CN102686624B - 来自可再生资源的异戊二烯的聚合 - Google Patents

来自可再生资源的异戊二烯的聚合 Download PDF

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Abstract

本发明表征了用于生产源自可再生资源的异戊二烯的聚合物的组合物和方法，所述异戊二烯例如从使用可再生碳源的培养的细胞生产的异戊二烯。起始异戊二烯组合物，诸如生物异戊二烯组合物，与基于石油的异戊二烯的区别在于，纯度特性(例如除了异戊二烯以外的某些C5烃的更低水平，与生产的生物过程有关的某些化合物的存在)和碳同位素的相对含量。根据本发明通过聚合这样的起始异戊二烯组合物得到的聚合物，诸如聚异戊二烯同聚物或具有源自异戊二烯的重复单元的共聚物，可与来自石化产品资源的含有异戊二烯的聚合物区分开。本发明更具体地公开了包含源自异戊二烯单体的重复单元的聚异戊二烯聚合物，其中所述聚异戊二烯聚合物具有大于-22‰的δ13C值。这类聚异戊二烯可以是顺式-1，4-聚异戊二烯同聚物橡胶。也提供了用于验证聚异戊二烯同聚物或具有源自异戊二烯的重复单元的共聚物含有来自可持续的可再生的非石油衍生来源的异戊二烯的方法。

Description

来自可再生资源的异戊二烯的聚合
相关申请的交叉引用 
本申请要求2009年6月17日提交的美国临时专利申请号61/187,944的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文。 
背景技术
异戊二烯(2-甲基-丁-1，3-二烯)是用于多种用途的重要有机化合物。例如，异戊二烯被用作合成许多化学组合物和聚合物的中间体或原料。异戊二烯也是由许多植物和动物(包括人)天然地合成的一种重要生物物质。异戊二烯在室温是无色液体，且是高度可燃性的。 
当在二十世纪六十年代早期它的立体调节的聚合变得商业上可行时，异戊二烯变成可用于合成顺式-1，4-聚丁二烯的一种重要单体。通过这种立体调节的聚合制备的顺式-1，4-聚异戊二烯在结构和性质方面类似于天然橡胶。尽管它不同于天然橡胶，但是它在许多用途中可以用作天然橡胶的替代物。例如，合成的顺式-1，4-聚异戊二烯橡胶被广泛地用于生产轮胎和其它橡胶产品。对合成的顺式-1，4-聚异戊二烯橡胶的这种需求会消耗全球市场上可得到的大部分异戊二烯。剩余的异戊二烯被用于制备其它合成橡胶、嵌段共聚物、和其它化学产品。例如，异戊二烯被用于制备丁二烯-异戊二烯橡胶、苯乙烯-异戊二烯共聚物橡胶、苯乙烯-异戊二烯-丁二烯橡胶、苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物、和苯乙烯-异戊二烯嵌段共聚物。 
多年来，已经研究了许多用于生产异戊二烯的合成途径。例如，通过在有催化剂存在下使异丁烯与甲醛反应来合成异戊二烯，被描述在美国专利3,146,278、美国专利3,437,711、美国专利3,621,072、美国专利3,662,016、美国专利3,972,955、美国专利4,000,209、美国专利4,014,952、美国专利4,067,923、和美国专利4,511,751中。美国专利3,574,780公开了通过使甲基-叔丁基醚和空气的混合物经过混合的氧化物催化剂来生产异戊二烯的 另一种方法。然后使甲基-叔丁基醚在催化剂上裂解成异丁烯和甲醇。生成的甲醇被氧化成甲醛，所述甲醛然后在相同催化剂上与异丁烯反应，以生成异戊二烯。美国专利5,177,290公开了一种用于包括异戊二烯在内的二烯的方法，所述方法包括：在足以生产高产率的二烯且具有醚的最小再循环的反应条件下，使叔烷基醚和氧源的反应混合物在两种不同功能的催化剂上反应。 
在工业用途中使用的异戊二烯通常作为石油或石脑油的热裂解副产物而生产，或者以其它方式从石化流中提取。这是一种相对昂贵的能量集中型方法。由于全球对基于石化产品的产物的需求不断地增加，预期异戊二烯的成本会长期地升高至高得多的水平，且它的可用性在任意情况下会受到限制。换而言之，担心的是，将来从基于石化产品的来源供给异戊二烯将不足以满足突出的需求，且价格会升高到空前的水平。因此，目前需要从环境友好的低成本的可再生来源获取异戊二烯来源。 
另外，在可以将它转化成聚合物之前，从石化产品原料生成的异戊二烯需要大量纯化。需要节省成本的方法来从可再生资源生产高纯度的异戊二烯，并利用生物异戊二烯组合物的高纯度和/或独特的杂质特性，将它转化成聚异戊二烯产物。 
本文描述的发明满足了这些需要，并且还提供了额外的益处。 
发明内容
除了别的以外，本发明提供了用于从可再生资源生产异戊二烯聚合物的组合物和方法。 
因此，在一个方面，本发明提供了用于生产异戊二烯共聚物的系统，所述系统包括：(a)源自可再生资源的异戊二烯起始组合物；和(b)从至少一部分异戊二烯原料生产的聚合物；其中至少一部分异戊二烯起始组合物经历与另一种非异戊二烯分子的聚合，以生成共聚物。在一个实施方式中，所述源自可再生资源的异戊二烯起始组合物包含大于约2mg异戊二烯，且包含重量占组合物中所有的C5烃总重量的大于或约99.94％的异戊二烯。在另一个实施方式中，所述源自可再生资源的异戊二烯起始组合物包 含大于约2mg异戊二烯，且包含一种或多种选自下述的化合物：乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇、和具有10或更多个碳原子的类异戊二烯化合物。在另一个实施方式中，所述源自可再生资源的异戊二烯起始组合物包含大于约2mg异戊二烯，且包含一种或多种选自下述的第二化合物：乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、异丁烯醛、甲基乙烯基酮、2-甲基-2-乙烯基环氧乙烷、顺式-和反式-3-甲基-1，3-戊二烯、C5异戊二烯基醇、2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，4，5-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、二乙酰、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、异丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、3-甲基丁基乙酸酯、3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯、3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯、(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、和2，3-环庚烯醇吡啶；其中第二化合物的量与异戊二烯的量之比是大于或约0.01％(w/w)。在另一个实施方式中，所述源自可再生资源的异戊二烯起始组合物包含大于约2mg异戊二烯，且包含小于或约0.5μg/L的每种化合物(对于组合物中抑制异戊二烯聚合的任意化合物)。在另一个实施方式中，从异戊二烯原料生成的聚合物是包含源自异戊二烯单体的重复单元的聚异戊二烯聚合物，其中所述聚异戊二烯聚合物具有大于-22‰或在-30‰至-28.5‰范围内的δ13C值。在另一个实施方式中，从异戊二烯原料生成的聚合物是包含源自异戊二烯单体和至少一种额外单体的重复单元的聚合物，其中所述聚合物包含源自异戊二烯的重复单元段，且其中源自异戊二烯的重复单元段具有大于-22‰或在-32‰至-24‰范围内的δ13C值。在另一个实施方式中，从异戊二烯原料生成的聚合物是包含源自异戊二烯单体和至少一种额外单体的重复单元的聚合物，其中所述聚合物包含源自异戊二烯的重复单元段，且其中源自异戊二烯的重复单元段具有大于-22‰或在-34‰至-24‰范围内的δ13C值。在另一个实施方式中，所述聚合物是选自下述的共聚物：(i)异戊二烯和1，3-丁二烯的共聚物，(ii)异戊二烯和苯乙烯的共聚物，(iii)异戊二烯、1，3-丁二烯、和苯乙烯的共聚物，和(iv)异戊二烯和α-甲基苯乙烯的共聚物。在另一个实施方式中，从异戊二烯原料生成的聚合物是包含源自异戊二烯 单体的重复单元的聚异戊二烯聚合物，其中所述聚异戊二烯聚合物具有大于0.9的fM值。在另一个实施方式中，所述系统另外包含下述的一种或多种：(i)用于聚合异戊二烯的催化剂，(ii)聚合引发剂，(iii)离子型表面活性剂，(iv)合适的有机溶剂，和(v)聚合链终止剂。 
在另一个方面，本发明提供了用于生产异戊二烯聚合物的系统，所述系统包括：(a)源自可再生资源的异戊二烯起始组合物；和(b)从至少一部分异戊二烯原料生产的聚合物；其中至少一部分异戊二烯起始组合物经历与其它异戊二烯分子的聚合，以生成分子量为约5,000至约100,000的异戊二烯聚合物。 
在另一个方面，本发明提供了用于生产源自可再生资源的异戊二烯的共聚物的方法，所述方法包括：(a)在适合生产异戊二烯的培养条件下培养细胞，所述细胞包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸；(b)生产异戊二烯；和(c)使源自可再生资源的异戊二烯与另一种非异戊二烯分子聚合，以生成共聚物。在一个实施方式中，所述方法另外包括：在聚合之前，从生产异戊二烯的细胞培养物回收异戊二烯。在另一个实施方式中，所述方法另外包括步骤(d)回收生成的聚合物。 
在另一个方面，本发明提供了用于生产源自可再生资源的异戊二烯的聚合物的方法，所述方法包括：(a)在适合生产异戊二烯的培养条件下培养细胞，所述细胞包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸；(b)生产异戊二烯；和(c)使源自可再生资源的异戊二烯与其它异戊二烯分子聚合，以生成分子量为约5,000至约100,000的异戊二烯聚合物。 
在另一个方面，本发明提供了通过本文所述的任意方法生产的源自可再生资源的异戊二烯的聚合物。 
在一个方面，本发明提供了用于生产异戊二烯聚合物的系统，所述系统包括：(a)源自可再生资源的异戊二烯起始组合物；和(b)从至少一部分异戊二烯原料生产的聚合物；其中至少一部分异戊二烯起始组合物经历聚合。在一些实施方式中，源自可再生资源的异戊二烯起始组合物包含大于约2mg异戊二烯，且包含重量占组合物中所有的C5烃总重量的大于或约99.94％的异戊二烯。在一些实施方式中，源自可再生资源的异戊二烯起始 组合物包含大于约2mg异戊二烯，且包含一种或多种选自下述的化合物：乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇、和具有10个或更多个碳原子的类异戊二烯化合物。在一些实施方式中，源自可再生资源的异戊二烯起始组合物包含大于约2mg异戊二烯，且包含一种或多种选自下述的第二化合物：乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、异丁烯醛、甲基乙烯基酮、2-甲基-2-乙烯基环氧乙烷、顺式-和反式-3-甲基-1，3-戊二烯、C5异戊二烯基醇、2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，4，5-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、二乙酰、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、异丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、3-甲基丁基乙酸酯、3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯、3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯、(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、香茅醇和香叶醇；其中第二化合物的量与异戊二烯的量之比是大于或约0.01％(w/w)。在一些实施方式中，源自可再生资源的异戊二烯起始组合物包含大于约2mg异戊二烯，且包含小于或约0.5μg/L的每种化合物(对于组合物中抑制异戊二烯聚合的任意化合物)。 
在一些实施方式中，从异戊二烯原料生产的聚合物是包含源自异戊二烯单体的重复单元的聚异戊二烯聚合物，其中所述聚异戊二烯聚合物具有大于-22‰或在-30‰至-28.5‰范围内的δ13C值。在一些实施方式中，从异戊二烯原料生产的聚合物是包含源自异戊二烯单体和至少一种额外单体的重复单元的聚合物，其中所述聚合物包含源自异戊二烯的重复单元段，且其中源自异戊二烯的重复单元段具有大于-22‰或在-32‰至-24‰范围内的δ13C值。在一些实施方式中，从异戊二烯原料生产的聚合物是包含源自异戊二烯单体和至少一种额外单体的重复单元的聚合物，其中所述聚合物包含源自异戊二烯的重复单元段，且其中源自异戊二烯的重复单元段具有大于-22‰或在-31‰至-24‰范围内的δ13C值。在一些实施方式中，从异戊二烯原料生产的聚合物是包含源自异戊二烯单体和至少一种额外单体的重复单元的聚合物，其中所述聚合物包含源自异戊二烯的重复单元段，且其中源自异戊二烯的重复单元段具有大于-22‰或在-34‰至-24‰范围内的δ13C 值。在一些实施方式中，所述聚合物是选自下述的共聚物：(i)异戊二烯和1，3-丁二烯的共聚物，(ii)异戊二烯和苯乙烯的共聚物，(iii)异戊二烯、1，3-丁二烯、和苯乙烯的共聚物，和(iv)异戊二烯和α-甲基苯乙烯的共聚物。在一些实施方式中，从异戊二烯原料生产的聚合物是包含源自异戊二烯单体的重复单元的聚异戊二烯聚合物，其中所述聚异戊二烯聚合物具有大于0.9的fM值。 
在一些实施方式中，所述系统另外包括：用于聚合异戊二烯的催化剂。在一些实施方式中，所述系统另外包括：聚合引发剂。在一些实施方式中，所述系统另外包括：离子型表面活性剂。在一些实施方式中，所述系统另外包括：合适的有机溶剂。在一些实施方式中，所述系统另外包括：聚合链终止剂。在一些实施方式中，所述系统另外包括：选自1，3-丁二烯和苯乙烯的一种额外的单体。在一些实施方式中，所述系统另外包括：包括1，3-丁二烯和苯乙烯二者的额外单体。 
在一个方面，提供了用于生产源自可再生资源的异戊二烯的聚合物的方法，所述方法包括：(a)获得来自可再生资源的异戊二烯；(b)聚合源自可再生资源的异戊二烯；和(c)回收生成的聚合物。在一些实施方式中，通过包括下述步骤的方法，获得来自可再生资源的异戊二烯：(i)在适合生产异戊二烯的培养条件下培养细胞，所述细胞包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，(ii)生产异戊二烯，和(iii)从培养物回收异戊二烯。也提供了通过本文所述的任意方法生产的源自可再生资源的异戊二烯的聚合物。 
在一个方面，提供了包含源自异戊二烯单体的重复单元的聚异戊二烯聚合物，其中所述聚异戊二烯聚合物具有大于-22‰的δ13C值。在一些实施方式中，所述聚异戊二烯聚合物具有在-30‰至-28.5‰范围内的δ13C值。在一些实施方式中，所述聚异戊二烯聚合物具有在-32‰至-24‰范围内的δ13C值。在一些实施方式中，所述聚异戊二烯聚合物具有在-34‰至-24‰范围内的δ13C值。在多个实施方式中，所述聚异戊二烯不含有蛋白。在一些实施方式中，所述聚异戊二烯是聚异戊二烯同聚物。 
在一个方面，提供了包含源自异戊二烯单体的重复单元的聚异戊二烯聚合物，其中所述聚异戊二烯聚合物具有小于99.9％的顺式-1，4-微结构含 量，其中所述聚异戊二烯聚合物具有小于99.9％的反式-1，4-微结构含量，且其中所述聚异戊二烯聚合物具有大于-22‰的δ13C值。在一些实施方式中，所述聚异戊二烯聚合物具有在-30‰至-28.5‰范围内的δ13C值。在一些实施方式中，所述聚异戊二烯聚合物具有在-32‰至-24‰范围内的δ13C值。在一些实施方式中，所述聚异戊二烯聚合物具有在-34‰至-24‰范围内的δ13C值。 
在一个方面，提供了包含源自异戊二烯单体的重复单元的聚异戊二烯聚合物，其中所述聚异戊二烯聚合物具有大于2％的3，4-微结构含量，且其中所述聚异戊二烯聚合物具有大于-22‰的δ13C值。在一些实施方式中，所述聚异戊二烯聚合物具有在-30‰至-28.5‰范围内的δ13C值。在一些实施方式中，所述聚异戊二烯聚合物具有在-32‰至-24‰范围内的δ13C值。在一些实施方式中，所述聚异戊二烯聚合物具有在-34‰至-24‰范围内的δ13C值。 
在一个方面，提供了包含源自异戊二烯单体的重复单元的聚异戊二烯聚合物，其中所述聚异戊二烯聚合物具有大于2％的1，2-微结构含量，且其中所述聚异戊二烯聚合物具有大于-22‰的δ13C值。在一些实施方式中，所述聚异戊二烯聚合物具有在-30‰至-28.5‰范围内的δ13C值。在一些实施方式中，所述聚异戊二烯聚合物具有在-32‰至-24‰范围内的δ13C值。在一些实施方式中，所述聚异戊二烯聚合物具有在-34‰至-24‰范围内的δ13C值。 
在一个方面，提供了包含源自异戊二烯单体和至少一种额外单体的重复单元的聚合物，其中所述聚合物包含源自异戊二烯的重复单元段，且其中源自异戊二烯的重复单元段具有大于-22‰的δ13C值。在一些实施方式中，所述聚异戊二烯聚合物具有在-30‰至-28.5‰范围内的δ13C值。在一些实施方式中，所述聚异戊二烯聚合物具有在-32‰至-24‰范围内的δ13C值。在一些实施方式中，所述聚异戊二烯聚合物具有在-34‰至-24‰范围内的δ13C值。 
在一个方面，提供了包含源自异戊二烯单体的重复单元的液体聚异戊二烯聚合物，其中所述液体聚异戊二烯聚合物具有在5,000至100,000范围 内的重均分子量，且其中所述液体聚异戊二烯聚合物具有大于-22‰的δ13C值。在一些实施方式中，所述聚异戊二烯聚合物具有在-30‰至-28.5‰范围内的δ13C值。在一些实施方式中，所述聚异戊二烯聚合物具有在-32‰至-24‰范围内的δ13C值。在一些实施方式中，所述聚异戊二烯聚合物具有在-34‰至-24‰范围内的δ13C值。 
在一个方面，提供了用于验证聚异戊二烯同聚物是来自可持续的可再生的非石油衍生来源的方法，所述方法包括：(I)测定聚异戊二烯同聚物的δ13C值；(II)如果所述聚异戊二烯同聚物具有在-34‰至-30‰范围内或在-28.5‰至-24‰范围内的δ13C值，额外地分析所述聚异戊二烯同聚物，以测定：(1)它的顺式-微结构含量、(2)它的3，4-微结构含量、(3)它的1，2-微结构含量、(4)它的重均分子量或(5)是否存在指示天然橡胶的残余蛋白、脂肪酸盐、脂质、树脂、或糖；和(III)如果它具有(i)大于-22‰的δ13C值、(ii)在-30‰至-28.5‰范围内的δ13C值、或(iii)在-34‰至-30‰范围内或在-28.5‰至-24‰范围内的δ13C值，且如果它(a)具有小于100％的顺式-微结构含量、(b)含有3，4-微结构、(c)含有1，2-微结构、(d)具有小于100,000的重均分子量或(e)不含有指示天然橡胶的残余蛋白、脂肪酸盐、脂质、树脂、或糖，则验证聚异戊二烯同聚物是来自可持续的可再生的非石油衍生来源。在一些实施方式中，所述方法另外包括：分析聚合物的14C含量，并验证fM值大于0.9。 
在一个方面，提供了用于验证具有源自异戊二烯的重复单元的共聚物含有来自可持续的可再生的非石油衍生来源的异戊二烯的方法，所述方法包括：(I)测定共聚物中至少一个聚异戊二烯段的δ13C值；和(II)如果所述聚异戊二烯段具有(i)大于-22‰的δ13C值、或(ii)在-34‰至-28.5‰范围内的δ13C值，则验证共聚物中的异戊二烯是来自可持续的可再生的非石油衍生来源。在一些实施方式中，所述方法另外包括：分析聚合物的14C含量，并验证fM值大于0.9。 
在任意方面的一些实施方式中，由培养的细胞生产异戊二烯单体。在一些实施方式中，所述培养的细胞能够生产大于约400纳摩尔或约1000纳摩尔的异戊二烯单体/克细胞的细胞湿重/小时(nmol/gwcm/hr)的异戊二烯 单体。在一些实施方式中，所述细胞具有异源核酸，所述异源核酸：(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)可操作地连接至启动子上。在一些实施方式中，所述细胞培养于包括碳源的培养基中，碳源例如但不限于：碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的成分、或前述2种或更多种的任意组合。在一些实施方式中，在限制葡萄糖条件下培养细胞。 
在一些实施方式中，所述培养的细胞能够将超过约0.002％的细胞培养基中的碳转化成异戊二烯单体。在一些实施方式中，所述细胞具有异源核酸，所述异源核酸：(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)可操作地连接至启动子上。在一些实施方式中，所述细胞培养于包括碳源的培养基中，碳源例如但不限于：碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的成分、或前述2种或更多种的任意组合。在一些实施方式中，在限制葡萄糖条件下培养细胞。 
在一些实施方式中，所述培养的细胞包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸。在一些实施方式中，所述细胞具有异源核酸，所述异源核酸：(i)编码异戊二烯合酶多肽且(ii)可操作地连接至启动子上。在一些实施方式中，所述细胞培养于包括碳源的培养基中，碳源例如但不限于：碳水化合物、丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的成分、或前述2种或更多种的任意组合。在一些实施方式中，在限制葡萄糖条件下培养细胞。 
在一些实施方式中，所述培养的细胞在稳定期中能够生产的异戊二烯单体的量(例如所生产的异戊二烯的总量或所生产的异戊二烯的量/升培养液/小时/OD600)大于在生长期的相同时间段内生产的异戊二烯单体的量，或 是约2倍或更多倍。在一些实施方式中，所述培养的细胞仅能够在稳定期中生产异戊二烯单体。在一些实施方式中，所述培养的细胞能够在生长期和稳定期二者中生产异戊二烯单体。在多个实施方式中，所述培养的细胞在稳定期中能够生产的异戊二烯单体的量大于在生长期的相同时间段内生产的异戊二烯单体的量，或是约2、3、4、5、10、20、30、40、50倍、或更多倍。 
在任意方面的一些实施方式中，异戊二烯单体的异戊二烯是来自组合物。在一些实施方式中，所述组合物包含大于或约2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000mg异戊二烯单体。在一些实施方式中，所述组合物包含大于或约2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100g异戊二烯单体(w/w)，组合物中挥发性有机级分是异戊二烯单体。 
在一些实施方式中，所述组合物包含重量占组合物中所有的C5烃总重量的大于或约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％、或100％的异戊二烯单体。在一些实施方式中，所述组合物包含重量占组合物中所有C5烃总重量的小于或约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的除了异戊二烯单体之外的C5烃(例如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊烯、2-戊烯、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，所述组合物具有重量占组合物中所有C5烃总重量的小于或约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊烯、2-戊烯、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔。在具体的实施方式中，所述组合物具有大于约2mg异戊二烯单体，并具有重量占组合物中所有C5烃总重量的大于或约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％、或100％的异戊二烯单体。 
在一些实施方式中，对于组合物中抑制异戊二烯单体聚合的任意化合 物，组合物具有小于或约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的抑制异戊二烯单体聚合的化合物。在具体的实施方式中，所述组合物还具有大于约2mg异戊二烯单体。 
在一些实施方式中，所述组合物具有一种或多种选自下述的化合物：乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇、和具有10个或更多个碳原子的类异戊二烯化合物。在一些实施方式中，所述组合物具有大于或约0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、60、80、100、或120μg/L的乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇(例如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)、或前述的任意两种或更多种。在具体实施方式中，所述组合物具有大于约2mg异戊二烯单体，且具有一种或多种选自下述的化合物：乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇、和具有10个或更多个碳原子的类异戊二烯化合物。 
在一些实施方式中，所述组合物包括异戊二烯单体和一种或多种选自下述的第二化合物：2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，4，5-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、二乙酰、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、异丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、3-甲基丁基乙酸酯、3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯、3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯、(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、香茅醇和香叶醇。在多个实施方式中，按照重量百分比单位，这些第二成分中的一种的量相对于异戊二烯单体的量(即所述成分的重量除以异戊二烯的重量乘以100)是大于或大约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或110％(w/w)。 
在一些实施方式中，组合物包含(i)包含异戊二烯单体的气相和(ii)生产大于约400nmol/gwcm/hr的异戊二烯的培养的细胞。在一些实施方式中，组合物包含封闭的系统，并且气相包含大于或约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/L的异戊二烯单体(当针对培养了1小时的1mL 1OD600进行校正时)。在一些实施方式中，组合物包含开放的系统，并且气相包含大于或约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/L 的异戊二烯单体(当以1vvm的速率鼓泡时)。在一些实施方式中，气相的挥发性有机级分包含重量占挥发性有机级分中所有C5烃总重量的大于或约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％、或100％的异戊二烯单体单体。在一些实施方式中，气相的挥发性有机级分包含重量占挥发性有机级分中所有C5烃总重量的小于或约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的除了异戊二烯单体的以外的C5烃(例如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊烯、2-戊烯、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，气相的挥发性有机级分具有重量占挥发性有机级分中所有C5烃总重量的小于或约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊烯、2-戊烯、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔。在具体的实施方式中，气相的挥发性有机级分具有大于约2mg异戊二烯单体，并且具有重量占挥发性有机级分中所有C5烃总重量的大于或约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％、或100％的异戊二烯单体单体。 
在一些实施方式中，对于气相的挥发性有机级分中的抑制异戊二烯单体聚合的任意化合物，组合物的气相的挥发性有机级分具有小于或约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的抑制异戊二烯聚合的化合物。在具体的实施方式中，气相的挥发性有机级分还具有大于约2mg异戊二烯单体。 
在一些实施方式中，组合物的气相的挥发性有机级分具有一种或多种选自下述的化合物：乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇、和具有10个或更多个碳原子的类异戊二烯化合物。在一些实施方式中，气相的挥发性有机级分具有大于或约0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、60、80、100、或120μg/L的乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇(例如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)、或前述的任意两种或更多种。在具体实施 方式中，气相的挥发性有机级分具有大于约2mg异戊二烯单体，且具有一种或多种选自下述的化合物：乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇、和具有10个或更多个碳原子的类异戊二烯化合物。 
在一些实施方式中，组合物的气相的挥发性有机级分包括异戊二烯单体和一种或多种选自下述的第二化合物：2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，4，5-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、二乙酰、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、异丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、3-甲基丁基乙酸酯、3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯、3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯、(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、香茅醇和香叶醇。在多个实施方式中，按照重量百分比单位，这些第二成分中的一种的量相对于异戊二烯单体的量(即所述成分的重量除以异戊二烯的重量乘以100)是气相的挥发性有机级分的大于或约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或110％(w/w)。 
在任意组合物的一些实施方式中，至少一部分的异戊二烯单体在气相中。在一些实施方式中，至少一部分的异戊二烯单体在液相(例如冷凝物)中。在一些实施方式中，至少一部分的异戊二烯单体在固相中。在一些实施方式中，至少一部分的异戊二烯单体吸附至固体支持物，例如包括二氧化硅和/或活性炭的支持物。在一些实施方式中，组合物包括乙醇。在一些实施方式中，组合物包括约75重量％至约90重量％的乙醇，例如约75重量％至约80重量％、约80重量％至约85重量％、或约85重量％至约90重量％的乙醇。在一些实施方式中，组合物包含约4重量％至约15重量％的异戊二烯单体，例如约4重量％至约8重量％、约8重量％至约12重量％、或约12重量％至约15重量％的异戊二烯单体。 
在一些实施方式中，所述培养的细胞来自系统，所述系统包括反应室，其中所述细胞能够生产大于约400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、或更多nmol/gwcm/hr的异戊二烯单体。在一些实施方式中，系统不是封闭系统。在一些实施方 式中，从系统中回收至少一部分的异戊二烯单体。在一些实施方式中，系统包括包含异戊二烯单体的气相。在多个实施方式中，气相包含本文描述的任意组合物。 
在一个方面，提供了轮胎，所述轮胎包含本文所述的任意聚异戊二烯聚合物。例如，在一个实施方式中，提供了包含聚异戊二烯聚合物的轮胎，所述聚异戊二烯聚合物包含源自异戊二烯单体的重复单元，其中所述聚异戊二烯聚合物具有大于-22‰的δ13C值或在-30‰至-28.5‰、-32‰至-24‰、或-34‰至-24‰范围内的δ13C值。在这些实施方式中的一些中，所述聚异戊二烯不含有蛋白。在一些实施方式中，所述聚异戊二烯是聚异戊二烯同聚物。 
在一些实施方式中，如下生产本文所述的聚异戊二烯聚合物：(i)使本文描述的任意组合物中的异戊二烯单体聚合，或(ii)使从本文描述的任意组合物回收的异戊二烯聚合。在一些实施方式中，提供了如下生产本文所述的任意聚异戊二烯聚合物的方法：(i)使本文描述的任意组合物中的异戊二烯单体聚合，或(ii)使从本文描述的任意组合物回收的异戊二烯聚合。 
在本文所述的任意组合物、系统、和方法的一些实施方式中，生产气相中的非可燃浓度的异戊二烯单体。在一些实施方式中，气相包含小于约9.5％(体积)的氧。在一些实施方式中，气相包含大于或约9.5％(体积)的氧，并且气相中的异戊二烯单体的浓度小于燃烧下限或大于燃烧上限。在一些实施方式中，除了异戊二烯单体以外的气相部分包含约0％至约100％(体积)的氧，例如约10％至约100％(体积)的氧。在一些实施方式中，除了异戊二烯单体以外的气相部分包含约0％至约99％(体积)的氮。在一些实施方式中，除了异戊二烯单体以外的气相部分包含约1％至约50％(体积)的CO2。 
在一些实施方式中，培养的细胞生产大于或约400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、或更多nmol/gwcm/hr异戊二烯的异戊二烯单体。在一些实施方式中，所述培养的细胞将大于或约0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.12、0.14、0.16、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6％或更 多的细胞培养基中的碳转化为异戊二烯单体。在一些实施方式中，所述培养的细胞以大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、100,000、或更多ng异戊二烯单体/克细胞的细胞湿重/hr(ng/gwcm/h)生产异戊二烯单体。在一些实施方式中，所述培养的细胞以大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、50,000、100,000、或更多mg异戊二烯/L培养液(mg/L培养液，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)生产异戊二烯单体的累积效价(总量)。本文公开了异戊二烯单体生产的其它示例性速率和异戊二烯单体生产的总量。 
在任意方面的一些实施方式中，所述培养的细胞另外包含编码IDI多肽的异源核酸。在一些实施方式中，所述细胞另外包含编码IDI多肽的内源核酸的拷贝的插入。在一些实施方式中，所述细胞另外包含编码DXS多肽的异源核酸。在一些实施方式中，所述细胞另外包含编码DXS多肽的内源核酸的拷贝的插入。在一些实施方式中，所述细胞另外包含一个或多个编码IDI多肽和DXS多肽的核酸。在一些实施方式中，一个核酸编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽、和DXS多肽。在一些实施方式中，一个载体编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽、和DXS多肽。在一些实施方式中，所述载体包含选择性标志物，例如抗生素抗性核酸。 
在一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸可操作地连接至T7启动子，例如包含于中等或高拷贝质粒中的T7启动子。在一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸可操作地连接至Trc启动子，例如包含于中等或高拷贝质粒中的Trc启动子。在一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸可操作地连接至Lac启动子，例如包含于低拷贝质粒中的Lac启动子。在一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸可操作地连接至内源启动子，例如内源碱性丝氨酸蛋白酶启动子。在一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸整合进入不含选择性标志物的细胞染色体中。 
在一些实施方式中，一个或多个MVA途径、IDI、DXP、或异戊二烯 合酶核酸被置于在稳定期中比在生长期中更有活性的启动子或因子的控制之下。例如，一个或多个MVA途径、IDI、DXP、或异戊二烯合酶核酸可以置于稳定期∑因子(例如RpoS)的控制之下。在一些实施方式中，一个或多个MVA途径、IDI、DXP、或异戊二烯合酶核酸被置于在稳定期中可诱导的启动子(例如可被在稳定期中有活性的响应调节物诱导的启动子)的控制之下。 
在一些实施方式中，至少一部分培养的细胞维持异源异戊二烯合酶核酸至少或约5、10、20、40、50、60、65次、或更多次在连续培养(例如没有稀释的连续培养)中的细胞分裂。在一些实施方式中，包含异戊二烯合酶、IDI、或DXS核酸的核酸也包含选择性标志物，诸如抗生素抗性核酸。 
在一些实施方式中，所述培养的细胞另外包含编码MVA途径多肽(例如来自酿酒酵母或粪肠球菌的MVA途径多肽)的异源核酸。在一些实施方式中，所述细胞另外包含编码MVA途径多肽(例如来自酿酒酵母或粪肠球菌的MVA途径多肽)的内源核酸的拷贝的插入。在一些实施方式中，所述细胞包含异戊二烯合酶、DXS、和MVA途径核酸。在一些实施方式中，所述细胞包含异戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸、和MVA途径核酸(除了IDI核酸以外)。 
在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是来自植物的天然存在的多肽，所述植物例如葛属(例如越南葛藤或葛根)。 
在一些实施方式中，所述培养的细胞是细菌细胞，例如革兰氏阳性细菌细胞(例如，芽孢杆菌属细胞，例如枯草芽孢杆菌细胞；或链霉菌属细胞，例如浅青紫链霉菌、天蓝色链霉菌、或灰色链霉菌细胞)。在一些实施方式中，所述培养的细胞是革兰氏阴性细菌细胞(例如，埃希菌属细胞，例如大肠杆菌细胞；或泛菌属细胞，例如柠檬泛菌细胞)。在一些实施方式中，所述培养的细胞是真菌细胞，例如丝状真菌细胞(例如，木霉菌属细胞，例如里氏木霉细胞；或曲霉菌属细胞，例如米曲霉和黑曲霉)或酵母细胞(例如，耶氏酵母属细胞，例如解脂耶氏酵母细胞)。 
在一些实施方式中，微生物多肽碳源包括来自酵母或细菌的一种或多种多肽。在一些实施方式中，植物多肽碳源包括来自大豆、玉米、油菜、 麻风树、棕榈、花生、向日葵、椰子、芥、油菜籽、棉花籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、或亚麻仁的一种或多种多肽。 
在一个方面，本发明表征了由本发明的任意组合物或方法生产的产物。 
附图说明
图1是针对在大肠杆菌中的表达进行了密码子优化的野葛(kudzu)异戊二烯合酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。atg起始密码子以斜体表示，终止密码子以加粗字体表示，添加的PstI位点以下划线标示。 
图2是pTrcKudzu的图谱。 
图3A-3C是pTrcKudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。RBS以下划线标示，野葛异戊二烯合酶起始密码子以加粗大写字母表示，终止密码子以加粗大写斜体字母表示。载体骨架是pTrcHis2B。 
图4是pETNHisKudzu的图谱。 
图5A-5C是pETNHisKudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)。 
图6是pCL-lac-Kudzu的图谱。 
图7A-7C是pCL-lac-Kudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)。 
图8A的图显示了在无载体的大肠杆菌BL21细胞中生产异戊二烯。 
图8B的图显示了在具有pCL-lac-Kudzu的大肠杆菌BL21细胞中生产异戊二烯。 
图8C的图显示了在具有pTrcKudzu的大肠杆菌BL21细胞中生产异戊二烯。 
图8D的图显示了在具有pETN-HisKudzu的大肠杆菌BL21细胞中生产异戊二烯。 
图9A的图显示了在14升的补料分批发酵中，大肠杆菌BL21/pTrcKudzu的发酵随时间的OD。 
图9B的图显示了在14升的补料分批发酵中，大肠杆菌BL21/pTrcKudzu的发酵随时间生产的异戊二烯。 
图10A的图显示了柠檬泛菌(Pantoea citrea)中异戊二烯的生产。对照细胞中无重组野葛异戊二烯合酶。灰色菱形表示异戊二烯的合成，黑色方 框表示OD600。 
图10B的图显示了表达pCL-lac Kudzu的柠檬泛菌中异戊二烯的生产。灰色菱形表示异戊二烯的合成，黑色方框表示OD600。 
图10C的图显示了表达pTrcKudzu的柠檬泛菌中异戊二烯的生产。灰色菱形表示异戊二烯的合成，黑色方框表示OD600。 
图11的图显示了表达重组异戊二烯合酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中异戊二烯的生产。BG3594comK是无质粒的枯草芽孢杆菌菌株(天然的异戊二烯生产)。CF443-BG3594comK是具有pBSKudzu的枯草芽孢杆菌菌株(重组的异戊二烯生产)。y轴上的IS表示异戊二烯。 
图12A-12C是pBS Kudzu#2的核苷酸序列(SEQ ID NO：57)。 
图13是针对在耶氏酵母属(Yarrowia)中的表达进行了密码子优化的野葛异戊二烯合酶的核苷酸序列(SEQ ID NO：8)。 
图14是包含针对在耶氏酵母属中的表达进行了密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的pTrex3g的图谱。 
图15A-15C是载体pSPZ1(MAP29Spb)的核苷酸序列(SEQ ID NO：11)。 
图16是针对在耶氏酵母属中的表达进行了密码子优化的合成的野葛(越南葛藤(Pueraria montana))异戊二烯基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：12)。 
图17是合成的杂交白杨(poplar)(银白杨(Populus alba)x 欧洲山杨(Populus tremula))异戊二烯合酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：13)。ATG起始密码子以加粗表示，终止密码子以下划线标示。 
图18A(图18A1和18A2)显示了载体pYLA1、pYL1和pYL2的构建示意图。 
图18B显示了载体pYLA(POP1)的构建示意图。 
图18C显示了载体pYLA(KZ1)的构建示意图。 
图18D显示了载体pYLI(KZ1)的构建示意图。 
图18E显示了载体pYLI(MAP29)的构建示意图。 
图18F显示了载体pYLA(MAP29)的构建示意图。 
图19(图19A)显示了异戊二烯的MVA和DXP代谢途径(基于F.Bouvier等人，Progress in Lipid Res.44：357-429，2005)。以下描述包括该途径中的每种多肽的替代性名称，以及公开了用于测定指明的多肽的活性的测定法的参考文献(这些文献中的每一篇皆通过引用方式整体并入本文，尤其是关于测定MVA和DXP途径中的多肽的多肽活性的测定法的那些)。甲羟戊酸途径：AACT；乙酰基-辅酶A乙酰基转移酶，MvaE，EC 2.3.1.9.测定法：J.Bacteriol.，184：2116-2122，2002；HMGS；羟基甲基戊二酰-辅酶A合酶，MvaS，EC 2.3.3.10.测定法：J.Bacteriol.，184：4065-4070，2002；HMGR；3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶，MvaE，EC 1.1.1.34.测定法：J.Bacteriol.，184：2116-2122，2002；MVK；甲羟戊酸激酶，ERG12，EC 2.7.1.36.测定法：Curr Genet 19：9-14，1991.PMK；磷酸甲羟戊酸激酶，ERG8，EC 2.7.4.2，测定法：Mol Cell Biol.，11：620-631，1991；DPMDC；二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，MVD1，EC 4.1.1.33.测定法：Biochemistry，33：13355-13362，1994；IDI；异戊烯-二磷酸δ-异构酶，IDI1，EC 5.3.3.2.Assay：J.Biol.Chem.264：19169-19175，1989.DXP Pathway：DXS；1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶，dxs，EC 2.2.1.7.测定法：PNAS，94：12857-62，1997；DXR；1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶，dxr，EC 2.2.1.7.测定法：Eur.J.Biochem.269：4446-4457，2002；MCT；4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合酶，IspD，EC 2.7.7.60.测定法：PNAS，97：6451-6456，2000；CMK；4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶，IspE，EC 2.7.1.148.测定法：PNAS，97：1062-1067，2000；MCS；2C-甲基-D-赤藓醇2，4-环二磷酸合酶，IspF，EC 4.6.1.12.测定法：PNAS，96：11758-11763，1999；HDS；1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶，ispG，EC 1.17.4.3.测定法：J.Org.Chem.，70：9168-9174，2005；HDR；1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶，IspH，EC 1.17.1.2.测定法：JACS，126：12847-12855，2004。 
图19(图19B)显示了经典的和修饰的MVA途径。1，乙酰基-辅酶A乙酰基转移酶(AACT)；2，HMG-辅酶A合酶(HMGS)；3，HMG-辅酶A还原酶(HMGR)；4，甲羟戊酸激酶(MVK)；5，磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)；6，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD或DPMDC)；7，异戊烯二磷酸异构酶(IDI)；8， 磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)；9，异戊烯磷酸激酶(IPK)。经典的MVA途径从反应1开始，经过反应5和6一直到达反应7，而修饰的MVA途径经过翻译8和9。结构式中的P和PP分别是磷酸和焦磷酸。该图取自Koga和Morii，Microbiology and Mol.Biology Reviews，71：97-120，2007，该文献通过引用整体并入本文，尤其是关于修饰的MVA途径的核酸和多肽的部分。修饰的MVA途径存在于例如一些古细菌生物体(诸如马氏甲烷八叠球菌)中。 
图20(图20A和20B)中的图显示了由不含(左侧)或含有(右侧)野葛异戊二烯合酶基因的重组解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)菌株生产的异戊二烯的GC-MS分析的结果。箭头表示真实的异戊二烯标准物的洗脱时间。 
图21是pTrcKudzu yIDI DXS Kan的图谱。 
图22A-22D是pTrcKudzu yIDI DXS Kan的核苷酸序列(SEQ ID NO：20)。 
图23A的图显示了在BL21/pTrcKudzukan中，从葡萄糖生产异戊二烯。时间0是以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆形代表总的异戊二烯生产率(μg/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。 
图23B的图显示了在BL21/pTrcKudzu yIDI kan中，从葡萄糖生产异戊二烯。时间0是以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆形代表总的异戊二烯生产率(μg/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。 
图23C的图显示了在BL21/pTrcKudzu DXS kan中，从葡萄糖生产异戊二烯。时间0是以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆形代表总的异戊二烯生产率(μg/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。 
图23D的图显示了在BL21/pTrcKudzu yIDI DXS kan中，从葡萄糖 生产异戊二烯。时间0是以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆形代表总的异戊二烯生产率(μg/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。 
图23E的图显示了在BL21/pCL PtrcKudzu中，从葡萄糖生产异戊二烯。时间0是以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆形代表总的异戊二烯生产率(μg/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。 
图23F的图显示了在BL21/pCL PtrcKudzu yIDI中，从葡萄糖生产异戊二烯。时间0是以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆形代表总的异戊二烯生产率(μg/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。 
图23G的图显示了在BL21/pCL PtrcKudzu DXS中，从葡萄糖生产异戊二烯。时间0是以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆形代表总的异戊二烯生产率(μg/L)，方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。 
图23H的图显示了在BL21/pTrcKudzuIDIDXSkan中，从葡萄糖生产异戊二烯。箭头指示以IPTG(400μmol)诱导时的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600，y2轴是异戊二烯的总生产率(μg/L顶空或比生产率(μg/L顶空/OD)。黑色菱形代表OD600，黑色三角形代表异戊二烯生产率(μg/L)，白色方框代表异戊二烯的比生产率(μg/L/OD)。 
图24是pTrcKKDyIkIS kan的图谱。 
图25A-25D是pTrcKKDyIkIS kan的核苷酸序列(SEQ ID NO：33)。 
图26是pCL PtrcUpperPathway的图谱。 
图27A-27D是pCL PtrcUpperPathway的核苷酸序列(SEQ ID NO：46)。 
图28显示了包含下部MVA途径和用于整合进入枯草芽孢杆菌染色体的nprE基因座的酵母idi的盒的图谱。nprE上游/下游表示距离nprE基因座各1kb的序列以用于整合。aprE启动子(碱性丝氨酸蛋白酶启动子)表示aprE基因的启动子(-35，-10，+1转录起始位点，RBS)。MVK1表示酵母甲羟戊酸激酶基因。RBS-PMK表示在起始位点上游具有芽孢杆菌RBS的酵母磷酸甲羟戊酸激酶基因。RBS-MPD表示在起始位点上游具有芽孢杆菌RBS的酵母二磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因。RBS-IDI表示在起始位点上游具有芽孢杆菌RBS的酵母idi基因。终止子表示来自解淀粉芽孢杆菌(B.amyliquefaciens)的终止子碱性丝氨酸蛋白酶转录终止子。SpecR表示壮观霉素抗性标志物。“用于扩增的nprE上游重复序列”表示用于扩增的上游区的直接重复序列。 
图29A-29D是含有下部MVA途径和用于整合进入枯草芽孢杆菌染色体的nprE基因座的酵母idi的盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：47)。 
图30是p9796-poplar的图谱。 
图31A-31B是p9796-poplar的核苷酸序列(SEQ ID NO：48)。 
图32是pTrcPoplar的图谱。 
图33A-33C是pTrcPoplar的核苷酸序列(SEQ ID NO：49)。 
图34是pTrcKudzu yIDI Kan的图谱。 
图35A-35C是pTrcKudzu yIDI Kan的核苷酸序列(SEQ ID NO：50)。 
图36是pTrcKudzuDXS Kan的图谱。 
图37A-37C是pTrcKudzuDXS Kan的核苷酸序列(SEQ ID NO：51)。 
图38是pCL PtrcKudzu的图谱。 
图39A-39C是pCL PtrcKudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO：52)。 
图40是pCL PtrcKudzu A3的图谱。 
图41A-41C是pCL PtrcKudzu A3的核苷酸序列(SEQ ID NO：53)。 
图42是pCL PtrcKudzu yIDI的图谱。 
图43A-43C是pCL PtrcKudzu yIDI的核苷酸序列(SEQ ID NO：54) 。 
图44是pCL PtrcKudzu DXS的图谱。 
图45A-45D是pCL PtrcKudzu DXS的核苷酸序列(SEQ ID NO：55)。 
图46A-46E的图显示了从生物质原料生产异戊二烯。图板A显示了从玉米秸秆生产异戊二烯，图板B显示了从甘蔗渣生产异戊二烯，图板C显示了从软木浆生产异戊二烯，图板D显示了从葡萄糖生产异戊二烯，图板E显示了不用额外的原料从细胞生产异戊二烯。灰色方框代表在接种后的指明的时间培养物的OD600测量值，黑色三角形代表在接种后的指明的时间异戊二烯的产量。 
图47A的图显示了在未添加葡萄糖的培养物中，由BL21(λDE3)pTrcKudzu yIDI DXS(kan)生产的异戊二烯。方框代表OD600，三角形代表生产的异戊二烯(μg/ml)。 
图47B的图显示了由BL21(λDE3)pTrcKudzu yIDI DXS(kan)从1％的葡萄糖原料转化糖生产的异戊二烯。方框代表OD600，三角形代表生产的异戊二烯(μg/ml)。 
图47C的图显示了由BL21(λDE3)pTrcKudzu yIDI DXS(kan)从1％的转化糖原料生产的异戊二烯。方框代表OD600，三角形代表生产的异戊二烯(μg/ml)。 
图47D的图显示了由BL21(λDE3)pTrcKudzu yIDI DXS(kan)从1％的AFEX玉米秸秆原料生产的异戊二烯。方框代表OD600，三角形代表生产的异戊二烯(μg/ml)。 
图48A-48C的图显示了酵母提取物对生产异戊二烯的影响。图板A显示了加入不同量的酵母提取物的发酵罐内的光密度的时间进程。图板B显示了加入不同量的酵母提取物的发酵罐内的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。图板C显示了酵母提取物对于补料分批培养物中生长的大肠杆菌生产异戊二烯的影响。 
图49A-49C的图显示了从500L生物反应器中由含有pTrcKudzu+yIDI+DXS质粒的大肠杆菌细胞生产的异戊二烯。图板A显示了加入了葡萄糖和酵母提取物的500L生物反应器中的光密度的时间进程。图板B 显示了加入了葡萄糖和酵母提取物的500L生物反应器的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。图板C显示了从加入了葡萄糖和酵母提取物的500L生物反应器中生产的总的异戊二烯的时间进程。 
图50是pJMupperpathway2的图谱。 
图51A-51C是pJMupperpathway2的核苷酸序列(SEQ ID NO：56)。 
图52是pBS Kudzu#2的图谱。 
图53A的图显示了在14升的补料分批发酵中，表达重组野葛异戊二烯合酶的芽孢杆菌的发酵时间过程中的生长。黑色菱形代表无重组异戊二烯合酶的对照菌株(BG3594comK)(天然的异戊二烯生产)，灰色三角形代表CF443，即具有pBSKudzu的芽孢杆菌菌株BG3594comK(重组的异戊二烯生产)。 
图53B的图显示了在14升的补料分批发酵中，表达重组野葛异戊二烯合酶的芽孢杆菌的发酵时间过程中的异戊二烯生产。黑色菱形代表无重组异戊二烯合酶的对照菌株(BG3594comK)(天然的异戊二烯生产)，灰色三角形代表具有pBSKudzu的芽孢杆菌(重组的异戊二烯生产)。 
图54是加入了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度的时间进程。 
图55是加入了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。 
图56是从加入了葡萄糖的15L生物反应器中生产的总的异戊二烯的时间进程。 
图57是加入了甘油的15L生物反应器中的光密度的时间进程。 
图58是加入了甘油的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。 
图59是从加入了甘油的15L生物反应器中生产的总的异戊二烯的时间进程。 
图60A-60C是加入了葡萄糖的150L生物反应器中的光密度、甲羟戊酸效价、和比生产率的时间进程。 
图61A-61C是加入了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度、甲羟戊酸 效价、和比生产率的时间进程。 
图62A-62C是加入了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度、甲羟戊酸效价、和比生产率的时间进程。 
图63A-63C是加入了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度、异戊二烯效价、和比生产率的时间进程。 
图64A-64C是加入了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度、异戊二烯效价、和比生产率的时间进程。 
图65A-65C是加入了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度、异戊二烯效价、和比生产率的时间进程。 
图66A-66C是加入了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度、异戊二烯效价、和比生产率的时间进程。 
图67A-67C是加入了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度、异戊二烯效价、和比生产率的时间进程。 
图68的图是：对于系列A，对于多个氧水平，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。图例中列出的曲线是按照它们在图中出现的顺序。例如，图例中的第一个条目(40℃空气中的异戊二烯)对应于图中最高的曲线。 
图69的图是：对于系列B，对于多个氧水平与4％的水，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。图例中列出的曲线是按照它们在图中出现的顺序。 
图70的图是：对于系列C，对于多个氧水平与5％的CO2，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。图例中列出的曲线是按照它们在图中出现的顺序。 
图71的图是：对于系列D，对于多个氧水平与10％的CO2，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。图例中列出的曲线是按照它们在图中出现的顺序。 
图72的图是：对于系列E，对于多个氧水平与15％的CO2，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。图例中列出的曲线是按照它们在图中出现的顺序。 
图73的图是：对于系列F，对于多个氧水平与20％的CO2，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。图例中列出的曲线是按照它们在图中出现的顺序。 
图74的图是：对于系列G，对于多个氧水平与30％的CO2，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。图例中列出的曲线是按照它们在图中出现的顺序。 
图75A的表是：对于系列A，从重量％转化为体积％的CAFT模型结果。 
图75B的图是：对于系列A，将图68针对体积％作图，从CAFT模型获得的可燃性结果。 
图76A的表是：对于系列B，从重量％转化为体积％的CAFT模型结果。 
图76B的图是：对于系列B，将图69针对体积％作图，从CAFT模型获得的可燃性结果。 
图77的图显示了可燃性测试的器皿。 
图78A的图是测试系列1(0％蒸汽、0psig、和40℃)的可燃性曲线。 
图78B的表总结了测试系列1的爆炸和非爆炸数据点。 
图78C的图是测试系列1的可燃性曲线与CAFT模型的比较。 
图79A的图是测试系列2(4％蒸汽、0psig、和40℃)的可燃性曲线。 
图79B的表总结了测试系列2的爆炸和非爆炸数据点。 
图79C的图是测试系列2的可燃性曲线与CAFT模型的比较。 
图80A和80B的表是测试系列1的详细实验条件和结果。 
图81的表是测试系列2的详细实验条件和结果。 
图82的图是：在3个大气压下，对于多个氮/氧比例，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。 
图83的图是：在1个大气压下，对于多个氮/氧比例，随着燃料浓度变化的计算的绝热火焰温度。 
图84的图是：使用来自图82的数据，按照实施例13描述的方法构建的可燃性包迹(envelope)。实验数据点(圆圈)来自本文描述的在1个大气 压的最初系统压力下进行的测试。 
图85的图是：使用来自图83的数据，按照实施例13描述的方法构建的可燃性包迹。实验数据点(圆圈)来自本文描述的在1个大气压的最初系统压力下进行的测试。 
图86A是发酵废气的GC/MS色谱图。 
图86B是图86A的扩展，以显示存在于发酵废气中的较少的挥发物。 
图87A是在-78℃进行低温冷阱后，存在于废气中的痕量挥发物的GC/MS色谱图。 
图87B是在-196℃进行低温冷阱后，存在于废气中的痕量挥发物的GC/MS色谱图。 
图87C是图87B的扩展。 
图87D是图87C的扩展。 
图88A和88B是GC/MS色谱图，比较了源自汽油的异戊二烯(图88A)与生物生产的异戊二烯(图88B)的C5烃。标准物含有在异戊二烯主峰附近洗脱的3种C5烃杂质(图88A)。与之相反，生物生产的异戊二烯含有某些量的乙醇和丙酮(运行时间为3.41分钟)(图88A)。 
图89是表达野葛异戊二烯合酶并进料葡萄糖与3g/L酵母提取物的大肠杆菌BL21(DE3)pTrcIS菌株的发酵废气的分析的图。 
图90显示了在结构上与异戊二烯相似并且也可以用作聚合催化剂毒的数种杂质的结构。 
图91是pTrcHis2AUpperPathway(也称作pTrcUpperMVA)的图谱。 
图92A-92C是pTrcHis2AUpperPathway(也称作pTrcUpperMVA)的核苷酸序列(SEQ ID NO：86)。 
图93是加入了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度的时间进程。 
图94是加入了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。 
图95是加入了葡萄糖的15L生物反应器中生产的总异戊二烯的时间进程。 
图96是进料了转化糖的15L生物反应器中的光密度的时间进程。 
图97是进料了转化糖的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。 
图98是进料了转化糖的15L生物反应器中生产的总异戊二烯的时间进程。 
图99是加入了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度的时间进程。 
图100是加入了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。 
图101是加入了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯比活性的时间进程。 
图102是pCLPtrcUpperPathwayHGS2的图谱。 
图103A-103C是pCLPtrcUpperPathwayHGS2的核苷酸序列(SEQ ID NO：87)。 
图104是加入了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度的时间进程。 
图105是加入了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。 
图106是加入了葡萄糖的15L生物反应器中生产的总异戊二烯的时间进程。 
图107是质粒MCM330的图谱。 
图108A-108C是质粒MCM330的核苷酸序列(SEQ ID NO：90)。 
图109是pET24D-Kudzu的图谱。 
图110A和110B是pET24D-Kudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO：101)。 
图111A是加入了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度的时间进程。 
图111B是加入了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。 
图111C是加入了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯比生产率的时间进程。 
图112是质粒pET24 P.alba HGS的图谱。 
图113A和113B是质粒pET24 P.alba HGS的核苷酸序列(SEQ ID  NO：102)。 
图114是示意图，其显示了用于进行核酸内切酶消化以构建质粒EWL230的限制性位点，以及BspHI与NcoI位点之间的相容性粘末端。 
图115是质粒EWL230的图谱。 
图116A和116B是质粒EWL230的核苷酸序列(SEQ ID NO：103)。 
图117是示意图，其显示了用于进行核酸内切酶消化以构建质粒EWL244的限制性位点，以及NsiI与PstI位点之间的相容性粘末端。 
图118是EWL244的图谱。 
图119A和119B是质粒EWL244的核苷酸序列(SEQ ID NO：104)。 
图120是质粒MCM484-487的图谱。 
图121A-121C是质粒MCM484的核苷酸序列(SEQ ID NO：105)。 
图122A-122C是质粒MCM485的核苷酸序列(SEQ ID NO：106)。 
图123A-123C是质粒MCM486的核苷酸序列(SEQ ID NO：107)。 
图124A-124C是质粒MCM487的核苷酸序列(SEQ ID NO：108)。 
图125A-125D的图是大肠杆菌菌株(EWL256)的异戊二烯生产，所述菌株表达来自MVA途径的基因，并生长在没有酵母提取物补料的15L规模的补料分批培养物中。图125A显示了加入了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度的时间进程。图125B显示了加入了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。将效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。图125C显示了从加入了葡萄糖的15L生物反应器生产的总异戊二烯的时间进程。图125D显示了加入了葡萄糖的15L生物反应器中的总二氧化碳形成速率(TCER)或代谢活性谱。 
图126A-126E的图是大肠杆菌菌株(EWL256)的异戊二烯生产，所述菌株表达来自MVA途径的基因，并生长在没有酵母提取物补料的15L规模的补料分批培养物中。图126A显示了加入了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度的时间进程。图126B显示了加入了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。将效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。图126C显示了从加入了葡萄糖的15L生物反应器生产的总异戊二烯的时间进程。图126D显示了加入了葡萄糖的15L生物反应器中的体积 生产率。在酵母提取物补料下，1.1g/L/hr的平均值维持了40小时的时段(23-63小时)。图126E显示了加入了葡萄糖的15L生物反应器中的二氧化碳形成速率(CER)或代谢活性谱。 
图127A-127D显示了经由MVA(途径)从不同碳源生产异戊二烯。图127A显示了大肠杆菌EWL256(其含有MVA途径和异戊二烯合酶)在作为唯一碳源的葡萄糖、生物质水解物、甘油、或乙酸盐上的生长。将不同的碳源加入培养基中至1％的浓度。包括了没有加入碳源的阴性对照。将生长测量为在600nM的光密度。图127B显示了当在作为唯一碳源的葡萄糖、生物质水解物、甘油、或乙酸盐上生长时，含有MVA途径和异戊二烯合酶的大肠杆菌EWL256的异戊二烯比生产率。将不同的碳源加入培养基中至1％的浓度。包括了没有加入碳源的阴性对照。在接种后190分钟、255分钟和317分钟取样，并使用GC-MS测量细菌生产的异戊二烯。图127C显示了大肠杆菌EWL256在作为唯一碳源的葡萄糖或木糖上的生长。将不同的碳源加入培养基中至1％的浓度。包括了没有加入碳源的阴性对照。将生长测量为在600nM的光密度。图127D显示了当在作为唯一碳源的葡萄糖或木糖上生长时，大肠杆菌EWL256的异戊二烯比生产率。将碳源加入培养基中至1％的浓度。包括了没有加入碳源的阴性对照。在接种后260分钟、322分钟和383分钟取样，并使用GC-MS测量细菌生产的异戊二烯。 
图128A和128B显示了大肠杆菌菌株分别从葡萄糖和从脂肪酸生产异戊二烯。对于图128A，挑取11个用pMCM118(携带下部甲羟戊酸途径的质粒)转化WW4而形成的菌落，以验证该下部途径的存在。在含有0.1％酵母提取物和2％葡萄糖的TM3培养基中，培养来自所述菌落的细胞。在诱导4小时以后，测定诱导的培养物的等分试样的异戊二烯生产。所有菌落表现出异戊二烯生产。诱导物IPTG具有强烈的生长抑制作用，这从50-900μM浓度的诱导物使细胞密度降低了3-4.6倍而可见(数据未显示)。该图表明，更高的诱导会产生更高的异戊二烯比效价。对于图128B，以1-10稀释度，从洗涤过的过夜培养物接种生产培养物。使培养物生长几小时，并用50μM IPTG诱导。左边的条显示了诱导后4小时继之以1小时 异戊二烯积累测定的异戊二烯测定结果。中间的条显示了具有相同的诱导期但是通过12小时异戊二烯积累测定分析的相同培养物的1小时标准化值。右边的条显示了诱导13小时的培养物的1小时异戊二烯积累测定的值。 
图129是用于从野葛克隆异戊二烯合酶的大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pUWL201PW(6400碱基对)的图谱。Tsr，硫链丝菌肽抗性基因。图像取自：Doumith等人，Mol.Gen.Genet.264：477-485，2000。 
图130显示了白色链霉菌野生型菌株(“wt”)和携带质粒pUWL201PW(阴性对照)或pUWL201_iso(编码来自野葛的异戊二烯合酶)的菌株的异戊二烯形成。 
图131A是马氏甲烷八叠球菌古细菌下部途径操纵子的图谱。 
图131B和131C是马氏甲烷八叠球菌古细菌下部途径操纵子的核苷酸序列(SEQ ID NO：127)。 
图132A是来自马氏甲烷八叠球菌古细菌Lowerin pET200D的MCM376-MVK的图谱。 
图132B和132C是来自马氏甲烷八叠球菌古细菌Lowerin pET200D的MCM376-MVK的核苷酸序列(SEQ ID NO：128)。 
图133A-133D显示了EWL256与RM11608-2相比的生长和异戊二烯生产的比生产率。用白色菱形表示生长(OD550)；用实心条表示异戊二烯的比生产率。x-轴是用200(图133A和133B)或400(图133C和133D)μM IPTG诱导以后的时间(小时)。Y-1轴是异戊二烯的生产率(μg/L/OD/hr)，Y-2是在550波长的光密度的任意单位。OD550的这些值必须乘以6.66，以得到培养物的实际OD。 
图134是质粒pBBRCMPGI1.5-pgl的图谱。 
图135A和135B是质粒pBBRCMPGI1.5-pgl的核苷酸序列(SEQ ID NO：136)。 
图136A-136F是由表达马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶、银白杨异戊二烯合酶、和pgl(RHM111608-2)并且生长于15L规模的补料分批培养物中的大肠杆菌菌株生产异戊二烯的图。图136A显示了加入了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度的时间进程。图136B显示了加入了葡萄糖的15L 生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。用于计算异戊二烯的方法：在59小时内生产的累积异戊二烯，在59小时的g/发酵罐体积，L[＝]g/L培养液。图136C也显示了加入了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。用于计算异戊二烯的方法：∫(瞬时异戊二烯生产速率，g/L/hr)dt从t＝0至59小时[＝]g/L发酵液。图136D显示了从加入了葡萄糖的15L生物反应器中生产总异戊二烯的时间进程。图136E显示了加入了葡萄糖的15L生物反应器中的体积生产率。图136F显示了加入了葡萄糖的15L生物反应器中的二氧化碳形成速率(CER)或代谢活性谱。 
图137A是质粒pJ201：19813的图谱。 
图137B和137C是pJ201：19813的核苷酸序列(SEQ ID NO：137)。 
图138显示了加入了葡萄糖的15L生物反应器中的光密度的时间进程。 
图139显示了加入了葡萄糖的15L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。将效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。 
图140显示了从加入了葡萄糖的15L生物反应器生产的总异戊二烯的时间进程。 
图141的图显示了加入了葡萄糖和酵母提取物的500L生物反应器中的光密度的时间进程。 
图142的图显示了加入了葡萄糖和酵母提取物的500L生物反应器中的异戊二烯效价的时间进程。将效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。 
图143的图显示了加入了葡萄糖和酵母提取物的500L生物反应器中的总异戊二烯的时间进程。 
具体实施方式
除了别的以外，本发明提供了用于从可再生资源生产异戊二烯聚合物的组合物和方法。在一个实施方式中，本文提供了用于制备异戊二烯和其它非异戊二烯分子的共聚物的组合物和方法。在另一个实施方式中，本文 提供了具有不同分子量的源自可再生资源的异戊二烯的聚合物，例如，顺式-1，4-聚异戊二烯同聚物橡胶。通过聚合源自可再生资源的异戊二烯，生产聚合物。含有合成的异戊二烯的本发明的聚合物会提供下述益处：可证实源自基于非石化产品的资源。在一个方面，来自可再生资源的异戊二烯包含生物异戊二烯。在另一个方面，源自可再生资源的异戊二烯可以是生物异戊二烯。在另一个方面，源自可再生资源的异戊二烯可以是通过培养表达异源异戊二烯合酶的细胞所生产的生物异戊二烯组合物。在一些方面，源自可再生资源的异戊二烯经历聚合，以生产聚异戊二烯诸如顺式-1，4-聚异戊二烯。在其它方面，源自可再生资源的异戊二烯经历与一个或多个其它单体的聚合，以生产包含源自异戊二烯单体的重复单元的共聚物。 
定义 
除非本文另有定义，在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等效的任意方法和材料可以用于实践本发明，本文描述了优选的方法和材料。因此，通过参考说明书整体，更完整地描述了在下面紧接着定义的术语。在有关的部分中引用的所有文件通过引用并入本文。但是，任何文件的引用不应解释为承认它是关于本发明的现有技术。 
本文使用的“可再生资源”表示不是矿物燃料的资源。通常，可再生资源源自活生物体或最近的活生物体，它们可以随着它们的消耗而补充。可再生资源可以被天然的生态循环或合理的管理实践替代。非限制性实例包括生物质(例如，柳枝稷、大麻、玉米、白杨、柳树、蜀黍物、甘蔗)、树、和其它植物。可再生资源、可再生碳源和生物可再生资源在本文中通常是可互换的。 
本文使用的“至少一部分异戊二烯起始组合物”可以表示至少约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、或100％的异戊二烯起始组合物经历聚合。 
术语“异戊二烯”或“异戊二烯单体”表示2-甲基-1，3-丁二烯(CAS# 78-79-5)，它是从3，3-二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)消除焦磷酸而产生的直接的和最终的挥发性C5烃产物，并且不包括IPP分子与DMAPP分子的连接或聚合。术语“异戊二烯”一般不意在限于其生产方法，除非本文另外指出。 
本文使用的“生物地生产的异戊二烯”或“生物异戊二烯”是通过任何生物学方法生产的异戊二烯，诸如由遗传工程化的细胞培养物、天然微生物、植物或动物生产。生物异戊二烯组合物通常含有比从石化产品来源生产的异戊二烯更少的烃杂质，且经常需要最少的处理即可达到聚合级。生物异戊二烯组合物也具有不同于从石化产品生产的异戊二烯组合物的杂质特性。 
通过化学聚合，可以将源自可再生碳的生物异戊二烯转化成多种聚合物。本文提供了从发酵回收异戊二烯并随后转化成包含源自异戊二烯单体的重复单元的聚合物的方法。这些方法包括、但不限于：从发酵废气回收和纯化异戊二烯，并随后进行气相或液相聚合。在本发明范围内预见到连续和分批模式方法二者。 
如本文进一步详述的，生物异戊二烯组合物与基于石油的异戊二烯(在本文中称作“石油-异戊二烯”)组合物的区别在于，生物异戊二烯组合物基本上不含有在石油-异戊二烯组合物中经常存在的任何污染性的不饱和的C5烃，例如，但不限于：1，3-环戊二烯、反式-1，3-戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊烯、2-戊烯、3-甲基-1-丁烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、和顺式-戊-3-烯-1-炔。如果任何污染性的不饱和的C5烃存在于本文所述的生物异戊二烯原料组合物中，它们以比在石油-异戊二烯组合物中更低的水平存在。这些杂质中的几种是特别有问题的，因为它们与异戊二烯的结构相似性和它们可以起聚合催化剂毒物的作用的事实。如下面详述的，在没有经历充分纯化下，生物地生产的异戊二烯组合物可以基本上不含有任何污染性的不饱和的C5烃。 
生物异戊二烯组合物与石油-异戊二烯组合物的区别在于，生物异戊二烯组合物含有其它生物副产物(与生物异戊二烯一起得到的源自生物来源和/或与生物方法有关的化合物)，所述生物副产物在石油-异戊二烯组合物 中不存在或以远远更低的水平存在，诸如醇、醛、酮等。所述生物副产物可以包括、但不限于：乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、异丁烯醛、甲基乙烯基酮、2-甲基-2-乙烯基环氧乙烷、顺式-和反式-3-甲基-1，3-戊二烯、C5异戊二烯基醇(例如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)、2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，4，5-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、二乙酰、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、异丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、3-甲基丁基乙酸酯、3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯、3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯、(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、2，3-环庚烯醇吡啶、3-己烯-1-醇、3-己烯-1-基乙酸酯、柠檬烯、香叶醇(反式-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇)、香茅醇(3，7-二甲基-6-辛烯-1-醇)或直链异戊二烯聚合物(例如源自多个异戊二烯单元的聚合的直链异戊二烯二聚体或直链异戊二烯三聚体)。在一些方面，在聚合之前，从生物异戊二烯组合物去除这些化合物中的一种或多种。在其它方面，这些化合物中的一种或多种被包含在聚合反应物中。 
此外，生物异戊二烯与石油-异戊二烯的区别在于碳指纹图谱。在一个方面，生物异戊二烯具有比石油-异戊二烯更高的放射性碳-14(14C)含量或更高的14C/12C比。生物异戊二烯由可再生碳源生产，因而生物异戊二烯中的14C含量或14C/12C比与现在大气中的相应值相同。另一方面，石油-异戊二烯源自数千至数百万年前沉积的矿物燃料，因而14C含量或14C/12C比由于放射性衰变而减小。如在本文中更详细地讨论的，源自生物异戊二烯的燃料产物具有比源自石油-异戊二烯的燃料产物更高的14C含量或 14C/12C比。在一个实施方式中，源自本文所述的生物异戊二烯的燃料产物具有与大气中的相应值类似的14C含量或14C/12C比。在另一个方面，通过稳定的碳同位素配给(13C/12C，其可以报告为用符号δ13C表示的“δ值”)，可以在分析上将生物异戊二烯与石油-异戊二烯区分开。例如，对于萃取蒸馏来自石油精炼厂的C5流所衍生出的异戊二烯，δ13C是约-22‰至约-24‰。对于源自石油的不饱和轻烃而言，该范围是典型的，且源自基于石油的异戊二烯的产物通常含有具有相同δ13C的异戊二烯单元。通过发酵玉米衍生 的葡萄糖(δ13C-10.73‰)和小量其它含碳的营养物(例如，酵母提取物)生成的生物异戊二烯，会生产这样的异戊二烯：其可以聚合成具有δ13C-14.66‰至-14.85‰的聚异戊二烯。预期从这样的生物异戊二烯生产的产物具有比源自基于石油的异戊二烯的产物更低的负值的δ13C值。 
虽然可以通过分馏石油来获得异戊二烯，但是该物质的纯化是昂贵且耗时的。烃的C5流的石油裂解仅产生约15％的异戊二烯。异戊二烯也由多种微生物、植物、和动物物种天然地生产。具体地，已经为异戊二烯的生物合成鉴别出了2个途径：甲羟戊酸(MVA)途径和非甲羟戊酸(DXP)途径。在生物反应器中的遗传工程化的细胞培养物已经更有效地以更大的量、以更高的纯度和/或以独特的杂质特性生产异戊二烯，例如描述在：美国临时专利申请号61/013,386和61/013,574(2007年12月13日提交)，WO 2009/076676，美国临时专利申请号61/134,094、61/134,947、61/134,011和61/134,103(2008年7月2日提交)，WO 2010/003007，美国临时专利申请号61/097,163(2008年9月15日提交)，WO 2010/031079，美国临时专利申请号61/097,186(2008年9月15日提交)，WO 2010/031062，美国临时专利申请号61/097,189(2008年9月15日提交)，WO 2010/031077、美国临时专利申请号61/097,200(2008年9月15日提交)，WO 2010/031068，美国临时专利申请号61/097,204(2008年9月15日提交)，WO 2010/031076，美国临时专利申请号61/141,652(2008年12月30日提交)、PCT/US09/069862，美国专利申请号12/335,071(US 2009/0203102A1)(2008年12月15日提交)和美国专利申请号12/429,143(US 2010/0003716A1)(2009年4月23日提交)，它们通过引用整体并入。 
在一个方面，本发明表征了用于生产异戊二烯聚合物的组合物和系统，它们包括：(a)源自可再生资源的异戊二烯起始组合物；和(b)从至少一部分异戊二烯原料生产的聚合物；其中至少一部分异戊二烯起始组合物经历聚合。源自可再生资源的异戊二烯原料进行化学聚合，以生产聚合物，所述聚合物包含源自来自可再生来源的异戊二烯单体的重复单元。在一个方面，源自可再生资源的异戊二烯起始组合物可以是源自可再生碳源的生物异戊二烯组合物。 
示例性的起始异戊二烯组合物 
在一些实施方式中，源自可再生资源的异戊二烯起始组合物包含大于或约2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000mg异戊二烯。在一些实施方式中，所述起始异戊二烯组合物包含大于或约2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100g异戊二烯。在一些实施方式中，所述起始异戊二烯组合物包含大于或约0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000kg异戊二烯。在一些实施方式中，起始组合物中异戊二烯的量是约2至约5,000mg，诸如约2至约100mg、约100至约500mg、约500至约1,000mg、约1,000至约2,000mg、或约2,000至约5,000mg。在一些实施方式中，起始组合物中异戊二烯的量是约20至约5,000mg、约100至约5,000mg、约200至约2,000mg、约200至约1,000mg、约300至约1,000mg、或约400至约1,000mg。在一些实施方式中，起始组合物中异戊二烯的量是约2至约5,000g，诸如约2至约100g、约100至约500g、约500至约1,000g、约1,000至约2,000g、或约2,000至约5,000g。在一些实施方式中，起始组合物中异戊二烯的量是约2至约5,000kg、约10至约2,000kg、约20至约1,000kg、约20至约500kg、约30至约200kg、或约40至约100kg。在一些实施方式中，大于或约20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％(w/w)的起始组合物的挥发性有机级分是异戊二烯。 
在一些实施方式中，源自可再生资源的异戊二烯起始组合物包含重量占起始组合物中所有C5烃的总重量的大于或约98.0％、98.5％、99.0％、99.5％、或100％的异戊二烯。在一些实施方式中，所述高纯度的异戊二烯起始组合物包含重量占起始组合物中所有C5烃的总重量的大于或约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％、或100％的异戊二烯。在一些实施方式中，与起始组合物中所有C5烃的检测器响应相比，所述起始组合物对于异戊二烯具有大于或约98.0％、98.5％、99.0％、99.5％、或100％的相对检测器响应。在一些实施方式中，与起始组合物中所有C5烃的检测器响应相比，所述起始组合物对于异戊二烯具有大于或约99.90％、99.91％、99.92％、99.93％、99.94％、99.95％、99.96％、99.97％、99.98％、 99.99％、或100％的相对检测器响应。在一些实施方式中，所述起始异戊二烯组合物包含重量占起始组合物中所有C5烃的总重量的约98.0％至约98.5％、约98.5％至约99.0％、约99.0％至约99.5％、约99.5％至约99.8％、约99.8-100％的异戊二烯。在一些实施方式中，所述起始异戊二烯组合物包含重量占起始组合物中所有C5烃的总重量的约99.90％至约99.92％、约99.92％至约99.94％、约99.94％至约99.96％、约99.96至约99.98％、约99.98-100％的异戊二烯。 
在一些实施方式中，源自可再生资源的异戊二烯起始组合物包含重量占起始组合物中所有C5烃的总重量的小于或约2.0％、1.5％、1.0％、0.5％、0.2％、0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的除了异戊二烯以外的C5烃(例如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊烯、2-戊烯、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，与起始组合物中所有C5烃的检测器响应相比，所述起始组合物对于除了异戊二烯以外的C5烃具有小于或约2.0％、1.5％、1.0％、0.5％、0.2％、0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的相对检测器响应。在一些实施方式中，与起始组合物中所有C5烃的检测器响应相比，所述起始组合物对于1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊烯、2-戊烯、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔具有小于或约2.0％、1.5％、1.0％、0.5％、0.2％、0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的相对检测器响应。在一些实施方式中，所述高纯度的异戊二烯起始组合物包含重量占起始组合物中所有C5烃的总重量的约0.02至约0.04％、约0.04至约0.06％、约0.06至0.08％、约0.08至0.10％、或约0.10至约0.12％的除了异戊二烯以外的C5烃(例如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊烯、2-戊烯、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1- 丁烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。 
在一些实施方式中，源自可再生资源的异戊二烯起始组合物包含小于或约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的抑制异戊二烯聚合的化合物(对于起始组合物中抑制异戊二烯聚合的任意化合物)。在一些实施方式中，所述起始异戊二烯组合物包含约0.005至约50，诸如约0.01至约10、约0.01至约5、约0.01至约1、约0.01至约0.5、或约0.01至约0.005μg/L的抑制异戊二烯聚合的化合物(对于起始组合物中抑制异戊二烯聚合的任意化合物)。在一些实施方式中，所述起始异戊二烯组合物包含小于或约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的除了异戊二烯以外的烃(例如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊烯、2-戊烯、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，所述起始异戊二烯组合物包含约0.005至约50，诸如约0.01至约10、约0.01至约5、约0.01至约1、约0.01至约0.5、或约0.01至约0.005μg/L的除了异戊二烯以外的烃。在一些实施方式中，所述起始异戊二烯组合物包含小于或约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的蛋白或脂肪酸(例如天然地伴随天然橡胶的蛋白或脂肪酸)。 
在一些实施方式中，源自可再生资源的异戊二烯起始组合物包含小于或约10、5、1、0.8、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005ppm的α乙炔、戊二烯、乙腈、或1，3-环戊二烯。在一些实施方式中，所述起始异戊二烯组合物包含小于或约5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005ppm的硫或丙二烯。在一些实施方式中，所述起始异戊二烯组合物包含小于或约30、20、15、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005ppm的所有乙炔(例如1-戊烯、2-戊烯、3-甲基-1-丁烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、和顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，所述起始异戊二烯组合物包含小于或约2000、1000、500、200、100、50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005ppm的异戊二烯二聚体，例如环式异戊二烯二聚体(例如，源自两个异戊二烯单元的二聚化的环式C10化合物)。 
在一些实施方式中，源自可再生资源的异戊二烯起始组合物包括乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、异丁烯醛、甲基乙烯基酮、2-甲基-2-乙烯基环氧乙烷、顺式-和反式-3-甲基-1，3-戊二烯、C5异戊二烯基醇(例如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)、或前述的任意两种或更多种。在具体实施方式中，所述起始异戊二烯组合物包含大于或约0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、60、80、100、或120μg/L的乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、异丁烯醛、甲基乙烯基酮、2-甲基-2-乙烯基环氧乙烷、顺式-和反式-3-甲基-1，3-戊二烯、C5异戊二烯基醇(例如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)、或前述的任意两种或更多种。在一些实施方式中，所述异戊二烯组合物包含约0.005至约120(诸如约0.01至约80、约0.01至约60、约0.01至约40、约0.01至约30、约0.01至约20、约0.01至约10、约0.1至约80、约0.1至约60、约0.1至约40、约5至约80、约5至约60、或约5至约40)μg/L的乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、异丁烯醛、甲基乙烯基酮、2-甲基-2-乙烯基环氧乙烷、顺式-和反式-3-甲基-1，3-戊二烯、C5异戊二烯基醇、或前述的任意两种或更多种。 
在一些实施方式中，源自可再生资源的异戊二烯起始组合物包括一种或多种下述成分：2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2，4，5-三甲基吡啶、2，3，5-三甲基吡嗪、香茅醛、乙醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、二乙酰、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、异丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、3-甲基丁基乙酸酯、3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯、3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯、(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、2，3-环庚烯醇吡啶、或直链异戊二烯聚合物(例如源自多个异戊二烯单元的聚合的直链异戊二烯二聚体或直链异戊二烯三聚体)。在多个实施方式中，按照重量百分比单位，这些成分中的一种的量相对于异戊二烯的量(即所述成分的重量除以异戊二烯的重量乘以100)是大于或约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或110％(w/w)。在一些实施方式中，与对异戊二烯的检测器响应相比，对第二化合物的相对检测器响应是大于或约 0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或110％。在多个实施方式中，按照重量百分比单位，这些成分中的一种的量相对于异戊二烯的量(即所述成分的重量除以异戊二烯的重量乘以100)是约0.01至约105％(w/w)，诸如约0.01至约90％、约0.01至约80％、约0.01至约50％、约0.01至约20％、约0.01至约10％、约0.02至约50％、约0.05至约50％、约0.1至约50％、或0.1至约20％(w/w)。 
在一些实施方式中，至少一部分源自可再生资源的异戊二烯起始组合物是在气相中。在一些实施方式中，至少一部分源自可再生资源的异戊二烯起始组合物是在液相(例如冷凝物)中。在一些实施方式中，至少一部分源自可再生资源的异戊二烯起始组合物是在固相中。在一些实施方式中，至少一部分源自可再生资源的异戊二烯起始组合物吸附至固体支持物，例如包括二氧化硅和/或活性炭的支持物。在一些实施方式中，所述起始异戊二烯组合物与一种或多种溶剂相混合。在一些实施方式中，所述起始异戊二烯组合物与一种或多种气体相混合。 
关于在生产异戊二烯的细胞的培养物中生产异戊二烯的技术描述在：美国临时专利申请号61/013,386和61/013,574(2007年12月13日提交)，WO 2009/076676，美国临时专利申请号61/134,094、61/134,947、61/134,011和61/134,103(2008年7月2日提交)，WO 2010/003007，美国临时专利申请号61/097,163(2008年9月15日提交)，WO 2010/031079，美国临时专利申请号61/097,186(2008年9月15日提交)，WO 2010/031062，美国临时专利申请号61/097,189(2008年9月15日提交)，WO 2010/031077，美国临时专利申请号61/097,200(2008年9月15日提交)，WO 2010/031068，美国临时专利申请号61/097,204(2008年9月15日提交)，WO 2010/031076，美国临时专利申请号61/141,652(2008年12月30日提交)，PCT/US09/069862，美国专利申请号12/335,071(US 2009/0203102A1)(2008年12月15日提交)和美国专利申请号12/429,143(US 2010/0003716A1)(2009年4月23日提交)，它们的教导通过引用并入本文，用于教导通过这样的方法生产和回收异戊二烯的技术的目的。在任意情况下，美国 临时专利申请号61/013,386和61/013,574(2007年12月13日提交)，WO 2009/076676，美国临时专利申请号61/134,094、61/134,947、61/134,011和61/134,103(2008年7月2日提交)，WO 2010/003007，美国临时专利申请号61/097,163(2008年9月15日提交)，WO 2010/031079，美国临时专利申请号61/097,186(2008年9月15日提交)，WO 2010/031062，美国临时专利申请号61/097,189(2008年9月15日提交)，WO 2010/031077，美国临时专利申请号61/097,200(2008年9月15日提交)，WO 2010/031068，美国临时专利申请号61/097,204(2008年9月15日提交)，WO 2010/031076，美国临时专利申请号61/141,652(2008年12月30日提交)，PCT/US09/069862，美国专利申请号12/335,071(US 2009/0203102A1)(2008年12月15日提交)和美国专利申请号12/429,143(US 2010/0003716A1)(2009年4月23日提交)，教导了用于在细胞培养物中生产增加的量的异戊二烯的组合物和方法。美国专利申请号12/335,071(US 2009/0203102A1)(2008年12月15日提交)进一步教导了从培养的细胞共生产异戊二烯和氢的组合物和方法。具体地，这些组合物和方法增大了异戊二烯的生产速率，并且增加了所生产的异戊二烯的总量。例如，已经制备了产生4.8 x 104nmol/gwcm/hr异戊二烯的细胞培养物系统(表1)。这些系统将细胞从细胞培养基中消耗的大约2.2％的碳转化为异戊二烯，由此证明了其效率。如实施例和表2所示，每升培养液产生了大约3g异戊二烯。如果需要，可以使用其它条件例如本文描述的那些获得甚至更大量的异戊二烯。在一些实施方式中，可再生的碳源用于生产异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯的生产与细胞的生长解除偶联。在一些实施方式中，异戊二烯和任意氧化剂的浓度在不可燃的范围内，以减少或消除生产或回收异戊二烯过程中可能起火的风险。所述组合物和方法是合乎需要的，因为它们允许获得高异戊二烯产率/细胞、高碳产率、高异戊二烯纯度、高生产率、低能量使用、低生产成本和投入、以及最小的副反应。这种用于生产异戊二烯的有效率的大规模的生物合成方法提供了用于基于合成的异戊二烯的产物(诸如橡胶)的异戊二烯来源，并且提供了替代使用天然橡胶的合乎需要的低成本的替代方式。 
如下文进一步讨论的，通过向细胞中导入编码异戊二烯合酶多肽(例如植物异戊二烯合酶多肽)的异源核酸，可以极大地增加细胞生产的异戊二烯的量。异戊二烯合酶多肽将二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)转化为异戊二烯。如在实施例中所示，在多种宿主细胞中表达异源越南葛藤(野葛)或银白杨(白杨)异戊二烯合酶多肽，所述宿主细胞例如大肠杆菌、柠檬泛菌、枯草芽孢杆菌、解脂耶氏酵母、和里氏木霉(Trichoderma reesei)。也如在实施例中所示，在诸如大肠杆菌等宿主细胞中表达异源马氏甲烷八叠球菌(M.mazei)甲羟戊酸激酶(MVK)，以增加异戊二烯生产。所有这些细胞都生产比不含异源异戊二烯合酶多肽的对应细胞更多的异戊二烯。如表1和2所示，使用本文描述的方法生产了大量的异戊二烯。例如，在14升的发酵罐中，具有异源异戊二烯合酶核酸的枯草芽孢杆菌生产的异戊二烯是对应的不含异源核酸的对照枯草芽孢杆菌细胞的10倍(表2)。在发酵罐中，大肠杆菌所生产的60.5g异戊二烯/升培养液(mg/L，其中培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积)和枯草芽孢杆菌所生产的30mg/L表明可以产生显著量的异戊二烯(表2)。如果需要，可以在更大的规模上生产异戊二烯，或者可以使用本文描述的其它条件以进一步增加异戊二烯的量。在下文以及在实施例部分更详细地描述了表1和表2中所列的载体和实验条件。 
表1：使用本发明的细胞培养物和方法从摇瓶中生产的示例性的异戊二烯产率。用于测定异戊二烯产量的测定法描述于实施例I，第II部分。对于该测定法，在一个或多个时间点从摇瓶中取出样品并培养30分钟。然后测定该样品中生产的异戊二烯的量。生产的异戊二烯的顶空浓度和比速率列于表1并在本文中有进一步描述。 
*就1mL的1OD600进行校正，在液体∶顶空的体积比为1∶19的密封的顶空管中培养1小时 
表2：使用本发明的细胞培养物和方法在发酵罐中生产的示例性的异戊二烯产率。用于测定异戊二烯产量的测定法描述于实施例I，第II部分。对于该测定法，取出发酵罐的废气的样品并分析其异戊二烯的量。在表2中列出了峰值顶空浓度(发酵过程中最高的顶空浓度)、效价(每升培养液生产的累积的异戊二烯的总量)、和生产异戊二烯的峰值比速率(发酵过程中的最高比速率)并在本文中有进一步描述。 
**就1vvm(1体积废气/1L培养液/分钟)的废气流速进行校正 
另外，可以通过增加细胞所表达的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)多肽和/或异戊烯二磷酸异构酶(IDI)多肽的量来增加含异源异戊二烯合酶核酸的细胞所生产的异戊二烯。例如，可以将DXS核酸和/或IDI核酸导入细胞。DXS核酸可以是异源核酸或内源核酸的重复拷贝。类似地，IDI核酸可以是异源核酸或内源核酸的重复拷贝。在一些实施方式中，通过将内源性DXS和/或IDI启动子或调节区替换为其它的引起DXS和/或IDI 核酸的更大的转录的启动子和/或调节区来增加DXS和/或IDI多肽的量。在一些实施方式中，细胞包含编码异戊二烯合酶多肽(例如植物异戊二烯合酶多肽)的异源核酸和编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸的重复拷贝。 
所编码的DXS和IDI多肽是异戊二烯的生物合成的DXP途径(图19A)的一部分。DXS多肽将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转化为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。不被任何特定理论所限，相信增加DXS多肽的量会增大通过DXP途径的碳流，引起更大的异戊二烯产量。IDI多肽催化异戊烯二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的相互转化。不被任何特定理论所限，相信增加细胞中IDI多肽的量会增加被转化为DMAPP的IPP的量(和转化速率)，DMAPP继而被转化为异戊二烯。 
例如，具有野葛异戊二烯合酶、酿酒酵母IDI、和大肠杆菌DXS核酸的大肠杆菌细胞的发酵用于生产异戊二烯。异戊二烯的水平经15小时的时间段在50至300μg/L变化(实施例7，第VII部分)。作为另一个实施例，具有马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶(MVK)、银白杨异戊二烯合酶、上部MVA途径、和集成的下部MVA途径的大肠杆菌的发酵用于生产异戊二烯。异戊二烯的水平经67小时的时间段在32至35.6g/L变化(实施例14，第III部分)。 
在另一个实施例中，具有马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶(MVK)、银白杨异戊二烯合酶、pgl过表达(RHM111608-2)、上部MVA途径、和集成的下部MVA途径的大肠杆菌的发酵用于生产异戊二烯。异戊二烯的水平经40小时的时间段在33.2g/L至40.0g/L变化，或经59小时的时间段在48.6g/L至60.5g/L变化(实施例17，第(ii)部分)。 
在一些实施方式中，异源的或额外的内源异戊二烯合酶、IDI、和DXS核酸的存在使细胞相对于仅具有这些异源或额外的内源核酸中的一项或两项的对应细胞以繁殖力更强的方式生长或维持更长时间的存活。例如，包含异源异戊二烯合酶、IDI、和DXS核酸的细胞比仅具有异源异戊二烯合酶和DXS核酸的细胞或仅具有异源异戊二烯合酶核酸的细胞生长得更好。另外，使异源异戊二烯合酶、IDI、和DXS核酸成功地可操作地连接于维持于大肠杆菌细胞内的高拷贝数质粒的强启动子上，这提示可以在细胞中 表达大量的这些多肽而不对细胞引起过量的毒性。不被任何特定理论所限，相信异源或额外的内源异戊二烯合酶和IDI核酸的存在可以降低一种或多种潜在的毒性中间体的量，如果在细胞中仅存在异源或额外内源DXS核酸，则所述毒性中间体将会累积。 
在一些实施方式中，通过增加细胞表达的MVA多肽的量而提高包含异源异戊二烯合酶核酸的细胞生产的异戊二烯(图19A和19B)。示例性的MVA途径多肽包括任意下列多肽：乙酰基-辅酶A乙酰转移酶(AA-辅酶A硫解酶)多肽，3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A合酶(HMG-辅酶A合酶)多肽，3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶(HMG-辅酶A还原酶)多肽，甲羟戊酸激酶(MVK)多肽，磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽，磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)多肽，异戊烯磷酸激酶(IPK)多肽，IDI多肽，和具有两个或更多个MVA途径多肽的活性的多肽(例如融合多肽)。例如，可以将一个或多个MVA途径核酸导入细胞中。在一些实施方式中，细胞包含上部MVA途径，其包括AA-辅酶A硫解酶、HMG-辅酶A合酶、和HMG-辅酶A还原酶核酸。在一些实施方式中，细胞包含下部MVA途径，其包括MVK、PMK、MVD、和IDI核酸。在一些实施方式中，细胞包含整个MVA途径，其包括AA-辅酶A硫解酶、HMG-辅酶A合酶、HMG-辅酶A还原酶、MVK、PMK、MVD、和IDI核酸。在一些实施方式中，细胞包含整个MVA途径，其包括AA-辅酶A硫解酶、HMG-辅酶A合酶、HMG-辅酶A还原酶、MVK、PMDC、IPK、和IDI核酸。MVA途径核酸可以是异源核酸或内源核酸的重复拷贝。在一些实施方式中，通过将MVA途径核酸的内源启动子或调节区替换为引起MVA途径核酸的更大的转录的其它启动子和/或调节区来增加一种或多种MVA途径多肽的量。在一些实施方式中，细胞包含编码异戊二烯合酶多肽(例如植物异戊二烯合酶多肽)的异源核酸和编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸的重复拷贝二者。 
例如，包含编码野葛异戊二烯合酶多肽和编码酿酒酵母MVK、PMK、MVD、和IDI多肽的核酸的大肠杆菌细胞以6.67 x 104nmol/L培养液/OD600/hr的速率产生异戊二烯(见实施例8)。另外，具有编码粪肠球菌AA-辅酶 A硫解酶、HMG-辅酶A合酶、和HMG-辅酶A还原酶多肽的大肠杆菌细胞的14升发酵生产22克的甲羟戊酸(MVA途径的中间体)。这些细胞的摇瓶生产2-4克的甲羟戊酸/升。这些结果表明：异源MVA途径核酸在大肠杆菌中是有活性的。相对于仅具有下部MVA途径和野葛异戊二烯合酶的核酸的大肠杆菌细胞(菌株MCM 131)，含有上部MVA途径和下部MVA途径二者以及野葛异戊二烯合酶的核酸的大肠杆菌细胞(菌株MCM 127)生产显著更多的异戊二烯(874μg/L发酵液/hr/OD)(见表3和实施例8，第VIII部分)。含有编码银白杨异戊二烯合酶多肽的核酸和编码马氏甲烷八叠球菌MVK多肽的核酸的大肠杆菌细胞产生了320.6g(峰值比速率为9.54 x 104nmol/L发酵液/OD600/hr(即9.5 x 10-5mol/L发酵液/OD600/hr))的异戊二烯(在67小时发酵期间，在没有酵母提取物补料存在下)或395.5g(峰值比速率为8.66 x 104nmol/L发酵液/OD600/hr)(在68小时发酵期间，在有酵母提取物补料存在下)(参见实施例14)。 
在一些实施方式中，细胞中的至少一部分在持续培养(例如不稀释的持续培养)中保持异源异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径核酸至少大约5、10、20、50、75、100、200、300或更多次细胞分裂。在本发明的任意方面的一些实施方式中，包含异源异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径核酸或内源异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径核酸的重复拷贝的核酸还包含选择性标志物，例如卡那霉素、氨比西林、羧苄西林、庆大霉素、潮霉素、腐草霉素、博来霉素、新霉素、或氯霉素抗生素抗性核酸。 
如实施例7第VI部分所示，使用具有野葛异戊二烯合酶、酿酒酵母IDI、和大肠杆菌DXS核酸的大肠杆菌细胞来生产异戊二烯，通过向细胞培养基中添加酵母提取物，可以进一步增加所生产的异戊二烯的量。具体地，对于所测试的浓度，所生产的异戊二烯的量与细胞培养基中酵母提取物的量成线性比例(图48C)。另外，从含有酵母提取物和葡萄糖的细胞培养基中生产了大约0.11g异戊二烯/L培养液(实施例7，第VIII部分)。相对于在存在酵母提取物的情况下增加葡萄糖的量，在存在葡萄糖的情况下增加酵母提取物的量生产更多的异戊二烯。另外，增加酵母提取物的量 允许细胞在更长的时间生产更高水平的异戊二烯并改善细胞的健康。 
还使用三种类型的水解的生物质(甘蔗渣、玉米秸秆、和软木浆)作为碳源证明了异戊二烯的生产(图46A-C和图127A和127B)。具有野葛异戊二烯合酶、酿酒酵母IDI、和大肠杆菌DXS核酸的大肠杆菌细胞从这些水解的生物质碳源生产的异戊二烯与从等量的葡萄糖(例如，1％葡萄糖，w/v)生产的异戊二烯一样多。表达银白杨异戊二烯合酶和MVA途径的大肠杆菌细胞从氨纤维膨胀(AFEX)预处理的玉米秸秆以比从等量的葡萄糖更高的起始生长速率生产异戊二烯(图127A和127B)。如果需要，可以在本发明的组合物和方法中使用任意其它生物质碳源。生物质碳源是合乎需要的，因为它们比很多常规的细胞培养基便宜，从而促进了异戊二烯的经济生产。 
另外，证明转化糖作为碳源用于产生异戊二烯(图47D)。例如，从表达MVA途径多肽和野葛异戊二烯合酶的细胞生产了2.4g/L的异戊二烯(实施例8，第XV部分)。还使用甘油作为碳源，从表达野葛异戊二烯合酶的细胞产生了2.2mg/L的异戊二烯(实施例8，第XIV部分)。除了异戊二烯合酶核酸以外，还表达DXS核酸、IDI核酸、和/或一种或多种MVA途径核酸(例如编码整个MVA途径的核酸)可以增加从甘油生产异戊二烯。 
另外，木糖、乙酸盐、和甘油也被证实会起碳源的作用，用于制备异戊二烯(图127A-127D)。例如，在作为唯一碳源的乙酸盐上生长的、具有银白杨异戊二烯合酶和MVA途径的大肠杆菌细胞的异戊二烯比生产率是在葡萄糖上生长期间的约2倍(实施例14，第IV部分；图127A和127B)。 
在一些实施方式中，在细胞培养基中包括油。例如，当在含有油和葡萄糖源的细胞培养基中培养时，包含野葛异戊二烯合酶核酸的枯草芽孢杆菌细胞生产异戊二烯(实施例4，第III部分)。作为另一个实例，当在含有棕榈油和葡萄糖源的细胞培养基中培养时，含有上部和下部MVA途径+野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌fadR atoC突变型细胞生产异戊二烯(实施例16，第II部分)。在一些实施方式中，在细胞培养基中包括了一种以上的油(例如2、3、4、5、或更多种油)。不被任何特定理论所限，相信： (i)油可以增加细胞中的可用于被转化为异戊二烯的碳的量；(ii)油可以增加细胞中乙酰基-辅酶A的量，从而增加经过MVA途径的碳流；和/或(iii)油可以向细胞提供额外的营养物，这是合乎需要的，因为细胞中的多数碳被转化为异戊二烯而不是其它产物。在一些实施方式中，在含有油的细胞培养基中培养的细胞天然地使用MVA途径来生产异戊二烯或经过遗传修饰以包含整个MVA途径的核酸。在一些实施方式中，在添加到细胞培养基中之前，油被部分地或全部地水解以促进宿主细胞对油的利用。 
在细胞(例如细菌)中商业化生产小分子例如异戊二烯的一个主要障碍是使分子的生产与细胞的生长解除偶联。在商业上可行的生产异戊二烯的一些实施方式中，来自原料的显著量的碳被转化为异戊二烯，而非为了细胞的生长和维持(“碳效率”)。在多个实施方式中，细胞将细胞培养基中的大于或大约0.0015％、0.002％、0.005％、0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％、或8.0％的碳转化为异戊二烯。在具体的实施方式中，被转化为下游产物的来自原料的显著部分的碳被转化为异戊二烯。如实施例11中所描述，表达MVA途径和野葛异戊二烯合酶核酸的大肠杆菌细胞显示出异戊二烯或中间体甲羟戊酸的生产与生长之间的解除偶联，这导致高的碳效率。特别地，从表达来自粪肠球菌的上部MVA途径的细胞形成了甲羟戊酸。从表达来自粪肠球菌的上部MVA途径、来自酿酒酵母的下部MVA途径、和来自越南葛藤(野葛)的异戊二烯合酶的细胞形成了异戊二烯。在四种不同的大肠杆菌菌株BL21(LDE3)、BL21(LDE3)Tuner、FM5、和MG1655中证明了异戊二烯或甲羟戊酸的生产与生长的解除偶联。前两种大肠杆菌菌株是B菌株，后两种是K12菌株。在缺失了ack和pta基因的MG1655的变体中也证明了生产与生长的解除偶联。该变体还证明生产较少的乙酸。 
示例性的多肽和核酸 
本发明的组合物和方法中可以使用多种异戊二烯合酶、DXS、IDI和/ 或MVA途径多肽和核酸。 
本文使用的“多肽”包括多肽、蛋白、肽、多肽片段和融合多肽，所述融合多肽包括部分或全部的第一多肽(例如，异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径多肽)和部分或全部的第二多肽(例如，促进融合多肽的纯化或检测的肽，例如His-标签)。在一些实施方式中，融合多肽具有两种或更多种MVA途径多肽(例如AA-辅酶A硫解酶和HMG-辅酶A还原酶多肽)的活性。在一些实施方式中，多肽是具有两种或更多种MVA途径多肽的活性的天然存在的多肽(例如由粪肠球菌mvaE核酸编码的多肽)。 
在多个实施方式中，多肽具有至少或大约50、100、150、175、200、250、300、350、400、或更多个氨基酸。在一些实施方式中，多肽片段包含来自全长多肽的至少或大约25、50、75、100、150、200、300、或更多个连续氨基酸并且具有至少或大约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％的对应的全长多肽的活性。在具体的实施方式中，多肽包括任意天然存在的异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径多肽的氨基酸序列区段或整个氨基酸序列。在一些实施方式中，相对于野生型(即天然存在的序列)异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径多肽的序列，多肽具有一个或多个突变。 
在一些实施方式中，多肽是分离的多肽。本文使用的“分离的多肽”不是多肽文库的一部分，所述多肽文库例如2、5、10、20、50或更多个不同多肽的文库；而是分离自天然状态下与其一起产生的至少一个成分。例如通过表达编码多肽的重组核酸，可以获得分离的多肽。 
在一些实施方式中，多肽是异源多肽。“异源多肽”是指这样的多肽：其氨基酸序列与在相同宿主细胞中天然表达的另一多肽的氨基酸序列不相同。具体地，异源多肽与天然状态下存在于相同宿主细胞中的野生型多肽不相同。 
本文使用的“核酸”是指单链或双链形式的两个或更多个脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。在一些实施方式中，核酸是重组核酸。“重组核酸”是指这样的目标核酸：其不含在所述目标核酸所源自的生物体的天然状态下存在的基因组中侧接该目标核酸的一个或多个核酸(例如基因)。因此， 该术语包括例如，掺入到载体中、掺入到自我复制型质粒或病毒中、或掺入到原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA，或作为独立于其它序列的单独分子(例如，cDNA、基因组DNA片段、或通过PCR或限制性内切核酸酶消化产生的cDNA片段)而存在。在多个实施方式中，核酸是重组核酸。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、efe、DXS、IDI、或MVA途径核酸可操作地连接至编码全部或部分的另一多肽的另一核酸，从而重组核酸编码融合多肽，所述融合多肽包括异戊二烯合酶、efe、DXS、IDI、或MVA途径多肽和全部或部分另一多肽(例如促进融合多肽的纯化或检测的肽，例如His-标签)。在一些实施方式中，部分或全部的重组核酸是化学合成的。应该理解：突变，包括单核苷酸突变，可以发生在本文定义的核酸内。 
在一些实施方式中，核酸是异源核酸。“异源核酸”是指这样的核酸：其核酸序列与在相同宿主细胞中天然存在的另一核酸的核酸序列不相同。 
在具体的实施方式中，核酸包括任意天然存在的异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸的核酸序列区段或整个核酸序列。在一些实施方式中，核酸包括来自天然存在的异戊二烯合酶核酸DXS、IDI、或MVA途径核酸的至少或约50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、或更多个连续核苷酸。在一些实施方式中，相对于野生型(即天然存在的序列)异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸的序列，核酸具有一个或多个突变。在一些实施方式中，核酸具有增加异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸的转录或翻译的一个或多个突变(例如沉默突变)。在一些实施方式中，核酸是编码异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径多肽的任意核酸的简并变体。 
“密码子简并性”是指遗传密码的多样性，其允许核苷酸序列变化而不影响所编码的多肽的氨基酸序列。技术人员熟知：特定的宿主细胞在使用核苷酸密码子来指定给定氨基酸时表现出的“密码子偏爱”。因此，当合成用于改善宿主细胞中的表达的核酸时，在一些实施方式中合乎需要地将核酸设计为使其密码子使用频率达到宿主细胞的优选密码子使用频率。 
示例性的异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径多肽和核酸的 登记号列举于附件1(附件1的登记号和它们的相应序列通过引用整体并入本文，尤其是关于异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径多肽和核酸的氨基酸和核酸序列的内容)。Kegg数据库也包含多个示例性的异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径多肽和核酸的氨基酸和核酸序列(参见，例如，互联网网址：“genome.jp/kegg/pathway/map/map00100.html”和其中的序列，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径多肽和核酸的氨基酸和核酸序列的内容)。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径多肽和/或核酸中的一项或多项具有与2007年12月12日或2008年12月11日公共可得的序列相同的序列，例如对应于附件1中的任意登记号的任意序列，或Kegg数据库中的任意序列。另外的示例性的异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径多肽和核酸在下面进一步描述。 
示例性的异戊二烯合酶多肽和核酸 
如上所述，异戊二烯合酶多肽将二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)转化为异戊二烯。示例性的异戊二烯合酶多肽包括具有异戊二烯合酶多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽、和融合多肽。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽将DMAPP转化为异戊二烯的能力，使用标准方法来测定该多肽是否具有异戊二烯合酶多肽活性。在示例性的测定法中，按照实施例1描述的摇瓶方法使菌株(例如，本文描述的大肠杆菌/pTrcKudzu菌株)生长，以此来制备细胞提取物。诱导结束后，通过在7000 x g离心10分钟沉淀约10mL细胞，并重悬于5ml不含甘油的PEB中。使用弗氏压碎器(French Pressure cell)使用标准程序将细胞裂解。或者，在-80℃冷冻/解冻后，以溶菌酶(Ready-Lyse溶菌酶溶液；EpiCentre)处理细胞。 
可以按照例如Silver等人，J.Biol.Chem.270：13010-13016，1995及其中的参考文献(它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于异戊二烯合酶多肽活性的测定法的部分)的描述来测定细胞提取物中异戊二烯合酶多肽的活性。在氮气流下，使DMAPP(Sigma)蒸发至干燥，并在pH8.2的100mM磷酸钾缓冲液中重新水化至100mM的浓度，并储存于-20℃。为了进 行测定，将5μL 1M MgCl2、1mM(250μg/ml)DMAPP、65μL植物提取物缓冲液(PEB)(50mM Tris-HCl，pH 8.0，20mM MgCl2，5％甘油，和2mM DTT)的溶液加入到20ml的具有金属螺丝盖和特氟隆包被的硅隔膜的顶空瓶(Agilent Technologies)中的25μL细胞提取物中，并在37℃摇动培养15分钟。通过加入200μL 250mM EDTA使反应猝灭，按照实施例1第II部分的描述通过GC/MS进行定量测定。 
示例性的异戊二烯合酶核酸包括编码具有异戊二烯合酶多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽、或融合多肽的核酸。示例性的异戊二烯合酶多肽和核酸包括来自本文描述的任意生物体来源的天然存在的多肽和核酸以及源自本文描述的任意生物体来源的突变体多肽和核酸。 
在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽或核酸来自豆科(Fabaceae)，例如蝶型花亚科(Faboideae)。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽或核酸是来自下列的多肽或核酸：越南葛藤(野葛)(Sharkey等人，Plant Physiology 137：700-712，2005)，葛根(Pueraria lobata)，白杨(例如银白杨、欧洲黑杨、毛果杨、银白杨x 欧洲山杨(CAC35696)或银白杨(Sasaki等人，FEBS Letters 579(11)：2514-2518，2005；Miller等人，Planta 213：483-487，2001)，白杨(aspen)(例如美洲山杨)(Silver等人，JBC 270(22)：13010-1316，1995)，或英国栎(夏栎(Quercus robur))(Zimmer等人，WO 98/02550)，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于异戊二烯合酶核酸和异戊二烯合酶多肽的表达的内容。适宜的异戊二烯合酶包括但不限于Genbank登记号AY341431、AY316691、AY279379、AJ457070、和AY182241(它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于异戊二烯合酶核酸和多肽的序列的内容)中确定的那些。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽或核酸不是的来自夏栎的天然存在的多肽或核酸(即，异戊二烯合酶多肽或核酸是除了来自夏栎的天然存在的多肽或核酸以外的异戊二烯合酶多肽或核酸)。在一些实施方式中，异戊二烯合酶核酸或多肽是来自白杨的天然存在的多肽或核酸。在一些实施方式中，异戊二烯合酶核酸或多肽不是来自白杨的天然存在的多肽或核酸。 
示例性的DXS多肽和核酸 
如上所述，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)多肽将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转化为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。示例性的DXS多肽包括具有DXS多肽的至少一项活性的多肽、多肽片段、肽、和融合多肽。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转化为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有DXS多肽活性。示例性的DXS核酸包括编码具有DXS多肽的至少一项活性的多肽、多肽片段、肽、或融合多肽的核酸。示例性的DXS多肽和核酸包括来自本文描述的任意生物体来源的天然存在的多肽和核酸以及源自本文描述的任意生物体来源的突变体多肽和核酸。 
示例性的IDI多肽和核酸 
异戊烯二磷酸异构酶多肽(异戊烯-二磷酸δ-异构酶或IDI)催化异戊烯二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的相互转化(例如，将IPP转化为DMAPP和/或将DMAPP转化为IPP)。示例性的IDI多肽包括具有IDI多肽的至少一项活性的多肽、多肽片段、肽、和融合多肽。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽使IPP和DMAPP相互转化的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有IDI多肽活性。示例性的IDI核酸包括编码具有IDI多肽的至少一项活性的多肽、多肽片段、肽、或融合多肽的核酸。示例性的IDI多肽和核酸包括来自本文描述的任意生物体来源的天然存在的多肽和核酸以及源自本文描述的任意生物体来源的突变体多肽和核酸。 
示例性的MVA途径多肽和核酸 
示例性的MVA途径多肽包括乙酰基-辅酶A乙酰转移酶(AA-辅酶A硫解酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A合酶(HMG-辅酶A合酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶(HMG-辅酶A还原酶)多肽、甲羟戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽、磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)多肽、异戊烯磷酸激酶(IPK)多肽、IDI多肽、和具有两个或更多个MVA途径多肽的活性的多肽(例如融合多肽)。具体地，MVA途径多肽包括具有MVA途径多肽的至少一项活 性的多肽、多肽片段、肽、和融合多肽。示例性的MVA途径核酸包括编码具有MVA途径多肽的至少一项活性的多肽、多肽片段、肽、或融合多肽的核酸。示例性的MVA途径多肽和核酸包括来自本文描述的任意生物体来源的天然存在的多肽和核酸以及源自本文描述的任意生物体来源的突变体多肽和核酸。 
具体地，乙酰基-辅酶A乙酰转移酶多肽(AA-辅酶A硫解酶或AACT)将两分子的乙酰基-辅酶A转化为乙酰乙酰基-辅酶A。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽将两分子的乙酰基-辅酶A转化为乙酰乙酰基-辅酶A的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有AA-辅酶A硫解酶多肽活性。 
3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A合酶(HMG-辅酶A合酶或HMGS)多肽将乙酰乙酰基-辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽将乙酰乙酰基-辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有HMG-辅酶A合酶多肽活性。 
3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶(HMG-辅酶A还原酶或HMGR)多肽将3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A转化为甲羟戊酸。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽将3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A转化为甲羟戊酸的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有HMG-辅酶A还原酶多肽活性。 
甲羟戊酸激酶(MVK)多肽将甲羟戊酸磷酸化以形成甲羟戊酸-5-磷酸。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸-5-磷酸的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有MVK多肽活性。 
磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽将甲羟戊酸-5-磷酸磷酸化以形成甲羟戊酸-5-二磷酸。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽将甲羟戊酸-5-磷酸转化为甲羟戊酸-5-二磷酸的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有PMK多肽活性。 
二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD或DPMDC)多肽将甲羟戊酸-5-二磷酸 转化为异戊烯二磷酸(IPP)。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽将甲羟戊酸-5-二磷酸转化为IPP的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有MVD多肽活性。 
磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)多肽将甲羟戊酸-5-磷酸转化为异戊烯磷酸(IP)。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽将甲羟戊酸-5-磷酸转化为IP的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有PMDC多肽活性。 
异戊烯磷酸激酶(IPK)多肽将异戊烯磷酸(IP)磷酸化以形成异戊烯二磷酸(IPP)。可以通过在体外、在细胞提取物中、或在体内测定多肽将IP转化为IPP的能力，使用标准方法(例如本文描述的那些)来测定多肽是否具有IPK多肽活性。 
示例性的IDI多肽和核酸如上所述。 
示例性的分离核酸的方法 
使用标准方法，可以分离异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径核酸。从目标来源生物体(例如细菌基因组)获得需要的核酸的方法是分子生物学领域常见的和熟知的(参见，例如，WO 2004/033646及其中引用的参考文献，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于目标核酸的分离的内容)。例如，如果核酸的序列是已知的(例如本文描述的已知核酸的任意项)，可以通过限制性内切核酸酶消化来产生合适的基因组文库，并可以使用与需要的核酸序列互补的探针进行筛选。一旦分离了序列，则可以使用标准的引物指导的扩增方法，例如聚合酶链式反应(PCR)(美国专利号4,683,202，它通过引用整体并入本文，尤其是关于PCR方法的内容)来扩增DNA，以获得适合于使用合适的载体进行转化的量的DNA。 
或者，使用标准方法，可以化学地合成异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径核酸(例如具有已知核酸序列的任意异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径核酸)。 
使用标准方法，可以鉴别出可能适用于本文所述的组合物和方法中的其它的异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径多肽和核酸。例如，可以在生物体例如大肠杆菌中构建已知天然地产生异戊二烯的生物体的染色体 DNA的粘粒文库，然后就异戊二烯的产生进行筛选。具体地，可以产生这样的粘粒文库，其中基因组DNA的大的区段(35-45kb)被包装进入载体中，并用于转化合适的宿主。粘粒载体的独特之处在于能够容纳大量的DNA。一般地，粘粒载体具有至少一个拷贝的cos DNA序列，其对于异源DNA的包装和随后的环化是必需的。除了cos序列之外，这些载体还包含复制起始点(例如ColEI)和药物抗性标志物(例如对氨比西林或新霉素的核酸抗性)。使用粘粒载体转化合适的细菌宿主的方法在Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，1989中有完善的描述，其通过引用整体并入本文，尤其是关于转化方法的内容。 
通常，为了克隆粘粒，使用适当的限制性内切核酸酶分离异源DNA，并使用合适的连接酶连接至邻近的粘粒载体的cos区域。然后，使含有线性化的异源DNA的粘粒载体与DNA包装介体例如噬菌体反应。在包装过程中，cos位点被切割，并且异源DNA被包装进入细菌病毒颗粒的头部。然后，这些颗粒用于转染合适的宿主细胞，例如大肠杆菌。一旦注射进入细胞，异源DNA在cos粘末端的影响下发生环化。按照这种方式，可以将异源DNA的大区段导入宿主细胞并在其中表达。 
用于得到异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径核酸的其它方法包括：通过试验(例如本文所述的顶空试验)，或通过PCR(使用针对编码一定长度的保守氨基酸(例如，至少3个保守氨基酸)的核苷酸的引物)，筛选宏基因组文库。通过比对已知的异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径多肽的氨基酸序列，可以鉴别出保守氨基酸。基于已知的异戊二烯合酶多肽的比对的序列，可以鉴定异戊二烯合酶多肽的保守氨基酸。可以使天然产生异戊二烯的生物体经历标准的蛋白纯化方法(其是本领域熟知的)，并且可以使用标准方法测序得到的纯化的多肽。其它方法见文献(参见，例如，Julsing等人，Applied.Microbiol.Biotechnol.75：1377-84，2007；Withers等人，Appl Environ Microbiol.73(19)：6277-83，2007，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于鉴定参与异戊二烯合成的核酸的内容)。 
另外，基于它们与已知的DXS、IDI、或MVA途径多肽和核酸的初级 和/或预测的多肽二级结构上的相似性，可以使用标准的序列比对和/或结构预测程序来鉴定另外的DXS、IDI、或MVA途径多肽和核酸。也可以使用标准的数据库例如swissprot-trembl数据库(互联网网址为“expasy.org”，Swiss Institute of Bioinformatics Swiss-Prot group CMU-1 rue Michel Servet CH-1211 Geneva 4，瑞士)来鉴定异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径多肽和核酸。使用标准结构预测程序例如PredictProtein(630 West，168 Street，BB217，New York，N.Y.10032，USA)的缺省设定，可以预测异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径多肽的二级和/或三级结构。或者，可以使用标准方法确定异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径多肽的真实的二级和/或三级结构。通过与产生于已知的异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸的探针杂交，还可以鉴定另外的异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸。 
示例性的启动子和载体 
本文描述的任意异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸可以包含于一个或多个载体中。因此，本发明还表征了含有编码本文描述的任意异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径多肽的一个或多个核酸的载体。本文使用的“载体”是指能够递送并合乎需要地在宿主细胞中表达一种或多种目标核酸的构建体。载体的实例包括、但不限于：质粒、病毒载体、DNA或RNA表达载体、粘粒和噬菌体载体。在一些实施方式中，所述载体包含处于表达控制序列控制下的核酸。 
本文使用的“表达控制序列”是指指导目标核酸的转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，例如组成型或诱导型启动子或增强子。“诱导型启动子”是在环境或发育调节下有活性的启动子。表达控制序列可操作地连接至待转录的核酸区段上。 
在一些实施方式中，载体含有选择性标志物。术语“选择性标志物”是指能够在宿主细胞中表达以允许容易地选择含有导入的核酸或载体的那些宿主细胞的核酸。选择性标志物的实例包括、但不限于：抗生素抗性核酸(例如，卡那霉素、氨苄西林、羧苄西林、庆大霉素、潮霉素、腐草霉素、博来霉素、新霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢优势例如营养优势的 核酸。示例性的营养选择性标志物包括本领域已知的那些标志物，例如amdS、argB和pyr4。在用于转化木霉菌属(Trichoderma)的载体系统中有用的标志物是本领域已知的(参见，例如，Finkelstein，Chapter 6 in Biotechnology of Filamentous Fungi，Finkelstein等人，Butterworth-Heinemann编，Boston，MA，Chap.6.，1992；和Kinghorn等人，Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi，Blackie Academic and Professional，Chapman and Hall，London，1992，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于选择性标志物的内容)。在一些实施方式中，选择性标志物是amdS核酸，其编码乙酰胺酶，允许转化的细胞以乙酰胺作为氮源生长。构巢曲霉(A.nidulans)amdS核酸作为选择性标志物的应用，描述在Kelley等人，EMBO J.4：475-479，1985和Penttila等人，Gene 61：155-164，1987(它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于选择性标志物的内容)。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸整合进入无选择性标志物的细胞的染色体中。 
合适的载体是与所用的宿主细胞相容的那些。合适的载体可以源自，例如，细菌、病毒(例如噬菌体T7或源自M-13的噬菌体)、粘粒、酵母、或植物。用于获得和使用此类载体的程序是本领域人员已知的(参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，1989，其通过引用整体并入本文，尤其是关于载体的使用的内容)。 
启动子是本领域熟知的。可以使用任意在宿主细胞中有作用的启动子，在宿主细胞中表达异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸。有多种起始控制区或启动子可用于驱动异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸在多种宿主细胞中的表达，并且是本领域技术人员熟知的(参见，例如，WO 2004/033646和其中引用的参考文献，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于用于表达目标核酸的载体的内容)。事实上任何能够驱动这些核酸的启动子都适合于本发明，包括但不限于：CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADCI、TRP1、URA3、LEU2、ENO、和TPI(用于在酵母属中的表达)；AOX1(用于在毕赤酵母属中的表 达)；和lac、trp、λPL、λPR、T7、tac、和trc(用于在大肠杆菌中的表达)。 
在一些实施方式中，使用葡萄糖异构酶启动子(参见，例如美国专利号7,132,527及其中引用的参考文献，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于用于表达目标多肽的启动子和质粒系统的内容)。报道的葡萄糖异构酶启动子突变体可用于改变与葡萄糖异构酶启动子可操作地连接的核酸编码的多肽的表达水平(美国专利号7,132,527)。在多个实施方式中，葡萄糖异构酶启动子包含于低拷贝、中等拷贝、或高拷贝质粒中(美国专利号7,132,527)。 
在多个实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径核酸包含于低拷贝质粒(例如，以约1至约4个拷贝/细胞维持的质粒)、中等拷贝质粒(例如，以约10至约15个拷贝/细胞维持的质粒)或高拷贝质粒(例如，以约50或更多个拷贝/细胞维持的质粒)中。在一些实施方式中，异源的或额外的内源的异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸可操作地连接至T7启动子。在一些实施方式中，可操作地连接至T7启动子的异源的或额外的内源的异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸包含于中等或高拷贝质粒中。在一些实施方式中，异源的或额外的内源的异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸可操作地连接至Trc启动子。在一些实施方式中，可操作地连接至Trc启动子的异源的或额外的内源的异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸包含于中等或高拷贝质粒中。在一些实施方式中，异源的或额外的内源的异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸可操作地连接至Lac启动子。在一些实施方式中，可操作地连接至Lac启动子的异源的或额外的内源的异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸包含于低拷贝质粒中。在一些实施方式中，异源的或额外的内源的异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸可操作地连接至内源性启动子，例如内源性埃希菌属、Panteoa属、芽孢杆菌属、耶氏酵母属、链霉菌属或木霉菌属启动子或内源性碱性丝氨酸蛋白酶、异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径启动子。在一些实施方式中，可操作地连接至内源性启动子的异源的或额外的内源的异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸包含于高拷贝质粒中。在一些实施方式中，载体是不整合到细胞 的染色体中的复制质粒。在一些实施方式中，部分或全部载体整合进细胞的染色体中。 
在一些实施方式中，载体是任意的这样的载体：当被导入真菌宿主细胞中时，整合进入宿主细胞基因组并且被复制。关于载体的列表，参见Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains(FGSC，互联网网址为“fgsc.net”以及其中引用的参考文献，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于载体的内容)。在下列文献中提供了合适的表达和/或整合载体的另外的实例：Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，1989，Current Protocols in Molecular Biology (F.M.Ausubel等人(编)1987，Supplement 30，section 7.7.18)；van den Hondel等人in Bennett and Lasure(编)More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press pp.396-428，1991；和美国专利号5,874,276，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于载体的内容。特别有用的载体包括pFB6、pBR322、PUC18、pUC100、和pENTR/D。 
在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸可操作地连接至在真菌宿主细胞中显示出转录活性的适宜的启动子。启动子可以源自编码宿主细胞的内源性或异源性的多肽的一个或多个核酸。在一些实施方式中，启动子可用于木霉菌属宿主。启动子的合适的非限制性实例包括cbh1、cbh2、egl1、egl2、pepA、hfb1、hfb2、xyn1和amy。在一些实施方式中，启动子是宿主细胞的天然启动子。例如，在一些实施方式中，当里氏木霉是宿主时，启动子是天然里氏木霉启动子。在一些实施方式中，启动子是里氏木霉cbh1，其是诱导型启动子并保藏于GenBank，保藏号为D86235，其通过引用整体并入本文，尤其是关于启动子的内容。在一些实施方式中，启动子是真菌宿主细胞的异源的启动子。有用的启动子的其它实例包括来自泡盛曲霉(A.awamori)和黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶(glaA)的基因的启动子(Nunberg等人，Mol.Cell Biol.4：2306-2315，1984和Boel等人，EMBO J.3：1581-1585，1984，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于启动子的内容)；黑曲霉α淀粉酶、米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、里氏木霉xln1、和里氏木霉纤维二糖水解酶1的基因的启 动子(EP 137280，其通过引用整体并入本文，尤其是关于启动子的内容)。 
在一些实施方式中，表达载体还包括终止序列。终止控制区也可以源自宿主细胞的多个天然基因。在一些实施方式中，终止序列和启动子序列源自相同的来源。在另一个实施方式中，终止序列是宿主细胞内源性的。特别适宜的终止子序列是源自木霉菌株(例如里氏木霉)的cbh1。其它有用的真菌终止子包括来自黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶核酸的终止子(Nunberg等人，Mol.Cell Biol.4：2306-2315，1984和Boel等人，EMBO J.3：1581-1585，1984；它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于真菌终止子的内容)。任选地，可以包括终止位点。为了有效表达多肽，使编码多肽的DNA通过起始密码子可操作地连接至选择的表达控制区，从而表达引起形成合适的信使RNA。 
在一些实施方式中，启动子、编码区和终止子全部来自待表达的异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸。在一些实施方式中，将异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸的编码区插入一般目的表达载体中，从而使其处于表达构建体启动子和终止子序列的转录控制下。在一些实施方式中，将基因或其一部分插入至强cbh1启动子的下游。 
使用标准技术(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，1982，其通过引用整体并入本文，尤其是关于筛选合适的DNA序列和构建载体的内容)，可以将异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸掺入到载体例如表达载体中。用于连接包含目标核酸(例如异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸)、启动子、终止子、和其它序列的DNA构建体以及用于将它们插入合适的载体中的方法是本领域熟知的。例如，限制性酶可用于切割异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸和载体。然后，可以连接经切割的异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸和经切割的载体的相容性末端。一般通过在方便的限制性位点处的连接来实现连接。如果不存在此类位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸接头(参见，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，1989，以及Bennett和Lasure，More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press，San Diego， 第70-76页，1991，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于寡核苷酸接头的内容)。另外，可以使用已知的重组技术构建载体(例如，Invitrogen Life Technologies，Gateway Technology)。 
在一些实施方式中，可能需要以远高于天然存在的细胞中目前存在的水平过表达异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸。可以通过将编码那些多肽的核酸选择性克隆进入多拷贝质粒或将那些核酸置于强可诱导或组成型启动子下来实现该结果。用于过表达需要的多肽的方法是分子生物学领域常见的和熟知的，实例可以见Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，1989，其通过引用整体并入本文，尤其是关于克隆技术的内容。 
以下资源包括用于本发明的另外的一般性方法的描述：Kreigler，Gene Transfer and Expression；A Laboratory Manual，1990和Ausubel等人，Eds.Current Protocols in Molecular Biology，1994，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于分子生物学和克隆技术的内容。 
示例性的来源生物体 
从任何天然包含异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径核酸的生物体，可以获得异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸(及其编码的多肽)。如上所述，有多种生物体天然地形成异戊二烯，例如细菌、真菌、植物、和动物。生物体包含用于产生异戊二烯的MVA途径、DXP途径、或MVA与DXP途径二者(图19)。因此，可以获得DXS核酸，例如，从包含DXP途径或含有MVA与DXP途径二者的任意生物体获得。可以从例如包含MVA途径、DXP途径或MVA与DXP途径二者的任意生物体，获得IDI和异戊二烯合酶核酸。可以获得MVA途径核酸，例如，从包含MVA途径或含有MVA和DXP途径二者的任意生物体获得。 
在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径的核酸序列与通过下列任意生物体天然产生的核酸的序列相同。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径多肽的氨基酸序列与通过下列任意生物体天然产生的多肽的序列相同。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸或多肽是源自本文描述的任意生物体 的突变体核酸或多肽。本文使用的“源自”是指核酸或多肽的来源，所述核酸或多肽中导入了一个或多个突变。例如，“源自植物多肽”的多肽是指由于向野生型(即天然存在的序列)植物多肽的序列中导入了一个或多个突变而产生的目标多肽。 
在一些实施方式中，来源生物体是真菌，其实例有：曲霉属的物种，例如米曲霉和黑曲霉；酵母属的物种，例如酿酒酵母；裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的物种，例如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；以及木霉属的物种，例如里氏木霉。在一些实施方式中，来源生物体是丝状真菌细胞。术语“丝状真菌”是指真菌亚门中的所有的丝状形式(参见，Alexopoulos，C.J.(1962)，Introductory Mycology，Wiley，New York)。这些真菌的特征在于营养菌丝体，其具有由壳多糖、纤维素、和其它复合多糖组成的细胞壁。丝状真菌在形态、生理和遗传上与酵母菌不同。丝状真菌的营养生长是通过菌丝的延长，碳分解代谢是专有性好氧的。丝状真菌亲代细胞可以是下列种的细胞但不限于此：木霉属(例如，里氏木霉，红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的无性型，之前被分类为长枝木霉(T.longibrachiatum)，绿色木霉(Trichoderma viride)，康氏木霉(Trichoderma koningii)，哈茨木霉(Trichoderma harzianum)(Sheir-Neirs等人，Appl.Microbiol.Biotechnol 20：46-53，1984；ATCC No.56765和ATCC No.26921)；青霉属(Penicillium sp.)，腐质霉属(Humicola sp.)(例如，特异腐质霉(H.insolens)、H.lanuginose、或灰色腐质霉(H.grisea))；金孢属(Chrysosporium sp.)(例如，C.lucknowense)、粘帚霉(Gliocladium sp.)，曲霉属(例如，米曲霉、黑曲霉、酱油曲霉(A sojae)、日本曲霉(A.japonicus)，构巢曲霉，或泡盛曲霉)(Ward等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.39：7380743，1993和Goedegebuur等人，Genet 41：89-98，2002)，镰菌属(Fusarium sp.)(例如，粉红镰刀菌(F.roseum)、禾谷镰刀菌(F.graminum)、F.cerealis、尖孢镰刀菌(F.oxysporuim)、或F.venenatum)，脉孢霉属(Neurospora sp.)(例如，粗糙脉胞菌(N.crassa)，肉座菌属(Hypocrea sp.)，毛霉菌属(Mucor sp.)(例如，米黑毛霉菌(M.miehei)，根霉属(Rhizopus sp.)，和裸胞壳属(Emericella sp.)(另外见，Innis等，Sci.228：21-26，1985)。术语 “木霉菌”或“木霉菌属(Trichoderma sp.)”或“木霉菌(Trichoderma spp.)”是指之前或目前被分类为木霉菌的任意真菌属。 
在一些实施方式中，真菌是构巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉、日本曲霉、里氏木霉、绿色木霉、尖孢镰刀菌、或茄镰孢(F.solani)。曲霉菌菌株公开于Ward等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.39：738-743，1993和Goedegebuur等人，Curr Gene 41：89-98，2002，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于真菌的内容。在具体的实施方式中，真菌是木霉的菌株，例如里氏木霉的菌株。里氏木霉的菌株是已知的，其非限制性实例包括ATCC No.13631、ATCC No.26921、ATCC No.56764、ATCC No.56765、ATCC No.56767、和NRRL 15709，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于里氏木霉的菌株的内容。在一些实施方式中，宿主菌株是RL-P37的衍生物。RL-P37公开于Sheir-Neiss等，Appl.Microbiol.Biotechnology 20：46-53，1984，其通过引用整体并入本文，尤其是关于里氏木霉的菌株的内容。 
在一些实施方式中，来源生物体是酵母，例如酵母属、裂殖酵母属、毕赤酵母属、或假丝酵母属(Candida sp)。 
在一些实施方式中，来源生物体是细菌，例如芽孢杆菌属的菌株，例如地衣芽孢杆菌(B.lichenformis)或枯草芽孢杆菌；泛菌属的菌株，例如柠檬泛菌；假单胞菌的菌株，例如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)；链霉菌属的菌株，例如白色链霉菌(S.albus)、浅青紫链霉菌(S.lividans)或锈棕色链霉菌(S.rubiginosus)；或埃希菌属的菌株，例如大肠杆菌。 
本文使用的“芽孢杆菌属”包括本领域技术人员已知的落在芽孢杆菌属内的所有物种，包括但不限于：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、B.halodurans、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽胞杆菌(B.coagulans)、环状芽胞杆菌(B.circulans)、B.lautus和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。认识到：芽孢杆菌属仍然会持续进行分类学上的改组。因此，该属意在包括被重新分类 的物种，包括但不限于这样的生物体，例如嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)，其现在被称作“嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)”。在存在氧的条件下产生抗性内生孢子被认为是芽孢杆菌属的定义特征，虽然该特征也适用于最近被命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、解硫胺素杆菌属(Aneurinibacillus)、无氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、线芽孢杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、热杆菌属(Thermobacillus)、解脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。 
在一些实施方式中，来源生物体是革兰氏阳性细菌。非限制性实例包括下述属的菌株：链霉菌属(例如，白色链霉菌、浅青紫链霉菌、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、或灰色链霉菌(S.griseus))和芽孢杆菌属。在一些实施方式中，来源生物体是革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌)或假单胞菌属。 
在一些实施方式中，来源生物体是植物，例如来自豆科的植物，例如蝶型花亚科。在一些实施方式中，来源生物体是野葛、白杨(例如银白杨x 欧洲山杨CAC35696或银白杨)(Sasaki等人，FEBS Letters 579(11)：2514-2518，2005)、白杨(例如美洲山杨)或夏栎。 
在一些实施方式中，来源生物体是藻类，例如绿藻、红藻、灰胞藻(glaucophyte)、chlorarachniophytes、眼虫、假菌界(Chromista)、或腰鞭毛虫(dinoflagellates)。 
在一些实施方式中，来源生物体是蓝细菌，例如基于形态分类为下列组的蓝细菌：色球藻目(Chroococcales)、宽球藻目(Pleurocapsales)、颤藻目(Oscillatoriales)、念珠藻目(Nostocales)、或真枝藻目(Stigonematales)。 
在一些实施方式中，来源生物体是厌氧生物体。厌氧生物体可以包括、但不限于：专性厌氧菌、兼性厌氧菌(facultatitive anaerobes)、和耐氧性厌氧菌(aerotolerant anaerobes)。这样的生物体可以是上面列出的任意生物体、细菌、酵母等。在一个实施方式中，所述专性厌氧菌可以是选 自下述的任一种或组合：Clostridium ljungdahlii、Clostridium autoethanogenum、Eurobacterium limosum、Clostridium carboxydivorans、产生消化链球菌(Peptostreptococcus productus)、和食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)。应当理解，本文所述的任意来源生物体的任意组合可以用于本发明的其它实施方式。 
示例性的宿主细胞 
多种宿主细胞可用于要求保护的发明的方法中表达异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径多肽并生产异戊二烯。示例性的宿主细胞包括来自标题为“示例性的来源生物体”的前一部分中所列的任意生物体的细胞。宿主细胞可以是天然产生异戊二烯的细胞，或者是不天然产生异戊二烯的细胞。在一些实施方式中，宿主细胞通过DXP途径天然产生异戊二烯，并且加入异戊二烯合酶、DXS和/或IDI核酸，以增加通过该途径产生的异戊二烯。在一些实施方式中，宿主细胞通过MVA途径天然产生异戊二烯，并且加入异戊二烯合酶和/或一个或多个MVA途径核酸，以增加通过该途径产生的异戊二烯。在一些实施方式中，宿主细胞通过DXP途径天然产生异戊二烯，并且加入一个或多个MVA途径核酸，以增加通过部分或全部MVA途径以及DXP途径产生的异戊二烯。在一些实施方式中，宿主细胞通过DXP和MVA途径天然产生异戊二烯，并且加入一个或多个异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸，以增加通过这些途径之一或二者产生的异戊二烯。应当理解，本文所述的任意宿主生物体的任意组合可以用于本发明的其它实施方式。 
示例性的转化方法 
使用标准技术，可以将异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径核酸或包含它们的载体插入宿主细胞(例如本文描述的植物细胞、真菌细胞、酵母细胞或细菌细胞)中，以表达所编码的异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径多肽。使用下列技术，可以将DNA构建体或载体导入宿主细胞中：例如，转化、电穿孔、细胞核显微注射、转导、转染(例如脂转染介导的或DEAE-糊精介导的转染，或使用重组噬菌体病毒的转染)、与磷酸钙DNA沉淀物一起温育、以DNA包被的微粒高速轰击和原生质体 融合。一般性的转化技术是本领域已知的(参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人(编)Chapter 9，1987；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，1989；和Campbell等人，Curr.Genet.16：53-56，1989，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于转化方法的内容)。在木霉中表达异源多肽的描述见美国专利6,022,725；美国专利6,268,328；美国专利7,262,041；WO 2005/001036；Harkki等人，Enzyme Microb.Technol.13：227-233，1991；Harkki等人，Bio Technol.7：596-603，1989；EP 244,234；EP 215,594；和Nevalainen等人，“The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes，”见Molecular Industrial Mycology，Eds.Leong and Berka，Marcel Dekker Inc.，NY pp.129-148，1992，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于转化和表达方法的内容)。对于曲霉菌株的转化，还参考了Cao等人，(Sci.9：991-1001，2000；EP 238023；和Yelton等人，Proceedings.Natl.Acad.Sci.USA 81：1470-1474，1984(它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于转化方法的内容)。导入的核酸可以整合进入染色体DNA或者可以维持为染色体外的复制序列。 
可以使用本领域已知的任意方法来选择转化体。在一个非限制性实例中，包含amdS标志物的稳定转化体与不稳定转化体通过下列区分开：在含有乙酰胺的固体培养基上更快的生长速率和形成具有平滑而非不整齐的轮廓圆形菌落。另外，在一些情况下，通过下列进行进一步的稳定性测试：在固体非选择性培养基(例如不含乙酰胺的培养基)上生长转化体，从该培养基收集孢子，和检测随后在含有乙酰胺的选择性培养基上萌芽并生长的这些孢子的百分比。 
在一些实施方式中，通过涉及原生质体形成和原生质体转化、然后通过已知方式再生细胞壁的方法转化真菌细胞。在一个具体的实施方式中，制备用于转化的木霉属包括：从真菌菌丝体制备原生质体(参见，Campbell等人，Curr.Genet.16：53-56，1989，其通过引用整体并入本文，尤其是关于转化方法的内容)。在一些实施方式中，从萌芽的营养孢子获得菌丝体。以 消化细胞壁的酶处理菌丝体，从而产生原生质体。然后通过悬浮培养基中渗透稳定剂的存在来保护原生质体。这些稳定剂包括山梨醇、甘露醇、氯化钾、硫酸镁等。这些稳定剂的通常的浓度是0.8M-1.2M。在悬浮培养基中使用约1.2M的山梨醇溶液是合乎需要的。 
宿主木霉属的菌株对DNA的摄取依赖于钙离子的浓度。一般而言，在摄取溶液中使用约10mM CaCl2至50mM CaCl2。除了摄取溶液中的钙离子之外，一般包括的其它化合物是：缓冲系统，例如TE缓冲液(10Mm Tris，pH 7.4；1mM EDTA)或10mM MOPS，pH 6.0缓冲液(吗啉丙磺酸)和聚乙二醇(PEG)。不被任何特定理论所限，相信聚乙二醇的作用是融合细胞膜，因此允许培养基的内容物被递送至木霉属菌株的细胞质并使质粒DNA转移至细胞核。这种融合通常允许多个拷贝的质粒DNA整合进入宿主染色体。 
通常在转化中使用含有密度为105至107/mL(例如2 x 106/mL)的已经过渗透性处理的木霉属原生质体或细胞的悬浮液。将体积为100μL的这些原生质体或细胞(在合适的溶液中，例如，1.2M山梨醇和50mM CaCl2)与需要的DNA混合。一般而言，向摄取溶液中加入高浓度的PEG。可以向原生质体悬浮液中加入0.1-1体积的25％PEG 4000。在一些实施方式中，向原生质体悬浮液中加入约0.25体积。也可以向摄取溶液中加入添加剂，例如二甲基亚砜、肝素、精脒，氯化钾等并辅助转化。用于其它真菌宿主细胞的类似程序是可以获得的(参见，例如，美国专利6,022,725和美国专利6,268,328，它们各自通过引用整体并入本文，尤其是关于转化方法的内容)。 
一般而言，然后将混合物在约0℃培养10-30分钟的时间段。然后向混合物中加入另外的PEG以进一步增加需要的核酸序列的摄取。一般加入转化混合物体积的5-15倍体积的25％PEG 4000；然而，更大和更小体积可以是合适的。转化混合物体积的约10倍的25％PEG 4000是合乎需要的。加入PEG之后，然后在室温或在冰上培养转化混合物，然后加入山梨醇和CaCl2溶液。然后将原生质体悬浮液加入到生长培养基的熔化的等份中。当生长培养基包括生长选择剂(例如，乙酰胺或抗生素)时，其仅 允许转化体生长。 
可以根据常规方法进行细菌细胞的转化，所述常规方法例如描述于Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，1982的方法，其通过引用整体并入本文，尤其是关于转化方法的内容。 
示例性的细胞培养基 
本发明还包括生产异戊二烯的细胞或培养的细胞群体。“培养的细胞”是指在允许细胞进行一次或多次细胞分裂的溶液(例如细胞培养基)中的两个或更多个细胞。“培养的细胞”不包括这样的植物细胞：其是包含已经分化为植物组织的细胞的活的多细胞植物的一部分。在多个实施方式中，细胞培养物包含至少或约10、20、50、100、200、500、1,000、5,000、10,000或更多个细胞。 
可以使用任意碳源来培养宿主细胞。术语“碳源”是指能够被宿主细胞或生物体代谢的一种或多种含碳化合物。例如，用于培养宿主细胞的细胞培养基可以包含适合于维持宿主细胞存活或生长的任意碳源。 
在一些实施方式中，碳源是碳水化合物(例如单糖、二糖、寡糖、或多糖)、转化糖(例如，酶处理的蔗糖糖浆)、丙三醇、甘油(例如，生产生物柴油或肥皂的工艺的甘油副产物)、二羟基丙酮、一碳源、油(例如，植物油或菜油，例如玉米油、棕榈油、或大豆油)、乙酸盐、动物脂肪、动物油、脂肪酸(例如，饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、或多不饱和脂肪酸)、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、可再生碳源(例如，生物质碳源，例如水解的生物质碳源)、酵母提取物、来自酵母提取物的成分、聚合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、琥珀酸、乳酸、乙酸、乙醇、或前述中的两项或多项的任意组合。在一些实施方式中，碳源是光合作用的产物，包括但不限于葡萄糖。在一些实施方式中，碳水化合物是木糖或葡萄糖。 
示例性的单糖包括葡萄糖和果糖；示例性的寡糖包括乳糖和蔗糖，示例性的多糖包括淀粉和纤维素。示例性的碳水化合物包括C6糖(例如，果糖、甘露糖、半乳糖、或葡萄糖)和C5糖(例如，木糖或阿拉伯糖)。 在一些实施方式中，细胞培养基包括碳水化合物以及除了碳水化合物之外的碳源(例如，丙三醇、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂质、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、或来自酵母提取物的成分)。在一些实施方式中，细胞培养基包含碳水化合物以及多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)。在一些实施方式中，微生物多肽是来自酵母或细菌的多肽。在一些实施方式中，植物多肽是来自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈、花生、向日葵、椰子、芥、油菜籽、棉花籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、或亚麻仁。 
在一些实施方式中，碳水化合物的浓度是至少或大约5g/升培养液(g/L，其中培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积二者)，例如至少或大约10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、400、或更多g/L。在一些实施方式中，碳水化合物的浓度是大约50至大约400g/L，例如大约100至大约360g/L，大约120至大约360g/L，或大约200至大约300g/L。在一些实施方式中，碳水化合物的该浓度包括在培养宿主细胞之前和/或过程中加入的碳水化合物的总量。 
在一些实施方式中，在限葡萄糖的条件下培养细胞。“限葡萄糖的条件”意思是加入的葡萄糖的量小于或等于细胞消耗的葡萄糖的量的大约105％(例如大约100％)。在具体的实施方式中，加入到培养基中的葡萄糖的量大约等于特定时间段期间细胞消耗的葡萄糖的量。在一些实施方式中，通过限制加入的葡萄糖的量来控制细胞生长速率，从而细胞在可以被细胞培养基中的葡萄糖的量支持的速率生长。在一些实施方式中，在细胞培养的时间期间，葡萄糖不积累。在多个实施方式中，在限葡萄糖的条件下培养细胞超过或等于大约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、或70个小时。在多个实施方式中，在限葡萄糖的条件下培养细胞超过或等于大约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％的总细胞培养时间长度。不被任何特定理论所限，相信限葡萄糖的条件可以允许更有利的细胞调节。 
在一些实施方式中，在存在过量葡萄糖的条件下培养细胞。在具体的实施方式中，加入的葡萄糖的量大于大约105％(例如大约或大于110％、 120％、150％、175％、200％、250％、300％、400％、或500％)或更高的细胞在特定时间段期间消耗的葡萄糖的量。在一些实施方式中，在细胞培养时间过程中葡萄糖积累。 
示例性的脂质是包含一种或多种C4和以上脂肪酸的脂肪酸的任意物质，所述脂肪酸是饱和、不饱和、或分支的。 
示例性的油是在室温为液态的脂质。在一些实施方式中，脂质包含一种或多种C4或以上的脂肪酸(例如包含一种或多种具有4个或更多个碳的饱和的、不饱和的、或分支的脂肪酸)。在一些实施方式中，油获自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈、花生、向日葵、椰子、芥、油菜籽、棉花籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、亚麻仁、油质微生物细胞、乌桕、或前述两项或更多项的任意组合。 
示例性的脂肪酸包括式RCOOH的化合物，其中“R”是烃。示例性的不饱和脂肪酸包括这样的化合物：其中“R”包括至少一个碳-碳双键。示例性的不饱和脂肪酸包括但不限于油酸、异油酸、亚油酸、棕榈油酸、和花生四烯酸。示例性的多不饱和脂肪酸包括这样的化合物：其中“R”包括多个碳-碳双键。示例性的饱和脂肪酸包括这样的化合物：其中“R”是饱和的脂肪族基团。在一些实施方式中，碳源包括一种或多种C12-C22脂肪酸，例如C12饱和脂肪酸、C14饱和脂肪酸、C16饱和脂肪酸、C18饱和脂肪酸、C20饱和脂肪酸、或C22饱和脂肪酸。在示例性的实施方式中，脂肪酸是棕榈酸。在一些实施方式中，碳源是脂肪酸(例如，不饱和脂肪酸)的盐、脂肪酸(例如，不饱和脂肪酸)的衍生物、或脂肪酸(例如，不饱和脂肪酸)的衍生物的盐。合适的盐包括但不限于：锂盐、钾盐、钠盐等。甘油二酯和甘油三酯是甘油的脂肪酸酯。 
在一些实施方式中，脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯的浓度是至少或大约1g/升培养液(g/L，其中培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积二者)，例如至少或大约5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、400、或更多g/L。在一些实施方式中，脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯的浓度是大约10至大约400g/L，例如大约25至大约300g/L，大约60至 大约180g/L，或大约75至大约150g/L。在一些实施方式中，该浓度包括在培养宿主细胞之前和/或过程中加入的脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯的总量。在一些实施方式中，碳源包括(1)脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯和(ii)碳水化合物，例如葡萄糖。在一些实施方式中，脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯与碳水化合物的比是大约1∶1(基于碳)(即，脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯中的一个碳/碳水化合物的碳)。在具体的实施方式中，脂质、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯的量是大约60至180g/L，并且碳水化合物的量是大约120至360g/L。 
示例性的微生物多肽碳源包括来自酵母或细菌的一种或多种多肽。示例性的植物多肽碳源包括来自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈、花生、向日葵、椰子、芥、油菜籽、棉花籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、或亚麻仁的一种或多种多肽。 
示例性的可再生碳源包括干酪乳清渗透物、玉米浸液、甜菜糖蜜、大麦芽、和来自前述任意项的成分。示例性的可再生碳源还包括存在于生物质中的乙酸盐、葡萄糖、己糖、戊糖和木糖，所述生物质例如玉米、柳枝稷、甘蔗、发酵过程的细胞废物、以及来自大豆、玉米、或小麦的研磨的蛋白质副产物。在一些实施方式中，生物质碳源是木质纤维素、半纤维素、或纤维质材料，例如但不限于草、小麦、麦秸、甘蔗渣、甘蔗渣、软木浆、玉米、玉米芯或稻壳、玉米仁、来自玉米仁的纤维、玉米秸秆、柳枝稷、稻壳产物、或从谷物(如玉米、高粱、黑麦、triticate、大麦、小麦、和/或蒸馏谷物)的湿或干研磨生产的副产物。示例性的纤维质材料包括木材、纸和浆废液、草本植物、及果肉。在一些实施方式中，碳源包括任意植物部分，如茎、谷粒、根、或块茎。在一些实施方式中，任意以下植物的全部或部分用作碳源：玉米、小麦、黑麦、高粱、triticate、水稻、粟、大麦、木薯、豆类如大豆和豌豆、马铃薯、蕃薯、香蕉、甘蔗、和/或木薯。在一些实施方式中，碳源是生物质水解物，如包含木糖和葡萄糖二者或包含蔗糖和葡萄糖二者的生物质水解物。 
在一些实施方式中，在添加到细胞培养基中之前预处理可再生碳源(例如生物质)。在一些实施方式中，预处理包括酶预处理、化学预处理、或酶和化学预处理二者的组合(见，例如，Farzaneh等人，Bioresource Technology 96(18)：2014-2018，2005；美国专利号6,176,176；美国专利号6,106,888；其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于可再生碳源的预处理的内容)。在一些实施方式中，在添加到细胞培养基之前，将可再生碳源部分或全部水解。 
在一些实施方式中，在添加到细胞培养基之前，可再生碳源(例如玉米秸秆)经历氨气爆破法(AFEX)预处理(见，例如，Farzaneh等人，Bioresource Technology 96(18)：2014-2018，2005)。在AFEX预处理过程中，在中等温度(例如大约60℃至大约100℃)和高压(例如大约250psi至大约300psi)以液态无水氨将可再生碳源处理大约5分钟。然后，迅速释放压力。在该过程中，木质素溶解、半纤维素水解、纤维素的解晶作用、和增加的表面积的化学和物理的组合效应使得纤维素和半纤维素几乎能够完全酶促转化为可发酵的糖。AFEX预处理具有以下优点：几乎所有的氨都可以被回收和再利用，剩余的则作为下游过程中的微生物的氮源。另外，AFEX预处理无需洗涤流。因此，AFEX处理之后的干物质回收基本上是100％。AFEX基本上是干—干的过程。经处理的可再生碳源在长时间内是稳定的，并且可以以非常高的固体载量进料到酶促水解或发酵过程中。纤维素和半纤维素在AFEX过程中被良好保存，甚少降解或无降解。对于经历了AFEX预处理的可再生碳源而言，在酶促水解之前无需中和。AFEX处理的碳源的酶促水解为随后的发酵用途产生清洁的糖流。 
在一些实施方式中，碳源(例如可再生碳源)的浓度是至少或大约0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、或50％葡萄糖(w/v)。可以通过使用标准的HPLC方法，使用葡萄糖作为参照物来测定葡萄糖的当量，以测定从碳源生产的葡萄糖的量。在一些实施方式中，碳源(例如可再生碳源)的浓度相当于大约0.1％至大约20％葡萄糖，例如大约0.1％至大约10％葡萄糖，大约0.5％至大约10％葡萄糖，大约1％至大约10％葡萄糖，大约1％至大约5％葡萄糖，或大约 1％至大约2％葡萄糖。 
在一些实施方式中，碳源包括酵母提取物或酵母提取物的一种或多种成分。在一些实施方式中，酵母提取物的浓度是至少1克酵母提取物/升培养液(g/L，其中培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积二者)，例如至少或大约5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、或更多g/L。在一些实施方式中，酵母提取物的浓度是大约1至大约300g/L，例如大约1至大约200g/L，大约5至大约200g/L，大约5至大约100g/L，或大约5至大约60g/L。在一些实施方式中，该浓度包括在培养宿主细胞之前和/或过程中加入的酵母提取物的总量。在一些实施方式中，碳源包括酵母提取物(或其一种或多种成分)和另一种碳源，例如葡萄糖。在一些实施方式中，酵母提取物与其它碳源的比例是大约1∶5，大约1∶10，或1∶20(w/w)。 
另外，碳源也可以是一碳底物，例如二氧化碳或甲醇。已经报道了在甲基营养酵母(Yamada等人，Agric.Biol.Chem.，53(2)541-543，1989，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于碳源的内容)和细菌(Hunter等人，Biochemistry，24，4148-4155，1985，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于碳源的内容)从单一碳源(例如，甲醇、甲醛、或甲酸)生产甘油。这些生物体可以同化单一碳化合物：从甲烷氧化态至甲酸，并且生产甘油。碳同化的途径可以经由核酮糖一磷酸、经由丝氨酸或经由木酮糖-一磷酸(Gottschalk，Bacterial Metabolism，Second Edition，Springer-Verlag：New York，1986，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于碳源的内容)。核酮糖一磷酸途径包括甲酸与核酮糖-5-磷酸缩合以形成6碳糖，该6碳糖变为果糖，并最终变为3碳产物甘油醛-3-磷酸。类似地，丝氨酸途径使一碳化合物通过亚甲基四氢叶酸同化进入糖酵解途径。 
除了一碳和二碳底物，还已知甲基营养生物体利用多种其它含碳化合物，例如甲胺、葡萄糖胺和多种氨基酸以用于代谢活性。例如，已知甲基营养酵母利用来自甲胺的碳以形成海藻糖或甘油(Bellion等人，Microb.Growth Cl Compd.，[Int.Symp.]，7th ed.，415-32.Editors：Murrell等人，Publisher：Intercept，Andover，UK，1993，其通过引用方式全文并入本文， 尤其是关于碳源的内容)。类似地，假丝酵母属的多个种代谢丙氨酸或油酸(Sulter等人，Arch.Microbiol.153(5)，485-9，1990，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于碳源的内容)。 
在一些实施方式中，在含有生理盐和营养物的标准培养基中培养细胞(见，例如，Pourquie，J.等人，Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation，eds.Aubert等人，Academic Press，pp.71-86，1988和Ilmen等人，Appl.Environ.Microbiol.63：1298-1306，1997，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于细胞培养基的内容)。示例性的生长培养基是通常商业上制备的培养基，例如Luria Bertani(LB)培养基，Sabouraud Dextrose(SD)培养基，或酵母培养基(YM)肉汤。也可以使用其它的确定的或合成的生长培养基，用于特定宿主细胞的生长的合适的培养基是微生物或发酵科学领域技术人员已知的。 
除了合适的碳源之外，细胞培养基合乎需要地包含合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液、和本领域技术人员已知的适合于培养物生长或增加异戊二烯产量的其它成分(见，例如，WO 2004/033646及其中引用的参考文献，以及WO 96/35796及其中引用的参考文献，其各自通过引用方式全文并入本文，尤其是关于细胞培养基和细胞培养条件的内容)。在一些实施方式中，当异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径核酸处于可诱导启动子控制下时，向培养基中合乎需要地加入有效诱导异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径多肽的表达的浓度的诱导剂(例如糖、金属盐或抗微生物剂)。在一些实施方式中，细胞培养基具有对应于载体(其具有一种或多种DXS、IDI、或MVA途径核酸)上的抗生素抗性核酸(例如卡那霉素抗性核酸)的抗生素(例如卡那霉素)。 
示例性的细胞培养条件 
适合于维持和生长细菌培养物的材料和方法是本领域熟知的。示例性的技术可以见Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardt等人，eds)，American Society for Microbiology，Washington，D.C.(1994)或Brock in Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，Second Edition(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA，其通过引用方式全文并 入本文，尤其是关于细胞培养技术的内容。在一些实施方式中，在允许表达一种或多种由插入至宿主细胞内的核酸编码的异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径多肽的条件下在培养基中培养细胞。 
可以使用标准的细胞培养条件来培养细胞(见，例如，WO 2004/033646及其中引用的参考文献，其各自通过引用方式全文并入本文，尤其是关于细胞培养物和发酵条件的内容)。细胞生长并维持于合适的温度、气体混合物、和pH下(例如大约20℃至大约37℃，在大约6％至大约84％CO2中，以及在大约5至大约9的pH下)。在一些实施方式中，细胞在35℃生长于合适的细胞培养基中。在一些实施方式中，例如，在大约28℃在合适的培养基中在振荡培养物或发酵器中培养，直至达到所需要的量的异戊二烯的生产。在一些实施方式中，用于发酵的pH范围是大约pH 5.0至大约pH 9.0(例如大约pH 6.0至大约pH 8.0，或大约6.5至大约7.0)。可以基于宿主细胞的需要，在有氧、缺氧、或无氧条件下进行反应。用于给定的丝状真菌的示例性培养条件是本领域已知的，且可以查阅科学文献和/或从真菌来源处获得，例如American Type Culture Collection and Fungal Genetics Stock Center。 
在多个实施方式中，使用任意已知的发酵模式使细胞生长，例如批式、补料分批、或连续方法。在一些实施方式中，使用批式发酵方法。经典的批式发酵是封闭系统，其中在发酵开始时设定培养基的成分，并且在发酵过程中不进行人为改变。因此，在发酵开始时，将需要的宿主细胞接种于细胞培养基，进行发酵，但不向系统中加入任何物质。然而，通常来讲，“批式”发酵是就加入碳源的批而言的，通常会尝试控制因素，例如pH和氧浓度。在批式系统中，系统的代谢物和生物质组成一直在变化，直至发酵停止时。在批式培养物中，细胞经过静止的停滞期进入高速生长对数期，最终到达稳定期，在稳定期生长速率下降或停止。在一些实施方式中，处于对数期的细胞负责大量生产异戊二烯。在一些实施方式中，处于稳定期的细胞生产异戊二烯。 
在一些实施方式中，使用标准的批式系统的变体，例如补料分批系统。补料分批发酵方法包括典型的批式系统，只不过随着发酵的进程以增量添 加碳源。当分解代谢产物抑制倾向于抑制细胞的代谢并且需要在细胞培养基中具有有限量的碳源时，补料分批系统是有用的。可以使用有限或过量的碳源(例如葡萄糖)进行补料分批发酵。补料分批系统中的实际的碳源浓度是难以测定的，因此根据可测因素例如pH、溶解氧、和废气例如CO2的分压的变化来估计。批式和补料分批发酵是常见的并且是本领域熟知的，其实例可以见Brock，Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，Second Edition(1989)Sinauer Associates，Inc.，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于细胞培养和发酵条件的内容。 
在一些实施方式中，使用连续发酵方法。连续发酵是开放的系统，其中连续向生物反应器中添加确定的发酵培养基，并且同时取出等量的条件化培养基以进行处理。连续发酵一般将培养物维持在恒定的高密度，其中细胞主要处于对数生长期。 
连续发酵允许调节影响细胞生长或异戊二烯生产的一个因素或任意数目的因素。例如，一种方法将限制性营养物例如碳源或氮水平维持在固定的速率，并允许所有其它参数适度。在其它系统中，可以持续改变影响生长的多个因素，同时保持细胞浓度恒定(例如通过培养基浊度测定的浓度)。连续系统努力维持稳定状态的生长状况。因此，由于培养基排出而损失的细胞针对发酵物中的细胞生长速率进行平衡。调节用于连续发酵方法的营养物和生长因素的方法和用于使产物形成速率最大化的技术是工业微生物学领域熟知的，多种方法描述于Brock，Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，Second Edition(1989)Sinauer Associates，Inc.，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于细胞培养和发酵条件的内容。 
在一些实施方式中，细胞固定于基底上作为整个细胞催化剂并经历发酵条件以生产异戊二烯。 
在一些实施方式中，将液体培养物的瓶置于振荡器上以将氧导入液体中并维持培养物的均一性。在一些实施方式中，使用温育器控制温度、湿度、振荡速度、和/或培养物生长的其它条件。最简单的温育器是具有可调节的加热器(通常最高至～65℃)的隔离箱。更复杂的温育器还包括降低温度(通过致冷)的能力，或控制湿度或CO2水平的能力。多数温育器包 括计时器；一些还可以程序化以在不同的温度、湿度水平等之间循环。温育器的尺寸可以是各种各样的，从台式到小型房间大小的单位。 
如果需要，可以改变一部分或全部的细胞培养基以补充营养物和/或避免积累潜在有害的代谢副产物和死亡的细胞。在悬浮培养物的情况下，可以通过离心或过滤悬浮培养物而从培养基中分离细胞，然后将细胞重悬于新鲜的培养基中。在贴壁培养的情况下，可以通过吸液而直接去掉培养基并更换。在一些实施方式中，细胞培养基允许细胞中的至少一部分在连续培养物(例如未稀释的连续培养物)中分裂以进行至少或大约5、10、20、40、50、60、65、或更多次细胞分裂。 
在一些实施方式中，使用组成型或渗漏启动子(例如Trc启动子)，不添加用于诱导与启动子可操作地连接的异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸的表达的化合物(例如IPTG)。在一些实施方式中，添加化合物(例如IPTG)以诱导与启动子可操作地连接的异戊二烯合酶、DXS、IDI、或MVA途径核酸的表达。 
用于使异戊二烯的生产与细胞生长解除偶联的示例性方法 
合乎需要地，来自原料的碳被转化为异戊二烯而非转化为细胞的生长和维持。在一些实施方式中，细胞生长至低至中等的OD600，然后开始或增大异戊二烯的生产。该策略允许将大部分的碳转化为异戊二烯。 
在一些实施方式中，细胞达到的光密度使得它们不再分裂或分裂极为缓慢，但是持续数小时地产生异戊二烯(例如大约2、4、6、8、10、15、20、25、30、或更多个小时)。例如，图60A-67C显示：在细胞达到它们不再分裂或分裂极为缓慢的光密度后，细胞可以持续生产显著量的甲羟戊酸或异戊二烯。在一些情况中，550nm处的光密度随时间下降(例如，由于细胞裂解而使细胞不再处于对数生长期之后光密度的下降)，并且细胞持续生产显著量的甲羟戊酸或异戊二烯。在一些实施方式中，经一定的时间段(例如大于或大约5、10、15、20、25、30、40、50或60个小时)，细胞在550nm处的光密度增加小于或大约50％(例如，小于或大约40％、30％、20％、10％、5％、或0％)，并且在该时间段期间，细胞生产的异戊二烯是大于或大约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、 700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、或更多nmole异戊二烯/克细胞的湿细胞重/小时(nmole/gwcm/hr)。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约2至大约5,000nmole/gwcm/hr，例如大约2至大约100nmole/gwcm/hr，大约100至大约500nmole/gwcm/hr，大约150至大约500nmole/gwcm/hr，大约500至大约1,000nmole/gwcm/hr，大约1,000至大约2,000nmole/gwcm/hr，或大约2,000至大约5,000nmole/gwcm/hr。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约20至大约5,000nmole/gwcm/hr，大约100至大约5,000nmole/gwcm/hr，大约200至大约2,000nmole/gwcm/hr，大约200至大约1,000nmole/gwcm/hr，大约300至大约1,000nmole/gwcm/hr，或大约400至大约1,000nmole/gwcm/hr。 
在一些实施方式中，经一定的时间段(例如大于或大约5、10、15、20、25、30、40、50或60个小时)，细胞在550nm处的光密度增加小于或大约50％(例如，小于或大约40％、30％、20％、10％、5％、或0％)，并且在该时间段期间，细胞生产的异戊二烯的累积效价(总量)是大于或大约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、50,000、100,000、或更多毫克异戊二烯/升培养液(mg/L培养液，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约2至大约5,000mg/L培养液，例如大约2至大约100mg/L培养液，大约100至大约500mg/L培养液，大约500至大约1,000mg/L培养液，大约1,000至大约2,000mg/L培养液，或大约2,000至大约5,000mg/L培养液。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约20至大约5,000mg/L培养液，大约100至大约5,000mg/L培养液，大约200至大约2,000mg/L培养液，大约200至大约1,000mg/L培养液，大约300至大约1,000mg/L培养液，或大约400至大约1,000mg/L 培养液。 
在一些实施方式中，经一定的时间段(例如大于或大约5、10、15、20、25、30、40、50或60小时)，细胞在550nm处的光密度增加小于或大约50％(例如，小于或大约40％、30％、20％、10％、5％、或0％)，并且在该时间段期间，细胞将大于或大约0.0015％、0.002％、0.005％、0.01％、 0.02％、0.05％、0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％、或8.0％的细胞培养基中的碳转化为异戊二烯。在一些实施方式中，碳向异戊二烯的转化百分率是例如大约0.002％至大约4.0％，大约0.002％至大约3.0％，大约0.002％至大约2.0％，大约0.002％至大约1.6％，大约0.002％至大约0.005％，大约0.005％至大约0.01％，大约0.01％至大约0.05％，大约0.05％至大约0.15％，0.15％至大约0.2％，大约0.2％至大约0.3％，大约0.3％至大约0.5％，大约0.5％至大约0.8％，大约0.8％至大约1.0％，或大约1.0％至大约1.6％。在一些实施方式中，碳向异戊二烯的转化百分率是大约0.002％至大约0.4％，0.002％至大约0.16％，0.04％至大约0.16％，大约0.005％至大约0.3％，大约0.01％至大约0.3％，或大约0.05％至大约0.3％。 
在一些实施方式中，仅在稳定期生产异戊二烯。在一些实施方式中，在生长期和稳定期都生产异戊二烯。在多个实施方式中，在稳定期期间生产的异戊二烯的量(例如所生产的异戊二烯的总量或所生产的异戊二烯的量/升培养液/小时/OD600)是大于或大约生长期期间相同时间长度生产的异戊二烯量的2、3、4、5、10、20、30、40、50、或更多倍。在多个实施方式中，细胞在稳定期生产的异戊二烯大于或大约是所生产的异戊二烯总量(例如在发酵过程的一定的时间例如20小时生产的异戊二烯)的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、或更高。在多个实施方式中，细胞分裂缓慢或完全不分裂以致于细胞在550nm处的光密度增加小于或大约是50％(例如小于或大约40％、30％、20％、10％、5％、或0％)时生产的异戊二烯大于或大约是所生产的异戊二烯总量(例如在发酵过程的一定的时间例如20小时生产的异戊二烯)的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高。在一些实施方式中，仅在生长期生产异戊二烯。 
在一些实施方式中，将一种或多种MVA途径、IDI、DXP、或异戊二烯合酶核酸置于在稳定期比在生长期具有更高活性的启动子或因子的控制 下。例如，可以将一种或多种MVA途径、IDI、DXP、或异戊二烯合酶核酸置于稳定期σ因子例如RpoS的控制下。在一些实施方式中，将一种或多种MVA途径、IDI、DXP、或异戊二烯合酶核酸置于在稳定期可诱导的启动子控制下，例如可以被在稳定期有活性的应答调节子诱导的启动子。 
在安全操作范围内生产异戊二烯 
根据其可燃性特征在安全操作水平内生产异戊二烯简化了商业设施的设计和构建，极大地改进了安全操作的能力，并限制了起火的潜在可能。特别地，生产异戊二烯的最佳范围在安全区内，即在异戊二烯浓度的非可燃范围内。在一个这样的方面，本发明的特征在于用于在异戊二烯浓度的非可燃范围内(在异戊二烯的可燃性包迹之外)生产异戊二烯的方法。 
因此，使用了计算机模拟和实验测试来确定异戊二烯(例如在O2、N2、CO2、或上述气体中的两种或更多种的任意组合存在时的异戊二烯)的可燃极限，以确保操作的安全性。可燃性包迹的特征在于燃烧下限(LFL)、燃烧上限(UFL)、极限氧浓度(LOC)、和极限温度。对于可燃的系统而言，必须在存在最少量的氧化剂(通常是氧)的情况下有最少量的燃料(例如异戊二烯)。LFL是使燃烧持续所需的最少量的异戊二烯，而UFL是可以存在的最大量的异戊二烯。在该极限之上，混合物富含燃料并且氧的级份太低以致于不能形成可燃混合物。LOC表示形成可燃混合物还需要存在的氧的最小级份。极限温度基于异戊二烯的闪点，其是异戊二烯的燃烧可以传播的最低温度。这些限值对于异戊二烯的浓度、氧化剂的类型和浓度、系统中存在的惰性物、系统的温度和压力是特异性的。在可燃性包迹极限内的成分会使燃烧传播并需要加工设备的设计和操作上的另外的安全考虑。 
使用计算机模拟和数学分析和实验测试检测了如下条件。如果需要，可以使用本文描述的方法测试其它条件(例如其它温度、压力、和永久气体成分)以测定LFL、UFL、和LOC浓度。 
(1)计算机模拟和数学分析 
测试组1： 
异戊二烯：0wt％-14wt％ 
O2：6wt％-21wt％ 
N2：79wt％-94wt％ 
测试组2： 
异戊二烯：0wt％-14wt％ 
O2：6wt％-21wt％ 
N2：79wt％-94wt％ 
以水饱和 
测试组3： 
异戊二烯：0wt％-14wt％ 
O2：6wt％-21wt％ 
N2：79wt％-94wt％ 
CO2：5wt％-30wt％ 
(2)用于最终测定可燃极限的实验测试 
测试组1： 
异戊二烯：0wt％-14wt％ 
O2：6wt％-21wt％ 
N2：79wt％-94wt％ 
测试组2： 
异戊二烯：0wt％-14wt％ 
O2：6wt％-21wt％ 
N2：79wt％-94wt％ 
以水饱和 
使用模拟软件以产生数种不同测试条件下的系统的可燃特性的估计。CO2没有显示出对于系统的可燃极限的显著性影响。通过实验测试确认了测试组1和2。模拟结果与实验测试结果是一致的。在加入水的情况下仅发现有少许差异。 
在40℃和1个大气压下，异戊二烯、O2、N2、和CO2混合物的LOC经测定是9.5vol％。加入高达30％的CO2未对异戊二烯、O2、和N2混合物的可燃特性造成显著影响。在干燥的和水饱和的异戊二烯、O2、和N2系统之间仅显示出少许可燃特性上的差异。极限温度是大约-54℃。低于大 约-54℃的温度太低以致于不能使异戊二烯的燃烧传播。 
在一些实施方式中，异戊二烯的LFL范围为大约1.5vol.％至大约2.0vol％，异戊二烯的UFL范围为大约2.0vol.％至大约12.0vol.％，这取决于系统中氧的量。在一些实施方式中，LOC是大约9.5vol％氧。在一些实施方式中，异戊二烯的LFL是大约1.5vol.％至大约2.0vol％，异戊二烯的UFL是大约2.0vol.％至大约12.0vol.％，当温度是大约25℃至大约55℃(例如大约40℃)并且压力是大约1个大气压至3个大气压时，LOC是大约9.5vol％氧。 
在一些实施方式中，在存在小于大约9.5vol％氧(即，低于形成异戊二烯的可燃化合物所需的LOC)的情况下生产异戊二烯。在存在大于或大约9.5vol％氧的情况下生产异戊二烯的一些实施方式中，异戊二烯的浓度低于LFL(例如低于大约1.5vol.％)。例如，可以通过以惰性气体稀释异戊二烯成分(例如，通过持续或周期性加入惰性气体，例如氮气，以保持异戊二烯成分低于LFL)而将异戊二烯的量保持在低于LFL。在存在大于或大约9.5vol％氧的情况下生产异戊二烯的一些实施方式中，异戊二烯的浓度高于UFL(例如高于大约12vol.％)。例如，可以通过使用以高于UFL的浓度生产异戊二烯的系统(例如本文描述的任意细胞培养系统)将异戊二烯的量保持高于UFL。如果需要，可以使用相对低水平的氧，从而UFL也相对低。在这种情况下，需要较低的异戊二烯浓度以保持高于UFL。 
在存在大于或大约9.5vol％氧的情况下生产异戊二烯的一些实施方式中，异戊二烯浓度在可燃性包迹内(例如在LFL和UFL之间)。在异戊二烯浓度可以落在可燃性包迹内的一些实施方式中，进行一个或多个步骤以降低起火或爆炸的可能性。例如，可以避免一个或多个燃火源(例如可以产生火星的任何物质)。在一些实施方式中，进行一个或多个步骤以减少异戊二烯的浓度保持在可燃性包迹内的时间。在一些实施方式中，使用感应器来检测异戊二烯的浓度何时接近或落在可燃性包迹内。如果需要，可以在细胞培养过程中的一个或多个时间点测定异戊二烯的浓度，并且，如果异戊二烯的浓度接近或落在可燃性包迹内，可以使用标准方法调节细胞培养条件和/或惰性气体的量。在具体的实施方式中，调节细胞培养条件(例 如发酵条件)以使异戊二烯的浓度降低至低于LFL或使异戊二烯的浓度升高至高于UFL。在一些实施方式中，通过以惰性气体稀释异戊二烯成分(例如，通过持续或周期性加入惰性气体以保持异戊二烯成分低于LFL)而将异戊二烯的量保持在低于LFL。 
在一些实施方式中，所生产的异戊二烯的量是异戊二烯之外的可燃性挥发物(例如一种或多种糖)的量的至少大约2、5、10、50、75、或100倍。在一些实施方式中，除了异戊二烯气体之外的气相部分包含大约0％至大约100％(体积)的氧，例如大约0％至大约10％、大约10％至大约20％、大约20％至大约30％、大约30％至大约40％、大约40％至大约50％、大约50％至大约60％、大约60％至大约70％、大约70％至大约80％、大约90％至大约90％、或大约90％至大约100％(体积)的氧。在一些实施方式中，除了异戊二烯气体之外的气相部分包含大约0％至大约99％(体积)的氮，例如大约0％至大约10％、大约10％至大约20％、大约20％至大约30％、大约30％至大约40％、大约40％至大约50％、大约50％至大约60％、大约60％至大约70％、大约70％至大约80％、大约90％至大约90％、或大约90％至大约99％(体积)的氮。 
在一些实施方式中，除了异戊二烯气体之外的气相部分包含大约1％至大约50％(体积)的CO2，例如大约1％至大约10％，大约10％至大约20％，大约20％至大约30％，大约30％至大约40％，或大约40％至大约50％(体积)的CO2。 
在一些实施方式中，异戊二烯组合物还包含乙醇。例如，乙醇可用于异戊二烯的提取蒸馏，从而产生包含乙醇和异戊二烯的组合物(例如中间产物流)。合乎需要地，乙醇的量在乙醇的可燃性包迹之外。乙醇的LOC是大约8.7vol％，乙醇的LFL在标准条件(例如大约1个大气压和大约60℉(NFPA 69 Standard on Explosion Prevention Systems，2008版，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于LOC、LFL、和UFL值的内容)下是3.3vol％。在一些实施方式中，在存在小于形成乙醇的可燃混合物所需的LOC的情况下(例如小于大约8.7％vol％)生产包含异戊二烯和乙醇的组合物。在存在大于或大约形成乙醇的可燃混合物所需的LOC的情况下生产 包含异戊二烯和乙醇的组合物的一些实施方式中，乙醇的浓度小于LFL(例如小于大约3.3vol.％)。 
在多个实施方式中，氧化物(例如氧)的量低于系统中任意燃料(例如异戊二烯或乙醇)的LOC。在多个实施方式中，氧化物(例如氧)的量低于异戊二烯或乙醇的LOC的大约60％、40％、30％、20％、10％、或5％。在多个实施方式中，氧化物(例如氧)的量比异戊二烯或乙醇的LOC低至少2、4、5、或更多个绝对百分点(vol％)。在具体的实施方式中，氧的量比异戊二烯或乙醇的LOC低至少2个绝对百分点(vol％)(例如，当异戊二烯的LOC是9.5vol％时，氧的浓度低于7.5vol％)。在多个实施方式中，燃料(例如异戊二烯或乙醇)的量比该燃料的LFL低或是其大约25％、20％、15％、10％、或5％。 
示例性的异戊二烯的生产 
在一些实施方式中，在允许细胞生产异戊二烯的条件下在培养基中培养细胞。“峰值绝对生产率”意思是：在细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行的细胞培养中)期间的废气中的异戊二烯的最大绝对量。“峰值绝对生产率时间点”意思是：在发酵运行期间，当废气中的异戊二烯的绝对量是细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间的最大值时的时间点。在一些实施方式中，在峰值绝对生产率时间点测定异戊二烯的量。在一些实施方式中，细胞的峰值绝对生产率是大约本文公开的任意的异戊二烯的量。 
“峰值比生产率”意思是细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间每细胞生产的异戊二烯的最大量。“峰值比生产率时间点”意思是：在细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间，当每细胞生产的异戊二烯的量是最大值时的时间点。峰值比生产率是这样确定的：以总的生产率除以细胞的量，细胞的量如通过600nm处的光密度(OD600)所测定。在一些实施方式中，在峰值比生产率时间点测定异戊二烯的量。在一些实施方式中，细胞的峰值比生产率是大约本文公开的任意的异戊二烯的量/细胞。 
“峰值体积生产率”意思是在细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵 运行期间的细胞培养)期间，每体积培养液(包括细胞和细胞培养基的体积)所生产的异戊二烯的最大量。“峰值比体积生产率时间点”意思是：在细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间，当每体积培养液生产的异戊二烯的量是最大值时的时间点。峰值比体积生产率是这样确定的：以总的生产率除以培养液的体积和时间的量。在一些实施方式中，在峰值比体积生产率时间点测定异戊二烯的量。在一些实施方式中，细胞的峰值比体积生产率是大约本文公开的任意的异戊二烯的量/体积/时间。 
“峰值浓度”意思是在细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间，生产的异戊二烯的最大量。“峰值浓度时间点”意思是：在细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间，当每细胞生产的异戊二烯的量是最大值时的时间点。在一些实施方式中，在峰值浓度时间点测定异戊二烯的量。在一些实施方式中，细胞的峰值浓度是大约本文公开的任意的异戊二烯的量。 
“平均体积生产率”意思是在细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间，每体积培养液(包括细胞和细胞培养基的体积)所生产的异戊二烯的平均量。平均体积生产率是这样确定的：以总的生产率除以培养液的体积和时间的量。在一些实施方式中，细胞的平均比体积生产率是大约本文公开的任意的异戊二烯的量/体积/时间。 
“累积总生产率”意思是在细胞培养的特定时间段(例如在特定发酵运行期间的细胞培养)期间，生产的异戊二烯的累积的总量。在一些实施方式中，测定异戊二烯的累积的总量。在一些实施方式中，细胞的累积的总生产率是大约本文公开的任意的异戊二烯的量。 
如在本文中使用，“相对检测器应答”是指一个化合物(例如异戊二烯)的检测器应答(例如GC/MS面积)与一个或多个化合物(例如所有的C5烃)的检测器应答(例如GC/MS面积)之间的比率。可以按照本文的描述测定检测器应答，例如使用配有Agilent HP-5MS GC/MS柱(30m x 250μm；0.25μm膜厚度)的Agilent 6890 GC/MS系统进行GC/MS分析。如果需要，可以使用每种化合物的应答因子将相对检测器应答转化为重量百分率。这种 应答因子是对于给定量的特定化合物产生多少信号的度量(即，检测器对于特定化合物有多灵敏)。当检测器对于所比较的化合物具有不同的灵敏性时，该应答因子可用作校正因子以将相对检测器应答转化为重量百分率。可替代地，可以通过假设“所比较的化合物的应答因子是相同的”来约计重量百分率。因此，可以假设重量百分率近似等于相对检测器应答。 
在一些实施方式中，所述培养的细胞以大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、12,500、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000、100,000、125,000、150,000、188,000、或更多纳摩尔的异戊二烯/克细胞的细胞湿重/小时(nmol/gwcm/hr)生产异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯的量是约2至约200,000nmol/gwcm/hr，诸如约2至约100nmol/gwcm/hr、约100至约500nmol/gwcm/hr、约150至约500nmol/gwcm/hr、约500至约1,000nmol/gwcm/hr、约1,000至约2,000nmol/gwcm/hr、约2,000至约5,000nmol/gwcm/hr、约5,000至约10,000nmol/gwcm/hr、约10,000至约50,000nmol/gwcm/hr、约50,000至约100,000nmol/gwcm/hr、约100,000至约150,000nmol/gwcm/hr、或约150,000至约200,000nmol/gwcm/hr。在一些实施方式中，异戊二烯的量是约20至约200,000nmol/gwcm/hr、约100至约5,000nmol/gwcm/hr、约200至约2,000nmol/gwcm/hr、约200至约1,000nmol/gwcm/hr、约300至约1,000nmol/gwcm/hr、约400至约1,000nmol/gwcm/hr、约1,000至约5,000nmol/gwcm/hr、约2,000至约20,000nmol/gwcm/hr、约5,000至约50,000nmol/gwcm/hr、约10,000至约100,000nmol/gwcm/hr、约20,000至约150,000nmol/gwcm/hr、或约20,000至约200,000nmol/gwcm/hr。 
可以按照如美国专利5,849,970中公开的内容测定异戊二烯的量，单位是nmole/gwcm/hr，该文献通过引用方式全文并入本文，尤其是关于测定异戊二烯的生产的内容。例如，使用标准气相色谱系统，例如等温(85℃)操作的具有正辛烷/多孔硅C柱(Alltech Associates，Inc.，Deerfield，Ill.)并偶联于RGD2氧化汞还原气体检测器(Trace Analytical，Menlo Park，CA)的系统分析2mL顶空(例如，来自于培养物的顶空，所述培养物例如在32℃ 以200rpm振荡培养大约3小时的密封瓶中培养的2mL培养物)中的异戊二烯(见，例如，Greenberg等人，Atmos.Environ.27A：2689-2692，1993；Silver等人，Plant Physiol.97：1588-1591，1991，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于测定异戊二烯的产生的内容)。通过标准的异戊二烯浓度校正曲线将气相色谱面积单位转化为nmol异戊二烯。在一些实施方式中，通过获得细胞培养物的样品的A600值、然后基于具有已知的A600值的细胞培养物的湿重的校正曲线将A600值转化为细胞的克数，来计算湿细胞重的细胞的克数。在一些实施方式中，通过假设A600值为1的1升培养液(包括细胞培养基和细胞)具有1克湿细胞重来估计细胞的克数。还将该值除以培养物已被温育的小时数，例如3个小时。 
在一些实施方式中，培养物中的细胞生产大于或大约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、100,000、或更多ng的异戊二烯/克细胞的湿细胞重/小时(ng/gwcm/h)的异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约2至大约5,000ng/gwcm/h，例如大约2至大约100ng/gwcm/h，大约100至大约500ng/gwcm/h，大约500至大约1,000ng/gwcm/h，大约1,000至大约2,000ng/gwcm/h，或大约2,000至大约5,000ng/gwcm/h。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约20至大约5,000ng/gwcm/h，大约100至大约5,000ng/gwcm/h，大约200至大约2,000ng/gwcm/h，大约200至大约1,000ng/gwcm/h，大约300至大约1,000ng/gwcm/h，或大约400至大约1,000ng/gwcm/h。可以通过将如上讨论的单位为nmole/gwcm/hr的异戊二烯的产量值乘以68.1来计算以ng/gwcm/h表示的异戊二烯的量(如以下等式5所描述)。 
在一些实施方式中，培养物中的细胞生产大于或大约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、50,000、100,000、或更多毫克的异戊二烯/L培养液(mg/L培养液，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)的异戊二烯的累积效价(总量)。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约2至大约5,000mg/L培养液，例如大约2至大约100mg/L 培养液，大约100至大约500mg/L培养液，大约500至大约1,000mg/L培养液，大约1,000至大约2,000mg/L培养液，或大约2,000至大约5,000mg/L培养液。在一些实施方式中，异戊二烯的量是大约20至大约5,000mg/L培养液，大约100至大约5,000mg/L培养液，大约200至大约2,000mg/L培养液，大约200至大约1,000mg/L培养液，大约300至大约1,000mg/L培养液，或大约400至大约1,000mg/L培养液。 
以毫克异戊二烯/升顶空(来自摇瓶或类似培养物)表示的异戊二烯的比生产率可以这样测定：在OD600值为大约1.0时从细胞培养物中取出1ml样品，将其置于20ml的瓶中，温育30分钟，然后测定顶空中的异戊二烯的量(例如实施例I第II部分中的描述)。如果OD600值不是1.0，则可以通过除以OD600值来将测定值校正为1.0的OD600值。可以通过乘以因子38而将毫克异戊二烯/升顶空的值转化为mg/L培养液/hr/培养液的OD600。可以将单位为mg/L培养液/hr/OD600的值乘以小时数和OD600值来获得单位为毫克异戊二烯/升培养液的累积效价。 
在一些实施方式中，培养物中的细胞具有大于或大约0.1、1.0、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1100、1200、1300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、或更多毫克异戊二烯/升培养液/小时(mg/L培养液/hr，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)的异戊二烯的平均体积生产率。在一些实施方式中，异戊二烯的平均体积生产率是大约0.1至大约3,500mg/L培养液/hr，例如大约0.1至大约100mg/L培养液/hr，大约100至大约500mg/L培养液/hr，大约500至大约1,000mg/L培养液/hr，大约1,000至大约1,500mg/L培养液/hr，大约1,500至大约2,000mg/L培养液/hr，大约2,000至大约2,500mg/L培养液/hr，大约2,500至大约3,000mg/L培养液/hr，或大约3,000至大约3,500mg/L培养液/hr。在一些实施方式中，异戊二烯的平均体积生产率是大约10至大约3,500mg/L培养液/hr，大约100至大约3,500mg/L培养液/hr，大约200至大约1,000mg/L培养液/hr，大约200至大约1,500mg/L培养液/hr，大约1,000至大约3,000mg/L培养液/hr，或大约1,500至大约 3,000mg/L培养液/hr。 
在一些实施方式中，培养物中的细胞具有大于或大约0.5、1.0、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1100、1200、1300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,750、4,000、4,250、4,500、4,750、5,000、5,250、5,500、5,750、6,000、6,250、6,500、6,750、7,000、7,250、7,500、7,750、8,000、8,250、8,500、8,750、9,000、9,250、9,500、9,750、10,000、12,500、15,000、或更多毫克异戊二烯/升培养液/小时(mg/L培养液/hr，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)的异戊二烯的峰值体积生产率。在一些实施方式中，异戊二烯的峰值体积生产率是大约0.5至大约15,000mg/L培养液/hr，例如大约0.5至大约10mg/L培养液/hr，大约1.0至大约100mg/L培养液/hr，大约100至大约500mg/L培养液/hr，大约500至大约1,000mg/L培养液/hr，大约1,000至大约1,500mg/L培养液/hr，大约1,500至大约2,000mg/L培养液/hr，大约2,000至大约2,500mg/L培养液/hr，大约2,500至大约3,000mg/L培养液/hr，大约3,000至大约3,500mg/L培养液/hr，大约3,500至大约5,000mg/L培养液/hr，大约5,000至大约7,500mg/L培养液/hr，大约7,500至大约10,000mg/L培养液/hr，大约10,000至大约12,500mg/L培养液/h，或大约12,500至大约15,000mg/L培养液/hr。在一些实施方式中，异戊二烯的峰值体积生产率是大约10至大约15,000mg/L培养液/hr，大约100至大约2,500mg/L培养液/hr，大约1,000至大约5,000mg/L培养液/hr，大约2,500至大约7,500mg/L培养液/hr，大约5,000至大约10,000mg/L培养液/hr，大约7,500至大约12,500mg/L培养液/hr，或大约10,000至大约15,000mg/L培养液/hr。 
发酵器中的以mg/L培养液/hr表示的瞬时异戊二烯生产速率可以这样测定：取出发酵器废气的样品，通过例如实施例I第II部分的描述分析其异戊二烯的量(单位是例如毫克异戊二烯/L气体)，并将该数值乘以废气通过每升培养液的速率(例如，在1vvm(空气体积/培养液体积/分钟)时是60L 气体/小时)。因此，1mg/L气体的废气水平对应于气流为1vvm时60mg/L培养液/hr的瞬时生产速率。如果需要，可以将单位为mg/L培养液/hr的数值除以 OD600值以获得单位为mg/L培养液/hr/OD的比速率。可以通过将此平均废气异戊二烯浓度乘以发酵过程中每升发酵液鼓泡的废气的总量而将以毫克异戊二烯/L气体表示的平均值转化为总产物生产率(异戊二烯克数/升发酵液，mg/L培养液)。因此，在1vvm经10小时的0.5mg/L培养液/hr的平均废气异戊二烯浓度对应于300毫克异戊二烯/L培养液的总产物浓度。 
在一些实施方式中，所述培养的细胞将大于或约0.0015、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.12、0.14、0.16、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0、2.2、2.4、2.6、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、16.0、17.0、18.0、19.0、20.0、21.0、22.0、23.0、23.2、23.4、23.6、23.8、24.0、25.0、30.0、31.0、32.0、33.0、35.0、37.5、40.0、45.0、47.5、50.0、55.0、60.0、65.0、70.0、75.0、80.0、85.0、或90.0摩尔％的细胞培养基中的碳转化成异戊二烯。在一些实施方式中，碳向异戊二烯的转化百分比是约0.002至约90.0摩尔％，诸如约0.002至约0.005％、约0.005至约0.01％、约0.01至约0.05％、约0.05至约0.15％、0.15至约0.2％、约0.2至约0.3％、约0.3至约0.5％、约0.5至约0.8％、约0.8至约1.0％、约1.0至约1.6％、约1.6至约3.0％、约3.0至约5.0％、约5.0至约8.0％、约8.0至约10.0％、约10.0至约15.0％、约15.0至约20.0％、约20.0至约25.0％、约25.0％至30.0％、约30.0％至35.0％、约35.0％至40.0％、约45.0％至50.0％、约50.0％至55.0％、约55.0％至60.0％、约60.0％至65.0％、约65.0％至70.0％、约75.0％至80.0％、约80.0％至85.0％、或约85.0％至90.0％。在一些实施方式中，碳向异戊二烯的转化百分比是约0.002至约0.4摩尔％、0.002至约0.16摩尔％、0.04至约0.16摩尔％、约0.005至约0.3摩尔％、约0.01至约0.3摩尔％、约0.05至约0.3摩尔％、约0.1至0.3摩尔％、约0.3至约1.0摩尔％、约1.0至约5.0摩尔％、约2至约5.0摩尔％、约5.0至约10.0摩尔％、约7至约10.0摩尔％、约10.0至约20.0摩尔％、约12至约20.0摩尔％、约16至约20.0摩尔％、约18至约20.0摩尔％、约18至23.2摩尔％、约18至23.6摩尔％、约18至约23.8摩尔％、约18至约24.0摩尔％、约18至约25.0摩尔％、约20至约30.0摩尔％、约30至约40.0摩尔％、约30至约50.0 摩尔％、约30至约60.0摩尔％、约30至约70.0摩尔％、约30至约80.0摩尔％、或约30至约90.0摩尔％。 
碳至异戊二烯的转化百分率(也称作“％碳产率”)可以这样测定：将所生产的异戊二烯中的摩尔碳除以碳源中的摩尔碳(例如批式和进料的葡萄糖和酵母提取物中的碳摩尔数)。将该数值乘以100％以得到百分率数值(如等式1所示)。 
等式1 
％碳产率＝(所生产的异戊二烯中的摩尔碳)/(碳源中的摩尔碳)×100 
为了这个计算，可以假设酵母提取物包含505w/w的碳。举例而言，对于实施例7第VIII部分中描述的500升，可以根据等式2计算碳至异戊二烯的转化百分率。 
等式2 
％碳产率＝(39.1g异戊二烯×1/68.1mol/g×5C/mol)/[(181221g葡萄糖×1/180mol/g×6C/mol)+(17780g酵母提取物×0.5×1/12mol/g)]×100＝0.042％ 
对于本文描述的两个500升的发酵(实施例7，第VII和VIII部分)，碳至异戊二烯的转化百分率是0.04％-0.06％。使用如本文描述的14升的系统，达到了0.11％-0.16％的碳产率。 
本领域技术人员可以容易地将异戊二烯的生产速率或异戊二烯的生产量转化为任意其它单位。以下列出了用于在单位之间相互转化的示例性的等式。 
用于异戊二烯生产速率(总速率和比速率)的单位
等式3 
1g异戊二烯/L培养液/hr＝14.7mmol异戊二烯/L培养液/hr(总体积速率) 
等式4 
1nmol异戊二烯/gwcm/hr＝1nmol异戊二烯/L培养液/hr/OD600(该转化假设OD600值为1的1升培养液具有1克湿细胞重) 
等式5 
1nmol异戊二烯/gwcm/hr＝68.1ng异戊二烯/gwcm/hr(给出异戊二烯的分子量) 
等式6 
1nmol异戊二烯/L气体O2/hr＝90nmol异戊二烯/L培养液/hr(在90L/hr的O2流速每升培养液) 
等式7 
废气中的1ug异戊二烯/L气体异戊二烯＝在60L气体每L培养液(1vvm)的流速的60μg异戊二烯/L培养液/hr 
效价的单位(总效价和比效价) 
等式8 
1nmol异戊二烯/mg细胞蛋白＝150nmol异戊二烯/L培养液/OD600(该转化假设OD600值为1的1升培养液具有总共大约150mg的细胞蛋白)(比生产率) 
等式9 
1g异戊二烯/L培养液＝14.7mmol异戊二烯/L培养液(总效价) 
如果需要，等式10可用于将任何包括湿细胞重的单位转化为包括干细胞重的对应的单位。 
等式10 
干细胞重＝(湿细胞重)/3.3 
如果需要，可以使用等式11在单位ppm与μg/L之间转化。具体地，“ppm”意思是以μg/g(w/w)定义的百万分之几。也可以使用“ppmv”(体积的百万分之几)基于体积来表示气体的浓度，以μL/L(vol/vol)定义。μg/L与ppm(例如，μg分析物/g气体)的转化可以通过测定每升废气的质量(即气体的密度)来进行。例如，在标准温度和压力(STP；101.3kPa(1bar)和273.15K)下，1升空气的密度是大约1.29g/L。因此，1ppm(μg/g)的浓度等于STP下的1.29μg/L(等式11)。Ppm(μg/g)向μg/L的转化与压力、温度、和废气总体成分有关。 
等式11 
1ppm(ug/g)在标准温度和压力(STP；101.3kPa(1bar)和273.15K)下 等于1.29μg/L。 
可以使用普适气体定律(等式12)进行ug/L向ppmv的转化(例如，uL分析物/升气体)。例如，1000ug/L气体的废气浓度对应于14.7μmol/L气体。普适气体常数是0.082057L.atm K-1mol-1，所以使用等式12，在STP下由14.7μmol HG占据的体积等于0.329mL。因此，1000μg/L HG的浓度等于STP下的329ppmv或0.0329％(v/v)。 
等式12 
PV＝nRT，其中“P”是压力，“V”是体积，“n”是气体的摩尔数，“R”是普适气体常数，“T”是开氏温度。 
本文中通常基于重量/体积(w/v)以单位例如μg/L来测定异戊二烯组合物中的杂质的量。如果需要，可以使用等式13将单位为μg/L的测量值转化为mg/m3的单位。 
等式13 
1μg/L＝1mg/m3
在本发明包括的一些实施方式中，包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸的细胞生产的异戊二烯的量是在基本上相同的条件下生长的不含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸的相应的细胞生产的异戊二烯的量的至少或大约2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍、或更高。 
在本发明包括的一些实施方式中，包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸和编码DXS、IDI、和/或MVA途径多肽的一种或多种异源核酸的细胞生产的异戊二烯的量是在基本上相同的条件下生长的不含异源核酸的相应的细胞生产的异戊二烯的量的至少或大约2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍、或更高。 
在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含重量占组合物中所有的C5烃总重量的大于或大约99.90％、99.92％、99.94％、99.96％、99.98％、或100％的异戊二烯。在一些实施方式中，组合物中的异戊二烯具有组合物中所有C5烃的检测器应答的大于或大约99.90％、99.91％、99.92％、99.93％、99.94％、99.95％、99.96％、99.97％、99.98％、99.99％、或100％的相对 检测器应答。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含重量为组合物中的所有C5烃的总重量的大约99.90％至大约99.92％、大约99.92％至大约99.94％、大约99.94％至大约99.96％、大约99.96％至大约99.98％、大约99.98％至100％的异戊二烯。 
在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含重量占组合物中所有C5烃总重量的小于或大约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的除了异戊二烯之外的C5烃(例如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，组合物中除了异戊二烯之外的C5烃具有组合物中所有C5烃的检测器应答的小于或大约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的相对检测器应答。在一些实施方式中，组合物中的1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔具有组合物中所有C5烃的检测器应答的小于或大约0.12％、0.10％、0.08％、0.06％、0.04％、0.02％、0.01％、0.005％、0.001％、0.0005％、0.0001％、0.00005％、或0.00001％的相对检测器应答。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含重量占组合物中所有C5烃的总重量的大约0.02％至大约0.04％、大约0.04％至大约0.06％、大约0.06％至0.08％、大约0.08％至0.10％、或大约0.10％至大约0.12％的除了异戊二烯之外的C5烃(例如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。 
在一些实施方式中，对于组合物中的抑制异戊二烯聚合的任意化合物，异戊二烯组合物包含小于或大约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的抑制异戊二烯聚合的化合物。在一些实施方式中，对于组合物中的抑制异戊二烯聚合的任意化合物，异戊二烯组合物包 含大约0.005至大约50、例如大约0.01至大约10、大约0.01至大约5、大约0.01至大约1、大约0.01至大约0.5、或大约0.01至大约0.005μg/L的抑制异戊二烯聚合的化合物。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含小于或大约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的除了异戊二烯之外的烃(例如1，3-环戊二烯、顺式-1，3-戊二烯、反式-1，3-戊二烯、1，4-戊二烯、1-戊炔、2-戊炔、1-戊烯、2-甲基-1-丁烯、3-甲基-1-丁烯、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、或顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含大约0.005至大约50、例如大约0.01至大约10、大约0.01至大约5、大约0.01至大约1、大约0.01至大约0.5、或大约0.01至大约0.005μg/L的除了异戊二烯之外的烃。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含小于或大约50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005μg/L的蛋白或脂肪酸(例如与天然橡胶天然结合的蛋白或脂肪酸)。 
在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含小于或大约10、5、1、0.8、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005ppm的α乙炔、戊二烯、乙腈、或1，3-环戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含小于或大约5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005ppm的硫或丙二烯。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含小于或大约30、20、15、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005ppm的所有乙炔(例如1-戊炔、2-戊炔、3-甲基-1-丁炔、戊-4-烯-1-炔、反式-戊-3-烯-1-炔、和顺式-戊-3-烯-1-炔)。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含小于或大约2000、1000、500、200、100、50、40、30、20、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01、或0.005ppm的异戊二烯二聚体，例如环式异戊二烯二聚体(例如，源自两个异戊二烯单元的二聚化的环式C10化合物)。 
在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇(例如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)、或前述任意两项或更多项。在具体的实施方式中，异戊二烯组合物包含大于或大约0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、60、80、100、或120μg/L的乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇(例如3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1- 醇)、或前述任意两项或更多项。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含大约0.005至大约120、例如大约0.01至大约80、大约0.01至大约60、大约0.01至大约40、大约0.01至大约30、大约0.01至大约20、大约0.01至大约10、大约0.1至大约80、大约0.1至大约60、大约0.1至大约40、大约5至大约80、大约5至大约60、或大约5至大约40μg/L的乙醇、丙酮、C5异戊二烯基醇、或前述任意两项或更多项。 
在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含下列成分中的一种或多种：2-庚酮，6-甲基-5-庚烯-2-酮，2，4，5-三甲基吡啶，2，3，5-三甲基吡嗪，香茅醛，乙醛，甲硫醇，乙酸甲酯，1-丙醇，二乙酰，2-丁酮，2-甲基-3-丁烯-2-醇，乙酸乙酯，2-甲基-1-丙醇，3-甲基-1-丁醛，3-甲基-2-丁酮，1-丁醇，2-戊酮，3-甲基-1-丁醇，异丁酸乙酯，3-甲基-2-丁烯醛，乙酸丁酯，3-甲基丁基乙酸酯，3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯，3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯，(E)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯，(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯，2，3-环庚烯醇吡啶，或线性异戊二烯聚合物(例如，源自多个异戊二烯单元的聚合的线性异戊二烯二聚体或线性异戊二烯三聚体)。在多个实施方式中，以重量％为单位，这些成分中的一种的量相对于异戊二烯的量(即，该成分的重量除以异戊二烯的重量乘以100)是大于或大约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或110％(w/w)。在一些实施方式中，第二化合物的相对检测器应答相对于异戊二烯的检测器应答是大于或大约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或110％。在多个实施方式中，以重量％为单位，这些成分中的一种的量相对于异戊二烯的量(即，该成分的重量除以异戊二烯的重量乘以100)是大约0.01％至大约105％(w/w)，例如大约0.01％至大约90％，大约0.01％至大约80％，大约0.01％至大约50％，大约0.01％至大约20％，大约0.01％至大约10％，大约0.02％至大约50％，大约0.05％至大约50％，大约0.1％至大约50％，或0.1％至大约20％(w/w)。 
在一些实施方式中，异戊二烯组合物包括下列一项或多项：醇、醛、酯、或酮(例如本文中描述的醇、醛、或酮中的任意项)。在一些实施方式 中，异戊二烯组合物包括(i)醇和醛；(ii)醇和酮；(iii)醛和酮；或(iv)醇、醛、和酮。 
在一些实施方式中，异戊二烯组合物包括下列一项或多项：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3-甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇、或吲哚。在一些实施方式中，异戊二烯组合物包含1ppm或更多的下列一项或多项：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3-甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇、或吲哚。在一些实施方式中，异戊二烯组合物(例如纯化前的废气)中的下列一项或多项的浓度是大约1至大约10,000ppm：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3-甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇、或吲哚。在一些实施方式中，异戊二烯组合物(例如经历一个或多个纯化步骤之后的废气)包括下列一项或多项：甲醇、乙醛、乙醇、甲硫醇、1-丁醇、3-甲基-1-丙醇、丙酮、乙酸、2-丁酮、2-甲基-1-丁醇、或吲哚，其浓度为大约1至大约100ppm，例如大约1至大约10ppm，大约10至大约20ppm，大约20至大约30ppm，大约30至大约40ppm，大约40至大约50ppm，大约50至大约60ppm，大约60至大约70ppm，大约70至大约80ppm，大约80至大约90ppm，或大约90至大约100ppm。可以使用标准方法例如本文描述的那些方法或其它标准方法例如质子转移反应质谱(见，例如，Bunge等人，Applied and Environmental Microbiology，74(7)：2179-2186，2008，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于分析挥发性有机化合物的内容)分析来自细胞培养物的挥发性有机化合物(例如，细胞培养物的顶空中的挥发性有机化合物)。 
在一些实施方式中，组合物包含大于大约2mg异戊二烯，例如大于或大约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、或1000mg异戊二烯。在一些实施方式中，组合物包含大于或大约2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100g异戊二烯。在一些实施方式中，组合物中异戊二烯的量是大约2至大约5,000mg，例如大约2至大约100mg，大约100至大约500mg，大约500至大约1,000mg，大约1,000至大约2,000mg，或大约2,000至大约5,000mg。在一些实施方式中，组合物中异戊二烯的量是大约20至大约5,000 mg，大约100至大约5,000mg，大约200至大约2,000mg，大约200至大约1,000mg，大约300至大约1,000mg，或大约400至大约1,000mg。在一些实施方式中，组合物中大于或大约20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％重量的挥发性有机级份是异戊二烯。 
在一些实施方式中，组合物包含乙醇。在一些实施方式中，组合物包含大约75％至大约90％重量的乙醇，例如大约75％至大约80％、大约80％至大约85％、或大约85％至大约90％重量的乙醇。在组合物包含乙醇的一些实施方式中，组合物还包含大约4％至大约15％重量的异戊二烯，例如大约4％至大约8％、大约8％至大约12％、或大约12％至大约15％重量的异戊二烯。 
在本发明包含的一些实施方式中，包含编码异戊二烯合酶多肽、DXS多肽、IDI多肽、和/或MVA途径多肽的一种或多种异源核酸的细胞生产大于或大约在基本上相同的条件下生长的不含所述一种或多种异源核酸的对应细胞生产的类异戊二烯化合物的量的2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍、或更多的量的类异戊二烯化合物(例如在一个或多个IPP分子与一个或多个DMAPP分子的反应中形成的具有10个或更多个碳原子的化合物)。在本发明包含的一些实施方式中，包含编码异戊二烯合酶多肽、DXS多肽、IDI多肽、和/或MVA途径多肽的一种或多种异源核酸的细胞生产大于或大约在基本上相同的条件下生长的不含所述一种或多种异源核酸的对应细胞生产的C5异戊二烯基醇的量的2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍、或更多的量的C5异戊二烯基醇(例如，3-甲基-3-丁烯-1-醇或3-甲基-2-丁烯-1-醇)。 
示例性的异戊二烯纯化方法 
在一些实施方式中，本文描述的任意方法还包括回收异戊二烯。例如，可以使用标准技术回收通过本发明的组合物和方法生产的异戊二烯，所述标准技术为例如气提、分馏、吸附/解吸附、渗透蒸发、从固相热或真空解吸附异戊二烯、或使用溶剂提取固定至或吸附至固相的异戊二烯(见，例如，美国专利号4,703,007和美国专利号4,570,029，其各自通过引用方式全文 并入本文，尤其是关于异戊二烯回收和纯化方法的内容)。在一些实施方式中，异戊二烯的回收包括分离液体形式的异戊二烯(例如异戊二烯的纯溶液或异戊二烯在溶剂中的溶液)。气提包括以持续方式从发酵废气流中获取异戊二烯蒸气。这种获取可以通过数种不同方式进行，包括但不限于：吸附至固相、分入液相、或直接冷凝。在一些实施方式中，在蒸气的露点以上对稀释的异戊二烯蒸气流进行膜富集，引起液体异戊二烯的冷凝。 
异戊二烯的回收可以包括一个步骤或多个步骤。在一些实施方式中，从发酵废气中获取异戊二烯蒸气和将异戊二烯转化为液相是同时进行的。例如，可以从废气流中直接冷凝异戊二烯以形成液体。在一些实施方式中，从发酵废气中获取异戊二烯蒸气和将异戊二烯转化为液相是依次进行的。例如，可以使异戊二烯吸附至固相，然后使用溶剂从固相提取。在一个实施方式中，通过使用描述于美国临时申请号61/288,142的吸附气提回收异戊二烯。 
在一些实施方式中，本文描述的任意方法还包括纯化异戊二烯。例如，可以使用标准技术纯化使用本发明的组合物和方法生产的异戊二烯。纯化是指这样的过程：通过该过程将异戊二烯与生产异戊二烯时存在的一种或多种成分分离开。在一些实施方式中，以基本上纯的液体形式获得异戊二烯。纯化方法的实例包括(i)在液体提取剂中从溶液中蒸馏；和(ii)色谱。如本文使用的“纯化的异戊二烯”意思是已经与生产异戊二烯时存在的一种或多种成分分离的异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯是至少大约20％(按重量)不含在生产异戊二烯时存在的其它成分。在多种实施方式中，异戊二烯是至少或大约25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、或99％(按重量)纯的。可以通过任何合适方法例如通过柱色谱、HPLC分析、或GC-MS分析测定纯度。 
在一些实施方式中，通过将气相导入用于生产异戊二烯的细胞培养系统(例如发酵器)以使在去除异戊二烯的一个或多个回收步骤之后剩余的至少一部分气相再循环。 
异戊二烯聚合 
本文所述的生物异戊二烯组合物可以进行化学反应，以将它聚合成不同的产物，诸如特定分子量的共聚物或聚合物。如上所述，“共聚物”表示由聚合异戊二烯与另一种非异戊二烯分子(包括但不限于，1，3-丁二烯、苯乙烯、α-甲基苯乙烯)制成的聚合物。在任何聚合反应之前，可以从生物异戊二烯组合物中纯化异戊二烯。在一个实施方式中，使用的异戊二烯是异戊二烯单体。在另一个实施方式中，使用的异戊二烯是聚异戊二烯，其中异戊二烯单体已经聚合形成异戊二烯单元的聚合物。在一个实施方式中，所述聚异戊二烯不是直链聚异戊二烯(即，非直链的聚异戊二烯)。在另一个实施方式中，所述聚异戊二烯是直链聚异戊二烯。 
聚合物(聚异戊二烯或共聚物)也可以是可溶性聚合物或凝胶聚合物或其组合。在一个实施方式中，聚合物是至少约30％的可溶性聚合物、至少约40％的可溶性聚合物、至少约50％的可溶性聚合物、至少约60％的可溶性聚合物、至少约70％的可溶性聚合物、至少约80％的可溶性聚合物、至少约90％的可溶性聚合物、至少约95％的可溶性聚合物、或至少约100％的可溶性聚合物，剩余部分是凝胶聚合物。 
在一些实施方式中，所述聚合物是可溶性聚合物。可溶性聚合物可以具有300,000至800,000的分子量。可溶性聚合物可以具有至少约300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、或1,000,000的分子量。可溶性聚合物可以具有最大约300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、或1,000,000的分子量。可溶性聚合物可以是二维的。 
在其它实施方式中，所述聚合物是凝胶聚合物。在一个实施方式中，所述凝胶聚合物具有至少约100万至至少约5000万的分子量。在一些实施方式中，所述凝胶聚合物是至少约100万、至少约200万、至少约300万、至少约400万、至少约500万、至少约600万、至少约700万、至少约800万、至少约900万、至少约1000万、至少约1500万、至少约2000万、至少约2500万、至少约3000万、至少约3500万、至少约4000万、至少约4500万、或至少约5000万。在其它实施方式中，所述凝胶聚合物是最大约100万、最大约200万、最大约300万、最大约400万、最大约500万、 最大约600万、最大约700万、最大约800万、最大约900万、最大约1000万、最大约1500万、最大约2000万、最大约2500万、最大约3000万、最大约3500万、最大约4000万、最大约4500万或最大约5000万。凝胶成分可以是三维的。 
在一些方面，提供了聚异戊二烯聚合物和制备聚异戊二烯聚合物的方法。聚异戊二烯可以包含一个或多个本文所述的实施方式(例如，指示的δ13C值)。在一些实施方式中，本文所述的任意方法(例如，制备和/或纯化异戊二烯的方法)另外包括聚合异戊二烯(例如，本文所述的任意异戊二烯)。例如，可以使用标准方法来聚合纯化的异戊二烯，以形成顺式-聚异戊二烯或其它下游产物。因此，如本文所述，在一个方面，提供了轮胎，所述轮胎包含从本文公开的任意异戊二烯组合物和/或使用本文公开的任意聚合方法制备的聚异戊二烯，诸如顺式-1，4-聚异戊二烯和/或反式-1，4-聚异戊二烯。在这些实施方式中的一些中，所述聚异戊二烯(例如，本文所述的任意聚异戊二烯聚合物)由本文所述的任意异戊二烯或异戊二烯组合物制成。 
在一些方面，本发明提供了用于生产异戊二烯聚合物的系统，所述系统包括：(a)源自可再生资源的异戊二烯起始组合物；和(b)从至少一部分异戊二烯原料生产的聚合物；其中至少一部分异戊二烯起始组合物经历与其它异戊二烯分子的聚合，以生成分子量为约5,000至约100,000的异戊二烯聚合物。本文使用的“至少一部分异戊二烯起始组合物”可以表示至少约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、或100％的异戊二烯起始组合物经历聚合。 
在其它方面，提供了聚异戊二烯聚合物和共聚物以及制备这些类型的不同分子量的聚合物的方法。在一个实施方式中，所述聚合物具有约5,000至约100,000的分子量。在其它实施方式中，所述聚合物具有至少约6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、12,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、70,000、80,000、90,000或100,000的分子量。在其它实施方式中，所述聚合物具有最大约6,000、 7,000、8,000、9,000、10,000、12,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、70,000、80,000，90,000或100,000的分子量。 
其它方法和组合物描述在：美国临时专利申请号61/097,186(2008年9月15日提交)，WO 2010/031062，美国临时专利申请号61/097,189(2008年9月15日提交)，WO 2010/031077，美国临时专利申请号61/097,163(2008年9月15日提交)，WO 2010/031079，和美国专利申请系列号12/335,071(US 2009/0203102A1)，它们都通过引用整体并入，尤其是关于生产异戊二烯的组合物和方法的内容。 
在一个方面，提供了用于生产源自可再生资源的异戊二烯的聚合物的方法，所述方法包括：(a)获得来自可再生资源的异戊二烯；(b)聚合源自可再生资源的异戊二烯；和(c)回收生成的聚合物。在一些实施方式中，通过包括下述步骤的方法，获得来自可再生资源的异戊二烯：(i)在适合生产异戊二烯的培养条件下培养细胞，所述细胞包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸，(ii)生产异戊二烯，和(iii)从培养物回收异戊二烯。本发明包括通过本文所述的任意方法生产的源自可再生资源的异戊二烯的聚合物，诸如聚异戊二烯同聚物、液体聚异戊二烯聚合物或异戊二烯和一个或多个其它单体的共聚物。 
在一些实施方式中，本发明提供了用于生产异戊二烯共聚物的系统，所述系统包括：(a)源自可再生资源的异戊二烯起始组合物；和(b)从至少一部分异戊二烯原料生产的聚合物；其中至少一部分异戊二烯起始组合物经历与另一种非异戊二烯分子的聚合，以生成共聚物。本文使用的“至少一部分异戊二烯起始组合物”可以表示至少约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、或100％的异戊二烯起始组合物经历聚合。 
在一些实施方式中，使用与适用于源自石化产品来源的异戊二烯相同的技术，可以使本发明的异戊二烯聚合成有用的聚合物，包括合成橡胶。 合适地，根据适合二烯单体聚合过程的不同方法，进行这样的含有异戊二烯的聚合物的聚合和回收。这包括在不含有空气和其它大气杂质(特别是氧和水分)的条件下分批的、半连续的、或连续的操作。也可以在许多不同的聚合反应器系统中进行异戊二烯单体的聚合，所述系统包括但不限于本体聚合、气相聚合、溶液聚合、悬浮聚合、乳液聚合、和沉淀聚合系统。商业上优选的聚合方法通常是溶液聚合和乳液聚合。 
在一些实施方式中，用于通过聚合源自可再生资源的异戊二烯来生产异戊二烯聚合物的系统和组合物另外包含：用于聚合异戊二烯的催化剂。在一些实施方式中，所述系统和组合物另外包含聚合引发剂。使用多种不同的聚合引发剂或催化剂系统，也可以引发聚合反应。使用的引发剂或催化剂系统取决于要合成的含有异戊二烯的聚合物的希望的特征。例如，在制备顺式-1，4-聚异戊二烯橡胶的情况下，可以使用由四氯化钛和三乙基铝组成的Ziegler Natta催化剂系统。在合成其它类型的含有异戊二烯的聚合物时，可能需要其它类型的引发剂系统。例如，使用适宜的自由基引发剂、氧化还原引发剂、阴离子引发剂、或阳离子引发剂，可以制备含有异戊二烯的聚合物。优选的引发或催化剂系统取决于聚合物微结构、分子量、分子量分布、和希望的链分支。优选的引发剂也取决于异戊二烯是否与其它单体同聚或共聚。在共聚物的情况下，使用的引发剂也取决于是否希望将聚合物制成具有随机的、非随机的、或渐变的重复单元分布，所述重复单元源自特定单体。例如，在合成具有异戊二烯块的嵌段共聚物时，通常使用阴离子引发剂或受控的自由基引发剂。 
重要的是，采用的引发剂或催化剂系统与使用的聚合系统的类型相容。例如，在乳液聚合中，通常使用自由基引发剂。在溶液聚合中，通常采用阴离子引发剂(诸如烷基锂化合物)来引发聚合。自由基聚合的一个优点是，通常可以在比离子型聚合更低严格性条件下进行反应。自由基引发系统也表现出痕量杂质的更大耐受性。 
在根据本发明聚合异戊二烯时，也可以使用常规乳液配方；但是，可能因为包含额外的共聚单体或对聚合参数的限制而产生一些限制和修改。在一些实施方式中，用于通过聚合源自可再生资源的异戊二烯来生产异戊 二烯聚合物的系统和组合物另外包括：离子型表面活性剂。在本发明中可以使用本领域已知的离子型表面活性剂，包括磺酸酯去污剂和羧化物、硫酸酯、和磷酸酯肥皂。基于有机成分的总重量，计算离子型表面活性剂的水平，且可以在约2至30份离子型表面活性剂重量/100份有机成分重量的范围内。 
可用于实践本发明的自由基引发剂的实例是称作“氧化还原”引发剂的那些，诸如螯合的铁盐、甲醛合次硫酸钠、和有机氢过氧化物的组合。有机氢过氧化物的代表是氢过氧化枯烯、氢过氧化对薄荷烷(paramenthane hydroperoxide)、和叔丁基氢过氧化物。叔丁基氢过氧化物(t-BHP)、叔丁基过乙酸酯(t-BPA)和诸如偶氮二异丁腈(AIBN)等“偶氮”引发剂是优选的。 
在自由基聚合中使用的反应温度通常维持在0℃至150℃范围内。约20℃至120℃的温度通常是优选的，在60℃至100℃范围内的温度通常是最优选的。反应压力无关紧要。它通常仅足够高以维持液相反应条件；它可以是自然发生的压力，其随反应混合物的成分和温度而变化，或它可以更高，例如，多达1000psi。 
在一些实施方式中，用于生产源自可再生资源的异戊二烯的聚合物的方法包括：在分批工艺中，聚合源自可再生资源的异戊二烯。在分批操作中，聚合时间可以根据需要而变化，从少至几分钟到长至几天。当单体不再被吸收时，或根据需要更早地(例如，如果反应混合物变得过于粘稠)，可以终止在分批工艺中的聚合。在连续操作中，可以使聚合混合物穿过一个反应器或具有任意合适设计的一串反应器。在这样的情况下，通过改变在反应器系统中的停留时间，适当地调节聚合反应。停留时间随反应器系统的类型而变化，范围是从10至15分钟至24小时或更久。反应混合物中单体的浓度可以从占反应混合物的5重量％向上变化，取决于采用的条件；20至80重量％的范围是优选的。 
在一些实施方式中，用于通过聚合源自可再生资源的异戊二烯来生产异戊二烯聚合物的系统和组合物另外包括：合适的有机溶剂。在一些实施方式中，在合适的有机溶剂中进行异戊二烯聚合，所述有机溶剂在反应条 件下是液体，且是相对惰性的。所述溶剂可以具有与二烯反应物相同的碳原子数目/分子，或它可以具有不同的沸程。优选的有机溶剂通常是烷烃和环烷烃。所述溶剂可以包含一种或多种芳族的、石蜡族的或环石蜡族的化合物。这些溶剂通常含有约4个碳原子/分子至约10个碳原子/分子，且在聚合条件下是液体。合适的有机溶剂的一些代表性的实例包括：戊烷、异辛烷、环己烷、甲基环己烷、异己烷、正庚烷、正辛烷、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、乙基苯、二乙基苯、异丁基苯、石油醚、煤油、石油醚、石油精等，它们是单独的或混合的。也可以采用芳族烃，诸如苯、甲苯、异丙基苯、二甲苯、或卤代的芳族化合物，诸如氯苯、溴苯、或邻二氯苯，但是在大多数情况下不是优选的。其它有用的溶剂包括四氢呋喃和二噁烷。 
在溶液聚合中，在聚合介质中通常存在5至30重量％的单体。这样的聚合介质当然包含有机溶剂和单体。在大多数情况下，优选地，聚合介质含有10至25重量％的单体。通常更优选地，聚合介质含有15至20重量％的单体。 
通常进行聚合，以实现将单体基本上完全转化成聚合物。为了避免过度的凝胶形成，可以使用增加的单体加入或链转移剂。这样的微小修改属于技术人员的技能。在聚合结束以后，从聚合物的料浆或溶液中回收聚合物。简单的过滤可能足以从稀释液中分离出聚合物。可以采用从稀释液中分离出聚合物的其它方法。可以单独地或在反应混合物中制浆的同时处理聚合物，以便分离残余物。这样的处理可以使用醇(诸如甲醇、乙醇、或异丙醇)，使用酸化的醇，或使用其它类似的极性液体。在许多情况下，在烃溶液中得到聚合物，并可以如下回收聚合物：通过用酸化的醇(例如，快速搅拌的含有2％盐酸的甲醇或异丙醇)凝固。在该初步凝固以后，可以用适当的液体(诸如甲醇)洗涤聚合物。 
在一些实施方式中，用于通过聚合源自可再生资源的异戊二烯来生产异戊二烯聚合物的系统和组合物另外包括：一种或多种额外的单体。如前面已经指出的，也可以使异戊二烯与一种或多种额外的共聚单体共聚，以制备有用的共聚物。聚合配方或反应条件的一些调节可能是必要的，以便得到令人满意的聚合物形成速率，这取决于包括的异戊二烯的相对量和包 含的其它单体。可用于实践本发明的共聚单体的实例包括：其它二烯单体，诸如1，3-丁二烯和己二烯。乙烯基芳族单体也可以与异戊二烯共聚，以制备有用的聚合物。这样的乙烯基芳族单体包括苯乙烯、α-甲基苯乙烯、二乙烯基苯、氯乙烯、乙酸乙烯酯、偏二氯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、乙烯基吡啶、丙烯腈、甲基丙烯腈、甲基丙烯酸、衣康酸和丙烯酸。不同的共聚单体的混合物也可以在不同的水平使用。 
在一些实施方式中，使异戊二烯单体与一种或多种额外的缀合的二烯单体共聚。对于商业目的，含有4至8个碳原子的那些通常是优选的。可以与异戊二烯共聚的缀合的二烯单体的一些具体的代表性的实例包括：1，3-丁二烯、2，3-二甲基-1，3-丁二烯、戊二烯、3-丁基-1，3-辛二烯、2-苯基-1，3-丁二烯等，它们是单独的或混合的。 
在一些实施方式中，使异戊二烯单体与一种或多种额外的乙烯基不饱和的单体(ethylenically unsaturated monomer)共聚。可以与异戊二烯共聚的乙烯基不饱和的单体的一些代表性的实例包括：丙烯酸烷基酯，诸如丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸甲酯等；具有一个或多个末端CH2＝CH-基团的亚乙烯基单体；乙烯基芳族化合物诸如苯乙烯、α-甲基苯乙烯、溴苯乙烯、氯苯乙烯、氟苯乙烯等；α-烯烃诸如乙烯、丙烯、1-丁烯等；卤化乙烯，诸如溴乙烯、氯乙烯(氯化乙烯)、氟乙烯、碘乙烯、1，2-二溴乙烯、1，1-二氯乙烯(偏二氯乙烯)、1，2-二氯乙烯等；乙烯基酯，诸如乙酸乙烯酯；α，β-烯烃不饱和的腈，诸如丙烯腈和甲基丙烯腈；α，β-烯烃不饱和的酰胺，诸如丙烯酰胺、N-甲基丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺等。在制备有用的橡胶聚合物时，也可以任选地使官能化的单体与异戊二烯共聚。这类官能化的单体和将它们掺入橡胶聚合物中的方法，描述在：美国专利6,627,721和美国专利6,936,669。为了描述这样的官能化的单体和它们向含有异戊二烯的聚合物中的掺入的目的，将美国专利6,627,721和美国专利6,936,669的教导通过引用并入本文。 
橡胶聚合物(它们是一个或多个二烯单体与一个或多个其它乙烯基不饱和的单体的共聚物)通常含有约50重量％至约99重量％的缀合的二烯单体(包括异戊二烯)和约1重量％至约50重量％的除了缀合的二烯单体以 外的其它乙烯基不饱和的单体。例如，异戊二烯单体与乙烯基芳族单体的橡胶样共聚物(诸如苯乙烯-异戊二烯橡胶)通常含有50至95重量％的异戊二烯和5至50重量％的乙烯基芳族单体。 
乙烯基芳族单体可能是经常掺入含有异戊二烯的橡胶中的最重要的一类乙烯基不饱和的单体。这样的乙烯基芳族单体通常含有8至20个碳原子。通常，乙烯基芳族单体含有8至14个碳原子。最广泛使用的乙烯基芳族单体是苯乙烯。可以使用的乙烯基芳族单体的一些实例包括：苯乙烯、1-乙烯基萘、2-乙烯基萘、α-甲基苯乙烯、4-苯基苯乙烯、3-甲基苯乙烯等。 
含有异戊二烯的橡胶聚合物的一些代表性的实例包括：顺式-1，3-聚异戊二烯同聚物橡胶、3，4-聚异戊二烯橡胶、苯乙烯-异戊二烯橡胶(SIR)、β-甲基苯乙烯-异戊二烯橡胶、苯乙烯-异戊二烯-丁二烯橡胶(SIBR)、苯乙烯-异戊二烯橡胶(SIR)、异戊二烯-丁二烯橡胶(IBR)、α-甲基苯乙烯-异戊二烯-丁二烯橡胶和α-甲基苯乙烯-苯乙烯-异戊二烯-丁二烯橡胶。在橡胶聚合物包含源自2种或更多种单体的重复单元的情况下，源自不同单体(包括异戊二烯)的重复单元通常以基本上随机的方式分布。源自单体的重复单元与该单体的差别在于，聚合反应通常会消耗掉双键。 
在一些实施方式中，用于生产源自可再生资源的异戊二烯的聚合物的方法包括：在连续工艺中聚合源自可再生资源的异戊二烯。可以如下制备橡胶聚合物：在分批工艺中通过溶液聚合，或在连续工艺中通过将异戊二烯单体和任选的额外的单体连续装载进聚合区中。聚合区通常是聚合反应器或一串聚合反应器。聚合区通常提供搅拌，以保持单体、聚合物、引发剂、和改性剂均匀地分散在聚合区的有机溶剂中。这样的连续聚合通常在多反应器系统中进行。合成的橡胶聚合物从聚合区连续地退出。在聚合区中实现的单体转化率通常是至少约85％。优选地，单体转化率是至少约90％。 
在一些实施方式中，用于通过聚合源自可再生资源的异戊二烯来生产异戊二烯聚合物的系统和组合物另外包括：聚合引发剂和极性改性剂。用诸如烷基锂化合物等阴离子引发剂，可以引发聚合。可以使用的烷基锂化合物通常含有1至约8个碳原子，诸如正丁基锂。使用的锂引发剂的量随 聚合的单体和合成聚合物的理想分子量而变化。但是，作为一般规律，使用0.01至1phm(份/100份单体重量)的锂引发剂。在大多数情况下，使用0.01至0.1phm的锂引发剂，优选地使用0.025至0.07phm的锂引发剂。 
这样的阴离子聚合任选地在有极性改性剂(诸如烷基四氢糠基醚)存在下进行。可以使用的具体极性改性剂的一些代表性的实例包括：甲基四氢糠基醚、乙基四氢糠基醚、丙基四氢糠基醚、丁基四氢糠基醚、己基四氢糠基醚、辛基四氢糠基醚、月桂基四氢糠基醚、二乙醚、二正丙基醚、二异丙基醚、二正丁基醚、四氢呋喃、二噁烷、乙二醇二甲基醚、乙二醇二乙醚、二乙二醇二甲基醚、二乙二醇二乙醚、三乙二醇二甲基醚、三甲胺、三乙胺、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺、N-甲基吗啉、N-乙基吗啉、或N-苯基吗啉。 
极性改性剂通常在下述水平使用：其中极性改性剂与锂引发剂的摩尔比是在约0.01∶1至约5∶1范围内。极性改性剂与锂引发剂的摩尔比更通常是在约0.1∶1至约4∶1范围内。通常优选地，极性改性剂与锂引发剂的摩尔比是在约0.25∶1至约3∶1范围内。通常最优选地，极性改性剂与锂引发剂的摩尔比是在约0.5∶1至约3∶2范围内。 
在这样的阴离子聚合中使用的聚合温度可以在约-20℃至约180℃的宽范围内变化。在大多数情况下，使用在约30℃至约125℃范围内的聚合温度。通常优选地，聚合温度是在约45℃至约100℃范围内。通常最优选地，聚合温度是在约60℃至约90℃范围内。使用的压力通常足以在聚合反应条件下维持基本上液相。 
在一些实施方式中，用于通过聚合源自可再生资源的异戊二烯来生产异戊二烯聚合物的系统和组合物另外包括：聚合链终止剂，诸如醇、终止剂、或偶联剂。异戊二烯的这种阴离子聚合通常进行足以允许基本上完成异戊二烯和存在的任意额外单体的聚合的时间长度。换而言之，通常进行聚合至实现至少约85％的高转化率。然后通常通过加入试剂(诸如醇、终止剂、或偶联剂)来终止聚合。例如，卤化锡和/或卤化硅可以用作偶联剂。在需要不对称偶联的情况下，连续地加入卤化锡和/或卤化硅。锡偶联剂和/或硅偶联剂的这种连续加入通常在反应区中进行，所述反应区与发生主要 聚合的区域分离。在已经达到希望的转化程度以后，通常在单独的反应器中加入偶联剂。可以将偶联剂加入烃溶液(例如，环己烷)中，在适当的混合下加入聚合混合物中，以实现分布和反应。换而言之，通常仅在已经达到高转化程度以后，加入偶联剂。例如，通常仅在已经实现大于约85％的单体转化率以后，加入偶联剂。通常优选地，在单体转化率达到至少约90％以后，加入偶联剂。 
用作偶联剂的卤化锡通常是四卤化锡，诸如四氯化锡、四溴化锡、四氟化锡或四碘化锡。但是，也可以任选地使用三卤化锡。与三卤化锡偶联的聚合物具有最多3个臂。当然，这不同于与四卤化锡偶联的聚合物，后者具有最多4个臂。为了诱导更高水平的分支，四卤化锡通常是优选的。作为一般规律，四氯化锡是最优选的。 
可以使用的硅偶联剂通常是四卤化硅，诸如四氯化硅、四溴化硅、四氟化硅或四碘化硅。但是，也可以任选地使用三卤化硅。与三卤化硅偶联的聚合物具有最多3个臂。当然，这不同于与四卤化硅偶联的聚合物，后者具有最多4个臂。为了诱导更高水平的分支，四卤化硅通常是优选的。作为一般规律，四氯化硅是最优选的硅偶联剂。 
卤化锡和卤化硅的组合可以任选地用于偶联橡胶聚合物。通过使用这样的锡和硅偶联剂的组合，可以实现改良的轮胎橡胶性质，诸如更低的滞后。特别希望在含有二氧化硅和碳黑二者的轮胎胎面化合物中使用锡和硅偶联剂的组合。在这样的情况下，在偶联橡胶聚合物时采用的卤化锡与卤化硅的摩尔比通常是在20∶80至95∶5范围内。在偶联橡胶聚合物时采用的卤化锡与卤化硅的摩尔比更通常地是在40∶60至90∶10范围内。在偶联橡胶聚合物时采用的卤化锡与卤化硅的摩尔比优选地是在60∶40至85∶15范围内。在偶联橡胶聚合物时采用的卤化锡与卤化硅的摩尔比最优选地是在65∶35至80∶20范围内。 
宽泛地且示例性地，每100克橡胶聚合物采用约0.01至4.5毫克当量范围的锡偶联剂(卤化锡和卤化硅)。通常优选地，每100克聚合物使用约0.01至约1.5毫克当量的偶联剂，以得到希望的穆尼粘度。更大的量倾向于导致生成含有末端反应基团的聚合物或偶联不充分。认为1当量的锡偶 联剂/当量的锂是使分支最大化的最佳量。例如，如果使用四卤化锡和四卤化硅混合物作为偶联剂，每4摩尔活性锂末端使用1摩尔的偶联剂。在使用三卤化锡和三卤化硅的混合物作为偶联剂的情况下，每3摩尔活性锂末端最佳地使用1摩尔的偶联剂。可以将偶联剂加入烃溶液(例如，环己烷)中，在适当的混合下加入在反应器中的聚合混合物中，以实现分布和反应。 
在已经结束偶联以后，三元螯合烷基1，2-乙二胺或环醇的金属盐可以任选地加入聚合物料浆(polymer cement)中，以稳定化偶联的橡胶聚合物。在大多数情况下，将约0.01phr(份重量/100份干橡胶重量)至约2phr的螯合烷基1，2-乙二胺或环醇的金属盐加入聚合物料浆中，以稳定化橡胶聚合物。通常，加入约0.05phr至约1phr的螯合烷基1，2-乙二胺或环醇的金属盐。更通常地，将约0.1phr至约0.6phr的螯合烷基1，2-乙二胺或环醇的金属盐加入聚合物料浆中，以稳定化橡胶聚合物。 
可以用于停止聚合和“终止”活性橡胶聚合物的终止剂包括：单卤化锡、单卤化硅、N，N，N′，N′-四二烷基二氨基-二苯甲酮(例如四甲基二氨基二苯甲酮等)、N，N-二烷基氨基-苯甲醛(例如二甲氨基苯甲醛等)、1，3-二烷基-2-咪唑啉酮(例如1，3-二甲基-2-咪唑啉酮等)、1-烷基取代的吡咯烷酮、1-芳基取代的吡咯烷酮、含有约5至约20个碳原子的二烷基-二环烷基-碳二亚胺、和含有约5至约20个碳原子的二环烷基-碳二亚胺。 
在已经结束终止步骤和任选的稳定化步骤以后，可以从有机溶剂中回收橡胶聚合物。通过诸如化学(醇)凝固、热脱溶剂化等方法或其它合适的方法，可以从有机溶剂和残余物中回收偶联的橡胶聚合物。例如，经常希望通过向聚合物溶液中加入含有约1至约4个碳原子的低级醇，从有机溶剂中沉淀出橡胶聚合物。适用于从聚合物料浆中沉淀出橡胶的低级醇包括：甲醇、乙醇、异丙基醇、正丙基醇和叔丁基醇。使用低级醇从聚合物料浆中沉淀出橡胶聚合物，也会通过灭活锂末端基团而“终止”任何剩余的活性聚合物。在从溶液中回收偶联的橡胶聚合物以后，可以采用汽提来降低偶联的橡胶聚合物中挥发性的有机化合物的水平。另外，通过转鼓式干燥、挤出机干燥、真空干燥等，可以从橡胶聚合物中去除有机溶剂。 
如以前已经解释的，通过异戊二烯与Ziegler Natta催化剂系统(其包 含四氯化钛(TiCl4)和有机铝化合物，诸如三乙基铝Al-(CH2-CH3)3)的溶液聚合，可以生产合成的顺式-1，3-聚异戊二烯橡胶(其类似至足以自由替换天然橡胶)。用该Ziegler Natta催化剂系统制备的聚异戊二烯橡胶具有占最多98％的高顺式-微结构，这非常类似于来自巴西橡胶树(常见的橡胶树)的天然橡胶的结构，后者具有实际上100％的顺式-微结构含量。但是，聚合物微结构的该轻微差异导致在某些方面劣于天然橡胶的物理性质。例如，天然橡胶通常表现出优于合成的顺式-1，4-聚异戊二烯橡胶的生坯强度。另一方面，在某些其它方面，合成的顺式-1，4-聚异戊二烯橡胶优于来自巴西橡胶树、银胶菊、和Taraxacum kok-Saghyz(俄罗斯蒲公英)的天然橡胶。例如，天然橡胶含有残余蛋白、脂肪酸盐、树脂、和糖，这是因为它来自植物。在有些应用中，这些残余杂质的存在可能是非常有害的。例如，残余蛋白在橡胶产品中的存在可以在有些人中造成严重的变态反应，且是某些含有橡胶的产品(诸如橡胶手套、避孕套、注射器活塞等)的生产商的一个主要关注问题。在任意情况下，本发明的合成的聚异戊二烯同聚物橡胶不含有在天然橡胶(包括来自巴西橡胶树的天然橡胶)中存在的蛋白、脂肪酸盐、树脂、和糖。 
美国专利3,931,136公开了用于生产高分子量顺式-1，4-聚异戊二烯的方法。在该方法中使用的催化剂是下述三成分的混合物：(A)四氯化钛，(B)式AlR3的有机铝化合物，其中每个R表示烷基(优选含有1至8个碳原子的烷基)、芳基(优选苯基)、或环烷基(优选环己基)，和(C)下式的β-二酮： 
其中R′和R”可以是相同的或不同的，并表示烷基或芳基。R′和R”优选地表示含有1至5个碳原子的烷基或苯基。为了教导可以用于合成顺式-1，4-聚异戊二烯的催化剂系统和聚合技术的目的，美国专利3,931,136的教导通过引用并入本文。 
在美国专利4,430,487中，公开了用于合成顺式-1，4-聚异戊二烯的溶液 聚合技术，其中使用包含四氯化钛和三烷基铝化合物的混合物的催化剂系统。在该方法中，用4，7-二氮杂-癸烷-1，10-二胺速止(shortstop)聚合。为了教导可以用于合成顺式-1，4-聚异戊二烯的催化剂系统和聚合技术的目的，美国专利4,430,487的教导通过引用并入本文。 
使用包含四卤化钛、三烷基铝化合物和二苯基醚的催化剂系统通过聚合异戊二烯来合成顺式-1，4-聚异戊二烯，可以导致不希望的凝胶的形成。美国专利5,919,876披露，通过在有二芳基胺(诸如对苯乙烯化的二苯胺)存在下进行这样的聚合，可以减少凝胶形成。美国专利5,919,876更具体地公开了用于合成具有低凝胶含量的顺式-1，4-聚异戊二烯的方法，所述方法包括，在惰性有机溶剂中，使用如下制备的完成的催化剂系统来聚合异戊二烯：在有至少一种醚存在下，使有机铝化合物与四卤化钛(诸如四氯化钛)反应，其中所述聚合在约0℃至约100℃范围内的温度进行，且其中所述聚合在有二芳基胺存在下进行。为了教导可以用于合成顺式-1，4-聚异戊二烯橡胶的催化剂系统和溶液聚合技术的目的，美国专利5,919,867的教导通过引用并入本文。 
顺式-1，4-聚异戊二烯可以通过气相聚合来制备，所述气相聚合使用通过使有机铝化合物与四氯化钛反应而制备的完成的催化剂。美国专利6,066,705公开了在包括下述步骤的工艺中将异戊二烯气相聚合成顺式-1，4-聚异戊二烯的方法：(1)优选地在有至少一种醚存在下，将所述异戊二烯和通过使有机铝化合物与四氯化钛反应而制备的完成的催化剂系统装载进反应区中；其中通过温度和压力的适当组合，使异戊二烯维持在所述反应区的气相中；(2)在约35℃至约70℃范围内的温度，使所述异戊二烯聚合成顺式-1，4-聚异戊二烯；和(3)从所述反应区取出所述顺式-1，4-聚异戊二烯。已经确定，通过在有二芳基胺(诸如对苯乙烯化的二苯胺)存在下进行异戊二烯单体的聚合，可以在这样的气相聚合中减少凝胶形成。为了教导可以用于合成顺式-1，4-聚异戊二烯橡胶的催化剂系统和气相聚合技术的目的，美国专利6,066,705的教导通过引用并入本文。 
使用钕催化剂系统，可以合成澄清的(透明的)和高纯度的聚异戊二烯橡胶。美国专利6,780,948涉及这样的用于合成聚异戊二烯橡胶的方法，所 述方法包括，在有钕催化剂系统存在下聚合异戊二烯单体，其中所述钕催化剂系统如下制备：(1)在有异戊二烯存在下，使羧化钕与有机铝化合物反应约10分钟至约30分钟的时段，以生成钕-铝催化剂成分，和(2)随后使钕-铝催化剂成分与氯化二烷基铝反应至少30分钟的时段，以生成钕催化剂系统。为了教导可以用于合成高纯度的顺式-1，4-聚异戊二烯橡胶的催化剂系统和聚合技术的目的，美国专利5,919,867的教导通过引用并入本文。 
美国专利7,091,150和美国专利7,199,201公开了钕催化剂系统用于将异戊二烯单体聚合成合成的聚异戊二烯橡胶的应用，所述合成的聚异戊二烯橡胶具有非常高的顺式-微结构含量和高立体规律性。该聚异戊二烯橡胶会在应变下结晶，且可以以与天然橡胶类似的方式化合成橡胶制品。该技术更具体地公开了用于合成聚异戊二烯橡胶的方法，所述方法包括：在有钕催化剂系统存在下聚合异戊二烯单体，其中所述钕催化剂系统通过包括下述步骤的方法来制备：(1)在有机溶剂中，使羧化钕与有机铝化合物反应，以生产钕-铝催化剂成分，和(2)随后使钕-铝催化剂成分与卤素元素反应，以生产钕催化剂系统。在实践该方法时，钕催化剂系统通常不包括含镍的化合物。 
通过该方法制备的合成的聚异戊二烯橡胶包含源自异戊二烯的重复单元，其中所述合成的聚异戊二烯橡胶具有在98.0％至99.5％范围内的顺式-微结构含量，在0.5％至2.0％范围内的3，4-微结构含量，和在0.0％至0.5％范围内的反式-微结构含量。为了教导可以用于合成具有非常高的顺式-微结构含量和高立体规律性的顺式-1，4-聚异戊二烯橡胶的钕催化剂系统和聚合技术的目的，美国专利7,091,150和美国专利7,199,201的教导通过引用并入本文。 
单一成分镧系元素催化剂，诸如镧系元素二碘化物，也可以用于合成具有非常高的顺式-微结构含量的聚异戊二烯。例如，二碘化铥、二碘化镝、和二碘化钕可以引发异戊二烯聚合成高顺式-1，4-聚异戊二烯橡胶，不需要任何额外的催化剂成分。因此，镧系元素二碘化物可以用于在溶液聚合条件下引发异戊二烯单体聚合成高顺式-1，4-聚异戊二烯。 
美国专利4,894,425揭示了用于合成聚异戊二烯的方法，所述聚异戊二烯可能具有官能团，且含有超过70％的1，2-和3，4-结构单元。该方法包括：在惰性烃溶剂中，在有有机锂化合物(作为催化剂)和醚(作为辅催化剂)存在下，进行异戊二烯的阴离子聚合，其中使用的辅催化剂是式R1-O-CH2-CH2-O-R2的乙二醇二烷基醚，其中R1和R2是具有不同碳原子数目的烷基，所述烷基选自：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、和叔丁基，且其中2个烷基R1和R2中的碳原子的总数是在5至7范围内。为了教导可以用于合成具有高1，2-和3，4-微结构含量的聚异戊二烯的催化剂系统和聚合技术的目的，美国专利4,894,425的教导通过引用并入本文。 
通过使用美国专利5,082,906所述的催化剂系统，可以在短聚合时间以后在有机溶剂中合成可结晶的3，4-聚异戊二烯至定量产率。使用该催化剂系统制备的3，4-聚异戊二烯是应变可结晶的，且可以用于轮胎胎面中，这会提供改良的牵引和改良的裂口延伸阻力。美国专利5,082,906具体地公开了用于合成3，4-聚异戊二烯的方法，所述方法包括：在有机溶剂中，在约-10℃至约100℃范围内的温度，在由下述物质组成的催化剂系统存在下，聚合异戊二烯单体：(a)有机铁化合物，(b)有机铝化合物，(c)芳族螯合胺，和(d)质子化合物；其中螯合胺与有机铁化合物的摩尔比是在约0.1∶1至约1∶1范围内，其中有机铝化合物与有机铁化合物的摩尔比是在约5∶1至约200∶1范围内，且其中质子化合物与有机铝化合物的摩尔比是在约0.001∶1至约0.2∶1范围内。为了教导可以用于合成聚异戊二烯(其具有高3，4-微结构含量，且是应变可结晶的)的催化剂系统和聚合技术的目的，美国专利5,082,906的教导通过引用并入本文。 
美国专利5,356,997也涉及用于合成应变可结晶的3，4-聚异戊二烯的方法。该3，4-聚异戊二烯具有在约65％至约85％范围内的3，4-微结构含量、在约15％至约35％范围内的顺式-1，4-微结构含量、和基本上没有反式-1，4-微结构或1，2-微结构。在短聚合时间以后，它可以在有机溶剂中合成至定量产率。美国专利5,356,997具体地公开了用于合成3，4-聚异戊二烯的方法，所述方法包括：在有机溶剂中，在约-10℃至约100℃范围内的温度，在催 化剂系统存在下，聚合异戊二烯单体，所述催化剂系统包含：(a)可溶于有机溶剂中的有机铁化合物，其中有机铁化合物中的铁是处于+3氧化状态，(b)部分地水解的有机铝化合物，其通过向有机铝化合物中加入选自水、醇和羧酸的质子化合物而制备，和(c)芳族螯合胺；其中螯合胺与有机铁化合物的摩尔比是在约0.1∶1至约1∶1范围内，其中有机铝化合物与有机铁化合物的摩尔比是在约5∶1至约200∶1范围内，且其中质子化合物与有机铝化合物的摩尔比是在约0.001∶1至约0.2∶1范围内。为了教导可以用于合成聚异戊二烯(其具有高3，4-微结构含量，且是应变可结晶的)的催化剂系统和聚合技术的目的，美国专利5,356,997的教导通过引用并入本文。 
美国专利5,677,402揭示了用于制备3，4-聚异戊二烯橡胶的方法，所述方法包括：在约30℃至约100℃范围内的温度，在有烷氧基钠和极性改性剂存在下，用有机锂引发剂聚合异戊二烯单体，其中烷氧基钠与有机锂引发剂的摩尔比是在约0.05∶1至约3∶1范围内；且其中极性改性剂与有机锂引发剂的摩尔比是在约0.25∶1至约5∶1范围内。为了教导可以用于合成3，4-聚异戊二烯的催化剂系统和聚合技术的目的，美国专利5,677,402的教导通过引用并入本文。 
美国专利7,351,768公开了液体聚异戊二烯的合成，所述液体聚异戊二烯具有在5,000至100,000范围内、优选在20,000至80,000范围内的重均分子量。为了例证液体聚异戊二烯的合成的目的，美国专利5,677,402的教导通过引用并入本文。 
美国专利6,576,728公开了用于使苯乙烯和异戊二烯共聚以生产低乙烯基苯乙烯-异戊二烯橡胶的方法，所述橡胶具有源自苯乙烯的重复单元的随机分布。在这些聚合中采用的引发剂系统包含：(a)锂引发剂和(b)选自下述的成员：(1)烷氧基钠，(2)磺酸的钠盐，和(3)乙二醇醚的钠盐。重要的是，在这些聚合中使用的引发剂系统不含有极性改性剂，诸如路易斯碱。为了例证苯乙烯-异戊二烯橡胶的合成的目的，美国专利6,576,728的教导通过引用并入本文。 
美国专利6,313,216公开了用于合成随机的苯乙烯-异戊二烯橡胶的方 法，所述方法包括：(1)将异戊二烯、苯乙烯、引发剂、和溶剂连续地装载进第一聚合区，(2)使异戊二烯和苯乙烯在第一聚合区中共聚至60至95％的总转化率，以生成含有活性苯乙烯-异戊二烯链的聚合物料浆，(3)将含有活性苯乙烯-异戊二烯链和额外的异戊二烯单体的聚合物料浆连续地装载进第二聚合区，其中反应的异戊二烯总量中的5至40％被装载进第二聚合区，(4)使共聚在第二聚合区中持续至至少90％的异戊二烯单体转化率，其中第二聚合区中苯乙烯和异戊二烯的总转化率被限制于最大98％，(5)从第二反应区取出具有活性链末端的随机的苯乙烯-异戊二烯橡胶的聚合物料浆，(6)灭活随机的苯乙烯-异戊二烯橡胶上的活性链末端，和(7)从聚合物料浆回收随机的苯乙烯-异戊二烯橡胶，其中第一聚合区和第二聚合区中的共聚是在70℃至100℃范围内的温度进行，且其中装载进第一聚合区的苯乙烯的量比结合进橡胶中的苯乙烯总量多至少2％。为了例证苯乙烯-异戊二烯橡胶的合成的目的，美国专利6,313,216的教导通过引用并入本文。 
通过使用在美国专利5,061,765中公开的方法，可以在有机溶剂中在短聚合时间以后合成具有高乙烯基含量的异戊二烯-丁二烯共聚物至高产率。使用该方法制备的异戊二烯-丁二烯共聚物具有在约0℃至约-60℃范围内的玻璃转化温度，且可以用于轮胎胎面中，这会提供改良的牵引和改良的裂口延伸阻力。美国专利5,061,765更具体地公开了用于合成具有高乙烯基含量的异戊二烯-丁二烯共聚物的方法，所述方法包括：在有机溶剂中，在约-10℃至约100℃范围内的温度，在有催化剂系统存在下，共聚异戊二烯单体和丁二烯单体，所述催化剂系统包含：(a)有机铁化合物，(b)有机铝化合物，(c)芳族螯合胺，和(d)质子化合物；其中螯合胺与有机铁化合物的摩尔比是在约0.1∶1至约1∶1范围内，其中有机铝化合物与有机铁化合物的摩尔比是在约5∶1至约200∶1范围内，且其中质子化合物与有机铝化合物的摩尔比是在约0.001∶1至约0.2∶1范围内。为了例证异戊二烯-丁二烯橡胶的合成的目的，美国专利5,061,765的教导通过引用并入本文。 
在美国专利5,137,998中公开了用于合成苯乙烯、异戊二烯和丁二烯的橡胶样三元共聚物的技术。这些橡胶样三元共聚物表现优良的性质组合， 所述性质可用于轮胎胎面橡胶化合物中。通过在轮胎胎面中使用这样的三元共聚物，可以制造出具有改良的湿滑阻抗的轮胎，而不会牺牲滚动阻力或胎面摩耗特征。美国专利5,137,998更具体地公开了用于制备苯乙烯、异戊二烯、和丁二烯的橡胶样三元共聚物的方法，所述橡胶样三元共聚物具有多个玻璃转化温度，且具有适用于制备轮胎胎面的优良性质组合，所述方法包括：在有机溶剂中，在不超过约40℃的温度，在有下述物质存在下，三元共聚苯乙烯、异戊二烯和1，3-丁二烯：(a)至少一个选自三哌啶子基氧化膦和碱金属烷醇盐的成员，和(b)有机锂化合物。为了例证苯乙烯-异戊二烯-丁二烯橡胶的合成的目的，美国专利5,137,998的教导通过引用并入本文。 
通过在美国专利6,562,895中公开的方法，可以制备液体异戊二烯-丁二烯橡胶(IBR)，其特别适用于制备高性能汽车轮胎(包括赛车轮胎)的胎面，所述胎面表现出优良的干燥牵引特征和耐久性。该异戊二烯-丁二烯橡胶在室温是液体，且包含源自约5重量％至约95重量％的异戊二烯和约5重量％至约95重量％的1，3-丁二烯的重复单元，其中所述源自异戊二烯和1，3-丁二烯的重复单元处于基本上随机的次序中。该IBR也具有在约3,000至约50,000范围内的低数均分子量，且具有在约-50℃至约20℃范围内的玻璃转化温度。 
使用有机锂引发剂和极性改性剂，合成这些异戊二烯-丁二烯共聚物。采用的有机锂引发剂的水平取决于要合成的液体异戊二烯-丁二烯聚合物的分子量。作为一般规律，在所有阴离子聚合中，生产的聚合物的分子量与使用的引发剂的量成反比。因为要合成具有相对低分子量的液体异戊二烯-丁二烯聚合物，采用的引发剂的量相对较大。作为一般规律，采用约0.1至约2phm(份/100份单体重量)的有机锂化合物。在大多数情况下，优选地使用约0.2至约1phm的有机锂化合物，最优选地使用约0.4phm至0.6phm的有机锂化合物。在任意情况下，选择有机锂引发剂的量，以导致生产具有在约3,000至约50,000范围内的数均分子量的液体异戊二烯-丁二烯聚合物。 
优选地选择有机锂引发剂的量，以导致生产具有在约5,000至约30,000 范围内的数均分子量的液体异戊二烯-丁二烯聚合物。最优选地选择有机锂引发剂的量，以导致生产具有在约8,000至约18,000范围内的数均分子量的液体异戊二烯-丁二烯聚合物。在任意情况下，至关重要的是，在有极性改性剂(诸如N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TMEDA))存在下，进行1，3-丁二烯和苯乙烯的共聚，以实现在约-50℃至20℃范围内的高玻璃转化温度。为了例证液体异戊二烯-丁二烯聚合物的合成的目的，美国专利6,562,895的教导通过引用并入本文。 
通过在美国专利5,242,984中所述的方法，可以制备含有聚异戊二烯段的嵌段共聚物。例如，通过该方法，可以制备苯乙烯和异戊二烯的直链二段共聚物(S-I嵌段共聚物)以及苯乙烯和异戊二烯的直链三段共聚物(S-I-S三段共聚物)。在该技术中，通过在惰性有机溶剂中的阴离子聚合，顺序地聚合单体。通常，使用有机碱金属化合物(诸如烷基锂化合物)来引发聚合，所述聚合可以在宽温度范围内进行。 
在美国专利3,149,182和美国专利3,231,635中，描述了控制段和总聚合物的分子量的方法，所述美国专利声称，通过改变催化剂的量，可以使单体的量保持恒定，并可以实现不同的分子量，或者，通过改变单体的量，可以使催化剂的量保持恒定，并可以实现不同的分子量。在连续聚合以后，通过例如加入质子性的终止剂(例如水、醇或其它试剂)或使用氢，终止产物，其目的是，取出形成缩聚物产物的核心的锂自由基。然后例如通过使用热水或蒸汽或二者的凝固，回收嵌段共聚物产品。为了教导用于合成S-I嵌段共聚物和S-I-S三段共聚物的方法的目的，美国专利5,242,984、美国专利3,149,182、和美国专利3,231,635的教导通过引用并入本文。 
碳指纹法 
使用本发明的异戊二烯制备的所有类型的聚合物可以验证为用不是源自石化产品来源的异戊二烯制成。另外，本发明的含有异戊二烯的聚合物也可以与来自天然来源(诸如天然橡胶)的含有异戊二烯的聚合物区分开。因此，本发明的含有异戊二烯的聚合物可以通过分析验证为来自本文描绘的生物可再生的、环境友好的来源。 
基于二元碳-同位素指纹法，可以将源自生物异戊二烯的聚合物与源自 石化产品碳的聚合物区分开。另外，通过二元碳-同位素指纹法(参见，美国专利号7,169,588，它通过引用并入本文)，可以确定生物来源的碳(例如葡萄糖相对于甘油)的具体来源。 
该方法可有用地区分化学上相同的物质，并按照生物圈的(植物)成分的生长来源(和可能的年份)来分配产品中的碳。同位素14C和13C会带来关于该问题的补充信息。放射性碳定年同位素(14C，它的核半衰期为5730年)可以明确地分配化石(“死的”)和生物圈的(“活的”)原料之间的样本碳[Currie，L.A.“Source Apportionment of Atmospheric Particles，”Characterization of Environmental Particles，J.Buffle和H.P.van Leeuwen编，IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series(Lewis Publishers，Inc)(1992)374的第I卷第1册]。放射性碳定年的基础假设是，大气中14C浓度的恒定性导致活生物体中14C的恒定性。当处理分离的样品时，通过下述关系式，可以大致推导出样品的年龄：t＝(-5730/0.693)ln(A/AO)，其中t＝年龄，5730年是放射性碳的半衰期，A和AO分别是样品和modem标准品(modem standard)的具体14C活性[Hsieh，Y.，Soil Sci.Soc.Am J.，56，460，(1992)]。但是，因为自1950年以后的大气层核试验和自1850年以后的矿物燃料的燃烧，14C已经获得第二个地球化学时间特性。在二十世纪六十年代中期的核试验高峰时，它在大气CO2中(因此在活的生物圈中)的浓度大致倍增。以后已经逐渐恢复至约1.2x10-12的稳态宇宙发生的(大气的)基线同位素比率(14C/12C)，大约松弛7-10年的“半衰期”(该后一个半衰期不必精确地计入；相反，必须使用详细的大气核输入/衰变函数来跟踪自核时代开始以后大气的和生物圈的14C的变化)。该后一个生物圈的14C时间特性延伸出最近的生物圈碳的年代测定的前途。通过加速器质谱法(AMS)可以测量14C，以“modem碳的分数”(fM)为单位给出结果。fM由国家标准和技术研究所(NIST，National Institute of Standards and Technology)标准参照物(SRM)4990B和4990C(分别称作草酸标准品HOxI和HOxII)来确定。该基础定义涉及0.95x14C/12C同位素比率HOxI(参照AD 1950)。这大致等于衰变校正的工业化革命前的木材。对于当前的活的生物圈(植物材料)，fM≈1.1。 
稳定的碳同位素比率(13C/12C)会为来源辨别和分配提供补充途径。碳同位素13C和12C之比可以用于鉴别或排除许多含碳样品的潜在起源。该方法较好地工作，因为：(1)两种同位素在地质学时间范围内是稳定的；(2)使用燃烧分析、气相色谱法、和同位素比率质谱法的组合，可以在高精确度测量13C与12C之比；(3)许多天然存在的物质的13C/12C比率发生在那些物质特有的狭窄范围内；和(4)许多物质的13C/12C比率随着这些物质发生化学反应以可预测的方式变化。 
涉及在或接近天然丰度水平的13C/12C比率的研究，通常将同位素数据报告为“δ值”，它们用符号δ13C表示，并按照相对于标准参照样品的千分之一份数(‰)来给出。对于碳，参照样品通常是Pee Dee Belemite，它具有1.112328％的13C天然丰度，且被指定δ13C 0.00‰。将13C/12C比率与δ值相关联的公式是： 
相对于标准品的δ13C(‰)＝[(R样品-R标准品)/R标准品](1000)，其中R样品是样品的13C/12C比，且R标准品是Pee Dee Belemite的比率。 
尽管碳的同位素(即，13C和12C)参与相同的物理过程和相同的化学反应，13C和12C之间轻微的质量差异可以显示为许多反应和过程的速率的非常轻微的差异。这导致发生化学反应或物理过程的样品之间的13C/12C比率的小差异。例如，诸如蒸发或扩散等物理过程会辨别出更重的同位素，并随着更轻的同位素更快速地蒸发或扩散离开，通常导致更重的同位素在原始样品中的轻度富集。因此，13C/12C比随着蒸发或扩散的发生而轻微增加。对于包括酶反应在内的化学反应，情形更复杂，但是经常存在一种同位素与另一种同位素的轻微差别，这可以通过测量13C/12C比率或δ13C值来检测。例如，大气CO2可以经由2个非常不同的光合作用机制转化成植物物质：发生在C3植物中的Calvin-Benson途径，和发生在C4植物中的Hatch-Slack途径。这2个机制不同至足以产生来自相同CO2的δ13C的可测量的差异。对于C4植物，δ13C通常在-9‰至-17‰范围内，平均值接近-13‰。对于C3植物，δ13C通常在-20‰至-32‰范围内，平均值接近-27‰。因为这些范围如此不同，且常规地可以测量在0.02‰以内的δ13C值，可以相对容易地区分源自C3或C4植物的植物残余物。这在考古学和其它领域 中具有众多用途，其中来自烹饪或遗骨的含碳残余物的分析可以用于跟踪人和其它动物的进化、活动和饮食。 
最近，δ13C值已经被用于检测经济欺诈，特别是在食物中掺杂其它物质——包括源自石化产品的可能有害的合成物。例如，玉米油被认为是溢价植物油，不法生产者面临用更廉价的油来稀释玉米油的诱惑。幸运的是，玉米油源自C4植物，而大多数更廉价的替代物源自C3植物或动物。真的玉米油的δ13C因此是-13.7‰至-16.4‰，而替代物是-25‰至-32‰。通过测量δ13C，可以检测用更廉价的替代物对玉米油的任何显著稀释。类似地，通过测量δ13C值，可以检测蔗糖(C4光合作用的产物)向果汁、葡萄酒、烈酒、和蜂蜜(都是C3光合作用的产物)中的添加。通过δ13C值，甚至可能检测合成类似物在天然香料中的掺杂，和非法的合成激素添加剂的使用。 
本发明利用准确地测量δ13C值的能力，以便生产新的、同位素上独特的异戊二烯聚合物，其可以与源自基于石油的原料的聚合物容易地区分开。本发明也利用准确地测量δ13C值的能力，以便生产新的、同位素上独特的异戊二烯聚合物，其可以与天然橡胶容易地区分开。本发明的一个显著特征是，它提供了新的聚合物，所述聚合物具有可以定制的宽δ13C值范围，并可以随后验证真实性。如前所述，这些新的聚合物满足了消费者对可证实的产品日益增加的需求，所述产品既不含有潜在的蛋白性的变应原，也不含有源自石油的原料。 
本发明描述的聚合物含有异戊二烯单元，其在同位素方面不同于天然橡胶和含有石油-衍生的异戊二烯的合成聚合物。在源自巴西橡胶树(即，常见的天然橡胶树)的天然橡胶的情况下，δ13C值通常在约-27‰至约-28‰范围内。源自荒漠灌木的银胶菊橡胶具有约-31‰的δ13C。两种橡胶都表现出C3光合作用产物的预期δ13C值，且已知两种橡胶都含有聚合物-结合的蛋白。 
根据异戊二烯的来源，传统的合成的聚异戊二烯可以具有不同的δ13C值。对于萃取蒸馏来自石油精炼厂的C5流所产生的异戊二烯，δ13C是约-22‰至约-24‰。该范围对于源自石油的不饱和轻烃而言是典型的，含有基于石油的异戊二烯的聚合物通常含有具有相同δ13C的异戊二烯单元。对 于含有异丁烯与甲醛的反应所产生的异戊二烯的聚合物，δ13C值可以是约-34.4‰，因为甲醛经常源自具有远远更负δ13C值的原料。 
本发明提供了具有非常不同的δ13C值的含有异戊二烯的聚合物。例如，发酵含有微量其它含碳营养物(例如，酵母提取物)的玉米衍生的葡萄糖(δ13C-10.73‰)，会生产这样的异戊二烯，其可以聚合成具有δ13C-14.66‰至-14.85‰的聚异戊二烯。该聚合物的δ13C明显是在新的范围内，该范围显然脱离了天然橡胶和所有以前已知的合成聚异戊二烯的正常范围，且是在通常与C4植物衍生出的产物有关的范围内。该聚合物的独特δ13C值是下述事实的直接结果：即所述聚合物中的异戊二烯源自基于玉米的葡萄糖，后者实际上是源自C4植物的产品。 
本领域普通技术人员公认，使用其它糖或源自C4植物的发酵物，可以得到类似的结果。例如，来自甘蔗的蔗糖(δ13C-10.4‰)、来自甘蔗的转化糖(δ13C-15.3‰)、来自玉米淀粉的葡萄糖(δ13C-11.1‰)、和来自玉米秸秆(δ13C-11.3‰)或甘蔗甘蔗渣(δ13C-13.0‰)的水解性降解的葡萄糖，都会生产这样的异戊二烯，其可以用于生产具有比天然橡胶或含有基于石油的异戊二烯的合成聚合物更低负值的δ13C值的异戊二烯聚合物。本领域普通技术人员也会认识到，从具有大约大于(即，更低负值)约-18‰的δ13C的可发酵原料(包括具有大约大于约-18‰的平均δ13C的可发酵原料的混合物)，可能生产具有比约-22‰更低负值的δ13C的异戊二烯和异戊二烯聚合物。 
除了生产含有异戊二烯的聚合物(其具有源自C4植物的产物特有的δ13C值)以外，本领域技术人员会认识到，从可发酵的非-C4原料可以制备出含有独特地同位素标记的异戊二烯的聚合物。例如，来自水解的软木浆的葡萄糖(δ13C-23‰)会产生具有接近-27‰的δ13C的异戊二烯和聚异戊二烯，所述δ13C是在用萃取蒸馏C5级分产生的异戊二烯和异丁烯与甲醛的反应产生的异戊二烯所观察到的正常范围之间的独特范围内。本领域技术人员也会认识到，发酵具有大约-20‰至约-28‰的δ13C范围的其它糖，会生产具有在约-24‰至约-32‰范围内的δ13C的异戊二烯和异戊二烯聚合物。这些其它糖可能包括(但不限于)源自水解纤维素的葡萄糖(δ13C-25±2‰)、来自甜菜糖的转化糖(δ13C-26‰至-27‰)、和乳糖(δ13C-27‰至 -28‰)。发酵植物油(δ13C-26‰至-32‰)，包括棕榈油(δ13C-30‰)，会产生具有比-30‰更大负性的δ13C的异戊二烯聚合物。 
本领域技术人员会认识到，2种或更多种原料的共同发酵，可以用于生产具有中间δ13C值的异戊二烯和由此得到的含有异戊二烯的聚合物。例如，来自甘蔗的蔗糖(δ13C-10.4‰)和来自甜菜糖的蔗糖(δ13C-26‰至-27‰)的1∶1混合物，会生产这样的异戊二烯和由此得到的含有异戊二烯的聚合物：其δ13C值与源自具有平均δ13C值(即，大约-18.5‰)的单一来源的蔗糖生产的聚合物大约相同。对于源自糖和甜菜的转化糖，也是如此。在两种情况下，显而易见，通过混合和然后(共)聚合等量的分别从源自甘蔗和甜菜的蔗糖或转化糖制备出的异戊二烯，可以合成相同的聚合物。还显而易见，共同发酵糖和其它可发酵原料(诸如酵母提取物和植物油)，可以生产具有中间δ13C值的异戊二烯和由此得到的含有异戊二烯的聚合物。例如，共同发酵比例为181.2∶17.6的葡萄糖(δ13C-10.73‰)和酵母提取物(δ13C-26‰至-27‰)，会生成这样的异戊二烯：其可以聚合成具有-18‰至-20‰的δ13C值的聚异戊二烯。相比而言，发酵含有微量酵母提取物的葡萄糖并随后聚合异戊二烯，会生成具有-14‰至-15‰的δ13C值的聚异戊二烯。 
对于异戊二烯与其它单体的共聚物，本领域技术人员认识到，有限量的异戊二烯被掺入聚合物背景中，作为聚异戊二烯的“段”。异戊二烯的形成2个或更多个异戊二烯单元的段(甚至在“随机的共聚物”中)的趋势取决于许多因素，包括异戊二烯相对于其它单体的量、用于聚合的催化剂的类型、和聚合的具体反应条件。通过NMR波谱学，通常可以检测到这些段沿着聚合物主链的存在。通过使用化学降解(例如，臭氧分解)和色谱法的组合，可能分离这些段的片段用于化学分析，包括测量源自异戊二烯的段的δ13C值。这会提供测定异戊二烯与其它单体的共聚物是否含有源自可再生的/可持续的原料(尤其是源自C4植物的原料)的异戊二烯的方法。 
借助于它们的δ13C值和其它聚合物特征，可以如此鉴别出本发明的聚异戊二烯聚合物，所述聚合物用来自利用生物可再生碳源的细胞培养物的异戊二烯单体制成。例如，下述的含有异戊二烯的聚合物可被验证为含有使用本发明的方法生产的异戊二烯单体： 
(1)包含源自异戊二烯单体的重复单元的聚异戊二烯聚合物，其中所述聚异戊二烯聚合物具有大于-22‰的δ13C值。这样的聚异戊二烯聚合物可以具有大于-21‰的δ13C值，且也可以具有大于-20‰的δ13C值。在某些情况下，聚异戊二烯聚合物具有在-22‰至-10‰范围内的δ13C值，且在其它情况下，它具有在-21‰至-12‰范围内的δ13C值。在其它情况下，聚异戊二烯聚合物具有在-20‰至-14‰范围内的δ13C值。在许多情况下，聚异戊二烯聚合物是聚异戊二烯同聚物橡胶。 
(2)包含源自异戊二烯单体的重复单元的聚异戊二烯聚合物，其中所述聚异戊二烯聚合物具有在-30‰至-28.5‰范围内的δ13C值。这样的聚异戊二烯聚合物可以具有在-30‰至-29‰范围内的δ13C值。在某些情况下，聚异戊二烯聚合物具有在-30‰至-29‰范围内的δ13C值，且在其它情况下，聚异戊二烯聚合物具有在-30‰至-29.5‰范围内的δ13C值。在其它情况下，聚异戊二烯聚合物可以具有在-29.5‰至-28.5‰范围内的δ13C值，在其它另外的情况下，聚异戊二烯聚合物可以具有在-29.0‰至-28.5‰范围内的δ13C值。在许多情况下，聚异戊二烯聚合物是聚异戊二烯同聚物橡胶。 
(3)包含源自异戊二烯单体的重复单元的聚异戊二烯聚合物，其中所述聚异戊二烯不含有蛋白，且其中所述聚异戊二烯聚合物具有在-34‰至-24‰范围内的δ13C值。在有些情况下，该聚异戊二烯聚合物具有在-32‰至-25‰范围内的δ13C值。在有些情况下，该聚异戊二烯聚合物具有在-34‰至-25‰范围内的δ13C值。在其它情况下，聚异戊二烯聚合物具有在-33‰至-25‰范围内的δ13C值，且在其它情况下，聚异戊二烯聚合物具有在-32‰至-25‰范围内的δ13C值。在许多情况下，聚异戊二烯聚合物是聚异戊二烯同聚物橡胶。 
(4)包含源自异戊二烯单体的重复单元的聚异戊二烯聚合物，其中所述聚异戊二烯聚合物具有小于99.9％的顺式-1，4-微结构含量，其中所述聚异戊二烯聚合物具有小于99.9％的反式-1，4-微结构含量，且其中所述聚异戊二烯聚合物具有在-34‰至-24‰范围内的δ13C值。这样的聚异戊二烯可以具有在-34‰至-25‰范围内的δ13C值。在有些情况下，聚异戊二烯聚合物具有在-33‰至-25‰范围内的δ13C值。在其它情况下，聚异戊二烯聚合 物具有在-32‰至-25‰范围内的δ13C值。在其它情况下，聚异戊二烯聚合物具有在-32‰至-24‰范围内的δ13C值。聚异戊二烯聚合物可以具有小于99.8％的顺式-1，4-微结构含量。在其它情况下，聚异戊二烯聚合物具有小于99.7％的顺式-1，4-微结构含量。在其它情况下，聚异戊二烯聚合物具有小于99.5％或甚至小于99％的顺式-1，4-微结构含量。在许多情况下，聚异戊二烯聚合物具有小于98.5％或甚至小于98％的顺式-1，4-微结构含量。该聚异戊二烯聚合物也可以具有小于2.0或甚至小于1.8的多分散性。在有些情况下，聚异戊二烯聚合物具有小于1.6或甚至小于1.5的多分散性。在其它情况下，聚异戊二烯聚合物可以具有小于1.4或甚至小于1.2的多分散性。在许多情况下，聚异戊二烯聚合物具有小于1.1的多分散性。 
(5)包含源自异戊二烯单体的重复单元的聚异戊二烯聚合物，其中所述聚异戊二烯聚合物具有大于2％的3，4-微结构含量，且其中所述聚异戊二烯聚合物具有在-34‰至-24‰范围内的δ13C值。这样的聚异戊二烯聚合物可以具有在-34‰至-25‰范围内的δC13值。在有些情况下，聚异戊二烯聚合物具有在-33‰至-25‰范围内的δ13C值。在其它情况下，聚异戊二烯聚合物具有在-32‰至-25‰范围内的δ13C值。在其它情况下，聚异戊二烯聚合物具有在-32‰至-24‰范围内的δ13C值。聚异戊二烯聚合物可以具有大于5％的3，4-微结构含量。在有些情况下，聚异戊二烯聚合物具有大于10％的3，4-微结构含量。在其它情况下，聚异戊二烯聚合物具有大于15％的3，4-微结构含量。在其它情况下，聚异戊二烯聚合物具有大于20％的3，4-微结构含量。在许多情况下，聚异戊二烯聚合物具有大于25％的3，4-微结构含量。该聚异戊二烯聚合物可以具有小于2.0的多分散性。在有些情况下，聚异戊二烯聚合物具有小于1.8的多分散性。在其它情况下，聚异戊二烯聚合物具有小于1.6的多分散性。在其它情况下，聚异戊二烯聚合物具有小于1.5或甚至小于1.4的多分散性。在许多情况下，聚异戊二烯聚合物具有小于1.2或甚至小于1.1的多分散性。 
(6)包含源自异戊二烯单体的重复单元的聚异戊二烯聚合物，其中所述聚异戊二烯聚合物具有大于2％的1，2-微结构含量，且其中所述聚异戊二烯聚合物具有在-34‰至-24‰范围内的δ13C值。这类聚异戊二烯聚合物 可以具有在-34‰至-25‰范围内的δ13C值。在某些情况下，聚异戊二烯聚合物具有在-33‰至-25‰范围内的δ13C值。在其它情况下，聚异戊二烯聚合物具有在-32‰至-25‰范围内的δ13C值。在其它情况下，聚异戊二烯聚合物具有在-32‰至-24‰范围内的δ13C值。聚异戊二烯聚合物可以具有大于5％的1，2-微结构含量。在某些情况下，聚异戊二烯聚合物具有大于10％的1，2-微结构含量。在其它情况下，聚异戊二烯聚合物具有大于15％的1，2-微结构含量。在其它情况下，聚异戊二烯聚合物具有大于20％的1，2-微结构含量。在许多情况下，聚异戊二烯聚合物具有大于25％的1，2-微结构含量。聚异戊二烯聚合物可以具有小于2.0的多分散性。在某些情况下，聚异戊二烯聚合物具有小于1.8的多分散性。在其它情况下，聚异戊二烯聚合物具有小于1.6的多分散性。在其它情况下，聚异戊二烯聚合物具有小于1.5的多分散性。在许多情况下，聚异戊二烯聚合物具有小于1.4或甚至小于1.2的多分散性。聚异戊二烯聚合物可能具有小于1.1的多分散性。 
(7)包含源自异戊二烯单体和至少一种额外单体的重复单元的聚合物，其中所述聚合物包含源自异戊二烯的重复单元段，且其中源自异戊二烯的重复单元段具有大于-22‰的δ13C值。这样的聚异戊二烯聚合物可以具有大于-21‰的δ13C值。在某些情况下，聚异戊二烯聚合物具有大于-20‰的δ13C值。在其它情况下，聚异戊二烯聚合物具有在-22‰至-10‰范围内的δ13C值。在其它情况下，聚异戊二烯聚合物具有在-21‰至-12‰范围内的δ13C值。在许多情况下，聚异戊二烯聚合物具有在-20‰至-14‰范围内的δ13C值。 
(8)包含源自异戊二烯单体和至少一种额外单体的重复单元的聚合物，其中所述聚合物包含源自异戊二烯的重复单元段，且其中源自异戊二烯的重复单元段具有在-34‰至-24‰范围内的的δ13C值。这样的共聚物可以具有在-34‰至-25‰范围内的δ13C值。在某些情况下，这类共聚物具有在-33‰至-25‰范围内的δ13C值。在其它情况下，这类共聚物具有在-32‰至-25‰范围内的δ13C值。在其它情况下，这类共聚物具有在-32‰至-24‰范围内的δ13C值。这类共聚物可以是异戊二烯和1，3-丁二烯的橡胶样共聚物、异戊二烯和苯乙烯的橡胶样共聚物、异戊二烯和α-甲基苯乙烯的橡胶 样共聚物等。 
(9)包含源自异戊二烯单体的重复单元的液体聚异戊二烯聚合物，其中所述聚异戊二烯聚合物具有在5,000至100,000范围内的重均分子量，且其中所述液体聚异戊二烯聚合物具有在-34‰至-24‰范围内的δ13C值。这样的液体聚异戊二烯聚合物可以具有在-34‰至-25‰范围内的δ13C值。在某些情况下，液体聚异戊二烯聚合物具有在-33‰至-25‰范围内的δ13C值。在其它情况下，液体聚异戊二烯聚合物具有在-32‰至-25‰范围内的δ13C值。在其它情况下，液体聚异戊二烯聚合物具有在-32‰至-24‰范围内的δ13C值。这样的液体聚异戊二烯聚合物可以具有在20,000至80,000范围内的重均分子量。在某些情况下，液体聚异戊二烯聚合物具有在30,000至50,000范围内的重均分子量。在其它情况下，聚异戊二烯聚合物具有小于2.0或甚至小于1.8的多分散性。在其它情况下，液体聚异戊二烯聚合物具有小于1.6或甚至小于1.5的多分散性。在许多情况下，液体聚异戊二烯聚合物具有小于1.4或甚至小于1.2的多分散性。液体聚异戊二烯聚合物可能具有小于1.1的多分散性。 
(10)包含源自异戊二烯单体的重复单元的液体聚异戊二烯聚合物，其中所述液体聚异戊二烯聚合物具有在5,000至100,000范围内的重均分子量，且其中所述液体聚异戊二烯聚合物具有在-34‰至-24‰范围内的δ13C值。这样的液体聚异戊二烯聚合物可以具有在-34‰至-25‰范围内的δ13C值。在某些情况下，液体聚异戊二烯聚合物具有在-33‰至-25‰范围内的δ13C值。在其它情况下，液体聚异戊二烯聚合物具有在-32‰至-25‰范围内的δ13C值。在其它情况下，液体聚异戊二烯聚合物具有在-32‰至-24‰范围内的δ13C值。这样的液体聚异戊二烯可以具有在20,000至80,000范围内的重均分子量。液体聚异戊二烯通常具有在30,000至50,000范围内的重均分子量。这样的液体聚异戊二烯可以具有小于2.0的多分散性。在某些情况下，液体聚异戊二烯聚合物具有小于1.8的多分散性。在其它情况下，液体聚异戊二烯聚合物具有小于1.6的多分散性。在其它情况下，液体聚异戊二烯聚合物具有小于1.5或甚至小于1.4的多分散性。在许多情况下，液体聚异戊二烯聚合物具有小于1.2或甚至小于1.1的多分散性。 
通过化学聚合源自可再生资源的异戊二烯生产的聚异戊二烯同聚物、液体聚异戊二烯聚合物或聚异戊二烯共聚物、或本文所述的任意变体，可以通过它的14C含量与源自石化产品资源的产品区分开。在一些实施方式中，源自生物异戊二烯的聚合物包含放射性碳-14。在一些实施方式中， 14C/12C比是大于或约1.0 x 10-12、1.05 x 10-12、1.1 x 10-12、1.15 x 10-12、或1.2 x 10-12。在一些实施方式中，源自生物异戊二烯的聚合物具有大于或约0.9、0.95、1.0、1.05或1.1的fM值。在一些实施方式中，源自生物异戊二烯的聚合物具有大于或约0.9、0.95、1.0、1.05或1.1的fM值，和比-22‰更大(更低负性)的δ13C值。在一些实施方式中，源自生物异戊二烯的聚合物具有大于或约0.9、0.95、1.0、1.05或1.1的fM值，和在-22至-10、-21至-12、或-20至-14‰范围内的δ13C值。在一些实施方式中，源自生物异戊二烯的聚合物具有大于或约0.9、0.95、1.0、1.05或1.1的fM值，和在-34至-24、-32至-24、-34至-25、-33至-25、-32至-25、-30至-29、-30.0至-29.5、-29.5至-28.5、或-29.0至-28.5‰范围内的δ13C值。 
下面的实施例例证了本发明，所述实施例仅仅为了例证目的而给出，不应视作限制本发明的范围或本发明的的实践方式。除非另外明确指出，按照重量给出份数和百分比。 
实施例
实施例纯粹是意在例示本发明，因此不应该被解释为以任何方式限制本发明，实施例也描述并详细叙述了如上所讨论的本发明的方面和实施方式。除非另有指明，否则温度是指摄氏度，压力是在大气压下或接近大气压。前述实施例和详细描述是以举例方式而不是限制性方式提供。本说明书中引用的所有公开物、专利申请、和专利通过引用方式并入本文，如同每篇公开物、专利申请、或专利皆特别地且单一地通过引用方式并入一样。具体地，为了描述和公开可能用于本发明的组合物和方法的目的，将本文引用的所有公开物明确地通过引用方式并入本文。虽然已经为了清楚理解的目的，通过例示和实例的方式在一定程度上详细描述了前述发明，但是本领域普通技术人员根据本发明的教导显而易见的是，可以对其作出一些变化和修饰而不脱离随附的权利要求的精神或范围。 
在本发明的实践中，可以如下进行13C分析：使用Costech ECS4010元素分析仪作为ThermoFinnigan Delta+XP同位素比率质谱仪的入口，将0.5-1.0mg样品装载进用于碳同位素分析的锡罐中。将样品滴入1020℃的氧化亚钴/三氧化二钴燃烧反应器中，燃烧气体在氦流中以85mL/min穿过铜反应器(650℃)，以将NOx转化成N2。使用3-m 分子筛柱，分离CO2和N2。然后，使用2个实验室标准品(Acetanilide B，-29.52±0.02‰m和玉米淀粉A，-11.01±0.02‰)，将13C/12C比率校正至VPDB级，所述标准品已经使用2-标准品方案(T.B.Coplen等人，New Guidelines for δ13C Measurements，Anal.Chem.，78，2439-2441(2006))通过离线燃烧和双入口分析仔细地校正至VPDB级。为了教导用于测定δ13C值的技术的目的，Coplen的教导通过引用并入本文。 
实施例1：在表达重组野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌中生产异戊二烯 
I.用于在大肠杆菌中表达野葛异戊二烯合酶的载体的构建 
从GenBank获得野葛(越南葛藤)异戊二烯合酶基因(IspS)的蛋白序列(AAQ84170)。从DNA2.0购买针对大肠杆菌中的密码子使用进行了优化的野葛异戊二烯合酶基因(SEQ ID NO：1)。通过以限制性内切核酸酶BspLU11I/PstI消化从提供的质粒中切下异戊二烯合酶基因，进行凝胶纯化，并连接进经NcoI/PstI消化的pTrcHis2B(Invitrogen)。设计构建体，使得异戊二烯合酶基因中的终止密码子在PstI位点的5’。结果是：当构建体被表达时，His-标签不附着于异戊二烯合酶蛋白。通过测序来验证得到的质粒pTrcKudzu(图2和3)。 
还将异戊二烯合酶基因克隆进入pET16b(Novagen)。在本例中，将异戊二烯合酶基因插入至pET16b，使得重组异戊二烯合酶蛋白包含N-末端的His标签。使用下列引物集合通过PCR从pTrcKudzu扩增异戊二烯合酶基因： 
pET-His-Kudzu-2F： 
5’-CGTGAGATCATATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTTAC(SEQ ID NO：3)和 
pET-His-Kudzu-R： 
5’-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG(SEQ ID NO：4)。 
这些引物在基因的5’末端添加NdeI位点，在3’末端添加BamH1位点。如上所述的质粒pTrcKudzu用作模板DNA，根据生产商的说明书使用Herculase聚合酶(Stratagene)，加入浓度为10pMol的引物。以25μl的总体积进行PCR。以NdeI/BamH1消化PCR产物，并克隆进入经相同的酶消化的pET16b。将连接混合物转化进大肠杆菌Top10(Invitrogen)，通过测序选择正确的克隆。得到的质粒被称作pETNHisKudzu(图4和5)，其中野葛异戊二烯表达自T7启动子。 
还将野葛异戊二烯合酶基因克隆进入低拷贝数的质粒pCL1920。按照上文描述使用引物从pTrcKudzu扩增异戊二烯合酶基因。正向引物向5’末端添加HindIII位点和大肠杆菌共有RBS。PstI克隆位点已经存在于pTrcKudzu中，恰在终止密码子的3’，所以反向引物被构建为使得最终的PCR产物包括PstI位点。引物的序列是： 
HindIII-rbs-Kudzu F： 
5’-CATATGAAAGCTTGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACC(SEQ ID NO：6)和 
BamH1-Kudzu R： 
5’-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG(SEQ ID NO：4)。 
使用Herculase聚合酶和浓度为10pmol的引物以及1ng模板DNA(pTrcKudzu)扩增PCR产物。扩增程序包括：30个循环的“95℃，1分钟；60℃，1分钟；72℃，2分钟”。以HindIII和PstI消化产物并连接进也经过HindIII和PstI消化的pCL1920。将连接混合物转化进大肠杆菌Top10。通过测序检查数个转化体。得到的质粒被称作pCL-lac-Kudzu(图6和7)。 
II.测定异戊二烯的生产 
对于摇瓶培养物，将1ml的培养物从摇瓶转移至20ml CTC顶空瓶(Agilent瓶目录号5188 2753；帽目录号5188 2759)。将盖旋紧，将瓶在相 同温度下在250rpm振荡温育。30分钟后，从温育箱中取出瓶并按照如下所述进行分析(关于该测定中的一些实验数值，见表1)。 
在测定发酵罐中的异戊二烯产量的情况下，从发酵罐的废气中取出样品并按照如下所述直接进行分析(关于该测定中的一些实验数值，见表2)。 
使用连接了CTC Analytics(瑞士)CombiPAL自动取样仪(以顶空模式运行)的Agilent 6890 GC/MS系统进行分析。使用Agilent HP-5MS GC/MS柱(30m x 0.25mm；膜厚0.25μm)来分离分析物。将取样仪设定为注入500μL顶空气体。GC/MS法使用氦作为载气，流速为1ml/分钟。注入口维持在250℃，分流比为50∶1。在分析过程中，将烤箱温度维持在37℃持续2分钟。在m/z 67下以单离子监控(SIM)模式运行Agilent 5793N质量选择性检测器。在1.4至1.7分钟将检测器关闭，以允许洗脱永久气体。在这样的条件下，在1.78分钟观察到异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)的洗脱。使用校准表来定量异戊二烯的绝对量，发现在1μg/L至200μg/L是线性的。估计使用该方法的检测限是50-100ng/L。 
III.在含有表达重组异戊二烯合酶的大肠杆菌细胞的摇瓶中生产异戊二烯 
将如上描述的载体导入大肠杆菌菌株BL21(Novagen)以产生菌株BL21/ptrcKudzu、BL21/pCL-lac-Kudzu和BL21/pETHisKudzu。为了分离，将菌株涂覆于LA(Luria琼脂)和羧苄西林(50μg/ml)，并在37℃温育过夜。将单一菌落接种于250ml振荡培养瓶，其中含有20ml Luria Bertani培养基(LB)和羧苄西林(100μg/ml)。培养物在20℃在200rpm振荡生长过夜。测定过夜培养物的OD600，并将培养物在含有30ml MagicMedia(Invitrogen)和羧苄西林(100μg/ml)的250ml振荡培养瓶中稀释至OD600～0.05。将培养物在30℃在200rpm振荡温育。当OD600达到～0.5-0.8时，加入400μM IPTG，并在30℃在200rpm振荡温育细胞另6个小时。以IPTG诱导后0、2、4和6小时，收集1ml的培养物等分试样，测定OD600，并按照如上的描述测定所生产的异戊二烯的量。结果显示于图8。 
IV.在14升发酵中从BL21/ptrcKudzu生产异戊二烯 
从补料分批培养物测定从含有重组野葛异戊二烯合酶基因的大肠杆菌中异戊二烯的大规模生产。对于每升发酵培养基，发酵培养基(TM2)的配方如下：K2HPO413.6g，KH2PO413.6g，MgSO4*7H2O 2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，(NH4)2SO43.2g，酵母提取物5g，1000X改良痕量金属溶液(改良痕量金属olution)1ml。所有成分一起加入和溶于去离子H2O中。使用氢氧化钾(KOH)将pH调节至6.8并定容。以0.22μm滤器过滤除菌最终产物(仅过滤，不高压灭菌)。1000X改良痕量金属溶液的配方如下：柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO4*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3100mg，NaMoO4*2H2O 100mg。每个成分逐一溶于去离子H2O中，使用HCl/NaOH调节pH至3.0with，然后定容，并以0.22μm滤器过滤除菌。 
在需要的发酵、pH 6.7和34℃的温度，在14升生物反应器中进行该实验以监测从葡萄糖形成的异戊二烯。在大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基中制备从冷冻瓶中取出的大肠杆菌菌株BL21/ptrcKudzu的接种物。接种物生长至OD550＝0.6之后，离心2个600ml的瓶并将内容物重悬于70ml上清液中以将细胞沉淀物(70ml OD 3.1的材料)转移至生物反应器。在接种后的多个时间点，取出样品并按照上文描述测定所生产的异戊二烯的量。结果显示于图9。 
实施例2：在表达重组白杨异戊二烯合酶的大肠杆菌中生产异戊二烯 
从GenBank获得白杨(银白杨x 欧洲山杨)异戊二烯合酶的蛋白序列(CAC35696)(Schnitzler，J-P等人(2005)Planta 222：777-786)。从DNA2.0购买针对大肠杆菌进行了密码子优化的基因(p9796-poplar，图30和31)。通过以限制性内切核酸酶BspLU11I/PstI消化从提供的质粒中切下异戊二烯合酶基因，进行凝胶纯化，并连接进已经NcoI/PstI消化的pTrcHis2B。克隆构建体，使得插入片段中的终止密码子在PstI位点之前，这导致产生这样的构建体：其中His-标签不附着于异戊二烯合酶蛋白。通过测序来验证得到的质粒pTrcPoplar(图32和33)。 
实施例3：在表达重组野葛异戊二烯合酶的柠檬泛菌中生产异戊二烯 
将实施例1中描述的pTrcKudzu和pCL-lac Kudzu质粒电穿孔进入柠檬泛菌(美国专利号7,241,587)。分别在含有羧苄西林(200μg/ml)或壮观霉素(50μg/ml)的LA上选择转化体。从摇瓶中生产异戊二烯并按照实施例1中针对表达重组野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌菌株的描述测定所生产的异戊二烯的量。结果显示于图10。 
实施例4：在表达重组野葛异戊二烯合酶的枯草芽孢杆菌中生产异戊二烯 
I.用于表达野葛异戊二烯合酶的枯草芽孢杆菌复制质粒的构建 
在枯草芽孢杆菌aprEnprE Pxyl-comK菌株(BG3594comK)中使用aprE启动子控制下的复制质粒(具有氯霉素抗性盒的pBS19)表达野葛异戊二烯合酶。使用PCR单独扩增异戊二烯合酶、aprE启动子和转录终止子并使它们融合。然后将构建体克隆进入pBS19并转化进枯草芽孢杆菌。 
a)aprE启动子的扩增 
使用下列引物从枯草芽孢杆菌的染色体DNA扩增aprE启动子 
CF 797(+)起始aprE启动子MfeI 
5’-GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC(SEQ  ID NO：58) 
CF 07-43(-)使aprE启动子融合至Kudzu ispS 
5’-ATTGAGAAGAGGTCGCACACACTCTTTACCCTCTCCTTTTA(SEQ ID NO：59) 
b)异戊二烯合酶基因的扩增 
从质粒pTrcKudzu(SEQ ID NO：2)扩增野葛异戊二烯合酶基因。该基因针对大肠杆菌进行密码子优化，由DNA 2.0合成。使用下列引物： 
CF 07-42(+)使aprE启动子融合至野葛异戊二烯合酶基因(GTG起始密码子) 
5’-TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT(SEQ ID NO：60) 
CF 07-45(-)使野葛异戊二烯合酶基因的3’末端融合至终止子 
5’-CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC(SEQ ID NO：61) 
c)转录终止子的扩增 
使用下列引物从之前测过序的质粒pJHPms382扩增解淀粉芽孢杆菌的碱性丝氨酸蛋白酶的终止子： 
CF 07-44(+)使野葛异戊二烯合酶的3’末端融合至终止子 
5’-GATTAACCAGCTGATGTATGTCTAAAAAAAACCGGCCTTGG(SEQ ID NO：62) 
CF 07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子的末端(BamHI) 
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQ ID NO：63) 
使用下列引物通过PCR使野葛片段融合至终止子片段： 
CF 07-42(+)使aprE启动子融合至野葛异戊二烯合酶基因(GTG起始密码子) 
5’-TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT(SEQ ID NO：61) 
CF 07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子的末端(BamHI) 
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQ ID NO：63) 
使用下列引物通过PCR使野葛终止子片段融合至启动子片段： 
CF 797(+)起始aprE启动子MfeI 
5’-GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC(SEQ ID  NO：64) 
CF 07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子的末端(BamHI) 
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQ ID NO：63) 
使用Qiagen试剂盒纯化融合PCR片段并以限制性酶MfeI和BamHI消化。使用Qiagen试剂盒凝胶纯化该经消化的DNA片段并连接进载体pBS19，所述载体已经过EcoRI和BamHI消化并进行了凝胶纯化。 
将连接混合物转化进大肠杆菌Top 10细胞，在LA+50羧苄西林平板上选择菌落。选择总共6个菌落，在LA+50羧苄西林中生长过夜，然后使用Qiagen试剂盒分离质粒。以EcoRI和BamHI消化质粒以检查插入片段，将三个正确的质粒送去测序，其中使用下列引物： 
CF 149(+)aprE启动子的EcoRI起始 
5’-GACATGAATTCCTCCATTTTCTTCTGC(SEQ ID NO：65) 
CF 847(+)pXX 049中的序列(aprE启动子的末端) 
5’-AGGAGAGGGTAAAGAGTGAG(SEQ ID NO：66) 
CF 07-45(-)使野葛异戊二烯合酶的3’末端融合至终止子 
5’-CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC(SEQ ID NO：61) 
CF 07-48(+)用于野葛异戊二烯合酶的测序引物 
5’-CTTTTCCATCACCCACCTGAAG(SEQ ID NO：67) 
CF 07-49(+)野葛异戊二烯合酶中的测序 
5’-GGCGAAATGGTCCAACAACAAAATTATC(SEQ ID NO：68) 
通过测序，被称作pBS Kudzu#2(图52和12)的质粒是正确的，将其转化进枯草芽孢杆菌宿主菌株BG 3594 comK。在LA+5氯霉素平板上进行选择。选择转化体并在LA+5氯霉素上划线为单一菌落，然后在LA+5氯霉素中生长直至其达到1.5的OD600。将其在-80℃在存在甘油的瓶中冷冻储存。得到的菌株被称作CF 443。 
II.在含有表达重组异戊二烯合酶的枯草芽孢杆菌细胞的摇瓶中生 产异戊二烯 
以来自LA+氯霉素(Cm，25μg/ml)的CF 443的单一菌落接种过夜培养物。培养物在37℃在LB+Cm中在200rpm振荡生长。这些过夜培养物(1ml)用于接种含有25ml Grants II培养基和终浓度为25μg/ml的氯霉素的250ml振荡培养瓶。Grants II培养基的配方是：10g大豆胨，3ml 1M K2HPO4，75g葡萄糖，3.6g脲，100ml 10X MOPS，以水定容至1L，pH7.2；10X MOPS的配方是：83.72g MOPS，7.17g tricine，12g KOH丸，10ml 0.276M K2SO4溶液，10ml 0.528M MgCl2溶液，29.22g NaCl，100ml 100X微量营养素，以水定容至1L；100X微量营养素的配方是：1.47g CaCl2*2H2O，0.4g FeSO4*7H2O，0.1g MnSO4*H2O，0.1g ZnSO4*H2O，0.05g CuCl2*2H2O，0.1g CoCl2*6H2O，0.1g Na2MoO4*2H2O，以水定容至1L。将摇瓶在37℃温育，在第18、24、和44小时取出样品。在第18小时，对CF443和对照菌株的顶空取样。这代表18小时的异戊二烯累积。通过如实施例1描述的气相色谱测定异戊二烯的量。通过表达重组异戊二烯合酶显著增加了异戊二烯的产量(图11)。 
III.在14L的发酵中通过CF443生产异戊二烯 
从补料分批培养物中测定由含有在复制质粒上的重组野葛异戊二烯合酶基因的枯草芽孢杆菌大规模生产的异戊二烯。在含有大豆粉(Cargill)、磷酸钠和磷酸钾、硫酸镁和柠檬酸的溶液、氯化铁和氯化锰的营养培养基中，通过常规补料分批发酵方式培养表达野葛异戊二烯合酶基因的芽孢杆菌菌株CF 443或不表达野葛异戊二烯合酶基因的对照菌株。在发酵之前，使用酶的混合物(包括纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶)将培养基浸软90分钟(见WO95/04134)。向14L分批发酵罐中进料60％wt/wt葡萄糖(Cargill DE99右旋糖，ADM Versadex greens或Danisco转化糖)和99％wt/wt油(西方家用豆油，其中99％wt/wt是加入到细胞培养基之前油的浓度)。当批次中的葡萄糖不可检出时，开始进料。进料速率经数小时渐变，调整以相同的碳要素添加油。使用28％w/v氢氧化铵将pH控制在6.8-7.4。如果起泡沫，则向培养基中加入防沫剂。将发酵温度控制在37℃，以750rpm搅拌发酵培养物。在整个过程中监测多个其它参数，例如pH、 DO％、气流、和压力。将DO％维持在20以上。经36小时的时间过程取样并分析细胞生长(OD550)和异戊二烯的生产。这些实验的结果显示于图53A和53B。 
IV.野葛异戊二烯合酶(ispS)整合进入枯草芽孢杆菌 
将野葛异戊二烯合酶基因克隆进入整合质粒(pJH101-cmpR)，处于aprE启动子的控制下。在所测的条件下，没有检测到异戊二烯。 
实施例5：在木霉中生产异戊二烯 
I.用于在里氏木霉中表达野葛异戊二烯合酶的载体的构建 
由DNA 2.0合成解脂耶氏酵母密码子优化的野葛IS基因(SEQ ID NO：8)(图13)。该质粒作为下列PCR扩增反应的模板：1μl质粒模板(20ng/ul)，1μl引物EL-945(10μM)5’-GCTTATGGATCCTCTAGACTATTACACGTACATCAATTGG(SEQ ID NO：9)，1μl引物EL-965(10μM)5’-CACCATGTGTGCAACCTCCTCCCAGTTTAC(SEQ ID NO：10)，1μl dNTP(10mM)，5μl 10x PfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶缓冲液，1μl PfuUltra II Fusion HS DNA聚合酶，40μl水，总反应体积为50μl。正向引物在5’末端包含不对应于解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的另外4个核苷酸，但是这4个核苷酸对于克隆进入pENTR/D-TOPO载体是必需的。反向引物在5’末端包含不对应于解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的另外21个核苷酸，但插入这21个核苷酸以克隆进入其它载体骨架。使用MJ Research PTC-200热循环仪，按照如下进行PCR反应：95℃，2分钟(仅第一个循环)；“95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，30秒”(重复27个循环)；最后一个循环后72℃，1分钟。在1.2％E-凝胶上分析PCR产物以确认成功扩增了解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因。 
然后根据生产商的说明书，使用TOPO pENTR/D-TOPO克隆试剂盒克隆PCR产物：1μl PCR反应物，1μl盐溶液，1μl TOPO pENTR/D-TOPO载体和3μl水，总反应体积是6μl。将反应物在室温温育5分钟。将1μl  TOPO反应物转化进TOP10化学感受态大肠杆菌细胞。在LA+50μg/ml卡那霉素平板上选择转化体。挑取数个菌落，每个接种于含有LB+50μg/ml卡那霉素的5ml管中，使培养物在37℃在200rpm振荡生长过夜。根据生产商的说明书，使用QIAprep旋转微量制备试剂盒从过夜培养物分离质粒。对数个质粒进行测序以验证DNA序列是正确的。 
编码解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的单一pENTR/D-TOPO质粒用于Gateway克隆进入订制的pTrex3g载体。pTrex3g的构建描述于WO 2005/001036A2。根据生产商关于Gateway LR Clonase II Enzyme Mix试剂盒(Invitrogen)的说明书进行反应：1μl解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因pENTR/D-TOPO供体载体，1μl pTrex3g目的载体，6μl TE缓冲液，pH 8.0，总反应物体积为8μl。将反应物在室温温育1小时，然后加入1μl蛋白酶K溶液，在37℃继续温育10分钟。然后将1μl反应物转化进TOP10化学感受态大肠杆菌细胞。在LA+50μg/ml羧苄西林平板上选择转化体。挑取数个菌落，每个接种于含有LB+50μg/ml羧苄西林的5ml管中，使培养物在37℃在200rpm振荡生长过夜。根据生产商的说明书，使用QIAprep旋转微量制备试剂盒(Qiagen，Inc.)从过夜培养物管中分离质粒。对数个质粒进行测序以验证DNA序列是正确的。 
使用Biolistic PDS-1000/HE颗粒递送系统(见WO 2005/001036A2)进行解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶pTrex3g质粒(图14)向quad缺失的里氏木霉菌株的生物弹转化。使用专利公开WO 2005/001036A2的实施例11所列的程序进行稳定转化体的分离和摇瓶评价。 
II.在重组里氏木霉菌株中生产异戊二烯 
将如上描述的异戊二烯合酶转化体的1ml的15和36小时的培养物转移至顶空瓶中。将瓶密封并在30℃温育5小时。通过实施例1描述的方法测定顶空气体并鉴定异戊二烯。转化体中有2个显示出痕量的异戊二烯。通过14小时的温育可以增加异戊二烯的量。对于14小时的温育，两个阳性样品显示出约0.5μg/L的异戊二烯水平。未经转化的对照未显示出可检出水平的异戊二烯。该实验证明：当提供外源异戊二烯合酶时，里氏木霉 能够从内源前体生产异戊二烯。 
实施例6：在耶氏酵母中生产异戊二烯 
I.用于在解脂耶氏酵母中表达野葛异戊二烯合酶的载体的构建 
用于在解脂耶氏酵母中表达野葛异戊二烯合酶基因的载体的构建起始点是载体pSPZ1(MAP29Spb)。该载体的完整序列(SEQ ID No：11)显示于图15。 
使用解脂耶氏酵母菌株GICC 120285的染色体DNA作为模板通过PCR扩增以下片段：URA3基因的无启动子形式，18S核糖体RNA基因的片段，解脂耶氏酵母XPR2基因的转录终止子以及包含XPR2和ICL1基因的启动子的两个DNA片段。使用以下PCR引物： 
ICL13 
5’-GGTGAATTCAGTCTACTGGGGATTCCCAAATCTATATATACTGCAGGTGAC(SEQ ID NO：69) 
ICL15 
5’-GCAGGTGGGAAACTATGCACTCC(SEQ ID NO：70) 
XPR 3 
5’-CCTGAATTCTGTTGGATTGGAGGATTGGATAGTGGG(SEQ ID NO：71) 
XPR 5 
5’-GGTGTCGACGTACGGTCGAGCTTATTGACC(SEQ ID NO：72) 
XPRT3 
5’-GGTGGGCCCGCATTTTGCCACCTACAAGCCAG(SEQ ID NO：73) 
XPRT 5 
5’-GGTGAATTCTAGAGGATCCCAACGCTGTTGCCTACAACGG(SEQ ID NO：74) 
Y18S3 
5’-GGTGCGGCCGCTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCG(SEQ ID NO：75) 
Y18S 5 
5’-GGTGGGCCCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAG(SEQ ID NO：76) 
YURA3 
5’-GGTGACCAGCAAGTCCATGGGTGGTTTGATCATGG(SEQ ID NO：77) 
YURA 50 
5’-GGTGCGGCCGCCTTTGGAGTACGACTCCAACTATG(SEQ ID NO：78) 
YURA 51 
5’-GCGGCCGCAGACTAAATTTATTTCAGTCTCC(SEQ ID NO：79) 
对于PCR扩增，根据生产商的说明书，使用PfuUltraII聚合酶(Stratagene)、生产商提供的缓冲液和dNTP、2.5μM的引物和指明的模板DNA。使用下列循环进行扩增：95℃，1分钟；34x(95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，3分钟)，和在72℃，10分钟，然后在4℃温育。 
从DNA 2.0获得编码针对在耶氏酵母中表达进行了密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的合成的DNA分子(图16；SEQ ID NO：12)。在图18中显示了分别携带在XPR2和ICL1启动子控制下的合成的野葛异戊二烯合酶基因的质粒pYLA(KZ1)和pYLI(KZ1)的完整详细的构建示意图。还构建了对照质粒，其中插入了交配因子基因(MAP29)以替代异戊二烯合酶基因(图18E和18F)。 
类似的克隆程序可用于表达白杨(银白杨x 欧洲山杨)异戊二烯合酶基因。白杨异戊二烯的序列描述于Miller B等人(2001)Planta 213，483-487并显示于图17(SEQ ID NO：13)。在图18A和B中显示了产生分别携带在XPR2和ICL1启动子控制下的合成的白杨异戊二烯合酶基因的质粒 pYLA(POP1)和pYLI(POP1)的构建示意图。 
II.通过解脂耶氏酵母的重组菌株生产异戊二烯 
使用SacII消化载体pYLA(KZ1)、pYLI(KZ1)、pYLA(MAP29)和pYLI(MAP29)并通过标准的醋酸锂/聚乙二醇程序用于转化解脂耶氏酵母菌株CLIB 122至尿苷原养型。简而言之，酵母细胞在YEPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)中生长过夜，通过离心(4000rpm，10分钟)收集，以无菌水洗涤一次并悬于pH 6.0的0.1M醋酸锂中。将200μl的细胞悬浮液等份与线性化的质粒DNA溶液(10-20μg)混合，在室温温育10分钟，在相同的缓冲液中与1ml 50％PEG 4000混合。将悬浮液在室温再温育1小时，然后在42℃热击2分钟。然后将细胞铺板于SC his leu平板(0.67％酵母氮源，2％葡萄糖，各100mg/L的亮氨酸和组氨酸)。在30℃温育3-4天后出现转化体。 
使来自pYLA(KZ1)转化的3个分离体，来自pYLI(KZ1)转化的3个分离体，来自pYLA(MAP29)转化的2个分离体和来自pYLI(MAP29)转化的2个分离体在YEP7培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，pH 7.0)中在30℃振荡生长24小时。通过离心从10ml的培养物收集细胞，重悬于3ml的新鲜YEP7中并置于15ml旋盖瓶中。将瓶在室温温育过夜，轻微(60rpm)振荡。使用如实施例1描述的质谱检测器通过气相色谱分析这些瓶的顶空中的异戊二烯含量。以pYLA(KZ1)和pYLI(KZ1)获得的所有转化体都生产容易检出的量的异戊二烯(0.5μg/L至1μg/L，图20)。在携带肌醇六磷酸酶基因而非异戊二烯合酶基因的对照菌株的顶空中未检出异戊二烯。 
实施例7：在表达野葛异戊二烯合酶和idi、或dxs、或idi和dxs的大肠杆菌中生产异戊二烯 
I.构建用于在大肠杆菌中生产异戊二烯的编码野葛异戊二烯合酶和idi、或dxs、或idi和dxs的载体 
i)pTrcKudzuKan的构建 
将pTrcKudzu(如实施例1所描述)的bla基因替换为赋予卡那霉素抗性的基因。为了除掉bla基因，以BspHI消化pTrcKudzu，以虾碱性磷酸 酶(SAP)处理，在65℃热杀灭，然后以Klenow片段和dNTP进行末端填充。从琼脂糖凝胶纯化5kbp大的片段，并连接至kanr基因，所述kanr基因是使用引物MCM22 5’-GATCAAGCTTAACCGGAATTGCCAGCTG(SEQ ID NO：14)和MCM23 5’-GATCCGATCGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC(SEQ ID NO：15)从pCR-Blunt-II-TOPO通过PCR扩增而来的；以HindIII和PvuI消化，并进行末端填充。在含有50μg/ml卡那霉素的LA上选择携带赋予卡那霉素抗性的质粒(pTrcKudzuKan)的转化体。 
ii)pTrcKudzu yIDI Kan的构建 
以PstI消化pTrcKudzuKan，以SAP处理，热杀灭，并进行凝胶纯化。将其连接至编码具有合成的RBS的来自酿酒酵母的idi的PCR产物。用于PCR的引物是NsiI-YIDI 1F 5’-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC(SEQ ID NO：16)和PstI-YIDI 1R 5’-CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC(SEQ ID NO：17)；模板是酿酒酵母基因组DNA。以NsiI和PstI消化PCR产物，并进行凝胶纯化，然后连接。将连接混合物转化进化学感受态TOP10细胞并在含有50μg/ml卡那霉素的LA上选择。分离了数个转化体并测序，得到的质粒被称作pTrcKudzu-yIDI(kan)(图34和35)。 
iii)pTrcKudzu DXS Kan的构建 
以PstI消化质粒pTrcKudzuKan，以SAP处理，热杀灭，并进行凝胶纯化。将其连接至编码具有合成的RBS的来自大肠杆菌的dxs的PCR产物。用于PCR的引物是：MCM13 5’-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG(SEQ ID NO：18)和MCM14 5’-CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT(SEQ ID NO：19)；模板是大肠杆菌基因组DNA。以NsiI和PstI消化PCR产物，并进行凝胶纯化，然后连接。将得到的转化反应物转化进TOP10细胞并在含有50μg/ml卡那霉素的LA上选择。分离了数个转化体并测序，得到的质粒被称作pTrcKudzu-DXS(kan)(图36和37)。 
iv)pTrcKudzu-yIDI-dxs(kan)的构建 
以PstI消化pTrcKudzu-yIDI(kan)，以SAP处理，热杀灭，并进行凝胶纯化。将其连接至编码具有合成的RBS的来自大肠杆菌的dxs的PCR产物(引物MCM13 5’-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG(SEQ ID NO：18)和MCM14 5’-CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT(SEQ ID NO：19)；模板TOP10细胞)，所述PCR产物经过NsiI和PstI消化和凝胶纯化。最终的质粒被称作pTrcKudzu-yIDI-dxs(kan)(图21和22)。 
v)pCL PtrcKudzu的构建 
使用SspI从pTrcKudzu消化包含来自上述实施例1的启动子、结构基因和终止子的DNA片段，并进行凝胶纯化。将其连接至经过PvuII消化、SAP处理和热杀灭的pCL1920。将得到的连接混合物转化进TOP10细胞并在含有50μg/ml壮观霉素的LA中选择。分离了数个克隆并测序，选择了两个。pCL PtrcKudzu和pCL PtrcKudzu(A3)具有方向相反的插入片段(图38-41)。 
vi)pCL PtrcKudzu yIDI的构建 
将来自上述(ii)的NsiI-PstI消化的、凝胶纯化的IDI PCR扩增子连接进已经过PstI消化、SAP处理、和热杀灭的pCL PtrcKudzu。将连接混合物转化进TOP10细胞并在含有50μg/ml壮观霉素的LA中选择。分离了数个克隆并测序，得到的质粒被称作pCL PtrcKudzu yIDI(图42和43)。 
vii)pCL PtrcKudzu DXS的构建 
将来自上述(iii)的NsiI-PstI消化的、凝胶纯化的DXS PCR扩增子连接进已经过PstI消化、SAP处理、和热杀灭的pCL PtrcKudzu(A3)。将连接混合物转化进TOP10细胞并在含有50μg/ml壮观霉素的LA中选择。分离了数个克隆并测序，得到的质粒被称作pCL PtrcKudzu DXS(图44和45)。 
II.以不同拷贝数表达野葛异戊二烯合酶、idi、和/或dxs的培养物的顶空中的异戊二烯的测定 
之前经过质粒pTrcKudzu(kan)(A)、pTrcKudzu-yIDI kan(B)、pTrcKudzu-DXS kan(C)、pTrcKudzu-yIDI-DXS kan(D)转化的大肠杆菌BL21(λDE3)的培养物生长于含有50μg/mL卡那霉素的LB中。pCL PtrcKudzu(E)、pCL PtrcKudzu、pCL PtrcKudzu-yIDI(F)和pCL PtrcKudzu-DXS(G)的培养物生长于含50μg/mL壮观霉素的LB中。在时间0点(OD600是约0.5)以400μM IPTG诱导培养物，取出样品以进行顶空异戊二烯测定(见实施例1)。结果显示于图23A-23G。 
通过转化将质粒pTrcKudzu-yIDI-dxs(kan)导入大肠杆菌菌株BL21。得到的菌株BL21/pTrc Kudzu IDI DXS在20℃在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB中过夜生长，并用于接种摇瓶中的含有1％葡萄糖的TM3(13.6g K2PO4，13.6g KH2PO4，2.0g MgSO4*7H2O，2.0g一水合柠檬酸，0.3g柠檬酸铁铵，3.2g(NH4)2SO4，0.2g酵母提取物，1.0ml 1000x改良痕量金属溶液，调节至pH 6.8并以水定容，过滤除菌)。将培养瓶在30℃温育直至达到OD600为0.8，然后以400μM IPTG诱导。在诱导后的不同时间取出样品并按照实施例1的描述测定顶空中的异戊二烯的量。结果显示于图23H。 
III.在大肠杆菌/pTrcKudzu yIDI DXS中从生物质生产异戊二烯 
测定了菌株BL21 pTrcKudzuIDIDXS从三种类型的生物质：甘蔗渣、玉米秸秆和软木浆生产异戊二烯的能力，葡萄糖作为对照。通过酶促水解制备生物质的水解物(Brown，L和Torget，R.，1996，NREL标准测定法Lap-009“Enzymatic Saccharification of Lignocellulosic Biomass”)，以基于葡萄糖当量的稀释度使用。在本例中，葡萄糖当量等于1％的葡萄糖。来自BL21(DE3)pTrcKudzu yIDI DXS(kan)的新鲜转化的细胞的平板的单一菌落用于接种5ml LB+卡那霉素(50μg/ml)。培养物在25℃振荡温育过夜。次日，在25ml TM3+0.2％YE+1％原料中，将过夜培养物稀释至OD600＝0.05。原料是玉米秸秆、甘蔗渣、或软木浆。葡萄糖用作阳性对照，无葡萄糖的状况用作阴性对照。培养物在30℃在180rpm振荡温育。监测培养物的OD600，当其达到OD600＝～0.8时，按照实施例1的描述分析1小时和3小时之时培养物的异戊二烯生产。不诱导培养物。所有的包含添加 的原料的培养物生产与葡萄糖阳性对照相等的异戊二烯。实验按照一式两份进行，显示于图46。 
IV.在大肠杆菌/pTrcKudzuIDIDXS中从转化糖生产异戊二烯 
来自BL21(λDE3)/pTrcKudzu yIDI DXS(kan)的新鲜转化的细胞的平板的单一菌落用于接种5mL LB+卡那霉素(50μg/ml)。培养物在25℃振荡温育过夜。次日，在25ml TM3+0.2％YE+1％原料中，将过夜培养物稀释至OD600＝0.05。原料是葡萄糖、转化糖或玉米秸秆。通过酶促处理蔗糖糖浆制备转化糖原料(Danisco转化糖)。按照下文的描述(第V部分)制备AFEX玉米秸秆。细胞在30℃生长，当培养物达到OD600为～0.8-1.0时(0小时)，测定第一个样品。按照实施例1的描述，在0、1和3小时分析培养物的生长(如通过OD600所测定)和异戊二烯的生产。结果显示于图47。 
V.从AFEX预处理的玉米秸秆制备水解物 
从Michigan Biotechnology Institute获得AFEX预处理的玉米秸秆。预处理条件是：60％的水分，1∶1的氨载量，在90℃持续30分钟，然后风干。AFEX预处理的玉米秸秆中的水分含量是21.27％。AFEX预处理的玉米秸秆中的葡聚糖和木聚糖的含量分别是31.7％和19.1％(干重)。糖化过程如下：将20g AFEX预处理的玉米秸秆加入到500ml培养瓶中，瓶中含有5ml 1M柠檬酸钠缓冲液pH 4.8、2.25ml Accellerase 1000、0.1ml Grindamyl H121(来自面包制作工业的黑曲霉的Danisco木聚糖酶产物)、和72.65ml DI水。将培养瓶置于定轨振荡器上并在50℃温育96小时。从振荡器中取出1个样品并使用HPLC分析。水解物含有38.5g/l葡萄糖、21.8g/l木糖、和10.3g/l葡萄糖和/或木糖的低聚物。 
VI.酵母提取物对于生长于补料分批培养物中的大肠杆菌生产异戊二烯的效应 
按照之前的描述，使用含有如上所述的pTrcKudzu yIDI DXS质粒的大肠杆菌细胞以14升的规模进行发酵。以指数速率进料酵母提取物(Bio Springer，Montreal，Quebec，Canada)。在40小时的发酵过程中，输送进入发酵罐的酵母提取物的总量是70-830g。在550nm的波长下测定发酵液的 光密度。发酵罐内的最终的光密度与加入的酵母提取物的量成比例(图48A)。按照之前的描述测定来自发酵罐的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程而增大(图48B)。所生产的异戊二烯的量与进料的酵母提取物的量成线性比例(图48C)。 
VII.在pTrcKudzu DXS yIDI的500L发酵中生产异戊二烯 
含有野葛异戊二烯合酶、酿酒酵母IDI、和大肠杆菌DXS核酸的大肠杆菌细胞(大肠杆菌BL21(λDE3)pTrc Kudzu dxs yidi)的500升发酵用于生产异戊二烯。经15小时的时间段，异戊二烯的水平介于50至300μg/L。基于平均异戊二烯浓度、流经设备的平均流和异戊二烯突破程度，经计算，所收集的异戊二烯的量是约17g。 
VIII.生长于补料分批培养物中的大肠杆菌的500L发酵生产的异戊二烯 
培养基配方(每升发酵培养基)： 
K2HPO47.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分同时加入并溶解于去离子H2O中。该溶液经高压灭菌。以氨气(NH3)将pH调节至7.0，并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺*HCl 0.1g、和抗生素，并调节pH。 
1000X改良痕量金属溶液： 
柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO4*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3100mg，NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分逐一溶解于去离子H2O中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，并以0.22μm的滤器过滤除菌。 
在500L生物反应器中以含有pTrcKudzu yIDI DXS质粒的大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃时从葡萄糖和酵母提取物形成的异戊二烯。在大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基中制备从冷冻瓶中取出的大肠杆菌菌株的接种物。接种物生长至OD0.15(在550nm测定)后，使用20ml接种含有2.5L大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基的生物反应器。在该生物反应器中在30℃生长至OD 1.0，将 2.0L转移至500L生物反应器。 
以指数速率进料酵母提取物(Bio Springer，Montreal，Quebec，Canada)和葡萄糖。在50小时的发酵过程中输送进入生物反应器的葡萄糖和酵母提取物的总量分别是181.2kg和17.6kg。生物反应器中的光密度随时间的变化显示于图49A。按照之前的描述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程而增加(图49B)。在50小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是55.1g，生产的时间进程显示于图49C。 
实施例8：在表达野葛异戊二烯合酶和重组甲羟戊酸途径基因的大肠杆菌中生产异戊二烯。 
I.克隆下部MVA途径 
用于克隆下部甲羟戊酸途径的策略如下。通过PCR从酿酒酵母染色体DNA扩增甲羟戊酸生物合成途径的4个基因：甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)和异戊烯二磷酸异构酶的基因，并各自克隆进入pCR BluntII TOPO质粒(Invitrogen)。在一些情况下，从大肠杆菌染色体DNA扩增idi基因。将引物设计为使得大肠杆菌共有RBS(AGGAGGT(SEQ ID NO：80)或AAGGAGG(SEQ ID NO：81))被插入至5’末端，在起始密码子的上游8bp处，并且在3’末端添加PstI位点。然后将基因逐个克隆进入pTrcHis2B载体，直至组装整个途径。 
来自酿酒酵母S288C的染色体DNA获自ATCC(ATCC 204508D)。根据生产商的说明书，使用PfuTurbo，使用引物MVKF(5’-AGGAGGTAAAAAAACATGTCATTACCGTTCTTAACTTCTGC，SEQ ID NO：21)和MVK-Pst1-R(5’-ATGGCTGCAGGCCTATCGCAAATTAGCTTATGAAGTCCATGGTAAATTCGTG，SEQ ID NO：22)从酿酒酵母的染色体扩增MVK基因。通过在1.2％E-凝胶(Invitrogen)上的电泳鉴定正确大小的PCR产物(1370碱基对)，并克隆进入pZeroBLUNT TOPO。得到的质粒被称作pMVK1。以SacI和Taq1限制性内切核酸酶消化质粒pMVK1，将片段凝胶纯化并连接 进入经SacI和BstBI消化的pTrcHis2B。得到的质粒被称作pTrcMVK1。 
使用下列引物通过PCR扩增甲羟戊酸生物合成途径的第二个基因PMK：PstI-PMK 1R(5’-GAATTCGCCCTTCTGCAGCTACC，SEQ ID NO：23)和BsiHKA I-PMK 1F(5’-CGACTGGTGCACCCTTAAGGAGGAAAAAAACATGTCAG，SEQ ID NO：24)。根据生产商的说明书，使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)进行PCR反应。以PstI和BsiHKI消化正确大小的产物(1387碱基对)，并连接进入经PstI消化的pTrcMVK1。得到的质粒被称作pTrcKK。按照相同的方式克隆MVD和idi基因。使用引物对PstI-MVD 1R(5’-GTGCTGGAATTCGCCCTTCTGCAGC，SEQ ID NO：25)和NsiI-MVD 1F(5’-GTAGATGCATGCAGAATTCGCCCTTAAGGAGG，SEQ ID NO：26)进行PCR以扩增MVD基因，使用引物对PstI-YIDI 1R(5’-CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC，SEQ ID NO：27)和NsiI-YIDI 1F(5’-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC，SEQ ID NO：28)进行PCR以扩增yIDI基因。在一些情况下，使用IPP异构酶基因，来自大肠杆菌的idi。为了从大肠杆菌染色体DNA扩增idi，使用下列引物集合：PstI-CIDI 1R(5’-GTGTGATGGATATCTGCAGAATTCG，SEQ ID NO：29)和NsiI-CIDI 1F(5’-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATG，SEQ ID NO：30)。模板DNA是通过标准方法从大肠杆菌FM5分离的染色体DNA(WO 96/35796和WO 2004/033646，其各自通过引用整体并入本文，尤其是关于核酸分离的内容)。最终的质粒被称作pKKDIy，其是编码酵母idi基因的构建体；或称作pKKDIc，其是编码大肠杆菌idi基因的构建体。将质粒转化进入大肠杆菌宿主BL21以进行随后的分析。在一些情况下，将来自野葛的异戊二烯合酶克隆进入pKKDIy，生产质粒pKKDIyIS。 
还将下部MVA途径克隆进入含有卡那霉素抗生素抗性标志物的pTrc。以限制性内切核酸酶ApaI和PstI消化质粒pTrcKKDIy，在1.2％的琼脂糖E-凝胶上分离5930bp的片段，并根据生产商的说明书，使用 Qiagen凝胶纯化试剂盒纯化。以限制性内切核酸酶ApaI和PstI消化实施例7中描述的质粒pTrcKudzuKan，使用Qiagen凝胶纯化试剂盒从1.2％的E-凝胶上纯化包含载体的3338bp的片段。使用Roche快速连接试剂盒连接3338bp载体片段和5930bp下部MVA途径片段。将连接混合物转化进入大肠杆菌TOP10细胞，转化体在37°生长过夜并在含有卡那霉素(50μg/ml)的LA上选择。通过限制性酶消化验证转化体，将一个冷冻作为贮液。该质粒被称作pTrcKanKKDIy。 
II.将野葛异戊二烯合酶基因克隆进入pTrcKanKKDIy 
通过PCR从实施例1中描述的pTrcKudzu扩增野葛异戊二烯合酶基因，使用引物MCM50 5’-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTTACT(SEQ ID NO：31)和MCM53 5’-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG(SEQ ID NO：32)。将得到的PCR片段克隆进入pCR2.1并转化进入大肠杆菌TOP10。该片段含有野葛异戊二烯合酶的编码序列和含有来自大肠杆菌的RBS的上游区。转化体在37℃过夜温育并在含有羧苄西林(50μg/ml)的LA上选择。通过测序验证片段的正确插入，该菌株被称作MCM93。 
以限制性内切核酸酶NsiI和PstI消化来自菌株MCM93的质粒，以释放含有RBS和野葛异戊二烯合酶的1724bp的插入片段。在1.2％的琼脂糖E-凝胶上分离1724bp片段，并根据生产商的说明书使用Qiagen凝胶纯化试剂盒纯化。以限制性内切核酸酶PstI消化质粒pTrcKanKKDIy，以SAP在37℃处理30分钟，并使用Qiagen PCR清除试剂盒纯化。使用Roche快速连接试剂盒连接质粒和编码野葛异戊二烯合酶的DNA片段。将连接混合物转化进入大肠杆菌TOP10细胞，转化体在37°生长过夜并在含有50μg/ml卡那霉素的LA上选择。通过限制性消化验证正确的转化体，该质粒被称作pTrcKKDyIkISKan(图24和25)。将该质粒转化进入BL21(λDE3)细胞(Invitrogen)。 
III.在表达重组下部甲羟戊酸途径和来自野葛的异戊二烯合酶的大肠杆菌中从甲羟戊酸生产异戊二烯 
在调节至pH 7.1并补充了0.5％葡萄糖和0.5％甲羟戊酸的MOPS培养基(Neidhardt等人，(1974)J.Bacteriology 119：736-747)中培养菌株BL21/pTrcKKDyIkISKan。还使用相同的条件建立了对照培养物，只不过不加入0.5％甲羟戊酸。培养物起始于过夜种子培养物，以1％接种并在培养物达到OD600为0.3至0.5时以500μM IPTG诱导。培养物在30℃以250rpm振荡培养。在诱导后3个小时，使用实施例1中描述的顶空测定法分析异戊二烯的生产。异戊二烯的最大产量是6.67 x 10-4mol/L培养液/OD600/hr，其中L培养液是培养液的体积，并且包括细胞培养基的体积和细胞的体积。未补充甲羟戊酸的对照培养物不产生可测量的异戊二烯。 
IV.克隆上部MVA途径 
从粪肠球菌克隆上部甲羟戊酸生物合成途径，其包含编码三种酶活性的两个基因。mvaE基因编码具有乙酰基-辅酶A乙酰转移酶和3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A(HMG-辅酶A)还原酶(该途径中的第一个和第三个蛋白)的酶活性的蛋白，mvaS基因编码该途径中的第二个酶HMG-辅酶A合酶。使用下列引物从粪肠球菌基因组DNA(ATCC 700802D-5)扩增具有位于其前面的大肠杆菌核糖体结合位点和间隔子的mvaE基因： 
CF 07-60(+)mvaE w/RBS的起始点+ATG起始密码子SacI 
5’-GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG(SEQ ID NO：34) 
CF 07-62(-)将mvaE融合至mvaS，它们中间是RBS 
5’-TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATTGTTTTCTTAAATC(SEQ ID NO：35) 
使用下列引物从粪肠球菌基因组DNA(ATCC 700802D-5)克隆具有位于其前面的来自大肠杆菌的RBS和间隔子的mvaS基因： 
CF 07-61(+)将mvaE融合至mvaS，它们中间是RBS 
5’-GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGG ATTGATAAA(SEQ ID NO：36) 
CF 07-102(-)mvaS基因的末端BglII 
5’-GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQ ID NO：37) 
使用下列引物通过PCR将PCR片段融合在一起： 
CF 07-60(+)mvaE w/RBS的起始点+ATG起始密码子SacI 
5’-GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG(SEQ ID NO：34) 
CF 07-102(-)mvaS基因的末端BglII 
5’-GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQ ID NO：37) 
使用Qiagen试剂盒纯化融合PCR片段并以限制性酶SacI和BglII消化。使用Qiagen试剂盒对该消化的DNA片段进行凝胶纯化并连接进入已经SacI和BglII消化以及凝胶纯化的商售载体pTrcHis2A。 
将连接混合物转化进入大肠杆菌Top 10细胞，在LA+50μg/ml羧苄西林平板上选择菌落。总共选择了6个菌落，在LB+50μg/ml羧苄西林中生长过夜，并使用Qiagen试剂盒分离质粒。以SacI和BglII消化质粒以检查插入片段，使用下列引物对一个正确质粒进行测序： 
CF 07-58(+)mvaE基因的起始点 
5’-ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC(SEQ ID NO：38) 
CF 07-59(-)mvaE基因的末端 
5’-ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC(SEQ ID NO：39) 
CF 07-82(+)mvaS基因的起始点 
5’-ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG(SEQ ID NO：40) 
CF 07-83(-)mvaS基因的末端 
5’-TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQ ID NO：41) 
CF 07-86(+)mvaE中的序列 
5’-GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC(SEQ ID NO：42) 
CF 07-87(+)mvaE中的序列 
5’-TTGCCAATCATATGATTGAAAATC(SEQ ID NO：43) 
CF 07-88(+)mvaE中的序列 
5’-GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG(SEQ ID NO：44) 
CF 07-89(+)序列mvaS 
5’-GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC(SEQ ID NO：45) 
通过测序证明被称作pTrcHis2AUpperPathway#1的质粒是正确的，并转化进入商售大肠杆菌菌株BL21。在LA+50μg/ml羧苄西林上进行选择。选择了两个转化体并在LB+50μg/ml羧苄西林中生长直至它们达到OD600为1.5。将两个菌株在-80℃在存在甘油的情况下冷冻于瓶中。BL21分离体#1中的pTrcHis2AUpperPathway#1的菌株被称作CF 449，BL21分离体#2中的pTrcHis2AUpperPathway#1的菌株被称作CF 450。当分析时，发现两个克隆的行为是相同的。 
V.将上部MVA途径克隆进入pCL1920 
以限制性内切核酸酶消化质粒pTrcHis2AUpperPathway以释放包含pTrc-mvaE-mvaS-(His标签)-终止子的片段。在该片段中，his-标签不被翻译。使用Qiagen凝胶纯化试剂盒从1.2％的E-凝胶纯化该平末端化的4.5kbp的片段。通过以限制性内切核酸酶PvuII消化载体、以SAP处理并使用Qiagen凝胶纯化试剂盒从1.2％的E-凝胶进行凝胶纯化而从pCL1920制备去磷酸化的平末端化的4.2kbp的片段。使用Roche快速连接试剂盒连接这两个片段并转化进入TOP10化学感受态细胞。在含有壮观霉素(50μg/ml)的LA上选择转化体。通过PCR就插入片段的存在进行筛选，从而鉴定正确的菌落。该质粒被称作pCL PtrcUpperPathway(图26和27)。 
VI.表达组合的上部和下部甲羟戊酸途径的菌株 
为了获得具有完整的甲羟戊酸途径+野葛异戊二烯合酶的菌株，将质粒pTrcKKDyIkISkan和pCLpTrcUpperPathway都转化进入BL21(λDE3)感受态细胞(Invitrogen)，在含有卡那霉素(50μg/ml)和壮观霉素(50μg/ml)的LA上选择转化体。通过质粒制备检查转化体以确保两个质粒都保持在 宿主中。该菌株被称作MCM127。 
VII.在大肠杆菌/pUpperpathway中从葡萄糖生产甲羟戊酸 
将BL21/pTrcHis2A-mvaE/mvaS或FM5/p pTrcHis2A-mvaE/mvaS的单一菌落接种至LB+羧苄西林(100μg/ml)，并在37℃以200rpm振荡过夜生长。将这些培养物在250ml的培养瓶中的50ml培养基中稀释至OD600为0.1。培养基是：TM3+1％或2％葡萄糖+羧苄西林(100μg/ml)或TM3+1％葡萄糖+水解的豆油+羧苄西林(100μg/ml)或TM3+生物质(制备的甘蔗渣、玉米秸秆或柳枝稷)。培养物在30℃以200rpm振荡生长大约2-3小时，直至达到OD600为0.4。在该点，通过加入IPTG(400μM)诱导从mvaE mvaS构建体的表达。再将培养物温育20或40小时，在诱导后以2小时至6小时的间隔取样，然后视需要在24、36和48小时取样。通过取出1ml培养物进行取样，测定OD600，在微量离心机中使细胞沉淀，取上清并分析其甲羟戊酸。 
以TM3培养基和2％的葡萄糖作为细胞培养基，具有编码粪肠球菌AA-辅酶A硫解酶、HMG-辅酶A合酶、和HMG-辅酶A还原酶多肽的大肠杆菌细胞的14升发酵生产了22g甲羟戊酸。以LB培养基和1％的葡萄糖作为细胞培养基，这些细胞的摇瓶生产2-4g的甲羟戊酸/升。在这些菌株中甲羟戊酸的产生表明MVA途径在大肠杆菌中是有功能的。 
VIII.从含有上部和下部MVA途径+野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌BL21生产异戊二烯 
通过转化进入如上所述的包含上部和下部MVA途径和野葛异戊二烯合酶基因的质粒与如实施例7描述的包含idi、dxs、和dxr及异戊二烯合酶基因的质粒的多种组合而产生下列菌株。使用的宿主细胞是化学感受态BL21(λDE3)，通过标准方法进行转化。在含有卡那霉素(50μg/ml)或卡那霉素+壮观霉素(二者浓度都是50μg/ml)的L琼脂上选择转化体。平板在37℃生长。得到的菌株命名如下： 
卡那霉素+壮观霉素(各50μg/ml)上生长 
MCM127-pCL Upper MVA+pTrcKKDyIkIS(kan)，在BL21(λDE3)中 
MCM131-pCL1920+pTrcKKDyIkIS(kan)，在BL21(λDE3)中 
MCM125-pCL Upper MVA+pTrcHis2B(kan)，在BL21(λDE3)中 
在卡那霉素(50μg/ml)上生长 
MCM64-pTrcKudzu yIDI DXS(kan)，在BL21(λDE3)中 
MCM50-pTrcKudzu(kan)，在BL21(λDE3)中 
MCM123-pTrcKudzu yIDI DXS DXR(kan)，在BL21(λDE3)中 
上述菌株从冷冻贮液中划线至LA+合适的抗生素，并在37℃过夜生长。来自每个平板的单一菌落用于接种摇瓶(25ml LB+合适的抗生素)。在22℃在200rpm振荡下过夜温育该瓶。次晨，将瓶转移至37℃的温育箱并在200rpm振荡下再生长4.5小时。离心25ml的培养物以使细胞沉淀，将细胞重悬于5ml LB+合适的抗生素。然后将培养物在25ml LB+％葡萄糖+合适的抗生素中稀释至OD600为0.1。每个菌株建立2个瓶，一组以IPTG(800μM)诱导，第二组不诱导。在37℃在250rpm振荡下温育培养物。在1.50小时后(取样时间点1后即时)诱导一组培养物。在每个取样时间点，测定OD600并按照实施例1的描述测定异戊二烯的量。结果显示于表3。产生的异戊二烯的量表示为特定菌株的峰值产量时的量。 
表3.大肠杆菌菌株中异戊二烯的生产 
  菌株 异戊二烯(μg/L发酵液/hr/OD
  MCM50 23.8
  MCM64 289
  MCM125 ND
  MCM131 痕量
  MCM127 874
ND：未检测 
痕量：存在峰值但不可汇总。 
IX.甲羟戊酸的分析 
甲羟戊酸内酯(1.0g，7.7mmol)(CAS#503-48-0)由Sigma-Aldrich(WI， USA)以溶解于水中的糖浆(7.7mL)提供，以氢氧化钾(7.7mmol)处理以生产甲羟戊酸的钾盐。通过1H NMR分析确认向甲羟戊酸的转化。通过在14,000rpm离心5分钟除掉细胞、然后将300μl等份的上清液加入至900μl水中来制备用于HPLC分析的样品。然后加入高氯酸(36μl的70％溶液)，然后混合并在冰上冷却5分钟。然后再次离心样品(14,000rpm，5分钟)，将上清液转移至HPLC。通过相同的方式制备甲羟戊酸标准物(20、10、5、1和0.5g/L)。通过HPLC分析甲羟戊酸(20uL注入体积)：使用BioRadAminex 87-H+柱(300mm×7.0mm)，以5mM硫酸以0.6mL/分钟洗脱，并检测折射率(RI)。在这些条件下，甲羟戊酸以内酯的形式在18.5分钟时洗脱。 
X.从含有上部MVA途径+野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌BL21生产异戊二烯 
使用表达甲羟戊酸途径多肽和野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌的15升规模的发酵从补料分批培养物中的细胞生产异戊二烯。该实验证明在限葡萄糖条件下生长的细胞生产2.2g/L的异戊二烯。 
培养基配方(每升发酵培养基)： 
使用下列成分/升发酵培养基制备培养基：K2HPO47.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，和1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于去离子H2O中。该溶液经高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺*HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。 
1000X改良痕量金属溶液： 
使用下列成分制备1000X改良痕量金属溶液：柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO4*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3100mg，和NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分依次溶解于去离子H2O水中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，以0.22μm的滤器过滤除菌。 
在15L生物反应器中以含有pCL PtrcUpperPathway(图26)和pTrcKKDyIkIS质粒的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以 监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃从葡萄糖形成的异戊二烯。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)并在37℃温育。将单一菌落接种至大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至5L生物反应器。 
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。在54小时的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是3.7kg。通过加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)进行诱导。当在550nm时的光密度(OD550)达到10的时候，使IPTG的浓度是25μM。当OD550达到190时，IPTG的浓度升高至50μM。在发酵38小时的时候，IPTG的浓度升高至100μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图54。按照本文的描述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程达到最终的值2.2g/L(图55)。在54小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是15.9g，生产的时间进程显示于图56。 
XI.以15L的规模在补料分批培养物中生长且表达甲羟戊酸途径的基因的大肠杆菌发酵生产异戊二烯 
使用表达甲羟戊酸途径多肽和野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌的15升规模的发酵从补料分批培养物中的细胞生产异戊二烯。该实验证明在限葡萄糖条件下生长的细胞生产3.0g/L的异戊二烯。 
培养基配方(每升发酵培养基)： 
使用下列成分/升发酵培养基制备培养基：K2HPO47.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，和1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于去离子H2O中。该溶液经高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺*HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。 
1000X改良痕量金属溶液： 
使用下列成分制备1000X改良痕量金属溶液：柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO *7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3100mg，和NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分依次溶解于去离子H2O水中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，以0.22μm的滤器过滤除菌。 
在15L生物反应器中以含有pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃从葡萄糖形成的异戊二烯。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)并在37℃温育。将单一菌落接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至5L生物反应器。 
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。在59小时的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是2.2kg。通过加入IPTG进行诱导。当在550nm时的光密度(OD550)达到10的时候，使IPTG的浓度是25μM。当OD550达到190时，IPTG的浓度升高至50μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图93。按照本文的描述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程达到最终的值3.0g/L(图94)。在59小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是22.8g，生产的时间进程显示于图95。用于在发酵过程中生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是2.2％。从葡萄糖生产的异戊二烯的重量百分比产率是1.0％。 
XII.以15L的规模在补料分批培养物中生长且表达甲羟戊酸途径的基因的大肠杆菌发酵生产异戊二烯 
使用表达甲羟戊酸途径多肽、葛根异戊二烯合酶、和野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌的15升规模的发酵从补料分批培养物中的细胞生产异戊二烯。该实验证明在限葡萄糖条件下生长的细胞生产3.3g/L的异戊二烯。 
i)pCLPtrcUpperPathwayHGS2的构建 
使用引物NsiI-RBS-HGS F(CTTGATGCATCCTGCATTCGCCCTTAGGAGG，SEQ ID NO：88)和pTrcR(CCAGGCAAATTCTGTTTTATCAG，SEQ ID NO：89)，使用pTrcKKDyIkIS作为模板，通过PCR从葛根扩增编码异戊二烯合酶的基 因。以NsiI和PstI对由此获得的PCR产物进行限制性消化，并进行凝胶纯化。以PstI限制性消化质粒pCL PtrcUpperPathway，并根据生产商的说明书，使用rAPid碱性磷酸酶(Roche)进行去磷酸化。 
将这些DNA片段连接在一起并将连接反应物转化进入大肠杆菌Top10化学感受态细胞(Invitrogen)，铺板于含有壮观霉素(50μg/ml)的L琼脂上并在37℃过夜温育。使用Qiaquick旋转微量制备试剂盒从6个克隆制备质粒DNA。以限制性酶EcoRV和MluI消化质粒DNA以鉴定具有正确方向的插入片段的克隆(即基因与pTrc启动子的方向相同)。 
得到的正确的质粒被称作pCLPtrcUpperPathwayHGS2。使用本文描述的顶空测定法测定该质粒，发现其在大肠杆菌Top10中生产异戊二烯，由此验证了基因的功能性。将该质粒转化进入含有pTrcKKDyIkIS的BL21(LDE3)中以产生菌株BL21/pCLPtrcUpperPathwayHGS2-pTrcKKDyIkIS。该菌株相对于BL21/pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS菌株(实施例8，第XI部分)具有额外的异戊二烯合酶拷贝。该菌株相对于实施例8第XI部分中使用的BL21/pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS菌株还具有增加的HMGS表达和活性。 
ii)以15L的规模在补料分批培养物中生长且表达pCLPtrcUpperPathwayHGS2-pTrcKKDyIkIS的大肠杆菌发酵生产异戊二烯 
培养基配方(每升发酵培养基)： 
使用下列成分/升发酵培养基制备培养基：K2HPO47.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，和1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于去离子H2O中。该溶液经高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺*HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。 
1000X改良痕量金属溶液： 
使用下列成分制备1000X改良痕量金属溶液：柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO4 *7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3100mg，和NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分依次溶解于去离子H2O水中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，以0.22μm的滤器过滤除菌。 
在15L生物反应器中以含有pCLPtrcUpperPathwayHGS2和pTrc KKDyIkIS质粒的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃从葡萄糖形成的异戊二烯。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)并在37℃温育。将单一菌落接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至5L生物反应器。 
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。在58小时的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是2.1kg。通过加入IPTG进行诱导。当在550nm时的光密度(OD550)达到9的时候，使IPTG的浓度是25μM。当OD550达到170时，IPTG的浓度升高至50μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图104。按照本文的描述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程提高至最终的值3.3g/L(图105)。在58小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是24.5g，生产的时间进程显示于图106。用于在发酵过程中生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是2.5％。从葡萄糖生产的异戊二烯的重量百分比产率是1.2％。分析显示：相对于表达CL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的BL21，异戊二烯合酶的活性增加了大约3-4倍(数据未显示)。 
XIII.大肠杆菌中下部甲羟戊酸途径的染色体整合 
含有甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、和IPP异构酶的合成操纵子被整合进入大肠杆菌的染色体。如果需要，可以通过在操纵子的5’整合不同的启动子来改变表达。 
表4列出了用于该实验的引物。 
表4.引物 
i)靶载体构建 
选择attTn7位点用于整合。通过PCR从MG1655细胞扩增同源性上 游(attTn7 up)(引物MCM78和MCM79)和下游(attTn7 down)(引物MCM88和MCM89)的区域。将50uL的反应物(1uL 10uM引物，3uL ddH2O，45uL Invitrogen Platinum PCR Supermix High Fidelity)和刮下的MG1655菌落在94℃变性2分钟，进行25个循环的“94℃2分钟，50℃30秒，68℃1分钟”，在72℃延伸7分钟，并冷却至4℃。根据生产商的说明书，将得到的该DNA克隆进入pCR2.1(Invitrogen)，得到质粒MCM278(attTn7 up)和MCM252(attTn7 down)。从MCM252消化并凝胶纯化的832bp ApaI-PvuI片段克隆进入ApaI-PvuI消化并经凝胶纯化的质粒pR6K，产生质粒MCM276。从MCM278消化并凝胶纯化的825bp PstI-NotI片段克隆进入PstI-NotI消化并经凝胶纯化的MCM276，产生质粒MCM281。 
ii)下部途径和启动子的克隆 
根据生产商的说明书，使用Roche Expand Long PCR System，使用引物MCM104和MCM105，从pTrcKKDyIkIS扩增MVK-PMK-MVD-IDI基因。以NotI和ApaI消化该产物并克隆进入已经NotI和ApaI消化的并经凝胶纯化的MCM281。使用Stratagene Pfu Ultra II，使用引物MCM120和MCM127从GeneBridges FRT-gb2-Cm-FRT模板扩增CMR盒。使用四个50μL PCR反应物(包含1μL～10ng/μL模板、1μL每种引物、1.25μL 10mM dNTP、5μL 10X缓冲液、1μL酶、和39.75μL ddH2O)进行下列PCR程序：95℃变性4分钟；5个循环的“95℃20秒，55℃20秒，72℃2分钟”；25个循环的“95℃20秒，58℃20秒，72℃2分钟”；72℃，10分钟；然后冷却至4℃。将反应物合并，在Qiagen PCR清除柱上纯化，并用于电穿孔经水洗涤的包含质粒MCM296的Pir1细胞。在2mM的杯中在2.5V和200ohm进行电穿孔。在30℃在LB中恢复电穿孔反应物3小时。在含有CMP5、Kan50的LA上选择转化体MCM330(图107和108A-108C)。 
iii)整合进入大肠杆菌染色体 
以SnaBI消化来自MCM330的微量制备的DNA(Qiaquick旋转试剂盒)并用于电穿孔BL21(DE3)(Novagen)或含有GeneBridges质粒pRedET  Carb的MG1655。细胞在30℃生长至～OD1，然后在37℃以0.4％L-阿拉伯糖诱导1.5小时。在4℃ddH2O中将这些细胞洗涤3次，然后以2μL DNA进行电穿孔。在含有氯霉素(5μg/ml)的L琼脂上选择整合子，然后确认不在L琼脂+卡那霉素(50μg/ml)上生长。冷冻BL21整合子MCM331和MG1655整合子MCM333。 
iv)构建编码野葛异戊二烯合酶的pET24D-Kudzu 
将野葛异戊二烯合酶基因从pCR2.1载体(Invitrogen)亚克隆进入pET24d载体(Novagen)。具体地，使用引物MCM50 5’-GATCATGCAT TCGCCCTTAG GAGGTAAAAA AACATGTGTG CGACCTCTTC TCAATTTACT(SEQ ID NO：99)和MCM53 5’-CGGTCGACGG ATCCCTGCAG TTAGACATAC ATCAGCTG(SEQ ID NO：100)从pTrcKudzu模板DNA扩增野葛异戊二烯合酶基因。使用Taq DNA聚合酶(Invitrogen)进行PCR反应，将得到的PCR产物克隆进入pCR2.1-TOPO TA克隆载体(Invitrogen)，并转化进入大肠杆菌Top10化学感受态细胞(Invitrogen)。将转化体铺板于含有羧苄西林(50μg/ml)的L琼脂上，并在37℃过夜温育。以单一转化体接种含有50μg/ml羧苄西林的5ml Luria Broth培养物，并在37℃过夜生长。通过测序分离自1ml液体培养基(Luria Broth)的质粒DNA就正确的插入片段筛选了5个菌落，使用QIAprep旋转微量制备试剂盒(Qiagen)纯化。得到的质粒被称作MCM93，其含在pCR2.1骨架中的野葛异戊二烯合酶编码序列。 
通过以PciI和BamH1(Roche)进行限制性内切核酸酶消化而切下野葛编码序列，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)凝胶纯化。以NcoI和BamHI(Roche)消化pET24d载体DNA，以虾碱性磷酸酶(Roche)处理，并使用QIAprep旋转微量制备试剂盒(Qiagen)纯化。使用快速DNA连接试剂盒(Roche)，以片段∶载体＝5∶1的比例，以20μl的总体积，将野葛异戊二烯合酶片段连接进入经NcoI/BamH1消化的pET24d。将连接混合物的一部分(5μl)转化进入大肠杆菌Top 10化学感受态细胞，并铺板于含有卡那霉素(50μg/ml)的L琼脂上。通过测序验证正确的转化体并转化进入化学感受态BL21(λDE3)pLysS细胞(Novagen)。在37℃在含有卡那霉素(50 μg/ml)的L琼脂上过夜生长后，选择单一的菌落。图109中显示了得到的质粒的图谱，其被称作pET24D-Kudzu。pET24D-Kudzu的序列(SEQ ID NO：101)显示于图110A和110B。使用顶空测定法确认异戊二烯合酶活性。 
v)生产菌株 
以质粒pCLPtrcupperpathway和pTrcKudzu或pETKudzu共转化菌株MCM331和MCM333，得到如表5所示的菌株。 
表5.生产菌株 
vi)以15L的规模在补料分批培养物中生长且表达甲羟戊酸途径的大肠杆菌发酵生产异戊二烯 
培养基配方(每升发酵培养基)： 
使用下列成分/升发酵培养基制备培养基：K2HPO47.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，和1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于去离子H2O中。该溶液经高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺*HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。 
1000X改良痕量金属溶液： 
使用下列成分制备1000X改良痕量金属溶液：柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO4*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3100mg，和NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分依次溶解于去离子H2O水中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，以0.22μm的滤器过滤除菌。 
在15L的生物反应器中以含有如上所述的gi1.2整合的下部MVA途径和pCL PtrcUpperMVA和pTrcKudzu质粒的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进 行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃从葡萄糖形成的异戊二烯。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)上并在37℃温育。将单一菌落接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至5L的生物反应器。 
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。在57小时的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是3.9kg。通过加入IPTG进行诱导。当二氧化碳释放速率达到100mmol/L/hr的时候，使IPTG的浓度是100μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图111A。按照本文的描述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程提高至最终的值1.6g/L(图111B)。发酵过程中异戊二烯的比生产率显示于图111C，峰值为1.2mg/OD/hr。在57小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是16.2g。用于在发酵过程中生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是0.9％。从葡萄糖生产的异戊二烯的重量百分率产率是0.4％。 
XIV.使用甘油作为碳源从含有野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌BL21生产异戊二烯 
使用表达野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌的15升规模的发酵从补料分批培养物中进料了甘油的细胞生产异戊二烯。该实验证明在存在甘油(无葡萄糖)的条件下生长的细胞生产2.2mg/L的异戊二烯。 
培养基配方(每升发酵培养基)： 
使用下列成分/升发酵培养基制备培养基：K2HPO47.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g、和1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于diH2O中。该溶液经高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入甘油5.1g、硫胺*HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。 
1000X改良痕量金属溶液： 
使用下列成分/升发酵培养基制备培养基：柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3100mg，和NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分依次溶解于diH2O水中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，以0.22μm的滤器无菌过滤。 
在15L的生物反应器中以含有pTrcKudzu质粒的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度35℃从甘油形成的异戊二烯。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线至LA培养基琼脂平板(含有抗生素)上并在37℃温育。将单一菌落接种至大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基并在35℃生长。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用600mL接种至7.5L的生物反应器。 
以指数速率进料甘油直至细胞达到550nm下的光密度(OD550)为153。在36小时的发酵过程中输送到生物反应器中的甘油的总量是1.7kg。除了接种物中的葡萄糖，不再向生物反应器中添加葡萄糖。通过加入IPTG进行诱导。当OD550达到50的时候，使IPTG的浓度是20μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图57。按照本文的描述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程提高至最终的值2.2mg/L(图58)。在54小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是20.9mg，生产的时间进程显示于图59。 
XV.使用转化糖作为碳源在15L规模的补料分批培养物中生长且表达甲羟戊酸途径的基因的大肠杆菌发酵生产异戊二烯 
使用表达甲羟戊酸途径多肽和野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌的15升规模的发酵从补料分批培养物中进料了转化糖的细胞生产异戊二烯。该实验证明在存在转化糖的条件下生长的细胞生产2.4g/L的异戊二烯。 
培养基配方(每升发酵培养基)： 
使用下列成分/升发酵培养基制备培养基：K2HPO47.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，和1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于diH2O中。该溶液经高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入转化糖10g、硫胺*HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。 
1000X改良痕量金属溶液： 
使用下列成分制备1000X改良痕量金属溶液：柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3100mg，和NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分依次溶解于DiH2O水中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，以0.22μm的滤器无菌过滤。 
在15L的生物反应器中以含有pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃从转化糖形成的异戊二烯。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)并在37℃温育。将单一菌落接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至5L的生物反应器。 
以指数速率进料转化糖直至细胞达到稳定期。此后，降低转化糖进料以满足代谢需求。在44小时的发酵过程中输送到生物反应器中的转化糖的总量是2.4kg。通过加入IPTG进行诱导。当550nm下的光密度(OD550)达到9的时候，使IPTG的浓度是25uM。当OD550达到200时，IPTG的浓度升高至50μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图96。按照本文的描述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程提高至最终的值2.4g/L(图97)。在44小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是18.4g，生产的时间进程显示于图98。用于在发酵过程中生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是1.7％。从葡萄糖生产的异戊二烯的重量百分率产率是0.8％。 
实施例9.构建上部和下部MVA途径以整合进入枯草芽孢杆菌 
I.在枯草芽孢杆菌中构建上部MVA途径 
将来自粪肠球菌的上部途径整合进入枯草芽孢杆菌，处于aprE启动子的控制下。上部途径由两个基因组成：mvaE，其编码AACT和HMGR；以及mvaS，其编码HMGS。使这两个基因融合在一起，其间有终止密码子，在mvaS前面有RBS位点，并且它们处于aprE启动子的控制下。终止子位于mvaE基因之后。将氯霉素抗性标志物克隆于mvaE基因之后， 使用同源性的侧接区通过双交叉将构建体整合于aprE基因座。 
通过PCR扩增四个DNA片段，使得它们含有悬突，这将允许它们通过PCR反应而融合在一起。根据生产商的说明书，使用Herculase聚合酶进行PCR扩增。 
1.PaprE 
CF 07-134(+)aprE启动子PstI的起始点 
5’-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC(SEQ ID NO：82) 
CF 07-94(-)将PaprE融合至mvaE 
5’-CAATAATAACTACTGTTTTCACTCTTTACCCTCTCCTTTTAA(SEQ ID NO：83) 
模板：枯草芽孢杆菌染色体DNA 
2.mvaE 
CF 07-93(+)将mvaE融合至aprE启动子(GTG起始密码子) 
5’-TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG(SEQ ID NO：84) 
CF 07-62(-)将mvaE融合至mvaS，它们中间有RBS 
5’-TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATTGTTTTCTTAAATC(SEQ ID NO：35) 
模板：粪肠球菌染色体DNA(来自ATCC) 
3.mvaS 
CF 07-61(+)将mvaE融合至mvaS，它们中间有RBS 
5’-GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAA(SEQ ID NO：36) 
CF 07-124(-)将mvaS的末端融合至终止子 
5’- CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQ ID NO：85) 
模板：粪肠球菌染色体DNA 
4.解淀粉芽孢杆菌碱性丝氨酸蛋白酶终止子 
CF 07-123(+)将mvaS的末端融合至终止子 
5’-ACCGTTCGTTCTTATCGAAACTAAAAAAAACCGGCCTTGGCCCCG(SEQ ID NO：86) 
CF 07-46(-)解淀粉芽孢杆菌的末端终止子BamHI 
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQ ID NO：63) 
模板：解淀粉芽孢杆菌染色体DNA 
PCR融合反应 
5.将mvaE融合至mvaS 
CF 07-93(+)将mvaE融合至aprE启动子(GTG起始密码子) 
5’-TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG(SEQ ID NO：84) 
CF 07-124(-)将mvaS的末端融合至终止子 
5’-CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQ ID NO：85) 
模板：来自上述的#2和3 
6.将mvaE-mvaS融合至aprE启动子 
CF 07-134(+)aprE启动子PstI的起始点 
5’-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC(SEQ ID NO：82) 
CF 07-124(-)将mvaS的末端融合至终止子 
5’-CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGG T(SEQ ID NO：85) 
模板：来自上述的#1和#4 
7.将PaprE-mvaE-mvaS融合至终止子 
CF 07-134(+)aprE启动子PstI的起始点 
5’-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC(SEQ ID NO：82) 
CF 07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子BamHI的末端 
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQ ID NO：63) 
模板：#4和#6 
以限制性核酸内切酶PstI/BamHI消化产物并连接进入经PstI/BamHI消化的pJM102(Perego，M.1993.Integrational vectors for genetic manipulation in Bacillus subtilis，p.615-624.In A.L.Sonenshein，J.A.Hoch，和R.Losick(ed.)，Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria：biochemistry，physiology，and molecular genetics.American Society for Microbiology，Washington，D.C.)。将连接物转化进入大肠杆菌TOP 10化学感受态细胞，在含有羧苄西林(50μg/ml)的LA上选择转化子。通过测序鉴别正确的质粒并将其命名为pJMUpperpathway2(图50和51)。将纯化的质粒DNA转化进入枯草芽孢杆菌aprEnprE Pxyl-comK，在含有氯霉素(5μg/ml)的L琼脂上选择转化子。选择正确的菌落并依次铺板于含有10、15、和25μg/ml氯霉素的L琼脂上，以扩大含有上部途径的盒的拷贝数。 
通过在含有1％葡萄糖和1％的LB中生长来测试得到的菌株的甲羟戊酸的生产。通过GC分析培养物中甲羟戊酸的生产。 
随后该菌株用作宿主以整合下部甲羟戊酸途径。 
使用下列引物来测序以上各个构建体。 
测序引物： 
CF 07-134(+)aprE启动子PstI的起始点 
5’-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC(SEQ ID NO：82) 
CF 07-58(+)mvaE基因的起始点 
5’-ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC(SEQ ID NO：39) 
CF 07-59(-)mvaE基因的末端 
5’-ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC(SEQ ID NO：39) 
CF 07-82(+)mvaS基因的起始点 
5’-ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG(SEQ ID NO：40) 
CF 07-83(-)mvaS基因的末端 
5’-TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQ ID NO：41) 
CF 07-86(+)mvaE中的序列 
5’-GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC(SEQ ID NO：42) 
CF 07-87(+)mvaE中的序列 
5’-TTGCCAATCATATGATTGAAAATC(SEQ ID NO：43) 
CF 07-88(+)mvaE中的序列 
5’-GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG(SEQ ID NO：44) 
CF 07-89(+)mvaS中的序列 
5’-GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC(SEQ ID NO：45) 
在含有浓度为5μg/ml的氯霉素的LA上选择转化子。通过测序确认了一个菌落具有正确的整合，将其铺板于LA，其中经数天逐渐增大LA中氯霉素的浓度，直至达到最终水平25μg/ml。这导致包含目标基因的盒的扩增。得到的菌株被称作CF 455：pJMupperpathway#1X枯草芽孢杆菌aprEnprE Pxyl comK(经扩增以在含有25μg/ml氯霉素的LA上生长)。 
II.在枯草芽孢杆菌中构建下部MVA途径 
由基因mvk1、pmk、mpd和idi组成的下部MVA途径组合于盒中，所述盒由下列组成：来自枯草芽孢杆菌染色体的nprE区域(整合位点)的侧接DNA区域，aprE启动子，和壮观霉素抗性标志物(见图28和29)。该盒由DNA2.0合成，并整合进入含有在aprE基因座整合的上部MVA途径的枯草芽孢杆菌的染色体中。从实施例4描述的复制质粒表达野葛异戊二烯合酶基因并转化进入整合了上部和下部途径的菌株中。 
实施例10：示例性的异戊二烯组合物及其制备方法 
I.含有异戊二烯的发酵废气的成分分析 
以含有两个质粒(pCL upperMev；pTrcKKDyIkIS，编码用于类异戊二烯前体生物合成的完整甲羟戊酸途径、来自酵母的异戊烯焦磷酸异构酶、和来自野葛的异戊二烯合酶)的重组大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行14L规模的发酵。在大约峰值异戊二烯生产率的时间(27.9小时的已发酵时间，“EFT”)，将来自14L槽的发酵废气收集于20mL顶空瓶中，通过顶空GC/MS分析挥发性成分。 
使用配有Agilent HP-5MS GC/MS柱(30m x 250μm；膜厚0.25μm)的Agilent 6890 GC/MS系统进行顶空分析。使用combiPAL自动注射器从20mL顶空瓶中取出500uL等份试样的样品。GC/MS法使用氦作为载气，流速为1ml/分钟。注入口维持在250℃，分流比为50∶1。最初将烤箱温度维持在37℃持续2分钟，然后以25℃/分钟的速率升高至237℃，总共的方法时间为10分钟。Agilent 5793N质量选择检测器从m/z 29至m/z 300扫描。该系统的检测限值是大约0.1μg/L气体或大约0.1ppm。如果需要，可以使用具有更低的检测限值的更灵敏的设备。 
废气由下列组成：99.925％(v/v)的永久气体(N2，CO2和O2)，大约0.075％的异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)(～750ppmv，2100μg/L)和痕量(＜50ppmv)的乙醇、丙酮、和两种C5异戊二烯基醇。没有测定水蒸气的量，但是估计其等于0℃时的平衡蒸气压。通过积分GC/MS色谱图中峰下的面积来确定挥发性有机级份的组成(图86A和86B)，并列于表6中。使用标准方法，通过乙醇和丙酮标准物的校正曲线将GC面积转化为气相的浓度(单位为ug/L)。 
表6.发酵废气中的挥发性有机成分的组成。分析使用表达异源甲羟戊酸途径、来自酵母的异戊烯焦磷酸异构酶、和来自野葛的异戊二烯合酶的大肠杆菌BL21(DE3)菌株发酵的27.9小时的时间点时的废气。 
  化合物   RT(分钟)   GC面积   面积％ 浓度(μg/L)
  乙醇   1.669   239005   0.84 62+/-6
  丙酮   1.703   288352   1.02 42+/-4
  异戊二烯(2-甲基-1，3-丁   1.829   27764544   97.81 2000+/-200
  二烯)        
  3-甲基-3-丁烯-1-醇   3.493   35060   0.12 ＜10
  3-甲基-2-丁烯-1-醇   4.116   58153   0.20 ＜10
II.在重组大肠杆菌菌株发酵过程中与异戊二烯共同生产的痕量挥发性有机化合物(VOC)的测定 
以含有编码用于类异戊二烯前体生物合成的完整甲羟戊酸途径、来自酵母的异戊烯焦磷酸异构酶、和来自野葛的异戊二烯合酶的两个质粒(pCL upperMev；pTrcKKDyIkIS)的重组大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行14L规模的发酵。 
使发酵废气通过冷却的顶空瓶以浓缩并鉴别痕量挥发性有机成分。以1L/分钟的速率对来自该发酵的废气取样，持续10分钟，通过配有石英毛(2g)的20mL的顶空瓶并以干冰冷却至-78℃。使用洁净的瓶盖重新将瓶盖上盖，并使用实施例10中第I部分中描述的条件通过顶空GC/MS分析捕获的VOC。图87A-87D中观察到的化合物的比率是发酵废气中总体水平、-78℃时的相对蒸气压、和质谱仪的检测应答的组合。例如，相对于氧化的挥发物(例如丙酮和乙醇)的低水平的异戊二烯与该物质的高挥发性有关，从而其在-78℃时不在顶空瓶中积累。 
这些化合物中的很多化合物的存在对于源自生物来源的异戊二烯组合物是特异的。结果显示于图87A-87D并总结于表7A和7B。 
表7A：在-78℃冷捕集后，由大肠杆菌BL21(DE3)(pCL upperMev；pTrcKKDyIkIS)生产的废气中存在的痕量挥发物 
  化合物   RT(分钟)   GC面积1   面积％2   比率％3
  香茅醛   7.756   208092   0.251   2.08
  2，3-环庚烯醇吡啶   8.98   1119947   1.349   11.18
1 GC面积是对应于所列的化合物的峰下的未校正的面积。 
2 面积％是以相对于所有化合物的总的峰面积表示为％的峰面积。 
3 比率％是相对于2-甲基-1，3-丁二烯的峰面积表示为％的峰面积。 
表7B：在-196℃冷捕集后，由大肠杆菌BL21(DE3)(pCL upperMev；pTrcKKDyIkIS)生产的废气中存在的痕量挥发物 
  化合物   RT(分钟)   GC面积1   面积％2   比率％3
  乙醛   1.54   1655710   0.276   0.33
  甲硫醇   1.584   173620   0.029   0.03
  乙醇   1.631   10259680   1.707   2.03
  丙酮   1.722   73089100   12.164   14.43
  2-甲基-1，3-丁二烯   1.771   506349429   84.269   100.00
  乙酸甲酯   1.852   320112   0.053   0.06
  1-丙醇   1.983   156752   0.026   0.03
  二乙酰   2.148   67635   0.011   0.01
  2-丁酮   2.216   254364   0.042   0.05
  2-甲基-3-丁烯-2-醇   2.312   684708   0.114   0.14
  乙酸乙酯   2.345   2226391   0.371   0.44
  2-甲基-1-丙醇   2.451   187719   0.031   0.04
  3-甲基-1-丁醛   2.696   115723   0.019   0.02
  3-甲基-2-丁酮   2.751   116861   0.019   0.02
  1-丁醇   2.792   54555   0.009   0.01
  2-戊酮   3.034   66520   0.011   0.01
  3-甲基-3-丁烯-1-醇   3.516   1123520   0.187   0.22
  3-甲基-1-丁醇   3.561   572836   0.095   0.11
  异丁酸乙酯   3.861   142056   0.024   0.03
1 GC面积是对应于所列的化合物的峰下的未校正的面积。 
2 面积％是以相对于所有化合物的总的峰面积表示为％的峰面积。 
3 比率％是相对于2-甲基-1，3-丁二烯的峰面积表示为％的峰面积。 
III.在源自发酵的异戊二烯中不存在C5烃异构体 
使用在液氮中冷却的2mL顶空瓶进行存在于发酵废气中的异戊二烯的冷捕集。首先使废气通过(1L/分钟)含有氢氧化钠珠的20mL瓶以使冰态和固态CO2在2mL瓶中的积累最小化(-196℃)。使大约10L的废气通过瓶，然后在通风的状况下使其升温至-78℃，然后以洁净的瓶盖重新将其密封，并通过GC/MS分析。 
使用顶空模式下的100μL气密性注射器，以Agilent 6890 GC/MS系统进行GC/MS顶空分析。使用Zebron ZB-624 GC/MS柱(30m x 250μm；膜厚度1.40μm)进行分析物的分离。GC自动注射器配有气密性的100μL注射器，针头高度调节为允许从2mLGC瓶注射50μL的顶空样品。GC/MS法使用氦作为载气，流速为1ml/分钟。注入口维持在200℃，分流比为20∶1。在分析过程中将烤箱温度维持在37℃，持续5分钟。在m/z 55、66、67 和70以单离子监控(SIM)模式运行Agilent 5793N质量选择性检测器。在这些条件下，观察到异戊二烯在2.966分钟时洗脱(图88B)。还是用该方法分析了源自石油的异戊二烯的标准物(Sigma-Aldrich)，并且发现该标准物含有另外的C5烃异构体，所述异构体在主峰之前或之后的短时间洗脱，并基于校正的GC面积进行定量(图88A)。 
表8A：源自石油的异戊二烯的GC/MS分析 
表8B：源自发酵的异戊二烯的GC/MS分析(占总C5烃的百分率) 
在另外的实验中，分析了C5烃的标准混合物以确定每种化合物的检测器应答是否相同。化合物是2-甲基-1-丁烯、2-甲基-1，3-丁二烯、(E)-2-戊烯、(Z)-2-戊烯和(E)-1，3-戊二烯。在这种情况下，在维持于50℃的Agilent DB-Petro柱(100m x 0.25mm，膜厚度0.50um)上进行分析15分钟。GC/MS法使用氦作为载气，流速为1ml/分钟。注入口维持在200℃，分流比为50∶1。从m/z 19至m/z 250以全扫描模式运行Agilent 5793N质量选择性检测器。在这些条件下，浓度为100μg/L的每种标准物生产实验误差内的相同检测器应答。 
IV.包含吸附到固相上的异戊二烯的组合物 
使生物生产的异戊二烯吸附至活性炭，生产包含50％至99.9％的碳、0.1％至50％的异戊二烯、0.01％至5％的水、和痕量(＜0.1％)其它挥发性有机成分的固相。 
使发酵废气通过维持在0℃的铜冷凝旋管，然后通过颗粒硅石干燥剂过滤器以除掉水蒸气。然后使经除湿的废气通过含碳的过滤器(Koby Jr，Koby Filters，MA)达到通过GC/MS在过滤器排放中检测到异戊二烯突破(breakthrough)的点。可以通过计算废气中的浓度、总的流速和收集期间的突破百分率来间接确定吸附至筒的异戊二烯的量。或者，可以通过热、真空、或溶剂介导的解吸附从过滤器中回收吸附的异戊二烯。 
V.冷凝的异戊二烯的收集和分析 
将发酵废气除湿，通过经由合适的吸附剂(例如烧碱石棉)过滤而除掉CO2。然后使得到的废气流通过液氮冷却的冷凝器以使流体中的VOC冷凝。收集瓶含有叔丁基儿茶酚以抑制得到的异戊二烯冷凝物。通过GC/MS和NMR分析冷凝物以测定纯度，其中使用标准方法，例如如本文描述的那些。 
VI.通过发酵生产异戊二烯基醇 
对来自于表达野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌BL21(DE3)菌株的废气的分析揭示出异戊二烯和3-甲基-3-丁烯-1-醇(异戊二烯醇)的存在。发酵过程中，发酵废气中的这两种化合物的水平显示于图89，如通过顶空GC/MS所测定。在该实验中得到的异戊二烯醇(3-甲基-3-丁烯-1-醇，3-MBA)的水平接近10μg/L废气。另外的实验在发酵废气中生产了大约20μg/L废气的水平。 
实施例11：在补料分批培养物中发酵并表达来自甲羟戊酸途径的基因的大肠杆菌的生长与异戊二烯的生产的解除偶联 
实施例11例示了从甲羟戊酸的细胞生长与异戊二烯生产之间的解除偶联。 
I.发酵条件 
培养基配方(每升发酵培养基)： 
使用下列成分/升发酵培养基制备培养基：K2HPO47.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，和1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于diH2O中。 该溶液经高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺*HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。 
1000X改良痕量金属溶液： 
使用下列成分制备1000X改良痕量金属溶液：柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3100mg，和NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分依次溶解于DiH2O水中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，以0.22μm的滤器无菌过滤。 
以含有pTrcHis2AUpperPathway(也称作pTrcUpperMVA，图91和92A-92C)(50μg/ml羧苄西林)或pCL PtrcUpperMVA(也称作pCL PtrcUpperPathway(图26))(50μg/ml壮观霉素)质粒的大肠杆菌细胞进行发酵。对于其中生产异戊二烯的实验，大肠杆菌细胞还含有pTrc KKDyIkIS(50μg/ml卡那霉素)质粒。进行这些实验以监测在需要的发酵pH7.0和温度30℃从葡萄糖形成的甲羟戊酸或异戊二烯。从冷冻瓶取出大肠杆菌菌株的接种物，划线至LA培养基琼脂平板(含有抗生素)并在37℃温育。将单一菌落接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。当接种物生长至光密度1.0时(在550nm测定)，将其用于接种至生物反应器。 
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。通过加入IPTG进行诱导。通过将高氯酸(Sigma-Aldrich # 244252)处理的样品(0.3M，在4℃温育5分钟)施加至有机酸HPLC柱(BioRad # 125-0140)来测定发酵液中甲羟戊酸的浓度。通过将培养液甲羟戊酸峰的大小与从经高氯酸处理的甲羟戊酸内酯(Sigma-Aldrich # M4667)以形成D，L-甲羟戊酸而生产的校正曲线进行比较来测定浓度。按照本文的描述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯的水平。异戊二烯效价定义为每升发酵液生产的异戊二烯的量。 
II.以150L的规模从表达pTrcUpperMVA质粒的大肠杆菌BL21(DE3)细胞生产甲羟戊酸 
按照上文实施例11第I部分的解释将生长于平板上的BL21(DE3)细胞接种于含有45mL胰蛋白胨-酵母提取物培养基的培养瓶中并在30℃以 170rpm振荡温育5小时。将该溶液转移至5L的生物反应器中的胰蛋白胨-酵母提取物培养基中，细胞在30℃和27.5rpm生长直至培养物达到OD550为1.0。将5L的接种物接种入含有45-kg培养基的150L生物反应器中。当OD550达到10时，使IPTG的浓度为1.1mM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图60A。甲羟戊酸效价随着发酵的进程提高至最终的值61.3g/L(图60B)。整个发酵过程中的比生产率谱显示于图60C，其与图60A的对比证明了生长与甲羟戊酸生产之间的解除偶联。在52.5小时的发酵过程中从利用的14.1kg的葡萄糖生产的甲羟戊酸的总量是4.0kg。用于在发酵过程中生产甲羟戊酸的所利用的碳的摩尔产率是34.2％。 
III.以15L的规模从表达pTrcUpperMVA质粒的大肠杆菌BL21(DE3)细胞生产甲羟戊酸 
按照上文实施例11第I部分的解释将生长于平板上的BL21(DE3)细胞接种于含有500mL胰蛋白胨-酵母提取物培养基的培养瓶中并在30℃以160rpm生长至OD5501.0。将该物质接种入含有4.5-kg培养基的15L生物反应器中。当OD550达到10时，使IPTG的浓度为1.0mM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图61A。甲羟戊酸效价随着发酵的进程达到最终的值53.9g/L(图61B)。整个发酵过程中的比生产率谱显示于图61C，其与图61A的对比证明了生长与甲羟戊酸生产之间的解除偶联。在46.6小时的发酵过程中从利用的2.1kg的葡萄糖生产的甲羟戊酸的总量是491g。用于在发酵过程中生产甲羟戊酸的所利用的碳的摩尔产率是28.8％。 
IV.以15L的规模从表达pTrcUpperMVA质粒的大肠杆菌FM5细胞生产甲羟戊酸 
按照上文实施例11第I部分的解释将生长于平板上的FM5细胞接种于含有500mL胰蛋白胨-酵母提取物培养基的培养瓶中并在30℃以160rpm生长至OD5501.0。将该物质接种入含有4.5-kg培养基的15L生物反应器中。当OD550达到30时，使IPTG的浓度为1.0mM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图62A。甲羟戊酸效价随着发酵的进程提高至最终的值23.7g/L(图62B)。整个发酵过程中的比生产率谱显示于图 62C，其与图62A的对比证明了生长与甲羟戊酸生产之间的解除偶联。在51.2小时的发酵过程中从利用的1.1kg的葡萄糖生产的甲羟戊酸的总量是140g。用于在发酵过程中生产甲羟戊酸的所利用的碳的摩尔产率是15.2％。 
V.以15L的规模从表达pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的大肠杆菌BL21(DE3)细胞生产异戊二烯 
按照上文实施例11第I部分的解释将生长于平板上的表达pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的BL21(DE3)细胞接种于含有500mL胰蛋白胨-酵母提取物培养基的培养瓶中并在30℃以160rpm生长至OD5501.0。将该物质接种入含有4.5-kg培养基的15L生物反应器中。当OD550达到10时，使IPTG的浓度为25μM。当OD550达到190时，使IPTG的浓度升高至50μM。在发酵38小时的时候使IPTG的浓度升高至100μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图63A。异戊二烯效价随着发酵的进程提高至最终的值2.2g/L发酵液(图63B)。整个发酵过程中的比生产率谱显示于图63C，其与图63A的对比证明了生长与异戊二烯生产之间的解除偶联。在54.4小时的发酵过程中从利用的2.3kg的葡萄糖生产的异戊二烯的总量是15.9g。用于在发酵过程中生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是1.53％。 
VI.以15L的规模从表达pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的大肠杆菌BL21(DE3)tuner细胞生产异戊二烯 
按照上文实施例11第I部分的解释将生长于平板上的表达pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的BL21(DE3)tuner细胞接种于含有500mL胰蛋白胨-酵母提取物培养基的培养瓶中并在30℃以160rpm生长至OD5501.0。将该物质接种入含有4.5-kg培养基的15L生物反应器中。当OD550达到10时，使IPTG的浓度为26μM。当OD550达到175时，使IPTG的浓度升高至50μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图64A。异戊二烯效价随着发酵的进程提高至最终的值1.3g/L培养液(图64B)。整个发酵过程中的比生产率谱显示于图64C，其与图64A的对比证明了生长与异戊二烯生产之间的解除偶联。在48.6小时的发酵过程中 从利用的1.6kg的葡萄糖生产的异戊二烯的总量是9.9g。用于在发酵过程中生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是1.34％。 
VII.以15L的规模从表达pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的大肠杆菌MG1655细胞生产异戊二烯 
按照上文实施例11第I部分的解释将生长于平板上的表达pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的MG1655细胞接种于含有500mL胰蛋白胨-酵母提取物培养基的培养瓶中并在30℃以160rpm生长至OD5501.0。将该物质接种入含有4.5-kg培养基的15L生物反应器中。当OD550达到45时，使IPTG的浓度为24μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图65A。异戊二烯效价随着发酵的进程提高至最终的值393mg/L培养液(图65B)。整个发酵过程中的比生产率谱显示于图65C，其与图65A的对比证明了生长与异戊二烯生产之间的解除偶联。在67.4小时的发酵过程中从利用的520g的葡萄糖生产的异戊二烯的总量是2.2g。用于在发酵过程中生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是0.92％。 
VIII.以15L的规模从表达pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的大肠杆菌MG1655ack-pta细胞生产异戊二烯 
按照上文实施例11第I部分的解释将生长于平板上的表达pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的MG1655ack-pta细胞接种于含有500mL胰蛋白胨-酵母提取物培养基的培养瓶中并在30℃以160rpm生长至OD5501.0。将该物质接种入含有4.5-kg培养基的15L生物反应器中。当OD550达到10时，使IPTG的浓度为30μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图66A。异戊二烯效价随着发酵的进程达到最终的值368mg/L培养液(图66B)。整个发酵过程中的比生产率谱显示于图66C，其与图66A的对比证明了生长与异戊二烯生产之间的解除偶联。在56.7小时的发酵过程中从利用的531g的葡萄糖生产的异戊二烯的总量是1.8g。用于在发酵过程中生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是0.73％。 
IX.以15L的规模从表达pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的大肠杆菌FM5细胞生产异戊二烯 
按照上文实施例11第I部分的解释将生长于平板上的表达pCL  PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的FM5细胞接种于含有500mL胰蛋白胨-酵母提取物培养基的培养瓶中并在30℃以160rpm生长至OD5501.0。将该物质接种入含有4.5-kg培养基的15L生物反应器中。当OD550达到15时，使IPTG的浓度为27μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图67A。异戊二烯效价随着发酵的进程达到最终的值235mg/L培养液(图67B)。整个发酵过程中的比生产率谱显示于图67C，其与图67A的对比证明了生长与异戊二烯生产之间的解除偶联。在52.3小时的发酵过程中从利用的948g的葡萄糖生产的异戊二烯的总量是1.4g。用于在发酵过程中生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是0.32％。 
实施例12：在补料分批培养物中发酵且表达甲羟戊酸途径的基因的大肠杆菌的指数生长期期间生产异戊二烯 
实施例12例示了在细胞的指数生长期期间生产异戊二烯。 
培养基配方(每升发酵培养基)： 
使用下列成分/升发酵培养基制备培养基：K2HPO47.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，和1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于diH2O中。该溶液经高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺*HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。 
1000X改良痕量金属溶液： 
使用下列成分制备1000X改良痕量金属溶液：柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3100mg，和NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分依次溶解于DiH2O水中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，以0.22μm的滤器无菌过滤。 
在15L的生物反应器中以含有pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的ATCC11303大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃从葡萄糖形成的异戊二烯。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素) 并在37℃温育。将单一菌落接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至5L的生物反应器。 
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。在50小时的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是2.0kg。通过加入IPTG进行诱导。当550nm下的光密度(OD550)达到10的时候，使IPTG的浓度是25μM。当OD550达到190时，IPTG的浓度升高至50μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图99。按照本文的描述测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯效价随着发酵的进程达到最终的值1.4g/L(图100)。在50小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是10.0g。生物反应器内异戊二烯的比生产率随时间变化的图谱显示于图101。在发酵过程中促成生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是1.1％。从葡萄糖生产的异戊二烯的重量百分率产率是0.5％。 
实施例13：可燃性模拟和异戊二烯测试 
I.可燃性模拟和异戊二烯测试的概述 
对于多种烃/氧/氮/水/二氧化碳混合物进行了可燃性模拟和实验。这种模拟和实验测试旨在确定在固定的压力和温度下，在指定的蒸汽和一氧化碳浓度下的异戊二烯和氧/氮/可燃性曲线。在表9中显示了模型条件的矩阵，在表10中显示了所进行的实验的矩阵。 
表9.模拟的异戊二烯可燃性的总结 
表10.异戊二烯可燃性测试的总结 
II.计算的绝热火焰温度(CAFT)模型的描述 
燃烧传播的计算的绝热火焰温度(CAFT)和选择的极限火焰温度用于确定异戊二烯的可燃性包迹。在该研究中用于计算火焰温度的计算机程序是NASA Glenn Research Center CEA(Chemical Equilibrium with Applications)软件。 
使用均一燃烧机制(其中燃料和氧化剂都处于气态)的绝热火焰温度模型来确定可燃性包迹包括5个步骤：选择需要的反应剂，选择测试条件，选择极限火焰温度，修改反应剂，和从计算中构建可燃性包迹。 
在第一个步骤“选择需要的反应剂”中，必须确定将存在于系统中的反应剂种类和各自的数量。在很多情况下，用于计算的计算机程序具有反应剂和产物种类的列表。如果在程序中不存在要研究的种类的任何数据，则可以从其它来源例如JANAF表或从互联网获得它们。在本模型中，水、氮、氧和二氧化碳的数据存在于程序数据库中。程序数据库中不具有异戊二烯种类；因此，人工加入热力学特性。 
下一个步骤是确定最初的压力和温度条件是否是发生燃烧过程的压力和温度。在该模型中，压力是1个大气压(绝对)，温度是40℃，即异戊二烯的沸点。 
可以基于理论原理选择燃烧的极限火焰温度或通过实验来确定。每种方法具有其自身的限制性。 
基于之前的研究，烃的极限火焰温度在1000K至1500K的范围内。对于该模型，选择1500K的数值。其是一氧化碳至二氧化碳的反应(高度放热的反应并构成显著比例的火焰能量)形成自我持续时的温度。 
一旦确定了极限火焰温度，在给定的反应剂混合物(种类浓度)上进行模拟计算并确定绝热火焰温度。只有当温度高于极限火焰温度时认为发生了火焰传播。然后修改反应剂混合物的组成以产生传播和非传播混合物的数据组。 
这种类型的模型显示出与实验确定的可燃极限的良好的一致性。衍生的包迹之外的区域是不可燃的，其内的区域是可燃的。包迹的形状形成前端。包迹的前端与气态燃料的极限氧浓度(LOC)相关。 
III.计算的绝热火焰温度(CAFT)的结果 
图68至74中的图形分别是种类A至G的CAFT模型结果。图中绘制了针对数种氧/氮比率(按重量计)的计算的绝热火焰温度(使用NASACEA程序)，其随着燃料浓度(按重量计)而变化。高于1500K(所选的极限火焰温度)的曲线的部分含有足以维持火焰传播的燃料水平。以图68至74呈现的形式可能难以判读结果。另外，目前的形式不利于与实验数据进行比较(实验数据一般是以体积百分率的形式呈现的)。 
使用系列A作为实例，图68中的数据可以按照传统的可燃包迹作图。使用图68并从纵座标上的1500K温度线读取，可以通过针对与其交叉的每条曲线(氧/氮的比率)的横坐标取正切来确定该极限火焰温度的燃料浓度。然后可以将这些数值制成表格：针对给定重量百分率的氧化剂的燃料的重量百分率(图75A)。然后，已知燃料的组成(100wt.％异戊二烯)和氧化剂的组成(水、氧和氮的相对含量)，可以建立摩尔量。 
从这些摩尔量可以计算百分体积浓度。然后可以将体积百分率形式的浓度作图以产生可燃包迹(图75B)。包迹包围的面积是可爆炸的范围，其外的是非可爆炸范围。包迹的前端是极限氧浓度。图76A和76B包含从图69呈现的数据产生的系列B的可燃性包迹的计算的体积浓度。可以在图 70-74呈现的数据中使用类似的方法。 
IV.可燃性测试的实验设备和程序 
在4升的高压容器中进行可燃性测试。容器是圆柱形的，内径为6”，内高为8.625”。使用由PID控制器控制的外部加热器维持容器(以及其中的气体)的温度。为了防止热损失，在压力容器的周围包裹陶瓷羊毛和反射绝热体。使用K型热电偶来测定气体空间的温度以及容器本身的温度。图77例示了测试容器。 
在进行测试之前，排空该容器并以氮气吹扫以确保除掉之前测试中的任何气体。然后对容器吸真空。在这之后的压力通常是约0.06bar(a)。由于氮气的吹扫，假设产生此最初压力的气体是氮气。然后使用分压，加入合适量的水、异戊二烯、氮气、和氧气以达到所要的测试条件。容器内的磁力驱动的混合扇确保了气体内容物的混合。使气体混合大约2分钟，在点火前大约1分钟关闭风扇。 
点火器包含位于定时电路上的1.5ohm nicrome线圈和交流电源。使用示波镜测定出34.4VAC被输送至点火器，持续3.2秒。在大约一半的点火周期内产生最大为3.8amp的电流。因此，最大电能是131W，点火周期提供的总能量是大约210J。 
使用连接于数据获取系统的可变阻力Validyne DP215压力传感器获得爆燃数据。如果压力上升大于或等于5％，则认为气体混合物发生爆燃。 
V.可燃性测试结果 
在40℃和0psig且没有蒸汽的情况下进行第一个实验系列(系列1)。在不同浓度的异戊二烯和氧下进行的测试产生了图78A所示的可燃性曲线。该曲线中显示的数据点仅仅是曲线边缘的点。该系列所获取的所有数据点的详细列表显示于图80A和80B。 
图78B总结了图78A所显示的可爆炸数据点。图78C是实验数据与CAFT模型预测的可燃性包迹的比较。模型与实验数据良好吻合。不一致处可能是由于测试室的非绝热性和模型的局限性造成的。模型考虑的是氧化反应的无限时间范围，不考虑任何反应动力学限制。 
另外，模型受到其数据库中的平衡化学种类的数目的限制，因此，可 能不能正确预测热解种类。同样地，通过模型开发的可燃性包迹使用一个极限火焰温度值(1500K)。极限火焰温度可以是1,000K至1,500K范围的值，这取决于反应化学物质种类。在高于化学计量的燃料/氧化剂水平的燃料浓度下形成的热解化学物质种类的复杂性质是该模型可能不能精确预测该系统的燃烧上限的一个原因。 
在40℃和0psig以固定的4％的蒸汽浓度进行第二个实验系列(系列2)。在不同浓度的异戊二烯和氧下进行的测定产生了如图79A所示的可燃性曲线。该曲线中显示的数据点仅仅是曲线边缘的点。该系列所获取的所有数据点的详细列表显示于图81。由于系列1中的数据之间的相似性，仅测试了燃烧下限、极限氧浓度、和燃烧上限的关键点。向测试混合物中加入4％的蒸汽未显著改变可燃性包迹的关键限值。应该注意：较高浓度的蒸汽/水和或其它惰性物(inertant)的加入可能影响可燃性包迹。 
图79B总结了图79A所示的爆炸数据点。图79C是实验数据与CAFT模型预测的可燃性包迹的比较。模型与实验数据良好吻合。不一致处可能是由于系列1中描述的相同的因素。 
VI.计算在3个大气压的压力下空气中的异戊二烯的可燃极限 
同样使用实施例13第IV部分中描述的方法计算3个大气压的绝对系统压力和40℃下异戊二烯的可燃极限。将这些结果与实施例13第I-IV部分在1个大气压的绝对系统压力和40℃下的结果进行比较。测试较高的压力，这是因为可燃性包迹随着最初系统压力的增大而延伸或变得更大。燃烧上限受到的影响最大，其次是极限氧成分。燃烧下限受到的影响最小(见，例如“Bulletin 627-Flammability Characteristics of Combustible Gases and Vapors”，作者Michael G.Zabetakis，由以前的US Bureau of Mines出版(1965)，其通过引用方式全文并入本文，尤其是关于计算可燃极限的内容)。 
在图82中，绘制计算的绝热火焰温度，其随着异戊二烯(燃料)浓度而变，浓度表示为总燃料/氮/氧的重量百分率，其中系统压力最初是3个大气压。计算的火焰温度与在1个大气压的系统中最初测定的非常相似(图83)。结果是：当使用计算的绝热可燃数据产生可燃性包迹时，曲线是非常 相似的(见图84和85)。因此，基于这些理论计算，从1个大气压至3个大气压的系统压力增大不会导致可燃性包迹的显著增大/变宽。如果需要，可以使用实验测试(例如，如本文描述的在1个大气压的压力下进行的实验测试)来验证这些模型结果。 
VII.可燃性研究的总结 
对于40℃和0psig下的异戊二烯/氧/氮/水/二氧化碳系统的可燃性包迹开发了计算的绝热温度模型。所开发的CAFT模型与通过本研究中进行的测试所产生的实验数据良好吻合。来自系列1和2的实验结果验证了来自系列A和B的模型结果。 
实施例14：在表达马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶和银白杨异戊二烯合酶的大肠杆菌中生产异戊二烯 
I.编码马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶(MVK)和银白杨异戊二烯合酶的质粒和菌株的构建 
(i)菌株EWL201(BL21，Cm-GI1.2-KKDyI)的构建 
经MCM331 P1裂解物(根据Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley and Sons，Inc.描述的方法制备的裂解物)转导的大肠杆菌BL21(Novagen brand，EMD Biosciences，Inc.)是受体菌株。通过将细胞涂覆于L琼脂和20μg/μl氯霉素上来选择转导子。将平板在30℃温育过夜。转导子分析显示：在对照平板(水+细胞对照平板，用于逆转；水+P1裂解物对照平板，用于裂解物污染)上没有菌落。 
挑取了4个转导子并用于接种5mL L Broth和20μg/μl氯霉素。培养物在30℃以200rpm振荡生长过夜。为了制备用于PCR分析的每个转导子的基因组DNA制备物，离心1.5mL过夜细胞培养物。将细胞沉淀重悬于400μl重悬缓冲液(20mM Tris，1mM EDTA，50mM NaCl，pH 7.5)，加入4μl不含DNA酶的RNA酶(Roche)。在37℃将管温育30分钟，然后加入4μl 10％SDS和4μl 10mg/ml的蛋白酶K贮液(Sigma-Aldrich)。在37℃将管温育1小时。将细胞裂解物转移至2ml Phase Lock Light Gel管(Eppendorf)，加入各200μl的饱和苯酚pH7.9(Ambion Inc.)和氯仿。将管 混合均匀并微离心5分钟。使用400μl氯仿进行第二次提取，将含水层转移至新的eppendorf管。通过加入1ml 100％的乙醇并离心5分钟使基因组DNA沉淀。以1ml 70％的乙醇洗涤基因组DNA沉淀。除掉乙醇，使基因组DNA沉淀短暂风干。将基因组DNA重悬于200μl TE。 
使用Pfu Ultra II DNA聚合酶(Stratagene)和200ng/μl基因组DNA作为模板，根据生产商的说明书制备了2组不同的PCR反应管。对于第1组，使用引物MCM130和GB Cm-Rev(表18)以确保转导子正确地整合进入attTn7基因座。用于第1组的PCR参数是：95℃2分钟(仅第一个循环)；95℃25秒，55℃25秒，72℃25秒(步骤2-4重复28个循环)；72℃1分钟。对于第2组，使用引物MVD For和MVD Rev(表18)以确保gi1.2-KKDyI操纵子正确整合。用于第2组的PCR参数是：95℃2分钟(仅第一个循环)；95℃25秒，55℃25秒，72℃10秒(步骤2-4重复28个循环)；72℃1分钟。在1.2％E-凝胶(Invitrogen Corp.)上对PCR扩增子的分析表明：所有4个转导子克隆都是正确的(挑取1个并命名为菌株EWL201)。 
ii)菌株EWL204(BL21，环出-GI1.2-KKDyI)的构建 
按照Datsenko和Wanner(2000)(Datsenko等人，Proc Natl.Acad.Sci USA 97：6640-6645，2000)的描述，使用质粒pCP20从菌株EWL201中环出氯霉素标志物。使用PCR产物将大肠杆菌K-12中的氯霉素基因进行一步失活(Datsenko等人，PNAS，97：6640-6645，2000)。EWL201细胞在L Broth中生长至指数中期，然后在冰冷的无菌水中洗涤3次。将50μl的细胞悬浮液等份与1μl pCP20混合，使用基因脉冲电穿孔仪(Bio-Rad Inc.)，在2mm杯(Invitrogen Corp.)中在2.5伏特和25uFd，将细胞悬浮液混合物进行电穿孔。立即向细胞中加入1ml LB，然后转移进入具有金属盖的14ml聚丙烯管(Sarstedt)中。 
通过在30℃生长1小时而使细胞恢复。在L琼脂和20μg/μl氯霉素和50μg/μl羧苄西林上选择转化子并在30℃过夜温育。次日，单一克隆在30℃在10ml L Broth和50μg/μl羧苄西林上生长直至早期对数期。然后使生长中的培养物的温度变为42℃，持续2小时。进行连续稀释，然后将细胞涂 覆于LA平板(无抗生素选择)并在30℃过夜温育。次日，挑取20个菌落并点染至L琼脂(无抗生素)和LA+20μg/μl氯霉素平板。然后将平板在30℃过夜温育。能够在LA平板上生长但不能在LA+20μg/μl氯霉素平板上生长的细胞被认为是发生了氯霉素标志物环出(挑取1个并命名为菌株EWL204)。 
iii)质粒pEWL230(pTrc P.alba)的构建 
基于针对大肠杆菌表达的密码子优化方法，将产生编码银白杨异戊二烯合酶(银白杨HGS)的合成基因的工作外包给DNA2.0 Inc.(Menlo Park，CA)。将合成的基因订制克隆进入质粒pET24a(Novagen brand，EMD Biosciences，Inc.)并冻干运输(图112，113A和113B)。 
根据生产商的说明书，使用pET24a银白杨HGS作为模板，引物MCM182和MCM192以及Herculase II Fusion DNA聚合酶(Stratagene)，进行PCR反应以扩增银白杨异戊二烯合酶(银白杨HGS)基因。PCR条件如下：95℃2分钟(仅第一个循环)；95℃25秒，55℃20秒，72℃1分钟(重复25个循环)；最后在72℃延伸3分钟。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen Inc.)纯化银白杨异戊二烯合酶PCR产物。 
然后在含有1μl BspHI核酸内切酶(New England Biolabs)和2μl 10X NEB缓冲液4的20μl反应物中消化银白杨异戊二烯合酶PCR产物。将反应物在37℃温育2小时。然后使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化消化的PCR片段。在含有1μl PstI核酸内切酶(Roche)和2μl 10X缓冲液H的20μl反应物中进行第二限制性消化。将反应在37℃温育2小时。然后使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化消化的PCR片段。在含有1μl NcoI核酸内切酶(Roche)、1μl PstI核酸内切酶、和2μl 10X缓冲液H的20μl反应物中消化质粒pTrcHis2B(Invitrogen Corp.)。将反应物在37℃温育2小时。使用1.2％E-凝胶(Invitrogen Corp.)凝胶纯化经消化的pTrcHis2B载体，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)提取(图114)。使用BspHI和NcoI位点的兼容性粘末端，制备20μl连接反应物，其中含有5μl银白杨异戊二烯合酶插入片段、2μl pTrc载体、1μl T4 DNA连接酶(New England Biolabs)、2μl 10X连接酶缓冲液、和10μl ddH2O。将连接混合物 在室温温育40分钟。使0.025μm硝酸纤维素膜滤纸(Millipore)在ddH2O的皮氏培养皿中漂浮并将连接混合物轻轻地施加于所述硝酸纤维素膜滤纸上并在室温持续30分钟，以此来使连接混合物脱盐。MCM446细胞(见第II部分)在LB中生长至指数中期，然后在冰冷的无菌水中洗涤3次。将50μl细胞悬浮液等份试样与5μl脱盐的pTrc P.albaHGS连接混合物混合在一起。使用基因脉冲电穿孔仪，在2mm杯中在2.5伏特和25uFd对细胞悬浮液混合物进行电穿孔。立即向细胞中加入1ml LB，然后转移至具有金属盖的14ml聚丙烯管(Sarstedt)。 
通过在30℃生长2小时使细胞恢复。在L琼脂和50μg/μl羧苄西林和10mM甲羟戊酸上选择转化子并在30℃温育。次日，挑取6个转化子并在30℃在5ml L Broth和50μg/μl羧苄西林管中过夜生长。使用QIAquick旋转微量制备试剂盒(Qiagen)在过夜培养物上进行质粒制备。由于使用了BL21细胞用于繁殖质粒，所以在生产商的标准程序中引入了下列修改：以5X的PB缓冲液和3X的PE缓冲液洗涤旋转柱，以实现高质量的质粒DNA。在20μl反应中以PstI消化质粒以确保正确大小的线性片段。所有6个质粒都是正确大小，并送去Quintara Biosciences(Berkeley，CA)测序，测序使用引物MCM65、MCM66、EL1000(表11)。DNA测序结果显示：所有6个质粒都是正确的。挑取1个质粒，命名为质粒EWL230(图57，58A和58B)。 
iv)质粒pEWL244(pTrc P.alba-mMVK)的构建 
根据生产商的说明书，使用MCM376作为模板(见第v部分)、引物MCM165和MCM177(见表11)、和Pfu Ultra II Fusion DNA聚合酶(Stratagene)，进行PCR反应以扩增马氏甲烷八叠球菌(M.mazei)MVK基因。PCR条件如下：95℃2分钟(仅第一个循环)；95℃25秒，55℃25秒，72℃18秒(重复28个循环)；最后在72℃延伸1分钟。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen Inc.)纯化马氏甲烷八叠球菌MVK PCR产物。 
然后在包含8μl PCR产物、2μl PmeI核酸内切酶(New England Biolabs)、4μl 10X NEB缓冲液4、4μl 10X NEB BSA、和22μl ddH2O的40μl反应物中消化马氏甲烷八叠球菌MVK PCR产物。将反应物在37℃ 温育3小时。然后使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化经消化的PCR片段。在含有2μl NsiI核酸内切酶(Roche)、4.7μl 10X缓冲液H、和40μl PmeI消化的马氏甲烷八叠球菌MVK片段的47μl反应物中进行第二限制性消化。将反应物在37℃温育3小时。然后使用1.2％E-凝胶对经消化的PCR片段进行凝胶纯化，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒提取。在含有10μl质粒、2μl PmeI核酸内切酶、4μl 10X NEB缓冲液4、4μl 10X NEB BSA、和20μμl of ddH2O的40μl反应物中消化质粒EWL230。将反应物在37℃温育3小时。然后使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化经消化的PCR片段。在含有2μl PstI核酸内切酶、4.7μl 10X缓冲液H、和40μl PmeI消化的EWL230线性片段的47μl反应物中进行第二限制性消化。将反应物在37℃温育3小时。然后使用1.2％E-凝胶对经消化的PCR片段进行凝胶纯化，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒提取(图117)。使用NsiI和PstI位点的兼容性粘末端，制备20μl连接反应物，其中含有8μl马氏甲烷八叠球菌MVK插入片段、3μl EWL230质粒、1μl T4 DNA连接酶、2μl 10X连接酶缓冲液、和6μl ddH2O。将连接混合物在16℃过夜温育。次日，通过使0.025μm硝酸纤维素膜滤纸在ddH2O的皮氏培养皿中漂浮并将连接混合物轻轻地施加于所述硝酸纤维素膜滤纸上并在室温持续30分钟而使连接混合物脱盐。MCM446细胞在LB中生长至指数中期，然后在冰冷的无菌水中洗涤3次。将50μl细胞悬浮液等份试样与5μl脱盐的pTrc P.alba-mMVK连接混合物混合在一起。使用基因脉冲电穿孔仪，在2mm杯中在2.5伏特和25uFd对细胞悬浮液混合物进行电穿孔。立即向细胞中加入1ml LB，然后将细胞转移至具有金属盖的14ml聚丙烯管。通过在30℃生长2小时使细胞恢复。在LA和50μg/μl羧苄西林和5mM甲羟戊酸平板上选择转化子并在30℃温育。次日，挑取6个转化子并在30℃在5ml LB和50μg/μl羧苄西林管中过夜生长。使用QIAquick旋转微量制备试剂盒在过夜培养物上进行质粒制备。由于使用了BL21细胞用于繁殖质粒，所以在生产商的标准程序中引入了下列修改：以5X的PB缓冲液和3X的PE缓冲液洗涤旋转柱，以实现高质量的质粒DNA。在20μl反应物中以PstI消化质粒以确保正确大小的线性片段。6个质粒中的3个是正确大小，并 送去Quintara Biosciences测序，测序使用引物MCM65、MCM66、EL1000、EL1003、和EL1006(表11)。DNA测序结果显示：所有3个质粒都是正确的。挑取1个，命名为质粒EWL244(图118，119A和199B)。 
v)质粒MCM376的构建-将来自马氏甲烷八叠球菌远古下部的MVK构建进入pET200D 
使用Invitrogen Platinum HiFi PCR混合物，使用引物MCM161和MCM162(表11)，通过PCR扩增来自马氏甲烷八叠球菌远古下部途径操纵子(图131A-C)的MVK ORF。将45uL PCR混合物与1μL模板、1μL 10μM的每种引物、和2μL水混合。反应循环如下：94℃2分钟；30个循环的“94℃30秒，55℃30秒和68℃1分15秒”，然后72℃7分钟，置于4℃直至冷却。根据生产商的程序，将3μL该PCR反应物连接进入Invitrogen pET200D质粒。将3μL此连接物导入Invitrogen TOP10细胞，在LA/kan50上选择转化子。分离来自转化子的质粒并对插入片段进行测序，得到MCM376(图131A-C)。 
vi)菌株EWL251(BL21(DE3)，Cm-GI1.2-KKDyI，pTrc P.alba-mMVK)的构建 
MCM331细胞(其含有编码酿酒酵母甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、和IPP异构酶的染色体构建体gi1.2KKDyI)在LB中生长至对数中期，然后在冰冷的无菌水中洗涤3次。将50μl细胞悬浮液与1μl质粒EWL244混合。使用基因脉冲电穿孔仪，在2mm杯中在2.5伏特和25uFd对细胞悬浮液混合物进行电穿孔。立即向细胞中加入1ml LB，然后将细胞转移至具有金属盖的14ml聚丙烯管。通过在30℃生长2小时使细胞恢复。在LA和50μg/μl羧苄西林和5mM甲羟戊酸平板上选择转化体并在37℃温育。选择1个菌落并命名为菌株EWL251。 
vii)菌株EWL256(BL21(DE3)，Cm-GI1.2-KKDyI，pTrc P.alba-mMVK，pCL Upper MVA)的构建 
EWL251细胞在LB中生长至对数中期，然后在冰冷的无菌水中洗涤3次。将50μl细胞悬浮液与1μl质粒MCM82(它是编码粪肠球菌mvaE和mvaS的pCL PtrcUpperPathway)混合。使用基因脉冲电穿孔仪，在2mm 杯中在2.5伏特和25uFd对细胞悬浮液混合物进行电穿孔。立即向细胞中加入1ml LB，然后将细胞转移至具有金属盖的14ml聚丙烯管。通过在30℃生长2小时，使细胞恢复。在LA和50μg/μl羧苄西林和50μg/μl壮观霉素平板上选择转化体，并在37℃温育。挑取1个菌落并命名为菌株EWL256。 
表11：引物序列 
II.MCM442-449(含有FRT-cmR-FRT-gi1.x-mKKDyI的BL21和BL21(DE3))的构建 
i)重组模板的构建 
从Gene Bridges GmbH(德国)得到基于FRT的重组盒和用于Red/ET-介导的整合和抗生素标志物环出的质粒。根据Gene Bridges手册，进行使用这些材料的操作。根据生产商的说明书，使用Stratagene Herculase II Fusion试剂盒，使用引物MCM193和MCM195从FRT-gb2-Cm-FRT模板扩增抗性盒。如下循环50μL反应物：95℃，2分钟；(95℃，20秒，55℃， 20秒，72℃，1分钟)x 5，(95℃，20秒，60℃，20秒，72℃，1分钟)x 25；72℃，3分钟；4℃直到冷却。根据生产商的说明书，使用Qiagen PCR柱纯化扩增子，并在30μL EB(洗脱缓冲液)中洗脱。在含有1x Roche H缓冲液和0.5μL BSA的20μL反应物中，用NdeI和PciI消化DNA。在含有1μL每种NdeI、NcoI和Roche H缓冲液的10μL反应物中，消化质粒MCM376。在37℃进行反应过夜，然后在Qiagen PCR柱上纯化切割的DNA，并在30μL EB中洗脱。在含有1μL载体、3μL PCR产物、1μL Roche Quick连接酶缓冲液2、5μL缓冲液1、和1μL连接酶的反应物中，将PCR产物连接进MCM376中。反应在室温进行3小时，然后根据生产商的说明书，将5μL转化进Invitrogen TOP10细胞中。在L琼脂(LA)和氯霉素(10μg/mLO)上在37℃选择转化体过夜。 
将转化体菌落涂布(patch)在含有氯霉素(30μg/mL)和卡那霉素(50μg/ml)的LA上进行保藏，并送至Quintara(Berkeley，CA)进行测序。发现4个克隆(各自在引物MCM195中的“N”处具有4个不同的核苷酸)具有插入的启动子的正确序列。在5mL含有氯霉素(30μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)的LB上培养克隆，并用于制备质粒DNA。将该质粒重新转化进TOP10细胞中，并将菌株冷冻为： 
表12：MCM484-487 
ii)重组靶菌株MCM349和MCM441的制备 
根据生产商的说明书，使用质粒pGB706(GeneBridges)，使氯霉素抗性(cmR)标志物环出菌株MCM331。在LB中培养MCM331细胞至对数中 期，然后在冰冷的无菌水中洗涤3次。将1μL pGB706 DNA等分试样加入50μL细胞悬浮液中，在2mm杯中在2.5伏特和25uFd对该混合物进行电穿孔，然后立即在500μL LB中在30℃恢复1小时。在含有四环素(5μg/ml)的LB上在30℃选择转化体。次日，在含有四环素(5μg/ml)的LB上在30℃培养克隆，直到明显浑浊(OD600～0.5-0.8)。将该培养物在LB上划线，在37℃过夜过夜。将不能在含有氯霉素(10μg/mL)的LB或含有四环素(5μg/mL)的LB上生长的克隆冷冻为MCM348。如上所述，将质粒MCM356(pRedET羧苄西林；GeneBridges)电穿孔，并在含有羧苄西林(50μg/mL)的LB上在30℃选择转化体。在LB+羧苄西林(50μg/mL)中在30℃培养克隆，并冷冻为MCM349。 
通过如上所述将质粒MCM356电转化进EWL204中，制备菌株MCM441。 
iii)将FRT-cmR-FRT-gi1.x-mMVK重组进MCM349和MCM441中 
使用质粒MCM484-487作为模板，使用引物MCM120和MCM196和Herculase II Fusion试剂盒，根据生产商的说明书，进行PCR扩增。每个模板进行3个反应，分别使用0、1、或3μL DMSO。如下循环50μL反应物：95℃，2分钟；5个(95℃，20秒；55℃20秒；72℃，1.5分钟)循环；25个(95℃，20秒；60℃20秒；72℃，1.5分钟)循环；72℃，3分钟；4℃，过夜。合并来自特定模板的3个反应物，并在Qiagen PCR柱上纯化，用30μL EB在60℃洗脱。用1μL DpnI in 1x Roche缓冲液A在37℃消化5μL DNA 3小时。然后在过量水中对该DNA进行微透析30分钟。 
在5mL含有羧苄西林(50μg/mL)的LB中，在30℃培养来自新划线的菌株至约0.5的OD600。加入40mM L-阿拉伯糖，并在37℃温育培养物1.5小时。收获细胞，用3μL上面透析过的扩增子电穿孔，然后在500μL SOC中在37℃恢复1.5-3小时。在含有氯霉素(5μg/mL)的LA平板上在37℃选择转化体。 
通过PCR，筛选卡那霉素敏感的克隆中扩增子的插入。对来自阳性克隆的PCR产物进行测序，以验证插入的DNA的序列。扩增子是一致的，在MCM441和348中在attTn7处的FRT-gi1.2-yKKDyI被替换为 FRT-cmR-FRT-gi1.x-mKKDyI(yK和mK命名分别表示来自酿酒酵母和马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶)。 
表13A：在含有氯霉素(5μg/mL)的LB中培养下述菌株并冷冻 
表13B：引物 
III.酵母提取物对以15L规模在补料分批培养物中培养的、表达来自甲羟戊酸途径的基因的大肠杆菌的异戊二烯生产的影响 
培养基配方(每升发酵培养基)： 
K2HPO47.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于去离子H2O中。该溶液经高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺*HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。 
1000X改良痕量金属溶液： 
柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl  10g，FeSO4*7H2O  1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO4*7H2O 1g，CuSO4*5H2O  100mg，H3BO3100mg，NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分逐一溶解于去离子H2O中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，以0.22μm的滤器过滤除菌。 
在15L生物反应器中用BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵，所述细胞含有上部甲羟戊酸(MVA)途径(pCL Upper)、集成的下部MVA途径(gi1.2KKDyI)、以及来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶和来自银白杨的异戊二烯合酶的高表达(pTrcAlba-mMVK)。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度30℃从葡萄糖形成的异戊二烯。融化大肠杆菌菌株的冷冻瓶，并接种进胰蛋白胨-酵母提取物培养基中。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种15L生物反应器，使起始体积至5-L。 
i)在没有酵母提取物补料的补料分批培养物中生长的大肠杆菌细胞(EL256)中的异戊二烯生产 
以指数速率进料葡萄糖，直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料，以满足代谢需求。在67小时的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是3.9kg。通过加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)进行诱导。当在550nm时的光密度(OD550)达到9的值时，使IPTG的浓度是102μM。当OD550达到140时，IPTG的浓度升高至192μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图125A。使用Hiden质谱仪测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯的效价随着发酵过程增大，最终值为35.6g/L(图125B)。在67小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是320.6g，生产的时间进程显示于图125C。通过TCER测定的代谢活性谱显示于图125D。发酵过程中用于生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是17.9％。从葡萄糖至异戊二烯的重量百分比产率是8.1％。 
ii)在含有酵母提取物补料的补料分批培养物中生长的大肠杆菌细胞(EL256)中的异戊二烯生产 
以指数速率进料葡萄糖，直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料，以满足代谢需求。在68小时的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是7.1kg。在发酵过程中还进料共1.06kg酵母提取物。通过加入IPTG进行诱导。当在550nm时的光密度(OD550)达到7的值时，使IPTG的浓度是208μM。当OD550达到180时，IPTG的浓度升高至193μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图126A。使用Hiden质谱仪测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯的效价随着发酵过程增大，最大值为32.2g/L(图126B)。在68小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是395.5g，生产的时间进程显示于图126C。体积生产率的时间进程显示于图126D，并证实，在23至63小时维持1.1g/L/hr的平均速率。通过CER测定的代谢活性谱显示于图126D。发酵过程中用于生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是10.3％。从葡萄糖至异戊二烯的重量百分比产率是5.2％。 
IV.在携带甲羟戊酸(MVA)途径和异戊二烯合酶(EWL256)的大肠杆 菌中从不同碳源生产异戊二烯 
培养基配方(每升发酵培养基)： 
K2HPO413.6g，KH2PO413.6g，MgSO4*7H2O 2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，(NH4)2SO43.2g，酵母提取物0.2g，1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分顺序地溶解于去离子H2O中。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至6.8并定容。以0.22μm的滤器过滤除菌培养基。加入碳源至1％的终浓度。在灭菌以后加入需要的抗生素并调节pH。 
1000X痕量金属溶液(每升发酵培养基)： 
柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO4*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3100mg，NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分依次溶解于去离子H2O，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，以0.22μm的滤器过滤除菌。 
i)AFEX生物质水解物的制备 
水解AFEX预处理的玉米秸秆，以制备含有木糖、葡萄糖和乙酸盐的生物质水解物。 
使用AFEX预处理的玉米秸秆，其来自Michigan Biotechnology Institute。预处理条件是：60％水分，1∶1氨水装载，90℃30分钟，然后风干。AFEX预处理的玉米秸秆的水分含量是21.27％。AFEX预处理的玉米秸秆中的葡聚糖和木聚糖的含量分别是31.7％和19.1％(干重基础)。使用的酶是accellerase 1000、Grindamyl H121(Danisco木聚糖酶产品，来自用于面包制造业的黑曲霉)。 
为了糖化，与5ml 1M pH 4.8柠檬酸钠缓冲液、2.25ml Accellerase 1000、0.1ml Grindamyl H121、和72.65ml去离子水一起，将20g AFEX预处理的玉米秸秆加入500ml烧瓶中。将烧瓶放入定轨摇床中，在50℃温育96小时。 
为了分析，从摇床取出一份样品，并使用HPLC进行分析。水解物含有37.2g/l的葡萄糖和24.3g/l的木糖以及7.6g/l的葡萄糖和/或木糖的寡聚 物。另外，水解物也含有1.17g/L的乙酸盐。 
ii)实验方法 
从冷冻瓶取出含有MVA途径和异戊二烯合酶的大肠杆菌菌株EWL256的接种物，并在含有壮观霉素(50μg/mL)和羧苄西林(50μg/mL)的LB培养液琼脂平板上划线，在30℃温育过夜。将单个菌落接种进含有葡萄糖、木糖、甘油、乙酸盐或生物质作为唯一碳源的TM3培养基中，并在30℃培养过夜。在乙酸盐上生长的细胞达到明显更低的光密度。在20mL含有各种碳源的TM3培养基中，稀释在葡萄糖、甘油、生物质水解物或乙酸盐上生长的细胞，达到0.1的光密度(在600nM测量)。从葡萄糖过夜培养物制备不含有任何碳源的阴性对照。用葡萄糖和木糖进行一个单独的实验，其中将培养物稀释至0.05的光密度。一式两份地测试所有培养条件(除了乙酸盐和甘油以外)，显示的结果是这些培养物之间的平均值。从实验开始，用200μM IPTG诱导异戊二烯的生产。在定轨摇床(200rpm)中在30℃温育烧瓶，并通过测量光密度来监测生长。在葡萄糖饲喂的培养物已经达到大约0.4的光密度以后，每小时测试样品中来自所有测试的碳源的异戊二烯生产，持续3小时。一式两份地将100μL样品转移至2mL玻璃瓶，密封，并在30℃温育30min。然后通过在80℃温育8分钟，热灭活细菌。使用GC-MS，测量生产的异戊二烯的量，并计算比生产率(μg/L*hr)。 
iii)结果 
在所有测试的碳源上培养期间，可以证实显著的异戊二烯生产。这些碳源是含有普通的醇、有机酸、含有5或6碳单元(C5或C6)的糖和生物质水解物的实例。 
在生物质水解物上的起始生长速率与在葡萄糖上的生长速率相当(图127A)。在生物质水解物上的生长期间的起始比生产率明显高于在葡萄糖上生长期间。这表明，生物质水解物可以用作异戊二烯生产的有效碳源。在生物质水解物上生长255分钟以后，比生产率下降(图127B)。当使用木糖作为唯一碳源时，所述细菌具有比葡萄糖更低的生长速率(图127C)，但是测量到显著的异戊二烯比生产率(图127D)。这表明，C5和C6糖都可 以用于经由甲羟戊酸途径生产异戊二烯。 
令人惊讶地，在乙酸盐(作为唯一碳源)上生长的细菌的异戊二烯比生产率是在葡萄糖上生长期间的约2倍(图127A)。在乙酸盐上生长的细菌比葡萄糖更慢(图127B)，但是进行的实验表明，乙酸盐也可以用作用于异戊二烯生产的碳源。通过HPLC测得，乙酸盐也存在于生物质水解物中。 
使用甘油作为唯一碳源时，细菌生长较好(图127A)，并表现出显著的异戊二烯生产(图127B)。这表明，普通的醇也可以用作碳源，用于经由甲羟戊酸途径生产异戊二烯。 
实施例15：来自植物的异戊二烯合酶在链霉菌属中的表达。 
从质粒pJ201：19813得到野葛异戊二烯合酶的基因。质粒pJ201：19813编码来自葛根(野葛植物)的异戊二烯合酶，并针对荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、沼泽红假单胞菌和棒杆菌属进行了密码子优化(图137A-137C(SEQ ID NO：137))。用限制性酶NdeI和BamHI消化质粒pJ201：19813，将释放的基因iso19813连接进链霉菌属-大肠杆菌穿梭载体pUWL201PW中(Doumith等人，Mol.Gen.Genet.264：477-485，2000；图129)，以制备pUWL201_iso。通过pUWL201_iso的限制性分析，验证成功的克隆。异戊二烯合酶iso19813的表达是在erm-启动子控制下，后者允许在链霉菌物种中组成型表达，但是不在大肠杆菌中表达。 
通过Hopwood等人，The John innes foundation，Norwich，1985所述的原生质体转化，将PUWL201PW(没有插入片段)和pUWL201_iso导入白色链霉菌J1074中(Sanchez等人，Chem.Biol.9：519-531，2002)。 
用1.9μg pUWL201PW或2.9μg pUWL201_iso，转化原生质体悬浮液的200μl等分试样。在非选择性的R5-琼脂平板上在28℃温育过夜以后，通过在含有硫链丝菌肽(250μg/ml)的R3-覆盖琼脂中另外温育4天，选择阳性的转化体。使用Plasmid Mini试剂盒(Qiagen)，通过质粒制备，检查硫链丝菌肽抗性的转化体中pUWL-质粒的存在。将制备的质粒DNA重新导入大肠杆菌DH5α中，以制备足够用于限制性分析的量的质粒DNA。在含有氨苄西林的L-琼脂平板上选择阳性的转化体，并通过用NdeI和 BamHI内切核酸酶消化质粒DNA，进行插入片段分析。将异戊二烯合酶鉴别为阳性的pUWL201 iso克隆中的1.7kb片段，而在对照菌株(pUWL201PW)中，没有观察到这样的片段。 
分析了野生型菌株和含有对照质粒pUWL201PW或编码异戊二烯合酶的pUWL201_iso的白色链霉菌的转化体的异戊二烯形成。在有或没有硫链丝菌肽(200μg/ml)存在下，在固体培养基(胰蛋白酶处理的大豆培养液琼脂，TSB；2.5ml)上一式两份地培养菌株，并在密封的顶空瓶(总容积20ml)中在28℃温育4天。通过GC-MS(在SIM-模式)分析500μl顶空样品(终点测量)，并根据参考保留时间和分子质量(67m/z)，鉴别异戊二烯。通过以前制备的校正曲线，定量在顶空样品中存在的异戊二烯。尽管携带pUWL201PW的野生型白色链霉菌和对照菌株生产的异戊二烯浓度稍微高于检测限(0.04-0.07ppm)，携带pUWL201_iso的白色链霉菌生产的异戊二烯是对照的至少10倍(0.75ppm；图130)。结果证实源自植物的异戊二烯合酶在放线菌组的原核生物体中的成功表达。 
实施例16：在含有上部或下部甲羟戊酸途径+野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌fadR atoC LS5218中从脂肪酸或棕榈油生产异戊二烯或甲羟戊酸 
从大肠杆菌遗传物保藏中心(Coli Genetic Stock Center)，得到大肠杆菌fadR atoC菌株LS5218(#6966)。FadR编码转录阻遏物，所述阻遏物负调节编码脂肪酸降解酶的基因的表达(Campbell等人，J.Bacteriol.183：5982-5990，2001)。AtoC是双成分调节系统中的响应调节物，其中AtoS调节乙酰乳酸代谢。fadR atoC菌株允许脂肪酸降解基因的组成型表达，并将长链脂肪酸掺入长链长度的聚羟基脂肪酸酯中。当将棕榈油用作用于甲羟戊酸或异戊二烯生产的碳源时，棕榈油会被转化成甘油+脂肪酸。其方法是本领域熟知的，既可以通过与脂肪酶(例如猪胰腺脂肪酶、皱褶假丝酵母菌脂肪酶、或其它类似的脂肪酶)一起温育酶促地进行，也可以通过与诸如氢氧化钠等碱的皂化化学地进行。 
i)表达上部甲羟戊酸途径的大肠杆菌fadR atoC菌株 
使用标准方法(Sambrooke等人，Molecular Cloning：A Laboratory  Manual，第2版，Cold Spring Harbor，1989)，通过将pCLPtrcUpperPathway电穿孔进LS5218中，制备菌株WW4。通过当在补充了C12脂肪酸(FA)或棕榈油作为碳源的TM3培养基中培养细胞时甲羟戊酸(MVA)的生产，证实了质粒的整合。为了证实WW4从脂肪酸生产MVA，在补充了0.25％C12 FA(Sigma目录号L9755)的5mL改良TM3培养基(没有酵母提取物的TM3)中，1∶100稀释来自过夜培养物的细胞。在30℃过夜温育IPTG诱导的培养物以后，出现MVA生产(24mg/L)的第一个迹象。在3天内产量增加，生产的最终水平是194mg/L的MVA。为了证实WW4从油生产MVA，在补充了200mg消化的棕榈油/5mL TM3培养基的改良TM3培养基中，1∶100稀释来自过夜培养物的细胞。在30℃过夜温育IPTG诱导的培养物以后，出现MVA生产(50mg/L)的第一个迹象。在3天内产量增加，生产的最终水平是500mg/L的MVA。 
ii)表达上部和下部MVA途径+野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌fadRatoC菌株 
用pMCM118[pTrcKKDyIkIS]转化大肠杆菌菌株WW4(LS5218 fadR atoC pCLPtrcUpperPathway)，以生成WW10。通过当在TM3和葡萄糖中培养菌株并用IPTG(100、300、或900μM)诱导时异戊二烯生产的证据，证实了质粒的整合。所述菌株对IPTG是相对敏感的，并在甚至100μM IPTG时，表现出显著的生长缺陷。这些结果显示于图128A。 
为了测试来自十二烷酸的异戊二烯生产，在200rpm摇动下，在含有壮观霉素(50μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的L发酵液中在37℃培养WW10过夜。通过离心，用改良TM3培养基洗涤细胞，并用该培养基重新悬浮它们至最初的培养体积。在含有0.125％C12脂肪酸(Sigma目录号L9755)的5mL改良TM3培养基中，1∶100和1∶10稀释来自该起始培养物的洗涤过的并重新悬浮的细胞。 
为了证实从棕榈油生产甲羟戊酸，用脂肪酶在37℃和250rpm预消化该油几天，以释放脂肪酸(通过当摇动试管时形成的泡沫，判断水解的证据)。 
另外，通过在试管中包含的含有棕榈油的改良TM3培养基中1∶10稀 释洗涤过的细胞，建立培养物。通过向不经进一步稀释的余量(2.5mL)洗涤过的细胞中加入0.125％C12FA，建立另一个试管(生物转化)。在250rpm摇动下在30℃培养3.75小时以后，通过加入50μM IPTG，诱导所有培养物。此后继续温育4小时，使用改良的顶空试验(在500rpm摇动，在30℃，1小时积累)，测定200μL每种培养物的异戊二烯积累。在GCMS分析之前，通过温育测定玻璃块12小时，进行一个额外的异戊二烯测定。继续温育诱导的培养物过夜，并在次日早晨再次测定200μL等分试样的异戊二烯生产(1小时，30℃，500rpm Shel-Lab摇床)。这些培养物的分析表明显著水平的异戊二烯的生产。在以1/10稀释度从过夜起始培养物接种的培养物中，在已经温育并诱导它过夜以后，观察到最高水平的异戊二烯。该结果提示，该培养物继续生长，且细胞密度增加。这些结果显示于图128B。不能直接地测量细胞密度，因为脂肪酸悬浮液具有浑浊的外观。因此，如下测定该培养物的细胞密度：将培养物的等分试样接种平板，并形成8x107菌落形成单位。这大致对应着0.1的OD600。尽管如此，该培养物证实了显著的异戊二烯生产；对于在该实施例中描述的没有该途径的类似菌株，没有观察到异戊二烯。 
实施例17：通过ybhE在大肠杆菌中的组成型表达提高异戊二烯生产 
该实施例显示了与具有野生型ybhE的对照菌株相比，组成性地表达ybhE(pgl)的菌株中的异戊二烯生产。基因ybhE(pgl)编码6-磷酸葡萄糖酸内酯酶，该酶抑制异源表达的蛋白的翻译后葡糖酰化，并提高产物溶解度和产率，同时也提高生物质产率和通过戊糖磷酸途径的通量(Aon等人，Applied and Environmental Microbiology，74(4)：950-958，2008)。 
构建生产异戊二烯的大肠杆菌BL21菌株(EWL256)，其在复制质粒pBBR1MCS5(庆大霉素)(获自K.Peterson博士，Louisiana State University)上组成型表达ybhE基因。 
从Gene Bridges GmbH(Germany)获得基于FRT的重组盒，和用于Red/ET-介导的整合和抗生素标志物环出的质粒。根据Gene Bridges的程序进行使用这些材料的程序。根据生产商的程序，使用Stratagene  Herculase II Fusion试剂盒，使用引物Pgl-F和PglGI1.5-R从FRT-gb2-Cm-FRT模板扩增抗性盒。PCR反应物(最终体积为50uL)包含：5μL缓冲液，1μL模板DNA(来自Gene Bridges的FRT-gb2-Cm-F)，10pmol的每种引物，和1.5μL 25mM dNTP混合物，加水至50μL。反应循环如下：1 x 2分钟，95℃，然后30个循环的“30秒95℃；30秒63℃；3分钟72℃)。 
使用QiaQick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化得到的PCR产物并电穿孔进入如下所述的携带包含pRed-ET重组酶的质粒的电感受态MG1655细胞。细胞这样制备：在5mL L broth中在30℃生长至OD600～0.6。通过加入4％的阿拉伯糖诱导细胞表达重组酶并允许在30℃生长30分钟，然后在37℃生长30分钟。在冰冷的dH2O中将细胞的1.5mL等份试样洗涤3-4次。将最终的细胞沉淀重悬于40μL冰冷的dH2O中并加入2-5μL PCR产物。在1-mm空隙杯中在1.3kV下在基因脉冲电穿孔仪(Bio-Rad Inc.)中进行电穿孔。使细胞在30℃恢复1-2小时，并铺板于含有氯霉素的L琼脂(5μg/mL)。通过PCR分析了5个转化体并使用侧接整合位点的引物(2个引物集合：pgl和49rev和3′EcoRV-pglstop；Bottom Pgb2和Top GB’s CMP(946))进行测序。选择正确的转化体，该菌株被称作MG1655 GI1.5-pgl::CMP。 
MG1655 GI1.5-pgl::CMP的染色体DNA用作模板以产生包含FRT-CMP-FRT-GI1.5-ybhE构建体的PCR片段。如下所述将该构建体克隆进入pBBR1MCS5(庆大霉素)。 
使用5’引物Pglconfirm-F和3’引物3′EcoRV-pglstop扩增在本文中被称作CMP-GI1.5-pgl的片段。使用Invitrogen TOPO-Blunt克隆试剂盒将得到的片段克隆进入质粒载体pCR-Blunt II-TOPO，如生产商所建议。将携带CMP-GI1.5-pgl片段的NsiI片段克隆进入pBBR1MCS5(庆大霉素)的PstI位点。制备20μl的连接反应物，其包含5μl CMP-GI1.5-pgl插入片段、2μl pBBR1MCS5(庆大霉素)载体、1μl T4 DNA连接酶(New England Biolabs)、2μl 10X连接酶缓冲液、和10μl ddH2O。将连接混合物在室温温育40分钟，然后使用上文公开的参数将2-4μL电穿孔进入电感受态 Top10细胞(Invitrogen)。在含有10μg/ml氯霉素和5μg/ml庆大霉素的L琼脂上选择转化体。使用如上所述的多个引物以及Sequetech，CA提供的自用的T3和反向引物测定所选的克隆的序列。该质粒被称作pBBRCMPGI1.5-pgl(图135A-B和SEQ ID NO：136)。 
将质粒pBBRCMPGI1.5-pgl电穿孔进入上面实施例10所述的EWL256，并将转化体铺板于含有氯霉素(10μg/mL)、庆大霉素(5μg/mL)、壮观霉素(50μg/mL)和羧苄西林(50μg/mL)的L琼脂上。选择1个转化体并命名为RM11608-2。 
引物： 
Pgl-F 
5’-ACCGCCAAAAGCGACTAATTTTAGCTGTTACAGTCAGTTGAATTAACCCTCACTAAAGGGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO：129) 
PglGI1.5-R 
5’-GCTGGCGATATAAACTGTTTGCTTCATGAATGCTCCTTTGGGTTACCTCCGGGAAACGCGGTTGATTTGTTTAGTGGTTGAATTATTTGCTCAGGATGTGGCATAGTCAAGGGCGTGACGGCTCGCTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAG-3’(SEQ ID NO：130) 
3′EcoRV-pglstop：5’-CTT GAT ATC TTA GTG TGC GTT AAC CAC CAC(SEQ ID NO：131) 
pgl+49rev：CGTGAATTTGCTGGCTCTCAG(SEQ ID NO：132) 
Bottom Pgb2：GGTTTAGTTCCTCACCTTGTC(SEQ ID NO：133) 
Top GB’s CMP(946)：ACTGAAACGTTTTCATCGCTC(SEQ ID NO：134) 
Pglconfirm-F 
5’-ACCGCCAAAAGCGACTAATTTTAGCT-3’(SEQ ID NO：135) 
i)小规模分析 
培养基配方(每升发酵培养基)： 
K2HPO413.6g，KH2PO413.6g，MgSO4*7H2O 2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，(NH4)2SO43.2g，酵母提取物1g，1000X痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于去离子H2O中。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至6.8并定容。培养基以0.22μm的滤器过滤除菌。灭菌后加入葡萄糖5.0g和抗生素并调节pH。 
1000X痕量金属溶液(每升发酵培养基)： 
柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O 1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO4*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3100mg，NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分逐一溶解于去离子H2O中。以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容溶液，并以0.22μm的滤器过滤除菌。 
a)实验方法 
通过使菌株在来自MicroReactor Technologies，Inc的CelleratorTM中生长而分析异戊二烯的生产。24个孔中的每一个孔中的工作体积是4.5mL。温度维持在30℃，pH设定点是7.0，氧流设定点是20sccm，搅拌速率是800rpm。将取自冷冻瓶的大肠杆菌菌株接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)并在30℃温育。将单一菌落接种进入含有抗生素的培养基中并生长过夜。将细菌稀释进入4.5mL含有抗生素的培养基，达到0.05的光密度(在550nm下测定)。 
使用气体色谱-质谱仪(GC-MS)(Agilent)顶空测定法进行废气中的异戊二烯的分析。样品制备如下：将100μL完整培养液置于密封的GC瓶中并在30℃温育30分钟的固定的时间。加热杀灭步骤之后(其包括在70℃温育5分钟)，将样品装载至GC。 
在运行过程中使用微板读数器(Spectramax)获得550nm的波长下的光密度(OD)。通过将异戊二烯浓度(μg/L)除以读取的OD值和时间(小时)而获得比生产率。 
在200和400μM IPTG诱导水平测定两个菌株EWL256和RM11608-2。在诱导后1、2.5、4.75、和8小时分析样品的异戊二烯生产情况和细胞生长(OD550)。以一式两份进行样品测定。 
b)结果 
该实验证明：在2个不同浓度的IPTG时，表达ybhE(pgl)的菌株的异戊二烯的比生产率比对照菌株显著高2-3倍。 
ii)以15L的规模在补料分批培养物中生长并表达马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶、银白杨异戊二烯合酶和pgl过表达(RHM111608-2)的大肠杆菌的异戊二烯发酵 
培养基配方(每升发酵培养基) 
K2HPO47.5g，MgSO4*7H2O 2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，1000X改良痕量金属溶液1ml。所有的成分一起添加并溶解于去离子H2O中。该溶液经高压灭菌。使用氢氧化铵(30％)将pH调节至7.0并定容。灭菌后加入葡萄糖10g、硫胺*HCl 0.1g、和抗生素并调节pH。 
1000X改良痕量金属溶液： 
柠檬酸*H2O 40g，MnSO4*H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4*7H2O1g，CoCl2*6H2O 1g，ZnSO4*7H2O 1g，CuSO4*5H2O 100mg，H3BO3100mg，NaMoO4*2H2O 100mg。每种成分逐一溶解于去离子H2O中，以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，以0.22μm的滤器过滤除菌。 
在15L的生物反应器中以含有上部甲羟戊酸(MVA)途径(pCL Upper)、整合的下部MVA途径(gi1.2KKDyI)、高度表达的来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶和来自银白杨的异戊二烯合酶(pTrcAlba-mMVK)、和高度表达的pgl(pBBR-pgl)的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行该实验以监测在需要的发酵pH 7.0和温度34℃从葡萄糖形成的异戊二烯。解冻大肠杆菌菌株的冷冻瓶并接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD 1.0后(在550nm测定)，使用500mL接种至15L生物反应器，使最初体积至5L。 
以指数速率进料葡萄糖直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料以满足代谢需求。在40小时(59小时)的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是3.1kg(59小时的话则是4.2kg)。通过加入IPTG进 行诱导。 
当在550nm时的光密度(OD550)达到4时，使IPTG的浓度是110μM。当OD550达到150时，IPTG的浓度升高至192μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图136A。使用Hiden质谱仪测定来自生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯的效价随着发酵过程增大，在40小时的时候达到最大值33.2g/L(59小时的话则是48.6g/L)(图136B)。异戊二烯的效价随着发酵过程增大，在40小时的时候达到最大值40.0g/L(59小时的话则是60.5g/L)(图136C)。在40小时(59小时)的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是281.3g(59小时的话则是451.0g)，生产的时间进程显示于图136D。体积生产率的时间进程显示于图136E，其显示：在0至40小时，平均速率保持在1.0g/L/hr(在19至59小时保持在1.4g/L/小时)。通过CER测定的代谢活性谱显示于图136F。在40小时的情况下，发酵过程中用于生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是19.6％(59小时的话则是23.6％)。在40小时的情况下，从葡萄糖至异戊二烯的重量百分比产率是8.9％(59小时的话则是10.7％)。 
实施例18.异戊二烯聚合 
用于聚合的异戊二烯样品的制备 
(a)1000X改良痕量金属溶液的制备： 
将下述成分中的每一种逐一溶解于去离子H2O中：柠檬酸*H2O(40g)，MnSO4*H2O(30g)，NaCl(10g)，FeSO4*7H2O(1g)，CoCl2*6H2O(1g)，ZnSO4*7H2O(1g)，CuSO4*5H2O(100mg)，H3BO3(100mg)，NaMoO4*2H2O(100mg)。以HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容，以0.22μm的滤器过滤除菌。 
(b)发酵培养基的制备： 
每升发酵培养基含有：K2HPO4(7.5g)，MgSO4*7H2O(2g)，一水合柠檬酸(2g)，柠檬酸铁铵(0.3g)，酵母提取物(0.5g)，1000X改良痕量金属溶液(1ml)。所有的成分一起添加并溶解于去离子H2O中。该溶液经高压灭菌。用氨气(NH3)调节pH至7.0，并定容。在灭菌以后加入葡萄糖 (10g)、硫胺*HCl(0.1g)、和抗生素，并调节pH。 
(c)用于纯化和聚合的异戊二烯样品集合： 
通过使发酵尾气穿过平行地排列在排气歧管上的活性炭罐，通过吸附在活性炭上，收集异戊二烯。 
(d)使用大肠杆菌从葡萄糖制备异戊二烯聚合样品A 
在15L生物反应器中，使用含有pCL PtrcUpperMVA和pTrc KKDyIkIS质粒的BL21(DE3)大肠杆菌细胞，在pH 7.0和30℃进行发酵。将来自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线至LB培养基琼脂平板(含有抗生素)并在37℃温育。将单一菌落接种至胰蛋白胨-酵母提取物培养基。接种物生长至OD 1.0(在550nm测定)后，使用500mL接种至5L生物反应器。 
以指数速率进料葡萄糖，直至细胞达到稳定期。此后，降低葡萄糖进料，以满足代谢需求。在54小时的发酵过程中输送到生物反应器中的葡萄糖的总量是3.7kg。通过加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)进行诱导。当在550nm时的光密度(OD550)达到10的值时，使IPTG的浓度是25μM。当OD550达到190时，IPTG的浓度升高至50μM。在发酵38小时时，IPTG的浓度升高至100μM。生物反应器内的OD550随时间变化的图谱显示于图138。异戊二烯的效价随着发酵过程增大，最终值为2.2g/L(图139)。在54小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是15.9g，生产的时间进程显示于图140。发酵过程中用于生产异戊二烯的所利用的碳的摩尔产率是1.53％(参见图138-140)。 
(e)使用大肠杆菌从葡萄糖和酵母提取物制备异戊二烯聚合样品B 
在500L生物反应器中，使用含有pTrcKudzu+yIDI+DXS质粒的大肠杆菌细胞，在pH 7.0和30℃从葡萄糖和酵母提取物生产异戊二烯。在大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基中制备从冷冻瓶中取出的大肠杆菌菌株的接种物。接种物生长至OD 0.15(在550nm测定)之后，使用20mL接种含有2.5-L胰蛋白胨-酵母提取物培养基的生物反应器。在30℃培养2.5L生物反应器至OD 1.0，将2.0-L转移至500L生物反应器。以指数速率进料酵母提取物(Bio Springer，Montreal，Quebec，Canada)和葡萄糖。在 50小时发酵期间递送给生物反应器的葡萄糖和酵母提取物的总量分别是181.2kg和17.6kg。生物反应器内随时间的光密度显示于图141。异戊二烯的效价随着发酵过程增大(图142)。在50小时的发酵过程中生产的异戊二烯的总量是55.1g，生产的时间进程显示于图143。 
从活性炭解吸异戊二烯(方法A)： 
与搅拌棒一起，将已经暴露于发酵罐废气流的活性炭(130g)放入1000mL烧瓶中。将环己烷(563mL)加入烧瓶，将料浆搅拌2小时。经由线内致冷阱(30mL容量，浸入液氮中)，施加真空(100mbar)。收集并合并4个级分，以产生异戊二烯/环己烷溶液(2.1重量％的异戊二烯，总体积＝53.1g)。在100mbar真空蒸馏该溶液，收集新的异戊二烯/环己烷溶液(产量＝10.1g)，经3A分子筛干燥。该溶液的气相色谱法分析指示7.7重量％的异戊二烯含量。 
从活性炭解吸异戊二烯(方法B)： 
与搅拌棒一起，将已经暴露于发酵罐废气流的活性炭(65g)放入500mL烧瓶中。将Jarytherm DBT(250g)加入活性炭，将料浆搅拌2小时。经由线内致冷阱(30mL容量，浸入液氮中)，施加真空(5mbar)。1小时以后，将所述阱温热至环境温度。在阱中存在2个液相(总重量1.82g)。用环己烷(3.26g)稀释有机相，倾析，经3A分子筛干燥。该溶液的气相色谱法分析指示27.3重量％(或1.22g)的异戊二烯含量。 
钕催化剂的制备： 
将叔碳酸钕(2.68mL，0.51M在己烷中)、三异丁基铝(54mL，1.0M在己烷中)、和氯化二乙基铝(3.40mL，1.0M在己烷中)吸入配有钢套管的塑料注射器中。将前2种成分加入1，3-丁二烯在己烷中的溶液(22.4mL，15重量％的1，3-丁二烯)，放入具有隔膜盖的100mL玻璃罐中，在环境温度搅拌0.5h。将最后一种成分加入溶液中，然后将该溶液在65℃热老化0.5h。最终的溶液是澄清的黄色。基于钕的溶液浓度是0.0164M。 
钛催化剂的制备： 
将具有隔膜入口且含有磁力搅拌棒的100mL玻璃反应器放入0℃冰浴中，装入正己烷(5.07mL，无水)，并在剧烈搅拌下装入纯TiCl4(1.5mL， 13.7mmol)。单独地，制备由二苯基醚(1.2mL，7.6mmol)和三异丁基铝(14.6mL，12.6mmol，25重量％溶液在己烷中)组成的溶液。将该溶液在5分钟内加入反应器中。在加入过程中，形成褐色沉淀物。将悬浮液搅拌10分钟，然后在-40℃储存备用。 
聚合： 
通过使用钕催化剂和n-BuLi聚合异戊二烯聚合样品A，生产主要源自葡萄糖的聚异戊二烯样品。通过使用钕催化剂、钛催化剂、n-BuLi催化剂、和乳液自由基聚合来聚合异戊二烯聚合样品B，生产源自葡萄糖和酵母提取物的共同发酵的聚异戊二烯样品。代表性的聚合条件如下所述。 
使用钕催化剂的异戊二烯的溶液聚合： 
将具有特氟隆包被的搅拌棒的4mL螺旋盖玻璃瓶在烘箱中在150℃退火3h。该瓶配有特氟隆包被的有机硅隔膜和开顶式盖(open-top cap)。然后使用注射器，向瓶中装入异戊二烯溶液(1.5g，7.7重量％在环己烷中，无水)。使用微注射器，将钕催化剂溶液(60μL)注射进瓶中。将瓶子放在调节至65℃的搅拌棒/加热板上，搅拌棒在500rpm旋转。在15分钟以后，溶液变得明显更粘稠。在1.5h的反应时间以后，用异丙醇和丁羟甲苯(BHT)的溶液(30μL，10重量％BHT)猝灭反应。取出100mg料浆样品，用于GPC分析。在环境条件下干燥剩余的聚合物料浆。测得重为110mg的分离的聚合物具有935,000的重均分子量(通过GPC测定)和大于90％的顺式-微结构含量(通过13C-NMR测定)。 
使用Ti催化剂的异戊二烯的溶液聚合： 
将具有特氟隆包被的搅拌棒的4mL螺旋盖玻璃瓶在烘箱中在150℃退火3h。该瓶配有预刻痕的特氟隆包被的有机硅隔膜和开顶式盖。然后使用注射器，向瓶中装入异戊二烯溶液(1.5g，7.7重量％在环己烷中，无水)。磁力地搅拌该钛催化剂悬浮液，用一次性尖头吸管，取出样品(70μL)，然后穿过预刻痕的隔膜将它加入反应瓶中。将反应瓶隔膜替换为实体帽(solid cap)，将瓶子放在调节至65℃的搅拌棒/加热板上，搅拌棒在500rpm旋转。在5分钟以后，溶液变得明显更粘稠。在1.5h的反应时间以后，用异丙醇和丁羟甲苯(BHT)的溶液(30μL.10重量％BHT)猝灭反应。 取出100mg料浆样品，用于GPC分析。在环境条件下干燥剩余的聚合物料浆。测得重为108mg的分离的聚合物具有221,000的重均分子量(通过GPC测定)，且具有大于94％的顺式-微结构含量(通过13C-NMR测定)。 
异戊二烯的乳液聚合： 
将20mL瓶用作聚合罐。用锥子刺穿金属盖2次，将卡纸板衬(linear)替换为橡胶垫圈和特氟隆衬(linear)。用去离子水冲洗瓶子，并在氮下干燥。 
向瓶中加入7.05g去离子水、1.14g 10％肥皂(混合的脂肪酸的钾盐)、174mg 10％过硫酸铵溶液、和24mg正十二烷硫醇。用氮净化烧瓶30秒，并盖上盖。穿过橡胶/特氟隆垫圈，向瓶中装入3mL bio-HG(2.033克异戊二烯)。将瓶子放入标准的瓶聚合浴(第二个空瓶，其允许瓶子安置在4盎司瓶架中)中。将混合物在65℃(+/-0.2℃)搅拌25.5小时。 
后处理： 
将乳液转移至50mL梨形烧瓶，用10mL水稀释。通过在真空下(54mmHg，40-50℃)蒸发2mL水，去除未反应的挥发性有机物。向该乳液中，加入抗氧化剂分散体，140mg 50％活性多酚抗氧化剂(Bostex 24)。通过将它加入稀酸溶液(12mL，18％硫酸在150mL反渗透水)中，使乳液凝固。聚合物凝固成单个大块，将其压碎，并用反渗透水洗涤。样品为灰白色软橡胶样物质。产量是1.24克湿碎块。 
最终的总固体含量(TSC＝100*干重/湿重)是18.9重量％，或大约84％的转化率。 
使用丁基锂的异戊二烯的聚合： 
以1∶10的比例，用正己烷(无水)稀释丁基锂(1.6M在己烷中)。使用在THF中的标准品N-特戊酰基-邻苄基苯胺，滴定溶液。通过使它穿过含有热处理过的硅胶的小柱，干燥异戊二烯在环己烷中的溶液(4mL)。 
给4mL玻璃瓶(在150℃烘干)装入特氟隆包被的小磁力搅拌棒和异戊二烯在环己烷中的溶液(1.35g，21.5重量％)。经由注射器，加入丁基锂(0.14M，己烷)，将该瓶在搅拌棒/加热板上加热至65℃3h。用BHT/异丙醇溶液(10重量％BHT在异丙醇中)猝灭聚合物反应。在真空下去除所有挥发 物。该操作产生290mg聚合物，其代表约100％的理论产率。通过GPC分析，测得该聚合物具有17,880的重均分子量(Mw)，并通过13C NMR，测得其具有67％的顺式-微结构含量、25％的反式-微结构含量、和8％的3，4-微结构含量。 
聚合物的GPC分析： 
尺寸排阻色谱法(SEC)是非常确定的用于测量聚合物分子量和多分散性(Mw/Mn)的技术。使用2个串联的Polymer Laboratories C微凝胶柱，使用四氢呋喃作为载体溶剂，流速为0.7ml/min，柱温度为40℃。使用与Hewlett Packard 1047A折射率检测器相连的Wyatt Technologies miniDawn光散射检测器，进行SEC。使用聚苯乙烯标准品校正该仪器。 
聚合物的NMR分析： 
通过在Varian Unity-+400MHz波谱仪上的13C-NMR分析，在氯仿-d溶剂中测定聚合物微结构。 
表14：来自13C/12C同位素分析的数据 
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义是本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义。Singleton等人，Dictionary of  Microbiology and Molecular Biology，第2版，John Wiley and Sons，New York(1994)，和Hale & Marham，The Harper Collins Dictionary of Biology，Harper Perennial，N.Y.(1991)为技术人员提供了本发明中使用的很多术语的一般含义。应该理解：本发明不限于所描述的特定的方法、程序、和试剂，因为它们是可变的。本领域技术人员还将认识到，也可以使用与本文描述的那些相似或等同的任意方法和材料来实施或测试本发明。 
本文提供的小标题不是本发明的各个方面或实施方式的限制，而已通过参考作为一个整体的说明书来获得本发明。 
除非另有明确指明，否则在本文中使用的术语“一个”、“一种”等是指一个或多个。单数术语“一个”、“一种”和“所述”包括复数所指，除非上下文另外清楚地指明。 
在本文中提及“约”某数值或参数包括(并且描述)涉及该数值或参数本身的实施方式。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。数值范围包括界定该范围的数值。 
应该理解，本文描述的本发明的方面和实施方式包括：“包含”、“由……组成”、和“基本上由……组成”的方面和实施方式。 
在本说明书中给出的每个最大数值限意图包括每个更小的数值限，如同这样的更小的数值限明确地写在本文中。在本说明书中给出的每个最小数值限将包括每个更大的数值限，如同这样的更大的数值限明确地写在本文中。在本说明书中给出的每个数值范围将包括落入这样的更宽数值范围内的每个更窄的数值范围，如同这样的更窄的数值范围都明确地写在本文中。 
附件1 
示例性的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶核酸和多肽 
示例性的乙酰基-辅酶A-乙酰转移酶核酸和多肽 
示例性的HMG-辅酶A合酶核酸和多肽 
示例性的羟基甲基戊二酰-辅酶A还原酶核酸和多肽 
示例性的甲羟戊酸激酶核酸和多肽 
示例性的磷酸甲羟戊酸激酶核酸和多肽 
示例性的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶核酸和多肽 
示例性的异戊烯基磷酸激酶(IPK)核酸和多肽 
示例性的异戊烯基-二磷酸Δ-异构酶(IDI)核酸和多肽 
示例性的异戊二烯合酶核酸和多肽 
Genbank登记号 
AY341431 
AY316691 
AY279379 
AJ457070 
AY182241 

Claims (12)

1.一种用于生产异戊二烯的共聚物的系统，所述系统包括：(a)源自可再生资源的异戊二烯起始组合物；和(b)从至少一部分异戊二烯原料生产的聚合物；其中至少一部分异戊二烯起始组合物经历与另一种非异戊二烯分子的聚合，以生成共聚物，其中所述源自可再生资源的异戊二烯起始组合物包含大于2mg异戊二烯，且包含重量占所述组合物中所有的C5烃总重量的大于99.94％的异戊二烯。
2.权利要求1的系统，其中所述源自可再生资源的异戊二烯起始组合物包含一种或多种选自下述的化合物：乙醇、丙酮、3－甲基－2－丁烯－1－醇、和具有10个或更多个碳原子的类异戊二烯化合物。
3.权利要求1的系统，其中所述聚合物是选自下述的共聚物：(i)异戊二烯和1,3-丁二烯的共聚物，(ii)异戊二烯和苯乙烯的共聚物，(iii)异戊二烯、1,3-丁二烯、和苯乙烯的共聚物，和(iv)异戊二烯和α-甲基苯乙烯的共聚物。
4.权利要求1的系统，其中从异戊二烯原料生产的聚合物是包含源自异戊二烯单体的重复单元的聚异戊二烯聚合物，其中所述聚异戊二烯聚合物具有大于0.9的fM值，其中fM指modem碳的分数，由国家标准和技术研究所标准参照物4990B和4990C来确定。
5.权利要求1的系统，其还包含下述的一种或多种：(i)用于聚合异戊二烯的催化剂，(ii)聚合引发剂，(iii)离子型表面活性剂，(iv)合适的有机溶剂，和(v)聚合链终止剂。
6.权利要求2的系统，其中所述聚合物是选自下述的共聚物：(i)异戊二烯和1,3-丁二烯的共聚物，(ii)异戊二烯和苯乙烯的共聚物，(iii)异戊二烯、1,3-丁二烯、和苯乙烯的共聚物，和(iv)异戊二烯和α-甲基苯乙烯的共聚物。
7.权利要求2的系统，其中从异戊二烯原料生产的聚合物是包含源自异戊二烯单体的重复单元的聚异戊二烯聚合物，其中所述聚异戊二烯聚合物具有大于0.9的fM值。
8.权利要求2的系统，其还包含下述的一种或多种：(i)用于聚合异戊二烯的催化剂，(ii)聚合引发剂，(iii)离子型表面活性剂，(iv)合适的有机溶剂，和(v)聚合链终止剂。
9.权利要求2的系统，其中所述源自可再生资源的异戊二烯起始组合物包含丙酮。
10.权利要求2的系统，其中所述源自可再生资源的异戊二烯起始组合物包含至少一种C5异戊二烯基醇。
11.权利要求2的系统，其中所述源自可再生资源的异戊二烯起始组合物包含至少一种具有10个或更多个碳原子的类异戊二烯化合物。
12.权利要求1的系统，其中所述系统还包含一种或多种选自下述的化合物：乙醇、丙酮、甲醇、乙醛、异丁烯醛、甲基乙烯基酮、2-甲基-2-乙烯基环氧乙烷、顺式-和反式-3-甲基-1,3-戊二烯、C5异戊二烯基醇、2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2,4,5-三甲基吡啶、2,3,5-三甲基吡嗪、香茅醛、甲硫醇、乙酸甲酯、1-丙醇、二乙酰、2-丁酮、2-甲基-3-丁烯-2-醇、乙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醛、3-甲基-2-丁酮、1-丁醇、2-戊酮、3-甲基-1-丁醇、异丁酸乙酯、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸丁酯、3-甲基丁基乙酸酯、3-甲基-3-丁烯-1-基乙酸酯、3-甲基-2-丁烯-1-基乙酸酯、(E)-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯、(Z)-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯、和2,3-环庚烯醇吡啶；和(b)从至少一部分异戊二烯原料生产的聚合物；其中至少一部分异戊二烯起始组合物经历与另一种非异戊二烯分子的聚合，以生成共聚物。
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