KR20120047908A - 이소프렌 유도체들을 포함하는 연료 조성물들 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다양한 탄화수소 연료들 및 연료 첨가물들의 생산을 위해, 재생가능한 (renewable) 탄소로부터 유래한 바이오이소프렌 (bioisoprene)을 사용하는 방법들, 조성물들 및 시스템들을 제공한다.

Description

이소프렌 유도체들을 포함하는 연료 조성물들 {FUEL COMPOSITIONS COMPRISING ISOPRENE DERIVATIVES}

본 발명은 다양한 탄화수소 연료들 및 연료 첨가물들의 생산을 위해, 재생가능한 탄소로부터 유래한 바이오이소프렌 (bioisoprene)을 사용하는 방법들, 조성물들 및 시스템들을 제공한다.

재생가능한 운송 (transportation) 연료의 개발은 21세기의 중요한 도전 과제의 하나이다. 최근의 시장은 슈크로스와 전분의 효모 발효로부터 유래한 에탄올이 또한 약간의 정도는 트리글리세라이드 (triglycerides)로부터 유래한 바이오디젤 (지방산 에스테르들)이 점유하고 있다. 에탄올은 탄화수소에 비해 더 낮은 에너지 밀도를 가지는 액체 연료로서 한계점을 가진다. 또한, 에탄올은 그의 물에 대한 친화성 및 부식 특성으로 인해 통상적인 기반 (infrastructure)으로는 운송될 수 없다. 재생가능한 탄소원 (바이오매스, 슈가, 오일)의 탄화수소로의 전환 공정은 바이오에탄올 (bioethanol)에 대한 매력적인 대안을 제시한다.

이소프렌 (2-메틸-1,3-부타디엔)은 합성 고무의 생산에 주로 사용되는 중요한 산업적 화합물이다. 최근 들어, 이소프렌은 직접적으로 나프타 및 기타 다른 석유 분획의 열분해 (cracking)에 의해, 또는 간접적으로 화학적 합성에 의해 석유화학적 출처로부터 유래한다 (예를 들어, H. Pommer and A. Nurrenbach, Industrial Synthesis of Terpene Compounds, Pure Appl. Chem., 1975, 43, 527-551; H. M. Weitz and E. Loser, Isoprene, in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 제 7판, Electronic Release, Wiley-VCH Verlag GMBH, Weinheim, 2005; and H.M. Lybarger, Isoprene in Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology,제 4판, 윌리 (Wiley) 출판사, 뉴욕 (1995), 14, 934-952을 참조하라). 그 결과 나온 조 (crude) 이소프렌 수증기는 전형적으로 수많은 화학적으로 유사한 불순물들을 제거하도록 철저한 (extensive) 정제 공정을 거쳐야 하는 데, 이들의 많은 수가 중합체 및 다른 화합물로의 이소프렌의 연속적 변환 (transformation)을 방해할 수도 있다.

대조적으로, 생물학적 출처로부터 유래한 이소프렌은 매우 적은 탄화수소 불순물을 포함하는 대신 에탄올, 아세트알데하이드 및 아세톤과 같은 많은 산화된 화합물들을 포함한다. 이들 화합물의 많은 수는 물과 접촉에 의해 또는 알루미나 또는 다른 흡착제 (adsorbents)에 의해 쉽게 제거될 수 있다.

산업은 이소프렌의 생산을 위해 석유화학적 공급원료에 의존하고 이소프렌이 중합체 및 다른 화합물들로 변환될 수 있기 이전에 철저한 정제 공정이 필요하다. 생물학적으로 생산된 이소프렌을 고순도 (high purity) 및/또는 이소프렌의 독특한 불순도 프로파일 (unique impurity profiles)을 장점으로 하는 소중한 화학적 제품으로 전환하기 위해서는 비용이 저렴한 방법이 바람직하다.

본 명세서에서 인용되는 모든 특허들, 특허 출원들, 서류들, 및 논문들은 전부가 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있다.

매우 순수한 이소프렌으로부터 연료 성분 (fuel constituents)을 생산하는 방법들 및 시스템들 또한 매우 순수한 이소프렌으로부터 생산된 연료 조성물들 (fuel compositions)이 기재되어 있다.

한 가지 관점에서, 본 발명은 바이오이소프렌 조성물 (bioisoprene composition)에서 이소프렌의 실질적인 부분을 비-이소프렌 화합물들로 화학적으로 변환시키는 것을 포함하는 바이오이소프렌 조성물로부터 연료 성분을 생산하는 방법을 제공한다. 한 가지 구현예에서, 본 바이오이소프렌 조성물은 이소프렌 이중합 (dimerization)에 적합한 가열 (heat) 또는 촉매적 조건에 바이오이소프렌 조성물을 맡겨두어 이소프렌 이중체 (isoprene dimer)를 생산한 다음, 이소프렌 이중체를 촉매적으로 수소화하여 포화된 C10 연료 성분을 형성하는 것에 의해 화학적으로 변환된다. 또 다른 구현예에서, 본 바이오이소프렌 조성물은 (i) 바이오이소프렌 조성물을 부분적으로 수소화하여 이소아밀렌 (isoamylene)을 생산하고, (ii) 이소아밀렌을 이소아밀렌, 프로필렌 및 이소부텐으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 모노-올레핀과 이중합하여 디메이트 (dimate)를 형성하고, 또한 (iii) 디메이트를 완전하게 수소화하여 연료 성분을 생산하는 것에 의해 화학적으로 변환된다. 일정 구현예에서, 바이오이소프렌 조성물에서 적어도 약 95%의 이소프렌은 화학적 변환 과정 (chemical transformation) 동안 비-이소프렌 화합물들로 전환된다. 일정 구현예에서, 바이오이소프렌 조성물은 약 150℃ 내지 약 250℃로 가열되어 불포화된 고리형 (unsaturated cyclic) 이소프렌 이중체를 생산하고, 불포화된 고리형 이소프렌 이중체는 촉매적으로 수소화되어 포화된 고리형 (saturated cyclic) 이소프렌 이중체의 연료 성분을 생산한다. 일정 구현예에서, 본 방법은 (i) 바이오이소프렌 조성물을 이소프렌의 고리-이중합 (cyclo-dimerization)을 촉매 작용하는 촉매와 접촉시켜서 불포화된 고리형 이소프렌 이중체를 생산하고, 상기 불포화된 고리형 이소프렌 이중체는 촉매적으로 수소화되어 포화된 고리형 이소프렌 이중체의 연료 성분을 생산하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 고리-이중합을 촉매 작용하는 촉매는 니켈 (nickel) 촉매, 철 (iron) 촉매 및 크롬 (chromium) 촉매로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 촉매를 포함한다. 일정 구현예에서, 바이오이소프렌 조성물을 부분적으로 수소화하는 단계는 바이오이소프렌 조성물을 수소 기체 및 이소프렌의 부분적 수소화를 촉매 작용하는 촉매와 접촉시키는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 부분적 수소화를 촉매 작용하는 촉매는 팔라듐 (palladium) 촉매를 포함한다. 일정 구현예에서, 이소아밀렌을 모노-올레핀 (mono-olefins)과 이중합하는 단계는 이소아밀렌을 모노-올레핀의 이중합을 촉매 작용하는 촉매의 존재 시 모노-올레핀과 접촉시키는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 모노-올레핀의 이중합을 촉매 작용하는 촉매는 산 (acid) 촉매를 포함한다. 일정 구현예에서, 본 방법은 상기에 더하여 바이오이소프렌 조성물을 연료 성분으로 화학적으로 변환시키기 이전에 상기 바이오이소프렌 조성물로부터 이소프렌을 정제하는 것을 포함한다.

한 가지 관점에서, 본 발명은 바이오이소프렌 조성물에서 이소프렌의 실질적인 부분을 비-이소프렌 화합물로 화학적으로 전환시키는, 바이오이소프렌 조성물로부터 연료 성분을 생산하는 시스템을 제공하고, 본 시스템은 바이오이소프렌 조성물 또한 (a)(i) 바이오이소프렌 조성물에서 이소프렌을 이중합할 수 있는 하나 이상의 화합물 또는 바이오이소프렌 조성물에서 이소프렌을 이중합할 수 있는 가열원 (source of heat); 및 (ii) 이소프렌 이중체를 수소화하여 포화된 C10 연료 성분을 형성할 수 있는 촉매; 또는 (b)(i) 바이오이소프렌 조성물에서 이소프렌을 부분적으로 수소화하여 이소아밀렌을 생산할 수 있는 화합물, (ii) 이소아밀렌을 이소아밀렌, 프로필렌 및 이소부텐으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 모노-올레핀으로 이중합하여 디메이트를 형성할 수 있는 화합물, 및 (iii) 디메이트를 완전하게 수소화하여 연료 성분을 생산할 수 있는 화합물을 포함한다.

본 시스템의 일정 구현예에서, 바이오이소프렌 조성물은 약 2 mg 이상의 이소프렌을 포함하고, 상기 조성물에서의 모든 C5 탄화수소의 전체 무게에 대비한 무게로 약 99.94% 이상의 이소프렌을 포함한다. 시스템의 일정 구현예에서, 이소프렌을 이중합할 수 있는 하나 이상의 화합물은 루테늄 (ruthenium) 촉매, 니켈 촉매, 철 촉매 및 크롬 촉매로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 촉매를 포함하는 이소프렌의 고리-이중합 (cyclo-dimerization)을 촉매 작용하는 촉매를 포함한다. 시스템의 일정 구현예에서, 불포화된 이소프렌 이중체를 수소화하는 촉매는 팔라듐 촉매, 니켈 촉매, 루테늄 촉매 및 로듐 (rhodium) 촉매로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 촉매를 포함한다. 시스템의 일정 구현예에서, 이소프렌을 부분적으로 수소화할 수 있는 화합물은 팔라듐 촉매를 포함한다. 시스템의 일정 구현예에서,이소아밀렌을 모노-올레핀으로 이중합할 수 있는 화합물은 산 촉매를 포함한다.

한 가지 관점에서, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 방법에 의해 생산되는 연료 성분을 포함하는 연료 조성물을 제공한다. 일정 구현예에서, 연료 조성물은 실질적으로 이소프렌이 없다. 일정 구현예에서, 연료 조성물은 -22‰ 이상 또는 -32‰ 내지 -24‰의 범위 이내인 δ¹³C 값을 가진다.

일정 관점에서, 본 발명은 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌의 적어도 일부분이 화학적 변환을 거치는, (a) 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌; 및 (b) 매우 순수한 이소프렌의 적어도 일부분으로부터 생산된 연료 성분:을 포함하는 이소프렌으로부터 연료 성분을 생산하는 시스템을 제공한다.

본 시스템의 일정 구현예에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌은 약 2 mg 이상의 이소프렌을 포함하고, 상기 조성물에서의 모든 C5 탄화수소의 전체 무게에 대비하여 무게로 약 99.94% 이상의 이소프렌을 포함한다. 일정 구현예에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌은 약 2 mg 이상의 이소프렌을 포함하고, 에탄올, 아세톤, C5 프레닐 알코올 (C5 prenyl alcohols), 및 10개 이상의 탄소 원자를 가지는 이소프레노이드 화합물 (isoprenoid compounds)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함한다. 일정 구현예에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌은 약 2 mg 이상의 이소프렌을 포함하고, 에탄올, 아세톤, 메탄올, 아세트알데하이드, 메타크롤레인 (methacrolein), 메틸 비닐 케톤 (methyl vinyl ketone), 2-메틸-2-비닐옥시란 (2-methyl-2-vinyloxirane), 시스- 및 트랜스-3-메틸-1,3-펜타디엔 (cis- and trans-3-methyl-1,3-pentadiene), C5 프레닐 알코올, 2-헵탄온 (2-heptanone), 6-메틸-5-헵텐-2-온 (6-methyl-5-hepten-2-one), 2,4,5-트리메틸피리딘 (2,4,5-trimethylpyridine), 2,3,5-트리메틸피라진 (2,3,5-trimethylpyrazine), 시트로넬랄 (citronellal), 메탄티올 (methanethiol), 메틸 아세테이트 (methyl acetate), 1-프로판올 (1-propanol), 디아세틸 (diacetyl), 2-부탄온 (2-butanone), 2-메틸-3-부텐-2-올 (2-methyl-3-buten-2-ol), 에틸 아세테이트 (ethyl acetate), 2-메틸-1-프로판올 (2-methyl-1-propanol), 3-메틸-1-부탄알 (3-methyl-1-butanal), 3-메틸-2-부탄온 (3-methyl-2-butanone), 1-부탄올 (1-butanol), 2-펜탄온 (2-pentanone), 3-메틸-1-부탄올 (3-methyl-1-butanol), 에틸 부틸레이트 (ethyl isobutyrate), 3-메틸-2-부텐알 (3-methyl-2-butenal), 부틸 아세테이트 (butyl acetate), 3-메틸부틸 아세테이트 (3-methylbutyl acetate), 3-메틸-3-부텐-1-일 아세테이트 (3-methyl-3-buten-1-yl acetate), 3-메틸-2-부텐-1-일 아세테이트 (3-methyl-2-buten-1-yl acetate), 3-헥센-1-올 (3-hexen-1-ol), 3-헥센-1-일 아세테이트 (3-hexen-1-yl acetate), 리모넨 (limonene), 게라니올 (트랜스-3,7-디메틸-2,6-옥타디엔-1-올)(geraniol (trans-3,7-dimethyl-2,6-octadien-1-ol)), 시트로넬롤 (3,7-디메틸-6-옥텐-1-올) (citronellol (3,7-dimethyl-6-octen-1-ol)), (E)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔 ((E)-3,7-dimethyl-1,3,6-octatriene), (Z)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔 ((Z)-3,7-dimethyl-1,3,6-octatriene), 및 2,3-사이클로헵텐올피리딘 (2,3-cycloheptenolpyridine)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 두 번째 화합물을 포함하고; 이소프렌의 양에 대비한 두 번째 화합물의 양은 약 0.01% (w/w) 이상이 된다. 일정 구현예에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌은 약 2 mg 이상의 이소프렌을 포함하고, 이소프렌의 다중합 (polymerization)을 저해하는 조성물에서의 화합물이라면 모두는 화합물 당 약 0.5 μg/L 이하를 포함한다. 일정 바람직한 구현예에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌은 생물학적 공정에 의해 생산된다.

본 시스템의 일정 구현예에서, 연료 성분은 고리형 이소프렌 이중체 (dimers) 및 삼중체 (trimers), 직선형 이소프렌 올리고머 (oligomers), 방향족 (aromatic) 및 비-고리형 (alicyclic) 이소프렌 유도체, 및 산화된 이소프렌 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함한다. 일정 구현예에서, 산화된 이소프렌 유도체는 이소프렌으로부터 유래한 알코올, 케톤, 에스테르 및 에테르로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물이다.

일정 구현예에서, 연료 성분은 고리형 이소프렌 이중체를 포함하고 화학적 변환은 이소프렌의 이중합 반응을 포함한다. 일정 구현예에서, 이중합 반응은 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌을 가열하여 수행된다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 이중합 반응은 불포화된 이소프렌 이중체를 포함하는 산물을 생산하고 화학적 변환은 불포화된 이소프렌 이중체의 수소화 반응 (hydrogenation reaction)을 포함한다. 일정 구현예에서, 시스템은 좀 더 나아가 불포화된 이소프렌 이중체의 수소화 반응을 촉매 작용하는 촉매를 포함한다. 일정 구현예에서, 불포화된 이소프렌 이중체의 수소화 반응을 촉매 작용하는 촉매는 팔라듐 촉매, 니켈 촉매, 루테늄 촉매 및 로듐 (rhodium) 촉매로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 촉매를 포함한다.

일정 구현예에서, 이중합 반응은 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌을 이소프렌의 고리-이중합을 촉매 작용하는 촉매와 접촉하여 수행된다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 고리-이중합을 촉매 작용하는 촉매는 루테늄 촉매, 니켈 촉매, 철 촉매 및 크롬 촉매로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 촉매를 포함한다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 고리-이중합을 촉매 작용하는 촉매는 니켈 촉매이고, 연료 성분은 8개-구성원으로 된 하나 이상의 이소프렌의 고리 이중체를 포함한다.

일정 구현예에서, 연료 성분은 이소프렌의 직선형 및/또는 고리형 삼중체를 포함하고 화학적 변환은 이소프렌의 촉매적 삼중합 (trimerization)을 포함한다.

한 가지 관점에서, 본 발명은 (a) 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌을 획득하고; 또한 (b) 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌의 적어도 일부분을 연료 성분으로 화학적으로 변환하는 것:을 포함하는 이소프렌으로부터 연료 성분을 생산하는 방법을 제공한다. 일정 구현예에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌은 바이오이소프렌 (bioisoprene)을 포함한다.

일정 구현예에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌은, (i) 세포가 (1) 약 400 nmole/g_wem/시간 이상의 이소프렌을 생산하거나, (2) 세포 배양 배지로부터 연소하는 탄소의 0.02 몰라 퍼센트 이상을 이소프렌으로 전환시키거나, (3) 약 0.1 mg/L_액체배지/시간 이상 이소프렌의 이소프렌의 평균 부피측정 생산도를 가지는, 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드 (isoprene synthase polypeptide)를 인코딩하는 이종유래 (heterologous) 핵산을 포함하는 세포를 이소프렌의 생산에 적합한 배양 조건 하에서 배양하고; 또한 (ii) 이소프렌을 생산하는 것:을 포함하는 단계에 의해 획득된다. 일정 구현예에서, 세포는 좀 더 나아가 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드 또는 MVA 경로 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산을 포함한다.

본 명세서에서 기술된 방법의 일정 구현예에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌의 적어도 일부분을 연료 성분으로 화학적으로 변환시키는 것은 (i) 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌을 약 150℃ 내지 약 250℃로 가열하고; (ii) 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌의 적어도 일부분을 불포화된 고리형 이소프렌 이중체로 전환시키고; (iii) 불포화된 고리형 이소프렌 이중체를 수소화하여 포화된 고리형 이소프렌 이중체를 생산하고; 또한 (iv) 연료 성분을 생산하는 것:을 포함한다. 일정 구현예에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌에서 적어도 약 20% 내지 약 100%의 이소프렌은 불포화된 고리형 이소프렌 이중체로 전환된다.

본 방법의 일정 구현예에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌의 적어도 일부분을 연료 성분으로 화학적으로 변환하는 것은 (i) 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌을 이소프렌의 고리-이중합을 촉매 작용하는 촉매와 접촉시키고; (ii) 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌의 적어도 일부분을 고리형 이소프렌 이중체로 전환시키고; 또한 (iii) 연료 성분을 생산하는 것:을 포함한다.

본 방법의 일정 구현예에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌의 적어도 일부분을 연료 성분으로 화학적으로 변환하는 것은 (i) 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌을 이소프렌의 고리-이중합을 촉매 작용하는 촉매와 접촉시키고; (ii) 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌의 적어도 일부분을 불포화된 고리형 이소프렌 이중체로 전환시키고; (iii) 불포화된 고리형 이소프렌 이중체를 수소화하여 포화된 고리형 이소프렌 이중체를 생산하고; 또한 (iv) 연료 성분을 생산하는 것:을 포함한다. 본 방법의 일정 구현예에서, 이소프렌의 고리-이중합을 촉매 작용하는 촉매는 니켈 촉매, 철 촉매 및 크롬 촉매로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 촉매를 포함한다.

본 방법의 일정 구현예에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌의 적어도 일부분을 연료 성분으로 화학적으로 변환하는 것은 (i) 매우 순수한 이소프렌을 촉매 시스템과 접촉시키고; (ii) 시작 (starting) 이소프렌 조성물의 적어도 일부분을 불포화된 이소프렌 이중체 및/또는 삼중체로 전환시키고; (iii) 불포화된 이중체 및/또는 삼중체를 수소화하여 포화된 C10 및/또는 C15 탄화수소를 생산하는 것:을 포함한다.

일정 구현예에서, 이소프렌으로부터 연료 성분을 생산하는 방법은 (a) 본 명세서에서 기술된 매우 순수한 이소프렌의 시작 조성물이라면 모두의 시판되는 유리한 양을 획득하고; (b) 시작 이소프렌 조성물의 적어도 일부분을 산화된 이소프렌 유도체로 전환시키고; 또한 임의적으로 (c) 불포화된 산화된 이소프렌 유도체를 수소화하여 포화된 산화물을 생산하는 것:을 포함한다. 일정 구현예에서, 산화된 이소프렌 유도체는 이소프렌으로부터 유래한 알코올, 케톤, 에스테르, 및 에테르로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물이다.

일정 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 방법이라면 모두는 좀 더 나아가 적어도 일부분의 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌을 연료 성분으로 화학적으로 변환하기 이전에 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌을 정제하는 것을 포함한다.

한 가지 관점에서, (a) 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌을 연속적으로 생산하고; 또한 (b) 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌의 적어도 일부분을 연료 성분으로 연속적으로 변환하는 것:을 포함하는 이소프렌으로부터 연료 성분을 생산하는 연속적 방법 (continuous process)이 제공된다. 일정 구현예에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌은 이소프렌을 포함하는 기체 상 (gas phase)을 포함한다. 일정 구현예에서, 본 방법은 좀 더 나아가 적어도 일부분의 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌을 화학적으로 변환시키도록 이소프렌을 포함하는 기체 상을 반응기 (reactor)에 통과시키는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌은 바이오이소프렌을 포함한다.

또한 본 명세서에서 기술된 방법이라면 모두에 의해 생산된 연료 성분을 포함하는 연료 조성물이 제공된다. 일정 구현예에서, 연료 성분은 본 명세서에서 기술된 방법에 따른 단계를 거친 이후에 이소프렌이 아닌 C5 탄화수소로부터 나온 약 0.5 μg/L 이하의 산물을 포함한다. 일정 구현예에서, 연료 성분은 본 명세서에서 기술된 방법에 따른 단계를 거친 이후에 에탄올, 아세톤, 메탄올, 아세트알데하이드, 메타크롤레인, 메틸 비닐 케톤, 2-메틸-2-비닐옥시란, 시스- 및 트랜스-3-메틸-1,3-펜타디엔, C5 프레닐 알코올, 2-헵탄온, 6-메틸-5-헵텐-2-온, 2,4,5-트리메틸피리딘, 2,3,5-트리메틸피라진, 시트로넬랄, 메탄티올, 메틸 아세테이트, 1-프로판올, 디아세틸, 2-부탄온, 2-메틸-3-부텐-2-올, 에틸 아세테이트, 2-메틸-1-프로판올, 3-메틸-1-부탄알, 3-메틸-2-부탄온, 1-부탄올, 2-펜탄온, 3-메틸-1-부탄올, 에틸 부틸레이트, 3-메틸-2-부텐알, 부틸 아세테이트, 3-메틸부틸 아세테이트, 3-메틸-3-부텐-1-일 아세테이트, 3-메틸-2-부텐-1-일 아세테이트, 3-헥센-1-올, 3-헥센-1-일 아세테이트, 리모넨, 게라니올 (트랜스-3,7-디메틸-2,6-옥타디엔-1-올), 시트로넬롤 (3,7-디메틸-6-옥텐-1-올), (E)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔, (Z)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔, 및 2,3-사이클로헵텐올피리딘로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물로부터 나온 하나 이상의 산물을 포함한다.

일정 구현예에서, 연료 조성물은 -22‰ 이상인 δ¹³C 값을 가지는 연료 조성물을 포함한다. 일정 구현예에서, 연료 조성물은 -22‰ 내지 -10‰ 또는 -34‰ 내지 -24‰ 범위 이내인 δ¹³C 값을 가진다. 일정 구현예에서, 연료 조성물은 0.9 이상이 되는 f_M 값을 가진다. 전체 연료 조성물의 전체 무게 또는 부피를 기초로 하여 무게 또는 부피로 약 1%로부터 약 95%까지의 양으로 석유를 기초로 하는 연료와 본 명세서에서 기술된 연료 조성물이라면 모두의 혼합물도 또한 제공된다.

본 출원은 기재 내용이 본 명세서에서 참고문헌으로 전부 통합되어 있는, 2009년 06월 17일자로 제출된 미국 가특허출원 번호 제 61/187,959호에 대한 우선권을 주장한다.

본 발명은 그 중에서도 특히 이소프렌으로부터 연료 성분을 생산하는 조성물들 및 방법들을 제공한다. 본 명세서에서는 연료 성분 또는 첨가제, 예를 들어 고리형 이소프렌 이중체 (dimers) 및 삼중체 (trimers), 직선형 이소프렌 올리고머 (oligomers), 방향족 (aromatic) 및 비고리형 (acyclic) 이소프렌 유도체 및 산화된 (oxygenated) 이소프렌 유도체가 제공된다. 본 연료 성분은 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌을 포함하는 시작 물질의 화학적 변환에 의해 생산될 수 있다. 한 가지 관점에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌은 바이오이소프렌 (bioisoprene)을 포함한다. 또 다른 관점에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌은 이종유래 이소프렌 합성효소를 발현하는 세포를 배양하여 생산되는 매우 순수한 이소프렌 조성물일 수 있다. 다른 관점에서, 매우 순수한 이소프렌은 올리고중합 (oligomerization)를 거쳐서 고리형 이중체 또는 삼중체 및 직선형 올리고머와 같은 불포화된 이소프렌 올리고머를 형성한다. 불포화된 올리고머는 수소화되어 포화된 탄화수소 연료 성분을 생산할 수 있다. 일정 구현예에서, 산 촉매의 존재 시 매우 순수한 이소프렌의 알코올과 반응은 연료 산화물 (fuel oxygenates)을 생산한다. 또 다른 관점에서, 매우 순수한 이소프렌은 부분적으로 수소화되어 이소아밀렌 (isoamylenes)을 생산한다. 일정 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌으로부터 유래한 이소아밀렌 산물은 이중합을 거쳐서 이소데센 (isodecenes)을 형성한다. 일정 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌으로부터 유래한 이소아밀렌 산물은 산 촉매의 존재 시 알코올과 반응하여 연료 산화물을 생산한다.

재생가능한 탄소 (renewable carbon)로부터 유래한 바이오이소프렌은 화학적 촉매작용 (catalysis)에 의해 다양한 탄화수소 연료들로 전환될 수 있다. 본 명세서에서는 더 높은 분자량의 화합물에 대한 화학적 촉매작용에 의해 발효 및 이어지는 탄화수소 연료로의 전환으로부터 이소프렌을 회수하는 방법들이 제공된다. 이들 방법은 이에 제한되는 것은 아니지만, 발효 배출-기체 및 이어지는 기체 상 또는 액상 촉매작용으로부터 연료값 (fuel value)을 가지는 화합물을 제공하도록 이소프렌을 회수하고 정제하는 것을 포함한다. 연속식 및 회분식 공정은 둘 다 본 발명의 범위 이내인 것으로 고려될 수 있다.

본 명세서에서 보다 상세하게 기술되는 바, 바이오이소프렌 조성물은 보통 석유-이소프렌 (petro-isoprene) 조성물에 존재하는, 이에 제한되는 것은 아니지만 1,3-사이클로펜타디엔 (1,3-cyclopentadiene), 트랜스-1,3-펜타디엔 (trans-1,3-pentadiene), 시스-1,3-펜타디엔 (cis-1,3-pentadiene), 1,4-펜타디엔 (1,4-pentadiene), 1-펜틴 (1-pentyne), 2-펜틴 (2-pentyne), 3-메틸-1-부틴 (3-methyl-l-butyne), 펜트-4-엔-1-인 (pent-4-ene-1-yne), 트랜스-펜트-3-엔-1-인 (tans-pent-3-ene-1-yne), 및 시스-펜트-3-엔-1-인 (cis-pent-3-ene-1-yne)과 같은 오염시키는 불포화된 C5 탄화수소라면 모두가 실질적으로 없어서 석유-이소프렌 조성물과는 구별된다.

본 명세서에서 기술된 바이오이소프렌 시작 물질에서 오염시키는 불포화된 C5 탄화수소라면 모두가 존재하지 않는 경우는, 그들이 석유-이소프렌 조성물에서 보다 낮은 수준으로 존재하는 것이다. 따라서, 본 명세서에서 기술된 바이오이소프렌 조성물로부터 유래한 연료 산물이라면 모두가 오염시키는 불포화된 C5 탄화수소 또는 이러한 오염시키는 불포화된 C5 탄화수소로부터 유래한 산물이라면 모두가 본질적으로 없거나, 석유-이소프렌으로부터 유래한 연료 산물에서보다 낮은 수준으로 포함한다. 또한, 바이오이소프렌 조성물에서 황 수준은 석유-이소프렌 조성물에서의 황 수준보다 낮다. 바이오이소프렌 조성물로부터 유래한 연료 산물은 석유-이소프렌으로부터 유래한 연료 산물에서보다 낮은 수준의 황을 포함한다.

바이오이소프렌은 알코올, 알데하이드, 케톤 등과 같은 석유-이소프렌 조성물에서 존재하지 않거나 보다 더 낮은 수준으로 존재하는 다른 바이오-부산물들 (bio-byproducts) (바이오이소프렌과 함께 획득되는 생물학적 출처 및/또는 관련 생물학적 공정로부터 유래한 화합물들)과 함께 바이오이소프렌이 생산되는 점에서 석유-이소프렌과 구별된다. 바이오-부산물로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 에탄올, 아세톤, 메탄올, 아세트알데하이드, 메타크롤레인, 메틸 비닐 케톤, 2-메틸-2-비닐옥시란, 시스- 및 트랜스-3-메틸-1,3-펜타디엔, C5 프레닐 알코올, 2-헵탄온, 6-메틸-5-헵텐-2-온, 2,4,5-트리메틸피리딘, 2,3,5-트리메틸피라진, 시트로넬랄, 메탄티올, 메틸 아세테이트, 1-프로판올, 디아세틸, 2-부탄온, 2-메틸-3-부텐-2-올, 에틸 아세테이트, 2-메틸-1-프로판올, 3-메틸-1-부탄알, 3-메틸-2-부탄온, 1-부탄올, 2-펜탄온, 3-메틸-1-부탄올, 에틸 부틸레이트, 3-메틸-2-부텐알, 부틸 아세테이트, 3-메틸부틸 아세테이트, 3-메틸-3-부텐-1-일 아세테이트, 3-메틸-2-부텐-1-일 아세테이트, 3-헥센-1-올, 3-헥센-1-일 아세테이트, 리모넨, 게라니올 (트랜스-3,7-디메틸-2,6-옥타디엔-1-올), 시트로넬롤 (3,7-디메틸-6-옥텐-1-올), (E)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔, (Z)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔, 2,3-사이클로헵텐올피리딘, 또는 직선형 이소프렌 중합체 (복수의 이소프렌 단위의 다중합으로부터 유래한 직선형 이소프렌 이중체 또는 직선형 이소프렌 삼중체와 같음)를 포함할 수 있다. 바이오이소프렌으로부터 유래한 연료 산물은 하나 이상의 바이오-부산물 또는 바이오-부산물이라면 모두로부터 유래한 화합물들을 포함한다. 또한, 바이오이소프렌으로부터 유래한 연료 산물은 이어지는 화학적 전환 과정 동안 이들 바이오-부산물로부터 형성되는 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 화합물의 예로는 이소프렌 또는 그의 연료 유도체로 친디엔체 (dienophiles)의 디엘-알더 고리첨가 (Diels-Alder cycloaddition), 이소프렌 또는 그의 연료 유도체의 산화로부터 유래한 것을 포함한다.

좀 더 나아가, 바이오이소프렌은 탄소 지문분석 (finger-print)에 의해 석유-이소프렌과 구별된다. 한 가지 관점에서, 바이오이소프렌은 석유-이소프렌보다 높은 방사성 탄소-14 (¹⁴C) 함량 또는 ¹⁴C/¹²C 비율을 가진다. 바이오이소프렌은 재생사능한 탄소원으로부터 생산되고, 따라서 바이오이소프렌에서 ¹⁴C 함량 또는 ¹⁴C/¹²C 비율은 현재 대기에서의 수치와 동일하다. 한편, 석유-이소프렌은 수십 억년 전에 퇴적된 화석 연료로부터 유래하고, 따라서 ¹⁴C 함량 또는 ¹⁴C/¹²C 비율은 방사성 붕괴로 인해 감소된다. 본 명세서에서 보다 상세하게 기술되는 바, 바이오이소프렌으로부터 유래한 연료 산물은 석유-이소프렌으로부터 유래한 석유 산물보다 높은 ¹⁴C 함량 또는 ¹⁴C/¹²C 비율을 가진다. 한 가지 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 바이오이소프렌으로부터 유래한 연료 산물은 대기에서의 수치와 유사한 ¹⁴C 함량 또는 ¹⁴C/¹²C 비율을 가진다. 또 다른 관점에서, 바이오이소프렌은 안정한 탄소 동위원소 비율 (¹³C/¹²C)에 의해 석유-이소프렌과 분석적으로 구별될 수 있고, 이는 기호 δ¹³C로 표시되는 "델타 값 (delta values)"으로서 보고될 수 있다. 예를 들어, 석유 정련 장치로부터 나온 C₅ 스트림의 추출적 증류 (extractive distillation)로부터 유래한 이소프렌의 경우, δ¹³C 값은 약 -22‰ 내지 -24‰이다. 이 범위는 석유로부터 유래한 가벼운 불포화된 탄화수소의 경우 전형적이고, 석유-기초 이소프렌으로부터 유래한 산물은 전형적으로 동일한 δ¹³C 값을 가진 이소프렌 단위를 포함한다. 최소량의 다른 탄소-포함 영양분 (예로, 효모 추출물)을 사용하여 옥수수-유래 포도당 (δ¹³C -10.73‰)의 발효에 의해 생산된 바이오이소프렌은 δ¹³C - 14.66‰ 내지 -14.85‰를 가진 폴리이소프렌으로 다중합될 수 있는 이소프렌을 생산한다. 이러한 바이오이소프렌으로부터 생산된 산물은 석유-기초 이소프렌으로부터 유래한 것보다 음성인 δ¹³C 값을 가질 것으로 기대된다.

이들 방법에 의해 제조된 화합물은 고리형 이소프렌 이중체 및 삼중체, 직선형 올리고머, 방향족 및 비고리형 유도체를 포함한다. 디이소아밀렌 (diisoamylene)은 바이오이소프렌 조성물의 부분적 수소화를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 이소프렌의 이들 화학적 유도체는 액체 운송 연료 (이소퓨얼^TM (IsoFuels^TM))로서 및 연료 첨가제로서 유용하다.

본 명세서에서는 알코올, 케톤, 에스테르 및 에테르를 포함하는 이소프렌의 산화된 유도체의 생산 방법도 역시 제공된다. 이소프렌의 산화된 유도체의 합성 방법도 역시 균질 및 비균질 촉매를 사용하여 액상 또는 기체 상에서 수행될 수 있다. 본 화학적 부류의 화합물도 역시 액체 운송 원료로서 유용하고, 방출 감소를 위한 연료 산화물로서 또한 예를 들어 디젤을 위한 세탄 자극제 (cetane boosters)와 같은 연료 변형제 (fuel modifiers)로서 연료 혼합물 (fuel blends)에 사용될 수 있다.

이소프렌이 석유를 분획하여 획득될 수 있는 반면, 이 물질의 정제는 비싸고 시간이 많이 든다. 탄화수소의 C5 스트림의 석유 열분해 (cracking)는 약 15%의 이소프렌만을 생산한다. 이소프렌은 또한 다양한 미생물, 식물 및 동물 종에 의해서도 자연적으로 생산된다. 상세하게는, 두 가지 경로가 이소프렌의 생합성에 대해 확인되어 왔다: 메발로네이트 (MVA) 경로 및 비-메발로네이트 (DXP) 경로. 생물반응기 (bioreactors)에서 유전적으로 조작된 세포의 배양은, 예로 참고문헌으로 그의 내용 전부가 통합되어 있는 2007년 12월 13일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/013,386호 및 제 61/013,574호, 국제특허출원 제 WO 2009/076676호, 2008년 7월 2일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/134,094호, 제 61/134,947호, 제 61/134,011호 및 제 61/134,103호, 국제특허출원 제 WO 2010/003007호, 2008년 9월 15일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/097,163호, 국제특허출원 제 WO 2010/031079호, 2008년 9월 15일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/097,186호, 국제특허출원 제 WO 2010/031062호, 2008년 9월 15일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/097,189호, 국제측허출원 제 WO 2010/031077호, 2008년 9월 15일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/097,200호, 국제특허출원 제 WO 2010/031068호, 2008년 9월 15일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/097,204호, 국제특허출원 제 WO 2010/031076호, 2008년 12월 30일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/141,652호, 국제특허출원 제 PCT/US09/069862호, 2008년 12월 15일자로 제출된 미국 특허출원 제 12/335,071호 (미국 특허공개 제 US 2009/0203102 A1호) 및 2009년 4월 23일 제출된 미국 특허 제 12/429,143호 (미국 특허공개 제 US 2010/0003716 A1호)에 기술되어 있는 바와 같이, 이소프렌을 더 많은 양으로, 더 높은 순도로 및/또는 독특한 불순도 프로파일을 가지고 보다 효율적으로 생산하여 왔다.

정의

본 명세서에서 달리 정의되지 않는 경우라면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어의 의미는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 보편적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에서 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법들 및 물질들은 본 발명의 관행에서의 용도를 발견할지라도, 바람직한 방법들 및 물질들은 본 명세서에서 기술될 수 있다. 따라서, 하기에 바로 정의된 용어는 보다 상세하게 본 명세서에 대한 참고문헌으로 전체적으로 기술된다. 모든 인용된 서류가 적절한 부분에서 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있다. 그러나, 모든 서류의 인용이 본 발명에 관한 선행 기술이라는 승인으로서 참작되지는 않는다.

본 명세서에서 사용되는 바, 단수적 용어 "하나 (a)", "하나 (an)" 및 "그 (the)"는 문맥 상 명백하게 달리 표시되지 않는 경우라면, 복수의 표현을 포함한다.

본 명세서를 통하여 주어진 최대의 수적 제한 (numerical limitation) 모두는 더 낮은 수적 제한 모두를, 마치 본 명세서에서 이러한 더 낮은 수적 제한이 명백하게 기재되어 있은 것과 같이 포함한다. 본 명세서를 통하여 주어진 최소의 수적 제한 모두는 더 높은 수적 제한 모두를, 마치 본 명세서에서 이러한 더 높은 수적 제한이 명백하게 기재되어 있은 것과 같이 포함할 것이다. 본 명세서를 통하여 주어진 수적 범위 모두는 이러한 더 넓은 수적 범위 이내에 속하는 더 좁은 수적 범위 모두를, 마치 본 명세서에서 이러한 더 좁은 수적 범위가 명백하게 기재되어 있은 것과 같이 포함할 것이다.

용어 "이소프렌 (isoprene)"은 2-메틸-1,3-부타디엔 (2-methyl-1,3-butadiene) (CAS# 78-79-5)를 말하고, 이는 3,3-디메틸아릴 피로포스페이트 (3,3-dimethylallyl pyrophosphate, DMAPP)로부터 피로포스페이트의 제거로부터 나온 직접적 및 최종 휘발성 C5 탄화수소 산물이고, (하나의) DMAPP 분자(들)에 (하나의) IPP 분자(들)의 연결 (linking) 또는 다중합은 관여하지 않는다. 용어 "이소프렌"은 일반적으로 본 명세서에서 달리 표시되지 않는 경우라면 그의 생산방법을 제한하도록 의도되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 바, "생물학적으로 생산된 이소프렌 (biologically produced isoprene)" 또는 "바이오이소프렌 (bioisoprene)"은 유전적으로 조작된 세포 배양, 천연 미생물, 식물 또는 동물과 같은 생물학적 수단이라면 모두에 의해 생산된 이소프렌이다.

"바이오이소프렌 조성물 (bioisoprene composition)"은 이소프렌을 생산하도록 조작된 시스템 (예로, 세포)와 같은 생물학적 수단이라면 모두에 의해 생산될 수 있는 조성물을 말한다. 이것은 이소프렘 및 이소프렌과 함께 공동-생산되고 및/또는 분리된 다른 화합물 (불순물 포함)을 포함한다. 바이오이소프렌 조성물은 보통 석유화학적 출처로부터 생산된 이소프렌보다 적은 탄화수소 불순물을 포함하고, 종종 다중합 등급 (polymerization grade)이 되도록 최소의 처리를 요구한다. 본 명세서에서 상술된 바, 바이오이소프렌 조성물은 또한 석유화학적으로 생산된 바이오이소프렌 조성물과는 서로 다른 불순도 프로파일을 가진다.

본 명세서에서 사용되는 바, 이소퓨얼^TM (IsoFuels^TM)은 이소프렌으로부터 유래한 액체 운송 연료를 포함하는 연료를 말한다. 바이오이소퓨얼^TM (BioIsoFuels^TM)은 바이오이소프렌으로부터 유래한 액체 운송 연료를 포함하는 연료를 말한다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "올리고중합 (oligomerization)"은 둘 이상의 단일체 단위를 조합하는 화학적 공정을 말한다. 이소프렌의 "올리고중합"은 이소프렌의 직선형 이중체, 이소프렌의 고리형 이중체, 이소프렌의 직선형 삼중체, 및 이소프렌의 고리형 삼중체 등과 같은 둘 이상의 이소프렌 분자로부터 유래한 이소프렌의 유도체를 생산한다.

"완전한 수소화 (complete hydrogenation)", "완전하게 수소화하다 (completely hydrogenate)" 또는 "전부 수소화하다 (fully hydrogenate)"은 전형적으로 수소화 촉매의 존재 시, 전부 포화된 산물 화합물을 만들도록 전구 화합물 (precursor compound) 안에 있는 탄소-탄소 이중 결합과 같은 불포화된 기능기 모두에 수소 (H₂)의 첨가로서 정의된다. 예를 들어, 이소프렌의 완전한 수소화는 이소펜탄을 형성하고 여기에서 이소프렌 몰 당 2몰의 H₂가 소모된다.

"부분적 수소화 (partial hydrogenation)" 또는 "부분적으로 수소화하다 (partially hydrogenate)"는 전형적으로 수소화 촉매의 존재 시, 전구 화합물 안에 있는 탄소-탄소 이중 결합과 같은 불포화된 기능기 모두는 아니지만 적어도 하나에 수소 (H₂)의 첨가로서 정의된다. 분분적 수소화의 산물(들)은 좀 더 나아가 전부 포화된 산물 화합물을 만들도록 완전하게 수소화될 수 있다. 디엔 (diene)의 부분적 수소화는 하나 이상의 모노-올레핀을 형성한다. 예를 들어 이소프렌의 부분적 수소화는 3가지의 이성질체 이소펜텐 (isomeric isopentenes) (2-메틸부트-1-엔, 2-메틸부트-2-엔, 및 3-메틸부트-1-엔)을 형성할 수 있고 여기에서 이소프렌 몰 당 1몰의 H₂가 소모된다.

"선택적 수소화 (selective hydrogenation)" 또는 "선택적으로 수소화하다 (selectively hydrogenate)"는 전형적으로 수소화 촉매의 존재 시, 전구체 화합물 안에 있는 탄소-탄소 이중 결합과 같은 불포화된 기능기 모두는 아니지만 적어도 하나에 수소 (H₂)의 첨가로서 정의되고, 여기에서 소정의 불포화된 기능기는 바람직하게 선택된 조건 하에서 다른 불포화된 그룹 위에서 수소화된다. 예를 들어, 이소프렌의 선택적 수소화는 바람직하게 2-메틸-2-부텐, 2-메틸-1-부텐, 3-메틸-1-부텐 또는 그의 혼합물을 형성할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "폴리펩타이드 (polypeptides)"는 폴리펩타이드, 단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드의 단편, 및 융합 폴리펩타이드를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바, "분리된 폴리펩타이드 (isolated polypeptide)"는 2, 5, 10, 20, 또는 50개 이상의 서로 다른 폴리펩타이드의 라이브러리와 같은 폴리펩타이드 라이브러리의 일부가 아니고 그것이 자연적으로 발생하게 된 성분의 적어도 하나로부터 분리된다. 분리된 폴리펩타이드는 예를 들어 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 핵산의 발현에 의해 획득될 수 있다.

"이종유래 폴리펩타이드 (heterologous polypeptide)"에 의하여, 아미노산 서열이 동일한 숙주세포에서 자연적으로 발현되는 또 다른 폴리펩타이드의 서열과 일치하지 않는 폴리펩타이드를 의미한다. 상세하게, 이종유래 폴리펩타이드는 동일한 숙주세포에서 자연적으로 발견되는 야생형 폴리펩타이드와 일치하지 않는다.

"코돈 반복성 (codon degeneracy)"은 인코드되는 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 영향을 주지 않고 뉴클레오타이드 서열의 변화를 허용하는 유전적 코드에서의 다양성을 말한다. 당업자라면 주어진 아미노산을 특정하도록 뉴클레오타이드 코돈의 사용 시 특이 숙주세포에 의해 나타나는 코돈-편향성 (codon-bias)을 잘 인식하고 있다. 따라서 일정 구현예에서, 숙주세포에서 개선된 발현을 하는 핵산을 합성할 때, 그의 코돈 사용의 빈도가 숙주세포에서 바람직한 코돈 사용의 빈도에 근접하도록 핵산을 설계하는 것이 바람직하다.

본 명세서에서 사용되는 바, "핵산 (nucleic acid)"은 단일 또는 이중-가닥 형태로 공유적으로 함께 결합된 둘 이상의 데옥시리보뉴클레오타이드 (deoxyribonucleotides) 및/또는 리보뉴클레오타이드 (ribonucleotides)를 말한다.

"재조합 핵산 (recombinant nucleic acid)"에 의하여, 관심 있는 핵산이 유래한 생물의 자연적으로 발생되는 게놈에서 관심 있는 핵산에 끼어있는 하나 이상의 핵산 (예로, 유전자)이 아닌 관심 있는 핵산을 의미한다. 따라서 용어는 예를 들어 벡터 내, 자발적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스 내, 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA 내로 도입되거나, 개별 분자 (예로, cDNA, 게놈 DNA 단편, 또는 PCR 또는 제한효소 소화에 의해 생산된 cDNA 단편)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다.

"이종유래 핵산 (heterologous nucleic acid)"에 의하여, 핵산 서열이 동일한 숙주세포에서 자연적으로 발견되는 또 다른 핵산의 서열과 일치하지 않는 핵산을 의미한다. 상세하게는, 이종유래 핵산은 동일한 숙주세포에서 자연적으로 발견되는 야생형 핵산과 일치하지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 바, "벡터 (vector)"는 숙주세포에서 관심 있는 하나 이상의 핵산을 운반하고 바람직하게 발현할 수 있는 제작물 (construct)을 의미한다. 벡터의 예로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 플라스미드, 바이러스성 벡터, DNA 또는 RNA 발현 벡터, 코스미드, 및 파지 벡터를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바, "발현 조절 서열 (expression control sequence)"은 관심 있는 핵산의 전사를 지향하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 조절 서열은 전신발현 (constitutive) 또는 유도가능한 (inducible) 프로모터, 또는 인핸서 (enhancer)와 같은 프로모터일 수 있다. "유도가능한 프로모터"는 환경적 또는 발생적 조절 하에서 활성을 가진 프로모터이다. 발현 조절 서열은 전사될 핵산 분절과 작동적으로 연결되어 있다.

용어 "선택적 마커 (selective marker)" 또는 "선택가능한 마커 (selectable marker)"는 도입된 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주세포의 선별 용이성을 허용하는 숙주세포에서 발현될 수 있는 핵산을 말한다. 선별 마커의 예로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 항생제 저항성 핵산 [예로, 카나마이신 (kanamycin), 앰피실린 (ampicillin), 카베니실린 (carbenicillin), 젠타마이신 (gentamicin), 하이그로마이신 (hygromycin), 플레오마이신 (phleomycin), 블레오마이신 (bleomycin), 네오마이신 (neomycin), 또는 클로로암페니콜 (chloramphenicol)] 및/또는 영양적 유익과 같은 숙주세포에 대사적 유익을 부여하는 핵산을 포함한다. 대표적인 영양성 선별 마커 (nutritional selective markers)로는 amdS, argB, 및 pyr4와 같이 당해 기술분야에 알려진 이들 마커를 포함한다.

조성물 및 시스템

일반적으로 석유화학적 출처로부터 유래한 이소프렌은 물질이 다중합 또는 다른 화학적 변환에 적합하기 이전에 철저한 정제 과정을 요구하는 불순한 C5 탄화수소 분획이다. 여러 가지 불순물이 상세하게는 이소프렌과 그들의 구조적 유사도 및 그들이 다중합 촉매 독 (poisons)으로 작용할 수 있는 사실 때문에 문제가 된다. 이러한 화합물은 이에 제한되는 것은 아니지만, 1,3-사이클로펜타디엔, 시스- 및 트랜스-1,3-펜타디엔, 1,4-펜타디엔, 1-펜틴, 2-펜틴, 3-메틸-1-부틴, 펜트-4-엔-1-인, 트랜스-펜트-3-엔-1-인, 및 시스-펜트-3-엔-1-인을 포함한다. 하기에 상술한 바와 같이, 생물학적으로 생산된 이소프렌은 철저한 정제 과정을 거치지 않고도 오염시키는 불포화된 C5 탄화수소가 실질적으로 없을 수 있다. 일정의 생물학적으로 생산된 이소프렌은 에탄올, 아세톤, 및 C5 프레닐 알코올을 포함한다. 이들 성분은 석유화학적 출처로부터 유래한 이소프렌 조성물에 존재하는 이성질체 C5 탄화수소보다 용이하게 이소프렌 스트림으로부터 제거될 수 있다. 좀 더 나아가, 이들 불순물은 예를 들어 생산 균주의 유전적 변형, 탄소 공급원료, 대안의 발효 조건, 회수 공정 변형 및 추가적인 또는 대안의 정제 방법에 의해 생물공정 (bioprocess)에서 해결될 수 있다.

한 가지 관점에서, 본 발명은 (a) 매우 순수한 이소프렌의 시작 조성물의 시판되는 유리한 양; 및 (b) 매우 순수한 이소프렌 시작 물질의 적어도 일부분으로부터 생산된 연료 성분:을 포함하는 조성물들 및 이들을 포함하는 이소프렌으로부터 연료 성분을 생산하는 시스템들을 특징으로 하고, 여기에서 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌의 적어도 일부분은 화학적 변환을 거친다. 매우 순수한 이소프렌 시작 물질은 연료를 만드는 데 유용한 시판되는 유리한 양의 산물을 생산하도록 화학적 반응에 맡긴다. 한 가지 관점에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌은 바이오이소프렌을 포함한다. 한 가지 관점에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌은 바이오이소프렌일 수 있다.

대표적인 시작 이소프렌 조성물

일정 구현예에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물은 약 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 mg 이상의 이소프렌을 포함한다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 약 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 g 이상의 이소프렌을 포함한다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 약 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1000 kg 이상의 이소프렌을 포함한다. 일정 구현예에서, 시작 조성물에서 이소프렌의 양은 약 2 내지 약 100 mg 사이, 약 100 내지 약 500 mg 사이, 약 500 내지 약 1,000 mg 사이, 약 1,000 내지 약 2,000 mg 사이, 또는 약 2,000 내지 약 5,000 mg 사이와 같은, 약 2 내지 약 5,000 mg 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 시작 조성물에서 이소프렌의 양은 약 100 내지 약 5,000 mg 사이, 약 200 내지 약 2,000 mg 사이, 약 200 내지 약 1,000 mg 사이, 약 300 내지 약 1,000 mg 사이, 또는 약 400 내지 약 1,000 mg 사이와 같은, 약 20 내지 약 5,000 mg 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 시작 조성물에서 이소프렌의 양은 약 2 내지 약 100 g 사이, 약 100 내지 약 500 g 사이, 약 500 내지 약 1,000 g 사이, 약 1,000 내지 약 2,000 g 사이, 또는 약 2,000 내지 약 5,000 g 사이와 같은, 약 2 내지 약 5,000 g 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 시작 조성물에서 이소프렌의 양은 약 2 내지 약 5,000 kg 사이, 약 10 내지 약 2,000 kg 사이, 약 20 내지 약 1,000 kg 사이, 약 20 내지 약 500 kg 사이, 약 30 내지 약 200 kg 사이, 또는 약 40 내지 약 100 kg 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 시작 조성물의 휘발성 유기 분획의 약 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 95% (w/w) 이상은 이소프렌이다.

일정 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물은 시작 조성물에 있는 모든 C5 탄화수소의 전체 무게에 대비한 무게로 약 98.0, 98.5, 99.0, 99.5, 또는 100% 이상의 이소프렌을 포함한다. 일정 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물은 시작 조성물에 있는 모든 C5 탄화수소의 전체 무게에 대비한 무게로 약 99.90, 99.92, 99.94, 99.96, 99.98, 또는 100% 이상의 이소프렌을 포함한다. 일정 구현예에서, 시작 조성물은 시작 조성물에 있는 모든 C5 탄화수소에 대한 검출기 반응에 대비하여 이소프렌을 위한 약 98.0, 98.5, 99.0, 99.5, 또는 100% 이상의 상대적인 검출기 반응을 가진다. 일정 구현예에서, 시작 조성물은 시작 조성물에 있는 모든 C5 탄화수소에 대한 검출기 반응에 대비하여 이소프렌을 위한 약 99.90, 99.91, 99.92, 99.93, 99.94, 99.95, 99.96, 99.97, 99.98, 99.99, 또는 100% 이상의 상대적인 검출기 반응을 가진다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 시작 조성물에 있는 모든 C5 탄화수소의 전체 무게에 대비한 무게로 약 98.0 내지 약 98.5, 약 98.5 내지 약 99.0, 약 99.0 내지 약 99.5, 약 99.5 내지 약 99.8, 약 99.8 내지 약 100% 사이의 이소프렌을 포함한다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 시작 조성물에 있는 모든 C5 탄화수소의 전체 무게에 대비한 무게로 약 99.90 내지 약 99.92, 약 99.92 내지 약 99.94, 약 99.94 내지 약 99.96, 약 99.96 내지 약 99.98, 약 99.98 내지 약 100% 사이의 이소프렌을 포함한다.

일정 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물은 시작 조성물에 있는 모든 C5 탄화수소의 전체 무게에 대비한 무게로 약 2.0, 1.5, 1.0, 0.5, 0.2, 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005, 또는 0.00001% 이하의 이소프렌이 아닌 C5 탄화수소 (1,3-사이클로펜타디엔, 시스-1,3-펜타디엔, 트랜스-1,3-펜타디엔, 1,4-펜타디엔, 1-펜틴, 2-펜틴, 1-펜텐, 2-메틸-1-부텐, 3-메틸-1-부틴, 펜트-4-엔-1-인, 트랜스-펜트-3-엔-1-인, 또는 시스-펜트-3-엔-1-인과 같음)를 포함한다. 일정 구현예에서, 시작 조성물은 시작 조성물에 있는 모든 C5 탄화수소에 대한 검출기 반응에 대비하여 이소프렌이 아닌 C5 탄화수소를 위한 약 2.0, 1.5, 1.0, 0.5, 0.2, 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005, 또는 0.00001% 이하의 상대적인 검출기 반응을 가진다. 일정 구현예에서, 시작 조성물은 시작 조성물에 있는 모든 C5 탄화수소에 대한 검출기 반응에 대비하여 1,3-사이클로펜타디엔, 시스-1,3-펜타디엔, 트랜스-1,3-펜타디엔, 1,4-펜타디엔, 1-펜틴, 2-펜틴, 1-펜텐, 2-메틸-1-부텐, 3-메틸-1-부틴, 펜트-4-엔-1-인, 트랜스-펜트-3-엔-1-인, 또는 시스-펜트-3-엔-1-인를 위한 약 2.0, 1.5, 1.0, 0.5, 0.2, 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005, 또는 0.00001% 이하의 상대적인 검출기 반응을 가진다. 일정 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물은 시작 조성물에 있는 모든 C5 탄화수소의 전체 무게에 대비한 무게로 약 0.02 내지 약 0.04%, 약 0.04 내지 약 0.06%, 약 0.06 내지 약 0.08%, 약 0.08 내지 약 0.10%, 또는 약 0.10 내지 약 0.12% 사이의 이소프렌이 아닌 C5 탄화수소 (1,3-사이클로펜타디엔, 시스-1,3-펜타디엔, 트랜스-1,3-펜타디엔, 1,4-펜타디엔, 1-펜틴, 2-펜틴, 1-펜텐, 2-메틸-1-부텐, 3-메틸-1-부틴, 펜트-4-엔-1-인, 트랜스-펜트-3-엔-1-인, 또는 시스-펜트-3-엔-1-인과 같음)를 포함한다.

일정 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물은 이소프렌의 다중합을 저해하는 시작 조성물에 있는 화합물이라면 모두의 경우 약 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 또는 0.005 μg/L 이하의 이소프렌의 다중합을 저해하는 화합물을 포함한다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 이소프렌의 다중합을 저해하는 시작 조성물에 있는 화합물이라면 모두의 경우 약 0.01 내지 약 10, 약 0.01 내지 약 5, 약 0.01 내지 약 1, 약 0.01 내지 약 0.5, 또는 약 0.01 내지 약 0.005 μg/L와 같은 약 0.005 내지 약 50 μg/L 사이의 이소프렌의 다중합을 저해하는 화합물을 포함한다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 약 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 또는 0.005 μg/L 이하의 이소프렌이 아닌 (1,3-사이클로펜타디엔, 시스-1,3-펜타디엔, 트랜스-1,3-펜타디엔, 1,4-펜타디엔, 1-펜틴, 2-펜틴, 1-펜텐, 2-메틸-1-부텐, 3-메틸-1-부틴, 펜트-4-엔-1-인, 트랜스-펜트-3-엔-1-인, 또는 시스-펜트-3-엔-1-인과 같음) 탄화수소를 포함한다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 약 0.01 내지 약 10, 약 0.01 내지 약 5, 약 0.01 내지 약 1, 약 0.01 내지 약 0.5, 또는 약 0.01 내지 약 0.005 μg/L와 같은 약 0.005 내지 약 50 μg/L 사이 범위의 이소프렌이 아닌 탄화수소를 포함한다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 약 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 또는 0.005 μg/L 이하의 단백질 또는 지방산 (자연적으로 천연 고무와 관련되어 있는 단백질 또는 지방산과 같음)을 포함한다.

일정 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물은 약 10, 5, 1, 0.8, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 또는 0.005 ppm 이하의 알파 아세틸렌 (alpha acetylenes), 피페릴렌 (piperylenes), 아세토니트릴 (acetonitrile), 또는 1,3-사이클로부타디엔 (1,3-cyclopentadiene)을 포함한다. 일정 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물은 약 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 또는 0.005 ppm 이하의 황 또는 알렌 (allens)을 포함한다. 일정 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물은 약 30, 20, 15, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 또는 0.005 이하의 아세틸렌 모두 (1-펜틴, 2-펜틴, 3-메틸-1-부틴, 펜트-4-엔-1-인, 트랜스-펜트-3-엔-1-인, 및 시스-펜트-3-엔-1-인와 같음)를 포함한다. 일정 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물은 약 2000, 1000, 500, 200, 100, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 또는 0.005 ppm 이하의 고리형 이소프렌 이중체 (예로, 두 개의 이소프렌 단위의 이중합으로부터 유래한 고리형 C10 화합물)와 같은 이소프렌 이중체를 포함한다.

일정 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물은 에탄올, 아세톤, 메탄올, 아세트알데하이드, 메타크롤레인, 메틸 비닐 케톤, 2-메틸-2-비닐옥시란, 시스- 및 트랜스-3-메틸-1,3-펜타디엔, C5 프레닐 알코올 (3-메틸-3-부텐-1-올 또는 3-메틸-2-부텐-1-올), 또는 상기의 둘 이상이라면 모두를 포함한다. 상세한 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100, 또는 120 μg/L 이상의 에탄올, 아세톤, 메탄올, 아세트알데하이드, 메타크롤레인, 메틸 비닐 케톤, 2-메틸-2-비닐옥시란, 시스- 및 트랜스-3-메틸-1,3-펜타디엔, C5 프레닐 알코올 (3-메틸-3-부텐-1-올 또는 3-메틸-2-부텐-1-올), 또는 상기의 둘 이상이라면 모두를 포함한다. 일정 구현예에서, 이소프렌 조성물은 약 0.01 내지 약 80, 약 0.01 내지 약 60, 약 0.01 내지 약 40, 약 0.01 내지 약 30, 약 0.01 내지 약 20, 약 0.01 내지 약 10, 약 0.1 내지 약 80, 약 0.1 내지 약 60, 약 0.1 내지 약 40, 약 5 내지 약 80, 약 5 내지 약 60, 또는 약 5 내지 약 40 사이와 같은 약 0.005 내지 약 120 사이 범위의 에탄올, 아세톤, 메탄올, 아세트알데하이드, 메타크롤레인, 메틸 비닐 케톤, 2-메틸-2-비닐옥시란, 시스- 및 트랜스-3-메틸-1,3-펜타디엔, C5 프레닐 알코올, 또는 상기의 둘 이상이라면 모두를 포함한다.

일정 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물은 하나 이상의 다음의 성분을 포함한다: 2-헵탄온, 6-메틸-5-헵텐-2-온, 2,4,5-트리메틸피리딘, 2,3,5-트리메틸피라진, 시트로넬랄, 메탄티올, 메틸 아세테이트, 1-프로판올, 디아세틸, 2-부탄온, 2-메틸-3-부텐-2-올, 에틸 아세테이트, 2-메틸-1-프로판올, 3-메틸-1-부탄알, 3-메틸-2-부탄온, 1-부탄올, 2-펜탄온, 3-메틸-1-부탄올, 에틸 부틸레이트, 3-메틸-2-부텐알, 부틸 아세테이트, 3-메틸부틸 아세테이트, 3-메틸-3-부텐-1-일 아세테이트, 3-메틸-2-부텐-1-일 아세테이트, 3-헥센-1-올, 3-헥센-1-일 아세테이트, 리모넨, 게라니올 (트랜스-3,7-디메틸-2,6-옥타디엔-1-올), 시트로넬롤 (3,7-디메틸-6-옥텐-1-올), (E)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔, (Z)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔, 2,3-사이클로헵텐올피리딘, 또는 직선형 이소프렌 중합체 (복수의 이소프렌 단위의 다중합으로부터 유래한 직선형 이소프렌 이중체 또는 직선형 이소프렌 삼중체와 같음). 다양한 구현예들에서, 무게로 단위 퍼센트의 이소프렌 양에 대비한 이들 화합물 하나의 양 (예로, 이소프렌의 무게로 나눈 성분의 무게 곱하기 100)은 약 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 110% (w/w) 이상이다. 일정 구현예에서, 이소프렌에 대한 검출기 반응에 대비한 두 번째 화합물에 대한 상대적인 검출기 반응은 약 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 110% (w/w) 이상이다. 다양한 구현예들에서, 무게로 단위 퍼센트의 이소프렌 양에 대비한 이들 화합물 하나의 양 (예로, 이소프렌의 무게로 나눈 성분의 무게 곱하기 100)은 약 0.01 내지 약 90, 약 0.01 내지 약 80, 약 0.01 내지 약 50, 약 0.01 내지 약 20, 약 0.01 내지 약 10, 약 0.02 내지 약 50, 약 0.05 내지 약 50, 약 0.1 내지 약 50, 또는 약 0.1 내지 약 20% (w/w) 사이와 같은, 약 0.01 내지 약 105% (w/w) 사이의 범위이다.

일정 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물의 적어도 일부분은 기체 상으로 있다. 일정 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물의 적어도 일부분은 액상으로 있다 (농축물 (condensate)과 같음). 일정 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물의 적어도 일부분은 고체 상에 있다. 일정 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물의 적어도 일부분은 실리카 (silica) 및/또는 활성 탄소 (activated carbon)를 포함하는 지지체 (support)와 같은 고체 지지체에 흡착된다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 하나 이상의 용매와 혼합된다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 하나 이상의 기체와 혼합된다.

일정 구현예에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물은 생물학적 공정에 의해 생산된다. 일정 바람직한 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물은 세포의 습윤 무게/시간 (nmole/g_wem/시간)의 이소프렌으로 약 400 nmole 이소프렌/세포 그램수 이상을 생산하는 세포를 배양하여 생산된 바이오이소프렌 조성물이다. 일정 구현예에서, 바이오이소프렌 조성물은 세포 배양 배지에 있는 탄소의 약 0.002% 이상을 이소프렌으로 전환시키는 세포를 배양하여 생산된다. 일정 구현예에서, 세포는 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드, 예로 자연적으로 생기는 푸엘라리아 (Pueraria)와 같은 식물로부터 나온 폴리펩타이드를 인코드하고, (ii) T7 프로모터와 같은 프로모터에 작동적으로 연결되어 있는 이종유래 핵산을 가진다. 예를 들어 포풀라 및 자연적으로 생기는 부모 이소프렌 합성효소의 변형체로부터 나온 다른 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드는 바이오이소프렌을 생산하는 데 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 이소프렌 합성효소 및 그의 변형체의 예는 본 명세서에서 전부가 통합되어 있는 미국 특허출원 제 12/429,143호에 기술되어 있다.

일정 구현예에서, 세포는 이에 제한되는 것은 아니지만 탄소화물, 글리세롤, 글리세린, 디하이드록시아세톤, 일-탄소원, 오일, 동물 지방, 동물 오일, 지방산, 지질, 인지질, 글리세롤 지질, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 트리글리세라이드, 재생가능한 탄소원, 폴리펩타이드 (예로, 미생물 또는 식물 단백질 또는 펩타이드), 효모 추출물, 효모 추출물로부터 나온 성분, 또는 상기 둘 이상의 조합이라면 모두와 같은 탄소원을 포함하는 배양 배지에서 배양된다. 일정 구현예에서, 세포는 제한된 포도당 배지에서 배양된다. 일정 구현예에서, 세포는 좀 더 나아가 IDI 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산을 포함한다. 일정 구현예에서, 세포는 좀 더 나아가 MVD 경로 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산을 포함한다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 2008년 7월 2일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/134,094호, 국제특허출원 제 WO 2010/003007호, 및 2008년 12월 12일자로 제출된 미국 특허출원 제 12/335,071호 (US 2009/0203102 A1)에서 기술된 바와 같은 이소프렌 조성물이거나, 이에 기술된 세포라면 모두를 배양하여 생산된다.

일정 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물은 이소프렌을 생산하는 배양의 세포에 의해 생산되는 기체 상 (배출-기체)을 포함한다. 일정 구현예에서, 기체 상은 이소프렌의 비발화성 농도를 가진다. 일정 구현예에서, 기체 상은 약 9.5% (부피) 이하의 산소를 포함한다. 일정 구현예에서, 기체 상은 약 9.5% (부피) 이상의 산소를 포함하고, 기체 상에서의 이소프렌의 농도는 저부 발화도 한계 (lower flammability limit) 이하이거나 고부 발화도 한계 (upper flammability limit) 이상이다. 일정 구현예에서, 이소프렌이 아닌 기체 상의 부분은 약 10% 내지 약 100% (부피) 산소 사이와 같은 약 0% 내지 약 100% (부피) 산소 사이의 범위를 포함한다. 일정 구현예에서, 이소프렌이 아닌 기체 상의 부분은 약 0% 내지 약 99% (부피) 질소 사이의 범위를 포함한다. 일정 구현예에서, 이소프렌이 아닌 기체 상의 부분은 약 1% 내지 약 50% (부피) CO₂ 사이의 범위를 포함한다.

일정 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물은 다음의 하나 이상을 포함한다: 알코올, 알데하이드, 케톤, 또는 에스테르 (본 명세서에 기술된 알코올, 알데하이드, 케톤, 또는 에스테르라면 모두와 같음). 일정 구현예에서, 이소프렌 조성물은 (i) 알코올 및 알데하이드, (ii) 알코올 및 케톤, (iii) 알데하이드 및 케톤, 또는 (iv) 알코올, 알데하이드 및 케톤을 포함한다. 일정 구현예에서, 이소프렌 조성물이라면 모두 좀 더 나아가 에스테르를 포함한다.

일정 구현예에서, 생물학적 출처 (세포 배양과 같음)로부터 유래한 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물은 다음의 하나 이상을 포함한다: 메탄올, 아세트알데하이드, 에탄올, 메탄티올, 1-부탄올, 3-메틸-1-프로판올, 아세톤, 아세트산, 2-부탄온, 2-메틸-1-부탄올, 또는 인돌. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 1 ppm 이상의 다음의 하나 이상을 포함한다: 메탄올, 아세트알데하이드, 에탄올, 메탄티올, 1-부탄올, 3-메틸-1-프로판올, 아세톤, 아세트산, 2-부탄온, 2-메틸-1-부탄올, 또는 인돌. 일정 구현예에서, 다음의 하나 이상의 농도는: 메탄올, 아세트알데하이드, 에탄올, 메탄티올, 1-부탄올, 3-메틸-1-프로판올, 아세톤, 아세트산, 2-부탄온, 2-메틸-1-부탄올, 또는 인돌, 시작 이소프렌 조성물에서 (정제되기 이전의 배출-기체와 같음) 약 1 내지 약 10,000 ppm 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 (하나 이상의 정제 단계를 거치기 이전의 배출-기체와 같음) 다음의 하나 이상을: 메탄올, 아세트알데하이드, 에탄올, 메탄티올, 1-부탄올, 3-메틸-1-프로판올, 아세톤, 아세트산, 2-부탄온, 2-메틸-1-부탄올, 또는 인돌, 약 1 내지 10 ppm, 약 10 내지 20 ppm, 약 20 내지 30 ppm, 약 30 내지 40 ppm, 약 40 내지 50 ppm, 약 50 내지 60 ppm, 약 60 내지 70 ppm, 약 70 내지 80 ppm, 약 80 내지 90 ppm, 또는 약 90 내지 100 ppm 사이와 같은 약 1 내지 100 ppm 사이의 농도로 포함한다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 1 ppm 이하의 메탄티올 (강력한 촉매 독 및 최종 연료 산물에서의 황원 (source of sulfur))을 포함한다. 세포 배양으로부터 나온 휘발성 유기 화합물 (세포 배양의 상부공간에서의 휘발성 유기 화합물과 같음)은 본 명세서에서 기술된 것과 같은 표준 방법들 또는 양성자 전이 반응-질량 분광측정법 (proton transfer reaction-mass spectrometry)과 같은 다른 표준 방법들을 사용하여 분석될 수 있다 (예를 들어, Bunge et al., Applied and Environmental Microbiology, 74(7): 2179-2186, 2008을 참조하고, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부 상세하게는 휘발성 유기 화합물의 분석에 관하여 통합되어 있다).

또한 본 발명은 이소프렌과 수소를 공동-생산하고 생물학적 출처 (세포 배양과 같음)로부터 유래한 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물의 용도에 관한 것이다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 3 몰라 퍼센트의 수소마다 적어도 1 몰라 퍼센트의 이소프렌으로부터 4 몰라 퍼센트의 수소마다 적어도 1 몰라 퍼센트의 이소프렌까지의 범위를 가지는 비율로 이소프렌과 수소를 포함한다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 약 1 내지 9, 2 내지 8, 3 내지 7, 4 내지 6, 5 내지 5, 6 내지 4, 7 내지 3, 8 내지 2, 또는 9 내지 1의 몰라 비율로 이소프렌과 수소를 포함한다. 일정 구현예에서, 조성물은 좀 더 나아가 1 부터 11 몰라 퍼센트까지의 이소프렌 및 4 부터 44 몰라 퍼센트까지의 수소를 포함한다. 일정 구현예에서, 조성물은 좀 더 나아가 산소, 이산화탄소, 또는 질소를 포함한다. 일정 구현예에서, 조성물은 좀 더 나아가 0 부터 21 몰라 퍼센트까지의 산소, 18 부터 44 몰라 퍼센트까지의 이산화탄소, 또한 1 부터 78 몰라 퍼센트까지의 질소를 포함한다. 일정 구현예에서, 조성물은 좀 더 나아가 1.0 x 10^-4 몰라 퍼센트 이하의 비-메탄성 휘발성 불순물을 포함한다. 일정 구현예에서, 비-메탄성 휘발성 불순물은 다음의 하나 이상을 포함한다: 2-헵탄온 (2-heptanone), 6-메틸-5-헵텐-2-온 (6-methyl-5-hepten-2-one), 2,4,5-트리메틸피리딘 (2,4,5-trimethylpyridine), 2,3,5-트리메틸피라진 (2,3,5-trimethylpyrazine), 시트로넬랄 (citronellal), 아세트알데하이드 (acetaldehyde), 메탄티올 (methanethiol), 메틸 아세테이트 (methyl acetate), 1-프로판올 (1-propanol), 디아세틸(diacetyl), 2-부탄온(2-butanone), 2-메틸-3-부텐-2올 (2-methyl-3-buten-2-ol), 에틸 아세테이트 (ethyl acetate), 2-메틸-1-프로판올 (2-methyl-1-propanol), 3-메틸-1-부탄알 (3-methyl-1-butanal), 3-메틸-2-부탄온 (3-methyl-2-butanone), 1-부탄올 (1-butanol), 2-펜탄온 (2-pentanone), 3-메틸-1-부탄올 (3-methyl-1-butanol), 에틸 이소부틸레이트 (ethyl isobutyrate), 3-메틸-2-부텐알 (3-methyl-2-butenal), 부틸 아세테이트 (butyl acetate), 3-메틸부틸 아세테이트 (3-methylbutyl acetate), 3-메틸-3-부텐-1-일 아세테이트 (3-methyl-3-buten-1-yl acetate), 3-메틸-2-부텐-1-일 아세테이트 (3-methyl-2-buten-1-yl acetate), 3-헥센-1-올 (3-3-hexen-1-ol), 3-헥센-1-일 아세테이트 (3-hexen-1-yl acetate), 리모넨 (limonene), 제라니올 (geraniol, 트랜스-3,7-디메틸-2,6-옥타디엔-1-올 (trans-3,7-dimethyl-2,6-octadien-1-ol)) 및 시트로넬롤 (citronellol, 3,7-디메틸-6-옥텐-1-올 (3,7-dimethyl-6-octen-1-ol)), (E)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔 ((E)-3,7-dimethyl-1,3,6-octatriene), (Z)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔 ((Z)-3,7-dimethyl-1,3,6-octatriene), 2,3-사이클로헵텐올피리딘 (2,3-cycloheptenolpyridine), 또는 직선상 이소프렌 중합체 (복수의 이소프렌 단위의 다중합로부터 유래한 직선상 이소프렌 이중체 또는 직선상 이소프렌 삼중체와 같음). 일정 구현예에서, 이소프렌 조성물은 다음의 하나 이상을 포함한다: 알코올, 알데하이드, 또는 케톤 (본 명세서에 기술된 알코올, 알데하이드, 또는 케톤이라면 모두와 같음). 일정 구현예에서, 이소프렌 조성물은 (i) 알코올 및 알데하이드, (ii) 알코올 및 케톤, (iii) 알데하이드 및 케톤, 또는 (iv) 알코올, 알데하이드 및 케톤을 포함한다. 일정 구현예에서, 비-메탄성 휘발성 불순물은 다음의 하나 이상을 포함한다: 메탄올, 아세트알데하이드, 에탄올, 메탄티올, 1-부탄올, 3-메틸-1-프로판올, 아세톤, 아세트산, 2-부탄온, 2-메틸-1-부탄올, 또는 인돌.

이소프렌을 생산하는 세포의 배양에서 이소프렌을 생산하는 기법들은 2007년 12월 13일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/013,386호 및 제 61/013,574호, 국제특허출원 제 WO 2009/076676호, 2008년 7월 2일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/134,094호, 제 61/134,947호, 제 61/134,011호 및 제 61/134,103호, 국제특허출원 제 WO 2010/003007호, 2008년 9월 15일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/097,163호, 국제특허출원 제 WO 2010/031079호, 2008년 9월 15일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/097,186호, 국제특허출원 제 WO 2010/031062호, 2008년 9월 15일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/097,189호, 국제측허출원 제 WO 2010/031077호, 2008년 9월 15일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/097,200호, 국제특허출원 제 WO 2010/031068호, 2008년 9월 15일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/097,204호, 국제특허출원 제 WO 2010/031076호, 2008년 12월 30일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/141,652호, 국제특허출원 제 PCT/US09/069862호, 2008년 12월 15일자로 제출된 미국 특허출원 제 12/335,071호 (미국 특허공개 제 US 2009/0203102 A1호) 및 2009년 4월 23일 제출된 미국 특허 제 12/429,143호 (미국 특허공개 제 US 2010/0003716 A1호)에 기술되어 있고, 그들의 교육 내용은 이러한 공정에 의해 이소프렌을 생산하고 회수하는 교육적 기법들의 목적으로 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있다. 어떠한 경우라도, 2007년 12월 13일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/013,386호 및 제 61/013,574호, 국제특허출원 제 WO 2009/076676호, 2008년 7월 2일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/134,094호, 제 61/134,947호, 제 61/134,011호 및 제 61/134,103호, 국제특허출원 제 WO 2010/003007호, 2008년 9월 15일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/097,163호, 국제특허출원 제 WO 2010/031079호, 2008년 9월 15일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/097,186호, 국제특허출원 제 WO 2010/031062호, 2008년 9월 15일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/097,189호, 국제측허출원 제 WO 2010/031077호, 2008년 9월 15일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/097,200호, 국제특허출원 제 WO 2010/031068호, 2008년 9월 15일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/097,204호, 국제특허출원 제 WO 2010/031076호, 2008년 12월 30일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/141,652호, 국제특허출원 제 PCT/US09/069862호, 2008년 12월 15일자로 제출된 미국 특허출원 제 12/335,071호 (미국 특허공개 제 US 2009/0203102 A1호) 및 2009년 4월 23일 제출된 미국 특허 제 12/429,143호 (미국 특허공개 제 US 2010/0003716 A1호)은 세포 배양에서 증가된 양의 이소프렌의 조성물들 및 이들을 생산하는 방법들을 가르치고 있다. 2008년 12월 15일자로 제출된 미국 특허출원 제 12/335,071호 및 제 US 2009/0203102 A1호는 좀 더 나아가 배양된 세포로부터 이소프렌과 수소의 조성물들 및 이들을 공동-생산하는 방법들을 가르치고 있다. 상세하게는, 이들 조성물 및 방법은 이소프렌 생산률을 증가시키고 생산되는 이소프렌의 전체량을 증가시킨다. 예를 들어, 4.8 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간의 이소프렌을 생성하는 세포 배양 시스템이 생산되어 왔다 (표 1). 이들 시스템의 효율은 세포가 세포 배양 배지로부터 이소프렌으로 연소되는 약 2.2%의 탄소의 전환에 의해 드러난다. 실시예 및 표 2에 나타난 바와 같이, 액체배지 리터 당 대략 3 g의 이소프렌이 생성되었다. 원하는 경우, 훨씬 더 많은 이소프렌이 본 명세서에서 기술된 것과 같은 기타 조건을 사용하여 획득되었다. 일정 구현예에서, 재생가능한 탄소원이 이소프렌의 생산에 사용되었다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 생산은 세포의 성장과 관련되지 않는다. 일정 구현예에서, 이소프렌과 산화제라면 모두의 농도는 이소프렌 생산 또는 회수 기간 동안 화재가 발생될 수 있는 위험성을 감소하거나 없앨 수 있도록 발화가능하지 않는 범위 이내에 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 그들이 세포 당 높은 이소프렌 수율, 높은 탄소 수율, 높은 이소프렌 정제도, 높은 생산도, 낮은 에너지 사용, 낮은 생산 비용과 투자, 및 최소의 부작용을 가능하게 하기 때문에 바람직하다. 본 이소프렌 생산을 위한 효율적, 대규모, 생합성 방법은 합성 이소프렌-기초한 고무를 위한 이소프렌 출처를 제공하고 천연 고무를 사용하는 것에 바람직한 저-비용의 대안을 제공한다.

좀 더 나아가 하기에 논의된 바와 같이, 세포에 의해 생산된 이소프렌량은 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드 (예로, 식물 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드)를 인코딩하는 이종유래 핵산을 세포 내로 도입함에 의해 크게 증가될 수 있다. 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드는 디메틸아릴 디포스페이트 (DMAPP)을 이소프렌으로 전환시킨다. 실시예들에서 보여진 바와 같이, 이종유래 푸엘라리아 몬타나 (쿠쥬) [Pueraria Montana (kudzu)] 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드는 에스케리키아 콜라이, 판토테오아 시트레아, 바실러스 섭틸리스, 야로위야 리포리티카, 및 트리코더마 리세이 와 같은 다양한 숙주세포에서 발현되었다. 이들 세포 모두는 이종유래 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드가 없는 해당되는 세포보다 더 많은 이소프렌을 생산하였다. 표 1 및 표 2에서 설명된 바와 같이, 많은 양의 이소프렌이 본 명세서에서 기술된 방법을 사용하여 생산된다. 예를 들어, 이종유래 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드 핵산을 가진 B. subtilis 세포는 이종유래 핵산이 없는 해당되는 대조군 B. subtilis 세포보다 14 리터 발효기에서 대략 10배 더 많은 이소프렌을 생산하였다 (표 2). 발효기에서 대장균에 의한 액체배지 리터 당 300 mg의 이소프렌 (mg/L, 여기에서 액체배지의 부피는 세포 배지의 부피 및 세포의 부피 둘 다를 포함함) 또한 B. subtilis 에 의한 30 mg/L은 이소프렌이 유의한 양으로 생성될 수 있는 것을 표시한다 (표 2). 원하는 경우, 이소프렌은 훨씬 더 큰 규모로 생산될 수 있거나 본 명세서에서 기술된 조건은 이소프렌량을 좀 더 증가시키는 데 사용될 수 있다. 표 1 및 표 2에 나열된 벡터 및 실험적 조건은 하기 및 실시예 섹션에서 좀 더 상세히 기술된다.

표 1은 본 발명의 세포 배양 및 방법을 사용한 진탕 플라스트로부터 이소프렌의 대표적인 수율을 나타낸다. 이소프렌 생산을 측정하는 분석법은 실시예 1, 제 II부에 기술되어 있다. 본 분석법을 위해, 시료가 진탕 플라스크로부터 하나 이상의 시간대에 수집되고 30분 동안 배양되었다. 그 다음 본 시료에서 생산된 이소프렌량이 측정되었다. 상부공간 농도 및 특이 이소프렌 생산률은 표 1에 나열되어 있고 본 명세서에서 좀 더 기술된다.

균주	상부공간 바이알에서 이소프렌 생산*
	상부공간 농도μg/ L gas	특이 생산률 mg /L 액체배지 /시간/ OD ( nmol / g wcm /시간)
E. coli BL21/pTrcKudzu IS	1.40	53.2 (781.2)
E. coli BL21/ pCL DXS yidi Kudzu IS	7.61	289.1 (4.25 x 103)
kudzu IS 및 전체 MVA 경로를 가진 E. coli BL21/MCM127 with	23.0	874.1 (12.8 x 103)
E. coli BL21/ pET N-HisKudzu IS	1.49	56.6 (831.1)
Pantoea citrea /pTrcKudzu IS	0.66	25.1 (368.6)
E. coli w/ Poplar IS [Miller (2001)]	-	5.6 (82.2)
Bacillis licheniformis Fall US 5849970	-	4.2 (61.4)
쿠쥬 이소프렌 합성효소를 가진 Yarrowia lipolytica	~0.05 mg/L	~2 (~30)
쿠쥬 이소프렌 합성효소를 가진 Trichoderma reesei	~0.05 mg/L	~2 (~30)
쿠쥬 IS 및 하부 MVA 경로를 가진 E. coli BL21/ pTrcKKDyIkIS	85.9	3.2 x 103 (4.8 x 104)

* OD₆₀₀ 1의 1 mL로 정상화되고, 액체를 넣은 밀봉된 상부공간 바이알에서 1 : 19의 상부공간 부피 비율까지 1시간 동안 배양됨.

표 2는 본 발명의 세포 배양 및 방법을 사용한 발효기로부터의 이소프렌의 대표적인 수율을 나타낸다. 이소프렌 생산을 측정하는 분석법은 실시예 1, 제 II부에 기술되어 있다. 본 분석법을 위해, 발효기의 배출기체의 시료가 수집되고 이소프렌량이 분석되었다. 피크 상부공간 농도 (발효 기간 동안 가장 높은 상부공간 농도), 역가 (액체배지 리터 당 생산된 이소프렌의 누적된 전체량), 및 이소프렌 생산의 피크 특이 생산률 (발효 기간 동안 가장 높은 특이 생산률)는 표 2에 나열되어 있고 본 명세서에서 좀 더 기술된다.

균주	발효기에서 이소프렌 생산
	피크 상부공간 농도** (μg/L gas )	역가 (mg/L 액체배지 )	피크 특이 생산률 μg/L 액체배지 /시간/OD (nmol/g wcm /시간)
쿠쥬 IS를 가진 E. coli BL21 /pTrcKudzu	52	41.2	37 (543.3)
E. coli FM5/pTrcKudzu IS	3	3.5	21.4 (308.1)
E. coli BL21/ 삼중 균주 (DXS, yidi, IS)	285	300	240 (3.52 x 103)
E. coli FM5/ 삼중 균주(DXS, yidi, IS)	50.8	29	180.8 (2.65 x 103)
쿠쥬 IS 와 전체 MVA 경로를 가진 E. coli/MCM127	3815	3044	992.5 (1.46 x 104)
E. coli BL21/pCLPtrc UpperPathway gi1.2 통합된 하부 경로 pTrcKudzu	2418	1640	1248 (1.83 x 104)
E. coli BL21/MCM401 2 x 50 μM IPTG	13991	23805	3733 (5.49 x 104)
E. coli BL21/MCM401 2 x 1000 μM IPTG	22375	19541	5839.5 (8.59 x 104)
E. coli BL21/pCLPtrc UpperPathwayHGS2 -pTrcKKDyIkIS	3500	3300	1088 (1.60 x 104)
야생형 바실러스 섭틸리스	1.5	2.5	0.8 (11.7)
Bacillus pBS Kudzu IS	16.6	~30 (100시간 초과)	5 (73.4)
Bacillus Marburg 6051 [ Wagner and Fall (1999)]	2.04	0.61	24.5 (359.8)
Bacillus Marburg 6051 Fall US 5849970	0.7	0.15	6.8 (100)
E. coli BL21/ pCLPtrcUpperPathway 및 gil.2KKDyI 및 pTrcAlba-mMVK	2.03 x 104	3.22 x 104	5.9 x 103 (8.66 x 104)
E. coli BL21/pCLPtrcUpper Pathway 및 gi1.2KKDyI 및 pTrcAlba-mMVK 더한 pBBRCMPGI1.5pgl	3.22 x 104	6.05 x 104	1.28 x 104 (1.88 x 105)

** 배출기체 유속 1 vvm (분 당 1 L_액체배지 당 1 부피 배출기체)으로 정상화됨.

추가적으로, 이종유래 이소프렌 합성효소 핵산을 포함하는 세포에 의한 이소프렌의 생산은 세포에 의해 생산되는 1-데옥시-D-자일루로스-5-포스페이트 합성효소 (DXS) 폴리펩타이드 및/또는 이소펜테닐 디포스페이트 이소머라제 (IDI)의 양을 증가시켜서 증진될 수 있다. 예를 들어, DXS 핵산 및/또는 IDI 핵산은 세포 내로 도입될 수 있다. DXS 핵산은 이종유래 핵산 또는 내재성 핵산의 이중 사본일 수 있다. 유사하게, IDI 핵산은 이종유래 핵산 또는 내재성 핵산의 이중 사본일 수 있다. 일정 구현예에서, DXS 및/또는 IDI 폴리펩타이드의 양은 내재성 DXS 및/또는 IDI 프로모터 또는 조절 부위를 DXS 및/또는 IDI 핵산의 더 큰 전사를 가져오는 다른 프로모터 및/또는 조절 부위로 대체함에 의해 증가된다. 일정 구현예에서, 세포는 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드 를 인코딩하는 이종유래 핵산 (예로, 식물 이소프렌 합성효소 핵산) 및 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코딩하는 내재성 핵산의 이중 사본) 둘 다를 포함한다.

인코드된 DXS 및 IDI 폴리펩타이드는 이소프렌 생합성을 위한 DXP 경로의 일부이다 (도 19A). DXS 폴리펩타이드는 피루베이트 및 D-글루타르알데하이드-3-포스페이트를 1-데옥시-D-자일루로스-5-포스페이트로 전환시킨다. 상세한 이론으로 설명하려고 의도하지는 않지만, DXS 폴리펩타이드의 양을 증가시키는 것은 DXP 경로를 통한 탄소의 유량을 증가시키고, 더 많은 이소프렌 생산을 유발하는 것으로 여겨진다. IDI 폴리펩타이드는 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP) 및 디메틸아릴 디포스페이트 (DMAPP)의 상호전환을 촉매한다. 상세한 이론으로 설명하려고 의도하지는 않지만, 세포에서 IDI 폴리펩타이드의 양을 증가시키는 것은 DMAPP로 전환되어 다시 이소프렌으로 전환되는 IPP양 (및 전환율)을 증가시키는 것으로 여겨진다.

예를 들어, 쿠쥬 이소프렌 합성효소, S. cerevisia IDI, 및 E. coli DXS 핵산을 가지는 대장균 세포의 발효가 이소프렌을 생산하는 데 사용되었다. 이소프렌의 수준은 50으로부터 300 μg/L까지 15시간의 기간 동안 다양하다 (실시예 7, 제 VII부).

일정 구현예에서, 이종유래 또는 별도의 내재성 이소프렌 합성효소, IDI, 및 DXS 핵산의 존재는 세포가 이들 이종유래 또는 별도의 내재성 이소프렌 합성효소의 하나 이상만을 가진 해당되는 세포와 비교하여, 더 재현적으로 (reproducibly) 성장하도록 유도하거나 더 오래 생존가능하게 유지한다. 예를 들어, 이종유래 이소프렌 합성효소, IDI, 및 DXS 핵산을 포함하는 세포는 이종유래 이소프렌 합성효소 및 DXS 핵산만을 가지는 또는 이종유래 이소프렌 합성효소 핵산만 가지는 세포보다 더 잘 자란다. 또한, 이종유래 이소프렌 합성효소, IDI, 및 DXS 핵산은 대장균 세포에 의해 유지되었던 높은 사본수 플라스미드 상에서 성공적으로 강한 프로모터에 작동적으로 연결되었고, 많은 양의 이들 폴리펩타이드가 세포에 과다한 양의 독성을 유발하지 않고도 세포에서 발현될 수 있는 것을 제시한다. 상세한 이론으로 설명하려고 의도하지는 않지만, 이종유래 또는 별도의 이소프렌 합성효소, IDI, 및 DXS 핵산의 존재가 세포에서 단지 이종유래 또는 별도의 내재성 DXS핵산이 존재하는 경우 축적될 잠재적으로 독성을 가진 하나 이상의 중간산물의 양을 감소시킬 수 있는 것으로 여겨진다.

일정 구현예에서, 이종유래 이소프렌 합성효소 핵산을 포함하는 세포에 의한 이소프렌의 생산은 세포에 의해 발현되는 MVA 폴리펩타이드의 양을 증가시킴에 의해 증대된다 (도 19A 및 19B). 대표적인 MVA 경로 폴리펩타이드는 하기 폴리펩타이드를 포함한다: 아세틸-CoA 아세틸전이효소 (AA-CoA 티올라제) 폴리펩타이드, 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 합성효소 (HMG-CoA 합성효소) 폴리펩타이드, 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 환원효소 (HMG-CoA 환원효소) 폴리펩타이드, 메발로네이트 키나제 (MVK) 폴리펩타이드, 포스포메발로네이트 키나제 (PMK) 폴리펩타이드, 디포스포메발로네이트 키나제 (MVD) 폴리펩타이드, 포스포메발로네이트 탈탄산화효소 (PMDC) 폴리펩타이드, 이소펜테닐 포스페이트 키나제 (IPK) 폴리펩타이드, IDI 폴리펩타이드, 및 둘 이상의 MVA 경로 폴리펩타이드의 활성을 가진 폴리펩타이드 (예로, 융합 폴리펩타이드). 예를 들어, 하나 이상의 MVA 경로 핵산은 세포 내로 도입될 수 있다. 일정 구현예에서, 세포는 상부 MVA 경로를 포함하고, 이는 AA-CoA 티올라제, HMG-CoA 합성효소, 및 HMG-CoA 환원효소 핵산을 포함한다. 일정 구현예에서, 세포는 하부 MVA 경로를 포함하고, 이는 MVK, PMK, MVD, 및 IDI 핵산을 포함한다. 일정 구현예에서, 세포는 전체 MVA 경로를 포함하고, 이는 AA-CoA 티올라제, HMG-CoA 합성효소, HMG-CoA 환원효소, MVK, PMK, MVD, 및 IDI 핵산을 포함한다. 일정 구현예에서, 세포는 전체 MVA 경로를 포함하고, 이는 AA-CoA 티올라제, HMG-CoA 합성효소, HMG-CoA 환원효소, MVK, PMDC, IPK, 및 IDI 핵산을 포함한다. MVA 경로 핵산은 이종유래 핵산 또는 내재성 핵산의 이중 사본일 수 있다. 일정 구현예에서, 하나 이상 MVA 경로 폴리펩타이드의 양은 MVA 경로에 대한 프로모터 또는 조절 부위를 MVA 경로 핵산의 더 큰 전사를 가져오는 다른 프로모터 및/또는 조절 부위로 대체함에 의해 증가된다. 일정 구현예에서, 세포는 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산 (예로, 식물 이소프렌 합성효소 핵산) 및 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코딩하는 내재성 핵산의 이중 사본) 둘 다를 포함한다.

예를 들어, 쿠쥬 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 및 Saccharomyces cerevisiae MVK, PMK, MVD, 및IDI 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 대장균은 6.67 x 10^-4 mol/L_액체배지/OD₆₀₀/시간으로 이소프렌을 생산하였다 (실시예 8을 참조하라). 추가적으로, Enterococcus faecalis AA-CoA 티올라제, HMG-CoA 합성효소, 및HMG-CoA 환원효소 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 가진 대장균의 14리터 발효는 22 그램의 메발론산 (MVA 경로의 중간산물)을 생산하였다. 이들 세포의 진탕 플라스크는 리터 당 2-4 그램 메발론산을 생산하였다. 이들 결과는 이종유래 MVA 경로 핵산은 대장균에서 활성을 가지는 것을 표시한다. 상부 MVA 경로 및 하부 MVA 경로 둘 다뿐만 아니라 쿠쥬 이소프렌 합성효소 (MCM 127 균주)에 대한 핵산을 포함하는 세포는 단지 하부 MVA 경로 및 쿠쥬 이소프렌 합성효소 (MCM 131 균주)에 대한 핵산을 가진 대장균과 비교하여 유의하게 더 많은 이소프렌 (874 μg/L)을 생산하였다 (표 3 및 실시예 8, 제 VIII부를 참조하라).

일정 구현예에서, 세포의 적어도 일정량은 이종유래 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, 및/또는 MVA 경로 핵산을 적어도 약 5, 10, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 이상의 세포분열 동안 연속식 배양에서 유지된다. 본 발명의 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 이종유래 또는 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, 및/또는 MVA 경로 핵산의 이중 사본을 포함하는 핵산은 또한 카나마이신 (kanamycin), 앰피실린 (ampicillin), 카베니실린 (carbenicillin), 젠타마이신 (gentamicin), 하이그로마이신 (hygromycin), 플레오마이신 (phleomycin), 블레오마이신 (bleomycin), 네오마이신 (neomycin), 또는 클로로암페니콜 (chloramphenicol) 항생제 저항성 핵산과 같은 선별 마커를 포함한다.

실시예 7, 제 VI 부에 나타난 바와 같이, 생산된 이소프렌량은 효모 추출물을 세포 배양배지에 첨가하여 좀 더 증가될 수 있다. 본 실시예에서, 생산된 이소프렌량은 테스트된 농도의 세포 배지에서 효모추출물의 양에 직선적으로 비례하였다 (도 48C). 추가적으로, 액체배지 리터 당 대략 0.11 그램의 이소프렌이 효모추출물과 포도당을 가진 세포 배지로부터 생산되었다 (실시예 7, 제 VIII부). 이들 실험 둘 다는 이소프렌을 생산하도록 쿠쥬 이소프렌 합성효소, S. cerevisia IDI, 및 E. coli DXS 핵산을 가지는 대장균을 사용하였다. 효모추출물의 양을 포도당 존재 시 증가시키는 것은 포도당의 양을 효모추출물 존재 시 증가시키는 것보다 더 많은 생산된 이소프렌량을 가져왔다. 또한, 효모추출물의 양을 증가시키는 것은 세포가 더 오랜 기간 동안 높은 수준의 이소프렌을 생산하도록 하고 세포의 건강을 개선시켰다.

이소프렌의 생산도 역시 탄소원으로서 세 가지 유형의 가수분해된 바이오매스 (바가스, 옥수수 스토버, 및 연목질 펄프)를 사용하여 기술되었다 (도 46A 내지 46C). 쿠쥬 이소프렌 합성효소, S. cerevisia IDI, 및 E. coli DXS 핵산을 가지는 대장균은 동등한 양의 포도당 (예로, 1% 포도당, w/v)으로부터 나온 것만큼 이들 가수분해된 바이오매스 탄소원으로부터 이소프렌을 생산하였다. 원하는 경우, 어떠한 바이오매스 탄소원이라도 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 바이오매스 탄소원은 그들이 많은 통상적인 세포 배지보다 저렴하여 이소프렌의 경제적인 생산을 용이하게 하기 때문에 바람직하다.

추가적으로, 역슈가가 이소프렌의 생산을 위한 탄소원으로서 기능하는 것을 보여주었다 (도 47C 및 도 96 내지 도 98). 예를 들어, 2.4 g/L의 이소프렌이 MVA 경로 폴리펩타이드 및 쿠쥬 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 발현하는 세포로부터 생산되었다 (실시예 8, 제 XV부). 글리세롤도 역시 쿠쥬 이소프렌 합성효소를 발현하는 세포로부터 2.2 mg/L의 이소프렌을 생산하는 탄소원으로서 사용되었다 (실시예 8, 제 XIV부). 이소프렌 합성효소 핵산에 추가하여, DXS 핵산, IDI 핵산 및/또는 하나 이상의 MVA 경로 핵산 (전체 MVA 경로를 인코딩하는 핵산과 같음)은 글리세롤로부터 이소프렌의 생산을 증가시킬 수 있다.

일정 구현예에서, 오일이 세포 배지에 포함된다. 예를 들어, 쿠쥬 이소프렌 합성효소 핵산을 포함하는 B. subtilis 세포는 오일과 포도당원을 포함하는 세포에서 배양될 때 이소프렌을 생산한다 (실시예 4, 제 III부). 일정 구현예에서, 하나 이상의 오일 (2, 3, 4, 5개 이상의 오일과 같음)이 세포 배지에 포함된다. 상세한 이론으로 설명하려고 의도하지 않지만, (i) 오일은 세포에서 이소프렌의 전환에 사용가능한 탄소의 양을 증가시킬 수 있고, (ii) 오일은 세포에서 아세틸-CoA의 양을 증가시키고 따라서 MVA 경로를 통한 탄소 유량을 증가시킬 수 있으며, 및/또는 (iii) 오일은 과다 영양을 세포로 공급할 수 있고, 이는 세포에서 많은 탄소가 다른 산물보다는 이소프렌으로 전환되기 때문에 바람직하다. 일정 구현예에서, 오일을 포함하는 세포 배지에서 배양된 세포는 이소프렌을 생산하도록 전체 MVA 경로를 자연적으로 사용하거나 전체 MVA 경로에 대한 핵산을 포함하도록 유전적으로 변형된다. 일정 구현예에서, 오일은 세포 배양 배지에 첨가되기 이전에 숙주세포에 의한 오일의 사용을 용이하게 하도록 부분적으로 또는 완전하게 가수분해된다.

세포 (예로, 박테리아)에서 이소프렌과 같은 작은 분자의 상업적 생산에 대한 주요한 장애물 하나는 세포의 성장으로부터 분자의 생산을 자연적으로 분리시키는 (decoupling) 것이다. 이소프렌의 상업적으로 생존가능한 생산을 위한 일정 구현예에서, 공급원료로부터 유의한 양의 탄소가 세포의 성장 및 유지보다는 오히려 이소프렌으로 전환된다 ("탄소 효율 (carbon efficiency)"). 다양한 구현예에서, 세포는 세포 배양 배지에서 탄소의 약 0.0015, 0.002, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.12, 0.14, 0.16, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 또는 8.0% 이상을 이소프렌으로 전환시킨다. 상세한 구현예에서, 하류 산물로 전환되는 공급원료으로부터 나온 탄소의 유의한 일정량은 이소프렌으로 전환된다. 실시예 11에서 좀 더 기술된 바와 같이, MVA 경로 및 쿠쥬 이소프렌 합성효소 핵산을 발현하는 대장균 세포는 이소프렌 또는 중간산물 메발론산의 생산을 성장과 분리하여 높은 탄소 효율을 가져오는 것을 보여주었다. 상세하게, 메발론산은 Enterococcus faecalis로부터 나온 상부 MVA 경로를 발현하는 세포로부터 형성되었다. 이소프렌은 Enterococcus faecalis로부터 나온 상부 MVA 경로를 발현하는 세포, Saccharomyces cerevisiae로부터 나온 상부 MVA 경로, 및 Pueraria montana (Kudzu)로부터 나온 이소프렌 합성효소로부터 형성되었다. 이러한 이소프렌 또는 메발론산 생산과 성장의 분리는 네 가지 서로 다른 균주 E. coli: BL21(LDE3), BL21(LDE3) Tuner, FM5, 및 MG1655에서 나타났다. 처음 두 가지 E. coli 균주는 B 균주이고, 후자 두 가지는 K12 균주이다. 또한 생산과 성장의 분리는 결실된 ack 및 pta 유전자를 가진 MG1655 변이체에서도 나타났다. 본 변이체도 역시 더 적은 아세테이트의 생산을 나타냈다.

대표적인 폴리펩타이드 및 핵산

다양한 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 돌연변이 또는 전사인자 폴리펩타이드 및 핵산이 본 명세서에서 기술된 조성물들 및 방법들에 사용될 수 있다.

일정 구현예에서, 융합 폴리펩타이드는 첫 번째 폴리펩타이드 (예로, 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 돌연변이 또는 전사인자 폴리펩타이드 또는 그의 촉매적으로 활성을 가진 단편)의 일부 또는 전부를 포함하고, 임의적으로 두 번째 폴리펩타이드 (예로, 히스-태그 (His-tag)와 같은 융합 폴리펩타이드의 정제 또는 검출을 용이하게 하는 펩타이드)의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 일정 구현예에서, 융합 폴리펩타이드는 둘 이상의 MVA 경로 폴리펩타이드의 활성을 가진다 (AA-CoA 티올라제 및HMG-CoA 환원효소 폴리펩타이드와 같음). 일정 구현예에서, 폴리펩타이드는 둘 이상의 MVA 경로 폴리펩타이드의 활성을 가지는 자연적으로-발생하는 폴리펩타이드이다.

다양한 구현예에서, 폴리펩타이드는 적어도 또는 약 50, 100, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 또는 400개 이상의 아미노산을 가진다. 일정 구현예에서, 폴리펩타이드 단편은 전장의 폴리펩타이드로부터 나온 적어도 또는 약 25, 50, 75, 100, 150, 200, 또는 300개 이상의 연속된 아미노산을 가지고, 해당되는 전장 폴리펩타이드의 적어도 또는 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100%의 활성을 가진다. 상세한 구현예에서, 폴리펩타이드는 자연적으로 발생하는 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 돌연변이 또는 전사인자 폴리펩타이드라면 모두의 분절 또는 전장 아미노산 서열을 포함한다.

일정 구현예에서, 폴리펩타이드는 야생형 (예로, 자연적으로 발생하는 서열) 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 돌연변이 또는 전사인자 폴리펩타이드의 서열과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 가진다.

일정 구현예에서, 핵산은 재조합 핵산이다. 일정 구현예에서, 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 돌연변이 또는 전사인자 핵산은 또 다른 폴리펩타이드의 전부 또는 일부를 인코딩하는 또 다른 핵산과 작동적으로 연결되어 있어서, 재조합 핵산은 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 돌연변이 또는 전사인자 폴리펩타이드 및 또 다른 폴리펩타이드의 전부 또는 일부 (예로, 히스-태그와 같은 융합 폴리펩타이드의 정제 또는 검출을 용이하게 하는 펩타이드)를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 인코드한다. 일정 구현예에서, 재조합 핵산의 일부 또는 전부는 화학적으로 합성된다.

일정 구현예에서, 핵산은 이종유래 핵산이다. 상세한 구현예에서, 핵산은 자연적으로 발생하는 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 돌연변이 또는 전사인자 핵산이라면 모두의 분절 또는 전체 핵산서열을 포함한다. 일정 구현예에서, 핵산은 야생형 (예로, 자연적으로 발생하는 서열) 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 돌연변이 또는 전사인자 핵산의 서열과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 가진다. 일정 구현예에서, 핵산은 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 돌연변이 또는 전사인자 핵산의 전사 또는 해독을 증가시키는 하나 이상의 돌연변이 (예로, 침묵 돌연변이 (silent mutation))를 가진다. 일정 구현예에서, 핵산은 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 돌연변이 또는 전사인자 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산이라면 모두의 반복 변형체 (degenerate variant)이다.

대표적인 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, 및/또는 MVA 경로 폴리펩타이드 및 핵산의 기탁번호가 별첨 1에 나열되어 있다 (별첨 1의 기탁번호 및 그들의 해당 서열은 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, 및/또는 MVA 경로 폴리펩타이드 및 핵산에 관하여 통합되어 있다). 케그 데이터베이스 (Kegg database)도 역시 수많은 대표적인 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, 및/또는 MVA 경로 폴리펩타이드 및 핵산의 아미노산 및 핵산 서열을 포함한다 (예를 들어, 전세계적 웹 "genome.jp/kegg/pathway/map/map00100.html" 및 여기에서 서열들을 참조하고, 이들은 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, 및/또는 MVA 경로 폴리펩타이드 및 핵산에 관하여 통합되어 있다). 일정 구현예에서, 하나 이상의 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, 및/또는 MVA 경로 폴리펩타이드 및/또는 핵산은 별첨 1에서 기탁번호라면 모두 또는 케그 데이터베이스에 존재하는 서열이라면 모두에 해당하는 서열이라면 모두와 같은2007년 12월 12일 또는 2008년 9월 14일에 공개적으로 사용가능한 서열과 일치하는 서열을 가진다. 추가적인 대표적 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, 및/또는 MVA 경로 폴리펩타이드 및 핵산은 하기에 좀 더 기술된다.

대표적인 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드 및 핵산

상기 주목된 바와 같이, 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드는 디메틸아릴 디포스페이트 (DMAPP)를 이소프렌으로 전환시킨다. 대표적인 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드는 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드의 적어도 하나의 활성을 가지는 폴리펩타이드, 폴리펩타이드의 단편, 펩타이드, 및 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 표준 방법이 폴리펩타이드가 시험관내 (in vitro), 세포추출물에서 또는 생체내 (in vivo)에서 DMAPP를 이소프렌으로 전환하는 활성을 측정하여 폴리펩타이드가 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드의 활성을 가지는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다. 대표적인 분석법에서, 세포 추출물은 균주 (예로, 본 명세서에서 기술된 E. coli/pTrcKudzu 균주)를 실시예 1에 기술된 바와 같이 진탕 플라스크 방법으로 성장시켜서 제조된다. 유도가 끝난 이후, 대략 10 mL의 세포를 7000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛으로 만들고, 글리세롤이 없는 5 ml의 PEB에 재현탁시킨다. 세포는 표준 절차를 사용하는 프렌치 프레스기를 사용하여 용해시킨다. 대안으로 세포는 -80˚C에서 냉동/해동 이후에 라이소자임 (Ready-Lyse lysozyme solution; EpiCentre)으로 처리된다.

세포 추출물에서 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드의 활성이, 예를 들어 Silver et al., J. Biol. Chem. 270:13010-13016, 1995 및 여기에서의 문헌들에 기술된 바와 같이 측정될 수 있고, 이들은 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드 활성에 관하여 통합되어 있다. DMAPP (Sigma)는 질소 스트림 하에서의 증발 건조되고 100 mM 의 농도로 100 mM 포타슘 포스페이트 완충용액 pH 8.2에 재수화되며 -20℃에서 저장된다. 분석법을 수행하기 위하여, 5 mL의 1M MgCl₂, 1 mM (250 mg/ml) DMAPP, 65 mL의 식물 추출물 완충용액 (Plant Extract Buffer, PEB) (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 20 mM MgCl₂, 5% 글리세롤 및 2 mM DTT)이 금속 회전 뚜껑과 테프론 코팅된 실리콘 격막을 가진 20 ml 상부공간 바이알 (애질런트 테크놀로지사 (Agilent Technologies))에 넣은 25 mL의 세포 추출물에 첨가되고 37℃에서 15분 동안 진탕하면서 배양된다. 반응은 200 mL의 250 mM EDTA 를 첨가하여 정지되고 실시예 1, 제 II부에 기술된 바와 같은 GC/MS에 의해 정량된다.

대표적인 이소프렌 합성효소 핵산은 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드의 적어도 하나의 활성을 가지는 폴리펩타이드, 폴리펩타이드의 단편, 펩타이드, 또는 융합 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산을 포함한다. 대표적인 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드 및 핵산은 본 명세서에서 기술된 출처 생물이라면 모두로부터 나온 자연적으로-발생하는 폴리펩타이드 및 핵산 뿐만 아니라 본 명세서에서 기술된 출처 생물이라면 모두로부터 유래한 돌연변이 폴리펩타이드 및 핵산을 포함한다.

일정 구현예에서, 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드 또는 핵산은 파보이대 아과 (Faboideae subfamily)과 같은 파바시애과 (Fabaceae family)로부터 나온다. 일정 구현예에서, 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드 또는 핵산은 푸엘라리아 몬타나 (쿠쥬) (Sharkey et al., Plant Physiology 137: 700-712, 2005), 푸엘라리아 로바타, 포풀라 (포풀러스 알바, 포풀러스 니그라, 포풀러스 트리코카르파, 또는 포풀러스 알바 x 트레물라 (CAC35696) 와 같음; Miller et al., Planta 213: 483-487, 2001) 아스펜 (Populus tremuloides와 같음; Silver et al., JBC 270(22): 13010-1316, 1995), 또는 영국 오크 (English Oak, Quercus robur) (Zimmer et al., 국제특허출원 제 WO 98/02550호)로부터 나오고, 이들은 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 이소프렌 합성효소 핵산 및 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드의 발현에 관하여 통합되어 있다. 적합한 이소프렌 합성효소는, 이에 제한되는 것은 아니지만 진뱅크 기탁번호 AY341431, AY316691, AY279379, AJ457070, 및 AY182241로 확인된 것들을 포함하고, 이들은 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 이소프렌 합성효소 핵산 및 폴리펩타이드의 서열에 관하여 통합되어 있다. 일정 구현예에서, 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드 또는 핵산은 자연적으로-발생하는 쿠에르쿠스 로바르 (Quercus robur) 로부터 나온 폴리펩타이드 또는 핵산이 아니다 (예로, 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드 또는 핵산은 자연적으로 발생하는 쿠에르쿠스 로바르로부터 나온 폴리펩타이드 또는 핵산가 아닌 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드 또는 핵산이다). 일정 구현예에서, 이소프렌 합성효소 핵산 또는 폴리펩타이드는 자연적으로-발생하는 포풀라로부터 나온 폴리펩타이드 또는 핵산이다. 일정 구현예에서, 이소프렌 합성효소 핵산 또는 폴리펩타이드는 또는 핵산은 자연적으로 발생하는 포풀라로부터 나온 폴리펩타이드 또는 핵산이 아니다.

대표적인 DXS 폴리펩타이드 및 핵산

상기 주목된 바와 같이, 1-데옥시-D-자일루로스-5-포스페이트 합성효소 (DXS) 폴리펩타이드는 피루베이트 및 D-글루타르알데하이드-3-포스페이트를 1-데옥시-D-자일루로스-5-포스페이트로 전환시킨다. 대표적인 DXS 폴리펩타이드는 DXS 폴리펩타이드의 적어도 하나의 활성을 가지는 폴리펩타이드, 폴리펩타이드의 단편, 펩타이드, 및 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 표준 방법 (본 명세서에서 기술된 것과 같음)이 폴리펩타이드가 시험관내 (in vitro), 세포추출물에서 또는 생체내 (in vivo)에서 피루베이트 및 D-글루타르알데하이드-3-포스페이트를 1-데옥시-D-자일루로스-5-포스페이트로 전환하는 활성을 측정하여 폴리펩타이드가 DXS 폴리펩타이드의 활성을 가지는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다. 대표적인 DXS 핵산은 DXS 폴리펩타이드의 적어도 하나의 활성을 가지는 폴리펩타이드, 폴리펩타이드의 단편, 펩타이드, 또는 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 대표적인 DXS 폴리펩타이드 및 핵산은 본 명세서에서 기술된 출처 생물이라면 모두로부터 나온 자연적으로-발생하는 폴리펩타이드 및 핵산뿐만 아니라 본 명세서에서 기술된 출처 생물이라면 모두로부터 유래한 돌연변이 폴리펩타이드 및 핵산을 포함한다.

대표적인 IDI 폴리펩타이드 및 핵산

이소펜테닐 디포스페이트 이소머라제 폴리펩타이드 (이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제 또는 IDI)는 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP) 및 디메틸아릴 디포스페이트 (DMAPP)의 상호전환을 촉매한다 (예로, DMAPP로의 IPP 전환 및/또는 IPP로 DMAPP의 전환). 대표적인 IDI 폴리펩타이드는 IDI 폴리펩타이드의 적어도 하나의 활성을 가지는 폴리펩타이드, 폴리펩타이드의 단편, 펩타이드, 및 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 표준 방법 (본 명세서에서 기술된 것과 같음)이 폴리펩타이드가 IDI 폴리펩타이드의 활성을 가지는지 여부를 폴리펩타이드가 시험관내 (in vitro), 세포추출물에서 또는 생체내 (in vivo)에서 IPP와 DMAPP가 상호전환하는 활성을 측정하여 결정하는 데 사용될 수 있다. 대표적인 IDI 핵산은 IDI 폴리펩타이드의 적어도 하나의 활성을 가지는 폴리펩타이드, 폴리펩타이드의 단편, 펩타이드, 또는 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 대표적인 IDI 폴리펩타이드 및 핵산은 본 명세서에서 기술된 출처 생물이라면 모두로부터 나온 자연적으로 발생하는 폴리펩타이드 및 핵산 뿐만 아니라 본 명세서에서 기술된 출처 생물이라면 모두로부터 유래한 돌연변이 폴리펩타이드 및 핵산을 포함한다.

대표적인 MVA 경로 폴리펩타이드 및 핵산

대표적인 MVA 경로 폴리펩타이드는 아세틸-CoA 아세틸전이효소 (AA-CoA 티올라제) 폴리펩타이드, 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 합성효소 (HMG-CoA 합성효소) 폴리펩타이드, 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 환원효소 (HMG-CoA 환원효소) 폴리펩타이드, 메발로네이트 키나제 (MVK) 폴리펩타이드, 포스포메발로네이트 키나제 (PMK) 폴리펩타이드, 디포스포메발로네이트 키나제 (MVD) 폴리펩타이드, 포스포메발로네이트 탈탄산화효소 (PMDC) 폴리펩타이드, 이소펜테닐 포스페이트 키나제 (IPK) 폴리펩타이드, IDI 폴리펩타이드, 및 둘 이상의 MVA 경로 폴리펩타이드의 활성을 가진 폴리펩타이드 (예로, 융합 폴리펩타이드)를 포함한다. 상세하게, MVA 경로 폴리펩타이드는 MVA 경로 폴리펩타이드의 적어도 하나의 활성을 가지는 폴리펩타이드, 폴리펩타이드의 단편, 펩타이드, 및 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 대표적인 MVA 경로 핵산은 MVA 경로 폴리펩타이드의 적어도 하나의 활성을 가지는 폴리펩타이드, 폴리펩타이드의 단편, 펩타이드, 또는 융합 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 대표적인 MVA 경로 폴리펩타이드 및 핵산은 본 명세서에서 기술된 출처 생물이라면 모두로부터 나온 자연적으로-발생하는 폴리펩타이드 및 핵산 뿐만 아니라 본 명세서에서 기술된 출처 생물이라면 모두로부터 유래한 돌연변이 폴리펩타이드 및 핵산을 포함한다.

상세하게, 아세틸-CoA 아세틸전이효소 폴리펩타이드 (AA-CoA 티올라제 또는 AACT)는 두 분자의 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환시킨다. 표준 방법 (본 명세서에서 기술된 것과 같음)이 폴리펩타이드가AA-CoA 티올라제 폴리펩타이드 활성을 가지는지 여부를 폴리펩타이드가 시험관내 (in vitro), 세포추출물에서 또는 생체내 (in vivo)에서 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 전환하는 활성을 측정하여 결정하는 데 사용될 수 있다.

3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 합성효소 (HMG-CoA 합성효소 또는 HMGS) 폴리펩타이드는 아세토아세틸-CoA를 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 로 전환한다. 표준 방법 (본 명세서에서 기술된 것과 같음)이 폴리펩타이드가HMG-CoA 합성효소 폴리펩타이드 활성을 가지는지 여부를 폴리펩타이드가 시험관내, 세포추출물에서 또는 생체내에서 아세토아세틸-CoA를 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA로 전환하는 활성을 측정하여 결정하는 데 사용될 수 있다.

3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 환원효소 (HMG-CoA 환원효소 또는 HMGR) 폴리펩타이드는 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA를 메발로네이트로 전환한다. 표준 방법 (본 명세서에서 기술된 것과 같음)이 폴리펩타이드가HMG-CoA 환원효소 폴리펩타이드 활성을 가지는지 여부를 폴리펩타이드가 시험관내, 세포추출물에서 또는 생체내에서 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA를 메발로네이트로 전환하는 활성을 측정하여 결정하는 데 사용될 수 있다.

메발로네이트 키나제 (MVK) 폴리펩타이드는 메발로네이트를 인산화하여 메발로네이트-5-포스페이트를 형성한다. 표준 방법 (본 명세서에서 기술된 것과 같음)이 폴리펩타이드가 메발로네이트 키나제 (MVK) 폴리펩타이드 활성을 가지는지 여부를 폴리펩타이드가 시험관내, 세포추출물에서 또는 생체내에서 메발로네이트를 메발로네이트-5-포스페이트로 전환하는 활성을 측정하여 결정하는 데 사용될 수 있다.

포스포메발로네이트 키나제 (PMK) 폴리펩타이드는 메발로네이트-5-포스페이트를 인산화하여 메발로네이트-5-디포스페이트를 형성한다. 표준 방법 (본 명세서에서 기술된 것과 같음)이 폴리펩타이드가 PMK폴리펩타이드 활성을 가지는지 여부를 폴리펩타이드가 시험관내, 세포추출물에서 또는 생체내에서 메발로네이트-5-포스페이트를 메발로네이트-5-디포스페이트로 전환하는 활성을 측정하여 결정하는 데 사용될 수 있다.

디포스포메발로네이트 탈탄산화효소 (MVD 또는 DPMDC) 폴리펩타이드는 메발로네이트-5-디포스페이트를 인산화하여 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)를 형성한다. 표준 방법 (본 명세서에서 기술된 것과 같음)이 폴리펩타이드가 MVD폴리펩타이드 활성을 가지는지 여부를 폴리펩타이드가 시험관내, 세포추출물에서 또는 생체내 에서 메발로네이트-5-디포스페이트를 IPP로 전환하는 활성을 측정하여 결정하는 데 사용될 수 있다.

포스포메발로네이트 탈탄산화효소 (PMDC) 폴리펩타이드는 메발로네이트-5-포스페이트를 인산화하여 이소펜테닐 포스페이트 (IP)를 형성한다. 표준 방법 (본 명세서에서 기술된 것과 같음)이 폴리펩타이드가 PMCD폴리펩타이드 활성을 가지는지 여부를 폴리펩타이드가 시험관내, 세포추출물에서 또는 생체내에서 메발로네이트-5-포스페이트를 IP로 전환하는 활성을 측정하여 결정하는 데 사용될 수 있다.

이소펜테닐 포스페이트 키나제 (IPK) 폴리펩타이드는 이소펜테닐 포스페이트 (IP)를 인산화하여 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP)를 형성한다. 표준 방법 (본 명세서에서 기술된 것과 같음)이 폴리펩타이드가 IPK폴리펩타이드 활성을 가지는지 여부를 폴리펩타이드가 시험관내, 세포추출물에서 또는 생체내에서 IP를 IPP로 전환하는 활성을 측정하여 결정하는 데 사용될 수 있다.

대표적인 IDI 폴리펩타이드 및 핵산은 상기에 기술된다.

대표적인 수소화효소 폴리펩타이드 및 핵산

수소화효소 폴리펩타이드는 반응 2H⁺ + 2e ^- <-> H₂:을 촉매 작용한다. 시험관내 반응은 가역적이지만, 소정의 수소화효소는 생체내에서 H₂를 산화하거나 H⁺를 환원하는 어느 한쪽 방향으로만 작용할 수 있다. 수소화효소 폴리펩타이드는 산소-민감성일 수 있고 복합체 금속 보조인자 (cofactors)를 그들의 촉매적 중심의 일부로서 포함하며 '성숙 (maturation)'인자 또는 전사조절인자 (예로, 활성인자 (activators) 또는 억제인자 (repressors))와 같은 때로 부가적인 부속 폴리펩타이드가 연루된 수소화효소 유전자의 발현을 가지는 다수의 소단위 (multiple subunits)로 구성될 수 있다. 수소화효소는 그들의 촉매적 중심에 금속 보조인자의 유형에 근거하여 적어도 세 가지의 광범위한 그룹으로 분류된다: (1) 니켈-철 ("NiFe" 수소화효소는 니켈/철 보조인자를 가지고; (2) 철-철 수소화효소 ("FeFe"는 철/철 보조인자를 가지며; 또한 (3) 철/황-없는 ("Fe" 수소화효소, 이는 (1)과 (2) 그룹에서 발견되는 4Fe4S 집합이 결여되어 있고, 철 보조인자 및 메테닐-테트라하이드로메탄노프테린 전자 운반체 (methenyl-tetrahydromethanopterin electron carrier). 예로, Chung-Jung Chou et al., "Hydrogenesis in hyperthermophilic microorganisms: implications for biofuels," Metabol. Eng. 10:394-404 (2008), 또한 Gonul Vardar-Schara et al.,"Metabolically engineered bacteria for producing hydrogen via fermentation," Microbial Biotechnol. 1(2):107-125 (2008)를 참조하고, 이들 둘 다는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 수소화효소의 다양한 유형 및 클래스에 관하여 통합되어 있다. 많은 생물이 다수의 수소화효소를 포함하긴 하지만, 소수만이 NiFe 및 FeFe 수소화효소 둘 다에 대한 유전자를 포함한다.

NiFe 수소화효소의 촉매적 중심은 니켈 원자 및 철 원자로 구성되고 각각은 두 개의 일산화탄소 (CO) 및 두 개의 시아나이드 (cyanide, CN^-) 리간드를 가진다. NiFe 수소화효소 모두는 촉매적 중심까지 및 이로부터의 전자 전달을 위한 다수의 철-황 (Fe-S) 중심을 포함하는 적어도 두 번째 소단위를 포함한다. NiFe 수소화효소는 네 가지의 주요 클래스로 다시 나눌 수 있다: (1) 호흡 효소, 이는 혐기성 조건 하에서 H₂ 산화와 SO₄ ^2- 또는 NO₃ ^- 와 같은 말단 전자 수용체의 환원을 결합시키거나, 호기성 조건 하에서 O₂ 를 결합시키는 다중효소 시스템의 일부분이며; (2) H₂ 센서, 이는 대사적으로 활성을 가진NiFe 수소화효소의 발현을 활성화시키고; (3) NADP⁺를 사용할 수 있는 다수의 소단위를 포함하는 세포질 수소화효소, 이는 시험관내 에서는 바로 가역적이지만 생체내 에서는 단지 H₂만을 산화할 수 있으며; 또한 (4) 막-부착, 에너지-보존 다중효소 복합체, 이것도 역시 박테리아와 알키아 (Archaea)에서 발견된다. Chung-Jung Chou et al., "Hydrogenesis in hyperthermophilic microorganisms: implications for biofuels," Metabol. Eng. 10:394-404 (2008).

FeFe 수소화효소의 촉매적 중심은 단일 단백질 (시스테인) 리간드에 의해 이중핵 (binuclear) (FeFe) 부위를 [4Fe-4S] 중심에 조화롭게 연결시키는 촉매적 "H 집합 (H cluster)"을 포함한다. 이중핵 중심은 각각 두 개의 일산화탄소 (CO) 및 두 개의 시아나이드 (CN^-) 리간드를 가지고, 작은 유기 분자의 일부인 두 개의 황 원자에 의해 또한 연결된다. 대부분의 FeFe 수소화효소는 약 50 킬로달톤 (kDa)의 모노머 효소이고, 생체내에서 주로 양성자를 수소 기체로 환원시켜 과다 환원 동등물을 버리는 기능을 가지는 것으로 보인다. Chung-Jung Chou et al., "Hydrogenesis in hyperthermophilic microorganisms: implications for biofuels," Metabol. Eng. 10:394-404 (2008).

Fe 수소화효소의 촉매적 중심은 원래는 관여된 금속이 전혀 없는 유기적 보조인자에 기초하는 활성 부위를 가진 것으로 생각되었지만, 이후에 단핵 Fe 원자를 포함하는 것으로 밝혀졌다. 세 가지 유형의 수소화효소 간의 계통학적 차이점에도 불구하고 적어도 하나의 철 원자에 더하여, 수소화효소의 세 가지 그룹 모두도 역시 철 원자에 대한 적어도 하나의 일산화탄소 (CO) 리간드를 그들의 활성 부위에 포함하고, H₂ 의 촉매적 산화 및 양성자의 환원을 용이하게 한다. Chung-Jung Chou et al., "Hydrogenesis in hyperthermophilic microorganisms: implications for biofuels," Metabol. Eng. 10:394-404 (2008).

대표적인 수소화효소 폴리펩타이드로는 이에 제한되는 것은 아니지만, E. coli 수소화효소 -1 (Hyd-1) 폴리펩타이드, E. coli 수소화효소-2 (Hyd-2) 폴리펩타이드, E. coli 수소화효소 -3 (Hyd-3) 폴리펩타이드, E. coli 수소화효소 -4 (Hyd-4) 폴리펩타이드, 포르메이트 및 CO₂ 로부터 산성 pH의 혐기성 조건 하에서 수소 기체를 생산하는 E. coli 포르메이트 수소 용해효소 (FHL) 복합체 (예로, Akihito Yoshida et al., "Efficient induction of formate hydrogen lyase of aerobically grown Escherichia coli in a three-step biohydrogen production process," Appl. Microbiol. Biotechnol. 74:754-760 (2007)를 참조하고, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 대장균에서 포르메이트 수소 용해효소의 유도 및 발현에 관하여 통합되어 있다), 랄스토니아 유트로파 H16 수소화효소 (R. eutropha HoxH), 로도코커스 오파쿠스 MR11 수소화효소 (R. opacus HoxH) 폴리펩타이드, 시네코스티스 종 PCC 6803 수소화효소 (Syn. PCC 6803 HoxH) 폴리펩타이드, 디설포비브리오 기가스 수소화효소 (D. gigas) 폴리펩타이드, 및 디설포비브리오 디설퓨리칸스 ATCC 7757 수소화효소 (D. desulfuricans) 폴리펩타이드 (예로, Gonul Vardar-Schara et al., "Metabolically engineered bacteria for producing hydrogen via fermentation," Microbial Biotechnol. 1(2):107-125 (2008)를 참조하고, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 다양한 유형 및 클래스의 수소화효소에 관하여 통합되어 있다), 또한 둘 이상의 수소화효소 폴리펩타이드의 활성을 가진 폴리펩타이드 (예로, 융합 폴리펩타이드)를 포함한다. 대표적인 수소화효소 핵산은 수소화효소 폴리펩타이드의 적어도 하나의 활성을 가지거나 수소화효소 폴리펩타이드의 발현, 프로세싱, 또는 성숙에 필요한 적어도 하나의 활성을 가지는 폴리펩타이드, 폴리펩타이드의 단편, 펩타이드, 또는 융합 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산을 포함한다. 대표적인 수소화효소 폴리펩타이드 및 핵산은 본 명세서에서 기술된 출처 생물이라면 모두로부터 나온 자연적으로-발생하는 폴리펩타이드 및 핵산 뿐만 아니라 본 명세서에서 기술된 출처 생물이라면 모두로부터 유래한 돌연변이 폴리펩타이드 및 핵산을 포함한다.

E. coli Hyd-3는 혐기성 포르메이트 수소 용해효소 (FHL) 복합체의 일부분이고, hyc 오페론 (hycA, hycB, hycC, hycD, hycE, hycF, hycG, hycH, 및 hycI 유전자를 포함함)에 의해 인코드된다. E. coli Hyd-4는 hyf 오페론 (hyfA, hyfB, hyfC, hyfD, hyfE, hyfF, hyfG, hyfH, hyfI, hyfJ, 및 hyfR 유전자를 포함함)에 의해 인코드된다. E. coli FHL는 hyc 오페론으로부터 나온 여섯 개의 유전자 (hycB, hycC, hycD, hycE, hycF 및 hycG) 및 fdhF 유전자 (포르메이트 탈수소화효소 H (Fdh-H)를 인코드함)에 의해 인코드된다. FHL 복합체의 발현은 좀 더 나아가 피루베이트 포르메이트 용해효소 (pfl), FhlA, fdhF 와 hyc 오페론의 전사를 활성화하는 전사인자, 또는 FHL의 전사를 음성적으로 조절하는 hycA 유전자에 의해 인코드되는 전사인자인 HycA의 결실/불활성화와 관련될 수 있다. 이소프렌과 수소의 공동-생산은 수소화효소 및 기타효소, 예를 들어 철-황 복합체 전자 조절인자 (iscR) (Kalim-Akhtar et al., "Deletion of iscR stimulates recombinant Clostridial Fe/Fe hydrogenase activity and H₂-accumulation in Escherichia coli BL21(DE3)," Appl. Microbiol. Biotechnol. 78:853-862 (2008) 를 참조하고, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 클로스트리듐 Fe/Fe 수소화효소 활성의 자극 및 대장균에서 iscR 유전자의 결실에 의한 수소 축적에 관하여 통합되어 있다)와 같은 것의 유전자 발현의 조절에 관여하는 부가적인 단백질의 발현 또는 불활성화/결실에 의해 개선될 수 있다.

대표적인 페로레독신-의존성 수소화효소 폴리펩타이드는, 이에 제한되는 것은 아니지만 크로스트리듐 아세토부툴리쿰 수소화효소 A (HydA) (예로, P.W. King et al., "Functional studies of [FeFe] hydrogenase maturation in an Escherichia coli biosynthetic system," J. Bacteriol. 188(6):163-172 (2006)을 참조하고, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 HydA 및 세 가지HydA-관련 성숙 효소 (HydE, HydG, 및 HydF)에 의한 수소 생산에 관하여 통합되어 있다), 이는 단독으로 또는 하기 하나 이상과 조합하여 발현될 수 있고: (1) 바실러스 섭틸리스 페로레독신 산화환원효소 (NFOR) (예로, Viet et al., (2008)를 참조하고, 이는 본 명세서에 참고문헌으로 전부 상세하게는 NFOR에 의한 수소 생산에 관하여 통합되어 있으며; PCT 국제특허출원 제 WO/2007/089901호도 역시 참조하고, 이는 본 명세서에 참고문헌으로 전부 상세하게는 수소 생산하기 위한 대장균 균주의 최적화에 관하여 통합되어 있다), 클로스트리듐 클루이베리 (Clostridium kluyveri) NADH 페로레독신 산화환원효소 (RnfCDGEAB) (Henning Seedorf et al., "The genome of Clostridium kluyveri, a strict anaerobe with unique metabolic features," Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 105(6):2128-2133 (2008), 이는 본 명세서에 참고문헌으로 전부 상세하게는 NADH 페로레독신 산화환원효소에 관하여, 또한 혐기성 에탄올-아세테이트 발효 경로의 성분에 관하여 통합되어 있다) 또는 클로스트리듐 파스퇴라니움 (Clostridium pasteuranium) ferredoxin oxidoreductase (Fdx); (2) 글리세르알데하이드-3-포스페이트 페로레독신 산화환원효소 ("GAPOR"); 또는 (3) 피루베이트 페로레독신 산화환원효소 (pyruvate oxidoreductase, "POR"), 및 둘 이상의 수소화효소 폴리펩타이드, 또는 하나 이상의 수소화효소 폴리펩타이드의 활성 및 하나 이상의 페로레독신-의존성 산화환원효소의 활성을 가지는 폴리펩타이드 (예로, 융합 폴리펩타이드)을 포함한다. 상세하게, 페로레독신-의존성 수소화효소 폴리펩타이드는 페로레독신-의존성 수소화효소 폴리펩타이드의 적어도 하나의 활성을 가지는 폴리펩타이드, 폴리펩타이드의 단편, 펩타이드, 및 융합 폴리펩타이드를 포함한다.

대표적인 NADPH-의존성 수소화효소 폴리펩타이드로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 Pyrococcus furiosus 수소화효소 (예로, J. Woodward et al., "Enzymatic production of biohydrogen," Nature 405(6790):1014-1015 (2000)를 참고하라)와 같은 열친화성 수소화효소 폴리펩타이드 및 둘 이상의 NADPH-의존성 수소화효소 폴리펩타이드의 활성을 가지는 폴리펩타이드 (예로, 융합 폴리펩타이드)를 포함한다. 상세하게, NADPH-의존성 수소화효소 폴리펩타이드는 NADPH-의존성 수소화효소 폴리펩타이드는 적어도 하나의 활성을 가지는 폴리펩타이드, 폴리펩타이드의 단편, 펩타이드, 및 융합 폴리펩타이드를 포함한다.

대표적인 산소-내성 또는 산소-비민감성 수소화효소로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 Rubrivivax gelatinosus 수소화효소 (예로, P.C. Maness et al., "Characterization of the oxygen tolerance of a hydrogenase linked to a carbon monoxide oxidation pathway in Rubrivivax gelatinosus," Appl. Environ. Microbiol. 68(6):2633-2636 (2002)를 참조하고, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 R. gelatinosus 수소화효소에 관하여 통합되어 있다), 및 Ralstonia eutropha 수소화효소 폴리펩타이드 (예로, T. Burgdorf et al., "[NiFe]-hydrogenases of Ralstonia eutropha H16: modular enzymes for oxygen-tolerant biological hydrogen oxidation,"J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 10(2-4):181-196 (2005)를 참조하고, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 R. eutropha 수소화효소 폴리펩타이드에 관하여 통합되어 있다)를 포함한다. 대안으로, 수소화효소 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산은 표준 방법 및 분석법 (예로, L.E. Nagy et al., "Application of gene-shuffling for the rapid generation of novel [FeFe]-hydrogenase libraries," Biotechnol. Letts. 29(3)421-430 (2007)를 참조하고, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 돌연변이화 및 산소 내성 수소화효소 폴리펩타이드에 대한 검색에 관하여 통합되어 있다)을 사용하여 돌연변이화될 수 있고O₂-내성 또는 O₂-비민감성에 대해 검색될 수 있다.

표준 방법이 (본 명세서에서 기술된 것과 같음) 폴리펩타이드가 수소화효소 폴리펩타이드의 활성을 가지는지 여부를 폴리펩타이드가 시험관내, 세포추출물에서 또는 생체내 수소 기체를 생산하는 활성을 측정하여 결정하는 데 사용될 수 있다.

발효 부산물과 관련된 유전자에 대한 대표적인 폴리펩타이드 및 핵산

대장균에서 이종유래 또는 자연 그대로의 수소화효소를 발현하거나 과다-발현하는 것과 더불어, 이소프렌과 수소의 공동-생산은 혐기성 생합성 경로의 불활성화에 의해 개선될 수 있고, 따라서 산소-제한되거나 혐기성 조건 하에서 생산되는, 이에 제한되는 것은 아니지만 락테이트, 아세테이트, 피루베이트, 에탄올, 숙시네이트, 및 글리세롤를 포함하는 다양한 대사물 (예로, 발효 부산물)로의 탄소 유량을 차단시킨다. 발효 부산물의 생산과 관련된 대표적인 폴리펩타이드는 포르메이트 탈수소화효소 N, 알파 소단위 ( fdnG), 포르메이트 탈수소화효소 O, 큰 소단위 (fdoG), 나이트레이트 환원효소 (narG), 포르메이트 전달자 A (formate transporter A, focA), 포르메이트 전달자 B (focB), 피루베이트 산화효소 (poxB), 피루베이트 탈수소화효소 E1 성분 ackA/pta (aceE), 알코올 탈수소화효소 (adhE), 푸마레이트 환원효소 막 단백질 (frdC), 및 락테이트 탈수소화효소 (ldhA)를 포함한다. 예로, Toshinori Maeda et al., "Enhanced hydrogen production from glucose by metabolically engineered Escherichia coli," Appl. Microbiol. Biotechnol. 77(4):879-890 (2007)를 참조하고, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 변형된 포도당 대사를 가지는 대장균 균주의 생산에 관하여 통합되어 있다. 이소프렌과 수소의 공동-생산을 개선하도록 불활성화도 역시 될 수 있는 발효 부산물의 생산과 관련된 유전자의 조절 또는 발현과 관련된 대표적인 폴리펩타이드는, 이에 제한되는 것은 아니지만 포르메이트 수소 용해효소 (hycA)의 억제인자 (repressor), 푸마레이트 환원효소 조절인자 (fumarate reductase regulator, fnr), 아세틸-코엔자임 A 합성효소 (acs), 및 포르메이트 탈수소화효소 조절 단백질 (hycA)를 포함하고, 이는 전사 조절인자 fhlA (포르메이트 수소 용해효소 전사 활성인자)의 발현을 조절한다.

수소 재흡수와 관련된 유전자에 대한 대표적인 폴리펩타이드 및 핵산

이소프렌과 수소의 공동-생산을 개선하도록 불활성화도 될 수 있는 수소 재흡수에 관여하는 대표적인 폴리펩타이드는, 이에 제한되는 것은 아니지만 E. coli 수소화효소-1 (Hyd-1) (hya 오페론) 및 E. coli 수소화효소-2 (Hyd-2) (hyb 오페론)를 포함한다. E. coli Hyd-1은 hya 오페론 (hyaA, hyaB, hyaC, hyaD, hyaE, 및 hyaF 유전자를 포함함)에 의해 인코드된다. E. coli Hyd-2은 hyb 오페론 (hybA, hybB, hybC, hybD, hybE, hybF, hybG, 및 hybO 유전자를 포함함)에 의해 인코드된다.

핵산을 분리하는 대표적인 방법

이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산은 표준 방법을 사용하여 분리될 수 있다. 관심 있는 출처 생물 (예로, 박테리아 게놈)로부터 원하는 핵산을 획득하는 방법은 보편적이고 분자생물학의 기술분야에서 잘 알려져 있다 (예를 들어, 국제특허출원 제 WO 2004/033646호 및 본 명세서에서 인용된 참고문헌들을 참조하고, 이들은 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 관심 있는 핵산의 분리에 관하여 통합되어 있다). 예를 들어, 핵산의 서열이 알려져 있는 경우라면 (본 명세서에서 기술된 기지의 핵산 모두와 같음), 적합한 게놈 라이브러리가 제한효소 소화에 의해 만들어질 수 있고 원하는 핵산 서열에 상보적인 탐침으로 검색될 수 있다. 일단 서열이 분리되면, DNA는 적절한 벡터를 사용한 형질전환에 적합한 DNA 양을 획득하도록 중합효소 연쇄반응 (PCR)과 같은 (미국특허 제 US 4,683,202호, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 PCR 방법에 관하여 통합되어 있다) 표준 프라이머 지향된 증폭법을 사용하여 증폭될 수 있다.

대안으로, 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산 (기지의 핵산 서열을 가진 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산과 같음)은 표준 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다.

본 명세서에서 기술된 조성물 및 방법에서의 용도로 적합할 수 있는 추가적인 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 폴리펩타이드 및 핵산은 표준방법을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 이소프렌을 자연적으로 생산하는 것으로 알려진 생물의 염색체 DNA의 코스미드 라이브러리가 대장균과 같은 생물에서 제작된 다음 이소프렌 생산에 대해 검색될 수 있다. 상세하게, 코스미드 라이브러리는 게놈 DNA (35-45 kb)의 큰 분절이 벡터 내로 포장되는 곳에서 만들어져서 적절한 숙주를 형질전환하는 데 사용될 수 있다. 코스미드는 많은 양의 DNA를 수용할 수 있는 점에서 독특하다. 일반적으로 코스미드 벡터는 포장 (packaging)과 이어지는 이종유래 DNA의 고리화 (circularization)에 필요한 적어도 하나의 코스 DNA 서열 사본을 가진다. 코스 서열에 더하여, 이들 벡터도 역시 ColEI과 같은 복제 원점 및 앰피실린 또는 네오마이신에 대한 저항성 핵산과 같은 약물 저항성 마커를 포함한다. 적합한 박테리아 숙주의 형질전환을 위한 코스미드 벡터를 사용하는 방법은 샘브룩 등 (Sambrook et al.), 분자적 클로닝: 실험실 매뉴얼 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), 제 2판, 콜드 스트링 하버 연구소 (Cold Spring Harbor), 1989에 잘 기술되어 있고, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 형질전환 방법에 관하여 통합되어 있다.

전형적으로 코스미드를 클론하기 위하여, 이종유래 DNA는 적절한 제한효소를 사용하여 분리되고 적절한 라이게이즈를 사용하여 코스미드 벡터의 코스 부위 근처에 결찰된다. 직선화된 이종유래 DNA를 포함하는 코스미드 벡터는 다시 박테리오파지와 같은 DNA 포장 운반체 (packaging vehicle)와 함께 반응시킨다. 포장 과정 동안 코스 부위는 절단되고 이종유래 DNA는 박테리아 바이러스 입자의 상부 내로 포장된다. 이들 입자는 그 다음 대장균과 같은 적합한 숙주세포를 형절전환시키는 데 사용된다. 일단 세포 내로 주입되면, 이종유래 DNA는 코스 점착성 말단 (cos sticky ends)의 영향 하에서 고리화된다. 본 방식으로, 많은 분절의 이종유래 DN가 도입되어 숙주세포에서 발현될 수 있다.

이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산을 획득하는 추가적인 방법은 분석법 (본 명세서에서 기술된 상부공간 분석법과 같음)에 의한 또는 보존되는 아미노산의 길이 (예를 들어, 적어도 3개의 보존되는 아미노산)를 인코딩하는 뉴클레오타이드에게로 유도되는 프라이머를 사용하는 PCR에 의한 메타게놈 라이브러리 (metagenomic library)의 검색을 포함한다. 보존되는 아미노산은 기지의 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 폴리펩타이드의 아미노산 서열 정렬하여 확인될 수 있다. 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드에 대한 보존되는 아미노산은 기지의 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드의 정렬된 서열에 근거하여 확인될 수 있다. 이소프렌을 자연적으로 생산하는 것으로 밝혀진 생물은 표준 단백질 정제 방법 (당해 기술분야에 잘 알려져 있음)에 적용될 수 있고, 그 결과 나온 정제된 폴리펩타이드는 표준 방법을 사용하여 서열결정될 수 있다. 기타 방법은 참고문헌에 밝혀져 있다 (예를 들어, Julsing et al., Applied. Microbiol. Biotechnol. 75: 1377-84, 2007; Withers et al., Appl Environ Microbiol. 73(19):6277-83, 2007를 참조하고, 이들은 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 이소프렌의 합성에 관여하는 핵산의 확인에 관하여 통합되어 있다).

추가적으로, 표준 서열 정렬 및/또는 구조 예측 프로그램은 추가적인 DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 폴리펩타이드 및 핵산을 그들의 일차 및/또는 예측된 폴리펩타이드 이차구조의 유사도에 근거하여 기지의 DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 폴리펩타이드 및 핵산의 것과 함께 확인하는 데 사용될 수 있다. 스위스프로트-트럼블 데이터베이스 (swissprot-trembl database) (전세계적인 웹 "expasy.org", Swiss Institute of Bioinformatics Swiss-Prot group CMU - 1 rue Michel Servet CH-1211 Geneva 4, 스위스)와 같은 표준 데이터베이스도 역시 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 폴리펩타이드 및 핵산을 확인하는 데 사용될 수 있다. 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 폴리펩타이드의 이차 및/또는 삼차 구조는 프리딕트프로테인 (PredictProtein) (630 West, 168 Street, BB217, New York, N.Y. 10032, USA)과 같은 표준 구조 예측 프로그램의 디폴트 세팅을 사용하여 예측될 수 있다. 대안으로, 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 폴리펩타이드의 실제적 이차 및/또는 삼차 구조는 표준 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 추가적인 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산도 역시 기지의 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산으로부터 생성된 탐침에 대한 혼성화 (hybridization)에 의해 확인될 수 있다.

대표적인 프로모터 및 벡터

본 명세서에서 기술된 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산이라면 모두가 하나 이상의 벡터에 포함될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 기술된 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산이라면 모두를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 가진 벡터도 또한 본 명세서에서 기술되어 있다. 일정 구현예에서, 벡터는 발현 조절 서열의 통제 하에서의 핵을 포함한다.

일정 구현예에서, 벡터는 선별 마커 또는 선별가능한 마커를 포함한다. 트리코더마 (Trichoderma)의 형질전환을 위한 벡터 시스템에 유용한 마커는 당해 기술분야에 알려져 있다 (예로, Finkelstein, Chapter 6 in Biotechnology of Filamentous Fungi, Finkelstein et al., Eds. Butterworth-Heinemann, Boston, MA, Chap. 6., 1992; 및 Kinghorn et al., Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, Blackie Academic and Professional, Chapman and Hall, London, 1992을 참조하고, 이들은 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 선별 마커에 관하여 통합되어 있다). 일정 구현예에서, 선별 마커는 amdS 핵산이고, 이는 아세트아미다제 (acetamidase) 효소를 인코드하고 형질전환된 세포가 질소원으로서 아세트아마이드 상에서 성장하도록 허용한다. 선별 마커로서 A. 니둘란스 (A. nidulans) amdS 핵산의 용도는 Kelley et al., EMBO J. 4: 475-479, 1985 및 Penttila et al., Gene 61:155-164, 1987에 기술되어 있다 (이들은 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 선별 마커에 관하여 통합되어 있다). 일정 구현예에서, 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산은 선별 마커 없이도 세포의 염색체 내로 도입된다.

적합한 벡터는 사용되는 숙주세포와 양립가능한 (compatible) 것이다. 적합한 벡터는, 예를 들어 박테리아, 바이러스 (박테리오파지 T7 또는 M-13 유래 파지), 코스미드, 효모, 또는 식물로부터 유래할 수 있다. 이러한 벡터를 획득하고 사용하는 프로토콜은 당해 기술분야에 숙지되어 있다 (예를 들어, 샘브룩 등, 분자적 클로닝: 실험실 매뉴얼, 제 2판, 콜드 스트링 하버 연구소, 1989를 참조하고, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 벡터의 사용에 관하여 통합되어 있다).

프로모터는 당해 기술분야에 잘 숙지되어 있다. 숙주세포에서 기능하는 프로모터라면 모두가 숙주세포에서 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산의 발현에 사용될 수 있다. 다양한 숙주세포에서 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵의 발현을 진행하는 데 유용한 개시 조절 부위 (initiation control regions) 또는 프로모터는 많이 있고 당업자에게는 친숙하다 (예를 들어, 국제특허출원 제 WO 2004/033646호 및 본 명세서에서 인용된 참조문헌들을 참조하고, 이들은 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 관심 있는 핵산의 발현을 위한 벡터에 관하여 통합되어 있다). 실제적으로, 이들 핵산을 진행시킬 수 있는 프로모터라면, 이에 제한되는 것은 아니지만 CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADCI, TRP1, URA3, LEU2, ENO, 및 TPI (사카로마이세스 (Saccharomyces)에서 발현에 유용함); AOX1 (피키아 (Pichia)에서 발현에 유용함); and lac, trp, SP_L, SP_R, T7, tac, 및 trc (대장균에서 발현에 유용함)를 포함하여 모두가 본 발명에 적합하다.

일정 구현예에서, 포도당 이소머라제 프로모터가 사용된다 (예를 들어, 미국특허 제 US 7,132,527호 및 본 명세서에 인용된 참조문헌들을 참조하고, 이들은 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 관심 있는 폴리펩타이드의 발현을 위한 프로모터 및 플라스미드 시스템에 관하여 통합되어 있다). 보고된 포도당 이소머라제 프로모터 돌연변이가 포도당 이소머라제 프로모터에 작동적으로 연결된 핵산에 의해 인코드되는 폴리펩타이드의 발현 수준을 변화시키는 데 사용될 수 있다 (미국 특허 제 US 7,132,527호). 다양한 구현예에서, 포도당 이소머라제 프로모터가 낮은, 중간 또는 높은 사본수 플라스미드에 포함된다 (미국 특허 제 US 7,132,527호).

다양한 구현예에서, 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산이 낮은 사본수 플라스미드 (예로, 세포 당 약 1개 내지 약 4개의 사본수로 유지되는 플라스미드), 중간 사본수 플라스미드 (예로, 세포 당 약 10개 내지 약 15개의 사본수로 유지되는 플라스미드), 또는 높은 사본수 플라스미드 (예로, 세포 당 약 15개 이상의 사본수로 유지되는 플라스미드)에 포함된다. 일정 구현예에서, 이종유래 또는 별도의 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산은 T7 프로모터에 작동적으로 연결된다. 일정 구현예에서, T7 프로모터에 작동적으로 연결된 이종유래 또는 별도의 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산은 중간 또는 높은 사본수 플라스미드에 포함된다. 일정 구현예에서, 이종유래 또는 별도의 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산은 Trc 프로모터에 작동적으로 연결된다. 일정 구현예에서, Trc 프로모터에 작동적으로 연결된 이종유래 또는 별도의 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산은 중간 또는 높은 사본수 플라스미드에 포함된다. 일정 구현예에서, 이종유래 또는 별도의 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산은 Lac 프로모터에 작동적으로 연결된다. 일정 구현예에서, Lac 프로모터에 작동적으로 연결된 이종유래 또는 별도의 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산은 낮은 사본수 플라스미드에 포함된다. 일정 구현예에서, 이종유래 또는 별도의 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산은 대장균 (Escherichia), 판테오아 (Panteoa), 바실러스 (Bacillus), 야로위아 (Yarrowia), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 또는 트리코더마 (Trichoderma) 프로모터와 같은 내재성 프로모터에 또는 내재성 알칼라인 세린 프로테아제, 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 프로모터에 작동적으로 연결된다. 내재성 프로모터에 작동적으로 연결된 이종유래 또는 별도의 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산은 높은 사본수 플라스미드에 포함된다. 일정 구현예에서, 벡터는 세포에서 염색체 내로 통합되지 않는 복제하는 플라스미드이다. 일정 구현예에서 벡터의 일부 또는 전부는 세포에서 염색체 내로 통합된다.

일정 구현예에서, 벡터는 곰팡이 숙주세포 내로 도입될 때 숙주세포 내로 도입되어 복제하는 벡터라면 모두이다. 벡터의 리스트를 위해 곰팡이 유전학 스톡 센터 균주 카탈로그 (Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains, FGSC) 가 참고문헌으로 작성되어 있다 (전세계적인 웹 "fgsc.net" 및 본 명세서에서 인용된 참고문헌들을 참조하고, 이들은 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 벡터에 관하여 통합되어 있다). 적합한 발현 및/또는 삽입 벡터의 추가적인 예가 샘브룩 등, 분자적 클로닝: 실험실 매뉴얼, 제 2판, 콜드 스트링 하버 연구소, 1989; 분자생물학에서의 최신 프로토콜 (Current Protocols in Molecular Biology) (F. M. Ausubel et al. (eds) 1987, 부록 30 (Supplement 30), 섹션 7.7.18); van den Hondel et al. in Bennett and Lasure (Eds.) More Gene Manipulations in Fungi, 아카데믹 프레스사 (Academic Press) pp. 396-428, 1991; 및 미국 특허 제 US 5,874,276호에 제공되어 있고, 이들 각각은 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 벡터에 관하여 통합되어 있다. 상세하게, 유용한 벡터는 pFB6, pBR322, PUC18, pUC100, 및 pENTR/D를 포함한다.

일정 구현예에서, 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산은 곰팡이 숙죽세포에서 전사적 활성을 보여주는 적합한 프로모터에 작동적으로 연결된다. 프로모터는 숙주세포에 내재성 또는 이종유래 둘 중 하나인 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 하나 이상으로부터 유래할 수 있다. 일정 구현예에서, 프로모터는 트리코더마 (Trichoderma) 숙주에서 유용한다. 적합한 프로모터의 제한되지 않는 예로는 cbh1, cbh2, egl1, egl2, pepA, hfb1, hfb2, xyn1, 및 amy를 포함한다. 일정 구현예에서, 프로모터는 숙주세포에서 나온 것이다. 예를 들어, 일정 구현예에서 T. reesei 가 숙주일 때 천연 (native) T. reesei 프로모터이다. 일정 구현예에서 프로모터는 T. reesei cbh1이고, 이는 유도성 프로모터이고 진뱅크 기탁번호 제 D86235호 하로 기탁되었으며, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 프로모터에 관하여 통합되어 있다. 일정 구현예에서, 프로모터는 곰팡이 숙주세포에서 이종유래인 것이다. 유용한 프로모터의 기타 다른 예로는 A. awamori의 유전자로부터 나온 프로모터 및 A. niger 글루코아밀라제 (glaA) (Nunberg et al., Mol. Cell Biol. 4:2306-2315, 1984 및 Boel et al., EMBO J. 3:1581-1585, 1984, 이들 각각은 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 프로모터에 관하여 통합되어 있다); 아스퍼질러스 니거 (Aspergillus niger) 알파 아밀라제, 아스퍼질러스 오리자이 (Aspergillus oryzae) TAKA 아밀라제, T. reesei xln1, 및 T. reesei 셀로바이오하이드롤라제 1 (cellobiohydrolase 1) (유럽특허 제 EP 137280호, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 프로모터에 관하여 통합되어 있다)을 포함한다.

일정 구현예에서, 발현 벡터는 또한 종결 서열 (termination sequence)을 포함한다. 종결 조절 부위는 숙주세포에서 천연의 다양한 유전자들로부터 유래할 수 있다. 일정 구현예에서, 종결 서열 및 프로모터 서열은 동일한 출처로부터 유래할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 종결 서열은 숙주세포에서 내재성이다. 상세하게, 적합한 종결 서열은 트리코더마 균주 (T. reesei와 같음)로부터 유래한 cbh1이다. 기타 유용한 곰팡이 종결인자는 A. niger 또는 A. awamori 글루코아밀라제 핵산으로부터 나온 종결인자를 포함한다 (Nunberg et al., Mol. Cell Biol. 4:2306-2315, 1984 및 Boel et al., EMBO J. 3:1581-1585, 1984; 이들은 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 곰팡이 종결인자에 관하여 통합되어 있다). 임의적으로, 종결 부위가 포함될 수 있다. 폴리펩타이드의 효과적인 발현을 위해, 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA는 개시 코돈을 통해 선택된 발현 조절 부위에 작동적으로 연결될 수 있어 발현은 적정한 메신저 RNA의 형성을 가져온다.

일정 구현예에서, 프로모터, 코딩 부위 및 종결인자는 모두 발현될 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산으로부터 유래된다. 일정 구현예에서, 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산에 대한 코딩 부위는 일반적인-목적의 발현 벡터 내에 삽입되어, 이것은 발현 제작 프로모터 및 종결인자 서열의 전사 조절 하에 놓여진다. 일정 구현예에서, 그의 유전자 또는 일부는 강력한 cbh1 프로모터의 하류에 삽입된다.

이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산은 표준 기법 (샘브룩 등, 분자적 클로닝: 실험실 매뉴얼, 콜드 스트링 하버 연구소, 1982, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 적절한 DNA 서열의 검색 및 벡터의 제작에 관하여 통합되어 있다)을 사용하여 발현 벡터와 같은 벡터 내에 도입될 수 있다. 관심 있는 핵산 (이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산과 같음)을 포함하는 DNA 제작물, 프로모터, 종결인자, 및 기타 서열을 결찰하는 데 또한 그들을 적합한 벡터 내에 삽입하는 데 사용되는 방법들은 당해 기술분야에 잘 숙지되어 있다. 예를 들어, 제한효소가 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산 및 벡터를 절단하는 데 사용될 수 있다. 다음으로 절단된 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산 및 절단된 벡터의 양립가능한 말단은 결찰될 수 있다. 연결 (linking)은 일반적으로 편리한 제한효소 부위에서 라이게이션에 의해 수행된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우라면, 합성 올리고뉴클레오타이드 링커 (oligonucleotide linkers)가 통상적인 관행에 따라 사용된다 (샘브룩 등, 분자적 클로닝: 실험실 매뉴얼, 제 2판, 콜드 스트링 하버 연구소, 1989, 및 Bennett and Lasure, More Gene Manipulations in Fungi, 아카데믹 프레스사, 샌디에고, pp 70-76, 1991을 참조하고, 이들은 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 올리고뉴클레오타이드 링커에 관하여 통합되어 있다). 추가적으로, 벡터는 기지의 재조합 기법 (예로, 인비트로겐 라이프 테크놀로지사 (Invitrogen Life Technologies), 게이트웨이 테크놀로지사 (Gateway Technology))을 사용하여 제작될 수 있다.

일정 구현예에서, 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산은 자연적으로 발생하는 세포에서 최근 발견되는 것보다 훨씬 더 높은 수준으로 과다-발현하는 것이 바람직할 수 있다. 본 결과는 이들 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산의 복수 사본 플라스미드 내로의 선별적인 클로닝에 의해 또는 이들 핵산을 강력한 유도성 또는 전신성 프로모터 조절 하에 배치하여 달성될 수 있다. 원하는 폴리펩타이드를 과다-발현하는 방법은 보편적이고 분자생물학의 기술분야에서 잘 알려져 있으며 예들이 샘브룩 등, 분자적 클로닝: 실험실 매뉴얼, 제 2판, 콜드 스트링 하버 연구소, 1989에서 발견될 수 있고, 이는 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 클로닝 기법에 관하여 통합되어 있다.

일정 구현예에서, 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 폴리펩타이드-인코딩 핵산은 자연적으로 발생하는 세포에서 최근 들어 발견되는 것보다 훨씬 더 낮은 수준으로 과소-발현 (예로, 돌연변이, 불활성화 또는 결실)하는 것이 바람직할 수 있다. 본 결과는 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산의 발현에 필요한 전사 조절 단백질의 돌연변이 또는 불활성화에 의해, 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산의 결실에 의해, 또는 이들 핵산을 강력한 억제가능한 프로모터의 조절 하에 배치하여 달성될 수 있다. 원하는 폴리펩타이드를 돌연변이화, 불활성화, 도는 결실시키는 방법은 보편적이고 분자생물학의 기술분야에서 잘 숙지되어 있으며 예로는 샘브룩 등, 분자적 클로닝: 실험실 매뉴얼, 제 2판, 콜드 스트링 하버 연구소, 1989에서 발견될 수 있고, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 클로닝 및 돌연변이화 기법에 관하여 통합되어 있다.

다음의 재원 (resources)은 본 발명에 따라 유용한 추가적인 일반 방법론의 기술내용을 포함한다: Kreigler, 유전자 전달 및 발현: 실험실 매뉴얼 (Gene Transfer and Expression; A Laboratory Manual), 1990 및 Ausubel et al., Eds. 분자생물에서의 최신 프로토콜 (Current Protocols in Molecular Biology), 1994, 이들은 각각 본 명세서에 참고문헌으로 전부, 상세하게는 분자생물학 및 클로닝 기법에 관하여 통합되어 있다

대표적인 출처 생물

이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산 (및 그들의 인코드된 폴리펩타이드)는 자연적으로 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산을 포함하는 생물이라면 모두로부터 획득될 수 있다. 상기에서 주목된 바와 같이, 이소프렌은 박테리아, 효모, 식물, 및 동물과 같은 다양한 생물에 의해 자연적으로 형성된다. 생물은 이소프렌을 생산하기 위해 MVA 경로, DXP 경로, 또는 MVA 및 DXP 경로 둘 다를 포함한다 (도 19A 및 19B). 따라서, DXS 핵산은, 예로 DXP 경로를 포함하거나 MVA 및 DXP 경로 둘 다를 포함하는 생물이라면 모두로부터 획득될 수 있다. IDI 및 이소프렌 합성효소 핵산은, 예로 MVA 경로, DXP 경로, 또는 MVA 및 DXP 경로 둘 다를 포함하는 생물이라면 모두로부터 획득될 수 있다. MVA 경로 핵산은, 예로 MVA 경로, 또는 MVA 및 DXP 경로 둘 다를 포함하는 생물이라면 모두로부터 획득될 수 있다. 수소화효소 핵산은, 예로 수소를 산화하거나 수소 이온을 환원하는 생물이라면 모두로부터 획득될 수 있다. 발효 부산물 유전자는, 예로 당분해와 같은 산소-제한된 또는 혐기성 호흡을 하는 생물이라면 모두로부터 획득되거나 확인될 수 있다.

일정 구현예에서, 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자의 핵산 서열은 자연적인 하기 생물이라면 모두에 의해 생산되는 핵산의 서열과 일치한다. 일정 구현예에서, 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 자연적인 하기 생물이라면 모두에 의해 생산되는 폴리펩타이드의 서열과 일치한다. 일정 구현예에서, 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산 또는 폴리펩타이드는 본 명세서에서 기술된 생물이라면 모두로부터 유래한 돌연변이 핵산 또는 폴리펩타이드이다. 본 명세서에서 사용되는 바, "로부터 유래한 (derived from)"은 하나 이상의 돌연변이가 도입된 핵산 또는 폴리펩타이드의 출처를 말한다. 예를 들어, "식물 폴리펩타이드로부터 유래한 (derived from a plant polypeptide)"은 하나 이상의 돌연변이를 야생형 (예로, 자연적으로 발생하는 서열) 식물 폴리펩타이드의 서열 내로 도입한 결과 얻어지는 관심 있는 폴리펩타이드를 말한다.

일정 구현예에서, 출처 생물은 곰팡이이고, 그의 예로는 A. oryzae 및 A. niger와 같은 아스퍼질러스 (Aspergillus) 종, S. cerevisiae와 같은 사카로마이세스 (Saccharomyces) 종, S. pombe와 같은 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces) 종, 또한 T. reesei와 같은 트리코더마 (Trichoderma) 종이 있다. 일정 구현예에서, 출처 생물은 필라멘트성 곰팡이 세포이다. 용어 "필라멘트성 곰팡이 (filamentous fungi)"는 유마이코티나 아문 (Eumycotina subdivision)의 필라멘트성 형태를 말한다 (Alexopoulos, C. J. (1962), 곰팡이학 입문 (Introductory Mycology), Wiley, New York를 참조하라). 이들 곰팡이는 키틴, 셀룰로스 및 기타 복잡한 폴리사카라이드로 구성된 세포벽을 가진 무성생식 균사체 (mycelium)을 특징으로 한다. 필라멘트성 곰팡이는 형태적으로, 생리적으로, 및 유전적으로 효모와는 구별된다. 필라멘트성 곰팡이에 의한 무성생식 성장은 균사 확장에 의하고 탄소 대사는 절대적 호기성을 가진다. 필라멘트성 곰팡이의 부모 세포는, 이에 제한되는 것은 아니지만 트리코더마 (예로, 트리코더마 리세이 (Trichoderma reesei), 하이포크레아 제코리나 (Hypocrea jecorina)의 무성생식 형태로 이전에는 T. longibrachiatum, Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Trichoderma harzianum로 분류됨) (Sheir-Neirs et al., Appl. Microbiol. Biotechnol 20: 46-53, 1984; ATCC 기탁번호 제 56765호 및 ATCC 기탁번호 제 26921호); 페니실리움 종 (Penicillium sp.), 휴미콜라 종 (Humicola sp.) (예로, H. insolens, H. lanuginose, 또는 H. grisea); 크립소스포리움 종 (Chrysosporium sp.) (예로, C. lucknowense), 글리오클라디움 종 (Gliocladium sp.), 아스퍼질러스 종 (예로, A. oryzae, A. niger, A sojae, A. japonicus, A. nidulans, 또는 A. awamori) (Ward et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 39: 7380743, 1993 및 Goedegebuur et al., Genet 41: 89-98, 2002), 푸사리움 종 (Fusarium sp.) (예로, F. roseum, F. graminum F. cerealis, F. oxysporuim, 또는 F. venenatum), 뉴로스포라 종 (Neurospora sp.) (예로, N. crassa), 하이포크레아 종 (Hypocrea sp.), 뮤코 종 (Mucor sp.) (예로, M. miehei), 라이조푸스 종 (Rhizopus sp.) 및 에메리셀라 종 (Emericella sp.) (또한, Innis et al., Sci. 228: 21-26, 1985를 참조하라)의 종 세포일 수 있다. 용어 "트리코더마 (Trichoderma)" 또는 "트리코더마 종 (Trichoderma sp)" 또는 "트리코더마 종들 (Trichoderma spp.)"은 이전에 또는 최근에 트리코더마로 분류된 곰팡이 속이라면 모두를 말한다.

일정 구현예에서, 곰팡이는 A. nidulans, A. awamori, A. oryzae, A. aculeatus, A. niger, A. japonicus, T. reesei, T. viride, F. oxysporum, or F. solani 이다. 아스퍼질러스 (Aspergillus) 균주가 Ward et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 39:738-743, 1993 및 Goedegebuur et al., Curr Gene 41:89-98, 2002에 기재되어 있고, 이들은 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 곰팡이에 관하여 통합되어 있다. 상세한 구현예에서, 곰팡이는 T. reesei의 균주와 같은 트리코더마 균주이다. T. reesei 균주가 알려져 있으며, 비제한적인 예로는 ATCC 기탁번호 제 13631호, ATCC 기탁번호 제 26921호, ATCC 기탁번호 제 56764호, ATCC 기탁번호 제 56765호, ATCC 기탁번호 제 56767호, 및 NRRL 기탁번호 제 15709호를 포함하고, 이들은 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 T. reesei 균주에 관하여 통합되어 있다. 일정 구현예에서, 숙주 균주는 RL-P37의 유도체이다. RL-P37는 Sheir-Neiss et al., Appl. Microbiol. Biotechnology 20: 46-53, 1984에 기재되어 있고, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 T. reesei 균주에 관하여 통합되어 있다.

일정 구현예에서, 출처 생물은 사카로마이세스 종 (Saccharomyces sp.), 스키조사카로마이세스 종 (Schizosaccharomyces sp.), 피키아 종 (Pichia sp.), 또는 칸다다 종 (Candida sp.)와 같은 효모이다. 일정 구현예에서, 사카로마이세스 종 은 사카로마이세스 세레비시아애 (Saccharomyces cerevisiae)이다.

일정 구현예에서, 출처 생물은 박테리아이고, B. lichenformis 또는B. subtili와 같은 바실러스 균주, P. citrea와 같은 판토에아 균주, P. alcaligenes, P. putida,또는 P. fluorescens와 같은 슈도모나스 균주, S. lividans 또는 S. rubiginosus와 같은 스트렙토마이세스 균주, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)과 같은 코리네박테리움 종 균주, 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris)와 같은 로도슈도모나스 종 (Rhodopseudomonas sp.) 균주 또는 E. coli와 같은 에스케리키아 (Escherichia) 균주이다.

본 명세서에서 사용되는 바, "바실러스 속 (genus Bacillus)"은 당업자가 알고 있는 바와 같이 "바실러스" 속 내의 모든 종을 포함하고, 이에 제한되는 것은 아니지만 B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, 및 B. thuringiensis를 포함한다. 바실러스 속은 분류적 재구성이 계속 진행되는 것으로 알려져 있다. 따라서 속은 재분류되었던 종을 포함하도록 하고, 이에 제한되는 것은 아니지만 현재는 "제오바실러스 스테아로써모필러스 (Geobacillus stearothermophilus)"라고 명명되는 B. stearothermophilus와 같은 생물을 포함한다. 산소 존재 시, 저항성 내생포자의 생산이 바실러스 속의 특징을 정의하는 것이라고 생각되지만, 본 특징은 최근에 명명된 알리사이클로바실러스 (Alicyclobacillus), 엠피바실러스 (Amphibacillus), 어뉴리니바실러스 (Aneurinibacillus), 아녹시바실러스 (Anoxybacillus), 브레비바실러스 (Brevibacillus), 필로바실러스 (Filobacillus), 그라실리바실러스 (Gracilibacillus), 할로바실러스 (Halobacillus), 패니바실러스 (Paenibacillus), 살리바실러스 (Salibacillus), 써모바실러스 (Thermobacillus), 우레이바실러스 (Ureibacillus) 및 버지바실러스 (Virgibacillus)에도 역시 적용된다.

일정 구현예에서, 출처 생물은 그램-양성 박테리아이다. 비제한적 예는 스트렙토마이세스 (예로, S. lividans, S. coelicolor, 또는 S. griseus) 및 바실러스 균주를 포함한다. 일정 구현예에서, 출처 생물은 대장균 (E. coli.), 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris)와 같은 로도슈도모나스 종,또는 P. alcaligenes, P. putida, 또는 P. fluorescens와 같은 슈도모나스 종과 같은 그램-음성 박테리아이다.

일정 구현예에서, 출처 생물은 파보이대 (Faboideae) 아과와 같은 파바시애 (Fabaceae)과로부터 나온 식물과 같은 식물이다. 일정 구현예에서, 출처 생물은 쿠쥬 (Kudzu), 포풀라, (포풀라 알바 x 트레물라 (Populus alba x tremula) CAC35696와 같음), 아스펜 (포풀러스 트레물로이데스 (Populus tremuloides)와 같음), 또는 쿠에르커스 로바르 (Quercus robur)이다.

일정 구현예에서, 출처 생물은 녹조류, 적조류, 글라코파이트 (glaucophytes), 클로르아라크니오파이트 (chlorarachniophytes), 유글레니드 (euglenids), 크로미스타 (chromista), 또는 디노플라젤레이트 (dinoflagellates)와 같은 조류이다.

일정 구현예에서, 출처 생물은 형태에 근거하여 다음의 그룹이라면 모두로 분류되는 시아노박테리아와 같은 시아노박테리아 (cyanobacteria)이다: 클로오코칼레스 (Chroococcales), 플루로캅살레스 (Pleurocapsales), 오실라토리알레스 (Oscillatoriales), 노스토칼레스 (Nostocales), 또는 스티고네마탈레스 (Stigonematales).

일정 구현예에서, 출처 생물은 혐기성 생물이다. 혐기성 생물은, 이에 제한 되는 것은 아니지만 절대적 혐기성 미생물, 조건부 혐기성, 및 공기내성 (aerotolerant) 혐기성 미생물을 포함할 수 있다. 이러한 생물은 상기에 나열된 생물, 박테리아, 효모 등이라면 모두일 수 있다. 한 가지 구현예에서, 절대적 혐기성 미생물은 크로스트리듐 엘정다리 (Clostridium ljungdahlii), 크로스트리듐 오토에타노게눔 (Clostridium autoethanogenum), 유로박테리움 리모섬 (Eurobacterium limosum), 크로스트리듐 카르복시디보란스 (Clostridium carboxydivorans), 펩토스트렙토코커스 프로닥투스 (Peptostreptococcus productus), 및 부티리박테리움 메틸로트로피쿰 (Butyribacterium methylotrophicum)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 조합이라면 모두일 수 있다.

대표적인 숙주세포

다양한 숙주세포가 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 폴리펩타이드를 발현하고, 본 명세서에서 기술된방법으로 이소프렌과 수소를 생산하는 데 사용될 수 있다. 대표적인 숙주세포는 이전의 섹션에서 "대표적인 출처 생물"이라는 제목 하에서 나열된 생물이라면 모두로부터 나온 세포를 포함한다. 숙주세포는 자연적으로 이소프렌을 생산하는 세포 또는 자연적으로는 이소프렌을 생산하지 못하는 세포일 수 있다. 일정 구현예에서, 숙주세포는 DXP 경로를 사용하여 이소프렌을 자연적으로 생산하고, 또한 이소프렌 합성효소, DXS, 및/또는 IDI 핵산이 본 경로를 사용하여 이소프렌의 생산을 증진시키도록 첨가된다. 일정 구현예에서, 숙주세포는 MVA 경로를 사용하여 이소프렌을 자연적으로 생산하고, 또한 이소프렌 합성효소, 및/또는 하나 이상의 MVA 경로 핵산이 본 경로를 사용하여 이소프렌의 생산을 증진시키도록 첨가된다. 일정 구현예에서, 숙주세포는 DXP 경로를 사용하여 이소프렌을 자연적으로 생산하고, 또한 하나 이상의 MVA 경로 핵산이 MVA 경로 일부 또는 전부뿐만 아니라 DXP 경로를 사용하여 이소프렌의 생산하도록 첨가된다. 일정 구현예에서, 숙주세포는 DXP 및 MVA경로 둘 다를 사용하여 이소프렌을 자연적으로 생산하고, 또한 하나 이상의 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, 또는 MVA 경로 핵산이 이들 경로의 하나 또는 둘 다에 의해 이소프렌의 생산을 증진시키도록 첨가된다.

일정 구현예에서, 숙주세포는 DXP 및 MVA 경로 둘 다를 사용하여 이소프렌을 자연적으로 생산하고, 하나 이상의 이소프렌 합성효소, DXS, IDI 또는MVA 경로 핵산이 이들 경로의 하나 또는 둘 다에 의해 이소프렌의 생산을 증진시키도록 첨가되며, 하나 이상의 수소화효소 핵산이 수소 생산을 증진시키도록 첨가되고 또한 하나 이상의 발효 부산물-생산 유전자가 발효 부산물의 생산을 제한하도록 불활성화되거나 결실된다. 일정 구현예에서, 숙주세포는 DXP 및 MVA 경로 둘 다를 사용하여 이소프렌과 수소를 자연적으로 공동-생산하고, 하나 이상의 이소프렌 합성효소, DXS, IDI 또는MVA 경로 핵산이 이들 경로의 하나 또는 둘 다에 의해 이소프렌의 생산을 증진시키도록 첨가되며, 하나 이상의 수소화효소 핵산이 수소 생산을 증진시키도록 첨가되고, 하나 이상의 발효 부산물-생산하는 유전자가 발효 부산물의 생산을 제한하도록 불활성화되거나 결실되며, 또한 하나 이상의 수소 재흡수 유전자가 수소 생산을 증가시키도록 불활성화되거나 결실된다. 일정 구현예에서, 숙주세포는 DXP 및 MVA 경로 둘 다 및 수소화효소를 사용하여 이소프렌과 수소를 자연적으로 공동-생산하고, 하나 이상의 이소프렌 합성효소, DXS, IDI 또는MVA 경로 핵산이 이들 경로의 하나 또는 둘 다에 의해 이소프렌의 생산을 증진시키도록 첨가되며, 하나 이상의 수소화효소 핵산이 수소 생산을 증진시키도록 첨가되고, 하나 이상의 수소화효소 성숙 핵산이 수소 생산을 증진시키도록 첨가되며, 하나 이상의 발효 부산물-생산 유전자가 발효 부산물의 생산을 제한하도록 불활성화되거나 결실되고, 또한 하나 이상의 수소 재흡수 유전자가 수소 생산을 증가시키도록 불활성화되거나 결실된다. 일정 구현예에서, 숙주세포는 DXP 및 MVA 경로 둘 다를 사용하여 이소프렌과 수소를 자연적으로 공동-생산하고, 하나 이상의 이소프렌 합성효소, DXS, IDI 또는MVA 경로 핵산이 이들 경로의 하나 또는 둘 다에 의해 이소프렌의 생산을 증진시키도록 첨가되며, 하나 이상의 수소화효소 핵산이 수소 생산을 증진시키도록 첨가되고, 하나 이상의 수소화효소 성숙 핵산이 수소 생산을 증진시키도록 첨가되며, 하나 이상의 전사인자 핵산이 수소화효소 생산을 증진시키도록 첨가되거나 불활성화되거나 결실되며, 하나 이상의 발효 부산물-생산하는 유전자가 발효 부산물의 생산을 제한하도록 불활성화되거나 결실되고, 또한 하나 이상의 수소 재흡수 유전자가 수소 생산을 증가시키도록 불활성화되거나 결실된다.

대표적인 형질전환 방법

다양한 숙주세포가 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 핵산 또는 이들을 포함하는 벡터가 인코드된 다양한 숙주세포가 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 및/또는 전사인자 폴리펩타이드의 발현을 위한 표준 기법을 사용하여 숙주세포 내로 (예로, 본 명세서에서 기술된 식물 세포, 곰팡이 세포, 효모 세포, 또는 박테리아 세포) 삽입될 수 있다. 숙주세포 내로 DNA 제작물의 도입은 형질전환, (transformation), 전기천공 (electroporation), 핵 미세주입 (nuclear microinjection), 형질감염 (transduction), 형질전환 (transfection) (예로, 리포펙션-매개성 또는 DEAE-덱스트란 매개성 형질전환 또는 재조합 파지 바이러스를 사용한 형질전환), 칼슘 포스페이트 DNA 침전물로의 배양, DNA-코팅된 미세주사로의 높은 속도 충돌, 및 원형질 융합 (protoplast fusion)과 같은 기법을 사용하여 수행될 수 있다. 일반적인 형질전환 기법은 당해 기술분야에 숙지되어 있다 (예로, 분자생물학에 있어서 최신 프로토콜 (F. M. Ausubel et al. (eds) 제 9장, 1987; 샘브룩 등, 분자적 클로닝; 실험실 매뉴얼, 제 2판, 콜드 스프링 하버 연구소, 1989; 또한 Campbell et al., Curr. Genet. 16:53-56, 1989을 참조하고, 이들은 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 형질전환 방법에 관하여 통합되어 있다). 트리코더마에서 이종유래 폴리펩타이드의 발현은 미국 특허 제 US 6,022,725호; 제 US 6,268,328호; 제 US 7,262,041호; 국제특허출원 제 WO 2005/001036호; Harkki et al., Enzyme Microb. Technol. 13:227-233, 1991; Harkki et al., Bio Technol. 7:596-603, 1989; EP 244,234; EP 215,594; 및 Nevalainen et al., "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes," in Molecular Industrial Mycology, Eds. Leong and Berka, Marcel Dekker Inc., NY pp. 129 148, 1992에 기술되어 있고, 이들은 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 형질전환 및 발현 방법에 관하여 통합되어 있다. 아스퍼질러스 균주의 형질전환을 위해 카오 등 (Cao et al., Sci. 9:991-1001, 2000); 유럽 특허 제 EP 238023호; 및 Yelton et al., Proceedings. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, 1984 (이들은 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 형질전환 방법에 관하여 통합되어 있다)의 참고문헌이 또한 작성되어 있다. 도입된 핵산은 염색체 DNA 내로 통합되거나 염색체외 복제 서열 (extrachromosomal replicating sequences)로서 유지될 수 있다.

당해 기술분야에서 기지의 방법이라면 모두가 형질전환체를 선별하는 데 사용될 수 있다. 하나의 비제한적 예에서, amdS 마커를 포함하는 안정한 형질전환체가 그들의 빠른 상장율과 아세트아마이드를 포함하는 고형 배양 배지 상에서 울퉁불퉁한 외관이 아닌 매끄러운 윤곽선을 가진 원형 콜로니의 형성에 의해 불안정한 형질전환체와 구별된다. 추가적으로 일정 사례에서, 심화된 안정성 테스트가 고형의 비-선택적 배지 (예로, 아세트아미이드가 결핍된 배지) 상에서 형질전환체를 성장시키고, 본 배양 배지로부터 포자를 수확하며, 이어서 아세트아마이드를 포함하는 선택적 배지 상에서 발아시키고 성장하는 이들 포자의 퍼센트를 결정하여 시행될 수 있다.

일정 구현예에서, 곰팡이 세포는 원형질체 형성 및 원형질체의 형질전환과 이어지는 기지의 방식으로 세포의 재생을 포함하는 방법에 의해 형질전환된다. 하나의 특정한 구현예에서, 형질전환을 위한 트리코더마 종의 제조는 곰팡이 균사체로부터 원형질체의 제조가 관여되어 있다 (Campbell et al., Curr. Genet. 16:53-56, 1989을 참고하고, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 형질전환 방법에 관하여 통합되어 있다). 일정 구현예에서, 균사는 발아된 무성생식 포자로부터 획득된다. 균사체는 원형질체가 될 세포벽을 소화하는 효소로 처리된다. 그 다음 원형질체는 현탁된 배지에서 삼투압 안정제의 존재에 의해 보호된다. 이들 안정제로는 소비톨, 만니톨, 포타슘 클로라이드, 마그네슘 설페이트 등등을 포함한다. 보통 이들 안정제의 농도는 0.8 M 및 1.2 M 범위 사이에서 변화한다. 현탁 배지에서는 소비톨의 약 1.2 M 용액을 사용하는 것이 바람직하다.

숙주 트리코더마 종 균주 내로의 DNA 흡수는 칼슘 이온 농도에 의존한다. 일반적으로, 약 10 mM CaCl₂ 및 50 mM CaCl₂ 사이의 범위가 흡수 용액 (uptake solution)에서 사용된다. 흡수 용액에서는 칼슘 이온에 더하여, 일반적으로 포함되는 다른 화합물은 TE 완충용액 (10 Mm 트리스, pH 7.4; 1 mM EDTA) 또는 10 mM MOPS (morpholinepropanesulfonic acid), pH 6.0 완충용액 및 폴리에틸렌글리콜 (PEG)과 같은 완충 시스템이다. 상세한 이론으로 설명하려고 의도하지는 않지만, 폴리에틸렌 글리콜은 세포막을 융합하도록 작용하여, 배지의 내용물이 트리코더마 종 균주의 세포질 내로 운반되고 플라스미드 DNA가 핵 내로 움직이도록 허용하는 것으로 여겨진다. 본 융합은 빈번히 숙주 염색체 내로 통합된 복수 사본의 플라스미드를 남긴다.

보통 10⁵ 내지 10⁷/mL (2 x 10⁶/mL와 같음)의 밀도로 투과성 (permeability) 처리가 되었던 트리코더마 종 원형질체 또는 세포를 포함하는 현탁액이 형질전환에 사용된다. 이들 적절한 용액 (예로, 1.2 M 소비톨 및 50 mM CaCl₂)에 녹인 원형질체 또는 세포의 100 μL 부피가 원하는 DNA와 혼합된다. 일반적으로 고농도의 PEG가 흡수 용액에 첨가된다. 0.1로부터 1까지 부피의 25% PEG 4000가 원형질체 현탁액에 첨가된다. 일정 구현예에서, 약 0.25 부피가 원형질체 현탁액에 첨가된다. 디메틸 설포옥사이드, 헤파린, 스퍼미딘, 포타슘 클로라이드 등과 같은 첨가물도 역시 흡수 용액에 첨가될 수 있고 형질전환을 도와준다. 유사한 절차가 다른 곰팡이 숙주 세포에 대해서 사용가능하다 (예로, 미국 특허 제 US 6,022,725호 및 제US 6,268,328호를 참조하고, 이들은 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 형질전환 방법에 관하여 통합되어 있다).

일반적으로, 혼합물이 다시 대략 0℃에서 10 내지 30분의 기간 동안 배양된다. 그 다음 추가적인 PEG가 좀 더 원하는 핵산 서열의 흡수를 증진시키도록 혼합물에 첨가된다. 25% PEG 4000는 일반적으로 형질전환 혼합물의 5 내지 15배의 부피로 첨가된다; 그러나, 더 크거나 작은 부피도 적합할 수 있다. 25% PEG 4000는 바람직하게 형질전환 혼합물의 약 10배의 부피이다. PEG가 첨가된 이후, 형질전환 혼합물은 다음으로 소비톨과 CaCl₂를 첨가하기 이전에 상온에서 또는 얼음 위에서 배양된다. 그 다음 원형질체 현탁액은 성장 배지의 녹은 (molten) 일정량에 좀 더 첨가된다. 성장 배지가 성장 선별액 (예로, 아세트아마이드 또는 항생제)을 포함할 때, 이것은 형질전환체의 성장만을 허용하다.

박테리아 세포의 형질전환은 통상적인 방법에 따라서, 예로 샘브룩 등, 분자적 클로닝; 실험실 매뉴얼, 제 2판, 콜드 스프링 하버 연구소, 1982에 기술된 바와 같이 수행될 수 있고, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 형질전환 방법에 관하여 통합되어 있다.

대표적인 세포 배양 배지

본 발명은 또한 이소프렌과 수소를 공동-생산하는 배양에서 세포 또는 세포의 집단을 포함한다. "배양에서 세포 (cells in culture)"에 의하여, 세포가 한 번 이상의 세포 분열을 겪도록 허용하는 용액 (예로, 세포 성장 배지)에서 둘 이상의 세포를 의미한다. "배양에서 세포"는 식물 조직으로 분화된 세포를 포함하는 살아있고 다중세포 (multicellular) 식물의 일부인 식물세포를 포함하지 않는다. 다양한 구현예에서, 세포 배양은 적어도 또는 약 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1,000, 5,000, 10,000개 이상의 세포를 포함한다.

"산소-제한된 배양에서 세포 (cells in oxygen-limited culture)"는 세포가 한 번 이상의 세포 분열을 겪도록 허용하는, 제한된 양의 산소를 포함하는 용액 (예로, 세포 성장 배지)에서 둘 이상의 세포를 의미한다. 용어 "산소-제한된 배양 (oxygen-limited culture)"은 무산소이거나 동등물을 산소로 환원하는 생물학적 전달을 통해 호흡을 유지하여 필요한 양 이하의 산소를 포함하고, 혐기성 배양도 역시 포괄한다. 산소-제한된 배양 조건 하에서는, 탄소 대사로부터 유래한 일정 전자가 산소 농도가 너무 낮기 때문에 수용될 수 없어, 세포가 그들이 적절한 대사적 경로를 포함하고 있는 경우라면 수소 생산을 하도록 전환을 유도한다. 산소-제한된 배양 조건은 산소 전달율 (oxygen transfer rate, ("OTR")이 배양 배지에서 영점에 접근하는 용존 산소 농도로 표시되는 산소 흡수율 (oxygen uptake rate, ("OUR") 이하일 때 발생될 수 있다.

탄소원이라면 모두가 숙주세포를 배양하는 데 사용될 수 있다. 용어 "탄소원 (carbon source)"은 숙주세포 또는 생물에 의해 대사될 수 있는 하나 이상의 탄소를 포함하는 화합물을 말한다. 예를 들어, 숙주세포를 배양하는 데 사용되는 세포 배지는 생존도를 유지하거나 숙주세포를 성장시키는 데 적합한 탄소원이라면 모두를 포함할 수 있다.

일정 구현예에서, 탄소원은 탄수화물 (예로, 모노사카라이드, 디사카라이드, 올리고사카라이드, 또는 폴리사카라이드), 역슈가 (예로, 효소적으로 처리된 슈크로스 시럽), 글리세롤, 글리세린 (예로, 바이오디젤 또는 비누-제조 공정의 글리세린 부산물), 디하이드로아세톤, 일-탄소원, 오일 (예로, 옥수수, 팜, 또는 콩 오일과 같은 식물 또는 식물성 오일), 동물 지방, 동물 오일, 지방산 (예로, 포화 지방산, 불포화 지방산, 또는 폴리불포화 지방산), 지질, 인지질, 글리세롤지질, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 트리글리세라이드, 폴리글리세라이드 (예로, 미생물 또는 식물 단백질 또는 펩타이드), 재생가능한 탄소원 (예로, 가수분해된 바이오매스 탄소원과 같은 바이오매스 탄소원), 효모 추출물, 효모 추출물로부터 나온 성분, 중합체, 산, 알코올, 알데하이드, 케톤, 아미노산, 숙시네이트, 락테이트, 아세테이트, 에탄올, 또는 상기 둘 이상의 조합이라면 모두를 포함한다. 일정 구현예에서, 탄소원은 광합성의 산물이고, 이에 제한되는 것은 아니지만 포도당을 포함한다.

대표적인 모노사카라이드 (monosaccharides)는 포도당 및 과당을 포함하고, 대표적인 올리고사카라이드 (oligosaccharides)는 락토스 및 슈크로스를 포함하며, 대표적인 폴리사카라이드 (polysaccharides)는 전분 및 셀룰로스를 포함한다. 대표적인 탄수화물은 C6 당 (예로, 과당, 만노스, 갈락토스, 또는 포도당) 및 C5 당 (예로, 자일로스 또는 아라비노스)를 포함한다. 일정 구현예에서, 세포 배지는 탄수화물뿐만 아니라 탄수화물 이외에 하나 이상의 탄소원 (예로, 글리세롤, 글리세린, 디하이드로아세톤, 일-탄소원, 오일, 동물 지방, 동물 오일, 지방산, 지질, 인지질, 글리세롤지질, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 트리글리세라이드, 폴리글리세라이드, 재생가능한 탄소원, 효모 추출물, 효모 추출물로부터 나온 성분). 일정 구현예에서, 세포 배지는 탄소화물뿐만 아니라 폴리펩타이드 (예로 미생물 또는 식물 단백질 또는 펩타이드)를 포함한다. 일정 구현예에서, 식물 폴리펩타이드는 콩, 옥수수, 카놀라, 자트로파, 팜, 땅콩, 해바라기, 코코넛, 머스타드, 평지종자 (rapeseed), 목화종자 (cottonseed), 팜 줄기, 올리브, 잇꽃 (safflower), 참깨, 또는 아마종자 (linseed)로부터 나온 폴리펩타이드를 포함한다.

일정 구현예에서, 탄수화물의 농도는 적어도 또는 약 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 또는 400 g/L 이상과 같은 액체배지 리터 당 (g/L, 여기에서 액체배지의 부피는 세포 배지의 부피와 세포의 부피 둘 다를 포함함) 적어도 또는 약 5 그램이다. 일정 구현예에서, 탄수화물의 농도는 약100 및 약 360 g/L 사이, 약 120 및 약 360 g/L 사이, 또는 약 200 및 약 300 g/L 사이와 같은 약 50 및 약 400 g/L 범위 사이이다. 일정 구현예에서, 탄수화물의 농도는 숙주세포의 배양 이전에 및/또는 배양 중에 첨가되는 탄수화물의 전체량을 포함한다.

일정 구현예에서, 세포는 제한된 포도당 조건 하에서 배양된다. "제한된 포도당 조건 (limited glucose conditions)"에 의하여, 첨가된 포도당의 양은 세포에 의해 연소되는 포도당의 양이 약 105% (약 100%와 같음) 이하인 것을 의미한다. 상세한 구현예에서, 배양 배지에 첨가된 포도당의 양은 특정 기간 동안 세포에 의해 연소되는 포도당의 양과 대략 동일하다. 일정 구현예에서, 세포 성장률은 첨가된 포도당의 양을 제한하여 조절되고, 세포는 세포 배지에 들어있는 포도당의 양에 의해 지원될 수 있는 속도로 성장한다. 일정 구현예에서, 포도당은 세포가 배양되는 기간 동안 축적되지 않는다. 다양한 구현예에서, 세포는 제한된 포도당 조건 하에서 약 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 또는 70시간 이상 동안 배양된다. 다양한 구현예에서, 세포는 제한된 포도당 조건 하에서 세포가 배양되는 기간의 전체 길이의 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 또는 100% 이상의 시간 동안 배양된다. 상세한 이론으로 설명하려고 의도하지는 않지만, 제한된 포도당 조건은 세포의 더욱 바람직한 조절을 가능하게 할 수 있다.

일정 구현예에서, 세포는 과다한 포도당의 존재 시 배양될 수 있다. 상세한 구현예에서, 첨가되는 포도당의 양은 약 105% 이상 (약 110, 120, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 또는 500% 이상과 같음)이고 특정 기간 동안 세포에 의해 연소되는 포도당의 양 이상이다. 일정 구현예에서 포도당은 세포가 배양되는 기간 동안 축적된다.

대표적인 지질은 포화된, 불포화된, 또는 가지상인 C4 초과 지방산이 되는 하나 이상의 지방산을 포함하는 물질이라면 모두이다.

대표적인 오일은 상온에서 액체인 지질이다. 일정 구현예에서, 지질은 하나 이상의 C4 초과의 지방산을 포함하고 (예로, 네 개 이상의 탄소를 가지는 하나 이상의 포화된, 불포화된, 또는 가지상 지방산을 포함한다). 일정 구현예에서, 오일은 콩, 옥수수, 카놀라, 자트로파, 팜, 땅콩, 해바라기, 코코넛, 머스타드, 평지종자, 목화종자, 팜 줄기, 올리브, 잇꽃, 참깨, 아마종자, 오일성 미생물 세포, 중국 수지 (Chinese tallow), 또는 상기 둘 이상의 조합이라면 모두로부터 획득된다.

대표적인 지방산은 화학식 RCOOH의 화합물을 포함하고, 여기에서 "R"은 탄화수소이다. 대표적인 불포화 지방산은 "R"이 적어도 하나의 탄소-탄소 이중결합을 포함하는 화합물을 포함한다. 대표적인 불포화 지방산은, 이에 제한되는 것은 아니지만 올레익산, 바세닉산 (vaccenic acid), 리놀레익산, 팔미토익산 및 아라키도닉산을 포함한다. 대표적인 다중불포화 지방산은 "R"이 다수의 탄소-탄소 이중결합을 포함하는 화합물을 포함한다. 대표적인 포화 지방산은 "R"이 포화된 지방족 그룹인 화합물을 포함한다. 일정 구현예에서, 탄소원은 C₁₂ 포화된 지방산, C₁₄ 포화된 지방산, C₁₆ 포화된 지방산, C₁₈ 포화된 지방산, C₂₀ 포화된 지방산, 또는 C₂₂ 포화된 지방산과 같은 하나 이상의 C₁₂ 내지 C₂₂ 지방산을 포함한다. 대표적인 구현예에서, 지방산은 팔미트산이다. 일정 구현예에서, 탄소원은 지방산의 염 (예로, 불포화 지방산), 지방산의 유도체 (예로, 불포화 지방산), 또는 지방산의 유도체 염 (예로, 불포화 지방산)이다. 적합한 염은, 이에 제한되는 것은 아니지만 리튬 염, 포타슘 염, 소듐 염 등을 포함한다. 디- 및 트리글리세롤은 글리세롤의 지방산 에스테르이다.

일정 구현예에서, 지질, 오일, 지방, 지방산, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 또는 트리글리세라이드의 농도는 적어도 또는 약 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 또는 400 g/L 이상과 같은 액체배지 리터 당 (g/L, 여기에서 액체배지의 부피는 세포 배지의 부피와 세포의 부피 둘 다를 포함함) 적어도 또는 약 5 그램이다. 일정 구현예에서, 지질, 오일, 지방, 지방산, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 또는 트리글리세라이드의 농도는 약 25 및 약 300 g/L 사이, 약 60 및 약 180 g/L 사이, 또는 약 75 및 약 150 g/L 사이와 같은 약 10 및 약 400 g/L 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 농도는 숙주세포의 배양 이전에 및/또는 배양 동안 첨가되는 지질, 오일, 지방, 지방산, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 또는 트리글리세라이드의 전체량을 포함한다. 일정 구현예에서, 탄소원은 (i) 지질, 오일, 지방, 지방산, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 또는 트리글리세라이드 또한 (ii) 포도당과 같은 탄수화물, 둘 다를 포함한다. 일정 구현예에서, 지질, 오일, 지방, 지방산, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 또는 트리글리세라이드의 비율은 탄소 기준으로 (예로, 탄수화물 탄소 당 지질, 오일, 지방, 지방산, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 또는 트리글리세라이드에서의 일 탄소) 약 1 : 1이다. 상세한 구현예에서, 지질, 오일, 지방, 지방산, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 또는 트리글리세라이드의 양은 약 60 및 약 180 g/L 사이의 범위이고 탄수화물의 양은 약 120 및 약 360 g/L 사이의 범위이다.

대표적인 미생물 폴리펩타이드 탄소원은 효모 또는 박테리아로부터 나온 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함한다. 대표적인 식물 폴리펩타이드 탄소원은 콩, 옥수수, 카놀라, 자트로파, 팜, 땅콩, 해바라기, 코코넛, 머스타드, 평지종자, 목화종자, 팜 줄기, 올리브, 잇꽃, 참깨, 또는 아마종자로부터 나온 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함한다.

대표적인 재생가능한 탄소원은 치즈 유장 투과액 (cheese whey permeate), 옥수수 음료 (cornsteep liquor), 슈가 비트 당밀 (sugar beet molasses), 보리맥주 (barley malt), 및 상기 모두로부터 나온 성분을 포함한다. 또한 대표적인 재생가능한 탄소원은 옥수수, 스위치풀, 사탕수수, 발효 공정의 세포 잔여물, 및 콩, 옥수수, 또는 밀의 제분과정으로부터 나온 단백질 부산물과 같은 바이오매스에 존재하는 포도당, 육탄당, 오탄당 및 자일로스를 포함한다. 일정 구현예에서, 바이오매스 탄소원은, 이에 제한되는 것은 아니지만 잔디, 밀, 밀 줄기, 바가스, 사탕수수, 연목질 펄프, 옥수수, 옥수수 껍질, 옥수수 줄기, 옥수수 줄기로부터 나온 섬유, 옥수수 스토버, 스위치풀, 쌀 산물, 또는 곡물의 습식 또는 건조 제분으로부터 나온 부산물 (예로, 옥수수, 수수, 호밀, 트리티케이트, 보리, 밀, 및/또는 증류 곡물)과 같은 리그노셀룰로스, 헤미셀룰로스 또는 셀룰로스 물질이다. 대표적인 셀룰로스 물질은 나무, 종이 및 펄프 잔여물, 허브성 식물, 및 과일 펄프를 포함한다. 일정 구현예에서, 탄소원은 줄기, 곡물, 뿌리, 또는 괴경과 같은 식물 일부라면 모두를 포함한다. 일정 구현예에서, 하기 식물의 전부 또는 일부는 탄소원으로서 사용될 수 있다: 옥수수, 밀, 호밀, 수수, 트리티케이트, 쌀, 기장, 보리, 카사바, 콩과 완두와 같은 콩류, 감자, 고구마, 바나나, 사탕수수, 및/또는 타피오카. 일정 구현예에서, 탄소원은 자일로스와 포도당을 둘 다 포함하거나 슈크로즈와 포도당을 둘 다 포함하는 바이오매스 가수분해물과 같은 바이오매스 가수분해물이다.

일정 구현예에서, 재생가능한 탄소원 (바이오매스와 같음)은 세포 배양 배지에 첨가되기 이전에 전처리된다. 일정 구현예에서, 전처리 과정은 효소적 전처리, 화학적 전처리, 또는 효소적 및 화학적 전처리 둘 다의 조합을 포함한다 (예를 들어, Farzaneh et al., Bioresource Technology 96 (18): 2014-2018, 2005; 미국 특허 제 US 6,176,176호; 제 US 6,106,888호를 참조하고; 이들은 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 재생가능한 탄소원의 전처리에 관하여 통합되어 있다). 일정 구현예에서, 재생가능한 탄소원은 세포 배양 배지에 첨가되기 이전에 부분적으로 또는 완전히 가수분해되어 있다.

일정 구현예에서, 재생가능한 탄소원 (옥수수 스토버와 같음)은 세포 배양 배지에 첨가되기 이전에 암모니아 섬유 확장 (AFEX) 전처리를 받는다 (예를 들어, Farzaneh et al., Bioresource Technology 96 (18): 2014-2018, 2005를 참조하라). AFEX 전처리하는 동안, 재생가능한 탄소원은 액체 무수 암모니아로 적당한 온도(약60 내지 약 100℃와 같음) 및 높은 압력 (약 250 내지 약 300 psi와 같음) 에서 5분 동안 처리된다. 다음으로 압력은 신속히 방출된다. 본 공정에서, 리그닌 용액화, 반셀룰로스 가수분해, 셀룰로스 탈결정화, 및 증가된 표면적이라는 조합된 화학적 및 물리적 효과는 발효가능한 당으로 셀룰로스와 헤미셀룰로스의 거의 완전한 효소적 전환을 가능하게 한다. AFEX 전처리는 거의 모든 암모니아가 회수되어 재사용될 수 있는 한편, 잔여물은 미생물에게 하류 공정에서 질소원으로서 제공되는 장점을 가진다. 또한, 세척 공정이 AFEX 전처리에는 요구되지 않는다. 따라서, AFEX 전처리에 이어지는 건조 물질 회수는 반드시 100%이다. AFEX는 기본적으로 건조 대 건조 공정이다. 처리된 재생가능한 탄소원은 장기간 동안 안정하고 효소적 가수분해 또는 발효 공정에서 매우 높은 고형체 투입으로 첨가될 수 있다. 셀룰로스 및 헤미세룰로스는 AFEX 공정에서 분해가 거의 없거나 전혀 없이 잘 보존된다. AFEX-전처리 과정을 겪은 재생가능한 탄소원의 효소적 가수분해 이전에 중화 과정은 전혀 필요없다. AFEX-전처리된 탄소원의 효소적 가수분해는 연속적인 발효 용도를 위해 깨끗한 당 스트림을 제공한다.

일정 구현예에서, 탄소원 (예로, 재생가능한 탄소원)의 농도는 적어도 또는 약 0.1, 0.5, 1, 1.5 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 또는 50% 포도당 (w/v)과 동등하다. 포도당의 동등한 양은 탄소원으로부터 생성된 포도당의 양을 측정하도록 포도당을 기준으로 하는 표준 HPLC 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 일정 구현예에서, 탄소원(예로, 재생가능한 탄소원)의 농도는 약 0.1 및 약 10% 포도당 사이, 약 0.5 및 약 10% 포도당 사이, 약 1 및 약 10% 포도당 사이, 약 1 및 약 5% 포도당 사이 또는 약 1 및 약 2% 포도당 사이와 같은 약 0.1 및 약 20% 포도당 사이의 범위와 동등하다.

일정 구현예에서, 탄소원은 효모 추출물 또는 효모 추출물의 하나 이상의 성분을 포함한다. 일정 구현예에서, 효모 추출물의 농도는 적어도 또는 약 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 또는 300 g/L 이상과 같은 액체배지 리터 당 (g/L, 여기에서 액체배지의 부피는 세포 배지의 부피와 세포의 부피 둘 다를 포함함) 적어도 약 1 그램이다. 일정 구현예에서, 효모 추출물의 농도는 약 1 및 약 200 g/L 사이, 약 5 및 약 200 g/L 사이, 약 5 및 약 100 g/L 사이, 약 5 및 약 60 g/L 사이와 같은 약 1 및 약 300 g/L 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 농도는 숙주세포의 배양 이전에 및/또는 배양 중에 첨가되는 효모 추출물의 전체량을 포함한다. 일정 구현예에서, 탄소원은 효모 추출물 (또는 그의 하나 이상의 성분) 및 포도당과 같은 또 다른 탄소원 둘 다를 포함한다. 일정 구현예에서, 효모 추출물과 기타 탄소원의 비율은 약 1:5, 약 1:10, 또는 약 1:20 (w/w)이다.

추가적으로, 탄소원은 이산화탄소, 또는 메탄올과 같은 일-탄소 물질일 수도 있다. 단일 탄소원 (예로, 메탄올, 포름알데하이드, 또는 포르메이트)으로부터 글리세롤 생산은 메틸영양성 효모 (Yamada et al., Agric. Biol. Chem., 53(2) 541-543, 1989, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 탄소원에 관하여 통합되어 있다) 및 박테리아 (Hunter et. al., Biochemistry , 24, 4148-4155, 1985, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 탄소원에 관하여 통합되어 있다)에서 보고된 바 있었다. 이들 생물은 산화 상태에서 메탄올로부터 포르메이트까지 분포하는 단일 탄소 화합물을 동화시킬 수 있다. 탄소 동화의 경로는 리불로스 모노포스페이트를 통해, 세린을 통해, 또는 자일룰로스 모노포스페이트를 통해 진행될 수 있다 (Gottschalk, 박테리아 대사 (Bacterial Metabolism), 제 2판, 스프링거-버라그 출판사 (Springer-Verlag): 뉴욕, 1986, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 탄소원에 관하여 통합되어 있다). 리불로스 모노포스페이트 (ribulose monophosphate) 경로는 과당이 되고 결국에는 세 개의 탄소 산물인 글리세르알데하이드-3-포스페이트가 되는 여섯 개의 탄소당을 형성하도록 리불로스-5-포스페이트를 사용하여 포르메이트의 농축에 관여한다. 마찬가지로, 세린 경로는 일-탄소 화합물을 메틸렌테트라하이드로폴레이트를 통해 당분해 경로 내로 동화시킨다.

한 개 및 두 개의 탄소 물질에 더하여, 메틸영양성 생물도 역시 메틸아민, 글루코사민 및 대사적 활성을 위한 다양한 아미노산과 같은 화합물을 포함하는 많은 기타 탄소를 사용하는 것으로 알려져있다. 예를 들어, 메틸영양성 효모는 트레할로스 또는 글리세롤을 형성하도록 메틸아민으로부터 탄소를 사용하는 것으로 알려져있다 (Bellion et al., Microb. Growth Cl Compd., [Int. Symp.], 제 7판, 415-32. Editors: Murrell et al. , Publisher: Intercept, Andover, UK, 1993, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 탄소원에 관하여 통합되어 있다). 유사하게, 칸디다의 다양한 종들도 알라닌 또는 올레익산을 대사작용하고 있다 (Sulter et al., Arch. Microbiol. 153(5), 485-9, 1990, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 탄소원에 관하여 통합되어 있다).

일정 구현예에서, 세포는 생리학적 염과 영양분을 포함하는 표준 배지에서 배양된다 (예로, Pourquie, J. et al., Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, eds. Aubert et al., Academic Press, pp. 71-86, 1988, 및 Ilmen et al., Appl. Environ. Microbiol. 63:1298-1306, 1997, 이들은 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 세포 배지에 관하여 통합되어 있다). 대표적인 성장 배지는 보편적이고 상업적으로 제조되는 루리아 버타니 (LB) 액체배지, 사부로드 덱스트로스 (Sabouraud Dextrose, SD) 액체배지, 또는 효모 배지 (YM) 액체배지와 같은 배지이다. 기타 다른 정의된 또는 합성 성장 배지도 역시 사용될 수 있고, 특정한 숙주 세포의 성장을 위한 적절한 배지는 미생물학 또는 발효과학의 기술분야에서 당업자라면 알고 있다.

적절한 탄소원에 더하여, 세포 배지는 바람직하게 적합한 미네랄, 염, 공인자, 완충용액, 및 당업자에게 배양액의 성장 또는이소프렌 생산의 증진에 적합한 것으로 알려져 있는 기타 성분을 포함한다 (예를 들어, 국제특허출원 제 WO 2004/033646호 및 본 명세서에서 인용된 참고문헌들 또한 국제특허출원 제 WO 96/35796 호 및 본 명세서에서 인용된 참고문헌들을 참조하고, 이들은 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 세포 배지 및 세포 배양 조건에 관하여 통합되어 있다). 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, 및/또는 MVA 경로 핵산이 유도성 프로모터 조절 하에 있는 일정 구현예에서, 유도제 (inducing agent)는 (예로 당, 금속염 또는 항미생물제)는 바람직하게 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, 및/또는 MVA 경로의 발현을 유도하는 데 효과적인 농도로 배지가 첨가된다. 일정 구현예에서, 세포 배지는 하나 이상의 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, 및/또는 MVA 경로 핵산을 가지는 벡터 상에서 항생제 저항성 핵산 (카나마이신 저항성 핵산과 같음)에 해당하는 항생제 (카나마이신과 같음)를 가진다.

대표적인 세포 배양 조건

박테리아 배양액의 유지 및 성장에 적합한 재료 및 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 대표적인 기법은 Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardt et al., eds), 미국 미생물학회 (American Society for Microbiology), 워싱턴, D.C. (1994) 또는 Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, 제 2판 (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA에서 확인될 수 있고, 이들은 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 세포 배양 기법에 관하여 통합되어 있다. 일정 구현예에서, 세포는 숙주세포 내로 삽입된 핵산에 의해 인코드되는 하나 이상의 이소프렌 합성효소, DXS, IDI, 및/또는 MVA 경로 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 조건 하 배양 배지에서 배양된다.

표준 세포 배양 조건이 세포를 배양하는 데 사용될 수 있다 (예를 들어, 국제특허출원 제 WO 2004/033646호 및 본 명세서에 기술된 참고문헌들을 참조하고, 이들은 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 세포 배양 및 발효 조건에 관하여 통합되어 있다). 세포는 적절한 온도, 기체 혼합물, 및 pH (약 20℃ 내지 약 37℃, 약 6% 내지 약 84% CO₂, 및 pH 약 5 내지 약 9)에서 성장하고 유지된다. 일정 구현예에서, 세포는 적절한 배지로 35℃에서 성장한다. 일정 구현예에서, 예로 배양액은 대략 28℃에서 적절한 배지로 원하는 양의 이소프렌과 수소 공동-생산이 달성될 때까지 진탕 배양기 또는 발효기에서 배양된다. 일정 구현예에서, 발효를 위한 pH 범위는 약 pH 5.0 내지 약 pH 9.0 사이 (약 pH 6.0 내지 약 pH 8.0 또는 약 pH 6.5 내지 pH 7.0)이다. 반응은 숙주세포의 요구조건을 근거로 하여 호기성, 무산소, 또는 혐기성 조건 하에서 수행될 수 있다. 일정 구현예에서, 세포는 산소-제한된 조건 하에서 배양된다. 일정 구현예에서, 세포는 산소 존재 시 생산된 이소프렌 당 0.5 몰의 산소가 흡수되는 조건 하에서 배양된다. 일정 구현예에서, 세포는 혐기성 조건 하에서 배양된다. 주어진 필라멘트상 곰팡이를 위한 대표적인 배양 조건은 당해 기술분야에 알려져 있고, 과학문헌에서 및/또는 미국 타입배양 수집기관 (American Type Culture Collection) 및 곰팡이유전학 스톡 센터 (Fungal Genetics Stock Center)와 같은 곰팡이 출처로부터 확인될 수 있다.

다양한 구현예에서, 세포는 회분식 (batch), 사료첨가-회분식 (fed-batch), 또는 연속식 공정과 같은 기지의 발효방식이라면 모두를 사용하여 배양될 수 있다. 일정 구현예에서, 발효의 회분식 방법이 사용된다. 고전적인 회분식 발효는 배지의 조성이 발효 시작 시점에 설정되고 발효되는 동안 인위적인 변화가 가능하지 않은 폐쇄 시스템이다. 따라서, 발효 시작 시점에 세포 배지가 원하는 숙주세포와 함께 접종되고 시스템에 첨가하는 것이 전혀 허용되지 않으면서 발효가 진행된다. 그러나 전형적으로는, "회분식 (batch)" 발효가 탄소원의 첨가에 관하여 회분이고 종종 pH와 산소 농도와 같은 인자를 조절하려고 시도된다. 회분식 시스템에서, 시스템의 대사물과 바이오매스 조성물은 발효가 정지되는 시간까지 계속적으로 변화된다. 회분식 배양 내에서, 세포는 래그 정지기를 통해 높은 로그 성장기로 진행되고, 최종적으로 성장율이 감소되거나 멈추는 안정기로 진행된다. 일정 구현예에서, 로그기에 있는 세포는 이소프렌의 벌크 생산을 부여한다. 일정 구현예에서, 안정기에 있는 세포는 이소프렌을 생산한다.

일정 구현예에서, 표준 회분식 시스템에 대한 다양한 변화가 사료첨가-회분식 시스템 (Fed-Batch system)와 같이 사용될 수 있다. 사료첨가-회분식 발효 공정은 탄소원이 발효가 진행되면서 점차 첨가되는 것을 제외하고는 전형적인 회분식 시스템을 포함한다. 사료첨가-회분식 시스템은 분해대사물 억제가 세포의 대사를 저해하기 쉬울 때, 또한 세포 배지에서 제한된 양의 탄소원을 가지는 것이 바람직한 곳에서 유용하다. 사료첨가-회분식 발효는 제한되거나 과다한 양의 탄소원 (예로, 포도당)으로 수행될 수 있다. 사료첨가-회분식 시스템에서 실제적 탄소원 농도의 측정은 어렵고 따라서 pH, 용존 산소, 및 CO₂와 같은 잔여 기체의 부분압과 같은 측정가능한 인자의 변화를 근거로 하여 평가된다. 회분식 및 사료첨가-회분식 발효는 보편적이고 당해 기술분야에 잘 숙지되어 있으며 예들이 Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, 제 2판 (1989) Sinauer Associates, Inc.에서 확인될 수 있고, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 세포 배양 및 발효 조건에 관하여 통합되어 있다.

일정 구현예에서, 연속식 발효방법이 사용된다. 연속식 발효는 정의된 발효 배지가 생물반응기로 계속하여 첨가되는 개방 시스템이고 동일한 양의 조정된 배지 (conditioned medium)가 프로세싱을 위해 동시에 제거된다. 연속식 발효는 일반적으로 세포가 일차적으로 로그기 성장에 있는 일정한 높은 밀도에서 배양을 유지시킨다.

연속식 발효는 세포 성장 또는 이소프렌 생산에 영향을 주는 하나의 인자 또는 많은 인자들의 조정을 허용한다. 예를 들어, 한 가지 방법은 탄소원 또는 질소 수준과 같은 제한 영양분을 고정된 속도로 유지시키고 모든 기타 매개변수는 적당해지도록 한다. 다른 시스템에서, 세포 농도 (예로, 배지 혼탁도에 의해 측정되는 농도)가 일정하게 유지되는 반면 성장에 영향을 주는 많은 인자는 계속하여 변화될 수 있다. 연속식 시스템은 지속된 상태로 성장 조건을 유지하려고 한다. 따라서, 배출되는 배지로 인한 세포 소실은 발효에서 세포 성장율에 대해 맞추어진다. 연속식 발효 공정을 위해 영양분 및 성장인자를 조정하는 방법뿐만 아니라 산물 생산율을 최대화하는 기법은 산업미생물학의 기술분야에 잘 숙지되어 있고, 다양한 방법이 Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, 제 2판 (1989) Sinauer Associates, Inc.에 상세히 기술되어 있으며, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 세포 배양 및 발효 조건에 관하여 통합되어 있다.

일정 구현예에서, 세포는 전체 세포 촉매인 기질 상에 고정되어 있고 이소프렌 생산을 위한 발효 조건이 주어진다.

일정 구현예에서, 액체 배양액의 용기는 액체에 산소를 도입하고 배양액의 균일도를 유지시키기 위해 진탕기에 놓여진다. 일정 구현예에서, 배양기가 배양액이 자라는 온도, 습도, 진탕 속도, 및/또는 기타 조건을 조절하는 데 사용된다. 가장 단순한 배양기는 전형적으로 ~ 65℃까지 올라가는 조절가능한 히터를 가진 밀폐된 박스이다. 좀 더 정교한 배양기는 또한 온도를 강하하는 능력 (냉장고에 의해), 또는 습도 또는 CO₂ 수준을 조절하는 능력을 포함할 수 있다. 가장 좋은 배양기는 타이머를 포함하고; 일부는 또한 서로 다른 온도, 습도 수준 등을 통해 순환하도록 프로그램될 수 있다. 배양기는 탁자 위로부터 작은 방 크기의 유닛까지 크기가 다양해질 수 있다.

원하는 경우라면, 세포 배지의 일정량 또는 전부가 영양분을 보충하고 및/또는 잠재적으로 해로운 대사 부산물 및 죽은 세포의 생성을 피하도록 변화될 수 있다. 현탁 배양의 경우, 세포는 현탁 배양을 원심분리하거나 여과한 다음 세포를 새로운 배지에 재현탁함에 의해 배지로부터 분리될 수 있다. 부착 배양의 경우, 배지는 흡입 (aspiration)에 의해 직접적으로 제거되어 대체될 수 있다. 일정 구현예에서, 세포 배지는 적어도 일정량의 세포가 연속식 배양에서 (희석이 없는 연속식 배양과 같음) 적어도 또는 약 5, 10, 20, 40, 50, 60, 65회 이상의 세포분열 동안 분열하도록 허용한다.

일정 구현예에서, 전신 발현 또는 누출 (leaky) 프로모터 (Trc 프로모터와 같음)가 사용되고 화합물 (IPTG와 같음)이 프로모터에 작동적으로 연결된 이소프렌 합성효소 DXS, IDI, 또는MVA 경로 핵산(들)의 발현을 유도하도록 첨가되지 않는다. 일정 구현예에서, 화합물 (IPTG와 같음)이 프로모터에 작동적으로 연결된 이소프렌 합성효소 DXS, IDI, 또는 MVA 경로 핵산(들)의 발현을 유도하도록 첨가된다.

이소프렌 생산을 세포 성장과 분리하는 대표적인 방법

바람직하게, 공급원료로부터 나온 탄소는 세포의 성장 및 유지로 진행하기보다는 이소프렌으로 전환된다. 일정 구현예에서, 세포는 낮은 OD₆₀₀에서 중간 OD₆₀₀으로 성장한 다음 이소프렌의 생산을 시작하거나 이를 증가시킨다. 본 전략은 탄소의 많은 부분이 이소프렌으로 전환되도록 한다.

일정 구현예에서, 세포는 더 이상 분열하지 않거나 극히 천천히 분열하는 광학 농도에 도달하지만 수 시간 동안 (약2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 또는30시간 이상과 같음) 이소프렌을 계속 생산한다. 예를 들어, 도 60A 내지 67C는 세포가 더 이상 분열하지 않거나 극히 천천히 분열하는 광학 농도에 도달한 이후에 실질적인 양의 메발론산 또는 이소프렌을 계속 생산할 수 있는 것을 설명하고 있다. 일정 경우에서, 550 nm에서 광학 밀도는 시간 경과 시 감소되고 (세포가 지수적 성장기를 지나서 광학 밀도에서의 감소와 같음), 세포는 계속하여 실질적인 양의 메발론산 또는 이소프렌을 생산한다. 일정 구현예에서, 세포의 550 nm에서 광학 밀도는 소정의 기간 경과 시 (약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 60시간 이하와 같음) 약 50% 이하까지 (약 0, 30, 20, 10, 5, 또는 0% 이하까지와 같음) 감소되고, 세포는 본 기간 경과 시 약 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 또는 5,000 nmole 이상의 세포의 습윤무게/시간에 대한 세포의 이소프렌/그램 (nmole/g_wcm/시간)으로 이소프렌을 생산한다. 일정 구현예에서, 이소프렌량은 약 2 내지 약 100 nmole/g_wcm/시간, 약 100 내지 약 500 nmole/g_wcm/시간, 약 150내지 약 500 nmole/g_wcm/시간, 약 500 내지 약 1000 nmole/g_wcm/시간, 약 1,000 내지 약 2000 nmole/g_wcm/시간 또는 약 2,000 내지 약 5,000 nmole/g_wcm/시간과 같은 약 2 내지 약 5000 nmole/g_wcm/시간 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 이소프렌량은 약 20 내지 약 5000 nmole/g_wcm/시간, 약 100 내지 약 5,000 nmole/g_wcm/시간, 약 200내지 약 2,000 nmole/g_wcm/시간, 약 200 내지 약 1,000 nmole/g_wcm/시간, 약 300 내지 약 1,000 nmole/g_wcm/시간 또는 약 400 내지 약 1,000 nmole/g_wcm/시간 사이의 범위이다.

일정 구현예에서, 세포의 550 nm에서 광학 밀도는 소정의 기간 경과 시 (약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는60시간 이하와 같음) 약 50% 이하까지 (약40, 30, 20, 10, 5 또는 0% 이하까지와 같음) 증가되고, 세포는 본 기간 동안 약 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000 mg 이상의 이소프렌/액체배지 L로 (mg/L_액체배지, 여기에서 액체배지의 부피는 세포와 세포 배지의 부피를 포함함) 이소프렌의 누적 역가 (전체량)를 생산한다. 일정 구현예에서, 이소프렌량은 약 2 내지 약 100 mg/L_액체배지, 약 100 내지 약 500 mg/L_액체배지, 약 500 내지 약 1,000 mg/L_액체배지, 약 1,000 내지 약 2,000 mg/L_액체배지, 또는 약 2,000 내지 약 5,000 mg/L_액체배지 사이와 같은 약 2 내지 약 5,000 mg/L_액체배지 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 이소프렌량은 약 20 내지 약 5,000 mg/L_액체배지, 약 100 내지 약 5,000 mg/L_액체배지, 약 200 내지 약 2,000 mg/L_액체배지, 약 200 내지 약 1,000 mg/L_액체배지, 약 300 내지 약 1,000 mg/L_액체배지, 또는 약 400 내지 약 1,000 mg/L_액체배지 사이의 범위이다.

일정 구현예에서, 세포의 550 nm에서 광학 밀도는 소정의 기간 경과 시 (약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는60시간 이하와 같음) 약 50% 이하까지 (약 40, 30, 20, 10, 5 또는 0% 이하까지와 같음) 증가되고, 세포는 본 기간 동안 세포 배양 배지에서 약 0.0015, 0.002, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.12, 0.14, 0.16, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 또는 8.0% 이상의 탄소를 이소프렌으로 전환한다. 일정 구현예에서, 탄소의 이소프렌으로의 전환 퍼센트는 약 0.002 내지 약 4.0%, 약 0.002 내지 약 3.0%, 약 0.002 내지 약 2.0%, 약 0.002 내지 약 1.6%, 약 0.002 내지 약 0.005%, 약 0.005 내지 약0.01%, 약 0.01 내지 약 0.05%, 약 0.05 내지 약 0.15%, 약 0.15 내지 약 0.2%, 약 0.2 내지 약 0.3%, 약 0.3 내지 약 0.5%, 약 0.5 내지 약 0.8%, 약 0.8 내지 약 1.0%, 또는 약 1.0 내지 약 1.6% 와 같은 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 탄소의 이소프렌으로의 전환 퍼센트는 약 0.002 내지 약 4.0%, 약 0.002 내지 약 0.16%, 약 0.04 내지 약 0.16%, 약 0.005 내지 약 0.3%, 약 0.01 내지 약 0.3%, 또는 약 0.05 내지 약 0.3% 사이의 범위이다.

일정 구현예에서, 이소프렌은 안정기 (stationary phase)에서만 생산된다. 일정 구현예에서, 이소프렌은 성장기 및 안정기 둘 다에서만 생산된다. 다양한 구현예에서, 안정기 동안 생산되는 이소프렌량은 (생산되는 이소프렌의 전체량 또는 OD₆₀₀당 시간당 액체배지 리터 당 생산되는 이소프렌량과 같음)은 동일 기간 동안 생산되는 이소프렌량보다 약 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50배 이상이다. 다양한 구현예에서, 생산되는 이소프렌의 전체량 (발효 시 20시간 정도의 소정의 기간 동안 이소프렌의 생산과 같음)의 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99% 이상이 세포가 안정기에 있을 때 생산된다. 다양한 구현예에서, 생산되는 이소프렌의 전체량 (발효 시 20시간 정도의 소정의 기간 동안 이소프렌의 생산과 같음)의 약5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99% 이상이 세포가 천천히 분열하거나 안정기에 있을 때 생산되지만, 세포의 550 nm에서 광학 밀도가 약 50% 이하까지 (약40, 30, 20, 10, 5 또는 0% 이하까지와 같음) 증가될 때는 전혀 생산되지 않는다.

일정 구현예에서, 하나 이상의 MVA 경로, IDI, DXP, 또는 이소프렌 합성효소 핵산은 성장기보다는 안정기에 활성이 더 큰 프로모터 또는 인자의 조절 하에 놓여진다. 예를 들어, 하나 이상의 MVA 경로, IDI, DXP, 또는 이소프렌 합성효소 핵산은 RpoS와 같은 안정기 시그마 인자 (sigma factor)의 조절 하에 놓여질 수 있다. 일정 구현예에서, 하나 이상의 MVA 경로, IDI, DXP, 또는 이소프렌 합성효소 핵산은 안정기에 활성이 있는 반응 조절인자에 의해 유도가능한 프로모터와 같은 안정기에 유도가능한 프로모터의 조절 하에 놓여진다.

안전한 작동 범위 내의 이소프렌 생산

발화성 특성에 따른 안전한 작동 수준 이내에서의 이소프렌의 생산은 상업적 시설의 설계 및 제작을 단순화하고, 안전하게 작동하는 능력을 크게 개선시키며, 화재가 일어날 가능성을 제한시킨다. 상세하게, 이소프렌의 생산을 위한 최적의 범위는 예로 이소프렌 농도의 발화가능하지 않은 범위인 안전 영역 (safe zone) 이내이다. 이러한 한 가지 관점에서, 본 명세서에서는 발화가능하지 않은 범위의 이소프렌 농도 이내에서 (이소프렌의 발화도 경계 외부) 이소프렌의 생산 방법이 기술되어 있다.

따라서, 컴퓨터 모델링 및 실험적 테스트가 공정 안전성을 보장하는 이소프렌의 (O₂, N₂, CO₂, 또는 둘 이상의 상기 기체의 조합이라면 모두 존재 시 이소프렌과 같음) 발화도 한계를 결정하는 데 사용되었다. 발화도 경계 (flammability envelope)는 저부 발화도 한계 (lower flammability limit, LFL), 고부 발화도 한계 (upper flammability limit, UFL), 제한 산소농도 (limiting oxygen concentration, LOC), 및 제한 온도에 의해 특징지워진다. 발화가능한 시스템의 경우, 최소량의 연료 (이소프렌과 같음)는 최소량의 산화제, 전형적으로 산소가 존재해야 한다. LFL는 연소를 유지하기 위해 존재해야 하는 이소프렌의 최소량인 한편, UFL은 존재할 수 있는 이소프렌의 최대량이다. 본 한계를 넘으면, 혼합물은 연료 초과가 되고 산소의 분획은 너무 낮아 발화가능한 혼합물을 가질 수 없다. LOC는 발화가능한 혼합물을 가지기 위해 존재해야 하는 산소의 최소 분획을 표시한다. 제한 온도는 이소프렌의 점화점에 근거를 두고 이소프렌의 연소가 전파될 수 있는 가장 낮은 온도이다. 이들 한계는 이소프렌의 농도, 산화제의 유형 및 농도, 시스템에 존재하는 불활성 물질, 온도, 및 시스템의 압력에 대해 특이적이다. 발화도 경계의 한계 이내 있는 조성물은 연소를 전파시키고 공정 시설의 설계 및 작동에 추가적인 안전성 유의사항을 요구한다.

다음의 조건은 컴퓨터 시뮬레이션과 수학적 분석 및 실험적 테스트를 사용하여 시험되었다. 원하는 경우, 기타 다른 조건 (다른 온도, 압력, 및 영구적 기체 조성)이 LFL, UFL, 및 LOC 농도를 결정하도록 본 명세서에서 기술된 방법을 사용하여 시험될 수 있다.

(1) 컴퓨터 시뮬레이션과 수학적 분석

테스트 1조:

이소프렌: 0 wt% - 14 wt%

O₂: 6 wt% - 21 wt%

N₂: 79 wt% - 94 wt%

테스트 2조:

이소프렌: 0 wt% - 14 wt%

O₂: 6 wt% - 21 wt%

N₂: 79 wt% - 94 wt%

H₂O로 포함됨

테스트 3조:

이소프렌: 0 wt% - 14 wt%

O₂: 6 wt% - 21 wt%

N₂: 79 wt% - 94 wt%

CO₂: 5 wt% - 30 wt%

(2) 발화도 한계의 최종 결정을 위한 실험적 테스트

테스트 1조:

이소프렌: 0 wt% - 14 wt%

O₂: 6 wt% - 21 wt%

N₂: 79 wt% - 94 wt%

테스트 2조:

이소프렌: 0 wt% - 14 wt%

O₂: 6 wt% - 21 wt%

N₂: 79 wt% - 94 wt%

H₂O로 포화됨

시뮬레이션 소프트웨어가 여러가지 서로 다른 시험 조건에 대한 시스템의 발화도 특성을 평가하는 데 사용되었다. CO₂ 는 시스템의 발화도 한계에 미치는 유의한 영향을 나타내지 않았다. 테스트 1조 및 2조는 실험적 테스트에 의해 입증되었다. 모델링 결과는 실험적 테스트 결과와 일치하였다. 약간의 변화 (variation)만이 물의 첨가로 확인되었다.

LOC는 40℃, 1기압 하에서 이소프렌, O₂, N₂, 및CO₂ 혼합물의 경우 9.5 vol%인 것으로 결정되었다. 30% CO₂까지의 첨가는 이소프렌, O₂, 및 N₂ 혼합물의 발화도 특성에 유의한 영향을 주지 않았다. 발화도 특성의 약간의 변화만이 건조 및 물 포화된 이소프렌, O₂, 및 N₂시스템 간에 나타났다. 제한 온도는 약 -54℃이었다. 약 -54℃ 미만의 온도는 너무 낮아 이소프렌의 연소를 전파시키지 못한다.

일정 구현예에서, 이소프렌의 LFL는 시스템에서 산소의 양에 따라 약 1.5 vol%로부터 약 2.0 vol%까의지 범위이고 이소프렌의 UFL는 약 2.0 vol%로부터 12.0 vol%까지의 범위이다. 일정 구현예에서, LOC는 약 9.5 vol% 산소이다. 일정 구현예에서, 온도가 25℃ 내지 약 55℃ 사이 (약 40℃와 같음)이고 압력이 약 1 기압 및 3기압 사이일 때 이소프렌의 LFL는 약 1.5 vol.% 내지 약 2.0 vol% 사이이고, 이소프렌의 UFL는 약 2.0 vol.% 내지 약 12.0 vol.% 사이이며, 또한, LOC는 약 9.5 vol% 산소이다.

일정 구현예에서, 이소프렌은 약 9.5 vol% 이하의 산소 존재 시 (즉, 이소프렌의 발화가능한 혼합물을 가지는 데 요구되는 LOC 미만) 생산된다. 이소프렌이 약 9.5% 이상의 산소 존재 시 생산되는 일정 구현예에서, 이소프렌 농도는 LFL 미만 (약 1.5 vol.% 미만과 같음)이다. 예를 들어, 이소프렌량은 불활성 기체를 가지는 이소프렌 조성물을 희석하여 (예로, 이소프렌 조성물을 LFL 미만으로 유지하도록 질소와 같은 불활성 기체를 연속적으로 또는 정기적으로 첨가하여) LFL 미만으로 유지될 수 있다. 이소프렌이 약 9.5% 이상의 산소 존재 시 생산되는 일정 구현예에서, 이소프렌의 농도는 UFL 초과 (약 12 vol% 초과와 같음)이다. 예를 들어, 이소프렌량은 이소프렌을 UFL 초과 농도로 생산하는 시스템을 사용하여 (본 명세서에서 기술된 세포 배양 시스템이라면 모두와 같음) UFL 초과로 유지될 수 있다. 원하는 경우, 상대적으로 낮은 산소 수준이 사용될 수 있어 UFL도 상대적으로 낮다. 본 경우에서, 더 낮은 이소프렌 농도가 UFL 초과로 남아있는 데 필요하다.

이소프렌이 약 9.5% 이상의 산소 존재 시 생산되는 일정 구현예에서, 이소프렌 농도는 발화도 한계 이내 (LFL 및 UFL 사이의 범위와 같음)이다. 이소프렌 농도가 발화도 한계 이내에 놓여질 수 있는 일정 구현예에서, 하나 이상의 단계가 화재 또는 폭발의 가능성을 감소시키도록 수행된다. 예를 들어, 하나 이상의 점화원 (스파크를 생성할 수 있는 물질이라면 모두와 같음)을 피해야 한다. 일정 구현예에서, 하나 이상의 단계가 이소프렌의 농도가 발화도 한계 이내에 남아있는 시간량을 감소시키도록 수행된다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 농도가 발화도 한계에 근접하거나 이내일 때 센서가 검출하는 데 사용된다. 원하는 경우, 이소프렌의 농도는 세포를 배양하는 동안 하나 이상의 시점에서 측정될 수 있고, 세포 배양 조건 및/또는 불활성 기체의 양은 이소프렌의 농도가 발화도 한계에 근접하거나 이내인 경우라면 표준 방법을 사용하여 조정될 수 있다. 상세한 구현예에서, 세포 배양 조건 (발효와 같음)은 이소프렌의 농도를 LFL 미만으로 감소시키기거나 이소프렌의 농도를 UFL 초과로 증가시키도록 조정된다. 일정 구현예에서, 이소프렌량은 불활성 기체를 가지는 이소프렌 조성물을 희석하여 (이소프렌 조성물을 LFL 미만으로 유지하도록 질소와 같은 불활성 기체를 연속적으로 또는 정기적으로 첨가하는 것과 같음) LFL 미만으로 유지된다.

일정 구현예에서, 이소프렌이 아닌 발화가능한 휘발성 물질 (하나 이상의 당)의 양은 생산된 이소프렌량보다 적어도 약 2, 5, 10, 50, 75, 또는 100배이다. 일정 구현예에서, 이소프렌이 아닌 기체상의 부분은 약 0% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약100% (부피) 산소 사이와 같은 약 0% 내지 약100% (부피) 산소 사이의 범위를 포함한다. 일정 구현예에서, 이소프렌이 아닌 기체상의 부분은 약 0% 내지 약10%, 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 99% (부피) 질소 사이와 같은 약 0% 내지 약 99% (부피) 질소 사이의 범위를 포함한다.

일정 구현예에서, 이소프렌이 아닌 기체상의 부분은 약 1% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 50% (부피) CO₂ 사이와 같은 약 0% 내지 약 50% (부피) CO₂ 사이의 범위를 포함한다.

일정 구현예에서, 이소프렌 조성물은 또한 에탄올을 포함한다. 예를 들어, 에탄올은 이소프렌의 추출적 증류를 위해 사용될 수 있고, 에탄올과 이소프렌을 둘 다 포함하는 조성물 (중간 산물 스트림과 같음)을 가져온다. 바람직하게, 에탄올의 양은 에탄올에 대한 발화도 한계 외부이다. 약 1 기압 및 약 60˚F와 같은 (NFPA 69 Standard on Explosion Prevention Systems, 2008년판, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로, 상세하게는 LOC, LFL, 및 UFL 값에 관하여 통합되어 있다) 표준 조건에서, 에탄올의 LOC는 약 8.7 vol%이고, 에탄올에 대한 LFL은 약 3.3 vol%이다. 일정 구현예에서, 이소프렌과 에탄올을 포함하는 조성물은 에탄올의 발화가능한 혼합물을 가지는 데 필요한 LOC 이하로 존재 시 (약 8.7 vol% 이하와 같음) 생산된다. 일정 구현예에서, 이소프렌과 에탄올을 포함하는 조성물은 에탄올의 발화가능한 혼합물을 가지는 데 필요한 LOC 이상으로 존재 시 생산될 때, 에탄올의 농도는 LFL 미만 (약 3.3 vol% 이하와 같음)이다.

다양한 구현예에서, 산화제 (산소와 같음)의 양은 시스템에서의 연료라면 모두의 LOC 미만이다. 다양한 구현예에서, 산화제 (산소와 같음)의 양은 이소프렌 또는 에탄올의 LOC의 약 60, 40, 30, 20, 10, 또는 5% 이하이다. 다양한 구현예에서, 산화제 (산소와 같음)의 양은 이소프렌 또는 에탄올의 LOC보다 적어도 2, 4, 5 이상의 절대 퍼센트 값 (vol%) 더 적다. 상세한 구현예에서, 산소의 양은 이소프렌 또는 에탄올의 LOC보다 (이소프렌의 LOC가 9.5vol%일 때 7.5 vol% 이하의 산소 농도와 같음) 적어도 2의 절대 퍼센트 값 (vol%) 더 적다. 다양한 구현예에서, 연료 (이소프렌 또는 에탄올과 같음)의 양은 해당 연료에 대한 LFL의 약 25, 20, 15, 10, 또는 5% 이하이다.

발효에 의한 휘발성 탄화수소, 이소프렌의 고효율 생산 및 회수

본 명세서에서는, 1) 세포를 이소프렌의 생산에 적합한 조건 하에서 배양하고; 또한 2) 이소프렌을 생산하는 단계를 포함하는 이소프렌을 생산하는 방법이 제공되고, 여기에서, 이소프렌의 액상 농도는 약 200 mg/L이하이다. 일정 구현예에서, 배양액에서의 이소프렌의 액상 농도는 약 175 mg/L, 150 mg/L, 125 mg/L, 100 mg/L, 75 mg/L, 50 mg/L, 25 mg/L, 20 mg/L, 15 mg/L, 10 mg/L, 5 mg/L, 또는 2.5 mg/L 이하이다. 일정 구현예에서, 배양액에서의 이소프렌의 액상 농도는 약 0.1 mg/L 내지 200 mg/L, 1 mg/L 내지 200 mg/L, 1 mg/L 내지 150 mg/L, 1 mg/L 내지 100 mg/L, 1 mg/L 내지 50 mg/L, 1 mg/L 내지 25 mg/L, 1 mg/L 내지 20 mg/L, 또는 10 mg/L 내지 20 mg/L 사이 범위이다. 일정 구현예에서, 생산된 이소프렌은 "대표적인 이소프렌의 생산"이라는 제목으로 된 섹션에서 기재된 농도 또는 양이라면 모두이다. 일정 구현예에서, 액상 농도는 이소프렌의 용해도 한계 미만이다.

본 방법의 일정 구현예에서, 세포는 약 400 nmole/g_wcm/시간 이상의 이소프렌을 생산한다. 일정 구현예에서, 이소프렌량은 약 400 nmole/g_wcm/시간 내지 1 mole/g_wcm/시간, 400 nmole/g_wcm/시간 내지 1 mmole/g_wcm/시간, 400 nmole/g_wcm/시간 내지 40 mmole/g_wcm/시간, 400 nmole/g_wcm/시간 내지 4 mmole/g_wcm/시간, 1 mmole/g_wcm/시간 내지 1.5 mmole/g_wcm/시간, 1.5 mmole/g_wcm/시간 내지 3 mmole/g_wcm/시간, 3 mmole/g_wcm/시간 내지 5 mmole/g_wcm/시간, 5 mmole/g_wcm/시간 내지 25 mmole/g_wcm/시간, 25 mmole/g_wcm/시간 내지100 mmole/g_wcm/시간, 100 mmole/g_wcm/시간 내지 500 mmole/g_wcm/시간, 또는 500 mmole/g_wcm/시간 to 1000 mmole/g_wcm/시간 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 이소프렌량은 약1 mmole/g_wcm/시간, 1.5 mmole/g_wcm/시간, 2 mmole/g_wcm/시간, 3 mmole/g_wcm/시간, 4 mmole/g_wcm/시간, 또는 5 mmole/g_wcm/시간이다.

헨리 계수 (Henry's coefficient)(M atm^-1 단위에서)에 대한 낮은 값은 이소프렌이 낮은 살포율, 예를 들어 0.01 vvm 내지 2 vvm 로 기체 제거 (stripping)에 의해 발효 배지로부터 회수될 수 있는 것을 의미한다. 일정 구현예에서, 기체 살포율은 약0.1 vvm 내지 1 vvm, 0.01 vvm 내지 0.5 vvm, 0.2 vvm 내지 1 vvm, 또는 0.5 vvm 내지 1 vvm이다. 일정 구현예에서, 기체 살포율은 약 0.1 vvm, 0.25 vvm, 0.5 vvm, 0.75 vvm, 1 vvm, 1.25 vvm, 1.5 vvm, 1.75 vvm, 또는 2 vvm이다. 일정 구현예에서, 낮은 기체 살포율은 발효의 전체 진행 과정 동안, 성장기 동안, 또는 안정기 동안 유지된다. 일정 구현예에서, 낮은 기체 살포율은 약 1 시간 내지 5 시간, 5 시간 내지 10 시간, 10 시간 내지 20 시간, 20 시간 내지 30 시간, 30 시간 내지 40 시간, 40 시간 내지 50 시간, 또는 50 시간 내지 60 시간 사이의 범위 동안 유지된다. 더 낮은 바람직한 기체 살포율 한계는 수성상 (aqueous phase)이 이소프렌과 액체 유기상 형태로 포화되는 시점에 의해 정의된다. 이것은 액체 이소프렌 상이 전혀 형성되지 않을 이소프렌의 비등점 (1 기압에서 34.1℃) 미만에서만 일어날 수 있다. 이소프렌의 비등점 미만의 온도에서, 액상의 형성은 이소프렌의 물 용해도에 의해 정의되고, 이는 25℃에서 대략 650 mg/L이다. 이것이 액상 이소프렌의 형성을 피하기 위하여 매우 바람직한 반면, 세포가 독성 효과 없이 액체 이소프렌의 존재를 견뎌낼 수 있는 경우라면 당연히 필요하지 않다.

일정 구현예에서, 산소, CO₂, 및 이소프렌은 "안전한 작동 범위 내의 이소프렌의 생산 방법"이라는 제목으로 된 섹션에서 논의된 양 또는 농도라면 모두이다. 일정 구현예에서, 모든 산소는 호기성 대사를 전적으로 유지하면서 세포에 의해 연소된다. 일정 구현예에서, 산소 첨가는 세포의 산소 요구를 만족시키도록 사용된다. 배출기체에서 산소의 바람직한 범위는 20%이하, 또는 15% 이하 또는 10% (v/v) 이하이다. 상세하게 이소프렌의 연소를 위해 요구되는 (1 기압에서 9.5% v/v) 한계 산소 농도 미만의 산소 수준이 바람직하다. 일정 구현예에서, 산소-풍부 공기는 세포의 산소 요구를 만족시키면서 최소의 기체 제거율을 허용할 목적으로 사용된다. 일정 구현예에서, 제거 기체의 기체상 부분은 약 0.1% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약20%, 또는 약 20% 내지 30% (부피) 산소 사이의 범위를 포함한다. 일정 구현예에서, 이소프렌 발효는 녹아있는 필요한 산소 수준을 액상으로 유지하는 데 요구되는 산소 첨가량을 최소화하도록 높은 압력 하에서 수행된다.

일정 구현예에서, 발효기를 통한 기체 제거율의 감소는 이러한 조건이 배출기체 이소프렌 수준을 약 30,000 ug/L (약 1% v/v)까지 세포의 생리학에 역효과를 주지 않고 높이는 통합된 이소프렌 생산 공정에 유리하다.

일정 구현예에서, 감소된 기체-제거율은 세포의 생리학에 역효과를 유의하게 주지 않는다. 일정 구현예에서, 감소된 기체 제거율을 가지는 배양에서 세포의 이산화탄소 발생율은 약 1 x 10^-18 mmol/L/시간 내지 약 1 mol/L/시간, 1 mmol/L/시간 내지 1 mol/L/시간, 25 mmol/L/시간 내지 750 mmol/L/시간, 25 mmol/L/시간 내지 75 mmol/L/시간, 250 mmol/L/시간 내지 750 mmol/L/시간, 또는 450 mmol/L/시간 내지 550 mmol/L/시간 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 이산화탄소 발생율은 약 50 mmol/L/시간, 100 mmol/L/시간, 150 mmol/L/시간, 200 mmol/L/시간, 250 mmol/L/시간, 300 mmol/L/시간, 350 mmol/L/시간, 400 mmol/L/시간, 450 mmol/L/시간, 또는 500 mmol/L/시간이다. 일정 구현예에서, 감소된 기체-제거율을 가진 세포 생존도는 약 1.75배, 1.5배, 1.25배, 1배, 0.75배, 0.5배, 또는 0.25배 이하로 감소된다. 일정 구현예에서, 감소된 기체-제거율을 가진 세포 생존도는 약 2배로 감소된다. 일정 구현예에서, MVA 경로 및/또는 DXP 경로 핵산의 하나 이상의 이종유래 및/또는 이중 사본으로부터 나온 MVA 경로 및/또는 DXP 경로RNA 및/또는 단백질을 발현하는 세포의 감소된 기체-제거율을 가진 세포 생존도는 MVA 경로 및/또는 DXP 경로 핵산의 하나 이상의 이종유래 및/또는 이중 사본이 결여된 감소된 기체-제거율을 가진 대조군 세포와 대비된다. 일정 구현예에서, MVA 경로 및/또는 DXP 경로 핵산의 하나 이상의 이종유래 및/또는 이중 사본으로부터 나온 MVA 경로 및/또는 DXP 경로RNA 및/또는 단백질을 프로모터가 유도되는, 유도가능한 (inducible) 프로모터 하에서 발현하는 세포의 감소된 기체-제거율을 가진 세포 생존도가 MVA 경로 및/또는 DXP 경로 핵산의 하나 이상의 이종유래 및/또는 이중 사본을 프로모터가 유도되지 않는, 유도가능하지 않는 (uninducible) 프로모터 하에서 포함하는 감소된 기체-제거율을 가진 대조군 세포와 대비된다. 일정 구현예에서, 유도성 프로모터는 베타-갈락토시다제 프로모터 (beta-galactosidase promoter)이다.

일정 구현예에서, 유전적으로 변형된 숙주 생물의 발효는 생물에 의해 연소되는 전체 탄소의 적어도 5%를 휘발성, 불포화 탄화수소로 전환시킨다. 일정 구현예에서, 불포화 탄화수소의 생산은 적어도 약 100 μg/L, 500 μg/L, 1000 μg/L, 2, 500 μg/L, 5,000 μg/L, 7,500 μg/L, 또는 10,000 μg/L의 수준으로 발효 배출기체에 존재하는 정도이다.

일정 구현예에서, 불포화 탄화수소는 높은 생산율에 적합한 방식으로 배출기체 유량으로부터 회수되고, 이는 배출기체에서의 농도, 적어도 약 100 μg/L, 500 μg/L, 1000 μg/L, 2,500 μg/L, 5,000 μg/L, 7,500 μg/L, 또는 10,000 μg/L에 해당한다. 일정 구현예에서, 발효 배출기체로부터 불포화 탄화수소의 추출 및 회수는, 상세하게 낮은 기체 제거율에서는 이로부터 얻은 배출기체는 관심 있는 휘발성 성분이 풍부하다. 일정 구현예에서, 본 방법에 의한 휘발성 탄화수소의 회수는 휘발물질의 증가된 농도에 의존한다. 예를 들어, 압축/농축 또는 추출식 증류 기법의 사용을 통한 발효 배출기체에서 이소프렌의 효율적인 포집을 들 수 있다. 또한 실리카겔 흡착제에 더하여 활성화된 탄소 카트리지의 사용, 탄소 카트리지로부터 이소프렌의 탈착과 농축, 및/또는 약 5% 이상의 포도당 기질을 이소프렌으로 전환시킬 수 있고 약 15,000 μg/L 이상의 배출기체 농도를 가져올 수 있는 대장균 균주와 같은 숙주 생물의 제작과 발효도 고려된다. 회수 방법은 본 명세서에 기술된 방법이라면 모두를 포함한다.

또한 본 명세서에서는 (a) 약 250 M/atm 이하의 헨리의 법칙 계수 및 (b) 약 100 g/L 이하의 물 용해도로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 가지는 화합물을 생산하는 방법이 제공된다. 일정 구현예에서, 방법은 a) 기체가 약 0.01 vvm 내지 약 2.0 vvm 사이의 기체 살포율로 첨가되는 (발효 시스템과 같은 시스템에 기체의 첨가와 같음), 화합물의 생산에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하고; 또한 b) 화합물을 생산하는 단계:를 포함한다.

일정 구현예에서, 세포 질량 내로 배분되는 화합물의 양은 액상 수용성 값에 포함되지 않는다. 일정 구현예에서, 액상 농도는 화합물의 수용성 한계 미만이다.

일정 구현예에서, 화합물은 발효 액체배지로부터 적당 (moderate) 내지 낮은 기체 살포율 (gas sparging rates)로 기체의 비워냄 (gas stripping)에 의해 계속적으로 회수될 수 있고, 상세하게는 이들 화합물은 약 250 M/atm, 200 M/atm, 150 M/atm, 100 M/atm, 75 M/atm, 50 M/atm, 25 M/atm, 10 M/atm, 5 M/atm, 또는 1 M/atm 이하의 헨리의 법칙 계수를 가진다. 예로는 아세트알데하이드 (15 M/atm)와 같은 알데하이드, 아세톤 (30 M/atm) 또는 2-부탄온 (20 M/atm)과 같은 케톤, 또는 메탄올 (220 M/atm), 에탄올 (200 M/atm), 1-부탄올 (120 M/atm) 또는 3-메틸-3-부텐-1-올 및 3-메틸-2-부텐-1올 (50 - 100 M/atm)을 포함하는 C5 알코올을 포함하는 알코올을 포함한다. 알코올의 에스테르, 예를 들어 C5 알코올의 에틸아세테이트 (6 - 9 M/atm) 또는 에틸에스테르 (< 5 M/atm)는 일반적으로 각각의 알코올보다 더 낮은 헨리의 상수를 가진다. 상세하게는 1 M/atm 이하의 헨리의 법칙 계수를 가진 화합물이 바람직하다. 예로는 C1 내지 C5 탄화수소 (예로, 메탄, 에탄, 에틸렌, 또는 프로필렌)와 같은 기타 탄화수소에 더하여 헤미테르펜 (hemiterpenes), 모노테르펜 (monoterpenes), 또는 세스퀴테르펜 (sesquiterpenes)을 포함한다. 일정 구현예에서, C1 내지 C5 탄화수소와 같은 탄화수소는 포화, 불포화, 또는 가지상이다.

일반적으로, 헨리의 법칙 계수 및 물 수용성 간의 상호관련성이 있고, 매우 낮은 계수를 가지는 화합물은 물에 조금 녹는다 (sparingly soluble) (실질적으로는 물에 녹지 않음). 물에서 무한한 수용성을 가지는 휘발성 물질 (예로, 아세톤 또는 에탄올)은 기체 비워냄에 의해 제거될 수 있지만, 바람직한 수용성 한계는 약 100 g/L, 75 g/L, 50 g/L, 25 g/L, 10 g/L, 5 g/L, 또는 1 g/L 이하의 범위이다.

상기 기술된 화합물이라면 모두를 생산하는 방법이라면 모두의 일정 구현예에서, 기체 살포율은 약 0.1 vvm to 1 vvm, 0.2 vvm to 1 vvm, 또는 0.5 vvm 내지 1 vvm 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 기체 살포율은 약 0.1 vvm, 0.25 vvm, 0.5 vvm, 0.75 vvm, 1 vvm, 1.25 vvm, 1.5 vvm, 1.75 vvm, 또는 2 vvm 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 낮은 살포율은 발효 진행의 전 과정 동안, 성장기 동안, 또는 안정기 동안 유지된다. 일정 구현예에서, 낮은 기체 살포율은 1 시간 내지 5 시간, 5 시간 내지 10 시간, 10 시간 내지 20 시간, 20 시간 내지 30 시간, 30 시간 내지 40 시간, 40 시간 내지 50 시간, 또는 50 시간 내지 60 시간 사이의 기간 동안 유지된다.

본 명세서에서 기술된 시스템이라면 모두가 상기 기술된 화합물을 생산하는 방법에 사용될 수 있다. "대표적인 정제 방법"이라는 제목으로 된 섹션에 기술된 것과 같은 표준 방법이 정제하는 데 사용될 것이다. 분리는 회수-이후 (post-recovery), 예를 들어 증류 또는 선택적 흡착 기법에 의해 수행될 수 있다.

대표적인 바이오이소프렌의 생산

일정 구현예에서, 세포는 세포에 의한 이소프렌의 생산을 허용하는 조건 하에 세포 배지에서 배양된다.

"피크 절대 생산도 (peak absolute productivity)"에 의하여, 특정한 기간의 시간 동안 세포를 배양할 때 (예로, 특정한 발효 진행 동안 세포의 배양) 배출-기체에서 이소프렌의 절대적 최대량을 의미한다. "피크 절대 생산도 시점 (peak absolute productivity time point)"에 의하여, 특정한 기간의 시간 동안 세포를 배양할 때 (예로, 특정한 발효 진행 동안 세포의 배양) 배출-기체에서 이소프렌의 절대량이 최대가 되는 발효 동안의 시점을 의미한다. 일정 구현예에서, 이소프렌량은 피크 절대 생산도 시점에서 측정된다. 일정 구현예에서, 세포에 대한 피크 절대 생산도는 본 명세서에서 기재된 이소프렌량이라면 모두의 정도이다.

"피크 특이 생산도 (peak specific productivity)"에 의하여, 특정한 기간의 시간 동안 세포를 배양할 때 (예로, 특정한 발효 진행 동안 세포를 배양함) 세포 당 생산된 이소프렌의 최대량을 의미한다. "피크 특이 생산도 시점 (peak specific productivity time point)"에 의하여, 특정한 기간의 시간 동안 세포를 배양할 때 (예로, 특정한 발효 진행 동안 세포를 배양함) 세포 당 생산된 이소프렌량이 최대가 되는 시점을 의미한다. 피크 특이 생산도는 600 nm에서 광학 밀도 (OD₆₀₀)에 의해 결정된 바와 같이 전체 생산도를 세포량으로 나누어 결정된다. 일정 구현예에서, 이소프렌량은 피크 특이 생산도 시점에서 측정된다. 일정 구현예에서, 세포에 대한 피크 특이 생산도는 본 명세서에서 기재된 시간 당 세포 당 이소프렌량이라면 모두의 정도이다.

"평균 부피측정 생산도 (average volumetric productivity)"에 의하여, 특정한 기간의 시간 동안 세포를 배양할 때 (예로, 특정한 발효 진행 동안 세포를 배양함) 액체배지의 부피 당 (세포 및 세포 배지의 부피를 포함함) 생산된 이소프렌의 최대량을 의미한다. "피크 특이 부피측정 생산도 시점 (peak volumetric productivity time point)"에 의하여, 특정한 기간의 시간 동안 세포를 배양할 때 (예로, 특정한 발효 진행 동안 세포를 배양함) 액체배지의 부피 당 생산된 이소프렌량이 최대가 되는 시점을 의미한다. 피크 특이 부피측정 생산도는 전체 생산도를 액체 배지의 부피 및 시간량으로 나누어 결정된다. 일정 구현예에서, 이소프렌량은 피크 특이 부피측정 생산도 시점에서 측정된다. 일정 구현예에서, 세포에 대한 피크 특이 부피측정 생산도는 본 명세서에서 기재된 시간 당 세포 당 이소프렌량이라면 모두의 정도이다.

"피크 농도 (peak concentration)"에 의하여, 특정한 기간의 시간 동안 세포를 배양할 때 (예로, 특정한 발효 진행 동안 세포를 배양함) 생산된 이소프렌의 최대량을 의미한다. "피크 농도 시점 (peak concentration time point)"에 의하여, 특정한 기간의 시간 동안 세포를 배양할 때 (예로, 특정한 발효 진행 동안 세포를 배양함) 세포 당 생산된 이소프렌량이 최대가 되는 시점이다. 일정 구현예에서, 이소프렌량은 피크 농도 시점에서 측정된다. 일정 구현예에서, 세포에 대한 피크 농도는 본 명세서에서 기재된 이소프렌량이라면 모두의 정도이다.

"평균 부피측정 생산도 (average volumetric productivity)"에 의하여, 특정한 기간의 시간 동안 세포를 배양할 때 (예로, 특정한 발효 진행 동안 세포를 배양함) 액체배지의 부피 당 (세포 및 세포 배지의 부피를 포함함) 생산된 이소프렌의 평균량을 의미한다. 평균 부피측정 생산도는 전체 생산도를 액체 배지의 부피 및 시간량으로 나누어 결정된다. 일정 구현예에서, 세포에 대한 평균 특이 부피측정 생산도는 본 명세서에서 기재된 시간 당 부피 당 이소프렌량이라면 모두의 정도이다.

"전체 누적 생산도 (cumulative total productivity)"에 의하여, 특정한 기간의 시간 동안 세포를 배양할 때 (예로, 특정한 발효 진행 동안 세포를 배양함) 생산된 이소프렌의 누적 전체량을 의미한다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 전체 누적 생산도는 측정된다. 일정 구현예에서, 세포에 대한 전체 누적 생산도는 본 명세서에서 기재된 이소프렌량이라면 모두의 정도이다.

본 명세서에서 사용되는 바, "상대적 검출기 반응 (relative detector response)"은 하나의 화합물 (이소프렌과 같음)에 대한 검출기 반응 (GC/MS 면적과 같음) 내지 하나 이상의 화합물 (모든 C5 탄화수소와 같음)의 검출기 반응 (GC/MS 면적과 같음) 사이의 비율을 말한다. 검출기 반응은, 애질런트(Agilent) HP-5MS GC/MS 컬럼 (30 m x 250 μm; 0.25 μm 필름 두께)이 장착된 애질런트 6890 GC/MS 시스템에 의해 수행된 GC/MS 분석법과 같은 본 명세서에서 기술된 바와 같이 측정될 수 있다. 원하는 경우, 상대적 검출기 반응은 각 화합물의 반응인자를 사용하여 무게 퍼센트로 전환될 수 있다. 본 반응인자는 특정한 화합물의 주어진 양에 대해 생성되는 신호량의 척도이다 (즉, 검출기가 특정 화합물에 대해 민감한 정도). 본 반응인자는 검출기가 비교되는 화합물에 대해 서로 다른 민감도를 가질 때 상대적 검출기 반응을 무게 퍼센트로 전환시키는 교정인자로서 사용될 수 있다. 대안으로, 무게 퍼센트는 반응인자가 비교되는 화합물과 동일한 점을 가정하여 근접될 수 있다. 따라서, 무게 퍼센트는 상대적 검출기 반응과 대략 동일한 것으로 가정될 수 있다.

일정 구현예에서, 배양에서의 세포는 약 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 12,500, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 75,000, 100,000, 125,000, 150,000, 188,000 이상 mole 이소프렌/세포의 습윤 무게에 대한 세포의 그램수/시간 (nmole/g_wcm/시간)으로 이소프렌을 생산한다. 일정 구현예에서, 이소프렌량은 약 2 내지 약 100 nmole/g_wcm/시간, 약 100 내지 약 500 nmole/g_wcm/시간, 약 150 내지 약 500 nmole/g_wcm/시간, 약 500 내지 약 1,000 nmole/g_wcm/시간, 약 1,000 내지 약 2,000 nmole/g_wcm/시간, 약 2,000 내지 약 5,000 nmole/g_wcm/시간, 약 5,000 내지 약 10,000 nmole/g_wcm/시간, 약 10,000 내지 약 50,000 nmole/g_wcm/시간, 약 50,000 내지 약 100,000 nmole/g_wcm/시간, 약 100,000 내지 약 150,000 nmole/g_wcm/시간, 또는 약 150,000 내지 약 200,000 nmole/g_wcm/시간과 같은 약 2 내지 약 200,000 nmole/g_wcm/시간 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 이소프렌량은 약 20 내지 약 5,000 nmole/g_wcm/시간, 약 100 내지 약 5,000 nmole/g_wcm/시간, 약 200 내지 약 2,000 nmole/g_wcm/시간, 약 200 내지 약 1,000 nmole/g_wcm/시간, 약 300 내지 약 1,000 nmole/g_wcm/시간, 약 400 내지 약 1,000 nmole/g_wcm/시간, 약 1,000 내지 약 5,000 nmole/g_wcm/시간, 약 2,000 내지 약 20,000 nmole/g_wcm/시간, 약 5,000 내지 약 50,000 nmole/g_wcm/시간, 약 10,000 내지 약 100,000 nmole/g_wcm/시간, 약 20,000 내지 약 150,000 nmole/g_wcm/시간, 또는 약 20,000 내지 약 200,000 nmole/g_wcm/시간 사이의 범위이다.

이소프렌량은 nmole/g_wcm/시간 단위로 미국 특허 제 US 5,849,970호에 기재된 바와 같이 측정될 수 있고, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 상세하게는 이소프렌 생산의 측정에 관하여 통합되어 있다. 예를 들어, 2 mL의 상부공간 (예로, 밀봉된 바이알에서 32℃에 200 rpm으로 진탕하면서 대략 3 시간 동안 배양된 2 ml의 배양액과 같은 배양액으로부터 나온 상부공간)이 n-옥탄/포라실 C 컬럼 (n-octane/porasil C column; Alltech Associates, Inc., Deerfield, Ill)을 사용하는 등온적으로 작동하고 (85℃) RGD2 머큐릭옥사이드 환원기체 검출기 (Trace Analytical, Menlo Park, CA)과 연결된 시스템과 같은 표준 기체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 이소프렌에 대해 분석된다 (예를 들어, Greenberg et al, Atmos. Environ. 27A: 2689-2692, 1993; Silver et al., Plant Physiol. 97:1588-1591, 1991를 참조하고, 이들은 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 이소프렌 생산의 측정에 관하여 통합되어 있다). 기체 크로마토그래피 면적 단위는 표준 이소프렌 농도 측정 곡선 (calibration curve)을 통해 이소프렌 nmol로 전환된다. 일정 구현예에서, 세포의 습윤 무게에 대한 세포의 그램수는 세포 배양액 시료에 대한 A₆₀₀ 값을 획득한 다음 본 A₆₀₀ 값을 기지의A₆₀₀ 값을 가지는 세포 배양액에 대한 습윤 무게의 측정 곡선에 근거하여 세포의 그램수로 전환시킴에 의해 계산된다. 일정 구현예에서, 세포의 그램은 A₆₀₀ 값 1을 가진 액체배지 일 리터 (세포 배지 및 세포를 포함함)가 1 그램의 습윤 세포 무게를 가지는 것으로 가정하여 평가된다. 또한 본 값은 배양액이 배양되었던 시간, 3시간과 같은 수로 나눈다.

일정 구현예에서, 배양에서의 세포는 약 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 또는 100,000 이상 ng 이소프렌/세포의 습윤 무게에 대한 세포의 그램수/시간 (ng/g_wcm/시간)으로 이소프렌을 생산한다. 일정 구현예에서, 이소프렌량은 약 2 내지 약 100 ng/g_wcm/시간, 약 100 내지 약 500 ng/g_wcm/시간, 약 500 내지 약 1000 ng/g_wcm/시간, 약 1,000 내지 약 2,000 ng/g_wcm/시간, 약 2,000 내지 약 5,000 ng/g_wcm/시간 사이와 같은 약 2 내지 약 5,000 ng/g_wcm/시간 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 이소프렌량은 약 20 내지 약 5,000 ng/g_wcm/시간, 약 100 내지 약 5,000 ng/g_wcm/시간, 약 200 내지 약 2,000 ng/g_wcm/시간, 약 200 내지 약 1,000 ng/g_wcm/시간, 약 300 내지 약 1,000 ng/g_wcm/시간, 또는 약 400 내지 약 1,000 ng/g_wcm/시간 사이의 범위이다. 이소프렌의 ng/g_wcm/시간으로 표현된 양은 상기 논의된 nmole/g_wcm/시간의 단위에서의 이소프렌 생산의 수치를 68.1로 곱하여 계산될 수 있다 (하기 공식 5에서 기술된 바와 같음).

일정 구현예에서, 배양에서 세포는 약 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 50,000, 또는 100,000 이상 mg 이소프렌/액체배지 L (mg/L_액체배지, 여기에서 액체배지의 부피는 세포 및 세포 배지의 부피를 포함함)로 이소프렌의 누적 역가를 생산한다. 일정 구현예에서, 이소프렌량은 약 2 내지 약 100 mg/L _액체배지, 약 100 내지 약 500 mg/L _액체배지, 약 500 내지 약 1,000 mg/L _액체배지, 약 1,000 내지 약 2,000 mg/L _액체배지, 또는 약 2,000 내지 약 5,000 mg/L 액체배지 사이과 같은 약 2 내지 약 5,000 mg/L _액체배지 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 이소프렌량은 약 2 내지 약 5,000 mg/L _액체배지, 약 100 내지 약 5,000 mg/L _액체배지, 약 200 내지 약 2,000 mg/L _액체배지, 약 200 내지 약 1,000 mg/L _액체배지, 약 300 내지 약 1,000 mg/L _액체배지 또는 약 400 내지 약 1,000 mg/L _액체배지 사이의 범위이다.

이소프렌 mg/진탕 플라스크 또는 유사한 배양으로부터 상부공간 L에서의 이소프렌의 특이 생산도는 대략 1의 OD₆₀₀ 값에서 세포 배양액으로부터 1 ml 시료를 얻어 이를 20 mL 바이알에 넣고 30 분 동안 배양한 다음, 상부공간에서의 이소프렌량을 측정하여 측정될 수 있다 (예를 들어, 실시예 1, 제 1부에 기술된 바와 같음). OD₆₀₀ 값이 1.0이 아닌 경우라면, 측정은 OD₆₀₀ 값으로 나누어 OD₆₀₀ 값이 1로 정상화될 수 있다. 이소프렌 mg/상부공간 L의 값은 38의 팩터로 곱하여 mg/L_액체배지/시간/액체배지의 OD₆₀₀으로 전환될 수 있다. mg/L_액체배지/시간/OD₆₀₀ 단위의 수치는 이소프렌 mg/ L_액체배지 단위의 누적 역가를 얻기 위하여 시간 및 OD₆₀₀ 값으로 곱해질 수 있다.

일정 구현예에서, 배양에서의 세포는 약 0.1, 1.0, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1100, 1200, 1300, 1,400, 1,500, 1,600, 1,700, 1,800, 1,900, 2,000, 2,100, 2,200, 2,300, 2,400, 2,500, 2,600, 2,700, 2,800, 2,900, 3,000, 3,100, 3,200, 3,300, 3,400, 또는 3,500 이상 mg 이소프렌/액체배지 L/시간 (mg/L_액체배지/시간, 여기에서 액체배지의 부피는 세포 및 세포 배지의 부피를 포함함)의 이소프렌의 평균 부피측정 생산도를 가진다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 평균 부피측정 생산도는 약 0.1 내지 약 100 mg/L_액체배지/시간, 약 100 내지 약 500 mg/L_액체배지/시간, 약 500 내지 약 1,000 mg/L_액체배지/시간, 약 1,000 내지 약 1,500 mg/L_액체배지/시간, 약 1,500 내지 약 2,000 mg/L_액체배지/시간, 약 2,000 내지 약 2,500 mg/L_액체배지/시간, 약 2,500 내지 약 3,000 mg/L_액체배지/시간, 또는 약 3,000 내지 약 3,500 mg/_액체배지/시간과 같은 약 0.1 내지 약 3,500 mg/L_액체배지/시간 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 평균 부피측정 생산도는 약 10 내지 약 3,500 mg/L_액체배지/시간, 약 100 내지 약 3,500 mg/L_액체배지/시간, 약 200 내지 약 1,000 mg/L_액체배지/시간, 약 200 내지 약 1,500 mg/L_액체배지/시간, 약 1,000 내지 약 3,000 mg/L_액체배지/시간, 또는 약 1,500 내지 약 3,000 mg/L 사이의 범위이다.

일정 구현예에서, 배양에서 세포는 약 0.5, 1.0, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1100, 1200, 1300, 1,400, 1,500, 1,600, 1,700, 1,800, 1,900, 2,000, 2,100, 2,200, 2,300, 2,400, 2,500, 2,600, 2,700, 2,800, 2,900, 3,000, 3,100, 3,200, 3,300, 3,400, 3,500, 3,750, 4,000, 4,250, 4,500, 4,750, 5,000, 5,250, 5,500, 5,750, 6,000, 6,250, 6,500, 6,750, 7,000, 7,250, 7,500, 7,750, 8,000, 8,250, 8,500, 8,750, 9,000, 9,250, 9,500, 9,750, 10,000, 12,500, 또는 15,000 이상 mg 이소프렌/액체배지의 L/시간 (mg/L_액체배지/시간, 여기에서 액체배지의 부피는 세포 및 세포 배지의 부피를 포함함)의 이소프렌의 피크 부피측정 생산도를 가진다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 피크 부피측정 생산도는 약 0.5 내지 약 10 mg/L_액체배지/시간, 약 1.0 내지 약 100 mg/L_액체배지/시간, 약 100 내지 약 500 mg/L_액체배지/시간, 약 500 내지 약 1,000 mg/L_액체배지/시간, 약 1,000 내지 약 1,500 mg/L_액체배지/시간, 약 1,500 내지 약 2,000 mg/L_액체배지/시간, 약 2,000 내지 약 2,500 mg/L_액체배지/시간, 약 2,500 내지 약 3,000 mg/L_액체배지/시간, 약 3,000 내지 약 3,500 mg/L_액체배지/시간, 약 3,500 내지 약 5,000 mg/L_액체배지/시간, 약 5,000 내지 약 7,500 mg/L_액체배지/시간, 약 7,500 내지 약 10,000 mg/L_액체배지/시간, 약 10,000 내지 약 12,500 mg/L_액체배지/시간, 약 12,500 내지 약 15,000 mg/L_액체배지/시간과 같은 약 0.5 내지 약 15,000 mg/L_액체배지/시간 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 피크 부피측정 생산도는 약 10 내지 약 15,000 mg/L_액체배지/시간, 약 100 내지 약 2,500 mg/L_액체배지/시간, 약 1,000 내지 약 5,000 mg/L_액체배지/시간, 약 2,500 내지 약 7,500 mg/L_액체배지/시간, 약 5,000 내지 약 10,000 mg/L_액체배지/시간, 약 7,500 내지 약 12,500 mg/L_액체배지/시간, 또는 약 10,000 내지 약 15,000 mg/L_액체배지/시간 사이의 범위이다.

발효기에서 일시적 이소프렌 생산률 mg/L_액체배지/시간 단위는 발효기 배출-기체의 시료를 수집하고, 예를 들어 실시예 1, 제 II부에 기술된 바와 같이 이를 이소프렌량에 대해 (L_기체 당 이소프렌 mg 단위로) 분석하며, 본 값을 배출-기체가 액체배지의 각 리터를 통과하는 속도 (예로, 1 vvm (공기의 부피/ 액체배지의 부피/분)에서 이것은 시간 당 60 L_gas이다)로 곱하여 측정될 수 있다. 따라서, 1 mg/L_gas 의 배출-기체 수준은 1 vvm의 공기유동에서 60 mg/L_액체배지/시간의 일시적 생산률에 해당한다. 원하는 경우, mg/L_액체배지/시간 단위의 값은 mg/L_액체배지/시간/OD 단위의 특이 생산률을 획득하도록 OD₆₀₀ 값으로 나눌 수 있다. 이소프렌 mg/L_기체의 평균값은 본 평균 배출-기체 이소프렌 농도를 발효과정 동안 발효 배지 리터 당 살포된 배출-기체의 전체량으로 곱하여 전체 산물 생산도 (발효 액체배지 리터 당 이소프렌 그램, mg/L_액체배지)로 전환될 수 있다. 따라서, 1vvm에서 10시간 경과 시 평균 배출-기체 이소프렌 농도 0.5 mg/L_액체배지/시간 는 전체 산물 농도300 mg 이소프렌/L_액체배지 에 해당한다.

일정 구현예에서, 배양에서의 세포는 약 0.0015, 0.002, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.12, 0.14, 0.16, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0, 12.0, 13.0, 14.0, 15.0, 16.0, 17.0, 18.0, 19.0, 20.0, 21.0, 22.0, 23.0, 23.2, 23.4, 23.6, 23.8, 24.0, 25.0, 30.0, 31.0, 32.0, 33.0, 35.0, 37.5, 40.0, 45.0, 47.5, 50.0, 55.0, 60.0, 65.0, 70.0, 75.0, 80.0, 85.0, 또는 90.0 몰라% 이상의 세포 배양 배지에서의 탄소를 이소프렌으로 전환시킨다. 일정 구현예에서, 이소프렌으로 탄소의 전환 퍼센트는 약 0.002 내지 약 0.005%, 약 0.005 내지 약 0.01%, 약 0.01 내지 약 0.05%, 약 0.05 내지 약 0.15%, 약 0.15 내지 약 0.2%, 약 0.2 내지 약 0.3%, 약 0.3 내지 약 0.5%, 약 0.5 내지 약 0.8%, 약 0.8 내지 약 1.0%, 약 1.0 내지 약 1.6%, 약 1.6 내지 약 3.0%, 약 3.0 내지 약 5.0%, 약 5.0 내지 약 8.0%, 약 8.0 내지 약 10.0%, 약 10.0 내지 약 15.0%, 약 15.0 내지 약 20.0%, 약 20.0 내지 약 25.0%, 약 25.0 내지 약 30.0%, 약 30.0 내지 약 35.0%, 약 35.0 내지 약 40.0%, 약 45.0 내지 약 50.0%, 약 50.0 내지 약 55.0%, 약 55.0 내지 약 60.0%, 약 65.0 내지 약 70.0%, 약 70.0 내지 약 75.0%, 약 75.0 내지 약 80.0%, 약 80.0 내지 약 85.0%, 또는 약 85.0 내지 약 90.0%과 같은 약 0.002 내지 약 90.0 몰라% 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 이소프렌으로 탄소의 전환 퍼센트는 약 0.002 내지 약 0.4 몰라%, 약 0.002 내지 약 0.16 몰라%, 약 0.04 내지 약 0.16 몰라%, 약 0.005 내지 약 0.3 몰라%, 약 0.01 내지 약 0.3 몰라%, 약 0.05 내지 약 0.3 몰라%, 약 0.1 내지 약 0.3 몰라%, 약 0.3 내지 약 1.0 몰라%, 약 1.0 내지 약 5.0 몰라%, 약 2 내지 약 5.0 몰라%, 약 5.0 내지 약 10.0 몰라%, 약 7 내지 약 10.0 몰라%, 약 10.0 내지 약 20.0 몰라%, 약 12 내지 약 20.0 몰라%, 약 16 내지 약 20.0 몰라%, 약 18 내지 약 20.0 몰라%, 약 18 내지 약 23.2 몰라%, 약 18 내지 약 23.6 몰라%, 약 18 내지 약 23.8 몰라%, 약 18 내지 약 24 몰라%, 약 18 내지 약 25 몰라%, 약 20 내지 약 30.0 몰라%, 약 30 내지 약 40.0 몰라%, 약 30 내지 약 50.0 몰라%, 약 30 내지 약 60.0 몰라%, 약 30 내지 약 70.0 몰라%, 약 30 내지 약 80.0 몰라%, 또는 약 30 내지 약 90.0 몰라% 사이의 범위이다.

탄소의 이소프렌으로 전환 퍼센트 ("% 탄소 수율 (% carbon yield)"이라고도 약칭됨)는 생산된 이소프렌에서 탄소 몰을 탄소원에서 탄소 몰 (회분식 및 포도당 및 효모추출물 사료첨가-회분식에서 탄소의 몰과 같음)로 나누어서 측정될 수 있다. 본 수치는 퍼센트 값을 주도록 100%를 곱한다 (공식 1에 표시된 바와 같음).

공식 1

% 탄소 수율 = (생산된 이소프렌에서 탄소 몰)/(탄소원에서 탄소 몰) * 100

본 계산을 위해, 효모추출물은 50% w/w 탄소를 포함하는 것으로 가정될 수 있다. 예로서 실시예 7, 제 VIII부에 기술된 500 리터의 경우, 이소프렌으로 탄소의 전환 퍼센트는 공식 2에 나타난 바와 같이 계산될 수 있다.

공식 2

% 탄소 수율 = (39.1 g 이소프렌 * 1/68.1mol/g * 5 C/mol)/[(181221 g 포도당 * 1/180 mol/g * 6 C/mol) + (17780 g 효모추출물 * 0.5 * 1/12 mol/g)] * 100 = 0.042%

본 명세서에서 기술된 두 개의 500 리터 발효의 경우 (실시예 7, 제 VII 부 및 제 VIII부), 이소프렌으로 탄소의 전환 퍼센트는 0.04 - 0.06% 사이의 범위이었다. 0.11-0.16% 탄소 수율은 본 명세서에서 기술된 바와 같이 14리터 시스템을 사용하여 달성되었다. 실시예 11, 제 V부는 이소프렌으로 탄소의 전환이 본 명세서에서 기술된 방법을 사용하여 1.53% 인 것을 기술하고 있다.

당업자라면 이소프렌 생산률 또는 생산된 이소프렌량을 기타 다른 단위로 바로 전환할 수 있다. 대표적인 공식은 단위들 간 상호전환을 위해 하기에 나열된다.

이소프렌 생산률의 단위 (전체 및 특이)

공식 3

1 g 이소프렌/L_액체배지/시간 = 14.7 mmol 이소프렌/L_액체배지/시간 (전체 부피측정률)

공식 4

1 nmol 이소프렌 /g_wcm/시간 = 1 nmol 이소프렌 /L_액체배지/시간/OD₆₀₀

(본 전환은 OD₆₀₀ 값 1을 가진 액체배지 1 리터가 1 그램의 습윤 세포 무게를 가지는 것을 가정한다.)

공식 5

1 nmol 이소프렌/g_wcm/시간 = 68.1 ng 이소프렌/g_wcm/시간

(이소프렌의 분자량이 주어짐)

공식 6

1 nmol 이소프렌/L_gas O₂/시간 = 90 nmol 이소프렌/L_액체배지/시간

(배양 액체배지 리터 당 90 L/시간의 O₂ 유속에서)

공식 7

1 μg 이소프렌/L_기체 배출-기체에서 이소프렌 = L_액체배지 당 60 L_기체의 유속 (1 vvm)에서 60 μg 이소프렌/L_액체배지/시간

역가에 대한 단위 (전체 및 특이)

공식 8

1 nmol 이소프렌/mg 세포 단백질 = 150 nmol 이소프렌/L_액체배지/OD₆₀₀

(본 전환은 OD₆₀₀ 값 1을 가진 액체배지 1 리터가 대략 150 mg의 전체 세포 단백질을 가지는 것으로 가정한다)(특이 생산도)

공식 9

1 g 이소프렌/L _액체배지 = 14.7 mmol 이소프렌/L _액체배지 (전체 역가)

원하는 경우, 공식 10은 세포의 습윤 무게를 포함하는 단위라면 모두를 세포의 건조 무게를 포함하는 해당하는 단위로 전환시키는 데 사용될 수 있다.

공식 10

세포의 건조 무게 = (세포의 습윤 무게)/3.3

원하는 경우, 공식 11은 단위 ppm 및 μg/L 간을 전환하는 데 사용될 수 있다. 상세하게는, "ppm"은 μg/g (w/w)의 표현으로 정의된 백만 당의 부분을 의미한다. 기체의 농도도 역시 μg/L (vol/vol)의 표현으로 정의된 "ppmv"(부피에 의한 백만 당 부분)를 사용하고 부피측정 기초로 하여 표현될 수 있다. ppm (예로, 기체 g 당 분석물의 μg)으로 μg/L의 전환은 배출-기체 L 당 질량 (예로, 기체의 밀도)을 결정하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 표준 온도 및 압력에서 공기의 리터 (STP; 101.3 kPa (1 bar) 및 273.15 K)는 대략 1.29 g/L의 밀도를 가진다. 따라서, 1 ppm (μg/g)의 농도는 STP에서 1.29 μg/L와 동등하다 (공식 11). ppm (μg/g)의 μg/L로 전환은 압력, 온도, 및 배출-기체의 전체 조성 모두의 함수이다.

공식 11

표준 온도와 압력에서 1 ppm (μg/g)은 1.29 mg/L와 동등하다 (STP; 101.3 kPa (1 bar) 및 273.15K).

ppmv (예로, 기체 L 당 분석물 μL)로 μg/L의 전환은 보편적인 기체 법칙 (공식 12)를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 1000 μg/L_gas의 배출-기체 농도는 14.7 mol/L_기체에 해당한다. 보편적인 기체 상수는 0.082057 L.atm K^-1mol^-1이고, 공식 12를 사용하여 STP 에서 14.7 mol의 HG에 의해 채워진 부피는 0.329 mL와 동등하다. 따라서. 1000 μg/L HG의 농도는 STP 에서 329 ppmv 또는 0.0329% (v/v)와 동등하다.

공식 12

PV = nRT, 여기에서 "P"는 압력이고, "V"는 부피이며, "n"은 기체의 몰수, "R"은 보편적인 기체 상수이고 또한 "K"는 켈빈 온도이다.

이소프렌 조성물에 있는 불순물의 양은 μg/L 과 같은 단위로 부피 당 무게 (w/v)를 기초로 하여 전형적으로 본 명세서에서 측정된다. 원하는 경우, μg/L 단위로의 측정은 공식 13을 사용하여 mg/m³ 단위로 전환될 수 있다.

공식 13

1 ug/L = 1 mg/m³

본 명세서에서 기술되는 일정 구현예에서, 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산을 포함하는 세포는 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산은 없이 필수적으로 동일한 조건 하에서 성장한 해당하는 세포로부터 생산된 이소프렌량보다 적어도 약 2배, 3배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 150배, 200배, 400배 이상의 이소프렌량을 생산한다.

본 명세서에서 기술되는 일정 구현예에서, 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산 또한 DXS, IDI, 및/또는 MVA 경로 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 이종유래 핵산을 포함하는 세포는 이종유래 핵산은 없이 필수적으로 동일한 조건 하에서 성장한 해당하는 세포로부터 생산된 이소프렌량보다 적어도 약 2배, 3배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 150배, 200배, 400배 이상의 이소프렌량을 생산한다.

일정 구현예에서, 이소프렌 조성물은 조성물 내의 모든 C5 탄화수소의 전체 무게와 대비한 무게로 약 99.90, 99.92, 99.94, 99.96, 99.98, 또는 100% 이상의 이소프렌을 포함한다. 일정 구현예에서, 조성물은 조성물 내의 모든 C5 탄화수소에 대한 검출기 반응과 대비하여 이소프렌에 대해 약 99.90, 99.91, 99.92, 99.93, 99.94, 99.95, 99.96, 99.97, 99.98, 99.99, 또는 100% 이상의 상대적 검출기 반응을 가진다. 일정 구현예에서, 이소프렌 조성물은 조성물 내의 모든 C5 탄화수소의 전체 무게와 대비한 무게로 약 99.90 내지 약 99.92, 약 99.92 내지 약 99.94, 약 99.94 내지 약 99.96, 약 99.96 내지 약 99.98, 약 99.98 내지 약 100% 사이 범위의 이소프렌을 포함한다.

일정 구현예에서, 이소프렌 조성물은 조성물 내의 모든 C5 탄화수소의 전체 무게와 대비한 무게로 약 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005, 또는 0.00001% 이하의 이소프렌이 아닌 C5 탄화수소 (1,3-사이클로펜타디엔, cis-1,3-펜타디엔, trans-1,3-펜타디엔, 1,4-펜타디엔, 1-펜틴, 2-펜틴, 1-펜틴, 2-메틸-1-부텐, 3-메틸-l-부틴, 펜트-4-엔-1-인, trans-펜트-3-엔-1-인, 또는 cis-펜트-3-엔-1-인과 같음)를 포함한다. 일정 구현예에서, 조성물은 조성물 내의 모든 C5 탄화수소에 대한 검출기 반응과 대비하여 이소프렌이 아닌 C5 탄화수소에 대해 약 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005, 또는 0.00001% 이하의 상대적 검출기 반응을 가진다. 일정 구현예에서, 조성물은 조성물 내의 모든 C5 탄화수소에 대한 검출기 반응과 대비하여 이소프렌이 아닌 C5 탄화수소에 대해 약 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005, 또는 0.00001% 이하의 상대적 검출기 반응을 가진다. 일정 구현예에서, 조성물은 조성물 내의 모든 C5 탄화수소에 대한 검출기 반응과 대비하여 1,3-사이클로펜타디엔, cis-1,3-펜타디엔, trans-1,3-펜타디엔, 1,4-펜타디엔, 1-펜틴, 2-펜틴, 1-펜틴, 2-메틸-1-부텐, 3-메틸-l-부틴, 펜트-4-엔-1-인, trans-펜트-3-엔-1-인, 또는 cis-펜트-3-엔-1-인에 대해 약 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005, 또는 0.00001% 이하의 상대적 검출기 반응을 가진다. 일정 구현예에서, 이소프렌 조성물은 조성물 내의 모든 C5 탄화수소의 전체 무게와 대비한 무게로 약 0.02 내지 약 0.04%, 약 0.04 내지 약 0.06%, 약 0.06 내지 약 0.08%, 약 0.08 내지 약 0.10%, 또는 약 0.10 내지 약 0.12% 사이 범위의 이소프렌이 아닌 C5 탄화수소 (1,3-사이클로펜타디엔, cis-1,3-펜타디엔, trans-1,3-펜타디엔, 1,4-펜타디엔, 1-펜틴, 2-펜틴, 1-펜틴, 2-메틸-1-부텐, 3-메틸-l-부틴, 펜트-4-엔-1-인, trans-펜트-3-엔-1-인, 또는 cis-펜트-3-엔-1-인과 같음)를 포함한다.

일정 구현예에서, 이소프렌 조성물은 이소프렌의 다중합을 저해하는 조성물에 있는 화합물이라면 모두에 대해 약 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 또는0.005 μg/L 이하의 이소프렌의 다중합을 저해하는 화합물을 포함한다. 일정 구현예에서, 이소프렌 조성물은 이소프렌의 다중합을 저해하는 조성물에 있는 화합물이라면 모두에 대해 약 0.01 내지 약 10, 약 0.01 내지 약 5, 약 0.01 내지 약 1, 약 0.01 내지 약 0.5, 약 0.01 내지 약 0.005와 같은 약 0.005 내지 약 50 μg/L 사이 범위의 이소프렌의 다중합을 저해하는 화합물을 포함한다. 일정 구현예에서, 이소프렌 조성물은 약 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 또는0.005 μg/L 이하의 이소프렌이 아닌 탄화수소 (1,3-사이클로펜타디엔, cis-1,3-펜타디엔, trans-1,3-펜타디엔, 1,4-펜타디엔, 1-펜틴, 2-펜틴, 1-펜틴, 2-메틸-1-부텐, 3-메틸-l-부틴, 펜트-4-엔-1-인, trans-펜트-3-엔-1-인, 또는 cis-펜트-3-엔-1-인과 같음)를 포함한다. 일정 구현예에서, 이소프렌 조성물은 약 0.01 내지 약 10, 약 0.01 내지 약 5, 약 0.01 내지 약 1, 약 0.01 내지 약 0.5, 약 0.01 내지 약 0.005와 같은 약 0.005 내지 약 50 μg/L 사이 범위의 이소프렌이 아닌 탄화수소 (1,3-사이클로펜타디엔, cis-1,3-펜타디엔, trans-1,3-펜타디엔, 1,4-펜타디엔, 1-펜틴, 2-펜틴, 1-펜틴, 2-메틸-1-부텐, 3-메틸-l-부틴, 펜트-4-엔-1-인, trans-펜트-3-엔-1-인, 또는 cis-펜트-3-엔-1-인과 같음)를 포함한다. 일정 구현예에서, 이소프렌 조성물은 약 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 또는 0.005 μg/L 이하의 단백질 또는 지방산 (자연적으로 천연 고무와 관련된 단백질 또는 지방과 같음)을 포함한다.

일정 구현예에서, 이소프렌 조성물은 약 10, 5, 1, 0.8, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 또는 0.005 ppm 이하의 알파 아세틸렌, 피페릴렌, 아세토니트릴, 또는 1,3-사이클로펜타디엔을 포함한다. 일정 구현예에서, 이소프렌 조성물은 약 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 또는 0.005 ppm 이하의 황 또는 알렌 (allenes)을 포함한다. 일정 구현예에서, 이소프렌 조성물은 약 30, 20, 15, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 또는 0.005 ppm 이하의 모든 아세틸렌 (1-펜틴, 2-펜틴, 3-메틸-l-부틴, 펜트-4-엔-1-인, trans-펜트-3-엔-1-인, 및 cis-펜트-3-엔-1-인과 같음)을 포함한다. 일정 구현예에서, 이소프렌 조성물은 약 2000, 1000, 500, 200, 100, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 또는 0.005 ppm 이하의 사이클릭 이소프렌 이중체 (dimers) (예로, 두 개의 이소프렌 단위의 이중합으로부터 유래한 사이클릭 C10 화합물)과 같은 이소프렌 이중체를 포함한다.

일정 구현예에서, 이소프렌 조성물은 에탄올, 아세톤, C5 프레닐 알코올 (3-메틸-3-부텐-1-올, 또는 3-메틸-2-부텐-1-올과 같음), 또는 상기의 둘 이상이라면 모두를 포함한다. 상세한 구현예에서, 이소프렌 조성물은 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100, 또는 120 μg/L 이상의 에탄올, 아세톤, C5 프레닐 알코올 (3-메틸-3-부텐-1-올, 또는 3-메틸-2-부텐-1-올과 같음), 또는 상기의 둘 이상이라면 모두를 포함한다. 일정 구현예에서, 이소프렌 조성물은 약 0.01 내지 약 80, 약 0.01 내지 약 60, 약 0.01 내지 약 40, 약 0.01 내지 약 30, 약 0.01 내지 약 20, 약 0.01 내지 약 10, 약 0.1 내지 약 80, 약 0.1 내지 약 60, 약 0.1 내지 약 40, 약 5 내지 약 80, 약 5 내지 약 60, 또는 약 5 내지 약 40과 같은 약 0.005 내지 약 120 μg/L사이 범위의 에탄올, 아세톤, C5 프레닐 알코올 또는 상기 둘 이상이라면 모두를 포함한다.

일정 구현예에서, 이소프렌 조성물은 다음의 성분의 하나 이상을 포함한다: 2-헵탄온, 6-메틸-5-헵텐-2-온, 2,4,5-트리메틸피리딘, 2,3,5-트리메틸피라진, 시트로넬랄 (citronellal), 아세트알데하이드, 메탄티올, 메틸 아세테이트, 1-프로판올, 디아세틸, 2-부탄온, 2-메틸-3-부텐-2-올, 에틸 아세테이트, 2-메틸-1-프로판올, 3-메틸-1-부탄알, 3-메틸-2-부탄온, 1-부탄올, 2-펜탄온, 3-메틸-1-부탄올, 에틸 이소부틸레이트, 3-메틸-2-부텐알, 부틸 아세테이트, 3-메틸부틸 아세테이트, 3-메틸-3-부텐-1-일 아세테이트, 3-메틸-2-부텐-1-일 아세테이트, 3-헥센-1-올, 3-헥센-1-일 아세테이트, 리모넨, 게라니올 (트랜스-3,7-디메틸-2-부텐-1-일 아세테이트), 시트로넬롤 (3,7-디메틸-6-옥텐-1-올), (E)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔, (Z)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔, 2,3-사이클로헵텐올피리딘, 또는 직선상 이소프렌 중합체 (복수의 이소프렌 단위의 다중합으로부터 유래한 직선상 이소프렌 이중체 또는 직선상 이소프렌 삼중체와 같음). 다양한 구현예에서, 무게에 의한 퍼센트 단위로 이소프렌량에 상대적인 이들 성분 하나의 양 (예로, 이소프렌의 무게로 나눈 성분의 무게 곱하기 100)은 약 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 110% (w/w) 이상이다. 일정 구현예에서, 두 번째 성분에 대한 상대적인 검출기 반응은 이소프렌에 대한 검출기 반응과 대비하여 약 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 110% (w/w) 이상이다. 다양한 구현예에서, 무게에 의한 퍼센트 단위로 이소프렌량에 상대적인 이들 성분 하나의 양 (예로, 이소프렌의 무게로 나눈 성분의 무게 곱하기 100)은 약 0.01 내지 약 90, 약 0.01 내지 약 80, 약 0.01 내지 약 50, 약 0.01 내지 약 20, 약 0.01 내지 약 10, 약 0.02 내지 약 50, 약 0.05 내지 약 50, 약 0.1 내지 약 50, 또는 약 0.1 내지 약 20% (w/w)와 같은 약 0.01 내지 약 105% 사이의 범위이다.

일정 구현예에서, 이소프렌 조성물은 하기의 하나 이상을 포함한다: 알코올, 알데하이드, 또는 케톤 (본 명세서에서 기술된 알코올, 알데하이드, 또는 케톤이라면 모두와 같음). 일정 구현예에서, 이소프렌 조성물은 (i) 알코올 및 알데하이드, (ii) 알코올 및 케톤, (iii) 알데하이드 및 케톤, 또는 (iv) 알코올, 알데하이드, 및 케톤을 포함한다.

일정 구현예에서, 이소프렌 조성물은 다음의 하나 이상을 포함한다: 메탄올, 아세트알데하이드, 에탄올, 메탄티올, 1-부탄올, 3-메틸-1-프로판올, 아세톤, 아세트산, 2-부탄온, 2-메틸-1-부탄올, 또는 인돌. 일정 구현예에서, 이소프렌 조성물은 1 ppm 이상의 다음의 하나 이상을 포함한다: 메탄올, 아세트알데하이드, 에탄올, 메탄티올, 1-부탄올, 3-메틸-1-프로판올, 아세톤, 아세트산, 2-부탄온, 2-메틸-1-부탄올, 또는 인돌. 일정 구현예에서, 이소프렌 조성물 (정제되기 이전의 배출-기체와 같음)에 있는 다음의 하나 이상, 메탄올, 아세트알데하이드, 에탄올, 메탄티올, 1-부탄올, 3-메틸-1-프로판올, 아세톤, 아세트산, 2-부탄온, 2-메틸-1-부탄올, 또는 인돌:의 농도는 약 1 내지 약 10,000 ppm 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 이소프렌 조성물 (하나 이상의 정제 단계를 거친 이후의 배출-기체와 같음)은 다음의 하나 이상, 메탄올, 아세트알데하이드, 에탄올, 메탄티올, 1-부탄올, 3-메틸-1-프로판올, 아세톤, 아세트산, 2-부탄온, 2-메틸-1-부탄올, 또는 인돌:을 약 1 내지 약 10 ppm, 약 10 내지 약 20 ppm, 약 20 내지 약 30 ppm, 약 30 내지 약 40 ppm, 약 40 내지 약 50 ppm, 약 50 내지 약 60 ppm, 약 60 내지 약 70 ppm, 약 70 내지 약 80 ppm, 약 80 내지 약 90 ppm, 또는 약 90 내지 약 100 ppm과 같은 약 1 내지 약 100 ppm 사이 범위의 농도로 포함한다. 세포 배양액으로부터 나온 휘발성 유기 화합물 (세포 배양액의 상부공간에 있는 휘발성 유기 화합물과 같음)은 본 명세서에서 기술된 것과 같은 표준 방법 또는 양성자 전달 반응-질량 분광측정법 (proton transfer reaction-mass spectrometry)과 같은 기타 표준 방법 (예를 들어, Bunge et al., Applied and Environmental Microbiology, 74(7):2179-2186, 2008를 참조하고, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 휘발성 유기 화합물의 분석에 관하여 통합되어 있다)을 사용하여 분석될 수 있다.

일정 구현예에서, 조성물은 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 mg 이상의 이소프렌과 같은 약 2 mg 이상의 이소프렌을 포함한다. 일정 구현예에서, 조성물은 약 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 g 이상의 이소프렌을 포함한다. 일정 구현예에서, 조성물에 있는 이소프렌량은 약 2 내지 약 100 mg, 약 100 내지 약 500 mg, 약 500 내지 약 1,000 mg, 약 1,000 내지 약 2,000 mg, 또는 약 2,000 내지 약 5,000 mg과 같은 약 2 내지 약 5,000 mg 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 조성물에 있는 이소프렌량은 약 20 내지 약 5,000 mg, 약 100 내지 약 5,000 mg, 약 200 내지 약 2,000 mg, 약 200 내지 약 1,000 mg, 약 300 내지 약 1,000 mg, 또는 약 400 내지 약 1,000 mg 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 휘발성 유기 분획의 무게로 약 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 95% 이상이 이소프렌이다.

일정 구현예에서, 조성물은 에탄올을 포함한다. 일정 구현예에서, 조성물은 에탄올을 무게로 약 75 내지 약 80%, 약 80 내지 약 85%, 약 85 내지 약 90% 사이와 같은 에탄올을 무게 약 75 내지 약 90% 사이 범위로 포함한다. 조성물이 에탄올을 포함하는 일정 구현예에서, 조성물은 또한 이소프렌을 무게로 약 4 내지 약 8%, 약 8 내지 약 12%, 약 12 내지 약 15% 사이와 같은 에탄올을 무게 약 4 내지 약 15% 사이의 범위로 포함한다.

본 명세서에서 기술된 일정 구현예에서, 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드, DXS 폴리펩타이드, IDI 폴리펩타이드, 및/또는 MVA 경로 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 이종유래 핵산을 포함하는 세포는 이소프레노이드 화합물 (하나 이상의 DMAPP 분자와 하나 이상의 IPP 분자의 반응으로부터 형성되고 10개 이상의 탄소 원자를 가진 화합물과 같음)을 하나 이상의 이종유래 핵산은 없지만 필수적으로 동일한 조건 하에서 성장한 해당하는 세포로부터 생산된 이소프레노이드 화합물의 양보다 약 2배, 3배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 150배, 200배, 또는 400배 이상의 양으로 생산한다. 본 명세서에서 기술된 일정 구현예에서, 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드, DXS 폴리펩타이드, IDI 폴리펩타이드, 및/또는 MVA 경로 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 이종유래 핵산을 포함하는 세포는 C5 프레닐 알코올 (3-메틸-3-부텐-1-올 또는 3-메틸-2-부텐-1-올과 같음)을 하나 이상의 이종유래 핵산은 없지만 필수적으로 동일한 조건 하에서 성장한 해당하는 세포로부터 생산된 C5 프레닐 알코올의 양보다 약 2배, 3배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 150배, 200배, 또는 400배 이상의 양으로 생산한다.

대표적인 바이오이소프렌 및 수소의 공동-생산

일정 구현예에서, 프로모터에 작동적으로 연결된 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드, DXS 폴리펩타이드, IDI 폴리펩타이드, 및/또는 MVA 경로 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 이종유래 핵산을 포함하는 본 명세서에서 기술된 이소프렌-생산하는 세포라면 모두가 좀 더 나아가 하나 이상의 수소화효소 폴리펩타이드 또는 수소화효소 폴리펩타이드의 조절 및 발현에 관여하는 하나 이상의 폴리펩타이드(예로, 수소화효소 성숙 단백질 또는 전사인자)를 인코딩하고 프로모터에도 역시 작동적으로 연결된 이종유래 핵산을 포함한다. 일정 구현예에서, 프로모터에 작동적으로 연결된 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드, DXS 폴리펩타이드, IDI 폴리펩타이드, MVA 경로 폴리펩타이드, 하나 이상의 수소화효소 폴리펩타이드 또는 수소화효소 폴리펩타이드의 조절 및 발현에 관여하는 하나 이상의 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 이종유래 핵산을 포함하는 본 명세서에서 기술된 이소프렌-생산하는 세포라면 모두가 좀 더 나아가 발효 부산물의 생산에 관여하는 하나 이상의 폴리펩타이드, 발효 부산물의 생산을 위한 유전자의 조절 또는 발현에 관여하는 하나 이상의 폴리펩타이드, 또는 수소 재흡수에 관여하는 하나 이상의 폴리펩타이드를 불활성화하는 돌연변이 또는 결실을 포함한다. 이러한 세포는 이소프렌과 수소를 공동-생산할 수 있다.

본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 세포는 그램-양성 박테리아 세포와 같은 박테리아 세포이다 (예로, 바실러스 섭틸리스와 같은 바실러스 세포, 또는 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans), 스트렙토마이세스 실리컬러 (Streptomyces coelicolor), 또는 스트렙토마이세스 그리서스 (Streptomyces griseus) 세포와 같은 스트렙토마이세스 세포). 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 세포는 그램-음성 박테리아 세포이다 (예로, 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) 세포와 같은 에스케리키아 (Escherichia) 세포, 로도슈도모나스 팔루스트리스 세포와 같은 로도모나스 종 세포, 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens) 세포 또는 슈도모나스 푸티다 세포와 같은 슈도모나스 종 세포, 또는 판토에아 시트레아 세포와 같은 판토에아 세포). 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 세포는 필라멘트성 곰팡이 세포와 같은 곰팡이 세포 (예로, 트리코더마 리세이 세포와 같은 트리코더마 세포 또는 아스퍼질러스 오리자이 (Aspergillus oryzae) 및 아스퍼질러스 니거 (Aspergillus niger)와 같은 아스퍼질러스 세포) 또는 효모 세포 (예로, 야로위야 리포리티카 (Yarrowia lipolytica)와 같은 야로위야 세포 또는 사카로마이세스 세레비시애와 같은 사카로마이세스 세포)이다.

본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드는 푸엘라리아 (Pueraria) (예로, 푸엘라리아 몬타나 (Pueraria montana) 또는 푸엘라리아 로바타 (Pueraria lobata)) 또는 포풀러스 (Populus) (예로, 포풀러스 트레물로이데스 (Populus tremuloides), 포풀러스 알바 (Populus alba), 포풀러스 니그라 (Populus nigra), 포풀러스 트리코카르파 (Populus trichocarpa), 또는 하이브리드 포풀러스 알바 x 포풀러스 트레물라 (Populus alba x Populus tremula))로부터 나온 폴리펩타이드이다.

본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 세포는 좀 더 나아가 IDI 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산을 포함한다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 세포는 좀 더 나아가 IDI 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산의 사본의 삽입을 포함한다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 세포는 좀 더 나아가 DXS 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산을 포함한다. 본 발명의 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 세포는 좀 더 나아가 DXS 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산 사본의 삽입을 포함한다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 세포는 좀 더 나아가 IDI 폴리펩타이드 및 DXS 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함한다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 하나의 핵산은 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드, IDI 폴리펩타이드, 및 DXS 폴리펩타이드를 인코드한다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 하나의 벡터는 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드, IDI 폴리펩타이드, 및 DXS 폴리펩타이드를 인코드한다. 일정 구현예에서, 벡터는 항생제 저항성 핵산과 같은 선별 마커 (selective marker) 또는 선별가능한 (selectable marker) 마커를 포함한다.

본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 세포는 좀 더 나아가 MVA 경로 폴리펩타이드 (사카로마이세스 세레비시애 또는 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis)로부터 나온 MVA 경로 폴리펩타이드)를 인코딩하는 이종유래 핵산을 포함한다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 세포는 좀 더 나아가 MVA 경로 폴리펩타이드 (사카로마이세스 세레비시애 또는 엔테로코커스 페칼리스로부터 나온 MVA경로 폴리펩타이드)를 인코딩하는 이종유래 핵산 사본의 삽입을 포함한다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 세포는 이소프렌 합성효소, DXS, 및 MVA 경로 핵산을 포함한다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 세포는 이소프렌 합성효소 핵산, DXS 핵산, IDI 핵산 및 MVA 경로 핵산을 포함한다.

일정 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 이소프렌-생산하는 세포는 좀 더 나아가 프로모터에 작동적으로 연결된 수소화효소 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산을 포함한다. 일정 구현예에서, 수소화효소 폴리펩타이드는 E. coli 수소화효소-1 (Hyd-1), E. coli 수소화효소-2 (Hyd-2), E. coli 수소화효소-3 (Hyd-3), E. coli 수소화효소-4 (Hyd-4), 산성 pH의 혐기성 조건 하에서 포르메이트와 CO₂ 로부터 수소 기체를 생산하는 E. coli 포르메이트수소 용해효소 (formate hydrogen lyase, FHL) 복합체, 로도코커스 오파쿠스 (Rhodococcus opacus) MR11 수소화효소 (R. opacus HoxH), 시네코시스티스 종 (Synechosystis sp.) PCC 6803 수소화효소 (Syn. PCC 6803 HoxH), 디설포비브리오 기가스 (Desulfovibrio gigas) 수소화효소 (D. gigas), 및 디설포비브리오 디설퓨리칸스 (Desulfovibrio desulfuricans) ATCC 7757 (D. desulfuricans) 수소화효소를 포함한다. 일정 구현예에서, 프로모터에 작동적으로 연결된 수소화효소 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산을 좀 더 나아가 포함하는 이소프렌-생산하는 세포는 좀 더 나아가 E. coli 수소화효소 -3 (Hyd-3), E. coli 피루베이트 포르메이트 용해효소 (pyruvate formate lyase, pfl), 및 E. coli 포르메이트 수소 용해효소 (FHL) 복합체를 포함한다.

일정 구현예에서, 수소화효소 폴리펩타이드는 페로레독신-의존성 수소화효소 폴리펩타이드를 인코드한다. 일정 구현예에서, 페로레독신-의존성 수소화효소 폴리펩타이드는 크로스트리듐 아세토부툴리쿰 수소화효소 A (HydA)를 포함하고, 이는 하기 하나 이상의 (1) 바실러스 섭틸리스 NADPH 페로레독신 산화환원효소 (NFOR), 크로스트리듐 클루이베리 NADH 페로레독신 산화환원효소 (RnfCDGEAB), 또는 클로스트리듐 파스퇴라니움 페로레독신 산화환원효소 (Fdx); (2) 글리세르알데하이드-6-포스페이트 페로레독신 산화환원효소 (GAPOR); 또는 (3) 피루베이트 페로레독신 산화환원효소 (POR):와 결합하여 발현될 수 있다. 일정 구현예에서, 페로레독신-의존성 수소화효소 폴리펩타이드 크로스트리듐 아세토부툴리쿰 수소화효소 A (HydA)는 세 가지의 HydA-관련 성숙 효소 (HydE, HydG, 및 HydF)와 함께 발현되고, 좀 더 나아가 하나 이상의: (1) 바실러스 섭틸리스 NADPH 페로레독신 산화환원효소 (NFOR), 크로스트리듐 클루이베리 NADH 페로레독신 산화환원효소 (RnfCDGEAB), 또는 크로스트리듐 파스퇴라니움 페로레독신 산화환원효소 (Fdx); (2) 글리세르알데하이드-6-포스페이트 페로레독신 산화환원효소 (GAPOR); 또는 (3) 피루베이트 페로레독신 산화환원효소 (POR):와 결합하여 발현된다.

일정 구현예에서, 수소화효소 폴리펩타이드는 NADPH-의존성 수소화효소 폴리펩타이드를 인코드한다. 일정 구현예에서, NADPH-의존성 수소화효소 폴리펩타이드는 파이로코커스 푸리오서스 (Pyrococcus furiosus) 수소화효소를 포함한다. 일정 구현예에서, 수소화효소 폴리펩타이드는 산소-내성 수소화효소를 인코드한다. 일정 구현예에서, 산소-내성 수소화효소는 루브리비박스 젤라티노서스 (Rubrivivax gelatinosus) 수소화효소 및 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha) 수소화효소를 포함한다.

일정 구현예에서, 본 명세서에 기술된 이소프렌-생산하는 세포는 좀 더 나아가 철-황 복합체 전사인자 (iscR) 와 같은 수소화효소 활성의 조절에 관여하는 유전자를 불활성화하는 돌연변이 또는 결실을 포함한다 (Kalim-Akhtar et al., "Deletion of iscR stimulates recombinant Clostridial Fe/Fe hydrogenase activity and H₂-accumulation in Escherichia coli BL21(DE3)," Appl. Microbiol. Biotechnol. 78:853-862 (2008), 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 상세하게는 iscR 유전자의 결실에 의한 대장균에서 크로스트리디아 Fe/Fe 수소화효소 활성의 촉진 및 수소 축적에 관하여 통합되어 있다).

일정 구현예에서, 본 명세서에 기술된 이소프렌-생산하는 세포는 좀 더 나아가 락테이트, 아세테이트, 피루베이트, 에탄올, 숙시네이트, 및 글리세롤과 같은 발효 부산물의 생산에 관여하는 하나 이상의 세포성 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자를 불활성화하는 돌연변이 또는 결실을 포함한다. 일정 구현예에서, 발효 부산물의 생산에 관여하는 불활성화된 폴리펩타이드는 포르메이트 탈수소화효소 N, 알파 소단위 (fdnG), 포르메이트 탈수소화효소 O, 큰 소단위 (fdoG), 나이트레이트 환원효소 (narG), 포르메이트 전달자 A (formate transporter A, focA), 포르메이트 전달자 B (focB), 피루베이트 산화효소 (poxB), 피루베이트 탈수소화효소 E1 성분 ackA/pta (aceE), 알코올 탈수소화효소 (adhE), 푸마레이트 환원효소 막 단백질 (frdC), 또는 락테이트 탈수소화효소 (ldhA)를 인코딩하는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함한다.

일정 구현예에서, 본 명세서에 기술된 이소프렌-생산하는 세포는 좀 더 나아가 발효 부산물의 생산에 관여하는 유전자의 조절 또는 발현에 관여하는 하나 이상의 세포성 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자를 불활성화하는 돌연변이 또는 결실을 포함한다. 일정 구현예에서, 발효 부산물의 생산에 관여하는 유전자의 조절 또는 발현에 관여하는 불활성화된 폴리펩타이드는 포르메이트 수소 용해효소 (hycA)의 억제인자 (repressor), 푸마레이트 환원효소 조절인자 (fumarate reductase regulator, fnr), 아세틸-코엔자임 A 합성효소 (acs), 및 포르메이트 탈수소화효소 조절 단백질 (hycA)를 포함한다.

일정 구현예에서, 본 명세서에 기술된 이소프렌-생산하는 세포는 좀 더 나아가 수소 재흡수에 관여하는 하나 이상의 세포성 폴리펩타이드를 인코딩하는 유전자를 불활성화하는 돌연변이 또는 결실을 포함한다. 일정 구현예에서, 수소 재흡수에 관여하는 불활성화된 폴리펩타이드는 E. coli 수소화효소-1 (Hyd-1) (hya 오페론) 및 E. coli 수소화효소-2 (Hyd-2) (hyb 오페론)를 포함한다.

본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 이종유래 이소프렌 합성효소, DXS폴리펩타이드, IDI 폴리펩타이드, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 또는 전사인자 폴리펩타이드 또는 핵산은, 중간 또는 높은 사본수 플라스미드에 포함되는 T7 프로모터와 같은 T7 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 이종유래 이소프렌 합성효소, DXS폴리펩타이드, IDI 폴리펩타이드, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 또는 전사인자 핵산은, 중간 또는 높은 사본수 플라스미드에 포함되는 Trc 프로모터와 같은 Trc 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 이종유래 이소프렌 합성효소, DXS폴리펩타이드, IDI 폴리펩타이드, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 또는 전사인자 핵산은, 낮은 사본수 플라스미드에 포함되는 Lac 프로모터와 같은 Lac 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 이종유래 이소프렌 합성효소, DXS폴리펩타이드, IDI 폴리펩타이드, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 또는 전사인자 핵산은, 내재성 알칼라인 세린 프로테아제 프로모터와 같은 내재성 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 이종유래 이소프렌 합성효소, DXS폴리펩타이드, IDI 폴리펩타이드, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 또는 전사인자 핵산은 선별 마커가 없거나 선별가능한 마커가 없는 세포의 염색체 내로 도입된다.

일정 구현예에서, 하나 이상의 MVA 경로, IDI, DXS, 이소프렌 합성효소, 수소화효소, 수소화효소 성숙 또는 전사인자 핵산은 성장기보다는 안정기에 활성이 더 큰 프로모터 또는 인자의 조절 하에 놓인다. 예를 들어, 하나 이상의 MVA 경로, IDI, DXS, 이소프렌 합성효소, 수소화효소, 수소화효소 성숙 또는 전사인자 핵산은 RopS와 같은 안정기 시그마인자 (stationary phase sigma factor)의 조절 하에 놓인다. 일정 구현예에서, 하나 이상의 MVA 경로, IDI, DXS, 이소프렌 합성효소, 수소화효소, 수소화효소 성숙 또는 전사인자 핵산은 안정기에 활성이 있는 반응 조절인자에 의해 유도가능한 프로모터와 같은, 안정기에 유도가능한 프로모터의 조절 하에 놓인다.

본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 적어도 세포의 일정 부분은 이종유래 이소프렌 합성효소, DXS폴리펩타이드, IDI 폴리펩타이드, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 또는 전사인자 핵산을 연속식 배양 (희석이 없는 연속식 배양과 같음)에서 적어도 또는 약 5, 10, 20, 40, 50, 60 또는 65회 이상의 세포 분열 동안 유지시킨다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 이종유래 이소프렌 합성효소, DXS폴리펩타이드, IDI 폴리펩타이드, MVA 경로, 수소화효소, 수소화효소 성숙 또는 전사인자 핵산을 포함하는 핵산도 또한 항생제 저항성 핵산과 같은 선별 마커 또는 선택가능한 마커를 포함한다.

본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 이소프렌과 수소를 공동-생산하는 세포는 본 명세서에서 기술된 배양 배지라면 모두에서 세포에 의한 이소프렌과 수소의 공동-생산을 용이하게 하는 산소-제한된 조건 하에서 배양된다. 일정 구현예에서, 세포는 산소-제한된 배양에서 성장된다. 일정 구현예에서, 세포는 이소프렌 몰 당 0.5 몰의 산소 존재 시 성장된다. 일정 구현예에서, 세포는 산소 부재 시 혐기적으로 성장된다.

일정 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 세포라면 모두는 산소-제한된 배양에서 성장되고 이소프렌과 수소를 공동-생산한다. 일정 구현예에서, 산소-제한된 배양에서의 세포는 약 400 nmole/g_wcm/시간보다 큰 속도로 이소프렌을 생산하고, 약 125 nmole/g_wcm/시간보다 큰 속도로 수소를 생산한다. 일정 구현예에서, 산소-제한된 배양에서의 세포는 약 400 nmole/g_wcm/시간 내지 약 2.0 x 10⁵ nmole/g_wcm/시간 사이의 속도로 이소프렌을 생산하고, 약125 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이의 속도로 수소를 생산한다. 일정 구현예에서, 산소-제한된 배양에서의 세포는 약 400 nmole/g_wcm/시간 내지 약 2.0 x 10⁵ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 500 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.5 x 10⁵ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 750 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1 x 10⁵ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 1,000 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1 x 10⁵ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 2500 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1 x 10⁵ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 5000 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1 x 10⁵ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 7500 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1 x 10⁵ nmole/g_wcm/시간 사이, 및 약 1 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 내지 약 1 x 10⁵ nmole/g_wcm/시간 사이의 속도로 이소프렌을 생산한다. 일정 구현예에서, 산소-제한된 배양에서의 세포는 약 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 또는 5,000 이상 nmole/g_wcm/시간으로 이소프렌을 생산한다. 일정 구현예에서, 산소-제한된 배양에서의 세포는 약 125 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 250 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 500 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 750 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 1,000 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 1,250 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 2,500 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 5,000 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 7,500 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이, 및 약 1.00 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이의 속도로 수소를 생산한다. 일정 구현예에서, 산소-제한된 배양에서의 세포는 약 125, 250, 500, 750, 1000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 7,500, 또는 10,000 이상 nmole/g_wcm/시간으로 수소를 생산한다.

일정 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 세포라면 모두는 산소-제한된 배양에서 성장되고 이소프렌과 수소를 공동-생산한다. 일정 구현예에서, 산소-제한된 배양에서의 세포는 약 0.1 mg/L_액체배지/시간 이상의 이소프렌의 평균 부피측정 생산도 및 약 0.005 mg/L_액체배지/시간 이상의 수소의 평균 부피측정 생산도를 가진다. 일정 구현예에서, 산소-제한된 배양에서의 세포는 약 1,000 mg/L_액체배지/시간 이상의 이소프렌의 피크 부피측정 생산도 및 약 5 mg/L_액체배지/시간 이상의 피크 부피측정 생산도를 가진다. 일정 구현예에서, 산소-제한된 배양에서의 세포는 약 3,000 mg/L_액체배지/시간 이상의 이소프렌의 피크 부피측정 생산도 및 약 5 mg/L_액체배지/시간 이상의 피크 부피측정 생산도를 가진다. 일정 구현예에서, 산소-제한된 배양에서의 세포는 약 5,000 mg/L_액체배지/시간 이상의 이소프렌의 피크 부피측정 생산도 및 약 5 mg/L_액체배지/시간 이상의 피크 부피측정 생산도를 가진다. 일정 구현예에서, 산소-제한된 배양에서의 세포는 약 0.1 mg/L_액체배지/시간 및 약 5,000 mg/L_액체배지/시간 사이의 이소프렌의 평균 부피측정 생산도 및 약0.005 mg/L_액체배지/시간 및 약 5 mg/L_액체배지/시간 사이의 수소의 평균 부피측정 생산도를 가진다. 일정 구현예에서, 산소-제한된 배양에서의 세포는 약 1 mg/L_액체배지/시간 및 약 5,000 mg/L_액체배지/시간, 약 5 mg/L_액체배지/시간 및 약 5,000 mg/L_액체배지/시간, 약 10 mg/L_액체배지/시간 및 약 5,000 mg/L_액체배지/시간, 약 25 mg/L_액체배지/시간 및 약 5,000 mg/L_액체배지/시간, 약 50 mg/L_액체배지/시간 및 약 5,000 mg/L_액체배지/시간, 약 100 mg/L_액체배지/시간 및 약 5,000 mg/L_액체배지/시간, 약 250 mg/L_액체배지/시간 및 약 5,000 mg/L_액체배지/시간, 약 500 mg/L_액체배지/시간 및 약 5,000 mg/L_액체배지/시간, 약 1,000 mg/L_액체배지/시간 및 약 5,000 mg/L_액체배지/시간, 및 약 2500 mg/L_액체배지/시간 및 약 5,000 mg/L_액체배지/시간 사이의 이소프렌의 평균 부피측정 생산도, 또한 약0.01 mg/L_액체배지/시간 및 약 5 mg/L_액체배지/시간 사이, 약0.025 mg/L_액체배지/시간 및 약 5 mg/L_액체배지/시간 사이, 약0.05 mg/L_액체배지/시간 및 약 5 mg/L_액체배지/시간 사이, 약0.1 mg/L_액체배지/시간 및 약 5 mg/L_액체배지/시간 사이, 약0.25 mg/L_액체배지/시간 및 약 5 mg/L_액체배지/시간 사이, 약0.5 mg/L_액체배지/시간 및 약 5 mg/L_액체배지/시간 사이, 약1 mg/L_액체배지/시간 및 약 5 mg/L_액체배지/시간 사이, 및 약2.5 mg/L_액체배지/시간 및 약 5 mg/L_액체배지/시간 사이 의 수소의 평균 부피측정 생산도를 가진다.

일정 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 세포라면 모두는 산소-제한된 배양에서 성장되고 이소프렌과 수소를 공동-생산한다. 일정 구현예에서, 산소-제한된 배양에서의 세포는 세포가 세포 배양 배지로부터 이소프렌으로 연소되는 탄소의 약 0.002 몰라 퍼센트 이상을 이소프렌으로 전환시키고, 또한 세포가 세포 배양 배지로부터 연소하는 탄소의 약0.024 몰라 퍼센트 이상과 동등한 수소를 생산한다. 일정 구현예에서, 산소-제한된 배양에서의 세포는 세포가 세포 배양 배지로부터 이소프렌으로 연소되는 탄소의 약 0.002 몰라 퍼센트 이상을 이소프렌으로 전환시키고, 또한 세포가 세포 배양 배지로부터 연소하는 탄소의 약 400 몰라 퍼센트 이상과 동등한 수소를 생산한다.

일정 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 세포라면 모두는 산소-제한된 배양에서 성장되고 이소프렌과 수소를 공동-생산한다. 일정 구현예에서, 산소-제한된 배양에서의 세포는 3 몰라 퍼센트의 수소마다 적어도 1 몰라 퍼센트의 이소프렌으로부터 4 몰라 퍼센트의 수소마다 적어도 1 몰라 퍼센트의 이소프렌까지의 범위에 이르는 비율로 이소프렌과 수소를 포함한다. 일정 구현예에서, 산소-제한된 배양에서의 세포는 1부터 11 몰라 퍼센트까지의 이소프렌, 또한 3부터 33 몰라 퍼센트까지의 수소를 포함하는 배출-기체를 생산한다. 일정 구현예에서, 세포는 1부터 11 몰라 퍼센트까지의 이소프렌, 또한 4부터 44 몰라 퍼센트까지의 수소를 생산한다. 일정 구현예에서, 산소-제한된 배양에서의 세포는 산소, 이산화탄소, 또는 질소를 포함하는 배출-기체를 생산한다. 일정 구현예에서, 산소-제한된 배양에서의 세포는 0부터 21몰라 퍼센트까지의 산소, 18부터 44 몰라 퍼센트까지의 이산화탄소, 및 1부터 78 몰라 퍼센트까지의 질소를 포함하는 배출-기체를 생산한다.

또 다른 관점에서, 본 명세서에서는 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산을 포함하는 이소프렌 및 수소를 공동-생산하는 세포가 제공되고, 여기에서 세포는: (i) 이소프렌을 약 400 nmole/g_wcm/시간 이상으로 생산하고 수소를 약 125 nmole/g_wcm/시간 이상으로 생산하며; (ii) 약 0.1 mg/L_액체배지/시간 이상의 이소프렌의 평균 부피측정 생산도 및 약 0.005 mg/L_액체배지/시간 이상의 수소의 평균 부피측정 생산도를 가지고; 또는 (iii) 세포가 세포 배양 배지로부터 연소하는 탄소의 약 0.002 몰라 퍼센트 이상을 이소프렌으로 전환시키고, 또한 세포가 세포 배양 배지로부터 연소하는 탄소의 약 0.024 몰라 퍼센트 이상과 동등한 수소를 생산한다.

일정 구현예에서, 산소-제한된 배양에서 세포는 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산을 포함하고, 여기에서 이종유래 핵산은 프로모터에 작동적으로 연결되고, 세포는 이소프렌을 약 400 nmole/g_wcm/시간 이상으로 및 수소를 약 125 nmole/g_wcm/시간 이상으로 생산한다. 일정 구현예에서, 산소-제한된 배양에서 세포는 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산을 포함하고, 여기에서 이종유래 핵산은 프로모터에 작동적으로 연결되고, 세포는 약 0.1 mg/L_액체배지/시간 이상의 이소프렌의 평균 부피측정 생산도 및 약 0.005 mg/L_액체배지/시간 이상의 수소의 평균 부피측정 생산도를 가진다. 일정 구현예에서, 산소-제한된 배양에서 세포는 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산을 포함하고, 여기에서 이종유래 핵산은 프로모터에 작동적으로 연결되고, 세포는 세포가 세포 배양 배지로부터 연소하는 탄소의 약 0.002 몰라 퍼센트 이상을 이소프렌으로, 또한 세포가 세포 배양 배지로부터 연소하는 탄소의 약 0.024 몰라 퍼센트 이상과 동등한 수소로 전환시킨다. 일정 구현예에서, 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드는 식물 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드이다.

일정 구현예에서, 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산을 포함하는 산소-제한된 배양에서 세포는 약 400 nmole/g_wcm/시간 내지 약 2.0 x 10⁵ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 500 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.5 x 10⁵ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 750 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1 x 10⁵ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 1,000 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1 x 10⁵ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 2500 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1 x 10⁵ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 5000 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1 x 10⁵ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 7500 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1 x 10⁵ nmole/g_wcm/시간 사이, 및 약 1 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 내지 약 1 x 10⁵ nmole/g_wcm/시간 사이의 속도로 이소프렌을 생산하고, 약 125 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 250 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 500 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 750 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 1,000 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 1,250 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 2,500 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 5,000 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 7,500 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이, 및 약 1.00 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이의 속도로 수소를 생산한다.

일정 구현예에서, 본 명세서에서는 이소프렌 및 수소를 공동-생산하는 방법이 제공되고, 방법은 (a) 이소프렌과 수소의 공동-생산에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하고; 또한 (b) 이소프렌과 수소를 공동-생산하는 것을 포함하며, 여기에서 세포는 약 400 nmole/L_wem/시간 이상의 이소프렌을 생산하고 약 125 nmole/L_wem/시간 이상의 수소를 생산한다.

일정 구현예에서, 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산을 포함하는 산소-제한된 배양에서 세포는 약 400 nmole/g_wcm/시간 내지 약 2.0 x 10⁵ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 500 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.5 x 10⁵ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 750 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1 x 10⁵ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 1,000 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1 x 10⁵ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 2500 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1 x 10⁵ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 5000 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1 x 10⁵ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 7500 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1 x 10⁵ nmole/g_wcm/시간 사이, 및 약 1 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 내지 약 1 x 10⁵ nmole/g_wcm/시간 사이의 속도로 이소프렌을 생산하고, 약 125 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 250 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 500 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 750 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 1,000 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 1,250 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 2,500 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 5,000 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이, 약 7,500 nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이, 및 약 1.00 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 내지 약 1.25 x 10⁴ nmole/g_wcm/시간 사이의 속도로 수소를 생산한다.

일정 구현예에서, 본 명세서에서는 이소프렌 및 수소를 공동-생산하는 방법이 제공되고, 방법은 (a) 이소프렌과 수소의 공동-생산에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하고; 또한 (b) 이소프렌과 수소를 공동-생산하는 것을 포함하며, 여기에서 세포는 약 0.1 mg/L_액체배지/시간 이상의 이소프렌의 평균 부피측정 생산도 및 0.005 mg/L_액체배지/시간 이상의 수소의 평균 부피측정 생산를 가진다.

일정 구현예에서, 본 명세서에서는 이소프렌 및 수소를 공동-생산하는 방법이 제공되고, 방법은 (a) 이소프렌과 수소의 공동-생산에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하고; 또한 (b) 이소프렌과 수소를 공동-생산하는 것을 포함하며, 여기에서 세포는 세포가 세포 배양 배지로부터 소비하는 탄소의 약 0.002 몰라 퍼센트 이상을 이소프렌으로 전환시키고, 세포가 세포 배양 배지로부터 소비하는 탄소의 약 0.024 몰라 퍼센트 이상과 동등한 수소를 생산한다.

일정 구현예에서, 본 명세서에서는 이소프렌과 수소를 3 몰라 퍼센트의 수소마다 적어도 1 몰라 퍼센트의 이소프렌으로부터 4 몰라 퍼센트의 수소마다 적어도 1 몰라 퍼센트의 이소프렌까지의 범위에 이르는 비율로 이소프렌과 수소, 또한 0.1 몰라 퍼센트 이하의 휘발성 불순물을 포함하는 조성물이 제공된다. 일정 구현예에서, 조성물은 좀 더 나아가 1부터 11몰라 퍼센트까지의 이소프렌 및 4부터 44까지의 몰라 퍼센트까지의 수소를 포함한다. 일정 구현예에서, 조성물은 좀 더 나아가 산소, 이산화탄소, 또는 질소를 포함한다. 일정 구현예에서, 조성물은 좀 더 나아가 0부터 21몰라 퍼센트까지의 산소, 18부터 44 몰라 퍼센트까지의 이산화탄소, 및 1부터 78 몰라 퍼센트까지의 질소를 포함한다. 일정 구현예에서, 조성물은 좀 더 나아가 1.0 x 10^-4 몰라 퍼센트 이하의 비-메탄 휘발성 불순물을 포함한다. 일정 구현예에서, 비-메탄 휘발성 불순물은 다음의 하나 이상을 포함한다: 2-헵탄온 (2-heptanone), 6-메틸-5-헵텐-2-온 (6-methyl-5-hepten-2-one), 2,4,5-트리메틸피리딘 (2,4,5-trimethylpyridine), 2,3,5-트리메틸피라진 (2,3,5-trimethylpyrazine), 시트로넬랄 (citronellal), 아세트알데하이드 (acetaldehyde), 메탄티올 (methanethiol), 메틸 아세테이트 (methyl acetate), 1-프로판올 (1-propanol), 디아세틸(diacetyl), 2-부탄온(2-butanone), 2-메틸-3-부텐-2올 (2-methyl-3-buten-2-ol), 에틸 아세테이트 (ethyl acetate), 2-메틸-1-프로판올 (2-methyl-1-propanol), 3-메틸-1-부탄알 (3-methyl-1-butanal), 3-메틸-2-부탄온 (3-methyl-2-butanone), 1-부탄올 (1-butanol), 2-펜탄온 (2-pentanone), 3-메틸-1-부탄올 (3-methyl-1-butanol), 에틸 이소부틸레이트 (ethyl isobutyrate), 3-메틸-2-부텐알 (3-methyl-2-butenal), 부틸 아세테이트 (butyl acetate), 3-메틸부틸 아세테이트 (3-methylbutyl acetate), 3-메틸-3-부텐-1-일 아세테이트 (3-methyl-3-buten-1-yl acetate), 3-메틸-2-부텐-1-일 아세테이트 (3-methyl-2-buten-1-yl acetate), 3-헥센-1-올 (3-hexen-1-ol), 3-헥센-1-일 아세테이트 (3-hexen-1-yl acetate), 리모넨 (limonene), 제라니올 (geraniol, 트랜스-3,7-디메틸-2,6-옥타디엔-1-올 (trans-3,7-dimethyl-2,6-octadien-1-ol)), 시트로넬롤 (citronellol, 3,7-디메틸-6-옥텐-1-올 (3,7-dimethyl-6-octen-1-ol)), (E)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔 ((E)-3,7-dimethyl-1,3,6-octatriene), (Z)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔 ((Z)-3,7-dimethyl-1,3,6-octatriene), 2,3-사이클로헵텐올피리딘 (2,3-cycloheptenolpyridine), 또는 직쇄상 이소프렌 중합체 (다수의 이소프렌 단위의 다중합반응으로부터 유래된 직쇄상 이소프렌 이중체 또는 직쇄상 이소프렌 삼중체와 같음). 일정 구현예에서, 비-메탄 휘발성 불순물은 다음의 하나 이상을 포함한다: 이소프렌 조성물은 하기의 하나 이상을 포함한다: 알코올, 알데하이드, 또는 케톤 (본 명세서에서 기술된 알코올, 알데하이드, 또는 케톤이라면 모두와 같음). 일정 구현예에서, 이소프렌 조성물은 (i) 알코올 및 알데하이드, (ii) 알코올 및 케톤, (iii) 알데하이드 및 케톤, 또는 (iv) 알코올, 알데하이드 및 케톤을 포함한다. 일정 구현예에서, 비-메탄 휘발성 불순물은 다음의 하나 이상을 포함한다: 메탄올, 아세트알데하이드, 에탄올, 메탄티올, 1-부탄올, 3-메틸-1-프로판올, 아세톤, 아세트산, 2-부탄온, 2-메틸-1-부탄올, 또는 인돌.

또한 본 명세서에서는 이소프렌 및 수소를 공동-생산하는 방법이 제공되고, 방법은 (a) 이소프렌과 수소의 공동-생산에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하고; 또한 (b) 이소프렌과 수소를 공동-생산하는 것을 포함하며, 여기에서 산소-제한된 배양에서의 세포에 의해 생산된 이소프렌의 피크 농도는 약 10 ng/L_액체배지 이상이고, 세포의 수소 발생율은 약 0.0025 mmol/L_액체배지/시간 이상이다. 이들 방법이라면 모두의 일정 구현예에서, 수소 발생율은 약 0.0025 mmol/L_액체배지/시간 및 약 10 mmol/L_액체배지/시간 사이, 약 0.0025 mmol/L_액체배지/시간 및 약 5 mmol/L_액체배지/시간 사이, 약 0.0025 mmol/L_액체배지/시간 및 약 2.5 mmol/L_액체배지/시간 사이, 약 0.0025 mmol/L_액체배지/시간 및 약 1 mmol/L_액체배지/시간 사이, 약 0.0025 mmol/L_액체배지/시간 및 약 0.5 mmol/L_액체배지/시간 사이, 약 0.0025 mmol/L_액체배지/시간 및 약 0.25 mmol/L_액체배지/시간, 약 0.0025 mmol/L_액체배지/시간 및 약 0.025 mmol/L_액체배지/시간 사이, 약 0.025 mmol/L_액체배지/시간 및 약 0.5 mmol/L_액체배지/시간 사이, 약 0.025 mmol/L_액체배지/시간 및 약 1 mmol/L_액체배지/시간 사이, 약 0.025 mmol/L_액체배지/시간 및 약 2.5 mmol/L_액체배지/시간 사이, 약 0.025 mmol/L_액체배지/시간 및 약 5 mmol/L_액체배지/시간 사이, 약 0.025 mmol/L_액체배지/시간 및 약 10 mmol/L_액체배지/시간 사이, 약 0.25 mmol/L_액체배지/시간 및 약 1 mmol/L_액체배지/시간 사이, 0.25 mmol/L_액체배지/시간 및 약 2.5 mmol/L_액체배지/시간 사이, 약 0.25 mmol/L_액체배지/시간 및 약 5 mmol/L_액체배지/시간 사이, 약 0.025 mmol/L_액체배지/시간 및 약 10 mmol/L_액체배지/시간 사이의 범위이다.

또한 본 명세서에서는 (a) 이소프렌과 수소의 공동-생산에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하고; 또한 (b) 이소프렌과 수소를 공동-생산하는 것을 포함하는, 이소프렌과 수소를 공동-생산하는 방법이 제공되고, 여기에서 이소프렌의 액상 농도는 약 200 mg/L이하이고, 세포는 이소프렌을 약 400 nmole/g_wcm/시간 이상으로 생산하며, 세포의 수소 발생율은 약 0.0025 mmol/L/시간 이상이다. 일정 구현예에서, 배양에서 이소프렌의 액상 농도는 약 175 mg/L, 150 mg/L, 125 mg/L, 100 mg/L, 75 mg/L, 50 mg/L, 25 mg/L, 20 mg/L, 15 mg/L, 10 mg/L, 5 mg/L, 또는 2.5 mg/L 이하이다. 일정 구현예에서, 배양에서 이소프렌의 액상 농도는 약 0.1 mg/L 내지 200 mg/L, 1 mg/L 내지 200 mg/L, 1 mg/L 내지 150 mg/L, 1 mg/L 내지 100 mg/L, 1 mg/L 내지 50 mg/L, 1 mg/L 내지 25 mg/L, 1 mg/L 내지 20 mg/L, 또는 10 mg/L 내지 20 mg/L 사이의 범위이다. 이들 방법이라면 모두의 일정 구현예에서, 수소 발생율은 약 0.0025 mmol/L_액체배지/시간 및 약 10 mmol/L_액체배지/시간 사이, 약 0.0025 mmol/L_액체배지/시간 및 약 5 mmol/L_액체배지/시간 사이, 약 0.0025 mmol/L_액체배지/시간 및 약 2.5 mmol/L_액체배지/시간 사이, 약 0.0025 mmol/L_액체배지/시간 및 약 1 mmol/L_액체배지/시간 사이, 약 0.0025 mmol/L_액체배지/시간 및 약 0.5 mmol/L_액체배지/시간 사이, 약 0.0025 mmol/L_액체배지/시간 및 약 0.25 mmol/L_액체배지/시간 사이, 약 0.0025 mmol/L_액체배지/시간 및 약 0.025 mmol/L_액체배지/시간 사이, 약 0.025 mmol/L_액체배지/시간 및 약 0.5 mmol/L_액체배지/시간 사이, 약 0.025 mmol/L_액체배지/시간 및 약 1 mmol/L_액체배지/시간 사이, 약 0.025 mmol/L_액체배지/시간 및 약 2.5 mmol/L_액체배지/시간 사이, 약 0.025 mmol/L_액체배지/시간 및 약 5 mmol/L_액체배지/시간 사이, 약 0.025 mmol/L_액체배지/시간 및 약 10 mmol/L_액체배지/시간 사이, 약 0.25 mmol/L_액체배지/시간 및 약 1 mmol/L_액체배지/시간 사이, 약 0.25 mmol/L_액체배지/시간 및 약 2.5 mmol/L_액체배지/시간 사이, 및 약 0.25 mmol/L_액체배지/시간 및 약 10 mmol/L_액체배지/시간 사이의 범위이다.

한 가지 관점에서, 본 명세서에서는 이소프렌 및 수소를 공동-생산하는 산소-제한된 배양에서의 세포가 제공된다. 일정 구현예에서, 산소-제한된 배양은 혐기성이다. 일정 구현예에서, 산소-제한된 배양에서의 세포는 약 400 nmole/g_wem/시간 이상의 이소프렌 또한 약 125 nmole/g_wem/시간 이상의 수소를 생산한다. 일정 구현예에서, 세포는 (i) 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코드하고 (ii) 프로모터에 작동적으로 연결된 이종유래 핵산을 포함한다. 일정 구현예에서, 세포는 이에 제한되는 것은 아니지만 탄소화물, 글리세롤, 글리세린, 디하이드록시아세톤, 일-탄소원, 오일, 동물 지방, 동물 오일, 지방산, 지질, 인지질, 글리세롤지질, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 트리글리세라이드, 재생가능한 탄소원, 폴리펩타이드 (예로, 미생물 또는 식물 단백질 또는 펩타이드), 효모 추출물, 또는 효모 추출물로부터 나온 성분, 또는 전술한 둘 이상의 조합이라면 모두와 같은 탄소원을 포함하는 배양 배지에서 배양된다. 일정 구현예에서, 세포는 제한된 포도당 조건 하에서 배양된다.

일정 구현예에서, 본 명세서에서는 세포 배양 배지에서 약 0.002% 이상의 탄소를 이소프렌으로 전환시키고, 또한 세포가 세포 배양 배지로부터 연소하는 탄소의 약0.024 몰라 퍼센트 이상과 동등한 수소를 생산하는 산소-제한된 배양에서의 세포가 제공된다. 일정 구현예에서, 산소-제한된 배양은 혐기성이다. 일정 구현예에서, 세포는 (i) 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코드하고 또한 (ii) 프로모터에 작동적으로 연결된 이종유래 핵산을 가진다. 일정 구현예에서, 세포는 이에 제한되는 것은 아니지만 탄소화물, 글리세롤, 글리세린, 디하이드록시아세톤, 일-탄소원, 오일, 동물 지방, 동물 오일, 지방산, 지질, 인지질, 글리세롤지질, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 트리글리세라이드, 재생가능한 탄소원, 폴리펩타이드 (예로, 미생물 또는 식물 단백질 또는 펩타이드), 효모 추출물, 또는 효모 추출물로부터 나온 성분, 또는 전술한 둘 이상의 조합이라면 모두와 같은 탄소원을 포함하는 배양 배지에서 배양된다. 일정 구현예에서, 세포는 제한된 포도당 조건 하에서 배양된다.

일정 구현예에서, 본 명세서에서는 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산을 포함하는 산소-제한된 배양에서의 세포가 제공된다. 일정 구현예에서, 산소-제한된 배양은 혐기성이다. 일정 구현예에서, 세포는 (i) 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코드하고 또한 (ii) 프로모터에 작동적으로 연결된 이종유래 핵산을 가진다. 일정 구현예에서, 세포는 이에 제한되는 것은 아니지만 탄소화물, 글리세롤, 글리세린, 디하이드록시아세톤, 일-탄소원, 오일, 동물 지방, 동물 오일, 지방산, 지질, 인지질, 글리세롤지질, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 트리글리세라이드, 재생가능한 탄소원, 폴리펩타이드 (예로, 미생물 또는 식물 단백질 또는 펩타이드), 효모 추출물, 또는 효모 추출물로부터 나온 성분, 또는 전술한 둘 이상의 조합이라면 모두와 같은 탄소원을 포함하는 배양 배지에서 배양된다. 일정 구현예에서, 세포는 제한된 포도당 조건 하에서 배양된다.

한 가지 관점에서, 본 명세서에서는 이소프렌과 수소를 공동-생산하는 본 명세서에서 기술된 세포라면 모두를 사용하는 방법과 같은, 또 다른 화합물과 함께 이소프렌을 공동-생산하는 방법이 제공된다. 일정 구현예에서, 방법은 약 400 nmole/g_wem/시간 이상의 이소프렌을, 또한 약 125 nmole/g_wem/시간 이상의 수소를 생산하는 데 충분한 산소-제한된 조건 하에서 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 산소-제한된 배양은 혐기성이다. 일정 구현예에서, 방법은 또한 세포에 의해 생산된 이소프렌과 수소를 회수하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 방법은 좀 더 나아가 세포에 의해 생산된 이소프렌과 수소를 정제하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 방법은 이소프렌을 다중합하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 세포는 (i) 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코드하고 (ii) 프로모터에 작동적으로 연결된 이종유래 핵산을 가진다. 일정 구현예에서, 세포는 이에 제한되는 것은 아니지만 탄소화물, 글리세롤, 글리세린, 디하이드록시아세톤, 일-탄소원, 오일, 동물 지방, 동물 오일, 지방산, 지질, 인지질, 글리세롤지질, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 트리글리세라이드, 재생가능한 탄소원, 폴리펩타이드 (예로, 미생물 또는 식물 단백질 또는 펩타이드), 효모 추출물, 또는 효모 추출물로부터 나온 성분, 또는 전술한 둘 이상의 조합이라면 모두와 같은 탄소원을 포함하는 배양 배지에서 배양된다. 일정 구현예에서, 세포는 제한된 포도당 조건 하에서 배양된다. 다양한 구현예에서, 안정기 동안 생산된 이소프렌량 (생산된 이소프렌의 전체량 또는 OD₆₀₀ 당 시간 당 액체배지 리터 당 생산된 이소프렌량과 같음)은 동일한 기간에 성장기 동안 생산된 이소프렌량보다 약 2배 이상이다.

일정 구현예에서, 방법은 세포 배양 배지에서 약 0.002% 이상의 탄소를 이소프렌으로 전환시키고, 세포가 세포 배양 배지로부터 연소하는 탄소의 약 0.024 몰라 퍼센트 이상과 동등한 수소를 생산하는 데 충분한 산소-제한된 배양에서 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 산소-제한된 배양은 혐기성이다. 일정 구현예에서, 방법은 또한 세포에 의해 생산된 이소프렌과 수소를 회수하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 방법은 좀 더 나아가 세포에 의해 생산된 이소프렌과 수소를 정제하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 방법은 이소프렌을 다중합하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 세포는 (i) 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코드하고 (ii) 프로모터에 작동적으로 연결된 이종유래 핵산을 가진다. 일정 구현예에서, 세포는 이에 제한되는 것은 아니지만 탄소화물, 글리세롤, 글리세린, 디하이드록시아세톤, 일-탄소원, 오일, 동물 지방, 동물 오일, 지방산, 지질, 인지질, 글리세롤지질, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 트리글리세라이드, 재생가능한 탄소원, 폴리펩타이드 (예로, 미생물 또는 식물 단백질 또는 펩타이드), 효모 추출물, 또는 효모 추출물로부터 나온 성분, 또는 전술한 둘 이상의 조합이라면 모두와 같은 탄소원을 포함하는 배양 배지에서 배양된다.

본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 미생물 폴리펩타이드 탄소원은 효모 또는 박테리아로부터 나온 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함한다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 식물 폴리펩타이드 탄소원은 콩, 옥수수, 카놀라, 자트로파, 팜, 땅콩, 해바라기, 코코넛, 머스타드, 평지종자, 목화종자, 팜 줄기, 올리브, 잇꽃, 참깨, 또는 아마종자로부터 나온 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함한다.

일정 구현예에서, 이소프렌과 수소는 안정기에만 공동-생산된다. 일정 구현예에서, 이소프렌과 수소는 성장기 및 안정기 둘 다에서 공동-생산된다. 다양한 구현예에서, 안정기 동안 생산된 이소프렌량 (생산된 이소프렌의 전체량 또는 OD₆₀₀당 시간 당 액체배지 리터 당 생산된 이소프렌량과 같음)은 동일한 기간에 성장기 동안 생산된 이소프렌량보다 약 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 또는 50배 이상이다. 다양한 구현예에서, 안정기 동안 생산된 수소량 (생산된 수소의 전체량 또는 OD₆₀₀당 시간 당 액체배지 리터 당 생산된 수소량과 같음)은 동일한 기간에 성장기 동안 생산된 수소량보다 약 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 또는 50배 이상이다.

일정 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 조성물은 조성물 내의 모든 C5 탄화수소의 전체 무게와 대비한 무게로 약 99.90, 99.92, 99.94, 99.96, 99.98, 또는 100% 이상의 이소프렌 및 수소를 포함한다. 일정 구현예에서, 조성물은 조성물 내의 모든 C5 탄화수소의 전체 무게와 대비한 무게로 약 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005, 또는 0.00001% 이하의 이소프렌이 아닌 C5 탄화수소 (1,3-사이클로펜타디엔, cis-1,3-펜타디엔, trans-1,3-펜타디엔, 1-펜틴, 2-펜틴, 1-펜틴, 2-메틸-1-부텐, 3-메틸-l-부틴, trans-피페릴렌, cis-피페릴렌, 펜트-4-엔-1-인, trans-펜트-3-엔-1-인, 또는 cis-펜트-3-엔-1-인과 같음)를 포함한다. 일정 구현예에서, 조성물은 1,3-사이클로펜타디엔, cis-1,3-펜타디엔, trans-1,3-펜타디엔, 1-펜틴, 2-펜틴, 1-펜틴, 2-메틸-1-부텐, 3-메틸-l-부틴, 펜트-4-엔-1-인, trans-펜트-3-엔-1-인, 또는 cis-펜트-3-엔-1-인에 대하여 조성물 내의 모든 C5 탄화수소의 전체 무게와 대비한 무게로 약 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005, 또는 0.00001% 이하로 가진다. 상세한 구현예에서, 조성물은 약 2 mg이상의 이소프렌을 가지고, 조성물 내의 모든 C5 탄화수소의 전체 무게와 대비한 무게로 약 99.90, 99.92, 99.94, 99.96, 99.98, 또는 100% 이상의 이소프렌을 가진다. 일정 구현예에서, 이소프렌 조성물은 이소프렌의 다중합을 저해하는 조성물에 있는 화합물이라면 모두에 대해 약 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 또는0.005 μg/L 이하의 이소프렌의 다중합을 저해하는 화합물을 포함한다. 상세한 구현예에서, 조성물은 또한 약 2 mg 이상의 이소프렌 및 약 0.48 mg 이상의 수소를 포함한다.

일정 구현예에서, 기체상의 휘발성 유기 분획은 이소프렌의 다중합을 저해하는 기체상의 휘발성 유기 분획에 있는 화합물이라면 모두에 대해 약 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 또는0.005 μg/L 이하의 이소프렌의 다중합을 저해하는 화합물을 포함한다. 일정 구현예에서, 기체상의 휘발성 유기 분획은 또한 약 2 mg 이상의 이소프렌 및 약 0.48 mg 이상의 수소를 포함한다.

일정 구현예에서, 본 시스템은 본 명세서에서 기술된 세포 및/또는 조성물이라면 모두를 포함한다. 일정 구현예에서, 본 시스템은 체임버가 약 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 또는 5,000 이상 nmole/g_wcm/시간의 이소프렌을 또한 약 125, 250, 500, 750, 1000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 7,500, 또는 10,000 이상 nmole/g_wcm/시간의 수소를 생산하는 산소-제한된 배양에서의 세포를 포함하는 반응기를 포함한다. 일정 구현예에서, 시스템은 폐쇄된 시스템이 아니다. 일정 구현예에서, 적어도 이소프렌의 일부분은 시스템으로부터 제거된다. 일정 구현예에서, 시스템은 이소프렌과 수소를 포함하는 기체상을 포함한다. 다양한 구현예에서, 기체상은 본 명세서에서 기술된 조성물이라면 모두를 포함한다.

한 가지 관점에서, 본 명세서에서는 본 명세서에서 기술된 조성물 또는 방법이라면 모두에 의해 생산되는 산물을 특징으로 한다.

이소프렌 고역가에서 세포 생존도

이소프렌은 많은 식물, 동물, 및 미생물에 의해 분비되는 소수성 분자이다. 바실러스와 같은 박테리아는 매우 낮은 수준으로 이소프렌을 생산한다. 식물이 열보호 (thermoprotection)를 도와주도록 이소프렌을 분비한다는 일정 증거가 존재하고 있고, 이소프렌이 시아노박테리아 또는 곰팡이에 길항적으로, 또는 항미생물 제제로서 작용할 수 있는 것이 가설로 주장되어 왔다. 예로, Ladygina et al., Process Biochemistry 41:1001-1014 (2006)를 참조하고, 이는 본 명세서에서 참조문헌으로 전부, 상세하게는 길항적으로 작용하는 이소프렌에 관하여 통합되어 있다. 자연에서 발생하는 매우 낮은 생산 수준이 항-미생물 작용으로는 충분하기 때문에, 이소프렌의 상업화에 필요한 이소프렌의 역가 및 생산도 수준은 숙주 미생물을 죽일 것이라고 많이 우려된다.

본 발명자들은 이산화탄소 발생율 또는 전체 이산화탄소 발생율에 의해 표시되는 세포 생존도 및/또는 대사적 활성을 유지하면서 이소프렌의 상업화에 필요한 이소프렌의 역가 및 생산도 수준을 생산하는 방법을 발견하였다.

본 명세서에서는 (a) 이소프렌의 생산에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하고; 또한 (b) 이소프렌을 생산하는 것을 포함하는 이소프렌을 생산하는 방법이 제공되고, 여기에서 세포는 이소프렌을 약 400 nmole/g_wcm/시간 이상으로 생산하고, 이산화탄소 발생율은 약 1 x 10^-18 mmol/L/시간 이상이다. 일정 구현예에서, 생산된 이소프렌은 "대표적인 이소프렌의 생산"이라는 제목으로 된 섹션에 기술된 농도 또는 양이라면 모두이다. 일정 구현예에서, 이소프렌량은 약 400 nmole/g_wcm/시간 내지 1 mole/g_wcm/시간, 약 400 nmole/g_wcm/시간 내지 1 mmole/g_wcm/시간, 약 400 nmole/g_wcm/시간 내지 40 mmole/g_wcm/시간, 약 400 nmole/g_wcm/시간 내지 4 mmole/g_wcm/시간, 약 1 mmole/g_wcm/시간 내지 1.5 mmole/g_wcm/시간, 약 1.5 mmole/g_wcm/시간 내지 3 mmole/g_wcm/시간, 약 3 mmole/g_wcm/시간 내지 5 mmole/g_wcm/시간, 약 5 mmole/g_wcm/시간 내지 25 mmole/g_wcm/시간, 약 25 mmole/g_wcm/시간 내지 100 mmole/g_wcm/시간, 약 100 mmole/g_wcm/시간 내지 500 mmole/g_wcm/시간, 또는 약 500 mmole/g_wcm/시간 내지 1000 mmole/g_wcm/시간 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 이소프렌량은 약 1 nmole/g_wcm/시간, 1.5 nmole/g_wcm/시간, 2 nmole/g_wcm/시간, 3 nmole/g_wcm/시간, 4 nmole/g_wcm/시간, 또는 5 nmole/g_wcm/시간이라면 모두이다. 일정 구현예에서, 이산화탄소 발생율은 약 1 x 10^-18 mmol/L/시간 내지 1 mol/L/시간, 1 mmol/L/시간 내지 1 mol/L/시간, 25 mmol/L/시간 내지 750 mmol/L/시간, 25 mmol/L/시간 내지 75 mmol/L/시간, 250 mmol/L/시간 내지 750 mmol/L/시간, 또는 450 mmol/L/시간 내지 550 mmol/L/시간 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 이산화탄소 발생율은 약 50 mmol/L/시간, 100 mmol/L/시간, 150 mmol/L/시간, 200 mmol/L/시간, 250 mmol/L/시간, 300 mmol/L/시간, 350 mmol/L/시간, 400 mmol/L/시간, 450 mmol/L/시간, 또는500 mmol/L/시간이라면 모두이다.

또한 본 명세서에서는 (a) 이소프렌의 생산에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하고; 또한 (b) 이소프렌을 생산하는 것을 포함하는 이소프렌을 생산하는 방법이 제공되고, 여기에서 세포는 이소프렌을 약 400 nmole/g_wcm/시간 이상으로 생산하고, 세포 생존도는 약 두 배 이하로 감소된다. 일정 구현예에서, 생산된 이소프렌은 "대표적인 이소프렌의 생산"이라는 제목으로 된 섹션에 기술된 농도 또는 양이라면 모두이다. 일정 구현예에서, 이소프렌량은 약 400 nmole/g_wcm/시간 내지 1 mole/g_wcm/시간, 약 400 nmole/g_wcm/시간 내지 1 mmole/g_wcm/시간, 약 400 nmole/g_wcm/시간 내지 40 mmole/g_wcm/시간, 약 400 nmole/g_wcm/시간 내지 4 mmole/g_wcm/시간, 약 1 mmole/g_wcm/시간 내지 1.5 mmole/g_wcm/시간, 약 1.5 mmole/g_wcm/시간 내지 3 mmole/g_wcm/시간, 약 3 mmole/g_wcm/시간 내지 5 mmole/g_wcm/시간, 약 5 mmole/g_wcm/시간 내지 25 mmole/g_wcm/시간, 약 25 mmole/g_wcm/시간 내지 100 mmole/g_wcm/시간, 약 100 mmole/g_wcm/시간 내지 500 mmole/g_wcm/시간, 또는 약 500 mmole/g_wcm/시간 내지 1000 mmole/g_wcm/시간 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 이소프렌량은 약 1 nmole/g_wcm/시간, 1.5 nmole/g_wcm/시간, 2 nmole/g_wcm/시간, 3 nmole/g_wcm/시간, 4 nmole/g_wcm/시간, 또는 5 nmole/g_wcm/시간이라면 모두이다. 일정 구현예에서, 세포 생존도는 약 1.75배, 1.5배, 1.25배, 1배, 0.75배, 0.5배, 또는 0.25배 이하라면 모두로 감소된다. 일정 구현예에서, 세포 생존도는 약 2배로 감소된다.

좀 더 나아가 본 명세서에서는 (a) 이소프렌의 생산에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하고; 또한 (b) 이소프렌을 생산하는 것을 포함하는 이소프렌을 생산하는 방법이 제공되고, 여기에서 배양액에서 세포에 의해 생산된 이소프렌의 전체 누적 생산도는 약 0.2 mg/L_액체배지/시간 이상이고, 세포의 이산화탄소 발생율은 약 1 x 10^-18 mmol/L/시간 이상이다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 전체 누적 생산도는 "대표적인 이소프렌의 생산"이라는 제목으로 된 섹션에 기술된 농도 또는 양이라면 모두이다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 전체 누적 생산도는 약 0.2 mg/L_액체배지/시간 내지 약 5 g/L_액체배지/시간, 약 0.2 mg/L_액체배지/시간 내지 약 1 g/L_액체배지/시간, 약 1 mg/L_액체배지/시간 내지 약 2.5 g/L_액체배지/시간, 약 2.5 g/L_액체배지/시간 내지 약 5 g/L_액체배지/시간 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 이산화탄소 발생율은 약 1 x 10^-18 mmol/L/시간 내지 1 mol/L/시간, 1 mmol/L/시간 내지 1 mol/L/시간, 25 mmol/L/시간 내지 750 mmol/L/시간, 25 mmol/L/시간 내지 75 mmol/L/시간, 250 mmol/L/시간 내지 750 mmol/L/시간, 또는 450 mmol/L/시간 내지 550 mmol/L/시간 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 이산화탄소 발생율은 약 50 mmol/L/시간, 100 mmol/L/시간, 150 mmol/L/시간, 200 mmol/L/시간, 250 mmol/L/시간, 300 mmol/L/시간, 350 mmol/L/시간, 400 mmol/L/시간, 450 mmol/L/시간, 또는 500 mmol/L/시간이라면 모두이다.

본 명세서에서는 (a) 이소프렌의 생산에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하고; 또한 (b) 이소프렌을 생산하는 것을 포함하는 이소프렌을 생산하는 방법이 제공되고, 여기에서 배양액에서 세포에 의해 생산된 이소프렌의 전체 누적 생산도는 약 0.2 mg/L_액체배지/시간 이상이고, 세포 생존도는 약 두 배 이하로 감소된다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 전체 누적 생산도는 "대표적인 이소프렌의 생산"이라는 제목으로 된 섹션에 기술된 농도 또는 양이라면 모두이다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 전체 누적 생산도는 약 0.2 mg/L_액체배지/시간 내지 약 5 g/L_액체배지/시간, 약 0.2 mg/L_액체배지/시간 내지 약 1 g/L_액체배지/시간, 약 1 mg/L_액체배지/시간 내지 약 2.5 g/L_액체배지/시간, 약 2.5 g/L_액체배지/시간 내지 약 5 g/L_액체배지/시간 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 세포 생존도는 약 1.75배, 1.5배, 1.25배, 1배, 0.75배, 0.5배, 또는 0.25배 이하라면 모두로 감소된다.

또한 본 명세서에서는 (a) 이소프렌의 생산에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하고; 또한 (b) 이소프렌을 생산하는 것을 포함하는 이소프렌을 생산하는 방법이 제공되고, 여기에서 배양액에서 세포에 의해 생산된 이소프렌의 피크 농도는 약 10 ng/L_액체배지 이상이고, 세포의 이산화 발생율은 약 1 x 10^-18 mmol/L/시간 이상이다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 피크 농도는 "대표적인 이소프렌의 생산"이라는 제목으로 된 섹션에 기술된 농도 또는 양이라면 모두이다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 피크 농도는 약 10 ng/L_액체배지 내지 500 ng/L_액체배지, 500 ng/L_액체배지 내지 1 μg/L_액체배지, 1 μg/L_액체배지 내지 5 μg/L_액체배지, 5 μg/L_액체배지 내지 50 μg/L_액체배지, 5 μg/L_액체배지 내지 100 μg/L_액체배지, 5 μg/L_액체배지 내지 250 μg/L_액체배지, 250 μg/L_액체배지 내지 500 μg/L_액체배지, 500 μg/L_액체배지 내지 1 mg/L_액체배지, 1 mg/L_액체배지 내지 50 mg/L_액체배지, 1 mg/L_액체배지 내지 100 mg/L_액체배지, 1 mg/L_액체배지 내지 200 mg/L_액체배지, 10 mg/L_액체배지 내지 200 mg/L_액체배지, 5 μg/L_액체배지 내지 100 mg/L_액체배지, 또는 5 μg/L_액체배지 내지 200 mg/L_액체배지 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 피크 농도는 약 10 ng/L_액체배지, 100 ng/L_액체배지, 1 μg /L_액체배지, 5 μg /L_액체배지, 1 mg /L_액체배지, 30 mg /L_액체배지, 100 mg /L_액체배지, 또는 200 mg /L_액체배지 이라면 모두이다. 일정 구현예에서, 이산화탄소 발생율은 약 1 x 10^-18 mmol/L/시간 내지 1 mol/L/시간, 1 mmol/L/시간 내지 1 mol/L/시간, 25 mmol/L/시간 내지 750 mmol/L/시간, 25 mmol/L/시간 내지 75 mmol/L/시간, 250 mmol/L/시간 내지 750 mmol/L/시간, 또는 450 mmol/L/시간 내지 550 mmol/L/시간 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 이산화탄소 발생율은 약 50 mmol/L/시간, 100 mmol/L/시간, 150 mmol/L/시간, 200 mmol/L/시간, 250 mmol/L/시간, 300 mmol/L/시간, 350 mmol/L/시간, 400 mmol/L/시간, 450 mmol/L/시간, 또는 500 mmol/L/시간이라면 모두이다.

또한 본 명세서에서는 (a) 이소프렌의 생산에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하고; 또한 (b) 이소프렌을 생산하는 것을 포함하는 이소프렌을 생산하는 방법이 제공되고, 여기에서 배양액에서 세포에 의해 생산된 이소프렌의 피크 농도는 약 10 ng/L_액체배지 이상이고, 세포 생존도는 약 두 배 이하로 감소된다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 피크 농도는 "대표적인 이소프렌의 생산"이라는 제목으로 된 섹션에 기술된 농도 또는 양이라면 모두이다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 피크 농도는 약 10 ng/L_액체배지 내지 500 ng/L_액체배지, 500 ng/L_액체배지 내지 1 μg/L_액체배지, 1 μg/L_액체배지 내지 5 μg/L_액체배지, 5 μg/L_액체배지 내지 50 μg/L_액체배지, 5 μg/L_액체배지 내지 100 μg/L_액체배지, 5 μg/L_액체배지 내지 250 μg/L_액체배지, 250 μg/L_액체배지 내지 500 μg/L_액체배지, 500 μg/L_액체배지 내지 1 mg/L_액체배지, 1 mg/L_액체배지 내지 50 mg/L_액체배지, 1 mg/L_액체배지 내지 100 mg/L_액체배지, 1 mg/L_액체배지 내지 200 mg/L_액체배지, 10 mg/L_액체배지 내지 200 mg/L_액체배지, 5 μg/L_액체배지 내지 100 mg/L_액체배지, 또는 5 μg/L_액체배지 내지 200 mg/L_액체배지 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 피크 농도는 약 10 ng/L_액체배지, 100 ng/L_액체배지, 1 μg /L_액체배지, 5 μg /L_액체배지, 1 mg /L_액체배지, 30 mg /L_액체배지, 100 mg /L_액체배지, 또는 200 mg /L_액체배지 이라면 모두이다. 일정 구현예에서, 세포 생존도는 약 1.75배, 1.5배, 1.25배, 1배, 0.75배, 0.5배, 또는 0.25배 이하라면 모두로 감소된다. 일정 구현예에서, 세포 생존도는 약 2배로 감소된다.

또한 본 명세서에서는 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 배양에서의 세포가 제공되고, 여기에서 세포는 이소프렌을 약 400 nmole/g_wcm/시간 이상으로 생산하고, 이산화탄소 발생율은 약 1 x 10^-18 mmol/L/시간 이상이다. 일정 구현예에서, 생산된 이소프렌은 "대표적인 이소프렌의 생산"이라는제목으로 된 섹션에 기술된 농도 또는 양이라면 모두이다. 일정 구현예에서, 이소프렌량은 약 400 nmole/g_wcm/시간 내지 1 mole/g_wcm/시간, 약 400 nmole/g_wcm/시간 내지 1 mmole/g_wcm/시간, 약 400 nmole/g_wcm/시간 내지 40 mmole/g_wcm/시간, 약 400 nmole/g_wcm/시간 내지 4 mmole/g_wcm/시간, 약 1 mmole/g_wcm/시간 내지 1.5 mmole/g_wcm/시간, 약 1.5 mmole/g_wcm/시간 내지 3 mmole/g_wcm/시간, 약 3 mmole/g_wcm/시간 내지 5 mmole/g_wcm/시간, 약 5 mmole/g_wcm/시간 내지 25 mmole/g_wcm/시간, 약 25 mmole/g_wcm/시간 내지 100 mmole/g_wcm/시간, 약 100 mmole/g_wcm/시간 내지 500 mmole/g_wcm/시간, 또는 약 500 mmole/g_wcm/시간 내지 1000 mmole/g_wcm/시간 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 이소프렌량은 약 1 nmole/g_wcm/시간, 1.5 nmole/g_wcm/시간, 2 nmole/g_wcm/시간, 3 nmole/g_wcm/시간, 4 nmole/g_wcm/시간, 또는 5 nmole/g_wcm/시간이라면 모두이다. 일정 구현예에서, 이산화탄소 발생율은 약 1 x 10^-18 mmol/L/시간 내지 1 mol/L/시간, 1 mmol/L/시간 내지 1 mol/L/시간, 25 mmol/L/시간 내지 750 mmol/L/시간, 25 mmol/L/시간 내지 75 mmol/L/시간, 250 mmol/L/시간 내지 750 mmol/L/시간, 또는 450 mmol/L/시간 내지 550 mmol/L/시간 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 이산화탄소 발생율은 약 50 mmol/L/시간, 100 mmol/L/시간, 150 mmol/L/시간, 200 mmol/L/시간, 250 mmol/L/시간, 300 mmol/L/시간, 350 mmol/L/시간, 400 mmol/L/시간, 450 mmol/L/시간, 또는 500 mmol/L/시간이라면 모두이다.

또한 본 명세서에서는 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 배양에서의 세포가 제공되고, 여기에서 배양액에서 세포에 의해 생산된 이소프렌의 전체 누적 생산도는 약 0.2 mg/L_액체배지/시간 이상이고, 세포의 이산화탄소 발생율은 약 1 x 10^-18 mmol/L/시간 이상이다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 전체 누적 생산도는 "대표적인 이소프렌의 생산"이라는 제목으로 된 섹션에 기술된 농도 또는 양이라면 모두이다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 전체 누적 생산도는 약 0.2 mg/L_액체배지/시간 내지 약 5 g/L_액체배지/시간, 약 0.2 mg/L_액체배지/시간 내지 약 1 g/L_액체배지/시간, 약 1 mg/L_액체배지/시간 내지 약 2.5 g/L_액체배지/시간, 약 2.5 g/L_액체배지/시간 내지 약 5 g/L_액체배지/시간 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 이산화탄소 발생율은 약 1 x 10^-18 mmol/L/시간 내지 1 mol/L/시간, 1 mmol/L/시간 내지 1 mol/L/시간, 25 mmol/L/시간 내지 750 mmol/L/시간, 25 mmol/L/시간 내지 75 mmol/L/시간, 250 mmol/L/시간 내지 750 mmol/L/시간, 또는 450 mmol/L/시간 내지 550 mmol/L/시간 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 이산화탄소 발생율은 약 50 mmol/L/시간, 100 mmol/L/시간, 150 mmol/L/시간, 200 mmol/L/시간, 250 mmol/L/시간, 300 mmol/L/시간, 350 mmol/L/시간, 400 mmol/L/시간, 450 mmol/L/시간, 또는500 mmol/L/시간이라면 모두이다.

또한 본 명세서에서는 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 배양에서의 세포가 제공되고, 여기에서 배양액에서 세포에 의해 생산된 이소프렌의 피크 농도는 약 10 ng/L_액체배지 이상이고, 세포의 이산화탄소 발생율은 약 1 x 10^-18 mmol/L/시간 이상이다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 피크 농도는 "대표적인 이소프렌의 생산"이라는 제목으로 된 섹션에 기술된 농도 또는 양이라면 모두이다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 피크 농도는 약 10 ng/L_액체배지 내지 500 ng/L_액체배지, 500 ng/L_액체배지 내지 1 μg/L_액체배지, 1 μg/L_액체배지 내지 5 μg/L_액체배지, 5 μg/L_액체배지 내지 50 μg/L_액체배지, 5 μg/L_액체배지 내지 100 μg/L_액체배지, 5 μg/L_액체배지 내지 250 μg/L_액체배지, 250 μg/L_액체배지 내지 500 μg/L_액체배지, 500 μg/L_액체배지 내지 1 mg/L_액체배지, 1 mg/L_액체배지 내지 50 mg/L_액체배지, 1 mg/L_액체배지 내지 100 mg/L_액체배지, 1 mg/L_액체배지 내지 200 mg/L_액체배지, 10 mg/L_액체배지 내지 200 mg/L_액체배지, 5 μg/L_액체배지 내지 100 mg/L_액체배지, 또는 5 μg/L_액체배지 내지 200 mg/L_액체배지 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 피크 농도는 약 10 ng/L_액체배지, 100 ng/L_액체배지, 1 μg /L_액체배지, 5 μg /L_액체배지, 1 mg /L_액체배지, 30 mg /L_액체배지, 100 mg /L_액체배지, 또는 200 mg /L_액체배지 이라면 모두이다. 일정 구현예에서, 이산화탄소 발생율은 약 1 x 10^-18 mmol/L/시간 내지 1 mol/L/시간, 1 mmol/L/시간 내지 1 mol/L/시간, 25 mmol/L/시간 내지 750 mmol/L/시간, 25 mmol/L/시간 내지 75 mmol/L/시간, 250 mmol/L/시간 내지 750 mmol/L/시간, 또는 450 mmol/L/시간 내지 550 mmol/L/시간 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 이산화탄소 발생율은 약 50 mmol/L/시간, 100 mmol/L/시간, 150 mmol/L/시간, 200 mmol/L/시간, 250 mmol/L/시간, 300 mmol/L/시간, 350 mmol/L/시간, 400 mmol/L/시간, 450 mmol/L/시간, 또는 500 mmol/L/시간이라면 모두이다.

본 명세서에서 기술된 방법 및 세포라면 모두의 일정 구현예에서, MVA 경로 및/또는 DXP 경로 핵산의 이종유래 및/또는 이중 사본의 하나 이상으로부터 나온 MVA 경로 및/또는 DXP 경로 RNA 및/또는 단백질을 발현하는 세포의 이산화탄소 발생율 및/또는 세포 생존도는 MVA 경로 및/또는 DXP 경로 핵산의 이종유래 및/또는 이중 사본의 하나 이상이 결여된 대조군 세포와 대비된다. 일정 구현예에서, MVA 경로 및/또는 DXP 경로 핵산의 이종유래 및/또는 이중 사본의 하나 이상으로부터 나온 MVA 경로 및/또는 DXP 경로 RNA 및/또는 단백질을 유도성 프로모터의 조절 하에서 발현하는 세포의 이산화탄소 발생율 및/또는 세포 생존도는 프로모터가 유도될 때, MVA 경로 및/또는 DXP 경로 핵산의 이종유래 및/또는 이중 사본의 하나 이상을 유도성 프로모터의 조절 하에서 프로모터가 유도되지 않을 때 (uninduced) 이를 포함하는 대조군 세포와 대비된다. 일정 구현예에서, 유도성 프로모터는 베타-갈락토시다제 프로모터이다.

일정 구현예에서, 이소프렌을 생산하는 방법은 (a) 이소프렌의 생산에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하고; 또한 (b) 이소프렌을 생산하는 것:을 포함하고, 여기에서 세포는 이소프렌을 약 400 nmole/g_wcm/시간 이상으로 생산하고, 세포의 이산화탄소 발생율은 약 1 x 10^-18 mmol/L/시간 이상이다. 좀 더 나아가 본 명세서에서는 (a) 이소프렌의 생산에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하고; 또한 (b) 이소프렌을 생산하는 것:을 포함하는 이소프렌을 생산하는 방법이 제공되고, 여기에서 배양액에서 세포에 의해 생산된 이소프렌의 전체 누적 생산도는 약 0.2 mg/L_액체배지/시간 이상이고, 세포의 이산화탄소 발생율은 약 1 x 10^-18 mmol/L/시간 이상이다. 또한 본 명세서에서는 (a) 이소프렌의 생산에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하고; 또한 (b) 이소프렌을 생산하는 것:을 포함하는 이소프렌을 생산하는 방법이 제공되고, 여기에서 배양액에서 세포에 의해 생산된 이소프렌의 피크 농도는 약 10 ng/L_액체배지 이상이고, 세포의 이산화 발생율은 약 1 x 10^-18 mmol/L/시간 이상이다. 이들 방법이라면 모두의 일정 구현예에서, 이산화탄소 발생율은 약 1 x 10^-18 mmol/L/시간 내지 1 mol/L/시간, 1 mmol/L/시간 내지 1 mol/L/시간, 25 mmol/L/시간 내지 750 mmol/L/시간, 25 mmol/L/시간 내지 75 mmol/L/시간, 250 mmol/L/시간 내지 750 mmol/L/시간, 또는 450 mmol/L/시간 내지 550 mmol/L/시간 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 이산화탄소 발생율은 약 50 mmol/L/시간 또는 500 mmol/L/시간이다.

본 명세서에서는 좀 더 나아가 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 배양되는 세포가 제공되고, 여기에서 세포는 이소프렌을 약 400 nmole/g_wcm/시간 이상으로 생산하고, 세포의 이산화탄소 발생율은 약 1 x 10^-18 mmol/L/시간 이상이다. 또한 본 명세서에서는 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 배양에서의 세포가 제공되고, 여기에서 배양액에서 세포에 의해 생산된 이소프렌의 전체 누적 생산도는 약 0.2 mg/L_액체배지/시간 이상이고, 세포의 이산화탄소 발생율은 약 1 x 10^-18 mmol/L/시간 이상이다. 또한, 본 명세서에서는 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 배양에서의 세포가 제공되고, 여기에서 배양되는 세포에 의해 생산된 이소프렌의 피크 농도는 약 10 ng/L_액체배지 이상이고, 세포의 이산화 발생율은 약 1 x 10^-18 mmol/L/시간 이상이다. 이들 배양에서의 세포라면 모두의 일정 구현예에서, 이산화탄소 발생율은 약 1 x 10^-18 mmol/L/시간 내지 1 mol/L/시간, 1 mmol/L/시간 내지 1 mol/L/시간, 25 mmol/L/시간 내지 750 mmol/L/시간, 25 mmol/L/시간 내지 75 mmol/L/시간, 250 mmol/L/시간 내지 750 mmol/L/시간, 또는 450 mmol/L/시간 내지 550 mmol/L/시간 사이의 범위이다. 일정 구현예에서, 이산화탄소 발생율은 약 50 mmol/L/시간 또는 500 mmol/L/시간이다.

본 명세서에서는 또한, a) 세포를 이소프렌의 생산에 적합한 조건 하에서 배양하고; 또한 b) 이소프렌을 생산하는 것을 포함하는 이소프렌을 생산하는 방법이 제공되고, 여기에서, 이소프렌의 액상 농도는 약 200 mg/L 이하이고 세포는 이소프렌을 약 400 nmole/g_wcm/시간 이상으로 생산한다. 일정 구현예에서, 배양액에서의 이소프렌의 액상 농도는 약 175 mg/L, 150 mg/L, 125 mg/L, 100 mg/L, 75 mg/L, 50 mg/L, 25 mg/L, 20 mg/L, 15 mg/L, 10 mg/L, 5 mg/L, 또는2.5 mg/L 이하이다. 일정 구현예에서, 배양에서의 이소프렌의 액상 농도는 약 0.1 mg/L 내지 200 mg/L, 1 mg/L 내지 200 mg/L, 1 mg/L 내지 150 mg/L, 1 mg/L 내지 100 mg/L, 1 mg/L 내지 50 mg/L, 1 mg/L 내지 25 mg/L, 1 mg/L 내지 20 mg/L, 또는 10 mg/L 내지 20 mg/L 사이 범위이다.

또한 본 명세서에서는 (a) 약 250 M/atm 이하의 헨리의 법칙 계수 및 (b) 약 100 g/L 이하의 물 용해도로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 특징을 가지는 화합물을 생산하는 방법이 제공된다. 일정 구현예에서, 본 방법은 a) 기체가 약 0.01 vvm 내지 약 2.0 vvm 사이의 기체 살포율로 첨가되는 (발효 시스템과 같은 시스템에서 기체의 첨가와 같음), 화합물의 생산에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하고; 또한 b) 화합물을 생산하는 것:을 포함한다. 일정 구현예에서, 화합물의 헨리의 법칙 계수는 약 250 M/atm, 200 M/atm, 150 M/atm, 100 M/atm, 75 M/atm, 50 M/atm, 25 M/atm, 10 M/atm, 5 M/atm, 또는 1 M/atm 이하라면 모두이다. 일정 구현예에서, 화합물의 물 용해도는 약 75 g/L, 50 g/L, 25 g/L, 10 g/L, 5 g/L, 또는 1 g/L 이하라면 모두이다. 일정 구현예에서, 화합물은 이소프렌, 알데하이드 (예로, 아세트알데하이드), 케톤 (예로, 아세톤 또는 2-부탄온), 알코올 (예로, 메탄올, 에탄올, 1-부탄올 또는 3-메틸-3-부텐-1-올 또는 3-메틸-2-부텐-1올과 같은 C5알코올), 알코올의 에스테르 (에틸아세테이트 또는 C5 알코올의 에틸에스테르), 헤미테르펜 (hemiterpenes), 모노테르펜 (monoterpenes), 세스퀴테르펜 (sesquiterpenes) 및 C1 내지 C5 탄화수소 (예로, 메탄, 에탄, 에틸렌, 또는 프로필렌)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일정 구현예에서, C1 내지 C5 탄화수소는 포화, 불포화, 또는 가지상이다. 상세한 구현예에서, 화합물은 이소프렌이다. 상기 기술된 화합물이라면 모두를 생산하는 방법의 일정 구현예에서, 기체 살포율은 약 0.1 vvm 내지 1 vvm, 0.2 vvm 내지 1 vvm, 또는 0.5 vvm 내지 1 vvm 사이라면 모두의 범위이다.

한 가지 관점에서, 배양에서의 세포가 이소프렌을 생산하는 데 사용된다. 일정 구현예에서, 본 배양에서의 세포는 약 400 nmole 이소프렌/세포의 습윤 무게에 대한 세포의 그램수/시간 (nmole/g_wem/시간) 이상의 이소프렌을 생산한다. 일정 구현예에서, 세포는 (i) 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코드하고 (ii) 프로모터에 작동적으로 연결된 이종유래 핵산을 포함한다. 일정 구현예에서, 세포는 이에 제한되는 것은 아니지만 탄소화물, 글리세롤, 글리세린, 디하이드록시아세톤, 일-탄소원, 오일, 동물 지방, 동물 오일, 지방산, 지질, 인지질, 글리세롤지질, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 트리글리세라이드, 재생가능한 탄소원, 폴리펩타이드 (예로, 미생물 또는 식물 단백질 또는 펩타이드), 효모 추출물, 효모 추출물로부터 나온 성분, 또는 전술한 둘 이상의 조합이라면 모두과 같은 탄소원을 포함하는 배양 배지에서 배양된다. 일정 구현예에서, 세포는 제한된 포도당 조건 하에서 배양된다.

일정 구현예에서, 본 배양에서의 세포는 세포 배양 배지에서 약 0.002% 이상의 탄소를 이소프렌으로 전환시킨다. 일정 구현예에서, 세포는 (i) 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코드하고 또한 (ii) 프로모터에 작동적으로 연결된 이종유래 핵산을 가진다. 일정 구현예에서, 세포는 이에 제한되는 것은 아니지만 탄소화물, 글리세롤, 글리세린, 디하이드록시아세톤, 일-탄소원, 오일, 동물 지방, 동물 오일, 지방산, 지질, 인지질, 글리세롤지질, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 트리글리세라이드, 재생가능한 탄소원, 폴리펩타이드 (예로, 미생물 또는 식물 단백질 또는 펩타이드), 효모 추출물, 효모 추출물로부터 나온 성분, 또는 전술한 둘 이상의 조합이라면 모두과 같은 탄소원을 포함하는 배양 배지에서 배양된다. 일정 구현예에서, 세포는 제한된 포도당 조건 하에서 배양된다.

일정 구현예에서, 본 배양에서의 세포는 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산을 포함한다. 일정 구현예에서, 세포는 (i) 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코드하고 또한 (ii) 프로모터에 작동적으로 연결된 이종유래 핵산을 가진다. 일정 구현예에서, 세포는 이에 제한되는 것은 아니지만 탄소화물, 글리세롤, 글리세린, 디하이드록시아세톤, 일-탄소원, 오일, 동물 지방, 동물 오일, 지방산, 지질, 인지질, 글리세롤지질, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 트리글리세라이드, 재생가능한 탄소원, 폴리펩타이드 (예로, 미생물 또는 식물 단백질 또는 펩타이드), 효모 추출물, 또는 효모 추출물로부터 나온 성분, 또는 전술한 둘 이상의 조합이라면 모두과 같은 탄소원을 포함하는 배양 배지에서 배양된다. 일정 구현예에서, 세포는 제한된 포도당 조건 하에서 배양된다.

한 가지 관점에서, 본 명세서에서는 이소프렌을 생산하도록 본 명세서에서 기술된 세포라면 모두를 사용하는 방법과 같은, 이소프렌을 생산하는 방법이 기술된다. 일정 구현예에서, 방법은 이소프렌을 약 400 nmole/g_wem/시간 이상으로 생산하는 데 충분한 조건 하에서 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 본 방법은 또한 세포에 의해 생산된 이소프렌을 회수하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 방법은 좀 더 나아가 세포에 의해 생산된 이소프렌을 정제하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 본 방법은 이소프렌을 다중합하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 세포는 (i) 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코드하고 (ii) 프로모터에 작동적으로 연결된 이종유래 핵산을 가진다. 일정 구현예에서, 세포는 이에 제한되는 것은 아니지만 탄소화물, 글리세롤, 글리세린, 디하이드록시아세톤, 일-탄소원, 오일, 동물 지방, 동물 오일, 지방산, 지질, 인지질, 글리세롤지질, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 트리글리세라이드, 재생가능한 탄소원, 폴리펩타이드 (예로, 미생물 또는 식물 단백질 또는 펩타이드), 효모 추출물, 또는 효모 추출물로부터 나온 성분, 또는 전술한 둘 이상의 조합이라면 모두과 같은 탄소원을 포함하는 배양 배지에서 배양된다. 일정 구현예에서, 세포는 제한된 포도당 조건 하에서 배양된다. 다양한 구현예에서, 안정기 동안 생산된 이소프렌량 (생산된 이소프렌의 전체량 또는 OD₆₀₀당 시간 당 액체배지 리터 당 생산된 이소프렌량과 같음)은 동일한 기간에 성장기 동안 생산된 이소프렌량보다 약 2배 이상이다. 일정 구현예에서, 기체상은 약 9.5% (부피) 산소 이상을 포함하고, 기체상에서 이소프렌의 농도는 저부 발화도 한계 이하이고, 고부 발화도 한계 이상이다. 상세한 구현예에서, (i) 기체상에서 이소프렌의 농도는 저부 발화도 한계 이하이고, 고부 발화도 한계 이상이고, 또한 (ii) 세포는 이소프렌을 약 400 nmole/g_wcm/시간 이상으로 생산한다.

일정 구현예에서, 본 방법은 세포 배양 배지에서 약 0.002% 이상의 탄소 (mol/mol)를 이소프렌으로 전환시키는 데 충분한 조건 하에서 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 방법은 또한 세포에 의해 생산된 이소프렌을 회수하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 방법은 세포에 의해 생산된 이소프렌을 정제하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 방법은 이소프렌을 다중합하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 세포는 (i) 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코드하고 또한 (ii) 프로모터에 작동적으로 연결된 이종유래 핵산을 가진다. 일정 구현예에서, 세포는 이에 제한되는 것은 아니지만 탄소화물, 글리세롤, 글리세린, 디하이드록시아세톤, 일-탄소원, 오일, 동물 지방, 동물 오일, 지방산, 지질, 인지질, 글리세롤지질, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 트리글리세라이드, 재생가능한 탄소원, 폴리펩타이드 (예로, 미생물 또는 식물 단백질 또는 펩타이드), 효모 추출물, 또는 효모 추출물로부터 나온 성분, 또는 전술한 둘 이상의 조합이라면 모두과 같은 탄소원을 포함하는 배양 배지에서 배양된다. 일정 구현예에서, 세포는 제한된 포도당 조건 하에서 배양된다.

일정 구현예에서, 이소프렌은 안정기에만 생산된다. 일정 구현예에서, 이소프렌은 성장기 및 안정기 둘 다에서 공동-생산된다. 다양한 구현예에서, 안정기 동안 생산된 이소프렌량 (생산된 이소프렌의 전체량 또는 OD₆₀₀당 시간 당 액체배지 리터 당 생산된 이소프렌량과 같음)은 동일한 기간에 성장기 동안 생산된 이소프렌량보다 약 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 또는 50배 이상이다.

한 가지 관점에서, 본 명세서에서는 이소프렌을 포함하는 조성물들 및 시스템들이 기술된다. 일정 구현예에서, 조성물은 약 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 mg 이상의 이소프렌을 포함한다. 일정 구현예에서, 조성물은 약 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 g 이상의 이소프렌(w/w)을 포함하고, 조성물의 휘발성 유기 분획은 이소프렌이다.

일정 구현예에서, 조성물은 조성물 내의 모든 C5 탄화수소의 전체 무게와 대비한 무게로 약 99.90, 99.92, 99.94, 99.96, 99.98, 또는 100% 이상의 이소프렌을 포함한다. 일정 구현예에서, 조성물은 조성물 내의 모든 C5 탄화수소의 전체 무게와 대비한 무게로 약 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005, 또는 0.00001% 이하의 이소프렌이 아닌 C5 탄화수소 (1,3-사이클로펜타디엔, 시스-1,3-펜타디엔, 트랜스-1,3-펜타디엔, 1,4-펜타디엔, 1-펜틴, 2-펜틴, 1-펜텐, 2-메틸-1-부텐, 3-메틸-l-부틴, 펜트-4-엔-1-인, 트랜스-펜트-3-엔-1-인, 또는 시스-펜트-3-엔-1-인과 같음)를 포함한다. 일정 구현예에서, 조성물은 1,3-사이클로펜타디엔, 시스-1,3-펜타디엔, 트랜스-1,3-펜타디엔, 1,4-펜타디엔, 1-펜틴, 2-펜틴, 1-펜텐, 2-메틸-1-부텐, 3-메틸-l-부틴, 펜트-4-엔-1-인, 트랜스-펜트-3-엔-1-인, 또는 시스-펜트-3-엔-1-인에 대하여 조성물 내의 모든 C5 탄화수소의 전체 무게와 대비한 무게로 약 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005, 또는 0.00001% 이하로 가진다. 상세한 구현예에서, 조성물은 약 2 mg이상의 이소프렌을 가지고, 조성물 내의 모든 C5 탄화수소의 전체 무게와 대비한 무게로 약 99.90, 99.92, 99.94, 99.96, 99.98, 또는 100% 이상의 이소프렌을 가진다.

일정 구현예에서, 조성물은 이소프렌의 다중합을 저해하는 조성물에 있는 화합물이라면 모두에 대해 약 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 또는 0.005 μg/L 이하의 이소프렌의 다중합을 저해하는 화합물을 포함한다. 상세한 구현예에서, 조성물은 또한 약 2 mg 이상의 이소프렌을 포함한다.

일정 구현예에서, 조성물은 에탄올, 아세톤, C5 프레닐 알코올, 및 10개 이상의 탄소 원자를 가진 이소프레노이드 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 가진다. 일정 구현예에서, 조성물은 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100, 또는 120 μg/L 이상의 에탄올, 아세톤, C5 프레닐 알코올 (3-메틸-3-부텐-1-올, 또는 3-메틸-2-부텐-1-올과 같음), 또는 전술한 둘 이상이라면 모두를 포함한다. 상세한 구현예에서, 조성물은 약 2 mg 이상의 이소프렌을 가지고, 에탄올, 아세톤, C5 프레닐 알코올, 및 10개 이상의 탄소 원자를 가진 이소프레노이드 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 가진다.

일정 구현예에서, 조성물은 이소프렌과 하기 성분으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 두 번째 화합물을 포함한다: 2-헵탄온, 6-메틸-5-헵텐-2-온, 2,4,5-트리메틸피리딘, 2,3,5-트리메틸피라진, 시트로넬랄 (citronellal), 아세트알데하이드, 메탄티올, 메틸 아세테이트, 1-프로판올, 디아세틸, 2-부탄온, 2-메틸-3-부텐-2-올, 에틸 아세테이트, 2-메틸-1-프로판올, 3-메틸-1-부탄알, 3-메틸-2-부탄온, 1-부탄올, 2-펜탄온, 3-메틸-1-부탄올, 에틸 이소부틸레이트, 3-메틸-2-부텐알, 부틸 아세테이트, 3-메틸부틸 아세테이트, 3-메틸-3-부텐-1-일 아세테이트, 3-메틸-2-부텐-1-일 아세테이트, 3-메틸-2-부텐-1-일 아세테이트, 3-헥센-1-올, 3-헥센-1-일 아세테이트, 리모넨, 게라니올 (트랜스-3,7-디메틸-2,6-옥타디엔-1-올), 시트로넬롤 (3,7-디메틸-6-옥텐-1-올), (E)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔, (Z)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔, 및 2,3-사이클로헵텐올피리딘. 다양한 구현예에서, 무게에 의한 퍼센트 단위로 이소프렌량에 상대적인 이들 두 번째 성분 하나의 양 (예로, 이소프렌의 무게로 나눈 성분의 무게 곱하기 100)은 약 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 110% (w/w) 이상이다.

일정 구현예에서, 조성물은 (i) 이소프렌을 포함하는 기체상 및 (ii) 이소프렌을 약 400 nmole/g_wcm/시간 이상으로 생산하는 배양에서의 세포를 포함하는 조성물을 포함한다. 일정 구현예에서, 조성물은 폐쇄 시스템을 포함하고, 기체상은 OD₆₀₀이 1인 1 mL로 정상화될 때 이소프렌을 약 5. 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ug/L 이상으로 포함한다. 일정 구현예에서, 조성물은 개방 시스템을 포함하고, 기체상은 1 vvm의 속도로 살포될 때 이소프렌을 약 5. 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ug/L 이상으로 포함한다. 일정 구현예에서, 기체상의 휘발성 유기 분획은 이소프렌을 휘발성 유기 분획 내의 모든 C5 탄화수소의 전체 무게와 대비한 무게로 약 99.90, 99.92, 99.94, 99.96, 99.98, 또는 100% 이상으로 포함한다. 일정 구현예에서, 기체상의 휘발성 유기 분획은 휘발성 유기 분획 내의 모든 C5 탄화수소의 전체 무게와 대비한 무게로 약 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005, 또는 0.00001% 이하의 이소프렌이 아닌 C5 탄화수소 (1,3-사이클로펜타디엔, cis-1,3-펜타디엔, trans-1,3-펜타디엔, 1,4-펜타디엔, 1-펜틴, 2-펜틴, 1-펜틴, 2-메틸-1-부텐, 3-메틸-l-부틴, 펜트-4-엔-1-인, trans-펜트-3-엔-1-인, 또는 cis-펜트-3-엔-1-인과 같음)를 포함한다. 일정 구현예에서, 기체상의 휘발성 유기 분획은 1,3-사이클로펜타디엔, cis-1,3-펜타디엔, trans-1,3-펜타디엔, 1,4-펜타디엔, 1-펜틴, 2-펜틴, 1-펜틴, 2-메틸-1-부텐, 3-메틸-l-부틴, 펜트-4-엔-1-인, trans-펜트-3-엔-1-인, 또는 cis-펜트-3-엔-1-인에 대하여 휘발성 유기 분획 내의 모든 C5 탄화수소의 전체 무게와 대비한 무게로 약 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005, 또는 0.00001% 이하로 가진다. 상세한 구현예에서, 기체상의 휘발성 유기 분획은 약 2 mg 이상의 이소프렌을 가지고, 휘발성 유기 분획 내의 모든 C5 탄화수소의 전체 무게와 대비한 무게로 약 99.90, 99.92, 99.94, 99.96, 99.98, 또는 100% 이상의 이소프렌을 가진다.

일정 구현예에서, 기체상의 휘발성 유기 분획은 이소프렌의 다중합을 저해하는 기체상의 휘발성 유기 분획에 있는 화합물이라면 모두에 대해 약 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 또는0.005 μg/L 이하의 이소프렌의 다중합를 저해하는 화합물을 포함한다. 상세한 구현예에서, 기체상의 휘발성 유기 분획은 또한 약 2 mg 이상의 이소프렌을 포함한다.

일정 구현예에서, 기체상의 휘발성 유기 분획은 에탄올, 아세톤, C5 프레닐 알코올, 및 10개 이상의 탄소 원자를 가진 이소프레노이드 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 가진다. 일정 구현예에서, 기체상의 휘발성 유기 분획은 약 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100, 또는 120 μg/L 이상의 에탄올, 아세톤, C5 프레닐 알코올 (3-메틸-3-부텐-1-올, 또는 3-메틸-2-부텐-1-올과 같음), 또는 전술한 둘 이상이라면 모두를 포함한다. 상세한 구현예에서, 기체상의 휘발성 유기 분획은 약 2 mg 이상의 이소프렌을 가지고, 에탄올, 아세톤, C5 프레닐 알코올, 및 10개 이상의 탄소 원자를 가진 이소프레노이드 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 가진다.

일정 구현예에서, 기체상의 휘발성 유기 분획은 이소프렌과, 2-헵탄온, 6-메틸-5-헵텐-2-온, 2,4,5-트리메틸피리딘, 2,3,5-트리메틸피라진, 시트로넬랄 (citronellal), 아세트알데하이드, 메탄티올, 메틸 아세테이트, 1-프로판올, 디아세틸, 2-부탄온, 2-메틸-3-부텐-2-올, 에틸 아세테이트, 2-메틸-1-프로판올, 3-메틸-1-부탄알, 3-메틸-2-부탄온, 1-부탄올, 2-펜탄온, 3-메틸-1-부탄올, 에틸 이소부틸레이트, 3-메틸-2-부텐알, 부틸 아세테이트, 3-메틸부틸 아세테이트, 3-메틸-3-부텐-1-일 아세테이트, 3-메틸-2-부텐-1-일 아세테이트, 3-헥센-1-올, 3-헥센-1-일 아세테이트, 리모넨, 게라니올 (트랜스-3,7-디메틸-2,6-옥타디엔-1-올), 시트로넬롤 (3,7-디메틸-6-옥텐-1-올), (E)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔, (Z)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔, 및 2,3-사이클로헵텐올피리딘으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 두 번째 화합물을 포함한다. 다양한 구현예에서, 무게에 의한 퍼센트 단위로 이소프렌량에 상대적인 이들 두 번째 성분 하나의 양 (예로, 이소프렌의 무게로 나눈 성분의 무게 곱하기 100)은 기체상의 휘발성 유기 분획에서 약 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 110% (w/w) 이상이다.

본 명세서에서 기술된 조성물이라면 모두의 일정 구현예에서, 적어도 이소프렌 일부분은 기체상으로 있다. 일정 구현예에서, 적어도 이소프렌 일부분은 액상 (농축물과 같음)으로 있다. 일정 구현예에서, 적어도 이소프렌 일부분은 기체상으로 있다. 일정 구현예에서, 적어도 이소프렌 일부분은 실리카 및/또는 활성화 탄소를 포함하는 지지체와 같은 고체 지지체에 흡착되어 있다. 일정 구현예에서, 조성물은 에탄올을 포함한다. 일정 구현예에서, 조성물은 에탄올의 무게로 약 75 내지 약 80%, 약 80 내지 약 85%, 또는 약 85 내지 약 90%와 같은 에탄올을 무게로 약 75 내지 약 90% 사이의 범위로 포함한다. 일정 구현예에서, 조성물은 이소프렌의 무게로 약 4 내지 약 8%, 약 8 내지 약 12%, 또는 약 12 내지 약 15%와 같은 이소프렌을 무게로 약 4 내지 약 15% 사이의 범위로 포함한다.

일정 구현예에서, 본 시스템은 본 명세서에서 기술된 세포 및/또는 조성물이라면 모두를 포함한다. 일정 구현예에서, 시스템은 체임버가 이소프렌을 약 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 또는 5,000 nmole/g_wcm/시간 이상으로 생산하는 배양에서의 세포를 포함하는 반응기를 포함한다. 일정 구현예에서, 시스템은 폐쇄된 시스템이 아니다. 일정 구현예에서, 적어도 이소프렌의 일부분은 시스템으로부터 제거된다. 일정 구현예에서, 시스템은 이소프렌을 포함하는 기체상을 포함한다. 다양한 구현예에서, 기체상은 본 명세서에서 기술된 조성물이라면 모두를 포함한다.

본 명세서에서 기술된 조성물들, 시스템들, 및 방법들이라면 모두의 일정 구현예에서, 기체상에서 발화가능하지 않은 농도의 이소프렌이 생성된다. 일정 구현예에서, 기체상은 약 9.5% (부피) 이하의 산소를 포함한다. 일정 구현예에서, 기체상은 약 9.5% (부피) 이상의 산소를 포함하고, 기체상에서 이소프렌의 농도는 저부 발화도 한계 이하이고, 고부 발화도 한계 이상이다. 일정 구현예에서, 이소프렌이 아닌 기체상의 부분은 약 10% 내지 약 100% (부피) 사이의 산소와 같은 약 0% 내지 약 100% (부피) 사이 범위의 산소를 포함한다. 일정 구현예에서, 이소프렌이 아닌 기체상의 부분은 약 0% 내지 약 99% (부피) 사이 범위의 질소를 포함한다. 일정 구현예에서, 이소프렌이 아닌 기체상의 부분은 약 1% 내지 약 50% (부피) 사이 범위의 CO₂를 포함한다.

본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 배양에서의 세포는 이소프렌을 약 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 또는 5,000 nmole/g_wcm/시간 이상으로 생산한다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 배양에서의 세포는 세포 배양 배지에서 탄소의 약 0.002, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.12, 0.14, 0.16, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6% 이상을 이소프렌으로 전환시킨다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 배양에서의 세포는 이소프렌을 약 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 100,000 ng/세포의 습윤 무게에 대한 세포의 그램수/시간 (ng/g_wcm/h) 이상으로 생산한다. 본 발명의 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 배양에서의 세포는 이소프렌의 누적 역가 (전체량)을 약 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000 mg 이소프렌/L 액체배지 (mg/L_액체배지, 여기에서 액체배지의 부피는 세포 및 세포 배지의 부피를 포함한다) 이상으로 생산한다. 기타 대표적인 이소프렌 생산의 속도 및 이소프렌 생산의 전체량은 본 명세서에 기재되어 있다.

본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 세포는 좀 더 나아가 IDI 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산을 포함한다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 세포는 좀 더 나아가 IDI 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산의 사본의 삽입을 포함한다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 세포는 좀 더 나아가 DXS 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산을 포함한다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 세포는 좀 더 나아가 DXS 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산 사본의 삽입을 포함한다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 세포는 좀 더 나아가 IDI 폴리펩타이드 및 DXS 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함한다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 하나의 핵산은 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드, IDI 폴리펩타이드, 및 DXS 폴리펩타이드를 인코드한다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 하나의 벡터는 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드, IDI 폴리펩타이드, 및 DXS 폴리펩타이드를 인코드한다. 일정 구현예에서, 벡터는 항생제 저항성 핵산과 같은 선별 마커를 포함한다.

본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 이종유래 이소프렌 합성효소는 중간 또는 높은 사본수 플라스미드에 포함되는 T7 프로모터와 같은 T7 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 이종유래 이소프렌 합성효소 핵산은, 중간 또는 높은 사본수 플라스미드에 포함되는 Trc 프로모터와 같은 Trc 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 이종유래 이소프렌 합성효소 핵산은, 낮은 사본수 플라스미드에 포함되는 Lac 프로모터와 같은 Lac 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 이종유래 이소프렌 합성효소 핵산은, 내재성 알칼라인 세린 프로테아제 프로모터와 같은 내재성 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 이종유래 이소프렌 합성효소 핵산은 선별 마커가 없이 세포의 염색체 내로 통합된다.

일정 구현예에서, 하나 이상의 MVA 경로, IDI, DXP, 또는 이소프렌 합성효소, 핵산은 성장기보다는 안정기에 활성이 더 큰 프로모터 또는 인자의 조절 하에 놓인다. 예를 들어, 하나 이상의 MVA 경로, IDI, DXP, 또는 이소프렌 합성효소 핵산은 RopS와 같은 안정기 시그마인자의 조절 하에 놓인다. 일정 구현예에서, 하나 이상의 MVA 경로, IDI, DXP, 이소프렌 합성효소 핵산은 안정기에 활성이 있는 반응 조절인자에 의해 유도가능한 프로모터와 같은, 안정기에 유도가능한 프로모터의 조절 하에 놓인다.

본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 적어도 세포의 일부분은 이종유래 이소프렌 합성효소 핵산을 연속식 배양 (희석이 없는 연속식 배양과 같음)에서 적어도 또는 약 5, 10, 20, 40, 50, 60 또는 65번 이상의 세포 분열 동안 유지시킨다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 이종유래 이소프렌 합성효소, IDI, 또는 DXS 핵산을 포함하는 핵산도 또한 항생제 저항성 핵산과 같은 선별 마커를 포함한다.

본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 세포는 좀 더 나아가 MVA 경로 폴리펩타이드 (사카로마이세스 세레비시아애 또는 엔테로코커스 페칼리스 로부터 나온 MVA경로 폴리펩타이드와 같음)를 인코딩하는 이종유래 핵산을 포함한다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 세포는 좀 더 나아가 MVA경로 폴리펩타이드 (사카로마이세스 세레비시아애 또는 엔테로코커스 페칼리스 로부터 나온 MVA경로 폴리펩타이드와 같음)를 인코딩하는 이종유래 핵산 사본의 삽입을 포함한다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 세포는 이소프렌 합성효소, DXS, 및 MVA 경로 핵산을 포함한다. 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 세포는 이소프렌 합성효소 핵산, DXS 핵산, IDI 핵산 및 MVA 경로 핵산 (IDI 핵산에 추가함)을 포함한다.

본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드는 푸엘라리아 (Pueraria) (예로, 푸엘라리아 몬타나 (Pueraria montana) 또는 푸엘라리아 로바타 (Pueraria lobata)) 또는 포풀러스 (Populus) (예로, 포풀러스 트레물로이데스 (Populus tremuloides), 포풀러스 알바 (Populus alba), 포풀러스 니그라 (Populus nigra), 포풀러스 트리코카르파 (Populus trichocarpa), 또는 하이브리드 포풀러스 알바 x 포풀러스 트레물라 (Populus alba x Populus tremula))로부터 나온 폴리펩타이드이다.

본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 세포는 그램-양성 박테리아 세포와 같은 박테리아 세포이다 (예로, 바실러스 섭틸리스와 같은 바실러스 세포, 또는 스트렙토마이세스 리비단스 (Streptomyces lividans), 스트렙토마이세스 실리컬러 (Streptomyces coelicolor), 또는 스트렙토마이세스 그리서스 (Streptomyces griseus) 세포와 같은 스트렙토마이세스 세포). 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 세포는 그램-음성 박테리아 세포이다 (예로, 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) 세포와 같은 에스케리키아 세포, 로도슈도모나스 팔루스트리스 세포와 같은 로도모나스 종 세포, 슈도모나스 플루오레센스 세포 또는 슈도모나스 푸티다 세포와 같은 슈도모나스 종 세포, 또는 판토에아 시트레아 세포와 같은 판토에아 세포). 본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 세포는 필라멘트성 곰팡이 세포와 같은 곰팡이 세포 (예로, 트리코더마 리세이 세포와 같은 트리코더마 세포 또는 아스퍼질러스 오리자이 및 아스퍼질러스 니거와 같은 아스퍼질러스 세포) 또는 효모 세포 (예로, 야로위야 리포리티카와 같은 야로위야 세포 또는 사카로마이세스 세레비시애와 같은 사카로마이세스 세포)이다.

본 명세서에서 기술된 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 미생물 폴리펩타이드 탄소원은 효모 또는 박테리아로부터 나온 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명의 관점이라면 모두의 일정 구현예에서, 식물 폴리펩타이드 탄소원은 콩, 옥수수, 카놀라, 자트로파, 팜, 땅콩, 해바라기, 코코넛, 머스타드, 평지종자, 목화종자, 팜 줄기, 올리브, 잇꽃, 참깨, 또는 아마종자로부터 나온 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함한다.

합성 기체를 에너지원으로 사용하여 혐기성 미생물에서 이소프렌의 생산

일정 구현예에서, 바이오이소프렌 조성물은 2009년 12월 22일자로 제출되고 본 명세서에서 내용 전부가 참고문헌으로 통합되어 있는 미국 가특허출원 제 61/289,347호 및 제 61/289,355호에서 기술된 바와 같이, 합성 기체를 에너지원으로 사용하여 혐기성 미생물에서 생산된다.

합성가스 (syngas)로부터 혐기성 생물에 의한 이소프렌의 생산은 호기성 생물에 의한 슈가로부터 이소프렌의 생산보다 많은 장점을 제공할 수 있다. 먼저, 이소프렌의 최대 이론적 질량 수율은 좀 더 나아가 하기에 논의된 바와 같이 호기성 생물의 경우 더 클 수 있다. 둘째, 혐기성 생물은 세포 성장, 부산물 (글리세롤, 젖산, 또는 에탄올)의 형성 또는 분자적 산소를 사용한 산화에 의해 전환되어야만 하는 NAD(P)H의 형태에서 과잉 환원력을 가지지 않는다. 이러한 NAD(P)H 전환 (turnover) 요구가 없더라도, 혐기성 생물은 더 높은 에너지 수율, 더 낮은 산소 요구도, 더 낮은 발효 열, 및 더 낮은 사용 비용을 가지고 공정을 진행할 수 있다. 셋째, 혐기성 생물은 시스템에서의 산소 결핍으로 인해 배출 기체에서 더 높은 이소프렌 농도, 발화가능한 이소프렌-산소 혼합물을 만드는 더 낮은 가능성, 보다 쉬운 회수, 및 더 높은 이소프렌 품질을 가질 수 있다. 네째, 혐기성 생물은 기존의 바이오에탄올의 생산을 위해 설계된 공장과 같은 기존의 기반시설을 사용하여 보다 용이하게 성장될 수 있다.

이소프렌 생산에 유용한 혐기성 생물로는 절대적 혐기성 생물 (obligate anaerobes), 조건부 혐기성 생물 (facultative anaerobes) 및 공기내성 혐기성 생물 (aerotolerant anaerobes)를 포함할 수 있다. 절대적 혐기성 생물은 크로스트리듐 엘정다리 (Clostridium ljungdahlii), 크로스트리듐 오토에타노게늄 (Clostridium autoethanogenum), 유로박테리움 리모슘 (Eurobacterium limosum), 크로스트리듐 카르복시디보란스 (Clostridium carboxydivorans), 펩토스트렙토코커스 프로닥투스 (Peptostreptococcus productus), 및 부티리박테리움 메틸로트로피쿰 (Butyribacterium methylotrophicum)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 조합이라면 모두일 수 있다. 이소프렌의 생산에 에너지원으로서 유용한 합성가스는 메탄 재형성 (methane reforming), 석탄 액화 (coal liquefaction), 보조-발화 (co-firing), 발효적 반응 (fermentative reactions), 효소적 반응 (enzymatic reactions), 및 바이오매스 기체화 (biomass gasification)를 포함하는 다양한 공정에 의해 공급원료로부터 유래할 수 있다.

대표적인 정제 방법

일정 구현예에서, 본 발명에서 기술된 방법이라면 모두는 좀 더 나아가 공동-생산된 화합물을 회수하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 본 발명에서 기술된 방법이라면 모두는 좀 더 나아가 이소프렌을 회수하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 본 발명에서 기술된 방법이라면 모두는 좀 더 나아가 수소를 흡착 매트릭스-기초한 분리 방법인 저온발생 막 (cryogenic membrane)에 의해 회수하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 본 발명에서 기술된 방법이라면 모두는 좀 더 나아가 에탄올을 회수하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 본 발명에서 기술된 방법이라면 모두는 좀 더 나아가 1,3-프로판디올을 회수하는 것을 포함한다.

본 명세서에서 기술된 조성물 및 방법을 사용하여 생산된 이소프렌과 수소는 기체 비워냄법 (gas stripping), 막 증진된 분리법 (membrane enhanced separation), 분획법 (fractionation), 흡착/탈착법 (adsorption/desorption), 증발법 (pervaporation), 고체 상으로부터 이소프렌의 열 또는 증기 탈착법, 또는 용매로 고체 상에 고정되거나 흡수된 이소프렌의 추출법과 같은 표준 방법을 사용하여 회수될 수 있다 (예를 들어, 미국특허 제 4,703,007호, 제 4,570,029호, 및 제 4,740,222호 ("정련 및 석유화학적 배출-기체 스트림으로부터 수소의 회수 및 정제 (Recovery and Purification of Hydrogen from Refinery and Petrochemical Off-gas Streams)")을 참조하고, 이들은 각각 본 명세서에서 참조문헌으로 전부, 상세하게는 이소프렌 회수 및 분리 방법 ('007 및 '029 특허) 및 수소 회수 및 분리 방법 ('222 특허)에 관하여 통합되어 있다). 상세한 구현예에서, 알코올 (에탄올, 메탄올, 프로판올 또는 그의 조합과 같음)을 사용한 추출적 증류법이 이소프렌을 회수하는 데 사용된다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 회수는 액체 형태 (이소프렌의 순수 용액 또는 용매에 녹인 이소프렌 용액과 같음)로 이소프렌의 분리를 포함한다. 기체 비워냄은 연속적 방식으로 발효 배출-기체 증기로부터 이소프렌 증기의 제거를 포함한다. 이러한 제거는, 이에 제한되는 것은 아니지만 고체 상에 대한 흡착, 액상 내로 분배 (partition), 또는 직접적인 농축 (농축 코일에 노출로 인한 또는 압력의 증가로 인한 농축과 같음)을 포함하는 여러 가지 다른 방식으로 달성될 수 있다. 일정 구현예에서, 증기의 이슬점 이상에서 희석된 이소프렌 증기의 막 농축 (membrane enrichment)은 액체 이소프렌의 농축을 가져온다. 일정 구현예에서, 이소프렌은 압축되고 농축된다.

이소프렌의 회수는 한 단계 또는 복수의 단계를 포함할 수 있다. 일정 구현예에서, 발효 배출-기체로부터 이소프렌 증기의 제거 및 액상으로 이소프렌의 전환은 동시적으로 수행된다. 예를 들어, 이소프렌은 액체를 형성하도록 배출-기체로부터 직접 농축될 수 있다. 일정 구현예에서, 발효 배출-기체로부터 이소프렌 증기의 제거 및 액상으로 이소프렌의 전환은 연속적으로 수행된다. 예를 들어, 이소프렌은 고체 상에 흡착된 다음 용매를 사용하여 고체 상으로부터 추출될 수 있다.

수소의 회수는 한 단계 또는 복수의 단계를 포함할 수 있다. 일정 구현예에서, 발효 배출-기체로부터 수소 증기의 제거 및 액상으로 수소의 전환은 동시적으로 수행된다. 일정 구현예에서, 발효 배출-기체로부터 수소 증기의 제거 및 액상으로 수소의 전환은 연속적으로 수행된다. 예를 들어, 수소는 고체 상에 흡착된 다음 압력 스윙 (pressure swing)에 의해 고체 상으로부터 탈착된다. 일정 구현예에서, 회수된 수소는 농축되고 압축된다.

일정 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 방법이라면 모두는 좀 더 나아가 이소프렌을 정제하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 조성물 및 방법을 사용하여 생산된 이소프렌은 표준 기법을 사용하여 정제될 수 있다. 정제는 이소프렌을 생산할 때 존재하는 하나 이상의 성분으로부터 이소프렌이 분리되는 과정을 말한다. 일정 구현예에서, 이소프렌은 실질적으로 순수한 액체로서 획득된다. 정제 방법의 예로는 (i) 액체 추출물로 있는 용액으로부터 증류 및 (ii) 크로마토그래피를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바, "정제된 이소프렌 (purified isoprene)"은 이소프렌을 생산할 때 존재하는 하나 이상의 성분으로부터 분리되었던 이소프렌을 의미한다. 일정 구현예에서, 이소프렌은 무게로 이소프렌을 생산할 때 존재하는 하나 이상의 성분으로부터 떨어져 나온 것의 적어도 약 20%이다. 다양한 구현예에서, 이소프렌은 무게로 순수한 것의 적어도 또는 약 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%이다. 정제도는 적절한 방법이라면 모두, 예로 컬럼 크로마토그래피, HPLC 분석법, 또는 GC-MS 분석법에 의해 분석될 수 있다.

일정 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 방법이라면 모두는 좀 더 나아가 수소를 정제하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 조성물 및 방법을 사용하여 생산된 수소는 표준 기법을 사용하여 정제될 수 있다. 정제는 수소를 생산할 때 존재하는 하나 이상의 성분으로부터 수소가 분리되는 과정을 말한다. 일정 구현예에서, 수소는 실질적으로 순수한 기체로서 획득된다. 일정 구현예에서, 수소는 실질적으로 순수한 액체로서 획득된다. 본 정제 방법의 예로는 (i) 냉동발생 농축 및 (ii) 고체 매트릭스 흡착을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바, "정제된 수소 (purified hydrogen)"는 수소를 생산할 때 존재하는 하나 이상의 성분으로부터 분리되었던 수소를 의미한다. 일정 구현예에서, 수소는 무게로 수소를 생산할 때 존재하는 하나 이상의 성분으로부터 떨어져 나온 것의 적어도 약 20%이다. 다양한 구현예에서, 수소는 무게로 순수한 것의 적어도 또는 약 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%이다. 정제도 (purity)는 적절한 방법이라면 모두, 예로 컬럼 크로마토그래피, 또는 GC-MS 분석법에 의해 분석될 수 있다.

일정 구현예에서, 이소프렌의 제거를 위하여 하나 이상의 회수 단계 이후에 남아있는 기체 상의 적어도 일부분은 기체 상을 이소프렌의 생산을 위한 세포 배양 시스템에 도입하여 재순환된다.

바이오이소프렌 조성물의 발효기 배출-기체로부터 정제를 위한 방법들 및 장치들은 2009년 12월 18일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/88,142호에 기술되어 있고, 이는 본 명세서에서 내용 전부가 참고문헌으로 통합되어 있다.

발효기 배출-기체로부터 나온 바이오이소프렌 조성물은 휘발성 분순물 및 바이오-부산물 불순물을 가진 바이오이소프렌을 포함할 수 있다. 일정 구현예에서, 바이오이소프렌 조성물은 (a) 발효기 배출-기체를 첫 번째 컬럼에서 용매와 접촉시켜서 용매, 대부분의 이소프렌, 대부분의 바이오-부산물 분순물을 포함하는 이소프렌-풍부 용액을 형성하고; (b) 이소프렌-풍부 용액을 첫 번째 컬럼으로부터 두 번째 컬럼으로 전달하고; 또한 (c) 이소프렌을 두 번째 컬럼에서의 이소프렌-풍부 용액으로부터 비워내어 대부분의 바이오-부산물 분순물을 포함하는 이소프렌-빈약 용액을 형성하는 것:을 포함하는 방법을 사용하여 정제된다.

도 169는 이소프렌을 정제하는 대표적인 방법 및 대표적인 장치를 도시하고 있다. 이소프렌을 포함하는 발효기 배출-기체는 재생가능한 자원 (예로, 탄소원)으로부터, 예를 들어 이의 내용이 본 명세서에서 참고문헌으로, 상세하게는 이소프렌을 포함하는 발효기 배출-기체를 생성하는 방법에 관하여 통합되어 있는 미국 가특허출원 제 61/187,944호에 기술된 바와 같이, 당해 기술분야에서의 방법이라면 모두에 의해 생성될 수 있다. 하나 이상의 개별적 발효기 12 (예로, 일련으로 및/또는 평행으로 연결된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 이상의 발효기)로부터 생성된 발효기 배출-기체는 첫 번째 컬럼 14로 인도될 수 있다. 하기에 기술된 바와 같이, 발효기 배출-기체는 분리 유닛 16을 통하여 인도될 수 있고 및/또는 압축 시스템 18과 같은 압축 수단에 의해 압축될 수 있다. 추가적으로, 발효기 배출-기체의 온도는 임의적으로 예를 들어 용매 (이소프렌과 같은 하나 이상의 배출-기체의 용해 (solubilization)를 도울 수 있음)와 접촉하기 이전에 농축물 또는 부분적 농축물을 형성하도록 일정 시점으로 내릴 수 있다. 발효기 배출-기체는 컬럼 14에서 용매 (예로, 비극성 고비등점 용매와 같은 본 명세서에서 기술된 용매라면 모두)와 접촉 (예로, 흡수)될 수 있다. 용매에서 (상세하게는, 비극성 고비등점 용매로) 흡수 경향성이 적은 휘발성 불순물은 남아있는 용매/발효기 배출-기체 혼합물로부터 분리되어, 대부분의 휘발성 불순물 (예로, 포트 20에 존재함)을 포함하는 증기 또한 대부분의 이소프렌 및 대부분의 바이오-부산물 불순물을 가지는 이소프렌-풍부 용액 (예로, 포트 22에서)이 된다. 임의적으로 용매는 발효기 배출-기체와의 접촉 이전에 및/또는 이후에 적합한 수단이라면 모두에 의해 (예로, 수증기에 의해) 동시적으로 가열될 수 있고, 이는 남아있는 용액으로부터 휘발상 불순물의 분리를 도와줄 수 있다. 수증기는 컬럼을 통하여 인도되어 (도 169에 나타난 바와 같이 배출-기체의 입구 근처 및/또는 휘발성 불순물 출구의 반대쪽 말단과 같은 적합한 위치라면 모두에서) 휘발성 불순물의 제거를 도와줄 수 있는 일소하는 (sweeping) 증기 상을 제공한다.

대부분의 이소프렘 및 대부분의 바이오-부산물 불순물을 가지는 이소프렌-풍부 용액 (예로, 포트 22에서)는 두 번째 컬럼 24로 인도될 수 있다. 두 번째 컬럼은 첫 번째 컬럼 14로부터 분리될 수 있거나 (도 169에 나타난 바와 같음) 첫 번째 및 두 번째 컬럼 둘 다를 포함하는 단일 컬럼의 일부일 수 있다 (예로, 용매가 첫 번째 컬럼을 한쪽 말단 또는 그 근처로 들어가고 두 번째 컬럼을 한쪽 말단 또는 그 근처로 나오는 나란히 배열된 컬럼). 이소프렌은 두 번째 컬럼에서 이소프렌-풍부 용액으로부터 비워져서 정제된 이소프렌 조성물 (예로, 포트 26에서) 및 대부분의 바이오-부산물 불순물 (예로, 포트 28에서)을 포함하는 이소프렌-빈약 용액을 생성한다. 이소프렌-풍부 용액은 적합한 수단이라면 모두에 의해 (예로, 수증기에 의해) 가열될 수 있고, 이는 남아있는 용액으로부터 이소프렌의 분리 (stripping)를 도와줄 수 있다. 수증기는 컬럼을 통하여 인도된다 (도 169에서 나타난 바와 같이 이소프렌-풍부 용액의 입구 근처 및/또는 이소프렌-빈약 용액 출구의 반대쪽 말단과 같은 적합한 위치라면 모두에서).

본 명세서에서 기술된 바와 같이, 컬럼은 통상적인 것이고 적합한 크기라면 모두가 된다. 대표적인 유형의 컬럼은 코흐 모듈 프로세스 시스템사 (Koch Modular Process Systems. 파라무스 (Paramus), NJ), 플루오르사 (Fluor Corporation, 어바인, TX), 미국 쿠흐니사 (Kuhni) (Mount Holly, NC)를 포함하는 제조사로부터 시판되고 있다. 일반적으로, 컬럼은 증기/액체 접촉을 최대화하도록 설계되어 원하는 효율을 달성한다. 이것은 컬럼을 충전 물질 (packing material) 또는 컬럼을 따라 규칙적인 간격으로 공간 배치된 선반 (trays) 둘 중 하나로 컬럼을 채우는 것에 의해 달성된다. 적합한 충전 물질로는 금속, 유리, 중합체 및 세라믹 물질을 기초로 하는 무작위 (random) 및 구조화된 (structured) 유형 둘 다를 포함한다. 대표적인 무작위 충전 유형으로는 라쉬그 고리 (Raschig rings), 팰 고리 (Pall rings), 에이-팩 고리 (A-PAK rings), 새들 고리 (Saddle rings), 프로-팩 (Pro-Pak), 헬리-팩 (Heli-Pak), 세라믹 새들 (Ceramic saddles) 및 플렉시링스^®(FLEXIRINGS^®)을 포함한다. 구조화된 충전으로는 와이어 메쉬 및 천공된 금속판 유형 물질을 포함한다. 컬럼 충전에서 전문화된 제조사로는 ACS 세퍼레이션 & 매스-트랜스퍼 프로덕트사 (ACS Separations & Mass-Transfer Products, 휴스톤, TX), 존슨 브로스. 금속 성형사 (Johnson Bros. Metal Forming Co., 버클리, IL) 및 고흐 글리치사의 나이트 지사 (Koch Glitsch, Inc. Knight Div., 이스트캔튼, OH)를 포함한다. 기체 분리 컬럼 (gas stripping column)의 효율은 이론적인 판의 높이 및 컬럼에서 판의 전체 숫자로 표현된다. 일반적으로, 존재하는 이론적인 판의 숫자가 더 많아지면, 컬럼의 효율은 더 커진다. 실험실 규모의 컬럼은 에이스 글라스사 (Ace Glass, 바인랜드, NJ), 시그마-알드리치사 (Sigma-Aldrich, 세인트루이스, MO) 및 켐글라스사 (Chemglass, 바인랜드, NJ)로부터 구입할 수 있다. 적합한 유형의 유리 컬럼으로는 비그류 (Vigreux), 스나이더 (Snyder), 헴플 및 천공된-판형 컬럼을 포함한다. 컬럼은 충전 물질을 포함하거나 증기/액체 접촉을 최대화하도록 설계된 특징을 가질 수 있다. 실험실 규모의 기체 분리 유닛 (gas scrubber unit) (부분 # CG-1830-10)이 켐글라스사로부터 입수가능하고 이는 충전된 유리 컬럼, 용매 저장고 (solvent reservoir) 및 용매 재순환 펌프 (solvent recirculation pump)로 구성된다.

두 번째 컬럼 24로부터 나온 정제된 이소프렌 조성물 (예로, 포트 26에 존재함)은 좀 더 나아가 적합한 수단이라면 모두에 의해 (예로, 환류 농축기 (reflux condenser) 34 및/또는 실리카 흡착 시스템과 같은 흡착 시스템 (adsorption system) 36을 사용하는 것에 의해) 정제될 수 있다. 환류는 이소프렌 산물에서 용매 조성물을 감소시킨다. 이소프렌-빈약 용액은 재사용을 위해 첫 번째 컬럼으로 재순환될 수 있다 (예로, 도 169에서 포트 30으로 나타난 바와 같음). 이소프렌-빈약 용액은 바이오-부산물의 양을 감소하도록 첫 번째 컬럼 14로 재순환되기 이전에 적합한 수단이라면 모두에 의해 (예로, 액체-액체 추출 및/또는 실리카 흡착 시스템과 같은 흡착 시스템 32에 의해) 정제될 수 있다. 추가적으로, 이소프렌-빈약 용액의 온도는 첫 번째 컬럼 14로 재순환되기 이전에 적합한 수단이라면 모두에 의해 (예로, 임의적으로 이소프렌 용액을 정제하기 이전에 및/또는 이후에 동시적으로) 강하될 수 있다. 도 169는 이소프렌-빈약 용액을 정제하기 이전에 포트 40에서 이소프렌-빈약 용액의 온도를 강하하는 예를 나타내고 있다 (이 경우에, 온도 강하를 위해 냉각제 (coolant)를 사용함).

대부분의 휘발성 불순물을 포함하는 증기 (예로, 도 169에서 포트 20에 존재하는 증기)는 소수 일부분의 이소프렌 (예로, 이소프렌-풍부 용액에 남아있지 않은 잔존 이소프렌)을 포함할 수 있다. 잔존 이소프렌은 적합한 수단이라면 모두에 의해 (활성 탄소 흡착 시스템과 같은 흡착 시스템 38) 대부분의 휘발성 불순물을 포함하는 증기로부터 사용 시 재수집될 수 있고, 일정 경우 도 169에 나타난 바와 같이 정제된 이소프렌 조성물과 조합될 수 있다 (시스템 36과 유사한 흡착 시스템과 같은 추가적인 정제 이전에, 기간 동안, 또는 이후에). 도 169도 역시 증기로부터 대기 내로 방출되는 바람직하지 않은 성분의 양을 감소시킬 수 있는 임의적 포획 장치 (capture device) 42 (예로, 열 산화기 (thermal oxidizer) 및/또는 CO₂ 포획 시스템)를 나타내고 있다.

이소프렌의 대표적인 화학적 변환

이소프렌의 최근의 산업적 용도가 합성 고무의 생산에 있어 선호되기는 하지만, 이소프렌은 반응성 있는 결합된 디엔 (conjugated diene)이고 다양한 화학적 변환을 거쳐서 산화물 및 더 높은 분자량의 탄화수소를 형성한다. 예를 들어, 팔라듐(0) 복합체 (Pd(acac)₂-Ph₃P 및 Pd(OAc)₂-Ph₃P)는 알코올 용매에서 이소프렌의 이중합 및 말단중합 (telomerization)을 촉매하여 직선형 이소프렌 이중체 (예로, 2,7-디메틸-1,3,7-옥타트리엔 (2,7-dimethyl-1,3,7-octatriene)) 및 메톡시디메틸옥타디엔 (methoxydimethyloctadienes) (Zakharkin, L. I. and Babich, S. A. Russ. Chem. Bull. (1976), pp 1967-1968.)을 준다. 아담스 및 클랩은 이가 및 삼가 전이 금속-교환 몬트모릴로나이트 (montmorillonites) (예로, Cr³⁺-몬트모릴로나이트) 위에 이소프렌의 반응이 이소프렌 이중체 및 메탄올과의 부가물 (adducts)을 주는 것을 보고하였다 (Adams, J. M. and Clapp, T. V., Clay and Clay Minerals (1986), 34(3), 287-294). Ni(0)-아미노포스피나이트 (Ni(0)-aminophosphinite) 시스템에 의해 촉매된 이소프렌의 직선형 이중합은 경쟁적 고리이중합 (cyclodimerization) 반응에 의해 수반되는 부위선택적 꼬리-꼬리 (regioselective tail-to-tail) 직선형 이중체를 유도한다 (Denis, Philippe; Croizy, Jean Francois; Mortreux, Andre; Petit, Francis, Journal of Molecular Catalysis (1991), 68(2), 159-75. Denis, Philippe; Jean, Andre; Croizy, Jean Francois; Mortreux, Andre; Petit, Francis, Journal of the American Chemical Society (1990), 112(3), 1292-4.). 새로운 키랄성 아미노포스피나이트 (chiral aminophosphinite) 리간드, 예로, (+)-MeCH₂CHMeCH(NH₂)CH₂OPPh₂가 이소프렌의 직선형 이중합에서 균질 촉매로서 연구되었고, 50% 초과하는 전환율을 유도하였다 (Masotti, Henriette; Peiffer, Gilbert; Siv, Chhan; Courbis, Pierre; Sergent, Michelle; Phan Tan Luu, Roger, Bulletin des Societes Chimiques Belges (1991), 100(1), 63-77).

이소프렌의 다중합 저해제로서의 디니트로크레졸 (dinitrocresol)의 존재 시 110 - 250℃에서 열 이중합은 고수율의 이중체 및 매우 적은 중합체를 낸다 (미국 특허 제 4,973,787호). 이소프렌의 Ni-촉매된 이중합은 80%의 1,5-디메틸-1,5-사이클로옥타디엔 및 20%의 1,6-디메틸-1,5-사이클로옥타디엔으로 이루어진 디메틸-1,5-사이클로옥타디엔 혼합물을 수득한다 (Doppelt, Pascal; Baum, Thomas H.; Ricard, Louis, Inorganic Chemistry (1996), 35(5), 1286-91). 이소프렌은 촉매적 양의 Cp*Ru(η-이소프렌)Cl 및 AgOTf를 사용하여 디메틸사이클로옥타디엔으로 전환된다 (Itoh, Kenji; Masuda, Katsuyuki; Fukahori, Takahiko; Nakano, Katsumasa; Aoki, Katsuyuki; Nagashima, Hideo, Organometallics (1994), 13(3), 1020-9.). 일본 특허공개 제 JP59065026A호 (1984)는 Fe 카복실레이트 또는 β-디케톤 화합물, 오가노-Al 또는 Mg 화합물, 및 전자-공여기를 가지는 2,2'-디피리딜 유도체를 포함하는 촉매의 존재 시 이소프렌의 고리형 이중합에 의한 1,6-디메틸-1,5-사이클로옥타디엔의 제조를 보고한 바 있었다. 디메틸사이클로옥타디엔은 Ni-카복실레이트 또는 β-케톤, 오가노알루미늄 또는 오가노마그네슘 화합물 및 치환된 트리페닐포스파이트 (일본 특허공개 제 JP58055434A호, 1983)를 포함하는 3개-성분 촉매 위에 이소프렌의 고리이중합에 의해 제조되었다. 1,5-디메틸-1,5-사이클로옥타디엔은 Fe(3) 염 오가노알루미늄 화합물 및 활성인자를 포함하는 균질 촉매의 존재 시 (특허공개 제 SU615056A1호, 1978), Ni 아세틸아세토네이트, 트리아릴포스파이트 및 퍼하이드로알루모페놀렌 (perhydroalumophenolene)을 포함하는 균질 촉매의 존재 시 (특허공개 제 SU493455A1호, 1975), Ni 카복실레이트 또는 Ni의 카복실레이트 또는 킬레이트 화합물 및 1-하이드록시-3-카르보닐 화합물, 트리알킬알루미늄, 디알킬마그네슘 또는 결합된 디엔으로부터 획득된 활성을 가진 유기-Mg 화합물, Mg, 트리아릴 포스파이트 및 삼차 아민의 혼합물을 포함하는 촉매의 존재 시 (일본 특허공개 제 JP48064049A호, 1973), 또는 Ni 나프테네이트 (Ni naphthenate), Et₃Al, 및 트리-o-크레실 포스페이트로 구성되는 촉매의 존재 시 (Suga, K.; Watanabe, S.; Fujita, T.; Shimada, T., Israel Journal of Chemistry (1972), 10(1), 15-18) 불활성 유기 용매로 100 - 300℃에서 이소프렌의 고리 이중합에 의해 제조되었다. 미국 특허 제 3,954,665호는 Fe, Co, 또는 Ni 카르보닐과 [(η3-C6H5)NiBr]₂ 또는 [M(NO)₂X]₂ (M = Fe, Co; X = Cl, I, Br)의 반응 산물의 존재 시 이소프렌의 이중합을 기재하였다. 유럽 특허 제 2411호 (1981)는 -5℃로부터 +20℃까지에서 Fe(NO)₂Cl-비스(1,5-(1,5-사이클로옥타디엔)니켈 촉매 위에 이소프렌의 고리이중합으로 1-메틸- 및 2-메틸-4-이소프로페닐-1-사이클로헥센 또한 1,4- 및 2,4-디메틸-4-비닐-1-사이클로헥센을 주는 것을 기재하였다. 미국 특허 제 4,189,403호는 트리스 (치환된 하이드로카빌)포스파이트, 아세나이트 (arsenite), 또는 안티모나이트 (antimonite) 및 그룹 VIII 금속(0) 화합물 (예로, Ni 아세틸아세토네이트)의 혼합 촉매와 이소프렌을 접촉시켜서 1,5-디메틸-1,5-사이클로옥타디엔 및 1,4-디메틸-4-비닐-1-사이클로헥센의 제조를 기재하였다. Jackstell, R.; Grotevendt, A.; Michalik, D.; El Firdoussi, L.; Beller, M. J. Organometallic Chem. (2007) 692(21), 4737-4744은 이소프렌 이중합을 위한 팔라듐/카벤 촉매의 용도를 인용하고 있다. Bowen, L.; Charernsuk, M.; Wass, D.F. Chem. Commun. (2007) 2835-2837은 이소프렌의 직선형 및 고리형 삼중체의 생산을 위한 크롬 N,N-비스(디아릴포스피노)아민 촉매의 용도를 기술하고 있다.

이소프렌은 보고된 대로 Ni 촉매의 존재 시 이중합되어 시스-2-이소프로페닐-1-메틸비닐사이클로부탄을 수득한다 (Billups, W. E.; Cross, J. H.; Smith, C. V., Journal of the American Chemical Society (1973), 95(10), 3438-9). 전자 공여자로서 다양한 포스파이트의 존재 시 니켈 나프테네이트 및 이소프렌마그네슘에 의해 촉매된 이소프렌의 올리고중합 [78-79-5]은 디메틸사이클로옥타디엔 [39881-79-3]을 포함하는 고리형 이중체를 주었고; 상세하게는, 1,1,1-트리스(하이드록시메틸)프로판 포스파이트 [39865-19-5]는 선택적으로 트리메틸사이클로도데카트리엔 [39881-80-6]을 주었다 (Suga, Kyoichi; Watanabe, Shoji; Fujita, Tsutomu; Shimada, Takashi, Journal of Applied Chemistry & Biotechnology (1973), 23(2), 131-8). 국제특허출원 제 WO2006/051011호는 Ni 및/또는 Ti, 하나 이상의 오가노금속 화합물, 및 그룹 VA 화합물을 포함하고 반응이 하이드록시기-포함 용매에서 시행되는 촉매 시스템의 존재 시 이소프렌의 삼중합에 의해 향수 및 방향제로서 유용한 트리메틸사이클로옥타디엔의 제조를 기재하고 있다. Ligabue, R. A.; Dupont, J.; de Souza, R. F., Alegre, R.S. J. Mol. Cat. A: Chem. (2001), 169(1-2), 11-17은 이온성 액체에서 철 니트로실 촉매를 사용하여 6개-구성원으로 된 이중체로의 이소프렌의 선택적 이중합을 기술하고 있다. Huchette, D.; Nicole, J.; Petit, F., Tetrahedron Letters (1979), (12), 1035-8은 철 니트로실 촉매의 전기화학적 생성 또한 이어지는 이소프렌의 사이클로헥센 이중체로 이중합을 위한 용도를 기술하고 있다. Zakharkin, L. I.; Zhigareva, G. G.; Pryanishnikov, A. P. Zhurnal Obshchei Khimii (1987), 57(11), 2551-6는 복합 니켈 및 철 촉매 상에서 이소프렌의 고리올리고중합 (cyclooligomerization)을 기술하고 있다.

본 명세서에서 기술된 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물은 각각의 촉매 시스템 및 인용된 참고문헌들에 기재된 반응 조건을 사용하여 화학적으로 변환된다. 1,3-부타디엔의 화학적 변환에 적용되는 촉매 및 반응 조건과 같은 당해 기술분야에 알려진 기타 다른 촉매 및 반응 조건들은 당업자에 의해 본 이소프렌 시작 조성물에 적응될 수 있다.

이중합 및 삼중합

일정 구현예에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌 시작 물질은 촉매적 화학적 변환을 거쳐서 이중체 및 삼중체를 준다. 촉매 시스템은 당해 기술분야에 알려진 방법을 사용하여 확인된다. 바람직한 촉매로는 고효율로 이소프렌을 이중체 및 삼중체로 전환하는 것으로 알려진 것들을 포함한다. 예로는 팔라듐, 니켈, 코발트, 철 및 크롬에 기초하는 것들을 포함한다.

일정 구현예에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌 시작 물질은 열 또는 촉매적 이중합을 거친다. 이소프렌 시작 조성물은 압력 하에서 시작 조성물을 가열하여 불포화된 6개 및 8개-구성원으로 된 고리를 포함하는 이중체의 혼합물로 전환된다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 물질은 압력 하에서 약 100, 125, 150, 175, 200, 225 또는 250℃ 또는 이의 초과 온도로 가열된다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 물질은 라디칼-매개성 다중합을 방지하도록 항산화제 (예로, 2,6-디-터르-부틸-4-메틸페놀)의 존재 시 가열된다. 일정 구현예에서, 반응은 이소프렌의 고리형 이중합을 촉매 작용하는 기술분야에 알려진 촉매들로부터 선택되는 하나 이상의 촉매, 예로 미국 특허 제 4,144,278호, 제 4,181,707호, 제 5,545,789호 및 유럽 특허공개 제 EP0397266A2호에서 기술된 철 니트로실 할로겐화물 촉매에 의해 가속된다. 이온성 액체에서 철 니트로실 촉매의 사용은 Ligabue et al. (2001) J. Mol. Catalysis A: Chemical, 169 (2), 11-17에 의해 기술되어 있다. 촉매의 예로는 이에 제한되는 것은 아니지만, Fe(NO)₂Cl₂ 및 Cr³⁺-몬트모릴로나이트를 포함한다. 또 다른 예에서, 이소프렌 시작 조성물은 루테늄 촉매를 사용하여 C10 고리형 이중체 (예로, 디메틸-사이클로옥타디엔의 혼합물)로 전환된다 (Itoh, Kenji; Masuda, Katsuyuki; Fukahori, Takahiko; Nakano, Katsumasa; Aoki, Katsuyuki; Nagashima, Hideo, Organometallics (1994), 13(3), 1020-9).

특정한 구현예에서, 액상의 이소프렌 시작 조성물은 압력 하에서 산화제의 존재 시 100℃ 초과 온도로 가열되어 6개- 및 8개-구성원으로 된 고리를 포함하는 이중체의 혼합물, 예를 들어 Organometallics (1994), 13(3), 1020-9에 기술된 바와 같이 리모넨(1-메틸-4-(프로프-1-엔-2-일)사이클로헥스-1-엔), 1-메틸-5-(프로프-1-엔-2-일)사이클로헥스-1-엔, 1,4-디메틸-4-비닐사이클로헥센, 2,4-디메틸-4-비닐사이클로헥센, 1,5-디메틸사이클로옥타-1,5-디엔, 1,6-디메틸사이클로옥타-1,5-디엔, 2,6-디메틸-1,3-사이클로옥타디엔, 2,6-디메틸-1,4-사이클로옥타디엔, 3,7-디메틸-1,5-사이클로옥타디엔, 3,7-디메틸-1,3-사이클로옥타디엔, 3,6-디메틸-1,3-사이클로옥타디엔 및 기타 8개-구성원으로 된 고리형 이소프렌 이중체를 생산한다. 이들 화합물의 입체이성질체 모두가 고려된다. 이소프렌의 이중체로 전환은 바람직하지 않은 반응 산물의 생산을 피하도록 산소의 부재 시 최고로 잘 수행된다.

일정 구현예에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌 시작 물질은 광-이중합 (photo-dimerization)을 거쳐서 4개-구성원으로 된 고리 이중체를 준다. 이소프렌 시작 조성물은 하나 이상의 1,2-디(프로프-1-엔-2-일)사이클로부탄, 1,3-디(프로프-1-엔-2-일)사이클로부탄, 1-메틸-1-비닐-3-(프로프-1-엔-2-일)사이클로부탄, 1-메틸-1-비닐-2-(프로프-1-엔-2-일)사이클로부탄, 1,3-디메틸-1,3-디비닐사이클로부탄, 1,2-디메틸-1,2-디비닐사이클로부탄 및 그들의 입체이성질체들을 포함하는 혼합물에 광 조사 (light irradiation)에 의해 전환된다. 일정 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 시작 물질은 촉매 (예로, 니켈 촉매) 또는 광민감화제 (photosensitizer) (예로, 벤조페논)의 존재 시 이중합되어 6개- 및 8개-구성원으로 된 고리에 추가하여 4개-구성원으로 된 고리 이중체, 예로 시스-2-이소프로페닐-1-메틸비닐사이클로부탄을 수득한다 [Hammond, J.S. ;Turro, N.J. ; Liu, R.S.H. (1963) Mechanisms of Photochemical Reactions in Solution. XVI. Photosensitized Dimerization of Conjugated Dienes. J. Org. Chem., 28, 3297-3303를 참고하라] .

일정 구현예에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌 시작 물질은 촉매 시스템의 존재 시 고리형 삼중체로 전환된다. 일정 구현예에서, 고리형 삼중체는 트리메틸사이클로도데카트리엔이다. 일정 구현예에서, 촉매 시스템은 니켈 촉매를 포함한다. 일정 구현예에서, 촉매 시스템은 티타늄 (titanium) 화합물을 포함한다. 일정 구현예에서, 촉매 시스템은 니켈 촉매 및 티타늄 화합물을 포함한다. 일정 구현예에서, 촉매 시스템은 하나 이상의 오가노금속 화합물 및 그룹 VA 화합물을 포함한다. 일정 구현예에서, 촉매적 변환은 하이드록시기-포함 용매에서 시행된다. 상세한 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 Ni 및/또는 Ti, 하나 이상의 오가노금속 화합물 및 그룹 VA 화합물을 포함하고 반응이 하이드록시기-포함 용매에서 시행되는 촉매 시스템의 존재 시 트리메틸사이클로도데카트리엔으로 전환된다.

일정 구현예에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌 시작 물질은 C2 내지 C5 불포화된 탄화수소로 처리하여 C7 내지 C14 범위에 있는 탄화수소로의 열 또는 촉매적 전환을 거친다. C2 내지 C5 탄화수소는 알켄, 디엔 또는 알킨일 수 있다. 예를 들어 일정 구현예에서, 이소프렌은 에틸렌 및 적절한 촉매와 접촉하여 C7 화합물을 생산한다. 또 다른 구현예에서, 이소프렌은 1,3-부타디엔과 접촉하여 고리형 C9 화합물을 생산한다. C7 내지 C14 탄화수소의 수소화는 제트 연료 및 기타 항공 연료로서 사용에 적합한 조성물을 가져온다. 보다 또 다른 구현예에서, 이소프렌으로부터 유래한 불포화된 C7 내지 C14 탄화수소 및 하나 이상의 불포화된 탄화수소는 탈수소화를 거쳐서 제트 연료 및 기타 항공 연료로서 또는 이러한 연료를 위한 혼합원료 (blendstocks)로서 사용에 적합한 방향족 유도체를 형성한다.

일정 구현예에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌 시작 물질은 알코올 용매에 있는 촉매 시스템을 사용하여 직선형 이중체 및 삼중체의 혼합물로 전환된다. 본 반응도 역시 메탄올 또는 에탄올에서 수행될 때 알콕시 유도체를 생산한다. 일정 구현예에서, 촉매 시스템은 팔라듐-기초 촉매 시스템, 예로 팔라듐 아세틸아세토네이트 - 트리페닐포스파인 시스템 또는 팔라듐 아세데이트-트리페닐포스파인 시스템이다. 일정 구현예에서, 알코올 용매는 메탄올, 에탄올 또는 이소프로필 알코올이다. 산물의 특성 (nature)은 사용된 촉매 및 용매에 의존한다. 예를 들어, 팔라듐-기초 촉매 시스템 예로 Pd(acac)₂-Ph₃P 및 Pd(OAc)₂-Ph₃P가 이소프로필 알코올 용매에서 사용될 때, 이소프렌의 직선형 이중체 예로 2,7-디메틸-1,3,7-옥타트리엔 및 2,7-디메틸-2,4,6-옥타트리엔이 형성된다. 본 반응이 메탄올에서 수행될 때, 디메틸옥타트리엔과 같은 직선형 이소프렌 이중체에 추가하여 메톡시디메틸옥타디엔 (예로, 1-메톡시-2,7-디메틸-2,7-옥타디엔 및 3-메톡시-2,7-디메틸-1,7-옥타디엔)이 형성된다. 일정 반응은 α-파네센 (α-farnescene)(3,7,11-트리메틸-1,3,6,10-도데카테트라엔), β-파네센 (7,11-디메틸-3-메틸렌-1,6,10-도데카트리엔) 및 기타 다른 자리 (positional) 이성질체 (예로, 이소프렌 단위의 꼬리로부터 꼬리까지 및 머리로부터 머리까지 첨가)와 같은 이소프렌의 직선형 삼중체를 생산한다. 또 다른 예에서, 이소프렌은 크롬 N,N-비스(디아릴포스피노)아민 촉매를 사용하여 이소프렌의 직선형 및 고리형 삼중체로 전환된다 (Bowen, L.; Charernsuk, M.; Wass, D.F. Chem. Commun. (2007) 2835-2837).

산화물로의 전환

일정 구현예에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌 시작 물질은 산 촉매의 존재 시 에탄올 및 기타 알코올과 반응에 의해 연료 산화물로 전환된다. 일정 구현예에서, 산 촉매는 황산이다. 또 다른 구현예에서, 산촉매는 고체 상 황산 (예로, 도웩스 마라톤

(Dowex Marathon

))이다. 다른 촉매로는 액상 및 고체-상 플루오로설폰 산 둘 다, 예를 들어 트리플루오로메탄설폰산 및 나피온-H (Nafion-H, 듀퐁사)를 포함한다. 제올라이트 (zeolite) 예를 들어 베타-제올라이트도 역시 리모넨 및 관련 모노테르펜의 메톡시화 (methoxylation)에 관해 헨셀 등에 의해 기술된 것과 유사한 조건 하에서 사용될 수 있다 [Hensen, K.; Mahaim, C.; Holderich, W.F., Applied Catalysis A: General (1997) 140(2), 311-329]. 일정 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 시작 물질은 하이드록시화/에스테르화 공정 또는 당해 기술분야에 알려진 다른 알켄 반응, 예를 들어 퍼아세트산 및 3-클로로퍼벤조산과 같은 과산 (peracids)을 사용한 에폭사이드로의 과산화 (peroxidation); 또한 i) 물 및 산 촉매 ii) 붕소수화 (hydroboration) 방법을 사용하여 알코올 및 디올을 주는 수화 (hydration)에 의해 알코올 및 에스테로로 전환된다. 이러한 반응은 예를 들어 Michael B. Smith 및 Jerry March, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 제 6판, John Wiley & Sons, 2007에 기술되어 있다. 도 3 및 도 4는 시작 이소프렌 조성물로부터 생산될 수 있는 알코올 및 산화물의 예를 나타내고 있다.

부분적 수소화

일정 구현예에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌 시작 물질은 모노-올레핀 (예로, 2-메틸부트-1-엔, 3-메틸부트-1-엔 및 2-메틸부트-2-엔)으로 부분적으로 수소화된다. 일정 구현예에서, 모노-올레핀은 이소부틸렌을 이소옥탄으로 전환하는 데 사용되는 것과 같은, 전통적인 탄화수소 양이온성 촉매작용을 사용하는 기타 다른 올레핀과 이중합 또는 반응을 거친다. 예를 들어, H.M. Lybarger. Isoprene in Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 제 4판, 윌리 출판사, 뉴욕 (1995), 14, 934-952를 참조하라. 일정 바람직한 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 시작 물질은 바이오이소프렌 조성물이다.

일정 구현예에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌 시작 물질은 부분적 수소화를 거쳐서 모노-올레핀 (예로, 2-메틸부트-1-엔, 3-메틸부트-1-엔 및 2-메틸부트-2-엔)을 형성한다. 일정 바람직한 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 시작 물질은 바이오이소프렌 조성물이다. 일정 구현예에서, 이소프렌 시작 물질의 부분적 수소화는 이소펜탄으로 최소의 전환 및 잔존 이소프렌의 낮은 수준으로 고수율의 모노-올레핀을 생산한다. 일정 구현예에서, 모노-올레핀 및 이소펜탄의 혼합물이 낮은 수준의 잔존 이소프렌으로 생산된다. 일정 구현예에서, 부분적 수소화는 2-메틸부트-2-엔, 2-메틸부트-1-엔, 또는 3-메틸부트-1-엔과 같은 특정한 모노-올레핀이 선호적으로 생산되는 선택적인 수소화이다. 바람직한 수소화 촉매는 높은 촉매 활성을 주고, 시간 경과 시 촉매적 활성을 유지하며, 이소프렌의 모노-올레핀으로 전환을 위해 매우 선택적이다.

이소프렌 시작 조성물의 부분적 수소화에 적합한 촉매는 백금, 팔라듐, 로듐, 또는 루테늄과 같은 백금-그룹 금속, 또는 니켈, 코발트, 구리, 철, 몰리브덴과 같은 전이 금속, 또는 원소 형태로 은 또는 금과 같은 고귀한 금속, 또는 유기 및 무기 리간드를 가지는 염 또는 복합체를 포함한다. 이들 금속의 합금도 역시 일정 상황에서 사용될 수 있다. 이들 금속 및 그들의 유도체는 순수하거나 다른 활성 및 불활성 물질과 혼합될 수 있다. 촉매는 유효한 표면적을 최대화하도록 지지 물질 (support material) (예로, 활성 탄소, 알루미나, 또는 실리카)에 흡착될 수 있다. 수소화 촉매의 물리적 형상은 그의 성적 (performance)에 상당한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 바람직한 수소화 촉매는 지지 물질에 대비하여 0.1% Pd로부터 20% Pd (w/w)까지 범위의 등급으로 탄소 상의 팔라듐 (Pd/C), 알루미나 상의 팔라듐 (Pd/Al₂O₃), 실리카 상의 팔라듐 (Pd/SiO₂)과 같은 균질 팔라듐 촉매를 포함한다. 적합한 선택적 수소화 촉매의 예로는 LD 2773, 알루미나 상의 황 내성 촉진된 Pd (프랑스 Rueil-Malmaison Cedex, 아센)이다. 이소펜탄으로 최소의 전환으로 이소프렌의 이소아밀렌으로 전환을 허용하는 부분적 수소화 촉매는 린드라 촉매 (Lindlar catalyst, 퀴놀린으로 처리된 Pd/BaSO₄), 그룹 15 원소 (N, P, As)의 트리페닐 유도체로 처리된 Pd/C, 황-포함 화합물로 처리된 Pd/C, 몰리브덴 설파이드, 및 Pd/Fe 합금을 포함한다. 한 가지 바람직한 촉매는 달걀-껍질 알루미나 (δ-Al₂O₃)에 흡착된 팔라듐을 포함한다. 상세하게는, 열분해 가솔린으로부터 디올레핀 및 알킨의 제거를 위해 정련 산업에 사용되는 촉매가 바람직하고, 예를 들어 Ni/Al₂O₃ 및 Pd/Al₂O₃ 기초한 촉매이다. 이소아밀렌으로 이소프렌의 전환을 위한 또 다른 적합한 부류의 촉매는 열분해 가솔린의 수화처리 (hydrotreating) 산업에 사용되는 것들이다. 예를 들어, 미국 특허 제 7,014,750호 및 제 6,9949,686호 또한 본 명세서에서 인용된 참고문헌을 참조하라. 일반적으로, 열분해 기체 수화처리에 사용되는 촉매는 모노올레핀으로 아세틸렌 및 디올레핀 (예로, 이소프렌 및 피페릴렌)의 선택적 전환을 허용한다.

수소원 (hydrogen source)은 수소 기체 또는 이에 제한되는 것은 아니지만 수소 기체 (H₂), 포름산, 하이드라진, 또는 이소프로판올을 포함하는 수소원일 수 있다. 수소원은 화학적으로 또는 생물학적으로 유래할 수 있다. 일정 구현예에서, 수소화에 사용되는 수소는 발효 과정 동안 이소프렌과 공동-생산된다. 수소화는 0.5 기압으로부터 200 기압까지 범위 이상이 되는 수소 압력에서 수행된다. 온도는 0℃로부터 200℃까지 범위일 수 있다.

바이오이소프렌 조성물의 부분적 수소화로부터 나온 산물은 시작 이소프렌 조성물에 원래 존재하는 소정의 불순물 및/또는 아세톤, 에탄올, 아밀 알코올, 에틸 아세테이트, 이소아밀 아세테이트, 메틸 에틸케톤 및 기타 포화된 극성 불순물과 같은 불순물의 수소화된 유도체를 포함한다.

일정 구현예에서, 이소프렌 시작 조성물은 팔라듐 촉매의 존재 시 부분적 수소화 또는 선택적 수소화를 거친다. 예를 들어 Pd/CaCO₃, Pd/BaSO₄, Pd/C, Pd black, Pd/SiO3, Pd/Al₂O₃, 또는 Pd/SiO₂와 같은 팔라듐 촉매는 전부 환원된 C5 알칸 위에 95% 이상의 선택도로 이소프렌을 모노-올레핀으로 전환하는 것으로 관찰되었다. 이들 팔라듐 촉매의 사용은 3-메틸부트-1-엔에 대한 가장 큰 선택도를 가지는 5% Pd/CaCO3 및 2-메틸부트-2-엔에 대한 가장 큰 선택도를 가지는 5% Pd/SiO₂를 사용하여 모노-올레핀 산물의 혼합물을 주었다 (G.C. Bond and A.F. Rawle. J. Mol. Catalysis A: Chemical 109 (1996) 261-271를 참조하라). 본드 및 라울 (Bond and Rawle)도 역시 팔라듐-금 및 팔라듐-은 촉매 (예로, Pd-Au/SiO₂ 및 Pd-Ag/SiO₂)가 전부 환원된 C5 알칸 위에 이소프렌의 모노-올레핀으로 환원하는 높은 선택도를 가지는 것을 관찰하였다. 일정 구현예에서, 실리카-지지된 폴리아미도아민 (PAMAM) 덴드리머 (dendrimer)-팔라듐 복합체가 모노-올레핀 혼합물에 고리형 및 비고리형 디엔의 환원을 선택적으로 촉매 작용하는 데 사용되어 왔다. 다양한 모노-올레핀 이성질체에 대한 선택도는 촉매에 사용되는 정확한 PAMAM 리간드에 의존적이다 (P.P. Zweni and H. Alper. Adv. Synth. Catal. 348 (2006) 725-731를 참조하라). 일정 구현예에서, 모노-올레핀으로 이소프렌의 환원은 무기 지지체 (예로, 금속 제올라이트) 상의 그룹 VIB 금속을 촉매로서 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, Mo/Al₂O₃ 촉매가 1,3-부타디엔을 각각의 모노-올레핀으로 선택적으로 환원하는 데 사용되었다 (미국 특허공개 제 6,235,954 B1호를 참조하라). 일정 구현예에서, 이소프렌은 그룹 IB, VIB, VIIB, 또는 아연으로부터 나온 금속에 의해 촉진된 그룹 VIII 금속 촉매를 사용하여 모노-올레핀으로 환원될 수 있다 (미국 특허공개 제 6,949,686 B2호를 참조하라). 일정 구현예에서, 이소프렌은 단암의 (monolithic) 촉매 베드를 사용하여 모노-올레핀으로 환원될 수 있고, 이에는 니켈, 백금, 팔라듐, 로듐, 루테늄, 은, 철, 구리, 코발트, 크롬, 이리듐, 주석, 및 합금 또는 그들의 혼합물과 같은 금속을 포함할 수 있다 (미국 특허 제 US 7,014,750 B2호를 참조하라). 일정 구현예에서, 이소프렌은 달걀 껍질 Pd/δ-Al₂O₃ 촉매를 사용하여, 상세하게는 반응에 물이 없는 경우 모노-올레핀으로 환원될 수 있다. 달걀 껍질 Pd/δ-Al₂O₃ 촉매는 전부 환원된 알칸 위의 모노-올레핀에 대해 선택적이고, 2-메틸부트-2-엔은 열역학적으로 바람직한 이성질체이다 (J.-R. Chang and C.-H. Cheng. Ind. Eng. Chem. Res. 36 (1997) 4094-4099를 참조하라).

가벼운 올레핀 (C3 - C6)은 산 촉매를 사용하여 바로 이중합되어 디메이트 (dimate)라고도 알려진 고차 올레핀 (C6 - C12)을 낸다. 예를 들어, 이소부틸렌 (2-메틸프로펜)의 이소옥텐으로 전환은 황산, 인산, 및 기타 무기질 산, 설폰산, 플루오로설폰산, 제올라이트 및 산성 클레이를 포함하는 다양한 산 촉매를 사용하는 것으로 당해 기술분야에서 잘 기술되어 있다.

일정 구현예에서, 이소프렌 시작 조성물은 부분적 수소화 또는 선택적 수소화를 거쳐서 모노-올레핀을 형성하고, 모노-올레핀은 이소부틸렌을 이소옥탄으로 전환하는 데 사용되는 것인, 예로 황산, 인산, 및 기타 무기질 산, 설폰산, 플루오로설폰산, 제올라이트 및 산성 클레이와 같은 전통적인 탄화수소 양이온성 촉매작용을 사용하여 이중합 또는 다른 올레핀과의 반응을 거친다. 예를 들어, H.M. Lybarger. Isoprene in Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 4th ed., Wiley, New York (1995), 14, 934-952를 참조하라. 일정 바람직한 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 시작 물질은 바이오이소프렌 조성물이다. 액체 및 고체 형태 둘 다에서 산 촉매가 사용될 수 있다. 산 레진이 바람직하고 이로는 앰버리스트 (Amberlyst) 15, 35, XE586, XN1010 (롬 및 하스사 (Rohm and Haas)) 및 유사한 산성 이온-교환 레진을 포함한다. ZSM-5, 페리에라이트 (ferrierite), ZSM-22 및 ZSM-23과 같은 중간-공극의 산 분자적 체 (medium-pore acid molecular sieve)를 포함하는 산성의 분자적 체도 역시 바람직한 촉매이다.

일정 구현예에서, 이소프렌 시작 조성물은 부분적 수소화 또는 선택적 수소화를 거쳐서 이소아밀렌을 형성한다. 일정 구현예에서, 이소아밀렌은 이중합되어 이소데센과 같은 C10 디메이트를 준다. 일정 구현예에서, 이소아밀렌은 프로필렌, 부탄 또는 이소부텐과 같은 올레핀과 이중합되어 C8 - C10 디메이트를 준다. 일정 구현예에서, 모노-올레핀은 레진 촉매 (예로, 앰버리스트, 앰버리스트 35, 앰버리스트 15, 앰버리스트 XN1010, 앰버리스트 XE586)를 사용하는 이중합을 거쳐서 디이소아밀렌을 생산한다. 이러한 레진 촉매의 사용은 열 분해 (cracking) 및 좀 더 나아가 올리고중합 반응을 최소화하는 것으로 관찰되어 왔고, 최적의 조건 하에서 레진 촉매는 8% 이하의 삼중체 형성과 함께 92% 이상의 이중체에 대한 선택도를 제공한다. 예를 들어, M. Marchionna et al. Catalysis Today 65 (2001) 397-403를 참조하라. 일정 구현예에서, 모노-올레핀은 제올라이트 구조, ZSM-5, 페리에라이트, ZSM-22 및 ZSM-23에 박힌 중간공극 (mesoporous) 체와 같은 산성의 중간공극 분자적 체를 포함하는 촉매 물질을 사용하는 이중합을 거친다. 상세한 구현예에서, 촉매 물질은 고온에서 (예로, 적어도 900℃)에서 열적으로 안정하다. 또 다른 상세한 구현예에서, 모노-올레핀은 이소프렌과 같이 다중-불포화된 탄화수소가 실질적으로 없다. 이중합을 위해 산성의 중간공극 분자적 체를 포함하는 촉매 물질의 사용은 80% 초과의 이중체에 대한 선택도를 유도할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허공개 제 2007/0191662 A1호를 참조하라. 일정 구현예에서, 모노-올레핀은 고체 산성 촉매 (예로, 고체 인산 촉매, 산성의 이온 교환 레진)를 사용하는 이중합을 거친다. 고체 인산 촉매를 사용하는 이중체에 대한 선택도는 적어도 75%, 적어도 85% 또는 적어도 90%일 수 있다. 예를 들어, 미국 특허공개 제 2009/0099400 A1호 및 제 6,660,898 B1호를 참조하라.

효율적인 이중합은 때로 공급 스트림에서 물 및 산화된 화합물과 같은 극성 성분(들)의 존재를 요구할 수 있다. 예로는 메탄올, 에탄올 및 t-부탄올과 같은 알코올, 메틸 t-부틸 에테르 (MTBE) 및 메틸 t-아밀 에테르 (TAME)와 같은 에테르 또는 C1 내지 C5 아세테이트와 같은 에스테르를 포함한다. 일정 구현예에서, 이소아밀렌은 산 촉매의 존재 시 알코올로 처리에 의해 TAME과 같은 에테르로 전환될 수 있다.

일정 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 방법이라면 모두에 의해 생산된 모노-올레핀의 C10 이중체는 전부 포화된 C10 알킬레이트로 환원될 수 있다 (예로, 수소화에 의함). 상세한 구현예에서, 이소프렌 또는 모노-올레핀은 폴리아크릴레이트와 같은 중합체 성분과 혼합된, 황산, 플루오로설폰산, 퍼할로알킬설폰산, 이온성 액체, 또는 브론스태드 산 및 루이스 산의 혼합물과 같은 산 성분을 포함하는 촉매를 사용하여 알킬레이트로 환원될 수 있다 (미국 특허공개 제 2010/0094072 A1호를 참조하라).

일정 구현예에서, 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌 시작 물질은 산 촉매의 존재 시 올리고중합을 거쳐서 이중체, 삼중체, 고차 (higher) 올리고머, 방향족 산물, 및/또는 중합 산물 (polymeric products)을 생산한다. 반응의 동적 (kinetic) 조절은 검 형성 (gum formation) 및 코크 형성 (coking)이 촉매 탈활성 (deactivation)을 유도하는 문제점이 보고되긴 했더라도, 소정의 산물 예를 들어 저차 (lower) 올리고머를 선호할 수 있다.

대표적인 불포화된 이소프렌 유도체

일정 구현예에서, 이소프렌으로부터 연료 성분을 생산하는 조성물 및 시스템은 좀 더 나아가 이소프렌 시작 조성물의 연료 성분으로 화학적 변환을 위한 불포화된 탄화수소 또는 산화물 중간체를 포함한다. 일정 구현예에서, 불포화된 탄화수소 중간체는 1,2-디(프로프-1-엔-2-일)사이클로부탄, 1,3-디(프로프-1-엔-2-일)사이클로부탄, 1-메틸-1-비닐-3-(프로프-1-엔-2-일)사이클로부탄, 1-메틸-1-비닐-2-(프로프-1-엔-2-일)사이클로부탄, 1,3-디메틸-1,3-디비닐사이클로부탄, 1,2-디메틸-1,2-디비닐사이클로부탄, 1-메틸-4-(프로프-1-엔-2-일)사이클로헥스-1-엔, 1-메틸-5-(프로프-1-엔-2-일)사이클로헥스-1-엔, 1,4-디메틸-4-비닐사이클로헥센, 2,4-디메틸-4-비닐사이클로헥센, 1,5-디메틸사이클로옥타-1,5-디엔, 1,6-디메틸사이클로옥타-1,5-디엔, 1,4-디메틸-4-비닐-1-사이클로헥센, 2,4-디메틸-4-비닐-1-사이클로헥센, 2,7-디메틸-1,3,7-옥타트리엔, 2,7-디메틸-2,4,6-옥타트리엔, 2,6-디메틸-1,3-사이클로옥타디엔, 2,6-디메틸-1,4-사이클로옥타디엔, 3,7-디메틸-1,5-옥타디엔, 3,7-디메틸-1,3-사이클로옥타디엔 및 3,6-디메틸-1,3-사이클로옥타디엔으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 이소프렌의 불포화된 이중체를 포함한다. 일정 구현예에서, 불포화된 탄화수소 중간체는 α-파네센, β-파네센 , 트리메틸사이클로도데카트리엔 (예로, 1,5,9-트리메틸-(1E,5E,9E)-사이클로도데카테트라엔 및 그의 자리 이성질체 및 기하 이성질체) 및 트리메틸사이클로도데카테트라엔 등과 같은 하나 이상의 불포화된 삼중체를 포함한다. 일정 구현예에서, 불포화된 산화물 중간체는 1-메톡시-2,7-디메틸-2,7-옥타디엔 및 3-메톡시-2,7-디메틸-1,7-옥타디엔 등과 같은 하나 이상의 불포화된 메틸 에스테르를 포함한다. 일정 구현예에서, 불포화된 산화물 중간체는 에틸 3-메틸-3-부테닐 에테르, 에틸 1,1-디메틸-2-프로페닐 에테르, 에틸 1,2-디메틸-2-프로페닐 에테르, 에틸 2-메틸-2-부테닐 에테르 등과 같은 하나 이상의 불포화된 에틸 에스테르를 포함한다. 일정 구현예에서, 불포화된 산화물 중간체는 3-메틸-3-부텐-1-올, 2-메틸-3-부텐-2-올, 3-메틸-3-부텐-2-올, 2-메틸-3-부텐-1-올 등과 같은 하나 이상의 불포화된 알코올을 포함한다. 일정 구현예에서, 불포화된 산화물 중간체는 3-메틸-3-부텐-1-일 아세테이트, 2-메틸-3-부텐-2-일 아세테이트, 3-메틸-3-부텐-2-일 아세테이트, 2-메틸-3-부텐-1-일 아세테이트 및 기타 C₃ - C₁₈ 지방족 카르복실산의 에스테르 등과 같은 하나 이상의 불포화된 에스테르를 포함한다. 일정 구현예에서, 불포화된 탄화수소 중간체는 하나 이상의 이소아밀렌, 예로 2-메틸부트-1-엔, 3-메틸부트-1-엔 및 2-메틸부트-2-엔을 포함한다. 일정 구현예에서, 불포화된 탄화수소 중간체는 이소아밀렌의 이중합으로부터 유래한 하나 이상의 이소아밀렌을 포함한다.

화학식 I.

대표적인 불포화된 6개- 및 8개-구성원으로 된 고리 중간체

화학식 II.

대표적인 불포화된 4개-구성원으로 된 고리 중간체

화학식 III.

대표적인 불포화된 이소프렌 텔로머 및 산화물 중간체

화학식 IV.

대표적인 불포화된 에틸 에테르 중간체

화학식 V.

대표적인 불포화된 알코올 중간체

화학식 VI.

대표적인 불포화된 에스테르 중간체

대표적인 불포화된 중간체의 수소화

불포화된 이소프렌 중간체는 수소화 촉매의 존재 시 수소화되어 포화된 화합물을 생산한다. 포화된 화합물은 특성분석되고 그들의 연료로서의 가치는 측정된다. 일정 구현예에서, 수소화를 위한 수소원은 수소 기체이다. 일정 구현예에서, 수소 기체는 2008년 12월 30일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/141,652호 및 미국 특허공개 제 2009/0203102 A1호에 기술된 바와 같이 바이오이소프렌과 함께 공동-생산된다. 일정 구현예에서, 수소화 촉매는 Pd/C (예로, 5% (wt.) Pd/C)와 같은 팔라듐 기초한 촉매이다. 일정 구현예에서, 수소화 촉매는 라니 (Raney) 니켈 촉매이다. 일정 구현예에서, 수소화 촉매는 루테늄 또는 로듐 기초한 균질 수소화 촉매와 같은 균질 촉매이다. 일정 구현예에서, 불포화된 이소프렌 이중체 및 삼중체는 수소화되어 연료를 만드는 데 적합한 포화된 C10 및 C15 탄화수소를 생산한다. 일정 구현예에서, 불포화된 고리형 이중체는 수소화되어 1,2-비스(이소프로필)사이클로부탄, 1,2-비스(이소프로필)사이클로부탄, 1-메틸-4-이소프로필사이클로헥산, 1-메틸-3-이소프로필사이클로헥산, 1-에틸-1,4-디메틸사이클로헥산, 1-에틸-1,3-디메틸사이클로헥산, 1,5-디메틸사이클로옥탄 및 1,4-디메틸사이클로옥탄과 같은 포화된 고리형 C10 탄화수소를 생산한다. 일정 구현예에서, 불포화된 고리형 삼중체는 수소화되어 1,5,9-트리메틸사이클로도데칸 및 1,5,10-트리메틸사이클로도데칸과 같은 포화된 고리형 C15 탄화수소를 생산한다 (화학식 VII를 참조하라). 일정 구현예에서, 불포화된 직선형 이중체는 수소화되어 2,6-디메틸옥탄, 2,7-디메틸옥탄 및 3,6-디메틸옥탄과 같은 포화된 지방족 C10 탄화수소를 생산한다. 일정 구현예에서, 불포화된 직선형 삼중체는 수소화되어 2,6,10-트리메틸도데칸, 2,7,10-트리메틸도데칸 및 3,7,10-트리메틸도데칸과 같은 포화된 지방족 C15 탄화수소를 생산한다 (화학식 VIII를 참조하라). 일정 구현예에서, 이소아밀렌의 이중합의 산물 (디아밀렌 또는 C10 디메이트)은 이소파라핀 (예로, 2,3,4,4-테트라메틸헥산, 2,2,3,4-테트라메틸헥산, 2,3,3,4-테트라메틸헥산 및 3,3,5-테트라메틸헥산)으로 전부 수소화된다 (화학식 VIIIa를 참조하라). 일정 구현예에서, 시판되는 유익한 양의 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물은 수소화되어 2-메틸부탄을 포함하는 산물을 생산한다. 일정 구현예에서, 불포화된 이소프렌 수산화물은 C5 알코올 및 디올 (예로, 3-메틸-부탄-1-올, 2-메틸-부탄-1-올 및 2-메틸-부탄-2-올, 3-메틸-부탄-1,3-디올 및 2-메틸-부탄-2,3-디올), C-10 알코올 및 디올 (예로, 3,7-디메틸옥탄-1-올, 2,7-디메틸옥탄-1-올, 2,7-디메틸옥탄-2-올 및 2,7-디메틸옥탄-2,7-디올), 및 고리형 C-10 알코올 (예로, 2-(4-메틸사이클로헥실)프로판-2-올, 2-(4-메틸사이클로헥실)프로판-1-올, 2-(1,4-메틸사이클로헥실)에탄올 및 4-에틸-1,4-디메틸사이클로헥산올과 같은 포화된 수산화물을 생산한다 (화학식 IX를 참조하라). 일정 구현예에서, 불포화된 이소프렌 산화물은 수산화되어 1,3-디에톡시-3-메틸부탄, 1-에톡시-3-메틸부탄, 1-메톡시-2,7-디메틸옥탄 및 3-메톡시-2,7-디메틸옥탄과 같은 포화된 에테르를 생산한다 (화학식 X를 참조하라). 알켄 소부분 (moiety)은 수소화될 때, 하나 이상의 입체 이성질체가 생산되는 것으로 이해된다. 입체 이성질체 간의 상대적 비율은 반응 조건 및 사용된 촉매에 의존한다. 적용가능할 때, 각각 및 모든 입체 이성질체는 본 명세서에서 기술된 포화된 탄화수소 및 산화물에 대한 것으로 의도된다.

화학식 VII.

이소프렌으로부터 유래한 고리형 탄화수소의 예

화학식 VIII.

이소프렌으로부터 유래한 지방족 탄화수소의 예

화학식 VIIIa.

이소아밀렌으로부터 유래한 이소데칸의 예

화학식 IX.

이소프렌으로부터 유래한 이소퓨얼^TM 알코올의 예

화학식 X.

이소프렌으로부터 유래한 이소퓨얼^TM 산화물의 예

일정 구현예에서, 시판되는 유익한 양의 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물의 화학적 변환에 의해 생산되는 연료 성분은 포화된 이소프렌 유도체를 포함한다. 일정 구현예에서, 연료 성분은 이소프렌으로부터 유래한 포화된 C10 및 C15 탄화수소를 포함한다. 일정 구현예에서, 연료 성분은 1,2-비스(이소프로필)사이클로부탄, 1,2-비스(이소프로필)사이클로부탄, 1-메틸-4-이소프로필사이클로헥산, 1-메틸-3-이소프로필사이클로헥산, 1-에틸-1,4-디메틸사이클로헥산, 1-에틸-1,3-디메틸사이클로헥산, 1,5-디메틸사이클로옥탄 및 1,4-디메틸사이클로옥탄으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 포화된 고리형 C10 탄화수소를 포함한다. 일정 구현예에서, 연료 성분은 1,5,9-트리메틸사이클로도데칸 및 1,5,10-트리메틸사이클로도데칸으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 포화된 고리형 C15 탄화수소를 포함한다. 일정 구현예에서, 연료 성분은 2,6-디메틸옥탄, 2,7-디메틸옥탄 및 3,6-디메틸옥탄으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 포화된 지방족 C10 탄화수소를 포함한다. 일정 구현예에서, 연료 성분은 2,6,10-트리메틸도데칸, 2,7,10-트리메틸도데칸 및 3,7,10-트리메틸도데칸으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 포화된 지방족 C15 탄화수소를 포함한다. 일정 구현예에서, 연료 성분은 2-메틸부탄을 포함한다. 일정 구현예에서, 연료 성분은 2,3,4,4-테트라메틸헥산, 2,2,3,4-테트라메틸헥산, 2,3,3,4-테트라메틸헥산 및 3,3,5-테트라메틸헥산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 이소파라핀을 포함한다. 일정 구현예에서, 연료 성분은 3-메틸-부탄-1-올, 2-메틸-부탄-1-올 및 2-메틸-부탄-2-올, 3-메틸-부탄-1,3-디올, 2-메틸-부탄-2,3-디올, 3,7-디메틸옥탄-1-올, 2,7-디메틸옥탄-1-올, 2,7-디메틸옥탄-2-올, 2,7-디메틸옥탄-2,7-디올, 2-(4-메틸사이클로헥실)프로판-2-올, 2-(4-메틸사이클로헥실)프로판-1-올, 2-(1,4-메틸사이클로헥실)에탄올 및 4-에틸-1,4-디메틸사이클로헥산올로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 포화된 수산화물을 포함한다. 일정 구현예에서, 연료 성분은 1,3-디에톡시-3-메틸부탄, 1-에톡시-3-메틸부탄, 1-메톡시-2,7-디메틸옥탄 및 3-메톡시-2,7-디메틸옥탄으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 포화된 에테르를 포함한다. 일정 구현예에서, 연료 성분은 3-메틸테트라하이드로퓨란, 3-메틸-2-부탄온 및 이소펜틸 아세테이트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 이소프렌의 산화물을 포함한다.

일정 구현예에서, 이소프렌으로부터 나온 조성물 및 이로부터 연료 성분을 생산하는 시스템은 좀 더 나아가 이소프렌 시작 조성물의 연료 성분 또는 연료 성분을 만드는 중간체로의 화학적 변환을 촉매 작용하는 촉매를 포함한다. 일정 구현예에서, 이소프렌으로부터 나온 조성물 및 이로부터 연료 성분을 생산하는 시스템은 좀 더 나아가 포화된 연료 성분을 생산하도록 불포화된 중간체의 수소화를 촉매 작용하는 촉매를 포함한다. 일정 구현예에서, 촉매는 기술된 촉매라면 모두 또는 본 명세서에서 기술된 하나 이상의 촉매의 조합이다.

연료를 생산하는 방법 및/또는 공정

본 발명은 (a) 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌을 획득하고; 또한 (b) 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌 시작 물질의 적어도 일부분을 연료 성분으로 화학적으로 변환하는 것:을 포함하는 이소프렌으로부터 연료 성분을 생산하는 방법 및/또는 공정을 제공한다. 일정 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌조성물은 연속적인 화학적 공정에서 연료 성분으로 변환된다. 또 다른 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌은 좀 더 나아가 연료 조성물로의 화학적 변환 이전에 정제된다. 보다 또 다른 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌은 중간체 조성물로 화학적으로 변환되고; 중간체 조성물은 다 나아가 화학적 변환을 거쳐서 연료 또는 연료 성분을 생산한다. 더 나아간 구현예에서, 생산된 연료 성분은 석유 증류물 (distillate) 및 다른 임의적 첨가제와 혼합되어 연료를 생산한다. 일정 바람직한 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌은 바이오이소프렌 조성물일 수 있다.

일정 구현예에서, 이소프렌으로부터 연료 성분을 생산하는 방법은 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌 조성물을 획득하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 본 발명에 유용한 매우 순수한 이소프렌 조성물은 약 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 mg 이상의 이소프렌을 포함한다. 일정 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 조성물은 약 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 g 이상의 이소프렌을 포함한다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 약 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 또는 1000 kg 이상의 이소프렌을 포함한다.

일정 구현예에서, 이소프렌으로부터 연료 성분을 생산하는 방법은 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌 조성물을 획득하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물은 시작 조성물에 있는 모든 C5 탄화수소의 전체 무게에 대비한 무게로 약 98.0, 98.5, 99.0, 99.5, 또는 100% 이상의 이소프렌을 포함한다. 일정 구현예에서, 본 발명에서 유용한 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물은 조성물에 있는 모든 C5 탄화수소의 전체 무게에 대비한 무게로 약 99.90, 99.92, 99.94, 99.96, 99.98, 또는 100% 이상의 이소프렌을 포함한다. 일정 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 조성물은 조성물에 있는 모든 C5 탄화수소의 전체 무게에 대비한 무게로 약 2.0, 1.5, 1.0, 0.5, 0.2, 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005, 또는 0.00001% 이하의 이소프렌이 아닌 C5 탄화수소 (1,3-사이클로펜타디엔, 시스-1,3-펜타디엔, 트랜스-1,3-펜타디엔, 1,4-펜타디엔, 1-펜틴, 2-펜틴, 1-펜텐, 2-메틸-1-부텐, 3-메틸-1-부틴, 펜트-4-엔-1-인, 트랜스-펜트-3-엔-1-인, 또는 시스-펜트-3-엔-1-인과 같음)를 포함한다. 일정 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 조성물은 조성물에 있는 모든 C5 탄화수소의 전체 무게에 대비한 무게로 1,3-사이클로펜타디엔, 시스-1,3-펜타디엔, 트랜스-1,3-펜타디엔, 1,4-펜타디엔, 1-펜틴, 2-펜틴, 1-펜텐, 2-메틸-1-부텐, 3-메틸-1-부틴, 펜트-4-엔-1-인, 트랜스-펜트-3-엔-1-인, 또는 시스-펜트-3-엔-1-인에 대해 약 2.0, 1.5, 1.0, 0.5, 0.2, 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005, 또는 0.00001% 이하를 가진다. 상세한 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 조성물은 약 2 mg 이상의 이소프렌을 가지고, 조성물에 있는 모든 C5 탄화수소의 전체 무게에 대비한 무게로 약 98.0, 98.5, 99.0, 99.5. 99.90, 99.92, 99.94, 99.96, 99.98, 또는 100% 이상의 이소프렌을 가진다.

일정 구현예에서, 이소프렌으로부터 연료 성분을 생산하는 방법은 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌 조성물을 획득하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 본 발명에서 유용한 매우 순수한 이소프렌 조성물은 이소프렌의 다중합을 저해하는 조성물에 있는 화합물이라면 모두의 경우 약 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 또는 0.005 μg/L 이하의 이소프렌의 다중합을 저해하는 화합물을 포함한다. 상세한 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 조성물은 약 2 mg 이상의 이소프렌을 가진다.

일정 구현예에서, 이소프렌으로부터 연료 성분을 생산하는 방법은 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌 조성물을 획득하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 본 발명에서 유용한 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물은 에탄올, 아세톤, C5 프레닐 알코올 및 10개 이상의 탄소 원자를 가지는 이소프레노이드 화합물을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함한다. 일정 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 조성물은 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100, 또는 120 μg/L 이상의 에탄올, 아세톤, C5 프레닐 알코올 (3-메틸-3-부텐-1-올 또는 3-메틸-2-부텐-1-올와 같음), 또는 상기의 둘 이상이라면 모두를 포함한다. 일정 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌 조성물은 약 2 mg 이상의 이소프렌을 가지고, 에탄올, 아세톤, C5 프레닐 알코올 및 10개 이상의 탄소 원자를 가지는 이소프레노이드 화합물을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 가진다.

일정 구현예에서, 이소프렌으로부터 연료 성분을 생산하는 방법은 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌 조성물을 획득하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 본 발명에서 유용한 매우 순수한 이소프렌 조성물은 이소프렌 또한 2-헵탄온, 6-메틸-5-헵텐-2-온, 2,4,5-트리메틸피리딘, 2,3,5-트리메틸피라진, 시트로넬랄, 메탄티올, 메틸 아세테이트, 1-프로판올, 디아세틸, 2-부탄온, 2-메틸-3-부텐-2-올, 에틸 아세테이트, 2-메틸-1-프로판올, 3-메틸-1-부탄알, 3-메틸-2-부탄온, 1-부탄올, 2-펜탄온, 3-메틸-1-부탄올, 에틸 부틸레이트, 3-메틸-2-부텐알, 부틸 아세테이트, 3-메틸부틸 아세테이트, 3-메틸-3-부텐-1-일 아세테이트, 3-메틸-2-부텐-1-일 아세테이트, 3-헥센-1-올, 3-헥센-1-일 아세테이트, 리모넨, 게라니올 (트랜스-3,7-디메틸-2,6-옥타디엔-1-올), 시트로넬롤 (3,7-디메틸-6-옥텐-1-올), (E)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔, (Z)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔, 및 2,3-사이클로헵텐올피리딘으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 두 번째 화합물을 포함한다. 다양한 구현예들에서, 무게로 단위 퍼센트의 이소프렌 양에 대비한 이들 두 번째 화합물 하나의 양 (예로, 이소프렌의 무게로 나눈 성분의 무게 곱하기 100)은 약 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 110% (w/w) 이상이다. 일정 구현예에서, 무게로 단위 퍼센트의 이소프렌 양에 대비한 메탄티올의 양은 0.01% (w/w) 이하이다.

일정 구현예에서, 이소프렌으로부터 연료 성분을 생산하는 방법은 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌 조성물을 획득하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 본 방법은 (a) 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산을 포함하는 상기 세포를 이소프렌의 생산에 적합한 배양 조건 하에 배양하고, (a) 상기 세포가 (i) 약 400 nmole/g_gem/시간 이상의 이소프렌을 생산하고, (ii) 세포 배양 배지로부터 세포가 연소하는 탄소의 약 0.002 몰라 퍼센트 이상을 이소프렌으로 전환시키고, (iii) 약 0.1 mg/L_액체배지/시간의 이소프렌 이상의 이소프렌의 평균 부피측정 생산도를 가지며, 또한 (b) 이소프렌을 생산하는 것:을 포함하는 생물학적 공정으로부터 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌 조성물을 획득하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 세포는 이소프렌 합성효소 폴리펩타이드, 예로 자연적으로 생기는 푸엘라리아 (Pueraria)와 같은 식물로부터 나온 폴리펩타이드를 인코드하고, (ii) T7 프로모터와 같은 프로모터에 작동적으로 연결되어 있는 이종유래 핵산을 가진다. 일정 구현예에서, 세포는 이에 제한되는 것은 아니지만 탄소화물, 글리세롤, 글리세린, 디하이드록시아세톤, 일-탄소원, 오일, 동물 지방, 동물 오일, 지방산, 지질, 인지질, 글리세롤 지질, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 트리글리세라이드, 재생가능한 탄소원, 폴리펩타이드 (예로, 미생물 또는 식물 단백질 또는 펩타이드), 효모 추출물, 효모 추출물로부터 나온 성분, 또는 상기 둘 이상의 조합이라면 모두와 같은 탄소원을 포함하는 배양 배지에서 배양된다. 일정 구현예에서, 세포는 제한된 포도당 조건 하에서 배양된다. 일정 구현예에서, 세포는 좀 더 나아가 IDI 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산을 포함한다. 일정 구현예에서, 세포는 좀 더 나아가 MVD 경로 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종유래 핵산을 포함한다. 일정 구현예에서, 본 방법은 2008년 7월 2일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/134,094호, 국제특허출원 제 WO 2010/003007호, 및 2008년 12월 12일자로 제출된 미국 특허출원 제 12/335,071호 (미국 특허공개 제 2009/0203102 A1호)에서 기술된 방법을 사용하여 이소프렌을 생산하는 것을 포함한다.

일정 구현예에서, 본 방법은 이소프렌을 생산하는 배양의 세포에 의해 생산되는 기체 상 (배출-기체)을 포함한다. 일정 구현예에서, 배양에서의 세포는 약 400 nmole/g_gem/시간 이상의 이소프렌을 생산한다. 일정 구현예에서, 기체 상은 1 vvm의 속도로 살포될 때 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 μg/L 이상의 이소프렌을 포함한다. 일정 구현예에서, 기체 상의 휘발성 유기 분획은 휘발성 유기 분획에 있는 모든 C5 탄화수소의 전체 무게에 대비한 무게로 약 99.90, 99.92, 99.94, 99.96, 99.98, 또는 100% 이소프렌을 포함한다. 일정 구현예에서, 기체 상의 휘발성 유기 분획은 휘발성 유기 분획에 있는 모든 C5 탄화수소의 전체 무게에 대비한 무게로 약 2.0, 1.5, 1.0, 0.5, 0.2, 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005, 또는 0.00001% 이하의 이소프렌이 아닌 C5 탄화수소 (1,3-사이클로펜타디엔, 시스-1,3-펜타디엔, 트랜스-1,3-펜타디엔, 1,4-펜타디엔, 1-펜틴, 2-펜틴, 1-펜텐, 2-메틸-1-부텐, 3-메틸-1-부틴, 펜트-4-엔-1-인, 트랜스-펜트-3-엔-1-인, 또는 시스-펜트-3-엔-1-인과 같음)를 포함한다. 일정 구현예에서, 기체 상의 휘발성 유기 분획은 휘발성 유기 분획에 있는 모든 C5 탄화수소에 대비한 무게로 1,3-사이클로펜타디엔, 시스-1,3-펜타디엔, 트랜스-1,3-펜타디엔, 1,4-펜타디엔, 1-펜틴, 2-펜틴, 1-펜텐, 2-메틸-1-부텐, 3-메틸-1-부틴, 펜트-4-엔-1-인, 트랜스-펜트-3-엔-1-인, 또는 시스-펜트-3-엔-1-인에 대해 약 2.0, 1.5, 1.0, 0.5, 0.2, 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005, 또는 0.00001% 이하를 가진다. 상세한 구현예에서, 기체 상의 휘발성 유기 분획은 약 2 mg 이상의 이소프렌을 가지고, 휘발성 유기 분획에 있는 모든 C5 탄화수소의 전체 무게에 대비한 무게로 약 99.90, 99.92, 99.94, 99.96, 99.98, 또는 100% 이상의 이소프렌을 가진다.

일정 구현예에서, 본 방법은 이소프렌을 생산하는 배양에서 세포에 의해 생산되는 기체 상 (배출-기체)를 획득하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 기체 상의 휘발성 유기 분획은 이소프렌의 다중합을 저해하는 기체 상의 휘발성 유기 분획에 있는 화합물이라면 모두의 경우 약 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 또는 0.005 μg/L 이하의 이소프렌의 다중합을 저해하는 화합물을 포함한다. 상세한 구현예에서, 기체 상의 휘발성 유기 분획도 또한 약 2 mg 이상의 이소프렌을 가진다. 일정 구현예에서, 기체 상의 휘발성 유기 분획은 에탄올, 아세톤, C5 프레닐 알코올 및 10개 이상의 탄소 원자를 가지는 이소프레노이드 화합물을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함한다. 일정 구현예에서, 기체 상의 휘발성 유기 분획은 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100, 또는 120 μg/L 이상의 에탄올, 아세톤, C5 프레닐 알코올 (3-메틸-3-부텐-1-올 또는 3-메틸-2-부텐-1-올과 같음), 또는 상기의 둘 이상이라면 모두를 포함한다. 일정 구현예에서, 기체 상의 휘발성 유기 분획은 약 2 mg 이상의 이소프렌을 가지고, 에탄올, 아세톤, C5 프레닐 알코올 및 10개 이상의 탄소 원자를 가지는 이소프레노이드 화합물을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 가진다. 일정 구현예에서, 기체 상의 휘발성 유기 분획은 이소프렌 또한 2-헵탄온, 6-메틸-5-헵텐-2-온, 2,4,5-트리메틸피리딘, 2,3,5-트리메틸피라진, 시트로넬랄, 메탄티올, 메틸 아세테이트, 1-프로판올, 디아세틸, 2-부탄온, 2-메틸-3-부텐-2-올, 에틸 아세테이트, 2-메틸-1-프로판올, 3-메틸-1-부탄알, 3-메틸-2-부탄온, 1-부탄올, 2-펜탄온, 3-메틸-1-부탄올, 에틸 부틸레이트, 3-메틸-2-부텐알, 부틸 아세테이트, 3-메틸부틸 아세테이트, 3-메틸-3-부텐-1-일 아세테이트, 3-메틸-2-부텐-1-일 아세테이트, 3-헥센-1-올, 3-헥센-1-일 아세테이트, 리모넨, 게라니올 (트랜스-3,7-디메틸-2,6-옥타디엔-1-올), 시트로넬롤 (3,7-디메틸-6-옥텐-1-올), (E)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔, (Z)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔, 및 2,3-사이클로헵텐올피리딘으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 두 번째 화합물을 포함한다. 다양한 구현예들에서, 무게로 단위 퍼센트의 이소프렌 양에 대비한 이들 두 번째 화합물 하나의 양 (예로, 이소프렌의 무게로 나눈 성분의 무게 곱하기 100)은 기체 상의 휘발성 유기 분획에서 약 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 110% (w/w) 이상이다. 일정 구현예에서, 본 방법은 좀 더 나아가 기체 상으로부터 이소프렌을 회수하는 것을 포함한다. 예를 들어, 이소프렌을 포함하는 기체 상에서의 이소프렌은 기체 비워냄법 (gas stripping), 막 증진된 분리법 (membrane enhanced separation), 분획법 (fractionation), 흡착/탈착법 (adsorption/desorption), 증발법 (pervaporation), 고체 상으로부터 이소프렌의 열 또는 증기 탈착법, 또는 용매로 고체 상에 고정되거나 흡수된 이소프렌의 추출법과 같은 표준 방법을 사용하여 회수될 수 있다 (예를 들어, 미국특허 제 4,703,007호 및 제 4,570,029호을 참조하고, 이들은 각각 본 명세서에서 참조문헌으로 전부, 상세하게는 이소프렌 회수 및 정제 방법에 관하여 통합되어 있다). 상세한 구현예에서, 알코올 (에탄올, 메탄올, 프로판올 또는 그의 조합과 같음)로의 추출 증류법이 이소프렌을 회수하는 데 사용된다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 회수는 액체 형태 (이소프렌의 순수 (neat) 용액 또는 용매에 녹인 이소프렌 용액과 같음)로 이소프렌의 분리를 포함한다. 기체 비워냄은 연속적 방식으로 발효 배출-기체 증기로부터 이소프렌 증기의 제거를 포함한다. 이러한 제거는, 이에 제한되는 것은 아니지만 고체 상에 대한 흡착, 액상 내로 분배, 또는 직접적인 농축 (농축 코일에 노출로 인한 또는 압력의 증가로 인한 농축과 같음)을 포함하는 여러 가지 다른 방식으로 달성될 수 있다. 일정 구현예에서, 증기의 이슬점 이상에서 희석된 이소프렌 증기의 막 농축은 액체 이소프렌의 농축을 가져온다. 일정 구현예에서, 이소프렌은 압축되고 농축된다.

이소프렌의 회수는 한 단계 또는 복수의 단계를 포함할 수 있다. 일정 구현예에서, 발효 배출-기체로부터 이소프렌 증기의 제거 및 액상으로 이소프렌의 전환은 동시적으로 수행된다. 예를 들어, 이소프렌은 액체를 형성하도록 배출-기체로부터 직접적으로 농축될 수 있다. 일정 구현예에서, 발효 배출-기체로부터 이소프렌 증기의 제거 및 액상으로 이소프렌의 전환은 연속적으로 수행된다. 예를 들어, 이소프렌은 고체 상에 흡착된 다음 용매를 사용하여 고체 상으로부터 추출될 수 있다.

일정 구현예에서, 순수 바이오이소프렌을 포함하는 이소프렌의 고리형 이중체를 생산하는 방법이 제공된다. 생산된 이소프렌의 고리형 이중체는 6개-구성원으로 된 고리 이중체 (예로, 리모넨과 같은 [2+4] 전기고리화 (electrocyclization) 산물) 또는 8개-구성원으로 된 고리 이중체 또는 그의 혼합물일 수 있다. 6개-구성원으로 된 고리 이중체의 예로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 1-메틸-4-(프로프-1-엔-2-일)사이클로헥스-1-엔, 1-메틸-5-(프로프-1-엔-2-일)사이클로헥스-1-엔, 1,4-디메틸-4-비닐사이클로헥센, 2,4-디메틸-4-비닐사이클로헥센 등을 포함한다. 8개-구성원으로 된 고리 이중체의 예로는 1,5-디메틸사이클로옥타-1,5-디엔, 1,6-디메틸사이클로옥타-1,5-디엔 등을 포함한다. 일정 구현예에서, 순수 생물학적으로 생산된 이소프렌은 약 100℃ 내지 약 300℃, 바람직하게는 약 150℃ 내지 약 250℃의 온도로 가열하여 이중합된다. 압력은 약 2 내지 3 atm에서 유지된다. 또 다른 구현예에서, 결합된 디엔의 이중합을 촉매 작용하는 데 적합한 촉매가 사용될 수 있다. 산물 혼합물에 있는 다양한 이중체들의 비율은 촉매 및 다른 반응 조건에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 니켈 촉매는 8개-구성원으로 된 고리 이중체의 형성을 촉진할 수 있다.

일정 구현예에서, 바이오이소프렌의 광-이중합을 포함하는 이소프렌의 고리형 이중체를 생산하는 방법이 제공된다. 생산된 이소프렌의 고리형 이중체는 4개-구성원으로 된 고리 이중체 또는 그의 혼합물일 수 있다. 4개-구성원으로 된 고리 이중체의 예로는 이제 제한되는 것은 아니지만 1,2-디(프로프-1-엔-2-일)사이클로부탄, 1,3-디(프로프-1-엔-2-일)사이클로부탄, 1-메틸-1-비닐-3-(프로프-1-엔-2-일)사이클로부탄, 1-메틸-1-비닐-2-(프로프-1-엔-2-일)사이클로부탄, 1,3-디메틸-1,3-디비닐사이클로부탄, 1,2-디메틸-1,2-디비닐사이클로부탄 등을 포함한다. 일정 구현예에서, 순수 생물학적으로 생산된 이소프렌은 UV 광으로 조사되어, 바람직하게는 벤조페논과 같은 광민감화제의 존재 시 이중합된다.

이소프렌 이중체는 수소화되어 포화된 연료로서 작용하거나 연료 내로 혼합되는 C₁₀ 탄화수소를 형성한다. 일정 구현예에서, 포화된 이소프렌 이중체는 촉매적 수소화되어 부분적으로 수소화된 및/또는 전부 수소화된 산물을 생산한다. 전부 수소화된 산물의 예로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 1-메틸-4-이소프로필사이클로헥산, 1-메틸-5-이소프로필사이클로헥산, 1,4-디메틸-4-에틸사이클로헥산, 2,4-디메틸-4-에틸사이클로헥산, 1,2-디이소프로필사이클로부탄 및 1,3-디이소프로필사이클로부탄,1-메틸-1-비닐-3-(프로프-1-엔-2-일)사이클로부탄, 1-메틸-1-비닐-2-(프로프-1-엔-2-일)사이클로부탄, 1,3-디메틸-1,3-에틸사이클로부탄, 1,2-디메틸-1,2-에틸사이클로부탄, 1,5-디메틸사이클로옥탄, 1,6-디메틸사이클로옥탄 등을 포함한다.

일정 구현예에서, 이소프렌으로부터 연료 성분을 생산하는 방법은 (a) 본 명세서에서 기술된 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물이라면 모두의 시판되는 유리한 양을 획득하고; 또한 (b) (i) 매우 순수한 이소프렌 조성물을 압력 하에서 약 100℃ 또는 이의 초과 온도로 가열하고; (ii) 시작 이소프렌 조성물의 적어도 일부분을 불포화된 고리형 이소프렌 이중체로 전환시키고; 또한 (iii) 불포화된 고리형 이소프렌 이중체를 수소화하여 포화된 고리형 이소프렌 이중체를 생산하는 것:을 포함하는 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물의 적어도 일부분을 연료 성분으로 화학적으로 변환하는 것:을 포함한다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 물질은 압력 하에서 약 100, 125, 150, 175, 200, 225 또는 250℃ 또는 이의 초과 온도로 가열된다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 물질은 라디칼-매개성 다중합을 방지하도록 항산화제 (예로, 2,6-디-터르-부틸-4-메틸페놀)의 존재 시 가열된다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 열적 이중합은 다중합 저해제로서 디니트로크레졸의 존재 시 수행된다. 적합한 산화제가 다중합 저해제 (polymerization inhibitors)로서 사용될 수 있다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물의 적어도 일부분은 6개 및 8개-구성원으로 된 고리, 예를 들어 리모넨 (1-메틸-4-(프로프-1-엔-2-일)사이클로헥스-1-엔), 1-메틸-5-(프로프-1-엔-2-일)사이클로헥스-1-엔, 1,4-디메틸-4-비닐사이클로헥센, 2,4-디메틸-4-비닐사이클로헥센, 1,5-디메틸사이클로옥타-1,5-디엔, 1,6-디메틸사이클로옥타-1,5-디엔, 2,6-디메틸-1,3-사이클로옥타디엔, 2,6-디메틸-1,4-사이클로옥타디엔, 3,7-디메틸-1,5-사이클로옥타디엔, 3,7-디메틸-1,3-사이클로옥타디엔 및 3,6-디메틸-1,3-사이클로옥타디엔을 포함하는 불포화된 이중체의 혼합물이다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물에서 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 또는 100% 이상의 이소프렌이 불포화된 고리형 이소프렌 이중체로 전환된다. 일정 구현예에서, 포화된 고리형 이소프렌 이중체는 1-메틸-4-이소프로필사이클로헥산, 1-메틸-3-이소프로필사이클로헥산, 1-에틸-1,4-디메틸사이클로헥산, 1-에틸-1,3-디메틸사이클로헥산, 1,5-디메틸사이클로옥탄 및 1,4-디메틸사이클로옥탄으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 C10 탄화수소를 포함한다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 바이오이소프렌 조성물이다.

일정 구현예에서, 이소프렌으로부터 연료 성분을 생산하는 방법은 (a) 본 명세서에서 기술된 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물이라면 모두의 시판되는 유리한 양을 획득하고; 또한 (b) (i) 매우 순수한 이소프렌 조성물을 촉매 시스템과 접촉시키고; (ii) 시작 이소프렌 조성물의 적어도 일부분을 불포화된 고리형 이소프렌 이중체 및/또는 삼중체로 전환시키고; 또한 (iii) 불포화된 이중체 및/또는 삼중체를 수소화하여 포화된 C10 및/또는 C15 탄화수소를 생산하는 것:을 포함하는 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물의 적어도 일부분을 연료 성분으로 화학적으로 변환하는 것:을 포함한다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물에서 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 또는 100% 이상 이소프렌의 불포화된 이소프렌의 이중체 및/또는 삼중체로 전환된다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 당해 기술분야에 알려져 있는 적절한 촉매 시스템과 접촉시켜서 1,2-디(프로프-1-엔-2-일)사이클로부탄, 1,3-디(프로프-1-엔-2-일)사이클로부탄, 1-메틸-1-비닐-3-(프로프-1-엔-2-일)사이클로부탄, 1-메틸-1-비닐-2-(프로프-1-엔-2-일)사이클로부탄, 1,3-디메틸-1,3-디비닐사이클로부탄, 1,2-디메틸-1,2-디비닐사이클로부탄, 1-메틸-4-(프로프-1-엔-2-일)사이클로헥스-1-엔, 1-메틸-5-(프로프-1-엔-2-일)사이클로헥스-1-엔, 1,4-디메틸-4-비닐사이클로헥센, 2,4-디메틸-4-비닐사이클로헥센, 1,5-디메틸사이클로옥타-1,5-디엔, 1,6-디메틸사이클로옥타-1,5-디엔, 1,4-디메틸-4-비닐-1-사이클로헥센, 2,4-디메틸-4-비닐-1-사이클로헥센, 2,7-디메틸-1,3,7-옥타트리엔, 2,7-디메틸-2,4,6-옥타트리엔, 2,6-디메틸-1,3-사이클로옥타디엔, 2,6-디메틸-1,4-사이클로옥타디엔, 3,7-디메틸-1,5-옥타디엔, 3,7-디메틸-1,3-사이클로옥타디엔 및 3,6-디메틸-1,3-사이클로옥타디엔으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 불포화된 고리형 이소프렌 이중체를 수득한다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 당해 기술분야에 알려져 있는 적절한 촉매 시스템과 접촉시켜서 트리메틸사이클로도데카트리엔 및 트리메틸사이클로도데카테트라엔 등과 같은 하나 이상의 불포화된 고리형 이소프렌 삼중체를 수득한다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 당해 기술분야에 알려져 있는 적절한 촉매 시스템과 접촉시켜서 디메틸옥타트리엔 (예로, 2,7-디메틸-1,3,7-옥타트리엔 및 2,7-디메틸-2,4,6-옥타트리엔) 및 트리메틸도데카테트라엔 (예로, 2,6,10-트리메틸-1,5-9,11-도데카테트라엔, α-파네센, 및 β-파네센)과 같은 하나 이상의 이소프렌의 불포화된 직선형 이중체 및/또는 삼중체를 수득한다. 일정 바람직한 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 바이오이소프렌 조성물이다.

일정 구현예에서, 이소프렌으로부터 연료 성분을 생산하는 방법은 매우 순수한 이소프렌 조성물을 촉매 시스템과 접촉시켜서 시작 이소프렌 조성물의 적어도 일부분을 불포화된 이소프렌 이중체 및/또는 삼중체로 전환하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 촉매 시스템은 Ni, Fe 또는 Co 촉매를 포함하고 시작 조성물에서 이소프렌은 1,5-디메틸사이클로옥타-1,5-디엔 및 1,6-디메틸사이클로옥타-1,5-디엔과 같은 디메틸사이클로옥타디엔을 포함하는 8개-구성원으로 된 고리 이소프렌 이중체로 전환된다. 일정 구현예에서, 촉매 시스템은 니켈 화합물을 포함한다. 이소프렌의 Ni-촉매된 이중합은 1,5-디메틸사이클로옥타-1,5-디엔 대비 1,6-디메틸사이클로옥타-1,5-디엔의 90 내지 10, 80 내지 20, 70 내지 30, 60 내지 40, 50 내지 50, 40 내지 60, 30 내지 70, 80 내지 20 및 10 내지 90 비율로 구성되는 디메틸-1,5-사이클로옥타디엔 혼합물을 수득한다. 일정 구현예에서, 촉매 시스템은 디메틸사이클로옥타디엔은 Ni-카복실레이트 또는 β-케톤, 오가노알루미늄 또는 오가노마그네슘 화합물 및 치환된 트리페닐포스파이트를 포함하는 3개-성분 촉매를 포함한다. 예를 들어, 무수 톨루엔에 녹인 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물의 탈기된 (degassed) 용액은 질소 대기 하에서 Ni(acac)₂, Et₃Al 및 트리스(3,4-비스(디메틸아미노)페닐)포스파이트와 혼합되고 혼합물은 95℃로 가열되어 디메틸사이클로옥타디엔을 낸다. 또 다른 구현예에서, 촉매 시스템은 Fe 카복실레이트 또는 β-디케톤 화합물, 오가노-Al 또는 Mg 화합물, 및 전자-공여기를 가지는 2,2'-디피리딜 유도체를 포함한다. 예를 들어, 시작 이소프렌 조성물은 톨루엔에 녹인 Fe 아세틸아세토네이트, 4,4'-디메틸-2,2'-디피리딜 및 Et₃Al의 혼합물과 함께 가열되어 좋은 수율로 1,6-디메틸-1,5-사이클로옥타디엔을 낸다. 일정 바람직한 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 바이오이소프렌 조성물이다.

일정 구현예에서, 이소프렌으로부터 연료 성분을 생산하는 방법은 매우 순수한 이소프렌 조성물을 촉매 시스템과 접촉시켜서 시작 이소프렌 조성물의 적어도 일부분을 불포화된 이소프렌 이중체 및/또는 삼중체로 전환하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 촉매 시스템은 Ru, Fe, Ni 또는 Pd 촉매 또는 그의 조합을 포함하고, 시작 조성물에서 이소프렌은 6개-구성원으로 된 고리 이소프렌 이중체를 포함하는 혼합물로 전환된다. 일정 구현예에서, 촉매 시스템은 Fe(NO)₂Cl-비스(1,5-사이클로옥타디엔)니켈 촉매 시스템이고 시작 조성물에서 이소프렌은 낮은 온도 (예로, -5℃로부터 +20℃까지)에서 고리이중합되어 1-메틸- 및 2-메틸-4-이소프로페닐-1-사이클로헥센 또한 1,4- 및 2,4-디메틸-4-비닐-1-사이클로헥센을 준다. 또 다른 구현예에서, 트리스 (치환된 하이드로카빌)포스파이트, 아세나이트 (arsenite), 또는 안티모나이트 (antimonite) 및 그룹 VIII 금속(0) 화합물 (예로, Ni 아세틸아세토네이트)의 혼합 촉매와 접촉시키는 것은 시작 조성물에서의 이소프렌을 1,4-디메틸-4-비닐-1-사이클로헥센 및 1,5-디메틸-1,5-사이클로옥타디엔으로 전환시킨다. 또 다른 구현예에서, 이소프렌 시작 조성물을 루테늄 촉매와 접촉시키는 것은 (Itoh, Kenji; Masuda, Katsuyuki; Fukahori, Takahiko; Nakano, Katsumasa; Aoki, Katsuyuki; Nagashima, Hideo, Organometallics (1994), 13(3), 1020-9) 이소프렌을 C10 고리형 이중체 (예로, 디메틸-사이클로옥타디엔의 혼합물)로 전환시킨다. 루테늄 촉매는 RuCl₃ 및 펜타메틸사이클로펜타디엔 (C₅Me₅H)으로부터 두 단계로 합성될 수 있다. 공정은 회분식으로 수행될 수 있고, 촉매는 회수되어 재순환될 수 있다. 일정 바람직한 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 바이오이소프렌 조성물이다. 본 방법의 하나의 구현예가 화학식 XI에 묘사되어 있다.

일정 구현예에서, 이소프렌으로부터 연료 성분을 생산하는 방법은 매우 순수한 이소프렌 조성물을 촉매 시스템과 접촉시켜서 시작 이소프렌 조성물의 적어도 일부분을 불포화된 이소프렌 이중체 및/또는 삼중체로 전환하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 촉매 시스템은 Ni, Ti, Al, 또는 Mg 촉매 또는 그의 혼합물을 포함하고, 시작 조성물에서 이소프렌은 트리메틸사이클로도데카트리엔과 같은 고리형 이소프렌 삼중체를 포함하는 혼합물로 전환된다. 일정 구현예에서, 이소프렌의 삼중합을 위한 촉매 시스템은 Ni 및/또는 Ti, 하나 이상의 오가노금속 화합물, 및 그룹 VA 화합물을 포함한다. 반응은 하이드록시기-포함 용매에서 시행될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 전자 공여자로서 다양한 포스파이트의 존재 시 니켈 나프테네이트 및 이소프렌마그네슘에 의해 촉매된 이소프렌의 올리고중합은 디메틸사이클로옥타디엔을 포함하는 고리형 이중체를 주고; 상세하게는, 1,1,1-트리스(하이드록시메틸)프로판 포스파이트는 선택적으로 트리메틸사이클로도데카트리엔을 준다.

화학식 XI

일정 구현예에서, 이소프렌으로부터 연료 성분을 생산하는 방법은 매우 순수한 이소프렌 조성물을 촉매 시스템과 접촉시켜서 시작 이소프렌 조성물의 적어도 일부분을 불포화된 이소프렌 이중체 및/또는 삼중체로 전환하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 촉매 시스템은 Ni, Pd 또는 Cr 촉매 또는 그의 혼합물을 포함하고, 시작 조성물에서 이소프렌은 말단체 또는 직선형 이중체 및/또는 삼중체로 전환된다. 한 가지 구현예에서, Pd(0) 복합체 (Pd(acac)₂-Ph₃P 및 Pd(OAc)₂-Ph₃P)를 포함하는 촉매 시스템은 이소프렌의 이중합 및 말단중합 (telomerization)을 촉매하여 직선형 이소프렌 이중체 (예로, 2,7-디메틸-1,3,7-옥타트리엔)을 준다. 한 가지 다양성에서, 반응은 용매로서 메탄올에서 수행되고 메톡시디메틸옥타디엔 (예로, 1-메톡시-2,7-디메틸-2,7-옥타디엔 및 3-메톡시-2,7-디메틸-1,7-옥타디엔)과 같은 메틸 에테르가 생산된다. 또 다른 구현예에서, 촉매 시스템은 이가 및 삼가 전이 금속-교환 몬트모릴로나이트 (예로, Cr³⁺-몬트모릴로나이트)를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 촉매 시스템은 Ni(0)-아미노포스피나이트 (Ni(0)-aminophosphinite) 촉매를 포함하고 시작 조성물에서 이소프렌은 부위선택적 꼬리-꼬리 직선형 이중체로 전환된다. 일정 다양성에서, 직선형 이중체 형성이 경쟁적 고리이중합 반응에 의해 수반된다. 또 다른 구현예에서,촉매 시스템은 크롬 N,N-비스(디아릴포스피노)아민 촉매 (Bowen, L.; Charernsuk, M.; Wass, D.F. Chem. Commun. (2007) 2835-2837)를 포함하고 이소프렌은 직선형 및 고리형 C15 삼중체로 전환된다. 한 가지 다양성에서 크롬 촉매는 CrCl₃(THF)₃ 및 PNP 포스파인 리간드로부터 제자리에서 (in situ) 만들어진다.

일정 구현예에서, 바이오이소프렌 조성물로부터 연료 성분을 생산하는 방법은 (i) 바이오이소프렌 조성물을 이소프렌의 삼중합을 촉매 작용하는 촉매와 접촉시켜서 불포화된 이소프렌 삼중체를 생산하고 또한 (ii) 이소프렌 삼중체를 수소화하여 연료 성분을 생산하는 것에 의해, 바이오이소프렌 조성물에서 이소프렌의 실질적인 부분을 화학적으로 변환하는 것을 포함한다. 일정 구현예에서, 바이오이소프렌 조성물에서 적어도 약 95%의 이소프렌이 화학적 변환과정 동안 비-이소프렌 화합물로 전환된다.

일정 구현예에서, 이소프렌으로부터 연료 성분을 생산하는 방법은 (a) 본 명세서에서 기술된 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물이라면 모두의 시판되는 유익한 양을 획득하고; (b) 시작 이소프렌 조성물의 적어도 일부분을 불포화된 이소프렌 유도체로 전환하고; 또한 (c) 불포화된 이소프렌 유도체를 수소화하여 포화된 화합물을 생산하는 것:을 포함한다. 일정 구현예에서, 불포화된 이소프렌 유도체의 포화된 화합물로의 수소화는 회분식 방식으로 수행된다. 일정 구현예에서, 불포화된 이소프렌 유도체의 포화된 화합물로의 수소화는 연속식 방식으로 수행된다. 본 방법의 한 가지 구현예는 화힉식 XII에 묘사되어 있다.

화학식 XII

일정 구현예에서, 이소프렌으로부터 연료 성분을 생산하는 방법은 (a) 본 명세서에서 기술된 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물이라면 모두의 시판되는 유익한 양을 획득하고; (b) 시작 이소프렌 조성물의 적어도 일부분을 산화된 이소프렌 유도체로 전환하고; 또한 임의적으로 (c) 산화된 이소프렌 유도체를 수소화하여 포화된 화합물을 생산하는 것:을 포함한다. 일정 구현예에서, 이소프렌 시작 조성물은 알코올 (예로, 메탄올 또는 에탄올 또는 그의 혼합물)의 존재 시 촉매와 접촉하여 하나 이상의 불포화된 또는 포화된 에테르 (예로, 메틸 에테르 또는 에틸 에테르 또는 그의 혼합물)을 포함하는 산화된 이소프렌 유도체를 형성한다. 일정 구현예에서, 촉매는 황산, 고체 상 황산 (예로, 도웩스 마라톤

), 액상 및 고체-상 플루오로설폰산 (예로, 트리플루오로메탄설폰산 및 나피온-H (듀퐁사))과 같은 산 촉매이다. 제올라이트 예를 들어 베타-제올라이트도 역시 리모넨 및 관련 모노테르펜의 메톡시화에 관해 헨셀 등에 의해 기술된 것과 유사한 조건 하에서 사용될 수 있다 [Hensen, K.; Mahaim, C.; Holderich, W.F., Applied Catalysis A: General (1997) 140(2), 311-329]. 일정 구현예에서, 이소프렌 시작 조성물 또는 불포화된 이소프렌 이중체 또는 삼중체는 산화/수소화를 거쳐서 C5, C10 및 C15 알코올 및 디올과 같은 하나 이상의 알코올을 포함하는 수산화된 이소프렌 유도체를 형성한다. 일정 구현예에서, 이소프렌 시작 조성물은 하이드록시화/에스테르화를 거쳐서 알코올 및 에스테를 형성한다. 예를 들어, 바이오이소프렌 또는 불포화된 중간체는 퍼아세트산 및 3-클로로퍼벤조산과 같은 과산 (peracids)을 사용한 에폭사이드로의 과산화; 또한 i) 물 및 산 촉매 및 ii) 붕소수화 (hydroboration) 방법을 사용하여 알코올 및 디올을 주는 수화 (hydration)를 거친다. 이러한 반응은 예를 들어 Michael B. Smith 및 Jerry March, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 제 6판, John Wiley & Sons, 2007에 기술되어 있다. 일정 바람직한 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 바이오이소프렌 조성물이다.

일정 구현예에서, 이소프렌으로부터 연료 성분을 생산하는 방법은 (a) 본 명세서에서 기술된 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물이라면 모두의 시판되는 유익한 양을 획득하고; (b) 시작 이소프렌 조성물을 모노-올레핀 (예로, 2-메틸부트-1-엔, 3-메틸부트-1-엔 및 2-메틸부트-2-엔)으로 부분적으로 수소화하고; 또한 (c) 모노-올레핀으로부터 연료 성분을 생산하는 것:을 포함한다. 일정 구현예에서, 모노-올레핀은 이소부틸렌을 이소옥탄으로 전환하는 데 사용되는 것과 같은 전통적인 탄화수소 양이온성 촉매작용을 사용하여 다른 올레핀과 반응시킨다. 그 다음 다른 올레핀과의 이중합 또는 반응의 산물은 수소화를 거쳐서 포화된 연료 성분을 준다. 일정 바람직한 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌은 바이오이소프렌 조성물이다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 Pd/CaCO₃, Pd/BaSO₄, Pd/C, Pd black, Pd/SiO3, Pd/Al₂O₃, 또는 Pd/SiO₂와 같은 팔라듐 촉매를 사용하여 부분적으로 수소화된다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 실리카-지지된 폴리아미도아민 (PAMAM) 덴드리머-팔라듐 복합체를 사용하여 부분적으로 수소화된다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 팔라듐-금 및 팔라듐-은 촉매 (예로, Pd-Au/SiO₂ 및 Pd-Ag/SiO₂)를 사용하여 부분적으로 수소화되고, 전부 환원된 C5 알칸 위에 이소프렌의 모노-올레핀으로 환원하는 높은 선택도를 가진다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 무기 지지체 (예로, 금속 제올라이트) 상의 그룹 VIB 금속을 촉매 예로 Mo/Al₂O₃ 촉매로서 사용하여 부분적으로 수소화된다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 단암의 (monolithic) 촉매 베드를 사용하여 부분적으로 수소화되고 이는 벌집 모양이 될 수 있다. 단암의 촉매 베드를 위한 촉매 지지체 물질은 니켈, 백금, 팔라듐, 로듐, 루테늄, 은, 철, 구리, 코발트, 크롬, 이리듐, 주석, 및 합금 또는 그들의 혼합물과 같은 금속을 포함할 수 있다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 달걀 껍질 Pd/δ-Al₂O₃ 촉매를 사용하여, 상세하게는 반응에 물이 없는 경우 부분적으로 수소화된다. 일정 구현예에서, 시작 이소프렌 조성물은 그룹 IB, VIB, VIIB, 또는 아연으로부터 나온 금속에 의해 촉진된 그룹 VIII 금속 촉매를 사용하여 부분적으로 수소화되어 촉매 독을 감소시킨다. 이소프렌을 이소아밀렌 (모노-올레핀)으로 전환하는 방법은 균질 또는 비균질 촉매 둘 다를 사용하여 연속식 또는 회분식 방식으로 수행될 수 있다. 본 발명의 한 가지 구현예는 화학식 XIII에 묘사되어 있다.

일정 구현예에서, 이소프렌의 부분적 수소화로부터 생산된 이소아밀렌은 이온 교환 레진 및 제올라이트 위에 액상으로 삼중합을 거친다. GranGranollers, Ind. Eng. Chem. Res., 49 (8), pp 3561-3570 (2001)을 참조하라.

화학식 XIII

일정 구현예에서, 이소프렌으로부터 연료 성분을 생산하는 방법은 (a) 본 명세서에서 기술된 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물이라면 모두의 시판되는 유익한 양을 획득하고; (b) 시작 이소프렌 조성물을 모노-올레핀 (예로, 2-메틸부트-1-엔, 3-메틸부트-1-엔 및 2-메틸부트-2-엔)으로 부분적으로 수소화하고; (c) 모노-올레핀을 모노-올레핀의 이중합을 위한 촉매와 접촉시켜서 또 다른 모노-올레핀과 디메이트를 형성하고; (d) 이중합의 산물 (디메이트)를 수소화하여 포화된 탄화수소 연료 성분을 생산하는 것:을 포함한다. 일정 바람직한 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌은 바이오이소프렌 조성물이다. 일정 구현예에서, 다른 모노-올레핀은 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물로부터 유래한 이소아밀렌이다. 일정 구현예에서, 다른 모노-올레핀은 프로필렌, 부탄 또는 이소부탄과 같은 또 다른 출처로부터 나온 올레핀이다. 일정 구현예에서, 이중합을 위한 촉매는 레진 촉매 (예로, 앰버리스트, 앰버리스트 35, 앰버리스트 15, 앰버리스트 XN1010, 앰버리스트 XE586)이다. 일정 구현예에서, 이중합을 위한 촉매는 제올라이트 구조, ZSM-5, 페리에라이트, ZSM-22 및 ZSM-23에 박힌 중간공극 체와 같은 산성의 중간공극 분자적 체를 포함하는 촉매 물질이다. 일정 구현예에서, 이중합을 위한 촉매는 고온에서 (예로, 적어도 900℃)에서 열적으로 안정한 촉매 물질이다. 일정 구현예에서, 이중합을 위한 촉매는 산성의 중간공극 분자적 체를 포함하는 촉매 물질이다. 일정 구현예에서, 이중합을 위한 촉매는 고체 산성 촉매 (예로, 고체 인산 촉매, 산성의 이온 교환 레진)이다. 본 방법의 한 가지 구현예는 화학식 XIV에 묘사되어 있다.

화학식 XIV

일정 구현예에서, 이소프렌으로부터 연료 성분을 생산하는 방법은 (a) 본 명세서에서 기술된 매우 순수한 이소프렌 시작 조성물이라면 모두의 시판되는 유익한 양을 획득하고; (b) 시작 이소프렌 조성물을 이소아밀렌 (예로, 2-메틸부트-1-엔, 3-메틸부트-1-엔 및 2-메틸부트-2-엔)으로 부분적으로 수소화하고; (c) 이소아밀렌을 알코올 및 촉매와 접촉시켜서 산화물을 형성하고; (d) 이소아밀렌 산화물로부터 연료 성분을 생산하는 것:을 포함한다. 일정 바람직한 구현예에서, 매우 순수한 이소프렌은 바이오이소프렌 조성물이다. 일정 구현예에서, 이소아밀렌은 에탄올과 접촉시키고 형성된 연료 산화물은 TAME과 같은 에테르이다.

일정 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 방법이라면 모두는 좀 더 나아가 화학적 변환 이전에 시작 이소프렌 조성물을 정제하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에서 기술된 조성물 및 방법을 사용하여 생산된 이소프렌은 표준 기법을 사용하여 정제될 수 있다. 정제는 이소프렌을 생산할 때 존재하는 하나 이상의 성분으로부터 이소프렌이 분리되는 과정을 말한다. 일정 구현예에서, 이소프렌은 실질적으로 순수한 액체로서 획득된다. 정제 방법의 예로는 (i) 액체 추출물 (extractant)로 있는 용액으로부터 증류 및 (ii) 크로마토그래피를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바, "정제된 이소프렌 (purified isoprene)"은 이소프렌을 생산할 때 존재하는 하나 이상의 성분으로부터 분리되었던 이소프렌을 의미한다. 일정 구현예에서, 이소프렌은 무게로 이소프렌을 생산할 때 존재하는 하나 이상의 성분으로부터 떨어져 나온 것의 적어도 약 20%이다. 다양한 구현예에서, 이소프렌은 무게로 순수한 것의 적어도 또는 약 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%이다. 정제도는 적절한 방법이라면 모두, 예로 컬럼 크로마토그래피, HPLC 또는 GC-MS 분석법에 의해 분석될 수 있다. 일정 구현예에서, 바이오이소프렌은 탈착 및 농축이 이어지는 활성 탄소의 초기 흡착에 의해 발효 배출-기체로부터 회수되어 연료 성분으로 화학적 변환을 위한 액체 이소프렌 조성물을 준다.

연료를 생산하는 연속식 공정

본 발명은 또한 (a) 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌을 연속적으로 생산하고; 또한 (b) 시판되는 유리한 양의 매우 순수한 이소프렌의 적어도 일부분을 연료 성분으로 연속적으로 변환하는 것:을 포함하는 이소프렌으로부터 연료 성분을 생산하는 연속적인 방법이 제공된다. 본 발명에 따른 연속식 공정에서, 매우 순수한 이소프렌의 수증기는 예를 들어 생물학적 공정 (예로, 이소프렌을 생산하는 세포를 배양하는 것)에 의해 연속적으로 생산되고 화학적 변환을 위해 반응기를 통과시킨다. 일정 구현예에서, 발효 배출-기체로부터 나온 이소프렌은 추출적 증류, 농축, 흡착 또는 연속적 정제 유닛을 사용하여 물 및 다른 영구적 기체 (예로, O₂, N₂ 및 CO₂)로부터 분리되고, 여기에서 산소 수준은 ppm 범위로 낮아지고 다른 우려되는 불순물은 제거되고; 이소프렌 증기는 불균질 촉매를 사용하여 이중체 (C10) 및 삼중체 (C15)로 촉매적으로 전환되고; 원하는 산물은 분리되고 미반응된 (unreacted) 이소프렌은 심화된 전환을 위해 반응기로 돌아간다. 일정 구현예에서, 촉매적 이중합은 기체 상에서 바람직한 C10 탄화수소의 수준을 측정하여 감시된다.

일정 구현예에서, 생물학적으로 생산된 이소프렌의 수증기는 약 100℃ 내지 약 300℃의 온도에서 유지되는 화학적 반응기 (예로, 반응 튜브)를 관통하고, 여기에서 생물학적으로 생산된 이소프렌은 이중합 반응을 거친다. 한 가지 구현예에서, 이소프렌 이중체는 산물 스트림으로부터 분리되고 미반응된 이소프렌의 적어도 일부분은 화학적 반응기 내로 다시 재순환된다. 한 가지 다양성에서, 생산된 불포화된 이소프렌 이중체는 두 번째 화학적 반응기에서 수소화 촉매 및 수소원과 접촉되어 부분적으로 수소화된 및/또는 전부 수소화된 산물을 생산한다. 본 공정은 좀 더 나아가 이소프렌을 생산하는 생물-반응기의 배출-기체로부터 이소프렌을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

일정 구현예에서, 공동-생산된 수소를 포함하는 바이오이소프렌의 스트림은 먼저 수소 기체로부터 분리되고, 바이오이소프렌의 스트림은 약 100℃ 내지 약 300℃의 온도에서 유지되는 화학적 반응기 (예로, 반응 튜브)를 관통하고, 여기에서 생물학적으로 생산된 이소프렌은 이중합 반응을 거친다. 한 가지 다양성에서, 이소프렌 이중체는 산물 스트림으로부터 분리되고 미반응된 이소프렌의 적어도 일부분은 화학적 반응기 내로 다시 재순환된다. 한 가지 구현예에서, 생산된 불포화된 이소프렌 이중체는 두 번째 화학적 반응기에서 수소화 촉매 및 수소원과 접촉되어 부분적으로 수소화된 및/또는 전부 수소화된 산물을 생산한다. 한 가지 다양성에서, 이소프렌-수소 공동-생산으로부터 분리된 수소 스트림은 수소화 단계에서 사용된다. 본 공정은 좀 더 나아가 이소프렌을 생산하는 생물-반응기의 배출-기체로부터 이소프렌을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 본 공정은 좀 더 나아가 냉동발생 농축 및 고체 매트릭스 흡착과 같은 당해 기술분야에서 알려져 있는 정제 방법을 사용하여 이소프렌-수소 공동-생산으로부터 분리된 수소 스트림을 정제하는 단계를 포함할 수 있다.

연료 산물로부터 디엔 및 중합체의 제거

연료 조성물은 시간 경과 시 검, 레진, 중합체 및 기타 다른 원치않는 부산물을 형성할 수 있는 불포화된 화합물 (올레핀, 디올레핀 및 폴리올레핀)을 종종 포함한다 (예를 들어, Pereira and Pasa (2006) Fuel, 85, 1860-1865 및 본 명세서에서 참고문헌들을 참조하라). 일반적으로, 주어진 화합물의 불포화도가 증가하면서, 화합물은 이러한 부산물을 형성하기가 더욱 쉽다. 이소프렌은 연료 조성물에 존재할 때 원치않는 중합 부산물을 바로 형성하는 1,3-디엔이다. 부산물 형성의 정도를 감소시킬 수 있는 연료 첨가제 (항-산화제, 라디칼 제거제 (radica quenchers) 등)가 존재하면서도, 이러한 부산물은 시간 경과시 여전히 형성될 수 있다. 올레핀도 역시 연료로부터 증발 시 대기 내로 방출될 때, 또는 올레핀-포함 연료의 불완전한 연소의 결과로서 기저 수준 (ground level) 오존의 형성에 기여할 수 있다.

따라서, 전적으로 또는 부분적으로 이소프렌으로부터 유래한 연료 조성물은 자유 이소프렌을 거의 또는 전혀 포함하지 않아야 한다. 여러 가지의 방법이 증류에 의한 정제, 에테르를 형성하는 알코올과의 반응 또는 이소프렌을 포화된 유도체로 전환하는 수소화와 같이 연료 조성물로부터 이소프렌을 제거하는 데 사용될 수 있다. 대안으로, 이소프렌은 원치않는 부산물의 형성에 기여하지 않는 불활성 부가물 (adducts)을 생산하는 말릭 안하이드라이드와 같은 디엔 친화기 (dienophile)로 처리될 수 있다.

실질적으로 이소프렌이 없는 이소프렌 유도체를 포함하는 연료 조성물이 제공된다. 일정 구현예에서, 연료 조성물은 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10% 또는 15% 이하의 이소프렌을 포함한다. 또한 바이오이소프렌 조성물을 실질적으로 이소프렌이 없는 이소프렌 유도체를 포함하는 연료 조성물로 화학적으로 변환하는 방법이 제공된다. 일정 구현예에서, 바이오이소프렌 조성물로부터 나온 이소프렌의 실질적인 일부분이 연료 성분으로 전환된다. 일정 구현예에서, 바이오이소프렌 조성물로부터 나온 이소프렌의 실질적인 일부분이 좀 더 나아가 연료 성분을 생산하도록 전환될 수 있는 중간체로 전환된다. 일정 구현예에서, 바이오이소프렌 조성물로부터 나온 이소프렌의 실질적인 일부분이 이소프렌이 아닌 화합물로 전환된다. "실질적인 일부분 (substantial portion)"은 99.99%, 99.9%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80%이다.

일정 경우에, 이소프렌 및 다른 결합된 디엔은 원하는 산물의 수율을 감소시키고 및/또는 촉매를 탈활성화할 수 있는 검-유사 경도 (gum-like consistency)를 가지는 중합 산물을 형성할 수 있다 (R.C.C. Pereira and V.M.D. Pasa. Fuel 85 (2006) 1860-1865). 일정 구현예에서, 산물 혼합물에 존재하는 결합된 디엔의 양을 결정하는 방법이 제공된다. 안드레이드 등은 존재하는 결합된 디엔의 양을 결정하는 다양한 방법들을 기술하고 있고, (D.F. Andrade et al., Fuel (2010), doi:10.106/j.fuel/2010.01.003) 다음을 포함한다: 1) 디엔과의 디엘-알더 반응에 의해 연소되는 말레익 안하이드라이드의 양이 측정되는 반-정량적 방법인 UOP-326 방법 (말레익 안하이드라이드 방법); 2) 편광 기록법 (polarography); 3) 디엔이 4-메틸-1,2,4-트리아졸린-3,5-디온 (MTAD) 또는 4-페닐-1,2,4-트리아졸린-3,5-디온 (PTAD)과 같은 유도체화 제제와 반응될 수 있는, 기체 크로마토그래피 (gas chromatography); 4) HPLC; 5) 초임계 유체 크로마토그래피 (supercritical fluid chromatography); 6) NMR; 7) UV 및 IR 근방 분광분석법 (spectroscopy); 또한 8) p-니트로벤젠디아조니움 플루오로보레이트 (p-nitrobenezenediazonium fluoroborate)로 디엔을 먼저 유도체화하는 것을 포함할 수 있는 다른 분광분석법들.

본 명세서에서는 검-형성을 최소화하고 및/또는 생산되었던 검의 양을 감소시키는 방법이 제공된다. 일정 구현예에서, 항-산화제는 검-형성을 최소화하는 데 사용된다. 일정 구현예에서, 중합 부산물은 공정 스트림으로 다시 재순환된다. 일정 구현예에서, 중합 부산물의 탈중합 (depolymerization)이 올레핀 상호교환 (metathesis)에 의해 수행된다. 올레핀 상호교환은 2,6-디이소프로필페닐이미도 네오필리덴 몰리브덴 비스(2-터르부틸페녹사이드)(2,6-diisopropylphenylimido neophylidene molybdenum bis(2-tertbutylphenoxide))와 같은 몰리브덴 또는 텅스텐 촉매를 사용하여 수행될 수 있다 (미국 특허 제 US 5,446,102호를 참조하라).

일정 구현예에서, 본 명세서에서 기술된 방법이라면 모두는 좀 더 나아가 이들 반응의 산물을 특성 분석하고 잠재적인 연료값을 평가하는 것을 포함한다. 예를 들어, 산물은 당해 기술분야에 알려져 있는 표준 방법, 예로 GC/MS, NMR, UV-Vis 및 IR 분광분석법, 비등점, 밀도 및 기타 물리적 성질에 의해 특성 분석된다. 산물은 좀 더 나아가 이중적 탄소-동위원소 지문분석법 (dual carbon-isotopic fingerprinting)에 의해 특성 분석될 수 있다 (미국 특허 제 US 7,169,588호를 참조하라). 산물의 잠재적인 연료값은 에너지 밀도, 가열값 (heating value), 물 용해도, 옥탄/세탄 수, 밀도, 점도, 표면 장력, 증발 엔탈피, 증기 분산도 (vapor diffusivity), 점화점, 자가점화점 (autoignition point), 발화도 한계, 구름점 (cloud point) 및 화학적 안정도와 같은 연료 성질을 측정을 측정하는 변수에 의해 평가된다.

시판되는 석유 연료들과 마찬가지로, 바이오이소퓨얼^TM (BioIsoFuel^TM) 산물은 그들의 산성도, 밀도, 미량 무기질 함량, 벤젠, 전체 방향족 물질 함량, 물 함량 및 부식성 (corrosivity)에 대해 테스트될 수 있다. 바이오이소퓨얼^TM에 있는 소수의 불순물이 그들의 물질 특성에 나쁜 영향을 주는지 확인하기 위하여, 시료도 또한 부식성을 위한 물과 구리 스트립에 대한 칼 피셔 (Karl Fischer)와 같은 표준 ASTM 테스트에 의해 그들의 부식성 및 연료 시스템과의 양립성에 대해 테스트될 수 있다.

연료 조성물

본 발명은 본 명세서에서 기술된 방법 및 공정이라면 모두에 의해 생산된 연료 성분을 포함하는 연료 조성물을 제공한다. 일정 구현예에서, 연료 성분은 이소프렌 및 이소프렌의 산화된 유도체로부터 유래한 포화된 C10 및 C15 탄화수소로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 탄화수소를 포함한다. 탄화수소 바이오이소퓨얼^TM 산물은 석유 가솔린 및 디젤과 완전하게 양립가능할 것으로 기대된다. 시판되는 석유 연료와 바이오이소퓨얼^TM의 혼합물은 그들이 산, 황, 방향족 물질, 또는 기타 다른 원치않는 분순물을 포함하지 않기 때문에 더욱 바람직한 특성을 가질 것으로 기대된다.

일정 바람직한 구현예에서, 연료 성분은 바이오이소프렌의 유도체를 포함한다. 재생가능한, 비-석유화학 기초한 자원으로부터 만들어진 바이오이소프렌으로부터 유래한 연료에 대한 중대한 필요성이 있을 것으로 예상된다. 산업적 고객 및 소비자는 석유화학적 공정으로부터 유래한 이소프렌으로 만들어진 것보다 이러한 환경 친화적인 출처로부터 유래한 연료 성분을 구입하도록 바랄 것으로 여겨진다. 좀 더 나아가 고객은 재생가능한 자원으로 만들어진 이러한 환경 친화적인 산물을 위해 추가 비용을 기꺼이 지불할 것으로 여겨진다. 본 명세서에서 기술된 바이오이소프렌 조성물로부터 유래한 연료 성분은 비-석유화학 기초한 자원으로부터 유래한 것을 입증하는 유익을 제시한다.

일정 구현예에서, 연료 성분은 1,2-비스(이소프로필)사이클로부탄, 1,2-비스(이소프로필)사이클로부탄, 1-메틸-4-이소프로필사이클로헥산, 1-메틸-3-이소프로필사이클로헥산, 1-에틸-1,4-디메틸사이클로헥산, 1-에틸-1,3-디메틸사이클로헥산, 1,5-디메틸사이클로옥탄 및 1,4-디메틸사이클로옥탄과 같은 하나 이상의 포화된 고리형 C10 탄화수소를 포함한다. 일정 구현예에서, 연료 성분은 1,5,9-트리메틸사이클로도데칸 및 1,5,10-트리메틸사이클로도데칸과 같은 하나 이상의 포화된 고리형 C15 탄화수소를 포함한다. 일정 구현예에서, 연료 성분은 2,6-디메틸옥탄, 2,7-디메틸옥탄 및 3,6-디메틸옥탄과 같은 하나 이상의 포화된 지방족 C10 탄화수소를 포함한다. 일정 구현예에서, 연료 성분은 2,6,10-트리메틸도데칸, 2,7,10-트리메틸도데칸 및 3,7,10-트리메틸도데칸과 같은 하나 이상의 포화된 지방족 C15 탄화수소를 포함한다. 일정 구현예에서, 연료 성분은 2-메틸부탄을 포함한다. 일정 구현예에서, 연료 성분은 1,2-비스(이소프로필)사이클로부탄, 1,2-비스(이소프로필)사이클로부탄, 1-메틸-4-이소프로필사이클로헥산, 1-메틸-3-이소프로필사이클로헥산, 1-에틸-1,4-디메틸사이클로헥산, 1-에틸-1,3-디메틸사이클로헥산, 1,5-디메틸사이클로옥탄, 1,4-디메틸사이클로옥탄, 1,5,9-트리메틸사이클로도데칸, 1,5,10-트리메틸사이클로도데칸, 1,6-디메틸옥탄, 2,7-디메틸옥탄, 3,6-디메틸옥탄, 2,6,10-트리메틸도데칸, 2,7,10-트리메틸도데칸, 3,7,10-트리메틸도데칸 및 2-메틸부탄으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 탄화수소를 포함한다.

일정 구현예에서, 연료 성분은 C5 알코올 및 디올 (예로, 3-메틸-부탄-1-올, 2-메틸-부탄-1-올 및 2-메틸-부탄-2-올, 3-메틸-부탄-1,3-디올 및 2-메틸-부탄-2,3-디올), C-10 알코올 및 디올 (예로, 3,7-디메틸옥탄-1-올, 2,7-디메틸옥탄-1-올, 2,7-디메틸옥탄-2-올, 2,7-디메틸옥탄-2,7-디올), 및 고리형 C-10 알코올 (예로, 2-(4-메틸사이클로헥실)프로판-2-올, 2-(4-메틸사이클로헥실)프로판-1-올, 2-(1,4-메틸사이클로헥실)에탄올 및 4-에틸-1,4-디메틸사이클로헥산올)과 같은 하나 이상의 포화된 수산화물을 포함한다. 일정 구현예에서, 연료 성분은 1,3-디에톡시-3-메틸부탄, 1-에톡시-3-메틸부탄, 1-메톡시-2,7-디메틸옥탄 및 3-메톡시-2,7-디메틸옥탄과 같은 하나 이상의 포화된 에테르를 포함한다. 일정 구현예에서, 연료 성분은 3-메틸-부탄-1-올, 2-메틸-부탄-1-올, 2-메틸-부탄-2-올, 3-메틸-부탄-1,3-디올, 2-메틸-부탄-2,3-디올, 3,7-디메틸옥탄-1-올, 2,7-디메틸옥탄-1-올, 2,7-디메틸옥탄-2-올, 2,7-디메틸옥탄-2,7-디올, 2-(4-메틸사이클로헥실)프로판-2-올, 2-(4-메틸사이클로헥실)프로판-1-올, 2-(1,4-메틸사이클로헥실)에탄올, 4-에틸-1,4-디메틸사이클로헥산올, 1,3-디에톡시-3-메틸부탄, 1-에톡시-3-메틸부탄, 1-메톡시-2,7-디메틸옥탄 및 3-메톡시-2,7-디메틸옥탄으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 이소프렌 유래한 산화물을 포함한다.

일정 구현예에서, 연료 성분은 본 명세서에서 기술된 방법 및 공정이라면 모두에 따른 단계를 거친 이후에 이소프렌이 아닌 C5 탄화수소로부터 나온 약 0.5 μg/L 이하 산물을 포함한다. 한 가지 구현예에서, 연료 성분은 본 명세서에서 기술된 방법 및 공정이라면 모두에 따른 단계를 거친 이후에 이소프렌이 아닌 C5 탄화수소로부터 나온 산물이 실질적으로 없다. 일정 구현예에서, 연료 성분은 시작 조성물에 있는 모든 C5 탄화수소의 전체 무게에 대비한 무게로 0.2, 0.12, 0.10, 0.08, 0.06, 0.04, 0.02, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005, 또는 0.00001% 이하의 이소프렌이 아닌 C5 탄화수소 (1,3-사이클로펜타디엔, 시스-1,3-펜타디엔, 트랜스-1,3-펜타디엔, 1,4-펜타디엔, 1-펜틴, 2-펜틴, 1-펜텐, 2-메틸-1-부텐, 3-메틸-1-부틴, 펜트-4-엔-1-인, 트랜스-펜트-3-엔-1-인, 또는 시스-펜트-3-엔-1-인과 같음)를 포함한다. 일정 구현예에서, 연료 성분은 이소프렌이 아닌 C5 탄화수소 (1,3-사이클로펜타디엔, 시스-1,3-펜타디엔, 트랜스-1,3-펜타디엔, 1,4-펜타디엔, 1-펜틴, 2-펜틴, 1-펜텐, 2-메틸-1-부텐, 3-메틸-1-부틴, 펜트-4-엔-1-인, 트랜스-펜트-3-엔-1-인, 또는 시스-펜트-3-엔-1-인과 같음)를 100, 10, 1, 0.1 또는 0.01 ppm 이하의 농도로 포함한다.

본 명세서에서 기술된 바이오이소프렌 조성물에서 이소프렌이 아닌 성분은 본 명세서에서 기술된 다양한 공정을 거친 이후에 서로 다른 산물로 전환될 것이다. 본 방법/공정에 사용되는 금속-기초 촉매의 이소프렌이 아닌 성분에 대한 민감도는 이들 성분의 성질 및 수준에 의존하여 서로 달라진다. 열적 이중합 공정의 경우, 보다 더 넓은 범위의 화합물을 인내할 수 있다. 일정 경우에, 이소프렌이 아닌 성분은 이소프렌과 반응하여 부가물을 생산하고, 예를 들어 이소프렌과의 메타크롤레인 및 메틸 비닐 케톤의 디엘-알더 반응은 6개-구성원으로 된 산물을 준다. 불포화된 부가물은 좀 더 나아가 연료 성분 및 조성물에 존재하는 포화된 유도체, 예로 1,4-디메틸-1-(하이드록시메틸)사이클로헥산 및 1-(1-하이드록시에틸)-4-메틸사이클로헥산으로 수소화될 수 있다 (화학식 XV를 참조하라).

화학식 XV

일정 구현예에서, 연료 성분은 본 명세서에서 기술된 방법 및 공정이라면 모두에 따른 단계를 거친 이후에 에탄올, 아세톤, C5 프레닐 아코올, 및 10개 이상의 탄소 원자를 가지는 이소프레노이드 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 화합물로부터 나온 산물을 포함한다. 일정 구현예에서, 연료 성분은 본 명세서에서 기술된 방법 및 공정이라면 모두에 따른 단계를 거친 이후에 에탄올, 아세톤, 메탄올, 아세트알데하이드, 메타크롤레인, 메틸 비닐 케톤, 2-메틸-2-비닐옥시란, 시스- 및 트랜스-3-메틸-1,3-펜타디엔, C5 프레닐 알코올 (3-메틸-3-부텐-1-올 또는 3-메틸-2-부텐-1-올과 같음), 2-헵탄온, 6-메틸-5-헵텐-2-온, 2,4,5-트리메틸피리딘, 2,3,5-트리메틸피라진, 시트로넬랄, 메탄티올, 메틸 아세테이트, 1-프로판올, 디아세틸, 2-부탄온, 2-메틸-3-부텐-2-올, 에틸 아세테이트, 2-메틸-1-프로판올, 3-메틸-1-부탄알, 3-메틸-2-부탄온, 1-부탄올, 2-펜탄온, 3-메틸-1-부탄올, 에틸 부틸레이트, 3-메틸-2-부텐알, 부틸 아세테이트, 3-메틸부틸 아세테이트, 3-메틸-3-부텐-1-일 아세테이트, 3-메틸-2-부텐-1-일 아세테이트, 3-헥센-1-올, 3-헥센-1-일 아세테이트, 리모넨, 게라니올 (트랜스-3,7-디메틸-2,6-옥타디엔-1-올), 시트로넬롤 (3,7-디메틸-6-옥텐-1-올), (E)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔, (Z)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔, 및 2,3-사이클로헵텐올피리딘으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물로부터 나온 하나 이상의 산물을 포함한다. 일정 구현예에서, 연료 성분은 1,4-디메틸-1-(하이드록시메틸)사이클로헥산, 1-(1-하이드록시에틸)-4-메틸사이클로헥산, 2-메틸부탄, 3-메틸펜탄, 2-프로판올, 2-메틸-1-프로판올, 2-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 에틸 아세테이트 및 3-메틸-1-부틸 아세테이트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함한다. 일정 구현예에서, 연료 성분은 1,4-디메틸-1-(하이드록시메틸)사이클로헥산, 1-(1-하이드록시에틸)-4-메틸사이클로헥산, 2-메틸부탄, 3-메틸펜탄, 2-프로판올, 2-메틸-1-프로판올, 2-부탄올, 3-메틸-1-부탄올, 에틸 아세테이트 및 3-메틸-1-부틸 아세테이트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 약 10 ppm, 1 ppm, 100 ppb 또는 1 ppb 이상의 수준으로 포함한다.

일정 구현예에서, 연료 성분은 에탄올, 아세톤, 메탄올, 아세트알데하이드, 메타크롤레인, 메틸 비닐 케톤, 2-메틸-2-비닐옥시란, 시스- 및 트랜스-3-메틸-1,3-펜타디엔, C5 프레닐 알코올 (3-메틸-3-부텐-1-올 또는 3-메틸-2-부텐-1-올과 같음), 2-헵탄온, 6-메틸-5-헵텐-2-온, 2,4,5-트리메틸피리딘, 2,3,5-트리메틸피라진, 시트로넬랄, 메탄티올, 메틸 아세테이트, 1-프로판올, 디아세틸, 2-부탄온, 2-메틸-3-부텐-2-올, 에틸 아세테이트, 2-메틸-1-프로판올, 3-메틸-1-부탄알, 3-메틸-2-부탄온, 1-부탄올, 2-펜탄온, 3-메틸-1-부탄올, 에틸 부틸레이트, 3-메틸-2-부텐알, 부틸 아세테이트, 3-메틸부틸 아세테이트, 3-메틸-3-부텐-1-일 아세테이트, 3-메틸-2-부텐-1-일 아세테이트, 3-헥센-1-올, 3-헥센-1-일 아세테이트, 리모넨, 게라니올 (트랜스-3,7-디메틸-2,6-옥타디엔-1-올), 시트로넬롤 (3,7-디메틸-6-옥텐-1-올), (E)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔, (Z)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔, 및 2,3-사이클로헵텐올피리딘으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 약 10 ppm, 1 ppm, 100 ppb 또는 1 ppb 이상의 수준으로 포함한다.

탄소 지문분석법

바이오이소프렌으로부터 유래한 바이오이소퓨얼은 이중적 탄소-동위원소 지문분석법을 기초로 하여 석유화학적 탄소로부터 유래한 연료와 구별될 수 있다. 추가적으로, 생물로부터 나온 (biosourced) 탄소의 특정한 출처 (예로, 포도당 대비 글리세롤)는 이중적 탄소-동위원소 지문분석법에 의해 결정될 수 있다 (미국 특허 제 7,169,588호를 참조하고, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있다).

본 방법은 유용하게도 화학적으로-일치하는 물질을 구별하고, 생물환경적 (식물) 성분의 성장원 (source of growth) (및 가능하게는 햇수)에 의해 산물에서 탄소를 배분한다. 동위원소 ¹⁴C 및 ¹³C는 이 문제에 대한 보완적인 정보를 가져온다. 5730년의 핵 반감기를 가지는 방사성탄소 연대측정 동위원소 (radiocarbon dating isotope, ¹⁴C)는 화석 ("죽은") 및 생물환경적 ("살아있는") 공급원료 간 표본 탄소를 배분하도록 허용한다 [Currie, L. A. "대기 입자의 출처 분배 (Source Apportionment of Atmospheric Particles)," 환경적 입자의 특성분석 (Characterization of Environmental Particles), J. Buffle and H. P. van Leeuwen, IUPAC 환경 분석 화학 시리즈 (Environmental Analytical Chemistry Series)의 초판 제 1권 (루이스 출판사) (1992) 3 74]. 방사성탄소 연대측정에서 기본 가정은 대기에서 ¹⁴C 농도의 항존도 (constancy)는 살아있는 생물에서 ¹⁴C 의 항존도를 유도한다. 분리된 시료를 다룰 때, 시료의 연대는 t = (-5730/0.693)ln(A/A_O) (공식 14) 관련성에 의해 대략적으로 추론될 수 있고, 여기에서 t = 연대, 5730 년은 방사성탄소의 반감기이고, A 및 A_O 는 각각 시료 및 표준 모뎀의 특이적 ¹⁴C 활성이다 [Hsieh, Y., Soil Sci. Soc. Am J., 56, 460, (1992)]. 그러나 1950년 이래 대기의 핵 실험 및 1850 이래 화석 연료의 연소 때문에, ¹⁴C는 두 번째 지질화학적 시간 특징을 획득하게 되었다. 대기적 CO₂에서의 - 또한 살아있는 생물환경 (biosphere)에서 - 그의 농도는 1960년대 중반에 핵 실험의 피크 시기에 대략적으로 두 배가 되었다. 이것은 그 이래로 약 1.2 x 10¹²의 안정기 우주생성 (cosmogenic) (대기적) 지저선 동위원소 비율 (¹⁴C/¹²C)로 점차 회귀되어 왔으며 7 - 10 년의 대략적 완화 "반감기"를 가진다. (본 후자의 반감기는 문자 그대로 고려되어서는 안되고; 오히려 핵 나이의 시작 이후에 상세한 대기의 핵 유입/붕괴 함수를 사용하여 대기적 및 생물환경적 ¹⁴C의 다양성을 추적해야 한다.) 이것은 최근의 생물환경적 탄소의 매년 연대측정의 전망을 후퇴시키는 이러한 후자의 생물환경적 ¹⁴C 시간의 특징이다. ¹⁴C는 "모뎀 탄소의 분획 (fraction of modem carbon)" (f_M)의 단위로 주어지는 결과를 가지고 가속기 질량 분광분석법 (accelerator mass spectrometry, AMS)에 의해 측정될 수 있다. f_M 은 옥살산 표준 HOxI 및 HOxII으로서 알려져 있는 국립표준기술연구소 (National Institute of Standards and Technology, NIST) 표준 기준 물질 (Standard Reference Materials, SRMs) 4990B 및 4990C에 의해 각각 정의된다. 기본적인 정의는 ¹⁴C/¹²C 동위원소 비율 HOxI (AD 1950 기준) 곱하기 0.95에 관한 것이다. 이것은 대략적으로 붕괴-교정된 산업혁명 이전의 나무와 동등하다. 현재 살아있는 생물환경 (식물 물질)의 경우 f_M

1.1이다.

안정한 탄소 동위원소 비율 (¹³C/¹²C)은 출처 구분 및 배분에 보완적인 경로를 제공한다. 주어진 생물출처의 물질에서 ¹⁴C/¹²C 비율은 이산화탄소가 고정된 시기에 대기적 이산화탄소에 있는 ¹⁴C/¹²C 비율의 결과이고 대사 과정도 역시 반영하고 있다. 지역적인 다양성도 또한 발생한다. 석유, C₃ 식물 (잎이 넓음), C₄ 식물 (초목), 및 해양 카보네이트는 모두 ¹⁴C/¹²C 및 이에 해당하는 δ¹³C에서 유의한 차이를 보여준다. 또한, C₃ 및 C₄ 식물의 지질 물질은 대사 과정의 결과로서 동일한 식물의 탄수화물 성분으로부터 유래한 물질과는 다르게 분석하고 있다. 측정의 정확성 범위 이내에서, ¹³C는 동위원소 분획 효과로 인해 큰 다양성을 보여주고 있으며 본 발명의 경우에 이들 중 가장 중요한 것은 광합성 기작이다. 식물에서 탄소 동위원소에서 차이의 주요한 원인은 식물에서 광합성적 탄소 대사의 경로에서, 상세하게는 일차적인 카복시화 예로 대기적 CO₂의 초기 고정 과정 동안 발생하는 반응에서 차이와 밀접하게 연관되어 있다. 증식 (vegetation)의 두 가지 큰 부류는 "C₃" (또는 칼빈-벤슨 (Calvin-Benson)) 광합성 순환을 사용하는 것 및 "C₄" (또는 해치-슬랙 (Hatch-Slack)) 광합성 순환을 사용하는 것이다. 단단한 나무 및 칩엽수와 같은 C₃ 식물은 적당한 기후 지역에 우세하다. C₃ 식물에서, 일차적인 CO₂ 고정 및 카복시화 반응에는 효소 리불로스-1,5-디포스페이트 카복시화제 (ribulose-1,5-diphosphate carboxylase)가 관여하고 첫 번째 안정한 산물은 3개-탄소 화합물이다. 한편 C₄ 식물은 열대성 초목, 옥수수 및 사탕수수와 같은 식물을 포함한다. C₄ 식물에서, 또 다른 효소 포스페놀-피루베이트 카복시화제 (phosphoenol-pyruvate carboxylase)가 관여하는 추가적인 카복시화 반응은 일차적인 카복시화 반응이다. 첫 번째 안정한 탄소 화합물은 연속적으로 탈카복시화되는 4개-탄소산이다. 따라서 방출되는 CO₂는 C₃ 순환에 의해 재고정된다.

C₄ 및 C₃ 식물은 ¹³C/¹²C 동위원소 비율의 범위를 나타내지만, 전형적인 값은 밀리그램 당 약 -10 내지 -14 (C₄) 및 밀리그램 당 -21 to -26 (C₃)이다 [Weber et al., J. Agric. Food Chem., 45, 2942 (1997)]. 석탄과 석유는 일반적으로 본 후자의 범위에 속한다. ¹³C 측정 척도 (scale)는 원래 피디 전석 (pee dee belemnite, PDB) 석회암에 의한 영점 설정 (zero set)에 의해 원래 정의되었고, 여기에서 수치는 본 물질로부터 일천 오차 (thousand deviations) 당 부분으로 주어진다. "δ¹³C" 값은 (밀리그램 당) 일천 당 부분, 약어로는 ‰이며, 다음의 (공식 15)과 같이 계산된다:

(공식 15)

PDB 기준 물질 (RM)이 소진된 이후에도, 대안의 RMs이 IAEA, USGS, NIST 및 기타 선택된 국제 동위원소 연구소들과 협력하여 개발되어 왔다. PDB로부터 밀리그램 당 오차에 대한 표시는 δ¹³C이다. 측정은 질량 44, 45 및 46의 분자적 이온 상에서 고성능 안정한 비율 질량 분광분석법 (IRMS)에 의해 시행된다.

석유 정련으로부터 나온 C₅ 스트림의 추출적 증류로부터 유래한 이소프렌의 경우, δ¹³C가 약 -22‰ 내지 약 -24‰이다. 본 범위는 석유로부터 유래한 가볍고 불포화된 탄화수소에 전형적이고 석유-기초 이소프렌으로부터 유래한 산물은 전형적으로 동일한 δ¹³C를 가진 이소프렌 단위를 포함한다. 최소량의 다른 탄소-포함 영양분 (예로, 효모 추출물)을 가지는 옥수수-유래 포도당 (δ¹³C - 10.73‰)의 발효에 의해 생산된 바이오이소프렌은 δ¹³C - 14.66‰ 내지 -14.85‰를 가진 폴리이소프렌으로 다중합될 수 있는 이소프렌을 생산한다. 이러한 이소프렌으로부터 생산되는 산물은 석유-기초 이소프렌으로부터 유래한 것보다 더 음성인 δ¹³C 값을 가질 것으로 예상된다. 이소프렌의 포름알데하이드와 반응으로부터 유래한 이소프렌의 경우, δ¹³C 값은 포름알데하이드가 종종 보다 더 음성인 δ¹³C 값을 가진 공급원료로부터 유래하기 때문에 약 -34.4‰이 될 수 있다.

생물-재생가능한 탄소원을 사용하는 세포 배양으로부터 나온 이소프렌으로 만들어지는 본 발명의 연료 및 연료 성분은 그들의 δ¹³C 값 및 기타 다른 특징에 의해 마찬가지로 확인될 수 있다. 일정 구현예에서, 바이오이소프렌으로부터 유래한 연료 성분은 -22‰ 이상의 (덜 음성인) δ¹³C 값을 가진다. 일정 구현예에서, 바이오이소프렌으로부터 유래한 연료 성분은 -20, -18, -16, -14, -12, 또는 -10‰ 이상의 δ¹³C 값을 가진다. 일정 구현예에서, 바이오이소프렌으로부터 유래한 연료 성분은 -22 내지 -10, -21 내지 -12, 또는 -20 내지 -14‰의 범위 이내에 있는 δ¹³C 값을 가진다. 일정 구현예에서, 바이오이소프렌으로부터 유래한 연료 성분은 -34 내지 -24, -34 내지 -25, -33 내지 -25, -32 내지 -24, -32 내지 -25, -31 내지 -25, -30 내지 -29, -30.0 내지 -29.5, -29.5 내지 -28.5, 또는 -29.0 내지 -28.5‰의 범위 이내에 있는 δ¹³C 값을 가진다.

일정 구현예에서, 바이오이소프렌으로부터 유래한 연료 성분은 방사성 탄소-14를 포함한다. 일정 구현예에서, ¹⁴C/¹²C 비율은 약 1.0 x 10^-12, 1.05 x 10^-12, 1.1 x 10^-12, 1.15 x 10^-12,또는 1.2 x 10^-12 이상이다. 일정 구현예에서, 바이오이소프렌으로부터 유래한 연료 성분은 약 0.9, 0.95, 1.0, 1.05 또는 1.1 이상의 f_M 값을 가진다. 일정 구현예에서, 바이오이소프렌으로부터 유래한 연료 성분은 약 0.9, 0.95, 1.0, 1.05 또는 1.1 이상의 f_M 값을 가지고, -22‰ 이상의 (덜 음성인) δ¹³C 값을 가진다. 일정 구현예에서, 바이오이소프렌으로부터 유래한 연료 성분은 약 0.9, 0.95, 1.0, 1.05 또는 1.1 이상의 f_M 값 및 -22‰ 이상의 (덜 음성인) δ¹³C 값을 가진다. 일정 구현예에서, 바이오이소프렌으로부터 유래한 연료 성분은 약 0.9, 0.95, 1.0, 1.05 또는 1.1 이상의 f_M 값, 또한 -22 내지 -10, -21 내지 -12, 또는 -20 내지 -14‰의 범위 이내에 있는 δ¹³C 값을 가진다. 일정 구현예에서, 바이오이소프렌으로부터 유래한 연료 성분은 약 0.9, 0.95, 1.0, 1.05 또는 1.1 이상의 f_M 값, 또한 -34 내지 -24, -34 내지 -25, -33 내지 -25, -32 내지 -24, -32 내지 -25, -31 내지 -25, -30 내지 -29, -30.0 내지 -29.5, -29.5 내지 -28.5, 또는 -29.0 내지 -28.5‰의 범위 이내에 있는 δ¹³C 값을 가진다.

바이오이소프렌 유도체 및 관련된 바이오이소퓨얼, 중간체 및 혼합물은 ¹⁴C (f_M) 및 이중적 탄소-동위원소 지문분석법을 기초로 하여 그들의 석유화학적 유래의 물질과는 완벽하게 구별될 수 있고, 물질의 새로운 조성을 표시하고 있다.

일정 구현예에서, 본 발명의 연료 성분은 에탄올의 것보다 높은 에너지 밀도를 가진다. 일정 구현예에서, 연료 성분은 연료, 예로 석유-기초 연료의 세탄 수를 변화시킨다 (boost). 일정 구현예에서, 연료 성분은 석유 기초한 연료의 방출을 감소시킨다. 일정 구현예에서, 연료 성분은 약 80 내지 약 120 사이의 범위에 있는 옥탄 수를 가진다. 일정 구현예에서, 연료 성분은 약 30 내지 약 130 사이의 범위에 있는 세탄 수를 가진다.

일정 구현예에서, 본 발명의 연료 조성물은 하나 이상의 디메틸사이클로옥탄 화합물을 포함한다. 일정 구현예에서, 본 발명의 연료 조성물은 치환된 사이클로헥산과 같은 하나 이상의 C10 탄화수소를 포함한다. 일정 구현예에서, 본 발명의 연료 조성물은 본 명세서에서 기술된 하나 이상의 이소프렌 유래한 산화물을 포함한다. 일정 구현예에서, 본 발명에서 기술된 연료 조성물이라면 모두는 좀 더 나아가 모든 연료 조성물의 전체 무게 또는 부피를 기초로 한 무게 또는 부피로 약 1%로부터 약 95%까지의 양으로 석유 기초한 연료를 포함한다.

본 발명은 좀 더 나아가 석유 증류물을 획득하고 본 발명의 연료 성분을 첨가하는 것을 포함하는 연료 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 다음의 실시예들을 참고하여 좀 더 이해될 수 있으며, 이는 설명하려고 제공된 것이고 제한하려는 것은 아니다.

도 1은 대장균 (E. coli)에서 발현을 위해 코돈-최적화된 쿠쥬 이소프렌 합성효소 (kudzu isoprene synthase) 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸 것이다 (서열번호 1). atg 시작 코돈은 이탤릭체로 표시되고, 종결 코돈은 굵은 문자로 표시되며, 첨가된 PstI 부위는 밑줄로 표시된다.
도 2는 pTrcKudzu의 지도를 나타낸 것이다.
도 3A 내지 3C는 pTrcKudzu (서열번호 2)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸 것이다. RBS는 밑줄로 표시되고, 쿠쥬 이소프렌 합성효소의 시작 코돈은 굵은 대문자로 표시되며 종결 코돈도 굵은 대문자로 표시된다. 벡터 골격은 pTrcHis2B이다.
도 4는 pETNHisKudzu의 지도를 나타낸 것이다.
도 5A 내지 5C는 pETNHisKudzu의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 3)을 나타낸 것이다.
도 6은 pCL-lac-Kudzu의 지도를 나타낸 것이다.
도 7A 내지 7C는 pCL-lac-Kudzu의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 4)을 나타낸 것이다.
도 8A는 벡터가 없는 대장균 BL21 에서 이소프렌의 생산을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다.
도 8B는 pCL-lac-Kudzu 를 사용하여 대장균 BL21 에서 이소프렌의 생산을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다.
도 8C는 pTrcKudzu를 사용하여 대장균 BL21 에서 이소프렌의 생산을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다.
도 8D는 pETN-HisKudzu 를 사용하여 대장균 BL21 에서 이소프렌의 생산을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다.
도 9A 는 14 리터 사료첨가 회분식 발효 (fed batch fermentation)에서 대장균 BL21/pTrcKudzu 발효의 OD 오버타임을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다.
도 9B는 14 리터 회분식 발효에서 대장균 BL21/pTrcKudzu 발효의 이소프렌 생산 오버타임을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다.
도 10A는 판테오아 시트레아 (Panteoa citrea)에서 이소프렌의 생산을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. 대조군 세포는 재조합 쿠쥬 이소프렌 합성효소가 없음. 회색 다이아몬드는 이소프렌 합성효소를 나타내고, 검은색 네모는 OD₆₀₀을 나타낸다.
도 10B 는 pCL-lac Kudzu를 발현하는 판테오아 시트레아에서 이소프렌의 생산을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. 회색 다이아몬드는 이소프렌 합성효소를 나타내고, 검은색 네모는 OD₆₀₀을 나타낸다.
도 10C 는 pTrcKudzu 를 발현하는 판테오아 시트레아에서 이소프렌의 생산을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. 회색 다이아몬드는 이소프렌 합성효소를 나타내고, 검은색 네모는 OD₆₀₀을 나타낸다.
도 11은 재조합 이소프렌 합성효소를 발현하는 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis)에서 이소프렌의 생산을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. BG3594comK 는 플라스미드 (천연 그대로의 이소프렌 생산)가 없는 B. 섭틸리스 균주이다. CF443 는 pBSKudzu (재조합 이소프렌 생산)을 가지는 B. 섭틸리스 균주 BG3594comK이다. Y-축 상의 IS는 이소프렌을 표시한다.
도 12A 내지 12C 는 pBS Kudzu #2의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 5)를 나타낸 것이다.
도 13은 야로위야 (Yarrowia)에서 발현을 위해 코돈-최적화된 쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 6)을 나타낸 것이다.
도 14는야로위야에서 발현을 위해 코돈-최적화된 쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자를 포함하는 pTrex3g의 지도를 나타낸 것이다.
도 15A 내지 15C는 벡터pSPZ1(MAP29Spb)의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 7)을 나타낸 것이다.
도 16은 는야로위야에서 발현을 위해 코돈-최적화된 합성 쿠쥬 (푸에라리아 몬타나 (Pueraria montana)) 이소프렌 합성효소 유전자의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 8)을 나타낸 것이다.
도 17은 합성 하이브리드 포풀라 (포풀라 알바 (Populus alba) x 포풀라 트레물라 (Populus tremula)) 이소프렌 합성효소 유전자의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 9)을 나타낸 것이다. ATG 시작 코돈은 굵은 문자로 표시하고 종결 코돈은 밑줄로 표시한다.
도 18A (도 18A1 및 18A2)는 벡터 pYLA 1, pYL1 및 pYL2의 도식적 윤곽 제작 (서열번호 75, 73, 72, 71, 70, 69)을 나타낸 것이다.
도 18B는 벡터 pYLA(POP1)의 도식적 윤곽 제작을 나타낸 것이다.
도 18C는 벡터 pYLA(KZ1)의 도식적 윤곽 제작을 나타낸 것이다.
도 18D는 벡터 pYLI(KZ1)의 도식적 윤곽 제작을 나타낸 것이다.
도 18E는 벡터 pYLI(MAP29)의 도식적 윤곽 제작을 나타낸 것이다.
도 18F는 벡터 pYLA(MAP29)의 도식적 윤곽 제작을 나타낸 것이다.
도 19A는 이소프렌을 위한 MVA 및 DXP 대사 경로 (F. Bouvier et al., Progress in Lipid Res. 44: 357-429, 2005에 근거하고 있음)를 나타낸 것이다. 하기 기술내용은 경로에 있는 각 폴리펩타이드에 대한 대안의 명칭 및 표시된 폴리펩타이드의 활성을 측정하는 분석법을 기재하고 있는 참고문헌을 포함한다 (이들 참고문헌의 각각은 본 명서세에서 전부, 상세하게는 MVA 및 DXP 경로에서의 폴리펩타이드를 위한 폴리펩타이드 활성 분석법에 관하여 참고문헌으로 통합되어 있다). 메발로네이트 경로: AACT; 아세틸-CoA 아세틸전이효소 (MvaE), EC 2.3.1.9. 분석법: J. Bacteriol., 184: 2116-2122, 2002; HMGS; 하이드록시메틸글루타릴-CoA 합성효소, MvaS, EC 2.3.3.10. 분석법: J. Bacteriol., 184: 4065-4070, 2002; HMGR; 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 환원효소, MvaE, EC 1.1.1.34. 분석법: J. Bacteriol., 184: 2116-2122, 2002; MVK; 메발로네이트 키나제, ERG12, EC 2.7.1.36. 분석법: Curr Genet 19:9-14, 1991. PMK; 포스포메발로네이트 키나제, ERG8, EC 2.7.4.2, 분석법: Mol Cell Biol., 11:620-631, 1991; DPMDC; 디포스포메발로네이트 탈탄산화효소, MVD1, EC 4.1.1.33. 분석법: Biochemistry, 33:13355-13362, 1994; IDI; 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제, IDI1, EC 5.3.3.2. 분석법: J. Biol. Chem. 264:19169-19175, 1989. DXP Pathway: DXS; 1-디옥시자일루로스-5-포스페이트 합성효소, dxs, EC 2.2.1.7. 분석법: PNAS, 94:12857-62, 1997; DXR; 1-디옥시-D-자일루로스 5-포스페이트 환원이소머라제, dxr, EC 2.2.1.7. 분석법: Eur. J. Biochem. 269:4446-4457, 2002; MCT; 4-디포스포사이티딜-2C-메틸-에리트리톨 합성효소, IspD, EC 2.7.7.60. 분석법: PNAS, 97: 6451-6456, 2000; CMK; 4-디포스포사이티딜-2-C-메틸-D-에리트리톨 키나제, IspE, EC 2.7.1.148. 분석법: PNAS, 97:1062-1067, 2000; MCS; 2C-메틸-D-에리트리톨 2,4-사이클로디포스페이트 합성효소, IspF, EC 4.6.1.12. 분석법: PNAS, 96:11758-11763, 1999; HDS; 1-하이드록시-2-메틸-2-(E)-부테닐 4-디포스페이트 합성효소, ispG, EC 1.17.4.3. 분석법: J. Org. Chem., 70:9168-9174, 2005; HDR; 1-하이드록시-2-메틸-2-(E)-부테닐 4-디포스페이트 환원효소, IspH, EC 1.17.1.2. 분석법: JACS, 126:12847-12855, 2004.
도 19B는 고전적 및 변형된 MVA 경로를 나타낸 것이다. 1. 아세틸-CoA 아세틸전이효소 (AACT); 2, HMG-CoA 합성효소 (HMGS); 3, HMG-CoA 환원효소 (HMGR); 4, 메발로네이트 키나제 (MVK); 5, 포스포메발로네이트 키나제 (PMK); 6, 디메발로네이트 키나제 (MVD 또는 DPMDC); 7, 이소펜테닐 디포스페이트 이소머라제 (IDI); 8, 포스포메발로네이트 탈탄산화효소 (PMDC); 9, 이소펜테닐 포스페이트 키나제 (IPK). 고전적 MVA 경로는 반응 1로부터 반응 5 및 반응 6을 통해 반응 7까지 진행되는 한편, 변형된 MVA 경로는 반응 8 및 반응 9를 통과한다. 구조 화학식에서 P 및 PP는 각각 포스페이트 및 피로포스페이트이다. 본 도면은 고가 및 모리 문헌 Koga and Morii, Microbiology and Mol. Biology Reviews, 71:97-120, 2007으로부터 가져왔고, 이는 본 명세서에서 전부, 상세하게는 변형된 MVA 경로의 핵산 및 폴리펩타이드에 관하여 참고문헌으로 통합되어 있다. 변형된 MVA 경로는 예를 들어 메타노사르시나 마제이 (Methanosarcina mazei)와 같은 일부 고생물에서 존재한다.
도 20 (도 20A 및 20B)은 쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자가 없거나 (왼쪽) 이를 가지는 (오른쪽) 재조합 Y. 리포리티카 (Y. lipolytica) 균주에 의한 이소프렌 생산의 GC-MS 분석 결과를 보여주는 그래프를 나타낸 것이다.
도 21은 pTrcKudzu yIDI DXS Kan의 지도를 나타낸 것이다.
도22A 내지 22D는 pTrcKudzu yIDI DXS Kan의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 10)을 나타낸 것이다.
도23A는 대장균 BL21/pTrcKudzukan에서 포도당으로부터 이소프렌의 생산을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. 시간 0는 IPTG (400 μmol)로 유도한 시간이다. x-축은 유도 이후 시간이고; y-축은 OD₆₀₀이며 y2-축은 이소프렌의 전체 생산도 (μg/L 상부공간) 또는 특이 생산도 (μg/L 상부공간/OD)이다. 다이아몬드는 OD₆₀₀을 표시하고, 원은 전체 이소프렌 생산도 (μg/L)를 표시하며 네모는 이소프렌의 특이 생산도 (μg/L/OD)를 표시한다.
도23B는 대장균 BL21/pTrcKudzu yIDI kan에서 포도당으로부터 이소프렌의 생산을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. 시간 0는 IPTG (400 μmol)로 유도한 시간이다. x-축은 유도 이후 시간이고; y-축은 OD₆₀₀이며 y2-축은 이소프렌의 전체 생산도 (μg/L 상부공간) 또는 특이 생산도 (μg/L 상부공간/OD)이다. 다이아몬드는 OD₆₀₀을 표시하고, 원은 전체 이소프렌 생산도 (μg/L)를 표시하며 네모는 이소프렌의 특이 생산도 (μg/L/OD)를 표시한다.
도23C는 대장균 BL21/pTrcKudzu DXS kan에서 포도당으로부터 이소프렌의 생산을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. 시간 0는 IPTG (400 μmol)로 유도한 시간이다. x-축은 유도 이후 시간이고; y-축은 OD₆₀₀이며 y2-축은 이소프렌의 전체 생산도 (μg/L 상부공간) 또는 특이 생산도 (μg/L 상부공간/OD)이다. 다이아몬드는 OD₆₀₀을 표시하고, 원은 이소프렌의 전체 생산도 (μg/L)를 표시하며 네모는 이소프렌의 특이 생산도 (μg/L/OD)를 표시한다.
도23D는 대장균 BL21/pTrcKudzu yIDI DXS kan에서 포도당으로부터 이소프렌의 생산을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. 시간 0는 IPTG (400 μmol)로 유도한 시간이다. x-축은 유도 이후 시간이고; y-축은 OD₆₀₀이며 y2-축은 이소프렌의 전체 생산도 (μg/L 상부공간) 또는 특이 생산도 (μg/L 상부공간/OD)이다. 다이아몬드는 OD₆₀₀을 표시하고, 원은 전체 이소프렌 생산도 (μg/L)를 표시하며 네모는 이소프렌의 특이 생산도 (μg/L/OD)를 표시한다.
도23E는 대장균 BL21/ pCL PtrcKudzu에서 포도당으로부터 이소프렌의 생산을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. 시간 0는 IPTG (400 μmol)로 유도한 시간이다. x-축은 유도 이후 시간이고; y-축은 OD₆₀₀이며 y2-축은 이소프렌의 전체 생산도 (μg/L 상부공간) 또는 특이 생산도 (μg/L 상부공간/OD)이다. 다이아몬드는 OD₆₀₀을 표시하고, 원은 전체 이소프렌 생산도 (μg/L)를 표시하며 네모는 이소프렌의 특이 생산도 (μg/L/OD)를 표시한다.
도23F는 대장균 BL21/ pCL PtrcKudzu yIDI에서 포도당으로부터 이소프렌의 생산을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. 시간 0는 IPTG (400 μmol)로 유도한 시간이다. x-축은 유도 이후 시간이고; y-축은 OD₆₀₀이며 y2-축은 이소프렌의 전체 생산도 (μg/L 상부공간) 또는 특이 생산도 (μg/L 상부공간/OD)이다. 다이아몬드는 OD₆₀₀을 표시하고, 원은 전체 이소프렌 생산도 (μg/L)를 표시하며 네모는 이소프렌의 특이 생산도 (μg/L/OD)를 표시한다.
도23G는 대장균 BL21/ pCL PtrcKudzu DXS에서 포도당으로부터 이소프렌의 생산을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. 시간 0는 IPTG (400 μmol)로 유도한 시간이다. x-축은 유도 이후 시간이고; y-축은 OD₆₀₀이며 y2-축은 이소프렌의 전체 생산도 (μg/L 상부공간) 또는 특이 생산도 (μg/L 상부공간/OD)이다. 다이아몬드는 OD₆₀₀을 표시하고, 원은 전체 이소프렌 생산도 (μg/L)를 표시하며 네모는 이소프렌의 특이 생산도 (μg/L/OD)를 표시한다.
도23H는 대장균 BL21/pTrcKudzuIDIDXSkan에서 포도당으로부터 이소프렌의 생산을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. 시간 0는 IPTG (400 μmol)로 유도한 시간이다. x-축은 유도 이후 시간이고; y-축은 OD₆₀₀이며 y2-축은 이소프렌의 전체 생산도 (μg/L 상부공간) 또는 특이 생산도 (μg/L 상부공간/OD)이다. 다이아몬드는 OD₆₀₀을 표시하고, 원은 전체 이소프렌 생산도 (μg/L)를 표시하며 네모는 이소프렌의 특이 생산도 (μg/L/OD)를 표시한다.
도 24는 pTrcKKDyIkIS kan의 지도를 나타낸 것이다.
도 25A 내지 25D는 pTrcKKDyIkIS kan의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 11)을 나타낸 것이다.
도 26은 pCL PtrcUpperPathway의 지도를 나타낸 것이다.
도 27A 내지 27D는 pCL PtrcUpperPathway의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 12)를 나타낸 것이다.
도 28은 B. 섭틸리스 (B. subtilis) 염색체의 nprE 좌위 (locus) 내로 도입하기 위한 하부 MVA 경로 및 효모 idi를 포함하는 카세트의 지도를 나타낸 것이다. 상류 (upstream)/하류 (downstream) nprE는 도입을 위한 nprE 좌위로부터 각 1kb의 서열을 표시한다. aprE 프로모터 (알칼라인 세린 프로테아제 프로모터 (alkaline serine protease promoter))는 aprE 유전자의 프로모터 (-35, -10, +1 전사 시작 부위, RBS)를 표시한다. MVK1는 효모 메발로네이트 키나제 유전자를 표시한다. RBS-PMK는 바실러스의 시작 부위의 RBS 상류를 가진 효모 포스포메발로네이트 키나제 유전자를 표시한다. RBS-MPD는 바실러스의 시작 부위의 RBS 상류를 가진 효모 디포스포메발로네이트 탈탄산화효소 유전자를 표시한다. RBS-IDI는 바실러스의 시작 부위의 RBS 상류를 가진 효모 idi 유전자를 표시한다. 종결인자 (terminator)는 B. 아밀리크파시엔스 (B. amyliquefaciens)로부터 나온 종결인자 알칼라인 세린 프로테아제 전사 종결인자를 표시한다. SpecR은 스펙티노마이신 저항성 마커 (spectinomycin resistance marker)를 표시한다. "amp을 위한 nprE 상류 반복서열 (nprE upstream repeat for amp)"는 증폭 (amplification)하는 데 사용되는 상류 부위의 직접 반복서열 (direct repeat)을 표시한다.
도 29A 내지 29D는 B. 섭틸리스 염색체의 nprE 좌위 내로 도입하기 위한 하류 MVA 경로 및 효모 idi를 포함하는 카세트의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 13)을 나타낸 것이다.
도 30은 p9796-poplar의 지도를 나타낸 것이다.
도 31A 및 31B는 p9796-poplar의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 14)을 나타낸 것이다.
도 32는 pTrcPoplar의 지도를 나타낸 것이다.
도 33A 내지 33C는 pTrcPoplar의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 15)을 나타낸 것이다.
도 34는 pTrcKudzu yIDI Kan의 지도를 나타낸 것이다.
도 35A 내지 35C는 pTrcKudzu yIDI Kan의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 16)을 나타낸 것이다.
도 36은 pTrcKudzuDXS Kan의 지도를 나타낸 것이다.
도 37A 내지 37C는 pTrcKudzuDXS Kan의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 17)을 나타낸 것이다.
도 38은 pCL PtrcKudzu의 지도를 나타낸 것이다.
도 39A 내지 39C는 pCL PtrcKudzu의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 18)을 나타낸 것이다.
도 40은 pCL PtrcKudzu A3의 지도를 나타낸 것이다.
도 41A 내지 41C는 pCL PtrcKudzu A3의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 19)을 나타낸 것이다.
도 42는 pCL PtrcKudzu yIDI의 지도를 나타낸 것이다.
도 43A 내지 43C는 pCL PtrcKudzu yIDI의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 20)을 나타낸 것이다.
도 44는 pCL PtrcKudzu DXS의 지도를 나타낸 것이다.
도 45A 내지 45D는 pCL PtrcKudzu DXS의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 21)을 나타낸 것이다.
도 46A 내지 46E는 바이오매스 공급원료로부터 이소프렌의 생산을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. 패널 A는 옥수수 스토버 (corn stover)으로부터 이소프렌의 생산을 보여주고, 패널 B는 사탕수수 찌꺼기 (baggasse)로부터 이소프렌의 생산을 보여주며, 패널 C는 연목질 펄프 (softwood pulp)로부터 이소프렌의 생산을 보여주고, 패널 D는 포도당으로부터 이소프렌의 생산, 또한 패널 E는 추가적인 공급원료가 전혀 없이 세포로부터 이소프렌의 생산을 보여준다. 회색 네모는 접종후 지정된 시간에서 배양의 OD₆₀₀ 측정을 표시하고 검은색 세모는 접종-이후 지정된 시간에서 이소프렌의 생산을 표시한다.
도 47A는 첨가된 포도당이 전혀 없는 배양에서 대장균 BL21 (λDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)에 의한 이소프렌 생산을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. 네모는 O_D600를 표시하고, 세모는 생산된 이소프렌 (μg/ml)을 표시한다.
도 47B는 1% 포도당 공급원료인 역슈가 (invert sugar)으로부터 대장균 BL21 (λDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)에 의한 이소프렌 생산을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. 네모는 O_D600를 표시하고, 세모는 생산된 이소프렌 (μg/ml)을 표시한다.
도 47C는 1% 역 설탕 공급원료로부터 대장균 BL21 (λDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)에 의한 이소프렌 생산을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. 네모는 O_D600를 표시하고, 세모는 생산된 이소프렌 (μg/ml)을 표시한다.
도 47D는 1% AFEX 옥수수 스토버 공급원료로부터 대장균 BL21 (λDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)에 의한 이소프렌 생산을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. 네모는 O_D600를 표시하고, 세모는 생산된 이소프렌 (μg/ml)을 표시한다.
도 48A 내지 48C는 이소프렌 생산에서 효모 추출물의 효과를 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. 패널 A는 다양한 양의 효모 추출물을 첨가한 발효기 내의 광학 밀도의 시간 경과를 보여준다. 패널 B는 다양한 양의 효모 추출물을 첨가한 발효기 내의 이소프렌 역가의 시간 경과를 보여준다. 역가는 발효 액체배지 리터 당 생산된 이소프렌량으로서 정의된다. 패널 C는 사료첨가-회분식 배양 (fed-batch culture)에서 자란 대장균에서 이소프렌 생산에 미치는 효모 추출물의 효과를 보여준다.
도 49A 내지 49C는 pTrcKudzu + yIDI + DXS 플라스미드를 포함하는 대장균 세포를 사용하여 500-L 생물반응기 (bioreactor)로부터 이소프렌의 생산을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. 패널 A는 포도당 및 효모 추출물을 첨가한 500-L 생물반응기 내의 광학 밀도의 시간 경과를 보여준다. 패널 B는 포도당 및 효모 추출물을 첨가한 500-L 생물반응기 내의 이소프렌 역가의 시간 경과를 보여준다. 패널 C는 포도당 및 효모 추출물을 첨가한 500-L 생물반응기 로부터 생산된 전체 이소프렌의 시간 경과를 보여준다.
도 50은 pJMupperpathway2의 지도를 나타낸 것이다.
도 51A 내지 51C는 pJMupperpathway2의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 22)을 나타낸 것이다.
도 52는 pBS Kudzu #2의 지도를 나타낸 것이다.
도 53A는 14 리터 회분식 발효에서 재조합 쿠쥬 이소프렌 합성효소를 발현하는 바실러스의 발효 시간 동안의 성장을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. 검은색 다이아몬드는 재조합 이소프렌 합성효소가 없는 (천연 그대로의 이소프렌 생산) 대조군 균주 (BG3594comK)를 표시하고 회색 세모는 pBSKudzu를 가진CF443, 바실러스 균주 BG3594comK (재조합 이소프렌 생산)을 표시한다.
도 53B는 14 리터 회분식 발효에서 재조합 쿠쥬 이소프렌 합성효소를 발현하는 바실러스의 발효 시간 동안의 이소프렌 생산을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. 검은색 다이아몬드는 재조합 이소프렌 합성효소가 없는 (천연 그대로의 이소프렌 생산) 대조군 균주 (BG3594comK)를 표시하고 회색 세모는 pBSKudzu를 가진CF443, 바실러스 균주 BG3594comK (재조합 이소프렌 생산)을 표시한다.
도 54는 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 광학 밀도의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 55는 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 이소프렌 역가의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 56은 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기로부터 생산된 전체 이소프렌의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 57은 글리세롤을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 광학 밀도의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 58은 글리세롤을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 이소프렌 역가의 시간 경과를 나타낸 것이다. 역가는 발효 액체배지 리터 당 생산된 이소프렌량으로서 정의된다.
도 59는 글리세롤을 첨가한 15-L 생물반응기로부터 생산된 전체 이소프렌의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 60A 내지 60C는 포도당을 첨가한 150-L 생물반응기 내의 광학 밀도, 메발론산 역가, 및 특이 생산도의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 61A 내지 61C는 포도당을 첨가한 150-L 생물반응기 내의 광학 밀도, 메발론산 역가, 및 특이 생산도의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 62A 내지 62C는 포도당을 첨가한 150-L 생물반응기 내의 광학 밀도, 메발론산 역가, 및 특이 생산도의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 63A 내지 63C는 포도당을 첨가한 150-L 생물반응기 내의 광학 밀도, 메발론산 역가, 및 특이 생산도의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 64A 내지 64C는 포도당을 첨가한 150-L 생물반응기 내의 광학 밀도, 메발론산 역가, 및 특이 생산도의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 65A 내지 65C는 포도당을 첨가한 150-L 생물반응기 내의 광학 밀도, 메발론산 역가, 및 특이 생산도의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 66A 내지 66C는 포도당을 첨가한 150-L 생물반응기 내의 광학 밀도, 메발론산 역가, 및 특이 생산도의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 67A 내지 67C는 포도당을 첨가한 150-L 생물반응기 내의 광학 밀도, 메발론산 역가, 및 특이 생산도의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 68은 A 시리즈를 위한 계산된 단열 발화 온도 (adiabatic flame temperatures)의 그래프를 다양한 산소 수준에 대한 연료 농도의 함수로서 나타낸 것이다. 도면 설명은 그래프로 표현된 곡선을 순서대로 나열하고 있다. 예를 들어, 도면 설명의 첫 번째 순서 (40℃에서 대기 내의 이소프렌)는 그래프에서 가장 높은 곡선에 해당한다.
도 69는 A 시리즈를 위한 계산된 단열 발화 온도의 그래프를 4% 물을 가진 다양한 산소 수준에 대한 연료 농도의 함수로서 나타낸 것이다. 도면 설명은 그래프로 표현된 곡선을 순서대로 나열하고 있다.
도 70은 A 시리즈를 위한 계산된 단열 발화 온도의 그래프를 5% CO₂를 가진 다양한 산소 수준에 대한 연료 농도의 함수로서 나타낸 것이다. 도면 설명은 그래프로 표현된 곡선을 순서대로 나열하고 있다.
도 71은 A 시리즈를 위한 계산된 단열 발화 온도의 그래프를 10% CO₂를 가진 다양한 산소 수준에 대한 연료 농도의 함수로서 나타낸 것이다. 도면 설명은 그래프로 표현된 곡선을 순서대로 나열하고 있다.
도 72는 A 시리즈를 위한 계산된 단열 발화 온도의 그래프를 15% CO₂를 가진 다양한 산소 수준에 대한 연료 농도의 함수로서 나타낸 것이다. 도면 설명은 그래프로 표현된 곡선을 순서대로 나열하고 있다.
도 73은 A 시리즈를 위한 계산된 단열 발화 온도의 그래프를 20% CO₂를 가진 다양한 산소 수준에 대한 연료 농도의 함수로서 나타낸 것이다. 도면 설명은 그래프로 표현된 곡선을 순서대로 나열하고 있다.
도 74는 A 시리즈를 위한 계산된 단열 발화 온도의 그래프를 30% CO₂를 가진 다양한 산소 수준에 대한 연료 농도의 함수로서 나타낸 것이다. 도면 설명은 그래프로 표현된 곡선을 순서대로 나열하고 있다.
도 75A는 A 시리즈에 대한 무게 퍼센트 대 부피 퍼센트로부터 나온 CAFT 모델 결과의 전환 (conversion) 표를 나타낸 것이다.
도 75B는 부피 퍼센트로서 좌표 표시된 도 69에서 A 시리즈에 대한 CAFT 모델로부터 나온 발화도 (flammability) 결과의 그래프를 나타낸 것이다.
도 76A는 B 시리즈에 대한 무게 퍼센트 대 부피 퍼센트로부터 나온 CAFT 모델 결과의 전환 표를 나타낸 것이다.
도 76B는 부피 퍼센트로서 좌표 표시된 도 69에서 B 시리즈에 대한 CAFT 모델로부터 나온 발화도 결과의 그래프를 나타낸 것이다.
도 77은 발화도 테스트 용기를 묘사한 도면을 나타낸 것이다.
도 78A는 테스트 시리즈 1에 대한 발화도 곡선의 그래프를 나타낸 것이다: 0% 스트림, 0 psig, 및 40℃.
도 78B는 테스트 시리즈 1에 대한 폭발 및 비-폭발 데이터 좌표를 요약한 표를 나타낸 것이다.
도 78C는 CAFT 모델과 비교한 테스트 시리즈 1에 대한 발화도 곡선의 그래프를 나타낸 것이다.
도 79A는 테스트 시리즈 2에 대한 발화도 곡선의 그래프를 나타낸 것이다: 4% 스트림, 0 psig, 및 40℃.
도 79B는 테스트 시리즈 2에 대한 폭발 및 비-폭발 데이터 좌표를 요약한 표를 나타낸 것이다.
도 79C는 CAFT 모델과 비교한 테스트 시리즈 2에 대한 발화도 곡선의 그래프를 나타낸 것이다.
도 80A 및 80B는 상세한 실험적 조건 및 테스트 시리즈 1에 대한 결과의 표를 나타낸 것이다.
도 81은 상세한 실험적 조건 및 테스트 시리즈 2에 대한 결과의 표를 나타낸 것이다.
도 82는 3기압에서 다양한 질소/산소 비율에 대한 연료 농도의 함수로서 좌표 표시된 계산된 단열 발화 온도의 그래프를 나타낸 것이다.
도 83은 1기압에서 다양한 질소/산소 비율에 대한 연료 농도의 함수로서 좌표 표시된 계산된 단열 발화 온도의 그래프를 나타낸 것이다.
도 84는 도 82으로부터 나온 데이터 및 실시예 13에 기술된 방법론을 사용하여 제작된 발화도 한계의 그래프를 나타낸 것이다. 실험적 데이터 좌표 (원)은 본 명세서에 기술된 테스트로부터 나오고 1 기압의 초기 시스템 압력에서 수행되었다.
도 85는 도 83으로부터 나온 데이터 및 실시예 13에 기술된 방법론을 사용하여 제작된 발화도 한계의 그래프를 나타낸 것이다. 실험적 데이터 좌표 (원)은 본 명세서에 기술된 테스트로부터 나오고 1기압의 초기 시스템 압력에서 수행되었다.
도 86A는 발효 배출-기체의 GC/MS 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 86B은 발효 배출-기체에 존재하는 소수의 휘발성 물질을 보여주는 도 86A의 연장선이다.
도 87A는 -78℃에서 냉동-포획에 이어서 배출-기체에 존재하는 소량 휘발성 물질의 GC/MS 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 87B는 -196℃에서 냉동-포획에 이어서 배출-기체에 존재하는 소량 휘발성 물질의 GC/MS 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 87C는 도 87B의 연장선을 나타낸 것이다.
도 87D는 도 87C의 연장선을 나타낸 것이다.
도 88A 및 88B는 석유-유래 이소프렌 (도 88A)로부터 나온 C5 탄화수소와 생물학적으로 생산된 이소프렌 (도 88B)를 비교하는 GC/MS 크로마토그램을 나타낸 것이다. 표준은 주요 이소프렌 피크 주변에서 용출되는 세 가지의 D5 탄화수소 불순물을 포함한다 (도 88A). 대조적으로, 생물학적으로 생산된 이소프렌은 많은 에탄올 및 아세톤 (3.41분의 진행 시간)을 포함한다 (도 88A).
도 89는 쿠쥬 이소프렌 합성효소를 발현하고 3 g/L 효모 추출물과 함께 포도당으로 배양된 대장균 BL21(DE3) pTrcIS 균주의 발효 배출-기체 분석의 그래프를 나타낸 것이다.
도 90은 이소프렌과 구조적으로 유사하고 또한 다중합반응 촉매 독 (catalyst poisons)으로서 작용하는 여러 가지 분순물들의 구조를 나타낸 것이다.
도 91은 pTrcHis2AUpperPathway (pTrcUpperMVA라고도 명명됨)의 지도를 나타낸 것이다.
도92A 내지92C는 pTrcHis2AUpperPathway (pTrcUpperMVA라고도 명명됨)의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 23)을 나타낸 것이다.
도 93은 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 광학 밀도의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 94는 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 이소프렌 역가의 시간 경과를 나타낸 것이다. 역가는 발효 액체배지 리터 당 생산된 이소프렌량으로서 정의된다.
도 95는 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기로부터 생산된 전체 이소프렌의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 96은 역슈가를 첨가한 15-L 생물반응기 내의 광학 밀도의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 97은 역슈가를 첨가한 15-L 생물반응기 내의 이소프렌 역가의 시간 경과를 나타낸 것이다. 역가는 발효 액체배지 리터 당 생산된 이소프렌량으로서 정의된다.
도 98은 역슈가를 첨가한 15-L 생물반응기로부터 생산된 전체 이소프렌의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 99는 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 광학 밀도의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 100은 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 이소프렌 역가의 시간 경과를 나타낸 것이다. 역가는 발효 액체배지 리터 당 생산된 이소프렌량으로서 정의된다.
도 101은 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기로부터 생산된 전체 이소프렌의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 102는 pCLPtrcUpperPathwayHGS2의 지도를 나타낸 것이다.
도103A 내지103C는 pCLPtrcUpperPathwayHGS2의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 24)을 나타낸 것이다.
도 104는 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 광학 밀도의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 105은 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 이소프렌 역가의 시간 경과를 나타낸 것이다. 역가는 발효 액체배지 리터 당 생산된 이소프렌량으로서 정의된다.
도 106은 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기로부터 생산된 전체 이소프렌의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 107은 플라스미드 MCM330 (attTn7에서 FRT-cm-FRT-gi1.2-KKDy)의 지도를 나타낸 것이다.
도108A 내지108C는 플라스미드 MCM330의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 25)을 나타낸 것이다.
도 109는 pET24D-Kudzu의 지도를 나타낸 것이다.
도110A 및 110B는 pET24D-Kudzu의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 26)을 나타낸 것이다.
도 111A는 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 광학 밀도의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 111B는 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 이소프렌 역가의 시간 경과를 나타낸 것이다. 역가는 발효 액체배지 리터 당 생산된 이소프렌량으로서 정의된다.
도 111C는 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기로부터 생산된 전체 이소프렌의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 112A는 M. 마제이 고대 하부 경로 오페론 (archaeal Lower Pathway operon)의 지도를 나타낸 것이다.
도 112B 내지 112C는 M. 마제이 고대 하부 경로 오페론의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 27)을 나타낸 것이다.
도 113A는 MCM382 -pTrcKudzuMVK(mazei)의 지도를 나타낸 것이다.
도113B 내지 113C는 MCM382 - pTrcKudzuMVK(mazei)의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 28)을 나타낸 것이다.
도 114A는 pET200D에서 M. 마제이 고대 하부로부터 나온 MCM376 - MVK의 지도를 나타낸 것이다.
도 114B 및 114C는pET200D에서 M. 마제이 고대 하부로부터 나온 MCM376 - MVK의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 29)을 나타낸 것이다.
도 115A 내지 115D는 MVK및 이소프렌 합성 효소의 과다-발현이 증가된 이소프렌의 생산을 유도하는 것을 나타낸 것이다. 이소프렌 생산 시 100 및 200 μM IPTG 유도를 사용하여 100 mL 생물반응기에서 포도당으로 성장하는 동안 MCM401 및 MCM343으로부터 나온 축적된 이소프렌 및 CO₂는 22시간 시간 경과를 통하여 측정되었다. 도 115A는 MCM343로부터 나온 축적된 이소프렌 (%)의 그래프이다. 도 115B는 MCM401로부터 나온 축적된 이소프렌 (%)의 그래프이다. 도 115C는 MCM343로부터 나온 축적된 CO₂ (%)의 그래프이다. 도 115D는 MCM401로부터 나온 축적된 CO₂ (%)의 그래프이다.
도 116은 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 광학 밀도의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 117은 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 이소프렌 역가의 시간 경과를 나타낸 것이다. 역가는 발효 액체배지 리터 당 생산된 이소프렌량으로서 정의된다.
도 118은 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기로부터 생산된 전체 이소프렌의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 119는 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 전체 이산화탄소 발생율 (carbon dioxide evolution rate, TCER), 또는 대사활성 프로파일의 그래프를 나타낸 것이다.
도 120은 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내에서 이소프렌 생산 동안 세포 생존도의 그래프를 나타낸 것이다. TVC/OD는 광학 밀도 단위 (OD₅₅₀) 당 1 mL의 액체배지에서 전체 생존가능 계수 (콜로니 형성 단위)이다.
도 121은 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 광학 밀도의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 122는 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 이소프렌 역가의 시간 경과를 나타낸 것이다. 역가는 발효 액체배지 리터 당 생산된 이소프렌량으로서 정의된다.
도 123은 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기로부터 생산된 전체 이소프렌의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 124는 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 부피측정 생산도의 시간 경과를 나타낸 것이다. 부피측정 생산도는 시간 당 액체배지 리터 당 생산된 이소프렌량으로서 정의된다.
도 125는 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 일시적 수득율 (instantaneous yield)의 시간 경과를 나타낸 것이다. 일시적 수득율은 데이터 좌표들 간 시간 간격 동안 생물반응기 (w/w)에 첨가된 포도당량 (그램)당 생산된 이소프렌량으로서 정의된다.
도 126은 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 전체 이산화탄소 발생율 (TCER), 또는 대사활성 프로파일의 그래프를 나타낸 것이다.
도 127은 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내에서 이소프렌 생산 동안 세포 생존도의 그래프를 나타낸 것이다. TVC/OD는 광학 밀도 단위 (OD₅₅₀) 당 1 mL의 액체배지에서 전체 생존가능 계수 (콜로니 형성 단위)이다.
도 128은 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 광학 밀도의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 129는 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 이소프렌 역가의 시간 경과를 나타낸 것이다. 역가는 발효 액체배지 리터 당 생산된 이소프렌량으로서 정의된다.
도 130은 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기로부터 생산된 전체 이소프렌의 시간 경과를 나타낸 것이다.
도 131은 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 전체 이산화탄소 발생율 (TCER), 또는 대사활성 프로파일의 그래프를 나타낸 것이다.
도 132는 생물반응기로의 공기 유동 (airflow)에서 일시적 감소가 대사활성 (TCER)에서 급격한 감소를 유발하지 않았던 배출-기체에서 이소프렌 농도의 스파이크 (spike)를 유도하였던 것을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. TCER, 또는 대사활성은 전체 이산화탄소 발생율이다.
도 133은 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내에서 이소프렌 생산 동안 세포 생존도의 그래프를 나타낸 것이다. TVC/OD는 광학 밀도 단위 (OD₅₅₀) 당 1 mL의 액체배지에서 전체 생존가능 계수 (콜로니 형성 단위)이다.
도 134는 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 광학 밀도의 시간 경과를 나타낸 것이다. 점선으로 된 수직선은 이소프렌이 1 g/L/시간으로 생물 반응기 내에 도입되었던 때 시간 간격을 표시한다.
도 135는 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 전체 이산화탄소 발생율 (TCER), 또는 대사활성 프로파일의 그래프를 나타낸 것이다. 점선으로 된 수직선은 이소프렌이 1 g/L/시간의 속도로 생물 반응기 내에 도입되었던 때 시간 간격을 표시한다.
도 136은 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내에서 이소프렌 생산 동안 세포 생존도를 나타낸 것이다. TVC/OD는 광학 밀도 단위 (OD₅₅₀) 당 1 mL의 액체배지에서 전체 생존가능 계수 (콜로니 형성 단위)이다. 점선으로 된 수직선은 이소프렌이 1 g/L/시간으로 생물 반응기 내에 도입되었던 때 시간 간격을 표시한다.
도 137A 및 137B는 굵은 문자로 강조된 포풀러스 알바 (Populus alba) pET24a: 이소프렌 합성효소 유전자의 서열 (서열번호 30)을 나타낸 것이다.
도 137C 및 137D는 굵은 문자로 강조된 포풀러스 니그라 (Populus nigra) pET24a: 이소프렌 합성효소 유전자의 서열 (서열번호 31)을 나타낸 것이다.
도 137E 및 137F는 굵은 문자로 강조된 포풀러스 트레물로이데스 (Populus tremuloides) pET24a의 서열 (서열번호 32)을 나타낸 것이다.
도 137G는 포풀러스 트레물로이데스 (Populus tremuloides) 이소프렌 합성효소 유전자의 아미노산 서열 (서열번호 33)을 나타낸 것이다.
도 137H 및 137I는 굵은 문자로 강조된 포풀러스 트리코카르파 (Populus trichocarpa) pET24a: 이소프렌 합성효소 유전자의 서열 (서열번호 34)을 나타낸 것이다.
도 137J 및 137K는 굵은 문자로 강조된 포풀러스 트레물라 x 포풀러스 알바 pET24a: 이소프렌 합성효소 유전자의 서열 (서열번호 35)을 나타낸 것이다.
도 137L 은 pCR2.1 골격에 쿠쥬 IspS 코딩 서열을 포함하는 MCM93의 지도를 나타낸 것이다.
도 137M 및 137 N은 MCM93의 서열 (서열번호 36)을 나타낸 것이다.
도 137O는 pET24D-Kudzu의 지도를 나타낸 것이다.
도 137P 및 137Q 는 pET24D-Kudzu의 서열 (서열번호 37)을 나타낸 것이다.
도 138은 전체 세포 상부공간 분석법에서 측정된 바와 같은 다양한 포풀라 종에 대한 이소프렌 합성효소 발현 데이터를 나타낸 것이다. Y-축은 IPTG로 유도된 0.2 mL 배양에 의해 생산된 이소프렌의 μg/L/OD이다.
도 139는 DMAPP 분석법에 의해 측정된 바와 같이 포풀라 이소프렌 합성효소의 상대적 활성을 나타낸 것이다. 포풀라 효소는 쿠쥬로부터 나온 이소프렌 합성효소보다 유의하게 더 높은 활성을 가진다. 포풀라 [알바 x 트레물라]는 적은 (< 1%) 활성만을 가지고 좌표에 표시되지는 않는다.
도 140은 pDONR221:19430 - hybrid_HGS의 지도를 나타낸 것이다.
도 141는 pDONR221:19430 - hybrid_HGS, 효모에 코돈-최적화된 쿠쥬 이소프렌 합성효소의 서열 (서열번호 38)을 나타낸 것이다.
도 142A는 pDW14의 지도를 나타낸 것이다.
도 142B 및 142C는 pDW14의 완전한 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 39)을 나타낸 것이다.
도 143은 pDW14 또는 pYES-DEST52을 보유하는 유도된 INVSc-1 균주를 나타낸 것이다. 도 143A. 갈락토스로 유도되고 심플리블루 세이프스테인 (SimplyBlue SafeStain, Invitrogen)으로 염색된 INVSc-1 균주로부터 생성된 용출액의 4-12% 비스 트리스 젤 (Novex, Invitrogen). 도 143B. 웨스턴브리즈 키트 (WesternBreeze kit, Invitrogen)를 사용한 동일한 균주의 웨스턴 블럿 분석. 레인 설명은 다음과 같다: 1, INVSc-1 + pYES-DEST52; 2, INVSc-1 + pDW14 (분리물 1); 3, INVSc-1 + pDW14 (분리물 2). MW가 (kDa으로) (시블루 플러스2 (SeeBlue Plus2) 분자량 기준을 사용하여) 표시된다.
도 144 (도 144A 및 144B)는 pDW14 또는 pYES-DEST52를 보유하는 유도된 INVSc-1 균주를 나타낸 것이다. 도 144A. 용해 이전 갈락토스-유도된 균주의 OD₆₀₀. y-축은 OD₆₀₀이다. 도 144B. 대조군 및 이소프렌 합성효소-보유 균주에서 이소프렌 합성효소 상부공간의 DMAPP 분석법. 특이 활성은 μg HG/L/OD로서 계산되었다. 시료는 다음과 같다: 대조군, INVSc-1 + pYES-DEST52; HGS-1, INVSc-1 + pDW14 (분리물 1); HGS-2, INVSc-1 + pDW14 (분리물 2).
도 145A는 코돈 최적화된 이소프렌 합성효소 fluo-opt2v2의 지도를 나타낸 것이다.
도 145B는 코돈 최적화된 이소프렌 합성효소 fluo-opt2v2 (서열번호 40)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸 것이다.
도 146A는 pBBR1MCS5의 지도를 나타낸 것이다.
도 146B 및 146C는 pBBR1MCS5 (서열번호 41)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸 것이다.
도 147A는 pBBR5HGSOpt2_2의 지도를 나타낸 것이다.
도 147B 및 147C는 pBBR5HGSOpt2_2 (서열번호 42)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸 것이다.
도 148은 CER 대 IPTG (4 x 50 μmol) 또는 IPTG (2 x 100 μmol)로 유도되거나, 유도되지 않은 MCM401 균주에 대한 발효 시간의 그래프를 나타낸 것이다.
도 149는 pH 조정되거나 조정되지 않은 사탕수수 용액에서 포도당의 농도를 살균 횟수 (cycles)의 함수 (일회 = 30분)로서 나타낸 것이다.
도 150은 포도당, 사탕수수, 및 전환된 사탕수수에서 슈도모나스 푸티다 F1 (Pseudomonas putida F1) 및 슈도모나스 플루오레센스 ATCC13525 (Pseudomonas fluorescens ATCC13525)의 성장 곡선 (시간의 함수로서 OD₆₀₀ )을 나타낸 것이다.
도 151은 포도당, 사탕수수, 및 전환된 사탕수수에서 대장균 BL21(DE3), MG1655, ATCC11303 및 B REL 606의 성장 곡선 (시간 함수로서OD₆₀₀ )을 나타낸 것이다.
도 152는 플라스미드 pET24 P.alba HGS의 지도를 나타낸 것이다.
도 153A 및 153B는 플라스미드 pET24 P.alba HGS의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 43)을 나타낸 것이다.
도 154는 플라스미드 EWL230를 제작하기 위하여 엔도뉴클레아제 소화에 사용되는 제한효소 부위 또한 BspHI 및 NcoI 부위 간 양립가능한 점착성 (cohesive) 말단을 보여주는 모식도를 나타낸 것이다.
도 155는 플라스미드 EWL230의 지도를 나타낸 것이다.
도 156A 및 156B는 플라스미드 EWL230의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 44)을 나타낸 것이다.
도 157은 플라스미드 EWL244를 제작하기 위하여 엔도뉴클레아제 소화에 사용되는 제한효소 부위 또한 NsiI 및 PstI 부위 간 양립가능한 점착성 말단을 보여주는 모식도를 나타낸 것이다.
도 158은 플라스미드 EWL244의 지도를 나타낸 것이다.
도 159A 및 159B는 플라스미드 EWL230의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 45)을 나타낸 것이다.
도 160A는 M. 마제이 고대 하부 경로 오페론의 지도를 나타낸 것이다.
도160B 및 도 160C는 M. 마제이 고대 하부 경로 오페론의 뉴클레오타이 서열 (서열번호 46)을 나타낸 것이다.
도 161A는 pET200D에서 M. 마제이 고대 하부로부터 나온 MCM376-MVK의 지도를 나타낸 것이다.
도 161B 및 161C는 pET200D에서 M. 마제이 고대 하부로부터 나온 MCM376-MVK의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 47)을 나타낸 것이다.
도 162는 플라스미드 pBBRCMPGI1.5-pgl의 지도를 나타낸 것이다.
도 163A 및 163B는 플라스미드 pBBRCMPGI1.5-pgl의 뉴클레오타이드 서열 (서열번호 48)을 나타낸 것이다.
도 164A 내지 164F는 M. 마제이 메발로네이트 키나제, P. 알바 이소프렌 합성효소, 및 pgl (RHM111608-2)을 발현하고, 15-L 규모의 회분식 배양에서 자라는 대장균 균주에 의한 이소프렌 생산의 그래프를 나타낸 것이다. 도 164A는 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 광학 밀도의 시간 경과를 보여준다. 도 164B는 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 이소프렌 역가의 시간 경과를 보여준다. 역가는 발효 액체배지 리터 당 생산된 이소프렌량으로서 정의된다. 이소프렌을 계산하는 방법: 59시간에서 생산된 누적 이소프렌, g/59시간에서 발효기 부피, L [=] g/L 액체배지. 도 164C도 역시 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 이소프렌 역가의 시간 경과를 보여준다. 이소프렌을 계산하는 방법: t = 0 로부터 59시간까지 ∫(일시적 이소프렌 생산율, g/L/시간)dt [=] g/L 액체배지. 도 164D는 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기로부터 생산된 전체 이소프렌의 시간 경과를 보여준다. 도 164E는 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내 부피측정 생산도를 보여준다. 도 164F는 포도당을 첨가한 15-L 생물반응기 내의 이산화탄소 발생율 (CER), 또는 대사활성 프로파일을 보여준다.
도 165A 및 165B는 15L 생물반응기에서 발효로부터 나온 배출기체의 분석을 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. 시료 A는 64.8 시간에 수집된 균주 RM111608-2이다. 시료 B는 34.5시간에 수집된 균주 EWL256이고 이는 대장균 BL21 (DE3), pCL 상부, cmR-gi1.2-yKKDyI, pTrcAlba-mMVK이었다. 수소는 시료 둘 다의 경우 기저선 (baseline) 이상으로 검출된다.
도 166A는 대표적인 바이오이소프렌^TM 회수 유닛을 나타낸 것이다.
도 166B는 대표적인 바이오이소프렌^TM 탈착/농축 설정을 나타낸 것이다.
도 167은 바이오이소프렌^TM 산물의 GC/FID 크로마토그램을 나타낸 것이다. 물질은 99.7% 순수한 것으로 측정되었다.
도 168A 내지 도 168C는 알루미나 (B) 또는 실리카 (C)로의 처리 이전에 (A) 및 이후 (B)에 바이오이소프렌^TM 시료의 GC/FID 크로마토그램을 나타낸 것이다. 이들 크로마토그램에서 이소프렌 피크는 도시되지 않는다.
도 169는 발효 배출-기체로부터 이소프렌을 정제하는 방법 및 관련 장치의 모식도를 나타낸 것이다.
도 170은 부분적으로 수소화된 바이오이소프렌^TM 단일체 (monomer)의 GC/FID 크로마토그램을 나타낸 것이다. 화합물 1 (RT = 12.30분) = 3-메틸-1-부텐, 화합물 2 (RT = 12.70분) = 2-메틸부탄, 화합물 3 (RT = 13.23분) = 2-메틸-1-부텐, 화합물 4 (RT = 13.53분) = 이소프렌, 화합물 5 (RT = 14.01분) = 2-메틸-2-부텐.
도 171은 2-메틸-2-부텐의 앰버리스트-15 (Amberlyst-15) 산 레진-촉매된 이중합으로부터 유래한 산물에 대한 GC/MS 전체 이온 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 172는 바이오이소프렌^TM 단일체의 앰버리스트-15 산 레진-촉매된 올리고중합 (oligomerization)으로부터 유래한 산물을 위한 GC/MS 전체 이온 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 173은 이중합 반응기를 사용한 C5 스트림의 C10/C15 산물 스트림으로 전환을 위한 공정 (process flow) 모식도를 나타낸 것이다. C5 스트림은 바이오이소프렌^TM 단일체 및/또는 바이오이소프렌^TM 단일체의 C5 유도체를 포함한다.

실시예

실시예 1: 재조합 쿠쥬 이소프렌 합성효소를 발현하는 대장균에서 이소프렌의 생산

I. 대장균에서 쿠쥬 이소프렌 합성효소를 발현하는 벡터의 제작

쿠쥬 (푸에라리아 몬타나 (Pueraria montana)) 이소프렌 합성효소 유전자 (IspS)에 대한 단백질 서열은 진뱅크 (GenBank, AAQ84170)로부터 획득되었다. 쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자는 대장균 (E. coli) 코돈 사용에 최적화되어 있고 DNA2.0로부터 구입되었다 (서열번호 1). 이소프렌 합성효소 유전자는 BspLU11I /PstI를 사용한 제한효소 소화에 의해 공급된 플라스미드로부터 제거되었고, 젤로 정제되었으며, NcoI/PstI 를 사용하여 소화되었던 pTrcHis2B (Invitrogen) 내로 라이게이션되었다. 제작물 (construct)은 이소프렌 합성효소 유전자 5'에 있는 종결 코돈이 PstI 부위에 위치하도록 설계되었다. 그 결과, 제작물이 발현되었을 때 히스-태그 (His-Tag)가 이소프렌 합성효소 단백질에 부착되지 않는다. 그 결과 나온 플라스미드 pTrcKudzu는 서열결정법 (sequencing)에 의해 확인되었다 (도 2 및 도 3; 서열번호 2).

이소프렌 합성효소 유전자도 역시 pET16b (Novagen) 내에 클론되었다. 이 경우에, 이소프렌 합성효소 유전자는 재조합 이소프렌 합성효소 단백질이 N-말단 히스 태그를 포함하도록 pET16b 내에 삽입되었다. 이소프렌 합성효소 유전자는pTrcKudzu로부터 프라이머 세트인 pET-His-Kudzu-2F: 5'-CGTGAGATCATATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTTAC (서열번호 49) 및 pET-His-Kudzu-R: 5'-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG (서열번호 50)을 사용한 PCR에 의해 증폭되었다. 이들 프라이머에는 유전자의 5' 말단에 NdeI 부위를 또한 3' 말단에 BamH1 부위를 각각 첨가시켰다. 상기에서 기술된 플라스미드 pTrcKudzu는 주형으로 사용되었고, 허큘라제 중합효소 (Herculase polymerase, Stratagene)는 제조사의 지침에 따라 사용되었으며, 프라이머는 10 pMol 농도로 첨가되었다. PCR은 전체 부피 25 μl에서 수행되었다. PCR 산물은 NdeI/BamH1로 소화되었고 동일한 효소로 소화된 pET16b 내에 클론되었다. 라이게이션 믹스 (mix)가 대장균 Top10 (Invitrogen) 내로 형질전환되었고 정확한 클론이 서열결정법에 의해 선별되었다. 그 결과 나온 플라스미드는 쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자가 T7 프로모터로부터 발현되었으며, pETNHisKudzu 라고 명명되었다 (도 4 및 도 5; 서열번호 51).

쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자도 역시 낮은 사본수 플라스미드 pCL1920 내에 클론되었다. 프라이머가 상기 기술된 pTrcKudzu로부터 쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자를 증폭시키는 데 사용되었다. 정방 프라이머는 HindIII 부위와 대장균 동일 (consensus) RBS를 5' 말단에 첨가하였다. PstI 클로닝 부위는 이미 pTrcKudzu의 3, 종결 코돈에 존재하였고 역방 프라이머가 그렇게 제작되었으며 최종 PCR 산물은 PstI 부위를 포함한다. 프라이머의 서열은 다음과 같았다: HindIII-rbs-Kudzu F: 5'-CATATGAAAGCTTGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACC (서열번호 51) 및 BamH1-Kudzu R: 5'-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG (서열번호 50). PCR 산물은 10 pmol농도의 프라이머 및 1 ng의 주형 DNA (pTrcKudzu)와 함께 헤르큘라제 중합효소를 사용하여 증폭되었다. 증폭 프로토콜은 (95℃에서 1 분, 60℃에서 1분, 72℃에서 2분)의 30회 사이클을 포함하였다. 산물은 HindIII 및 PstI으로 소화되었고 이미 HindIII 및 PstI으로 역시 소화되어 있던 pCL1920 내로 라이게이션시켰다. 라이게이션 혼합액은 대장균 Top10 내로 형질전환되었다. 여러가지 형질전환제가 서열결정법에 의해 검토되었다. 그 결과 나온 플라스미드는 pCL-lac-Kudzu라고 명명되었다 (도 6 및 도 7; 서열번호 4).

II. 이소프렌 생산의 결정

플라스크 진탕 배양을 위해, 1 ml의 배양액을 진탕 플라스크로부터 20 ml CTC 상부공간 바이알 (Agilent 바이알 cat# 5188 2753; 뚜껑 cat# 5188 2759)로 이동시켰다. 뚜껑은 단단히 돌려막았고 바이알을 250 rpm에서 진탕하면서 동등한 온도에서 배양하였다. 30분 이후에 바이알은 배양기로부터 옮겼고 하기에 기술된 바와 같이 분석되었다 (본 분석법으로부터 나온 일정 실험값은 표 1을 참조하라).

발효기에서 이소프렌 생산이 결정된 경우에서, 시료는 발효기의 배출기체로부터 가져왔고 하기에 기술된 바와 같이 직접 분석되었다 (본 분석법으로부터 나온 일정 실험값은 표 1을 참조하라).

상부공간 방식으로 작동하는CTC 분석학 (스위스) 콤비PAL (CTC Analytics CombiPAL) 자동시료수집기를 내장한 애질런트 6890 GC/MS 시스템을 사용하여 분석이 수행되었다. 애질런트 HP-5MS GC/MS 컬럼 (30 m x 0.25 mm; 0.25 μm 필름 두께)이 분석물의 분리를 위해 사용되었다. 시료수집기는 500 μL의 상부공간 기체를 주입하도록 설정되었다. GC/MS 방법은 헬륨을 운반 기체로서 1 ml/분의 유속에서 사용하였다. 주입 포트는 250℃에서 50 : 1의 분리율로 유지되었다. 오븐 온도는 37℃에서 분석의 2분 지속 기간 동안 유지되었다. 애질런트 5793N 질량 선택 검출기 (mass selective detector)는 단일 이온 감시 (SIM) 방식으로 m/z 67상에서 작동되었다. 검출기는 1.4분으로부터 1.7분까지 영속적 기체의 용출이 가능하도록 전원을 껐다. 이들 조건 하에서 이소프렌 (2-메틸-1,3-부타디엔)은 1.78분에서 용출되는 것이 관찰되었다. 측정 (calibration) 표가 이소프렌의 절대적 양을 정량하는 데 사용되었고 1 μg/L으로부터 70,000 μg/L까지 직선상인 것이 관찰되었다. 검출 한계는 이 방법을 사용하여 50 내지 100 ng/L인 것으로 평가되었다.

III. 재조합 이소프렌 합성효소를 발현하는 대장균 세포를 포함하는 진탕 플라스크에서 이소프렌의 생산

상기 기술된 벡터는 대장균 균주 BL21/ptrcKudzu, BL21/pCL-lac-Kudzu 및 BL21/pETHisKudzu를 생산하도록 대장균 균주 BL21 (Novagen)에 도입되었다. 균주는 LA (루리아 아가배지) + 카베니실린 (carbenicillin, 50 μg/ml) 상에서 분리를 위해 도말되었고 37℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 단일 콜로니를 20 ml 루리아 버타니 (Luria Bertani) 액체배지 (LB) 및 카베니실린 (100 μg/ml)를 포함하는 250 ml의 진탕 플라스크 내에 접종하였다. 배양액은 20℃에서 200 rpm으로 진탕하면서 하룻밤 동안 성장시켰다. 밤샘 배양액의 OD₆₀₀가 측정되었고 배양액은 30 ml 매직미디아 (MagicMedia, Invitrogen) + 카베니실린 (100 μg/ml)을 포함하는 250 ml의 진탕 플라스크 내에 OD₆₀₀ ~ 0.05까지 희석시켰다. 배양액은 30℃에서 200 rpm으로 진탕하면서 배양되었다. OD₆₀₀ ~ 0.5 - 0.8로 될 때, 400 μM IPTG가 첨가되었고 세포는 추가로 6시간 동안 30℃에서 200 rpm으로 진탕하면서 배양되었다. IPTG 유도하고 0, 2, 4 및 6 시간에, 1 ml의 배양액 일정량이 수집되었고, OD₆₀₀가 결정되었으며 생산된 이소프렌량이 상기 기술된 바와 같이 측정되었다. 결과는 도 8에 나타나있다.

IV. 14 리터 발효에서 대장균 BL21/ptrcKudzu 로부터 이소프렌의 생산

재조합 쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자를 포함하는 대장균으로부터 이소프렌의 대량 생산은 회분식 배양으로부터 결정되었다. 발효 배지의 리터 당 발효 배지 (TM2)를 위한 레시피는 다음과 같다: K₂HPO₄ 13.6 g, KH₂PO₄ 13.6 g, MgSO4 * 7H₂O 2 g, 시트르산 모노하이드레이트 2 g, 철 암모늄 사이트레이트 0.3 g, (NH₄)₂SO₄ 3.2 g, 효모추출물 5 g, 1000X 변형된 미량 금속 용액 1 ml. 모든 성분은 다같이 첨가되었고 diH₂O에 녹였다. pH는 포타슘 하이록사이드 (KOH)로 6.8에 조정하고 부피를 q.s.맞춘다. 최종 산물은 0.22μ 필터로만 여과 멸균되었다 (고압멸균 (autoclave)하지 말라). 1000X 변형된 미량 금속 용액은 다음과 같다: 시트르산 * H₂O 40 g, MnSO₄ * H₂O 30 g, NaCl 10 g, FeSO₄ * 7H₂O 1 g, CoCl₂ * 6H₂O 1 g, ZnSO * 7H₂O 1 g, CuSO₄ * 5H₂O 100 mg, H₃BO₃ 100 mg, NaMoO₄ * 2H₂O 100 mg. 각 성분은 HCl/NaOH으로 pH 3.0으로 맞춘 di H₂O에 한 번에 하나씩 녹인 다음 부피를 맞추었고 0.22 μ 필터로 여과 멸균하였다.

본 실험은 14 L 생물반응기에서 수행되었고 pH 6.7 및 온도 34℃의 원하는 발효에서 포도당으로부터 이소프렌 형성을 감시하였다. 냉동 바이알로부터 가져온 대장균 균주BL21/ptrcKudzu 는 소이톤-효모추출물-포도당 배지에 제조되었다. 접종액이 OD₅₅₀ = 0.6까지 성장한 이후, 두 개의 600 ml 플라스크가 원심분리 되었고 내용물이 70 ml 상청액에 재현탁 되었으며 세포 펠렛 (OD 3.1 물질 70 ml)으로 생물반응기로 이동되었다. 접종 이후 다양한 시간에, 시료는 제거되었고 생산된 이소프렌량이 상기 기술된 바와 같이 결정되었다. 결과는 도 9에 나타나있다 (70 ml의 OD 3.1 물질)

실시예 2: 재조합 포풀라 이소프렌 합성효소를 발현하는 대장균에서 이소프렌의 생산

포풀라 (포풀라 알바 (Populus alba) x 포풀라 트레물라 (Populus tremula)) 이소프렌 합성효소에 대한 단백질 서열 (Schnitzler, J-P, et al. (2005) Planta 222:777-786)은 진뱅크 (GenBank, CAC35696)로부터 획득되었다. 대장균에 코돈 최적화된 유전자는 DNA2.0 (p9796-poplar, 도 30 및 도 31; 서열번호 14)로부터 구입되었다. 이소프렌 합성효소 유전자는 BspLU11I/PstI 를 사용한 제한효소 소화에 의해 공급된 플라스미드로부터 제거되었고, 젤로 정제되었으며, NcoI/PstI 를 사용하여 소화되었던 pTrcHis2B (Invitrogen) 내로 라이게이션되었다. 제작물은 삽입 유전자에 있는 종결 코돈이 PstI 부위 이전에 있도록 클론되었고, 이는 히스-태그 (His-Tag)가 이소프렌 합성효소 단백질에 부착되지 않는 제작물을 만든다. 그 결과 나온 플라스미드 pTrcpoplar는 서열결정법 (sequencing)에 의해 확인되었다 (도 32 및 도 33; 서열번호 15).

실시예 2B: 여러가지 포풀러스 이소프렌 합성효소로부터 이소프렌 합성효소 활성의 조사

하기 이소프렌 합성효소가 조사되었다; 포풀러스 알바 (Populus alba) (기탁번호 BAD98243; 도 137A 및 137B; 서열번호 30), 포풀러스 니그라 (Populus nigra (기탁번호 CAL69918; 도 137C 및 137D; 서열번호 31), 포풀러스 트레물로이데스 (Populus tremuloides) (기탁번호 AAQ16588; 도 137E, 137F, 및 137G; 서열번호 32-33), 포풀러스 트리코카르파 (Populus trichocarpa) (기탁번호 ACD70404; 도137H 및 137I; 서열번호 34), 포풀러스 알바 (Populus alba) x 포풀러스 트레물라 (Populus tremula) (기탁번호 CAJ29303; 도 137J 및 137K; 서열번호 35), 및 MCM112-Kudzu.

pET24Kudzu (MCM112라고도 명명함)가 다음과 같이 제작되었다: 쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자는 pCR2.1 벡터 (Invitrogen)로부터 pET24d 벡터 (Novagen) 내로 서브클론되었다. 쿠쥬 IspS 유전자는 pTrcKudzu 주형DNA로부터 프라이머 MCM50 5'-gatcatgcat tcgcccttag gaggtaaaaaaacatgtgtgcgacctcttc tcaatttact (서열번호 52); 및 MCM53 5'-CGGTCGACGGATCCCTGCAG TTAGACATAC ATCAGCTG (서열번호 52)를 사용하여 증폭되었다. PCR 반응은 Taq DNA 중합효소 (Invitrogen)를 사용하여 수행되었고, 그 결과 나온 PCR 산물은 pCR2.1-TOPO TA 클로닝 벡터 내로 클론되었으며 화학적으로 능력있는 (competent) E. coli Top10 내로 형질전환되었다. 형질전환체는 카베니실린 (50 mg/ml)을 포함하는 L-아가 상에 도말되었고 37℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 다섯 개의 콜로니가 1 ml의 액체 배양액 (루리아 액체배지)으로부터 분리된 플라스미드 DNA의 서열결정에 의해 정확한 삽입물로 검색되었고 QIA프렙 스핀 미니-프렙 키트 (QIAprep Spin Mini-prep Kit, Qiagen)를 사용하여 정제되었다. 그 결과 나온 MCM93이라고 명명되는 플라스미드는 pCR2.1 골격에 쿠쥬 IspS 코딩 서열을 포함한다 (도 137L). MCM93의 서열 (서열번호 36)은 도 137M 및 137N에 나타나있다.

쿠쥬 코딩 서열은 PciI 및 BamH1 (Roche)로 제한효소 소화에 의해 제거되었고 QIA퀵 젤 추출 키트 (QIAquick Gel Extraction kit, Qiagen)를 사용하여 젤 정제되었다. pET24d 벡터 DNA는 NcoI 및BamHI (Roche)으로 소화되었고 새우 알칼라인 포스파타제 (Roche)로 처리되었으며, QIA프렙 스핀 미니-프렙 키트 (Qiagen)를 사용하여 정제되었다. 쿠쥬 IspS 단편은 NcoI/BamH1 소화된 pET24d 에 래피드DNA 라이게이션 키트 (Rapid DNA Ligation Kit, Roche)를 사용하여 5 : 1의 단편 대 벡터 비율로 20 ml의 전체 부피에서 라이게이션되었다. 라이게이션 혼합액의 일부 (5 ml)는 화학적으로 능력있는 E. coli Top10 내에 형질전환되었고 카나마이신 (50 mg/ml)을 포함하는 L 아가 상에 도말되었다. 정확한 형질전환체는 서열결정법에 의해 확인되었고 화학적으로 능력있는 대장균 BL21(lDE3)pLysS cells (Novagen) 내로 형질전환되었다. 단일 콜로니는 밤샘 성장 이후에 37℃에서 카나마이신 (50 mg/ml)을 포함하는 L 아가 상에 도말되었다. 그 결과 나온 pET24D-Kudzu로서 명명된 플라스미드의 지도는 도 137O에 나타나있다. pET24D-Kudzu (서열번호 37)의 서열은 도 137P 및 137Q에 나타나 있다.

포풀러스 트레물로이데스, 포풀러스 알바, 포풀러스 니그라, 및 포풀러스 트리코카르파를 위해 pET24a 발현 벡터 (Novagen)에 클론된 대장균 (Escherichia coli) 최적화된 이소프렌 합성효소 유전자가 DNA2.0 (Menlo Park, CA)로부터 구입되었다. 유전자는 엽록체 이동 펩타이드 서열 (chloroplast transit peptide sequence)이 제거되어 성숙한 단백질의 발현이 되도록 합성되었다.

본 실시예에서 쿠쥬 이소프렌 합성효소를 위한 제작물은 대조군으로서 사용되었다. 플라스미드는 대장균 발현 숙주 BL21(DE3)plysS 내에 형질전환되었고 형질전환체는 0.6 ml TM3 배지에서 성장시켰다. TM3 배지를 위한 레시피는 다음과 같다: K₂HPO₄ (13.6 g/l), KH₂PO₄ (13.6 g/l), MgSO4 * 7H₂O (2 g/L), 시트르산 모노하이드레이트 (2 g/L), 철 암모늄 사이트레이트 (0.3 g/L), (NH₄)₂SO₄ (3.2 g/L), 효모추출물 (0.2 g/L), 1 ml의 1000x 미량 원소 용액을 암모늄 하이록사이드로 pH 6.8에 조정하였고 부피를 멸균된 diH₂O로 q.s. 맞추었으며 0.22 마이크론 필터로 여과 멸균되었다. 1000X 변형된 미량 원소 용액은 다음과 같다: 시트르산 * H₂O (40 g/L), Mn_SO₄ * H₂O (30 g/L), NaCl (10 g/L), Fe_SO₄ * 7 H₂O (1 g/L), CoCl₂ * 6 H₂O (1 g/L), Zn_SO₄ * 7 H₂O (1 g/L), Cu_SO₄ * 5 H₂O (100 mg/L), H_3BO₃ (100 mg/L), NaM_oO₄ * 2 H₂O (100 mg/L). 각 성분은 HCl/NaOH을 사용하여 pH 3.0으로 맞춘 diH₂O에 한 번에 하나씩 녹였고 부피를 맞추었으며 0.22 마이크론 필터로 여과 멸균하였다.

배양액은 400 μM IPTG로 유도되었고 성장은 O_D600 의 약 5까지 계속되었다. 배양액의 분량이 깊은 유리 웰 플레이트에 이동되었고 웰은 알루미늄 플레이트 밀봉제로 밀봉되었다. 플레이트는 25℃에서 30분 동안 450 rpm으로 진탕하면서 배양되었다. 그 다음은 반응은 온도를 70℃까지 올려서 5분 동안 불활성화되었다. 전체 세포 상부공간은 실시예 1, 제 II부에 기술된 바와 같이 GCMS 방법에 의해 측정되었다.

K_m 값은 유사한 방식으로 성장시킨 배양액으로부터 획득되었지만 세포는 수확되었고 냉동/해동 (freeze/thaw) 라이소자임 프로토콜에 의해 용해되었다. 부피 400 μL의 배양액은 새로운 96-웰 플레이트 (Perkin Elmer, 카탈로그 번호 6008290) 내로 이동되었고 세포는 벡크만 쿨터 알레그라 (Beckman Coulter Allegra) 6R 원심분리기에서 2500 x g로 원심분리에 의해 수확되었다. 펠렛은 200 mL의 저장성 완충용액 (5 mM MgCL₂, 5 mM 트리스 HCl, 5 mM DTT pH 8.0)에 재현탁시켰고 플레이트는 -80℃에서 60분의 최소시간 동안 냉동시켰다. 세포 용출액은 플레이트를 해동시키고 32 mL의 이소프렌 합성효소DMAPP 분석 완충용액 (57 mM 트리스 HCl, 19 mM MgCl₂, 74 mg/mL DNase I (시그마사 카탈로그 번호 DN-25), 2.63 x 10⁵ U/mL의 래디 라이소자임 (ReadyLyse lysozyme) 용액 (Epicentre Catalog No. R1802M), 및 5 mg/mL의 분자생물학 등급 BSA를 첨가하여 제조되었다. 플레이트는 25℃에서 30분 동안 진탕하면서 배양된 다음 얼음 위에 두었다. DMAPP 및 용출액은 원하는 농도로 밀봉된 깊은 유리 웰 블록에 상기 기술된 전체 세포 상부공간 분석법 (whole cell head space assay)을 위해 첨가되었다. 반응은 1시간 동안 진행되도록 한 다음 상기 기술된 열 단계에 의해 종결되었고 상부공간 활성도 역시 기술된 바와 같이 측정되었다.

대안의 접근법에서는, 효소의 활성이 25 mL 부피에서 배양되고 상기 기술된 바와 유사하게 유도된 세포로부터 측정되었다. 세포는 원심분리에 의해 수확되었고 펠렛은 프렌치 프레싱 (French pressing)에 의해 50% 글리세롤과 1 : 1로 혼합된 20 mM 트리스/HCl pH 7.4, 20 mM MgCl₂, 200 mM KCl, 1 mM DTT를 포함하는 완충용액에서 용해되었다. 25 μL부피의 용출액은 75 μL의 분석 완충용액 (66.6 mM 트리스/HCl pH 8, 6.66 mM DMAPP, 43 mM, MgCl₂)을 포함하는 2 mL 회전 뚜껑 바이알에서 이소프렌 합성효소 활성에 대해 분석되었다. 반응은 15 분 동안 30℃에서 배양되었고 100 μL의 250 mM EDTA를 바이알의 벽을 통해 첨가하여 정지되었다. 이소프렌은 실시예 1, 제 II부에서 기술된 바와 같이 GC/MS에 의해 측정되었다.

활성을 측정하는 모든 방법은 순수하게 키운 포풀라로부터 유래한 포풀라 효소가 포풀러스 [알바 x 트레물라]보다 여러 배 더 높은 것을 보여주었다. 도 138 및 도 139는 전체 세포 상부공간 분석법 및 DMAPP 분석법에 대한 이들 결과를 각각 보여주었고, 놀랍게도 P. nigra, P. tremuloides, P. trichocarpa, and P. alba로부터 나온 효소는 모두 하이브리드 [P. 알바 x P.트레물라]보다 유의하게 더 높은 활성을 가지는 것을 표시한다.

DMAPP 분석법은 다음과 같이 수행되었다: 부피 400 μL의 배양액은 새로운 96-웰 플레이트 (퍼킨엘머사, 카탈로그 번호 6008290) 내로 이동되었고 세포는 벡크만 쿨터 알레그라 (Beckman Coulter Allegra) 6R 원심분리기에서 2500 x g로 원심분리에 의해 수확되었다. 펠렛은 200 mL의 저장성 완충용액 (5 mM MgCL₂, 5 mM 트리스 HCl, 5 mM DTT pH 8.0)에 재현탁시켰고 플레이트는 -80℃에서 60분의 최소시간 동안 냉동시켰다. 세포 용출액은 플레이트를 해동시키고 32 mL의 이소프렌 합성효소 DMAPP 분석 완충용액 (57 mM 트리스 HCl, 19 mM MgCl₂, 74 mg/mL DNase I (시그마사 카탈로그 번호 DN-25), 2.63 x 10⁵ U/mL의 래디 라이소자임 용액 (에피센트르사 카탈로그 번호 R1802M), 및 5 mg/mL의 분자생물학 등급 BSA를 첨가하여 제조되었다. 플레이트는 25℃에서 30분 동안 진탕하면서 배양된 다음 얼음 위에 두었다. 이소프렌 생산을 위해 80 mL 분량의 용출액이 96-웰 깊은 유리 플레이트 (Zinsser 카탈로그 번호 3600600)에 이동시켰고 100 mM K₂HPO₄, pH 8.2 (Cayman Chemical 카탈로그 번호 63180)에 녹인 20 mL의 10 mM DMAPP 용액이 첨가되었다. 플레이트는 알루미늄 플레이트 밀봉제 (Beckman Coultor Catalog No. 538619)로 밀봉되었고 30℃에서 60분 동안 진탕하면서 배양되었다. 효소적 반응은 유리 블록을 가열하여 (70℃에서 5분) 종결되었다. 각 웰의 세포 상부 공간은 실시예 1, 제 II부에 기술된 바와 같이 정량적으로 분석되었다.

명확하게, P. alba, P. tremuloides, P. trichocarpa는 쿠쥬로부터 나온 이소프렌 합성효소보다 더 높은 활성을 가졌다. P. 알바로부터 나온 효소는 모든 테스트된 효소의 가장 큰 활성으로 발현되었다. 전체 세포 상부공간 분석법과 비교하여 세포 용출액으로 관찰된 더 높은 활성은 이들 효소의 기질이고 세포의 내재성 데옥시자일루로스 5-포스페이트 (DXP) 경로에 의해 운반된 DMAPP에서의 제한으로 인한 것 같았다.

K_m 동적 매개변수는 이 값이 결정된 모든 효소에서 약 2 내지 3 mM인 것으로 측정되었다.

실시예 3: 재조합 쿠쥬 이소프렌 합성효소를 발현하는 판테오아 시트레아 에서 이소프렌의 생산

실시예 1에 기술된 pTrcKudzu 및 pCL-lac Kudzu 플라스미드는 P. citrea (미국 특허 제 7,241,587호) 내로 전기천공되었다. 형질전환체는 카베니실린 (200μg/ml) 또는 스펙트로마이신 (spectinomycin, 50 μg/ml)을 각각 포함하는 LA 상에서 선별되었다. 진탕 플라스크로부터 이소프렌의 생산 및 생산된 이소프렌 양의 결정은 쿠쥬 이소프렌 합성효소를 발현하는 E. coli 균주에 대하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행되었다. 결과는 도 10에 나타나있다.

실시예 4: 재조합 쿠쥬 이소프렌 합성효소를 발현하는 바실러스 섭틸리스 에서 이소프렌의 생산

I. 쿠쥬 이소프렌 합성효소의 발현을 위한 B. subtilis 복제 플라스미드의 제작

쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자는 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis) aprEnprE Pxyl-comK 균주 (BG3594comK)에서 aprE 프로모터 조절 하에 복제 플라스미드 (클로로암페니콜 저항성 카세트를 가진 pBS19)를 사용하여 발현되었다. 이소프렌 합성효소 유전자, aprE 프로모터 및 전사 종결인자 (transcription terminator)가 분리되어 증폭되었고 PCR을 사용하여 융합되었다. 그 다음 제작물은 pBS19 내로 클론 되었고 B. subtilis 내로 형질전환되었다.

a) aprE 프로모터의 증폭

aprE 프로모터는 하기 프라이머를 사용하여 Bacillus subtilis 로부터 나온 염색체 DNA로부터 증폭되었다.

CF 797 (+) 시작 aprE 프로모터 MfeI

5'-GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC (서열번호 53)

CF 07-43 (-) aprE 프로모터를 쿠쥬 ispS에 융합

5'-ATTGAGAAGAGGTCGCACACACTCTTTACCCTCTCCTTTTA (서열번호 54)

b) 이소프렌 합성효소 유전자의 증폭

쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자는 플라스미드 pTrcKudzu (서열번호 2)로부터 증폭되었다. 유전자는 먼저 대장균에 코돈 최적화되었고 DNA 2.0에 의해 합성되었다. 하기 프라이머가 사용되었다:

CF 07-42 (+) aprE 프로모터를 쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자에 융합

(GTG 시작 코돈)

5'-TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT (서열번호 55)

CF 07-45 (-) 쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자의 3'말단을 종결인자에 융합

5'-CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC (서열번호 56)

c) 전사 종결인자의 증폭

바실러스 아밀리크파시엔스 (Bacillus amyliquefaciens)의 알칼라인 세린 프로테아제로부터 나온 종결인자가 하기 프라이머를 사용하여 미리 서열결정된 플라스미드 pJHPms382로부터 증폭되었다:

CF 07-44 (+) 쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자의 3' 말단을 종결인자에 융합

5'-GATTAACCAGCTGATGTATGTCTAAAAAAAACCGGCCTTGG (서열번호 57)

CF 07-46 (-) B. amyliquefaciens 종결인자의 말단 (BamHI)

5'-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (서열번호 58)

쿠쥬 단편은 하기 프라이머로 된 PCR을 사용하여 종결인자 단편에 융합되었다:

CF 07-42 (+)(+) aprE 프로모터를 쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자에 융합

(GTG 시작 코돈)

5'-TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT (서열번호 55)

CF 07-46 (-) B. amyliquefaciens 종결인자의 말단 (BamHI)

5'-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (서열번호 58)

쿠쥬-종결인자 단편은 하기 프라이머로 된 PCR을 사용하여 프로모터 단편에 융합되었다:

CF 797 (+) 시작 aprE 프로모터 MfeI

5'-GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC (서열번호 53)

CF 07-46 (-) B. amyliquefaciens 종결인자의 말단 (BamHI)

5'-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (서열번호 58)

융합 PCR 단편은 퀴아젠 (Qiagen) 키트를 사용하여 정제되었고 제한효소 MfeI 및 BamHI으로 소화되었다. 본 소화된 DNA 단편은 퀴아젠 키트를 사용하여 젤 정제되었고 미리 EcoRI 및 BamHI으로 소화되었고 젤 정제되었던 pBS19라도 알려진 벡터에 결찰되었다.

라이게이션 혼합액은 대장균 Top10 세포 내에 형질전환되었고 콜로니가 LA+50 카베니실린 플레이트 상에서 선별되었다. 전부 여섯 개의 콜로니가 선택되었고 LB+50 카베니실린에서 하룻밤 동안 키운 다음 퀴아젠 키트를 사용하여 분리되었다. 플라스미드는 삽입물 (inserts)를 검토하기 위해 EcoRI 및 BamHI으로 소화되었고 세 개의 정확한 플라스미드가 하기 프라이머로 서열결정하기 위해 보내졌다:

CF 149 (+) aprE 프로모터의 EcoRI 시작

5'-GACATGAATTCCTCCATTTTCTTCTGC (서열번호 59)

CF 847 (+) pXX 049에서의 서열 (aprE 프로모터의 말단)

5'-AGGAGAGGGTAAAGAGTGAG (서열번호 60)

CF 07-45 (-)쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자의 3' 말단을 종결인자에 융합

5'-CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC (서열번호 56)

CF 07-48 (+) 쿠쥬 이소프렌 합성효소를 위한 서열결정 프라이머

5'-CTTTTCCATCACCCACCTGAAG (서열번호 61)

CF 07-49 (+) 쿠쥬 이소프렌 합성효소에서 서열결정

5'-GGCGAAATGGTCCAACAACAAAATTATC (서열번호 62)

pBS Kudzu #2 (도 52 및 도 12; 서열번호 5)라고 명명된 플라스미드는 서열결정에 의해 정확성이 바실러스 섭틸리스 숙주 균주인 BG 3594 comK 내로 형질전환되었다. 선별은 LA + 5 클로로암페니콜 플레이트 상에서 이루어졌다. 형질전환체가 선택되었고 LA + 5 클로로암페니콜 상에 단일 콜로니로 키운 다음 LB + 5 클로로암페니콜에서 OD₆₀₀ 1.5가 될 때까지 성장시켰다. 이것은 바이알에 넣어 글리세롤 존재 시 -80℃에서 냉동 저장되었다. 그 결과 나온 균주는 CF 443라고 명명되었다.

II. 재조합 이소프렌 합성효소를 발현하는 B. 섭틸리스 세포를 포함하는 진탕 플라스크에서 이소프렌의 생산

밤샘 배양액이 LA + 클로로암페니콜 (Cm, 25 μg/ml)로부터 나온 CF 443 의 단일 콜로니로 접종되었다. 배양액은 LB + Cm을 사용하여 37℃에서 200 rpm으로 진탕하면서 성장시켰다. 이들 밤샘 배양액 (1 ml)은 25 ml 그랜트 II 배지 및 클로로암페니콜을 25 μg/ml 농도로 포함하는 250 ml의 진탕 플라스크를 접종하는 데 사용되었다. 그랜트 II 배지 레시피는 10 g 소이톤, 3 ml 1M K₂HPO₄, 75 g 포도당, 3.6 g 우레아, 100 ml 10X MOPS가 pH 7.2 H₂O를 사용하여 1 L로 q.s 맞춰졌고; 10X MOPS 레시피는 83.72 g MOPS, 7.17 g 트리신 (tricine), 12 g KOH 펠렛, 10 ml 0.276M K₂SO₄ 용액, 10 ml 0.528M MgCl₂ 용액, 29.22 g NaCl, 100 ml 100X 미량영양소 (micronutrients)가 H₂O를 사용하여 1 L로 q.s 맞춰졌으며; 또한 100X 미량영양소 레시피는 1.47 g CaCl₂*2H₂O, 0.4 g FeSO₄*7H₂0, 0.1 g MnSO₄*H₂0, 0.1 g ZnSO₄*H₂O, 0.05 g CuCl₂*2H₂O, 0.1 g CoCl₂*6H₂O, 0.1 g Na₂MoO₄*2H₂O가 H₂O를 사용하여 1 L로 q.s 맞춰졌다. 진탕 플라스크는 37℃에서 배양되었고, 시료는 18, 24, 및 44 시간에 가져왔다. 18 시간에서 CF443 및 대조군 균주의 상부공간이 채취되었다. 이것은 이소프렌 축적의 18시간을 보여주었다. 이소프렌량은 실시예 1에 기술된 바와 같이 기체 크로마토그래피에 의해 결정되었다. 이소프렌량은 재조합 이소프렌 합성효소를 발현함에 의해 유의하게 증진되었다 (도 11).

III. 14 L 발효에서 CF443에 의한 이소프렌의 생산

복제 플라스미드 상에 재조합 이소프렌 합성효소 유전자를 포함하는 B. subtilis 로부터 이소프렌의 대량 생산은 회분식 배양으로부터 결정되었다. 쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자를 발현하는 바실러스 균주 CF 443, 또는 쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자를 발현하지 않는 대조군 균주는 소이밀 (soy meal, Cargill), 소듐과 포타슘 포스페이트, 마그네슘 설페이트 및 시트르산, 염화 철 및 염화 망간의 용액을 포함하는 영양 배지에서 통상적인 회분식 배양에 의해 배양되었다. 발효 이전에, 배지는 셀루라제 (cellulases), 헤미셀룰라제 (hemicellulases) 및 펙티나제 (pectinases)를 포함하는 효소 혼합물 (국제특허출원 제 WO 95/04134호를 참조하라)을 사용하여 90분 동안 부드럽게 만들었다. 14-L 회분식 발효는 60% wt/wt 포도당 (Cargill DE99 덱스트로스, ADM 베르사덱스 그린 (Versadex greens) 또는 Danisco 역슈가) 및 99% wt/wt 오일 (세포 배양배지에 첨가되지 이전에 오일 농도가 99% wt/wt인 웨스턴 패밀리 콩 오일)이 첨가되었다. 배양은 포도당이 회분에서 검출 가능하지 않을 때 시작되었다. 배양 속도는 여러 시간 동안 시도하여 동일한 탄소 조성 상에 오일을 첨가하도록 조절되었다. pH 는 28% w/v 암모늄 하이드록사이드를 사용하여 6.8 - 7.4로 조절되었다. 거품이 나는 경우, 항거품 제제가 배지에 첨가되었다. 발효 온도는 37℃로 조절되었으며 발효 배양은 750 rpm으로 진탕되었다. pH, DO%, 공기유동 및 압력과 같은 다양한 기타 변수들이 전 공정을 통하여 감시되었다. DO%는 20 이상으로 유지되었다. 시료는 36시간 경과 동안 가져왔고 세포 성장 (OD₅₅₀) 및 이소프렌 성장에 대해 분석되었다. 이들 실험의 결과는 도 53A 및 53B에 나타나있다.

IV. B. 섭틸리스에서 쿠쥬 이소프렌 합성효소 (ispS)의 통합

쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자는 삽입되는 플라스미드 (pJH101-cmpR)에 aprE 프로모터의 조절 하에 클론되었다. 테스트된 조건 하에서, 이소프렌은 전혀 검출되지 않았다.

실시예 5: 트리코더마 에서 이소프렌의 생산

I. 트리코더마 리세이 (Trichoderma reesei)에서 쿠쥬 이소프렌 합성효소의 발현을 위한 벡터의 제작

야로위야 리포리티카 (Yarrowia lipolytica) 코돈-최적화된 쿠쥬 IS 유전자는 DNA 2.0 (서열번호 6) (도 13)에 의해 합성되었다. 본 플라스미드는 하기 PCR 반응을 위한 주형으로서 제공되었다: 1 μl 플라스미드 주형 (20 ng/μl), 1 μl 프라이머 EL-945 (10 μM) 5'-GCTTATGGATCCTCTAGACTATTACACGTACATCAATTGG (서열번호 63), 1 μl 프라이머 EL-965 (10 μM) 5'-CACCATGTGTGCAACCTCCTCCCAGTTTAC (서열번호 64), 1 μl dNTP (10 mM), 5 μl 10x PfuUltra II 융합 HS DNA 중합효소 완충용액, 1 μl PfuUltra II 융합 Fusion HS DNA 중합효소, 40 μl 물에 녹여 전체 50 μl의 반응 부피. 전방 프라이머는 5' 말단에 Y. lipolytica 코돈-최적화된 쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자에 해당하지 않았지만 pENTR/D-TOPO 벡터를 위해서는 필요한 4개의 부가적인 뉴클레오타이드를 포함하였다. 역방 프라이머는 5'말단에 Y. lipolytica 코돈-최적화된 쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자에 해당하지 않았지만 다른 벡터 골격 내 클로닝을 위해 삽입되었던 21개의 부가적인 뉴클레오타이드를 포함하였다. MJ 리서치 PTC-200 열순환기 (MJ Research PTC-200 Thermocycler)를 사용하여, PCR 반응이 다음과 같이 수행되었다: 95℃ 2분 (최초 사이클만), 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30 초 (27회 사이클 반복), 마지막 사이클 이후 72℃ 1분. PCR 산물은 1.2% E-젤 상에서 Y. lipolytica 코돈-최적화된 쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자의 성공적인 증폭을 검증하기 위하여 분석되었다.

그 다음 PCR 산물은 TOPO pENTR/D-TOPO 클로닝 키트의 하기 제조사의 지침을 사용하여 클로닝되었다: 1 μl PCR 반응, 1 μl 염 용액, 1 μl TOPO pENTR/D-TOPO 벡터 및 3 μl 물에 녹인 전체 6 μl의 반응 부피. 반응은 상온에 5분 동안 배양되었다. 1 마이크로리터의 TOPO 반응은 TOP10 화학적으로 능력있는 E. coli 세포 내로 형질전환되었다. 형질전환체는 LA + 50 μg/ml 카나마이신 플레이트 상에서 선별되었다. 여러가지 콜로니가 찍혔고 각각은 LB + 50 μg/ml 카나마이신을 포함하는 5 ml 튜브 내에 접종되었으며 배양액은 37℃에서 200 rpm으로 진탕하면서 하룻밤 동안 성장시켰다. 플라스미드는 제조사의 프로토콜에 따라 QIA프렙 스핀 미니프렙 키트를 사용하여 밤샘 배양 튜브로부터 분리되었다. 여러가지 플라스미드가 DNA 서열이 정확한지 확인하기 위해 서열결정되었다.

Y. lipolytica 코돈-최적화된 쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자를 인코딩하는 단일 pENTR/D-TOPO 플라스미드가 주문-제작된 pTrex3g 벡터 내에 게이트웨이 클로닝 (Gateway Cloning)을 위해 사용되었다. pTrex3g의 제작은 국제특허출원 공개번호 제 WO 2005/001036 A2호에 기술되어 있다. 반응은 게이트웨이LR 클로나제II 효소 믹스 키트 (Gateway LR Clonase II Enzyme Mix Kit, Invitrogen)에 대한 제조사의 프로토콜에 따라 수행되었다: 1 μl Y. lipolytica 코돈-최적화된 쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자 pENTR/D-TOPO 공여자 벡터, 1 μl pTrex3g 목적 벡터, 6 μl TE 완충용액에 녹인 전체 8 μl의 반응 부피. 반응은 상온에서 1시간 동안 배양된 다음 1 μl 프로테나제 K 용액이 첨가되었으며 반응은 37℃에서 10분 동안 계속되었다. 그 다음 1 μl의 반응액은 화학적으로 능력있는 TOP10 E. coli 세포에 형질전환되었다. 형질전환체는 LA + 50 μg/ml 카베니실린 플레이트 상에서 선별되었다. 여러가지 콜로니가 찍혔고 각각은 LB + 50 μg/ml 카베니실린을 포함하는 5 ml 튜브 내로 접종되었으며 배양액은 37℃에서 200 rpm으로 진탕하면서 하룻밤 동안 성장시켰다. 플라스미드는 제조사의 프로토콜에 따라 QIA프렙 스핀 미니프렙 키트를 사용하여 밤샘 배양 튜브로부터 분리되었다. 여러가지 플라스미드가 DNA 서열이 정확한지 확인하기 위해 서열결정되었다.

Y. lipolytica 코돈-최적화된 쿠쥬 이소프렌 합성효소 pTrex3g 플라스미드 (도 14)의 quad 결실 트리코더마 리세이 (Trichoderma reesei) 균주 내로의 바이올리스틱 형질전환은 바이올리스틱 PDS-1000/HE 입자 전달 시스템 (Biolistic PDS-1000/HE Particle Delivery System) (국제특허출원 공개번호 제 WO 2005/001036 A2호)을 사용하여 수행되었다. 안정한 형질전환체의 분리 및 진탕 플라스크 평가는 국제특허 공개번호 제 WO 2005/001036 A2호의 실시예 11에 나열된 프로토콜을 사용하여 수행되었다.

II. T.리세이 재조합 균주에서 이소프렌의 생산

상기에서 기술된 이소프렌 합성효소 형질전환체의 오래된 15 및 36 시간 배양액 1 ml이 상부공간 바이알로 이동되었다. 바이알은 밀봉되었고 30℃에서 5시간 동안 배양되었다. 상부공간 지체가 측정되었고 이소프렌이 실시예 1에 기술된 방법에 의해 확인되었다. 두 개의 형질전환체가 미량의 이소프렌을 보여주었다. 이소프렌량은 14시간 배양까지 증가될 수 있었다. 두 개의 양성 시료가 14시간 배양 동안 약 0.5 μg/L의 수준에서 이소프렌을 보여주었다. 형질전환되지 않은 대조군은 검출 가능한 수준의 이소프렌을 전혀 보여주지 못하였다. 본 실험은 T. reesei 가 외재성 이소프렌 합성효소와 함께 공급될 때 내재성 전구체로부터 이소프렌을 생산할 수 있는 것을 보여준다.

실시예 6: 야로위야 에서 이소프렌의 생산

I. 야로위야 리포리티카 에서 쿠쥬 이소프렌 합성효소의 발현을 위한 벡터의 제작

야로위야 리포리티카 (Yarrowia lipolytica)에서 쿠쥬 이소프렌 합성효소의 발현을 위한 벡터의 제작을 위한 시작점은 pSPZ1(MAP29Spb)이었다. 본 벡터의 완전한 서열 (서열번호 7)은 도 15에 나타나있다.

하기 단편은 주형으로서: URA3 유전자의 프로모터 없는 형태, 18S 리보좀 RNA 유전자의 단편, Y. lipolytica XPR2 유전자의 전사 종결인자 및 프로모터 XPR2와 ICL1 유전자를 포함하는 두 개의 DNA 단편인 Y. lipolytica 균주 GICC 120285의 염색체 DNA를 사용하여 PCR에 의해 증폭되었다. 하기 PCR 프라이머가 사용되었다:

ICL1 3

5'-GGTGAATTCAGTCTACTGGGGATTCCCAAATCTATATATACTGCAGGTGAC (서열번호 65)

ICL1 5

5'-GCAGGTGGGAAACTATGCACTCC (서열번호 66)

XPR 3

5'-CCTGAATTCTGTTGGATTGGAGGATTGGATAGTGGG (서열번호 67)

XPR 5

5'-GGTGTCGACGTACGGTCGAGCTTATTGACC (서열번호 68)

XPRT3

5,-GGTGGGCCCGCATTTTGCCACCTACAAGCCAG (서열번호 69)

XPRT 5

5'-GGTGAATTCTAGAGGATCCCAACGCTGTTGCCTACAACGG (서열번호 70)

Y18S3

5'-GGTGCGGCCGCTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCG (서열번호 71)

Y18S 5

5'-GGTGGGCCCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAG (서열번호 72)

YURA3

5'-GGTGACCAGCAAGTCCATGGGTGGTTTGATCATGG (서열번호 73)

YURA 50

5'-GGTGCGGCCGCCTTTGGAGTACGACTCCAACTATG (서열번호 74)

YURA 51

5'-GCGGCCGCAGACTAAATTTATTTCAGTCTCC (서열번호 75)

PCR 증폭을 위해 PfuUltraII 중합효소 (Stratagene), 공급자-제공 완충용액 및 dNTPs 또한 표시된 주형 DNA가 제조사의 지침에 따라 사용되었다. 증폭은 하기 사이클을 사용하여 수행되었다: 95℃ 1분; 34회 (95℃ 30초; 55℃ 30초; 72℃ 3분) 4℃ 배양에 이어서 10분 72℃.

야로위야에서 발현을 위해 코돈-최적화된 쿠쥬 이소프렌 합성효소를 인코딩하는 합성 DNA 분자는 DNA 2.0 (도 16; 서열번호 8)로부터 획득되었다. 각각 XPR2 및 ICL1 프로모터의 조절 하에 합성 쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자를 보유하는 플라스미드 pYLA(KZ1) 및 pYLI(KZ1)의 제작 도식의 상세한 사항 전부는 도 18에 나타나있다. 메이팅 인자 (mating factor) 유전자 (MAP29)가 이소프렌 합성효소 유전자의 자리에 삽입된 대조군 플라스미드도 역시 제작되었다 (도 18E 및 18F).

유사한 클로닝 과정이 포풀라 (Populus alba x Populus tremula) 이소프렌 합성효소 유전자를 발현하는 데 사용될 수 있다. 포풀라 이소프렌의 서열은 Miller B. et al. (2001) Planta 213, 483-487에 기술되어 있고 도 17 (서열번호 9)에 보여진다. 각각 XPR2 및 ICL1 프로모터의 조절 하에 합성 쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자를 보유하는 플라스미드 pYLA(POP1) 및 pYLI(POP1)의 제작 도식은 도 18A 및 18B에 나타나있다.

II. 재조합 Y. 리포리티카 균주에 의한 이소프렌의 생산

벡터 pYLA(KZ1), pYLI(KZ1), pYLA(MAP29) 및 pYLI(MAP29)가 SacII로 소화되었고 표준 리튬 아세테이트/폴리에틸렌 글리콜 과정에 의해 Y. lipolytica CLIB 122 균주를 우리딘 원형영양성 (uridine prototrophy)으로 형질전환시켰다. 간략하게, YEPD (1% 효모추출물, 2% 펩톤, 2% 포도당)에서 하룻밤 동안 자란 효모 세포는 원심분리 (4000 rpm, 10 분)에 의해 수확되었으며, 멸균된 물로 한 번 세척되었고 pH 6.0의 0.1 M 리튬 아세테이트에 현탁되었다. 200 μl 분량의 세포 현탁액은 직선화 플라스미드 DNA 용액 (10 - 20 μg)과 혼합되었고, 상온에서 10분 동안 배양되었으며 1 ml의 50% PEG 4000과 동일한 완충용액에서 혼합되었다. 현탁액은 좀 더 나아가 42℃에서 2분 열 충격에 이어서 상온에서 1시간 동안 배양되었다. 그 다음 세포는 SC 히스 루이 플레이트 (0.67% 효모 질소 베이스, 2% 포도당, 각각 100 mg/L의 루이신 및 히스티딘) 상에 도말되었다. 형질전환체는 30℃에서 3 - 4일의 배양 이후에 나타났다.

pYLA(KZ1) 형질전환으로부터 세 개의 분리물, pYLI(KZ1) 형질전환으로부터 세 개의 분리물, pYLA(MAP29) 형질전환으로부터 두 개의 분리물 및 pYLI(MAP29) 형질전환으로부터 두 개의 분리물을 24시간 동안 YEP7 배지 (1% 효모추출물, 2% 펩톤, pH 7.0)로 30℃에서 진탕하면서 성장시켰다. 10 ml 의 배양액으로부터 나온 세포는 원심분리에 의해 수집되었고 3ml의 새로운 YEP7에 재현탁시켰으며 15 ml 회전 뚜껑 바이알 내에 넣었다. 바이알은 상온에서 부드럽게 진탕하면서 (60 rpm) 하룻밤 동안 상온에서 배양되었다. 이들 바이알의 상부공간에서 이소프렌 내용물은 실시예 1에 기술된 바와 같이 질량-분광측정 검출기 (mass-spectrometric detector)를 사용하여 기체 크로마토그래피에 의해 분석되었다. pYLA(KZ1) 및 pYLI(KZ1)로 획득된 모든 형질전환체는 즉시 검출가능한 양의 이소프렌을 생산하였다 (0.5 μg/L 내지 1 μg/L, 도 20). 이소프렌 합성효소 유전자 대신 파이타제 (phytase) 유전자를 보유하는 대조군 균주의 상부공간에서는 이소프렌이 전혀 검출되지 않았다.

실시예 7: 쿠쥬 이소프렌 합성효소 및 idi, 또는 dxs, 또는 idi 및 dxs를 발현하는 대장균에서 이소프렌의 생산

I. 대장균에서 이소프렌의 생산을 위한 쿠쥬 이소프렌 합성효소 및 idi, 또는 dxs, 또는 idi 및 dxs를 인코딩하는 벡터의 제작

i) pTrcKudzuKan의 제작

pTrcKudzu (실시예 1에 기술됨)의 bla 유전자가 카나마이신 저항성을 부여하는 유전자와 대체되었다. bla 유전자를 제거하기 위하여, pTrcKudzu가 BspHI으로 소화되었고, 새우 알칼라인 포스파타제 (SAP)로 처리되었으며, 65℃에서 열 사멸된 다음 클레노 조각효소 및 dNTPs을 사용하여 말단이 채워졌다. 5 kbp 큰 단편은 아가로스 젤로부터 정제되었고 pCR-Blunt-II-TOPO 로부터 프라이머 MCM22 5'- GATCAAGCTTAACCGGAATTGCCAGCTG (서열번호 76) 및 MCM23 5'- GATCCGATCGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC (서열번호 77)을 사용하여 PCR 증폭되었고 HindIII 및 PvuI으로 소화되었으며 말단이 채워졌던 kan^r 유전자에 결찰되었다. 카나마이신 저항성을 부여하는 플라스미드 (pTrcKudzuKan)를 보유하는 형질전환체는 카나마이신 50 μg/ml을 포함하는 LA 상에서 선별되었다.

ii) pTrcKudzu yIDI Kan의 제작

pTrcKudzuKan은 PstI으로 소화되었고, SAP으로 처리되었으며, 열 사멸되어 젤 정제되었다. 이것은 S. cerevisiae 로부터 합성 RBS와 함께 idi 를 인코딩하는 PCR 산물에 결찰되었다. PCR을 위한 프라이머는 NsiI-YIDI 1 F 5'- CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC (서열번호 78) 및 PstI-YIDI 1 R 5'- CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC (서열번호 79)이었고; 또한 주형은 S. cerevisiae 게놈DNA이었다. PCR 산물은 NsiI 및 PstI으로 소화되었고 결찰 이전에 젤 정제되었다. 라이게이션 혼합액은 화학적으로 능력있는 TOP10 세포 내에 형질전환되었고 50 μg/ml 카나마이신을 포함하는 LA 상에서 선별되었다. 여러가지 형질전환체가 분리되었고 서열결정 되었으며 그 결과 나온 플라스미드는 pTrcKudzu-yIDI(kan)라고 명명되었다 (도 34 및 도 35; 서열번호 16).

iii) pTrcKudzu DXS Kan의 제작

플라스미드 pTrcKudzuKan는 PstI으로 소화되었고, SAP으로 처리되었으며, 열 사멸되어 젤 정제되었다. 이것은 대장균으로부터 합성 RBS와 함께 dxs 를 인코딩하는 PCR 산물에 결찰되었다. PCR을 위한 프라이머는 MCM13 5'-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG (서열번호 80) 및 MCM14 5'-CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT (서열번호 81); 또한 주형은 PCR 산물은 NsiI 및 PstI으로 소화되었고 결찰 이전에 젤 정제되었다. 그 결과 나온 라이게이션 반응은 TOP10 세포 내에 형질전환되었고 50 μg/ml 카나마이신을 포함하는 LA 상에서 선별되었다. 여러가지 형질전환체가 분리되었고 서열결정 되었으며 그 결과 나온 플라스미드는 pTrcKudzu-DXS(kan)라고 명명되었다 (도 36 및 도 37; 서열번호 17).

iv) pTrcKudzu-yIDI-dxs (kan)의 제작

pTrcKudzu-yIDI(kan)는 PstI으로 소화되었고, SAP으로 처리되었으며, 열 사멸되어 젤 정제되었다. 이것은 합성 RBS와 함께 대장균dxs 를 인코딩하는 NsiI 및 PstI로 이미 소화되었고 젤 정제되었던 PCR 산물에 결찰되었다 (프라이머 MCM13 5'-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG (서열번호 80) 및 MCM14 5'-CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT (서열번호 81); 주형 TOP10 세포). 최종 플라스미드는 pTrcKudzu-yIDI-dxs (kan)라고 명명되었다 (도 21 및 도 22; 서열번호 10).

v) pCL PtrcKudzu의 제작

실시예 1로부터 나온 프로모터, 구조 유전자 및 종결인자를 포함하는 DNA 단편은 pTrcKudzu로부터 SspI 사용하여 소화되었고 젤 정제되었다. 이것은 이미 PvuII로 소화되었고 SAP으로 처리되었으며 열 사멸되었던 pCL1920에 결찰되었다. 그 결과 나온 라이게이션 혼합액은 TOP10 세포 내로 형질전환되었고 50 μg/ml 스펙티노마이신을 포함하는 LA 상에서 선별되었다. 여러가지 클론이 분리되었고 서열결정되었으며 두 개가 선별되었다. pCL PtrcKudzu 및 pCL PtrcKudzu (A3)는 반대 방향으로 된 삽입물을 가진다 (도 38 내지 도 41; 서열번호 18 내지 19).

vi) pCL PtrcKudzu yIDI의 제작

상기 (ii)로부터 나온 NsiI-PstI 소화되고, 젤 정제된 IDI PCR 증폭자 (amplicon) 는 이미 PstI으로 소화되었고 SAP으로 처리되었으며 열 사멸되었던 pCL PtrcKudzu 내에 결찰되었다. 라이게이션 혼합액은 TOP10 세포 내에 형질전환되었고 50 μg/ml 스펙티노마이신을 포함하는 LA 상에서 선별되었다. 여러가지 클론이 분리되었고 서열결정되었으며 그 결과 나온 플라스미드는 pCL PtrcKudzu yIDI라고 명명되었다 (도 42 및 도 43; 서열번호 20).

vii) pCL PtrcKudzu DXS의 제작

상기 (iii)로부터 나온 NsiI-PstI 소화되고, 젤 정제된 DXS PCR 증폭자는 이미 PstI으로 소화되었고 SAP으로 처리되었으며 열 사멸되었던 pCL PtrcKudzu (A3) 내에 결찰되었다. 라이게이션 혼합액은 TOP10 세포 내에 형질전환되었고 50 μg/ml 스펙티노마이신을 포함하는 LA 상에서 선별되었다. 여러가지 클론이 분리되었고 서열결정되었으며 그 결과 나온 플라스미드는 pCL PtrcKudzu DXS라고 명명되었다 (도 44 및 도 45; 서열번호 21).

II. 쿠쥬 이소프렌 합성효소, idi , 및/또는 dxs 를 서로 다른 사본수로 발현하는 배양으로부터 나온 상부공간 이소프렌의 측정

플라스미드 pTrcKudzu(kan) (A), pTrcKudzu-yIDI kan (B), pTrcKudzu-DXS kan (C), pTrcKudzu-yIDI-DXS kan (D)로 이전에 형질전환되었던 E. coli BL21(λDE3)을 LB 카나마이신 50 μg/mL에서 성장시켰다. pCL PtrcKudzu (E), pCL PtrcKudzu, pCL PtrcKudzu-yIDI (F) 및 pCL PtrcKudzu-DXS (G)의 배양액은 LB 스펙트로마이신 50 μg/mL에서 성장시켰다. 배양액은 400 μM IPTG을 사용하여 0 시간 (대략 0.5의 OD₆₀₀)에서 유도시켰고 시료는 이소프렌 상부공간 측정을 위해 수집되었다 (실시예 1 참조하라). 결과는 도 23A 내지 23G에 나타나 있다.

플라스미드 pTrcKudzu-yIDI-dxs (kan)가 E. coli 균주 BL21에 형질전환에 의해 도입되었다. 그 결과 나온 균주 BL21/pTrc Kudzu IDI DXS는 카나마이신 (50 μg/ml)을 포함하는 LB 상에 하룻밤 동안 20℃에서 성장시켰고 TM3 (13.6 g K₂PO₄, 13.6 g KH₂PO₄, 2.0 g MgSO₄*7H₂O), 2.0 g 시트르산 모노하이드레이트, 0.3 g 철 암모늄 사이트레이트, 3.2 g (NH₄)₂SO₄, 0.2 g 효모추출물, 1.0 ml 1000 x 변형된 미량 금속 용액, pH 6.8로 조절되어 물로 q.s. 맞추어지고 여과 멸균됨)의 진탕 플라스크를 접종하는 데 사용되었다. 플라스크는 OD₆₀₀ 0.8이 될 때까지 30℃에서 배양된 다음 400 μM IPTG를 사용하여 유도되었다. 시료는 유도 이후 다양한 시간대에 가져왔고 상부공간에서 이소프렌량은 실시예 1에 기술된 바와 같이 측정되었다. 결과는 도 23H에 나타나 있다.

III. E. coli/pTrcKudzu yIDI DXS에서 바이오매스로부터 이소프렌의 생산

대장균 BL21 pTrcKudzuIDIDXS 균주가 세 가지 유형의 바이오매스 로부터 이소프렌을 생성하는 능력에 대해 테스트되었다; 대조군으로서 포도당과 함께 바가스 (bagasse), 옥수수 스토버 및 연목질 펄. 바이오매스의 가수분해물은 효소적 가수분해에 의해 제조되었고 (Brown, L and Torget, R., 1996, NREL standard assay method Lap-009 "Enzymatic Saccharification of Lignocellulosic Biomass" 포도당 동등물에 기초한 희석에서 사용되었다. 본 실시예에서, 포도당 동등물은 1% 포도당과 동일하다. 플레이트로부터 나온 단일 콜로니인 대장균 BL21 (λDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)의 새로이 형질전환된 세포가 카나마이신 (50 μg/ml)을 더한 5 ml LB에 접종하는 데 사용되었다. 배양액은 하룻밤 동안 25℃에서 진탕하면서 배양되었다. 다음 날 밤샘 배양액은 OD₆₀₀ 0.05까지 25 ml의 TM3 + 0.2% YE + 1% 공급원료로 희석시켰다. 공급원료는 옥수수 스토버, 바가스 또는 연목질 펄프이었다. 포도당은 양성 대조군으로서 사용되었고 무포도당은 음성 대조군으로서 사용되었다. 배양액은 30℃에서 180 rpm으로 진탕하면서 배양되었다. 배양액이 OD₆₀₀에 대해 감시되었고 이것이 OD₆₀₀ ~0.8이 될 때, 실시예 1에 기술된 바와 같이 배양액은 1 및 3시간에서 이소프렌 생산에 대해 분석되었다. 배양액은 유도되지 않는다. 첨가된 공급원료을 포함하는 모든 배양액은 포도당 양성 대조군의 것과 동등한 이소프렌을 생산한다. 실험은 이중으로 수행되었고 도 46에 나타나있다.

IV. E. coli/pTrcKudzuIDIDXS에서 역슈가로부터 이소프렌의 생산

플레이트로부터 나온 단일 콜로니인 대장균 BL21 (λDE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan)의 새로이 형질전환된 세포가 5 ml LB + 카나마이신 (50 μg/ml)을 접종하는 데 사용되었다. 배양액은 하룻밤 동안 25℃에서 진탕하면서 배양되었다. 다음 날 밤샘 배양액은 OD₆₀₀ 0.05까지 25 ml의 TM3 + 0.2% YE + 1% 공급원료로 희석시켰다. 공급원료는 포도당, 역 포도당 또는 옥수수 스토버이었다. 역슈가 공급원료 (Danisco Invert Sugar)은 효소적으로 처리된 슈크로스 시럽에 의해 제조되었다. AFEX 옥수수 스토버는 하기에 기술된 바와 같이 제조되었다 (제 V부). 세포는 30℃에서 성장시켰고 첫 번째 시료는 배양액이 OD₆₀₀ ~0.8-1.0 (0시간)이 될 때 측정되었다. 배양액은 성장을 위해 OD₆₀₀ 에 의해 측정된 바와 같이 또한 이소프렌 생산을 위해 실시예 1에서와 같이 1, 2 및 3시간대에서 분석되었다. 결과는 도 47에 나타나 있다.

V. AFEX 전처리된 옥수수 스토버로부터 가수분해물의 제조

AFEX 전처리된 옥수수 스토버는 미시간 생물공학연구소 (Michigan Biotechnology Institute)로부터 획득되었다. 전처리 조건은 60% 수분, 1 : 1 암모니아 로딩, 및 90℃에서 30분 동안 처리한 다음 공기 건조되었다. AFEX 전처리된 옥수수 스토버에서 수분 함량은 21.27%이었다. AFEX 전처리된 옥수수 스토버에서 글루칸 (glucan) 및 자일란 (xylan)의 함량은 각각 31.7% 및 19.1% (건조 기준)이었다. 당화 (saccharification) 공정은 다음과 같았다; 20 g 의 AFEX 전처리된 옥수수 스토버가 500 ml 플라스크 내로 5 ml의 1 M 소듐 사이트레이트 완충용액 pH 4.8, 2.25 ml의 아셀러라제 (Accellerase) 1000, 0.1 ml의 그린다밀 (Grindamyl) H121 (빵-제조업을 위한 아스퍼질러스 니제르 (Aspergillus niger)로부터 나온 대니스코 자일라나제 제품), 및 72.65 ml의 DI물과 함께 첨가되었다. 플라스크는 궤도 교반기에 넣었고 50℃에서 96시간 동안 배양되었다. 한 시료를 교반기로부터 가져왔고 HPLC를 사용하여 분석되었다. 가수분해물은 38.5 g/l의 포도당, 21.8 g/l의 자일로스, 및 10.3 g/l의 포도당 및/또는 자일로스의 올리고머를 포함하였다.

VI. 회분식 배양에서 자란 대장균에서 이소프렌 생산에 미치는 효모추출물의 효과.

발효는 상기 기술된 pTrcKudzu yIDI DXS 플라스미드를 포함하는 대장균 세포를 사용하여 이전에 기술된 바와 같이 14-L 규모로 수행되었다. 효모추출물 (Bio Springer, Montreal, Quebec, Canada)은 지수적 속도로 첨가되었다. 발효기에 운반된 효모추출물의 전체 양은 40시간 동안 70-830 g 사이에서 변화되었다. 발효 액체배지의 광학 밀도는 550 nm의 파장에서 측정되었다. 발효기 내의 최종 광학 밀도는 첨가된 효모추출물의 양과 비례하였다 (도 48A). 발효기로부터 나온 배출기체에서 이소프렌 수준은 이전에 기술된 바와 같이 결정되었다. 이소프렌 역가는 발효 과정 내내 증가되었다 (도 48B). 생산된 이소프렌량은 첨가된 효모추출물의 양과 직선상으로 비례하였다 (도 48C).

VII. pTrcKudzu DXS yIDI의 500 L 발효에서 이소프렌의 생산

쿠쥬 이소프렌 합성효소, S. cerevisiae IDI, 및 E. coli DXS 핵산 (E. coli BL21 (λDE3) pTrc Kudzu dxs yidi)을 가진 대장균 세포의 500 리터 발효가 이소프렌을 생산하는 데 사용되었다. 이소프렌의 수준은 15시간의 기간 동안 50으로부터 300 μg/L까지 변화되었다. 평균 이소프렌 농도, 장치를 통과하는 평균 유량 및 이소프렌 통과의 정도를 근거로 하여, 수집된 이소프렌량이 17 g인 것으로 계산되었다.

VIII. 회분식 배양에서 자란 대장균의 500 L 발효에서 이소프렌의 생산

배지 레시피 (발효 배지 리터 당):

K₂HPO₄ 7.5 g, MgSO₄ * 7H₂O 2 g, 시트르산 모노하이드레이트 2 g, 철 암모늄 시트르산 0.3 g, 효모추출물 0.5 g, 1000X 변형된 미량 금속 용액1 ml. 모든 성분은 다같이 첨가되었고 diH₂O에 녹였다. 본 용액은 고압 멸균되었다. pH는 7.0으로 암모늄 기체 (NH₃)를 사용하여 조정되었고 부피는 q.s. 맞추었다. 포도당 10 g, 티아민 (thiamine) * HCl 0.1 g, 및 항생제가 멸균 및 pH 조정 이후에 첨가되었다.

1000X 변형된 미량 금속 용액:

시트르산 * H₂O 40 g, MnSO₄ * H₂O 30 g, NaCl 10 g, FeSO₄ * 7H₂O 1 g, CoCl₂ * 6H₂O 1 g, ZnSO * 7H₂O 1 g, CuSO₄ * 5H₂O 100 mg, H₃BO₃ 100 mg, NaMoO₄ * 2H₂O 100 mg. 각 성분은 DIH₂O에 한 번에 하나씩 녹이고, pH는 3.0으로 HCl/NaOH를 사용하여 조정한 다음 부피를 q.s. 맞추고 0.22 마이크론 필터로 여과 살균된다.

발효는 pTrcKudzu yIDI DXS를 포함하는 대장균 세포를 사용하여 500-L 생물반응기에서 수행되었다. 본 실험은 원하는 발효 pH 7.0 및 온도 30℃에서 포도당 및 효모로부터 이소프렌 형성을 감시하도록 수행되었다. 냉동 바이알로부터 가져온 대장균 균주의 접종액 (inoculums)은 소이톤-효모추출물-포도당 배지에서 제조되었다. 접종액이 550 nm에서 측정된 OD 0.15까지 된 이후에, 20 ml이 2.5-L 소이톤-효모추출물-포도당 배지를 포함하는 생물반응기에 접종하는 데 사용되었다. 2.5-L 생물반응기를 30℃에서 OD 1.0까지 성장시켰고 2.0-L은 500-L 생물반응기로 이동시켰다.

효모추출물 (Bio Springer, Montreal, Quebec, Canada)과 포도당은 지수적 속도로 첨가되었다. 50시간 발효 동안 생물반응기로 운반된 포도당과 효모추출물의 전체 양은 각각 181.2 kg 및 17.6 kg이었다. 이 시간에 생물반응기 내 광학 밀도는 도 49A에 나타나있다. 생물반응기로부터 나온 배출기체에서 이소프렌 수준은 이전에 기술된 바와 같이 결정되었다. 이소프렌 역가는 발효 과정 내내 증가되었다 (도 49B). 50시간 발효 동안 생산된 이소프렌의 전체 양은 55.1 g이었고 생산의 시간 과정은 도 49C에 나타나있다.

실시예 8: 쿠쥬 이소프렌 합성효소 및 재조합 메발론산 경로 유전자를 발현하는 대장균에서 이소프렌의 생산

I. 하부 MVA 경로의 클로닝

하부 메발론산 경로를 클로닝하는 전략은 다음과 같다. 메발론산 생합성 경로의 네 가지 유전자; 메발로네이트 키나제 (MVK), 포스포메발로네이트 키나제 (PMK), 디포스포메발로네이트 탈탄산화효소 (MVD) 및 이소펜테닐 디포스페이트 이소머라제 유전자가 S. cerevisiae 염색체 DNA로부터 PCR에 의해 증폭되었고 개별적으로 pCR BluntII TOPO 플라스미드 (Invitrogen) 내로 클론되었다. 일정 경우에, idi 유전자는 대장균 염색체 DNA로부터 증폭되었다. 프라이머는 대장균 동일 RBS (AGGAGGT (서열번호 82) 또는 AAGGAGG (서열번호 83))가 시작 코돈의 8 bp 상방 5'-말단에 삽입되고 PstI 부위가 3'-말단에 첨가되도록 설계되었다. 그 다음 유전자는 pTrcHis2B 벡터 내로 하나씩 전체 경로가 모일 때까지 클론되었다.

S. cerevisiae S288C로부터 나온 염색체 DNA가 ATCC (ATCC 204508D)로부터 획득되었다. MVK 유전자는 제조사의 지침과 같이 PfuTurbo를 사용하는 프라이머 MVKF (5'-AGGAGGTAAAAAAACATGTCATTACCGTTCTTAACTTCTGC, 서열번호84) 및 MVK-Pst1-R (5'-ATGGCTGCAGGCCTATCGCAAATTAGCTTATGAAGTCCATGGTAAATTCGTG, 서열번호 85)를 사용하여 S. cerevisiae 의 염색체로부터 증폭되었다. 정확한 크기의 PCR 산물 (1370 bp)이 1.2% E-젤 (Invitrogen)을 통한 전기영동에 의해 확인되었고 pZeroBLUNT TOPO 내로 클론되었다. 그 결과 나온 플라스미드는 pMVK1라고 명명되었다. 플라스미드 pMVK1는 SacI 및 Taq1 제한효소로 소화되었고 단편은 젤 정제되었으며 SacI 및 BstBI으로 소화된 pTrcHis2B 내로 결찰되었다. 그 결과 나온 플라스미드는 pTrcMVK1라고 명명되었다.

메발론산 생합성 경로, PMK에서 두 번째 유전자는 프라이머: PstI-PMK1 R (5'-GAATTCGCCCTTCTGCAGCTACC, 서열번호 86) 및 BsiHKA I-PMK1 F (5'-CGACTGGTGCACCCTTAAGGAGGAAAAAAACATGTCAG, 서열번호 87)를 사용하는 PCR에 의해 증폭되었다. PCR 반응은 제조사의 지침과 같이 Pfu Turbo 중합효소 (Stratagene)를 사용하여 수행되었다. 정확한 크기의 산물 (1387 bp)은 PstI 및 BsiHKI으로 소화되었고 PstI으로 소화된 pTrcMVK1 내로 결찰되었다. 그 결과 나온 플라스미드는 pTrcKK라고 명명되었다. MVD 및 idi 유전자도 동일한 방식으로 클론되었다. PCR은 MVD 유전자를 증폭하도록 프라이머 쌍 PstI-MVD 1 R (5'-GTGCTGGAATTCGCCCTTCTGCAGC, 서열번호 88) 및 NsiI-MVD 1 F (5'-GTAGATGCATGCAGAATTCGCCCTTAAGGAGG, 서열번호 89)를, 또한 yIDI 유전자를 증폭하도록 프라이머 쌍 PstI-YIDI 1 R (5'-CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC, 서열번호 79) 및 NsiI-YIDI 1 F (5'-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC, 서열번호 78)을 사용하여 수행되었다. 일정 경우에, 대장균으로부터 나온 IPP 이소머라제 유전자, idi 가 사용되었다. 대장균으로부터 idi 를 증폭하기 위해, 다음과 같은 프라이머 세트가 사용되었다: PstI-CIDI 1 R (5'-GTGTGATGGATATCTGCAGAATTCG, 서열번호 90) 및 NsiI-CIDI 1 F (5'-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATG, 서열번호 91). 주형 DNA는 표준 방법에 의해 E. coli FM5로부터 분리된 염색체 DNA이었다 (국제특허출원 제 WO 96/35796호 및 제 WO 2004/033646호, 이들은 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 핵산의 분리에 관하여 통합된다). 최종 플라스미드는 효모 idi 유전자를 인코딩하는 제작물을 pKKDIy 또한 E. coli idi 유전자를 인코딩하는 제작물을 pKKDIc라고 명명하였다. 플라스미드는 연속되는 분석을 위해 대장균 숙주 BL21 내로 형질전환되었다. 일정 경우에 쿠쥬로부터 나온 이소프렌 합성효소는 pKKDIy 수득 플라스미드pKKDIyIS 내로 클론되었다.

하부 MVA 경로도 역시 카나마이신 항생제 저항성 마커를 포함하는 pTrc 내로 클론되었다. 플라스미드 pTrcKKDIy는 제한효소 ApaI 및 PstI로 소화되었고, 5930 bp 단편이 1.2% 아가로스 E-젤 상에서 분리되었으며 제조사의 지침에 따라 퀴아젠 젤 정제 키트 (Qiagen Gel Purification kit)를 사용하여 정제되었다. 실시예 7에서 기술된 플라스미드 pTrcKudzuKan는 제한효소 ApaI 및 PstI으로 소화되었고, 벡터를 포함하는3338 bp 단편은1.2% 아가로스 E-젤 로부터 퀴아젠 젤 정제 키트를 사용하여 정제되었다. 3338 bp 벡터 단편과 5930 bp 하부 MVA 경로 단편이 로슈 퀵 라이게이션 키트 (Roche Quick Ligation kit)를 사용하여 결찰되었다. 라이게이션 혼합액은 E. coli TOP10 세포 내로 형질전환되었고 형질전환체는 37℃에서 하룻밤 동안 카나마이신 (50 μg/ml)을 포함하는 LA 상에서 선별하면서 배양되었다. 형질전환체는 제한효소 소화에 의해 확인되었고 한 개는 스톡으로서 냉동되었다. 플라스미드는 pTrcKanKKDIy라고 명명되었다.

II. 쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자의 pTrcKanKKDIy 내로 클로닝

쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자는 PCR에 의해 실시예 1에 기술된 pTrcKudzu로부터 프라이머 MCM50 5'-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTTACT (서열번호 52) 및 MCM53 5'-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG (서열번호 50)를 사용하여 증폭되었다. 그 결과 나온 PCR 단편은 pCR2.1 내로 클론되었고 E. coli TOP10 내로 형질전환되었다. 본 단편은 쿠쥬 이소프렌 합성효소 및 대장균으로부터 나온 RBS를 포함하는 상류 부위에 대한 코딩 서열을 포함한다. 형질전환체는 37℃에서 하룻밤 동안 카베니실린 (50 μg/ml)을 포함하는 LA 상에서 선별하면서 배양되었다. 단편의 정확한 삽입이 서열결정법에 의해 확인되었고 본 균주는 MCM93라고 명명되었다.

MCM93 균주로부터 나온 플라스미드는 제한효소 NsiI 및 PstI로 소화되어 RBA 및 쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자를 포함하는 1724 bp 삽입자을 만들었다. 내놓았다. 1724 bp 단편은 1.2% 아가로스 E-젤 상에서 분리되었고 퀴아젠 젤 정제 키트를 사용하여 제조사의 지침에 따라 정제되었다. 플라스미드 pTrcKanKKDIy는 제한효소 PstI로 소화되었고, SAP으로 30분 동안 37℃에서 처리되었으며 퀴아젠 PCR 세척 키트 (Qiagen PCR cleanup kit)를 사용하여 정제되었다. 플라스미드 및 이소프렌 합성효소를 인코딩하는 DNA 단편은 로슈 퀵 라이게이션 키트를 사용하여 결찰되었다. 라이게이션 혼합액은 E. coli TOP10 세포 내로 형질전환되었고 형질전환체는 37℃에서 하룻밤 동안 카나마이신 50 μg/ml을 포함하는 LA 상에서 선별하면서 배양되었다. 정확한 형질전환체는 제한효소 소화에 의해 확인되었고 플라스미드는 pTrcKKDyIkISKan (도 24 및 도 25; 서열번호 11)라고 명명되었다. 본 플라스미드는 대장균 BL21(λDE3) (Invitrogen) 세포 내로 형질전환되었다.

III. 재조합 하부 메발로네이트 경로 및 쿠쥬로부터의 이소프렌 합성효소를 발현하는 대장균에서 메발로네이트로부터 이소프렌의 생산

대장균 균주 BL21/pTrcKKDyIkISKan는 pH 7.1로 조정되고 0.5% 포도당 및 0.5% 메발론산이 보충된 MOPS 배지 (Neidhardt et al., (1974) J. Bacteriology 119:736-747) 에서 배양되었다. 대조군 배양액도 역시 0.5% 메발론산의 첨가하지 않은 동일한 조건을 사용하여 설정되었다. 배양액은 밤샘 종자 배양으로부터 1% 접종액으로 시작되었고 배양액이 OD₆₀₀ 0.3 내지 0.5가 될 때 500 μM IPTG로 유도되었다. 배양액은 30℃에서 250 rpm으로 진탕하면서 배양되었다. 이소프렌의 생산은 유도한지 3시간 이후에 실시예 1에 기술된 상부공간 분석법을 사용하여 분석되었다. 이소프렌의 최대 생산은 6.67 x 10^-4 mol/L_액체배지/OD₆₀₀/시간이었고, 여기에서 L_액체배지 는 액체배지의 부피이고 세포 배지의 부피와 세포의 부피를 둘 다 포함한다. 메발론산이 보충되지 않은 대조군 배양액은 측정 가능한 이소프렌을 생산하지 않았다.

IV. 상부MVA 경로의 클로닝

세 가지 효소적 활성을 인코딩하는 두 개의 유전자를 포함하는 상부 메발로네이트 ㅎ합성 경로는 엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis)로부터 클론되었다. mvaE 유전자는 경로의 첫 번째 및 세 번째 단백질인 아세틸-CoA 아세틸전이효소 (acetyl-CoA acetyltransferase) 및 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA(HMG-CoA) 환원효소 (3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA) reductase) 둘 다의 효소적 활성을 가진 단백질을 인코드하고, mvaS 유전자는 경로의 두 번째 효소인 HMG-CoA 합성효소를 인코드한다. mvaE 유전자는 대장균 리보좀 결합 부위 및 전방 공간자를 가진 E. faecalis 게놈 DNA (ATCC 700802D-5)로부터 하기 프라이머를 사용하여 증폭되었다:

CF 07-60 (+) mvaE 시작 w/ RBS + ATG 시작 코돈 SacI

5'- GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG (서열번호 93)

CF 07-62 (-) 둘 사이 RBS로 mvaE 및 mvaS의 융합

5' TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATTGTTTTCTTAAATC (서열번호 94)

mvaS 유전자는 RBS 및 대장균으로부터의 전방 공간자를 가진 E. faecalis 게놈 DNA (ATCC 700802D-5)로부터 하기 프라이머를 사용하여 증폭되었다:

CF 07-61 (+) 둘 사이 RBS로 mvaE 및 mvaS 의 융합

5'-GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAA (서열번호 95)

CF 07-102 (-) mvaS 유전자의 말단 BglII

5'-GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (서열번호 96)

PCR 단편은 하기 프라이머를 사용하여 PCR로 융합되었다:

CF 07-60 (+) mvaE의 시작w/ RBS + ATG 시작 코돈 SacI

5'-GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG (서열번호 93)

CF 07-102 (-) mvaS 유전자의 말단 BglII

5'-GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (서열번호 96)

융합 PCR 단편은 퀴아젠 키트를 사용하여 정제되었고 제한효소 SacI 및 BglII로 소화되었다. 본 소화된 DNA 단편은 퀴아젠 키트를 사용하여 젤 정제되었고 미리 SacI 및 BglII로 소화되었고 젤 정제되었던 시판되는 벡터 pTrcHis2A 내로 결찰되었다.

라이게이션 혼합액은 E. coli Top 10 세포 내로 형질전환되었고 콜로니가 LA+ 50 μg/ml 카베니실린 플레이트 상에서 선별되었다. 모두 여섯 개의 콜로니가 선택되었고 하룻밤 동안 LB+ 50 μg/ml 카베니실린에서 배양되었으며 플라스미드는 퀴아젠 키트를 사용하여 분리되었다. 플라스미드는 삽입물을 검토하도록 SacI 및 BglII 로 소화시켰으며 한 개의 정확한 플라스미드는 하기 프라이머로 서열결정되었다:

CF 07-58 (+) mvaE 유전자의 시작

5'-ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC (서열번호 97)

CF 07-59 (-) mvaE 유전자의 말단

5'-ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC (서열번호 98)

CF 07-82 (+) mvaS 유전자의 시작

5'-ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG (서열번호 99)

CF 07-83 (-) mvaS 유전자의 말단

5'-TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (서열번호 100)

CF 07-86 (+) mvaE 서열

5'-GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC (서열번호 101)

CF 07-87 (+) mvaE 서열

5'-TTGCCAATCATATGATTGAAAATC (서열번호 102)

CF 07-88 (+) mvaE 서열

5'-GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG (서열번호 103)

CF 07-89 (+) mvaS 서열

5'-GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC (서열번호 104)

pTrcHis2AUpperPathway#1 라고 명명된 플라스미드는 서열결정법에 의해 정확하였고 시판되는 E. coli strain BL21 내에 형질전환되었다. 선별이 LA+ 50 μg/ml 카베니실린 상에서 이루어졌다. 두 개의 형질전환체가 선택되었고 LB+ 50 μg/ml 카베니실린에서 OD₆₀₀ 1.5가 될 때까지 성장시켰다. 균주 둘 다는 바이알에 -80℃로 글리세롤 존재 시 냉동시켰다. 균주는 대장균 BL21에서 pTrcHis2AUpperPathway#1, 분리물 #1은 CF 449라고 또한 대장균 BL21에서 pTrcHis2AUpperPathway#1, 분리물 #2는 CF 450라고 명명되었다. 클론 둘 다는 분석되었을 때 동일하게 행동하는 것으로 관찰되었다.

V. pCL1920 내로 UpperMVA 경로의 클로닝

플라스미드pTrcHis2AUpperPathway는 제한효소 SspI으로 pTrc-mvaE-mvaS-(His tag)-terminator를 방출하였다. 본 단편에서. 히스-태그는 해독되지 않는다. 본 무딘 말단을 가진 4.5 kbp 단편은 퀴아젠 젤 정제 키트를 사용하여 1.2% E-젤로부터 정제되었다. pCL1920 로부터 나온 탈인산화된 무딘 말단을 가진 4.2 kbp 단편은 제한효소 PstII로 벡터를 소화시키고 SAP으로 처리하며 퀴아젠 젤 정제 키트를 사용하여 1.2% E-젤로부터 젤 정제함에 의해 제조되었다. 두 가지 단편이 로슈 퀵 라이게이션 키트를 사용하여 결찰되었고 화학적으로 능력있는 TOP10 세포에 형질전환되었다. 형질전환체는 스펙티노마이신 (50 μg/ml)을 포함하는 LA 상에서 선별되었다. 정확한 콜로니가 PCR에 의해 삽입물의 존재를 검색하여 확인되었다. 플라스미드는 pCL PtrcUpperPathway (도 26 및 도 27A 내지 27D; 서열번호 12)라고 명명되었다.

VI. 조합된 상부 및 하부 메발론산 경로를 발현하는 균주

쿠쥬 이소프렌 합성효소를 더한 완전한 메발론산 경로를 가진 균주를 얻기 위하여, 플라스미드 pTrcKKDyIkISkan 및 pCLpTrcUpperPathway가 둘 다 능력있는 대장균 BL21(λDE3) 세포 (Invitrogen) 내로 형질전환 되었고 형질전환체는 카나마이신 (50 μg/ml) 및 스펙티노마이신 (50 μg/ml)을 포함하는 LA 배지 상에서 선별되었다. 형질전환체는 플라스미드 둘 다가 숙주에 보유되어 있는 것을 검증하기 위해 플라스미드 프렙에 의해 검토되었다. 균주는 MCM127이라고 명명되었다.

VII. E. coli/pUpperpathway에서 포도당으로부터 메발론산의 생산

대장균 BL21/pTrcHis2A-mvaE/mvaS 또는 FM5/p pTrcHis2A-mvaE/mvaS 가 LB + 카베니실린 (100 μg/ml) 내에 접종되었고 37℃에서 200 rpm으로 진탕하면서 성장되었다. 이들 배양액은 250 ml 진탕 플라스크에 넣어 50 ml 배지로 OD₆₀₀ 0.1까지 희석시켰다. 배지는 TM3 + 1 또는 2% 포도당 + 카베니실린 (100 μg/ml) 또는 TM3 + 1% 포도당 + 가수분해된 콩 오일 + 카베니실린 (100 ug/ml) 또는 TM3 + 바이오매스 (제조된 바가스, 옥수수 스토버 또는 스위치풀)이었다. 배양액은 30℃에서 200 rpm으로 진탕하면서 대략 2-3 시간 동안 OD₆₀₀ 0.4가 될 때까지 성장시켰다. 이 때 mvaE mvaS 제작물로부터 발현은 IPTG (400 μM) 첨가에 의해 유도되었다. 배양액은 유도 이후 6시간까지 2시간 간격으로 또한 다시 필요한 경우 24, 36 및 48시간대에 모아진 시료로 추가로 20 또는 40시간 동안 배양되었다. 시료 수집은 1 ml 배양액을 덜어 OD₆₀₀를 측정하고 세포를 마이크로 원심분리기 (microfuge)에서 펠렛으로 만들며 상청액을 제거하고 이를 메발론산에 대해 분석하여 이루어졌다.

엔테로코커스 페칼리스 AA-CoA 티올라제, HMG-CoA 합성효소, 및 HMG-CoA 환원효소를 인코딩하는 핵산을 가진 대장균 세포의 14 리터 발효는 TM3 배지 및 2% 포도당을 세포 배지로 하여 22 그램의 메발론산을 생산하였다. 이들 세포의 진탕 플라스크는 LB 배지 및 1% 포도당을 세포 배양 배지로서 하여 리터 당 2-4 그램의 메발론산을 생산하였다. 이들 균주에서 메발론산의 생산은 MVA 경로가 대장균에서 기능적인 것을 나타내었다.

VIII. 쿠쥬 이소프렌 합성효소를 더한 상부 및 하부 MVA 경로를 포함하는 E. coli BL21로부터 이소프렌의 생산

하기 균주는 상기 기술된 바와 같이 상부와 하부 MVA 경로 및 쿠쥬 이소프렌 합성효소를 포함하는 플라스미드의 또한 실시예 7에 기술된 idi, dxs, dxr 및 이소프렌 합성효소 유전자를 포함하는 플라스미드의 다양한 조합으로 형질전환하여 만들어졌다. 숙주세포는 화학적으로 능력있는 대장균 BL21(λDE3)이었고 형질전환은 표준 방법에 의해 이루어졌다. 형질전환체는 카나마이신 (50 μg/ml) 또는 스펙티노마이신을 더한 카나마이신 (둘 다 농도 50 μg/ml로)을 포함하는 L 아가 상에서 선별되었다. 플레이트는 37℃에서 성장시켰다. 그 결과 나온 균주는 다음과 같이 명명되었다:

스펙티노마이신을 더한 카나마이신 상에서 성장 (각각 50 μg/ml)

MCM127 - pCL Upper MVA + pTrcKKDyIkIS (kan) in BL21(λDE3)

MCM131 - pCL1920 + pTrcKKDyIkIS (kan) in BL21(λDE3)

MCM125 - pCL Upper MVA + pTrcHis2B (kan) in BL21(λDE3)

카나마이신 상에서 성장 (50 μg/ml)

MCM64 - BL21(λDE3)에 있는 pTrcKudzu yIDI DXS (kan)

MCM50 - BL21(λDE3)에 있는 pTrcKudzu (kan)

MCM123 - BL21(λDE3)에 있는 pTrcKudzu yIDI DXS DXR (kan)

상기 균주는 냉동 스톡으로부터 LA + 적절한 항생제 상에 뿌려졌고 (streaked) 37℃에서 하룻밤 동안 성장되었다. 각 플레이트로부터 나온 단일 콜로니는 진탕 플라스크 (25 ml LB + 적절한 항생제)를 접종하는 데 사용되었다. 플라스크는 22℃에서 하룻밤 동안 200 rpm으로 진탕하면서 배양되었다. 다음날 아침 플라스크는 37℃ 배양기로 이동되었고 추가로 4.5 시간 동안 200 rpm으로 진탕하면서 배양되었다. 25 ml 배양액은 세포를 펠렛을 만들도록 원심분리되었고 세포는 5 ml LB + 적절한 항생제에 재현탁되었다. 그 다음 배양액은 25 ml LB + 1% 포도당 + 적절한 항생제로 OD₆₀₀ 0.1까지 희석되었다. 각 균주에 대한 두 개 플라스크가 설정되어 한 세트는 IPTG (800 μM)로 유도되고 다른 세트는 유도되지 않았다. 배양액은 37℃에서 200 rpm으로 진탕하면서 배양되었다. 한 세트의 배양액은 1.50 시간 이후 (시료수집 시간대 1에 이어서 즉시) 유도되었다. 각 시료수집 시간대에, OD₆₀₀이 측정되었고 이소프렌량이 실시예 1에 기술된 바와 같이 결정되었다. 결과는 표 1에 나타나있다. 제조된 이소프렌량은 특정 균주의 생산 피크에서의 양으로서 표시된다. 표 3은 E. coli 균주에서 이소프렌의 생산을 나타낸다.

균주	이소프렌 (μg/리터/OD/시간)
MCM50	23.8
MCM64	289
MCM125	ND
MCM131	미량
MCM127	874

ND: 검출되지 않음

미량: 표시는 있지만 합산가능하지 않은 피크.

IX. 메발론산의 분석.

메발로노락톤 (mevalonolactone, 1.0 g, 7.7 mmol) (CAS# 503-48-0)은 물 (7.7 mL)에 녹인 시럽으로 시그마-알드리치사 (WI, USA)로부터 공급되었고 메발론산의 포타슘 염을 생성하도록 포타슘 하이드록사이드 (7.7 mmol)로 처리되었다. 메발론산의 전환은 ¹H NMR 분석에 의해 검증되었다. HPLC 분석을 위한 시료는 4,000 rpm으로 5 분 동안 원심분리하여 세포를 제거하였고 이어서 900 μl H₂O에 300 μl 분량의 상청액을 첨가하다. 그 다음 과염산 (36 μl의 70% 용액)이 첨가되었고 혼합하여 얼음 위에서 5분 동안 식혔다. 그 다음 시료는 다시 원심분리되었고 (14,000 rpm 5분) 상청액은 HPLC로 옮겨졌다. 메발론산 표준용액 (20, 10, 5, 및 0.5 g/L)이 동일한 방식으로 제조되었다. 메발론산의 분석 (20 μL 주입 부피)은 반발 지수 (refractive index, RI) 검출로 5 mM 황산에 0.6 mL/분 속도로 용출되는 바이오래드 아미넥스 87-H+ 컬럼 (BioRad Aminex 87-H+ column) (7.0 mm 씩 300 mm)을 사용한 HLPC에 의해 수행되었다. 이들 조건 하에서 메발론산은 18.5분에 락톤 형태로 용출되었다.

X. 쿠쥬 이소프렌 합성효소를 더한 상부 MVA 경로를 포함하는 E. coli BL21 로부터 이소프렌의 생산

메발론산 경로 폴리펩타이드 및 쿠쥬 이소프렌 합성효소를 발현하는 대장균의 15-L 규모의 발효가 회분식 배양에서 세포로부터 이소프렌을 생산하는 데 사용되었다. 본 실험은 포도당 제한 조건 하에서 세포를 성장시키는 것이 2.2 g/L의 이소프렌 생산을 가져오는 것을 보여준다.

배지 레시피 (발효 배지 리터 당):

배지는 발효 배지 리터 당 하기 성분을 사용하여 생성되었다: K₂HPO₄ 7.5 g, MgSO₄ * 7H₂O 2 g, 시트르산 모노하이드레이트 2 g, 철 암모늄 시트르산 0.3 g, 효모추출물 0.5 g, 1000X 변형된 미량 금속 용액1 ml. 모든 성분은 다같이 첨가되었고 diH₂O에 녹였다. 본 용액은 고압 멸균되었다. pH는 7.0으로 암모늄 하이드록사이드 (30%)를 사용하여 조정되었고 부피는 q.s. 맞추었다. 포도당 10 g, 티아민 * HCl 0.1 g, 및 항생제가 멸균 및 pH 조정 이후에 첨가되었다.

1000X 변형된 미량 금속 용액:

1000X 변형된 미량 금속 용액은 하기 성분을 사용하여 생성되었다: 시트르산 * H₂O 40 g, MnSO₄ * H₂O 30 g, NaCl 10 g, FeSO₄ * 7H₂O 1 g, CoCl₂ * 6H₂O 1 g, ZnSO * 7H₂O 1 g, CuSO₄ * 5H₂O 100 mg, H₃BO₃ 100 mg, NaMoO₄ * 2H₂O 100 mg. 각 성분은 한 번에 하나씩 DIH₂O에 녹이고, pH는 3.0으로 HCl/NaOH를 사용하여 조정한 다음 부피를 q.s. 맞추고 0.22 마이크론 필터로 여과 살균되었다.

발효는 pCL PtrcUpperPathway (도 26) 및 pTrcKKDyIkIS 플라스미드를 포함하는 대장균 BL21(DE3) 세포를 사용하여 15-L 생물반응기에서 수행되었다. 본 실험은 원하는 발효 pH 7.0 및 온도 30℃에서 포도당으로부터 이소프렌 형성을 감시하도록 수행되었다. 냉동 바이알로부터 가져온 대장균 균주의 접종액은 LB 액체배지 아가 플레이트 (항생제 첨가) 상에 뿌려졌고 37℃에서 배양되었다. 단일 콜로니가 소이톤-효모추출물-포도당 배지 내에 접종되었다. 접종액이 550 nm에서 측정되어 OD 1.0까지 된 이후에, 500 mL 이 5-L 생물반응기를 접종하는 데 사용되었다.

포도당은 세포가 안정상에 도달할 때까지 지수적 속도로 첨가되었다. 이 시점 이후 포도당 첨가는 대사적 요구를 만족시키기 위해 감소되었다. 54시간 발효 동안 생물반응기로 운반된 포도당의 전체 양은 3.7 kg이었다. 이 시간에 생물반응기 내 광학 밀도는 도 49A에 나타나있다. 유도는 이소프로필-베타-D-1-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)를 첨가하여 달성되었다. IPTG 농도는 광학 밀도가 550 nm (OD₅₅₀)에서 10이 도달할 때 25 μM가 되었다. IPTG 농도는 OD₅₅₀이 190에 도달할 때 50 μM로 올라갔다. IPTG 농도는 발효 38시간에서 100 μM로 올라갔다. 시간 경과에 따른 생물반응기의 OD₅₅₀ 프로파일은 도 54에 나타나있다. 생물반응기로부터 나온 배출기체에서 이소프렌의 수준은 본 명세서에서 기술된 바와 같이 결정되었다. 이소프렌의 역가는 발효 과정을 통해 2.2 g/L의 최종 값까지 증가되었다 (도 55). 54시간 발효 동안 생산된 이소프렌의 전체 양은 15.9 g이었고, 생산의 시간 과정은 도 56에 나타나있다.

XI. 메발론산 경로로부터의 유전자를 발현하고 15-L 규모의 회분식 배양에서 자란 대장균으로부터의 이소프렌 발효

메발론산 경로 폴리펩타이드 및 쿠쥬 이소프렌 합성효소를 발현하는 대장균의 15-L 규모의 발효가 회분식 배양에서 세포로부터 이소프렌을 생산하는 데 사용되었다. 본 실험은 포도당 제한 조건 하에서 세포를 성장시키는 것이 3.0 g/L의 이소프렌 생산을 가져오는 것을 보여준다.

배지 레시피 (발효 배지 리터 당):

배지는 발효 배지 리터 당 하기 성분을 사용하여 생성되었다: K₂HPO₄ 7.5 g, MgSO₄ * 7H₂O 2 g, 시트르산 모노하이드레이트 2 g, 철 암모늄 시트르산 0.3 g, 효모추출물 0.5 g, 1000X 변형된 미량 금속 용액1 ml. 모든 성분은 다같이 첨가되었고 diH₂O에 녹였다. 본 용액은 고압 멸균되었다. pH는 7.0으로 암모늄 하이드록사이드 (30%)를 사용하여 조정되었고 부피는 q.s. 맞추었다. 포도당 10 g, 티아민 * HCl 0.1 g, 및 항생제가 멸균 및 pH 조정 이후에 첨가되었다.

1000X 변형된 미량 금속 용액:

1000X 변형된 미량 금속 용액은 하기 성분을 사용하여 생성되었다: 시트르산 * H₂O 40 g, MnSO₄ * H₂O 30 g, NaCl 10 g, FeSO₄ * 7H₂O 1 g, CoCl₂ * 6H₂O 1 g, ZnSO * 7H₂O 1 g, CuSO₄ * 5H₂O 100 mg, H₃BO₃ 100 mg, NaMoO₄ * 2H₂O 100 mg. 각 성분은 한 번에 하나씩 DIH₂O에 녹이고, pH는 3.0으로 HCl/NaOH를 사용하여 조정한 다음 부피를 q.s. 맞추고0.22 마이크론 필터로 여과 살균되었다.

발효는 pCL PtrcUpperMVA 및 pTrc KKDyIkIS 플라스미드를 포함하는 대장균 BL21(DE3) 세포를 사용하여 15-L 생물반응기에서 수행되었다. 본 실험은 원하는 발효 pH 7.0 및 온도 30℃에서 포도당으로부터 이소프렌 형성을 감시하도록 수행되었다. 냉동 바이알로부터 가져온 대장균 균주의 접종액은 LB 액체배지 아가 플레이트 (항생제 첨가) 상에 뿌려졌고 37℃에서 배양되었다. 단일 콜로니가 소이톤-효모추출물-포도당 배지 내에 접종되었다. 접종액이 550 nm에서 측정되어 OD 1.0까지 된 이후에, 500 mL 이 5-L 생물반응기를 접종하는 데 사용되었다.

포도당은 세포가 안정상에 도달할 때까지 지수적 속도로 첨가되었다. 이 시점 이후 포도당 첨가는 대사적 요구를 만족시키기 위해 감소되었다. 59시간 발효 동안 생물반응기로 운반된 포도당의 전체 양은 2.2 kg이었다. 유도는 IPTG를 첨가하여 달성되었다. IPTG 농도는 광학 밀도가 550 nm (OD₅₅₀)에서 10에 도달할 때 25 uM가 되었다. IPTG 농도는 OD₅₅₀이 190에 도달할 때 50 uM로 올라갔다. 시간 경과에 따른 생물반응기의 OD₅₅₀ 프로파일은 도 93에 나타나있다. 생물반응기로부터 나온 배출기체에서 이소프렌의 수준은 본 명세서에서 기술된 바와 같이 결정되었다. 이소프렌의 역가는 발효 과정을 통해 3.0 g/L의 최종 값까지 증가되었다 (도 94). 59시간 발효 동안 생산된 이소프렌의 전체 양은 22.8 g이었고, 생산의 시간 과정은 도 95에 나타나있다. 발효 동안 이소프렌을 생산하는 데 들어갔던 사용된 탄소의 몰라 수율은 2.2% 이었다. 포도당으로부터 나온 이소프렌의 무게 퍼센트 수율은 1.0%이었다.

XII. 메발론산 경로로부터의 유전자를 발현하고 15-L 규모의 회분식 배양에서 자란 대장균으로부터의 이소프렌 발효

메발론산 경로 폴리펩타이드 및 푸엘라리아 로바타 (Pueraria lobata) 이소프렌 합성효소를 발현하는 대장균의 15-L 규모의 발효가 회분식 배양에서 세포로부터 이소프렌을 생산하는 데 사용되었다. 본 실험은 포도당 제한 조건 하에서 세포를 성장시키는 것이 3.3 g/L의 이소프렌 생산을 가져오는 것을 보여준다.

i) pCLPtrcUpperPathwayHGS2의 제작

푸엘라리아 로바타로부터 이소프렌 합성효소를 인코딩하는 유전자는 프라이머 NsiI-RBS-HGS F (cttgATGCATCCTGCATTCGCCCTTAGGAGG, 서열번호 105) 및 pTrcR (CCAGGCAAATTCTGTTTTATCAG, 서열번호106)를 또한 주형으로 pTrcKKDyIkIS 를 사용하여 PCR-증폭되었다. 따라서 PCR 산물은 NsiI 및 PstI로 소화되어 획득되었고 젤-정제되었다. 플라스미드 pCL PtrcUpperPathway는 제한효소 PstI로 소화되었고 제조사의 지침에 따라 rAPid 알칼라인 포스파타제 (Roche)를 사용하여 탈인산화되었다.

이들 DNA 단편은 다같이 결찰되었고 라이게이션 반응은 화학적으로 능력있는 E. coli Top10 세포 (Invitrogen) 내에 형질전환되었으며, 스펙티노마이신 (50 μg/ml)을 포함하는 L 아가 상에 도말되었고 370℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 플라스미드 DNA는 퀴아젠 스핀 미니-프렙 키트를 사용하여 6개의 클론으로부터 제조되었다. 플라스미드 DNA는 제한효소 EcoRV 및 MluI으로 소화되어 삽입물가 올바른 방향 (예로, pTrc promoter와 동일한 방향으로 배치된 유전자)을 가지는 클론을 확인하였다.

그 결과 나온 정확한 플라스미드는 pCLPtrcUpperPathwayHGS2라고 명명되었다. 본 플라스미드는 본 명세서에서 기술된 상부공간 분석법을 사용하여 분석되었고 E. coli Top10에서 이소프렌을 생산하는 것이 관찰되었으며 따라서 유전자의 기능성을 확인하였다. 플라스미드는 pTrcKKDyIkIS 를 포함하는 대장균 BL21(LDE3) 내에 형질전환되어 대장균 균주 BL21/pCLPtrcUpperPathwayHGS2-pTrcKKDyIkIS가 수득되었다. 본 균주는 대장균 BL21/pCL PtrcUpperMVA 및 pTrc KKDyIkIS 균주 (실시예 8, 제 XI부)와 비교하여 이소프렌 합성효소의 별도의 사본을 가진다. 본 균주는 또한 실시예 8, 제 XI부에서 사용된 대장균 BL21/pCL PtrcUpperMVA 및 pTrc KKDyIkIS 균주와 비교하여 HMGS 의 발현 및 활성을 증가시켰다.

ii) pCLPtrcUpperPathwayHGS2-pTrcKKDyIkIS를 발현하고 15-L 규모의 회분식 배양에서 자란 대장균으로부터의 이소프렌 발효.

배지 레시피 (발효 배지 리터 당):

배지는 발효 배지 리터 당 하기 성분을 사용하여 생성되었다: K₂HPO₄ 7.5 g, MgSO₄ * 7H₂O 2 g, 시트르산 모노하이드레이트 2 g, 철 암모늄 시트르산 0.3 g, 효모추출물 0.5 g, 1000X 변형된 미량 금속 용액 1 ml. 모든 성분은 다같이 첨가되었고 diH₂O에 녹였다. 본 용액은 고압 멸균되었다. pH는 7.0으로 암모늄 하이드록사이드 (30%)를 사용하여 조정되었고 부피는 q.s. 맞추었다. 포도당 10 g, 티아민 * HCl 0.1 g, 및 항생제가 멸균 및 pH 조정 이후에 첨가되었다.

1000X 변형된 미량 금속 용액:

1000X 변형된 미량 금속 용액은 하기 성분을 사용하여 생성되었다: 시트르산 * H₂O 40 g, MnSO₄ * H₂O 30 g, NaCl 10 g, FeSO₄ * 7H₂O 1 g, CoCl₂ * 6H₂O 1 g, ZnSO * 7H₂O 1 g, CuSO₄ * 5H₂O 100 mg, H₃BO₃ 100 mg, NaMoO₄ * 2H₂O 100 mg. 각 성분은 한 번에 하나씩 DI H₂O에 녹이고, pH는 3.0으로 HCl/NaOH를 사용하여 조정한 다음 부피를 q.s. 맞추고 0.22 마이크론 필터로 여과 살균되었다.

발효는 pCLPtrcUpperPathwayHGS2 및 pTrc KKDyIkIS 플라스미드를 포함하는 대장균 BL21(DE3) 세포를 사용하여 15-L 생물반응기에서 수행되었다. 본 실험은 원하는 발효 pH 7.0 및 온도 30℃에서 포도당으로부터 이소프렌 형성을 감시하도록 수행되었다. 냉동 바이알로부터 가져온 대장균 균주의 접종액은 LB 액체배지 아가 플레이트 (항생제 첨가) 상에 뿌려졌고 37℃에서 배양되었다. 단일 콜로니가 소이톤-효모추출물-포도당 배지 내에 접종되었다. 접종액이 550 nm에서 측정되어 OD 1.0까지 된 이후에, 500 mL 이 5-L 생물반응기를 접종하는 데 사용되었다.

포도당은 세포가 안정상에 도달할 때까지 지수적 속도로 첨가되었다. 이 시점 이후 포도당 첨가는 대사적 요구를 만족시키기 위해 감소되었다. 59시간 발효 동안 생물반응기로 운반된 포도당의 전체 양은 2.1 kg이었다. 유도는 IPTG를 첨가하여 달성되었다. IPTG 농도는 광학 밀도가 550 nm (OD₅₅₀)에서 9값에 도달할 때 25 uM가 되었다. IPTG 농도는 OD₅₅₀이 170에 도달할 때 50 μM로 올라갔다. 시간 경과에 따른 생물반응기의 OD₅₅₀ 프로파일은 도 104에 나타나있다. 생물반응기로부터 나온 배출기체에서 이소프렌의 수준은 본 명세서에서 기술된 바와 같이 결정되었다. 이소프렌의 역가는 발효 과정을 통해 3.3 g/L의 최종 값까지 증가되었다 (도 105). 58시간 발효 동안 생산된 이소프렌의 전체 양은 24.5 g이었고, 생산의 시간 과정은 도 106에 나타나있다. 발효 동안 이소프렌을 생산하는 데 들어갔던 사용된 탄소의 몰라 수율은 2.5% 이었다. 포도당으로부터 나온 이소프렌의 무게 퍼센트 수율은 1.2%이었다. 분석은 이소프렌 합성효소의 활성이 CL PtrcUpperMVA 및 pTrc KKDyIkIS를 발현하는 대장균 BL21과 비교하여 대략 3 - 4배 증가되었던 것을 보여준다 (결과 미도시).

XIII. 대장균에서 하부 메발로네이트 경로의 염색체 도입

메발로네이트 키나제, 메발로네이트 포스페이트 키나제, 메발로네이트 피로포스페이트 탈탄산화효소, 및 IPP 이소머라제를 포함하는 합성 오페론은 대장균 염색체 내로 도입되었다. 원하는 경우, 발현은 오페론의 서로 다른 프로모터를 도입하여 변화될 수 있다.

표 4는 본 실험에 사용되는 프라이머들을 나열하고 있다.

MCM78	삽입 제작물을 위한 attTn7 up rev	gcatgctcgagcggccgcTTTTAATCAAACATCCTGCCAACTC (서열번호 107)
MCM79	삽입 제작물을 위한 attTn7 down rev	gatcgaagggcgatcgTGTCACAGTCTGGCGAAACCG (서열번호 108)
MCM88	삽입 제작물을 위한 attTn7 up forw	ctgaattctgcagatatcTGTTTTTCCACTCTTCGTTCACTTT (서열번호 109)
MCM89	삽입 제작물을 위한 attTn7 down forw	tctagagggcccAAGAAAAATGCCCCGCTTACG (서열번호 110)
MCM104	GI1.2 프로모터 - MVK	Gatcgcggccgcgcccttgacgatgccacatcctgagcaaataattcaaccactaattgtgagcggataacacaaggaggaaacagctatgtcattaccgttcttaacttc (서열번호 111)
MCM105	aspA 종결인자 - yIDI	Gatcgggccccaagaaaaaaggcacgtcatctgacgtgccttttttatttgtagacgcgttgttatagcattcta (서열번호 112)
MCM120	attTn7 전방: attTn7 상동성, GB 마커 상동성	aaagtagccgaagatgacggtttgtcacatggagttggcaggatgtttgattaaaagcAATTAACCCTCACTAAAGGGCGG (서열번호 113)
MCM127	Rev complement of 1.2 GI: GB 마커 상동성 (초과 길이), 프로모터, RBS, ATG	AGAGTGTTCACCAAAAATAATAACCTTTCCCGGTGCAgaagttaagaacggtaatgacatagctgtttcctccttgtgttatccgctcacaattagtggttgaattatttgctcaggatgtggcatcgtcaagggcTAATACGACTCACTATAGGGCTCG (서열번호 114)

i) 표적 벡터 제작

attTn7 부위가 통합 (integration)을 위해 선택되었다. 상동성 상류 (attTn7 up) (프라이머 MCM78 및 MCM79) 또한 하류 (attTn7 하류) (프라이머 MCM88 및 MCM89)의 부위들이 MG1655 세포로부터 PCR에 의해 증폭되었다. 1 μL 10 μM 프라이머, 3 μL dd H2O, 45 μL 인비트로겐 플래티넘 PCR 혼합액 (Invitrogen Platinum PCR Supermix High Fidelity), 및 MG1655의 찍힌 콜로니 (scraped colony)가 들어 있는 50 μL 반응은 2:00분 동안 94℃에서 변성되고 25회 사이클 (2:00분 94℃, 0:30분 50℃, 및 1:00분 68℃) 반복되고, 7:00분 72℃ 로 연장되며, 40℃로 식혀졌다. 이로부터 나온 DNA는 제조사의 지침에 따라 pCR2.1 (Invitrogen) 내로 클론되어 플라스미드 MCM278 (attTn7 상류) 및 MCM252 (attTn7 하류)가 만들어졌다. MCM252으로부터 ApaI-PvuI 소화되고 젤 정제된 832bp의 단편은 ApaI-PvuI 소화되고 젤 정제된 플라스미드 pR6K 내로 클론되어 플라스미드 MCM276가 제작되었다. MCM278 으로부터 PstI-NotI 소화되고 젤 정제된 825 bp 단편은 PstI-NotI 소화되고 젤 정제된 MCM276 내로 클론되어 플라스미드 MCM281가 제작되었다.

ii) 하부 경로 및 프로모터의 클로닝

MVK-PMK-MVD-IDI 유전자는 제조사의 지침에 따라 로슈 PCR 시스템 (Roche Expand Long PCR System)을 사용하여 프라이머 MCM104 및 MCM105로 pTrcKKDyIkIS로부터 증폭되었다. 본 산물은 NotI 및 ApaI으로 소화되었고 미리 NotI 및 ApaI으로 소화되었고 젤 정제되었던 MCM281 내에 클론되었다. 프라이머 MCM120 및 MCM127는 스트라타젠 Pfu Ultra II 를 사용하는 진브리지 (GeneBridges) FRT-gb2-Cm-FRT 주형 DNA로부터 CMR카세트를 증폭하는 데 사용되었다. PCR 프로그램은 95℃ 4:00분, 5회 사이클 95℃ 0:20분, 55℃ 0:20분, 72℃ 2:00분, 25회 사이클 95℃ 0:20분, 58℃ 0:20분, 72℃ 2:00분, 72℃ 10:00분, 그 다음 4℃로 식히는 과정이 1 μL ~10 ng/μL 주형, 1 μL 각 프라이머, 1.25 μL 10mM dNTPs, 5 μL 10X 완충용액, 1 μL 효소 및 39.75 μL ddH20을 포함하는 네 개의 50 μL PCR 반응에 사용되었다. 반응은 진행되었고 퀴아젠 PCR 세척 컬럼 (Qiagen PCR cleanup column) 상에서 정제되었으며, 플라스미드 MCM296을 포함하는 물로 세척된 Pir1 세포를 전기천공하는 데 사용되었다. 전기천공은 2 mM 큐벳 (cuvettes)으로 2.5V 및 200 ohms에서 수행되었다. 전기천공 반응은 LB에 넣어 3시간 동안 30℃에서 회복되었다. 형질전환체 MCM330은 CMP5, Kan50을 가지는 LA 상에서 선별되었다 (도 107 및 도 108A 내지 108C; 서열번호 25).

iii) E. coli 염색체 내로 통합

MCM330 로부터 미니프렙된 DNA (Qiaquick Spin kit)는 SnaBI으로 소화되었고 대장균 BL21(DE3) (Novagen) 또는 진브리지 플라스미드 pRedET Carb를 포함하는 MG1655를 전기천공하는 데 사용되었다. 세포는 30℃에서 ~OD1까지 성장시킨 다음 0.4% L-아라비노스로 37℃ 에서 1.5시간 동안 유도되었다. 이들 세포는 4℃ ddH2O에 넣어 2 μL DNA로 전기천공하기 이전에 세 번 세척되었다. 통합물 (integrants)는 클로로암페니콜 (5 μg/ml)을 포함하는 L 아가 상에서 선별되었고 연속적으로 L 아가 + 카나마이신 (50 μg/ml) 상에서 성장하지 못하는 것이 검증되었다. 대장균 BL21 통합물 MCM331 및 MG1655 통합물 MCM333는 냉동되었다.

iv) 쿠쥬 이소프렌 합성효소를 인코딩하는 pET24D-Kudzu의 제작

쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자가 pCR2.1 벡터 (Invitrogen)로부터 pET24d 벡터 (Novagen) 내로 클론되었다. 상세하게, 쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자는 pTrcKudzu 주형 DNA로부터 프라이머MCM50 5'-gatcatgcat tcgcccttag gaggtaaaaa aacatgtgtg cgacctcttc tcaatttact (서열번호 52) 및 MCM53 5'-CGGTCGACGG ATCCCTGCAG TTAGACATAC ATCAGCTG (서열번호 50)를 사용하여 증폭되었다. PCR 반응은 Taq DNA 중합효소 (Invitrogen)를 사용하여 수행되었고, 그 결과 나온 PCR 산물은 pCR2.1-TOPO TA 클로닝 벡터 (Invitrogen) 내로 클론되었고, 화학적으로 능력있는 E. coli Top10 세포 (Invitrogen) 내로 형질전환되었다. 형질전환체는 카베니실린 (50 mg/ml)을 포함하는 L 아가 상에서 도말되었고 37℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 카베니실린 50 mg/ml을 포함하는 5 ml의 루리아 액체배지 배양액은 단일 형질전환체가 접종되고 37℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 5개의 콜로니가 1 ml 액체 배양 (루리아 액체배지)으로부터 분리된 플라스미드 DNA의 서열결정에 의해 정확한 삽입물에 대해 검색되었고 QIA프렙 스핀 미니-프렙 키트 (Qiagen)를 사용하여 정제되었다. 그 결과 나온 MCM93이라고 명명되는 플라스미드는 pCR2.1 골격에 쿠쥬 이소프렌 합성효소 코딩 서열을 포함한다.

쿠쥬 코딩 서열은 PciI 및 BamH1 (Roche)으로 제한효소 소화에 의해 제거되었고 QIA퀵 젤 추출 키트 (Qiagen)를 사용하여 젤 정제되었다. pET24d 벡터 DNA는 NcoI 및 BamHI (Roche)으로 정제되었고 새우 알칼라인 포스파타제 (Roche)로 처리되었으며 QIA프렙 스핀 미니-프렙 키트 (Qiagen)를 사용하여 정제되었다. 쿠쥬 이소프렌 합성효소 단편은 5 : 1의 단편 대 벡터 비율로 전체 20 ml 에서 래피드 DNA 라이게이션 키트 (Roche)를 사용하여 NcoI/BamH1 소화된 pET24d에 결찰되었다. 라이게이션 혼합액의 일정량 (5 ml)이 화학적으로 능력있는 E. coli Top 10 세포에 형질전환되었고 카나마이신 (50 mg/ml)을 포함하는 L 아가 상에 도말되었다. 정확한 형질전환체는 서열결정하여 검증되었고, 화학적으로 능력있는 BL21(lDE3)pLysS cells (Novagen) 내로 형질전환되었다. 단일 콜로니가 카나마이신 (50 mg/ml)을 포함하는 L 아가 상에 37^oC로 하룻밤 성장 이후에 선별되었다. 그 결과 나온 pET24D-Kudzu라고 명명되는 플라스미드의 지도는 도 109에 나타나있다. pET24D-Kudzu의 서열 (서열번호 26)는 도 110A 및 도 110B에 나타나있다. 이소프렌 합성효소 활성은 상부공간 분석법을 사용하여 검증되었다.

v) 생산 균주

균주MCM331 및 MCM333는 플라스미드 pCLPtrcupperpathway 및 pTrcKudzu 또는 pETKudzu 둘 중 하나로 공형질전환되었고 표 1에 나타난 균주들을 가져왔다.

표 5는 생산 균주를 나타낸다.

기저	통합된 하부	상부 MVA 플라스미드	이소프렌 합성효소 플라스미드	생산 균주
BL21(DE3)	MCM331	pCLPtrcUpper Pathway	pTrcKudzu	MCM343
BL21(DE3)	MCM331	pCLPtrcUpper Pathway	pET24D-Kudzu	MCM335
MG1655	MCM333	pCLPtrcUpper Pathway	pTrcKudzu	MCM345

vi) 메발론산 경로부터 나온 유전자를 발현하고 15-L 규모의 회분식 배양에서 자란 대장균으로부터의 이소프렌 발효.

배지 레시피 (발효 배지 리터 당):

배지는 발효 배지 리터 당 하기 성분을 사용하여 생성되었다: K₂HPO₄ 7.5 g, MgSO₄ * 7H₂O 2 g, 시트르산 모노하이드레이트 2 g, 철 암모늄 시트르산 0.3 g, 효모추출물 0.5 g, 1000X 변형된 미량 금속 용액1 ml. 모든 성분은 다같이 첨가되었고 diH₂O에 녹였다. 본 용액은 고압 멸균되었다. pH는 7.0으로 암모늄 하이드록사이드 (30%)를 사용하여 조정되었고 부피는 q.s. 맞추었다. 포도당 10 g, 티아민 * HCl 0.1 g, 및 항생제가 멸균 및 pH 조정 이후에 첨가되었다.

1000X 변형된 미량 금속 용액:

1000X 변형된 미량 금속 용액은 하기 성분을 사용하여 생성되었다: 시트르산 * H₂O 40 g, MnSO₄ * H₂O 30 g, NaCl 10 g, FeSO₄ * 7H₂O 1 g, CoCl₂ * 6H₂O 1 g, ZnSO * 7H₂O 1 g, CuSO₄ * 5H₂O 100 mg, H₃BO₃ 100 mg, NaMoO₄ * 2H₂O 100 mg. 각 성분은 한 번에 하나씩 DIH₂O에 녹이고, pH는 3.0으로 HCl/NaOH를 사용하여 조정한 다음 부피를 q.s. 맞추고 0.22 마이크론 필터로 여과 살균되었다.

발효는 상기 기술된gi1.2 도입된 하부 MVA 경로 또한 pCLPtrcUpperMVA 및 pTrc Kudzu 플라스미드를 포함하는 대장균 BL21(DE3) 세포를 사용하여 15-L 생물반응기에서 수행되었다. 본 실험은 원하는 발효 pH 7.0 및 온도 30℃에서 포도당으로부터 이소프렌 형성을 감시하도록 수행되었다. 냉동 바이알로부터 가져온 대장균 균주의 접종액은 LB 액체배지 아가 플레이트 (항생제 첨가) 상에 뿌려졌고 37℃ 에서 배양되었다. 단일 콜로니가 트립톤-효모추출물 배지 내에 접종되었다. 접종액이 550 nm에서 측정되어 OD 1.0까지 성장한 이후에, 500 mL이 5-L 생물반응기를 접종하는 데 사용되었다.

포도당은 세포가 안정상에 도달할 때까지 지수적 속도로 첨가되었다. 이 시점 이후 포도당 첨가는 대사적 요구를 만족시키기 위해 감소되었다. 57시간 발효 동안 생물반응기로 운반된 포도당의 전체 양은 3.9 kg이었다. 유도는 IPTG를 첨가하여 달성되었다. IPTG 농도는 이산화탄소 발생율이 100 mmol/L/시간에 도달할 때 100 uM가 되었다. 시간 경과에 따른 생물반응기 내의 OD₅₅₀ 프로파일은 도 111A에 나타나있다. 생물반응기로부터 나온 배출기체에서 이소프렌의 수준은 본 명세서에서 기술된 바와 같이 결정되었다. 이소프렌의 역가는 발효 과정을 통해 1.6 g/L의 최종 값까지 증가되었다 (도 111B). 발효 과정을 통해 이소프렌의 특이 생산도는 도 11C에 나타나있고 1.2 mg/OD/시간에서 피크에 도달하였다. 57시간 발효 동안 생산된 이소프렌의 전체 양은 16.2 g이었다. 발효 동안 이소프렌을 생산하는 데 들어갔던 사용된 탄소의 몰라 수율은 0.9% 이었다. 포도당으로부터 나온 이소프렌의 무게 퍼센트 수율은 0.4%이었다.

XIV. 탄소원으로서 글리세롤을 사용하는 쿠쥬 이소프렌 합성효소를 포함하는 대장균 BL21로부터의 이소프렌 발효.

쿠쥬 이소프렌 합성효소를 발현하는 대장균의 15-L 규모의 발효가 회분식 배양에서 글리세롤을 준 세포로부터 이소프렌을 생산하는 데 사용되었다. 본 실험은 글리세롤 존재 시 (포도당 없이) 세포를 성장시키는 것이 2.2 mg/L의 이소프렌 생산을 가져오는 것을 보여준다.

배지 레시피 (발효 배지 리터 당):

배지는 발효 배지 리터 당 하기 성분을 사용하여 생성되었다: K₂HPO₄ 7.5 g, MgSO₄ * 7H₂O 2 g, 시트르산 모노하이드레이트 2 g, 철 암모늄 시트르산 0.3 g, 효모추출물 0.5 g, 1000X 변형된 미량 금속 용액 1 ml. 모든 성분은 다같이 첨가되었고 diH₂O에 녹였다. 본 용액은 고압 멸균되었다. pH는 7.0으로 암모늄 하이드록사이드 (30%)를 사용하여 조정되었고 부피는 q.s. 맞추었다. 글리세롤 5.1 g, 티아민 * HCl 0.1 g, 및 항생제가 멸균 및 pH 조정 이후에 첨가되었다.

1000X 변형된 미량 금속 용액:

1000X 변형된 미량 금속 용액은 하기 성분을 사용하여 생성되었다: 시트르산 * H₂O 40 g, MnSO₄ * H₂O 30 g, NaCl 10 g, FeSO₄ * 7H₂O 1 g, CoCl₂ * 6H₂O 1 g, ZnSO * 7H₂O 1 g, CuSO₄ * 5H₂O 100 mg, H₃BO₃ 100 mg, NaMoO₄ * 2H₂O 100 mg. 각 성분은 한 번에 하나씩 DIH₂O에 녹이고, pH는 3.0으로 HCl/NaOH를 사용하여 조정한 다음 부피를 q.s. 맞추고0.22 마이크론 필터로 여과 살균되었다.

발효는 pTrcKudzu 플라스미드를 포함하는 대장균 BL21(DE3) 세포를 사용하여 15-L 생물반응기에서 수행되었다. 본 실험은 원하는 발효 pH 7.0 및 온도 30℃에서 포도당으로부터 이소프렌 형성을 감시하도록 수행되었다. 냉동 바이알로부터 가져온 대장균 균주의 접종액은 LB 액체배지 아가 플레이트 (항생제 첨가) 상에 뿌려졌고 37℃에서 배양되었다. 단일 콜로니가 소이톤-효모추출물-포도당 배지 내에 접종되었고 35℃에서 성장시켰다. 접종액이 550 nm에서 측정되어 OD 1.0까지 된 이후에, 600 mL 이 5-L 생물반응기를 접종하는 데 사용되었다.

글리세롤은 세포가 550 nm (OD₅₅₀)에서 광학 밀도가 153에 도달할 때까지 지수적 속도로 첨가되었다. 36시간 발효 동안 생물반응기로 운반된 포도당의 전체 양은 1.7 kg이었다. 접종액에 넣은 포도당 이외에는 포도당은 생물반응기에 전혀 첨가되지 않았다. 유도는 IPTG를 첨가하여 달성되었다. IPTG 농도는 광학 밀도가 550 nm (OD₅₅₀)에서 50에 도달할 때 20 μM가 되었다. 시간 경과에 따른 생물반응기의 OD₅₅₀ 프로파일은 도 57에 나타나있다. 생물반응기로부터 나온 배출기체에서 이소프렌의 수준은 본 명세서에서 기술된 바와 같이 결정되었다. 이소프렌의 역가는 발효 과정을 통해 2.2 mg/L의 최종 값까지 증가되었다 (도 58). 54시간 발효 동안 생산된 이소프렌의 전체 양은 20.9 mg이었고, 생산의 시간 과정은 도 59에 나타나있다.

XIV. 메발론산 경로로부터 나온 유전자를 발현하고 탄소원으로 역슈가를 사용하여 회분식 배양에서 15-L 규모로 자란 대장균 BL21로부터의 이소프렌 발효

메발론산 경로 폴리펩타이드 및 쿠쥬 이소프렌 합성효소를 발현하는 대장균의 15-L 규모의 발효가 회분식 배양에서 역슈가를 준 세포로부터 이소프렌을 생산하는 데 사용되었다. 본 실험은 역슈가 존재 시 세포를 성장시키는 것이 2.4 g/L의 이소프렌 생산을 가져오는 것을 보여준다.

배지 레시피 (발효 배지 리터 당):

배지는 발효 배지 리터 당 하기 성분을 사용하여 생성되었다: K₂HPO₄ 7.5 g, MgSO₄ * 7H₂O 2 g, 시트르산 모노하이드레이트 2 g, 철 암모늄 시트르산 0.3 g, 효모추출물 0.5 g, 1000X 변형된 미량 금속 용액1 ml. 모든 성분은 다같이 첨가되었고 diH₂O에 녹였다. 본 용액은 고압 멸균되었다. pH는 7.0으로 암모늄 하이드록사이드 (30%)를 사용하여 조정되었고 부피는 q.s. 맞추었다. 역슈가 10 g, 티아민 * HCl 0.1 g, 및 항생제가 멸균 및 pH 조정 이후에 첨가되었다.

1000X 변형된 미량 금속 용액:

1000X 변형된 미량 금속 용액은 하기 성분을 사용하여 생성되었다: 시트르산 * H₂O 40 g, MnSO₄ * H₂O 30 g, NaCl 10 g, FeSO₄ * 7H₂O 1 g, CoCl₂ * 6H₂O 1 g, ZnSO * 7H₂O 1 g, CuSO₄ * 5H₂O 100 mg, H₃BO₃ 100 mg, NaMoO₄ * 2H₂O 100 mg. 각 성분은 한 번에 하나씩 DI H₂O에 녹이고, pH는 3.0으로 HCl/NaOH를 사용하여 조정한 다음 부피를 q.s. 맞추 고0.22 마이크론 필터로 여과 살균되었다.

발효는 pCL PtrcUpperMVA 및 pTrc KKDyIkIS pTrcKudzu 플라스미드를 포함하는 대장균 BL21(DE3) 세포를 사용하여 15-L 생물반응기에서 수행되었다. 본 실험은 원하는 발효 pH 7.0 및 온도 30℃에서 포도당으로부터 이소프렌 형성을 감시하도록 수행되었다. 냉동 바이알로부터 가져온 대장균 균주의 접종액은 LB 액체배지 아가 플레이트 (항생제 첨가) 상에 뿌려졌고 37℃에서 배양되었다. 단일 콜로니가 트립톤-효모추출물 배지 내에 접종되었다. 접종액이 550 nm에서 측정되어 OD 1.0까지 된 이후에, 500 mL 이 5-L 생물반응기를 접종하는 데 사용되었다.

역슈가는 세포가 정지상에 도달할 때까지 지수적 속도로 첨가되었다. 이 시점 이후 첨가된 역슈가는 대사적 요구를 만족시키도록 감소되었다. 44시간 발효 동안 생물반응기로 운반된 포도당의 전체 양은 2.4 kg이었다. 유도는 IPTG를 첨가하여 달성되었다. IPTG 농도는 광학 밀도가 550 nm (OD₅₅₀)에서 9값에 도달할 때 25 μM가 되었다. IPTG 농도는 OD₅₅₀가 200에 도달할 때 50 μM이 되었다. 시간 경과에 따른 생물반응기 내의 OD₅₅₀ 프로파일은 도 96에 나타나있다. 생물반응기로부터 나온 배출기체에서 이소프렌의 수준은 본 명세서에서 기술된 바와 같이 결정되었다. 이소프렌의 역가는 발효 과정을 통해 2.4 g/L의 최종 값까지 증가되었다 (도 97). 44시간 발효 동안 생산된 이소프렌의 전체 양은 18.4 g이었고, 생산의 시간 과정은 도 98에 나타나있다. 발효 동안 이소프렌을 생산하는 데 들어갔던 사용된 탄소의 몰라 수율은 1.7% 이었다. 포도당으로부터 나온 이소프렌의 무게 퍼센트 수율은 0.8%이었다.

실시예 9: 바실러스 섭틸리스 내로 통합되기 위한 상부 및 하부 MVA 경로의 제작

I. 바실러스 섭틸리스에서 상부 MVA 경로의 제작

엔테로코커스 페칼리스 (Enterococcus faecalis)로부터 나온 상부 경로는 aprE 프로모터의 조절 하에 B. 바실러스 내로 통합되었다. 상부 경로는 두 개의 유전자로 구성된다; AACT 및 HMGR를 인코딩하는 mvaE, 또한 HMGS를 인코딩하는 mvaS. 두 개 유전자는 둘 사이에 종결 코돈, mvaS 앞에 RBS 부위를 두고 함께 융합되고 aprE 프로모터의 조절 하에 놓인다. 종결인자는 mvaE 유전자 뒤에 위치한다. 클로로암페니콜 저항성 마커는 mvaE 유전자 뒤에 클론되고 제작물은 aprE 좌위에 사이에 낀 상동성 부위를 사용하여 이중 교차 (double cross over)에 의해 도입된다.

네 개의 DNA 단편이 PCR 반응에 의해 다같이 융합되도록 하는 돌출부 (overhangs)를 포함하도록 PCR에 의해 증폭된다. PCR 증폭은 제조사의 지침에 따라 허큘라제 중합효소를 사용하여 수행된다.

1. PaprE

CF 07-134 (+) aprE 프로모터의 시작 PstI

5'-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (서열번호 115)

CF 07-94 (-) PaprE 와 mvaE 융합

5'- CAATAATAACTACTGTTTTCACTCTTTACCCTCTCCTTTTAA (서열번호 116)

주형: Bacillus subtilis 염색체DNA

2. mvaE

CF 07-93 (+) aprE 프로모터에 mvaE 융합 (GTG 시작 코돈)

5'- TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG (서열번호 117)

CF 07-62 (-) 둘 사이 RBS로 mvaE 와 mvaS 융합

5'- TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATTGTTTTCTTAAATC (서열번호 94)

주형: Enterococcus faecalis 염색에 DNA (ATCC로부터 입수)

3. mvaS

CF 07-61 (+) 둘 사이 RBS로 mvaE 와 mvaS 융합

5'- GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAA (서열번호 95)

CF 07-124 (-) 종결인자에 mvaS 말단 융합

5'- CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (서열번호 118)

주형: Enterococcus faecalis 염색체DNA

4. B. amyliquefaciens 알칼라인 세린 프로테아제 종결인자

CF 07-123 (+) 종결인자에 mvaS 말단 융합

5'- ACCGTTCGTTCTTATCGAAACTAAAAAAAACCGGCCTTGGCCCCG (서열번호 119)

CF 07-46 (-) B. amyliquefaciens 종결인자의 말단BamHI

5'- GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (서열번호 58)

주형: Bacillus amyliquefaciens 염색체 DNA

PCR 융합 반응

5. mvaE 와 mvaS 융합

CF 07-93 (+) aprE 프로모터에 mvaE 융합 (GTG 시작 코돈)

5'- TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG (서열번호 117)

CF 07-124 (-) 종결인자에 mvaS 말단 융합

5'- CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (서열번호 118)

주형: 상기로부터 #2 및 #3

6. aprE 프로모터에 mvaE-mvaS 융합

CF 07-134 (+) aprE 프로모터의 시작 PstI

5'- GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (서열번호 115)

CF 07-124 (-) 종결인자에 mvaS 말단 융합

5'- CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (서열번호 118)

주형: 상기로부터 #1 및 #4

7. 종결인자에 PaprE-mvaE-mvaS 융합

CF 07-134 (+) aprE 프로모터 시작 PstI

5'- GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (서열번호 115)

CF 07-46 (-) B. amyliquefaciens 종결인자 말단 BamHI

5'- GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (서열번호 58)

주형: #4 및 #6

산물은 제한효소 PstI/BamHI로 소화되고 PstI/BamHI로 소화된 pJM102 (Perego, M. 1993. Integrational vectors for genetic manipulation in Bacillus subtilis, p. 615-624. In A. L. Sonenshein, J. A. Hoch, and R. Losick (ed.), Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria: biochemistry, physiology, and molecular genetics. 미국 미생물학회, 워싱턴 DC)와 결찰된다. 라이게이션은 화학적으로 능력있는 E.coli TOP 10 세포에 형질전환되고 형질전환체는 카베니실린 (50 μg/ml)을 포함하는 LA 상에서 선별된다. 정확한 플라스미드는 서열결정에 의해 확인되고 pJMUpperpathway2라고 명명된다 (도 50 및 도 51). 정제된 플라스미드 DNA는 Bacillus subtilis aprEnprE Pxyl-comK 내에 형질전환되고 클로로암페니콜 (5 μg/ml)을 포함하는 L 아가 상에서 선별된다. 정확한 콜로니가 선별되고 상부 경로를 포함하는 카세트의 복제 수를 증폭시키도록 클로로암페니콜 10, 15 및 25 μg/ml을 포함하는 L 아가 상에서 차례대로 도말된다.

그 결과 나온 균주는 1% 포도당을 포함하는 LB에서 성장시켜서 메발론산 생산에 대해 테스트된다. 배양액은 메발론산의 생산에 대해 GC에 의해 분석된다.

본 균주는 하부 메발론산 경로의 통합을 위한 숙주로서 계속 사용된다.

하기 프라이머는 하기 다양한 제작물을 서열결정하는 데 사용된다. 서열결정 프라이머:

CF 07-134 (+) aprE 프로모터 시작 PstI

5'- GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (서열번호 115)

CF 07-58 (+) mvaE 유전자의 시작

5'- ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC (서열번호 97)

CF 07-59 (-) mvaE 유전자의 말단

5'- ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC (서열번호 98)

CF 07-82 (+) mvaS 유전자의 시작

5'- ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG (서열번호 99)

CF 07-83 (-) mvaS 유전자의 말단

5'- TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (서열번호 100)

CF 07-86 (+) mvaE 서열

5'- GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC (서열번호 101)

CF 07-87 (+) mvaE 서열

5'- TTGCCAATCATATGATTGAAAATC (서열번호 102)

CF 07-88 (+) mvaE 서열

5'- GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG (서열번호 103)

CF 07-89 (+) mvaS 서열

5'- GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC (서열번호 104)

형질전환체는 클로로암페니콜을 5 μg/ml의 농도로 포함하는 LA 상에서 선별된다. 한 개 콜로니가 서열결정에 의해 정확한 도입을 가진 것으로 검증되고 수일 동안 25 μg/ml 의 최종 수준까지 증가하는 클로로암페니콜 농도를 가진 LA 상에서 도말된다. 이것은 관심있는 유전자를 포함하는 카세트의 증폭을 유발한다. 그 결과 나온 균주는 CF 455: pJMupperpathway#1 X Bacillus subtilis aprEnprE Pxyl comK (클로로암페니콜 25 μg/ml을 포함하는 LA 상에서 성장하도록 증폭됨)라고 명명된다.

II. 바실러스 섭틸리스에서 하부 MVA 경로의 제작

유전자 mvk1, pmk, mpd 및 idi로 구성되는 하부 MVA 경로는 B. subtilis 염색체의 nprE 부위로부터 나온 사이에 낀 DNA 부위 (통합 부위), aprE 프로모터, 및 스펙티노마이신 저항성 마커로 구성되는 카세트에 조합된다 (도 28 및 도29를 참조하라; 서열번호13). 본 카세트는 DNA2.0에 의해 합성되고 aprE 좌위에 도입되는 상부 MVA 경로를 포함하는 B. subtilis 염색체 내로 도입된다. 쿠쥬 이소프렌 합성효소 유전자는 실시예 14에 기술된 복제 플라스미드로부터 발현되고 통합된 상부 및 하부 경로 둘 다를 가진 균주 내에 형질전환된다.

실시예 10: 대표적인 이소프렌 조성물 및 이를 제조하는 방법

I. 이소프렌을 포함하는 발효 배출기체의 조성 분석.

14 L 규모의 발효가 이소프레노이드 전구체 생합성에 대한 전체 메발로네이드 경로, 효모로부터 나온 이소프레닐 피로포스페이트 이소머라제, 및 쿠쥬로부터 나온 이소프렌 합성효소를 인코딩하는 두 가지 플라스미드 pCL upperMev; pTrcKKDyIkIS를 포함하는 재조합 E. coli BL21 (DE3) 균주를 사용하여 수행되었다. 14 L 탱크로부터 나온 발효 배출기체는 피크 이소프렌 생산도 주변의 시점 (27.9 시간 경과된 발효시간, "EFT")에 20 mL 상부공간 바이알 내로 수집되었고 휘발성 성분에 대해 상부공간 GC/MS에 의해 분석되었다.

상부공간 분석이 애질런트 HP-5MS GC/MS 컬럼 (30 m x 250 mm; 0.25 mm 필름 두께)에 맞춘 애질런트6890 GC/MS 시스템으로 수행되었다. combiPAL 자동 주입기가 20 mL 상부공간 바이알로부터 500 μL 분량을 수집하는데 사용되었다. GC/MS 방법은 헬륨을 운반기체로서 1 mL/분의 유속에서 사용하였다. 주입기 포트는 250℃에서 50 : 1의 분리비율로 유지되었다. 오븐 온도는 37℃ 에서 초기 2분의 기간 동안 유지되었고 이어서 전체 방법 시간 10분 동안 25℃/분의 속도에서 237℃로 증가되었다. 애질런트 5793N 질량 선별 검출기는 m/z 29로부터m/z 300까지 스캔하였다. 본 시스템의 검출 한계는 대략 0.1 μg/L_gas 또는 대략 0.1 ppm이다. 원하는 경우, 더 낮은 검출 한계를 가진 더 민감한 기기가 사용될 수 있다.

배출기체는 99.925 % (v/v)의 영속적 기체 (N₂, CO₂ and O₂), 대략 0.075%의 이소프렌 (2-메틸-1,3-부타디엔) (~750 ppmv, 2100 mg/L) 및 소량의 에탄올 (< 50 ppmv), 아세톤, 및 두 개 C5 프레닐 알코올로 구성되었다. 물 증기의 양은 결정되지 않았지만, 0℃에서 평형 증기압과 동등한 것으로 평가되었다. 휘발성 유기 분획의 조성은 GC/MS 크로마토그램 (도 86A 및 86B)에서 피크 면적을 통합하여 결정되었고 표 6에 나열되어 있다. 표준 에탄올과 아세톤에 대한 측정 곡선이 표준방법을 사용하여 GC면적이 μg/L 단위의 기체 상 농도로 전환을 가능하게 하였다.

표 6은 발효 배출기체에서 휘발성 유기 성분의 조성을 나타낸다. 발효-기체가 발효 27.9 시간 시점에 이종유래 메발로네이트 경로, 효모로부터 나온 이소프레닌 피로포스페이트 이소머라제, 및 쿠쥬로부터 나온 이소프렌 합성효소를 발현하는 E. coli BL21 (DE3) 균주를 사용하여 분석되었다.

화합물	RT (분)	GC 면적	면적 %	농도 (ug/L)
에탄올	1.669	239005	0.84	62 +/- 6
아세톤	1.703	288352	1.02	42 +/- 4
이소프렌 (2-메틸-1,3-부타디엔)	1.829	27764544	97.81	2000 +/- 200
3-메틸-3-부텐-1-올	3.493	35060	0.12	<10
3-메틸-2-부텐-1-올	4.116	58153	0.20	<10

II. 재조합 대장군 균주의 발효 동안 공동-생산되는 미량 휘발성 유기화합물 (VOCs)의 측정.

14 L 규모의 발효가 이소프레노이드 전구체 생합성에 대한 전체 메발로네이드 경로, 효모로부터 나온 이소프레닐 피로포스페이트 이소머라제, 및 쿠쥬로부터 나온 이소프렌 합성효소를 인코딩하는 두 가지 플라스미드 (pCL upperMev; pTrcKKDyIkIS)를 포함하는 재조합 E. coli BL21 (DE3) 균주를 사용하여 수행되었다.

발효 배출-기체는 미량 휘발성 유기성분을 농축하여 확인하도록 식힌 상부공간 바이알을 통과시켰다. 본 발효로부터 나온 배출-기체는 수정 모직 (quartz wool, 2g)로 포장된 20 mL 상부공간 바이알을 통하여 1 L/분의 속도로 10분 동안 수집되었고 드라이아이스로 -78℃까지 식혔다. 바이알은 새로운 바이알 뚜껑으로 다시 덮고 실시예 10, 제 I부에 기술된 조건을 사용하여 포집된 VOCs에 대하 상부공간 GC/MS에 의해 분석되었다. 도 87A 내지 87D에서 관찰된 화합물의 비율은 발효 배출-기체의 전체 수준, -78℃에서 상대적 증기압, 및 질량분광기의 검출기 반응의 조합이다. 예를 들어, 산화된 휘발물질 (예로, 아세톤과 에탄올)에 대비한 이소프렌의 낮은 수준은 본 물질의 높은 휘발도의 함수이어서, 이것은 -78℃에서 상부공간 바이알에 축적되지 않는다.

많은 이들 화합물의 존재는 생물학적 출처로부터 유래한 이소프렌 조성물에 독특한 것이다. 결과는 도 87A 내지 87D에 나타나있고 표 7A 및 표 7B에 요약되어 있다.

표 7A는 E. coli BL21 (DE3) (pCL upperMev; pTrcKKDyIkIS)에 의해 생산되고 이어서 -78℃에서 냉동-포집된 배출-기체에 존재하는 미량 휘발물질을 나타내고, 여기에서 1은 GC 면적은 나열된 화합물에 해당하는 피크 아래의 미교정된 면적이고, 2 는 면적 % 는 모든 화합물의 전체 피크 면적에 대비한 %로서 표현되는 피크 면적이고, 3은 비율 %는 2-메틸-1,3-부타디엔의 피크 면적에 대비한 %로서 표현되는 피크 면적이다.

표 7B는 E. coli BL21 (DE3) (pCL upperMev; pTrcKKDyIkIS)에 의해 생산되고 이어서 -196℃에서 냉동-포집된 배출-기체에 존재하는 미량 휘발물질을 나타내고, 1은 GC 면적은 나열된 화합물에 해당하는 피크 아래의 미교정된 면적이고, 2은 면적 % 는 모든 화합물의 전체 피크 면적에 대비한 %로서 표현되는 피크 면적이고, 3은 비율 %는 2-메틸-1,3-부타디엔의 피크 면적에 대비한 %로서 표현되는 피크 면적이다.

표 7A: E. coli BL21 (DE3) (pCL upperMev; pTrcKKDyIkIS)에 의해 생산되고 이어서 -78℃에서 냉동-포집된 배출-기체에 존재하는 미량 휘발물질
화합물	RT (분	GC 면적1	면적 %2	비율%3
아세트알데하이드	1.542	4019861	4.841	40.14
에탄올	1.634	10553620	12.708	105.39
아세톤	1.727	7236323	8.714	72.26
2-메틸-1,3-부타디엔	1.777	10013714	12.058	100.00
1-프로판올	1.987	163574	0.197	1.63
디아세틸	2.156	221078	0.266	2.21
2-메틸-3부텐-2-올	2.316	902735	1.087	9.01
2-메틸-1-프로판올	2.451	446387	0.538	4.46
3-메틸-1-부탄알	2.7	165162	0.199	1.65
1-부탄올	2.791	231738	0.279	2.31
3-메틸-3-부텐-1-올	3.514	14851860	17.884	148.32
3-메틸-1-부탄올	3.557	8458483	10.185	84.47
3-메틸-2-부텐-1-올	4.042	18201341	21.917	181.76
3-메틸-2-부탄알	4.153	1837273	2.212	18.35
3-메틸부틸 아세테이트	5.197	196136	0.236	1.96
3-메틸-3-부텐-1-일 아세테이트	5.284	652132	0.785	6.51
2-헵탄온	5.348	67224	0.081	0.67
2,5-디메틸피라진	5.591	58029	0.070	0.58
3-메틸-2-부텐-1-일 아세테이트	5.676	1686507	2.031	16.84
6-메틸-5-헵텐-2-온	6.307	101797	0.123	1.02
2,4,5-트리메틸피리딘	6.39	68477	0.082	0.68
2,3,5-트리메틸피라진	6.485	30420	0.037	0.30
(E)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔	6.766	848928	1.022	8.48
(Z)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔	6.864	448810	0.540	4.48
3-메틸-2-부텐-1-일 부틸레이트	7.294	105356	0.127	1.05
시트로넬랄	7.756	208092	0.251	2.08
2,3-사이클로헵텐올피리딘	8.98	1119947	1.349	11.18
표 7B: E. coli BL21 (DE3) (pCL upperMev; pTrcKKDyIkIS)에 의해 생산되고 이어서 -196℃에서 냉동-포집된 배출-기체에 존재하는 미량 휘발물질
화합물	RT(분)	GC 면적1	면적%2	비율%3
아세트알데하이드	1.54	1655710	0.276	0.33
메탄티올	1.584	173620	0.029	0.03
에탄올	1.631	10259680	1.707	2.03
아세톤	1.722	73089100	12.164	14.43
2-메틸-1,3-부타디엔	1.771	506349429	84.269	100.00
메틸 아세테이트	1.852	320112	0.053	0.06
1-프로판올	1.983	156752	0.026	0.03
디아세틸	2.148	67635	0.011	0.01
2-메틸-3-부텐-2-올	2.216	254364	0.042	0.05
에틸 아세테이트	2.312	684708	0.114	0.14
2-메틸-1-프로판올	2.345	2226391	0.371	0.44
3-메틸-1-부탄알	2.451	187719	0.031	0.04
3-메틸-2-부탄온	2.696	115723	0.019	0.02
1-부탄올	2.792	54555	0.009	0.01
2-펜탄온	3.034	66520	0.011	0.01
3-메틸-3-부텐-1-올	3.516	1123520	0.187	0.22
3-메틸-1-부탄올	3.561	572836	0.095	0.11
에틸 이소부틸레이트	3.861	142056	0.024	0.03
3-메틸-2-부텐-1-올	4.048	302558	0.050	0.06
3-메틸-2-부텐알	4.152	585690	0.097	0.12
부틸 아세테이트	4.502	29665	0.005	0.01
3-메틸부틸 아세테이트	5.194	271797	0.045	0.05
3-메틸-3-부텐-1-일 아세테이트	5.281	705366	0.117	0.14
3-메틸-2-부텐-1-일 아세테이트	5.675	815186	0.136	0.16
(E)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔	6.766	207061	0.034	0.04
(Z)-3,7-디메틸-1,3,6-옥타트리엔	6.863	94294	0.016	0.02
2,3-사이클로헵텐올피리딘	8.983	135104	0.022	0.03

III. 발효로부터 유래한 이소프렌에서 C5 탄화수소 이성질체의 부재.

발효 배출-기체에 존재하는 이소프렌의 냉동-포집은 액체 질소에서 식힌 2 mL 상부공간 바이알을 사용하여 수행된다. 배출-기체 (1 L/분)은 먼저 소듐 하이드록사이드 펠렛을 포함하는 20 mL 바이알을 통과시켜서 2 mL 바이알 (-196℃)에서 얼음 및 고형 CO₂의 축적을 최소화하였다. 대략 10L의 배출-기체가 바이알을 통과하였고, 이후에 이는 환기시키면서 -78℃로 데워졌으며, 이어서 새로운 바이알 뚜껑으로 재밀봉하고 GC/MS에 의해 분석되었다.

GC/MS 상부공간 분석은 상부공간 방식에 100 μL 기체를 채운 주사기를 사용하여 애질런트 6890 GC/MS 시스템으로 수행되었다. 제브론 (Zebron) ZB-624 GC/MS 컬럼 (30 m x 250 mm; 1.40 mm 필름 두께)이 분석물의 분리를 위해 사용되었다. GC 자동주입기가 기체-채운 100 uL 주사기에 맞추어졌고, 바늘 높이가 2 mL GC 바이알로부터 50 uL 상부공간 시료의 주입을 허용하도록 조정되었다. GC/MS 방법은 운반 기체로서 헬륨을 1 mL/분의 유속에서 사용하였다. 주입 포트는 200℃에서 20 : 1의 분리율로 유지되었다. 오븐 온도는 37℃에서 분석의 5분 지속기간 동안 유지되었다. 애질런트 5793N 질량 선택 검출기는 단일 이온 감시 (SIM) 방식으로 m/z 55, 66, 67및 70 상에서 작동되었다. 이들 조건 하에서, 이소프렌은 2.966분에서 용출되는 것이 관찰되었다 (도 88B). 석유 유래 이소프렌의 표준 (시그마-알드리치사)도 역시 본 방법을 사용하여 분석되었고 추가적인 C5 탄화수소 이성질체를 포함하는 것이 확인되었으며, 이는 주요 피크 직전 또는 직후에 용출되고 교정된 GC 면적에 근거하여 정량되었다 (도 88A). 표 8A는 석유-유래 이소프렌의 GC/MS 분석표를 나타내고, 표 8B는 발효-유래 이소프렌의 GC/MS 분석 (전체 C5 탄화수소의 면적%)을 나타낸다.

표 8A: 석유-유래 이소프렌의 GC/MS 분석
화합물	RT (분)	GC 면적	전체 C5 탄화수소의 면적%
2-메틸-1-부텐	2.689	18.2 x 103	0.017%
(Z)-2-펜텐	2.835	10.6 x 104	0.101%
이소프렌	2.966	10.4 x 107	99.869%
1,3-사이클로펜타디엔(CPD)	3.297	12.8 x 103	0.012%
표 8B: 발효-유래 이소프렌의 GC/MS 분석 (전체 C5 탄화수소의 면적%)
화합물	RT (분)	교정된 GC 면적	전체 C5 탄화수소의 %
이소프렌	966	1 x 107	0%

개별적 실험에서, C5 탄화수소의 표준 혼합물은 검출기 반응이 각 화합물에 대해 동일한지 여부를 결정하도록 분석되었다. 화합물은 2-메틸-1-부텐, 2-메틸-1,3-부타디엔, (E)-2-펜텐, (Z)-2-펜텐 및 (E)-1,3-펜타디엔이었다. 본 경우에서, 분석은 50℃에서 유지된 애질런트DB-Petro 컬럼 (100 m x 0.25 mm, 0.50 μm 필름 두께) 상에서 15분 동안 수행되었다. GC/MS 방법은 운반 기체로서 헬륨을 1 mL/분의 유속에서 사용하였다. 주입 포트는 200℃에서 50 : 1의 분리율로 유지되었다. 애질런트 5793N 질량 선택 검출기는 완전 스캔 방식으로 m/z 19로부터 진행되었다. 이들 조건 하에서, 100 μg/L 농도의 각 표준은 실험적 오차 범위 내에서 동일한 검출기 반응을 생성하였다.

IV. 고체 상에 흡착된 이소프렌을 포함하는 조성물

생물학적으로-생산된 이소프렌이 활성화된 탄소에 흡착되어 50 내지 99.9% 탄소, 0.1% 내지 50% 이소프렌, 0.01% 내지 5% 물, 및 소량 (< 0.1%)의 기타 휘발성 유기성분을 포함하는 고체 상이 되었다.

발효 배출-기체는 0℃에 유지된 구리 농축 코일을 통과하였고, 물 증기를 제거하도록 입자화된 실리카 건조제 여과가 이어졌다. 그 다음 습기가 제거된 배출-기체는 사용된 필터에서 이소프렌의 통과가 GC/MS에 의해 검출되었던 시점에 필터를 포함한 탄소 (Koby Jr, Koby Filters, MA)를 통과시켰다. 카트리지에 흡착된 이소프렌량은 배출-기체에서 농도, 전체 유속 및 수집 기간에 따른 통과 퍼센트를 계산하여 간접적으로 결정될 수 있다. 대안으로, 흡착된 이소프렌은 열, 진공, 또는 용매-매개성 탈착에 의해 필터로부터 회수될 수 있다.

V. 농축된 이소프렌의 수집 및 분석

발효 배출-기체는 습기가 제거되었고, CO₂ 가 적합한 흡착제 (예로, 아스카리트 (ascarite))를 통한 여과에 의해 제거되었다. 그 결과 얻은 배출-기체 유량은 다시 유량으로부터 VOCs를 농축하도록 액체 질소로 식힌 농축기를 통과시켰다. 수집 용기는 그 결과 나온 이소프렌 농축물을 억제하도록 t-부틸 카테콜을 포함하였다. 농축물은 본 명세서에서 기술된 방법과 같은 표준 방법을 사용하여 정제도를 결정하도록 GC/MS 및 NMR에 의해 분석되었다.

VI. 발효에 의한 프레닐 알코올의 생산

쿠쥬 이소프렌 합성효소를 발현하는E. coli BL21 (DE3) 균주로부터 나온 배출-기체의 분석은 이소프렌과 3-메틸-3-부텐-1-올 (이소프레놀) 둘 다의 존재를 보여주었다. 발효 기간 동안 발효 배출-기체에서 두 가지 화합물의 수준은 상부공간 GC/MS에 의해 결정된 바와 같이 도 89에 나타나 있다. 수집된 이소프레놀의 수준 (3-메틸-3-부텐-1-올, 3-MBA)은 본 실험에서 거의 10 μg/L_offgas 가 되었다. 추가적인 실험은 발효 배출-기체에서 대략 20 μg/L_offgas의 수준을 생성하였다.

실시예 11: 메발론산 경로로부터 나온 유전자를 발현하고 사료첨가- 회분식 배양으로 발효되는 대장균에서 성장 및 이소프렌 생산의 분리

실시예 11은 메발론산으로부터 세포 성장 및 이소프렌 생산의 분리를 설명하고 있다.

I. 발효 조건

배지 레시피 (발효 배지 리터 당):

배지는 발효 배지 리터 당 하기 성분을 사용하여 생성되었다: K₂HPO₄ 7.5 g, MgSO₄ * 7H₂O 2 g, 시트르산 모노하이드레이트 2 g, 철 암모늄 시트르산 0.3 g, 효모추출물 0.5 g, 1000X 변형된 미량 금속 용액 1 ml. 모든 성분은 다같이 첨가되었고 di H₂O에 녹였다. 본 용액은 고압 멸균되었다. pH는 7.0으로 암모늄 하이드록사이드 (30%)를 사용하여 조정되었고 부피는 q.s. 맞추었다. 포도당 10 g, 티아민 * HCl 0.1 g, 및 항생제가 멸균 및 pH 조정 이후에 첨가되었다.

1000X 변형된 미량 금속 용액:

1000X 변형된 미량 금속 용액은 하기 성분을 사용하여 생성되었다: 시트르산 * H₂O 40 g, MnSO₄ * H₂O 30 g, NaCl 10 g, FeSO₄ * 7H₂O 1 g, CoCl₂ * 6H₂O 1 g, ZnSO * 7H₂O 1 g, CuSO₄ * 5H₂O 100 mg, H₃BO₃ 100 mg, NaMoO₄ * 2H₂O 100 mg. 각 성분은 한 번에 하나씩 di H₂O에 녹이고, pH는 3.0으로 HCl/NaOH를 사용하여 조정한 다음 부피를 q.s. 맞추고 0.22 마이크론 필터로 여과 살균되었다.

발효는 pTrcHis2AUpperPathway (또한 pTrcUpperMVA라고도 명명됨, 도 91 및 도 92A 내지 92C; 서열번호 23) (50 mg/ml 카베니실린) 또는pCL PtrcUpperMVA (또한 pCL PtrcUpperPathway라고도 명명됨, (도 26)) (50 mg/ml 스펙티노마이신) 플라스미드를 포함하는 대장균 세포를 사용하여 수행되었다. 이소프렌을 생산하는 실험을 위해 대장균은 pTrc KKDyIkIS (50 mg/ml 카나마이신)도 역시 포함하였다. 본 실험은 원하는 발효 pH 7.0 및 온도 30℃에서 포도당으로부터 메발론산 또는 이소프렌 형성을 감시하도록 수행되었다. 냉동 바이알로부터 가져온 대장균 균주의 접종액은 LB 액체배지 아가 플레이트 (항생제 첨가) 상에 뿌려졌고 37℃에서 배양되었다. 단일 콜로니가 트립톤-효모추출물 배지 내에 접종되었다. 접종액이 550 nm에서 측정되어 OD 1.0까지 된 이후에, 생물반응기를 접종하는 데 사용되었다.

포도당은 세포가 안정상에 도달할 때까지 지수적 속도로 첨가되었다. 이 시점 이후 포도당 첨가는 대사적 요구를 만족시키기 위해 감소되었다. 유도는 IPTG를 첨가하여 달성되었다. 발효 액체배지에서 메발론산 농도는 과염산 (Sigma-Aldrich # 244252) 처리된 시료 (0.3 M, 4℃에서 5분 동안 배양됨)을 HPLC 컬럼 (BioRad # 125-0140)에 적용하여 결정되었다. 농도는 액체배지 메발론산 피크 크기를 D,L-메발로네이트를 형성하도록 과염산으로 처리된 메발론올아세톤 (mevalonolacetone, Sigma-Aldrich # M4667)으로부터 생성된 측정 곡선과 비교하여 결정되었다. 생물반응기로부터 나온 배출기체에서 이소프렌의 수준은 본 명세서에서 기술된 바와 같이 결정되었다. 이소프렌 역가는 발효액체 배지 리터당 생산되는 이소프렌량으로서 정의된다.

II . pTrcUpperMVA 플라스미드를 발현하는 E. coli BL21 ( DE3 ) 세포로부터 150-L 규모로 메발론산 생산

상기 실시예 11에서 설명된 바와 같이 플레이트 상에서 자란 대장균 BL21 (DE3) 세포는 45 mL의 트립톤-효모추출물 배지를 포함하는 플라스크 내에 접종되었고 30℃에서 170 rpm으로 진탕하면서 5분 동안 배양되었다. 본 용액은 트립톤-효모추출물 배지의 5-L 생물반응기로 전달되었고, 세포를 배양액의 OD₅₅₀ 1.0이 될 때까지 30℃에서 27.5 rpm으로 진탕하면서 성장시켰다. 5 L의 접종액은 45-kg의 배지를 포함하는150-L 생물반응기 내로 접종되었다. IPTG 농도는 OD₅₅₀가 수치 10에 도달할 때 1.1 mM이 되었다. 시간 경과에 따른 생물반응기 내의 OD₅₅₀ 프로파일은 도 60A에 나타나있다. 메발론산 역가는 발효 과정을 통해 61.3 g/L의 최종 값까지 증가되었다 (도 60B). 발효 과정을 통한 특이 생산도 프로파일은 도 60C에 나타나있고 도 60A와의 대비는 성장과 메발론산 생산의 분리를 설명하고 있다. 52.5 시간의 발효 동안 생산된 메발론산의 전체량은 사용된 포도당 14.1 kg으로부터 4.0 kg이었다. 발효과정 동안 메발론산을 생산하는 데 들어갔던 사용된 탄소의 몰라 수율은 34.2% 이었다.

III. pTrcUpperMVA 플라스미드를 발현하는 E. coli BL21 (DE3) 세포로부터 15-L 규모로 메발론산 생산

상기 실시예 11에서 설명된 바와 같이 플레이트 상에서 자란 대장균 BL21 (DE3) 세포는 500 mL의 트립톤-효모추출물 배지를 포함하는 플라스크 내에 접종되었고 30℃에서 160 rpm으로 진탕하면서 OD₅₅₀ 1.0까지 성장시켰다. 본 물질은 4.5-kg의 배지를 포함하는 15-L 생물반응기 내로 접종되었다. IPTG 농도는 OD₅₅₀가 10값에 도달할 때 1.0 mM이 되었다. 시간 경과에 따른 생물반응기 내의 OD₅₅₀ 프로파일은 도 61A에 나타나있다. 메발론산 역가는 발효 과정을 통해 53.9 g/L의 최종 값까지 증가되었다 (도 61B). 발효 과정을 통한 특이 생산도 프로파일은 도 61C에 나타나 있고 도 61A와의 대비는 성장과 메발론산 생산의 분리를 설명하고 있다. 46.6 시간의 발효 동안 생산되는 메발론산의 전체량은 사용된 포도당 2.1 kg으로부터 491 g이었다. 발효과정 동안 메발론산을 생산하는 데 들어갔던 사용된 탄소의 몰라 수율은 28.8% 이었다.

IV. pTrcUpperMVA 플라스미드를 발현하는 E. coli FM5 세포로부터 15-L 규모로 메발론산 생산

상기 실시예 11, 제 I부에서 설명된 바와 같이 플레이트 상에서 자란 대장균 FM5 세포는 500 mL의 트립톤-효모추출물 배지를 포함하는 플라스크 내에 접종되었고 30℃에서 160 rpm으로 진탕하면서 OD₅₅₀ 1.0까지 배양되었다. 본 물질은 4.5-kg의 배지를 포함하는15-L 생물반응기 내로 접종되었다. IPTG 농도는 OD₅₅₀가 수치 10에 도달할 때 1.0 mM이 되었다. 시간 경과에 따른 생물반응기 내의 OD₅₅₀ 프로파일은 도 62A에 나타나있다. 메발론산 역가는 발효 과정을 통해 23.7 g/L의 최종 값까지 증가되었다 (도 62B). 발효 과정을 통한 특이 생산도 프로파일은 도 62C에 나타나있고 또한 도 62A와의 대비는 성장과 메발론산 생산의 분리를 설명하고 있다. 51.2 시간의 발효 동안 생산된 메발론산의 전체량은 사용된 포도당 1.1 kg으로부터 140 g이었다. 발효과정 동안 메발론산을 생산하는 데 들어갔던 사용된 탄소의 몰라 수율은 15.2% 이었다.

V. pCL PtrcUpperMVA 및 pTrc KKDyIkIS 플라스미드를 발현하는 E. coli BL21(DE3) 세포로부터 15-L 규모로 이소프렌 생산

상기 실시예 11, 제 I부에서 설명된 바와 같이 플레이트 상에서 자란 pCL PtrcUpperMVA 및 pTrc KKDyIkIS 플라스미드를 발현하는 대장균 BL21(DE3) 세포는 500 mL의 트립톤-효모추출물 배지를 포함하는 플라스크 내에 접종되었고 30℃에서 160 rpm으로 진탕하면서 OD₅₅₀ 1.0까지 배양되었다. 본 물질은 4.5-kg의 배지를 포함하는 15-L 생물반응기 내로 접종되었다. IPTG 농도는 OD₅₅₀ 가 10값에 도달할 때 25 μM이 되었다. IPTG 농도는 OD₅₅₀ 가 190에 도달할 때 50 μM로 올라갔다. IPTG 농도는 발효 38시간 시점에 100 μM로 올라갔다. 시간 경과에 따른 생물반응기 내의 OD₅₅₀ 프로파일은 도 63A에 나타나있다. 이소프렌 역가는 발효 과정을 통해 2.2 g/L의 최종 값까지 증가되었다 (도 63B). 발효 과정을 통한 특이 생산도 프로파일은 도 63C에 나타나있고 또한 도 63A와의 대비는 성장과 이소프렌 생산의 분리를 설명하고 있다. 54.4 시간의 발효 동안 생산된 이소프렌의 전체량은 사용된 포도당 2.3 kg으로부터 15.9 g이었다. 발효과정 동안 이소프렌을 생산하는 데 들어갔던 사용된 탄소의 몰라 수율은 1.53% 이었다.

VI. pCL PtrcUpperMVA 및 pTrc KKDyIkIS 플라스미드를 발현하는 E. coli BL21(DE3) 튜너 세포로부터 15-L 규모로 이소프렌 생산

상기 실시예 11, 제 I부에서 설명된 바와 같이 플레이트 상에서 자란 pCL PtrcUpperMVA 및 pTrc KKDyIkIS 플라스미드를 발현하는 대장균 BL21(DE3) 세포는 500 mL의 트립톤-효모추출물 배지를 포함하는 플라스크 내에 접종되었고 30℃에서 160 rpm으로 진탕하면서 OD₅₅₀ 1.0까지 배양되었다. 본 물질은 4.5-kg의 배지를 포함하는15-L 생물반응기 내로 접종되었다. IPTG 농도는 OD₅₅₀ 가 10값에 도달할 때 26 μM이 되었다. IPTG 농도는 OD₅₅₀ 가 175에 도달할 때 50 μM로 올라갔다. 시간 경과에 따른 생물반응기 내의 OD₅₅₀ 프로파일은 도 64A에 나타나있다. 이소프렌 역가는 발효 과정을 통해 1.3 g/L의 최종 값까지 증가되었다 (도 64B). 발효 과정을 통한 특이 생산도 프로파일은 도 64C에 나타나있고 또한 도 64A와의 대비는 성장과 이소프렌 생산의 분리를 설명하고 있다. 48.6 시간의 발효 동안 생산된 이소프렌의 전체량은 사용된 포도당 1.6 kg으로부터 9.9 g이었다. 발효과정 동안 이소프렌을 생산하는 데 들어갔던 사용된 탄소의 몰라 수율은 1.34% 이었다.

VII. pCL PtrcUpperMVA 및 pTrc KKDyIkIS 플라스미드를 발현하는 E. coli MG1655 세포로부터 15-L 규모로 이소프렌 생산

상기 실시예 11, 제 I부에서 설명된 바와 같이 플레이트 상에서 자란 pCL PtrcUpperMVA 및 pTrc KKDyIkIS 플라스미드를 발현하는 대장균 MG1655 세포는 500 mL의 트립톤-효모추출물 배지를 포함하는 플라스크 내에 접종되었고 30℃에서 160 rpm으로 진탕하면서 OD₅₅₀ 1.0까지 배양되었다. 본 물질은 4.5-kg의 배지를 포함하는15-L 생물반응기 내로 접종되었다. IPTG 농도는 OD₅₅₀가 수치 45에 도달할 때 24 μM이 되었다. 시간 경과에 따른 생물반응기 내의 OD₅₅₀ 프로파일은 도 65A에 나타나있다. 이소프렌 역가는 발효 과정을 통해 393 mg/L의 최종 값까지 증가되었다 (도 65B). 발효 과정을 통한 특이 생산도 프로파일은 도 65C에 나타나있고 또한 도 65A와의 대비는 성장과 이소프렌 생산의 분리를 설명하고 있다. 67.4 시간의 발효 동안 생산된 이소프렌의 전체량은 사용된 포도당 520 g으로부터 2.2 g이었다. 발효과정 동안 이소프렌을 생산하는 데 들어갔던 사용된 탄소의 몰라 수율은 0.92% 이었다.

VIII. pCL PtrcUpperMVA 및 pTrc KKDyIkIS 플라스미드를 발현하는 E. coli MG1655ack-pta 세포로부터 15-L 규모로 이소프렌 생산

상기 실시예 11, 제 I부에서 설명된 바와 같이 플레이트 상에서 자란 pCL PtrcUpperMVA 및 pTrc KKDyIkIS 플라스미드를 발현하는 대장균 MG1655ack-pta 세포는 500 mL의 트립톤-효모추출물 배지를 포함하는 플라스크 내에 접종되었고 30℃에서 160 rpm으로 진탕하면서 OD₅₅₀ 1.0까지 배양되었다. 본 물질은 4.5-kg의 배지를 포함하는15-L 생물반응기 내로 접종되었다. IPTG 농도는 OD₅₅₀ 가 10값에 도달할 때 30 μM이 되었다. 시간 경과에 따른 생물반응기 내의 OD₅₅₀ 프로파일은 도 66A에 나타나있다. 이소프렌 역가는 발효 과정을 통해 368 mg/L의 최종 값까지 증가되었다 (도 66B). 발효 과정을 통한 특이 생산도 프로파일은 도 66C에 나타나있고 또한 도 66A와의 대비는 성장과 이소프렌 생산의 분리를 설명하고 있다. 56.7 시간의 발효 동안 생산된 이소프렌의 전체량은 사용된 포도당 531 g으로부터 1.8 g이었다. 발효과정 동안 이소프렌을 생산하는 데 들어갔던 사용된 탄소의 몰라 수율은 0.73% 이었다.

IX. pCL PtrcUpperMVA 및 pTrc KKDyIkIS 플라스미드를 발현하는 E. coli FM5 세포로부터 15-L 규모로 이소프렌 생산

상기 실시예 11, 제 I부에서 설명된 바와 같이 플레이트 상에서 자란 pCL PtrcUpperMVA 및 pTrc KKDyIkIS 플라스미드를 발현하는 대장균 FM5 세포는 500 mL의 트립톤-효모추출물 배지를 포함하는 플라스크 내에 접종되었고 30℃에서 160 rpm으로 진탕하면서 OD₅₅₀ 1.0까지 배양되었다. 본 물질은 4.5-kg의 배지를 포함하는15-L 생물반응기 내로 접종되었다. IPTG 농도는 OD₅₅₀ 가 15값에 도달할 때 27 μM이 되었다. 시간 경과에 따른 생물반응기 내의 OD₅₅₀ 프로파일은 도 67A에 나타나있다. 이소프렌 역가는 발효 과정을 통해 235 mg/L의 최종 값까지 증가되었다 (도 67B). 발효 과정을 통한 특이 생산도 프로파일은 도 67C에 나타나있고 또한 도 67A와의 대비는 성장과 이소프렌 생산의 분리를 설명하고 있다. 52.3 시간의 발효 동안 생산된 이소프렌의 전체량은 사용된 포도당 948 g으로부터 1.4 g이었다. 발효과정 동안 이소프렌을 생산하는 데 들어갔던 사용된 탄소의 몰라 수율은 0.32% 이었다.

실시예 12: 메발론산 경로으로부터 나온 유전자를 발현하고 사료첨가- 회분식 배양으로 발효되는 대장균의 지수적 성장기 동안 이소프렌의 생산

실시예 12는 세포의 지수적 성장기 동안 이소프렌의 생산을 설명하고 있다.

배지 레시피 (발효 배지 리터 당):

배지는 발효 배지 리터 당 하기 성분을 사용하여 생성되었다: K₂HPO₄ 7.5 g, MgSO₄ * 7H₂O 2 g, 시트르산 모노하이드레이트 2 g, 철 암모늄 시트르산 0.3 g, 효모추출물 0.5 g, 1000X 변형된 미량 금속 용액 1 ml. 모든 성분은 다같이 첨가되었고 di H₂O에 녹였다. 본 용액은 고압 멸균되었다. pH는 7.0으로 암모늄 하이드록사이드 (30%)를 사용하여 조정되었고 부피는 q.s. 맞추었다. 포도당 10 g, 티아민 * HCl 0.1 g, 및 항생제가 멸균 및 pH 조정 이후에 첨가되었다.

1000X 변형된 미량 금속 용액:

1000X 변형된 미량 금속 용액은 하기 성분을 사용하여 생성되었다: 시트르산 * H₂O 40 g, MnSO₄ * H₂O 30 g, NaCl 10 g, FeSO₄ * 7H₂O 1 g, CoCl₂ * 6H₂O 1 g, ZnSO * 7H₂O 1 g, CuSO₄ * 5H₂O 100 mg, H₃BO₃ 100 mg, NaMoO₄ * 2H₂O 100 mg. 각 성분은 한 번에 하나씩 di H₂O에 녹이고, pH는 3.0으로 HCl/NaOH를 사용하여 조정한 다음 부피를 q.s. 맞추고 0.22 마이크론 필터로 여과 살균되었다.

발효는 pTrcUpperMVA 및 pTrc KKDyIkIS 플라스미드를 포함하는 기탁번호 제ATCC 11303호의 대장균 세포를 가진 15-L 생물반응기 내에서 수행되었다. 본 실험은 원하는 발효 pH 7.0 및 온도 30℃에서 포도당으로부터 이소프렌 형성을 감시하도록 수행되었다. 냉동 바이알로부터 가져온 대장균 균주의 접종액은 LB 액체배지 아가 플레이트 (항생제 첨가) 상에 뿌려졌고 37℃에서 배양되었다. 단일 콜로니가 트립톤-효모추출물 배지 내에 접종되었다. 접종액이 550 nm에서 측정되어 OD 1.0까지 된 이후에, 500 ml이 5-L 생물반응기를 접종하는 데 사용되었다.

포도당은 세포가 안정상에 도달할 때까지 지수적 속도로 첨가되었다. 이 시점 이후 포도당 첨가는 대사적 요구를 만족시키기 위해 감소되었다. 50시간의 발효과정 동안 생물반응기로 첨가된 포도당의 전체량은 2.0 kg이었다. 유도는 IPTG를 첨가하여 달성되었다. IPTG 농도는 550 nm에서 광학 밀도 (OD₅₅₀)가 10값에 도달할 때 25 μM이 되었다. IPTG 농도는 OD₅₅₀가 190에 도달할 때 55 μM이 되었다. 시간 경과에 따른 생물반응기 내의 OD₅₅₀ 프로파일은 도 99에 나타나있다. 생물반응기로부터 나온 배출기체에서 이소프렌의 수준은 본 명세서에서 기술된 바와 같이 결정된다. 이소프렌 역가는 발효 과정을 통해 1.4 g/L의 최종 값까지 증가되었다 (도 100). 50시간 발효과정 동안 생산된 이소프렌의 전체량은 10.0 g이었다. 발효 과정을 통한 특이 생산도 프로파일은 도 101에 나타나있다. 발효과정 동안 이소프렌을 생산하는 데 들어갔던 사용된 탄소의 몰라 수율은 1.1% 이었다. 포도당으로부터 이소프렌의 무게 퍼센트 수율은 0.5%이었다.

실시예 13: 발화도 모델링 및 이소프렌 테스트

I. 발화도 모델링 및 이소프렌 테스트의 요약

발화도 모델링 및 실험은 다양한 탄화수소/산소/질소/물/이산화탄소 혼합물에 대해 수행되었다. 본 모델링 및 실험적 테스트는 특정된 유량 하에서 이소프렌과 산소/질소의 발화도 곡선 및 고정된 압력과 온도에서 일산화탄소 농도를 정의하는 데 목적이 있었다. 모델 조건의 매트릭스는 표 9에 나타나있고 수행된 실험의 매트릭스는 표 5에 나타나있다. 표 9는 모델이 된 이소프렌 발화도의 요약을 나타낸다. 표 10은 이소프렌 발화도 테스트의 요약을 나타낸다.

시리즈	온도 (℃)	압력 (psig)	스팀 농도 (wt%)	이산화탄소 농도 (wt. %)	이소프렌 농도 (vol. %)	산소 농도 (vol. %)
A	40	0	0	0	다양함	다양함
B	40	0	4	0	다양함	다양함
C	40	0	0	5	다양함	다양함
D	40	0	0	10	다양함	다양함
E	40	0	0	15	다양함	다양함
F	40	0	0	20	다양함	다양함
G	40	0	0	30	다양함	다양함

일련 번호	온도 (℃)	압력 (psig)	스팀 농도 (vol. %)	이소프렌 농도 (vol. %)	산소 농도 (vol. %)
1	40	0	0	다양함	다양함
2	40	0	4	다양함	다양함

II. 계산된 단열 발화 온도 (CAFT) 모델의 기재

연소의 전파를 위한 선택된 발화 온도와 함께 계산된 단열발화 온도 (CAFT) 가 이소프렌에 대한 발화도 경계 (envelope)를 결정하는 데 사용되었다. 본 연구에서 발화 온도를 계산하는 데 사용되는 컴퓨터 프로그램은 NASA 글렌 연구소 CEA (Chemical Equilibrium with Applications) 소프트웨어이다.

균일한 연소 기작 (연료와 산화제 둘 다가 기체 상태로 있는 지점)을 위한 단열발화 온도 모델을 사용하여 발화도 경계를 결정하는 데 관여하는 다섯 가지 단계가 있다: 원하는 반응물의 선택, 시험 조건의 선택, 한계 발화온도의 선택, 반응물의 변형, 및 계산으로부터 발화 한계의 작성.

본 첫 번째 단계에서, 원하는 반응물의 선택은 시스템에 존재하게 될 반응물의 종류 및 각각의 정량에 관하여 결정된다. 많은 경우에, 계산에 사용되는 컴퓨터 프로그램은 반응물 및 산물 종류의 리스트를 가진다. 연구될 각 종류에 대한 데이터 모두가 프로그램에서 발견되지 않는 경우라면, 그것들은 JANAF 표와 같은 기타 출처로부터 또는 인터넷으로부터 획득될 수 있다. 본 현재 모델에서, 산소, 질소, 산소 및 이산화탄소에 대한 데이타가 프로그램 데이터베이스에 존재한다. 본 프로그램 데이터베이스는 종류로 이소프렌을 가지지 않았고; 따라서 열역학적 특성은 수동으로 입력되었다.

다음 단계는 연소 공정의 초기 압력 및 온도 조건에서 일어나는 지 여부를 결정하는 것이다. 본 모델에서, 압력은 1 기압 (절대값)이었고, 온도는 이소프렌의 비등점인 40℃이었다.

연소를 위한 한계 발화 온도는 이론적인 원칙에 근거하여 선택되거나 실험적으로 결정될 수 있다. 각 방법은 그 자체 제한점을 가진다.

이전의 연구에 기초하여, 탄화수소의 한계 발화온도는 1000 K 내지 1500 K 범위에 놓여진다. 본 모델의 경우, 1500 K값이 선택되었다. 이것은 일산화탄소의 이산화탄소로의 반응 (높은 발열 반응으로 발화에너지의 유의한 부분이 된다)이 스스로 유지되는 온도이다.

일단 한계 발화온도가 결정되었던 경우라면, 모델 계산이 주어진 반응물 혼합 (종류의 농도) 상에서 수행되고 단열발화 온도가 결정된다. 발화 전파는 온도가 한계 발화온도보다 높은 경우에만 발생되었던 것으로 사료된다. 반응물 혼합 조성이 그 다음 전파 및 비전파 혼합물의 데이타 세트를 만들기 위해 변형되었다.

본 유형의 모델은 실험적으로 결정된 발화도 경계와 좋은 일치를 보여준다. 유래된 경계 외부 지역은 발화가능하지 않고 그의 내부 지역은 발화가능하다. 경계의 모양은 돌출부를 형성한다. 경계의 돌출부는 기체 상 연료에 대해 산소 농도를 제한하는 것과 관련이 있다.

III. 계산된 단열 발화 온도 (CAFT) 모델로부터 나온 결과

시리즈 A 내지 G에 대한 CAFT 모델 결과는 도 68 내지 도 74에서 좌표로 표시되었다. 도면은 계산된 단열발화 온도를 여러가지 산소/질소 비율 (무게 기준)에 대한 연료 농도 (무게 기준)의 함수로서 (NASA CEA 프로그램을 사용함) 좌표 표시된다. 선택된 한계 발화 온도인 1500 K 초과하는 곡선 부분은 발화 전파에 충분한 연료 수준을 포함한다. 결과는 도 68 내지 도 74에 나타난 형태로는 해석하는 것이 어려울 수 있다. 추가적으로, 현재의 형태는 일반적으로 부피 퍼센트로 표현된 실험적 데이터와 비교되지 않는다.

시리즈 A를 예로서 사용하여, 도 68에서의 데이터가 통상적인 발화도 경계의 형태로 좌표 표시될 수 있다. 도 68 및 1500 K온도선을 따른 종좌표 상의 결과 (reading)를 사용하여, 본 한계 발화 온도에 대한 연료 농도를 상호교차하는 각 곡선에 대한 횡좌표의 탄젠트를 대입하여 (산소 대 질소의 비율) 결정할 수 있다. 이들 값은 다시 주어진 산화제의 무게 퍼센트에 대한 연료의 무게 퍼센트로서 도표화될 수 있다 (도 75A). 그 다음 연료의 조성 (100 wt.% 이소프렌) 및 산화제의 조성 (물, 산소 및 질소의 상대적 함유량)을 알아내어 몰라 정량이 확립될 수 있다.

이들 몰라 정량으로부터 부피 백분율 농도가 계산될 수 있다. 그 다음 부피 퍼센트로 표현된 농도는 발화도 경계를 생성하도록 좌표 표시될 수 있다 (도 75B). 경계에 의해 정해진 면적은 폭발가능한 범위이고 배제된 면적은 폭발가능하지 않는 범위이다. 경계의 "노이즈"는 제한 산소 농도이다. 도 76A 및 76B는 표 69에 나타난 데이터로부터 생성된 시리즈 B의 경우에서 발화도 경계에 대한 계산된 부피 농도를 포함한다. 유사한 접근법이 도 70 내지 도 74에 나타난 데이터 상에 사용될 수 있다.

IV. 발화도 테스트 실험적 설비 및 절차

발화도 테스트는 4 리터의 고압 용기에서 시행되었다. 용기는 6" 내부 직경과 8.625"내부 높이를 가진 원통 형태이었다. 용기 (및 내부 기체)의 온도는 PID 조절기에 의해 조절되는 외부 히터를 사용하여 유지되었다. 열 소실을 막기 위하여, 세라믹 모직 및 반사적 절연이 압력 용기 주변을 둘러쌓았다. 타입 K 써모커플 (thermocouples)이 기체 공간의 온도뿐만 아니라 용기 자체의 온도를 측정하는데 사용되었다. 도 77은 테스트 용기를 묘사하고 있다.

테스트가 진행되기 이전에, 용기는 진공화되었고 이전의 테스트로부터 나온 기체 모두가 제거된 것을 보장하도록 질소로 세척되었다. 그 다음 진공이 용기 상에 당겨졌다. 본 과정이 시행된 이후에 압력은 0.06 bar(a) 주변이었다. 질소 살포로 인해, 본 초기 압력을 부여하는 기체는 질소인 것으로 가정되었다. 분압을 사용하여, 물, 이소프렌, 질소, 및 산소가 그 다음 문제가 되는 테스트 조건을 달성하도록 적절한 양으로 첨가되었다. 용기 내에 전가기적으로 작동하는 혼합팬이 기체 내용물의 혼합을 보장해주었다. 기체는 팬이 점화 대략 1분 전에 꺼지면서 약 2분 동안 혼합되도록 하였다.

점화기는 1.5 ohm 니크롬 코일 및 순환 타이머 상에 AC 전압원을 포함한다. 진동측정기 (oscilloscope)를 사용하여, 34.4 VAC이 점화기에 3.2초 동안 전달된 것이 결정되었다. 3.8 amps의 최대 전류가 점화 회로 내로 대략 절반이 발생하였다. 따라서, 최대 전력은 131 W 이었고, 점화 회로 통과 시 제공된 전체 에너지는 대략 210 J이었다.

연소 (deflagration) 데이터는 데이터 획득 시스템에 연결된 다양한 저항Validyne DP215 압력 전달기를 사용하여 획득되었다. 기체 혼합물은 압력 증가가 5% 이상이 되는 경우 급히 연소되는 것으로 생각되었다.

V. 발화도 테스트의 결과

첫 번째 일련의 실험 (시리즈 1)은 증기가 전혀 없이 40℃ 및 0 psig에서 진행되었다. 이소프렌과 산소의 다양한 농도에서 진행되는 테스트는 도 78A에 나타난 발화도 곡선을 생성하였다. 본 곡선에 나타난 데이터 값은 단지 곡선의 경계가 되는 것이다. 본 시리즈를 위해 가져온 모든 데이터 값의 상세한 리스트는 도 80A 및 80B에 나타나 있다.

도 78B는 도 78A에 나타난 폭발도 데이터 값을 정리하고 있다. 도 78C는 실험적 데이터를 CAFT 모델로 예측된 발화도 경계와 비교한 것이다. 모델은 실험적 데이터와 잘 일치하고 있다. 차이점은 테스트 체임버의 비-단열 본성과 모델의 문제점으로 인한 것일 수 있다. 모델은 산화 반응에 대해 무한한 수평적 시간을 바라보지만, 반응 역학적 제한은 전혀 고려하지 않는다.

추가적으로, 모델은 그의 데이터베이스에 있는 평형 화학적 종의 수가 제한되어 있어 열분해 종을 적절히 예측할 수 없다. 도한, 모델에 의해 개발된 발화도 경계는 제한 발화 온도 (1500K)에 대해 하나의 값을 사용한다. 제한 발화 온도는 반응하는 화학적 종에 따라 1,000K 로부터 1,500K까지 값의 범위일 수 있다. 화학량적 연료 (stoichiometric fuel)/산화제 수준 초과의 연료 농도에서 형성되는 열분해 화학적 종의 복잡한 본성은 모델이 본 시스템을 위한 상부 발화가능성 제한을 정확히 예측할 수 없는 하나의 이유가 된다.

두 번째 일련의 실험 (시리즈 2)은 4%의 고정된 증기 농도를 사용하여 40℃와 0 psig에서 진행되었다. 이소프렌과 산소의 다양한 농도에서 진행되는 테스트는 도 79A에 나타난 발화도 곡선을 생성하였다. 본 곡선에 나타난 데이터 값은 단지 곡선의 경계가 되는 것이다. 본 시리즈를 위해 가져온 모든 데이터 값의 상세한 리스트는 도 81에 나타나있다. 시리즈 1에서의 데이터 간 유사성으로 인해, 하부 발화가능성 한계, 제한 산소 농도, 및 상부 발화가능성 한계의 중요한 지점만이 테스트되었다. 테스트 혼합물에 4% 증기의 첨가는 발화도 경계의 중요한 한계 지점을 유의하게 변화시키지 않았다. 증기/물 또는 기타 불활성물의 농도가 더 높으면 발화도 경계에 영향을 줄 수 있는 것이 주목되어야 한다.

도 79B는 도 79A에 나타난 폭발도 데이터 값을 정리하고 있다. 도 79C는 실험적 데이터를 CAFT 모델로 예측된 발화도 경계와 비교한 것이다. 모델은 실험적 데이터와 잘 일치하고 있다. 차이점은 시리즈 1에서 기술된 동일한 인자로 인한 것일 수 있다.

VI. 3 기압 공기에서 이소프렌의 발화도 한계의 계산

실시예 13, 제 I 내지 제 IV부에서 기술된 방법은 또한 3 기압의 절대 시스템 압력 및 40℃에서 이소프렌의 발화도 한계를 계산하는 데 사용되었다. 이들 결과는 1기압의 절대 시스템 압력 및 40℃에서의 실시예 13, 제 I 내지 제 IV부의 것과 대비되었다. 본 더 높은 압력은 발화도 경계가 초기 시스템 압력이 증가되면서 더 크게 확장되거나 성장하기 때문에 테스트되었다. 고부 발화도 한계가 가장 많이 영향을 받고, 이어서 제한 산소 조성에 의해 영향을 받는다. 저부 발화도 한계는 가장 적게 영향을 받는다 (예를 들어, Michael G. Zabetakis 등이 기록한 "Bulletin 627 - Flammability Characteristics of Combustible Gases and Vapors", US Bureau of Mines가 발행함 (1965)을 참조하고, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 발화도 한계의 계산에 관하여 통합된다).

도 82에서, 계산된 단열 발화 온도는 전체 연료/질소/산소의 무게 퍼센트로 표현되는 이소프렌 (연료) 농도의 함수로서 좌표 표시되고, 여기에서 시스템 압력은 처음에 3기압이었다. 계산된 발화 온도는 1 기압 시스템에서 처음에 결정된 것과 매우 유사하다 (도 83). 그 결과, 발화도 경계가 계산된 발화도 데이터를 사용하여 생성될 때, 곡선은 매우 유사하다 (도 84 및 도 85를 참조하라). 따라서 이들 이론적인 계산을 근거로 하여, 1기압으로부터 3기압까지의 시스템 압력 증가는 발화도 경계의 유의한 증가/확장을 가져오지 않는다. 원하는 경우, 이들 모델 결과는 실험적 테스트를 사용하여 (본 명세서 기술된 1기압의 압력에서 실험적 테스트와 같음) 입증될 수 있다.

VII. 발화도 연구의 요약

계산된 단열 온도 모델은 이소프렌/산소/질소/물/이산화탄소 시스템의 40℃ 와 0 psig에서의 발화도 경계를 위해 개발되었다. 개발된 CAFT 모델은 본 작업에서 시행된 테스트에 의해 생성된 실험적 데이터와 잘 일치하였다. 시리즈 1 및 2로부터 나온 실험적 결과는 시리즈 A 및 B로부터 나온 모델 결과를 입증해주었다.

실시예 14: 발현 제작물 및 균주

I. 메발로네이트 키나제를 인코딩하는 플라스미드의 제작.

Methanosarcina mazei 하부 MVA 경로 (기탁번호 NC_003901.1, NC_003901.1, NC_003901.1, 및 NC_003901.1, 이들은 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 전부 통합된다)가 대장균에서 발현을 위한 코돈 최적화를 사용하여 합성되었다. 본 제작물은 M. mazei 고대 하부 경로 오페론 (archeal Lower Pathway operon) (도 112A 내지112C; 서열번호 27)라고 명명되고 M. mazei MVK, 가정적인 탈탄산화효소, IPK, 및 IDI 효소를 인코드한다. MVK (기탁번호 NC_003901.1) 를 인코딩하는 유전자는 프라이머 MCM165 및 MCM177 (표 11)를 사용하고 제조사의 프로토콜에 따라 스트라타젠 허큘라제 II 융합 키트 (Strategene Herculase II Fusion kit)를 사용하여 어닐링 온도 550℃ 및 연장 시간 60초를 30회 반복하여 PCR 증폭되었다. 본 증폭자는 퀴아젠 PCR 컬럼을 사용하여 정제된 다음 10 mL 반응에서 PmeI (NEB 완충용액 4와 BSA 존재 시)으로 37℃에서 소화되었다. 한 시간 이후에, NsiI과 로슈 완충용액 H가 37℃에서 추가 1시간 동안 첨가되었다. 소화된 DNA는 퀴아젠 PCR 컬럼을 통해 정제되었고 유사하게 소화되고 정제된 플라스미드 MCM29 (MCM29는 쿠쥬 이소프렌 합성효소를 인코딩하는 pTrcKudzu로 형질전환된 E. coli TOP10 (Invitrogen)이다) 에 5 μL의 로슈 퀵 라이게이즈 완충용액 1, 1 μL 완충용액 2, 1 μL 플라스미드, 3 μL 증폭자, 및 1 μL 라이게이즈를 포함하는 11 μL 반응에서 결찰되었다 (상온에서 1시간). MCM 29는 pTrcKudzuKan이다. 라이게이션 반응은 인비트로겐 TOP10 세포 내로 도입되었고 형질전환체는 LA/kan50 플레이트 상에서 선별되었으며 37℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 그 결과 나온 플라스미드 MCM382에서 MVK 삽입물는 서열결정되었다 (도 113A 내지 113C; 서열번호 28). 표 11. 올리고뉴클레오타이드들을 나타낸다.

MCM161	M.mazei MVK for	CACCATGGTATCCTGTTCTGCG (서열번호 120)
MCM162	M.mazei MVK rev	TTAATCTACTTTCAGACCTTGC (서열번호 121)
MCM165	M.mazei MVK for w/ RBS	gcgaacgATGCATaaaggaggtaaaaaaacATGGTATCCTGTTCTGCGCCGGGTAAGATTTACCTG (서열번호 122)
MCM177	M.mazei MVK rev Pst	gggcccgtttaaactttaactagactTTAATCTACTTTCAGACCTTGC (서열번호 123)

II. 메발로네이트 키나제 및 이소프렌 합성효소를 과다 발현하는 균주의 제조

플라스미드 MCM382는 LB배지에서 중간로그기까지 자랐고 무균 얼음물에 세 번 세척하였던 MCM331 세포 (S. cerevisiae 메발로네이트 키나제, 메발로네이트 포스페이트 키나제, 메발로네이트 피로포스페이트 탈탄산화효소 및 IPP 이소머라제를 인코딩하는 염색체 제작물 gi1.2KKDyI을 포함함) 내에 형질전환되었다. 1 mL의 DNA가 50 mL의 세포 현탁액에 첨가되었고, 본 혼합물은 2 mm 큐벳에서 2.5 volts, 25 uFd로 천기천공되었고, 이어서 500 mL LB 배지로 1시간 동안 37℃에서 회복되었다. 형질전환체는 LA/kan50 상에서 선별되었고 MCM391라고 명명되었다. 플라스미드 MCM82는 본 균주 내로 동일한 전기천공 프로토콜에 의해 도입되었고 이어서 LA/kan50/spec50 상에서 선별되었다. 그 결과 나온 균주 MCM401는 cmp-표시된 염색체 제작물 gi1.2KKDyI, kan-표시된 플라스미드 MCM382, 및 spec-표시된 플라스미드 MCM82 (이는 E. faecalis mvaE 및 mvaS를 인코딩하는 pCL PtrcUpperPathway 이다)를 포함한다. 표 12는 메발로네이트 키나제 및 이소프렌 합성효소를 과다 발현하는 균주를 나타내고, 이를 참조하라.

MCM382	E. coli BL21 (lambdaDE3) pTrcKudzuMVK(M. mazei)GI1.2KKDyI
MCM391	MCM331 pTrcKudzuMVK(M. mazei)
MCM401	MCM331pTrcKudzuMVK(M.mazei)pCLPtrcUpperpathway
MCM396	MCM333pTrcKudzuMVK(M. mazei)
MCM406	MCM333pTrcKudzuMVK(M.mazei)pCLPtrcUpperpathway

III. pET200D 에서의 M. mazei archeal Lower로부터 나온 플라스미드 MCM376 - MVK의 제작.

M. mazei 고대 하부 경로 오페론 (도 112A 내지 112C; 서열번호 27) 으로부터 나온 MVK ORF는 프라이머 MCM161 및 MCM162 (표 11)을 사용하고 인비트로겐 플래티넘 하이파이 PCR 믹스 (Invitrogen Platinum HiFi PCR mix)을 사용하여 PCR 증폭되었다. 45 μL의 PCR 믹스는 1 μL 주형, 1 μL의 각 10 μM 프라이머, 및 2 μL 물과 조합되었다. 반응은 하기와 같이 순환되었다: 94℃ 2:00분; 94℃ 0:30분, 55℃ 0:30분, 및 68℃ 1:15의 30회 사이클; 그 다음 72℃ 7:00분, 또한 식을 때까지 4℃. 본 PCR 반응액 3 μL이 제조사의 지침에 따라 인비트로겐 pET200D 플라스미드에 결찰되었다. 본 라이게이션의 3 μL이 인비트로겐 TOP10 세포 내로 도입되었고, 형질전환체가 LA/kan50 상에서 선별되었다. 형질전환체로부터 플라스미드는 분리되었고 삽입물는 서열결정되었으며, MCM376가 제작되었다 (도 114A 내지 114C; 서열번호 29).

V. 발현 균주 MCM378의 제조

플라스미드 MCM376는 제조사의 프로토콜에 따라 인비트로겐 BL21(DE3) pLysS 세포 내로 형질전환되었다. 형질전환체 MCM378는 LA/kan50 상에서 선별되었다.

실시예 15: 상부 메발론산 (MVA) 경로, 삽입된 하부 MVA 경로 (gi1.2KKDyI), M. mazei 로부터 나온 메발로네이트 키나제, 및 쿠쥬로부터 나온 이소프렌 합성효소를 발현하고 20 mL 회분식 규모로 사료첨가-회분식 배양에서 자란 대장균에 의한 이소프렌의 생산

배지 레시피 (발효 배지 리터 당):

발효 배지의 각 리터는 K₂HPO₄ 13.6 g, K₂H₂PO₄ 13.6 g, MgSO₄ * 7H₂O 2 g, 시트르산 모노하이드레이트 2 g, 철 암모늄 시트르산 0.3 g, (NH₄)₂SO₄ 3.2g, 효모추출물 1 g, 및 1000X 변형된 미량 금속 용액 1 ml을 포함하였다. 모든 성분은 다같이 첨가되었고 di H₂O에 녹였다. pH 6.8로 암모늄 하이드록사이드 (30%)를 사용하여 조정되었고 부피를 맞추었다. 배지는 0.22 마이크론 필터로 여과 살균되었다. 포도당 (2.5 g) 및 항생제가 멸균 및 pH 조정 이후에 첨가되었다.

1000X 미량 금속 용액:

1000X 미량 금속 용액은 시트르산 * H₂O 40 g, MnSO₄ * H₂O 30 g, NaCl 10 g, FeSO₄ * 7H₂O 1 g, CoCl₂ * 6H₂O 1 g, ZnSO * 7H₂O 1 g, CuSO₄ * 5H₂O 100 mg, H₃BO₃ 100 mg, NaMoO₄ * 2H₂O 100 mg을 포함하였다. 각 성분은 DI H₂O에 한 번에 하나씩 녹이고, pH는 3.0으로 HCl/NaOH를 사용하여 조정한 다음 부피를 q.s. 맞추고 0.22 마이크론 필터로 여과 살균되었다.

균주:

MCM343 세포는 상부 메발론산 (MVA) 경로 (pCL Upper), 삽입된 하부 MVA 경로 (gi1.2KKDyI), 및 쿠쥬로부터 나온 이소프렌 합성효소 (pTrcKudzu)를 포함하는 대장균 BL21 (DE3) 세포이다.

MCM401 세포는 상부 메발론산 (MVA) 경로 (pCL PtrcUpperPathway), 삽입된 하부 MVA 경로 (gi1.2KKDyI), M. mazei로부터 나온 메발로네이트 키나제의 높은 발현 및 쿠쥬로부터 나온 이소프렌 합성효소 (pTrcKudzuMVK(M.mazei))를 포함하는 대장균 BL21 (DE3) 세포이다.

이소프렌 생산은 균주를 20 mL의 작동 부피를 가지는100 mL 생물반응기로 30℃에서 성장시켜서 분석되었다. 냉동 바이알로부터 가져온E. coli 균주의 접종액은 LB 액체배지 아가 플레이트 (항생제 포함) 상에 뿌려졌고 30℃에서 배양되었다. 단일 콜로니는 배지에 접종되었고 하룻밤 동안 배양되었다. 박테리아는 550 nm에서 측정된 광학밀도가 0.05에 도달하도록 20 mL 배지 내로 희석되었다. 100 mL 생물반응기가 밀봉되었고, 공기가 8 mL/분 속도로 주입되었다. 배지의 적당한 교반이 자기 막대를 사용하여 600 rpm으로 교반하여 시행되었다. 생물반응기로부터 나온 배출-기체가 온라인 Hiden HPR-20 질량 분광측정기를 사용하여 분석되었다. 이소프렌, CO₂, 및 공기에서 자연적으로 발생하는 기타 기체에 해당하는 질량이 감시되었다. 축적된 이소프렌과 CO₂의 생산이 시간 경과에 따른 각 기체의 농도 (퍼센트)를 합하여 계산되었다. 대기 CO₂가 대사적 활성으로 인해 방출되는 CO₂를 평가하기 위해 전체로부터 차감되었다.

전체 메발론산 경로 및 쿠쥬 이소프렌 합성효소 (MCM343)를 발현하는 균주로부터 이소프렌 생산이 100 mL 생물반응기에서 추가적으로 M. mazei로부터 나온 MVK및 쿠쥬 이소프렌 합성효소 (MCM401)를 과다 발현하는 균주와 대비되었다. 박테리아는 탄소원으로서 포도당을 가진 정의된 배지에서 동일한 조건 하에서 성장시켰다. 이소프렌 생산의 유도는 이소프로필-베타-D-1-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)를 100 μM 또는 200 μM의 최종 농도로 첨가하여 달성되었다. 배출-기체 측정은 MVK 및 이소프렌 합성효소 (MCM401) 둘 다를 과다 발현하는 균주가 도 115A 내지 115D에서 나타난 바와 같이 메발론산과 쿠쥬 이소프렌 합성효소 (MCM343)만을 발현하는 균주에 비해 이소프렌을 유의하게 더 많이 생산하였던 것을 보여주었다. 100 μM 유도에서, MCM401 균주는 MCM343 균주에 비해 3.4배 더 많은 이소프렌을 생산하였다. 대사적 활성의 척도이기도 한 생물반응기로부터 나온 배출-기체에서 CO₂ 분석은 대사적 활성이 IPTG 유도 및 이소프렌 생산과는 독립적이었던 것을 보여준다.

실시예 16: 상부 메발론산 (MVA) 경로, 삽입된 하부 MVA 경로 (gi1.2KKDyI), M. mazei 로부터 나온 메발로네이트 키나제, 및 쿠쥬로부터 나온 이소프렌 합성효소를 발현하고 15-L 규모로 사료첨가-회분식 배양에서 자란 대장균에 의한 이소프렌의 생산

배지 레시피 (발효 배지 리터 당):

발효 배지의 각 리터는 K₂HPO₄ 7.5 g, K₂H₂PO₄ 7.5 g, MgSO₄ * 7H₂O 2 g, 시트르산 모노하이드레이트 2 g, 철 암모늄 시트르산 0.3 g, 효모추출물 0.5 g, 1000X 변형된 미량 금속 용액1 ml을 포함하였다. 모든 성분은 다같이 첨가되었고 di H₂O에 녹였다. 본 용액은 고압 멸균되었다. pH는 7.0으로 암모늄 하이드록사이드 (30%)를 사용하여 조정되었고 부피는 q.s. 맞추었다. 포도당 10 g, 티아민 * HCl 0.1 g, 및 항생제가 멸균 및 pH 조정 이후에 첨가되었다.

1000X 변형된 미량 금속 용액:

1000X 변형된 미량 금속 용액은 시트르산 * H₂O 40 g, MnSO₄ * H₂O 30 g, NaCl 10 g, FeSO₄ * 7H₂O 1 g, CoCl₂ * 6H₂O 1 g, ZnSO * 7H₂O 1 g, CuSO₄ * 5H₂O 100 mg, H₃BO₃ 100 mg, NaMoO₄ * 2H₂O 100 mg을 포함하였다. 각 성분은 한 번에 하나씩 DIH₂O에 녹이고, pH는 3.0으로 HCl/NaOH를 사용하여 조정한 다음 부피를 q.s. 맞추고 0.22 마이크론 필터로 여과 멸균되었다.

발효는 상부 메발론산 (MVA) 경로 (E. faecalis mvaE 및 mvaS를 인코딩하는 pCL PtrcUpperPathway), 삽입된 하부 MVA 경로 (S. cerevisiae 메발로네이트 키나제, 메발로네이트 포스페이트 키나제, 메발로네이트 피로포스페이트 탈탄산화효소, 및 IPP 이소머라제를 인코딩하는gi1.2KKDyI), M. mazei로부터 나온 메발로네이트 키나제의 높은 발현 및 쿠쥬로부터 나온 이소프렌 합성효소 (pTrcKudzuMVK(M.mazei))를 포함하는 대장균 BL21 (DE3) 세포를 사용하여 15-L 생물반응기에서 수행되었다. 본 실험은 원하는 발효 pH 7.0 및 온도 30℃에서 포도당으로부터 이소프렌 형성을 감시하도록 수행되었다. 냉동 바이알로부터 가져온 대장균 균주의 접종액은 LB 액체배지 아가 플레이트 (항생제 첨가) 상에 뿌려졌고 37℃에서 배양되었다. 단일 콜로니가 트립톤-효모추출물 배지 내에 접종되었다. 접종액이 550 nm에서 측정되어 OD 1.0까지 된 이후에, 500 mL 이 15-L 생물반응기에서 5 L의 배지를 접종하는 데 사용되었다.

포도당은 세포가 안정상에 도달할 때까지 지수적 속도로 첨가되었다. 이 시점 이후 포도당 첨가는 대사적 요구를 만족시키기 위해 감소되었다. 68시간 발효 동안 생물반응기로 운반된 포도당의 전체 양은 3.8 kg이었다. 유도는 이소프로필-베타-D-1-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)를 첨가하여 달성되었다. IPTG 농도는 광학 밀도가 550 nm (OD₅₅₀)에서 수치 9에 도달할 때 51 μM가 되었다. IPTG 농도는 OD₅₅₀이 149에 도달할 때 88 uM로 올라갔다. 추가적인 IPTG 첨가는 농도를 OD₅₅₀=195에서 119 μM또한 OD₅₅₀=210에서 210 μM까지 올렸다. 시간 경과에 따른 생물반응기의 OD₅₅₀ 프로파일은 도 116에 나타나있다. 생물반응기로부터 나온 배출기체에서 이소프렌 수준은 하이덴 (Hiden) 질량 분광측정기를 사용하여 결정되었다. 이소프렌의 역가는 발효 과정을 통해 23.8 g/L의 최종 값까지 증가되었다 (도 117). 68시간의 발효과정 동안 생산된 이소프렌의 전체 양은 227.2 g이었고, 생산의 시간 과정은 도 118에 나타나있다. 대사적 활성 프로파일은 TCER에 의해 측정된 바와 같이 도 119에 나타나있다. 전체 생존가능한 수 (전체 콜로니 형성 단위)는 발효 10 및 39시간 사이에서 두 배 정도 감소되었다 (도 120). 발효 동안 이소프렌을 생산하는 데 들어갔던 사용된 탄소의 몰라 수율은 13.0% 이었다. 포도당으로부터 나온 이소프렌의 무게 퍼센트 수율은 6.3%이었다.

실시예 17: 상부 메발론산 (MVA) 경로, 삽입된 하부 MVA 경로 (gi1.2KKDyI), M. mazei 로부터 나온 메발로네이트 키나제, 및 쿠쥬로부터 나온 이소프렌 합성효소를 발현하고 15-L 규모로 사료첨가-회분식 배양에서 자란 대장균에 의한 이소프렌의 생산 (2x 100μM IPTG 유도)

배지 레시피 (발효 배지 리터 당):

발효 배지의 각 리터는 K₂HPO₄ 7.5 g, MgSO₄ * 7H₂O 2 g, 시트르산 모노하이드레이트 2 g, 철 암모늄 시트르산 0.3 g, 효모추출물 0.5 g, 1000X 변형된 미량 금속 용액1 ml을 포함하였다. 모든 성분은 다같이 첨가되었고 diH₂O에 녹였다. 본 용액은 고압멸균되었다. pH는 7.0으로 암모늄 하이드록사이드 (30%)를 사용하여 조정되었고 부피는 q.s. 맞추었다. 포도당 10 g, 티아민 * HCl 0.1 g, 및 항생제가 멸균 및 pH 조정 이후에 첨가되었다.

1000X 변형된 미량 금속 용액:

1000X 변형된 미량 금속 용액은 시트르산 * H₂O 40 g, MnSO₄ * H₂O 30 g, NaCl 10 g, FeSO₄ * 7H₂O 1 g, CoCl₂ * 6H₂O 1 g, ZnSO * 7H₂O 1 g, CuSO₄ * 5H₂O 100 mg, H₃BO₃ 100 mg, NaMoO₄ * 2H₂O 100 mg을 포함하였다. 각 성분은 한 번에 하나씩 DIH₂O에 녹이고, pH는 3.0으로 HCl/NaOH를 사용하여 조정한 다음 부피를 q.s. 맞추고 0.22 마이크론 필터로 여과 멸균되었다.

발효는 상부 메발론산 (MVA) 경로 (E. faecalis mvaE 및 mvaS를 인코딩하는pCL PtrcUpperPathway), 삽입된 하부 MVA 경로 (S. cerevisiae 메발로네이트 키나제, 메발로네이트 포스페이트 키나제, 메발로네이트 피로포스페이트 탈탄산화효소, 및 IPP 이소머라제를 인코딩하는gi1.2KKDyI), M. mazei로부터 나온 메발로네이트 키나제의 높은 발현 및 쿠쥬로부터 나온 이소프렌 합성효소 (pTrcKudzuMVK(M.mazei))를 포함하는 대장균 BL21 (DE3) 세포를 사용하여 15-L 생물반응기에서 수행되었다. 본 실험은 원하는 발효 pH 7.0 및 온도 30℃에서 포도당으로부터 이소프렌 형성을 감시하도록 수행되었다. 냉동 바이알로부터 가져온 대장균 균주의 접종액은 LB 액체배지 아가 플레이트 (항생제 첨가) 상에 뿌려졌고 37℃에서 배양되었다. 단일 콜로니가 트립톤-효모추출물 배지 내에 접종되었다. 접종액이 550 nm에서 측정되어 OD 1.0까지 된 이후에, 500 mL 이 15-L 생물반응기에서 5 L의 배지를 접종하는 데 사용되었다.

포도당은 세포가 안정상에 도달할 때까지 지수적 속도로 첨가되었다. 이 시간 이후 포도당 첨가는 대사적 요구를 만족시키기 위해 감소되었다. 55시간의 발효과정 동안 생물반응기로 운반된 포도당의 전체 양은 1.9 kg이었다. 유도는 이소프로필-베타-D-1-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)를 첨가하여 달성되었다. IPTG 농도는 광학 밀도가 550 nm (OD₅₅₀)에서 수치 9에 도달할 때 111 μM가 되었다. IPTG 농도는 OD₅₅₀이 155에 도달할 때 193 μM로 올라갔다. 시간 경과에 따른 생물반응기의 OD₅₅₀ 프로파일은 도 121에 나타나있다. 생물반응기로부터 나온 배출기체에서 이소프렌 수준은 하이덴 질량 분광측정기를 사용하여 결정되었다. 이소프렌의 역가는 발효 과정을 통해 19.5 g/L의 최종 값까지 증가되었다 (도 122). 55시간의 발효과정 동안 생산된 이소프렌의 전체 양은 133.8 g이었고, 생산의 시간 과정은 도 123에 나타나있다. 일시적인 부피측정 생산도 수준은 1.5 g/이소프렌/L 액체배지/시간 정도에 도달하였다 (도 124). 일시적인 수율 수준은 17.7% 정도에 도달하였다 (도 125). 대사적 활성 프로파일은 TCER에 의해 측정된 바와 같이 도 126에 나타나있다. 전체 생존가능한 수 (전체 콜로니 형성 단위)는 발효 8 및 36시간 사이에서 두 배 정도 감소되었다 (도 127). 발효 과정 동안 이소프렌을 생산하는 데 들어갔던 사용된 탄소의 몰라 수율은 15.8% 이었다. 전체 발효과정에 따른 포도당으로부터 나온 이소프렌의 무게 퍼센트 수율은 7.4%이었다.

또한 대조군으로서, 발효가 상부 메발론산 (MVA) 경로 (E. faecalis mvaE 및 mvaS를 인코딩하는pCL PtrcUpperPathway), 삽입된 하부 MVA 경로 (S. cerevisiae 메발로네이트 키나제, 메발로네이트 포스페이트 키나제, 메발로네이트 피로포스페이트 탈탄산화효소, 및 IPP 이소머라제를 인코딩하는gi1.2KKDyI), M. mazei로부터 나온 메발로네이트 키나제의 높은 발현 및 쿠쥬로부터 나온 이소프렌 합성효소 (pTrcKudzuMVK(M.mazei))를 포함하는 대장균 BL21 (DE3) 세포를 사용하여 15-L 생물반응기에서 수행되었다. 본 실험은 원하는 발효 pH 7.0 및 온도 30℃에서 포도당으로부터 CER에 의해 측정되는 바와 같이 유도되지 않은 세포 대사 활성을 감시하도록 수행되었다. 냉동 바이알로부터 가져온 대장균 균주 (상기에서 기술된 MCM401)의 접종액은 LB 액체배지 아가 플레이트 (항생제 첨가) 상에 뿌려졌고 37℃에서 배양되었다. 단일 콜로니가 트립톤-효모추출물 배지 내에 접종되었다. 접종액이 550 nm에서 측정되어 OD 1.0까지 된 이후에, 500 mL이 15-L 생물반응기에서 5 L의 배지를 접종하는 데 사용되었다. 포도당은 세포가 안정상에 도달할 때까지 지수적 속도로 첨가되었다. 이 시간 이후에는 포도당 첨가가 대사적 요구를 만족시키기 위해 감소되었다.

도 148은 상기에 기술된 유도되지 않은 세포 및 이소프로필-베타-D-1-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)에 의해 유도된 세포에 대한 CER 프로파일을 실시예 16 및 실시예 17에서 비교한 것이다.

실시예 18: 상부 메발론산 (MVA) 경로, 삽입된 하부 MVA 경로 (gi1.2KKDyI), M. mazei 로부터 나온 메발로네이트 키나제, 및 쿠쥬로부터 나온 이소프렌 합성효소를 발현하고 15-L 규모로 사료첨가-회분식 배양에서 자란 대장균에 의한 이소프렌의 생산 (1x 50μM IPTG + 150μM IPTG 첨가 유도)

배지 레시피 (발효 배지 리터 당):

발효 배지의 각 리터는 K₂HPO₄ 7.5 g, MgSO₄ * 7H₂O 2 g, 시트르산 모노하이드레이트 2 g, 철 암모늄 시트르산 0.3 g, 효모추출물 0.5 g, 1000X 변형된 미량 금속 용액1 ml을 포함하였다. 모든 성분은 다같이 첨가되었고 diH₂O에 녹였다. 본 용액은 고압 멸균되었다. pH는 7.0으로 암모늄 하이드록사이드 (30%)를 사용하여 조정되었고 부피는 q.s. 맞추었다. 포도당 10 g, 티아민 * HCl 0.1 g, 및 항생제가 멸균 및 pH 조정 이후에 첨가되었다.

1000X 변형된 미량 금속 용액:

1000X 변형된 미량 금속 용액은 시트르산 * H₂O 40 g, MnSO₄ * H₂O 30 g, NaCl 10 g, FeSO₄ * 7H₂O 1 g, CoCl₂ * 6H₂O 1 g, ZnSO * 7H₂O 1 g, CuSO₄ * 5H₂O 100 mg, H₃BO₃ 100 mg, NaMoO₄ * 2H₂O 100 mg을 포함하였다. 각 성분은 한 번에 하나씩 DIH₂O에 녹이고, pH는 3.0으로 HCl/NaOH를 사용하여 조정한 다음 부피를 q.s. 맞추고 0.22 마이크론 필터로 여과 멸균되었다.

발효는 상부 메발론산 (MVA) 경로 (E. faecalis mvaE 및 mvaS를 인코딩하는pCL PtrcUpperPathway), 삽입된 하부 MVA 경로 (S. cerevisiae 메발로네이트 키나제, 메발로네이트 포스페이트 키나제, 메발로네이트 피로포스페이트 탈탄산화효소, 및 IPP 이소머라제를 인코딩하는gi1.2KKDyI), M. mazei로부터 나온 메발로네이트 키나제의 높은 발현 및 쿠쥬로부터 나온 이소프렌 합성효소 (pTrcKudzuMVK(M.mazei))를 포함하는 대장균 BL21 (DE3) 세포를 사용하여 15-L 생물반응기에서 수행되었다. 본 실험은 원하는 발효 pH 7.0 및 온도 30℃에서 포도당으로부터 이소프렌 형성을 감시하도록 수행되었다. 냉동 바이알로부터 가져온 대장균 균주의 접종액은 LB 액체배지 아가 플레이트 (항생제 첨가) 상에 뿌려졌고 37℃에서 배양되었다. 단일 콜로니가 트립톤-효모추출물 배지 내에 접종되었다. 접종액이 550 nm에서 측정되어 OD 1.0까지 된 이후에, 500 mL이 15-L 생물반응기에서 5 L의 배지를 접종하는 데 사용되었다.

포도당은 세포가 안정상에 도달할 때까지 지수적 속도로 첨가되었다. 이 시간 이후 포도당 첨가는 대사적 요구를 만족시키기 위해 감소되었다. 55시간 발효과정 동안 생물반응기로 운반된 포도당의 전체 양은 1.9 kg이었다. 유도는 이소프로필-베타-D-1-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)를 첨가하여 달성되었다. IPTG 농도는 광학 밀도가 550 nm (OD₅₅₀)에서 수치 10에 도달할 때 51 μM이 되었다. IPTG 스파이크에 덧붙여, OD₅₅₀ = 10일 때 일정한 첨가가 시작되었고 18시간 경과에 따라 164 mg의 IPTG가 전달되었다. 시간 경과에 따른 생물반응기 내의 OD₅₅₀ 프로파일은 도 128에 나타나있다. 생물반응기로부터 나온 배출기체에서 이소프렌 수준은 하이덴 질량 분광측정기를 사용하여 결정되었다. 이소프렌의 역가는 발효 과정을 통해 22.0 g/L의 최종 값까지 증가되었다 (도 129). 55시간의 발효과정 동안 생산된 이소프렌의 전체 양은 170.5 g이었고, 생산의 시간 과정은 도 130에 나타나있다. 대사적 활성 프로파일은 TCER에 의해 측정된 바와 같이 도 131에 나타나있다. 생물반응기로의 공기유동이 약 1.7시간의 기간 동안 8 slpm으로부터 4 slpm까지 감소되었을 때, 배출기체에서 이소프렌의 농도는 0.51로부터 0.92 w/w%까지 증가하였다 (도 132). 이들 이소프렌의 오른 수준은 전체 이산화탄소 발생율 (TCER)에 의해 측정된 바와 같이 TCER이 37.2 및 39.3 시간 사이에서 단지 7%가 내려갔기 때문에 세포 대사적 활성에 부정적 영향을 주는 것으로 보이지는 않았다 (도 132). 전체 생존가능한 수 (전체 콜로니 형성 단위)는 발효 7 및 36시간 사이에서 두 배 정도 감소되었다 (도 133). 발효 과정 동안 이소프렌을 생산하는 데 들어갔던 사용된 탄소의 몰라 수율은 16.6% 이었다. 전체 발효과정에 따른 포도당으로부터 나온 이소프렌의 무게 퍼센트 수율은 7.7%이었다.

실시예 19: 1-L 규모로 사료첨가-회분식 배양에서 자란 야생형 대장균에 미치는 외부적으로 첨가된 이소프렌의 효과

배지 레시피 (발효 배지 리터 당):

발효 배지의 각 리터는 K₂HPO₄ 7.5 g, MgSO₄ * 7H₂O 2 g, 시트르산 모노하이드레이트 2 g, 철 암모늄 시트르산 0.3 g, 효모추출물 0.5 g, 1000X 변형된 미량 금속 용액1 ml을 포함하였다. 모든 성분은 다같이 첨가되었고 diH₂O에 녹였다. 본 용액은 고압 멸균되었다. pH는 7.0으로 암모늄 하이드록사이드 (30%)를 사용하여 조정되었고 부피는 q.s. 맞추었다. 포도당 10 g, 티아민 * HCl 0.1 g, 및 항생제가 멸균 및 pH 조정 이후에 첨가되었다.

1000X 변형된 미량 금속 용액:

1000X 변형된 미량 금속 용액은 시트르산 * H₂O 40 g, MnSO₄ * H₂O 30 g, NaCl 10 g, FeSO₄ * 7H₂O 1 g, CoCl₂ * 6H₂O 1 g, ZnSO * 7H₂O 1 g, CuSO₄ * 5H₂O 100 mg, H₃BO₃ 100 mg, NaMoO₄ * 2H₂O 100 mg을 포함하였다. 각 성분은 한 번에 하나씩 DIH₂O에 녹이고, pH는 3.0으로 HCl/NaOH를 사용하여 조정한 다음 부피를 q.s. 맞추고 0.22 마이크론 필터로 여과 멸균되었다.

발효는 대장균 BL21 (DE3) 세포를 사용하여 1-L 생물반응기에서 수행되었다. 본 실험은 원하는 발효 pH 7.0 및 온도 30℃에서 포도당 첨가-회분식 생물반응기에서 세포 생존도 및 대사적 활성에 미치는 이소프렌의 효과를 감시하도록 수행되었다. 냉동 바이알로부터 가져온 대장균 균주의 접종액은 트립톤-효모추출물 배지 내에 접종되었다. 접종액이 550 nm에서 측정되어 OD 1.0까지 된 이후에, 50 mL 이 1-L 생물반응기에서 0.5 L의 배지를 접종하는 데 사용되었다.

포도당은 세포가 안정상에 도달할 때까지 지수적 속도로 첨가되었다. 이 시간 이후 포도당 첨가는 대사적 요구를 만족시키기 위해 감소되었다. 이소프렌은 질소 기체를 운반체로 사용하여 생물반응기 내로 첨가되었다. 이소프렌 첨가의 속도는 중간-성장기 동안 (OD₅₅₀ = 31-33) 1g/L/시간이었고 전체 75분 (13.2 내지 14.4 시간) 동안 지속되었다. 시간 경과에 따른 생물반응기 내의 OD₅₅₀ 프로파일은 도 134에 나타나있다. 대사적 활성 프로파일은 TCER에 의해 측정된 바와 같이 도 135에 나타나있다. 전체 생존가능한 수 (전체 콜로니 형성 단위)는 이소프렌이 생물반응기 내로 도입되는 기간 동안 14배 정도 증가되었다 (도 136).

실시예 20: Saccharomyces cerevisiae 에 의한 이소프렌의 생산 및 이소프렌 합성효소의 발현

쿠쥬 이소프렌 합성효소는 하이브리드 Saccharomyces cerevisiae/Pichia pastoris 코돈 사용 표에 따라 발현을 위해 최적화되었고, 합성되었으며 또한 pDONR221:19430 (DNA 2.0에 의함, 지도는 도 140 또한 서열 (서열번호 38)은 도 141) 내에 클론되었다. 게이트웨이®클로닝 (Invitrogen) 반응이 제조사의 프로토콜에 따라 수행되었다: pDONR221:19430는 "침입 (entry)" 벡터이기 때문에, LR 클로나제 II 효소 (LR 반응)가 코돈-최적화된 이소프렌 합성효소를 "최종 목적 (destination)" 벡터 pYES-DEST52 (Invitrogen) 내로 도입하는 데 사용되었다.

LR 반응은 다시 제조사의 지침에 따라 화학적으로 능력있는 Top10 세포 (Invitrogen) 내로 형질전환되었고, 이소프렌 합성효소 ORF 를 가지는 pYES-DEST52 플라스미드를 보유하는 박테리아는 50 mg/ml의 카베니실린을 포함하는 LA 플레이트 상에서 선별되었다. 개별 양성 형질전환체는 T7 전방 프라이머 및 효모 이소프렌 합성효소-Rev2 프라이머와 함께 (표 13을 참조하라) 일러스트라-PuReTaq 레디-투-고^TM PCR (illustra PuReTaq Ready-To-Go^TM PCR) 비드 (GE 헬스케어)를 사용한 콜로니 PCR (하기 프라이머 농도 및 열순환 매개변수를 참조하라)에 의해 테스트되었다. 표 13. 이소프렌 합성효소를 증폭하기 위한 프라이머 서열을 나타낸다.

프라이머 명칭	서열 (5' 내지 3')	목적
효모 HGS -For2	CACCAAAGACTTCATAGACT (서열번호 124)	최적화된 효모 이소프렌 합성효소를 위한 전방 프라이머
효모HGS -Rev2	AGAGATATCTTCCTGCTGCT (서열번호 125)	최적화된 효모 이소프렌 합성효소를 위한 역방 프라이머
T7 전방	TAATACGACTCACTATAGGG (서열번호 126)	PCR 및 서열결정 프라이머

정확한 크기 (1354 bp)의 PCR 단편을 수득한 플라스미드는 미니프렙 (Qiagen)에 의해 정제되었고 T7 전방 프라이머 및 효모 이소프렌 합성효소-Rev2 프라이머 (표 13을 참조하라)를 사용한 서열결정 (Quintara Biosciences, Berkeley, CA)을 위해 위탁되었다. 서열결정으로부터 나온 결과는 pDONR221:19430의 기지의 서열과 대비되었고 (벡터 NTI 소프트웨어를 사용함, Invitrogen),단일 플라스미드, pDW14가 심화 연구를 위해 선별되었다 (지도는 도 142A 또한 완전한 서열은 도 142B 및 142C (서열번호 39)). pDW14의 서열은 단일 뉴클레오타이드에 의해 (도 142B에서 굵게 표시됨) pDONR221:19430와는 달라졌다. 단일 뉴클레오타이드 변화 (G에서 A로)는 라이신-인코딩 코돈의 세 번째 위치이기 때문에 ORF에 변화를 가져오지는 못하였다.

정제된 pDW14는 S. c. EasyComp 형질전환 키트 (Invitrogen)를 사용하여 Saccharomyces cerevisiae 균주 INVSc-1에 형질전환되었다. pDW14 또는 pYES-DEST52 (천연 그대로인 URA3 유전자를 포함함)를 보유하는 INVSc-1 균주는 pYES-DEST52 게이트웨이 벡터 매뉴얼 (Invitrogen)에 기술된 바와 같이 2% 포도당을 가진 SC 최소 배지 상에서 우라실 없이 유지되었다. pDW14를 포함하는 INVSc-1의 두 개 독립적인 분리물과 pYES-DEST52를 가진 단일 대조군 균주가 심화 연구를 위해 선택되었다.

이소프렌 합성효소 발현을 유도하기 위하여, 배양은 액체 SC 최소 배지에서 하룻밤 동안 성장되었다. 그 다음 배양은 대략 0.2의 OD₆₀₀으로 희석되었으며 2-3시간 동안 성장되었다. 배양액은 원심분리되었고 한 번 세척되었으며 우라실 없이 1% 라피노스, 2% 갈락토스를 가진 동일한 부피 (10 ml)의 SC 최소 배지에 재현탁하였다. 균주의 OD₆₀₀가 결정되었고 (도 144A), 균주가 원심분리에 의해 수확되었으며 2 ml의 용해 완충용액 (50% 글리세롤과 PEB pH 7.4의 1 : 1 혼합액 : 트리스 염기 2.423 g/L, MgCl₂ (무수형) 1.904 g/L, KCl 14.910 g/L, DTT 0.154 g/L, 글리세롤 50 mL/L)에 재현탁하였다.

용해 혼합물은 프렌치 프레스기를 세 번 통과시켰고, 용출물은 SDS-PAGE에 의해 분석되었다. 쿠마시 (Coomassie) 젤 분석을 위해 (도 143A), 시료를 환원제를 가진 2X SDS 로딩 완충용액으로 1 : 1로 희석시켰고, 4 - 12% 비스-트리스 젤 상에 로딩하였으며 (20 ml 전체 부피), MES 완충용액에서 진행시켰고, 제조사의 프로토콜에 따라 (Invitrogen Novex 시스템) 심플리블루 세이프스테인 (Simply Blue SafeStain)을 사용하여 염색하였다.

웨스턴브리즈 키트 (WesternBreeze kit, Invitrogen)가 트랜스퍼와 나이트로셀룰로스 막 상에 이소프렌 합성효소의 발색 검출을 위해 사용되었다. 일차 항체는 인비트로겐 항체 희석제에서 1 : 1000으로 10주 희석된 1799A이었다. 일차 항체 결합에 이어서 Alexa Fluor 488 (Invitrogen 카탈로그 번호 A-11008)로 표지된 이차 항체로 정량적 신호 결정을 가능하도록 현상되었다. 웨스턴 블럿 절차는 인비트로겐에 의해 기술된 바와 같이 수행되었다. 형광 신호는 블루필터 설정 (blue filter setting)을 사용하여 분자 다이나믹스 스톰 (Molecular Dynamics Storm) 기기에서 기록되었고 분자 다이나믹스 영상측정 (Molecular Dynamics ImageQuant) 영상 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 정량적으로 분석되었다. 라이브러리 구성원의 특이 활성이 유도 배양액의 A60 또는 웨스턴 블럿에 의해 결정된 이소프렌 합성효소 단백질 농도 둘 중 하나로 나눈 생산된 이소프렌량의 비율로부터 계산되었다. 도 143B는 이소프렌 합성효소가 pYES-DEST52을 보유하는 대조군과 대비하여 (레인 1), pDW14를 보유하는 유도된 INVSc-1 균주에 존재하는 것 (레인 2 및 레인 3)을 보여준다.

이소프렌 합성효소 상부공간에 대한 DMAPP 분석법은 각 균주로부터 나온 25 mL 의 용출물 상에서 수행되었고, 5 mL 1 M MgCl₂, 5 mL 100 mM DMAPP, 및 65 mL 50 mM 트리스 pH 8가 첨가되었다. 반응은 30℃에서 15분 동안 기체가 가득찬 1.8 mL GC 튜브에서 수행되었다. 반응은 100 μL의 250 mM EDTA pH 8의 첨가에 의해 정지되었다. 도 144B는 pDW14를 보유하는 유도된 균주의 특이 활성값 (mg HG/L/OD)을 대조군과 대비하여 보여주었다. pDW14를 보유하는 유도된 균주는 이소프렌 합성효소가 없는 대조군보다 대략 20X 더 높은 활성을 나타내었다.

PCR 순환 매개변수

일러스트라 PuReTaq 레디-투-고^TM PCR 비드 (GE Healthcare)가 각각 25 ml 전체 부피/반응에서 0.4 mM 농도인 올리고뉴클레오타이드 프라이머쌍과 함께 사용되었다. LR 클로나제 반응 (Invitrogen)으로부터 나온 플라스미드의 분석을 위해, 선별 플레이트 상의 개별적 콜로니로부터 나온 적은 양의 박테리아가 상기 기술된 PCR 믹스를 포함하는 각 튜브에 첨가되었다. 반응 사이클은 다음과 같다: 1) 95℃ 4분; 2) 95℃ 20초; 3) 52℃ 20초; 4) 72℃ 30초; 2) 내지 4) 단계의 5회 사이클 반복; 5) 95℃ 20초; 6) 55℃ 20초; 7) 72℃ 30초; 5) 내지 7) 단계의 25회 사이클 반복; 72℃ 10분, 또한 식을 때까지 4℃ .

실시예 21: 슈도모나스 및 기타 그램 음성 박테리아에서 이소프렌의 생산

pBBR5HGSOpt2_2의 제작, 슈도모나스 에서 접합 및 이소프렌 합성효소 활성의 측정

푸엘라리아 로바타 (Pueraria lobata, Kudzu 식물)로부터 나온 이소프렌 합성효소를 인코딩하는 유전자는 관심있는 서로 다른 미생물 종에 코돈-최적화되었고 (표 14; fluo-opt2v2는 선택된 서열이었음) DNA2.0, Menlo Park, CA에 의해 합성되었다. fluo-opt2v2의 지도와 서열은 도 145A 및 145B (서열번호 40)에서 확인할 수 있다. HindIII및 BamHI 제한효소 부위가 용이한 클로닝을 위해 합성된 서열에 첨가되었고, RBS가 전사를 증진시키도록 ATG 앞에 첨가되었다.

푸엘라리아 로바타로부터 나온 코돈-최적화된 이소프렌 합성효소의 서로 다른 버전에서 희귀 코돈의 수는 미생물 종의 함수이다. 여러 번의 최적화 과정은 관심있는 종 모두에서 희귀 코돈이 전혀 없는 유전자를 유도하였다.

표 14는 희귀 코돈의 수를 나타낸다.

생물	fluo-opt1 (quote)	fluo-opt2	fluo-opt3	E. coli opt	fluo-opt2v2
Pseudomonas fluorescens Pf-5	19	X	X	57	0
Phodopseudomonas palustris CGA009	37	13	3	74	0
Pseudomonas putida F1	0	0	0	29	0
Corynebacterium glutamicum (ATCC)	4 (Ser)	0	0	0	0
Pseudomonas fluorescens PfO-1	1 (Val)	0	0	57	0

유전자는 클로닝 벡터에서 DNA2.0에 의해 제공된다. 벡터는 HindIII/BamHI로 소화되었고, 관심있는 삽입물에 해당하는 밴드가 젤-정제되었으며, HindIII/BamHI-소화된 pBBR1MCS5 (Kovach et al, Gene 166:175-176, 1995, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 전부, 상세하게는 pBBR1MCS5에 관하여 통합되어 있다)와 결찰되었다 (지도는 도 146A 및 서열은 도 146B 및 146C (서열번호 41)). 그 결과 이것은 이소프렌 합성효소가 pBBR1MCS5에 표현되는 lac 프로모터로부터 발현되는 플라스미드 pBBR5HGSOpt2_2 (지도는 도147A 및 서열은 도 147B 및 147C (서열번호 42))가 되었다.

벡터는 E. coli S17-1에 형질전환되었고 Pseudomonas putida F1 ATCC700007 및 Pseudomonas fluorescens ATCC 13525와 메이팅되었다. LB 상에서 결합 이후에, 플라스미드를-보유하는 슈도모나스 균주에 대한 선별이 M9 + 16 mM 소듐 사이트레이트 + 젠타마이신 50 ug/ml 상에서 시행되었다. 따라서 생성된 균주에서 플라스미드의 존재는 퀴아젠 키트 (Valencia, CA)를 사용한 플라스미드의 제조에 의해 검토될 수 있다.

재조합 균 주P. putida, pBBR5HGSOpt2_2 및 P. fluorescens, pBBR5HGSOpt2_2의 이소프렌 합성효소 활성은 TM3 배지 (실시예 1, 제 II부에 기술된 바와 같음) + 10 g/L 포도당에서 균주를 성장시키고, 중간-로그기에 바이오매스를 수확하며, 프렌치 프레스기에 의해 세포를 파쇄하고 DMAPP 분석법을 시행하여 분석되었다. 분석법의 결과는 표 15에 나타나있다. DMAPP 분석법에 의해 측정되는 활성의 존재는 이소프렌 합성효소가 Pseudomonas에서 발현된 것을 검증하여 주었다.

이소프렌 합성효소 활성은 pBBR5HGSOpt2_2를 사용하여 lac 프로모터로부터 이소프렌 합성효소를 발현하는 슈도모나스 푸티다 및 슈도모나스 플루오레센스에서 조사되었다.

표 15는 슈도모나스 푸티다 및 슈도모나스 플루오레센스에서 이소프렌 합성효소 활성을 나타낸다.

균주	OD	이소프렌 합성효소 활성 mg 이소프렌/(L.h.OD)
P. fluorescens , pBBR5HGSOpt2_2	1.46	0.96
P. putida , pBBR5HGSOpt2_2	3.44	0.65
대조군 ( P. putida w/o plasmid)	8.32	결정될 예정

실시예 22: 대장균 및 슈도모나스 균주의 포도당에 대비한 사탕수수에서의 성장, 및 기질 둘 다를 사용한 이소프렌 합성효소의 발현

I. 액체 사탕수수의 제조.

결정화된 가공하지 않은 사탕수수를 하기 방식으로 물에 녹였다: 750 g H₂O 가 250 g 당에 첨가되었다. 용액은 저어주었고 녹을 때까지 가만히 가열하였다. 일부 물질은 녹지 않았다. 용액의 무게는 용해 이후에 증발된 물을 보충하여 1kg으로 조정되었다. 용액의 부피는 940 mL인 것으로 측정되었다. 따라서 용액의 농도는 265 g/L이었다. 산물 표지는 15 g의 가공되지 않은 사탕수수에 대해 14 g의 탄수화물을 표시하였다. 따라서 용액의 탄수화물 농도는 248 g/L이었다. 건조 고체는 24.03% 이고, 예상된 250 g/kg와 근접한 것으로 측정되었다. 용액의 pH는 5.49이었다. 포도당 농도는 포도당 산화제와 함께 효소적/분광측정 분석법을 사용하여 측정되었다. 포도당 농도는 17.4 g/L이었다.

대다수 미생물은 슈크로스를 사용하지 않지만, 포도당과 과당은 사용할 수 있다. 용액은 둘로 나뉘었다. 하나는 한 번 30분 동안 고압 멸균되었다 (사탕수수 그대로). 포도당 함량이 29.75 g/L로 증가되면서 일부 전환이 생겼다 (도 149를 참조하라). 용액의 나머지 반은 포스포릭산을 사용하여 pH 4.0로 조절된 다음, 고압멸균에 의해 전환되었다 (역슈가). 도 149에서 나타난 바와 같이, 3회의 30분 순환이 완전한 전환을 획득하는 데 충분하였다. 용액 둘 다가 하기 기술된 성장 곡선을 위해 사용되었다.

II. 대장균 및 슈도모나스 의 서로 다른 균주의 포도당에 대비한 사탕수수에서의 성장

표 16에서 나타난 각 균주의 콜로니 한 개가 25 ml TM3 + 10 g/L 포도당에 접종되었고, 30℃에서 200 rpm으로 하룻밤 동안 성장되었다. TM3은 실시예 7, 제 II부에 기술되어 있다. 다음날 아침에 각 배양액 1 ml이 25 mL TM3 및 10 g/L 포도당, 10 g/L 그대로인 사탕수수, 또는 10 g/L 전환된 사탕수수 (상기 기술된 사탕수수 용액)을 포함하는 플라스크를 접종하는 데 사용되었다. 플라스크는 30℃에서 200 rpm으로 배양되었고, 시료는 OD600을 측정하도록 규칙적으로 수집되었다. 도 150 및 도 151은 슈도모나스 및 대장균 균주 둘 다의 경우 성장율 및 바이오매스 수율이 포도당 및 전환된 사탕수수에 대해 비교 가능하였던 것을 보여준다. P. fluorescens는 전환되지 않았던 사탕수수도 사용할 수 있는 약간의 증거를 보여주었다.

표 16은 본 연구에서 사용된 균주들을 나타낸다.

	균주
Escherichia coli	BL21
	MG1655
	ATCC11303
	B REL 606
Pseudomonas	putida F1 (ATCC700007)
	Fluorescens (ATCC13525)

III. 포도당 또는 사탕수수에서 성장할 때 이소프렌을 발현하는 대장균으로부터 이소프렌 생산의 비교.

실시예 14에서 기술된 바와 같이, MVA 경로, M. mazei 로부터 나온 메발로네이트 키나제, 및 푸엘라리아 로바타 (Pueraria lobata)로부터 나온 이소프렌 합성효소를 포함하는 E. coli MCM401 (BL21(DE3))을 TM3 + 10 g/L 포도당 또는 10 g/L 전환된 사탕수수 (시럽의 탄소화물 농도에 근거함) 둘 중 하나에서 성장시켰다. 플라스크는 TM3 + 10 g/L 포도당을 넣어 OD₆₀₀ = 0.2까지 키운 밤샘 배양액으로부터 접종되었다. 필요한 경우 항생제가 첨가되었다. 두 시간 이후에, 대장균 배양액은 400 μM IPTG로 유도되었다. 성장 6시간 이후에, 실시예 2B에 기술된 바와 같이 DMAPP 분석법을 사용하여 이소프렌 생산 및 이소프렌 합성효소 활성이 측정되었다. 결과는 표 17에 나타나있고 전환된 사탕수수가 세포 기준으로 이소프렌 및 이소프렌 합성효소 생산의 측면에서 포도당과 동등한 것을 분명하게 설명하고 있다.

균주	탄소원	OD	이소프렌 합성효소 활성 mg 이소프렌/(L.h.OD)	이소프렌 생산 mg 이소프렌/(L.h.OD)
MCM401	포도당	2.20	21.06	8.98
MCM401	전환된 사탕수수	2.32	20.20	9.23

실시예 23: S. cerevisiae gi1 .2 KKDyI 오페론 , P. alba 이소프렌 합성효소, M. mazei 메발로네이트 키나제 , pCL Upper MVA ( E. faecalis mvaE 및 mvaS ) 및 ybhE ( pgl )을 발현하는 대장균 균주의 제작

(i) EWL201 (BL21, Cm-GI1.2-KKDyI) 균주의 제작

E. coli BL21 (Novagen, EMD Biosciences, Inc.)이 수여 균주로서 MCM331 P1 용출액 (Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc.에 기술된 방법에 따라 제조된 용출액)으로 형질감염되었다. MCM331 세포는 S. cerevisiae 메발로네이트 키나제, 메발로네이트 포스포페이트 키나제, 메발로네이트피로포스페이트 탈탄산화효소, 및 IPP 이소머라제를 인코딩하는 염색체 제작물 gi1.2KKDyI을 포함한다 (예로, S. cerevisiae로부터 나온 gi1.2-KKDyI 오페론). 형질감염체는 세포를 L 아가 및 20 mg/ml 클로로암페니콜 상에 뿌려서 선별되었다. 플레이트는 30℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 형질감염체의 분석은 대조군 플레이트에서 콜로니를 전혀 보여주지 않았다 (전환에 대해 물 + 세포 대조군 플레이트 또한 용출물 오염에 대해 물과 P1 용출물 대조군 플레이트).

네 개의 형질감염체가 찍혔고 5 mL L 액체배지와 20 mg/ml 클로로암페니콜을 접종하는 데 사용되었다. 배양액은 30℃에서 200 rpm으로 진탕하면서 하룻밤 동안 배양되었다. PCR 분석을 위한 각 형질감염체의 게놈 DNA 프렙을 얻기 위하여, 1.5mL의 밤샘 세포 배양액이 원심분리되었다. 세포 펠렛은 400 ml 재현탁 완충용액 (20 mM 트리스, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, pH 7.5)으로 재현탁되었고 4 ml DNase-없는 RNase, (Roche)가 첨가되었다. 튜브는 37℃에서 30분 동안 배양되었고, 이어서 4 ml의 10% SDS와 4 ml의 10 mg/ml 프로테아제 K 스톡 용액 (Sigma-Aldrich)이 첨가되었다. 튜브는 37℃에서 1분 동안 배양되었다. 세포 용출액은 2 ml 상 잠금 라이트 젤 (Phase Lock Light Gel) 튜브 (Eppendorf) 내로 전달되었고 각 200ml의 포화된 페놀 pH 7.9 (Ambion Inc.)과 클로로포름이 첨가되었다. 튜브는 잘 혼합되었고 5분 동안 마이크로 원심분리 되었다. 두 번째 추출이 400 ml의 클로로포름을 사용하여 시행되었고, 수성 층은 새로운 에펜도르프 튜브에 옮겨졌다. 게놈 DNA는 1 ml의 100% 에탄올의 첨가와 5분 동안 원심분리에 의해 침전되었다. 게놈 DNA 펠렛은 1 ml의 70% 에탄올로 세척되었다. 에탄올은 제거되었고 게놈 DNA 펠렛은 간단하게 공기 건조되도록 하였다. 게놈 DNA 펠렛은 200 ml TE에 재현탁되었다.

Pfu Ultra II DNA 중합효소 (Stratagene) 및 주형으로서 200 ng/ml의 게놈 DNA를 사용하여, 2가지의 서로 다른 세트의 PCR 반응 튜브는 제조사의 프로토콜에 따라 제조되었다. 세트 1의 경우, 프라이머 MCM130 및 GB Cm-Rev (표 18)가 형질감염체가 성공적으로 attTn7 좌위 내에 삽입되었는지 입증하는 데 사용되었다. 세트 1을 위한 PCR 매개변수는 95℃ 2분 (최초 사이클만), 95℃ 25초, 55℃ 25초, 72℃ 25초 (2-4 단계의 28회 반복), 72℃ 1분이었다. 세트 2의 경우, 프라이머 MVD 및 MVDRev (표 18)이 gi1.2-KKDyI 오페론이 적절히 삽입되었는지 입증하는데 사용되었다. 세트 2을 위한 PCR 매개변수는 95℃ 2분 (최초 사이클만), 95℃ 25초, 55℃ 25초, 72℃ 10초 (2-4 단계의 28회 반복), 72℃ 1분이었다. 1.2% E-젤 (Invitrogen Corp.) 상에서 PCR 증폭자의 분석은 4개의 형질감염체 클론 모두가 정확한 것을 보여주었다. 한 개를 뽑아 균주 EWL201라고 명명하였다.

(ii) EWL204 (BL21, loopout-GI1.2-KKDyI) 균주의 제작

클로로암페니콜 마커는 Datsenko 및 Wanner (2000) (Datsenko et al., Proc Natl. Acad. Sci USA 97:6640-6645, 2000)에 기술된 바와 같이 플라스미드 pCP20를 사용하여 EWL201 균주 밖으로 빠져나왔다. 대장균 K-12 에서 염색체 유전자의 일-단계 불활성화는 PCR 산물을 사용한다 (Datsenko et al., PNAS, 97: 6640-6645, 2000). EWL201 세포는 L 액체배지에서 중간로그기로 성장된 다음 얼음에 식힌 무균 물로 세 번 세척되었다. 50 ml 분량의 세포 현탁액이 1 ml의 pCP20와 혼합되었고 세포 현탁 혼합액은 2 mm 큐벳 (Invitrogen Corp.)에 넣어 2.5 Volts 및 25uFd에서 진펄서 전기천공기 (Gene Pulser Electroporator, Bio-Rad Inc.)를 사용하여 전기천공되었다. 1 ml의 LB가 바로 세포에 첨가된 다음 14ml 금속 뚜껑을 가진 폴리프로필렌 튜브 (Sarstedt)로 옮겨졌다. 세포는 30℃에서 1시간 동안 키워서 회복되도록 하였다. 형질전환체는 L 아가 및 20 mg/ml 클로로암페니콜과 50 mg/ml 카베니실린 상에서 선별되었고 30℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 다음 날, 단일 콜론이 10 ml L 액체배지 및 50 mg/ml 카베니실린에서 초기 로그기까지 배양되었다. 자라는 배양액의 온도는 그 다음 2시간 동안 42℃로 올랐다. 일련의 희석이 시행된 다음 세포는 LA 플레이트 (항생제 선별 없음) 상에 뿌려졌으며 30℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 다음 날, 20개의 콜로니가 뽑혔고 L 아가 (항생제 없음) 또한 LA 와 20 mg/ml 클로로암페니콜 플레이트 상에 찍었다. LA 플레이트 상에서 성장할 수 있지만 LA와 20 mg/ml 클로로암페니콜 플레이트 상에서는 그렇지 못한 세포는 클로로암페니콜 마커가 빠져나온 것이 되었다 (한 개를 뽑아 EWL204 균주라고 명명하였다).

(iii) 플라스미드 pEWL230 (pTrc P. alba)의 제작

포풀라 알바 (Populus alba) 이소프렌 합성효소 (P. alba HGS)를 인코딩하는 합성 유전자의 생성은 대장균 발현을 위한 코돈-최적화에 근거하여 외부업체 DNA2.0 Inc. (Menlo Park, CA)에 맡겼다. 합성 유전자는 플라스미드 pET24a (Novagen, EMD Biosciences, Inc.) 내에 주문 클론되었고 냉동건조로 운반되었다 (도 152, 도 153A 내지 153B; 서열번호 43).

P. alba 이소프렌 합성효소 (P. alba HGS) 유전자를 증폭하기 위하여 PCR 반응이 주형으로서 pET24a P. alba HGS, 프라이머 MCM182 및 MCM192, 또한 허큘라제 II 융합 DNA 종합효소 (Stratagene)를 제조사의 지침에 따라 사용하여 수행되었다. PCR 조건은 다음과 같았다: 95℃ 2분 (최초 사이클만), 95℃ 25초, 55℃ 20초, 72℃ 1분, 28회 반복, 또한 72℃ 1분 동안 최종 연장. P. alba 이소프렌 합성효소 PCR 산물은 QIAquick PCR 정제 키트 (Qiagen Inc.)를 사용하여 정제되었다.

P. alba 이소프렌 합성효소 PCR 산물은 다시 2 ml 10X NEB 완충용액 4와 함께 1 ml의 BspHI 제한효소 (New England Biolabs)를 포함하는 20 ml 반응에서 소화되었다. 반응은 37℃에서 2시간 동안 배양되었다. 그 다음 소화된 PCR 단편은 QIAquick PCR 정제 키트를 사용하여 정제되었다. 두 번째 제한효소 소화가 2 ml 10X 완충용액 H와 함께 1 ml PstI 제한효소 (Roche)를 포함하는 20 ml 반응에서 수행되었다. 반응은 37℃에서 2시간 동안 배양되었다. 그 다음 소화된 PCR 단편은 QIAquick PCR 정제 키트를 사용하여 정제되었다. 플라스미드 pTrcHis2B (Invitrogen Corp.)는 1 ml NcoI 제한효소 (Roche), 1 ml PstI 제한효소, 및 2 ml 10X 완충용액 H를 포함하는 20 ml 반응에서 소화되었다. 반응은 37℃에서 2시간 동안 배양되었다. 소화된 pTrcHis2B 벡터는 1.2% E-젤 (Invitrogen Corp.)을 사용하여 젤 정제되었고 QIAquick 젤 추출 키트 (Qiagen) 를 사용하여 추출되었다 (도 154). BspHI 및 NcoI 부위의 양립가능한 점착성 말단을 사용하여, 5 ml P. alba 이소프렌 합성효소 삽입물, 2ml pTrc 벡터, 1 ml T4 DNA 라이게이즈 (New England Biolabs), 2 ml 10X 라이게이즈 완충용액, 및 10 ml ddH₂O를 포함하는 20ml라이게이션 반응이 제조되었다. 라이게이션 혼합액은 상온에서 40분 동안 배양되었다. 라이게이션 혼합액은 dd H₂O 의 페트리 디쉬에 넣은 0.025 mm 나이트로셀룰로스 막 필터 (Millipore)를 부유시키고 라이게이션 혼합액을 상온에서 30분 동안 나이트로셀룰로스 막 필터 위에 가만히 적용하여 탈염시켰다. MCM446 세포 (섹션 II를 참조하라) 는 LB 에서 중간로그기로 성장시킨 다음 얼음에 식힌 무균 물로 세 번 세척하였다. 50 ml 분량의 세포 현탁액이 5 ml의 탈염된 pTrc P.alba HGS 라이게이션 믹스와 혼합되었다. 세포 현탁 혼합액은 2 mm 큐벳에 넣어 2.5 Volts 및 25 μFd에서 진펄서 전기천공기를 사용하여 전기천공되었다. 1 ml의 LB가 바로 세포에 첨가된 다음 14 ml 금속 뚜껑을 가진 폴리프로필렌 튜브 (Sarstedt)로 옮겨졌다. 세포는 30℃에서 2시간 동안 키워서 회복되도록 하였다. 형질전환체는 L 아가와 50 mg/ml 카베니실린 또한 10 mM 메발론산 상에서 선별되었고 30℃에서 배양되었다. 다음 날, 6개의 형질전환체가 뽑혔고 5 ml L 액체배지 및 50 mg/ml 카베니실린 튜브에서 30℃로 하룻밤 동안 배양되었다. 플라스미드 프렙이 밤샘 배양액으로 QIAquick 스핀 미니프렙 키트 (Qiagen)를 사용하여 수행되었다. 플라스미드를 증식하기 위해 BL21세포를 사용하기 때문에, 스핀 컬럼을 PB 완충용액 5X 및 PE 완충용액 3X로 세척하는 변형이 높은 품질의 플라스미드 DNA를 성취하기 위해 제조사의 표준 프로토콜에 통합되었다. 플라스미드는 20ml 반응에서 PstI으로 소화되어 정확한 크기의 직선상 단편을 입증하였다. 모두 6개의 플라스미드가 정확한 크기를 가졌고 프라이머 MCM65, MCM66, EL1000 (표 18)를 사용한 서열결정을 위해 퀸타라 바이오사이언스사 (Quintara Biosciences, Berkeley, CA)로 보내졌다. DNA 서열결정 결과는 6개 플라스미드 모두가 정확한 것으로 보여주었다. 한 개의 플라스미드가 뽑혔고 플라스미드 EWL230라고 명명하였다 (도 155, 도 156A 및 156B; 서열번호 44).

(iv) 플라스미드pEWL244 (pTrc P. alba-mMVK)의 제작

메타노사르시나 마제이 (Methanosarcina mazei, M. mazei) MVK 유전자를 증폭하기 위하여, PCR 반응이 주형으로 MCM376 (하기 섹션 (v)를 참조하라), 프라이머MCM165 및 MCM177 (표 18을 참조하라), 및 Pfu Ultra II 융합 DNA 중합효소(Stratagene)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 수행되었다. PCR 조건은 하기와 같았다: 95℃ 2분 (최초 사이클만), 95℃ 25초, 55℃ 25초, 72℃ 18분, 28회 반복, 또한 72℃ 1분 동안 최종 연장. M. mazei 이소프렌 합성효소 PCR 산물은 QIAquick PCR 정제 키트 (Qiagen Inc.)를 사용하여 정제되었다.

M. mazei MVK PCR 산물은 그 다음 8 ml PCR 산물, 2 ml PmeI 제한효소 (New England Biolabs), 4 ml 10X NEB 완충용액 4, 4 ml 10X NEB BSA, 및 22 ml of ddH₂O를 포함하는 40 ml 반응으로 소화되었다. 반응은 37℃에서 3시간 동안 배양되었다. 그 다음 소화된 PCR 단편은 QIAquick PCR 정제 키트를 사용하여 정제되었다. 두 번째 제한효소 소화는 2 ml NsiI 제한효소 (Roche), 4.7 ml 10X 완충용액 H, 및 40 ml의 PmeI 소화된 M. mazei MVK 단편을 포함하는 47 ml 반응으로 수행되었다. 반응은 37℃에서 3시간 동안 배양되었다. 그 다음 소화된 PCR 단편은 1.2% E-젤을 사용하여 젤 정제되었고 QIAquick 젤 추출 키트 (Qiagen)를 사용하여 추출되었다. 플라스미드 EWL230는 10 ml 플라스미드, 2ml PmeI 제한효소, 4 ml 10X NEB 완충용액 4, 4 ml 10X NEB BSA, 및 20 ml of ddH₂O를 포함하는 40 ml 반응으로 소화되었다. 반응은 37℃에서 3시간 동안 배양되었다. 그 다음 소화된 PCR 단편은 QIAquick PCR 정제 키트를 사용하여 정제되었다. 두 번째 제한효소 소화는 2ml PstI 제한효소, 4.7 ml 10X 완충용액 H, 및 40 ml의 PmeI 소화된 M. mazei EWL 단편을 포함하는 47 ml 반응으로 수행되었다. 반응은 37℃에서 3시간 동안 배양되었다. 그 다음 소화된 PCR 단편은 1.2% E-젤을 사용하여 젤 정제되었고 QIAquick 젤 추출 키트 (Qiagen)를 사용하여 추출되었다 (도 157). NsiI 및PstI 부위의 양립가능한 점착 발단을 사용하여, 8 ml M. mazei MVK 삽입물, 3 ml EWL230 플라스미드, 1 ml T4 DNA 라이게이즈, 2 ml 10X 라이게이즈 완충용액, 및 6 ml ddH₂O을 포함하는 20 ml 라이게이션 반응이 제조되었다. 라이게이션 혼합액은 16˚C에서 하룻밤 동안 배양되었다. 다음 날, 라이게이션 혼합액은 ddH₂O의 페트리 디쉬에 넣은 0.025 mm 나이트로셀룰로스 막 필터를 부유시키고 라이게이션 혼합액을 상온에서 30분 동안 나이트로셀룰로스 막 필터 위에 가만히 적용하여 탈염시켰다. MCM446 세포는 LB 에서 중간로그기로 성장시킨 다음 얼음에 식힌 무균 물로 세 번 세척하였다. 50 ml 분량의 세포 현탁액이 5 ml의 탈염된 pTrc P.alba mMVK 라이게이션 믹스와 혼합되었다. 세포 현탁 혼합액은 2 mm 큐벳에 넣어 2.5 Volts 및 25 μFd에서 진펄서 전기천공기를 사용하여 전기천공되었다. 1 ml의 LB가 바로 세포에 첨가된 다음 14 ml 금속 뚜껑을 가진 폴리프로필렌 튜브로 옮겨졌다. 세포는 30℃에서 2시간 동안 키워서 회복되도록 하였다. 형질전환체는 LA와 50 mg/ml 카베니실린 또한 5 mM 메발론산 플레이트 상에서 선별되었고 30℃에서 배양되었다. 다음 날, 6개의 형질전환체가 뽑혔고 5 ml L 액체배지 및 50 mg/ml 카베니실린 튜브에서 30℃ 로 하룻밤 동안 배양되었다. 플라스미드 프렙이 밤샘 배양액으로 QIAquick 스핀 미니프렙 키트 (Qiagen)를 사용하여 수행되었다. 플라스미드를 증식하기 위해 BL21세포를 사용하기 때문에, 스핀 컬럼을 PB 완충용액 5X 및 PE 완충용액 3X로 세척하는 변형이 높은 품질의 플라스미드 DNA를 성취하기 위해 제조사의 표준 프로토콜에 통합되었다. 플라스미드는 20ml 반응에서 PstI으로 소화되어 정확한 크기의 직선상 단편을 입증하였다. 6개 플라스미드 중 세 개가 정확한 크기를 가졌고 프라이머 MCM65, MCM66, EL1000, EL1003, 및 EL1006 (표 18)를 사용한 서열결정을 위해 퀸타라 바이오사이언스사로 보내졌다. DNA 서열결정 결과는 3개 플라스미드 모두가 정확한 것을 보여주었다. 한 개의 플라스미드가 뽑혔고 플라스미드 EWL244라고 명명하였다 (도 158, 도 159A 및 159B; 서열번호 45).

(v) pET200D의 M. mazei archaeal Lower로부터 플라스미드 MCM376 - MVK의 제작

M. mazei archaeal 하부 경로 오페론으로부터 나온 MVK ORF (도 160A 내지 160C; 서열번호 46) 가 인비트로겐 플래티넘 HiFi PCR 믹스를 사용하여 프라이머MCM161 및 MCM162 (표 18)로 PCR 증폭되었다. 45 μL의 PCR 혼합액이 1 μL 주형, 1 μL 의 각 10 μM 프라이머, 및 2 μL 물과 조합되었다. 반응은 하기와 같이 순환되었다: 94℃ 2분; 94℃ 30초, 55℃ 30초, 및 68℃ 1.15분, 30회 반복; 그 다음 72℃ 7분, 및 식을 때까지 4℃. 본 PCR 반응 3 μL은 인비트로겐 pET200D 플라스미드에 제조사의 프로토콜에 따라 결찰되었다. 본 라이게이션 반응 3 μL은 인비트로겐 TOP10 세포 내로 도입되었고, 형질전환체는 LA/kan50 상에서 선별되었다. 형질전환체로부터 나온 플라스미드가 분리되었고 삽입물는 서열결정되어 그 결과 MCM376이 제조되었다 (도 161A 내지 161C).

(vi) EWL251 (BL21(DE3), Cm-GI1.2-KKDyI, pTrc P.alba-mMVK) 균주의 제작

MCM331 세포 (S. cerevisiae 메발로네이트 키나제, 메발로네이트 포스포페이트 키나제, 메발로네이트피로포스페이트 탈탄산화효소, 및 IPP 이소머라제를 인코딩하는 염색체 제작물 gi1.2KKDyI을 포함한다)는 LB 배지에서 중간로그기로 성장시킨 다음 얼음에 차갑게 한 무균 물에 세 번 세척하였다. 50 ml의 세포 현탁액은 1 ml의 플라스미드EWL244와 혼합되었다. 세포 현탁 혼합액은 2 mm 큐벳에 넣어 2.5 Volts 및 25 μFd에서 진펄서 전기천공기를 사용하여 전기천공되었다. 1 ml의 LB가 바로 세포에 첨가된 다음 14 ml 금속 뚜껑을 가진 폴리프로필렌 튜브로 옮겨졌다. 세포는 30℃에서 2시간 동안 키워서 회복되도록 하였다. 형질전환체는 LA와 50 mg/ml 카베니실린 및 5 mM 메발론산 플레이트 상에서 선별되었고 37℃에서 배양되었다. 한 개의 콜로니가 선택되었고 균주 EWL251이라고 명명되었다.

(vii) EWL256 (BL21(DE3), Cm-GI1.2-KKDyI, pTrc P.alba-mMVK, pCL Upper MVA) 균주의 제작

EWL251 세포는 LB에서 중간로그기로 성장시킨 다음 얼음에 차갑게 한 무균 물에 세 번 세척하였다. 50 ml의 세포 현탁액은 1 ml의 플라스미드 MCM82 (E. faecalis mvaE 및 mvaS를 인코딩하는 pCL PtrcUpperPathway ("pCL Upper MVA"라고도 알려려 있음)와 혼합되었다. 플라스미드 pCL Ptrc Upper Pathway는 상기 실시예 8에서 기술된 바와 같이 제작되었다. 세포 현탁 혼합액은 2 mm 큐벳에 넣어 2.5 Volts 및 25 μFd에서 진펄서 전기천공기를 사용하여 전기천공되었다. 1 ml의 LB가 바로 세포에 첨가되었다. 그 다음 세포는 14 ml 금속 뚜껑을 가진 폴리프로필렌 튜브로 옮겨졌다. 세포는 30℃에서 2시간 동안 키워서 회복되도록 하였다. 형질전환체는 LA와 50 mg/ml 카베니실린 및 50 mg/ml 스펙티노마이신 플레이트 상에서 선별되었고 37℃에서 배양되었다. 한 개의 콜로니가 뽑혔고 균주 EWL256이라고 명명되었다.

표 18은 프라이머 서열들을 나타낸다.

프라이머 명칭	프라이머 서열
MCM130	ACCAATTGCACCCGGCAGA (서열번호 127)
GB Cm Rev	GCTAAAGCGCATGCTCCAGAC (서열번호 128)
MVD For	GACTGGCCTCAGATGAAAGC (서열번호 129)
MVD Rev	CAAACATGTGGCATGGAAAG (서열번호 130)
MCM182	GGGCCCGTTTAAACTTTAACTAGACTCTGCAGTTAGCGTTCAAACGGCAGAA (서열번호 131)
MCM192	CGCATGCATGTCATGAGATGTAGCGTGTCCACCGAAAA (서열번호 132)
MCM65	ACAATTTCACACAGGAAACAGC (서열번호 133)
MCM66	CCAGGCAAATTCTGTTTTATCAG (서열번호 106)
EL1000	GCACTGTCTTTCCGTCTGCTGC (서열번호 134)
MCM165	GCGAACGATGCATAAAGGAGGTAAAAAAACATGGTATCCTGTTCTGCGCCGGG TAAGATTTACCTG (서열번호 122)
MCM177	GGGCCCGTTTAAACTTTAACTAGACTTTAATCTACTTTCAGACCTTGC (서열번호 123)
EL1003	GATAGTAACGGCTGCGCTGCTACC (서열번호 137)
EL1006	GACAGCTTATCATCGACTGCACG (서열번호 138)
MCM161	CACCATGGTATCCTGTTCTGCG (서열번호 120)
MCM162	TTAATCTACTTTCAGACCTTGC (서열번호 121)

(viii) RM111608-2 (Cm-GI1.2-KKDyI, pTrc P.alba-mMVK, pCL Upper MVA, pBBRCMPGI1.5-pgl) 균주의 제작

이소프렌 합성효소를 생산하는 대장균 BL21 균주 (EWL256)가 복제 플라스미드 pBBR1MCS5(젠타마이신) (Dr. K. Peterson, Louisiana State University로부터 획득함) 상에서 ybhE 유전자의 전신성 발현 (E. coli 6-포스포글루코노락토나제 (phosphogluconolactonase))을 사용하여 제작되었다.

FRT-기초한 재조합 카세트, Red/ET-매개성 삽입을 위한 플라스미드 및 루프아웃 항생제 마커는 진브리지 (Gene Bridges GmbH, Germany)로부터 획득되었다. 이들 재료를 사용하는 절차는 진브리지 프로토콜에 따라 수행되었다. 프라이머 Pgl-F (서열번호 139) 및 PglGI1.5-R (서열번호 140)가 FRT-gb2-Cm-FRT주형으로부터 저항성 카세트를 스트라타젠 허큘라제 II 융합 키트를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 증폭시키는 데 사용되었다. PCR 반응 (50 μL의 최종 부피)은 다음을 포함한다: 5 μL 완충용액, 1 μL 주형 DNA (진브리지로부터 나온 FRT-gb2-Cm-F), 10 pmols의 각 프라이머, 및 1.5 μL의 25mM dNTP 믹스에 dH₂O를 첨가하여 50 μL로 제조됨. 반응은 다음과 같이 순환되었다: 95℃ 1 x 2 분; 그 다음 30회 반복 (95℃ 30초; 63℃ 30초; 72℃ 3분).

그 결과 나온 PCR 산물은 QiaQuick PCR 정제 키트 (Qiagen)를 사용하여 정제되었고 pRed-ET 재조합효소-포함하는 플라스미드를 보유하는 전기적으로 능력있는 MG1655 세포 내로 하기와 같이 전기천공되었다. 세포는 5 mL의 L 배지에서 OD600 ~0.6 로 30℃에서 성장시켜 제조되었다. 세포는 4% 아라비노스의 첨가에 의해 재조합효소의 발현이 유도되었고, 30℃에서 30분 동안 성장시켰으며 이어서 37℃에서 30분 동안 성장되었다. 1.5 mL 분량의 세포가 얼음에 차갑게 한 dH₂O로 세척되었다. 최종 세포 펠렛은 40 μL 의 얼음에 차갑게 한 dH₂O에 재현탁되었고 2-5 μL 의 PCR 산물이 첨가되었다. 전기천공법은 1-mm 공간 큐벳에 넣어 1.3 kV에서 진펄서 전기천공기 (Bio-Rad Inc.)를 사용하여 수행되었다. 세포는 30℃에서 1-2시간 동안 회복되었고, 클로로암페니콜 (5 mg/ml)을 포함하는 L 아가 상에 도말되었다. 다섯 개의 형질전환체가 PCR에 의해 분석되었고 삽입 부위가 끼워진 프라이머 (2가지 프라이머 세트: pgl 및 49 rev와 3' EcoRV-pglstop; Bottom Pgb2 및 Top GB CMP (946))를 사용하여 서열결정되었다. 정확한 형질전환체가 선별되었고, 본 균주는 MG1655 GI1.5-pgl::CMP라고 명명되었다.

MG1655 GI1.5-pgl::CMP의 염색체 DNA가 FRT-CMP-FRT-GI1.5 - ybhE 제작물을 포함하는 PCR 단편을 생성하는데 주형으로서 사용되었다. 본 제작물은 pBBR1MCS5 (젠타마이신) 내로 하기와 같이 클론되었다. 여기서 CMP-GI1.5-pgl라고 명명되는 단편은 5'프라이머 Pglconfirm-F (서열번호 141) 및 3' 프라이머 EcoRV-pglstop (서열번호 142)를 사용하여 증폭되었다. 그 결과 나온 단편은 인비트로겐 TOPO-Blunt 클로닝 키트를 사용하여 제조사로부터 제시된 바와 같이 플라스미드 벡터 pCR-Blunt II-TOPO 내로 클론되었다. CMP-GI1.5-pgl 단편을 보유하는 NsiI 단편은 pBBR1MCS5(전타마이신)의 PstI 부위 내로 클론되었다. 5ml CMP-GI1.5-pgl 삽입물, 2 ml pBBR1MCS5 (전타마이신) 벡터, 1 ml T4 DNA 라이게이즈 (New England Biolabs), 2 ml 10X 라이게이션 완충용액, 및 10 ml ddH₂O 을 포함하는 20 ml의 라이게이션 반응이 제조되었다. 라이게이션 혼합액은 상온에서 40분 동안 배양된 다음 2-4 μL이 전기적으로 능력있는 Top10 세포 (Invitrogen) 내로 상기 기재된 매개변수를 사용하여 전기천공되었다. 형질전환체는 10 μg/ml 클로로암페니콜 및 5 μg/ml 젠타마이신을 포함하는 L 아가 상에서 선별되었다. 선택된 클론의 서열은 상기에 기술된 많은 프라이머 뿐만 아니라 Sequetech, CA 에 의해 제공된 보통의 T3 및 역방 프라이머를 사용하여 결정되었다. 본 플라스미드는 pBBRCMPGI1.5-pgl라고 명명되었다 (도 162, 또한 도 163A 및 163B, 또한 서열번호 48).

본 명세서에서 기술된 바와 같이, 플라스미드 pBBRCMPGI1.5-pgl는 EWL256 내로 전기천공되었고 형질전환체는 클로로암페니콜 (10 μg/mL), 젠타마이신 (5 μg/mL), 스펙티노마이신 (50 μg/mL), 및 카베니실린 (50 μg/mL)을 포함하는 L 아가 상에 도말되었다. 한 개의 형질전환체가 선택되었고 균주 RM111608-2라고 명명되었다.

프라이머:

Pgl-F

5'-accgccaaaagcgactaattttagctgttacagtcagttgaattaaccctcactaaagggcggccgc-3'

(서열번호 139)

PglGI1.5-R

5'- gctggcgatataaactgtttgcttcatgaatgctcctttgggttacctccgggaaacgcggttgatttgtttagtggttgaattatttgctcaggatgtggcatagtcaagggcgtgacggctcgctaatacgactcactatagggctcgag-3'(서열번호 140)

3' EcoRV-pglstop:

5'-CTT GAT ATC TTA GTG TGC GTT AAC CAC CAC (서열번호 142)

pgl +49 rev: CGTGAATTTGCTGGCTCTCAG (서열번호 136)

Bottom Pgb2: GGTTTAGTTCCTCACCTTGTC (서열번호 135)

Top GB' CMP (946): ACTGAAACGTTTTCATCGCTC (서열번호 92)

Pglconfirm-F

5'-accgccaaaagcgactaattttagct-3'(서열번호 141)

실시예 24: 대장균에서 ybhE (pgl)의 전신성 발현에 의한 이소프렌 합성의 개선

본 실시예는 E. coli ybhE (pgl)를 전신적으로 발현하는 균주에서 이소프렌의 생산을 ybhE 를 야생형 수준으로 발현하는 대조군 균주 (예로, EWL256)과 대비하여 보여주고 있다. 유전자ybhE (pgl)는 이종유래 발현된 단백질의 해독후 글루코닐화를 억제하고 산물 용해도와 수율을 개선시키면서 펜토스 포스페이트 경로를 통한 바이오매스 수율 및 유량도 개선시키는 E. coli 6-포스포글루코노락토나제를 인코드한다 (Aon et al., Applied and Environmental Microbiology, 74(4): 950-958, 2008).

i) 소규모 분석

배지 레시피 (발효 배지 리터 당): K₂HPO₄ 7.5 g, MgSO₄ * 7H₂O 2 g, 시트르산 모노하이드레이트 2 g, 철 암모늄 시트르산 0.3 g, 효모추출물 0.5 g, 1000X 변형된 미량 금속 용액 1 ml. 모든 성분은 다같이 첨가되었고 diH₂O에 녹였다. pH는 7.0으로 암모늄 하이드록사이드 (30%)를 사용하여 조정되었고 부피를 맞추었다. 배지는 0.22 마이크론 필터로 여과-멸균되었다. 포도당 10 g, 티아민 * HCl 0.1 g, 및 항생제가 멸균 및 pH 조정 이후에 첨가되었다.

1000X 미량 금속 용액 (발효 배지 리터 당): 시트르산 * H₂O 40 g, MnSO₄ * H₂O 30 g, NaCl 10 g, FeSO₄ * 7H₂O 1 g, CoCl₂ * 6H₂O 1 g, ZnSO * 7H₂O 1 g, CuSO₄ * 5H₂O 100 mg, H₃BO₃ 100 mg, NaMoO₄ * 2H₂O 100 mg. 각 성분은 한 번에 하나씩 DIH₂O에 녹였다. pH는 3.0으로 HCl/NaOH를 사용하여 조정한 다음, 용액으로 부피를 맞추었고 0.22 마이크론 필터로 여과-멸균되었다.

(a) 실험적 절차

이소프렌 합성은 마이크로리액터 테크놀로지사 (MicroReactor Technologies, Inc)로부터 나온 Cellerator^TM 에서 균주를 성장시켜서 분석되었다. 24 웰의 각각의 작동 부피는 4.5 mL이었다. 온도는 30℃로 유지되었고, pH 설정점은 7.0이었으며, 산소 유량 설정점은 20 sccm이었고 진탕 속도는 800 rpm이었다. 냉동 바이알로부터 가져온 E. coli 균주의 접종액이 LB 액체배지 아가 플레이트 (항생제 참가) 상에 뿌려졌고 30℃에서 배양되었다. 단일 콜로니가 항생제를 가진 배지에 접종되었고 하룻밤 동안 성장되었다. 박테리아는 항생제를 가진 배지 4.5 mL 내로 550 nm에서 측정된 광학 밀도 0.05 에 도달하도록 희석되었다.

이소프렌의 배출-기체 분석은 기체 크로마토그래프-질량 분광측정기 (GC-MS) (Agilent) 상부공간 분석법을 사용하여 수행되었다. 시료 제조는 다음과 같다: 전체 액체배지 100 mL를 밀봉된 GC 바이알에 넣었고 고정된 30분 시간 동안 30℃에서 배양되었다. 이어서 70℃에서 5분 동안 배양되는 것으로 구성되는 열 사멸 단계가 시행되었고 시료는 GC에 로딩되었다.

550 nm 의 파장에서의 광학 밀도 (OD)가 진행 과정 동안 마이크로플레이트 리더 (Spectramax)를 사용하여 획득되었다. 특이 생산도가 이소프렌 농도 (mg/L)를 OD 해독 및 시간대 (시간)로 나누어 획득되었다.

두 가지 균주 EWL256 및 RM11608-2는 200 및 400 uM IPTG 유도 수준에서 조사되었다. 시료는 유도후 1, 2.5, 4.75, 및 8 시간대에서 이소프렌 생산에 대해 분석되었다. 시료는 이중으로 분석되었다.

(b) 결과

실험은 2가지 서로 다른 IPTG 농도에서, ybhE (pgl) 를 발현하는 균주는 이소프렌의 특이 생산도가 대조군 균주와 대비하여 2-3배 극적으로 증가하는 것을 보여주었다.

Cm-GI1.2-KKDyI, M. mazei 메발로네이트 키나제, P. alba 이소프렌 합성효소, 및 ybhE (pgl) (RM111608-2)을 발현하는 대장균으로부터 15 -L 규모로 사료첨가-회분식 배양에서 배양된 이소프렌 발효.

배지 레시피 (발효 배지 리터 당): K₂HPO₄ 7.5 g, MgSO₄ * 7H₂O 2 g, 시트르산 모노하이드레이트 2 g, 철 암모늄 시트르산 0.3 g, 효모추출물 0.5 g, 1000X 변형된 미량 금속 용액1 ml. 모든 성분은 다같이 첨가되었고 diH₂O에 녹였다. 본 용액은 고압 멸균되었다. pH는 7.0으로 암모늄 하이드록사이드 (30%)를 사용하여 조정되었고 부피를 q.s. 맞추었다. 포도당 10 g, 티아민 * HCl 0.1 g, 및 항생제가 멸균 및 pH 조정 이후에 첨가되었다.

1000X 미량 금속 용액 (발효 배지 리터 당): 시트르산 * H₂O 40 g, MnSO₄ * H₂O 30 g, NaCl 10 g, FeSO₄ * 7H₂O 1 g, CoCl₂ * 6H₂O 1 g, ZnSO * 7H₂O 1 g, CuSO₄ * 5H₂O 100 mg, H₃BO₃ 100 mg, NaMoO₄ * 2H₂O 100 mg. 각 성분은 한 번에 하나씩 DI H₂O에 녹였다. pH는 3.0으로 HCl/NaOH를 사용하여 조정한 다음, 부피를 q.s. 맞추었고 0.22 마이크론 필터로 여과-멸균되었다.

발효는 상부 메발론산 (MVA) 경로 (pCL Upper), 삽입된 하부 MVA 경로 (gi1.2KKDyI), M. mazei로부터 나온 메발로네이트 키나제의 높은 발현 및 P. alba (pTrcAlba-mMVK)로부터 나온 이소프렌 합성효소, 및 E. coli pgl (pBBR-pgl)의 높은 발현을 포함하는 대장균 BL21(DE3) 세포를 사용하여 15-L 생물반응기에서 수행되었다. 본 실험은 원하는 발효 pH 7.0 및 온도 34℃에서 포도당으로부터 이소프렌 형성을 감시하도록 수행되었다. 대장균 균주의 냉동 바이알은 해동되었고 트립톤-효모추출물 배지 내에 접종되었다. 접종액이 550 nm에서 측정되어 OD 1.0까지 된 이후에, 500 mL 이 초기 부피가 5-L가 되는15-L 생물반응기를 접종하는 데 사용되었다.

포도당은 세포가 안정상에 도달할 때까지 지수적 속도로 첨가되었다. 이 시점 이후 포도당 첨가는 대사적 요구를 만족시키기 위해 감소되었다. 40시간 (59시간) 발효 동안 생물반응기로 운반된 포도당의 전체 양은 3.1 kg (59시간에서는 4.2 kg)이었다. 유도는 IPTG를 첨가하여 달성되었다. IPTG 농도는 광학 밀도가 550 nm (OD₅₅₀)에서 4값에 도달할 때 110 μM가 되었다. IPTG 농도는 OD₅₅₀이 150에 도달할 때 192 μM로 올라갔다. 시간 경과에 따른 생물반응기의 OD₅₅₀ 프로파일은 도 164A에 나타나 있다. 생물반응기로부터 나온 배출기체에서 이소프렌의 수준은 하이덴 질량 분광측정기를 사용하여 결정되었다. 이소프렌의 역가는 발효과정의 경과에 따라 40시간에서 33.2 g/L (59시간에서는 48.6 g/L)의 최대값까지 증가되었다 (도 164B). 발효과정의 경과에 따른 이소프렌 역가는 40시간에서 40.0 g/L (59시간에서는 60.5 g/L)의 최대값까지 증가되었다 (도 164C). 40시간 발효 동안 생산된 이소프렌의 전체 양은 281.3 g (59시간에서는 451.0 g)이었고, 생산의 시간 과정은 도 164D에 나타나있다. 부피측정 생산도의 시간 경과는 도 164E에 나타나있고, 4 및 40 시간 사이에서 1.0g/L/시간의 평균 비율이 유지되었다 (19 및 59시간 사이에서는 1.0g/L/시간). 대사적 프로파일은 CER에 의해 측정된 바와 같이 도 164F에 나타나있다. 발효과정 동안 이소프렌을 생산하는 데 들어갔던 사용된 탄소의 몰라 수율은 40시간에서 19.6% (59시간에서는 23.6%)이었다. 포도당으로부터 나온 이소프렌의 무게 퍼센트 수율은 40시간에서 8.9% (59시간에서는 10.7%)이었다.

실시예 25: M. mazei 메발로네이트 키나제, P. alba 이소프렌 합성효소, pCL Upper MVA ( E. faecalis mvaE와 mvaS) 및 ybhE (pgl)를 발현하는 대장균 균주에서 이소프렌 및 수소의 공동-생산

발효 배출-기체의 수집 및 수소와 이소프렌 수준에 대한 분석

발효는 균주 RM111608-2 (E. coli BL21 (DE3), pCL Upper MVA, cmR-gi1.2-yKKDyI, pTrcAlba-mMVK, pBBR cmR-gi1.5-pgl) 및 EWL 256 (E. coli BL21 (DE3), pCL Upper MVA, cmR-gi1.2-yKKDyI, pTrcAlba-mMVK)를 사용하여 수행되었다. 박베타리 균주의 제작은 상기 실시예 23에 기술되어 있다.

대장균으로부터 이소프렌의 대량 생산은 M. mazei 메발로네이트 키나제, P. alba 이소프렌 합성효소, pCL Upper MVA (E. faecalis mvaE 와 mvaS)를 발현하고 ybhE (pgl)를 전신적으로 발현 (RM111608-2)하거나 ybhE (pgl) 를 정상적으로 발현 (EWL256)하는 E. coli 균주 EWL256 및 RM111608-2의 사료첨가-회분식 배양으로부터 조사되었다. 본 실험은 성장하는 세포가 포도당 존재 시 이소프렌과 수소를 공동-생산하게 되는 것을 보여준다.

발효 배지 (TM2) 리터 당 발효 배지의 레시피는 다음과 같다: K₂HPO₄ 13.6 g, KH₂PO₄ 13.6 g, MgSO₄ * 7H₂O 2 g, 시트르산 모노하이드레이트 2 g, 철 암모늄 시트르산 0.3 g, (NH₄)₂SO₄ 3.2g, 효모추출물 5 g, 1000X 변형된 미량 금속 용액1 ml. 1000X 변형된 미량 금속 용액: 시트르산 * H₂O 40 g, MnSO₄ * H₂O 30 g, NaCl 10 g, FeSO₄ * 7H₂O 1 g, CoCl₂ * 6H₂O 1 g, ZnSO * 7H₂O 1 g, CuSO₄ * 5H₂O 100 mg, H₃BO₃ 100 mg, NaMoO₄ * 2H₂O 100 mg. 1000X 변형된 미량 금속 용액의 경우, 각 성분은 한 번에 하나씩 DIH₂O에 녹이고, pH는 3.0으로 HCl/NaOH를 사용하여 조정한 다음 증류수로 부피를 맞추고 0.22 마이크론 (μm) 필터로 여과 멸균된다 (본 용액은 고압 멸균되지 않는다). TM2 발효 배지의 경우, 모든 성분은 다같이 첨가되었고, diH₂O에 녹였으며, pH는 6.8에서 포타슘 하이드록사이드 (KOH)로 조정되어 부피를 q.s. 맞추었고, 배지는 0.22 마이크론 (μm) 필터로 여과 멸균되었다. 포도당은 99DE (덱스트로스와 동등함), 71% DS (건조 고형) 시럽으로서 카길 (Cargill)로부터 공급되었다.

발효는 상부 메발론산 (MVA) 경로 (pCL Upper MVA), 삽입된 상부 MVA 경로 (cmR-gi1.2-yKKDyI), M. mazei 로부터 메발로네이트 키나제 및 P. alba (pTrcAlba-mMVK)로부터 이소프렌 합성효소를 발현하고, ybhE (pgl) 를 전신적으로 발현 (RM111608-2)하거나 ybhE (pgl)를 정상적으로 발현 (EWL256)하는 E. coli 균주 EWL256 또는 RM111608-2를 사용하여 15-L 생물 반응기에서 수행되었다. 본 실험은 원하는 발효 조건 (pH 7.0 및 온도 34℃)에서 포도당으로부터 이소프렌의 형성을 감시하도록 수행되었다.

냉동 바이알로부터 가져온 적절한 E. coli 균주의 접종액이 펩톤-효모 추출물 배지에서 제조되었다. 접종액이 OD₅₅₀ = 0.6이 된 이후에, 600 mL 이 TM2 배지를 포함하는 15-L 생물반응기를 접종하는 데 사용되었다. 포도당은 세포가 안정상에 도달할 때까지 지수적 속도로 첨가되었다. 이 시점 이후 포도당 첨가는 대사적 요구를 만족시키기 위해 감소되었다. 67시간 발효 동안 생물반응기로 운반된 포도당의 전체 양은 3.9 kg이었다. 유도는 이소프로필-베타-D-1-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)를 첨가하여 달성되었다. IPTG 농도는 광학 밀도가 550 nm (OD₅₅₀)에서 9값에 도달할 때 102 uM이 되었다. IPTG 농도는 OD₅₅₀이 140에 도달할 때 192 uM로 올라갔다. 접종 이후 다양한 시간대에 시료가 수집되었고 생산된 이소프렌량은 하기에 기술된 바와 같이 결정되었다. 생물반응기로부터 나온 배출기체에서 수소, 질소, 산소, 이산화탄소, 및 이소프렌의 수준은 하기에 논의된 바와 같이 하이덴 HPR-20 질량 분광측정기를 사용하여 결정되었다.

15-L 생물반응기로부터 나온 발효 배출-기체의 시료는 바이알을 1 L_배출기체/분 속도로 10초 동안 세척하여 (sparging) 20 mL 유리 상부공간 바이알 내로 수집되었고 테프론-코팅된 격막 (Agilent, CA)에 맞춘 금속 회전 뚜껑으로 밀봉되었다. 바이알은 수집 30분 이내에 분석되었다.

두 가지 시료의 분석은 하이덴 HPR-20 질량 분광측정기 (Hiden Analytics, U.K.) 내에 질량 분광측정기의 유입 튜브를 뚜껑이 없는 상부공간 바이알 내에 1-2분 동안 놓아두고 4 scc/분 (4 mL/분)의 속도로 주입하여 수행되었다. HPR-20 기기는 수소 (m/z 2), 질소 (m/z 28), 산소 (m/z 32), 이산화탄소 (m/z 44) 및 이소프렌 합성효소 (m/z 67)에 해당하는 질량을 스캔하도록 만들어졌다. 파라데이 검출기 (Faraday detector)가 질량28, 32, 44 및 67에 대해 사용되었다. SEM 검출기는 수소 (m/z 2)에 대해 사용되었다. 검출기 반응은 임의적 단위의 압력 (Torr)에서 측정되었다. 절대적 수소 수준은 실제 수소 기체 표준과 비교하여 평가되었다. 결과는 MASsoft V 6.21.0.51 소프트웨어 (Hiden Analytics, 영국)를 사용하여 기록되었다.

결과

배출-기체 시료가 두 가지 발효 진행으로부터 수집되었고 상기에 기술된 바와 같이 분석되었다:

A) 균주 RM111608-2 (E. coli BL21 (DE3), pCL upper, cmR-gi1.2-yKKDyI, pTrcAlba-mMVK, pBBR cmR-gi1.5-pgl). 시료는 발효가 혐기적으로 1 vvm 에서 질소 살포로 진행되고 있는 동안 64.8 시간대에 수집되어 분석되었다.

B) 균주 EWL256 (E. coli BL21 (DE3), pCL upper, cmR-gi1.2-yKKDyI, pTrcAlba-mMVK). 시료는 발효가 혐기적으로 1 vvm 에서 공기 살포로 진행되고 있는 동안 34.5 시간대에 수집되어 분석되었다.

결과는 도165A 및 165B에 나타나있다. 둘 다의 경우에서, 이소프렌, 산소 및 이산화탄소에 덧붙여 낮은 수준의 수소가 검출되었다. 수소에 대한 기저선 리딩은 0.95 x 10^-8 Torr이었다. 시료 A 및 B 둘 다는 1.3 x 10^-8 Torr 주변의 리딩값을 가졌다. 수소 표준과의 비교에 근거하여, 시료 A 및 B의 경우 배출-기체에 존재하는 수소의 양이 10 ppmv (백만 부피 당 부분) 이하이지만 기저선 초과인 것으로 평가되었다. 도 165A 및 165B에서 나타난 바와 같이, 시료 A 및 B 둘 다는 이소프렌과 이산화탄소의 유의한 양도 역시 포함하였다.

실시예 26: M. mazei 메발로네이트 키나제, P. alba 이소프렌 합성효소, pCL Upper MVA ( E. faecalis mvaE와 mvaS) 및 ybhE (pgl)를 발현하는 대장균 균주에서 이소프렌 및 수소의 공동-생산

발효 배출-기체의 수집 및 수소와 이소프렌 수준에 대한 분석

본 실험의 목적은 대장균의 조작된 균주에서 수소와 이소프렌을 공동-생산하는 것이다. 본 목적을 위해, 대장균 수소화효소-3를 인코딩하는 hyc 오페론의 일부가 본 명세서에서 기술된 RM111608-2와 같은 박테리아 균주라면 모두가 유사하게 변형될 수 있긴 하지만 본 명세서에서 기술된 바와 같이 제조된 균주 EWL256 [BL21 (DE3), pCL upper, cmR-gi1.2-yKKDyI, pTrcAlba-mMVK]에서 발현될 것이다. hyc 오페론 유전자 hycB (gi|16130631), hycC (gi|16130630), hycD (gi|16130629), hycE (gi|16130628), hycF (gi|16130627), 및 hycG (gi|16130626) 를 포함하는 발현 제작물이 공개적으로 사용가능한 유전자 서열에 의거하여 당해 기술분야에 숙지되어 있는 표준 클로닝 방법에 의해 제조되었고, 새로운 균주 EWL256+Hyd-3를 생산하도록 균주 EWL256 내에 도입되었다.

수소와 이소프렌의 공동-생산에 미치는 추가적인 돌연변이의 영향이 EWL256+Hyd-3에서, 수소화효소-3의 성숙 또는 조절에 관여하는 유전자를 도입에 의해 (예로, hycH (gi|16130625) 및 hycI (gi|16130624)), 수소 흡수 또는 전달에 관여하는 유전자 (예로, E. coli 수소화효소-1 (hya 오페론) 및 수소화효소-2 (hyb 오페론)) 또는 관련 단백질 (예로, 포르메이트 탈수소화효소 (fdhF (gi|16130624)), 포르메이트 용해효소의 억제인자 (hycA (gi|16130632)), 포르메이트 탈수소화제 N, 알파 소단위 (fdnG (gi|16129433)), 포르메이트 탈수소화효소 O, 큰 소단위 (fdoG (gi|16131734)), 나이트레이트 환원효소 (narG (gi|16129187)), 푸마레이트 환원효소 조절인자 (fnr (gi|16129295)), 및 아세틸-공효소 A 합성효소 (acs (gi|16131895)))의 불활성화 또는 결실에 의해, 수소화효소의 상승조절에 관여하는 유전자의 불활성화에 의해 (예로, 수소 포르메이트 용해효소의 활성인자 (fhlA (gi|16130638)), 발효 부산물의 생산에 관여하는 유전자 (예로, 락테이트 탈수소화효소 (ldhA (gi|16129341)), 푸마레이트 환원효소 막 단백질 (frdC (gi|16131977)), 알코올 탈수소화효소 (adhE (gi|16129202)), 피루베이트 산화효소 (poxB (gi|16128839)), 피루베이트 탈수소화효소 E1 능력있는 ackA/pta (aceE (gi|16128107)), 포르메이트 탈수소화효소 조절 단백질 (hycA (gi|16130632 )), 포르메이트 운반체 A와 B (FocA (gi|16128871) 및 FocB (gi|16130417))를 불활성화 또는 결실에 의해, 또는 수소 대사에 관여하는 이종유래 유전자 (예로, Clostridium acetobutylicum로부터 나온 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소화효소 (gapC (gi|15893997))의 발현에 의해, 단독 또는 조합하여 평가된다.

발효는 본 명세서에서 기술된 바와 같이 하나 이상의 돌연변이를 단독 또는 조합으로, 필수적으로 상기 실시예 25에서 기술된 바와 같이 포함하도록 변형된, 균주 EWL 256+Hyd-3 (BL21 (DE3), pCL upper, cmR-gi1.2-yKKDyI, pTrcAlba-mMVK and hycB-F)의 조작된 변이체를 사용하여 수행되었다. 수소와 이소프렌의 공동-생산은 필수적으로 상기에서 기술된 바와 같이 배출-기체 시료의 분석에 의해 평가된다. 균주는 이소프렌과 수소 공동-생산률에 근거하는 심화된 분석을 위해 선택된다.

달리 정의되지 않는 경우라면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어의 의미는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의해 보편적으로 이해되는 것이다. Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York (1994), 및 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, N.Y. (1991)은 본 발명에서 사용되는 많은 용어의 일반적인 사전으로 당업자에게 제공된다. 본 발명은 이들이 다양해질 수 있기 때문에 특정한 방법론, 프로토콜, 및 기술된 반응액에 제한되지 않는 것으로 이해된다. 당업자라면 또한 본 명세서에서 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이라면 모두도 역시 본 발명을 시행하거나 테스트하는 데 사용될 수 있는 점을 인정할 것이다.

실시예 27: 쿠쥬 이소프렌 합성효소를 더한 상부 또는 상부 및 하부 메발론산 경로를 포함하는 대장균 fadR atoC LS5218에서 지방산 또는 팜 오일로부터 나온 이소프렌 또는 메발로네이트의 생산

대장균 fadR atoC 균주 LS5218 (#6966)는 콜라이 유전적스톡 센터로부터 획득되었다. FadR는 지방산 분해효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 음성적으로 조절하는 전사 억제인자 (transcription repressor)를 인코드한다 (Campbell et al., J. Bacteriol. 183: 5982-5990, 2001). AtoC는 AtoS가 아세토아세테이트 대사를 조정하는 두 가지-성분 조절 시스템에서 반응 조절인자이다. fadR atoC 균주는 지방산 분해 유전자의 전신 발현을 허용하고 긴 사슬 지방산을 긴-사슬 길이 폴리하이드록시알카노에이트 내로 통합시킨다. 팜 오일이 메발로네이트 또는 이소프렌 생산 둘 중 하나의 탄소원으로서 사용될 때, 팜 오일은 지방산을 더한 글리세롤으로 전환된다. 이를 위한 방법은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있고 이것은 리파제 (예를 들어 돼지 췌장 리파제, 칸디다 루고사 (Candida rugosa) 리파제, 또는 기타 유사한 리파제)를 사용한 배양에 의해 효소적으로 또는 소듐 하이드록사이드와 같은 염기와의 비누화 (saponification)에 의해 화학적으로 시행될 수 있다.

i) 상부 메발론산 경로를 발현하는 대장균 fadR atoC 균주

WW4 균주는 표준 방법을 사용하여 pCLPtrcUpperPathway를 LS5218 내로 전기천공하여 만들어졌다 (Sambrooke et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제 2판, 콜드 스프링 하버, 1989). 플라스미드의 도입은 세포가 탄소원으로서 C12 지방산 (FA) 또는 팜 오일 둘 중 하나를 보충한 TM3 배지에서 배양될 때 메발론산 (MVA)의 생산에 의해 전시되었다. 지방산으로부터 WW4에 의한 MVA의 생산을 나타내기 위하여, 밤샘 배양으로부터 얻은 세포는 0.25% C12 FA (시스마사 카탈로그 번호 # L9755)가 보충된 5 mL의 변형된 TM3 배지 (효모 추출물이 없는 TM3) 내에서 1 내지 100으로 희석되었다. MVA 생산의 첫 번째 표시 (24 mg/L)는 IPTG 유도된 세포 배양을 30℃에서 하룻밤 동안 배양한 이후에 드러났다. 생산은 3일 초과 기간 동안 최종 수준이 194 mg/L의 생산된 MVA까지 증가하였다. 오일로부터 WW4에 의한 MVA 생산을 나타내기 위하여, 밤샘 배양으로부터 나온 세포는 5 mL의 TM3 배지 당 200 mg의 소화된 팜 오일이 보충된 변형된 TM3 배지 내에서 1 내지 100으로 희석되었다. MVA 생산의 첫 번째 표시 (50 mg/L)는 IPTG 유도된 세포 배양을 30℃에서 하룻밤 동안 배양한 이후에 드러났다. 생산은 3일 초과 기간 동안 최종 수준이 500 mg/L의 생산된 MVA까지 증가하였다.

ii) 쿠쥬 이소프렌 합성효소를 더한 상부 및 하부 메발론산 경로를 발현하는 대장균 fadR atoC 균주

대장균 균주 WW4 (LS5218 fadR atoC pCLPtrcUpperPathway)가 pMCM118 [pTrcKKDyIkIS]로 형질전환되어 WW10를 획득하였다. 플라스미드의 도입은 균주가 TM3 및 포도당에서 배양되어 IPTG (100, 300, 또는 900 μM)로 유도되었을 때 이소프렌 생산의 입증에 의해 전시되었다. 균주는 IPTG에 상대적으로 민감하였고 심지어 100 μM IPTG에서는 유의한 성장 결함을 보여주었다. 이들 결과는 도 70A에 나타나있다.

도데칸산으로부터 이소프렌 생산을 테스트하기 위하여, WW10가 스펙트로마이신 (50 μg/ml), 및 카나마이신 (50 μg/ml)을 포함하는 LB 배지에서 200 rpm으로 진탕하면서 하룻밤 동안 배양되었다. 세포는 변형된 TM3 배지로 원심분리 및 본 배지를 사용한 그들의 원래 배양 부피에서의 재현탁에 의해 세척되었다. 본 시작 (starter) 배양으로부터 세척되고 재현탁된 세포는 0.125% C12 지방산 (시그마 카탈로그 번호 #L9755)을 포함하는 5 mL의 변형된 TM3 배지 내에서 1 내지 100 및 1 내지 10으로 희석되었다.

팜 오일로부터 메발로네이트 생산을 전시하기 위하여, 오일은 37℃에서 250 rpm으로 수 일 동안 리파제로 전-소화되어 지방산을 방출하였다 (가수분해의 입증은 튜브가 진탕되었을 때 형성되는 거품에 의해 판단되었다).

또한, 배양액은 세척된 세포를 팜 오일과 함께 테스트 튜브에 포함된 변형된 TM3 배지 내에서 1 내지 10으로 희석되는 것으로 설정되었다. 좀 더 나아가 튜브는 추가적 희석 없이 세척된 세포의 나머지 (2.5 mL)에 0.125% C12 FA을 추가하는 것으로 설정되었다 (생물전환). 250 rpm으로 진탕하면서 30℃에서 3.75 시간의 배양 이후에, 모든 배양액은 50 μM IPTG의 첨가에 의해 유도되었다. 배양은 200 μL의 각 배양액이 변형된 상부공간 분석법으로 이소프렌 축적에 대해 분석된 시점 이후에 (500 rpm으로 진탕하면서 30℃에서 1 시간 축적) 4시간 동안 계속되었다. 추가적인 이소프렌 분석법이 GCMS 분석 이전에 분석 유리 블록의 12 시간 배양에 의해 시행되었다. 유도된 배양액의 배양이 하룻밤 동안 계속되었고 200 μL 분량이 다시 이소프렌 생산에 대해 다음날 아침에 분석되었다. 이들 배양액의 분석은 유의한 수준의 이소프렌의 생산을 보여주었다. 가장 높은 수준의 이소프렌이 하룻밤 동안 배양되고 유도되었던 이후에 밤샘 시작 배양액으로부터 나온 1/10 희석으로 접종된 배양액에서 관찰되었다. 본 결과는 본 배양액이 계속 증식하였고 세포 밀도가 증가되었던 것을 제시한다. 이들 결과는 도 70B에 나타나있다. 세포 밀도는 지방산 현탁액이 혼탁한 모습을 가지기 때문에 직접적으로 측정될 수는 없었다. 본 배양액의 세포 밀도는 따라서 배양액의 분량을 도말하여 결정되었으며 8 x 10⁷ 콜로니 형성 단위를 보여주었다. 이것은 대략적으로 0.1의 OD₆₀₀에 해당한다. 그럼에도 불구하고, 본 배양액은 유의한 이소프렌 생산을 제공하였다: 이소프렌은 본 실시예에서 기술된 경로가 없이는 유사한 균주의 경우에도 전혀 관찰되지 않는다.

실시예 28: 스트렙토마이세스 종에서 식물로부터 나온 이소프렌-합성효소의 발현

쿠쥬 이소프렌 합성효소에 대한 유전자가 플라스미드 pJ201:19813로부터 획득되었다. 플라스미드 pJ201:19813는 푸엘라리아 로바타 (Pueraia lobata) (Kudzu 식물)로부터 나온 이소프렌 합성효소를 인코드하고 슈도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida), 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris) 및 코리네박테리움 (Corynebacterium)을 위해 코돈-최적화되었다 (도 79A 내지 79C (서열번호 123)). 플라스미드 pJ201:19813의 제한효소 NdeI 및 BamHI로의 소화는 스트렙토마이세스-대장균 셔틀 벡터 (Streptomyces-E.coli shuttle vector) pUWL201PW (Doumith et al., Mol. Gen. Genet. 264: 477-485, 2000; 도 71) 내로 결찰되었던 유전자 iso 19813을 방출하여 pUWL201_iso를 생성하였다. 성공적인 클로닝이 pUWL201_iso의 제한효소 분석에 의해 확인되었다. 이소프렌 합성효소 iso19813의 발현은 스트렙토마이세스 종에서 전신 발현을 허용하지만 대장균에서 발현은 허용하지 않는 erm-프로모터의 조절 하에 두었다.

PUWL201PW (삽입물 없음) 및 pUWL201_iso는 스트렙토마이세스 알부스 (Streptomyces albus) J1074 (Sanchez et al., Chem. Biol. 9:519-531, 2002)에 Hopwood et al., The John innes foundation, Norwich, 1985에 의해 기술된 바와 같은 원형질체 (protoplasts)의 형질전환에 의해 도입되었다.

200 μl 분량의 원형질체 현탁액이 1.9 μg의 pUWL201PW 또는 2.9 μg의pUWL201_iso로 형질전환되었다. 비-선택적 R5-아가 플레이트 상에서 28℃로 밤샘 배양한 이후에, 양성 형질전환체가 티오스트렙톤 (thiostrepton) (250 μg/ml)을 포함하는 R3-오버레이 아가에서 4일 동안 더 배양하여 선별되었다. 티오스트렙톤 저항성 형질전환체가 플라스미드 미니 키트 (퀴아젠사)를 사용하는 플라스미드 준비에 의해 pUWL-플라스미드의 존재에 대해 조사되었다. 준비된 플라스미드 DNA는 충분한 양의 플라스미드 DNA를 생성하도록 대장균 DH5α 내에 재도입되었고 제한효소 분석에 의해 분석되었다. 양성 형질전환체는 앰피실린-포함 L-아가 플레이트 상에서 선별되었고 삽입물 분석이 제한효소 NdeI 및 BamHI로 플라스미드 DNA의 소화에 의해 시행되었다. 이소프렌 합성효소는 양성 pUWL201 iso 클론에서 1.7 kb 단편으로서 확인되었고 반면 대조군 균주 (pUWL201PW)는 이러한 단편이 전혀 관찰되지 않았다.

S. 알부스의 야생형 균주 및 대조군 플라스미드 pUWL201PW 또는 이소프렌 합성효소를 인코딩하는 pUWL201_iso 를 포함하는 형질전환체가 이소프렌 형성에 대해 분석되었다. 균주는 티오스트렙톤 (200 μg/ml)의 존재 시 또는 부재 시 고체 배지 상에서 두 벌씩 고체 배지 상에서 (트립신 소이 액체배지 아가, TSB; 2.5 ml) 세포 배양되었고 밀봉된 상부-공간 바이알 (전체 부피 20 ml)에서 28℃로 4일 동안 배양되었다. 500 μl의 상부-공간 시료 (종말점 측정)가 SIM 모드에서 GC-MS에 의해 분석되었고, 이소프렌이 기준 보유 시간 및 분자적 질량 (67 m/z)에 따라 확인되었다. 상부-공간 시료에 존재하는 이소프렌은 이전에 생성된 측정 곡선에 의해 정량되었다. 야생형 S. 알부스 및 pUWL201PW를 보유하는 대조군 균주는 검출 한계 (0.04 - 0.07 ppm)보다 약간 높은 농도로 이소프렌을 생산하였던 반면, pUWL201_iso를 보유하는 S. 알부스는 대조군과 대비하여 적어도 10배 초과의 이소프렌을 생산하였다 (0.75 ppm; 도 72). 본 결과는 악티노마이세스 (Actinomycetes) 그룹의 원생생물에서 식물-유래 이소프렌 합성효소의 성공적인 발현을 나타낸다.

실시예 29: 바이오이소프렌 ^TM 의 회수

바이오이소프렌^TM은 활성 탄소의 흡착에 의해 이에 이어지는 오프-라인 스트림의 탈착 및 농축에 의해 발효 배출-기체 스트림으로부터 나온 이소프렌의 비워냄이 연루된 두-단계 작동에 있는 4가지의 14-L 발효의 세트로부터 회수되어 액체 바이오이소프렌^TM을 주었다 (도 166A 및 166B). 네 대의 발효기에 의해 생산된 바이오이소프렌^TM의 전체량은 1150 g (16.9 mol)이었으며, 이 중에서 953 g (14 mol, 83%) 은 탄소 필터에 흡착되었다. 스트림 탈착/농축 단계 이후에, 회수된 액체 바이오이소프렌^TM의 양은 810 g이었으며 전체 회수 수율은 70%에 해당하였다. 회수된 바이오이소프렌^TM은 불순물의 존재에 대해 분석되었다.

바이오이소프렌 ^TM 액체의 분석 및 분순물 프로파일

회수된 바이오이소프렌^TM 액체는 불순물의 성질 및 수준을 결정하도록 GC/MS 및 기체 크로마토그래피/발화 이온화 검출 (flame ionization detection) (GC/FID)에 의해 분석되었다. 산물은 > 99.5% 순수한 것으로 결정되었고 많은 소수의 성분에 더하여 여러가지 우세한 불순물을 포함하고 있었다. GC/FID 크로마토그램은 도 167에 나타나 있고, 불순물의 전형적인 수준은 표 19에 보여진다. 불순물 프로파일은 본 규모로 생산된 다른 바이오이소프렌^TM 배치와 유사하였다. 표 19는 바이오이소프렌^TM의 여러가지 배치에서 나타난 불순물의 성질 및 수준의 요약 정리를 나타낸다.

화합물	보유 시간 (분)		농도 범위
	GC/MS	GC/FID
에탄올	1.59	11.89	<50 ppm
아세톤	1.624	12.673	<100 ppm
메타크롤레인	1.851	15.369	<200 ppm
메틸 비닐 케톤	1.923	16.333	<20 ppm
에틸 아세테이트	2.037	17.145	100 내지 800 ppm
3-메틸-1,3-펜타디엔	2.27	18.875	50 내지 500 ppm
메틸 비닐 옥시란	2.548	19.931	<100 ppm
이소프레놀	2.962	21.583	<500 ppm
3-메틸-1-부탄올	2.99	21.783	<50 ppm
3-헥센-1-올	4.019	24.819	<100 ppm
이소펜테닐 아세테이트	4.466	25.733	200 to 1000 ppm
3-헥센-1-일 아세테이트	5.339	27.223	<400 ppm
리모넨	5.715	27.971	< 500 ppm
기타 고리형 화합물	5.50 - 6.50	27.5 - 28.0	<200 ppm

흡착제로의 처리에 의한 바이오이소프렌 ^TM 의 정제

흡착제는 탄화수소 공급원료로부터 미량 불순물의 제거를 위한 산업에 의해 널리 사용되고 있다. 적합한 흡착제로는 제올라이트, 알루미나 및 실리카-기초 물질을 포함한다. 바이오이소프렌^TM은 실리카겔 위에 통과에 의해, 또한 더 적은 정도로 알루미나를 사용하여 실질적으로 정제될 수 있다. 도 168은 처리 이전 (A) 또한 알루미나 (B) 또는 실리카 (C)로 처리하기 이후에 바이오이소프렌^TM의 GC/FID 크로마토그램을 보여준다. BASF로부터 나온 셀렉스소브^TM (Selexsorb^TM) 흡착제 제품은 바이오이소프렌^TM으로부터 나온 극성 불순물의 제거를 위해 선택되는 흡착제의 하나이다. 상세하게는, 설렉스소브 CD 및 CDX 제품은 이소프렌 및 부타디엔 공급원료로부터 극성 불순물의 제거를 위한 그들의 입증된 유용성이 있기 때문에 바람직하다.

실시예 30: 바이오이소프렌 ^TM 의 화학적 변환

화합물 및 용매는 시그마 알드리치사 (미국 WI)로부터 받아서 사용하였다. 바이오이소프렌^TM은 이소프렌 합성효소 및 이종유래 메발론산 (MVA) 이소프렌 전구체 생합성 경로를 발현하는 대장균 BL21 균주의 발효에 의해 생산되었다. 바이오이소프렌은 조, 액체 이소프렌을 획득하도록 활성 탄소에 흡착에 의해, 이어지는 수증기 탈착 및 농축에 의해 발효 배출-기체로부터 회수되었다. 바이오이소프렌은 사용 전 바로 분획 증류법에 의해 정제되었다.

¹ H NMR 분석법

양성자 Proton (¹H) 핵 자기 공명 (NMR) 스펙트럼이 배리안 VNMRS 500 MHz NMR 시스템 상에서 기록되었다. 모든 NMR 스펙트럼은 테트라메틸실란 (TMS, 0 ppm) 또는 클로로포름 (CHCl₃, 7,26 ppm)을 기준으로 하였고 피크 빈도는 달리 특정되지 않는 경우라면 ppm 단위로 기록되었다. 시료는 중수소 클로로포름 (CDCl₃) 또는 메탄올 (CD₃OD) 둘 중 하나에서 진행되었다.

GC/MS 분석법

분석은 상부공간 모드에서 작동하는 CTC 분석법 (스위스) CombiPAL 자동시료수집기가 내장된 애질런트 6890 GC/MS 시스템을 사용하여 수행되었다. 애질런트 HP-5MS GC/MS 컬럼 (30 m x 0.25 mm; 0.25 μm의 필름 두께)가 분석물의 분리를 위해 사용되었다. 자동시료수집기는 10 μL 액체 주사기로부터 1 μl의 액체 시료를 주입하도록 설정되었다. GC/MS 방법은 운반 기체로서 헬륨을 1 mL/분의 유속으로 사용하였다. 주입 포트는 250℃에서 100 : 1의 간격 비율 (split ratio)로 유지되었다. 오븐 프로그램은 50℃에서 2분 동안 시작되었고, 25℃/분의 속도로 225℃까지 증가하였으며, 10분의 전체 진행 시간 동안 1분의 유지 (hold)가 이어졌다. 애질런트 5793N 질량 선택 검출기 (mass selective detector)는 스캔 모드에서 m/z 29로부터 500까지 진행되었다. 1.5분의 용매 지연이 시행되었다. 이들 조건 하에서 이소프렌 (2-메틸-1,3-부타디엔)은 0.675분에서 용출되는 것이 관찰되었다.

GC/FID 분석법

분석은 액체 모드에서 작동하는 CTC 분석법 (스위스) CombiPAL 자동시료수집기가 내장된 애질런트 6890 GC/FID 시스템을 사용하여 수행되었다. 애질런트 DB-Petro GC 컬럼 (100 m x 0.25 mm; 0.50 μm의 필름 두께)가 분석물의 분리를 위해 사용되었다. 자동시료수집기는 10 μL 액체 주사기로부터 1 μl의 액체 시료를 주입하도록 설정되었다. GC/FID 방법은 운반 기체로서 헬륨을 1 mL/분의 유속으로 사용하였다. 주입 포트는 200℃에서 50 : 1의 간격 비율 (split ratio)로 유지되었다. 오븐 프로그램은 50℃에서 15분 동안 시작되었고, 25℃/분의 속도로 250℃까지 증가하였으며, 33분의 전체 진행 시간 동안 10분의 유지 (hold)가 이어졌다. FID 검출기는 280℃에서 불변 제조 모드 (Constant makeup mode)를 사용하여 35 mL/분의 수소 유속 및 250 mL/분의 공기 유속으로 유지되었다. 이들 조건 하에서 이소프렌 (2-메틸-1,3-부타디엔)은 13.54분에서 용출되는 것이 관찰되었다.

I. 열 디엘-알더 고리부가를 통한 이소프렌의 고리형 이중체의 제조

이소프렌 (1.02 g, 0.015 mole)은 열 이중합의 저해제로서 작용하는 2,6-디-터르-4-메틸페놀 (0.165 g, 0.05 mole)의 존재 시 150℃에서 24시간 동안 가열되었다. 반응은 진공 오븐에서 반응 이전에 24시간 동안 건조되었던 밀봉된 두꺼운-벽을 가진 유리 반응 용기에서 수행되었다. 빈응의 진행은 질량-분광분석 검출기 (GC/MS)를 가진 기체 크로마토그래피에 의해 감시되었다. 반응이 끝난 이후에, 그 결과 얻은 이성질체의 혼합물은 헥산을 용출용매로 가진 실리카겔 크로마토그래피를 사용하여 정제되었다. 회전 진공 증발기 상의 농축에 이어서, 산물은 GC-MS 및 ¹H-NMR에 의해 특성분석되었다. . GC-MS: 산물 A: 5.17, 5.19분; 산물 B: 5.72, 5.74분; 산물 C: 6.11분. ¹H-NMR (CDCl₃)δ: 5.8 (m); 5.4 (m); 4.95 (m); 2.4-1.2 (m).

II. Pd-촉매된 올리고중합을 통한 이소프렌 올리고체의 제조

이소프렌 (2.03 g, 0.03 mole)은 밀봉된 두꺼운-벽을 가진 유리 반응 용기에서 이소프로판올 (1.79 g, 0.03 mole)과 혼합되었다. 반응 이전에 유리 체임버는 진공 오븐에서 24시간 동안 건조되었다. 모든 반응액의 트랜스퍼가 불활성 질소 대기 하에서 시행되었다. 팔라듐 아세틸아세토네이트 (0.55 mg, 0.06 mmole) 및 트리페닐포스파인 (1.49 mg, 0.19 mmol)이 반응 혼합물에 첨가되었다. 그 다음 반응 체임버는 자기 교반기를 사용하여 혼합하면서 100℃에서 24시간 동안 가열되었다. 반응의 경과는 GC-MS에 의해 분석되었다. 일단 반응이 끝나면, 산물은 헥산을 용출용매로 가진 실리카겔 크로마토그래피를 사용하여 정제되었다. 최종 산물은 GC-MS 및 ¹H-NMR에 의해 특성분석되었다. GC-MS: 산물 A: 5.54 분; 산물 B: 6.6분; 산물 C: 6.85분.

III. 불포화된 화합물의 수소화

실시예 2 (1.36 g, 0.01 mole)에서 획득된 이성질체의 혼합물은 자기 교반기를 장착하고 수소화 촉매 (Pd/C, 5 wt%) (0.21 g, 0.1 mmol)를 포함하는 유리 체임버에 놓아둔다. 모든 유리 용기는 실험을 수행하기 이전에 진공 건조되었다. 수소 기체가 시스템 내에 도입되었고 압력은 3 기압으로 유지되었다. 몇 시간 이후에 반응 혼합물 Pd/C는 반응 혼합물로부터 여과되었고 산물은 실리카겔 크로마토그래피를 사용하여 분리되었다. 최종 분석은 GC/MS 및 NMR에 의해 시행되었다.

IV. 이소프렌의 에톡시화된 유도체의 제조

이소프렌 (0.982 g, 0.014 mole)은 자기 교반기를 장착한 두꺼운 유리벽 체임버에서 완전 에탄올 (0.665 g, 0.014 mol)과 혼합되었다. 농축된 황산의 촉매적 양이 반응 혼합물에 첨가되었고, 이어서 85℃에서 하룻밤 동안 교반되었다. 반응의 진행은 GC-MS에 의해 감시되었다. 가열하고 16시간 이후에 GC-MS 추적은 다음의 보유 시간을 가지는 이성질체의 혼합물의 존재를 드러냈다: 산물 A: 2.66분 m/z⁺ = 99; 산물 B: 3.88 m/z⁺ = 99, 114; 산물 C: 5.41분, m/z⁺ = 87, 99, 114.

V. 루테늄 촉매로 이소프렌의 C10 고리형 이중체로의 전환

이소프렌의 C10 고리형 이중체로의 전환은 루테늄 촉매를 사용하여 디메틸-사이클로옥타디엔의 혼합물로 탁월한 수율로 달성되어 왔다 (Itoh, Kenji; Masuda, Katsuyuki; Fukahori, Takahiko; Nakano, Katsumasa; Aoki, Katsuyuki; Nagashima, Hideo, Organometallics (1994), 13(3), 1020-9). 95% 이상의 전환이 매우 적당한 (moderate) 온도에서 (60℃ 정도로 낮음)에서 보고되어 있다. 촉매, 펜타메틸사이클로펜타디에닐-기초 루테늄 오가노금속 화합물은 루테늄 클로라이드 (RuCl₃) 및 펜타메틸사이클로펜타디엔 (C₅Me₅H)을 시작 물질로 사용하는 간단한 두 단계로 제조될 수 있다. 이중합 반응을 위해 촉매는 은 트리플레이트 (silver triflate, AgOTf)로 활성화되어 활성이 있는 종을 생산하지만, 다른 활성인자도 마찬가지로 사용될 수 있다.

VI. 크롬 촉매로 이소프렌의 C15 삼중체로의 전환

이소프렌의 C10 고리형 삼중체로의 전환은 P-N-P 리간드, N,N-비스(디아릴포스피노)아민을 가진 크롬 촉매를 사용하여 수행될 수 있다. 촉매는 그대로 (in situ) 제조되고 이것은 Bowen, L.; Charernsuk, M.; Wass, D.F. Chem. Commun. (2007) 2835-2837에 기술된 바와 같이 MAO를 사용하여 활성화된다. 직선형 및 고리형 산물의 혼합물 (3 : 1)로 구성되는 C15 삼중체로의 이소프렌의 보고된 전환은 적당한 온도 (70℃)에서 95% 정도로 높다. 사중체 (tetramers)는 모든 경우에 주요한 기타 산물로서 확인되었다.

V. 이소프렌의 수소화

이소프렌 (10 mL의 순수 에탄올에 녹인 10% 용액 (v/v))은 H-큐브 수소화 장치 (탈러스나노사 (ThalesNano), 미국 NJ 프린스턴)를 사용하여 연속적 방식으로 2-메틸부탄 (이소펜탄)으로 수소화되었다. 이소프렌 용액은 70℃로 유지된 10% Pd/C 촉매 카트리지를 통하여 0.5 mL/분의 속도로 펌프되었다. 수소 기체는 1 기압에서 "완전 모드 (full mode)"를 사용하여 도입되었다. 산물은 수집되었고 ¹H NMR 및 GC/FID에 의해 분석되었으며, 이는 부분적으로 수소화된 소량의 모노-올레핀을 추가하여 90% 초과 수율로 2-메틸부탄으로 이소프렌의 전환을 확인해주었다. ¹H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 0.8 (m, 9H, CH ₃ ); 1.12 (m, 2H, CH ₂ ); 1.37 (m, 1H, CH). GC/FID: 2-메틸부탄; 보유 시간 = 12.69분.

VIII. 이소프렌의 부분적 수소화

바이오이소프렌^TM 산물 (50 mL, 0.5 mol)은 톨루엔 (200 mL)과 혼합되었고 40℃ 및 5 bar 수소압에서 미디-큐브 수소화 장치 (탈레스나노사, 헝가리 부다페스트) 상의 5% Pd/C 촉매 위에서 부분적으로 수소화되었다. 기질 유속은 10 mL/분이었고 수소는 125 mM/분 (5 mmole/분)으로 운반되었다. 산물 스트림은 장치를 통해 2시간의 기간 동안 재순환되었고, 이후에 산물의 분량은 GC/MS 및 GC/FID에 의해 분석되었으며 시작 물질의 대부분이 이소펜탄 및 일정 미반응된 이소프렌에 추가하여 이소아밀렌 (2-메틸-1-부텐, 2-메틸-2-부텐 및 3-메틸-1-부텐)의 혼합물로 전환되었던 것을 보여주었다 (도 170).

IX. 바이오이소프렌 ^TM 산물의 선택적 수소화

바이오이소프렌^TM 산물은 달걀껍질 Pd/δ-Al₂O₃ 촉매를 사용하여 상기 실시예에서 인용된 조건 하에서 선택적으로 수소화되어 이소아밀렌의 혼합물을 주고, 이것은 GC/MS 분석법에 의해 결정된 바와 같이 2-메틸-2-부텐이 전체 이소아밀렌의 > 50%에 해당하는 우세한 산물이 되고, 3-메틸-1-부텐이 전체 이소아밀렌의 < 25%에 해당하는 소수의 산물이 된다. 이소프렌 및 잔존 이소프렌의 양은 전체 산물 스트림의 < 10% 에 해당한다. 유사한 결과가 탄소 촉매 상에 황화된 팔라듐이 반응을 수행하는 데 사용될 때 획득된다.

X. 기체 상에서 바이오이소프렌 ^TM 산물의 부분적 수소화

바이오이소프렌^TM 산물을 포함하는 건조한 기체 스트림이 약간 과다량의 수소 기체 (mol/mol)와 혼합되고 기체성 혼합물은 미국 특허출원 제 20090203520호에서 기술된 바와 같이 높은 공극 부피를 가지는 그룹 IB-촉진된 팔라듐 촉매와 같은 비균질 수소화 촉매 위를 통과하여 이소아밀렌의 혼합물 및 바이오이소프렌^TM 산물이 원래 유래한 발효 공정으로부터 유래한 하나 이상의 불순물을 생산한다. 전환은 0.5로부터 200 bar까지 범위의 압력 및 0℃로부터 200℃까지의 온도에서 수행된다.

XI. 고체 산 촉매로 이소아밀렌의 이중합

2-메틸-2-부텐 (1.5 mL) 및 톨루엔 (4 mL)은 앰버리스트 15 산 레진 (186 mg)으로 12시간 동안 상온에서 교반되었다. 분량 (500 μL)이 반응 혼합물로부터 제거되었고 GC 바이알로 이동되었다. 혼합물의 분석은 GC/MS (도 171)에 의해 수행되었고 바이오이소프렌^TM 성분으로서 적합한 C10 이중체 (디이소아밀렌)으로 부분적 전환을 드러냈다.

이중합 반응의 산물 (디이소아밀렌, C10 디메이트)은 임의적으로 실시예 30 제 VII부에 기술된 조건 하에서 또는 올레핀의 이소파라핀으로 수소화를 위한 당해 기술분야에 알려져 있는 조건을 통해서 [예를 들어, Marichonna (2001)을 참조하라] 전부 수소화된다.

XII. 고체 산 촉매로 바이오이소프렌 ^TM 산물의 연속적 올리고중합

바이오이소프렌^TM 단일체는 앰버리스트 15 이온 교환 레진 또는 동등한 촉매를 포함하는 이중합 반응기에서 C10 이중체 및 C15 삼중체로 연속적으로 전환된다. 바이오이소프렌^TM 공급 스트림은 바이오이소프렌^TM 단일체를 포함하고, 임의적으로 바이오이소프렌^TM과 보조-용매의 C5 유도체를 포함한다. 공정은 20으로부터 200℃까지 범위의 온도 및 0.5로부터 200 bar까지의 압력에서 시행된다. 이중합 단계의 산물은 첫 번째 분획 컬럼에서 분획되어 미반응된 이소프렌을 고차 (> C5) 올리고머로부터 분리된다. C5 분획은 이중합 반응기로 돌아가서 무거운 > C5 분획은 원하는 C10/C15 분획이 상부 스트림으로부터 수집되는 두 번째 분획법 내로 도입된다. > C15 올리고머로 구성되는 저부 분획은 Grubbs 2세대 촉매와 같은 상호교환 촉매 (metathesis catalyst)를 포함하는 재순환 (heavy recycle) 반응기 내로 공급된다. 상호교환 촉매는 고차 올리고머 분획의 일부분을 도 173에 나타난 바와 같이 분획 컬럼 #1 내로 연속하여 공급되는 올레핀 교차-상호교환 반응에 의해 더 가벼운 성분으로 전환시킨다.

전체적으로, 공정은 실시예 30, 제 VII부에서 기술된 조건 하에서 다음으로 부분적 또는 완전한 수소화에 들어가는 C10 이중체 및 C15 삼중체 바이오이소퓨얼^TM 전구체로의 바이오이소프렌 단일체의 전환을 유도한다. 그 결과 얻은 부분적으로 또는 전부 포화된 화합물은 바이오이소퓨얼^TM 조성물로서 또한 바이오이소퓨얼^TM 혼합원료로서 적합하다.

실시예 31: ¹³ C/ ¹² C 동위원소 분석

¹³C 분석은 코스테크 ECS4010 원소 분석기 (Costech ECS4010 Elemental Analyzer)를 써모피니간 델타 플러스 XP (ThermoFinnigan Delta Plus XP) 동위원소 비율 질량 분광분석기를 위한 인렛으로서 사용하여 탄소 동위원소 분석을 위한 주석 컵 내로 0.5 내지 1.0 mg 시료를 로딩하여 시행될 수 있다. 연소 기체가 헬륨 스트림에서 구리 반응기 (650℃)를 통하여 85 mL/분으로 통과되면서 시료는 1020℃에서 4가 코발트/2가 코발트 옥사이드 연소 반응기 내에 점적되어, NO_x를 N₂로 전환시키고, N₂는 3-m 5Å 분자적 체 컬럼을 사용하여 분리된다. 그 다음 ¹³C/¹²C 비율이 T. B. Coplen et al, New Guidelines for δ¹³C Measurements, Anal. Chem., 78, 2439-2441 (2006)의 두 가지 표준 접근법을 사용하는 오프-라인 연소 및 이중-인렛 분석 (dual-inlet analysis)에 의해 VPDB 척도로 조심스럽게 측정되었던 두 가지 실험실 표준 (아세트아닐리드 B, -29.52 ± 0.02‰m 및 옥수수전분 A, -11.01 ± 0.02‰)을 사용하여 VPDB 척도로 측정된다. 코프란 (Coplen)의 지도 (teachings)가 본 명세서에서 δ¹³C 값을 결정하는 기법을 가르칠 목적을 위해 참고문헌으로 통합되어 있다.

2008년 6월 30일에 제출된 미국 가특허출원 제 61/133,521호 및 국제특허출원 공개 제 WO 2010/05525 A1호는 공급원료 및 다양한 출처로부터 유래한 이소프렌의 중합체들을 위한 δ¹³C 값을 표 20에 나열된 것들을 포함하여 나열하고 있다.

시료	δ 13 C
팜오일	-30.00
효모 추출물	-25.70
추출적 증류로부터 얻은 시판되는 폴리이소프렌	-23.83
연목질 펄프로부터 얻은 슈가	-23.00
이소프렌 시료 B로부터 얻은 폴리이소프렌 (에멀젼 다중합)	-19.67
역슈가	-15.37
이소프렌 시료 A로부터 얻은 폴리이소프렌 (네오디뮴 촉매)	-14.85
바가스로부터 얻은 포도당	-13.00
옥수수 스토버로부터 얻은 포도당	-11.20
옥수수 전분	-11.10
포도당	-10.73

실시예 32: 대표적인 연료 특성

표 21은 본 명세서에서 기술된 방법을 사용하여 이소프렌으로부터 만들어질 수 있는 소정의 화합물의 연료 특성을 나열하고 있다.

본 명세서에서 제공된 제목은 본 발명의 명세서에 대한 참고문헌으로 전체적으로 설명되는 다양한 관점들 또는 구현예들의 제한은 아니다.

본 명세서에서 인용된 모든 출간물들, 특허 출원들, 및 특허들은 각각의 출간물, 특허 출원, 및 특허가 특정하여 또한 개별적으로 참고문헌으로 통합되는 것을 표시한 것처럼 본 명세서에서 참고문헌으로 통합된다. 상세하게는, 본 명세서에서 인용된 출간물 모두는 본 발명과 연관되어 사용될 수 있는 조성물 및 방법론을 기술하고 기재하는 목적으로 본 명세서에서 참고문헌으로 명백하게 통합되어 있다. 전술한 발명이 명확한 이해의 목적으로 설명과 예시가 어느 정도 상세하게 기술되었을지라도, 이것은 소정의 변화와 변형이 첨부된 청구항의 정신 또는 범위로부터 벗어나지 않고 만들어질 수 있다는 본 발명의 가르침에 비추어 당업자에게 명백한 것이 될 것이다.

부록 1

대표적인 1-데옥시-D-자일루로스-5-포스페이트 합성효소 및 폴리펩타이드

대표적인 아세틸-CoA-아세틸전이효소 핵산 및 폴리펩타이드

대표적인 HMG-CoA 합성효소 핵산 및 폴리펩타이드

대표적인 하이드록시메틸글루타릴-CoA 환원효소 핵산 및 폴리펩타이드

대표적인 메발로네이트 키나제 핵산 및 폴리펩타이드

대표적인 포스포메발로네이트 키나제 핵산 및 폴리펩타이드

대표적인 디포스포메발로네이트 탈탄산효소 핵산 및 폴리펩타이드

대표적인 이소펜테닐 포스페이트 키나제 (IPK) 핵산 및 폴리펩타이드

대표적인 이소펜테닐-디포스페이트 델타-이소머라제 (IDI) 핵산 및 폴리펩타이드

대표적인 이소프렌 합성효소 핵산 및 폴리펩타이드

진뱅크 기탁번호

AY341431

AY316691

AY279379

AJ457070

AY182241

<110> Danisco US Inc. MCAULIFFE, Joseph C. PARAMONOV, Sergey E. SANFORD, Karl J. <120> FUEL COMPOSITIONS COMPRISING ISOPRENE DERIVATIVES <130> 643842001440 <140> Not Yet Assigned <141> 2010-06-17 <150> PCT/US2010/039088 <151> 2010-06-17 <150> 61/187,959 <151> 2009-06-17 <160> 142 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1701 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 atgtgtgcga cctcttctca atttactcag attaccgagc ataattcccg tcgttccgca 60 aactatcagc caaacctgtg gaatttcgaa ttcctgcaat ccctggagaa cgacctgaaa 120 gtggaaaagc tggaggagaa agcgaccaaa ctggaggaag aagttcgctg catgatcaac 180 cgtgtagaca cccagccgct gtccctgctg gagctgatcg acgatgtgca gcgcctgggt 240 ctgacctaca aatttgaaaa agacatcatt aaagccctgg aaaacatcgt actgctggac 300 gaaaacaaaa agaacaaatc tgacctgcac gcaaccgctc tgtctttccg tctgctgcgt 360 cagcacggtt tcgaggtttc tcaggatgtt tttgagcgtt tcaaggataa agaaggtggt 420 ttcagcggtg aactgaaagg tgacgtccaa ggcctgctga gcctgtatga agcgtcttac 480 ctgggtttcg agggtgagaa cctgctggag gaggcgcgta ccttttccat cacccacctg 540 aagaacaacc tgaaagaagg 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gacgtgtatg acgtttatgg cactctggac gaactgcaac tgttcaccga 1380 tgctgtagag cgctgggacg ttaacgctat taacaccctg ccggactata tgaaactgtg 1440 tttcctggca ctgtacaaca ccgttaacga cacgtcctat tctattctga aagagaaagg 1500 tcataacaac ctgtcctatc tgacgaaaag ctggcgtgaa ctgtgcaaag cctttctgca 1560 agaggcgaaa tggtccaaca acaaaattat cccggctttc tccaagtacc tggaaaacgc 1620 cagcgtttcc tcctccggtg tagcgctgct ggcgccgtct tacttttccg tatgccagca 1680 gcaggaagac atctccgacc acgcgctgcg ttccctgacc gacttccatg gtctggtgcg 1740 ttctagctgc gttatcttcc gcctgtgcaa cgatctggcc acctctgcgg cggagctgga 1800 acgtggcgag actaccaatt ctatcattag ctacatgcac gaaaacgatg gtaccagcga 1860 ggaacaggcc cgcgaagaac tgcgtaaact gatcgacgcc gaatggaaaa agatgaatcg 1920 tgaacgcgtt agcgactcca ccctgctgcc taaagcgttc atggaaatcg cagttaacat 1980 ggcacgtgtt tcccactgca cctaccagta tggcgatggt ctgggtcgcc cagactacgc 2040 gactgaaaac cgcatcaaac tgctgctgat tgaccctttc ccgattaacc agctgatgta 2100 tgtctaactg cagctggtac catatgggaa ttcgaagctt tctagaacaa aaactcatct 2160 cagaagagga 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Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 26 gtgcggccgc aagcttgtcg acggagctcg aattcggatc cctgcagtta gacatacatc 60 agctggttaa tcgggaaagg gtcaatcagc agcagtttga tgcggttttc agtcgcgtag 120 tctgggcgac ccagaccatc gccatactgg taggtgcagt gggaaacacg tgccatgtta 180 actgcgattt ccatgaacgc tttaggcagc agggtggagt cgctaacgcg ttcacgattc 240 atctttttcc attcggcgtc gatcagttta cgcagttctt cgcgggcctg ttcctcgctg 300 gtaccatcgt tttcgtgcat gtagctaatg atagaattgg tagtctcgcc acgttccagc 360 tccgccgcag aggtggccag atcgttgcac aggcggaaga taacgcagct agaacgcacc 420 agaccatgga agtcggtcag ggaacgcagc gcgtggtcgg agatgtcttc ctgctgctgg 480 catacggaaa agtaagacgg cgccagcagc gctacaccgg aggaggaaac gctggcgttt 540 tccaggtact tggagaaagc cgggataatt ttgttgttgg accatttcgc ctcttgcaga 600 aaggctttgc acagttcacg ccagcttttc gtcagatagg acaggttgtt atgacctttc 660 tctttcagaa tagaatagga cgtgtcgtta acggtgttgt acagtgccag gaaacacagt 720 ttcatatagt ccggcagggt gttaatagcg ttaacgtccc agcgctctac agcatcggtg 780 aacagttgca gttcgtccag 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ctgtctggac ctggtgagtt tccccg 36 <210> 72 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 72 ggtgggccca ttaaatcagt tatcgtttat ttgatag 37 <210> 73 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 73 ggtgaccagc aagtccatgg gtggtttgat catgg 35 <210> 74 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 74 ggtgcggccg cctttggagt acgactccaa ctatg 35 <210> 75 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 75 gcggccgcag actaaattta tttcagtctc c 31 <210> 76 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 76 gatcaagctt aaccggaatt gccagctg 28 <210> 77 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 77 gatccgatcg tcagaagaac tcgtcaagaa ggc 33 <210> 78 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 78 catcaatgca tcgcccttag gaggtaaaaa aaaatgac 38 <210> 79 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 79 ccttctgcag gacgcgttgt tatagc 26 <210> 80 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 80 gatcatgcat tcgcccttag gaggtaaaaa aacatgagtt ttgatattgc caaatacccg 60 60 <210> 81 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 81 catgctgcag ttatgccagc caggccttga t 31 <210> 82 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 82 aggaggt 7 <210> 83 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 83 aaggagg 7 <210> 84 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 84 aggaggtaaa aaaacatgtc attaccgttc ttaacttctg c 41 <210> 85 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 85 atggctgcag gcctatcgca aattagctta tgaagtccat ggtaaattcg tg 52 <210> 86 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 86 gaattcgccc ttctgcagct acc 23 <210> 87 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 87 cgactggtgc acccttaagg aggaaaaaaa catgtcag 38 <210> 88 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 88 gtgctggaat tcgcccttct gcagc 25 <210> 89 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 89 gtagatgcat gcagaattcg cccttaagga gg 32 <210> 90 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 90 gtgtgatgga tatctgcaga attcg 25 <210> 91 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 91 catcaatgca tcgcccttag gaggtaaaaa aacatg 36 <210> 92 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 92 actgaaacgt tttcatcgct c 21 <210> 93 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 93 gagacatgag ctcaggaggt aaaaaaacat gaaaacagta gttattattg 50 <210> 94 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 94 tttatcaatc ccaattgtca tgttttttta cctcctttat tgttttctta aatc 54 <210> 95 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 95 gatttaagaa aacaataaag gaggtaaaaa aacatgacaa ttgggattga taaa 54 <210> 96 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 96 gacatgacat agatctttag tttcgataag aacgaacggt 40 <210> 97 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 97 atgaaaacag tagttattat tgatgc 26 <210> 98 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 98 atgttattgt tttcttaaat catttaaaat agc 33 <210> 99 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 99 atgacaattg ggattgataa aattag 26 <210> 100 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 100 ttagtttcga taagaacgaa cggt 24 <210> 101 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 101 gaaatagccc cattagaagt atc 23 <210> 102 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 102 ttgccaatca tatgattgaa aatc 24 <210> 103 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 103 gctatgcttc attagatcct tatcg 25 <210> 104 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 104 gaaacctaca tccaatcttt tgccc 25 <210> 105 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 105 cttgatgcat cctgcattcg cccttaggag g 31 <210> 106 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 106 ccaggcaaat tctgttttat cag 23 <210> 107 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 107 gcatgctcga gcggccgctt ttaatcaaac atcctgccaa ctc 43 <210> 108 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 108 gatcgaaggg cgatcgtgtc acagtctggc gaaaccg 37 <210> 109 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 109 ctgaattctg cagatatctg tttttccact cttcgttcac ttt 43 <210> 110 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 110 tctagagggc ccaagaaaaa tgccccgctt acg 33 <210> 111 <211> 111 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 111 gatcgcggcc gcgcccttga cgatgccaca tcctgagcaa ataattcaac cactaattgt 60 gagcggataa cacaaggagg aaacagctat gtcattaccg ttcttaactt c 111 <210> 112 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 112 gatcgggccc caagaaaaaa ggcacgtcat ctgacgtgcc ttttttattt gtagacgcgt 60 tgttatagca ttcta 75 <210> 113 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 113 aaagtagccg aagatgacgg tttgtcacat ggagttggca ggatgtttga ttaaaagcaa 60 ttaaccctca ctaaagggcg g 81 <210> 114 <211> 160 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 114 agagtgttca ccaaaaataa taacctttcc cggtgcagaa gttaagaacg gtaatgacat 60 agctgtttcc tccttgtgtt atccgctcac aattagtggt tgaattattt gctcaggatg 120 tggcatcgtc aagggctaat acgactcact atagggctcg 160 <210> 115 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 115 gacatctgca gctccatttt cttctgc 27 <210> 116 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 116 caataataac tactgttttc actctttacc ctctcctttt aa 42 <210> 117 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 117 ttaaaaggag agggtaaaga gtgaaaacag tagttattat tg 42 <210> 118 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 118 cggggccaag gccggttttt tttagtttcg ataagaacga acggt 45 <210> 119 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 119 accgttcgtt cttatcgaaa ctaaaaaaaa ccggccttgg ccccg 45 <210> 120 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 120 caccatggta tcctgttctg cg 22 <210> 121 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 121 ttaatctact ttcagacctt gc 22 <210> 122 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 122 gcgaacgatg cataaaggag gtaaaaaaac atggtatcct gttctgcgcc gggtaagatt 60 tacctg 66 <210> 123 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 123 gggcccgttt aaactttaac tagactttaa tctactttca gaccttgc 48 <210> 124 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 124 caccaaagac ttcatagact 20 <210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 125 agagatatct tcctgctgct 20 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 126 taatacgact cactataggg 20 <210> 127 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 127 accaattgca cccggcaga 19 <210> 128 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 128 gctaaagcgc atgctccaga c 21 <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 129 gactggcctc agatgaaagc 20 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 130 caaacatgtg gcatggaaag 20 <210> 131 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 131 gggcccgttt aaactttaac tagactctgc agttagcgtt caaacggcag aa 52 <210> 132 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 132 cgcatgcatg tcatgagatg tagcgtgtcc accgaaaa 38 <210> 133 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 133 acaatttcac acaggaaaca gc 22 <210> 134 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 134 gcactgtctt tccgtctgct gc 22 <210> 135 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 135 ggtttagttc ctcaccttgt c 21 <210> 136 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 136 cgtgaatttg ctggctctca g 21 <210> 137 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 137 gatagtaacg gctgcgctgc tacc 24 <210> 138 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 138 gacagcttat catcgactgc acg 23 <210> 139 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 139 accgccaaaa gcgactaatt ttagctgtta cagtcagttg aattaaccct cactaaaggg 60 cggccgc 67 <210> 140 <211> 152 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 140 gctggcgata taaactgttt gcttcatgaa tgctcctttg ggttacctcc gggaaacgcg 60 gttgatttgt ttagtggttg aattatttgc tcaggatgtg gcatagtcaa gggcgtgacg 120 gctcgctaat acgactcact atagggctcg ag 152 <210> 141 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 141 accgccaaaa gcgactaatt ttagct 26 <210> 142 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 142 cttgatatct tagtgtgcgt taaccaccac 30

Claims (19)

1. (1) 바이오이소프렌 조성물을 이소프렌 이중합 (dimerization)에 적합한 가열 (heat) 또는 촉매적 조건에 맡겨두어 이소프렌 이중체 (isoprene dimer)를 생산한 다음, 이소프렌 이중체를 촉매적으로 수소화하여 포화된 C10 연료 성분을 형성하는 것; 또는
   (2) (i) 상기 바이오이소프렌 조성물을 부분적으로 수소화하여 이소아밀렌을 생산하고, (ii) 상기 이소아밀렌을 이소아밀렌, 프로필렌 및 이소부텐으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 모노-올레핀과 이중합하여 디메이트 (dimate)를 형성하고, 또한 (iii) 상기 디메이트를 완전하게 수소화하여 연료 성분을 생산하는 것:
   에 의해 상기 바이오이소프렌 조성물에서 이소프렌의 실질적인 부분을 비-이소프렌 화합물들로 화학적으로 변환시키는 것을 포함하는 상기 바이오이소프렌 조성물로부터 연료 성분을 생산하는 방법.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 바이오이소프렌 조성물에서 적어도 95%의 이소프렌은 비-이소프렌 화합물들로 전환되는, 방법
3. 제 1항에 있어서,
   상기 바이오이소프렌 조성물은 약 150℃ 내지 약 250℃로 가열되어 불포화된 고리형 이소프렌 이중체를 생산하고, 상기 불포화된 고리형 이소프렌 이중체는 촉매적으로 수소화되어 포화된 고리형 이소프렌 이중체 연료 성분을 생산하는, 방법.
4. 제 1항에 있어서,
   상기 방법은 (i) 바이오이소프렌 조성물을 이소프렌의 고리-이중합 (cyclo-dimerization)을 촉매 작용하는 촉매와 접촉시켜서 불포화된 고리형 이소프렌 이중체를 생산하고, 상기 불포화된 고리형 이소프렌 이중체는 촉매적으로 수소화되어 포화된 고리형 이소프렌 이중체 연료 성분을 생산하는, 방법.
5. 제 4항에 있어서,
   상기 이소프렌의 고리-이중합을 촉매 작용하는 촉매는 니켈 촉매, 철 촉매 및 크롬 촉매로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 촉매를 포함하는, 방법.
6. 제 1항에 있어서,
   상기 바이오이소프렌 조성물을 부분적으로 수소화하는 단계는 바이오이소프렌 조성물을 수소 기체 및 이소프렌의 부분적 수소화를 촉매 작용하는 촉매와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
7. 제 6항에 있어서,
   상기 이소프렌의 부분적 수소화를 촉매 작용하는 촉매는 팔라듐 촉매를 포함하는, 방법.
8. 제 1항에 있어서,
   상기 이소아밀렌을 모노-올레핀으로 이중합하는 단계는 모노-올레핀의 이중합을 촉매 작용하는 촉매의 존재 시 상기 이소아밀렌을 상기 모노-올레핀과 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
9. 제 8항에 있어서,
   상기 모노-올레핀의 이중합을 촉매 작용하는 촉매는 산 촉매를 포함하는, 방법
10. 제 1항에 있어서,
    상기에 더하여 상기 바이오이소프렌 조성물을 연료 성분으로 화학적으로 변환시키기 이전에 상기 바이오이소프렌 조성물로부터 이소프렌을 정제하는 것을 포함하는, 방법
11. 바이오이소프렌 조성물에서 이소프렌의 실질적인 부분을 비-이소프렌 화합물들로 화학적으로 전환시키고, 시스템은 상기 바이오이소프렌 조성물 또한
    (a)(i) 상기 바이오이소프렌 조성물에서 이소프렌을 이중합할 수 있는 하나 이상의 화합물 또는 상기 바이오이소프렌 조성물에서 이소프렌을 이중합할 수 있는 가열원 (source of heat); 및 (ii) 상기 이소프렌 이중체를 수소화하여 포화된 C10 연료 성분을 형성할 수 있는 촉매; 또는
    (b)(i) 상기 바이오이소프렌 조성물에서 이소프렌을 부분적으로 수소화하여 이소아밀렌을 생산할 수 있는 화합물, (ii) 상기 이소아밀렌을 이소아밀렌, 프로필렌 및 이소부텐으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 모노-올레핀과 이중합하여 디메이트를 형성할 수 있는 화합물, 및 (iii) 상기 디메이트를 완전하게 수소화하여 연료 성분을 생산할 수 있는 화합물:
    을 포함하는, 상기 바이오이소프렌 조성물로부터 연료 성분을 생산하는 시스템.
12. 제 11항에 있어서,
    상기 바이오이소프렌 조성물은 약 2 mg 이상의 이소프렌을 포함하고, 상기 조성물에서의 모든 C5 탄화수소의 전체 무게에 대비하여 무게로 약 99.94% 이상의 이소프렌을 포함하는, 시스템.
13. 제 11항에 있어서,
    상기 이소프렌을 이중합할 수 있는 하나 이상의 화합물은 루테늄 촉매, 니켈 촉매, 철 촉매 및 크롬 촉매로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 촉매를 포함하는 이소프렌의 고리-이중합 (cyclo-dimerization)을 촉매 작용하는 촉매를 포함하는, 시스템.
14. 제 11항에 있어서,
    상기 불포화된 이소프렌 이중체를 수소화하는 촉매는 팔라듐 촉매, 니켈 촉매, 루테늄 촉매 및 로듐 촉매로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 촉매를 포함하는, 시스템.
15. 제 11항에 있어서,
    상기 이소프렌을 부분적으로 수소화할 수 있는 화합물은 팔라듐 촉매를 포함하는, 시스템.
16. 제 11항에 있어서,
    상기 이소아밀렌을 모노-올레핀과 이중합할 수 있는 화합물은 산 촉매를 포함하는, 시스템.
17. 제 1항의 방법에 의해 생산되는 연료 성분을 포함하는 연료 조성물.
18. 제 17항에 있어서,
    상기 연료 조성물은 실질적으로 이소프렌이 없는, 연료 조성물.
19. 제 17항에 있어서,
    상기 연료 조성물은 -22‰ 이상 또는 -32‰내지 -24‰의 범위 이내인 δ¹³C 값을 가지는, 연료 조성물.

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