生长曲线与在葡萄糖上的生长曲线的对比
将表16所示的每种菌株的一个菌落接种于25ml TM3+10g/L葡萄糖，并在30℃和200rpm过夜生长。TM3如实施例7第II部分所描述。次晨，使用1ml的每种培养物接种含有25mL TM3+10g/L葡萄糖、10g/L原样蔗糖、或10g/L转化蔗糖(如上所述的蔗糖溶液)的培养瓶中。在30℃和200rpm温育培养瓶，定期取出样品以测定OD600。图150和151显示：对于葡萄糖和转化的蔗糖而言，对于假单胞菌和大肠杆菌菌株，生长速率和生物质产率是相当的。荧光假单胞菌也显示出一些能够利用未被转化的蔗糖的迹象。
表16.本研究中使用的菌株
  菌株
  大肠杆菌   BL21
  MG1655
  ATCC11303
  B REL 606
  假单胞菌   恶臭假单胞菌F1(ATCC700007)
  荧光假单胞菌(ATCC13525)
III.在葡萄糖上生长的与在蔗糖上生长的表达异戊二烯合酶的大肠杆菌生产异戊二烯的比较
如实施例14第II部分所述的含有完整MVA途径、来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶和来自葛根的异戊二烯合酶的大肠杆菌MCM401(BL21(DE3))生长于TM3+10g/L葡萄糖或10g/L转化的蔗糖(基于糖浆中的碳水化合物浓度)上。将OD600＝0.2的培养于TM3+10g/L葡萄糖的过夜培养物接种至培养瓶。视需要加入抗生素。2小时后，以400μM IPTG诱导大肠杆菌培养物。生长6小时后，通过实施例2B中描述的DMAPP测定法测定异戊二烯产量和异戊二烯合酶活性。结果显示于表17，其清楚地表明：就异戊二烯和异戊二烯合酶的产量而言(基于每个细胞)，转化的蔗糖与葡萄糖是等同的。
表17
Figure BDA0000135567880002911
Figure BDA0000135567880002921
实施例23：表达酿酒酵母gi1.2KKDyI操纵子、银白杨异戊二烯合 酶、马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶、pCL Upper MVA(粪肠球菌mvaE 和mvaS)和ybhE(pgl)的大肠杆菌菌株的构建
(i)菌株EWL201(BL21，Cm-GI1.2-KKDyI)的构建
经MCM331P1裂解物(根据Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology.John Wiley and Sons，Inc.描述的方法制备的裂解物)转导的大肠杆菌BL21(Novagen brand，EMD Biosciences，Inc.)是受体菌株。MCM331细胞含有编码酿酒酵母甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、和IPP异构酶(即来自酿酒酵母的gi1.2-KKDyI操纵子)的染色体构建体gi1.2KKDyI。通过将细胞涂覆于L琼脂和20μg/μl氯霉素上来选择转导子。将平板在30℃温育过夜。转导子分析显示：在对照平板(水+细胞对照平板，用于逆转；水+P1裂解物对照平板，用于裂解物污染)上没有菌落。
挑取了4个转导子并用于接种5mL L Broth和20μg/μl氯霉素。培养物在30℃以200rpm振荡生长过夜。为了制备用于PCR分析的每个转导子的基因组DNA制备物，离心1.5mL过夜细胞培养物。将细胞沉淀重悬于400μl重悬缓冲液(20mM Tris，1mM EDTA，50mM NaCl，pH7.5)，加入4μl不含DNA酶的RNA酶(Roche)。在37℃将管温育30分钟，然后加入4μl 10％SDS和4μl 10mg/ml的蛋白酶K贮液(Sigma-Aldrich)。在37℃将管温育1小时。将细胞裂解物转移至2mlPhase Lock Light Gel管(Eppendorf)，加入各200μl的饱和苯酚pH7.9(Ambion Inc.)和氯仿。将管混合均匀并微离心5分钟。使用400μl氯仿进行第二次提取，将含水层转移至新的eppendorf管。通过加入1ml 100％的乙醇并离心5分钟使基因组DNA沉淀。以1ml 70％的乙醇洗涤基因组DNA沉淀。除掉乙醇，使基因组DNA沉淀短暂风干。将基因组DNA重悬于重悬于200μl TE。
使用Pfu Ultra II DNA聚合酶(Stratagene)和200ng/μl基因组DNA作为模板，根据生产商的说明书制备了2组不同的PCR反应管。对于第1组，使用引物MCM130和GB Cm-Rev(表18)以确保转导子正确地整合进入attTn7基因座。用于第1组的PCR参数是：95℃2分钟(仅第一个循环)；95℃ 25秒，55℃ 25秒，72℃ 25秒(步骤2-4重复28个循环)；72℃ 1分钟。对于第2组，使用引物MVD For和MVD Rev(表18)以确保gi1.2-KKDyI操纵子正确整合。用于第2组的PCR参数是：95℃2分钟(仅第一个循环)；95℃ 25秒，55℃ 25秒，72℃ 10秒(步骤2-4重复28个循环)；72℃ 1分钟。在1.2％E-凝胶(Invitrogen Corp.)上对PCR扩增子的分析表明：所有4个转导子克隆都是正确的。挑取1个并命名为菌株EWL201。
(ii)菌株EWL204(BL21，环出-GI1.2-KKDyI)的构建
按照Datsenko和Wanner(2000)(Datsenko等人，Proc Natl.Acad.SciUSA 97：6640-6645，2000)的描述，使用质粒pCP20从菌株EWL201中环出氯霉素标志物。使用PCR产物将大肠杆菌K-12中的氯霉素基因进行一步失活(Datsenko等人，PNAS，97：6640-6645，2000)。EWL201细胞在L Broth中生长至指数中期，然后在冰冷的无菌水中洗涤3次。将50μl的细胞悬浮液等份与1μl pCP20混合，使用基因脉冲电穿孔仪(Bio-RadInc.)，在2mm杯(Invitrogen Corp.)中在2.5伏特和25uFd，将细胞悬浮液混合物进行电穿孔。立即向细胞中加入1ml LB，然后转移进入具有金属盖的14ml聚丙烯管(Sarstedt)中。通过在30℃生长1小时而使细胞恢复。在L琼脂和20μg/μl氯霉素和50μg/μl羧苄西林上选择转化子并在30℃过夜温育。次日，单一克隆在30℃在10ml L Broth和50μg/μl羧苄西林上生长直至早期对数期。然后使生长中的培养物的温度变为42℃，持续2小时。进行连续稀释，然后将细胞涂覆于LA平板(无抗生素选择)并在30℃过夜温育。次日，挑取20个菌落并点染至L琼脂(无抗生素)和LA+20μg/μl氯霉素平板。然后将平板在30℃过夜温育。能够在LA平板上生长但不能在LA+20μg/μl氯霉素平板上生长的细胞被认为是发生了氯霉素标志物环出(挑取1个并命名为菌株EWL204)。
(iii)质粒pEWL230(pTrc P.alba)的构建
基于针对大肠杆菌表达的密码子优化方法，将产生编码银白杨异戊二烯合酶(银白杨HGS)的合成基因的工作外包给DNA2.0Inc.(MenloPark，CA)。将合成的基因订制克隆进入质粒pET24a(Novagen brand，EMD Biosciences，Inc.)并冻干运输(图152，153A-B；SEQ ID NO：43)。
根据生产商的说明书，使用pET24银白杨HGS作为模板，引物MCM182和MCM192以及Herculase II Fusion DNA聚合酶(Stratagene)，进行PCR反应以扩增银白杨异戊二烯合酶(银白杨HGS)基因。PCR条件如下：95℃ 2分钟(仅第一个循环)；95℃ 25秒，55℃ 20秒，72℃ 1分钟(重复25个循环)；最后在72℃延伸3分钟。使用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen Inc.)纯化银白杨异戊二烯合酶PCR产物。
然后在含有1μl BspHI核酸内切酶(New England Biolabs)和2μl 10XNEB缓冲液4的20μl反应物中消化银白杨异戊二烯合酶PCR产物。将反应物在37℃温育2小时。然后使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化消化的PCR片段。在含有1μl PstI核酸内切酶(Roche)和2μl 10X缓冲液H的20μl反应物中进行第二限制性消化。将反应在37℃温育2小时。然后使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化消化的PCR片段。在含有1μlNcoI核酸内切酶(Roche)、1μl PstI核酸内切酶、和2μl 10X缓冲液H的20μl反应物中消化质粒pTrcHis2B(Invitrogen Corp.)。将反应物在37℃温育2小时。使用1.2％E-凝胶(Invitrogen Corp.)凝胶纯化经消化的pTrcHis2B载体，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)提取(图154)。使用BspHI和NcoI位点的兼容性粘末端，制备20μl连接反应物，其中含有5μl银白杨异戊二烯合酶插入片段、2μl pTrc载体、1μl T4DNA连接酶(New England Biolabs)、2μl 10X连接酶缓冲液、和10μl ddH2O。将连接混合物在室温温育40分钟。使0.025μm硝酸纤维素膜滤纸(Millipore)在ddH2O的皮氏培养皿中漂浮并将连接混合物轻轻地施加于所述硝酸纤维素膜滤纸上并在室温持续30分钟，以此来使连接混合物脱盐。MCM446细胞(见第II部分)在LB中生长至指数中期，然后在冰冷的无菌水中洗涤3次。将50μl细胞悬浮液等份试样与5μl脱盐的pTrcP.albaHGS连接混合物混合在一起。使用基因脉冲电穿孔仪，在2mm杯中在2.5伏特和25uFd对细胞悬浮液混合物进行电穿孔。立即向细胞中加入1ml LB，然后转移至具有金属盖的14ml聚丙烯管(Sarstedt)。通过在30℃生长2小时使细胞恢复。在L琼脂和50μg/μl羧苄西林和10mM甲羟戊酸上选择转化子并在30℃温育。次日，挑取6个转化子并在30℃在5ml L Broth和50μg/μl羧苄西林管中过夜生长。使用QIAquick旋转微量制备试剂盒(Qiagen)在过夜培养物上进行质粒制备。由于使用了BL21细胞用于繁殖质粒，所以在生产商的标准程序中引入了下列修改：以5X的PB缓冲液和3X的PE缓冲液洗涤旋转柱，以实现高质量的质粒DNA。在20μl反应中以PstI消化质粒以确保正确大小的线性片段。所有6个质粒都是正确大小，并送去Quintara Biosciences(Berkeley，CA)测序，测序使用引物MCM65、MCM66、EL1000(表18)。DNA测序结果显示：所有6个质粒都是正确的。挑取1个质粒，命名为质粒EWL230(图155，156A-B；SEQ ID NO：44)。
(iv)质粒pEWL244(pTrc P.alba-mMVK)的构建
根据生产商的说明书，使用MCM376作为模板(见下文第(v)部分)、引物MCM165和MCM177(见表18)、和Pfu Ultra II Fusion DNA聚合酶(Stratagene)，进行PCR反应以扩增马氏甲烷八叠球菌(M.mazei)MVK基因。PCR条件如下：95℃ 2分钟(仅第一个循环)；95℃ 25秒，55℃ 25秒，72℃ 18秒(重复28个循环)；最后在72℃延伸1分钟。使用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen Inc.)纯化马氏甲烷八叠球菌MVK PCR产物。
然后在包含8μl PCR产物、2μl PmeI核酸内切酶(New EnglandBiolabs)、4μl 10X NEB缓冲液4、4μl 10X NEB BSA、和22μl ddH2O的40μl反应物中消化马氏甲烷八叠球菌MVK PCR产物。将反应物在37℃温育3小时。然后使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化经消化的PCR片段。在含有2μl NsiI核酸内切酶(Roche)、4.7μl 10X缓冲液H、和40μl PmeI消化的马氏甲烷八叠球菌MVK片段的47μl反应物中进行第二限制性消化。将反应物在37℃温育3小时。然后使用1.2％E-凝胶对经消化的PCR片段进行凝胶纯化，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒提取。在含有10μl质粒、2μl PmeI核酸内切酶、4μl 10X NEB缓冲液4、4μl 10X NEB BSA、和20μl of ddH2O的40μl反应物中消化质粒EWL230。将反应物在37℃温育3小时。然后使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化经消化的PCR片段。在含有2μl PstI核酸内切酶、4.7μl 10X缓冲液H、和40μl PmeI消化的EWL230线性片段的47μl反应物中进行第二限制性消化。将反应物在37℃温育3小时。然后使用1.2％E-凝胶对经消化的PCR片段进行凝胶纯化，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒提取(图157)。使用NsiI和PstI位点的兼容性粘末端，制备20μl连接反应物，其中含有8μl马氏甲烷八叠球菌MVK插入片段、3μl EWL230质粒、1μl T4DNA连接酶、2μl 10X连接酶缓冲液、和6μl ddH2O。将连接混合物在16℃过夜温育。次日，通过使0.025μm硝酸纤维素膜滤纸在ddH2O的皮氏培养皿中漂浮并将连接混合物轻轻地施加于所述硝酸纤维素膜滤纸上并在室温持续30分钟而使连接混合物脱盐。MCM446细胞在LB中生长至指数中期，然后在冰冷的无菌水中洗涤3次。将50μl细胞悬浮液等份试样与5μl脱盐的pTrc P.alba-mMVK连接混合物混合在一起。使用基因脉冲电穿孔仪，在2mm杯中在2.5伏特和25uFd对细胞悬浮液混合物进行电穿孔。立即向细胞中加入1ml LB，然后将细胞转移至具有金属盖的14ml聚丙烯管。通过在30℃生长2小时使细胞恢复。在LA和50μg/μl羧苄西林和5mM甲羟戊酸平板上选择转化子并在30℃温育。次日，挑取6个转化子并在30℃在5ml LB和50μg/μl羧苄西林管中过夜生长。使用QIAquick旋转微量制备试剂盒在过夜培养物上进行质粒制备。由于使用了BL21细胞用于繁殖质粒，所以在生产商的标准程序中引入了下列修改：以5X的PB缓冲液和3X的PE缓冲液洗涤旋转柱，以实现高质量的质粒DNA。在20μl反应物中以PstI消化质粒以确保正确大小的线性片段。6个质粒中的3个是正确大小，并送去Quintara Biosciences测序，测序使用引物MCM65、MCM66、EL1000、EL1003、和EL1006(表18)。DNA测序结果显示：所有3个质粒都是正确的。挑取1个，命名为质粒EWL244(图158和159A-B；SEQ ID NO：45)。
(v)质粒MCM376的构建-将来自马氏甲烷八叠球菌远古下部的MVK构建进入pET200D
使用Invitrogen Platinum HiFi PCR混合物，使用引物MCM161和MCM162(表18)，通过PCR扩增来自马氏甲烷八叠球菌远古下部途径操纵子(图160A-C；SEQ ID NO：46)的MVK ORF。将45μL PCR混合物与1μL模板、1μL 10μM的每种引物、和2μL水混合。反应循环如下：94℃ 2分钟；30个循环的“94℃ 30秒，55℃ 30秒和68℃ 1分15秒”，然后72℃ 7分钟，置于4℃直至冷却。根据生产商的程序，将3μL该PCR反应物连接进入Invitrogen pET200D质粒。将3μL此连接物导入Invitrogen TOP10细胞，在LA/kan50上选择转化子。分离来自转化子的质粒并对插入片段进行测序，得到MCM376(图161A-C；SEQ IDNO：47)。
(vi)菌株EWL251(BL21(DE3)，Cm-GI1.2-KKDyI，pTrcP.alba-mMVK)的构建
MCM331细胞(其含有编码酿酒酵母甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、和IPP异构酶的染色体构建体gi1.2KKDyI)在LB中生长至指数中期，然后在冰冷的无菌水中洗涤3次。将50μl细胞悬浮液与1μl质粒EWL244混合。使用基因脉冲电穿孔仪，在2mm杯中在2.5伏特和25uFd对细胞悬浮液混合物进行电穿孔。立即向细胞中加入1ml LB，然后将细胞转移至具有金属盖的14ml聚丙烯管。通过在30℃生长2小时使细胞恢复。在LA和50μg/μl羧苄西林和5mM甲羟戊酸平板上选择转化子并在37℃温育。选择1个菌落并命名为菌株EWL251。
(vii)菌株EWL256(BL21(DE3)，Cm-GI1.2-KKDyI，pTrcP.alba-mMVK，pCL Upper MVA)的构建
EWL251细胞在LB中生长至指数中期，然后在冰冷的无菌水中洗涤3次。将50μl细胞悬浮液与1μl质粒MCM82(其包含编码粪肠球菌mvaE和mvaS的pCL PtrcUpperPathway(也称作“pCL Upper MVA”))混合。根据上文的实施例8的描述构建质粒pCL Ptrc Upper Pathway。使用基因脉冲电穿孔仪，在2mm杯中在2.5伏特和25uFd对细胞悬浮液混合物进行电穿孔。立即向细胞中加入1ml LB。然后将细胞转移至具有金属盖的14ml聚丙烯管。通过在30℃生长2小时使细胞恢复。在LA和50μg/μl羧苄西林和50μg/μl壮观霉素平板上选择转化子并在37℃温育。挑取1个菌落并命名为菌株EWL256。
表18：引物序列
Figure BDA0000135567880002981
(viii)菌株RM111608-2(Cm-GI1.2-KKDyI，pTrc P.alba-mMVK，pCLUpper MVA，pBBRCMPGI1.5-pgl)的构建
构建生产异戊二烯的大肠杆菌BL21菌株(EWL256)，其在复制质粒pBBR1MCS5(庆大霉素)(获自K.Peterson博士，Louisiana StateUniversity)上组成型表达ybhE基因(编码大肠杆菌6-磷酸葡萄糖酸内酯酶)。
从Gene Bridges GmbH(Germany)获得基于FRT的重组盒，和用于Red/ET-介导的整合和抗生素标志物环出的质粒。根据Gene Bridges的程序进行使用这些材料的程序。根据生产商的程序，使用StratageneHerculase II Fusion试剂盒，使用引物Pgl-F(SEQ ID NO：139)和PglGI1.5-R(SEQ ID NO：140)从FRT-gb2-Cm-FRT模板扩增抗性盒。PCR反应物(最终体积为50μL)包含：5μL缓冲液，1μL模板DNA(来自GeneBridges的FRT-gb2-Cm-F)，10pmol的每种引物，和1.5μL 25mM dNTP混合物，加水至50μL。反应循环如下：1x 2分钟，95℃，然后30个循环的“30秒 95℃；30秒 63℃；3分钟 72℃)。
使用QiaQick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化得到的PCR产物并电穿孔进入如下所述的携带包含pRed-ET重组酶的质粒的电感受态MG1655细胞。细胞这样制备：在5mL L broth中在30℃生长至OD600～0.6。通过加入4％的阿拉伯糖诱导细胞表达重组酶并允许在30℃生长30分钟，然后在37℃生长30分钟。在冰冷的dH2O中将细胞的1.5mL等份试样洗涤3-4次。将最终的细胞沉淀重悬于40μL冰冷的dH2O中并加入2-5μL PCR产物。在1-mm空隙杯中在1.3kV下在基因脉冲电穿孔仪(Bio-Rad Inc.)中进行电穿孔。使细胞在30℃恢复1-2小时，并铺板于含有氯霉素的L琼脂(5μg/mL)。通过PCR分析了5个转化子并使用侧接整合位点的引物(2个引物组：pgl和49rev和3′EcoRV-pglstop；BottomPgb2和Top GB’s CMP(946))进行测序。选择正确的转化子，该菌株被称作MG1655 GI1.5-pgl::CMP。
MG1655 GI1.5-pgl::CMP的染色体DNA用作模板以产生包含FRT-CMP-FRT-GI1.5-ybhE构建体的PCR片段。如下所述将该构建体克隆进入pBBR1MCS5(庆大霉素)。使用5’引物Pglconfirm-F(SEQ IDNO：141)和3’引物3′EcoRV-pglstop(SEQ ID NO：142)扩增在本文中被称作CMP-GI1.5-pgl的片段。使用Invitrogen TOPO-Blunt克隆试剂盒将得到的片段克隆进入质粒载体pCR-Blunt II-TOPO，如生产商所建议。将携带CMP-GI1.5-pgl片段的NsiI片段克隆进入pBBR1MCS5(庆大霉素)的PstI位点。制备20μl的连接反应物，其包含5μl CMP-GI1.5-pgl插入片段、2μl pBBR1MCS5(庆大霉素)载体、1μl T4DNA连接酶(NewEngland Biolabs)、2μl 10X连接酶缓冲液、和10μl ddH2O。将连接混合物在室温温育40分钟，然后使用上文公开的参数将2-4μL电穿孔进入电感受态Top10细胞(Invitrogen)。在含有10μg/ml氯霉素和5μg/ml庆大霉素的L琼脂上选择转化子。使用如上所述的多个引物以及Sequetech，CA提供的自用的T3和反向引物测定所选的克隆的序列。该质粒被称作pBBRCMPGI1.5-pgl(图162、163A-B和SEQ ID NO：48)。
将质粒pBBRCMPGI1.5-pgl电穿孔进入如本文所述的EWL256，并将转化子铺板于含有氯霉素(10μg/mL)、庆大霉素(5μg/mL)、壮观霉素(50μg/mL)、和羧苄西林(50μg/mL)的L琼脂。选择1个转化子并命名为菌株RM111608-2。
引物：
Pgl-F
5’-ACCGCCAAAAGCGACTAATTTTAGCTGTTACAGTCAGTTGAATTAACCCTCACTAAAGGGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO：139)
PglGI1.5-R
5’-GCTGGCGATATAAACTGTTTGCTTCATGAATGCTCCTTTGGGTTACCTCCGGGAAACGCGGTTGATTTGTTTAGTGGTTGAATTATTTGCTCAGGATGTGGCATAGTCAAGGGCGTGACGGCTCGCTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAG-3’(SEQ ID NO：140)
3′EcoRV-pglstop：
5’-CTT GAT ATC TTA GTG TGC GTT AAC CAC CAC(SEQ IDNO：142)
pgl+49rev：CGTGAATTTGCTGGCTCTCAG(SEQ ID NO：136)
Bottom Pgb2：GGTTTAGTTCCTCACCTTGTC(SEQ ID NO：135)
Top GB’s CMP(946)：ACTGAAACGTTTTCATCGCTC(SEQ IDNO：92)
Pglconfirm-F
5’-ACCGCCAAAAGCGACTAATTTTAGCT-3’(SEQ ID NO：141)
实施例24：通过在大肠杆菌中组成型表达ybhE(pgl)提高异戊二烯产 量
该实施例显示了相对于以野生型水平表达ybhE的对照菌株(即，EWL256)，组成型表达大肠杆菌ybhE(pgl)的菌株中的异戊二烯的生产。基因ybhE(pgl)编码大肠杆菌6-磷酸葡萄糖酸内酯酶，该酶抑制异源表达的蛋白质的翻译后葡糖酰化并提高产物溶解性和产率，同时也提高生物质产率和通过戊糖磷酸途径的流量(Aon等人，Applied and EnvironmentalMicrobiology，74(4)：950-958，2008)。
i)小规模分析
培养基配方(每升发酵培养基)：K2HPO4 13.6g，KH2PO4 13.6g，MgSO4*7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，(NH4)2SO43.2g，酵母提取物1g，1000X痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于Di H2O中。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至6.8并定容。培养基以0.22μm的滤器无菌过滤。灭菌后加入葡萄糖5.0g和抗生素并调节pH。
1000X痕量金属溶液(每升发酵培养基)：柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO4*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3 100mg，NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分逐一溶解于Di H2O中。以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容溶液，并以0.22μm的滤器无菌过滤。
(a)实验程序
通过使菌株在来自MicroReactor Technologies，Inc的CelleratorTM中生长而分析异戊二烯的生产。24个孔中的每一个孔中的工作体积是4.5mL。温度维持在30℃，pH设定点是7.0，氧流设定点是20sccm，搅拌速率是800rpm。将取自冷冻瓶的大肠杆菌菌株接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)并在30℃温育。将单一菌落接种进入含有抗生素的培养基中并生长过夜。将细菌稀释进入4.5mL含有抗生素的培养基，达到0.05的光密度(在550nm下测定)。
使用气体色谱-质谱仪(GC-MS)(Agilent)顶空测定法进行废气中的异戊二烯的分析。样品制备如下：将100μL完整培养液置于密封的GC瓶中并在30℃温育30分钟的固定的时间。加热杀灭步骤之后(其包括在70℃温育5分钟)，将样品装载至GC。
在运行过程中使用微板读数器(Spectramax)获得550nm的波长下的光密度(OD)。通过将异戊二烯浓度(μg/L)除以读取的OD值和时间(小时)而获得比生产率。
在200和400μM IPTG诱导水平测定两个菌株EWL256和RM11608-2。在诱导后1、2.5、4.75、和8小时分析样品的异戊二烯生产情况和细胞生长(OD550)。以一式两份进行样品测定。
(b)结果
该实验证明：在2个不同浓度的IPTG时，表达ybhE(pgl)的菌株的异戊二烯的比生产率比对照菌株显著高2-3倍。
ii)以15L的规模在补料分批培养物中生长并表达Cm-GI1.2-KKDyI、马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶、银白杨异戊二烯合酶、和ybhE(pgl)(RM111608-2)的大肠杆菌发酵生产异戊二烯
培养基配方(每升发酵培养基)：K2HPO4 7.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于Di H2O中。将该溶液高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺*HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。
1000X改良痕量金属溶液：柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO4*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3 100mg，NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分逐一溶解于Di H2O中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，并以0.22μm的滤器无菌过滤。
在15L的生物反应器中以含有上部甲羟戊酸(MVA)途径(pCLUpper)、整合的下部MVA途径(gi1.2KKDyI)、高度表达的来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶和来自银白杨的异戊二烯合酶(pTrcAlba-mMVK)、和高度表达的大肠杆菌pgl(pBBR-pgl)的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度34℃从葡萄糖形成的异戊二烯。解冻大肠杆菌菌株的冷冻瓶并接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至15L生物反应器，使最初体积至5L。
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。在40小时(59小时)的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是3.1kg(59小时的话则是4.2kg)。通过加入IPTG进行诱导。当550nm下的光密度(OD550)达到4的时候，使IPTG的浓度是110μM。当OD550达到150时，IPTG的浓度升高至192μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图164A。使用Hiden质谱仪测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯的效价随着发酵过程增大，在40小时的时候达到最大值33.2g/L(59小时的话则是48.6g/L)(图164B)。异戊二烯的效价随着发酵过程增大，在40小时的时候达到最大值40.0g/L(59小时的话则是60.5g/L)(图164C)。在40小时(59小时)的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是281.3g(59小时的话则是451.0g)，生产的时间进程显示于图164D。体积生产率的时间进程显示于图164E，其显示：在0至40小时，平均速率保持在1.0g/L/hr(在19至59小时保持在1.4g/L/小时)。通过CER测定的代谢活性谱显示于图164F。在40小时的情况下，发酵过程中用于生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是19.6％(59小时的话则是23.6％)。在40小时的情况下，从葡萄糖生产的异戊二烯的重量百分率产率是8.9％(59小时的话则是10.7％)。
实施例25：在表达马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶、银白杨异戊二 烯合酶、pCL Upper MVA(粪肠球菌mvaE和mvaS)和ybhE(pgl)的大肠 杆菌菌株中共同生产异戊二烯和氢
收集发酵废气并分析氢和异戊二烯的水平
使用菌株RM111608-2(大肠杆菌BL21(DE3)，pCL Upper MVA，cmR-gi1.2-yKKDyI，pTrcAlba-mMVK，pBBR cmR-gi1.5-pgl)和EWL256(大肠杆菌BL21(DE3)，pCL Upper MVA，cmR-gi1.2-yKKDyI，pTrcAlba-mMVK)进行发酵。细菌菌株的构建描述于上文实施例23。
从表达马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶、银白杨异戊二烯合酶、pCLUpper MVA(粪肠球菌mvaE和mvaS)并组成型表达ybhE(pgl)(RM111608-2)或正常表达ybhE(pgl)(EWL256)的大肠杆菌菌株EWL256和RM111608-2的补料分批培养物测定从大肠杆菌的大规模生产的异戊二烯。该实验证明在存在葡萄糖的情况下生长的细胞共同生产异戊二烯和氢。
每升TM2发酵培养基的发酵培养基(TM2)配方如下：K2HPO4 13.6g，KH2PO4 13.6g，MgSO4*7H2O 2g，一水柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，(NH4)2SO4 3.2g，酵母提取物5g，1000X改良痕量金属溶液1ml。1000X改良痕量金属溶液：柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO4*7H2O 1g，CuSO4*5H2O100mg，H3BO3 100mg，NaMoO4*2H2O 100mg。对于1000X改良痕量金属溶液，将每种成分逐一溶解于DiH2O中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后以蒸馏水定容，并以0.22微米(μm)的滤器无菌过滤(该溶液不进行高压灭菌)。对于TM2发酵培养基，所有成分一起添加，溶解于Di H2O中，以氢氧化钾(KOH)将pH调节至6.8，定容，培养基以0.22微米(μm)的滤器无菌过滤。葡萄糖以99DE(右旋糖当量)、71％DS(干固体)糖浆源自Cargill。
在15L的生物反应器中以含有上部甲羟戊酸(MVA)途径(pCL UpperMVA)、整合的下部MVA途径(cmR-gi1.2-yKKDyI)、来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶和来自银白杨的异戊二烯合酶(pTrcAlba-mMVK)、和组成型表达ybhE(pgl)(RM111608-2)或正常表达的ybhE(pgl)(EWL256)的大肠杆菌菌株EWL256或RM111608-2进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵条件(pH 7.0和温度34℃)从葡萄糖形成的异戊二烯。
将获自冷冻瓶的合适的大肠杆菌菌株的接种物制备于胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD550＝0.6后，使用600mL接种至含有TM2培养基的15L生物反应器。以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。在67小时的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是3.9kg。通过加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)进行诱导。当550nm下的光密度(OD550)达到9的时候，使IPTG的浓度是102μM。当OD550达到140时，IPTG的浓度升高至192μM。在诱导后的多个时间，取出样品并按照如下的描述测定所生产的异戊二烯的量。按照下文的讨论使用HidenHPR-20质谱仪测定来自生物反应器的废气中的氢、氮、氧、二氧化碳、和异戊二烯的水平。
通过以1L废气/分钟的速率喷洒瓶10秒并以具有特氟隆-包被的间隔的金属旋盖(Agilent，CA)密封而将来自15L生物反应器的发酵废气样品收集进入20mL的玻璃顶空瓶中。在收集之后30分钟内分析该瓶。
将质谱仪的入口管置于未加盖的顶空瓶中1-2分钟，以4scc/分钟(4mL/min)的速率注入Hiden HPR-20质谱仪(Hiden Analytics，U.K.)，以进行两个样品的分析。HPR-20仪器配置为扫描对应于氢(m/z 2)、氮(m/z28)、氧(m/z 32)、二氧化碳(m/z 44)和异戊二烯(m/z 67)的质量。Faraday检测器用于质量28、32、44和67。SEM检测器用于氢(m/z 2)。以压力的任意单位(Torr)测定检测器应答。通过与真实可靠的氢气标志物比较来估计绝对氢水平。使用MASsoft V 6.21.0.51软件(Hiden Analytics，UnitedKingdom)记录结果。
结果
从两个发酵运行获得废气样品并按照如上所述进行分析：
A)菌株RM111608-2(大肠杆菌BL21(DE3)，pCL upper，cmR-gi1.2-yKKDyI，pTrcAlba-mMVK，pBBR cmR-gi1.5-pgl)。在64.8小时取出样品进行运行，当时的发酵以无氧方式运行，以1vvm喷洒氮气。
B)菌株EWL256(大肠杆菌BL21(DE3)，pCL upper，cmR-gi1.2-yKKDyI，pTrcAlba-mMVK)。在34.5小时取出样品进行运行，当时的发酵以有氧方式运行，以1vvm喷洒空气。
结果显示于图165A-B。在两种情况下，除了异戊二烯、氧和二氧化碳，检测到低水平的氢。对于氢读取的基线是0.95x 10-8Torr。样品A和B都给出大约1.3x 10-8Torr的读数。基于与氢标准物的比较，存在于样品A和B的废气中的氢的量经估计是小于10ppmv(每百万体积分之几)但在基线之上。如图165A-B所示，样品A和B都包含显著量的异戊二烯和二氧化碳。
实施例26：在表达马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶、银白杨异戊二 烯合酶、pCL Upper MVA(粪肠球菌mvaE和mvaS)和ybhE(pgl)的大肠 杆菌菌株中共同生产异戊二烯和氢
收集发酵废气并分析氢和异戊二烯的水平
本实验的目标是在工程化的大肠杆菌菌株中共同生产氢和异戊二烯。为此目的，将编码大肠杆菌氢化酶-3的hyc操纵子的一部分在菌株EWL256[BL21(DE3)，pCL upper，cmR-gi1.2-yKKDyI，pTrcAlba-mMVK]中表达(如上所述制备)，虽然可以类似地修饰本文描述的任意细菌菌株例如RM111608-2。基于公众可获得的基因序列，通过本领域已知的标准克隆方法制备包含hyc操纵子基因hycB(gi|16130631)、hycC(gi|16130630)、hycD(gi|16130629)、hycE(gi|16130628)、hycF(gi|16130627)、和hycG(gi|16130626)的表达构建体，并导入菌株EWL256以生产新的菌株EWL256+Hyd-3。
通过下列方式，在EWL256+Hyd-3中单独或联合测定另外的突变对于共同生产氢和异戊二烯之影响：导入参与氢化酶-3的成熟或调节氢化酶-3的基因(例如，hycH(gi|16130625)和hycI(gi|16130624))；失活或缺失参与氢的摄取或运输的基因(例如，大肠杆菌氢化酶-1(hya操纵子)和氢化酶-2(hyb操纵子))或相关的蛋白(例如，甲酸脱氢酶(fdhF(gi|16130624))、甲酸裂解酶的阻抑子(hycA(gi|16130632))、甲酸脱氢酶Nα亚基(fdnG(gi|16129433))、甲酸脱氢酶O大亚基(fdoG(gi|16131734))、硝酸还原酶(narG(gi|16129187))、延胡索酸还原酶调节子(fnr(gi|16129295))、和乙酰基-辅酶A合成酶(acs(gi|16131895)))；激活参与氢化酶的上调的基因(例如，甲酸氢裂解酶的激活子(fhlA(gi|16130638))；失活或缺失参与产生发酵副产物的基因(例如，乳酸脱氢酶(ldhA(gi|16129341))、延胡索酸还原酶膜蛋白(frdC(gi|16131977))、醇脱氢酶(adhE(gi|16129202))、丙酮酸氧化酶(poxB(gi|16128839))、丙酮酸脱氢酶E1成分ackA/pta(aceE(gi|16128107))、甲酸脱氢酶调节蛋白(hycA(gi|16130632))、以及甲酸转运子A和B(FocA(gi|16128871)和FocB(gi|16130417))；或通过表达参与氢代谢的异源基因(例如，来自丙酮丁醇梭杆菌(Clostridiumacetobutylicum)的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapC(gi|15893997))。
使用菌株的工程化变体EWL 256+Hyd-3(BL21(DE3)、pCL upper、cmR-gi1.2-yKKDyI、pTrcAlba-mMVK和hycB-F)进行发酵，该变体被修饰为包含一个或多个如本文描述的另外的突变(单独或组合)，基本上如上文实施例25所描述。基本上按照如上所述通过分析废气样品测定氢和异戊二烯的共同生产。基于异戊二烯和氢的共同生产速率选择菌株进行进一步分析。
除非另外定义，本文所用的全部术语及科学术语的意思是本发明所属领域的技术人员共同理解的那些意思。Singleton等人，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology，第2版，John Wiley and Sons，NewYork(1994)和Hale与Markham，The Harper Collins Dictionary ofBiology，Harper Perennial，NY(1991)为技术人员提供本发明中使用的许多术语的一般含义。应当理解本发明不限于所描述的具体方法学、方案、和试剂，因为它们可以变动。本领域技术人员也理解与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任意方法和材料也可以用来实施或检验本发明。
实施例27：在含有上部甲羟戊酸途径或上部及下部甲羟戊酸途径外 加野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌fadR atoC LS5218中从脂肪酸或棕榈油 产生异戊二烯或甲羟戊酸
大肠杆菌fadR atoC菌株LS5218(#6966)从Coli遗传学原种中心获得。FadR编码负向调节编码脂肪酸降解酶的基因表达的转录阻抑子(Campbell等人，J.Bacteriol.183：5982-5990，2001)。AtoC是其中AtoS调节乙酰乳酸代谢的双组件调节系统中的应答调节物。fadR atoC菌株允许脂肪酸降解基因的组成型表达，并且将长链脂肪酸掺入长链长度的聚羟基链烷酸酯中。使用棕榈油作为产生甲羟戊酸或异戊二烯的碳源时，棕榈油转化成甘油外加脂肪酸。用于这种情况的方法是本领域熟知的，并且它可以通过与脂肪酶(例如猪胰脂肪酶、皱褶假丝酵母(Candidarugosa)脂肪酶、或其他类似脂肪酶)孵育而酶促地进行或通过用碱(如氢氧化钠)皂化来化学地进行。
i)表达上部甲羟戊酸途径的大肠杆菌fadR atoC菌株
菌株WW4通过使用标准法(Sambrooke等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，1989)使pCLPtrcUpperPathway电穿孔至LS5218中产生。质粒的并入通过在补充有作为碳源的C12脂肪酸(FA)或棕榈油的TM3培养基中培养细胞时甲羟戊酸(MVA)的产生而证明。为显示通过WW4从脂肪酸产生MVA，来自过夜培养物的细胞以1比100稀释至补充有0.25％C12FA(Sigma目录号L9755)的5mL改良TM3培养基(无酵母提取物的TM3)中。在30℃过夜孵育IPTG诱导的培养物后，MVA产生量的首个迹象(24mg/L)是明显的。产生量在3日范围内增加，所产生MVA的最终水平是194mg/L。为证明通过WW4从油产生MVA，来自过夜培养物的细胞以1比100稀释至每5mL TM3培养基补充有200mg消化的棕榈油的改良TM3培养基中。在30℃过夜孵育IPTG诱导的培养物后，MVA产生量的首个迹象(50mg/L)是明显的。产生量在3日范围内增加，所产生MVA的最终水平是500mg/L 。
ii)表达上部和下部MVA途径外加野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌fadR atoC菌株
大肠杆菌菌株WW4(LS5218fadR atoC pCLPtrcUpperPathway)用pMCM118[pTrcKKDyIkIS]转化以产生WW10。该质粒的并入通过在TM3和葡萄糖中培养并且用IPTG(100、300、或900μM)诱导菌株时产生甲羟戊酸(MVA)的证据证明。该菌株相对地对IPTG敏感并且甚至在100μM IPTG显示显著的生长缺陷。这些结果在图70A中显示。
为检验来自十二烷酸的异戊二烯产生，将WW10在37℃于含有壮观霉素(50μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的L培养液中以200转/分钟振摇下过夜培养。通过离心并且用改良TM3培养基以细胞的起初培养体积重悬，用这种培养基洗涤细胞。洗涤和重悬的来自该发酵剂培养物的细胞以1比100和1比10稀释至含有0.125％C12脂肪酸(Sigma目录号L9755)的5mL改良TM3培养基中。
为证明从棕榈油产生甲羟戊酸，该油用脂肪酶在37℃和250转/分钟预消化几日以释放脂肪酸(水解的证据由管摇动时形成的泡沫判定)。
此外，培养物通过将洗涤的细胞以1比10稀释到含于带棕榈油的试管内的改良TM3培养基中设立。通过添加0.125％C12FA至剩余部分(2.5mL)的洗涤细胞而无进一步稀释，设立又一个管(生物转化)。在30℃以250转/分钟振摇下生长3.75小时后，通过添加50μM IPTG诱导全部的培养物。孵育继续4小时，此时间后，用改良顶空测定法测定200μL每个培养物的异戊二烯积累量(在30℃以500转/分钟振摇下，1小时积累量)。在GCMS分析前，通过孵育分析玻璃块12小时来进行额外的异戊二烯测定法。继续孵育诱导的培养物过夜，并且次日早晨对200μL等分试样再次分析异戊二烯产生量(1小时，30度，500转/分钟Shel-Lab摇床)。对这些培养物的分析显示产生显著水平的异戊二烯。从已经孵育并且诱导过夜后的过夜发酵剂培养物中以1/10稀释度接种的培养物内观察到最高水平的异戊二烯。这个结果表明这种培养物继续生长并且细胞密度增加。这些结果在图70B中显示。因为脂肪酸悬液具有浑浊的外观，故不可能直接地测量细胞密度。因此，这种培养物的细胞密度通过涂布等分量的所述培养物来确定并且显示8x107个菌落形成单位。这大致对应于OD6000.1。然而，这种培养物提供显著的异戊二烯产生量；对于本实施例中所述的没有该途径的相似菌株，未观察到异戊二烯。
实施例28：在链霉菌物种中表达来自植物的异戊二烯合酶
野葛异戊二烯合酶的基因从质粒pJ201：19813获得。质粒pJ201：19813编码来自野葛(Pueraia lobata)(葛属植物)的异戊二烯合酶并且对荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、沼泽红假单胞菌和棒状杆菌属进行密码子优化(图79A-79C(SEQ ID NO：123))。用限制性酶NdeI和BamHI消化质粒pJ201：19813而释放基因iso19813，其中将所述基因iso19813连接入链霉菌-大肠杆菌穿梭载体pUWL201PW(Doumith等人，Mol.Gen.Genet.264：477-485，2000；图71)以产生pUWL201_iso 。通过pUWL201_iso的限制性分析验证成功的克隆。异戊二烯合酶iso19813的表达处于允许在链霉菌物种中组成型表达、但不允许大肠杆菌中表达的erm-启动子控制下。
将PUWL201PW(无插入序列)和pUWL201_iso通过Hopwood等人，The John innes foundation，Norwich，1985所述的原生质体转化法导入白色链霉菌J1074(Sanchez等人，Chem.Biol.9：519-531，2002)中。
200μL等分试样的原生质体悬液用1.9μg pUWL201PW或2.9μgpUWL201_iso转化。在28℃于非选择性R5琼脂平板上孵育过夜后，通过在含有硫链丝菌肽(250μg/ml)的R3覆层琼脂上进一步孵育4日而选择阳性转化体。通过使用质粒Mini试剂盒(Qiagen)制备质粒，对硫链丝菌肽抗性转化体检验pUWL-质粒的存在。将制备的质粒DNA再导入大肠杆菌DH5α中以产生足够量的待通过限制性分析法分析的质粒DNA。在含有氨苄青霉素的L-琼脂平板上选择阳性转化体，并且通过用NdeI和BamHI核酸内切酶消化质粒DNA进行插入物分析。鉴定到作为阳性pUWL201iso克隆中1.7kb片段的异戊二烯合酶，而在对照菌株(pUWL201PW)中，观察不到该片段。
对白色链霉菌的野生型菌株和含有对照质粒pUWL201PW或编码异戊二烯合酶的pUWL201_iso的转化体分析异戊二烯形成。将菌株一式两份在固体培养基(胰蛋白酶大豆培养液琼脂，TSB；2.5ml)上在硫链丝菌肽(200μg/ml)存在或不存下培养，并且在密封的顶空小瓶(总体积20ml)中于28℃孵育4日。通过GC-MS以SEM模式分析500μl顶空样品(终点量值)，并且根据参比停留时间和分子质量(67m/z)鉴定异戊二烯。通过事先产生的校正曲线定量顶空样品中存在的异戊二烯。尽管野生型白色链霉菌和携带pUWL201PW的对照菌株以略高于检测限值(0.04-0.07ppm)的浓度产生异戊二烯，然而携带pUWL201_iso的白色链霉菌与对照相比以至少十倍的过量产生异戊二烯(0.75ppm；图72)。结果证明植物衍生的异戊二烯合酶在放线菌群的原核生物中成功表达。
实施例29：生物异戊二烯 TM 的回收
从一组4个14-L规模发酵物中以两步骤操作回收生物异戊二烯TM，所述两步骤操作包括通过吸附于活性炭从发酵废气流中汽提异戊二烯、随后离线蒸气解吸附和冷凝以产生液态生物异戊二烯TM(图166A和166B)。由4个发酵器产生的生物异戊二烯TM的总量是1150g(16.9mol)，其中953g(14mol，83％)由碳滤器吸附。在蒸气解吸附和冷凝步骤后，回收的液态生物异戊二烯TM的量是810g，对应于70％整体回收产率。对回收的生物异戊二烯TM分析杂质的存在。
对生物异戊二烯 TM 液体的分析及其杂质情况
通过GC/MS和气相色谱/火焰电离检测法(GC/FID)分析回收的生物异戊二烯TM液体以确定杂质的性质和水平。确定该产物是＞99.5％纯的，并且除许多微量组分外，还含有几种优势杂质。在图167中描绘GC/FID色谱图，并且在表19中显示杂质的常见水平。杂质情况类似于在此规模上产生的其它生物异戊二烯TM批次。
表19.几个批次生物异戊二烯TM中所见杂质的性质和水平的汇总。
Figure BDA0000135567880003121
Figure BDA0000135567880003131
通过吸收剂处理纯化生物异戊二烯 TM
吸收剂广泛地由工业用于从碳氢化合物原料中除去痕量杂质。合适的吸收剂包括沸石、氧化铝和基于二氧化硅的材料。生物异戊二烯TM可以借助通过硅胶大幅度纯化，并且用氧化铝较少程度地纯化。图168显示生物异戊二烯TM样品处理之前(A)和用氧化铝(B)或二氧化硅(C)处理之后的GC/FID色谱图。来自BASF的SelexsorbTM吸收剂产品是用于从生物异戊二烯TM除去极性杂质的所选吸收剂之一。具体地，鉴于其证明过的从异戊二烯和丁二烯原料除去极性杂质的用途，优选Selexsorb CD和CDX产品。
实施例30：生物异戊二烯 TM 的化学转变
化学品和溶剂如从Sigma Aldrich Corp(WI，USA)接收那样使用。通过表达异戊二烯合酶和异源甲羟戊酸(MVA)异戊二烯前体生物合成途径的大肠杆菌BL21菌株的发酵产生生物异戊二烯TM。通过吸附于活性炭从发酵废气中回收生物异戊二烯，随后蒸气解吸附和冷凝以获得粗制的液态生物异戊二烯。生物异戊二烯在使用前才通过分馏纯化。
1H NMR分析
在Varian VNMRS 500MHz NMR系统上记录质子(1H)核磁共振(NMR)谱。全部NMR谱参比于四甲基硅烷(TMS，0ppm)或氯仿(CHCl3，7,26ppm)，并且以ppm记录峰值频率，除非另外指明。样品在氘化的氯仿(CDCl3)或甲醇(CD3OD)中运行。
GC/MS分析
使用Agilent 6890 GC/MS系统进行该分析，所述系统连接以顶空模式运行的CTC Analytics(瑞士)CombiPAL自动采样器。将AgilentHP-5MS GC/MS柱(30m x 0.25mm；0.25μm膜厚度)用于分析物的分离。将采样仪设置成从10μL液体注射器上样1μL液体样品。GC/MS方法利用流速1ml/分钟的氦作为载气。将进样口维持在250℃，分流比100∶1。烘箱程序在50℃开始持续2分钟，以25℃/分钟的速率上升至225℃，随后停留1分钟，总运行时间10分钟。Agilent 5793N质量选择性检测器以扫描模式从m/z 29至500运行。使用1.5分钟的溶剂延迟。在这些条件下，观察到异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)在0.675分钟洗脱。
GC/FID分析
使用Agilent 6890GC/FID系统进行该分析，所述系统连接以液体模式运行的CTC Analytics(瑞士)CombiPAL自动采样器。将AgilentDB-Petro GC柱(100m x 0.25mm；0.50μm膜厚度)用于分析物的分离。将采样仪设置成从10μL液体注射器上样1μL液体样品。GC/FID方法利用流速1ml/分钟的氦作为载气。将进样口维持在200℃，分流比50∶1。烘箱程序在50℃开始持续15分钟，以25℃/分钟的速率上升至250℃，随后停留10分钟，总运行时间33分钟。在280℃以恒定补偿模式维持FID检测器，伴以35mL/分钟的氢流量和250mL/分钟的空气流量。在这些条件下，观察到异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)在13.54分钟洗脱。
I.经热Diels-Alder环加成作用制备异戊二烯的环状二聚体
异戊二烯(1.02g，0.015摩尔)在150℃在充当热聚合抑制剂的2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(0.165g，0.05摩尔)存在下加热24小时。在密封的厚壁玻璃反应容器中进行该反应，所述厚壁玻璃反应容器在该反应前于真空烘箱中干燥24小时。反应混合物用磁力搅拌器搅拌。通过带有质谱仪检测器的气相色谱(GC-MS)监测反应的进程。在反应完成后，所得的异构体混合物使用硅胶层析法以己烷作为洗脱液进行纯化。在旋转真空蒸发器上浓缩后，通过GC-MS和1H-NMR表征该产物。GC-MS：产物A：5.17，5.19分钟；产物B：5.72，5.74分钟；产物C：6.11分钟。1H-NMR(CDCl3)δ：5.8(m)；5.4(m)；4.95(m)；2.4-1.2(m)。
II.经Pd-催化的寡聚化制备异戊二烯低聚物
在密封的厚壁玻璃反应容器中将异戊二烯(2.03g，0.03摩尔)与异丙醇(1.79g，0.03摩尔)混合。在该反应前，玻璃缸在真空烘箱中干燥24小时。全部试剂的转移在惰性氮气氛下进行。将乙酰丙酮合钯(0.55mg，0.06mmole)和三苯膦(1.49mg，0.19mmol)添加至反应混合物。随后加热反应室至100℃持续24小时，以磁力搅拌器提供搅拌。通过GC-MS分析反应的过程。一旦反应完成，使用己烷作为洗脱液，通过硅胶柱层析法分离产物。通过GC-MS和1H-NMR波谱法表征终产物。GC-MS：产物A：5.54分钟；产物B：6.6分钟；产物C：6.85分钟。
III.不饱和化合物的氢化
将实施例2中获得的异构体混合物(1.36g，0.01摩尔)置于配备磁力搅拌器并且含有氢化催化剂(Pd/C，5wt％)(0.21g，0.1mmol)的玻璃缸中。在进行本实验前，全部玻璃器皿经真空干燥。将氢气导入该系统，并且维持压力在3大气压上。几小时后，从反应混合物滤出反应混合物Pd/C，并且产物使用硅胶层析法分离。使用GC-MS和NMR进行终末分析。
IV.异戊二烯的乙氧基化衍生物的制备
在配备磁力搅拌器的厚壁玻璃缸中将异戊二烯(0.982g，0.014摩尔)与异丙醇(0.665g，0.014摩尔)混合。添加催化量的浓硫酸至反应混合物，随后在85℃搅拌过夜。通过GC-MS监测反应的进程。在16小时加热后，GC-MS轨迹揭示存在具有以下停留时间的异构体的混合物：产物A：2.66分钟，m/z+＝99；产物B：3.88m/z+＝99，114；产物C：5.41分钟，m/z+＝87，99，114。
V.使用钌催化剂转化异戊二烯成C10环状二聚体
Figure BDA0000135567880003161
已经针对二甲基-环辛二烯的混合物使用钌催化剂以优异产率实现异戊二烯至C10环状二聚体的转化(Itoh，Kenji；Masuda，Katsuyuki；Fukahori，Takahiko；Nakano，Katsumasa；Aoki，Katsuyuki；Nagashima，Hideo，Organometallics(1994)，13(3)，1020-9)。报道了在极温和温度(低至60℃)高于95％的转化。使用氯化钌(RuCl3)和五甲基环戊二烯(C5Me5H)作为原料，以两个便利步骤制备催化剂，基于五甲基环戊二烯基的钌有机金属化合物。对于所述二聚化反应，该催化剂用三氟甲磺酸银(AgOTf)活化以产生活性种类，但是也可以使用其他活化剂。
VI.使用铬催化剂转化异戊二烯成C15三聚体
使用带有P-N-P配体N，N-双(二芳基膦)胺的铬催化剂，可以进行异戊二烯转化成C15三聚体。如Bowen，L.；Charernsuk，M.；Wass，D.F.Chem.Commun.(2007)2835-2837中所述，原位地制备该催化剂并且使用MAO活化它。报道的异戊二烯至C15三聚体的转化在温和温度(70℃)高达95％，所述C15三聚体由线性和环状产物的混合物(3∶1)组成。在每种情况下鉴定到四聚体作为另外的主要产物。
VII.异戊二烯的氢化
使用H-cube氢化仪(ThalesNano，Princeton，NJ，美国)，将异戊二烯(10mL在无水乙醇(v/v)中的10％溶液)以连续方式氢化成2-甲基丁烷(异戊烷)。将异戊二烯溶液以0.5mL/分钟泵送经过维持于70℃的10％Pd/C催化剂室。在1个大气压下使用“全模式”导入氢气。将产物收集并且通过1H NMR和GC/FID分析，证实除了少量部分氢化的单烯烃外，异戊二烯以超过90％的产率转化成2-甲基丁烷。1H NMR(500MHz，CDCl3)：δ0.8(m，9H，CH3)；1.12(m，2H，CH2)；1.37(m，1H，CH)。GC/FID：2-甲基丁烷；停留时间＝12.69分钟。
VIII.异戊二烯的部分氢化
生物异戊二烯TM产物(50mL，0.5mol)与甲苯(200mL)混合并且经过Midi-Cube氢化仪(ThalesNano，布达佩斯，匈牙利)上的5％Pd/C催化剂在40℃和5bar氢压力下部分地氢化。底物流速是10mL/分钟，并且氢以125mL/分钟(5mmol/分钟)输送。将产物流经过该装置再循环2小时时间，在此时间后，通过GC/MS和GC/FID分析产物的等分试样，所述GC/MS和GC/FID显示除异戊烷和一些未反应的异戊二烯之外，大部分的原料已经转化成异戊烯的混合物(2-甲基-1-丁烯、2-甲基-2-丁烯和3-甲基-1-丁烯)(图170)。
IX.生物异戊二烯 TM 产物的选择性氢化
在上文实施例中所引用的条件下，使用卵壳型Pd/δ-Al2O3催化剂选择性氢化生物异戊二烯TM产物，产生异戊烯的混合物，其中如GC/MS分析所确定，2-甲基-2-丁烯是占＞50％总异戊烯类的主导产物，并且3-甲基-1-丁烯是占＜25％总异戊烯产物的次要产物。异戊烷和残余异戊二烯的量占＜10％的总产物流。使用硫化的钯/碳催化剂来进行该反应时，获得相似的结果。
X.气相中生物异戊二烯 TM 产物的部分氢化
含有生物异戊二烯TM产物的干燥气流与略微过量的氢气混合(mol/mol)，并且使气体混合物通过多相氢化催化剂，例如，如美国专利申请20090203520中所述的具有高孔隙度的IB族增进型钯催化剂，以产生从发酵过程衍生的异戊烯和一种或多种杂质的混合物，其中最初从所述发酵过程衍生生物异戊二烯TM产物。在范围从0.5至200bar的压力和0℃至200℃的温度进行转化。
XI.用固态酸性催化剂二聚化异戊烯
2-甲基-2-丁烯(1.5mL)和甲苯(4mL)在室温与Amberlyst 15酸性树脂(186mg)搅拌12小时。从反应混合物取出等分试样(500μL)并且转移至GC小瓶。通过GC/MS进行混合物的分析(图171)，并且所述分析揭示部分转化成适合作为BioIsofuelTM组分的C10二聚体(二异戊烯)。
二聚化反应的产物(二异戊烯，C10二聚体)是任选地在实施例30，第VII部分中所述的条件下或通过本领域已知使烯烃氢化成异链烷烃的条件[例如，见Marichonna(2001)]充分地氢化。
XII.用固态酸催化剂寡聚化生物异戊二烯 TM 产物
Figure BDA0000135567880003181
生物异戊二烯TM单体、2-甲基-2-丁烯(1.5mL)和甲苯(4mL)的混合物在室温与Amberlyst 15酸性树脂(186mg)搅拌12小时。从反应混合物取出等分试样(500μL)并且转移至GC小瓶。通过GC/MS进行混合物的分析(图172)并且揭示了复杂的产物混合物，其由异戊二烯、线性、环状及芳族C10、C15和更高级低聚物组成。
XIII.用固态酸性催化剂连续寡聚化生物异戊二烯 TM 产物
生物异戊二烯TM单体在含有Amberlyst 15离子交换树脂或等同催化剂的二聚化反应器中连续地转化成C10二聚体和C15三聚体。生物异戊二烯TM进料流包含生物异戊二烯TM单体和任选地生物异戊二烯TM的C5衍生物及共溶剂。该过程在范围从20℃至200℃的温度和0.5至200bar的压力下进行。二聚化步骤的产物在第一分馏塔中分馏以将未反应的异戊二烯与高级(＞C5)低聚物分开。将C5馏分返回二聚化反应器，并且将重质＞C5馏分导入第二分馏塔中，在所述第二分馏塔中从塔顶流收集合乎需要的C10/C15馏分。由＞C15低聚物组成的塔底馏分被送入含有复分解催化剂如Grubbs第二代催化剂的重质循环反应器中。复分解催化剂将一部分高级低聚物馏分通过烯烃交叉复分解反应转化成较轻质组分，这些组分随后送入如图173中所绘制的分馏塔#1中。
总体而言，该过程导致生物异戊二烯单体转化成C10二聚体和C15三聚体BioIsofuelTM前体，所述前体随后在实施例30，第VII部分中所述的条件下经历部分或完全氢化。所得的部分或充分饱和的化合物适合作为BioIsofuelTM组合物和作为BioIsofuelTM调和用储料。
实施例31  13 C/ 12 C同位素分析
13C分析可以通过下述方式进行：将0.5至1.0mg样品载入用于碳同位素分析的锡杯，其中使用Costech ECS4010元素分析仪作为ThermoFinnigan Delta Plus XP同位素比率质谱计的入口。将样品滴入在1020℃的氧化亚钴/氧化钴燃烧反应器，同时使燃烧气在氦气流中以85mL/分钟通过铜反应器(650℃)以使NOx转化成N2。使用3-m
Figure BDA0000135567880003191
分子筛柱将CO2和N2分开。随后，使用两种实验室标准物(乙酰苯胺B，-29.52±0.02‰m和玉米淀粉A，-11.01±0.02‰)，针对VPDB标准校正13C/12C比率，其中所述实验室标准物已经使用T.B.Coplen等人，δ13C测量的新指南(New Guidelines for δ13C Measurements)，Anal.Chem.，78，2439-2441(2006)的2-标准方法，通过离线燃烧和双入口(dual-inlet)分析针对VPDB标准仔细校准。Coplen的教授内容通过引用的方式并入本文，旨在教授用于确定δ13C值的技术。
美国临时专利申请号61/133,521(2008年6月30日提交)和WO2010/05525 A1列出从多种来源衍生的异戊二烯的原料和聚合物的δ13C值，包括表20中所列的δ13C值。
表20
 样品   δ13C
 棕榈油   -30.00
 酵母提取物   -25.70
 来自萃取蒸馏的商业聚异戊二烯   -23.83
 来自软木浆的糖   -23.00
 来自异戊二烯样品B(乳液聚合)的聚异戊二烯   -19.67
 转化糖   -15.37
 来自异戊二烯样品A(钕催化剂)的聚异戊二烯   -14.85
 来自甘蔗渣的葡萄糖   -13.00
 来自玉米秸秆的葡萄糖   -11.20
 玉米淀粉   -11.10
 葡萄糖   -10.73
实施例32-示例性的燃料特性
表21列出可以使用本文所述的方法从异戊二烯制备的某些化合物的燃料特性。
Figure BDA0000135567880003211
Figure BDA0000135567880003221
本文提供的小标题不是本发明的各个方面或实施方式的限制，其中可以通过参考作为一个整体的本说明书来获得本发明。
本说明书中引用的全部出版物、专利申请、和专利通过引用方式并入本文，如同特别地且逐一地指明每份单独的出版物、专利申请、或专利皆通过引用方式并入一样。特别地，本文所引用的全部出版物明确地通过引用方式并入本文，目的在于描述和公开可能连同本发明一起使用的组合物和方法。虽然为了清楚理解的目的，已经通过例示和实例方式在一定程度上描述了前述发明，但是对受到本发明教导内容影响的本领域普通技术人员显而易见的是，可以对其作出某些变化和修改而不脱离随附权力要求的精神或范围。
附录1
示例性1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶核酸和多肽
Figure BDA0000135567880003261
Figure BDA0000135567880003271
示例性乙酰CoA-乙酰转移酶核酸和多肽
Figure BDA0000135567880003281
Figure BDA0000135567880003291
Figure BDA0000135567880003301
Figure BDA0000135567880003311
Figure BDA0000135567880003321
示例性HMG-CoA合酶核酸和多肽
Figure BDA0000135567880003331
Figure BDA0000135567880003341
示例性羟甲基戊二酰-CoA还原酶核酸和多肽
Figure BDA0000135567880003342
Figure BDA0000135567880003351
示例性甲羟戊酸激酶核酸和多肽
Figure BDA0000135567880003352
Figure BDA0000135567880003361
示例性磷酸甲羟戊酸激酶核酸和多肽
Figure BDA0000135567880003371
示例性二磷酸甲羟戊酸脱羧酶核酸和多肽
Figure BDA0000135567880003381
Figure BDA0000135567880003391
示例性异戊烯基磷酸激酶(IPK)核酸和多肽
Figure BDA0000135567880003392
示例性异戊烯基-二磷酸Δ-异构酶(IDI)核酸和多肽
Figure BDA0000135567880003393
Figure BDA0000135567880003401
Figure BDA0000135567880003411
Figure BDA0000135567880003421
示例性异戊二烯合酶核酸和多肽
Genbank登录号.
AY341431
AY316691
AY279379
AJ457070
AY182241

Claims (19)

1.一种用于从生物异戊二烯组合物产生燃料组分的方法，所述方法包括将所述生物异戊二烯组合物中的大部分异戊二烯通过以下方式化学地转变成非异戊二烯化合物：
(a)使所述生物异戊二烯组合物经历适于异戊二烯二聚化的热或催化条件以产生异戊二烯二聚体，并且随后催化地氢化所述异戊二烯二聚体以形成饱和的C10燃料组分；或
(b)(i)部分地氢化所述生物异戊二烯组合物以产生异戊烯，(ii)使所述异戊烯与选自异戊烯、丙烯和异丁烯的单烯烃二聚化以形成二聚物，并且(iii)完全氢化所述二聚物以产生燃料组分。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物异戊二烯组合物中至少约95％的异戊二烯转化成非异戊二烯化合物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中加热所述生物异戊二烯组合物到约150℃至约250℃以产生不饱和的环状异戊二烯二聚体，并且催化地氢化所述不饱和的环状异戊二烯二聚体以产生饱和的环状异戊二烯二聚体燃料组分。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括：(i)使所述生物异戊二烯组合物与用于催化异戊二烯的环二聚化的催化剂接触以产生不饱和的环状异戊二烯二聚体，并且催化地氢化所述不饱和的环状异戊二烯二聚体以产生饱和的环状异戊二烯二聚体燃料组分。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述用于催化异戊二烯的环二聚化的催化剂包括选自镍催化剂、铁催化剂和铬催化剂的催化剂。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述部分地氢化所述生物异戊二烯组合物的步骤包括使所述生物异戊二烯组合物与氢气和用于催化异戊二烯的部分氢化的催化剂接触。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述用于催化异戊二烯的部分氢化的催化剂包括钯催化剂。
8.根据权利要求1所述的方法，其中使所述异戊烯与单烯烃二聚化的步骤包括使所述异戊烯与所述单烯烃在用于催化单烯烃的二聚化的催化剂存在下接触。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述用于催化单烯烃的二聚化的催化剂包括酸催化剂。
10.根据权利要求1所述的方法，还包括在将所述生物异戊二烯组合物化学地转变成燃料组分之前纯化来自所述生物异戊二烯组合物的异戊二烯。
11.一种用于从生物异戊二烯组合物产生燃料组分的系统，其中将所述生物异戊二烯组合物中的大部分异戊二烯化学地转化成非异戊二烯化合物，所述系统包含生物异戊二烯组合物和：
(a)(i)能够使所述生物异戊二烯组合物中的异戊二烯二聚化的一种或多种化学品或能够使所述生物异戊二烯组合物中的异戊二烯二聚化的热源；和(ii)能够氢化异戊二烯二聚体以形成饱和的C10燃料组分的催化剂；或
(b)(i)能够部分地氢化所述生物异戊二烯组合物中的异戊二烯以产生异戊烯的化学品，(ii)能够使所述异戊烯与选自异戊烯、丙烯和异丁烯的单烯烃二聚化以形成二聚物的化学品，和(iii)能够完全氢化所述二聚物以产生燃料组分的化学品。
12.根据权利要求11所述的系统，其中所述生物异戊二烯组合物包含大于约2mg的异戊二烯并且包含重量占所述组合物中全部C5烃的总重量的大于或约99.94％的异戊二烯。
13.根据权利要求11所述的系统，其中能够使异戊二烯二聚化的所述一种或多种化学品包括用于催化异戊二烯的环二聚化的催化剂，所述催化剂包括选自钌催化剂、镍催化剂、铁催化剂和铬催化剂的催化剂。
14.根据权利要求11所述的系统，其中用于氢化不饱和的异戊二烯二聚体的催化剂包括选自钯催化剂、镍催化剂、钌催化剂和铑催化剂的催化剂。
15.根据权利要求11所述的系统，其中能够部分地氢化异戊二烯的化学品包括钯催化剂。
16.根据权利要求11所述的系统，其中能够使所述异戊烯与单烯烃二聚化的化学品包括酸催化剂。
17.一种燃料组合物，其包含由根据权利要求1所述的方法产生的燃料组分。
18.根据权利要求17所述的燃料组合物，其中所述燃料组合物基本上不含异戊二烯。
19.根据权利要求17所述的燃料组合物，其中所述燃料组合物具有大于-22‰或在-32‰至-24‰范围内的δ13C值。
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